Influenza virus vaccines, process for preparing them and process for propagating influenza viruses

Abstract: 1. Method of preparing an influenza virus vaccine in which cells are infected with an influenza virus and the virus multiplies in the cells, whereupon the virus is isolated and a vaccine is prepared from the isolated virus, characterized in that some of the cells of a liquid cell culture are infected with an influenza virus and the infected culture is incubated in the presence of a proteolytic enzyme the concentration of which is sufficiently high to cause growth in a multiple number of cycles without causing any detachment of cells when confluent monolayers are used as the cell culture.

Description: Influenzavirus-Vaccine, Verfahren zu ihrer Herstellung, Ver fahren zur Vermehrung von Influenzaviren sowie mit Influen zaviren beimpfte Zellkultur Die Erfindung betrifft eine neue Influenzavirus Vaccine, Verfahren zu ihrer Herstellung, Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren sowie mit Influenzaviren beimpfte Zellkultur. Influenzavaccine sind seit den frühen Vierzigerjahren für die Impfung von Menschen und seit den späten Sechziger jahren für die Impfung von Pferden in Gebrauch. Alle zur Zeit verwendeten Influenzavaccine werden durch Züchten der Vaccinevirusstämme im bebrüteten Hühnerei hergestellt. Die hierbei erhaltenen Virusstärnine werden dann zur Her stellung von Virus-Lebendvaccinen verwendet oder zur Her stellung von abgetöteten Virusvaccinen weiterverarbeitet. Es ist Virologen allgemein bekannt, dass Influenzaviren in Zellkulturen nur in sehr begrenztem Masse wachsen. Das Wachstum wird als "einstufiger Wachstumszyklus" bezeich net, d.h. nur die ursprünglich infizierten Zellen pflanzen Viren fort. Diese Erscheinung wird beispielsweise von Davis et al in MICROBIOhOGY, Harper and Row Publishers, Kapitel 44, S. 1138-1139 (1968) beschrieben. Da die Viren der ursprünglich infizierten Zellen aufeinanderfolgende Zahlen von Zellen in der gleichen Zellkultur nicht zu infizieren vermögen, sind die erhaltenen Ausbeuten bei weitem zu niedrig, um für die Herstellung von Virusvacci nen brauchbar zu sein. Flüssige Zellkulturen wurden daher für die Grossherstellung von Influenzavirus-Vaccinen nicht verwendet. Bebrütete Hühnereier werden zur Herstellung von Viren mit Titern verwendet, die für die Herstellung von Impfstoffen genügend hoch sind. Leider erfordern auf dem Brutei gezüchtete Viren gewöhnlich eine Konzentrierung und im Falle von menschlichen Vaccinen ausserdem in irgendeiner Form eine Reinigung, um toxische Reaktionen als Folge des unerwünschten Eiereiweisses zu reduzieren. Die Verwendung von Eiern für die Impfstoffherstellung ist zeitraubend, arbeitsintensiv und erfordert verhältnismässig hohe Materialkosten,.und die Ausbeute aus einem Ei genügt gewöhnlich nur, um Vaccine für etwa 1 bis 1,5 Dosen herzustellen. Die Herstellung von Millionen Dosen erfordert somit die Beimpfung und Gewinnung von Millionen Bruteiern. Vor kurzem wurde festgestellt, dass die verschiedensten Influenza-A-Viren einschliesslich der bei Menschen, Pferden, Schweinen und Vögeln vorkommenden Stämme produktiv in einer festliegenden Linie von Hundenierenzellen unter einem Auflagemedium ("overlay medium"), das Trypsin enthält, wachsen und ohne Rücksicht auf ihre Passagenvorgeschichte wohldefinierte Plaques bilden; siehe die Arbeit von K. Tobita et al "Plaque Assay and Primary Isolation of Influenza A Viruses in an Established Line of Canine Kidney Cells (MDCK) in the presence of Trypsin", Med. Microbiol. Immunol. 162 (1975) 9-14. Ferner wird auf die Veröffentlichung von Hans-Dieter Klenk et al "Activation of Influenza A Viruses by Trypsin Treatment" in Virology 68 (1975) 426-439 verwiesen. Es ist zu bemerken, dass bei den vorstehend genannten Berichten die Wirkungen von Trypsin auf die Influenzavirus-Vermehrung in halbfesten Kulturen bei Plaquebildungsbestimmungen und -isolierungsmethoden beobachtet wurden, bei denen es sich in keinem Fall um flüssige Zellkulturen oder die grosstechnische oder kommerzielle Vermehrung von Influenzaviren für die Impfstoffherstellung handelte. Der hier gebrauchte Aus druck "flüssige Zellkultur" bezeichnet die Züchtung von Zellen in vitro und die Vermehrung von Viren in einem chemisch definierten flüssigen Medium. Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass proteolytische Enzyme ebenfalls in flüssigen Zellkulturen verwendet werden können, um die Infizierung aufeinanderfolgender Generationen von Zellen in der gleichen Zellkultur zu erleichtern. Dadurch, dass in dieser Weise die Begrenzungen des "einstufigen Wachstumszyklus" der bisherigen Methoden der Kultivierung in flüssigen Zellkulturen überwunden wurden, ist es möglich, eine Influenzavirus-Ausbeute zu erzielen, die 1000- bis 10.000fach grösser ist als bei nicht mit Protease behandelten Kulturen. Dies ermöglicht die Anwendung der Methoden der Kultivierung in flüssigen Zellkulturen für die Grossherstellung von Influenza-Impfstoffen, wodurch die mit der Verwendung von bebrüteten Hühnereiern verbundenen Nachteile vermieden werden. Einzelheiten des Kulturmediums, der Methoden der Virusvermehrung und der Vaccineherstellung sowie Gebrauchsmethoden werden nachstehend beschrieben. Das Influenzavirus-Vermehrungsmedium gemäss der Erfindung umfasst eine Zellkultur, die mit einem Influenzavirus infizierbar ist, ein Influenzavirus und ein proteinhydrolysierendes Enzym, das in einer genügenden Menge vorliegt, um den einstufigen Wachstums zyklus des Virus auszuschalten. Das Virusvermehrungsverfahren gemäss der Erfindung umfasst die Stufen der Beimpfung oder Infizierung einer flüssigen Influenzavirus-Zellkultur mit den Influenza-Viren, der Inkubation des Inoculats in Gegenwart eines proteinhydrolysierenden Enzyms unter Bedingungen, die genügen, um maximales Viruswachstum (oder einen maximalen zytopathischen Effekt) zu gewährleisten, und der Gewinnung des Virus. Die Infizierung der Zellen mit dem Virus kann vor oder nach der Bildung der Mbnoschicht der Zellen oder auch einfach durch Infizierung einer flüssigen Suspension der Zellen erfolgen. Das Vaccineherstellungsverfahren gemäss der Erfindung umfasst die anschliessende Stufe des Abtötens des geernteten Virus oder des Abschwächens durch eine weitere Passage in der Zellkultur für den Vaccinegebrauch. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen wird die Protease Trypsin in Verbindung mit einem Hundenierenzelllinie zur Vermehrung aller beliebigen verschiedenen Typen von Influenza-Viren verwendet. Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die Abbildungen weiter erläutert. Fig. 1 bis Fig. 5 sind Balkendiagramme, die die Steigerungen des Titers veranschaulichen, die erreicht wurden, wenn die genannten Virus stämme in einer flüssigen Zellkultur in Gegenwart verschiedener Mengen einer typischen Protease, des Trypsins, inkubiert wurden. Die Ergebnisse sind als geometrische mittlere Titer angegeben. Nachstehend werden spezielle Ausführungsformen der Erfindung beschrieben. Bei den erfindungsgemässen Verfahren zur Influenzaviruszüchtung und lmpfstoffherstellung ist die Verwendung von Influenza-Vaccineviren vorgesehen. Der hier gebrauchte Ausdruck "Influenzavirus" umfasst alle Viren, die in der Lage sind, bei Tieren (einschliesslich des Menschen) einen febrilen Krankheitszustand hervorzurufen, der durch respiratorische Symptome, Schleimhautentzündung und häufig systemischen Befall gekennzeichnet ist. Das Medium und die Verfahren gemäss der Erfindung sind besonders vorteilhaft für die Erzeugung der verschiedensten Influenza Viren einschliesslich der Stämme, die Mensch, Pferd, Schwein und Vögel befallen. Beispiele der Herstellung typischer Influenza-Viren des Typs A und B werden später beschrieben. Die Impfstoffe gemäss der Erfindung umfassen alle Präparate von abgetöteten, lebenden abgeschwächten oder lebenden voll virulenten Influenza-Viren, die verabreicht werden können, um Immunität gegen jede Influenza-Erkrankung zu erzeugen oder künstlich zu steigern. Bei bevorzugten Ausführungsformen liegt die Vaccine als wässrige Suspension der Viruspartikel in gebrauchsfertiger Form vor. Für die Zellkulturen, die als geeignet für die Durchführung des Verfahrens gemäss der Erfindung vorgesehen sind, kamxn alle tierischen Zellstämme oder -linien infrage, die durch einen oder mehrere gegebene Influenza-Virusstämme infizierbar sind und die Vermehrung dieser Virusstämme ermöglichen. Zwar ist eine Anzahl solcher Zellen bekannt und wird als geeignet für die hier beschriebenen Verfahren gehalten, jedoch wurden von der Anmelderin besonders gute Ergebnisse mit einem ganz bestimmten Zellstarnrn erhalten, der als Cutter Laboratories Dog Kidney (CLDK)-Zellstamm (Hundenieren-Zellstamm der Cutter Laboratories) bekannt ist. Der CLDK-Zellstamm ist vom Landwirtschaftsministerium der U.S.A. für die Verwendung zur Herstellung von Veterinär-Vaccinen genehmigt worden und ist dem Madin Darby Hundenieren-Zellstamm (ATCC Nr. CCL 34) und den in der US-PS 3 616 203 beschriebenen Hundenieren-Zellstamm ähnlich. Nachstehend folgen eine kurze Geschichte und eine Beschreibung des für den Zellstamm in den Beispielen verwendeten speziellen Ursprungs-Gewebematerials, obwohl natürlich die hier beschriebenen Methoden als geeignet für alle für Influenza-Viren brauchbaren Zellkulturen gehalten werden. Hundenieren-Zellstamm der Cutter Laboratories (CLDK) Geschichte Der Ursprungs stamm von CLDK wurde von der Niere eines offensichtlich normalen Beagle-Hundes, der von der Universität California in Davis erhalten worden war, durch die Cutter Laboratories, Inc., Berkeley, California (USA.), herangezüchtet und als Permanentkultur weitergeführt. Der Stamm wurde auf 0,5% Milcheiweisshydrolysat und 0,2% Hefe extrakt in Earle's ausgewogener Salzlösung plus 5% Kalbs-, Schafs- oder Pferdeserum und Antibiotika gehalten und nach den Methoden von J.S. Younger (Proc. of Exp. Biol. and Med., V 85, 202) kultiviert. Eine