TEST SYSTEM AND PROCESS FOR THE DETECTION OF COMPONENTS OF LIQUIDS

Abstract: 1. A test system for estimating the constituents of liquids using compressible matrices impregnated with reagents, characterised in that it contains at least one impregnated compressible matrix in a reaction vessel and a device by means of which, after absorbing the liquid to be investigated, the matrix is compressed so as to release the reaction product.

Description: Testsystem und Verfahren zur Bestimmung von Inhaltsstoffen von Flüssigkeiten Die Erfindung betrifft ein Testsystem und Verfahren zur Bestimmung von Inhaltsstoffen von Flüssigkeiten, wobei das Testsystem im wesentlichen aus mindestens einer, in einem Reaktionsgefäss angeordneten preRfahigen Matrix besteht Die Bestimmung von Inhaltsstoffen komplexer Systeme, insbesondere von biologischen Flüssigkeiten, erfordert eine genau festgelegte Versuchsdurchführung, wobei die Probe mit der zu bestimmenden Substanz verschiedene Reaktionsprozesse durchläuft. Dabei sind je nach der verwendeten Methode und der Anzahl der Proben Zugabe und Zeitpunkt der zu mischenden Reagenzien verschieden. Ein nach Ablauf der Reaktion auszuwertendes Messsignal, das Sür die Methode und die zu bestimmende Substanz charakteristisch ist, führt schliesslich zur Konzentrationsermittlung der ge suchten Substanz. Entsprechend der Komplexität solcher Prozesse sind bisher eine Reihe unterschiedlicher Ver fahren erprobt worden, die ein Optimum an Zuverlässig keit, Einfachheit und Wirtschaftlichkeit erbringen sollen. Vor allem in der klinischen Chemie wurden als Folge der zum Teil sehr hohen Analysenzahlen Methoden entwickelt, die die Durchführung vieler Bestimmungen auE möglichst einfache Weise und in kurzer Zeit ermöglichen. Einer seits wird dies durch-den Einsatz mechanisierter Analysen systeme, andererseits durch die Bereitstellung der not- wendigen Reagenzien und Reaktionsgemische in weitgehend vorbereiteter Form erreicht. Dabei kommen vor allem Ana lysensysteme zum Einsatz, bei denen die Probe mit Re aktionslösungen aus Vorratsbehältern manuell oder voll mechanisiertgemischt wird. Die Bereitstellung der Lösungen, die eventuell erforderliche Vorbereitung der Probe sowie die Uberwachung und Reinigung des Vertei lungs- und Mischungssystems bedingte jedoch eine Viel zahl von Arbeitsschritten und möglichen Fehlerquellen. Insbesondere die relativ geringe Baltbarkent einiger Analysensubstanz-en in Lösung erfordert sehr oft einen Austausch nicht aufgebrauchter Lösungen. Zudem verlangen die Testbedingungen stets eine exakt reproduzierbare Zugabe verschiedener Volumina unterschiedlicher Lösung, was bei automatisierten Systemen ein einfaches Auswechseln von Analysenverfahren unmöglich macht Die beschriebenen Schwierigkeiten führten zur Entwicklung von verschiedenen Testsystemen. So ist zum Beispiel be kann, die Reagenzien in fester Form entweder als Impräg- nierte Trägermaterialien, wie getränkte Filterpapiere, oder als Lyophilisate in entsprechenden Reaktionsgefässen mit der zu untersuchenden Probe in Kontakt zu bringen; bei derartigen Systemen ist nur noch ein Zupipettieren von Lösungsmittel und Untersuchungsprobe erforderlich. Ein Anbringen verschiedener lyophilisierter Reagenzien an unterschiedlichen Stellen erlaubt dabei die Durchführung hintereinandergeschalteter Reaktionen. Diese Systeme stellen für die Testdurchführung eine Vereinfachung dar, bieten aber bei der Herstellung der entsprechenden Reaktionsgefässe sehr grosse Probleme. Vor allem bleibt diesen Ausfüh- rungsformen der für alle wässrigen Systeme gemeinsame Nachteil, keine für die Analyse von Körperflüssigkeiten erforderlichen Auf- und Abtrennungen damit durchführen zu können und alle im Verlauf einer Analyse zugegebenen Reagenzien mitführen zu müssen. Bei den sogenannten trockenen Analysenverfahren entfällt dagegen von vornherein ein Teil dieser Probleme. Hierbei wird die zu untersuchende Probe auf einen meist saugfähigen Träger aufgebracht, der im einfachsten Fall in einer einzigen Matrixschicht alle notwendigen Reagenzien in optimaler Konzentration enthält; dadurch entfallen alle sonst üblichen Pipettierschritte. Ausserdem stellt die Lagerung solcher trockenen Systeme in bezug auf die Haltbarkeit kein schwerwiegendes Problem dar. Als Nachteil dieser einstufigen Systeme erweist sich jedoch, wie auch bei den wässrigen