METHOD OF MONITORING THE DEVELOPMENT OF MICRO-ORGANISMS

Abstract: 1. A method of qualitatively and/or quantitatively, in vivo, monitor the growth of microorganisms growing on a culture medium by means of staggered fluorescent measurements whose intensity is in proportion to the amount of microorganisms present at the measurement time, characterized in adding to said culture medium at the time of sowing thereof with said microorganisms an excess of a fluorogenic substance with little or no intrinsic fluorescence but capable of reacting with said microorganisms, whereby a fluorescent emitter agent is produced without inhibiting the growth of the microorganisms, the quantity of said added fluorogenic substance constituting a sufficient potential reserve of said fluorescent agent, whatever the extent of said growth at the end of said staggered measurements.

Description: METHODE POUR OBSERVER LE DEVELOPPEMENT DE MICROORC\NISS La présente invention a pour objet l'étude du mode et de la vitesse de croissance de microorganismes et, notamment une méthode pour suivre ou surveiller in-vivo le dé-veloppement de micro-organis- mes sur un milieu de culture sélectionr.é. Cette surveillance se fait grâce à des mesures périodiques de. fluorescence dont un agent fluorescent présent dans le milieu étudié est à l'origine et dontl'in- tensité est en raison directe de la quantité de micro-organismes pre- sents dans la culture soumise à ltexamen au moment de ia mesure. Le terme "in-vivo" utilisé ici doit être bien compris comme signifiant que l'observation porte sur des micro-organismes vivants dont le dé- velopeemen' n'est en aucune façon modifié par la mesure elle-même et uniquement conditionné par les composants du milieu de culture à llex- clusion de l'agent fluorescent lui-même. Le terme "in-vivo" ne se réfère donc nullement au milieu de culture proprement dit ou à un hôte éventuel au sein duquel la culture pourrait s'effectuer. En résumé, la présente méthode se caractérise par le fait que, lors de l'ensemencement dudit milieu de culture avec les micro-organismes en question, on ajoute à celui-ci un excès d'une substance ne présentant que peu ou pas de fluorescence propre mais capable de réagir avec lesdits micro-organismes et, par cela, de fournir ledit agent fluorescent sans porter tort audit développement, la quantité ajou tée de ladite substance constituant une réserve dudit agent fluorescent à l'état potentiel quelque soit le taux dudit développement. En vertu de la définition qui précède, la présente méthode peut se prêter à de nombreuses applications du domaine de la microbiologie. Ainsi elle peut s'appliquer à l'analyse microbiologique et, plus particulièrement, à un procédé pour détecter et identifier des micro-organismes tels que bactéries, levures, moisissures et germes variés, de même que pour mesurer leur concentration dans des échantillons bio- logiques, des matières végétales, animales ou minérales, des produits alimentaires, etc... A l'heure actuelle, la plupart des méthodes destinées à réali ser le but sus-mentionné consistent à mettre en culture un échantil lon a analyser sur certains milieux nutritifs appropriés et, après une Période d'incubation définie, à identifier par une technique ou une autre, le type de micro-organisme présent et à mesurer sa concentration. Une des techniques les plus répandues pour effectuer une telle analyse consiste à ajouter au milieu de culture une ou plusieurs substances donnant une coloration en présence des micro-organismes recherchés, l'intensité de cette coloration étant, en général, proportionnelle à la concentration de ceux-ci et constituant, ainsi, un moyen de mesure de cette concentration par colorimétrie. Ainsi, à titre d'e xemple, le brevet USP 3,496,066 MERDER et al) décrit l'utilisation de composés nitro-indoliques lesquels forment des dérivés colorés en présence de bactéries contenues dans des fluides biologiques tels que le sérum et l'urine ainsi que dans des produits alimentaires, lait, eau, infusions, etc... Par mesure de ia coloration, on peut estimez la concentration des micro-organismes présents dans ces matières. Le brevet USP 4,026,767 (SHAH et al) décrit la mise en culture d'échantillons contenant des microorganismes à analyser avec addition de sels de tetrazolium, ces derniers étant enzymatiquement réduits, en présence desdits micro-organismes, et fournissant une coloration bleue dont l'intensité, mesurée, permet d'évaluer la concentration de ces micro-organismes. Le brevet USP 3,881,993 (FREAKE et al) décrit un papier analytique poreux imprégné d'un milieu de culture, d'un fixateur (polysaccharide) et d'un réactif se oelorant en rouge (formazan) au contact des micro-organismes croissant sur le milieu de culture. Cette coloration, apparaissant sur le papier, permet une estimation semi-quanr titative de la quantité de micro-organismes présents. D'autres références décrivent des méthodes similaires, à savoir le brevet autrichien No 286.500 et les brevets allemands DP 868.080 et DOS 24 29 380, ce dernier décrivant notamment un mode de traitement chimique de bactéries conduisant à former des sites susceptibles de réagir avec certains colorants, le composé ainsi forme permettant alors d'identifier les bactéries en question. Cependant, ces méthodes colorimétriques présentent certains in convénients dûs, notamment, à leur sensibilité limitée ce qui oblige à prévoir des temps de culture relativement longs (de l'ordre de 12 à 36 h) avant que des résultats significatifs puissent être obtenus. On a cherché à remédier à cet inconvénient grâce à la fluorimétrie dont la sensibilité est nettement plus élevée, notamment en raison du fait que l'intensité de la fluorescence est proportionnelle à l'in- tensité de la radiation d'excitation et qu'il existe, disponibles com- mercialement, des sources d'excitation de très forte puissance. Ainsi, le brevet USP 3,902,971 décrit-il une méthode de détection et de mesure de micro-organismes dans l'atmosphère ou dans les eaux, cette méthode consistant à faire passer, en continu, des échantillons du milieu à analyser dans un circuit où s'effectue un mélarw ge de l'échantillon avec un anti-sérum fluorescent de manière que les pathogènes éventuellement présents soient marqués par une réaction du type "antigène-anticorps", à amener ces pathogènes ainsi marqués sous le faisceau d'une lampe à fluorescence et à enregistrer l'inten- sité de la fluorescence produite à intervalles régulIers, ces mesures permettent un contrôle périodique de la contamination éventuelle de l'atmosphère ou de l'eau à analyser. Le brevet britannique No 1,476,006 (BLOCK) décrit une méthode pour détecter, par fuorescence, des spécimens biologiques en faible quantité. Suivant ce procédé, on ajoute au spécimen un composé "flue urochrome", c'est à dire une substance qui, à l'état libre, n'est que peu ou pas fluorescente mais qui, une fois complexé avec le specimen à déterminer, émet une fluorescence détectable. Tbujours suivant ce prccédé, on peut distinguer, côte à côte, deux substances fluorescentes différentes en mesurant l'intensité du signal d'émission de fluorescence à un instant donné après avoir éteint la source d'excitation, la courbe de décroissance du signal de fluorescence étant caractéristique de chacune de ces substances. De même, il existe des procédés pour distinguer et déterminer, par mesures de fluorescence, les composants de fluides biologiques comme le sang. Ces procédés sont décrits, Par exemple, dans les bre vets britanniques Nos 1,471,969 et 1,492,556. Finalement, dans le brevet allemand DRP 731.205, on décrit une méthode permettant de distinguer, parmi des bactéries, levures et pro tozoaires, les individus encore vivants de;ceux qui ont été inhibés ou tués. Cette méthode est basée sur le fait que la fluorescence des complexes entre un fluorochrome (conne par exemple le jaune d'acri dine) et un micro-organisme vivant (verte) est différente de celle du complexe correspondant avec un micro-organisme mort (rouge). Les méthodes résumées ci-dessus permettent de détecter (souvent de façon sélective) la présence de micro-organismes dans de nombreux milieux et d'évaluer, avec plus ou moins de précision, leur concentration dans ce milieu au moment de la mesure. Aucune cependant ne permet de suivre avec précision, in vivo, l'évolution de la croissance de micro-organismes donnés et d'établir, par une série de mesures à intervalles connus, le mcde et le taux de croissance de tels micro-organismes dans un milieu approprié, ce mode et ce taux étant caractéristique du type de micro-organisme et de sa concentration au départ. C'est ce but que se propose de réaliser la présente application de 1' invention. En effet, celle-ci a pour objet un procédé pour détecter, identifier et doser (mesurer la concentration) dans un échan tillon une ou plusieurs espèces de micro-organismes, ce procédé ca- prenant les étapes suivantes: : a) on ensemence avec des aliquots de l'échantillon à analyser une série de différents milieux ou compositions de culture, chacun d'entre ceux-ci étant apte à prancrvoir la croissance sélective d'une souche distincte de micro-organismes, contenant au moins une substance pouvant causer, sous irradiation convenable et en présence de mi croorgaismes, une émission de fluorescence avec une intensité proportionnelle à la quantité de ceux-ci, b) à intervalles de temps, on irradie ledit milieu et on mesure le degré d'intensité de cette fluorescence dans chaque milieu de culture de manière à déterminer le taux de croissance desdits micro-organismes, c) on compare les taux ainsi mesurés avec des taux de croissan- ce standard établis dans les mêmes milieux, pour des cultures de chacune des souches à l'état pur, de manière à identifier les micro-organismes soumis à l'analyse, et d) on utilise les résultats des mesures pour calculer statistiquement, par exemple par extrapolation au temps zéro, la quantité des micro-organismes présents dans 1' échantillon de départ. Cette méthode, bien différente des techniques fluorométriques de l'art antérieur où le but recherché nlest que de mesurer la concentration de micro-organismes présents dans un échantillon donné à un moment donné, et non pas le mode et le taux de développement avec le temps de ce micro-organisme, est, en soi, à rapprocher des méthodes classiques suivant lesquelles on ensemence, en boites de Petri, des échantillons à analyser sur des milieux de culture appropriés et, après un temps donné souvent relativement long (24 à 48h), on observe visuellement les milieux de cultures afin de détecter ltéventuel- le apparition des colonies de micro-organismes dont on soupçonnait la présence dans 1' échantillon à analyser. Cependant, la méthode de l'invention présente les avantages considérables suivants par rapport aux méthodes classiques: 1) Elle est beaucoup plus sensible du fait que les signaux de fluorescence sont déjà mesurables pour des quantités de substance fluo rescente extrement faibles. 