POLYMER BEADS AND THEIR USE IN IMMOBILIZING ENZYMES

Abstract: 1. A macroporous, crosslinked bead polymer which has been prepared from 10 to 100% of divinylbenzene and/or a benzene containing more than two vinyl groups, and from 0 to 90% of styrene, which can be mono- or poly-C1-4 -alkyl-substituted and/or methyl methacrylate, wherein the beads have been subjected to an abrasion-causing surface treatment.

Description: perlpolymerisat und dessen Verwendung zur Immobilisierung von Enzymen Die vorliegende Erfindung betrifft ein makroporöses, ver netztes Perlpolymerisat und dessen Verwendung zur Immobi lisierung von Enzymen. Immobilisierte, d.h. trägergebundene Enzyme, finden u.a. An wendung in der medizinischen Analytik, bei der Herstellung pharmazeutischer Produkte, der Herstellung optisch aktiver Substanzen sowie bei der Herstellung von Nahrungsmitteln, wie beispielsweise die Isoglucose. Die Vorteile der Ver wendung von immobilisierten Enzymen ergeben sich aus ihrer Wiederve rwendbarkeit, ihrer einfachen Ab trennung vom Sub strat bzw. dessen Lösung, ihrer oftmals erhöhten Stabili tät im Vergleich zur löslichen Form, aus der Vermeidung einer Verunreinigung der Reaktionsprodukte sowie aus der Möglichkeit, kontinuierliche Reaktionen in Säulen oder ähnlichen Reaktoren durchführen zu können. Es sind eine Reihe von Möglichkeiten der Immobilisierung von Enzymen bekannt. Die bekannten Verfahren weisen jedoch mehr oder weniger erhebliche Mängel auf. So erhält man bei der Einbettung von Enzymen durch Polymerisation in der Re gel gelartige Präparate mit mangelhaften mechanischen Ei genschaften. Ausserdem besteht bei diesem Verfahren die Ge fahr einer Schädigung der Enzyme durch Monomere oder, wenn auch in geringerem AusmaR, durch Präpolymere. Schliess- lich gelingt die Einbettung der Enzyme oft nicht voll ständig, so dass ein Teil derselben aus den Präparaten bei Gebrauch ausblutet. Bei den gebräuchlichsten Verfahren zur Immobilisierung von Enzymen erfolgt die Herstellung einer kovalenten Bindung an einen Träger. Dabei kann als Trägermaterial sowohl anor WK/BL ganisches als auch organisches polymeres Material nativen oder synthetischen Ursprungs verwendet werden. Die Bindung des Enzyms erfolgt in der Regel mit Hilfe von reaktiven Gruppen, die unter milden Bedingungen mit Hydroxy- und/oder Aminogruppen der Enzyme zu reagieren vermögen. Eine aus führliche Übersicht befindet sich in Methods in Enzymology, Vol. XLIV: Immobilized Enzymes, Academic Press, 1976. Trotz der Vielzahl der bekannten derartigen Verfahren erhält man in jedem Falle ein Präparat, welches einen oder mehrere der folgenden Nachteile aufweist: mangelhafte Aktivität, ge ringe mechanische Stabilität, unbefriedigende hydrodyna mische Eigenschaften, Empfindlichkeit gegen mikrobiellen Abbau, komplizierte und teure Herstellung des Trägers, geringe Lagerstabilität des unbeladenen Trägers durch emp findliche reaktive Gruppen sowie das Vorhandensein von toxischen Substanzen auf dem Träger, die zur kovalenten Bindung der Enzyme an den Träger benötigt werden. Darüber hinaus sind kovalent bindende Träger nicht oder nur mit unverhältnismässig grossem Auf wand regenerierbar. Als weiteres