DIAGNOSTIC METHOD, ESPECIALLY FOR THE EARLY RECOGNITION OF MALIGNANT TUMORS AND/OR VIRAL DISEASES, AND MEANS TO CARRY IT OUT

Abstract: 1. A diagnostic method, in particular for the early detection of malignant tumors and/or viral diseases in the human or animal organism, using a body fluid collected from the organism being examined for the content of specific pteridines, characterized in that 7,8-dihydropteridine or its oxidation products or its reduction products or their substituted products, with the exception of biopterin and its reduction products, is qualitatively detected and/or semi-quantitatively or quantitatively determined in the body fluid.

Description: Verfahren zur Diagnostizierung, insbesondere Früh erkennung von malignen Tumoren und/oder viralen Er krankungen und Mittel zu seiner Durchführung Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Diagnosti zierung, insbesondere Früherkennung von malignen Tumoren und/ oder viralen Erkrankungen im menschlichen oder tierischen Organismus, wobei eine dem Organismus entnommene Sörperflüssig- keit auf den Gehalt bestimmter Pteridine untersucht wird sowie Mittel zur Durchführung des Verfahrens. Die Diagnose maligner Tumore erfolgt heute fast ausschliesslich aufgrund von klinischen, radiologischen, endoskopischen, histologischen und zytologischen Untersuchungen. Klinisch chemische oder biochemische Befunde, die für einen malignen Tumor eine sichere Voraussage zulassen, existieren bis heute noch nicht. Speziell bei endokrin wirksamen Geschwülsten, die vermehrt Hormone produzieren, kann zwar die quantitative Bestimmung dieser Hormone im Serum oder im Urin wichtige diagnostische Hinweise liefern. Die erhöhten Hormonwerte lassen jedoch nicht sicher auf maligne Neoplasien schliessen, sondern können auch bei anderen Erkrankungen auftreten. In neuerer Zeit hat auch die Bestimmung einiger tumorassoziierter Antigene, z. B. des carcinoembryonalen Antigens (CEA) oder des t1-Fetoproteins eine gewisse Bedeutung erlangt. Da diese Antigene einerseits je nach Tumor im besten Falle nur bei 30 - 90% der Tumorpatienten erhöht sind, andererseits auch bei Patienten mit anderen Erkrankungen erhöhte Werte gefunden werden, bleibt der praktische Wert dieser Untersuchungen sehr begrenzt. Erfolgversprechender, obwohl bisher in der Praxis noch nicht verwendet, scheint eine Tumordiagnose aufgrund der Bestimmung des Gehaltes bestimmter Pteridine in Körperflüssigkeiten. Kokolis und Ziegler (Kokolis N. und Ziegler J., Cancer Biochem. Biophys. 1977, Vol.2, pp. 79-85) fanden im Serum von Tumor-Patienten erhöhte Werte von Tetrahydrobiopterin. Untersuchungen von Halpern et al. (Cancer Research 38, 2378- 2384, 1978,) ergaben in Gewebskulturen von malignen Zellen erhöhte Mengen von 6-Hydroxymethylpterin nach vorheriger Gabe von Folsäure. Es wurde jetzt gefunden, dass überraschenderweise auch bei viralen Erkrankungen erhöhte Mengen bestimmter Pteridine vorhanden sind und nachgewiesen werden können. Die klinische Laboratoriumsdiagnostik der Viruskrankheiten beruht derzeit im wesentlichen auf drei Ver fahrensprinzipien: 1) Isolierung, Züchtung und Identifizierung des Virus vom Kranken (Dauer der Untersuchung ca. 6 Wochen); 2) Nachweis von virusspezifischen Antikörpern im Serum oder Liquor des Kranken (Dauer der Untersuchung ca. 3 Wochen); 3) Züchtung und Identifizierung von Bakterien des Kranken, bei negativem Ergebnis Ausschluss der bakteriellen Er krankung und Annahme einer viralen Erkrankung (indi rekter Nachweis - Dauer der Untersuchung 2 bis 3 Tage, Wiederholungsuntersuchungen erforderlich). Die unter Punkt 1 genannten Methoden, die auch als "grosse Virusdiagnostik" bezeichnet werden, sind kostspielig und mühevoll. Sie sind auch für die Klinik nicht immer befriedigend; dies gilt z. B. dann, wenn Erkrankungen der oberen Luftwege oder meningoencephalitische Syndrome aufgeklärt werden sollen. Die Isolierung und Identifizierung bedeuten in diesen Situationen für den Einzelfall keine diagnostische Hilfe, weil ihre Resultate zu spät ablesbar sind. Die unter Punkt 2 genannten Methoden sind