THYMOSIN-ALPHA-1 FRAGMENTS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS WITH IMMUNOREGULATING ACTION CONTAINING THEM

Abstract: 1. Medicament with immune-regulating action which contains at least one thymosine alpha 1 fragment and/or at least one derivative thereof in free form of in the form of a pharmacologically acceptable salt, characterised in that as thymosine alpha 1 fragment it contains R1 -Val-Val-R2 , whereby R1 = H-, Glu-, Lys-Lys-Glu-, Glu-Lys-Lys-Glu-, Lys-Glu-Lys-Lys-Glu or Thr-Lys-Asp-Leu-Lys- Glu-Lys-Lys-Glu- and R2 = -H or -Glu, or contains a derivative of this thymosine alpha 1 fragment, the N-terminal end of which carries, as additional amino acid, acetylserine, acetyldehydroalanine, acetyllysine or, insofar as there is no N-terminal lysine, lysine.

Description: Beschreibung Die Erfindung betrifft Arzneimittel mit immunregulierender Wirkung, die zur Behandlung von Immunmangelerkrankungen, von Virusinfektionen, des beschleuniqten Alterns, Tumorbildungswahrscheinlichkeit und insbesondere von Krebs eingesetzt werden können, sowie Thymosinocl-Fragmente,'die in diesen Arzneimitteln als Wirkstoff enthalten sind. Thymosina1 ist ein saures Polypeptid der Thymusdrüse mit der Sequenz 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-I le-Thr-Thr- 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala 27 28 Glu-Asn, in dem die erste Aminosäure, Serin, acetyliert vorliegt. Thymosin 1-Präparate finden klinische Anwendung bei der Krebsbekämpfung und im Rahmen der Regulation des immunologischen Abwehrapparates (P=B. Chretienne et. al., J.D. Cancer treatment Reports, 62, 1787-1790 (1978)). Da sich Thmosinw1 nur sehr mühsam aus Thymusdrüsen isolieren lässt, wurden bereits Methoden zu seiner Totalsynthese vorgeschlagen (J.A.C.S. 101, 252-254 (1979), P 29 19 592.4 der Anmelderin). Wie in EPA 80 10 7997.1 offenbart, haben einige Fragmente des Thymosina1 bereits die gleichen immunregulierenden Wirkungen wie Thymosin 1, wenngleich auch in geringerem Ausmass. Trotz der etwas schwächeren Wirksamkeit bietet die Verwendung von Thymosin 1- Fragmenten anstelle von Thynosintl in der Immuntherapie Vorteile: 1. Thymosinc(l ist mit einem Molekulargewicht von 3107 und 28 Aminosäuren ein relativ grosses Polypeptid, dessen Synthese Schwierigkeiten be reitet. Die erfindungsgemässen Thymosinz1-Frag- mente dagegen sind sehr viel kleiner und lassen sich daher wesentlich einfacher, mit höheren Ausbeuten und besserer Reinheit herstellen. 2. Man findet unter den ThymosinKl-Fragmenten so wohl Peptide mit immunstimulierender als auch Peptide mit immunsuppressiver Wirkung. Bei den Fragmenten mit immunstimulierender Wirkung han delt es sich hauptsächlich um C-terminale Frag mente, während den N-terminalen Fragmenten eher eine immunsuppressive Wirkung zukommt. Ent sprechend ihrer unterschiedlichen pharmakologi schen Eigenschaften lassen sich diese Fragmente' einzeln oder in Kombination zu einer gezielten Immuntherapie einsetzen. Es wurden nun weitere Fragmente des Thymosinql gefunden, die überraschenderweise auch die Eigenschaften der schon bekannten Fragmente besitzen. Gegenstand der Erfindung ist daher ein Arzneimittel mit i nregulierender Wirkung, welches mindestens 1 Thy=osin1-Fragment und/oder mindestens ein Derivat davon in freier Form oder in Form eines pharmakologisch annehmbaren Salzes enthält, welches durch die Formel R1-Val-Val-R2 gekennzeichnet ist, wobei R1 = H-, Glu-, Lys-Lys-Glu-, Glu-Lys-Lys-Glu-, Lys-Glu-Lys-Lys-Glu oder Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu ist und R2 = -H oder -Glu ist. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Arz neimittel, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es als ThymosinXl-Fragment R3-Lys-Glu-R4 enthält, wobei R3 = H, Lys, Glu-Lys, Lys-Glu-Lys, Leu-Lys-Glu-Lys-, Leu-, Asp-Leu- oder Lys-Asp-Leu ist und R4 = -H, -Val, -Val-Val, -Val-Val-Glu-Glu, -Val-Val Glu-Glu-Ala oder -Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu ist. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Arzneimittel, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es als Thymosin 1-Fragment R5-Glu-Lys-R6 enthält, wobei R5 = H-, Leu-Lys-, Asp-Leu-Lys, Lys-Asp-Leu-Lys-, Thr-Lys-Asp-Leu-Lys ist und R6 = -H ist. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Arznei mittel, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es als Thymosino(l-Fragment R7-Glu-Ala-R8 enthält, wobei R7 = H-, Glu- oder Val-Glu- ist und R8 = -H oder -Glu ist. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Arz neimittel, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es als Thymosinl-Fragment Rg-Glu-Ile-Thr enthält, wobei Rg = H-, Ser- oder Ser-Ser- ist. Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Arzneimittel, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es als Thymosin al-Fragment R10-Ala-Val-Asp enthält, wobei R10 = Ala- oder Asp-Ala- ist. Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Arzneimittel, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es als Thymosin D(1-Fragment Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp Leu-Lys-Glu-Lys enthält. Die entsprechenden Thymosindl-Fragmente sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Die erfindungsgemässen Arzneimittel können auch zwei oder mehrere der aufgeführten Thymosinil-Fragmente enthalten. Beispiele für die erfindungsgemässen Thymosin o-Fragmente sind im einzelnen in Tabelle 1 zusammengestellt. Die Fragmente können auch in Form von Derivaten verwendet werden. Bevorzugt werden Derivate, bei denen das N-terminale Ende des Thymosinorl-Fragments als zusätzliche Aminosäure Acetylserin, Acetyldehydroalanin oder Acetyllysin enthält. Thymosin1-Derivate, an deren N-terminalem Ende kein Lysin steht, können als zusätzliche Aminosäure am N-terminalen Ende auch Lysin tragen. Die erfindungsgemässen ThymosinoC1-Fragmente können auch in üblicher Weise unter Anwendung von vorzugsweise pharmakologisch annehmbaren Säuren oder Basen in die entsprechenden Salze überführt werden. Neben den Wirkstoffen in Form von Thymosindl- Fragmenten und/oder ihren Derivaten können die erfindungsgemässen Arzneimittel auch übliche, für den gewählten Verabreichungsweg geeignete pharmakologisch annehmbare Bindemittel, Trägermaterialien und sonstige Hilfsstoffe enthalten. Die erfindungsgemässen ThymosinXl-Fragmente können unter Anwendung üblicher Peptidsyntheseverfahren hergestellt werden, wie durch konventionelle Synthese in Lösung mit maximalem Schutz oder minimalem Schutz der Seitenketten, durch Festphasensynthese nach Merryfield, wobei das Peptid am polymeren Träger aufgebaut wird, oder nach der Polymerreagens-Methode, nach der das Peptid zur Kettenverlängerung über die polymergebundene aktivierte Aminosäure geleitet wird. In besonders bevorzugter Weise bildet man jedoch die erfindungsgemässen ThymosinAl-Fragmente nach der Verfahrensweise der deutschen Offenlegungsschrift P 29 19 592.4 der Anmelderin. Nach dieser Verfahrensweise werden die erfindungsgemässen Thymosinal-Fragmente durch schrittweise Sequenzverlängerung mit Hilfe der gemischten Anhydridmethode aufgebaut. Dabei werden insbesondere Schutzgruppen mit tertiärem Kohlenstoffatom in der Urethangruppierung, wie die tertiäre Butyloxycarbonylgruppe, die c < , c < -Dimethyl-3,5- dimethoxybenzyloxy-carbonylgruppe