PROCESS FOR THE PREPARATION OF 11-ALPHA-HYDROXY-20-ALPHA-HYDROXYMETHYL-1,4-PREGNADIENE-3-ONE

Abstract: 1. Process for manufacturing 11 alpha-hydroxy-20 alpha-hydroxymethyl- 1,4-pregnadien-3-one, characterised in that 20 alpha-hydroxymethyl-1,4-pregnadien-3-one is fermented with a live culture of Aspergillus occhraceus which is capable of the appropriate reaction.

Description: Die Erfindung betrifft das in den Patentansprüchen gekennzeichnete Verfahren zur Herstellung von lla-Hydroxy-3-oxo- #1,4-steroiden der Androstan- oder Pregnanreihe. 11&alpha;-Hydroxy-3-oxo-#1,4-steroide der hndrostan- oder Pregnanreihe sind bekanntlich wertvolle Zwischenprodukte zur Synthese pharmakologisch wirksamer Steroide. Nach dem bekannten Stand der Technik werden die Verbindungen in der Weise hergestellt. dass man die entsprechenden 3-Oxo-#4-steroide der Androstanoder Pregnanreihe mikrobiologisch in der lla-Position hy 4 droxyliert und die erhaltenen lla-Hydroxy-3-oxo-ss4-steroide in der 1,2-Position hydriert. Diese Methode hat aber oft den Nachteil, dass bei der lla-Hydroxylierung als Nebenreaktion eine 6ss-Hydroxylierung beobachtet wird, was zur Folge hat, dass die Ausbeute an erwünschtem Verfahrensprodukt vermindert wird und seine Isolierung aufwendiger wird. Es wurde nun gefunden, dass eine 6ss-Hydroxylierung praktisch nicht auftritt, wenn man bei der Fermentation mit einer lebenden Kultur von Aspergillus occhraceus anstelle der 3-Oxo-#4-steroide die entsprechenden 3-Oxo-#1,4-steroide als Substrate verwendet. Man erhält die entsprechenden lla Rydroxy-1,4-steroide in hohen Ausbeuten und hoher Reinheit. Die als Substrate verwendeten 3-Oxo-#1,4-steroide der Androstan- oder Pregnanreihe können, abgesehen davon, dass die ll-Position unsubstituiert ist,in üblicher Weise substituiert sein. Geeignete Substituenten sind Oxogruppen beispielsweise in der 17-Position von 3-0xo-1,4-steroiden der Androstanreihe oder in der 20-Position von 3-0xo-1,4-steroiden der Pregnanreihe, Hydroxygruppen beispielsweise in der 17B-Position von 3-Oxo-#1,4-steroiden der Androstanreihe oder in der 16a,17a und/oder 21-Position von 3-Oxo-#1,4-steroiden der Pregnanreihe, Acyloxygruppen (wie Formyloxygruppe, die Acetoxygruppe, die Propionyloxygruppe, die Butyryloxygruppe, die Pentanoyl oxygruppe, die Hexanoyloxygruppe, die Dimethylacetoxygruppe, die Trimethylacetoxygruppe oder die Benzoyloxygruppe) mit maximal 8 Kohlenstoffatomen beispielsweise in der 16a,17a und/oder 21-Position von 3-Oxo-114-steroiden der Pregnanreihe , Isopropylidendioxygruppen in der 16a,17a- Position von 3-Oxo-ss1'4-steroiden der Pregnanreihe, Fluoratome in der 6a-Position, Methylgruppen beispielsweise in der 6a, 16a, 16B und/oder 17a-Position, Methylengruppen beispielsweise in der l,2a und/oder 16a,17a-Position etc.. Zusätzlich können die 3-Oxo-#1,4-steroide auch noch weitere Doppelbindungen, beispielsweise in der 6-und/oder 16-Position tragen. Die für die Umsetzung benötigten Aspergillus occhraceus Stämme stehen der Fachwelt bei anerkannten Mikroorganisne,-Sammlungen frei zur Verfügung. Geeignete Aspergillus occhraceus Stämme sind beispielsweise: Aspergillus occhraceus CBS 13 252, ATCC 1008, ATOC 12 337, ATOC 18 500 oder NRRL 405. Das erfindungsgemässe Verfahren wird unter den 3edingungen durchgeführt, die man üblicherweise bei der mikrobiologischen