SUCROSE-MUTASE, IMMOBILIZED SUCROSE-MUTASE AND USE OF THIS IMMOBILIZED SUCROSE-MUTASE FOR THE PRODUCTION OF ISOMALTULOSE(6-O-ALPHA-D-GLUCOPYRANOSIDO-D FRUCTOSE)

Abstract: 1. An enzyme which has been isolated from bacteria and converts sucrose into isomaltulose as the main product and in addition into 1-O-alpha-D-glucopyranosido-D-fructose, fructose and glucose as the most important by-products, but into no detectable quantities of other disaccharides.

Description: Saccharose-Mutase, immobilisierte Saccharose-Mutase und Verwendung von dieser immobilisierten Saccharose Mutase zur Herstellung von Isomaltulose (6-O-OC-D- Glucopyranosido-D-fructose) Gegenstand der Erfindung ist das neue Enzym Saccharose Mutase, das Saccharose in hoher Ausbeute in Isomaltulose umwandelt, immobilisierte Saccharose-Mutase und die kontinuierliche Umwandlung von Saccharose in Isomaltulose (6-0-&alpha;-D-Glucopyranosido-D-fructose) mit Hilfe dieser immobilisierten Saccharose-Mutase. Aus IsomaLulose kann durch Hydrierung nach DE-AS 2 520 173 bzw. DE-PS 2 217 628 ein Gemisch aus C-0-&alpha;-D- glucopyranosiCc-D-sorbit und 6-0-&alpha;-D-glacopyranosido-D- Mannit gewonnen werden, das als Zuckeraustausctistoz= verwendet werden kann. Es ist bekannt, dass Saccharose durch Zellen von Protaminobacter rubrum in guter Ausbeute in Isomaltulose umgewandelt werden kann (DE-OS 1 049 800). Nach DE-PS 2 217 628 verläuft diese Umsetzung optimal in 15-40 %iger Saccharose-Lösung bei 20-370C und starkem Rühren und Belüften. Nach DE-OS 2 806 216 kann die Vermehrung der Bakterien und die Umwandlung von Saccharose in Isomaltulose gleichzeitig und kontinuierlich durchgeführt werden. Statt Protaminobacter rubrum können in solchen Verfahren auch andere Bakterien, wie Erwinia carotovora, Serratia marcescens (NCIB 8285), Serratia plymuthica (ATCC 15 928) und Leuconostoc mesenteroides (NRRL B-572f) (ATCC 10830a) verwendet werden. Diese Fermentationsverfahren haben verschiedene Nachteile: 1. Für die Vermehrung der Zellen wird ein Teil der eingesetzten Saccharose als Kohlenstoff-Quelle verbraucht. 2. Die für die Zellvermehrung notwendige Rührung und. Belüftung erfordert einen hohen Energie aufwand. 3. Bei der Abtrennung der Zellen geht ein Teil des Produktes verloren. o, ' Die optimale Saccharosekonzentration liegt nach DE-OS 2 806 216 bei ca. 25 %. Der Zucker muss dem nach zuerst auf diese0 Konzentration verdünnt und nach der Umsetzung zur Rristallisation des Pro duktes mit hohem Energieaufwand wieder aufkonzen triert werden. 5. Die Vermehrung der Bakterien erfordert neben der Kohlenstoff-Quelle Saccharose stickstoff haltige Substanzen und Salze, deren Anwesenheit bei der Kristallisation des Produktes zu Ver lusten führt. Alle diese Nachteile sind prinzipiell vermeidbar, wenn es gelingt, die Umwandlung der Saccharose in Isomaltulose von der Zellvermehrung zu trennen und über längere Zeit zu stabilisieren. Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass man aus den Zellen von Isomaltulose-bildenden Bakterien, insbesondere Protaminobacter rubrum CBS 57 477, ein Enzym gewinnen kann, das hochkonzentrierte Lösungen von reiner Saccharose in sehr guter Ausbeute in Isomaltulose umwandelt. Das isolierte Enzym kann nach verschiedenen, grundsätzlich bekannten Verfahren immobilisiert und stabilisiert werden, womit eine kontinuierliche Umwandlung von Saccharose lösungen in einer Konzentration von 10 bis zu 75 Gew.- bei 30-600C durcngeführt werden kann. Die Isolierung des Enzyms war insbesondere deshalb überraschend, weil Enzyme mit ähnlicher Aktivität, d.h. Mutasen, die eine intramolekulare Transfer Reaktion an Oligosacchariden bewirken, bisher nicht bekannt geworden sind. Soweit bekannt,werden Di sacc:^aride in der lebenden Zelle entweder durch Ab bau von höheren Polymeren oder durch energieab händige Synthese über Nucleotid-Derivate gebildet. Das isolierte Enzym ist als Saccharose-Mutase (Saccharose EMI4.1 Isomaltulose-Mutase) zu bezeichnen. Das erfindungsgemässe Verfahren gliedert sich in folgende vier Schritte: 