METHOD FOR THE DETERMINATION OF CHYMOTRYPSIN OR TRYPSIN ACTIVITY IN A STOOL

Abstract: 1. Process for the determination of the activity of chymotrypsin or trypsin in faeces by measurement of the velocity of the splitting of a suitable substrate by a faecal suspension in aqueous or aqueous-organic medium, characterised in that one suspends the faeces in the presence of a surface-active agent.

Description: Beschreibung Bei Verdacht auf eine chronische Pankreatitis als auch auf Mukoviscidose bei Säuglingen ist die Diagnose einer Pankreasinsuffizienz ein wichtiger Parameter, dessen klinisch-chemischer Nachweis bis heute noch nicht in befriedigender Weise gelöst werden konnte. Als verlässlichste Methode hierfür wird allgemein der Pankreozymin-Sekretin Test angesehen. Hierbei wird nach Stimulation durch Pan und kreozymin Sekretin mittels einer Sonde das Pankreasseret aufgefangen und anschliessend auf folgende Parameter untersucht: Volumen, Bicarbonatkonzentration-Aktivitäten von ATlase, Lipase, Trypsin und Chymotrypsin. Der Hauptnachteil dieser Mthode ist der hohe zeitliche und technische Aufwand sowie die grosse Belästigung für den Patienten. Eine weitere Methode ist, sowohl als Suchtest als auch zur Verlaufskontrolle der chronischen Pankreatitis und der Mukoviscidose, die Bestimmung von Chymotrypsin oder Trypsin im Stuhl. Im Fall einer chronischen Pankreatitis und bei Mukoviscidose sind die Aktivitätswerte von Trypsin und Chymotrypsin erniedrigt, wobei sich die Chymotrypsinwerte als die besseren Parameter erwiesen haben. Zur Bestimmung von Chymotrypsin oder Trypsin im Stuhl wird eine Stuhlsuspension mit einer wässrig-methanolischen Lösung eines spezifischen Substrats versetzt und die in der Zeiteinheit freigesetzte Aminosäure bestimmt. Die Bestimmung der freigesetzten Aminosäure kann z. B. durch Titration mittels Lauge, insbesondere Natronlauge, erfolgen (pH-stat-Verfahren, Haverback et al., Gastroenterology 44 (1963), 588-597; Ammann, Fortschritte in der Pankreasfunktionsdiagnostik, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York (1967)), oder es wird die Zeit gemessen, die zur Erniedrigung des pH-Werts der Lösung um 0,1 Einheiten führt (pH-drop-Verfahren, vgl. Robinson, Smith, Elliott, Clin. Chim. Acta 62 (1975), 225-229). Alle bekannten Methoden zur Bestimmung der Aktivität von Chymotrypsin oder Trypsin im Stuhl besitzen jedoch den Nachteil eines hohen apparativen und zeitlichen Aufwands. Eine rasche und einfache Bestimmung der Aktivität auf photanetrischem Wege war bisher nicht möglich: Für eine einigermassen genaue BestzmFans sind bei sehr kleinem Probeneinsatz die zu bestimmenden Messgrössen zu gering, bei höherem Probeneinsatz die Eigenfärbung und Trübung durch. Suspnsions-Partikel zu stark. Eine photometrische Bestimmung nach einer Zentrifugation der Stuhlsuspfflsion ist deshalb nicht möglich, well das Enzym relativ fest an die Stuhlpartikel gebunden ist und sich nacn der Zentrifugation fast vollständig im Sediment befindet oder sich nur unvollständig und nicht reproduzierbar in lösung begibt. Aufgabe der Erfindung ist deshalb die Schaffung eines Verfahrens zur raschen, einfachen, genauen und gut reproduzierbaren Bestimmung der Aktivität-von Chymotrypsin oder Trypsin im Stuhl. Diese Aufgabe wird mit dem erfindungsgemässen Verfahren zur Aktivitätsbestimmung gelöst. Gegenstand der Erfindung ist ein