PROCESS FOR THE PREPARATION OF 1-ALPHA-HYDROXY DEHYDROEPIANDROSTERONE

Abstract: 1. Process for the microbiological manufacture of 1 alpha-hydroxydehydroepiandrosterone, characterized by bringing together dehydroepiandrosterone or a derivative thereof with a microorganism of the species Penicillium oxalicum or Aspergillus terreus, which is capable of 1 alpha-hydroxylating dehydroepiandrosterone or a derivative thereof, or with mycelium isolated from a culture of the said microorganisms or with an enzyme extract prepared in a manner known per se from the culture solution or the mycelium at a point in time at which the carbon source of the culture medium is almost completely consumed.

Description: Verfahren zur Herstellung von la-Hydroxydehydroepiandrosteron Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von la-Hydroxydehydroepiandrosteron, dadurch gekennzeichnet, dass man Dehydroepiandrosteron oder ein Derivat davon mit einem Mikroorganismus der Spezies Penicillium oxalicum oder Aspergillus terreus oder mit aus einer Kultur der genannten Mikroorganismen isoliertem Mycel zu einem Zeitpunkt zusammenbringt, an dem die Kohlenstoffquelle des Kulturmediums fast vollständig aufgebraucht ist. Aus der japanischen Patentanmeldung Kokai No. 63990/1976 ist bekannt, la,l7ss-Dihydroxysteroide durch la-Hydroxylierung von 17ss-Hydroxy-17a-substituierten oder unsubstitu-erten 4-Oestren-3-onen mittels ' vrVorgannsylen der Genera Rhizoctonia, Calonectria, Glome-ella, Aspergillus, Corticium, Septomyxa, Mucor, Isaria, Irpex oder Fusarium herzustellen. Alle diese Mikroorganismen mit Ausnahme der Spezies Aspergillus terreus sind nicht in der Lage, Dehydroepiandrosteron in lo-Stellung zu hydroxylieren. Dieser Umstand bedeutet, dass eine la-Hydroxylierung von Steroiden nur mit aanz bestimmten Kombinationen von Mikroorganismen und Substraten durchgeführt werden kann. Es ist in der Tat sehr schwierig, eine solche Kombination herauszufinden. Nach dem Verfahren der oben erwähnten Pa tentanmeldung können Aspergillus clavatus ATCC 9598, A. fumigatus mut. helvola CBS 110.46 und A. conics IFO 4047 Steroide mit einer Oxogruppe in 3-Stellung, einer Doppelbindung in der 4,5-Stellung und einer Hydroxygruppe in 17ss-Stellung in la-Stellung hydroxylieren. Diese Mikroorganismen können jedoch Dehydroepiandrosteron, das in 3-Stellung eine Hydroxygruppe, eine 5,6-Doppelbindung und eine 17-Oxogruppe aufweist, oder Derivate davon, nicht in la-Stellung hydroxylieren. Aus der US Patentschrift 2 883 794 ist bekannt, Dehydroisoandrosteron (Dehydroepiandrosteron) mittels Penicillium sp. ATCC 12556 in la-Stellung zu hydroxylieren. Dieses bekannte Verfahren besitzt den Nachteil, dass dabei viel niedrigere Substratkonzentrationen, nämlich 0,35 g/l, eingesetzt werden. Es ist daher schwierig, la-Hydroxy-dehydroepiandrosteron nach der in der US Patentschrift 2 883 794 beschriebenen Arbeitsweise in hoher Ausbeute herzustellen, dies umsomehr, als sich bei der angewandten niedrigen Substratkonzentration das Hydroxylierungsprodukt unmittelbar nach Erreichen der höchsten Ausbeute zu zersetzen scheint. Es wurde nun gefunden, dass man la-Hydroxydehydroepiandrosteron in hoher Ausbeute durch Hydroxylierung von Dehydroepiandrosteron oder einem Derivat davon mittels Mikroorganismen der