1. Vermehrung der Zellen; 2. Isolierung des Enzyms; 3. L-.:nobilisierung des Enzyms; 4. Umwandlung von Saccharose in Isomaltulose mit dem i-.mobilisierten Enzym. Zur Isolierung des Enzyms wurden insbesondere Zellen des Protaminobacter rubrum(CBS 57 477)in grundsätzlich bekannter Weise gezüchtet: Für den Zweck optimaler Enzymproduktion verwendet man vorteilhaft ein Medium aus Saccharose-haltigem Dicksaft, der auf einen Gehalt von 5 - 25 X Trockensubstanz verdünnt wird mit Zusatz von 2 % Maisquellwasser und 0,1 % (NH4)2HPO4. Man erreicht damit in einer Fermentationszeit von 1416 Stunden bei 300C eine Ausbeute von 10-50 g sedimentierte Zellen/Liter Fermentationslösung und eine enzymatische Aktivität von 10-30 E/ml (1 E (Einheit) - Umwandlung von 1Mol Saccharose/min bei 300C; zum Test siehe Beispiel 1b). Die Isolierung des Enzyms erfolgt nach Konzentrierung und Auf schluss der Zellen nach allgemein bekannten Methoden der Enzymreinigung. Folgende Vorgehensweise hat sich besonders bewährt: Die Zellen werden in einer Röhren zentrifuge oder einem selbstentschlammenden Separator auf das ca. 20-fache konzentriert. Zur Freisetzung des Enzyms aus dem Zellinneren werden die konzentrierten Zellen, z.B. durch einen Hochdruckhomogenisator (Manton Gaulin) bei 500 bar aufgeschlossen. Die so erhaltene Lösung des Enzyms mit suspendierten Zelltrümmern kann, gegebenenfalls nach Einstellung eines vorteilhaften pH-Wertes zur Ausfällung von Verunreinigungen (z.B. pH 5), durch Zentrifugation oder Filtration geklärt werden. Diese geklärte Lösung des Enzyms kann bereits zur Immobilisierung verwendet werden. Für die meisten Immobilisierungs-Verfahren ist es jedoch vorteilhafter, das Enzym zuvor noch weiter anzureichern. Dazu eignen sich Fällungsverfahren, z.B. mit Ammoniumsulfat oder Polyethylglykol, und chromatographische Verfahren, z.B. Molekularsiebchromatographie (Gelchromatographie) , Ionenaustauscher Chromatographie und Adsorptionschromatographie. Als besonders wirkungsvoll hat sich die Chromatographie an CM-Sephadex (Carboxymethyl-substituiertes quervernetztes Dextran) erwiesen. Eine praktische Aus fuhrung ist in Beispiel ic beschrieben. Durch einmalige Chromatographie wird eine spezifische Aktivität des Enzyms von 50-250 E/mg Protein erreicht. Durch Wiederholung der Chromatographie an CM-Sephadex wird elektrophoretisch nahezu einheitliches Enzym mit einer spezifischen Aktivität von 450 E/ms gewonnen. Das gereinigte Enzym wandelt in hoher Ausbeute Saccharose in Isomaltulose an. Zum Beispiel wurden aus einer 48 %igen Saccharose-Lösung bei 350C 86,5 % Isomaltulose, 8,6 % 1-0- oC-D-Glucopyranosido-D- fructose, 4,0 % Fructose und 0,9 % Glucose erhalten. Andere charakteristische Eigenschaften des neuen Enzyms sind: Molmasse: ca. 50 000 (durch Gelchromato graphie) Isoelektrischer Punkt: 8,0 + 0,3 pH-Optimum: pH 6,5 + 0,5 Stabilitäts-Optimum: pH 5,5 + 0,5 Das freie Enzym wird bei Temperaturen > 400C rascn inaktiviert. Die Reaktion wird durch Cu- + Zn-Ionen stark geheim.. Ca, Mn , Mg und Borat haben keinen Einfluss auf die enzymatische Aktivität. Die Immobilisierung des Enzyms kann nach einer Vielzahl von grundsätzlich bekannten Verfahren durchgeführt werden, wie sie z.B. in einer Zusammenfassung von I. Chibata: Immobilized Enzymes, Halsted Press (A Division of I. Wiley & Sons) New York 1978, beschrieben sind. In systematischer Weise kann man folgende Immobilisierungsverfahren unterscheiden, die alle grundsätzlich für die Immobilisierung der Saccharose-Mutase angewendet werden können: Einsc?iluss-Verfahren; Vernetzungs-Verfahren; Bindung an feste Träger durch Adsorption; Kovalente Bindung; Vernetzung; Bindung an Membranen: Bindung an lösliche Träger. Ein Beispiel für Einschluss-Verfahren ist der Einschluss der Enzymlösung in semipermeable Hohlfasern mit einer Porengrösse, die den Zuckermolekülen den Durchtritt gestattet, die Enzymmoleküle jedoch im Inneren der Hohlfasern zurückhält. Eine praktische Ausführung dieses Verfahrens ist in Beispiel 2 beschrieben. Als feste Träger für die Adsorption