yerfahren zur Bestimmung der Aktivität von thymotrypsin oder Trypsin im Stuhl durch Messung der Geschwindigkeit der Spaltung eines geeigneten Substrats durch eine Stuhlsuspension in wässrigem oder wässrig-organischem Medium, dadurch gekennzeichnet, dass man den Stuhl in Gegenwart eines oberflächenaktiven Mittels suspendiert. Die Messung der Geschwindigkeit der Spaltung des Substrats kann nach einer der aus dem Stand der Technik da für bekannten Methoden erfolgen, wie z. B. durch Titration der freigesetzten Aminosäure mittels Lauge (pH-stat Verfahren). Dabei hat es sich gezeigt, dass bei der erfin dungsgemässen Durchführung des Verfahrens in Gegenwart eines oberflächenaktiven Mittels im allgemeinen mehr als 90 8 der Enzymaktivität solubilisiert sind, die Reaktionsgeschwindickeit der Substratspaltung beträchtlich erhöht und der scheinbare Km-Wert des Substrats herabgesetzt ist (Aktivierungsfaktor ca. 2 bis 10), wodurch die bisher auftretenden Probleme (insbesondere Bindung des Enzyms an die Stuhlpar titel und überraschend grosse Km-Werte für unbehandelte Stuhlproben im Vergleich zu kristallinem Enzym bei bestinn- ten Substraten) überwunden werden können. Insbesondere ist es dadurch möglich, die Geschwindigkeit der Spaltung des Substrats auch auf photometrischem Wege rasch, einfach, genau und mit geringem Substrateinsatz zu messen. Die mit dem erfindungsgemässen Verfahren in Gegenwart eines oberflächenaktiven Mittels erhaltenen Ergebnisse sind insbesondere auch deshalb überraschend, weil bei reinem i-Chymotrypsin aus Rinderpankreas praktisch kein Unterschied bei der Durchführung der Bestimmungsmethode in oder ohne Gegenwart eines oberflächenaktiven Mittels festgestellt wurde. Als oberflächenaktives Mittel kann im Prinzip jedes oe- eignet Tensid eingesetzt werden, wie anionische oder ampholytische Tenside, und vorzugsweise nichtionogene Ten side und insbesondere kationische Tenside. Anionische Tenside sind zum BeispieL Alkansulfonate, Ole finsulfonate, zum Beispiel Cumensulfonat, Estersulfonate, Alkylarylsulfonate, insbesondere Alkylbenzolsulfonate vom Typ des Dodecylbenzolsulfonats und Alkylnaphthalinsulfona te, Alkylsulfate, wie zum Beispiel Natrium-laurylsulfat, Äthersulfate oder Fettalkoholsulfate, Salze von Fettsäu ren und Cholsäuren; ampholytische Tenside sind solche mit anionenaktiven und kationenaktiven hydrophilen Gruppen, wie zum Beispiel Glycerinderivate mit Betain-Struktur, Sulfobetaine und Lecithine; nichtionogene Tenside sind zum Beispiel Polyäther, insbesondere Alkylphenolpolyglysol- äther und andere Produkte der Äthoxylierung von Fettsäuren, Fettsäureamiden, Fettaminen und Fettalkoholen, zum Beispiel äthoxylierter Laurylalkohol, Polymere aus Propylen und Äthylenoxid, Polyoxyäthylen-alkyläther oder -nonylphenyl - äther, Polyoxyäthylen-sorbitan-mono-oleat oder Laureat, Additionsprodukte aus Propylenoxid/Äthyiendiamin/Äthylo- oxid, Aminoxide und Fettsäureester von Polyalkoholen, Talg-Alkohol-Polyglykoläther; kationische Tenside sind zum Beispiel geradkettige und cyclische Ammoniumverbindungen, z. B. N-Cetyl-N-äthyl-morpholinmetosulfat, Benzalkoniumchloride und andere quartäre Ammoniumsalze, Aminsalze, Pyridiniumsalze oder quaternäre Fettamin-polyglykoläther. Die Wahl des am besten geeigneten Tensids ist auch von den übrigen Reaktionsbedingungen abhängig, insbesondere von der Art des Enzyms und Substrats, von