Spezies Penicillium oxalicum oder Aspergillus terreus herstellen kann, wenn man das Substrat der Kulturlösung der genannten Mikroorganismen zu einem Zeitpunkt zusetzt, an dem die Kohlenstoffquelle der Nährlösung fast vollständig verbraucht ist. Als Derivate des Dehydroepiandrosterons kommen für den erfindungsgemässen Zweck vor allem 3-Acylderivate, insbessondere das 3-Acetylderivat, in Betracht. Das erfindungsgemässe Verfahren kann mit allen Stämmen der Spezies Penicillium oxalicum oder Aspergillus terreus durchgeführt werden, die zu 1K-Hydroxylierung von Dehydroepiandrosteron oder einem Derivat davon befähigt sind. Bevorzugte Stämme sind Penicillium oxalicum IFO-5748 (FERM-P. No. 4727; ATCC 20590), -P. oxalicum IFO-6579 (FERM-P No. 4728; ATCC 20591), P. oxalicum IFO-7000 (FERM-P No. 4729; ATCC 20592), P. oxalicum IFO-7085 (FERM-P No. 4730; ATCC 20593), Aspergillus terreus IFO-6123 (FERM-P No. 4726; ATCC 20589) und Varianten davon. Die Bezeichnung IFO bezieht sich auf Kulturen des Institute for Fermentation, Osaka, Japan; die Bezeichnung FERM-P bezieht sich auf Kulturen des Fermentation Research Institute, Chiba city, Japan und ATCC bezeichnet die American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA. Die folgenden Stämme des Genus Penicillium und Aspergillus können Dehydroepiandrosteron oder ein Derivat davon nicht hydroxylieren: P. verruculosum, P. notatum, P. chrysogenum, P. decumbens, P. fellutanum, P. frequentans, P. purpurrescens, P. terlikowskii, P. lilacino-echinulatum, P. multicolor, P. simplicissimum, P. herquei, P. implicatum, P. janthinellum, P. charlesii, P. citreo-viride, P. corylophiloides, P. cyaneum, P. adametzi, P. aeneum, P. thomii, und P. sclerotiorum: A. flavus, A. ustus, A. clavatus, A. parasiticus, A. conicus, A. carneus und A. fumigatus. Der Mikroorganismus kann in Form der Kulturlösung, des Mycels oder in aufbereiteter Form verwendet werden. Die Kulturlösung kann durch Beimpfen eines geeigneten Mediums mit dem Mikroorganismus hergestellt werden. Das Kulturmedium kann Kohlenstoffquellen, Stn offq; eS-i, anorganische Salze und andere für das tXavls-mm des Mik±tc- organismus geeignete Nährstoffe enthalten. Kohlenstoffquellen sind z.B. Glucose, Sucrose, Dextrin, Mannose, Stärke, Lactose und Glycerin; Stickstoffquellen sind beispielsweise stickstoffhaltige organische Substanzen, wie Peptone, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser und Casein, oder stickstoffhaltige anorganische Verbindungen,wie Nitrate und anorganische Ammoniumsalze. Beispiele anorganischer Salze sind Phosphate oder Natrium-, Kalium-, Mangan-, Magnesium-, Eisen- und Kupfer-Salze. Die Kultivierung des Mikroorganismus kann als Submerskultur, als Schüttelkultur oder als stationäre Kultur erfolgen. Vorzugsweise wird der Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen kultiviert. Das erfindungsgemässe Verfahren wird zweckmässig dadurch ausgeführt, dass man Dehydroepiandrosteron oder ein Derivat davon der Nährlösung zusetzt. Die Konzentration des Substrats beträgt zweckmässig 1-15 g/l, vorzugsweise l-lO g/l. Die la-Hydroxylierung kann dadurch ausgeführt werden, dass man die Kultivierung des Mikroorganismus unter den oben erwähnten Bedingungen fortsetzt. Die Kultivierungszeit kann vom verwendeten Mikroorganismus, von der