ADHESIVE COMPOSITION FOR DEPOSITING AN ADHESIVE COATING ABLE TO FIX BIOFUNCTIONAL MOLECULES, COATING OBTAINED AND PROCESS FOR ITS PREPARATION, SUBSTRATE COVERED WITH THE COATING AND ITS USE AS A BIOCATALYST

Abstract: Acrylic acid-based photopolymerisable adhesive composition containing a copolymerisable monomer having a function capable of fixing biofunctionnal substances. This composition provides coatings adhering on mineral or organic supports which are appropriate for use, after irradiation, as biosorbants and, after fixing of biofunctionnal molecules, as biocatalysts.

Description: COMPOSITION ADHESIVE POUR LE DEPOT D'UN REVETEMENT ADHESIF FIXATEUR DE MOLECULES BIOFONCTIONNELLES Et REVETEMENT OBTENU AU MOYEN D'UNE TELLE COMPOSITION Domaine technique La présente invention concerne le danaine des produits synthétiques biologiquement actifs et, plus particulièrement, celui des substrats dont la surface possède une activité biologique, notamment enzymatique ou autre. Des travaux oonsidérables ont été effectués ces dernières années pour mettre au point des matériaux, sous forme divisée ou non, dont la surface permet de fixer, de faucon permanente ou temporaire, des molécules biologiquement actives. Par "molécules biologiquement actives" on entend, en général, des molécules qui ont un rôle à jouer dans les processus chimiques dont dépendent les êtres vivants. Parmi de telles substances ont peut citer les enzymes, les inhibiteurs d'enzymes, les ferments, les hormones, les antigènes, les anticorps, les inhibiteurs biologiques, l'héparine, les lectines, etc... Ces molé- cules présentent généralement un ou plusieurs sites réactifs spécifique de telle ou telle réaction ou processus particulier et, par extension, on désignera également dans la présente description par le terme de molécules biologiques ou biofonctionnelles les substances d'origine synthétique ayant un comportement analogue, et pouvant fonctionner tomme biocatalyseurs, biosorbants, etc... Ainsi, de tels matériaux supports contenant une substance biofonctionnelle peuvent agir, vis à vis d'un substrat, comme le ferait la- substance biofonctionnelle elle-même à l'état libre; cependant, à la fin de la réaction, de tels matériaux peuvent généralement être isolés du milieu réactionnel par les moyens habituels sans difficultés particulières alors que ce n'est pas nécessairement le cas pour une substance biologiquement active à l'état libre. Un exemple particulièrement oonnu de tels matériaux biologiquement actifs est celui des résines recouvertes ou imprégnées d'une enzyme; ces matériaux, une fois activés, sont mis en présence d'un substrat à modifier biochimiquement de manière qu'une réaction enzymatique entre celui-ci et la couche active du matériau s'effectue. Une fois la réaction terminée, le matériau actif est séparé du milieu de réaction par les moyens habituels et il peut être réutilisé généralement sans autre ou, si besoin est, son activité peut être restaurée par un traitement de régénération apEproprié. Ainsi, lorsque de telles substances biofonctionnelles sont fixées à un support inerte et que, dans cet état, elles peuvent agir sur un substrat à transformer, on les appelle souvent du nom de "biocatalyseur". De façon analogue un "biosorbant" est un substrat sur lequel on a fixé des molécules biofonctionnelles capable de capturer une substance que l'on désire séparer d'un mélange. Etat de la technique Parmi les publications récentes les plus marquantes dans ce du- ne on peut citer, à titre d'exemple, les documents suivants 1. Pellicular Immobilized enzymes par C. Horwath, Biochim. & BR< Biophys. Acta 338 (1974), 164-177. Cette référence souligne les avantages résultant de l'utilisation de pellicules minces d'un substrat contenant une enzyme par rapport à l'utilisation d'une enceinte rem- plie de particules d'un tel substrat à l'état divisé, par exemple colonnes chargées de particules de résine contenant des enzymes ifr mobilisées dans la masse de celle-ci. En effet, 1' action d'un tel substrat sur une solution avec laquelle il est en contact est essentiellement de nature superficielle et l'emploi de pellicules minces de matière active déposée sur un support rigide est avantageux pour des raisons évidentes d'économie de matière et de stabilité mécanique. Cette référence indique, notamnent, que les matières en couches minces déposées sur un support rigide, une bille de verre par exemple, activées par des enzymes peuvent être classées dans trois catégories principales, à savoir a) l'enzyme est immobilisée dans une matrice à consistance de gel, l'enzyme étant liée au gel avant ou après le débit de celui-ci sur le support. b) Le substrat oonsiste en une couche micro-poreuse formes, par exemple, d'un absorbant minéral ou organique (silice, alumine, carbone, nylon poreux, etc...) et l'enzyme est fixée sur ce substrat par couplage ou par réticulation à la surface de celui-ci, (voir éga lement USP 4,025,669) c) Le substrat pelliculaire minéral organique est macroporeux (pores de l'ordre de 100-200 nm) il est possible de l'imprégner par une solution d'un couple ("conjugate)" enzyme-polymère après quoi on fait évaporer ce solvant de façon que ledit couple se dépose sur le substrat. Dans un tel cas, le système comporte donc, dans son ensemble, trois phases distinctes (i) un support inerte (bille de verre) recouvert (ii) d'un premier substrat (par exemple, polymère inerte macroporeux), la surf ace des pores de celui-ci étant elle mêzne (iii) recouverte d'une couche d'un autre polymère contenant l'enzyme. Par ailleurs, la même référence décrit, dans le cadre des matériaux de la catégorie (b) ci-dessus, une méthode pour revêtir des billes de verre au moyen d' une solution d' un polymère riche en grou- pe -COOH (un copolymère d'anhydride maléique et d'éther méthyl-vinylique) et, après séchage, pour activer cette pellicule de polymère par contact avec des solutions aqueuses d'enzymes telles que trypsine, cwmotrypsine, protéase, ribonucléase, papaine, etc... 2. Les brevets français Nos 2.028.702 et 2.035.774 décrivent la fixation de molécules biologiquement actives, telles que des enzymes, antigènes, allergènes, hormones, etc., sur des supports organiques ou minéraux tels que cellulose, amidon, diginates, collagène, polysilanes, résines polyacryliques, verre, métal, etc., en utilisant des agents de pontage, tels que apposés diazo, époxides, carbodiimides, chlorure de sulfonyle et dialdéhydes, le glutaraldéhyde par exemple. Le glutaraldéhyde agit également c nme réticulant de telles molécules biologiquement actives. Une méthode similaire est aussi décrite dans l'article suivant : Preparation and Properties of Urease Chemically Attached to Nylon Tubes par P.V SUNDARAM et al, FEBs letters 10 5 , 325 (1970), ainsi que dans la publication de demande de brevet allemand DOS 2.636.206. 3. Le brevet d'Allemagne de l'Est No 106.856 ¯0CA 82, 82332q) décrit la fabrication d'un gel de polyacroléine dans lequel on a incorporé, par mélange, de l'uréase. 4. Le brevet .16P 3 844 892 (CA, 82 82328 t) décrit l'immobili- sation de la glucose oxidase par réaction avec un copolymère époxydique obtenu par copolymérisation de nitriles acryliques et d'esters époxyacryliques. La fixation de 1' enzyme se fait donc 1 par réac- tion de celle-ci avec le groupe oxirane du copolymère. 5. La demande de brevet japonais Kokai 75/10.585 (CA 83, 159962 a) décrit la polymérisation d'un mélange d'asparaginase, d'acrylamide, de stabilisateur et d'initiateur de polymérisation, le tout déposé, sous forme d'une couche mince, sur la paroi d'un tube de verre. 6. La demande de brevet japonais Kokai 75/70.584 C 83, 159 963 b) décrit également un film de polymère dans lequel est noyée une enzyme. Ce polymère est constitué d'un mélange de l'enzyme (aminoacylase) avec de l'acrylamide, du N,N'-méthylène-bis-acrylamide, du o -aminopropionitrile et du K2S2O7 qu'on a déposé et fait polymériser sur un support hydrophile fritté. 7. La demande de brevet japonais Kokai 76/63.985 CN 85, 107 494 w) décrit la formation d'un copolymère similaire à celui mentionné au point (5) ci-dessus et son utilisation pour d¯composer 1' aci- de aspartique d'une solution sanguine qu'on fait circuler au contact de ce copolymère actif. 8. La demande de brevet japonais Kokai 77/145,592 C > N 88, 117 050 z) décrit la préparation d'un film de nitrocellulose contenant une enzyme, ce film étant obtenu par adjonction de l'enzyme à une solution de polymère dans un solvant organique, puis dépôt du mélange sur un support réticulé en nylon et séchage du revêtement ainsi obtenu. Certaines méthodes font appel à des procesus de photopolyméri- sation; ainsi : 9. La demande de brevet allemand DOS 2.305.320 (CA 80, 24327 q) décrit l'incorporation d'enzyme (urease) à du poly(2-hydroxyéthyl)- métacrylate puis le dépôt de ce mélange sur un support de polyéthylène, le durcissement de ce dépôt par irradiation (UV) et la protection de ce dzpôt par une nouvelle couche de poly-(2-hydroxyéthyl)-mé- thacrylate de manière à fournir un film enzymatiquement actif et stable au stockage. 