DEVICE FOR THE DETECTION OF AGENTS FOR THE INHIBITION OF MICROORGANISM GROWTH

Abstract: 1. Device for the detection of substances inhibiting micro-organisms in a liquid sample, consisting of a nutrient substrate and a micro-organism-containing substrate, characterised in that the micro-organism containing substrate is a dry film produced from a synthetic resin dispersion which contains micro-organisms in an amount of from 10 to 109 per g. and water-soluble or water-swellable, macromolecular openers, as well as possibly further additive materials, whereby the amount ratio of synthetic resin to opener amounts to 1000:1 to 1:10.

Description: Vorrichtungen zum Nachweis von Mikroorganismen hemmenden Stoffen Die Erfindung betrifft Vorrichtungen zum Nachweis von Mikroorganismen hemmenden Stoffen. Der Nachweis von Antibiotika und anderen, das Wachs- tum von Mikroorganismen hemmenden Stoffen, wird allgemein nach dem Prinzip der Agardiffusion (z.B. Blättchentest, Agar lochtest) durchgeführt. Als Indikatororganismen werden im allgemeinen Mikroorganismen aus der Familie der Bacillaceae eingesetzt, deren ausgeprägte Morphogenese für den Bio-Assay ausgenutzt wird. Der Fähigkeit, dieser Bakterien zur Endosporenbildung kommt eine grosse ökologische und anzçendungs- technische Bedeutung zu, da sie eine erhöhte Resistenz gegenüber Umwelteinflüssen wie Hitze, Trockenheit, toxische Substanzen und Strahlung erreichen. In diesem kryptobiotischen Zustand persistieren die Endosporen solange, bis günstige Milieubedingungen eine Sporenkeimung und folgendes vegetatives Wachstum zulassen. Auf der anderen Seite kann die relativ hohe Sensitivität gegenüber wachstumshemmenden Substanzen (Antibiotika, Detergenzien, Stoffwechselantagonisten usw.) während der Keim- beziehungsweise vegetativen Phase zum qualitativen und quantitativen Nachweis dieser Stoffe herangezogen werden. Der Einsatz von Bakterien aus der Familie der Bacillaceae als Bioindikatoren -um Nachweis wachs- tumshemmender Substanzen wird heute routinemässig betrieben. Dazu werden Endosporen dieser Bakterien in einen Nähragar eingebettet und die 7 untersuchende Substanz nach dem Prinzip der Agardifftision getestet. In der Humanmedizin wird die Diagnose bakterieller Infektionskrankheiten in Körperflüssigkeiten olz durch die Gegenwart von Hemmstoffen erschwert. Der Anteil an falsch negativen Aussagen aufgrund einer Hemmwirkung kann zum Beispiel in der Harndiagnostik bis zu 3O Ï der zu untersuchenden Urine umfassen. Aus diesem Grunde wird parallel zum routinemässigen Bakteriennachweis ein Test auf Hemmstoffgegenwart gefordert, der aber wegen seines komplizierten Ablaufs für Routineuntersuchungen in der Regel zu aufwendig ist und daher sehr selten durchgeführt wird. Bei einem solchen Test müssen Endosporen in Petrischalen in einen Nähragar eingebettet werden, auf diesen Filterblättchen, die mit der Probe getränkt und getrocknet sind, aufgelegt, bei niedrigen Temperaturen vorinkubiert und bebrütet werden. Bei Anwesenheit von Hemmstoffen unterbleibt um das entsprechende Filterblättchen das Wachstum der Bakterien. Neben der komplizierten Handhabung ist der Einsatz dieser Methode auch wegen der bei solchen Verfahren relativ schwierigen Probenidentifizierung nicht unproblematisch und ausserdem ist das Verfahren bei kleinen Probenzahlen unrationell. Dazu kommt noch die sehr geringe Lagerstabilität der mit Sporen versetzten Agarplatten; sie sind nur wenige Wochen bei Kühlschranklagerung haltbar. In der Milch- und Fleischwirtschaft ist eine Überprüfung der Produkte auf Antibiotikafreiheit verbindlich vorgeschrieben. Hierfür wird als Indikatormikroorganismus vor zugsweise Bacillus stearothermophilus var. calidolactis eingesetzt. Die