METHOD AND DEVICE FOR THE KINETIC PROCESS CONTROL OF ENZYMATIC REACTIONS

Abstract: 1. Method for the kinetic process control of enzymatic reactions, characterised in that the reaction mixture, which contains the substrate to be hydrolysed and the hydrolytic enzymes, is divided into two streams by means of an ultrafiltration membrane, the ultrafiltration stream containing the cleavage products and the retentate stream containing the substrate, and the enzyme concentration is subsequently determined from the change in the substrate or product concentration in the retentate or ultrafiltration stream respectively.

Description: Verfahren zur kinetischen Prozesskontrolle von enzymatischen Stoffumsetzungen und Vorrichtung" Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur direkten Messung der Kinetik des enzymatischen Abbaues von hochpolymeren Substrnten. bisher wurden für die Bestimmung von Enzym-Aktivitä- ten zur Xontrolle von Reaktionsabläufen sog. Endpunktsmethoden, z.B. Automat. Anal. Chem. Techniton Symp., 1967, Vol 1, S. 587 ff oder Analyt. Biochem. 23 (1968), S. 466 ff beschrieben. Bei diesen Verfahren werden die im liydrolysereaktionsansatz gespaltenen Produkte von den nicht-umgesetzten Substraten durch nach Grösse klassierende Methoden-, wie Filtration, Zentrifugation oder Dialyse abgetrennt und anschliessend die Konzentraktion der Spaltprodukte, z.B. photocolorimetrisch bestimmt. Diese sog. Endpunktmethoden haben den Nachteil, dass sie eine direkte Verfolgung der Reaktion nicht ermöglichen. Weitere Nachweismethoden für den Abbau von hochpolymeren Substraten beruhcn darauf, dass die bei fortschreitender Reaktion eintretende Verringerung der Viskosität oder Veränderung der Lichtstreuung gemessen wird. (Vgl. Anal. Biochem., 90 (1978) S. 192 ff; Unters. Forsch., 162 (1976), S. 31 ff.). Diese Verfahren sind jedoch meist nicht allgemein auf Enzymklassen anwendbar, sondern müssen je nach Enzyme art von Fall zu Fall adaptiert werden, da beispiclswei se bekannte Substrate unter den Messbedingungen nicht löslich sind oder die Reaktionsgeschwindigkeit oft cr heblich reduziert wird. Hufig ist die Nachweisgrenze gering. Die in der Litcratur beschriebenen Verfahren sind sehr zeit- und personalaufwendig, da sie im all gemeinen mehrere verschiedene Arbeitsschrittc (Inkuba tion, Neutralisation, Fällung, Filtration, Zentrifuga tion, Dialyse, Anfärbung, Detektion und Auswertung) er fordern, welche zumeist nacheinander erfolgen müssen. Diese Verfahren sind zwar prinzipiell automatisierbar, aber aufgrund der Verknüpfung vcrschiedener heteroge ner Arbeitsschritte erfordern die Messgeräte einen sehr komplizierten Aufbau. Diese Nachteile der bekannten Messmethoden von Enzyn aktivitäten sollen durch das erfindungsgemässe Verf ah- ren vermieden werden. Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur kine tischen Prozesskontrolle von enzynatischen Stoffum setzungen, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man die Reaktionsmischung, welche das zu hydrolysierende, makromolekulare Substrat und die hydrolytischen Enzyme enthält, durch eine Ultrafiltrationsmembran in 2 Vo lumenströme aufteilt und anschlessend die Konzentra- tionsänderung an hydrolytischen Enzymen im Ultrafil trationsstrom oder Retentat niet, Die bei den herkömm- lichen Verfahren erforderlichen verschiedenen Reaktions schritte, wie 1.