SERPENTINE, ALSTONINE AND SEMPERVIRINE DRUGS FOR THE SPECIFIC INHIBITION OF TUMUROUS AND CANCEROUS CELLS

Abstract: 1. Pharmaceutical compositions having preferential action on the replication of DNA and the synthesis RNA in tumorous, cancerous and viral cells, characterized in that they consist of microgranules having a neutral central core, at least one first intermediary layer comprising at least one alkaloid of the group of beta-carbolines of the type serpentine, alstonine, sempervirine and flavopereirine, and at least an outer layer made up by a microporous envelope, comprising at least a natural and/or synthetic polymer of the type : shellac, arabic gum, gelatine, cellulose, ethyl cellulose, cellulose acetophtalate, cellulose triacetate, polyvinyl pyrrolidone, polyoxyethylene glycol, methacrylates and styrene-acrylonitrile copolymers.

Description: Serpentine, alstonine et sempervirine, médicaments inhibant spécifiquement les cellules cancéreuses et tumorales La présente invention concerne des produits utilisables comme médicaments comportant de la serpentine, alstonine, sempervirine et flavopéreirine à action préférentielle sur la réplication des ADN et la synthèse des ARN des cellules tumorales, cancéreuses et vitales. Une substance anti-cancéreuse, anti-tumorale vraie doit distinguer les cellules tumorales des cellules saines, et tuer les premières, sans porter préjudice aux secondes. On a trouvé que quatre alcaloïdes extraits de végétaux et appartenant au groupe des béta-carbolines quaternaires, possèdent ces propriétés anti-cancéreuses, anti-tumorales, ou antivirales, et peuvent être utilisés comme médicaments pour le traitement des cancers chez les humains en particulier s'il sont administrés sous une forme galénique à libération prolongée. Ce sont : la serpentine, de formule I, alcaloïde du Rauwolfia serpentina, qui peut être extraite à l'état pur de cette plante ; l'alstonine, de formule II, alcaloide de diverses variétés de Rauwolfia (obscura, vomitoria) de Vinca rosea et autres apocynacées qui peut être extraite de Rauwolfia obscura ; la sempervirine, de formule III, alcaloIde de gelsemium sempervirens (jasmin jaune de Caroline) qui peut etre synthétique et la flavopéreirine, alcaloide du Geissospernum laeve (Vellozo) Baillon, apocynacées de formule IV qui peut être synthétisé. Les formules I, II, III et IV de ces quatre alcaloïdes sont représentées ci-après dans la figure 1. I1 a été démontré que les quatre alcaloïdes selon l'invention ont une activité anti-cancéreuse vraie, c'est-a-dire qu'ils détruisent les cellules cancéreuses, mais ne détruisent pas les cellules saines. Des cultures de cellules saines (cellules primaires de reins de singe, cellules de lignée "Vero" et "SIRC") et des cultures de cellules cancéreuses (cellules K.B., cellules Hela, cellules Hep II et cellules L)ont reçu une dose de 200 Mg, soit de serpentine, soit d'alstonine, soit de sempervirine, par ml de culture. Les résultats sont résumés dans le tabeau I ci-après : toutes les cellules cancéreuses étaient détruites, aussi bien par la serpentine, que par la sempervirine en 24 à 48 heures ; par contre, il n'y avait aucune destruction des cellules saines au bout de huit jours d'observation. L'effet cytotoxique spécifique, vis-à-vis des cellules tumorales utilisées, ne s'est jamais démenti au cours des très nombreuses expériences effectuées. Par contre, pour effectuer les cellules saines il a fallu des quantités d'alcaloïdes au moins dix fois plus grandes (plus de 2 mg/ml). (Les cultures de cellules in-vitro sans mycoplàsmes ont été effectuées dans les conditions classiques et en l'absence d'antibiotique qui pourraient fausser les résultats). L'activité anti-cancéreuse des quatre alcaloïdes selon l'invention a été confirmée par des expériences pharmacologiques sur des souris atteintes de différents types de cancers Action sur le cancer mammaire greffable de la souris - Vingt souris de 18 à 20g, de souche RhO III ont été inoculées, par voie sous-cutanée, par 0 < ' n1 d'un extrait de tumeur MS 301, broyé. Dix rr1'i ont été gardées comme témoins ; dix autres 1- vaient, le troisième jour après l'inoculati(n, 400 Kg d'alstonine au niveau de l'implantation tumorale, deux fois par jour, pendant quinze jours. Au seizième jour, les souris étaient anesthésiées et sacrifiées, les tumeurs excisées et pesé@@. - La même expérience fut effectuée avec la serpen tine au lieu d'alstonine. Les résultats sont donnés dans le tableau II ci-dessous TABLEAU II EMI3.1 <tb> <SEP> POIDS <SEP> MOYEN <SEP> (en <SEP> grammes) <SEP> DES <SEP> TUMEURS, <SEP> AU <SEP> 16è <SEP> JOUR <tb> <SEP> Souris <SEP> témonins <SEP> Souris <SEP> traitées <SEP> Souris <SEP> traitées <tb> par <SEP> la <SEP> serpentine <SEP> par <SEP> l'alstonine <tb> <SEP> 3,2 <SEP> (compris <SEP> entre <SEP> 1,6 <SEP> (compris <SEP> 1,7 <SEP> (compris <tb> <SEP> 2,6 <SEP> et <SEP> 3,8) <SEP> entre <SEP> 0,9 <SEP> et <SEP> 2,5) <SEP> entre <SEP> 0,8 <SEP> et <SEP> 2,6) <tb> <SEP> Signification <SEP> statis <tb> <SEP> tique <SEP> p <SEP> : <SEP> 0,01 <tb> Activité vis-a-vis du lymphome YC 8 de la souris Trente souris BALB C de 17 à 20 g sont inoculées