METHOD FOR THE DETERMINATION OF LECITHIN AND REAGENT FOR CARRYING OUT THIS METHOD

Abstract: 1. Process for the determination of lecithin in a sample, in which lecithin is split with the help of phospholipase-C and alkaline phosphatase to choline, this is reacted in the presence of adenosine triphosphate with the help of choline kinase again to give phosphoryl-choline and the thereby formed adenosine diphosphate is measured according to known methods, characterised in that the splitting of the lecithin is carried out in the presence of a borate/borax buffer and of a non-ionic detergent based on a condensation product of polyethyleneglycol with isooctylphenol.

Description: Verfahren zur Bestimmung von Lecithin sowie Reagens zur I)urchführung dieses Verfahrens Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von Lecithin in einer Probe durch enzymatische Spaltung des Lecithins mit Hilfe von Phospholipase-C und alkalischer Phosphatase zu Cholin, Umsetzung des Cholins mit Hilfe von Cholinkinase in Gegenwart von Adenosintriphosphat zu Phosphorylcholin und Adenosindiphosphat und anschliessendem Nachweis des entstandenen Adenosin diphosphatsnach bekannten Methoden, wobei die Spaltung des Lecithins in Gegenwart eines Borat/ Borax-Puffers und eines nicht-ionischen Detergens auf der Basis eines Kondensationsproduktes von Polyethylenglykol mit Isooctylphenol durchgeführt wird. Eine Bestimmung des Lecithins wird beispielsweise bei der Untersuchung von Lebensmitteln durchgeführt. Lecithin kommt vor allem im Eidotter vor. Der Lecithingehalt des Eidotters unterliegt nur geringen Schwankungsbreiten, so dass darin ein Mass für den Eigehalt einer Lebensmittelprobe gesehen werden kann. Besondere Bedeutung hat die Bestimmung des Lecithingehaltes im Fruchtwasser. Damit lässt sich die fetale Lungenreife bereits vor der Geburt weitgehend feststellen und das mögliche Risiko eines Atemnotsyndroms für das Neugeborene abschätzen. Das Atemnotsyndrom ist eine der wichtigsten Komplikationen, die bei Frühgeborenen nach der Geburt auftreten können. Es wird durch einen Mangel an Surfactant hervorgerufen, der bei reifen Neugeborenen als dünner Film die Lungenalveolen auskleidet und die Aufgabe hat, die Oberflächenspannung an der Grenzfläche Luft/ Flüssigkeit in den Alveolen zu senken und dadurch die Stabilität der Alveolen zu gewährleisten. Der Surfactant besteht aus Proteine, Kohlenhydraten und Lipoiden, wobei den Phospholipiden, beispielsweise Dipalmitoyllecithin, Phosphatidylglycerol und Sphingomyelin, die entscheidenden oberflächenaktiven Eigenschaften zukommen. Der Lecithingehalt im Fruchtwasser bewegtsich während der Schwangerschaft lange Zeit zwischen 1 und 2 mg/dl, steigt in der 35. und 37. Woche auf 5-10 mg/dl und liegt in der 40. Woche meist bei einem Wert über 10 mg/dl. Der steile Anstieg der Lecithinkonzentration zwischen der 55. und 37. Woche der Schwangerschaft kann als charakteristisches Mass für das Vorliegen der fetalen Lungenreife herangezogen werden. Durch die Atembewegungen des Feten kommt es zu einem ständigen Austausch der Alveolarflüssigkeit mit dem Fruchtwasser, so dass die Möglichkeit besteht, sich durch die Messung des Phospholipidgehaltes im Fruchtwasser ein Bild vom Surfactantgehalt in den fetalen Alveolen zu machen und dadurch bereits vor der Geburt eine Aussage über den Reifeustand der Lungen zu erhalten. Die