12-ALPHA-HYDROXY STEROIDS AND THEIR PREPARATION

Abstract: 1. Process for the manufacture of 12 alpha-hydroxysteroids of the general formula I see diagramm : EP0019162,P3,F1 in which X represents a hydrogen atom or a fluorine atom, R1 represents a hydrogen atom or a methyl group, and R2 represents a hydrogen atom or a hydroxy group, or R1 and R2 together represent an isopropylidenedioxy group, characterised in that a steroid of the general formula II see diagramm : EP0019162,P3,F3 in which X, R1 and R2 have the meanings given above and R3 represents a hydrogen atom or an alkanoyl group having from 1 to 6 carbon atoms, is fermented with a culture of Cercospora kaki (CBS 128 39).

Description: Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen 2 bis 4 ge kennzeichneten 12a-Hydroxysteroide, sowie das im Anspruch 1 gekennzeichnete Verfahren zur Herstellung von 12a-Hydroxy- steroiden. Die bisher bekannten Verfahren zur mikrobiologischen Her stellung von 12a-Hydroxysteroiden sind technisch nicht an wendbar, da die hierbei erzielten Ausbeuten an gewünschtem Verfahrensprodukt zu gering sind. Es wurde nun gefunden, dass es mit Hilfe einer Kultur von Cereospora kaki (CBS 128 39) überraschenderweise möglich ist, Steroide der allge meinen Formel II in relativ guten Ausbeuten in der 12a Position zu hydroxylieren. Enthalten die Steroide der allgemeinen Formel II in der 21-Position als Substituenten R3 eine Alkanoylgruppe - zum Beispiel eine Formylgruppe, eine Acetylgruppe, eine Propionylgruppe oder eine Butyryl gruppe - so wird diese bei der fermentativen Umwandlung verseift. Das erfindungsgemäBe Verfahren wird unter den Bedingungen durchgeführt, die man üblicherweise bei der mikrobiolo gischen Hydroxylierung von Steroiden anwendet. Unter den üblicherweise verwendeten Kulturbedingungen werden in einem geeigneten Nährmedium unter Belüften, Submerskulturen angezüchtet. Dann setzt man den Kulturen das Substrat der allgemeinen Formel II (in einem Lösungs mittel gelöst oder in emulgierter Form) zu und fermentiert, bis eine maximale Substratumwandlung erreicht ist. Geeignete Su'bstratl ösu;igsmittel sind beispielsweise Methanol, Äthanol, Glykolmonomethyläther, Dimethylformamid, oder Dimethylsulfoxyd. Die Emulgierung des Substrates kann beispielsweise bewirkt werden, indem man diese in mikro nisierter Form oder in einem mit Wasser mischbaren Lösungs mittel (wie Methanol, Äthanol, Aceton, Glykolmonomethyläther, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxyd) gelöst unter starker Dirbulenz in (vorzugsweise entkalktem) Wasser, welches die üblichen Emulgationshilfen enthält, eindüst. Geeignete Etaulgationshilfen sind nichtionogene Emulgatoren, wie zum Beispiel Äthylenoxyaddukte oder Fettsäureester von Polyglykolen. Als geeignete mmulgatoren seien die handelsüblichen Netzmittel Tegin (R), Tween(R) und Span beispielsmässig genannt. Die optimale Substratkonzentration, Substratzugabezeit und Fermentationsdauer ist von den angewendeten Fermenta tioncbedingungen abhängig. Diese Grössen müssen, wie dies bei mikrobiologischen Steroidumwandlungen allgemein erforderlich ist, im Einzelfall durch Vorversuche, wie sie dem Fachmann geläufig sind, ermittelt werden. Die erhaltenen l2a-Hydroxysteroide der allgemeinen Formel I sind wertvolle Zwischenprodukte zur Herstellung pharmakologisch wirksamer Steroide. So kann man diese Verbindungen beispielsweise unter den gleichen Bedingungen wie die entsprechenden lla- oder llss-Rydroxysteroide in der 1,2-Position dehydrieren und dehydratisieren (US-Patent 3,232,839) und erhält die entsprechenden 1,4,11(12)-Pregnatrien-3,20- dion Derivate, welche in bekannter Weise in antiinflammatorisch wirksame 12-Ealogen-llss-h;ydroxysteroide überführt werden können (Französisches Patent Nr. 1506008, US-Patent Nr. 3,053,837 und deutsche Offenlegungsschrift Nr. 26 32 678). Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele dienen zur Erläuterung des erfindungsgemässen Verfahrens. Beispiel 1 500 ml einer sterilen Nährlösung bestehend aus 10 % flüssigem Stärkezucker, (50 % Glucosegehalt), 0,5 % Cornsteep liquor, 0,2 % Natriumnitrat, 0,1 v/o Kaliumdihydrogenphosphat, 0,05 % Kaliumchlorid, 0,05 gXo Magnesiumsulfatheptahydrat 0,002% Eisen(Ii)-s'ffliatheptahydrat werden mit einer zwei Wochen alten Schrägagarkultur von Cereospora kaki (CBS 12 839) beimpft und fünf Tage lang bei 300 C geschüttelt. Die so erhaltene Vorkultur dient zur Beimpfung eines 20 l-Vorfermenters, der mit 15 1 eines sterilen Mediums, enthaltend LO % flüssigen Stärkezucker, (50 % Glucosegehalt), 0,5 % Cornsteep liquor, 0,2 % Natriumnitrat, 0,1 % Kaliumdihydrogen phosphat, 0,05 % Kaliumchlorid, 0,05 % Magnesiumsulfat- heptahydrat und 0,002% Eisen(II)-sulfatheptahydrat (mit 25 % Natronlauge pH eingestellt auf 6,5) beschickt ist. Man lässt die Vorkultur 48 bis 72 Stunden lang unter Rühren (220 U/Min.) und Belüftung (151 Buft/Min.) bei 0 C anwachsen. 29 0 900 ml einer so erhaltenen Vorkultur werden in einen 20 1 Hauptfermenter überführt, welcher 14,1 1 eines sterilen Mediums bestehend aus 6 % flüssigem Stärkezucker, 1 % Cornsteep liquor, 0,2 % Natriumnitrat, 0,1 % Ealiumdi- hydrogenphosphat, 0,2 % Kaliumhydrogenphosphat, 0,05 % Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,002 % Eisen(II)-sul fat und 0,05 % Kaliumchlorid (pH eingestellt auf 5,8) beschickt ist. Man lässt die Kultur unter Rühren und Belüftung bei 290 C anwachsen und fügt nach 12 Stunden oder 24 Stunden eine sterilfiltrierte Lösung von 3,75 g 17a,21-Dihydroxy- 4-pregnen-3,20-dion in 100 ml Dimethylformamid hinzu, wonach unter gleichen Bedingungen weiterfermentiert wird. Die Kontrolle der Umsetzung erfolgt dünnschichtchromatographisch auf Fertigplatten Kieselgel 60 F 254 Merck von Methyl i sobutylket onext rakt en von Intervallproben der Kulturbrühe. Nach vollständiger Umwandlung des Ausgangsmaterials(ca. 37 Stunden) wird der Fermenteransatz filtriert, das Filtrat und das Myzel mit Methylisobutylketon extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt und im Vakuum eingeengt. Der erhaltene Rückstand wird zweimal mit je 100 ml Hexan von anhaftendem Antischaummittel (Silicon SH) gewaschen, über eine Kieselgelsäule chromatographiert und aus Essigester unter Zusatz von Aktivkohle umkristallisiert. Man erhält 1,16 g 12&alpha;,17&alpha;,21-Trihydrox;y-4-pregnen-3,20-dion vom Schmelzpunkt 209-210 C. BeisPiel 2 Unter den Bedingungen von Beispiel 1 werden 1,2 g 17a,21 Dihydroxy-16&alpha;-methyl-4-pregnen-3,20-dion in 19 Stunden Kontaktzeit fermentiert. Man erhält 370 mg 12a,17a,21-2ri- hydroxy-16&alpha;-methyl-4-pregnen-3, 20-dion vom Schmelzpunkt 237-239 C. Beispiel 3 Unter den Bedingungen von Beispiel 1 werden 3,75 g 21 H;srdroxy-6a-fluor-16a-methyl-4-pregnen-3,20-dion in 21 Stunden Kontaktzeit fermentiert. Man erhält nach chro matographischer Reinigung des Rohproduktes 895 mg 12a,21- Dihydroxy-6a- fluor-16&alpha;-methyl-4--pregnen- 3, 20-dic!- vom---- Schmelzpunkt 205-206 C.

Claims: PatentansDrüche 1. Verfahren zur Herstellung von 12a-H;ydroxysteroiden der allgemeinen Formel I EMI5.1 worin X ein Wasserstoffatom oder ein Fluoratom bedeutet, und R1 ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe sowie R2 ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxygruppe oder R1 und R2 gemeinsam eine Isopropylidendioxygruppe darstellen, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Steroid der allgemeinen Formel II EMI6.1 worin X, R1 und R2 die obengenannte Bedeutung besitzen und R3 ein Wasserstoffatom oder eine Alkanoylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt, mit einer Kultur Cereospora kaki (CBS 128 39) fermentiert. 2. 12&alpha;,17&alpha;,21-Trihydroxy-4-pregnen-3,20-dion. 3. 12a,17a,21-Urihydroxy-16a-methyl-4-pregnen-5,20-dion. 4. 12&alpha;,21-Dihydroxy-6&alpha;-fluor-16&alpha;-methyl-4-pregnen-3,20- dion.

Inventors: KERB, ULRICH, DR., KIESLICH, KLAUS, DR.
Applicants: SCHERING AKTIENGESELLSCHAFT BERLIN UND BERGKAMEN
Application year: 1980
Main classification: C12P33
IPC codes: C07J5, C12R1, C12P33