REAGENT FOR THE DETERMINATION OF GLUCOSE IN BIOLOGICAL FLUIDS

Abstract: 1. An agent for detecting glucose in biological fluids, which essentially comprises an adsorbent matrix containing a chromogen, a glucose oxidase, a peroxidase and, optionally, a stabilizer, which contains a nitrate and, optionally, a UV absorber.

Description: Mittel zum Nachweis von Glucose in biologischen Flüssigkeiten Die Erfindung betrifft ein Mittel zum Nachweis von Glucose in biologischen Flüssigkeiten, das im wesentlichen aus einer adsorbierenden Matrix, einer Glucoseoxidase, einer Peroxidase und einem Chromogen als Reagenz besteht und ein Nitrat und gegebenenfalls einen UV-Absorber enthält. Der Diabetis mehl situs ist eine chronische Krankheit, die fortwährend überwacht werden muss. Es hat sich als sinnvoll erwiesen, dass der Diabetiker nach Einweisung durch den Arzt seine Stoffwechsel lage selber kontrolliert, um so gegebenenfalls sofort die notwendige Insulin-Dosis dem wechselnden Bedarf anpassen zu können. Die Stoffwechsel kontrolle wird so durchgeführt, dass der Glucose Gehalt routinemässig im Harn oder im Blut bestimmt wird. Im allgemeinen wird dabei vom Diabetiker der Harn-Glucose-Wert selber halbquantitativ bestimmt, während die quantitative Blutz-ucker-Messung dagegen vom Fachmann durchgeführt wird. Bei der Harn-Glucose-Bestimmung sollte ein Konzentra tionsbereich bis etwa 5 g Glucose/100 ml Harnerfasst werden. Zur Zeit gibt es zwei Methoden für die schnelle halbquantitative Glucose-Bestimmung: 1. Test-Tabletten entsprechend der unspezifischen Reduktionsmethode nach BENEDIKT und 2. Teststreifen, die mit der spezifisch reagierenden Glu cose-Oxidase, einem Chromogen und einer Peroxidase imprägniert sind. In den Teststreifen katalysiert die Glucoseoxidase die Oxidation von Glucose mit Sauerstoff zu Gluconolacton und Wasserstoffperoxid. In einer unspezifischen nachgeschalteten Reaktion oxydiert dieses unter Peroxidase Katalyse ein Chromogen zu einem Farbstoff. Die beiden erwähnten Methoden sind mit Nachteilen behaftet: Die Reduktionsmethode ist unspezifisch, da auch andere reduzierende Verbindungen wie beispielsweise Galactose erfasst werden. Weiterhin muss bei ihr mit ätzenden Reagenzien gearbeitet werden (G. Friedrich, "Der informierte Arzt" 8 (9), Separatum, 1980). Die Reaktion ist ausserdem bei einer nicht unerheblichen Wärmetönung mit einer störenden Schaumbildung verbunden. Die Handhabung der Teste mit Tabletten und Reagenzgläsern ist aufwendig, umständlich und teuer. Ähnliches gilt auch für die zweite Bestimmungsmethode. Da die semiquantitativen Urinteststreifen bisher nur einen Anzeigenbereich bis maximal 2 g Glucose/100 ml Urin umfassen, sind diese für die tagtägliche Routineuntersuchung nicht geeignet, weil höhere Glucose-Konzentrationen ebenfalls erfasst werden sollen. Zur Umgehung dieses Nachteils wird die Verwendung eines Verdünnungsbestecks vorgeschlagen (Sorge, Schlebusch, "Medizinische Klinik" 75, 587-591, 1980). Solche Verdünnungsbestecke sind für die einfache Routinebestimmung von Nachteil, da vom ungeübten Diabetiker Manipulationen erwartet werden, die er nicht beherrscht (Pipettieren, Verdünnen, Auswerten). Die Anforderungen an die Hygiene sind sehr hoch und nicht immer erfüllbar. Dem Diabetiker sollte demgegenüber ein einfacher, leicht zu beherrschender und hygienisch einwandfreier Test zur Verfügung gestellt werden, der einen möglichst grossen Konzentrationsbereich umfasst. Das Ziel der vorliegenden Erfindung war somit ein verbessertes Mittel zur Bestimmung von Glucose in biologischen Flüssigkeiten. Aus Biochem. Journal 42, 221 (1948) ist bekannt, dass die Glucoseoxidase zu 13 % von Natriumnitrat inhibiert wird. Diese Hemmwirkung ist für Glucose-Teststreifen, bei denen mit einem grossen Überschuss an Enzymen gearbeitet wird, so gering, dass von ihr bisher noch kein Gebrauch gemacht wurde. Eigene Versuche ergaben auch, dass ein entsprechender Schnel ltest zur Glucose-Bestimmung von Nitraten nicht inhibiert wird. Dagegen wurde nun überraschend gefunden, dass durch die Imprägnierung von Glucose-Teststreifen mit Nitraten deren Anzeigebereich wesentlich erweitert wird, besonders wenn hydrophierende