der Art und Konzentration der Salze, aber auch vom pH-Wert des Mediums. Von den für das erfindungsgemässe Verfahren in erster Li nie geeigneten kationischen Detergentien zeigen den stärk- sten Aktivierungseffekt quarLare -itrtxniurrnrerbindungen, - vorzugsweise der Formel RlR22(CH3)2 t worin R1 torzugsweise einen Alkylrest mit 8 bis 14 Kohlenstoffatomen, und insbesondere Lauryl und Cetyl bedeutet, und R2 vorzugsweise einen Niederalkylrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen oder einen Aralkylrest, oder auch einen Hydroxyalkylrest, und insbesondere Methyloder Benzyl, und Alkylpyridiniumsalze mit vorzugsweise 12 bis 18 Kohlenstoffatomen im Alkylrest, wie z. B.Laurylpyridiniumchlorid, Laurylpyridiniumdisulfat, und insbesondere das Hexadecylpyridiniumchlorid. Ein für das erfindungsgemässe Verfahren besonders gut geeignetes Tensid ist das Lauryl-trimethyl-ammoniumchlorid. Die Konzentration des oberflächenaktiven Mittels in der zur Suspension des Stuhls verwendeten Homogenisierlösung beträgt im allgemeinen ca. 0,02 bis ca. 10 Gew.-%, vorzugsweise 0,5 bis 5 Gew.-%. Die Konzentration des oberflächen- aktiven Mittels in der Messlösung (Stuhlsuspension und Substratlösung) sollte zweckmässigerweise ca. 0,0005 bis 0,5, und vorzugsweise 0,01 bis O,3Gew.-% betragen. Die Konzentration der Stuhlprobe in der Suspension beträgt z. B. bei Verwendung des Substrats Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA 0,2 bis 2 %. Vorzugsweise enthält die zur'Suspension des Stuhls verwendete Homogenisierlösung neben dem oberflächenaktiven Mittel noch ein oder mehrere wasserlösliche Salze, wie z. B. Alkali- und/oder Erdalkalichloride oder Sulfat. Als besonders zweckmässig hat sich ein Gehalt an NaCl von 100 bis 1000 mMol/l oder ein Gehalt an CaC12 von 20 bis 500 ntlol/ 1 oder eine Kombination beider Salze in den genannten Konzentrationsbereichen erwiesen. Es eignen sich aber auch organische Salze, z. B. Acetate oder Citrate,sowie Salze anderer Kationen. Die Salze sollten zweckmässig in einer Konzentration vorliegen, die einer Ionenstärke von 20 bis 1000 mVal/l entspricht. Dabei wurde überraschend festgestellt, dass durch eine ein oberflächenaktives Mittel und Salze (lonenstärke) enthaltende Homogenisierlösung eine überadditive Steigerung der Enzymaktivität (Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit) eintritt, d. h. die Steigerung ist grösser als die Summe der in Gegenwart von oberflächenaktivem Mittel oder in Gegenwart von Salzen erhaltenen Werte. Des weiteren bringt erst die Kombination von Salz und Detergens - im Gegensatz zu den Einzelkomponenten - einen konstant hohen und repräsentatl- ven Teil des partikel gebundenen Enzyms in Lösung. Als Substrat kann im allgemeinen jedes aus dem Stand der Technik für die Bestimmung der Aktivität von Chymotrypsin oder Trypsin im Stuhl nach den bisherigen Methoden als geeignet bekanntes Substrat verwendet werden (vgl. z.B. Grossman, Proc. Soc. Biol. Med. 110 (1962), 41; Del Mar et al., Anal. Biochem. 99 (1979) 316; Nakajama et al., J. Biol. Chem. 254 (10), 1979, 4027-4032). Für die Chymotrypsin-Bestimmung als besonders geeignet, vor allem im Hinblick auf Wasserlöslichkeit, Stabilität, Km Wert und Geschwindigkeitskonstante, erwiesen sich das Ala-Ala-Phe-pNA und insbesondere das Succ-Ala-Ala-Pro-Phe- pNA und MeO-Succ-Arg-Pro-Tyr-pNA; sie eignen sich insbesor.