OLIGOPEPTIDE SELECTIVELY INHIBITING THE GROWTH OR MULTIPLICATION OF NORMAL AND LEUKAEMIC MYELOID CELLS, TO BE ISOLATED FROM HEALTHY WHITE BLOOD CELLS OR GRANULOCYTES, PROCESS FOR ITS PREPARATION, AND MEDICAMENTS CONTAINING IT

Abstract: For the Contracting States : BE, CH, DE, FR, GB, IT, LI, NL, SE 1. Oligopeptide isolable from sound erythrocytes or granulocytes, respectively, selectively inhibiting the growth or proliferation, respectively, of normal and leukemic myeloid cells, characterized in that it has the gross amino acid composition Tau1 , Asx1 , Ser2 , Thr1 , Glx3 , Gly2 , Ala1 , (PO4 )1 in which Tau represents a radical of taurine, Asx means a radical of L-asparagin and/or L-asparaginic acid, Ser represents a radical of L-serine, Thr means a radical of L-threonine, Glx represents a radical of L-glutamine and/or L-glutamic acid, Gly means a radical of glycine and Ala represents a radical of L-alanine and exhibits at a pH-value of 6.5 a negative charge and a relative electrophoretic mobility of from -0.55 to -0.65 referred to asparaginic acid or at a pH-value of 1.9 no charge and a relative mobility of about 0.26 referred to epsilon-(dinitrophenyl)-lysine and has a positive reaction to chlorotolidine. For the Contracting State : AT 1. A process for preparing an oligopeptide isolable from sound erythrocytes or granulocytes, respectively, selectively inhibiting the growth or proliferation, respectively, of normal and leukemic myeloid cells having the gross amino acid composition Tau1 , Asx1 , Ser2 , Thr1 , Glx3 , Gly2 , Ala1 , (PO4 )1 in which Tau represents a radical of taurine, Asx means a radical of L-asparagin and/or L-asparaginic acid, Ser represents a radical of L-serine, Thr means a radical of L-threonine, Glx represents a radical of L-glutamine and/or L-glutamic acid, Gly means a radical of glycine and Ala represents a radical of L-alanine and exhibits at a pH-value of 6.5 a negative charge and a relative electrophoretic mobility of from -0.55 to -0.65 referred to asparaginic acid or at a pH-value of 1.9 no charge and a relative mobility of about 0.26 referred to epsilon-(dinitrophenyl)-lysine and having a positive reaction to chlorotolidine, characterized in that one a) homogenises sound erythrocytes gained from animal or human blood, particularly horse blood, in a buffer solution having a pH-value of from 7 to 8, one centrifuges the liquid homogenisate, one separates from the supernantant liquid the dissolved components having molecular weights below 10 000, one subjects this fraction to a further fractionation, suitably by gel chromatography, and separates the fraction precipitating at volume values ve /vo of from 1.15 to 1.45 and optionally lyophilises it or b) homogenises animal organs containing granulocytes, particularly calf spleen, in an organic solvent miscible with water, one separates from the obtained liquid suspension the solids and extracts them with an organic solvent dissolving fats, one extracts the thus obtained solids with water, one separates from the liquid suspension obtained the insoluble part and one separates from the liquid phase the dissolved components having molecular weights below 10 000, one subjects this fractions to a further fractionation, suitably by gel chromatography, and one separates the fraction precipitating at volume values ve /vo of from 1.3 to 2.5 and optionally lyophilises and one purifies the concentrate of active principle obtained according to one of the above variants a) and b) by chromatographing fractionating on account of the ionic charge and particle size and/or by paper-electrophoresis and one separates the oligopeptide having at a pH-value of 6.5 a negative charge and a relative mobility of from -0.55 to -0.65 referred to asparaginic acid or exhibiting at a pH-value of 1.9 no charge and a relative mobility of about 0.26 referred to epsilon-(dinitrophenyl)-lysine, respectively and positively reacting to chlorotolidine and optionally lyophilises it.

