METHOD OF PREPARATION OF COLLAGEN-BASED BONE SUBSTITUTE MATERIAL WITH IMPROVED BIOLOGICAL STABILITY AND BONE SUBSTITUTE MATERIAL OBTAINED BY THIS METHOD

Abstract: 1. A process for producing a bone substitute material having an improved biological stability by using animal or human bone material as the starting substance, which includes a) removing the blood pigment and other water-soluble proteins from the bone material by treatment with water ; subsequently b) removing water-insoluble proteins by treatment with H2 O2 solution ; then c) rinsing in cold water ; then d) degreasing with an organic solvent ; and e) sterilizing the material obtained by a conventional method, characterized in that f) the step of degreasing is carried out immediately after the step of rinsing in cold water which follows upon the removal of proteins, g) the mineral content is subsequently eliminated by dissolution with a complexing agent or an ion exchanger, and h) the material obtained is rinsed in running water in order to remove the residual salts therefrom.

Description: Knochenersatzmaterial mit verbesserter biologischer Stabilität auf Basis von Kollagen und Verfahren zu dessen Herstellung Die Erfindung betrifft ein Knochenersatzmaterial mit verbesserter biologischer Stabilität auf Basis von Kollagen. In der Chirurgie besteht immer wieder die Notwendigkeit, Knochendefekte mit einem Füllmaterialzu versehen. Dies ist vor allem notwendig nach Unfallverletzungen, die zu Knochenbrüchen mit Knochensubstanzverlust oder Knocheneinstauchung geführt haben. Es gibt jedoch zahlreiche wei. tere Anwendungen, wie z.B. Defektfüllung nach Entfernung von Knochentumoren oder Ausräumung von Knochenzysten. Weiterhin wird ein Knochenfüllmaterial in den Fällen benötigt, in denen der Chirurg im Rahmen von Korrekturmassnahmen am Knochen einen bereits vorhandenen oder von ihm selbst geschaffenen Hohlraum auffüllen muss. Nach dem derzeitigen Stand der chirurgischen Technik ist das bestgeeignete Material autologe Spongiosa oder ein autologer kortiko spongiöser Span (Literatur: Unfall heilkunge, 81, 565 - #67 (1978) In diesem @@@@ist der Empfanger zugleich auch der Spender des Knochens. Die Ubertragung von menschlichen Knochen von einer Person auf eine andere, die homologe Transplantation, ist ebenfalls gebräuchlich. hierzu sind stellenweise Knochen banken eingerichtet, die geeignetes Material bereithalten. Des weiteren ist die Ubertragung von tierischen Knochen, der einem geeigneten Aufbereitungsverfahren unterworfen wurde, wie z.B. Einlagerung in Cialitlösung oder nach dem in der DE-PS 961 654 angegebenen Verfahren bekannt und gebräuchlich. Die besten chirurgischen Ergebnisse am Einpflanzungsort werden bis jetzt ohne jeden Zweifel dann erzielt, wenn vom gleichen Patienten, der dieses Material erhalten soll, auch der Knochen entnommen wird (autologe Transplantation). Hierbei ergeben sich zwei entscheidende Nachteile: 1. Das Knochenersatzmaterial muss hier durch eine zusätz liche Operation gewonnen werden. Der zusätzliche opera tive Eingriff führt zu einer Verlangerunc3 der Gesamt operationszeit, die für den Patienten sehr nachteilig, in einzelnen Fällen sogar lebensbedrohlich sein kann. Hiervon sind vor allen Dingen betroffen Schwerverletzte, alte Menschen oder durch sonstige allgemeine Erkran kungen unabhängig von dem notwendigen chirurgischen Eingriff vorbelastete Menschen. Die zusätzliche