Bestimmung des Lecithins im Fruchtwasser ist daher von entscheidender Bedeutung für die Schwangerschaftsdiagnostik, insbesondere im Hinblick auf eine frühzeitige Terminierung einer Risikoschwangerschaft wegen eines drohenden Atemnotsyndroms. Für die Bestimmung des Lecithins im Fruchtwasser stehen zahlreiche Methoden zur Verfügung, die sich einerseits durch den unterschiedlichen Arbeitsaufwand und andererseits durch die Genauigkeit der Vorhersage teilweise beträchtlich unterscheiden. Aus Geburtshilfe und Frauenheilkunde 39 (1979) S. 849856 ist eine enzymatische Lecithinbestimmung in Fruchtwasser bekannt, die leichter durchführbar als die nicht-enzvmatischen Methoden und diesen an Genauigkeit und Praktikabilität gleichwertig, oft sogar überlegen ist. Das Lecithin wird bei dieser Bestimmungsmethode mit Hilfe von Phospholipase-C in einer Glycinpuffer enthaltenden Lösung zu Phosphorylcholin gespalten, das durch alkalische Phosphatase weiter zu Cholin abgebaut wird. Letzteres wird in Gegenwart von Adenosintriphosphat mit Hilfe von Cholinkinase wieder zu Phosphorylcholin unter Bildung von Adenosindiphosphat umgesetzt. Das gebildete Adenosindiphosphat wird über eine an sich bekannte enzymatische Reaktionskette photometrisch gemessen. Dieses Nachweisverfahren kann durch die folgenden Reaktionsgleichungen beschrieben werden: (1) Lecithin + H20 EMI3.1 1,2-Diglycerid + Phosphorylcholin (2) Phosphorylcholin + H20 EMI3.2 Cholin + PO (3) Cholin + ATP EMI3.3 Phosphorylcholin + ADP (4) ADP + PEP EMI3.4 ATP + Pyruvat (5) Pyruvat + NADH + H+ EMI3.5 Lactat + NAD Die benutzten Abkürzungen bedeuten im Einzelnen: : AP = alkalische Phosphatase ATP = Adenosin-51-triphosphat ADP = Adenosin-5'-diphosphat PEP = Phosphoenolpyruvat PK = Pyruvatkinase NADH/NAD+ = Nicotinamid-adenin-dinucleotid, reduzierte/ oxidierte Form LDH = Lactatdehydrogenase Die Beurteilung eines drohenden Atemnotsyndroms ist zwar durch das enzymatische Verfahren zur Bestimmung von Lecithin in Fruchtwasser wesentlich vereinfacht worden. Es weist jedoch einen erheblichen Nachteil auf: In einer beachtlichen Anzahl von Proben treten bei der Messung Störungen auf, die von einer starken Trübung der Messlösung herrühren und zuweilen eine Lecithinbestimmung völlig unmöglich machen. Der Grund liegt in der hohen Trübung des Fruchtwassers, das mit einem relativ grossen Probevolumen in die Küvette eingesetzt wird und daher auch im Test eine starke, nicht mehr messbare Trübung verursachen kann. Es werden zu hohe Anfangs extinktionen gemessen, die zu einer hohen Fehlerquote und zu einer mangelhaften Präzision der Messung führen. Ferner werden bei der Messung solcher Proben erhebliche Abweichungen von der Linearität der Messung gefunden. Aufgabe der Erfindung war es nun, ein Verfahren bereit zu stellen, das die oben erwähnten Nachteile nicht mehr aufweist. Gelöst wurde diese Aufgabe durch das erfindungsgemässe Verfahren, das von dem Verfahren gemäss dem Stand der Technik dadurch abweicht, dass die Spaltung des Lecithins mit Phospholipase-C und alkalischer Phosphatase nicht in einem Glycin-Puffer, sondern in einem Borat/Borax-Puffer in Gegenwart eines nicht-ionischen Detergens auf der Basis eines Kondensationsproduktes von Polyethylenglykol mit Isooctylphenol durchgeführt wird. Grundsätzlich ist eine Klärung der zu messenden Lösung durch viele Detergentien erreichbar. Doch