par voie intrapéritonéale par 103 cellules asditi- ques du lymphome YC 8 de la souris fraichement prélevées. Dix souris sont gardées comme témoins. Dix souris sont traitées, le 3è jour après l'ino culation, par l'alstonine : deux fois par voie intrapéritonéale et pendant huit jours consécu tifs (400 Ag par jour). Dix souris sont traitées le 3è jour après l'ino culation, par un mélange alstonine + cyclophospha mide. Dans ces expériences l'alstonine peut être remplacée par la serpentine. Les résultats sont présentés dans le tableau III ci-après et illustrent la survie des animaux pendant trois mois (une survie de quelques jours n'est pas prise en considération) Chez les souris témoins la tumeur ascitique se développe en 20-22 jours environ et la souris atteint alors un poids de 32-36 g. Les quatre souris ayant survécu au traitement par l'alstonine ont plus de trois mois. Elles sont tout à fait normales et leur poids initial a faiblement et normalement progressé (23-24 g). Lorsquton applique, par voie intra-péritonéale, un traitement par un mélange d'alstonine et de cyclophosphamide (doses par jour et par souris de 400 M < J d'alstonine et 2 mg de cyclophosphamide) neuf sur dix souris survivent parfaitement sans amaigrissement ni récidive < Tableau III ci-après). TABLEAU III EMI4.1 <tb> <SEP> TEMPS <SEP> DE <SEP> SURVIE <SEP> DES <SEP> SOURIS <SEP> TEMOINS <SEP> ET <SEP> TRAITEES <tb> <SEP> Traitées <SEP> par <SEP> Traitées <SEP> par <tb> Jours <SEP> de <SEP> survie <SEP> Témoins <SEP> l'alstonine <SEP> alstonine <SEP> + <tb> <SEP> cyclophosphamid <tb> <SEP> O <SEP> 10/10 <SEP> 10/10 <SEP> 10/10' <tb> <SEP> 22 <SEP> 0/10 <SEP> 7/10 <SEP> 9/10 <tb> <SEP> 60 <SEP> - <SEP> 4/10 <SEP> 9/10 <tb> <SEP> 90 <SEP> - <SEP> 4/10 <SEP> 9/10 <tb> Par contre, lorsque le cyclophosphamide seul est administré, on constate que les souris sont guéries, mais ceci n'est qu'une apparence car après 1-3 mois, l'amaigrissement est tel qu'elles meurent et que chez d'autres l'apparition de nouvelles tumeurs s'observe. I1 faut noter que des souris porteuses de lymphome YC 8 et traitées par l'alstonine seule, aux mêmes doses par voie sous-cutanée, ne survivent pas plus longtemps que les souris témoins. Par contre, l'administration simultanée par voie sous cutanée d'alstonine et de cyclcphosphamide, pendant 4 à 5 jours consécutifs, se traduit par une survie parfaite de toutes les souris traitées (6/6). Activité vis-à-vis des tumeurs "Ascite d1Ehrlich" chez la souris 5 x 103 cellules Ascite d'Ehrlich sont inoculées à des souris blanches Swiss de 20-24 g, par voie intrapéritonéale. Divers traitements furent appliqués dès le quatrième ou le cinquième jour et pendant dix a quinze jours. Nous pouvons conclure que ni le cyclophosphamide injecté seul, par voie intrapéritonéale ou sous-cutanee, ni l'alstonine seule, ni la serpentine seule, ne peuvent définitivement arrêter la tumeur ascitique d'Ehrlich. Un net ralentissement du développement des tumeurs est observé, mais les tumeurs repartent après arret du traitement dans le cas du cyclophosphamide seul, le redémarrage peut être plus tardif qu'avec la serpentine ou l'alstonine. Par contre, l'association de serpentine (400 g par jour) et de cyclophosphamide (2 ma par jour) par voie I.P. permet d'obtenir une survie définitive (survie définitive : survie normale pendant trois mnis sans perte de poids) et le pourcentage des survivants varie de 80 à 100% (Tableau IV ci-après). Les souris ainsi guéris augmentent normalement de poids et après quatre à six mois celui-ci est de 24-26 g. Leur aspect est absolument normal et rien ne les distingue de souris saines. (Dans les expé riences, seule la survie sans récidive est prise en consi- dération). TABLEAU IV EMI6.1 <tb> SURVIE <SEP> DES <SEP> SOURIS <SEP> PORTEUSES <SEP> DE <SEP> TUMEURS <SEP> ASCITIQUES <SEP> D'EHRLICH <SEP> <tb> <SEP> Traitées <SEP> Traitées <SEP> par <tb> Jours <SEP> de <SEP> Témoins <SEP> Traitées <SEP> par <SEP> le <SEP> cyclo <SEP> Serpentine <tb> <SEP> survie <SEP> . <SEP> par <SEP> la <SEP> phosphamide <SEP> + <SEP> cyclo <tb> <SEP> serpentine <SEP> phosphamide <tb> (I.P.) <SEP> (I.P.) <SEP> (I.P.) <tb> <SEP> O <SEP> 10/10 <SEP> 10/10 <SEP> 6/6 <SEP> 10/10 <tb> <SEP> 25 <SEP> 0/10 <SEP> 10/10 <SEP> 6/6 <SEP> 10/10 <tb> <SEP> 35 <SEP> - <SEP> <SEP> 0/10 <SEP> 6/6 <SEP> 9/10 <tb> <SEP> 60 <SEP> - <SEP> <SEP> - <SEP> <SEP> 2/6 <SEP> 9/10 <tb> <SEP> 120 <SEP> - <SEP> - <SEP> 0/6 <SEP> 9/10 <tb> La figure 2, où sont portés en abscisses le nombre de jours de traitement et en ordonnées le poids (en gramme) des souris, montre l'évolution de la tumeur d'Ehrlich chez les souris traitées, soit par la serpentine seule (courbe 2), soit par le cyclophosphamide seul (courbe 3), soit par la serpentine + cyclophosphamide (courbe 4) par voie intrapéritonéale/et aux doses indiquées ci-dessus. Les deux traitements, soit par la serpentine, soit par le cyclophosphamide seul, permettent d'obtenir un net ralentissement du poids des tumeurs avec toutefois un amaigrissement très fort de la souris traitée par le cyclophosphamide seul. Aucun de ces deux traitements ne permet d'obtenir une survie. dé- finitive. Par contre, le