MICROBIOLOGICALLY PRODUCED POLYPEPTIDE HAVING THE AMINO ACID SEQUENCE OF MONKEY PROINSULIN, DNA AND PLASMIDS CODING FOR THIS SEQUENCE, MICROORGANISMS CONTAINING THIS GENETIC INFORMATION, AND PROCESS FOR THEIR PRODUCTION

Abstract: The process for the preparation of the polypeptide which contains the amino-acid sequence of the proinsulin of primates entails the genetic information for the biosynthesis of the said polypeptide being obtained by means of mRNA from primates, the cDNA being prepared therefrom and inserted into a plasmid, the resulting hybrid plasmid being used to transform microorganisms, and the microorganisms producing the polypeptide being obtained by selection and cultivation.

Description: Mikrobiologisch hergestelltes Polypeptid mit der Aminos & re- sequenz des Proinsulins von Primaten, DNA und Plasmide, die für diese Sequenz codieren, Mikroorganismen, die diese genetischen Informationen enthalten, und Verfahren zu deren Herstellun In zunehmendem Masse werden menschliche Hormone für die Therapie benötigt. Dazu gehört unter anderen das Hormon Insulin. Da es unmöglich ist, Hormone in grösseren Mengen aus menschlichen Organen zu gewinnen, müssen geeignete Techniken entwickelt werden, diese Hormone ausserhalb des menschlichen Organismus zu erzeugen. Die vorliegende Erfindung zeigt einen solchen Weg auf. Sie betrifft die Isolierung von Nukleotidsequenzen, die den genetischen Code für ein spezifisches Protein enthalten, die Synthese von DNA mit diesen spezifischen Nukleotidsequenzen und den Transfer dieser DNA in einen Mikroorganismus als Wirt, in dem die Replikation und Expression dieser DNA erfolgt. Es ist bekannt, Polypeptide und Proteine durch Kultivieren von solchen Bakterien herzustellen, die Plasmide mit Genen tragen, die für die gewünschten Polypeptide oder Proteine codieren. Ferner ist bekannt, dass Plasmide konstruiert werden können, die den sie tragenden Wirt dazu veranlassen, Genprodukte herzustellen, die von Natur aus nicht für diesen charakteristisch sind. Es ist auch bekannt, dass durch DNA-Rekombinationstechniken die genetische Information von Ratten-Präproinsulin in Bakterien kloniert wurde. Es konnte gezeigt werden, dass diese Bakterien Protein exprimieren, das Antigen-Determinanten von Insulin besitzt. Darüber hinaus ist bekannt, dass die genetische Information von A- und B-Kette des Menscheninsulins getrennt in Bakterien kloniert wurde. Dieses wurde dadurch erreicht, dass die entsprechenden DNAs für A- und B-Kette de novo synthetisiert wurden. Die durch die Bakterien produzierten A- und B-Ketten konnten dann in vitro zum Insulinmolekül verknüpft werden. Keiner dieser Wege hat zu einem in der menschlichen Therapie verwendbaren Pharmakon geführt. Im Falle des Rattenproinsulins ist das Endprodukt, das Ratteninsulin, ein Eiweiss, das zu allergischen Reaktionen führt. Im Falle der Human-Aund B-Kette stehen die Eigenschaften der B-Kette wegen ihrer Polymerisationsneigung und die sehr schlechte Ausbeute bei der Kombination von A- und B-Kette dem