調査地と供試材料
 静岡県磐田市ではベッコウトンボの発生は桶ヶ谷沼、鶴ヶ池、人工池の3ヵ所で確認されている。桶ヶ谷沼自然環境保全地域は約50haからなり、その南側に位置する桶ヶ谷沼は周囲約1.7kmからなる。その桶ヶ谷沼の北側に位置する鶴ヶ池は周囲約1.5kmからなり、これらはいずれも自然の平地性淡水池沼である。また、トンボ類の発生を促進するために、2002年から桶ヶ谷沼の北東部に隣接する場所に人工池が設置されている。これは長さ1065×幅726×高さ303mm、容積180Lのプラスチック製コンテナ容器220個からなり、桶ヶ谷沼を考える会・磐田南高校と岩井里山の会によって管理されている。以後、本論文では桶ヶ谷沼地域にあるこれらの発生地を区別するために桶ヶ谷沼、鶴ヶ池、人工池とそれぞれ呼び分けることにした。ベッコウトンボは絶滅危惧種であり、また種の保存法の指定種であることから、本種の個体数に影響を与えないように本実験では羽化殻をDNA解析に用いることにした。2008年4月下旬に桶ヶ谷沼、鶴ヶ池、人工池でベッコウトンボの羽化殻をそれぞれ20個体ずつ採集したものを解析に使用した。
 
 DNAの抽出とRAPD解析
 遺伝子型解析のためのDNAは各個体の羽化殻から抽出した。それぞれの羽化殻からすべての脚を切断して10%SDS溶液中で実体顕微鏡を使いながら表面に付着した汚れをブラシにより除去し、99%エタノールですすぎ洗いをした。羽化殻のDNA抽出方法はWatts et al.(2005)および福永ほか(2006)の方法に従って行った。まず1個体につき6本の脚それぞれに対してDNeasy mini kit(QIAGEN)のカラムを1個ずつ使ってDNAを抽出した。抽出したDNAは個体ごとにまとめてエタチンメイト(NIPPONGENE)を使用してエタノール沈殿を行い、30ng/μlの濃度になるようにEB (QIAGEN)バッファーで調整した。これらのDNA溶液は解析まで-20°Cで保存した。RAPD-PCR反応液は鋳型DNAを2μl、2.5 mM dNTP混合液(TaKaRa)を1μl、10×反応バッファー(TaKaRa)を1.5μl、ExTaq(TaKaRa)を1units、プライマーを10pmol、DNase free水(Ambion)で最終容量を15μlとした。プライマーは10塩基のランダムプライマーが各20種類からなるプライマーセットのH、I、Y、Z(Operon Technologies)の合計80種類を用いた。PCR増幅にはサーマルサイクラー(Bio-Rad)を用いて、94°Cで3分間熱変性を行った後、94°Cで30秒、37°Cで30秒、72°Cで2分間の反応条件を45回繰り返し、最後に72°Cで5分間伸長反応を行った。PCR産物10μlにローディングバッファー1μlを加えて混和後に、1.8%のNuSieve3:1アガロースゲル(TaKaRa)を用いてTBE緩衝液中で100Vで30分間の電気泳動を行った。分子量を特定するために20bpと100bpの2種類のladderマーカー(Takara)も同時に泳動した。泳動後のゲルはエチジウムブロマイドで染色後、紫外線照射下で写真撮影をして増幅多型を検出した。再現性を得るためにPCRから電気泳動を2回繰り返し、再現性のあるプライマーのDNAバンドを記録した。各増幅バンドは分子量ごとにRAPDマーカーとして同定し、マーカーの存在を1、非存在を0とした。RAPD分析により得られたデータはLynch and Milligan(1994)の方法に従って解析した。DNA多型の遺伝的関係を解明するためにクラスター分析を行った。DNA多型間の遺伝的距離はAFLP-SUV version 1.0(Vekemans 2002)を使用してNei and Li(1979)の方法によって求めた。クラスター分析はPHYLIPパッケージ内のNEIGHBOURを用いて平均距離法(UPGMA法)によって行った。遺伝的多様度を解析するために、遺伝子多様度 (HE)、シャノンの情報指数(I)、遺伝的分化係数 (GST)、Analysis of molecular variance(AMOVA)を算出した。これらはARLEQUIN version 3.1とPOPGENE version 1.31を使って計算した。

カテゴリ: 生物学
質問: PCR増幅は合計で何分、行いましたか。
回答: PCR増幅は合計で143分、行いました。