PROCESS FOR PREPARING PEARL-SHAPED BIOCATALYSTS COMPRISING AN EXTREMELY SENSITIVE ENZYMATICALLY ACTIVE SUBSTANCE

Abstract: 1. A method for producing bead-like biocatalysts with extreme enzymatically active substance by ionic network of polycations in using the mixture (A) as solution or suspension of an enzymatically active substance in the aqueous solution of a polyelectrode, characterized in that in mixture (A) a protonized chitosan or a natural polymer or a natural polymer after chemical modification or a synthetic cationic polyelectrolyte in a concentration range of 0,1 to 15 % by weight is used as cationic polyelectrolyte, and as a precipitation bath the solution of a polyvalent anion in a temperature range of -5 degrees C to 80 degrees C is used as mixture (B), and in stage 1 the mixture (A) being injected into the mixture (B), thus forming bead-like particles of a grain range of about 0,5 to about 10 mm, and said particles being compacted under stirring within a period of about 5 minutes to 4 hours, and in stage 2 the formed catalyst beads being filtered out with the entrapped enzymatically active substance, and for equilibration being introduced into an aqueous solution stabilizing the enzyme system and the network, and thereafter being discharged in the moist condition.

Description: Die Fixierung von Enzymen,Zellfragmenten und ganzen Zellen hat in jüngster Zeit in der Fachwelt besondere Aufmerksamkeit gefunden.Dies liegt daran,dass solche Verfahren für die industrielle,biokatalytische Produktion von technischer und wirtschaftlicher Bedeutung ist. Ein nicht veröffentlichtes Verfahren zur Herstellung von Biokatalysatoren mit hoher mechanischer Festigkeit und hoher Beladung an enzymatisch aktiver Substanz durch Polymereinschluss von ganzen Zellen,Zellfragmenten oder Enzymen ist Gegenstand des Patentes ... ... (Patentanmeldung P 28 35 875.0). Dieses Verfahren betrifft die Herstellung einer Suspension oder Lösung (A) einer enzymatisch aktiven Substanz in der wässrigen Lösung eines Polyelektrolyten und eines Fällungsbades (B) aus einer Lösung einer Verbindung,die mehrwertige,dem Polyelektrolyten der Mischung (A) entgegengesetzt geladenen Ionen, enthält. Es werden aus den Mischungen (A) und (B) durch Eindüsen von (A) in (B) perlförmige Teilchen im Kornbereich von etwa 0,5 bis 5 mm hergestellt,die an ihrer Oberfläche etwa 5 min bis 4 h verfestigt werden,daraus wird in Stufe 2 durch Waschen mit physiologischer Salzlösung und und in Stufe 3 durch schonende Trocknung mit Luft einer Temperatur bis 80 C bis etwa 48 h und in Stufe 4 durch Eintragen in ein Fällungsbad der Mischung (B) und durch einen Waschprozess in Stufe 5 ale ickatalysatoren eraestellt. Die nach diesem Verfahren hergestellten Biokatalysatorn-Perlen weisen eine none mechanische Festigkeit unc eine hohe Beladung an enzymatisch aktiver Substanz auf. Die Druckfestigkeiten solcher Kataly satorenperlen weisen eine DruckEestig- zeit (P/ Perlt) von üe 300 bis 1000 und eine Beladung in Gramm enzymatischer Substanz pro Gramm Katalysatorperlen bis 0,9 auf.rs können bereits Werte er 0,2 als höher als der bisher bekannte Stand der Technik bezeichnet werden. Ein anderes,nicht veröffentlichtes Verfahren zur Herstellung von Biokata lysatoren mit hoher mechanischer Festig keit und hoher Beladung an enzymatisch sktiver Substanz durch Polymereinschluss von ganzen Zellen , Zellfragmenten, oder Enzymen ist dadurch gekennzeichnet,dass in Stufe 1 die Mischung (A),welche einen kationischen Polyelektrolyten im Konzentrationsbereich von o,l bis 15 Gew.