Apoptóza

Apoptóza je jeden z hlavních typů programované buněčné smrti (PCD, někdy je s ní dokonce synonymizována), probíhající především u živočichů, ale v určitém slova smyslu i u rostlin a dalších skupin. Zahrnuje sled biochemických procesů vedoucích k typickým změnám vzhledu buňky (degradace cytoskeletu a následná změna tvaru cytoplazmatické membrány, smrštění buňky, fragmentace jádra i chromozomů uvnitř). Následně dochází k šetrnému odstranění zbytků této buňky (a nikoliv k zánětu), čímž se apoptóza v základech liší od nekrózy. Mezi nekrózou a apoptózou však není ostrá hranice a často se tyto jevy kombinují, čímž dochází k nejednoznačně pojmenovatelným typům buněčné smrti.

Apoptózu lze v mnohých případech vnímat jako pozitivní proces, ke kterému například lidské tělo sahá v průběhu svého vývoje (známým příkladem je proces vzniku prstů tak, že buňky mezi budoucími prsty spáchají apoptózu). Apoptoticky však umírají i různé poškozené buňky, a to buď na základě „vlastního rozhodnutí“ samotné buňky (vnitřní cesta), nebo díky buňkám imunitního systému.

Od počátku devadesátých let se množství publikací věnovaných tomuto tématu prudce zvýšilo. Mimo skutečnost, že je to významný biologický fenomén jako takový, je dnes známo, že porucha schopnosti apoptózy může u člověka způsobit poměrně široké spektrum onemocnění. Nadměrná apoptóza může vést k hypotrofii tkáně (některé typy ischemie), naopak nedostatečná apoptóza může obecně způsobit nadměrné pomnožení buněk (proliferaci), a tak například vést k rakovině.

Objev apoptózy a původ slova 

Programovanou buněčnou smrt poprvé popsali vědci již v devatenáctém století. Německý přírodovědec Carl Vogt byl v roce 1842 pravděpodobně prvním, kdo popsal základní princip apoptózy. Podrobnější schéma tohoto procesu později v roce 1885 popsal německý cytogenetik Walther Flemming. Znovu se však vědci začali zabývat tímto fenoménem až v druhé polovině dvacátého století. John F. R. Kerr a jeho kolegové v roce 1972 poprvé použili termínu apoptóza (z řec. apoptosis — padání). Samotné slovo apoptóza je totiž inspirováno skutečností, že při padání listů na podzim musí dojít k apoptotickému odumření vrstvy buněk v řapíku. Není však bez zajímavosti, že termínu apoptóza již ve starověku používali Hippokratés či Galénos ve smyslu „plešatění“, „řídnutí kostí“ nebo „odpadávání strupů“.

Apoptóza je v současnosti velmi intenzívně zkoumána. Počet publikací o apoptóze roste geometrickou řadou a roku 2005 je o apoptóze více než 100 000 vědeckých článků. Roku 2002 dostali Sydney Brenner, H. Robert Horvitz a John E. Sulston Nobelovu cenu za fyziologii a lékařství za výzkum v oblasti genetické regulace vývoje orgánů a programované buněčné smrti.

Morfologické změny buňky 

Buňka procházející apoptózou se odlišuje od běžných buněk zejména těmito rysy:

 Smrštění buňky
 Blebbing membrány (váčkovité výrůstky z membrány), způsobený rozkladem kortikálního cytoskeletu (tvořen aktinem a fodrinem)
 Změny v struktuře membrány, např. vysunutí fosfatidylserinu na její vnější povrch („eat-me“ signál)
 Poruchy propustnosti mitochondriální membrány a uvolňování cytochromu c
 Pyknóza chromatinu (kondenzace do kompaktních shluků), načež proběhne karyorrhexe (tzv. internukleozomální štěpení DNA do relativně malých úseků) a následný rozpad jádra (karyolýza)
 Rozpad buňky na apoptotická tělíska

