# Publicatieblad C 43/2010

| | ISSN 1725-2474
  doi:10.3000/17252474.C_2010.043.nld |
| --- | --- |
| Publicatieblad
  van de Europese Unie | C 43 |
| | |
| Uitgave in de Nederlandse taal | Mededelingen en bekendmakingen | 53e jaargang19 februari 2010 |

ISSN 1725-2474

doi:10.3000/17252474.C_2010.043.nld

Publicatieblad

van de Europese Unie

C 43

Uitgave in de Nederlandse taal

Mededelingen en bekendmakingen

53e jaargang19 februari 2010

---

| Nummer | Inhoud | Bladzijde |
| --- | --- | --- |
| | II   Mededelingen |
| | MEDEDELINGEN VAN DE INSTELLINGEN, ORGANEN EN INSTANTIES VAN DE EUROPESE UNIE |
| | Europese Commissie |
| 2010/C 043/01 | Lijst en beschrijving van de in artikel 120 octies, eerste alinea, van Verordening (EG) nr. 1234/2007 van de Raad bedoelde analysemethoden (gepubliceerd overeenkomstig artikel 15, lid 2, van Verordening (EG) nr. 606/2009 van de Commissie van 10 juli 2009
  ) | 1 |

Nummer

Inhoud

Bladzijde

II   Mededelingen

MEDEDELINGEN VAN DE INSTELLINGEN, ORGANEN EN INSTANTIES VAN DE EUROPESE UNIE

Europese Commissie

2010/C 043/01

Lijst en beschrijving van de in artikel 120 octies, eerste alinea, van Verordening (EG) nr. 1234/2007 van de Raad bedoelde analysemethoden (gepubliceerd overeenkomstig artikel 15, lid 2, van Verordening (EG) nr. 606/2009 van de Commissie van 10 juli 2009
  )

octies

(gepubliceerd overeenkomstig artikel 15, lid 2, van Verordening (EG) nr. 606/2009 van de Commissie van 10 juli 2009

)

1

| NL | |
| --- | --- |

NL

---

II Mededelingen

MEDEDELINGEN VAN DE INSTELLINGEN, ORGANEN EN INSTANTIES VAN DE EUROPESE UNIE

Europese Commissie

| 19.2.2010 | NL | Publicatieblad van de Europese Unie | C 43/1 |
| --- | --- | --- | --- |

19.2.2010

NL

Publicatieblad van de Europese Unie

C 43/1

---

Lijst en beschrijving van de in artikel 120 octies, eerste alinea, van Verordening (EG) nr. 1234/2007 van de Raad (1) bedoelde analysemethoden

(gepubliceerd overeenkomstig artikel 15, lid 2, van Verordening (EG) nr. 606/2009 van de Commissie van 10 juli 2009
   (2)
  )

2010/C 43/01

Onderstaande tabel bevat de lijst met analysemethoden die van toepassing zijn voor de controle van grenswaarden en voorschriften die in de communautaire regelgeving voor de productie van wijnbouwproducten zijn vastgesteld. In de derde kolom wordt voor elke parameter de referentie vermeld van de desbetreffende analysemethode die is beschreven in de meest recente uitgave (2009) van het „Recueil des méthodes internationales d’analyse des vins et des moûts” (Handboek van internationale analysemethoden voor wijn en most) van de OIV die op de datum van publicatie beschikbaar was. Voor elke parameter worden alleen de referentiemethoden („type I” of „type II” in de OIV-indeling) beschreven, behalve wanneer er voor een parameter momenteel geen gevalideerde methode van type I of II bestaat. De bijlage van deze mededeling bevat de beschrijving van de methoden.

Ter herinnering:

Bijlage A, deel I, van het Handboek van de OIV bevat de definitie van de verschillende types analysemethoden en met name van type I (benchmarkmethode), type II (referentiemethode) en type IV (voorlopige methode).

De analysemethoden voor lood en cadmium worden nu beschreven in Verordening (EG) nr. 333/2007 van de Commissie van 28 maart 2007 (bijlage C-3) (3). Daarnaast worden in bijlage II.4 van Verordening (EG) nr. 401/2006 van 23 februari 2006 (4) algemene criteria vastgesteld voor de analysemethoden voor ochratoxine A en er behoeft voor deze stof derhalve geen specifieke methode voor wijnbouwproducten te worden beschreven.

LIJST VAN ANALYSEMETHODEN

| Nr. | Parameter | Methode van het OIV-handboek | Type |
| --- | --- | --- | --- |
| 1 | (Relatieve) dichtheid | AS-2-01-MASVOL | I |
| 2 | Brekingsindex | AS-2-02-SUCREF | I |
| 3 | Totaal droog extract | AS-2-03-EXTSEC | I |
| 4 | Isotopenverhouding 18O/16O van water in wijn | AS-2-09-MOUO18 | II |
| 5 | Folin-getal | AS-2-10-INDFOL | IV |
| 6 | Suikergehalte (= glucose+fructose) | AS-311-02-GLUFRU | II |
| 7 | Saccharosegehalte (HPLC-meting) | AS-311-03-SUCRES | II |
| 8 | Kernspinresonantie – Deuterium in ethanol in wijn | AS-311-O5-ENRRMN (wordt nu herzien) | I |
| 9 | Alcoholvolumegehalte in % | AS-312-01-TALVOL | I |
| 10 | Isotopenverhouding 13C/12C van ethanol in wijn | AS-312-06-ETHANO | II |
| 11 | Totaal zuurgehalte | AS-313-01-ACITOT | I |
| 12 | Gehalte aan vluchtige zuren | AS-313-02-ACIVOL | I |
| 13 | Citroenzuur | AS-313-09-ACIENZ | II |
| 14 | Sorbinezuur | AS-313-14-ACISOR | IV |
| 15 | pH van most | AS-313-15-PH | I |
| 16 | Ascorbinezuur | AS- 313-22 ACASCO | II |
| 17 | CO2 in g/l | AS-314-01-DIOCAR | II |
| 18 | CO2 in g/l (manometrisch) | AS-314-04-CO2MAN | II |
| 19 | CO2-overdruk | AS-314-02-SURPRES | I |
| 20 | Lysozym | AS-315-14-LYSOZY | IV |
| 21 | Kaliumsulfaat | AS-321-05-SULFAT | II |
| 22 | IJzer | AS-322-05-FER | IV |
| 23 | Koper | AS-322-06-CUIVRE | IV |
| 24 | Sulfiet (SO2) of
  Zwaveldioxide totaal | AS-323-04-DIOSU | II |

Nr.

Parameter

Methode van het OIV-handboek

Type

1

(Relatieve) dichtheid

AS-2-01-MASVOL

I

2

Brekingsindex

AS-2-02-SUCREF

I

3

Totaal droog extract

AS-2-03-EXTSEC

I

4

Isotopenverhouding 18O/16O van water in wijn

AS-2-09-MOUO18

II

5

Folin-getal

AS-2-10-INDFOL

IV

6

Suikergehalte (= glucose+fructose)

AS-311-02-GLUFRU

II

7

Saccharosegehalte (HPLC-meting)

AS-311-03-SUCRES

II

8

Kernspinresonantie – Deuterium in ethanol in wijn

AS-311-O5-ENRRMN (wordt nu herzien)

I

9

Alcoholvolumegehalte in %

AS-312-01-TALVOL

I

10

Isotopenverhouding 13C/12C van ethanol in wijn

AS-312-06-ETHANO

II

11

Totaal zuurgehalte

AS-313-01-ACITOT

I

12

Gehalte aan vluchtige zuren

AS-313-02-ACIVOL

I

13

Citroenzuur

AS-313-09-ACIENZ

II

14

Sorbinezuur

AS-313-14-ACISOR

IV

15

pH van most

AS-313-15-PH

I

16

Ascorbinezuur

AS- 313-22 ACASCO

II

17

CO2 in g/l

AS-314-01-DIOCAR

II

18

CO2 in g/l (manometrisch)

AS-314-04-CO2MAN

II

19

CO2-overdruk

AS-314-02-SURPRES

I

20

Lysozym

AS-315-14-LYSOZY

IV

21

Kaliumsulfaat

AS-321-05-SULFAT

II

22

IJzer

AS-322-05-FER

IV

23

Koper

AS-322-06-CUIVRE

IV

24

Sulfiet (SO2) of

Zwaveldioxide totaal

AS-323-04-DIOSU

II

De beschrijving van enkele analysemethoden wordt door de instanties van de OIV geactualiseerd. Deze beschrijvingen zullen worden gepubliceerd in een volgende mededeling van de Commissie, zodra door de OIV een geactualiseerde tekst wordt gepubliceerd in de uitgave van 2010 van het Handboek van internationale analysemethoden van de OIV.

---

(1)  PB L 299 van 16.11.2007.

(2)  PB L 193 van 24.7.2009, blz. 1.

(3)  PB L 88 van 29.3.2007, blz. 29.

(4)  PB L 70 van 9.3.2006, blz. 12.

---

BIJLAGE

INHOUD

| 1 | DICHTHEID BIJ 20 °C EN RELATIEVE DICHTHEID BIJ 20 °C (OIV-AS2-01-MASVOL) — Methode Type I |
| --- | --- |

1

| 2 | REFRACTOMETRISCHE BEPALING VAN HET SUIKERGEHALTE VAN MOST, GECONCENTREERDE MOST EN GERECTIFICEERDE GECONCENTREERDE MOST (OIV-AS2-02-SUCREF) — Methode Type I |
| --- | --- |

2

| 3 | TOTAAL DROOG EXTRACT (OIV-AS-2-03-EXTSEC) Totaal droge stof — Methode Type I |
| --- | --- |

3

| 4 | BEPALING VAN DE ISOTOPENVERHOUDING 18O/16O VAN WATER IN WIJN (OIV-AS-2-09-MOUO18) — Methode Type II |
| --- | --- |

4

| 5 | FOLIN-CIOCALTEU-GETAL (OIV-AS-2-10-INDFOL) — Methode Type IV |
| --- | --- |

5

| 6 | GLUCOSE EN FRUCTOSE (OIV-AS-311-02-GLUFRU) — Methode Type II |
| --- | --- |

6

| 7 | KWANTITATIEVE BEPALING VAN SUIKERS MET BEHULP VAN HPLC (SACCHAROSE) (OIV-AS-311-03-SUCRES) — Methode Type II |
| --- | --- |

7

| 8 | AANTONEN VAN VERRIJKING VAN MOST, GECONCENTREERDE MOST, GERECTIFICEERDE GECONCENTREERDE MOST EN WIJN MET BEHULP VAN DEUTERIUMKERNSPINRESONANTIE (OIV-AS-311-05-ENRRMN) — Methode Type I |
| --- | --- |

8

| 9 | ALCOHOLVOLUMEGEHALTE (OIV-AS-312-01-TALVOL) — Methoden Type I |
| --- | --- |

9

| 10 | BEPALING VAN DE ISOTOPENVERHOUDING 13C/12C VAN ETHANOL IN WIJN OF VAN ETHANOL DAT WORDT VERKREGEN DOOR VERGISTING VAN MOST, GECONCENTREERDE MOST OF GERECTIFICEERDE GECONCENTREERDE MOST, MET BEHULP VAN ISOTOPENMASSASPECTROMETRIE (OIV-AS-312-06-ETHANO) — Methode Type II |
| --- | --- |

10

| 11 | TOTAAL ZUURGEHALTE (OIV-AS-313-01-ACITOT) — Methode Type I |
| --- | --- |

11

| 12 | GEHALTE AAN VLUCHTIGE ZUREN (OIV-AS-313-02-ACIVOL) — Methode Type I |
| --- | --- |

12

| 13 | CITROENZUUR (OIV-AS-313-09-ACIENZ) — Methode Type II |
| --- | --- |

13

| 14 | SORBINEZUUR (OIV-AS-313-14-ACISOR) — Methode Type IV |
| --- | --- |

14

| 15 | pH (OIV-AS-313-15-PH) — Methode Type I |
| --- | --- |

15

| 16 | GELIJKTIJDIGE BEPALING VAN L-ASCORBINEZUUR EN D-ISOASCORBINEZUUR MET BEHULP VAN HPLC EN UV-DETECTIE (OIV-AS-313-22-ACASCO) — Methode Type II |
| --- | --- |

16

| 17 | KOOLSTOFDIOXIDE (OIV-AS-314-01-DIOCAR) — Methode Type II |
| --- | --- |

17

| 18 | BEPALING VAN KOOLSTOFDIOXIDE IN WIJN MET EEN MANOMETRISCHE METHODE (OIV-AS-314-04-CO2MAN) — Methode Type II |
| --- | --- |

18

| 19 | METING VAN DE OVERDRUK BIJ MOUSSERENDE WIJN EN PARELWIJN (OIV-AS-314-02-SURPRES) — Methode Type I |
| --- | --- |

19

| 20 | BEPALING VAN LYSOZYM IN WIJN MET BEHULP VAN HPLC (OIV-AS-315-14) — Methode Type IV |
| --- | --- |

20

| 21 | SULFAAT (OIV-AS-321-05-SULFAT) — Methode Type II |
| --- | --- |

21

| 22 | IJZER (OIV-AS-322-05-FER) — Methode Type IV |
| --- | --- |

22

| 23 | KOPER (OIV-AS-322-06) — Methode Type IV |
| --- | --- |

23

| 24 | ZWAVELDIOXIDE (OIV-AS-323-04-DIOSU) — Methode Type II |
| --- | --- |

24

1   DICHTHEID BIJ 20 °C EN RELATIEVE DICHTHEID BIJ 20 °C (OIV-AS2-01-MASVOL) — METHODE TYPE I

1.   DEFINITIES

De dichtheid is het quotiënt van de massa van een bepaald volume wijn of most bij 20 °C en dit volume. De dichtheid wordt uitgedrukt in gram per milliliter. Het symbool is ρ20 °C.

De relatieve dichtheid bij 20 °C of de dichtheid 20 °C/20 °C is de in decimale getallen uitgedrukte verhouding van de massa van een bepaald volume wijn of most bij 20 °C tot de massa van hetzelfde volume water bij dezelfde temperatuur. Het symbool is Formula

2.   PRINCIPE VAN DE METHODE

De dichtheid en de relatieve dichtheid bij 20 °C worden bepaald door middel van:

| | pyknometrie: de referentiemethode; of |
| --- | --- |

pyknometrie: de referentiemethode; of

| | densimetrie met de hydrostatische balans of elektronische densimetrie. |
| --- | --- |

densimetrie met de hydrostatische balans of elektronische densimetrie.

Opmerking:

Voor zeer nauwkeurige bepalingen moet de dichtheid worden gecorrigeerd voor de invloed van zwaveldioxide:

| ρ20 °C | = | ρ′20 °C – 0,0006 × S |
| --- | --- | --- |
| ρ20 °C | = | gecorrigeerde dichtheid |
| ρ′20 °C | = | waargenomen dichtheid |
| S | = | totaal zwaveldioxide in g/l |

ρ20 °C

=

ρ′20 °C – 0,0006 × S

ρ20 °C

=

gecorrigeerde dichtheid

ρ′20 °C

=

waargenomen dichtheid

S

=

totaal zwaveldioxide in g/l

3.   VOORBEHANDELING VAN HET MONSTER

Als de wijn of most aanzienlijke hoeveelheden koolstofdioxide bevat, dient het grootste deel hiervan te worden verwijderd door 250 ml wijn in een erlenmeyer van 1 000 ml te schudden of onder afzuigen te filtreren over 2 g katoenwatten in een trechter.

4.   REFERENTIEMETHODE

4.1.   Apparatuur

Gebruikelijke laboratoriumuitrusting en met name:

4.1.1.   Pyknometer (1) van pyrex met een inhoud van ongeveer 100 ml, voorzien van een ingeslepen thermometer die van 10 °C tot 30 °C is onderverdeeld in 0,1 graad. Deze thermometer moet worden geijkt (figuur 1).

Image

Deze pyknometer is voorzien van een zijbuis van 25 mm lengte met een inwendige diameter van maximaal 1 mm, waarvan het uiteinde konisch is geslepen. Deze zijbuis kan worden afgesloten met een daarop passend slijpstuk waarvan het uiteinde is uitgetrokken en dichtgesmolten. Dit slijpstuk doet dienst als dilatatieruimte.

De slijpstukken moeten uiterst nauwkeurig zijn uitgevoerd.

4.1.2.   Tarrafles, met hetzelfde uitwendige volume (tot op 1 ml nauwkeurig) als de pyknometer, waarvan de massa overeenkomt met de massa van de pyknometer wanneer deze is gevuld met een vloeistof met een dichtheid van 1,01 (2 %-natriumchlorideoplossing (m/v)).

Thermisch geïsoleerde mantel die precies om de pyknometer past.

4.1.3.   Tweearmige balans, met een capaciteit van ten minste 300 g, gevoelig tot op 0,1 mg,

of,

eenarmige balans, met een capaciteit van ten minste 200 g, gevoelig tot op 0,1 mg.

4.2.   IJking van de pyknometer

Voor de ijking van de pyknometer dienen de volgende constanten te worden bepaald:

| — | de lege massa, |
| --- | --- |

—

de lege massa,

| — | het volume bij 20 °C, |
| --- | --- |

—

het volume bij 20 °C,

| — | de waterwaarde bij 20 °C. |
| --- | --- |

—

de waterwaarde bij 20 °C.

4.2.1.   Gebruik van een tweearmige balans

Plaats de tarrafles op de linkerschaal van de balans en de schone en droge pyknometer, voorzien van het afsluitslijpstuk, op de rechterschaal. Breng evenwicht tot stand door bij de pyknometer gewichten te plaatsen. Zij dit p gram.

Vul de pyknometer zorgvuldig met gedestilleerd water van kamertemperatuur en plaats de thermometer; maak de pyknometer zorgvuldig droog en plaats deze in de geïsoleerde mantel; wacht, onder af en toe omzwenken, tot de op de thermometer afgelezen temperatuur constant is. Vul precies tot de bovenrand van de zijbuis. Droog de zijbuis en breng het afsluitslijpstuk aan; lees zorgvuldig de temperatuur t °C af en corrigeer deze eventueel voor de afwijking in de schaal van de thermometer. Weeg de pyknometer gevuld met water. Zij p' gram nodig om evenwicht te bereiken.

Berekening

| | Lege massa van de pyknometer:
  Lege massa= p + m
  m= de massa van de in de pyknometer aanwezige lucht
  m= 0,0012 (p – p′). |
| --- | --- |

Lege massa van de pyknometer:

Lege massa= p + m

m= de massa van de in de pyknometer aanwezige lucht

m= 0,0012 (p – p′).

| | Volume bij 20 °C:
  V20 °C= (p + m – p′) × Ft

  Ft= factor afhankelijk van de temperatuur t °C, zie tabel I
  V20 °C moet tot op 0,001 ml nauwkeurig worden berekend. |
| --- | --- |

Volume bij 20 °C:

V20 °C= (p + m – p′) × Ft

Ft= factor afhankelijk van de temperatuur t °C, zie tabel I

V20 °C moet tot op 0,001 ml nauwkeurig worden berekend.

| | Waterwaarde bij 20 °C:
  M20 °C= V20 °C × 0,998203
  0,998203= dichtheid van water bij 20 °C. |
| --- | --- |

Waterwaarde bij 20 °C:

M20 °C= V20 °C × 0,998203

0,998203= dichtheid van water bij 20 °C.

4.2.2.   Gebruik van een eenarmige balans

Bepaal:

| — | de massa van de droge en schone pyknometer: P |
| --- | --- |

—

de massa van de droge en schone pyknometer: P

| — | de massa van de pyknometer gevuld met water van t °C; deze zij P1; volg hierbij de aanwijzingen in punt 4.2.1 |
| --- | --- |

—

de massa van de pyknometer gevuld met water van t °C; deze zij P1; volg hierbij de aanwijzingen in punt 4.2.1

| — | de massa van de tarrafles: T0. |
| --- | --- |

—

de massa van de tarrafles: T0.

Berekening

Lege massa van de pyknometer:

| | Lege massa= P – m
  m= de massa van de in de pyknometer aanwezige lucht
  m= 0,0012 (P1 – P) |
| --- | --- |

Lege massa= P – m

m= de massa van de in de pyknometer aanwezige lucht

m= 0,0012 (P1 – P)

| | Volume bij 20 °C:
  V20 °C= [P1 – (P – m)] · Ft

  Ft= factor afhankelijk van de temperatuur t °C, zie tabel I. |
| --- | --- |

Volume bij 20 °C:

V20 °C= [P1 – (P – m)] · Ft

Ft= factor afhankelijk van de temperatuur t °C, zie tabel I.

| | Het volume bij 20 °C moet tot op 0,001 ml nauwkeurig worden berekend. |
| --- | --- |

Het volume bij 20 °C moet tot op 0,001 ml nauwkeurig worden berekend.

| | Waterwaarde bij 20 °C:
  M20 °C= V20 °C ·0,998203
  0,998203= dichtheid van water bij 20 °C. |
| --- | --- |

Waterwaarde bij 20 °C:

M20 °C= V20 °C ·0,998203

0,998203= dichtheid van water bij 20 °C.

4.3.   Meting

4.3.1.   Gebruik van een tweearmige balans

Weeg de pyknometer gevuld met het monster (3); volg hierbij de aanwijzingen in punt 4.2.1.

Zij p'' gram nodig om evenwicht te bereiken bij t °C.

Massa van de vloeistof in de pyknometer = p + m – p''.

Schijnbare dichtheid bij t °C:

ρt °C = (p + m – p′′)/(V20 °C)

Bereken de dichtheid bij 20 °C met behulp van een van de hierna volgende correctietabellen, afhankelijk van de aard van de onderzochte vloeistof: droge wijn (tabel II), natuurlijke of geconcentreerde most (tabel III) en zoete wijn (tabel IV).

De relatieve dichtheid 20 °C/20 °C van wijn wordt berekend door de dichtheid bij 20 °C te delen door 0,998203.

4.3.2.   Gebruik van een eenarmige balans

Weeg de tarrafles, zij T1 de massa.

Bereken dT = T1 – T0.

Massa van de lege pyknometer op het moment van de bepaling = P – m + dT.

Weeg de pyknometer gevuld met het monster (3); volg hierbij de aanwijzingen in punt 4.2.1; zij P2 de massa bij t °C.

Massa van de vloeistof in de pyknometer bij t °C = P2 – (P – m + dT).

Schijnbare dichtheid bij t °C:

ρt °C = (P2 – (P – m + dT)/(V20 °C)

Bereken de dichtheid bij 20 °C van de onderzochte vloeistof: droge wijn, natuurlijke of geconcentreerde most of zoete wijn, zoals aangegeven in punt 4.3.1.

De relatieve dichtheid 20 °C/20 °C wordt berekend door de dichtheid bij 20 °C te delen door 0,998203.

