METHOD OF PREPARING LIPID VESICLES BY ULTRASONIC TREATMENT, THE USE OF THIS METHOD AND APPARATUS FOR ITS APPLICATION

Abstract: 1. A method of preparing lipid vesicles from biological membranes or lipid suspensions, in which the lipid suspensions or lipid particles to be desintegrated are ultrasonically treated in a dispersion fluid inside a treatment container at a substantially constant temperature, characterized in that the size respectively size distribution of the lipid vesicles, effective for the desired purpose, and the optimum ultrasonic frequency and intensity in the dispersion fluid required for obtaining this size respectively this size distribution are determined, and that the thus determined optimum ultrasonic frequency and intensity, with the other constant conditions, are maintained constant in such a manner that during the ultrasonic treatment the actuel value of frequency and intensity of the ultrasonic field in the reaction medium is continuously measured and the output power and the frequency of the electric generator supplying the sound transmitter are controlled in dependence upon the actuel value of the frequency and intensity of the ultrasonic field.

Description: Beschreibung Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von uniformen, unilamellaren sogenannten kleinen Lipid-Vesikeln, insbesondere ein Verfahren zum Überführen von lamellär angeordneten Lipiden in Lipidvesikel, bei dem die zu desin- tegrierenden Lipid-Strukturen (Lamellen) in einer Suspensionsflüssigkeit innerhalb eines Beschallungsgefässes bei im wesentlichen konstanter Temperatur einer Ultraschallbehandlung unterworfen werden. Die Erfindung umfasst ferner geeignete Vorrichtungen zur Durchführung des Verfahrens. Lipid-Vesikel werden zum Beispiel für medizinischtherapeutische und wissenschaftliche Zwecke benötigt. Arzneimittel, die einen intrazellulären Wirkort haben, müssen die Zell-Membran passieren können. Viele Effektoren, die den intrazellulären Stoffwechsel kontrollieren und in der Zelle gebildet werden, können die Zelle weder verlassen noch in diese von aussen eindringen. Der therapeutische Einsatz dieser Stoff-Klasse macht daher einen Transportmechanismus erforderlich, der es erlaubt, nicht-membran-permeable Stoffe in die Zellen hineinzuschleusen, ohne dass diese Stoffe die Zellen wieder verlassen können. Ein solcher Transportmechanismus soil darüberhinaus möglichst unabhängig von dem zu transportierenden Wirkstoff sein, also jede Art von Effektor transportieren können, andererseits aber Zell-spezifisch sein, d.h. den Transport nur in bestimmte Zellen ermöglichen. Ein Transport-System mit den oben genann Eigenschaften stellen Lipid-Vesikel dar, welche die verschiedensten Stoffe einschliessen können, wie Enzyme, Arzneimittel, Chelat-bildende Substanzen, Hormone, Zell-Effektoren, Antigene, Antikörper, Interferon-Induktoren und Gene. In den Lipid-Vesikeln sind das Lösungsmittel und die im Lösungsmittel gelösten Stoffe von Phospholipid-Doppelschichtmembranen umschlossen. Die Lipid-Membran hat eine Dicke von 4 nm, die Vesikel können einen Durchmesser von 25 bis 120 nm annehmen. Die Grösse der Vesikel lässt sich mit Hilfe der Laser-Lichtstreuung, durch Ultrazentrifugation, Gelfiltration oder im Raster Elektronenmikroskop bestimmen. Ein wichtiges Anwendungsgebiet der Lipid-Vesikel ist die Inkorporierung von Inositolhexaphosphat (IHP) in rote Blutzellen nach dem von Y.C. Nicolau und K. Gersonde beschriebenen Verfahren (tJS-Patent 4.192.869), zur Herabsetzung der Sauerstoff-Affinität des Hämoglobins. Man weiss nämlich, dass z.B. bei der Lagerung von Blutkonserven die Sauerstoff-Affinität des Hämoglobins in den roten