Opera tion führt weiterhin zu höherem Blutverlust und ist für den Betroffenen wegen der entstehenden Schmerzen unangenehm. Ausserdem hat jeder operative Eingriff eine gewisse Komplikationsrate, die zu weiteren, im Einzel fall nicht immer vorhersehbaren, weiteren Schädigungen führen kann. Die Menge des zur Verfügung stehenden autologen Knochens ist begrenzt. Die zur Verfügung stehenden Reservoire sind die Beckenw kämme beiderseits, Rippen, der Schienbeinkopf und die körperfernen Teile der Speiche. Selbst die voll- ständige Ausnutzung dieser Quellen, die dann mehrere operative Eingriffe erforderlich macht, liefert nicht in jedem Falle eine ausreichende Menge an Knochener- satzmaterial. Ist der Bedarf grösser, so ist der Opera- teur gezwungen, entweder nicht ausreichende Mengen Knochenersatzmaterial zu verwenden oder auf weniger gut geeignete. Knochen von anderen Menschen oder vom Tier zurückzugreifen. Bei derhomologen Knochentransplantation von einem Men- schen zum anderen wird das Transplantat vom Empfanger oftmals nicht gut angenommen. Dafür ist vor allen Dingen die Bildung von Antikörpern gegen fremdes Eiweiss verant wortlich. Geeignetes Spendermaterial ist ausserdem nur schwierig zu bekommen. In der Regel muss man auf von der Leiche entnommenen Knochen zurückgreifen, der in seinem Wert schon wieder stark gemindert ist. Die Ubertragung von Infektionen auf den Empfänger ist nicht ausgeschlossen. Die Verwendung von heterologem Transplantationsmaterial wie z.B. Kieler Knochenspan nach DE-PS 961 654 im Laufe vieler Jahre zeigte, dass von einigen Patienten dieses Material nicht gut angenommen wurde. Die vom Chirurgen eingesetzten Knochenstücke wurden häufig nicht zu leben- dem Knochengewebe umgebaut, sondern blieben im Gewebe als totes Material liegen. Die Erfindung stellt sich daher die Aufgabe, ein neues Material zu schaffen, das in beliebiger Menge verfügbar ist, bei der Einpflanzung in den Körper von Mensch oder Tier keine Antikörper erzeugt, gut gewebeverträglich ist und nach Einpflanzung in den Körper zu Knochengewebe umgebaut wird. Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen dargelegten Gegenstände. Als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemässe Knochenersatzmaterial dienen Knochen und insbesondere Bovines Knochenmaterial, z.B. vom Kalb. Es können jedoch auch andere Ausgangsmaterialien wie menschliche Knochen oder ähnliches kollagenhaltiges Material verwendet werden. Nachstehend wird das Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemässen Knochenersatzmaterials anhand von Kalbsknochen als Ausgangsmaterial beispielhaft dargestellt. Das Verfahren stellt eine Kombination von verschiedenen Stufen dar, die in der angegebenen Reihenfolge durchgeführt werden müssen, um das erfindungsgemässe Knochenersatzmaterial mit verbesserter biologischer Stabilität zu erhalten. In einer ersten Stufe werden die Knochen zur Entfernung des Blutfarbstoffes und an-derer wasserlöslicher Eiweisse über einen gewissen Zeitraum gewässert. Vorzugsweise beträgt dieser Zeitraum 2 - 3 Tage. Bei diesem Wässern wird die Waschflüssigkeit häufig erneuert. Das Wässern kann auch als fliessendes Wässern durchgeführt werden. Eine besondere Temperatur ist nicht erforderlich, doch wird zweckmässig bei Umgebungstemperatur gewässert. Eine zweite Verfahrensstufe dient der Entfernung weiterer, nicht wasserlöslicher Eiweissanteile. Es ist wichtig, dass