zeigen die meisten Detergentien eine mehr oder weniger stark ausgeprägte Hemmwirkung auf die enzymatisch ablaufenden Prozesse, die zu falschen Messergebnissen führen. Andererseits laufen enzymatische Reaktionen in befriedigender Weise nur in einem realtiv engen pH-Bereich ab. Im Falle der Lecithinbestimmung in einer Probe ist ein pH-Bereich von 7, O8,5 optimal. Darüberhinaüs hat sich gezeigt, dass für das komple'xe System der enzymatischen Reaktionen, die für die Lecithinbestimmung erforderlich sind, nur wenige Puffersysteme in Frage kommen. Es hat sich überraschenderlfeise gezeigt, dass optimale Messbedingungen für eine störungsfreie Bestimmung von Lecithin in einer Probelösung erreicht erden können, wenn bei der Spaltung des Lecithins ein Borat/Borax-Puffer und ein nicht-ionisches Detergens auf der Basis eines Kondensationsproduktes von Polyethylenglykol mit Isooctylphenol verwendet werden. Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Bestimmung von Lecithin in einer Probe, bei dem zunächst Lecithin mit Hilfe von Phospholipase-C und alkalischer Phosphatase zu Cholin gespalten, danach das entstandene Cholin in Gegenwart von Adenosintriphosphat mit Hilfe von Cholinkinase wieder zu Phosphorylcholin umgesetzt und das dabei gebildete Adenosindiphosphat nach bekannten Methoden gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Spaltung des Lecithins in Gegenwart eines Borat/ Borax-Puffers und in Gegenwart eines nicht-ionischen Detergens auf der Basis eines Kondensationsproduktes von Polyethylenglykol mit Isooctylphenol durchgeführt wird. Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird zunächst die Probe - beissielsweise Fruchtwasser, gegebenenfalls mit Wasser verdünnt - mit dem Borat/Borax-Puffer, einem Magnesiumsalz, dem Detergens, mit Phospholipase C und alkalischer Phosphatase vermischt und bei Raumtemperatur oder leicht erhöhter Temperatur inkubiert. Die Inkubationszeit beträgt je nach der gewählten Temperatur vorzugsweise 10-60 Minuten. Danach wird kurze Zeit auf 95-1000C, beispielsweise in einem Wasserbad, erhitzt. Nach dem Abkühlen des Gemisches wird abzentrifugiert und der Überstand mit NADH, ATP, Phosphoenolpyruat, Glukose, Pyruvatkinase und Lactatdehydrogenase versetzt. Nach kurzer Wartezeit (ca. 5 Minuten) wird die Extinktion E1 gemessen. Anschliessend wird eine Cholinkinase Lösung zugegeben, um die Reaktionskette zum Nachweis des aus Lecithin freigesetzten Cholins in Gang zu setzen. Ist die Reaktion abgeschlossen, wird die Extinktion E2 2gemessen. Aus der Extinktionsdifferenz lässt sich der Lecithingehalt der Probe ermitteln. Es empfiehlt sich, neben der eigentlichen Bestimmung der Probe einen Reagentienleerwert zu messen. Es ist zweckmässig, die für das erfindungsgemässe Verfahren benötigten Enzyme und Hilfsstoffe zu bestimmten Lösungen bzw. Suspensionen zusammenzufassen. So wird vorzugsweise der Borat/Borax-Puffer zusammen mit dem Detergens und dem Magnesiumsalz in Form einer "Pufferlösung" eingesetzt. Vorteilhafterweise wird ein Borat/Borax-Puffer mit pH 7,0-8,5 in einer Konzentration von 0,05-0,5 mol/l Pufferlösung, vorzugsweise von 0,07-0,25 mol/l Pufferlösung, eingesetzt. Ganz besonders bevorzugt ist ein Borat/Borax Puffer vom pH-Wert 7,8-8,2, der in einer Konzentration von 0,1-0,2 mol/l Pufferlösung bei der Bestimmung benutzt wird. Das nicht-ionische Detergens auf der Basis