2) Elle est plus précise, en raison de la qualité intrinsèque des mesures opto-fluorimétriques, en comparaison avec les méthodes visuelles classiques de comptage, par exemple sous microscope ou sous la loupe. 3) Elle est plus rapide car sa sensibilité permet d'effectuer les mesures relativement peu de temps après l'ensemencement des milieux de culture. 4) Elle est plus sélective car les micro-organismes peuvent etre distingués non seulement par leur taux de croissance spécifique dans un milieu donné mais, dans de noMbreux cas, par la nature du signal de fluorescence du complexe fluorescent, (temps de réponse, contenu chromatique et forme de la courbe d'intensité d'émission). Parmi les substances utilisables pour engendrer un signal de fluorescence, on peut citer, de préférence, les "substrats fluorogéniques" qui comprennent des substrats (non fluorescents au départ) consomma- bles par les micro-organismes, cette consommation ayant pour effet de libérer un agent fluorescent en quantité proportionnelle à celle des micro-organismes présents. En effet, ces substrats fluorogéniques sont constitués d'une base sucrée, aminée ou lipidique à laquelle est liée un groupement potentiellement fluorescent, cette fluorescence n'apparaissant que lors de la scission, par les enzymes produits par les micro-organismes, de ce groupement. Parmi les substrats fluorogéniques, on peut citer les corps suivants: 4-méthyl-umbelliféryl- ss -D-glucopyrannoside; 4-méthylumbelli féryl- -Dgalactopyranms ide; glycine- -naph tylamide; leucine-p-naph- tylamide; diacétate et dibutyrate de fluorescéine. On préfère utiliser les substrats fluorogéniques car, avant libération de la portion fluorescente, ceux-ci sont totalement non fluorescents et ne provoquent pas un signal de fond dans le fluorirètre. La présente invention peut également s'appliquer aux antibiogrammes, c'est à dire aux tests permettant de déterminer l'activité inhibitrice des antibiotiques (ou autres substances apparentés) sur la croissance des micro-organismes. Pour la mise en oeuvre d'un tel test, on procède conne suit: a) on s'électionne une souche de micro-organismes de développement positif sur un milieu de culture donné et, après avoir ajouté un substrat fluorogénique et l'antibiotique à tester à un tel milieu, on ensemence celui-ci par lesdits micro-organismes, - et le maintient dans des conditions propices à la croissance de ceux-ci, b) à intervalles de temps, on irradie ledit milieu et on mesure le degré d'intensité de la fluorescence qui en résulte ce qui permet de déterminer la vitesse de croissance desdits micro-organismes, c) on compare le taux ainsi mesuré avec celui obtenu de manière similaire dans une culture exempte de l'antibiotique à tester de manière à déterminer le degré du pouvoir inhibiteur de celui-ci. Bien entendu, on pourra alors répéter les étapes a) à c) ci-dessus en utilisant d'autres concentrations de l'antibiotique afin d' éden tuellement déterminer, par rapport aux micro-organismes sélectionnés, quelles sont les quantités mimimum d'antibiotiques nécessaires pour inhiber, de façon significative, la croissance desdits micro-organis- mes. Il est également évident que pour établir un spectre d'action plus complet, on répétera le test ci-dessus vis à vis d'autres micro-organismes. Inversément, il pourra s 'agir, dans certains cas, de découvrir une substance aux propriétés antibiotiques vis à vis de types de micro-organismes non encore identifiés mais dont au moins un milieu favorable de culture a été déterminé. On procédera alors comme décrit ci-dessus à partir de cultures identiques desdits micro-organismes non identifiés et en faisant varier, d'un test à l'autre, la nature de l'antibiotique mis en jeu, ceci de manière à déterminer, parmi les substances inhibitrices dont on dispose, laquelle est la plus indiquée pour lutter contre contre une infection provoquée par lesdits micro-organismes non identifiés. La présente invention peut encore s'appliquer au test dit de "Ames" qui consiste à déterminer si une substance quelconque est, ou non, carcinogénique. Pour la mise en oeuvre d'un tel test on ensemence un milieu de culture approprié par un micro-organisme, en 1' occur- rence Salmonella tiphiirurium (histidine moins), qui, normalement, presente un taux de croissance nul dans un tel milieu. Par contre, les mutants de S. tiphinurlun (his-) tels que ceux provoqués par un produit cancérigène se développent positivement dans un tel milieu, ce qu'on met en évidence par la formation de colonies de tels mutants. Dans le cas de l'application de la méthode de la présente invention au test de "Ames" on procède comme suit: a) on ensemence de la gélose SS salmonella sans histidine con tenant un substrat fluorogènique et la substance éventuellement mu tagète avec une souche de S. thiphimurium (hie) et on maintient l'échantillon dans des conditions propices à la croissance des bactér ies. b) à intervales de temps, on irradie ledit milieu et on mesure l'intensité de la fluorescence éventuellement émise par l1échantil- lon, ce qui permet de déterminer si la substance examinée est, ou non mutagène, et, le cas échéant, suivant la forme de la courbe de fluorescence, son degré d'activité-en fonction de la vitesse de dévelop pement desdits mutants. Bien entendu, en utilisant le fluorimètre de l'invention, on peut soumettre