eingefrorene Ampulle der 142. Passage dieses Zellstamms wurde anschliessend in einem 75 cm2 (250 ml)-Falconkolben in ein Gewebekulturmedium gegeben, das aus Earle's ausgewogener Salzlösung als essentielles Minimum-Medium (Earle's balanced salt solution Minimum Essential Medium (SEM)) und 10% fötalem Rinderserum bestand. Die Zellen wurden in der gleichen Weise und im gleichen Medium weitergezüchtet, um das eingefrorene Masterzellmaterial in der Passage 148 herzustellen. Eine Ampulle des Masterzellmaterials wurde aufgetaut und reihenmässig 20mal weiterkultiviert, wobei Flaschenkulturen der 168. Passage erhalten wurden. Diese Zellen wurden dann eingefroren. Beschreibung des Masterzellmaterials (MCS) Nummer der Seriensubkulturen vom Ursprungsgewebe: 148 Gefriermedium: Essentielles Mindestmedium (Eagle) in Earle's BSS mit reduziertem Bicarbonat (1,65 g/l) 80%; fötales Rindersrum 10%; Dimethylsulfoxid 10%. Lebensfähigkeit: Ungefähr 75% (Farbsto±fausschluss). Kulturmedium: Essentielles Mindestmedium (minimum essential medium) (Eagle) in Earle's BSS mit reduziertem Bicarbonat (1,65 .g/l) 908; fötales Rinderserum 2-10 & Antibiotika: Penicillin und Streptomycin 100 E. oder i /ml. Wachstumsmerkmale der aufgetauten Zellen: Ein Inoculum von 3 x i06 lebens fähigen Zellen/ml, kultiviert im vorstehend genannten Kulturmedium bei 37 0C in einem geschlossenen System, vermehrt sich in 5 Tagen ungefähr 6- bis 8fach. Morphologie: epithelialartig. Karyologie: Chromosomenfrequenzverteilung 100 Zellen: 2N = 72. Zellen: 1 1 2 4 6 9 69 5 3 Chromosomen: 60 65 68 69 70 71 72 73 74 Keine Markierungschromosomen. Sterilitätstests: Frei von Mykoplasma, Bakterien und Pilzen Spezies: Durch Immunofluoreszenztest als Hund bestätigt. Virus-Anfälligkeit: Empfänglich für Influenza-Viren, Rabies-Virus, infektiöse Rinder-Rhinotracheitis, infektiöse Hundehäpatitis, Hundestaupe-Virus und möglicherweise andere Viren. Zu den Proteine hydrolysierenden Enzymen (proteolytisches Enzym oder Protease), die als geeignet für die Zwecke der Erfindung vorgesehen sind, gehören bekannte Proteasen, z. B. Trypsin, Chymotrypsin, Pepsin, Pancreatin, Papain, Pronase, Carboxypeptidase u.dgl., wobei Trypsin ein besonders bevorzugtes Enzym ist. Der genaue Mechanismus bzw. die genauen Mechanismen, nach denen eine Protease wie Trypsin die Influenzavirus-Infektiosität steigert, sind noch nicht völlig geklärt. Ein möglicher Mechanismus wird in dem vorstehend genannten Artikel von Klenk et al vorgeschlagen. Wie nachstehend beschrieben, sollte die Menge der aktiven Protease, die erforderlich ist, um die aufeinanderfolgende Infektuosität zu steigern, wenigstens genügen, um die Begrenzungen des einstufigen Wachstums zyklus auszuschalten, aber im Falle von konfluierenden Monoschichtkulturen nicht so hoch sein, dass Ablösung von konfluierenden Zellen von den Oberflächen des Gewebekulturgefässes (d.h. der Innenfläche einer Rollflasche) verursacht wird. Im Falle des bei den in den folgenden Beispielen beschriebenen Versuchen verwendeten speziellen Enzyms wird eine Menge des Enzyms im Bereich von etwa 4 bis 25 pg/ml des flüssigen Gewebekulturmediums, insbesondere eine Menge von etwa 10 ug/ml, bevorzugt. Virusverznehrungsmethoden Das hier beschriebene Verfahren zur Vermehrung von Influenza-Viren umfasst die drei allgemeinen Stufen der Infizierung eines Teis der Zellen einer flüssigen Zellkultur mit dem Influenza-Virus, der Inkubation der Zellen in Gegenwart eines proteolytischen Enzyms unter Bedingungen, die genügen, um maximalen zytopathischen (CP) Effekt zu gewährleisten, und der Isolierung der Viren von der Kultur. Die Impfstoffherstellung umfasst die anschliessende Stufe der Modifizierung des isolierten Virus nach bekannten Methoden zur Herstellung einer Lebendvaccine mit virulenten oder abgeschwächten Viren oder einer Vaccine mit abgetöteten (inaktiven) Viren. Die Vaccine kann in trockener Form für die Vermischung mit einem Verdünnungsmittel oder in flüssiger, gebrauchsfertiger Form vorliegen. Wie nachstehand beschrieben, können geeignete Adjuvantien zur Steigerung der Immunisierungsfähigkeit einbezogen werden. Die Protease kann einer wässrigen Suspension der Zellkultur oder vor oder nach der Bilding einer konfluenten Monoschichtkultur zugesetzt werden. Einige der verschiedenen Vermehrungsmethoden werden nachstehend als Beispiel beschrieben, Methode A: Infizierung der vorgebildeten Monoschichten 1. Die Zellen werden bis zur Konfluenz in Kulturgefässen wie Rollflaschen, Povitsky-Kolben oder Roux-Flaschen unter Verwendung bekannter Zellkulturmedien gezüchtet. 2. Vor der Infizierung wird das Nährmedium aus den Mono schichten der Zellen entfernt. 3. Das Arbeits-Impfmaterial des Influenza-Virus wird im Züchtungsmedium verdünnt, das zusätzliche Vitamine, nicht-essentielle Aminosäuren, L-Glutamin, Dextrose und Antibiotika enthält, wobei der pH-Wert auf 6,6 bis 6,8 eingestellt wird. 4. Eine Menge des das Virus enthaltenden Verdünnungs mittels wird zur Zellmonoschicht in Mengen von 10% bis 100% des endgültigen, für die Isolierung vorgesehenen Volumens gegeben. 