# Diario Oficial C 43/2010

| | ISSN 1725-244X
  doi:10.3000/1725244X.C_2010.043.spa |
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| Diario Oficial
  de la Unión Europea | C 43 |
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| Edición en lengua española | Comunicaciones e informaciones | 53o año19 de febrero de 2010 |

ISSN 1725-244X

doi:10.3000/1725244X.C_2010.043.spa

Diario Oficial

de la Unión Europea

C 43

Edición en lengua española

Comunicaciones e informaciones

53o año19 de febrero de 2010

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| Número de información | Sumario | Página |
| --- | --- | --- |
| | II   Comunicaciones |
| | COMUNICACIONES QUE PROCEDAN DE LAS INSTITUCIONES, ÓRGANOS Y ORGANISMOS DE LA UNIÓN EUROPEA |
| | Comisión Europea |
| 2010/C 043/01 | Lista y descripción de los métodos de análisis contemplados en el artículo 120 octies, párrafo primero, del Reglamento (CE) no 1234/2007 del Consejo [publicadas de conformidad con el artículo 15, apartado 2, del Reglamento (CE) no 606/2009 de la Comisión, de 10 de julio de 2009
  ] | 1 |

Número de información

Sumario

Página

II   Comunicaciones

COMUNICACIONES QUE PROCEDAN DE LAS INSTITUCIONES, ÓRGANOS Y ORGANISMOS DE LA UNIÓN EUROPEA

Comisión Europea

2010/C 043/01

Lista y descripción de los métodos de análisis contemplados en el artículo 120 octies, párrafo primero, del Reglamento (CE) no 1234/2007 del Consejo [publicadas de conformidad con el artículo 15, apartado 2, del Reglamento (CE) no 606/2009 de la Comisión, de 10 de julio de 2009
  ]

octies

o

[publicadas de conformidad con el artículo 15, apartado 2, del Reglamento (CE) no

]

1

| ES | |
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ES

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II Comunicaciones

COMUNICACIONES QUE PROCEDAN DE LAS INSTITUCIONES, ÓRGANOS Y ORGANISMOS DE LA UNIÓN EUROPEA

Comisión Europea

| 19.2.2010 | ES | Diario Oficial de la Unión Europea | C 43/1 |
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19.2.2010

ES

Diario Oficial de la Unión Europea

C 43/1

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Lista y descripción de los métodos de análisis contemplados en el artículo 120 octies, párrafo primero, del Reglamento (CE) no 1234/2007 del Consejo (1)

[publicadas de conformidad con el artículo 15, apartado 2, del Reglamento (CE) no 606/2009 de la Comisión, de 10 de julio de 2009
   (2)
  ]

2010/C 43/01

El cuadro que figura más abajo recoge la lista de métodos de análisis aplicables para el control de los límites y exigencias fijados en la normativa comunitaria en relación con la producción de productos vitivinícolas. En la tercera columna se encuentra, respecto a cada uno de los parámetros, la referencia del método de análisis correspondiente descrito en el Compendio de los métodos internacionales de análisis de los vinos y de los mostos de la OIV (Recueil des méthodes internationales d'analyse des vins et des moûts), en la última edición (2009) disponible a fecha de la presente publicación. Respecto a cada parámetro, solo se describen los métodos de referencia («tipo I» o «tipo II» en la clasificación de la OIV), salvo los parámetros para los que actualmente no existe ningún método de tipo I o II validado. La descripción de los métodos se recoge en el anexo de la Comunicación.

Recordatorio:

El Compendio de la OIV establece en su anexo A, sección I, la definición de los distintos tipos de métodos de análisis y, en particular, el tipo I (Método de referencia criterio), el tipo II (Método de referencia) y el tipo IV (Método provisional).

Los métodos de análisis del plomo y del cadmio se describen ahora en el Reglamento (CE) no 333/2007 de la Comisión, de 28 de marzo de 2007 (anexo C-3) (3). Por otra parte, el Reglamento (CE) no 401/2006, de 23 de febrero de 2006 (4), establece criterios generales para los métodos de análisis de la ocratoxina A en su anexo II.4, por lo que no es necesario describir ningún método de ensayo de esta sustancia que sea específico de los productos vitivinícolas.

LISTA DE MÉTODOS DE ANÁLISIS

| No | Parámetro | Método del Compendio de la OIV | Tipo |
| --- | --- | --- | --- |
| 1 | Densidad absoluta/relativa | AS-2-01-MASVOL | I |
| 2 | Índice refractométrico | AS-2-02-SUCREF | I |
| 3 | Extracto seco total | AS-2-03-EXTSEC | I |
| 4 | Relación isotópica 18O/16O del agua del vino | AS-2-09-MOUO18 | II |
| 5 | Índice de Folin | AS-2-10-INDFOL | IV |
| 6 | Contenido en azúcar (= glucosa + fructosa) | AS-311-02-GLUFRU | II |
| 7 | Contenido en sacarosa (medido por HPLC) | AS-311-03-SUCRES | II |
| 8 | Resonancia magnética nuclear – Deuterio del etanol del vino | AS-311-O5-ENRRMN (en revisión) | I |
| 9 | Grado alcohólico volumétrico en % (GAV) | AS-312-01-TALVOL | I |
| 10 | Relación isotópica 13C/12C del etanol del vino | AS-312-06-ETHANO | II |
| 11 | Acidez total | AS-313-01-ACITOT | I |
| 12 | Acidez volátil | AS-313-02-ACIVOL | I |
| 13 | Ácido cítrico | AS-313-09-ACIENZ | II |
| 14 | Ácido sórbico | AS-313-14-ACISOR | IV |
| 15 | pH de los mostos | AS-313-15-PH | I |
| 16 | Ácido ascórbico | AS- 313-22 ACASCO | II |
| 17 | CO2 en g/l | AS-314-01-DIOCAR | II |
| 18 | CO2 en g/l (manometría) | AS-314-04-CO2MAN | II |
| 19 | Sobrepresión de CO2 | AS-314-02-SURPRES | I |
| 20 | Lisozima | AS-315-14-LYSOZY | IV |
| 21 | Sulfato de potasio | AS-321-05-SULFAT | II |
| 22 | Hierro | AS-322-05-FER | IV |
| 23 | Cobre | AS-322-06-CUIVRE | IV |
| 24 | Sulfitos (SO2) o
  dióxido de azufre total | AS-323-04-DIOSU | II |

No

Parámetro

Método del Compendio de la OIV

Tipo

1

Densidad absoluta/relativa

AS-2-01-MASVOL

I

2

Índice refractométrico

AS-2-02-SUCREF

I

3

Extracto seco total

AS-2-03-EXTSEC

I

4

Relación isotópica 18O/16O del agua del vino

AS-2-09-MOUO18

II

5

Índice de Folin

AS-2-10-INDFOL

IV

6

Contenido en azúcar (= glucosa + fructosa)

AS-311-02-GLUFRU

II

7

Contenido en sacarosa (medido por HPLC)

AS-311-03-SUCRES

II

8

Resonancia magnética nuclear – Deuterio del etanol del vino

AS-311-O5-ENRRMN (en revisión)

I

9

Grado alcohólico volumétrico en % (GAV)

AS-312-01-TALVOL

I

10

Relación isotópica 13C/12C del etanol del vino

AS-312-06-ETHANO

II

11

Acidez total

AS-313-01-ACITOT

I

12

Acidez volátil

AS-313-02-ACIVOL

I

13

Ácido cítrico

AS-313-09-ACIENZ

II

14

Ácido sórbico

AS-313-14-ACISOR

IV

15

pH de los mostos

AS-313-15-PH

I

16

Ácido ascórbico

AS- 313-22 ACASCO

II

17

CO2 en g/l

AS-314-01-DIOCAR

II

18

CO2 en g/l (manometría)

AS-314-04-CO2MAN

II

19

Sobrepresión de CO2

AS-314-02-SURPRES

I

20

Lisozima

AS-315-14-LYSOZY

IV

21

Sulfato de potasio

AS-321-05-SULFAT

II

22

Hierro

AS-322-05-FER

IV

23

Cobre

AS-322-06-CUIVRE

IV

24

Sulfitos (SO2) o

dióxido de azufre total

AS-323-04-DIOSU

II

La descripción de algunos métodos de análisis está siendo objeto de actualización por parte de las instancias de la OIV. Estas descripciones se publicarán en una próxima Comunicación de la Comisión en cuanto la OIV haya publicado un texto actualizado en la edición 2010 del Compendio de métodos internacionales de análisis de la OIV.

---

(1)  DO L 299 de 16.11.2007.

(2)  DO L 193 de 24.7.2009, p. 1.

(3)  DO L 88 de 29.3.2007, p. 29.

(4)  DO L 70 de 9.3.2006, p. 12.

---

ANEXO

ÍNDICE

| 1. | DENSIDAD ABSOLUTA A 20 °C Y DENSIDAD RELATIVA A 20 °C (OIV-AS2-01-MASVOL) — Método de tipo I |
| --- | --- |

1.

| 2. | EVALUACIÓN MEDIANTE REFRACTOMERÍA DEL CONTENIDO EN AZÚCARES DE MOSTOS, MOSTOS CONCENTRADOS Y MOSTOS CONCENTRADOS RECTIFICADOS (OIV-AS2-02-SUCREF) — Método de tipo I |
| --- | --- |

2.

| 3. | EXTRACTO SECO TOTAL (OIV-AS-2-03-EXTSEC) Materias secas totales — Método de tipo I |
| --- | --- |

3.

| 4. | DETERMINACIÓN DE LA RELACIÓN ISOTÓPICA 18O/16O DEL AGUA DEL VINO (OIV-AS-2-09-MOUO18) — Método de tipo II |
| --- | --- |

4.

| 5. | ÍNDICE DE FOLIN-CIOCALTEU (OIV-AS-2-10-INDFOL) — Método de tipo IV |
| --- | --- |

5.

| 6. | GLUCOSA Y FRUCTOSA (OIV-AS-311-02-GLUFRU) — Método de tipo II |
| --- | --- |

6.

| 7. | DETERMINACIÓN DE AZÚCARES POR HPLC (SACAROSA) (OIV-AS-311-03-SUCRES) — Método de tipo II |
| --- | --- |

7.

| 8. | DETECCIÓN DEL AUMENTO DEL GRADO ALCOHÓLICO NATURAL DE MOSTOS DE UVA, DE MOSTOS DE UVA CONCENTRADOS, DE MOSTOS DE UVA CONCENTRADOS RECTIFICADOS Y DE VINOS POR APLICACIÓN DE LA RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DEL DEUTERIO (OIV-AS-311-05-ENRRMN) — Método de tipo I |
| --- | --- |

8.

| 9. | GRADO ALCOHÓLICO VOLUMÉTRICO (OIV-AS-312-01-TALVOL) — Métodos de tipo I |
| --- | --- |

9.

| 10. | DETERMINACIÓN DE LA RELACIÓN ISOTÓPICA 13C/12C POR ESPECTROMETRÍA DE MASA ISOTÓPICA DEL ETANOL DEL VINO O DEL ETANOL OBTENIDO POR FERMENTACIÓN DE MOSTOS, MOSTOS CONCENTRADOS O MOSTOS CONCENTRADOS RECTIFICADOS (OIV-AS-312-06-ETHANO) — Método de tipo II |
| --- | --- |

10.

| 11. | ACIDEZ TOTAL (OIV-AS-313-01-ACITOT) — Método de tipo I |
| --- | --- |

11.

| 12. | ACIDEZ VOLÁTIL (OIV-AS-313-02-ACIVOL) — Método de tipo I |
| --- | --- |

12.

| 13. | ÁCIDO CÍTRICO (OIV-AS-313-09-ACIENZ) — Método de tipo II |
| --- | --- |

13.

| 14. | ÁCIDO SÓRBICO (OIV-AS-313-14-ACISOR) — Método de tipo IV |
| --- | --- |

14.

| 15. | pH (OIV - AS-313-15-PH) — Método de tipo I |
| --- | --- |

15.

| 16. | DETERMINACIÓN SIMULTÁNEA DE ÁCIDO L-ASCÓRBICO Y DE ÁCIDO D-ISOASCÓRBICO POR HPLC Y DETECCIÓN UV (OIV-AS-313-22-ACASCO) — Método de tipo II |
| --- | --- |

16.

| 17. | DIÓXIDO DE CARBONO (OIV-AS-314-01-DIOCAR) — Método de tipo II |
| --- | --- |

17.

| 18. | DETERMINACIÓN DEL DIÓXIDO DE CARBONO EN EL VINO POR MÉTODO MANOMÉTRICO (OIV - AS314-04-CO2MAN) — Método de tipo II |
| --- | --- |

18.

| 19. | MEDICIÓN DE LA SOBREPRESIÓN DE LOS VINOS ESPUMOSOS Y DE AGUJA (OIV - AS-314-02-SURPRES) — Método de tipo I |
| --- | --- |

19.

| 20. | DETERMINACIÓN DE LA LISOZIMA EN EL VINO POR HPLC (OIV-AS-315-14) — Método de tipo IV 73 |
| --- | --- |

20.

| 21. | SULFATOS (OIV- AS-321-05-SULFAT) — Método de tipo II |
| --- | --- |

21.

| 22. | HIERRO (OIV - AS-322-05-FER) — Método de tipo IV |
| --- | --- |

22.

| 23. | COBRE (OIV - AS 322-06) — Método de tipo IV |
| --- | --- |

23.

| 24. | DIÓXIDO DE AZUFRE (OIV - AS-323-04-DIOSU) — Método de tipo II |
| --- | --- |

24.

1   DENSIDAD ABSOLUTA A 20 °C Y DENSIDAD RELATIVA A 20 °C (OIV - AS2 - 01- MASVOL) — MÉTODO DE TIPO I

1.   DEFINICIONES

La densidad absoluta es la proporción entre la masa de un determinado volumen de vino o mosto a 20 °C y ese volumen. Se expresa en gramos por mililitro y su símbolo es ρ20 °C.

La densidad relativa a 20 °C o densidad 20 °C/20 °C es la relación, expresada en número decimal, entre la masa de cierto volumen de vino o de mosto a 20 °C y la masa del mismo volumen de agua a la misma temperatura. Su símbolo es Formula

2.   PRINCIPIO DE LOS MÉTODOS

La densidad absoluta y la densidad relativa a 20 °C se determinan en la muestra problema:

| | bien por picnometría: método de referencia, |
| --- | --- |

bien por picnometría: método de referencia,

| | bien por densimetría con balanza hidrostática o por densimetría electrónica. |
| --- | --- |

bien por densimetría con balanza hidrostática o por densimetría electrónica.

Nota:

En determinaciones muy precisas, debe corregirse la acción del dióxido de azufre sobre la densidad absoluta:

| ρ20 °C | = | ρ′20 °C – 0,0006 • S |
| --- | --- | --- |
| ρ20 °C | = | densidad absoluta corregida |
| ρ′20 °C | = | densidad absoluta observada |
| S | = | dióxido de azufre total en g/l |

ρ20 °C

=

ρ′20 °C – 0,0006 • S

ρ20 °C

=

densidad absoluta corregida

ρ′20 °C

=

densidad absoluta observada

S

=

dióxido de azufre total en g/l

3.   TRATAMIENTO PREVIO DE LA MUESTRA

Si el vino o el mosto contiene cantidades importantes de dióxido de carbono, eliminar la mayor cantidad posible de este agitando 250 ml de vino en un frasco de 1 000 ml o filtrando a baja presión sobre 2 g de algodón colocado en una alargadera.

4.   MÉTODO DE REFERENCIA

4.1.   Material

Material corriente de laboratorio, y en particular:

4.1.1.   Picnómetro (1), de vidrio pyrex, con una capacidad de 100 ml aproximadamente y termómetro móvil esmerilado, graduado en décimas de grado, de 10 a 30 °C. Este termómetro debe estar contrastado (figura 1).

Image

Este picnómetro lleva un tubo lateral de 25 mm de longitud y 1 mm, como máximo, de diámetro interior, terminado en una parte cónica esmerilada. El tubo lateral puede estar cubierto por un «tapón receptor» constituido por un tubo cónico esmerilado terminado en una parte alargada. Dicho tapón sirve de cámara de dilatación.

Las dos partes esmeriladas del aparato deben estar realizadas con gran cuidado.

4.1.2.   Frasco tara, del mismo volumen exterior (con una precisión superior a 1 ml) que el picnómetro y de masa igual a la del picnómetro lleno de líquido de densidad 1,01 (solución al 2 % (m/v) de cloruro sódico).

Recipiente termostático que se ajuste exactamente al cuerpo del picnómetro.

4.1.3.   Balanza de dos platos de una capacidad de 300 g por lo menos y una sensibilidad de una décima de miligramo

o

balanza monoplato de una capacidad de 200 g por lo menos y una sensibilidad de una décima de miligramo.

4.2.   Calibrado del picnómetro

El calibrado del picnómetro supone la determinación de las características siguientes:

| — | la tara en vacío, |
| --- | --- |

—

la tara en vacío,

| — | el volumen a 20 °C, |
| --- | --- |

—

el volumen a 20 °C,

| — | la masa del agua a 20 °C. |
| --- | --- |

—

la masa del agua a 20 °C.

4.2.1.   Utilización de una balanza de dos platos

Poner el frasco tara en el plato izquierdo de la balanza y el picnómetro limpio, seco y con su «tapón receptor» en el plato derecho, equilibrar colocando al lado del picnómetro pesas marcadas (sea su masa p gramos).

Llenar con cuidado el picnómetro con agua destilada a temperatura ambiente y colocar el termómetro; secar cuidadosamente el picnómetro y colocarlo dentro del recipiente termostático; agitar por inversión hasta que el termómetro señale una temperatura constante. Enrasar exactamente hasta el borde superior del tubo lateral. Secar dicho tubo, colocar el tapón receptor; leer la temperatura t °C con cuidado y, en su caso, corregir la inexactitud de la escala del termómetro. Pesar el picnómetro lleno de agua; se denominará p' a la masa en gramos con la que se consigue el equilibrio.

Cálculos

| | Tara del picnómetro vacío:
  Tara en vacío= p + m
  m= masa de aire contenida en el picnómetro
  m= 0,0012 (p – p′) |
| --- | --- |

Tara del picnómetro vacío:

Tara en vacío= p + m

m= masa de aire contenida en el picnómetro

m= 0,0012 (p – p′)

| | Volumen a 20 °C:
  V20 °C= (p + m – p′) • Ft

  Ft= factor tomado de la tabla I para la temperatura t °C
  V20 °C debe conocerse con una aproximación de ± 0,001 ml. |
| --- | --- |

Volumen a 20 °C:

V20 °C= (p + m – p′) • Ft

Ft= factor tomado de la tabla I para la temperatura t °C

V20 °C debe conocerse con una aproximación de ± 0,001 ml.

| | Masa de agua a 20 °C:
  M20 °C= V20 °C • 0,998203
  0,998203= densidad absoluta del agua a 20 °C. |
| --- | --- |

Masa de agua a 20 °C:

M20 °C= V20 °C • 0,998203

0,998203= densidad absoluta del agua a 20 °C.

4.2.2.   Utilización de una balanza monoplato

Determinar:

| — | la masa del picnómetro limpio y seco: P |
| --- | --- |

—

la masa del picnómetro limpio y seco: P

| — | la masa del picnómetro lleno de agua a t °C: P1, siguiendo las indicaciones que figuran en 4.2.1, |
| --- | --- |

—

la masa del picnómetro lleno de agua a t °C: P1, siguiendo las indicaciones que figuran en 4.2.1,

| — | la masa del frasco tara T0. |
| --- | --- |

—

la masa del frasco tara T0.

Cálculos

Tara del picnómetro vacío:

| | Tara en vacío= P – m
  m= masa de aire contenida en el picnómetro
  m= 0,0012 (P1 – P) |
| --- | --- |

Tara en vacío= P – m

m= masa de aire contenida en el picnómetro

m= 0,0012 (P1 – P)

| | Volumen a 20 °C:
  V20 °C= [P1 – (P – m)] • Ft

  Ft= factor tomado de la tabla I para la temperatura t °C. |
| --- | --- |

Volumen a 20 °C:

V20 °C= [P1 – (P – m)] • Ft

Ft= factor tomado de la tabla I para la temperatura t °C.

| | El volumen a 20 °C debe conocerse con una precisión de ± 0,001 ml. |
| --- | --- |

El volumen a 20 °C debe conocerse con una precisión de ± 0,001 ml.

| | Masa de agua a 20 °C:
  M20 °C= V20 °C • 0,998203
  0,998203= densidad absoluta del agua a 20 °C. |
| --- | --- |

Masa de agua a 20 °C:

M20 °C= V20 °C • 0,998203

0,998203= densidad absoluta del agua a 20 °C.

4.3.   Técnica de una medida

4.3.1.   Utilización de una balanza de dos platos

Pesar el picnómetro lleno con la muestra problema preparada (punto 3) siguiendo las indicaciones que figuran en 4.2.1.

Sea p′′ la masa en gramos con la que se consigue el equilibrio a t °C.

Masa del líquido contenido en el picnómetro = p + m – p′′.

Densidad absoluta aparente a t °C:

ρt °C = (p + m – p′′)/V20 °C

Calcular la densidad absoluta a 20 °C utilizando una de las tablas de corrección que figuran a continuación, en función de la naturaleza del líquido estudiado: vino seco (tabla II), mosto natural o concentrado (tabla III), vino dulce (tabla IV).

La densidad 20 °C/20 °C del vino se expresa dividiendo la densidad absoluta a 20 °C por 0,998203.

4.3.2.   Utilización de una balanza monoplato

Pesar el frasco tara; sea su masa T1.

Calcular dT = T1 – T0

Masa del picnómetro vacío en el momento de la medida = P – m + dT

Pesar el picnómetro lleno con la muestra problema preparada (punto 3) siguiendo las indicaciones que figuran en el punto 4.2.1. Sea P2 su masa a t °C.

Masa del líquido contenido en el picnómetro a t °C = P2 – (P – m + dT)

Densidad absoluta aparente a t °C:

ρt °C = (P2 – (P – m + dT))/V20 °C

Calcular la densidad absoluta a 20 °C del líquido estudiado: vino seco, mosto natural o concentrado y vino dulce, tal como se indica en el punto 4.3.1.

La densidad 20 °C/20 °C se obtiene dividiendo la densidad absoluta a 20 °C por 0,998203.

