PROCESS FOR IMMOBILIZING ENZYMATICALLY ACTIVE PREPARATIONS

Abstract: 1. A process for immobilizing enzymatically active formulations, wherein a suspension containing precipitated silica or silica hydrogel is prepared, and then a porous filler and the enzymatically active formulation are incorporated into the suspension, and the resulting composition is moulded and dried.

Description: Verfahren zur Immobilisierung von enzymatisch aktiven Präparaten Es ist bereits bekannt, Enzyme bzw. Biomassen zu immobili- sieren. Mit solchen Immobilisaten lassen sich Prozesse wirtschaftlich und verfahrenstechnisch günstiger durchführen. Zur Immobilisierung werden meist organische 42teri21ien herangezogen, wie Cellulosederivate, organische Polymere - z.B. Polyphenole - oder Ionen-Austauschharze. Auch Xombi- nationen von organischen und anorganischen Trägermateria- lien, z.B. Acrylate mit Molekularsieben oder Aktivkohle (DE-OS 27 03 834) sind für diesen Zweck vorgeschlagen worden. Ausserdem sina einige Verfahren beschrieben, die einen anorganischen Träger verwenden, z.B. Alluminiumoxid (Dr-OS 25 37 670), kolloidale Kieselsäure (DE-OS 27 13 861) und Kieselgele (DE-OS 19 39 347). Die Herstellung dieser Immobilisate ist jedoch recht um stündlich und aufwending, oder die in oesen enthaltenen Biokatalysatoren sina nicht sehr aktiv. Weiter bereitet die Formgebung Schwierigkeiten. Es wurde nun ein Verfahren gefunden, bei dem diese. Nach- teile nicht auftreten. Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur immobilisie- rung von enzymatisch aktiven Präparaten, welches darin besteht, dass man eine Fällungskieselsäure oder Kieselsäure- -nydrogel enthaltende Suspension herstellt, In diese einen porösen Füllstoff und die enzymatisch aktive Substanz ein arebeitet und die so erhaltene Masse in Formkörper Überführt und trocknet. Die Fällungskieselsäure kann nach bekannten Verfahren hergestellt werden (vgl. DE-PS 536 546). So kann man Kieselsäure aus Wasserglas mit Schwefelsäure ausfällen. Die Kieselsäure wird anschliessend beispielsweise in einer Filter- presse salzfrei gewaschen und in einer Mühle, z.B. einer Zahnkolloidmühle, so weit zerkleinert, bis eine fliessfähige Suspension von Kieselsäurepartikeln in Wasser entstanden ist. Es kann hieroei zweckmässig oder erforderlich sein, vor, während oder nach der Mahlung Wasser zuzugeben. Anstelle einer Fällungskieselsäure kann auch ein nach bekannten Verfahren hergestelltes Kieselsäure-Hydrogel (vgl. z.B. DE-AS 21 03 2L'.3) verwendet werden, das je nach dem zu verwendenden Enzymprcparat als eng-, mittel- oder weitporig ausgebildet ist und gegebenenfalls salzfrel gewaschen wurde. Unter Suspension wird ein grobcisperses System verstanden, bei dem aie in einem flüssigen Lösungsmittel verteilten Partikel einen Durchmesser besitzen, der im wesentlichen grösser als 1 m ist (vgl. Hollemann-Wiberg, Lehrbuch der anorganischen Chemie, 57-70 Auflage, 1964 Seite 336). Die Konsistenz der Suspension kann in weiten Grenzen von Åaünn- flüssig bis pastös variieren. Als Suspensionsmittel wird in der Regel Wasser verwendet. Es können aber auch andere Flüssigkeiten oder aeren Mischun- gen untereinander oder mit Wasser verwendet werden, sofern diese das EnzmprGparat nicht schGdigen. In die Kieselsäure-Suspension wird - je nach Viskosität mit einem Rührwerk oder einem Kneter - der poröse Füllstoff ein gearbeitet Der Füllstoff hat die Aufgabe, den fertigen Katalysator wasserfest zu machen, eine ausreichende Diffusion zu gewährleisten und enzymhaltigen Biomassen die ög- lichkeit des Quellens zu geben, ohne dass der Katalysator zerstört wird. Als Füllstoffe eignen sich z.B. Aktivkohle, Kieselgur, Russ und Kieselgel. Art und enge des Füllstoffes ricntet sich nach der Art und Menge des einzuarbeitenden Enzympräparates. Nach der Zugabe