mélange de serpentine et de cyclophosphamide permet d'obtenir une survie définitive. Inoculées par voie sous-cutanée, aux doses indiquées cidessus, et séparément, l'alstonine et la serpentine sont sans effet sur la survie définitive des souris, alors que l'association alstonine (ou serpentine) + cyclophosphamide par voie sous-cutanée, provoque l'arrêt de l'évolution de la tumeur et la survie des souris ainsi traitées est normale. Activité vis-a-vis de l'ascite solide d'Ehrlich de la cuisse, chez la souris - Le muscle interne de la souris de souche Swiss décroît 106 cellules de l'ascite d'Ehrlich par voie intramusculaire. Le traitement n'est com mencé que lorsque la tumeur est apparente. La serpentine, ou l'alstonine, est administrée seule par voie intramusculaire dans la région de la tumeur aux doses de 0,8 mg par jour et pendant dix jours consécutifs. Après 26 jours, les souris sont sacrifiées, les tumeurs exci sées et pesées. On constate que l'alstonine (ou la serpentine) réduit le poids moyen des tumeurs, de l'ordre de 40 à 50% (comme on peut le voir d'après le tableau V ci-après), ce qui, lorsque les souris ne sont pas sacrifiées se tra duit par une survie de quelques jours seulement. - Par contre, l'administration d'alstonine (ou de serpentine) et de cyclophosphamide dans la tumeur elle-même (400 g d'alstonine + 2mg de cycloDhos- phamide) par jour et pendant 10 jours consécutifs, conduit à la nécrose de la tumeur. La souris re- trouve une mobilité normale. Le taux de survie des souris ainsi traitées est de l'ordre de 80%. Lorsque le traitement est arrêté trop tôt (avant 5 jours) quelques souris présentent une récirlivn. De nouvelles injections de serpentine (ou aisto- nine) + cyclophosphamide, permettent d'arrèter difinitivement le développement de la tumeur. TABLEAU V Régression de la tumeur solide d'Ascite dEhrlich EMI8.1 <tb> <SEP> POIDS <SEP> MOYEN <SEP> DES <SEP> TUMEURS <SEP> (en <SEP> gramme) <tb> <SEP> Souris <SEP> têmoins <SEP> Souris <SEP> traitées <SEP> par <SEP> Souris <SEP> traitées <SEP> par <tb> l'alstonine <SEP> alstonine <SEP> + <SEP> cyclo <tb> <SEP> phosphamide <tb> Poids <SEP> moyen <SEP> 11,4 <SEP> ; <SEP> Poids <SEP> moyen <SEP> 7,8 <SEP> ; <SEP> Poids <SEP> moyen <SEP> 0,07 <SEP> ; <tb> compris <SEP> entre <SEP> compris <SEP> entre <SEP> compris <SEP> entre <tb> 10,4 <SEP> et <SEP> 12,4 <SEP> 5,5 <SEP> et <SEP> 10,4 <SEP> 0,04 <SEP> et <SEP> 0,11 <tb> p <SEP> : <SEP> 0,01 <SEP> <tb> Les expériences présentées ont été répétées plusieurs fois. Par ailleurs, l'effet cytotoxique spécifique de la sempervirine sur des cellules cancéreuses cultivées in-vitro a été comfirmé sur des souris porteuses de cellules cancéreuses et traitées par cet alcaloïde. On décrit ci-après à titre d'exemple l'activité de la sempervirine vis-à-vis du lymphome YC 8 de la souris. 34 souris BALB c de 17-20 g sont inoculées par voie intrapéritonéale par 103 cellules ascitiques du lymphome YC 8 de la souris fraîchement prélevées et dix souris sont gardées comme témoins. 24 souris sont traitées le deuxième jour après inoculation par la sempervirine dissoute en milieu tamponné (pH 7,65) à raison de deux fois par jour par voie intrapéritonEale (300 g par jour) et pendant 10 jours consécutifs. Les résultats sont présentés dans le tableau IX ci-après et illustrent la survie pendant trois mois des animaux traités. (Une survie de plusieurs jours n'est pas prise en considération). Temps de survie des souris témoins et traitées (tableau IX) EMI9.1 <tb> ours <SEP> de <SEP> survie <SEP> Témoins <SEP> Traitées <SEP> par <SEP> la <tb> <SEP> sempervirine <tb> <SEP> O <SEP> 10/10 <SEP> 24/24 <tb> <SEP> 20 <SEP> 0/10 <SEP> 24/24 <tb> <SEP> 60 <SEP> 0/10 <SEP> 20/24 <tb> <SEP> 90 <SEP> 0/10 <SEP> 20/24 <tb> Chez les souris témoins, la tumeur ascitique se développe en 20-22 jours environ, et la souris atteint un poids de 34-38 g. Les souris ayant survécu au traitement par la Sempervirine ont été gardées plus de trois mois. Les résultats sont indépendants du sexé des souris utilisées. Les souris survivantes sont tout à fait normales et leur poids initial a normalement progressé. Il faut noter que des souris porteuses de lymphome YC 8 et traitées par la sempervirine par voie sous-cutanée ne survivent pas très longtemps après les souris témoins. De mime, on a étudié l'activité de la sempervirine vis-avis des tumeurs Ascite d'Ehrlich de la souris 30 souris BALB c de 17-20 g ont été inoculées par voie intrapéritonéale par 5 x 103 cellules d'Ascite d'Ehrlich, fraîchement prélevées. 