METHOD FOR THE CULTURE OF MICROORGANISMS, IN PARTICULAR OF YEAST, ON LACTOSERUM WITH AN ASSOCIATION OF CAREFULLY CHOSEN STRAINS AND OF SPECIFIC MUTANTS OF A STRAIN

Abstract: 1. A method for culturing microorganisms, particularly yeasts, on lactoserum as starting substrate characterized in that, after separating proteins in lactoserum and recovering the other constituents, the culture is carried out on the thus obtained lactic substrate, by using, on one hand, an association of strains, each of which develops specifically on a given substrate present naturally in the medium, or on metabolities formed during the fermentation process, and, on the other hand, specific mutants of a strain so as to create ecological "niches" corresponding to an association of strains pertaining to the same species.

Description: PROCEDE DE CULTURE DE MICROORGANTSMES, EN PARTICULIER DE LEVURES, SUR' DU LACTOSERUM AVEC UNE ASSOCIATION DE SOUCHES JUDICIEUSEMENT CHOISIES ET DES MUTANTS SPECIFIQUES D'UNE SOUCHE. La La présente invention se rapporte à l'industrie ali- mentaire et, plus spécifiquement, à un procédé d'optimisation de cultures de microorganismes, notamment de levures, spéciale- ment de levures lactiques, pour la production de biomasse ou de métabolites intermédiaires de fermentation, utilisables dans 1'industrie alimentaire. Un des procédés connus de culture de levures lactiques sur du lactosérum est décrit dans le brevet français n 1.128.063 de la société dite Fromageries Bel. Il se rapporte à un procédé de fabrication de levures lactiques éclatées,qui consiste a séparer par précipitation les corps fermentescibles - azotés, protéines et albumines, contenus dans le sérum de fromagerie ou de caséinerie ou dans le mélange serum-babeurre; ;et à absorber et transformer par des levures les corps hydrocarbo- hés existant dans le sérum ou le mélange ainsi déprotéiné. La fermentation, menée dans des conditions de pE, d'aération et de températures précises, est effectuée par des souches de Saccharomyces, classées ultérieurement dans l'espèce Kluyveromyces tLodder, 1970). Depuis la date de dép8t (22 juin 1955) du brevet fran çais n 1.128.063,ce procédé a fait l'objet de nombreuses amé- liorations-, notamment en ce qui concerne 1 'adaptation des cu7- tures aux nouvelles techniques de déprotéination du lacto sérum,ainsi que le conditionnement et la conservation des cellules de levures obtenues. La déprotéination du lactose,autrefois effectuée par préciptation thermique, est maintenant réalise par ultrafiltration et chromatographie échangeuse d'ions.De plus, le substrat carboné, autrefois constitué de lactose, est maintenant formé de lactose hydrolysé, tel que cela est indiqué dans la demande de brevet français n 78/30229 déposée par la so ciété dite des Fromageries Bel, où l'on conduit la culture d'un microorganisme sur le substrat laitier renfermant du lactose hydrolysé. Actuellement, la production de levure-aliment est basée sur la culture préférentielle de certaines souches sur certains milieux : par exemple, le Kluyveromyces fragilis est cultivé sur du lactosérum, le Candida lipolytica sur des alcanes, le Candida tropicalis sur du gaz-oil et le Candida utilis sur des mêlasses. Ces fermentations, conduites le plus souvent dans des conditions de non-stérilité, entraînent la présence, dans le mélange, d'autres espèces qui, le p?us souvent, ne sont pas souhaitées. De ce fait, un inconvénient résultant est que la souche souhaitée peut outre amenée a être éliminée du fermenteur par une souche "pirate contaminante" De plus, si l'on veut obtenir le développement d'une culture pure, il faut que le substrat carboné de croissance soit de qualité stérile constante pour maintenir une souche unique de fermentation. Or, les lactosérums provenant de la fabrica- tion de fromages à caillé lactique ou de caséine lactique (lactosérums acides) contiennent 4 a"' lo.g/l d'acide lactique, alors que les lactosérums provenant de la fabrication de fromages à caillé présure ou de caséines-présure (lactosérums doux) ne contiennent que I à 3 g/l placide lactique. De plus, la variation de la: teneur en acide lactique du substrat est due egalement au fait que les unités industrielles de traitement du lac tosérum reçoivent cette matière à traiter continuellement tout le long de la journée et, en fonction de son origine, ce lactosérum a un rapport lactose/acide lactique qui varie tout le long de celle-ci. Pour répondre 12 la variation de ce rapport, Si est nécessaire de concevoir un système susceptible de s'adapter à ces variations par une sélec- tion de souches présentant une spécificité d'assimilation des substrats telle spécificité, compte tenu des phénomènes de diauxie existant en cultu re continue,n'est e""isa,geable que par la sélection de mutants qui au ront perdu la capacité d1assi,,miler l'un ou l'autre des subs.trats carbonés présents. On entend