und die 2- (p-Biphenyl) -propyl-2-oxy-carbonylgruppe eingesetzt, die Nebenreaktionen durch sterische Hinderung unterdrücken und es ermöglichen, grössere Uberschüsse des gemischten Anhydrids wiederholt anzuwenden. Die folgenden Beispiele verdeutlichen die Herstellung der erfindungsgemässen Thymosin y-Fragmente und ihre pharmakologische Wirksamkeit. Die verwendeten Abkürzungen entsprechen den IUPAC-IUP-Vorschlägen (J. Biol. Chem. 247 (1972) 977-983). Dabei bedeuten: Ddz: ,-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxy- carbonyl, Z: Benzyloxycarbonyl, Ac: Acetyl, tert. tert.-Butylester, tdbh: 4,4' -Dimethyloxybenzhydryl, Me: Methyl, OBzl: Benzylester, und- But: tert.-Butyl. Die in den folgenden Beispielen angegebenen Herstellungsmethoden enden bei den geschützten Thymosindl- - Fragmenten, deren Schutzgruppen wie folgt abgespalten werden können: a) Abspalten der Ddz-Schutzgruppe Der Ddz-geschützte Peptidester wird mit dem 8- bis 10-fachen Überschuss wasserfreier Trifluoressigsäure in Form einer 5 %igen Lösung in Methylenchlorid (absolut) versetzt und während 15 bis 30 Minuten bei Raumtempera tur gerührt. Bei längeren Peptiden ist die Zeit zu verlängern. Ist die säurelabile 4,4'-Dimethoxybenzhydrylgruppe in der Se quenz enthalten, so wird die Ddz-Schutzgruppe mit 2,5 %iger oder 1 %iger Trifluoressigsäure während 30 bis 60 Minuten abgespalten. Zum Reaktionsabbruch wird die Lösung auf -15 OC gekühlt und mit der berechneten Menge N-Methyl morpholin (+10%) auf einen pH-Wert von 7,0 bis 7,5 gebracht. Mit Trifluoressigsäure in Form einer 50 %igen Lösung in Methylenchlorid unter Zusatz von Anisol werden primär die tert.-Butylester-Reste sowie die tert.-Butyläther-Gruppen abgespalten, während schliesslich dann die 4,4'-Dimethoxybenzhydril Schutzgruppe mit 95 % Trifluoressigsäure/Anisol abgelöst wird. Enthalten die Fragmente Benzyloxy carbonyl-Schutzgruppen und/oder Benzylester, so werden diese vor der erwähnten Trifluoressigsäure behandlung in üblicher Weise durch Hydrieren in Ge genwart von Palladium auf Kohle in alkoholischer Lösung abgespalten. Beispiel 1 Herstellung von allseits geschützten (19 bis 24), t t Ddz-Lys (Z) -Lys (Z) -Glu (OBu ) -Val-Val-Glu(OBu ) OMe Reaktionslösung A: Zuerst wurde Ddz-(20-24)-OMe dargestellt. a) Ddz-(24)-OMe, Ddz-Glu(OBut)-OMe 20 mMol Ddz-Glu(OBut)-OH wurden in Aceton gelöst und mit der äquivalenten Menge Diazomethan (äthe rische Lösung) versetzt. 100 % Ausbeute eines gelblichen Öls, chromatographisch einheitlich. b) Ddz-(23-24)-OMe, Ddz-Val-Glu(OBut)-OMe 7,5 mMol Ddz-Val-OH wurden mit 5 mMol Ddz-Glu (OBut) -OMe zum Dipeptid umgesetzt. Endreinigung über Kieselgel mit CHC13/Äthanol 93 : 7. Das Peptid enthielt noch Ddz-Spaltstück, welches weitere Syntheseschritte nicht beeinflusste. c) Ddz-(22-24)-OMe, Ddz-Val-Val-Glu(OBut)-OMe Das Tripeptid wurde auf üblichem Wege nach Chro matographie über Sephadex LH 20 mit Methanol rein erhalten. Es war gut in Methanol und CHCl3 löslich. 60 % Ausbeute eines farblosen Öls. d) Ddz-(21-24)-OMe, Ddz-Glu(OBut)-Val-Val-Glu(Obut) -OMe 6 mMol Ddz-Glu (OBut)-OH wurden mit 2,98 mMol Ddz-(22-24)-OMe wie üblich zum Tetrapeptid umge setzt. Es wurde über eine Sephadex LH 20/Methanol Säule gegeben, um in 94 %iger Ausbeute das Produkt als farbloses Glas zu erhalten. Das Tetrapeptid löste sich gut in CHCl3, Methanol Dimethylforma mid und Dioxan. Es ist dünnschichtchromatographisch in 93 : 7, 7 : 1 und 85 : 10 : 5 einheitlich und zeigte mit Ninhydrin die gewöhnliche violette Farbe. e) Ddz-(20-24)-OMe, Ddz-Lys(Z)-Glu(OBut)-Val-Val-Glu (OBut )-OMe 9 mMol Ddz-Lys(Z)-OH wurden mit 2,43 mMol Ddz (21-24)-OMe wie üblich zum Pentapeptid umgesetzt. Nach dem Ausschüttelvorgang wurde über eine Metha nol/Sephadex LH 20-Säule chromatographisch ge reinigt, um in 99 %iger Ausbeute das Produkt als farbloses Glas zu erhalten. 