5. Die infizierten Monoschichten werden 1 bis 72 Stunden bei 340 bis 37 0C inkubiert. 6. Protease wird allein oder in Kombination mit dem Virus züchtungsmedium in einer Konzentration zugesetzt, die das Wachstum in vielfachen Zyklen fördert, ohne Los lösung von Zellen hervorzurufen.Bei Trypsin liegt diese optimale Konzentration zwischen etwa 8 und 15 pg/ml. 7. Die Viruszüchtungsbehälter werden erneut bei 340 bis 37 0C inkubiert, bis maximale zytopathische Effekte beobachtet werden. Zu diesem Zeitpunkt werden die Virusflüssigkeiten isoliert. 8. Zur Isolierung werden die Behälter kräftig geschüttelt, um die Zellen zu entfernen, und die Flüssigkeiten und Zellen in einen sterilen Behälter zur weiteren Verar beitung überführt. Methode B: Infizierung der flüssigen Zellsuspension vor der Monoschichtbildung 1. Die Zellen werden aus den Kultivierungsbehältern nach üblichen Verfahren entfernt. 2. Die Zellen werden durch Zentrifugation eingeengt und dann in einer Menge frischen Nährmediums, das zusätz liche Vitamine, nicht-essentielle Aminosäuren, L-Glu tamin, Dextrose und Antbiotika enthält, erneut suspen diert. 3. Dieser konzentrierten.Zellsuspension wird dann Influenza virus zugesetzt. 4. Die Zell-Virus-Suspension wird in einem sterilen ge schlossenen GefäB (z.B. einem Erlenmeyerkolben mit Schraubkappe) inkubiert (250 bis 37 0C), während sie auf einem Magnetrührer oder einer rotierenden Schüttel vorrichtung 10 Minuten bis 4 Stunden gemischt wird. 5. Aliquote Teile der Zell-Virus-Suspension werden in Züchtungsbehälter (Rollflaschen, Roux-Flaschen, Povits ky-Kolben) gegeben, wobei das volle Volumen der Medien die in B-2 genannten Bestandteile plus 5% fötales Kalbsserum enthält. 6. Die Kultivierungsbehälter werden bei 340 bis 370C inku biert, bis konfluente Monoschichten sich gebildet haben (ungefähr 2 bis 4 Tage). 7. Nachdem sich Monoschichten gebildet haben, wird Pro tease in einer Konzentration zugesetzt, die Wachstum in vielen Zyklen fördert, ohne dass Zellen abgelöst werden. Bei Trypsin liegt diese optimale Konzentration zwischen 10 und 25 pg/ml. 8. Die Kultivierungsbehälter werden bei 340 bis 370C inkubiert, bis maximale zytopathische Effekte beobach tet werden. Das Virus wird dann isoliert. 9. Zur Isolierung werden die Behälter kräftig geschüttelt, um die Zellen zu entfernen, und die Zellen und Flüssig keiten in einen sterilen Behälter zur weiteren Verar beitung überführt. Methode C: Beimpfen einer Kultur in flüssiger Suspension 1. An die Suspensionskultur angepasste Zellen werden bis zur optimalen Zahl im Nährmedium in Behältern für die Suspensionskultur gezüchtet. 2. Die Zellen werden zentrifugiert und in einer Menge frischen Nährmediums, das zusätzliche Vitamine, nicht essentielle Aminosäure, L-Glutamin, Dextrose und Antibiotika enthält, erneut suspendiert. 3. Influenzavirus wird dann zugesetzt und das Kulturmedium bei 340 bis 37 0C 10 Minuten bis zu einigen Stunden inkubiert. 4. Fötales Kalbsserum kann zugesetzt werden, und die Kul tursuspension wird 1 bis 72 Stunden bei 340 bis 37 0C weiter inkubiert. 5. Protease wird in einer Konzentration zugesetzt, die Züchtung in vielen Zyklen ermöglicht, ohne dass eine nachteilige Wirkung auf die Zellen ausgeübt wird. Bei Trypsin liegt die optimale Konzentration zwischen 4 und 25 ug/ml. 6. Die Inkubation bei 340 bis 37 0C wird fortgesetzt, bis maximale zytopathische Effekte beobachtet werden. Zu diesem Zeitpunkt werden die Flüssigkeiten isoliert. 7. Zur Isolierung werden die Flüssigkeiten in einen steri len Behälter zur weiteren Verarbeitung überführt. Nachstehend folgen spezielle Beispiele der Anwendung der Methoden gemäss der Erfindung und der Nährmedien für die Vermehrung ausgewählter Stämme von Influenzaviren. Falls nicht anders angegeben, wurden übliche bekannte Gewebekulturverfahren angewendet. Da die Verfahren der Herstellung und Vorbereitung sowohl der Zellen als auch des Mediums bekannt sind, werden sie hier nicht ausführlich beschrieben. Beispiel 1 Das Pferde-Influenzavirus A2, als Miami-Stamm bezeichnet, wurde ursprünglich von einem Pferd an der Universität Miami isoliert. Dieses Virus wurde von der Medical School der Universität Pennsylvania bezogen, wo es in 6 Passagen über bebrütete Hühnereier geführt wurde. Die 7. Passage wurde bei Lederle Laboratories durchgeführt und von diesen erhalten. Der Stamm wurde über weitere Passagen in bebrüteten Hühnereiern geführt und in den Passagen 11 bis 16 verwendet. Das zur Zeit bevorzugte Verfahren zur Vermehrung des Stamms A2 in der Gewebekultur wird wie folgt durchgeführt: Eine junge, konfluente Monoschicht von CLDK-Zellen wird beimpft. Die Zellen werden in Rollflaschen eingesetzt, wobei Hank's essentielles Mindestmedium (Minimum Essential Medium) (MEMH), das die folgenden Bestandteile enthält, verwendet wird: Fötales Rinderserum 5 bis 10 % nicht-essentielle Aminosäuren 10 ml/l (gibco) L-Glutamin