einfacher auszuführen und für den Klinikbetrieb von grösserer Bedeutung. a) Der Neutralisationstest b) Der Hämagglutinations-Hemmungstest < Hirst-Test) c) Die Komplementbindungsreaktion (KBR). Für all diese Untersuchungen ist es notwendig, dass sie gleichzeitig an zwei Serumproben des gleichen Kranken quantitativ ausgeführt werden. Die erste Serumprobe soll sogleich nach dem Erscheinen der klinischen Symptome entnommen werden, die zweite Serumprobe nach etwa 14 Tagen. Die Serumproben werden sofort nach Entnahme eingeschickt und im Laboratorium eingefroren. Die Untersuchung des Serumpaares erfolgt stets am gleichen Tag. Auch bei dieser "kleinen Virusdiagnostik" ergibt sich ein wesentlicher Zeitfaktor und erheblicher diagnostischer und kostspieliger Aufwand. Beim dritten Verfahren handelt es sich um ein Ausschluss verfahren mit allen diesen Verfahren anhaftenden Mängeln. Die Viruserkrankung selbst wird dabei nicht direkt nachgewiesen. Aufgabe der Erfindung ist es, ein gegenüber den bisherigen Vorschlägen verbessertes klinisch chemisches Verfahren zur Diagnose, insbesondere Früherkennung von malignen Tumoren und/oder viralen Erkrankungen sowie zur Verlaufskontrolle der Erkrankungen im menschlichen oder tierischen Organismen zu schaffen, und zwar durch Bestimmung bestimmter Pteridine in Körperflüssigkeiten. Dies wird erfindungsgemäss dadurch erreicht, dass in der Körperflüssigkeit ein vorzugsweise unkonjugiertes, gegebenenfalls derivatisiertes 7,8-Dihydropteridin oder sein Oxidationsprodukt oder sein Reduktionsprodukt qualitativ nachgewiesen und/oder halbquantitativ bzw. quantitativ bestimmt wird. Das 7,8 Dihydropteridin hat folgende Formel: EMI5.1 Beispiele für Dihydropteridine sind: das 7,8-Dihydropterin EMI5.2 das 7,8-Dihydrolumazin EMI5.3 das 7, 8-Dihydroxanthopterin EMI5.4 die 7,8-Dihydro-7-xanthopterincarbonsäure EMI6.1 das 7,8-Dihydro-isoxanthopterin EMI6.2 die 7,8-Dihydro-6-isoxanthopterincarbonsäure EMI6.3 Die bisherigen Beispiele betrafen unkonjugierte Pteridine. Als Beispiel eines konjugierten Pteridins sei die Folsäure genannt: EMI6.4 Das erfindungsgemässe Verfahren beruht auf der im Tierversuch gewonnenen Erkenntnis, dass z. B. im Harn von Ehrlich-Ascites-Tumor tragenden oder virusinfizierten Mäusen eine signifikant erhöhte Ausscheidung von 7,8dihydro-6-hydroxylumazin, einem 7, 8-Dihydropteridin auftritt, die sehr früh nachzuweisen ist und sehr gut mit dem Tumorwachstum oder mit der Schwere des Infektes der Modelltiere korreliert. Auch beim Menschen wurde festgestellt, dass das (vermehrte) Auftreten von 7,8 Dihydropteridinen in Körperflüssigkeiten ein sicherer Hinweis von malignem Wachstum und/oder viralen Erkrankungen ist. Das Verfahren kann darüber hinaus auf die speziellen Gegebenheiten beim Menschen dadurch besser angepasst werden, dass in der Körperflüssigkeit, vorzugsweise im Harn, Neopterin (6-Erythro-1,2,3 trihydroxypropyl-pterin) bzw. sein hydriertes (reduziertes) oder substituiertes Produkt qualitativ nachgewiesen und/oder halbquantitativ bzw. quantitativ bestimmt wird. Das erfindungsgemäss nachzuweisende Neopterin kann in folgender Weise vorliegen: als D-Neopterin EMI8.1 als L-Neopterin EMI8.2 bzw. als Racemat des Neopterins. Als reduziertes Derivat aes Neopterins kommt insbesondere das Biopterin mit der Formel EMI8.3 in Frage. Das erfindungsgemäss nachzuweisende Dihydropteridin kann auf unterschiedliche Art substituiert sein, beispielsweise durch Gruppen wie OH, NH2, CH3, CH2OH, COOH, CHO, Alkohole oder Zucker. Das erfindungsgemäss nachzuweisende Neopterin kann auf unterschiedliche Art substituiert sein, beispielsweise durch Zucker oder Phosphat. Das Dihydropteridin, das Neopterin bzw. sein hydriertes oder substituiertes Produkt kann in verschiedenen Körperflüssigkeiten, z. B. Blut, Serum, Harn, Speichel u. a. nachgewiesen werden. Das erfindungsgemässe Verfahren setzt dabei nicht unbedingt voraus, dass dem Organismus, dem die zu untersuchende Körperflüssigkeit entnommen wird, vorher ein Pteridinderivat bzw. ein in den Pteridinstoffwechsel eingreifendes Präparat verabreicht wird. Der qualitative