lmmobilisierungsverfahren wird die Adsorption von Enzymen an anorganische oder organische Träger vorge schlagen, wobei als Ausgangsstoffe oft Materialien nativen Ursprungs verwendet werden. Beispiele für derartige Träger sind poröse Oxide von Magnesium und Aluminium und DEAE -Cellulose (DEAE = Diethylaminoethyl). Die Adsorption und Desorption von Enzymen an sogenannte Adsorbentien, d.h. makroporöse Harze, zum Zwecke der Reinigung wird in der DE-PS 12 74 128 vorgeschlagen. Im allgemeinen gilt die adsorptive Bindung von Enzymen als wenig dauerhaft, so dass mit dem Ausbluten der Enzyme zu rechnen ist (J. Chibata: Immobilized Enzymes, Kodansha Ltd./John Wiley & Sons, 1978). Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, poröse organische polymere Träger zu schaffen, die die obengenannten Nachteile vermeiden und Enzyme unter weitgehender Erhaltung ihrer Aktivität zu binden vermögen, so dass die entstehenden enzymatisch aktiven Präparate unter den üblichen Bedingungen der Anwendung stabil sind. Die erfindungsgemässen Präparate weisen als besondere Vorzüge hohe Aktivität, gute hydrodynamische Eigenschaften und mechanische Stabilität auf und sind einfach herzustellen. Gegenstand der Erfindung ist ein makroporöses, vernetztes Perlpolymerisat, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Oberflächen der Perlen einer einen Abrieb erzeugenden Behandlung unterzogen worden snd. Als makroporoses, vernetztes Polerisat komr.t i.sveson- dere eines in Betracht, welches aus 10 bis 100 % Divinylbenzol und/oder einem drei oder mehr Vinylgruppen enthaltendes Benzol sowie 0 bis 90 % Styrol, das ein- oder mehrfach C1-alkyl-substituiert sein kann, und/oder Methylmethacrylat besteht. Es ist jedoch auch möglich, weitere mit Styrol und Divinylbenzol copolymerisierbare Monomere in einer Menge von bis zu 30 %, bezogen auf die Gesamtmenge an Monomeren, einzupolymerisieren. Solche Monomere sind z.B. Alkylester der Methacrylsäure, Alkylester der Acrylsäure, sowie Acryl- und Methacrylsäure selbst. Allerdings nimmt mit zunehmender Kettenlänge der Monomeren die Brauchbarkeit ab. Auch der Ersatz des Divinylbenzols durch mehrfunktionelle Ester, wie Hexandioldimethacrylat oder Tri methylolpropantriacrylat, führt zu keinen brauchbaren Polymerisaten. Die Brauchbarkeit eines Monomeren lässt sich am besten durch einen Vorversuch ermitteln. Es ist auch zu berücksichtigen, dass wasserlösliche Substanzen 'wie die Acryl- und Methacrylsäure - bei der Suspensionspolymerisation nicht vollständig in das Polymerisat eingebaut werden. Diese müssen deshalb in überschüssiger Menge in die Polymerisationsreaktion eingesetzt werden. Die Polymerisation des Monomerengemischs wird in Form einer Suspensionspolymerisation mit Wasser als äusserer Phase durchgeführt, wobei eine Teilchengrösse von 0,05 bis 3 mm, bevorzugt 0,2 bis 0,8 mm, angestrebt wird. Zur Erzeugung der Makroporosität des Polymerisats wird ein Porenbildner verwendet. Als Porenbildner eignen sich beispielsweise Alkane mit 7 bis 12 C-Atomen, bevorzugt n-Octan oder Benzine mit einem Siedepunkt 2 lOO C. Die Menge an Poren bildner beträgt 50 bis 4OO Gew.