COLOURED TOXOPLASMS IN A STABLE SUSPENSION AND THEIR APPLICATION TO THE DIAGNOSIS OF TOXOPLASMOSIS

Abstract: 1. Reagent for assay of toxoplasmosis by direct agglutination, comprising a suspension of killed toxoplasma, characterised in that the latter are stained with a dye for the organelies or cell components chosen in such a way that the antigenic properties of the toxoplasma are preserved and that the auspension is stable in course of time.

Description: "Toxoplasmes colorés en suspension stable et leur application au dépistage de la toxoplasmose". La présente invention concerne le dépistage de la toxomoplasmose. E11e concerne plus particulièrement des toxoplasmes colorés en suspension stable dans un milieu liquide et un procédé amélioré pour le dépistage de la toxoplasmose utilisant de tels toxoplasmes et reposant sur une agglutination directe de ceux-ci. Parmi les tests connus de dépistage de la toxoplasmose, l'agglutination directe est un des plus répandus. Son principe est connu depuis 1965 il consiste à visualiser la présence éventuelle d'anticorps anti-toxoplasmes par l'agglutination d'une suspension de parasites dans une cupule de microtitration. En présence d'anticorps, les parasites, reliés par un réseau de gamma-globulines, forment un voile qui tapisse le fond de la cupule. En l'absence d'anticorps, par contre, ils sédimentent en bouton. Sur ce principe, le document FR-A-1.602.301 décrit des compositions d'un mélange anti-gammaglobulines fluorescentes auxquelles est ajoute un contre-colorant du type Bleu Evans et qui sont destinées à être utilisées lors des examens microscopiques par immunofluorescence ; le contre-colorant a alors pour fonction d'améliorer le contraste de lecture de la fluorescence et de diminuer la fluorescence non spécifique. L'inconvénient majeur de cette réaction très spécifique est de fatiguer la vue des personnes qui effectuent ces tests. Les toxoplasmes sont pratiquement transparents et les voiles d'agglutination sont pratiquement invisibles. Les boutons de sédimentation exigent un éclairage rasant pour être bien visibles. De ce fait, nombre de biologistes préfèrent utiliser des hématies sensibilisées avec un extrait antigénique de toxoplasmes. L'hémagglutination-ou la sédimentation- peut alors être constatée sans aucune fatigue visuelle. Cependant, pour être spécifique, la réaction nécessite qu'on épuise au préalable les sérums en anticorps anti-hématies, de façon à ne laisser subsister que les anticorps anti-toxoplasmose. Cette technique présente également un autre inconvénient comme elle fait appel à un antigène figuré, réalisé en greffant chimiquement une fraction antigénique solubilisée sur une hématie, la réponse de la réaction d'hémagglutination est moins parallèle à la technique de référence (dite dyetest) que l'agglutination directe. La présente invention a pour but de procurer un moyen de dépistage de la toxoplasmose qui allie la spécificité a' la lisibilité et permette ainsi de procéder à des tests surs sans fatigue visuelle excessive. On y parvient selon l'invention en rendant l'agglutination directe très facilement lisible grâce à l'utilisation de toxoplasmes colorés en suspension stable, c'est-à-dire d'une suspension de toxoplasmes colorés qui garde ses qualités d'antigénicité et de coloration pendant une longue période, en pratique pendant plusieurs mois. La réaction d'agglutination est alors aussi nette qu'elle le serait avec des hématies. I1 est bien certan que le principe consistant à colorer des microorganismes est connu depuis longtemps. Cependant, -toutes ces colorations ont en commun deux points qui les distinguent de la présente invention, du point de vue tand du choix et de l'agencement que de la f-inalité des moyens concernés - la coloration est toujours extemporanée et est destinée à faciliter un examen microscopique immédiat. La préoccupation de stabilité à long terme de la coloration et de la qualité antigénique de parasite est toujours absente de ce type d'examen. - la coloration n'a Jamais été employée, à la connaissance de la demanderesse, pour visualiser un phénomène