MEANS FOR RAPID DETECTION OF OCCULT BLOOD AND PROCESS FOR THEIR PREPARATION

Abstract: 1. Rapid diagnostic agents for diagnostically detecting blood in excreta and body fluids, consisting of at least one solid carrier which is charged with chromogenic phenylamino compounds or guaiacum resin as indicator, characterised in that the carrier material is impregnated with acrylic and/or methacrylic resins of an anionic nature from an aqueous dispersion.

Description: Verbesserte Schnelldiagnostica Das Bedürfnis nach einfachen, schnellen und gleichzeitig sicheren Diagnoseverfahren hat in der Medizin unter anderem zur Entwicklung der Teststreifen-Methode geführt. Der Grundgedanke besteht darin, Reagentien auf einem festen Träger aufzubringen, die nach dem Befeuchten unter der Einwirkung der nachzuweisenden Stoffe mittelbar oder unmittelbar mit einer visuell erkennbaren Veränderung, in der Regel unter Bildung eines Farbstoffs oder unter Farbumschlag reagieren. Grosse praktische Bedeutung haben die für den Nachweis okkulten Bluts in Exkreten wie Stuhl bzw. Urin und in Körperflüssigkeiten entwickelten Teststreifen erlangt. Der Test beruht auf dem Nachweis des perioxidase-wirksamen Blutbestandteils Hämoglobin. Bei Anwesenheit von Peroxid tritt unter der Einwirkung des Hämoglobins bei einer Reihe geeigneter Indikatoren (Chromogene) eine erkennbare Färbung bzw. Farbänderung auf. Als Chromogene werden einerseits Guajak Harz, andererseits Chromogene aus der Klasse der Phenylaminoverbindungen wie z.B. o-Toluidin, m-Toluidin und ihre Säureadditionssalze, Benzidin, 3,3', 5,5'-Tetramethylbenzidin, Diphenylamin, 4-Diphenylsulfonsäure und 2,6-Dichlorindophenol- Natrium angewendet. In der DE-OS 26 52 545 wird die Mitverwendung von gewissen Thiazolverbindungen als Sensibilisatoren für die Chromogene empfohlen. Zum Nachweis von okkultem Blut im Stuhl bzw. im Urin bedarf es demnach eines geeigneten Trägers, wie z.B. ein Filterpapierstreifen, der mit der chromogenen Substanz getränkt ist (Teststreifen) und auf den eine Probe des zu untersuchenden Stuhls bzw. Urins aufgebracht wird. "Entwickelt" wird dann beispielsweise durch Zugabe von Peroxid-Lösung. Bei der Gestaltung des Teststreifens (Testbrief) im einzelnen sind verschiedene Lösungen vorgeschlagen worden, beispielsweise wird in der US-PS 3 996 006 ein Mehrloch-Testbrief beschrieben. Aus der inzwischen gewonnenen praktischen Erfahrung heraus kommt einer Forderung an die Teststreifenmethode zur Erfassung okkulten Blutes im Stuhl kritisches Gewicht zu: Die Methode soll nicht zu sensitiv sein, um falsch-positive Resultate wegen ihrer psychologischen und materiellen Folgen zu vermeiden. Die Methode darf umgekehrt auch nicht zu wenig sensitiv sein, um unter allen Umständen ein falsch-negatives Resultat zu vermeiden. In diesem Zusammenhang wirkt sich als besonders gravierende Störung aus, wenn das Chromogen bereits ohne Einwirkung des peroxidase-wirksamen Hämoglobins Farbveränderungen ähnlicher oder gleicher Art zeigt, wie die, die man in qualitativen Tests auf Hämoglobin bewertet. Derartige Störungen sind bei der Anwendung von Indikatorfarbstoffen (Chromogenen) aus der oben genannten Klasse der Phenylaminoverbindungen bekannt. Weiter beobachtet man bei Vertretern dieser Klasse von Chromogenen öfters ein unerwünscht rasches Nachlassen der Farbintensität bis zum völligen Verblassen. Insgesamt