%, bezogen auf die Monomeren. Die obere Grenze der Porenbildner-Menge ergibt sich aus den mechanischen Eigenschaften des Polymerisats und ist vom jeweiligen Porenbildner abhängig. Wesentlich ist die Er zeugung eines Porenvolumens von 0,8 bis 4 cm3/g, bevorzugt 3 1,5 bis 3 > 5 cm cm3/g, wobei die Durchmesser der Poren 2,5 . 1O 5 bis 2 . 1O mm, bevorzugt 4 . 10 5 bis 5 . 1O 4 mm betragen sollen. Die Herstellung von makroporö sen Perlpolymerisaten als solche ist bekannt und kann z.B. der US-Patentschrift 3 322 695 entnommen werden. Zur Erzielung einer hohen immobilisierten Enzymaktivität wird der Träger einer Abrieb erzeugenden Behandlung unter zogen, wodurch vermutlich die Durchlässigkeit der Ober fläche des Trägers erhöht wird. Geeignete Massnahmen sind das Rollen des Polymerisats, gegebenenfalls in Gegenwart von harten, inerten Körpern, wie z.B. Glaskugeln, oder hef tiges Schütteln in einer Maschine. Dabei kann das Polymeri sat in trockener oder feuchter Form vorliegen. Die Dauer der Behandlung richtet sich nach ihrer Intensität. Eine weitere Methode zur Erhöhung der Aktivität ist das schnel le Rühren des Polymerisats in Wasser oder einer anderen Flüssigkeit, wobei eine Apparatur mit rauher Oberfläche verwendet wird und/oder ein hartes Inertmaterial, wie z.B. Sand, zugesetzt wird. Auch die Verwendung von Aeroklassie rern, vorzugsweise Schwingsiebsichtern, stellt eine geeig nete Massnahme dar. Nach der Abrieb erzeugenden Behandlung ist es vorteilhaft, den Träger sorgfältig zu waschen. Sofern der Träger nicht bereits in Wasser vorliegt, muss er vor der Beladung mit einem Enzym (oder mehreren Enzymen) aufgrund seines hydrophoben Charakters mit Wasser benetzt bzw. benetzbar gemacht werden. Hierzu wird er z.B. in ein organisches, mit Wasser mischbares Lösungsmittel, wie z.B. Methanol, Ethanol, Aceton, Dimethylformamid oder Tetrahydrofuran, gegeben. Aus diesem wird er dann direkt oder nach Überführung in Wasser oder eine wässrige Puffer lösung in die wässrige Lösung des zu immobilisierenden Enzyms gegeben. Die Beladung des Trägers geschieht in einer wässrigen Enzym lösung, die gegebenenfalls einen Puffer enthalten kann. Die Konzentration des Enzyms in der Lösung beträgt 1 bis 100 mg/ml, die Beladungsdauer 1 bis 100 Stunden, vorzugs weise 5 bis 70 Stunden. Die Temperatur der Enzymlösung liegt - je nach Enzym - bei O bis 9O C. Nach der Beladung wird der Träger von überschüssigem Enzym durch Waschen be freit und als heterogener Katalysator mit enzymatischer Aktivität entweder im diskontinuierlichen Betrieb oder im kontinuierlichen, z.B. in einer Säule, eingesetzt. Zur Beladung auf dem Träger geeignete Enzyme sind vorzugs weise Invertase, Glucoseisomerase, Amyloglucosidase, o & und ss-Amylase, Aminosäureacylase, Penicillinacylase und Hydantoinase. Ferner sind geeignet: Oxidoreduktasen - wie Alkoholdehydrogenase, Lactatdehydrogenase, Aminosäureoxi dase, Peroxidase, Katalase, Glucoseoxidase, Alkohol 'oxidase, Succinatdehydrogenase, Glutamatdehydrogenase > Uricase, Phenoloxidase, Catecholoxidase, Monoaminooxidase, Lipoxygenase, Luciferase, Nitratreduktase, Nitritreduktase, Chlorperoxidase, Acetaldehyddehydrogenase, Aldehydoxigena se, Diaphorase, Cholesterinoxidase, Glutarthioreduktase, Hydroxysteroiddehydrogenase, Xanthinoxidase, Dopamin