PROCESS FOR SURFACE GROWING OF NUCLEUS-CONTAINING CELLS AND PRODUCTION OF CELL CULTURE-DEPENDENT PRODUCTS

Abstract: 1. Process for the surface culture of nucleated cells and for the recovery of cell culture-dependent substances from the cells thus obtained, characterized in that coils, saddle-shaped members, spirals or wire spirals each made of metal are used as the culture surface, these objects retaining less than 8 % of the medium, based on the free volume, after the aqueous culture medium has run out, and at the same time the ratio of the surface area of the culture surface to the free volume is between 20:1 and 5:1 cm**-1.

Description: Verfahren zur Oberflächenzüchtung von kernhaltigen Zellen und Gewinnung von Zellkultur-abhängigen Stoffen Es ist bekannt, dass die Züchtung von nicht transformierten, kernhaltigen Zellen (Eukaryonten) nur mit der Oberflächen Züchtungsmethode gelingt. Dies bedeutet, dass die in Suspension gehaltenen Zellen nicht wachsen. Sie müssen vielmehr Gelegenheit haben, sich auf einer geeigneten Oberfläche abzusetzen, um sich dort bis zur Kontakt-Inhibition vermehren zu können. Die Oberflächen-Züchtungsmethode wird in ihrer einfachsten Art in einem Gefäss mit planem Boden durchgeführt, wobei darauf geachtet werden muss, dass der Gefässboden möglichst genau waagerecht liegt. Ein derartiges Gefäss besteht vorzugsweise aus Glas oder einem geeigneten Kunststoff, wobei die Grösse des Behälters letztlich nur durch die erforderliche Handhabung beschränkt wird. Um hierbei eine möglichst grosse Oberfläche zu erzielen, existieren auch Behälter, in denen mehrere horizontal übereinander liegende plane Flächen, welche durch entsprechende Öffnungen mit einander verbunden sind, angeordnet sind. Dem gleichen Prinzip folgend wurde auch ein Wannenstapler beschrieben, der 10 über 2 einanderliegende plane Kulturflächen mit je 600 cm Oberfläche aufweist, wobei dieser Behälter auch zu Blöcken à 4 Stück parallel geschaltet werden kann. Desweiteren wird bei anderen Zellkultur-Verfahren durch Drehen des Behälters die gesamte Innenfläche, z.B. bei den sogenannten Rollerflaschen, für die Zellkultur verwendet. Eine derartige Rollerflasche kann mit Scheiben oder anderen Rörpern so beschickt werden, dass die Oberfläche vergrössert und ausserdem die Versorgung mit Nährstoffen mittels eines Mediums sowie das erforderliche Sauerstoffangebot sichergestellt werden kann. Diese Verfahren finden jedoch dort ihre Grenzen, wo sie wegen des Behälterumfanges nicht mehr oder nur schwer gehandhabt werden können. Uberdies lassen sich während des Betriebs die für Änderungen in der Kultur erforderlichen Schlauchverbindungen wegen der Bewegung nur schwer bewerkstelligen. Es gibt jedoch auch Geräte, die aus einem Behälter mit mehreren Zellkulturflächen und einer Pumpe bestehen. Durch Umpumpen des Mediums wird das erforderliche Nährstoff- und Sauerstoffangebot gewährleistet. So wird beispielsweise ein Gerät von 2 Liter Volumeninhalt beschrieben, in dem die planen Kulturflächen durch kleine Glas-Zylinder ersetzt werden und der pH des umgepumpten Mediums durch Begasung reguliert wird. In gleicher Weise wird bei der bekannten Organ-Perfusions-Technik verfahren. Bei dem beschriebenen Oberflächen-Züchtungsverfahren mit kleinen Glaszylindern von ca. 6 mm Länge, ca. 4 mm äusserem Durchmesser und ca. 2 mm innerem Durchmesser in einem Behälter bei gleichzeitigem Umpumpen des Mediums ist jedoch aufgrund der auftretenden physikalischen Wirkungen wie Benetzung, Kappilarwirkung und anderer Grenzflächenwirkungen, insbesondere wegen der Bildung von Luftblasen, eine Bedeckung aller Kulturflächen nicht möglich. Aus den gleichen Gründen lassen sich die mit Zellen bedeckten Kulturflächen nicht ausreichend spülen. Es erfolgt kein vollständiger Rückfluss, da ein Teil des ursprünglichen Mediums hartnäckig festgehalten wird. Die physikalischen