4.3.3.   Repetibilidad de la densidad absoluta:

para los vinos secos y semisecos: r = 0,00010

para los vinos dulces: r = 0,00018

4.3.4.   Reproducibilidad de la densidad absoluta:

para los vinos secos y semisecos: R = 0,00037

para los vinos dulces: R = 0,00045

TABLA I

Factores F

por los que hay que multiplicar la masa del agua contenida en el picnómetro de vidrio pyrex a t °C para calcular el volumen del picnómetro a 20 °C

[Remitirse a la tabla I del anexo II del método AS2 - 01 descrito en el Compendio de métodos internacionales de análisis de la OIV]

TABLA II

Correcciones c de temperatura sobre la densidad absoluta de vinos secos y de vinos secos de los que se ha eliminado el alcohol, medida en un picnómetro de vidrio pyrex a t °C para referir el resultado a 20 °C

[Remitirse a la tabla II del anexo II del método AS2 - 01 descrito en el Compendio de métodos internacionales de análisis de la OIV]

| ρ20 = ρ
  t
  ± (c/1 000) | – si t °C es inferior a 20 °C
  - si t °C es superior a 20 °C |
| --- | --- |

ρ20 = ρ
  t
  ± (c/1 000)

– si t °C es inferior a 20 °C

- si t °C es superior a 20 °C

TABLA III

Correcciones c de temperatura sobre la densidad absoluta de mostos naturales y concentrados, medida a t °C mediante un picnómetro de vidrio pyrex, para referir el resultado a 20 °C

[Remitirse a la tabla III del anexo II del método AS2 - 01 descrito en el Compendio de métodos internacionales de análisis de la OIV]

| ρ20 = ρ
  t
  ± (c/1 000) | – si t °C es inferior a 20 °C
  - si t °C es superior a 20 °C |
| --- | --- |

ρ20 = ρ
  t
  ± (c/1 000)

– si t °C es inferior a 20 °C

- si t °C es superior a 20 °C

TABLA IV

Correcciones c de temperatura sobre la densidad absoluta de vinos de 13 % vol. o más que contengan azúcar residual, medida con un picnómetro de vidrio pyrex a t °C para referir el resultado a 20 °C

[Remitirse a la tabla IV del anexo II del método AS2 - 01 descrito en el Compendio de métodos internacionales de análisis de la OIV]

| ρ20 = ρ
  t
  ± (c/1 000) | – si t °C es inferior a 20 °C
  - si t °C es superior a 20 °C |
| --- | --- |

ρ20 = ρ
  t
  ± (c/1 000)

– si t °C es inferior a 20 °C

- si t °C es superior a 20 °C

2   EVALUACIÓN MEDIANTE REFRACTOMERÍA DEL CONTENIDO EN AZÚCARES DE MOSTOS, MOSTOS CONCENTRADOS Y MOSTOS CONCENTRADOS RECTIFICADOS (OIV - AS2 - 02-SUCREF) — MÉTODO DE TIPO I

1.   PRINCIPIO DEL MÉTODO

El índice de refracción a 20 °C, expresado de modo absoluto o como porcentaje en masa de sacarosa, se lleva a la tabla correspondiente para obtener el contenido en azúcares en gramos por litro y en gramos por kilogramo de mosto, mosto concentrado y mosto concentrado rectificado.

2.   MATERIAL

2.1.   Refractómetro de tipo Abbé

El refractómetro utilizado deberá estar provisto de una escala que indique:

| — | el porcentaje en masa de sacarosa, con precisión de 0,1 %, o bien |
| --- | --- |

—

el porcentaje en masa de sacarosa, con precisión de 0,1 %, o bien

| — | el índice de refracción con cuatro decimales. |
| --- | --- |

—

el índice de refracción con cuatro decimales.

El refractómetro deberá estar provisto de un termómetro, cuya escala estará graduada como mínimo de + 15 °C a + 25 °C, y de un dispositivo de circulación de agua que permita realizar las mediciones a una temperatura de 20 °C ± 5 °C.

Deberán seguirse estrictamente las instrucciones sobre el manejo de este instrumento, en particular las concernientes al calibrado y a la fuente luminosa.

3.   PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

3.1.   Mostos y mostos concentrados

Puede pasarse el mosto a través de una gasa seca doblada en cuatro; tras haber eliminado las primeras gotas de filtrado, efectuar la determinación con el producto filtrado.

3.2.   Mostos concentrados rectificados

Utilizar, según su concentración, el mosto concentrado rectificado o bien la solución obtenida añadiendo agua a 200 g de mosto concentrado rectificado exactamente pesados hasta llegar a 500 g.

4.   PROCEDIMIENTO

Llevar la muestra a una temperatura próxima a 20 °C. Colocar una pequeña porción de la muestra en el prisma inferior del refractómetro procurando que, estando los prismas en estrecho contacto entre sí, aquélla cubra uniformemente la superficie del vidrio, y efectuar la medición con arreglo a las instrucciones de manejo del aparato utilizado.

Medir el porcentaje en masa de sacarosa con una precisión de 0,1 % o anotar el índice de refracción con cuatro decimales.

Efectuar al menos dos determinaciones de cada muestra preparada. Anotar la temperatura t °C.

5.   CÁLCULO

5.1.   Corrección de temperatura

5.1.1.   Aparatos graduados en porcentaje en masa de sacarosa. Utilizar la tabla I para la corrección de temperatura.

5.1.2.   Aparatos graduados en índices de refracción; llevar el índice medido a t °C a la tabla II para obtener (columna 1) el valor correspondiente del porcentaje en masa de sacarosa a t °C. Mediante la tabla I se corregirá este valor expresándolo a 20 °C.

5.2.   Contenido en azúcares de mostos y mostos concentrados

Llevar el porcentaje en masa de sacarosa a 20 °C a la tabla II para obtener el contenido en azúcares en gramos por litro y en gramos por kilogramo. El contenido en azúcares se expresará en azúcar invertido con un decimal.

5.3.   Contenido en azúcares de mosto concentrado rectificado

Llevar el porcentaje en masa de sacarosa a 20 °C a la tabla III para obtener el contenido en azúcares en gramos por litro y en gramos por kilogramo. El contenido en azúcares se expresará en azúcar invertido con un decimal.

Si la medición se ha efectuado con el mosto concentrado rectificado diluido, se multiplicará el resultado por el factor de dilución.

5.4.   Índice de refracción de mostos, mostos concentrados y mostos concentrados rectificados

Llevar el porcentaje en masa de sacarosa a 20 °C a la tabla II para obtener el índice de refracción a 20 °C. Este índice se expresará con cuatro decimales.

Nota: El grado alcohólico volumétrico en potencia de mostos, mostos concentrados y mostos concentrados rectificados puede determinarse utilizando el cuadro de correspondencias que figura en el anexo I del Reglamento (CE) no 1623/2000 de la Comisión, de 25 de julio de 2000 (DO L 194 de 31.7.2000).

TABLA I

Corrección que deberá efectuarse cuando el porcentaje en masa de sacarosa se determine a una temperatura diferente de 20 °C

[Remitirse a la tabla I del anexo del método AS2 - 02 descrito en el Compendio de métodos internacionales de análisis de la OIV]

TABLA II

Tabla del contenido en azúcar, en gramos por litro y en gramos por kilogramo, de mostos y mostos concentrados, determinado mediante un refractómetro graduado bien en porcentaje en masa de sacarosa a 20 °C o bien en índice de refracción a 20 °C. También se indica la densidad absoluta a 20 °C.

[Remitirse a la tabla II del anexo del método AS2 - 02 descrito en el Compendio de métodos internacionales de análisis de la OIV]

TABLA III

Tabla del contenido en azúcar, en gramos por litro y en gramos por kilogramo, de mostos concentrados rectificados, determinado mediante un refractómetro graduado en porcentaje en masa de sacarosa a 20 °C o en índice de refracción a 20 °C. También se indica la densidad absoluta a 20 °C.

[Remitirse a la tabla III del anexo del método AS2 - 02 descrito en el Compendio de métodos internacionales de análisis de la OIV]

3   EXTRACTO SECO TOTAL (OIV-AS-2-03-EXTSEC) MATERIAS SECAS TOTALES — MÉTODO DE TIPO I

1.   DEFINICIÓN

El extracto seco total o materias secas totales es el conjunto de todas las substancias que no se volatilizan en determinadas condiciones físicas. Estas condiciones físicas deben establecerse de tal forma que las substancias que componen el extracto sufran el mínimo de alteraciones.

El extracto no reductor es el extracto seco total menos los azúcares totales.

El extracto reducido es el extracto seco total menos los azúcares totales que excedan de 1 g/l, el sulfato potásico que exceda de 1 g/l, el manitol, si lo hubiere, y todas las substancias químicas que se puedan haber añadido al vino.

El resto del extracto es el extracto no reductor menos la acidez fija expresada en ácido tartárico.

El extracto se expresa en gramos por litro y debe determinarse con una precisión de 0,5 g.

2.   PRINCIPIO DEL MÉTODO

[La descripción de este método de análisis está siendo objeto de actualización por parte de las instancias de la OIV. Esta descripción se publicará en una próxima Comunicación de la Comisión en cuanto la OIV haya publicado un texto actualizado en la edición 2010 del Compendio de métodos internacionales de análisis de la OIV. A título indicativo, a la espera de dicha publicación, cabe remitirse al capítulo 4 del anexo del Reglamento (CEE) no 2676/90 de la Comisión.]

4   DETERMINACIÓN DE LA RELACIÓN ISOTÓPICA 18O/16O DEL AGUA DEL VINO (OIV-AS-2-09-MOUO18) — MÉTODO DE TIPO II

(p.m.)

[La descripción de este método de análisis está siendo objeto de actualización por parte de las instancias de la OIV. Esta descripción se publicará en una próxima Comunicación de la Comisión en cuanto la OIV haya publicado un texto actualizado en la edición 2010 del Compendio de métodos internacionales de análisis de la OIV. A título indicativo, a la espera de dicha publicación, cabe remitirse al capítulo 43 del anexo del Reglamento (CEE) no 2676/90 de la Comisión.]

5   ÍNDICE DE FOLIN-CIOCALTEU (OIV-AS-2-10-INDFOL) — MÉTODO DE TIPO IV

1.   DEFINICIÓN

El índice de Folin-Ciocalteu es el resultado de la aplicación del método que se describe a continuación.

2.   PRINCIPIO

El conjunto de los compuestos fenólicos del vino se oxida con el reactivo de Folin-Ciocalteu. Este último está constituido por una mezcla de ácido fosfotúngstico (H3PW12O40) y ácido fosfomolíbdico (H3PMo12O40) que se reduce, en la oxidación de los fenoles, a una mezcla de óxidos azules de tungsteno (W8O23) y de molibdeno (Mo8O23).

La coloración azul producida posee una absorción máxima en torno a 750 nm y es proporcional al porcentaje de compuestos fenólicos.

3.   REACTIVOS

Los reactivos deben ser de calidad analítica. El agua utilizada será agua destilada o agua de pureza equivalente.

3.1.   Reactivo de Folin-Ciocalteu

Este reactivo se encuentra en el comercio listo para su empleo. Puede prepararse de la forma siguiente: disolver en 700 ml de agua destilada 100 g de tungstato de sodio (Na2WO4×2 H2O) y 25 g de molibdato de sodio (Na2MoO4·2 H2O); añadir 50 ml de ácido fosfórico al 85 % (ρ20 = 1,71 g/ml) y 100 ml de ácido clorhídrico concentrado (ρ20 = 1,19 g/ml). Llevar a ebullición bajo reflujo durante 10 horas, añadir a continuación 150 g de sulfato de litio (Li2SO4·H2O), algunas gotas de bromo y hervir de nuevo durante 15 minutos. Enfriar y completar hasta 1 litro con agua destilada.

3.2.   Carbonato de sodio (Na2CO3) anhidro en solución al 20 % (m/v).

4.   MATERIAL

Material corriente de laboratorio, y en particular:

4.1.   Matraces aforados de 100 ml.

4.2.   Espectrofotómetro que permita trabajar a 750 nm.

5.   PROCEDIMIENTO

5.1.   Vinos tintos

En un matraz aforado de 100 ml (punto 4.1), introducir respetando el orden siguiente:

| | 1 ml de vino diluido al 1/5, |
| --- | --- |

1 ml de vino diluido al 1/5,

| | 50 ml de agua destilada, |
| --- | --- |

50 ml de agua destilada,

| | 5 ml de reactivo de Folin-Ciocalteu (punto 3.1), |
| --- | --- |

5 ml de reactivo de Folin-Ciocalteu (punto 3.1),

| | 20 ml de solución de carbonato de sodio (punto 3.2). |
| --- | --- |

20 ml de solución de carbonato de sodio (punto 3.2).

Enrasar a 100 ml con agua destilada.

Agitar para homogeneizar. Esperar 30 minutos, para que se estabilice la reacción. Determinar la absorbancia a 750 nm en una cubeta de 1 cm con relación a un testigo preparado con agua destilada en lugar del vino.

Si la absorbancia leída no está próxima a 0,3, conviene modificar la dilución del vino.

5.2.   Vinos blancos

Operar de la misma forma con 1 ml de vino sin diluir.

5.3.   Mostos concentrados rectificados

5.3.1.   Preparación de la muestra

Utilizar una solución cuyo contenido en azúcares sea del 25 % (m/m) (25° Brix), preparada del modo indicado en el capítulo «pH» (punto 4.1.2).

5.3.2.   Medida

Proceder como en el caso de los vinos tintos (punto 5.1) con 5 ml de muestra preparada de acuerdo con el punto 5.3.1, midiendo la absorbancia en relación con un testigo preparado con 5 ml de solución de azúcar invertido al 25 % (m/m).

6.   EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

6.1.   Modo de cálculo

El resultado se expresa en forma de índice obtenido al multiplicar la absorbancia por 100 en el caso de los vinos tintos diluidos al 1/5 (o por el factor correspondiente a la dilución empleada) y por 20 en el caso de los vinos blancos. En el caso de los mostos concentrados rectificados, la absorbancia hay que multiplicarla por 16.

6.2.   Repetibilidad

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simultáneamente o inmediatamente una después de otra por el mismo analista no debe ser superior a 1.

La buena repetibilidad de los resultados depende de la utilización de un material (matraces aforados y cubetas del espectrofotómetro) rigurosamente limpio.

6   GLUCOSA Y FRUCTOSA (OIV-AS-311-02-GLUFRU) — MÉTODO DE TIPO II

1.   DEFINICIÓN

La glucosa y la fructosa pueden determinarse por separado mediante un método enzimático, con vistas únicamente a calcular la relación glucosa/fructosa.

2.   PRINCIPIO

Se fosforilan la glucosa y la fructosa con adenosina-trifostato (ATP) mediante una reacción enzimática catalizada por la hexocinasa (HK), dando como resultado glucosa-6-fosfato (G6P) y fructosa-6-fosfato (F6P):

| | glucosa + ATP ←→ G6P + ADP |
| --- | --- |

glucosa + ATP ←→ G6P + ADP

| | fructosa + ATP ←→ F6P + ADP |
| --- | --- |

fructosa + ATP ←→ F6P + ADP

En un primer momento, el glucosa-6-fosfato se oxida a gluconato-6-fosfato mediante el nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato (NADP) en presencia de la enzima glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (G6PDH). La cantidad de nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato reducido (NADPH) que se origina corresponde a la cantidad de glucosa-6-fosfato y, por lo tanto, a la de glucosa:

G6P + NADP+ ←→ gluconato-6-fosfato + NADPH + H+

El nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato reducido se determina por su absorción a 340 nm.

Una vez finalizada esta reacción, el fructosa-6-fosfato se transforma en glucosa-6-fosfato por la acción de la fosfoglucosa-isomerasa (PGI):

F6P←→G6P

El glucosa-6-fosfato reacciona nuevamente con el nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato para dar gluconato-6-fosfato y nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato reducido, que es el que se determina.

3.   MATERIAL

| — | Espectrofotómetro que permita efectuar medidas a 340 nm, máximo de absorción del NADPH. Por tratarse de medidas absolutas (no existe curva de calibrado, sino referencia al coeficiente de extinción del NADPH), deben controlarse las escalas de las longitudes de onda y de las absorbancias del aparato.
  En su defecto, utilizar un espectrofotómetro de espectro discontinuo que permita efectuar medidas a 334 nm o 365 nm. |
| --- | --- |

—

Espectrofotómetro que permita efectuar medidas a 340 nm, máximo de absorción del NADPH. Por tratarse de medidas absolutas (no existe curva de calibrado, sino referencia al coeficiente de extinción del NADPH), deben controlarse las escalas de las longitudes de onda y de las absorbancias del aparato.

En su defecto, utilizar un espectrofotómetro de espectro discontinuo que permita efectuar medidas a 334 nm o 365 nm.

| — | Cubetas de vidrio o cubetas desechables de 1 cm de camino óptico. |
| --- | --- |

—

Cubetas de vidrio o cubetas desechables de 1 cm de camino óptico.

| — | Pipetas para ensayos enzimáticos de 0,02; 0,05; 0,1; 0,2 ml. |
| --- | --- |

—

Pipetas para ensayos enzimáticos de 0,02; 0,05; 0,1; 0,2 ml.

4.   REACTIVOS

4.1.   Solución 1: Amortiguador (trietanolamina 0,3 M; pH = 7,6; 4 x 10-3 M en Mg2+): disolver 11,2 g de clorhidrato de trietanolamina ((C2H5)3N·HC1) y 0,2 g de MgSO4 7 H2O en 150 ml de agua bidestilada; añadir alrededor de 4 ml de solución 5 M de hidróxido sódico (NaOH) para obtener un pH igual a 7,6 y llevar a 200 ml.

Esta solución amortiguadora se conserva 4 semanas a + 4 °C.

4.2.   Solución 2: Solución de nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato (11,5 x 10–3 M aproximadamente): disolver 50 mg de nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato disódico en 5 ml de agua bidestilada.

Esta solución se conserva 4 semanas a + 4 °C.

4.3.   Solución 3: Solución de adenosina-5′-trifosfato (81 x 10–3 M, aproximadamente): disolver 250 mg de adenosina-5′-trifosfato disódico y 250 mg de hidrogenocarbonato sódico (NaHCO3) en 5 ml de agua bidestilada.

Esta solución se conserva 4 semanas a + 4 °C.

4.4.   Solución 4: Hexocinasa/glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa: mezclar 0,5 ml de hexocinasa (2 mg de proteína/ml, es decir 280 U/ml) y 0,5 ml de glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (1 mg de proteína/ml).

Esta solución se conserva un año a + 4 °C.

4.5.   Solución 5: Fosfoglucosa-isomerasa (2 mg de proteína/ml, es decir 700 U/ml). La suspensión se utiliza sin dilución.

Esta solución se conserva un año a + 4 °C.

Observación:

El conjunto de reactivos necesarios para esta determinación se comercializa ya preparado.

5.   PROCEDIMIENTO

5.1.   Preparación de la muestra

En función de la cantidad estimada de glucosa + fructosa por litro, efectuar las diluciones siguientes:

| Medida a 340 nm y 334 nm | Medida a 365 nm | Dilución con agua | Factor F de dilución |
| --- | --- | --- | --- |
| Hasta 0,4 g/l | Hasta 0,8 g/l | — | — |
| Hasta 4,0 g/l | Hasta 8,0 g/l | 1 + 9 | 10 |
| Hasta 10,0 g/l | Hasta 20,0 g/l | 1 + 24 | 25 |
| Hasta 20,0 g/l | Hasta 40,0 g/l | 1 + 49 | 50 |
| Hasta 40,0 g/l | Hasta 80,0 g/l | 1 + 99 | 100 |
| Por encima de 40,0 g/l | Por encima de 80,0 g/l | 1 + 999 | 1 000 |

Medida a 340 nm y 334 nm

Medida a 365 nm

Dilución con agua

Factor F de dilución

Hasta 0,4 g/l

Hasta 0,8 g/l

—

—

Hasta 4,0 g/l

Hasta 8,0 g/l

1 + 9

10

Hasta 10,0 g/l

Hasta 20,0 g/l

1 + 24

25

Hasta 20,0 g/l

Hasta 40,0 g/l

1 + 49

50

Hasta 40,0 g/l

Hasta 80,0 g/l

1 + 99

100

Por encima de 40,0 g/l

Por encima de 80,0 g/l

1 + 999

1 000

5.2.   Determinación

Regulando el espectrofotómetro a la longitud de onda de 340 nm, efectuar las medidas con respecto al aire (sin cubeta en el camino óptico) o con respecto al agua.

Temperatura de 20 a 25 °C.

En dos cubetas de 1 cm de camino óptico, introducir:

| | Testigo | Determinación |
| --- | --- | --- |
| Solución 1 (4.1) (a 20 °C) | 2,50 ml | 2,50 ml |
| Solución 2 (4.2) | 0,10 ml | 0,10 ml |
| Solución 3 (4.3) | 0,10 ml | 0,10 ml |
| Muestra problema | | 0,20 ml |
| Agua bidestilada | 0,20 ml | |

Testigo

Determinación

Solución 1 (4.1) (a 20 °C)

2,50 ml

2,50 ml

Solución 2 (4.2)

0,10 ml

0,10 ml

Solución 3 (4.3)

0,10 ml

0,10 ml

Muestra problema

0,20 ml

Agua bidestilada

0,20 ml

Mezclar y, transcurridos 3 min. aproximadamente, leer la absorbancia de las soluciones (A1). Desencadenar la reacción, añadiendo:

| Solución 4 (4.4) | 0,02 ml | 0,02 ml |
| --- | --- | --- |

Solución 4 (4.4)

0,02 ml

0,02 ml

Mezclar; esperar 15 min.; medir la absorbancia y verificar el cese de la reacción cuando hayan pasado 2 min. (A2).

Inmediatamente después, añadir:

| Solución 5 (4.5) | 0,02 ml | 0,02 ml |
| --- | --- | --- |

Solución 5 (4.5)

0,02 ml

0,02 ml

Mezclar; leer al cabo de 10 min.; comprobar el cese de la reacción después de 2 min. (A3).

Determinar las diferencias de absorbancia:

| | A2 – A1 correspondiente a la glucosa, |
| --- | --- |

A2 – A1 correspondiente a la glucosa,

| | A3 – A2 correspondiente a la fructosa, |
| --- | --- |

A3 – A2 correspondiente a la fructosa,

tanto en relación con el testigo como con la determinación.

Deducir la diferencia de absorbancia del testigo (ΔAT) y la de la muestra (ΔAM) y establecer:

| | para la glucosa: ΔAG = ΔAM – ΔAT |
| --- | --- |

para la glucosa: ΔAG = ΔAM – ΔAT

| | para la fructosa: ΔAF = ΔAM – ΔAT |
| --- | --- |

para la fructosa: ΔAF = ΔAM – ΔAT

Observación:

El tiempo necesario para la acción de las enzimas puede variar de un lote a otro. Aquí solo se ha dado a título indicativo. Se recomienda determinarlo con cada lote.

