METHOD OF BINDING AND SEPARATING IN RESPECT OF COMPETITIVE RADIOIMMUNOASSAY, AND REAGENT THEREFOR

Abstract: 1. Process for binding, in an aqueous solution, an antigen which is specifically bound to a first antibody, and for separating this bound antigen from antigen which is not bound, for the determination of the antigen concentration in a body liquid with the aid of competitive radioimmunoassay, whereby the first antibody with the specifically bound antigen is separated from the free antigen which is dissolved in the aqueous solution, the separation being carried out by means of a second antibody, which is bound, on the one hand, to a Staphylococcus aureus cell, and, on the other hand, specifically binds the first antibody, and the process comprises adding a reaction accelerator to the aqueous solution, the reaction accelerator accelerating the specific binding of the first antibody by the second antibody, whereby 4-8 percent by weight polyethylene glycol, 5-10 percent by weight dextran, 5-10 percent by weight polyvinylpyrrolidone, 0,5-0,9 molar ammonium sulfate or 0,8-1,2 sodium sulfite are used as reaction accelerator.

Description: Verfahren zum Binden und Trennen für den kompetitiven Radioimmunoassay und Reagenz hierzu Beim kompetitiven Radioimmunoassay wird ein radioaktiv markiertes Antigen, ein unmarkiertes Antigen und ein für das Antigen spezifischer Antikörper einer kompetitiven Antigen Antikörper-Reaktion in einer wässrigen Pufferlösung unterworfen. Dabei konkurrieren eine definierte Menge an radio- aktiv markiertem Antigen und unmarkiertes Antigen um eine definerte Menge Antikörper, wobei der Antikörper im Vergleich zum Antigen im Unterschuss vorliegt. Der am Antikörper gebundene Anteil des radioaktiv markierten Antigens ist von der Menge des unmarkierten Antigens abhängig und nimmt mit steigender Menge des unmarkierten Antigens ab. Das Prinzip der radioimmunometrischen Messmethode beruht darauf, dass der am Antikörper gebundene Anteil des radicaktiv markierten Antigens, der bei einer zu messenden Probe beobachtet wird, verglichen wird mit dem Brgebnis von Eichproben mit bekanntem Antigengehalt und dadurch der Antigengehalt der zu messenden Probe bestimmt wird. Pbr die messung des am Antikörper gebundenen Anteils des radioaktiv markierten Antigens ist es notwendig, den Antigen Antikörper-Komplex vom nicht gebundenen Antigen abzutrennen. Die Methode des kompetitiven Radioimmunoassay ist im einzelnen in der Literatur beschrieben (vgl. R.P. Eins. Br.Med.Bull. 30, 3-11 (1974), sowie C.M. Boyd, D.L. Herzberg, in: Practical radioimmunoassay S. 1-17 (A.J. Moss, G.V. Dalrymple, C.M. Boyd, eds.) The C.V. Mosby Conpany, Saint Louis 1976). Die Genauigkeit des kompetitiven Radioimmunoassays hangt wesentlich von der Trennung des an den Antikörper gebun denen radioaktiv markierten Antigens vom freien radioaktiv markierten Antigen nach Beendigung der Antigen-Antikörper- Reaktion ab. Methoden und Trennreagenzien zur Trennung von Antikörpergebundenen und freien Antigenen sind bekannt, z.B. 1. Fällung des Antigen-Antikörper-Komplexes mit Protein fällungsreagensien, vgl. B. Desbuquois, G.D. Aurbach J.Clin.Endocr. 33, 732-738 (1971) 2. Adsorption des freien Antigens an Adsorptionsmittel 3. Bindung des Antikörpers (vor der Antigen-Antikörper Reaktion) an Oberflächen von wasserunföslichen Festkör pern, vgl. DOS 2 322 533 4. Adsorption des Antigen-Antikörper-Komplexes an Staphylo coccus aureus-Zellen, vgl. S. Jonsson, G. Kronvall Eur.J.Immunol. 4, 29-73 (1974) 5. Fällung des Antigen-Antikörper-Komplexes durch einen zweiten Antikörper (Trennantikörper), vgl. M.J. Martin, J. Landon Radioimmunoassay in Clinical Biochemistry S. 269-281 (Pasternak, editor) Heyden, london (1975) 6. Adsorption des Antigen-Antikörper-Komplexes an kleinen, wasserunlöslichen Partikeln (Festkörpern), die mit einen zweiten Antikörper (Trennantikörper) beschichtet sind, vgl. F.C. Den Hollander, A.H. W.M. Schuurs Radioimmuno assay Methode S. 419-422 (Kirkham and Hunter, eds.) Churchill Livingstone, London (1971); 5. Jonsson, G. Kronvall IAEA Report SM 177/48, 287-298 (1974). Die Trennung von Antikörper-gebundenem und freiem Antigen wird durch eine Phasentrennung vorgenommen, der meist ein Zentrifugationsschritt vorausgeht. Die oben genannten Methoden können wie folgt beschrieben werden: 1. Die Fällung von