Hydroxylierung von Steroiden anwendet. Unter den üblicherweise verwendeten Kulturbedingungen werden in einem geeigneten Nährmedium unter Belüften, Submerskulturen angezüchtet. Dann setzt man den Kulturen das Substrat (in einem Lösungsmittel gelöst oder in emulgierter Form) zu und fermentiert, bis eine maximale Substratumwandlung erreicht ist. Geeignete Substratlösungsmittel sind beispielsweise Methanol, Äthanol, Glykolmonomethyläther, - Dimethylformamid, oder Dimethylsulfoxyd. Die Emulgierung des Substrates kann beispielsweise bewirkt werden, indem man diese in mikronisierter Form oder in einem mit Wasser mischbaren Lösungs mittel (wie Methanol, Äthanol, Aceton, Glykolmonomethyläther, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxyd) gelöst unter starker Turbulenz in (vorzugsweise ent',alkte) Wasser, welches die üblichen Emulgationshilfen enthält, eindüst. Geeignete Emulgationshilfen sind nichtionogene Emulgatoren, wie zum Beispiel Äthylenoxyaddukte oder Sett- säureester von Polyglkolen. Als geeignete Emulgatoren seien die handelsüblichen Netzmittel Tegin (R), Tween(R) und Span beispielsmässig genannt. Die optimale Substratkonzentration, Substratzugabezeit und Bermentationsdauer ist von den angewendeten Bermentz- tionsbedingungen abhängig. Diese Grossen müssen, wie dies bei mikrobiologischen Steroidumwandlungen allgemein er fcrderlich isQ-, im Einzelfall durch Vorversuche, wie sie dem Fachmann geläufig sind, ermittelt werden. Enthalten die Substrate in der 16&alpha; und/oder 21-Position Acyloxygruppen, so werden diese bei der Fermentation verseift. Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele dienen zur Erläuterung des erfindungsgemässen Verfahrens. Beispiel 1 Ein 2 1 Erlenmeyerkolben mit 500 ml einer sterilen Nähr- lösung, enthaltend 1 % Cornsteep liquor, 1,25 % Sojabohnenmehl und 0,005 % Sojaöl wird mit einer 10 Tage alten Schrägagarkultur von Aspergillus occhraceus ATCC 1008 beimpft und 72 Stunden lang bei 30 C und 165 Umdrehungen pro Minute geschüttelt. Mit dieser Anzuchtskultur wird ein 20 1 Glasfermenter enthaltend 14,5 sterilisierter Nährlösung gleicher Zusammensetzung - beimpft und unter Rühren (220 Umdrehungen pro Niinute) und Belüften (15 1 pro Minute) bei 300 C germiniert. Nach 24 Stunden werden 900 ml der Vorkultur in einen 20 1 Fermenter mit 9 1 des gleichen Mediums überführt und unter Rühren und Belüften wie oben beschrieben bei 300 C angezüchtet. 12, 14, 16 und 18 Stunden nach der Beimpfung setzt man der Kultur jeweils 50 ml einer sterilfiltrierten Lösung von je 2,5 g 1,4-Pregnadien-3,20-dion in Dimethylformamid zu und fermentiert bis die Umwandlung beendet ist. (63 Stunden). Dann extrahiert man die kulturbrühe dreimal mit je 4 1 Methylisobutylketon und engt die vereinigten Extrakte im Vakuum zur Trockne ein. Der Rückstand wird mit Hexan gewaschen, aus Äthylacetat umkristallisiert und man erhält 8,3 g lla-Hy- droxy-114-pregnadien-3,20-dion vom Schmelzpunkt 229-230 C. Praktisch die gleiche Ausbeute erhält man, wenn man die Fermentation mittels Aspergillus occhraceus ATCC 18500, ATCC 12 337, CBS 13 252 oder NRRL 405 durchführt. BeisPiel 2 Unter den Bedingungen des Beispiels 1 werden 10,0 g 17a-Hy- droxy-1,4-pregnadien-3,20-dion mit Aspergillus occhraceus NRRL 405 umgesetzt, aufbereitet und man erhält 7,8 g lla,17a