CARRIER TRIPEPTIDES WITH ANTIFUNGAL ACTIVITY

Abstract: 1. Use of the tripeptides A) L-arginyl-[DL-(p-fluorophenylalanyl)]-L-phenylalanine, B) L-arginyl-[DL-(m-fluorotyrosyl)]-L-phenylalanine, C) N'-acetyl-L-arginyl-[DL-(p-fluorophenylalanyl)]-L- phenylalanine and D) L-arginyl-[DL-(p-fluorophenylalanyl)]-L- phenylalanine amide as antifungal agent, in particular with effectiveness against candida albicans.

Description: Es ist bekannt, dass Oligopeptide physiologische Wirksamkeit besitzen. So weisen das Oxytocin und Vasopressin als Hinterlappenhormone neun Aminosäurereste auf. Das Phalloidin als Giftstoff des Knollenblätterpilzes weist sieben Aminosäurereste auf. Es ist aber auch bekannt, dass relativ niedermolekulare Oligopeptide z.B. bei der Zellatmung wichtige physiologische Funktionen ausüben. So bewirkt das Tripeptid Glutathion, das das L-Glutaminyl-L-cysteinyl-L-glycin ist, die Funktion eines intermediären Wasserstoffüberträgers in der Atxnungskette im Zusammenhang mit der ATP-Bildung auf, und zwar aufgrund der reversiblen Oxidation der HS Gruppe des Cysteinbausteins. Es gibt zahlreiche biochemische Antagonisten oder Antimetaboliten, deren Wirkungsmechanismus teilweise noch ungeklärt ist. Ein bekanntes einfaches Beispiel stellt die vor etwa 50 Jahren eingeführte Sulfonamidtherapie dar, die das erste Beispiel in der Medizin ist für das Anwenden eines Antagonisten, der ein Strukturanaloges der p-Aminobenzoesäure ist, die ufer die bakterielle Folsäurebiosynthese erforderlich ist, so dass die Mikroorganismen aufgrund des Einbaues einer falschen Verbindung zum Absterben gebracht werden. Es ist weiterhin bekannt geworden, dass es auf dem Gebiet der niederen Oligopeptide Antimetaboliten geben kann. So wurde festgestellt, dass das durch Keratinophyton terreum gebildete L-Arginyl-D-allothreonyl-L-phenylalanin eine antifungische Wirksamkeit besitzt. (Synthese, biologische Aktivität und medizinische Bedeutung von Peptiden der Sequenz L-Arg-X-L-phe. Universität Tübingen, Dissertation 1975). Im Hinblick auf die ungewöhnliche D-Konfiguration des mittelständigen Aminosäurerestes sind Tripeptide synthetisiert worden, die in der Mittelstellung N-a-Methyl oder D-Aminosäurereste aufweisen. Es wurde hierbei gefunden, dass von den untersuchten Tripeptiden L-Arginyl-D-phenylalanyl-L-phenylalanin und L-Arginyl-N-a-methyl-L-phenyl alanyl-L-phenylalanin bezüglich ihrer biologischen Wirksamkeiten der oben genannten natürlich vorkommenden Verbindung am nächsten kommen. Diese Peptide zeigen jedoch gegenüber Problemkeimen wie insbesondere candida albicans keinerlei oder nur eine sehr schwache wachstumshemmende Aktivität. Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, durch weitere molekulare Veränderungen des mittelständigen Bausteins, im nachfolgenden X genannt, der eingangs genannten Verbindung L-Argenyl-X-L-phenylalanin, Verbindungen herzustellen, die bestimmte zweckmässige physiologische Eigenschaften aufweisen. Diese Aufgabe wird nun in erfindungsgemässer Weise durch die Struktur L-Arg-X-L-phe gelöst, bei der X eine atypische Aminosäure mit einem gegebenenfalls substituierten Phenylrest ist. Es wurde überraschenderweise gefunden, dass die Verbindungen 1 und 2 nicht nur eine- vergleichbare biologische Aktivität wie die eingangs genannte, natürlich vorkommende Verbindung L-Arg-D-allothre-L-phe besitzen, sondern darüber hinaus auch sehr gute Wirksamkeit gegen insbesondere candida albicans aufweisen. Die Verbindungen 5, 6, 7 und 8 zeigen eine sehr gute Wirksamkeit gegenüber candida albicans, candida tropicalis, aspergillus fumj,:gatus und aspergillus flavus. Darüber hinaus weist die Verbindung 5 erstmals Wirksamkeit auf gegenüber candida tropicalis und in dieser Serie insbesondere dem Pilz trichophyton metagrophytes. Es sind die folgenden Tripeptide der Struktur L-Arg-X-L-phe hergestellt und auf ihre biologische Aktivität untersucht worden. 