PROCESS FOR PREPARING HUMAN INTERFERON FROM LYMPHOBLASTOID CELLS

Abstract: 1. Process for preparing human interferon, characterised in that NC-37 cells cultivated in suspension are treated with one or more stimulator substances selected from the series of short-chain fatty acids or salts thereof, the production of interferon is stimulated by viral inductors and the interferon thus formed is separated off and/or purified.

Description: Verbessertes Verfahren zur Herstellung von Humaninter feron aus lymphoblastoiden Zellen Die Herstellung von Humaninterferon aus Zellen menschlichen Ursprungs hat aufgrund der medizinischen Bedeutung der Interferone bei der Behandlung akuter und chronischer Virusinfektionen, sowie bei der Krebstherapie weltweite Beachtung gefunden. Die hierfür benötigten Mengen von Interferon können jedoch durch die bis er bekannten Herstellungsverfahren nicht zur Verfügung gestellt erden, da nur niedrige Konzentrationen von Humaninterferon erreicht werden. Die Herstellung der Interferone erfolgt bei den bisher bekannten Verfahren durch Behandlung der Zellen mit einem Interferoninduktor (z.B. Virus oder Nukleinsäure) und anschliessende Inkubation der behandelten Zellen in Zellkulturmedium. Die Interferonausbeute kann hierbei gesteigert werden, wenn Zellen vor der Induktion mit kleinen Mengen Interferon, dem sogenannten Priming (siehe Stewart et al. in J. Virol. 7, 792 (1971)), behandelt wer den. Da Interferone speziesspezifisch wirksam sind, können zur Herstellung von am Menschen wirksamen Interferonen nur Humanzellen verwendet werden. Dafür kommen sowohl Zellen des Fibroblastentyps in Frage, welche auf Oberflächen kultiviert werden, als auch Zellen hämatopoetischen Ursprungs, welche in Suspension kultiviert werden können. Zur letzt genannten Gruppe zählen humane lymphoblastoide Zellen, welche den Vorteil besitzen, unbeschränkte Zeit in Suspensionskultur mit einem Minimum an technischer Manipulation propagiert werden zu können. Besonders geeignet erwies sich die Zellinie Namalwa (Strander H., Mogensen, K.E. and Cantell, K.: Production of human lymphoblastoid Interferon in Journal of Clinical Microbiology 1, 116 (1975)). Diese Zellen produzieren nach Induktion mit Sendai Virus oder Newcastle Disease Virus 102 2 104 Internationale Einheiten (IE) Interferon/ml. Desweiteren ist bekannt (siehe EU-OS 0.000.520), dass durch Vorbehandlung von Namalwa Zellen mit kurzkettigen Fettsäuren vor Priming und Virus induktion sich die Produktion von Interferon steigern lässt und Werte bis zu 6 x 104 IE/ml erreicht. Uberraschenderweiae wurde nun gefunden, dass durch Zugabe einer oder mehreren Stimulatqrsubstanzen, wie einer kurzkettigen Fettsäure, zu ganz bestimmten humanen lymphoblastoiden Zellen, nämlich zu NC-37-Zellen, die Interferonproduktion wesentlich stärker gesteigert werden kann als bei Namalwa Zellen und dass Interferonmengen von 105 IE/ml produziert werden können, wobei die Reinheit einer derartigen Präparation in bezug auf Gesamtprotein der Erntelösung bei 106 IE/mg Protein ohne Verwendung weiterer Reinigungsschritte liegt. Als Stimulatorsubstanz hat sich insbesondere eine gesättigte, aliphatische Carbonsäure, z.B. eine Alkansäure mit 3-6 Kohlen- stoffatomen, wie die Propionsäure, n-Buttersäure, Isobuttersäure, Valeriansäure, Capronsäure und deren Salze mit anorganischen oder organischen Basen, insbesondere jedoch deren Alkalisalze, und als lymphoblastoide Zellinie insbesondere die Linie NC-37 bewahrt, welche von Durr, F.E., Monroe, J.H., Schmitter, K., Traul, K.A., und Hirsaut (Y. International Journal of Cancer 6, 436 (1970)) aus peripheren Blutzellen eines Epstein-Barr Virus (EBV) seroaktiven, gesunden Donors, isoliert wurde und durch Associated Biomedical Systems Inc., Buffalo (USA), erhältlich ist. NC-37 