io ml/l (Gibco) Neomycinsulfat 30.000 Polymyxin B 30.000 Einheiten /1 Mycostatin 25.000 Einheiten/l Die Zellen sind gewöhnlich nach 72 Stunden konfluent. Zu diesem Zeitpunkt wird das Mesium abgegossen, und die Zellen werden infiziert. Das Impfmedium enthält das A2-Virus auf einen "Egg Infective Dose50(EID50)"-Titer von etwa 1o3,0/ml in MEMH verdünnt, das mit den folgenden Bestandteilen ergänzt ist: 50 %ige Dextrose 2,6 ml/l MEM-Vitamine 30 ml/l (Gibco) nicht-essentielle Aminosäuren 1o ml/l (Gibco) L-Glutamin 1o ml/l (Gibco) Neomycinsulfat 30.0001ug/l Polymyxin B 30.000 Einheiten/l Mycostatin 25.000 Einheiten/l Das Inoculierungsmedium, das 14 % des Endvolumens entspricht, wird zu jeder Rollflasche gegeben, und die Behälter werden 72 Stunden bei 34 bis 350C inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wird das verbliebene Medium (86 %), das 12/ug/ml sterile Trypsinlösung (Sigma 1:250) (o,1 g/loo ml) enthält, zu jeder Rollflasche gegeben. Die Gefässe werden erneut bei 34 bis 35 0C inkubiert, bis der maximale zytopatische Effekt beobachtet wird (48 bis 72 Stunden). Zu diesem Zeitpunkt werden die Flüssigkeiten isoliert. Zur Isolierung werden die Rollflaschen zur Entfernung von etwa anhaftenden Zellen kräftig geschüttelt und die Zellen und Virusflüssigkeiten zur Weiterverarbeitung in einen sterilen, chargenweise arbeitenden Behälter überführt. Die EID50 -Titer des nach diesem Verfahren gezüchteten Influenzavirus A2 nach der Isolierung sind in Tabelle 1 genannt. Ferner wird auf Fig. 1 verwiesen. Ein Vergleich wird mit dem nach dem gleichen Verfahren, jedoch ohne Zusatz von Trypsin gezüchteten A2-Virus vorgenommen. Tabelle 1 EID von Pferde-Influenzavirus, Miamistamm, gezüchtet in CLDK Zellen mit und ohne Zusatz von Trypsin. Trypsin- Titer (EID50/ml) x-fache Steigerung menge, pg/ml Einsatz nach mit Trypsin Isolierung - 10216 10612 - 103,2 10612 5 102,9 108,3 126 5 102,9 108,1 79 5 102t6 > 109f2 > 1000 10 10219 109t2 1000 10 102t9 10815 200 10 in3,2 1o8t2 100 10 103t2 1010,0 6310 10 1o3t1 1014,5 199, 526, 232 15 10311 108,9 501 Die Zugabe von Trypsin zum Kulturmedium ergab einen geometrischen Anstieg von 3,2 log oder 1711mal so viele Virus partikel/ml während der Produktion des Miami-Stamms. Beispiel 2 Eine Probe des virulenten Typs des Pferde-Influenzavirus Al wurde von der Medical School der Universität Pennsylvania bezogen. Der als Pennsylvania (A7) bezeichnete Stamm wurde von einem Pferd isoliert und über sechs Passagen im bebrüteten Hühnerei geführt. Der Stamm wurde über weitere Passagen im Brutei geführt und wird bei den Passagen 12 bis- 17 für die Gewebekulturproduktion verwendet. Für die Vermehrung des Stamms Al in der Gewebekultur wird die folgende Methode bevorzugt: Eine Suspension von CLDK Zellen wird vor der Bildung der Monoschicht infiziert. Die CLDK-Zellen in einer Konzentration von etwa 10 '5/ml, Pennsylvania-Stamm des Virus bei einem EID50-Titer von 103,0/mol bis 105,0/mol und Hank's Minimum Essential Medium (MEtE), das durch die nachstehend genannten Stoffe ergänzt ist, werden bei 25 0C inkubiert, während sie auf einem Magnetrührer in einem geschlossenen sterilen Erlenmeyerkolben gemischt werden. Der pH-Wert wird während der Inkubationszeit von 2 bis 3 Stunden mit 1N-HCl bei 6,7-6,8 gehalten. Ergänztes MEMH-Medium 50%3be Dextrose 2,6 ml/l MEM-Vitamine 30 ml/l (Gibco) Nicht-essentielle Aminosäuren 10 ml/l (Gibco) L-Glutamin 10 ml/l (Gibco) Neomycinsulfat 30.000 Polymyxin B 30.000 Einheiten/l Mycostatin 25.000 Einheiten/l Nach dieser Züchtung in Suspension werden aliquote Teile von je 10 ml der Zell-Virus-Suspension in Rollflaschen gegeben, die 1 1 des in der vorstehend genannten Weise ergänzten MEMH-Mediums, das 5% fötales Kalbsserum enthält, enthalten. Die Rollflaschen werden bei 340 bis 35 0C inkubiert, bis die Monoschicht konfluent ist (ungefähr 48 bis 72 Stunden), worauf 20 ml einer sterilen Trypsinlösung von 1 mg/ml (Sigma 1:250) in jede Rollflasche gegeben werden. Die Rollflaschen werden erneut bei 340 bis 35 0C inkubiert, bis der maximale zytopathische Effekt beobachtet wird (3 bis 5 Tage). Die Virusflüssigkeiten werden isoliert, indem jede Rollflasche zur Entfernung der haften gebliebenen Zellen kräftig geschüttelt wird und die Zellen und Flüssig keiten zur weiteren Verarbeitung in ein steriles Gefäss überführt werden. Die EID50-Titer des nach diesem Verfahren gezüchteten Influenzavirus Al sind in Tabelle 2 genannt. Ferner wird auf Fig. 2 verwiesen. Ein Vergleich wird mit dem nach dem gleichen Verfahren ohne Trypsin gezüchteten Virus A1 vorgenommen. Tabelle 2 EID -Titer von in CLDK-Zellkultur mit und ohne Trypsin gezüchtetem Pferde-Influenzavirus, Stamm Pennsylvania. Trypsinmenge Titer (EID50/ml) x-fache Steigerung p9/mi Einsatz nach mit Trypsin Isolierung 105,3 105,9 - 104,9 105t4 10 105'3 1074 50 10 104'9 106,8 13 10 105,1 108,0 200 20 105t3 108f7 1000 20 104t9 108,5 631 20 105,0 107t1 25 20 104t9 108,3 398 20 103,2 109t2 3162 20 103t2 107,5 63 20 103,2 108,2 