Endziel, Humaninsulin, entgegen. Mit der vorliegenden Erfindung wird daher ein anderer Weg eingeschlagen. Es ist bekannt, dass Affen- und Menscheninsulin eine identische Struktur besitzen. Wenn es gelingt, Affenproinsulin herzustellen, kann man daraus durch Spaltung Menscheninsulin gewinnen. Die vorliegende Erfindung betrifft nun im besonderen die Darstellung von Genen für Affenproinsulin, den Transfer dieser Gene in einen mikrobiellen Wirt, Replikation von Wirt und Gen und Expression des Gens durch den Wirt. Dabei entstehen Proteine, die die Aminosäuresequenzen des Affenproinsulins enthalten. Zur Erreichung des erfindungsgemässen Zieles kann man in folgender Weise verfahren, wobei der aufgezeichnete Weg beispielhaft für mehrere begangene steht. Man gewinnt aus Affenpankreata, vorzugsweise vom Rhesusaffen oder Cynomolgen, durch proteolytische Verdauung, die wegen der möglichen weitergehenden Zerstörung sehr sorgfältig kontrolliert werden muss, und anschliessende Zentrifugation Einzelzellen. Aus diesen wird durch Dichtezentrifuga tion über einen Gradienten eine an ss-Zellen reiche Schicht gewonnen. Diese Zellschicht wird denaturiert und die RNA als Niederschlag nach einer Cäsiumchloridzentrifugation gewonnen. Nach weiterem Umfällen wird aus dieser RNA die mRNA über eine Oligo-dT-Cellulosesäule abgetrennt. Die gewonnene mRNA wird mit Hilfe des Enzyms Reverse Trans criptase zu einem RNA-DNA-Doppelstrang komplettiert. Nach Verdauung des RNA-Stranges wird der DNA-Strang (die komplementäre DNA = cDNA) mit Reverser Transkriptase oder dem Enzym Polymerase I zum DNA-DNA-Doppelstrang (dsDNA) komplettiert. Diese doppelsträngige DNA muss nun in ein Plasmid eingebaut werden. Dazu ist die Verlängerung des 3'-Endes der DNA z. B. mit dCMP-Resten notwendig. Das Plasmid (z.B. pBR 322) wird mit der Restriktionsnuklease PstI aufgeschnitten und z. B. mit dGMP-Resteh verlängert. Bei Zusammengabe der so verlängerten DNA mit dem entsprechend verlängerten Plasmid erfolgt Basenpaarung zwischen DNA und Plasmid. Dieses zirkularisierte Molekül wird dann in Mikroorganismen (vor allem Bakterien, vorzugsweise E. coli, wie E. coli K 12 oder X1776) transformiert; die noch nicht geschlossenen Bindungen werden durch die Enzyme des Mikroorganismus kovalent geknüpft. Die transformierten Mikroorganismen, werden auf Agarplatten ausplattiert und auf Antibiotikaresistenzen, die durch das gewählte Plasmid und die eingesetzte Restriktionsnuklease gegeben sind, selektioniert. Mit Hilfe immunologischer Teste werden die Klone, die insulinhaltige Proteine exprimieren, herausgesucht. Diese Klone werden gezüchtet, die Mikroorganismenmasse abzentrifugiert, extrahiert und auf Insulingehalt getestet. Hierbei konnten in einer Reihe von Klonen Insulinwerte von über einer Insulineinheit ( = 1 IE) pro Liter Kulturlösung gemessen werden. Diese Kulturlösung dient als Ausgangsmaterial für die Gewinnung von Äffenproinsulin und nachfolgend Humaninsulin. Die erfindungsgemässen Verfahren können in folgender Weise durchgeführt weren: 