PROCESS FOR DOSING AMINOGLYCOSIDES AND REAGENTS FOR PUTTING THIS PROCESS INTO OPERATION

Abstract: 1. Method of determining aminoglycosides using compounds with fluorescent marking, characterised in that the modification of the aminoglycoside to be determined is carried out, by specific enzymatic reactions and controlled by means of fluorescent cofactors, of the ethenonucleotide type, similar to triphosphate nucleotides possessing an adenine nucleus or cytosine nucleus, and nucleotidyltransferases having for substrate aminoglucosides having the "desoxystreptamine" ring and carrying out reading of the intensity of the fluorescence of the product thus-obtained.

Description: La présente invention est relative à un nouveau procédé de dosage des aminoglycosides, ainsi qu'à de nouveaux réactifs pour la réalisation de ce dosage. Les aminoglycosides, ou oligosaccharides, consti- tuent un important groupe d'antibiotiques basiques de structuré chimique similaire et comportent généralement la désoxystreptamine (commune à tous les aminoglycosides à l'exception de la streptomycine, de la spectinomycine et de la kasugamycine) liée à d'autres sucres aminés variables selon l'aminoglycoside considéré. Ces sucres aminés sont la glucosamine, la méthyl-glucosamine, la kanosamine, la néobiosamine, la gentosamine, la garosamine, la purpurosamine, etc... Les aminoglycosides qui ont un spectre d'action large, sont des médicaments toxiques : néphrotoxiques ou ototoxiques (ototoxicité à prédominance vestibulaire ou à prédominance cochléaire). Aussi est-il très important de suivre avec précision le taux de ces antibiotiques dans les fluides biologiques ; cela devient même indispensable lorsque l'infection. a traiter est grave ou lorsqu'elle survient chez un malade insuffisant rénal.. Le dosage précis des aminoglycosides dans les différents fluides biologiques et en particulier dans le sang, est en outre nécessaire en ce qu'il apporte la preuve objective qu'une concentration d'antibiotique supérieure à la concentràtion minimale inhibitrice (CMI) ,de la bactérie, est présente dans la circulation sanguine ; ce dosage permet, d'autre part, de vérifier que la teneur d'antibiotique est dans les limites acceptées de tolérance du produit, surtout lorsque le produit utilisé présente une marge relativement étroite (et c'est souvent le cas) entre les taux souhaités pour traiter les malades et les taux réputés limites de la toxicité. C'est la raison pour laquelle plusieurs méthodes de dosage des antibiotiques en général et des-amino- glycosides en particulier, ont été mises au point': 'cependant, aucune méthode préconisée jusqu'ici ne satisfait aux cinq critères énumérés ci-après qui sont non seulement utiles mais nécessaires, voire indispensables - réaliser un dosage précis ; reproductible ; rapide ; simple ; peu onéreux. C'est ainsi qu'ortété proposés - des dosages biologiques par diffusion en gélose Zcf. en particulier les travaux de JUSTESEN et TAGE dans Acta. Pathol. microbiol. Scand. (1973) 241, 111-114 ou de DOIVA et JACKSON dans J. Infect. Dis. (1975) 132 399-406/. Ces dosages reposent sur la comparaison de l'activité bactériostatique de l'échantillon à doser vis-à-vis de témoins contenant des quantités connues d'antibiotique. Ils sont longs et difficilement repro ductibles d'un laboratoire à un autre - des dosages microbiologiques rapides Zcf. en particu lier les travaux de FENTON et alia dans "9ème Congrès International de Chimiothérapie" LONDRES Juillet 1975 ou NOONE et alia dans Soc. Appli. Bacteriol. Tech. Ser. (1975) 8 153-167/. Ces dosages plus utilisés, car plus rapides et qui reposent en général sur l'amplitude de la variation du pH du milieu dans lequel se trouvent un germe test et l'antibiotique à doser, ne-sont pas très précis et ne peuvent pas être utilisés dans de nombreux cas où la précision est indispensable - des dosages par chromatographie liquide haute performance (HPLC) décrits par exemple par ANHALT et JOHN dans Antimicrobiol. Agents and Chemother. (1977) 11 (4) 651-655. Cette chromatographie qui est couplée, en sor tie de colonne, à un système de détection (par exemple un réfractomètre) constitue