Untersuchung der Proben erfolgt in der gleichen auf endigen Art und Weise wie oben ftir Harnproben beschrieben. Die Aufgabenstellung der vorliegenden Erfindung war es, ein Fixier beziehungsweise Einschlussverfahren für lebende Zellen zu finden, bei dem die Zelln während des Einschlussverfahrens nicht geschädigt werden, ihre Ausi;eim- und Teilungsfähigkeit oll erhalten bleibt, die Sensibilität auskeimender Sporen gegenüber Antibiotika nicht wesentlich beeinflusst wird und die eingeschlossenen Zellen mit der Einschlussmatrix technisch problemlos zu verarbeiten sind. Die Zellen müssen also während der Lagerung im eingeschlossenen Zustand potentiell wachstumsfähig bleiben und das Wachstum erst durch einen von ausserhalb der Matrix gesetzten Reiz induziert werden. Das Stützgerüst der Matrix darf das Zellwachstum nicht wesentlich einengen. Für das Einschlussverfahren dürfen keine Reagenzien verwendet werden, die mit den Zellen reagieren, oder solche, die auf das Wachstum der Zellen schädigend wirken könnten. Zum Trägerfixieren von Mikroorganismen sind verschiedene Verfahren bekannt, die sich in folgende Kategorien einteilen lassen: Adsorption an einer Oberfläche, kovalente Bindung an einer Oberfläche, Vernetzung der Zellen untereinander, Einkapseln der Zellen, Einschliessen der Zellen in eine poröse Matrix. (Vergleiche J. Klein, Kontakte 3/80 Firmenzeitschrift der Firma E. Merck. Darmstandt) Die Verfahren zielen alle darauf ab, das enzymatische Potential der Zellen auf möglichst engen Raum zu konzentrieren und zu fixieren, um die Enzymaktivitäten in einer Art Käfig für Umsatzreaktionen verschiedenster Art zur Verfügung zu haben. Dieses Ziel wird durch Fixierung und/oder Einschluss in ein polymeres Netzwerk erreicht. Die bisher bekannten Verfahren werden in den folgenden beiden Tabellen dargestellt, die aus der vorstehenden Literatur übernommen wurden: EMI5.1 Bezeichnung <SEP> Grösse <SEP> der <SEP> Aus- <SEP> Vernetzungs- <SEP> Beispiel <SEP> Begrenzende <SEP> Faktoren <tb> <SEP> gangsmoleküle <SEP> reaktion <tb> 1. <SEP> Gelierung <SEP> Polymer <SEP> unspezifisch <SEP> Agar <SEP> geringe <SEP> Zellbeladung <tb> <SEP> Collagenn <SEP> und <SEP> mechanisch <tb> <SEP> Carrageenan <SEP> Stabilität <tb> 2. <SEP> Fällung <SEP> Polymer <SEP> unspezifisch <SEP> Cellulosetriacetat <SEP> unphysiologische <tb> <SEP> Polystyrol <SEP> Lösungsmittel <tb> <SEP> Eudragit <tb> 3. <SEP> Ionotrope <tb> <SEP> Gelbildung <SEP> Polymer <SEP> ionisch <SEP> Alginat <SEP> empfindlich <SEP> bei <SEP> ioni <SEP> Styrol/Malein- <SEP> schen <SEP> Substraten <SEP> und <tb> <SEP> säure <SEP> Pufferlösungen <tb> <SEP> Carboxymethyl <SEP> cellulose <tb> 4. <SEP> Polykon <SEP> densation <SEP> Oligomer <SEP> kovalent <SEP> Epoxidharze <SEP> Toxizität <SEP> der <SEP> funktio5. <SEP> Polymeri <SEP> sation <SEP> Oligomer <SEP> kovalent <SEP> Polyacrylamid <SEP> geringe <SEP> Zellbeladung <tb> <SEP> Monomer <SEP> kovalent <SEP> Polymethacryl <SEP> amid <tb> Tabelle 1: Einstufenverfahren zum Einschuss ganzer Zellen in polymere netzwerke EMI6.1 <tb> Verfahrenskombination <SEP> I <SEP> Beispiel <tb> 1. <SEP> Gelierung <SEP> und <SEP> Kondensation <SEP> 1 <SEP> Collagen <SEP> und <SEP> Glutaral <tb> <SEP> dehud <SEP> <tb> <SEP> Garrageenan <SEP> und <SEP> Glut <tb> <SEP> araldehyd <tb> 2. <SEP> Ionotrope <SEP> Gebildung <SEP> und <tb> <SEP> kontrollierte <SEP> Trocknung <SEP> Alginat/Ca <tb> 3. <SEP> Ionotrope <SEP> Gelbildung <SEP> und <tb> <SEP> Polykondensation <SEP> Alginat <SEP> und <SEP> Epoxid <tb> 4. <SEP> Polykondensation <SEP> und <SEP> Poly <tb> <SEP> merisation <SEP> Epoxid <SEP> und <SEP> Polymethacryl <tb> <SEP> amid <tb> Tabelle 2: Zweistufenverfahren zum Einschluss ganzer