背景と研究目的：
一般に、金属を保持したタンパク質の分子内部に見られる「金属結合部位（活性中心）」は、そのタンパク質が生体中で定められた機能を発揮するために最適な幾何学構造をとっていると考えられている。この概念は、1968年に初めてProf. R.J.P. Williamsによって“エンタティック（entatic）”という言葉を用いて提案され[1]、今もなお、酵素や触媒化学等の分野で幅広く引用・支持され続けている。一方、20種類のアミノ酸が数百〜千個繋がったポリペプチド鎖から成るタンパク質では、その独特の折り畳まれ方に応じて、局所的に強固な立体構造を保持する領域や、比較的、変化を起こし易い“柔らかい”部分などを併せ持つ構造的性質を有する。そのため、タンパク質分子内部で「どういった配位環境が特別な活性金属中心（構造）を生み出す要素となるか」について定義することは一般に難しいとされる。そこで、本研究では“エンタティック”に関わるタンパク質の立体構造情報を実験的に得るために、これまでよく知られている銅含有亜硝酸還元酵素（CuNiR（図１））を材料として用い、その“エンタティック”な部位としての２種類の銅結合部位（タイプ-1および-2銅部位）を異種金属イオンで置換し、その時にどのような構造的差異が生じるか調べることを目的とした。著者らはこれまでに様々な酸化還元金属酵素の分子間電子伝達について研究を継続しており[2,3]、本研究から得られる基礎データは、それら分子間電子伝達機構解明の一助になると期待される。

実験：

銅以外の金属を含む金属置換体タンパク質は、N末端に6xHisタグを導入した亜硝酸還元酵素を遺伝子工学的に作成し大腸菌での発現系を用いて発現させ、Ni-NTAアフィニティーカラムクロマトグラフィーで精製したものを用いた。精製後の試料は50mM EDTAを含む中性緩衝液中に一週間以上漬けることで金属を含まないアポ型タンパク質として調製し、その試料に対し各種金属（M2+: Co, Ni, Zn）イオンを含む緩衝液で透析する（４℃で一週間）ことで各金属置換体を調製した。続いて、過剰なM2+イオンを除去後、各金属置換体タンパク質の結晶化とX線回折実験を行った。X線回折実験は大型放射光施設SPring-8 蛋白研ビームラインBL44XUにて実施した。各々の回折データおよび構造精密化統計値を表１に示す。分子置換法により初期位相の決定およびRefmacによる構造精密化を行い、最終的にR因子値が〜20%程に到達したところで精密化を終了した。Znに置換した試料についてはタイプ-１銅部位およびタイプ-２銅部位がZnに置換された構造は確認できたが、分子表面の所々に不明瞭かつ解釈不能な電子密度が多く見られ、今回は精密化途中の段階で断念することとし、参考データ程度として扱うことのみにした。

実験：
著者らは銅以外の金属を含む金属置換体タンパク質は、N 末端に 6xHis タグを導入した亜硝酸還元酵素を遺伝子工学的に作成し大腸菌での発現系を用いて発現させ、Ni-NTA アフィニティーカラムクロマトグラフィーで精製したものを用いた。著者らは精製後の試料は 50 mM EDTA を含む中性緩衝液中に一週間以上漬けることで金属を含まないアポ型タンパク質として調製し、その試料に対し各種金属（M2+: Co, Ni, Zn）イオンを含む緩衝液で透析する（４℃で一週間）ことで各金属置換体を調製した。続いて、過剰な M2+イオンを除去後、各金属置換体タンパク質の結晶化と X 線回折実験を行った。X 線回折実験は大型放射光施設 SPring-8 蛋白研ビームライン BL44XU にて実施した。各々の回折データおよび構造精密化統計値を表１に示す。分子置換法により初期位相の決定およびRefmac による構造精密化を行い、最終的に R 因子値が〜20%程に到達したところで精密化を終了した。Zn に置換した試料についてはタイプ-１銅部位およびタイプ-２銅部位が Zn に置換された構造は確認できたが、分子表面の所々に不明瞭かつ解釈不能な電子密度が多く見られ、今回は精密化途中の段階で断念することとし、参考データ程度として扱うことのみにした。

カテゴリ: 物理
質問: 筆者らは試料を、金属イオンを含む緩衝液でどれくらいの期間かつ何度で透析しましたか。
回答: 筆者らは試料を4℃で一週間透析しました。