PROCESS FOR THE IMMUNOLOGICAL DETERMINATION OF ENZYMES, AGENT FOR ITS REALIZATION AND ITS USE

Abstract: 1. Method for the determination of enzymes with the aid of antibodies against the enzyme to be determined, which are bonded to a water-insoluble carrier, characterised in that enzymes which, with an inhibitor, form an enzyme/inhibitor complex are incubated in form of such a complex with the bonded antibodies, the sample solution is removed, the washed antibody carrier which is charged with the enzyme/inhibitor complex is incubated with a coupling product formed from an antibody, which reacts specifically with the inhibitor, and from a marker substance, the coupling product which has not been bonded is removed and the concentration of the marker substance on the solid phase is determined, as a measure of the enzyme concentration which is to be determined.

Description: Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Enzymen; Mittel zur Durch führung des Verfahrens und seine Verwendung Die Erfindung betrifft Verfahren und Mittel zur immunologischen Bestimmung von Enzymen, die mit einem Inhibitor einen Enzym-Inhibitor-omplex bilden, insbesondere zur Bestimmung von Proteasen. In entzündlichen Prozessen spielen Proteasen aus polymorphkernigen Leukocyten und Makrophagen eine kausale Rolle bei der Schädigung der betroffenen Gewebe. Die leukocytären Proteasen wie z.B. Elastase oder Collagenase sind in den Lysosomen der weissen Blutzellen lokalisiert und werden nach pathologischen Reizen in das extrazelluläre Milieu abgegeben. Sie bewirken dort einen Abbau von Bindegewebssubstanzen und nach Eintritt in den Blutkreislauf eine Störung der Homeostase z.B. durch Abbau von Gerinnungsfaktoren und Fibrinogen. Der quantitative Nachweis von leukocytären Proteasen im Blut ist deshalb sehr wertvoll für die Beurteilung der Muität von Entzündungen, für die Verlaufsbeobachtung bei chronischen Entzündungen, für die Kontrolle der Therapie und die Prognostik. Die Bestimmung dieser Fak- toren erscheint immer dann nötig, wenn im Zusammenhang mit Erkrankungen Beukocytosen auftreten, wie bei bestimmten Infektionskrankheiten, Intoxikationen, Gewebsnekrosen, endokrinologischen Erkrankungen, bei malignen Tumoren usw. Der exakte quantitative Nachweis von Leukocytenproteasen im Blut wurde bisher dadurch behindert, dass diese Proteine beim Eintritt in die Zirkulation rasch Komplexe mit den im Blut reichlich vorhandenen Proteaseinhibitoren, z.B. mit a1-Antitrypsin, 2-Makroglobulin und anderen, bilden. Die Komplexe mit a1-Antitrypsin sind stöchiometrisch aufgebaute Verbindungen aus einem Molekül Protease und einem Molekül Inhibitor unter Bildung einer kovalenten Bindung. Im Komplex ist die Protease enzymatisch inaktiv. Daher ist die Bestimmung der enzymatischen Aktivität völlig ungeeignet für die quantitative Erfassung der Protease-Konzentrationen im Plasma, Serum oder auch in anderen Körperflüssigkeiten wie Synovialflüssigkeit, Exsudat, Gewebsextrakt usw. Unter den leukocytären Proteasen hat die Elastase (EC 3.4021.11) eine besondere Bedeutung: Sie kommt in den Leukocyten reichlich vor und stellt zusammen mit Collagenase 5 % des Trockengewichts von Granulocyten. Das Enzym hat eine geringe Substratspezifität und kann viele verschiedene, biologisch wichtige Substanzen proteolytisch abbauen, wie z.B. Elastin, Proteoglycane, Collagen, IgG, Complementfaktoren, Fibrinogen und Gerinnungsfaktoren. Elastase liegt im Plasma zu 92 % gebunden an a1-Antitrypsin und zu 8 % gebunden an andere Inhibitormoleküle vor. Komplexe aus Elastase und a1-Antitrypsin wurden bei entzündlichen Prozessen z.B. in Plasma, Serum, Peritonealflüssigkeit und Eiter nachgewiesen. Da die Proteasen in Körperflüssigkeiten stets gebunden an Inhibitoren vorkommen, ist deren Nachweis praktisch nur mit Hilfe immunologischer Methoden möglich. Bekannte Methoden sind die Elektroimmunodiffusion, der Radioimmunoassay und die Agglutinationstests