4.3.3.   Herhaalbaarheid

Voor de dichtheid van droge en zachte wijn: r = 0,00010

Voor de dichtheid van zoete wijn: r = 0,00018

4.3.4.   Reproduceerbaarheid

Voor de dichtheid van droge en zachte wijn: R = 0,00037

Voor de dichtheid van zoete wijn: R = 0,00045

TABEL I

Tabel van de factor F

waarmee de massa van het water in de pyknometer van pyrex bij t °C moet worden vermenigvuldigd om het volume van de pyknometer bij 20 °C te berekenen

[Zie tabel I van bijlage II van methode AS2 – 01, beschreven in het Handboek van internationale analysemethoden van de OIV]

TABEL II

Tabel van de temperatuurcorrectie c die moet worden toegepast om de dichtheid van droge wijn en van alcoholvrij gemaakte droge wijn, bepaald in een pyknometer van pyrex bij t °C, te herleiden naar 20 °C

[Zie tabel II van bijlage II van methode AS2 – 01, beschreven in het Handboek van internationale analysemethoden van de OIV]

| ρ20 = ρ
  t
  ± (c/1 000) | – als t °C < 20 °C
  - als t °C > 20 °C |
| --- | --- |

ρ20 = ρ
  t
  ± (c/1 000)

– als t °C < 20 °C

- als t °C > 20 °C

TABEL III

Tabel van de temperatuurcorrectie c die moet worden toegepast om de dichtheid van natuurlijke most en geconcentreerde most, bepaald in een pyknometer van pyrex bij t °C, te herleiden naar 20 °C

[Zie tabel III van bijlage II van methode AS2 – 01, beschreven in het Handboek van internationale analysemethoden van de OIV]

| ρ20 = ρ
  t
  ± (c/1 000) | – als t °C < 20 °C
  - als t °C > 20 °C |
| --- | --- |

ρ20 = ρ
  t
  ± (c/1 000)

– als t °C < 20 °C

- als t °C > 20 °C

TABEL IV

Tabel van de temperatuurcorrectie c die moet worden toegepast om de dichtheid van wijn met een alcoholgehalte van 13 % vol en meer, met restsuikers, bepaald in een pyknometer van pyrex bij t °C, te herleiden naar 20 °C

[Zie tabel IV van bijlage II van methode AS2 – 01, beschreven in het Handboek van internationale analysemethoden van de OIV]

| ρ20 = ρ
  t
  ± (c/1 000) | – als t °C < 20 °C
  - als t °C > 20 °C |
| --- | --- |

ρ20 = ρ
  t
  ± (c/1 000)

– als t °C < 20 °C

- als t °C > 20 °C

2   REFRACTOMETRISCHE BEPALING VAN HET SUIKERGEHALTE VAN MOST, GECONCENTREERDE MOST EN GERECTIFICEERDE GECONCENTREERDE MOST (OIV-AS2-02-SUCREF) — METHODE TYPE I

1.   PRINCIPE VAN DE METHODE

De brekingsindex bij 20 °C wordt gemeten met behulp van een refractometer, uitgedrukt in absolute eenheden of in massaprocent saccharose. Uit een tabel wordt het met de brekingsindex overeenkomende suikergehalte afgelezen, uitgedrukt in g/l of in g/kg most, geconcentreerde most en gerectificeerde geconcentreerde most.

2.   APPARATUUR

2.1.   Refractometer van het Abbé-type

De te gebruiken refractometer moet een schaalverdeling hebben met:

| — | het massapercentage saccharose tot op 0,1 %; |
| --- | --- |

—

het massapercentage saccharose tot op 0,1 %;

| — | of de brekingsindex tot op vier decimalen. |
| --- | --- |

—

of de brekingsindex tot op vier decimalen.

De refractometer moet zijn voorzien van een thermometer met ten minste een afleesbereik gaande van + 15 °C tot + 25 °C en van een thermostaatbad waardoor metingen kunnen worden uitgevoerd bij een temperatuur van 20 °C ± 5 °C.

De bedieningsvoorschriften van de refractometer dienen strikt te worden nageleefd, met name die betreffende de ijking en de lichtbron.

3.   VOORBEHANDELING VAN HET MONSTER

3.1.   Most en geconcentreerde most

Filtreer indien nodig de most eerst over een in vieren gevouwen droge rondfilter. Laat de eerste druppels van het filtraat weglopen en neem de rest voor de bepaling.

3.2.   Gerectificeerde geconcentreerde most

Gebruik, afhankelijk van de concentratie, de gerectificeerde geconcentreerde most als dusdanig of de verdunning, verkregen door nauwkeurig 200 g gerectificeerde geconcentreerde most met water aan te lengen tot 500 g.

4.   WERKWIJZE

Breng het monster op een temperatuur van ongeveer 20 °C. Breng een klein deel van het monster op de onderste prisma van de refractometer. Zorg ervoor dat het monster, bij het tegen elkaar aanklemmen van de prisma's, het glasoppervlak uniform bedekt en voer de meting uit conform de bedieningsvoorschriften van het gebruikte apparaat.

Lees het massapercentage saccharose tot op 0,1 % nauwkeurig of de brekingsindex tot op vier decimalen af.

Voer ten minste twee bepalingen uit op hetzelfde voorbehandelde monster. Noteer de temperatuur t °C.

5.   BEREKENINGEN

5.1.   Temperatuurcorrectie

5.1.1.   Toestellen met een afleesschaal in massaprocent saccharose: gebruik tabel I om te corrigeren voor de temperatuur.

5.1.2.   Toestellen met een afleesschaal in brekingsindexeenheden: zoek in tabel II, kolom 1, bij de bij t °C gemeten brekingsindex het hiermee overeenkomende massapercentage saccharose bij t °C. Deze waarde wordt met behulp van tabel I gecorrigeerd voor de temperatuur en uitgedrukt in 20 °C.

5.2.   Suikergehalte van most en geconcentreerde most

Zoek in tabel II bij het massapercentage saccharose bij 20 °C het hiermee overeenkomende suikergehalte in g/l en in g/kg. Het suikergehalte wordt uitgedrukt als invertsuiker opgegeven met één decimaal.

5.3.   Suikergehalte van gerectificeerde geconcentreerde most

Zoek in tabel III bij het massapercentage saccharose bij 20 °C het hiermee overeenkomende suikergehalte in g/l en in g/kg. Het suikergehalte wordt uitgedrukt als invertsuiker opgegeven met één decimaal.

Als de bepaling is uitgevoerd met een verdunning van de gerectificeerde geconcentreerde most, moet het resultaat vermenigvuldigd worden met de verdunningsfactor.

5.4.   Brekingsindex van most, geconcentreerde most en gerectificeerde geconcentreerde most

Zoek in tabel II bij het massapercentage saccharose bij 20 °C de hiermee overeenkomende brekingsindex bij 20 °C. De brekingsindex wordt opgegeven met vier decimalen.

NB: Het pötentiële alcoholgehalte van most, geconcentreerde most en gerectificeerde geconcentreerde most kan worden bepaald met behulp van de tabel in bijlage I van Verordening (EG) nr. 1623/2000 van de Commissie van 25 juli 2000 (PB L 194 van 31 juli 2000).

TABEL I

Temperatuurcorrectie voor het geval het massapercentage saccharose is bepaald bij een temperatuur die afwijkt van 20 °C

[Zie tabel I van de bijlage van methode AS2 – 02, beschreven in het Handboek van internationale analysemethoden van de OIV]

TABEL II

Overzicht van het suikergehalte van most en geconcentreerde most in g/l en in g/kg, bepaald met behulp van een refractometer met een schaalverdeling in massaprocent saccharose bij 20 °C of in brekingsindexeenheden bij 20 °C. De dichtheid bij 20 °C is eveneens vermeld.

[Zie tabel II van de bijlage van methode AS2 – 02, beschreven in het Handboek van internationale analysemethoden van de OIV]

TABEL III

Overzicht van het suikergehalte van gerectificeerde geconcentreerde most in g/l en in g/kg, bepaald met behulp van een refractometer met een schaalverdeling in massaprocent saccharose bij 20 °C of in brekingsindexeenheden bij 20 °C. De dichtheid bij 20 °C is eveneens vermeld.

[Zie tabel III van de bijlage van methode AS2 – 02, beschreven in het Handboek van internationale analysemethoden van de OIV]

3   TOTAAL DROOG EXTRACT (OIV-AS-2-03-EXTSEC) TOTAAL DROGE STOF — METHODE TYPE I

1.   DEFINITIE

Het „totaal droog extract” of „totaal droge stof” is de totale massa aan stoffen die onder bepaalde fysische omstandigheden niet vervluchtigen. Deze fysische omstandigheden moeten van dien aard zijn dat de stoffen waaruit het extract bestaat zo min mogelijk verandering ondergaan.

Het „niet reducerend extract” is het droog extract verminderd met het totaal aan suikers.

Het „gereduceerd extract” is het totaal droog extract verminderd met het suikergehalte, voor zover dat hoger is dan 1 g/l, met het kaliumsulfaatgehalte, voor zover dit hoger is dan 1 g/l, met het gehalte aan mannitol, voor zover aanwezig, en met alle eventueel aan de wijn toegevoegde chemische stoffen.

De „extractrest” is het niet reducerend extract verminderd met het in wijnsteenzuur uitgedrukte gehalte aan gebonden zuur.

Het extract wordt uitgedrukt in gram per liter en moet tot op 0,5 g nauwkeurig worden bepaald.

2.   PRINCIPE VAN DE METHODE

[De beschrijving van deze analysemethode wordt door de instanties van de OIV geactualiseerd. Deze zal worden gepubliceerd in een volgende mededeling van de Commissie zodra een geactualiseerde tekst door de OIV wordt gepubliceerd in de uitgave van 2010 van het Handboek van internationale analysemethoden van de OIV. Ter indicatie wordt in afwachting van deze publicatie verwezen naar hoofdstuk 4 van de bijlage van Verordening (EEG) nr. 2676/90 van de Commissie.]

4   BEPALING VAN DE ISOTOPENVERHOUDING 18O/16O VAN WATER IN WIJN (OIV-AS-2-09-MOUO18) — METHODE TYPE II

(p.m.)

[De beschrijving van deze analysemethode wordt door de instanties van de OIV geactualiseerd. Deze zal worden gepubliceerd in een volgende mededeling van de Commissie zodra een geactualiseerde tekst door de OIV wordt gepubliceerd in de uitgave van 2010 van het Handboek van internationale analysemethoden van de OIV. Ter indicatie wordt in afwachting van deze publicatie verwezen naar hoofdstuk 43 van de bijlage van Verordening (EEG) nr. 2676/90 van de Commissie.]

5   FOLIN-CIOCALTEU-GETAL (OIV-AS-2-10-INDFOL) — METHODE TYPE IV

1.   DEFINITIE

Het Folin-Ciocalteu-getal is het resultaat verkregen door toepassing van onderstaande methode.

2.   PRINCIPE VAN DE METHODE

Het totaal aan fenolische stoffen van de wijn wordt met Folin-Ciocalteu-reagens geoxideerd. Het Folin-Ciocalteu-reagens bestaat uit een mengsel van fosfowolfraamzuur (H3PW12O40) en fosfomolybdeenzuur (H3PMo12O40), dat bij de oxidatie van fenolen wordt gereduceerd tot een blauw mengsel van wolfraamoxide (W8O23) en molybdeenoxide (Mo8O23).

De gevormde blauwe verbinding heeft een extinctiemaximum bij ongeveer 750 nm en is evenredig aan het gehalte aan fenolische stoffen.

3.   REAGENTIA

De te gebruiken reagentia moeten van analysekwaliteit zijn. Water dient te zijn gedistilleerd of van een gelijkwaardige zuiverheid te zijn.

3.1.   Folin-Ciocalteu-reagens

Dit reagens is kant en klaar in de handel verkrijgbaar. Het kan ook als volgt worden bereid: los 100 g natriumwolframaat (Na2WO4·2H2O) en 25 g natriummolybdaat (Na2MoO4·2H2O) op in 700 ml gedestilleerd water; voeg 50 ml 85 % fosforzuur (ρ20 = 1,71 g/ml) en 100 ml geconcentreerd zoutzuur (ρ20 = 1,19 g/ml) toe. Laat gedurende 10 uur onder reflux koken, voeg vervolgens 150 g lithiumsulfaat (Li2SO4·H2O) en enkele druppels broom toe en laat opnieuw gedurende 15 minuten koken. Koel af en vul met gedistilleerd water aan tot 1 liter.

3.2.   Oplossing van watervrij natriumcarbonaat (Na2CO3), 20 % (m/v).

4.   APPARATUUR

Gebruikelijke laboratoriumuitrusting en met name:

4.1.   Maatkolven, 100 ml;

4.2.   Spectrofotometer waarmee bij 750 nm kan worden gemeten.

5.   WERKWIJZE

5.1.   Rode wijn

Breng in een maatkolf van 100 ml (4.1) achtereenvolgens:

| | 1 ml wijn, 1 op 5 verdund, |
| --- | --- |

1 ml wijn, 1 op 5 verdund,

| | 50 ml gedestilleerd water, |
| --- | --- |

50 ml gedestilleerd water,

| | 5 ml Folin-Ciocalteu-reagens (3.1), |
| --- | --- |

5 ml Folin-Ciocalteu-reagens (3.1),

| | 20 ml natriumcarbonaatoplossing (3.2). |
| --- | --- |

20 ml natriumcarbonaatoplossing (3.2).

Vul aan tot 100 ml met gedistilleerd water.

Schud om te homogeniseren. Wacht 30 minuten om de reactie tot een evenwichtstoestand te laten komen. Bepaal de extinctie bij 750 nm in een kuvet van 1 cm tegen een blanco waarin de wijn is vervangen door gedistilleerd water.

Indien de afgelezen extinctie niet in de buurt van 0,3 ligt, dient de verdunning van de wijn te worden gewijzigd.

5.2.   Witte wijn

Voer dezelfde procedure uit met 1 ml onverdunde wijn.

5.3.   Gerectificeerde geconcentreerde most

5.3.1.   Voorbehandeling van het monster

Gebruik de oplossing met een suikergehalte van 25 % (m/m) (25o Brix), bereid zoals aangegeven in punt 4.1.2 van het hoofdstuk „pH”.

5.3.2.   Bepaling

Voer de voor rode wijn (5.1) beschreven procedure uit met 5 ml volgens punt 5.3.1 voorbehandeld monster en meet de extinctie tegen een blanco die bereid is met 5 ml invertsuikeroplossing van 25 % (m/m).

6.   WEERGAVE VAN DE RESULTATEN

6.1.   Berekening

Het resultaat wordt uitgedrukt in de vorm van een getal dat wordt verkregen door de extinctie voor rode wijn die 1 op 5 verdund is met 100 te vermenigvuldigen (of met een factor die overeenkomt met de gebruikte verdunning) en voor witte wijn met 20. Bij gerectificeerde geconcentreerde most moet de extinctie met 16 worden vermenigvuldigd.

6.2.   Herhaalbaarheid

Het verschil tussen de resultaten van twee gelijktijdig of kort na elkaar door dezelfde analist uitgevoerde bepalingen mag niet groter zijn dan 1.

Een goede herhaalbaarheid van de resultaten is sterk afhankelijk van het gebruik van zorgvuldig gereinigde apparatuur (maatkolven en kuvetten).

6   GLUCOSE EN FRUCTOSE (OIV-AS-311-02-GLUFRU) — METHODE TYPE II

1.   DEFINITIE

Glucose en fructose kunnen langs enzymatische weg afzonderlijk worden bepaald waardoor de verhouding glucose/fructose kan worden berekend.

2.   PRINCIPE VAN DE METHODE

Glucose en fructose worden tijdens een enzymatische reactie die wordt gekatalyseerd door hexokinase (HK), met adenosinetrifosfaat (ATP) gefosforyleerd tot glucose-6-fosfaat (G6P) en fructose-6-fosfaat (F6P):

| | glucose + ATP←→G6P + ADP |
| --- | --- |

glucose + ATP←→G6P + ADP

| | fructose + ATP←→F6P + ADP |
| --- | --- |

fructose + ATP←→F6P + ADP

Het glucose-6-fosfaat wordt in eerste instantie met nicotinezuuramide-adenine-dinucleotidefosfaat (NADP) in aanwezigheid van het enzym glucose-6-fosfaatdehydrogenase (G6PDH) geoxideerd tot gluconaat-6-fosfaat. De hoeveelheid gereduceerd nicotinezuuramide-adenine-dinucleotidefosfaat (NADPH) die hierbij ontstaat is een maat voor de hoeveelheid glucose-6-fosfaat en dus voor glucose:

G6P + NADP+←→gluconaat-6-fosfaat + NADPH + H +

De bepaling van het gereduceerde nicotinezuuramide-adenine-dinucleotidefosfaat vindt plaats door meting van de extinctie bij 340 nm.

Wanneer deze reactie is beëindigd wordt fructose-6-fosfaat onder invloed van fosfoglucose-isomerase (PGI) omgezet in glucose-6-fosfaat:

F6P←→G6P

Dit glucose-6-fosfaat reageert opnieuw met nicotinezuuramide-adenine-dinucleotidefosfaat waardoor weer gluconaat-6-fosfaat en gereduceerd nicotinezuuramide-adenine-dinucleotidefosfaat wordt gevormd; dit wordt weer bepaald.

3.   APPARATUUR

| — | Spectrofotometer waarmee bij 340 nm, het extinctiemaximum van NADPH, kan worden gemeten Als het om absolute metingen gaat (zonder ijklijn maar met behulp van de extinctiecoëfficiënt van NADPH), moeten de golflengte- en extinctieschaal van het apparaat worden geijkt.
  Indien een dergelijke spectrofotometer niet beschikbaar is, kan een spectrofotometer met een discontinu spectrum worden gebruikt, waarmee metingen kunnen worden verricht bij 334 nm of 365 nm. |
| --- | --- |

—

Spectrofotometer waarmee bij 340 nm, het extinctiemaximum van NADPH, kan worden gemeten Als het om absolute metingen gaat (zonder ijklijn maar met behulp van de extinctiecoëfficiënt van NADPH), moeten de golflengte- en extinctieschaal van het apparaat worden geijkt.

Indien een dergelijke spectrofotometer niet beschikbaar is, kan een spectrofotometer met een discontinu spectrum worden gebruikt, waarmee metingen kunnen worden verricht bij 334 nm of 365 nm.

| — | Glazen kuvetten met een optische weglengte van 1 cm of wegwerpkuvetten. |
| --- | --- |

—

Glazen kuvetten met een optische weglengte van 1 cm of wegwerpkuvetten.

| — | Pipetten voor enzymtest: 0,02, 0,05, 0,1 en 0,2 ml. |
| --- | --- |

—

Pipetten voor enzymtest: 0,02, 0,05, 0,1 en 0,2 ml.

4.   REAGENTIA

4.1.   Oplossing 1: buffer (0,3 M triethanolamine; pH = 7,6; 4 × 10-3 M Mg2+): los 11,2 g triethanolaminechloorhydraat, (C2H5)3N·HCl, en 0,2 g MgSO4·7H2O op in 150 ml dubbel gedestilleerd water; voeg ongeveer 4 ml 5 M natriumhydroxideoplossing (NaOH) toe om een pH van 7,6 te verkrijgen en vul aan tot 200 ml.

Deze bufferoplossing is vier weken houdbaar bij + 4 °C.

4.2.   Oplossing 2: nicotinezuuramide-adenine-dinucleotidefosfaatoplossing (ongeveer 11,5 × 10-3 M): los 50 mg van het dinatriumzout van nicotinezuuramide-adenine-dinucleotidefosfaat op in 5 ml dubbel gedestilleerd water.

Deze oplossing is vier weken houdbaar bij + 4 °C.

4.3.   Oplossing 3: adenosine-5′-trifosfaatoplossing (ongeveer 81 × 10-3 M): los 250 mg van het dinatriumzout van adenosine-5′-trifosfaat en 250 mg natriumwaterstofcarbonaat (NaHCO3) op in 5 ml dubbel gedestilleerd water.

Deze oplossing is vier weken houdbaar bij + 4 °C.

4.4.   Oplossing 4: hexokinase/glucose-6-fosfaatdehydrogenase: meng 0,5 ml hexokinase (2 mg eiwit per ml of 280 U/ml) en 0,5 ml glucose-6-fosfaatdehydrogenase (1 mg eiwit per ml).

De oplossing is één jaar houdbaar bij + 4 °C.

4.5.   Oplossing 5: fosfoglucose-isomerase (2 mg eiwit per ml of 700 U/ml). Deze suspensie wordt onverdund gebruikt.

De suspensie is één jaar houdbaar bij + 4 °C.

Opmerking:

Al deze reagentia worden in de handel in kitvorm aangeboden.

5.   WERKWIJZE

5.1.   Voorbehandeling van het monster

Maak, afhankelijk van de geschatte hoeveelheid glucose + fructose per liter, de volgende verdunningen:

| Meting bij 340 nm en 334 nm | Meting bij 365 nm | Verdunning met water | Verdunningsfactor F |
| --- | --- | --- | --- |
| Tot en met 0,4 g/l | Tot 0,8 g/l | — | — |
| Tot en met 4,0 g/l | Tot 8,0 g/l | 1 + 9 | 10 |
| Tot en met 10,0 g/l | Tot 20,0 g/l | 1 + 24 | 25 |
| Tot en met 20,0 g/l | Tot 40,0 /l | 1 + 49 | 50 |
| Tot en met 40,0 g/l | Tot 80,0 g/l | 1 + 99 | 100 |
| Meer dan 40,0 g/l | Boven 80,0 g/l | 1 + 999 | 1 000 |

Meting bij 340 nm en 334 nm

Meting bij 365 nm

Verdunning met water

Verdunningsfactor F

Tot en met 0,4 g/l

Tot 0,8 g/l

—

—

Tot en met 4,0 g/l

Tot 8,0 g/l

1 + 9

10

Tot en met 10,0 g/l

Tot 20,0 g/l

1 + 24

25

Tot en met 20,0 g/l

Tot 40,0 /l

1 + 49

50

Tot en met 40,0 g/l

Tot 80,0 g/l

1 + 99

100

Meer dan 40,0 g/l

Boven 80,0 g/l

1 + 999

1 000

5.2.   Bepaling

Stel de spectrofotometer in op meting bij 340 nm en voer de metingen uit tegen lucht (geen kuvet in de lichtweg) of tegen water.

Temperatuur: 20-25 °C.

Breng in twee kuvetten met een optische weglengte van 1 cm:

| | Blanco | Bepaling |
| --- | --- | --- |
| Oplossing 1 (4.1) (op 20 °C gebracht) | 2,50 ml | 2,50 ml |
| Oplossing 2 (4.2) | 0,10 ml | 0,10 ml |
| Oplossing 3 (4,3) | 0,10 ml | 0,10 ml |
| Monsteroplossing | | 0,20 ml |
| Dubbel gedestilleerd water | 0,20 ml | |

Blanco

Bepaling

Oplossing 1 (4.1) (op 20 °C gebracht)

2,50 ml

2,50 ml

Oplossing 2 (4.2)

0,10 ml

0,10 ml

Oplossing 3 (4,3)

0,10 ml

0,10 ml

Monsteroplossing

0,20 ml

Dubbel gedestilleerd water

0,20 ml

Meng en lees na ongeveer 3 minuten de extinctie van de oplossingen af (E1). Start de reactie door toe te voegen:

| Oplossing 4 (4.4) | 0,02 ml | 0,02 ml |
| --- | --- | --- |

Oplossing 4 (4.4)

0,02 ml

0,02 ml

Meng; wacht 15 minuten; meet de extinctie (E2) en ga na 2 minuten na of de reactie is beëindigd.