des nülistoffes wird das - in der Regel als Feuchtmasse - vorbereitete Enzympräparat ebenfalls mechanisch in aie erhaltene Masse eingearbeitet. Anschliessend wird das so gewonnene Produkt durch Stehenlassen oder Zugabe eines Elektrolyten, z.B. Calciumcarbonat, verfestigt. Die verfestigte Masse wird danach in Formkörper überführt, was z. B. durch Herstellen von Extrudaten mit einer Strangpresse geschehen kann. So können selbst Strangpresslinge mit kleiner. Abmessungen, z.B. 0,5 mm Durchmesser, hergestellt werden. Die Formkörper werden schliesslich getrocknet. Dabei muss die Temperatur so gewählt werden, dass das Enzympräparat nicht irreversibel inaktiviert wird. Das neue Verfahren ltSt sich mit Enzymen und Enzympräpara- ten, wie Zellmaterial, mikrobiologischen, pflanzlichen, tierischen oder humanen Ursprungs durchführen. Beispiele hierfür sind Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae und Arthrobacter sp. Der Gehalt des Biokatalysators an Trockenzellmasse kann dabei bis zu 30 Gewichtsprozent betragen. Die Erfindung führt im Vergleich mit dem Stand der Technik zu folgenden Vorteilen: Das enzymatisch aktive Präparat kann im neutralen pH-Bereich in die Trägermasse eingearbetet werten, die in diesem Be- reich lange-Zeit stabil ist. Das Trägermaterial kann vor der Einarbeitung des Enzyms auf einfache Weise salzfrei gewaschen werden. Das Verfahrensprodukt kann In beliebige Formkörper überführt werden. Das Verfahrensprodukt kann leicht bis auf einen Gehalt an Restwasser getrocknet werden, der dem Enzym nicht mehr schadet. Das immobilisierte enzymatisch aktive Präparat kann in dem Träger quellen, ohne aa3 der Träger mitqulllt oder sich verformt. Das Verfahrensprodukt ist sehr druckfest, so dass es auch in nohen Säulen eingesetzt werden kann. Aufgrund seiner hohen Porosität werden mit dem Verfahrensprodukt hohe Diffusionskoeffizienten erreicht, ohne dass eine Auswaschung des Enzympräparates erfolgt. Das Verfahrensprodukt behält seine enzymatische Aktivität über einen sehr langen Zeitraum bei. Zur Immobilisierung der enzymatischen aktiven Präparate werden toxikologisch unbedenkliche Substanzen verwendet, die gegen den Befall von Mikroorganismen resistent und gegen den Angriff von Chemikalien stabil sina. Beispiel 1 Als Trägermaterial wird eine aus Na-Wasserglas und Schwefesäure hergestellte und in einer Filterpresse salzfrei ge- waschene Fällungskieselsäure verwendet (DE-PS 536 546, Beispiel 1). Die Fällungskieselsäure-Paste mit ca. 23 % SiO2 wi-d mit 4,5 Gewichtsprozent Wasser versetzt una in einer Zahnkolloid- mühle zu einer Suspension vermahlen. Die Teilchengrösse liegt zu mindestens 95% über 1 m. In 735 g der dünnflüssigen Fällungskieselsäure-Suspension mit einem SiO2-Gehalt von ca. 22 % werden mit elnem Labo-- rührwerk 75 g eines weitporigen Kieselsäure-Xerogels mit einer Korngrösse von ca. 5 bis 20 m eingerührt. Die Mischung soll einen pH-Wert von ca. 5 aufweisen. Wenn erforderlich, wird der pH-Wert mit verdünnter Schwefelsäure oder verdünnter Natronlauge nachgestellt. In diese Mischung werden 187,5 a einer Trockenhefean- schl#ämmung (Saccharomyces cerevisiae) mit einem Feststoff gehalt von ca. 40 , und einem pH-Wert von 6 eingerührt. Nach ca. einstündigem Stehen wird die Katalysatormasse auf einer Strangpresse zu Extrudaten mit 2,5 mm Durchmesser verpresst und anschliessend 24 Stunaen bei 55 0C in einem. Trockenschrank getrocknet. Nach dem Trocknen ist der Strangdurchmesser auf ca. 1,5 mm geschrumpft. 