FLUORESCENT REAGENT AND IMMUNOFLUORESCENT DETERMINATION METHOD

Abstract: 1. Fluorescent diagnostic reagent, containing a compound consisting of a) a hydrophobic hapten, b) a hydrophilic compound and c) a hydrophobic fluorescent compound based on fluoresceine, umbelliferone or fluorescamine, whilst both the hydrophobic hapten and also the hydrophobic fluorescent compound are bonded to the hydrophilic compound separately from each other, characterised in that the hydrophilic compound is an aminoglycoside of general formula see diagramm : EP0047459,P10,F1 wherein : R1 represents =C or -CH ; R2 represents -CH2 OH, -CH2 NH2 , -CH2 NHCH3 , see diagramm : EP0047459,P10,F2 or see diagramm : EP0047459,P10,F3 R3 represents =C or -CH ; R4 , R5 and R9 represent -H or -OH ; R6 represents -OH or -NH2 ; R7 represents -NH2 , -NHCH2 CH3 or -NH-COCH(OH)CH2 CH2 NH2 ; R8 represents -H or -CH2 OH ; R10 represents -OH or -CH3 and R11 represents -NH2 or -NHCH3 .

Description: Die Erfindung betrifft ein verbessertes fluoreszierendes Reagenz und eine Immunofluoreszenz-Bestimmungsmethode. Bei den bekannten Immunofluoreszenz-Bestimmungsmethoden an festen Oberflächen wird der zu analysierende Körper, beispielsweise ein Hapten, mit einem fluoreszierenden Bestandteil markiert und in Konkurrenz mit einem unmarkierten Hapten durch Adsorption oder in anderer Weise an einer Oberfläche fixiert (Tsay et al., Quantitation of Serum Gentamicin Concentration by a Solid Phase Immunofluorescence Method", Clin. Chem., Vol. 26 (1980)). Beim Eintauchen dieser Oberfläche, an die eine bestimmte Menge eines Antikörpers gebunden ist, in eine Serumprobe, wird eine der Bindungsmöglichkeit des Antikörpers entsprechende begrenzte Menge an markiertem und unmarkiertem Hapten immunologisch gebunden. Nach dem Herausnehmen der Oberfläche aus dem Serum wird mit Hilfe eines Präzisionsfluorometers die Hapten-Antigen-Konzentration im Serum bzw. Blut gemessen. Als Präzisionsfluorometer eignet sich das FIAXSystem 100, und zwar sowohl für qualitative als auch für quantitative Messungen. Die Immunofluoreszenz-Bestimmung an einer festen Oberfläche ist eine schnelle, einfache und vergleichsweise genaue Methode zur quantitativen Bestimmung des zu analysiernden Körpers. Sie besitzt jedoch wenigstens drei schwerwiegende Nachteile, nämlich nichtspezifische Bindungen an der Oberfläche, verminderte Antigenität und nicht spezifische Bindung mit anderen Serumbestandteilen und die hierdurch bedingte Fluoreszenzlöschung. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Überwindung dieser Nachteile. Es ist anzunehmen, dass die hohe Anzahl der nichtspezifischen Bindungen des markierten Haptens an der Ober fläche im wesentlichen auf hydrophobe Wechselwirkungen zwischen der festen Oberfläche und dem fluoreszenzmarkkierten Hapten-Komplex zurückzuführen ist. Wenn beispielsweise die fluoreszierende Verbindung oder die Markierung Fluoresceinisothiocyanat und das Hapten Diphenylhydantoin sind, so ist der fluoreszenzmarkierte Hapten-Komplex hydrophob. Bei einer Reihe von üblichen Oberflächen auf Cellulose-Basis