également un moyen de sépa rer et de doser les aminoglycosides. Ce procédé de do sage est onéreux et le matériel qu'il nécessite est com plexe et coûteux - des dosages radioimmunologiques Zcf. en particulier les travaux de MAHON et alia dans Antimicrobiol. Agents and Chemother. (1973) 3 585-589 ou de BROUGHTON et STRONG dans Chin. Chim. Acta (1976) 66 125-129/. Cci; dosages sont basés sur la compétition d'un antihiotique radio actif et de l'antibiotique à doser pour des anticorps anti-antibiotiques. Une courbe-étalon préalablement établie permet un dosage rapide et précis. Malheureu- sement, cette méthode présente deux inconvérjients ma jeurs : la préparation d'anticorps anti-antihiotiques et le comptage d'un élément radioactif - des dosages radioenzymatiques zcf. en particulier les travaux de F. LE GOFFIC et J.F. ACAR dans Méthode de dosage de la gentamicine (1973) Monographie de la Gazette Médicale de France ou de BROUGHALL et REEWE' dans J. Clin. Pathol. Microbiol. (1975) 28 140-1457. Ces dosages consistent en la transformation quantitative de l'anti biotique à doser par une enzyme d'inactivation, en un produit dosable. Les enzymes d'inactivation utilisant des cofacteurs (acétyl CoA, ATP), la technique proposée pour'doser le produit de la réaction consiste en l'uti lisation de cofacteurs radioactif s. On obtient de cette manière un antibiotique modifié radioactif, dosable. Cette méthode de dosage qui est très precise, présente toutefois plusieurs inconvénients l'utilisation de composés radioactifs est toujours délicate et nécessite des précautions particulières ces composés sont très coûteux et impliquent, pour leur dosage, un matériel trop lourd pour des laboratoires courants d'analyses médicales. La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à une méthode de dosage des arinoglycosides qui soit rapide, peu onéreuse, simple demplo, ne nécessitant aucune précaution particulière, ne mettre pas en oeuvre des composés radioactifs, particulièrer,,rnt précise et reproductible. La présente invention a pour objet un nouveau procédé de dosage des aminogiycosides, caractérisE en ce que l'on effectue la modification de l'aminoglycoside à doser, par des réactions enzymatiques spécifiques et contrôlées à l'aide de cofacteurs fluorescents et d'enzymes choisies parmi celles ayant pour substrat des aminoglycosides pos sédant le cycle "désoxystreptamine" et en ce que l'on effectue la lecture de l'intensité de la fluorescence du produit ainsi obtenu. Le principe de ce dosage repose sur la modification de l'antibiotique par "branchement" d'un marqueur fluorescent sur la molécule. On obtient ainsi un antibiotique fluorescent facilement dosable. Cette modification par branchement du marqueur fluorescent peut être réalisée chimiquement : on dispose en effet de plusieurs réactifs fluorescents et notamment des amines. Mais comme les aminoglycosides sont des molécules polyfonctionnelles possédant plusieurs fonctions amines et plusieurs fonctions alcools de réactivités plus ou moins proches, il est donc très difficile de contrôler de telles modifications, de savoir combien de marqueurs ont réagi sur la molécule, et, partant, de pouvoir doser avec précision l'antibiotique marque Afin de pallier cet inconvénient, la Demanderesse a mis au point et a utilisé la sélectivité des réactions enzymatiques pour aboutir au dosage fluoroenzymatique conforme à la présente invention. Il est connu en effet que les aminoglycosides peuvent être modifiés par des enzymes d'inactivation par acétylation, phosphorylation et nucléotidylation Ces enzymes d'inactivation utilisent par exemple comme cofacteurs l'acétylcoenzyme A (AcCoA) et l'adénosine triphosphate (ATP). Ainsi la Demanderesse, en utilisant comme cofacteur un analogue fluorescent, a pu brancher de manière parfaitement sélective un marqueur et un seul sur une seule fonction prédéterminée de l'antibiotique. Suivant un mode de réalisation avantageux du procédé objet de la présente invention, les cofacteurs utilisés sont des cofacteurs fluorescents analogues des nucléotides triphosphates possédant le noyau adénine ou le noyau cytosine. Le schéma réactionnel