Kräfte der bisher bei der Oberflächenvermehrung benützten Glas-Zylinder oder Kugeln verhindern aber gerade beispielsweise bei der Fibroblasten Interferon-Herstellung die erforderliche vollständige Entfernung des Induktionsmediums bzw. des Fremdproteins mittels Spülen. Ausserdem zerstören die bei der Interferonherstellung üblicherweise verwendeten Pumpen, bei welchen Scherkräfte auftreten, grösstenteils das bereits hergestellte Interferon. Unter der Bezeichnung Microcarrier-Technik werden geeignete Kugeln, wie beispielsweise aus Dextran, mit einem Durchmesser von ca. 0,15 - 0,25 mm im Medium suspendiert und durch Bewegung in Suspension gehalten. Auf der Oberfläche dieser Kugeln lassen sich bei geeigneter Technik (siehe Biotechnology and Bioengineering, Vol. XXI, 433-442 (1979)) Zellen züchten. Die zur Verfügung stehende Oberfläche, gegeben durch die Beziehung Medium/Volumen, ist hier besonders gross. Sie beträgt bei 0,5 g Dextran-Trägern in 100 ml Medium 3.000 cm . Die mit Zellen bewachsenen Kugeln sind jedoch gegen mechanische Einflüsse sehr empfindlich. Durch Absetzenlassen der Carrier und Absaugen der überstehenden Flüssigkeit wird das Medium entfernt. Damit lässt sich gleichfalls keine vollständige Spülung ermöglichen. Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass sich die oben geschilderten Nachteile bei der Oberflächenzüchtung und somit bei der Gewinnung von Zellkultur-abhängigen Stoffen wie Interferon, Viren, Fermente, Immunabwehrstoffe, wie z.B. Immunglobuline, ausschalten lassen, wenn als Kulturflächen Körper verwendet werden, die auf Grund ihrer Form keine störenden Grenzflächenwirkungen erzeugen und somit eine vollständige Bedeckung und ausreichendes Spülen der Kulturfläche gestattet. Zweckmässigerweise werden hierbei Füllkörper verwendet, die eine für eine Zellkul tur günstige Oberfläche aufweisen und ihnen eine ausreichende Haftungsmöglichkeit bieten, sowie nach Auslaufen des Mediums weniger als 8 % des Mediums bezogen auf freies Volumen zurückhalten. Als derartige Füllkörper kommen die in der Chemie bei der fraktionierten Destillation zur Herstellung einer optimalen Fläche für die Phasenberührung fest eingebauten Körper wie Böden und Siebe und beweglichen Körper wie Sattelkörper, kugelförmige oder zylindrische Füllkörper in Betracht, welche aus Materialien wie Glas, Keramik, z.B. aus Ton oder Porzellan, Kunststoffe, z.B. aus Duranit, Azidur oder Teflon, Metallen, z.B. aus Titan, V2A- oder V4A-Stahl, oder Sinterprodukten, z.B. aus Korund, hergestellt werden können. Unter dem Begriff der "beweglichen Füllkörper" kommen insbesondere Ringe wie Pallringe, Raschig-Ringe, Prymringe, Porzellanringe, Perforinge, Streckmetallringe und Intosringe, Wendeln und Spiralen wie Glasspiralen, Wilson-Spiralen, Federwendeln, Glaswendeln, Drahtspiralen, Spulen und Rollen, Sattelkörper wie der Perl-Sattel, Supersattel und Novalox-Sattel, Intalox- und Interpackfüllkörper, Perlen, Kugeln, Sternfüllkörper, Zwillingskörper und Vollkörper in Betracht. Besonders bevorzugte bewegliche Füllkörper stellen jedoch die Spiralen, Wendeln und Sattelkörper dar, insbesondere Wendeln und Drahtspiralen in gestreckter Form aus V2A- oder V4A-Stahl, bei denen sich die einzelnen Windungen gegenseitig nicht berühren, oder Sättel, da diese gleichzeitig bei einer grossen Oberfläche auf das umlaufende Medium nur einen geringen Fliesswiderstand und beim Spülen nur eine geringe Haftwirkung auf das Medium aufweisen. Als Drahtspiralen sind hierbei insbesondere diejenigen geeignet, die eine Gesamtlänge von 4-8 mm, vorzugsweise jedoch 5-7 mm, eine Gesamtbreite von 4-8 mm, vorzugsweise jedoch 5-7 mm, und einen Drahtdurchmesser von 0,4 - 0,8 mm, vorzugsweise jedoch 0,5 - 0,7 mm, aufweisen, wobei der Zwischen raum der einzelnen Windungen 0,1 - 0,5 mm, vorzugsweise jedoch 0,2 - 0,4 mm, beträgt. Beispielsweise wurden die Füllkörper