IMMUNOLOGICAL DIAGNOSTIC REAGENT FOR PREGNANCY DETECTION, PROCESS FOR ITS PREPARATION AND ITS USE IN PREGNANCY DETECTION

Abstract: 1. An immunological diagnostic reagent for the determination of pregnancy by means of HCG determination and latex agglutination containing discrete particles of an immunologically inert latex polymer having a particle size of 0.01 to 0.9 mu m and a specific weight of 0.01 to 1.1, to which human choriongonadotropin (HCG) has been covalently bound via an amide bridge with a carbodiimide coupling agent at a pH of 5-8, characterized in that the HCG is used in the form of its beta-chain, whereby this beta-chain is substantially free from the alpha-chain and whereby this beta-chain has been separated from the alpha-chain by treating partially purified HCG containing 2000-5000 IU/mg of HCG for 1/2 to 2 hours at a pH of 4-5.5 and a temperature of 20-50 degrees C with a chaotropic agent, namely with a 7-10 molar aqueous solution of urea, a 7-10 molar aqueous solution of lithium bromide, a 4.5-6 molar aqueous solution of guanidine hydrochloride or a 2-3 molar aqueous solution of ammonium thiocyanate, subsequently adjusting the pH of the reaction mixture to 7.5 and separating the mixture of HCG/chaotropic agent by ion exchange and/or further conventional methods in accordance with which molecules can be separated on the basis of differences in the elektrostatic charge, and whereby neither the partially purified HCG nor the beta-chain thereof have been purified further.

Description: linmunologisches diagnostisches Reagens zur Bestimmung der Schwangerschaft Verfahren zu dessen Herstellumlg sowie desser Verwendung zur Bestimmung der Schwangerschaft. Die Verwendung von menschlichem Choriongonadotropin (nachfolgend HCG genannt) zur Herstellung von Latexreagenzien zur Bestimmung der Schwangerschaft ist längst bekannt. So wird z.B. im U.S. Patent Nr. 3,857,931, welches am 31. Dezember 1974 veröffentlicht wurde, die Herstellung und Verwendung solcher Reagenzien beschrieben. Im weiteren sind eine Reihe von Reagenzien zur Bestimmung der Schwangerschaft im Handel, welche dem Latex-HCG-Typ entsprechen. Die kommerziell erhältlichen Latex HCG Schwangerschaftstests benutzen in der Regel HCG in einer teilweise gereinigten Form, welches an einen serologisch inerten Latex Polymerträger gebunden ist. Bei Gebrauch des Tests wird ein Tropfen Urin einer Frau auf einen gereinigten Glasobjektträger gegeben, mit einem Tropfen Anti-HCG Serum vermischt und dann mit einem Tropfen einer wässrigen Suspension eines Latexträgers, an den HCG gebunden ist, vermischt. Nach wenigen Minuten wird der Objektträger daraufhin untersucht, ob eine Agglutination stattgefunden hat, was ein negatives Resultat bedeutet. Dies ist nur eine sehr allgemeine Angabe der Methode, denn es existieren Varianten sowohl bezüglich der Technik wie bezüglich der verwendeten Materialien. Da eine Anzahl Schwangerschaftstests auf der HCG Latexbasis kommerzialisiert sind, ist in diesem kompetitiven Gebiet ein konstantes Bemühen, diese Tests zu verbessern, und zwar bezüglich der Sensibilität, der Materialkosten, der Herstellung sowie der Bequemlichkeit in der Handhabung und Verwendung. Bei der Suche nach mehr spezifischeren Tests wurde gefunden, dass durch die Auftrennung von HCG in seine a- und ss-Kette und nachfolgendes Reinigen der B-Kette ein höchst spezifisches Reagens hergestellt werden kann [Morgan and Canfield, Endocrinology, Vol. 88, p. 1045 (1971)). - Es gibt bekannte Methoden zur Reinigung der ss-Kette von HCG, doch sind die bisher bekannten Methoden äusserst teuer und daher - obwohl ein Reagens mit verbesserter Spezifität mit reiner B-Kette von HCG erhalten werden kann - ist die Kommerzialisierung als ein Test auf Latexbasis praktisch ausgeschlossen. Das einzige Produkt auf Latexbasis, das sich im Markt befindet und das ss-Kette Material ver wendet, ist ein Produkt, welches ss-Kette Antiserum und keine gereinigte 8-Kette von HCG Antigen benutzt, was wohl auf die kostspielige Reinigung der ss-Kette von HCG zurückzuführen ist. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde nun eine Methode gefunden, wonach rohes HCG, wie es kommerziell erhältlich ist, ohne zusäztliche aufwendige Reinigung behandelt werden kann, um die S-Kette von HCG zu erhalten, welche - unerwarteterweise - immunologisch sehr reaktiv ist Die ss-Kette von HCG gemäss vorliegender Erfindung kann in einfacher Weise an immunologisch inerte Latexpartikel gebunden werden, wobei man ein Reagens erhält, welches 2-4fach mehr sensitiv ist, als ähnliche, bekannte Reagenzien, welche kommerziell erhältliches HCG verwenden. Die grosse Sensibilität des Reagens gemäss vorliegender Erfindung ist beachtlich vorteilhaft, wenn man bedenkt, dass es von relativ unreinem HCG hergestellt werden kann, ohne aufwendige ¯ Reinigungstechniken, welche man bisher als notwendig erachtet hat bei der Verwendung der B-Kette von HCG. Gemäss der vorliegenden Erfindung wird relativ unreines HCG, wie es käuflich erhältlich ist, mit einem chaotropischen Mittel (welches nachfolgend definiert wird) in die a- und 6-Kette gespalten, welche dann nach herkömmlichen Methoden, wie z.B. Ionenaustauschchromatographie, getrennt werden. Die so erhaltene 6-Kette von HCG zeigt eine hohe immunologische Sensitivität, obwohl sie immer noch eine grosse Menge von Proteinen, z.B. Urinproteinen, enthält, welche vom ungereinigten Ausgangsmaterial herstammen. Die 6-Kette von HCG, welche gemäss der Methode der vorliegenden Erfindung erhalten wird, kann leicht in an sich bekannter-Weise an immunologisch inerte Latexträgerpartikel gebunden werden. Vom erhaltenen Reagens wurde gefunden, dass es die 2-4fache immunologische Sensitivität im Vergleich mit kommerzialisierten Präparaten aufweist, welche kommerziell erhältliches HCG an einen geeigneten Latex gebunden haben. Beim Verfahren gemäss vorliegender Erfindung wird als Ausgangsmaterial ein relativ unreines HCG verwendet, wie es üblicherweise kommerziell erhältlich ist-. Dieses Material enthält HCG in Gegenwart von proteinhaltigem Material. Der Gehalt an HCG in solchen kommerziell erhältlichen Präparaten schwankt gewöhnlich zwischen etwa 2000 und etwa 5000 internationalen Einheiten/mg. Das proteinhaltige Material, welches in solchen Präparaten vorhanden ist, verunreinigt das HCG immunologisch nicht, sondern "ver dünne" es nur. Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung werden solche HCG Präparate als "teilweise gereinigtes" HCG bezeichnet. Im Gegensatz zum vorerwähnten "teilweise gereinigten" HCG versteht der Fachmann unter gereinigtem HCG solches mit ungefähr 10,000 bis ungefähr 20,000 IE/mg. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde nun gefunden, dass "teilweise gereinigtes" HCG, d.h; also HCG enthaltend von ungefähr 2000 bis ungefähr 5000 IE/rag, n;it einem chaotropischen I"iittel behandelt werden';tann und dass die daraus isolierte ss-Kette - obwohl sie noch in wesentlichem Ausmass proteinhaltiges Material von "teilweise gereinigtem" HCG enthält - zur Herstellung eines äusserst sensitiven Latex-Schwangerschaftsreagens verwendet werden kann. Selbstverständlich können im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Ausgangs-HCG auch Präparate verwendet werden, welche als "teilweise gereinigt" oder "roh" betrachtet werden, obwohl sie möglicherweise mehr als 5000 IE/mg HCG enthalten. Der Bereich von 2000 IE/mg bis 5000 IE/mg, welcher für die gegenwärtig erhältlichen kommerziellen Präparate als indikativ angegeben wird und die als "roh" oder anteilweise gereinigt" bezeichnet werden, soll in keiner Weise den Umfang der vorliegenden Erfindung limitieren. Ob kommerzielle Präparate, welche signifikant höhere Konzentrationen von HCG aufweisen, gemäss der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, wird von den Kosten solcher Präparate abhängen. Beim Ausdruck "chaotropisches Mittel" gemäss vorliegender Beschreibung wird ein Mittel verstanden, welches in der Lage ist, Wasserstoffbrücken eines Polypeptidmoleküls zu trennen. Charakteristischerweise trennen chaotropische Mittel kovalente Bindungen in solchen Molekülen nicht. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird verstanden, dass das chaotropische Mittel mehr oder weniger auf der Oberfläche des HCG Moleküls wirkt und die Wasserstoffbrücken bricht und das Molekül in die a- und ss-Kette spaltet. Obwohl der genaue Mechanismus, gemäss welchem das chaotropische Mittel teilweise gereinigtes" HCG mehr sensitiv macht, nicht bekannt ist, wird vermutet, dass das chaotropische Mittel mehr immunologisch aktive Stellen an der Oberfläche des HCG Moleküls aufdeckt. Durch dieses Phänomen wird das HCG mehr immunospezifisch und deshalb mehr sensitiv ohne dass es nötig ist, auf eine kostspielige Reinigung zurückgreifen zu müssen. Geeignete chaotropische Mittel, welche gemäss vorliegender Erfindung verwendet werden können, umfassen z.B. eine wässrige Lösung von Harnstoff, ungefähr 7 bis ungefähr 10 molar, eine wässrige Lösung von Lithiumbromid bei ähnlicher Konzentration, eine wässrige Lösung von Guanidinhydrochlorid in einer Konzentration