-% enthält in die Mischung (B) mit einem ,ein mednrtiges Anion enthaltenden Verbindung im Konzentrationsbereich von 0,02 bis 35 Gew.-% eingedüst wird unter Bildung perlförmiger Teilchen eines Kornbereiches von etwa 0,5 bis etwa lo mm und diese unter Rühren in einer Zeit zwischen etwa 0,5 bis 4 h verfestigt werden und in Stufe 2 die Katalysatorenperlen mit der eingeschlossenen enzymatischen Substand abfiltriert,mit Wasser gewaschen oder einer wässrigen Salzlösung gewaschen und in Stufe 3 durch überleiten von Luft einer Temperatur bis 800C bis etwa 48 h unter Schrumfung und Verfestigung getrocknet werden und in Stufe 4 die Katalysatorenperlen zur Äquilibrierung in eine, das Enzym-System und das Netzwerk stabilisierende wässrige Lösung eingebracht und danach im feuchten Zustand bis nach etwa 24 h ausgeführt werden. Nach dem Verfahren gemäss der Erfindung liegt auch ersbwLig eine ionotrope Matrix vor,die in der Lösung eines Phosphatpuffers stabil ist. Dieses Verfahren nach Patent ... .. . (Patentanmeldung:Zusatzanmeldung zur Patentanmelaung P 28 35 875.0,datiert auf den 28.01.80.) wird durch das Verfahren der Erfindung erweitert. Das Verfahren der Erfindung stellt sich die Aufgabe, nun auch hochempfindliche Enzyme oder Enzym-Systeme,insbesondere lebende Zellen, zu immobilisieren und in einer Phosphat-Pufferlösung aktiv zu erhalten. Diese erweiterte Aufgabe kann durch die Verfahren nach dem noch nicht ver öffentlichten Stand der Technik nicht gelöst werden.Die einfache Vernetzung mit Alginat,auch ohne Härtung,kann diese Aufgabe der Technik nicht lösen, weil die Matrix sich in einer Phosphat Pufferlösung wieder auflöst. Dazu wird auf S.Suzuki und J.Karube in Immobilized Microbial Cells,ACS Symposium Series 106,1979,Seite 60,hingewiesen. Es ist zwar durch Verwendung des kationischen Polyelektrolyten "Chitosan" möglich, diese Auflösung zu verhindern,aber es ist die Verfahrensstufe der Trocknung der Katalysatorperlen auf hochempfindliche Systeme nicht anwendbar.Dieser Nachteil wird durch das Verfahren der Erfindung überwunden und dieser nicht veröffentlichte Stand der Technik auf solche hochempfindlichen Systeme erweitert. Zur Lösung dieser Aufgabe des Verfahrens der Erfindung wird in Stufe 1 die Mischung (A) als Lösung oder Suspension einer enzymatisch aktiven Substanz in der wässrigen Lösung eines kationischen Polyelektrolyten in einem Konzentrationsbereich von 0,1 bis 15 Gew,-% in die Mischung (B) als Fällungsbad aus der Lösung eines mehrwertigen Anions im Temperaturbereich von - 50C bis 800C eingedüst unter Entstehung perlförmiger Teilchen mit einem bestimmten Kornbereich von etwa 0,5 bis etwa lo mm und diese unter Rühren innerhalb einer Verweilzeit von etwa 5 min bis 4 h verfestigt und danach in Stufe 2 die gebildeten Katalysatorperlen mit der eingeschlossenen enzymatisch aktiven Substanz abfiltriert und zur Äquilibrierung in eine,das Enzym System und das Netzwerk stabilisierende, wässrige Lösung eingebracht und danach im feuchten Zustand ausgeführt. Das Verfahren der Erfindung ist im Patentanspruch 1 definiert. Die alternative Ausgestaltung des Verfahrens der Erfindung ist in den Unteransprüchen definiert. Diese betreffen die enzymatich aktive Substanz aus vermehrungsfähigen,ganzen Zellen oder Zellfragmenten oder aus einem isoliertem Enzym oder einem Enzym-Komplex,vorzugsweise aus gegen mehrwertige Kationen empfindlichen oder mechanisch empfindlichen