HdN₂ORの精製は既報のやり方に従った[3]。続いて、結晶化はHampton Research社のスクリーニングキットPEG/ION Screenを用い、ハンギングドロップ法にて4°Cで行った。結果、No. 27（0.2 M Sodium acetate、20% PEG 3,350）で微結晶が得られ、続いてその条件をもとにアディティブスクリーニングにより結晶化最適条件を検討した。最終的に、HdN₂OR濃度20mg/mL（20mM Tris-HCl, pH8.0）、0.3M Sodium acetate、19% PEG 3,350、0.04M EDTA の条件で 0.2×0.1×0.2mm³程の結晶が得られた。X線回折実験にはSPring-8 BL44XUを用いて測定温度100Kで行った。抗凍結剤として母液に終濃度15%となるよう2-methyl-2,4-pentandiolを加えたものを使用した。
 
 本結晶の回折は、波長0.9000ÅのX線ビーム1秒の露光（振動角1度）とDectris社製EIGER 16M検出器を用いておよそ〜1.2Å程の分解能で得られた。空間群はP2₁で、格子パラメーターは a=73.6Å、b=85.4Å、c=94.0Å（β=103.3°）であることがわかった。そのまま回転角180度まで連続データ測定後、測定回折データをXDS[6] により処理し、最終的に分解能1.20Åまでの回折データを完全性97.6%で取得することに成功した。HdN₂ORの分子量（およそ65kDa）でMatthew coefficient (V_M)を見積もったところ、2分子でVᴍ=2.21Å³/Da，Vₛₒₗᵥ=44.4%であることがわかった。続いて、この回折データをもとに、本蛋白質とアミノ酸配列相同性が40%程度のParacoccus denitrificans N₂OR (PDB ID: 1FWX) [7] の座標データを用いて分子置換ソフトMolRep[8]により初期位相の探索を行った。結果、解として非対称単位中に2分子（ホモダイマーとして1分子）のHdN₂OR分子を見つけることに成功し、さらにRefmac5[9]を用いた構造精密化後、最終的にR_factor=14.0%、R_free=16.0%で精密化終了とした。

カテゴリ: 化学
質問: この実験を改良するたびにR_factorとR_freeが元の値の10%ずつ低下する場合、5回以内にR_factorの数値が10%未満になりますか。
回答: はい、R_factorの数値は10%未満になります。