Filme (H. Wishinsky in Quality Control in Clinical Chemistry; Amido, Rosalki, v.Kampen, S. 425, de Gruyter, Berlin 1975) verwendet werden. Es gelingt so, den Anzeigenbereich eines üblichen semiquantitativen Testbezirks, der bis maximal etwa 2 g Glucose/100 ml Harn reicht, bis auf über 5 g Glucose/100 ml Harn zu erweitern. Diese modifizierten Teststreifen entsprechen somit bezüglich ihres Anwendungsbereiches den Anforderungen, die ein Diabetiker an ein einfaches Diagnostikum stellt. Weiterhin erfüllt ein solcher Teststreifen die hygienischen Ansprüche. Es wurde weiterhin gefunden, dass durch den Zusatz von UV-Absorbern die Lichtbeständigkeit dieser Teststreifen verbessert werden kann. Die oben geschilderte Aufgabe wird nun dadurch gelöst, dass das Mittel neben den üblichen Bestandteilen ein Nitrat und gegebenenfalls einen UV-Absorber enthält. Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Mittel zum Nachweis von Glucose in biologischen Flüssigkeiten, bestehend im wesentlichen aus einer adsorbierenden Matrix, enthaltend ein Chromogen, eine Glucoseoxidase, eine Peroxidase und gegebenenfalls einen Stabilisator, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Nitrat und gegebenenfalls einen UV-Absorber enthält. Im weiteren Sinne ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung von Ammoniumnitrat oder eines Nitrats eines Elements aus der ersten Gruppe des Periodensystems, wobei Ammonium- und Natriumnitrat bevorzugt werden. Als UV Absorber können verwendet werden beispielsweise die Derivate des Benzophenons, der Benzoesäure, Oxalsäure oder des Benzotriazins. Verbindungen dieser Art werden beschrieben in "Ullmanns Enzyklopädie der technischen Chemie", 4. Auflage, Band 15, S. 259, Verlag Chemie, Weinheim, Bundesrepublik Deutschland. Bevorzugt werden 2,2'-Dihydroxy-4-methoxybenzophenon (Cyasorb UV 24, American Cyanamid), 2-Hydroxy4-methoxybenzophenpnsulfonsäure-(5) (UV-Absorber HMBS "Riedel", Riedel-de Haen AG, Seelze, Bundesrepublik Deutschland) oder Dihydroxybenzophenone. Das erfindungsgemässe Mittel besteht somit aus einer adsorbierenden Trägermatrix, in welche eine Glucoseoxidase,eine Peroxidase, ein Chromogen, ein wasserlösliches Nitrat und gegebenenfalls ein UV-Absorber eingelagert sind. Als Trägermatrix können alle saugfähigen, flächenförmigen Gebilde natürlichen oder synthetischen Ursprungs verwendet werden wie beispielsweise Vliese, Papiere, Asbest oder Folien aus Polymeren. Das Mittel wird zweckmässigerweise so zubereitet, dass das Chromogen, der Puffer und die Enzyme in wässriger Lösung gemeinsam mit dem Nitrat auf das Testpapier aufgetragen werden. In dieser Tränklösung kann der UV-Absorber ebenfalls gelöst werden. Es ist auch möglich, den UV-Absorber mit einem Hydrophobierungsmittel In einem weiteren Schritt auf die Trägermatrix aufzubringen. Die Reihenfolge der Tränkschrltte ist beliebig; es kann auch mit der Hydrophobierung begonnen werden. Bewährt hat sich ein Verfahren, bei dem zunächst ein Indikatorrohpapier mit Chromogen, Puffer, Enzymen, Netzmittel, Stabil isator, einem wasserlöslichen Nitrat und einem UV-Absorber imprägniert wird. Dann werden ein weiterer UV-Absorber und ein Hydrophobierungsmittel, beispielsweise Ethylcellulose, in einem organischen mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie Toluol, gelöst aufgetragen. Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung eines erfin dungsgemässen Mittels umfasst somit zwei Stufen. Nach dem Trocknen wird der Reaktionsträger zwecks leichterer Handhabung auf einen Kunststoff-Film laminiert. Die Menge des jeweils verwendeten Nitrats ist nicht kritisch; sie kann dem jeweiligen Verwendungszweck, das heisst dem zu umfassenden Konzentrationsbereich angepasst werden. Bezogen auf Ammoniumnitrat kann sie zwischen 0,1 und 7 t (v:v) liegen. Bevorzugt wird eine Konzentration zwischen 0,3 und 4,0 % (v:v). Auch die Menge der verwendeten UV-Adsorber ist nicht kritisch. Im allgemeinen wird für eine grössere Nitratmenge auch eine grössere Menge an UV-Absorber eingesetzt. Die maximale Konzentration des UV-Absorbers ist durch dessen Löslichkeit in dem ausgewählten Lösungsmittel begrenzt. Die Konzentrationen können