du dosage pourrait donc être représenté de la manière suivante EMI5.1 <tb> <SEP> enzyme <tb> Aminoglycoside <SEP> + <SEP> ±NTP <SEP> - <SEP> > <SEP> ±NMP-Aminoglycoside <SEP> + <SEP> PPi <tb> (par exemple dans (fluorescent dosable) le sérum ENTP = éthénonucléotide-triphosphate eNMP = éthénonucléotide-monophosphate Suivant un autre mode de réalisation avantageux de l'objet de l'invention, les enzymes choisies pour modifier les aminoglycosides sont des nucléotidyltransférases. Selon une modalité particulière de ce mode de réalisation, la nucléotidyltransférase choisie est une 4' aminoglycosidenucléotidyltransférase (ANT (4')) qui catalyse l'adénylation de la fonction alcool en 4' du cycle purpurosamine des aminoglycosides. Cette enzyme peut être obtenue suivant - par exemple - la méthode décrite par F. LE GOFFIC et coll. dans Ann. Microbio. (Inst. Pasteur), 127, 391-399. Selon une autre modalité particulière de l'invention, la nucléotidyltransférase choisie est une 2"aminoglycoside nucléotidyltransférase (ANT (2")) qui catalyse I'adénylation de l'hydroxyle en 2" du cycle garosamine ou kanosamine des aminoglycosides. Cette enzyme peut être obtenue par exemple suivant la technique décrite par BENVENISTE et DAVIES (1971) dans Febs. Letters, 14, 293. Ainsi donc, tout aminoglycoside contenant la déoxy2-streptamine et possédant une fonction alcool en 4' ou en 2", peut être adénylé par l'une ou l'autre de ces enzymes. Un problème demeure toutefois encore : afin que ce dosage simple, rapide et précis puisse être utilisé à grande échelle dans tous les laboratoires d'analyse, il est indispensable de surmonter le handicap que constitue l'instabilité particulière des enzymes d'inactivation et notamment la thermolabilité des nucléotidyltransférases leur activité ne peut être conservée qu'en les transportant et en les stockant à des basses températures, de l'ordre de -200C. Conformément à l'invention et afin de rendre la méthode d'un emploi facile et d'un prix de revient peu élevé, les enzymes d'inactivation des aminoglycosides sont stabilisées par immobilisation sur support soluble. Suivant un mode de réalisation avantageux du procédé de dosage objet de la présente invention, les enzymes d'inactivation utilisées le sont sous forme d'extrait brut, après lyse des bactéries. Des travaux récents (1977) ont en effet démontré que les enzymes d'inactivation non purifiées se trouvant dans un environnement stabilisant, supportent mieux l'immobilisation que les enzymes purifiées (cf. notamment les travaux de LE GOFFIC, SICSIC et VINCENT dans Biochimie 59 927-932). Conformément à l'invention, la stabilisation par immobilisation a été réalisée par réticulation avec le glutaraldéhyde sur un support soluble du type dextrane. I1 est en effet nécessaire, lors de l'immobilisation, de préserver absolument le site actif. I1 y a une forte probabilité pour que le site de fixation des aminoglycosides soit constitué d'une cavité à caractère anionique, les substrats étant polyaminés. La Demanderesse a, en tenant compté de cette caractéristique, mis au point une immobilisation par participation des fonctions amines, l'immobilisation covalente utilisant les fonctions carboxyliques de ces enzymes étant susceptibles de les inactiver. Le choix du support a été déterminé par sa solubilité afin que le dosage soit facilement réalisable, qu'il ait lieu dans une phase homogène, dans un simple tube à hémolyse, et qu'il soit possible de prélever plusieurs fois le même nombre d'unités enzymatiques en prélevant un même volume d'enzyme immobilisée. Suivant un mode de réalisation avantageux du procédé conforme à la présente-invention, l'immobilisation est effectuée en procédant tout d'abord à l'absorption de l'extrait enzymatique sur le support, en réticulant ensuite par le glutaraldéhyde à 25 % dans l'eau et en finissant par une opération de congélation et décongélation. Suivant un mode de réalisation particulièremenfr avantageux du procédé conforme à l'invention, la solution contenant l'enzyme immobilisée est conservée sous forme lyophilisée. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. La présente invention vise particulièrement le procédé de dosage des aminoglycosides à l'aide des opérations fluoroenzymatiques conforme aux dispositions qui précèdent, les réactifs (enzymes, supports, analogues fluorescents) nécessaires à ce dosage, les moyens propres à la mise en oeuvre de ce procédé, ainsi que les procédés d'ensemble dans lesquels sont inclus le procédé et les réactifs conformes à la présente invention. L'invention pourra être mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention et notamment à la réalisation de la synthèse d'un cofacteur fluorescent, à la stabilisation des enzymes d'inactivation par immobilisation sur support soluble, à la réalisation de l'hémisynthèse d'antibiotiques modifiés fluorescents, au dosage par fluorescence des antibiotiques modifiés, et au protocole expérimental réalisant la transformation quantitative de l'antibiotique à doser dans un fluide biologique, en produit fluorescent et le dosage de ce produit par fluorescence. I1 doit être bien entendu,toutefois, que ces exem plies et les différents tests décrits ci-après, sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'in vention, mais n'en constituent en aucune maniere une limitation. EXEMPLE 1 - SYNTHESE DU COFACTEUR FLUORESCENT La préparation du cofacteur fluorescent (le 1N6 éthéno ATP représenté par la formule I ci-après) : EMI8.1 a été réalise en s'inspirant de la méthode décrite par KOCHETOV dans "TETRAHEDRON LETTERS" (1971), 22, 1993-1996 et par SECRIST et LEONARD dans J. Amer. Chem. Soc. (1972), 11, 3499-3506. En milieu légèrement acide, le chloroacéaldéhyde xéagit sur l'adénine selon le schéma suivant EMI8.2 où R représente le résidu ribosyl-triphosphate. La réaction est totale en 18 heures à 37 C. La disparition de 1'ATP est contrôlée en effectuant régulièrement des chromatographies sur couche mince. Quant la totalité de 1'ATP a réagi, le chloroacétaldéhyde en excès est extrait. Le produit peut alors être purifié par simple chromatographie sur colonne de gel d'exclusion (dessalage). L'ATP utilisé est légèrement radioactif au 14C sur le carbone en 8 de l'adénine. Cela permet par la suite de réaliser simultanément le dosage radioenzymatique et fluoroenzymatique à des fins de comparaison. On procèdera par exemple ainsi 30 ml d'une solution aqueuse de chloroacétaldéhyde 2M sont ajustés à pH=4,5 par une solution de soude 1M. On ajoute alors 1,3 g d'ATP (Boehringer) et 50 pCi de 140 ATP à 53 mCi/mmole (CEA Saclay). La température du mélange réactionnel est maintenue à 370C et le pH à 4,5. L'avancement de la réaction est contrôlé par chromatographie sur couche mince (gel de silice) avec comme éluant un mélange 25:5:5 de méthanol d'ammoniaque à 20 % et a'eau (V/V/V). Au bout de 38 heures, tout 1'ATP a disparu. Le chloroacétaldéhyde en excès est extrait par six fois 20 ml d'éther. Le produit est alors dessalé par chromatographie sur gel d'exclusion "SEPHADEX" G10 et lyophilisé. On obtient ainsi 2 mmoles d'ÀTP à 23,3 uCi/mmole. EXEMPLE 2 - PREPARATION DE L'EXTRAIT ENZYMATIQUE Tampon A : Tris HCl 10-2M (pH = 7,5) NaCl 3.10-1M Tampon B : Tris HCl 10-2M (pH = 7,5 NH4Cl 6.10-2M MgCl2 10-2M ss mercapto thanol 0.6.10-3M Tampon C : Tris HCl 10-1M (pH = 7,5 NH4Cl 6.10-1M MgCl2 10-1M ss mercaptoéthanol 0,6.10 M a) Cuiture des bactéries : A partir d'une colonie de Staphylococcus Aureus (Riv) ou Escherichia Coli R55 isolée sur boîte de Pétri, on ensemence dans un milieu complet Trypticase Soy Broth (30 g/l). Les bactéries sont récoltées en fin de phase exponentielle de croissance, par centrifugation (10 000 g/30 mm). Le culot d'un litre de cuiture est lavé trois fois par du tampon A. b) Lyse des bactéries : Pour E.