A PARTIAL THROMBOPLASTINE

Abstract: (for the contracting States : BE, CH, DE, FR, IT, LI, NL 1. A partial thromboplastin substantially consisting of soybean phospholipid, a water-soluble calcium salt and purpurogallin or ellagic acide or alkali metal salts thereof. (for the Contracting State AT) 1. Process for preparing a partial thromboplastin comprising dispersing soybean phospholipid in water, adding a watersoluble calcium salt and purpurogallin or ellagic acid or alkali metal salts thereof and optionially lyophilizing.

Description: Neuempffrtielles Thromboplastin und dessen Verwendung Die Erfindung betrifft ein neues partielles Thromboplastin, hergestellt aus pflanzlichen lipidreichen Extrakten, Erdalkalisalzen und Gerbsäurederivaten oder deren Salzen sowie dessen Verwendung. Zum diagnostischen Nachweis von Blutungsanomalien wird zur katalytischen Unwandlung von Prothrombin in Thrombin eine Thromboplastin genannte Substanz benötigt. Man unterscheidet zwischen kom- pletten und partiellen Thromboplastinen, wobei das kompiet- te Thromboplastin zum Nachweis der Blutgerinnungsfaktoren II-, V-, VII- und X- bzw. deren Mangel herangezogen wird, während das partielle Thromboplastin zu Diagnose der Hämophilie A (Faktor VIll-Mangel) und Hämophilie B (Faktor IX-Mangel) sowie der seltener auftretenden Faktor XI-, Faktor XII-, Präkallikrein- und Kininogen-35ängel dient. Es ist bereits bekannt, dass zur Herstellung eines partiellen Thromboplastins Extrakte aus tierischen oder humanen Geweben mit organischen Lösungsmitteln sowie SuspensIonen von getrockneten humanen Thrombozyten verwendet werden können. Präparationen dieser Art sind in der US-Patentschrift 3,486,981 (1969) und der deutschen Patentschrift 23 16 430 (Ma 160) beschrieben. Auch pflanzliche Lipid-Fraktionen sind nach W.E. Connor et al. (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 97, 38 (1958))als Ausgangsmaterial für ein partielles Thromboplastin brauchbar. Diese Extrakte erheben für sich allein noch kein praktisch gebrauchsfahiges Reagenz. Sie sind nur dessen Basis. Ein praktisch einsetzbares partielles Thromboplastin muss nämlich in einem standardisierten Testansatz, folgende Werte liefern: Die Gerinnungszeit eines normalen Citrat-Plasmas muss zwischen 20 und 50 Sekunden liegen; die Gerinnungszeit eines Plasmas mit einem Mangel an mindestens einem der geschilderten Faktoren, muss mindestens das doppelte derjenigen eines Normalplasmas betragen. Um diesen Anforderungen zu entsprechen, sind sogenannte Aktivatoren notwendig. Als solche dienen beispielsweise wasserunlösliche, oberflächenaktive, anorganische Materialien wie Kieselsäure oder Kaolin oder wasserlösliche organische Säuren, die sich von der Gerbsäure ableiten, wie Ellagsäure, Purpurogallin oder Quercetin bzw. deren Alkali Salze. Für die diagnostische Praxis haben alle partiellen Thromboplastine, die einen anorganischen, wasserunlöslichen Aktivator, wie beispielsweise Kaolin, enthalten, den Nachteil, dass sie optisch trübe sind. Sie können deshalb in Koagulometern mit optischer Endpunktanzeige nicht verwendet werden. Andererseits wurden bisher optisch klare Aktivatoren nur in Verbindung mit tierischen oder humanen Lipid--Extrakten eingesetzt. So können nach o.D. Ratnoff et al. (J. Lab. Clin. Med. 63, 359 (1964) und USP 3,486,981 Ellagsäure-Salze als Aktivatoren verwendet werden, die in Verbindung mit Extrakten aus tierischem oder humanem Gewebe diagnostisch brauchbare Reagenzien ergeben. Die tierischen oder humanen Extrakte haben aber den Nachteil, dass sie oft nur nach umständlichen Verfahren reproduzierbar hergestellt werden können oder nur in begrenztem Umfang für eine kontinuierliche Produktion zur Verfügung stehen. Es ist deshalb wünschenswert, bei dem ständig steigenden Bedarf an empfindlichen partiellen Thromboplastinen