Dihydroxy-1,4-pregnadien-3,20-dion vom Schmelzpunkt 258-259 C. Beispiel 3 Unter den Bedingungen des Beispiels 1 werden 10,0 g 6a,16a Dimethyl-1,4-pregnadien-3,20-dion mit Aspergillus occhraceus NRRL 405 umgesetzt, aufbereitet und man erhält 8,0 g 11&alpha;-Hydroxy-6&alpha;,16&alpha;-dimethyl-1,4-pregnadien-3,20-dion vom Schmelzpunkt 153-154 C. Beispiel 4 Unter den Bedingungen des Beispiels 1 werden 10,0 g 17a Hydroxy-6&alpha;,16&alpha;-dimethyl-1,4-pregnadien-3,20-dion umgesetzt, aufbereitet und man erhält 8,5 g lla,17a-Dihydroxy-6a,16a- dimethyl-1,4-pregnadien-3,20-dion vom Schmelzpunkt 180-1850C. Beispiel 5 Unter den Bedingungen des Beispiels 1 werden 10,0 g 21-Acetoxy 6&alpha;-fluor-16&alpha;-methyl-1,4-pregnadien-3,20-dion umgesetzt, aufbereitet und man erhält 8,0 g 6a-Fluor-lla-,2l-dihydroxy- 16a-methyl-l ,4-pregnadien-3,20-dion vom Schmelzpunkt Beispiel 6 Unter den Bedingungen des Beispiels 1 werden 10,0 g 17a,21- Dihydroxy-16a-methyl-1 ,4-pregnadien-3, 20-dion umgesetzt, aufbereitet und man erhält 8,3 g 11&alpha;,17&alpha;,21-Trihydroxy-16&alpha; ;- methyl-1 ,4-pregnadien-3,20-dion vom Schmelzpunkt Beispiel 7 Unter den Bedingungen des Beispiels 1 werden 30,0 g 1,4 Androstadien-3,20-dion mit Aspergillus occhraceus NRRL 405 umgesetzt aufbereitet und man erhält 22,3 g 11a-Hydroxy- 1,4-androstadien-3,20-dion vom Schmelzpunkt 207-208 C. Beispiel 8 Unter den Bedingungen des Beispiels 1 werden 10,0 g 17ss Hxdroxy-17&alpha;-methyl-1,4-androstadien-3-on umgesetzt, aufbereitet und man erhält 7,9 g 11&alpha;,17ss-Dihydroxy-17&alpha;- methyl-1,4-androstadien-3-on vom Schmelzpunkt 221-223 C. Beispiel 9 Ein 2 1 Erlenmeyerkolben, der 1 Liter einer sterilisierten Nährlösung aus ,0 % Glucose, 1,0 % Corn steep, 0,2 % Natriumnitrat, 0,1 56 Kaliumdihydrogenphosphat, 0,2 56 Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumphosphat, 0,002 % Eisenphosphat und 0,05 56 Kaliumchlorid, wird mit einer Lyphile kultur von Aspergillus occhraceus (NRRL 405) beimpft und 72 Stunden bei 300 C auf einem Rotationsschüttler geschüttelt. Mit 125 ml dieser Vorkultur wird dann ein 20 1 Fermenter beimpft, der 7,5 1 eines sterilisierten Nährmediums enthält, das aus 1 56 Corn steep und 1 56 Sojabohnenmehl besteht. Unter Zugabe von Silicon SH als Antischaummittel wird bei 290 C unter Belüftung (10 Liter pro Minute), 0,7 atü Druck und Rühren (220 Umdrehungen pro Minute) 24 Stunden germiniert. Mit 1,8 Liter dieser Vorfermenter-Kuhler wird anschliessend unter sterilen Bedingungen ein 30 1 Fermenter mit 26 1 sterilem Nshrmedium, bestehen aus 1,0 56 Corn steep und 1,25 % Sojabohnenmehl, beimpft und nach Zugabe von Antischaummittel bei 290 C unter Belüftung (10 Liter pro Minute), 0,7 atü Druck und Rühren (220 Umdrehungen pro Minute) 12 Stunden anwachsen lassen. Danach gibt man eine sterilisierte Suspension von 90 g feinstgemahlenem 20-Hydroxymethyl-1,4 pregnadien-3-on in 2 1 Wasser hinzu und ruhrt und belüftet weiter. Nach 60 Stunden Kontaktzeit wird der Fermenterin halt dreimal mit je 10 1 Methylisobutylketon ausgerührt und die vereinigten Extrakte bei 500 C Badtemperatur im Vakuum konzentriert. Dabei fällt die entstandene lla-Eydroxy-Ver- bindung in Form eines weissen Kristallisats aus. Nach dem Absaugen und Trocknen erhält man 81 g lla-Eydroxy-20a- hydroxymethyl-1,4-pregnadien-3-on vom Schmelzpunkt 251252 C.

