INSULIN ANALOGUES

Abstract: 1. Claims for Contracting States : BE, LI, DE, FR, GB, IT, NL, SE Insulin of the formula I see diagramm : EP0046979,P10,F1 in which X denotes Thr or OH and Y denotes Asp or Asn. 1. Claims for Contracting States : AT A process for the preparation of an insulin of the formula I, see diagramm : EP0046979,P12,F1 in which X denotes Thr or OH and Y denotes Asp or Asn, which comprises a) converting human insulin, desamido**A21 -human insulin, des-Thr**B30 -human insulin, desamido**A21 -des-Thr**B30 -human insulin, des-Ala**B30 -swine insulin or desamido**A21 - des-Ala**B30 swine insulin into the N**alpha AI -N**vepsiln B29 -bis-Boc compound and subjecting this to Edman degradation, b) treating des-Phe**BI -human insulin or des-Phe**BI -des-Ala**B20 -swine insulin with acid, or c) treating a compound of the formula I in which X denotes Ala with carboxypeptidase A.

Description: Neue Analoga des Insulins Die Erfindung betrifft Insuline der Formel 1 EMI1.1 Die neuen Verbindungen besitzen mit Ausnahme einer geringfügigen Veränderung die Aminosäuresequenz des Humaninsulins. Insuline mit fehlendem B1-Phenylalanin sind bereits bekannt, jedoch ist das DesB1-Phenylalanin-humaninsulin (des PheB1-humaninsulin) bisher noch nicht beschrieben worden. Nachdem nunmehr Humaninsulin als Ausgangsprodukt für Versuchszwecke auf mehreren Wegen hergestellt werden kann, war es erstmals möglich, die vorteilhaften Eigenschaften von Des-PheB1-humaninsulin (Formel I mit X = Thr, Y = Asn) zu erkennen. Bei den erfindungsgemässen Verbindungen mit X = Thr ist ganz allgemein die Löslichkeit gegenüber den Verbindungen, die noch pheB1 enthalten, beträchtlich erhöht, so dass hochkonzentrierte Lösungen hergestellt werden können wie sie für Insulinpumpen benötigt werden. Darüberhinaus besitzen diese Verbindungen Vorzüge auf immunologischem Gebiet insofern, als sie in geringerem Masse die Bildung von Antikörpern hervorrufen. Bei der Langzeitbehandlung mit Insulinen spielt bekanntlich die Erzeugung von Antikörpern eine kritische Rolle, die sogar durch homologes Insulin induziert werden kann. So ist z.B. beobachtet worden, dass auch Humaninsulin beim Menschen Antikörper zu erzeugen vermag. Ein empfindliches Testmodell für die Erzeugung von Antikörpern ist die Ziege, die in Anwesenheit von Freund'schem Adjuvans gegen Schweineinsulin und gegen Humaninsulin sehr rasch Antikörper bildet. Nach Diabetes 27 (1978), Seite 14, Abb. 4 ist die Bindekapazität von Antikörpern gegen das heterologe Des-PheB1-insulin vom Schwein niedriger und die Antikörperbildung erfolgt langsamer als beim unveränderten Schweineinsulin oder selbst beim homologen Schafin sulin. Die erfindungsgemässen Verbindungen, vor allem die mit X = OH, bewirken in diesem Testmodell eine weiter verlangsamte Antikörperbildung und die Bindekapazität gegen über der von Des-PheB1-insulin vom Schwein wird nochmals um 15 % verringert. Ähnlich wie Humaninsulin zeigen auch die erfindungsgemässen Verbindungen bei der Behandlung des Menschen gegenüber dem Schweineinsulin den Vorteil einer besseren Glucosetoleranz. Diese Eigenschaft wird offensichtlich durch die Abspaltung von PheBi nicht verändert. Darüberhinaus verfügt insbesondere das DesPheBI -Humanin- sulin (I mit X = Thr) über eine rasch einsetzende und lange anhaltende Wirkung. Spaltet man zusätzlich zu PheBi aus dem Humaninsulin noch ThrB30 (I mit X = OH) enzymatisch ab, so bleiben alle genannten vorteilhaften Eigenschaften des Des-PheB1-humaninsulins erhalten. Dasselbe gilt für