Blutzellen ständig zunimmt. Ebenso beobachtet man bei bestimmten Krankheiten eine erhöhte Sauerstoff-Affinität des Hämoglobins. Diese erhöhte Sauerstoff-Affinität führt dazu, dass nur ein geringer Anteil des Sauerstoffs, der an Hämoglobin gebunden ist und im Blut zirkuliert, tatsächlich an das Gewebe abgegeben wird. Diese hohe 02-Affinität des Hämoglobins kann durch Bindung von bestimmten Effektoren an das Hämoglobin herabgesetzt werden. Der stärkste Effektor dieser Art ist das Inositolhexaphosphat (IHP). Die Inkorporierung von THP wird erreicht dadurch, dass intakte Zellen mit IHP-bela denen Lipid-Vesikeln inkubiert werden, wobei durch Fusion der Lipid-Membranen der Zelle und der Vesikel IHP in die Zelle eingeschleust wird und dort seine Wirkung erzielt, nämlich die Veränderung der 02 Affinität des Hämoglobins, messbar als "Rechtsverschiebung" der Hämoglobin02-Dissoziationskurve. Nach Rückkehr dieser IHPbeladenen roten Blutzellen in den Kreislauf wird ein erheblich höherer Anteil der in den roten Blutzellen gespeicherten 02- Menge in der Peripherie abgegeben. Diese Eigenschaft der modifizierten roten Blutzellen bleibt während des gesamten Lebens der Zelle erhalten. Für die Inkorporierung von Inositolhexaphosphat in rote Blutzellen werden kleine, unilamellare IHP-beladene Lipid-Vesikel mit einem Durchmesser von 20 bis 50 nm benötigt. Es ist bekannt, Lipid Vesikel durch Des integration von Lipid-Suspensionen im Ultraschallfeld herzustellen. Der Fortschritt in der Anwendung von Lipid-Vesikeln in der Therapie vollzieht sich bisher nur sehr langsam, da die Herstellung von für die Fusion mit den roten Blutzellen geeigneten Lipid-Vesikeln in ausreichender Menge mit erheblichen Schwierigkeiten verbunden ist. Die für diesen Zweck geeigneten Lipid-Vesikel müssen nämlich nicht nur in grossen Mengen hergestellt werden können, sondern auch reproduzierbar von einheitlicher Grösse und somit dosierbar in der therapeutischen Anwendung sein. Die nachträgliche Anwendung von Trennverfahren zum Abtrennen geeigneter Fraktionen der Lipid-Vesikel wirft vielerlei Probleme auf, z.B. Aufrechterhaltung der Sterilität und Anwendung aufwendiger und zeitraubender Trenn-Techniken, die die biologische Effektivität der Vesikel, die nur eine Halb-Lebenszeit von ca. 1 Tag haben, stark vermindern. Das einzige Verfahren, das die Herstellung grosser Mengen von Vesikeln in kurzer Zeit erlaubt, ist die Desintegration im Ultraschall. Ausser von der Art und Zusammensetzung der Lipid-Membran der Vesikel hängen der Erfolg und die Reproduzierbarkeit der wissenschaftlichen Untersuchung bzw. der therapeutischen Behandlung, d.h. Einschleusung von IHP in rote Blutzellen,wesentlich von der Grösse der Lipid-Vesikel ab. Die Kontrolle, ob sich bei der Desintegration der Lipid-Suspension die Lipid-Vesikel in ausreichender Homogenität und somit Qualität und in ausreichender Menge gebildet haben, erfolgt in der Weise, dass man mit den hergestellten Lipid-Vesikeln die gewünschten IHP-Einschleusungsversuche in rote Blutzellen- durchführt, das intrazelluläre IHP chemisch nachweist und die Hämoglobin-02 - Dissoziationskurve intakter Zellen misst bzw. die gewünschte biologische oder therapeutische Wirkung der IHP-beladenen roten Blutzellen im Tierversuch nachweist. Die Ergebnisse der Versuche bzw. der Erfolg der Behandlung können also erst nach aufwendigen Experimenten beurteilt werden, und der Erfolg der Ultraschallbehandlung, nämlich die Herstellung von für die Fusion mit den roten Blutzellen befähigten Vesikeln, erst im Nachhinein erkannt werden. Es hat sich gezeigt, dass die Herstellung von Lipid Vesikeln - insbesondere in grossen Volumina, wie sie für therapeutische Verfahren erforderlich sind mit gleichbleibenden Eigenschaften mit Hilfe der bekannten Ultraschall-Technik schwierig ist. Trotz Einhaltung anscheinend völlig gleicher äusserer Bedingungen bei der Desintegration der Lipid Suspensionen im Ultraschallfeld gelingt es bisher nicht, stets die gleiche Ausbeute an sogenannten kleinen unilamellaren und somit fusionswirksamen Lipid-Vesikeln zu erhalten. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, das eingangs genannte Verfahren zur Herstellung von Lipid-Vesikeln, die erfolgreich Effektoren in Zellen einschleusen, dahingehend weiterzuentwickeln, dass der Wirkungsgrad des Verfahrens erhöht wird, und dass in reproduzierbarer Weise eine hohe Ausbeute an für den jeweils gewünschten Zweck hochwirksamen Lipid-Vesikeln erzielt wird. Die Erfindung besteht darin, dass die für den gewünschten Zweck wirksamste Vesikelgrösse bzw. Vesikelgrössenverteilung, sowie die für die Erzielung dieser Vesikelgrösse bzw. Vesikelgrössenverteilung optimale Ultraschall-Frequenz und -Intensität ermittelt wird, und dass die so ermittelte optimale Ultraschall-Frequenz und -Intensität bei im übrigen gleichen Behandlungsbedingungen dadurch konstantgehalten wird, dass während der Ultraschallbehandlung der Istwert der Frequenz und der Intensität des Ultraschallfeldes in dem Reaktionsmedium fortlaufend gemessen, und in Abhängigkeit von diesem Istwert die Ausgangsleistung und die Frequenz des den Schwingungsgeber speisenden elektrischen Generators geregelt wird. Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass bei Verwendung der Vesikel zu therapeutischen Zwecken Grösse bzw. Grössenverteilung der Vesikel für die Wirksamkeit derselben von ausschlaggebender Bedeutung ist, und dass andererseits die Grösse und Homogenität der im Ultraschallfeld erzeugten Vesikel in empfindlicher Weise von der Konstanz und Intensität des auf die Lipide einwirkenden Ultraschallfeldes abhängen. Während es bisher üblich ist, die in den Schallgeber eingekoppelte Schallenergie zu messen und konstant zu halten, schlägt die Erfindung vor, die in dem Reaktionsmedium wirksame Schallenergie zu messen und gezielt zu verändern, und zwar in der Weise, dass die effektive Schallenergie im Reaktionsmedium selbst auf ihrem optimalen Wert konstantgehalten wird. Durch das Messen der effektiven Schallenergie im Reaktionsmedium selbst, und durch die Verwendung dieses Istwertes zum Regeln der eingekoppelten Schallenergie, werden alle Einflüsse kompensiert, die die effektive Schallintensität und die Schallfrequenz am Vesikel-Bildungsort beeinflussen, wie z.B. unterschiedliche und sich verändernde Absorption der Schallenergie mit fortschreitender Reaktion, sich ändernde geometrische Verhältnisse innerhalb des Reaktionsmediums bei Auftreten von Gasbläschen während der Ultraschallbehandlung, sowie Reflexion eines Frequenzbandes von Schallwellen, das sich mit den vom Schallgeber abgestrahlten Schallwellen überlagert, und gegebenen falls bei phasenverschobener Oberlagerung bis zur Auslöschung der Schallenergie führt. Wenn man also gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren zunächst mit Hilfe der bekannten Untersuchungsmethoden den für den jeweiligen Zweck optimalen Vesikeldurchmesser bzw. die optimale Verteilungskurve der wirksamsten Vesikeldurchmesser feststellt, sodann in einer weiteren Versuchsreihe die optimalen Ultraschallbedingungen wie Frequenz und Schalldruck ermittelt, die zu der gewünschten Verteilungskurve führen, und dann die so ermittelte optimale Ultraschallintensität und Ultraschallfrequenz innerhalb des Reaktionsmediums während der Reaktionsdauer konstant hält, erhält man eine sehr hohe Ausbeute an für