- Inkubation des Enzyms mit den Substrat für eine vorgegebene Zeit; 2. Abstoppen der Reaktion 3. Abtrennung -der Reaktionsprodukte durch z.B. Wellung mit anschliessender Filtration der Zentrifugation bzw. über Dialysemembranen. 4. Färbereaktion (chem. Umsetzung der Spaltprodukte); 5. Messung (z.B. photometrisch) 6. Auswertung (Differenzwertbestimmung, Eichung, Be- rechnung) fallen bei diesem neuen Verfahren praktisch zeitlich zusammen, so dass das Verfahren mit einem erheblichen Zeitgewinn durchführbar ist. Das neue Verfahren, das alle Vorteile von direkten kinetischen Analyserometho- den aufweist, kann mit hochmolekularen Substraten durchgeführt werden. Eine Grössenklassierung der gelösten Substrate und Abbauprodukte durch Ultrafiltration erlaubt es, den Abbau der hochmolekularen Substrate direkt und kontinuierlich zu verfolgen. Es ist wesentlich für die direkte Messung der Reaktionsgeschwindig keit einer.enzymatischen Hydrolyse, dass die verwendete Membran den zeitlichen Verlauf der Xonzentrationsver- änderung nicht merklich beeinflusst. Diese Bedingung ist erfüllt, wenn man Ultrafiltrationsmembrane einsetzt, deren Zeitkonstante (Flux, Druckverlust) möglichst kleiner ist als die vermutliche Reaktionsgeschwindigkeit des enzymatischen Umsatzes. Das erfindungsgemässe Verfahren ist schr gut auto:nati- sierbar, wobei der Vorteil darin liegt, dass der apparative Aufwand geringer ist, weil Reaktion, Inkubation Trennung der Spaltprodukte in einem einzigen Apparat (UF-Reaktor oder -Messzelle) kontibuierlich ablaufen und die Reaktion direkt verfolgt werden kann. Der einfache Aufbau und eine mögliche kontinuierliche Betriebs- führung erlauben es, dieses Verfahren zur Prozessanalyse, z.B. an Fermentern oder Reaktoren einzusetzen. Rine Kontrolle, Steuerung und Auswertung über eine Pechnereinheit (Mikroprozessor, Prozessrechner) ist zweckmässig. Als Anwendungsgebiet kommen vor allem die Prozesskontrolle von Fcrmentationen oder von enzynatischen Stoffumsetzungen (St:irkeabbau, Proteinhydrólyse -etc.) zur Bestimmung der enzymatischen Aktivitäten in Frage. Weiterhin ist das Verfahren im Labor, insbesondere für die Prozessanalytik bei der Aufarbeitung von Ilydrolasen einsetzbar. Das neue Verfahren ermöglicht eine vollkontinuierliche automatische Betriebs- bzw. Prozesskontrolle. Für das neue Verfahren sind handelsübliche Membranen geeignet Sie sollen eine optimale Trennung von Produkt und Substrat gewährleisten und hohe Standzeiten haben. Sie müssen gegen den Angriff von Enzymen und Reagenzien inert sein, möglichst geringe Adsorptionseigenschaften und ausreichende Druckfestigkeit (ca. #P 1 bar) haben. Sic sollen geringen Druckverluste und eine klcine Zeit konstante haben. Bevorzugt werden Membranen aus Polysulfonen (Polyelektrolytkomplexe) oder aus Polyamid,l welche sich besonders durch hohc Fluxraten, geringe unspezifische Adsorption und klcine Zeitkonstante auszeichnen. Beispielhaft dafür seien genannt die Membranen der Firma Amicon Corp., Typen der PM, XM, YM-Reihe mit verschiedenen Ausschlussgrenzen (5.O00, 10.0D0, 30.0O0 dalton) oer der Firma Millipore der Type PTGC oder von Eerghof die Type BM. als