10. A. TANAKk et al, J. Ferment. Technol. 1977, 55 (1), 71-5 décrivent le piégeage d'enzymes ou de cellules microbiennes par des résines photoréticulables, telles que le diméthacrylate de polyéthy- lène glycol. 11. La demande de brevet japonais Kokai 77/151.788 o > N 88, 117 046 c) décrit le piègeage d'enzymes dans une dispersion de résine photodurcissable. Suivant cette référence, on mélange une résine ob tenue à partir de polyéthylèneglycol, de 2-hydroxyéthylméthacrylate et de xylène diisocyanate avec une poudre de diatomées et un rtwr to-initiateur , puis on ajoute une solution aqueuse d'enzyme (invertase) et on irradie le mélange au moyen d'une lampe W de manière à obtenir une masse enzymatiquement active. 12. La demande de brevet japonais Kokai 77/143.279 décrit la mise en suspension d'une protéine biologiquement active dans une résine photosensible liquide contenant un photosensibilisateur hydrosoluble, le tout étant ensuite émulsifié dans une phase aqueuse et irradié de manière à réaliser le piègeage ("immobilisation") de lar dite protéine par photopolymérisation des particules de résine contenant celle-ci. 13. La demande de brevet japonais Kokai 77/143.282 (CA 88, 117048 e) décrit une méthode suivant laquelle on irradie, par rayonnement UV, un mélange d'une enzyme et d'une résine photopolymérisable, ce mélange étant préalablement utilisé pour imprégner un support poreux, par exemple un réseau de fils textiles, le tout formant alors une bande souple recouverte d'une pellicule enzymatiquement active. 14. Dans la demande de brevet japonais Kokai 75/78.641 (CA 84, 3309 c), on décrit le mélange d'une enzyme en solution aqueuse (glucose isomérase) et d'un monomère acrylique photopolymérisable puis la transformation, par irradiation W de ce mélange, en une poudre de polymère contenant, "immobilisée", l'enzyme sous forme active. 15. Dans la demande de brevet japonais Kokai 78/34.984 ( 89, 19234 p), on décrit une méthode suivant laquelle on mélange une en zyme ( ss -Glucosidase) avec une solution aqueuse de gélatine et d'un monomère photoréticulant fixateur de l'enzyme (le 4,4'-diazidostil bène-2,2'-disulfonate), puis on dépose un film de oe mélange (50 m) sur une plaque de verre et on irradie le tout afin de préparer un film enzymatiquement actif. Les références suivantes concernent la préparation de matériaux de forme divisée dont les particules sont recouvertes d'une préparation biologiquement active, les molécules actives étant généralement fixées au substrat par pontage. 16. Le brevet USP 4,070,246 (CA 88, 117052 b, 1978) décrit un procédé suivant lequel on met en suspension une poudre métallique dans un mélange aqueux d'acide praminobenzolque et de formaldéhyde, après quoi on filtre la poudre enrobée du polymère résultant de la condensation de ces osmposés, on soumet oelle-ci à une diazotation et on fait copuler le substrat ainsi diazoté avec une enzyme de manière à fixer celle-ci sur le polymère. 17. Dans le brevet USP 4,071,409 (CA 88, 117053 c, 1978), on décrit le- traitement d'un substrat tel que la silice ou le rutile en poudre par un di-isocyanate, ce dernier servant en I'occurence de pont pour la fixation, sur le substrat, d'une enzyme telle que la papaïne. 18. Le brevet USP 4,072,566 (CA 88, 117054 d) divulgue une méthode suivant laquelle on adsorbe de la pphénylènediamine sur des particules de verre poreux, on diazote l'amine aromatique et on fait copuler le produit diazoté avec de la papaine. 19. Le brevet USP 4,007,089 (CA 86, 116834 a) décrit l'utilisation de 1-N (2-nitro-4-azidophényl) -6N' (4, 6-dichîoro-triazinyl) -dia- minohexane pour ponter des enzymes et des anticorps sur des supports organiques non solubles dans l'eau, le groupement azido se transformant en groupe nitrène par irradiation W et se fixant au support tandis que le groupe triazinyl se lie à la molécule protéinique enzymatique. 20. La demande de brevet japonais Kokai 76/31.689 (CA 85, 47 837 y) décrit le traitement de substrat hydroxylés (par exemple si- licagel) par des aminosilanes et des polymères contenant des groupe pes dinitrobenzène-pyridinium afin de rendre ces substrats aptes à fixer des enzymes de façon stable. 21. Le brevet français No 2.235.133 (CA 83, 74687 q) décrit la fixation d'enzymes (aminotransférase) sur des films ou fibres de collagène par activation préalable au HC1 puis pontage par traitement au moyen d'hydrazine en présence d'acide nitreux. 22. La demande de brevet allemand DOS 2.323.422 décrit la préparation de copolymères de méthacrylate de 2-hydroxyethyle et de diméthacrylate d'éthylène-glycol contenant, liés de manière covalente, des molécules biologiquement actives telles que, respectivement, des inhibiteurs d'enzymes, des enzymes, des antigènes, des anticorps, etc... Des résines particulaires constituées par de tels polymères fournissent des charges actives permettant de fixer, par contact avec leurs solutions, les substances conjuguées de celles qui sont fixées sur ledit polymère, à savoir, respectivement, des enzymes, des inhibiteurs d'enzymes, des anticorps des antigènes, etc... Outre les pontages chimiques réalisés par les méthodes mentionnées ci-dessus, on peut citer la fixation des enzymes sur des s ports par des méthodes de greffage faisant intervenir des radiations plus ou moins énergétiques. Ainsi : 23. H. EARKER et al, Proc. Int. Congr. Catal., 6th 1976, Publ. Chem. Soc. Letchworth, Engi., ( 87, 196426 g) décrivent le greffage sous irradiation de monomètres, tels que le p-nitrostyrène, sur des supports tels que les polyoléfines et le PVC, le groupe N02 étant ensuite converti en isothiocyanate, un groupe fixateur d'enzymes (trypsine). Comme type possible de sources d'irradiation, la référence cite les rayons , un faisceau d'électron et les UV. 24. Dans l'article de A.S. HOFFMAN et al, Trans., Am. Soc. Artif. lntern. Organs. 1972, 18, 10-18, il est indiqué qu'on a pu greffer, par irradiation # sur des supports de caoutchouc silicone, des hydrogels de photopolymères contenant du méthacrylate de 2-hydroxyethyle et de la N-vinyl-pyrrolidone, ce greffage étant réalisé directement ou par l'intermediaire d'acide E -aminocaproique. Ces hydrogels ont ensuite permis de fixer chimiquement des molécules biologiques telles que l'albumine, l'héparine et la streptokinase, le tout constituant des substrats biologiquement actifs. 25. De même, A.S. H0FFMAN et al dans Am. Chem. Soc. Div. Org. Coat. Plast. Chem. Pap. 1974, 34 [î3 , 568-73 passent en revue les méthodes connues permettant de fixer, par les techniques d'irradiai tion, des polymères hydrophiles sur des supports inertes, des molécules biologiquement actives pouvant ensuite être fixées chimiquement sur les groupements -0H, -CDOH, etc. libres de ces polymères hydrophiles. 26. De telles méthodes sont également décrites par A.S. H0FF- dans les références suivantes : Polym. Prepr. Amer. Chem. Soc., Div. Polym. Chem. 1972, 13 [2], 740-6 et 723-8; USP 3,826,678. Un perfectionnement dans la réalisation de polymères aptes à fixer des molécules biologiquement actives consiste, non pas à immobiliser celles-ci par piègeage dans la masse du polymère ou à les greffer sur un substrat donné, mais bien à préparer un copolymère entre un monomère de base assurant la formation de l'assise proprement dite du copolymère et un autre manière lié à une molécule biologiquement active ou porteur d'un groupe réactif apte à fixer, ultérieurement, une molécule biologiquement active, cette liaison étant réalisée, soit directement, soit par l'intermédiaire d'une channe additionnelle (spacer) permettant de maintenir la molécule active à une distance choisie du substrat; cette distance est généralement adaptée de manière que les de' placements des portions de molécules mises en jeu pendant la réaction biologique ne soient pas entravés par la trop grande proximité de ce substrat. 27. Le brevet français 2.212.340 décrit ainsi une méthode suivant laquelle on polymérise ou copolymérise un monomère porteur d'une enzyme en présence d'un réticulant et d'un initiateur, l'enzyme fixée étant, par exemple, l'uréase, l'amylogluoosidase, la glucose oxida se, la fumarase, l'aspartase et la pénicilline aspartase. 