316 mittleren Die Zugabe von Trypsin zum Kulturmedium ergab einen/ geometrischen Anstieg von 2,3 log oder 187mal so viele Virus partikel/ml während der Produktion des Pennsylvania-Stamms. Beispiel 3 Ein Stamm des menschlichen Influenzavirus mit der Bezeichnung B/Hongkong/5/72 (BX-1) wurde vom The Center for Disease Control in Atlanta, Georgia, bezogen. Dieser Stamm wurde in einer Passage über bebrütete Hühnereier geführt und bei -700C als Arbeitsimpfvirus eingefroren. Für die Vermehrung des Stamms B/Hongkong/5/72 in der Gewebekultur wird die folgende Methode bevorzugt: Eine junge konfluente Monoschicht von CLDK-Zellen ähnlich denen in Beispiel 1 wird infiziert. Die Zellen werden auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise gezüchtet. Das Nährmedium wird von den Zellen entfernt und verworfen. Die Zellen werden dann mit dem Virus infiziert, das in dem in Beispiel 1 genannten Impfmedium auf einen EID50-Titer von etwa 103' 5'0/ml verdünnt worden ist. Das Inoculum besteht aus einem Volumen, das 33,3% des endgültigen isolierten Volumens entspricht. Gefässe werden 40 bis 48 Stunden bei 340 bis 350C inkubiert, worauf das restliche Medium (66,7%), das 12 ug/ml Trypsinlösung (0,1 g/ 100 ml) enthält, jedem Gefäss zugesetzt wird. Die Inkubation bei 340-350C wird fortgesetzt, bis der maximale zytopathische Effekt beobachtet wird (48 bis 72 Stunden), worauf die Virusflüssigkeiten isoliert werden. Die Isolierung erfolgt durch kräftiges Schütteln jedes Gefässes zur Entfernung der Zellen und Überführung von Zellen und Flüssigkeiten in ein steriles Gefäss zur Weiterverarbeitung. Die EID50-Titer des nach diesem Verfahren gezüchteten Influenzavirus B/Hong Kong/5/72 nach der Isolierung sind nachstehend in Tabelle 3 genannt. Ferner wird auf Fig. 3 verwiesen. Ein Vergleich wird mit diesem nach dem gleichen Verfahren, jedoch ohne Zusatz von Trypsin gezüchteten Virus vorgenommen. Tabelle 3 EID50 -Titer des menschlichen Influenzavirusstamms B/Hong Kong/5/72, der in CLDK-Zellen mit und ohne Trypsin gezüchtet worden ist. Trypsinmenge Titer (EID /ml) x-fache Steigerung pg/ml Einsatz Nah mit Trypsin Isolierung in3,2 10610 - 105'7 10614 ¯ 8 10310 1o8x7 316 8 10210 109,0 631 8 104t5 1e9t5 1995 8 103t5 > 1o10,2 > 10000 Die Zugabe von Trypsin zum Kulturmedium ergibt einen geometrischen mittleren Anstieg von 3,1 log oder 1412mal so viele Viruspartikel während der Produktion des Stamms B/Hong Kong. Beispiel 4 Ein Stamm des menschlichen Influenzavirus mit der Bezeichnung A/Texas/1/77 wurde von The Center for Disease Control in Atlanta, Georgia, bezogen. Dieser Stamm wurde in einer Passage über bebrütete Hühnereier geführt und bei -700C als Arbeitsimpfvirus eingefroren. Für die Vermehrung des Stamms A/Texas/1/77 in der Gewebekultur wird das insgesamt in Beispiel 3 beschriebene Verfahren bevorzugt. Die EID50-Titer des nach diesem Verfahren gezüchteten und isolierten menschlichen Influenzavirus-Stamms A/Texas/ 1/77 sind in Tabelle 4 genannt. Ferner wird auf Fig. 4 verwiesen. Ein Vergleich wird mit diesen. nach dem gleichen Verfahren, jedoch ohne Zusatz von Trypsin gezüchteten Stamm vorgenommen. Tabelle 4 EID50-Titer des in CLDK-Zellen mit und ohne Trypsin gezüchteten menschlichen Influenzavirus, Stamm A/Texas/ 1/77 Trypsinmenge Titer (EID /ml) x-fache Steigerung eg/ml Einsatz Nach mit Trypsin Isolierung Isolierung ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ 105,2 8 1051 108,9 5,012 8 104,1 > 1010,2 > 100.000 10 103,0 108'3 1.259 10 102 109,8 39.811 Die Zugabe von Trypsin zum Kulturmedium ergab einen geometrischen mittleren Anstieg von 4,1 log oder 12590mal so viele Viruspartikel/ml während der Produktion des A/Texas Stamms. Beispiel 5 Ein Stamm des menschlichen Influenzavirus mit der Bezeichnung A/USSR/90/77 wurde vom The Center for Disease Control in Atlanta, Georgia, bezogen. Dieser Stamm wurde mit einer Passage über bebrütete Hühnereier geführt und bei -700C als Arbeitsimpfvirus eingefroren. Für die Vermehrung des Stamms A/USSR/90/77 in der Gewebekultur wird das insgesamt in Beispiel 3 beschriebene Verfahren bevorzugt. Die EID50-Titer des nach diesem Verfahren gezüchteten und isolierten menschlichen Influenza-Stamms A/USSR/90/77 sind in Tabelle 5 genannt. Ferner wird auf Fig. 5 verwiesen. Ein Vergleich wird mit diesem nach dem gleichen Verfahren, jedoch ohne Zusatz von Trypsin gezüchteten Stamms vorgenommen. Tabelle 5 EID50-Titer des in CLDK-Zellen mit und ohne Trypsin gezüchteten menschlichen Influenzavirus, Stamm A/USSR/90/77 Trypsinmenge Titer (EID50/ml) x-fache Steigerung ps/ml insatz nach Iso- mit Trypsin lierung 0 104,0 106,3 10 104,0 108,7 251 10 104t 109,0 501 10 104t5 1084 126 Die Zugabe von Trypsin zii:ti Kulturmedium ergab einen geometrischen mittleren Anstieg von 2,4 log oder 251mal so viele Viruspartikel ährend der Produktion des A/USSR ml Stamms. Impstoffherstellung Beispiel 6: Virusabschwächung Die Abschwächung des Virus aus den gemäss Beispiel 1 isolierten Flüssigkeiten erfolgt