1. L-Arginyl-p-F-DL-phenylalanyl-L-phenylalanin 2. L-Arginyl-m-F-DL-tyrosyl-L-phenylalanin 3. (CH3CO-)-L-arginyl-p-F-DL-phenylalanyl-L-phenylalanin 4. L-Arginyl-p-F-DL-phenylalanyl-L-phenylalanin-(NH2) 5. ta-Arginyl-p-J-phenylalanyl-L-phenylalanin 6. L-Arginyl-p-methoxyphenylalanyl-L-phenylalanin 7. L-Arginyl-p-nitrophenylalanyl-L-phenylalanin 8. L-Arginyl-p-Br-phenylalanyl-L-phenylalanin Der Erfindungsgegensatnd wird nachfolgend beispielsweise erläutert. Beispiel 1 Die Herstellung der Verbindungen erfolgte aus den drei Komponenten vermittels des Merrifield Verfahrens (Feststoffphase-Verfahren). Hierbei erfolgt zunächst eine Chlormethylierung eines Copolymeren aus 98% Styrol und 2% Divinylbenzol, sodann Anesterung der N-t-BOC-Aminosäure an das Trägerharz in Form des genannten Copolymer, Anwenden von DCCI als Xupplungsreagens und sodann Ablösen des fertigen, geschützten Peptids als freie Säure mit Bromwasserstoffsäure und Trifluoressigsäure oder Eisessig oder mit Bor. Die Acetylierung des N-terminalen L-Argininrestes mit Acetanhydrid/Pyridin wird vermittels des Verfahrens von Merrifield ausgeführt. Die a-Carboxamidbildung an dem Cterminalen L-Phenylalanin wird vermittels eines Verfahrens durchgeführt, bei dem ein Benzhydrylamin-Harz angewandt wird. Nach der Fluorwasserstoffabspaltung werden die Peptide vermittels Säulenchromatographie mit Silikagel gereinigt. Die Peptide werden bei 40C mit n-Butanol:H20: Essigsäure in einem Verhältnis von 4:2:1 eluiert. Die bei den antifungischen Untersuchungen angewandten Tripeptide erwiesen sich als homogen vermittels Dünnschichtchromatographie an Silikagel unter Anwenden von drei Lösungsmittelsystemen. Die relativen Aminosäure-Zusammensetzungen werden unter Anwenden eines Beckman 121 Aminosäureanalysators be stätigt. Beispiel 2 Die antifungischen Wirksamkeiten werden gegenüber Testisolaten von Paecilomyces varioti und Mucor miehei, candida albicans, candida tropicales, candida pseudotropicales, candida krusei, aspergillus fumatus, aspergillus niger und weiteren auf einem komplexen Medium und Malzextrakt-Agar untersucht. In der beigefügten Tabelle I sind die kleinsten inhibierenden Konzentrationen der beiden beispielsweisen erfindungsgemässen Tripeptide 1 und 2 denjenigen der freien Antimetaboliten gegenübergestellt anhand des Beispiels candida albicans. Die Untersuchungen wurden in einem yeast nitrogen base Medium mit einem Glukosegehalt von 2% und einem pH-Wert von 7,2 durchgefUhrh. Die Zellzahl zu Versuchsbeginn beläuft sich auf 10 /ml. Die Tests werden in Mikrotiterschalen durchgeführt und es wird 24 Stunden bei 300C inkubiert. Der N-terminal acetylierte Abkömmling des Peptids 1, die Verbindung 3 und der C-terminal amidierte Abkömmling des Peptids 1, die Verbindung 4, besitzen eine auf etwa 50% reduzierte Aktivität des Peptids 1, zeichnen sich aber dadurch aus, dass sie durch Carboxypeptidasen schwerer spaltbar sind. Keines der Peptide zeigt antibakterielle Wirksamkeiten gegenüber Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae und BaciLlus subtilis. Auch hier ist es wiederum von Interesse festzustellen, dass die Aminosäure-Antagonisten p-F-DL-Phenylalanin und B-2-DL-Thienylalanin, die gegenüber einigen Bakterien Wirksamkeit zeigen, dieselbe dann verlieren, wenn sie in Tripeptiden der angegebenen Formeln vorliegen. Tabelle I Minimale Hemmkonzentration bei candida albicans a) Anzahl der inhibierenden Isolate b) minimale inhibierende Konzentration = g/ml (mMole/l) L-Arg-p-F-DL-Phe-L-Phe p-F-DL-Phe L-Arg-m-F-DL-Tyr-L-Phe m-F-DL-Tyr Candida a) 8 a) 0 a) 2 a) 0 albicans b) < 32 (6,5x10-5) b) < 250(1,4x10-3) b) < 125(2,5x10-4) b) < 250(1,3x10-3) 10) a)2 b) < 125(2,6x10-4) Die Tripeptide 5, 6, 7 und 8 wurden gegenüber candida albicans, candida tropicalis, aspergillus fumigatus und aspergillus flavus getestet bezüglich der minimalen inhibierenden Konzentration MIC50 und MIC100 und dieselbe mit dem freien Metaboliten verglichen. Die Versuchsergebnisse sind in den nachfolgenden Tabellen wiedergegeben, die zum einen die minimal inhibierenden Konzentrationen für 50 und 100 für die erfindungsgemässen Verbindungen, und zum anderen fär den freien Metaboliten