den jeweiligen Zweck ausserordentlich wirkungsvollen Lipid-Vesikeln. Das erfindungsgemässe Verfahren lässt sich nicht nur für die Herstellung von Lipid-Vesikeln, sondern mit demselben Erfolg auch zum Behandeln von natürlichen biologischen Membranen und deren Umwandlung in Vesikel anwenden, beispielsweise bei der Erforschung von Funktion und Struktur von Membran Enzymen. Auch hierfür ist es nämlich erforderlich, die Membran-Enzyme reproduzierbar in Vesikel bestimmter Grösse zu überführen, was nach den bekannten Verfahren nicht mit ausreichender Sicherheit möglich ist. Weitere Einzelheiten und Vorteile des erfindungsgemässen Verfahrens werden nachfolgend anhand der Zeichnungen und anhand von Ausführungsbeispielen näher beschrieben. Von den Zeichnungen zeigt: Fig. 1 eine für die Herstellung von klei neren Mengen von Lipid-Vesikel Suspensionen geeignete Vorrichtung mit den Merkmalen der Erfindung, teilweise in schematischer Darstel lung, und Fig. 2 eine für die Herstellung von Lipid Vesikel-Suspensionen in Steril Packungen für den klinischen Ge brauch in Liter-Quantitäten geeig nete Vorrichtung, ebenfalls in teilweise schematischer Darstellung. Das Reaktionsmedium 1 in Form einer Suspension eines Lipides in einem geeigneten Dispersionsmittel befindet sich in dem inneren zylinderförmagen Rohr 2 des doppelwandigen gläsernen Reaktionsgefässes 3. Der Boden des Reaktionsgefässes 3 weist eine zu dem Reaktionsraum 3 durchgehende Öffnung auf, in die ein Schallaufnehmer 5 eingesetzt ist. Der Schallaufnehmer 5 ist mit Hilfe einer Epoxidharzschicht 6 mit der die Öffnung umgebenden Wand 7 verklebt und abgedichtet. Von oben taucht in das Reaktionsmedium 1 ein Ultraschall-Schwingungsgeber 8 ein. Der aus dem Reaktionsgefäss 3 oben herausragende Teil 9 des Schwingungsgebers 8 ist mit einer Kupplung 9 für den Stromanschluss versehen. Durch die doppelte Wand des Reaktionsgefässes wird ein Hohlraum 10 gebildet, der von Kühlwasser durchströmt ist. Die Rohrstutzen 11 und 12 dienen zur Zuleitung bzw. zur Abführung des Kühlwassers. Der Rohrstutzen 13 führt in den Reaktionsraum oberhalb des Reaktionsmediums 1 und dient zur Zuführung eines Inertgases wie Argon. Nach oben ist der Reaktionsraum abgeschlossen durch einen Deckel 14. Durch die zwischen dem Deckel 14 und dem Ultraschallgeber bzw. der Gefässwand verbleibenden Spalte kann das unter geringem Oberdruck stehende Inertgas entweichen. Der Schallaufnehmer 5 weist als eigentlichen Schalldruck- bzw. Schallintensitätsempfänger an seinem oberen, mit dem Reaktionsmedium 1 in Kontakt stehenden Ende eine Piezo-Scheibe 18 auf, die in dem dargestellten Fall radial in einem Halterohr eingebaut, und in diesem Halterohr beispielsweise mit Epoxidharz eingeklebt und abgedichtet ist. Das von der Piezo-Scheibe 18 gelieferte elektrische Signal ist ein Mass für die effektive Schallfrequenz und die effektive Schallintensität in dem Reaktionsmedium. Dieses elektrische Signal stellt den Istwert des Regelkreises dar und wird über die Leitung 20 dem Regelverstärker 21 zugeführt. Auf dem Oszillographen 22 können gegebenenfalls die effektive Frequenz und die Schallintensität visuell verfolgt, und erforderlichenfalls von Hand Nachregulierungen der Frequenz und der Ausgangsleistung des Hochfrequenzgenerators 23 vorgenommen werden. Dem Regelverstärker 21 wird über eine Sollwert Einstell-Vorrichtung 24 der Sollwert für die Ultraschall-Intensität, und über eine Sollwert Einstell-Vorrichtung 25 der Sollwert für die Ultraschall-Frequenz vorgegeben. Bei Abweichungen der Istwerte der Frequenz und der Intensität des Ultraschallfeldes im Reaktionsmedium von den vorgegebenen Sollwerten wird über die Leitung 26 der