SEPARATION OF THE FREE AND ANTIBODY-BOUND LIGAND FOR LABELLED-LIGAND IMMUNO-ASSAYS

Abstract: 1. Method for the separation of the free (F) and antibody-bound (B) ligand in the performance of the labelled-ligand immuno-assays, characterized in that the separation is carried out by way of an immuno-immobilized precipitation reagent (IIPR) consisting of a finely dispersed immuno precipitate which has been gained after short time-incubation of normal serum (NS) of the donating animals of ligand specific antisera with an antiserum (AK2 ) against the immuno globulines of this species at optimized antigen-antibody-ratio.

Description: Titel der Erfindung Trennung des freien und antikörpergebundenen Liganden für labelled-Ligand-Immunoassays Anwendungsgebiet der Erfindung Die Erfindung beinhaltet ein universelles Verfahren zur Trennung des freien und antikörpergebundenen markierten Antigens bzw. Haptens für alle Ligand-Immunoassay-Systeme zur quantitativen Bestimmung, vorwiegend biologisch aktiver Substanzen wie Hormone, Enzyme oder Pharmaka bis zu Eon- zentrationen um 10-12 mol/1, meistens in Körperflüssigkeiten. Das umfangreichste Anwendungsgebiet liegt beim Radioimmuno- assay (RIA) und Enzymimmunoassay (EIA) Charakterisierung der bekannten technischen Lösungen Nach Einführung des Radioimmunoassays (RIA) durch YALOW und BERSON (J. clin. Invest. 39 (1960) 1157) zur Insulinbestimmung im Serum wurden bis heute für über 200 Substan- zen Ligand-Immunoassays publiziert. Sie beruhen auf der Messung der prozentualen Bindung des markierten Liganden durch den ligandspezifischen Antikörper AK1 in Abhängigkeit von der zu bestimmenden Konzentration des unmar- kierten Liganden L. Bei allen Methoden stellt sich für die ligandspezifische Immunreaktion folgendes Gleichgewicht ein: markiert er Ligand (XL) + ANTIKÖRPER (AK1) EMI1.1 XL-AK1 + XL (B) (F) Ligand (L) unbekannte Konzentrat ion Die Konzentration xL und AKi sind in einem Inkubationsansatz konstant gehalten. Nach Gleichgewichtseinstellung ist eine Trennung des freien (B) und antikörpergebundenen (B) markierten Liganden erforderlich. Da der T > munkomplex selbst löslich ist, wurden hierzu verschiedene Trennmethoden entwickelt, jedoch hat sich bisher keine universell vorteilhaft anwendbare Methode ergeben. Somit liegen die grössten Unterschiede der publizierten Radioimmunoassays und kommerziell angebotenen RIA-Kits in der Durchführung der Trennung von B und F. Die Trennung soll möglichst quantitativ erfolgen, hierdurch wird die untere Erfassungsgrenze eines R1A und auch seine Präzision wesentlich beeinflusst. Das Trennverfahren muss sich für einen hohen Probendurchsatz eignen. Das Gleichgewicht der ligandspezifischen Immunreaktion sollte durch die Trennung nicht nachweislich geändert werden. Da diese Anforderungen oft schwierig einzuhalten sind, wurden viele rennmethoden entwickelt. So wurden die Elektrophorese, Chromatographie und Ultrazentrifugation auf Grund verschiedener Mobilität von B und F zur Trennung angewendet. Als Nachteile für diese Methoden sind die starken Gleichgewichtsstörungen, der hohe Zeitaufwand und ein geringer Probendurchsatz zu nennen. Eine Trennung kann auch erreicht werden, wenn B durch Äthanol, Dioxan, Polyäthylenglykol bei 125 g/l oder Ammoniumsulfat bei 215 g/l präzipitiert wird. Die beiden ersten, sonst eleganten Verfahren haben den Nachteil, dass mit zunehmendem Proteingehalt der markierte freie Ligand (B) zunehmend kopräzipitiert. Ausserdem werden hierbei die Immunkomplexe niederaffiner Antikörper gespalten. Eine andere Gruppe von Trennmethoden beruht auf der Adsorption des freien Liganden (2) an