bzw. Agglutinationshemmtests. Diese Methoden haben jedoch erhebliche Nachteile. Die Elektroimmunodiffusion ist langwierig und für Routinebestimmungen ungeeignet; die Auswertung ist nur qualitativ und schlecht reproduzierbar. Der Radioimmunoassay ist ebenfalls zeitaufwendig und nachteilig wegen der Verwendung radioaktiver Substanzen. Besondere Nachteile sind: Notwendigkeit spezieller Laborausrüstungen, besondere Sicherheitsmassnahmen wegen der Strahlungsgefahr, geringe Stabilität der radioaktiv markierten Reagenzien, Entsorgung usw. Aus der DOS 26- 41 840 ist ein Agglutinationstest bekannt, bei dem das zu untersuchende Plasma mit einer Suspension von Teilchen aus synthetischem Harz oder Blutkörperchen, die Antikörper gegen einen Enzym-Inhibitor-Komplex auf ihrer Oberfläche tragen, kontaktiert und dann unmittelbar beobachtet wird, ob Agglutination vorkommt oder nicht. Diese Methode hat den Nachteil, dass sie nur semiquantitative Ergebnisse liefert und nicht routinefähig ist. Die verwendeten Antikörper müssen durch aufwendige Herstellungsverfahren spezifisch gemacht werden für antigene Determinanten, die nur in den Enzym-Inhibitor-Komplexen vorhanden sind. In der DAS 22 06 103 ist eine Methode beschrieben, bei der eine zu bestimmende Komponente mit einem unlöslich gemachten Bindungspartner reagiert und einer dieser beiden Partner über ein enzymmarkiertes Indikatormolekül nachgewiesen wird. Die spezifische quantitative Bestimmung eines Enzym-Inhibitor Komplexes ist nach dieser Methode nicht möglich. Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verfahren und Mittel zur quantitativen Bestimmung von Enzymen, die in Form von Enzym-Inhibitor-Komplexen vorliegen, zur Verfügung zu stellen, mit denen die geschilderten Nachteile der bekannten Methoden vermieden werden können. Erfindungsgemäss wurde die Aufgabe dadurch gelöst, dass man einen Enzym-Inhibitor-Komplex mit Hilfe eines Festphasen-Antikörpers gegen den Enzymanteil bindet und die Bestimmung über einen markierten Antikörper gegen den Inhibitoranteil des Molekülverbandes erfolgt. Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von Enzymen mit Hilfe von an einen wasserunlöslichen Träger gebundenen Antikörpern. gegen das zu bestimmende Enzym, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man Enzyme, die mit einem Inhibitor einen Enzym-Inhibitor-Komplex bilden, mit den gebunden Antikörpern inkubiert, die Probelösung entfernt, den ausgewaschenen, mit dem Enzym-Inhibitor Komplex beladenen Antikörper-Träger mit einem Eupplungs- produkt, gebildet aus einem spezifisch mit dem Inhibitor reagierenden Antikörper und einer Markersubstanz, inkubiert, das ungebundene Kupplungsprodukt entfernt und die Konzentration der Markersubstanz an der festen Phase als Mass für die zu bestimmende Enzymkonzentration ermittelt. Ferner betrifft die Erfindung Mittel zur Durchführung dieses Verfahren, enthaltend mit Antikörper gegen das zu bestimmende Enzym beschichtete Reaktionsgefässe und ein Kupplungsprodukt, gebildet aus einem spezifisch mit dem Inhibitor reagierenden Antikörper und einer Markersubstanz. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung besteht in der Verwendung dieser Mittel zur Bestimmung von Enzymen, die mit Inhibitoren einen Enzym-Inhibitor Komplex bilden. Mit dem erfindungsgemässen Verfahren und Mittel können prinzipiell alle Enzyme bestimmt werden, die mit einem Inhibitor einen Enzym-Inhibitor-Komplex zu bilden vermögen und deshalb der direkten enzymatischen Aktivitätsbestimmung nicht zugänglich sind. Das Verfahren eignet sich besonders zur Bestimmung von Komplexen aus Proteasen mit den für sie jeweils relevanten Proteaseinhibitoren wie Elastase/1-Antitrypsin, Thrombin/Antithrombin III, Plasmin/Antiplasmin, Trypsin/X1-Antitrypsin usw. Das Verfahren ist spezifisch, einfach, schnell und empfindlich. Für die Durchführung werden lediglich drei spezifisch hergestellte Reagenzien benötigt (Antikörperbeschichtete