PROCESS FOR PRODUCING CAPSULAR POLYOSIDES, CAPSULAR POLYOSIDES SO OBTAINED AND THEIR USE IN THE PREPARATION OF VACCINES

Abstract: 1. Claims (for the Contracting States : BE, CH, DE, FR, GB, IT, LI, LU, NL, SE) Process for the production of immunogenic capsular polyosides from capsulated bacteriae containing same, characterised in that it consists in cultivating the bacteriae in a synthetic medium which may contain up to about 0.5% by weight of naturally occuring materials ; at the end of the growth stage of said culture removing the microbial bodies, submitting the liquid phase after removal of the microbial bodies to a filtration through a membrane which retains the molecules of a molecular weight of 100 000 daltons or more, to give a capsular polyosides-rich retained material ; and removing the proteins, the nucleic acids and the lipids from said retained material, to give a purified capsular polyoside. 1. Claims (for the Contracting State AT) Process for the production of immunogenic capsular polyosides from capsulated bacteriae containing same, characterised in that it consists in cultivating the bacteriae in a synthetic medium which may contain up to about 0.5% by weight of naturally occuring materials ; at the end of the growth stage of said culture removing the microbial bodies, submitting the liquid phase after removal of the microbial bodies to a filtration through a membrane which retains the molecules of a molecular weight of 100 000 daltons or more, to give a capsular polyosides-rich retained material ; and removing the proteins, the nucleic acids and the lipids from said retained material, to give a purified capsular polyoside.

Description: Procédé d'obtention de polyosides capsulaires, polyosides capsulaires ainsi obtenus et leur application a la préparation de vaccins. La présente invention concerne un procédé d'ob tention-de polyosides capsulaires, les polyosides obtenus par ce procédé et l'application de ces polyosides à la préparation de vaccins. On sait que la lutte contre les maladies infectieuses peut être exercée à deux niveaux : soit par une action directe à l'égard du germe pathogène (antibiotiques, antiseptiques), soit par une action indirecte par le renforcement de défenses de l'organisme (vaccination, sérothérapie, immunomodulation). I L'utilisation des agents susceptibles d'agir directement se heurte souvent à certaines difficultés pouvant limiter son action (notamment toxicité de la molécule et résistance bactérienne). Par contre, le renforcement des défenses de l'organisme par l'acquisition des anticorps spécifiques présente des avantages certains, notamment du point de vue de la durée de la protection et de la spécificité. Mais, la vaccination à l'aide de corps microbiens entiers n'est pas toujours sans inconvénients : phénomènes d'hypersensibilisation, mauvaise tolérance ou pyrogénicité sont parmi les plus fréquents. Ils sont liés à la présence de multiples antigènes de la bactérie. C'est donc tout naturellement vers l'isolement de l'antigène responsable des anticorps protecteurs que les efforts des chercheurs se sont cristallisés. Dans le cas des bactéries capsulées, les polyosides capsulaires se révèlent immunogènes chez l'homme, avec peu de réactions secondaires. Une première application chez l'homme de ces polyosides capsulaires est l'apparition du vaccin antiméningococcique A et C et, tout récemment, du vaccin polyvalent contenant les polyosides purifiés de quatorze types sérologiques de pneumocoque. Plusieurs autres bactéries capsulées sont impliquées dans divers processus pathologiques, par exemple - Hemophilus influenzae, type b, - Klebsiella pneumoniae, - Escherichia coli, ou - Streptocoques, groupe B, et des vaccins correspondants peuvent être préparés à partir de leurs polyosides capsulaires. Dans la demande de brevet européen 0 002 404, on a décrit un procédé d'obtention de polyosides capsulaires à partir de Streptococcus pneumoniae. Selon ce procédé, on cultive le microorganisme à l'aide de milieux de culture complexes. Puis, après inactivation au phénol, sans séparer les microorganismes du milieu de culture, on effectue une première addition d'alcool tel que ltéthanol, on sépare les impuretés précipitées, on effectue une deuxième addition d'alcool afin de