Nachweis eines 7,8-Dihydropteridins oder des Neopterins bzw. seiner Oxidationsprodukte, Reduktionsprodukte oder substituierten Produkte genügt, wenn der betreffende gesunde Organismus, d. h. ohne Vorhandensein eines malignen Tumors oder einer viralen Erkrankung in die zu untersuchende Körperflüssigkeit kein 7,8-Dihydropteridin abgibt. Andernfalls ist eine quantitative bzw. halbquantitative Bestimmung des 7,8-Dihydropteridins oder des Neopterins bzw. seiner Oxidationsprodukte, Reduktionsprodukte oder substituierten Produkte nötig, wobei diese Werte mit Normalwerten (von Gesunden) je nach der speziellen Untersuchungsmethode der Körperflüssigkeit zu vergleichen sind. Zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung der erfindungsgemässen Pteridinderivate oder des Neopterins einschliesslich der oxidierten, hydrierten oder substituierten Produkte eignen sich übliche Analysenverfahren, wie: - Niedervolt- oder Hochspannungselektrophorese auf Trä gern oder trägerfrei kombiniert mit in-situ-Fluorome trie bzw. Remissionsmessung im W- bzw. sichtbaren Bereich nach Anfärbung; - Dünnschichtchromatographie kombiniert mit in-situ Fluorometrie oder Remissionsmessung im UV- bzw. sicht baren Bereich nach Anfärbung; - Papierchromatographie kombiniert mit in-situ-Fluorome trie oder Remissionsmessung im UV- bzw. sichtbaren Be reich nach Anfärbung; - Gaschromatographie; - Gaschromatographie kombiniert mit Massenspektrometrie; - Felddesorptionsmassenspektrometrie; - Hochdruckflüssigkeitschromatographie und Fluoreszenz detektion bzw. Detektion im UV- bzw. sichtbaren Bereich nach chemischer Reaktion bzw. elektrochemische Detek tion; - Hochdruckflüssigkeitschromatographie und Massenspektro- metrie; Flüssigshromatographie an Ionenaustauschern; - Photometrie; - Fluorometrie; - Spektroskopie (UV-, IR-, kernmagnetische Resonanz, Mas senspektrometrie); - Immunologische Methoden (Radio-Immuno-Assay (RIA), En zyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay (ELISA), Enzym-Immuno Assay (EMIT), Immunelektrophorese u. - Isotopenverdünnung; - Enzymtest, z. B. mittels Xanthinoxidase; - Farbtest; - Biologischer Test (Crithidia-Wachstumstest u. - iso-elektrische Fokussierung; - kinetische Nephelometrie. Für die Praxis bevorzugt, da einerseits senr spezifisch, andererseits mit relativ einfachen Mitteln im Routinebetrieb einsetzbar , sind die immunologischen Methoden, wie RIA, ELISA und EMIT. Hierfür ist es erforderlich, Antikörper gegen die zu bestimmenden Pteridine, beispielsweise Xanthopterin, Neopterin oder Biopterin zu gewinnen. Diese Antikörper werden auf an sich bekanntem Weg durch Immunisierung von Versuchstieren, vorzugsweise Kaninchen, mit geeigneten Pteridin-Konjugaten gewonnen . Die Kupplung der Pteridine an die immunogenen Träger, z. B. Serumalbumine, erfolgt nach an sich bekannten Methoden. Die erforderliche Spezifität der Antikörper für das jeweils zu bestimmende Pteridin wird durch die Auswahl der zur Kupplung eingesetzten Pteridinderivate erhalten. Antikörper für allgemein in 6-Stellung durch eine Seitenkette substituierte Pterine werden erhalten, indem die Kupplung des Haptens an den immunogenen Träger über die 6-Stellung erfolgt. EMI11.1 R = OH n = 2,3,... R = COOH n = 1,2,... Dabei wird z. B. Xanthopterin mit Äthylenglykol unter saurer Katalyse umgesetzt und anschliessend die endständige OH-Gruppe zur Carboxygruppe oxydiert. Dieses reaktionsfähige Haptenderivat wird mit einem Carbodiimid in an sich bekannter Weise, z. B. an Rinderserumalbumin, konjugiert. Bei einem Antikörper, der spezifisch für Neopterin ist, muss die Trihydroxypropylseitenkette des Neopterins als Determinante bei der Kupplung des Haptens an den immunogenen Träger erhalten bleiben. Daher wird als einfachste Reaktion die Alkylierung, die vorwiegend in 3-Stellung des Moleküls stattfindet, mit einem Alkylhalogenid durchgeführt, das zusätzlich eine, evtl. geschützte, weitere reaktionsfähige Gruppe besitzt. EMI12.1 R = Me R=H n > 3 Z. B. führt die Umsetzung von Neopterin mit t > -Bromvale- riansäuremethylester zum Neopteryl- # t-valeriansäure- methylester, der