28. Dans la demande de brevet allemand DOS 2,426,988, on décrit la fixation d'enzymes à des substrats par liaison covalente en faisant copolywriser un polysaccharide activé et un monomère, celui-ci possédant un groupement susceptible de se lier à une enzyme. on décrit également, en variante, la fixation d'une enzyme à un copoly- mère par réticulation de celui-ci au moyen d'un agent réticulant auquel on a préalablement fixé ladite enzyme. I1 est utile à ce stade de donner quelques précisions sur les applications des substrats biologiquement actifs, notamment lorsque ceux-ci se présentent sous formes de couches minces sur des supports minéraux ou organiques. Une des applications majeures de tels substrats est constituée par l'analyse autanatique de certains fluides biologiques dont un exemple type est représenté par le dosage de glu cose dans le sang et le sérum. L'échantillon à analyser est mis en circulation, après dilution appropriée et dialyse éventuelle, dans un circuit oanprenant, en tant qu'élément réactif, un tube ou une batterie de tubes dont la paroi interne est recouverte d' un revêtement enzymatiquement actif vis à vis de la solution à analyser. A la sortie dudit élément, les produits de la réaction entre la sol tion et le revêtement sont analysés par les méthodes habituelles, par exemple par spectrophotométrie en continu. L'élément actif d'un tel dispositif d'analyse doit donc conserver intactes, avec le temps, ses propriétés enzymatiques et, de plus, posséder une spécificité et une stabilité suffisantes pour garantir la reproductibilité des résultats au cours d'une période prolongée de travail. Par ailleurs, l'activité spécifique du revetement actif doit être élevée pour que l'élément actif ne soit pas trop encanbrant au point de vue de ses dimensions. L'état de la technique dans ce domaine peut être illustré par les références suivantes 29. Open Tubular Heterogeneous Enzyme Reactors : C. HORtJATH et B.A. SOIN, Biotechnology & Bioengineering 14, 885-914 (1972). 30. L.P. LEON & al, Clin. Chem. 22/7, 1017-1023 (1976 > ; 23/9, 1556-1562 (1977). Au vu des références précitées, on peut conclure que, à l'heure actuelle, la technologie des revêtements enzymatiquement actifs en couches minces sur des supports rigides se résume aux procédés suivants A. Gels contenant, immobilisée, la molécule biofonctionnelle, Ces gels étant déposés, sous forme d'un revêtement sur un support. B. Substrats poreux déposés, sous forme d' une couche mince, sur un support et contenant l'enzyme à l'état adsorbé ou fixée de manière covalente. C. Support dont la surface elle-mêrae (généralement lisse ou nr gueuse) a été activée, soit chimiquement soit par irradiation, de manière à devenir apte à fixer l'enzyme, soit directement soit par l'intermédiaire d'un agent de pontage. D. Revêtement de résine polymère contenant l'enzyme, soit piégée dans la masse, soit fixée par liaison covalente. Dans tous les cas, les problèmes principaux liés à l'obtention de couches d'une efficacité satisfaisante sont les suivants. a) Surface de contact effective entre la solution à traiter et le substrat actif aussi grande que possible, d'oui bonne pénétration de ladite solution dans le revêtement actif; porosité élevée des gels ou substrats poreux; faculté de gonflement des matrices de résines polymères; hydrophilie suffisante des polymères utilisés. b) Spécificité déterminée dans la nature des sites récepteurs et fixateurs des molécules bioactives suivant les buts recherchés : obtention d1 un substrat d' activité biologique permanente ou extraction temporaire de substance active avec relargage ultérieur (purification d'enzymes ou chromatographie d'affinité). c) Possibilité d'utiliser la totalité ou presque de la masse active, certaines substances biofonctionnelles étant très onéreuses, d'où possibilité de produire des revêtements actifs dont seules les portions accessibles à la solution à traiter contiendront des molécules actives. d) Adhésion irréprochable du substrat actif sur son support. Or, a l'heure actuelle aucune des techniques connues ne permet de concilier simultanément ces exigences à un degré élevé. En effet, les gels et les substrats poreux sont difficiles à faire adhérer solidement à un support inerte et, par ailleurs, leur perméabilité et leur porosité sont difficiles à contrôler de manière à assurer une circulation libre et efficace entre les sites actifs et la solution à traiter. D'autre part, le traitement direct des supports par voie chimique ou par irradiation manque souvent d'efficacité (taux de fixation superficiel insuffisant); de plus, les irradiations très énergi ques (rayons lS ) peuvent avoir un effet destructeur sur lesdits supports. Par ailleurs, les méthodes actuelles manquent - de versatilité en ce sens que chaque cas particulier réclame une technique indivi duelle souvent très différente de ces oelle qu' exige un cas apparemment similaire et n'en différant que par un caractère d'aspect anodin. Ainsi, par exemple, il n'est pas possible, au moyen de techniques connues, de préparer une composition enzymatiquement active unique qui convienne à la fois au verre poreux et au poye'thylène lisse, c'est à dire qui puisse s'appliquer directement sur l'un de ces supports, au choix, sans traitement particulier propre à l'un ou l'autre de ces supports. Description de l'invention La présente invention remédie à ces inconvénients et met en oeuvre une technique à la fois simple et d'une très grande versatili té en ce sens qu'elle s'applique pratiquement à tous les supports envisageables et que, par des modifications mineures et facilement prévisibles, elle peut s'appliquer à l'obtention de substrats biofonctionnels en couche mince d'une variété pratiquement illimitée. Pour cela l'invention met en oeuvre une composition photo-adhésive (I). Cette composition est adhésive pratiquement vis à vis de la totalité des supports solides minéraux et organiques usuels : verre, céramiques, métaux, bois, résines artificielles, etc... c. à.d. tous supports pouvant être raisonnablement envisagés pour une telle application et, cela, sans qu'il soit nécessaire de procéder a un traitement particulier quelconque de la surface de ces supports. La cosnpositon de l'invention est à base d'acide acrylique; elle continent, bien entendu, (i) un photo-initiateur et, en outre, (ii) un agent activateur de pbotopolymérisation (pour permettre une photo-adhésion et un photo-durcissement rapide) et pranoteur d'adhésion (pour garantir une adhésion suffisante du revêtement photopolymérisé sur le support). La oomposition contient encore (iii) au moins un monomère ocxnprenant un groupement apte à fixer, par liaison directe avec celui-ci ou par l'entremise d'un pont intermediaire préalablement relié à ce groupement, une substance biologiquement active ou potentiellement biologiquement active. On entend par "potentiellement viologiquetment active" (par cw position à "directement ou cinétiquement active") une molécule normalement biofonctionnelle mais qui, dans certaines conditions, peut être inactivée, par exemple par couplage avec un inhibiteur ou par blocage de son ou ses sites bioactifs. Lorsqu' on a appliqué la oomposition photo-adhésive de l'inven- tion sur un support, on soumet le tout à une photo-irradiation, par exemple au moyen de rayons W, ce qui provoque la copolymérisation de l'acide acrylique, du monomère (iii) et d'autres substances copo- lymérisables éventuellement encore présentes dans la cmposition. On obtient ainsi un revêtement photopolymérisé (II) de résine hydrophile adhérant fermement aux supports minéraux ou organiques synthétiques ou naturels, superficiellement perméable à l'eau et gonflant en présence de celle-ci, cette résine contenant, à l'état oopolymé- risé, au moins un type de maillon apte à fixer, par liaison directe ou par 1' entremise d' un pont préalablement ou ultérieurement relié à celui-ci, une ou plusieurs substances macromoléculaires actives (ou potentiellement actives) et, cela, de façon stable et sans que l'activité réelle ou potentielle de cas substances soit sensiblement altérée ou modifiée. Bien entendu, un tel revêtement photopolyméri sé (II) fait également partie de l'invention de même que le sçort revêtu d'un tel revêtement. Une fois le revêtement photopolymérisé obtenu sur sai support, on peut y fixer les substances biologiquement actives, soit par contact direct avec celles-ci, soit par fixation préalable d'un pont intermédiaire (pi), dont l'extrémité libre oontiendra une fonction susceptible de fixer la substance biofonctionnelle, soit de manière permanente tcovalence), soit de manière temporaire (cpmplexation). Dans ce dernier cas, le pont intermédiaire sera considéré comme ligand spécifique de la molécule à capturer. Le revêtement photopoly mérité porteur de molécules biofonctionnelles (ou potentiellement biofonctionnelle) (III) fait également partie de l'invention, de même que le support recouvert d'un tel revêtement. Modes de réalisation et mise en oeuvre Lorsque