実験：
　8位のメチル基をN-メチル基で置換したリボフラビンは前大阪市大の笠井氏より提供された[3]。置換リボフラビンをFAD合成酵素によりFAD型にし、C18のHPLCカラムを用いて精製した。ブタ腎臓由来のD-アミノ酸酸化酵素（DAO）は、大腸菌で大量発現したのち既報の通り精製を行い、2 M KBrを含む緩衝液(100 mM Na-ピロリン酸, pH8.3)での透析によりFADをはずした後、KBrを含まない緩衝液で透析してから、人工FADを加えることで再構成した。再構成したDAOを用いて、野生型酵素と同様にBenzoateと共結晶化すること[1]により、X線構造解析に適した結晶が得られた。Benzoateを含まない沈殿剤溶液（200 mM Na-Acetate, 100 mM Na-citrate, 30 %(w/v) PEG4000）で結晶を洗った後、10mMのD-ロイシン、D-セリン、D-バリンをそれぞれ沈殿剤溶液に加えたものに12時間漬けることにより、基質アミノ酸のソーキングを試みた。ソーキング後の結晶は，そのままループですくい-180℃の条件下でBL38B1にてデータ収集を行った。位相決定は、既に構造が分かっている野生型DAO（PDBID; 1VE9）のBenzoate複合体構造をモデル構造とした分子置換法により決定し、全てのデータについて構造解析を行った。また、構造解析の結果、Benzoateが活性中心に残っていた場合には、さらに濃度をあげ、ソーキング時間を長くするなどの検討をおこない、再測定をした。それぞれの基質について複数のデータを収集したが、最も分解能が良かったものについて表１に纏めた。

カテゴリ: 化学
質問: 前大阪市大の笠井氏より提供されたのは、何を何で置換したリボフラビンですか？
回答: 前大阪市大の笠井氏より提供されたのは、8位のメチル基をN-メチル基で置換したリボフラビンです。

カテゴリ: 化学
質問: 置換リボフラビンは何によりFAD型にされ、何を用いて精製されましたか？
回答: 置換リボフラビンはFAD合成酵素によりFAD型にされ、C18のHPLCカラムを用いて精製されました。