hydroxylase, Cytochromoxidase, Monoaminooxidase, Diacetyl reduktase, Superoxiddismutase, Limonatdehydrogenase Transferasen - wie Polynucleotidphosphorylase, Dextran sucrase, Phosphorylase, Carbanatkinase, Aminotransferase, Transaldolase, Methyltransferase, Pyruvatkinase, Carbamoyl transferase, Phosphofructokinase, Dextransynthetase - ; ; Hydrolasen - wie Lipase, Esterase, Lactase, Lysozym, Cellulase, Urease, Trypsin, Chymotrypsin, Glutaminase, Asparaginase, Papain, Ficin, Pepsin, Leucinaminopeptidase, Carboxypeptidase A+B, Naringinase, Bromelain, Subtilisin, Phospholipase, Isoamylase, Cephalosporinamidase, Adenosin - deaminase, Penicillinase, Maltose, Dextranase, Desoxyribo nuclease, Sulfatase, Pullulanase, Phosphatase, Ct-Galacto- sidase, Dextranase, 6-Glucanase - ; Lyasen - wie Trypto phanase, Tyrosindecarboxylase, Oxinitrilzse, Phenylalanin decarboxylase, Phenylalaninammoniumlyase, Aminosäurede carboxylase, Pyruvatdecarboxylase, -Fumarase, Enolase, Aspartase, Aminolaevulindehydratase, Carboanhydratase Isomerasen - wie Aminosäureracemase, Triosephosphatisomera se - ; Ligasen - wie Glutathionsynthetase Zur Regenerierung kann der Träger mit Hilfe der wässrigen Lösung eines oberflächenaktiven Mittels vom Enzym befreit werden. Danach wird durch Behandlung mit einem organischen Lösungsmittel, beispielsweise Methanol, das oberflächenak tive Mittel entfernt. Der Träger wird dann - wie oben be schrieben - erneut mit Enzym beladen und zum Einsatz ge bracht. Beispiel 1 A. Herstellung des Perlpolymerisats Unter Verwendung von a) 50 g Styrol, b) 25 g Ethylvinyl benzol, c) 25 g Divinylbenzol, d) 100 g n-Octan und e) 500 ml Wasser sowie 1 g Lauroylperoxid als Radikalbild ner und 1 g Polyvinylpyrrolidon als Suspensionshilfsmittel wird in einem Kolben mit Rückflusskühler und Rührer unter Einleiten von Stickstoff ein Perlpolymerisat hergestellt, wobei 4 Stunden auf 7000 und dann 4 Stunden auf 950C er hitzt wird. Das Polymerisat wird nacheinander in Aceton, Wasser und Methanol gewaschen und danach bei 700C im Vakuum getrocknet und auf eine Teilchengrösse von 3,1 . 10 3 bis 8 . 10 3 cm gesiebt, Ausbeute 83 g. Das Produkt besitzt folgende Porendaten, die quecksilberporosimetrisch ermit telt wurden: Porenvolumen: 1,96 cm /g, Porendurchmesser: 4,6 . 10 6 bis 3 . 10 5 cm. B. 20 g des gemäss A erhaltenen Polymerisats werden mit 4 g Glasperlen (Durchmesser 3 mm) 24 Stunden in einer 250 ml Glasflasche auf einem Rollstuhl gerollt. Nach Entfernen der Glasperlen wird das Polymerisat nacheinander jeweils 1 Stun de bei Raumtemperatur in Aceton, Wasser und Methanol ge rührt und bei 700C im Vakuum getrocknet. C. Beladung des Polymerisats mit Enzym 0,5 g Polymerisat wird zweimal 1 Stunde in 50 ml 0,05 M Natriumacetatpuffer (pH 5,3) geschüttelt. Anschliessend wird es in 20 ml einer Lösung von 100 mg Invertase (150 Units/mg) in dem genannten Puffer gegeben und 64 Stunden bei 40r ge schüttelt. Danach wird das Polymerisat bei Raumtemperatur zweimal 5 Minuten und einmal 1 Stunde in je 50 ml 0,0025 M Natriumacetatpuffer (pH = 5,3) gewaschen. 