les molécules biofonctionnelles ont été liées sur le substrat de l'invention, on obtient ainsi un produit bioactif (ou potentiellement bioactif) qu'on peut mettre en oeuvre dans les diverses applications auxquelles il est destiné. Par exemple, s'il s'agit d'un revêtement (III) porteur d'une enzyme, le substrat est mis en contact avec une solution de matières à traiter au moyen de cette enzyme, de manière que la réaction désirée s'effectue, en continu ou en discontinu. Puis on sépare le milieu réactionnel du substrat actif, on récupère celui-ci et on le réutilise autant de fois qu'on le désire. Suivant un autre exemple, s' il s'agit de la capture spé- cifique par catiplexation d'une molécule biofonctionnelle dans un me- lange de celle-ci avec d'autres substances, on procède comme ci-dessus au moyen du substrat (II), puis on sépare le substrat (III) chargé de ladite molécule et, par un traitement approprié, on provoque la scission du cariplexe et la libération de la molécule capturée. I1 est également entendu çe la présente invention s'etend à l'utilisation des revetements (II) et (III) canne agents actifs dans les réactions de transformation biochimiques propres aux substances biofonctionnelles fixées sur lesdits revêtements ou substrats. De tels ingrédients peuvent parfois être désignés sous le nan de "biocatalyseurs". Canme on l'a vu plus haut, la oomposition (I) de l'invention est à base d'acide acrylique. Ce monomère convient particulièrement bien car il donne aux copolymères qu'on en obtient des propriétés hydrophiles favorables et, de plus, il polymérise facilement et rapidement sous l'influence de photo-initiateurs convenables. Par contre l'acide méthacrylique n'est pas à recommander pour la comosi- tion (I) car il ne photopolymérise pas assez rapidement. Carne photo-initiateurs (i), on peut utiliser, dans la compo- sition (I) des cétones aromatiques habituellement utilisées carme photo-pranoteurs de polymérisation (voir par exemple le brevet USP 3,759,807). On peut citer, par exemple, la benzophénone, l'acétophé- none et les composés halogénés correspondants. On peut également utiliser des composés anthraquinoniques cxxnme la 2-éthyl-anthraquinoZ ne, l'acide anthraquinone-2-carboxylique, de même que d'autres photoinitiateurs tels que la benzine, le 2,5 diéthyl-aminophényl-l-oxyW 3,4-diazole et le sulfochlorure de naphtalène. Canme activateur de polymérisation et promoteur d' adhésion (ii), on utilise de préférence un acrylate ou Boéthacryla.e d'amino-aloool tel que le méthacrylate de dimethylaminoéthyle M). Cependant, on peut également utiliser des métacrylates d'autres amino-alcools, tels que le N-diethylaminoéthanol ou le N-éthyl-N-ter.butyl-aminoéthanol. L'utilisation de tels activateurs dans les asmpositions d'adhésifs est d'ailleurs, en soi, connue (voir brevet Français No 2.881.968 et demande suisse CH 9815/78). Outre 1' acide acrylique en tant que monomère de base du présent copolymère, la composition peut encore contenir d'autres monomères oléfiniques tels que l'acrylamide, des esters acryliques et métacry liques, des acrylates polyfonctionnels et des prépolymères acryliques. Les esters acryliques monofonctionnels et l'acrylamide peuvent être ajoutés dans le but de donner plus de liant et une viscosité plus adéquate à la composition adhésive et, en outre, de régler 1' hy- grophilie du copolymère après photodurcissement. Les quantités de tels adjuvants sont donc à faire varier par l'homme de métier, sui vant les besoins en fonction des propriétés à donner au copolymère envisagé. Parmi les esters qui peuvent être utilisés avantageusement, on citera les acrylates et méthacrylates d' alcoyles inférieurs (né- thyle, éthyle, propyle, butyle, isobutyle, tert.butyle, etc...), de dodécyle, d'éthyl-hexyle, de méthoxyéthyle, etc. Les acrylates poly- fonctionnels peuvent être utilisés pour donner plus de rigidité au présent cx)polymore suivant les besoins. Comme tels, on peut citer le triacrylate de triméthylol-propane (TMPTA), le triacrylate de pentaerythrite (PETRA) et le tetraacrylate correspondant (PETEA). Les prépolymères acryliques ou vinyliques peuvent être ajoutés en petite quantité à'la composition de l'invention lorsqu'on désire lui oonférer plus de souplesse et d'élasticité. Coeine tels prépolymères, on peut citer les composés connus sous les rsms ammerciaux de UVI THANE THIOKOL Corporation, EBECRYL (Union Chimique Belge). Par ailleurs, des polymères similaires sont décrits dans le brevet britannique No 1.430.422 et la demande de brevet allemand DOS 25.42.314. Les monomères (iii) possèdant une fonction réactive susceptible de lier, directement ou par l'intermédiaire d'un pont, des molécules bio-fonctionnelles sont extremement variés et peuvent être choisis, suivant les besoins, de cas en cas. De manière générale, il devront comporter une double liaison oléfinique (par exemple acrylique ou vinylique) et, lorsqu'il s'agit de fixer directement, par exanw ple, une grosse molécule peptidique (enzyme, inhibiteur d'enzyme, antigène, anticorps, etc...), un groupe fonctionnel susceptible de réagir avec, par exemple, un groupement amine de ladite molécule à capturer. Des composés contenant de tels groupes fonctionnels (agents acylants, groupes protecteurs, composés porteurs de "leaving groups") sont abondamment décrits dans la littérature consacrée aux synthè- ses de polypeptides. La plupart des nomères oléfiniques pourvus de tels groupes fonctionnels peuvent convenir à la présente invention. A titre d'exemple, on peut citer les composés suivant acrylate de N-hydroxys uccinimide, acr ylamido-caproate de N-hydroxysuccinimide, acrylate d'époxypropanol, acrylate de 2-isocyanato-éthy- le. De manière générale, d'autres monomères semblables, mais dans lesquels la double liaison et le groupe fonctionnel seront séparés par une chaîne hydrocarbonée d'une longueur supérieure à celle des monomères susmentionnés peuvent être avantageux dans le cas ai on désire donner plus de liberté à la molécule bio-fonctionnelle, c'est à dire à la maintenir, pour des raisons d'encombrement stérique, à une distance plus grande du substrat. De manière générale une telle chaine hydrocarbonée pourra avoir de 5 à 15 atanes de carbone. Lorsqu' il s'agit de fixer des molécules bioactives sur le substrat par l'entremise du monomère (iii) et par l'intermédiaire d'un pont intercalaire (pi), ledit monomère (iii) comporte, outre la double liaison, un groupe réactif susceptible de former facilement, avec un composé approprié, ledit pont intercalaire. Comme tels groupes réactifs on peut citer les groupes ZH, esters, H, -NH2, etc... En conséquence, camne mononères convenant à l'introduction de tels groupes, on peut citer le monoacrylate d'éthylène-glycol, 1' acryla- te du monoacétate de glycol, 1'acrylate de 2-aminoéthanol, l'anhy- dride maléique et d'autres monomères similaires. A titre d'exemple, on précisera que cane ponts intermédiaires (pi) on peut utiliser des carbodiimides (réaction sur les groupes -COOH avec formation d'acylurées, elles mêmes réactives avec les molécules protéiniques); l'hydrazine (réagissant sur les esters et formant, avec HN02, des groupes azides réactifs avec les enzymes); des diisocyanates (se liant, d'un côté sur les groupes ori (uréthannes) ou NH2 (urée) et, de l'autre, sur les molécules biofonctionnelles à pièger. De manière générale, lesdits ponts intercalaires co(tpor- tent, à leur extrémité libre un groupement fonctionnel capable de réagir avec la molécule biofonctionnelle et de fixer. celle-ci au substrat, la définition d'un tel groupement étant la même que celle donnée plus haut. De manière plus détaillée, on peut encore ajouter les exemples suivants de ligands terminaux susceptibles de fonctionner carne bittes de fixation de molécules biofonctionnelles sur le revêtement de l'invention : l'aminobenzamidine spécifique de la trypsine; la 4-phénylbutylamine spécifique de la chymotrypsine; les colorants tels que le CIBACHRON BLUTE F3G-A et le PIOCICN gED HE-3B spécifique des deshydrogénases; les sucres tels que le maltose qui est spécifique de certaines lectines ainsi que la Dgalactoeamine spécifique des galactosidases; 1' acide imiriacétique (IDA) qui, sous la forme de sel de Zn, complexe spécifiquement certaines protéines plasmatiques (&gamma;-globulines,&gamma;-macroglobulines, etc.), la lysine ainsi que le pa minobenzoate de butyle qui sont spécifique du rilasminogène. D'autres exemples figurent dans l'ouvrage "Methods in Enzymology, Vol 34. Les proportions des divers ingrédients que peut contenir la présente composition sont extremement variées et peuvent facilement être adaptées, suivant les besoins, par le technicien compétent. En règle générale, cependant, les proportions d'acide acrylique ne devraient