von ungefähr 4,5 bis ungefähr 6 Mol und eine wässrige Lösung von Ammoniumthiocyanat, ungefähr 2 bis 3 molar. Die Harnstofflösung ist bevorzugt. Die vorliegende Erfindung ist durch die Angabe dieser spezifischen chaotropischen Mittel in keiner Weise limitiert. Jede andere Substanz, welche keinen schädlichen Effekt auf die gewünschten Eigenschaften des HCG aufweist, kann erfindungsgemass verwendet werden. Ob eine spezifische Substanz chaotropische Eigenschaften aufweist mit Bezug auf teilweise gereinigtes HCG, ohne schädlichen Einfluss, kann sehr einfach bestimmt werden und liegt im Bereich des Fachwissens. Es sei bemerkt, dass die vorerwähnten chaotropischen Mittel in grösseren Konzentrationen als oben angegeben verwendet werden können. Es wurde jedoch gefunden, dass merkbar höhere Konzentrationen als die oben angegebenen die Wirksamkeit der Behandlung nicht verbessern. Weiterhin muss beachtet werden, dass ein grösseres Ansteigen der Konzentrationen des chaotropischen Mittels in gewissen Fällen einen negativen Einfluss auf das gewünschte Resultat haben kann. Im allgemeinen werden die chaotropischen Mittel zur Behandlung des "teilweise gereinigten" HCG gemäss vorliegender Erfindung in einem pH-Bereich von ungefähr 4 bis 5,% vorzugsweise ungefähr 5, verwendet. Eine anorganische - Säure, vorzugsweise Salzsäure, wird zur Einstellung des bevorzugten pH-Bereiches des chaotropischen Mittels verwendet. Für die einzelnen chaotropischen Mittel kann der bevorzugte pH leicht variieren. So z.B. beträgt der bevorzugte pH-Bereich bei Verwendung von Harnstoff als chaotropisches Mittel ungefähr 4,5. Im allgemeinen lässt man das chaotropische Mittel während ungefähr einer halben bis ungefähr 2 Stunden, vorzugsweise während ungefähr einer Stunde, in wässriger Lösung auf das "teilweise gereinigte" HCG einwirken. Nach dieser Zeit wird der pH des Reaktionsgemisches wenig über neutral, z.B. auf ungefähr 7,5 gestellt. Im allgemeinen wird eine Temperatur von ungefähr 20-500C, vorzugsweise ungefähr 37 C verwendet. Es muss Sorge dafür getragen werden, dass der pH nicht auf einen Bereich angehoben wird, bei dem das HCG denaturieren könnte, d.h. einen pH von ungefähr 9,5 oder darüber. Ebenso sollten zur Vermeidung der Denaturierung der vorhandenen Urinproteine Temperaturen, die wesentlich über 600C sind, vermieden werden. Zum Einstellen des pH der HCG Lösung auf leicht über neutral nach der Auftrennung wird eine geeignete anorganische Base, wie z.B. ein Alkalimetallhydroxyd wie Natriumhydroxyd oder Kaliumhydroxyd verwendet. Um die Wiedervereinigung der a- und ss-Kette von HCG nach der Behandlung mit dem chaotropischen Mittel zu verhindern, wird das Gemisch HCG/chaotropisches Mittel nach konventionellen Methoden getrennt, z.B. durch Ionenaus- tausch (Schicht oder Kolonne), Electrophorese und/oder weiteren herkömmlichen Methoden, gemäss denen Moleküle aufgrund von Differenzen in der elektrostatischen Ladung getrennt werden können. Die Ionenaustauschchromatographie ist bevorzugt. Jedes konventionelle lonenaustauschmaterial kann zur Trennung der a- und ss-Kette von HCG verwendet werden. Ein bevorzugtes Material ist ein hydrophiles, wasserunlösliches, quervernetztes Dextranpolymergel. Dieses Material und die Methode zu seiner Herstellung sind im britischen Patent Nr. 854,715 beschrieben. Das bevorzugte Gelmaterial, welches käuflich von der Firma Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden unter dem Warenzeichen Sephadex erhältlich ist, besteht aus einem dreidimensionalen, makroskopischen Netzwerk von Dextransubstanzen, welche miteinander verbunden oder quervernetzt sind. Dieses Material ist fähig, unter Schwellen Wasser zu absorbieren. Die Fähigkeit des Gels zur Wasseraufnahme ist umgekehrt proportional zum Grad der Quervernetzung der Dextransubstanzen. Das Gelmaterial ist u1 eierVielzahl von unterschiedlichen Graden bezüglich der Porösität erhältlich. Aehnliche in der Fachwelt bekannte Materialien können ebenfalls verwendet werden. Durch die Verwendung dieser Trennungstechnik erhält man die B-Kette on HCG, welche im wesentlichen frei ist von der verunreinigenden a-Kette.