10 souris ont été gardées comme témoins et 20 souris ont été traitées le deuxième jour après l'inoculation par la sempervirine à raison de deux fois par jour par voie intrapéritonéale (300 Ag par jour et pendant 10 jours consécutifs. Les résultats sont présentés dans le tableau X ci-après et illustrent la survie des animaux pendant trois mois, une survie de plusieurs jours n1 étant pas prise en considération. Temps de survie des souris témoins et traitées (Tableau X) EMI10.1 <tb> Jours <SEP> de <SEP> survie <SEP> Témoins <SEP> Traitées <SEP> par <SEP> la <tb> <SEP> sempervirine <tb> <SEP> 0 <SEP> 10/10 <SEP> 20/20 <tb> <SEP> 21 <SEP> 1/10 <SEP> 15/20 <tb> <SEP> 60 <SEP> 0/10 <SEP> 10/20 <tb> <SEP> 90 <SEP> 0/10 <SEP> 10/20 <tb> Les résultats montrent que le traitement par la sempervirine seule permet une guérison définitive des souris porteuses de cellules d'Ascite d'Ehrlich dans une proportion qui se situe autour de 50%. Les mêmes résultats ont été obtens lorsque les souris blanches SWISS ont été utilisées dans ce même type d'expérience. On a par ailleurs étudié l'action de la flavopéreirine sur les cellules saines et sur les cellules cancéreuses culti- vées in vitro. Les cellules en culture ont reçu une dose de 150 g de rl-, vopéreirine par ml de culture ; les cellules cancéreus@ utilisées sont détruites en 24-48 heures, par contre @ cellules saines ne sont pas détruites pendant les 7 jo@@s d'observation. Cellules normales : (tableau VI) - Cellules primaires - + 150Ag de fla- - Pas de destruc de reins de singe vopéreirine dès tion pendant 7 l'ensemencement jours - Cellules "Vero" - + 150 g de fla- - Pas de destruc (cellules de lignés vopéreirine des tion pendant 7 l'ensemencement jours Cellules cancéreuses - Cellules KB - + 150 g de fla- - Destruction to vopéreirine dès tale en 24-48 l'ensemencement heures - Cellules Hela - + 150 g de fla- - Destruction to (culture de 3 jours vopéreirine dès tale en 24-48 l'ensemencement heures - Cellules L - + 150 g de fla- - Destruction to vopéreirine dès tale en 24-48 l'ensemencement heures. Les cellules cancéreuses et saines utilisées ne contenaient pas de mycopLasmes et le milieu de culture ne contenait pas d'antibiotique, ces derniers pouvant sensibiliser les cel- lules et par conséquent fausser les résultats. L'activité anticancéreuse de la flavopéreirine a été @@@f@@ mée par des expériences sur des souris atteintes soit les cellules ascitique de lymphome YC 8, soit sur dnn { ri atteintes de tumeur ascitique d'Ehrlich. En ce qui concerne l'activité de la flavopéreirine vis-@- vis du lumphome YO 8 de la souris, 30 souris BALB c de 18 20 g ont été inoculées par voie intrapéritonéale pr 11 cellules ascitiques du lymphome YC 8 fralchement prél@vé@@ et en pleine division chez la souris. Dix souris ont été gardées comme témoins et 20 souris ont été traitées 24 heures après inoculation. La flavopéreirine est dissoute en milieu physiologique tamponné (pH 7,65) et deux injections par voie intrapéritonéale et par jour sont administrées, (2 x 150Mg de flavopEreirine) t ceci pendant 10 jours consécutifs. Les résultats présentés dans le tableau VII ci-dessous illustrent la survie des animaux traités Temps de survie des souris témoins et traitées (tableau VII) EMI12.1 <tb> Jours <SEP> de <SEP> survie <SEP> Témoins <SEP> Traitées <SEP> par <SEP> la <tb> <SEP> flavopéreirine <tb> <SEP> O <SEP> 10/10 <SEP> 20/20 <tb> <SEP> 21 <SEP> 0/10 <SEP> 20/20 <tb> <SEP> 60 <SEP> 0/10 <SEP> 17/20 <tb> <SEP> 90 <SEP> 0/10 <SEP> 17/20 <tb> Toutes les souris qui ont survécu au traitement par la flavopéreirine (voie I.P.) ne pouvaient se distinguer de souris de laboratoire non inoculées par des cellules tumorales, leur développement étant tout à fait normal pendant plus de trois mois d'observation. L'administration de flavopéreirine par voie sous-cutanée ralentit le développement des cellules tumorales (lymphome YC 8) et la survie de trois mois concerne environ 70-80% des souris traitée à raison de deux fois par jour (2 x 150 Ag ) et pendant 10 jours consécutifs. On a constaté que le poids des souris témoins augmente essentiellement à partir du 10-12 éme jour et vers le 20-21 ème jour, les souris atteignent un poids de 34-37 g. En ce qui concerne l'activité de la flavopéreirine, vis-àvis des tumeurs ascites d'Ehrlich de la souris, 30 souris SUISS de 20- 22 g ont été inoculées par voie intrapérito néale par 5 x 103 cellules ascite d'Ehrlich fraichement prélevées. Irix souris ont été gardées témoins et 20 souris ont été traités 24 heures après l'inoculation par la flavoperei- rine à raison de deux fois par jours (2 x 150 g) par voie intrapéritonéale et pendant 10 jours consécutifs. Les résultats du tableau VIII ci-après illustrent la survie des animaux pendant trois mois (une survie de plusieurs jours n'est pas prise en considération). Temps de survie des souris témoins et traitées (tableau VIII) EMI13.1 <tb> Jours <SEP> de <SEP> survie <SEP> Témoins <SEP> Traitées <SEP> par <SEP> la <tb> <SEP> flavopéreirine <tb> <SEP> O <SEP> 10/10 <SEP> 20/20 <tb> <SEP> 24 <SEP> 0/10 <SEP> 17/20 <tb> <SEP> 60 <SEP> 0/10 <SEP> 11/20 <tb> <SEP> 90 <SEP> 0/10 <SEP> 11/20 <tb> Les résultats montrent que la flavopéreirine utilisée seule permet la guérison d'un important pourcentage de souris dont la vie est tout à fait normale et ceci pendant les trois mois d'observation. Les mêmes résultats ont été obtenus lorsque les souris BALB c ont été utilisées dans ce me- me type d'expérience. Par ailleurs, on a étudié l'action anti-virale des alcaloïdes selon l'invention. On a étudié l'activité de la sempervirine vis-à-vis du virus du fibrome de Shope du lapin de la façon suivante : Le stock de virus de fibrome de Shope a été pré paré à partir des testicules de lapins injectés in vivo et conservés sous