pas être trop faibles pour que le polymère présente une hygrophilie suffisante et pourront être comprisse entre environ 10 et 70 96 en poids de la cnmposition et, de préférence, entre 20 % et 50 9s en poids. Le photo-initiateur (i) est en concentration de 0,5 à 10 %, de préférence aux alentours de 1 à 5 % pour assurer une photopolymèrisa- tion efficace et la proportion de l'activateur et promoteur (ii) est comprise entre environ 0,5 et 15 %, la gamme préférée se situant entre 4 et 8 9s en poids. La quantité du monomère (iii) est essentiellement dépendante de l'activité spécifique qu'on désire impartir au copolymère une fois que celui-ci est déposé sur son support. Une telle activité continence à être significative lorsque la position ne oen- tient que des quantités relativement faibles de monomère (iii) mais, souvent, dans la pratique, on cherche à parvenir à des activités spécifiques (par unité de surface) aussi élevées que possible. Dans un tel cas, on incorpore à la composition jusqu a 30 et meme 50 % du n?ononaère (iii), la limite supérieure étant dictée par les propriétés physiques du revêtement obtenu par copolymérisation. En effet, des quantités trop importantes du monomère (iii) peuvent engendrer l'apparition de défauts du revêtement : manque d'lys drophilie, manque d'adhésion, friabilité, etc... Lorsque la présente composition continent, en plus, un ester acry- lique, celui-ci pourra remplacer une partie de l'acide acrylique et sa concentration pourra être comprise entre 0 et 60 96 environ. Les autres acrylates (polyfonctionnels ou prépolymères) décrits plus hauts seront éventuellement ajoutés en faibles quantités, ne dépassant pas, en général, 5 à 10 96. I1 reste cependant à noter que les concentrations cidessus ne sont pas critiques et peuvent être outrepassées, si besoin est, dans certains cas spéciaux. En ce qui concerne la préparation de la présente composition adhésive, elle peut être réalisée facilement par mélange des divers ingrédients choisis, étant bien entendu que ceux-ci doivent être com- patibles entre-eux. Ce mélange peut être effectué par les moyens habituels, notamment au moyen d'un malaxeur. Une fois le mélange ob- tenu, on le laisse reposer quelques heures afin de le laisser s'équilibrer puis on peut le stocker à l'obscurité ou l'utiliser directement à la préparation de revêtements adhésifs. Pour préparer de tels revêtements, on dépose la composition sur un support suivant les technique habituelles : pinceau, pulvérisation, lame d'étalement, etc... Canme on l'a déjà dit, pratiquement tous les supports conviennent : plaques, billes, tubes supports lisses ou rugueux, verre, mé- taux, plastiques, polyoléfines, nylon, PVC, résines expansées, etc... Dans la pratique, on préfère, par exemple, traiter des billes de verre ou en matière synthétique, de telles billes pouvant, par la suite, être utilisées Une bio-catalyseurs dans divers dispositifs de la boratoire ou industriels colonnes de purification, enceintes de traitements de liquides biologiques, etc... On peut aussi recouvrir des films très minces de polyéthylène qui, une fois repliés ou enroulés, offrent une grande surface de contact dans un volume réduit; ou encore imprègner une mousse de polyuréthanne (transparente aux UV) de manière à obtenir une structure poreuse dont la surface interne, recouverte d'un film de la composition, est très étendue. Suivant une autre forme d'application, on pllvérise la position sur la surface interne d'un tube, le revêtement ainsi obtenu servant, par la suite, d'élément d'analyse dans un appareil de mesure automatique de certains constituants de fluides biologiques. La quantité de composition qu'on utilise par unité de surface du support peut être très faible. En effet, il a été constaté que lors du contact entre un fluide à traiter et la surface du revêtement, activé, obtenu à partir de la présente composition, seule une profondeur correspondant à quelques couches monomoléculaires était mise en jeu (10 à 20 nm environ). Aussi, la couche efficace des revêtements obtenus à partir de la présente composition peut-elle être très mince (de l'ordre de 0,1 à 5g/m2) ce qui constitue un mmnta- ge économique non négligeable. Une fois la présente composition étalée en oouche sur tout ou partie du substrat porteur, on procède à son durcissement par photo irradiation. Lorsque le support est transparent celle-ci peut se faire recto ou, de préférence, verso, l'adhésion étant améliorée dans ce cas, Comme source de rayonnement, on peut utiliser toute source de rayonnement électranagnétique dont le spectre d'émission est constitué au moins en majeure partie par le danaine spectral situé au-dessus de 0,3 micron, par exemple une lampe à vapeur de mercure. On utilise, de préférence, une ou plusieurs lampes à vapeur de mercure ayant une puissance comprise entre 20 Watts et 10 kilowatts. Par exemple, on peut utiliser une lampe à vapeur de mercure ayant une puissance naninale de 2 kilowatts aanme une lampe de marque PHI- LIPS vendue sous la désignation fBQ7 ou encore une lampe à vapeur de mercure ayant une puissance nominale de 5 kilowatts caste une lampe à vapeur de mercure à haute pression délivrant une énergie de 80 Watts/cm, de marque iNOVCA. Des lampes à argon ou à krypton peuvent également convenir. La durée d' irradiation nécessaire pour obtenir la polymérisation de l'adhésif correspond à l'obtention d'une dose minimale d'irradiation de longueur d'onde appropriée reçue par la couche d' adhé- sif. Elle varie donc essentiellement en fonction de la puissance, de la distribution spectrale de la source de rayonnement et de la distance entre cette source et l'adhésif. Cependant, la mise en oeuvre de la camposition selon l'inven- tion pernet d'obtenir avec des durées d'irradiations très courtes (comprises, par exemple, entre 0,5 seconde et quelques minutes suivant la puissance de la source de rayonnement utilisée et ses caractéristiques d'émission spectrale) une polymérisation et une- adhésion satisfaisantes sur la presque totalité des supports envisageables. De plus, cette adhésion n'est que peu ou pas affectée lorsque le substrat, activé, est mis en contact avec les solutions aqueuses, notaw ment les solutions avec lesquelles on le fait réagir. Une fois le revêtement photopolymérisé (Il) obtenu, on procède à l'activation de celui-ci. Pour cela, il faut considérer, soit l'activation directe par mise en contact du substrat avec la ou les molécules biofonctionnelles à lier, soit l'activation par l'inter médiaire du pont intercalaire évoqué plus haut. Dans le premier cas, on procède de manière très simple, généralement en immergeant le support muni du substrat réactif dans une solution de la substance à fixer et en l'y laissant, sous agitation, le temps voulu pour atteindre un taux de fixation suffisant. Dans la pratique, on trempe le substrat dans une solution aqueuse, par exemple d' une enzyme, et on laisse ces éléments en contact de quelques minutes à plusieurs heures, après quoi on lave le substrat activé jusqu'à disparition, dans les eaux de lavage, de l'enzyme libre. Dans le second cas, on commence par procéder à la fixation du pont intercalaire, cela suivant les méthodes déjà évoquées plus haut ou suivant les méthodes abondamment décrites dans les références citées dans l'introduction. Puis on procède à la fixation des molécules biofonctionnelles calme décrit plus haut. Dans les exemples qui sont donnés plus loin on donne des précisions sur la manière de réaliser plusieurs formes d'exécution de l'invention. En résumé, la présente invention présente, sur les techniques de l'art antérieur, les avantages suivants Mise en oeuvre très simple et très rapide. Degré de spécifici- té des sites fixateurs très élevé et excellent contrôle du taux d' ac- tivation et de la nature des molécules fixées. Extrême versatilité de la méthode, sur la base d' une composition adhésive cnnmune, par simple variation de la nature du monomère à copolymériser. Structure simple et bien définie du polymère, ainsi que du catalyseur biologiciue qu'on en obtient. Degré d'hygrophilie et perméabilité du po- lymère réglable à volonté. Adaptation à, pratiquement, tous les sup- ports. Suivant un exemple d' application typique d' un substrat activé (III) suivant l'invention, on revêt par pulvérisation la paroi interne de tubes de verre d' une couche d'environ 1 um d' une crxnposi- tion (I) contenant, coetrne monomère (iii), de l'acrylate de N-hydroxysuccinimide et on irradie 10 sec au moyen d' une source W de 2 D placée à 15-20 an du tube. Puis on active une portion du revêtement par immersion de la première moitié du tube dans une solution aqueuse de glucose oxydase et une seconde portion dudit revêtement par imnersion de la seconde moitié du tube