METHOD OF DETERMINING GAMMA-GLUTAMYL TRANSPEPTIDASE

Abstract: 1. Process for quantitatively determining gamma-glutamyltranspeptidase by means of a lyophilized salt of gamma-glutamyl-p-nitranilide with an acid, which process comprises dissolving that salt in a buffer, adding the sample containing the gamma-glutamyltranspeptidase and determining the amount of p-nitraniline set free.

Description: Substrat zur Bestimmung der y-Glutamyltranspeptidase Die Erfindung betrifft ein Substrat zur Bestimmung der y-Glutamyltranspeptidase in wässrigen Systemen, vor allem in biologischen Flüssigkeiten, insbesondere in Blutserum. Es findet hauptsächlich Verwendung zur Erkennung und Verlaufsdiagnose von Lebererkrankungen. Die Bestimmung der y-Glutamyltranspeptidase (y-GT) Aktivität erfolgt nach dem bekannten Reaktionsschema: y-Glutamyl-p-Nitranilid + Glycylglycin EMI1.1 p-Nitranilin + Glutamylglycylglycin. Die Freisetzung des gelbgefärbten p-Nitranilins kann optisch verfolgt werden. Sie ist ein direktes Mass für die vorhandene y-GT-Aktivität. Der Vorzug des einfachen Nachweises des Nitranilins ist z. Zt. mit dem Nachteil verknüpft, dass das Substrat y-Glutamyl-p-Nitranilid in wässrigen Lösungen mit pH-Werten,wie sie bei der Bestimmung der y-GT eingehalten werden müssen, sehr schlecht löslich ist. Dies ist u.a. aus den Patentanmeldungen DE-OS 20 42 829 und DE-OS 22 59 512 bekannt. Man hat schon mehrfach versucht, dieses Problem zu lösen. So wurde das Substrat beispielsweise in verdünnter Salzsäure oder in organischen Lösungsmitteln in hoher Konzentration vorgelöst und in dieser Form den Bestimmungsansätzen zugefügt, wodurch eine starke Verschiebung des pH-Wertes vermieden wird. Zu dem Nachteil dieser wenig eleganten Methode'kommt noch die Instabilität des Substrates hinzu, die in stark saurem, wässrigen Milieu beobachtet wird. Daher sind solche Lösungen nur kurzfristig für Messungen einsetzbar. Gemäss einem anderen bekannten Verfahren wird das y-Glutamyl-p-Nitranilid bei einer Temperatur zwischen 50 und 60 C aufgelöst und danach auf Zimmertemperatur abgekühlt. Auch hierbei besteht die Gefahr der spontanen Hydrolyse der chromophoren Gruppe. Weiterhin ist das Auflöseverfahren zeitraubend und häufig wegen der Rekristallisation des Substrates ohnehin nicht erfolgreich. Solche Methoden sind für die routinemässige Anwendung des Testes in klinischen Laboratorien unbefriedigend, so dass die Aufgabe bestand, die damit verbundenen Nachteile zu beseitigen. Das Substrat y-Glutamyl-p-Nitranilid soll bei der für die Durchführung der Bestimmung einzuhaltenden Temperatur von etwa 250C ausreichend gut löslich sein. Erfindungsgemäss wurde nun gefunden, dass sich trockenes y-Glutamyl-p-Nitranilid, vorzugsweise als Lyophilisat, im Testpuffer bei 20 bis 250C nahezu augenblicklich auflöst, wenn das Substrat protonisiert, das heisst als Salz vorliegt. Dies bedeutet, dass das y-Glutamyl-p-Nitranilid vor der Trocknung mit einer Säure im stöchiometrischen Verhältnis oder im Überschuss zu den Basenäquivalenten versetzt wird. Gegenstand der Erfindung ist demnach eine trockene Zubereitung des y-Glutamyl-p-Nitranilids zur Verwendung als Substrat zur Bestimmung der y-GT, gekennzeichnet durch den Gehalt einer Säure in mindestens molarem Verhältnis zu dessen Basenäquivalent. Da.zudem gefunden wurde, dass das Reagenz auch nach, Wiederauf lösung eine bessere Farbstabilität besitzt, wenn es mit einem quaternären Polykation versetzt wird, gehört es zum Gegenstand der Erfindung, dass die trockene Zubereitung gegebenenfalls mit einem solchen hochmolekularen Lösungsstabilisator versetzt ist. Im