forme lyophilisée. Le titre a été évalué en inoculant les dilutions de virus par voie intradermique et en observant la grosseur des tumeurs. Des lapins blancs (Australie, Bouska) de 2,5 à 3,5 kg ont eu les deux flancs rasés. Après désin fection de la peau, le virus (10 DI 50 sans 0,2 ml) a été injecté par voie intradermique en 4 points par côté. Le traitement par la sempervirine a toujours été effectué dans les sites du flanc droit, 24 heures après l'inoculation du virus à raison d'une fois par jour et pendant trois jours de suite. Chez les lapins témoins, apparaît au troisième ou quatrième jour, aux sites d'inoculation, une papule qui s'agrandit pour atteindre sa grosseur maximale (diamètre 1-1,5 cm) vers le sixième ou huitième jour. Au dixième jour, on observe un début de nécrose qui sera totale au quinzième jour et la tumeur disparaît progressivement. Chez les lapins dont uniquement les sites d'inoculation du virus du flanc droit ont été traités par la sempervirine, les papules n'apparaissent pas lorsque les doses de 200 Ag à 800 axa par point d'injection ont été administrées. Chez ces mêmes lapins, les papules se développent normalement sur le flanc du lapin, côté non traité. Des expériences préliminaires ont été réalises avec le virus de la vaccine (neurovaccine lyophilisée), titré par inoculation intradermique. Ds petites papules apparaissent 48 heures après inoculation intradermique du virus. La taille des papules n'auamente pas après 4 jours. L'injection de sempervirine (100-400 Ag), 24 heures après l'inoculation dans cette même région se traduit par la non apparition de papules ou apparition de papules dont la tail 12 est considérablement diminuée. La sempervirine est active contre la multiplication de virus du type de celui du fibrome de Shope et de la vaccine. On a étudié l'activité de la flavopéreirine vis-a-vis du virus du fibrome de Shope et de la vaccine du lapin de la façon suivante. Le virus du fibrome de Shope, gardé sous forme lyophilisée, est dilué et son titre évalué en pratiquant des injections intradermiques sur les deux flancs rasés des lapins (lapins blancs d'Australie, Bouska) de 3,0 à 3,5 kg. Le virus a été injecté en quatre points par côté. Le traitement par voie intradermique, par la flavopéreirine a toujours été effectué dans les sites du flanc droit, 24 heures après l'inoculation du virus : une fois par jour et pendant quatre jours de suite. Chez les lapins témoins apparaît au troisième ou quatrième jour, aux sites d'inoculation, une papule qui s'agrandit pour atteindre sa grosseur maximale de 1,5 cm de diamètre vers le huitième jour. Au dixième jour, la nécrose de la tumeur commence et devient totale;vers le quinzième jour : la tumeur n'existe plus. Chez les lapins traités dont uniquement les sites d'inoculation du virus du flanc droit ont été traités par la flavo péreirine,les papules n'apparaissent pas lorsque les doses d2 150-600 Ag par point d'injection ont été quotidiennement administrées. En conclusion, la flavopéreirine (200-600 Eg) administrée par voie intradermique dans la région oû le virus de la vaccinz a été inoculé, empèche l'apparition et le développe m2nt des papules virales et la flavopéreirine est active contre les virus du type de ceux du fibrome de Shope et cie la vaccine. D'autre part, on a étudié ci-après l'activité de la sempervirine, flavopéreirine, alstonine et serpentine, contre le virus de la grippe - Une suspension de stock du virus de la grippe, après dilution convenable est inoculée par voie nasale à 45 souris SWISS de 17-19 g. - Dans le groupe A, 15 souris ont été gardées com me témoins et dans le groupe B, 15 souris ont été traitées dès l'inoculation virale par la semper virine : 200v4g par voie intrapéritonéale, deux fois par jours (soit 400g par jour) et pendant 8 jours consécutifs. - Dans le groupe C, 15 souris ont été traitées 24 heures après l'inoculation virale comme les sou ris du groupe B. Dix jours après l'inoculation, 5 souris de chaque groupe ont été anesthésiées et sacrifiées, et l'on procède à un examen macroscopique de chaque lobe des poumons. Le degré de congestion a été noté de O à 5 croix. Les résultats du tableau XI montrent que chez les témoins, cliniquement malades, la moitié des lobes sont atteints par le virus (congestion) et chez les traitées, apparemment bien portantes, 0 ou 1 lobe par poumon atteint, montrant un très net ralentissement ou même une inhibition notable de la multiplication du virus de la grippe par la sempervirine. Dt:s résultats tout à fait comparables peuvent etre obtenus si au lieu de sempervirine, on utilise à des doses compara bleus soit la flavopéreirine, soit la serpentine, soit l'alstonine. Tableau XI EMI17.1 <tb> Jours <SEP> de <SEP> survie <SEP> Témoins <SEP> Traitées <SEP> par <SEP> la <SEP> sempervirine <tb> <SEP> Groupe <SEP> A <SEP> Groupe <SEP> B <SEP> Groupe <SEP> C <tb> <SEP> O <SEP> 10/10 <SEP> 10/10 <SEP> 10/10 <tb> <SEP> 10 <SEP> 8/10 <SEP> 10/10 <SEP> 10/10 <tb> <SEP> 16 <SEP> 2/10 <SEP> 8/10 <SEP> 6/10 <tb> Les souris témoins sont toutes cliniquement malades. On a étudié la toxicité des ss-carbolines quaternaires objets de l'invention. Par les 4 