des Enzyms eignen sich z.B. Ionenaustauscher. Als besonders vorteilhaft haben sich Kationenaustauscher auf Polysaccharid-Basis gezeigt, z.B. CM-Cellulose (Beispiele 3 und 4). Die adsorptive Bindung ist so fest, dass selbst hohe Saccharose-Konzentrationen, z.B. 60 %, das Enzym nicht vom Träger ablösen. Es ist auch möglich, die Bindung durch Quervernetzung, z.B. mit Glutardialdehyd noch fester zu machen (Beispiel 5). Eine besonders feste Bindung wird durch kovalente Verknüpfung erreicht. An Träger mit Hydroxylgruppen oder Aminegruppen kann eine kovalente Bindung, z.B. mit Reagentien wie Bromcyan, Cyanurchlorid oder FCP (Trifluorchlor-Pyrimidin) durchgeführt werden. Beispiele sind Bindungen an Cellulose und Sepharose mit verschiedenen Reagentien (Beispiele 6-8), an Polymere mit Anhydridgruppen (Beispiel 9) und an Silikat (Beispiel 10). Aus kinetischen Gründen ist die Verwendung von membrangebundenen Enzymen besonders vorteilhaft (DE-OS 2 553 649). Praktische Ausführungsformen der Bindung von Saccharose-Mutase an Membranen sind in den Beispielen 11 und 12 beschrieben. Vorteilhaft ist auch die Immobilisierung durch kovalente Bindung an lösliche Träger, z.B. lösliche Stärke. Das Enzym wird dadurch stabilisiert und kann infolge des hohen Molgewichts des Trägers auf einfache Weise mit semipermeablen Membranen von der Isomaltulose-Lösung getrennt und wieder verwendet werden (Beispiel 13-17). Die zweckmässige Durchführung der Umwandlung von Saccharose in Isomaltulose mit dem nach einer der vorgenannten Methoden immobilisierten Enzym Saccharose Mutase richtet sich nach den speziellen Charakteristika des immobilisierten Enzyms. In allen Fällen wird eine 40-70 %ige Lösung von Saccharose bei 30-600C mit dem immobilisierten Enzym solange in Kontakt gebracht, bis der gewünschte Grad der Umsetzung erreicht ist. Typischerweise erhält man, wenn die Kontaktzeit für vollständigen Verbrauch der Saccharose gerade ausreichend ist, ein Produktgemisch der Zusammensetzung 5 % Fructose, 2 % Glucose, 9 % 1-0- Çs'-D-Gluco- pyranosido-D-fructose und 84 % Isomaltulose. Eine wesentlich verlängerte Kontaktzeit führt zu einer geringeren Ausbeute an Isomaltulose und höheren Ausbeuten an Fructose, Glucose und 1-C-uc-D-glucopyranosi- do-D-fructose. Die Bildung dieser Nebenprodukte wird auch durch hochgereinigte Präparate der Saccharose Mutase in nahezu unverändertem Mengenverhältnis katalysiert und ist deshalb als eine charakteristische Eigenschaft dieses Enzyms anzusehen. Die Saccharose-Konzentration und die Reaktionstemperatur haben nur geringen Einfluss auf das Produktspektrum. Verwendet man für die Umwandlung der Saccharose in Isomaltulose das freie oder an lösliche Träger ge bundene Enzym, so kann man die Reaktion z.B. in einem Hohifaser-Reaktor (3eispiel 2) durchführen. Eine andere Möglichkeit ist ein durch eine semipermeable Membran abgeschlossenes Gefäss, in dem man die Reaktion entweder kontinuierlich oder chargenweise durchführen kann. An feste Träger gebundenes Enzym kann ebenfalls für chargenweisen Betrieb, z.B. in Rührkesseln oder für kontinuierlichen Betrieb in Säulen-Reaktoren mit aufsteigendem oder absteigendem Durchfluss eingesetzt werden. Derartige Säulen-Reaktoren müssen temperierbar sein und haben typischerweise ein Durchmesser: Füllhöhen-Verhältnis von 1:1 bis 1:10. An Membranen gebundenes Enzym kann als Flachmembran, Hohlfasermembran oder Filterpatrone vorliegen. Die mit Enzym beladene Membran wird in einer geeigneten temperierbaren Halterung von der Saccharose-Lösung einmal oder mehrmals durchströmt, bis der gewünschte Umsatz erreicht ist. Aus den auf eine dieser Arten umgesetzten Saccharoselösungen kann ein Teil der gebildeten Isomaltulose durch Abkühlen kristallin gewonnen werden. Durch Eindampfen der Mutterlauge kann man eine weitere Menge Isomaltulose zur Kristallisation bringen, insgesamt können so 90-92 % der gebildeten Isomaltulose gewonnen werden. Beispiele Beispiel 1: Herstellung des Enzvms 1a) Fermentation von Protaminobacter rubrum: Eine Ab impfung des Stammes