Messzellen eignen sich erfindungsgemäss grundsätzlich alle im I:andel befindlichen einen Ultrafiltra- tionszellen oder Dialysezellen. Gut bewährt hat sich z B. die Spiralultrafiltrationszelle, Typ CEC-1 der Firma Amicon Corp. Diese Zelle zeichnet sich durch ein geringes Totvolumen und durch eine Verninderung von Abscheidungen auf dem Filter durch Stromführung aus. Weitere Beispiele für geeignete Messzellen sind Magnetkern gerührte Mini-Reaktoren und andere als Flachmembranen verwendete Systeme. Die Abmessungen der Zellen werden im wesentlichen durch das Verhältnis des Totvolumens (Retentatvolumen) zu wirksamen Membranfläche (Vt/Fm) bestimmt. Am günstigsten ist ein Verhältnis Vt/Fm # 1. Das neue Verfahren ist für die Bestimmung der Reaktivität aller Arten-von Hydrolasen, wie Protcasen, Peptidasen, Glycosidasen, Phospatasen, Lipasen oder Nucleasen und für natürliche oder chemisch modifizierte, hochmolekulare Substrate wie Pro teine, Polysaccharide oder NucleinsSuren einsetzbar, Grundsätzlich ist auch der Einsatz für niedermoleku- lare Verbindungen, wie Peptide, oligomere Zucker, Disaccharide, Nucleotide oder Ester möglich. Bei Einsatz von niedermolekularen Substraten werden bevorzugt RS-Hembranen (RD = reverse osmosis) oder ED-Membranen (ED - electrodialysis) verwendet. Zur Erläuterung der Erfindung ist eine Messanordnung zur Durchführung des neuen Verfahrens in Figur 1 dargestellt. In dieser Messanordnung ist die Pumpe (1) mit dem Reaktionsansatz (5) und der UF-Zelle (2) verbunden. (6),(7)+(8) sind Vorrichtungen zur Kontrolle bzw. Regelung von Durchfluss, Druck und Temperatur. Die UF-Zelle (2) ist mit dem Detektor (3) verbunden und letzterer mit dem Schreiber (4). Das Verfahren kann sowohl batchweise - bei automatisiertem Betrieb taktweise - erfolgen, als auch kontinuierlich, d.h. entweder das Substrat oder das Enzym werden fortlaufend durch dio Zelle gepumpt und Enzym bzw. Substrat pulsweise zugegeben, resp. beide werden kontinuierlich zugegeben und gemischt. Bei der Detektion -kann gegen eine Referenzzelle gemessen werden z.B. mit einem Enzym- oder Substratstandard. Alterna tiv ist auch die Detektion im Retentatstrom möglich. Der vom Detektor erfasste Signalwert-Verlauf wird per Schreiber aufgezeichnet. Die Auswertung erfolgt in der weise, dass eine Tangente an die Kurve des Messverlaufs im Punkte der max. Änderung über der Zeit angelegt wird. Die Steigung dieser Tangente ( # 5/min.) ist ein Mass für die Reaktionsgeschwindigkeit. Die Ermittlung der Steigung kann zjB. mit einem Rech- ner erfolgen. Die Enzymaktivität errechnet sich nach folgender allgemeiner Formel: Enzymaktivität EMI7.1 =######### Verd. = Verdünnungsfaktor : = Eichraktor #S = Signalwert S entspricht z.B. bei photometrischer Messung der Ex tinktion E, bei refraktometrischer Messung dem Nicht brechungswinkel &alpha; In der Praxis erfolgt die Ermittlung der Enzymaktivi- tät mittels Eichkurven. - Die Eichung kann sowohl gegen das Produkt als auch ge gen das Substrat vorgenommen werden. Im einfachsten Falle ist eine Eichung gegen einen definierten Enzym standard möglich. B e i s p i e l 1 Bestimmung einer sauren POrotease (SP-1 Fa. Henkel): Betriebsbedingungen UF-Zelle-CEC-1 (Amicon) Membran-PM 30, # 90 mm (Amicon) Flow - 5 