-Coli R55, l'extraction se fait par désintégration des cellules. Après lavage, le culot est remis en suspension dans 20 ml de 2 tampon B et soumis à une pression de 1 300 à 2 000 kg/cmê. 5 mg-de désoxyribonucléase (Boehringer) sont ajoutés et la préparation est laissée pendant 30 mn sous faible agitation dans un bain de glace. Elle est ensuite centrifugée à 40 000 g pendant 30 mn. Pour Staphylococcus Aureus (Riv.), une fois le culot remis en suspension dans 20 ml de tampon B, les bactéries sont lysées par la lysostaphine (2 mg à 203 U/mg). Après action de la désoxyribonucléase, l'extrait est centrifugé à 40 000 g-pendant 30 mn. On obtient ainsi des extraits bruts de la 4'aminoglycosidenucléotidyltransférase et de la 2"aminoglycosidenucléotidyltransférase. EXEMPLE -3 - EVALUATION DE L'ACTIVITE ENZYMATIQUE DES EXTRAITS OBTENUS Dans un tube à hémol;yse, on mélange 5 ul d'une solution de tobramycine à 2 umole/ml, 5 ul de 14C ATP à 10 vmole/ml (activité spécifique 1 pCi/pmole);l0 ul de tampon C ci-dessus et 20 ul d'extrait enzymatique (obtenu comme décrit ci-dessus). Le mélange réactionnel, soit 40 p1, est incubé à 37 C pendant 10 mn puis déposé sur un carré de papier de phosphocellulose (Whatman P 81). La réaction enzymatique est arrêtée par immersion du papier dans l'eau à 800C. On le lave ensuite abondamment à l'eau froide pour éliminer l'excès d'ATP. Après séchage, la radioactivité retenue sur le papier est déterminée dans un liquide scintillant (5 g de PPO, 100 mg de POPOP dans 1 litre de toluène) par un spectromètre Intertechnique SL 30. Cette radioactivité représente la quantité d'antibiotique adénylé, fixé sur le papier par échange d'ions. Elle représente donc l'activité enzymatique de l'extrait. radioactivité retenue 2/10/0,02 (en p/mole/mn/ml radioactivité totale d'extrait) EXEMPLE 4 - IMMOBILISATION DES EXTRAITS ENZYMATIQUES SUR SUPPORT SOLUBLE L'extrait enzymatique est lentement décongelé. Le support DEAE-dextrane ou dextrane T500 (Pharmaàia) est dissous délicatement dans l'extrait (100 mg de support par ml d'extrait). A la solution ainsi obtenue ,on ajoute le glutaraldéhyde à 25 % dans l'eau (Eastman Kodak) (1,4 ul de glutaraldéhyde/ml d'extrait) et on homogénéise la préparation qui est ensuite congelée pendant 2 heures. Après lente décongélation, l'activité enzymatique peut être déterminée comme indiqué à l'Exemple 3 ci-dessus. Pour chaque mesure, un témoin sans antibiotique est réalisé. Cette précaution s'est révélée particulièrement utile quand le support utilisé pour l'immobilisation est le DEAE-dextrane.En effet, la nature cationique du support le rend capable de fixer de 1'ATP 14C et de se fixer lui-même sur le papier de phosphocellulose, faussant ainsi les résultats. Les solutions d'enzymes immobilisées ainsi préparées sont très actives. Leur stabilité en fonction du temps est remarquable. Les résultats sont reportés dans le Tableau I ci-après TABLEAU I EMI12.1 Support <SEP> Température <SEP> de <SEP> Forme <SEP> physique <SEP> de <SEP> Pourcentage <SEP> d'activité <tb> <SEP> stockage <SEP> la <SEP> préparation <tb> <SEP> après <SEP> 8 <SEP> après <SEP> 15 <SEP> après <SEP> 30 <tb> <SEP> jours <SEP> jours <SEP> jours <tb> DEAE-Dextrane <SEP> 25 C <SEP> liquide <SEP> 60 <SEP> - <SEP> Dextrane <SEP> T500 <SEP> 25 C <SEP> liquide <SEP> 50 <SEP> 20 <SEP> DEAE-Dextrane <SEP> 4 C <SEP> liquide <SEP> 75 <SEP> 60 <SEP> 50 <tb> Dextrane <SEP> T500 <SEP> 4 C <SEP> liquide <SEP> 90 <SEP> 80 <SEP> 75 <tb> Destrane <SEP> T500 <tb> ou <SEP> DEAE-Dextrane <SEP> 4 C <SEP> lyophilisée <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <tb> Les tests d'activité ont été effectués tous les jours d'abord, puis toutes les semaines durant plusieurs mois. Comme on le voit sur le Tableau I, le type d'immobilisation conforme à l'invention est remarquabie : alors que les enzymes non immobilisées perdent la totalité de leur activité en 2 a 5 jours, certaines préparations obtenues conformément à l'invention gardent plus de la moitié de leur activité durant plusieurs mois. EXEMPLE 5 - PREPARATION DE REACTIFS D'ADENYLATION Exemple de préparation de 4'ÀMP-tobramycine et de 2"eAMP-tobramycine EMI13.1 Ces hémisynthèses sont nécessaires pour deux raisons - pour étudier les propriétés de fluorescence de ce pro duit et sa stabilité dans différents milieux, - pour mettre au point un protocole de détection et de détermination des concentrations du produit dans le sérum. En effet, dans la plupart des cas, les composés fluorescents voient leur fluorescence perturbée dans le sérum. Cela est du à des phénomènes de transfert d'énergie des composés fluorescents sur d'autres molécules sériques, protéiques en particulier. Pour