Zellen werden in einem Wachstumsmedium, vorzugsweise dem Medium RPMI 1640 (Fa. Gibco, USA oder Fa. Flow, Grossbritannien) kultiviert, welches als Zusätze 1-10 Vol %, vorzugsweise jedoch 2-6 Vol % vorgereinigtes Humanserum enthält. Hierbei können alternativ oder zusätzlich zu Humanserum auch Serum oder Serumfraktionen anderer Spezies verwendet werden, z.B. fötales Rinderserum in einer Konzentration von 2-15 Vol %. Als weitere Zusätze können Lactalbuminhydrolysat - und Antibiotica - dem Wachstumsmedium zugesetzt werden. Die derart kultivierten Zellen werden in Suspension bei einer Dichte von 0.2 - 5 x 1o6 Zellen/ml, vorzugsweise aber bei einer Dichte von 0.4 - 1 x 106 Zellen/ml mit einer Stimulatorverbindung, z.B. einem Alkalisalz der n-Buttersäure, in einer Endkonzentration von zweckmässigerweise 1 mMol/l versetzt und zweckmässigerweise bei einer Temperatur von 33 - 39 0C inkubiert. Nach einem Zeitraum von 6-72 Stunden, vorzugsweise jedoch von 24-48 Stunden, werden die Zellen durch Zentrifugation gewonnen und zweckmässigerweise bei einer Dichte von 1 - 5 x 107 Zellen/ml in Medium, mit oder ohne Stimulatorsubstanz suspendiert. Diese Suspension kann nun wahlweise einem "Priming" mit Interferon unterworfen werden: Dazu wird die Zellsuspension mit 1-1000 IE/ ml Humaninterferon, vorzugsweise jedoch 100-500 IE/ml lIumanin- terferon, versetzt und bei 37 0C inkubiert. Die Zugabe des Interferons 5 Minuten vor Zugabe des Interferoninduktors hat sich dabei als ausreichend erwiesen. Die Zellsuspension, mit oder ohne "Priming" wird beispielsweise mit Sendaivirus bei einer Konzentration von 29 - 213 IIämagglutinierende Einheiten HAU/ml, bevor zugt jedoch mit 21 - 211 NAU/ml, als Interferoninduktor infiziert und bei 33-390C inkubiert. Nach ungefähr 1-3 Stunden werden die infizierten Zellen durch Zentrifugation gesammelt und bei einer Dichte von 1 - 5 x 106 Zellen/ml in einem serumfreien Zellkulturmedium, z.B. in "Minimum Essential Medium Eagle" (Fa. Gibco, USA oder Fa. Flow, Grossbritannien), für einen Zeitraum von 10-24 Stunden, vorzugsweise aber 18-20 Stunden, bei 33-390C und einem pH Wert des Gewebekulturmediums von 6,7 - 8,0, vorzugsweise jedoch von 7,3, inkubiert. Die erhaltene Lösung des lymphoblastoiden Rohinterferons wird durch Zentrifugation von den NC-37-Zellen abgetrennt und zur Inaktivierung restlicher Induktorviren durch Zugabe von Mineralsäure, beispielsweise von Salzsäure auf einen pH-Wert von vorzugsweise 2,0 eingestellt und mehrere Tage z.B. 1-5 Tage bei 0-4 C inkubiert. Zur weiteren Reinigung kann die so gewonnene Lösung von lymphoblastoidem Rohinterferon nach Belieben literaturbekannten Rei nigungsschritten unterzogen werden. Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern jedoch nicht den Umfang der Erfindung einschränken: Vorbemerkunq: NC-37 - Zellen werden ip Suspensionskultur in Schüttelkulturen, Rollkulturen oder in eipem Fermentor vermehrt. Hierbei wird als Wachstumsmedium das Medium RPMI 1640 verwendet, dem 0,1 Vol % Lactalbuminhydrolysat, 2-4 Vol % vorgereinigtes Humanserum und zusätzlich oder alternativ 2-5 % fötales Rinder serum zugegeben ist. Weiters enthält das Wachstumsmedium Antibiotica; entweder Penicillin-Streptomycin oder Gentamycin. Das vorgereinigte Human serum wird durch Fällung eines Teiles der Serumproteine mit 6 % Polyäthylenglykol 6000 hergestellt (Inglot et al. Acta Virol.19, 250 (1975)). Alternativ wird als Wachstumsmedium das "Minimum Essential Medium Eagle1 mit 5-10 % fötalem Rinderserum und Antibiotikazusatz verwendet. Das Sendai Virus wird in embryonierten Hühnereiern vermehrt, die Reinigung erfolgt durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation und anschliessende Suspension in Wachstums medium mittels Ultraschall-Behandlung. Das Sendai Virus wird bei -700C