précipiter alors le polyoside. Le polyoside remis en suspension est ensuite débarrassé des substances contaminantes (protéines, acides nucléiques) par un traitement enzymatique ou par un traitement par un surfactif cationique (bromure de citrimonium), qui peuvent être complétés par une diafiltration. Ce procédé n'a pas, en fait, de caractère général, car les conditions spécifiques de chaque stade varient avec le polyoside à séparer. Ainsi, il est nécessaire de faire des pré-tests afin de déterminer les conditions des diverses précipitations. De plus, en raison de llutilisatìon de certains milieux, ce procédé est susceptible d'entraSner une dégradation des chaSnes polyosidiques. La présente invention vise à fournir un procédé plus général, plus simple et moins dégradant permettant d'obtenir des polyosides de masse moléculaire très élevée. La présente invention a pour objet un procédé d'obtention de polyosides capsulaires immunogènes à partir de bactéries capsulaires les contenant, caractérisé en ce que l'on effectue une culture des bactéries en milieu synthétique ou semi-synthétique, à la fin de la phase de croissance de cette culture on sépare les corps microbiens d'une phase surnageante, on soumet cette phase surnageante à une filtration sur une membrane retenant les molécules d'une masseInléculalre égale ou supérieure à 100.000 daltons, obtenant ainsi un retentant riche en polyosides capsulaires,et l'on élimine les protéines, les acides nucléiques et les lipides de ce rétentat obtenant ainsi un polyoside capsulaire purifié. Ainsi, selon une caractéristique essentielle de la présente invention, on effectue la culture des bactéries en milieu synthétique ou semi-synthétique. Par milieu synthétique, on désigne des solutions aqueuses de composés chimiques connus, de faible masse moléculaire qui sont présents en proportions déterminées. Par milieu semi-synthétique, on désigne un milieu analogue au précédent, mais qui contient, en outre, une faible proportion (généralement moins de 0,5 8 en poids) de produits d'origine naturelle, tels que des hydrolysats de protéine. En outre, selon la présente invention, l'extraction des polyosides est effectuée sur le surnageant de la culture débarrassée des corps microbiens et non pas sur l'ensemble du milieu de culture. La filtration sur une membrane dont la porosité est capable de retenir les molécules d'une masse molécu laire égale ou supérieure à 100.000 daltons peeeet d'obtenir rapidement un rétentat renfermant principalement les polyosides, ainsi que, en faibles proportions, des protéines, des acides nucléiques et des lipides. L'élimination des contaminants est avantageusement effectuée de la façon suivante : ou soumet le reten- tat à une hydrolyse enzymatique, notamment à l'aide d'un mélange de Pronase, RNase et DNase, on ajoute un mélange butanol-chloroforme (de préférence un mélange 1:1 en volume), on sépare la phase aqueuse, on soumet la phase aqueuse à une dialyse et on effectue une filtration sur une membrane retenant les molécules ayant une masse moléculaire égale ou supérieure à 100.000 daltons. Le polyoside purifié peut être séparé, de manière connue, du rétentat par précipitation à l'aide d'un alcool tel que l'éthanol. Les exemples suivants illustrent la présente demande EXEMPLE 1 Polyoside pneumococcique du type 3. On part d'une souche lyophilisée de Streptococcus pneumoniae de type 3. a) Préparation de lots d'ensemencement. On introduit la souche lyophilisée dans du bouillon T. On effectue la culture pendant 16 heures à 370C. On mélange 5 ml de la culture obtenue avec 15 ml de lait écrémé stérilisé. On distribue dans des ampoules à raison de 0,5 ml/ampoule et on lyophilise. Les lyophilisats sont conservés à +40C. b) Préculture. On introduit un lot d'ensemencement (lyophilisat en ampoule) dans un ballon contenant 200 ml du milieu semi-synthétiaue indiqué ci-après et on effectue la culture à 370C pendant 6 heures. Milieu de culture Peptone pancréatique de caséine (IBF) 1500 mg Q-cystine 150 mg dl-tryptophane 20 mg Q-tyrosine 200 mg Phosphate bipotassique 4960 mg d-glucose anhydre 12500 mg Sulfate de magnésium, 7H2 O 500 mg Sulfate ferreux, 7H2O 5 mg Sulfate de zinc, 7H2O 0,8 mg Sulfate de manganèse, 7H20 0,3 mg Acide chlorhydrique RP fumant 17,8 mg d-biotine 