ml/min. (Rt : UF - 1 : 1) Reaktionsvolumen 3.5 ml Totvolumen 3.7 ml Signaltotvolumen 2.1 ml schreiber 500 mm/h Photometer 0.5 E/280 nm # 100 % Temperatur 40 C Uessanordnunq: Standard-Batchbetrieb, Detektion in UF (vgl. Fig. 1) Messlösung: 0.70 mTU/ml Fermenterprobe (70 h) Durchführung: Zuerst Wurde die gesamte Anlage mit Puffer gespült, bis konstanter Wert am Photometer sich eingestellt hat. In die temperierte Reaktionsvorlage wurden dann 2.3 ml Protease Puffer (pH 3.5) und 0.2 ml Enzylmlösung einpipettiert und gemischt. Diese Mischung wurde für ca. 5 wsin. durch den Reaktor (UF-Zelle) gepumpt, dabei stellte sich am Photometer ein dem Nullwert entsprechender Signalwert ein. Wenn dieser Signalwert konstant war, wurde in die Reaktionsvorlage 1 ml Standardcaseinlösung dazupipettient. Damit wurde die Reaktion gestartet. Nach einer Totzeit von ca. 1 min. war die Reaktion auf dem angeschlossenen Schreiber als Veränderung der Extinktion über der Zeit #E/min. zu beobachten. Nach Abschluss des Tests wurde die Anlage mit Puffer wieder rückgespült. Dieser Ansatz wurde mit zwei verschie- denen Messzellen zu Vergleichszwecken durchgeführt. Auswertung Aus dem Signalwertverlauf (Figur 2) wurde # Elmin. graphisch ermittelt und aus einer Eichkurve der zugehörige Wert für die Enzymkonzentration entnommen, bzw. aus der Steigung der Eichgeraden im linearen Arbeitsbereich (Figur 3) berechnet. Erstellung der Eichkurven: Eichgerade (Fig. 3): Aus Referenzmessung mit der Eichsubstanz AP-114, saure Pro tease (standartislertes Enzym) und Caseinld8ung als Substrat. Messanordnung wie in Fig. i Die Eichkurven für die Messzellen 1 und 2 werden parallel aufgenommen, und zwar exakt unter den beschriebenen Bedingungen und nach der gleichen Prozedur, wie oben beschrieben. Messzelle 1 : 0.0120 #E/min. mTU/ml Messzelle 2 : 0.0093 #E/min. mTU/ml Umrechungsfaktor: ### = ###### = 1.29 Ergebnisse: E/min. mTU/ml Elmin. mTU/ml a) 0.009 0.75 MZ2: 0.006 0.68 b) 0.009 0.75 o.o06 0.68 c) 0008 0.73 0.007 0,78 X = 0.74 X = 0.71 Abweichung vom Soll-Wert (0.70 mZU/ml) = 1-4#10-2mTU/l = 1 - 6 % (# = 3.5 %). B e i s p i e l 2 Bestimmung einer alkalischen Protease (Fermentations probe Fa. Henkel) Betreiebsbedingungen: UF-Zelle: CEC-1 (Amicon) Membran: PM 30, 90 mm (Amicon) Flow: 5.7 1/min. (Rt: UF = 1.5:1) Reaktionsvolumen: 5.0 ml Kreislaufvollumen total: 13 ml Temperatur: 50 C Substrat: Casein (n.Hammarsten) [1.5 ml] Enzymprobenvolumen: 1 ml Messanordnung: Batch-Kreislaufbetrieb, Detektion im UF bei 280 nin. Messlösung: Fermenterprobe der Fa. Henkel (Konzen trat), ca. 78 PE/ml (PE = Protease einheit) Durchführung: @analog zu Beispiel 1 Eichgerade (Fig. 4) aus Referenzmessung gegen Enzym Standard (Maxatase) Steigung m t 0.55 (MZ2) MZ1 = 0.41 ####### MZ2 = 0.55 ####### Umrechungsfaktor = 0.75 Berechnung: ######### = PE/ml (# mOD = #E; OD = optische Dich te) Messwerte MZ2 #m OD/min. PE/ml 42.5 77.3 45.0 81.8 50.0 90.9 40.0 72.7 50.0 90.9 50.0 90.9 84.08 Abweichung vom Soll-Wert = 6.1 g 7.7 % B e i s p i e l 3 Bestimmung von Pullulanase Betriebsbedingungen: UF-Zelle: CEC-1 (Amicon) -Membran: YM-5, 90 mm (Amicon) flow: 4 ml/min. (Rt:UF = Reaktionsvolumen: # 6 ml Kreislaufvolumen total: 15.7 ml Temperatur: 35 C Substrat: Pullulan (Serva) Enzymprobenvolumen: 