substances étudiées on a trouvé une DL50 comprise entre 335 et 450 mg par kg chez le rat par voie intrapéritonéale. Chez le chien, la toxicité par voie veineuse (en perfusion) est de l'ordre de 70 à 100 mg par kg et par injection flash de l'ordre de 50 mg par kg pour une dose maximum tolérée de l'ordre de 20 mg par kg, toujours par voie veineuse. Dans les expériences pharmacologiques, chez les souris porteuses de tumeurs (soit l'ascite d'Ehrlich, soit le lymphome YC 8) une dose journalière de serpentine ou alstonine de 400 à 800 Ag par voie intrapéritonéale, est facile- ment tolérée pendant 15 jours successifs. La même tolérance est observée lorsque les mêmes doses sont administrées par injections intramusculaires, ou par voie buccale. I1 faut souligner d'autre part que la serpentine et l'alstonine sont éliminées moins de trois heures après l'injection de 800 Ra par voie intraveineuse. Par contre, dans l'association ss-carboline quaternaire + cyclophosphamide l'alcaloSde n'est éliminé qu'au bout de 18 heures. Chez les souris la destruction des cellules cancéreuses et tumorales est obtenue par administration d'un mélange, préparé, de serpentine, d'alstonine ou flavopéreirine et de cyclophosphamide. L'alstonine, la serpentine, la sempervirine et la flavope- reirine peuvent être utilisées dans le traitement des cancers chez les humains et en particulier dans le traitement des cancers du sein. Ces produits peuvent etre administrés par voie intrapéritonéale, par voie intramusculaire, par voie intraveineuse ou par voie buccale, de préferenc2, en association avec le cyclophosphamide ou d'autres médicamants anticancéreux. Par voie I.M. et I.V. on utilise de préférence une association de 100 mg de -carboline quaternaire et de 10 mg de cyclophosphamide, cette dose administrée une fois par jour, et le traitement pouvant être poursuivi plusieurs mois. Par voie orale, on peut administrer 50 mg de p-carboline quaternaire + 5 mg de cyclophosphamide, une fois par jour, pendant plusieurs mois. Toutefois, on a pu constater au cours des essais cliniques sur l'humain que les p-carbolines quaternaires avaient une demi-vie trop courte pour être administrée sous forme ga génique mais que, de façon surprenante, on obtenait d'excellents résultats dans le traitement des cancers chez les humains en utilisant une nouvelle forme galénique constituée de microgranules à libération prolongée des p-carbolines quaternaires. Ces microgranules comprennent une ame neutre constituée d'un grain excipient inerte par exemple un ou plusieurs constituants tels que le sacchorose, l'amidon, le talc, la silice désséchante, le lactose et l'acide stéarique. le arain neutre étant muni i'une première couche comprenant la p-carboline quaternaire puis d'une seconde couche extérieure constituée par une enveloppe microporeuse comprenant au moins un polymère naturel et/ou synthétique appartenant à la classe constituée par la gomme laque, la acI arabique, la gélatine, l'éthylcellulose, l'acétophtalate d cellulose, le trjacétate de cellulose, le polyoxyéthylèneglycol, les méthacrylates, le copolymère styrèneacrylonitrile et la polyvinylpyrrolidone. EXEMPLE DE PREPARATION DE LA NOUVELLE FORME GALENInUE ()n indique ci-apres l'exemple de fabrication correspondant à 100.000 gélules dosées à 50 mg de p-carboline quaternaire, A) Formule de fabrication . ss-carboline quaternaire .................... 5 kg . Saccharose - amidon - gomme laque - talc - silice désséchante acide stéarique............................. 24,300 kg , Alcool éthylique absolu . q.s. B) Procédé de préparation On granule l'amidon de maïs et du saccharose puis on tamise et on turbine longuement las grains de façon à les rendre parfaitement sphériques. On tamise a nouveau et on sèche parfaitement. Dans un mélangeur en acier inoxydable, on projette sur les a mes neutres ainsi obtenues une solution alcoolique de p-carboline quaternaire. On réalise ensuite la première couche en incorporant à ces microgranules les autres excipients à l'exception de la gomme laque puis on recommence la pulvérisation de carboline quaternaire,cet enrobage étant recommencé plusieurs fois avec tamisage et séchage si nécessaire entre chaque couche. Lorsque la première couche contenant le principe actif est terminée, on réalise la couche extérieure microporeuse, en projetant sur les granules la gomme laque en solution dans l'alcool éthylique absolu. uii sèche soigneusement en éliminant l'alcool éthylique restant, on tamise à nouveau et on contrôle comme ci-après le titre des microgranules obtenus avant de mettre en gélules, après avoir ajusté éventuellement le titrage par addition et homogénéisé avec des microgranules neutre pour arriver au titrage désiré de 50 mg de p-carboline quaternaire. MESURE DE LA LIBERATION DE LA ss-CARBOLINE QUATERNAIRE La caractéristique des pores de l'enveloppe extérieure est choisie de façon à assurer une libération prolongée de p-carboline quaternaire théorique. . lère heure : libération inférieure à 40% 4ème heure : libération inférieure à 75% 8ème heure : libération supérieure à 80% Pour contrôler cette caractéristique, on utilise un appareil à délitement dans lequel