N-(N'-(2-CHLOROETHYL)-N'-NITROSO-CARBAMOYL)-OLIGOPEPTIDE ESTERS AND AMIDES, AND PROCESS FOR PREPARING THEM

Abstract: Compounds having the formula: <IMAGE> wherein: <IMAGE>R4 = -OCH3, -NH2, NH-R4, R4 being an oligopeptidic residue of which the terminal carboxyl group is blocked as a methyl ester or amide group. They are prepared by reacting the corresponding aminoacids or oligopeptides with an ester or an amide of a second aminoacid or of a second oligopeptide, in presence of an appropriate basic peptidic catalyst.

Description: Beschreibung Unter den Alkylantien ist in den letzten Jahren eine neue Stoff klasse in die Krebschemotherapie eingeführt worden, nämlich die Nitrosoharnstoffe, z. B. 1,3-bis-(2-Chloräthyl)-1-nitrosoharnstoff (BCNU), 1-(2-Chloräthyl)-3-cyclohexyl-1-nitrosoharnstoff (CCNU) und 1-(2-Chloräthyl)-3-(4-methylcyclohexyl)-1-nitrosoharnstoff (MeCCNU) (Proceeding of the 7th new drug seminar on the nitroso ureas,(Washington, D.C., Dec. 15-16, 1975), Cancer Treat. Rep., 60, 645-811 (1976)). Um Substanzen mit besserem therapeutischen Index zu erhalten, hat man in der letzten Zeit eine Reihe neuer Nitrosoharnstoffe mit verschiedenen Substituenten, z.B. Zuckerderivate, synthetisiert und experimentell getestet. (Anderson et al., Cancer Res. 35, 761 (1976), Hayat et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 3, 217 (1979). Im Gegensatz zu den bisher synthetisierten Substanzen, handelt es sich im vorliegenden Fall um Oligopeptidester, die an der Aminogruppe eine N- (2-Chloräthyl) -N-nitroso-carbamoylgrup pierung tragen. Als Ausgangsmaterial zur Synthese von Chloräthyl)-N'-nitroso 1carbamoyl-oligopeptidestern dienen NgN'- - (2-Chloräthyl)N'-nitroso]carbamoylaminosäuren oder -oligopeptide, die ihrerseits zweckmässig durch Reaktion von N-(2-Chloräthyl)-Nnitrosocarbamoylazid mit Aminosäuren bzw. Oligopeptiden zugänglich sind. Unter dem Einfluss von an sich bekannten Peptidkatalysatoren wie z.B. Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) reagieren die erwähnten NCN'-(2-Chloräthyl)N'-nitroso7carbamoylaminosäuren bzw. -oligopeptide zu Amiden, sodass sie mit dem Ester oder Amid einer zweiten Aminosäure bzw. eines zweiten Oligopeptids eine Peptidbindung bilden. Die Reaktion kann schematisch wie folgt dargestellt werden: EMI2.1 EMI2.2 R =R = -H, CH3, -CH(CH3)21 -CH2-CH(CH(CH3)2, -CH(CH3)C2H51-C2H5 EMI2.3 -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2-CH2-S-CH3, EMI2.4 R2= OH bzw. -NH-R'2, wobei R21 einen über die terminale Aminogruppe peptidisch gebundenen Oligopeptidrest mit freier Carboxylgruppe darstellt. Beispiele für R2: -Glycyl-Glycin -Glycyl-Glycyl-Glycin und Peptide anderer Aminosäuren bis zum Tripeptid, sowie gemischt Oligopeptide wie: Glycyl-Alanin Alanyl-Leucin Leucyl-Alanin Glycyl-Tyrosin Leucyl-Glycyl-Tyrosin Leucyl-Glycyl-Prolin R4=0CH31 NH2, -NHR41, wobei R4 Alkyl oder Aryl bzw. einen über die terminale Aminogruppe peptidisch gebundenen Oligopeptid rest darstellt, dessen endständige Carboxylgruppe ihrerseits als Methylester oder Amid vorliegt. Beispiele für R4: -Glycin-Methylester -Glycyl-Glycyl-Methylester -Glycyl-Glycyl-Glycylmethylester Peptide anderer Aminosäuren-bis Tripeptid sowie gemischte Oligopeptide wie: Glycyl-Alanin-Methylester Leucyl-Glycyl-Prolinmethylester Leucyl-Alinin-Amid Glycyl-Tyrosin-Amid Die Umsetzung des Ausgangsmaterials I mit dem Ester bzw. Amid einer weiteren Aminsäure