wird der fluoreszenzmarkierte Komplex nicht nur spezifisch am Antikörper, sondern unspezifisch an der gesamten festen Oberfläche gebunden. Das Problem der niedrigen oder verminderten Antigenität des fluoreszenzmarkierten Hapten-Komplexes ist aller Wahrscheinlichkeit nach auf die sterische Hinderung zwischen dem Hapten und dem Fluoreszenzmolekülteil zurückzuführen. Beim fluoreszenzmarkierten Komplex vermindert die Nähe des hydrophoben Fluoreszenzmolekülteiles die Antikörper-Hapten-Annäherung. Ausserdem bedingt dies die starke Bindung des Komplexes an Albumin oder andere Serumbestandteile. Die Folge hiervon ist ein vermindertes Fluoreszenzsignal, bekannt auch als 11Fluoreszenzlöschung". Die genannten Probleme dürften auf die räumliche Nähe der Fluoreszenzverbindung und des Haptenmolekülteiles im Komplexmolekül zurückzuführen sein. Der hydrophobe Charakter der beiden Molekülteile verstärkt die Probleme. Es wurde nunmehr gefunden, dass die genannten Nachteile überwunden werden, wenn zwischen die beiden obengenannten Molekülteile ein hydrophiles Zwischenglied ("spacer") eingebaut wird. Hierdurch erzielt man ein verbessertes fluoreszierendes Reagenz und eine verbesserte Immunofluoreszenz-Bestimmungsmethode. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es demzufolge, die nichtspezifische Bindung zwischen dem fluoreszenzmarkierten Hapten-Komplex und der festen Oberfläche durch Einbau eines hydrophilen Zwischengliedes in den markierten Komplex stark zu vermindern. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Er- höhung der Antigenität des fluoreszenzmarkierten Haptens. Ferner ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Fluoreszenzlöschung des fluoreszenzmarkierten Haptens durch Albumin oder andere Serumbestandteile zu vermindern. Gegenstand der Erfindung ist ein fluoreszierendes diagnostisches Reagenz, enthaltend eine Verbindung aus a) einem hydrophoben Hapten, b) einer hydrophilen Verbindung aus der Klasse der Aminoglykoside, der Peptide, der Proteine oder der Polyacrylamidhydrazine und c) einer hydrophoben fluoresziernden Verbindung auf Basis von Fluorescein, Umbelliferon oder Flu orescamin, wobei sowohl das hydrophobe Hapten als auch die hydrophobe fluoreszierende Verbindung voneinander getrennt an die hydrophile Verbindung gebunden sind. Die Erfindung ist bezüglich des Haptens praktisch unbeschränkt anwendbar. Die einzige Voraussetzung besteht lediglich darin, dass das Hapten ein hydrophobes Molekül ist und entweder bereits eine funktionelle Molekülgruppe für die Bindung des hydrophilen Zwischengliedes besitzt oder durch Modifizierung mit einer derartigen Molekülgruppe ausgestattet werden kann. Hierbei handelt es sich um dieselben funktionellen Gruppen, die üblicherweise bei der Verknüpfung des Haptens mit der Fluoreszenzmarkierung verwendet werden, nämlich beispielsweise um Alkohol-, Äther-, Ester-, Amid-, Halogen-, Nitrilound Mercaptogruppen, speziell um Amino- und Carboxylgruppen. Es bestehen vielfältige Möglichkeiten, für das jeweils zu analysierende Hapten eine geeignete funktionelle Gruppe auszusuchen und diese