1g des so erhaltenen immobilisierten Enzyms hydrolisiert pro Stunde 6,4 G Saccharose. Das entspricht einer Enzymnkti- vität von 68,7 %, wenn man die Enzymaktivität einer identischen Menge nicht immobilisierten Zellmaterials gleich 100 % setzt. Beispiel 2 Als Trägermaterial dient ein aus Na-Wasserglas und Schwefelsäure hergestelltes weitporlges granulatförmiges Kieselsäure- -Hydrogel, das salzfrei gewaschen wurde (DE-PS 456 406, Beispiel 2). Das Hydrogel mit einem SiO2-Geh27t von ca. 14 % wird unter Zusatz von Wasser in einer Zahnkolloidmühle zu einer 13 pro- zentigen Hydrogel-Suspension vermahlen. Die Teilchengrösse liegt zu mindestens 95 % über 1 m. n 200C 5 der Hydrogel-Suspension werden mit einem Labor rührwerk 130 g Kieselgur eingerührt. In diese Mischung werden 390 g Hefeanschlämmung (Saccharomyces cerevisiae) mit einem Trockenhefegehalt von ca. 33 % eingearbeitet. Zur Beschleunigung der Verfestigung der Katalysatormasse werten als elektrolyt 40 g einer 40prozentigen CaC03-Anschlämmung zugegeben. Anschliessend wird die verfestIgte Katalysator- masse auf einer Strangpresse zu 0,8 mm Extrudaten verpresst und in einem Trockenschrank 24 Stunden bei 55 0C getrocknet. Der nach der Trocknung durch Schrumpfen erhaltene Strang- durchmesser beträgt ca. 0,5 mm. 1 g des so erhaltenen immobilisierten Enzyms hydrolisiert pro Stunde 6,8 g Saccharose. Das entspricht einer Enzym- aktivität von 7S,7 r im Vergleich zur Enzymaktivität der nicht immobilisierten Zellmasse, die gleich 100% gesetzt wird. Beispiel 3 Es werden in 970 g einer wie unter Beispiel 2 hergestellten Hydrogel-Suspension 60 G Kieselgur mit einem Laborrührwerk eingerührt. In diese Mischung werden 240 g E. coli ATCC 11105 mit einem Trockensubstanzanteil von ca. 27 % eingearbeitet. Während weiterer. Rührens erfolgt die Verfestigung der Kata- lysatormasse unter Granulierung. Anschliessend wird das granulierte Material in einem Trockenschrank 24 Stunden be 5500 unter Vakuum getrocknet. Der mittlere Korndurchmesser des getrockneten Katalysators beträgt ca. 2 mm. 1 g des so erhaltenen immobilisierten Enzyms hydrolysiert pro Minute 5,1 Mol Penicillin G unter Bildung von 6-Aminopenicillansäure. Das entspricht einer Enzymaktivität von 10,5 % im Vergleich zur Enzymaktivität der nicht immobili- slerten Zellmasse, die gleich 100 % gesetzt wira. Beispiel 4 Es werden in 920 g einer wie unter Beispiel 2 hergestellten Hydrogel-Suspension 60 g Kieselgur mit einem Laborrührwerk eingerührt. In diese Mischung werden 300 g Arthrobacter NRRL 3726 mit einem Trockensubstanzanteil von ca. 19 % eingearbeitet. Zur Beschleunigung der Verfestigung der Kataly- satormasse werden als Elektrolyt 30 g eier 4o prozentigen CaCO3-Anschlämmung zugegeben. Anschliessend wird die verfestigte Katalysatormasse auf einer Strangpresse zu Extru- daten mit 1,5 mm Durchmesser verpresst und in einem Trockenschrank 24 Stunden bei 5500 unter Vakuum getrocknet. Der nach der Trocknung erhaltene Strangdurchmesser beträgt ca. 1 mm. 5 g des so erhaltenen immobilisierten Zellmaterials isomerisiert 19 Mol Glucose zu Fructose pro Minute. Das entspricht einer Enzymaktivitätä von 56,4% im Vergleich zur Enzymaktivitätä der nIcht immobilisierten Zellmasse, die gleich 100 gesetzt wird. Die in den vorgenannten Beispielen erwähnten Mikroorganismen können von den angegebenen Hinterlegungsstellen frei bezogen werden. Sollten diese irgendwann nicht mehr zur Verfügung stehen können die Beispiele mit anderen MiBro- organismen, die enzymatische Aktivität besitzen, durchgeführt werden.

Claims: Patentanspruch Verfahren zur Inmobilisierung von enzymatisch aktiven Pr=- paraten, dadurch gekennzeichnet, dass m2n eine Fällungskieselsäure oder Kieselsäure-Hydrogel enthaltende Suspension herstellt, in diese einen porösen Füllstoff und das enzymatisch aktive Präparat einarbeltet und die erhaltene Masse in Formkörper überfünrt und trocknet.

Inventors: KLEFENZ, HEINRICH, DR., MEISSNER, RUPRECHT, MERZ, GERHARD, DR., ZAHN, WOLFGANG, DR.
Applicants: BASF AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1980
Main classification: C12N11
IPC codes: A61K36, C12P37, C12N11, C12P19, A61K38