5.3.   Expresión de los resultados

5.3.1.   Cálculo

La fórmula general para el cálculo de las concentraciones es la siguiente:

C= ((V x PM)/(ε × d × v × 1 000)) × ΔA (g/l)

V= volumen contenido en la cubeta (ml)

v= volumen de la muestra (ml)

PM= masa molecular de la sustancia que va a determinarse

d= camino óptico de la cubeta (cm)

ε= coeficiente de absorción del NADPH a 340 nm = 6,3 (mmol–1 × l × cm–1)

V= 2,92 ml para la determinación de la glucosa

V= 2,94 ml para la determinación de la fructosa

v= 0,20 ml

PM= 180

d= 1.

Se obtiene:

| | para la glucosa: C (g/l) = 0,417 × ΔAG |
| --- | --- |

para la glucosa: C (g/l) = 0,417 × ΔAG

| | para la fructosa: C (g/l) = 0,420 × ΔAF |
| --- | --- |

para la fructosa: C (g/l) = 0,420 × ΔAF

Si al preparar la muestra se ha efectuado una dilución, multiplicar el resultado por el factor F.

Observación:

Si las medidas se han tomado a longitudes de onda de 334 o 365 nm, se obtiene:

| — | medida a 334 nm: ε = 6,2 (mmol–1 × l × cm–1)
  para la glucosa: C (g/l) = 0,425 × ΔAG

  para la fructosa: C (g/l) = 0,428 × ΔAF |
| --- | --- |

—

medida a 334 nm: ε = 6,2 (mmol–1 × l × cm–1)

para la glucosa: C (g/l) = 0,425 × ΔAG

para la fructosa: C (g/l) = 0,428 × ΔAF

| — | medida a 365 nm: ε = 3,4 (mmol–1 × l × cm–1)
  para la glucosa: C (g/l) = 0,773 × ΔAG

  para la fructosa: C (g/l) = 0,778 × ΔAF |
| --- | --- |

—

medida a 365 nm: ε = 3,4 (mmol–1 × l × cm–1)

para la glucosa: C (g/l) = 0,773 × ΔAG

para la fructosa: C (g/l) = 0,778 × ΔAF

5.3.2.   Repetibilidad (r)

r= 0,056 xi

5.3.3.   Reproducibilidad (R)

R= 0,12 + 0,076 xi

xi= contenido en glucosa o fructosa en gramos por litro.

7   DETERMINACIÓN DE AZÚCARES POR HPLC (SACAROSA) (OIV-AS-311-03-SUCRES) — MÉTODO DE TIPO II

(p.m.)

[La descripción de este método de análisis está siendo objeto de actualización por parte de las instancias de la OIV. Esta descripción se publicará en una próxima Comunicación de la Comisión en cuanto la OIV haya publicado un texto actualizado en la edición 2010 del Compendio de métodos internacionales de análisis de la OIV. A título indicativo, a la espera de dicha publicación, cabe remitirse al capítulo 6, punto 3, del anexo del Reglamento (CEE) no 2676/90 de la Comisión.]

8   DETECCIÓN DEL AUMENTO DEL GRADO ALCOHÓLICO NATURAL DE MOSTOS DE UVA, DE MOSTOS DE UVA CONCENTRADOS, DE MOSTOS DE UVA CONCENTRADOS RECTIFICADOS Y DE VINOS POR APLICACIÓN DE LA RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DEL DEUTERIO (OIV-AS-311-05-ENRRMN) — MÉTODO DE TIPO I

(p.m.)

[La descripción de este método de análisis está siendo objeto de reexamen por parte de las instancias científicas de la OIV. Esta descripción se publicará en una Comunicación de la Comisión en cuanto la Asamblea General de la OIV haya adoptado un texto definitivo. A título indicativo, a la espera de dicha decisión de la OIV, cabe remitirse al capítulo 8 del anexo del Reglamento (CEE) no 2676/90 de la Comisión.]

9   GRADO ALCOHÓLICO VOLUMÉTRICO (OIV-AS-312-01-TALVOL) — MÉTODOS DE TIPO I

(p.m.)

[Las descripciones de estos métodos de análisis están siendo objeto de actualización por parte de las instancias de la OIV. Se publicarán en una próxima Comunicación de la Comisión en cuanto la OIV haya publicado un texto actualizado en la edición 2010 del Compendio de métodos internacionales de análisis de la OIV. A título indicativo, a la espera de dicha publicación de la OIV, cabe remitirse al capítulo 3 del anexo del Reglamento (CEE) no 2676/90 de la Comisión.]

10   DETERMINACIÓN DE LA RELACIÓN ISOTÓPICA 13C/12C POR ESPECTROMETRÍA DE MASA ISOTÓPICA DEL ETANOL DEL VINO O DEL ETANOL OBTENIDO POR FERMENTACIÓN DE MOSTOS, MOSTOS CONCENTRADOS O MOSTOS CONCENTRADOS RECTIFICADOS (OIV-AS-312-06-ETHANO) — MÉTODO DE TIPO II

1.   ÁMBITO DE APLICACIÓN

El método permite la medición de la relación isotópica 13C/12C del etanol del vino y del etanol obtenido por fermentación de productos derivados de la vid (mosto, mosto concentrado, mosto concentrado rectificado).

2.   REFERENCIAS NORMATIVAS

| ISO: | 5725:1994 «Fidelidad de los métodos de ensayo: Determinación de la repetibilidad y de la reproducibilidad de un método de ensayo normalizado por ensayos interlaboratorios». |
| --- | --- |
| V-PDB: | Belemnita de Viena Pee-Dee (RPDB = 0,0112372). |
| Método OIV AS-311-O5-ENRRMN | «Detección del aumento del grado alcohólico natural de mostos, mostos concentrados, mostos concentrados rectificados y vinos por aplicación de la resonancia magnética nuclear del deuterio (FINE-RMN)» |

ISO:

5725:1994 «Fidelidad de los métodos de ensayo: Determinación de la repetibilidad y de la reproducibilidad de un método de ensayo normalizado por ensayos interlaboratorios».

V-PDB:

Belemnita de Viena Pee-Dee (RPDB = 0,0112372).

Método OIV AS-311-O5-ENRRMN

«Detección del aumento del grado alcohólico natural de mostos, mostos concentrados, mostos concentrados rectificados y vinos por aplicación de la resonancia magnética nuclear del deuterio (FINE-RMN)»

3.   TERMINOLOGÍA Y DEFINICIONES

| 13C/12C | : | Relación de los isótopos del carbono 13 (13C) y 12 (12C) en una muestra dada. |
| --- | --- | --- |
| δ13C | : | Contenido en carbono 13 (13C) expresado en partes por mil (‰). |
| FINE-RMN | : | Fraccionamiento isotópico natural específico estudiado por resonancia magnética nuclear. |
| V-PDB | : | Belemnita de Viena Pee-Dee. La PDB, referencia primaria para la medición de las variaciones naturales de los contenidos isotópicos en carbono 13, era un carbonato de calcio procedente de un rostro de belemnita del Cretácico, de la formación Pee-Dee de Carolina del Sur (EE.UU.). Su relación isotópica 13C/12C o RPDB es RPDB = 0,0112372. La PDB está agotada desde hace mucho tiempo, pero sigue siendo la referencia primaria para expresar las variaciones naturales de los contenidos isotópicos en carbono 13, frente a la que se calibran los materiales de referencia, disponibles en el Organismo Internacional de la Energía Atómica (OIEA) de Viena (Austria). Las determinaciones isotópicas de la presencia natural de carbono 13 se expresan entonces, por convención, respecto a la V-PDB. |
| m/z | : | Relación masa/carga. |

13C/12C

:

Relación de los isótopos del carbono 13 (13C) y 12 (12C) en una muestra dada.

δ13C

:

Contenido en carbono 13 (13C) expresado en partes por mil (‰).

FINE-RMN

:

Fraccionamiento isotópico natural específico estudiado por resonancia magnética nuclear.

V-PDB

:

Belemnita de Viena Pee-Dee. La PDB, referencia primaria para la medición de las variaciones naturales de los contenidos isotópicos en carbono 13, era un carbonato de calcio procedente de un rostro de belemnita del Cretácico, de la formación Pee-Dee de Carolina del Sur (EE.UU.). Su relación isotópica 13C/12C o RPDB es RPDB = 0,0112372. La PDB está agotada desde hace mucho tiempo, pero sigue siendo la referencia primaria para expresar las variaciones naturales de los contenidos isotópicos en carbono 13, frente a la que se calibran los materiales de referencia, disponibles en el Organismo Internacional de la Energía Atómica (OIEA) de Viena (Austria). Las determinaciones isotópicas de la presencia natural de carbono 13 se expresan entonces, por convención, respecto a la V-PDB.

m/z

:

Relación masa/carga.

4.   PRINCIPIO

En la fotosíntesis, la asimilación del gas carbónico por los vegetales se efectúa según dos tipos principales de metabolismo, que son los metabolismos C3 (ciclo de Calvin) y C4 (Hatch y Slack). Estos dos mecanismos de fotosíntesis presentan un fraccionamiento isotópico diferente. De esta manera, los productos de las plantas, como los azúcares y el alcohol obtenido por su fermentación, presentan contenidos en carbono 13 más elevados si proceden de plantas C4 que si proceden de plantas C3. La mayoría de los vegetales, como la vid y la remolacha, pertenecen al grupo C3, mientras que la caña de azúcar y el maíz pertenecen al grupo C4. La medición del contenido en carbono 13 permite, así pues, la detección y evaluación del azúcar de origen C4 (azúcar de caña o isoglucosa de maíz) añadido a los productos derivados de la uva (mostos de uva, vinos, etc.). La combinación de la información sobre el contenido en carbono 13 con la obtenida mediante FINE-RMN permite igualmente la cuantificación de la adición de mezclas de azúcares o de alcoholes procedentes de plantas C3 y C4.

El contenido en carbono 13 se determina en el gas carbónico resultante de la combustión completa de la muestra. La concentración de los principales isotopómeros de masa 44 (12C16O2), 45 (13C16O2 y 12C17O16O) y 46 (12C16O18O), resultado de las diferentes combinaciones posibles de los isótopos 18O, 17O, 16O, 13C y 12C, se determina a partir de las corrientes iónicas medidas en tres colectores diferentes de un espectrómetro de masa de relación isotópica. Las aportaciones de los isotopómeros 13C17O16O y 12C17O2 pueden despreciarse debido a su escasísima proporción. La corriente iónica correspondiente a m/z = 45 se corrige para tener en cuenta la aportación de 12C17O16O, que se calcula en función de la intensidad de la corriente medida correspondiente a m/z = 46, considerando las concentraciones relativas de 18O y 17O (corrección de Craig). La comparación con una referencia calibrada frente a la referencia internacional V-PDB permite calcular el contenido en carbono 13 en la escala relativa de δ 13C.

5.   REACTIVOS

Las sustancias y los materiales fungibles dependen del equipo (6) utilizado por el laboratorio. Los sistemas generalmente utilizados se basan en el analizador elemental. Este puede estar diseñado para la introducción de muestras colocadas en cápsulas metálicas herméticamente cerradas, o para la inyección de muestras líquidas a través de una membrana mediante una jeringa.

Según el tipo de instrumentación utilizado, pueden utilizarse las siguientes sustancias de referencia, reactivos y materiales fungibles:

| — | Sustancias de referencia |
| --- | --- |

—

Sustancias de referencia

| — | disponibles en el OIEA:







  Nombre | Material | δ13C frente a V-PDB (9) |
| --- | --- | --- | --- |
| — | IAEA-CH-6 |

—

disponibles en el OIEA:

Nombre

Material

δ13C frente a V-PDB (9)

—

IAEA-CH-6

sacarosa

–10,4 ‰

| — | IAEA-CH-7 |
| --- | --- |

—

IAEA-CH-7

polietileno

–31,8 ‰

| — | NBS22 |
| --- | --- |

—

NBS22

aceite

–29,7 ‰

| — | USGS24 |
| --- | --- |

—

USGS24

grafito

–16,1 ‰

| — | disponibles en el IRMM (Instituto de Materiales y Medidas de Referencia) de Geel (B):







  Nombre | Material | δ13C frente a V-PDB (9) |
| --- | --- | --- | --- |
| — | CRM/BCR 656 |

—

disponibles en el IRMM (Instituto de Materiales y Medidas de Referencia) de Geel (B):

Nombre

Material

δ13C frente a V-PDB (9)

—

CRM/BCR 656

alcohol de vino

–26,93 ‰

| — | CRM/BCR 657 |
| --- | --- |

—

CRM/BCR 657

glucosa

–10,75 ‰

| — | CRM/BCR 660 |
| --- | --- |

—

CRM/BCR 660

solución hidroalcohólica (graduación alcohólica 12 % vol.)

–26,72 ‰

| — | Muestra patrón de trabajo con una relación 13C/12C conocida, calibrada frente a materiales de referencia internacionales. |
| --- | --- |

—

Muestra patrón de trabajo con una relación 13C/12C conocida, calibrada frente a materiales de referencia internacionales.

| — | La lista indicativa de materiales fungibles que figura a continuación corresponde a los sistemas de flujo continuo:






  — | helio para análisis (CAS 07440-59-7), |
| --- | --- | --- |

—

La lista indicativa de materiales fungibles que figura a continuación corresponde a los sistemas de flujo continuo:

—

helio para análisis (CAS 07440-59-7),

| — | oxígeno para análisis (CAS 07440-44-7), |
| --- | --- |

—

oxígeno para análisis (CAS 07440-44-7),

| — | dióxido de carbono para análisis, utilizado como gas de referencia secundaria del contenido en carbono 13 (CAS 00124-38-9), |
| --- | --- |

—

dióxido de carbono para análisis, utilizado como gas de referencia secundaria del contenido en carbono 13 (CAS 00124-38-9),

| — | reactivo de oxidación para el horno del sistema de combustión, como por ejemplo óxido de cobre (II) para análisis elemental (CAS 1317-38-0), |
| --- | --- |

—

reactivo de oxidación para el horno del sistema de combustión, como por ejemplo óxido de cobre (II) para análisis elemental (CAS 1317-38-0),

| — | desecante para eliminar el agua producida por la combustión, por ejemplo anhidrona para análisis elemental (perclorato de magnesio) (CAS 10034-81-8) (innecesario en los equipos dotados de un sistema de eliminación del agua por separación mediante el frío o mediante un capilar con permeabilidad selectiva). |
| --- | --- |

—

desecante para eliminar el agua producida por la combustión, por ejemplo anhidrona para análisis elemental (perclorato de magnesio) (CAS 10034-81-8) (innecesario en los equipos dotados de un sistema de eliminación del agua por separación mediante el frío o mediante un capilar con permeabilidad selectiva).

6.   EQUIPO Y MATERIAL

6.1.   Espectrómetro de masa de relación isotópica (EMRI)

Espectrómetro de masa de relación isotópica (EMRI), que permita determinar el contenido natural relativo en 13C del gas CO2 con una precisión interna del 0,05 ‰ o mejor, expresado en valor relativo (punto 9). La precisión interna se define aquí como la diferencia entre dos medidas de la misma muestra de CO2. El espectrómetro de masa, destinado a la medición de relaciones isotópicas, está equipado generalmente con un colector triple para medir simultáneamente las intensidades correspondientes a m/z = 44, 45 y 46. El espectrómetro de masa de relación isotópica debe estar equipado con un sistema de introducción doble para medir en alternancia la muestra problema y una muestra de referencia, o bien utilizar un sistema integrado que efectúe la combustión cuantitativa de las muestras y separe el dióxido de carbono de los demás productos de combustión antes de la medición en el espectrómetro de masa.

6.2.   Equipo de combustión

Equipo de combustión capaz de convertir cuantitativamente el etanol en dióxido de carbono y de eliminar todos los demás productos de combustión, incluida el agua, sin ningún fraccionamiento isotópico. El equipo puede ser un sistema de flujo continuo integrado en la instrumentación de espectrometría de masa (punto 6.2.1), o bien un sistema autónomo de combustión (punto 6.2.2). El equipo debe permitir la obtención de una precisión al menos equivalente a la indicada en el punto 11.

6.2.1.   Sistemas de flujo continuo

Están constituidos por un analizador elemental o por un cromatógrafo de gases dotado de un sistema de combustión en línea.

En caso de sistemas equipados para la introducción de muestras contenidas en cápsulas metálicas, se utiliza el material de laboratorio siguiente:

| — | microjeringa o micropipeta aforada con puntas apropiadas, |
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—

microjeringa o micropipeta aforada con puntas apropiadas,

| — | balanza con escala de lectura de 1 μg al menos, |
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—

balanza con escala de lectura de 1 μg al menos,

| — | pinzas para encapsular, |
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—

pinzas para encapsular,

| — | cápsulas de estaño para muestras líquidas, |
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—

cápsulas de estaño para muestras líquidas,

| — | cápsulas de estaño para muestras sólidas. |
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—

cápsulas de estaño para muestras sólidas.

Nota:

A fin de limitar los riesgos de evaporación de las muestras de etanol, es posible poner en las cápsulas un material absorbente (por ejemplo, chromosorb W 45-60 mesh) del cual se habrá comprobado previamente, mediante un ensayo en blanco, que no lleva ninguna cantidad significativa de carbono que pueda alterar los resultados.

Si se emplea un analizador elemental dotado de inyector para líquidos o en caso de sistema de preparación por cromatografía-combustión, se utiliza el material de laboratorio siguiente:

| — | jeringa para líquidos, |
| --- | --- |

—

jeringa para líquidos,

| — | frascos provistos de cierres estancos y de membranas inertes. |
| --- | --- |

—

frascos provistos de cierres estancos y de membranas inertes.

Los materiales de laboratorio indicados en las listas anteriores se dan a título de ejemplo y pueden sustituirse por otros materiales de características equivalentes según el tipo de equipo de combustión y de espectrometría de masa utilizado por el laboratorio.

6.2.2.   Sistemas autónomos de preparación

En este caso, las muestras de dióxido de carbono procedentes de la combustión de las muestras problema y de referencia se recogen en ampollas que se instalan a continuación en el doble sistema de entrada del espectrómetro para efectuar el análisis isotópico. Pueden utilizarse varios tipos de equipos de combustión descritos en la bibliografía:

| — | sistema cerrado de combustión llenado con gas oxígeno circulante, |
| --- | --- |

—

sistema cerrado de combustión llenado con gas oxígeno circulante,

| — | analizador elemental con flujo de helio y de oxígeno, |
| --- | --- |

—

analizador elemental con flujo de helio y de oxígeno,

| — | ampolla sellada, de cristal, rellena de óxido de cobre (II) como agente de oxidación. |
| --- | --- |

—

ampolla sellada, de cristal, rellena de óxido de cobre (II) como agente de oxidación.

7.   PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS PROBLEMA

El etanol debe extraerse del vino antes de la determinación isotópica. Esta extracción se efectúa mediante destilación del vino, como se describe en el punto 3.1 del método de FINE-RMN (OIV - MA-E-AS311-05-ENRRMN).

Cuando se trate de mosto de uva, de mosto de uva concentrado y de mosto de uva concentrado rectificado, los azúcares deben fermentarse en primer lugar para convertirse en etanol, como se describe en el punto 3.2 del método de FINE-RMN (OIV - MA-E-AS311-05-ENRRMN).

8.   PROCEDIMIENTO

Todas las etapas preparatorias deben efectuarse evitando que se pierda por evaporación cualquier cantidad significativa de etanol, lo que podría cambiar la composición isotópica de la muestra.

La descripción que figura a continuación hace referencia a los procedimientos utilizados generalmente para la combustión de muestras de etanol por medio de sistemas automatizados de combustión presentes en el comercio. Para la preparación del dióxido de carbono a fines de análisis isotópico pueden convenir otros métodos, siempre que garanticen que la muestra de etanol se convierte cuantitativamente en dióxido de carbono, sin ninguna pérdida de etanol por evaporación.

Procedimiento experimental basado en la utilización de un analizador elemental:

| a) | Encapsulado de las muestras:






  — | utilizar cápsulas, pinzas y placa de preparación limpias, |
| --- | --- | --- |

a)

Encapsulado de las muestras:

—

utilizar cápsulas, pinzas y placa de preparación limpias,

| — | con ayuda de las pinzas, tomar una cápsula de dimensiones apropiadas, |
| --- | --- |

—

con ayuda de las pinzas, tomar una cápsula de dimensiones apropiadas,

| — | introducir el volumen necesario de líquido en la cápsula mediante la micropipeta, |
| --- | --- |

—

introducir el volumen necesario de líquido en la cápsula mediante la micropipeta,

| — | Nota:

  Para obtener 2 mg de carbono hacen falta 3,84 mg de etanol absoluto o 4,17 mg de destilado con un grado alcohólico de 92 % m/m. Debe calcularse de la misma manera la cantidad adecuada de destilado según la cantidad de carbono necesaria en función de la sensibilidad del equipo de espectrometría de masa. |
| --- | --- |

—

Nota:

Para obtener 2 mg de carbono hacen falta 3,84 mg de etanol absoluto o 4,17 mg de destilado con un grado alcohólico de 92 % m/m. Debe calcularse de la misma manera la cantidad adecuada de destilado según la cantidad de carbono necesaria en función de la sensibilidad del equipo de espectrometría de masa.

| — | cerrar la cápsula con ayuda de las pinzas, |
| --- | --- |

—

cerrar la cápsula con ayuda de las pinzas,

| — | cada cápsula debe cerrarse de forma totalmente hermética; en caso contrario, hay que eliminar la cápsula defectuosa y preparar una nueva, |
| --- | --- |

—

cada cápsula debe cerrarse de forma totalmente hermética; en caso contrario, hay que eliminar la cápsula defectuosa y preparar una nueva,

| — | preparar dos cápsulas de cada muestra, |
| --- | --- |

—

preparar dos cápsulas de cada muestra,

| — | poner las cápsulas en el lugar adecuado sobre la placa del introductor automático de muestras del analizador elemental; cada cápsula debe identificarse cuidadosamente con un número de orden, |
| --- | --- |

—

poner las cápsulas en el lugar adecuado sobre la placa del introductor automático de muestras del analizador elemental; cada cápsula debe identificarse cuidadosamente con un número de orden,

| — | poner sistemáticamente cápsulas que contengan referencias de trabajo al principio y al final de la serie de muestras, |
| --- | --- |

—

poner sistemáticamente cápsulas que contengan referencias de trabajo al principio y al final de la serie de muestras,

| — | introducir regularmente muestras de control en la serie de muestras. |
| --- | --- |

—

introducir regularmente muestras de control en la serie de muestras.

| b) | Control y ajuste del equipo de análisis elemental y de espectrometría de masa:






  — | ajustar la temperatura de los hornos del analizador elemental y los flujos de gas de helio y de oxígeno para una combustión óptima de la muestra, |
| --- | --- | --- |

b)

Control y ajuste del equipo de análisis elemental y de espectrometría de masa:

—

ajustar la temperatura de los hornos del analizador elemental y los flujos de gas de helio y de oxígeno para una combustión óptima de la muestra,

| — | verificar la ausencia de fugas en el sistema de análisis elemental y de espectrometría de masa (por ejemplo, controlando la corriente iónica de m/z = 28, correspondiente al N2), |
| --- | --- |

—

verificar la ausencia de fugas en el sistema de análisis elemental y de espectrometría de masa (por ejemplo, controlando la corriente iónica de m/z = 28, correspondiente al N2),

| — | ajustar el espectrómetro de masa para medir las intensidades de las corrientes iónicas correspondientes a m/z = 44, 45 y 46, |
| --- | --- |

—

ajustar el espectrómetro de masa para medir las intensidades de las corrientes iónicas correspondientes a m/z = 44, 45 y 46,

| — | verificar el sistema con ayuda de muestras de control conocidas antes de comenzar las mediciones de las muestras. |
| --- | --- |

—

verificar el sistema con ayuda de muestras de control conocidas antes de comenzar las mediciones de las muestras.

| c) | Desarrollo de una serie de mediciones:
  Se introducen sucesivamente las muestras situadas en el introductor automático de muestras del analizador elemental (o del cromatógrafo). El dióxido de carbono de cada combustión de una muestra se eluye hacia el espectrómetro de masa que mide las corrientes iónicas. El ordenador acoplado al equipo registra las intensidades de corriente iónica y calcula los valores δ correspondientes a cada muestra (punto 9). |
| --- | --- |

c)

Desarrollo de una serie de mediciones:

Se introducen sucesivamente las muestras situadas en el introductor automático de muestras del analizador elemental (o del cromatógrafo). El dióxido de carbono de cada combustión de una muestra se eluye hacia el espectrómetro de masa que mide las corrientes iónicas. El ordenador acoplado al equipo registra las intensidades de corriente iónica y calcula los valores δ correspondientes a cada muestra (punto 9).