¯ Es wurde gezeigt , dass diese Technik eine Wiedergewinnung von wesentlich mehr als 80% der HCG-Antigeneigenschaften erlaubt. Die "teilweise gereinigte" B-Kette von HCG wird nachher an einen geeigneten immunologisch inerten Latexträger gebunden. Die Ausdrücke "immunologisch inerte Latexpolymere" oder "immunologisch inerte Latexpolymerträgerpartikel" umfassen wasserunlösliche Latexpolymere mit einer Teilchengrösse von ungefähr 0,01 bis 0,9 und einem etwa dem von Wasser entsprechenden spezifischen Gewicht. Dies hat zur Folge, dass nach der Bindung der ss-Kette von HCG das spezifische Gewicht der Partikel ungefähr dem von Wasser entspricht oder leicht darüber liegt, d.h. 1,01 bis ungefähr 1,1, wodurch erreicht wird, dass die Teilchen in einer wässrigen Suspension verbleiben. Die Latexpartikel müssen eine genügende Ladungsdichte an der Oberfläche besitzen, damit nach der Bindung mit der 8-Kette von HCG ihre abstossenden Kräfte gross genug sind, um eine Agglutination zu verhindern. Die Latexpartikel müssen den immunologischen diagnostischen Tests gegenüber inert sein und vorzugsweise reaktive Gruppen besitzen, welche fähig sind, eine kovalente Bindung mit der 6-Kette von HCG zu bilden. Solche Gruppen sind z.B. Carboxygruppen, Aminogruppen oder Gruppen, welche in diese amwandelbar sind. Für die Zwecke der vorliegen den Erfindung besonders geeignete typische Gruppen an den Latexpartikeln sind solche, welche ein aktives Wasserstoffatom besitzen, wie z.B. -COOH, -CONH2 oder eine primäre Aminogruppe. Besonders geeignete Latexträgerteile sind solche, welche in Form einer wässrigen Latexsuspension mit einer Feststoffkonzentration von üblicherweise 50-60% im Handel erhältlich sind. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung eignen sich viele Arten von Latexpolymeren, vorausgesetzt, dass sie die oben erwähnten Kriterien erfüllen. Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung aller geeigneten Latexpolymere. Nach der vorliegenden-Erfindung kann die S-Kette vcn HCG physikalisch und/oder chemisch an die immunologisch inerten Latexpolymere gebunden werden. Nach einer bevorzugten Ausführungsweise wird die ss-Kette von HCG mit einem wasserlöslichen Carbodiimid Kopplungsmittel durch eine Amidbrücke kovalent an die Latexpolymerpartikel gebunden. Beispiele geeigneter Latexpolymere umfassen Carboxylenthaltende Polymere und Copolymere wie Polystyrol, Polyvinylpyridin, Styrolbutadien-Copolymere, Vinylacetat/acrylat Copolymere, Vinylchlorid-acrylat-Copolymere und dergleichen. Die Carboxylgruppen können durch herkömmliche Emulsionspolymerisationstechnik in den Latex eingearbeitet werden oder nachträglich durch Reaktion des bereits hergestellten Latexpolymer oder Copolymer wie dies in der Fachwelt bekannt ist. So z.B. kann ein Monomer wie Acrylsäure, Methacrylsäure, Itaconsäure, Maleinsäure oder dergleichen zum Monomergemisch gegeben werden. Andererseits können Carboxylgruppen auf herkömmliche Weise auf der Oberfläche des Latex gebildet werden, z.B. durch Oxidation von Hydroxylgruppen,Hydrolyse von Acrylat- oder Methacrylatgruppen an der Oberfläche und dergleichen. Die Latices können nach einer Vielzahl von herkömmlichen Emulsions polimerisationstechniken hergestellt werden, wie z.B. Emulsionspolymerisation im Chargenbetrieb, Emulsionspolymerisation mit Animpfung, halbkontiniuerliche oder kontinuierliche Emulsionspolymerisation. Für die Einführung einer Carboxylgruppe ist die Emulsionspolymerisation mit Animpfung bevorzugt, bei der - bevor die Reaktion gestartet wird - ein Impflatex zur Kontrolle der Anzahl der Partikel in das Reaktionsgefäss gegeben wird. In diesem Fall wird ein eine Carboxygruppe enthaltendes Monomer auf der Oberfläche der Impflatexpartikel polymerisiert. Käuflich erhältliche Latices, welche für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen z.B. carboxylierte Styrolbutadien-Copolymere, welche unter den Marken Dow 816 und Dow 421 bei Dow Chemical Company erhältlich sind, und ähnliche. Nach einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die "teilweise gereinigte" ss-Kette von HCG durch eine Amidbrücke kovalent zu den vorerwähnten ¯ Polymerlatices gebunden, wobei als Kopplungsmittel ein wasserlösliches Carbodiimid der allgemeinen Formel R-N=C=N-R worin R ein 5 oder 6 gliedriger Cycloalkylrest; ein gerader oder verzweigter Alkylrest mit 2-12 Kohlen stoffatomen, wie z.B. Aethyl, n-Propyl, Is-opropyl, n-Butyl, sec.-Butyl, tert. Butyl, Amyl, Hexyl, Octyl, Nonyl, Undecyl, Dodecyl und dergleichen; ein mono arylsubstituierter niederer Alkylrest, wie z.B. Benzyl, a- oder S-Phenyläthyl und dergleichen; ein Monoarylrest wie z.B.