Verfahren, die fehlende Vor- und Aufbereitungsmöglichkeit sowie die mangelnde Möglichkeit, störende Substanzen auszuschalten. Aber auch bei Testsystemen mit mehrschichtig angeordneten, trockenen Materialien, die zum Beispiel Schichten für die Abtrennung von Störsubstanzen, Konzentrierutgszonen sowie verschiedene Reaktions- und Sperrbereiche enthalten können, ist die Aufnahme und der Weitertransport der zu untersuchenden Flüssigkeit sowie der Ablauf der einzelnen Reaktionsschritte allein von der Diffusion und Kapillarwirkung abhängig und dadurch praktisch weder kontrollierbar noch steuerbar. So ist es nicht möglich, die Reaktion an einer bestimmten Stelle zu stoppen oder die Vers-eil -uer in einer Reaktionszone zu beeinflussen. Aus dem US-Patent 3,917,453 ist eine Testvorrichtung be kannt, die ein absorbierendes Material zur Aufnahme der Probelösung und eine ebenfalls aus einem absorbierenden Material bestehende pressfähige Schicht enthält, die der Dosierung und dem Transport der zu untersuchenden Flüssigkeit dient. Diese Schicht ist zwischen zwei Abdeckschichten angeordnet,-die die notwendigen Reagenzien enthalten und mit der zu bestimmenden Substanz unter Bildung eines Farbstoffs reagieren kann, der kolori metrisch ausgewertet wird. Diese Vorrichtung ist jedoch mit einer Reihe von Nachteilen behaftet: Quantitative Bestimmungen, eine photometrische Auswertung und eine Automatisierung sind nicht möglich; die Durchführung von Reaktionen, die mehrere hintereinander ablaufende Reaktionsstufen erfordern, und eventuell erforderliche Abtrennungen unerwünschter Substanzen zwischen zwei Reaktionszonen ist mit dieser Vorrichtung ebenfalls nicht möglich. Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde Vorrichtungen und Verfahren zur Bestimmung von Inhaltsstoffen von Körperflüssigkeiten zur Verfugung zu stellen, mit denen die geschilderten Nachteile vermieden werden können. Erfindungsgemäss wurde diese Aufgabe durch ein Testsystem gelöst, das aus einem Reaktionsgefäss besteht, das mindestens eine pressfähige Matrix enthält, womit ein einfacher, von der Diffusion unabhängiger Flussigkeitstransport durchgeführt werden kann, der sowohl manuell als auch automatisch steuerbar ist. Gegenstand der Erfindung ist ein Testsystem zur Bestimmung von Inhaltsstoffen von Flüssigkeiten unter Verwendung pressfähiger, mit Reagenzien imprägnierter Matrices, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eine imprägnierte Matrix in einem vorzugsweise zylindrischen Reaktionsgefäss und eine Vorrichtung enthält, durch die die Matrix nach Aufnahme der zu untersuchenden Flüssigkeit unter Abgabe des Reaktionsproduktes komprimiert wird. Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zur Bestimmung von Inhaltsstoffen von Flüssigkeiten unter Verwendung pressfähiger, mit Reagenzien imprägnierter Matrices, die dadurch gekennzeichnet sind, dass man die zu untersuchende Flüssigkeit auf eine in einem vorzugsweise zylindrischen Reaktionsgefäss angeordnete Matrix aufbringt und das Reaktionsprodukt durch Romprimieren der Matrix aus dieser entfernt und entweder direkt einer Auswertung zuführt oder erst nach einer oder mehreren weiteren Passagen durch imprägnierte Matrices. Überraschenderweise hat sich gezeigt,* dass das erfindungs gemässe Testsystem die Anwendung und Wirksamkeit der Analysenmethoden wie auch der Reagenzien in gleicher Weise ermöglicht wie ein vergleichbares System in wässriger Lösung, darüber hinaus jedoch zusätzliche Verfahren der Probenvorbereitung, wie Zentrifugationen, Filtrationen oder chromatographische Trennungen, in sich vereinigt oder sie ersetzt. Das Testsystem für die Analyse von Flüssigkeiten kann in einzelne Bereiche aufgegliedert werden, in denen voneinander getrennt alle für die Analyse notwendigen Trennungs-, Reaktions- und Bestimmungsreaktionen ablaufen. Dies schliesst zum Beispiel bei der Analyse von Körperflüssigkeiten neben dem für die eigentliche Bestimmung einer Substanz erforderlichen Reaktionsbereich und ggf. einen Anzeigebereich auch Vorbereitungsbereiche, etwa zur Enteiweissung oder Abtrennung von Störsubstanzen, ein. Dabei sind Art, Anzahl und Anordnung der einzelnen Bereiche frei kombinierbar. So können zum Beispiel bei speziellen Bestimmungen gesonderte Vorbereitungsbereiche entfallen, oder es können an einen gemeinsamen Vorbereitungsbereich mehrere verschiedene Reaktionsbereiche