Voeg onmiddellijk toe:

| Oplossing 5 (4.5) | 0,02 ml | 0,02 ml |
| --- | --- | --- |

Oplossing 5 (4.5)

0,02 ml

0,02 ml

Meng; lees na 10 minuten af (E3); ga na twee minuten na of de reactie is beëindigd.

Bepaal de extinctieverschillen:

| | E2 — E1 voor glucose, |
| --- | --- |

E2 — E1 voor glucose,

| | E3 — E2 voor fructose, |
| --- | --- |

E3 — E2 voor fructose,

zowel voor de blanco als voor de meetoplossing.

Leid hieruit het extinctieverschil af voor de blanco (ΔEB) en voor de meetoplossing (ΔEM) en bereken:

| | voor glucose: ΔEG = ΔEM – ΔEC |
| --- | --- |

voor glucose: ΔEG = ΔEM – ΔEC

| | voor fructose: ΔEF = ΔCM – ΔEB |
| --- | --- |

voor fructose: ΔEF = ΔCM – ΔEB

Opmerking:

De enzymactiviteit kan van charge tot charge verschillen. Bovenstaande reactietijd is dan ook slechts een indicatie. Het verdient aanbeveling deze per charge te bepalen.

5.3.   Weergave van de resultaten

5.3.1.   Wijze van berekening

De algemene formule voor de berekening van de concentraties is:

C= (V × PM)/(ε × d × v × 1 000) Δ E (g/l) where

V= totaalvolume van de test (ml)

v= volume van het monster (ml)

PM= molecuulmassa van de te bepalen stof

d= optische weglengte van de kuvet (cm)

ε= extinctiecoëfficiënt van NADPH bij 340 nm = 6,3 (mmol-1 × l × cm-1)

V= 2,92 ml voor de bepaling van glucose

V= 2,94 ml voor de bepaling van fructose

v= 0,20 ml

PM= 180

d= 1.

Het resultaat is:

| | voor glucose: C (g/l) = 0,417 × Δ EG |
| --- | --- |

voor glucose: C (g/l) = 0,417 × Δ EG

| | voor fructose: C (g/l) = 0,420 × Δ EF |
| --- | --- |

voor fructose: C (g/l) = 0,420 × Δ EF

Indien het monster vooraf is verdund dient het resultaat te worden vermenigvuldigd met de factor F.

Opmerking:

Indien de metingen bij 334 nm of bij 365 nm zijn uitgevoerd, is het resultaat:

| — | meting bij 334 nm: ε = 6,2 (mmole–1 × l × cm–1)
  voor glucose: C (g/l) = 0,425 × Δ EG

  voor fructose: C (g/l) = 0,428 × Δ EF |
| --- | --- |

—

meting bij 334 nm: ε = 6,2 (mmole–1 × l × cm–1)

voor glucose: C (g/l) = 0,425 × Δ EG

voor fructose: C (g/l) = 0,428 × Δ EF

| — | meting bij 365 nm: ε = 3,4 (mmole–1 × l × cm–1)
  voor glucose: C (g/l) = 0,773 × Δ EG

  voor fructose: C (g/l) = 0,778 × Δ EF |
| --- | --- |

—

meting bij 365 nm: ε = 3,4 (mmole–1 × l × cm–1)

voor glucose: C (g/l) = 0,773 × Δ EG

voor fructose: C (g/l) = 0,778 × Δ EF

5.3.2.   Herhaalbaarheid (r)

r= 0,056 xi

5.3.3.   Reproduceerbaarheid (R)

R= 0,12 + 0,076 xi

xi= het gehalte aan glucose of fructose in g/l.

7   KWANTITATIEVE BEPALING VAN SUIKERS MET BEHULP VAN HPLC (SACCHAROSE) (OIV-AS-311-03-SUCRES) — METHODE TYPE II

(p.m.)

[De beschrijving van deze analysemethode wordt door de instanties van de OIV geactualiseerd. Deze zal worden gepubliceerd in een volgende mededeling van de Commissie zodra een geactualiseerde tekst door de OIV wordt gepubliceerd in de uitgave van 2010 van het Handboek van internationale analysemethoden van de OIV. Ter indicatie wordt in afwachting van deze publicatie verwezen naar hoofdstuk 6, punt 3, van de bijlage van Verordening (EEG) nr. 2676/90 van de Commissie.]

8   AANTONEN VAN VERRIJKING VAN MOST, GECONCENTREERDE MOST, GERECTIFICEERDE GECONCENTREERDE MOST EN WIJN MET BEHULP VAN DEUTERIUMKERNSPINRESONANTIE (OIV-AS-311-05-ENRRMN) — METHODE TYPE I

(p.m.)

[De beschrijving van deze analysemethode wordt door de wetenschappelijke instanties van de OIV opnieuw bestudeerd. Deze zal worden gepubliceerd in een mededeling van de Commissie zodra een definitieve tekst door de algemene vergadering van de OIV zal worden vastgesteld. Ter indicatie wordt in afwachting van dit besluit van de OIV verwezen naar hoofdstuk 8 van de bijlage van Verordening (EEG) nr. 2676/90 van de Commissie.]

9   ALCOHOLVOLUMEGEHALTE (OIV-AS-312-01-TALVOL) — METHODEN TYPE I

(p.m.)

[De beschrijving van deze analysemethoden wordt door de instanties van de OIV geactualiseerd. Deze zal worden gepubliceerd in een volgende mededeling van de Commissie zodra een geactualiseerde tekst door de OIV wordt gepubliceerd in de uitgave van 2010 van het Handboek van internationale analysemethoden van de OIV. Ter indicatie wordt in afwachting van deze publicatie van de OIV verwezen naar hoofdstuk 3 van de bijlage van Verordening (EEG) nr. 2676/90 van de Commissie.]

10   BEPALING VAN DE ISOTOPENVERHOUDING 13C/12C VAN ETHANOL IN WIJN OF VAN ETHANOL DAT WORDT VERKREGEN DOOR VERGISTING VAN MOST, GECONCENTREERDE MOST OF GERECTIFICEERDE GECONCENTREERDE MOST, MET BEHULP VAN ISOTOPENMASSASPECTROMETRIE (OIV-AS-312-06-ETHANO) — METHODE TYPE II

1.   TOEPASSINGSGEBIED

Met deze methode kan de isotopenverhouding 13C/12C worden gemeten van ethanol in wijn en van ethanol dat wordt verkregen na vergisting van afgeleide wijnbouwproducten (most, geconcentreerde most en gerectificeerde geconcentreerde most).

2.   VERWIJZINGEN NAAR NORMEN

| ISO: | 5725:1994 „Nauwkeurigheid van meetmethoden — Bepaling van de herhaalbaarheid en de reproduceerbaarheid van een standaardmeetmethode door interlaboratoriaonderzoek”. |
| --- | --- |
| V-PDB: | Vienna-Pee-Dee Belemniet (RPDB = 0,0112372). |
| Methode OIV AS-311-O5-ENRRMN | „Aantonen van verrijking van most, geconcentreerde most, gerectificeerde geconcentreerde most en wijn met behulp van deuteriumkernspinresonantie (NMR-SNIF)” |

ISO:

5725:1994 „Nauwkeurigheid van meetmethoden — Bepaling van de herhaalbaarheid en de reproduceerbaarheid van een standaardmeetmethode door interlaboratoriaonderzoek”.

V-PDB:

Vienna-Pee-Dee Belemniet (RPDB = 0,0112372).

Methode OIV AS-311-O5-ENRRMN

„Aantonen van verrijking van most, geconcentreerde most, gerectificeerde geconcentreerde most en wijn met behulp van deuteriumkernspinresonantie (NMR-SNIF)”

3.   BEGRIPPEN EN DEFINITIES

| 13C/12C | : | Verhouding tussen de isotopen koolstof-13 (13C) en koolstof-12 (12C) voor een bepaald monster. |
| --- | --- | --- |
| δ13C C | : | Gehalte aan koolstof-13 (13C), uitgedrukt in deeltjes per duizend (‰). |
| NMR-SNIF: | : | Site-specifieke natuurlijke isotopenfractionering, bestudeerd met behulp van kernspinresonantie. |
| V-PDB | : | Vienna-Pee-Dee-Belemniet. PDB, benchmark voor het meten van natuurlijke variaties in het isotopengehalte aan koolstof-13, was calciumcarbonaat uit een belemnietrostrum (uit het Krijt) van de Pee-Dee-formatie in Zuid-Carolina (Verenigde Staten). De isotopenverhouding 13C/12C of RPDB hiervan is: RPDB = 0,0112372. PDB is al lang niet meer beschikbaar, maar is de benchmark gebleven voor het uitdrukken van natuurlijke variaties in het isotopengehalte aan koolstof-13, waartegen de referentiematerialen die bij de Internationale Organisatie voor atoomenergie (IAEA) in Wenen (Oostenrijk) beschikbaar zijn, worden geijkt. Isotopenbepalingen van de natuurlijke aanwezigheid van koolstof-13 worden daarom standaard in verhouding tot het V-PDB uitgedrukt. |
| m/z | : | Verhouding massa/lading. |

13C/12C

:

Verhouding tussen de isotopen koolstof-13 (13C) en koolstof-12 (12C) voor een bepaald monster.

δ13C C

:

Gehalte aan koolstof-13 (13C), uitgedrukt in deeltjes per duizend (‰).

NMR-SNIF:

:

Site-specifieke natuurlijke isotopenfractionering, bestudeerd met behulp van kernspinresonantie.

V-PDB

:

Vienna-Pee-Dee-Belemniet. PDB, benchmark voor het meten van natuurlijke variaties in het isotopengehalte aan koolstof-13, was calciumcarbonaat uit een belemnietrostrum (uit het Krijt) van de Pee-Dee-formatie in Zuid-Carolina (Verenigde Staten). De isotopenverhouding 13C/12C of RPDB hiervan is: RPDB = 0,0112372. PDB is al lang niet meer beschikbaar, maar is de benchmark gebleven voor het uitdrukken van natuurlijke variaties in het isotopengehalte aan koolstof-13, waartegen de referentiematerialen die bij de Internationale Organisatie voor atoomenergie (IAEA) in Wenen (Oostenrijk) beschikbaar zijn, worden geijkt. Isotopenbepalingen van de natuurlijke aanwezigheid van koolstof-13 worden daarom standaard in verhouding tot het V-PDB uitgedrukt.

m/z

:

Verhouding massa/lading.

4.   PRINCIPE VAN DE METHODE

Tijdens de fotosynthese wordt koolzuurgas door planten geassimileerd volgens twee soorten metabolisme, namelijk het C3-metabolisme (Calvincyclus) en het C4-metabolisme (Hatch en Slack). Deze twee fotosynthesemetabolismen leveren een verschillende isotopenfractionering op. Zo hebben producten die afkomstig zijn van C4-planten, zoals suikers en van vergisting afkomstige alcohol, een hoger gehalte aan koolstof-13 dan de producten van C3-planten. De meeste planten, zoals de wijnstok en de suikerbiet, behoren tot de C3-groep. Suikerriet en maïs behoren tot de C4-groep. De meting van het gehalte aan koolstof-13 maakt dus de opsporing en evaluatie mogelijk van suiker van C4-oorsprong (rietsuiker of isoglucose van maïs), die is toegevoegd aan producten die van de druif afkomstig zijn (druivenmost, wijn enz.). Door de informatie over het gehalte aan koolstof-13 te combineren met de informatie van NMR-SNIF kan ook de toevoeging van mengsels van suikers of alcoholen die van C3- en C4-planten afkomstig zijn, worden gekwantificeerd.

Het gehalte aan koolstof-13 wordt bepaald bij het koolzuurgas dat wordt gevormd als gevolg van de volledige verbranding van het monster. De hoeveelheden van de voornaamste massa-isotopomeren 44 (12C16O2), 45 (13C16O2 en 12C17O16O) en 46 (12C16O18O), die het resultaat zijn van de verschillende mogelijke combinaties van de isotopen 18O, 17O, 16O, 13C en 12C, worden bepaald aan de hand van de ionenstromen die op drie verschillende collectoren van een isotopenmassaspectrometer worden gemeten. De bijdragen van de isotopomeren 13C17O16O en 12C17O2 kunnen worden verwaarloosd aangezien ze maar heel weinig voorkomen. De ionenstroom voor m/z = 45 wordt gecorrigeerd voor de bijdrage van 12C17O16O, die wordt berekend aan de hand van de intensiteit van de stroom die voor m/z = 46 is gemeten, met inachtneming van de relatieve hoeveelheden 18O en 17O (correctie van Craig). Met behulp van de vergelijking met een referentie die geijkt is tegen de internationale referentie V-PDB, kan het gehalte aan koolstof-13 op de relatieve δ13C-schaal worden berekend.

5.   REAGENTIA

De materialen en verbruiksgoederen zijn afhankelijk van de apparatuur (punt 6) die door het laboratorium wordt gebruikt. Meestal worden systemen gebruikt op basis van apparatuur voor elementaire analyse. Deze kan worden uitgerust voor de introductie van monsters in gesloten metalen capsules of voor de injectie van vloeibare monsters door een septum met behulp van een injectiespuit.

Afhankelijk van de gebruikte soorten instrumenten, kunnen de volgende referentiematerialen, reagentia en verbruiksgoederen worden gebruikt:

| — | referentiematerialen |
| --- | --- |

—

referentiematerialen

| — | beschikbaar bij de IAEA:







  Naam | Materiaal | δ13C vs. V-PDB (9) |
| --- | --- | --- | --- |
| — | IAEA-CH-6 |

—

beschikbaar bij de IAEA:

Naam

Materiaal

δ13C vs. V-PDB (9)

—

IAEA-CH-6

saccharose

–10,4 ‰

| — | IAEA-CH-7 |
| --- | --- |

—

IAEA-CH-7

polyetheen

–31,8 ‰

| — | NBS22 |
| --- | --- |

—

NBS22

olie

–29,7 ‰

| — | USGS24 |
| --- | --- |

—

USGS24

grafiet

–16,1 ‰

| — | beschikbaar bij het IRMM (Instituut voor referentiematerialen en -metingen) in Geel (B):







  Naam | Materiaal | δ13C vs. V-PDB (9) |
| --- | --- | --- | --- |
| — | CRM/BCR 656 |

—

beschikbaar bij het IRMM (Instituut voor referentiematerialen en -metingen) in Geel (B):

Naam

Materiaal

δ13C vs. V-PDB (9)

—

CRM/BCR 656

wijnalcohol

–26,93 ‰

| — | CRM/BCR 657 |
| --- | --- |

—

CRM/BCR 657

glucose

–10,75 ‰

| — | CRM/BCR 660 |
| --- | --- |

—

CRM/BCR 660

oplossing alcohol in water (alcoholvolumegehalte 12 %)

–26,72 %

| — | Standaardwerkmonster met bekende 13C/12C-verhouding dat is geijkt tegen de internationale referentiematerialen. |
| --- | --- |

—

Standaardwerkmonster met bekende 13C/12C-verhouding dat is geijkt tegen de internationale referentiematerialen.

| — | Onderstaande indicatieve lijst met verbruiksgoederen is opgesteld voor de systemen met continue flux:






  — | helium voor analyse (CAS-nr. 07440-59-7); |
| --- | --- | --- |

—

Onderstaande indicatieve lijst met verbruiksgoederen is opgesteld voor de systemen met continue flux:

—

helium voor analyse (CAS-nr. 07440-59-7);

| — | zuurstof voor analyse (CAS-nr. 07782-44-7); |
| --- | --- |

—

zuurstof voor analyse (CAS-nr. 07782-44-7);

| — | koolstofdioxide voor analyse, gebruikt als secundair referentiegas voor het gehalte aan koolstof-13 (CAS-nr. 00124-38-9); |
| --- | --- |

—

koolstofdioxide voor analyse, gebruikt als secundair referentiegas voor het gehalte aan koolstof-13 (CAS-nr. 00124-38-9);

| — | oxidatiereagens voor de oven van het verbrandingssysteem, bijvoorbeeld koper(II)oxide voor elementaire analyse (CAS-nr. 1317-38-0); |
| --- | --- |

—

oxidatiereagens voor de oven van het verbrandingssysteem, bijvoorbeeld koper(II)oxide voor elementaire analyse (CAS-nr. 1317-38-0);

| — | droogmiddel voor de verwijdering van het water dat tijdens de verbranding ontstaat, bijvoorbeeld anhydron voor elementaire analyse (magnesiumperchloraat) (CAS-nr. 10034-81-8) (niet nodig voor apparaten die met een systeem voor het verwijderen van het water door middel van cryofixatie of door middel van een selectief doorlaatbaar capillair zijn uitgerust). |
| --- | --- |

—

droogmiddel voor de verwijdering van het water dat tijdens de verbranding ontstaat, bijvoorbeeld anhydron voor elementaire analyse (magnesiumperchloraat) (CAS-nr. 10034-81-8) (niet nodig voor apparaten die met een systeem voor het verwijderen van het water door middel van cryofixatie of door middel van een selectief doorlaatbaar capillair zijn uitgerust).

6.   APPARATUUR EN MATERIAAL

6.1.   Isotoopverhouding-massaspectrometer (IRMS)

Isotoopverhouding-massaspectrometer (IRMS), waarmee het relatieve 13C-gehalte van in de natuur voorkomend CO2-gas met een interne precisie van 0,05 ‰ of beter (relatieve waarde) kan worden bepaald (punt 9). De interne precisie wordt hier gedefinieerd als het verschil tussen twee metingen van hetzelfde CO2-monster. De massaspectrometer die voor de meting van isotoopverhoudingen bestemd is, is in het algemeen uitgerust met een drievoudige collector voor het gelijktijdig meten van de intensiteit voor m/z = 44, 45 en 46. De isotoopverhouding-massaspectrometer moet zijn voorzien van een dubbel invoersysteem om beurtelings het onbekende en een referentiemonster te meten, of een geïntegreerd systeem gebruiken dat de kwantitatieve verbranding van de monsters uitvoert en vóór de meting in de massaspectrometer het koolstofdioxide van de overige verbrandingsproducten scheidt.

6.2.   Verbrandingsapparatuur

Verbrandingsapparatuur die in staat is ethanol kwantitatief in koolstofdioxide om te zetten en alle andere verbrandingsproducten inclusief water zonder enige isotopenfractionering te elimineren. De apparatuur kan een systeem met continue flux zijn dat in de massaspectrometer-instrumentatie is geïntegreerd (punt 6.2.1), of een autonoom verbrandingssysteem (punt 6.2.2). Met deze apparatuur moet een precisie mogelijk zijn die ten minste gelijkwaardig is aan die welke in punt 11 wordt genoemd.

6.2.1.   Systemen met continue flux

Deze bestaan uit een elementaire analyser of een gaschromatograaf die is uitgerust met een systeem voor doorlopende verbranding.

Voor de systemen die zijn uitgerust voor het invoeren van monsters in metalen capsules, wordt onderstaand laboratoriummateriaal gebruikt:

| — | micro-injectiespuit of volumetrische micropipet met geschikte tips; |
| --- | --- |

—

micro-injectiespuit of volumetrische micropipet met geschikte tips;

| — | monsterbalans met afleesschaal van 1 μg of beter; |
| --- | --- |

—

monsterbalans met afleesschaal van 1 μg of beter;

| — | tang voor het hanteren en vullen van de capsules; |
| --- | --- |

—

tang voor het hanteren en vullen van de capsules;

| — | tinnen capsules voor vloeibare monsters; |
| --- | --- |

—

tinnen capsules voor vloeibare monsters;

| — | tinnen capsules voor vaste monsters. |
| --- | --- |

—

tinnen capsules voor vaste monsters.

NB:

Om de risico's van verdamping van de ethanolmonsters te beperken, kan in de capsules een absorberend materiaal (bijvoorbeeld chromosorb W 45-60 mesh) worden gebracht, waarvan men vooraf door een blancometing heeft vastgesteld dat het geen significante hoeveelheid koolstof bevat die de metingen zou kunnen beïnvloeden.

Bij gebruik van een elementaire analyser die met een injector voor vloeistoffen is uitgerust of bij een voorbehandelingssysteem voor chromatografie/verbranding, wordt het volgende laboratoriummateriaal gebruikt:

| — | injectiespuit voor vloeistoffen; |
| --- | --- |

—

injectiespuit voor vloeistoffen;

| — | flacons uitgerust met dicht sluitingssysteem en inerte septa. |
| --- | --- |

—

flacons uitgerust met dicht sluitingssysteem en inerte septa.

De in bovenstaande lijsten genoemde laboratoriummaterialen zijn als voorbeelden bedoeld en kunnen, afhankelijk van het soort verbrandingsapparatuur en massaspectrometer die het laboratorium gebruikt, door andere materialen met gelijkwaardige prestaties worden vervangen.

6.2.2.   Autonome voorbehandelingssystemen

In dit geval worden de koolstofdioxidemonsters die afkomstig zijn van de verbranding van de te analyseren monsters en van de referentie, verzameld in ampullen die vervolgens in het dubbele invoersysteem van de spectrometer worden geplaatst ten behoeve van de uitvoering van de isotopenanalyse. Verscheidene in de literatuur beschreven verbrandingsapparaten kunnen worden gebruikt:

| — | gesloten verbrandingssysteem met circulerend zuurstofgas; |
| --- | --- |

—

gesloten verbrandingssysteem met circulerend zuurstofgas;

| — | elementaire analyser met helium- en zuurstofflux; |
| --- | --- |

—

elementaire analyser met helium- en zuurstofflux;

| — | verzegelde glazen ampul, gevuld met koper(II)oxide als oxidatiemiddel. |
| --- | --- |

—

verzegelde glazen ampul, gevuld met koper(II)oxide als oxidatiemiddel.

7.   VOORBEHANDELING VAN DE MONSTERS VOOR DE PROEF

Vóór de isotopenbepaling dient het ethanol uit de wijn te worden geëxtraheerd. Deze extractie gebeurt door destillatie van de wijn zoals beschreven bij punt 3.1 van de NMR-SNIF-methode (OIV-MA-E-AS311-05-ENRRMN).

In het geval van druivenmost, geconcentreerde druivenmost en gerectificeerde geconcentreerde druivenmost dienen de suikers eerst tot ethanol te worden vergist zoals beschreven bij punt 3.2 van de NMR-SNIF-methode (OIV-MA-E-AS311-05-ENRRMN).

8.   WERKWIJZE

Alle voorbereidingsfasen dienen te worden uitgevoerd zonder enig significant verlies van ethanol door verdamping, waardoor de isotopensamenstelling van het monster zou veranderen.

In onderstaande beschrijving wordt verwezen naar de procedures die algemeen worden gebruikt voor de verbranding van ethanolmonsters met behulp van in de handel verkrijgbare geautomatiseerde verbrandingssystemen. Elke andere methode die waarborgt dat het ethanolmonster kwantitatief zonder enig verlies van ethanol door verdamping in koolstofdioxide wordt omgezet, kan voor de bereiding van koolstofdioxide voor de isotopenanalyse in aanmerking komen.