Zellen in polymere Netzwerke Unter Würdigung der Aufgabenstellung ist es offensichtlich dass keines der bisher bekannten Verfahren als Lösungsweg geeignet wäre, da die bekannten Präparationsverfahren entweder aggressive Reagenzien erfordern, die notwendigen Mengen an Zellen nicht eingeschlossen werden können, oder sich aus der Matrix keine technisch problemlos verarbeitbaren Filme herstellen lassen. Die Herstellung von Filmen ist für den Einsatz der Praparationsform als Reagenz die einzige praktikablc Möglichkeit, da alle anderen Variationen zu grossvolumig und damit zu unhandlich sind. Die gestellte Aufgabe wurde wie folgt gelöst: Zellen werden in eine Miszhung, bestehend aus einer wässrigen Kunststoffdisperison und einer wässrigen Lösung von "Öffnern", in die noch Zusatzstoffe eingearbeitet sein können, eingerührt. Diese Rohfilmmasse ird nach üblichen Verfahren auf eine Unterlage, zum Beispiel ausgegossen, aufgestrichen, aufgerakelt usw. und an schliessend getrocknet. In so hergestellten Filmen sind die Zellen fest fixiert, so dass sie nur durch grobe mechanische Belastung herausgebracht werden können. Die trockenen Filme enthalten Mikroorganismen in einer Menge von 10 - lO9 pro g und wasserlösliche oder wasserquellbare, makromolekulare Öffner sowie gegebenenfalls weitere Zusatz stoffe enthält, wobei das Mengenverhältnis von Kunst- stoff zu öffner 1000 : 1 bis 1 : lo. Die Funktionsweise der Dispersionspartikeln und der "Öffner" lässt sich folgendermassen erklären: Durch das Einarbeiten von "Öffnern", das heisst Wasser löslichen oder wasserquellbaren makromolekularen Sub stanzen, in Dispersionsfilme, wird die Eigenschaft dieser Filme dahingehend abgewandelt, dass sie befähigt sind, wesentlich mehr Wasser aufzunehmen, als ein Film ohne Öffner. Mit der Fähigkeit, dass Wasser gut aufgenommen wird, ist auch die Tatsache verbunden, dass in den Film wasserlösliche Substanzen, wie Nährstoffe beziehungsweise Hemmstoffe unschwer eindiffundieren können. Die Öffner präformieren in der Kugelpackung der Dispersionspartikel "offene Stellen", in denen die Zellen eingelagert sind, ohne jedoch das Film gerüst so zu stören, dass eine Ausbildung eines Filmes nicht mehr möglich ist. Wird nun von ausserhalb des Filmes, durch essen An- feuchten ein Wachstumsrein auf die Zellen ausgeübt, so beginnen diese von den "offenen Teilen" des Filmes ausgehend zu wachsen. Werden gleichzeitig mit den Nährstoffen Hemmstoffe an die Zellen herangeführt, so unterbleibt das Wachstum zu Kolonien. die ausgebildeten Kolonien können in bekannter Weise mit Hilfe von Indikatoren wie zum Beispiel pH-Indikatoren, Triphenyltetrazoliumsalzen usw. sichtbar gemacht werden. Arbeitet man hingegen Zellen in Kunststoffdispersionen ein, denen keine Öffner beigefügt sind und bildet Filme aus, so sind die Zellen dicht eingeschlossen. Werden Dispersionen verwendet, die Filme mit einer Wasseraufnahmefähigkeit bilden, so kann nur ein geringes Auskeimen und Kolonienwachstum beobachtet werden, da der Zutritt von Nährstoffen beziehungsweise Hemmstoffen zu stark beeinträchtigt wird, weil solche Filme keine "offenen Stellen" besitzen. Bei Dispersionen, die mehr oder minder hydrophobe Filme bilden, ist im allgemeinen kein Kolonienwachs tum mehr zu beobachten. Für das erfindungsgemässe Verfahren ist eine Vielzahl von Rohstoffen einsetzbar. Die Rohstoffe werden unten näher beschrieben. Es be steht lediglich eine wichtige Voraussetzung, dass sie keinen Hemmstoff für die einzusetzenden Zellen dar stellen, dass sie nicht mit Hemmstoffen verunreinigt sind und dass sie die Wirkung von Hemmstoffen nicht aufheben. Eine Prüfung auf Hemmstoff-Freiheit, die für die Roh stoffkontrolle notwendig ist, lässt sich unschwer nach den