simultanément au test d'Ames une sé- rie d'échantillons conforme à la description sus-mentionnée et qui diffèrent les uns des autres, soit par la nature de la substance à étudier soit par la concentration de celle-ci dans le milieu de culture. Le fluorimetre pour mettre en oeuvre la présente invention comprend un plateau porte-réactifs circulaire tournant creusé d'alvéoles pour contenir les échantillons à analyser et les réactifs nécessaires, un dispositif optique pour émettre un rayonnement d'excitation par impulsions, ce rayonnementr de longueur d'onde choisie, étant appliqué, lors de la mesure, sur les échantillons; un dispositif détecteur pour capter et diriger la lumière de fluorescence émise par échéant tillon sur un photodétecteur, et un centre électronique de contrôle, de commande, de traitement et d'affichage des résultats auquel le dis positif d'excitation et le plateau tournant sont asservis, chacune des alvéoles de celui-ci étant amenée par rotation dudit plateau en regard des dispositifs d'excitation et de détection sur commande dudit centre de contrôle, le tout de manière que, lors d'une séquence de mesures, chaque échantillon soit, tout à tour, irradié et le si- gnal de fluorescence détecté, aplifié, traité et affiché par l'en tremise dudit centre de contrôle. On va maintenant décrire plus en détail commuent on peut mettre en oeuvre une application de la méthode de l'invention, cette descr ip- tion étant étayée par le dessin annexé. la Fig. 1 représente schématiquement un fluorimètre à impulsions pour mesurer, à intervalles donnés, la fluorescence d'échantillons de cultures de micro-organismes. La Fig. 2 est un schéma de principe de ce fluorimètre comprenant, en plus, sds organes électroniques de commande et d'enregistrement. La Fig. 3 est un graphique consignant les résultats de mesures de fluorescences effectuées sur des cultures pures dlun premier micro-organisme. La Fig. 4 est un graphique similaire à celui de la fig. 3 mais concernant une seconde souche de micro-organismes. La fig. 5 est un graphique consignant les résultats de mesures de fluorescence effectuées sur des cultures de staphylocoques en présence, ou non, d'antibiotiques. Le fluorirrètre représenté à la fig. 1 comporte, dans ses grand des lignes, un boltier 1 pour loger la partie optique de celui-ci, un plateau porte-réactifs tournant amovible 2 et, solidaire de celui-ci mais séparable à volonté, un couvercle 3 entraînable en rotation par un moteur 4. Le plateau 2 est en un métal résistant à la corrosion et bon oen ducteur de la chaleur, par exemple le cuivre ou le laiton. 1l est percé de trous 5 dont la partie supérieure est évasée et la partie inférieure filetée de maniere qu'on puisse y adapter un embout 6 dont l'usage sera décrit plus loin. Les trous 5 sont distribués symétriquement de façon annulaire autour de l'axe 7 du plateau et leur nombre est varia'Ule, au choix, et dépend du nombre d'échantillons de milieux de culture qu'on désire analyser simultanément, comme on va le voir. En effet, dans chacun des trous 5, on peut placer, au niveau indiqué par 8, une membrane filtrante ou un papier filtre sur lequel on aura déposé la conposition de culture et les Inicro-organismes à étudier. Cette membrane est retenue en place par un anneau clip 9 fait en un métal bon conducteur de chaleur de manière qu'une température aussi constante que possible soit maintenue au niveau des échantillons. Par ailleurs, le plateau 2 est thermostatisé par circulation d'un liquide à la température appropriée à travers le canal circulaire 10, lui-meme alimenté par les conduits axiaux d'entrée et de sortie 11 et 12. L'axe 7 du plateau est maintenu dans un logement du bol- tier 1 grâce à un verrou 13 solidaire de celui-ci s'engageant dans une gorge 14 dudit axe 7. Une plaque circulaire 15, prenant appui sur des ressorts 16 logés dans des cotipartiments du boîtier appuie à frottendent doux contre le plateau 2 et fait office de pièce détanchéi- té optique, évitant que le rayonnement d'excitation ne se disperse à l'extérieur. Elle est maintenue radialement par des doigts 17. La plaque 15 assure aussi l'étanchéité du dispositif de façon à éviter l'évaporation prématurée du milieu de culture. Le couvercle 3 est rendu solidaire du plateau 2 grâce à un ergot 18 et est maintenu en place par une clavette 19. 1l est muni, sur sa périphérie, d'une denture 20 en prise avec un pignon d'entralne- ment 21 du moteur 4. La partie optique du présent fluorimètre (voir aussi le schéma de la fig. 2) comprend essentiellement une lampe excitatrice 30 (lampe "flash") de puissance réglable dont la lumière, réfléchie par un miroir 31, est condensée par une lentille 32 et filtrée par des filtres interchangeables 33. Ces filtres sont destinés, bien entendu, à sélectionner la ou les longueurs d'ondes choisies pour exciter la fluorescence des substances à analyser. Le rayonnement ainsi filtré traverse ensuite un miroir semi-réféchissant 34 qui en dévie une fraction déterminée et fixe du flux total (environ 10%) en direction d'un détecteur 35 (de référence) dont le rôle sera expliqué plus loin. Puis, après conde-lsation et refiltrage, la lumière d'excitation parvient à 1' échantillon placé dans la cuvette 5 perpendiculairement à celui-ci pour éviter toute réflexion oblique parasite. Une portion de la lumière de f:uorescence (celle-ci étant radiée uniformément dans tout l'angle solide délimité par les parois du trou 5) est