fremde Eiweisse bzw. Proteine ausserhalb des Kollagens wie z.B. Knochenzellen entfernt werden, um Antireaktionen durch Antikörperbildung auch enzymatischer Art zu vermeiden. Die Entfernung der Eiweissanteile' in dieser Stufe erfolgt durch Einlegen des Knochenmaterials in ein Eiweissentfernungsmittel, zum Beispiel in eine H02-Lösung. Diese H202-Lösung sollte eine Konzentration von über lo % aufweisen. Die Zeitdauer der Behandlung beträgt normalerweise 2 - 3 Tage. Auch hier muss die Lösung mehrfach erneuert werden, um eine vollständige Entfernung der Eiweissanteile zu gewährleisten. Die dritte Verfahrensstufe besteht wieder in einem Spülschritt, bei dem das in der zweiten Stufe erhaltene Material mit kaltem Wasser zur Auswaschung und Abführung der gelösten Weichteile gewässert wird. Hier ist das fliessende Wässern von Vorteil. In der vierten Verfahrensstufe wird das so erhaltene Material entfettet. Das Entfetten erfolgt mit Hilfe von organischen Lösungsmitteln. Geeignete Lösungsmittel sind z.B. Aceton oder Ather oder insbesondere eine Kombination beider Lösungsmittel. Die Entfettung kann in einer beliebigen dafür geeigneten Apparatur vorgenommen werden. Besonders geeignet ist eine Soxhlet-Apparatur für diese Entfettung. In der fünften Stufe des Verfahrens wird das in der vierten Stufe erhaltene Material mit Hilfe von Komplex bildnern oder Ionenaustauschern behandelt. Diese Stufe dient dem Zweck, den Mineralanteil des Knochens durch Komplexbildung herauszulösen. Geeignete Komplexbildner sind z.B. die Salze von Athylendiamintetraessigsäure. Eine geeignete Lösung kann nach einem in Romeis "Lehrbuch der mikroskopischen Technik" angegebenen Verfahren hergestellt werden. Dabei werden 250 g Dinatriumäthylendiamin tetraessigsäure mit 200 ml destilliertem Wasser versetzt und erwärmt. Unter dauerndem RiihEen werden So ml einer 4otgerX Natronlauge zugesetzt und das Ganze mit destilliertem Wasser auf Boo ml aufgefüllt. Durch tropfenweisen Zusatz von 4obiger Natronlauge wird auf pH 7,4 eingestellt und mit destilliertem Wasser auf looo ml Gesamtvolumen aufqefüllt. Das Knochenmaterial wird in eine solche Lösung eingelegt und verbleibt darin eine geraume Zeit, z.B. bis zu mehreren Wochen, bis ein kautschukartiges elastisches Produkt entstanden ist. Das so erhaltene kautschukartige elastische Produkt wird in einer sechsten Verfahrensstufe erneut gewaschen, um die vorhandenen Salzreste zu entfernen. Das Waschen geschieht durchfliessendes Wässern für einen ausreichenden Zeitraum, wie z.B. 2 - 3 Tage. Das dabei erhaltene Material wird dann einer siebten Verfahrensstufe gegebenenfalls einer Gefriertrocknung in üblicher Weise unterworfen. Das erhaltene Material wird dann in einer achten Verfahrensstufe der üblichen Sterilisation insbesondere der Strahlensterilisation unterworfen. Die Strahlensterilisation kann mit üblichen Dosen z.B. mit einer Dosis von 2,5 Megarad erfolgen. Bei dem oben geschilderten Kombinationsverfahren sind die Stufen 1 - 4 und die Stufe 4 an sich als solche bekannt Allerdings wird gemäss ni:-pS 961 654 nach der Arbeitsstufe 3 eine Trocknungsstufe eingeschoben, die bei höchstens 40 C über einen Zeitraum von 12'- 24 Stunden durchgeführt wird. Beim vorliegenden Verfahren darf diese Trocknungsstufe nicht angewandt werden, da man sonst nicht zu dem erfinderischen Ergebnis gelangt. Es ist also wesentlich, dass nach der Verfahrensstufe 3, d.h. dem