gekoppelt werden. Bei dem erfindungsgemässen Testsystem sind alle zur Reaktion erforderlichen Reagenzien von Anfang an gleichmässig in der gesamten Matrix lyophilisiert, immobilisiert oder in anderer Weise eingeschlossen enthalten Ein Auftragen der zu untersuchenden Flüssigkeit ftihrt zu einer direkten Durchmischung der Reaktionspartner über den gesamten Matrixbereich. Die einzelnen Reaktionsbereiche sind innerhalb des Reaktionssystems klar getrennt, das heisst, es erfolgt keine vorzeitige Diffusion oder Vermischung. Darüber hinaus bietet die erfindungsgemässe Vorrichtung eine Reihe weiterer Vorteile gegenüber dem Stand der Technik. So kann zum Beispiel eine Verbesserung der Durch mischung und eine Erhöhung der Reaktionsgeschwlndigkeit durch zusätzliche mechanische Manipulationen, wie Somprimieren der Matrixschicht während der Reaktion, erreicht werden; das Testsystem erlaubt die Verwendungverschiedener oder unterschiedlich vorbereiteter Matrices für die einzelnen Testbereiche; die Auswertung ist nicht nur visuell, sondern auch photometrisch möglich; die Durchführung kann manuell und mechanisiert erfolgen; die Verwendung der Matrix ermöglicht eine genaue Do- sierung und leichte Handhabung von Substanzen und Flüssigkeiten im Testsystem. Die erfindungsgemässe- Vorrichtung besitzt damit die bei den beschriebenen mehrschichtigen trockenen Verfahren erwähnten Vorteile (keine instabilen Reagenzlösungen, keine Pipettierschritte, mehrere Testbereiche), doch ist darüber hinaus der Gesamtablauf der Reaktion nicht diffusionsabhängig und daher, wie bei den entsprechenden wässrigen Systemen, beeinflussbar und beliebig unterbrechbar. Ein mögliches Baukastenprinzip erlaubt ein leichtes Austauschen von Teilbereichen und Gesamttestsystemen. Grundlage des Testsystems ist eine Matrix aus einem flexiblen, elastischen, saugfähigen Material, die als Träger für Reagenz und Probe sowie als Reaktionsraum dient, als Trennmedium fungiert und es gestattet, Lösungen möglichst vollständig, jedenfalls aber reproduzierbar, reversibel freizugeben. Diese Matrix ist in der Lage, ein bestimmtes Volumen einer Probeflüssigkeit vollständig und gleichmässig verteilt in sich aufzunehmen und zu speichern, um es z. B. bei einem angelegten geringen Über- oder Unterdruck bzw. einem entsprechenden mechanischen Druck möglichst vollständig abzugeben; dieser Vorgang ist beliebig wiederholbar. Die Matrix muss darüber hinaus eine genügende mechanische und chemische Stabilität besitzen. Unter flexibel und elastisch soll in diesem Zusammenhang eine bei gleichbleibenden äusseren Bedingungen konstante Raumund Formausfüllung der Matrix verstanden werden, ohne dass hierzu ein Stützgefäss erforderlich ist; sie soll durch Anwendung von Druck reversibel verändert werden können. D"ie Matrix kann aus einem Stück, aus mehreren Segmenten oder aus einer Vielzahl freier oder nachträglich miteinander, zum Beispiel durch Verkleben oder Vernetzen, verbundener Teile bestehen, die alle oder zum überwiegenden Teil den entsprechenden Anforderungen genügen. Geeignete Matrixmaterialien sind natürliche und synthetische schwamm- und schaumartige, poröse Stoffe, zum Beispiel offenzellige Schaumstoffe und Verbundschaumstoffe verschiedenen Ursprungs sowie entsprechend elastisch gemachte Mikrokapseln, Granulate oder andere Formkörper aus saugfähigen Materialien. Vorzugs weise zählen hierzu s offenzellige Polynrethanschäume, insbesondere Polyester- und Kaltschäume. Darüber hinaus sind aber, auch spezielle Schaumstoffe als Matrix verwendbar, wie. SH-Gruppen enthaltende Schaumstoffe bei der Verwendung von Enzymen, die SH-Cruppen benötigen, oder auch transparente Polymere für visuelle Auswertungen. Die Stanchhärte dieser Materialien sollte im Bereich von et:ça 2 bis 10 k?a liegen, wobei solche mit einer Stauch härte unter 2 kPa schlechte mechanische Eigenschaften zeigen, solche über 10 kPa erfordern einen zu grossen Druck bei der Flüssigkeitsabgabe. Das Raumgewicht hat keinen wesentlichen Einfluss auf das verwendbare Material. Die im Handel erhaltlichen Schaumstoffe weisen zum Teil eine starke Enzymhemmung auf; bei einigen kann es während der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens zu starken Trubengen kommen. Die Hemmungen lassen sich jedoch in der Regel vollständig durch den Zusatz von Komplexbildnern eliminieren. Darüber hinaus können weitere