9.   CÁLCULO

El objetivo del método consiste en medir la relación isotópica 13C/12C del etanol extraído a partir del vino o a partir de productos derivados de la uva previa fermentación. La relación isotópica 13C/12C puede expresarse mediante su desviación respecto a una referencia de trabajo. La desviación isotópica del carbono 13 (δ13C) se calcula entonces en una escala delta por mil (δ/1 000) comparando los resultados obtenidos con la muestra problema frente a los de la referencia de trabajo, calibrada anteriormente respecto a la referencia primaria internacional (V-PDB). Los valores δ13C se expresan respecto a la referencia de trabajo según la fórmula siguiente:

δ 13Cmuest/ref ‰ = 1 000 × (Rmuest-Rref)/Rref

donde Rmuest y Rref son, respectivamente, las relaciones isotópicas 13C/12C de la muestra y del dióxido de carbono utilizado como gas de referencia.

Los valores δ13C se expresan entonces respecto a la referencia V-PDB según la fórmula siguiente:

δ13Cmuest/V-PDB ‰ = δ13Cmuest/ref + δ13Cref/V-PDB + (δ13Cmuest/ref × δ13Cref/V-PDB)/1 000

donde δ13Cref/V-PDB es la desviación isotópica, determinada previamente, de la referencia de trabajo respecto al V-PDB.

Durante la medición en línea, pueden observarse pequeñas desviaciones debidas a la variación de las condiciones instrumentales. En este caso, las δ13C de las muestras deben corregirse en función de la diferencia entre el valor δ13C medido con la referencia de trabajo y su verdadero valor, calibrado previamente frente al V-PDB, comparando con uno de los materiales de referencia internacionales. Puede aceptarse que, entre dos mediciones de la referencia de trabajo, son lineales la desviación y, por tanto, la corrección que debe aplicarse a los resultados de las muestras. La referencia de trabajo debe medirse al principio y al final de todas las series de muestras. Después puede calcularse la corrección respecto a cada muestra por medio de una interpolación lineal.

10.   CONTROL Y GARANTÍA DE CALIDAD

Controlar que el valor 13C de la referencia de trabajo no difiere en más del 0,5 ‰ del valor admitido. En caso contrario, habrá que controlar los ajustes del equipo de espectrometría y, eventualmente, proceder a un reajuste.

Con cada muestra, verificar que la diferencia de resultados entre las dos cápsulas medidas sucesivamente es inferior al 0,3 ‰. El resultado final correspondiente a una muestra dada es el valor medio de las dos cápsulas. Si la diferencia es superior al 0,3 ‰, debe repetirse la medición.

El control de la corrección de la medición puede basarse en la intensidad de la corriente iónica correspondiente a m/z = 44, que es proporcional a la cantidad de carbono inyectado en el analizador elemental. En condiciones típicas, la intensidad de esta corriente iónica debería ser prácticamente constante con las muestras analizadas. Una desviación significativa debe hacer sospechar una evaporación de etanol (por ejemplo, en caso de cápsula mal sellada) o bien una inestabilidad del analizador elemental o del espectrómetro de masa.

11.   CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO (PRECISIÓN)

Se realizó un primer estudio en colaboración (punto 11.1) con destilados de alcoholes de origen vínico, y de alcoholes de caña y de remolacha, así como diferentes mezclas de estos tres orígenes. Dado que dicho estudio no tenía en cuenta la etapa de destilación, se ha prestado atención asimismo a datos complementarios procedentes de otros ensayos interlaboratorios realizados con vinos (punto 11.2) y, especialmente, de grupos de ensayos de aptitud (punto 11.3) para las mediciones isotópicas. Los resultados demuestran que los diferentes sistemas de destilación utilizados en condiciones satisfactorias y, en particular, los aplicables en las mediciones FINE-RMN no introducen variabilidad significativa en las determinaciones de δ13C del etanol del vino. Los parámetros de fidelidad observados respecto a los vinos son casi idénticos a los obtenidos en el estudio en colaboración (punto 11.1) con los destilados.

11.1.   Estudio en colaboración sobre los destilados

| Año del estudio interlaboratorios: | 1996 |
| --- | --- |
| Número de laboratorios: | 20 |
| Número de muestras: | 6 muestras con ocultación doble |
| Analito: | δ13C del etanol |

Año del estudio interlaboratorios:

1996

Número de laboratorios:

20

Número de muestras:

6 muestras con ocultación doble

Analito:

δ13C del etanol

| Código de las muestras | Alcohol de origen vínico | Alcohol de remolacha | Alcohol de caña |
| --- | --- | --- | --- |
| A & G | 80 % | 10 % | 10 % |
| B & C | 90 % | 10 % | 0 % |
| D & F | 0 % | 100 % | 0 % |
| E & I | 90 % | 0 % | 10 % |
| H & K | 100 % | 0 % | 0 % |
| J & L | 0 % | 0 % | 100 % |

Código de las muestras

Alcohol de origen vínico

Alcohol de remolacha

Alcohol de caña

A & G

80 %

10 %

10 %

B & C

90 %

10 %

0 %

D & F

0 %

100 %

0 %

E & I

90 %

0 %

10 %

H & K

100 %

0 %

0 %

J & L

0 %

0 %

100 %

| Muestras | A/G | B/C | D/F | E/I | H/K | J/L |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Número de laboratorios seleccionados previa eliminación de los resultados anómalos | 19 | 18 | 17 | 19 | 19 | 19 |
| Número de resultados aceptados | 38 | 36 | 34 | 38 | 38 | 38 |
| Valor medio (δ13C) ‰ | –25,32 | –26,75 | –27,79 | –25,26 | –26,63 | –12,54 |
| Sr
  2 | 0,0064 | 0,0077 | 0,0031 | 0,0127 | 0,0069 | 0,0041 |
| Desviación típica de la repetibilidad (Sr) ‰ | 0,08 | 0,09 | 0,06 | 0,11 | 0,08 | 0,06 |
| Límite de repetibilidad r (2,8 × Sr) ‰ | 0,22 | 0,25 | 0,16 | 0,32 | 0,23 | 0,18 |
| SR
  2 | 0,0389 | 0,0309 | 0,0382 | 0,0459 | 0,0316 | 0,0584 |
| Desviación típica de la reproducibilidad (SR) ‰ | 0,20 | 0,18 | 0,20 | 0,21 | 0,18 | 0,24 |
| Límite de reproducibilidad R (2,8 × SR) ‰ | 0,55 | 0,49 | 0,55 | 0,60 | 0,50 | 0,68 |

Muestras

A/G

B/C

D/F

E/I

H/K

J/L

Número de laboratorios seleccionados previa eliminación de los resultados anómalos

19

18

17

19

19

19

Número de resultados aceptados

38

36

34

38

38

38

Valor medio (δ13C) ‰

–25,32

–26,75

–27,79

–25,26

–26,63

–12,54

Sr
  2

0,0064

0,0077

0,0031

0,0127

0,0069

0,0041

Desviación típica de la repetibilidad (Sr) ‰

0,08

0,09

0,06

0,11

0,08

0,06

Límite de repetibilidad r (2,8 × Sr) ‰

0,22

0,25

0,16

0,32

0,23

0,18

SR
  2

0,0389

0,0309

0,0382

0,0459

0,0316

0,0584

Desviación típica de la reproducibilidad (SR) ‰

0,20

0,18

0,20

0,21

0,18

0,24

Límite de reproducibilidad R (2,8 × SR) ‰

0,55

0,49

0,55

0,60

0,50

0,68

11.2.   Estudio interlaboratorios con dos vinos y un alcohol

| Año del estudio interlaboratorios: | 1996 |
| --- | --- |
| Número de laboratorios: | 14 estudiaron la destilación de los vinos, y 7 de ellos también efectuaron la medición de δ13C del etanol de los vinos 8 efectuaron la medición de δ13C de la muestra de alcohol |
| Número de muestras: | 3 (vino blanco de graduación 9,3 % vol., vino blanco de graduación 9,6 % vol. y alcohol de graduación 93 % m/m). |
| Analito: | δ13C del etanol |

Año del estudio interlaboratorios:

1996

Número de laboratorios:

14 estudiaron la destilación de los vinos, y 7 de ellos también efectuaron la medición de δ13C del etanol de los vinos 8 efectuaron la medición de δ13C de la muestra de alcohol

Número de muestras:

3 (vino blanco de graduación 9,3 % vol., vino blanco de graduación 9,6 % vol. y alcohol de graduación 93 % m/m).

Analito:

δ13C del etanol

| Muestras | Vino tinto | Vino blanco | Alcohol |
| --- | --- | --- | --- |
| Número de laboratorios | 7 | 7 | 8 |
| Número de resultados aceptados | 7 | 7 | 8 |
| Valor medio (δ13C) ‰ | –26,20 | –26,20 | –25,08 |
| Varianza de la reproducibilidad SR
  2 | 0,0525 | 0,0740 | 0,0962 |
| Desviación típica de la reproducibilidad (SR) ‰ | 0,23 | 0,27 | 0,31 |
| Límite de reproducibilidad R (2,8 × SR) ‰ | 0,64 | 0,76 | 0,87 |

Muestras

Vino tinto

Vino blanco

Alcohol

Número de laboratorios

7

7

8

Número de resultados aceptados

7

7

8

Valor medio (δ13C) ‰

–26,20

–26,20

–25,08

Varianza de la reproducibilidad SR
  2

0,0525

0,0740

0,0962

Desviación típica de la reproducibilidad (SR) ‰

0,23

0,27

0,31

Límite de reproducibilidad R (2,8 × SR) ‰

0,64

0,76

0,87

Los laboratorios participantes utilizaron diferentes sistemas de destilación. Las determinaciones isotópicas de δ13C realizadas en un solo laboratorio con el conjunto de los destilados devueltos por los participantes no mostraron ningún valor anómalo ni significativamente distinto de los valores medios. La varianza de los resultados (S2 = 0,0059) es comparable a las varianzas de la repetibilidad Sr
  2 del estudio en colaboración sobre los destilados (punto 11.1).

11.3.   Resultados de los ejercicios de los grupos de aptitud para los ensayos isotópicos

Desde diciembre de 1994 se organizan regularmente ejercicios internacionales de aptitud para las determinaciones isotópicas de los vinos y alcoholes (destilados de graduación 96 % vol.). Los resultados permiten a los laboratorios participantes controlar la calidad de sus análisis. La explotación estadística de los resultados permite apreciar la variabilidad de las determinaciones en condiciones de reproducibilidad y, de esta manera, estimar los parámetros de varianza y de límite de reproducibilidad. Los resultados obtenidos con las determinaciones de δ13C del etanol de los vinos y destilados se resumen en el cuadro siguiente:

| Fecha | Vino | Destilados |
| --- | --- | --- |
| N | SR | SR
  2 | R | N | SR | SR
  2 | R |
| Diciembre 1994 | 6 | 0,210 | 0,044 | 0,59 | 6 | 0,151 | 0,023 | 0,42 |
| Junio 1995 | 8 | 0,133 | 0,018 | 0,37 | 8 | 0,147 | 0,021 | 0,41 |
| Diciembre 1995 | 7 | 0,075 | 0,006 | 0,21 | 8 | 0,115 | 0,013 | 0,32 |
| Marzo 1996 | 9 | 0,249 | 0,062 | 0,70 | 11 | 0,278 | 0,077 | 0,78 |
| Junio 1996 | 8 | 0,127 | 0,016 | 0,36 | 8 | 0,189 | 0,036 | 0,53 |
| Septiembre 1996 | 10 | 0,147 | 0,022 | 0,41 | 11 | 0,224 | 0,050 | 0,63 |
| Diciembre 1996 | 10 | 0,330 | 0,109 | 0,92 | 9 | 0,057 | 0,003 | 0,16 |
| Marzo 1997 | 10 | 0,069 | 0,005 | 0,19 | 8 | 0,059 | 0,003 | 0,16 |
| Junio 1997 | 11 | 0,280 | 0,079 | 0,78 | 11 | 0,175 | 0,031 | 0,49 |
| Septiembre 1997 | 12 | 0,237 | 0,056 | 0,66 | 11 | 0,203 | 0,041 | 0,57 |
| Diciembre 1997 | 11 | 0,127 | 0,016 | 0,36 | 12 | 0,156 | 0,024 | 0,44 |
| Marzo 1998 | 12 | 0,285 | 0,081 | 0,80 | 13 | 0,245 | 0,060 | 0,69 |
| Junio 1998 | 12 | 0,182 | 0,033 | 0,51 | 12 | 0,263 | 0,069 | 0,74 |
| Septiembre 1998 | 11 | 0,264 | 0,070 | 0,74 | 12 | 0,327 | 0,107 | 0,91 |
| Media ponderada | | 0,215 | 0,046 | 0,60 | | 0,209 | 0,044 | 0,59 |
| N | : | número de laboratorios participantes |

Fecha

Vino

Destilados

N

SR

SR
  2

R

N

SR

SR
  2

R

Diciembre 1994

6

0,210

0,044

0,59

6

0,151

0,023

0,42

Junio 1995

8

0,133

0,018

0,37

8

0,147

0,021

0,41

Diciembre 1995

7

0,075

0,006

0,21

8

0,115

0,013

0,32

Marzo 1996

9

0,249

0,062

0,70

11

0,278

0,077

0,78

Junio 1996

8

0,127

0,016

0,36

8

0,189

0,036

0,53

Septiembre 1996

10

0,147

0,022

0,41

11

0,224

0,050

0,63

Diciembre 1996

10

0,330

0,109

0,92

9

0,057

0,003

0,16

Marzo 1997

10

0,069

0,005

0,19

8

0,059

0,003

0,16

Junio 1997

11

0,280

0,079

0,78

11

0,175

0,031

0,49

Septiembre 1997

12

0,237

0,056

0,66

11

0,203

0,041

0,57

Diciembre 1997

11

0,127

0,016

0,36

12

0,156

0,024

0,44

Marzo 1998

12

0,285

0,081

0,80

13

0,245

0,060

0,69

Junio 1998

12

0,182

0,033

0,51

12

0,263

0,069

0,74

Septiembre 1998

11

0,264

0,070

0,74

12

0,327

0,107

0,91

Media ponderada

0,215

0,046

0,60

0,209

0,044

0,59

N

:

número de laboratorios participantes

11.4.   Límites de repetibilidad y de reproducibilidad

Así pues, los datos de los diferentes ejercicios interlaboratorios presentados en los cuadros anteriores permiten establecer para el presente método, incluyendo igualmente la etapa de destilación, los límites de repetibilidad y de reproducibilidad siguientes:

| | Límite de repetibilidad r: 0,24 |
| --- | --- |

Límite de repetibilidad r: 0,24

| | Límite de reproducibilidad R: 0,6. |
| --- | --- |

Límite de reproducibilidad R: 0,6.

11   ACIDEZ TOTAL (OIV - AS-313-01-ACITOT) — MÉTODO DE TIPO I

1.   DEFINICIÓN

La acidez total es la suma de los ácidos valorables cuando se lleva el pH a 7 añadiendo una solución alcalina valorada.

El dióxido de carbono no se incluye en la acidez total.

2.   PRINCIPIO DEL MÉTODO

Valoración potenciométrica o valoración en presencia de azul de bromotimol como indicador del final de la reacción, mediante comparación con un patrón de coloración.

3.   REACTIVOS

3.1.   Solución amortiguadora de pH 7,0:

| | Fosfato monopotásico (KH2PO4): 107,3 g |
| --- | --- |

Fosfato monopotásico (KH2PO4): 107,3 g

| | Solución M de hidróxido sódico (NaOH): 500 ml |
| --- | --- |

Solución M de hidróxido sódico (NaOH): 500 ml

| | Agua csp: 1 000 ml. |
| --- | --- |

Agua csp: 1 000 ml.

También pueden utilizarse soluciones amortiguadoras de referencia comerciales.

3.2.   Solución 0,1 M de hidróxido sódico (NaOH).

3.3.   Solución de azul de bromotimol de 4 g/l:

| Azul de bromotimol (C27H28Br2O5S) ... | 4 g |
| --- | --- |
| Alcohol neutro 96 % vol. ... | 200 ml |
| Una vez solubilizado, añadir: | |
| Agua sin CO2 ... | 200 ml |
| Solución M de hidróxido sódico | |
| csp coloración verde-azulada (pH 7) ... | 7,5 ml |
| Agua csp ... | 1 000 ml |

Azul de bromotimol (C27H28Br2O5S) ...

4 g

Alcohol neutro 96 % vol. ...

200 ml

Una vez solubilizado, añadir:

Agua sin CO2 ...

200 ml

Solución M de hidróxido sódico

csp coloración verde-azulada (pH 7) ...

7,5 ml

Agua csp ...

1 000 ml

4.   MATERIAL

4.1.   Trompa de vacío.

4.2.   Matraz Kitasato de 500 ml.

4.3.   Potenciómetro con escala graduada en unidades de pH y electrodos. El electrodo de vidrio debe conservarse en agua destilada. El electrodo de calomelanos y cloruro potásico saturado debe conservarse en una solución saturada de cloruro potásico. Generalmente se emplea un electrodo combinado, que se conserva en agua destilada.

4.4.   Vasos de precipitados de 50 ml de capacidad (en caso de vinos) y de 100 ml de capacidad (en caso de mostos concentrados rectificados).

5.   PROCEDIMIENTO

5.1.   Preparación de la muestra

5.1.1.   Vinos

Eliminación del dióxido de carbono. Colocar aproximadamente 50 ml de vino, en un matraz Kitasato; agitar y, al mismo tiempo, hacer el vacío con una trompa de agua. La agitación debe durar de 1 a 2 minutos

5.1.2.   Mostos concentrados rectificados

Verter 200 g de mosto concentrado rectificado, exactamente pesado, en un matraz aforado de 500 ml. Enrasar con agua. Homogeneizar.

5.2.   Valoración potenciométrica

5.2.1.   Calibrado del pH-metro

La calibración del pH-metro se efectúa a 20 °C, siguiendo las indicaciones del aparato que se utilice, mediante la solución amortiguadora de pH 7,00 a 20 °C.

5.2.2.   Técnica de una medición

En un vaso de precipitados (punto 4.4) verter 10 ml, si se trata de vino, o 50 ml, en caso de mosto concentrado rectificado, de muestra preparada como se indica en el punto 5.1. Añadir 10 ml de agua destilada, aproximadamente, y verter con una bureta la solución 0,1 M de hidróxido sódico (punto 3.2) hasta que el pH sea igual a 7 a 20 °C. La adición de licor alcalino debe efectuarse despacio, agitando continuamente la solución. Se denominará n al número de mililitros de NaOH 0,1 M vertidos.

5.3.   Valoración con indicador (azul de bromotimol)

5.3.1.   Ensayo previo: obtención del patrón de coloración

En un vaso de precipitados (punto 4.4), verter 25 ml de agua destilada y hervida, 1 ml de solución de azul de bromotimol (punto 3.3) y 10 ml, si se trata de vino, o 50 ml, en caso de mosto concentrado rectificado, de muestra preparada como se indica en el punto 5.1. Añadir la solución 0,1 M de hidróxido sódico (punto 3.2) hasta obtener una coloración verde-azulada. Añadir 5 ml de la solución amortiguadora de pH 7 (punto 3.1).

5.3.2.   Determinación

En un vaso de precipitados (punto 4.4), verter 30 ml de agua destilada y hervida, 1 ml de solución de azul de bromotimol (punto 3.3) y 10 ml, si se trata de vino, o 50 ml, en caso de mosto concentrado rectificado, de muestra preparada como se indica en el punto 5.1. Añadir la solución 0,1 M de hidróxido sódico (punto 3.2) hasta obtener una coloración idéntica a la obtenida en el ensayo previo (punto 5.3.1). Se denominará n al número de mililitros de solución de hidróxido sódico 0,1 M utilizados.

6.   EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

6.1.   Modo de cálculo

6.1.1.   Vino

La acidez total, expresada en miliequivalentes por litro, será:

A = 10 • n

El resultado se dará con 1 decimal.

La acidez total, expresada en gramos de ácido tartárico por litro, será:

A′ = 0,075 • A

El resultado se dará con 1 decimal.