Funkce

Udržení rovnováhy 
U dospělce je obvykle množství buněk v průběhu času relativně neměnné, a právě rovnováhu mezi buněčnou smrtí a buněčným dělením zajišťuje apoptóza. Když se buňky opotřebují či přestanou správně pracovat, jsou díky proliferaci okolní tkáně nahrazeny novými. Tato rovnováha je jedním z principů udržení vnitřní homeostázy, díky níž udržuje každý živý organismus své vnitřní prostředí v určitých limitech. Pokud je narušena, mohou se objevit dva základní druhy problémů:

 Pokud se buňky dělí rychleji než umírají, tkáň nadměrně bují a dochází k vzniku nádorů (konkrétně například adenokarcinom pankreatu);
 Pokud se buňky dělí pomaleji než umírají, výsledkem je porucha způsobená nedostatkem určitých buněk.

Usmrcení poškozených buněk 
Apoptóza se jako proces uplatňuje například v likvidaci poškozených buněk, buněk napadených virem nebo například nedostatečně zásobených živinami. Ionizující záření, které způsobí poškození DNA, může rovněž nastartovat proces apoptózy, stejně jako některé jedovaté látky. Obvykle se o to v těchto dvou případech stará protein p53, který tím zamezí jakémukoliv nádorovému bujení poškozené buňky. U téměř poloviny všech lidských nádorů je gen pro tento protein zmutovaný.

Usmrcení poškozených buněk jsou schopné docílit mimo jiné cytotoxické T-lymfocyty (typ bílých krvinek), které v cílové buňce vytvoří pomocí perforinu otvory a pomocí granzymů a různých proteáz nastartují v dané buňce apoptózu.

Role ve vývinu a v dalších procesech 

Apoptóza se uplatňuje i ve vývinu mnohobuněčných organizmů, zejména ve formaci určitých složitějších struktur, jichž by se jinak špatně docílilo prostým buněčným dělením v určitém směru. Je to ale v menší míře, než se dosud uvažovalo. Díky skutečnosti, že při apoptóze dochází ke smrštění a fragmentaci buňky, může být tato velmi snadno fagocytována a jejich stavební látky mohou být tělem opět využity. Výzkum zejména na kuřecích zárodcích ukázal, jak cílená apoptóza určitých buněk společně s cíleným množením buněk vytváří embryonální tkáně živočichů. V průběhu této embryogeneze se z určitých částí embrya (zejména ze struny hřbetní) vylučuje signální molekula Shh („Sonic hedgehog“). Buňky, na jejichž receptor Patched1 se tato signální molekula naváže, pokračují v růstu a množení. Naopak na receptory buněk, na něž se žádné Shh nenavázalo, se místo toho naváže kaspáza 3 a vyvolá ve výsledku celý proces apoptózy, díky němuž tato buňka zahyne.

Přebytečné mozkové buňky obratlovců (neurony) v průběhu embryogeneze spáchají apoptózu, pokud se na ně nenaváže dostatečné množství molekul NGF (nerve growth factor). Odstraňování ocasu pulců při jejich přeměně na dospělou žábu je zajištěno vylučováním hormonů ze štítné žlázy. Apoptóza se v masovém měřítku uplatňuje i ve správném vývoji T-lymfocytů v brzlíku a B-lymfocytů v kostní dřeni. Na počátku tohoto procesu se vytvoří velké množství buněk s různorodými vazebnými místy pro různé nebezpečné antigeny, ale vznikají rovněž buňky, které jsou neúčinné nebo dokonce potenciálně nebezpečné pro tělo. Také zmenšování prsou po odstavení kojence, zánik děložní sliznice při menstruaci, umírání pokožkových buněk, které je následováno jejich nahrazením buňkami novými, dobrovolná smrt neutrofilů během imunitní reakce, všechny tyto procesy existují díky apoptóze.