15 mg Acide nicotinique 1 mg Pyridoxine HCl 1 mg Riboflavine 1 mg Thiamine 1 mg Pentothénate de calcium 5 mg Adénine HCl 10 mg Uracile 10 mg Chlorure de choline 10 mg Asparagine 100 mg Eau distillée q.s.p. 1000 ml c) Culture. La culture proprement dite est effectuée dans un fermenteur contenant 18 1 du milieu de culture défini sous b. On ensemence à raison de 1 % avec la préculture. La culture est effectuée à 37 0C, à pH 7,4, sous agitation pendant généralement environ 16 h, jusqu'à la fin de la phase exponentielle de croissance. d) Séparation du surnageant. A la fin de la phase exponentielle, on sépare immédiatement le surnageant par centrifugation en continu à 5000 t/mn. Le surnageant est soumis à une filtration stérilisante sur membrane Millipore 0,22 et utilisé immédiatement ou bien il est conservé à -250C. e) Extraction. Un volume de surnageant égal à environ 20 ìi- tres est concentré à un volume de 2 litres par filtration sur membrane Millipore 105, permettant de retenir les molécules d'une masse moléculaireégale ou supérieure à 100.000 daltons. Le rétentat ainsi obtenu est diafiltré sur membrane Diaflo 103 après addition de 5 litres d'eau distillée stérile et apyrogène pour compléter la séparation selon la masse moléculaire. Plusieurs diafiltrations successives permettent de concentrer à environ 350 ml qui sont lyophilisés dans des ballons de 1 litre. Toutes ces opérations sont effectuées à une température au plus égale à 80C. f) Purification. Le produit intermédiaire lyophilisé est dissous dans 900 ml de tampon phosphate 0,01 M - pH 7. On ajoute ensuite 20 mg de RNase type 1, 20 mg de DNase pancréatique et 180 ssl (20 unités/ml) de Rnase T1. On effectue une incubation de 4 h à370C. On ajoute alors 170 mg de Pronase type 8, 900 ssl de phénol pur et 2 gouttes de toluène. On incube le mélange pendant une nuit à 370C. On arrête la réaction et on ajoute un volume égal (900 ml) d'un mélange butanol-chloroforme 1:1. On agite pendant 1 h. On décante les deux phases par centrifugation à 10.000 t/mn pendant 30 mn. La phase aqueuse qui contient le polyoside est dialysée contre 20 litres d'eau distillée stérile et apyrogène pendant environ 60 h. On diafiltre le dialysat sur membrane Amicon 105. Le volume du rétentat est de 1140 ml. On ajoute 160 ml d'acétate de sodium 40 % (concentration finale 5 %) et 3,9 litres d'éthanol absolu (3 volumes). On recueille le précipité par centrifugation à 12.000 t/mn pendant 30 mn. On dissout ce précipité dans de l'eau distillée apyrogène. On répartit la solution en flacons sous un volume de 4 ml. On lyophilise sous vide. On obtient 9 g de produit. C'est le polysaccharide purifié qui contient: - sucres 64 % - protéines 0,8 % - acide nucléique < 0,8 % Toutes les opérations (en dehors des incubations) sont effectuées entre 0 et + 40C. EXEMPLE 2 Polyoside pneumococcique du type 23. On part d'une souche lyophilisée de Streptococcus pneumoniae du type 23. On effectue la culture et la séparation du surnageant dans les conditions définies à l'exemple 1 (stades a à d) L'extraction et la purification du polyoside sont effectuées de la façon suivante e) Extraction Un volume de surnageant égal à 15 litres est concentré à un volume de 1,5 litre dans les conditions définies à l'exemple 1-e. Trois diafiltrations successives permettent de concentrer, puis de lyophiliser. On obtient 1,8 g de produit ayant la composition suivante - sucres 60 % - protéines 19 % - acide nucléique 3,6 % f) Purification On reprend le produit intermédiaire lyophilisé avec 200 ml de tampon phosphate 0,01 M - pH 7. On ajoute 1 mg de RNase, 1 mg de DNase et 20 unités de RNase Tl/ml. On incube pendant 3 h à 370C. On ajoute de la Pronase type 8 (180 ssg/ml), 1 Fl/ml de phénol et une goutte de toluène. On incube pendant une nuit à 370C. On effectue trois extractions successives avec un mélange à volume égal (200 ml) de butanol-chloroforme 1:1. Le mélange est agité mécaniquement. La phase aqueuse finale est dialysée pendant environ 60 heures contre 4 1 d'eau distillée stérile et apyrogène. Le dialysat est diafiltré sur membrane Amicon 105. On concentre à 50 ml. On ajoute 3 volumes d'éthanol absolu et de l'acétate de sodium (concentration finale 5 %). On laisse pendant une nuit à -200C On recueille le précipité par