6.1.2.   Mosto concentrado rectificado

| — | Acidez total expresada en miliequivalentes por kilogramo de mosto concentrado rectificado: a = 5 • n |
| --- | --- |

—

Acidez total expresada en miliequivalentes por kilogramo de mosto concentrado rectificado: a = 5 • n

| — | Acidez total expresada en miliequivalentes por kilogramo de azúcares totales:






  — | A = (500 • n)/P |
| --- | --- | --- |

—

Acidez total expresada en miliequivalentes por kilogramo de azúcares totales:

—

A = (500 • n)/P

| — | P = contenido porcentual (m/m) en azúcares totales. |
| --- | --- |

—

P = contenido porcentual (m/m) en azúcares totales.

El resultado se dará con 1 decimal.

6.2.   Repetibilidad (r) para la valoración con indicador (5.3)

| r | = | 0,9 meq por litro |
| --- | --- | --- |
| r | = | 0,07 g de ácido tartárico por litro |

r

=

0,9 meq por litro

r

=

0,07 g de ácido tartárico por litro

para los vinos blancos, rosados y tintos.

6.3.   Reproducibilidad (R) para la valoración con indicador (5.3)

| | Para los vinos blancos y rosados:







  R | = | 3,6 meq por litro |
| --- | --- | --- | --- |
| R | = | 0,3 g de ácido tartárico por litro. |

Para los vinos blancos y rosados:

R

=

3,6 meq por litro

R

=

0,3 g de ácido tartárico por litro.

| | Para los vinos tintos:







  R | = | 5,1 meq por litro |
| --- | --- | --- | --- |
| R | = | 0,4 g de ácido tartárico por litro. |

Para los vinos tintos:

R

=

5,1 meq por litro

R

=

0,4 g de ácido tartárico por litro.

12   ACIDEZ VOLÁTIL (OIV-AS-313-02-ACIVOL) — MÉTODO DE TIPO I

1.   DEFINICIÓN

La acidez volátil está constituida por los ácidos pertenecientes a la serie acética que se encuentran en los vinos, bien en estado libre, bien en forma de sal.

2.   PRINCIPIO DEL MÉTODO

Valoración de los ácidos volátiles separados del vino por arrastre de vapor de agua y rectificación de los vapores.

Previamente, debe eliminarse el dióxido de carbono del vino.

La acidez del dióxido de azufre (tanto libre como combinado) destilado en dichas condiciones debe restarse de la acidez del destilado.

Debe restarse, asimismo, la acidez del ácido sórbico eventualmente añadido al vino.

Observación:

El ácido salicílico, utilizado en algunos países para estabilizar los vinos antes del análisis, se encuentra en parte en el destilado. Es necesario valorarlo y restarlo de la acidez. El método de esta determinación se encuentra en el apartado 7 del presente capítulo.

3.   REACTIVOS

3.1.   Ácido tartárico cristalizado (C4H6O6)

3.2.   Solución 0,1 M de hidróxido sódico (NaOH)

3.3.   Solución de fenolftaleína al 1 % en alcohol neutro de 96 % vol.

3.4.   Ácido clorhídrico (ρ20 = 1,18 a 1,19 g/ml) diluido 1/4 (v/v)

3.5.   Solución 0,005 M de yodo (I2)

3.6.   Yoduro potásico cristalizado (KI)

3.7.   Engrudo de almidón de 5 g/l:

Desleír 5 g de almidón en unos 500 ml de agua. Llevar a ebullición agitando y mantener hirviendo durante 10 minutos; añadir 200 g de cloruro sódico. Una vez frío, llevar a 1 litro.

3.8.   Solución saturada de borato sódico (Na2B4O7 10 H2O), es decir, aproximadamente 55 g/l a 20 °C.

4.   MATERIAL

4.1.   Aparato de arrastre de vapor de agua, compuesto de:

| 1) | Un generador de vapor de agua; el vapor de agua producido debe estar exento de dióxido de carbono. |
| --- | --- |

1)

Un generador de vapor de agua; el vapor de agua producido debe estar exento de dióxido de carbono.

| 2) | Un borboteador. |
| --- | --- |

2)

Un borboteador.

| 3) | Una columna rectificadora. |
| --- | --- |

3)

Una columna rectificadora.

| 4) | Un refrigerante. |
| --- | --- |

4)

Un refrigerante.

Este aparato debe responder a los tres ensayos siguientes:

| a) | Poner en el borboteador 20 ml de agua hervida; recoger 250 ml de destilado y añadirles 0,1 ml de solución 0,1 M de hidróxido sódico (punto 3.2) y 2 gotas de la solución de fenolftaleína (punto 3.3); la coloración rosa debe permanecer estable durante 10 segundos, por lo menos (vapor de agua exento de dióxido de carbono). |
| --- | --- |

a)

Poner en el borboteador 20 ml de agua hervida; recoger 250 ml de destilado y añadirles 0,1 ml de solución 0,1 M de hidróxido sódico (punto 3.2) y 2 gotas de la solución de fenolftaleína (punto 3.3); la coloración rosa debe permanecer estable durante 10 segundos, por lo menos (vapor de agua exento de dióxido de carbono).

| b) | Poner en el borboteador 20 ml de solución 0,1 M de ácido acético. Recoger 250 ml de destilado. Valorar con la solución 0,1 M de hidróxido sódico (punto 3.2). El volumen empleado debe ser al menos igual a 19,9 ml. (ácido acético arrastrado ≥ 99,5 %). |
| --- | --- |

b)

Poner en el borboteador 20 ml de solución 0,1 M de ácido acético. Recoger 250 ml de destilado. Valorar con la solución 0,1 M de hidróxido sódico (punto 3.2). El volumen empleado debe ser al menos igual a 19,9 ml. (ácido acético arrastrado ≥ 99,5 %).

| c) | Poner en el borboteador 20 ml de solución M de ácido láctico. Recoger 250 ml de destilado y valorar su acidez con una solución 0,1 M de hidróxido sódico (punto 3.2). |
| --- | --- |

c)

Poner en el borboteador 20 ml de solución M de ácido láctico. Recoger 250 ml de destilado y valorar su acidez con una solución 0,1 M de hidróxido sódico (punto 3.2).

El volumen empleado debe ser inferior o igual a 1,0 ml. (ácido láctico destilado ≤ 0,5 %).

Todo aparato o técnica que satisfaga estos tres ensayos constituye un aparato o técnica oficial internacional.

4.2.   Trompa de vacío.

4.3.   Matraz Kitasato.

5.   PROCEDIMIENTO

5.1.   Preparación de la muestra: eliminación del dióxido de carbono.

Poner alrededor de 50 ml de vino en un matraz Kitasato; agitar y, al mismo tiempo, hacer el vacío por medio de la trompa de agua. La agitación debe durar de 1 a 2 minutos

5.2.   Arrastre por vapor de agua

Echar en el borboteador 20 ml de vino desprovisto de dióxido de carbono como se indica en el punto 5.1. Añadir unos 0,5 g de ácido tartárico (punto 3.1). Recoger, al menos, 250 ml de destilado.

5.3.   Valoración

Valorar con la solución 0,1 M de hidróxido sódico (punto 3.2) en presencia de 2 gotas de solución de fenolftaleína (punto 3.3). Se denominará n ml al volumen utilizado.

Añadir 4 gotas de ácido clorhídrico diluido 1/4 (punto 3.4), 2 ml de engrudo de almidón (punto 3.7) y algunos cristales de yoduro potásico (punto 3.6). Valorar el dióxido de azufre libre con la solución 0,005 M de yodo (punto 3.5). Se denominará n′ ml al volumen utilizado.

Añadir la solución saturada de borato sódico (punto 3.8) hasta que reaparezca la coloración rosa. Valorar con la solución 0,005 M de yodo (punto 3.5) el dióxido de azufre combinado. Se denominará n′′ ml al volumen utilizado.

6.   EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

6.1.   Modo de cálculo

La acidez volátil, expresada en miliequivalentes por litro, con 1 decimal, será:

A = 5 (n – 0,1 n′ – 0,05 n′′)

La acidez volátil, expresado en gramos de ácido acético por litro, con 2 decimales, será:

0,300 (n – 0,1 n′ – 0,05 n′′)

6.2.   Repetibilidad (r)

| r | = | 0,7 meq por litro |
| --- | --- | --- |
| r | = | 0,04 g de ácido acético por litro. |

r

=

0,7 meq por litro

r

=

0,04 g de ácido acético por litro.

6.3.   Reproducibilidad (R)

| R | = | 1,3 meq por litro |
| --- | --- | --- |
| R | = | 0,08 g de ácido acético por litro. |

R

=

1,3 meq por litro

R

=

0,08 g de ácido acético por litro.

6.4.   Caso de un vino con adición de ácido sórbico

Dado que el ácido sórbico es arrastrado por el vapor de agua en un 96 % para un volumen de destilado de 250 ml, su acidez debe restarse de la acidez volátil, sabiendo que 100 mg de ácido sórbico corresponden a una acidez de 0,89 miliequivalentes o de 0,053 g de ácido acético y conociendo el contenido en ácido sórbico (mg/l) determinado previamente.

7.   DETERMINACIÓN DEL ÁCIDO SALICÍLICO QUE SE HALLA EN EL DESTILADO UTILIZADO PARA VALORAR LA ACIDEZ VOLÁTIL

7.1.   Principio

Una vez efectuada la determinación de la acidez volátil y la corrección del dióxido de azufre, la presencia de ácido salicílico se caracteriza por la aparición, previa acidificación, de una coloración violeta tras haber añadido una sal de hierro III.

La determinación del ácido salicílico que se halla en el destilado con los ácidos volátiles se efectuará con un segundo destilado cuyo volumen sea igual al del utilizado para determinar la acidez volátil. El ácido salicílico se determinará en dicho destilado mediante un método colorimétrico de comparación y el resultado se restará de la acidez volátil.

7.2.   Reactivos

7.2.1.   Ácido clorhídrico (HCl) (ρ20 = 1,18 a 1,19 g/ml).

7.2.2.   Tiosulfato sódico (Na2S2O3 × 5 H2O) 0,1 M.

7.2.3.   Solución de sulfato de hierro III y de amonio (Fe2(SO4)3 × (NH4)2SO4 × 24 H2O) al 10 % (m/v).

7.2.4.   Solución de salicilato sódico (NaC7H5O3) 0,01 M, con 1,60 g/l de salicilato sódico.

7.3.   Procedimiento

7.3.1.   Caracterización del ácido salicílico en el destilado de la acidez volátil

Inmediatamente después de haber efectuado la determinación de la acidez volátil y la corrección del dióxido de azufre libre y combinado, verter en el matraz Erlenmeyer 0,5 ml de ácido clorhídrico (punto 7.2.1), 3 ml de solución 0,1 M de tiosulfato sódico (punto 7.2.2) y 1 ml de solución de sulfato de hierro III y de amonio (punto 7.2.3).

En presencia de ácido salicílico, aparece una coloración violeta.

7.3.2.   Determinación del ácido salicílico

En el matraz Erlenmeyer anterior, indicar mediante una señal de referencia el volumen del destilado. Vaciar y enjuagar el matraz.

Someter una nueva muestra de 20 ml de vino al arrastre por vapor de agua y recoger el destilado en el matraz Erlenmeyer hasta la señal de referencia. Añadir 0,3 ml de ácido clorhídrico puro (punto 7.2.1) y 1 ml de solución de sulfato de hierro III y de amonio (punto 7.2.3). El contenido del matraz Erlenmeyer adquiere una coloración violeta.

En un matraz Erlenmeyer idéntico al que lleva la señal de referencia, verter agua destilada hasta el mismo nivel que el del destilado. Añadir 0,3 ml de ácido clorhídrico puro (punto 7.2.1) y 1 ml de solución de sulfato de hierro III y de amonio (punto 7.2.3). Verter con una bureta la solución de salicilato sódico 0,01 M (punto 7.2.4) hasta que se obtenga una coloración violeta de la misma intensidad que la del matraz Erlenmeyer que contiene el destilado de vino.

Se denominará n′′′ al número de mililitros utilizados.

7.4.   Corrección de la acidez volátil

Restar el volumen 0,1 × n′′′ml del volumen n ml de solución de hidróxido sódico 0,1 M utilizado para valorar la acidez del destilado en la determinación de la acidez volátil.

13   ÁCIDO CÍTRICO (OIV-AS-313-09-ACIENZ) — MÉTODO DE TIPO II

1.   PRINCIPIO DEL MÉTODO

El ácido cítrico se transforma en oxalacetato y acetato en una reacción catalizada por la citrato-liasa (CL):

Citrato ←→ oxalacetato + acetato

En presencia de malato-deshidrogenasa (MDH) y de lactato-deshidrogenasa (LDH), el oxalacetato y su derivado de descarboxilación, el piruvato, se reducen a L-malato y L-lactato por el nicotinamida-adenina-dinucleótido reducido (NADH):

| | Oxalacetato + NADH + H+ ←→ L-malato + NAD+ |
| --- | --- |

Oxalacetato + NADH + H+ ←→ L-malato + NAD+

| | Piruvato + NADH + H+ ←→ L-lactato + NAD+ |
| --- | --- |

Piruvato + NADH + H+ ←→ L-lactato + NAD+

La cantidad de NADH oxidado a NAD+ en estas reacciones es proporcional al citrato presente. La oxidación de NADH se mide mediante la disminución de su absorbancia a la longitud de onda de 340 nm.

2.   REACTIVOS

2.1.   Amortiguador de pH 7,8

(glicilglicina 0,51 M; pH = 7,8; Zn2+: 0,6 × 10-3 M):

Disolver 7,13 g de glicilglicina en 70 ml, aproximadamente, de agua bidestilada.

Ajustar el pH a 7,8 con 13 ml, aproximadamente, de solución de hidróxido de sodio 5 M; añadir 10 ml de solución de cloruro de cinc ZnCl2, de 80 mg en 100 ml, y llevar a 100 ml con agua bidestilada.

La solución permanece estable por lo menos 4 semanas a + 4 °C.

2.2.   Solución de nicotinamida-adenina-dinucleótido reducido (NADH) (aprox. 6 × 10–3 M): Disolver 30 mg de NADH y 60 mg de NaHCO3 con 6 ml de agua bidestilada.

2.3.   Solución de malato-deshidrogenasa / lactato-deshidrogenasa (MDH/LDH), (0,5 mg MDH/ml; 2,5 mg LDH/ml):

Hacer una mezcla de 0,1 ml MDH (5 mg MDH/ml) / 0,4 ml de solución de sulfato de amonio (3,2 M) y 0,5 ml LDH (5 mg/ml). Esta solución se mantiene estable durante 1 año, por lo menos, a + 4 °C.

2.4.   Citrato-liasa CL (5 mg de proteína/ml): Disolver 168 mg de liofilizado en 1 ml de agua helada. La solución es estable por lo menos durante 1 semana a + 4 °C y durante 4 semanas congelada.

Antes de proceder a la determinación, se recomienda comprobar la actividad de la enzima.

2.5.   Polivinil-polipirrolidona (PVPP)

Observación: El conjunto de reactivos necesarios para esta determinación se comercializa ya preparado.

3.   MATERIAL

3.1.   Un espectrofotómetro que permita efectuar medidas a 340 nm (máximo de absorción del NADH).

En su defecto, fotómetro de espectro discontinuo que permita efectuar medidas a 334 nm o a 365 nm. Dado que se trata de medidas absolutas de absorbancia (no se utiliza curva de calibrado, sino el coeficiente de extinción del NADH), deben controlarse las escalas de las longitudes de onda y de las absorbancias del aparato.

3.2.   Cubetas de vidrio o cubetas desechables de 1 cm de camino óptico.

3.3.   Micropipetas que permitan tomar volúmenes comprendidos entre 0,02 ml y 2 ml.

4.   PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

La determinación del citrato se suele efectuar directamente sobre el vino sin decoloración previa y sin dilución, siempre que el contenido en ácido cítrico sea inferior a 400 mg/l. Si no, proceder a la dilución del vino de forma que la concentración de citrato se sitúe entre 20 y 400 mg/l (cantidad de citrato en la muestra comprendida entre 5 μg y 80 μg).

En caso de vino tinto rico en compuestos fenólicos, se recomienda tratarlo previamente con PVPP:

Poner en suspensión en el agua alrededor de 0,2 g de PVPP y dejar reposar 15 minutos. Pasar por filtro de pliegues.

Añadir a 10 ml de vino colocado dentro de un Erlenmeyer de 50 ml, la PVPP húmeda tomada del filtro con espátula. Agitar durante 2 o 3 minutos y filtrar.

5.   PROCEDIMIENTO

Se ajusta la longitud de onda del espectrofotómetro a 340 nm y se realizan las medidas de absorbancia en cubetas de 1 cm, habiendo ajustado el cero de absorbancia con respecto al aire (sin cubetas en el camino óptico). Introducir en cubetas de 1 cm:

| | Solución testigo | Solución de la muestra |
| --- | --- | --- |
| Solución 2.1 | 1,00 ml | 1,00 ml |
| Solución 2.2 | 0,10 ml | 0,10 ml |
| Muestra | — | 0,20 ml |
| Agua bidestilada | 2,00 ml | 1,80 ml |
| Solución 2.3 | 0,02 ml | 0,02 ml |

Solución testigo

Solución de la muestra

Solución 2.1

1,00 ml

1,00 ml

Solución 2.2

0,10 ml

0,10 ml

Muestra

—

0,20 ml

Agua bidestilada

2,00 ml

1,80 ml

Solución 2.3

0,02 ml

0,02 ml

Mezclar; transcurridos unos 5 minutos, leer las absorbancias de las soluciones testigo y de la muestra (A1).

Añadir:

| Solución 2.4 | 0,02 ml | 0,02 ml |
| --- | --- | --- |

Solución 2.4

0,02 ml

0,02 ml

Mezclar; esperar a que finalice la reacción (unos 5 minutos) y leer las absorbancias de las soluciones testigo y de la muestra (A2).

Determinar las diferencias de absorbancias (A1 – A2) de las soluciones testigo y de la muestra.

Restar la diferencia de absorbancias de la solución testigo (ΔAT) de la diferencia de absorbancias de la solución de la muestra (ΔAM):

ΔA = ΔAM – ΔAT

Observación: El tiempo necesario para la acción de las enzimas puede variar de un lote a otro. Aquí solo se ha dado a título indicativo. Se recomienda determinarlo con cada lote.

6.   EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

El contenido en ácido cítrico se expresa en miligramos por litro (mg/l) sin decimales.

6.1.   Modo de cálculo

La concentración en miligramos por litro viene dada por la fórmula general:

| C | = | ((V × PM)/(ε × d × v)) × ΔA |
| --- | --- | --- |
| V | = | volumen total de la solución en ml (aquí, 3,14 ml) |
| v | = | volumen de la muestra en ml (aquí, 2 ml) |
| PM | = | masa molecular de la sustancia que va a determinarse (aquí, ácido cítrico anhidro = 192,1) |
| d | = | camino óptico de la cubeta en cm (aquí, 1 cm) |
| ε | = | coeficiente de extinción del NADH; a 340 nm, |
| ε | = | 6,3 mmol– 1 × l × cm– 1. |

C

=

((V × PM)/(ε × d × v)) × ΔA

V

=

volumen total de la solución en ml (aquí, 3,14 ml)

v

=

volumen de la muestra en ml (aquí, 2 ml)

PM

=

masa molecular de la sustancia que va a determinarse (aquí, ácido cítrico anhidro = 192,1)

d

=

camino óptico de la cubeta en cm (aquí, 1 cm)

ε

=

coeficiente de extinción del NADH; a 340 nm,

ε

=

6,3 mmol– 1 × l × cm– 1.

Se obtiene:

C = 479 × ΔA

Si se ha efectuado una dilución durante la preparación de la muestra, multiplicar el resultado por el factor de dilución.

Observación: a 334 nm, C = 488 × ΔA (ε = 6,2 mmol– 1 × l × cm– 1) y,

a 365 nm, C = 887 × ΔA (ε = 3,4 mmol– 1 × l × cm– 1)

6.2.   Repetibilidad (r)

Contenido en ácido cítrico inferior a 400 mg/l: r = 14 mg/l

Contenido en ácido cítrico superior a 400 mg/l: r = 28 mg/l

6.3.   Reproducibilidad (R)

Contenido en ácido cítrico inferior a 400 mg/l: R = 39 mg/l.

Contenido en ácido cítrico superior a 400 mg/l: R = 65 mg/l.

14   ÁCIDO SÓRBICO (OIV-AS-313-14-ACISOR) — MÉTODO DE TIPO IV

1.   PRINCIPIO DE LOS MÉTODOS

1.1.   Método de determinación por espectrofotometría de absorción en el ultravioleta

El ácido sórbico (ácido trans,trans-hexa-2,4-dienoico) separado por destilación con arrastre de vapor de agua se determina en el destilado mediante espectrofotometría de absorción en el ultravioleta. Las sustancias que interfieren con la medida de la absorción en el ultravioleta se eliminan por evaporación a sequedad de la muestra del destilado, ligeramente alcalinizado por una solución de hidróxido de calcio. Los contenidos inferiores a 20 mg/l deben confirmarse por cromatografía en capa fina (sensibilidad: 1 mg/l).

1.2.   Método de determinación por cromatografía de gases

El ácido sórbico extraído en éter etílico se determina por cromatografía en fase gaseosa en presencia de un patrón interno.

1.3.   Método de detección de trazas por cromatografía de capa fina

El ácido sórbico extraído en éter etílico se separa por cromatografía en capa fina y se evalúa su concentración en forma semicuantitativa.

2.   MÉTODO DE DETERMINACIÓN POR ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN EN EL ULTRAVIOLETA

2.1.   Reactivos

2.1.1.   Ácido tartárico (C4H6O6) cristalizado.

2.1.2.   Solución de hidróxido de calcio (Ca(OH)2), aproximadamente 0,02 M.

2.1.3.   Solución de referencia de ácido sórbico de 20 mg por litro.

Disolver 20 mg de ácido sórbico (C6H8O2) en 2 ml aproximadamente de solución 0,1 M de hidróxido de sodio. Verter en un matraz aforado de 1 000 ml y enrasar con agua. También es posible disolver 26,8 mg de sorbato de potasio (C6H7KO2) en agua y completar con agua hasta 1 000 ml.

2.2.   Material

2.2.1.   Aparato de destilación con arrastre de vapor de agua (véase «Acidez volátil»).

2.2.2.   Baño de agua a 100 °C.

2.2.3.   Espectrofotómetro que permita efectuar medidas a la longitud de onda de 256 nm con cubetas de cuarzo de 1 cm de camino óptico.

2.3.   Procedimiento

2.3.1.   Destilación

Introducir en el borboteador del aparato de arrastre de vapor de agua 10 ml de vino, añadir entre1 y 2 g de ácido tartárico (punto 2.1.1). Recoger 250 ml de destilado.