konnten daher diese an sich leicht und in genügender Reinheit zugänglichen Indikatorfarbstoffe nur sehr bedingt als Chromogene zum Nachweis von okkultem Blut im Stuhl bzw. Urin empfohlen werden. Es wurde nun gefunden, dass die Eignung der als Chromogene verwendeten Indikatoren im Test auf okkultes Blut in Exkreten und Körperflüssigkeiten, d.h. die Eignung sowohl des Guajak Harz-Farbstoffs als auch der einschlägig verwendbaren Phenylaminoverbindungen entscheidend ver bessert werden kann, wenn man das Trägermaterial für das Chromogen - in der Regel Filterpapier mit einer Kunstharzdispersion, insbesondere einer wässrigen (Meth)-acrylharzdispersion behandelt. Die als Chromogene verwendbaren Phenylaminoverbindungen fallen im allgemeinen unter die Formel EMI4.1 worin R1 einen hydrophilen Rest wie eine OM- oder eine SO3M-Gruppe, worin M für Wasserstoff oder ein Metallkation steht oder einen Rest EMI4.2 ouer vvasserstott, R2, R3 und R4 unabhängig voneinander Wasserstoff oder einen niederen Alkylrest, vorzugsweise einen Methyl reste R Wasserstoff oder zusammen mit A ein Chinonimin und A Wasserstoff oder einen Rest EMI4.3 bedeutet mit der Massgabe, dass maximal zwei Phenylreste im Molekül vorhanden sind und die Summe der numerischen Werte der Indexzahlen bei R1, R2, R3 und R4 an einen Phenylrest den Wert 6 nicht überschreiten soll. Jedoch sind auch andere Chromogene dem Verfahren gemäss der Erfindung zugänglich. Genannt seien das o- und das m-Toluidin sowie ihre Säureadditionssalze, Benzidin, 3,3', 5,5' Tetramethylbenzidin, Diphenylamin, 4-Diphenylsulfonsäure und ihre Salze und 2,6-Dichlorindophenol-Natrium. Besonders wichtig für das erfindungsgemässe Verfahren ist das Guajak-Harz (Resina Guajaci). Es handelt sich hierbei um Harz der Guajakbäume (Guajacum officinale L. und Guajacum sanctum L.), beides in Süd- und Mittelamerika häufig vorkommende Baumarten. Ober Lignum Guajaci und Gewinnung des Guajakharzes in verschiedenen Qualitätsstufen informiere man sich aus 'Hagers Handbuch' der pharmazeutischen Praxis, Band I, zweiter berichtigter Neudruck, Springer Verlag (Berlin, Göttingen, Heidelberg) 1949, Seite 1397 und folgende. Im allgemeinen ist die dort als Resina Guajaci depurata beschriebene Qualität für Anfertigung von Papierstreifen zur Testung von Blut im Stuhl oder Urin ausreichend, jedoch können durch Chromatographie aus diesen Harzsubstanzen gewonnen werden, welche die chromogene Wirkung besitzen und die zusammen oder auch jede für sich zum Imprägnieren von Testpapier geeignet sind. In der Praxis bestimmt die Löslichkeit des Chromogens, speziell die Löslichkeit in Wasser den Applikationsmodus. Bei wasserlöslichen Chromogenen kann die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens zweckmässig so vorgenommen werden, dass man die wässrige (Meth)-Acrylharzdispersion gegebenenfalls in Verdünnung zusammen mit den Chromogenen, insbesondere denen der vorstehenden Formel ansetzt, und den Träger, speziell das Filterpapier mit der so erhaltenen wässrigen Lösung imprägniert. Wasserunlösliche Chromogene wie Guajakharz löst man in geeigneten organischen Lösungsmitteln und imprägniert damit das Papier. Anschliessend kann es mit der wässrigen Dispersion behandelt werden. Man kann aber auch das synthetische Polymere als Trockensubstanz gleichzeitig mit dem Chromogen im organischen LM lösen und beide simultan auf das Papier aufbringen. Dabei können hinsichtlich der Auswahl der Träger, insbesondere der Filterpapiere, der Konzentration und der Auftragsweise der Farbstoff-Indikatoren die Erfahrungen des Standes der Technik übernommen werden. * Auch die umgekehrte Reihenfolge des je weiligen Vorgehens ist möglich. Als Richtwert für die Konzentration der (Meth)acrylharzdispersion im wässrigen zum Imprägnieren vorgesehenen Medium kann 1 bis 10 Gew.