über ein Reagenz mit einem wasserlöslichen, optisch klaren Aktivator zu verzügen, der auf einem pflanzlichen Lipidextrakt basiert. In Verbindung mit pflanzlichen Lipid-Fxaktionen sind bisher allerdings nur anorganische Substanzen als Aktivatoren eingesetzt worden. Es ist bisher nicht bekannt, dass Gerbsäure-Derivate in Verbindung mit pflanzlichen Lipiden ein gebrauchsfähiges partielles Thromboplastin bilden können. Es ist weiterhin bekannt, dass, abhängig vom Ursprung der Lipid-Extrakte, Qualitätsunterschiede im Nachweis der geschilderten Faktorenmängel auftreten können. So ist z.B. ein Extrakt aus tierischem Gewebe unempfindlicher als ein solcher aus humanem Gewebe. Pflanzliche Lipid-Frak- tionen bilden nach M. J. Newlands et al. (Nature 176, 885 (1955) Reagenzien, die in ihrer Empfindlichkeit den aus humanem Gewebe hergestellten vergleichbar sind. Pflanzliche Lipide zusammen mit wasserlöslichen Aktivatoren füh- ren jedoch allein noch nicht zu einem geeigneten Reagenz. Es wurde nun überraschend gefunden, dass ein optisch klares partielles Thromboplastin aus pflanzlichen Lipiden in Verbindung mit einem wasserlöslichen Gerbsäurederivat als Aktivator dann zu einem partiellen Thromboplastin führt, wenn an Erdalkali-Metall-Ionen, zweckmässig in einer optima- len Konzentration, zugefügt wird. Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein partielles Throm- boplastin, im wesentlichen bestehend aus einem pflanzli- chen Lipid-Extrakt, vorzugsweise der Phospholip raRtion aus Soja-Bohne, in Kombination mit einem wasserlöslichen Erdalkali-Salz, insbesondere einem Ca-Salz und einen was- serlöslichen Gerbsäurederivat, insbesondere einem ir)erivot der Gallussäure wie ,purpurogallin oder vorzugsweise Ellagsäure oder deren Alkalisalzen. Vorzugsweise werden als pflanzliche Lipidextrakte Phos pholipid-Präparationen aus der Soja-Bohne verwendet, wie sie kommerziell bezogen werden können. Prinzipiell können aber auch Extrakte aus anderen fettreichen Pflanzenarten eingesetzt werden, sofern deren Phospholipidanteil angereichert und auf eine gerinnungsphisiologisch aktive Zusammensetzung gebracht werden kann. Die Eignung einer solchen Präparation für die Herstellung des erfindungsge- mässen Reagenzes kann folgendermassen überprüft werden: Man dispergiert die Lipidpräparation zu 0,05 bis 0,1 % in dest. Wasser und setzt anschliessend 0,01 bis 0,05 90 Ellagsaure zu. Nach 15 min Homogenisieren setzt man soviel Calciumsalz zu, dass eine Endkonzentration des Salzes von 0,1 . 10- bis 0,2 . 10- mol/l resultiert. Wenn diese Lösung im nachstehend beschriebenen Test zur Diagnose von Gerinnungsstörungen mit Normalplasma eine Gerinnungszeit zwischen 20 bis 50 sec ergibt, ist die eingesetzte Lipid-Präparation zur Reagenzlierstellung geeignet. Bei dem Verfahren zur Herstellung des partiellen Thrombo- plastins kann man beispielsweise wie folgt vorgehen: Man extrahiert getrocknetes, zerkleinertes Pflanzengewebe, vorzugsweise Soja-Bohnen, mit einer niedrigsiedenden Pe trolätherfraktion, wie beispielsweise Hexan oder Heptan, konzentriert den Extrakt durch Verdampfen des organischen Lösungsmittels an und setzt dem Konzentrat einen überschuss, beispielsweise das 10fache Volumen, an Azeton zu. Dabei fällt die phospholipidreiche Fraktion aus, die unerwünschten, gerinnungsinaktiven Lipide bleiben in Lösung. Der Niederschlag wird gewonnen, gewünschtenfalls durch Umfällen weitergereinigt: oder direkt verwendet, nachdem cas Fällangs- mittel durch Verdampfen in Vakuum entfernt wurde. Solche Präparate können auch im einschlägigen Fachhandel käuflich erworben werden. Das so erhaltene Phospholipid wird in einer Konzentration von 0,(1 bis 0,5 % w/v, vorteilhaft 0,05 bis 0,1 % w/v in Wasser vollständig dispergiert, wobei man sich nötigenfalls eines mechanischen Hilfsmittels bedienen kann. Dazu gibt man 0,C05 bis 0,5 % (w/v), vorzugsweise 0,01 bis 0,05 % Ellagsäure in fester, pulverisierter Form unter weiterer mechanischer Bearbeitung, z.B. mit einen hoch.