collimatée par le système ontique de détection 36, filtrée par le filtre 37, diaphrag mée par le 3iaphragme 38 et appliquée à un photomultiplicateur 39, celu ¯-i donnant naissance à un signal électrique porportionnel à 1' in tensité de la lumière de fluorescence émise. Le présent fluorimètre comprend encore les organes de traitement du signal électrique et de commande suivants: Une horloge 40 de synchronisation fournissant les irrpulsions de commande a, d'une part, un circuit 41 d'alimentation de la lairpe flash 30 et, d'autre part, à des circuits intégrateurs 42 et 43 lesquels sont chargés de transformer les impulsions en provenance, respect il vement, du photomultiplicateur 39 et du détecteur de base 35 en si- gnaux de niveau proportionnel à la grandeur totale de ces impulsions. La présence du détecteur 35 est rendue nécessaire par le fait que les éclairs successifs émis par la lampe 30 n'ont pas tous la meme énergie. En conséquence, grâce au miroir 34, le détecteur 35 recevra un pourcentage constant de l'énergie émise par chaque flash, le rapport (constant) entre l'énergie déviée et l'énergie envoyée sur 1'échantillon étant, en fait, l'élément de référence fondamental du présent système. Ainsi, les signaux issus des intégrateurs 42 et 43 sont en voyés simultanément à un circuit calculateur 44 où s'effectue le calcul de rapport entre le signal de référence (proportionnel à l'impul- sion d'excitation) issu, au départ, du détecteur 35 et le signal de fluorescence intégré dans 1' intégrateur 42. - Le résultat de ce calcul est affiché par un organe d'affichage 45 qui peut etre un instrument de mesure électrique quelconque: voltmètre enregistreur, oscillosco- pe, affichage digital, etc... Oh notera que le circuit du présent fluo rimètre compte encore des amplificateurs 46, 47 pour amplifier, avant intégration, les signaux de référence et de mesure, une alimentation 48 du photomultiplicateur et une ligne de commande 49 entre l'horlo- ge 40 et le moteur 4 dont le rôle va être expliqué plus bas. Dans la pratique habituelle de mise en oeuvre de la première des des applications précitées, on utilise le présent fluorimètre enregistreur comme suit: le plateau 2 et son couvercle 3 étant détachés de l'appareil, on commence par sélectionner un échantillon de souche de micro-organismes à étudier (produit à analyser ou culture de con trolle) et on dépose celui-ci sur un papier filtre ou une membrane filtrante du dialvetre convenable s'insérant dans la cuvette d' analyse 5. On tire ensuite à la trompe à eau par l'intermédiaire de l'embout 6 qu'on a préalablement vissé en place, de manière à éliminer le li quide du filtre et à ne laisser que les micro-organismes sur celui-ci. Puis on ajoute une quantité connue de milieu nutritif choisi pour favoriser la croissance sélective d'un type déterminé de micro-organisme et un substrat fluorogénique. Puis on répète ces opérations de manière à garnir, à volonté, une partie ou la totalité des autres cuvettes d'analyse 5 disponibles sur le plateau. On remonte le plateau 2 ainsi garni dans l'appareil et le cale en place au moyen du verrou 13, après quoi on positionne -et ajuste en place le couvercle 3 grâce à l'ergot 18 et on le fixe en replaçant la clavette 19. On règle la température du plateau 1 au moyen d'un courant de liquide à température constante, par exemple de l'eau à 370C en provenance d'un thermostat non représenté et alimentant ledit plateau par les tubulures 11 et 12. Puis on sélectionne, au moyen de touches (non représenties a" dessin) de lthorloge 40, les différents paramètres opératoires commandés par celle-ci: heure zéro de l'experience, nombre d'é clairs par mesure, intensité des éclairs, temps de succession des é- clairs, nombre de mesures dans le temps et délais entre celles-ci, etc. . Puis, toujours sur l'horloge, on enclenche la commande de mise en marche de l'analyse, les opérations qui en résultent étant les suivantes: Au temps zéro, fixé comme indiqué, le moteur 4 commandé par l'horloge 40 fait tourner le plateau 2 (par l'intermédiaire de son couvercle 3) de manière à amener un premier échantillon en position correcte pour une mesure de fluorescence, c'est à dire, à mettre l'une des cuvettes 5 en regard des systemes optiques - d'excitation et de détection. La lampe flash 30, sur commande de l'horloge, fournit le nomr bre d'éclairs demandés, à l'intensité choisie et aux intervalles se- lectionnés (de l'ordre de la seconde ou de la fraction de seconde) et, avec le léger décalage propre au phénomène de fluorescence, le signal de fluorescence est détecté (après chaque éclair), amplifié dans l'ampli 47, intégré dans 1'intégrateur 42 et envoyé, simultanement avec le signal de référence, dans le calculateur 44 dont le signal de sortie est affiché en 45, de préférence sous forme logarithmique, la conversion du signal en valeurs logarithmiques étant effectuée par ledit calculateur 44. I1 est bien entendu que le calculateur peut fournir des résultats (à l'affichage) indépendants pour chaque éclair ou, mieux, il en fait la moyelme, celle-ci seule étant affichée. I1 est aussi bien entendu que, sur cottirande des circuits de llhor- loge (micro-p.ccesseur), l'intégrateur 42 peut n'intégrer qu'une portion définie du signal photo-détecté et ceci après un temps donné réglable en fonction des paramètres de fluorescence de la substance fluorescente étudiée. I1 est en effet évident qu'on peut, par ce biais, distinguer deux substances fluorescentes différentes, même mélangées entre elles, étant donné qu'avec un fluorochrome commun, les comolexes résultant de l'union de celui-ci avec deux micro-organismes différents peuvent avoir des courbes de fluorescences différentes l'une de l'autre. Le présent fluorimètre peut donc se comporter, suivant les réglages de ses circuits de commande, comme un analyseur du contenu chromatique du signal de fluorescence aussi bien qu:un appareil pour mesurer l'énergie totale du signal de fluorescence émis. Les valeurs de fluorescence du premier échantillon au temps zéro étant enregistrées, l'échantillon ?' 