PROCESS FOR PREPARING LIPOSOME SOLUTIONS

Abstract: 1. A process for the manufacture of liposome solutions which optionally contain a pharmacologically active substance or stabilizers and antioxidants, characterized by treating an aqueous system, which contains a liposome former and an inert, volatile organic solvent or a mixture of such solvents, with ultrasound, whereby a pharmacologically active substance or stabilizers and antioxidants is/are optionally added prior to the acoustic irradiation.

Description: Verfahren zur Herstellung von Liposomen und Liposomenlösungen und -gele Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Liposomen bzw. Liposomenlösungen. Die Erfindung betrifft weiterhin hochkonzentrierte gelförmige Liposomenlösungen, die einen biologischen Wirkstoff enthalten können. Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man in einer wässrigen Lösung eines Liposomenbildners in Gegenwart eines inerten flüchtigen organischen Lösungsmittels oder eines Gemischs solcher Lösungsmittel oder eines inerten anorganischen oder organischen Gases, -eine Phasengrenze gegenüber der wässrigen Phase erzeugt. Als Liposomenbildner kommen Lipide, insbesondere Phospholipide, wie Lecithine in Betracht. Die Lecithine können pflanzlicher, tierischer oder synthetischer Art sein. Beispiele von Lecirthinen sind Sojalecithin, Eilecithin oder L-g-Oleoyl-y-palmitoyl-a-lecithin. Als Liposomenbildner können auch Gemische von Phospholipiden und Adjuvantien, wie Triglyceride, Cholesterine, Choleste rinester, Antioxidantien (z.B. a-Tocophero) und Zucker, verwendet werden. Beispiele inerter, flüchtiger organischer lösungsmittel, die auch als Gemische eingesetzt werden können, sind niedere aliphatische Alkohole, wie Aethanol, Propanol und Isopropanol; sowie Aether, insbesondere Diäthyläther. Beispiele anorganischer Gase sind Kohlendioxid, Stickstoff und Edelgase, wie Argon. Beispiele organischer Gase sind Kohlenwasserstoffe, insbesondere niedere aliphatische Kohlenwasserstoffe wie Propan und fluorierte niedere aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Freone. Die Erzeugung einer Phasengrenze kann durch Aenderung eines Parameters, der das Phasengleichgewicht beeinflusst, erfolgen, z.B. durch Aenderung von Druck oder Temperatur. Beispielsweise kann eine Aenderung im Phasenqleichqewicht des im Ausgangsmaterial vorlieqenden Svstems durch Einwirkung einer hochfreauenten Energiequelle, wie insbesondere Ultraschall, vorgenommen werden. Beispiele anderer Energiequellen bzw. Energiearten sind allgemein solche, die bei physikalisch-chemischen Relaxationsmethoden angewandt werden. Ultraschall wurde bisher bei der Herstellung von Liposomen zur mechanischen Zerkleinerung von bereits vorgebildeten multilamellaren Vesikeln angewandt. Mit diesen bekannten Verfahren konnten jedoch nur Liposomenlösungen in verhältnismässig niedriger Konzentration hergestellt werden. Weitere Nachteile bestanden in der starken Erwärmung der Präparate, hohem Energiebedarf, Materialabrieb am Ultraschallgerät und schlechter Durchführbarkeit im grosstechnischen Massstab. Das erfindungsgemässe Verfahren vermeidet diese Nachteile, indem durch Schwankungen des lokalen Drucks im System, wie sie beispielsweise durch Ultraschall bewirkt werden, das Löslichkeitsgleichgewicht einer inerten Hilfskomponente und das damit gekoppelte Phasengleichgewicht, z.B. Gas (gasförmig) EMI2.1 Gas (solvatisiert) zur Bildung der Liposomen ausgenutzt werden. Die lokalen Druckschwankungen führen zu einer periodisch auftretenden Phasentrennung, z.B. durch Ausgasen und Wiederverdichten bzw. Lösen der Hilfskomponente (d.h. des flüchtigen organischen Lösungsmittels oder anorganischen oder organischen Gases), die wiederum die Moleküle des Liposomenbildners zur Ausrichtung um die entstehenden und kollabierenden, submikroskopischen Phasenkompartimente (z.B. Gasbläschen) der Hilfskomponente veranlasst. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemässe Verfahren mit Lösungen durchgeführt, in denen der Liposomenbildner in einer Konzentration von etwa 20-50 Gew. -% vorliegt. Die Hilfskomponente kann in Mengen bis zur Sättigungskonzentration der Phospholipide anwesend sein. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform dient die Hilfskomponente als Lösungsmittel für den Liposomenbildner. Als Ultraschallquelle können die konventionellen Ultraschallgeräte, z.B. Geräte für Ultraschallreinigungsbäder, verwendet werden. Mit Ausgangskonzentrationen von 20-50% Lecithin erhält man nach kurzen Beschallungszeiten ein schaumiges Gel, das sich in Wasser aufnehmen lässt und dabei eine Liposomenlösung liefert, in der Liposomen von ca. 200 nm Durchmesser und signifikanter Grössenverteilung (Dispersität 2-3, gemessen im KONTRON-NANOSIZER) vorliegen. Das nach kurzer Beschallung konzentrierter Lösungen wie oben beschrieben erhaltene Liposomen-Gel geht nach weiterer Beschallung (ca. 15-30 Minuten) in eine klar-opake Liposomenlösung über, in der die Liposomen je nach Beschallungszeit einen Durchmesser von 40-130 nm und eine ausgezeichnete Monodispersität aufweisen. Auf diese Weise lassen sich viskose Liposomenlösungen z.B. mit 20-25 Gew.-% Liposomen herstellen, die z.B. ein Filter von 0,22 A Porenweite passieren. Die überschüssige Hilfskomponente kann z.B. durch Anlegen eines Vakuums entfernt werden. Das primär erhaltene Liposomengel kann auch als solches Verwendung finden, z.B. eignet es sich zur Ver wendurig als Salbengrundlage. Die Liposomenlösungen können z.B. zur Herstellung von Präparaten, insbesondere pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden, die einen in Wasser nicht oder schlecht. löslichen Wirkstoff enthalten. Beispiele solcher Wirk- stoffe sind lipophile pharmakologische Wirkstoffe, wie Benzodiazepine, z.B. Diazepam, Chlordiazepoxid, Flunitrazepam, Medazepam, Clonazepam und Bromazepam; oder fettlösliche Vitamine wie die Vitamine A, D, E und K. Die erfindungsgemässen Liposomenlösungen können auch wasserlösliche Wirkstoffe, z.B. Vitamine der B-Gruppe, wie Vitamin B1 und B6, enthalten. Zweckmässig werden diese Wirkstoffe der Lösung des Liposomenbildners (im Falle lipophiler Wirkstoffe) bzw. als wässrige Lösung (im Falle hydrophiler Wirkstoffe) vor der Beschallung zugesetzt. Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1 400 g Phospholipon 100 (PL 100) werden auf dem Wasserdampfbad in einem genügenden Volumen Aethanol in Lösung gebracht und anschliessend auf 600 g Konzentrat eingeengt. Dieses wird in ein einfaches Laborultraschallgerät (300 Watt, z.B. Compact TUC 300) unter Beschallung eingegeben und mit 2 1 stickstoffgesättigtem H20-bidest. untergerührt. Zur Vermeidung von Qxydationen im Reaktionsgemisch wird ein langsamer Strom von hochgereinigtem Stickstoff über die Lösung geleitet. Schon nach wenigen Minuten entsteht auf diese Weise ein blasiger Gel. Eine Probe wird in überschüssigem Volumen von H2 0 dispergiert und ergibt bereits jetzt Liposomen von ausgezeichneter Monodispersität und einem durchschnittlichen Vesikeldurchmesser von 0,20 u (gemessen im NANOSIZER der Firma KONTRON), Nach einer weiteren Beschallungszeit des Geles von ca. 30 Minuten beginnt die Verflüssigung zu einem hochviskoen, opaleszierenden Präparat, das unter starkem Rühren nach ca. weiteren 30 Minuten Beschallungszeit in den dünnflüssigen Zustand übergeht. Die von den Sonoren verursachte Eigenkonvektion der Lösung genügt um für die abschliessenden 15 Minuten Beschallungszeit, bis zur Fertigstellung der Liposomenlösung, eine ausreichende Durchmengung zu sichern. Während des gesamten Darstellungsprozesses sollte eine Temperatur von 40"C nicht überschritten und auf Einhaltung der