par,diauxie, la capacité d'adapta tion d'une souche a la consommation de différents,substrats. l'un apres l'autre, ce qui impose le choix entre des vitesses de croissance limitée de façon a consommer toutes les sources de carbone ou des vitesses, de croissance 'rapide et une perte de substances carbones. L'augmentation de la vitesse de'croissance d'une culture dans laquelle il y a spécificité de consommation d'une espèce vis-a-vis d'un substrat sé traduit en fait par la satu ration du métabolisme oxydatif des Kluyveromyces et une 'partie de la source de'carbone est dégradée par voie fermentai re, ce qui conduit à l'apparition obligatoire d'éthanol. Cet méthanol est connu comme étant un métabolite toxique pour les cellules ; de ce fait, sa présence entraine une inhibition de la croissance des levures On se trouve dès lors limité par la concentration de ce métabolite dans ce milieu. Il est donc indispensable,pour imposer des vitesses de croissance maxima, d'éliminer ce métabolite ; or, il représente une potentialité de synthèse. Une façon judicieuse de profiter de cette poten tialité est d'introduire une souche capable d'assimiler ce substrat et ce de façon spécifique. El serait donc utile de remèdier aux inconvénients du procédé habituel et d'apporter une solution aux problèmes décrits ci-dessus. La présente invention a pour but de permet tre l'optimisation des conditions de culture sur un substrat .lactique, en se basant sur les techniques de culture actuellement connues' et, notamment, sur l'opportunité d'avoir des cultures mixtes, tel que cela est décrit dans un article de Harrisson P.E. intitulé : Cultures mixtes dans les procédés de fermentation industrielle" (Advances in Applied Microbio logy (1978), 24, p.129-164) qui donne un exemple de cultures mixtes sur du méthane et du méthanol. L'emploi des cultures mixtes permet une augmentation des performances par utilisa tion des différents substrats. Un objet de la présente'invention est de prévoir un procédé de culture avec association de souches, dont cha cune utilisera un constituant différent du milieu, et ceci de façon exclusive, ce qui fournit une absence de competition visà-vis des différents autres substrats du milieu. Un autre objet de la présente invention est de sélectionner des mutants specifiques d'une souche pour un substrat afin de créer des niches" écolpgiques, chaque "niche" correspondant à une association de souches appartenant à la même espèce, souches qui seront dépendantes du développement global de la culture, donc des "nichés" voisines. D'autres objets apparaxtrcilt d'après la description suivante. Ces objets sont maintenant atteints par un procédé dé de culture de microorganismes, en particulier de levures, sur du lactosérum en tant que substrat de départ, procédé dans lequel, après séparation des protéines contenues dans le lactosérum et récupération des autres consttuants, on réalise la culture sur le substrat lactique ainsi obtenu en utilisant, d'une part, une association de souches judicieusement choisies, dont chacune se développe d'une façon spécifique sur un substrat donné présent naturellement dans le milieu ou sur les métabolites formés au cours du processus de fenrentation et, d'autre part, des mutants spécifiques d'une souche afin de créer des "niches" écologiques correspondant une association de souches 'appartenant à la même espèce. Dans la présente invention, les milieux de culture sont des lactosérums provenant de différents traitements laitiers et fromagers, c'est-à-dire des lactoséruns doux ou acides, par tiellement ou totalement deprotélnés par différents procédés connus et utilisables industriellement (précipitation.par traitement thermique, séparation par ultrafiltration, chromatographie d'exclusion et d'échange d'ions, etc.) et partiellement ou totalement hydrolysés par vo4 enzymatique' (traitement avec une p-galactosidase) ou chimique. Quel que sot le milieu de culture d'origine, il se compose toujours, d'une part, de lactose (ou d'un mélange de glucose, de galactose et de lactose dans le cas d'un lactose hydrolyse et, d'autre part, d'acide lactique et d'autres acides organiques.. La proportion de ces deux catégories de substrats peut varier selon l'origine et la technologie d'obtention du milieu. Dans le procédé de la présente invention, on sélectionne judicieusement plusieurs souches a hautes performances entre gui concerne leur taux de croissance ou le rendement de leur composition en protéines et leur spécificité a croître sur un substrat, et on les associe en vue de les cultiver sur chacun des substrats carbonés présents même en faible quantité dans la matière naturelle de départ .ou sur les métabolites formés au cours du processus de'fermentation. Au bout d'un certain temps, il résulte un équilibre de flore trés stable, la proportion des différentes espèces dépendant de la concentration des