- Phenyl, Morpholinyl, Piperidyl, ein morpholinylsubstituierter niederer Alkylrest, wie z.B. Morpholinoäthyl; ein di-nieder Alkylamino niederer alkylrest, und ein pyridylsubstituierter niederer Alkylrest, wie z.B. a, ss und y Methyl- oder Aethylpyridyl bedeutet, sowie Säureadditionssalze und quaternäre Amine davon, als Kondensationsmittel benützt. Bevorzugte Kopplungsmittel gemäss vorliegender Erfindung sind l-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl)-carbodiimid metho-p-toluolsulfonat und l-Äethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)- carbodiimid hydrochlorid. Die Reaktion der "teilweise gereinigten" ss-Kette von HCG und dem geeigneten Latexträger wird vorzugsweise in Gegenwart des Carbodiimid-Kopplungsmittels in wässrigem Medium, vorzugsweise bei Raumtemperatur (ungefähr 20-25 C) durchgeführt. Die Temperatur kann jedoch auch zwischen 5 C und 40 C liegen. Um sicher zu stellen, dass die 5-Kette von HCG wirksam an den Latexträger gebunden wurde, wird eine Menge an wasserlöslichem Carbodiimid verwendet, welche ungefähr 0,05 bis ungefähr 2 Gew.% basierend auf dem Gewicht der Trägerpartikel beträgt. Nochmehr bevorzugt wird ungefähr 1 Gew.% an Kopp lungsmittel (basierend auf dem Gewicht der Trägerpartikel) verwendet. Der Anteil an Carbodiimid-Kopplungsmittel kann über weite Bereiche variieren, ist jedoch abhängig z.B. von der Anzahl der Carboxylgruppen und der Anwesenheit von zusätzlichen negativ-geladenen Gruppen wie z.B. Sulfonatgruppen auf der Oberfläche der Latexpartikel. Der pH der Kopplungsreaktion ist wichtig und sollte zwischen ungefähr 5 und 8, vorzugsweise zwischen ungefähr 6 und 7 liegen. Es ist bevorzugt, den pH der Latexsuspension auf den gewünschten pH-Bereich, d.h. also zwischen ungefähr 6 und 7 zu bringen, bevor er zum Reaktionsgemisch gegeben wird. Die Reaktion ist nach ungefähr 5 Minuten bis ungefähr 24 Stunden beendet. Im allgemeinen genügen 1 1/2 bis 2 1/2 Stunden. Das erhaltene Produkt ist ein wasserunlösliches Material, welches in einem wässrigen Medium suspendiert ist und einen pH von ungefähr 7 bis ungefähr 8,5; vorzugsweise 8 aufweist. Das spezifische Gewicht des Materials entspricht ungefähr demjenigen von Wasser, was zur Folge hat, dass die Suspension des Produktes stabil ist. Das Produkt kann z.B. durch Zentrifugation isoliert werden und ist ein weisses, leicht ethixotropes, viskoses und lehmartiges Material. Chemisch gesehen besteht das Produkt aus einer ein-molekularen Schieht von 'teilweise gereinigter" 6-Kette von HCG, welche physikalisch und/oder chemisch über eine Amidbrücke an diskrete Partikel eines immunologisch inerten Trägers gebunden ist. Allfällige vorhandene kontaminierende Proteine beeinflussen serologisch die Empfindsamkeit der B-Kette von HCG nicht, wie dies bereits früher erwähnt wurde. Im Gegensatz zur chemischen Bindung können die Proteine durch hydrophobe Bindung der Reaktionsteilnehmer an den Latex gebunden werden. Für eine solche Bindung wird vorzugsweise ein Latex verwendet, welcher eine vergleichsweise geringe Zahl von reaktiven, hydrophilen Gruppen, wie z.B. Carboxylgruppen, aufweist. Gewöhnliche Polystyrolpolymere sind z.B. geeignet. Die Bindung solcher hydrophober Bindungen wird weiter begünstigt durch Binden in einem Puffersystem mit einem hohen pH-Wert, wie einem Dicarbonpuffer von pH 10-11 und/oder durch Behandeln des Proteins zur Entfernung saurer Zucker- oder Neuraminsäuregruppen von der ss-Kette, um so das Molekül weniger hydrophil zu machen. Dies kann erfolgen durch Erwärmen des Proteins auf ungefähr 800C oder durch Behandeln des Proteins mit einem Enzym, wie Neuramidose oder einem proteolytischen Enzym, welches Peptide, die saure Zuckergruppen enthalten, spaltet. Beispiele solcher Enzyme umfassen Trypsin, Papain und Bromelin. Für kommerzielle Zwecke wird das gemäss vorliegender Erfindung erhaltene Reagens in die Form einer wässrigen Lösung gebracht, welche ungefähr 0,5 bis ungefähr 3,5 Gew.% der B-Kette von HCG enthält, welche an den immunologisch inerten Träger gebunden ist. Besonders bevorzugt enthalten solche Suspensionen von ungefähr 1 bis ungefähr 2,5 Gew.% solcher Partikel. Nach einem bevorzugten Aspekt ist die B-Kette von HCG über eine Amidbrücke an carboxyliertes Eutaoien-Styrol Copolymer gebunden, welches ein Monomerverhältnis von ungefähr 45p Butadien und 55% Styrol aufweist und welches ungefähr 1-5 Ge., gewöhnlich 3 Gew.% an Carboxylgruppen aufweist. Die wässrige Suspension der "teilweise gereinigten" ss-Kette von HCG, welche an den immunologisch inerten Träger gebunden ist, wird nach der vorliegenden Erfindung vorzugsweise in die Form eines Test-Kits gebracht, welches in einem zweiten Behälter das geeignete Antiserum, d.h. das Anti-HCG-Serum enthält. Das erwähnte Anti-Serum kann in an sich bekannter Weise gewonnen werden.-So können Kaninchen oder Ziegen mit hoch-gereinigtem HCG oder gereinigter -. 