Inertatmosphäre geachtet werden. Nach Erreichen eines durchschnittlichen Vesikeldurchmessers von ca. 100-120 nm wird die hochprozentige Lösung abgegossen und sukzessive durch ein Membranfilter von 1,2 , 0,45 V und 0,22 u Porendurchmesser unter Stickstoff hindurch gepresst (ca. 5 at). Die so erhaltene Liposomenlösung kann sowohl durch Abkühlung unter 0 C wie auch durch Hitzesterilisation in einen klaren Gel überführt werden. Ist dieser Effekt nicht erwünscht kann durch Zugabe eines Elektrolyten (z.B. physiologisches Puffersystem) bzw. eines Zuckers wie u.a. Sorbitol die Gelumwandlung unterdrückt werden. Beispiel 2 Es wird ein Ansatz nach Beispiel 1 zubereitet, jedoch die Beschallung nach Erreichen des Gelzustandes (ca. 15 Minuten Beschallungszeit) abgebrochen. Der so erhaltene Gel wird mehrere Tage unter Inertgas aufbewahrt. Hiernach wurde unter den gleichen Versuchsbedingungen nach Zugabe von 200 ml stickstoffgesättigtem H 20 weiter beschallt. Schon nach 15-30 Minuten erhält man eine fertige Liposomenlösung von guter Dispersität und einem mittleren Vesikeldurchmesser von 120-130 nm. Die Lösung kann wie im Beispiel 1 filtriert werden. Beispiel 3 400 g PL 100 werden in ca. 200 ml Diäthyläther gelöst und bis zum Sättigungspunkt eingeengt. Das so erhaltene Konzentrat (ca. 500-600 ml) wird wie bereits beschrieben in das Ultraschallgerät gegeben, mit 2 1 stickstoffgesättigtem H2O überschichtet und unter Inertgas ca. 30 Minuten beschallt. Während der Beschallung werden die auf der Oberfläche flottierenden Teile mittels eines Handmixers zerkleinert und untergerührt. Es entsteht ein hochviskoser, schleimiger Gel, der nach weiterer Beschallung von ca. 15 Minuten eine bernsteinfarbene, gelartige Masse ergibt, welche sich bei weiterer Beschallung unter Blasenentwicklung zu verflüssigen beginnt. Die so erhaltene Liposomenlösung kann auch nach Austreibung des Aethers mittels eingeleitetem Stickstoff nur schwer in H2O aufgenommen werden (Agglomerisation). Bei Zugabe von einer Mischung aus Aceton und H2O im Verhältnis 1:1 erhält man hingegen eine milchig-opake Lösung, die sich nach Austreibung der organ. Lösungsmittel im Rotationsverdampfer leicht nach Beispiel 1 filtrieren lässt. Statt der Zugabe des Aceton-Wasser-Gemisches zu obigem agglomerisierendem Präparat lässt sich die Aufnahme in H2O auch durch Zugabe von ca. 100 ml Aethanol erreichen wobei die Lösungsmittel wie beschrieben entfernt werden. Der mittlere Vesikeldurchmesser beträgt 120-130 nm. Beispiel 4 400 g PL 100 werden in Alkohol gelöst und bis zum Sättigungspunkt eingedampft. Es werden 100 g Natriumbicarbonat und 400 g Traubenzucker eingerührt (statt Traubenzucker lässt sich auch Sorbitol verwenden). Die so erhaltene zähe Masse wird nach bereits beschriebener Weise in das Ultraschallbad gegeben und mit 2 1 stickstoffgesättigtem Wasser überschichtet. Unter vorsichtigem Rühren und gleichzeitiger Beschallung werden 100 g Phosphorsäure (80%) allmählich hinzugetropft. Bei Nachlassen der Gasentwicklung und Schäumung wird nur noch gelegentlich gerührt und nach ca. 60-90 Minuten die fertige Liposomenlösung nach beschriebenem Verfahren gefiltert. Das Präparat ist deutlich getrübt und zeigt eine mittlere Vesikelgrösse von 130 nm und guter Monodispersität. Ein Teil dieser Lösung wurde mit etwa 100 ml Aethanol versetzt und weitere 30 Minuten beschallt. Hierbei nahmen Viskosität und Transparenz deutlich zu, der mittlere Vesikeldurchmesser verringerte sich deutlich auf 110-120 nm. Beispiel 5 400 g PL 100 werden in 800 ml Aether gelöst und hiernach mit 800 ml Aceton aufgefüllt. Die Lösung wird nach bereits beschriebener Weise in das Ultraschallbad gegeben. Es werden unter Beschallung allmählich 1 1 stickstoffgesättigtes Wasser so zugetropft, dass keine Fällung entsteht. Die derart erhaltene honigfarbene, klare leicht viskose