Experimentele procedure op basis van het gebruik van een elementaire analyser:

| a) | Overbrengen van monsters in capsules:






  — | gebruik capsules, een tang en een plateau die schoon zijn; |
| --- | --- | --- |

a)

Overbrengen van monsters in capsules:

—

gebruik capsules, een tang en een plateau die schoon zijn;

| — | pak met behulp van de tang een capsule met de juiste afmeting; |
| --- | --- |

—

pak met behulp van de tang een capsule met de juiste afmeting;

| — | breng met behulp van de micropipet de noodzakelijke hoeveelheid vloeistof in de capsule; |
| --- | --- |

—

breng met behulp van de micropipet de noodzakelijke hoeveelheid vloeistof in de capsule;

| — | NB:

  Er is 3,84 mg absolute ethanol of 4,17 mg destillaat met een alcoholgehalte van 92 % (m/m) nodig om 2 mg koolstof te verkrijgen. De juiste hoeveelheid destillaat moet op dezelfde manier worden berekend, afhankelijk van de hoeveelheid koolstof die nodig is in verband met de gevoeligheid van de massaspectrometer-instrumentatie. |
| --- | --- |

—

NB:

Er is 3,84 mg absolute ethanol of 4,17 mg destillaat met een alcoholgehalte van 92 % (m/m) nodig om 2 mg koolstof te verkrijgen. De juiste hoeveelheid destillaat moet op dezelfde manier worden berekend, afhankelijk van de hoeveelheid koolstof die nodig is in verband met de gevoeligheid van de massaspectrometer-instrumentatie.

| — | sluit de capsule met behulp van de tangen; |
| --- | --- |

—

sluit de capsule met behulp van de tangen;

| — | elke capsule moet absoluut lekdicht worden afgesloten; is dat niet het geval, dan mag deze niet worden gebruikt en moet een nieuwe capsule worden gemaakt; |
| --- | --- |

—

elke capsule moet absoluut lekdicht worden afgesloten; is dat niet het geval, dan mag deze niet worden gebruikt en moet een nieuwe capsule worden gemaakt;

| — | bereid twee capsules per monster; |
| --- | --- |

—

bereid twee capsules per monster;

| — | plaats de capsules op de juiste plaats op het plateau van de automatische monsterwisselaar van de elementaire analyser; elke capsule dient zorgvuldig te worden gemerkt met een volgnummer; |
| --- | --- |

—

plaats de capsules op de juiste plaats op het plateau van de automatische monsterwisselaar van de elementaire analyser; elke capsule dient zorgvuldig te worden gemerkt met een volgnummer;

| — | plaats systematisch capsules met de werkreferenties aan het begin en aan het eind van de reeks monsters; |
| --- | --- |

—

plaats systematisch capsules met de werkreferenties aan het begin en aan het eind van de reeks monsters;

| — | voeg regelmatig controlemonsters toe aan de reeks monsters. |
| --- | --- |

—

voeg regelmatig controlemonsters toe aan de reeks monsters.

| b) | Controle en instelling van de instrumenten voor elementaire analyse en massaspectrometrie:






  — | stel de temperatuur van de ovens van de elementaire analyser en de helium- en zuurstofstromen in voor een optimale verbranding van het monster; |
| --- | --- | --- |

b)

Controle en instelling van de instrumenten voor elementaire analyse en massaspectrometrie:

—

stel de temperatuur van de ovens van de elementaire analyser en de helium- en zuurstofstromen in voor een optimale verbranding van het monster;

| — | controleer het systeem voor elementaire analyse en massaspectrometrie op lekken (bijvoorbeeld door het controleren van de ionenstroom voor m/z = 28, overeenkomend met N2); |
| --- | --- |

—

controleer het systeem voor elementaire analyse en massaspectrometrie op lekken (bijvoorbeeld door het controleren van de ionenstroom voor m/z = 28, overeenkomend met N2);

| — | stel de massaspectrometer in voor het meten van de ionenstromen voor m/z = 44, 45 en 46; |
| --- | --- |

—

stel de massaspectrometer in voor het meten van de ionenstromen voor m/z = 44, 45 en 46;

| — | controleer het systeem met behulp van bekende controlemonsters alvorens met het meten van de monsters te beginnen. |
| --- | --- |

—

controleer het systeem met behulp van bekende controlemonsters alvorens met het meten van de monsters te beginnen.

| c) | Verloop van een reeks metingen
  De monsters die op de automatische monsterwisselaar van de elementaire analyser (of de chromatograaf) zijn geplaatst worden achtereenvolgens ingebracht. Het koolstofdioxide van elke monsterverbranding wordt geëlueerd naar de massaspectrometer die de ionenstromen meet. De computer die met de instrumenten is verbonden, registreert de intensiteit van de ionenstromen en berekent voor elk monster de δ-waarde (punt 9). |
| --- | --- |

c)

Verloop van een reeks metingen

De monsters die op de automatische monsterwisselaar van de elementaire analyser (of de chromatograaf) zijn geplaatst worden achtereenvolgens ingebracht. Het koolstofdioxide van elke monsterverbranding wordt geëlueerd naar de massaspectrometer die de ionenstromen meet. De computer die met de instrumenten is verbonden, registreert de intensiteit van de ionenstromen en berekent voor elk monster de δ-waarde (punt 9).

9.   BEREKENING

Het doel van de methode is het meten van de 13C/12C-verhouding van het ethanol dat is geëxtraheerd uit wijn of uit vergistingsproducten van de druif. De 13C/12C-isotopenverhouding kan worden uitgedrukt in haar afwijking van een werkreferentie. De isotopenafwijking van koolstof-13 (δ13C) wordt dan berekend op een schaal van delta promille (δ/1 000), door de resultaten met het te meten monster te vergelijken met die van de werkreferentie, die vooraf geijkt is tegen de primaire internationale referentie (V-PDB). De δ13C-waarden worden ten opzichte van de werkreferentie uitgedrukt volgens:

δ13Cmon/ref ‰ = 1 000 × (Rmon-Rref)/Rref

waarin Rmon en Rref respectievelijk de 13C/12C-isotopenverhouding van het monster en die van het koolstofdioxide dat als referentiegas is gebruikt, aangeven.

De δ13C-waarden worden vervolgens uitgedrukt in verhouding tot V-PDB volgens:

δ13Cmon/V-PDB ‰ = δ13Cmon/ref + δ13Cref/V-PDB + (δ13Cmon/ref × δ13Cref/V-PDB)/1 000

waarin δ13Cmon/V-PDB de isotopenafwijking is die vooraf voor de werkreferentie ten opzichte van V-PDB is bepaald.

Tijdens de doorlopende meting kunnen als gevolg van wisselende omstandigheden van de instrumenten geringe afwijkingen worden geconstateerd. In dat geval dienen de δ13C-waarden van de monsters te worden gecorrigeerd aan de hand van het verschil tussen de voor de werkreferentie gemeten δ13C-waarde en de werkelijke waarde die eerder tegen het V-PDB is geijkt door vergelijking met een van de internationale referentiematerialen. Tussen twee metingen van de werkreferentie kunnen de afwijking, en dus de op de resultaten van de monsters toe te passen correctie, als lineair worden aangenomen. Aan het begin en aan het einde van iedere reeks monsters dient de werkreferentie te worden gemeten. Vervolgens kan per monster een correctie worden berekend door middel van een lineaire interpolatie.

10.   KWALITEITSBORGING EN -CONTROLE

Controleer of de 13C-waarde voor de werkreferentie niet meer dan 0,5 ‰ afwijkt van de aangenomen waarde. Is dat niet het geval, dan dienen de instellingen van de spectrometer-instrumenten te worden gecontroleerd en eventueel te worden bijgesteld.

Controleer per monster of het verschil in resultaat tussen de twee achtereenvolgens gemeten capsules kleiner is dan 0,3 ‰. Het eindresultaat voor een gegeven monster is dan de gemiddelde waarde van de twee capsules. Indien de afwijking groter is dan 0,3 ‰, dient de meting te worden herhaald.

Een controle op het juist functioneren van de meting kan worden gebaseerd op de intensiteit van de ionenstroom voor m/z = 44, die evenredig is aan de hoeveelheid koolstof die in de elementaire analyser is geïnjecteerd. Onder standaardomstandigheden zou de intensiteit van deze ionenstroom voor de monsters tijdens de analyse praktisch constant moeten zijn. Bij een aanzienlijke afwijking rijst het vermoeden dat sprake is van een ethanolverdamping (bijvoorbeeld een niet volledig gesloten capsule) of van instabiliteit van de elementaire analyser of de massaspectrometer.

11.   PRESTATIEKENMERKEN VAN DE METHODE (PRECISIE)

Er is een eerste ringonderzoek (punt 11.1) verricht van destillaten, waaronder alcoholen uit wijn en alcoholen uit suikerriet en suikerbieten, alsmede met verschillende mengsels van deze drie oorsprongen. Aangezien bij dit onderzoek geen rekening is gehouden met de destillatiestap, is ook rekening gehouden met aanvullende informatie uit andere ringonderzoeken op wijnen (punt 11.2) en met name gezamenlijke geschiktheidsproeven (punt 11.3) voor de isotopenmetingen. De resultaten laten zien dat de verschillende destillatiesystemen die in bevredigende omstandigheden zijn gebruikt en in het bijzonder die welke op de NMR-SNIF-metingen van toepassing zijn, geen significante variabiliteit meebrengen voor de δ13C-bepalingen van ethanol in wijn. De voor de wijnen waargenomen betrouwbaarheidsparameters zijn praktisch identiek aan die welke bij het ringonderzoek (punt 11.1) met destillaten zijn verkregen.

11.1.   Ringonderzoek met destillaten

| Jaar van het ringonderzoek | 1996 |
| --- | --- |
| Aantal laboratoria: | 20 |
| Aantal monsters: | 6 dubbelblindmonsters |
| Voorwerp van de analyse | δ13C-waarde van ethanol |

Jaar van het ringonderzoek

1996

Aantal laboratoria:

20

Aantal monsters:

6 dubbelblindmonsters

Voorwerp van de analyse

δ13C-waarde van ethanol

| Code van de monsters | Alcohol uit wijn | Alcohol uit suikerbiet | Alcohol uit suikerriet |
| --- | --- | --- | --- |
| A & G | 80 % | 10 % | 10 % |
| B & C | 90 % | 10 % | 0 % |
| D & F | 0 % | 100 % | 0 % |
| E & I | 90 % | 0 % | 10 % |
| H & K | 100 % | 0 % | 0 % |
| J & L | 0 % | 0 % | 100 % |

Code van de monsters

Alcohol uit wijn

Alcohol uit suikerbiet

Alcohol uit suikerriet

A & G

80 %

10 %

10 %

B & C

90 %

10 %

0 %

D & F

0 %

100 %

0 %

E & I

90 %

0 %

10 %

H & K

100 %

0 %

0 %

J & L

0 %

0 %

100 %

| Monsters | A/G | B/C | D/F | E/I | H/K | J/L |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Aantal overblijvende laboratoria na eliminatie van afwijkende resultaten | 19 | 18 | 17 | 19 | 19 | 19 |
| Aantal aanvaarde resultaten | 38 | 36 | 34 | 38 | 38 | 38 |
| Gemiddelde waarde (δ13C) ‰ | –25,32 | –26,75 | –27,79 | –25,26 | –26,63 | –12,54 |
| Sr
  2 | 0,0064 | 0,0077 | 0,0031 | 0,0127 | 0,0069 | 0,0041 |
| Standaardafwijking herhaalbaarheid (Sr) ‰ | 0,08 | 0,09 | 0,06 | 0,11 | 0,08 | 0,06 |
| Herhaalbaarheidslimiet r (2,8 × Sr) ‰ | 0,22 | 0,25 | 0,16 | 0,32 | 0,23 | 0,18 |
| SR
  2 | 0,0389 | 0,0309 | 0,0382 | 0,0459 | 0,0316 | 0,0584 |
| Standaardafwijking reproduceerbaarheid (SR) ‰ | 0,20 | 0,18 | 0,20 | 0,21 | 0,18 | 0,24 |
| Reproduceerbaarheidslimiet R (2,8 × SR) ‰ | 0,55 | 0,49 | 0,55 | 0,60 | 0,50 | 0,68 |

Monsters

A/G

B/C

D/F

E/I

H/K

J/L

Aantal overblijvende laboratoria na eliminatie van afwijkende resultaten

19

18

17

19

19

19

Aantal aanvaarde resultaten

38

36

34

38

38

38

Gemiddelde waarde (δ13C) ‰

–25,32

–26,75

–27,79

–25,26

–26,63

–12,54

Sr
  2

0,0064

0,0077

0,0031

0,0127

0,0069

0,0041

Standaardafwijking herhaalbaarheid (Sr) ‰

0,08

0,09

0,06

0,11

0,08

0,06

Herhaalbaarheidslimiet r (2,8 × Sr) ‰

0,22

0,25

0,16

0,32

0,23

0,18

SR
  2

0,0389

0,0309

0,0382

0,0459

0,0316

0,0584

Standaardafwijking reproduceerbaarheid (SR) ‰

0,20

0,18

0,20

0,21

0,18

0,24

Reproduceerbaarheidslimiet R (2,8 × SR) ‰

0,55

0,49

0,55

0,60

0,50

0,68

11.2.   Ringonderzoek met twee wijnen en een alcohol

| Jaar van het ringonderzoek | 1996 |
| --- | --- |
| Aantal laboratoria: | 14 voor de destillatie van de wijnen, waarvan zeven eveneens voor de meting van de δ13C-waarde van het ethanol in de wijnen, 8 voor de meting van de δ13C-waarde van het alcoholmonster. |
| Aantal monsters: | 3 (witte wijn, alcoholpercentage 9,3 % vol, witte wijn, alcoholpercentage 9,6 % vol, en alcohol met een alcoholometrisch gehalte van 93 % (m/m)). |
| Voorwerp van de analyse | δ13C-waarde van ethanol |

Jaar van het ringonderzoek

1996

Aantal laboratoria:

14 voor de destillatie van de wijnen, waarvan zeven eveneens voor de meting van de δ13C-waarde van het ethanol in de wijnen, 8 voor de meting van de δ13C-waarde van het alcoholmonster.

Aantal monsters:

3 (witte wijn, alcoholpercentage 9,3 % vol, witte wijn, alcoholpercentage 9,6 % vol, en alcohol met een alcoholometrisch gehalte van 93 % (m/m)).

Voorwerp van de analyse

δ13C-waarde van ethanol

| Monsters | Rode wijn | Witte wijn | Alcohol |
| --- | --- | --- | --- |
| Aantal laboratoria | 7 | 7 | 8 |
| Aantal aanvaarde resultaten | 7 | 7 | 8 |
| Gemiddelde waarde (δ13C) ‰ | –26,20 | –26,20 | –25,08 |
| Reproduceerbaarheidsvariantie SR2 | 0,0525 | 0,0740 | 0,0962 |
| Standaardafwijking reproduceerbaarheid (SR) ‰ | 0,23 | 0,27 | 0,31 |
| Reproduceerbaarheidslimiet R (2,8 × SR) ‰ | 0,64 | 0,76 | 0,87 |

Monsters

Rode wijn

Witte wijn

Alcohol

Aantal laboratoria

7

7

8

Aantal aanvaarde resultaten

7

7

8

Gemiddelde waarde (δ13C) ‰

–26,20

–26,20

–25,08

Reproduceerbaarheidsvariantie SR2

0,0525

0,0740

0,0962

Standaardafwijking reproduceerbaarheid (SR) ‰

0,23

0,27

0,31

Reproduceerbaarheidslimiet R (2,8 × SR) ‰

0,64

0,76

0,87

Door de deelnemende laboratoria zijn verschillende destillatiesystemen gebruikt. De δ13C-isotopenbepalingen die in één enkel laboratorium op alle door de deelnemers ingezonden destillaten zijn verricht, vertonen noch een afwijkende waarde, noch een waarde die significant afwijkt van de gemiddelde waarden. De variantie van de resultaten (S2 = 0,0059) is vergelijkbaar met de herhaalbaarheidsvarianties Sr2 van het ringonderzoek van de destillaten (punt 11.1).

11.3.   Resultaten van de gezamenlijke geschiktheidsproeven voor isotopenbepalingen

Sedert december 1994 worden regelmatig internationale geschiktheidsproeven voor de isotopenbepalingen op wijnen en alcoholen (destillaten met een alcoholgehalte van 96 % vol) georganiseerd. De resultaten stellen de deelnemende laboratoria in staat de kwaliteit van hun analyses te controleren. De statistische verwerking van de resultaten maakt het mogelijk de variabiliteit van de bepalingen in reproduceerbaarheidsomstandigheden te beoordelen en dus de variantieparameters en de reproduceerbaarheidslimiet te ramen. De resultaten die zijn verkregen voor de bepalingen van de δ13C-waarde van ethanol in wijnen en destillaten worden in onderstaande tabel samengevat:

| Datum | Wijnen | Destillaten |
| --- | --- | --- |
| N | SR | SR
  2 | R | N | SR | SR
  2 | R |
| December 1994 | 6 | 0,210 | 0,044 | 0,59 | 6 | 0,151 | 0,023 | 0,42 |
| Juni 1995 | 8 | 0,133 | 0,018 | 0,37 | 8 | 0,147 | 0,021 | 0,41 |
| December 1995 | 7 | 0,075 | 0,006 | 0,21 | 8 | 0,115 | 0,013 | 0,32 |
| Maart 1996 | 9 | 0,249 | 0,062 | 0,70 | 11 | 0,278 | 0,077 | 0,78 |
| Juni 1996 | 8 | 0,127 | 0,016 | 0,36 | 8 | 0,189 | 0,036 | 0,53 |
| September 1996 | 10 | 0,147 | 0,022 | 0,41 | 11 | 0,224 | 0,050 | 0,63 |
| December 1996 | 10 | 0,330 | 0,109 | 0,92 | 9 | 0,057 | 0,003 | 0,16 |
| Maart 1997 | 10 | 0,069 | 0,005 | 0,19 | 8 | 0,059 | 0,003 | 0,16 |
| Juni 1997 | 11 | 0,280 | 0,079 | 0,78 | 11 | 0,175 | 0,031 | 0,49 |
| September 1997 | 12 | 0,237 | 0,056 | 0,66 | 11 | 0,203 | 0,041 | 0,57 |
| December 1997 | 11 | 0,127 | 0,016 | 0,36 | 12 | 0,156 | 0,024 | 0,44 |
| Maart 1998 | 12 | 0,285 | 0,081 | 0,80 | 13 | 0,245 | 0,060 | 0,69 |
| Juni 1998 | 12 | 0,182 | 0,033 | 0,51 | 12 | 0,263 | 0,069 | 0,74 |
| September 1998 | 11 | 0,264 | 0,070 | 0,74 | 12 | 0,327 | 0,107 | 0,91 |
| Gewogen gemiddelde | | 0,215 | 0,046 | 0,60 | | 0,209 | 0,044 | 0,59 |
| N | : | Aantal deelnemende laboratoria. |

Datum

Wijnen

Destillaten

N

SR

SR
  2

R

N

SR

SR
  2

R

December 1994

6

0,210

0,044

0,59

6

0,151

0,023

0,42

Juni 1995

8

0,133

0,018

0,37

8

0,147

0,021

0,41

December 1995

7

0,075

0,006

0,21

8

0,115

0,013

0,32

Maart 1996

9

0,249

0,062

0,70

11

0,278

0,077

0,78

Juni 1996

8

0,127

0,016

0,36

8

0,189

0,036

0,53

September 1996

10

0,147

0,022

0,41

11

0,224

0,050

0,63

December 1996

10

0,330

0,109

0,92

9

0,057

0,003

0,16

Maart 1997

10

0,069

0,005

0,19

8

0,059

0,003

0,16

Juni 1997

11

0,280

0,079

0,78

11

0,175

0,031

0,49

September 1997

12

0,237

0,056

0,66

11

0,203

0,041

0,57

December 1997

11

0,127

0,016

0,36

12

0,156

0,024

0,44

Maart 1998

12

0,285

0,081

0,80

13

0,245

0,060

0,69

Juni 1998

12

0,182

0,033

0,51

12

0,263

0,069

0,74

September 1998

11

0,264

0,070

0,74

12

0,327

0,107

0,91

Gewogen gemiddelde

0,215

0,046

0,60

0,209

0,044

0,59

N

:

Aantal deelnemende laboratoria.

11.4.   Herhaalbaarheids- en reproduceerbaarheidslimieten

Met de gegevens van de verschillende gezamenlijke acties van deelnemende laboratoria die in de voorgaande tabellen zijn opgenomen, kunnen dus voor deze methode, met inbegrip van de destillatiestap, onderstaande herhaalbaarheids- en reproduceerbaarheidslimieten worden vastgesteld:

| | Herhaalbaarheidslimiet r: 0,24 |
| --- | --- |

Herhaalbaarheidslimiet r: 0,24

| | Reproduceerbaarheidslimiet R: 0,6. |
| --- | --- |

Reproduceerbaarheidslimiet R: 0,6.

11   TOTAAL ZUURGEHALTE (OIV-AS-313-01-ACITOT) — METHODE TYPE I

1.   DEFINITIE

Het totaal zuurgehalte van wijn is het totale titreerbare zuurgehalte bij titratie met een gestelde alkalische oplossing tot pH 7.

Bij het totaal zuurgehalte is koolstofdioxide niet inbegrepen.

2.   PRINCIPE VAN DE METHODE

Potentiometrische titratie of titratie in aanwezigheid van broomthymolblauw als indicator door vergelijking met een kleurstandaard.

3.   REAGENTIA

3.1.   Bufferoplossing pH 7,0:

| | Kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4): 107,3 g |
| --- | --- |

Kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4): 107,3 g

| | 1 M natriumhydroxideoplossing (NaOH): 500 ml |
| --- | --- |

1 M natriumhydroxideoplossing (NaOH): 500 ml

| | Aanvullen met water tot 1 000 ml. |
| --- | --- |

Aanvullen met water tot 1 000 ml.

Ook referentie-bufferoplossingen uit de handel kunnen worden gebruikt.

3.2.   0,1 M natriumhydroxideoplossing (NaOH).

3.3.   Broomthymolblauwoplossing, 4 g/l.

| Broomthymolblauw (C27H28Br2O5S) ... | 4 g |
| --- | --- |
| Neutrale alcohol 96 % vol ... | 200 ml |
| Voeg na oplossen toe: | |
| Water, CO2 ... | 200 ml |
| 1 M natriumhydroxideoplossing | |
| tot blauwgroene kleur verschijnt (pH 7) ... | 7,5 ml |
| Aanvullen met water tot | 1 000 ml |

Broomthymolblauw (C27H28Br2O5S) ...

4 g

Neutrale alcohol 96 % vol ...

200 ml

Voeg na oplossen toe:

Water, CO2 ...

200 ml

1 M natriumhydroxideoplossing

tot blauwgroene kleur verschijnt (pH 7) ...

7,5 ml

Aanvullen met water tot

1 000 ml

4.   APPARATUUR

4.1.   Waterstraalpomp

4.2.   Afzuigkolf van 500 ml

4.3.   Potentiometer, afleesbaar in pH-eenheden, en elektroden. Een glaselektrode moet in gedestilleerd water worden bewaard. Een calomel-elektrode (verzadigd kaliumchloride) moet in een verzadigde kaliumchlorideoplossing worden bewaard. Een gecombineerde elektrode, die het meest wordt gebruikt, moet in gedestilleerd water worden bewaard.

