HmVALT-Hisを発現させたSf9細胞を培養し、得られた膜画分を可溶化後、アフィニティークロマトグラフィーによる精製、His-tagの消化、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー精製を経て、培養細胞1L当たり0.7mgの高純度HmVALTタンパク質を得た。 HmVALT溶液を用いて MemGoldにより結晶化条件のスクリーニングを行ったところ、複数の条件で3日以内に結晶が得られた。その中で状態の良い結晶が得られた条件を基にして、100mM NaClの塩条件で、緩衝液のpHを5.8から7.4の範囲、沈殿剤としてPEG (Polyethylene glycol) を13-46％（v/v）の範囲で変化させて、さらに結晶化の検討を行った。pH7.4で良好な結晶を与えた一方、7.4より高いpHでは結晶は得られず、5.8以下では結晶の状態が悪かった。沈殿剤については、PEG200、300、400、500MME、1000を検討した結果、PEG400の濃度が40.5-42.5%の範囲で、一片が100µmを超える四角錐型の結晶を再現性よく得られることがわかった。これを基に、pH条件、沈殿剤の種類と濃度を最適化し、良質な単結晶を得る条件を調べた。 最終的に、100mM NaCl、pH7.2、沈殿剤に40.4％(v/v)PEG400の条件で得た良質な結晶でX線回折データを収集した。

カテゴリ: 物理
質問: 現在、緩衝液がpH9.5だとすると、良好な結晶を得るためにpHいくつ分を酸性に近づける必要がありますか。
回答: pH7.4で良好な結晶が得られるので、9.5-7.4=2.1より、良好な結晶を得るためにpH2.1分を賛成に近づける必要があります。