1,0 g Ddz(20-24)-OMe, wurden in 14 ml Dichlormethan gelöst, dem 0,7 ml Trifluoressigsäure zugesetzt waren, um die Ddz-Schutzgruppe abzuspalten. Nach 30 Minuten bei 20 OC wurde mit 1,03 ml N-Methylmorpholin neutralisiert. Das dabei gebildete Gel wurde durch Zusatz von 5 ml Dimethylformamid wieder aufgelöst. Reaktionslösung B 693 mg Ddz-Lys(Z)OH wurden in 15 ml Dichlormethan unter wasserfreien Bedingungen gelöst, auf -15 OC abgekühlt und mit 152 ssl N-Methylmorpholin und 162 til Isobutyloxycarbonylchlorid unter heftigem Rühren versetzt. Nach 8 Minuten Reaktion bei -15 OC wurde die obige Lösung A zugegeben und ohne Kühlung noch 3 Stunden gerührt. Zur Aufarbeitung wurde das Reaktionsgemisch mit 100 ml Chloroform verdünnt, bei 0 CC mit 0,5 M KHSO4-Lösung, 5 % XHCO3-Lösung und Wasser extrahiert und im Vakuum bei 30 CC eingedampft. Nach Kristallisation aus Äthylacetat/Äther, Ausbeute 1,125 g (91 % der Theorie), Fp. 216-218 CC (Zers.). Aminosäurenanalyse: Glu 2,20(2), Val 1,94(2), Lys 2,00(2) Dünnschichtchromatographie (Kieselgel MERCK F254, 0,250 mm) RfX 100 Laufmittel 73 CHC13/CH3OH/CH3CO2H 85 : 10 : 5 (V/V) 60 CHC13/C2H5OH 9 : 1 (V/V) Beispiel 2 Herstellung von allseits geschütztem t18-24J, Ddz-Glu (OBut) -Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBut)-Val-Val-Glu (OBut )OMe. 735 mg Ddz tl9-247OMe, erhalten nach Beispiel 1, werden entsprechend der voranstehenden Prozedur A von der Ddz- Schutzgruppe befreit und mit der Reaktionslösung entsprechend Prozedur B von 787 mg Ddz-Glu(OBut)CHA (CHA = Cyclohexylammoniumsalz) und 97 l Isobutyloxy- carbonylchlorid 5 Stunden umgesetzt und wie dort aufgearbeitet. Nach Kristallisation aus Äthylacetat, Ausbeute 730 mg (87 % der Theorie) Aminosäurenanalyse: Glu 2,99(3), Val 2,00(2), Lys 1,91(2) Rfx 100 Laufmittel 69 CHCl3/CH3OH/CH3CO2H 85 : 10 : 5 (V/V) 59 CHCl3/CH3OH 9 : 1 (V/V) Beispiel 3 Herstellung von allseits geschütztemfL7-242, t t Ddz-Lys(Z)-Glu(OBut) ) -Lys (Z)-Glu(OBut) ) -Val-Val- Glu(OBut )OMe. 350 mg Ddz±'18-24JOMe, erhalten nach Beispiel 2, werden entsprechend der Prozedur A von der Ddz-Schutzgruppe befreit und mit der Reaktions lösung entsprechend Prozedur B von 186 mg Ddz-Lys(Z)OH und 43,2 1 Isobutyloxycarbonylchlorid 5 Stunden umgesetzt und wie dort aufgearbeitet. Nach zweimaligem Umkristallisieren aus siedendem Methanol Ausbeute 245 mg (60 % der Theorie) Aminosäurenanalyse: Glu 3,38(3) Val 2,00(2) Lys 2,80(3) Rfx 100 Laufmittel 67 CHC13/CH30H7CH3C02H 85 : 10 : 5 (V/V) Beispiel 4 Herstellung von allseits geschütztem g25-27l, Ddz-Glu(OBut)-Ala-Glu(OBut)OBut. 1,5 g Ddz-Ala-Glu(OBut)OBut werden entsprechend der Prozedur A von der Ddz-Schutzgruppe befreit und mit der Reaktionslösung entsprechend Prozedur B von 2,84 g Ddz-Glu-( )CHA und 0,62 ml Isobutyloxycarbonylchlorid 2 Stunden umgesetzt. Nach der Aufarbeitung wie dort wurde an Sephadex LH 20 in Methanol chromatographisch gereinigt und aus Sther/Benzin (40 CC) kristallisiert. Ausbeute 1,7 g (85 % der Theorie), Fp. 88 bis 90 CC Aminosäurenanalyse: Glu 1,70 (2) Ala 1,00 (1) RfX 100 Laufmittel 45 CHC13/CH3COCH3 85 : 15 (V/V) Beispiel 5 Herstellung von allseits geschütztem g20-257, Ddz-Lys(Z)-Glu(OBut)-Val-Val-Glu(OBut)-Glu(OBut)OBut. 250 mg Ddz-/20-24/OH, hergestellt nach Beispiel 1, und 73,5 mg l-Hydroxybenzotriazol (HOBT) werden in 20 ml absolutem Tetrahydrofuran gelöst und bei 0 "C mit 50 mg Dicyclohexylcarbodiimid, gefolgt von 65 mg HGlu(OBut )OBut, umgesetzt während 