2 est mis en place toujours par rotation du plateau sur commande de l'horloge 40 et la séquence des opérations cidesus se répète, et ainsi de suite pour les échantillons restants. La mesure des échantillons au temps zéro peut être effectuée très rapidement, par exemple en quelques secondes pour un plateau comportant de six à dix cuvettes 5. On notera encore à ce propos, que la rotation du plateau 2 est assurée, au moment voulu, al- ternativement dans un sens ou dans l'autre, ceci afin d'éviter, le cas échéant, que les tuyaux souples amenant le liquide theroostati- sé aux canalisations 11 et 12 ne subissent des torsions exagérées. Puis, toujours sous contrôle de l'horloge, l'incubation des cultures dans chaque cuvette se poursuit et, après un temps donné (quel ques minutes, 1/2 h, 1 h, par exemple), les mesures sont refaites et les résultats enregistrés, par exemple sous forme d'un second point sur un enregistreur à papier. La succession des points obtenus après un certain nombre de mesures forme alors, pour chaque échantillon, une courbe illustrant la croissance des micro-organismes avec le temps. S'il s'agit de cultures pures, on peut, par référence au résultats d'analyses traditionnelles, mettre en rapport les résultats des courbes de fluorescence avec les concentrations effectives des micro-organismes considérés. On peut ainsi obtenir des courbes standard pour chaque micro-organisme considéré. On va voir, dans les exemples qui suivent, comment on réalise, pratiquement, de telles courbes standard pour certains micro-organismes connus et comment on utilise ces cour bes pour l'anlyse d'un échantillon contamine. Par ailleurs, l'utilisation du fluorimètre pour la mise en oeuvre des seconde et troisième applications de l'invention est absolument similaire et évidente pour l'homme de métier sur la base des explications qui précèdent. Des exemples concrets de telles aplications sont également fournis plus loin. Exemple 1 Courbes de fluorescence avec Escherichia coli On a utilisé un fluorimètre conforme à la description qui précède comportant une lampe excitative à'Xenon type FX-198-U (RG & G Electro-optics Co., Salem, Mass. USA) et un photodétecteur de type 1P28. Les filtres étaier.L destinés à laisser passer, à l'excitation, les longueurs d'onde A= 384 nm, et à l'émission, les longueurs d'on des r= 492 nm. Ottmrne échantillon d'étalonnage, on a utilisé les suspensions de concentrations suivantes, par ml, d'Escherichia coli: A 107; B 106; C 105; D 104; E zéro (contrôle). On a placé 0,1 ml de la suspension A sur une membrane filtrante disposée dans la cuvette du plateau du fluorimètre puis, après avoir tiré au vide de 10-12 Torr pendant quelques secondes, on a ajouté 0,1 ml de solution nutritive (gélose de Mr Conkey, dans l'eau à 52 g/l) et 0,1 ml d'une solution à 0,1t de 4-méthylumbelliféryl-&beta;-D-glucoside en solution de Ringer. La membrane poreuse utilisée au fond de la cuvette était une membru ne "Millipore Swinnex" (pores 0,45 p)de 13 irm de diamètre. Puis on a répété la même opération et chargé les autres cuvettes du plateau avec les suspensions B, C1 D et E et les réactifs correspondants. On a alors mis en marche le fluorimètre aux conditions opératoires suivantes: température du plateau: 370C; nombre de flashes par mesure et par échantillon: 3, séparés par 0,5 sec; énergie d'un éclair: 0,1 joule; durée de l'éclair: 10 sec; période entre les mesures: 1 h; temps de l'analyse: 8 h. Les résultats des mesures ont été enregis trés par une imprimante numérique de type courant- et sont rassemblés sous forme d'un graphique représenté à la fig. 3. Sur ce graphique, on a porté les heures en abcisses et le signal de fluorescence en unités arbitraires en ordonnées. Les courbes relatives aux échantillons sont désignées par leur lettre respective. On voit sur ce graphique que, après un certain temps de latence au cours duquel la fluorescence diminue (ceci se produit également pour le contrôle dont la fluorescence, en principe nulle, constitue le bruit de fond de l'appareil), le signal croît régulièrement jusqu a atteindre un palier (point de saturation). Ces courbes constituent donc des courbes étalon grâce auxquelles il est possible d'identifier, par comparaison, dans un échantillon quelconque, la présence d'Escherichia coli et d'évaluer sa con centration d'origine dans ledit échantillon. Exemple 2 Courbes de fluorescence avec Salmonella shigella On a procédé de maniere similaire à ce qui est décrit à l'Exem- ple 1 au moyen d'échantillons A', B', C' D' et El contenant Salmonella shigella aux concentrations par ml respectives suivantes: A' 107; B' 106; C' 10S; D' 104; E' zéro (contrôle). On a- utilisé comme milieu nutritif 0,1 ml dune solution de "Gelose SS" à 60 g/l et le meme indicateur fluorescent que dans l'Exemple précédent. Puis on- a prccé- dé