4.4.   Bekerglazen met een inhoud van 50 ml voor wijn en 100 ml voor gerectificeerde geconcentreerde most

5.   WERKWIJZE

5.1.   Voorbehandeling van het monster

5.1.1.   Wijn

Verwijdering van koolstofdioxide. Breng ongeveer 50 ml wijn in een afzuigkolf, sluit deze aan op de waterstraalpomp en zuig onder voortdurend schudden gedurende 1-2 minuten vacuüm.

5.1.2.   Gerectificeerde geconcentreerde most

Breng 200 g gerectificeerde geconcentreerde most (exact afgewogen) in een maatkolf van 500 ml. Vul met water aan tot de maatstreep en meng.

5.2.   Potentiometrische titratie

5.2.1.   IJking van de pH-meter

De ijking van de pH-meter gebeurt bij 20 °C volgens de aanwijzingen van het gebruikte toestel met behulp van de bufferoplossing van pH = 7,00 bij 20 °C.

5.2.2.   Meting

Breng in een bekerglas (4.4) een hoeveelheid volgens punt 5.1 voorbehandeld monster (voor wijn 10 ml en voor gerectificeerde geconcentreerde most 50 ml). Voeg ongeveer 10 ml gedestilleerd water toe en titreer met 0,1 M natriumhydroxide (3.2) tot pH 7 bij 20 °C. De base moet langzaam worden toegevoegd en de oplossing moet voortdurend worden geroerd. Zij n het gebruikte aantal milliliters 0,1 M NaOH.

5.3.   Titratie met indicator (broomthymolblauw)

5.3.1.   Voorafgaande bereiding van de kleurstandaard

Breng in een bekerglas (4.4) 25 ml gekookt gedestilleerd water, 1 ml broomthymolblauwoplossing (3.3) en een hoeveelheid volgens punt 5.1 voorbehandeld monster (voor wijn 10 ml en voor gerectificeerde geconcentreerde most 50 ml). Titreer met 0,1 M natriumhydroxide (3.2) tot een blauwgroene kleur wordt verkregen. Voeg 5 ml bufferoplossing van pH 7 (3.1) toe.

5.3.2.   Bepaling

Breng in een bekerglas (4.4) 30 ml gekookt gedestilleerd water, 1 ml broomthymolblauwoplossing (3.3) en een hoeveelheid volgens punt 5.1 voorbehandeld monster (voor wijn 10 ml en voor gerectificeerde geconcentreerde most 50 ml). Titreer met 0,1 M natriumhydroxide (3.2) tot een blauwgroene kleur wordt verkregen die identiek is aan de kleur van de kleurstandaard (5.3.1). Zij n het gebruikte aantal milliliters 0,1 M NaOH.

6.   WEERGAVE VAN DE RESULTATEN

6.1.   Berekening

6.1.1.   Wijn

Het totaal zuurgehalte, uitgedrukt in milli-equivalent per liter, is:

A = 10 n

Het resultaat wordt opgegeven met één decimaal.

Het totaal zuurgehalte, uitgedrukt in gram wijnsteenzuur per liter, is:

A′ = 0,075 × A

Het resultaat wordt opgegeven met één decimaal.

6.1.2.   Gerectificeerde geconcentreerde most

| — | Totaal zuurgehalte, uitgedrukt in milli-equivalent per kilogram gerectificeerde geconcentreerde most: a = 5 × n |
| --- | --- |

—

Totaal zuurgehalte, uitgedrukt in milli-equivalent per kilogram gerectificeerde geconcentreerde most: a = 5 × n

| — | Totaal zuurgehalte, uitgedrukt in milli-equivalent per kilogram totale suikers:






  — | A = (500 × n)/(P) |
| --- | --- | --- |

—

Totaal zuurgehalte, uitgedrukt in milli-equivalent per kilogram totale suikers:

—

A = (500 × n)/(P)

| — | P = totaal suikergehalte in % (m/m). |
| --- | --- |

—

P = totaal suikergehalte in % (m/m).

Het resultaat wordt opgegeven met één decimaal.

6.2.   Herhaalbaarheid (r) voor de titratie met indicator (5.3)

| r | = | 0,9 me/l |
| --- | --- | --- |
| r | = | 0,07 g wijnsteenzuur/l |

r

=

0,9 me/l

r

=

0,07 g wijnsteenzuur/l

voor witte wijn, rosé wijn en rode wijn.

6.3.   Reproduceerbaarheid (R) voor de titratie met indicator (5.3)

| | Voor witte wijn en rosé wijn:







  R | = | 3,6 me/l |
| --- | --- | --- | --- |
| R | = | 0,3 g wijnsteenzuur/l. |

Voor witte wijn en rosé wijn:

R

=

3,6 me/l

R

=

0,3 g wijnsteenzuur/l.

| | Voor rode wijn:







  R | = | 5,1 me/l |
| --- | --- | --- | --- |
| R | = | 0,4 g wijnsteenzuur/l. |

Voor rode wijn:

R

=

5,1 me/l

R

=

0,4 g wijnsteenzuur/l.

12   GEHALTE AAN VLUCHTIGE ZUREN (OIV-AS-313-02-ACIVOL) — METHODE TYPE I

1.   DEFINITIE

Het gehalte aan vluchtige zuren omvat het in de wijn aanwezige azijnzuur en zijn homologen, zowel vrij als gebonden.

2.   PRINCIPE VAN DE METHODE

Titratie van de via stoomdestillatie en rectificatie van de stoom uit wijn afgescheiden vluchtige zuren.

De wijn wordt vooraf van koolstofdioxide ontdaan.

Het zuurgehalte van het destillaat moet worden gecorrigeerd voor het vrije en gebonden zwaveldioxide dat onder deze omstandigheden mee overdestilleert.

Ook voor het eventueel aan de wijn toegevoegde sorbinezuur moet worden gecorrigeerd.

Opmerking:

In sommige landen wordt salicylzuur gebruikt om wijn vóór de analyse te stabiliseren en dit destilleert gedeeltelijk over. Het is noodzakelijk dit te bepalen en het zuurgehalte hiervoor te corrigeren. De bepalingsmethode hiervoor wordt in punt 7 van dit hoofdstuk vermeld.

3.   REAGENTIA

3.1.   Wijnsteenzuurkristallen (C4H6O6)

3.2.   0,1 M natriumhydroxideoplossing (NaOH)

3.3.   Fenolftaleïneoplossing, 1 % in neutrale alcohol 96 % vol

3.4.   Zoutzuur (ρ20 = 1,18-1,19 g/ml), verdund 1/4 (v/v)

3.5.   0,005 M joodoplossing (I2)

3.6.   Kaliumjodidekristallen (KI)

3.7.   Zetmeeloplossing, 5 g/l

Meng 5 g stijfsel met ongeveer 500 ml water. Breng al roerend aan de kook en laat gedurende 10 minuten doorkoken; voeg 200 g natriumchloride toe. Vul na afkoelen aan tot 1 l.

3.8.   Verzadigde natriumboraatoplossing (Na2B4O7 +10 H2O), ongeveer 55 g/l bij 20 °C.

4.   APPARATUUR

4.1.   Stoomdestillatie-opstelling, bestaande uit:

| 1) | stoomgenerator; de geproduceerde stoom moet koolstofdioxidevrij zijn; |
| --- | --- |

1)

stoomgenerator; de geproduceerde stoom moet koolstofdioxidevrij zijn;

| 2) | borrelvat; |
| --- | --- |

2)

borrelvat;

| 3) | rectificeerkolom; |
| --- | --- |

3)

rectificeerkolom;

| 4) | koeler. |
| --- | --- |

4)

koeler.

De opstelling moet voldoen aan de volgende drie voorwaarden:

| a) | Breng 20 ml gekookt water in het borrelvat. Destilleer 250 ml over en voeg hieraan 0,1 ml 0,1 M natriumhydroxideoplossing (3.2) en 2 druppels fenolftaleïneoplossing (3.3) toe; de roze kleur moet ten minste 10 seconden blijven bestaan (controle of de stoom koolstofdioxidevrij is). |
| --- | --- |

a)

Breng 20 ml gekookt water in het borrelvat. Destilleer 250 ml over en voeg hieraan 0,1 ml 0,1 M natriumhydroxideoplossing (3.2) en 2 druppels fenolftaleïneoplossing (3.3) toe; de roze kleur moet ten minste 10 seconden blijven bestaan (controle of de stoom koolstofdioxidevrij is).

| b) | Breng 20 ml 0,1 M azijnzuuroplossing in het borrelvat. Destilleer 250 ml over. Titreer met de 0,1 M natriumhydroxideoplossing (3.2). Het gebruikte volume moet ten minste 19,9 ml zijn (overgedestilleerd azijnzuur ≥ 99,5 %). |
| --- | --- |

b)

Breng 20 ml 0,1 M azijnzuuroplossing in het borrelvat. Destilleer 250 ml over. Titreer met de 0,1 M natriumhydroxideoplossing (3.2). Het gebruikte volume moet ten minste 19,9 ml zijn (overgedestilleerd azijnzuur ≥ 99,5 %).

| c) | Breng 20 ml 1 M melkzuuroplossing in het borrelvat. Destilleer 250 ml over en titreer met de 0,1 M natriumhydroxideoplossing (3.2). |
| --- | --- |

c)

Breng 20 ml 1 M melkzuuroplossing in het borrelvat. Destilleer 250 ml over en titreer met de 0,1 M natriumhydroxideoplossing (3.2).

Het gebruikte volume mag maximaal 1,0 ml zijn (overgedestilleerd melkzuur ≤ 0,5 %).

Elke opstelling of elke techniek die aan deze voorwaarden voldoet, wordt officieel internationaal erkend.

4.2.   Waterstraalpomp

4.3.   Afzuigkolf

5.   WERKWIJZE

5.1.   Voorbereiding van het monster; verwijdering van koolstofdioxide.

Breng ongeveer 50 ml wijn in een afzuigkolf, sluit deze aan op de waterstraalpomp en zuig onder voortdurend schudden gedurende 1-2 minuten vacuüm.

5.2.   Stoomdestillatie

Breng 20 ml volgens punt 5.1 koolstofdioxidevrij gemaakte wijn in het borrelvat. Voeg ongeveer 0,5 g wijnsteenzuur (3.1) toe. Vang ten minste 250 ml destillaat op.

5.3.   Titratie

Titreer met 0,1 M natriumhydroxideoplossing (3.2) in aanwezigheid van twee druppels fenolftaleïneoplossing (3.3). Zij n ml het gebruikte volume.

Voeg hierna vier druppels 1/4 verdund zoutzuur (3.4), 2 ml zetmeeloplossing (3.7) en enkele kaliumjodidekristallen (3.6) toe. Titreer het vrije zwaveldioxide met 0,005 M joodoplossing (3.5). Zij n' ml het gebruikte volume.

Voeg vervolgens zoveel verzadigde natriumboraatoplossing (3.8) toe dat de roze kleur weer verschijnt. Titreer het gebonden zwaveldioxide met 0,005 M joodoplossing (3.5). Zij n'' ml het gebruikte volume.

6.   WEERGAVE VAN DE RESULTATEN

6.1.   Berekening

Het gehalte aan vluchtige zuren, uitgedrukt in milli-equivalent per liter met één decimaal, is:

A = 5 • (n - 0,1 • n′ - 0,05 • n′′)

Het gehalte aan vluchtige zuren, uitgedrukt in gram azijnzuur per liter met twee decimalen, is:

0,300 • (n - 0,1 • n′ - 0,05 • n′′)

6.2.   Herhaalbaarheid (r)

| r | = | 0,7 me/l |
| --- | --- | --- |
| r | = | 0,04 g azijnzuur/l. |

r

=

0,7 me/l

r

=

0,04 g azijnzuur/l.

6.3.   Reproduceerbaarheid (R)

| R | = | 1,3 me/l |
| --- | --- | --- |
| R | = | 0,08 g azijnzuur/l. |

R

=

1,3 me/l

R

=

0,08 g azijnzuur/l.

6.4.   Wijn met toegevoegd sorbinezuur

Het gehalte aan vluchtige zuren moet worden gecorrigeerd voor het sorbinezuur, dat voor 96 % overkomt bij een destillaatvolume van 250 ml. Elke 100 mg sorbinezuur komt overeen met 0,89 milli-equivalenten of 0,053 g azijnzuur. De bepaling van sorbinezuur (in mg/l) wordt elders beschreven.

7.   BEPALING VAN HET MET HET DESTILLAAT OVERGEKOMEN SALICYLZUUR

7.1.   Principe

Na de bepaling van het gehalte aan vluchtige zuren en de correctie voor zwaveldioxide wordt de aanwezigheid van salicylzuur aangetoond door de violette kleur die na aanzuren verschijnt bij toevoeging van een ijzer(III)zout.

De bepaling van het met het destillaat overgekomen salicylzuur gebeurt bij een tweede destillaat met een volume dat gelijk is aan het volume waarin het gehalte aan vluchtige zuren is bepaald. In dit destillaat wordt salicylzuur colorimetrisch bepaald door middel van een vergelijkende bepaling. Het gevonden gehalte moet in mindering worden gebracht op het zuurgehalte van het destillaat ter bepaling van het vluchtige zuur.

7.2.   Reagentia

7.2.1.   Zoutzuur (HCl) (ρ20 = 1,18 to 1,19 g/ml).

7.2.2.   0,1 M natriumthiosulfaat (Na2S2O3 × 5H2O)

7.2.3.   IJzer(III)ammoniumsulfaat (Fe2 (SO4)3 × (NH4)2 SO4 × 24 H2O), 10 %-oplossing (m/v)

7.2.4.   0,01 M natriumsalicylaatoplossing die 1,60 g natriumsalicylaat (NaC7H5O3)/l bevat.

7.3.   Werkwijze

7.3.1.   Aantonen van salicylzuur in het destillaat ter bepaling van de vluchtige zuren

Voeg, onmiddellijk na de bepaling van de vluchtige zuren en de correctie voor het vrije en gebonden zwaveldioxide, aan deze oplossing in de erlenmeyer 0,5 ml zoutzuur (7.2.1), 3 ml 0,1 M natriumthiosulfaatoplossing (7.2.2) en 1 ml ijzer(III)ammoniumsulfaatoplossing (7.2.3) toe.

Als salicylzuur aanwezig is, verschijnt er een violette kleur.

7.3.2.   Kwantitatieve bepaling van salicylzuur

Geef de hoogte van het vloeistofniveau met een streep op de gebruikte erlenmeyer aan. Ledig en reinig de erlenmeyer.

Voer bij een nieuw monster van 20 ml wijn stoomdestillatie uit en vang het destillaat tot de aangebrachte streep in de erlenmeyer op. Voeg 0,3 ml zuiver zoutzuur (7.2.1) en 1 ml ijzer(III)ammoniumsulfaatoplossing (7.2.3) toe. De inhoud van de erlenmeyer zal violet kleuren.

Breng in een identieke erlenmeyer zoveel gedestilleerd water dat het vloeistofniveau even hoog staat als in de erlenmeyer met destillaat. Voeg 0,3 ml zuiver zoutzuur (7.2.1) en 1 ml ijzer(III)ammoniumsulfaatoplossing (7.2.3) toe. Voeg met een buret 0,01 M natriumsalicylaatoplossing (7.2.4) toe tot een violette kleur verschijnt met dezelfde intensiteit als die in de erlenmeyer met het destillaat van de wijn.

Zij het gebruikte volume n''' ml.

7.4.   Op het gehalte aan vluchtige zuren aan te brengen correctie

Verminder het volume 0,1 M natriumhydroxide (n) dat is gebruikt bij het titreren van het destillaat voor de bepaling van het gehalte aan vluchtige zuren, met 0,1 × n'''.

13   CITROENZUUR (OIV-AS-313-09-ACIENZ) — METHODE TYPE II

1.   PRINCIPE VAN DE METHODE

Citroenzuur wordt tijdens een door citraatlyase (CL) gekatalyseerde reactie omgezet in oxaalacetaat en acetaat:

Citraat ←→ oxaalacetaat + acetaat

Het oxaalacetaat en zijn decarboxyleringsproduct (pyruvaat) worden met gereduceerd nicotinezuuramide-adenine-dinucleotide (NADH) in aanwezigheid van malaatdehydrogenase (MDH) en lactaatdehydrogenase (LDH) gereduceerd tot L-malaat en L-lactaat:

| | Oxaalacetaat + NADH + H+ ←→ L-malaat + NAD+ |
| --- | --- |

Oxaalacetaat + NADH + H+ ←→ L-malaat + NAD+

| | Pyruvaat + NADH + H+ ←→ L-lactate + NAD+ |
| --- | --- |

Pyruvaat + NADH + H+ ←→ L-lactate + NAD+

De hoeveelheid bij deze reacties tot NAD+ geoxideerd NADH is evenredig aan het aanwezige citraat. Het geoxideerde NADH wordt bepaald door de afname van de extinctie bij een golflengte van 340 nm te meten.

2.   REAGENTIA

2.1.   Buffer, pH 7,8

(0,51 M glycylglycine; pH = 7,8; 0,6 × 10-3 M Zn2+)

Los 7,13 g glycylglycine op in ongeveer 70 ml dubbel gedestilleerd water.

Breng de pH met ongeveer 13 ml 5 M natriumhydroxideoplossing op 7,8; voeg 10 ml zinkchlorideoplossing (80 mg ZnCl2 in 100 ml) toe en vul aan tot 100 ml met dubbel gedestilleerd water.

De oplossing is ten minste vier weken houdbaar bij +4 °C.

2.2.   Gereduceerd nicotinezuuramide-adenine-dinucleotide-oplossing (NADH), ongeveer 6.10-3 M: Los 30 mg NADH en 60 mg NaHCO3 op in 6 ml dubbel gedestilleerd water.

2.3.   Oplossing van malaatdehydrogenase/lactaatdehydrogenase (MDH/LDH) (0,5 mg MDH/ml; 2,5 mg LDH/ml):

Meng 0,1 ml MDH (5 mg MDH/ml), 0,4 ml ammoniumsulfaatoplossing (3,2 M) en 0,5 ml LDH (5 mg LDH/ml). Deze suspensie is ten minste één jaar houdbaar bij + 4 °C.

2.4.   Citraatlyase (CL) (5 mg eiwit/ml): Los 168 mg lyofilisaat op in 1 ml ijskoud water. Deze oplossing is ten minste één week houdbaar bij + 4 °C en ten minste vier weken in bevroren vorm.

Het verdient aanbeveling de enzymactiviteit te controleren alvorens een meting uit te voeren.

2.5.   Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP)

Opmerking: Alle voor deze bepaling benodigde reagentia worden in de handel in kitvorm aangeboden.

3.   APPARATUUR

3.1.   Spectrofotometer waarmee bij 340 nm (het extinctiemaximum van NADH) kan worden gemeten.

Indien een dergelijke spectrofotometer niet beschikbaar is, kan een spectrofotometer met discontinu spectrum worden gebruikt waarmee metingen kunnen worden verricht bij 334 nm of 365 nm. Aangezien het om absolute metingen gaat (geen ijkreeks, maar berekening met de extinctiecoëfficiënt van NADH), moeten de golflengte- en extinctieschaal van het apparaat worden geijkt.

3.2.   Glazen kuvetten met een optische weglengte van 1 cm of wegwerpkuvetten.

3.3.   Micropipetten waarmee volumes van 0,02 tot 2 ml kunnen worden genomen.

4.   VOORBEHANDELING VAN HET MONSTER

De bepaling van het citraat gebeurt in het algemeen direct in de wijn zonder voorafgaande ontkleuring en zonder verdunning, mits het citroenzuurgehalte lager is dan 400 mg/l. Bij hogere gehalten moet de wijn zodanig worden verdund dat de citraatconcentratie tussen 20 en 400 mg/l komt te liggen (hoeveelheid citraat in het monster tussen 5 en 80 μg).

Voor rode wijn die rijk is aan fenolische bestanddelen, wordt aanbevolen deze eerst te behandelen met PVPP:

maak een suspensie van ongeveer 0,2 g PVPP in water. Laat 15 minuten bezinken. Filtreer over een vouwfilter.

Voeg aan 10 ml wijn in een erlenmeyer van 50 ml met behulp van een spatel het vochtige PVPP toe. Schud gedurende 2-3 minuten en filtreer.

5.   WERKWIJZE

Stel de spectrofotometer in op meting bij een golflengte van 340 nm; de extinctie wordt gemeten in kuvetten van 1 cm; de nulwaarde wordt ingesteld door een meting uit te voeren tegen lucht (geen kuvet in de lichtweg). Breng in twee kuvetten met een optische weglengte van 1 cm:

| | Blanco | Bepaling |
| --- | --- | --- |
| Oplossing 2.1 | 1,00 ml | 1,00 ml |
| Oplossing 2.2 | 0,10 ml | 0,10 ml |
| Monster | — | 0,20 ml |
| Dubbel gedestilleerd water | 2,00 ml | 1,80 ml |
| Oplossing 2.3 | 0,02 ml | 0,02 ml |

Blanco

Bepaling

Oplossing 2.1

1,00 ml

1,00 ml

Oplossing 2.2

0,10 ml

0,10 ml

Monster

—

0,20 ml

Dubbel gedestilleerd water

2,00 ml

1,80 ml

Oplossing 2.3

0,02 ml

0,02 ml

Meng; lees na ongeveer 5 minuten de extinctie van de blanco en de meetoplossing af (E1).

Voeg toe:

| Oplossing 2.4 | 0,02 ml | 0,02 ml |
| --- | --- | --- |

Oplossing 2.4

0,02 ml

0,02 ml

Meng; wacht het einde van de reactie af (ongeveer 5 minuten) en lees de extinctie van de blanco en de meetoplossing af (E2).

Bepaal de extinctieverschillen (E1 - E2) voor de blanco en de meetoplossing.

Trek het extinctieverschil van de blanco van het extinctieverschil van de meetoplossing af:

ΔE = ΔE M – ΔEB

Opmerking: De enzymactiviteit kan van charge tot charge verschillen. Bovenstaande reactietijd is dan ook slechts een indicatie. Het verdient aanbeveling deze per charge te bepalen.

6.   WEERGAVE VAN DE RESULTATEN

Het gehalte aan citroenzuur wordt opgegeven in milligram per liter (mg/l) zonder decimalen.

6.1.   Berekening

De concentratie in milligram per liter wordt berekend met de algemene formule:

C = ((V × M)/(ε × d × v)) × ΔE

| V | = | volume in de kuvet in ml (hier 3,14 ml) |
| --- | --- | --- |
| v | = | volume van het monster in ml (hier 0,2 ml) |
| M | = | molecuulmassa van de te bepalen stof (watervrij citroenzuur = 192,1) |
| d | = | optische weglengte van de kuvet in cm (hier 1 cm) |
| ε | = | extinctiecoëfficiënt van NADH bij 340 nm: |
| ε | = | 6,3 mmole– 1 × l × cm– 1. |

V

=

volume in de kuvet in ml (hier 3,14 ml)

v

=

volume van het monster in ml (hier 0,2 ml)

M

=

molecuulmassa van de te bepalen stof (watervrij citroenzuur = 192,1)

d

=

optische weglengte van de kuvet in cm (hier 1 cm)

ε

=

extinctiecoëfficiënt van NADH bij 340 nm:

ε

=

6,3 mmole– 1 × l × cm– 1.