2 Stunden Reaktionszeit bei 0 CC und 4 Stunden bei 20 CC. Nach dem Eindampfen im Vakuum bei 30 "C wird in 50 ml Äthylacetat aufgenommen, Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat mit 0,5 M KHSO4-.Lösung, 5 %iger KHCO3-Lösung und Wasser extrahiert. Die organische Phase wird über bas. Al203 (Säule 3 x 10 cm) filtriert, die mit 250 ml Äthylacetat nachgewaschen wird. Das Eluat wird im Vakuum eingedampft bei 30 CC und hinterlässt das Endprodukt als farbloses Glas in reiner Form. Ausbeute 160 mg (52 % der Theorie) Aminosäurenanalyse: Glu 2,90(3), Val 2,00(2), Lys 0,99(1) RfX 100 Laufmittel 91 CHC13/CH3OH/CH3CO2H 85 : 10 : 5 (V/V) 58 CHC13/C2H5OH 9 : 1 (V/V) Beispiel 6 Herstellung von allseits geschütztem L25-261, Ddz-Glu(OBut) -AlaOBzl. Entsprechend der Prozedur B wurden 2,1 g Ddz-Glu (OBut )CHA mit 468 ijl Isobutyloxycarbonylchlorid aktiviert und mit 500 mg HCl.AlaOBzl und 443 ssl N-Methylmorpholin umgesetzt. Nach Eindampfen bei 30 CC im Vakuum wurde der ölige Rückstand in 5 ml Äthylacetat aufgenommen und über eine Säule (3 x 10 cm) mit bas. Al203 filtriert. Nach Elution mit 250 ml Äthylacetat und Eindampfen im Vakuum bei 30 OC wurde das reine Produkt als farbloses Glas gewonnen. Ausbeute: 1,31 g (96 % der Theorie) Rf X 100 Laufmittel 85 CHCl3/CH3OH/CH3CO2H 85 : 10 : 5 (V/V) 51 CHCl3/CH3COCH3 85 : 15 (V/V) Beispiel 7 Herstellung von allseits geschütztem 120-262, Ddz-Lys(Z)-Glu(OBut)-Val-Val-Glu(OBut)-Glu(OBut)-AlaOBzl Entsprechend der Prozedur A wurde von 176 mg Ddz±25-26,7- OBzl, hergestellt nach Beispiel 6, die Ddz-Schutzgruppe abgespalten, mit 330 1 neutralisiert und im Vakuum bei 20 CC eingedampft. Der Rückstand wurde in 2 ml Dimethylformamid gelöst und dem nachfolgend beschriebenen Ansatz zugesetzt. 250 mg Ddzg20-2470H und 73,5 mg HOBT wurden in 3 ml Dimethylformamid gelöst, bei 0 CC mit 100 mg Dicyclohexylcarbodiimid aktiviert und mit der obigen Lösung von H25-26,7Bzl versetzt. Nach Reaktion von 1 Stunde bei 0 CC und 3 Tagen bei 20 CC wurde entsprechend der Synthese von Fragment [20-25] aufgearbeitet und gereinigt. Nach Umkristallisation aus Methanol, Ausbeute 190 mg (58 % der Theorie) Aminosäurenanalyse: Glu 3,06(3) Ala 1,00(1) Val 1,77(2) Lys 1,05(1) Rf X 100 Laufmittel 78 CHC13/C2H5OH 9 : 1 (V/V) Für eine Reihe von erfindungsgemässen Thymosin &alpha;1-Fragmenten sind in der nachstehenden Tabelle 2 die Rf - Werte angegeben. Sie wurden auf Kieselgel dünnschichtplatten, 0,25 mm, MERCK 60 F254 bestimmt und sind als Rf x 100-Werte wieder gegeben. Laufmittel 1: n-Butanol/Pyridin/Eisessig/Wasser 5 : 5 : 1 : 4 (V/V) Laufmittel 2: Essigester/Pyridin/Eisessig/Wasser 15 : 20 : 6 : 11 (V/V) Laufmittel 3: n-Pentanol/Pyridin/2-Butanon/Ameisen säure/Wasser 40 : 28 : 11 : 5 : 15 (V/V) Die Bezeichnung der Fragmente erfolgt in der Nummerierung von Tabelle 1. TABELLE 1 Thymosin 1-Fragmente mit immunregulierender Wirkung Fragment Fragmente der Formel R1-Val-Val-R1 Nr. 1 22-24 Val-Val-Glu 2 21-23 Glu-Val-Val 3 21-24 Glu-Val-Val-Glu 4 19-24 Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu 5 18-24 Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu 6 17-24 Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val Glu 7 13-24 Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys Lys Glu- Val-Val-Glu R1-Lys-Glu-R2 8 17-18 Lys-Glu 9 20-22 Lys-Glu-Val 10 20-23 Lys-Glu-Val-Val 11 20-25 Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu 12 20-26 Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala 13 20-27 Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala Glu 14 19-22 Lys-Lys-Glu-Val 15 18-22 Glu-Lys-Lys-Glu-Val 16 17-22 Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val 