1. Verfahren zur Isolierung von RNA a) Die Isolierung von insulinproduzierenden Pankreas zellen Von Primaten, vorzugsweise Rhesus-Affen oder Cynomol lgen, werden die Pankreata unter sterilen Bedingungen gewonnen und nach Beseitigung der Häute und grösserer Blutgefässe zunächst mechanisch mittels Scheren zer kleinert. Dabei ist darauf zu achten, dass das Gewebe während der Arbeiten kühl gehalten wird, um einen Selbstaufschluss infolge des darin enthaltenen Pan kreatin-Enzymgemisches zU vermeiden. Das zerkleinerte Gewebe wird mehrmals mit gekühltem Säugetierserum, vorzugsweise Kälberserum, gewaschen, danach in Kölb chen gegeben und mit einer sterilen 0,125 %igen er wärmten Collagenaselösung in PBS versetzt. Die Colla genaselösung ist stets frisch vor dem Aufschluss anzu setzen. Entscheidend für die Ausbeute an Zellen aus Pankreas ist die gleichzeitige Zugabe von 20 und mehr % Serum, vorzugsweise Kälberserum, zur Collagenase. Dieses Gemisch wird 10 Minuten gerührt und der ge samte Überstand zunächst verworfen. Danach wird erneut ein Collagenase-Serumgemisch zugesetzt und etwa 6 bis 10 Minuten gerührt. Dieser Vorgang wird etwa 10 mal wiederholt und der jeweils gewonnene Aufschluss im Kühlbehalter gesammelt. Das gesammelte Material mit den enzymatisch gewonnenen Zellen wird bei etwa 1 000 upm 10 Minuten in einer Kühlzentrifuge zentrifugiert, der Uberstand verworfen und der Zell bodensatz in frischem Dulbecco-Medium mit 1 g/l Glu kose und 20 % Kälberserum, resuspendiert. Diese Zen trifugation wird wiederholt und der danach gewonnene Bodensatz in 10 ml Dulbecco-Medium mit 15 % Serumzu satz resuspendiert. Dieses Zellmaterial, das aus einem Gemisch von ss-Zel len, Fibroblasten und epitheloiden Zellen besteht, wird anschliessend über einen Dichtegradienten, bei spielsweise'aus Ficole oder Percoll, aufgetrennt. Am besten bewährt hat sich hierzu ein Ficoll-Dichtegra dient. Dazu wurde Ficoll 400/Pharmacia in Dulbecco Medium ohne Serum gelöst und im Refraktometer auf eine Viskosität von 1,38 oder mit der Spindel auf eine Dichte von 1,16 eingestellt, durch ein Membran filter mit einer Porenweite von 0,45/u sterilfil triert und bei +4 C bis zur Verwendung aufbewahrt. Von dieser Ficollausgangssuspension werden Dichten mit einer Viskosität von 1,373, 1,370 und 1,3672 durch Zugabe von Dulbecco-Medium eingestellt und im Zentrifugenröhrchen übereinandergeschichtet. Obenauf werden die resuspendierten Pankreaszellen gegeben und 10 Minuten bei +40C und 3 200 upm zentrifugiert. Nach der Zentrifugation werden die einzelnen Banden vor sichtig gewonnen und von restlichem Ficole mit Dul becco-Medium freigewaschen. Die Hauptmasse der insu linproduzierenden Zellen wird auf den obersten Schichten mit der geringsten Dichte und einer Visko sität von 1,3672 angereichert. b) Gewinnung von RNA Die erhaltenen Zellen werden in denaturierendem Me dium (4 M Guanidiniumthiocyanat, 1 M Mercaptoätha nol, 0,15 M Natriumacetat - pH 5,5) aufgenommen und 1 Minute bei 0 C mit dem Ultra-Turrax homogeni siert. Die Lösung wird 5 