Protaminobacter rubrum (CBS 57 477) wird in 200 ml einer Nährlösung aus auf 25 % Trockensubstanz verdünntem Dicksaft mit Zusatz von 0,5 g/l (NH4)2 HP04, eingestellt auf pH 7,2 in einem 1-Liter-Rolben 16 Stunden bei 300C auf der Schüttelmaschine bei 290 U/min angezogen. Die Rultur aus 5-10 solcher Kolben (1-2 Liter) wird zur Beimpfung eines 300-Liter-Fermenters eingesetzt. Das Medium besteht aus 200 Litern mit Wasser auf 25 % Trockensubstanz verdünntem Dicksaft (ca. 94 % Saccharose in der Trocken substanz) mit Zusatz von 0,5 g/l (NH4)2 HP04 und 2 % Maisquellwasser. Die Fermentation wird bei 300C ohne pH-Kontrolle mit einer Belüftung von 100 1/min und einer Rührgeschwindigkeit von 180 U/min durchgeführt und ist nach 16-18 Stunden beendet. lb) Bestimmung der Enzymaktivität Zur Bestimmung der Enzymaktivität wird ein In kubationsansatz aus 5 ml einer 10 % Saccharose Lösung in 0,01 M Phosphatpuffer pH 7,0 verwendet. Nach Zugabe von 1-10 E des zu testenden Enzympräparates (Zellsuspension, Enzymlösung oder immobilisiertes Enzym) wird 60 Minuten bei 300C unter Schütteln inkubiert. Dann beendet man die Reaktion durch Erhitzen auf 1000C für eine Minute. Eine Kontroliprobe wird direkt nach Zugabe des Enzympräparates durch Erhitzen auf 1000C abgestoppt. Die Bestimmung des Umsatzes kann nach 3 Methoden durchgeführt werden: 1. Bestimmung der nicht umgesetzten Saccharose und der Produkte durch HPLC (Hochdruck flüssigkeitschromatographie). 2. Enzymatische Bestimmung der nicht umgesetzten Saccharose, z.B. nach H.U. Bergmeyer und E. Bernt in H.U. Bergmeyer, Methoden der enzymatischen Analyse, 2. Auflage, Band II, Seite 1143-1146, Verlag Chemie 1970. 3. Durch Bestimmung der gebildeten reduzierenden Zucker mit Dinitrosalizylsäure, da Saccharose nicht reduziert, während die Produkte der Reaktion reduzierend wirken. Das Reagenz be steht aus einer wässrigen Lösung von 10 g Di nitrosalizylsäure, 16 g Natriumhydroxid und 300 g K, Na-tartrat in 1 Liter. Zur Durch führung der Reaktion werden 0,4 ml des Inku bationsansatzes mit 0,5 ml dieses Reagenz versetzt, 5 Minuten auf 100 C erhitzt, mit Wasser abgekühlt, mit 2,5 ml Wasser ver dünnt und die Extinktion bei 540 nm in einem Fotometer gegen einen Reagentien-O-Wert be stimmt. Die Auswertung erfolgt mittels einer Standardkurve, die mit reiner Isomaltulose gemessen wurde. Man erhält die gebildeten reduzierenden Zucker als Isomaltulose-Äquiva- lente in ssMol/ml des Inkubationsansatzes und errechnet daraus die enzymatische Aktivität nach der Formel: E/ml oder g = Mol/ml x 5 60 der x = Probenmenge Enzym (ml oder g) 1c) Isolierung des Enzyms Aus 200 Litern Fermentationslösung nach Beispiel 1a mit einer Aktivität von 11,5 E/ml werden durch Zentrifugation in einer Röhrenzentrifuge (Sharples) 28 Liter Bakterienschlamm mit einer Aktivität von 77,5 E/ml (94 % Ausbeute) erhalten. Der Bakterien schlamm wird mit entsalztem Wasser auf 50 Liter verdünnt und der pH-Wert durch Zugabe von ver dünnter Natronlauge auf pH 5,5-6,0 gehalten. Der verdünnte Schlamm wird in einem Hochdruck-Homo genisator (Manton-Gaulin) bei 500 bar mit einem Durchfluss von 20 Litern/Stunde aufgeschlossen. Anschliessend wird mit Essigsäure ein pH-Wert von 5,0 eingestellt und durch Zentrifugation in der R3hrenzentrifuge die Enzymlösung von Zelitrümmern und präzipitierten Verunreinigungen befreit. Das noch trübe Zentrifugat wird durch Filtration, z.B. über ein Seitz-AS-Filter weiter geklärt. Man erhält 44 Liter Enzymlösung mit 43 E/ml (87 % Ausbeute). Die Lösung enthält 19,1 mg Protein/ntl (Lowry Methode). Die spezifische Aktivität des Enzyms be trägt 2,15 E/mg. 756 ml (32 500 E) der geklärten Lösung werden mit verdünnter Natronlauge auf pH 6,0 eingestellt und zur Einstellung einer Leitfähigkeit von 4,5 mS mit entsalztem Wasser auf 3250 ml verdünnt. Diese Lösung wird auf eine Säule 11 x 30 cm (2,9 Liter) mit CM-Sephadex C-50, äquilibriert mit Kaliumphosphatpuffer pH 6,0, 4,5 mS aufgetragen. Dann wäscht man zur Entfernung von Verunreinigungen mit 3 Litern des gleichen Puffers