遺伝子座の分析は、Uesugi et al.(2005)の8プライマー(同一プライマーで2遺伝子座を検出するマーカーが2つある)を用いて10遺伝子座について行った。DNAの抽出は、DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN, Hilden, Germany)を用いた。プライマーは、ポストラベル法(Kikuta and Hayashi 2002)による蛍光標識反応をR6G-ddCTPで行うことができるように、Fwプライマーの5’側に「GTT」の配列を、Rvプライマーの5’側に「C」の配列を付加した。
 PCR増幅は、BIOTAQを用いて行い、反応液は5μLで、その組成は10×NH4Bufferが0.5μL、dNTP(2.5mM)が0.4μL、MgCl2(50mM)が0.3μL、各プライマー(50μM)が0.04μL×2、蒸留水が1.712μL、BIOTAQ(5U/μL)が0.008μLおよびテンプレートDNA溶液が2μLである。また、PCR反応は次の温度条件で行った : 94℃で3分の後、94℃で30秒・55℃で30秒・72℃で45秒を40サイクル繰り返し、72℃で10分間の後4℃に冷却した。増幅試料についてポストラベル法による蛍光標識を行い、サイズマーカーと混合してDNAシークエンサーで電気泳動を行った。これらの一連の分析は、かずさDNA研究所に委託した。
 アサザの日本集団の遺伝的多型性については、一遺伝子座当たりの対立遺伝子数(NA)、ヘテロ接合度(H)および近交係数(F)を算出した。また、集団内のクローンの識別率を評価するために、解析に用いた信頼性の高い4遺伝子座についてPI(Probability of identity)を、ソフトウェアGenAlEx6.5(Peakall and Smouse 2012)を用いて算出した。

カテゴリ: 生物学
質問: テンプレートDNA溶液を除いたPCR増幅の反応液は何μLですか？
回答: テンプレートDNA溶液を除いたPCR増幅の反応液は3μLです。