bekannten klassischen Verfahren, zum Beispiel Agarverdünnungstest, durchführen. Als Filmbildner lassen sich praktisch alle wässrigen Kunststoffdispersionen verwenden, wie zum Beispiel Homopolymere aus Vinylacetat, aus Acrylsäureestern, Copolymere aus Vinylacetat und Vinylpropionat, aus Vinylpropionat, Acrylnitril und Acrylsäureestern, aus Vinylacetat und Maleinsäureestern, aus Butadien und Styrol, aus Vinylchlorid und Vinylpropionat usw. Als' Öffner sind prinzipiell alle makromolekularen wasserlöslichen Substanzen einsetzbar. Darunter fallen zum Beispiel wasserlösliche, vollsynthetische Hochpolymere wie Polyvinylpyrrolidone, Polyvinylalkohole, teilverseifte Polyvinylacetate, Copolymere aus Vinylacetat und Vinylpyrrolidon, Polyäthylenglycole, Poly äthylenoxidharze, Acrylsäurepolymerisate, Mischpolymerisate aus Methylvinyläther und Maleinsäureanhydrid usw.. Ebenso wasserlösliche halbsynthetische Produkte und reine Naturprodukte wie zum Beispiel Methylcellulose, Hydroxyäthylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Carboxymethylcellulose, Alginate, Gelatine, Polyzucker, Stärken usw. sowie Mischungen dieser Substanzen. Als Zusatzstoffe können verwendet werden: Puffersalze, Neutralsalze, Zucker, Eiweisskörper, Netzmittel, Pigmente, Weichmacher wie zum Beispiel Glycerin, Propylglycol usw. sowie Indikatoren, die das Wachstum der Mikro- organismen anzeigen, wie zum Beispiel pH-Indikatoren, Triphenyltetrazoliumderivate usw.. Die Filmrohmassen werden so hergestellt, dass man in einem Gefäss die Kunststoffdispersion vorlegt, dazu eine Lösung des Öffners und der Zusatzstoffe gibt und unter Rühren zur Rohfilmmasse homogenisiert. Dabei kann das Mischungsverhältnis zwischen Festkörperanteil aus der Dispersion, Festkörperanteil der Öffner und Zusatzstoffen innerhalb grosser Grenzen gewählt werden. Die Mischungsverhältnisse sind nach folgenden Ge sichtspunkten zu ermitteln: a) Die aus der Filmrohmasse gebildeten Filme müssen eine in sich geschlossene Einheit bilden, das heisst sie dürfen keine Risse zeigen, ein Phänomen, das weitgehend von den stoffspezifischen Eigenschaften und den Wechselwirkungen von Dispersion und Öffner bestimmt wird. b) Die Filme müssen ausreichend "offen" sein, um den Nährstoffen und gegebenenfalls den Hemmstoffen einen ausreichenden Zutritt zu den Zellen zu ermöglichen, ein Phänomen, das ebenfalls weitgehend von den stoff spezifischen Eigenschaften und den Wechselwirkungen von Dispersion und Öffner sowie Zusatzstoffen bestimmt wird. c) In gewissem Masse wird das Mischungsverhältnis auch von der Viskosität der Dispersionen und der Öffnerlösungen bestimmt. Dabei ist zu beachten, dass die Viskosität der Filmrohmasse selbstverständlich nur so eingestellt sein darf, dass sie technisch weiter verarbeitbar ist. Das heisst, dass zum Beispiel von hochviskosen Öffnern nur weniger eingesetzt werden können als von nieder viskosen Substanzen. Unter Berücksichtigung aller oben genannten Tatsachen können Mischungsverhältnis se, von Disperslons -Festkörper zu Öffner-Festkörper von looo : 1 bis 1 : Io gewählt werden. Die Konzentrationen der Zusatzstoffe werden entsprechend den jeweiligen einzelnen Bedürfnissen gewählt. Es ist offensichtlich, dass Indikatoren, Weichmacher und Netzmittel in relativ niedrigen Konzentrationen einzusetzen sind, die sich danach richten, ab wann diese Substanzen eine hemmende Wirkung auf die Zellen ausüben beziehungsweise die Filme zu weich oder zu spröde machen. Die zu wählenden Salzkonzentrationen und Konzentrationen der Zucker- und Eiweisskörper dürfen keinen negativen Einfluss auf das Wachstumsvermögen der Zellen ausüben. Ebenfalls ist zu beachten, dass durch die Hilfsstoffe die Stabilität der Filme nicht negativ beeinflusst werden dürfen, das heisst ihre Konzentration eine obere Grenze nicht übersteigen darf. Vor der Verarbeitung der Filmrohmassen zu den Filmen werden Zellen in Konzentration von 10 - 1o8 je ml Rohmasse in diese eingerührt. Die Ausbildung der Filme kann nach den bekannten Verfahren, wie Ausgiessen in Formen, Beschichten von Trägern, Beschichten von Stützgeweben, die in die Filmmassen eingeschlossen werden usw. vorgenommen werden. Die bevorzugten Anwendungsgebiete des erfindungsgemässen Verfahrens sind: Der Einsatz des Verfahrens zur Herstellung von Lagerund Transportvorrichtungen für Mikroorganismen. Die Zellen werden dazu in einer Filmmatrix eingeschlossen und diese trocken gelagert. Werden die Mikroorganismen benötigt, wo wird der Film mit einer Nährbouillon überschichtet oder in diese eingelegt, bebrütet und so die Mikroorganismen vermehrt. Eine weitere Anwendungsmöglichkeit ist der Einsatz von Sporenfilmen zum Nachweis von Hemmstoffen in biologischem Material im Rahmen von Untersuchungen in der Humanmedizin, der Veterinärmedi der Lebensmittelkontrolle usw.. Dazu wird folgendermassen vorgegangen: Sporen von gegen Hemmstoffe besonders empfindlichen Alikroorganismen wie zum Beispiel die von Bacillus subtilis oder Bacillus stearothermophilus werden in eine Filmrohmasse eingearbeitet. Aus diesen Rohmassen wird auf einem transparenten Träger ein Film ausgestrichen, getrocknet und die Filme in eine handliche Grösse geschnitten. Der Sporenfilm wird zusammen mit einen Nährkarton in die zu untersuchenden Lösungen, wie Harn, Milch, Fleischsäfte usw. eingetaucht und bebrütet. Bei Abwesenheit von Hemmstoffen keimen die Sporen aus und das folgende Wachstum kann über einen Indikator nachgewiesen werden. Als Indikatoren werden Substanzen eingesetzt, die entweder die Kolonien anfärben, wie zum Beispiel Triphenyltetrazoliumverbindungen oder pH-Indikatoren, die eine durch das Keimwachstum hervorgerufene pH Änderung anzeigen. Eine bevorzugte technische Ausführungsform ist die, dass man den gleichen Aufbau wählt wie er bei Teststreifen üblich ist. Dazu befestigt man auf einem Träger, einen Nährkarton und darüberliegend einen auf einem transparenten Träger ausgebildeten Sporenfilm mit Hilfe eines Netzes so, dass die Filmseite des Sporenfilms auf die dem Träger abgewandte Seite des Nährkartons zu liegen kommt. Als Nährkarton kann ein mit geeigneten Nährstoffen für die jeweiligen Mikroorganismen imprägniertes saugfähiges Material, vorzugsweise Filterpapier, Glasfaser- oder Kunststoffvlies, oder ein in trockenem Zustand genügend stabiles Gel verwendet werden. Eingetrocknete Agar-Schichten oder ähnliche Substanzen lassen sich nicht verwenden, da sie zu langsam die Flüssigkeit wiederaufnehmen. Das erfindungsgemässe Verfahren wird anhand von Beispielen näher erläutert. Beispiel 1 In diesen Beispiel sollen die breit gefächerten Möglichkeiten der zu verwendenden wässrigen Kunststoffdispersionen dargestellt werden: Zur Herstellung einer Trägermatrix, in die Zellen eingeschlossen sind, wird dabei wie folgt verfahren: In einem Gefäss erden 60 g Kunststoffdispersion vogelegt. Als Dispersion können zum Beispiel folgende handelsübliche 50 - 60 %-ige Dispersionen in Wasser eingesetzt werden: Homopolymere aus Vinylacetat, aus Acrylsäureestern, Copolymere aus Vinylacetat und Vinylpropionat, aus Vinylpropionat, Acrylnitril und .Acrylsäureestern, aus Vinylacetat und Maleinsäureestern, aus Butadien und Styrol, aus Vinylchlorid und Vinylpropionat usw.. Die Dispersionen werden mit 35 g einer 40 eigen Lösung von Polyvinylpyrrolidon in 1/15 m Phosphatpuffer pH 6,5 verrührt, der pH-Xsert überprüft und gegebenenfalls nachgestellt. Dann wird die Mischung mit 200 ml sterilem destillierten