17 16-22 Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val 18 16-18 Leu-Lys-Glu 19 15-18 Asp-Leu-Lys-Glu 20 14-18 Lys-Asp-Leu-Lys-Glu R1-Glu-Lys-R2 21 18-19 Glu-Lys 22 17-19 Lys-Glu-Lys 23 16-19 Leu-Lys-Glu-Lys 24 - 15-19 Asp-Leu-Lys-Glu-Lys 25 14-19 Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys 26 7-19 Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu Lys R1-Glu-Ala-R2 27 25-26 Glu-Ala 28 25-27 Glu-Ala-Glu 29 24-26 Glu-Glu-Ala 30 23-26 Val-Glu-Glu-Ala 31 R-Glu-Ile-Thr 31 10-12 Glu-Ile-Thr 32 9-12 Ser-Glu-Ile-Thr 33 8-12 Ser-Ser-Glu-Ile-Thr R-Ala-Val-Asp 34 4-6 Ala-Val-Asp 35 3-6 Ala-Ala-Val-Asp 36 2-6 Asp-Ala-Ala-Val-Asp TABELLE 2 Fragment Rf-Wert Nr. L a u f m i t t e 1 1 2 3 12 40 61 28 13 14 17 3 14 14 18 2 15 6 9 0 20 19 29 5 21 20 31 5 22 18 25 3 37 21 29 8,5 Beispiel 7 Zur Verdeutlichung der pharmakologischen Wirksamkeit der erfindungsgemässen Thymosintl-Fragmente wurden pharmakologische Vergleichsversuche durchgeführt, bei denen die erfindungsgemässen Fragmente einerseits einem synthetischen Thymosin 1 und andererseits der bekannten Thymosinfraktion Nr. 5 gegenübergestellt wurden. Bei diesen pharmakologischen Vergleichsversuchen wurden die Methode der gemischten Lymphozytenkultur einerseits und der E-Rosettentest andererseits durchgeführt, wobei beide Testmethoden mit zusätzlicher Inhibierung der zellulären RNS-Polymerase durch -Amanitin ausgeführt wurden. Hierbei wurden im einzelnen die folgenden Bedingungen angewandt: 1. Gemischte Lymphozytenkultur (MLC), -Amanitin- Inhibierung Man suspendiert menschliche periphere T-Lymphozyten von zwei gesunden Spendern (105 T-Zellen) in 100 ijl eines Lymphozytenkulturmediums und inhibiert diese durch Zugabe von 2 Rg trAmanitin in 20 1 des Mediums. Anschliessend gibt man 0,004 iig der zu untersuchenden Probe in 20 ijl des Mediums zu (Responderzellen-Präparat). Zu dieser Kultur gibt man 105 T-Zellen, die getrennt mit Mytomycin-C blockiert worden sind, in Form einer Suspension in 100 1 des Mediums (Stimulatorzellen-Präparat, wie es üblicherweise bei der MLC verwendet wird). Man inkubiert die Kultur (mit einem Gesamtvolumen von 240 1) während 120 Stunden bei 37 CC. Während der letzten acht Inkubierungsstunden gibt man 100 ii Ci 3H-Thymidin zu der Kultur zu. Nach dem Isolieren der 3 Zellen bestimmt man die H-Thymidin-Aufnahme durch Flüssigszintillationszählung. Sämtliche Bestimmungen werden mindestens dreifach in einem Doppelblindversuch durchgeführt. Bewertung: Bei sämtlichen MLC-Kulturen werden vorher oder nachher d-amanitin-inhibierte Blindversuche B1 und B2 durchgeführt, wonach man den Mittelwert bildet: B = (B1 + B2)/2. Sämtliche 4LC-Bestimmungen werden in drei Gruppen in Abhängigkeit von der Durchführungszeit eingeteilt. Die Berechnung der ersten Gruppe wird auf den Blindversuch B1 bezogen, die mittlere Gruppe wird auf B bezogen und die letzte Gruppe wird mit dem Blindversuch B2 verglichen. Das stärkste Ansprechen erzielt man mit dem synthetischen Thymosin 1, welcher Wert als 100 % angenommen wurde. Sämtliche anderen Ergebnisse sind auf diesen relativen prozentualen Massstab bezogen. 2. E-Rosettentest, -Amanitin-Inhibierung Bei diesem E-Rosettentest, der nach 0. Brodner durchgeführt wird, suspendiert man 20 x 106 T-Zellen einer menschlichen peripheren T-Lymphozytenpopulation eines einzigen gesunden Spenders in 4 ml der Hanks-Lösung, wonach man 10 ssg q-Amanitin in 1 ml der Hanks-Lösung zusetzt. Man teilt den Pool in 50 Portionen á 100 1 auf. Zu jedem 100 Al-Anteil gibt man (wärmestabilisiertes) menschliches AB-Serum. Dann inkubiert man die Kulturen über Nacht (13,5 Stunden) bei 20 "C, wonach man die Testproben zugibt (2 mg/100 \Ll Hanks Pufferlösung) und während 1 Stunde bei 20 OC inkubiert. 