aux mesures avec le même fluorimètre et dans les mêmes conditions opératoires que celles de l'Exemple précédent. Les résultats obtenus sont présentés sous forme du graphique de la Fig. 4 où les lettres désignent, respectivement, les courbes de réponse des différents échantillons analysés. On voit que la forme générale de ces courbes est bien distincte de celles de l'S eRple précédent. Exemple 3 Analyse d'un échantillon contaminé simultanément par Escherichia coli et Salmonella shigella On a préparé un échantillon de lait contaminé en mélangeant dans celui-ci des portions de cultures des deux micro-organismes sus-men- tionnés. On a prélevé 10 ml de ce lait contaminé et on l'a dégraissé dans une centrifugeuse Haereus de laboratoire à 3000 rpn pendant 10 min. On a prélevé 4 échantillons de lait écrémé de 0,1 ml et on les a déposés dans quatre des cuvettes d'un fluorimètre analyseur tel que décrit cidessus, le fond de chaque cuvette ayant été préalablement garni d'une membrane filtrante "Millipore Swinnex" de 0,45 p. Puis, après avoir séché les échantillons par aspiration, comme déjà décrit, on a déposé sur deux d'entre-eux (F et G) 0,1 ml de la solution de "Gélose de Mc Conkey" (voir Exemple 1) et, sur les deux autres (H et I), 0,1 ml de solution de "Gelose SS" (voir Exemple 2). On a encore ajouté l'indicateur de fluorescence et on a procédé exactement comme dans les Exemples précédent. Les mesures ont donné les résultats suivants: Les échantillons F et G ont donné naissance à une courbe de fluorescence de forme sente blable à celles de la Fig . 3, cette courbe se situant approximativement à équidistance entre les courbes C et D; on en a donc conclu que la concentration initiale dans le lait écrémé à analyser d'Escherichia coli était comprise entre 10 000 et 100.000 bactéries/ml Les échantillons H et 1 ont donné des courbes se situant légè -rement au-dessus de la courbe B' de la Fig. 4. On en a donc conclu que le lait contaminé contenait un peu plus d'un million de Salmonella par mi. I1 reste bien entendu que les tests cidessus sont applicables à d'aunes micro-organismes mis en cultures sur d'autres milieu nutritifs; à titre d'exemples on peut citer les Streptocoques élevés en milieu de Litsksy (acide + violet d'éthyle) - les Staphylocoques en milieu de Chaman (mannitol + agar-sel) - Champignons et moisissures sur gélose "Fungiphil" (Biomérieux) - levures sur gélose de Sabouraud. etc... Exemple 4 Réalisation d'un antibiogramme On a utilisé un fluorirrètre conforme à celui décrit dans la présente spécification pour la détermination simultanée du pouvoir antibiotique de quatre substances différentes : la pénicilline (1), la gentamicine (2), l'ampicilline (3) et l'erytromycine (4). Pour ce faire, on a placé Q,1 ml d'une suspension à 105 germes/ml de staphylococcus aureus sur une membrane poreuse de 13 mm de diare- tre (membrane "Millipore Swinnex", pores de 0,45 ) placée dans une des alvéoles du plateau de mesure du fluorimètre. On a tiré à la trous pe à eau pour sécher la membrane puis on a ajouté successivement 0,1 ml de milieu de "Chlapman et Stone" (solution nutritive), 0,1 ml d'une solution de 4-méthylumbelliféryl-ss-D-glucoside à 0,1 % dans de la solution de Ringer et 0,1 ml d'une solution de l'antibiotique (1) à 1 pg/ml. on a chargé identiquement 4 autres alvéoles dudit plateau, mais en ajoutant sur chacun de 3 d'entre-eux la même quantité d'un des antibiotiques (2), (3) et (4) restants. La cinquième cuvette n'a pas reçu d'antibiotiques (témoin). On a ensuite mis le fluorimetre en marche et travaillé comme décrit en détail à l'Exemple 1 avec les différences suivantes : périodes entre les mesures 1/2 h, temps total de 1' analyse 5 h. Corrane décrit à l'Exemple 1, les résultats ont été enregistrés automatiquement sur un ruban de papier et sont consignés schématiquement sur le gra- phique de la fig. 5, ce graphique étant établi suivant les mêmes critères que ceux des figs. 3 et 4. Les courbes représentant la repos se de chacun des échantillons sont dérignées par les numéros respec- tifs désignant, comme indiqué plus haut, les antibiotiques étudiés. Le témoin n'est pas numéroté. On voit, par les résultats du graphique de la fig. 5, que la pénicilline n'a qu'un effet insignifiant sur la croissance de S. aureus, tandis que les autres antibiotiques inhibent nettement cette croissance et, plus particulièrement, l'erythrorrycine. Exemple 5 Réalisation dlun-test de Ames On a procédé exactement congre décrit aux ExempAes précédents à partir des réactifs suivants : suspension de Salmonella typhimurium (his-) à 105 germes/ml : 0,1 ml; solution nutritive (gélose SS salmonella sans histidine) : 0,1 ml; solution Ringer de 4-méthylumbel- liferyl-p-Dg¸coside à 0,1 % : 0,1 ml; substance dont le pouvoir mu- tagène est à déterminer en solution aqueuse à 1 yugvml : 0,1 ml. Par -mi celle-ci, on a sélectionné la tartrazine (un colorant alimentaire) et le caramel ordinaire (obtenu par pyrolyse du sucre). On a opéré comme décrit aux exemples précédents (durée du test 6 h) et en examinant les courbes de fluorescence, on a constaté que la fluorescence de l'échantillon contenant la tartrazine avait augmenté au cours du temps tandis que celle de l'échantillon contenant le caramel n1 avait pas évolué. On en a donc conclu que la tartrazi ne présente un pouvoir nutagénique et qu'elle est peut-être cancéri- gène aux concentrations du test alors que cela n'est pas le cas du caramel.

