文献の方法に従い還元型結晶を調製した。培養は嫌気的に行ったが、集菌操作は装置の都合、嫌気的に行うことができず大気下で行った。すべての精製操作はグローブボックス内で嫌気的に行い最終精製標品を得た。[NiFe]ヒドロゲナーゼを活性化状態で維持するために、グローブボックス内の気相の組成は(97±1%窒素,3±1%水素)となるように維持した。
 結晶化はシッティングドロップ蒸気拡散法により行った。0.29mMヒドロゲナーゼ、25mMTris-HCl(pH7.4)、30%2-methyl-2,4-pentanediol(MPD）となるように混合した溶液に種結晶をシードし調製したドロップを、25mMTris-HCl(pH7.4)、40%MPDを含むリザーバー溶液に対して蒸気平衡させた。結晶化プレートを10ºCに静置し結晶成長させた。結晶析出後、結晶化プレートをガス不透過フィルム(バリア三方袋KC-3-12、フィルム厚：0.06mm、フィルム構成：KOP20/ドライラミ/CPP40)でパックし、パック内の気相を100%窒素で置換し10ºCで24時間静置した。調製した還元型結晶は、窒素ガスで満たされたグローブボックス内で低温窒素気流により凍結し、液体窒素中で測定まで保管した。
 還元型結晶について、BL44XUにおいて窒素気流によって100Kに冷却し波長0.9ÅのX線で回折実験を行った。収集したデータセットはデータプロッセッシング、データマージング、データスケーリングを行った。その後、標準型[NiFe]ヒドロゲナーゼ(PDBID:4U9H)をサーチモデルとして、分子置換を行い初期位相を計算した。モデルの構築・修正と異方性温度因子を考慮した構造精密化を行った。精密化では、すべての可能な水素が結合したモデルではなく、活性部位にのみヒドリドが結合したモデルを用いて構造精密化を行った。

カテゴリ: 化学
質問: 今回の実験でパック内の気相を100%窒素で置換し10ºCで静置してから10時間経過した場合、静置させる残り時間は何時間ですか。
回答: 静置させる残り時間は14時間です。

カテゴリ: 化学
質問: 結晶化に使用した溶液に30%MPDが含まれていた場合、リザーバー溶液との差は何MPDですか。
回答: リザーバー溶液との差は10%MPDです。

カテゴリ: 化学
質問: グローブボックス内の気相の組成の、窒素の割合と水素の割合の差は何%ですか。
回答: 窒素と水素の割合の差は94%です。

カテゴリ: 化学
質問: ガス不透過フィルムを10枚用意した場合、フィルム厚は全部で何mmになりますか。
回答: ガス不透過フィルムを10枚用意した場合、フィルム厚は全部で0.6mmになります。