Někdy se ve vývinu odlišných skupin organismů uplatňují různé jiné signální molekuly a faktory. Například pro tvorbu prstů u ptáků jsou zásadní BMP proteiny („Bone morphogenetic proteins“). U octomilek (Drosophila) se na apoptóze významně podílí steroidní hormony. Vliv mohou mít i různé vývojové rozdíly mezi jedinci, jako je pohlaví. Díky němu páchají u samečků háďátek Caenorhabditis elegans buněčnou smrt určité neurony, konkrétně díky nízké aktivitě transkripčního faktoru TRA-1.

Průběh apoptózy 

Celý proces apoptózy buňky je spuštěn složitou soustavou různých látek. Tyto látky mohou být jak mimobuněčného původu, tak vnitrobuněčné, tedy produkované uvnitř buňky samotné. Z mimobuněčných molekul může apoptózu spustit vystavení buňky toxinům, hormonům, růstovým faktorům, oxidu dusnatému či cytokinům. Tyto látky buď proniknou přímo do buňky, nebo spustí biochemickou kaskádu z vnější části cytoplazmatické membrány. Jmenované látky mohou jak spouštět, tak zastavovat apoptózu v cílové buňce (tzv. negativní a pozitivní účinek). Vnitrobuněčná cesta se spouští převážně ve chvíli, kdy je buňka v jakékoliv formě stresu, jako je vystavení glukokortikoidům, teplu, radiaci, nedostatek živin, virová infekce buňky, nedostatek kyslíku či také zvýšený obsah vápenatých iontů uvnitř buňky. Všechny tyto jmenované signály jsou na počátku enzymatické kaskády, která je zodpovědná za provedení vlastní apoptózy.

Vnitřní cesta aktivace 
Některé skutečnosti, jako například poškozená DNA, jedy přítomně v buňce nebo oxidativní stres, mohou vyvolat vnitřní cestu aktivace apoptózy, která souvisí s mitochondriemi. Poškozením těchto organel se buňka vlastně vzdává poslední myšlenky na záchranu, protože mitochondrie představují nezbytné biochemické mašinérie, kde probíhá buněčné dýchání. Různé apoptotické proteiny (nebo možná i jiné látky, jako oxid dusnatý) se mohou na základě výše zmíněných situací uvnitř buňky navázat na mitochondrii a způsobit vznik pórů v její membráně nebo zvýšení její propustnosti, čímž dochází k vylití různých látek do cytosolu. Tyto látky mnohdy představují další články v apoptotické kaskádě. Patří k nim tzv. SMACs („Second mitochondria-derived activator of caspases“). Tyto se ihned navážou na další proteiny, tzv. IAPs (inhibitory apoptotických proteinů), deaktivují je a IAPs tím ztrácí svou schopnost bránit dalšímu pokračování apoptotické kaskády. Následně je aktivována skupina cystein proteáz, tzv. kaspázy, které způsobí vlastní degradaci buňky.

Z mitochondrií se však nevylučují jen SMACs, ale protože se vytvoří ze speciálních molekul MAC v membráně mitochondrií určité kanály, může skrz membránu ven uniknout i cytochrom c, protein, který se normálně podílí na transportu elektronů při buněčném dýchání. V tomto případě však funguje jako další z řady aktivátorů, protože se váže na protein Apaf-1 a za pomoci ATP také na pro-kaspázu 9. Z jmenovaných proteinů vzniká velký komplex zvaný apoptozom, který je schopný měnit pro-kaspázu 9 na kaspázu 3.

Pokud se ještě vrátíme k proteinovému kanálu MAC, je o něm známo, že je ovlivňován množstvím proteinů, jako je savčí Bcl-2 (bránící apoptóze), případně proteiny ced-9 u háďátka C. elegans. Bcl-2 proteiny jsou schopné regulovat apoptózu buď právě pomocí kanálu MAC, nebo nepřímo pomocí jiných proteinů, případně dokonce i poté, co cytochrom c už unikl z mitochondrie.