8-Kette von HCG immunisiert werden, worauf die Antiseren gesammelt werden, ihre Titer geprüft werden und dann gelagert werden. Die nachfolgenden Beispiele illustrieren die Erfindung. Beispiel 1 100 mg käufliches, rohes HCG, enthaltend ungefähr 2700 IE/mg, werden nach der-Methode von Morgan and Canfield in Endocrinology, Vol. 88., p. 1045 (1971) getrennt. Nach dieser Methode wird das rohe HCG in 15 ml einer 10 M wässrigen Lösung von Harnstoff gelöst, worauf der pH der resultierenden Lösung mit Salzsäure auf 4,5 eingestellt wird. Die Lösung wird während einer Stunde bei 37 C inkubiert, dann werden 3 ml einer 0,03 M wässrigen Lösung von Glycin zugegeben, worauf der pH mit Natriumhydroxid auf 7,5 eingestellt wird. Eine so erhaltene Lösung enthaltend die getrennte a- und S-Kette von HCG wird der Ionenaustauschchromatographie unterzogen, um die a- und S-Kette physikalisch zu trennen und eine Wiedervereinigung zu vermeiden. Die Chromatographie wird an einer 2,5x40 cm Chromatographiesäule durchgeführt, welche bis zu einer Höhe von 20 cm mit Sephadex A-50 (Pharmacia) beschickt ist. Das Produkt hat eine Partikelgrösse (trocken) von ungefähr 40-120 micron, ein Bettvolumen/ml/g des trockenen Gels von 25-33 und eine Kapazität von ungefähr 3 g Hämoglobin/g des Gels. Die Kolonne wird mit einer wässrigen Lösung von Glycin (0,03 M) und Harnstoff (8 M) von pH 7,5 äquilibriert. Die Durchflussgeschwindigkeit wird auf 60 ml/Std. einge stellt, worauf die Lösung enthaltend die a- und 6-Kette von HCG auf die Kolonne gebracht wird. Die Säule wird dann mit 500 ml der Glycin/Harnstofflösung eluiert, und das Eluat, welches die a-Kette des HCG enthält, wird auf einmal gesammelt und verworfen. Die Kolonne wird ein zweites Mal mit 500 ml einer wässrigen Lösung von Glycin (0,2 M), Natriumchlorid (1,0 M) und Harnstoff (8 M) von pH 7,5 eluiert. Die Eluate werden als eine Charge gesammelt, mit einem gleichen Anteil von destiliertem Wasser verdünnt und dann durch Ultrafiltration auf 2G ml verdünnt. Die Fraktion, welche die 8-Kette von HCG enthält wird dann mit 0,1 M Natriumboratpuffer vom pH 8,0, welcher 0,02 Gew.% Natriumazid enthält, äquilibriert Durch analytische Scheibenelektrophorese an Proben des ersten und zweiten Eluates konnte gezeigt werden, dass das zweite Eluat die ss-Kette von HCG, frei von a-Kette jedoch immer noch Urinproteine enthaltend, enthält, wogegen das erste Eluat a-Kette enthält, kontaminiert mit einem bestimmten Anteil ss-Kette HCG und Urinproteinen. Durch Latexagglutination konnte gezeigt werden, dass mehr-als 80% HCG Aktivität des rohen Ausgangsmaterials zurückgewonnen werden konnte. Beispiel 2 Gemäss Beispiel 1 aus "rohem", kommerziell erhältlichem HCG hergestellte 8-Kette von HCG wird durch das nachfolgende Verfahren kovalent an immunologisch inerte Latexträgerteilchen gebunden: 5 ml eines Latex aus carboxyliertem Styrolbutadiencopolymer (Dow Nr. 816) werden gewaschen, gemahlen, auf eine Konzentration von ungefähr 78-82 mg/ml eingestellt und dann in ein geeignetes Gefäss mit Rührer gegeben. Unter Rühren wird 1 ml S-Kette von HCG hergestellt nach Beispiel 1 zugegeben und auf eine Konzentration von 3000 IE HCG/ml gebracht. Wenn die B-Kette von HCG im Latex gut dispergiert ist, werden tropfweise und unter Rühren 3 ml einer liegen Lösung von l-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl)carboimid metho-p-toluolsulfonat in destiliertem Wasser zugegeben. Wenn die Zugabe des Kopplungsmittels beendet ist, wird während weiteren 2 Stunden gerührt. Der gekoppelte Latex wird dann während 30 Minuten bei 5-100C bei 1500 rpm zentrifugiert, in welcher Zeit sich der Latex völlig vom Suspensionsmedi-um abtrennt. Der Ueberstand wird zur Bestimmung von HCG-ARtivität analysiert und dann verworfen. Der Rückstand wird mit 10 ml destiliertem Wasser gewaschen, wie vorher beschrieben zentrifugiert, worauf der Ueberstand auf HCG-Aktivität analysiert und ver-c:rfen wird. Der Rückstand wird mit 10 .ml eines Puffers von pH 8-8,2 gewaschen, welcher 0,1 M Tris-HCl und 0,01% Merthiolat enthält. Der Latex wird erneut in der vorerwähnten Weise zentrifugiert, worauf der Ueberstand auf CG-Aktivität untersucht und verworfen wird. Der Rückstand wird wieder mit dem vorerwähnten Puffer gewaschen und dann in 10 ml dieses Puffer resuspendiert. Die Reihenfolge ZentrIfugieren, Ueberprüfung des Ueberstandes, Waschen und Resuspendieren wird wiederholt, bis zwei aufeinanderfPl-- gende Ueberstände nach dem Waschen mit Puffer frei von HCG-Aktivität sind. Der gekoppelte, gewaschene Latex ist dann bereit, um in ein diagnostisches Reagenskit