Description: Die Erfindung betrifft ein aus gesunden weissen Blutkörperchen beziehungsweise Granulozyten isolierbares, das Wachstum beziehungsweise die Vermehrung von normalen und leukämischen myeloiden Zellen selektiv hemmendes Oligopeptid, ein Verfahren zu dessen Herstellung und dieses enthaltende Arzneimittel. Bekanntlich sind fast sämtliche in der Chemotherapie der bösartigen beziehungsweise malignen Tumore verwendeten cytostatischen Wirkstoffe, wie die Alkyliermittel, die Äntimetaboliten oder die Indolalkaloide, stark toxische Produkte, welche auf alle sich teilenden Zelltypen schädliche Wirkungen ausüben. Demgegenüber sind die bösartigen beziehungsweise malignen Tumore pathologische Veränderungen eines einzigen Zelltyps: deshalb wäre es erwünscht, selektiv wirkende Mittel zur Hemmung ihres Wachstumes beziehungsweise ihrer Vermehrung zu schaffen und anzuwenden (vergleiche S. Eckhardt, Klinische Onkologie, Medicina-Verlag, Budapest, 1977). Zur Feststellung von solchen das Wachstum beziehungsweise die Vermehrung der Tumorzellen spezifisch hemmenden Mitteln wurden bereits bisher weitläufige Forschungsarbeiten durchgeführt; es wurden unter anderem etwa 25 verschiedene aus einheitlichen Zellgeweben hergestellte Zellenextrakte beschrieben, von denen behauptet beziehungsweise für die nachgewiesen wurde, dass sie bestimmte Zelltypen selektiv hemmende natürliche Regulatoren enthalten (vergleiche A. Balazs, I. Blazsek: Control of Cell Proliferation by Endogenous Inhibitors, Akademiai Eönyvkiadó, Budapest und Elsevier, North Holland, 1979). Gute Ergebnisse wurden besonders mit Extrakten von weissen Blutkörperchen beziehungsweise Granulozyten erzielt (vergleiche Rytömaa und Kiviniemi, Cell Tissue Einet. 1 E1968, 341; Paukovits, Nat. Cancer Inst. Monogr. 38 973J, 147; Paukovits und Mitarbeiter, Oncology 34 [1977], 187). Die biologische Wirksamkeit von teilweise gereinigten Extrakten von weissen Blutkörperchen beziehungsweise Granulozytenextrakten wurde auch an an leukämie leidenden Patienten demonstriert (vergleiche Rytömaa und Mitarbeiter, Scand. J. Raematol., Suppl. 27 Ei976' 5); schon früher wurden von A. Balazs und- Mitarbeiter (ungarische Patentschrift 162 447) aus menschlichem Blut be. ziehungsweise aus Kalbsblut oder aus der Bauchfellflüssigkeit beziehungsweise peritonealen Flüssigkeit von Menschen beziehungsweise Kälbern teilweise gereinigte Extrakte von weissen Blutkörperchen beziehungsweise Granulozytenextrakte hergestellt, welche eine selektive Hemmwirkung gegen die Vermehrung von weissen Blutkörperchen zeigten. Sämtliche bisher beschriebenen beziehungsweise hergestellten derartigen Extrakte waren aber nur teilweise gereinigt, noch zahlreiche Begleitstoffe enthaltende Präparate; die Herstellung von das Wachstum beziehungsweise die Vermehrung von bestimmten Zelltypen selektiv hemmenden reinen Wirkstoffen war dagegen bisher nicht bekannt. Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, einen aus weissen Blutkörperchen beziehungsweise Granulozyten isolierbaren, das Wachstum beziehungsweise die Ver mehrung der normalen und leukämischen myeloiden Zellen selektiv hemmenden reinen neuen Wirkstoff, ein Verfahren zu dessen Herstellung und diesen enthaltende Ärznei- mittel zu schaffen. Das Obige wurde überraschenderweise durch die Erfindung erreicht. Bei der Weiterentwicklung der Forschungsarbeit wurde nämlich nun überraschenderweise festgestellt, dass aus Extrakten von aus tierischem oder menschlichem Blut, besonders aus Pferdeblut, gewonnenen weissen Blutkörperchen oder von aus Granulozyte enthaltenden tierischen Organen, besonders Kalbsmilz, durch spezielle Fraktionierungsverfahrensweisen ein chemisch praktisch reiner einheitlicher gut charakterisierbarer Oligopeptidwirkstoff isoliert werden kann, welcher schon in äusserst niedrigen Konzentrationen eine signifikante selektive Henimwirkung gegen das Wachstum beziehungsweise die Vermehrung von normalen und leukämischen myeloiden Zellen zeigt. Gegenstand der Erfindung ist daher ein aus gesunden weissen Blutkörperchen beziehungsweise Granulozyten isolierbares, das Wachstlm-beziehungsweise die Vermehrung von normalen und leukämischen myeloiden Zellen selktiv hemmendes Oligopeptid, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es die summenmassige Aminosäurezusammensetzung Tau1 , Asx1 , 6er2 , Shr1 , Glx3 Gly2 s Ala1 , (P04)1 worin -au für einen Rest von Taurin steht, Asx- einen Rest von L-Asparagin und/oder L-Asparaginsäure bedeutet Ser einen Rest von L-Serin darstellt, Thr für einen Rest von L-Threonin steht, Glx einen Rest von L-Glutamin und/oder L-Glutaminsäure bedeutet, Gly einen Rest von Glykokoll darstellt und Ala für einen Rest von L-Alanin steht, aufweist und bei einem pR-Wert von 6,5 eine negative Ladung und eine auf Asparaginsäure bezogene relative elektrophoretische Beweglichkeit von -0,55 bis -0,65 be ziiungsweise bei einen pH-Wert von 1,9 keine Ladung und eine auf C- (Dinitrophenyl)- lysin [#-Dnp-Lysin] bezogene relative Beweglichkeit von etwa 0,26 zeigt und auf Chlortolidin positiv reagiert. Die oben verwendeten Abkürzungen wurden von der IUPAC (vergleiche Journal of Biological Chemistry 247 [1972], 9773 festgesetzt. Bekanntlich sind die Granulozyten der in den weissen Blutkörperchen (Leukozyten) überwiegend enthaltene Haupttyp derselben. Beim erfindungsgemässen chemisch einheitlichen Oligopeptid hat die Peptidkette nach den durchgeführten analytischen Untersuchungen keine freie endständige Aminogruppe. Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemässen Oligopeptides, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass a) aus tierischem oder menschlichem Blut, ins besondere Pferdeblut, gewonnene gesunde weisse Blutkörperchen in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7 bis 8 homogenisiert werden, das flüssige Homogenisat zentri fugiert wird, aus der überstehenden Flüssig keit die gelösten Bestandteile mit Molekular gewichten unter 10 000 abgetrennt werden, diese Fraktion einer weiteren Fraktionierung, zweckmäl3ig durch Gelchromatographie, unter worfen wird und die sich bei den Volumwerten v e abgetrennt und gegebenenfalls lyophilisiert wird oder b) Granulozyten enthaltende tierische Organe, insbesondere Ealbsmilz, in einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel homo genisiert werden, aus der erhaltenen flüs sigen Suspension die Feststoffe abgetrennt und mit einem fettlösenden organischen Lösungsmittel extrahiert werden, die so er haltenen Feststoffe mit Wasser extrahiert werden, aus der erhaltenen flüssigen Sus pension der unlösliche Teil abgetrennt wird und aus der flüssigen Phase die gelösten iBe- standteile mit Molekulargewichten unter 10 000 abgetrennt werden, diese Fraktion einer weiteren Fraktionierung, zweckmässig durch Gelchromatographie, unterworfen wird und die sich bei den Volumenwerten ffie von 1,3 bis 2,5 abscheidende Fraktion ab v0 getrennt und gegebenenfalls lyophilisiert wird und das nach einer der obigen Varianten a) und b) erhaltene Wirkstoffkonzentrat (im folgenden "Fraktion GI-3 genannt) durch ein auf Grund von lonenladung und Teil- chengrösse fraktionierendes Chromatographieren und/oder durch Papier-Elektrophorese gereinigt wird und das bei einem pH-Wert von 6,5 eine negative Ladung und eine auf Asparaginsäure bezogene relative Beweglichkeit von -0,55 bis -0,65 beziehungsweise bei einem pH-Wert von 1,9 keine Ladung und eine auf #-(Dinitrophenyl)-lysin bezogene relative Beweglichkeit von etwa 0,26 zeigende und auf Chlortolidin positiv reagierende Oligopeptid abgetrennt und gegebenenfalls lyophilisiert wird. Vorteilhaft wird als Pufferlösung eine Phosphatpufferlösung, beispielsweise aus Dinatriumhydrogenphosphat und Kaliumdihydrogenphosphat, verwendet. Zweckmässig wird das Abtrennen der Fraktion mit Molekulargewichten unter 10 000 durch Molekularfiltration durchgeführt. Vorzugsweise wird als mit Wasser mischbares orga- nisches Lösungsmittel Aceton verwendet. Zweckmässig wird das Abtrennen der in den flüssigen Suspensionen enthaltenen Feststoffe beziehungsweise unlöslichen Teile durch Zentrifugieren durchgeführt. Vorzugsweise werden als fettlösende organische Lösungsmittel Chlorkohlenwasserstoff verwendet. Bei der Variante a) des erfindungsgemässen Verfahrens kann vorteilhaft eine Gewinnung eines Granulozytenniederschlages durch suspendieren des, vorteilhaft durch Behandlung des tierischen beziehungsweise menschlichen Blutes mit Heparin, Sedimentieren und Abtrennen der an weissen Blutkörperchen (Leukozyten) reichen Schicht und Zentrifugieren erhaltenen, an Granulozyten angereicherten Niederschlages in der Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7 bis 8 und Zentrifugieren vorgeschaltet werden, welcher Granulozytenniederschlag dann den für die Variante a) angegebenen Massnahmen unterworfen wird. Gegebenenfalls kann auch die die Bestandteile mit Molekulargewichten unter 10 000 enthaltende Fraktion vor ihrer weiteren Fraktionierung lyophilisiert werden. Bei der Variante b) des erfindungsgemässen Verfahrens können die mit dem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel homogenisierten tierischen Organe vor der Abtrennung der Feststoffe aus ihnen bebrütet werden. Ferner sind erfindungsgemäss Arzneimittel, welche das erfindungsgemässe Oligopeptid als Wirkstoff, zweckmässiger- weise zusammen mit üblichen pharmazeutischen Konfektionierungsmitteln, enthalten, vorgesehen. Das, zweckmässig in lyophilisierter Form isolierte, erfindungsgemässe Oligopeptid zeigt nämlich wie bereits erwahnt eine vorteilhaft selektiv hemmende Wirkung in Bezug auf das Wachstum beziehungsweise die Vermehrung von normalen und leukämischen myeloiden Zellen. Es hemmt spezifisch nur das Wachstum beziehungsweise de Ver mehrung von myeloiden Zellen (von granuloiden Zellen von Ratten und Mäusen und transplantablen tierischen beziehungsweise spontanen akuten menschlichen myeloid -leukämischen Zellen), ist aber gegen die normalen Xhymozyten, von Fhytohämagglutinin stimulierten (PHA- -stimulierten) Lymphozyten, subakuten lymphoiden leukämischen Thymozyten, menschlichen lymphoiden leukämischen Blutzellen und HeLa humanen HeLa-Tumorzellen (aus menschlichen Cervix-Karzinomen isolierten, und in vitro unbeschränkt vermehrungsfähigen handelsüblichen Zellenstrang, der erstmalig 1952 von Gey isoliert wurde) wirkungslos. Die als Zwischenprodukt des erfindungsgemässen Verfahrens erhältliche partiell gereinigte Fraktion GI-3 enthält natürlich ebenfalls schon den erfindungsgemässen Oligopeptidwirkstoff, aber in nicht isolierter Form in Begleitung von verschiedenen weniger aktiven Bestandteilen und hauptsächlich einer überwiegenden Menge von inaktiven Verunreinigungen. Da aber die eigentliche aktive Substanz, der Oligopeptidwirkstoff in diesem Zwischenprodukt schon in erheblichen Mengen zugegen ist, zeigt es ebenfalls bereits eine (dem niedrigeren Oligopeptidgehalt entsprechend niedrigere) spezifische Hemmwirkung gegen das Wachstum beziehungsweise die Vermehrung von myeloiden Zellen. So ist in vitro die wirksame Mindestdosis (MED) der Fraktion GI-3 bezüglich der Hemmung des Einbaues von 3H-Thymidin in die säureunlösliche Desoxyribonucleinsäure (DNS) 110vug/cm3 und bezüglich der sich in Agar-Gel bildenden Kolonien 8/ug/cm3. Die entsprechenden ED50-Werte sind 430 g/cm beziehungsweise 90g/cm3. Der erfindungsgemässe Oligopeptidwirkstoff zeigt die folgenden charakteristischen Eigenschaften: Wirkungsdauer: in Suspensionskulturen > 8 Stunden in Gelkolonien > 1 Woche. Er ist nichttoxisch; so verursachter im 51Cr-release test" keine Verminderung der Lebenskraft beziehungsweise Vitalität der Zellen. Der Angriffspunkt der Wirkung ist die Phase G1 des Zellenzyklus. Die Wärmebeständigkeit des erfindungsgemässen Oligopeptides ist wie folgt. Durch eine 60 Minuten lange Wärmebehandlung bei 800 C wird seine biologische Wirksamkeit nicht beeinflusst und auch die Spezifizität der Wirkung bleibt unverändert. In Lösung bleibt die Wirkung bei 370C nach 72 Stunden unverändert. In der Lyophilisatform kann der erfindungsgemässe Oligopeptidwirkstoff bei -20 C mindestens 7 Wochen und in der Form von aus Aceton oder Chloroform gefälltem Pulver bei +40C mindestens 18 Monate ohne Wirkungsverlust gelagert werden. Die zur Ermittlung der Wirksamkeit des durch Ionenaustausch-Chromatographie beziehungsweise Papier-Elektrophorese isolierten und rückgetesteten erf.indungsgemassen Oligopeptidwirkstoffes sowie zum Vergleich der Wirksamkeiten des reinen erfindungsgemässen Oligopeptidwirkstoffes und der Fraktion GI-3 in vitro durchgeführten Versuche lieferten die in den folgenden Tabellen 1 und 2 zusammengestellten Ergebnisse. Tabelle 1 Selektive Wirkung von 100 g/cm des reinen erfindungsgemässen Oligopeptidwirkstoffes auf den Einbau von H-Thymidin in die säureunlösliche Desoxyribonucleinsäure in Knochenmark- und Thymusdrüsenkulturen EMI11.1 Versuchs- <SEP> Zahl <SEP> der: <SEP> Hemmung <SEP> im <SEP> Knochenmark <SEP> Thymus <SEP> in <SEP> der <tb> gruppe <SEP> Versuche <SEP> in <SEP> Signifikanz <SEP> Hemmungsdrüse <tb> % <SEP> P <SEP> in <SEP> Signifikanz <tb> der <SEP> beim <SEP> % <SEP> P <tb> Blindversuch <SEP> der <SEP> beim <tb> Blindversuch <tb> 1 <SEP> 12 <SEP> 53,2 <SEP> 14,6 <tb> < 0.001 <SEP> > 0,2 <tb> 2 <SEP> 14 <SEP> 59,9 <SEP> 7,3 <tb> Tabelle 2 Dosis/Wirkung-Zusammenhänge beim reinen erfindungsgemässen Oligopeptidwirkstoff und bei der Fraktion GI-3 EMI12.1 Art <SEP> der <SEP> Wirkung <SEP> Reiner <SEP> erfindungsgemässer <SEP> Oligopeptidwirkstoff <SEP> Fraktion <SEP> GI-3 <tb> Wirksame <SEP> Mindestdosis <SEP> ED50-Wert <SEP> Wirksame <SEP> Mindesdosis <SEP> ED50-Wert <tb> (MED) <SEP> in <SEP> (MED) <SEP> in <tb> in <SEP> Picomol/cm <SEP> in <SEP> g/cm <tb> Picomol/cm <SEP> g/cm <tb> Einbau <SEP> von <SEP> H -Thymidin <SEP> in <SEP> Knochenmark-Suspen- <SEP> 2,5* <SEP> 7,8* <SEP> 110* <SEP> 430* <tb> sionskulturen, <tb> 3 <SEP> bis <SEP> 4 <SEP> Stunden <tb> Kolonienbildung <tb> in <SEP> der <SEP> Agar-Gel -Kapillare, <tb> 7 <SEP> Tage <SEP> 0,2** <SEP> 1,6** <SEP> 8* <SEP> 90* <tb> * = Messwerte ** = Berechnete Werte Das erfindungsgemiBe Oligopeptid kann als biologischer Wirkstoff zur Hemmung der Wucherung beziehungsweise Proliferation von humanen normalen beziehungsweise leukämischen Eochenmark- und Blutzellen in vitro in Eonzen- trationen von 0,2 bis 10,0 Picomol/cm3 verwendet werden. Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert Beispiel 1 Herstellung der Fraktion GI-3 aus Pferdeblut Es wurden 10 1 Pferdeblut mit 3 500 Einheiten/l Heparin behandelt und dann zur Sedimentierung 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Die an weissen Blutkörperchen (Leukozyten) reiche obere Schicht wurde abgetrennt und mit einer Kraft von 800 g zentrifugiert. Die als Niederschlag erhaltene 80% Granulozyten enthaltende Zellenpopulation wurde dann in 200 cm3 einer 0,06 m Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,4 (Zusammensetzung: 9,500 g Dinatriumhydrogenphosphat- dihydrat und 1,815 g Kaliumdihdrogenphosphat in 1 1 destilliertem Wasser) suspendiert und wieder mit einer Kraft von 800 g zentrifugiert. Der erhaltene Granulozytenniederschlag wurde in derselben Phosphatpufferlösung in einer Konzentration von 4 . 109 Zellen/cm) suspen- diert und in einer Potter'schen Homogenisiervorrichtung mit 10 Hübe/Minute homogenisiert. Das erhaltene Homogenisat wurde mit einer Kraft von 1 550 g zentrifugiert und die abgetrennte überstehende Flüssigkeit wurde einer Ultrafiltration durch eine Membrane aus Amicon PM 102)unter einem Druck von 3 at unterworfen. Das erhaltene Filtrat wurde lyophili- siert und das Lyophilisat wurde in einer 0,05 m Ammoniumbicarbonatpufferlösung (pH-Wert = 7,9) gelöst und an einer Säule von Sephadex G 1Cp gelchromatographiert. Die bei den Volumwerten ve/ve von 1,15 bis 1,45 abgeschiedene Fraktion wurde abgetrennt und lyophilisiert. So wurden 65 mg Wirkstoffkonzentrat, das heisst Fraktion GI-3, in Form eines weissen Pulvers erhalten. Beispiel 2 Herstellung der Fraktion GI-3 aus Kalbsmilz Es wurden 1 000 g gereinigte und zerkleinerte Ealbs- milz mit auf 4 C gekühltem Aceton bis zu einem Gesamtvolumen von 4 1 versetzt, das Gemisch wurde bei dieser Temperatur homogenisiert, 60 Minuten lang bebrütet und dann zentrifugiert. Die abgetrennten