Verbesserungen durch entsprechende Vorbehandlung erhalten werden. Fur die kinetische Bestimmung von Enzymen in Flüssigkeiten können sich dagegen enzymhemmende Matrices als besonders vorteilhaft erweisen. So ist es möglich, die Matrix, die die erforderlichen Reagenzien enthält, mit der zu untersuchenden Flüssigkeit zu tränken, wobei die eigentliche Bestimmungsreaktion nicht oder nur langsam abläuft. Beim Überführen der Gesamtlösung aus der Matrix in den Testbereich bleiben die unerwünschten Hemmstoffe zurück, und die kinetische Bestimmung ist bei relativ geringer Anfangsextinktion möglich. Das Einbringen der Reagenzien in die Matrix erfolgt in der Regel durch Lyophilisieren der mit Reagenzlösung getränkten Schaumstoffsegmente. Dies hat neben einer grösseren Stabilität der aufgetragenen Substanzen auch den Vorteil, dass nur eine geringe Menge an Reagenzien erforderlich ist. So wurde überraschenderweise gefunden, dass etwa bei einer Abtrennung von Protein aus einer Untersuchungsprobe mit Hilfe eines Koagulierungsmittels, wie Trichloressigsäure, eine bis zu zehnfach geringere Menge an Koagulierungsmittel erforderlich ist als bei den üblichen Fällungsmethoden. Damit wird durch Vermeidung der sonst durch die notwen dige Neutralisation bedingten hohen Salzbeladung ein Hintereinanderschalten von verschiedenen Testbereichen nach der Erfindung begunstigt. Im allgemeinen werden alle für die Funktion des betreffenden Bereiches erforderlichen Reagenzien, getrennt für jeden Bereich, auf die Matrix aufgegeben. In speziellen Fällen, zum Beispiel bei Unverträglichkeit von Reagenzien oder gleichzeitigem Ablauf mehrerer Reaktionen mit verschiedenen Reagenzien, kann es auch zweckmässig sein, die erforderlichen Reagenzien getrennt voneinander aufzugeben. Dies geschieht vorzugsweise durch Zusammensetzen der Gesamtmatrix in diesem Bereich aus einzelnen Matrixsegmenten, die jeweils verschiedene Substanzen enthalten. Die Matrixsegmente können in Form und Grösse beliebig gestaltet sein, sie können zum Beispiel aus Kreissegmenten, Scheiben oder Kugeln bestehen, die voneinander unab hangig sind, oder aber vor bzw. nach Einbringen in das Reaktionsgefäss miteinander durch geeignete Mittel wie Verleimen oder mechanische Befestigung verbunden werden. In bestimmten Fällen kann es erforderlich sein, dass zwar eine vollstandige Ubertragung der Probelösung von einem Bereich zum nächsten gewährleistet sein muss, aber die im nächsten Bereich störenden Reagenzien nicht mitübertragen werden sollen. Dies erfordert die Zwischenschaltung einer entsprechend präparierten Matrix bzw eine Immobilisierung der Reagenzien, die zum Beispiel adsorptiv, durch Ein- kapselung oder durch chemische Methoden erfolgen kann Auf diese weise ist es möglich, mehrere hintereinandergeschaltete Bereiche mit sehr unterschiedlichen Reaktionsbedingungen, zum Beispiel unterschiedlichen pH-Werten oder mit sich gegenseitig störenden Reagenzien, zu kop peIn. Auch in Fällen, in denen ein Auftragen durch Tränken und Lyophilisieren nicht möglich ist, können die Substanzen in flüssiger Form, zum Beispiel durch Einschluss in der Matrix, bereitgehalten werden. Die verschiedensten Möglichkeiten der Immobilisierung von Stoffen an polymere Trägermaterialien durch chemische Methoden sind aus der Literatur bekannt Erwähnt seien zum Beispiel die Bindung an Träger mit funktionellen Gruppen oder die Vernetzung mit Glutardialdehyd, Acrylamid, usw. Auch Immobilisierungen von niedermolekularen Substanzen an Polyurethanschäumen, insbesondere an sogenannten Kaltschäumen, sind durch eine entsprechend adaptierte Variation des so genannten Triazin-Verfahrens möglich (Biochem.J. lO9, 137 (1968)). Dieses Verfahren gestattet es, eine Vielzahl von Verbindungen mit OH-, SE oder NE2-Gruppen an die Schaumstoffe mit einer Bin dungsausbeute von ca. 1 pmol/ml Schaumstoff zu binden. Neben den Reagenzien selbst ist es selbstverständlich auch möglich, kurz- und langkettige, zum Beispiel an Polymere wie Stärke oder Dextrane gebundene Derivate zu binden oder in dem Schaumstoff physikalisch oder durch Einschluss zurückzuhalten. Das Reaktionsgefäss hat zweckmässigerweise die Form eines Zylinders mit konischem Auslauf; vorzugsweise werden Pipetten, Injektionsspritzen oder sogenannte Einwegspritzen mit einem Durchmesser von 5 bis 30 mm und einer Länge von 10 bis 150 mm verwendet. Es können