Vnější cesta aktivace 
Vnější cesta aktivace apoptózy začíná na cytoplazmatické membráně, konkrétně na několika receptorech, zvaných „receptory smrti“. Na tyto receptory se vážou různé ligandy, jako je TNF („Tumor necrosis factor“) či Fas ligand. Receptory jsou v podstatě oba ze skupiny TNF receptorů (TNFR).

TNF je cytokin produkovaný zejména aktivovanými makrofágy. Obvykle bývají TNF receptory, přítomné na buňce, dvojího typu: TNF-R1 a TNF-R2. Vazba TNF na jeden z těchto receptorů má za následek aktivaci kaspáz, a to přes určité prostředníky (TRADD, FADD, TRAF2). Fas receptor (také Apo-1 či CD95) se po navázání na Fas ligand změní na tzv. DISC („death-inducing signaling complex“), který aktivuje kaspázu 8 a kaspázu 10. Kaspáza 8 pak obvykle aktivuje další kaspázy, které nevratně směřují k smrti buňky. Fas ligandy se uplatňují ve velké roli v imunitním systému, protože se nachází na povrchu cytotoxických T-lymfocytů a mohou tak indukovat apoptózu u vybraných buněk. Mimoto mají tyto T-lymfocyty rovněž Fas receptor, který se může navázat na Fas ligand na té samé buňce a způsobit tak řízenou apoptózu opotřebovaných T-lymfocytů. Nádorové buňky toho někdy využívají, jelikož mohou obsahovat na svém povrchu Fas ligand, a tak mohou indukovat buněčnou smrt u T-lymfocytů, jejich „protivníků“. Zvláštní způsob apoptózy, naprosto nezávislý na kaspázách, řídí molekula AIF (apoptosis-inducing factor).

Závěrečná fáze 
Přestože, jak bylo uvedeno výše, cest vedoucích k apoptóze je více, existuje jeden hlavní mechanismus, jehož úkolem je provedení apoptózy jako takové. Po přijetí signálu totiž jsou aktivovány proteolytické enzymy, tzv. kaspázy. Kaspázy jsou cysteinové proteázy (enzymy rozkládající proteiny), které štěpí na karboxyskupině kyseliny asparagové. Tzv. iniciační kaspázy katalyzují štěpení dalších druhů kaspáz a na konci tohoto řetězce vznikají tzv. exekutorové kaspázy. Exekutorové kaspázy se vážou na tzv. substráty smrti, mezi něž patří proteiny cytoskeletu, proteiny řídící opravu DNA, proteiny zabraňující apoptóze a podobně. V konečném důsledku vzniká z buňky několik váčků, tzv. apoptotická tělíska.

Umírající buňky, které podstoupily závěrečnou fázi apoptózy a změnily se na apoptotická tělíska, vystavují na svém povrchu různé molekuly vyzývající k jejich pozření (fagocytóze). Mezi tyto signály patří například fosfatidylserin.<ref name="Phosphatidylserine">{{Citace periodika | autor=Li MO, ''et al.| titul=Phosphatidylserine receptor is required for clearance of apoptotic cells| periodikum=Science| rok=2003| ročník=302| číslo=5650| pages=1560–3| doi=10.1126/science.1087621| pmid=14645847}}</ref> Tato molekula je v normální buňce pouze na vnitřní straně membrány, ale během apoptózy se díky proteinu skrambláze přemisťuje na vnější stranu. Fosfatidylserin a jiné molekuly označují buňku, aby mohla být pohlcena, a to buď okolními buňkami, nebo buňkami imunitního systému (jako zejména makrofágy).

 Onemocnění související s apoptózou 

Nadměrná apoptóza má relevanci k onemocněním, jako je AIDS, aplastická anémie, různé degenerativní neurologické poruchy (Alzheimerova choroba, Huntingtonova choroba, Parkinsonova choroba), diabetes mellitus typu I, Hashimotova struma, chronická neutropenie, ischemie, lupus erythematodes, myelodysplastický syndrom, roztroušená skleróza, některá selhání jater, spinální svalová atrofie, ulcerózní kolitis, široké spektrum různých vývojových vad či Wilsonova choroba.

