CARRIER-FIXED PROTEASES AND THEIR USE IN BIOTECHNOLOGY

Abstract: 1. Process for the preparation of proteases fixed on a carrier of gel-forming proteins, characterised in that the proteases are mixed with a gel-forming protein, the mixture is treated with an organic solvent having an enzyme-precipitating activity and subsequently the particle suspension formed is reacted with one or more cross-linking agents.

Description: Die Erfindung betrifft auf neuartige Weise kovalent an ein Trägerprotein fixierte Proteasen, ihre Herstellung und ihre Anwendung in der 3iotechnologie. Proteasen haben erhebliche Bedeutung in der Getränkeindustrie, da bei vielen klaren Getränken (wie Wein, Bier und Fruchtsäfte) in der Warme oder auch beim Abkühlen Eiweisstrübungen auftreten können. Diesem Problem wird z.T. bis heute durch Bentonit-Behandlung begegnet. Hierdurch wird zwar die erforderliche Stabilität erreicht, Jedoch tritt gleichzeitig eine Reihe gravierender Nachteile auf. So wird durch die starke Adsorptionswirkung auch eine Reihe wertvoller Substanzen, wie Aroma-, Bukett- und/oder Farbstoffe entfernt, ferner können unerwUnschte Metallionen eingetragen werden, und drittens ergeben sich erhebliche Mengen an Trub, dessen Aufarbeitung einigen Aufwand erfordert. Es wurde daher bereits vorgeschlagen, die den W & me- bzw. Kältetrub bildenden Proteine durch Proteasen aufzulösen (5 .Z. für Lebensmitteluntersuchung und -forschung 134 (1967), S. 87-97). Jedoch ergeben sich auch bei dieser Methode Nachteile. Zunächst sind die Kosten für die Enzymanreicherung und -isolierung recht hoch, da die Enzyme nicht stabil sind und auch nicht rückgewonnen werden können. Ferner ist das Verbleiben von löslichen Enzymen im Getränk lebensmittelrechtlich bedenklich oder sogar unzulässig. Zur Lösung dieser Probleme bietet sich an, die verwendeten Enzyme unlöslich zu machen, indem man sie an wasserunlösliche Trägerstoffe fixiert. Dies erlaubt, die Enzyme zurückzugewinnen und mehrfach einzusetzen Methoden zur Enzymfixierung sind bereits mannigfach bekannt. Eine Ubersicht über die neuesten Ergebnisse auf diesem Gebiet gibt z.B. J.C. Johnson (Herausgeber) in XImmobilized Enzymes, Preparation and Engineering"; Noyes Data Corp., Park Ridge, N.J., USA (1979). Durch die Trägerfixierung der Enzyme können, neben den oben angegebenen, weitere Vorteile erreicht werden. Dies sind z.B. - kontinuierliche Prozessführung - erhöhte Stabilität - kleineres Reaktionsvolumen - keine Verunreinigung der Reaktionsansätze - keine Hitzefällung des Enzyms Zur Bindung eines Enzyms an eine unlösliche Trägersubstanz gibt es kein Standardverfahren. Das Ziel, die biologische Aktivität des Enzyms möglichst weitgehend zu erhalten, erfordert eine individuelle Anpassung von Trägersubstanz und Immobilisierungsmethode an das Enzym. Besonders beliebte (da einfach zu verarbeitende und kostengünstige) Trägersubstanzen für diesen Zweck sind gelbildende Proteine wie Gelatine oder frisches Eiklar (s. hierzu beispielsweise die DE-AS 22 46 002). Diese Trägersubstanzen eignen sich jedoch nicht für die Fixierung von Enzymen mit proteolytischer Aktivität, da sie von ihnen hydrolysiert werden. Es wurde daher bereits vorgeschlagen (s. DE-AS 26 36 206.1 -41), die gelbildenden Proteine durch chemische Härtung (z.B. mit Formaldehyd, Glutardialdehyd oder Diisocyanat) zu denaturieren, um sie dadurch unangreifbar für die auf ihnen fixierten Proteasen zu machen. Auf diese Weise gelingt beispielsweise die Trägerfixierung des Labenzyms oder auch von Pepsin (s. Biotechnology Letters 1 (1979) S. 225-230). Uberraschenderweise wurde nun gefunden, dass Proteasen auch dann an gelbildende Proteine fixiert werden können, wenn man eine aufwendige chemische Vorbehandlung der Proteine unterlässt. Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Immobilisierung von Proteasen an gelbildenden Proteinen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man die Protease mit einem gelbildenden Protein (z.3. Gelatine, Eiklar, Sojaprotein u.a., vorzugsweise Albumin) versetzt, das Gemisch mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel (Fällungsmittel) behandelt und anschliessend die entstandene Teilchensuspension mit bi- und/oder polyfunktionellen Vernetzungsmitteln umsetzt. Gegenstand der Erfindung sind ferner die so erhaltenen trägerfixierten Enzympräparate und ihre Verwendung zum Abbau von Proteinen. Das Gemisch aus dem proteolytischen Enzym und dem gelbildenden Protein kann durch Auflösen oder Suspendieren des Enzyms in einer wässrigen Lösung des gelbildenden Proteins hergestellt werden. Dabei wird die Temperatur vorzugsweise so eingestellt, dass das aktive Gemisch in flüssiger Form erhalten wird. Das Gemisch aus proteolytischem Enzym und gelbildendem Protein wird vorzugsweise so hergestellt, dass man zunächst das proteolytische Enzym (z.3. Pepsin, Papain etc.) in Wasser löst und es dann mit einer wässrigen Lösung des gelbildenden Proteins vermischt. Dieses Ge mini wird dann mit einem organischen Lösungsmittel, das enzymfallend wirkt und mit dem Enzym verträglich ist, versetzt. Beispiele dafür sind Aceton, äthanol, Isopropanol oder Butanol. Die durch das Fällungsmittel entstandene Teilchensuspension wird derart und solange mit bifunktionellen oder polyfunktionellen Vernetzungsmitteln reagieren gelassen bis eine möglichst vollständige Vernetzung des Gemisches aus dem proteolytischen Enzym und dem gelbildenden Protein erreicht ist. Es ist auch möglich, das teilchenförmige Gemisch vorher von der organischen Flüssigkeit abzutrennen und erst dann mit dem Vernetzungsmittel zu behandeln. Für die Vernetzungsreaktion kommen bifunktionelle und polyfunktionelle Vernetzungsmittel für Proteine in Frage. Vorzugsweise wird eine wässrige Lösung von Glutardialdehyd verwendet. Es ist auch möglich, das Kopplungsreagenz in einer der obengenannten enzymfällend wirkenden Flüssigkeiten zu lösen und in dieser Form dem wässrigen Gemisch aus proteolytischem Enzym und gelbildenden Protein zuzusetzen. Dieses Reaktionsgemisch aus proteolytischem Enzym, gelbildendem Protein, enzymfällender Flüssigkeit und dem Vernetzungsmittel wird einige Zeit, vorzugsweise 0,5 4 Stunden kräftig gerührt. Die Kopplungsreaktion wird üblicherweise bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach Beendigung der Bindungsreaktion wird das Präparat mehrfach, vorzugsweise mit Wasser, gewaschen. Das so erhaltene Produkt kann dann auf den gewünschten Wasser gehalt getrocknet werden (2.B. durch Sprühtrocknung oder Acetontrocknung). Die e nach der oben dargestellten Arbeitsweise herge- stellten Enzympródukte können in ansatzweise durchgeführten Verfahren zur Proteolyse von Eiweiss (Eiweiss- abbau) unter Abtrennung und erneuter Verwendung des Enzymproduktes oder in kontinuierlichen Verfahren in einem Enzymreaktor angewandt werden. Sie eignen sich besonders zur Behandlung proteinhaltiger Getränke (wie z*B. Wein, Bier und Fruchtsäfte), bei denen keine Enzyme im Endprodukt verbleiben sollen. Bei dem verwendeten proteolytischen Enzym handelt es sich vorzugweise um Pepsin. Die Bestimmung der Pepsin-Aktivität der löslichen sowie der immobilisierten Form, erfolgt nach der Methode von Anson (Rick, W & Fritsch, W.