Dus:

C = 479 × ΔE

Indien bij de voorbehandeling van het monster een verdunning is uitgevoerd, moet het resultaat met de verdunningsfactor worden vermenigvuldigd.

Opmerking: Meting bij 334 nm: C = 488 × ΔE (ε = 6,2 mmole– 1 × l × cm– 1)

Meting bij 365 nm: C = 887 × ΔE (ε = 3,4 mmole– 1 × l × cm– 1)

6.2.   Herhaalbaarheid (r)

Citroenzuurgehalte lager dan 400 mg/l: r = 14 mg/l.

Citroenzuurgehalte hoger dan 400 mg/l: r = 28 mg/l.

6.3.   Reproduceerbaarheid (R)

Citroenzuurgehalte lager dan 400 mg/l: R = 39 mg/l.

Citroenzuurgehalte hoger dan 400 mg/l: R = 65 mg/l.

14   SORBINEZUUR (OIV-AS-313-14-ACISOR) — METHODE TYPE IV

1.   PRINCIPE VAN DE METHODE

1.1.   Bepaling met UV-absorptiespectrofotometrie

Sorbinezuur (trans,trans-2,4-hexadieenzuur) wordt door middel van stoomdestillatie geïsoleerd en in het destillaat door UV-absorptiespectrofotometrie bepaald. Stoffen die de UV-absorptiemeting storen, worden verwijderd door droogdampen van het monster van het destillaat nadat het vooraf met een calciumhydroxideoplossing licht alkalisch is gemaakt. Concentraties lager dan 20 mg/l moeten met dunnelaagchromatografie worden bevestigd (gevoeligheid: 1 mg/l).

1.2.   Gaschromatografische bepaling

Het in diethylether geëxtraheerde sorbinezuur wordt gaschromatografisch bepaald met behulp van een interne standaard.

1.3.   Aantonen van sporen met dunnelaagchromatografie

Het in diethylether geëxtraheerde sorbinezuur wordt met dunnelaagchromatografie gescheiden en de concentratie wordt semi-kwantitatief bepaald.

2.   BEPALING MET UV-ABSORPTIESPECTROFOTOMETRIE

2.1.   Reagentia

2.1.1.   Wijnsteenzuurkristallen (C4H6O6).

2.1.2.   Calciumhydroxideoplossing (Ca (OH)2)ongeveer 0,02 M.

2.1.3.   Referentiesorbinezuuroplossing, 20 mg/l

Los 20 mg sorbinezuur (C6H8O2) op in ongeveer 2 ml 0,1 M natriumhydroxideoplossing. Breng over in een maatkolf van 1 000 ml en vul met water aan tot de maatstreep. In plaats hiervan kan ook 26,8 mg kaliumsorbaat (C6H7KO2) worden opgelost in water en met water tot 1 000 ml worden aangevuld.

2.2.   Apparatuur

2.2.1.   Stoomdestillatieopstelling (zie het hoofdstuk „Gehalte aan vluchtige zuren”).

2.2.2.   Waterbad, 100 °C.

2.2.3.   Spectrofotometer waarmee bij een golflengte van 256 nm metingen kunnen worden uitgevoerd in kwartskuvetten met een optische weglengte van 1 cm.

2.3.   Werkwijze

2.3.1.   Destillatie

Breng 10 ml wijn in het borrelvat van de stoomdestillatieopstelling en voeg 1-2 g wijnsteenzuur (2.1.1) toe. Destilleer 250 ml over.

2.3.2.   IJklijn

Bereid door verdunning met water van de referentieoplossing (2.1.3) vier verdunde referentieoplossingen met een sorbinezuurconcentratie van respectievelijk 0,5, 1, 2,5 en 5 mg/l; meet met behulp van de spectrofotometer de respectieve extincties bij 256 nm tegen gedestilleerd water. Zet de verkregen extincties uit tegen de bijbehorende concentraties van de oplossingen. Dit levert een rechte lijn op.

2.3.3.   Bepaling

Breng 5 ml destillaat in een indampschaal met een doorsnede van 55 mm en voeg 1 ml calciumhydroxideoplossing (2.1.2) toe. Damp droog op het kokend waterbad.

Neem het residu op in enkele milliliters gedestilleerd water, breng dit kwantitatief over in een maatkolf van 20 ml en vul met waswater aan tot de maatstreep. Meet met de spectrofotometer de extinctie bij 256 nm tegen een blanco, verkregen door 1 ml calciumhydroxideoplossing (2.1.2) met water tot 20 ml aan te vullen.

Met de gemeten waarde van de extinctie wordt uit de ijklijn de concentratie C van de sorbinezuuroplossing afgelezen.

Opmerking: In de praktijk is droogdampen overbodig. Men kan de meting van de extinctie direct op het 1/4 met gedestilleerd water verdunde destillaat uitvoeren.

2.4.   Weergave van de resultaten

2.4.1.   Berekening

De sorbinezuurconcentratie van de wijn, uitgedrukt in milligram per liter, is dan:

100 × C

C = sorbinezuurconcentratie van de spectrofotometrisch geanalyseerde oplossing, uitgedrukt in milligram per liter.

3.   GASCHROMATOGRAFISCHE BEPALING

3.1.   Reagentia

3.1.1.   Diethylether, (C2H5)2O, vers gedestilleerd.

3.1.2.   Interne standaardoplossing: oplossing van undecaanzuur (C11H22O2) in 95 % vol. ethanol, 1 g/l.

3.1.3.   Oplossing van zwavelzuur (H2SO4) (ρ20 = 1,84 g/ml) in water, 1/3 (v/v).

3.2.   Apparatuur

3.2.1.   Gaschromatograaf met vlamionisatiedetector en roestvrij stalen kolom (4 m × 1/8 inch), vooraf behandeld met dimethyldichloorsilaan en gevuld met een stationaire fase, bestaande uit een mengsel van diethyleenglycolsuccinaat (5 %) en fosforzuur (1 %) (DEGS-H3PO4) of uit een mengsel van diethyleenglycoladipaat (7 %) en fosforzuur (1 %) (DEGA-H3PO4), gebonden aan Gaschrom Q 80 - 100 mesh.

Voor de behandeling met dimethyldichloorsilaan laat men een oplossing van 2-3 g DMDCS in tolueen door de kolom lopen. Was de kolom onmiddellijk met methanol; leid stikstof door de kolom, vervolgens hexaan en dan opnieuw stikstof. Daarna kan de kolom gevuld worden.

Werkomstandigheden:

| | Oventemperatuur: 175 °C. |
| --- | --- |

Oventemperatuur: 175 °C.

| | Injector- en detectortemperatuur: 230 °C. |
| --- | --- |

Injector- en detectortemperatuur: 230 °C.

| | Draaggas: stikstof (20 ml/min). |
| --- | --- |

Draaggas: stikstof (20 ml/min).

3.2.2.   Injectiespuit van 10 μl, onderverdeeld in 0,1 μl.

Opmerking: Ook met andere soorten kolommen kan een goede scheiding worden uitgevoerd, met name met een capillaire kolom (bijvoorbeeld FFAP).

Onderstaande werkwijze is als voorbeeld bedoeld.

3.3.   Werkwijze

3.3.1.   Voorbehandeling van het monster

Breng 20 ml wijn in een reageerbuis van ongeveer 40 ml met ingeslepen stop en voeg 2 ml interne standaardoplossing (3.1.2) en 1 ml verdund zwavelzuur (3.1.3) toe.

Voeg na herhaaldelijk omzwenken 10 ml diethylether (3.1.1) toe. Extraheer sorbinezuur naar de organische fase door de buis gedurende 5 minuten te schudden. Laat de fasen scheiden.

3.3.2.   Voorbehandeling van de referentieoplossing

Selecteer een wijn waarvan het chromatogram van het etherextract geen enkele piek vertoont met de retentietijd van sorbinezuur; voeg aan deze wijn sorbinezuur toe tot een concentratie van 100 mg/l. Pas op 20 ml van het aldus behandelde monster de in punt 3.3.1 beschreven werkwijze toe.

3.3.3.   Chromatografie

Injecteer met de injectiespuit achtereenvolgens 2 μl van de bij punt 3.3.2 verkregen etherfase en 2 μl van de bij punt 3.3.1 verkregen etherfase in de gaschromatograaf.

Registreer de respectieve chromatogrammen; zoek de pieken bij de retentietijd van respectievelijk sorbinezuur en de interne standaard. Meet de hoogte (of het oppervlak) van elk der geregistreerde pieken.

3.4.   Weergave van de resultaten

3.4.1.   Berekening

De sorbinezuurconcentratie van de geanalyseerde wijn, uitgedrukt in milligram per liter, is:

100 × (h/H) × (l/i)

H= piekhoogte van sorbinezuur in de referentieoplossing

h= piekhoogte van sorbinezuur in het geanalyseerde monster

l= piekhoogte van de interne standaard in de referentieoplossing

i= piekhoogte van de interne standaard in het geanalyseerde monster.

NB: De sorbinezuurconcentratie kan evenzo op basis van de respectieve piekoppervlakken worden bepaald.

15   PH (OIV-AS-313-15-PH) — METHODE TYPE I

1.   PRINCIPE VAN DE METHODE

Het potentiaalverschil wordt gemeten tussen twee elektroden die in de te onderzoeken vloeistof zijn gedompeld. Eén van deze elektroden heeft een potentiaal die een functie is van de pH van de vloeistof, de andere elektrode is de referentie-elektrode, die een vaste en bekende potentiaal heeft.

2.   APPARATUUR

2.1.   pH-meter, in pH-eenheden geijkt, waarmee metingen tot op 0,05 eenheden nauwkeurig kunnen worden uitgevoerd

2.2.   Elektroden

2.2.1.   Glaselektrode, te bewaren in gedestilleerd water

2.2.2.   Referentie-elektrode (calomel/verzadigd kaliumchloride), te bewaren in een verzadigde kaliumchlorideoplossing.

2.2.3.   Of een gecombineerde elektrode, te bewaren in gedestilleerd water

3.   REAGENTIA

3.1.   Bufferoplossingen

3.1.1.   Verzadigde oplossing van kaliumwaterstoftartraat. Deze oplossing bevat ten minste 5,7 g/l kaliumwaterstoftartraat (C4H5KO6) bij 20 °C. Deze oplossing is bij toevoeging van 0,1 g thymol per 200 ml 2 maanden houdbaar.

| pH | 3,57 bij 20 °C
  3,56 bij 25 °C
  3,55 bij 30 °C |
| --- | --- |

pH

3,57 bij 20 °C

3,56 bij 25 °C

3,55 bij 30 °C

3.1.2.   0,05 M kaliumwaterstofftalaatoplossing. Deze oplossing bevat 10,211 g/l kaliumwaterstofftalaat (C8H5KO4) bij 20 °C. (Maximale houdbaarheid: 2 maanden.)

| pH | 3,999 bij 15 °C
  4,003 bij 20 °C
  4,008 bij 25 °C
  4,015 bij 30 °C |
| --- | --- |

pH

3,999 bij 15 °C

4,003 bij 20 °C

4,008 bij 25 °C

4,015 bij 30 °C

3.1.3.   Oplossing bestaande uit:

| Kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2 PO4) ... | 3,402 g |
| --- | --- |
| Dikaliumwaterstoffosfaat (K2 H PO4) ... | 4,354 g |
| Gedestilleerd water tot: ... | 1 l |

Kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2 PO4) ...

3,402 g

Dikaliumwaterstoffosfaat (K2 H PO4) ...

4,354 g

Gedestilleerd water tot: ...

1 l

(Maximale houdbaarheid: 2 maanden.)

| pH | 6,90 bij 15 °C
  6,88 bij 20 °C
  6,86 bij 25 °C
  6,85 bij 30 °C |
| --- | --- |

pH

6,90 bij 15 °C

6,88 bij 20 °C

6,86 bij 25 °C

6,85 bij 30 °C

Opmerking: Men kan ook referentiebufferoplossingen uit de handel gebruiken.

4.   WERKWIJZE

4.1.   Voorbehandeling van het monster

4.1.1.   Most en wijn

Voer de bepaling direct op de most of de wijn uit.

4.1.2.   Gerectificeerde geconcentreerde most

Verdun de gerectificeerde geconcentreerde most met water om een oplossing te verkrijgen met een totaal suikergehalte van 25 ± 0,5 % (m/m) (25 oBrix).

Indien P het totale suikergehalte in % (m/m) van de gerectificeerde geconcentreerde most is, weeg dan een hoeveelheid af die gelijk is aan 2 500/P

en vul deze met water aan tot 100 g. Het gebruikte water moet een geleidend vermogen hebben dat lager is dan 2 microsiemens/cm.

4.2.   Nulpuntsinstelling van de pH-meter

Het nulpunt moet vóór elke meting volgens de bij de pH-meter behorende gebruiksaanwijzing worden ingesteld.

4.3.   IJking van de pH-meter

De ijking wordt bij 20 °C volgens de bij de pH-meter behorende gebruiksaanwijzing met bufferoplossingen van pH 6,88 en 3,57 bij 20 °C uitgevoerd.

Gebruik de bufferoplossing van pH 4,00 bij 20 °C om de ijking te controleren.

4.4.   Bepaling

Dompel de elektrode in het monster, dat een temperatuur tussen 20 en 25 °C en wel zo dicht mogelijk bij 20 °C moet hebben. Lees de pH-waarde direct op de schaal af.

Voer ten minste twee bepalingen bij hetzelfde monster uit.

Neem als resultaat het rekenkundige gemiddelde van de bepalingen.

5.   WEERGAVE VAN DE RESULTATEN

De pH van de most, de wijn of de tot 25 % (m/m) (25 oBrix) verdunde gerectificeerde geconcentreerde most wordt met twee decimalen opgegeven.

16   GELIJKTIJDIGE BEPALING VAN L-ASCORBINEZUUR EN D-ISOASCORBINEZUUR MET BEHULP VAN HPLC EN UV-DETECTIE (OIV-AS-313-22-ACASCO) — METHODE TYPE II

1.   INLEIDING

Ascorbinezuur is een antioxidant die van nature in een hele reeks voedingsmiddelen aanwezig is. De normale hoeveelheid ascorbinezuur in de druif daalt tijdens de bereiding van most en wijn. Ascorbinezuur mag binnen bepaalde grenzen aan most en aan wijn worden toegevoegd.

De beschreven methode is in het kader van ringonderzoeken gevalideerd door de analyse van wijnmonsters waaraan hoeveelheden van 30 mg/l tot 150 mg/l L-ascorbinezuur respectievelijk 10 mg/l tot 100 mg/l D-isoascorbinezuur zijn toegevoegd.

2.   TOEPASSINGSGEBIED

Deze methode is geschikt voor de gelijktijdige bepaling van L-ascorbinezuur en D-isoascorbinezuur (erythorbinezuur) in wijn met behulp van hogedrukvloeistofchromatografie en UV-detectie op een bereik van 3-150 mg/l.

Wanneer het gehalte hoger is dan 150 mg/l, moet het monster worden verdund.

3.   PRINCIPE VAN DE METHODE

De monsters worden na filtratie over een membraanfilter rechtstreeks in het HPLC-systeem geïnjecteerd. De te bepalen stoffen worden over een kolom met omgekeerde fase gescheiden en met UV bij 266 nm gedetecteerd. De kwantificering van L-ascorbinezuur en D-isoascorbinezuur gebeurt met behulp van een externe standaard.

Opmerking: De kolommen en werkomstandigheden worden als voorbeeld vermeld. Ook andere soorten kolommen kunnen een goede scheiding opleveren.

4.   REAGENTIA EN PRODUCTEN

4.1.   Reagentia

4.1.1.   n-Octylamine, zuiverheid ≥ 99,0 %

4.1.2.   Natriumacetaat × 3 H2O, zuiverheid ≥ 99,0 %

4.1.3.   Azijnzuur, 100 % zuiver

4.1.4.   Fosforzuur, ongeveer 25 %

4.1.5.   Oxaalzuur, zuiverheid ≥ 99,0 %

4.1.6.   Ascorbaatoxidase

4.1.7.   L-Ascorbinezuur, ultrazuiver ≥ 99,5 %

4.1.8.   D-Isoascorbinezuur, zuiverheid ≥ 99,0 %

4.1.9.   Dubbel gedestilleerd water

4.1.10.   Methanol p.a., 99,8 %

4.2.   Bereiding van de mobiele fase:

4.2.1.   Oplossingen voor de mobiele fase

Bereid de volgende oplossingen voor de mobiele fase:

4.2.1.1.   12,93 g n-octylamine in 100 ml methanol

4.2.1.2.   68,05 g natriumacetaat × 3 H2O in 500 ml dubbel gedestilleerd water

4.2.1.3.   12,01 g zuiver azijnzuur in 200 ml dubbel gedestilleerd water

4.2.1.4.   Bufferoplossing (pH 5,4): 430 ml natriumacetaatoplossing (4.2.1.2) en 70 ml verdund azijnzuur (4.2.1.3)

4.2.2.   Bereiding van de mobiele fase:

Voeg 5 ml n-octylamineoplossing (4.2.1.1) toe aan ongeveer 400 ml dubbel gedestilleerd water in een bekerglas. Breng deze oplossing op pH 5,4-5,6 door druppelsgewijs 25 %-fosforzuur (4.1.4) toe te voegen. Voeg 50 ml bufferoplossing (4.2.1.4) toe, breng het geheel over in een maatkolf van 1 000 ml en vul met dubbel gedestilleerd water aan tot de maatstreep. Vóór gebruik moet de mobiele fase worden gefiltreerd over een membraanfilter (geregenereerd cellulose, 0,2 μm) en indien mogelijk afhankelijk van de behoefte van het gebruikte HLPC-systeem met helium worden ontgast (gedurende ongeveer 10 minuten).

4.3.   Bereiding van de standaardoplossing

Opmerking:

Alle standaardoplossingen (stockoplossing (4.3.1) en werkoplossingen (4.3.2)) moeten elke dag vers worden bereid en bij voorkeur vóór injectie in een koelkast worden bewaard.

4.3.1.   Bereiding van de stockoplossing (1 mg/ml)

Bereid een 2 %-oplossing van oxaalzuur in water en verwijder de opgeloste zuurstof door stikstof door te leiden.

Weeg precies 100 mg L-ascorbinezuur en 100 mg D-isoascorbinezuur af in een maatkolf van 100 ml en vul met de 2 %-oxaalzuuroplossing aan tot de maatstreep.

4.3.2.   Bereiding van de werkoplossingen

Verdun voor de werkoplossingen de stockoplossing (4.3.1) met de 2 %-oxaalzuuroplossing tot de gewenste concentraties. Concentraties tussen 10 mg/l en 120 mg/l worden aanbevolen. Verdun bijvoorbeeld 100 μl, 200 μl, 400 μl, 800 μl en 1 200 μl tot 10 ml om concentraties van 10, 20, 40, 80 en 120 mg/l te krijgen.

5.   APPARATUUR

Gebruikelijke laboratoriumuitrusting en met name:

5.1.   HLPC-pomp

5.2.   Loopinjector, 20 μl

5.3.   UV-detector

6.   MONSTERNEMING

Wijnmonsters worden vóór injectie gefiltreerd over een membraanfilter met een poriegrootte van 0,2 μm.

Wanneer het gehalte hoger is dan 150 mg/l, moet het monster worden verdund.

7.   WERKWIJZE

7.1.   Werkomstandigheden voor het HLPC-systeem

Injecteer 20 μl over een membraanfilter gefiltreerd monster in de chromatograaf.

| Prekolom | : | bijvoorbeeld Nucleosil 120 C18 (4 cm × 4 mm × 7 μm) |
| --- | --- | --- |
| Kolom | : | bijvoorbeeld Nucleosil 120 C18 (25 cm × 4 mm × 7 μm) |
| Injectievolume | : | 20 μl |
| Mobiele fase | : | zie 4.2.2 (isocratisch) |
| Debiet | : | 1 ml/min |
| UV-detectie | : | 266 nm |
| Spoelcyclus | : | ten minste 30 ml dubbel gedestilleerd water, gevolgd door 30 ml methanol en 30 ml acetonitril. |

Prekolom

:

bijvoorbeeld Nucleosil 120 C18 (4 cm × 4 mm × 7 μm)

Kolom

:

bijvoorbeeld Nucleosil 120 C18 (25 cm × 4 mm × 7 μm)

Injectievolume

:

20 μl

Mobiele fase

:

zie 4.2.2 (isocratisch)

Debiet

:

1 ml/min

UV-detectie

:

266 nm

Spoelcyclus

:

ten minste 30 ml dubbel gedestilleerd water, gevolgd door 30 ml methanol en 30 ml acetonitril.

7.2.   Identificatie/Bevestiging

De identificatie van de pieken gebeurt door vergelijking van de retentietijden van de standaardoplossingen en de monsters. Met het beschreven chromatografiesysteem zijn de retentietijden voor L-ascorbinezuur en D-isoascorbinezuur respectievelijk 7,7 min en 8,3 min (zie chromatogram A in figuur 1).

Om positieve resultaten te bevestingen moeten deze monsters met een spatelpunt ascorbaatoxidase worden behandeld en opnieuw worden gemeten (zie chromatogram B in figuur 1).

Vanwege de afbraak van L-ascorbinezuur en D-isoascorbinezuur onder invloed van ascorbaatoxidase mag er bij de retentietijd van L-ascorbinezuur en D-isoascorbinezuur geen signaal meer worden gevonden. Wanneer er overlappende pieken zijn, moet er bij de berekening van de concentraties rekening worden gehouden met het oppervlak daarvan.

Image

Opmerking: Het verdient aanbeveling de met ascorbaatoxidase behandelde monsters aan het eind van een reeks te analyseren er daarna een spoelcyclus uit te voeren om resten ascorbaatoxidase uit de kolom te verwijderen, omdat anders L-ascorbinezuur en D-isoascorbinezuur tijdens de HPLC-meting door de resten ascorbaatoxidase kunnen worden omgezet en het resultaat daardoor kan worden beïnvloed.

8.   BEREKENING

Maak een ijklijn met behulp van de werkoplossingen (4.3.2). Volgens de externe-standaardmethode gebeurt de kwantificering van L-ascorbinezuur en D-isoascorbinezuur door het piekoppervlak te meten en de bijbehorende concentratie uit de ijklijn af te lezen.

Weergave van de resultaten

De resultaten worden met één decimaal uitgedrukt in mg L-ascorbinezuur respectievelijk D-isoascorbinezuur/l (bijvoorbeeld 51,3 mg/l).

Wanneer het gehalte hoger is dan 150 mg/l, moet rekening worden gehouden met de verdunningsfactor.

9.   BETROUWBAARHEID

De methode is getest in het kader van een ringonderzoek, dat in 1994 door het voormalige Duitse Federale Bureau voor de volksgezondheid (Bundesgesundheitsamt) is georganiseerd en waaraan 27 laboratoria hebben deelgenomen. Bij het ringonderzoek-programma is § 35 van de Duitse Wet inzake levensmiddelen gevolgd, die tot de introductie van het nieuwe protocol (OENO 6/2000) door de OIV is geaccepteerd.