Feststoffe wurden mit Aceton gewaschen und unter Vakuum bei 200C getrocknet. Die trockenen Feststoffe wurden 30 Minuten lang mit 2 1 Chloroform extrahiert und die dadurch angefallenen Feststoffe wurden abgetrennt, bei Raumtemperatur ge trocknet, 16 Stunden mit 3 1 doppeldestilliertem Wasser gerührt und dann mit einer Kraft von 20 000 g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde lyophilisiert und das Lyophilisat wurde in einer 0,05 m Ammoniumbicarbonatpufferlösung (pH-Wert = 7,9) gelöst und an einer Säule von Sephadex G 15# gelchromatographiert. Die bei den Volumwerten ve von 1,3 bis 2,5 abgeschiedene Fraktion wurde abgetrennt und lyophilisiert. So wurden 3,54 g Wirkstoffkonzentrat, das heisst Fraktion GI-3, in Form eines weissen Pulvers erhalten. Beispiel 3 Herstellung des reinen erfindungs gemässen Oligopeptidwirkstoffes Es wurden 300 mg der wie im Beispiel 1 oder 2 beschrieben hergestellten Fraktion GI-3 auf ein Chromatographierpapier (Whatman 3MR aufgetragen; der Ausgangspunkt wurde in der Mitte des Blattes angeordnet und die Gesamtmenge der aufgetragenen Probe wurde in einer Länge von 30 cm verteilt. Die Elektrophorese wurde in einem Puffergemisch aus Pyridin, Essigsäure und Wasser im Volumverhältnis von 90 : 4 : 900 (pH-Wert = 6,5) in einem Elektrophorese apparat mit horizontaler Anordnung, mit einem Spannungsgradienten von 50 V/cm und mit einer Zeitdauer von 2 Stunden durchgeführt. Die Lage des sauren, auf Ninhydrdrl negativ und auf Q)lor positiv reagierenden Bestandteiles wurde durch Färben mit Chlortolidin ermittelt. Der auf diese Weise erhaltene aktive Bestandteil wurde mit einem Puffergemisch aus Essigsäure, Ameisensäure und Wasser im Volumverhältnis von 8 : 2 : 90 (pH-Wert = 1,9) von dem Papier eluiert und im selben Puffergemisch einer weiteren Elektrophorese mit einem Spannungsgradienten von 80 V/cm und mit einer Zeitdauer von 90 Minuten unterworfen. Die Lage des bei diesem pH-Wert keine Ladung zeigenden aktiven Bestandteiles wurde mit Hilfe der Chlortolidinreaktion ermittelt. Dieser aktive Bestandteil wurde mit demselben Puffergemisch (pH-Wert = 1,9) eluiert und das Eluat wurde lyophilisiert. So wurden 8p:i reiner erfindungsgemässer Oligopeptidwirkstoff in Form eines weissen Pulvers erhalten. Patentansprüche

Claims: Patentansprüche 1.) Aus gesunden weissen Blutkörperchen beziehungs weise Granulozyten isolierbares, das Wachstum beziehungsweise die Vermehrung von normalen und leukämischen myeloiden Zellen selektiv hemmendes Oligopeptid, dadurch gekennzeichnet, dass es die summenmässige Aminosäurezusammensetzung Tau1 , Asx1 , Ser2 , Thr1 Glx3, Gly2, Ala1, (PO4)1 worin Tau für einen Rest von Taurin steht, Asx einen Rest von Asparagin und/oder L-Asparaginsäure bedeutet, - Ser einen Rest von L-serin darstellt, Thr für einen Rest von L-Threonin steht, Glx einen Rest von L-Glutamin und/oder L-Glutaminsäure bedeutet, Gly einen Rest von Glykokoll darstellt und Ala für einen Rest von L-Alanin steht, aufweist und bei einem pH-Wert von 6,5 eine negative Ladung und eine auf Asparaginsäure bezogene relative elektrophoretische Beweg lichkeit von -0,55 bis -0,65 beziehungsweise bei einem pH-Wert von 1,9 keine Ladung und eine auf 5-(Dinitrophenyl)-lysin bezogene relative Beweglichkeit von etwa 0,26 zeigt und auf Chlortolidin positiv reagiert. 