Reaktionsgefässe, enzymmarkierte Antikörper, Lösung mit definierter Konzentration des Enzym Inhibitor-Komplexes), die Ausführung ist mit der apparativen Ausstattung eines normalen klinisch-chemischen Labors möglich. Das Verfahren beruht auf der spezifischen Bindung des Enzym-Inhibitor-Komplexes an immobilisierten Antikörpern gegen das Enzym und einer nachfolgenden quantitativen Bestimmung des gebundenen Komplexes mit markierten Antikörpern gegen den Inhibitor. Zum Nachweis werden also zwei Antiseren mit absolut unterschiedlicher Bindungsspezifität, nämlich spezifisch für einen der beiden Partner des Molekülverbandes, eingesetzt. Ein für das z.B. im Protease-Proteaseinhibitor-Komplex vorliegende proteolytische Enzym spezifischer Reaktant wird an einen festen Träger gebunden. Reaktanten spezifisch für die Protease sind Antikörper oder deren Antigen-bindende Fragmente. Spezifische Antikörperpräparationen werden aus den Seren spezifisch immunisierter Tiere isoliert. Als Immunogen wird die Protease in gehemmtem Zustand nach Reaktion mit niedermolekularen Hemmstoffen oder auch in unbehandeltem Zustand verwendet. Geeignete Versuchstiere für die Herstellung der Antiseren sind beispielsweise Schafe oder Kaninchen, jedoch sind auch andere Versuchstiere geeignet. Der in fester Phase vorliegende Antikörper gegen die Protease kann trägerfrei vorliegen, z.B. durch Vernetzung mit polyfunktionellen Reagentien wie Dialdehyden, Dioxiden usw. unlöslich gemacht werden, vorzugsweise ist der Antikörper aber an ein festes Trägermaterial gebunden. Der feste Träger kann aus jedem gegenüber den im Test verwendeten Substanzen inerten Material bestehen, an das Antikörper gegen Proteasen gebunden werden können. Geeignete Träger sind z.B. Formkörper wie amorphe Partikel, Kugeln, Plättchen, Folien oder Reagenzgefässe aus anorganischem Material (z.B. Glas) oder organischem Material (z.B. Homooder Copolymere von Vinylverbindungen wie Olefinen, Vinylacetat, Vinylchlorid, Vinylidenchlorid, Tetrafluoräthylen, Styrol, Acrylsäure oder Methacrylsäure, ferner Polymere von Formaldehyd und cyclischen Acetalen sowie Polykondensate wie Polyester, Polycarbonate oder Polyamide oder vernetzte Kohlenhydrate und vernetzte Polypeptide), weiterhin biologische Partikel wie Zellen (z.B. Erythrocyten). Die Bindung der Antikörper an den festen Träger kann wahlweise adsorptiv, adhäsiv oder kovalent erfolgen. Es ist möglich, die Antikörper nach den üblichen Methoden der Proteinchemie zur kovalenten Bindung von biologisch aktiven Polypeptiden an festen Trägern zu fixieren. Typische Beispiele hierfür sind die Aktivierung von Trägeroberflächen nach der Bromcyan-Methode oder die oberflächliche Vernetzung der Antikörper auf dem Träger durch polyfunktionelle Vernetzungsmittel wie Glutardialdehyd und dergleichen. Es wurde gefunden, dass bei zahlreichen Trägermaterialien die Antikörper gegen die Protease durch Adsorption oder Adhäsion ausreichend fest an die Oberfläche des Trägers gebunden werden können. Für die Beschichtung wird der Träger mit den Antikörpern oder ihren Antigenbindenden Fragmenten in Kontakt gebracht. Beispielsweise wird das Protein in einer wässrigen Lösung, vorzugsweise einer 0,15 M Kochsalzlösung oder phosphatgepufferter isotonischer Kochsalzlösung (=PBS) mit pH 7,2, in einer Proteinkonzentration von 1 ug bis 1 g/l, vorzugsweise 10 mg/l, gelöst. Die Proteinlösung wird durch Verdünnen des Blutplasmas oder Blutserums spezifisch immunisierter Tiere hergestellt, vorzugsweise aber durch Lösung von gereinigtem Immunoglobulin aus dem Antiserum. Die Lösung wird 1 min bis 5 Tage, vorzugsweise 24 Stunden lang, mit dem Träger stehengelassen. Danach wird die Lösung vom Träger getrennt, beispielsweise durch Ausgiessen aus dem Behälter; der Träger wird mit Puffer, der zweckmässigerweise ein Detergens enthält (z.B. PBS pH 7,2 mit 0,05 % Polyoxyäthylensorbitanmonolaurat), gewaschen. Die Bestimmung der