DNA次世代シーケンス技術による分析
 シリカゲルを用いて乾燥した葉からCTAB法によりDNAを抽出し(Doyle and Doyle 1990)、MIG-seq法(Suyama and Matsuki 2015)を用いて一塩基多型を取得した。Suyama et al.(2022)のプロトコルに従って2回のPCRにより、ライブラリを作成した。まず、1st PCRではMIG-seq primer set 1(Suyama and Matsuki 2015)を用いて単純反復配列(SSR)に挟まれた領域(inter-simple sequence repeat, ISSR)を増幅した。次に、AMpure XP(Beckman Coulter, Brea, California)を用いて1st PCR産物の精製を行った。2nd PCRでは、精製された1st PCR産物にIllumina sequence adaptorとサンプルを識別するためのインデックス配列を付加した。その後、2nd PCR産物を等量ずつ混合し、350bp以上の断片を抽出した。シーケンスにはMiSeqとMiSeq Regent kit v3 150 cycle(Illumina, San Diego, California)を用いた。シーケンスでは、Darkcycleを用いて、Read1,2ともに先頭の17塩基をスキップすることにより、80塩基ずつのリードを得た。
 配列データはTrimmomatic 0.39(Bolger et al. 2014)を用いて低品質およびアダプター配列を含む短いリードを除去し、さらに各リード80塩基のうち読み取り精度の低い両末端の1塩基ずつを取り除いた。SNPの検出はStacks 2.56(Rochette et al. 2019)を用いた。Stacksではまずサンプル毎に同一の配列を持つリードをまとめたStacksを作成し、一定のミスマッチを許してStacksをまとめることにより候補遺伝子座を作成する。次に、サンプル間で候補遺伝子座を比較することにより、全サンプルでの候補遺伝子座のカタログを作成する。本解析では、各Stackの最低Depth(m)=3、サンプル内の遺伝子座内で許容するミスマッチ(M)=2、サンプル間の遺伝子座内で許容するミスマッチ(n)=2のパラメータを用いた。SNPの選抜には3つの条件を用いた。サンプルの80%以上が保有するSNPを対象に、ヘテロ接合度の観察値が0.6以上およびマイナーアリルの観察数が3未満のSNPを除外した。
 得られたSNPを用いて、最尤系統樹の構築と集団遺伝構造解析、遺伝的多様性および近交度を推定した。最尤系統樹はRAxML 8.2.10(Stamatakis 2014)を用いて、Lewisによるascertainment biasを補正したGTRモデルにより推定した。集団遺伝構造解析として、PLINK 1.9(Chang et al. 2015)を用いた主成分分析(PCA)とADMIXTURE 1.3.0(Alexander et al. 2009)による遺伝的クラスタリング解析を行った。ADMIXTURE解析では、各個体が共通の祖先集団からいくつかの想定集団(クラスター: K)に分化したことを仮定し、各個体がそれぞれの想定集団に由来する遺伝的要素をどのような割合で保有しているのかを100%積み上げ棒グラフによって可視化した。最適KはCV error(交差検証)に基づいて推定した。また、Pophelper 2.3.1(Francis 2017)によりクラスタリング結果を可視化した。遺伝的多様性および近交度を評価するために、Stacksのpopulationsプログラムにより、遺伝的多様性の指標としてヘテロ接合度の観察値(Ho)・期待値(He)、塩基多様度(π)を、近親交配の程度を示す指標として近交係数(FIS)を推定した。

カテゴリ: 生物学
質問: シーケンスで得た、SNPの検出で使用する各リードは、何塩基ありますか？
回答: シーケンスで得た、SNPの検出で使用する各リードは、78塩基あります。