Claims: REVENDICATIONS 1. Methode pour qualitativement et/ou quantitativement suivre invivo le développement de micro-organismes croissant sur un milieu de culture, par l'entremise de mesures périodiques de fluorescence dont l'intensité est proportionnelle à la quantité des micro-organismes présents au moment de la mesure, caractérisée par le fait que, lors de l'ensemencement dudit milieu de culture avec lesdits micro-organismes, on ajoute à celui-ci un excès d'une substance fluorogénique ne possédant que peu ou pas de fluorescence propre mais capable de réagir avec lesdits micro-organismes et, par cela, de fournir audit milieu sans porter préjudice au.développement de ceux-ci, un agent émetteur de fluorescence, la quantité ajoutée de ladite substance fluorogénique constituant une réserve potentielle suffisante dudit agent fluorescent quel que soit le degré dudit développement au terme desdites mesures périodiques. 2. Application de la méthode de la revendication 1 à la détection, l'identification et/ou le dosage un ou plusieurs types de micro-organismes dans des échantillons de matières organiques ou minérales dans laquelle a) on ensemence avec des aliquots de l'échantillon à analyser une série de milieux ou coirpositions de culture différentes, chacun d'entre ceux-ci étant apte à promouvoir la croissance sélective d'au moins une souche distincte de micro-organismes, contenant au moins une substance fluorogénique pouvant causer, sous l'influence d'une irradiation convenable et en présence de micro-organismes, une émission de fluorescence d'intensité proportionnelle à la quantité de ceuxci, b) à intervalles de temps, on irradie ledit milieu de culture et on mesure le degré d'intensité de cette fluorescence dans chaque milieu de culture de manière à observer l'évolution de la croissance desdits microorganismes et, le cas échéant, le taux de celle-ci, c) on compare les taux ainsi mesurés avec des taux de croissant ce standard établis, dans les mêmes milieux et dans les memes conditions pour des cultures de chacune des souches à l'état pur, de manière à identifier les micro-organismes soumis à l'analyse, et d) on utilise les résultats des mesures pour estimer ou calculer statistiquement, par exemple par extrapolation au temps zéro, la quantité des micro-organismes présents dans 1' échantillon de départ. 3. Application suivant la revendication 2, caractérisée par le fait que ladite substance provoquant la fluorescence est un substrat fluorogénique. 4. Application suivant la revendication 3, caractérisée par le fait que le composé fluorogénique est choisi parmi les 4-méthylumbel- liféryl-A-D-glucopyrannosides. 5. Application suivant la revendication 2, caractérisée par le fait que l'irradiation se fait par impulsions d'une lape flash, le signal fluorescent résultant étant photodétecté, dirplifié, comparé à un signal de référence et le résultat de la comparaison affiché sur un système d'affichage ou d'enregistremclt. 6. Application de la méthode de la revendication 1 à la réalisation d'un antibiograrre suivant laquelle: a) on sélectionne une souche de micro-organismes de développement positif sur un milieu de culture donné et, après y avoir ajouté un substat fluorogénique et un antibiotique à tester, on ensemence celui-ci avec lesdits micro-organismes et le maintient dans des conditions propices à la croissance de ceux-ci, b) à intervalles de temps, on irradie ledit milieu et on mesure le degré d'intensité de la fluorescence qui en résulte ce qui permet de déterminer la vitesse de croissance desdits micro-organismes, c) on compare ce taux ainsi mesuré avec celui obtenu de manière similaire au moyen d'une culture exempte de l'antibiotique étudié ce qui permet de déterminer le caractère inhibiteur ou non inhibiteur -de celui-ci et son degré d'activié. 7. Application suivant la revendication 6, caractérisée par le fait quton opère sur plusieurs échantillons de culture identiques, chacun d'entre eux contenant une concentration différente dudit antibiotique. 8. Application suivant la revendication 6, caractérisée par le fait qu'on opère sur des cultures de micro-organismes différents, chacun d'entre eux contenant une meme concentration dudit antibiotique 9. Application suivant la revendication 6, caractérisée par le fait qu'on opère sur plusieurs échantillons de culture identiques, chacun d'entre-eux contenant un antibiotique différent. 10. Application de la méthode de la revendication 1 à la réalisation du test d't'Ames" pour la détermination du pouvoir cancérigè- ne d'une matiere, caractérisée par le fait que, a) on ensemence de la gélose SS salmonella sans histidine contenant un substrat fluorogénique et la matière à étudier avec une souche de Salmonella thiphimurium (hie) et on maintient l'échantillon dans des conditions favorables au développement des bactéries, b) à intervalles de temps, on irradie ledit milieu et on mesure l'intensité de la fluorescence éventuellement émise par l'échantillon. 11. Application suivant la revendication 10, caractérisée par le fait qu'on opère sur plusieurs échantillons différents l'un de 11au- tre, soit par la nature de ladite matière, soit par la concentrat on de celle-ci dans le milieu de culture. 12. Fluorimètre pour mettre en oeuvre la méthode suivant la revendication 1, comprenant essentiellement un plateau porte-réactifs tournant creusé d'alvéoles destinées à recevoir les échantillons d'analyse et les réactifs nécessaires à celle-ci; un dispositif optique pour émettre un rayonnement d'excitation par irrpulsions, ce rayonnement, de longueur d'onde choisie, étant appliqué, lors de la mesure sur les échantillons; un dispositif détecteur pour capter et diriger la lumière de fluorescence émise par lléchantillon sur un photodétecteur; et un centre de contrôle et de calcul pour commander les fonctions du fluorimètre et notamment, traiter les signaux détectés et afficher les résultats des mesures, le dispositif d'excitation et ledit plateau étant, pour leur part, asservis audit centre de contrôle de manière que, sur commande de celui-ci, chacune des alveoles de ce plateau puisse être amenée en regard des dispositifs excitateur et détecteur, le tout étant agencé pour que, lors des mesures, chaque échantillon soit, tour à tour, irradié par le rayonnement excitateur, et le signal de fluorescence détecté, amplifié, traité et affiché par l'entremise dudit centre de contrôle. 13. Fluorimètre suivant la revendication 12, caractérisé par le -fait que le dispositif excitateur comprend une lampe flash fournissant des éclairs d'énergie réglable pouvant aller jusqu'à environ I Ws. 14. Fluorimètre suivant la revendication 12, caractérisé par le fait que la lumière d'excitation est dirigée perpendiculairement au milieu fluorescent, de manière à éviter les réflexions parasites en direction du photodétecteur. 15. Fluorirrètre suivant la revendication 12, caractérisé par le fait que les résultats des mesures sont affichés sur un dispositif enregistreur les imprimant sous forme de valeurs logarithmiques, ces valeurs étant calculées, à partir des signaux analogiques détectés et traités, par ledit centre de controle. 16. Utilisation du fluorimètre selon les revendications 12 à 15 pour la réalisation des applications-selon les revendications 2 à 11.

Inventors: AYERBE, ANDRE, HAUERT, BERNARD, MOULIN, MICHEL, REVILLET, GEORGES, THEVOZ, MICHEL, VAN SCHOUWENBURG, AALTJE, Ayerbe, André
Applicants: BATTELLE MEMORIAL INSTITUTE
Application year: 1981
Main classification: C12Q1
IPC codes: C12Q1, C12M1, G01N21