centrifugation. Ce précipité est dissous dans de l'eau distillée stérile et apyrogène puis lyophilisé. On obtient 1050 g d'un produit qui contient - sucres 75 % - protéines 1,7 % - acide nucléique 0,7 % Toutes les opérations (sauf indication contraire) sont effectuées entre 0 et +60C. EXEMPLE 3 Polyoside pneumococcique du type 19. On part d'une souche lyophilisée de Streptococcus pneumoniae du type 19. On effectue la culture et la séparation du surnageant dans les conditions définies à l'exemple 1 (stades a à d). L'extraction et la purification du polyoside sont effectuées de la façon suivante e) Extraction En opérant comme à l'exemple 1-e, on concentre un volume de surnageant de 75 litres par trois diafiltration à 2 litres. On obtient 2,3 g ayant la caposition suivante: - sucres 30 % - protéines 15 % - acide nucléique 3,4 % f) Purification Le produit intermédiaire lyophilisé est dissous avec 150 ml de tampon phosphate 0,01 M - pH 7. On ajoute 3 mg de Dnase, 3 mg de RNase et 30 l de RNase T1. On incube pendant 4 h à 370C. On ajoute ensuite 62 mg de Pronase, 150 ssl de phénol et une goutte de toluène. On laisse agir pendant une nuit à 37"C. On déprotéinise par le mélange chloroforme-butanol 1:1, à volume égal (3 extractions successives). La phase aqueuse est dialysée pendant 60 heures contre 4 litres d'eau distillée stérile et apyrogène. On effectue une diafiltration du dialysat sur membrane Amicon XM 100. On précipite le rétentat par 3 volumes d'éthanol contenant de l'acétate de sodium à 5 %. Après une nuit au congélateur, le précipité est dissous dans l'eau stérile et apyrogène et lyophilisé. On obtient 730 mg de produit qui contient - sucres 73 % - protéines 0,2 % - acide nucléique 0,5 % Là encore, toutes les opérations (en dehors des incubations) sont effectuées entre 0 et +40C. EXEMPLE 4 Polyoside pneumococcique du type 1. On part d'une souche lyophilisée de Streptococcus pneumoniae du type 1. On effectue la culture et la séparation du surnageant dans les conditions définies à l'exemple 1. L'extraction et la purification du polyoside sont effectuées de la façon suivante e) Extraction 100 litres de surnageant de culture sontdiafiltrés sur cassettes Pellicon (Millipore, membrane 105). Le volume du rétentat final est de 3 litres. On lyophilise en ballons. On obtient 6,1 g de produit contenant - acide galacturonique 46,5 % - protéines 7,7 % f) Purification On dissout le produit obtenu dans 800 ml d'EDS (eau distillée stérile) apyrogène. On ajoute - 16 mg de RNase - 16 mg de DNase - 160 til de RNase T1. On incube pendant 4 heures à 37"C. On ajoute alors 300 al de phénol, 2 gouttes de toluène et 150 mg de Pronase type 8. On incube pendant une nuit à 37 0C. On extrait encore les protéines à l'aide d'un mélange à volume égal de chloroforme-butanol (1:1). On dialyse la phase aqueuse pendant 60 heures. On diafiltre sur membrane Amicon XM 100. Le volume de térentat final est de 150 ml. On précipite la solution par 3 volumes d'éthanol froid contenant de ltacé- tate de sodium 5 %. Le culot est repris par 250 ml d'EDS apyrogène. On lyophilise en flacons sous vide. On obtient 3,7 g de polyoside purifié contenant - acide galacturonique 55,5 % (ce qui correspond à 85 % de sucres) - protéines 1 % Le coefficient de diffusion dans le gel KD du polyoside est de 0,05. La masse moléculaire est donc d'au moins 2 x 107. EZrnlPLE 5 Polyoside de K.pneumoniae du type 2 On part d'une souche de Klebsiella pneumoniae du type 2. On effectue la culture et la séparation du surnageant dans les conditions définies à l'exemple 1 (stade a à d), mais en utilisant comme milieu de culture le milieu de culture synthétique suivant Citrate trisodique 0,85 g Sulfate d'ammonium 0,17 g Sulfate de magnésium 0,17 g Acide glutamique 0,17 g d-glucose 16,70 g Phosphate bipotassique 10 g Phosphate monopotassique 6,66 g Eau distillée q.s.p. 1000 ml pH final : 6,8. L'extraction et la purification du polyoside sont effectuées de la façon suivante e) Extraction On utilise 90 litres de surnageant de culture. On diafiltre sur cassette Pellicon (2 cassettes, membrane 105). On effectue 3 lavages par 10 litres d'eau après avoir concentré à 1,5 litre. Le rétentat final est de 2,6 titres. On lyophilise en ballons, on obtient 6,1 g de produit qui contient - sucres 50 