entweder nachträglich oder bereits bei der Synthese des Haptens ein zubauen. Im Falle der Haptene Phenobarbital, Diphenylhydantoin und Primidon haben sich beispielsweise die Aminogruppe und Carboxylgruppen wie Methylcarboxymethyl-, Methylcarboxybutyl-, Carboxymethyl- und Carboxybutylgruppen bewährt. Die Erfindung ist insbesondere bei der Bestimmung von Antikonvulsiva wie beispielsweise Phenobarbital, Diphenylhydantoin und Primidon anwendbar. Diese Arzneimittel werden bei chronischen Krankheiten des Nervensystems, z.B. Epilepsie, verwendet. Da es bei einem Pharmakon in vielen Fällen von seiner Konzentration im Serum abhängt, ob es als Arzneimittel oder als Gift wirkt, ist seine genaue Konzentrationsbestimmung im Serum sehr wichtig. Mit Hilfe des erfindungsgemässen Reagenzes und der erfindungsgemässen Immunofluoreszenz-Bestimmung ist es möglich, diese Serumbestimmung durchzuführen. Als hydrophiles Zwischenglied stehen aus der Klasse der Aminoglykoside, der Peptide, der Proteine und der Polyacrylamidhydrazine zahlreiche Verbindungen zur Verfügung. Diese hydrophilen Verbindungen haben wenigstens zwei reaktive Molekalstellen, welche sowohl das Hapten als auch die Fluoreszenzmarkierung zu binden vermögen. Vorzugsweise werden als hydrophiles Zwischenglied ein Aminoglykosid-Antibioticum eingesetzt, insbesondere Gentamycine, Tobramycin, Amikacin, Sisomicin, Netilmicin und Kanamycine. Bevorzugte Aminoglykoside, welche als hydrophiles Zwischenglied Verwendung finden können, besitzen die folgende allgemeine Formel: EMI5.1 in welcher bedeuten: R1: =C oder -CH; R2: -CH20H, -CH2NH2, -CH2NHCH3, EMI5.2 oder EMI5.3 R3: =C oder -CH; R4, R5 und R9: -H oder -OH R6: -OH oder -NH2 R7: -NH2, -NHCH2CH3 oder -NH-COC(OH)CH2CH2NH2 R8 -H oder -CH2OH Rlo: -OH oder -CH3 und R11: -NH2 oder -NHCH3 Beispiele hierfUr sind in Tabelle I zusammengestellt. T a b e l l e I AMINOGLYKOSIDE Nr. Substituenten EMI6.1 <SEP> R1 <SEP> R2 <SEP> R3 <SEP> R4 <SEP> R5 <SEP> R6 <SEP> R7 <SEP> R8 <SEP> R9 <SEP> R10 <SEP> R11 <tb> 1. <SEP> -CH <SEP> -CH2OH <SEP> -CH <SEP> -OH <SEP> -OH <SEP> -NH2 <SEP> -NH2 <SEP> -H <SEP> -H <SEP> -OH <SEP> -NHCH3 <tb> 2. <SEP> -CH <SEP> -CH2NH2 <SEP> -CH <SEP> -H <SEP> -H <SEP> -NH2 <SEP> -NH2 <SEP> -H <SEP> -OH <SEP> -CH3 <SEP> -NHCH3 <tb> 3. <SEP> -CH <SEP> CH3 <tb> <SEP> -CHNHCH3 <SEP> -CH <SEP> -H <SEP> -H <SEP> -NH2 <SEP> -NH2 <SEP> -H <SEP> -OH <SEP> -CH3 <SEP> -NHCH3 <tb> 4. <SEP> CH3 <tb> <SEP> -CH <SEP> -CHNH2 <SEP> -CH <SEP> -H <SEP> -H <SEP> -NH2 <SEP> -NH2 <SEP> -H <SEP> -OH <SEP> -CH3 <SEP> -NHCH3 <tb> 5. <SEP> -CH <SEP> -CH2NH2 <SEP> -CH <SEP> -OH <SEP> -H <SEP> -NH2 <SEP> -NH2 <SEP> -CH2OH <SEP> -H <SEP> -OH <SEP> -NH2 <tb> <SEP> -NHCOCOH6. <SEP> -CH <SEP> -CH2NH2 <SEP> -CH <SEP> -OH <SEP> -OH <SEP> -OH <SEP> CH2CH2NH2 <SEP> -CH2OH <SEP> -H <SEP> -OH <SEP> -NH2 <tb> 7. <SEP> =C <SEP> -CH2NH2 <SEP> =C <SEP> -H <SEP> -H <SEP> -NH2 <SEP> -NH2 <SEP> -H <SEP> -OH <SEP> -CH3 <SEP> -NHCH3 <tb> 8. <SEP> =C <SEP> -CH2NH2 <SEP> =C <SEP> -H <SEP> -OH <SEP> -OH <SEP> -NHCH2CH3 <SEP> -CH2OH <SEP> -H <SEP> -OH <SEP> -NH2 <tb> 9. <SEP> -CH <SEP> -CH2NH2 <SEP> -CH <SEP> -OH <SEP> -OH <SEP> -OH <SEP> -NH2 <SEP> -CH2OH <SEP> -H <SEP> -OH <SEP> -NH2 <tb> 10. <SEP> -CH <SEP> -CH2NH2 <SEP> -CH <SEP> -OH <SEP> -OH <SEP> -NH2 <SEP> -NH2 <SEP> -CH2OH <SEP> -H <SEP> -OH <SEP> -NH2 <tb> 11. <SEP> -CH <SEP> -CH2OH <SEP> -CH <SEP> -OH <SEP> -OH <SEP> -NH2 <SEP> -NH2 <SEP> -CH2OH <SEP> -H <SEP> -OH <SEP> -NH2 <tb> 12. <SEP> -CH <SEP> -CH2NHCH3 <SEP> -CH <SEP> -H <SEP> -H <SEP> -NH2 <SEP> -NH2 <SEP> -H <SEP> -OH <SEP> -CH3 <SEP> -NHCH3 <tb> Die Bezeichnungen der in Tabelle I dargestellten Verbindungen werden in Tabelle II angegeben. T a b e l l e II Bezeichnung der in Tabelle I angegebenen Aminoglykoside. Nr. der Verbindungen in Tabelle 1 Bezeichnung 1 Gentamicin A 2 Gentamicin C1 a 3 Gentamicin* C1 4 Gentamicin* C2 5 Tobramicin 6 Amikacin 7 Sisomic in 8 Netilmicin 9 Kanamvcin A 10 Kanamycin B 11 Kanamvcin C 12 Sagamicin Gentamicin C ist ein Gemisch aus gleichen Teilen der unter Nr. 2 bis 4 genannten Isomeren. Die hydrophobe fluoreszierende Verbindung kann aus der Vielzahl der bekannten fluoreszierenden Reagentien ausgewählt werden, insbesondere aus den für die Fluoreszenzmarkierung üblichen Verbindungen. Beispiele geeigneter Verbindungen sind die.Derivate des Fluoresceins, des Umbelliferons und des Fluorescamins. Besonders bevorzugt sind 5-Jodacetyl-aminofluorescein, 5-Aminofluorescein, Fluoresceinisothiocyanat, 5-Dichlortriazinyl-aminofluorescein und Rhodaminisothiocyanat. Fluoresceinisothiocyanat (R= -NCS) und 5-Aminofluorescein (R= -NH2) besitzen die folgende Struktur: EMI8.1 Vorzugsweise besitzt die hydrophobe fluoreszierende Verbindung nur eine reaktive Molekurstelle, da im Falle mehrerer reaktiver Molekülstellen die Tendenz besteht, dass die quantitative Messung des zu analysierenden Haptens weniger genau ist. Das erfindungsgemässe fluoreszierende diagnostische Reagenz wird üblicherweise hergestellt, indem man zunächst das hydrophobe Hapten in der Form eines reaktiven Derivates mit der hydrophilen Verbindung umsetzt und dann das Reaktionsprodukt mit der fluoreszierenden Verbindung zur Reaktion bringt um letztere an das hydrophile Zwischenglied zu binden. Die Reaktionspartner werden im Molverhältnis von 1 : 1 : 1 zur Reaktion gebracht. Die Herstellung des Reagenzes erfolgt analog der bei der Synthese von fluoreszenzmarkierten Haptenen üblichen Weise und ergibt sich auch im einzelnen aus den Ausführungs- beispielen. Bevorzugte erfindungsgemässe fluoreszierende Reagentien sind Verbindungen aus den oben genannten Aminoglykosiden der angegebenen allgemeinen Formel und 5-Aminofluorescein oder Fluoresceinisothiocyanat und einem Antikonvulsivum, insbesondere Diphenylhydantoin, Phenobarbital oder Primidon. Besonders bevorzugt sind die Verbindungen aus einem Antikonvulsivum,speziell Diphenylhydantoin, Fluoresceinisothiocyanat und Gentamicin sowie Verbindungen aus einem Antikonvulsivum, insbesondere Phenobarbital, Tobramycin und Fluoresceinisothiocyanat. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Immunofluoreszenz-Bestimmungsmethode für Hapten-Antigene, die dadurch gekennzeichnet ist, dass man ein Reagenz verwendet, enthaltend eine Verbindung aus a) einem hydrophoben Hapten, b) einer hydrophilen Verbindung aus der Klasse der Aminoglykoside, der Peptide, der Proteine oder der Polyacrylamidhydrazine und c) einer hydrophoben fluoreszierenden Verbindung auf Basis von Fluorescein, Umbelliferon oder Fluorescamin, wobei sowohl das Hapten als auch die hydrophobe fluoreszierende Verbindung voneinander getrennt an die hydrophile Verbindung gebunden sind. Bevorzugt wird die Immunofluoreszenz-Bestimmungsmethode, bei welcher die Verbindung aus einem Aminoglykosid der oben.angegebenen allgemeinen Formel erhalten wurde. Nach weiteren bevorzugten Bestimmungsmethoden ist die im Reagenz enthaltene Verbindung aus dem obengenannten Aminoglykosid und 5-Aminofluorescein oder Fluoresceinisothiocyanat hergestellt, speziell aus einem Antikonvulsivumals Hapten, insbesondere aus Diphenylhy- dantoin, Phenobarbital oder Primidon. Nach einer besonders bevorzugten Bestimmungsmethode ist die im Reagenz enthaltene Verbindung aus einem Antikonvulsivum, speziell Diphenylhydantoin sowie Fluoresceinisothiocyanat und Gentamicin oder aus einem Antikonvulsivum als Hapten, insbesondere Phenobarbital, Tobramicin und Fluoresoeinisothiocyanat synthetisiert worden. Beispiel Ein fluoreszierendes diagnostisches Reagenz aus Diphenylhydantoin (DPH) als Hapten, Gentamicin als hydrophiler Verbindung und Fluoresceinisothiocyanat als fluoreszierenderVerbindung wurde in folgender Weise hergestellt. Herstellung des Diphenylhydantoin-Gentamicin-Derivates: Zu der Lösung eines Carbonsäurederivates aus 0,5 mMol Diphenylhydantoin und O,5 mMol N-Hydroxysuccinimid (NHS) in einem Milliliter wasserfreiem Dimethylformamid wurden 0,75 mMol Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) hinzugefügt. Anschliessend wurde das Gemisch noch eine Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt und unter Rühren über Nacht im Kühlschrank gekühlt. Nach dem Abfiltrieren eines weissen Niederschlages wurde das Filtrat langsam zu der Lösung von 600 mg Gentamicin in 5 ml eines 0,01 molaren Carbonatpuffers mit einem pH von 9.0 zugefügt. Unter Gentamicin wird ein Gemisch aus den in Tabelle 1 unter den Nummern 2, 3 und 4 genannten Verbindungen verstanden. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wurde überwacht und konstant auf dem Wert 9.0 gehalten. Danach wurde das Reaktionsgemisch unter Rühren über Nacht im Kühlschrank gekühlt und anschliessend bei 3000 Umdrehungen pro Minute 10 Minuten lang zentrifugiert. Der Uberstand wurde unter Verwendung von Silicagel beschichteten Platten gereinigt, wobei dreimal mit einem Methanol-Chloroform Gemisch im Verhältnis von 10 : 7 und einmal mit einem ammoniakalischen Methanol-Chloroform-Gemisch (Methanol Chloroform : 5 n NH40H = 2 : 1 : 1) eluiert wurde. Die UV-positive Zone, welche erst beim Eluieren mit dem Methanol-Chloroform-5nNH40H-Gemisch wanderte, wurde abgetrennt und mit einem Gemisch aus Methanol-Chloroform-5nNH40H extrahiert. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wurde das Diphenylhydantoin-Gentamicin als Rückstand erhalten. Herstellung des Diphenylhydantoin-Gentamicin-Fluoresceinisothiocyanat-Derivates: Die Synthese erfolgt analog der Herstellung des Di phenylhydanto in-Gentamicin-Derivates. Das in der oben beschriebenen Weise erhaltene Diphenylhydantoin-Gentamicin-Derivat wurde in 2 ml eines 0,01 molaren Carbonatpuffers (pH 9.0) gelöst und portionsweise mit einer äquimolaren Menge Fluoresceinisothiocyanat versetzt. Danach wurde das Reaktionsgemisch unter Ausschluss von Licht bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Danach war die Reaktion beendet. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt. Der Uberstand wurde unter Verwendung Silicagel beschichteter Platten gereinigt, wobei das Eluieren in der oben beschriebenen Weise erfolgte. Die fluoreszierende Zone wurde abgetrennt und mit einem Gemisch aus Methanol : Chloroform : 5nNH40H extrahiert. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der feste Rückstand in destilliertem Wasser, dem ein Tropfen konzentriertes Ammoniak zugesetzt worden war, aufgenommen. In der Tabelle III werden die Wasserlöslichkeiten der Haptene Phenobarbital und Diphenylhydantoin in unver änderter Form, in modifizierter Form (carboxyliert bzw. aminiert) und in der sogenannten konjugierten Form, nämlich als Umsetzungsprodukt mit Gentamicin gegenübergestellt. Hieraus ergibt sich, dass die Haptene in unver änderter und in modifizierter Form hydrophob sind (Die Unlöslichkeit in Wasser ist ein Mass für die Hydrophobie einer Verbindung). Mit steigender Unlöslichkeit der Verbindungen in Wasser steigt die Hydrophobie und die Wahrscheinlichkeit, dass sie an die Oberfläche gebunden werden, wobei durch die unspezifischen Bindungen grosse Ungenauigkeiten in der Immunofluoreszenz Bestimmungsmethode verursacht werden. Wie aus der Tabelle III weiterhin ersichtlich, erhält man ein lösliches, d.h. hydrophiles Produkt, wenn man ein hydrophobes Hapten wie Phenobarbital oder Diphenylhydantoin mit einer hydrophilen Verbindung wie Gentamicin verbindet. Derartige Produkte werden nicht als solche an die feste Oberfläche gebunden. T a b e l l e III Vergleich der Wasserlöslichkeiten EMI13.1 <tb> <SEP> Unmodi- <SEP> Modifiziertes <SEP> Carboxylierte <SEP> <tb> <SEP> fiziertes <SEP> Hapten <SEP> und <SEP> mit <SEP> Genta <SEP> <tb> <SEP> Hapten <SEP> Carboxyliert <SEP> micin <SEP> umges. <SEP> <tb> Produkt <tb> Phenobar- <SEP> unlöslich <SEP> unlöslich <SEP> unlöslich <SEP> löslich <tb> bital <tb> Diphenyl- <SEP> unlöslich <SEP> unlöslich <SEP> unlöslich <SEP> löslich <tb> hydantoin <tb> Die carboxylierten Verbindungen sind entweder ein Methylcarboxymethyl-, ein Methylcarboxybutyl-, ein Carboxymethyl- oder ein Carboxybutylderivat. Da die üblichen Fluoreszenzreagentien hydrophob sind, lagern sich Albumin und andere Serumproteine an sie an und verhindern oder vermindern deren Fähigkeit zur Fluoreszenz, wenn sie bei der Immunofluoreszenz-Bestimmung dem Anregungsstrahl ausgesetzt werden. In der Tabelle IV wird der fluoreszenzlöschende Effekt von Albumin am Beispiel zweier Fluoreszenz-Reagentien, nämlich des