nach saurer Hydrolyse der Methylester-. schutzgruppe mittels der Carbodiimidmethode an z. B. Rinderserumalbumin konjugiert wird. EMI12.2 Entsprechend reagiert z. B. w t-Bromvaleronitril mit Neop- terin zum 3-(4-Cyanobutyl-) neopterin, das durch Umsetzung in absolutem Methanol mit Chlorwasserstoff den entsprechenden Imidoester ergibt, der direkt mit Rinderserumalbumin umgesetzt werden kann. Neopterin steht hierbei je nach dem gewünschten Antikörper für D-erythro-Neopterin, L-erythro-Neopterin, L-threo Neopterin oder D-threo-Neopterin. Bei Biopterin bestehen prinzipiell dieselben Möglichkeiten der Derivatisierung wie beim Neopterin, es wird daher als Beispiel nur die Umsetzung mit 4-Bromvaleriansäure- methylester aufgezeigt. EMI13.1 R = Me R=H n33 Für alle optischen Isomeren L-erythro-, D-erythro-, L-threo- und D-threo-Biopterin gilt sinngemäss das gleiche. Spezifische Xanthopterin-Antikörper werden erhalten, indem die Kupplung des Haptens an den immunogenen Träger über die Position 3 erfolgt. Um Reaktionen an den sonst begünstigten Positionen 5 bzw. 6 auszuschliessen, ist es im allgemeinen erforderlich, diese vorübergehend zu schützen, z. B. durch Methylierung des Sauerstoffs in 6-Stellung. EMI13.2 Die Alkylierung des Stickstoffatoms in 3-Stellung mit (A)-Bronvalerinansäuremethylester wird durch vorherige Umsetzung mit Hexamethyldisilazan zum 0-4-Trimethylsilylderivat erleichtert; andernfalls wird auch das 0-4-Alkylderivat gebildet. Durch Erwärmen in Säure wird die 6-Methoxy- und die Methylesterschutzgruppe wieder entfernt. EMI13.3 n = 2,3,.. Eine weitere Möglichkeit besteht in der Verknüpfung des Xanthopterins mit dem immunogenen Träger über die 2-Aminogruppe. Umsetzung mit Bernsteinsäureanhydrid in der Wärme ergibt das Hemisuccinat des Xanthopterins, das in üblicher Weise mittels Carbodiimid z. B. an Rinderserumalbumin konjugiert wird. EMI14.1 R = H ,OH Für die Bestimmung reduzierter Formen der Pteridine' z. B. 7, 8-Dihydroxanthopterin oder 5 , 6', 7 , 8-Tetrahydrobiopterin können ebenfalls Antikörper erzeugt werden Däzu werden entweder die zuvor beschriebenen Konjugate einer Reduktion mit in der Pteridinchemie üblichen Verfahren unterzogen oder die hier beschriebenen reaktionsfähigen Pteridinderivate werden vor der Kupplung an immunogene Träger im gewünschten Masse hydriert. Dabei ist allerdings zu beachten, dass die reduzierten Pteridine, vor allem die 5,6,7, 8-Tetrahydroderivate sauerstoffempfindlich und noch lichtempfindlicher als die oxidierten Formen sind. Diese reaktionsfähigen Pteridinderivate werden ausser zu Verknüpfungen mit dem immunogenen Träger auch zur Herstellung der bei immunologischen Verfahren notwendigen Tracer (radioaktiv oder durch Enzyme markiert) verwendet. Dabei wird z. B. das 3-(4-Carboxybutyl-)D-erythro-neopterin mit 3-Radiojodtyramin nach der Carbodiimidmethode umgesetzt, wobei i. a. 125 J verwendet wird. Dieser Tracer ist für die radioimmunologische Bestimmung von Neopterin besonders geeignet. EMI15.1 Bei der Herstellung von Enzymkonjugaten wird ähnlich verfahren. Die Umsetzung von z. B. Peroxidase (z. 3. Meerrettich) und z. B. 3-(4-Carboxybutyl-)D-erythro-neopterin nach der Carbodiimidmethode ergibt ein Enzymkonjugat, das zur enzymimmunologischen Bestimmung von Neopterin verwendet wird. Nachstehend wird das erfindungsgemässe Verfahren anhand von Beispielen näher erläutert: Beispiel 1: Zum Nachweis eines malignen Wachstums und/oder viralen Erkrankungen beim Menschen eignet sich die quantitative Bestimmung des 7,8-Dihydroxanthopterin im Harn durch dünnschichtchromatographische Trennung des nativen Harnes. Nach Trocknung der Dünnschichtplatte erfolgt eine quantitative fluorometrische Direktauswertung. Humanharn werden portionsweise unter Zwischentrocknung mit einem Warmluftgebläse auf eine Cellulose-Dünnschichtplatte aufgetragen. In einer Dünnschichtkammer läuft das Laufmittel n-Butanol/Eisessig/Wasser (20/3/7) 12 cm weit. Nach Trocknung mit einem Warmluftgebläse wird die Dünnschichtplatte mit einem Chromatogrammspektralfluorometer gescannt und das Fluoreszenzsignal