7 Dann gibt man 5 x 10 rote Schafsblutzellen in 100 1 der Hanks-Pufferlösung zu und inkubiert während 5 Minuten bei 37 CC. Dann kühlt man in Eis auf 4 CC und zentrifugiert während 5 Minuten bei 4 CC und 100 g. Anschliessend inkubiert man während weiterer 30 Minuten bei 0 CC, wonach man die E-Rosetten auszählt (Aggregate - 3 rote Schafsblutzellen/l T-Zelle). Bewertung: Es werden 60(-amanitin-inhibierte Blindproben durchgeführt (Gesamtvolumen ebenfalls 210 1), woraus man den Mittelwert der geringen Aktivität ermittelt, der in der relativen Skala als 0 % gesetzt wird. In dem relativen Massstab wird die mittlere Aktivität des E-Rosettentests ohne Inhibierung miti-Amanitin und ohne zusätzliche Probe als 100 % angesetzt. Sämtliche Bestimmungen wurden nach der Doppelblindversuchtechnik durchgeführt. Die bei diesen pharmakologischen Untersuchungen ermittelten Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt: TABELLE Ergebnisse der pharmakologischen Vergleichsuntersuchungen Untersuchte Probe MLC-Test E-Rosettentest relative Ak- relative Akti tivität (%) vität (%) Nr. 3 (21-24) 49 35 Nr. 4 (19-24) 64 15 Nr. 5 (18-24) 60 53 Nr. 6 (17-24) 58 - Nr. 11 (20-25) 28 42 Nr. 12 (20-26) 90 12 Nr. 13 (20-27) 34 - Nr. 28 (25-27) 94 35 Nr. 15 (18-22) 53 - Nr. 7 (13-24)ss 76 - Thymosini1 100 Thymosin Frakt. 5 40 19

Claims: Thymosin wl-Fragmente enthaltende Arzneimittel mit immunregulierender Wirkung und Thymosin1-Fragmente Patentansprüche 1. Arzneimittel mit immunregulierender Wirkung, welches mindestens ein Thymosintl-Fragment oder/und mindestens ein Derivat davon in freier Form oder in Form eines pharmakologisch annehm baren Salzes enthält, dadurch gekennzeichnet, dass es als Thymosinq1-Fragment R1-Val-Val-R2 enthält, wobei R1 = H-, Glu-, Lys-Lys-Glu-, Glu-Lys-Lys-Glu-, Lys-Glu-Lys-Lys-Glu- oder Thr-Lys-Asp-Leu Lys-Glu-Lys-Lys-Glu- ist und R2 = -H oder*-Glu ist, oder ein Derivat dieses Thymosinoi-Fragments enthält, dessen N-terminales Ende als zusätzliche Aminosäure Acetylserin, Acetyldehydroalanin, Acetyllysin oder, soweit N-terminal noch kein Lysin steht, Lysin trägt. 2. Arzneimittel nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass es als Thymo sinq1-Fragment R3-Lys-Glu-R4 enthält, wobei R3 = H-, Lys-, Glu-Lys-, Lys-Glu-Lys-, Leu-Lys-Glu Lys-, Leu-, Asp-Leu- oder Lys-Asp-Leu- ist und R4 = -H, -Val, -Val-Val, -Val-Val-Glu-Glu, -Val Val-Glu-Glu-Ala oder -Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu ist, oder ein Derivat dieses ThymosinEl-Fragments enthält, dessen N-terminales Ende als zusätzliche Aminosäure Acetylserin, Acetyldehydroalanin, Acetyllysin oder, soweit N-terminal noch kein Lysin steht, Lysin trägt. 3. Arzneimittel nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daB es als Thymosins1-Fragment R5-Glu-Lys-R6 enthält, wobei R5 = H-, Lys-, Leu-Lys-, Asp-Leu-Lys-, Lys-Asp Leu-Lys-, Thr-Lys-Asp-Leu-Lys- ist und R6 = -H ist, oder ein Derivat dieses Thymosinq1-Fragments enthält,dessen N-terminales Ende als zusätzliche Aminosäure, Acetylserin, Acetyldehydroalanin, Acetyllysin oder, soweit N-terminal noch kein Lysin steht, Lysin trägt. 4. Arzneimittel nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass es als Thymo sinC1-Fragment R7-Glu-Ala-R8 enthält, wobei R7 = H-, Glu- oder Val-Glu- ist und R8 = -H oder -Glu ist, oder ein Derivat dieses Thymosin -Fragments enthält,dessen N-terminales Ende als zusätzliche Aminosäure Acetylserin, Acetyldehydroalanin, Acetyllysin oder,soweit N-terminal noch kein Lysin steht, Lysin trägt. 