Fluoresceinisothiocyanats und des 5-Aminofluoresceins dargestellt, und zwar am unveränderten Fluoreszenz-Reagenz, am Umsetzungsproduktmit dem Hapten sowie am erfindungsgemssen, aus Hapten fluoreszierender Verbindung und einer hydrophilen Verbindung erhaltenem Reagenz (Hapten-Gentamicin-Konougat). T a b e 1 1 e IV Fluoreszenzlöschung durch Albumin EMI14.1 <tb> Fluoreszierende <SEP> unveränderte <SEP> Umsetzungs- <SEP> Hapten <tb> Verbindung <SEP> fluor.Verb. <SEP> produkt <SEP> mit <SEP> Gentamicin <tb> <SEP> dem <SEP> Hapten <SEP> Konjugat <tb> Fluorescein- <SEP> ja <SEP> ja <SEP> nein <tb> isothincyanat <SEP> <tb> Aminofluoresce <SEP> ja <SEP> ja <SEP> nein <tb> Die nachstehende Tabelle V belegt die verbesserte Antigenität des Haptens, welches einen Bestandteil des erfindungsgemässen fluoreszierenden Reagenzes bildet. Wenn man beispielsweise das Hapten Diphenylhydantoin nur mit der hydrophoben fluoreszierenden Verbindung kombiniert, so ist seine Antigenität, das ist die Fähigkeit, sich mit dem korrespondierenden Antikörper zu verbinden, beträchtlich vermindert; wenn jedoch erfindungsgemäss zusätzlich eine hydrophile Verbindung wie z.B. das Gentamicin eingebaut wird, ist die Antigenität höher als bei dem Reaktionsprodukt aus Hapten und der fluoreszierenden Verbindung oder ist ebenso hoch wie die des reinen Haptens. T a b e l l e V Antigenität von Diphenylhydantoin (DPH) bezogen auf DPH in % EMI16.1 Unmodi- <SEP> Reaktionsprodukt <SEP> des <SEP> Reaktionsprodukt <SEP> des <SEP> DPH <SEP> mit <tb> fiziertes <SEP> DPH <SEP> mit <SEP> einer <SEP> Gentamicin <SEP> und <SEP> einer <SEP> fluoreszierenden <tb> <SEP> DPH <SEP> fluoreszierenden <SEP> Verbindung <tb> <SEP> Verbindung <tb> <SEP> * <SEP> * <SEP> * <tb> <SEP> Carboxy- <SEP> N-Aminopropyl- <SEP> Carboxy- <SEP> Carboxy- <SEP> Carboxy- <SEP> Carboxy <SEP> methyl- <SEP> diphenylhydantoin <SEP> propyl- <SEP> propyl- <SEP> propyl- <SEP> butyl <SEP> diphenyl- <SEP> fluoresceinisothio- <SEP> diphenyl- <SEP> diphenyl- <SEP> diphenyl- <SEP> diphenyl <SEP> hydantoin- <SEP> cyanat <SEP> hydantoin- <SEP> hydantoin- <SEP> hydantoin- <SEP> hydantoin <SEP> amino- <SEP> gentamicin- <SEP> gentamicin- <SEP> gentamicin- <SEP> gentamicin <SEP> fluorescein <SEP> fluorescein- <SEP> fluorescein- <SEP> fluorescein- <SEP> fluorescein <SEP> isothio- <SEP> isothio- <SEP> isothio- <SEP> isothio <SEP> cyanat <SEP> cyanat <SEP> cyanat <SEP> cyanat <tb> 100 <SEP> 17 <SEP> 30 <SEP> 100 <SEP> 101 <SEP> 58 <SEP> 150 <tb> *Es wurden drei verschiedene Verbindungen abgetrennt, sie entsprechen den in Tabelle I aufgeführten Gentamicin-Isomeren. Aus dem Ausführungsbeispiel wird ersichtlich, dass der Einbau einer hydrophilen Verbindung alle Schwierigkeiten löst, welche bei der Immunofluoreszenz-Bestimmungsmethode auftreten, wenn ein hydrophobes Testmolekül, wie z. B. ein Hapten mit einer hydrophoben Markierung, wie z. B. einer fluoreszierenden Verbindung kombiniert wird. Damit ist nachgewiesen, dass die erfindungsgemässen fluoreszierenden Reagentien die Nachteile der bislang üblichen Fluoreszenz-Bestimmungsmethoden beseitigt haben.