- tourigen Homogenisator und verteilt sie bis zur vollstän- digen Lösung. Man kann die Ellagsäure auch als konzentrierte Lösung in 0,1 bis 1 n Alkalilauge, beispielsweise in 0, n Natronlauge, zusetzen. In diesem Fall sollte allerdings die Phospholipidsuspension vorher mit einer Puffer- substanz, vorteilhaft einer Aminosäure wie Glycin, versetzt, werden. Danach fügt man unter weiterem Rühren soviel einer konzen- trierten Calcium Salzlösung, vorzugsweise Calciuia-Ch1orid- Lösung zu, dass die Endkonzentration an Calcium-Ionen 0,05 10 3 bis 1 . 10- mol/l, vorzugsweise 0,1 - 0,2 . 10- mol/ 1, beträgt. Die Calcium-Salzkonzentration ist nach oben hin durch die Löslichkeit des sich bildenden Calcium-Ellagates begrenzt. Der aktivierende Einfluss der Calcium-Ionen und die Abhängigkeit der Gerinnungszeit von der Calcium-Kon- zentration zeigt die folgende Tabelle am Beispiel von Normalplasma: EMI5.1 <tb> (CaII) <SEP> . <SEP> 10- <SEP> mol/l <SEP> 0 <SEP> 0,05 <SEP> 0,1 <SEP> 0,2 <SEP> 0,5 <SEP> 1,0 <SEP> 2,0 <tb> Gerinnungszeit <SEP> (sec.) <SEP> 115 <SEP> 49 <SEP> 43 <SEP> 41 <SEP> 41 <SEP> 45 <SEP> 50 <tb> Der pH-Wert der fertiggestellten Mischung kann zwischen 6,0 und 8,5 eingestellt werden ; vorteilhaft liegt er bei 7,0 - 7,8. Die Temperatur während der Herstellung kann zwischen 0 und +35 C, vorteilhaft bei 15 - 25 C liegen. Das so hergestellte partielle Thromboplastin kann nach Zusatz von Aminosäuren, wie z.B. Glycin und gewünschtenfalls mit Nohlenhs7draten, wie beispielsweise Saccharose, kombiniert gefriergetrocknet werden. Es kann zur Bestimmung der partiellen Thromboplastinzeit oder zur Einzel bestimmung der Faktoren VIII, IX, XI, XII, Präkallikrein oder Kininogen eingesetzt werden. Der Test zur Diagnose von Störungen des endogenen Gerinnunssystems (partielle Thromboplastinzeit) unter Verwendung des erfindungsgemässen Thromboplastins wird folgendermassen ausgeführt: Ein Volumenteil der Reagenzlösung wird mit einem Volumenteil normalem Plasma bzw. pathologischem Plasma, in dem die Gerinnungsstörungen qualitativ ermittelt werden sollen, in einem Teströhrchen vermischt und 2 min bei 37 t0,5 C inkubiert. Nach Zusatz von einem Teil einer auf 37 C vorgewärmten 0,025 molaren Calciumchlorid-Lösung wird die Zeit gemessen, die vom Zusatz der Calciumchlorid-Lösung bis zum Auftreten eines festen Fibringerinnsels vergeht. Weicht die Gerinnungszeit des pathologischen Plasmas von der des Nor- malplasmas (20 bis 50 sec.) nach längeren Zeiten hin ab, liegt eine Störung in der Aktivität des endogenen Gerinnungssystems vor (Faktor VIII-, XI-, XII-, Präkallikreinoder Kininogen-Mangel) . Voraussetzung für diese Aussage ist, dass andere qualitative Teste (Quick-Wert und Plasma tlirombinzeit) normale Gerinnungszeiten zeigen. Der Test zur Bestimmung der facto VIII-, IX-, XI-, XII-, Präkallikrein- oder Kininogen-Aktivität (quantitativ) unter Verwendung des Verfahrensproduktes wird folgendermassen ausgeführt: 1 Teil der Reagenzlösung wird mit einem Teil eines Faktor VIII-, IX-, XI-, XII-, Präkallikrein- bzw. Kininogen0Man- gelplasmas und einem Teil verdünntem Normalplasma bzw. pathologischem Plasma in einem Teströhrchen vermischt. Diese Mischung wird 2 min bei 370C gehalten. Nach Zusatz von einem Teil einer auf 37 C vorgewärmten 0,025 molaren Gal- ciumchlorid-Lösung wird die Zeit bestimmt, die vom Zusatz der Calciunchlorid-Lösung bis zum Auftreten eines festen Gerinnsels verstreicht. Zur quantitativen Aussage wird die aus dem verdünnten pathologischen Plasma sich ergebende Gerinnungszeit unter Bezugnahme auf eine mit einer Normalplasma-Verdünnungsreihe erzielten Eichkurve abgelesen. Das erfindungsgemässe