on met en contact une quantité de microgranules correspondant a environ 50 mg de principe actif avec des liquides artificiels, l'appareil permettant de maintenir une agitation constante et une température constante de 37 C + 5 C. Les liquides artificiels sont des solutions tamponnées à pH successifs utilisées selon le schéma ci- dessous Solutions Temps de pH Résultats libération Théoriques Réels 25 ml liquide 1 heure 1,5 < 40% 25% gastrique (lère heure) 25 ml liquide 1 heure 4,5 > 40% 41% intestinal (2ème heure) 25 ml liquide 2 heures 6,9 < 75% 64% intestinal (3ème et 4ème heures) 25 ml liquide 2 heures 6,9 > 75% 78% intestinal (5ème et 6ème heures) 25 ml liquide 2 heures 7,2 > 80% 91% intestinal (7ème et 8ème heures) Mis sous forme de microgranules, à libération prolongée, on n'a pas pu déterminer de DL50 chez le rat de sorte puisque aucune toxicité n' était à craindre des ss-carbolines objets de l'invention, sauf à des doses très élevées, on a pu procéder à des essais cliniques selon des doses journa lires pour une administration par voie orale comprise ritre 2 et 500 mg et de préférence entre 50 et 200 mg et plus précisément 100 mq par jour. A titre d'exemple, on a reproduit ci-après trois cas significatifs relatifs à des cancers du sein et pour lesquels on a utilisée la serpentine préparéeselon la nouvelle forme galénique objet de l'invention décrite ci-dessus. 1. Madame M. a un cancer du sein gauche d'apparition récente et un squirrhe datant De plus de deux ans du sein droit. En milieu hospitalier, on commence des irradiations préopératoires avec un pronostic pessimiste de trois mois de survie. Le traitement par la serpentine commence après irradiation à raison de 100mg en microgranules par jour per os en deux prises, l'une le matin, l'autre le soir. Un mois après, on constate une régression des deux tumeurs et devant le résultat, l'hôpital sursoit l'opération. Le traitement a la serpentine est poursuivi pendant 6 mois au cours desquels progressivement la tumeur du sein diminue et disparaît alors que le squirrhe lui-même régresse considérablement. Après ces six mois, le traitement est poursuivi de façon réduite six autres mois ( un mois sur deux). Depuis lors, la malade se porte bien. I1 reste une cicatrice souple du squirrhe mais plus aucune masse suspecte ni à droite ni à gauche. 2. On découvre chez Madame P. une tumeur du sein gauche cliniquement et radiologiquement maligne, confirmée par une ponction biopsique On instaure une thérapeutique radiothérapique dans un but opératoire, le chirurgien ayant décide l'amputation large du sein. Mais la malade refusa l'intervention et n'accepte qu'uns exèrèse localisée de la tumeur palpable. C'lest alors que Madame P. commence le traitement à la serpentine en microgranules durant trois mois à la dose de 100 mq par jour en deux prises matin et soir per os. Au cours de ces trois mois, la douleur qui persistait après l'intervention disparaît progressivement et le sein prend un aspect normal et indolore. Tous les trois mois, elle a eu 15 jours de traitement par la serpentine pendant un an. Depuis lors, sans traitement, la malade se porte parfaitement bien. Ses examens de sang sont normaux. Elle a subi une intervention pour la surdité sans aucune complication. Par ailleurs, elle continue sa vie professionnelle normalement. 3. Madame L., opérée dix ans auparavant d'un cancer du sein, fait une sciatique, qui se révèle être secondaire et la métastase sacrée. Malgré la radiothérapie et traitement chimiothérapique, des métastases osseuses multiples apparaissent à. la colonne vertébrale , au fémur, au calcaneum droit, aux côtes, à l'humérus gauche. Une fracture spontanée du col du fémur apparaît. C'est alors qu'est instauré un traitement à la serpentine en microgranules à libération prolongée. La fracture du col du fémur se consolide ainsi que disparait la métastase calcanéenne, ce qui permet après 6 mois de traitement à la malade de remarcher. Les autres métastases osseuses sont enrayées tandis qu'avec la serpentine est continué un traitement à l'endoxan et au méthotréxate, grâce à un produit nouveau leucostimulant. Aucune métastase organique n'est constateeJmais une métastase cranienne apparaît provoquant des crises d'épilepsie Bravaus-jacksonienne au cours desquelles la malade meurt. Les trois cas ci-dessus cités à titre d'exemple ont été soumis à un traitement à la serpentine. Les deux premiers ont abouti à une guérison clinique et la troisième a permis de stopper une évolution suraigue des métastases, d'aboutir à une consolidation de fractures et à une survie. Des essais comparables ont été menés avec les autres carbolines montrant des actions comparables sur les cellu- les tumorales, cancéreuses et virales (virus à ADN ou à ARN) aussi bien par voie orale, intraveineuse, intramusculaire ou intrapéritonéale. On peut donc conclure à une identité de nature d'action pour les produits objets de la présente invention. TABLEAU I Action de la serpentine, de l'alstonine de la sempervirine et de la flavopéreirine sur les cellules en culture, provenant de tissus sains et de tissus cancéreux. EMI24.1 Sur <SEP> cellules <SEP> normales <tb> Cellules <SEP> primaires <SEP> en <SEP> culture <SEP> de <SEP> 7 <SEP> jours <SEP> + <SEP> 200 <SEP> <SEP> g <SEP> de <SEP> serpentine/ml, <SEP> ou <SEP> Pas <SEP> de <SEP> destruction <tb> de <SEP> reins <SEP> de <SEP> singe <SEP> dès <SEP> l'ensemencement <SEP> alstonine <SEP> ou <SEP> sempervirine <SEP> ou <SEP> pendant <SEP> 8 <SEP> jours <tb> <SEP> flavopéreirine <tb> Cellules <SEP> "Vero" <SEP> en <SEP> culture <SEP> de <SEP> 3 <SEP> jours <tb> (cellules <SEP> de <SEP> lignée) <SEP> dès <SEP> l'ensemencement <SEP> " <SEP> " <tb> Cellules <SEP> "SIRC" <SEP> en <SEP> culture <SEP> de <SEP> 3 <SEP> à <SEP> 5 <tb> (cellules <SEP> de <SEP> lignée) <SEP> jours <SEP> dès <SEP> l'ansemence <SEP> ment <SEP> " <SEP> " <tb> Sur <SEP> cellules <SEP> cancéreuses <tb> Cellules <SEP> K.B. <SEP> en <SEP> culture <SEP> de <SEP> 3 <SEP> jours <SEP> + <SEP> 200 <SEP> <SEP> g <SEP> de <SEP> serpentine/ml, <SEP> ou <SEP> Destruction <SEP> totale <tb> dès <SEP> l'ensemencement <SEP> alstonine <SEP> ou <SEP> sempervirine <SEP> ou <SEP> en <SEP> 24-48 <SEP> heures <tb> <SEP> flavopéreirine <tb> Cellules <SEP> Hela <SEP> en <SEP> culture <SEP> de <SEP> 3 <SEP> jours <SEP> " <SEP> " <tb> <SEP> dès <SEP> l'ensemencement <SEP> " <SEP> " <tb> Cellules <SEP> Hep <SEP> II <SEP> en <SEP> culture <SEP> de <SEP> 3 <SEP> jours <SEP> " <SEP> " <tb> <SEP> dès <SEP> l'ensemencement <SEP> " <SEP> " <tb> Cellules <SEP> L <SEP> en <SEP> culture <SEP> de <SEP> 3 <SEP> jours <tb> <SEP> dès <SEP> l'ensemencement <SEP> " <SEP> " <tb> Ne@i@oblast@@@ <SEP> tumeurs <SEP> humaines <tb> Ne@roblasto@@ <SEP> @n <SEP> culture <tb> Tér@@ome <SEP> @@@@ire <SEP> " <SEP> " <tb>

Claims: Revendications 1. Compositions pharmaceutiques à action préférentielle sur la réplication des ADN et la synthèse des ARN des cellules tumorales, cancéreuses et virales,caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un alcaloïde appartenant au groupe des p-carbolines quaternaires du type serpentine, alstonine, sempervirine et flavopéreirine. 2. Compositions pharmaceutiques selon la revendication 1, caractérisées en ce que les p-carbolines quaternaires sont utilisées sous forme galénique à libération prolongée à raison de 2 mg à 500 mg par prise. 3. Compositions pharmaceutiques selon la revendication 2, caractérisées en ce que la forme galénique utilisée consiste en microgranules comportant une ame neutre, au moins une première couche comprenant lesdites ss-carbolines quaternaires puis au moins une seconde couche extérieure constituée par une enveloppa microporeuse comprenant au moins un polymère nature et/ou synthétique du type gomme laque, gomme arabique, gélatine, cellulose, éthyl cellulose, acéto- phtalate de cellulose, triacétate de cellulose, polyvinylprr- rolidone, polyoxyéthylèneglycol, méthacrylates et copolymrres styrène- acrylonitrile. 4. Compositions selon l'une quelconque des revendications i à 3, utiles comme agents anti-tumoraux, caractérisées en ce qu'elles sont associées avec au moins une substances an @@ tumorale classique du type cyclophosphamide selon un pr portion comprise entre 1 et 2 parties en poids pour 10 parties en poids de p-carboline quaternaire. 5. Compositions selon la revandication 1, caracterises n co qu elles se présentent sous forme de comprimés, crnrlulcjs, S"! positoires, sirops, granulés, poudres, solutions ou su@ sions injectables par voie intraveineuse, intramusculaire ou intrapéritonéale. Revendications EMI26.1 1. Compositions pharmaceutiques à action préférentielle sur la réplication des ADN et la synthèse des ARN des cellules tumorales, cancéreuses et virales, caractérisées en ce qu'elles sont constituées de microgranules comportant une ame neutre au moins une première couche intermédiaire comprenant au moins un alcaloïde appartenant au groupe des ,l3 -carbolines quaternaires du type serpentine, alstonine et flavopéréirine puis au moins une couche extérieure constituée par une enveloppe microporeuse comprenant au moins un polymère nature et/ou synthétique du type gomme laque, gomme arabique, gélatine, cellulose, éthyl cellulose, acétophtalate de cellulose, triacêtate de cellulose, polyvinylpyrrolidone, polyoxyéthylène glycol, méthacrylates et copolymères styrène acrylonitrile. 2. Compositions pharmaceutiques selon la revendication 1, caractérisées en ce que les 13-carbolines quaternaires sont utilisées sous forme galénique à libération prolongée à raison de 2 mg à 500 mg par prise. 3. Compositions selon une des revendications 1 ou 2, utiles comme agents anti-tumoraux, caractérisées en ce qu'elles sont associées avec au moins une substance anti-tumorale classique du type cyclophosphamide selon une proportion comprise entre 1 et 2 parties en poids pour 10 parties en poids de ss -carboline quaternaire. 4. Compositions selon la revendication 3, caractérisées en ce que la substance anti-tumorale du type cyclophosphamide est contenue dans une couche intermédiaire à chaque micro granule comprise entre I'ame neutre et ladite couche extérieure.

Inventors: BELJANSKI, MIRKO, BUGIEL, JEAN
Applicants: BELJANSKI, MIRKO, BUGIEL, JEAN
Application year: 1981
Main classification: A61K9
IPC codes: A61K9, A61K31