E - protéines 15 % f) Purification Le produit obtenu est dissous dans 350 ml d'eau. On ajoute - 7 ml de tampon phosphate 0,5 M, pH 7,0 - 7 mg de RNase - 7 mg de DNase - 70 1 de Rnase T1 (filtration préalable des enzymes sur 0,22ss). On incube 4 heures à 37 C. On ajoute ensuite 70 mg de protéase type 8, 350 jil de phénol et 1 goutte de toluène. On incube pendant la nuit à 370C. On arrête la réaction et on achève la déprotéinisation par 3 extractions au butanol-chloroforme (1:1). On dialyse la phase aqueuse pendant 60 heures contre de l'EDS apyrogène. On diafiltre sur membrane Amicon XM 100. Le volume de rétentat final est de 150 ml. On précipite la solution par 3 volumes d'éthanol absolu froid contenant de l'acétate de sodium 5 %. Le précipité, recueilli par centrifugation est dissous dans 250 ml d'eau, puis lyophilisé en flacons sous vide. On obtient un polyoside pur, contenant - sucres 76 % (Hexoses/acide uronique = 3:1) - protéines 3,8 % Le KD du polyoside obtenu est 0,1. La masse moléculaire est donc supérieure à 107. EXEMPLE 6 Polyoside de H.influenza du type b On part d'une souche lyophilisée dlHemophilus influenzae du type b. On effectue la culture et la séparation du surnageant dans les conditions définies à l'exemple 1 (stade a à d) mais en utilisant comme milieu de culture le milieu de culture semi-synthétique suivant Proteose peptone 5 g chlorure de sodium 3,5 g d-glucose 4g Phosphate monopotassique 1,3 g Phosphate bipotassique 3,5 g NAD (nicotine adenosine dinucléotide) 0,001 g Extrait globulaire 50 ml Eau distillée q.s.p. 1000 ml L'extraction et la purification du polyoside sont effectuées de la façon suivante e) Extraction On utilise 30 litres de surnageant de culture. On effectue une diafiltration sur membrane Millipore 100.000 (2 cassettes). La première concentration conduit à un volume de 1 litre. On lave par 3 fois 10 litres d'EDS. On concentre à 1,3 litre. On lyophilise en ballons. On obtient 3,9 g d'un produit qui contient - sucres 53 % - protéines 13 % Le produit obtenu est dissous dans 200 ml. On ajoute (après filtration sur 0,22 ): 4,5 ml de tampon phosphate 0,5 M, pH 7,0 4 mg RNase 4 mg DNase 40 iil RNase T1 On effectue une incubation pendant 4 heures à 370C. Ensuite on ajoute 65 mg de protéase type 8, 200A1 de phénol et 2 gouttes de toluène. On incube pendant une nuit à 37"C. On arrête la réaction par 3 extractions au butanol-chloroforme (1:1). On recueille la phase aqueuse par centrifugation à 12.000 t/mn à +40C pendant 30 minutes. On dialyse pendant 60 heures contre de l'EDS apyrogène (changements de milieu de dialyse fréquents). On concentre sur membrane Amicon XM 100. (2 lavages x 100 ml). Le volume du diafiltrat est de 100 ml. On précipite le diafiltrat par 3 volumes d'éthanol absolu froid contenant de l'acétate de sodium à 5 %. Le précipité, recueilli par centrifugation est repris dans 100 ml d'EDS apyrogène. La solution est lyophilisée en flacons sous vide. On obtient 1,3 g de polyoside pur contenant - sucres (PRP) 63 % - protéines 2 % * Le rapport des constituants du polyoside est le suivant: Ribose: Ribitol : Phosphore = 0,9 ; 1 ; 0,98 (rapport théorique : 1 : 1 : 1). Le KD avoisine 0,1, ce qui correspond à une masse moléculaire d'environ 107. Les polyosides capsulaires immunogènes purifiés obtenus selon la présente invention peuvent être utilisés pour la préparation de vaccins destinés à être adminis trés à titre préventif (ou curatif) à l'homme et aux animaux. Les vaccins peuvent être préparés par incorpo ration des polyosides capsulaires purifiés obtenus selon la présente invention dans un véhicule liquide physiolo giquement acceptable, tel qu'une solution physiologique ou de l'eau pour injection. On peut incorporer à cet effet un ou, de préfé rence, plusieurs polyosides capsulaires purifiés obtenus selon la présente invention et à partir de différents types sérologiques. En outre, des vaccins polyvalents peuvent êtrepréparés par incorporation de deux ou plu sieurs polyosides capsulaires purifiés obtenus à partir de différents germes. On donnera ci-après des résultats des essais mettant en évidence l'activité immunogène des polyosides obtenus selon la présente invention. a) Titrage des anticorps sériques chez la souris a - Des souris mâles Swiss de 20 g ont été groupées par lots de 10 animaux 1 lot témoin nta reçu aucun traitement. 