aufbewahrt. Beispiel 1 NC-37-Zellen in exponentiellem Wachstumsstadium wurden in Rollflaschenkulturen bei einer Dichte von 4 x 10 Zellen/ml in 2000 ml RPMI 1640 Wachstumsmedium 24 Stunden bei 37 C kultiviert, und anschliessend in Gegenwart von 1 mMol/l Natrium-n-butyrat im Wachstumsmedlum weitere 40 Stunden bei 370C inkubiert. Die Zeller wurden durch Zentrifugation (700 x g, 15 Minuten) gesammelt und bei einer Dichte von 20 x 106 Zellen/ml in 66 ml Wachstumsmedium bei 370C mit 2 ml Sendai Virus (HAU s 2 14/mol) zwei Stunden bei 370C geschüttelt. Die auf diese Weise induzierten Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und bei einer Dichte von 2.0 x 106 Zellen/ml in 660 ml serumfreiem Eagle's-Minimum Essential Medium (mit Earle Salzen) bei 370C 20 Stunden lang bei pH 7,3 in Rollerflaschen inkubiert. Die Rollgeschwindigkeit betrug 0,5 Umdrehungen/Minute. Die Rohlösung (=Zellüberstand) wurde nach Abzentrifugieren der Zellen (200 x g, 15 Minuten) bei einer Temnatur von maximal 10 c mit 5 n Salzsäure auf pH 2 eingestellt und 4 Tage bei 4 C zur Inaktivierung des Sendai Virus gelagert. in gleicher Versuchsanaatz, jedoch ohne Zusatz von Natrium-n butyrat, diente zur Bestimmung der Interferonproduktionssteierdung durch Stimulatorsubstanzen in NC-37 Zellen. Die nachfolgende Tabelle enthält die gefundene Ausbeutesteige ung an Interferon in NC-37 Zellen nach Zugabe von 1 mMol/l atrium-n-butyrat. EMI6.1 <tb> <SEP> Konzentration <SEP> Natrium-n <tb> <SEP> butyrat <SEP> (mMol/l) <SEP> <tb> <SEP> 0 <SEP> 1 <tb> Volumen <SEP> der <SEP> NC-37-Zellsuspension <tb> nach <SEP> Induktion <SEP> (ml) <SEP> 660 <SEP> 660 <tb> Interferonproduktion <SEP> (Interna <tb> tionale <SEP> Einheiten <SEP> IE/ml) <SEP> 30 <SEP> 44 <SEP> 200 <tb> Produktionssteigerung <SEP> (Faktor) <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 470 <tb> Gesamtproteingehalt <SEP> in <SEP> der <SEP> Roh <tb> interferonpräparation <SEP> (mg/ml > <SEP> 0.037 <SEP> 0.037 <tb> spezifische <SEP> Aktivität <SEP> des <SEP> Roh <tb> interferons <SEP> (IE <SEP> Interferon/mg <tb> Protein) <SEP> 810 <SEP> 1.215.420 <tb> Beispiel 2 Um die Interferonprodukte in NC-37 Zellen mit derjenigen in Namalwa Zellen mit und ohne Zusatz von Stimulatorsubstanzen zu vergleichen, wurde folgendes Beispiel durchgeführt: In Parallelkulturen wurden NC-37 Zellen und Namalwa Zellen bei einer Zelldichte von 0,25 x 106 Zellen/ml (Gesamtvolumen je 500 ml) in Minimum Essential Medium Eagle, welches mit 10 Vol * fötalem Rinderserum kompletiert wax, entweder mit 1 mMol/l Natrium-n-butyrat versetzt, oder unbehandelt 26 Stunden bei 370C inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt (700 x g, 15 Minuten) und bei einer Dichte von 5 x 107 Zellen/ml bei 370C 2 Stunden in Rollkulturflaschen mit Wachstumsmedium, welches 210 HAU Sendai Virus/ml enthielt, inkubiert. Die derart induzierten Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und bei einer Dichte von 5 x 106 Zellen/ml in serumfreiem Minimum Essential Medium Eagle bei 370C 20 Stunden lang bei pH = 7.3 inkubiert. Die Rohlösungen wurden nach Abzentrifugieren der Zellen, analog zu Beispiel 1 behandelt. Das Ergebnis von Beispiel 2 ist in der nachfolgenden Tabelle zu sammengefasst und zeigt im direkten Vergleich die Uberlegenheit von NC-37 Zellen gegenüber Namalwa Zellen für die Produktion von lymphoblastoidem Humaninterferon: Sowohl die Steigerung der Interferonproduktion durch Natrium-n-butyratbehandlung als auch die absolute Ausbeute an Interferon liegt in NC-37 Zellen höher als in Namalwa-Zellen. EMI7.1 <tb> Konzentration <SEP> Na- <SEP> Interferonproduktion <SEP> Steigerungsfaktor <tb> trium-n-butyrat <SEP> (IE/106 <SEP> Zellen): <SEP> der <SEP> Interferonproduktio <SEP> <tb> <SEP> m <SEP> Mol/l <SEP> Namalwa <SEP> NC-37 <SEP> Namalwa <SEP> NC-37 <tb> <SEP> 0 <SEP> 280 <SEP> 16 <SEP> 1 <SEP> 1 <tb> <SEP> 21 <SEP> <SEP> 270 <SEP> 21 <SEP> 000 <SEP> 26 <SEP> 1 <SEP> 300 <tb> Beispiel 3 Zur Bestimmung des wPriming"-Effekts auf die Interferonproduktio in NC-37 Zellen wurde folgendes Beispiel durchgeführt: NC-37 Zellen wurden wie in Beispiel 1 kultiviert und bei einer Zelldichte von 0.55 x 106 Zellen/ml (1000 ml) mit 1 mMol/l Natrium-n-butyrat 48 Stunden bei 370C inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet (700 x g, 15 Minuten), in 22 ml Wachstumsmedium resuspendiert und in zwei Aliquote zu 11 ml geteilt. Zu einem der Aliquote wurden 500 IE/ml Humaninterferon zugesetzt und 5 Minuten bei 370C geschüttelt ("Priming"), das zweite Aliquot wurde unbehandelt gelassen. Zu jedem der Aliquote wurden 0,35 ml Sendai Virus Suspension (214 HAU/ml) zugesetzt und 2 Stunden bei 370C unter Schütteln inkubiert. Die derart induzierten Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und bei einer Dichte von 2.0 x 106 Zellen/ml in serumfreiem Minimum Essential Medium Eagle bei 370C 18 Stun den bei pH - 7.3 inkubiert. Die Rohlösungen (nach Abzentrifugieren der Zellen bei 2000 x g, 15 Minuten) wurden wie in Beispiel 1 behandelt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefasst und zeigen, dass durch "PrimingZ mit Interferon in NC-37 Zellen eine Steigerung der Interferonproduktion auf 105 IE/ml Rohlösung erreicht werden konnte: ffekt des "Primings" mit Humaninterferon auf die Interferonausheute in NC-37 Zellen: EMI8.1 <tb> WPriming" <SEP> mit <SEP> IE <SEP> Interferon/ml <SEP> Interferonproduktion <SEP> in <SEP> NC-37 <tb> <SEP> Zellen <tb> <SEP> IE/ml <SEP> IE/mg <SEP> Protein <tb> <SEP> Rohlösung <SEP> in <SEP> der <SEP> Rohlösung <tb> <SEP> 0 <SEP> 67 <SEP> 900 <SEP> 622 <SEP> 500 <tb> <SEP> 500 <SEP> 97 <SEP> 000 <SEP> 970 <SEP> 000 <tb>

Claims: P a t e n t a n s p r ü c h e 1. Verfahren zur Herstellung von Humaninterferon, dadurch ge kennzeichnet, dass in Suspension kultivierte NC-37-Zellen mit einer oder mehreren Stimulatorsubstanzen behandelt und die Interferonproduktion durch virale Induktoren angeregt wird und das so gebildete Interferon abgetrennt und/oder gerei nigt wird. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Stimulatorsubstanzen eine oder mehrere kurzkettigen Fett säuren sowie deren Salze verwendet werden. 3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeich net, dass die verwendeten lymphoblastoiden Zellen vor der In duktion mit einer "Priming"-Substanz behandelt werden. 4. Verfahren nach den Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass als Stimulatorsubstanzen Alkansäuren mit 3 bis 6 Kohlen stoffatomen und deren Salze verwendet werden. 5. Verfahren nach den Ansprüchen 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass als Stimulatorsubstanz n-Buttersäure und als flprimingfl Substanz Humaninterferon verwendet wird. 6. Verfahren gemäss Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass die Endkonzentration der Stimulatorsubstanz 0.5 - 5 mblol/l beträgt. 17. Verfahren gemäss den Ansprüchen 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass Humaninterferon als "Priming"-Substanz vor und/oder während der Virus induktion zugesetzt wird. 8. Verfahren gemäss den Ansprüchen 1-7, dadurch gekennzeich nest, dass als Interferoninduktor ein viraler Induktor ver wendet wird. 9. Humaninterferon hergestellt gemäss den Ansprüchen 1-8. 10. Verwendung des gemäss den Ansprüchen 1-8 hergestellten Inter ferons zur Bekämpfung von Virusinfektionen, sowohl prophy laktisch als auch therapeutisch, oder zur Krebstherapie.

Inventors: ADOLF, GUNTHER, BODO, GERHARD, DR., SWETLY, PETER, DR., Adolf, Günther 
Applicants: DR. KARL THOMAE GMBH
Application year: 1981
Main classification: C12P21
IPC codes: C07K14, A61K38, C12P21