塩基配列の決定
 本研究では、魚類の遺伝学的解析において最もよく用いられている遺伝子領域の一つであるミトコンドリアCytb遺伝子領域とDNAバーコーディングに用いられているミトコンドリアCOI遺伝子領域および核のRAG1遺伝子領域を解析した。
 各個体の鰭から、QIAGENを用いてDNAを抽出した。抽出したDNAをテンプレートとして、KOD–Dash(東洋紡)を用いてPCR法にて以下の条件で各々の遺伝子領域の増幅を行った。Cytb遺伝子では、はじめに予備変性を98℃で4分間行い、次に熱変性98℃で70秒間・アニーリング63–57℃で50秒間・伸長72℃で90秒間の条件で30サイクル行い、最後に72℃で7分間伸長を行った。COI遺伝子では、予備変性を98℃で4分間行い、次に熱変性98℃で70秒間・アニーリング63–57℃で50秒間・伸長72℃で90秒間の条件で30サイクル行い、最後に72℃で7分間伸長を行った。RAG1遺伝子では、nested PCRを行った。1回目のPCRでは、プライマー(センスR21FとアンチセンスR21R)を用いて、予備変性を98℃で4分間行い、次に熱変性98℃で70秒間・アニーリング55–52℃で50秒間・伸長72℃で3分間の条件で30サイクル行い、最後に72℃で7分間伸長を行った。2回目のPCRでは、プライマー(センスNR13FとアンチセンスR13R)を用いて、予備変性を98℃で4分間行い、次に熱変性98℃で70秒間・アニーリング67–63℃で50秒間・伸長72℃で90秒間の条件で30サイクル行い、最後に72℃で7分間伸長を行った。
 反応終了後は、1.4%アガロースゲルを用いて、サイズマーカーであるMarker4 (Wako)と共にPCR産物を電気泳動し、トランスイルミネーター上でPCRの成否を確認し、QIAGENを用いてPCR産物を精製した。PCR産物を送付し、株式会社マクロジェン・ジャパンに委託して塩基配列を決定した。得られた塩基配列は、日本DNAデータバンク(DDBJ)に登録した。

カテゴリ: 生物学
質問: RAG1遺伝子のPCRにおけるアニーリング温度の最大温度は、1回目と2回目で何℃違いますか。
回答: RAG1遺伝子のPCRにおけるアニーリング温度の最大温度は、1回目と2回目で12℃違います。

カテゴリ: 生物学
質問: COI遺伝子の遺伝子領域の増幅に掛かった時間は、合計で何分ですか。
回答: COI遺伝子の遺伝子領域の増幅に掛かった時間は、合計で116分です。