PpaZ2の予想アミノ酸配列をシグナル配列予測サーバー（https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）で解析し、開始Met から 50番Alaまでがシグナル配列であることがわかった（¹M,,,,AQ⁵⁰A（シグナル配列）---⁵¹ATHEV,,,¹⁷³Q）。その予測結果をもとに51番AlaからC末端の173番Glnまでの配列をGeneScript社の受託人工遺伝子合成によりDNA合成した。合成後、PCRによりN末とC末に制限酵素SmaIならびにEcoRI部位を導入し、それぞれの制限酵素で消化後、発現ベクターpMal-c5x（New England Biolabs）のXmnIならびにEcoRI部位の間に挿入することで、PpaZ2のN末端にマルトース結合蛋白質（MalE）が融合したMBP-PpaZ2の形で発現実験を試みた。PpaZ2遺伝子を挿入した発現ベクターを用いて大腸菌JM109を形質転換し、抗生物質アンピシリン（Amp）を含むLB寒天プレート培地（Amp濃度, 100µg/mL）に塗布し、37℃で一晩静置培養した。翌日、プレート上に生育したコロニーから5mLのLB+Amp液体培地に植菌し6時間37 ℃で振盪培養した。続いて、2LのLB+Amp液体培地へ植え継ぎ、さらに37℃で振盪培養を~4時間継続し600nmの吸光度が0.8程まで増殖したところで培養温度を27℃に下げ、発現誘導試薬イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）を終濃度0.1mMになるよう加え、さらに振盪培養を14時間継続した。培養後、遠心分離（5,000rpm, 10min, 4℃）により集菌した。
 集菌した大腸菌を1mM CuSO₄を含む 20mM Tris-HCl (pH8.0)で懸濁し、INSONATOR 201M（KUBOTA）で流水による水冷下、30分間連続運転モードで超音波破砕（出力: 160W）した。破砕後、遠心分離(12,000rpm、30min, 4℃)により上清の可溶性画分を回収し、20mM Tris-HCl (pH8.0）で平衡化したQ-セファロースカラム（2.5´ 25cm）にのせた。同一緩衝液で洗浄後、終濃度0から1MのNaCl直線濃度勾配をかけることで目的のタンパク質を溶出させた。目的タンパク質（MBP-PpaZ2）が含まれるフラクションを回収し、続けてアミロースレジンカラムアフィニティークロマトグラフィー（New England Biolabs）により精製を行った。平衡化バッファーは 200mM NaClを含む20mM Tris-HCl (pH8.0)溶液を用いた。また、溶出には10mM Maltose と200mM NaCl を含む20mM Tris-HCl (pH8.0)を用いた。目的タンパク質が含まれる画分をSDS-PAGE 確認後、限外濾過フィルター(VIVASPIN20-3K, Sartorius)を用いて濃縮し、MBP-PpaZ2を調製した。

カテゴリ: 化学
質問: 吸光度が0.8程まで増殖した時、培養温度は何度下げられましたか。
回答: 培養温度は10℃下げられました。