nach. Anschliessend w,rd mit einem linearen Gradienten aus 5 Litern des Waschpuffers und 5 Litern des gleichen Puffers mit Zusatz von 0,5 M NaCl eluiert. Es werden Fraktionen von 25 ml aufgefangen. Die Saccharose Mutase-Aktivität erscheint in den Fraktionen 150200. Die vereinigten aktiven Fraktionen enthalten in 1230 ml 27 122 E (83,5 %) mit einer spezifischen Aktivität von 98 E/mg. Die Enzymlösung wird durch Ultrafiltration über eine Membran mit Ausschlussgrenze 20 000 Dalton (Amicon UM-20 E) auf 475 ml konzentriert. Das Konzentrat wird über eine Säule von Polyacrylamid-Gel (Biorad Biogel P4) mit dem Elutionsmittel Wasser entsalzt. Ausbeute 21 535 E (79 %) mit 107 E/mg. Beispiel 2 Einschluss des Enzyms in Hohlfasern Ein Bündel aus semipermeablen Hohlfasern (Typ H1P10 Fa. Amicon) wird mit 23 ml einer Lösung von Saccharose Mutase, enthaltend 1905 E mit einer spezifischen Aktivität von 48,7 E/mg, gefüllt. Durch das-Innere der Hohlfasern leitet man eine 10 %ige Saccharose-Lösung. Bei 25eC findet man in der ablaufenden Lösung durch HPLC-Analyse folgendes Produktgemisch: Bei 60 ml/Stunde: 4 % Fructose, 3 % Glucose, 1 % Saccharose, 86 % Isomaltulose und 6 % 1-0- i-D-glucopyrar,osi- do-D-fructose Bei 100 ml/Stunde: 4 % Fructose, 4 % Glucose, 7 % Saccharose, 76 % Isomaltulose, 9 % 1-0- i-D- lucopyranosido¯ D-fructose Diese Ergebnisse waren auch nach 5-tägigem Dauerbetrieb praktisch unverändert. Beispiel 3 Adsorptive Bindung an CM-Cellulose 121 ml einer Lösung von Saccharose-Mutase, enthaltend 5810 E mit einer spezifischen Aktivität von 49 E/mg werden mit 50 g feuchter auf pH 6,0 äquilibrierter CM-Cellulose (Typ CM 52, Fa. Whatman) versetzt. Die Leitfähigkeit der Enzymlösung liegt bei 4,2 mS. Die Suspension wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und das an den Träger adsorbierte Enzym abgenutscht. Ausbeute: 52,0 E/g - 2965 E (51 %). Im Filtrat finden sich 759 E (13 %). Beispiel 4 Adsorptive Bindung an C!-Cellulose In gleicher Weise werden 222 ml einer Lösung von Saccharose-Mutase, enthaltend 4770 E (77 E/mg), mit 25 g C!-Cellulose (Typ CM 11, Fa. Whatman) bei pH 5,5 umgesetzt. Ausbeute: 26,6 g mit 50,9 E/g - 1354 E = 28 8. Im Filtrat werden 730 E (15 %) gefunden. BeisPiel 5 Adsorption mit anschliessender Vernetzung 10 g des trägeradsorbierten Enzyms aus Beispiel 3 werden 1 Stunde mit einer Lösung von 50 ml 0,2 % Glutardialdehyd verrührt und dann abgenutscht. Aus beute: 10,4 g mit einer Aktivität von 49,2 E/g (98 %). Beispiel 6 Bromcyankupplung von Saccharose-Mutase an Sepharose 4B CL 3 g feuchte Sepharose oB CL werden mit 50 mg Bromcyan 30 Minuten bei pH 11,0 aktiviert, der pH-Wert der Suspension mit 1-n HCl auf pH 7,0 eingestellt und 2 Stunden bei pH 7,0 mit 25 ml Saccharose-Mutase-Lösung (enthaltend 6350,7 Einheiten und 30,62 mg Protein nach Lowry) gerührt. Der Enzymträger wird filtriert und mit destilliertem Wasser gewaschen. Ausbeute an Enzymträger: 2,7 g mit 50,0 Einheiten/g = 135 Einheiten - 2,1 % der eingesetzten Aktivität Filtrat: 120 ml mit 6486 Einheiten Beispiel 7 Kovalente Bindung von Saccharose-Mutase an Sepharose 4B CL nach Aktivierung mit Cyanur chlorid 90 g feuchte Sepharose 4B CL werden 30 Minuten lang mit 1,5 g Cyanurchlorid in einem Gemisch aus 100 ml destilliertem Wasser und 100 ml Dioxan bei pH 6 - 7 aktiviert. Die aktivierte Sepharose 4B wird abgesaugt, mit Dioxan und destilliertem Wasser gewaschen und zuletzt in 100 ml destilliertem Wasser suspendiert. 59 ml Saccharose-Mutase-Lösung mit 6661 Einheiten und 32,1 mg Protein nach Lowry werden zugefügt und 4 Stunden bei Raumtemperatur und pH 7,0 gerührt. Der Enzymträger wird abgesaugt und auf der Nutsche mit destilliertem Wasser gewaschen. Ausbeute an Enzymträger: 93,2 g mit 18,54 Einheitenlg = 1728 Einheiten - 27,2 % der eingesetzten Aktivität Filtrat: 280 ml mit 85,7 Einheiten = 1,35 % der eingesetzten Aktivität. Beispiel 8 Kovalente Bindung von Saccharose-Mutase an Cellulose nach Aktivierung mit Cyanurchlorid 50 g Cellulose (Avicel der Fa. Merck, Darmstadt) werden wie in Beispiel 7 beschrieben mit 5 g Cyanurchlorid aktiviert. Es werden zum aktivierten Träger 25 ml Saccharose-Mutase-Lösung mit 6350,7 Einheiten und 30,62 mg Protein nach Lowry zugefügt und wie unter 2.2. angegeben aufgearbeitet. Ausbeute an Enzymträger: 119,7 g mit 15,5 Einheiten/g = 1850,7 Einheiten = 29,1 % der eingesetzten Aktivität Filtrat: 275 ml mit 39,7 Einheiten = 0,63 % der eingesetzten Aktivität Beispiel 9 Kovalente Bindung von Saccharose-Mutase an Anhydridharz 10 g Anhydridharz (Copolymerisat aus 80 Gew.