d'agglutination d'une suspension de toxoplasmes, même extemporanément. C'est ainsi qu'on emploie classiquement notamment du Bleu Evans pour colorer les toxoplasmes et améliorer par ce biais le contraste de lecture en immuno-fluorescence; mais selon cette technique, qui repose sur une lecture en immuno-fluorescence, les parasites sont déposés sur une lame de microscope et mis à sécher, et on dépose sur la forme sèche du produit une goutte de colorant, on laisse incuber, puis on rince. Cette technique de coloration extemporanée a fondamentalement pour objectif d'améliorer le contraste entre le bord du microorganisme et le centre, lors d'un examen par fluorescence (voir par exemple Ann. Biol. Clin., vol. 28, 1970, pages 411415). Selon l'invention, par contre, on prépare des toxoplasmes colorés en suspension stable en milieu liquide et on satisfait à la double exigence de stabilité à long terme de la coloration et de la qualité antigénique du moyen de dépistage de la toxoplasmose ainsi réalisé Pour ce faire, on traite une suspension du parasite non sèche, en y fixant un colorant selon les techniques connues de 1'homme de l'art et appropriées au type de colorant choisi, et on lave pour enlever l'excès de colorant. Les substances colorantes qui peuvent être mises en oeuvre selon l'invention sont - d'une manière générale tous les colorants des protéines, des lipides, des lipo-protéines, des mucopolysaccharides, des glycoprotéines et/ou des acides nucléiques. - plus particulièrement tous les colorants du cytoplasme, des vacuoles, du noyau et autres organites intracellulaires ou des membranes cellulaires; et - plus spécifiquement, mais à titre d'exemples uniquement le Notr Soudan 8 (qui est actuellement le colorant qu'on préfère à tous les autres), le Bleu Evans, les sels de tétrazolium, l'acide osmique, 1'iode, etc...... Avant de mettre en oeuvre un colorant déterminé conformément à l'invention, il convient de vérifier par un test préalable si ce colorant est approprié ou non. Le test à effectuer est double et peut se définir comme suit : Après la réaction de coloration en milieu liquide, les toxoplasmes sont lavés et centrifugés jusqu'à ce que le surnageant des centrifugations soit limpide et incolore. Si les toxoplasmes sont encore colorés, on teste leur qualité antigénique par la réaction bien connue d'agglutination directe - les parasites ne doivent pas avoir perdu de sensibilité (même titre d'agglutination pour le meme sérum positif, avant et après coloration3 - ils ne doivent pas avoir perdu de spécificité : les sérums négatifs ne doivent pas donner diagglu- tination. Si ces tests sont satisfaisants, on examine alors la stabilité de la coloration - à court terme, en vieillissement accéléré de quelques jours à 370C, - à long terme, en vieillissement naturel d'un an à + 40C. Le milieu de suspension doit rester suffisam ment peu coloré pour permettre une parfaite visuali sation des parasites, et les qualités de spécificité et de sensibilité doivent être conservées. Si tous ces critères sont satisfaits, le co lorant testé peut être retenu. L'invention a donc pour premier objet des to toxoplasmes colorés en suspension stable en milieu li quide, qui satisfont au double test d'antigénicité, et de stabilité défini ci-dessus. Selon une variante tout particulièrement pré férée, mise en oeuvre selon les méthodes faisant ap pel à des techniques de fixation de substances en tre elles par liaisons covalentes que l'homme de 1' art est apte à adapter au cas d'espèce, les toxo plasmes colorés selon l'invention comportent un chro mophore fixé par liaison chimique covalente entre des fonctions respectives appropriées dudit chromophore et du toxoplasme. L'invention a également pour objet l'application de cestoxoplasmes colorés en suspension stable en milieu liquide au dépistage de la toxoplasmose par agglutination directe avec formation d'un voile coloré. La technique d'agglutination directe à laquelle peuvent être soumis les toxoplasmes colorés est décrite,notamment,dans "Agglutination Directe des Toxoplasmes "P.COUGINEAU et H.BAUFINE-DUCROCQ-Ann.Biol.Clin.28,411-415 (1970). L'invention est décrite plus en détail dans les exemples concrets ci-après, qui visent à mieux l'illustrer et ne la limitent aucunement. EXEMPLE 1 : Coloration du cytoplasme Les toxoplasmes sont suspendus dans une solution de Bleu Evans à 25 mg/l,de préférence tamponnée à pH 7,0 par un tampon phosphate 0,02 M contenant 7,5 g/l de chlorure de sodium (P.B.S.). Après incubation d'une demi-heure à 370C les toxoplasmes sont rincés environ 5 fois par CentEi- fugation dans du P.B.S., jusqu'à obtention d'un surnageant incolore. La richesse de la suspens ion est alors ajustée à 100.000 parasites/microlitre par dilution dans du P.B.S. contenant un conservateur, par exemple de l'azide de sodium à lg/l. Cette suspension est prête à l'emploi pour les tests dits d'agglutination directe. EXEMPLE 2 - Coloration des substances lipidiques On prépar-e une solution de Noir Soudan B dans la proportion suivante - Noir Soudan B 0,2 g - Ethanol 70 m1 - Eau 30 ml A 5 ml de suspension de toxoplasmes dans du P.B.S., on ajoute 2 ml de cette solution de Noir Soudan B. Le mélange est mis à incuber 30 minutes à 370C, puis les toxoplasmes sont rincés comme dans l'exemple lt La richesse de la suspens ion est ajustée de la même façon que dans l'exemple 1 et cette suspension ajustée est également prête à l'emploi pour des tests d'agglutination directe sur toxoplasmes colorés. EXEMPLE 3 - Couplage chimique d'un chromophore. Cet exemple a pour but de montrer qu'on peut également coupler une substance colorée par une liaison chimique covalente entre le chromophore et le support toxoplasme. On suspend les parasites dans une solution franche à 1 % d'acide périodique dans l'eau, ce qui transforme les alcools vicinaux des sucres en aldéhyde. Après incubation de 5 minutes, les toxoplasmes sont rincés une fois au P.B.S. On ajoute alors une solution de fuchsine basique préparée de la façon suivante - Fuschsine basique 2 g - Métabisulfite de potassium 4 g - Acide chlorhydrique 2 N 40 ml - Eau 400 ml. On incube 15 minutes à température ambiante. Les amines sont capables de se coupler aux fonctions aldéhydes créées par ltoxydation à l'acide périodique. On conjugue ainsi la fuschsine au toxoplasme. On rince 2 fois pendant 5 minutes avec une solution légèrement acide (pH 2,5) de 4 g/l de métabisulfite de potassium dans de l'eau additionnée d'acide chlorhydrique. On termine par un rinçage au P.B.S. et l'ajustement de la suspension comme décrit dans l'exemple 1. On obtient ainsi une suspension prête à l'emploi pour des tests d'agglutination directe améliorés conformément à l'invention.

Claims: REVENDICATIONS 1. Toxoplasmes colorés pour dépistage de la toxoplasmose par visualisation directe, caractérisés en ce qu'ils sont en-suspension stable en milieu liquide. 2. Toxoplasmes colorés selon la revendication 1, caractérisés en ce que le colorant est choisi parmi les colorants des protéines, des lipides, des lipoprotéines, des mucopoiysaccharides, des glycoprotéines etlou desacides nucléiques. 3. Toxoplasmes colorés selon la revendication 2; caractérisés en ce que le colorant est un colorant du cytoplasme, des vacuoles, du noyau et autres organites intracellulaires ou des membranes cellulaires. 4. Toxoplasmes colorés selon la revendication 2, caractérisés en ce que le colorant est choisi parmi le Noir Soudan B, le Bleu Evans et la fuschine en solution basique. 5. Toxoplasmes colorés selon 1'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce qu'ils sont en suspension stable en milieu aqueux. 6. Toxoplasmes colorés selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisés en ce qu'ils comportent un chromophore fixé par liaison chimique covalente entre des fonctions respectives appropriées dudit chromophore et du toxoplasme. 7. Application des toxoplasmes colorés selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 au dépistage de la toxoplasmose par agglutination directe avec formation d'un voile coloré.

Inventors: LAWNY, FRANCOIS, RIGAULT, YOLANDE, Lawny, François
Applicants: LABORATOIRES BIOTROL S.A.
Application year: 1982
Main classification: G01N33
IPC codes: G01N33