Aktivkohle, Ionenaustauscherharze, Cellulose oder Silicate. Der Nachteil dieser Methoden ist, dass auch B teilweise adsorbiert wird, wobei das Ausmass der Bindung milieuabhängig ist. Ene weitere Möglichkeit ist die chemische Fixierung des ligandspezifischen Antikörpers vor der Reaktion, z. B. an Cellulose oder Sepharose (solid-phase-method) bzw. an der Innenwand des Inkubationsröhrchens (tube-method) , wobei eine gewöhnliche Zentrifugation bzw. ein einfaches Abgiessen zur Trennung ausreicht. Diese Methoden haben die Nachteile, dass die immobilisierten Antikörper meistens in ihrer Affinität und damit die RIA in ihrer Empfindlichkeft vermindert sind. Der Verbrauch der meist teueren speziSi- schen Antikörper (ssEl) ist durch die Fixierung um ein Vielfaches erhöht. Ausserdem müssen die Inkubationsröhr- chen wegen der heterogenen Reaktionsphasen während der Inkubation ständig bewegt werden. Alle bis hierher genannten Methoden sind phsiko-chemi- scher Art Eine weitere Gruppe von Trennverfahren sind unter dem Begriff der Doppelantikörpermethode zusammen- zufassen. Hierbei erfolgt die Trennung von B und F dadurch, dass mittels eines zweiten Antikörpers (AK2), der gegen das Immunglobulin der Spenderspezies für AKl gerichtet ist, der lösliche Immunkomplex XL-AK1 präzipitiert wird. Da der AKl in sehr niedriger Konzentration (Verdünnung des Antiserums 1 : 103 bis 1 : 106) eingesetzt wird, wird dem Inkubat ein Normalserum (NS) der Spezies des AK1-Spenders bei einer Verdünnung von ca. 1 : 100 zugesetzt. Das Konzentrationsverhältnis von NS zu AK2 ist so abgestimmt, dass eine maximale Immunpräzipitation erreicht wird. Nach Ablauf der Präzipitation wird B abzentrifugiert. Die Doppelantikörpertechnik ergibt den besten Trenneffekt zwischen B und F, die unspezifische Präzipitation (Bu) ist sehr niedrig. Der Nachteil dieser Methode ist, dass die Bindung des l-AKl an AK2 durch Immunglobu-t line individueller Patienten (BRUNFELDT, K. und X.R. JÖR GENSEN, Acta Endocrin. 54 (1967) 347) kompetitiv gehemmt wird und somit falsch hohe Werte von L im Plasma bestimmt werden. Zudem wird die Präzipitation durch das Komplement quantitativ beeinflusst. Um die genannten Nachteile zu vermeiden, wurde mit dem sogenannten Bindungsreagens, dem vorpräzipitierten spezifischen AKl mit AK2 unter Zusatz von NS, gearbeitet (HAIES, C.N. and P.J. RANDLE, Biochem. J. 88 (1963) 137). Hierbei blieb der Vorteil der geringen Bu erhalten, auch wird die Kreuzreaktion des Immunglobulins mit dem AK2 und der Komplementeinfluss weitgehend unterbunden, aber gleichzeitig werden damit die Vorteile der homogenen Reaktionsphase für die ligandspezifische Immunreaktion aufgegeben. Eine andere Variante wurde durch DEN HOLLANDER u. a. (J. of Immunol. Methods 1 (1972) 247) beschrieben. Hiernach wird AKS an einen festen Träger fixiert und der lösliche Immunkomplex XL-AK1 wird durch Immunadsorption vom freien Liganden XL getrennt. Da der fixierte AK2 im aber schuss zugegeben werden kann, sind die Kreuzreaktionen des Immunglobulins mit AK2 und die Komplementreaktion ohne Einfluss auf die quantitative Bindung des XL-AK1. Der Nachteil dieser Methode liegt darin begründet, dass bei der chemischen Trägerfixierung ein erheblicher Teil AK2 in- aktiviert wird, dadurch steigt der AK2-Verbrauch. Zum anderen ist der Solidphase-AK2 nicht stabil, man findet schon nach wenigen Tagen Aufbewahrung freie AK2, wodurch dann falsch hohe Konzentration für den zu bestimmenden Liganden L gefunden werden, ausserdem kann die unspezifische Bindung durch die Festphase erhöht sein. Hinzu kommt, dass die Trägerfixierung nach noch zum Teil unübersichtlichen