la reaction,on a utilisé un cofacteur légère- ment radioactif ; on a pu, ainsi, suivre l'avancement de la réaction en mesurant la radioactivité retenue sur le papier de phosphocellulose avec ou sans rinçage. Au bout de 30 minutes, 80 % d'antibiotique sont transformés. En une heure, ].'adénylation est totale. On procède par exemple ainsi Dans 50 ml de tampon C (de l'Exemple 2) sont dissous 37,5 moles (18 mg) de tobramycine et 187,5 moles (100 mg) d'cATP C (radioactivité spécifique 23,2 pCi/ mmole). Le mélange est introduit dans une cellule d'ultrafiltration Amicon munie d'une membrane XM 100 A. 50 ml d'extrait enzymatique immobilisés et ultrafiltrés sont alors introduits. Après une heure, le rendement est quantitatif. Le produit est récupéré par ultrafiltration sous 2 bars. Armures dessalage sur une colonne de gel d'exclusion G10, une chromatographie analytique sur couche mince (gel de silice) est pratiquée avec, comme éluant, un mélange 3:1 MeOH NH4OH 20 % (V/V). Les chromatogrammes sont révéles par l'iode et par du phosphomolybdate d'ammonium (réactif des sucres), la radioactivité est localisée au Scanner BERTHOLD, l'absorption UV et la fluorescence au photomètre VERNON. 3 taches sont observées - une tache radioactive et fluorescente, ne réagissant pas avec le phosphomolybdate d'ammonium, de Rf=0,09. I1 s'agit de 1'EATP en excès ne migrant presque pas - une tache non radioactive et ne présentant pas de fluo rescence, réagissant avec le phosphomolybdate d'ammo nium, de Rf=0,3. I1 s'agit d'un peu de tobramycine rési duelle - une tache radioactive et fluorescente, réagissant avec le phosphomolybdate d'ammonium, de Rf=0,5. C'est 1'ÀMP tobramycine. Purification de l'cAMP tobramycine Le produit est repris dans 20 ml d'eau et l'on ajoute 5 g de résine CG 50 à 10,2 meq/g (Amberlite" 100-200 mesh) préalablement équilibrée sous la forme NH4 et lavée à l'eau distillée jusqu'à force ionique nulle. L'élution est pratiquée tout d'abord avec 50 ml d'eau. On récupère ainsi 1'ÀTP en excès. Ensuite le produit est élué par un gradient linéaire d'ammoniaque (0 à 0,5 N). Une chromatographie analytique sur gel de silice réalisée dans le système décrit précédemment, montre la présence de deux taches : 1'EAMP tobramycine et un peu de tobramycine. Le produit est alors fixé par échange d'ions sur une résine échangeuse d'anions AG1 X 8 à 3,2 meq/g (Bio-Rad 200 à 400 mesh préalablement équilibrée sous la forme formiate. Le pH étant fixé à 10,5, la résine est ajoutée jusqu'à disparition de la radioactivité dans la phase liquide. Elle est alors lavée avec 50 ml d'eau. Le produit est élué avec une solution d'acide formique 0,1N. I1 montre en chromatographie analytique une tache unique de Rf=0,5. 18 mg de 4'cAMP tobramycine et 20 mg de 2"#AMP tobramycine ont ainsi été obtanus EXEMPLE 6 - PROTOCOLE DE DOSAGE a) dans l'eau : les mesures de la fluorescence de 1'EAMP tobramycine sont réalisées sur un spectrophotofluorimètre AMINCO SPF 125 et on trace les spectres d'absorption et d'émission de 1'#AMP tobramycine dans l'eau a différents pH. A l'excitation, quatre maxima sont observés 285-nm, 290 nm, 303 nm, 322 nm, qui représentent l'absorption d'énergie par le produit, mais aussi les différentes bandes d'émission de la lampe. A l'émission, le produit présente un large spectre de 350 nm à 520 nm dont le maximum est à 420 nin. C'est à pH=7 que le produit présente la plus grande fluorescence. A pH=l, la fluorescence est bien plus faible et à pH basique le produit se dégrade et l'intensité de fluorescence décroît en fonction du temps. Les longueurs d'onde donnant la meilleure sensibilité sont 303 nm pour l'excitation et 420 nm pour l'émission. A ces longueurs d'onde, l'intensité de fluorescence est importante puisqu'elle permet de déterminer des concentrations en produit de 6.10 5 pmole/ml (5.10 pg/ml). b) dans le sérum : dans le sérum ou le plasma, les mesures réalisées montrent une très forte inhibition de la fluorescence, et ne permettent de déterminer que les grandes concentrations en produit. I1 a donc fallu mettre au point un protocole levant cette inhibition; La méthode choisie pour lever cette inhibition de