Ultraschallgenerator 23 angesteuert, dessen Frequenz und/oder Ausgangsleistung so lange ver ändert werden, bis die innerhalb des Reaktionsmediums 1 gemessenen effektiven Werte mit den vorgegebenen Sollwerten übereinstimmen. Von dem Hochfrequenzgenerator 23 wird der Ultraschallgeber 8 über die Leitung 28 mit der erforderlichen elektrischen Spannung versorgt. Die in Fig. 2 dargestellte Vorrichtung eignet sich für die Herstellung von Lipid-Vesikeln in grösseren Quantitäten. Das Reaktionsgefäss ist eine oben offene zylindrische rechteckige Wanne 30 aus korrosionsbeständigem Cr-Ni-Stahl. Die Kühlung der Flüssigkeit 31 in dem Reaktionsgefäss erfolgt durch eine Kühlschlangenanordnung 32, die in die in der Wanne 30 befindliche Flüssigkeit 31 eingesetzt wird. Unter dem Boden der Wanne 30 sind auf der Aussenseite acht elektro-akustische Wandler 33 angeordnet, deren Schwingungsgeber 34 an den Boden der Wanne 30 angekoppelt sind. Die Schallenergie wird so auf die Flüssigkeit 31 in der Wanne 30 übertragen. In die Flüssigkeit 31 taucht von oben der Schallaufnehmer 35 ein. Das Reaktionsmedium selbst befindet sich in einem verschlossenen Steril-Beutel 36, der durch die Kühlschlangenanordnung 32 innerhalb der Flüssigkeit 31 wenig oberhalb des Bodens der Wanne gehalten wird. Der Schallaufnehmer 35 wird so weit abgesenkt, dass der Schallaufnahmkopf, d.h. die Piezo-Scheibe 37, gegen den Steril-Beutel 36 gedrückt wird, und so das Ultraschallfeld in dem Reaktionsmedium erfasst. Das von der Piezo-Scheibe 37 gelieferte Signal steuert über die Leitung 38 den Regelverstärker 39 an und liefert diesem die Istwerte für den Regelvorgang. Die Sollwerte fü-r die Frequenz und die Intensität des Ultraschalls werden vorgegeben durch die Sollwert -Vorgbeeinrichtung 40 bzw. 41. Bei Abweichung der Istwerte von den vorgegebenen Sollwerten wird über die Leitung 42 der regelbare elektrische Generator 43 angesteuert, dessen an die elektromagnetischen Wandler 33 über die Leitung 44 abgegebene Ausgangsleistung und/oder Frequenz so lange verändert werden, bis Sollwerte und Istwerte übereinstimmen. Die von der Piezo-Scheibe 37 gemessene Frequenz und Amplitude des Ultraschallfeldes können auf dem Oszillographen 45 visuell beobachtet werden, so dass auch ggf. ein manueller Eingriff in die Regelung möglich ist. Mit Hilfe der beschriebenen Vorrichtungen werden beispielsweise folgende Reaktionen durchgeführt: Beispiel 1 Es sollen IHP-beladene Lipid-Vesikel für therapeutische Zwecke hergestellt werden, und zwar zur Einschleusung von IHP in rote Blutzellen mittels Fusion zur Verbesserung der 0 -Freisetzungs 2 eigenschaften der roten Blutzellen. Die generelle Methode zur Präparation von Lipid-Vesikeln ist in der US-Patentschrift 4.192.869 beschrieben, auf die insoweit Bezug genommen wird. Die Lipid-Vesikel sind aus Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin und Cholesterol im molaren Verhältnis von 8 : 2 : 7 aufgebaut. Diese Lipide werden zunächst in einem organischen Lösungsmittel aus 95 Teilen Chloroform und 5 Teilen Methanol gelöst, um eine homogene Lösung und Mischung dieser Lipide zu erreichen. Dann wird das Lösungsmittel bei 20 Grad Celsius im Rotationsverdampfer entfernt. Der dann im Rundkolben verbleibende Lipid-Film wird mit einer wässrigen Lösung, welche die biologisch aktive Substanz (hier IHP) enthält, aufgenommen und geschüttelt, so dass sich nunmehr ebene Lipid-Lamellen in dieser Suspension bilden. Diese Suspension enthält Lipide in einer Konzentration von ca. 17 - 200 ugll. Die Suspension ist ferner gesättigt an IHP und zwischen pH 7.o - 8.o gepuffert. In einer vorausgehenden Versuchsreihe wurde festgestellt, dass sich für die Fusion mit