2007年から2013年までの間に富山県および周辺県（新潟県、長野県、岐阜県、愛知県、石川県、福井県）の猟友会によって合法的に捕獲されたニホンイノシシを解析の対象とした。捕獲直後に猟友会によって雌雄判別された個体から骨格筋の一部を摘出し、99％エタノールで固定・保存した標本を、富山県自然保護課を介して入手した。毎年、富山県からは100検体、新潟県からは50検体、これ以外の各県からは10検体を目安に、収集された。一連の標本の内訳として、オス496個体、メス483個体、および性別不明61個体の合計1040個体であった。エタノール固定された筋肉組織から米1粒程度の肉片を摘出し、Gentra Puregene Tissue Kit（キアゲン社）を用いて総DNAを抽出した。そして、一部の個体を対象として、Watanobe et al.(2003)の方法に従ってミトコンドリアDNAの調節領域の部分塩基配列を解読した。その後、当該領域を効率的に解読するためのプライマーを新たに作成し、これを用いてすべての標本についてPCR法に基づく特異的な増幅を行った。PCR反応については、GeneAmp PCR system 9700(アプライド・バイオ社)を用いて、94℃、1分間の初期加熱の後、94℃、15秒間のDNA熱変性、55℃、15秒間のプライマーとの結合、72℃、30秒間のDNA伸長反応を35サイクル行い、72℃、7分間の最終伸長反応を行った。増幅のためのポリメラーゼとして、TaKaRa Ex taq(タカラ・バイオ社)を用い、試薬の分量はそのマニュアルに従った。得られた増幅産物について、ExoSAP-IT(アマシャム・ファルマシア社)を用いて精製した後、BigDye Terminater ver3.1 Cycle Sequencing Kit(アプライド・バイオ社)を用いて、サイクルシーケンス法に従い、増幅断片の生成と蛍光標識を行った。得られた産物について、ABI PRISM 310 Genetic Analyzer(アプライド・バイオ社)を用いて、塩基配列(約600塩基対)の解読を行った。塩基配列のアライメントには、ClustalW program(Thompson et al.1994)を用いた。それぞれの塩基配列について、Watanobe et al.(2003)によって報告されているハプロタイプ(J1~J23)と比較し、各個体のハプロタイプを決定した。解析したすべての個体について、ハプロタイプと捕獲場所を地図上にプロットした。これを年毎に比較することにより、富山県およびその周辺地域におけるニホンイノシシの遺伝的組成および移動経路の推定を行った。また、同じ調査日に、同じ場所で複数個体が捕獲された場合、それら個体のハプロタイプを比較した。

カテゴリ: 生物学
質問: DNA伸長反応と最終伸長反応は、合計で何秒間行われましたか。
回答: DNA伸長反応と最終伸長反応は、合計で1470秒間行われました。