aber auch küvettenartige Reaktionsgefässe verwendet werden. Diese Reaktionsgefässe können aus durchsichtigem oder zum Teil durchsichtigem Kunststoff oder festen Materialien wie Glas oder Metall bestehen. Bevorzugt sind flexible durchsichtige Kunststoffe. Nach einer besonderen Ausführungsform enthält das Testsystem nicht nur eine Matrix, sondern mehrere übereinander angeordnete Matrices, die durch flüssigkeitsdurchlässige Anordnungen wie Stege, durchlöcherte Zwischenscheiben oder Verjüngungen des Reaktionsgefässes vonein ander getrennt sind. Durch die Form dieser Anordnungen und die Grösse der Löcher in den Zwischenscheiben lassen sich die Fliess- und Diffusionsprozesse bei der Überfüh- rung der zu analysierenden Flüssigkeit zwischen den einzelnen Matrixbereichen beeinflussen. Die Zwischenscheiben können so in das Reaktionsgefäss eingepasst werden, dass sie bei Anwendung eines bestimmten Druckes verschiebbar sind. Falls das Reaktionsgefäss zwischen den einzelnen Matrices Verjüngungen besitzt, können diese durch seitlich von aussen angelegten Druck verschlossen werden; wird dabei die Matrix ebenfalls zusammengepresst, so tritt die Flüssig keit aus dem Schaumstoff aus, um beim Entspannen wieder vollständig vom Schaumstoff aufgenommen zu werden. Der Pressvorgang ist auch durch Herabdrücken eines durchlöcherten Stempels durchführbar. Die Abbildung zeigt eine schematische Darstellung einer erfindungsgemässen Vorrichtung. Die dargestellte Aus führungsform besteht aus dem Reaktionsgefäss 1, das in einer Verengung 2 ausläuft, die als Küvette gestaltet ist 3 ist entweder der Anzeigebereich des Testsystems oder Sammelbehälter für die ausserhalb des Reaktionsge fässes auszuwertende Flüssigkeit. Die mit Reagenzien im- prägnierten Matrices 4 sind durch Zwischenscheiben 5 voneinander getrennt; die obere Schicht 6 stellt eine Verteilungsschicht dar, mit 7 ist der Stempel bezeichnet. Die Durchführung des Verfahrens mit Rilfe der erfindungs- gemässen Vorrichtung erfolgt in der Weise, dass die zu untersuchende Probe durch ein übliches Auftragungssystem auf die obere Matrix des Reaktionsgefässes aufgebracht wird; dabei wird auch das zur Verdünnung notwendige Lösungsmittel zugegeben. Es ist natürlich auch möglich, durch einfachen Kontakt mit der Probeflüssigkeit diese durch Kapillarwirkung in den Bereich dieser Matrixschicht zu saugen. Dieser Vorgang kann durch geeignete Konstruktion des oberen Teils des Reaktionsgefässes, zum Beispiel durch Ausbildung einer eie bestimmtes Volumen fassenden Kammer, erleichtert werden. Auch der Einbau einer zusätzlichen Verteilungsschicht über der ersten Matrixschicht, die zum Beispiel aus einer Filterpapierschicht bestehen kann, ist möglich. Dabei kann die zu untersuchende Lösung vor oder nach der Auftragung verdünnt werden. Das Verfahren kann anschliessend entweder sofort weiter durchgeführt werden oder das Reaktionsgefäss kann zwischengelagert werden. Nach einer festgelegten Reaktionszeit wird die erste Matrixschicht durch eine dazu geeignete Vorrichtung, zum Beispiel einen Stempel, zusammengedrückt. Der Druck wird dabei so eingestellt, dass die Matrix zusammengepresst wird, die Zwischenscheibe ihre Lage jedoch beibehält. Dadurch wird gewährleistet, dass die in der Matrix enthaltene Flüssigkeit auf die zweite Matrix übertragen wird. Die Eigenschaften der beschriebenen Matrix machen dabei eine Dichtung zwischen den einzelnen Matrices überflüssig. Verschiedene Teilreaktionen können auf diese Weise getrennt voneinander durchgeführt werden, wie Enteiweissung, Auftrennung der Bestandteile des Vollblutes, Auftrennung von Isoenzymen, Immunreaktionen, spezifische Füllungen oder Komplexbildungen, enzymatische oder chemische Bestimmungsreaktionen. Darüber hinaus ist es möglich, Substanzen zusätzlich durch entsprechende Zwischenschichten zwischen zwei Bereichen zurückzuhalten. Diese Zwischenschichten können ebenfalls aus Schaumstoff, vorbehandeltem Schaumstoff oder auch aus Filterschichten aus Papier oder anderem saugfähigen Material bestehen. Es ist wesentlich, dass die zu untersuchende Flüssigkeit reproduzierbar von einem Bereich zum anderen transportiert wird. Bevorzugt wäre eine quantitative Überführung, was jedoch aufgrund der verwendeten Matrixmaterialien nicht erreicht werden kann. Es werden normalerweise etwa 2 bis 15 % der Flüssigkeit von der Matrix zurückgehalten. Dieser