A = Glasstäbe (Durchmesser: 10 mm, Länge: 30 mm), B = Teflon-Ringe (äusserer Durchmesser: 10,5 mm, innerer Durch messer: 5,5 mm, Länge: 10,2 mm), C = Duranit-Zylinder (äusserer Durchmesser: 10,5 mm, innerer Durchmesser: 6,5 mm, Länge: 11,5 mm), D = V4A-Spiralen (äusserer Durchmesser: 6 mm, Drahtdurchmesser: 0,6 mm, Länge: 6 mm), E = Glaskugeln (Durchmesser: 10 mm), F = Duranit-Zylinder (äusserer Durchmesser: 8 mm, innerer Durch messer: 5 mm, Länge: 9,5 mm), G = Glasstäbe (Durchmesser: 6 mm, Länge: 10 mm), H = Sättel (Durchmesser: 6 mm, Länge: 6 mm), I = V4A-Drahtgewebe-Zylinder (Durchmesser: 3 mm, Länge: 5 mm) und K = Glaskugeln (Durchmesser: 3,5-5 mm) im Vergleich zu L = Glaszylinder (äusserer Durchmesser: 4 mm, innerer Durchmesser: 2-mm, Länge: 6 mm) wie folgt auf ihre Eignung bei dem erfindungsgemässen Verfahren untersucht: Methodik: 1. Ein Glasrohr (innerer Durchmesser: 3-5 cm) wird unten zu einem Trichter verjüngt, mit einem Rohr von ca. 0,5 cm innerer Durchmesser als Auslauf angestückt und mit einem Hahn versehen. Am Übergang des Trichters zum 0,5 cm Rohr wird eine Markierung angebracht. Dann wird bei geschlossenem Hahn das Glasrohr bis zu dieser Marke mit Wasser gefüllt und das Volumen durch Wiegen des Auslaufs bestimmt. Anschliessend wird wieder bis zu dieser Marke mit Wasser gefüllt und eine abge wogene Menge Wasser (z.B. 200 ml) zugegeben. Der obere Spie gel wird mit einer Marke versehen. Dann wird das Wasser bis zur unteren Marke abgelassen. Gleichzeitig wird die Restmenge Wasser, die an der Glaswand haften bleibt durch Wiegen der abgelassenen Menge und Subtrahierung von dem angesetzten Soll volumen ermittelt. Das Ganze wird mehrmals wiederholt und der Mittelwert als Leerwert festgehalten. Vor jedem Versuch muss das Prüfrohr vollständig trocken sein (z.B. durch Auswaschen mit Aceton und anschliessendem Durch blasen mit Luft). Ebenso sind die zu prüfenden Füllkörper im Trockenschrank zu trocknen. Zur Prüfung werden die Füll körper in das Glasrohr bis zur oberen Marke eingefüllt. Da bei wird das Gewicht der eingefüllten Füllkörper und die Stückzahl ermittelt. Anschliessend wird bei geschlossenem Hahn bis zur oberen Marke eine abgewogene Menge Wasser eingefüllt, die Einfüllmenge durch Wiegen der übrigbleibenden Menge er mittelt und als "freies Volumen" festgehalten. Anschliessend wird der Hahn geöffnet, das bis zur unteren Marke ablaufende Wasser durch Auffangen in ein tariertes Gefäss auf einer Waage ermittelt. Durch Subtraktion der abgelaufenden Menge von "freien Volumen" wird die "Restmenge" Wasser berechnet, die in den Füllkörpern verblieben ist. Dabei wird der Leer wert berücksichtigt. Die Oberfläche der Füllkörper wird ent weder berechnet oder den Angaben des Herstellers entnommen. Als Ergebnis werden die experimentell ermittelten Daten zu 3 folgenden Werten berechnet: Freies Volumen pro Liter in cm Verhältnis der Füllkörper zum freien Volumen und Restmenge nach Auslauf in % zum freien Volumen. 2. Mit dem gleichen Glasrohr (trocken) wird die gleiche Menge Füllkörper eingefüllt und mit gefärbtem Wasser (z.B. 1 % Neutralrot - 100 %) aufgefüllt. Dann wird die obere öffnung luftdicht mit einem Schlauch verschlossen, der mit Wasser ge füllt und durch eine Schlauchpumpe abgeklemmt ist. Nach Öff nung des Hahnes wird über die Schlauchpumpe Wasser in einer abgemessenen Menge von 100 ml pro Minute zugegeben und der Spüleffekt pro Minute durch Messung der Farbintensität im Photometer erfasst. Der gemessene Wert wird in Beziehung zum Ausgangswert gesetzt und als Spülwirkung in % Restfarbe nach x-facher Spülung mit freier Volumenmenge errechnet. 