-* Tetraethylenglykoldimethacrylat, 10 Gew.-% Maleinsäure und 10 Gew.-% Maleinsäureanhydrid, Korngrösse: 0,5-0,8 mm) werden in Aceton suspendiert und noch mehrmals auf einer Fritte mit Aceton gewaschen. Das gewaschene Harz wird in 20 ml destilliertem Wasser suspendiert unc über Nacht bei pH 6,2 mit 66 ml Saccharose-Mutase Lösung (2003,1 Einheiten und 19,8 mg Protein nach Lowry) geruhrt. Der Enzymträger wird abgesaugt und auf der Fritte mit destilliertem Wasser, 10 Zeiger NaCl-Lösung und wieder mit destilliertem Wasser gewaschen. Ausbeute an Enzymträger: 14,48 g mit 18,9 Einheiten/g = 273,5 Einheiten 1'13,6 % der eingesetzten Aktivität Filtrat: 315 ml mit 85,1 Einheiten = 4,27 8 der eingesetzten Aktivität Beispiel 10 Kovalente Bindung von Saccharose-Mutase an Silikat 500 ml Natronwasserglas (Fa. Merck, Darmstadt) werden unter Rühren mit ca. 100 ml SO %einer Schwefelsäure versetzt, der Niederschlag abgesaugt, trockengepresst und im Umlufttrockenschrank bei 160-180 C getrocknet. Das erhaltene Silikat wird im Mörser zerkleinert. 50 g Silikat werden zur Einführung von Aminogruppen 8 Stunden mit 1,33 Litern einer 10 %igen Lösung von t-Aminopropyltriethoxysilan in Benzol am Rückfluss gekocht und nach Abkühlung mit je 330 ml Benzol und 330 ml Aceton je dreimal gewaschen. Das Aminogruppen tragende Silikat wurde mit ca. 1 Liter 0,05M Phosphatpuffer pH 7,0 portionsweise gewaschen. Ausbeute: 39,0 g Amino-Silikat 19,5 g Amino-Silikat werden in 200 ml destilliertem Wasser/Dioxan (1:1) suspendiert und mit 1,95 g Cyanurchlorid 60 Minuten bei pH 5-7 aktiviert. Das aktivierte Harz wird mit Dioxan und destilliertem Wasser gewaschen. Unter Rühren werden 100 ml Saccharose-Mutase-Lösung mit 15 030 Einheiten zugefügt und die Suspension 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der Enzymträger wird abgesaugt und auf der Nutsche gewaschen. Ausbeute an Enzymträger: 25,1 g mit 58,7 Einheiten/g = 1473 Einheiten = 9,8 % der eingesetzten Aktivität Filtrat: Keine Aktivität Beispiel 11 Isomerisierung der Saccharose zur Isomaltulose in einem Enzym-.Membran-Reaktor a) Eine Filtercartridge mit einer Silikat-Polymer Membran, z.B. eine Amerace H30-Cartridge mit einer Membran-Oberfläche von 0,25 m2, wird in ein ent sprechendes Filtergehäuse eingesetzt und mittels einer Pumpe mit destilliertem Wasser bei Zimmer temperatur vorgewaschen. In den Poren einer so vorbehandelten Membran-Cartridge wird das Enzym durch Umpumpen einer verdünnten Saccharose-Mutase Lösung (25 E/ml) bei +4 C adsorptiv-immobilisiert. Der Rest der Enzym-Lösung wird mit destilliertem Wasser bei +4 C herausgewaschen und der Enzym Membran-Reaktor feucht gelagert. b) Zur Isomerisierung der Saccharose zur Isomaltulose wird nach Abb. 1 eine filtrierte 10 %ige Saccharose Lösung aus dem Behälter (S) mittels einer stufen los regelbaren Pumpe (P) über einen Wärmeaus tauscher (W) durch einen Durchflussmesser (D) bei 340C kontinuierlich durch den Enzym-Membran Reaktor (EMR) in den Isomaltulose-Behälter (I) gepumpt. Die Zusammensetzung aer Isomaltulose-Lösung wird durch HPLC bestimmt. Die Umsatzrate ist gemäss nachstehender Tabelle 1 abhängig von der Durchflussgeschwindigkeit. Tabelle 1 Zusammensetzung der Isomaltulose-Lösung in Abhängigkeit von der DurchfluBgeschwindigkeit (0,25 m2 Membranoberfläche; 10 %ige Saccharose-Lösung) Durchflussge- Isomaltulose Rest-Saccharose snhwindigkeit in Ltr./h % % 0,68 72,6 0,0 1,9 70,3 9,4 4,2 65,3 16,1 8,2 31,4 59,1 Beispiel 12 Isomerisierung der Saccharose zur Isomaltulose in einem Enzym-Membran-Reaktor