Claims: Patentansprüche 1. Fluoreszierendes diagnostisches Reagenz, enthaltend eine Verbindung aus a) einem hydrophoben Hapten, b) einer hydrophilen Verbindung aus der Klasse der Aminoglykoside, der Peptide, der Proteine oder der Polyacrylamidhydrazine und c) einer hydrophoben fluoreszierenden Verbindung auf Basis von Fluorescein, Umbelliferon oder Fluorescamin, wobei sowohl das hydrophobe Hapten als auch die hydrophobe fluoreszierende Verbindung voneinander getrennt an die hydrophile Verbindung gebunden sind. 2. Fluoreszierendes diagnostisches Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrophile Verbindung ein Aminoglykosid der allgemeinen Formel EMI18.1 ist, in welcher bedeuten: R1: =C oder -CH, R2: -CH20H, -CH2NH2, -CH2NHCH3, EMI19.1 oder EMI19.2 R3: =C oder -CH; R4, R5 und Rg: -H oder -OH R6: -OH oder -NH2 R7: -NH2, -NHCH2CH3 oder -NH-COC (OH)CH2CH2NH2 R8: -H oder -CH2OH R10: -OH oder -CH3 und Rll: -NH2 oder -NHCH3 3. Fluoreszierendes diagnostisches Reagenz nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrophobe fluoreszierende Verbindung 5-Aminofluorescein ist. 4. Fluoreszierendes diagnostisches Reagenz nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrophobe flu oreszierende Verbindung Fluoresceinisothiocyanat ist. 5. Fluoreszierendes diagnostisches Reagenz nach den Ansprüchen 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Hapten ein Antikonvulsivum ist. 6. Fluoreszierendes diagnostisches Reagenz nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Antikonvulsivum Diphenylhydantoin ist. 7. Fluoreszierendes diagnostisches Reagenz nach den Ansprüchen 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrophobe fluoreszierende Verbindung Fluorescein isothiocyanat und das Aminoglykosid Gentamicin ist. 8. Fluoreszierendes diagnostisches Reagenz nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Antikonvulsivum Phenobarbital ist. 9. Fluoreszierendes diagnostisches Reagenz nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die fluoreszierende Verbindung Fluoresceinisothiocyanat und das Amino glykosid Tobramycin sind. 10. Fluoreszierendes diagnostisches Reagenz nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Antikonvulsivum Primidon ist. 112 Immunofluoreszenz-Bestimmungsmethode für Hapten Antigene, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Reagenz verwendet, enthaltend eine Verbindung aus a) einem hydrophoben Hapten, b) einer hydrophilen Verbindung aus der Klasse der Aminoglykoside, der Peptide, der Proteine oder der Polyacrylamidhydrazine und c) einer hydrophoben fluoreszierenden Verbindung auf Basis von Fluorescein, Umbelliferon oder Fluorescamin, wobei sowohl das hydrophobe Hapten als auch die hydrophobe fluoreszierende Verbindung voneinander getrennt an die hydrophile Verbindung gebunden sind. 12. Immunofluoreszenz-Bestimmungsmethode nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrophile Verbindung ein Aminoglykosid der allgemeinen Formel EMI21.1 ist, in welcher bedeuten: R1: =C oder -CH; R2: -CH20H, -CH2NH2, -CH2NHCH3, EMI21.2 oder EMI21.3 R3: =C oder -CH R4, R5 und R9: -H oder -OH R6: -OH oder -NH2 R7: -NH2, -NHCH2CH3 oder -NHCOC(OH)CH2-CH2-NH2 R8: -H oder -CH2OH R10: -OH oder -CH3 und R11 -NH2 oder -NHCH3 13. Immunofluoreszenz-Bestimmungsmethode nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrophobe fluores zierende Verbindung 5-Aminofluorescein ist. 14. Immunofluoreszenz-Bestimmungsmethode nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrophobe fluores zierende Verbindung Fluoresceinisothiocyanat ist. 15. Immunofluoreszenz-Bestimmungsmethode nach den Ansprüchen 13 und 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Hapten ein Antikonvulsivum ist. 16. Tmmunofluoreszenz-Bestimmungsmethode nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Antikonvulsivum Diphenylhydanto in ist. 17. Immunofluoreszenz-Bestimmungsmethode nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrophile fluoreszierende Verbindung Fluoresceinisothio cyanat und das Aminoglykosid Gentamicin ist. 18. Immunofluoreszenz-Bestimmungsmethode nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Antikonvulsivum Phenobarbital ist. 19. Immuno fluo re 5 zenz-Be s timmungsmetho de nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrophile fluoreszierende Verbindung Fluoresceinisothio cyanat und das Aminoglykosid Tobramycin sind. 20. Immunofluoreszenz-Bestimmungsmethode nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Antikonvulsivum Primidon ist.

Inventors: CHEN, JANET H., PALMER, RICHARD J., TSAY, YUH-GENG
Applicants: INTERNATIONAL DIAGNOSTIC TECHNOLOGY, INC.
Application year: 1981
Main classification: G01N33
IPC codes: C07H21, G01N33, C07H15