substrats les uns par-rapport aux autres. Pour fonctionner de manière optimale, un tel système nécessite des "niches" écologiques, A l'intérieur de chacune d'entre elles, il existe une compétition entre les diffe- rentes souches susceptibles de croître avec les vitesses va- riables sur le seul substrat présent. Il est évident que les sélections a l'intérieur de chacune des "niches" sont dépendantes, en particulier pour la niche "éthanol", dont. la concentration en substrat dépend de l'activité fermentaire des souches appartenant aux deux autres "niches" (lactose et ses drivés d'hydrolyse acide lactique et autres acides organiques) et, en particulier, à la niche "lactose". Les souches sélectionnées appartiennent notamment aux espèces suivantes : Aluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis et Torulopsis bovina. Les Kluyveromyces fragilis se développent sur du lactose, les Sluyveromyces lactis sur l'acide de lactique, sans possibilité d'interférences, et les Torulopsis bovina sur l'éthanol. L'équilibre entre les souches varie selon la proportion des substrats dans le milieu et de la capacité du fermenteur pour la quantité d'éthanol produite. A titre d'exeEple, oui peut donner la répartition suivante dans un milieu composé de lactose,d'acide lactique et d'éthanol comprenant 90-95 % de lactosérum,5-lO % d'acide lactique et 1-3 % d'éthanol - Kluyveromyces fragilis environ 90 a 95 t - KluW7erornyces lactis environ 5 a 10 t - Torulopsis bovina environ 1 a 3 % Si le milieu est du lactosérum partiellement ou tota lement hydrolysé, ce qui entraîne la présence de deux substrats carbonés supplementáires, le glucose et le galactose, il peut être intéressant d'utiliser une nouvelle souche de levures tel le que Saccharomyces cerevisae ou Candira utilis. On doit noter que le taux d'hydrolyse du lactose peut varier entre 0 et 100 %, la répartition du glucose et du galactose entre O et 45 % et celle du lactosé entre O et 95 %. L'équilibre des souches, qui varie en fonction de la nature des substrats, est le suivant,lorsqu'il y a hydrolyse du lactose à 80-90 % et que les substrats sont constitués de 10 20 8 de lactose, de 36-43 t de glucose, de 36-43 % de galactose, de 5-10 % d'acide lactique et de 1-3 % d'éthanol: : - Kluyveromy^es fragilis environ 45 à 65 % - Kluyveromyces lactis environ 5 a 10 % - Candida utilis environ 35 a 45 % - Torulopsis bovina environ l à 3 % Les fermenteurs employés travaillent, dans des con ditions optima, à des températures comprises entre environ 30 et 400C, a un pH d'environ 3 a 4, avec un débit d'arrivée d'air égal à environ 1800 m3/h, avec une gamme d'environ 2 a 3 mil liards de cellules totales par cm3, cette gamme étant la même quelle que soit la souche.On doit remarquer que, le volume d'air étant toujours fonction du volume du milieu, celui de 1800 m3/h correspond à un volume du milieu de 25 m3. En expri mant le volume d'air non pas en m3/h mais en Wm (volume d'air/ volume du milieu/mn), les conditions optima se situent entre 1,2 et 1,5. Comme 9n travaille en continu, le débit est cons tant pendant la fermentation et avant le soutirage. Le rendement en biomasse et/ou en métabolites peut être augmenté en incorporant dans le milieu de culture des substances minérales, telles que le phosphore, le cuivre, le zinc,le fer et divers autres éléments qui sont des substances nutritives ?our les microorganismeS (addition de H3PO4,CuSO4,ZnSO4,FeSO4). Par rapport-aux procédés de culture existant actuelle ment, à une seule souche primordiale et a souches secondaires parasites, le procédé de la presente-invention a les avantages suivants : 10) Il est possible d'adapter le procédé aux diffe- rents rapports lactose/acide lactique existant dans les lactosérums, qui sont les milieux naturels de culture. 20) On utilise la totalite-de chaque source de carbone avec limitation des pertes, d'où l'obtention d'un rende- ment optimum, qui est d'environ 50 à 55.%. En l'absence de souche métabolisant l'ethanol, la perte serait au moins égale a la proportion de Torulopsis bovina, soit 2 à 3 %. 30) Il est Possible de travailler avec des vitesses maxima de croissance des souches principales, du fait de la consommation par une tierce souche de métabolite intermédiaire toxique, d'où l'obtention d'une productivité maxima de l'ensemble du dispositif (fermenteur); le gain de prduc- tivité est environ 15 à 20 % par rapport au procédé normal a une seule souche primordiale. 4 ) On supprime la compétitivité "interniches", tout en maintenant, d'une part, la compétitivité à l'intérieur de chaque niche et, d'autre part, la compétitivité des souches entre les niches. 503 Les installations ne sont pas sophistiquées en ce qui concerne l'aération et la limitation des transferts airliquide qui constituent habituellement le facteur limitant ces installations. 