'Zur Ermittlung der Enzymaktivität ("immobilisierten Aktivi tat") wird das Polymerisat in 50 ml einer Lösung von 17,5 g Sucrose in 0,001 M Natriumacetatpuffer (pH = 5,3) geschüttelt. Die Hydrolyse der Sucrose wird polarimetrisch ermittelt. Die Beladung des gemäss A hergestellten Polymerisats führt zu einer immobilisierten Aktivität von 9,0 g Sucrose pro g Polymerisat und pro Stunde. Das gemäss B behandelte Polymerisat zeigt hingegen eine Aktivität von 32,2 g Sucrose pro g und pro Stunde. Beispiel 2 20 g gemäss Beispiel 1A hergestelltes Polymerisat werden in einer 250 ml Glasflasche 4 Stunden oder in einem 250 ml Kunststoffgefäss in Gegenwart von 6 g Stahlkugeln (4,5 mm Durchmesser) 0,5 Stunden geschüttelt. Anschliessend werden die Produkte analog Beispiel 1B gewaschen und getrocknet und analog Beispiel 1C beladen. Die erhaltenen Produkte be sitzen eine immobilisierte Aktivität von 30,5 g bzw. 32,7 g Sucrose pro g und pro Stunde. Beispiel 3 Das Beispiel 1 wird wiederholt, jedoch wird in A anstelle von n-Octan Benzin (Kp 155 - 185 C) eingesetzt. Das Polymere wird analog Beispiel 2 ohne Prallkörper behandelt. Die Be ladung und Prüfung des Polymeren erfolgt analog Beispiel 1C. Die immobilisierte Aktivität beträgt 28,9 g Sucrose pro g und pro Stunde. Beispiel 4 Das Beispiel 1 wird wiederholt, jedoch wird in A anstelle von Styrol 75 g Methylmethacrylat und anstelle von Ethyl vinylbenzol und Divinylbenzol 25 g technisches Divinylben zol verwendet. Die Beladung und Prüfung des Polymeren er folgt analog Beispiel 1C. Die immobilisierte Aktivität be trägt 36,4 g Sucrose pro g und pro Stunde. Beispiel 5 Das Beispiel 1 wird wiederholt, jedoch werden als Monomere für die Polymerisation 100 g technisches Divinylbenzol ver wendet. Der Träger enthält also etwa 50 % Divinylbenzol und etwa 50 % Ethylvinylbenzol. Das Trägermaterial wird auf eine Teilchengrösse von 5 . 10 3 bis 6,3 . 10 3 cm gesiebt und 3 Stunden analog Beispiel 2 ohne Prallkörper behandelt. Die Beladung und Prüfung des Polymeren erfolgt analog Bei spiel 1C. Die immobilisierte Aktivität beträgt 35,9 g Sucrose pro g und pro Stunde. Beispiel 6 Es wird ein Trager entsprechend Beispiel 1 hergestellt, wo bei jedoch 20 g Glasperlen verwendet werden und sich die Roll-Behandlung über 96 Stunden erstreckt. 1 g dieses Trä gers wird mit Invertase beladen (vgl. Beispiel 1C) und in eine Säule mit einem Durchmesser von 1,6 cm gefüllt, wobei sich eine Füllhöhe von ca. 2 cm ergibt. Die Säule wird auf 30 C thernostatisiert. Durch die Säule wird mit einer Fliessgeschwindigkeit von 40 ml/Stunde eine Lösung von 400 g Sucrose/l in 0,001 M Natriumacetatpuffer (pH 5,3) ge pumpt. Die Hydrolyse der Sucrose wird polarirnetrisch ver folgt. Nach 1 Tag beträgt der Hydrolysegrad der Sucrose nach Passieren der Säule 89 %, nach 20 Tagen 66 %. Beispiel 7 0,2 g Trager - wie in Beispiel 6 verwendet - werden 64 Stunden bei 4 C in 20 ml Lösung von 100 mg M-Amylase (130 Units/mg) in 0,005 M Natriumacetatpuffer vom pH 6,0 geschüttelt. Dann wird der Träger jeweils bei Rauntempera- tur zweimal 5 Minuten und zweimal 1 -Stunde in Je 50 ml 0,05 M Natriumacetatpuffer von pH 6,0 gewaschen. Zur Ermittlung der immobilisierten enzymatischen Aktivität wird der Träger bei 30 C 30 Minuten in 50 ml Lösung von 5 g Stärke nach Zulkowsky (Merck) in 0,016 M Natriumacetatpuffer (pH 