fluorescence est l'extraction du produit à doser, par chromatographie échangeuse d'ions. En passant l'échantillon de sérum sur une petite colonne échangeuse de cations CG50, 1'VAMP tobramycine s'accroche fortement à la résine. En rinçant abondamment la colonne, la plupart des composés sériques, et en particulier les protéines, sont éliminés. Il ne reste plus ensuite qu'à éluer le produit avec un tampon concentré à pH=7, directement dans la cellule de lecture du fluorimètre. L'cAMP tobramycine présente alors une bonne intensité de fluorescence et l'on peut aisément déterminer des concentrations de 1,2.10 3 vmole/ml (1 ug/ml). Lors de la mise en oeuvre du dosage proprement dit, cette méthode présente l'avantage de permettre l'elimi- nation de l'ÀTP en exces qui, ne s'accrochant pas à la résine, est lui aussi élué lors du rinçage. On procède par exemple comme suit a) transformation enzymatique : il faut déterminer d'abord les conditions expérimentales pour que, lors du dosage, la transformation de l'antibiotique soit totale. Pour cela, les activités spécifiques des préparations enzymatiques sont tout d'abord mesurées comme indiqué à l'Exemple 3. Elles sont d'environ 5.10 U/ml (1 unité catalysant la transformation de 1 mole/mm). Pour le dosage, on a à transformer de 1 g/ml à 25 g/ml d'antibiotique soit 2.10-3 à 5.10-2 moles pour des prises d'essai de 1 ml. Il faut aonc 5.10-3 pour que la tanosformation de l'échantillon le plus concentré soit totale en 10 mn. En mettant 1 ml d'enzyme par échantillon, on se place en excès de 10. Pour vérifier ces conditions, une gamme de 10 3 à 0.1 umole/ml (0,5 à 50 pg/ml) de tobramycine a été adénylée. Les résultats sont les suivants TABLEAU II EMI17.1 <tb> Tobramyeine <SEP> dans <SEP> l'échaptillon <SEP> 14C <SEP> ATP <SEP> Radioactivté <tb> <SEP> retenue <SEP> aprés <tb> <SEP> rinçage <tb> <SEP> en <SEP> g <SEP> en <SEP> mole <SEP> en <SEP> mole <SEP> en <SEP> mole <tb> <SEP> 50 <SEP> 10-7 <SEP> 5.10-7 <SEP> 76 <SEP> 400 <tb> <SEP> 25 <SEP> 5.10-8 <SEP> 5.10-7 <SEP> 41 <SEP> 800 <tb> <SEP> 10 <SEP> 2.10-8 <SEP> 5.10-7 <SEP> 18 <SEP> 000 <tb> <SEP> 5 <SEP> 10-8 <SEP> 5.10-7 <SEP> 9 <SEP> 200 <tb> <SEP> 1 <SEP> 2.10-9 <SEP> 5.10-7 <SEP> 2 <SEP> 150 <tb> <SEP> 0,5 <SEP> 10-9 <SEP> 5.10-7 <SEP> 960 <tb> b) extraction de l'cAMP-tobramycine : dans 1 ml de sérum on introduit 6.10-2 umoles (50 g) d'sAMP tobramycine. La résine CG50 équilibrée sous forme NH3 est ajoutée jusqu'à disparition de la radioactivité dans la phase liquide (100 mgEl meq.). Elle est ensuite rincée avec 50 ml d'eau distillée. 2 ml de tampon phosphate de potassium 1M pH=7 servent à l'élution du produit. Cet éluat présente une intensité de fluorescence de 40 unités relatives. On élue donc une petite colonne de capacité 1 meq. avec une quantité de tampon représentant 2 meq. L'élution n'est donc pas totale. Malgré cela si les conditions d'extraction sont toujours identiques (même quantité de résine et même quantité de tampon éluant), l'intensité de fluorescence de l'éluat doit être proportionnelle à la quantité d'ÀMP-tobramycine présente dans le sérum de départ. Cela a été vérifié comme représenté au Tableau III cidessous : TABLEAU III EMI18.1 <tb> Concentration <SEP> d'eAMP <SEP> tohramycine <SEP> Intensité <SEP> de <tb> <SEP> dans <SEP> le <SEP> sérum <SEP> fluorescence <tb> <SEP> en <SEP> g/ml <SEP> en <SEP> mole/ml <tb> <SEP> 50 <SEP> 6.10-2 <SEP> 85 <tb> <SEP> 20 <SEP> 2,4.10-2 <SEP> 34 <tb> <SEP> 10 <SEP> 1,2.10-2 <SEP> 17,5 <tb> <SEP> 4 <SEP> 5.10-3 <SEP> 6 <tb> <SEP> 2 <SEP> 2,4.10-3 <SEP> 3,2 <tb> <SEP> 1 <SEP> 1,2.10-3 <SEP> 2 <tb> <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0,8 <tb> c) dosage de la tobramycine dans le sérum : comme pour bien des dosages il faut avant tout tracer une courbeétalon. Pour cela dans des échantillons de sérum de 1 ml, sont introduites des quantités croissantes de tobramycine de 10 3 a 0,1 mole (0,5 à 50 g). Dans chaque tube, 50 l d'une solution d'#ATP à 7,11 mg/ml (soit un excès de 5 pour l'échantillon le plus concentré en antibiotique) sont ajoutés. 