nicht steuerbaren Reaktionen abläuft und somit die Kupplungsausbeute und der Inaktivierungsgrad für AK2 und damit die Bindeeigenschaften des Solidphase-AK2 für AKl sehr variieren können. Jedoch der grösste Nachteil liegt in der Durchführung selbst, denn während der gesamten Inkubation (einige Stunden) zur XL-AK1-Bindung müssen die Proben geschüttelt werden. Ziel der Erfindung Das Ziel der Erfindung ist die Einführung einer universellen Methode zur Trennung der freien (F) und antikörpergebundenen (B) Liganden in den vorteilhaft anzuwendenden Ligand-Immunoassay-Systemen zur Bestimmung z. B. von Hormonen, Enzymen, Pharmaka, spezifischen Proteinen u. a. Substanzen, vorwiegend in biologischen aber auch anderen Medien, unabhängig von der Markierungsart der Liganden (Radioimmunoassay, Enzymimmunoassay u. a. Immunoassays). Für den Erkenntnisgewinn in biochemischer und klinischer Forschung ist die hochspezifische, empfindliche Analytik eine wesentliche Voraussetzung, somit ist der Bedarf an den noch sehr teuren Testbestecken sehr hoch, Mit Ein- führung des erfindungsgemässen universellen Trennverfahrens wäre eine Standardisierung in der Fertigung und Destdurch- führung gegeben und damit gleichzeitig eine erhebliche Kosteneinsparung verbunden. Darlegung des Wesens der Erfindung Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, -ein neues, universelles Trennverfahren zur Separation des freien (2) und antikörpergebundenen (B) Liganden für die Radio-, Enzym-, Spin- oder allgemein labelled-'ligand-Immunoassas einzuführen. Das neue Trennverfahren ist dadurch charakterisiert, dass die Doppelantikörpermetho-de mit ihren Vorteilen in der Durchführung so modifiziert wurde, dass zusätzlich die Vorzüge der Solidphasenmethode ausgenutzt werden, bei gleichzeitiger Beibehaltung der homogenen Reaktionsphase für die ligandspezifische Immunreaktion, ohne die chemische Fixierung des, den ligandspezifischen Antikörper (hKl) bindenden, zweiten Antikörpers (AK2) und die damit verbundene teilweise Inaktivierung des AK2. Die Kombination der genannten Vorteile der verschiedenen Trennmethoden ist dadurch gelungen, dass nach Ablauf der ligandspezifischen Immunreaktion in homogener, flüssiger Phase, der lösliche Immunkomplex XL-AK1 durch Zugabe eines feindispers en Immunpräzipitats IIPR (immuno-immobilis ier- tes Präzipitationsreagens), das durch Immunpräzipitation des AK2 mit einem NS der Spezies des AK1-Spenders zubereitet wurde, gebunden wird: EMI6.1 Nach einer Inkubation von nur 30 min mit dem IIPR wird jede Probe mit 2 ml des ammoniumsulfathaltigen Assay- Puffers vermischt, wobei die Endkonzentration des (NH4)2SO4 1,16 mol/l betragen soll. Nach weiteren 30 min werden die Proben 15 min bei 2000 g zentrifugiert. Ein zusätzlicher Waschschritt ist in der Regel nicht erforderlich. Anstelle des (NE4)2S04 kann auch Polyäthylenglykol 6000 (Merck, Darmstadt) mit der Endkonzentration von 30 g/l verwendet werden. Das IIPR wird zweckmässig im Grossansatz (mehrere Tausend Ampullen) hergestellt. Das optimale Konzentrationsverhältnis des AK1-speziesgleichen Normalserums (NS) und des zweiten Antiserums (AK2), das gegen AK1-speziesgleiches Immunglobulin gerichtet ist, wird vorher ausgetestet. Hierzu werden . B. 0,1 ml NS-Verdünnung (1: 400) mit 0,1 ml der AK2-Verdünnungsreihe (1 : 2 bis 1 : 1000) 1 h bei Raumtemperatur (RD) inkubiert. Anschliessend werden 0,2 ml eines XL-AK1-Inkubates zugegeben, nach 30 min Inkubation bei RT wird das Inkubat mit 2,0 ml 1,4 mol/l (NH4)2S04-Assaypuffer vermischt und nach weiteren 30 min bei 2000 g für 15 min zentrifugiert. Der überstand wird verworfen, die