Protease-Proteaseinhibitor-Komplexe erfolgt in der Weise, dass der Träger, der mit spezifischen Antikörpern gegen die zu bestimmende Protease oder mit den Antigen-bindenden Fragmenten aus den Antikörpern beschichtet wurde, 1 min bis 48 Stunden, vorzugsweise 2 Stunden, mit der die Protease-Proteaseinhibitor Komplexe enthaltenden Flüssigkeit, z.B. Serumprobe, inkubiert wird. In parallelen Ansätzen werden Proben mit bekannter Konzentration der Protease-Proteaseinhibitor-Komplexe eingesetzt. Diese Proben werden durch Verdünnen eines Reaktionsgemisches aus hochgereinigter Protease und hochgereinigtem Proteaseinhibitor in Puffer (z.B. PBS pH 7,2) oder in Humanplasma, welches 0 vorher 30 min bei 56 C inaktiviert wurde, zubereitet. Nach Beendigung der Inkubation wird die Lösung vom Träger abgetrennt, der Träger wird zweckmässigerweise zur Entfernung überschüssiger Probenbestandteile mit Puffer (z.B. PBS pH 7,2) gewaschen. Anschliessend wird der so behandelte Träger mit einer Lösung eines markierten zweiten Reaktanten, der spezifisch für den komplexgebundenen Proteaseinhibitor ist, inkubiert. Die Dauer hängt in gewissem Umfang von den Bedingungen hinsichtlich pH-Wert, Temperatur und Konzentrationen ab. Im allgemeinen reicht eine Einwirkungszeit von 2 bis 24 Stunden. Reaktanten für diesen Versuchsschritt sind Antikörper oder Antikörperfragmente, die gegen antigene Determinanten des komplexgebundenen Proteaseinhibitormoleküls gerichtet sind. Spezifische Antikör perpräparationen werden aus den Seren spezifisch immunisierter Tiere isoliert. Es hat sich als zweckmässig erwiesen, die Antikörperfraktion aus diesen Antiseren durch Verfahren der Immunadsorption an immobilisiertem Antigen, Antigen-spezifisch anzureichern und von Antikörpern unbekannter Spezifität zu trennen. Als Markierungsmittel für den zweiten Reaktanten werden z.B. Enzyme, Lumineszenz- oder Elektronendichtemarker, fluoreszierende oder radioaktive Substanzen verwendet. Bevorzugt werden im Rahmen der Erfindung solche Markierungsenzyme verwendet, deren Aktivität sich leicht durch einen optischen Test bestimmen lässt, insbesondere durch eine Farbreaktion im sichtbaren Licht oder durch eine Anderung der Konzentration von NADH oder NADPH. Typische Beispiele für geeignete Markierungsenzyme sind alkalische Phosphatase, Peroxidase, Glucoseoxidase, t- und ss-Galactosidase, Glucoamylase, Invertase, Malatdehydrogenase oder Glucose-6-phosphat-dehydrogenase. Kovalente Bindungen der jeweiligen Markierungsenzyme mit den spezifischen Antikörpern gegen Proteaseinhibitoren oder Antigen-bindenden Antikörper fragmenten werden nach literaturbekannten Verfahren durchgeführt /z.B. J. Histochem. Cytochem. 22, 1084 (1974); Bull. Soc. Chim. Biol. 50, 1169 (1968)/. Die im Test einzusetzenden optimalen Verdünnungen der markierten Antikörper gegen den komplexgebundenen Proteaseinhibitor werden durch Vorversuche ermittelt. Sie dürfen keine unspezifische, d.h. ohne Anwesenheit von träger-gebundenem Protease-Proteaseinhibitor-Komplex nachweisbare Verbindung mit dem Träger eingehen. Zu diesem Zweck wird der Lösung des markierten Antikörpers ein Detergens, z.B. 1 mM Natriumdodecylsulfat, zugesetzt. Nach Beendigung der Inkubation wird die Lösung vom Träger getrennt, beispielsweise durch Abgiessen aus dem Behälter; der Träger wird mehrmals mit Puffer, welcher zweckmässigerweise ein Detergens enthält, gewaschen und anschliessend wird die Menge des am Träger gebundenen Markierungsmittels mit üblichen Methoden bestimmt. Zur Kontrolle auf unspezifische Bindung von Markierungsmittel am Träger dienen Versuche, die, wie oben beschrieben, jedoch mit Proben ohne Protease-Proteaseinhibitor-Kompléx der zu bestimmenden Zusammensetzung durchgeführt werden. Der Gehalt an Protease-Proteaseinhibitor-Komplex mit der zu bestimmenden Protease in einer biologischen Probe wird durch Vergleich mit den oben beschriebenen Standardproben quantitativ bestimmt. Die erfindungsgemässen Mittel können zusätzlich noch übliche Stabilisierungsmittel wie Proteinadditive (Rinderserumalbumin oder Ovalbumin), Kohlenhydrate, Glycerin, Bakteriostatika, Fungizide usw. enthalten. Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert. Beispiel 1 Quantitativer immunologischer Nachweis von Komplexen aus Leukocyten-Elastase und a1-Antitrypsin a) Herstellung von Antiserum gegen Leukocyten-Elastase Elastase wurde aus menschlichen polymorphkernigen Leukocyten gewonnen und durch Affinitätschromato graphie und Ionenaustauschchromatographie so weit gereinigt, dass in der Elektrophorese auf Polyacryl amidgel bei pH 4,3 und in der Immunelektrophorese mit Antiserum gegen Humanserumproteine kein verun reinigendes anderes Protein mehr nachweisbar war. Das gefriergetrocknete, salzfreie Protein wurde in 0,15 M Kochsalzlösung mit einer Konzentration von 2 mg/ml gelöst. 1 ml der Lösung wurde mit 1 ml kompletten Freund'schen Adjuvans emulgiert. Diese Emulsion wurde Schafen oder Ziegen an 3 bis 4 Stel len i.m. in die Hinterläufe injiziert. Gleiche In jektionen erfolgten noch zweimal im Abstand von je drei Wochen. 21 Tage nach der letzten Injektion wurde Blut entnommen. Weitere Injektionen erfolg ten im Abstand von 12 Wochen nach der letzten Blut entnahme.Jeweils 14 Tage nach der Boosterinjektion wurde Blut entnommen. Das Serum wurde nach üblichen Verfahren aus dem Blut gewonnen, durch Zusatz von 0,05 % Natriumazid sowie 0,05 % Natriumäthylqueck silberthiosalicylat stabilisiert und bei -200C ge lagert. D) Herstellung von Antiserum gegen O1-Antitrypsin Als Antigen wird hochgereinigtes 01-Antitrypsin aus Humanplasma verwendet. Antiserum gegen 1-Antitrypsin wurde in Schafen oder Ziegen nach dem gleichen Impf schema wie in a) beschrieben hergestellt. Für die Immunisation von Kaninchen wurde 1 mg gefriergetrockne tes, salzfreies Xj-Antitrypsin in 0,5 ml 0,15 M Koch salzlösung gelöst. Die Lösung wurde mit 0,5 ml komplet ten Freund'schen Adjuvans emulgiert und die Emulsion wurde dem Tier an 2 bis 3 Stellen i.m. in die Hinter läufe injiziert. Eine gleiche Emulsion erfolgte 4 Wo chen später s.c. in den Nacken. 7 Tage danach wurden ca. 40 ml Blut aus der marginalen Ohrvene entnommen. 4 Wochen später erfolgte jeweils eine weitere Booster injektion s.c. und im Abstand von 7 Tagen darauf eine Blutentnahme. Das Serum wurde, wie in a) beschrieben, behandelt. c) Isolierung von Immunglobulin aus den Antiseren Die IgG-Fraktion aus den Antiseren gegen Elastase bzw. gegen Z1-Antitrypsin wurde nach üblichen Ver fahren /Scand. J. Immunol. 2, Suppl. 1, 161 (1973) oder Arch. Biochim. Biophys. 134, 279 (1969)l aus den Seren isoliert und in salz freier, gefrierge trockneter Form gelagert. d) Reinigung von Antikörpern gegen w1-Antitrypsin durch Immunadsorption Antikörper gegen den Proteaseinhibitor wurden durch Chromatographie von gereinigten Immunglobulinen (nach c)) aus Antiseren gegen z1-Antitrypsin (nach b)) über Sepharose 4B oder über substituierte Agarose, welche kovalent gebundenes 1-Antitrypsin enthielten, immunspezifisch isoliert. Antikörper gegen den Protease inhibitor blieben an dem immobilisierten Antigen haften und wurden mit 0,1M Glycin/HCl-Puffer pH 2,8 oder 3 M Kaliumrhodanidlösung eluiert. Ca. 5 bis 20 % des aufge gebenen Immunoglobulins wurden auf diese Weise immun spezifisch isoliert; Immunoglobuline mit anderer Spezi fität wurden somit entfernt. Das Eluat mit den spezi fischen Antikörpern wurde gegen Phosphat-gepufferte Saline und danach gegen 0,01 M Ammoniumbicarbonatlö sung dialysiert. Anschliessend wurde das Protein ge friergetrocknet. e) Herstellung von Enzym-Antikörper-Konjugaten Immunspezifisch gereinigte Antikörper (nach d)) wurden mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdünndarm unter Verwendung von 0,2 % Glutardialdehyd vernetzt /Biochim. Biophys. Acta 251, 427 (1971)/. Das Reaktionsprodukt wurde über eine Säule mit Bio-Gel A 1,5 m (26 mm x 900 mm) chromatographiert. Die