chemisch oder. durch Standard Reihenpassagen einschliesslich abschliessender Verdünnungspassagenmethoden, bei denen eine genügende Anzahl von Passagen in einer empfänglichen Zellkultur angewendet wird, bis das Virus ohne Verlust der Immunisierungsfähigkeit nicht-pathogen gemacht worden ist. Ein in dieser Weise hergestellter Impfstoff löst bei Tieren, die für die Krankheit anfällig sina, eine Immunreaktion aus, ohne die klinischen Symptome, die normalerweise auf das virulente Mittel zurückzuführen sind, in wesentlichem Ausmass hervorzubringen. Die Vermehrung kann in den gleichen Geweben, wie sie bei der vorhergehenden Passage verwendet wurden, oder in verschiedenen Geweben erfolgen. Beispiel 7: InakXivierunq des Virus Die Methode ist ähnlich wie die in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen, jedoch werden die isolierten, virusbelade nen Flüssigkeiten durch Inaktivierung mit 0,1%dem Formaldehyd (Bereich 0,05 bis 0,2%) weiterverarbeitet, und das behandelte Material wird 10 bis 14 Tage bei 40C inkubiert. Die Testung des endgültigen inaktivierten Viruspräparats zeigte, dass es frei von lebendem Virus war. Bekannte Adjuvantien, z.B. Aluminiumhydroxid, Alaun, Aluminiumphosphat, Freund' Adjuvans oder die in den US PSen 3 790 665 und 3 919 411 beschriebenen Adjuvantien können zugesetzt werden. Das bevorzugte Adjuvans bei diesen Veröffentlichungen und in den Impfstoffen gemäss der Erfindung ist ein Acrylsäurepolymerisat, das mit einem Polyallylsaccharid (Carbopol 934 P) ähnlich dem in den vorstehend genannten Patentschriften beschriebenen vernetzt ist. Beispiel 8: Inaktivierter Virus-Impfstoff, Herstellung und Verwendung. Eine Pferaeimpfstoffdosis von 1,0 ml besteht aus 0,t5 ml des Stamms Pennsylvania (Al), 0,45 ml des Stamms Miami (A2) und 0,10 ml des vernetzten Acrylsäurepolymerisats (Carbopol 934 P) als Adjuvans. Gleiche Teile der gemäss Beispiel 7 erhaltenen inaktivierten Vaccinestämme wurden gemischt, und aliquote Teile von 1 ml wurden 19 Pferden intramuskulär verabreicht. Keine klinische Krankheit oder Symptome von Influenza wurden bei den Pferden nach der Impfung festgestellt. Die Antikörper-Titer sowohl gegen Pferde Influenza Al als auch Pferde-Influenza A2 wurden an den Blutseren aller Tiere nach 2, 4 und 8 Wochen nach der Impfung ermittelt. Diese Titer werden mit den Titern vor der Impfung mit Hilfe des Standard-Hämagglutinationshemmungstests (Diagnostic Procedures for Viral and Rickettsial Infections, 4.Auflage, Lennette und Schmidt, -S. 665-666 (1969), American Public Health Association, New York, N.Y. 10019, verglichen (Tabelle 6). Tabelle 6 EMI21.1 <tb> Pferd <SEP> Antikörperreaktionen <SEP> (Hämagglutinationshemmung) <SEP> <tb> Nr. <SEP> Pferde-Influenza <SEP> Al <SEP> Pferde-Influenza <SEP> A2 <tb> <SEP> Vor- <SEP> 2 <SEP> W. <SEP> 4 <SEP> W. <SEP> 8 <SEP> W. <SEP> Vor- <SEP> 2 <SEP> W. <SEP> 4 <SEP> w.x <SEP> 8 <SEP> Wochen <tb> <SEP> her <SEP> her <tb> <SEP> 2 <SEP> < 8 <SEP> 81-92 <SEP> 8192 <SEP> 8192 <SEP> < <SEP> 8 <SEP> 512 <SEP> 128 <SEP> 256 <tb> <SEP> 11 <SEP> < <SEP> 8 <SEP> 128 <SEP> 256 <SEP> 128 <SEP> < 8 <SEP> 64 <SEP> 1024 <SEP> 64 <tb> <SEP> 13 <SEP> < 8 <SEP> 128 <SEP> 256 <SEP> 2048 <SEP> < 8 <SEP> 256 <SEP> 256 <SEP> 1024 <tb> <SEP> 19 <SEP> < 8 <SEP> 256 <SEP> 64 <SEP> 64 <SEP> < 8 <SEP> 128 <SEP> 128 <SEP> 64 <tb> <SEP> 21 <SEP> < 8 <SEP> 128 <SEP> 64 <SEP> 512 <SEP> < 8 <SEP> 64 <SEP> 64 <SEP> 512 <tb> <SEP> 23 <SEP> < 8 <SEP> 256 <SEP> 128 <SEP> 128 <SEP> < 8 <SEP> 512 <SEP> 512 <SEP> 128 <tb> <SEP> 29 <SEP> < 8 <SEP> 128 <SEP> 32 <SEP> 1024 <SEP> t8 <SEP> 256 <SEP> 64 <SEP> 128 <tb> <SEP> 32 <SEP> < 8 <SEP> 1024 <SEP> 256 <SEP> 2048 <SEP> < 8 <SEP> 64 <SEP> 64 <SEP> 128 <tb> <SEP> 37 <SEP> < 8 <SEP> 128 <SEP> 32 <SEP> 512 <SEP> j <SEP> < 8 <SEP> 64 <SEP> 32 <SEP> 64 <tb> <SEP> 38 <SEP> 8 <SEP> 1024 <SEP> 512 <SEP> 1024 <SEP> < 8 <SEP> 512 <SEP> 256 <SEP> 64 <tb> <SEP> 40 <SEP> < 8 <SEP> 256 <SEP> 128 <SEP> 1024 <SEP> < 8 <SEP> 128 <SEP> 128 <SEP> 128 <tb> <SEP> 55 <SEP> < 8 <SEP> 512 <SEP> 512 <SEP> 8192 <SEP> < 8 <SEP> 512 <SEP> 256 <SEP> 256 <tb> <SEP> 61 <SEP> < 8 <SEP> 512 <SEP> 64 <SEP> 256 <SEP> < 8 <SEP> 1024 <SEP> 128 <SEP> 128 <tb> <SEP> 68 <SEP> c8 <SEP> 128 <SEP> 32 <SEP> 128 <SEP> < 8 <SEP> 512 <SEP> 256 <SEP> 256 <tb> <SEP> 79 <SEP> < 8 <SEP> 64 <SEP> 128 <SEP> 2048 <SEP> < 8 <SEP> 256 <SEP> 128 <SEP> 128 <tb> <SEP> 121 <SEP> C8 <SEP> <SEP> < : :8 <SEP> 32 <SEP> 512 <SEP> (8 <SEP> 1024 <SEP> 256 <SEP> 64 <tb> <SEP> 125 <SEP> < <SEP> 8 <SEP> 256 <SEP> 32 <SEP> 128 <SEP> < 8 <SEP> 256 <SEP> 128 <SEP> 128 <tb> <SEP> 128 <SEP> < 8 <SEP> 512 <SEP> 128 <SEP> 512 <SEP> < 8 <SEP> 256 <SEP> 128 <SEP> 256 <tb> <SEP> 129 <SEP> > 8 <SEP> 256 <SEP> 128 <SEP> 2048 <SEP> < 8 <SEP> 512 <SEP> 512 <SEP> 256 <tb> Tag des Booster-Effekts Wie die Werte in Tabelle 6 zeigen, bildeten sich Antikörper gegen beide Virus-Antigene in Pferden, die geimpft wurden. Diese geimpften Tiere würden immun gegen Pferdeinfluenza sein, da Antikörpertiter über 1:20 für A2 und 1:60 für A1 vom National Veterinary Services Laboratories des U.S.A.