-t vorzugsweise bis 5 Gew.-%, speziell ca. 3 Gew.-% angesehen werden. Gegebenenfalls kann die Verdünnung der ursprünglichen wässrigen (Meth)-acrylharzdisperson, beispielsweise der Handelsformen auch unter Zusatz eines geeigneten organischen Verdünnungsmittels, wie beispielsweise Athanol vorgenommen werden. Entscheidend für das Gelingen des Verfahrens ist, dass mit einer ausreichenden Menge des Chromogens pro Flächen- bzw. Raumeinheit des Trägers imprägniert wird. Die pro individuelles Chromogen benötigten Mengen können weitgehend als bekannt betrachtet werden. Als Richtwerte für den Gehalt an (Meth)-acrylharz des auf dem Filterpapier aufzubringenden Films können pro Flächeneinheit Filterpapier Werte von 0,1 bis 10 mg Harz/cmê Fläche angesehen werden. Bei Verwendung der besonders bevorzugten Dispersionen aus Methacrylsäure/Athylacrylat im Verhältnis 1 : 1 mit einem Molgewicht von ca. 259'000 kommen vorteilhaft zwischen 0,2 und 0,8 mg Harz/cm2 Fläche, vorzugsweise um 0,3 mg Harz/cm2 Fläche infrage. Die Konzentration an den Chromogenen wird vorteilhafterweise so bemessen, dass zwischen 0,001 - 10 mg des Indikatorfarbstoffs auf einen cm2 der Träger- fläche entfallen, in Abhängigkeit von den Daten des individuellen Farbstoffs. So rechnet man beispielsweise, dass zur Imprägnierung eines cm2 Filterpapier eines Teststreifens 0,2 bis 200 pg vorzugsweise 1 bis 10 pg o-Toluidin bzw. m-Toluidin bzw. eine entsprechende Menge ihrer Säureadditionssalze 1 bis 100 pg vorzugsweise 10.g Benzidin 1 bis 200 pg vorzugsweise 20 pg 3,3', 5,5' Tetramethyl benzidin 20 bis'2 000 pg vorzugsweise 500 pg Diphenylamin 50 bis 5 000 pg vorzugsweise 1 000 pg 4-Diphenylamin sulfonsäure, 20 bis 1 000 pg vorzugsweise 100 pg Guajakharz 2 bis 100 g vorzugsweise 10 g gereinigtes Guaj akharz eingesetzt werden. Die Imprägnierung kann in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch Besprühen oder durch Eintauchtechniken vorgenommen werden. Durch die Imprägnierung mit den genannten Acrylharzen lässt sich erfindungsgemäss sowohl die Empfind :lichkeit als die Ablesbarkeit des Blutnachweises in Urin und Stuhl erheblich verbessern. Die Grenzen des sicheren Nachweisbereichs für Hämoglobin im Urin konnten bei Verwendung von o-Toluidiniumchlorid als Indikator.von 250 - 1000 mg/l auf 100 - 5000 mg HB bei Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens ausgedehnt werden. Die Konturen der für die Erkennung massgeblichen Farbstoffflecke sind beim erfindungsgemässen Vorgehen schärfer und der Gesamtuntergrund zeigt weniger Eigenfärbung. Günstig wirkt sich für das Verfahren auch das wesentlich langsamere Verblassen der Farbflecke verglichen mit den unbehandelten Proben aus. Besonders verdient hervorgehoben zu werden, dass die störenden Farbentwicklungen vor dem eigentlichen "Entwickeln" ausbleiben, wodurch die Nullwerte deutlich negativ bleiben. Man erreicht auch je nach individueller Empfindlichkeit eines Chromogens, seiner Menge sowie der Menge an Polymeren abgestufte Empfindlichkeiten und gewinnt vor allem eine wesentlich bessere Sicherheit bei Erkennen niedriger Blutkonzentrationen. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Harzen, die durch Copolymerisation von Acryl- bzw. Methacrylsäureestern von C1 - C5-Alkoholen, vorzugsweise mit Methanol oder Äthanol und im Gewichtsverhältnis 1 : 4 bis 2 : 1 hergestellt worden sind. Erwähnt sei insbesondere die Imprägnierung mit wässrigen Dispersionen von Harzen, die durch Copolymerisation von Methacrylsäure mit Athylacrylat, vorzugsweise im Gewichtsverhältnis 1 : 1 hergestellt worden sind. Vergleichsversuche Die begleitende fotografische Dokumentation baut auf dem an sich bekannten Nachweis des katalytisch wirksamen Blutbestandteils Hämoglobin durch Oxidation des Indikatorfarbstoffs mit Peroxid als Oxidationsmittel auf. A. Versuchsreihe mit o-Toluidiniunchlorid als Indikator. a. Vorbereitung der Testpapiere ohne Acrylharzimprägnierung Rundfilter ( = 12,5 cm, EDEROL Nr. 1) wurden in eine wässrige Lösung von o-Toluidiniumchlorid (0,1 g/100 ml dest. H20) getaucht und anschliessend mit dem Föhn getrocknet. (Siehe Fotografie LJ.-Nr. 5932 - 45e) b. Vorbereitung der Testpapiere mit Acrylharzimprägnierung. Rundfilter, die zunächst wie unter a. vorbehandelt waren, werden in eine Dispersion eines Athylacrylat-Methylmeth- acrylat-Methacrylsäure-Copolymerisats im ungefähren Verhältnis 70 : 30 : 1 (3 "sig in H2O) getaucht und eben falls mittels eines Föhns getrocknet. (Siehe Fotografie LJ.-Nr. 5932 - 45f) c. Vorbereitung wie unter b., nur dass eine andere Polymer dispersion, nämlich aus Äthylacrylat-Methacrylsäure (im ungefähren Verhältnis 1 : 1, 3 tig in H2O bestehend, verwendet wird. (Siehe Fotografie U.-Nr. 5932 - 45g) B. Versuchsreihe mit Guajak-Harz als Indikator. a'. Vorbereitung von Testpapieren ohne Acrylharz imprägnierung Rundfilter ( = 12,5 an, EDEROL Nr.1) werden in eine Guajakharzlösung (0,5 g/100 ml Isopropanol p.a) getaucht und mit einem Föhn ge trocknet. (Siehe Fotografie LJ. -Nr. 5932 - 47a) b'. Filterpapiere - wie bei a'. behandelt - werden in eine Acrylatdispersion, wie unter b. beschrieben (3 tig in H20), getaucht und mit dem Föhn getrocknet. (Siehe Fotografie LJ.-Nr. 5932 - 47b) C. Auftragung von Hämoglobin-Lösungen Jedes gemäss A. bzw. B. imprägnierte Filterpapier wurde mit Bleistift in der unten angezeigten Weise markiert: EMI11.1 I;ut ctie numerlerten Stellen werden nun beginnend mit einem Blindwert (50 l dest. H2O) definierte Hämoglobinlösungen in ansteigender Menge aufgetragen. (Stammlösung = 4 % Hämo globin mit H20 dest. auf 0,004 % verdünnt.) Auf die einzelnen numerierten Stellen wurden aufgetragen: Nr. 1 Blindwert : 50 l dest. H20 2 1 l : 40 ng Hämoglobin 3 5 \il : 200 ng Hämoglobin 4 10 l : 400 ng Hämoglobin 5 20 rul : 800 ng Hämoglobin 6 50 ul : 2000 ng Hämoglobin D. Entwickeln Nach dem vollständigen Aufsaugen der Hämoglobin-Lösungen wurde mit einem Tropfen Entwicklerflüssigkeit entwickelt: (alkoholisch-wässrige Peroxid-Lösung mit 4 OQ Peroxidgehalt). In Abständen von 30 sec., 2 min., 5 min. und 15 min. wurden Aufnahmen gemacht. Polaroid-Kamera, Blende 16, Belichtungszeit 1/60 sec. Vorsätze: Close-up-Set mit Blitzlichtfilter, Stellung M, Abstand zum Filter: 30 cm) E. Auswertung der Ergebnisse: Beim Vergleich der den Stand der Technik repräsentierenden unbehandelten Serien Aa (Fotografie LJ. -Nr. 5932 - 45e) und Ba' (Fotografie LJ. -Nr. 5932 - 47a) mit den anmelde gemäss präparierten Serien Ab und Ac (Fotografie LJ.