質量分析による過酸化水素処理した血清アルブミンの酸化修飾の定量と、酸化アルブミンの免疫による自己抗体の産生
  
 背景
 Myeloperoxidase抗好中球細胞質抗体 (MPO-ANCA) は、ANCA関連血管炎患者に観察される自己抗体であり、好中球MPOを抗原とする。近年、我々は、過酸化水素処理により酸化修飾を導入したマウスMPOをマウスに免疫することで、正常なMPOに対する自己抗体が産生されることを示した。本研究では、この現象がタンパク質の種類によらない普遍的な現象であることを示すために、マウス血清アルブミンに酸化修飾を導入し、マウスに免疫することで自己抗体が産生されるかどうかを検証した。
 
 方法
 アルブミンに酸化修飾を導入する条件を検討するために、ウシ血清アルブミン (BSA、2.5mg/mL)を0～20 mMの過酸化水素、0.01mMの塩化鉄で37℃、30分間処理した。反応後、直ちにTCA沈殿を行うことで反応を停止し、Trypsin消化後、生じたペプチド (3ug) をLC-MS/MS (Triple TOF5600+、SCIEX)で解析した。Protein Pilot(SCIEX)を用いて295種類の翻訳後修飾を考慮したデータベース検索にかけて網羅的な翻訳後修飾の同定を行った。検出された酸化修飾ペプチドのXICから酸化修飾の定量を試みた。免疫実験では、同条件で酸化処理を行ったマウス血清アルブミン(MSA)もしくは未処理のMSA をfreundʼs adjuvantと混合し、8週齢のメスC57BL/6Jマウス(n=5)に腹腔内投与した。抗原はDay1とDay21に2回投与し、Day34に採血した。採取した血清を一次抗体としたELISAによってMSAに対する抗体価を評価した。
 
 結果と考察
 以前にMPOを酸化処理した際には、Metは過酸化水素濃度が0.02mMで、Trpは0.2mM で酸化を受け、未酸化の物は検出されなくなった。それに対して、BSA中のMetは0.2mMの過酸化水素ではほとんど酸化をうけず、20mMで8割程度が酸化を受けた。またTrpは20mMでもほとんど酸化をうけなかった。タンパク質の立体構造におけるMetやTrpの位置の違いが酸化の受けやすさに影響を与えている可能性が考えられた。この結果を受けて、 MSA を20mM の過酸化水素で処理し、マウスへ免疫を行った。その結果、MSAを免疫したコントロールと比べて、酸化MSAを処理したマウス血清の抗MSA抗体価は有意に増加した。コントロールの吸光度の平均値+2SDを閾値とした場合の陽性率は80%であった。以上のことから、酸化タンパク質の免疫による自己抗体の誘導は、タンパク質の種類によらない普遍的な現象であることが示唆された。

カテゴリ: 生物学
質問: 採血をしたのは、2回の抗原を投与してから何日後ですか？
回答: 採血をしたのは、2回の抗原を投与してから13日後です。