60) La. conduite des opérations est simplifiée. Le procédé de la présente invention. permet la production de biomasse (levure-aliment3 et/ou de métabolites intermédiai- res. La présente invention sera maintenant décrite a l'aide des exemples suivants qui ne sont donnés qu'a titre d'ilns- tration et non pas de limitation de la présente invention. EXEMPLE 1 On part d'un lactosérum doux provenant d'une fromagerie, que l'on derotéine par ultrafiltration Ce lactosérum déprotéiné est envoyé dans un fermenteur dit Airlift, travaillant dans les conditions suivantes - volume utile : 23 - débit : 7600 1/h - pH : 3 a 4 - température : 30 a 4O0C - débit d'air : 1800 m3 /h - addition d'une source azotée : NH4 OH Les souches sélectionnées sont les suivantes, avec l'équili- bre indiqué ci-dessous - Kluyveromyces fragilis sur lactose : 90-96 % - KLuyveromyces lactis sur acide lactique ' : 5-10 % - Torulopsis bovina sur éthanol : 1 a 3 % Des contrôles systématiques sur deux ans de la flore présente dans le milieu ont montré une répartition très stable entre les espèces. EXEMPLE 2 On part.d'un lactoserum acide provenant d'une caséinerie, que l'on a déprotéiné par ultrafiltration et dont on a hydrolysé partiellement (à 90 %) le lactose à l'aide d'une 5- galactosidase. La fermentation se fait selon les mêmes conditions que celles données dans l'exemple 1. Les souches sélectionnées sont les suivantes : - Kluyveromyces fragilis sur lactose et galactose - Kluyveromyces lactis sur acide lactique - Candida utilis sur glucose - Torulopsis bovina sur éthanol La répartition des souches est la suivante : - Kluyveromyces fragilis : 49,5-58,5 % - Kluvveromvces lactis : 5-10 % - Candida utilis : 40 - 43 % - Torulopsis bovina : 1 - 3 % Des contrôles systématiques sur deux ans de la flore présente da..ns le milieu ont montré une répartition très stable entre es especes. La présente invention n'est pas limitée aux exempies de réalisation qui viennent d'être decrits, elle est au contraire susceptible de variantes et de modifications qui apparaîtront a l'homme de l'art.

Claims: REVENDICATIONS. 1 - Procédé de culture de microorganismes, en particulier de levures, sur du lactosérum en tant que substrat de départ, caractérisé en ce qu'après séparation des protéines contenues dans le lactosérum et récupération des autres constituants, on réalise la culture sur le substrat lactique ainsi obtenu, en utilisant, d'une part, une association de souches,dont chacune se développe d'une façon spécifique sur un substrat donné présent naturellement dans le milieu, ou sur les métabolites formés au cours du processus de fermentation, et, d'autre part, des mutants spécifiques d'une souche afin de créer des "niches" écologiques correspondant a une association de souches appartenant a la même espèce. 2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'association de souches est constituée de Kluyveronv- ces fragilis, se développant sur du lactose, de Kluyveromyces lactis, se développant sur de l'acide lactique, de Candida utilis et de Saccharomyces cerevisae,se développant sur du glucose, et de ToruloPsis bovina se développant sur de l'ethanol. 3 - Procédé selon la revendication I, caractérisé en ce que le substrat de départ est un lactosérum doux ou acide provenant de divers traitements laitiers et fromagers. 4 - Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le substrat de départ est partiellement ou totalement .déprotéiné par précipitation l'aide d'un traitement thermique ou-acide, par séparation par ultrafiltration ou chromatographie d'éxclusion etU'échange d'ions. 5 - Procédé'selon la revendication 3, caractérisé en ce que le substrat de départ est également partiellement ou totalement hydrolysé par voie enzymatique ou chimique. 6 - Procédé selon l'une quelconque des revendicatiens 1 a ; caractérisé en ce que, quelle que soit son origi ne; le milieu de culture est composé d'un melange de deux (ou davantage) substrats choisis dans le groupe se composant de lactosse, d'acide lactique, d'éthanol et, éventuellement, de galac tosse et de glucose. 7 -. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'à l'intérieur de chacune des "niches", on maintient une compétition entre les différentes souches susceptibles'de croître avec le meilleur rendement sur le seul substrat sent. 8 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que les souches sélectionnées appartiennent aux espèces Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Torulopsis bovina, Saccharomyces cerevisae ou Candida utilis. 9 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les souches sélectionnées sont des microorganismes qui ont l'aptitude à croitre surie ou les substrats, présents dans le milieu, qui se forment au cours du processus de fermentation. /

Inventors: GALZY, PIERRE, GOUDAL, RAYMOND, MALIGE, BERNARD, MOULIN, GUY
Applicants: FROMAGERIES BEL
Application year: 1981
Main classification: C12N1
IPC codes: C12N1, C12P39