über einen Millivoltschreiber aufgezeichnet. Die Anregungswellenlänge beträgt hierbei 378 nm, die esswellenlänge 486 nm. Gemessen wird hierbei die Fluoreszenz eines Oxidationsproduktes, nämlich des Xanthopterins. Die Fläche der Bande des fluoreszierenden Fleckes bei Rf = 27 ist proportional dem im Harn ausgeschiedenen 7, 8-Dihydroxanthopterin. Beispiel 2: Zum Nachweis des Ehrlich-Ascites-Tumorund/oder viraler Infekte bei der Maus eignet sich z. B. die quantitative Bestimmung des 7,8-Dihydro-6-hydroxylumazins im Harn durch hochspannungselektrophoretische Trennung des nativen Harnes und anschliessender fluorometrischer Direktauswertung: 10 }ll Mausharn werden auf einem mit Michaelispuffer (pH = 8,6 Ionenstärke = 0,75) getränkten Papierbogen strichförmig auf 3 cm Länge aufgetragen. Der Lauf erfolgt in einer kommerziellen Hochspannungselektrophoresekammer bei 2700 Volt und 45 Minuten Dauer. Nach Lufttrocknung wird der Elektrophoresebogen 16 cm weit in einem Chromatogrammfluoreszenzspektralphotometer gescannt, wobei das Fluoreszenzsignal mit einem Millivoltschreiber auEge- zeichnet wird. Die Anregungswellenlänge beträgt hierbei 372 nm, die Messwellenlänge 456 um. Gemessen wird hierbei die Fluoreszenz eines Oxidationsproduktes des 7,8-Dihydro6-hydroxylumazins, nämlich des 6-Hydroxylumazins. Die Fläche der Bande bei der relativen elektrophoretischen Mobilität (bezogen auf 4-Hydroxyhippursäure = 100) hrM = 55 ist proportionaldem im Harn ausgeschiedenen 7,8-Dihydro6-hydroxylumazin. Beispiel 3: Ein weiteres mögliches Analysenverfahren zur Bestimmung des 7,8-Dihydro-6-hydroxylumazins besteht in Dünnschichtchromatographie auf Cellulose mit dem Laufmittel n-Butanol/ Eisessig/Wasser (20/3/7). Der hRf-Wert des'7,8-Dihydro- 6-hydroxylumazins liegt in diesem System bei 25. Auch hier erfolgt die quantitative Bestimmung des 7,8-Dihydro-6hydroxylumazins durch Direkt-Fluorometrie bei 372 nm An regung und 456 nm Messung mit einem Chromatogrammspektralfluorometer. Regt man bei 356 nm an und misst man bei 440 nm, so kann man durch Direkt-Fluormetrie beim hRf-Wert 37 Neopterin quantitativ erfassen. Beispiel 4: 7,8-Diyhdro-6-hydroxylumazin und sein Oxidationsprodukt 6-Hydroxylumazin werden simultan quantitativ flüssigchromatographisch bestimmt. Hierbei wird 1 ml vorgereinigte Probelösung auf eine Niederdrucksäule von 82 cm Länge und 6 mm innerem Durchmesser, gefüllt mit reversed-phase Material Bondapak C18, Teilchengrösse 37 - 75 pm, aufgegeben. Anschliessend wird isokratisch mit einer 25 mM Ammoniumacetatlösung, pH 4,5, bei einem Durchfluss von 100 ml/Stunde eluiert. 7,8-Dihydro-6-hydroxylumazin hat ein Retentionsvolumen von 47 - 53 ml und wird durch seine UV-Absorption bei 254 nm gemessen. 6-Hydroxylumazin wird von 54 - 60 ml eluiert und fluorome- trisch bei 366 nm Anregung und Messung oberhalb 400 nm gemessen. Beispiel 5: Zum Nachweis eines malignen Wachstums und/oder viraler Erkrankungen beim Menschen eignet sich z. B. die quantitative Bestimmung des Neopterins im Harn durch hochdruckflüssigchromatographische (HPLC) Trennung des nativen Harnes und Fluoreszenzdetektion.Gegebenenfalls kann vor der chromatographischen Trennung eine Vortrennung mittels Vorsäule oder dgl. erfolgen. 5 pl Humanharn bzw. die äquivalente Menge nach der Vorreinigung werden in das HPLC-System eingegeben. Am HPLC System wird isokratisch gefahren. Als Puffer wird Ammonacetat/Essigsäure (30 m mol/Liter, pH = 6,0) mit 5 9s Methanolzusatz verwendet. Benützt wird eine 30 cm-Säule mit reversed-phase -Material als Füllmittel. Die Durchflussgeschwindigkeit beträgt 2 ml/min.. Durch das HPLC-System erfolgt eine klare Abtrennung des Neopterins von anderen Substanzen, so dass das Neopterin mittels Fluoreszenzdetektor und angeschlossenem Schreiber quantitativ erfasst werden kann. Die Anregungswellenlänge beträgt hierbei 380 nm, die Messwellenlänge 450 nm. Gleichzeitig mit der Bestimmung des Neopterins wird das im Harn ausgeschiedene Kreatinin quantitativ bestimmt, so dass die Angabe in ng Neopterin pro mg Kreatinin erfolgen kann. Der Bezug auf Kreatinin empfiehlt sich immer