- dere sehr gut für eine photometrische Bestimmung. Ein fr die Bestimmung der Trypsin-Aktivität gut geeignetes Substrat ist z. B. Chromozym TRYQ Carbobenzoxy-valyl-glycnl- arginin-p-nitroanilid-acetat). Zur Herstellung der Reagens lösung wird das Substrat n Wasser oder einem Gemisch aus Wasser und einem organischen Lösungsmittel gelöst. Das organische Lösungsmittel dient dabei als Lösungsvermittler für das Substrat, und ist z. B. Acetonitril, Dimethylsulfoxid, Aceton oder Methanol. Die Reagenslösung enthält vorzugsweise auch noch die gleichen Salze wie sie für die Homogenisierlösung verwendet werden; die Konzentration dieser Salze in der Reages- lösung ist im allgemeinen niedriger als die Konzentration in der Homogenisierlösuna: die gesamte Salzkonzentration beträgt vorzugsweise ca. 10 bis 500 mMol/l, z. B. 250 mlolx 1 Natriumchlorid und 20 mMol/l Calciumchlorid. Zur Durchführung der Messung wird eine bestimmte menge einer Suspension der Stuhlprobe in der Homogenisierlösung oder des durch Zentrifugation bis zur Klärung erhaltenen Zentrifugationsüberstands zu einer bestimmten Menge der Reagenslösung zugegeben (z. B. 100 p1 Probensuspension zu 2mlReagenslösung) und die Geschwindigkeit der Spaltung z. B. titrimetrisch oder photometrisch bestimmt. Die Men ge an Probensuspension (Probenverdünnung) richtet sich dabei zur Erzielung gut messbarer Werte, z. B. gut messbarer Extinktionsanstiege/Minute, vor allem nach der zu erwartenden Enzymaktivität. Aufgrund der Empfindlichkeitssteigerung durch Einsatz des Detergens kann die Probenmenge so klein gewählt werden, dass die Eigenabsorption der suspendierten Festkörper gering ist und somit eine photometrische Messung mit der Suspension erst ermöglicht wird. Der pH-Wert der Homogenisierlösung ist nicht besonders kritisch; er liegt im allgemeinen zwischen 3 und 10, und insbesondere zwischen 6 und 8. Der pH-Wert der Mischung aus Probensuspension und Reagenslösung liegt im allgemeinen zwischen 8 und 10, und vorzugsweise bei pH = 9; diese Werte werden vorzugsweise über den pH-Wert der Reagenslösung eingestellt. Es kann auch vorteilhaft sein, den Lösungen zur Einstellunc des pH-Werts ein geeignetes Puffer gemisch zuzugeben, wie z. B. Tris-Puffer, Glycin-Puffer oder Glycylglycin-Puzfer. Die Pufferkonzentration liegt im allgemeinen zwischen 10 und 1000 mMol/l, insbesondere bei 50 bis 200 mMol/l. Liegen sehr geringe Chymotrypsinmengen vor, wie sie beispielsweise auftreten, wenn Dosierungsvorrichtungen verwendet werden, welche nur die in einer Grenzfläche vorhandene Chymotrypsinmenge zu erfassen gestatten, so ist es zweckmässig, eine besonders empfindliche Nachweis reaktion anzuwenden. Eine derartige empfindliche Reaktion ist in J. Biol. Chem. 128 (1939) 537, beschrie ben und als Bratton/Marshall-Reaktion bekannt. Sie beruht auf dem Zusatz von Natriumnitrit und N- -Na?hzhyl- äthylendiamin und anschliessenden Säurezusatz. Als Säure wird dabei -vorzugsweise Trichloressigsäure oder eine Säure vergleichbarer Stärke eingesetzt. Die Messung kann manuell oder mit einem automatischen Ana lysengerät durchgeführt wreden. Für die photometrische Ak tivitätsbestimmung, und insbesondere zur automatischen pinc- tometrischen Messung (Bestimmung der Extinktion) ist es zweckmässig, die Probensuspension vor der Messung bis zur Klärung zu zentrifugieren. Als besonders zweckmässig für die Durchführung des er findungsgemässen Verfahrens hat sich die in der deutschen Patentanmeldung P 31 39 702.6 unter der Bezeichnung "Gefäss zur Handhabung von pastösem Probenmaterial" der Anmelderin beschriebene Vorrichtung erwiesen. Mit dem erfindungsgemässen Verfahren ist eine einfache und ästhetische Probenahme, Dosierung, Aufarbeitung und Messung möglich, wodurch weder Patient noch Laborpersonal belastet werden. Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher, ohne sie darauf zu beschränken. Wenn nicht anders ancege- ben, beziehen sich Prozentangaben auf Gewichtsprozent. Beispiel 1 a) Herstellung der Homogenisierlösung: NaCl : 2,9 g (= 500 mmol/l) CaCl2 : 1,1 g (= 100 mmol/l) 33tig.Lauryl-trimethyl-ammoniumchlorid: 2,0 g (= 0,7 t) H2O dest. : ad 100 ml b) Herstellung der Reagenzlösung: Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA 29,5 mg (0,5 mmol,l! NaCl 1,46 g (250mmol/l) CaCl2 222 mg (20 mmol/l) Puffer Tris/HCl, pH 9,0, 60 mmol/l ad 100 ml c) Homogenisierung der Probe: Ca.100 mg Stuhlprobe werden mit der 100-fachen Gewichts menge an Homogenisierlösung versetzt und in einem geeig neten Gerät zu einer feinen Suspension verarbeitet. d) Durchführung der Messung: In eine 1 cm Messküvette werden 2 ml der Reagenzlösung pipettiert, auf 250 C temperiert und mit 100 p1 des Probenhomogenisats versetzt. Nach kurzer Durchmischung wird die Extinktionszunahme / min. bei 405 nm bestimmt. Zur Berechnung der Enzymaktivität / g Stuhl ist der Ex tinktionsanstieg / min. bei 405 nm mit dem Faktor 212 Zj mul itplizieren. Beispiel 2 Die Herstellung der Homogenisierlösung und der Reagenzlösung erfolgt gemäss Beispiel 1, ebenso die Homogenisierung der Probe. Im Anschluss an die Homogenisierung wird die Suspension bis zur Klärung der Lösung zentrifugiert. Vom Zentrifugationsüberstand wird ein Aliquot entnommen und entweder manuell wie in Beispiel 1 oder unter Einsatz eines automatischen Analysengeräts die Enzymaktivität bestimmt. Beispiel 3 a) Herstellung der Homogenisierlösung: Es wird eine wäss rige Lösung mit folgenden Bestandteilen hergestellt: Tris/HCl-Puffer, pH 9,0 60 mmol/l NaCl 250 mmol/l CaCl2 20 mmol/1 Lauryl-trimethyl-ammoniumchlorid 0,7 % b) Herstellung der Reagenzlösung: Die Herstellung der Reagenzlösung erfolgt gemäss Bei spiel 1. c) Homogenisierung der Probe: erfolgt gemäss Beispiel 1. d) Durchführung der Messung: erfolgt gemäss Beispiel 1. B e i s p i e 1 4 (Vergleichsbeispiel) Beispiel 4 entspricht Beispiel 3 mit dem einzigen Unterschied, dass die Homogenisierlösung kein Detergenz (Lauryltrimethyl-ammoniumchlorid) enthält. Die Ergebnisse einer vergleichenden Messung von identischen Proben mit einem Reagens gemäss Beispiel 3 und Beispiel 4 sind im folgenden gegenübergestellt. Probe Nr. Ohne Detergenz Mit Detergenz (Beispiel 4) (Beispiel 3) mE/min. mE/min. 1 31 181 2 8 68 3 6 42 4 8 68 5 20 159 Beispiel 5 a) Die Herstellung der Homogenisierlösung erfolgt gemäss Beispiel 1. b) Herstellung der Reagenslösung: Es wird eine wässrige Lösung mit folgenden Bestandteilen hergestellt: Ala-Ala-Phe-p-nitroanilid 2 mmol/l NaCl 250 mmol/l CaCl2 20 mmol/l Tris/HCl-Puffer, pH 9,0 60 mmol/l c) Homogenisierung der Probe: 200 mg Stuhlprobe werden mit 10 ml Homogenisierlösung versetzt und mit einem geeigneten Gerät zu einer feinen Suspension verarbei tet. d) Durchführung der Messung: In eine 1 cm-Küvette werden 1 ml der Reagenzlösung pipettiert, auf 