Prozentsatz ist jedoch für das verwendete Matrixmaterial reproduzierbar und geht als konstanter Faktor in die Auswertung ein. Die Auswertung erfolgt in an sich üblicher Weise nach allen gängigen Methoden. Bevorzugt sind optische oder reflektometrische Auswertungen Nach Passage der (letzten) Matrixschicht gelangt die Reaktionslösung entweder in eine Messzelle innerhalb des Reaktionsgefässes und wird innerhalb des Reaktionsgefässes ausgewertet. Es ist aber auch möglich, die Reaktionslösung in eine ausserhalb des Reaktionsgefässes befindliche Mess- zelle zu transportieren und die Auswertung darin vorzunehmen. Es sind aber auch spezielle Anzeigereaktionen durchführbar, wie z. B. eine Anzeige über Gasdiffusion oder eine elektrochemische Bestimmung. Als zu untersuchende Flüssigkeiten wurden hauptsächlich Körperflüssigkeiten eingesetzt, da das erfindungsgemässe Verfahren und Testsystem insbesondere zur Bestimmung der Inhaltsstoffe von Blut, Serum oder Earn geeignet ist. Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert: Beispiel l Enteiweissung einer Serumprobe Aus einem Polyurethan-Kaltschaum (Schaumstoff R 6590 der Firma MetzeGer, Memmingen) wurden scheibenförmige Segmente ( 15 mm, Höhe 4 mm) ausgebohrt. Diese wurden mit 50 Pl einer Trichloressigsäurelösung (2 mol/l) durch Auftragen in die Mitte des Segmentes getränkt und solange getrocknet, bis sie einen Trichloressigsäuregehalt von 5 x l0 5 mol aufwiesen. Je ein derartig vorbereitetes Matrixsegment wurde in eine a O-mI-Einwegspritze eingeführt. Das Zentrum des Segmentes wurde jeweils mit 10 Pl einer Probe von Seren (5,5 mg/dl Proteingehalt) versetzt, die verschiedene, definierte Glucosemengen enthielten. Anschliessend wurde ein am Stempel der Spritze befestigtes Matrixsegment aus einem Polyurethan-Polyesterschaum (Schaumstoff ME 6060 der Firma Metzeler, 15 mm, Höhe 16 mm), das mit 1,1 ml Wasser getränkt war, jeweils von oben zusammen mit dem Stempel eingeführt und bis zum Anschlag durchgedrückt. In der ausgedrückten Gesamtlösung wurde der Proteingehalt (Biuret-Verfahren) sowie der Glucosegehalt (Glucose Dehydrogenase-Verfahren) nach folgender Formel bestimmt: C=F .E wobei E die bei 365 nm gemessene Extinktion ist. Der Faktor F berücksichtigt Verdünnung, Blindwert und Glucoseverlust in der Matrix und wurde über Versuchsreihen mit Standardlösungen als 710 ermittelt Glucose [mg/100 ml3 Protein [g/100 ml] eingesetzt gefunden eingesetzt gefunden 20 19 5,5 0,1 34 32 5,5 0 50 52 5,5 0,2 70 74 5,5 0,1 100 97 5,5 0,1 141 135 5,5 0 167 174 5,5 0,1 250 245. 5,5 0,1 500 478 5,5 0,2 Die Zahlenwerte zeigen, dass die Enteiweissung gelungen ist und die Glucosewerte die eingesetzten Konzentrationen mit zufriedenstellender Genauigkeit wiedergeben. Beispiel 2 Glucosebestimmung Aus einem Polyurethan-Polyesterschaum (Schaumstoff ME 6060 der Firma Metzeler, Memmingen) wurden zylindrische Matrixsegmente (0 15 mm, Höhe 16 mm) ausgebohrt und ausgewaschen. Die getrockneten Segmente wurden mit 1,1 ml einer Lösung getränkt, die Q,2 mol/l Phosphatpuffer, pH 7,6, 0,15 mol/l Natriumchlorid, 5 kU/l Glucose-Dehydrogenase, 0,11 kU/l Mutarotase, 1 mmol/l NAD+ und 25 mmol/l Ethylendiamintetraacetat enthielt, und anschliessend lyophilisiert Die so herge- stellten Reaktionsmatrices wurden in einer t0-ml-Ein- wegspritze durch Aufs augen mit 1,1 ml einer enteiweissten Serumprobe, die jeweils 10 l einer definierten Glucosemenge enthielt, versetzt. Nach 10 Minuten wurde die Ge samtlösung durch Herabdrücken des Spritzenstempeis in eine Küvette ausgedrückt. Bei einer Extinktion von 365 nm (F - 647) wurde die Glucosekonzentration in der Probe bestimmt. Verglichen mit den Ergebnissen, die bei dem üblichen Bestimmungsverfahren (manueller Test, analoge Testbedingungen) erhalten wurden, wurden folgende Glu cosekonzentrationen [mg/100 ml] gefunden, die eine gute Übereinstimmung zeigen: manueller Test 50 80 100 165 200 370 435 500 Matrixsystem 50 79 102 161 204 365 427 485 Beispiel 3 Proteinbestimmung Aus einem Polyurethan-Kaltschaum (Schaumstoff R 7295 der Firma Metzeler, Memmingen) wurden zylindrische Matrixsegmente ( 12 mm, Höhe 8 mm) ausgebohrt, ausgewaschen, getrocket und anschliessend mit 0,5 ml einer Lösung getränkt, die 18 mmol/l K-Na-Tartrat, 10 mmol/l Kaliumjodid, 12 mmol/l Kupfersulfat und 200 mmol/l Natriumhydroxid enthielt, und anschliessend lyophilisiert. Die so