-Nr. 5932 - 45f bzw. 5932 - 45g) und Bb' (Fotografie LJ.-Nr. 5932 - 47b) fällt auf Anhieb die grössere Farbintensität und schärfere Begrenzung der korrespondierenden Farbflecke in den anmeldegemässen Serien ins Auge. Ein eingehender Vergleich zeigt, dass in den unbehandelten Serien Aa und Ba' bereits Hämoglobin gemäss Position Nr. 3, d.h. in Konzentrationen von 200 ng, nicht mehr als positiv bewertet würden, während in den anmeldegemäss präparierten Serien Ab und Bb' kein Zweifel an dem positiven Resultat bestehen kann. Bei den anmeldegemäss präparierten Serien gibt für den Fachmann bis zum Ablauf von 2 min. sogar die niedrigste Konzentration (Position 2) noch ein positives Resultat. Bei den Filtern Aa und Ba', die den Stand der Technik repräsentieren, sind ab 2 Minuten nach Entwicklung eindeutig positive Resultate überhaupt nicht mehr zu erhalten. Ganz anders die Situation bei den anmeldegemäss präparierten Ab, Ac und Bb'. Zusammenfassend stellen wir fest, dass durch die beiliegende fotographische Dokumentation die Uberlegenheit der anmeldegemässen Ausführung der infragestehenden Tests tatsächlich ad oculos demonstriert wird.

Claims: Patentansprüche 1. Verbesserte Schnelldiagnostika zur diagnostischen Erfassung von Blut in Exkreten und Körperflüssigkeiten, bestehend aus mindestens einem festen Träger, der mit einer chromogenen Substanz als Indikator beladen ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial mit Acryl- oder/und Methacrylharz imprägniert ist. 2. Verbesserte Schnelldiagnostika gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der feste Träger als Teststreifen aus gebildet und dass das Trägermaterial mit chromogenen Phenyl aminoverbindungen oder Guajakharz beladen und mit Acryl oder/und Methacrylharz imprägniert ist. 3. Verfahren zur Herstellung von verbesserten Schnelldiagnostika nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den festen Träger mit wässrigen Dispersionen von Acryl- oder/und Methacrylharzen imprägniert. 4. Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man mit wässrigen Dispersionen von Acryl- oder/und Methacryl harzen mit anionischem Charakter imprägniert. 5. Verfahren gemäss Anspruch 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, dass man mit wässrigen Dispersionen von Harzen imprägniert, die durch Copolymerisation von Acryl- oder/und Methacryl säureestern von C1 C C3-Alkoholen, vorzugsweise C1 und/oder C2-Alkoholen und Im Gewichtsverhältnis 1 : 4 bis 2 : 1 hergestellt worden sind. 6. Verfahren gemäss den Ansprüchen 3 bis 5, dadurch gekenn zeichnet, dass man mit wässrigen Dispersionen von Harzen imprägniert, die durch Copolymerisation von Methacryl säure mit Äthylacrylat, vorzugsweise im Gewichtsver hältnis 1 : 1 hergestellt worden sind. 7. Verfahren zur Herstellung von verbesserten Schnell diagnostika nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die chromogene Substanz und das Acryl- oder/und Methacrylharz in einem geeigneten organischen Lösungs- mittel löst und damit das Trägermaterial imprägniert.

Inventors: HARTL, ROLAND, KRAMER, DIETER, DR., LEHMANN, KLAUS, DR., Krämer, Dieter, Dr.
Applicants: ROHM GMBH
Application year: 1979
Main classification: G01N33
IPC codes: G01N33