250 C temperiert und mit 200 p1 Pro benhomogenisat versetzt. Nach kurzer Durchmischung wird die Extinktionszunahme bei 405 nm bestimmt. B e i s p i e 1 6 (Vergleichsbeispiel) Beispiel 6 entspricht Beispiel 5 mit dem einzigen Unterschied, dass die Homogenisierlösung kein Detergenz enthält. Das Ergebnis einer identischen Probe gemäss Beispiel 5 und Beispiel 6 ist im folgenden gegenübergestellt: Ohne Detergens Mit Detergens (Beispiel 6) (Beispiel 5) mE/min mE/min 31 45 Beispiel 7 a) Herstellung der Homogenisierlösung erfolgt gemäss Bei spiel 1. b) Herstellung der Reagenslösung: Es wird eine wässrige Lö sung mit folgenden Bestandteilen hergestellt: 3-Carbomethoxypropionyl-L-arginyl-L prolyl-L-tyrosin-p-nitroanilid-hydrochlorid 0,5 mMol/l NaCl 250 mMol/l CaCl2 20 mMol/l Tris/HCl-Puffer, pH 9,0 60 mMol/l c) Homogenisierung und Messung erfolgt gemäss Beispiel 1. B e i s p i e 1 8 (Vergleichsbeispiel) Beispiel 8 entspricht Beispiel 7 mit dem einzigen Unterschied, dass die Homogenisierlösung kein Detergens enthält. Das Ergebnis der Messung einer identische Probe gemäss Beispiel 7 und Beispiel 8 ist im folgenden gegenübergestellt: Ohne Detergens Mit Detergens (Beispiel 8) (Beispiel 7) mE/min mE/min 19 148 Beispiel 9 Bestimmung von Trypsin a) Die Herstellung der Homogenisierlösung erfolgt gemäss Beispiel 1. b) Herstellung der Reagenzlösung: Es wird eine wässrige Lösung mit folgenden Bestandteilen hergestellt: Carbobenzoxy-L-valyl-L-glycyl-L-arginin p-nitroanilid-acetat 5 mmol/l NaCl 250 mmol/l CaCl2 20 mmol/l Tris/HC1-Puffer, pH 9,0 60 mmol/l c) Homogenisierung und d) Messung erfolgt gemäss Beispiel 1. B e i s p i e 1 10 (Vergleichsbeispiel) Beispiel 10 entspricht Beispiel 9 mit dem einzigen Unterschied, dass die Homogenisierlösung kein Detergenz enthält. Das Ergebnis der Messung mit einer identischen Probe gemäss Beispiel 9 und Beispiel 10 ist im folgenden gegenübergestellt: Ohne Detergenz Mit Detergenz (Beispiel 10) (Beispiel 9) mE/min mE/min ca. 3 8 B e i s p i e 1 11 Ein Aliquot der Stuhlprobe wird durch eine geeignete Vorrichtung derart dosiert, dass sich die Probe in einem Raum befindet, der auf einer Seite von einem Filterpapier oder ähnlichem abgegrenzt wird. Hierzu sind z. B. verschiedene kommerzielle Vorrichtungen zur Bestimmung von Blut im Stuhl wie Hemo FE h oder Feca-NosticO nach Austausch des entsprechenden Filterpapiers geeignet. Das Filterpapier wird mit 50 1 einer wässrigen Solubilisierungslösung bestehend aus: Lauryltrimethylamoniumchlorid 50 g/l (5 %) NaCl 500 mmol/l CaCl2 100 mmol/l beträufelt, wobei das Chymotrypsin einer Grenzfläche solubilisiert wird und von dem Filterpapier aufgenommen wird. Anschliessend wird das Filterpapier mit 50 1 einer Reagenzlösung folgender Zusammensetzung beträufelt: Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA 2 mmol/l N--Naphthyläthylendiamin 5 g/l Natriumnitrit 1 g/l Puffer Tris/HCl pH 9,0 100 mmol/l Nach 5 Minuten Reaktionszeit wird das Papier mit einem Tropfen Trichloressigsäure (3,2 mmol/l) versetzt, wobei sich bei-Anwesenheit von Chymotrypsin in der Probe eine intensiv violette Färbung, deren Ausmass von der Enzymmenge abhängt, ausbildet. B e i s p i e 1 12 (Vergleichsbeispiel) Beispiel 11 wird wiederholt mit dem einzigen Unterschied, dass die zur Solubilisierung des Enzyms verwandte Lösung kein Detergenz enthält. Es entwickelt sich keine sichtbare Färbung.