0,4 ml Messanordnung: Batch-Kreislaufbetrieb, Detektion im UF mit einem Polarimeter bei 578 nm Hg. Messlösung: Enzymprobe der Fa. ABM-Chemicals (Pulluzyme), ca. 18 U/ml. Durchführung: Zuerst wurde die Anlage mit Puffer gespült, bis sich am Polarimeter ein konstanter Wert eingestellt hat. Die ser Wert wurde zu Null gesetzt. In die temperierte Reaktionsvorlage wurden 5 ml Citratpuffer (pH 5.0) und 0.6 ml Pullulanlsg. (2 %ig) gegeben und für ca. 5 min. im Kreislauf über die Membran gepumpt. Die An zeine des Polarimeters wurde erneut zu Null gesetzt. Dann wurde mit 0.4 ml Enzymlösung die Reaktion ge- startet. Der Reaktionsverlauf wurde am Polarimeter bzw. auf dem angeschlossenen Schreiber beobachtet. Die Än derun-g der opt. Drehung über der Zeit t (min) stellt das Mass für die Reaktionsgeschwindigkeit dar (#&alpha;Hg578/min#U/ml Pullulanase). Auswertung: Aus dem Signalwertlauf wurde #&alpha;/min. durch Anlegen einer Geraden im Bereich der max. Steigung wie üblich graphisch ermittelt. Berechnung: U/ml Pullalanase = ########################## 1 U/ml # 1 Mol Maltotriose pro Minute (pH 5.0; 35 C) Figur 6 zeigt die Konzentrationsabhängigkeit der Pullulanase im UF-Test, gemessen mit Polarimeter Hg 578. Eichfaktor: 0.0857 aus Eichkurve Maltotriose im Po larimeter bei Hg 578 nm (35 C) (Fig. 5) (m = ########## = ########## ###########) Ergebnisse: #&alpha;/min. Verd. faktor U/ml 0.048 39.25 21.9 0.048 39.25 21.9 0.043 39.25 19.7 0.042 39.25 19.2 0.047 39.25 21.5 0.043 39.25 19.7 X = 20.65 S = 1.25 (# 6 %) Abweichung vom Soll-Wert = # 15 % B e i s p i e l 4 Bestimmung von Amyloglucosidase (Glucoamylase) Betriebsbedingungen: UF-Zelle: CEC-1 (Amicon) Membran: PM 10, e 90 mm (Amicon) Flow: 3.5 ml/min. (Rt:UF = 2:1) Reaktionsvolumen: 5 ml Kreislaufvolumen: 19 ml Temperatur: 500 C Substrat: Starke (n. Zulkovsky) Enzymprobenvolumen: 0.1-0.6 ml Messanordnung: Batch-Kreislaufbetrieb, Detektion im Ultrariltrat durch chem. Nachweis (Nelson-Somogy). Messlösung: Amylglucosidase (Merck, Darmstadt), ca. 7.0 U/ml. Durchführung: I1e Anlage wurde 10 min. mit Pufferlösung vorgespült. Zu 30 ml Pufferlösung (Na-Acetat, pH 4.8) wurden 1.5 ml 1 %ige Stärkelösung zugesetzt und für 5 min. im Kreislaufbetrieb umgepumpt, danach wurde aus dem Ultrafiltratstrom eine Probe von 0.1 ml entnommen (Blindwert). Dann wurde eine Enzymmenge von 0.1 - 0.6 ml zugesetzt und unter rortlaufendem Umpumpen 10 min. lang alle zwei Minuten eine Probe von 0.1 ml entnommen, Die Proben wurden zusammen mit der 0-Probe nach der Methode von Nelson-Somogy auf Glucose getestet. Auswertung: Durch Auftragen der gefundenen Konzentrationen an Glu cose über der Zeit t in Minuten bekommt man eine Garade, deren Steigung der Enzymkonzentration entspricht. Mit Glucose als Eichsubstanz wurde eine entsprechende Eichkurve erstellt. Berechnung: #OD546 # Verd. faktor 10 [in U/ml = 1 Mol Glucose pro Minute (pH 4.8; 50 C)] Eichfaktor: 10cmê aus Eichkurve mit Glucose Mol (Nelson-Somogy-Test) bei 546 nm. Figur 7 zeigt die Konzentrationsabhängigkeit von Amylo glucosidase (chem. Nachweis). Messwerte: Probenvol. 