Enzym-Antikörper Komplexe waren im ersten Maximum der AP-Aktivität des Eluats enthalten. Die Lösung wurde durch Zu gabe von Ovalbumin (ad 0,1 %) und Natriumazid (ad 0,05 %) stabilisiert und bei 4OC gelagert. f) Beschichtung von Reaktionsgefässen mit Antikörpern gegen Elastase Antikörper gegen Elastase, hergestellt nach a) und aufgereinigt nach c) wurde durch Adsorption an Kunst stoff-Reaktionsgefässe immobilisiert. Als Reaktionsge fässe wurden Reagenzröhrchen aus Polystyrol 12 x 55 mm, Rundküvetten oder Platten für die Mikrotitration ver wendet. Im typischen Ansatz wurden die Röhrchen oder Küvetten mit 1 ml einer IgG-Lösung mit 10 po IgG/ml (in 0,15 M Kochsalzlösung mit 0,02 % Natriumazid) ge füllt. Für die Platten wurden pro Depot 0,2 ml einer IgG-Lösung mit 50Xug/ml eingesetzt. Die Gefässe wurden verschlossen und über Nacht bei 40C stehengelassen. Vor dem Gebrauch im Test wurde die Flüssigkeit dekan tiert oder abgesaugt. Die Gefässe wurden dann mehrere Male mit Spüllösung (0,15 M Kochsalzlösung mit 0,05 % eines Detergens und 0,02 g Natriumazid) gewaschen und kurz an der Luft getrocknet. g) Herstellung von Komplexen aus Leukocyten-Elastase und %1-Antitrypsin Als analytische Probe für den quantitativen Nachweis wurde der Komplex aus Protease und Proteaseinhibitor in vitro durch Inkubation der beiden isolierten hoch gereinigten Komponenten erzeugt. Hierzu wurden 0,2 ml einer Lösung von 0,5 mg reiner Leukocyten-Elastase (human) in 1 ml (gelöst in 10 mM Tris/HCl-Puffer pH 7,4 mit 0,12 M Natriumchlorid) und 0,2 ml einer Lösung von 2,8 mg reinem o1-Antitrypsin (aus Human plasma) in 1 ml (gelöst in 50 mM Tris/HCl-Puffer pH 8,8 mit 0,05 M Natriumchlorid) gemischt und da 0 nach 2 Stunden bei 37 C inkubiert. Das Gemisch wur 0 de anschliessend bei -20 C gelagert. Die Analyse mit der Immunelektrophorese zeigte, dass die gesamte Elastase im Inkubationsgemisch zu dem Elastase/ & -Antitrypsin-Komplex umgesetzt wurde. n) Wiederfindung von Komplexen aus Leukocyten-Elastase und s1-Antitrypsin In Mikrotiterplatten, die nach f) mit Antikörpern gegen Elastase beschichtet und für den Gebrauch vor bereitet wurden, wurden 0,2 ml Probe mit einem Gehalt von 0,1 - 10 ng Elastase im Inhibitorkomplex pro Depot eingefüllt. Die Proben mit dem definierten Elastase-Gehalt wurden durch Verdünnen des Enzym Inhibitor-Gemisches nach g) erhalten; als Verdünnungs mittel diente Phosphat-gepufferte Saline. Zur Bestim mung von Blindwerten wurden einige Depots parallel mit 0,2 ml Verdünnungsmittel ohne Enzym-Inhibitor-Komplex gefüllt. Nach einer Inkubation von 2 Stunden bei Raum temperatur wurde der Inhalt der Depots abgesaugt. Nach dreima li gem Waschen mit Phosphat- gepufferter Saline wurde Lösung mit Enzym-Antikörper-Konjugat nach e) (0,2 ml pro Depot) eingefüllt. Die Lösung wurde vor her auf ca. 800 U/l AP-Aktivität eingestellt. Ver dünnungsmittel hierfür war 10 mM Tris/HCl-Puffer pH 7,5 mit 2 mM Magnesiumchlorid, 0,025'mM Zink chlorid, 1 % Ovalbumin, 1 mM Natriumdodecylsulfat und 0,02 % Natriumazid. Die Platten wurden luft dicht verschlossen und bei Raumteperatur über Nacht inkubiert. Danach wurae die Flüssigkeit abqesaugt. Die Platten wurden dreimal gespült und kurz an der Luft getrocknet. Danach wurde Puffer-Substrat Lösung für die Bestimmung der Aktivität der alkalischen Phosphatase mit 0,2 ml pro Depot in zeitversetzter Reihe eingefüllt. Nach 10 min Inkubation bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch aus den Depots in eine Mikroküvette übergeführt und die Extinktion gemessen. Als Nullwert diente Puffer Substrat-Lösung. Depots ohne Proteinzusatz ergaben eine Extinktion, die ein Mass für die unspezifische Adsorption der Enzym-Antikörper-Konjugate an die Depots darstellt. In Depots, die Protease-Proteaseinhibitor-Komplexe enthielten, wurden erhöhte Extinktionswerte gefunden. Zur Auswertung wurde die gefundene Extinktion (minus die Extinktion für unspezifische Adsorption) der