Antigen-Antikörper-Komplexen durch Pro teinfällungsreagenzien wie Ethanol, Ammonsulfat oder Polyethylenglykol ist einfach durchzuführen, da sofort nach Vermischen mit dem Fällungsreagenz eine Trennung durch Zentrifugieren möglich ist. Diese Methode setzt jedoch voraus, dass in der zu messenden Probe eine aus reichende Menge an Immunoglobulinen enthalten ist. Dies ist zwar in Serum oder Plasma, nicht aber in Urin, Li quor oder Magensaft der Fall. Effektive Trennungen sind zudem nur bei Antigenen mit einem Molgewicht möglich, das wesentlich unter dem Mol gewicht der Antikörper liegt. Dementsprechend ist die ses Verfahren nur für Spezialfälle anwendbar. Ferner hat es den Nachteil, dass ein oftmals nicht unwesent licher Anteil des freien Antigens mitgefällt wird. Die se Mitfällung schwankt mit dem Proteingehalt und der Proteinzusammensetzung der Probe und kann das Messergeb nis stören. 2. Die Adsorption des freien Antigens an Adsorptionsmittel wie Plrtivkohle, Ionenaustauscher und Silikate ist nur für kleine Antigene (z.B. Steroide, Peptide) geeignet und nicht allgemein anwendbar. Zudem kann das Reaktions gleichgewicht bei längerer Reaktionszeit mit dem Ad sorptionsmittel gestört werden. 3. Bei Anwendung eines Antikörpers, der an Oberflächen von wasserunlöslichen Festkörpern (z.B. Deströhrcheninnen- wand, Papierstreifen, Polymerkugeln verschiedener Grössen, Glasperlen, Bakterienzellen) gebunden ist, liegt der während der Inkubation gebildete Antigen Antikörper-Komplex ebenfalls am Festkörper gebunden vor und wird mit dem Festkörper vom freien Antigen, das in der Reaktionslösung enthalten ist, abgetrennt. Die jeweils gleiche Menge an Antikörper, mit der solche Festkörper beschichtet sind, ist Voraussetzung für die Genauigkeit des kompetitiven Radioimmunoassays und ist nur mit grossem Aufwand und Sorgfalt erreichbar. Zusätz lich treten gelegentlich unerwünschte Störungen auf durch Adsorption von Proteinen aus der Probe an dem Festkörper und der damit verbundenen Blockierung der Antikörper, die in definierter Menge wirksam sein müssen. 4. Aufgrund der spezifischen Adsorptionseigenschaften der Staphylococcus aureus-Zellen für einige Klassen von Immunglobulinen verschiedener Tierspezies - die beim Radioimmunoassay verwendeten Antikörper zählen zu den Inmunglobulinen - können Staphylococcus aureus-Zellen als Adsorbens für Antigen-Antikörper-Komplexe dienen. Die Methode ist nur anwendbar, wenn der Antikörper einer Immunglobulinklasse von einer Tierspezies angehört, deren entsprechendes Immunglobulin vom Staphylococcus aureus spezifisch gebunden wird. Dementsprechend ist das Verfahren nicht für Antikörper jeder beliebigen Tierspezies anwendbar. Enthält neben dem als Reagenz verwendeten Antikörper zusätzlich auch die zu messende Probe (z.B. Serum oder Plasma) grössere Mengen von Staphylococcus aureus binden dem Immunglobulin, so muss eine entsprechend grössere Menge an Staphylococcus aureus-Zellen eingesetzt werden. Dies hat den Nachteil, dass durch unspezifische Adsorp tionen von freiem Antigen die Trennung nicht vollstän dig ist. 5. Die Fällung des Antigen-Antikörper-Komplexes durch ei nen zweiten Antikörper (Trennantikörper), der gegen den Antigen-spezifischen ersten Antikörper gerichtet ist, ist zeitraubend, weil zwei Antigen-Antikörper-Reaktionen durchgeführt werden müssen. Die zweite Antigen-Antikör per-Reaktion kann durch Reaktionsbeschleuniger abgekürzt werden. Diese Methode hat den Nachteil, dass unerwünschte Mitfällungen von freiem Antigen auftreten, die vom schwankenden Proteingehalt der Probe bestimmt werden. Zudem ist der Niederschlag nach der Fällung schlecht sichtbar und kann beim Abtrennen des Überstandes unbe merkt verloren gehen. 6. Die Adsorption des Antigen-Antikörper-Komplexes durch einen zweiten Antikörper (Trennantikörper), der gegen den Antigen-spezifischen ersten Antikörper gerichtet ist und kovalent an einem wasserunlöslichen Festkörper (z.B. Cellulose, Staphylococcus aureus) gebunden ist, hat den Nachteil, dass zur vollständigen Adsorption des Antigen-Antikörper-Komplexes einige Stunden benötigt werden, während denen zudem durch ständige Bewegung des Reaktionsgefässes eine homogene Suspension des Festkör- pers erzeugt werden muss. Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Trennverfahrens und eines Trennreagenzes zur Trennung von freiem Antigen von einem an einem ersten Antikörper gebundenen Antigen beim kompetitiven Radioimmunoassay, wobei das Trennverfahren und das Trennreagenz die Nachteile der oben unter 1 bis 6 genannten Trennverfahren und Trennreagenzien vermeidet. Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Binden eines an einen ersten Antikörper spezifisch gebundenen Antigens in einer wässrigen Lösung und zum Abtennen dieses gebundenen Antigens von nicht gebundenem Antigen zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung der Antigenkonzentration in einer Körperflüssigkeit mit Hilfe des kompetitiven Radioimmunoassays, wobei der erste Antikörper mit dem spezifisch ge bundenen Antigen durch eine zweiten Antikörper, der einer seits an einer Staphylococcus aureus-Zelle gebunden ist und andererseits den ersten Antikörper spezifisch bindet, von dem freien, in der wässrigen Lösung gelösten Antigen abgetrennt wird, dadurch gekennzeichnet, dass der wässrigen Lösung ein Reaktionsbeschleuniger zugesetzt wird, der die spezifische Bindung des ersten Antikörpers durch den zweiten Antikörper beschleunigt, so dass die Bindungsreaktion in wenigen Minuten abgeschlossen ist. Die im Verfahren gemäss der Erfindung verwendeten Antigene sind Peptide, Proteine oder Glykoproteine, die ihrer Funktion entsprechend Hormone, Enzyme, Transportproteine oder Strukturproteine sein können und die bei der Immunisierung verschiedener Wirbeltierarten, vorzugsweise Säugetieren, eine Bildung von Antigen-spezifischen ersten Antikörpern hervorrufen. Die Bestimmung des Antigens in Körperflüssigkeiten wie Blutplasma, Blutserum, Urin, Liquor, Magensaft, Duodenalsaft, Fruchtwasser oder Synovialflüssigkeit wird mit Hilfe des kompetitiven Radioimmunoassays vorgenommen, wobei die genannten Körperfüssigkeiten vom Menschen oder von einem Tier stammen können. Als zweite Antikörper finden solche verschiedener Tierklassen, in erster Linie von Wirbeltieren, vorzugsweise von Säugetieren Verwendung, wobei dieser zweite Antikörper durch Immunisierung der Tiere mit Immunglobulinen einer fremden Tierart, von der der erste Antikörper stammt, gewonnen wurde. Staphylococcus aureus-Zellen binden Gamma Globuline vom Menschen oder von verschiedenen Tierarten wie Esel, Ziege, Schwein, Hund, Katze, Meerschweinchen oder Kaninchen spezifisch über ihr Fc-Fragment, wobei das Antigen-spezifische Fab-Fragment der Gamma-Globuline von der Bindung an der Staphylococcus aureus-Zelle unberührt bleibt (vgl. J.W. Goding, J.Immunol.Meth. 20, 241-253 (1978)). Vorteilhaft ist die Verwendung eines zweiten Antikörpers von grösseren Tieren wie Ziege oder Esel. Der zweite Antikörper lässt sich durch Inkubation der Staphylococcus aureus-Zelle mit dem Serum des immunisierten Tieres binden, wobei insbesondere die Gamma-Globuline spezifisch gebunden werden und die nicht bindenden Serumproteine und anderen Serumbestandteile durch Waschen der Zellen leicht abgetrennt werden können, ohne dass eine wesentliche Menge des zweiten Antikörpers wieder desorbiert wird. Fur die Bestimmung eines Antigens in Körperflüssigkeiten, die grössere Mengen an Immunglobulinen, insbesondere Gamma Globuline enthalten, wie Blutserum oder Blutplasma, ist es vorteilhaft, den zweiten Antikörper zusätzlich zu der genannten spezifischen (adsorptiven) Bindung kovalent an die Staphylococcus aureus-Zelle zu binden. Dazu wird der zweite Antikörper nach der spezifischen Adsorption an die Staphylococcus aureus-Zelle unter milden Bedingungen mittels eines bifunktionellen Reagenzes kovalent gebunden, wobei die Reaktionsfähigkeit des zweiten Antikörpers nicht wesentlich nachlässt. Aufgrund der kovalenten Bindung kann sich der zweite Antikörper nicht von der Zelle lösen und nicht durch Gamma-Globuline der Probe verdrängt werden. Durch kovalente Bindung mit einem bifunktionellen Reagenz werden einerseits Aminogruppen des zweiten Antikörpers und andererseits Aminogruppen von Zellwandproteinen des Staphylococcus aureus mit einander verbunden. Als bifunktionelle Reagenzien werden Dialdehyde, Diimidate, Diester oder Diisocyanate, z.B. Glutardialdehyd, Dimethyladipindiimidat, Suberinsäuredimethylester oder Hexamethylendiisocyanat verwendet. Die Staphylococcus aureus-Zellen werden vor Verwendung im Verfahren gemäss der Erfindung zweckmässig abgetötet durch Hitze- oder Eormaldehydbehandlmig. Vorteilhaft werden die Zellen