wiedergeben. Tabelle II Verbin- candida albi- candida tro- aspergillus aspergillus dung cans picalis fumigatus flavus 100 MIC50 MIC100 MIC50 MIC100 MIC50 MIC100 MIC50 MIC MIC 0 MIC100 MIC 5 MIC MIC 5 4 8 4 16 2 4 2 32 6 32 64 4 16 32 32 16 64 7 32 64 32 64 64 64 32 64 8 16 32 8 16 4 16 8 16 Tabelle III Verbin- candida albi- candida tro- aspergillus aspergillus dung cans picalis fumigatus flavus MIC50 MIC100 MIC50 MIC100 MIC50 MIC100 MIC50 MIC100 p-J-Phe- 64 > 128 > 128 16 32 16 64 nylalanin p-Methoxyphenylalanin > 128 > 128 > 128 > 128 p-Nitrophenylalanin > 128 > 128 64 > 128 128 > 128 p-Br-phenylalanin > 128 > 128 16 128 32 > 128 Die tabellarisch zusammengefassten Versuchsergebnisse zeigen, dass diese erfindungsgemässen Verbindungen eine hohe antifungische Wirksamkeit gegenüber einer Mehrzahl an Pilzen aufweisen, die von grosser klinischer Bedeutung sind. Die Tabelle III zeigt die relative Unwirksamkeit der freien Metaboliten, die als atypische Aminosäurekomponente in den Tripeptiden aufgrund eines bisher noch nicht vollständig geklärten Mechanismus durch die beiden herkömmlichen, endständigen Aminosäuren in dem zu bekämpfenden Mikroorganismus wirksam werden. Das Tripeptid 5 ist erstmals wirksam gegen candida tropicalis. Mit der Synthese diser neuen Verbindungen ist es zum ersten Mal gelungen, in dieser Serie den Pilz trichophyton metagrophytes zu hemmen. Es werden jeweils 1±0mg Tripeptid bzw. freier Metabolit pro Milliliter physiologische Natriumchloridlösung angewandt und in Filterrondellen (Firma Oxoid) eingeführt und sodann getrocknet. Es erfolgt eine Überführung in mit Agar-Nährmedium beschickte Petrischalen. Die Inkubierung wird 36 bis 72 Stunden bei 37 0C ausgeführt. Die Versuchsergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV angegeben, wobei TM - trichophyton metagrophytes und i-= inkomplett (keine vollständige Wirksamkeit) bedeuten. Tabelle IV Verbindung Pilz Hemmzonendurchmesser freier Metabolit 5 TM 33 0 6 TM 20 0 7 TM 19i i 8 TM 28 16 Die erfindungsgemässen Verbindungen zeichnen sich gegenüber den vorbekannten Verbindungen insbesondere dadurch aus, dass ein breiterer Wirkungsbereich gegenüber pathogenen Pilzen gegeben ist. Während p-F-DL-Phenylalanin gegenüber Candida albicans nicht wirksam ist, zeigt sich eine ausgeprägte Wirksamkeit wenn diese Verbindung als X in dem eingangs genannten Tripeptid vorliegt. So werden alle überprüften Candida albicans Isolate durch weniger als 128 ug/ml des Peptids 1 inhibiert, während der freie Aminosäureantagonist keine Inhibierung bei einer Konzentration bis zu 256 pg/ml zeigt. Auf der molaren Grundlage weist dieses Tripeptid somit eine mehr als 20-fach grössere Wirksamkeit gegenüber 80% der überprüften Isolate auf. Candida krusei, es werden 10 Isolate überprüft, und Cryptococcus neoformans, es werden 4 Isolate überprüft, werden durch keine der erfindungsgemässen Verbindungen inhibiert.

Claims: Carrier Tripeptid mit antifungischer Wirksamkeit Patentansprüche 1. Carrier-Tripeptid mit antifungischer Wirksamkeit, g e k e n n z e i c h n e t durch die Struktur L-Arg-X-L-phe, bei der X eine atypische Aminosäure mit einem gegebenenfalls substituierten Phenylrest ist. 2. Carrier-Tripeptid nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , dass e6 L-Arginyl-p-F-DL-phenylalanyl-Lphenylalanin, L-Arginyl-m-F-DL-tyrosyl-L-phenylalanin, (Ca3CD-)-L-Arginyl-p-F-DL-phenylalanyl-L-phenylalanin, L-Arginyl-p-F-DL-phenylalanyl-L-phenylalanin-(NH2), L-Arginylp-J-phenylalanyl-L-phenylalanin, L-Arginyl-p-methoxyphenyl- alanyl-L-phenylalanin, L-Arginyl-p-nitrophenylalanyl-L-phenylalanin, L-Arginyl-p-Br-phenylalanyl-L-phenylalanin ist. 3. Antifungisches Mittel zur systemischen oder lokalen Behandlung von insbesondere durch candida albicans bedingte Pilzerkrankung, g e k e n n z e i ch n e t durch einen Gehalt der Carrier-Peptide nach Anspruch 1.

Inventors: ECHNER, HARTMUT, DIPL. CHEM., MEYER-GLAUNER, WILHELM, DR.MED.
Applicants: HELOPHARM W. PETRIK & CO.KG.
Application year: 1982
Main classification: C07K5
IPC codes: C07K5