schwanken zwischen 0,1 und 5,0 t (w:v), bevorzugt wird aber ein Konzentrationsbereich zwischen 0,4 und 3,0 t (w:v). Zur Verwendung des beschriebenen Mittels wird dieses kurz in die zu untersuchende Flüssigkeit eingetaucht. Abhängig von dem Gehalt der Flüssigkeit an Glucose entwickelt sich eine abgestufte Farbreaktion, die bis 5 g Glucose/100 ml Urin semiquantitativ abstufbar ist. Bei vergleichenden Untersuchungen mit Schnelldiagnostika gemäss dem Stand der Technik zeigt sich der Vorteil der Erfindung. Gemäss den Beispielen 1 bis 3 wurden drei Teststreifen Papiere hergestellt, von denen 1 a den Stand der Technik wiedergibt. 1 b wurde unter Verwendung eines wasserlöslichen Nitrats hergestellt. 1 c entspricht 1 b, jedoch wurde das Papier zusätzlich mit einem UV-Absorber impräg niet. Mit den konfektionierten Papieren wurden folgende Versuche durchgeführt: Die Papiere 1 a, 1 b und 1 c wurden dem Sonnenlicht ausgesetzt. 1 b verfärbt sich hierbei in etwa 20 min. so stark grün, dass es nach dem anschliessenden Benetzen mit einer Glucose-freien Lösung falsch positiv interpretiert wird. Die Papiere 1 a und 1 c verändern dagegen auch nach 60 min. ihre Grundfarbe nicht. In einer weiteren Versuchsreihe wurden die Papiere 1 a und 1 c in Urine eingetaucht, die 50, 150, 500, 1500, 3000 und 5000 mg/Glucose/100 ml Urin enthalten. Mit dem Papier 1 a können die Konzentrationsstufen bis 1500 mg/dl gut unterschieden werden, die beiden höheren Glucose-Konzentrationen werden nicht mehr erkannt. Dagegen kann mit Papier 1 c das gesamte Spektrum von 50 mg Glucose/100 ml Urin bis 5000 mg Glucose/100 ml Urin unterschieden werden. Mit den folgenden Beispielen wird die Erfindung näher erläutert. Beispiel 1 / Papier 1 a Lösung 1 In 100 ml 0,1 M Citratpuffer pH 5,5 werden gelöst 0,5 g Gelatine 7,0 mg Tatrazin 0,6 g o-Tolldin-di-hydrochlorid 0,2 g Peroxidase 0,3 g Glucoseoxldase 1,0 g Polyethylenglycol 1500 Papier 2316 von Schleicher und Schüll,Dassel, Bundesrepublik Deutschland, wird mit dieser Tränklösung imprägniert. Nach dem Trocknen bei 80 0C im Trockenschrank wird das Papier nachimprägniert mit Lösung 2, die 0,6 g Ethylcellulose In 100 ml Toluol enthält. Beispiel 2 / Papier 1 b Entsprechend Beispiel 1 wird ein Papier 1 b so hergestellt, dass in der Lösung 1 noch 2 g Ammoniumnitrat gelöst werden. Die Nachimprägnlerung erfolgt mit Lösung 2. Beispiel 3 / Papier 1 c In 100 ml der Tränklösung 1 gemäss Beispiel 1 werden noch 2,0 9 Ammoniumnitrat und 1,0 g UV-Absorber HMBS "Riedel" gelöst. In 100 ml Toluol werden für die Nachimprägnierung 0,5 g Ethylcellulose und 2,0 g Cyasorb, Cyanamid, gelöst. Die Papiere 1 a, 1 b und 7 c zeigen die früher beschriebenen Eigenschaften.

Claims: Patentansprüche: 1. Mittel zum Nachweis von Glucose in biologischen Flüssigkeiten, bestehend im wesentlichen aus einer adsorbierenden Matrix enthaltend ein Chromogen, eine Glucoseoxldase, eine Peroxidase und gegebenenfalls einen Stablllsator, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Nitrat und gegebenenfalls einen UV-Absorber enthält. 2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Nitrat ein Nitrat eines Elements aus der ersten Gruppe des Periodensystems oder Ammoniumnitrat ist. 3. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der UV-Absorber ein Derivat der Benzoesäure, des Benzophenons, der Oxalsäure oder ein Benzotriazin ist. 4. Mittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Nitrat Ammonium- oder Natriumnitrat ist. 5. Mittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der UV-Absorber 2,2'-Dihydroxy-4-methoxybenzophenon und 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenonsul fonsäure-(5) ist. 6. Verfahren zur Herstellung eines Mittels gemäss An spruch 1, da durch gekennzeichnet, dass ein Träger mit einer wässrigen Lösung, die das Nitrat, gegebenen falls den UV-Absorber, die Enzyme und das Chromogen enthält, nach einer Trocknung mit einer mit Wasser nicht mischbaren Lösung, die einen weiteren UV-Absor ber und ein Hydrophobierungsmittel enthält, behandelt wird.

Inventors: KOHL, HELMUT, DR.
Applicants: BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1982
Main classification: C12Q1
IPC codes: C12Q1, G01N33