hergestellten Reaktionsmatrices wurden in einer 5-mI-Einwegspritze je mit einer verschiedene Albuminmengen enthaltenden verdünnten Probelösung (10 \il Probe + 0,5 ml Wasser) versetzt. Durch Einführen und wiederholtes Herabdrücken eines mit Löchern versehenen Stempels wurde innerhalb von 10 Minuten die Lösung im Matrixsegment mehrmals in den Raum oberhalb der Matrix gepresst und wieder in den Schaumstoff zurückgesaugt. Während dieser Zeit war der Auslauf der Spritze abgedichtet. Danach wurde der Stempel durch einen nicht durchlöcherten Stempel ausgetauscht, die Gesamtlösung in eine Küvette gedrückt und die Extinktion der Lösung bei 546 nm gegen den Blindwert der Reagenzlösung gemessen. Durch Umrechnung lässt sich die Proteinkonzentration der Ausgangsprobe bestimmen (F = 15): Protein [g/100 ml] eingesetzt gefunden 2,0 2,1 3,0 3,0 5,0 4,9 6,0 6,2 8,0 7,9 10,0 10,1 l2,0 11,8 Beispiel 4 Bestimmung der Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT) Aus einem Polyurethan-Polyesterschaum (Schaumstoff ME 6060 der Firma Metzeler, Memmingen) wurden zylindrische Matrixsegmente ( 20 mm, Höhe 30 mm) ausgebohrt und ausge waschen. Die getrockneten Segmente wurden zur Hälfte (Segmente I) mit 3 ml einer Lösung getränkt, die 8Q mmol/l Phosphatpuffer, pH 7,4, 200 mmol/l t-Aspartat, 0,l8 mmol/l NADE, 1 g/l Albumin, > 1,2 kU/l LDH und > 0,6 kU/l MDH enthielt und lyophilisiert. In entsprechender Weise wurde die zweite Hälfte der Segmente (Segmente II) mit 3 ml einer Lösung von 20 mmol/l Phosphatpuffer, pH 7,4, 25 mmol/l Oxoglutarat und 10 mmol/l Ethylendiamintetraacetat versetzt und Iyophilisiert. In einer 20-ml-Einwegspritze wurde jeweils ein Segment 1 mit einer durchlöcherten Polyethylenzwischenscheibe ( 20 mm, Dicke 2 mm) und einem Segment II überschichtet. Auf das Segment II wurden 2,5 ml einer verdünnten Standardserumprobe (500 pI Serum mit verschiedenen eingestellten GOT-Aktivitäten + 2 ml physiologische Kochsalziösung) aufgegeben und nach 5 Minuten durch Herabdrücken des Spritzenstempels in das Segment I überführt. Dabei wurde nur soviel Druck angewendet, dass eine möglichst vollständige Überführung, nicht aber ein Verschieben der Zwischenscheibe bewirkt wurde. Nach weiteren 2 Minuten wurde durch vollständiges Herabdrücken des Stempels die Gesamtlösung in eine Küvette gepresst und der Extinktionsverlauf bei 334 nm registriert. Aus der Steigung der erhaltenen Kurven lässt sich die Enzymkonzentration der Untersuchungsprobe berechnen (F = 1471): GOT [ U/1] eingesetzt gefunden 2,9 3,2 5,3 5,0 14 14 23 21 40 38 57 58 74 76 109 111 143 140 Beispiel 5 Enteiweissung und Glucosebestimmung In einer 10-ml-Einwegsprit2e wurden getrennt durch eine mehrfach durchlöcherte Polyethylenscheibe ( 15 mm, Dicke 2 mm), ein Segment zur Glucosebestimmung (Beispiel 2) und ein Segment zur Enteiweissung (Beispiel 1) übereinander angeordnet. Zur Untersuchung des Glucosegehaltes von Seren wurden auf das obere mit Trichlor essigsäure imprägnierte Segment jeweils 10 ijl einer Serumprobe mit verschiedenen definierten Glucosemengen (Proteingehalt 5,5 mg/dl), wie in Beispiel 1 beschrieben, aufgegeben und mit 1,1 ml Wasser in das Segment zur Glucosebestimmung gepresst. Dabei wurde nur soviel Druck angewendet, dass eine möglichst vollständige Überführung der Gesamtlösung, nicht aber ein Verschieben der Zwischenscheibe bewirkt wurde. Nach 10 Minuten wurde durch Durch drücken des Stempels bis zum Anschlag die Gesamtlösung in eine Küvette gepresst. Die Bestimmung der Glucosekonzentration erfolgte über eine Messung der Extinktion bei 365 nm Man erhält analog Beispiel 2 einen linearen Messbereich von 20 bis > 500 mg/dl Glucose Beispiel 6 Glucosebestimmung Aus einem Polyurethan-Polyesterschaum (Schaumstoff ME 606S3 der Firma Metzeler Memmingen) wurden zylindrische Matrixsegmente ( 15 mm, Höhe 16 mm) ausgebohrt und ausgewaschen Die getrockneten Segmente wurden mit 1 ml einer Lösung ge-- tränkt, die 20 mmoI/l Phosphatpuffer, pH 7,5, 0,2 BU/I Diaphorase und 0,6 mol/I 3-(4-Jodphenyl)-2-(4-nitrophenyl)-5- phenyl-2w-tetrazo1iusckiorid enthielt und anschliessend lyophilisiert. Die so herge- stellten Reaktionsmatrices wurden in 10-ml-Einweg- spritzen, getrennt durch eine mehrfach durchlöcherte Polyethylenscheibe, mit jeweils entsprechenden Segmenten Reaktionsmatrices zur Glucosebestimmung (vgl. Beispiel 2) überschichtet. Auf letztere wurden