5 Minuten nach Beginn der Spülung wird der Wasserzulauf abgestellt, die Säule kurz geschüttelt und der Wert nach 30 Sekunden langem Zupumpen gemessen. Der Wert wird als Restfarbe in % nach x facher Spülung mit freier Volumenmenge nach anschliessendem Schütteln angegeben. Die nachfolgende Tabelle enthält die gefundenen Werte: EMI8.1 Füllkörper <SEP> Freies <SEP> Volumen <SEP> Verhältnis <SEP> der <SEP> Restmenge <SEP> nach <SEP> Spülwirkung <SEP> nach <SEP> x-facher <SEP> Restfarbe <tb> <SEP> pro <SEP> Liter <SEP> in <SEP> Oberfläche <SEP> der <SEP> Auslauf <SEP> in <SEP> % <SEP> Spülung <SEP> mit <SEP> freier <SEP> Vo- <SEP> nach <SEP> x <SEP> cm <SEP> Füllkörper <SEP> zum <SEP> zum <SEP> freien <SEP> lumenmenge <SEP> % <SEP> facher <tb> <SEP> freien <SEP> Volumen <SEP> Volumen <SEP> % <SEP> Spülung <tb> <SEP> 2 <SEP> mal <SEP> 3 <SEP> mal <SEP> 4 <SEP> mal <SEP> mit <SEP> freiem <tb> <SEP> Volumen <tb> A <SEP> 507 <SEP> 5,19 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 1,3 <SEP> 1,9 <SEP> 0,48 <SEP> 0,14 <SEP> 0,09 <SEP> 4,3 <tb> B <SEP> 595 <SEP> 7,4 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 1,43 <SEP> 1,87 <SEP> 0,24 <SEP> 0,08 <SEP> 0,24 <SEP> 3,7 <tb> C <SEP> 684 <SEP> 6,25 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 2,79 <SEP> 2,3 <SEP> 0,5 <SEP> 0+ <SEP> 0,46 <SEP> 3,5 <tb> D <SEP> 856 <SEP> 10,9 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 3,05 <SEP> 0,26 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 3 <tb> E <SEP> 452 <SEP> 7,65 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 4,67 <SEP> 1,3 <SEP> 0,22 <SEP> 0,06 <SEP> 0,02 <SEP> 4,7 <tb> F <SEP> 627 <SEP> 8,37 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 4,67 <SEP> 1,27 <SEP> 0,15 <SEP> 0+ <SEP> 0,09 <SEP> 3,5 <tb> G <SEP> 384 <SEP> 14,5 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 6,51 <SEP> 2,74 <SEP> 0,18 <SEP> 0,05 <SEP> 0,074 <SEP> 5,4 <tb> H <SEP> 622 <SEP> 15,4 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 6,68 <SEP> 0,91 <SEP> 0,22 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 3,6 <tb> I <SEP> 940 <SEP> 21,4 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 4,68 <SEP> 0,02 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 2,5 <tb> K <SEP> 373 <SEP> 24,8 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 7,53 <SEP> 1,62 <SEP> 0,08 <SEP> 0,04 <SEP> 0,15 <SEP> 5,6 <tb> L <SEP> 532 <SEP> 21,4 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 8,95 <SEP> 0,99 <SEP> 0,37 <SEP> 0,18 <SEP> 1,25 <SEP> 4,1 <tb> Die mit (+) gekennzeichneten Werte sind nur graphisch ermittelt, der letzte exp. Wert liegt davor. Auf Basis der obigen Methodik sind somit alle Füllkörper für das erfindungsgemässe Verfahren geeignet, welche 1. nach Auslaufen des Mediums weniger als 8 % des Mediums be zogen auf freies Volumen (Haftinhalt) zurückhalten und 2. nach 4-maligem Spülen mit freier Volumenmenge eine Farbmenge von max. 0,15 % bzw. nach 4-maligem Spülen mit freier Volumen menge und anschliessendem Schütteln eine Restfarbe von max. 0,5 % zeigen. Derartige Füllkörper ermöglichen ein Anhaften der in Suspension eingebrachten kernhaltigen Zellen, z.B. Fibroblasten-Zellen, Epithelzellen, innerhalb einer kurzen Zeitspanne, beispielsweise während 1 bis 3 Stunden. Desweiteren werden die Nährstoffe des umlaufenden Mediums gut aufgenommen, sodass ein rasches Wachstum der Zellen gewährleistet ist. Besonders vorteilhaft ist jedoch, dass sich die dicht gewachsenen Kulturen mit Induktionssubstanzen innerhalb des gewünschten Zeitraumes in Verbindung bringen lassen und anschliessend die erforderliche Entfernung der Induktionssubstanzen durch einfaches Spülen keinerlei Schwierigkeiten bereitet. Das Spülen kann hierbei kontinuierlich oder diskontinuierlich erfolgen, das heisst durch Ersatz des umlaufenden Mediums durch ein Spülmedium oder durch gegebenenfalls mehrmaliges Ablaufenlassen des Mediums und anschliessendem Auffüllen mit einem Spülmedium, in letzterem Fall erfolgt das Einbringen eines Spülmediums vorzugsweise von unten her. Ferner lassen sich die benützten Füllkörper ohne Schwierigkeiten säubern und anschliessend wieder verwenden. Dies bedeutet aber, dass die Zellen auf der Oberfläche derartiger Füllkörper ausreichend haften, um ein ungestörtes Zellwachstum zu gewährleisten, andererseits haften diese aber nicht so fest, dass sich die Zellen bei der anschliessenden Säuberung nicht mehr ablösen lassen. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein neues Verfahren zur Oberflächenzüchtung von kernhaltigen Zellen (Eukaryonten) und Gewinnung von Zellkultur-abhängigen Stoffen unter Verwendung von Füllkörpern, welche nach Auslaufen des Mediums weniger als 8 % des Mediums bezogen auf freies Volumen zurückhalten, also einen geringeren Haftinhalt als 8 % aufweisen, und somit keine störenden physikalischen Eigenschaften, z.B. keine störenden Grenzflächenwirkungen (Benetzung, Kapillarwirkung), besitzen, wobei zum Umpumpen des Mediums zweckmässigerweise Pumpen verwendet werden, bei denen keine Scherkräfte auftreten, z.B. Schlauchpumpen. Besonders bevorzugte Füllkörper stellen hierbei diejenigen dar, bei denen gleichzeitig das Verhältnis Oberfläche der Füllkörper zum freien Volumen 20 : 1 bis 2 : 1, vorzugsweise jedoch 15 : 1 bis 5 : 1, beträgt. Als besonders vorteilhaft hat sich das erfindungsgemässe Verfahren bei der Fibroblasten-Interferon-Herstellung erwiesen. Hierzu wird ein Reaktionsgefäss, vorzugsweise ein druckstabiles Reaktionsgefäss, z.B. ein 25 l-Doppelmantel-Reaktionsgefäss aus Duranglas, das üblicherweise mit einem Zu- und Ablauf, pH-Elektroden und Permeator versehen ist, mit sorgfältig gewaschenen Füllkörpern, vorzugsweise mit V4A-Drahtspiralen gestreckter Form (Länge: 6 mm, Breite: 6 mm, Drahtdurchmesser: 0,6 mm, Ganghöhe: 0,3 mm) zu ca. 3/4 gefüllt und vorzugsweise mit gespanntem Dampf sterilisiert. Hierbei beträgt das Verhältnis Oberfläche der Füllkörper zum freien Volumen ca. 11/1. Anschliessend werden Zellen, die vorzugsweise durch Trypsinierung von Oberflächen Zellkulturen gewonnen wurden, in Minimum Essential Medium, dem zweckmässigerweise 10 % fötales Kalbserum und ein Antibioticum wie Kanamycin in einer Konzentration von 200 pg/ml beigefügt sind, in einer Zelldichte von zweckmässigerweise 20.000 Zellen/ cm2 suspendiert. Die eingebrachte Zellkultur suspension bleibt ohne Umpumpen 2-4 Stunden bei 370C, anschliessend wird vorzugsweise mit einer Schlauchpumpe bei einer Umdrehungszahl von 30 Umdrehungen pro Minute das Medium umgepumpt und der pH zwischen 7,3 und 7,5 eingestellt. 24-48 Stunden nach Einbringen der Zellkultursuspension wird in regelmässigen Abständen Medium entnommen und frisches Wachstumsmedium der gleichen Zusammensetzung zugegeben, insgesamt werden in den folgenden 3-4 Tagen 80 Liter Medium zu- und abgeführt. Das weitere Verfahren richtet sich nach dem Stoff, der aus der Zellkultur gewonnen werden soll. Bei Interferon zum Beispiel wird 8-10 Tage nach Ansatz der Zellkultur das gesamte Medium entfernt und anschliessend nach bekannten Verfahren, z.B. mit Poly I:C, Mitomycin C, Virus oder anderen geeigneten Substanzen, induziert. Danach wird das gesamte Induktionsmedium entfernt und die Zellen mit Minimum Essential Medium mehrmals gewaschen. Anschliessend gibt man erneut Medium zu, dem ein für Interferon geeigneten Stabilisator, z.B. Serum-Albumin, zugefügt war. Diese Flüssigkeit wird erneut wie oben angegeben umgepumpt. Nach weiteren 12-24 Stunden wird das Medium geerntet und das erhaltene Rohinterferon nach an sich bekanntem Verfahren konzentriert und gereinigt. Erfindungsgemäss wird vorzugsweise eine Schlauchpumpe benützt, die bei einer Umdrehungszahl von 25 bis 60 pro Minute eine Förderleistung von 50 bis 400 % des Gesamtvolumens pro Stunde aufweist. Das erfindungsgemässe Verfahren lässt sich somit mit erheblich grösseren Volumen-Mengen als die bisher bekannten Verfahren durchführen und wird nur durch eine ausreichende Nährstoff- und Sauerstoffversorgung, sowie einer Konstanzhaltung des pH innerhalb eines für die Zellen geeigneten Bereichs begrenzt. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens besteht darin, dass die während der Produktionsphase gebildeten Zellkultur-abhängigen Stoffe wie z.B. Interferon diskontinuierlich oder kontinuierlich aus dem Kreislauf entnommen, durch neues Medium ersetzt, und beispielsweise das so entnommene Interferon auf eine Reinigungs- und Konzentrierungssäule gebracht werden kann. Ausserdem bereitet die Zugabe einer sogenannten Stimulatorsubstanz oder eines Gemisches derartiger Substanzen zu jedem gewünschten Zeitpunkt des Verfahrens, um die Ausbeute eines Zellkultur-abhängigen Stoffes zu steigern, bzw. deren Entfernung keinerlei Schwierigkeiten (siehe europäische Anmeldung 79.101 299.0 der gleichen Anmelderin vom 30. 04. 1979). Das nachfolgende Beispiel soll die Erfindung näher erläutern: Beispiel Ein 25 Liter-Doppelmantel-Reaktionsgefäss aus Duranglas wird mit 17 Litern sorgfältig gewaschenen Füllkörpern: V4A-Drahtspiralen, gestreckte Form, Länge 6 mm, Breite 6 mm, Drahtdurchmesser 0,6 mm, Ganghöhe: 0,3 mm, gefüllt (Verhältnis Oberfläche der Füllkörper zum freien Volumen (= ca. 11/1). Zu- und Ablauf werden mit Silicon-Gummischläuchen, Innendurchmesser 8-10 mm, versehen, über pH-Elektroden mit pH-Meter und Permeator geführt und zum Kreislauf verbunden. Die Anlage wird mit gespanntem Dampf sterilisiert. Durch Trypsinierung von Oberflächen-Zellkulturen gewonnene Zellen werden in 17 Liter Minimum Essential Medium mit 10 % fötalem Kälberserum une 200 ug/ml Kanamycin in einer Zahl von 20.000 Zellen/cmê suspendiert und in das Reaktionsgefäss eingebracht. Das Reaktionsgefäss wird über den Doppelmantel und einem Wasserbadthermostaten auf 37 0C aufgeheizt und bei dieser Temperatur geregelt. Die eingebrachte Zellkultursuspension bleibt 2-4 Stunden ohne Umpumpen im Reaktionsgefäss. Anschliessend wird der Siliconschlauch in eine Schlauchpumpe eingelegt und bei einer Umdrehungszahl von 30 Umdrehungen pro Minute bei einer Förderleistung von 40-80 1/Stunde umgepumpt. Der pH wird zwischen 7,3 und 7,5 geregelt. 24-48 Stunden nach Ansatz wird in regelmässigen Abständen Medium entnommen und frisches Wachstumsmedium der gleichen Zusammensetzung zugegeben. Insgesamt werden in den folgenden 3-4 Tagen 80 Liter Medium zu- und abgeführt. 8-10 Tage nach Ansatz der Zellkultur wird das gesamte Medium abgelassen, die Zellen durch Zugabe von Minimum Essential Medium ohne Serum gewaschen und anschliessend das Induktionsmedium zugegeben, das 100 Fg/ml Poly I:C und 2,5 Fg/ml Cycloheximid enthält. Das Medium bleibt 3 Stunden im Reaktionsgefäss. Anschliessend wird 2 pg/ml Actinomycin D zugegeben. Eine Stunde nach der Actinomycin D-Zugabe wird das gesamte Induktionsmedium entfernt und die Zellen mindestens 4 x mit Minimum Essential Me- dium ohne Serum gewaschen. Anschliessend wird Minimum Essential Medium mit 1 000 pg/ml Serum-Albumin zugegeben und, wie vorher beschrieben, umgepumpt. Die pH-Regulierung wird auf 7,5 - 7,6 eingestellt. 19-20 Stunden später wird das Medium geerntet und nach bekannten Verfahren konzentriert und gereinigt. Die Ausbeuten an Interferon in der Roh-Lösung betragen unter Bezug auf das internationale Referenz-Präparat G 023-902-527 des National Institutes of Healt (USA) 900-2.000 Einheiten/cm2 Kulturfläche. Unter Verwendung von verschiedenen Füllkörpern in verschiedenen Ansatzmengen wurde Fibroblasten-Interferon analog mit folgenden Ergebnissen hergestellt: EMI14.1 <tb> <SEP> Ansatz-Menge <SEP> Interferon-Referenz-Einheiten/cmê <tb> <SEP> + <SEP> <tb> <SEP> Füllkörper <SEP> in <SEP> Liter <SEP> Kulturfläche <tb> <SEP> A <SEP> 0,2 <SEP> 1.147 <tb> <SEP> A <SEP> 0,2 <SEP> 1.956 <tb> <SEP> A <SEP> 1,2 <SEP> 593 <tb> <SEP> B <SEP> 0,3 <SEP> 83 <tb> <SEP> D <SEP> 2,2 <SEP> 1.580 <tb> <SEP> D <SEP> 17,0 <SEP> 1.374 <tb> <SEP> D <SEP> 108,0 <SEP> 1.103 <tb> <SEP> H <SEP> 0,2 <SEP> 470 <tb> + <SEP> <tb> Vergleich <SEP> (L) <SEP> 0,2 <SEP> 23 <tb> <SEP> 0,2 <SEP> 19 <tb> + Definition siehe Seite 5 siehe Seite 2, Zeilen 18-24