die Verbindung, die anstelle von AsnA2l mit AspA21 eine zusätzliche Carboxylgruppe trägt (I mit X = OH, Y = Asp). In diesem Fall tritt sogar eine weitere Erhöhung der Löslichkeit ein, die vor allem im neutralen und schwach alkalischen Bereich sichtbar wird. Der besondere ökonomische Vorteil der Verbindungen I mit X = OH liegt darin, dass bei der Herstellung nicht das zur Zeit noch immer sehr schwer zugängliche Humaninsulin eingesetzt werden muss, sondern Schweineinsulin verwendet werden kann. Schweineinsulin unterscheidet sich von Humaninsulin nur in der Aminosäure B30 (Ala statt Thr) und wird nach Abspalten dieser Aminosäure mit Des-ThrB30-humaninsulin identisch. Die Abspaltung von AlaB30 aus Schweineinsulin ist schon in der US-Patentschrift 3,36lot,116 beschrieben worden. Des AlaB30-Schweineinsulin unterscheidet sich aber hinsichtlich seiner immunologischen Eigenschaftendnur wenig von Schwei neinsulin. Dagegen löst die zusätzliche Entfernung von PheBi strukturelle Veränderungen im Insulinmolekül aus, die für die vorteilhaften biologischen Eigenschaften verantwortlich sind. Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung der Insuline der Formel I. Dieses ist dadurch gekennzeichnet, dass man a) Humaninsulin DesamidoA21-Humaninsulin Des-ThrB30-Humaninsulin DesamidoA21-des-ThrB30-Humaninsulin Des-Al B30 chweieinsulin oder Desamido des AlaB30 Schweineinsulin in die N&alpha;A1-N #B29-Bis-Boc-Verbindung überführt und diese einem Edman-Abbau unterwirft, b) Des-PheB -Humaninsulin oder Des-PheB1 -des-AlaB20 Schweineinsulin mit Säure behandelt, oder c) eine Verbindung der Formel I, in der X Ala bedeutet, mit Carboxypeptidase A behandelt. Zur Herstellung der erfindungsgemässen Verbindungen mit X = Thr und Y = Asn geht man von Humaninsulin aus, das analog dem DBP 2 005 658 in die entsprechende Des-PheB1 Verbindung übergeführt wird. Zur Herstellung der Verbindung I mit X = OH und r = Asn geht man von Des-Al B30 . hweineinsulin aus, hergestellt z.B. nach Hoppe-Seyler's Z.Physiol.Chem. 359 (1978), Seite 799, durch enzymatische Abspaltung von AlaB30 und spaltet PheB1 analog dem DBP 2 005 658 ab. Man kann die Reihenfolge der Schritte auch uskenren und zunächst Phe Bi chemisch und anschliessend AlaB30 enzymatisch abspalten. Soll Y = Asp sein, so werden die Ausgangsverbindungen zunächst in bekannter Weise bei pH 2 - 3 mit wässriger Säure behandelt und durch Ionenaustauschchromatographie gerei nigt. PheBl bz. AlaB30 werden sodann wie oben beschrieben entfernt. Man kann die Säurebehandlung auch nach Abspalten von PheBl und gegebenenfalls AlaB30 vornehmen. Dies hat den Vorteil, dass bei der Endreinigung durch Ionenaustauscherchromatogra phie ein sehr einheitliches Produkt erscheint. Man kommt so mit 1 - 2 Reinigungsoperationen aus, während man beim umgekehrten Verfahren meist einen weiteren Reinigungsschritt benötigt. Die neuen Humaninsulin-Analoga werden zur Behandlung des Diabetes mellitus eingesetzt und können wegen ihrer sehr guten Löslichkeit bei pH 7 - 7.5 auch in der Insulinpumpe in einer Konzentration von etwa 10 % verwendet werden. Die Dosierung hängt von der Einstellung des Patienten ab und entspricht etwa der von Schweineinsulin, kann aber bei Patienten mit erhöhtem Antikörpertiter wesentlich niedriger liegen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine pharmazeutische Zubereitung der Verbindungen der Formel I, enthaltend eine Verbindung der Formel I in gelöster oder amorpher Form neben einer Verbindung der Formel I, die jedoch zusätzlich Phenylalanin