Erythrozyten und die Inkorporierung von IHP in Erythrozyten Vesikel eignen, die die oben beschriebene Zusammensetzung haben und die einen Durchmesser von 250 - 500 X aufweisen. Die Wirksamkeit ist um so grösser, je grösser der Mengenanteil dieser Vesikel-Formation in dem jeweiligen Präparat ist. Durch eine weitere Versuchsreihe wurde sodann ermittelt, dass sich diese gewünschte Durchmesserverteilung erreichen lässt, wenn die Lipide bei einer in etwa konstanten Temperatur von 37 Grad Celsius mit einer schmalbandigen Schallfrequenz von 20 kHz mit einer effektiven Schallenergie von 3 bis 6 W/ cm2beschallt werden. Die oben beschriebene Lipid-Suspension wird unter Inertgas in das Reaktionsgefäss 3 (Fig. 1) eingefüllt. Das Reaktionsgefäss wird durch das Rohr 13 mit Argon gespült. An den Sollwert-Einstellvorrichtungen 24 und 25 werden sodann die optimale Schallintensität und die gewünschte Schallfrequenz eingestellt. Die beschriebene Regeleinrichtung sorgt dafür, dass die optimale Schallintensität als effektive, auf die Reaktionsflüssigkeit zur vollen Einwirkung kommende Schallintensität während der gesamten Behandlungszeit eingehalten wird. Die Behandlung dauert 30 bis 60 Minuten. Während dieser Zeit wird durch das Kühlwasser die in dem Reaktionsgefäss entwickelte Wärme abgeführt und so die Temperatur konstant gehalten. Die auf diese Weise erhaltene Vesikel-Suspension wird nun mit roten Blutzellen bei 37 Grad Celsius 1 h inkubiert. Danach werden die roten Blutzellen in isotonischem Puffer pH 7,4 gewaschen und die Hämoglobin-02-Dissoziationskurve der modifizierten intakten Zellen gemessen. Der Erfolg der IHP-Inkorporierung wird als "Rechtsverschiebung" der Hämoglobin-02- Dissoziationskurve erkannt.Der durch IHP-Bindung an Hämoglobin maximal erreichbare 2- Halbsättigungsdruck beträgt bei 37 Grad Celsius und pH 7.4 95 mmHg. Der Erfolg der kontrollierten Ultraschall-Methode liegt vor allem darin, dass der maximale IHP-Inkorporierungseffekt mit Volumen-Verhältnissen RBC (Rote-Blutzellen): Vesikel oder mit Lipid-Konzen trationen erreicht wird, die nur noch 1o t der Werte betragen, die bei der bisher üblichen unkontrollierten Ultraschallanwendung für eine erfolgreiche IHP-Inkorporierung eingesetzt werden mussten. Daraus resultiert ein erheblicher wirtschaftlicher Vorteil, da Lipide teuer sind und nicht wiederverwendet werden können. Darüberhinaus sind mit der bisher üblichen Methode keine reproduzierbaren Ergebnisse zu erzielen, die unbedingte Voraussetzung für eine sichere Dosierung in der Therapie sind. Beispiel 2 Bei Lipid-Vesikeln für therapeutische Zwecke besteht die Forderung nach absoluter Keimfreiheit.Da eine Sterilisation der fertigen Vesikel Suspension auf äusserste Schwierigkeiten stösst, wird folgendes Verfahren angewandt: Die Ausgangskomponenten entsprechend dem Beispiel 1 werden zunächst sterilisiert, und unter sterilen Kaute- len in einen ebenfalls sterilisierten Beutel aus Polyäthylen oder Weich-PVC-Folie von eta o,5 mm Wandstärke gefüllt. Der Beutel wird steril dicht verschlossen und dann in dem Ultraschallgefäss nach Fig. 2 der Ultraschallwirkung ausgeset-t, wobei der Raum zwischen den Gefässwänden und dem Beutel mit Wasser ausgefüllt ist. Die Messung der Schallintensität erfolgt in diesem Fall an der Aussenseite des Beutels. Unter sonst gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 beschrieben werden die gleichen Ergebnisse erzielt, wenn die den Schwingungsgebern zugeführte Leistung etwa um den Faktor 1,65 erhöht wird. Dieser bei der vorgegebenen Versuchsanordnung anhand der Messungen experimentell ermittelte Faktor repräsentiert die durch die Einbringung des Beutels eintretenden Leistungsverluste.