Zusammensetzung des Kulturmediums, von dem verwendeten Substrat und seiner Konzentration abhängen. Im allgemeinen genügt eine Kultivierungszeit von l-lO Tagen. Die Kultivierungstemperatur liegt im allgemeinen zwischen 20 und 300C. Zweckmässig wird die Kultivierung bei einem pH zwischen 4 und 9 ausgeführt. Der Zeitpunkt des Zusatzes des Substrates zur Kultur lösung ist wichtig, um eine hohe Ausbeute an la-Hydroxydehydroepiandrosteron zu erhalten. Das erfindungsgemässe Verfahren, bei dem der Zusatz zur Nährlösung erfolgt, wenn die Kohlenstoffquelle beinahe vollständig verbraucht ist, führt zu einer hohen Ausbeute. Der Zeitpunkt, an dem die Kohlenstoffquelle in der Nährlösung beinahe vollständig aufgebraucht ist, kann z.B. durch Bestimmung des Glucosegehalts der Nährlösung festgestellt werden. Der Zusatz des Steroids kann z.B. erfolgen, wenn der Glucosegehalt der Nährlösung auf 0,05 bis 0,02% gesunken ist. Da das Wachstum des Mikroorganismus stagniert, wenn die Kohlenstoffquelle verbraucht ist, kann der Zeitpunkt des Steroidzusatzes auch durch Beobachtung der Aenderung der Zellmasse der Mikroorganismen pro Volumeneinheit (z.B. g Trockenzellen/Liter Fermentationslösung) ermittelt werden. Das Steroid wird zweckmässig zugesetzt, wenn das Trockenzellgewicht pro Volumeneinheit nicht mehr zunimmt. Dieser Zeitpunkt hängt von den Fermentationsbedingungen ab und kann z.B. nach 2 Tagen erreicht sein. Alternativ kann die erfindungsgemässe la-Hydroxylierung auch mit dem aus der Kulturlösung des Mikroorganismus isolierten Mycel oder mit einem in an sich bekannter Weise aus der Kulturlösung oder dem Mycel hergestellten Enzymextrakt ausgeführt werden. In diesem Falle wird die la- Hydroxylierung zweckmässig in Lösung, z.B. in einer Pufferlösung, in einer physiologischen Salzlösung, in frischer Nährlösung oder in Wasser ausgeführt. Das Substrat, Dehydroepiandrosteron oder ein Derivat davon, kann in Form eines feinen Pulvers oder in Form einer Lösung, in einem hydrophilen Lösungsmittel,wie Aceton, Dimethylsulfoxid, Methanol, Aethanol, Aethylenglykol, Propylenglykol oder Dioxan,zugesetzt werden. Man kann auch ein oberflächenaktives oder Dispersionsmittel einer wässrigen Suspension des Substrats zusetzen oder das Substrat kann durch Behandlung mit Ultraschall emulgiert werden. Auch wenn ein Derivat des Dehydroepiandrosterons, wie das Dehydroepiandrosteron-3-acetat, im erfindungsgemässen Verfahren eingesetzt wird, kann la-Hydroxydehydroepi androsteron erhalten werden. Das so erhaltene la-Hydroxydehydroepiandrosteron kann aus dem Fermentationsgemisch oder dem Reaktionsgemisch in an sich bekannter Weise isoliert werden, beispielsweise durch Solventextraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel,wie Chloroform, Methylenchlorid oder Aethylacetat, oder durch Chromatographie auf einem Träger,wie Aluminiumoxid, Silicagel oder Cellulose. Das so isolierte Produkt kann beispielsweise durch Umkristallisation aus Methanol, Aethanol, Aethylacetat, Benzol oder Aceton gereinigt werden. Das erfindungsgemäss hergestellte la-Hydroxydehydroepiandrosteron ist eine bekannte Verbindung, die als Zwischenprodukt zur Herstellung von Pharmazeutika Verwendung finden kann. Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben. Beispiel 1 Ein 500 ml-Kolben mit 100 ml eines Mediums, enthaltend 1 Glucose und 190 Maisquellwasser wurde 20 Minuten bei 120 autoklaviert. Das pH des Mediums wurde zuvor auf 6,5 eingestellt. Nach Abkühlen wurde der Kolbeninhalt mit Sporen einer Schrägagarkultur von Penicillium oxalicum IFO-7000 (FERM-P No. 4729) beimpft. Der Kolben wurde dann bei 26,50 2 Tage auf einer Rotationsschüttelmaschine inkubiert. Dehydroepiandrosteron wurde in einer O,l & gen Tween 80-Lösung unter Ultraschall suspendiert und dem Kolbeninhalt bis zu einer Endkonzentration von 5 g/l zugesetzt. Die Inkubation wurde 3 Tage unter den obigen Bedingungen fortgesetzt. 10 ml-Proben wurden entnommen und unter Schütteln mit drei Volumenteilen Aethylacetat extrahiert. Ein Teil des Extraktes wurde dünnschichtchromatographisch analysiert mit Silicagelplatten und einem Lösungsmittelsystem von Chloroform-Aceton (2:1) und Cyclohexan-Toluol-Aethanol (8:2:2,5), sowie durch Gasflüssigchromatoraphie. Die Ausbeute an la-Hydroxydehydroepiandrosteron betrug 45,08. Beispiel 2 In Analogie zu dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren bei dem das Substrat als Pulver in einer Endkonzentration von 5 g/l zugesetzt wurde, erhielt man la Hydroxydehydroepiandrosteron in 30,2% Ausbeute. Beispiel 3 In Analogie zu dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren erhielt man mit Substratkonzentrationen von 3 g/l und 7 s/l la-Hydroxydehydroepiandrosteron in Ausbeuten von 36,3% und 26,5%. Beispiel 4 In Analogie zu dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren erhielt man mit einer Substratkonzentration von 3 g/l Dehydroepiandrosteron-3-acetat la-Hydroxydehydroepiandrosteron in 32% Ausbeute. Beispiel 5 In Analogie zu dem Verfahren von Beispiel 1 erhielt man unter Verwendung von Penicillium oxalicum IF0-5748 (FERn1-P No. 4727), IFO-6579 (FERM-P No. 4728) und IFO7085 (FERM-P No. 4730) la-Hydroxydehydroepiandrosteron in Ausbeuten von 24,0%, 23,2% und 32,0%. Beispiel 6 Ein 500 ml-Kolben mit 100 ml eines Mediums enthaltend 1% Glucose und 1% Maisquellwasser wurde mit Sporen von Aspergillus terreus IFO-6123 (FERM-P No. 4726) beimpft und 2 Tage bei 26,50 geschüttelt. 100 mg Dehydroepiandrosteron wurden in 2 ml O,1%iger Tween 80-Lösung unter Ultraschall suspendiert und dem Inhalt des Kolbens zugesetzt. Die Kultivierung wurde 2 Tage fortgesetzt, worauf man aus dem Medium la-Hydroxydehydroepiandrosteron isolierte und identifizierte. Beispiel 7 Ein 500 ml-Kolben mit 100 ml vorsterilisiertem Medium (pH 6,5) enthaltend 1% Glucose und 1% Maisquellwasser wurde mit einer Schrägkultur von Penicillum oxalicum IFO-7000 (FERM-P No. 4729) beimpft und 2 Tage bei 26,5 geschüttelt. Ein 5 Liter-Fennentationsgefäss mit 3 Liter vorsterilisiertem Medium wurde mit der so erhaltenen Kultur beimpft. Die Fermentation wurde 37 Stunden und bei 26,5 mit Rühren (300 rpm) und Belüftung (1 v/v) fortgesetzt. Eine Suspension von 15 g Dehydroepiandrosteron in 300 ml 0,1%im Tween 80 wurde 1O Minuten beschallt und dem Fermentationsgefäss zugesetzt. Die Fermentation wurde 79 Stunden unter den obigen Bedingungen fortgeführt. Die Produktion an la-Hydroxydehydroepiandrosteron im Nährmedium betrug 5,36 g. Die Kultur wurde geerntet, mit 3 1 Aethylacetat extrahiert und das Mycel wurde abfiltriert. Der wässrige Acetonextrakt des Mycels wurde zur Entfernung des Acetons eingeengt und mit Aethylacetat extrahiert. Die wässrige Phase der ersten Extraktion wurde ebenfalls mit Aethylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen konzentriert. 