dans une solution de peroxydase. Le tube ainsi activé est ensuite disposé, cagne élément actif, dans un appareil de mesure automatique de glucose dans un fluide biologique, la solution traversant le tube dans le sens glucose oxydase + peroxydase. Lors de 1' analyse, le glucose contenu dans la solution passant dans la première moitié du tube est docanposé en présence de glucose oxydase avec libération de H202 et celle-ci est mise en évidence, par son action oxydante sur un indicateur (ptolidine, coloration tiLeue), cette action étant catalysée par la peroxydase de la seconde moitié du tube actif. Une méthode voisine permet de de terminer la quantité d'antigéne d'un fluide biologique, ceci, en raison du degré de reproductibilité et fiabilité élevé de 1' activité spécifique des revetements suivant l'invention. On procède canrne suit : On prépare un revête- ment d'activité spécifique oontrôlée en pulvérisant, à l'intérieur d'un tube donné, une quantité connue de composition et, après irradiation, on active le revêtement ainsi obtenu à un taux déterminé et reproductible par contact avec une solution d'anticorps. Puis, on mélange à la solution à analyser une proportion connue d' antigène marqué (+) (radioactif) et on met celle en contact avec le substrat activé le temps voulu pour saturer les sites actifs de oe degré nier. On mesure alors le taux de radioactivité de la solution résiduelle ce qui permet, par soustraction, de déterminer la quantité d'antigène marqué capturé et, par cela et en fonction de la quantité théorique devant être absorbé par le revêtement, la proportion d'antigène non marqué originalement présente dans l'échantillon. Les exemples suivants illustrent 1 invention en détail. Applications de laboratoire et industrielles Exemple 1 Préparation d'une composition adhésive (I) Dans un malaxeur, on a mélangé intimement les ingrédients suivants: Acide acrylique 58,4 %, méthacrylate de 2(diméthylamino > -é- thyle (DMAEMA) 13 %, acrylate de N-hydroxysuccinimide 26 %, benzo phénone 2,6 %. On a laissé reposé ce mélange plusieurs heures à température ambiante, puis on a étalé une couche mince de la composition sur une plaquette de verre surfaoé au mitoyen d'un outil de couchage manuel (Hand Coater) puis, pour abriter l'enduit de l'air ambiant, on a ap pliqué sur celui-ci une feuille de polyester non traité qu'on a éta lée, sans la presser, au moyen d'un rouleau de caoutchouc. Irradiation et préparation du revêtement (Il) On a soumis la plaque de verre ainsi préparée à 2 min. d'irradiation sous une lampe PHILIPS (Type HTQ7, 28W/cm) placée à 15 cm du substrat. Puis on a détaché la feuille de polyester qui s'est séparée facilement. Le revêtement ainsi obtenu était incolore, ferme et non cassant; son épaisseur était d'approximativement 8 . Activation et préparation du substrat activé (III) On a plongé la plaquette dans une solution aqueuse à 100 mg/ml de trypsine (SI( ) à EH 7,5 (tampon phosphate 0,5 M) et an l'a laissé immergée 4 h dans cette solution à température ambiante. Puis on l'en a retirée et on a constaté que le revêtement avait sensiblement gonflé mais qu'il adhérait toujours parfaitement à son support. On a soigneusement lavé la plaquette au tampon phosphate 0,5 M puis on a déterminé l'activité spécifique du substrat en la plongeant dans une solution aqueuse 10-3M de p-nitroanilide de benzoyl-arginine (BAP- NA). Sous l'action enzymatique de la plaquette activée, ce composé a libéré de la p-nitroaniline qu'on a dosée spectrophotomètriquement à 410 nm. La vitesse d'hydrolyse enzymatique de ce substrat en solution était de 22 Jamole/min à température ordinaire. On en a déduit que l'activité spécifique du revêtement actif était de 50 ug de trypsine/cm2. Exemple 2 On a procédé comne décrit à l'exemple 1 et on a préparé une xnr position (I) photo-adhésive à partir de Acide acrylique 32,5 %; acrylate de butyle 32,5 %; DMAFMA 6,5 t; acrylamidocaproate de N-hydroxysuccinimide 26 %; benzophénone 2,5 %. On appliqué cette ocmposition (stockée vers 400C de manière à empêcher sa cristallisation par refroidissement) à l'intérieur d'un tube de polyamide 6.6 (CErLPACK A.G., cH-56l0, WOHLEN+ AG) de dimensions suivantes : longueur utile 5 cm; diamètre 0,15 cm; surface intérieure utile 2,35 cm2. Pour ce faire, on a d'abord rempli le tu be de la composition adhésive, on l'a laissé se vider par gravité puis on a chassé l'excès de liquide au moyen d' un jet d'air csmpri- mé qu'on a fait circuler 3-5 sec dans le tube. Puis on a fait circuler un lent courant d'azote dans le tube tout en le soumettant 6 min à l'action d'une lampe W de 2 | placée à 15 cm et en le faisant lentement tourner axialement sur lui-même pendant le temps d'irradiation. Puis, campe à l'exemple précédent, on a immergé le tube ainsi préparé (phase (II)) dans une solution aqueuse de trypsine et, après 4 h à température ambiante, on a constaté que l'activité spécifique du revêtement (phase III) était de 36 g de trypsine par cmê. Une série de 12 tubes similaires a été préparée de la même manière et on a constaté que, a peu de chose près, l'activité spécifique de chacun de ceux-ci était identique. Ces tubes ont été groupés en un faisceau et réunis dans un tube de verre de diamètre en- viron 1,2 an de manière a constituer un élément actif dont l'activité totale était d'environ 1000 ug de trypsine. Exemple 3 On a procédé couine décrit aux exemples précédents et on a préparé une c!position adhésive contenant : acide acrylique 35 %, acrylate d'isopropyle 30 %; DMAEMA 65 %; acrylate de 2-hydroxyéthyle 26 %; benzophénone 2,5 %. On a dilué 100 g de cette ctinposition dans 100 ml de néthyl-éthyl-cétone et or, a pulvérisé ce mélange sous forme d'un brouillard très fin à l'intérieur de tubes de polyamide (de même type qu'à l'exem- ple 2) de manière à déposer, à la surface de ceux-ci, un film d'environ 1 um. Puis on a rapidement séché les tubes sous oourant d' azote, après quoi on a irradié le revêtement cotine décrit dans l'exett- ple 2. Puis on a imnergé ces tubes 15 min à température ordinaire dans une solution à 60 % de butylène diisocyanate dans du CHC13 après quoi on a rincé les tubes au chloroforme de manière à éliminer l'excès de diisocyanate et cn les a rapidement séchés sous N2 Pour rendre le revêtement biofonctionnel, on a procédé came suit : On a disposé deux tubes en série et on y a fait circuler 2 h à température ambiante à la cadence de 1 ml/min 10 ml d'une solution à 1,5 % d'héparine (SI(M, 170 unités USP/mg). Puis on a lave les tubes par une solution de NaC1 à 0,9 96 et on y a fait circuler à 370C une solution constituée d'un mélange de 0,3 ml de plasma, 0,3 ml d'une solution de thrombine (y2,4 unités NIH (National Ins titute of Health, USA)) et 0,3 ml de solution physiologique. Après 1 min. de circulation, on a détermine le temps de coagulation de cette solution suivant la technique standard, la valeur trouvée étant de 44 secondes. A titre comparatif, on a fait circuler un échantillon témoin de la solution ci-dessus dans un jeu de deux tubes identiques, placés en série, mais dont le revêtement n'avait pas été activé à l'héparine et on a mesuré, alors, un temps de coagulation de 18 sec. L'héparine s'est donc bien fixée au revêtement suivant l'invention et le tube ainsi préparé présentait une action anticoagulante significative. Exemple 4 On a utilisé la même composition adhésive que celle décrite à l'exemple 2 et, au moyen d'un dispositif de couchage à lame traînante, on a déposé un film d'environ 2-3 ,um sur une feuille de polypropylène biorienté de 12pm d'épaisseur. On a fait circuler cette feuille, sous protection d' un courant d'azote projeté, à sa surface, sous forme d'un flux laminaire, en regard d' une lampe W de 28 W/cm, de manière que chaque portion de cette feuille soit irradiée 3 sec à une distance de 8 cm. Puis on a découpé la feuille en bande de 5x10 cm et on a enroulé ces bandes en spirale dans le sens de la longeur de manière obtenir des cy- lindres qu'on a ensuite introduit dans des tubes de polyamide sem blable à celui décrit dans l'Exemple 2. Une fois le cylindre introduit dans le tube, la spirale se détend de manière que soit ménagé, entre les spires, un passage libre d'environ 2 à 5 ou d'épaisseur. On a immergé alors les tubes dans une solution aqueuse de trypsine et, après avoir procédé carme décrit dans l'Exemple 2, on a obtenu un substrat activé dont l'activité spécifique était d'environ 30 jig de trypsine/cm2. On a alors réuni les tubes par faisceaux de 12 me décrit à l'Exemple 2 ce qui a permis d'obtenir des éléments actifs d'environ 6 cm3 dont la surface active totale était de 600 cm2 et l'activité d'environ 18 mg de trypsine. On a testé cet élément en y faisant circuler à la cadence de 5 ml/min une solution 10-3M