eines Kondensationsproduktes von Polyethylenglykol mit Isooctylphenol wird in einer Konzentration von 0,5-5 g/l', vorzugsweise 1,0-3,0 g/l, der Pufferlösung zugesetzt. Als erfindungsgemässes Detergens hat sich besonders das Handelsprodukt Tinovetin JU der Fa. Ciba Geigy bewährt. Die Phospholipase-C und die alkalische Phosphatase werden zusammen als "Enzymsuspension A" verwendet, wobei die Konzentration an Phospholipase-C 40-200 U/ml, vorzugsweise 100 U/ml, und die Konzentration an alkalischer Phosphatase 20-200 U/ml, vorzugsweise 80 U/ml, betragen. NADH, ATP, Phosphoenolpyruvat und Glukose erden in vorteilhafter Weise als "Coenzymlösung" zusammen gefasst. Die einzelnen Konzentrationen in dieser Lösung betragen 2,5-6,0 mmol/l, vorzugsweise 4,0 mmol/l NADH, 10-30 mmol/l, vorzugsweise 20 mmol/l ATP, 3-10 mmol/l, vorzugsweise 7 mmol/l Phosphoenolpyruvat und 30-100 mmol/l, vorzugsweise 50-60 mmol/l Glukose. Pyruvatkinase und Lactatdehydrogenase werden zusammen als "Enzymsuspension B" zugegeben, wobei die Konzentrationen an Pyruvatkinase und an Lactatdehydrogenase jeweils 150-1000 U/ml, vorzugsweise 300 U/ml betragen. Cholinkinase wird vorzugsweise in Form einer getrennten Lösung mit einem Gehalt an 2-10 U/ml, vorzugsweise 2,5 U/ml verwendet. Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Reagens zur Lecithinbestimmung, das aus folgenden Bestandteilen besteht: a) einer Pufferlösung mit 0,05-0,5 mol/l Borat/Borax-Puffer, pH 7,0-8,5 2-20 mmol/l Magnesiumionen 0,5-5,0 g/l Detergens b) einer Enzymsuspension A mit 40-200 U/ml Phospholipase-C 20-200 U/ml alkalische Phosphatase c) einer Coenzym-Lösung mit 2,5-6,0 mmol/l NADH 10-0 mmol/l ATP 3-10 mmol/l Phosphoenolpyruvat 30-100 mmol/l Glukose d) einer Enzymsuspension B mit 150-1000 U/ml Pyruvatkinase 150-1000 U/ml Lactatdehydrogenase e) einer Lösung mit 2-10 U/ml Cholinkinase. Ganz besonders bevorzugt ist ein Reagens mit folgenden Bestandteilen: a) einer Pufferlösung mit 0,2 mol/l Borat/Borax-Puffer, pH 7,8-8,2 10 mmol/l Magnesiumsulfat 2,5 g/l Tinovetin JU b) einer Enzymsuspension A mit 80 U/ml Phospholipase-C 100 U/ml alkalische Phosphatase c) einer Coenzym-Lösung mit 4,0 mmol/l NADH 20 mmol/l ATP 7 mmol/l Phosphoenolpyruvat 56 mmol/l Glukose d) einer Enzymsuspension B mit 300 U/ml Pyruvatkinase 300 U/ml Lactatdehydrogenase e) einer Lösung mit 2,5 U/ml Cholinkinase. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagens zur Spaltung des Lecithins, gekennzeichnet durch einen Gehalt an 2-10 U/ml Phospholipase-C 1-10 U/ml alkalische Phosphatase 0,05-0,5 mol/l Borat/Borax-Puffer, pH 7,0-8,5 2-20 mmol/l Magnesiumionen 0,5-5,0 g/l Detergens. Zur Spaltung des Lecithins ist eine Reagentienzusammensetzung ganz besonders bevorzugt, die die einzelnen Bestandteile in folgenden Konzentrationen enthält: 4 U/ml Phospholipase-C 5 U/ml alkalische Phosphatase 0,2 mol/l Borat/Borax-Puffer, pH 7,8-8,2 10 mmol/l Magnesiumsulfat 2,5 g/l Tinovetin JU. Das erfindungsgemässe Reagens zur Spaltung des Lecithins wird zweckmässigerweise hergestellt, indem 1,0 ml der oben beschriebenen Pufferlösung mit 50 ul der oben erwähnten Enzymsuspension A versetzt wird Das so erhaltene Reagens wird der zu messenden Probe vorzugsweise im Verhältnis 1:1 zugesetzt. Die Erfindung wird durch folgende Beispiele näher erläutert: Beispiel 1 Bestimmung von Lecithin in Fruchtwasser 1 ml einer Probelösung, die