Wasser verdünnt und 10 - 107 Zellen von zum Beispiel Sporen von Bacillus subtilis je Gramm Dispersion-Öffnermischung zugegeben und verrührt. o,5 ml der so erhaltenen¯Rohfilmmasse werden in quadratische Gefässe von 2 cm Kantenlänge pipettiert und getrocknet. Bringt man auf die so hergestellten Filme 1 ml einer Nährbouillon, die 0,02 % Triphenyltetrazoliuirichlorid (TTC) enthält und bebrütet die verschlossenen Gefässe, so zeigen sich die gewachsenen Kolonien auf der Unterseite des Gefässes je nach Konzentration des Mikroorganismus als rote Punkte bis zu einem dichten homogenen roten Feld. Beispiel 2 In diesem Beispiel sollen die Möglichkeiten der verwendbaren Öffner abgehandelt werden: 2a) In einem Gefäss werden 62 g einer Dispersion zum Beispiel eines Copolymeren aus Vinylacetat und Vinylpropionat mit 200 ml Wasser vorgelegt. Dazu werden 37 g der Lösungen der Öffner gegeben und gut verrührt. Die Öffnerlösungen werden so hergestellt, dass man in einem 1/15 m Phosphat puffer pH 6,5 die Öffner in den in der Tabelle angegebenen Konzentrationen löst. Bei sauer rea gierenden Öffnern werden die Lösungen mit Natron lauge eingestellt. Tabelle 3 enthält Beispiele für mög liche Konzentrationen der öffner in der Puffer lösung und Angaben der aus diesen Mischungen im Film entstehenden Mischungsverhältnissen von Festkörper aus der Kunststoffdispersion zu Fest körper aus dem Öffner. Tabelle 3 Öffner Konzentration des Mischungsverhältnis des Öffners in der ein- Feststoff aus der Dis gesetzten Lösung persion zu Feststoff in Puffer des Öffners im Film Stärke 1 t0 80 : 1 Dextran 43 O 2 : 1 Alginat 2,35 t0 36 : 1 Aletnylcellulose 1,5 t 57 : Methylenhydroxy äthylcellulose 2,5 % 34 : 1 Methylhydroxypro pylcellulose 4,o % 21 : 1 Hydroxypropyl- 4,o % 21 ; 1 cellulose 0,5 % 170 : 1 Hydroxyäthyl- 4,o % 21 : 1 cellulose Polyvinylalkohol 8,0 % wo : 4 Polyäthylengly- 15,o e 5,5 : 1 kolharz 5,o % 17 : 1 Polyacrylsäure 1,7 % 50 : 1 Copolymerisat aus Methyl vinyl äthan und Malein säureanhydrid 23 % 3,7 : 1 Copolymerisat aus Vinylpyrro lidon und Vinyl acetat 15 % 5,5 : 1 2b) In Abwandlung zu Beispiel 2a kann man auch von einer relativ hochprozentigen Öffnerlösung ausgehen, was immer dann möglich ist, wenn der Öffner eine relativ niederviskose Lösung ergibt. Tabelle 4 gibt diese Möglichkeit wieder. Tabelle 4 Öffner Gewichtsanteile von Mischungsverhältnis wässriger Dispersion des Feststoffs aus zu Öffnerlösung der Dispersion zu Feststoff des Öffners im Film Polyäthylen glycol 50 % ige Lösung 50 g : 450 g - 450 g : 50 g 1 : 9 - 9 : 1 Polyvinyl pyrrol idon 42 % ige Lösung 1o g : 9o g - 9o g : 10 g 1 7 - 11 1 Carboxymethyl cellulose 2 Oo ige Lösung 8 g : loo g 2 : 1 2c) In Abwandlung zu Bespiel 2a können auch Mischungen von verschiedenen Öffnersubstanzen eingesetzt werden. 46 g einer wässrigen Dispersion des Mischpolymerisates von Vinylacetat und Vinylpropionat, 4,2 g einer 40 %igen Lösung von Polyäthylenglycol in 1/15 m Citratpuffer pH 6,5 , 16,o g einer 40 teigen Lösung von Polyvinylpyrrolidon in 1/15 m Citratpuffer (pH 6,5), 0,4 g Glycerin und 200 ml Wasser werden zu einer homogenen Masse verrührt. In die oben beschriebenen Rohfilmmassen werden Sporen von Bacillus subtilis in einer Konzentration von 106 je Gramm Rohfilmmasse eingearbeitet. Von der so her gestellten Sporenfilmrohmasse werden je o,5 ml in Gefässe von 2 cm Kantenlänge pipettiert und ge trocknet. Bringt man auf die so hergestellten Filme 1 ml einer Nährbouillon, die o,o2 % Triphenyltetrazoliumchlorid enthält und bebrütet die verschlossenen Gefässe, so zeigen sich die gewachsenen Kolonien als rote Punkte. Das Wachstum unterbleibt, wenn der Nährlösung eine Probe zugemischt ist, die Hemmstoffe, beispielsweise Antibiotica, in entsprechender Konzentration enthält. Beispiel 3 Verfahren zum Nachweis von Antibiotika in der Milch. 