2.3.2.   Curva patrón

Preparar mediante diluciones con agua a partir de la solución de referencia (punto 2.1.3) cuatro soluciones de referencia diluidas que contengan respectivamente 0,5, 1, 2,5 y 5 mg de ácido sórbico por litro; medir con el espectrofotómetro sus respectivas absorbancias a 256 nm respecto al agua destilada. Trazar la curva de absorbancias en función de la concentración de las soluciones. La variación es lineal.

2.3.3.   Determinación

Introducir en una cápsula de 55 mm de diámetro 5 ml de destilado, añadir 1 ml de solución de hidróxido de calcio (punto 2.1.2). Evaporar hasta sequedad en un baño de agua hirviendo.

Recoger el residuo con algunos mililitros de agua destilada, arrastrar cuantitativamente a un matraz aforado de 20 ml y enrasar con el agua de lavado. Medir la absorbancia a 256 nm con el espectrofotómetro en comparación con una solución testigo obtenida diluyendo hasta 20 ml con agua 1 ml de solución de hidróxido de calcio (punto 2.1.2).

Llevar el valor de la absorbancia medida a la recta patrón y deducir la concentración en ácido sórbico C de la solución.

Observación: En la práctica corriente, esta evaporación a sequedad puede no ser necesaria. Medir directamente la absorbancia en el destilado diluido a 1/4 frente a agua destilada.

2.4.   Expresión de los resultados

2.4.1.   Modo de cálculo

La concentración en ácido sórbico del vino expresada en miligramos por litro es igual a:

100 × C

C = concentración en ácido sórbico de la solución analizada mediante espectrofotometría, expresada en miligramos por litro.

3.   MÉTODO DE DETERMINACIÓN POR CROMATOGRAFÍA DE GASES

3.1.   Reactivos

3.1.1.   Éter etílico ((C2H5)2O) destilado en el momento de su utilización.

3.1.2.   Solución del patrón interno: solución de ácido undecanoico (C11H22O2) en etanol al 95 % vol., de 1 g por litro.

3.1.3.   Solución acuosa de ácido sulfúrico (H2SO4) (ρ20 = 1,84 g/ml) diluido 1/3 (v/v).

3.2.   Material

3.2.1.   Cromatógrafo de gases equipado con un detector de ionización de llama y una columna de acero inoxidable (4 m × 1/8 de pulgada) previamente tratada con dimetil-dicloro-silano y rellena con fase estacionaria, compuesta por una mezcla de succinato de dietilenglicol (5 %) y ácido fosfórico (1 %) (DEGS-H3PO4) o por una mezcla de adipato de dietilenglicol (7 %) y ácido fosfórico (1 %) (DEGA-H3PO4), sobre un soporte sólido de Gaschrom Q 80 — 100 mallas.

Para el tratamiento con dimetil-dicloro-silano (DMDCS), pasar por la columna una solución con 2 o 3 g de DMDCS en tolueno, lavar inmediatamente la columna con metanol y a continuación pasar una corriente de nitrógeno, después hexano y de nuevo una corriente de nitrógeno. Rellenarla a continuación.

Condiciones operativas:

| | Temperatura del horno: 175 °C. |
| --- | --- |

Temperatura del horno: 175 °C.

| | Temperatura del inyector y del detector: 230 °C. |
| --- | --- |

Temperatura del inyector y del detector: 230 °C.

| | Gas portador: nitrógeno (flujo 20 ml/min). |
| --- | --- |

Gas portador: nitrógeno (flujo 20 ml/min).

3.2.2.   Microjeringa de 10 microlitros de capacidad graduada en 0,1 microlitros.

Observación: Puede conseguirse igualmente una buena separación con otros tipos de columnas, como la columna capilar (por ejemplo, FFAP).

El modo operatorio descrito arriba se da a título de ejemplo.

3.3.   Procedimiento

3.3.1.   Preparación de la muestra problema

Introducir 20 ml de vino en un tubo de vidrio con una capacidad de unos 40 ml y provisto de un tapón esmerilado; añadir 2 ml de solución del patrón interno (punto 3.1.2) y 1 ml de solución diluida de ácido sulfúrico (punto 3.1.3).

Tras agitar el tubo invirtiéndolo varias veces, añadir al contenido 10 ml de éter etílico (punto 3.1.1). Extraer el ácido sórbico en la fase orgánica agitando el tubo durante 5 minutos. Dejar decantar.

3.3.2.   Preparación de la solución de referencia

Seleccionar un vino cuyo extracto etéreo produzca un cromatograma que no presente ningún pico en la zona de elución del ácido sórbico; añadir a este vino ácido sórbico hasta la concentración de 100 mg por litro. Tratar, según el procedimiento descrito en el punto 3.3.1, 20 ml de la muestra así preparada.

3.3.3.   Cromatografía

Inyectar sucesivamente en el cromatógrafo, con una microjeringa, 2 μl de la fase etérea obtenida en el punto 3.3.2 y 2 μl de la fase etérea obtenida en el punto 3.3.1.

Registrar los cromatogramas respectivos: comprobar la identidad de los tiempos de retención respectivos del ácido sórbico y del patrón interno. Medir la altura (o el área) de cada uno de los picos registrados.

3.4.   Expresión de los resultados

3.4.1.   Modo de cálculo

La concentración de ácido sórbico del vino analizado, expresada en miligramos por litro, es igual a:

100 × (h/H) × (l/i)

H= altura del pico del ácido sórbico en la solución de referencia,

h= altura del pico del ácido sórbico en la muestra problema,

l= altura del pico del patrón interno en la solución de referencia,

i= altura del pico del patrón interno en la muestra problema.

Nota: La concentración de ácido sórbico puede determinarse del mismo modo a partir de las medidas de la superficie de los picos respectivos.

15   PH (OIV-AS-313-15-PH) — MÉTODO DE TIPO I

1.   PRINCIPIO

Medida de la diferencia de potencial entre dos electrodos sumergidos en el líquido que se estudia. Uno de los dos electrodos tiene un potencial que es una función definida del pH del líquido, mientras que el otro tiene un potencial fijo y conocido y constituye el electrodo de referencia.

2.   MATERIAL

2.1.   pH-metro graduado en unidades de pH que permita efectuar medidas con una precisión mínima de 0,05 unidades.

2.2.   Electrodos

2.2.1.   Electrodo de vidrio, que deberá conservarse en agua destilada.

2.2.2.   Electrodo de referencia de calomelanos y cloruro potásico saturado, que se conservará en una solución saturada de cloruro potásico.

2.2.3.   O electrodo combinado, que deberá conservarse en agua destilada.

3.   REACTIVOS

3.1.   Soluciones amortiguadoras:

3.1.1.   Solución saturada de tartrato ácido de potasio. Solución con un contenido mínimo de 5,7 g/l de tartrato ácido de potasio (C4H5KO6) a 20 °C. Esta solución puede conservarse hasta 2 meses en presencia de 0,1 g de timol por cada 200 ml.

| pH | 3,57 a 20 °C
  3,56 a 25 °C
  3,55 a 30 °C |
| --- | --- |

pH

3,57 a 20 °C

3,56 a 25 °C

3,55 a 30 °C

3.1.2.   Solución 0,05 M de ftalato ácido de potasio. Solución con 10,211 g/l de ftalato ácido de potasio (C8H5KO4) a 20 °C (plazo máximo de conservación: 2 meses).

| pH | 3,999 a 15 °C
  4,003 a 20 °C
  4,008 a 25 °C
  4,015 a 30 °C |
| --- | --- |

pH

3,999 a 15 °C

4,003 a 20 °C

4,008 a 25 °C

4,015 a 30 °C

3.1.3.   Solución con:

| Fosfato monopotásico (K H2 PO4) ... | 3,402 g |
| --- | --- |
| Fosfato dipotásico (K2HPO4) ... | 4,354 g |
| Agua csp... | 1 l |

Fosfato monopotásico (K H2 PO4) ...

3,402 g

Fosfato dipotásico (K2HPO4) ...

4,354 g

Agua csp...

1 l

(Duración máxima de la solución: 2 meses)

| pH | 6,90 a 15 °C
  6,88 a 20 °C
  6,86 a 25 °C
  6,85 a 30 °C |
| --- | --- |

pH

6,90 a 15 °C

6,88 a 20 °C

6,86 a 25 °C

6,85 a 30 °C

Observación: También pueden utilizarse soluciones amortiguadoras de referencia comerciales.

4.   PROCEDIMIENTO

4.1.   Preparación de la muestra problema

4.1.1.   Mosto y vino

Utilizar directamente el mosto o el vino.

4.1.2.   Mosto concentrado rectificado

Diluir este mosto con agua a fin de obtener una concentración de 25 ± 0,5 % (m/m) en azúcares totales (25 ° Brix).

Si P es el contenido porcentual (m/m) en azúcares totales del mosto concentrado rectificado, pesar una masa igual a 2 500/P

y completar hasta 100 g con agua. El agua utilizada debe tener una conductividad inferior a 2 microsiemens por centímetro.

4.2.   Puesta a cero del aparato

Se efectuará antes de cada medida, siguiendo las instrucciones dadas para el aparato utilizado.

4.3.   Calibrado del pH-metro

El calibrado se efectúa a 20 °C siguiendo las indicaciones dadas para el aparato utilizado, con las soluciones amortiguadoras de pH 6,88 y 3,57 a 20 °C.

Utilizar la solución amortiguadora de pH 4,00 a 20 °C para controlar el calibrado de la escala.

4.4.   Medida

Introducir el electrodo en la muestra analizada, cuya temperatura deberá estar comprendida entre 20 y 25 °C y tan próxima a 20 °C como sea posible. Leer directamente el valor del pH.

Efectuar al menos dos determinaciones de cada muestra.

Tomar como resultado la media aritmética de las determinaciones.

5.   EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

El pH del mosto, del vino o de la solución al 25 % (m/m) (25 ° Brix) del mosto concentrado rectificado se expresará con dos decimales.

16   DETERMINACIÓN SIMULTÁNEA DE ÁCIDO L-ASCÓRBICO Y DE ÁCIDO D-ISOASCÓRBICO POR HPLC Y DETECCIÓN UV (OIV-AS-313-22-ACASCO) — MÉTODO DE TIPO II

1.   INTRODUCCIÓN

El ácido ascórbico es un antioxidante presente de forma natural en toda una serie de productos alimentarios. La cantidad normal de ácido ascórbico de la uva va disminuyendo a lo largo de la elaboración de los mostos y de la vinificación. Puede añadirse a los mostos y a los vinos dentro de ciertos límites.

El método descrito se ha validado en el marco de ensayos interlaboratorios, mediante análisis de muestras de vino con cantidades añadidas de ácido L-ascórbico y de ácido D-isoascórbico, de 30 mg/l a 150 mg/l y de 10 mg/l a 100 mg/l, respectivamente.

2.   ÁMBITO DE APLICACIÓN

Este método es adecuado para la determinación simultánea de ácido L-ascórbico y de ácido D-isoascórbico (ácido eritórbico) en el vino mediante cromatografía líquida de alta resolución (CLAR o HPLC (siglas de su nombre en inglés)) y detección UV en una banda de 3 a 150 mg/l.

En caso de contenido superior a 150 mg/l, hay que efectuar una dilución de la muestra.

3.   PRINCIPIO

Las muestras se inyectan directamente en el sistema de HPLC previa filtración por membrana. Los analitos se separan en una columna de fase inversa y se someten a detección UV a 266 nm. La cuantificación del ácido L-ascórbico y del ácido D-isoascórbico se efectúa con relación a un patrón externo.

Observación: Las columnas y las condiciones de funcionamiento se dan a título de ejemplo. Con otros tipos de columnas puede conseguirse igualmente una buena separación.

4.   REACTIVOS Y PRODUCTOS

4.1.   Reactivos

4.1.1.   n-octilamina, pureza ≥ 99,0 %

4.1.2.   Acetato de sodio trihidratado, pureza ≥ 99,0 %

4.1.3.   Ácido acético puro, al 100 %

4.1.4.   Ácido fosfórico, aproximadamente al 25 %

4.1.5.   Ácido oxálico, pureza ≥ 99,0 %

4.1.6.   Ascorbato-oxidasa

4.1.7.   Ácido L-ascórbico, ultra ≥ 99,5 %

4.1.8.   Ácido D-isoascórbico, pureza ≥ 99,0 %

4.1.9.   Agua bidestilada

4.1.10.   Metanol, p. a. 99,8 %

4.2.   Preparación de la fase móvil

4.2.1.   Soluciones para la fase móvil

Preparar las soluciones siguientes para la fase móvil:

4.2.1.1.   12,93 g de n-octilamina en 100 mlde metanol

4.2.1.2.   68,05 g de acetato de sodio trihidratado en 500 ml de agua bidestilada

4.2.1.3.   12,01 g de ácido acético puro en 200 ml de agua bidestilada

4.2.1.4.   Solución amortiguadora de pH 5,4: 430 ml de solución de acetato de sodio (4.2.1.2) y 70 ml de solución de ácido acético (4.2.1.3)

4.2.2.   Preparación de la fase móvil

Añadir 5 ml de solución de n-octilamina (4.2.1.1) a unos 400 ml de agua bidestilada en un vaso. Ajustar el pH de esta solución a 5,4 - 5,6, añadiendo gota a gota ácido fosfórico al 25 % (4.1.4). Añadir 50 ml de la solución amortiguadora (4.2.1.4), introducir el conjunto en un matraz aforado de 1 000 ml y enrasar con agua bidestilada. Antes de utilizarse, la fase móvil debe filtrarse por membrana (celulosa regenerada de 0,2 μm) y, si es posible, desgasificarse con helio (durante unos 10 minutos) según las necesidades del sistema de HPLC utilizado.

4.3.   Preparación de la solución patrón

Observación:

Todas las soluciones patrón (solución madre 4.3.1 y soluciones de trabajo 4.3.2) deben prepararse cada día y, de preferencia, guardarse en refrigerador hasta el momento de su inyección.

4.3.1.   Preparación de la solución madre (1 mg/ml)

Preparar una solución acuosa de ácido oxálico al 2 % y eliminar el oxígeno disuelto borboteando nitrógeno.

Pesar con exactitud 100 mg de ácido L-ascórbico y 100 mg de ácido D-isoascórbico en un matraz aforado de 100 ml y enrasar con solución acuosa de ácido oxálico al 2 %.

4.3.2.   Preparación de las soluciones de trabajo

Para obtener las soluciones de trabajo, diluir la solución madre (4.3.1) hasta las concentraciones deseadas con la solución de ácido oxálico al 2 %. Se recomienda obtener concentraciones entre 10 mg/l y 120 mg/l. Por ejemplo, llevar 100 μl, 200 μl, 400 μl, 800 μl y 1 200μl a 10 ml, lo que corresponde a 10, 20, 40, 80 y 120 mg/l.

5.   MATERIAL

Instrumental habitual de laboratorio y, en particular, el siguiente:

5.1.   Bomba de HPLC

5.2.   Inyector con bucle de 20 μl

5.3.   Detector de UV

6.   MUESTREO

Las muestras de vino se pasan por un filtro de membrana de 0,2 μm de diámetro de poro, antes de inyectarlas.

En caso de contenido superior a 150 mg/l, hay que efectuar una dilución de la muestra.

7.   PROCEDIMIENTO

7.1.   Condiciones para la utilización del sistema de HPLC

Inyectar en el aparato de cromatografía 20 μl de la muestra filtrada por membrana.

| Precolumna | : | por ejemplo, Nucleosil 120 C18 (4 cm x 4 mm x 7 μm) |
| --- | --- | --- |
| Columna | : | por ejemplo, Nucleosil 120 C18 (25 cm x 4 mm x 7 μm) |
| Volumen de inyección | : | 20 μl |
| Fase móvil | : | véase el punto 4.2.2, gradiente isocrático |
| Caudal | : | 1 ml/min |
| Detección de UV | : | 266 nm |
| Ciclo de lavado | : | al menos 30 ml de agua bidestilada, seguidos de 30 ml de metanol y de 30 ml de acetonitrilo. |

Precolumna

:

por ejemplo, Nucleosil 120 C18 (4 cm x 4 mm x 7 μm)

Columna

:

por ejemplo, Nucleosil 120 C18 (25 cm x 4 mm x 7 μm)

Volumen de inyección

:

20 μl

Fase móvil

:

véase el punto 4.2.2, gradiente isocrático

Caudal

:

1 ml/min

Detección de UV

:

266 nm

Ciclo de lavado

:

al menos 30 ml de agua bidestilada, seguidos de 30 ml de metanol y de 30 ml de acetonitrilo.

7.2.   Identificación/confirmación

La identificación de los picos se efectúa comparando los tiempos de retención de los patrones y de las muestras. Con el sistema cromatográfico que se describe como ejemplo, los tiempos de retención son de 7,7 min para el ácido L-ascórbico y de 8,3 min para el ácido D-isoascórbico (ver la figura 1, cromatograma A).

Para confirmar un resultado positivo, estas muestras deben tratarse con una espátula de ascorbato-oxidasa y medirse de nuevo (ver la figura 1, cromatograma B).

Debido a la degradación del ácido L-ascórbico y del ácido D-isoascórbico provocada por la ascorbato-oxidasa, no debería encontrarse ninguna señal al tiempo de retención del ácido L-ascórbico ni del ácido D-isoascórbico. En caso de detección de picos parásitos, es necesario tener en cuenta su superficie para calcular la concentración de los analitos.

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Observación: Se recomienda analizar las muestras tratadas con ascorbato-oxidasa al final de una secuencia, seguido del ciclo de lavado para eliminar de la columna los restos de ascorbato-oxidasa; en caso contrario, el ácido L-ascórbico y el ácido D-isoascórbico podrían ser transformados por los restos de ascorbato-oxidasa en la determinación por HPLC y el resultado podría verse afectado.

8.   CÁLCULOS

Preparar una curva de calibración a partir de las soluciones de trabajo (4.3.2). Según el método del patrón externo, la cuantificación del ácido L-ascórbico y del ácido D-isoascórbico se realiza midiendo las superficies de los picos y comparándolas con la concentración correspondiente en la curva de calibración.

Expresión de los resultados

Los resultados se expresan con un decimal en mg/l de ácido L-ascórbico y de ácido D-isoascórbico (por ejemplo, 51,3 mg/l).

En caso de contenido superior a 150 mg/l, hay que tener en cuenta la dilución.

9.   FIDELIDAD

El método se ha comprobado dentro de una prueba interlaboratorios organizada en 1994 por la antigua Oficina Federal de Sanidad (Bundesgesundheitsamt) de Alemania, con participación de 27 laboratorios. El programa de la prueba interlaboratorios seguía el artículo 35 de la Ley alemana relativa a los productos alimenticios, aceptado por la OIV hasta la introducción del nuevo protocolo (OENO 6/2000).

El estudio comprendía cuatro muestras diferentes de vino (dos vinos blancos y dos vinos tintos), con cinco repeticiones de cada muestra. Como no era posible preparar muestras con una estabilidad suficiente de los analitos (velocidades de degradación diferentes), se decidió enviar a los participantes cantidades definidas de sustancias patrón puras y las muestras de vino. Se dio a los laboratorios la consigna de transferir cuantitativamente los patrones a las muestras de vino y de analizar estas inmediatamente. Se analizaron muestras con 30 – 150 mg/l de ácido L-ascórbico y 10 - y 100 mg/l de ácido D-isoascórbico. En el anexo publicado por la OIV se recogen los resultados pormenorizados del estudio. La evaluación se realizó según la norma DIN/ISO 5725 (versión 1988).

Las desviaciones típicas de la repetibilidad (sr) y de la reproducibilidad (sR) eran adecuadas para las concepciones de ácido L-ascórbico y de ácido D-isoascórbico. El parámetro de precisión real puede calcularse mediante las ecuaciones siguientes:

| | Ácido L-ascórbico
  sr = 0,011 x + 0,31
  sR = 0,064 x + 1,39
  x: concentración de ácido L-ascórbico (mg/l) |
| --- | --- |

Ácido L-ascórbico

sr = 0,011 x + 0,31

sR = 0,064 x + 1,39

x: concentración de ácido L-ascórbico (mg/l)

| | Ácido D-isoascórbico
  sr = 0,014 x + 0,31
  sR = 0,079 x + 1,29
  x: concentración de ácido D-isoascórbico (mg/l) |
| --- | --- |

Ácido D-isoascórbico

sr = 0,014 x + 0,31

sR = 0,079 x + 1,29

x: concentración de ácido D-isoascórbico (mg/l)

Ejemplo:

| | 50 mg/l de ácido D-isoascórbico sr = 1,0 mg/l |
| --- | --- |

50 mg/l de ácido D-isoascórbico sr = 1,0 mg/l

| | sR = 5,2 mg/l |
| --- | --- |

sR = 5,2 mg/l

10.   OTRAS CARACTERÍSTICAS DEL ANÁLISIS

10.1.   Límite de detección

Se estima que el límite de detección de este método es de 3 mg/l para el ácido L-ascórbico y para el ácido D-isoascórbico.

10.2.   Exactitud

La recuperación media calculada a partir de la prueba interlaboratorios realizada con cuatro muestras (ver el anexo publicado en el Compendio de la OIV) fue de:

| — | 100,6 % para el ácido L-ascórbico |
| --- | --- |

—

100,6 % para el ácido L-ascórbico

| — | 103,3 % para él ácido D-isoascórbico. |
| --- | --- |

—

103,3 % para él ácido D-isoascórbico.

17   DIÓXIDO DE CARBONO (OIV-AS-314-01-DIOCAR) — MÉTODO DE TIPO II

1.   PRINCIPIO DEL MÉTODO

1.1.   Caso de vinos tranquilos (sobrepresión de CO2 ≤ 0,5 x 105 Pa)
   (2)

El volumen de vino tomado de la muestra y llevado a una temperatura próxima a los 0 °C se vierte en un exceso suficiente de solución valorada de hidróxido de sodio para lograr un pH de 10 a 11. Se valora con una solución ácida en presencia de anhidrasa carbónica. El contenido en dióxido de carbono se deduce del volumen empleado para pasar de pH 8,6 (forma de carbonato ácido) a 4,0 (ácido carbónico). Una valoración testigo efectuada en las mismas condiciones con el vino desprovisto de CO2 permite tener en cuenta el volumen de solución de hidróxido de sodio consumido por los ácidos del vino.

1.2.   Caso de vinos de aguja y vinos espumosos

Se lleva la muestra de vino problema a cerca de su punto de congelación. Después de tomar un cierto volumen que servirá de testigo una vez desprovisto de CO2, se alcaliniza el resto de la botella para fijar todo el CO2 en forma de Na2CO3. Se valora con una solución ácida en presencia de anhidrasa carbónica. El contenido en dióxido de carbono se deduce del volumen de solución ácida empleado para pasar de pH 8,6 (forma de carbonato ácido) a pH 4,0 (ácido carbónico). Una valoración testigo efectuada en las mismas condiciones con el vino desprovisto de CO2 permite tener en cuenta el volumen de solución de hidróxido de sodio consumido por los ácidos del vino.