ca. 0,1 mg Lecithin enthält, wird mit 1 ml einer Lösung, die 0,2 mol/l Borat/Borax-Puffer, pH 7,8-8,2, 10 mmol/l Magnesiumsulfat und 2,5 g/l Tinovetin JU enthält, versetzt. Zu diesem Gemisch werden 0,05 ml einer Enzymsuspension aus 80 U/ml Phospholipase-C und 100 U/ml alkalische Phosphatase gegeben. Das Gemisch wird bei 37 0C 20 Minuten stehengelassen. Danach wird 5 Minuten auf 95-100 C erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur werden 0,1 ml einer Lösung aus 4,0 mmol/l NADH, 20 mmol/l ATP, 7 mmol/l Phosphoenolpyruvat und 56 mmol/l Glukose sowie 0,02 nl eines Enzymgemisches aus 300 U/ml Pyruvatkinase und 300 U/ml Lactatdehydrogenase zugesetzt. Die erhaltene Lösung wird durchmischt und 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Probe wird in eine Küvette überführt und die Extinktion (E1) gemessen. Die enzymatische Umsetzung wird gestartet durch Zusatz von 0,05 ml einer Cholinkinase-Lösung mit 2,5 U/ml. Nach 30 Minuten Stehenlassen bei Raumtemperatur wird die Extinktion (E2) gemessen. Aus der Extinktionsdifferenz E1-E2 wird die Extinktionsabnahme AE berechnet, aus der sich der Lecithingehalt der Probe nach der Formel: Lecithin (mg/100ml) =E 47,86 ergibt. Zu jeder Bestimmung von Lecithin in einer Probelösung wird ein Reagentienleerwert ermittelt, der sich ergibt, wenn bei dem oben beschriebenen Bestimmungsverfahren anstelle der Probelösung 1 ml destilliertes Wasser eingesetzt wird. Der Reagentienleerwert wird vor der Berechnung des Lecithingehaltes nach der o.a. Formel von der gefundenen Extinktionsabnahme aE abgezogen. Beispiel 2 Bestimmung von Lecithin in Mayonnaise 5 g Mayonnaise werden mit 30 ml Ethanol/Benzol-Lösung (1+1, vZv) und 50 ml Wasser im Scheidetrichter etwa 5 Min. geschüttelt. Die organische Phase wird abgetrennt, die wässrige Phase wird zweimal mit ca. 20 ml Ethanol/Benzol-Lösung ausgeschüttelt. Die gesammelte organische Phase wird im Rotationsverdampfer bis fast zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird mit 5 ml tert. Butanol gelöst, mit Wasser auf 50 ml aufgefüllt und kräftig durchmischt. 2 ml der filtrierten, weitgehend klaren Lösung werden zur Lecithinbestimmung eingesetzt, die, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt wird. Beispiel 3 Bestimmung von Lecithin in Eierlikör In einen 100 ml-Alesskolben werden 2 g Eierlikör eingewogen und mit ca. 10 ml tert. Butanol gelöst. Mit Wasser wird auf 100 ml aufgefüllt und gemischt. 0,2 ml dieser Lösung erden zur Lecithinbestimmung eingesetzt, die, wie in Beispiel 1 angegeben, durchgeführt wird. Beispiel 4 Bestimmung von Lecithin in Backwaren 2 g einer Backwarenprobe werden zerkleinert und in einen 100 ml-Scheidetrichter übergeführt. Es werden 30 ml Ethanol/Benzol-Lösung (1+1, v/v) und 50 ml Wasser hinzugegeben. Das Gemisch wird 5 Min. kräftig geschüttelt. Die organische Phase wird abgetrennt. Die wässrige Phase wird zweimal mit je 10 ml Ethanol/ Benzol-Lösung ausgeschüttelt. Die organischen Phasen werden vereinigt, filtriert und am Rotationsverdampfer nahezu zur Trockene eingedampft, wobei der Rotationsverdampfer bis auf höchstens 45 0C erhitzt werden darf. Der Rückstand wird in 10 ml tert. Butanol gelöst, mit Wasser auf 50 ml aufgefüllt und kräftig durchmischt. 1 ml der filtrierten Lösung werden zur Lecithinbestimmung eingesetzt, die, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt wird.