dann, wenn nicht der Gesamt-Tagesurin sondern nur übliche Urinproben zur Verfügun < S-st3hen. Ein weiteres mögliches Analysenverfahren zur Bestimmung des Neopterins besteht in Dünnschichtchromatographie auf Cellulose mit dem Laufmittel 5 96ige Essigsäure. Der hRe- Wert des Neopterins liegt in diesem System bei 65. Die quantitative Bestimmung des Neopterins erfolgt durch Direktfluorometrie bei 364 nm Anregung und 456 nm Messung mit einem Chromatogrammspektralfluorometer. Beispiel 6: 6-(2-Carboxy-)äthoxypterin Im Dunkeln oder bei gedämpftem Licht wird 1 g Xanthopterin unter Rühren in 60 mol absolutem Propandiol-(1,3) auf 70 C (Ölbad) erhitzt. Dann wird trockener Chlorwasser stoff für ca. 3 h eingeleitet. Beim Einengen wird das Hydrochlorid erhalten, das durch Erhitzen (15 min.) mit Wasser das 6-(3-Hydroxy-)propyloxypterin ergibt. 0,5 g dieses Produktes werden in 20 ml 0,1 N NaOH mit KMnO4-Lösung behandelt. Der ausgefallene Niederschlag wird abgesaugt, das Filtrat liefert beim Ansäuern das 6- (2-Carboxy-) äthoxypterin. Beispiel 7: 3-(4-Carboxybutyl-)D-erythro-neopterin 48 mg D-erythro-Neopterin werden in 20 ml absol. DMF mit 50 mg wasserfreiem K2C03 und 0,2 mltO-Bromvaleriansäure- methylester unter Feuchtigkeitsausschluss bei Raumtemperatur gerührt. Nach 18 h werden weitere 0,2 ml w-Bromvale- riansäuremethylester zugegeben und für weitere 50 h gerührt. Danach werden 5 ml 2 N HCL bis zur sauren ie aktion (pH ca. 1-2) zugesetzt; nach 5 h wird im H. Vak. eingeengt, der Rückstand mit Wasser verrieben, abgesaugt und getrocknet. Dieses Produkt kann direkt für die Konjugation an Rinderserumalbumin verwendet werden. Die Arbeiten werden wie im Beispiel 7 und in den folgenden Beispielen 8 - 15 im Dunkeln oder bei gedämpftem Licht durchgeführt. Beispiel 8: 3- (4-Methoxyiminocarbonylbutyl-) D-erythro-neopterin 48 mg D-erythro-Neopterin werden in 10 ml absol. DMF mit 40 mg wasserfreiem K2CO3 und 0,4 ml c3-Bromvaleronitril unter Feuchtigkeitsausschluss bei 400 C (Bad) gerührt. Nach 2 Tagen wird i. H. Vak. einrotiert, der Rückstand in wenig methanol. NH3 gelöst und an Kieselgel schichtchromatographisch getrennt. Die dem 3-(4-Cyanobutyl-)D-erythro Neopterin entsprechende Zone wird eluiert und einrotiert. 30 mg dieses Produktes werden in 10 ml HCl-gesättigtem Methanol unter Kühlung suspendiert und unter weiterem Einleiten von trockenem HCl langsam auf 10 C erwärmt. Die Mischung bleibt dann 24 h stehen. Nach Zugabe von 20 ml absol. Diäthyläther-wird das Produkt abgesaugt, gewaschen und getrocknet. Beispiel 9: 3-(4-Carboxybutyl-)L-erythro-biopterin 22 mg L-erythro-Biopterin werden in 8 ml absol. DMF mit 20 mg wasserfreiem K2C03 und 0,2 ml-Bromvalerinansäure- methylester unter Feuchtigkeitsausschluss 3 Tage bei Raum temperatur gerührt. 6 h nach Zugabe von 2 ml Wasser und 2 N HCl bis pH 1 - 2 wird i. H. Vak. einrotiert, der Rückstand mit Wasser behandelt, abgesaugt und getrocknet. Beispiel 10: 3-(4-Carboxylbutyl-)xanthopterin 360 mg 6-Methoxypterin werden in 50 ml Hexamethyldisilazan unter Feuchtikeitsausschluss am Rückfluss erhitzt (20 h!, danach wird i. Vak. eingeengt. Der Rückstand wird in 40 ml absol. DMF mit 1 mlco-Bromvaleriansäureäthylester bei 40 C für 30 h umgesetzt. Das Lösungsmittel wird i. H. Vak. abgezogen. Der Rückstand wird schichtchromatographisch an Kieselgel gereinigt; die dem 3-(4-Carbomethoxybutyl-) 6-methoxypterin entsprechende Zone wird eluiert. Zur Abspaltung der Schutzgruppe werden 100 mg dieses Produktes in 30 ml Eisessig mit 3 ml 6 N HCl 4 h auf 700 C erhitzt. Danach wird i. Vak. einrotiert, der Rückstand aus Äthanol/Wasser umkristallisiert. Beispiel 11: Xanthopterin-Nê-hemisuccinat 200 mg Xanthopterin werden in 50 ml absolutem Pyridin mit 250 mg Bernsteinsäureanhydrid auf 700 C erwärmt. Nach 16 h wird auf Eis gegossen, der Niederschlag abgesaugt und mit Wasser gewaschen. Das Produkt kann direkt zum Konjugieren verwendet werden. Beispiel 12: 3-(Butyl-4-carbonsäure-/3'-125jod-]tyramid)-D-erythro-neop- terin Ca. 1 m Ci 3-125Jodtyramin werden mit 0,1 mg 3-(4-Carboxybutyl-)D-erythro-neopterin gemass Beispiel 