1 lot a été traité par voie I.P. à raison de plusieurs doses de polyoside de l'exemple 1 par animal. Le titrage des anticorps hémagglutinants a été effectué selon les techniques décrites dans la littérature, utilisant le globule rouge de mouton sensibilisé par le polyoside à l'aide du chlorure de chrome. Les résultats figurant dans le Tableau I mettent en évidence une augmentation du titre sérique des anticorps hémagglutinants chez les animaux traités aux faibles doses par rapport aux animaux témoins et une paralysie immunitaire classique pour les fortes doses. ss - Des essais analogues ont été effectués chez la souris avec le polyoside de l'exemple 5 (polyoside de Klebsiella pneumoniae, type 2). Les résultats sont donnés dans le Tableau II. T A B L E A U I EMI15.1 <SEP> SOURIS <SEP> - <SEP> TITRES <SEP> SERIQUES <SEP> ANTICORPS <SEP> HEMAGGLUTINANTS <tb> <SEP> Animaux <SEP> témoins <SEP> Animaux <SEP> traités <SEP> Animaux <SEP> traités <SEP> Animaux <SEP> traités <tb> <SEP> 77 g/souris <SEP> 0,77 g/souris <SEP> 0,077 g/souris <tb> <SEP> (1) <SEP> (2) <SEP> (1) <SEP> (2) <SEP> (1) <SEP> (2) <SEP> (1) <SEP> (2) <tb> 1 <SEP> 128 <SEP> 7 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 64 <SEP> 6 <SEP> > 4096 <SEP> 13 <tb> 2 <SEP> 128 <SEP> 7 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 8 <SEP> 3 <SEP> 2048 <SEP> 12 <tb> 3 <SEP> 128 <SEP> 7 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 512 <SEP> 9 <SEP> 128 <SEP> 7 <tb> 4 <SEP> 16 <SEP> 4 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 32 <SEP> 5 <SEP> 128 <SEP> 7 <tb> 5 <SEP> 4 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 512 <SEP> 9 <SEP> 256 <SEP> 8 <tb> 6 <SEP> 8 <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 256 <SEP> 8 <SEP> 128 <SEP> 7 <tb> 7 <SEP> 64 <SEP> 6 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 256 <SEP> 8 <SEP> 256 <SEP> 8 <tb> 8 <SEP> 64 <SEP> 6 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1024 <SEP> 10 <SEP> 64 <SEP> 6 <tb> 9 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 128 <SEP> 6 <SEP> 256 <SEP> 8 <tb> 10 <SEP> 64 <SEP> 6 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 2048 <SEP> 11 <SEP> > 4096 <SEP> 13 <tb> <SEP> 4,8 <SEP> 0 <SEP> 7,5 <SEP> 8,9 <tb> <SEP> + <SEP> + <SEP> + <tb> <SEP> - <SEP> 1,84 <SEP> -1,85 <SEP> -2,02 <tb> p <SEP> < <SEP> 0,05 <SEP> > <SEP> 0,01 <tb> (1) <SEP> Anticorps <SEP> Hémagglutinants <SEP> inverse <SEP> de <SEP> la <SEP> dilution <tb> (2) <SEP> Anticorps <SEP> hémagglutinants <SEP> log2 <SEP> de <SEP> l'inverse <SEP> de <SEP> la <SEP> dilution <tb> T A B L E A U I I EMI16.1 <SEP> Animaux <SEP> témoins <SEP> Animaux <SEP> traités <SEP> Animaux <SEP> traités <SEP> Animaux <SEP> traités <SEP> Animaux <SEP> traites <tb> <SEP> 1630 g/kg <SEP> 163 g/kg <SEP> 16,3 g/kg <SEP> 1,63 g/kg <tb> <SEP> (1) <SEP> (2) <SEP> (1) <SEP> (2) <SEP> (1) <SEP> (2) <SEP> (1) <SEP> (2) <SEP> (1) <SEP> (2) <tb> 1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 8 <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 16 <SEP> 4 <SEP> 16 <SEP> 4 <tb> 3 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 32 <SEP> 5 <SEP> 16 <SEP> 4 <tb> 4 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 16 <SEP> 4 <SEP> 32 <SEP> 5 <tb> 5 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 8 <SEP> 3 <SEP> 64 <SEP> 6 <tb> 6 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 8 <SEP> 3 <SEP> 16 <SEP> 4 <SEP> 32 <SEP> 5 <tb> 7 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 16 <SEP> 4 <SEP> 16 <SEP> 4 <tb> 8 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 16 <SEP> 4 <SEP> 32 <SEP> 5 <tb> 9 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 32 <SEP> 5 <SEP> 64 <SEP> 6 <tb> 10 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 64 <SEP> 6 <SEP> 16 <SEP> 4 <tb> <SEP> + <SEP> + <tb> <SEP> 4,2-0,69 <SEP> 4,3-1,28 <tb> p <SEP> < <SEP> 0,001 <SEP> < <SEP> 0,001 <tb> (1) <SEP> Anticorps <SEP> hémagglutinants <SEP> - <SEP> Inverse <SEP> de <SEP> la <SEP> dilution <tb> (2) <SEP> Anticorps <SEP> hémagglutinants <SEP> - <SEP> Log2 <SEP> de <SEP> l'inverse <SEP> de <SEP> la <SEP> dilution <tb> b) Titrage des anticorps sériques chez le rat. La même étude a été réalisée chez le rat Sprague Dawley de 