Claims: Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Chymo trypsin oder Trypsin im Stuhl Patentansprüche 1. Verfahren zu Bestimmung der Aktivität von Chymotrypsin oder Trypsin im Stuhl durch Messung der Geschwindigkeit der Spaltung eines geeigneten Substrats durch eine Stuhlsuspension in wässrigen oder wässrig-organischem Medium, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t dass man den Stuhl in Gegenwart eines oberflächenaktiven Mittels suspendiert. 2. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass man die bei einer Substratspaltung freigesetzte Aminosäure bestimmt. 3. Verfahren nach Anspruch 2, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass man die freigesetzte Aminosäure durch Titration mit einer Base bestimmt. 4. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass man die Geschwindigkeit der Spaltung des Substrates photometrisch bestimmt. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass man die Messung mit der Stuhlsuspension. oder mit dem durch Zentrifugation der Suspension erhaltenen Zentrifugationsüberstand durchführt. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass man die Bestimmung manuell oder mit einem automatischen Analysengerät durchführt. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass man als oberflächenaktives Mittel ein kationisches oder nichtionisches Tensid verwendet. 8. Verfahren nach Anspruch 7, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass man als oberflächenaktives Mittel ein quartäres Ammoniumsalz oder ein Alkylpyridiniumsalz verwendet, und insbesondere Lauryl-trimethyl-ammoniumchlorid. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass die Konzentration des oberflächenaktiven Mittels in der zur Suspension des Stuhls verwendeten Homogenisierlösung etwa 0,02 bis etwa 10 Gew.-%, vorzugsweise0,5bis 5 Gew.-%, beträgt. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, d a du r c h g ek e n n ze i c h n e t , dass die zur Suspension des Stuhls verwendete Homogenisierlösung neben dem oberflächenaktiven Mittel ein oder mehrere wasserlösliche Salze enthält. 11. Verfahren nach Anspruch 10, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass die Homogenisierlösung Natriumsalz oder/und Calciumsalz enthält. 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 oder 11, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass die Ionenstärke 20 bis 1000 mVal/l beträgt. 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass man Chymotrypsin bestimmt. 14. Verfahren nach Anspruch 13, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass man als Substrat Ala-Ala-Pe- pNA, Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA oder MeO-Succ-Arg-Pro-TyrpNA verwendet. 15. Verfahren nach einem der-Ansprüche 1 bis 12, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass man Trypsin bestimmt 16. Verfahren nach Anspruch 15, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass man als Substrat Carbobenzoxy-Val-Gly-Arg-pNA-acetat verwendet. 17. Das in den Beispielen beschriebene Verfahren. 18. Reagens zur Durchführung des Verfahrens nach Ansprucn 1 bis 17, g e k e n n z e i c h n e t d u r c h einen Gehalt an oberflächenaktivem Mittel, Enzymsubstrat, wasserlöslichem SalzWasser und einem pH-Wert von 7 bis 11. 19. Reagens nach Anspruch 18, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass es 0,02 bis 10 Gew.-% oberflächenaktives Mittel, 0,05 bis 5 mMol/l Enzymsubstrat, 20 bis 1000 mVal/l wasserlösliches Salz und 10 bis 1000 mMol/l Puffer, pH 7 bis 11, enthält. 20. Reagens nach Anspruch 19, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass es 0,5 bis 5 Gew.-% oberflächenaktives Mittel, 0,2 bis 2 mMol/l Substrat, 100 bis 1000 mMol/l NaCl oder/und 20 bis 500 mMol/l CaCl2 und 50 bis 200 mMol/l Tris-Puffer, pH 8 bis 10, enthält.

Inventors: KASPAR, KLAUS PETER, DR., MOLLER, GERALD, DR., Möller, Gerald, Dr.
Applicants: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH
Application year: 1982
Main classification: C12Q1
IPC codes: G01N33, C12Q1