2.   DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO

2.1.   Vinos tranquilos (sobrepresión de dióxido de carbono ≤ 0,5 x 105 Pa)

2.1.1.   Material

2.1.1.1.   Agitador magnético

2.1.1.2.   pH-metro

2.1.2.   Reactivos

2.1.2.1.   Solución de hidróxido de sodio (NaOH), 0,1 M

2.1.2.2.   Solución de ácido sulfúrico (H2SO4), 0,05 M

2.1.2.3.   Solución de 1 g/l de anhidrasa carbónica

2.1.3.   Procedimiento

Enfriar la muestra de vino hasta los 0 °C, aproximadamente, así como la pipeta de 10 ml que sirva para la toma de muestra.

En un vaso de precipitados de 100 ml, poner 25 ml de solución de hidróxido de sodio (punto 2.1.2.1); añadir 2 gotas de solución acuosa de anhidrasa carbónica (punto 2.1.2.3). Introducir 10 ml de vino con ayuda de la pipeta enfriada a 0 °C.

Poner el vaso de precipitados en el agitador magnético, colocar el electrodo y la varilla magnética y llevar a cabo una agitación moderada.

Cuando el líquido esté a la temperatura ambiente, verter lentamente la solución de ácido sulfúrico (punto 2.1.2.2) hasta llegar a pH 8,6.

Seguir después vertiendo ácido sulfúrico (punto 2.1.2.2) hasta pH 4,0. Sea n ml el volumen utilizado entre pH 8,6 y 4,0.

Por otro lado, eliminar el CO2 de unos 50 ml de la muestra de vino, agitando bajo vacío durante tres minutos y calentando el matraz en un baño de agua a 25 °C aproximadamente.

Aplicar el procedimiento anterior a 10 ml de vino desprovisto de CO2: sea n′ ml el volumen utilizado.

2.1.4.   Expresión de los resultados

1 ml de solución valorada de ácido sulfúrico 0,05 M corresponde a 4,4 mg de CO2.

La cantidad de CO2 en gramos por litro de vino se expresa mediante la fórmula:

0,44 (n – n′)

indicando 2 decimales.

Observación: En el caso de vinos con bajo contenido de CO2 (CO2 < 1 g/l), no es necesaria la adición de anhidrasa carbónica para catalizar la hidratación del CO2.

2.2.   Vinos de aguja y vinos espumosos

2.2.1.   Material

2.2.1.1.   Agitador magnético

2.2.1.2.   pH-metro

2.2.2.   Reactivos

2.2.2.1.   Solución de hidróxido de sodio (NaOH) al 50 % (m/m)

2.2.2.2.   Solución de ácido sulfúrico (H2SO4), 0,05 M

2.2.2.3.   Solución de 1 g/l de anhidrasa carbónica

2.2.3.   Procedimiento

Trazar una marca, al nivel del llenado, sobre la botella de vino problema y enfriarla hasta el inicio de la congelación.

Dejar que la botella se caliente ligeramente, agitando, hasta que desaparezcan los cristales de hielo.

Destapar rápidamente y apartar en una probeta graduada de 45 a 50 ml de vino que servirán para la determinación testigo. El volumen exacto de esta muestra, v ml, se determinará mediante lectura sobre la probeta, cuando el vino esté a la temperatura ambiente.

Añadir, inmediatamente después de haber tomado la muestra anterior, 20 ml de solución de hidróxido de sodio (punto 2.2.2.1) a la botella si tiene una capacidad de 750 ml.

Esperar a que el vino esté de nuevo a temperatura ambiente.

En un vaso de precipitados de 100 ml, poner 30 ml de agua destilada hervida y 2 gotas de solución de anhidrasa carbónica (punto 2.2.2.3). Añadir 10 ml de vino alcalinizado.

Poner el vaso en el agitador magnético, colocar el electrodo y la varilla magnética y llevar a cabo una agitación moderada.

Verter lentamente la solución de ácido sulfúrico (punto 2.2.2.2) hasta pH 8,6.

Seguir después vertiendo ácido sulfúrico (punto 2.2.2.2) hasta pH 4,0. Sea n ml el volumen utilizado entre pH 8,6 y 4,0.

Por otro lado, eliminar el CO2 de los v ml de vino apartados para la determinación testigo, agitando bajo vacío durante tres minutos y calentando el matraz en un baño de agua a 25 °C aproximadamente. Tomar 10 ml de vino desprovisto de CO2 en 30 ml de agua destilada hervida, añadir 2 o 3 gotas de solución de hidróxido de sodio (punto 2.2.2.1) para llevar el pH a 10-11. Aplicar después el procedimiento anterior. Sea n′ ml el volumen de ácido sulfúrico 0,05 M empleado.

2.2.4.   Expresión de los resultados

1 ml de solución de ácido sulfúrico 0,05 M corresponde a 4,4 mg de CO2.

Vaciar la botella del vino alcalinizado y determinar con una aproximación de 1 ml el volumen inicial de vino, llenándola con agua hasta la marca, sea V ml.

La cantidad de CO2 en gramos por litro de vino se expresa mediante la fórmula siguiente:

0,44 (n – n′) x ((V – v + 20)/(V – v))

indicando 2 decimales.

2.3.   Cálculo de la sobrepresión teórica

La sobrepresión a 20 °C, Paph20, expresada en pascales, viene dada por la fórmula:

Paph20 = ((Q)/(1,951 × 10-5(0,86 – 0,01 A)(1 – 0,00144 S))) - Patm

siendo:

| Q | : | contenido en gramos de CO2 por litro de vino |
| --- | --- | --- |
| A | : | grado alcohólico del vino a 20 °C |
| S | : | contenido en azúcares del vino en gramos por litro |
| Patm | : | presión atmosférica expresada en pascales. |

Q

:

contenido en gramos de CO2 por litro de vino

A

:

grado alcohólico del vino a 20 °C

S

:

contenido en azúcares del vino en gramos por litro

Patm

:

presión atmosférica expresada en pascales.

18   DETERMINACIÓN DEL DIÓXIDO DE CARBONO EN EL VINO POR MÉTODO MANOMÉTRICO (OIV-AS314-04-CO2MAN) — MÉTODO DE TIPO II

(p.m.)

[La descripción de este método de análisis está siendo objeto de actualización por parte de las instancias de la OIV. Esta descripción se publicará en una próxima Comunicación de la Comisión en cuanto la OIV haya publicado un texto actualizado en la edición 2010 del Compendio de métodos internacionales de análisis de la OIV].

19   MEDICIÓN DE LA SOBREPRESIÓN DE LOS VINOS ESPUMOSOS Y DE AGUJA (OIV - AS-314-02-SURPRES) — MÉTODO DE TIPO I

1.   PRINCIPIO

Tras la estabilización térmica y agitación de la botella, se mide la sobrepresión por medio de un afrómetro (calibre de presión). La sobrepresión se expresa en pascales (Pa) (método de tipo I). Este método también es aplicable a los vinos espumosos gasificados y a los vinos de aguja gasificados.

2.   MATERIAL

El aparato que se utiliza para medir la sobrepresión en las botellas de vinos espumosos y de aguja se llama afrómetro. Tiene distintas presentaciones que dependen del cierre de la botella (cápsula metálica, corona, tapón de corcho o de plástico).

2.1.   Botellas con cápsula o corona

Consta de tres partes (figura 1):

| — | La parte superior (o tornillo porta agujas), compuesta por un manómetro, una rueda de ajuste manual, un tornillo sinfín que se desliza en la parte media y una aguja que atraviesa la cápsula. La aguja tiene una perforación lateral que comunica la presión al manómetro. Una junta que queda sobre la cápsula de la botella garantiza la hermeticidad del conjunto. |
| --- | --- |

—

La parte superior (o tornillo porta agujas), compuesta por un manómetro, una rueda de ajuste manual, un tornillo sinfín que se desliza en la parte media y una aguja que atraviesa la cápsula. La aguja tiene una perforación lateral que comunica la presión al manómetro. Una junta que queda sobre la cápsula de la botella garantiza la hermeticidad del conjunto.

| — | La parte media (o tuerca), que sirve para centrar la parte superior. Se atornilla a la parte inferior de forma que el aparato quede fuertemente sujeto a la botella. |
| --- | --- |

—

La parte media (o tuerca), que sirve para centrar la parte superior. Se atornilla a la parte inferior de forma que el aparato quede fuertemente sujeto a la botella.

| — | La parte inferior (o estribo), provista de un espolón que se desliza bajo el anillo de la botella y sujeta todo el aparato. Existen anillos adaptados a cada tipo de botella. |
| --- | --- |

—

La parte inferior (o estribo), provista de un espolón que se desliza bajo el anillo de la botella y sujeta todo el aparato. Existen anillos adaptados a cada tipo de botella.

2.2.   Botellas con tapón

Consta de dos partes (figura 2):

| — | La parte superior es idéntica a la del aparato precedente, aunque la aguja es más larga. Esta última está formada por un tubo largo y hueco en cuyo extremo se halla una punta que permite perforar el tapón. La punta es amovible y cae dentro de la botella una vez que se ha perforado el tapón. |
| --- | --- |

—

La parte superior es idéntica a la del aparato precedente, aunque la aguja es más larga. Esta última está formada por un tubo largo y hueco en cuyo extremo se halla una punta que permite perforar el tapón. La punta es amovible y cae dentro de la botella una vez que se ha perforado el tapón.

| — | La parte inferior, formada por la tuerca y una base que se coloca sobre el tapón. La base tiene cuatro tornillos de ajuste con los que se sujeta el aparato al tapón. |
| --- | --- |

—

La parte inferior, formada por la tuerca y una base que se coloca sobre el tapón. La base tiene cuatro tornillos de ajuste con los que se sujeta el aparato al tapón.

| | |
| --- | --- |

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Observaciones sobre los manómetros que llevan estos dos tipos de aparato:

| — | Pueden ser mecánicos con tubo de Bourdon o numéricos con sensor piezoeléctrico. En el primer caso, el tubo de Bourdon debe ser obligatoriamente de acero inoxidable. |
| --- | --- |

—

Pueden ser mecánicos con tubo de Bourdon o numéricos con sensor piezoeléctrico. En el primer caso, el tubo de Bourdon debe ser obligatoriamente de acero inoxidable.

| — | Deben estar graduados en pascales (símbolo Pa). Para los vinos espumosos, lo más práctico es utilizar como unidad 105 pascales (105 Pa) o el kilopascal (kPa). |
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Deben estar graduados en pascales (símbolo Pa). Para los vinos espumosos, lo más práctico es utilizar como unidad 105 pascales (105 Pa) o el kilopascal (kPa).

| — | Pueden ser de distintas clases. La clase de un manómetro es la precisión de la lectura respecto de la escala completa expresada en porcentaje (ejemplo: «manómetro 1 000 kPa clase 1» significa presión máxima de utilización de 1 000 kPa y lectura con precisión de ± 10 kPa). Para mediciones precisas se recomienda la clase 1. |
| --- | --- |

—

Pueden ser de distintas clases. La clase de un manómetro es la precisión de la lectura respecto de la escala completa expresada en porcentaje (ejemplo: «manómetro 1 000 kPa clase 1» significa presión máxima de utilización de 1 000 kPa y lectura con precisión de ± 10 kPa). Para mediciones precisas se recomienda la clase 1.

3.   PROCEDIMIENTO

La medición debe efectuarse con botellas cuya temperatura lleve estabilizada 24 horas, como mínimo. Para efectuar la lectura, se perfora la corona o el tapón de corcho o plástico y se agita vigorosamente la botella hasta alcanzar una presión constante.

3.1.   Botellas con cápsula o corona

Deslizar el espolón del estribo bajo el anillo de la botella. Apretar la tuerca hasta que el conjunto quede ajustado a la botella. Enroscar la parte superior en la tuerca. Para evitar pérdidas de gas, debe perforarse la cápsula lo más rápidamente posible hasta que la junta quede en contacto con la cápsula. A continuación, se agita con fuerza la botella hasta alcanzar una presión constante para efectuar la lectura.

3.2.   Botellas con tapón

Colocar una punta en el extremo de la aguja. Disponer el aparato sobre el tapón. Ajustar los cuatro tornillos al tapón. Enroscar la parte superior (la aguja perfora entonces el tapón). La punta debe caer dentro de la botella para que la presión se transmita al manómetro. Efectuar la lectura después de agitar la botella hasta alcanzar una presión constante. Recuperar la punta después de la lectura.

4.   EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

La sobrepresión a 20 °C (Paph20) se expresa en pascales (Pa) o kilopascales (kPa). Deberá concordar con la precisión del manómetro (por ejemplo: 6,3 × 105 Pa o 630 kPa y no 6,33 × 105 Pa o 633 kPa si se utiliza un manómetro de 1 000 kPa de escala completa y de clase 1).

Cuando la temperatura de medición no sea de 20 °C, conviene corregir el resultado multiplicando la presión medida por el coeficiente que corresponda (véase la tabla 1).

Tabla 1

Relación entre la sobrepresión Paph20 de un vino de aguja o espumoso a 20 °C y la sobrepresión Paph
  t
  a una temperatura t

| °C | |
| --- | --- |
| 0 | 1,85 |
| 1 | 1,80 |
| 2 | 1,74 |
| 3 | 1,68 |
| 4 | 1,64 |
| 5 | 1,59 |
| 6 | 1,54 |
| 7 | 1,50 |
| 8 | 1,45 |
| 9 | 1,40 |
| 10 | 1,36 |
| 11 | 1,32 |
| 12 | 1,28 |
| 13 | 1,24 |
| 14 | 1,20 |
| 15 | 1,16 |
| 16 | 1,13 |
| 17 | 1,09 |
| 18 | 1,06 |
| 19 | 1,03 |
| 20 | 1,00 |
| 21 | 0,97 |
| 22 | 0,95 |
| 23 | 0,93 |
| 24 | 0,91 |
| 25 | 0,88 |

°C

0

1,85

1

1,80

2

1,74

3

1,68

4

1,64

5

1,59

6

1,54

7

1,50

8

1,45

9

1,40

10

1,36

11

1,32

12

1,28

13

1,24

14

1,20

15

1,16

16

1,13

17

1,09

18

1,06

19

1,03

20

1,00

21

0,97

22

0,95

23

0,93

24

0,91

25

0,88

5.   CONTROL DE LOS RESULTADOS

Método de determinación directa de parámetros físicos (método criterio de tipo I)

Verificación de los afrómetros

Los afrómetros deben verificarse periódicamente (al menos una vez al año).

La verificación se realiza con un banco de calibración. Éste permite comparar el manómetro con un manómetro de referencia, de clase superior, conectado a los patrones nacionales y montado en paralelo. En el control, se comparan los valores indicados por los dos aparatos para presiones crecientes y, después, para presiones decrecientes. Si hay alguna diferencia entre ambos, se efectúan las correcciones necesarias mediante un tornillo de regulación.

Todos los laboratorios y organismos autorizados están equipados con bancos de calibración de este tipo. También los constructores de manómetros disponen de ellos.

20   DETERMINACIÓN DE LA LISOZIMA EN EL VINO POR HPLC (OIV-AS-315-14) — MÉTODO DE TIPO IV

1.   INTRODUCCIÓN

Es preferible utilizar para la lisozima un método analítico que no esté basado en la actividad enzimática.

2.   ÁMBITO DE APLICACIÓN

Este método permite la cuantificación de la lisozima (mg de proteína/l) presente en los vinos blancos y tintos, independientemente de la actividad enzimática (que podría verse afectada por una desnaturalización parcial o por fenómenos de complejación o de coprecipitación) de la matriz.

3.   DEFINICIÓN

La cromatografía líquida de alta resolución (CLAR o, en inglés, HPLC) ofrece un enfoque analítico basado en interacciones de tipo estérico, polar o de adsorción entre la fase estacionaria y el analito y, en consecuencia, sin relación con la actividad enzimática real de la proteína.

4.   PRINCIPIO

El análisis se efectúa mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) a la que se asocia un detector espectrofotométrico y un detector espectrofluorimétrico. El contenido de lisozima en la muestra de vino se calcula en función de la superficie del pico cromatográfico utilizando el método del patrón externo.

5.   REACTIVOS

5.1.   Disolventes y soluciones

Acetonitrilo (CH3CN) para análisis HPLC

Ácido trifluoroacético (TFA) puro

Agua desionizada para análisis HPLC

Solución patrón: ácido tartárico 1 g/l, alcohol etílico al 10 % v/v con el pH ajustado a 3,2 con tartrato de potasio neutro

5.2.   Eluyentes

| A | : | CH3CN 1 %, TFA 0,2 %, H2O= 98,8 % |
| --- | --- | --- |
| B | : | CH3CN 70 %, TFA 0,2 %, H2O= 29,8 % |

A

:

CH3CN 1 %, TFA 0,2 %, H2O= 98,8 %

B

:

CH3CN 70 %, TFA 0,2 %, H2O= 29,8 %

5.3.   Soluciones de referencia

De 1 a 250 mg/L de lisozima patrón disuelta en la solución modelo mediante agitación continua durante un mínimo de 12 horas.

6.   MATERIAL

6.1.   Aparato de HPLC con sistema de bombeo capaz de efectuar un gradiente de elución

6.2.   Recinto para columna termostática (horno)

6.3.   Detector espectrofotométrico asociado a un detector espectrofluorimétrico

6.4.   Bucle de inyección de 20 μL

6.5.   Columna polimérica de fase inversa con grupos funcionales fenilo (diámetro de los poros = 1 000 Å, límite de exclusión = 1 000 000 Da), Tosoh Bioscience TSK-gel Phenyl 5PW RP 7,5 cm × 4,6 mm ID, por ejemplo

6.6.   Precolumna del mismo material que la columna, Tosoh Bioscience TSK-gel Phenyl 5PW RP Guardgel 1,5 cm × 3,2mm ID, por ejemplo

7.   PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Las muestras de vino se acidifican con HCl (10 M) diluido al 1/10 y se pasan, cinco minutos tras la adición, por un filtro de poliamida cuyos poros tienen un diámetro de 0,22 μm. El análisis cromatográfico se efectúa inmediatamente después de la filtración.

8.   CONDICIONES DE FUNCIONAMIENTO

8.1.   Flujo de eluyente: 1 ml/min

8.2.   Temperatura de la columna: 30 °C

8.3.   Detección espectrofotométrica: 280 nm

8.4.   Detección espectrofluorimétrica: λ ex = 276 nm ; λ em = 345 nm ; Ganancia (Gain) = 10

8.5.   Programa del gradiente de elución

| Tiempo (min) | Sol A % | Sol B % | Gradiente |
| --- | --- | --- | --- |
| 0 | 100 | 0 | |
| | | | isocrático |
| 3 | 100 | 0 | |
| | | | lineal |
| 10 | 65 | 35 | |
| | | | isocrático |
| 15 | 65 | 35 | |
| | | | lineal |
| 27 | 40,5 | 59,5 | |
| | | | lineal |
| 29 | 0 | 100 | |
| | | | isocrático |
| 34 | 0 | 100 | |
| | | | lineal |
| 36 | 100 | 0 | |
| | | | isocrático |
| 40 | 100 | 0 | |

Tiempo (min)

Sol A %

Sol B %

Gradiente

0

100

0

isocrático

3

100

0

lineal

10

65

35

isocrático

15

65

35

lineal

27

40,5

59,5

lineal

29

0

100

isocrático

34

0

100

lineal

36

100

0

isocrático

40

100

0

8.6.   Tiempo de retención media de la lisozima: 25,50 minutos

9.   CÁLCULO

Las soluciones de referencia que contienen las concentraciones siguientes de lisozima se analizan por triplicado: 1, 5, 10, 50, 100, 200, y 250 mg/l. En cada cromatograma, se llevan a un diagrama las áreas bajo el pico correspondiente a la lisozima, en función de sus concentraciones respectivas, con el fin de obtener las rectas de regresión lineal expresadas por la fórmula y = ax+b. El coeficiente de determinación r2 deberá ser > 0,999.

10.   CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO

Con el fin de evaluar la aptitud del método para el objetivo formulado, se ha efectuado un estudio de validación teniendo en cuenta la linealidad, los límites de detección y de cuantificación, y la precisión del método. Este último parámetro se ha determinado definiendo el nivel de precisión y de exactitud del método.

| | Banda de linealidad
  (mg/l) | Pendiente de la recta | Coeficiente de determinación
  (r2) | LD (mg/l) | LC (mg/l) | Repetibilidad (n = 5) DTR % | Reproducibilidad (n = 5) DTR % |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Patr.1 | V.T.2 | V.B.3 | Patr.1 |
| UV | 5-250 | 3 786 | 0,9993 | 1,86 | 6,20 | 4,67 | 5,54 | 0,62 | 1,93 |
| FLD | 1-250 | 52 037 | 0,9990 | 0,18 | 0,59 | 2,61 | 2,37 | 0,68 | 2,30 |

Banda de linealidad

(mg/l)

Pendiente de la recta

Coeficiente de determinación

(r2)

LD (mg/l)

LC (mg/l)

Repetibilidad (n = 5) DTR %

Reproducibilidad (n = 5) DTR %

Patr.1

V.T.2

V.B.3

Patr.1

UV

5-250

3 786

0,9993

1,86

6,20

4,67

5,54

0,62

1,93

FLD

1-250

52 037

0,9990

0,18

0,59

2,61

2,37

0,68

2,30

Cuadro 1: Datos relativos a las características del método: Patr.1: solución patrón; V.T.2: vino tinto; V.B.3: vino blanco.

10.1.   Linealidad del método

Según los resultados obtenidos gracias al análisis de regresión lineal se ha visto que el método es lineal en las bandas indicadas en el cuadro 1.

10.2.   Límite de detección y de cuantificación

El límite de detección (LD) y el límite de cuantificación (LC) se han calculado como la señal equivalente al triple y al décuplo, respectivamente, del ruido de fondo cromatográfico en condiciones de trabajo con una matriz real (cuadro 1).