Minuten auf 800C erwärmt und sofort in ein Eisbad gegeben. Diese wird dann auf eine Lösung (Kissen) aus 5 ml 5,7 M CsCl, 10 mM Tris-hydroxiaminomethan (Tris), 10 mM Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA) vom pH 7,6 geschichtet und in einem Beckman-SW 27 Rotor 36 Stun den bei 200C und 22 000 UpM zentrifugiert. Es wurde gefunden, dass, im Gegensatz zu Angaben in der Literatur, ein Zusatz von CsCl zu dem Lysat vermie den werden muss, um eine möglichst vollständige Ab trennung der mRNA im folgenden Reaktionsschritt zu erreichen. Nach beendeter Zentrifugation werden die Polyallomer-Röhrchen in flüssigem Stickstoff einge froren und der Boden des Röhrchens, auf dem sich der RNA-Niederchlag befindet, abgeschnitten. Der Nieder schlag wird in einer Lösung aus 10 mM Tris, 10 mM EDTA und 1 % fl5arkosyl1, (N-Lauryl-Sarkosin-Na-Salz) vom pH 7,6 aufgenommen und die Suspension bei 20 000 UpM 20 Minuten abzentrifugiert. Der erhaltene Nieder schlag wird nochmals in dem gleichen Puffer aufgenom men, 5 Minuten auf 650C erwärmt und erneut zentrifu giert. Die vereinigten Uberstände werden 0,3M an Na triumacetat gemacht, mit dem 2,5-fachen Volumen an Äthanol versetzt und bei -200C aufbewahrt. 2. Gewinnung von mRNA Die RNA wird durch Abzentrifugation aus der äthanoli schen Lösung (20 000 UpM, 30 Minuten, -50C) abgetrennt und in 0,5M NaCl, 10 mM Tris pH 7,5 gelöst. Diese Lösung wird auf eine Oligo-dT-Cellulose-Säule (Hersteller: Collaborative Research, Type 3), die mit dem gleichen Puffer äquilibriert ist, aufgetragen und mit 1 mM Tris pH 7,6 oder destilliertem Wasser eluiert. Die Elution der Poly-A-haltigen RNA (mRNA) kann durch Extinktions messung bei 260 nm verfolgt werden. Die so erhaltene mRNA wird mit Natriumacetat bis zu einer Endkonzentra tion von 0,3 M versetzt, das 2,5fache Volumen an Äthanol zugegeben und die Lösung bei -200C aufbewahrt. 3. Gewinnung der cDNA a) Gewinnung von Einzelstrang-cDNA Die Übertragung der mRNA in die entsprechende DNA (cDNA) erfolgt mit Hilfe des Enzyms Reverser Trans criptase. Der Inkubationsansatz enthält: 50 mM Tris, pH 8,3, 10 m MgCl2, 30 mM 2-Mercapto äthanol, 0,5 mM an allen 4 üblicherweise vorkommen den Desoxyribonukleosidtriphosphaten (entsprechende Triphosphate von Adenin, Guanin, Cytosin und Thymi din), 100 /ug/ml Oligo-dT12 18 (Hersteller: Boeh ringer Mannheim) etwa 100 /ug/ml polyadenylierte RNA und 800 Einheiten/ml Reverser Transcriptase (Herstel ler: Life Science Inc., St. Petersburg, USA). Zur Verfolgung der Reaktion kann ein in i-Stellung mit 32P-markiertes Desoxyribonukleosidtriphosphat (spez. Aktiv.: 50Ci/mMol) zum Ansatz gegeben werden. Das Gemisch wird 60 Minuten bei 420C inkubiert, wo rauf durch Zusatz von 20 mM EDTA die Reaktion abge stoppt wird. Die Lösung wird mit einem gleichen Volu men mit Wasser gesättigtem Phenol extrahiert, das Phenol durch Ausschütteln mit Äther entfernt und Reste Äther mit Stickstoff abgedampft. Nicht einge baute Desoxyribonukleosidtriphosphate werden durch Säulenchromatographie an Sephadex G50 in 10 