oder eines Oligopeptids II, die gleich oder verschieden von der ersten Aminosäure bzw. dem ersten Oligo peptid sein können, erfolgt vorzugsweise unter Kühlung (etwa OOC), aber auch problemlos bei Raumtemperatur. Beispielsweise werden 1 mM N-(N'-(2-chlorSthyl)-N'-nitrosocarbamoyl)amino- säure und 1 mM Aminosäuremethylester zusammen in 20 ml Di chlormethan gelöst. In diese Lösung wird unter Rühren 1,1 mM (230 mg) Dicyclhexyl-carbodiimid, gelöst in 10 ml Dichlormethan langsam zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird dann weiter eine Stunde gerührt und über Nacht bei Zimmertemperatur stehen ge lassen. Nach Abfiltrieren von N,N'-Dicyclohexylharnstoff wird das Filtrat unter Vakuum eingeengt. Man erhält das Rohprodukt, das man säulenchromatographisch mit Ether/Dichlormethan unterschiedlicher Mischungsverhältnisse an Kieselgel reinigt. Nach der Elution werden die Hauptfraktionen kombiniert und unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in Dichlormethan aufgenommen, wenn nötig mit n-Pentan versetzt, und im Kühlschrank zur Kristallisation gebracht. Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung: Beispiel 1 Herstellung von N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitroso-carbamoyl]glycyl-L-valinmethylester (allgemeine Formel III) R1=-H R2=-CH(CH3)2 N- rN'-(2-Chloräthyl) -N'-nitroso) -carbamoyl-glyci (1 mM) und L-Valinmethylester (1 mM) werden zusammen in 20 ml Dichlormethan gelöst. In dieser Lösung wird unter Rühren Dicyclohexyl-carbodiimid (DCC; 1,1 mM), gelöst in 10 ml Dichlormethan, zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird dann noch eine Stunde gerührt und bei Zimmertemperatur über Nacht stehengelassen. Nach Abfiltrieren von N,N'-Dicyclohexyl-harnstoff wird das Filtrat unter Vakuum eingeengt. Das Rohprodukt wird durch Säulenchromatographie gereinigt (Kieselgel, eluiert mit Äther/Dichlormethan 1:10). Aus den Haupt fraktionen wird das reine Produkt nach Entfernen von Lösungsmittel in Vakuum und durch Umkristallisation aus Di chlormethan/n-Pentan erhalten. Hellgelbe Nadeln, Ausbeute: ca. 70 %, Fp 97 bis 98 C (Zers.); Elementaranalyse: Ber.: C 40,94; H 5,93; N 17,36; Gef.: C 41,09; H 6,00; N 17,16. Die ÚH-NMR-spektroskopische Untersuchung ergab charakteristische Peaks bei = 0,95 ppm (m, -C(CH3)2); = 2,20 ppm (m, -CH=) ; = 3,50 ppm (t, Cl-CH2-); = 3,75 ppm (s, OCH3); 6 = 4,20 ppm ( -N-CH2-CO- und -CH2-N-N.O); = 4,60 ppm (m, -N-CH-C-); 6 = 6,70 ppm (d, -NH-); 6 = 7,70 ppm (t, -NH-). Das Massenspektrum zeigt kein Signal für ein Molekülion, aber charakteristische Fragmente bei M-107 und M-108, die der Abspaltung von Cl(CH2)2-NNO bzw. Cl(CH2)2-N=NOH zuzuschreiben sind, Beispiel 2 Herstellung von N- [N'-2-Chloräthyl)-N'-nitroso-carbamoyl]-L- valyl-L-valinmethylester (allgemeine Formel III) R1=R2=-CH(CH3)2) N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitroso-carbamoyl]-L-valin (1 mM) und L-Valinmethylester (1 mM) werden analog wie unter Beispiel 1 behandelt. Das Produkt kristallisiert aus Dichlormethan/n-Pentan als hellgelbe Nadeln, Ausbeute 65%, F .125 bis 126 C (Zers.); Elementaranalyse; Ber.: C 46,09; H 6,91; N 15,36; Gef.: C 46,31; H 7,10, N 15,23. Die 1H-NMR-spektroskopische Untersuchung ergab folgende charakteristische Peaks bei: #=0,9-1,1 ppm (m, -C(CH3)2); #=2,20 ppm (m, -CH=); #= 3,50 ppm (t, Cl-CH2-); #=3,75 ppm (s, -OCH3); #=4,20 ppm (t, -CH2-N-NO); g =4,50ppm (m, -N-CH-CO); #=6,,60 