analog Beispiel 2 1,1 ml enteiweisste Serumprobe aufgegeben und die Gesamtlösung wurde nach 2 - 3 Minuten in das Diaphorase/Tetrazoliumsalz-Segment überführt. Nach 10 Minuten erfolgte die Auswertung über einen visuellen Farbvergleich der mit der Probe getränkten Matrix mit einer Farbvergleichstabelle bzw. über eine Extinktionsmessung (400 - 600 nm) der ausgepressten Lösung. Es wurden analoge Resultate wie im Beispiel 2 erhalten. Beispiel 7 Enteiweissung und visuelle Glucosebestimmung In einer 10-ml-Einwegspritze wurden - jeweils von mehrfach durchlöcherten Polyethylenscheiben ( 15 mm, Dicke 2 mm) getrennt - von oben nach unten die Segmente zur Enteiweissung (Beispiel 1) sowie der Glucosebestimmung (Beispiel 6) übereinandergeschichtet. Auf die mit Trichloressigsäure beIadene Matrix wurden jeweils 10 p1 einer definierte Glucosemengen enthaltenden Serumprobe (5,5 mg/dl Proteingehalt) in der Mitte aufgetragen. Analog Beispiel 5 wurde die enteiweisste Probe anschliessend zusammen mit der Spüllösung in den Glucosebestimmungsbereich und nach weiteren 2 - 3 Minuten in das Diaphorase/Tetrazoliumsalz-Segment überfährt. Nach weiteren 10 Minuten erfolgte die Auswertung visuell mit Hilfe einer Farbvergleichstabelle bzw. über die Extinktion (578 nm) der ausgedrückten Lösung. Es wurden analoge Resultate wie in Beispiel 5 erhalten.

Claims: Patentansprüche 1Testsystem zur Bestimmung von Inhaltsstoffen von Flüssigkeiten unter Verwendung pressfähiger, mit Reagenzien iin:prägnier'ter Matrices, dadurch gekenn zeichnet, dass es mindestens eine imprägnierte Matrix in einem vorzugsweise zylindrischen Reak tionsgefäss und eine Vorrichtung enthält, durch die die Matrix nach Aufnahme der zu untersuchen den Flüssigkeit unter Abgabe des Reaktionsproduk tes komprimiert wird. 2. Testsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Matrices übereinander und durch flüssige keitsdurchlässige Vorrichtungen voneinander ge trennt angeordnet sind 3. Testsystem nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsgefäss die Gestalt einer Pipette oder einer Injektionsspritze aufweist. 4. Testsystem nach den Ansprüchen l bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die flüssigkeitsdurchlässigen Anordnungen Zwischenscheiben, Stege oder Ver jüngungen des ReaktionsgefäBes sind. 5. Testsystem nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrices scheibenförmig gestaltet sind. 6. Testsystem nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch ge kennzeichnet, dass eine Matrix aus mehreren, mit ver schiedenen Reagenzien imprägnierten Segmenten besteht. 7. Testsystem nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch ge kennzeichnet, dass zusätzliche Verteilungsschichten, vorzugsweise aus Filterpapier, über mindestens einer Matrix angebracht werden. 8. Testsystem nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch ge kennzeichnet, dass der Teil des Reaktionsgefässes, der zur Aufnahme der aus der (letzten) Matrix austretenden Flüssigkeit dient, als Anzeigebe reich gestaltet ist. 9. Verfahren zur Bestimmung von Inhaltsstoffen von Flüssigkeiten unter Verwendung pressfähiger, mit Reagenzien imprägnierter Matrices, dadurch gekenn zeichnet, dass man die zu untersuchende Flüssigkeit auf eine in einem vorzugsweise zylindrischen Reaktionsgefäss angeordnete Matrix aufbringt und das Reaktionsprodukt durch Komprimieren der Matrix aus dieser entfernt und entweder direkt einer Auswertung zuführt oder erst nach einer oder mehreren weiteren Passagen durch imprägnierte Matrices. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Komprimierung der Matrices durch Stempel oder Kolbendruck in einem zylindrischen Reaktionsge fäss erfolgt Ii. Verfahren nach den Ansprüchen 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, dass eine Passage nacheinander durch mehrere, verschiedenartig imprägnierte Matrices erfolgt, wobei jeweils das Reaktionspro edukt der einen Matrix in die folgende überführt wird. 12 Verfahren nach den Ansprüchen 8 bis 11, dadurch ge kennzeichnet, dass die Bestimmung durch Auswertung der im Reaktionsgefäss befindlichen Flüssigkeit er folgt, die nach der Passage der (letzten) Matrix anfällt.

Inventors: HELGER, ROLAND, DR., LIMBACH, BERTHOLD, DR.
Applicants: MERCK PATENT GESELLSCHAFT MIT BESCHRANKTER HAFTUNG
Application year: 1982
Main classification: G01N33
IPC codes: G01N33, C12Q1, G01N21