400-450 g mâle. Les lots de 10 animaux ont reçu une injection I.P. de 2 et 20 Ag de polyoside de Streptococcus pneumoniae, type 3, par animal. Le titrage des anticorps hémagglutinants a été effectué les 4, 6 et 14ème jours après l'adminsitration. Les résultats sont donnés dans le Tableau III. En accord avec la littérature, le titre s'élève progressivement pour atteindre son taux maximal le 6ème jour. T A B L E A U I I I EMI18.1 <SEP> RATS <SEP> - <SEP> TITRES <SEP> SERIQUES <SEP> - <SEP> ANTICORPS <SEP> HEMAGGLUTINANTS <tb> <SEP> LOG2 <SEP> DE <SEP> L'INVERSE <SEP> DE <SEP> LA <SEP> DILUTION <tb> <SEP> Animaux <SEP> témoins <SEP> Animaux <SEP> traités <SEP> Animaux <SEP> traités <tb> <SEP> 2 g/rat <SEP> 20 g/rat <tb> <SEP> J4 <SEP> J6 <SEP> J14 <SEP> J4 <SEP> J6 <SEP> J14 <SEP> J4 <SEP> J6 <SEP> J14 <tb> 1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 7 <SEP> 7 <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 0 <tb> 2 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 7 <SEP> 0 <SEP> 6 <SEP> 0 <tb> 3 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> 3 <SEP> 6 <SEP> 8 <SEP> 2 <tb> 4 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 7 <SEP> 6 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 0 <tb> 5 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 7 <SEP> 6 <SEP> 4 <SEP> 9 <SEP> 10 <SEP> 3 <tb> 6 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 6 <SEP> 0 <tb> 7 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 4 <SEP> 6 <SEP> 5 <SEP> 3 <SEP> 10 <SEP> 3 <tb> 8 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 0 <tb> 9 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 5 <SEP> 8 <SEP> 7 <SEP> 0 <SEP> 6 <SEP> 0 <tb> <SEP> 5,7 <SEP> 6,55 <SEP> 4,66 <SEP> 7,22 <tb> <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <tb> <SEP> -0,89 <SEP> -0,82 <SEP> -1,46 <SEP> -1,66 <tb> <SEP> < 0,001 <SEP> < 0,001 <SEP> < 0,001 <SEP> < 0,001 <SEP> NS <tb> c) Protection spécifique ci - Des lots de 10 souris malles, d'origine Swiss, ont été immunisés avec le polyoside de Streptococcus pneumoniae de type 1, obtenu selon l'exemple 4, par voie sous-cutanée (deux injections à une semaine d'intervalle); doses injectées : 0,47 - 4,7 - 47 et 470 g/kg. Le 10ème jour après la 2ème immunisation, les animaux ont été infectés avec le pneumocoque virulent du type 1, par voie sous-cutanée (1250 germes/animal). La mortalité après dix jours d'observation a été la suivante - animaux non traités 100 % - animaux traités 0,47g/kg 30 % - animaux traités 4,7ssg/kg 10 % - animaux traités 47ng/kg 30 % - animaux traités 470g/kg 40 % ss - Des lots de 10 souris mâles, d'origine Swiss, ont été immunisés avec le polyoside de KP2 par voie sous-cutanée (2 injections à une semaine d'intervalle- doses injectées: 53 - 533 - 5332g/kg. Le 8ème jour après le dernier traitement, les animaux ont été injectés avec la souche de Klebsiella pneumoniae type 2 à raison de 650 germes par animal. La mortalité après 10 jours d'observation a été la suivante - animaux non traités 100 % - animaux traités 53Fg/kg 0 % - animaux traité 533ssg/kg 0 % - animaux traités 5333ssg/kg 0 % Les polyosides obtenus selon la présente invention peuvent etre utilisés notamment pour la préparation des vaccins suivants a) vaccins destinés au traitement préventif et curatif des affections respiratoires aiguës et chroniques contenant un des polyosides purifiés correspondant à chacun des germes suivants Streptococcus pneumoniea Hemophilus influenzae, type b Klebsiella pneumoniae Escherichia coli A titre d'exemple 1) mélange de polyosides de S.pneumoniae, types 1, 6, 14, 23, ............................. 50 g polyoside de K.pneumoniae, type 2 20 tig oplyoside d'H.influenzae, type b ................ 20 g volume final 0,5 ml d'eau physiologique. 2) mélange de polyosides de S.pneumoniae, types 1, 6, 14, 23 ............................... 25 g polyoside de K.pneumoniae, type 2 ................10 g polyoside d'H.influenza, type b ...... 10 jig b) Vaccin antipneumococcique contenant les polyosides purifiés des types suivants de Streptococcus pneu moniae: 1, 3, 4, 6A, 7F, 8, 9N, 12F, 14, 18L, 19F, 23, 2, 11A, 15F. A titre d'exemples mélange à 50 g, dans un volume de 0,5 ml d'eau physiologique, mélange à 25Rg dans un volume de 0,5 ml d'eau physiologique.