ppm (d, -NH-); #=7,50 ppm (d, -NH-). Das Massenspektrum zeigt einen Molekülpeak bei 364 und Peaks bei m/e = 258 und 257 (M-107 und M-108). Die letzten beiden Peaks entstehen durch Abspaltung von Cl-CH2-CH2-N-NO oder Cl-CH2-CH2-N-NOH, entweder durch einfache Aufspaltung der N-C-Bindung oder durch eine McLafferty Umlagerung. Beispiel 3 Herstellung von N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitroso-carbamoyl] L-valyl-L-methioninmethylester (allgemeine Formel III) Rl=-CH(CH3)2; ; R2=-CH2-CH2-SCH3) N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitroso-carbamoyl]-L-Valin (1 mM) und L-Methioninmethylester (ImM) werden analog wie unter Beispiel 1 behandelt. Gelbliche Nadeln (Dichlormethan/n-Pentan), Ausbeute ca. 70%, F .81 bis 820C (Zers.). Elementaranalyse: p Ber. C 42,37; H 6,35; N 14,12; Gef.: C 42,65; H 6,50; N 14,14. Die ÚH-NMR-spekktroskopische Untersuchung ergab folgende charakteristische Peaks bei: #=1,00 ppm (m, -C(CH3)2 ); #=2,10 ppm (-CH2-S-cH3; -CH=); #=2,55 ppm (t, -CH2-); #= 3,50 ppmm (t, Cl-CH2-); #=3,80 ppm (s, -OCH3); #=4,20 ppm (-CH2-N-NO); / =4,40ppm (m, -N-CH-CO); /=4,80ppm (m, -N-CH-CO) #=6,80 ppm (d, -NH-); #=7,50 ppm (d, -NH-). Das Massenspektrum zeigt ein Molekülpeak bei 396 und Peaks bei m/e = 289 und 288 (M-107 und M-108). Beispiel 4 Herstellung von N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitroso-carbamoyl] L-isoleucyl-L-leucinmethylester (allgemeine Formel III) R1=-CH(CH3)CH2CH3; R2=-CH2-Ch(CH3)2) N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitroso-carbamoyl]-L-isoleucin (1 mM) und L-Leucinmethylester (1 mM) werden analog wie unter Beispiel 1 behandelt. Hellgelbe Nadeln (Dichlormethan/ n-pentan), Ausbeute ca. 60%, Fp. 128 bis 129 C (Zers.). Elementaranalyse: Ber.: C48,91; H 7,44; N 14,26; Gef.: C 49,03; H 49,03; H 7,70; N 13,96. Sie H-NMR-spektroskopische Unterschung ergab folgende Peaks bei: #=1,00 ppm (-CH3); #= 1,25-2,00 ppm (-CH=; -CH2-); #=3,50 ppm (t, Cl-CH2-); 6=3,80ppm (s, -OCH3); J =4,20 ppm (t, CH2-N-NO); g = 4,40ppm (m, -N-CH-CO); K=4,70ppm (m, -N-CH-CO); 6= 6,30ppm (d, -NH-); #=7,45 ppm (d, -NH-). Das Massenspektrum zeigt ein Molekül-Peak bei 392 und Peaks von m/e = 286, 285 (M-107, M-108). Beispiel 5 Herstellung von N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitroso-carbamoyl] L-phenylalanyl-L-valinmethylester (III, R1= -CH2-C6H5; R2= -CH(CH3)2 N-(N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitroso)-carbamoyl-L-phenylalanin (1 mM) und L-Valinmethylester (1 mM) werden analog wie unter Beispiel 1 behandelt. Gelbe Nadeln (Dichlormethan/n-Pentan), Ausbeute ca. 60% Fp. 107 bis 108 C. Elementaranalyse: Ber. C 52,36; H 6,10; N 13,57; Gef.: C 52,54; H 6,21; N 13,28. Die H-NMR-spektroskopische Untersuchung ergab folgende Peaks bei: #=0,85 ppm (m, -C(CH3)2);; #=2,10 ppm (m, -CH=); #=3,15 ppm (d, -CH2-ph); #=3,400 ppm (t, cl-CH2-); #= 3,70ppm (s, -OCH3); / =4,1Oppm (t, -CH2-N-NO); #=4,45 und 4,80ppm (m, -N-CH-CO); # =6,35ppm (d, -NH-); # =7,25ppm ( -C6E5); # =7,55 ppm ( d, -NH-). Das Massenspektrum zeigt einen Molekül-Peak bei 412 und Peaks bei m/e = 305, 304 (M-107, M-108). Beistiel 6 Herstellung von N-[N'-(2-chloräthyl)-N'-nitroso-carbamoyl] L-phenylalannyl-L-leucinmetehylester (allgemeine Formel III) R1=-CH2-C6H5;; R2=-CH2-CH(CH3)2) N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitroso-carbamoyl]-L-phennylalanyl (1 mM) und L-Leucinmethylester (1 mM) werden analog wie unter Beispiel 1 behandelt. Hellgelbe Nadeln (Dichlormethan/ n-Pentan), Ausbeute ca. 60%, F .96 bis 96,50C. p Elementaranalyse: Ber.: C 53,46; H 6,38; N 13,12; Gef.: C 53,29; H 6,34; N 12,92. Die 1H-NMR-spektroskopische Untersuchung ergab charakteristische Peaks bei: #=0,99 ppm (-C(CH3)2); #=1,50 ppm (m, -CH2-CH=); #=3,15 ppm (d, -CH2-ph); #=3,45 ppm (t, Cl- CH2¯); #=3,75 ppm (s, -OCH3); #=4,10 ppm (t, -CH2-N-NO); #=4,55 ppm (m, -N-CH-CO); #=4,80 ppm (m, -N-CH-CO); #=6,20 ppm (d, -NH-); #=7,30 ppm (-C6H5); #=7,50 ppm Cd, -NH-). Das Massenspektrum zeigt Molekül-Peaks bei 426 und Peaks bei m/e = 319,318 (M-107, M-108). Beispiel 7 Herstellung von N- [N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitroso-carbamoyl]- L-phenylalanyl-L-phenylalaninmethylester (allgemeine Formel III) R1= R2=-CH2-C6H5). N-[N'-(2-chloräthyl)-N'-nitroso-carbamoyl]-L-phenylalanin (1 mM) und L-Phenylalaninmethylester (1 mM) werden analog wie unter Beispiel 1 behandelt. Hellgelbe Nadeln (Dichlormethan/n-Pentan), Ausbeute ca. 60%, F .116 bis 1170C. Elementaranalyse: Ber.: C 57,33; H 5,47; N 12,16; Gef.: C 57,22; H 5,23; N 12,12. Die 1H-NMR-spektroskopische Untersuchung ergab folgende. Peaks bei: / =3,10ppm (CH2-ph); /.=3,40ppm (t, Cl-CH2-); oK=3,70ppm (s, -OCH3); /=4,l0ppm (t, -CH2-N-NO); #=4,75 ppm (-N-CH-CO); #=6,10 ppm (d, -NH-); #=7,20 ppm (-C6H5); #=7,40 ppm (d, -NH-). Das Massenspektrum zeigt Molekül-Peaks bei 460 und Peaks bei m/e = 353, 352 (M-107, M-108). Beispiel 8 Herstellung von N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitroso-carbamoyl] L-phenylalanyl-L-methioninmethylester (allgemeine Formel III) R1=-CH2-C6H5; R2=CH2-CH2-SCH3) N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitroso-carbamoyl]-L-phenylalanin (1 mM) und L-Methioninmethylester Cl mM) werden analog wie unter Beispiel 1 behandelt. Hellgelbe Nade ln (Dichlormethan/ n-Pentan), Ausbeute ca. 70%, F .74 bis 750C. p Elementaranalyse: Ber.: C 48,59; H 5,66; N 12,59; Gef.: C 48,69; H 5,67; N 12,41. Die H-NMR-spektroskopische Untersuchung ergab folgende charakteristische Peaks bei: #=2,05 ppm (-CH2-S-CH3); K=2,45ppm (-CH2-); /=3,20ppm (d, -CH2-ph); #=3,45 ppm (t, Cl-CH2-); =3,75 ppm (s, -OCH3) ; # =4,l0ppm (t, CH2-N-NO); #=4,65 ppm (m, -N-CH-CO); #=4,80 ppm (m, -N-CH-CO); #=6,50 ppm (d, -NH-); #=7,25 ppm (-C6H5); #=7,50 ppm Cd, -NH-). Das Massenspektrum zeigt einen Molekül-Peak bei 444 und Peaks bei m/e = 337,336 (M-107, M-108). Beispiel 9 Herstellung von N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitroso-carbamoyl]. L-methionyl-L-phenylalaninmethylester (allgemeine Formel III) R1=-CH2-CH2-SCH3; R2=CH2-C6H5). N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitroso-carbamoyl]-L-methionin (1 mM) und L-Phenylalaninmethylester (1 mM) werden analog wie unter Beispiel 1 behandelt. Hellgelbe Nadeln (Dichlormethan/ n-Pentan), Ausbeute ca. 70% , F 70 bis 710C. p Elementaranalyse: Ber.: C 48,59; H 5,66; N12,59; Gef.: C 48,64; H 5,68; N 12,36. Die H-NMR-spektroskopische Untersuchung ergab folgende Peaks bei: #=2,05-2,2 ppm (-CH2-S-CH3); #=2,65 ppm (t, -CH2-); #=3,10 ppm (d, -CH2-ph); #=3,45 ppm (t, Cl-CH2-); #=3,75 ppm (s, -OCH3); #=4,10 ppm (t, -CH2 N-NO); #=4,70-4,90 ppm (m, -N-CH-CO); / =6,80ppm (d, -NH-); K=7,20ppm (m, -C6H5); K=7,65ppm (d, -NH-). Das Massenspektrum zeigt einen Molekül-Peak bei 444 und Peaks bei m/e = 337i 336 (M-107, M-198).