oder temperatur empfindlichen oder trocknungsempfindlichen Zellen, Zellfragmenten oder Enzymen. Diese betreffen auch die Mischung (A) in die als kationischer Polyelektrolyt ein natürliches Polymer oder ein natür liches Polymer nach chemischer Modifi zierung eingesetzt wird,oder auch ein synthetischer kationischer Polyelek trolyt und zwar solche,die ionisch vernetzbar sind. Diese betreffen auch die Mischung (B), in welcher als ionische Verbindung mit mehrwertigem Anion die Verbindungen K4(Fe(cN)6)und/oder K3(Fe(CN)6) oder ein mehrwertiges Polyphosphat mit einem polymergrad kleiner 15 eingesetzt werden. Diese betreffen auch die Stufe 2,in welcher zur Äquilibrierung des Enzym Systems und des Netzwerkes eine Phosphat Pufferlösung eingesetzt wird. Das Verfahren der Erfindung wird durch das fclgende Ausführungsbeispiel beschrieben Dieses ist jedoch nicht auf dieses Beispiel beschränkt. Beispiel 1 Es wird die Mischung (A) durch Suspension von 2,5 g Pseudomonas 3ab DSM 672 in Form der zentrifugierten leuchten Masse in 27,5 g einer 2,0 Gew.-igen, wässrigen Chitosan-acetat-Lösung als Polyelektrolyt hergestellt. Als Fällungsbad (B) mT-t der Verbindung, die mehrwertige Ionen enthält, die dem Polyelektrolyten der Mischung (A) entgegengesetzt geladen sind, wird eine 0,05 molare K4(Fe(CN)6)- Lösung verwendet. Es wird dann in Stufe 1 in die Mischung (B) eingetropft, wobei periförmige Teilchen mit einem Durchmesser von ca. 5 mm entstehen. Diese werden unter weiterem Rühren bei einer Verweilzeit von 45 Minuten verfestigt. Es werden danach in Stufe 2 die gebildeten Katalysatorperlen mit der eingeschlossenen enzymatisch aktiven Substanz abfiltriert. Es werden danach die Perlen zur Aquilibierung in eine 0,1 molare K-Phosphat-Pufferlösung mit pH 8,5 für einen Zeitraum von 3 Stunden gegeben. Unter Einsatz dieser, nach dem Verfahren der Erfindung erzeugter Biokatalysatorperlen ist es möglich,die Synthese von Serin aus Glycin und Methanol nach dem Verfahren der DE-AS 2 554 530 durchzuführen mit einer relativen Aktivität von 15 %.Diese relative Aktivität ergibt sich aus dem Vergleich des Umsatzes,der sich nach 8 h mit jeweils 2 g BFM in freiem und immobilisierten Zustand in 100 ml Testlqsung (10 g/l Glycin;o,8 % 0 Methanol) einstellt.Dabei betrug die Temperatur 30 C und es wurde in einem Medium nach Jayasuria,Journ.Chem.Microbial. 12 (1955),419, bei einem pH-Wert von 8,5 gearbeitet. Das Verfahren der Erfindung löst die erweiterte Aufgabe der Anwendung auf hochempfindliche Systeme unter Erhaltung der Aktivität. Es wird zur Lösung der Aufgabe der Erfindung auf die hohe Beladung und die hohe Festigkeit der Biokatalysatoren gemäss der Erfindung verzichtet,die durch den Trocknungsprozess erzielt wird. Die katalytische Aktivität der Pseudomonas Zellen nach dem Beispiel war nach dieser Trocknunggstufe auf den Wert Null abgesunken. Es hat sich überraschend gezeigt,dass auch ohne diese Trocknungsstufe eine zwar niedrigere,aber in der Praxis noch ausreichende Festigkeit der Biokatalysatorperlen erzielt wird. Die Katalysatorperlen nach dem Verfahren gemäss der Erfindung sind offenbar aufgrund ihrer Elastizität auch bei intensivem Rühren stabil.Es ist deshalb überraschend möglich, eine biotechnische Synthese mit derartigen, hochempfindlichen Enzymen oder Enzym-Systemen durchzuführen.In dieser Erweiterung der erfindungsgemäss hergestellten Biokatalysatoren auf hochempfindliche Systeme liegt ein für die Biotechnologie erheblicher technischer Vorteil.