8ml) #OD546 Verd.faktor U/ml 0.1 0.007 9.5 # 10 6.65 0.2 0.015 4.75 # 10 7.13 0.3 0.020 3.17 # 10 6.34 0.4 0.026 2.38 # 10 6.19 0.5 0.036 1.90 # 10 6.84 0.6 0.040 1.58 # 10 6.32 X = 6.58 S = 0.36 (#5%) Abweichung vom Soll-Wert = -6 %. B e i s p i e l 5 Bestimmung einer alkalischen Protease (Fa. Henkel) mit einem synthetischen Substrat Betriebsbedingungen: UF-Zelle: CEC-1 (Amicon) Membran: M 30, 90 mm (Amicon) Flow: 5.7 ml/min. (Rt:UF = 1.5:1) Reaktionsvolumen: 5 ml Kreislaufvolumen: 13 ml Temperatur: 500 C Substrat: Casein-blau (Kupplung von Remazol Blau an Casein, Fa. Henkel). Enzymprobenvolumen: 1 ml Messanordnung: Batch-Kreislaufbetrieb Detektion in Ultrafiltrat bei 660 nm Messlösung: Fermenterprobe der Fa. Henkel (Konzen trat), verschiedene Konzentrationen. Durchführung: Zu 2.5 ml Pufferlösung wurden 1.5 ml Casein-blau-Lö- sung (12 mg/ml) in die Reaktionsvorlage gegeben und für ca. 5 - 10 mi;i. im Kreislauf durch die Messanordnung gepumpt, bis sich ein konstanter Wert am Photometer eingestellt hat. Dann wurde die Reaktion mit 1 ml En zymlösung gestartet. Nach einer kurzen Totzeit war am angeschlossenen Schreiber der Reaktionsverlauf an kontinuierlichen Anstieg des Photometersignals zu verfolgen. Die Auswertung erfolgte analog ZU Beispiel 1 und 2, durch Anlegen einer Tangente an die Kurve im Bereich der max. Steigung; Der so gefundene Wert für 4 #E/min. stellt ein Mass für die Enzymkonzentration dar. Berechnung: ########### = PE/ml Eichung: Unter dem gleichen Bedingungen wie oben beschrieben wird eine Eichkurve mit einem Standardenzym (Maxatase, Fa. Henkel) auf genommen. Die Steigung zur Ermittlung des Eichfaktors ist der Figur 8 zu entnehmen. Messwerte: Pr.-Nr. PE/ml zugegeben #mOD660 PE/ml gefunden 1 50 13.5 62.5 25 2 100 19.0 100.7 3 200 35.0 211.8 6 4 - 300 46.0 288.2 Mittlere Abweichung vom Soll-Wert - 9 %.

Claims: Patentansprüche 1. Verfahren zur kinetischen Prozesskontrolle von en zymatischen Stoffzumsetzungen, dadurch gekennzeich net, dass man die Reaktionsmischung, welche das zu hydrolysierende Substrat und dle hydrolytischen Enzyme enthalt, durch eine Ultrafiltrationsmembran in 2 Volumenströme aufteilt und anschliessend die Konzentrationsänderung an hydrolytischen Enzymen im Ultrafiltrationss trom oder Retentat misst. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Zelle mit einem Verhältnis des Tot volumens zu wirksamer Membranfläche Vt/Fm C 1 ver- wendet. 3. Verfahren nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekenn zeichnet, dass man die Veränderung der Produkt- oder Substratkonzentration kontinuierlich mit einem Spektral-Photometer, Refraktometer oder Polari meter misst. 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekenn zei:hnet dass man natürliche oder synthetische hoch molekulare Substrate einsetzt. 5. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 4, gekennzeichnet durch ein Reaktion gefäss (5), das über eine Leitung, in der eine Pumpe(2), sowie Einrichtungen zur Regelung von Druck, Temnera tur und Durchfluss (6,7,8) angeordnet sind, mit einer Ultrafiltrationszelle (2) verbunden ist,und zwei Leitungen, wobei zumindest in einer ein Detektor (3) angeordnet ist, von der Ultrafiltrationszelle (2) zum Reaktionsgefäss (5).

Inventors: KRONER, KARL-HEINZ
Applicants: GESELLSCHAFT FUR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF)
Application year: 1982
Main classification: C12Q1
IPC codes: C12Q1, B01J19, C12M1