mM Tris, pH 9,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA abgetrennt. Die elu ierte cDNA wird durch Zusatz von 0,3 M Natriumacetat und dem 2,5-fachen Volumen Äthanol ausgefällt. Nach Zentrifugation wird der Niederschlag in 0,1M NaOH aufgenommen und 20 Minuten bei 70 0C inkubiert oder in 0,3M NaOH über Nacht bei Raumtemperatur inku biert. Das Gemisch wird mit 1M HCl und 1M Tris auf pH 7,6 gebracht. b) Bildung von Doppelstrang-cDNA (ds DNA) Zur Synthese des zweiten DNA-Stranges kann wiederum das Enzym Reverse Transkriptase oder das Enzym Poly merase I verwendet werden. Bildung der dsDNA mit Reverser Transcriptase: Der Inkubationsansatz (pH 8,3) enthält 50 mM Tris, 10 mM MgCl2, 30 mM 2-Mercaptoäthanol, 0,5 mM der oben genannten 4 Desoxyribonukleosidtriphosphate, 50 /ug/ml cDNA und 800 Einheiten/ml Reverser Trans criptase. Die Reaktion wird 120 Minuten bei 420C durchgeführt und durch Zusatz von EDTA bis zur End konzentration von 20 mM abgestoppt. Anschliessend er folgt die Phenol-Extraktion und Gelpermeationschroma tographie an Sephadex G50 wie vorher beschrieben. Bildung der dsDNA mit Polymerase I: Der Inkubationsansatz (pH 6,9) enthält 200 mM Hepes, 0,5 mM der obengenannten 4 Desoxyribonukleosidtri phosphate, 10 mM MgCl2, 30 mM 2-Mercaptoäthanol und 70 mM KCl. Durch Zusatz von 32P-markierten Desoxyri bonukleotiden (an den-Positionen) zum Inkubations ansatz kann die Reaktion verfolgt werden. Die Reak tion wird mit 800 Einheiten/ml Polymerase I gestartet und 2 Stunden bei 150C durchgeführt. Durch Zusatz von 0,1 % Natriumdodecylsulfat und 100,ug/ml RNA wird die Reaktion abgestoppt. Die Lösung wird wie be schrieben extrahiert. Die nach der Extraktion erhal tene Lösung wird auf eine Sephadex G50 Säule aufge tragen und die Chromatographie mit 10 mM Tris pH 9,0, 100 mM NaCl und 1 mM EDTA durchgeführt. Die eluierte DNA kann durch die Radioaktivität bestimmt werden und wird durch Zusatz von 0,3 M Natriumacetat und 2,5-fa chem Volumen Äthanol gefällt. Der Äthanol-Nieder schlag wird in einer Lösung (pH 4,5) aus 300 mM NaCl, 30 mM Natriumacetat und 3 mM ZnCl2 aufgenommen und mit 1500 Einheiten/ml S1 Nuklease (Boehringr n. heim) versetzt. Die Reaktion wird nach einer Stunde bei 37 0C durch Zusatz von EDTA bis zu einer Endkon zentration von 20 mM beendet. Anschliessend erfolgt Extraktion mit Phenol und Fällung mit Äthanol wie be schrieben. c) Gewinnung von cDNA in einem "Eintopfverfahren" Alternativ zu den beschriebenen Reaktionen kann die dsDNA aus er mRNA auch in einem "Einto?fuerf.hren gewonnen werden. Dabei wird die Reaktiv ez evesen Transcriptase wie beschrieben durchgeführt, zm Inku bationsansatz wird allerdings noch 140 mM KGi hinzu gefügt. Nach beendeter Reaktion wird die Probe 4 Mi nuten auf 1000C erhitzt und der gebildete Nieder schlag abzentrifugiert. Zu dem Überstand wird das gleiche Volumen an 0,4 M Hepes Puffer (pH 6,9) gege ben, wobei die oben genannten Lt Desoxyribonukleoti de in dem Puffer 0,5 mM vorhanden sind. Durch Zugabe von 800 Einheiten/ml Polymerase I