Claims: Patentansprüche 1. Verfahren zur Herstellung von perlförmigen Bio katalysatoren mit extrem empfindlicher enzymatisch aktiver Substanz durch ionische Vernetzung von Polykationen unter Verwendung der Mischung (A) als Lösung oder Suspension einer enzymatisch aktiven Substanz in der wässrigen Lösung eines Polyelektrolyten im Konzentrationsbereich von o,5 bis 15 Gew.- & und der Mischung (B)als Fällungsbad durch Lösen einer Verbindung,die mehrwertige,dem Polyelektrolyten der Mischung (A) entge gesetzt geladene Ionen enthält,in einer Konzentration der Verbindung von 0,5 bis 35 Gew.- und in weichem in Stufe 1 die Mischung (A) in die Mischung (B) eingedüst wird unter Bildung perl förmiger Teilchen eines Kornbereiches von,5 bis etwa lo mm und diese unter Rühren an ihrer Oberfläche zwischen etwa o,5 bis 4 h verfestigt werden und in dem in Stufe 2 die Katalysatorperlen mit der eingeschlossenen enzymatisch aktiven Substanz abfiltriert,mi.t Wasser oder einer wässrigen Salzlösung gewaschen ünd in Stufe 3 durch überleiten von Luft einer Temperatur bis 80 C bis etwa 48 h unter Schrumpfung und Verfestigung ge trocknet werden, und in dem in Stufe 4 die Katalysatorperlen zur Äquill brierung in eine,das Enzym-System und das Netzwerk stabilisierende wässrige Lösung eingebracht und danach im feuchten Zustand bis nach etwa 24 h ausgeführt werden, in Fortentwicklung des Verfahrens nach Patent... ... (Patentanmeldung: :Zusatzanmeldung zur Patentanmeldung P 28 35 875.0, datiert auf den 28.01.80.), dadurch gekennzeichnet'dass die Mischung (A) als Lösung oder Suspension einer enzymatisch aktiven Substanz in der wässrigen Lösung eines kationischen Polyelektrolyten in einem Konzentrationsbereich von 0,1 bis 15 Gew.-% in Stufe 1 in an sich bekannter Weise in die Mischung (B) als Fällungsbad aus der Lösung eines mehrwertigen Anions im Temperaturbereich von - 5 0C bis 80 0C eingedüst wird unter Entstehung perlförmiger Teilchen mit einem bestimmten Kornbereich von etwa o,5 bis etwa 10 mm und diese unter Rühren innerhalb einer Verweil zeit von etwa 5 min bis 4 h verfestigt werden und danach in Stufe 2 die gebildeten Katalysatorperlen mit der eingeschlossenen enzymatisch aktiven Substanz abfiltriert und zur Äquilibrierung in eine,das Enzym System und das Netzwerk stabilisierende, wässrige Lösung eingebracht und danach im feuchten Zustand ausgeführt werden. 2.Verfahren nach Anspruch 1'dadurch gekenn zeichnet,dass das Fällungsbad (B) einen Konzentrationsbereich von 0,02 bis 35 % aufweist. 3.Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet,dass die enzymatisch aktive Substanz aus vermehrungsfähigen, ganzen Zellen oder nicht vermehrungsfähi gen ganzen Zellen oder Zellfragmenten besteht und als Suspension eingesetzt wird. 4.Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet,dass die enzymatisch aktive Substanz aus einem isolierten Enzym oder einem Enzym-Komplex besteht und als Lösung oder Suspension eingesetzt wird. 5.Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass als enzymatisch aktive Substanz gegen rtehrwertige Kationen em pfindliche oder mechanisch empfindliche oder temperaturempfindliche oder trxinungsempfind- liche Zellen,Zellfragmente oder Enzyme unter Beibehaltung physiologischer ositotischer Bedin gungen,eingesetzt werden. 6.Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet,dass in Mischung (A) als kationischer Polyelektrolyt ein natürliches Polymer oder ein natür licht Polymer nach chemischer Modifi ierung eingesetzt wird. 7.Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet,dass in Mischung (A) ein synthetischer kationischer Poly elektrolyt eingesetzt wird. 8.Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet,dass in Mischung (A) kationische Polyelektrolyte eingesetzt werden,die ionisch vernetzbar sind. 9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet,dass in Mischung (A) als kationischer Polyelektrolyt ein protonier tes Chitosan in einem Konzentrationsbereich von 0,1 bis 15 Gew.-% eingesetzt wird. 10.Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet,dass in Mischung (B) als ionische Verbindung mit mehrwertigem Anion K4(Fe (CN)6) und/oder K3(Fe (CN)6) in einem Konzentrationsbereich von 0,006 bis 1 Mol/l eingesetzt wird. 11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10 dadurch gekennzeichnet,dass zur Vernetzung des kationischen Polyelektrolyten in Mischung (A) das Polymere eines negativ geladenen Elektrolyten in einem Konzentrationsbreich von 0,006 bis 1 Mol/l eingesetzt wird. 12. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 11 dadurch gekennzeichnet,dass in Mischung (A) ein mehrwertiges Polyphosphat mit einem Polymergrad kleiner 15 eingesetzt wird. 13. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 12 dadurch gekennzeic-hnet,dass als Lösung in Stufe 2 zur Äquilibrierung des Enzym systems und des Netzwerkes eine Phosphat Puffer-Lösung eingesetzt wird.

Inventors: KLEIN, JOACHIM PROF.DR., VORLOP, KLAUS-DIETER DIPL.-CHEM., WAGNER, FRITZ PROF.DR.
Applicants: KLEIN, JOACHIM, PROF. DR., WAGNER, FRITZ, PROF. DR.
Application year: 1981
Main classification: C12N11
IPC codes: C12N11, C12P13