Claims: P a t e n t a n s p r ü c h e 1. Verfahren zur Oberflächenzüchtung von kernhaltigen Zellen und zur Gewinnung von Zellkultur-abhängigen Stoffen aus den so gewonnenen Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass als Kultur fläche ein Füllkörper verwendet wird, der aufgrund seiner Form nach Auslaufen des Mediums weniger als 8 % des Mediums bezogen auf freies Volumen zurückhält. 2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Füllkörper die in der Chemie bei der fraktionierten Destil lation zur Herstellung einer optimalen Fläche für die Phasen berührung fest eingebauten Körper wie Böden und Siebe oder bewegliche Körper wie Sattelkörper, kugelförmige oder zylin derische Füllkörper verwendet werden. 3. Verfahren gemäss den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeich net, dass als Füllkörper bewegliche Körper wie Ringe, Spiralen, Wendeln oder Sattelkörper hergestellt aus Glas, Keramik, Kunststoffen, Metallen oder Korund verwendet werden. 4. Verfahren gemäss den Ansprüchen 1, 2 und 3, dadurch gekenn zeichnet, dass bei den verwendeten Füllkörpern das Verhältnis Oberfläche der Füllkörper zum freien Volumen 20:1 bis 2:1, vorzugsweise jedoch 15:1 bis 5:1, beträgt. 5. Verfahren gemäss den Ansprüchen 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass als Füllkörper Spiralen, Wendeln oder Sättel aus V2A oder V4A-Stahl verwendet werden. 6. Verfahren gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Füllkörper eine Spirale gestreckter Form mit einer Gesamt länge von 4-8 mm, vorzugsweise jedoch 5-7 mm, einer Gesamt breite von 4-8 mm, vorzugsweise jedoch 5-7 mm, einem Draht durchmesser von 0,4 - 0,8 mm, vorzugsweise jedoch 0,5 0,7 mm, und einer Ganghöhe von 0,1 - 0,5 mm, vorzugsweise jedoch 0,2 - 0,4 mm, oder Sättel je aus V2A- oder V4A-Stahl verwendet werden. 7. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Füllkörper eine V4A-Drahtspirale benützt wird. 8. Verfahren gemäss den Ansprüchen 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass als Zellkultur-abhängiger Stoff Interferon hergestellt wird. 9. Verfahren gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das nach der Induktion der Zellen gebildete Interferon kon tinuierlich oder diskontinuierlich abgetrennt wird. 10. Verfahren gemäss den Ansprüchen 1-9, dadurch gekennzeichnet, dass zum Umpumpen des Mediums eine Pumpe benützt wird, bei der keine Scherkräfte auftreten. 11. Verwendung von Füllkörpern, die aufgrund ihrer Form nach dem Auslaufen des Mediums weniger als 8 % des Mediums bezogen auf freies Volumen zurückhalten, zur Oberflächenzüchtung von kernhaltigen Zellen und zur Gewinnung von Zellkultur-ab hängigen Stoffen aus den so gewonnen Zellen. 12. Verwendung von Füllkörpern gemäss Anspruch 11, die als fest eingebaute Körper wie Böden und Siebe oder als bewegliche Füllkörper wie Sattelkörper, kugelförmige oder zylindrische Körper, wie sie bei der fraktionierten Destillation zur Her stellung einer optimalen Fläche verwendet werden, ausgebil det sind. 13. Verwendung von beweglichen Körpern, wie Ringe, Spiralen, Wendeln oder Sattelkörper aus Glas, Keramik, Kunststoff, Metall oder Korund als Füllkörper gemäss den Ansprüchen 11 und 12. 14. Verwendung von Füllkörpern gemäss den Ansprüchen 11 bis 13 bei denen das Verhältnis ihrer Oberfläche zum freien Volumen 20 : 1 bis 2 : 1, vorzugsweise jedoch 15 : 1 bis 5 : 1, be trägt. 15. Verwendung von Spiralen, Wendeln oder Sätteln aus V2A- oder V4A-Stahl als Füllkörper gemäss den Ansprüchen 10 bis 14. 