eingesetzten Menge Elastase (ng) im Inhibitorkomplex gegenübergestellt. Die nachstehende Tabelle gibt die Endwerte der Extinktion bei 405 nm nach 10 min Reaktionszeit in Abhängigkeit von der Elastasemenge an. Elastase /ng7 OD405/10 min 12,5 1,000 6,25 1,030 3,125 0,830 1,563 0,540 0,781 0,315 0,390 0,115 0,195 0,030 0 = Blindwert 0' Die Daten zeigen, dass die Konzentration von Elastase- -Antitrypsin-Komplexen auf diese Weise quantitativ bestimmt werden kann. Es besteht ein streng korrelierter Zusammenhang zwischen der Menge von ca. 0,4 ng bis ca. 6 ng komplexgebundener Elastase in der Probe und de) gemessenen Extinktion. Als Puffer Substrat-Lösung wurde eine Lösung verwendet, die folgende Konzentrationen im Test hatte: 10 mM p-Ni trophenylphosphat, 0,5 mM Magnesiumchlorid, 1,0 mM Diäthanolamin-dCl-Puffer pH 9,8. Beispiel 2 Quantitativer immunologischer Nachweis von Komplexen aus Thrombin und Antithrombin III a) Isolierung von Immunglobulin aus den Antiseren Als Quelle der spezifischen Antikörper gegen Prote ase und Proteaseinhibitor wurden kommerziell erhält liche Antiseren vom Kaninchen gegen menschliches Prothrombin bzw. gegen Antithrombin III aus Human plasma verwendet. Die IgG-Fraktionen aus diesen Antiseren wurden nach bekannten Verfahren isoliert und in salzfreie gefriergetrockneter Form gelagert. b) Herstellung von enzymmarkierten Antikörpern gegen menschliches Antithrombin III Die nach a) isolierte Immunglobulinfraktion aus Anti serum gegen Antithrombin III vom Menschen wurde mit dem Markerenzym alkalische Phosphatase aus Kälber dünndarm chemisch kovalent verbunden und die derart hergestellten Konjugate aus IgG und Enzym wurden analog Beispiel 1 e) weiterbearbeitet. c) Beschichtung von Reaktionsgefässen mit Antikörpern gegen Prothrombin Die nach a) gereinigte Immunoglobulinfraktion aus dem Antiserum gegen menschliches Prothrombin wur de durch Adsorption an Kunststoffgefässen immobili siert. Hierfür wurden Mikrotiterplatten aus Poly styrol verwendet, die pro Depot mit 0,2 ml einer Lösung von 50 pg Immunoglobulin pro ml (in 0,15 M Kochsalzlösung mit 0,02 % Natriumazid) gefüllt-wur- den. Die Platten wurden luftdicht eingedeckt und 0 über Nacht-bei 4 C stehengelassen. Vor dem Gebrauch im Test wurde die IgG-haltige Flüssigkeit entfernt. Die Gefässe wurden mehrmals mit 0,15 M Kochsalzlö sung, welche zusätzliche noch 0,05 % Detergens und 0,02 % Natriumazid enthielt, gewaschen und kurz an der Luft getrocknet. d) Herstellung von Molekülkomplexen aus menschlichem Thrombin und menschlichem Antithrombin III Die Komplexe aus Thrombin und Antithrombin III vom Menschen zur Verwendung als analytische Probe im Test wurden durch Inkubation von Gemischen der bei den Komponenten in hochgereinigter Form erzeugt. Zu diesem Zweck wurden 50 Einheiten Antithrombin III (= Heparin-Cofaktor) und 50 Einheiten Heparin in einem Volumen von 1,26 ml in 10 mM Tris/HCl-Puffer 0 pH 7,5 30 min lang bei 37 C inkubiert, und an- schliessend wurden dem Gemisch 50 Einheiten Thrombin (entsprechend 16,7 ,ug Enzymprotein) in 50 kl des gleichen Puffers zugesetzt. Nach einer Inkubation von 2 Stunden bei 37 0C wurde die Reaktionslösung und ge eignete Verdünnungsstufen in den Test eingesetzt. Quantitativer Nachweis von Thrombin-Antithrombin. III Komplexen In die Depots von Mikrotiterplatten, die nach c) mit Antikörpern gegen Prothrombin beschichtet und für den Test vorbereitet wurden, wurden 0,2 ml Probe mit bekanntem Gehalt an Thrombin in komplexgebundener Form eingefüllt. Als Proben mit bekanntem Gehalt wurden Verdünnungsstufen des Inkubationsgemisches nach d) in Phosphat-gepufferter Saline verwendet. Zur Bestimmung von Blindwerten wurden einige Depots mit 0,2 ml Verdünnungsmittel ohne Enzym-Inhibitor-Komplex gefüllt. Nach 2 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur wurden alle Depots leergesaugt und dreimal mit Phosphat-gepufferter Saline, welche zusätzlich 0,05 % Detergens