Claims: P a t e n t a n s p r ü c h e 1.Verfahren zur Herstellung von 11&alpha;-Hydroxy-3-oxo-#1,4-stero- iden der kndrostan- oder Pregnanreihe, dadurch gekennzeich net, dass man die entsprechenden in der 11-Posit on unsub stituierten 3-0xo-1,4-steroide der Androstan- oder Preg nanreihe mit einer lebenden Kultur von Aspergillus acchraceus fermentiert. 2. Verfahren zur Herstellung von 11&alpha;-Hydroxy-3-oxo-#1,4 steroiden der allgemeinen Formel I EMI8.1 worin X ein Wasserstoffatom, ein Fluoratom oder eine Methylgruppe, R1 ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxygruppe R2 ein Wasserstoffatom, eine Hydroxygruppe oder eine Alyloxygruppe mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen und R3 ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe bedeuten, dadurch gekennzeichnet, dass man ein 3-0xo-1,4-steroid der allgemeinen Formel II EMI9.1 worin X, R2 und R3 die obengenannte Bedeutung besitzen und R4 die gleiche Bedeutung wie R1 hat oder eine Acyloxy gruppe mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen darstellt, mit einer lebenden Kultur von Aspergillus occhraceus fermen tiert. 3. Verfahren zur Herstellung von lla-Hydroxy-3-oxo-ss1'4- steroiden der allgemeinen Formel III EMI9.2 worin R5 und ss gemeinsam eine Oxogruppe oder R5 eine Rydroxygruppe und E ein Wasserstoffatom oder einen Kohlenwasserstoffrest mit maximal zwei Kohlenstoff- atomen bedeuten, dadurch gekennzeichnet, dass man ein 3-0xo-114-steroid der allgemeinen Formel IV EMI10.1 worin R5 und R6 die obengenannte Bedeutung besitzen, mit einer ebenden Kultur von Asp±rgillus occhraceus fermentiert. 4. Verfahren zur Herstellung von 11&alpha;-Hydroxy-20&alpha;-Hydroxymethyl- 1,4-pregnadien-3,20-dion, dadurch gekennzeichnet, dass man 20&alpha;-Hydroxymethyl-1,4-pregnadien-3,20-dion mit einer lebenden Kultur von Aspergillus occhraceus fermentiert. 5, 11&alpha;-Hydroxy-6&alpha;,16&alpha;-dimethyl-1,4-pregnadien-3,20-dion. 6. 11&alpha;,17&alpha;-Dihydroxy-6&alpha;,16&alpha;-1,4-pregnadien-3,20-dion.

Inventors: KIESLICH, KLAUS, DR., KRIEGER, BERNHARD, DR., PETZOLDT, KARL, DR., WEBER, ALFRED, DR.
Applicants: SCHERING AKTIENGESELLSCHAFT BERLIN UND BERGKAMEN
Application year: 1980
Main classification: C12P33
IPC codes: C07J7, C07J5, C12P33, C07J1, C07J9, C12R1