7 in 200 l absol. DMF unter Kühlung mit 80 pg Dicyclohexylcarbodiimid in 50 absol. Dioxan versetzt. Nach Stehen über Nacht und Erwärmen auf Raumtemperatur wird durch Papierchromatographie (Laufmittel n-Propanol 1/3 % wässr. NH3 1, v/v) das ge 125 wünschte 125J-Neopterinderivat abgetrennt und mit methanol. NH3 eluiert. Beispiel 13: N2-f3H 7Acetylxanthopterin 0,1 mg Xanthopterin (0,5 pMol) werden im verschlossenen Reaktionsgefäss 6 h mit 5 m Ci zu 3H g3HgEssigsäureanhydrid in 200 pl absol. DMF auf 1000 C erhitzt. Die Reaktionsmischung wird durch Papierchromatographie (Laufmittel n-Butanol 2/5 M Essigsäure 1, v/v) gereinigt. Die markierte Verbindung wird mit methanol. NH3 eluiert. Beispiel 14: Xanthopterinhemisuccinat-B-D-Galactosidase-KonDumat 14 mg Xanthopterin-N2-hemisuccinat gemäss Beispiel 11 und 9,2 mg Tri-n-butylamin werden in 500 pl absol. DMF im Eisbad gekühlt, nach Zugabe von 6,6 mg Chlorameisensäureisobutylester wird 30 min. gerührt. Danach werden 5 mg ss D-Galactosidase in 5 ml Wasser zugesetzt; die Reaktion wird durch Zugabe von 0,1 N NaOH bei pH 9 und unter 100 C gehalten. Nach 5 h Reaktionszeit wird über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt. Das Enzymkonjugat kann durch Chromatographie an Sephadex G 25 gereinigt werden. Beispiel 15: 3-(4-Carboxybutyl-)D-erythro-neopterin-Peroxidase-Konjugat 17 mg 3- (4-Carboxybutyl-)D-erythro-neopterin gemäss Beispiel 7 werden nach der Gemischten-Anhydrid-Methode mit Chlorameisensäureisobutylester in absol. DMF umgesetzt. Die Konjugation an 20 mg Peroxidase (HRP) erfolgt in DMF/ 0,5 9s NaHC03 (1:5), 6 h, < 100 C. Das Konjugat kann durch Chromatographie an Sephadex G-25 gereinigt werden. Beispiel 16: Enzyltfimmuno-Assay In einem kleinen Zentrifugenröhrchen (Eppendorf oder Sarstedt) werden 100 pl Serum mit 400 pl PBS-Puffer (0,05 M Phosphat pH 7,4; 0,1 M NaCl; 0,1 % Rinderserumalbumin), 100-Pl Xanthopterin-Antiserum (Kaninchen 1 : 100Ö) und 100 pl Xanthopterin-ss-D-galactoxidase-Konjugat (ca. 50 ng) 5 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe von 100 2. Antikörper (Ziege, Anti-Kaninchen) wird 3 h bei Raum v peratur (oder über Nacht im Kühlschrank) inkubiert. Nach Zentrifugieren wird der Uberstand abgesaugt, das Pellet in 1 ml PBS-Puffer resuspendiert. Nach Wiederholung des Zentrifugierens und Absaugens wird 0,1 ml Enzymsubstrat (0,1 M Phosphat pH 7,0, 2,3 mM O-Nitrophenyl ss-D-galactopyranosid, 1 mM MgCl2, 10 mM Mercaptoäthanol) zugesetzt und 2 h bei 230 C inkubiert. Nach für Standards und Proben gleicher Zeit, z. B. 2 h, werden 1,5 ml 0,2 M Na2C03 zugegeben und die optische Dichte bei 420 nm bestimmt. Beispiel 17: Radioimmunoassay In kleinen Zentrifugenröhrchen (Eppendorf, Sarstedt, o. ä.) werden 20 pl Urin, 300 Ml 0,1 M Phosphat pH 7,4, 100 Xanthopterin-Antiserum (Kaninchen, 1:1500 mit Zusatz von 7 g Kaninchen-r-globulin) und 100 pl 2-g3H-Acetylgxan- thopterin (in der Zählausbeute des Gerätes und der spez. Aktivität des Tracers angepasster Menge) 4 h bei Raumtemperatur inkubiert. Danach werden 100 pl 2. Antikörper (Anti-Kaninchen-Y-globulin-Serum, Ziege, 1:25) zugesetzt und für w Das Präzipitat wird anschliessend in 50 ul Soluene TM 100 gelöst, mit insgesamt 10 ml Insta-Gel-Szintillationsflüssigkeit (beides Packard Instrument Co.) in ein Szintillationsfläschchen überführt und im Zählgerät (Packard) gemessen. Eine nach den vorstehenden Beispielen und generell nach dem erfindungsgemässen Verfahren durchgeführte Untersuchung beansprucht nur einen geringen Zeitaufwand. So kann eine Untersuchung etwa nach Beispiel 5 in sechs Minuten durchgeführt werden. Die Untersuchungen nach dem erfindungsgemässen Verfahren können auch beliebig oft wiederholt werden und ermöglichen so auch eine Verlaufskontrolle der Viruserkrankung bzw. einer Therapie von malignen Tumoren. Von dem in der Körperflüssigkeit befindlichen Pteridin bzw. von dem angewendeten Bestimmungsverfahren hängt es ab, ob das ursprüngliche Pteridin selbst erfasst wird oder dessen z. B. durch Licht- und/oder Lufteinfluss entstehendes Abbauprodukt, Oxidationsprodukt bzw. Reduktionsprodukt.

