STABILIZED REAGENT FOR THE DETECTION OF HYDROGEN PEROXIDE

Abstract: 1. Stabilised reagent for the detection of H2 O2 or of H2 O2 -forming systems based upon methylbenzothiazolone hydrazone or a derivative thereof as colour former and an aromatic amine capable of undergoing oxidative coupling therewith with colour development, containing buffer substance and peroxidase, characterised by a content of at least one substance from the group alkali metal ferrocyanide, chelate former and alkali metal azide as stabiliser, as well as optionally an oxidase.

Description: Stabilisiertes Reagenz zum Nachweis von H202 Die Erfindung betrifft ein Reagenz zum Nachweis von H202 oder H202 liefernden Systemen mit überlegener Stabilität, insbesondere in Form der wässrigen Lösung. Reagenzien zum Nachweis von H 202 oder H 202 liefernden Systemen, welche die unter Farbstoffbildung verlaufende oxidative Kupplung zwischen Methylbenzthiazolonhydrazon oder einem Derivat davon mit einem aromatischen Amin, die durch H202 hervorgerufen wird, ausnutzen, sind bekannt. Ein Vorteil dieser Reagenzien ist darin zu sehen, dass der gebildete Farbstoff hinsichtlich seiner Menge und dementsprechend auf der Farbintensität der H202-Menge proportional ist und durch Bestimmung der Farbtiefe nach dem Beerschen Gesetz die quantitative H202-Bestimmung ermöglicht. Ein weiterer Vorteil dieses Reagenz besteht darin, dass es auch zusammen mit H202 liefernden Systemen, insbesondere enzymatischen Systemen, eingesetzt werden kann. Derartige H202 liefernde enzymatische Systeme bestehen in der Regel aus einer Oxidase, welche ein zu bestimmendes Substrat unter Bildung von H202 in gepufferter Lösung oxidiert. Das gebildete H202 bewirkt dann in Gegenwart von Peroxidase die oben erwähnte oxidative Kupplung unter Farbstoffbildung. Ein erheblicher Nachteil des bekannten Reagenz besteht jedoch in seiner Instabilität. Die Kupplungskomponenten neigen zur Autoxidation unter Farbstoffbildung. Dieser Nachteil ist besonders ausgeprägt bei den gebrauchsfertigen wässrigen Lösungen dieser Reagenzien. Aber auch die Trockenform des Reagenz lässt hinsichtlich der Stabilität zu wünschen übrig. Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, den erwähnten Nachteil unter Aufrechterhaltung der angegebenen Vorteile zu beseitigen und ein Reagenz der eingangs erwähnten Art zu schaffen, welches hinsichtlich der Autoxidationsempfindlichkeit wesentlich verbessert ist. Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, die Linearität der Farbstoffbildung in Abhängigkeit von der H202-Menge zu verbessern. Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäss durch ein stabilisiertes Reagenz zum Nachweis von H202 oder H202 liefernden Systemen auf Basis von Methylbenzthiazolonhydrazon oder einem Derivat desselben als Farbbildner und eines damit zur oxidativen Kupplung unter Farbentwicklung befähigten aromatischen Amins, enthaltend Puffersubstanz und Peroxidase, welches gekennzeichnet ist durch einen Gehalt an wenigstens einer Substanz aus der Gruppe Alkaliferrozyanid, Chelatbildner und Alkaliazid als Stabilisator sowie gegebenenfalls einer Oxidase. Der Farbbildner besteht beim erfindungsgemässen Reagenz vorzugsweise aus Methylbenzthiazolonhydrazonsulfonat, (MBTH-S) welches sich von Methylbenzthiazolonhydrazon (MBTH) durch eine Sulfonatgruppe am aromatischen Ring unterscheidet. Als aromatische Amin-Kupplungskomponente eignen sich prinzipiell alle aromatischen Verbindungen, welche chinoide Strukturen zu bilden vermögen und durch Halogenatome, Niedrigalkylgruppen, Hydroxyalkylgruppen oder/und Sulfonsäuregruppen substituiert sind. Eine Aufzählung geeigneter Amine findet sich in Analytical Chemistry 33, 723-724 (1961). Daneben können auch phenolische Verbindungen als Kupplungskomponenten verwendet werden, beispielsweise Naphtholdisulfonsäure oder Aminonaphtholdisulfonsäure. Bevorzugt