Lösung wird ca. 60 Minuten weiterbeschallt. Hierbei verdampft ein Grossteil des Aethers und teilweise das Aceton, wobei danach durch die Acetonunlöslichkeit des eingesetzten Lecithins die Abscheidung und Bildung der Phospholipidvesikel begünstigt wird. Die Restmengen an organischen Lösungmitteln werden im Rota tionsverdamfer entfernt und die Liposomenlösung nach beschriebenem Verfahren filtriert. Das Präparat ist in Durchsicht wasserklar, zeigt im Turbidimeter jedoch einen ausgeprägten Tyndall-Effekt. Die Monidispersität der Lösung ist ausgezeichnet und die monolammellaren Vesikel zeigen einen mittleren Teilchendurchmesser von 40-50 nm. Liposomenlösungen dieser Art zeigten auch ohne Zusatz weiterer Stabilisatoren eine ausgezeichnete Stabilität. .Beispiel 6 200 g PL 100 werden in 300 ml Aether gelöst und unter Rühren zu einer Lösung von 3 g Diazepam in 300 ml Aceton gegeben (Ausfällungen können durch kurze Beschallung beseitigt werden). Hiernach wird mit 650 ml N2-gesättigtem Wasser überschichtet und wie in Beispiel 1 ca. 45 Minuten beschallt. Eine eventuell auftretende Phasentrennung kann durch Hinzufügen von einigen ml Aceton rückgängig gemacht werden. Die verbliebenen Lösungsmittelreste werden im Rotationsverdampfer entfernt und das Präparatvolumen wird nach Zugabe eines Phosphatpuffers (pH 7) mit Sorbitol (70%ige wässrige Lösung) auf 1 1 eingestellt. Die so erhaltene Liposomenlösung konnte direkt durch eine Membran von 0,22 V Porengrösse filtriert und bei 1200C/20 Minuten sterilisiert werden. Der mittlere Teilchendurchmesser betrug hiernach 60-70 nm und die elektronenmikroskopische Aufzeichnung zeigte eine ausgezeichnete Monodispersität. Es wurden nach den oben beschriebenen Verfahren sowohl hydrophile wie auch lipophile Wirkstoffe in die organische bzw. wässrige Phase eingebracht und mit Erfolg in die Liposomensuspension eingeschlossen. Die Zugabe der Wirkstoffe in die'entsprechende Phase erfolgt jeweils entweder direkt in die Lösung der Liposomenbildner oder in die beigefügte wässrige Phase vor der Beschallung.

Claims: Patentansprüche 1. Verfahren zur herstellung von Liposomen, dadurch gekennzeichnet, dass man in einer wässriqen Lösung eines Liposomenbildners in Gegenwart eines inerten, flüchtigen organischen Lösungsmittels oder eines Gemischs solcher Lösungsmittel oder eines inerten anorqanischen oder organischen Gases eine Phasengrenze gegenüber der wässrigen Phase erzeugt. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Liposomenbildner ein Lipid, iiisbesondere ein Phospholipid wie Lecithin ist. 3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet. dass der Liposomenbildner in hinreichend hoher Konzentration vorliegt, dass während des Verfahrens ein hochviskoser Zustand erreicht oder durchschritten wird. 4. Verfahren nach den Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass das flüchtige organische Lösungsmittel ein niederer aliphatischer Alkohol, oder ein Aether ist. 5. Verfahren nach den Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass das anorganische Gas Kohlendioxid, Stickstoff oder ein Edelgas und das organische Gas ein inerter, gegebenenfalls fluorierter aliphatischer Kohlenwasserstoff ist. 6. Verfahren nach den Ansprüchen 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass die Phasengrenze durch Einwirkung einer hochfrequenten Energiequelle, insbesondere Ultraschall, erzeugt wird. 7. Verfahren nach den Ansprüchen 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich ein biologischer Wirkstoff bzw. Stabilisatoren und Antioxidantien anwesend sind. 8. Liposomenlösungen und -gele, die 20 oder mehr Gew.-% Liposomen enthalten.

Inventors: HEYNE CHRISTIAN DR, HEYNE, CHRISTIAN, DR.
Applicants: F. HOFFMANN-LA ROCHE & CO. AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1982
Main classification: A61K9
IPC codes: A61K9