in B1 enthält, in kristalliner Form. Die neuen Humaninsulin-Analoga können natürlich auch zusammen mit Verbindungen verwendet werden, die PheB1 noch enthalten. Sie liegen dann in gelöster oder amorpher Form vor während die PheB1-haltigen Verbindungen kristallin eingesetzt werden. Zweiphasige Insuline, bei denen rascher Wirkungseintritt mit langer Wirkdauer verbunden ist, sind an sich bekannt. Sie sind z.B. in der DOS 24 59 515 (HOE 74/F 377) und der DOS 22 56 215 (HOE 72/F 348) beschrieben. Die neuen erfindungsgemässen Zubereitungen werden analog den dort für Schweineinsulin gegebenen Vorschriften hergestellt. Eine andere Zubereitungsform, bei der eine Verbindung der Formel I mit Y = Asp in Lösung neben der entsprechenden mit Y = Asn in kristalliner Form vorliegt, ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Sie kann analog der DOS 28 03 996 hergestellt werden. BEISPIELE Die Charakterisierung der Zwischen- und Endprodukte erfolgte durch Papier- und Gel-Elektrophorese bei pH 2 und 8.3, durch Aminosäureanalyse, Dünnschichtchromatographie und HPLC in den bekannten Systemen. Beispiel 1: Des-PheB1-humaninsulin a) 1 g Humaninsulin werden in 70 ml 80-prozentigem, wässri gem Dimethylacetamid aufgenommen. Man gibt 1.45 g tert. Butyloxycarbonylazid und 3.3 ml 1N Natriumhydrogencar bonat zu und rührt 5 Stunden bei 35 0C. Dann wird die Lösung bei höchstens 500 C Badtemperatur eingeengt. Den Rückstand verreibt man mit Ether und digeriert ihn mit 10 ml 2-prozentiger Essigsäure. Ausbeute 942 mg N CA1 NEB29 vom vom Menschen. b) Die erhaltene Verbindung wird in 4 ccm 95-prozentigem Pyridin gelöst. Man gibt 0.03 ccm Phenylisothiocyanat zu und rührt 4 Stunden bei Raumtemperatur. Dann wird im Vakuum bei höchstens 50 0C Badtemperatur auf ein kleines Volumen eingeengt und die Verbindung mit Äther ausge fällt. Ausbeute: 830 mg N&alpha;(A1),N#(B29)-Di-tert.-Butyloxyearbo- nyl-N&alpha;(B1)-phenylehiocarbamoyl-humaninsulin c) 820 mg der nach b) hergestellten Verbindung werden 1 Stunde in 8,5 ccm Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur aufbewahrt. Auf Zusatz von 100 ccm Äther fallen 725 mg Des-Phenylalanin B1 -humaninsulin aus, die in bekannter Weise bei pH 5,0 bis 5,5 zur Kristallisation gebracht werden können. Phe Ber. 2.00, gef. 2.02 Beispiel 2: DesPheBldes ThrB3Ohumaninsulin a) 1.0 g Des-AlaB30-schweineinsulin, hergestellt nach Hop pe-Seyler's Z.Physiol.Chem. 359 (1978), Seite 799, wer den analog Beispiel 1a - c umgesetzt. Man erhält 710 mg der Titelverbindung, die durch Chromatographie an einer Säule Sephadex G 50 superfein 1 x 100 cm in 1-prozenti ger Essigsäure gereinigt werden kann. Ausbeute 623 mg. Kristallisation bei pH 5.4. Phe Ber. 2.00, gef. 1.99 b) 500 mg Des?heBlschweineinsulin, hergestellt analog Beispiel 1 aus Schweineinsulin, werden in 100 ml 0.1M Ammoniumhydrogencarbonatpuffer bei pH 8.2 gelöst. Man gibt 3 mg Carboxypeptldase A zu, hält 15 Stunden bei Raumtemperatur und lyophilisiert dann. Zur Entfernung von Salzen wird in 1-prozentiger Essigsäure über eine Sephadex G 15-Säule 1 x 50 cm chromatographiert. Zur weiteren Reinigung wurde in 30-prozentigem Isopro panol mit 0.05M Tris-Puffer bei pH 8 und einem NaCl-Gra dienten von 0 bis 0.25M in einer Säule 2.5 x 50 cm DEAE-Sephadex A-25 chromatographiert. Das Eluat wurde durch Dialyse gegen destilliertes Wasser entsalzt und lyophilisiert. Ausbeute 276 mg. Phe Ber. 2, gef. 1.98; Ala Ber. 1, gef. 1.01 Beispiel 3: D PheB1-/RspA21 7humaninsulin a) 0.5 g [AspA21 7Humaninsulin, hergestellt durch 3-tägiges