wird die Reaktion wie beschrieben bei 15 0C durchgeführt und durch Zu- satz von Natriumdodecylsulfat und RNA abgestoppt. An schliessend wird wie unter 3.b) Bildung der dsDNA mit Polymerase I" weiter verfahren. Lt. Verlängerung der 3'-Enden von cDNA mit dCTP (Desoxicy tosintriphosphat) Zum Einbau in das Plasmid ist die Verlängerung des 3'-Endes der DNA mit einem der oben genannten Lt Des oxynukleotide notwendig. Ferner werden die 3'-Enden des geschnittenen Plasmids mit dem komplementären Desoxynukleotid verlängert. Bei Zusammengabe der DNA mit dem Plasmid erfolgt dann eine Basenpaarung zwischen DNA und Plasmid. Dieses wieder zirkularisierte Molekül kann zur Transformation von Bakterien eingesetzt werden; die noch nicht geschlossenen Bindungen werden durch ein Enzymsystem im Bakterium kovalent verknüpft. Beispielsweise können die 3'-Enden der cDNA mit dCMP Resten (Desoxicytosinmonophosphatreste) und das Plasmid mit dGMP-Resten (Desoxiguanidinmonophosphat-Reste) verlängert werden. Bei Verwendung dieser Desoxynukleotide in der beschriebenen Weise und bei Öffnung des Plasmids durch das Restriktionsenzym Pst I wird nach Einbau der fremden DNA eine Pst I-Spaltstelle an jeder Insertionsstelle neu gebildet, so dass nach Vermehrung des Plasmids die insertierte DNA zur weiteren Untersuchung leicht wieder mit dem Restriktionsenzym Pst I herausgeschnitten werden kann. Der Niederschlag aus der Alkohol-Fällung nach Abbau mit S1 Nuklease wird in einer wässrigen Lösung (pH 6,7) aus 30 mM Tris, 1 mM CoCl2, 140 mM Kalium-Kacodylat, 150,uM dCTP, 100/ug autoklavierten Gelatinehydrolisats und 0,1 M Dithioerythrit gelöst. Zur Verfolgung der Reaktion sollte 32P-markiertes dCTP verwendet werden. Die Reaktion wird durch Zusatz von Terminaler Desoxynukleotidyl-Transferase gestartet und für 10 Minuten bei 37 C durchgeführt. Nach Ablauf der Reaktionszeit wird die Probe in Eis gestellt und durch Radioaktivitätsmessung im mit Trichloressigsäure fällbaren Niederschlag die Anzahl der eingebauten dCMP-Reste bestimmt. Bei der Reaktion sollten etwa 10 % der ursprünglich vorhandenen Nukleotide addiert worden sein; wenn dies nicht der Fall ist, kann durch Zusatz von weiterem Enzym die Reaktion fortgesetzt werden. Falls eine zu grosse Anzahl von dCMP Resten addiert wurde, kann die entstandene Kette mit Hilfe des Enzyms S1 Nuklease verkürzt werden. 5. Verfahren zur Integration von DNA in ein Piasm Ein geeignetes zirkuläres Plasmid, beispielsweise pE 322, wird mit einer Restriktionsendonuklease geschnit ten, welche nur eine Sequenz auf dem Plasmid erkennt. Günstig ist es, wenn diese Spaltstelle hinter einem starken oder induzierbaren Promotor liegt und/oder so lokalisiert ist, dass eine Antibiotikaresistenz beein flusst wird. Das solchermassen linearisierte Plasmid wird dann an den 3'-Enden um eines der vier Desoxynukleotide verlängert. Dies wird z. B. folgendermassen durchgeführt: 30/ug Plasmid werden mit 50 Einheiten Pst I Restrik tionsendonuklease in Gegenwart von 50 mM NaCl, 6 mM Tris, 6 mM MgCl2, 6 mM 