6,0) geschüttelt. Die entstehenden Oligosaccharide werden mit 3,5-Dinitrosalicylsäure nach P. Berenfeld (Methods in Enzymology, Vol. I, 149, Academic Press, 1955) > bestimmt. Aktivität des Trägers: 7,5 g hydrolysierte Stärke pro g und pro Stunde. Beispiel 8 0,2 g Träger - wie in Beispiel 6 verwendet - werden 64 Stunden bei 40C in 20 ml Lösung von 100 mg ss-Amylase (28 Units/ mg) in 0,05 M Natriumacetatpuffer (pH 4,8) geschüttelt. Dann wird der Träger jeweils bei Raumtemperatur zweimal 5 Minuten und zweimal 1 Stunde in je 50 ml 0,05 M Natriumacetatpuffer von pH 4,8 gewaschen. Zur Ermittlung der immobilisierten enzymatischen Aktivität wird der Träger bei 300C 30 Minuten in 50 ml Lösung von 5 g Stärke nach Zulkowsky (Merck) in 0,016 M Natriumacetatpuffer (pH 4,8) geschüttelt. Die gebildete Maltose wird mit 3,5-Dinitrosalicylsäure nach P. Berenfeld (Methods in Enzynology, Vol. 5, 149; Academic Press, 1955) bestimmt. Aktivität des Trägers: 3,3 g gebildete Maltose pro g und pro Stunde. Beispiel 9 Analog Beispiel 8 wird Amyloglucosidase an den Träger gebunden. Aktivität des Trägers: 2,3 g gebildete Glucose pro g und pro Stunde. Beispiel 10 0,1 g Träger (vgl. Beispiel 1) werden 70 Stunden bei 40C mit 10 ml Lösung von 50 mg Aminoacylase (25 Units/mg) in 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,6) geschüttelt. Dann wird der Träger jeweils bei Raumtemperatur zweimal 5 Minuten und einmal 1 Stunde in je 50 ml 0,05 M Phosphatpuffer von pH 7,6 gewaschen. Zur Ermittlung der immobilisierten enzymatischen Aktivität wird der Träger bei 30 C in 50 ml Lösung von 2,5 g N-Acetyl-D,L-methionin in 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,6) geschüttelt. Die Lösung ist ausserdem 5 . 10 4 M an Kobaltchlorid. Das gebildete L-Methionin wird photometrisch mit Ninhydrin bestimmt. Aktivität des Trägers: 1,7 g Methionin pro g und pro Stunde.

Claims: 'PatentansprUche 1. Makroporöses, vernetztes Perlpolymerisat, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberflächen der Perlen einer einen Abrieb erzeugenden Behandlung unterzogen worden sind. 2. Polymerisat gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung der Oberfläche durch Rollen des Polymerisats oder durch Schütteln erfolgt ist. 3. Polymerisat gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung der Oberfläche durch Rühren des Polymerisats in Gegenwart einer Flüssigkeit in einer Apparatur mit einer rauhen Wandung und/oder in Gegen wart eines harten inerten Materials erfolgt ist. 4. Polymerisat gemäss Anspruch 1, dadurch zekennzeichnet, dass die Behandlung der Oberfläche in einem Aerok'as- sierer erfolgt ist. 5. Polymerisat gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es aus 10 - 100 % Divinylbenzol und/oder einem mehr als zwei Vinylgruppen enthaltendes Benzol und O - 90 % Styrol, das ein- oder mehrfach C1 4-alkyl- substituiert sein kann und/oder .wIethyl- methacrylat besteht. 6. Verwendung der Polymerisate gemäss Anspruch 1 - 5 zur Immobilisierung von Enzymen.

Inventors: MARCINOWSKI, STEFAN, DR., SANNER, AXEL, DR., TSCHANG, CHUNG-JI, DR.
Applicants: BASF AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1981
Main classification: C08J9
IPC codes: C08J9, C12N11, C08J3