Nedostatečná apoptóza v podstatě znamená, že může dojít ke vzniku nádorů nebo autoimunitních chorob (revmatoidní artritida) Je klíčovým faktorem například u těchto onemocnění: autoimunitní lymfoproliferativní syndrom (Canale-Smithův syndrom). diabetes mellitus typu I. Gravesova choroba, hypereosinofilní syndrom, Hashimotova struma, leukémie, lupus erythematodes, různé lymfomy, osteoporóza, některé solidní nádory a neoplasie a také vývojové vady.

 Metody detekce apoptózy 
 Nejspolehlivější metodou detekce apoptózy je pozorování fragmentace DNA pomocí elektronového mikroskopu.

 TUNEL (TdT-mediated dUTP-biotin nick end labelling, TUNEL assay) - enzymem terminální deoxynukleotidyl-transferasa (TdT) se naváže na 3'OH konce DNA označený dUTP. (Biotinylovaný dUTP se detekuje pomocí streptavidin-peroxidasy a zvizualizuje pomocí DAB. Když je dUTP označený fluoresceinem, detekuje se pomocí konjugátu alkalické fosfatázy a antifluoresceionové protilátky a zvizualizuje pomocí NBT/BCIP.) Metoda značí buňky na začátku a ve střední fázi apoptózy. Detekuje ale také nekrotické buňky. Používá se na tkáňové řezy.
 ISNTA (in situ nick translation assay) - syntetizuje DNA v místech zlomů pomocí DNA-polymerasy. Takto syntetizované úseky se označí pomocí biotinylovaného dUTP. Metoda označuje buňky v pozdní fázi apoptózy a čím pozdější fáze (čím více zlomů), tím je buňka označena intenzivněji. Používá se na tkáňové řezy i na buněčné kultury.
 Detekce kaspázy.

 Seznamy molekul zahrnutých v apoptóze 
 Proapoptotické faktory charakteristické rysy indukující apoptózu: vývoj organismu
 genetická kontrolavnější vlivy schopné způsobit (vyvolávající) apoptózu: stres: tepelný šok (hypertermie), nefyziologická vlhkost, hypoxie
 poškození DNA a buňky
 volné radikály
 chemoterapie
 toxiny a toxické látky, např. H2O2, azid sodný
 NO
 hormony (steroidy)
 cytostatika (transformující růstové faktory – TNFα, TGF beta)
 (Fas-L, Reaper)
 ozáření (radiace), např. rentgenové záření, ionizující záření
 virová infekce, bakteriální infekce
 interakce buněk
 ztráta kontaktu s okolními buňkami
 různé imunitní pochody: interakce s cytotoxickými buňkami (TC lymfocyt) (když se naváže povrchový receptor s příslušným ligandem z jedné buňky na druhou)

 růstové faktory (hormony a další regulační faktory), apoptózu indukuje jejich nadbytek i nedostatek
 glukokortikoidy
 cytokiny (cytokiny aktivují sfingomyelinový cyklus, produktem je ceramid, který blokuje buněčný cyklus a podporuje apoptózu)vnitřní faktory podporující apoptózu Ca2+
 specifické molekuly, které se vážou na určité receptory
 TNF receptor
 např. cytokin (v tomto případě obecně FAS-ligand (FASL)) se naváže na trimer FAS receptoru. Trimer FAS se spojí s FADD (= Fas-associated death domain), FADD způsobí změnu procaspázy na caspázu.
geny:říjen 2005 apoptóza na stránkách firmy Roche - v levém menu např.: signální dráhy.
 podrodina Bax:
 onkogen bax (= bcl-2 associated X protein)
 gen bak (= bcl-2 homologous anthagonist/killer)
 gen bok/Mtd
 podrodina BH3:
 gen bik (= bcl-2 interacting killer) /Blk/Nbk
 gen hrk/DP5
 BNIP3
 gen bimL/Bod
 gen bad
 gen bid
 gen Egl-1

 gen bag, bag-1 (= bcl-2 associated athanogene-1)
 protein Bcl-G
 protein Bfk
 protein Bmf
 onkogen bcl-xS
 gen Diva
 gen p53
 gen c-jun
 protein Noxa
 protein Puma/Bbc3