dreissig Minuten auf 800C erwärmt und in einer 1.5 %igen Formaldehydlösung inkubiert, wodurch die Bindungsfähigkeit der Zellen für Gamma-Globuline nicht wesentlich abnimmt. Reaktionsbeschleuniger gemäss der Erfindung sind Substanzen, die die spezifische Bindungsreaktion eines ersten Antikörpers durch einen zweiten Antikörper beschleunigen, wobei sie die räumliche Polypeptidstruktur der Immunoglobuline, insbesondere der Gamma-Globuline, nicht wesentlich verändern und damit die spezifische Reaktionsfähigkeit der Antikörper nicht zerstören, z.B. hydrophile Polymere wie Dextran oder Polyvinylpyrrolidon. Vorteilhaft werden Substanzen verwendet, die in höheren Konzentrationen bevorzugt Immunglobuline, insbesondere Gamma-Globuline unlöslich machen oder ausfällen, z.B. hydrophile Polymere wie Polyethylenglykol, oder Salze, wie Ammonsulfat und Natriumsulfit. Hierbei ist eine niedrigere Konzentration dieser Substanzen zu verwenden als sie zum Fällen des ersten Antikörpers und des Antigens führen würde. Die Konzentration der Reaktionsbeschleuniger im Reaktionsgemisch bestehend aus dem ersten Antikörper und dem Antigen sowie dem an der Staphylococcus aureus-Zelle gebundenen zweiten Antikörper wird so gewählt, dass - die Polyethylenglykolkonzentration im allgemeinen drei bis zehn Gewichts-, vorzugsweise vier bis acht Ge wichts-, im besonderen 5 - 6 Gewichts-% beträgt bzw. - die Dextrankonzentration im allgemeinen drei bis zwanzig Gewichts-, vorzugsweise fünf bis zehn Gewichts-, im be sonderen sieben Gewichts- beträgt bzw. - die Polyvinylpyrrolidonkonzentration im allgemeinen drei bis fünfzehn Gewichts-, vorzugsweise fünf bis zehn Ge wichts-, im besonderen sieben Gewichts- beträgt bzw. - die Ammoniumsulfatkonzentration im allgemeinen 0.3 bis 1.2 Molar, vorzugsweise 0.5 - 0.9 Molar, im besonderen 0.7 - 0.8 Molar ist bzw. - die Natriumsulfitkonzentration im allgemeinen 0.5-1.5 Mo lar, vorzugsweise 0.8 - 1.2 Molar, im besonderen 1.0 Mo lar ist. Das Molekulargewicht der polymeren Reaktionsbeschleuniger liegt im Falle des Polyethylenglykols im allgemeinen zwischen 1000 und 20.000, vorzugsweise zwischen 2000 und 10.000, im besonderen bei 6000, im Falle des Dextrans im allgemeinen zwischen 2000 und 50.000, vorzugsweise zwischen 4000 und 20.000, im besonderen zwischen 8000 und 12.000, im Falle des Polyvinylpyrrolidons im allgemeinen zwischen 2000 und 25.000, vorzugsweise zwischen 5000 und 15.000, im besonderen bei 10.000. Der Reaktionsbeschleuniger kann schon vor der Reaktion des ersten Antikörpers mit dem Antigen zum Reaktionsgemisch gegeben werden, bevor der am Staphylococcus aureus gebundene zweite Antikörper zur Trennung zugegeben wird. Vorteilhaft wird aber zum Reaktionsgemisch bestehend aus Antigen und erstem Antikörper ein gebrauchsfertiges Trennreagenz zugegeben. Das gebrauchsfertige Trennreagenz enthält in einer wässrigen Pufferlösung den an Staphylococcus aureus gebundenen zweiten Antikörper sowie den Reaktionsbeschleuniger,dessen Konzentration so gewählt ist, dass nach der Zugabe des gebrauchsfertigen Trennreagenz zum Reaktionsgemisch bestehend aus Antigen und erstem Antikörper der Reaktionsbeschleuniger in den vorstehend genannten Konzentrationen vorliegt. Die Menge des am Staphylococcus aureus gebundenen zweiten Antikörpers (bei Verwendung von 0.1 ml zu bestimmender Körperflüssigkeit) entspricht der t¸nge, die üblicherweise bei einer Fällung des Antigen-Antikörper-Komplexes durch einen nicht gebundenen zweiten Antikörper benötigt wird. Die Menge an Staphylococcus beträgt (bei Verwendung von 0.1 ml zu bestimmender Körperflüssigkeit) im allgemeinen 0.5 bis 10 mg, vorzugsweise 1 bis 5 mg, im besonderen 2.5 mg. Zur Durchführung der radioimmunometrischen Bestimmung werden zurächst radioaktiv markiertes Antigen, nicht markiertes Antigen und Antigen-spezifischer erster Antikörper zusammen inkubiert. Dabei wird als nicht markiertes Antigen entweder eine Lösung von bekanntem Antigengehalt zur Verwendung als Eichprobe oder eine Körperflüssigkeit mit unbekanntem Antigengehalt als zu bestimmende Probe verwendet. Die Inkubation wird im allgemeinen bei Temperaturen zwischen Oo und 450C, vorzugsweise zwischen 170 und 270G und gewöhnlich bei Raumtemperatur vorgenommen. Das Trennreagenz wird vor der Zugabe zum Reaktionsgemisch geschüttelt, so dass eine gleichmässige Zellsuspension erhalten