2-Mercaptoäthanol und 0,1 mg/ml Gelatine für 40 Minuten bei 37 0C und einem pH-Wert von 7,5 inkubiert. Anschliessend wird mit Phenol und Äther wie beschrieben extrahiert und das geschnittene Plasmid mit Äthanol in Gegenwart von 0,3 M Natriumacetat ge fällt. Die Verlängerung der 3'-Enden des Plasmids mit dGTP (Desoxiguanidintriphosphat) erfolgt analog zu der oben beschriebenen Verlängerung der cDNA mit dCTP. Die verlängerte Plasmid-DNA wird dann in einer Lösung (pH 8,0) aus 0,1 M NaCl, 10 mM Tris und 1 mM EDTA mit der verlängerten ds cDNA vermischt, für 2 Minuten auf 560C erwärmt, 2 Stunden bei 420C inkubiert und dann langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Die solchermassen erhaltene hybride DNA wird dann zur Transformation von E. coli verwendet. 6. Klonierung des Hydridplasmids in E. coli Die Bakterien, beispielsweise E. coli 7 1776, wurden bei 37 C in 50 ml eines üblichen Nährmediums bis zu einer optischen Dichte von A600 = 0 > 5 - 0,6 wachsen ge lassen, sedimentiert, einmal mit 10 mM Tris ph 7,5 ge waschen und dann in 40 ml einer Lösung aus 75 mM CaCl2, 5 mM MgCl2 und 5 mM Tris vom pH 8,0 resuspendiert und 20 Minuten in Eis inkubiert. Dann wurden die Zellen se dimentiert und in 2 ml 75 mM CaCl2, 5 mM MgCl2, 5 mM Tris pH 8,0 resuspendiert. 0,2 ml dieser Bakteriensuspension wurden dann mit 0,1 ml Hybrid-DNA-Lösung vermischt und 45 Minuten auf Eis inku biert. Dann wurde für 90 Sekunden auf 420C erwärmt und anschliessend mit 0,2 ml Nährmedium vermischt. 501u1-75 /ul dieser Suspension wurden dann auf Tetracyc lin und Ampicillin enthaltende Agarplatten ausplattiert und auf Antibiotikaresistenz selektioniert. 7. Isolierung von Stämmen, die insulinenthaltende Proteine produzieren Mit Hilfe eines von Broome und Gilbert (Broome, S. und Gilbert, E. PNAS 75, 2746, 1978) entwickelten Testsy stems wurden die Klone auf die Expression insulinent haltender Proteine untersucht. Klone, die insulinenthal tende Proteine exprimieren, werden durch die Bindung von radioaktivem Antikörper an diese Proteine mit nachfol gender Autoradiographie dadurch erkenntlich, dass der Röntgenfilm an dieser Stelle geschwärzt wird. Dazu wurden bis zu 50 Klone pro Nitrocellulosefilter für ? Tage bei 370C wachsen gelassen. Dann wurden die Filter auf einen Agarblock gelegt, welcher 1 mg/ml Lyso zym enthielt; auf die Bakterienkolonie wurde eine mit Insulinantikörper beschichtete PVC-Folie aufgebracht, und dann wurde für 2 - 3 Stunden bei 40C inkubiert. Die PVC-Folie wurde anschliessend für 15 Stunden bei 4 0C in einer Lösung von 132Jod-markiertem Insulinantikörper inkubiert. Die spezifische Aktivität der Lösung war ca. 1 x 106 cpm/ml. Nach dem Waschen und Trocknen der Folien wurden diese autoradiographiert. Die auf der Platte immunologisch auf Insulin reagie @ den Klone werden in einem üblichen Nährmedium gezüchtet, die Bakterien abzentrifugiert, extrahiert und nun im Radioimmunoassay auf Insulingehalt ausgetestet. Eine Anzahl von Klonen zeigen dabei Insulinwerte von mehr als 1 IE pro Liter Kulturlösung.