d'ester éthylique de la benzoylarginine tsAEE) ce qui a provoqué la libération pratiquement quantitative de la benzoylarginine (déterminée par titration suivant les moyens habituels). Exemple 5 On a préparé une apposition adhésive identique à celle de l'Exemple 2, mais en remplaçant le monomère réactif de celle-ci par de la N-acryloyl-N'-t.butoxycarbonylhydrazine de formule CH2=CH-CO-NH-NH-CO-O-t.Bu. On a déposé cette canposition sur une feuille de polypropylène parme décrit dans l'Exemple précédent et, après irradiation, on a préparé des tubes garnis d'une feuille enroulée en spirale de ce polymère, toujours cutine à l'Exemple précédent. Pour rendre oes tubes biofonctionnels, on a procédé co;e suit : On y a fait circuler 2 h une solution d'HCl 2M à 300C puis on les a rincés avec cette même solution refroidie à 00. On y a alors introduit et laissé agir 5 min. à O C une solution d'HCl 1 M et de NaN02 1 M; puis on a rincé rapidement les tubes avec un tampon borate, 1 7,5 à OOC. On a alors fait circuler 2 h dans les tubes une solution 0,1 M de p-aminobenzamidine dans un tapon de borate, pH 8,5, à la cadence de 1 ml/min; puis on a rincé les tubes au tampon borate seul. Par ailleurs, on a préparé, dans une solution 0,02 M d'ions Caw, un extrait aqueux de pancréas de boeuf ccmne décrit à l'Exemple U et on a activé celui-ci par adjonction d'une petite portion de trypsine et lente agitation 3 h à EH 8,5. I1 s'est alors forme un précipité qu'on a séparé par centrifugation. On a ensuite prélevé 50 ml du liquide surnageant clair et on l'a fait circuler 1 h dans un jeu de 10 tubes préparés ocmne décrit ci-dessus, ces tubes étant reliés en série, à la cadence de 2 mlhnin. On a lavé les tubes par du te pon 0,1 M Tris.HCl, pH 8,1 à OOC, puis on y a fait circuler du HC1 aqueux dilué, EH 1,7 à OOC ce qui a eu pour effet de détacher la trypsine retenue par le revêtement des tubes. Finalement, on a dialysé l'extrait par une membrane standard de cellulose régénérée et ai a lyophilisé le concentrat ce qui a fourni 14 mg d'un produit riche en trypsine et correspondant à 64 % de la quantité de trypsine te tale du liquide centrifugé de départ, telle que mesurée au moyen de BAPNA (cf. Exemple 1) Exemple 6 Dans une plaque de polyéthylène expansé de 2 cm d'épaisseur (mous- se à structure ouverte) on a découpé à l'ewporte-pièce (perce-bou- chon) un cylindre de 4 mm de diamètre. On a imprégné ce "bouchon" de mousse de la composition adhésive de l'Exemple 2 puis on l'a introduit dans un tube de quartz de 4 mm de diamètre et on l'a pressé et trituré avec une baguette afin d' en exprimer le plus possible de liquide adhésif. Puis on a relié le tube à une source d'azote com primé et, tout en faisant circuler ce gaz dams le tube à un rythme très lent, on a irradié le tube 6 min tout en le faisant tourner sur lui même cnmme à l'exemple 2. Après durcissement de l'adhésif on a activé le substrat en faisant circuler dans le tube une solution de trypsine à 100 mg/ml. Après saturation du revêtement par la trypsine, on a fait circuler dans le tube une solution standard de BAPNA (voir Exemple 1). Par le dosage de la pnitroaniline libérée par hydrolyse on a estimé 1' acti- vité de la trypsine fixée sur la mousse à 240 Jug environ. Exemple 7 Dans un récipient cylindrique en alumine, on a placé 100 g de billes de verre d'environ 1 mm de diamètre et environ 0,6 g de la composition adhésive de l'Exemple 2. On a fait tourner le récipient 2 h sur un mélangeur à rouleaux horizontaux, après quoi on a introduit environ 0,3-0,4 g de ces billes dans un tube de 5 mm de diamè- tre et d environ 2 cm de long. Puis on a irradié ce tube 6 min. à température ambiante comme décrit aux exemples précédents tout en y faisant passer un lent courant d'azote. Après polymérisation, on a mesuré, par réfractométrie, l'épaisseur du dépôt (phase II) sur les billes et on a constaté que cette épaisseur était de l'ordre de 3 ,ut. Puis on procédé à l'activation biofonctionnelle des billes (phase III) comme décrit à l'Exemple 2. Exemple 8 On a sélectionné un tube de polyamide de même type que ceux décrits à l'Exemple 2 longueur 5 cm; diamètre 0,15 cm et on l'a revêtu intérieurement d'une couche (phase II) de copolymère au moyen de la composition adhésive de ce même Exemple 2. On a fait circuler 3 h dans ce tube une solution aqueuse oontenant les ingrédients suivants : tampon borate 0,5 M; pH 8,5; NaCl 0,5 M; glucose oxidase 100 mg/ml (MERCK 16 U/mg) On a placé le tube dans un bain à 250C (température stabilisée par thermostat) et à l'aide d'une pompe péristaltique, on a progressivement et successivement fait circuler des échantillons d'l ml chacun de solution de glucose (dans un tampon phosphate 0,1 M à psi 7,0) de concentrations croissant, par bonds, de 0,5 à 2,5 g/l; entre le passage de chacun des échantillons de glucose on a intercalé des portions séparatrices de 1 mi de tampon phosphate (0,lM, piI 7,0). Le débit dans le tube était de 3 ml/min. Après passage dans le tube ae tif, les échantillons ont été recueillis, un à un, dans de petites cuves contenant chacune 0,1 ml de solution aqueuse d'o-dianisidine (0,7 mg/ml) et 0,1 ml de solution de peroxidase (L mg/ml) dans du tapon phosphate 0,1M, pH 7,0. Après mélange, les solutions des cuves se sont colorées et l'intensité de cette coloration a été inesu- rée par spectrophotomètrie à 436 nm. Les résultats des mesures (densités optiques) sont rassemblés au Tableau I cidessous. TABLEAU I Analyse de glucose par la re'action 2 + glucose (glucose-oxydase) > H202 + o-dianisidine (peroxidase) colorant Solution de glucose Densité optique Echantillon g/l LgI/T (436 nm) o 1 0,5 0,12 2 1 0,242 3 1,5 0,363 4 2 0,47 5 2,5 0,58 On remarque donc qu' une relation pratiquement linéaire existe entre la concentration en glucose et la densité optique de la solution de colorant. On peut donc utiliser le revêtement activé suivant l'invention camne élément analytique pour le dosage du glucose dans des solutions aqueuses de concentration inconnue. Le revêtement enzymatiquement actif est particulièrement stable et son activité se maintient pratiquement sans changement pendant une longue période. Par ailleurs, on a fait transiter, toujours dans le tube décrit plus haut, des échantillons successifs d'l ml de solution de glucose, séparés par des portions d'l ml de tampon phosphate 0,1 M, pE 7,0, la concentration de ces échantillons étant, alternativement, de 0,2 g/l et de 2 g/l. On a procédé à la mesure spectrophotométrique des colorations obtenues comme décrit ci-dessus et cn a trouvé les résultats ci-dessous. TABLEAU II Solution de glucose Densités optiques Echantillon g/l 436 nm 6 0,2 0,045 7 2,0 0,465 8 0,2 0,05 9 2,0 0,47 10 0,2 0,05 Les résultats ci-dessous indiquent qu' aucun phénomène important de "mémoire" (carry-over) ne vient troubler la mesure lorsqu'on passe d' une forte concentration en glucose à une concentration 10 fois moindre, et vice-versa. La méthode présente donc des degrés de latitude de concentrations et de fiabilité élevés. De plus, le revêtement el.zymatiquement actif est parfaitement stable et son activité se maintient pratiquement sans changement durant une longue période. Exemple 9 On a placé dans une pipette de 20 ml 21 g de billes de verre de 1 mm recouvertes d'un revêtement photopolymérisé (phase II) telles que décrites à l'Exemple 7. Puis on a fait circuler 3 h en continu à température ambiante dans la pipette une solution aqueuse contenant 100 mg/ml de chymotrypsine (SIGMA) dans un tampon phosphate 0,5 M, H 7,5. On a rincé ensuite soigneusement la pipette au tampon phosphate 0,5 M puis on a mesuré l'activité spécifique du revue tement ainsi enzymatiquement activé au moyen du pnitroaniiide de la Nglutaryl-L-phénylalanine (GLUPHEPA). Cette méthode, décrite par exemple par B.F. ERIANGER et al, dans Arch. Bioehim. et Biophys. 