Wässern, ohne eine Trocknungsstufe die an sich bekannte Arbeitsstufe 4, d.h. das Entfetten mit organischen Lösungsmitteln, durchgeführt wird. Die Verfahrensstufe 5 ist als solche z.B. aus dem genannten "Lehrbuch der mikroskopischen Technik von Romeis bekannt. Nicht bekannt ist dagegen die Kombination der Verfahrensstufen 1 - 4 der vorliegenden Anmeldung mit der Verfahrensstufe 5 der Anmeldung. Bei den Verfahrensstufen 6 - 8 handelt es sich um üb lichte, an sich bekannte Verfahrensstufen. Jedoch sind auch diese Stufen in Kombination mit den Verfahrens stufen 1 - 5 der vorliegenden Anmeldung nicht bekannt. Durch die erfinderische Kombination der für sich genommen an sich bekannten Einzelverfahrensstufen ist es möglich geworden, ein Knochenersatzmaterial aus gereinigtem Xolla- gen und insbesondere gereinigtem Kalbskollagen zu erhalten, das durch sorgfältige Vermeidung aller schädigenden Faktorein wie z.B. Säure beim Entkalkungsprozess, in seiner molekularen Struktur weitgehend erhalten ist. Das so erhaltene Grundmaterial zeigt bei der Implantation in den Körper als Krochenersatzmateriai erstaunlich c;utc Eigenschaften. Beispielsweise ist die Resorptionszeit wo- sentlich höher als bei anderen bisher bekannten Materialien. Darüber hinaus haben feingewebliche Untersuchungen, die nach Einpflanzung in Versuchstiere zu verschiedenen eit- punkten entnommen wurden, eine hervorragende Verträglichkeit ohne Abstossungsreaktionen des Körpers gezeigt. Schon nach 14 Tagen konnte eine beginnende Umwandlung in Knochengeweben nachgewiesen werden. Feingewebliche Untersuchungen zeigten Einlagerungen von Mineralsubstanz, Bindegewebszellen, einsprossende Blutgefässe und knochenbildende Zellen. Das auf obige Weise erhaltene Grundmaterial kann in seinen hervorragenden Eigenschaften als Knochenersatzmaterial noch wesentlich verbessert werden, wenn man dieses Material mit einer geringen Menge des Hormons Calcitonin,auch Thyreo-Calcitonin genannt, vermischt. Beispielsweise eignen sich dazu im Handel erhältliche Calcitonin-Lösungen. Die wesentlich verbesserten Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass es sich hier um einen synergistisc zn Effekt zwischen dem Knochenersatzgrundmaterial und dem Hormon Calcitonin handelt. Die Knochenneubildungszit liess sich mit einem derart mit Calcitonin versetzten Knochenersatz¯ material weiter erheblich verkürzten. Die Erfindung wird nachstehend anhand eines Ausführungs- beispiels erläutert: 1 kg Kalbsknochen (Spongiosastücke) wird sorgfältig gewaschen und so von groben Blutresten befreit. Diese Knochenmenge wird dann in einem geeigneten Gefass mit Zu- und Abflussmöglichkeit gelagert und für 72 Stunden durch fliessendes Leitungswasser einer Dauerspülung ausgesetzt. Dann wird es in eine H202-Lösung (15 %) für 72 Stunden eingelegt. Die Lösung wird 3bis 4mal gewechselt. Die Behandlung mit fliessendem Leitungswasser wird dann für 24 Stunden wiederholt. Anschliessend wird die Entfettung in einer Soxhlet-Apparatur mit 60 % Aceton und 40 % Diäthyläther über ca. 12 Stunden vorgenommen. 