Claims: Patentansprüche 1. N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitroso-carbamoyl]-oligopeptid ester und -amide der allgemeinen Formel EMI11.1 und worin R1=R3=-H, CH3- -CH(CH3)2, -CH2-CH(CH3)2, -C2H5 -CH(CH3)C2H5, EMI11.2 -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2-CH2-S-CH3, EMI11.3 R4= -OCH3, -NH2, NH-R4 wobei R4 einen Oligopeptidrest dar- stellt, dessen endständige Carboxylgruppe ihrerseits als Methylester oder Amidgruppe verschlossen ist. 2. N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitroso)-carbamoyl]-glycyl-L-valinmethyl ester. 3. N- FN' - (2-Chloräthyl)-N'-nitroso)-carbamoyl]-L-valyl-L-valin- methvlester. 4. N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitroso)-carbamoyl]-L-valyl-L-methionin methylester. 5. N- EN'-(2-Chloräthyl)N'-nitroso)-carbamoy-L-isoleucyl-L- leucinmethylester. 6. N-[N'-(2-chloräthyl)-N'-nitroso)-carbamoyl]-L-phenylalanyl L-valinmethylester. 7. N- - (2-Chloräthyl) -N1-nitroso) -carbamoyL-phenylalanyl-L- leucinmethylester. 8. N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitroso)-carbamoyl]-L-phenylalanyl L-phenylalaninmethylester. 9. N- N'-(2-chloräthyl)-N'-nitroso) -carbamoyL-phenylalanyl- L-methioninmethylester. 10. N-[N'-(2-chloräthyl)-N'-nitroso)-carbamoyl]-L-methionyl-L phenylalaninmethylester. 11. Verfahren zur Herstellung von N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitroso- carbamoyl-oligopeptidestemoder-amiden nach Anspruch 1, da durch gekennzeichnet, dass N-[N'-(2-Chloräthyl)-N'-nitroso- carbamoyl-]aminosäuren oder -oligopeptide mit einem Ester oder Amid einer zweiten Aminosäure oder eines Oligopeptids die gleich den ersten oder verschieden sein können unter Ein wirkung eines geeigneten basischen Peptidkatalysators in der Kälte zu N-CN'-(2-Chloräthyl)-N'-nitroso-carbamoyl-oligo- peptidestern oder -amiden umgesetzt werden. 12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die als Ausgangsmaterial verwendeten N-[N'(2-Chloräthyl)-N'- nitroso-carbamoyl 7aminosäuren oder -oligopeptide aus N-(2-Chloräthyl)-N-nitroso-carbamoylazid und Aminosäure bzw. Oligopeptid in an sich bekannter Weise in einem ge eigneten Lösungsmittel, insbesondere Dichlormethan herge stellt werden und diese Reaktionslösung ohne Isolierung für die Umsetzung mit dem Aminosäureester oder -amid-- oder entsprechenden Oligopeptid eingesetzt wird. 13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass als basischer Peptidkatalysator Dicyclohexylcarbodiimid verwendet wird.

Inventors: EISENBRAND, GERHARD, DR., TANG, WEI-CI, PROF., ZELESNY, OTTO
Applicants: STIFTUNG DEUTSCHES KREBSFORSCHUNGSZENTRUM
Application year: 1982
Main classification: C07K5
IPC codes: C07C239, A61K38, C07C67, C07C281, C07K5