-P. in Bergmeyer (Herausgeber): Methoden der enzymatischen Analyse, 3. Auflage., Band 1, S. 1086-1090, Verlag Chemie, Weinheim, 1974). Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung: Beispiel 1 2 kg Pepsin wurden bei Zimmertemperatur in 10 1 dest. Wasser gelöst. Diese Enzymlösung wurde mit einer wässrigen Albuminlösung (200 g Albumin in 5 1 dest. Wasser) vermischt. Die so erhaltene Suspension wurde unter Rühren und bei einer Temperatur von 25 C in 24 1 Isopropanol (80 %) gegeben und anschliessend mit 1 1 Glutardialdehyd (25 zu versetzt. Dieses Reaktionsge misch wurde 2 Stunden bei 250C gerührt. Nach Ablauf dieser Zeit wurde das Reaktionsprodukt abzentrifugiert und griindlich mit 200 1 Wasser gewachen. Das gewaschene Produkt wurde über einen Laborsprühtrockner mit Zwei stoffdüse bei einer Lufteingangstemperatur von 155 C, einer Luftausgangstemperatur von 75 0C und einem Luft durchsatz von 420 Nm3/h getrocknet. Das verwendete Pepsin (20 kg) hatte eine Gesamt-Ausgangsaktivität von 6000 AE (Anson-Einheiten). Das trägerfixierte Trockenpräparat betrug 415 , und zeigte eine Gesamt Aktivität von 3800 AE, was einer Widergewinnung nach der Immobilisierung und Sprühtrocknung von 63,3 5' entspricht. Beispiel 2 20 g Pepsin aus Schweinemagen (5 AE/g) wurden mit 2 g Ei-Albumin in 150 ml dest. Wasser gelöst. Zu dieser Lösung wurden 200 ml eiskaltes Aceton hinzugerührt. Nach einigen Minuten wurde zu dieser Suspension 10 ml 25%iger Glutardialdehyd-Lösung zugesetzt und bei Zimmer temperatur gerührt oder geschüttelt. Nach einer Reaktionszeit von ca. 2 Stunden wurde das Reaktionsprodukt abfiltriert und gründlich mit dest. Wasser gewaschen. Das Filtrat wurde in eiskaltem Aceton suspendiert. Durch Filtration wurde das immobilisierte Enzymprodukt vom Aceton getrennt, das Filtrat anschliessend bei 450C im Vakuum-Trockenschrank getrocknet. Es resultierten 2,5 g trägerfixiertes Trockenpräparat mit einer Aktivität von 11 AE/g.

Claims: Patentansprüche 1. Verfahren zur Herstellung von auf gelbildenden Proteinen trägerfixierten Proteasen, dadurch ge kennzeichnet, dass man die Proteasen mit einem gel bildenden Protein versetzt, das Gemisch mit einem enzymfällend wirkenden organischen Lösungsmittel behandelt und anschliessend die entstandene Teilchen suspension mit einem oder mehreren Vernetzungsmitteln umsetzt. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als gelbildendes Protein Albumin einsetzt. 3. Verfahren nach einem der AnsprUche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Protease um Pepsin handelt. 4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Vernetzungsmittel Glutardialdehyd eingesetzt wird. 5. Trägerfixiertes Proteasepräparat, dadurch gekenn zeichnet, dass die Protease kovalent mittels eines Vernetzungsmittels an ein nicht gehärtetes gel bildendes Protein gebunden ist. 6. Proteasepräparat nach Anspruch 5, dadurch gekenn zeichnet, dass Pepsin kovalent mittels Glutardial dehyd an ein gelbildendes Protein gebunden ist 7. Proteasepräparat nach Anspruch 6, dadurch gekenn zeichnet, dass das gelbildende Protein Albumin ist. 8. Verwendung eines Proteasepräparats nach einem der Ansprüche 5 bis 7 in biotechnologischen Verfahren. 9. verwendung eines Proteasepräparats nach einem der Ansprüche 5 bis 7 zur Klärung von Getränken. 10. Verwendung eines Proteasepräparats nach Anspruch 7 zur Beseitigung des Eiweisstrubs in Wein oder Bier.

Inventors: BURGER, ERICH, DR., HARTMEIER, WINFRIED, PROF. DR., Bürger, Erich, Dr.
Applicants: BOEHRINGER INGELHEIM KG
Application year: 1982
Main classification: C12N11
IPC codes: C12N11, A23L2, C12H1