werden im Rahmen der Erfindung m-Toluidine eingesetzt, insbesondere Ethylhydroxytoluidin oder N-Ethyl-N-(2-Sulfo-ethyl)-m-toluidin. Als Alkaliferrozyanid können die Natrium-, Kalium-, Lithium- und Ammoniumsalze verwendet werden. Bevorzugt wird das Kaliumsalz. Als Chelatbildner kommen die bekannten, zur Komplexbildung befähigten Substanzen dieser Art in Betracht. Bevorzugt werden Aminpolyazetate wie z. B. Ethylendiamintetraessigsäure oder deren Natriumsalz, Nitrilotriessigsäure, N-Hydroxyethylendinitrilotetraessigsäure, Cyklohexandiamintetraessigsäure, Cyklohexylendinitrilotetraessigsäure, Diäthylentriaminpentaessigsäure und 3,6-Dioxaoctamethylendinitrilotetraessig 3,6-Dioxaoctamethylendinitrilotetraessig- säure. Besonders bevorzugt wird das Ethylendiamintetraessigsäurenatriumsalz. Die Wirkungsweise des Chelatbildners ist nicht bekannt. Die erwähnte unerwünschte Autoxidationsreaktion verläuft offenbar nicht unter dem katalytischen Einfluss von Schwermetallionen, die durch den Chelatbildner in unschädliche Komplexe überführt wurden, da die Autoxidationsreaktion durch den Zusatz katalytischer Mengen von Schwermetallionen an sich nicht beeinflusst wird. Als Alkaliazid wird Natriumazid bevorzugt, jedoch können auch die Kalium-, Lithium- und Ammoniumsalze verwendet werden. Die besten Ergebnisse werden mit einem erfindungsgemassen Reagenz erhalten, welches Alkaliferrozyanid, Chelatbildner und Alkaliazid gleichzeitig enthält. In einer bevorzugten Zusammensetzung enthält das Reagenz, bezogen auf einen Liter gebrauchsfertige wässrige Reagenzlösung, 1 bis 500 mg Ferrozyanid, 1 bis 1Q00 mg Ethylendiamintetraazetat und 5 bis 500 mg Alkaliazid. Die Konzentration an Farbbildner liegt zweckmässig zwischen 0,01 und 5 mMol/l, die Menge an aromatischem Amin zwischen 0,01 und 10 mMolil. Besonders bevorzugt wird eine Zusammensetzung, die 10 bis 50 mg Ferrocyanid, 100 bis 1000 mg Ethylendiamintetraazetat und 50 bis 500 mg Alkaliazid enthält. Als Puffersubstanz eignen sich solche, die im etwa neutralen Bereich, d. h zwischen etwa pH 5,0 und 9,0 puffern. Geeignete Konzentrationen liegen im allgemeinen zwischen 0,02 und 0,5 mol/l. Eine geeignete Peroxidasemenge liegt zwischen 0,005 und 10 x 10 3 Null. Das erfindungsgemässe Reagenz eignet sich auch zur Aufbringung auf saugfähiges Trägermaterial, beispielsweise Papier, poröse Kunststoffolien, poröses Glasgranulat und dergleichen. Bevorzugte Träger sind solche, wie sie für Teststreifen bekannt sind. Der H202-Nachweis kann in diesem Falle qualitativ durch Auftropfen der zu untersuchenden Probelösung auf den das erfindungsgemässe Reagenz enthaltenden blatt- oder bandförmigen Träger oder durch Einbringen des Trägermaterials in bestimmter Menge in die zu untersuchende Lösung erfolgen. Im letzteren Falle kann eine quantitative Bestimmung durchgeführt werden in gleicher Weise wie beim trägerlosen Reagenz. Wie bereits erwähnt, eignet sich das erfindungsgemässe Reagenz auch zur Bestimmung von H2 0 2-liefernden Systemen. Hierunter werden Verbindungen verstanden, die in einer Vorreaktion unter Bildung von H202 stöchiometrisch umgesetzt werden. Typische Beispiele sind die durch Oxidasen quantitativ umgesetzte Substanzen wie z. B. Glucose, Cholesterin, Harzsäure, Glycerin, Aminosäuren, Xanthin, Lactat, und dergleichen. In diesem Falle enthält das erfindungsgemässe Reagenz zusätzlich noch die entsprechende Oxidase, im Falle der Harnsäure also beispielsweise Uricase. Der erfindungsgemäss erzielte Stabilisierungseffekt unter Verwendung verschiedener Stabilisierungsmittel gemäss der Erfindung geht aus der nachstehenden Tabelle hervor. Sie zeigt den Extinktionsanstieg einer wässrigen Lösung, welche 0,2 mM/l MBTH bzw. MBTH-S, 0,6 mM/l Xthylhydroxytoluidin und 0,1 M/1 Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 enthält bei 25 OC. Tabelle 1 Ext. anstieg Ext. anstieg nach 1 h/250 nach 