3,82 g Feststoff wurden abfiltriert. Kristallisation des Feststoffes aus einem Gemisch von Methanol und Aethylacetat lieferten 2,56 g gereinigtes la-Hydroxydehydroepiandrosteron vom Schmelzpunkt ca. 279 . Die Mutterlauge aus der Filtration und der Kristallisation wurde zur Trockene eingedampft und auf einer Silicagel-Säule chromatographiert. Die Säule wurde mit einem Gemisch von Aceton und Chloroform eluiert. Während der Elution wurden die Anteile an Aceton nach und nach erhöht. Man erhielt so 1,5 g la-Hydroxydehydroepiandrosteron vom vom Schmelzpunkt 278,5 Beispiel 8 Zehn 500 ml-Kolben mit jeweils 100 ml Nährmedium (1% Glucose, 1% Maisquellwasser, pH 6,5) wurden mit Sporen einer Schrägkultur von Penicillium oxalicum IFO7000 (FERM-P No. 4729) beimpft und unter Schütteln bei 26,5 2 Tage lang kultiviert. Das Mycel wurde durch Filtration gesammelt, und mit sterilem Wasser gewaschen. Das gewaschene Mycel wurde in einen 5 LitesKolben mit 1 Liter 0,85%iger Salzlösung, 1O g CaC03 und 1 g Dehydroepiandrosteron gegeben. Der Kolben wurde unter Schütteln 20 Stunden bei 26,50 inkubiert. Danach waren 35% des Dehydroepiandro sterons in die entsprechende la-Hydroxy Verbindung überführt worden. Das Reaktionsgemisch wurde mit 1 Liter Aethylacetat extrahiert und das Mycel abfiltriert. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und zu einem Feststoff konzentriert, der dann auf eine Silicagel-Säule gegeben wurde. Die Säule wurde mit einem Gemisch von Aceton und Chloroform eluiert, wobei während der Elution die Aceton-Anteile nach und nach er höht:wurden. Man erhielt so 230 mg reines la-Hydroxydehydroepiandrosteron vom Schmelzpunkt 278,50.

Claims: Patentansprüche 1. Verfahren zur Herstellung von lo-Hydroxydehydroepiandrosteron, dadurch gekennzeichnet, dass man Dehydroepiandrosteron oder ein Derivat davon mit einem Mikroorganismus der Spezies Penicillium oxalicum oder Aspergillus terreus oder mit aus einer Kultur der genannten Mikroorganismen isoliertem Mycel zu einem Zeitpunkt zusammenbringt, an dem die Kohlenstoffguelle des Kulturmediums fast vollständig aufgebraucht ist. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Penicillium oxalicum IFO-5748 (FERM-P No. 4727), Penicillium oxalicum IF0-6579 (FERM-P No. 4728), Penicillium oxalicum IFO-7000 (FERM-P No. 4729), Penicillium oxalicum IFO-7085 (FERM-P No. 4730) oder Aspergillus terreus IFO-6123 (FERM-P No. 4726) ist. 3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Substrat Dehydroepiandrosteron verwendet. 4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Substrat Dehydroepiandrosteron-3acetat verwendet. 5. Verfahren nach den Ansprüchen 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass die Substratkonzentration 1-15 g/l beträgt. 6. Verfahren nach den Ansprüchen 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat mit dem Mycel in Lösung behandelt wird.

Inventors: FUJIWARA, AKIKO, MIYAMOTO, CHIKARA, OKUDA, TORU
Applicants: F. HOFFMANN-LA ROCHE & CO. AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1980
Main classification: C12P33
IPC codes: C12P33, C07J1, C12R1