engeren Sinne gehört es zum Gegenstand der Erfindung, dass als Substrat für die Bestimmung von y-Glutamyltranspeptidase die Ammoniumsalze des y-Glutamyl-p-Nitranilids gegebenenfalls mit einem überschuss an Säure verwendet werden. Als Säuren, die hierfür in Frage kommen, sind praktisch alle organischen oder anorganischen Säuren zu nennen, die ein Ammoniumsalz des y-Glutamyl-p-Nitranilids zu bilden vermögen, z.B. Schwefelsäure, die Phosphorsäuren, alle Halogenwasserstoff-Säuren, Oxyhalogenwasserstoff Säuren, Essigsäure und Trifluoressigsäure. Bewährt haben sich Kombinationen aus einer anorganischen und einer organischen Säure wie Di-, Tri-, Tetra-Carbonsäuren beziehungsweise -Hydroxycarbonsäuren, beispielsweise Malonsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Pimelinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäuren, Weinsäuren, Citronensäure, Ascorbinsäure, Glucuronsäure. Vorzugsweise wird eine anorganische Säure, z.B. Salzsäure, in Kombination mit einer organischen Säure, z.B. Weinsäure, verwendet. Bezogen auf ein Basenäquivalent des Nitranilids ist das Verhältnis von etwa 0,9 Squivalenten der anorganischen Säure und etwa 0,1 Äquivalentn der organischen Säure besonders günstig. Zur Herstellung des Substrates eignen sich alle gängigen Methoden der organischen Chemie zur Herstellung von Ammoniumsalzen von primären Aminen. Ein Überschuss der Säuren ist so lange nicht schädlich, so lange das Substrat ohne Nachteile gefriergetrocknet werden kann und das wiederaufgelöste Substrat die Kapazität des Testpuffers nicht überschreitet. Am einfachsten geht man von einer wässrigen Lösung des Y-Glutamyl-p-Nitranilids aus, stellt das stöchiometrische Verhältnis des Anilids zu einer Säure fest, versetzt die Lösung mit der betreffenden Säure in dem gewünschten Verhältnis, gegebenenfalls mit einem Überschuss von ca. 20 % und trocknet das Produkt, vorzugsweise durch Gefriertrocknung. Ein anderer sehr einfacher Weg zur Herstellung der erfindungsgemässen Zubereitung ist, die wässrige Lösung des Nitranilids mit der gewünschten Säure anzusäuern, wonach die Trocknung durchgeführt werden kann. Der wesentliche Vorteil des erfindungsgemässen Trockenproduktes besteht darin, dass es hierbei zu keiner nennens werten }hydrolyse vor dessen Verwendung im Test kommt und demgemäss eine Störung durch einen Leerwert hoher optischer Extinktion ausbleibt. Eine Verbesserung der Substrateigenschaft wird, wie bereits erwähnt, dadurch erreicht, dass dem Substrat ein quaternäres Polykation in einer Konzentration von 0,1 100 mg/ml Testlösung zugesetzt wird. Dieser Befund ist überraschend, da es bekannt ist, dass übliche kationische bzw. anionische Detergenzien die y-Glutamyltranspeptidase Aktivität hemmen bzw. vermindern. Demgegenüber beeinflus sen quaternäre Polykationen auf Basis von Polyvinylpyrrolidon die Enzymaktivität nicht messbar. Den gleicher Effekt zeigen äthoxylierte Alkylphenole oder äthoxylierte Phenole 5 owie Tetrafluoräthylen-Polymerisate mit verzweigten Perfluorgruppen. Diese Polymerenverzögern einzeln oder in Kombination die Rekristallisation des r -Glutamyl-p-Nitranilids bei Raumtemperatur. Das gegebenenfalls mit dem Polymeren versetzte Salz des -Glutamyl-p-Nitranilids wird in fester Form zur Verfügung gehalten. Dies kann in Trockenabfüllungen oder in Tabletten verpresst geschehen. Weitere Verbesserungen hinsichtlich der Stabilität des Produktes werden erreicht durch übliche Zuschläge bei der Gefriertrocknung von Produkten wie Gelatine oder Gelatine-Hydrolysaten, Zuckeralkoholen oder Kohlenhydraten, Pufferkomponenten, Konservierungsmitteln