Aktivität im Präzipitat gemessen. Aus der AK2-Verdünnung, die sicher die maximale Bindung des xI-AK2 garantiert, wird das optimale NS/AE2 Verhältnis für den Grossansatz zur Herstellung des IIPR ermittelt. Um gleichbleibend gute Binde- und Präzipitationseigenschaften des IIPR zu garantieren, werden die beiden Komponenten erfindungsgemäss so in einer Ampulle abgefüllt und lyophilisiert, dass die Reaktion miteinander bis zur Anwendung des IIPR ausgeschlossen bleibt: Pro Ampulle wer- den ca. 0,5 m AK2 tiefgefroren, danach werden in jede Ampulle 0,05 ml der NS-Verdünnung pipettiert. Das ES gefriert sofort, ohne dass das AK2 auftaut. Anschliessend wird lyophilisiert. Aus laborpraktischen Gründen werden das AK2 und NS bei Einhaltung des optimalen Konzentrationsverhältnisses so dosiert, dass jede Ampulle IIPR für 100 Teströhrchen enthält. Zur Anwendung des IIPR wird das Lyophilisat einer Ampulle mit 10 ml Assay-Puffer gelöst, nach 1 h Vor- inkubation bei RD werden 100 l des IIPR pro Teströhr- chen pipettiert. Da fast ausschliesslich die ligandspezifischen Antiseren durch Immunisierung von Meerschweinchen (GP) und Kaninchen (Rab) gewonnen werden, ist eine Herstellung von nur zwei IIPR (GP-IlPR und Rab-IIPR) zur B/F-Trennung bei den genannten Immunoassays erforderlich. Somit führt die Standardisierung der B/F-Trennung nach der erfindungsgemässen Methode zu einer hohen Effektivität bei der Produktion der Testbestecke, zusätzlich kommt eA zur Vereinfachung der Durchführung der RIA, EIA und anderer Immunoassay fur den Anwender, z. T. sind sehr unterschiedliche Laboraus- rüstungen z. B. für die verschiedenen. Radioimmunoassays erforderlich. Ausführungsbeispiel Die folgenden Beispiele sollen die prinzipielle Anwendungs- möglichkeit des beschriebenen Trennverfahrens mit Hilfe des IIPR illustrieren. Beispiel 1 Radioimmunoassay für Pankreasglukagon im Plasma: 0,5 ml der Plasmaproben werden mit 0,1 ml eines verdünnten Kaninchen-anti-Glukagon-Serums 2 Tage bei 4 C und nach Zusatz von 0,05 ml 125J-Glukagonlösung 20 h bei 4 oO inkubiert. Danach werden zur B/F-Trennung 0,1 ml Rab-IIPR zugegeben und 30 min bei RT inkubiert, mit 2,0 ml 1,6 mol/1 (NH4)2SO4 im Assay-Puffer gemischt und nochmals 30 min bei RT inkubiert Nach anschliessender Zentrifugation für 15 min bei 2000 g wird der Uberstand mit dem freien 125J-Glukagon (F) abgegossen und die Radio aktivität im Präzipitat gemessen. Der so durchgeführte RIA für Pankreasglukagon zeigt bei einer unspezifischen Bindung des 125J-Glukagons von 3,4 + 0,4 % und einem Präzipitationsindex von 3,4 + 0,3 % (x + SEM, n = 14) durch 100 pg Glukagon.im Inkubat einen Abfall des gebundenen 125J-Glukagons (B) auf 38 % gegenüber B bei Abwesenheit von Glukagon. Beispiel 2 Radioimmunoassay für Insulin im Plasma: 0,05 ml der Plasmaproben werden mit 0,1 ml eines verdünnten Meerschweinchen-anti-Tnsulin- Serums 20 h bei RT und nach Zusatz von 0,1 ml 125J-Insulin 90 min bei RT inkubiert. Danach werden zur B/F-Trennung 0,1 ml GP-IIPR zugegeben und 30 min bei RU inkubiert, mit 2,0 ml 1,36 mol/1 (NH4)2SO4 im Assay-Puffer gemischt und nochmals 30 min bei RT inkubiert. Nach anschliessender Zentrifugation für 15 min bei 2000 g wird der Uberstand mit dem freien 125J-Insulin (B) abgegossen und die Radioakti- vität (3) im Präzipitat gemessen. Der so durchgeführte RIA für Insulin zeigt bei einer unspezifischen Bindung des 125J-Insulins von 2,45 + 0,05 % und einem Präzipitationsindex von 2,6 + 0,3 % (x + SEM, n = 7) durch 300 pg (0,3 E) Insulin im Inkubat, einen Abfall des gebundenen 125J-Insulins (B) auf 12,6 % gegen über von B bei Abwesenheit von unmarkiertem Insulin.