 Antiapoptotické faktory 
 uplatňují se geny genové rodiny bcl-2, podrodina Bcl-2:
 onkogen bcl-2 (= B cell lymphomal leukemia-2) - produkuje protein BCL-2, který ve vnitřní membráně mitochondrií pravděpodobně omezuje vliv volných radikálů (detoxikuje volné radikály). V endoplazmatickém retikulu omezuje uvolňování Ca2+.
 onkogen bcl-xL
 protein Bcl-w
 gen Mcl-1 (= myeloid cell leukemia-1)
 gen A 1/bfl-1
 NR-13
 BHRF1 (virus Epsteina a Barrové)
 LMW5-HL (african swine fever virus)
 ORF16
 KS-bcl-2
 adenovirus protein E1B19kD
 ced-9 (hlístice Caenorhabditis elegans)
 gen Rb (= retinoblastoma gene product)
 gen brag-1
 gen boo
 protein Sonic hedgehog (SSH) - význam ve vývoji struny hřbetní (chorda dorsalis)

 Eat-me molekuly na apoptotické buňce 

 Fosfatidylserin se z vnitřní strany cytoplazmatické membrány přesmykne na vnější stranu a na něj se vážou některé z těchto proteinů.
 ABC1 = ATP binding-cassette-transporter 1 ze skupiny ABC transportérů
 AnxI = Annexin I
 β2-GPI = β2-glycoprotein-I
 C1q = complement protein C1q
 C3b/bi = complement protein C3b/bi
 Gas6 = growth arrest-specific 6
 ICAM-3 = intercellular adhesion molecule 3
 MBL = mannose binding lectin
 MFG-E8 = milk-fat-globule-EGF-factor 8
 OxLDL = oxidized low-density lipoprotein particle
 SP-A/D = lung surfactant protein A or D
 TSP-1 = thrombospondin-1
 vitronektin (vitronectin, S-protein, protein S, zkratka: Prot S)Receptory na makrofágu:'''
 CD14 = lipopolysaccharide receptor CD14
 CD91 = calreticulin/heat shock protein receptor; (CRT = calreticulin)
 CR3 = complement receptor 3
 CR4 = complement receptor 4
 LOX1 = lectin-like oxidized low-density lipoprotein particle receptor 1
 Mer = receptor-tyrosin-kinase (exprimuje se v monocytech a ve tkáních epiteliálního a rozmnožovacího původu)
 SR-A = class A macrophage scavenger receptor
 předpokládal se význam PS-receptor = phosphatidylserine receptor, ale normální apoptóza funguje i bez PS-receptoru

Odkazy

Reference

Související články 
 Aktivací indukovaná buněčná smrt

Externí odkazy 
 
  Programovaná buněčná smrt na Masarykově univerzitě - Pdf soubor
 Kušíková E.: Co je to apoptóza a proč nás zajímá?
 Topinková E.: Apoptóza - programovaná buněčná smrt a stárnutí. - Sanquis, 2002/20.
 Apoptóza - role kaspázy 3
 Apoptóza - role kaspázy 8
 Apoptóza - role kaspázy 7
 Biochemweb.org - rozcestník stránek o této tematice
 Apoptosis Info - Informace o průběhu apoptózy, odkazy, fóra, novinky
 Databáze proteinů zahrnutých v apoptóze
 Video apoptózy
 Přehledné vysvětlení molekulárního průběhu apoptózy 
 Wikipathways - kompletní přehled známých biochemických cest při apoptóze u člověka ve formě obrázku 
 signální dráhy tematicky roztříděné na jednotlivých slidech
 Finding Cancer’s Self-Destruct Button CR magazine (Spring 2007). Article on apoptosis and cancer.

Buněčná smrt
Imunita