Aufbewahren von Humaninsulin in wässriger Trifluoressig säure bei pH 2, Gefriertrocknen und Reinigung durch Chromatographie an DEAE-Sephadex A-25 analog Beispiel 2b) werden analog Beispiel 1a - c) umgesetzt. Man erhält nach Chromatographie analog Beipiel 2a) 324 mg der Titelverbindung. Phe Ber. 2, gef. 2.02 Charakterisierung in der Gel-Elektrophorese bei pH 8. Die Laufstrecke entspricht der von Desamidoinsulin (ge ringfügige Abweichung durch das fehlende Phenylalanin). b) 0.5 g Des-PheB1-humainsulin, hergestellt nach Beispiel 1, werden wie unter a) beschrieben in wässriger Trifluor essigsäure aufbewahrt und anschliessend an DEAE-Sephadex A-25 gereinigt. Man kristallisiert in bekannter Weise bei pH 5.0 und erhält 365 mg der Titelverbindung, die mit der nach a) hergestellten identisch ist. Beispiel 4: Des-PheB1-des-ThB30 - [AspA21 7humaninsulin 0.5 g Des-PheB1-des-ThrB30-humaninsulin, hergestelle nach Beispiel 2, werden nach Beispiel 3b) mit Säure behandelt wld gereinigt. Ausbeute 344 mg Phe Ber. 2, gef. 1.99; Ala Ber. 1, gef. 1.02 Weitere Charakterisierung durch Gelelektrophorese bei pH 8 analog Beispiel 3a).

Claims: Patentansprüche: 1. Insulin der Formel I EMI9.1 worin X Thr oder OH und Y Asp oder Asn bedeuten. 2. Verfahren zur Herstellung eines Insulins der Formel I, dadurch gekennzeichnet, dass man a) Humaninsulin Desamido A21 -Humaninsulin Des-ThrB30-Humaninsulin Desamido A2 -des-ThrB30-Humaninsulin Des-AlaB30-Schweineinsulin oder Desamido A21-des-AlaB30-Schweineinsulin in die N &alpha;A1-N #B29-Bis-Boc-Verbindung überführt und diese einem Edman-Abbau unterwirft, b) Des-PheB1-Humaninsulill oder Des-PheB1-des-AlaB20-Schweineinsulin mit Säure behandelt, oder c) eine Verbindung der Formel I, in der X Ala bedeutet, mit Carboxypeptidase A behandelt. 3. Pharmazeutische Zubereitung enthaltend eine Verbindung der Formel I in gelöster oder amorpher Form neben einer Verbindung der Formel I, die jedoch zusätzlich Phenylalanin in B1 enthält, in kristalliner Form. 4. Pharmazeutische Zubereitung enthaltend eine Verbindung der Formel I mit Y = Asparaginsäure in gelöster Form und eine Verbindung der Formel I mit Y = Asparagin in kristalliner Form. Patentansprüche Österreich: 1. Verfahren zur Herstellung eines Insulins der Formel I EMI11.1 worin X Thr oder OH und Y Asp oder Asn bedeuten, dadurch gekennzeichnet, dass man a) Humaninsulin DesamidoA2l -Humaninsulin Des-ThrB30-Humaninsulin DeSamidoA21-des-ThrB30- Uumaninsulin Des-Ala330-Schweineinsulin oder Desamido A21 -des-Ala Schweineinsulin in die N&alpha;A1-N#B29-Bis-Boc-Verbindung überführt und diese einem Edman-Abbau unterwirft, b) Des-PheB1-Humaninsulin oder Des-PheB1-des-AlaB20-Schweineinsulin mit Säure behandelt, oder c) eine Verbindung der Formel I, in der X Ala bedeutet, mit Carboxypeptidase A behandelt. 2. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zube reitung, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der Formel I in gelöster oder amorpher Form mit einer Verbindung der Formel I, die jedoch zusätzlich Phenyl alanin in B1 enthält, in kristalliner Form zusammengibt. 3. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zube reitung, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der Formel I mit Y = Asparaginsäure in gelöster Form mit einer Verbindung der Formel I mit Y = Asparagin in kristalliner Form zusammengibt.

Inventors: GEIGER, ROLF, PROF. DR.
Applicants: HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1981
Main classification: C07C103
IPC codes: A61P3, C07K16, C07K14, C07K1, A61K38