Claims: PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Trennung des freien und antikörpergebun denen Liganden bei der Durchführung der labelled-Ligand- Immunoassays, gekennzeichnet dadurch, dass die Trennung mit Hilfe eines immuno-immobilisierten Präzipitations- reagens (IlPR) vorgenommen wird. 2. Verfahren nach EMI10.1 EMI10.2 1, gekennzeichnet dadurch, dass das IIPR erst nach Ablauf der ligandspezifischen Immunreaktion in homogener Phase, als feindisperses Immun präzipitat, erhalten nach Kurzzeitinkubation von Normalserum (NS) der Spezies der Spendertiere der ligandspezifischen Antiseren mit einem Antiserum (AK2) gegen die Immunglobuline dieser Spezies bei optimiertem Antigen/Antikörper Verhältnis, mit dem spezifischen Inkubat vermischt wird. Die BfF-Trennung wird durch eine anschliessende einfache Zentrifugation und Abgiessen des Überstandes erreicht. 3. Verfahren nach EMI10.3 EMI10.4 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, dass die beiden Komponenten (NS und AK2) des IIPS, obwohl beide in flüssigem Zustand in eine Ampulle pipettiert, jedoch durch einen Gefrierzwischenschritt nicht vermischt, lyophilisiert, über Jahre gelagert werden können, wobei es erst nach Aufnahme mit Puffer, kurz vor Anwendung des IIPR, zur Ausbildung eines feindis- persen, hochreaktiven IIPR kommt. 4. Verfahren nach EMI10.5 EMI10.6 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, dass mit nur zwei Produktionsansätzen, jeweils für GP-IIPR und Rab-IlPR bei nahezu allen labelled-Ligand- Immunoassays die B/F-Trennung durchgeführt werden kann. 5. Verfahren nach EMI10.7 EMI10.8 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, dass durch Zusatz von z. B. Ammoniumsulfat oder Poly äthylenglykol der zeitliche Aufwand für die B/F- Trennung auf nur 1 h reduziert wird, wobei die Kon- zentration der genannten Zusätze und die Präzipi- tationsdauer so gewählt wird, dass auch die ohne (NH4)2SO4- bzw. PEG-Zusatz löslichen @L-AK1-AK2- Komplexe aber nicht der markierte freie (F) Ligand (XL) und die Immunglobuline selbst präzipitieren. 6. Verfahren nach EMI11.1 EMI11.2 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, dass der zu bestimmende Ligand jede Substanz sein kann, gegen die direkt oder nach Konjugation an einem Trägermaterial spezifische Antikörper erzeugt werden können und die im Ligand-Immunoassay als Antigen oder Hapten reagiert, wobei die Bestimmung von Liganden im Plasma der Spezies des Spendertieres für AKl ausgeschlossen ist. 7. Verfahren nach EMI11.3 EMI11.4 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, dass für den Ligand-Immunoassay der Ligand selbst oder eine antigene bzw. haptene ligandspezifiscbe Struktur- einheit mit einem empfindlich zu messenden Marker, bei Erhaltung der Reaktivität zum spezifischen Antikörper, etikettiert, eingesetzt wird, vorzugsweise wird die Markierung mit einem radioaktiven Isotop (Radioimmuno- assay) oder mit einem Enzym (Enzymimmunoassay) vorgenommen.

Inventors: DIAZ-ALONSO, JOSE, MANUEL, DIPL.-CHEM., WOLTANSKI, KLAUS-PETER, DIPL.-CHEM., ZIEGLER, MANFRED, DR. DIPL. CHEM.
Applicants: VEB ARZNEIMITTELWERK DRESDEN
Application year: 1981
Main classification: G01N33
IPC codes: G01N33