1250 g Dinatriumäthylendiamintetraessigsäure werden mit 1000 ml destilliertem H20 versetzt und erwärmt. Unter dauerndem Rühren werden 200 ml NaOH (40 %) zugesetzt und das ganze mit destilliertem Wasser auf 4ooo ml aufgefüllt. Durch tropfenweisen Zusatz von 40 %iger NaOH wird auf pH 7,4 eingestellt und mit destilliertem Wasser auf 5000 ml aufgefüllt. In die so erhaltene Lösung werden die wie vorstehend beschrieben behandelten Knochen eingelegt, bis mehrere entnommene Proben sich als mineralfrei erweisen. Bei Zimmertemperatur sind dazu je nach Grösse der Einzelstücke etwa 3 - 4 Wochen erforderlich. Dann wird erneut eine Entfettung mit 60 % Aceton und 40 % Diäthyläther in einer Soxhlet-Apparatur während etwa 12 Stunden durchgeführt. Anschliessend wird gefriergetrocknet. Danach wird nach geeigneter Folienverpackung durch Bestrahlen mit 2,SMrad strilisiert. Im Folgenden werden Versuche und ihre Ergebnisse beschris- ben, bei denen das Knochenersatzmaterial gemäss der Erb findung implantiert worden ist. Das erfindungsgemässe Knochenersatzmaterial wurde bei der Ratte und beim Kaninchen auf seine Eigenschaften geprüft. Die Kollagenmatrix wurde unter die Haut und in die Rückenmuskulator der Tiere eingepflanzt. Bei verschiedenen Gruppe wurden die Implantate nach 1, 2, 4, 8 und 12 Wochen ent fernt und histologisch untersucht. Nach 1 Woche war bereits das Einwachsen von feinsten Blutgefässen und Zellen erkennbar. Nach 14 Tagen konnten Chondroblasten, Fibroblasten und Osteoblasten nachgewiesen werden (knorpel-, bindegewebeund knochenbildende Zellen). Im weiteren Verlauf erfolgte fortscho tender Auf- und Umbau bis zur Ausbildung regulärer Xnochenstrukturen.

Claims: Patentansprüche 1. Knochenersatzmaterial mit verbesserter biologischer Stabilität auf Basis von Kollagen, dadurch gekennzeichnet, dass es aus natürlichem Kollagen besteht, das in seiner molekularen Struktur weitgehend erhalten ist und durch das folgende Verfahren hergestellt worden ist: a) Entfernung des Blutfarbstoffes und anderer wasserlds licher Eiweisse aus natürlichem kollagenhaltigem Material wie Knochen durch Behandeln mit Wasser; b) Entfernung von Eiweiss und Proteinen durch Behandeln mit 11202-Lösung; c) Spülen in kaltem Wasser; d) Entfettung mit organischen Lösungsmitteln; e) Herauslösung der Mineralanteile des Kollagenmaterials durch Komplexbildner oder Ionenaustauscher; f) Restsalzentfernung durch fliessendes Wässern; g) gegebenenfalls Gefriertrocknen in üblicher Weise und h) Sterilisation in üblicher Weise, insbesondere Strahlen strilisation. 2. Knochenersatzmaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Ausgangsmaterial Bovines-Knochen-, material, z.B. Knochen vom > Kalb, verwendet werden. 3. Knochenersatzmaterial nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich das Hormon Calcitonin enthält. 4. Knochenersatzmaterial mit verbesserter biologischer Stabilität auf Basis von Kollagen,dadurch gekennzeichnet, dass man: a) den Blutfarbstoff und andere wasserlösliche Eiweisse aus natürlichem kollagenhaltigem Material wie Knochen durch Behandeln mit Wasser entfernt; b) Eiweiss und Proteine durch Behandeln mit H202-Lösung entfernt; c) in kaltem Wasser spült; d) mit organischen Lösungsmitteln entfettet; e) die Mineralanteile des Kollagenmaterials durch Komplex bildner oder Ionenaustauscher heraus löst; f) zur Entfernung des Restsalzes, das erhaltene Material in fliessendem Wasser wässert; g) gegebenenfalls das erhaltene Material in üblicher Weise gefriertrocknet und h) das erhaltene Material in üblicher Weise sterilisiert insbesondere durch Strahlensterilisation.

Inventors: WERNER, HEINZ-HELMUT DR. MED.
Applicants: INTERMEDICAT GMBH
Application year: 1979
Main classification: A61F1
IPC codes: C07K14, A61L27, A61K38