partielle Thromboplastin ist in seiner Faktorenempfindlichkeit den aus tierischen oder humanen Geweben hergestellten Thromboplastinen gleichwertig. Dies zeigt folgende Tabelle, in der die Gerinnungszeiten bekannter Thromboplastine mit denen des erfindungsgemässen Thromboplastins für Normalplasma und Mangelplasma verglichen werden: EMI8.1 <tb> <SEP> REAGENZ <tb> <SEP> bekannt <SEP> bekannt <SEP> erfindungsgemäss <tb> Lipidkomponente <SEP> tierisch <SEP> human <SEP> pflanzlich <tb> Aktivator <SEP> Ellagsäure <SEP> Kaolin <SEP> Ellagsäure <tb> Gerinnungszeit <SEP> in <tb> sec <SEP> von: : <tb> Normalplasma <SEP> 34 <SEP> 44 <SEP> 40 <tb> Faktor <SEP> VIII-Mangel- <SEP> 98 <SEP> 112 <SEP> 106 <tb> plasma <tb> Faktor <SEP> IX-Mangel- <SEP> 114 <SEP> 107 <SEP> 124 <tb> plasma <tb> Faktor <SEP> XI-D5angel- <SEP> 118 <SEP> 136 <SEP> 288 <tb> plasma <tb> Faktor <SEP> XI <SEP> 1-Mangel- <SEP> 240 <SEP> 223 <SEP> 280 <tb> plasma <tb> Die Herstellung des erfindungsgemässen partiellen Thromboplastins soll an folgendem Beispiel erläutert werden: Beispiel 5 g Phospholipid aus Soja-Bohnen (Epikuron (R) 100 G, Lukas Meyer, Hamburg) werden mittels eines hochtourigen Elomogeni- sators (Janke u. Kunkel AG, Typ 18 - 10) 30 min bei 2000 UpM und 15 - 250C in 5 1 dest. Wasser bis zur vollständigen Homogenität dispergiet. Danach wird der Homogenisator entfernt, 100 g Glycin unter mässigem Rühren in fester Forr zugegeben und vollständig aufgelöst. Sodann löst man 1,5 g feinpulverisierte Ellagsäure in 50 ml 0,5 n Natronlauge unter Sauerstoffabschluss auf und setzt die tiefviolett ge farbe Lösung unter starkem Rühren in einem Guss der Phos- pholipid-Clycin-Lösung zu. Nach 15 min setzt man 30 ml einer 0,025 mol/l Calciumchlorid-Lösung ebenfalls unter starkem Rühren tropfenweise zu, rührt noch 15 min und misst den pH-1vert. Dieser beträgt bei dieser Form der Herstellung 7,4. Die Gerinnungszeit einer Frischplasma-Mischung mit dieser Reagenzlösung im beschriebenen Testansatz liegt bei 36 sec, diejenige eines lyophilisierten Standard-Human-Plasmas bei 40 sec. Die Reagenzlösung wird in Portionen zu 2 ml abgefüllt und lyophilisiert. Man erhält etwa 2500 Abfüllungen.

Claims: P a t e n t a n s p r ü c h e : 1. Partielles Thromboplastin, im wesentlichen bestehelld aus einem pflanzlichen Lipid-Extrakt, einem wasser löslichen Erdalkali-Salz und einem wasserlöslichen Gerbsäurederivat. 2. Partielles Thromboplastin nach Anspruch 1, dadurch ge- kennzeichnet, dass die Phospholipidfraktion Sojabohnen- Phospholipid ist, das Erdalkali-Salz ein Kalziumsalz und das Gerbsäurederival Ellagsaure. 3. Partielles Thromboplastin nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass es im wesentlichen 0,01 bis 0,5 % w/v Phospholipid, 0,005 bis 0,5 % w/v Ellagsäure und 0,05 . 10- bis 1,0 . 10- mol/1 Kalziumionen in wässriger Dispersion enthält. P a t e n t a n s p r ü c h e für Östorreich : 1. Verfahren zur Herstellung eines partiellen Thrombo plastins, dadurch gekennzeichnet, dass ein pflanzli- cher Lipid-Extrakt mit einem wasserlöslichen Erdalkali Salz und einem wasserlöslichen Gerbsäurederivat ver setzt und gegebenenfalls lyophilisiert wird. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Phospholipidfraktion Sojabohnen-Phospholipid ist, das Erdalkali-Salz ein Kalziumsalz und das Gerbsäurederviat Ellagsäure. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich net, dass im wesentlichen das Phospholipid mit soviel Ellagsäure und Kalziumionen versetzt wird, dass die wässrige Dispersion 0,01 bis 0,5 % w/v Phospholipid, 0,005 bis 0,5 % w/v Ellagsäure und 0,05 . 10 3 bis 1 . 10 3 mol/l Kalziumionen enthält.

Inventors: HERCHENHAN, BERND, SCHWINN, HORST, DR.
Applicants: BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1980
Main classification: C12Q1
IPC codes: G01N33, C12Q1, C07G99