115, 206 (1966) est basée sur le clivage du nitroanilide ci-dessus avec libération de p-nitroaniline qu'on mesure spectrophotomètriquement à 410 nm. On a ainsi établi que l'activité de la colonne était de 60 > ig de chymotrypsine/cm2 de revêtement des billes, la surface totale des ces billes était d'environ 300 cm2. Au moyen de la colonne ci-dessus, on a procédé à l'hydrolyse en continu d'une solution à 1 % de caséine dans du tampon phospha- te 0,1 M, pH 7,6. On a fait passer 1 litre de cette solution à travers la colonne ci-dessus à la cadence de 2 ml par min et on a constaté, par analyse de l'hydrolysat suivant les moyens habituels, que le taux de conversion dépassait 90 %. Cette analyse a été faite selon la méthode de KUNITZ, Methods in Enzymology, Vol II, p. 33. Pour cela on ajoute de 1' acide trichloracétique à un aliquot de solution à doser et, après séparation du précipité formé par centrifugation, on mesure l'absorbance du liquide à 280 nm. Après avoir laissé reposer la colonne 48 h en présence de tampon phosphate 0,1 M, on a, à nouveau, fait passer 1 1 dune solution de caséine à 1 % à travers le tube au même débit que précédemment et, par analyse de l'hydrolysat, on a constaté que le pouvoir enzy pratique du tube activé était demeuré inchangé. Exemple 10 On a préparé un film de polyéthylène recouvert d'une ouche de position adhésive cxxnme décrit dans l'exemple 4. Avant de soumettre le film ainsi couché à la photopolymérisa- tion, on l'a saupoudré d'alumine en poudre de granulométrie environ 5 m aux taux de 0,5 à 1 g/m2. Puis on a irradié le film Une déjà décrit et on l'a découpé en rubans qu'on a enroulés sur eux-même et glissés dans des tubes cxxmne décrit à l'Exemple 4. Les grains d'alumine fixés à la surface de l'adhésif font en sorte d'empêcher que les spires jointives du ruban n'adhèrent l'une à l'autre et qu'il subsiste un espace suffisant, entre chaque spire, pour qu'un liquide puisse aisément circuler dans le tube. On a fait circuler 3 h à température ordinaire dans un des tubes ainsi préparés une solution aqueuse de tampon phosphate 0,5 M, pH 7,5, contenant 100 mg/ml de Trypsine (SIGMA, type 1X). Puis on a rincé le tube au taon phosphate et on a détermine 1' activité enzymatique du revêtement fonctionnel au moyen du pnitroanilide de la benzoyl-arginine tS;PNA) de la manière suivante : On a fait circuler 5 min. dans le tube 5 ml de la solution 10-3M de TAPIR (débit 3 ml/min.) Puis on a analysé la solution ainsi traitée par spectro photomètrie à 410 nm (pic d'absorption de la pnitroaniline). On a ensuite déterminé la grandeur de l'équivalent de trypsine fixée sur le substrat par comparaison avec une courbe d'étalonnage standard, cette courbe représentant le taux de pnitroaniline en fonction de la quantité de trypsine agissant sur une solution équivalente de BAP S. Dans le présent cas, on a évalué l'activité du revêtement à environ 30 Jug de trypsine par an2. Exemple 11 Dans un tube en polyamide d'un diamètre de 1,5 mm et d'l m de long, on a fait circuler une solution à 30 % dans du CHOC13 de la composé sition adhésive de l'Exemple 3. On a soigneusement égoutté le tube par gravité puis on y a fait passer un lent courant d' azote chauffé à 400C. Après 10 minutes, période au cours de laquelle les traces de CHC13 ont été évaporées, on a soumis le tube à une irradiation au moyen d'une lampe W qu'on a déplaoée parallèlement au tube, tout en faisant tourner celui-ci sur lui-même, de manière que chaque portion du tube soit soumis au rayonnement de la lampe pen dant environ 4 min à une distance de 15 cm. On a ensuite rempli ce tube, par aspiration, d'une solution à 25 % de toluène diisocyanate dans le chloroforme et, après une attente de 15-20 min, on a vidé le tube et on l'a lavé au chloroforme anhydre. Après séchage du tube au moyen d'un courant d'azote sec, on a fait circuler 24 h dans celui-ci une solution à 50 mg/ml d'inhibiteur de soja tECLURA) dans un tampon borate à EXI 9. Puis on a rincé le tube à l'eau distillée. Par ailleurs, on a broyé et homogénéisé dans 600 ml d' eau distillée un pancréas frais de boeuf; on a centrifugé la suspension et fait circuler en continu le liquide surnageant dans le tube activé coltine décrit ci-dessus. Les traces de trypsine contenues dans cette solution ont été retenues par le revêtement interne du tube alors que les substances zymogènes (facilement trans formées par la trypsine) de l'extrait sont restées inchangées en solution. On a pu ensuite traiter cet extrait, débarrassé de la tryp sine indésirable, de manière à en isoler les substances zymogènes de la manière habituelle, celles-ci ayant alors pu être obtenues avec un rendement particulièrement élevé.

Claims: REVENDICATIONS 1. Composition adhésive photopolymérisable à base d' acide acry- lique contenant au moins un photo-initiateur (i) et au moins un activateur de photopolymérisation et promoteur d'adhésion (ii), caractérisée par le fait qu'elle comprend, en outre, au moins un monomère oléfinique oopolymérisable (iii), ce monomère étant apte à fixer, par liaison directe sur un groupement réactif de celui ou par l'entremise d' un pont intermédiaire préalablement relié audit groupe réactif, une substance immédiatement ou potentiellement biofonctionnelle. 2. Revêtement hydrophile adhérant fermement aux supports organiques et minéraux naturels et synthétiques constitué d'une résine photopolymérisée à base acrylique contenant, à l'état copolymérisé, au moins un composé apte à fixer, par liaison directe sur un grou pement réactif de celui-ci ou par 1' entremise d' un pont intermédiaire préalablement relié audit groupe réactif, une ou plusieurs substances macromoléculaires ayant, potentiellement ou directement, une activité biochimique. 3. Revêtement suivant la revendication 2, caractérisé par le fait qu'il comprend, fixée direct'ent ou indirectement à l'aide dudit groupement réactif, une ou plusieurs substances choisies parmi les enzymes, inhibiteurs d'enzymes, antigènes, anticorps, lectines, ferments, microbes, hormones, héparine et autres macro-rlécu- les biofonctionnelles à 1' état actif ou temporairement inhibé. 4. Substrat en matière organique ou minérale naturelle ou syrm thétique dont la surface possède, au moins en partie, une activité biofonctionnelle, caractérisé par le fait que cette surface est recouverte d'un revêtement suivant la revendication 3. 5. Substrat potentiellement biochimiquement fonctionnel en matière organique ou minérale naturelle ou synthétique dont la surface est recouverte, au moins en partie, d'un revêtement adhésif ob- tenu par photopolymérisation de la composition suivant la revendication 1. 6. Substrat biochimiquement fonctionnel dont la surface est recouverte, au moins en partie, d'un revêtement adhésif résultant de la photopolymérisation de la composition suivant la revendication 1 et, ultérieurement, de la fixation sur ce revêtement d' une ou plusieurs substances biofonctionnelles. 7. Procédé pour la préparation d'un revêtement suivant la revendication 2, caractérisé par le fait qu'on prépare une composition adhésive suivant la revendication 1, qu'on étale celle-ci sur un substrat minéral ou organique et qu'on photopolymérise le film ainsi ob tenu 8. Procédé pour la préparation d' un revêtement suivant la revendication 3, caractérisé par le fait qu'on prépare une composition adhésive suivant la revendication 1, qu'on étale celle-ci sur un substrat minéral ou organique de manière à former un film mince sur la surface de ce substrat, qu'on irradie celui-ci au moyen d'une source actinique afin de photopolymériser ce film, puis qu'on met en contact le substrat avec une substance biofonctionnelle à 1' état actif ou, temporairement, passif afin que cette dernière se fixe sur ledit revêtement. 9. Canposition selon la revendication 1, caractérisée par le fait qu'elle comprend, en outre, au moins un autre composé acrylique choisi parmi l'acrylamide, les esters acryliques et méthacryli- ques aliphatiques et cycloaliphtatiques, les acrylates polyfonctionnels et les prépolymères acryliques. 10. Ccmposition suivant la revendication 1, caractérisée par le fait que le photo-initiateur (i) est un cwosé cétonique aranatique. 11. Position suivant la revendication l,caractérisée par le fait que l'activateur de polymérisation et pranoteur d'adhésion (ii) est un acrylate ou méthacrylate d'amirealcool. 12. C4osition suivant la revendication 1, caractérisée par le fait que le mionère (iii) copolymérisable comporte une double liaison copolymérisable avec l'acide acrylique et un groupe fonctionnel susceptible de fixer des macromolécules biofonctionnelles, ces groupes fonctionnels étant choisis dans les catégories des agents acylants, agents protecteurs de synthèse polypeptidique, agents porteurs de bons "leaving groups", inhibiteurs d'enzymes, etc ... 13. Canposition suivant la revendication 1, caractérisée par le fait que le moire (iii), destiné à fixer un pont intercalaire entre le copolymère et la molécule biofonctionnelle, comprend, outre une double liaison oléfinique copolymérisable avec l'acide acry lique, un groupe réactif choisi parmi les groupes OH, ester, COOH et NH2. 14. Utilisation des substrats suivant les revendications 4 ou 6 comme biocatalyseurs de réactions biochimiques, pour éliminer, par extraction, des molécules biofonctionnelles indésirables dans des solutions bioactives ou pour la purification, par extraction sélective dans des solutions d'extraits de matières organiques, de molé- cules bioactives

Inventors: CHEVREUX, PIERRE, GUILLOT, CHRISTIAN, SCHNEIDER, MICHEL
Applicants: BATTELLE MEMORIAL INSTITUTE
Application year: 1980
Main classification: C09J3
IPC codes: C09J4, C12N11