Het onderzoek is uitgevoerd met vier verschillende wijnmonsters (twee witte en twee rode wijnen), terwijl de bepaling voor elk monster vijf keer moest worden herhaald. Aangezien het niet mogelijk was monsters te bereiden met een voldoende stabiliteit van de te bepalen stoffen (verschillende afbraaksnelheden), is besloten de deelnemers bepaalde hoeveelheden zuivere standaardstoffen en daarnaast wijnmonsters te sturen. De laboratoria hebben opdracht gekregen de standaardstoffen kwantitatief aan de wijnmonsters toe te voegen en deze onmiddellijk te analyseren. Voor L-ascorbinezuur zijn concentraties van 30 tot 150 mg/l geanalyseerd en voor D-isoascorbinezuur concentraties van 10 tot 100 mg/l. De gedetailleerde resultaten van het onderzoek worden in de door de OIV gepubliceerde BIJLAGE vermeld. De evaluatie is uitgevoerd overeenkomstig DIN/ISO 5725 (versie 1988).

De standaardafwijking herhaalbaarheid (sr) en reproduceerbaarheid (sR) waren evenredig met de concentraties van L-ascorbinezuur en D-isoascorbinezuur. De reële precisie kan met behulp van de volgende vergelijkingen worden berekend:

| | L-Ascorbinezuur
  sr = 0,011 x + 0,31
  sR = 0,064 x + 1,39
  x: concentratie L-ascorbinezuur (mg/l) |
| --- | --- |

L-Ascorbinezuur

sr = 0,011 x + 0,31

sR = 0,064 x + 1,39

x: concentratie L-ascorbinezuur (mg/l)

| | D-Isoascorbinezuur
  sr = 0,014 x + 0,31
  sR = 0,079 x + 1,29
  x: concentratie D-isoascorbinezuur (mg/l) |
| --- | --- |

D-Isoascorbinezuur

sr = 0,014 x + 0,31

sR = 0,079 x + 1,29

x: concentratie D-isoascorbinezuur (mg/l)

Voorbeeld:

| | 50 mg D-isoascorbinezuur/lr = 1,0 mg/l |
| --- | --- |

50 mg D-isoascorbinezuur/lr = 1,0 mg/l

| | sR = 5,2 mg/L |
| --- | --- |

sR = 5,2 mg/L

10.   ANDERE KARAKTERISTIEKEN VAN DE ANALYSE

10.1.   Detectielimiet

De detectielimiet van deze methode is geraamd op 3 mg/l voor L-ascorbinezuur en D-isoascorbinezuur.

10.2.   Nauwkeurigheid

De gemiddelde recovery, berekend op basis van het ringonderzoek met vier monsters (zie de in het handboek van de OIV gepubliceerde BIJLAGE) was:

| — | 100,6 % voor L-ascorbinezuur |
| --- | --- |

—

100,6 % voor L-ascorbinezuur

| — | 103,3 % voor D-isoascorbinezuur |
| --- | --- |

—

103,3 % voor D-isoascorbinezuur

17   KOOLSTOFDIOXIDE (OIV-AS-314-01-DIOCAR) — METHODE TYPE II

1.   PRINCIPE VAN DE METHODE

1.1.   Niet-mousserende wijn (CO2-overdruk ≤ 0,5 x 105 Pa)
   (2)

Uit de op ongeveer 0 °C gebrachte wijn wordt een hoeveelheid monster genomen dat wordt toegevoegd aan een zodanige overmaat gestelde natriumhydroxideoplossing dat de pH 10-11 wordt. De verkregen oplossing wordt in aanwezigheid van koolzuuranhydrase met zuur getitreerd. Het koolstofdioxidegehalte wordt afgeleid uit het volume dat is gebruikt om de pH van 8,6 (bicarbonaatvorm) op 4,0 (koolzuur) te brengen. Met een blancotitratie, onder dezelfde omstandigheden uitgevoerd op de koolzuurvrij gemaakte wijn, kan worden gecorrigeerd voor de hoeveelheid door de overige zuren van de wijn verbruikte natriumhydroxideoplossing.

1.2.   Parelwijn en mousserende wijn

Het te analyseren wijnmonster wordt op een temperatuur in de buurt van zijn vriespunt gebracht. Na een bepaald volume te hebben genomen om na het koolzuurvrij maken als blanco te kunnen gebruiken, wordt alle CO2 in de rest van de fles met base gebonden tot Na2CO3. De verkregen oplossing wordt in aanwezigheid van koolzuuranhydrase met zuur getitreerd. Het koolstofdioxidegehalte wordt afgeleid uit het volume zuur dat is gebruikt om de pH van 8,6 (bicarbonaatvorm) op 4,0 (koolzuur) te brengen. Met een blancotitratie, onder dezelfde omstandigheden uitgevoerd op de koolzuurvrij gemaakte wijn, kan worden gecorrigeerd voor de hoeveelheid door de overige zuren van de wijn verbruikte natriumhydroxideoplossing.

2.   BESCHRIJVING VAN DE METHODE

2.1.   Niet-mousserende wijn (CO2-overdruk ≤ 0,5 × 105 Pa)

2.1.1.   Apparatuur

2.1.1.1.   Magneetroerder

2.1.1.2.   pH-meter

2.1.2.   Reagentia

2.1.2.1.   0,1 M Natriumhydroxideoplossing (NaOH)

2.1.2.2.   0,05 M Zwavelzuuroplossing (H2SO4)

2.1.2.3.   Koolzuuranhydraseoplossing, 1 g/l

2.1.3.   Werkwijze

Koel de te bemonsteren wijn alsmede de pipet van 10 ml waarmee het monster wordt genomen af tot 0 °C.

Breng in een bekerglas van 100 ml 25 ml natriumhydroxideoplossing (2.1.2.1) en voeg twee druppels waterige koolzuuranhydraseoplossing (2.1.2.3) toe. Pipetteer met de tot 0 °C afgekoelde pipet 10 ml wijn bij dit mengsel.

Zet het bekerglas op de magneetroerder; breng de elektrode in en voeg de roermagneet toe; laat de roerder kalm draaien.

Voeg, wanneer de vloeistof op kamertemperatuur is gekomen, langzaam zwavelzuuroplossing (2.1.2.2) toe tot pH 8,6.

Druppel dan verder zwavelzuuroplossing (2.1.2.2) toe tot pH 4,0. Zij n ml het gebruikte volume tussen pH 8,6 en 4,0.

Verwijder tevens het CO2 uit ongeveer 50 ml wijn door gedurende 3 minuten onder vacuüm en onder verwarming van de kolf op een waterbad van ongeveer 25 °C te schudden.

Pas de hierboven beschreven werkwijze toe op 10 ml koolzuurvrij gemaakte wijn: zij n' ml het gebruikte volume.

2.1.4.   Weergave van de resultaten

1 ml gestelde 0,05 M zwavelzuuroplossing komt overeen met 4,4 mg CO2.

De hoeveelheid CO2 in gram per liter wijn is dan:

0,44 (n - n′)

Het gehalte wordt opgegeven met twee decimalen.

Opmerking: Bij wijnen met een laag CO2-gehalte (CO2 < 1 g/l) kan de toevoeging van koolzuuranhydrase om de hydratatie van CO2 te katalyseren achterwege blijven.

2.2.   Parelwijn en mousserende wijn

2.2.1.   Apparatuur

2.2.1.1.   Magneetroerder

2.2.1.2.   pH-meter

2.2.2.   Reagentia

2.2.2.1.   Natriumhydroxideoplossing (NaOH), 50 % (m/m)

2.2.2.2.   0,05 M Zwavelzuuroplossing (H2SO4)

2.2.2.3.   Koolzuuranhydraseoplossing, 1 g/l

2.2.3.   Werkwijze

Zet op de fles met de te analyseren wijn een streepje op de hoogte van het vloeistofniveau en koel de fles af totdat de wijn begint te bevriezen.

Laat onder schudden de fles weer langzaam opwarmen totdat de ijskristallen zijn verdwenen.

Ontkurk de fles dan snel en giet 45-50 ml wijn in een maatcilinder. Deze hoeveelheid wordt bewaard voor de blancobepaling. Het exacte volume (v ml) wordt pas afgelezen nadat de wijn weer op kamertemperatuur is gekomen.

Breng, zodra dit blancomonster is genomen, 20 ml natriumhydroxideoplossing (2.2.2.1) in de fles, uitgaande van een totale inhoud van de fles van 750 ml.

Wacht tot de wijn op kamertemperatuur is gekomen.

Breng in een bekerglas van 100 ml 30 ml uitgekookt gedestilleerd water en 2 druppels koolzuuranhydraseoplossing (2.2.2.3). Voeg hieraan 10 ml alkalisch gemaakte wijn toe.

Zet het bekerglas op de magneetroerder; breng de elektrode in en voeg de roermagneet toe; laat de roerder kalm draaien.

Voeg langzaam zwavelzuuroplossing (2.2.2.2) toe tot pH 8,6.

Druppel dan verder zwavelzuuroplossing (2.2.2.2) toe tot pH 4,0. Zij n ml het gebruikte volume tussen pH 8,6 en 4,0.

Verwijder tevens het CO2 uit de voor de blancobepaling apart gehouden hoeveelheid wijn (v ml) door gedurende drie minuten onder vacuüm en onder verwarming van de kolf op een waterbad van ongeveer 25 °C te schudden. Voeg 10 ml koolzuurvrij gemaakte wijn toe aan 30 ml uitgekookt gedestilleerd water en voeg 2-3 druppels natriumhydroxideoplossing (2.2.2.1) toe om de pH op 10-11 te brengen. Pas vervolgens de hierboven beschreven werkwijze toe. Zij n' ml het gebruikte volume 0,05 M zwavelzuur.

2.2.4.   Weergave van de resultaten

1 ml 0,05 M zwavelzuuroplossing komt overeen met 4,4 mg CO2.

Giet de alkalisch gemaakte wijn uit de fles en bepaal het oorspronkelijke volume van de wijn tot op 1 ml nauwkeurig door de fles tot het aangebrachte streepje te vullen met water; zij V ml het volume.

De hoeveelheid CO2 in gram per liter wijn is dan:

0,44(n – n′) × ((V - v + 20)/(V - v)).

Het gehalte wordt opgegeven met twee decimalen.

2.3.   Berekening van de theoretische overdruk

De overdruk bij 20 °C (Paph,20) uitgedrukt in pascal, wordt gegeven door:

Paph,20 = ((Q)/(1,951 × 10–5(0,86 – 0,01 A)(1 – 0,00144 S))) – Patm

waarbij:

| Q | : | het CO2-gehalte in gram per liter wijn |
| --- | --- | --- |
| A | : | het alcoholgehalte van de wijn bij 20 °C |
| S | : | het suikergehalte van de wijn in gram per liter |
| Patm | : | de atmosferische druk in pascal |

Q

:

het CO2-gehalte in gram per liter wijn

A

:

het alcoholgehalte van de wijn bij 20 °C

S

:

het suikergehalte van de wijn in gram per liter

Patm

:

de atmosferische druk in pascal

18   BEPALING VAN KOOLSTOFDIOXIDE IN WIJN MET EEN MANOMETRISCHE METHODE (OIV-AS-314-04-CO2MAN) — METHODE TYPE II

(p.m.)

[De beschrijving van deze analysemethode wordt door de instanties van de OIV geactualiseerd. Deze zal worden gepubliceerd in een volgende mededeling van de Commissie zodra een geactualiseerde tekst door de OIV wordt gepubliceerd in de uitgave van 2010 van het Handboek van internationale analysemethoden van de OIV]

19   METING VAN DE OVERDRUK BIJ MOUSSERENDE WIJN EN PARELWIJN (OIV-AS-314-02-SURPRES) — METHODE TYPE I

1.   PRINCIPE VAN DE METHODE

Nadat de fles thermisch gestabiliseerd en geschud is, wordt de overdruk gemeten met een overdrukmeter. De overdruk wordt uitgedrukt in pascal (Pa) (methode type I). De methode kan eveneens worden gebruikt bij mousserende wijn met toegevoegd koolzuurgas en bij parelwijn met toegevoegd koolzuurgas.

2.   APPARATUUR

Het instrument waarmee de overdruk in flessen mousserende wijn en parelwijn kan worden gemeten, wordt een overdrukmeter genoemd. Het apparaat bestaat, afhankelijk van de sluiting van de fles (metalen capsule, kroonkurk, kurk of plastic sluitdop), in verschillende vormen.

2.1.   Flessen met een capsule

De overdrukmeter bestaat in dat geval uit drie delen (figuur 1):

| — | het bovenste deel (schroef met naaldhouder) bestaat uit een manometer, een manueel te bedienen sluitring, een wormschroef die door het middelste deel loopt en een naald die door de capsule wordt geboord. Door een zijdelingse opening in de naald wordt de druk aan de manometer doorgegeven. Een pakking zorgt voor een hermetische afsluiting op de capsule van de fles; |
| --- | --- |

—

het bovenste deel (schroef met naaldhouder) bestaat uit een manometer, een manueel te bedienen sluitring, een wormschroef die door het middelste deel loopt en een naald die door de capsule wordt geboord. Door een zijdelingse opening in de naald wordt de druk aan de manometer doorgegeven. Een pakking zorgt voor een hermetische afsluiting op de capsule van de fles;

| — | het middelste deel (de moer) houdt het bovenste deel op zijn plaats. Het wordt op het onderste deel geschroefd om het instrument stevig op de fles vast te maken; |
| --- | --- |

—

het middelste deel (de moer) houdt het bovenste deel op zijn plaats. Het wordt op het onderste deel geschroefd om het instrument stevig op de fles vast te maken;

| — | het onderste deel (de beugel) is uitgerust met een pal die onder de rand van de flessenhals wordt vastgezet om het instrument op zijn plaats te houden. Voor elk type fles is er een beugel beschikbaar. |
| --- | --- |

—

het onderste deel (de beugel) is uitgerust met een pal die onder de rand van de flessenhals wordt vastgezet om het instrument op zijn plaats te houden. Voor elk type fles is er een beugel beschikbaar.

2.2.   Flessen met een kurk

De overdrukmeter bestaat in dat geval uit twee delen (figuur 2):

| — | het bovenste deel is hetzelfde als dat van het hierboven beschreven apparaat, maar heeft een langere naald. Deze heeft de vorm van een lange, holle buis met aan het uiteinde een punt die door de kurk wordt gestoken. Deze punt is afneembaar en valt in de wijn zodra de kurk helemaal doorboord is; |
| --- | --- |

—

het bovenste deel is hetzelfde als dat van het hierboven beschreven apparaat, maar heeft een langere naald. Deze heeft de vorm van een lange, holle buis met aan het uiteinde een punt die door de kurk wordt gestoken. Deze punt is afneembaar en valt in de wijn zodra de kurk helemaal doorboord is;

| — | het onderste deel bestaat uit de moer en een voet die op de kurk rust. Met behulp van vier schroeven aan de voet wordt het instrument op de kurk vastgezet. |
| --- | --- |

—

het onderste deel bestaat uit de moer en een voet die op de kurk rust. Met behulp van vier schroeven aan de voet wordt het instrument op de kurk vastgezet.

| | |
| --- | --- |

Image

Image

Opmerkingen over de manometers op beide soorten apparaten:

| — | de manometers kunnen mechanisch zijn met een Bourdonbuis of digitaal met een piëzo-elektrische sonde. In het eerste geval moet de Bourdonbuis van roestvrij staal zijn; |
| --- | --- |

—

de manometers kunnen mechanisch zijn met een Bourdonbuis of digitaal met een piëzo-elektrische sonde. In het eerste geval moet de Bourdonbuis van roestvrij staal zijn;

| — | de manometers zijn afleesbaar in pascal (Pa). Voor mousserende wijn verdient het de voorkeur 105 pascal (105 Pa) of de kilopascal (kPa) als eenheid te gebruiken; |
| --- | --- |

—

de manometers zijn afleesbaar in pascal (Pa). Voor mousserende wijn verdient het de voorkeur 105 pascal (105 Pa) of de kilopascal (kPa) als eenheid te gebruiken;

| — | er bestaan verschillende klassen. De klasse van een manometer is de precisie van de aflezing ten opzichte van de volle schaal, uitgedrukt als percentage (zo heeft een manometer van 1 000 kPa en klasse 1 een maximale gebruiksdruk van 1 000 kPa en een aflezing ± 10 kPa). Klasse 1 wordt aanbevolen voor nauwkeurige metingen. |
| --- | --- |

—

er bestaan verschillende klassen. De klasse van een manometer is de precisie van de aflezing ten opzichte van de volle schaal, uitgedrukt als percentage (zo heeft een manometer van 1 000 kPa en klasse 1 een maximale gebruiksdruk van 1 000 kPa en een aflezing ± 10 kPa). Klasse 1 wordt aanbevolen voor nauwkeurige metingen.

3.   WERKWIJZE

De meting wordt uitgevoerd op flessen waarvan de temperatuur ten minste 24 uur is gestabiliseerd. Nadat de kroonkurk, de kurk of de plastic sluitdop is doorboord, moet de fles vervolgens krachtig worden geschud tot constante druk, waarna de waarde wordt afgelezen.

3.1.   Flessen met een capsule

Zet de pal van de beugel onder de rand van de flessenhals vast. Draai de moer aan tot het geheel stevig op de fles geklemd zit. Schroef vervolgens het bovenste deel op de moer. Om gasontsnapping te voorkomen moet de capsule zo snel mogelijk worden doorboord, zodat de pakking de capsule kan afdichten. Schud de fles vervolgens krachtig tot constante druk en lees daarna de waarde af.

3.2.   Flessen met een kurk

Breng een punt aan op het uiteinde van de naald. Plaats het geheel op de kurk. Zet het met behulp van de vier schroeven vast op de kurk. Draai het bovenste deel aan (de naald doorboort daarbij de kurk). De druk wordt door de manometer gemeten zodra de punt in de wijn valt. Schud de fles vervolgens krachtig tot constante druk en lees daarna de waarde af. Haal na aflezing de punt uit de fles.

4.   WEERGAVE VAN DE RESULTATEN

De overdruk bij 20 °C (Paph,20) wordt uitgedrukt in pascal (Pa) of in kilopascal (kPa). De aflezing moet overeenkomen met de nauwkeurigheid van de manometer (bij een manometer met een volle schaaluitslag van 1 000 kPa en klasse 1 bijvoorbeeld 6,3 × 105 Pa of 630 kPa en niet 6,33 × 105 Pa of 633 kPa).

Indien de meting niet bij 20 °C is uitgevoerd, dient hiervoor te worden gecorrigeerd door de gemeten druk te vermenigvuldigen met een coëfficiënt (zie tabel 1).

Tabel 1

Verhouding tussen de overdruk Paph20 van parelwijn of mousserende wijn bij 20 °C en de overdruk Papht bij temperatuur t

| °C | |
| --- | --- |
| 0 | 1,85 |
| 1 | 1,80 |
| 2 | 1,74 |
| 3 | 1,68 |
| 4 | 1,64 |
| 5 | 1,59 |
| 6 | 1,54 |
| 7 | 1,50 |
| 8 | 1,45 |
| 9 | 1,40 |
| 10 | 1,36 |
| 11 | 1,32 |
| 12 | 1,28 |
| 13 | 1,24 |
| 14 | 1,20 |
| 15 | 1,16 |
| 16 | 1,13 |
| 17 | 1,09 |
| 18 | 1,06 |
| 19 | 1,03 |
| 20 | 1,00 |
| 21 | 0,97 |
| 22 | 0,95 |
| 23 | 0,93 |
| 24 | 0,91 |
| 25 | 0,88 |

°C

0

1,85

1

1,80

2

1,74

3

1,68

4

1,64

5

1,59

6

1,54

7

1,50

8

1,45

9

1,40

10

1,36

11

1,32

12

1,28

13

1,24

14

1,20

15

1,16

16

1,13

17

1,09

18

1,06

19

1,03

20

1,00

21

0,97

22

0,95

23

0,93

24

0,91

25

0,88

5.   CONTROLE VAN DE RESULTATEN

Methode voor de directe bepaling van fysische parameters (benchmarkmethode type I).

Controle van de overdrukmeters

De overdrukmeters moeten regelmatig worden gecontroleerd (ten minste één keer per jaar).

De controle vindt plaats met behulp van een ijkbank. Daarmee kan de te controleren manometer worden vergeleken met een parallel geschakelde, op basis van de nationale standaarden geijkte referentiemanometer van een hogere klasse. Bij de controle worden de waarden die beide apparaten bij toenemende en vervolgens afnemende druk aangeven, vergeleken. Verschillen kunnen worden gecorrigeerd met een regelschroef.

Alle erkende laboratoria en instanties beschikken over dergelijke ijkbanken; ze zijn daarnaast beschikbaar bij de fabrikanten van manometers.

20   BEPALING VAN LYSOZYM IN WIJN MET BEHULP VAN HPLC (OIV-AS-315-14) — METHODE TYPE IV

1.   INLEIDING

Het verdient de voorkeur om voor lysozym een analysemethode te gebruiken die niet op de enzymactiviteit is gebaseerd.

2.   TOEPASSINGSGEBIED

Met deze methode kan lysozym in witte en rode wijn onafhankelijk van de enzymactiviteit (die door gedeeltelijke denaturatie of door complexvorming en coprecipitatie kan worden beïnvloed) van de matrix kwantitatief (in mg eiwit/l) worden bepaald.

3.   DEFINITIE

Hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) maakt een analyse mogelijk op basis van de sterische, polaire of adsorptie-interactie tussen de stationaire fase en de te bepalen stof, die derhalve niet afhankelijk is van de reële enzymactiviteit van het eiwit.

4.   PRINCIPE VAN DE METHODE

De analyse wordt uitgevoerd door hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) met een spectrofotometer en een spectrofluorimeter als detector. De onbekende inhoud van het wijnmonster wordt aan de hand van het piekoppervlak in het chromatogram met behulp van een externe standaard berekend.

5.   REAGENTIA

5.1.   Oplosmiddelen en oplossingen

Acetonitril (CH3CN) voor HPLC

Trifluorazijnzuur (TFA), zuiver

Gedeïoniseerd water voor HPLC

Standaardoplossing: 1 g wijnsteenzuur/l, 10 % (v/v) ethylalcohol, op pH 3,2 gebracht met neutraal kaliumtartraat

5.2.   Elutievloeistoffen

| A | : | 1% CH3CN, 0,2% TFA, 98,8% H2O |
| --- | --- | --- |
| B | : | 70% CH3CN, 0,2% TFA, 29,8% H2O |

A

:

1% CH3CN, 0,2% TFA, 98,8% H2O

B

:

70% CH3CN, 0,2% TFA, 29,8% H2O

5.3.   Referentieoplossingen

Standaardlysozym, 1-250 mg/l, opgelost in standaardoplossing door gedurende ten minste 12 uur continu te roeren.

6.   APPARATUUR

6.1.   HPLC-apparaat met pompsysteem voor gradiëntelutie

6.2.   Behuizing voor thermostaatkolom (oven)

6.3.   Combinatiedetector van spectrofotometer met spectrofluorimeter

6.4.   Loopinjector, 20 μl

6.5.   Polymeerkolom, omgekeerde fase, met functionele fenylgroepen (poriegrootte = 1 000 Å, uitsluitingslimiet = 1 000 000 Da), bijvoorbeeld Tosoh Bioscience TSK-gel Phenyl 5PW RP 7,5 cm × 4,6 mm ID

6.6.   Prekolom van hetzelfde materiaal als de kolom, bijvoorbeeld Tosoh Bioscience TSK-gel Phenyl 5PW RP Guardgel 1,5 cm × 3,2 mm ID

7.   MONSTERVOORBEREIDING

De wijnmonsters worden aangezuurd met 1/10 verdund HCl (10 M) en na 5 minuten gefiltreerd over een polyamidefilter met een poriegrootte van 0,22 μm. De chromatografische bepaling gebeurt onmiddellijk na de filtratie.