16. Verwendung von Füllkörpern gemäss Anspruch 15 in Form von gestreckten Spiralen mit einer Gesamtlänge von 4-8 mm, vor zugsweise jedoch 5-7 mm, einer Gesamtbreite von 4-8 mm, vorzugsweise jedoch 5-7 mm, mit einem Drahtdurchmesser von 0,4-0,8 mm, vorzugsweise jedoch 0,5-0,7 mm, und einer Gang höhe von 0,1-0,5 mm, vorzugsweise jedoch 0,2-0,4 mm, oder in Form eines Sattels. 17. Verwendung einer Spirale aus V4A-Stahl gemäss Anspruch 16. P a t e n t a n s p r ü c h e (Benennungsland Österreich) 1. Verfahren zur Oberflächenzüchtung von kernhaltigen Zellen und zur Gewinnung von Zellkultur-abhängigen Stoffen aus den so gewonnen Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass als tultur- fläche ein Füllkörper verwendet wird, der aufgrund seiner Form nach Auslaufen des Mediums weniger als 8 % des Mediums bezogen auf freies Volumen zurückhält. 2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Füllkörper die in der Chemie bei der fraktionierten Destil lation zur Herstellung einer optimalen Fläche für die Phasen berührung fest eingebauten Körper wie Böden und Siebe oder bewegliche Körper wie Sattelkörper, kugelförmige oder zylin derische Füllkörper verwendet werden. 3. Verfahren gemäss den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeich net, dass als Füllkörper bewegliche Körper wie Ringe, Spiralen, Wendeln oder Sattelkörper hergestellt aus Glas, Keramik, Kunststoffen, Metallen oder Korund verwendet werden. 4. Verfahren gemäss den Ansprüchen 1, 2 und 3, dadurch gekenn zeichnet, dass bei den verwendeten Füllkörpern das Verhältnis Oberfläche der Füllkörper zum freien Volumen 20:1 bis 2:1, vorzugsweise jedoch 15:1 bis 5:1, beträgt. 5. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Kulturfläche ein in der Chemie beweglicher Füllkörper ver wendet wird. Priorität: 28. 06. 1979 (P 29 26 091.1) 6. Verfahren gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass bei den verwendeten Füllkörpern das Verhältnis Oberfläche der Füllkörper zum freien Volumen 15:1 bis 2:1 beträgt. Priorität: 28.06.1979 (P 29 26 091.1). 7. Verfahren gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Füllkörper eine Spirale gestreckter Form mit einer Gesamt länge von 4-8 mm, vorzugsweise jedoch 5-7 mm, einer Gesamt breite von 4-8 mm, vorzugsweise jedoch 5-7 mm, einem Draht durchmesser von 0,4-0,8 mm, vorzugsweise jedoch 0,5-0,7 mm, und einer Ganghöhe von 0,1-0,5 mm, vorzugsweise jedoch 0,2 0,4 mm, oder Perl-Sättel je aus Stahl, Titan, Korund, Dura nit, Azidur, Teflon oder Porzellan verwendet werden. Priorität: 28.06.1979 (P 29 26 091.1) 8. Verfahren gemäss den Ansprüchen 1-4, dadurch gekennzeich net, dass als Füllkörper Spiralen, Wendeln oder Sättel aus V2A- oder V4A-Stahl verwendet werden. 9. Verfahren gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Füllkörper eine Spirale gestreckter Form mit einer Gesamt länge von 4-8 mm, vorzugsweise jedoch 5-7 mm, einer Gesamt breite von 4-8 mm, vorzugsweise jedoch 5-7 mm, einem Draht durchmesser von 0,4 - 0,8 mm, vorzugsweise jedoch 0,5 0,7 mm, und einer Ganghöhe von 0,1 - 0,5 mm, vorzugsweise jedoch 0,2 - 0,4 mm, oder Sättel je aus V2A- oder V4A-Stahl verwendet werden. 10. Verfahren gemäss den Ansprüchen 7 und 9, dadurch gekennzeich net, dass als Füllkörper eine V4A-Drahtspirale benützt wird. Priorität: 28.06.1979 (P 29 26 091.1) 11. Verfahren gemäss den Ansprüchen 1-10, dadurch gekennzeich net, dass als Zellkultur-abhängiger Stoff Interferon herge stellt wird. Priorität: 28.06.1979 (P 29 26 091.1) 12. Verfahren gemäss Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das nach der Induktion der Zellen gebildete Interferon kontinuierlich oder diskontinuierlich abgetrennt wird. Priorität: 28.06.1979 (P 29 26 091.1) 13. Verfahren gemäss den Ansprüchen 1-12, dadurch gekennzeich net, dass zum Umpumpen des Mediums eine Pumpe benützt wird, bei der keine Scherkräfte auftreten. Priorität: 28. 06. 1979 (P 29 26 091.1).

Inventors: MERK, WALTER, DR.
Applicants: DR. KARL THOMAE GMBH
Application year: 1980
Main classification: C12N5
IPC codes: C07K14, C12P21