1 h/250 Zusatz MBTH MBTH-S 0. ohne 1.060 0,126 1. Nitrilotrieessigsäure l-mM 0,485 0,028 2. A 1 mM 0,045 0,015 3. B 1 mM 0,045 0,015 4. C 1 mM 0,040 0,015 5. D 1 mM 0,063 0,013 6. E 1 mM 0,052 0,013 7. Diäthylentriamin 1 mM --- 0,039 8. Acetylaceton 1 mM 0,581 0,030 9. Thiosemicarbazid 1 mM 0,120 0,023 10. K LFe (CN) 1 mM 0,053 0,026 11. NaN3 1 mM 0,209 0,026 12. R4 Se(CN)63 0,1 mM 0,016 0,005 6 A = Ethylendinitrilotetraessigsäure (EDTA) B = Ethylendinitrilotetraessigsäure Dinatriumsalz (EDTA-Na) C = 1,2 Cyclohexylendinitrilotetraessigsäure D = Diethylentriaminpentaessigsäure E = 3, 6-Dioxaoctamethylendinitrilotetraessigsäure Die Werte der obigen Tabelle zeigen die wesentlich überlegene Stabilität des erfindungsgemässen Reagenz im Vergleich zu einem Reagenz, welches keine der erfindungsgemäss stabilisierenden Substanzen enthält. Die Bestimmung wurde durchgeführt, indem der jeweiligen Lösung 1 U/ml Peroxidase zugesetzt, die Extinktion gemessen und nach einer Stunde erneut die Extinktion gemessen und die Extinktionsdifferenz bestimmt wird. Dass das erfindungsgemässe Reagenz auch in Gegenwart einer Oxidase überlegene Stabilität aufweist, zeigt das nachfolgende Beispiel. Beispiel Ein erfindungsgemässes Reagenz, bestehend aus 0,1 Mol Kaliumphosphat, pH 7,0, 0,4 mMol Ethylhydroxitoluidin, 0,2 mMol MBTH-S, 300 U Uricase, 1000 U Peroxidase, 20 mg Kaliumferrozyanid, 200 mg EDTA-Na2, 100 mg Natriumazid, wurde in 1 1 Wasser aufgelöst und die Extinktion bestimmt. Nach 1,5sttndigem Stehen bei 25 OC wurde die Extinktion erneut bestimmt. Zum Vergleich wurde ein entsprechendes Reagenz hergestellt, welches jedoch kein Kaliumferrozyanid, EDTA und Natriumazid enthielt. Das letztere, nicht erfindungsgemässe Reagenz ergab eine Extinktionsänderung von 0,172 E/h. Die entsprechende Xnderung beim erfindungsgemässen Reagenz betrug 0,0072 E/h.

Claims: Patentansprüche 1. Stabilisiertes Reagenz zum Nachweis von H202 oder H202 liefernden Systemen auf Basis von Methylbenzthiazolonhydrazon oder einem Derivat desselben als Farbbildner und eines damit zur oxidativen Kupplung unter Farbentwicklung be fähigten aromatischen Amins, enthaltend Puffer substanz und Peroxidase, g e k e n n z e i c h n e t durch einen Gehalt an wenig stens einer Substanz aus der Gruppe Alkaliferro zyanid, Chelatbildner und Alkaliazid als Stabili sator sowie gegebenenfalls einer Oxidase. 2. Reagenz nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass es Methyl benzthiazolonhydrazonsulfonat enthält. 3. Reagenz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es als aromatisches Amin ein m-Toluidin ent hält. 4. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es das Alkaliferrozyanid als Kaliumsalz ent hält. 5. Reagenz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet', dass es als Chelatbildner ein Aminpolyazetat ent hält. 6. Reagenz nach Anspruch 5, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass es pro Li ter gebrauchsfertige Lösung 1 bis 500 mg Kalium ferrozyanid, 1 bis 1000 mg Ethylendiamintetra azetat und 5 bis 500 mg Natriumazid enthält. 7. Reagenz nach Anspruch 6, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daS es pro Li ter gebrauchsfertige Lösung 10 bis 50 mg Kalium ferrozyanid, 100 bis 1000 mg Ethylendiamintetra azetat und 50 bis 500 mg Natriumazid enthält. 8. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es auf einem saugfähigen Trägermaterial im prägniert vorliegt. 9. Verfahren zum Nachweis von H202 oder H202 lie fernden Systemen, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass man der zu untersuchenden Lösung ein Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zusetzt und die gebildete Fär bung misst.

Inventors: KLOSE, SIGMAR, DR., SCHLUMBERGER, HELMUT
Applicants: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH
Application year: 1982
Main classification: C12Q1
IPC codes: C12N9, G01N33, C12Q1