wird. Die Temperatur des Trennreagenz liegt im allgemeinen zwischen Oo und +4500, vorteilhaft wird sie der Temperatur der vorangehenden Inkubation angepasst. Nach dem Vermischen des Trennreagenz mit dem Reaktionsgemisch ist die Bindung des ersten Antikörpers durch den zweiten Antikörper in wenigen Minuten abgeschlossen. Während dieser Zeit bleiben die Zellen wegen ihrer geringen Grösse gleichmässig in der Lösung verteilt, so dass sie nicht durch Sedimentation für eine Bindung verloren gehen. Durch anschliessende Zentrifugation wird das am ersten Antikörper gebundene Antigen mit der mit dem zweiten Antikörper beladenen Staphylococcus aureus-Zelle als Niederschlag von dem freien Antigen in der überstehenden Lösung abgetrennt. Zur Bestimmung der Menge des am ersten Antikörper gebundenen mattierten Antigens wird die überstehende Lösung dekan tiert oder abgesaugt, wobei der Niederschlag zweckmässig anschliessend mit einer Pufferlösung gewaschen wird. Bei einem grösseren Volumen der überstehenden Flüssigkeit kann auf das Waschen verzichtet werden. Die Bestimmung der Radioaktivität wird nach bekannten Verfahren durch Strahlungsdetektoren vorgenommen. A. Da-s Trennverfahren gemäss der Erfindung ist bei der Be stimmung von Antigenen mit niedrigem oder hohem Noleku- largewicht geeignet, insbesondere für Peptide und Pro teine wie Follikel-stimulierendes Hormon, luteinisieren des Hormon, Schilddrüsen-stimulierendes Hormon, Cho riongondotropin, Prolaktin, Placentalaktogen, Wachstums- hormon, adrenocortikotropes Hormon, Gukagon, B-Kette des Choriongonadotropin, Parathormon, Alphafetoprotein, carcinoembryonales Antigen, Prostata-spezifische saure Phosphate, schwangerschaftsspezifisches ss1-Glykoprotein, die bei Abwesenheit Antigen-spezifischer Antikörper nicht an Staphylococcus aureus-Zellen gebunden werden. B. Das Trennverfahren ist allgemein anwendbar zur Trennung von freiem Antigen und von an einem beliebigen ersten Antikörper gebundenen Antigen, wobei der erste Antikör per von einer beliebigen ersten Tierspezies stammt und der zweite Antikörper jeweils durch Immunisierung einer zweiten Tierspezies mit Immunglobulin der ersten Tier spezies gewonnen wird, wobei die zweite Tierspezies so gewählt wird, dass deren Gamma-Globuline grösstenteils von der Staphylococcus aureus-Zelle spezifisch gebunden werden. C. Durch die spezifische Bindung des Antigen-beladenen er sten Antikörpers an den spezifisch an der Staphylococcus aureus-Zelle gebundenen zweiten Antikörper ergibt das Trennverfahren eine weitgehend quantitative Trennung des freien Antigene vom am ersten Antikörper gebundenen Antigen, die auch durch stark schwankenden Proteingehalt der zu bestimmenden Probe nicht wesentlich gestört wird. D. Der Reaktionsbeschleuniger für die Bindung des Antigen beladenen ersten Antikörpers durch den Staphylococcus aureus-gebundenen zweiten Antikörper erfordert nur eine sehr kurze zweite Inkubationszeit, während der ein stän diges Bewegen des Reaktionsgemisches zur homogenen Ver teilung der Zellen überflüssig ist, so dass nach der Ver mischung mit dem Trennreagenz ohne einen weiteren Ar beitsschritt und ohne grösseren Verzug zentrifugiert wer den kann. E. Der Zellniederschlag nach der Zentrifugation ist deut lich sichtbar und haftet gut am Boden des Zentrifugen röhrchens, so dass das Abtrennen der überstehenden Flüs sigkeit durch Absaugen oder Dekantieren problemlos ist und visuell einfach kontrolliert werden kann. Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert. Sämtliche Prozentangaben dort beziehen sich auf Gewichtsprozent. Beispiel 1 Bestimmung des humanen luteinisierenden Hormons (hLH) in Blutplasma oder Blutserum a) Herstellung des Trennreagenzes Zu 50 ml einer 10 zeigen Suspension von Staphylococcus aureus-Zellen in einer 0.9 % Natriumchlorid enthaltenden 0.05 m wässrigen Natriumphosphatpufferlösung vom pH 7.4 wurden 16 ml eines Antiserums von der Ziege, das Antikör per gegen Gamna-Globulin vom Kaninchen enthält, gegeben. Die Suspension wurde eine Stunde gerührt. AnschlIessend wurden die mit Antikörper beladenen Zellen durch Zentri fugieren und Dekantieren vom Überstand abgetrennt. Die Zellen wurden in 45 ml des oben genannten Puffers resus pendiert und zur kovalenten Bindung des Antikörpers an den Zellen unter ständigem Rühren mit 50 ml einer 0.2 %igen Glutardialdehydlösung in dem