a) Eine Filtercartidge mit einer Silikat-Polymer Membran, z.B. eine Amerace H30-Cartridge mit einer Membran-Oberfläche von 0,25 m2, wird in ein entsprechendes Filtergehäuse eingesetzt und mittels einer Pumpe mit destilliertem Wasser bei Zimmertemperatur vorgewaschen. In den Poren einer so vorbehandelten Membran-Cartridge wird das Enzym durch Umpumpen einer verdünnten Saccharose Mutase-Lösung (25 E/ml) bei +40C adsorptiv-immo bilisiert. Der Rest der Enzym-Lösung wird mit destilliertem Wasser bei +40C herausgewaschen. Der Enzym-Membran-Reaktor wird feucht gelagert. b) Zur Isomerisierung der Saccharose zur Isomaltulose wird nach Abb. 1 eine filtrierte 20 %ige Saccharose Lösung aus dem Behälter (S) mittels einer stufen los regelbaren Pumpe (P) über einen Wärmeaus tauscher (W) bei 3oOC durch einen Durchflussmesser (D) kontinuierlich durch den Enzym-Membran-Reaktor (EMR) in den Isomaltulose-Behälter gepumpt. Der Ge halt der Isomaltulose-Lösung wird durch HPLC be stimmt. Nach Tabelle 2 ist die Umsatzrate abhängig von der Durchflussgeschwindigkeit. Bei einer Durch flussgeschwindigkeit von 0,58 Ltr. pro Stunde und bei einem Isomaltulose-Gehalt von 74,1 % (= 148,2 g/ Ltr.) berechnet sich eine Kapazität des Enzymmembran-Reaktors von ca. 8,3 kg Isomaltulose pro m2 Membranfläche pro Tag. Tabelle 2 Zusammensetzung der Isomaltulose-Lösung in Abhängigkeit von der Durchflussgeschwindigkeit (0,25 m2 Membranoberfläche; 20 %ige Saccharose-Lösung) Durchflussge- Isomaltulose Rest-Saccharose schwindigkeit in Ltr./h 0,58 74,1 0,0 1,1 72,8 2,8 2,3 69,1 14,7 3,9 41,2 48,7 Beispiel 13 Kovalente Bindung von Saccharose-Mutase an Stärke nach Aktivierung mit Bromcyan 2 g Stärke nach Zulkowsky (Fa. Merck, Darmstadt) werden in 50 ml destilliertem Wasser gelöst, mit 0,2 g Bromcyan bei pH 11,0 30 Minuten aktiviert und danach mit 2 n HCl auf pH 7,0 eingestellt. Es werden 20 ml Saccharose-Mutase-Lösung mit 10 000 Einheiten 2 Stunden bei Raumtemperatur und pH 6,5-7,0 gekuppelt. Der lösliche Enzymträger wird über eine Amicon XM 100 Membran von Saccharose-Mutase getrennt und mehrmals mit insgesamt 500 ml 0,1M Phosphatpuffer pH 7,0 gewaschen. 150 ml Stärke-Saccharose-Mutase mit 7020 Einheiten 70,2 % der eingesetzten Aktivität Beispiel 14 Kovalente Bindung von Saccharose-Mutase an Dextran 60 nach Aktivierung mit Bromcyan 2,5 g Dextran 60 (Molekulargewicht 60 000 - 90 000, Fa. Serva, Heidelberg) werden wie in Beispiel 13 angegeben mit Bromcyan aktiviert und mit 102 ml Saccharose Mutase-Lösung (12 500 Einheiten und 250 mg Protein nach Lowry) gekuppelt und wie unter 3.1. angegeben aufgearbeitet. 103 ml Dextran 60-Saccharose-Mutase mit 8580 Einheiten - 68,6 % der eingesetzten Aktivität. Beispiel 3 Kovalente Bindung von Saccharose-Mutase an Manucol LD nach Aktivierung mit Bromcyan 2,5 g Manucol LD (lösliches Alginat der Fa. Alginate Industries GmbH, Hamburg) werden wie in Beispiel 13 angegeben mit Saccharose-Mutase gekuppelt und aufgearbeitet. 192 ml Mar¯-1col-Saccharose-Mutase mit 11 712 Einheiten 93,7 % ar eingesetzten Aktivität. Manucol-Sacharose-Mutase kann nach Eintropfen in 1 %ige CaCl2-Lösu=g als unlöslicher Enzymträger ausgefällt werden. Beispiel 16 Kovalente Bindung von Saccharose-Mutase an Carrageenan nach Aktivierung mit Bromcyan 2,5 g Carrageenan (löslicher Polysaccharidschwefelsäure ester aus cer Seealge Chandrus crispus, Fa. Serva, Heidelberg) werden wie in Beispiel 13 angegeben mit Saccharose-Mutase gekuppelt und aufgearbeitet. 210 ml Car-ageenan-Saccharose-Mutase mit 8421 Einheiten - 6f,4 % der eingesetzten Aktivität. Beispiel 17 Kovalente Bindung von Saccharose-Mutase an ein lösliches Anhydrid-Polymer 0,5 g Gantrez AN 179 (lösliches Copolymer aus Malein säureanhydrid und Methylvinylether, Fa. Serva, Heidelberg) werden in 50 ml destilliertem Wasser gelöst, 12 250 Einheiten Saccharose-Mutase zugesetzt und die Lösung bei pH 6,2 bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Nicht gebundenes Enzym wird durch Ultrafiltration über eine Amicon XM 100-Membran abgetrennt. 