Claims: Patentansprüche 1. Verfahren zur Bestimmung von Lecithin in er Probe, bei dem Lecithin mit Hilfe von Phospho lipzase-C und alkalischer Phosphatase zu Cholin gespalten, dieses in Gegenwart von Adenosin t-.-iphosphat mit Hilfe von Cholinkinase wieder ù Phosphorylcholin umgesetzt und das dabei entstehende Adenosindiphosphat nach bekannten Methoden gemssen wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Spaltung des Lecithins in Gegenwart eines Borat/Borax-Puffer und eines nicht-ionischen Detergens auf der Basis eines Kondensationsproduktes von Polyethylenglykol mit Isooctylphenol durchgeführt wird. 2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Borat/Borax-Puffer, pH 7,0-8,5, ineiner Konzentration von 0,05-0,5 molilpufferlösung und das Detergens in einer Konzentration von 0,5-5,0 g/l Pufferlösung zuge setzt erden. 3. Verfahren gemäss einem der Ansprüche I und 2, dadurch gekennzeichnet, dass 0,07-0,25mol/l Pufferlösung Borat/BoraxPuffer und 1,0-3,0 g/lPufferlösung Detergens eingesetzt werden. 4. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass als Detergens Tinovetin JU verwendet wird. 5. Reagens zur Durchführung des Verfahrens gemäss den Ansprüchen 1-4, gekennzeichnet durch folgende Bestandteile: a) einer Pufferlösung mit 0,05-0,5 mol/l Borat/Borax-Puffer, pH 7,0-8,5 2-20 mmol/l Magnesiumionen 0,5-5,0 g/l Detergens b) einer Enzymsuspension A mit 40-200 U/ml Phospholipase-C 20-200 U/ml alkalische Phosphatase c) einer Coenzym-Lösung mit 2,5-6,0 mmol/l NADH 10-30 mmol/l ATP 3-10 mmol/l Phosphoenolpyruvat 30-100 mmol/l Glukose d) einer Enzymsuspension B mit 150-1000 U/ml Pyruvatkinase 150-1000 U/ml Lactatdehydrogenase e) einer Lösung mit 2-10 U/ml Cholinkinase. 6. Reagens gemäss Anspruch 5, gekennzeichnet durch folgende Bestandteile: a) einer Pufferlösung mit 0,2 mol/l Borat/Borax-Puffer, pH 7,8-8,2 10 mmol/l Magnesiumsulfat 2,5 g/l Tinovetin JU b) einer Enzymsuspension A mit 80 U/ml Phospholipase-C 100 U/ml alkalische Phosphatase c) einer Coenzym-Lösung mit 4,0 mmol/l NADH 20 mmol/l ATP 7 mmol/l Phosphoenolpyruvat 56 mmol/l Glukose d) einer Enzymsuspension B mit 300 U/ml Pyruvatkinase 300 U/ml Lactatdehydrogenäse e) einer Lösung mit 2,5 U/ml Cholinkinase. - a 1 v 7. Reagens zur Spaltung des Lecithins, gekennzeichnet durch einen Gehalt an 2-10 U/ml Phospholipase-C 1-10 U/ml alkalische Phosphatase 0,05-0,5 mol/l Borat/Borax-Puffer, pH 7,0-8,5 2-20 mmol/l Magnesiumionen 0,5-5,0 g/l Detergens. 8. Reagens gemäss Anspruch 7, gekennzeichnet durch einen Gehalt an 4 U/ml Phospholipase-C 5 U/ml alkalische Phosphatase-C 0,2 mol/l Borat/Borax-Puffer, pH 7,8-8,2 10 mmol/l Magnesiumsulfat 2,5 g/l Tinovetin JU.

Inventors: BECKER, JURGEN, BEINSTINGL, GERHARD, BEUTLER, HANS-OTTO, DR.RER.NAT., Becker, Jürgen 
Applicants: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH
Application year: 1982
Main classification: C12Q1
IPC codes: C12Q1, G01N33