und/oder Lösungsvermittlern. In der bevorzugten Form wird Mannit verwendet in einem Konzentrationsbereich von 1 - 50 mg/ml. Auch das in die Reaktion der Transpeptidase eingehende Glycylglycin kann in der trockenen Zubereitung bereits enthalten sein, so dass für den Test lediglich das Substratgemisch in Wasser aufgelöst werden muss, wonach das Enzym bestimmt werden kann. Das folgende Beispiel soll die Erfindung näher erläutern. Beipiel Das erfindungsgemässe Substrat wird wie folgt hergestellt: a) Substratkomtonenten 1) 1,17 g y-Glutamyl-p-nitranilid (1,176 g/1000 ml = 4,4 mM) 2) 8,7 g Glycylglycin 3) 16 g Mannit 4) 10 g Kalium-Natrium Tartrat . 4 H2O 5) 40 g Quarternäres Polyamin 6) 2 n HCl bis pH 2-3 7) dest. Wasser EMI6.1 1 Liter Die Komponenten 1 - 5 werden in ca. 600 bis 700 ml dest. Wasser aufgenommen, auf etwa 400C erwärmt und mit der Komponenten 6 bis zu einem pH-Wert zwischen 3 und 4 versetzt. Nach vollständiger Auflösung aller Substratkomponenten wird die Lösung auf etwa 20 C abgekühlt und der pR-Wert mit 2 n Hol (6) auf 2 bis 3 eingestellt. Die Lösung wird schliesslich mit destilliertem Wasser (7) auf 1,0 Liter aufgefüllt. Es hat sich als zweckmässig erwiesen, die Bestimmung der y-Glutamyltranspeptidase mit 2 ml dieser Substratlösung durchzuführen, so dass man hierfür Abfüllungen von 2 ml herstellt und anschliessend gefriertrocknets Für die Durchführung des Testes wird das gefriergetrock- nete Produkt mit der Pufferlösung b) wiederaufgelöst. b) Pufferlösunq 8) 24 g Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan 9) 5 g Natriumazid werden in etwa 800 ml dest. Wassers gelöst, mit 2 n HCl auf pH 9,2 bis 9,5 eingestellt und mit dest. Wasser auf 1,0 Liter aufgefüllt. Wird das lyophili sierte Substratgemisch nach a) mit 2 ml Pufferlösunq der erwähnten Zusammensetzung,versetzt, stellt sich ein pH-Wert von etwa 8,2 ein.

Claims: Patentansprüche: 1. Trockene Zubereitung des y-Glutamyl-Nitranilids zur Verwendung als Substrat zur Bestimmung der y-Glutamyltranspeptidase, gekennzeichnet dadurch, dass sie eine Säure in mindestens molarem Verhält nis zum Basenäquivalent des Nitranilids und ge gebenenfalls einen Lösungsstabilisator enthält. 2. Zubereitung gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, dass der Lösungsstabilisator ein quaternäres Polykation auf der Basis von Polyvinylpyrrolidon, einem äthoxylierten Alkylphenol, einem äthoxylier ten Phenol oder einem Tetrafluoräthylen-Polymerisat mit verzweigten Perfluorgruppen ist. 3. Zubereitung gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, dass der Lösungsstabilisator in einer Konzentra tion von 0,1 - 100 mgtml Testlösung vorliegt. Patentansprüche für Österreich: 1. Verfahren zur Herstellung einer trockenen Zuberei tung des y-Glutamyl-Nitranilids zur Verwendung als Substrat zur Bestimmung dery-Glutamyltranspeptia'ase, dadurch gekennzeichnet, dass man dem Nitranilid eine Säure in mindestens molarem Verhältnis zum Basen äquivalent und gegebenenfalls einen Lösungsstabilisator zusetzt. 2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Lösungsstabilisator ein quaternäres Poly kation auf der Basis von Polyvinylpyrrolidon, einem äthoxylierten Alkylphenol, einem äthoxylierten Phenol oder einem Tetrafluoräthylen-Polymerisat mit verzweigten Perfluorgruppen ist. 3. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Lösungsstabilisabr in einer Konzentration von 0,1 - 100 mg/ml Testlösung vorliegt.

Inventors: HEBER, HELMUT, DR., KOHL, HELMUT, DR.
Applicants: BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT
Application year: 1980
Main classification: C12Q1
IPC codes: C12Q1