Claims: REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention de polyosides capsulaires immunogènes à partir de bactéries capsulées les contenant, caractérisé en ce que l'on effectue une culture des bac téries en milieu synthétique ou semi-synthétique, à la fin de la phase de croissance de cette culture on sépare les corps microbiens d'une phase surnageante, on soumet cette phase surnageante à une filtration sur une membrane retenant les molécules d'une masse moléculaire égale ou supérieure à 100.000 daltons, obtenant ainsi un rétentat riche en polyosides capsulaires et l'on élimine les protéines, les acides nucléiques et les lipides de ce rétentat, obtenant ainsi un polyoside capsulaire purifié. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, pour éliminer les protéines, les acides nucléiques et les lipides du rétentat, on soumet le rétentat à une hydrolyse enzymatique, on ajoute un mélange butanolchloroforme, on sépare la phase aqueuse, on soumet la phase aqueuse à une dialyse et on effectue une filtration sur une membrane retenant les molécules ayant une masse moléculaire supérieure à 100.000 daltons. 3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendi cation 2, caractérisé en ce qu'on effectue la culture en milieu semi-synthétique contenant moins de 0,5 % en poids de produits d'origine naturelle. 4. Polyosides capsulaires obtenus par un procédé selon l'une quelconque des revendicatio ns 1 à 3. > 5. Polyosides capsulaires selon la revendication 4, caractérisés en ce qu'il sont obtenus à partir de Streptococcus pneumoniae, Hemophilus influenzae, Kleb siella pneumoniae ou Escherichia coli. 6. Polyosides capsulaires selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'ils sont obtenus à partir de Streptococcus pneumoniae. 7. Vaccin contenant au moins un polyoside capsu laire selon l'une quelconques des revendications 4 à 6. REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention de polyosides capsulaires immunogènes à partir de bactéries capsulées les contenant, caractérisé en ce que l'on effectue une culture des bactéries en milieu synthétique ou semi-synthétique, à la fin de la phase de croissance de cette culture on sépare les corps microbiens d'une phase surnageante, on soumet cette phase surnageante à une filtration sur une membrane retenant les itolécules d'une nuasse moléculaire égale au supérieure à 100.000 daltons, obtenant ainsi un rétentat riche en polyosides capsulaires et l'on élimine les protéines, les acides nucléiques et les lipides de ce rétentat, obtenant ainsi un polyoside capsulaire purifié. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, pour éliminer les protéines, les acides nucléiques et les lipides du rétentat, on soumet le rétentat à une hydrolyse enzymatique, on ajoute un mélange butanolchloroforme, on sépare la phase aqueuse1 on soumet la phase aqueuse à une dialyse et on effectue une filtration sur une membrane retenant les molécules ayant une masse moléculaire supérieure à 100.000 daltons. 3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendi cation 2, caractérisé en ce qu'on effectue la culture en milieu semi-synthétique contenant moins de 0,5 % en poids de produits d'origine naturelle.

Inventors: COUSIN, MIREILLE INSTITUT DE RECHERCHE, YAVORDIOS, DEMETRE INSTITUT DE RECHERCHE, Yavordios, Demètre INSTITUT DE RECHERCHE
Applicants: BERRI-BALZAC SOCIETE DITE:
Application year: 1982
Main classification: A61K39
IPC codes: C12P19, A61K39