5.10 2 unités enzymatiques sont alors ajoutées. Après 10 mn d'incubation, chaque échantillon est déposé sur une petite colonne contenant 100 mg de résine CG50 NH3. Après rinçage à l'eau distillée, chaque colonne est éluée avec 2 ml de tampon phosphate de potassium 1M pH=7. Cet éluat est introduit dans la cellule de lecture du fluorimètre. La longueur d'onde d'excitation est réglée à 303 nm et la longueur d'onde d'émission à 420 nm. On opère de la même façon quelle que soit l'aminoglycoside à doser. En se rapportant à la courbe-étalon, il est facile de déterminer la concentration en antibiotique, connaissant l'intensité de fluorescence. Des expériences de dosage réalisées en aveugle ont ainsi permis de déterminer des concentrations de 4.10 à 10 3 pmole/ml(30 à 1 pg/ml)avec une erreur inférieure à 10 10-3 mole/ml. La courbe-étalon ainsi que les dosages réalisés en aveugle,montrent que la méthode est très précise et particulièrement reproductible. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement a ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit au technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims: REVENDICATIONS 10- Procédé de dosage des aminoglycosides, carac térisé en ce que l'on effectue la modification de l'aminoglycoside à doser, par des réactions enzymatiques spécifiques et contrôlées à l'aide de cofacteurs fluorescents et d'enzymes choisies parmi celles ayant pour substrat des aminoglycosides possédant le cycle "désoxystreptamine", et en ce que l'on effectue la lecture de l'intensité de la fluorescence du produit ainsi obtenu. 20- Procédé selon la Revendication 1, caractérisé en ce que les cofacteurs mis en oeuvre sont des cofacteurs fluorescents, analogues des nucléotides triphosphates pos sédant le noyau adénine ou le noyau cytosine. 30- Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 et 2, caractérisé en ce que les enzymes mises en oeuvre pour modifier les aminoglycosides sont des nucléotidyltransférases. 40- Procédé selon la Revendication 3, caractérisé en ce que les nucléotidyltransférases mises en oeuvre sont choisies parmi les 4'aminoglycosidenucléotidyltransférases (ANT(4')) qui catalysent l'adénylation de la fonction alcool en 4' du cycle purpurosamine des aminoglycosides. 5 - Procédé selon la Revendication 3, caractérisé en ce que les nucléotidyltransférases mises en oeuvre sont choisies parmi les 2 "aminoglycosidenucléotidyîtransférases (ANT(2")) qui catalysent i'adénylation de l'hydroxyle en 2" du cycle garosamine ou kanosamine des aminoglycosides. 60- Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les enzymes d'inactivation des aminoglycosides sont stabilisées par immobilisation sur support soluble. 70- Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les enzymes d'inactivation utilisées le sont sous forme d'extrait brut. 80- Procédé selon-les Revendications 1 et 6, carac térisé en ce que la stabilisation par immobilisation a été réalisée par réticulation avec le glutaraldéhyde sur un support soluble du type dextrane. 90- Procédé selon la Revendication 8, caractérisé en ce que l'immobilisation est effectuée en procédant tout d'abord à l'absorption de l'extrait enzymatique sur le support, en réticulant ensuite par le glutaraldéhyde à 25 t environ dans l'eau,et en finissant par une opération de congélation et décongélation. 100- Procédé selon l'une quelconque des Revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la solution contenant l'enzyme immobilisée est conservée sous forme lyophilisée. 11 - En tant que réactif nécessaire dans le procédé pour le dosage des aminoglycosides selon l'une quelconque des Revendications 1 à 10, les éthénonucléotidemonophosphates des aminoglycosides, ±NMP-aminoglycosides. 12 - En tant que réactif nécessaire dans le procédé de dosage des aminoglycosides selon l'une quelconque des Revendications 1 à 10, les nucléotidyltransférases dtinac- tivation immobilisées sur support soluble obtenues selon l'une quelconque des Revendications 8 à 10.

Inventors: LE BIGOT, JEAN-FRANCOIS, LE GOFFIC, FRANCOIS, SICSIC, SAMES, Le Bigot, Jean-François, Le Goffic, François
Applicants: ANVAR AGENCE NATIONALE DE VALORISATION DE LA RECHERCHE
Application year: 1980
Main classification: G01N33
IPC codes: C12Q1, G01N33