50 g einer Dispersion eines Copolymeres aus Vinylacetat und Vinylpropionat, 2o g einer Lösung von 12 g Polyvinylpyrrolidon in 17 ml Wasser, 1 g Glucose und 1o8 Sporen von Bacillus stearothermophilus var. calidolactis werden homogen verrührt, anschliessend mit 150 ml Wasser verdünnt und mit Natronlauge auf pH 7,0 eingestellt. Von der so hergestellten Filmmasse werden jeweils 0,1 ml in zylindrische Gefässe von 1 cm Durchmesser mit flachem Boden pipettiert und getrocknet. Zur Testung auf Antibiotika in Milch werden Nährkartons, die aus Milchmedium mit dem Indikator Bromkresolblau hergestellt wurden, in die Probe eingetaucht, auf die Filme aufgelegt, die Gefässe dicht verschlossen und bei 6oOC bebrütet. Bei Abwesenheit von Hemmstoffen nehmen die Nährkartons eine olivgrüne Farbe an, in Gegenwart der Hemmstoffe bleiben sie auch nach dem Bebrüten bläulich. Nach diesem Verfahren können Antibiotika über ihre Wirkung als Hemmstoffe nachgewiesen werden. Die wichtigen Antibiotika zum Beispiel Penicillin, Tetracyclin und Chloramphenicol können nach diesem Verfahren ab folgenden Konzentrationen erfasst werden. Penicillin ab o,oo9/ug/ml, Tetracyclin ab o,11ug/ml, Chloramphenicol ab 4 ug/ml. Beispiel 4 Testvorrichtung zum Nachweis von Antibiotika in Flüssigkeiten. 200 g einer Dispersion aus Vinylacetat und Vinylpropionat, 90 g einer Lösung von 30 g Polyvinylpyrrolidon, 1o g Polyäthylenglycol in 1oo ml eines 0,2 molaren Citratpuffers von pH 6,5, 5 g Glucose, 7,2 g Polyoxyethylensorbitanmonooleat, 109 Sporen von Bacillus subtilis ATTC 6051 werden zu einer homogenen Masse verrührt. Diese Filmrohmasse wird mit einer Schichtdicke von 100/ u auf eine transparente Folie beschichtet, getrocknet und anschliessend in 1 cm breite Bahnen geschnitten. Diese Filmbahnen werden gemeinsam mit einem Nährkarton, der mit den Nährstoffen für Antibiotika-Testmedien und Triphenyltetrazoliumchlorid imprägniert ist, in bekannter Weise, zu 1 cm breiten Teststreifen so verarbeitet, dass der Nährkarton auf eine Trägerfolie zu liegen kommt, der Sporenfilm mit der Filmseite auf dem Nährkarton liegt und beide mit einem Netz , das neben dem Nährkarton auf der Folie befestigt ist, festgehalten werden. Mit der so hergestellten Testvorrichtung können Antibiotika ab den unten aufgeführten Konzentrationen über ihre Hemmwirkung nachgewiesen werden. Dazu werden die Test streifen in die zu untersuchenden wässrigen Lösungen eingetaucht und bei 37 0C bebrütet. Bei Abwesenheit von Hemmstoffen verfärben sich die Testfelder tief rot, bei Anwesenheit von Hemmstoffen tritt bis zu den unten angegebenen Konzentrationen eine Aufhellung der Farbe ein. Bei höheren Hemmstoffkonzentrationen unterbleibt das Wachstum der Sporen völlig, es tritt keine Verfärbung des Testbezirkes ein. Tabelle 5 Antibiotika mit Angaben zur minimalen Hemmkonzentration für Bacillus subtilis ATCC 6051 im Agarverdünnungstest (AVT) und im erfindungsgemässen Verfahren. Antibiotika AVT Teststreifen in g/ml in g/ml Penicillin G 0,002 0,002 Kanamycin 4 4 Tetracyclin 4 1 Polymyxin 32 16 Erythromycin o,125 0,32 Gentamicin o,125 0,2 Chloramphenicol 2 2 Cotrimoxaol 8 8 Ceftizoxim 8 8 Beispiel 5 Testvorrichtung zum Nachweis von antibiotisch wirksamen Substanzen in Flüssigkeiten 450 g einer Dispersion aus Vinylacetat und Vinylpropionat, 230 g einer Lösung von: 80 g Dextran; 5,6 g Citronensäure; 3,8 g NaOH; 4,5 g 1,2-Propandiol in 155 ml Wasser; 10 g Glucose; 2 ml einer Suspension, die 2 x lo9 Sporen von Bacillus subtilis enthält, werden homogen verrührt. Diese Filmrohmasse wird mit einer Schichtdicke von 12wozu auf eine transparente Folie