310 ml Gantrez AN 179-Saccharose-Mutase mit 3040 Einheiten - 24,3 % der eingesetzten Aktivität. Beispiel 18 Adsorptive Bindung von Saccharose-Mutase an Titandioxid mit anschliessender Querver netzung mittels Glutardialdehyd 10 g Enzacryl-Titandioxid (Koch-Light Laboratories Ltd., Colnbrook, Fngland) werden in 10 ml destilliertem Wasser suspendiert und mit 4 ml Saccharose-Mutase-Lösung bei pH 6,5 gerührt. Der Enzymträger wird abgesaugt und mit destilliertem Wasser gewaschen. Ausbeute an Enzymträger: 12,88 g Titandioxid-Saccharose Mutase mit 22,3 Einheiten/g = 286,3 Einheiten. Filtrat: 75 ml mit 448,5 Einheiten Der Titandioxid-Saccharose-Mutase-Träger kann durch 30-minütige Behandlung mit 0,1 Zeiger Glutardialdehyd Lösung vernetzt werden. Beispiel 19 Umwandlung von Saccharose in Isomaltulose mit adsorbierter Saccharose-Mutase a) 21,3 g des trägergebundenen Enzyms aus Beispiel 3 werden in einer Säule 1,6 x 14 cm bei 300C mit einer 10 % igen Saccharose-Lösung durchströnt. Bei einem Durchfluss von 60 ml/Std. wird durch HPLC Analyse folgende Zusammensetzung des Säulenab laufes gefunden: 80,7 % Isomaltulose, 0 % Saccharose, 7,4 % l-0- ±- D-glucopyranosico-D-fructose, 6,9 / Fructose, 5 % Glucose. b) In der gleichen Säule wird 60 %ige Saccharose-Lösung mit einem Durchfluss von 20 ml/Std. umgewandelt. HPLC-Analyse des Ablaufes: 85,6 % Isomaltulose, 0 % Saccharose, 10,6 % 1-0- i- D-=lucopyranosico-D-fructose, 3,1 % Fructose, 0,7 % Glucose. Der Säulenreaktor wurde über eine Zeit von 540 Stunden mit einem Aktivitätsverlust von weniger als 30 % betrieben. c) In gleicher Weise wurde die Reaktion mit 60 %iger Saccharose-Lösung bei 450C und einem Durchfluss von 30 ml/Std durchgeführt. Unter diesen Be dingungen ging der Umsatz in 430 Stunden auf 50 % zurück. Beispiel 20 Umwandlung von Saccharose in Isomaltulose mit kovalent gebundener Saccharose-Mutase 50 ml eines feuchten Präparates trägergebundener Saccharose-Mutase nach Beispiel 8 werden in eine Säule 2 x 17 cm gefüllt und von einer 48 % Saccharose Lösung mit 11 ml/Std. durchströmt. Die Reaktion wird zuerst 500 Stunden bei 350C, dann weitere 330 Stunden bei 45"C durchgeführt. Der Säulenablauf hat typischerweise die Zusammensetzung: 80 % Isomaltulose, 6 % Saccharose, 8 % 1-0-aC-D-glucopy- ranosido-D-fructose, 4 YO Fructose, 2 % Glucose. Über die gesamte Versuchsdauer ist der Aktivitätsverlust des Reaktors weniger als 20 %.

Claims: Patentansprüche 1. Das aus Bakterien isolierte Enzym, welches Saccha rose in Isomaltulose umwandelt. 2. Das Enzym nach Anspruch 1, welches aus Protamino bacter gewonnen wird. 3. Immobilisiertes Enzym, das durch Immobilisierung eines Enzyms nach Anspruch 1 oder 2 gewonnen wird. 4. Immobilisiertes Enzym nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Immobilisierung durch Einschluss in Hohlfasern erfolgt. 5. Immobilisiertes Enzym nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Immobilisierung durch Adsorption an einen festen Träger erfolgt. 6. Immobilisiertes Enzym nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Immobilisierung durch kovalente Bindung an einen festen Träger erfolgt. 7. Immobilisiertes Enzym nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Immobilisierung durch kovalente Bindung an einen löslichen Träger er folgt. 8. Immobilisiertes Enzym nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Immobilisierung durch Bindung an eine Membran erfolgt. 9. Verfahren zur Herstellung von Isomaltulose aus Saccharose, dadurch gekennzeichnet, dass man ein immobilisiertes Enzym nach Anspruch 3-8 ver wendet und die Reaktion bei 30-600C und einer Saccharose-Konzentration von 10-75 %, vorzugs weise 40-60 %, chargenweise oder kontinuierlich durchführt. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man ein immobilisiertes aus Protaminobacter gewonnenes Enzym verwendet.

Inventors: KUTZBACH, CARL, DR., SCHMIDT-KASTNER, GUNTER, DR. PROF., SCHUTT, HERMANN, DR., Schmidt-Kastner, Günter, Dr. Prof.
Applicants: BAYER AG
Application year: 1981
Main classification: C12N9
IPC codes: C12P19, C12N11, C12N9