oben genannten Puffer und nach einstündigem Rühren mit 50 ml einer 5 zeigen Na triumsulfitlösung in dem oben genannten Puffer versetzt; um den überschüssigen nicht umgesetzten Glutardialdehyd zu inaktivieren. Nach einer weiteren Stunde Rühren wurden die Zellen durch Zentrifugieren und Dekantieren vom Über stand abgetrennt. Die Zellen wurden gewaschen, indem sie in 200 ml 0.05 m wässrigen Natriumphosphatpuffer vom pH 7.4 resuspendiert wurden und durch Zentrifugieren und Dekantieren vom Waschpuffer abgetrennt wurden. Das gebrauchsfertige Trennreagenz wurde hergestellt, in dem die so behandelten Zellen mit dem zweiten Antikörper anschliessend in 500 ml einer 10 %igen Lösung von Poly ethylenglykol mit einem Molekulargewicht von 6000 in 0.05 m wässrigen Natriumphosphatpuffer vom pH 7.4 resus pendiert wurden. b) Durchführung der Bestimmung Die Analysen wurden in Zentrifugenröhrchen von 3 bis 5 ml aus Polystyrol oder Polypropylen durchgeführt. 0.1 ml der zu untersuchenden humanen Serum- oder Plasma probe wurde in ein Röhrchen gegeben. 0.1 ml einer Eichprobe mit verschiedenen hLH-Konzentra tionen, z.B. 0, 4, 7, 14, 27, 54 und 100 m Einheiten hLH/ml wurden jeweils in ein Röhrchen gegeben. 0.2 ml einer 125J-hTH enthaltenden Lösung (etwa 0.5 ng hLE/ml von einer spezifischen Radioaktivität von 100 nCi JQd-125/ng hLH) wurden in alle Röhrchen gegeben. Q.2 ml einer Antikörperlösung gegen hLH, die in Abwesen heit von unmarkiertem hLH 30 bis 50 % des 125J-hLH bin den konnte, wurde in alle Röhrchen gegeben. Die Inkubation fand während zwanzig Stunden bei Raumtem peratur statt. 0.5 ml des gebrauchsfertigen Trennreagenz entsprechend Beispiel 1a), das vor Gebrauch geschüttelt wurde, um eine homogene Zellsuspension zu erhalten, wurde in alle Röhrchen gegeben. Alle Röhrchen wurden zum Vermischen des Inhalts geschüt telt und nach mindestens zehn Minuten bei etwa 2000 g zehn Minuten lang zentrifugiert. Der Niederschlag wurde durch Dekantieren oder Absaugen der überstehenden Flüssigkeit abgetrennt und mit einer 0.05 m wässrigen Natriumphosphatpufferlösung vom pH 7.4 gewaschen. Nach dem Abtrennen der überstehenden Flüssigkeit wurde die Gamma-Strahlung des im Niederschlag enthaltenen markierten hLH in allen Röhrchen gemessen. In einem Diagramm wurden die Impulse der Gamma-Strahlung der Eichproben pro Zeiteinheit linear gegen die hLH-Kon zentration der Eichproben aufgetragen. Aus diesem Dia gramm wurde dann die hLH-Konsentration der unbekannten Probe bestimmt. Beispiel 2 Bestimmung des humanen Alphafetoproteins (AFP) in Fruchtwasser a) Herstellung des Trennreagenzes Zu 50 ml einer 10 Eigen Suspension von Staphylococcus aureus-Zellen in einer 0.9 zeiger wässriger Natriumchlorid wurden 50 ml eines Antiserums vom Esel, das Antikörper gegen Gamma-Globulin vom Kaninchen enthält, gegeben. Die Suspension wurde eine Stunde gerührt. Anschliessend wurden die Zellen durch Zentrifugieren und Dekantieren vom Über stand abgetrennt. Die Zellen wurden gewaschen,indem sie mit 200 ml 0.9 %iger wässriger Natriumchloridlösung re suspendiert und durch Zentrifugieren und Dekantieren von der Waschlösung abgetrennt wurden. Das gebrauchsfertige Trennreagenz wurde hergestellt, in dem die so behandelten Zellen mit dem zweiten Antikörper anschliessend in 500 ml einer wässrigen Pufferlösung vom pH 7.4, die 1.6 m Natriumsulfit und 0.05 m Natriumphos phat enthielt, resuspendiert wurden. b) Durchführung der Bestimmung Die Analysen wurden in Zentrifugenröhrchen von 5 bis 5 ml aus Polystyrol oder Polypropylen durchgeführt. 0.1 ml der zu untersuchenden, zuvor 1:100 verdünnten Fruchtwasserprobe wurde in ein Röhrchen gegeben. 0.1 ml einer Eichprobe mit verschiedenen AFP-Konzentra tionen, z.B. 0, 25, 50, 100, 200 und 400 Einheiten AFP/ml wurden jeweils in ein Röhrchen gegeben. 0.2 ml einer 125J-AFP enthaltenden Lösung (etwa 1 Ein heit AFP/ml von einer spezifischen Radioaktivität von 40 nCi Jod-125/Einheit AFP) wurden in alle Röhrchen gegeben. 0.2 ml einer Antikörperlösung gegen AFP, die in Abwesen heit von unrarkiertem AFP 40 bis 60 ffi des 125J-AFP binden konnte, wurde in alle Röhrchen gegeben. Die Inkulation fand während zwanzig Stunden bei Raumtem peratur statt. 