5. Arzneimittel nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass es als Thymo sinq1-Fragment Rg-Glu-Ile-Thr enthält, wobei R9 = H-, Ser- oder Ser-Ser- ist, oder ein Derivat dieses Thymosintl-Fragments enthält, dessen N-terminales Ende als zusätzliche Aminosäure Acetylserin, Acetyldehydroalanin, Acetyllysin oder, soweit N-terminal noch kein Lysin steht, Lysin trägt. 6. Arzneimittel nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass es als Thymosindl-Fragment R10-Ala-Val-Asp enthält, wobei R10 = H-, Ala- oder Asp-Ala- ist, oder ein Derivat dieses Thymosinb(l-Fragments enthält, dessen N-terminales Ende als zusätzliche Aminosäure Acetylserin, Acetyldehydroalanin, Acetyllysin oder, soweit N-terminal noch kein Lysin steht, Lysin trägt. 7. Arzneimittel nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass es das Thymo sinc < 1-Fragment der Formel Thr-Ser-Ser-Glu-I le-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys oder ein Derivat dieses Thymosino < 1-Fragments enthält, dessen N-terminales Ende als zusätzliche Aminosäure Acetylserin, Acetyldehydroalanin, Acetyllysin oder Lysin trägt. 8. Thymosintl-Fragment der Formel R1-Val-Val-R2, in der R1 = H-, Glu-, Lys-Lys-Glu-, Glu-Lys-Lys-Glu-, Lys Glu-Lys-Lys-Glu- oder Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu Lys-Lys-Glu- und R2 = -H oder -Glu bedeuten und dessen Derivate, die am N-terminalen Ende als zusätzliche Aminosäure Acetylserin, Acetyldehydroalanin, Acetyllysin oder, soweit N-ter minal noch kein Lysin steht, Lysin tragen. 9. ThymosinGl-Fragment der Formel R3-Lys-Glu-R4, in der R3 = H-, Lys-, Glu-Lys-, Lys-Glu-Lys-, Leu-Lys-Glu Lys-, Leu-, Asp-Leu- oder Lys-Asp-Leu- und R4 = -H, -Val, -Val-Val, -Val-Val-Glu-Glu, -Val-Val-Glu-Glu-Ala oder -Val-Val-Glu-Glu Ala-Glu bedeuten und dessen Derivate, die am N-terminalen Ende als zusätzliche Aminosäure Acetylserin, Acetyldehydroalanin, Acetyllysin oder, soweit N-terminal noch kein Lysin steht, Lysin tragen. 10. ThymosinA -Fragment der Formel R5-Glu-Lys-R6, in der R5 = H-, Lys-, Leu-Lys-, Asp-Leu-Lys-, Lys-Asp-Leu Lys-, Thr-Lys-Asp-Leu-Lys- und R6 = -H bedeuten und dessen Derivate, die am N-terminalen Ende als zusätzliche Aminosäure Acetylserin, Acetyldehydroalanin, Acetyllysin oder, soweit N-terminal noch kein Lysin steht, Lysin tragen. 11. ThymosinXl-Fragment der Formel R7-Glu-Ala-R8, in der R7 = H-, Glu- oder Val-Glu- und R8 = -H oder -Glu bedeuten und dessen Derivate, die am N-terminalen Ende als zusätzliche Aminosäure Acetylserin, Acetyldehydroalanin, Acetyllysin oder, soweit N-terminal noch kein Lysin steht, Lysin tragen. 12. ThymosinGl-Fragment der Formel R9-Glu-Ile-Thr, in der R9 = H-, Ser- oder Ser-Ser bedeuten und dessen Derivate, die am N-terminalen Ende als zusätzliche Aminosäure Acetylserin, Acetyldehydroalanin, Acetyllysin oder, soweit N-terminal noch kein Lysin steht, Lysin tragen. 13. Thymosina1-Fragment der Formel R1 -Ala-Val-Asp, in der 10 R10 = H-, Ala- oder Asp-Ala bedeuten und dessen Derivate, die am N-terminalen Ende als zusätzliche Aminosäure Acetylserin, Acetyldehydroalanin, Acetyllysin oder, soweit N-terminal noch kein Lysin steht, Lysin tragen. 14. Thymosin 1-Fragment der Formel Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys Glu-Lys und dessen Derivate, die am N-terminalen Ende als zu sätzliche Aminosäure Acetylserin, Acetyldehydro alanin, Acetyllysin oder, soweit N-terminal noch kein Lysin steht, Lysin tragen.

Inventors: BIRR, CHRISTIAN, DR., CIARDELLY, THOMAS, DR.
Applicants: MAX-PLANCK-GESELLSCHAFT ZUR FORDERUNG DER WISSENSCHAFTEN E.V.
Application year: 1982
Main classification: C07C103
IPC codes: A61K38, A61P37, C07K5, C07K14, A61P35, C07K7, A61P31