Claims: Patentansprüche 1. Verfahren zur Diagnostizierung, insbesondere Früherken nung von malignen Tumoren und/oder viralen Erkrankungen im menschlichen oder tierischen Organismus, wobei -eine dem Organismus entnommene Körperflüssigkeit auf den Ge halt bestimmter Pteridine untersucht wird, dadurch ge kennzeichnet, dass in der Körperflüssigkeit ein vorzugs weise unkonjugiertes, gegebenenfalls derivatisiertes 7,8-Dihydropteridin oder sein Oxidationsprodukt oder sein Reduktionsprodukt qualitativ nachgewiesen und/oder halbquantitativ bzw. quantitativ bestimmt wird. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vorzugsweise im Harn 7,8-Dihydroxanthopterin, 7,8-Dihy dro-isoxanthopterin oder 7,8-Dihydro-6-hydroxylumazin qualitativ nachgewiesen und/oder halbquantitativ bzw. quantitativ bestimmt wird. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vorzugsweise im Harn oder Serum Neopterin (6-Erythro 1,2,3-trihydroxypropyl-pterin) bzw. sein hydriertes (re duziertes) oder substituiertes Produkt qualitativ nach gewiesen und/oder halbquantitativ bzw. quantitativ be stimmt wird. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass D-Neopterin, L-Neopterin oder das Racemat des Neopterins qualitativ nachgewiesen und/oder halbquantitativ bzw. quantitativ bestimmt wird. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2,- dadurch ge kennzeichnet, dass der Nachweis bzw. die Bestimmung des 7,8-Dihydropteridinsbzw. seinerOxidations- oder Reduk tionsprodukte unter Bestrahlung und Messung der dabei entstehenden Fluoreszenzstrahlung erfolgt. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch ge kennzeichnet, dass die quantitative Bestimmung des 7,8 Dihydropteridinsbzw. seiner Oxidations- oder Reduktions produkte durch hochspannungselektrophoretische Trennung der Körperflüssigkeit und anschliessender fluorometrischer Direktauswertung erfolgt. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch ge kennzeichnet, dass die quantitative Bestimmung des 7,8 Dihydropteridinsbzw. seiner Oxidations- oder Reduktions produkte durch Dünnschichtchromatographie und anschlies sender fluorometrischer Direktauswertung erfolgt. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge kennzeichnet, dass das 7,8-Dihydropteridin bzw. seine Oxidations- oder Reduktionsprodukte quantitativ flüssig keitschromatographisch bestimmt und fluorometrisch und/ oder durch seine UV-Absorption gemessen werden. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch ge kennzeichnet, dass der Nachweis des Neopterins bzw. seiner hydrierten oder substituierten Produkte mittels HPLC unter Beziehung auf Kreatinin fluorometrisch erfolgt. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge kennzeichnet, dass das 7,8-Dihydropteridin oder Neopterin bzw. seine oxidierten, hydrierten oder substituierten Produkte immunologisch bestimmt werden. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge kennzeichnet, dass das 7,8-Dihydropteridin oder Neopterin bzw. seine oxidierten, hydrierten oder substituierten Produkte immunologisch durch Radio-Immuno-Assay oder En zym-Immuno-Assay bestimmt werden. 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge kennzeichnet, dass das 7,8-Dihydropteridin bzw. seine Oxidations- oder Reduktionsprodukte enzymatisch bestimmt werden. 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch ge kennzeichnet, dass das 7,8-Dihydropteridin oder Neopterin bzw. seine oxidierten, hydrierten oder substituierten Pro dukte in einer Körperflüssigkeit nachgewiesen bzw. be stimmt werden, die ohne vorherige Verabreichung eines Pteridinderivates bzw. eines in den Pteridinstoffwechsel eingreifenden Präparates dem Organismus entnommen wurden. 14. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man Antikörper einsetzt, die durch Kupplung eines immuno genen Trägers an Pteridin-Konjugate in 3- oder 6- Stellung des Pteridinsgewonnen wurden. 15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichent, dass man Tracer einsetzt, die durch Kupplung eines Enzyms oder einer radioaktiv markierten Gruppe an Pteridin-Konjugate in 3- oder 6-Stellung des Pteridins gewonnen wurden. 16. Diagnostisches Mittel zum immunologischen Nachweis von vorzugsweise unkonjugiertem, gegebenenfalls hydriertem, oxidiertem oder derivatisiertem 7,8-Dihydropteridin enthal tend einen Antikörper, der durch Kupplung eines iIrmunogenen Trägers an Pteridin-Konjugate in 3- oder 6-Stellung des Pteridins gewonnen wurden sowie eines Tracers, der durch Kupplung eines Enzyms oder einer radioaktiv markierten Gruppe an Pteridin-Konjugate in 3- oder 6-Stellung des Pteridins gewonnen wurden.

Inventors: GROSSMAYR, NIKOLAUS DR., HAUSEN, ARNULF DR., WACHTER, HELMUT, PROF. DR.
Applicants: WACHTER, HELMUT, UNIV.-PROF. DR.
Application year: 1979
Main classification: G01N33
IPC codes: G01N33, C07D475