Claims: Verfahren zur Herstellung von Lipid-Vesikeln durch Ultraschallbehandlung, Anwendung des Verfahrens und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens Patentansprüche 1. Verfahren zur Herstellung von Lipid-Vesikeln aus biologischen Membranen oder Lipid-Suspen sionen, bei dem die zu desintegrierenden Lipid Suspensionen oder Lipid-Partikel in einer Dis persionsflüssigkeit innerhalb eines Behandlungs gefässes bei im wesentlichen konstanter Tempe ratur einer Ultraschallbehandlung unterworfen werden, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, dass die für den gewünschten Zweck wirk same Vesikelgrösse bzw. Vesikelgrössenverteilung, sowie die für die Erzielung dieser Vesikel grösse bzw. dieser Vesikelgrössenverteilung opti male Ultraschall-Frequenz und -Intensität in der Dispersionsflüssigkeit ermittelt, und dass die so ermittelte optimale Ultraschall-Frequenz und -Intensität bei im übrigen gleichen Behand lungsbedingungen dadurch konstant gehalten wird, dass während der Ultraschallbehandlung der Ist wert der Frequenz und Intensität des Ultra schallfeldes in dem Reaktionsmedium fortlau fend gemessen, und in Abhängigkeit von dem Istwert die Ausgangsleistung und die Frequenz des den Schwingungsgeber speisenden elektri schen Generators geregelt wird. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, dass die Regelung des den Ultraschallgeber speisenden Generators mit Hilfe eines automa tischen Regelkreises mit Sollwert-Istwert-Ver gleich vorgenommen wird. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch ge kennzeichnet, dass zur Messung der Ultraschall Intensität und -Frequenz ein in die Reaktions flüssigkeit eintauchender piezoelektrischer Schallaufnehmer verwendet wird. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeich net, dass der piezoelektrische Schallaufnehmer am Boden des Reaktionsgefässes so angeordnet wird, dass die Richtung seiner höchsten Empfind lichkeit gegen den Ultraschallgeber gerichtet ist, während der Ultraschallgeber in das obere Drittel des Mediums eintaucht. 5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprü che 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsmedium unter einer Inertgasatmosphäre behandelt wird. 6. Verfahren nach einem oder mehreren der An sprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsmedium sterilisiert und in einem Steril-Beutel eingeschlossen, und der das Reaktionsmedium enthaltende Steril-Beutel innerhalb einer dem Ultraschallfeld ausge setzten Flüssigkeit behandelt wird. 7. Anwendung des Verfahrens nach einem oder meh reren der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung von für therapeutische Zwecke bestimmten, mit einem Wirkstoff wie Inositolhexaphosphat be ladenen, zur Fusion mit roten Blutzellen be fähigten Lipid-Vesikeln. 8. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, mit einem die Reaktionsflüs sigkeit aufnehmenden Behandlungsgefäss und min destens einem von einem elektrischen Generator gespeisten elektroakustischen Wandler zur Er zeugung eines Ultraschallfeldes in dem Reak tionsmedium, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass innerhalb des Behandlungs gefässes (3; 30) als Schallaufnehmer ein akustisch-elektrischer Wandler (18; 37) ange ordnet ist, dessen Ausgangssignal zur Regelung der Ultraschall-Intensität und -Frequenz in der Reaktionsflüssigkeit dient. 9. Vorrichtung nach Anspruch 8,gekennzeichnet durch einen den elektrischen Generator (23; 43) ansteuernden Regelverstärker (21; 39)mit Soll wert- Istwert-Vergleich. 10. Vorrichtung nach Anspruch 8 und 9, dadurch gekennzeichnet, dass der akustisch-elek trische Wandler (18; 37) aus einer am Ende eines Rohres angeordneten Piezo-Scheibe be steht, die mit ihrer gegen Schalldruck empfindlichsten Richtung gegen den Schwin gungsgeber gerichtet ist. 11. Vorrichtung nach Anspruch 8 bis 1o, dadurch gekennzeichnet, dass die Geometrie des Ul traschallgebers und des das Medium aufnehmen den Behandlungsgefässes (3; 30) so gewählt sind, dass die durch Reflexion verursachte Bildung von Ultraschallwellen mit einer von der Sollfrequenz abweichenden Frequenz und/ oder mit gegenüber den primären Ultraschall wellen verschobener Phase in dem beschallten Medium vermieden wird. 12. Vorrichtung nach Anspruch 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Behandlungsgefäss (3; 30) von einer Kühlflüssigkeit durchström te Doppelwände aufweist. 13. Vorrichtung nach Anspruch 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Behandlungsgefäss (3) gegen die Aussenatmosphäre abgeschlos sen ist und eine Zuleitung (13) für die Zufuhr von Inertgas zu dem Gasraum oberhalb des be schallten Reaktionsmediums (1) aufweist.

Inventors: GERSONDE, KLAUS, PROF. DR. MED., SCHAL, WILFRIED, DR., Schäl, Wilfried, Dr.
Applicants: GERSONDE, KLAUS, PROF. DR.
Application year: 1981
Main classification: A61K9
IPC codes: A61K9