2.) Verfahren zur Herstellung des Oligopeptides nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man a) aus tierischem oder menschlichem Blut, ins besondere Pferdeblut, gewonnene gesunde weisse Blutkörperchen in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7 bis 8 homogeni siert, das flüssige Homogenisat zentri fugiert, aus der überstehenden Flüssig keit die gelösten Bestandteile mit Nolekurlargewichten unter 10 000 abtrennt, diese Fraktion einer weiteren Fraktion nierung, zweckmässig durch Gelchromatographie, unterwirft; und die sich bei den Volumwerten v. von 1,15 bis 1,45 abscheidende Fraktion v0 abtrennt und gegebenenfalls lyophilisiert oder b) Granulozyten enthaltende tierische Organe, insbesondere Kalbsmilz, in einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel homo genisiert, aus der erhaltenen flüssigen Suspension die Feststoffe abtrennt und mit einem fettlösenden organischen Lösungs mittel extrahiert, die so erhaltenen Fest stoffe mit Wasser extrahiert, aus der er haltenen flüssigen Suspension den unlös lichen Teil abgetrennt und aus dertflüs- sigen Phase die gelösten Bestandteile mit Molekulargewichten unter 10 000 abtrennt, diese Fraktion einer weiteren Fraktionierung, zweckmässig durch Gelchromatiographie, unter wirft und die sich bei den Volumwerten v von 1,3 bis 2,5 abscheidende Fraktion ab v0 trennt und gegebenenfalls lyophilisiert und das nach einer der obigen Varianten a) und b) erhaltene Wirkstoffkonzentrat durch ein auf Grund von lonenladung und Teilchengrösse fraktionierendes Chromatographieren und/oder durch Papier-Elektrophorese reinigt und das bei einem pH-Wert von 6,5 eine negative Ladung und eine auf Asparaginsäure bezogene relative Beweglichkeit von -0,55 bis4,65 beziehungsweise bei einem pE-Wert von 1,9 keine Ladung und eine auf -(Dinitrophenyl)-lysin bezogene relative Beweglichkeit von etwa 0,26 zeigende und auf Chlortolidin positiv reagierende Oligopeptid abtrennt und gegebenenfalls lyophilisiert. 3.) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekenn zeichnet, dass man das Abtrennen der Fraktion mit Molekurlargewichten unter 10 000 durch Molekularfiltration durchführt. 4.) Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch ge kennzeichnet, dass man als mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel Aceton verwendet. 5.) Verfahren nach Anspruch 2 bis 4 dadurch ge kennzeichnet, dass man das Abtennen der in den flüssigen Suspensionen enthaltenen Feststoffe beziehungsweise unlöslichen Teile durch Zentrifugieren durchführt. 6.) Verfahren nach Anspruch 2 bis 5, dadurch ge kennzeichnet, dass man als fettlösende orga nische Lösungsmittel Chlorkohlenwasserstoffe verwendet. 7.) Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Ge halt am Oligopeptid nach Anspruch 1 als Wirk stoff, zweckmässigerweise zusammen mit üblichen pharmazeutischen Konfektionierungsmitteln.

Inventors: BALAZS, ANDRAS, DR., BARABAS, MIKLOSNE, KISFALUDY, LAJOS, DR., KLUPP, TIBOR, SAJGO, MIHALY, DR., Balázs, András, Dr., Barabás, Miklósné, Sajgó, Mihály, Dr.
Applicants: RICHTER GEDEON VEGYESZETI GYAR R.T.
Application year: 1981
Main classification: C07C103
IPC codes: A61K38, C07K14, A61K35