gebracht zu werden und wird in 20 ml des erwähnten Puffers resuspendiert. Ein typisches Reagenskit (Reagens - garnitur) enthaltend die ss-Kette von HCG hergestellt gemäss dem vorstehenden Verfahren würde in einem separaten Behälter Anti-HCG Serum enthalten. Solche Anti-Seren werden nach-herkömmlichen Methoden in Ziegen erzeugt, z.B. durch Immunisieren der Tiere mit hochgereinigtem HCG oder der gereinigten ss-Kette von HCG, Sammeln der Antiseren und Ueberprüfen der Titer. Um Kreuzreaktionen des Anti-HCG mit Urinproteinen zu eliminieren, wird die substraktive Affinitätschromatographie verwendet. Für dieses Verfahren werden 150 ml gewaschene Sepharose 4 B (Pharmacia) nach der Methode von Primus et al. in J. of Immuno., Vol. 188, p 55 (-1977) aktiviert. 0,5 g% Urinprotein in 200 ml 0,1 M Natriumboratpuffer vom pH 8,0 werden mit der aktivierten Sepharose 14B während 18 Stunden bei 4 C gemischt, um das Protein daran zu kuppeln. Das Produkt wird mit 1 Liter 0,1 M Natriumboratpuffer vom pH 8,0 gewaschen, um ungebundenes Protein zu entfernen, dann mit 500 ml einer 1,5 M wässrigen Lösung von 2-Aminoäthanol vom pH 8,0 gewaschen, um die aktivierten Gruppen des Sepharose 4 B Gels zu reduzieren, worauf mit Natriumboratpuffer vom pH 8,0 re-äquilibriert wird. Das erhaltene Urinproteinadsorbat wird in eine Chromatographiesäule von 4,5 cm Durchmesser gegeben. Zu dieser Kolonne werden nacheinander 10 ml normales Ziegenserum (1:2 in 0,1 M Natriumboratpuffer von pH 8,0), 300 ml 0,1 M Natriumboratpuffer vom pH 8,0 und 100 ml 3,0 M Ammoniumthiocyanat in 0,1 M Natriumphosphat vom pH 7,0 gegeben. Die Kolonne wird dann mit 500 ml 0,1 M Natriumboratpuffer re-äquilibriert. Das Anti-HCG Serum wird mit einem gleichen Anteil 0,1 M Natriumboratpuffer vom pH 8,0 verdünnt und auf die Kolonne gegeben. Zur Kontrolle des Adsorbtionsprozesses wurde ein automatischer Affinitätschromatograph mit Rezyklisierung verwendet. Die verdünnten Antiseren wurden automatisch durch den Apparat gegeben, bis alles chroma tographiert war. Eine Probe von 15 ml wurde bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 60 ml/Std. chromatographiert. Das Kolonneneluat wurde kontinuierlich durch Adsorbanz kontrolliert und - bevor Protein im Eluat aufschien wurde der Fluss für 1 Stunde unterbrochen, so dass die Probe mit dem Adsorbanz reagieren konnte. Mit 100 ml 3 M Ammoniumthiocyanat wurde zuerst unadsorbiertes Protein (spezifisches Antiserum zu HCG) und dann adsorbiertes Protein enthaltend Antikörper zu Urinproteinen eluiert. Die unadsorbierten Fraktionen wurden vereinigt und durch Ultrafiltration zum ursprünglichen Volumen der Probe konzentriert. Durch Latexagglutiation wurde gezeigt, dass nach der Adsorption die Wiedergewinnung an Antikörperaktivität mehr als 90% betrug. Die Spezifität der Antiseren wurde durch Immunodiffusion bestimmt und durch Immunoelektrophorese bestätigt. Beispiel 3 Die Sensitivität der gemäss Beispiel 1 hergestellten 6-Kette von HCG wurde wie folgt gezeigt: Ein Antiserum zu HCG, und zwar Ziegenserum, adsorbiert mit Urinproteinen wurde in einem mit physiologischer Kochsalzlösung gepuffertem Medium titriert. In Gegenwart konstanter Mengen von Latexkonjugaten wurde Anti-HCG verdünnt, und es wurde die letzte Verdünnung bestimmt, bei der nach einer Inkubation von 120 Minuten noch Agglutination oder Flokkulation beobachtet wurde. Die letzte Verdünnung wird als Endpunkt und Titer dieses Antiserums und des korrespondierenden Antigens betrachtet. Die Resultate sind in der nachfolgenden Tabelle I zusam- mengefasst. Die Latexkonjugate, die verglichen wurden, sind 6-Ketten-Latex gemäss Beispiel 2, ein ähnlich hergestelltes a-Ketten-Latex und ein kommerzieller Schwangerschaftstest enthaltend natives HCG gebunden an einen Latex. Tabelle I Verdünnung Latexkonjugat Latexkonjugat Anti-HCG HCG Alpha Beta 1:2,000 3-4 -3-14 2-3 1:4,000 3-4 3 3¯4 1:8,000 3-4 neg. 3-4 1:16,000 neg. neg. 3-4 1:32,000 neg. neg. 2 1:64,000 neg. neg. Spuren Eine Bewertung von 3-4 bedeutet starke Reaktion, 3 mittlere Reaktion, 2 mittel bis schwache Reaktion, Spuren ser schwache Reaktion und neg. keine Reaktion. Je höher die Verdünnung an Antiserum ist, desto weniger HCG wird zur Neutralisierung desselben benötigt. Die in der obigen Tabelle gegebenen Werte für natives HCG entsprechen ungefähr einer Sensitivität von 1,0 bis 1.25 HCG/ml Urin. Die Sensitivität, d.h. die letzte aestlmmGar-e Menge von 6-Ketben Latex ist ungefähr 0,25 E./ml Urin. Diese Korrelation kann wie folgt gezeigt werden: sn einer Probe von Antiserum wurde bestimmt, mit welcher enge von HCG in internationalen Einheiten sie reagiert. Eine Reihe von Verdünnungen dieser Probe im oben erwähnten Puffer wurde zu den zu testenden Urinproben gegeben. In jedem Falle wurden 2 ml gepuffertes Antiserum mit 1 ml Urin in einem Teströhrchen vereinigt. 