Claims: Patentansprüche: 1. Mikrobiologisch hergestelltes Polypeptid, das die Aminosäuresequenz des Proinsulins von Primaten ganz oder teilweise enthält. 2. Mikrobiologisch hergestelltes Polypeptid nach Anspruch 1, das die Aminosäuresequenz des C-Peptids des Proinsulins von Primaten ganz oder teilweise enthält. 3. DNA, die für Aminosäuresequenzen des Proinsulins gemäB Ansprüchen 1 bis 2 codiert, hergestellt mittels mRNA von Primaten. 4. Plasmid, das für Aminosäuresequenzen gemäss Ansprüchen 1 bis 2 codiert, hergestellt aus der cDNA gemäss Anspruch 3 und einem Plasmid, vorzugsweise dem Plasmid pBR 322. 5. Mikroorganismus, insbesondere E. coli, mit der genetischen Information für die Biosynthese des Poly peptids von Ansprüchen 1 bis 2. 6. Verfahren zur Herstellung des Polypeptids gemäss den Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die genetische Information für die Biosynthese des Poly peptids mittels mRNA von Primaten gewinnt, das er haltene Gen in an sich bekannter Weise in Mikro organismen einbringt und diejenigen Mikroorganismen in an sich bekannter Weise herausselektioniert und kultiviert, die dieses Polypeptid produzieren. 7. Verfahren zur Herstellung von cDNA nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man aus der Pankreas vo Primaten RNA gewinnt, daraus die mRNA isoliert und mittels dieser in an sich bekannter Weise cDNA her stellt. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man bei der Gewinnung von Inselzellen aus der Pankreas von Primaten Säugetierserum, vorzugsweise Kälberserum, in einer Menge von vorzugsweise 20 oder mehr Prozent des Gesamtvolumens verwendet und aus den so gewonnenen Inselzellen RNA gewinnt. 9. Verfahren zur Herstellung eines Mikroorganismus gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus, vorzugsweise E.coli, mit einem Plasmid gemäss Anspruch 4 transformiert. 10.Verfahren zur Gewinnung von RNA, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Cäsiumchlorid-freies Lysat auf eine wässrige konzentrierte Cäsiumchloridlösung auf schichtet, zentrifugiert und die RNA gewinnt. Patentansprüche für Österreich: 1. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus, der die genetischen Informationen für die Biosynthese des Polypeptids mit der Aminosäuresequenz des Proinsulins von Primaten ganz oder teilweise enthält, kultiviert und das von dem Mikroorganismus gebildete Polypeptid isoliert. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus, der die genetischen Informationen für die Biosynthese des Polypeptids mit der Aminosäuresequenz des C-Peptids des Proinsulins von Primaten ganz oder teilweise enthält, kultiviert und das so erzeugte Polypeptid isoliert. 3. Verfahren zur Herstellung des Polypeptids gemäss Ansprüchen 1-2, dadurch gekennzeichnet, dass man die genetischen Informationen für die Biosynthese des Polypeptids mittels mRNA von Primaten gewinnt, das erhaltene Gen in an sich bekannter Weise in Mikro organismen einbringt und diejenigen Mikroorganismen herausselektioniert und kultiviert, die das Polypeptid produzieren. 4. Verfahren zur Herstellung von cDNA, die für Amino säuresequenzen des Proinsulins von Primaten codiert, dadurch gekennzeichnet, dass man aus der Pankreas von Primaten RNA gewinnt, daraus die mRNA isoliert und mittels dieser in an sich bekannter Weise cDNA herstellt. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man bei der Gewinnung von Inselzellen aus der Pankreas von Primaten Säuretierserum, vorzugsweise Kälberserum, in einer Menge von 20 oder mehr Prozent des Gesamt volumens zusetzt und aus den so gewonnenen Insel zellen RNA gewinnt. 6. Verfahren zur Herstellung eines Plasmids, der für die Aminosäure sequenzen des Proinsulins von Primaten codiert, dadurch gekennzeichnet, dass man die nach Anspruch 4 hergestellte cDNA mit einem Plasmid, vor zugsweise dem Plasmid pBR 322, kombiniert. 7. Verfahren zur Herstellung des gemäss Ansprüchen 1 bis 2 eingesetzten Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus, vorzugsweise E.coli mit einem Plasmid, der gemäss Anspruch 6 hergestellt wurde, transformiert. 8. Verfahren zur Gewinnung von RNA, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Cäsiumchlorid-freies Lysat auf eine wässrige konzentrierte Cäsiumchloridlösung auf schichtet, zentrifugiert und die RNA gewinnt.

Inventors: GRONEBERG, JURGEN, DR., SUMM, HANS-PETER, DR., WENGENMAYER, FRIEDRICH, DR., WINNACKER, ERNST-LUDWIG, PROF. DR., Groneberg, Jürgen, Dr.
Applicants: HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1981
Main classification: C12N15
IPC codes: C12N1, C12N15, C07K14, C12P19, C12P21, C12R1, C07H21