0.5 ml des gebrauchsfertigen Trennreagenz entsprechend Beispiel 2a), das vor Gebrauch kurz geschüttelt wurde, um eine homcgene Zellsuspension zu erhalten, wurde in alle Röhrchen gegeben. Alle Röhrchen würden zum Vermischen des Inhalts kurz geschüttelt und fünf bis zehn Minuten später bei etwa 2000 g zehn Minuten lang zentrifugiert. Der Niedersnilag wurde durch Dekantieren oder Absaugen der überstehenden Flüssigkeit abgetrennt. Nach dem Abtrennen der überstehenden Flüssigkeit wurde die Gamma-Strahlung des im Niederschlag enthaltenen mar kierten AFP in allen Röhrchen gemessen In einem Diagramm wurden die Impulse der Gamma-Strahlung der Bichproben pro Zeiteinheit linear gegen die AFP-Kon zentrati der Eichproben aufgetragen. Aus diesem Dia gramm konnte dann die APP-Konzentration der unbekannten Probe bestimmt werden. Beispiel 3 Bestimmung des humanen Alphafetoproteins (AFP) in Frucht- wasser a) Herstellung des Trennreagenzes Die Herstelaung des Trennreagenzes wurde einschliesslich des Waschscrrittes entsprechend Beispiel 1a) durchge führt. Das gebrsucosfertige Trennreagenz wurde hergestellt indem die so teha elten Zellen mit dem zweiten Antikörper an schiebend in 500 ml einer 10 %igen Lösung von Polyvinyl pyrrolidon mit einem mittleren Molekulargewicht von 10.000 in 0.05 m wässrigem Natriumphosphatpuffer vom pH 7.4 resuspendiert wurden. b) Durchführung der Bestimmung Die Analysen wurden in Zentrifugenröhrchen von 3 bis 5 ml aus Polystyrol oder Polypropylen durchgeführt. 0.1 ml der zu untersuchenden, zuvor 1:100 verdünnten Pruchtwasserprobe wurde in ein Röhrchen gegeben. 0.1 ml einer Eichprobe mit verschiedenen AFP-Konzentra tionen, z.B. 0, 25, 50, 100, 200 und 400 Einheiten AFP/ml wurden jeweils in ein Röhrchen gegeben. 0.2 ml einer 125J-AFP enthaltenden Lösung (etwa 1 Einheit AFP/ml von einer spezifischen Radioaktivität von 40 nCi Jod-125/Einheit APP) wurden in alle Röhrchen gegeben. 0.2 ml einer Antikörperlösung gegen AFP, die in Abwesen heit von unmarkiertem AFP 40 bis 60 ffi des 125J-AFP binden konnte, wurde in alle Röhrchen gegeben. Die Inkubation fand während zwanzig Stunden bei Raumtem peratur statt. 1.0 ml des gebrauchsfertigen Trennreagenz entsprechend Beispiel 3a), das vor Gebrauch kurz geschüttelt wurde, um eine homogene Zellsuspension zu erhalten, wurde in alle Röhrchen gegeben. Alle Röhrchen wurden zum Vermischen des Inhalts kurz geschüttelt und zehn bis dreissig Minuten später bei etwa 2000 g zehn Minuten lang zentrifugiert. Der Niederschlag wurde durch Dekantieren oder Absaugen der überstehenden Flüssigkeit abgetrennt. Nach dem Abtrennen der überstehenden Flüssigkeit wurde die Gamma-Strahluno des im Niederschlag enthaltenen markierten AFP in allen Röhrchen gemessen. In einem Diagramm lrarden die Impulse der Gamma-Strahlung der Eichproben pro Zeiteinheit linear gegen die APP-Kon- zentration der Eichproben aufgetragen. Aus diesem Dia gramm konnte dann die AFP-Konzentration der unbekannten Probe bestimmt werden. Beispiel 4 Bestimmung des humanen Schilddrüsen-stimulierenden Hormons (hTSE) in Blutserum oder Blutplasma a) Herstellung des Trennreagenzes Die Herstellung des Trennreagenzes wurde einschliesslich des Waschschrittes entsprechend Beispiel 1a) durchge führt. Das gebrauchsfertige Trennreagenz wurde herge stellt, indem die so behandelten Zellen mit dem zweiten Antikörper anschliessend in 500 ml einer wässrigen Puffer lösung vom pH 7,4, die 1,3 m Ammonsulfat und 0,05 m Natriumphosphat enthielt, resuspendiert wurden. b) Durchführung der Bestimmung 0.1 ml der zu untersuchenden humanen Serum- oder Plasma probe wurde in ein Röhrchen gegeben. 0.1 ml einer Eichprobe mit verschiedenen hTSH-Konzentra- tionen, z.B. 0, 6, 12, 25, 50 und 100 /u Einheiten hTSH/ml wurden jeweils in ein Röhrchen gegeben. 0.1 ml einer 1 25J-hTSH enthaltenden Lösung (etwa 0.4 ng hTSH/ml von einer spezifischen Radioaktivität von 80 nCi Jod-125/ng hTSH) wurden in alle Röhrchen gegeben. 0.1 ml einer Antikörperlösung gegen hTSH, die in Abwesen heit von unmarkiertem hTSH 30 bis 50 % des 125J-hTSH binden konnte, wurde in alle Röhrchen gegeben. Die Inkubation fand während zwanzig Stunden bei Raumtem peratur statt. 