enthielt, gewaschen. Danach wurden pro Depot 0,2 ml Lösung mit Enzym-markierten Antikörpern gegen Antithrombin III, die nach b) hergestellt wurden, eingefüllt. Die Lösung wurde vorher auf ca. 300 U/l AP-Aktivität eingestellt. Als Verdünnungsmittel wurde 10 mM Tris/HCl-Puffer pH 7,5, welcher zusätzlich noch 2 mM Magnesiumchlorid, 0,025 mM Zinkchlorid, 1 % Ovalbumin, 1 mM Natriumdodecylsulfat und 0,02 % Natriumazid enthielt, verwendet. Die Platten wurden luftdicht verschlossen bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert. Danach wurde die Flüssigkeit abgesaugt. Die Platten wurden dreimal gespült und kurz an der Luft getrocknet. Dann wurden pro Depot 0,2 ml Puffer-Substrat-Lösung für den AP-Test eingefüllt. Nach 20 min Inkubationszeit wurde das Reaktionsgemisch aus den Depots in eine Mikroküvette übergeführt und die Extinktion wurde im Photometer gemessen. Als Nullwert diente Puffer-Substrat-Lösung. In den Depots, die Protease-Proteaseinhibitor Komplexe enthielten, wurden erhöhte Extinktionswerte gefunden. Zur Auswertung wurde die gefundene Extinktion bei 405 nm in der Puffer-Substrat-Lösung nach 20 min Inkubation in den jeweiligen Depots der eingesetzten berechneten Menge an Komplex-gebundenem Thrombin gegenüber gestellt. Die nachstehende Tabelle gibt die Endwerte der Extinktion bei 405 nm nach 20 min Reaktionszeit in Abhängigkeit von der Antigen-Menge an. Thrombin /R7 Ob405/ 20 min 1270 0,400 635 0,390 318 0,321 159 0,279 79,5 0,196 39,8 0,137 19,9 0,099 10,0 0,058 5,0 0,025 0 = Blindwert 0 Die Daten zeigen, dass zwischen der eingesetzten Menge Antigen und der photometrisch gemessenen enzymatischen Indikatorreaktion ein streng korretierter Zusammenhang besteht, der eine quantitative Bestimmung von Thrombin-Antithrombin III-Komplexen ermöglicht.

Claims: Patentansprüche: 1. Verfahren zur Bestimmung von Enzymen mit Hilfe von an einen wasserunlöslichen Träger gebundenen Antikörpern gegen das zu bestimmende Enzym, dadurch gekennzeichnet, dass man Enzyme, die mit einem Inhibitor einen Enzym Inhibitor-Komplex bilden, mit den gebundenen Antikörpern inkubiert, die Probelösung entfernt, den ausgewaschenen, mit dem Enzym-Inhibitor-Komplex beladenen Antikörper Träger mit einem Kupplungsprodukt, gebildet aus einem spezifisch mit dem Inhibitor reagierenden Antikörper und einer Markersubstanz, inkubiert, das ungebundene Kupplungsprodukt entfernt und die Konzentration der Markersubstanz an der festen Phase als Mass für die zu bestimmende Enzymkonzentration ermittelt. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zu bestimmenden Enzyme Proteasen und die Inhibi toren Proteaseinhibitoren sind. 3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch ge kennzeichnet, dass das zu bestimmende Enzym Elastase aus Leukocyten und der Inhibitor t1-Antitrypsin ist. 4o Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 3, enthaltend mit Antikörper gegen das zu bestimmende Enzym beschichtete Reaktionsge fässe und ein Kupplungsprodukt, gebildet aus einem spezifisch mit dem Inhibitor reagierenden Anti körper und einer Markersubstanz. 5. Mittel nach Anspruch 4, enthaltend mit Antikörper gegen Proteasen beschichtete Reaktionsgefässe und ein Kupplungsprodukt, gebildet aus einem spezifisch mit dem Proteaseinhibitor reagierenden Antikörper und einer Markersubstanz. 6. Mittel nach den Ansprüchen 4 und 5, enthaltend mit Antikörper gegen Elastase aus Leukocyten beschichtete Reaktionsgefässe und ein Kupplungsprodukt, gebildet aus einem spezifisch mit a1-Antitrypsin reagierenden Antikörper und einem Markerenzym. 7. Verwendung des Mittels nach den Ansprüchen 4 bis 6 zur Bestimmung von Enzymen, die mit Inhibitoren einen Enzym-Inhibitor-Komplex bilden.

Inventors: GUNZER, GERHARD, DR., HENNRICH, NORBERT, DR., LANG, HERMANN, DR., NEUMANN, SIEGFRIED, DR.
Applicants: MERCK PATENT GESELLSCHAFT MIT BESCHRANKTER HAFTUNG
Application year: 1981
Main classification: G01N33
IPC codes: G01N33, A61K38, C12Q1