10.3.   Precisión del método

Los parámetros que se han tomado en consideración son la repetibilidad y la reproducibilidad. El cuadro 1 indica los valores de estos parámetros (expresados como porcentaje de desviación típica de las medidas repetidas con diferentes concentraciones) que se han obtenido con la solución patrón, con vino blanco y con vino tinto

10.4.   Exactitud del método

Se ha calculado el porcentaje de recuperación con las soluciones patrón que contienen 5 et 50 mg/L de lisozima, a las que se ha añadido una cantidad determinada de esta sustancia, como se indica en el cuadro siguiente:

| | [C] inicial nominal (mg/l) | Adición (mg/l) | [C] teórica
  (mg/l) | [C] obtenida
  (mg/l) | Desviación típica | Recuperación % |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| UV 280 nm | 50 | 13,1 | 63,1 | 62,3 | 3,86 | 99 |
| FD | 50 | 13,1 | 63,1 | 64,5 | 5,36 | 102 |
| UV 280 nm | 5 | 14,4 | 19,4 | 17,9 | 1,49 | 92,1 |
| FD | 5 | 14,4 | 19,4 | 19,0 | 1,61 | 97,7 |

[C] inicial nominal (mg/l)

Adición (mg/l)

[C] teórica

(mg/l)

[C] obtenida

(mg/l)

Desviación típica

Recuperación %

UV 280 nm

50

13,1

63,1

62,3

3,86

99

FD

50

13,1

63,1

64,5

5,36

102

UV 280 nm

5

14,4

19,4

17,9

1,49

92,1

FD

5

14,4

19,4

19,0

1,61

97,7

Image

21   SULFATOS (OIV-AS-321-05-SULFAT) — MÉTODO DE TIPO II

1.   PRINCIPIO DE LOS MÉTODOS

1.1.   Método de referencia

Precipitación del sulfato de bario y pesada. El fosfato de bario precipitado en las mismas condiciones es eliminado por lavado del precipitado con ácido clorhídrico.

En caso de mostos o vinos ricos en dióxido de azufre, está indicado un desulfitado previo por ebullición al abrigo del aire.

1.2.   Método rápido de ensayo

Clasificación de los vinos en varias categorías por el método llamado de los límites, basado en la precipitación del sulfato de bario mediante una solución valorada de ión bario.

2.   MÉTODO DE REFERENCIA

2.1.   Reactivos

2.1.1.   Ácido clorhídrico, solución 2 M.

2.1.2.   Cloruro bárico en solución de 200 g/l de BaCl2×2 H2O.

2.2.   Procedimiento

2.2.1.   Caso general

En un tubo de centrífuga de 50 ml, introducir 40 ml de la muestra problema; añadir 2 ml de ácido clorhídrico 2 M y 2 ml de solución de cloruro bárico de 200 g/l; agitar con la varilla de vidrio; lavar la varilla con un poco de agua destilada y dejar en reposo durante 5 minutos. Centrifugar durante 5 minutos y decantar con precaución el líquido sobrenadante.

Lavar a continuación el precipitado de sulfato bárico de la forma siguiente: añadir 10 ml de ácido clorhídrico 2 M, poner el precipitado en suspensión y centrifugar durante 5 minutos. Separar con precaución el líquido sobrenadante. Repetir 2 veces el lavado del precipitado en las mismas condiciones con 15 ml de agua destilada cada vez.

Trasvasar cuantitativamente el precipitado, lavando con agua destilada, a una cápsula de platino tarada y colocarla en un baño María a 100 °C hasta evaporación a sequedad. El precipitado desecado se calcina varias veces brevemente sobre una llama hasta la obtención de un residuo blanco. Dejar enfriar en un desecador y pesar.

Sea m la masa en miligramos de sulfato de bario obtenida.

2.2.2.   Caso particular: mostos sulfitados y vino con un contenido elevado de dióxido de azufre.

Proceder previamente a la eliminación del dióxido de azufre.

En un matraz Erlenmeyer de 500 ml, provisto de un embudo de decantación y de un tubo de salida de vapor, introducir 25 ml de agua y 1 ml de ácido clorhídrico puro (ρ20 = 1,15 – 1,18 g/ml). Hervir para expulsar el aire e introducir por el embudo de decantación 100 ml de vino, manteniendo la ebullición. Continuar la ebullición hasta que el volumen del líquido contenido en el matraz se reduzca a unos 75 ml y trasvasarlo cuantitativamente, después de enfriar, a un matraz aforado de 100 ml. Enrasar con agua. Proceder a la valoración de los sulfatos con una porción de 40 ml como se indica en el punto 2.2.1.

2.3.   Expresión de los resultados

2.3.1.   Cálculos

El contenido en sulfatos, expresado en miligramos por litro de sulfato de potasio, K2SO4, es:

18,67 × m

El contenido en sulfatos de mostos o vinos se expresa en miligramos por litro de sulfato de potasio, sin decimales.

2.3.2.   Repetibilidad

Hasta 1 000 mg/l: r = 27 mg/l

Alrededor de 1 500 mg/l: r = 41 mg/l

2.3.3.   Reproducibilidad

Hasta 1 000 mg/l: R = 51 mg/l

Alrededor de 1 500 mg/l: R = 81 mg/l

22   HIERRO (OIV-AS-322-05-FER) — MÉTODO DE TIPO IV

1.   PRINCIPIO DE LOS MÉTODOS

MÉTODO DE REFERENCIA

El hierro se determina directamente por espectrofotometría de absorción atómica, previa dilución del vino y eliminación del alcohol.

MÉTODO USUAL

Después de la mineralización del vino con peróxido de hidrógeno, el hierro que se encuentra en forma de hierro III se reduce al estado de hierro II y se determina por la coloración roja que se produce con la ortofenantrolina.

2.   MÉTODO DE REFERENCIA

2.1.   Reactivos

2.1.1.   Solución patrón concentrada de hierro III, de 1 g/l.

Utilizar una solución patrón comercial de 1 g/l. Esta solución puede prepararse disolviendo 8,6341 g de sulfato de hierro III y de amonio (FeNH4(SO4)2×12 H2O) en agua destilada ligeramente acidificada con ácido clorhídrico M y llevando el volumen a 1 litro.

2.1.2.   Solución patrón diluida de hierro, de 100 miligramos por litro.

2.2.   Material

2.2.1.   Rotavapor con baño María termostático.

2.2.2.   Espectrofotómetro de absorción atómica provisto de mechero alimentado con aire y acetileno.

2.2.3.   Lámpara de cátodo hueco de hierro.

2.3.   Procedimiento

2.3.1.   Preparación de la muestra

Eliminar el alcohol del vino mediante reducción a la mitad del volumen de la muestra en un rotavapor (50-60 °C). Llevarlo de nuevo a su volumen inicial con agua destilada.

Si fuera necesario, efectuar una dilución previa a la determinación.

2.3.2.   Calibrado

En una serie de cinco matraces aforados de 100 ml, echar 1, 2, 3, 4 y 5 ml de la solución de hierro de 100 miligramos por litro (punto 2.1.2) y completar hasta 100 ml con agua destilada. Las soluciones preparadas tendrán un contenido de hierro de 1, 2, 3, 4 y 5 mg por litro.

Estas soluciones se conservarán en frascos de polietileno.

2.3.3.   Determinación

Seleccionar la longitud de onda a 248,3 nm. Regular el cero de la escala de absorbancias con agua destilada. Aspirar directamente la muestra diluida en el quemador del espectrofotómetro, y seguidamente hacer lo mismo con las soluciones patrón preparadas como se indica en el punto 2.3.2. Tomar las absorbancias. Efectuar las determinaciones por duplicado.

2.4.   Expresión de los resultados

2.4.1.   Modo de cálculo

Trazar la curva de variación de la absorbancia en función de la concentración de hierro de las soluciones patrón. Llevar a esta curva el valor medio de la absorbancia obtenida con la muestra de vino diluido y determinar la concentración en hierro C.

La concentración en hierro, expresada en miligramos por litro de vino con 1 decimal, será:

C × F

F = factor de dilución

23   COBRE (OIV-AS-322-06) — MÉTODO DE TIPO IV

1.   PRINCIPIO DEL MÉTODO

Empleo de la espectrofotometría de absorción atómica.

2.   MATERIAL

2.1.   Cápsula de platino.

2.2.   Espectrofotómetro de absorción atómica.

2.3.   Lámpara de cátodo hueco de cobre.

2.4.   Gas de alimentación: aire/acetileno o protóxido de nitrógeno /acetileno.

3.   REACTIVOS

3.1.   Cobre metálico.

3.2.   Ácido nítrico concentrado al 65 % (HNO3, ρ20 = 1,38 g/ml).

3.3.   Ácido nítrico diluido al 1/2 (v/v).

3.4.   Solución de cobre de 1 g/l.

Utilizar una solución patrón de cobre comercial de 1 g/l. Esta solución puede prepararse pesando 1 000 g de cobre metálico y transfiriendo este cuantitativamente a un matraz aforado de 1 000 ml. Añadir ácido nítrico diluido al 1/2 (punto 3.3) en cantidad estrictamente suficiente para disolver el metal, añadir 10 ml de ácido nítrico concentrado (punto 3.2) y enrasar con agua bidestilada.

3.5.   Solución de cobre de 100 mg/l.

Tomar 10 ml de la solución 3.4, introducirlos en un matraz aforado de 100 ml y enrasar con agua bidestilada.

4.   PROCEDIMIENTO

4.1.   Preparación de la muestra y determinación del cobre

Tomar 20 ml de la muestra, introducirlos en un matraz aforado de 100 ml y enrasar con agua bidestilada. Modificar la dilución en caso necesario.

Leer con el espectrofotómetro de absorción atómica la absorbancia de la muestra diluida, a la longitud de onda de 324,8 nm, tras haber regulado el cero de la escala de absorbancias con agua destilada. En caso necesario, preparar una dilución adecuada con agua bidestilada.

4.2.   Determinación de la curva patrón

Tomar 0,5, 1 y 2 ml de la solución del punto 3.5 (100 mg de cobre por litro), introducirlos en sendos matraces aforados de 100 ml y enrasar con agua bidestilada; las soluciones obtenidas contendrán respectivamente 0,5, 1 y 2 mg/l de cobre. Con los valores de absorbancias de estas soluciones, medidas como se especifica en el punto 4.1, trazar la curva patrón.

5.   EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

Trasladar a la curva patrón la absorbancia leída con la muestra de vino diluido y determinar la concentración C en mg/l.

Si F es el factor de dilución, el contenido en cobre del vino será, en miligramos por litro, F x C.

El resultado se dará con 2 decimales.

Comentarios:

| (a) | Las soluciones para determinar la curva patrón y las diluciones de la muestra deben elegirse en cualquier caso en función de la sensibilidad del aparato utilizado y de la concentración del cobre presente en la muestra. |
| --- | --- |

(a)

Las soluciones para determinar la curva patrón y las diluciones de la muestra deben elegirse en cualquier caso en función de la sensibilidad del aparato utilizado y de la concentración del cobre presente en la muestra.

| (b) | Cuando en la muestra hay concentraciones muy bajas de cobre, el procedimiento es el siguiente: poner 100 ml de muestra en una cápsula de platino, concentrar por evaporación en un baño María a 100 °C hasta que adquiera una consistencia de jarabe, añadir, gota a gota, 2,5 ml de ácido nítrico concentrado (punto 3.2) intentando cubrir todo el fondo de la cápsula. Incinerar con precaución el residuo en una placa calentadora eléctrica o sobre una pequeña llama; introducir a continuación la cápsula en un horno de mufla regulado a 500 °C ± 25 °C y mantenerla allí una hora aproximadamente. Cuando se haya enfriado, humedecer las cenizas con 1 ml de ácido nítrico concentrado (punto 3.2), triturándolas con una pequeña varilla de vidrio, evaporar e incinerar de nuevo como en el caso anterior. Poner otra vez la cápsula en el horno durante 15 minutos; repetir tres veces, como mínimo, este tratamiento con ácido nítrico concentrado. Solubilizar las cenizas añadiendo en la cápsula 1 ml de ácido nítrico concentrado (punto 3.2) y 2 ml de agua bidestilada; pasar a un matraz aforado de 10 ml. Lavar la cápsula tres veces con 2 ml de agua bidestilada cada vez y enrasar con agua bidestilada. Proceder a la determinación como se indica en el punto 4.1, utilizando los 10 ml de solución; tener en cuenta el factor de concentración a la hora de expresar los resultados. |
| --- | --- |

(b)

Cuando en la muestra hay concentraciones muy bajas de cobre, el procedimiento es el siguiente: poner 100 ml de muestra en una cápsula de platino, concentrar por evaporación en un baño María a 100 °C hasta que adquiera una consistencia de jarabe, añadir, gota a gota, 2,5 ml de ácido nítrico concentrado (punto 3.2) intentando cubrir todo el fondo de la cápsula. Incinerar con precaución el residuo en una placa calentadora eléctrica o sobre una pequeña llama; introducir a continuación la cápsula en un horno de mufla regulado a 500 °C ± 25 °C y mantenerla allí una hora aproximadamente. Cuando se haya enfriado, humedecer las cenizas con 1 ml de ácido nítrico concentrado (punto 3.2), triturándolas con una pequeña varilla de vidrio, evaporar e incinerar de nuevo como en el caso anterior. Poner otra vez la cápsula en el horno durante 15 minutos; repetir tres veces, como mínimo, este tratamiento con ácido nítrico concentrado. Solubilizar las cenizas añadiendo en la cápsula 1 ml de ácido nítrico concentrado (punto 3.2) y 2 ml de agua bidestilada; pasar a un matraz aforado de 10 ml. Lavar la cápsula tres veces con 2 ml de agua bidestilada cada vez y enrasar con agua bidestilada. Proceder a la determinación como se indica en el punto 4.1, utilizando los 10 ml de solución; tener en cuenta el factor de concentración a la hora de expresar los resultados.

24   DIÓXIDO DE AZUFRE (OIV-AS-323-04-DIOSU) — MÉTODO DE TIPO II

1.   DEFINICIONES

Se denomina dióxido de azufre al dióxido de azufre presente en el mosto o en el vino en las formas siguientes: H2SO3 y HSO3–, cuyo equilibrio es función del pH y de la temperatura:

H2SO3 ←→ H+ + HSO3–

H2SO3 representa el dióxido de azufre molecular.

Se denomina dióxido de azufre total al conjunto de las distintas formas de dióxido de azufre presentes en el vino en estado libre o combinado con sus componentes.

2.   DIÓXIDO DE AZUFRE LIBRE Y TOTAL

2.1.   Principio de los métodos

2.1.1.   Método de referencia

2.1.1.1.   Vinos y mostos

Arrastre del dióxido de azufre con una corriente de aire o de nitrógeno; fijación y oxidación por borboteo en una solución diluida y neutra de peróxido de hidrógeno. Valoración del ácido sulfúrico formado con una solución valorada de hidróxido sódico. El dióxido de azufre libre se extrae del vino por arrastre en frío (a 10 °C).

El dióxido de azufre total se extrae del vino por arrastre en caliente (a 100 °C aproximadamente).

2.1.1.2.   Mostos concentrados rectificados

Se extrae el dióxido de azufre total por arrastre en caliente (aproximadamente 100 °C) del mosto concentrado rectificado previamente diluido.

2.1.2.   Método rápido de ensayo (vinos y mostos)

Determinación del dióxido de azufre libre por valoración yodométrica directa.

Determinación del dióxido de azufre combinado por valoración yodométrica tras hidrólisis alcalina. La suma del dióxido de azufre libre y combinado permite obtener el dióxido de azufre total.

2.2.   Método de referencia

2.2.1.   Material

2.2.1.1.   El material utilizado debe ajustarse al esquema que figura a continuación, principalmente en lo que se refiere al refrigerante.

Image

El tubo de conducción de los gases al borboteador B termina en una pequeña esfera de 1 cm de diámetro que lleva, en su mayor círculo horizontal, 20 agujeros de 0,2 mm de diámetro. También puede terminar en una placa de vidrio fritado que permita la formación de gran número de pequeñas burbujas, realizando así un buen contacto entre las fases gaseosa y líquida.

El flujo de gas que debe recorrer el aparato ha de ser de 40 l/h aproximadamente. El frasco situado a la derecha del aparato se destina a limitar de 20 a 30 cm de agua la depresión producida por la trompa de agua. Para poder regular dicha depresión de forma que el caudal sea el correcto, conviene colocar un medidor de flujo de tubo semicapilar entre el borboteador y el frasco.

2.2.1.2.   Microbureta

2.2.2.   Reactivos

2.2.2.1.   Ácido fosfórico al 85 % (H3PO4) (ρ20 = 1,71 g/ml)

2.2.2.2.   Solución de peróxido de hidrógeno de 9,1 g de H2O2/l (3 volúmenes).

2.2.2.3.   Reactivo indicador:

| Rojo de metilo... | 100 mg |
| --- | --- |
| Azul de metileno... | 50 mg |
| Alcohol de 50 % vol.... | 100 ml |

Rojo de metilo...

100 mg

Azul de metileno...

50 mg

Alcohol de 50 % vol....

100 ml

2.2.2.4.   Solución de hidróxido de sodio (NaOH), 0,01 M

2.2.3.   Determinación del dióxido de azufre libre

2.2.3.1.   Procedimiento

El vino debe mantenerse a 20 °C en un frasco lleno y cerrado durante 2 días antes de la determinación.

| — | En el borboteador B, colocar de 2 a 3 ml de solución de peróxido de hidrógeno (punto 2.2.2.2) y 2 gotas de reactivo indicador; neutralizar a continuación la solución de peróxido de hidrógeno con la solución 0,01 M de hidróxido de sodio (punto 2.2.2.4). Acoplar el borboteador al aparato. |
| --- | --- |

—

En el borboteador B, colocar de 2 a 3 ml de solución de peróxido de hidrógeno (punto 2.2.2.2) y 2 gotas de reactivo indicador; neutralizar a continuación la solución de peróxido de hidrógeno con la solución 0,01 M de hidróxido de sodio (punto 2.2.2.4). Acoplar el borboteador al aparato.

| — | En el matraz A de 250 ml del aparato de arrastre introducir 50 ml de muestra y 15 ml de ácido fosfórico (punto 2.2.2.1). Acoplar el matraz al aparato. |
| --- | --- |

—

En el matraz A de 250 ml del aparato de arrastre introducir 50 ml de muestra y 15 ml de ácido fosfórico (punto 2.2.2.1). Acoplar el matraz al aparato.

| — | A continuación, hacer borbotear el aire (o el nitrógeno) durante 15 minutos. El dióxido de azufre libre arrastrado se oxida a ácido sulfúrico. Retirar el borboteador del aparato y valorar el ácido formado con la solución de hidróxido sódico 0,01 M (punto 2.2.2.4). Sea n el número de mililitros utilizados. |
| --- | --- |

—

A continuación, hacer borbotear el aire (o el nitrógeno) durante 15 minutos. El dióxido de azufre libre arrastrado se oxida a ácido sulfúrico. Retirar el borboteador del aparato y valorar el ácido formado con la solución de hidróxido sódico 0,01 M (punto 2.2.2.4). Sea n el número de mililitros utilizados.

2.2.3.2.   Expresión de los resultados

Dióxido de azufre libre en mg/l sin decimales

2.2.3.2.1.   Cálculo

Dióxido de azufre libre en miligramos por litro: 6,4 n.

2.2.4.   Determinación del dióxido de azufre total

2.2.4.1   Procedimiento

2.2.4.1.1.   En el caso del mosto concentrado rectificado, utilizar la solución obtenida diluyendo la muestra problema al 40 % (m/v), tal y como se indica en el capítulo «Acidez total», en el punto 5.1.2. En el matraz A de 250 ml del aparato de arrastre introducir 50 ml de esta solución y 5 ml de ácido fosfórico (punto 2.2.2.1). Acoplar el matraz al aparato.

2.2.4.1.2.   Vinos y mostos

Muestras en las que se suponga que el contenido en SO2 total sea ≤ 50 mg/l. En el matraz A de 250 ml del aparato de arrastre introducir 50 ml de muestra y 15 ml de ácido fosfórico (punto 2.2.2.1). Acoplar el matraz al aparato.

Muestras en las que se suponga que el contenido en SO2 total sea ≥ 50 mg/l. En el matraz A de 100 ml del aparato de arrastre introducir 20 ml de muestra y 5 ml de ácido fosfórico (punto 2.2.2.1). Acoplar el matraz al aparato.

Introducir en el borboteador B de 2 a 3 ml de solución de peróxido de hidrógeno (punto 2.2.2.2), neutralizarla como se ha hecho anteriormente, llevar a ebullición el vino contenido en el matraz A con una pequeña llama de 4 a 5 cm de altura que debe lamer directamente el fondo del matraz. No colocar bajo el matraz ninguna tela metálica, sino depositarlo sobre un disco perforado con un agujero de 30 mm de diámetro. Se evita así la pirogenación de las materias extractivas del vino sobre las paredes del matraz.

Mantener la ebullición durante el paso de la corriente de aire (o de nitrógeno). En 15 minutos el dióxido de azufre total habrá sido arrastrado y oxidado. Valorar con la solución 0,01 M de hidróxido de sodio (punto 2.2.2.4) el ácido sulfúrico formado.

Sea n el número de mililitros utilizados.

2.2.4.2.   Expresión de los resultados

El dióxido de azufre total se expresa en miligramos por litro (mg/l) o en miligramos por kilogramo (mg/kg) de azúcares totales, sin decimales.

2.2.4.2.1.   Cálculo

| — | Vinos y mostos
  Dióxido de azufre total en miligramos por litro:






  — | Muestras con bajo contenido en dióxido de azufre (muestra de 50 ml):
  6,4 × n |
| --- | --- | --- |

—

Vinos y mostos

Dióxido de azufre total en miligramos por litro:

—

Muestras con bajo contenido en dióxido de azufre (muestra de 50 ml):

6,4 × n

| — | Otras muestras (muestra de 20 ml):
  16 × n |
| --- | --- |

—

Otras muestras (muestra de 20 ml):

16 × n

| — | Mostos concentrados rectificados
  Dióxido de azufre en miligramos por kilo de azúcares totales (con 50 ml de muestra preparada) (punto 2.2.4.1.1):
  (1600 × n)/(P)
  P = contenido en % (m/m) de azúcares totales |
| --- | --- |

—

Mostos concentrados rectificados

Dióxido de azufre en miligramos por kilo de azúcares totales (con 50 ml de muestra preparada) (punto 2.2.4.1.1):

(1600 × n)/(P)

P = contenido en % (m/m) de azúcares totales

2.2.3.4.2.   Repetibilidad (r)

Contenido < 50 mg/l (muestra de 50 ml), r = 1 mg/l

Contenido > 50 mg/l (muestra de 20 ml), r = 6 mg/l

2.2.3.4.3.   Reproducibilidad (R)

Contenido < 50 mg/l (muestra de 50 ml), R = 9 mg/l

Contenido > 50 mg/l (muestra de 20 ml), R = 15 mg/l

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(1)  Puede utilizarse cualquier picnómetro de características equivalentes.

(2)  105 pascal (Pa) = 1 bar.

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