100 Mikroliter des zu testenden Latex wurden zu jeder Probe-gegeben, und es wurde durch Umkehren gemischt. Das untere Ende des Test- rönrchen wurde während 2 Stunden auf 37 0C erwärmt. Nach dieser Zeit sollte Agglutination oder Flokkulation zu beobachten sein, es sei denn, dass genügend HCG im Urin vorhanden ist, das die Reaktion inhibieren kann. Der Vergleich wurde zwischen einem Schwangerschaftstest enthalten natives HCG und einem B-Ketten Produkt gemäss Beispiel 2 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle II angegeben. Die Anmerkungen haben dieselbe Bedeutung wie für Tabelle I. Tabelle II Konzentration von - Latexkonjugat HCG in der Probe (IE/ml) HCG Beta 0,0 3-14 3-4 0,1 -- 2 0,2 -- 1/2 0,25 3-4 neg. 0,3 -- neg. 0,4 -- neg. 0,5 3-4 neg. 0,75 2-3 1,0 2 1,25 neg Diese Zahlen zeigen die verbesserte Sensitivität des B-Ketten Latex gemäss Beispiel 2 gegenüber dem Schwangerschaftstest enthaltend natives HCG.

Claims: Patentansprüche 1. Immunologisches diagnostisches Reagens zur Bestimmung der Schwangerschaft, dadurch gekennzeichnet, dass es diskrete Teilchen eines immunologisch inerten Latexpolymers aufweist, an welche die 8-Kette von menschlichem Choriongonadotropin gebunden ist, welche im wesentlichen frei von der a-Kette ist, wobei diese B-Kette von der a-Kette eines teilweise gereinigten menschlichen Choriongonadotropin abgetrennt wurde und wobei weder dieses menschliche Choriongonadotropin noch die B-Kette davon weiter gereinigt wurden. 2. Reagens gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die S-Kette mit Hilfe eines wasserlöslichen Carbodiimid Kopplungsmittels über eine Amidbrücke an die Latexpartikel gebunden ist. 3. Reagens gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Latex ein carboxyliertes Styrolbutadiencopolymer ist. 4. Reagens gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das wasserlösliche Carbodiimid Kopplungsmittel durch die nachfolgende allgemeine Formel dargestellt wird R-N=C=N-R worin R Cycloalkyl mit 5-6 Kohlenstoffatomen, gerades oder verzweigtes Alkyl mit 2-12 Kohlen stoffatomen, Monoarylsubstituiertes niederes Alkyl, Monoaryl, Morpholino, Piperidyl, Morpho lino-substituiertes niederes Alkyl, di-nieder Alkylamino niederes Alkyl oder Pyridyl substituiertes niederes Alkyl bedeutet, Säure additionssalze davon sowie quaternäre Amine davon. 5. Reagens gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Kopplungsmittel l-Cyclohexyl-3-(2-morpholino äthyl)carbodiimid metho-p-toluolsulfonat oder l-Aethyl3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid Hydrochlorid ist. 6. Verfahren zur Herstellung eines hochempfindlichen immunologischen Diagnosereagens zur Feststellung der Schwangerschaft, dadurch gekennzeichnet,¯dass man a) teilweise gereinigtes menschliches Choriongonadotropin mit einem chaotropischen Mittel behandelt und dabei die Auftrennung in die a-Kette und ss-Kette bewirkt, b) die ss-Kette frei von der a-Kette rückgewinnt, ohne dass man die B-Kette einer weiteren Reinigung unterzieht und c) die -Kette an einen wasserunlöslichen, immunologisch inerten polymeren Latex bindet. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das chaotropische Mittel eine wässrige Harnstofflösung mit einer Molarität von ungefähr 7-10 ist. 8. Verfahren zur Bestimmung der Schwangerschaft durch Bestimmen der Anwesenheit von Choriongonadotropin in Körperflüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Probe dieser Flüssigkeit mit Choriongonadotropin Antiserum mischt und dann diese Mischung mit einer wässrigen Suspension des immunologischen diagnostischen Reagens gemäss Anspruch 1 kontaktiert und die erhaltenen Resultate beobachtet. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die 6-Kette mit Hilfe eines wasserlöslichen Carbodiimid Kopplungsmittels über eine Amidbrücke an die Latexpartikel gebunden ist. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Latex ein carboxyliertes Styrolbutadiencopolymer ist und dass das Kopplungsmittel l-Cyclohexyl 3-(2-morpholinoäthyl)-carbodiimid metho-p-toluolsulfonat oder l-Aethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid Hydrochlorid ist.

Inventors: HANSEN, HANS JOHN
Applicants: F. HOFFMANN-LA ROCHE & CO. AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1980
Main classification: G01N33
IPC codes: G01N33