beschichtet, getrocknet und anschliessend in 1 cm breite Bahnen geschnitten. Es wird durch Imprägnieren eines Filterkartons mit einer Nährbouillon, bestehend aus einem 1 m Puffer von 2-(N-Morpholino)-äthansulfonsäure, des pH-Wertes 6,5, in dem Nährstoffe der üblichen Zusammensetzung und o,o4 % Triphenyltetrazoliunchlorid gelöst sind, ein Nährkarton hergestellt. Dieser Nährkarton wird ebenfalls in 1 cm breite Bahnen geschnitten. Sporenfilm und Nährkarton werden in bekannter Art und Weise zu 1 cm breiten Teststreifen so verarbeitet, dass der Nährkarton auf eine Trägerfolie zu liegen kommt, der Sporenfilm mit der Filmseite auf dem Nährkarton liegt und beide mit einem Netz, das neben dem Nährkarton auf der Folie befestigt ist,festgehalten werden. Der oben genannte Puffer hat im Vergleich zu üblicherweise eingesetzten Puffern den Vorteil, dass Störungen auf das Wachstum der Sporen, die von hohen osmotischen Drucken des Harns herrühren, signifikant vermindert werden. Mit der so hergestellten Testvorrichtung können Antibiotika ab den unten aufgeführten Konzentrationen über ihre Hemmwirkung nachgewiesen werden. Dazu werden die Teststreifen in die zu untersuchenden Körperflüssigkeiten eingetaucht und bei 370C bebrütet. Bei Abwesenheit von Hemmstoffen verfärben sich die Testfelder tief rot, bei Anwesenheit von Hemmstoffen tritt bis zu den unten angegebenen Konzentrationen eine Aufhellung der Farbe ein. Bei höheren Hemmstoffkonzentrationen unterbleibt das Wachstum der Sporen völlig, es tritt keine Verfärbung des Testbezirks. ein. Tabelle 6 Antibiotika mit Angaben zu ihrer minimalen Hemmkonzentra tion, die mit dem erfindungsgemässen Verfahren und die mit dem literaturbekannten Vergleichsverfahren (Blättchen test, arzt. Lab. 10, 208 - 210 (1S70)) aus Harnen gefunden werden. Antibiotikum erfindungsgemässes Vergleichsverfahren Verfahren jug/ml) (/ug/ml) Ampicillin o,o16 o,125 Cefazolin o,125 2 Chloramphenicol 2 8 Fosfomycin 256 256 Gentamycin 8 1 Nitrofurantoin 16 64 Penicillin G o,o16 o,o31 Pipemidsäure 32 64 Polymixin B 512 512 Tetracyclin 1 8 Trimethoprim. 16 32 Cotrimoxazol 2 128

Claims: Patentansprüche 1. Vorrichtung zum Nachweis von Mikroorganismen hemmen den Stoffen in einer flüssigen Probe, bestehend aus einem Nährsubstrat und einem Mikroorganismen enthal tendem Substrat, dadurch gekennzeichnet, dass das mikro organismenhaltige Substrat ein aus einer Kunststoff dispersion hergestellter trockener Film ist, welcher 9 Mikroorganismen in einer Menge von 10 - 10 pro g und wasserlösliche oder wasserquellbare, makromole kulare Öffner sowie gegebenenfalls weitere Zusatz stoffe enthält, wobei das Mengenverhältnis von Kunst stoff zu Öffner 1000 : 1 bis 1 : 10 beträgt. 2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Dispersionsfilm auf einem durchsichtigen Trä ger befestigt ist. 3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger ein Gefäss ist, auf dessen Boden oder Wand der Film befestigt ist. 4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Nährsubstrat als stabiles trockenes Gel bzw. als Lyophilisat enthalten ist. 5. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet, dass das Nährsubstrat aus einem schichtför migen, mit den Nährsubstanzen imprägnierten saugfähi gen Material besteht7 der auf eine Träger befestigt und mit dem Dispersionsfilm bedeckt ist, welcher seiner seits an einem abde-.-enden Träger befestigt ist. 5. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das saugfähige Material Filterpapier oder ein Vlies ist.

Inventors: BLEISTEINER, MANFRED, WIECZOREK, LOTHAR, DR. RER. NAT., WIELINGER, HANS, DR.
Applicants: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH
Application year: 1982
Main classification: C12Q1
IPC codes: C12Q1