0.5 ml des gebrauchsfertigen Trennreagenz entsprechend Beispiel 4a), das vor Gebrauch kurz geschüttelt wurde, um eine homogene Zellsuspension zu erhalten, wurde in alle Röhrchen gegeben. Alle Röhrchen wurden zum Vermischen des Inhalts kurz geschüttelt und fünfzehn bis dreissig Minuten später bei etwa 2000 g zehn Minuten lang zentrifugiert. Der Niederschlag wurde durch Dekantieren oder Absaugen der überstehenden Flüssigkeit abgetrennt und mit einer 0.05 m wässrigen Natriumphosphatpufferlösung vom pH 7.4 gewaschen. Nach dem Abtrennen der überstehenden Flüssigkeit wurde die Gamma-Strahlung des im Niederschlag enthaltenen markierten hTSH in allen Röhrchen gemessen. In einem Diagramm wurden die Impulse der Gamma-Strahlung der Eichproben pro Zeiteinheit linear gegen die hTSH-Kon zentration der Ei chpr oben aufgetragen. Aus diesem Dia gramm konnte dann die hTSH-Konzentration der unbekannten Probe 30 bestimmt werden. Beispiel 5 Bestimmung des humanen Follikel-stimulierenden Hormons (hFSH) in Blutserum oder Blutplasma a) Herstellung des Trennreagenzes Die Herstellung des Trennreagenzes wurde einschliesslich des Waschschrittes entsprechend Beispiel 1a) durchge führt. Das gebrauchsfertige Trennreagenz wurde hergestellt indem die so behandelten Zellen mit dem zweiten Antikörper an schliessend in 500 ml einer 15 zeigen Lösung von Polyvinyl pyrrolidon mit einem mittleren Molekulargewicht von 10.000 in 0.05 m wässrigem Natriumphosphatpuffer vom pH 7.4 resuspendiert wurden. b) Durchführung der Bestimmung Die Analysen wurden in Zentrifugenröhrchen von 3 bis 5 ml aus Polystyrol oder Polypropylen durchgeführt. Q.1 ml der zu untersuchenden humanen Serum- oder Plasma probe wurde in ein Röhrchen gegeben. 0.1 ml einer Eichprobe mit verschiedenen hFSH-Konzentra tionen, z.B. 0, 5, 10, 20, 40 und 80 m Einheiten hFSH/ml wurden jeweils in ein Röhrchen gegeben. 0.2 ml einer 125J-hFSH enthaltenden Lösung (etwa 0.5 ng hFSH/ml von einer spezifischen Radioaktivität von 100 nCi Jod-125/ng hFSH) wurden in alle Röhrchen gegeben. 0.2 ml einer Antikörperlösung gegen hFSH, die in Abwesen heit von unmarkiertem hFSH 30 bis 50 % des 125J-hFSH bin den konnte, wurde in alle Röhrchen gegeben. Die Inkubation fand während zwanzig Stunden bei Raumtem peratur statt. 0.5 ml des gebrauchsfertigen Trennreagenz entsprechend Beispiel 5a), das vor Gebrauch kurz geschüttelt wurde, um eine homogene Zellsuspension zu erhalten, wurde in alle Röhrchen gegeben. Alle Röhrchen wurden zum Vermischen des Inhalts kurz ge schüttelt und fünf zehn bis dreissig Minuten später bei etwa 2000 g zehn Minuten lang zentrifugiert. Der Niederschlag wurde durch Dekantieren oder Absaugen der überstehenden Flüssigkeit abgetrennt und mit einer 0.05 m wässrigen Natriumphosphatpufferlösung vom pH 7.4 gewaschen. Nach dem Abtrennen der überstehenden Flüssigkeit wurde die Gamma-Strahlung des fm Niederschlag enthaltenen markierten hFSH in allen Röhrchen gemessen. In einem Diagramm wurden die Impulse der Gamma-Strahlung der Eichproben pro Zeiteinheit linear gegen die hFSH-Kon zentration der Eichproben aufgetragen. Aus diesem Dia gramm konnte dann die hFSH-Konzentration der unbekannten Probe bestimmt werden.

Claims: Patentansprüche: 1. Verfahren zum Binden eines an einen ersten Antikörper spezifisch gebundenen Antigens in einer wässrigen Lö sung und zum Abtrennen dieses gebundenen Antigens von nicht gebundenem Antigen zur Bestimmung der Antigen konzentration in einer Körperflüssigkeit mit Hilfe des kompetitiven Radioimmunoassays, wobei der erste Anti körper mit dem spezifisch gebundenen Antigen durch einen zweiten Antikörper, der einerseits an einer Staphylococcus aureus-Zelle gebunden ist und anderer seits den ersten Antikörper spezifisch bindet von dem freien, in der wässrigen Lösung gelösten Antigen abge trennt wird, dadurch gekennzeichnet, dass der wässrigen Lösung ein Reaktionsbeschleuniger zugesetzt wird, der die spezifische Bindung des ersten Antikörpers durch den zweiten Antikörper beschleunigt. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Reaktionsbeschleuniger Polyethylenglykol, Dextran, Polyvinylpyrrolidon, Ammonsulfat oder Natriumsulfit ver wendet wird. 3. Reagenz für die Trennung von freiem Antigen von einem an einem ersten Antikörper gebundenen Antigen bei der Bestimmung eines Antigens mit Hilfe des kompetitiven Radioimmunoassays, bestehend aus einer wässrigen Puffer lösung, einem Reaktionsbeschleuniger und Staphylococcus aureus-Zellen, an die der zweite Antikörper spezifisch gebunden ist.

Inventors: HACHMANN, HENNING, DR., SEIDEL, LOTHAR, DR., STRECKER, HELMUT, DR.
Applicants: HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1981
Main classification: G01N33
IPC codes: G01N33