-Landwirtschaftsministeriums als schützende Titer akzeptiert sind. Klinische Versuche an 420 Pferden verschiedener Rassen und verschiedenen Alters ergaben, dass der Impfstoff sicher ist und nach intramuskulärer Impfung keine ungünstigen Reaktionen hervorruft. Beispiel 9: Verwendung von abgeschwächtem Virus-Impfstoff Drei Pferde erhielten intranasal 5 ml der gemäss Beispiel 6 hergestellten Lebendvaccine auf Basis des abgeschwächten Pferde-Influenza-A2-Vaccinestamms. Keine klinische Krank heit oder Symptome von Influenza wurden bei den Pferden nach der Impfung festgestellt. Die Antikörpertiter gegen Vaccinestamm wurden an Blutseren aller Tiere 1, 2 und 4 Wochen nach der Impfung ermittelt und mit dem Titer vor der Impfung mit Hilfe des Standard-Hämagglutinations hemmungstests (HAI) verglichen. Tabelle 7 Antikörperreaktion (HAI) - Pferdeinfluenza A2 Pferd Nr. Vorher 1 Woche 2 Wochen 4 Wochen 19 -8 128 256 128 23 8 64 128 128 61 8 128 256 128 Auch hier waren die ermittelten Antikörpertiter höher als für den Schutz erforderlich. Es ist zu bemerken, dass die Erfindung sowohl auf ein neues Kultursystem für Influenzaviren als auch die Verwen dung des Mediums zur Herstellung eines neuen Influenza Impfstoffs gerichtet ist. Für das erfindungsgemäss verwen dete flüssige Zellkultursystem werden anfällige Zellen, Influenzaviren, ein Nährmedium und ein proteolytisches Enzym verwendet, jedoch erfordert dieses Kultursystem im Gegensatz zu den bekannten System (z.B. das System gemäss Tobita et al) nicht die Verwendung von Agar, das das System in einen halbfesten Zustand bringt. Der Ausschluss von Agar ermöglicht somit die Grosserzeugung von Viren in üblicher bekannter Weise und führt zur Erzeugung von viralen Flüssigkeiten mit genügend hohen Titern für die Herstellung von Impfstoffen. Das Influenza-Impfstoffpräparat selbst enthält wirksame Mengen eines oder mehrerer Stämme von gegebenen Influenza Viruspartikeln und einen pharmazeutisch unbedenklichen Träger. Das gesamte Präparat, das vorzugsweise in wässriger Form vorliegt, ist im wesentlichen frei von reaktionsfähigen Proteinen, z.B. Eiereiweiss. Der hier gebrauchte Ausdruck "im wesentlichen frei von Eiereiwiss" bedeutet, dass die einzige mögliche Quelle von Eiereiweiss in den Impfstoffpräparaten das Impfvirus ist das 71:100.000 verdünnt ist. Die Impfstoffe werden Tieren auf verschiedenen Wegen einschliesslich intramuskulär, intravenös, subkutan, intratracheal, intranasal oder durch Aerosolspray verabreicht und sind für die vorteilhafte Verwendung bei den verschiedensten Tieren einschliesslich Mensch, Pferd, Schwein und Vögel vorgesehen. Die gemäss der Erfindung hergestellten Impfstoffe können zur Einstellung ihrer Wirksamkeit mit Wasser verdünnt werden. Ferner können ihnen Stabilisatoren wie Saccharose, Dextrose, Lactose oder andere ungiftige Stoffe zugesetzt werden. Die Viruspräparate können durch Gefriertrocknung für Lagerzwecke oder für die spätere Formulierung zu abgeschwächten Vaccinen getrocknet werden, oder sie können für die Herstellung von Virus-Tot-Impfstoffen chemisch inaktiviert werden.

Claims: Process for the preparation of an influenza virus vaccine which is essentially free of egg albumin, in which cells are infected with an influenza virus, the virus is replicated in the cells, then the virus is isolated and a vaccine is prepared from the isolated virus, characterized in that a part of the cells of a liquid cell culture are infected with an influenza virus and the infected culture is incubated in the presence of 4-25µg/ml of the liquid cell culture of a proteolytic enzyme. Process according to Claim 1, characterized in that, as proteolytic enzyme, trypsin, chymotrypsin, pepsin, pancreatin, papain, pronase or carboxypeptidase is employed. Process according to Claims 1 and 2, characterized in that, as proteolytic enzyme, trypsin is added in an amount of 8-15µg/ml of the liquid cell culture. Process according to Claims 1 to 3, characterized in that the culture is carried out in narrow-necked cylindrical bottles. Process according to Claims 1 to 4, characterized in that proteolytic enzyme is added to the previously infected culture. Process according to Claims 1 to 5, characterized in that, as virus, an equine influenza virus or a human influenza virus is employed. Process according to Claims 1 to 6, characterized in that, as cells in the liquid cell culture, canine kidney cells are used. Influenza vaccine, obtainable by the process according to Claims 1 to 7. Influenza vaccine preparation according to Claim 8, characterized by an efficacious amount of influenza virus particles and a pharmaceutically acceptable excipient, the preparation being free of egg albumin.

Inventors: BROWN KAREN K, STEWART RICHARD C, BROWN, KAREN K., STEWART, RICHARD C.
Applicants: MOBAY CORP, MOBAY CORPORATION
Application year: 1980
Main classification: A61K39
IPC codes: C12N7, C12N5, A61K39