8.   WERKOMSTANDIGHEDEN:

8.1.   Debiet van de elutievloeistof: 1 ml/min

8.2.   Kolomtemperatuur: 30 °C

8.3.   Spectrofotometrische detectie: 280 nm

8.4.   Spectrofluorimetrische detectie: λ ex = 276 nm; λ em = 345 nm; versterking = 10

8.5.   Programma voor de gradiëntelutie

| Tijd (min) | Opl. A (%) | Opl. B (%) | Gradiënt |
| --- | --- | --- | --- |
| 0 | 100 | 0 | |
| | | | isocratisch |
| 3 | 100 | 0 | |
| | | | lineair |
| 10 | 65 | 35 | |
| | | | isocratisch |
| 15 | 65 | 35 | |
| | | | lineair |
| 27 | 40,5 | 59,5 | |
| | | | lineair |
| 29 | 0 | 100 | |
| | | | isocratisch |
| 34 | 0 | 100 | |
| | | | lineair |
| 36 | 100 | 0 | |
| | | | isocratisch |
| 40 | 100 | 0 | |

Tijd (min)

Opl. A (%)

Opl. B (%)

Gradiënt

0

100

0

isocratisch

3

100

0

lineair

10

65

35

isocratisch

15

65

35

lineair

27

40,5

59,5

lineair

29

0

100

isocratisch

34

0

100

lineair

36

100

0

isocratisch

40

100

0

8.6.   Gemiddelde retentietijd van lysozym: 25,50 min

9.   WIJZE VAN BEREKENING

De referentieoplossingen met de concentraties 1, 5, 10, 50, 100, 200 en 250 mg lysozym/l worden in triplo bepaald. De piekoppervlakken van lysozym worden voor elk chromatogram uitgezet tegen de respectieve concentraties, zodat er een lineaire regressielijn wordt verkregen met als algemene vergelijking Y = ax + b. De determinatiecoëfficiënt r2 moet > 0,999 zijn.

10.   KARAKTERISTIEKEN VAN DE METHODE

Teneinde de geschiktheid van de methode voor de beoogde doelstelling te kunnen evalueren is een validatieonderzoek uitgevoerd met inachtneming van de lineariteit, de detectie- en bepalingsgrens en de nauwkeurigheid van de methode. De laatste parameter is bepaald door de precisie en de nauwkeurigheid van de methode vast te stellen.

| | Bereik lineariteit
  (mg/l) | Helling van de rechte | Determinatiecoëfficiënt
  (r2) | DG (mg/l) | BG (mg/l) | Herhaalbaarheid (n=5) RSD(%) | Reproduceerbaarheid (n=5) RSD(%) |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Std1 | R.W.2 | W.W.3 | Std1 |
| UV | 5-250 | 3,786 | 0,9993 | 1,86 | 6,20 | 4,67 | 5,54 | 0,62 | 1,93 |
| FLD | 1-250 | 52,037 | 0,9990 | 0,18 | 0,59 | 2,61 | 2,37 | 0,68 | 2,30 |

Bereik lineariteit

(mg/l)

Helling van de rechte

Determinatiecoëfficiënt

(r2)

DG (mg/l)

BG (mg/l)

Herhaalbaarheid (n=5) RSD(%)

Reproduceerbaarheid (n=5) RSD(%)

Std1

R.W.2

W.W.3

Std1

UV

5-250

3,786

0,9993

1,86

6,20

4,67

5,54

0,62

1,93

FLD

1-250

52,037

0,9990

0,18

0,59

2,61

2,37

0,68

2,30

Tabel 1: Gegevens over de karakteristieken van de methode; Std1: standaardoplossing; R.W.2: rode wijn; W.W.3: witte wijn.

10.1.   Lineariteit van de methode

Op basis van de resultaten van de lineaire regressieanalyse blijkt de methode voor het in tabel 1 vermelde bereik lineair te zijn.

10.2.   Detectie- en bepalingsgrens

De detectiegrens (DG) en de bepalingsgrens (BG) zijn berekend als het signaal dat overeenkomt met respectievelijk 3 keer en 10 keer de chromatografische achtergrondruis bij de werkomstandigheden en de reële matrix (tabel 1).

10.3.   Precisie van de methode

Als parameter zijn de herhaalbaarheid en de reproduceerbaarheid gebruikt. In tabel 1 worden de waarden van deze parameters vermeld (uitgedrukt als procentuele standaarddeviatie van herhaalde metingen met verschillende concentraties) zoals die zijn bepaald bij de standaardoplossing, de rode wijn en de witte wijn.

10.4.   Nauwkeurigheid van de methode

Het recoverypercentage is berekend bij de standaardoplossingen met 5 en 50 mg lysozym/l waaraan een bekende hoeveelheid lysozym is toegevoegd, zoals vermeld in onderstaande tabel.

| | Initiële nominale [C] (mg/l) | Toegevoegd (mg/l) | Theoretische [C]
  (mg/l) | Bepaalde [C]
  (mg/l) | Standaardafwijking | Recovery (%) |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| UV 280 nm | 50 | 13,1 | 63,1 | 62,3 | 3,86 | 99 |
| FD | 50 | 13,1 | 63,1 | 64,5 | 5,36 | 102 |
| UV 280 nm | 5 | 14,4 | 19,4 | 17,9 | 1,49 | 92,1 |
| FD | 5 | 14,4 | 19,4 | 19,0 | 1,61 | 97,7 |

Initiële nominale [C] (mg/l)

Toegevoegd (mg/l)

Theoretische [C]

(mg/l)

Bepaalde [C]

(mg/l)

Standaardafwijking

Recovery (%)

UV 280 nm

50

13,1

63,1

62,3

3,86

99

FD

50

13,1

63,1

64,5

5,36

102

UV 280 nm

5

14,4

19,4

17,9

1,49

92,1

FD

5

14,4

19,4

19,0

1,61

97,7

Image

21   SULFAAT (OIV- AS-321-05-SULFAT) — METHODE TYPE II

1.   PRINCIPE VAN DE METHODEN

1.1.   Referentiemethode

Bariumsulfaat wordt neergeslagen en gewogen. Het onder dezelfde omstandigheden neergeslagen bariumfosfaat wordt verwijderd door het neerslag met zoutzuur te wassen.

Bij most of wijn met veel zwaveldioxide moet dit vooraf worden verwijderd door koken in een omgeving zonder lucht.

1.2.   Screeningmethode

Indeling van wijn in verschillende categorieën door een zogenaamde limietmethode op basis van het neerslaan van bariumsulfaat met een gestelde bariumoplossing.

2.   REFERENTIEMETHODE

2.1.   Reagentia

2.1.1.   2 M zoutzuuroplossing.

2.1.2.   Bariumchlorideoplossing met 200 g BaCl2 2H2O/l.

2.2.   Werkwijze

2.2.1.   Algemene gevallen

Breng 40 ml te onderzoeken monster in een centrifugebuis van 50 ml; voeg 2 ml 2 M zoutzuur en 2 ml bariumchlorideoplossing met 200 g/l toe; roer met een glasstaaf; spoel de staaf met wat gedestilleerd water af en laat de buis 5 minuten rusten. Centrifugeer 5 minuten en giet vervolgens het supernatans voorzichtig af.

Was daarna het bariumsulfaatneerslag als volgt: voeg 10 ml 2 M zoutzuur toe, suspendeer het neerslag en centrifugeer 5 minuten. Giet het supernatans voorzichtig af. Was het neerslag nog twee keer op dezelfde manier met telkens 15 ml gedestilleerd water.

Breng het neerslag onder spoelen met gedestilleerd water kwantitatief over in een getarreerde platinaschaal en plaats deze op een waterbad van 100 °C tot het neerslag is drooggedampt. Het gedroogde neerslag wordt enkele malen kort boven een vlam gegloeid tot een wit residu is verkregen. Laat het in een exsiccator afkoelen en weeg het.

Zij m de massa van het verkregen bariumsulfaat in milligram.

2.2.2.   Bijzonder geval: most met sulfiet en wijn met een hoog gehalte aan zwaveldioxide

Verwijder vooraf het zwaveldioxide.

Breng in een erlenmeyer van 500 ml, voorzien van een druppeltrechter en een afvoerbuis, 25 ml water en 1 ml onverdund zoutzuur (ρ20 = 1,15-1,18 g/ml). Laat deze oplossing koken om de lucht te verdrijven en voeg onder doorkoken via de druppeltrechter 100 ml wijn toe. Ga door met koken tot het volume van de vloeistof in de erlenmeyer tot ongeveer 75 ml is afgenomen en breng de vloeistof na afkoelen kwantitatief over in een maatkolf van 100 ml. Vul met water aan tot de maatstreep. Bepaal op de onder 2.2.1 aangegeven wijze het sulfaat in een hoeveelheid van 40 ml.

2.3.   Weergave van de resultaten

2.3.1.   Berekening

Het gehalte aan sulfaat, uitgedrukt in milligram kaliumsulfaat (K2SO4) per liter, is:

18,67 × m

Het gehalte van most of wijn aan sulfaat wordt zonder decimaal uitgedrukt in milligram kaliumsulfaat per liter.

2.3.2.   Herhaalbaarheid

Tot 1 000 mg/l: r = 27 mg/l

Ongeveer 1 500 mg/l: r = 41 mg/l

2.3.3.   Reproduceerbaarheid

Tot 1 000 mg/l: R = 51 mg/l

Ongeveer 1 500 mg/l: R = 81 mg/l

22   IJZER (OIV-AS-322-05-FER) — METHODE TYPE IV

1.   PRINCIPE VAN DE METHODEN

REFERENTIEMETHODE

Na een geschikte verdunning van de wijn en verwijdering van de alcohol wordt ijzer rechtstreeks bepaald met behulp van atoomabsorptiespectrofotometrie.

GEBRUIKELIJKE METHODE

Na mineralisatie van de wijn met waterstofperoxide wordt driewaardig ijzer tot tweewaardig ijzer gereduceerd en bepaald via de roodgekleurde verbinding die met ortho-fenantroline ontstaat.

2.   REFERENTIEMETHODE

2.1.   Reagentia

2.1.1.   Geconcentreerde standaardoplossing met 1 g driewaardig ijzer/l.

Gebruik hiervoor een in de handel verkrijgbare standaardoplossing van 1 g/l. Deze oplossing kan ook worden bereid door 8,6341 g ijzer(III)ammoniumsulfaat (FeNH4(SO4)2·12H2O) op te lossen in gedestilleerd water dat licht is aangezuurd met 1 M zoutzuur, en aan te vullen tot 1 liter.

2.1.2.   Verdunde standaardoplossing met 100 mg ijzer/l.

2.2.   Apparatuur

2.2.1.   Rotatieverdamper met thermostaatwaterbad.

2.2.2.   Atoomabsorptiespectrofotometer met acetyleen/lucht-brander.

2.2.3.   Holle kathodelamp voor ijzer.

2.3.   Werkwijze

2.3.1.   Voorbehandeling van het monster

Verwijder de alcohol uit de wijn door het monster met de rotatieverdamper bij 50-60 °C tot op de helft in te dampen. Vul met gedestilleerd water aan tot het oorspronkelijke volume.

Verdun de oplossing indien nodig vóór de bepaling.

2.3.2.   Opstellen van de ijklijn

Breng in vijf maatkolven van 100 ml respectievelijk 1, 2, 3, 4 en 5 ml van de standaardoplossing met 100 mg ijzer/l (2.1.2) en vul met gedestilleerd water aan tot 100 ml. De aldus bereide oplossingen bevatten respectievelijk 1, 2, 3, 4 en 5 mg ijzer per liter.

Deze oplossingen moeten in polyethyleen flessen worden bewaard.

2.3.3.   Bepaling

Stel de golflengte in op 248,3 nm. Stel het nulpunt van de extinctieschaal in met gedestilleerd water. Verstuif het verdunde monster rechtstreeks in de brander van de spectrofotometer, gevolgd door de serie standaardoplossingen (2.3.2). Noteer de extincties. Voer de bepaling in duplo uit.

2.4.   Weergave van de resultaten

2.4.1.   Berekening

Stel de ijklijn op met behulp van de gemeten extincties en de daarbij behorende ijzerconcentraties van de standaardoplossingen. Lees met de gemeten gemiddelde extinctie van het verdunde monster uit de ijklijn de bijbehorende ijzerconcentratie C af.

De ijzerconcentratie van de wijn, uitgedrukt in milligram per liter met één decimaal, is dan:

C × F

F = verdunningsfactor.

23   KOPER (OIV-AS-322-06) — METHODE TYPE IV

1.   PRINCIPE VAN DE METHODE

Bepaling met behulp van atoomabsorptiespectrofotometrie.

2.   APPARATUUR

2.1.   Platinaschaal.

2.2.   Atoomabsorptiespectrofotometer.

2.3.   Holle kathodelamp voor koper.

2.4.   Brandergasmengsel: acetyleen/lucht of acetyleen/lachgas.

3.   REAGENTIA

3.1.   Metallisch koper.

3.2.   Geconcentreerd salpeterzuur, 65 % (HNO3, ρ20 = 1,38 g/ml).

3.3.   Salpeterzuur, 1/2 verdund (v/v).

3.4.   Koperoplossing, 1 g/l

Gebruik hiervoor een in de handel verkrijgbare standaardoplossing met 1 g koper/l. Deze oplossing kan ook worden bereid door 1 000 g metallisch koper af te wegen en dit kwantitatief over te brengen in een maatkolf van 1 000 ml. Voeg niet meer 1/2 verdund salpeterzuur (3.3) toe dan nodig is om het metaal op te lossen, voeg dan 10 ml geconcentreerd salpeterzuur (3.2) toe en vul met dubbel gedestilleerd water aan tot de maatstreep.

3.5.   Koperoplossing, 100 mg/l

Breng 10 ml koperoplossing (3.4) in een maatkolf van 100 ml en vul met dubbel gedestilleerd water aan tot de maatstreep.

4.   WERKWIJZE

4.1.   Voorbehandeling van het monster en bepaling van koper

Breng 20 ml monster in een maatkolf van 100 ml en vul met dubbel gedestilleerd water aan tot de maatstreep. Wijzig de verdunning indien dit nodig is.

Lees, na het nulpunt van de extinctieschaal met gedestilleerd water te hebben ingesteld, op de atoomabsorptiespectrofotometer de extinctie van het verdunde monster bij een golflengte van 324,8 nm af. Bereid indien nodig een geschikte verdunning met dubbel gedestilleerd water.

4.2.   Opstellen van de ijklijn

Neem respectievelijk 0,5 1 en 2 ml koperoplossing die 100 mg koper per liter bevat (3.5), breng deze in een serie maatkolven van 100 ml en vul met dubbel gedestilleerd water aan tot de maatstreep; de aldus bereide oplossingen bevatten respectievelijk 0,5 1 en 2 mg koper/l. Stel met de extinctiewaarden van deze oplossingen, gemeten zoals onder 4.1 wordt beschreven, de ijklijn op.

5.   WEERGAVE VAN DE RESULTATEN

Lees met de gemeten waarde van de extinctie voor het verdunde wijnmonster uit de ijklijn de concentratie C in mg/l af.

Als F de verdunningsfactor is, wordt het kopergehalte van de wijn in milligram per liter gegeven door: F × C.

Het gehalte wordt met twee decimalen opgegeven.

Opmerkingen:

| a) | De oplossingen voor het opstellen van de ijklijn en de verdunningen van het monster moeten echter worden gekozen aan de hand van de gevoeligheid van de te gebruiken apparatuur en de koperconcentratie van het monster. |
| --- | --- |

a)

De oplossingen voor het opstellen van de ijklijn en de verdunningen van het monster moeten echter worden gekozen aan de hand van de gevoeligheid van de te gebruiken apparatuur en de koperconcentratie van het monster.

| b) | Bij zeer lage koperconcentraties in het monster moet de volgende werkwijze worden gevolgd: breng 100 ml monster in een platinaschaal, damp op het waterbad van 100 °C in tot een stroperige consistentie en voeg druppelsgewijs 2,5 ml geconcentreerd salpeterzuur (3.2) toe, waarbij de bodem van de schaal geheel bedekt moet worden. Veras het residu voorzichtig op een elektrische verwarmingsplaat of met een kleine vlam; plaats de schaal vervolgens gedurende ongeveer een uur in een moffeloven, ingesteld op een temperatuur van 500 ± 25 °C. Bevochtig na afkoeling de as met 1 ml geconcentreerd salpeterzuur (3.2), waarbij de as met een kleine glasstaaf wordt fijngewreven, damp droog en veras opnieuw zoals hierboven beschreven. Plaats de schaal weer gedurende ongeveer 15 minuten in de oven; herhaal de behandeling met geconcentreerd salpeterzuur ten minste driemaal. Los de as op door aan de schaal 1 ml geconcentreerd salpeterzuur (3.2) en 2 ml dubbel gedestilleerd water toe te voegen; breng de vloeistof over in een maatkolf van 10 ml. Was de schaal driemaal met telkens 2 ml dubbel gedestilleerd water en vul met dubbel gedestilleerd water aan tot de maatstreep. Voer de bepaling met de 10 ml oplossing uit zoals onder 4.1 wordt vermeld; houd bij de weergave van de resultaten rekening met de concentratiefactor. |
| --- | --- |

b)

Bij zeer lage koperconcentraties in het monster moet de volgende werkwijze worden gevolgd: breng 100 ml monster in een platinaschaal, damp op het waterbad van 100 °C in tot een stroperige consistentie en voeg druppelsgewijs 2,5 ml geconcentreerd salpeterzuur (3.2) toe, waarbij de bodem van de schaal geheel bedekt moet worden. Veras het residu voorzichtig op een elektrische verwarmingsplaat of met een kleine vlam; plaats de schaal vervolgens gedurende ongeveer een uur in een moffeloven, ingesteld op een temperatuur van 500 ± 25 °C. Bevochtig na afkoeling de as met 1 ml geconcentreerd salpeterzuur (3.2), waarbij de as met een kleine glasstaaf wordt fijngewreven, damp droog en veras opnieuw zoals hierboven beschreven. Plaats de schaal weer gedurende ongeveer 15 minuten in de oven; herhaal de behandeling met geconcentreerd salpeterzuur ten minste driemaal. Los de as op door aan de schaal 1 ml geconcentreerd salpeterzuur (3.2) en 2 ml dubbel gedestilleerd water toe te voegen; breng de vloeistof over in een maatkolf van 10 ml. Was de schaal driemaal met telkens 2 ml dubbel gedestilleerd water en vul met dubbel gedestilleerd water aan tot de maatstreep. Voer de bepaling met de 10 ml oplossing uit zoals onder 4.1 wordt vermeld; houd bij de weergave van de resultaten rekening met de concentratiefactor.

24   ZWAVELDIOXIDE (OIV-AS-323-04-DIOSU) — METHODE TYPE II

1.   DEFINITIES

Onder zwaveldioxide wordt verstaan het zwaveldioxide dat in wijn of most aanwezig is in de vorm van H2SO3 of HSO3–, waarbij de ligging van het evenwicht afhankelijk is van de pH en de temperatuur:

H2SO3 ←→ H+ + HSO3–

H2SO3 is moleculair zwaveldioxide.

Onder totaal zwaveldioxide wordt verstaan het totaal van de verschillende vormen van zwaveldioxide die in vrije vorm of aan de bestanddelen gebonden in de wijn aanwezig zijn.

2.   VRIJ EN TOTAAL ZWAVELDIOXIDE

2.1.   Principe van de methoden

2.1.1.   Referentiemethode

2.1.1.1.   Wijn en most:

Het zwaveldioxide wordt met een stroom lucht of stikstof gestript; het wordt gebonden en geoxideerd door het door een verdunde en neutrale oplossing van waterstofperoxide te leiden. Het gevormde zwavelzuur wordt bepaald met een gestelde natriumhydroxideoplossing. Het vrije zwaveldioxide wordt koud (10 °C) uit wijn gestript.

Het totale zwaveldioxide wordt warm (ongeveer 100 °C) uit wijn gestript.

2.1.1.2.   Gerectificeerde geconcentreerde most

Het totale zwaveldioxide wordt warm (ongeveer 100 °C) uit de vooraf verdunde gerectificeerde geconcentreerde most gestript.

2.1.2.   Screeningmethode

Het vrije zwaveldioxide wordt door directe jodometrische titratie bepaald.

Het gebonden zwaveldioxide wordt vervolgens na alkalische hydrolyse door jodometrische titratie bepaald. Het totale zwaveldioxide wordt verkregen door het vrije en het gebonden zwaveldioxide op te tellen.

2.2.   Referentiemethode

2.2.1.   Apparatuur

2.2.1.1.   De te gebruiken opstelling moet, vooral wat de koeler betreft, overeenkomen met de hieronder afgebeelde opstelling.

Image

De gasinleidbuis in het borrelvat B eindigt in een kleine bol met een diameter van 1 cm, die ter hoogte van de grootste horizontale omtrek is voorzien van 20 gaatjes met een diameter van 0,2 mm. In plaats hiervan kan ook een glasfritplaatje worden gebruikt, waardoor een groot aantal heel kleine belletjes wordt gevormd, zodat er een goed contact tussen de gasfase en de vloeistoffase is.

De hoeveelheid door de opstelling stromend gas moet ongeveer 40 l/uur bedragen. De gaswasfles rechts van het borrelvat moet de door de waterstraalpomp veroorzaakte onderdruk beperken tot 20-30 cm water. Om deze onderdruk zodanig te kunnen regelen dat de gasstroom correct is, is het nuttig tussen het borrelvat en de gaswasfles een stromingsmeter met halfcapillaire buis te plaatsen.

2.2.1.2.   Microburet.

2.2.2.   Reagentia

2.2.2.1.   Fosforzuur (H3PO4, ρ20 = 1,71 g/ml), 85 % (v/v).

2.2.2.2.   Waterstofperoxideoplossing, 9,1 g H2O2/l (3 delen).

2.2.2.3.   Indicatoroplossing

| Methylrood ... | 100 mg |
| --- | --- |
| Methyleenblauw ... | 50 mg |
| Ethanol 50 % vol. ... | 100 ml |

Methylrood ...

100 mg

Methyleenblauw ...

50 mg

Ethanol 50 % vol. ...

100 ml

2.2.2.4.   Natriumhydroxideoplossing (NaOH), 0,01 M.

2.2.3.   Bepaling van vrij zwaveldioxide

2.2.3.1.   Werkwijze

De wijn moet vóór de bepaling gedurende twee dagen in een volle en afgesloten fles bij 20 °C worden bewaard.

| — | Breng 2-3 ml waterstofperoxideoplossing (2.2.2.2) en 2 druppels indicatoroplossing (2.2.2.3) in het borrelvat B en neutraliseer de waterstofperoxideoplossing met 0,01 M natriumhydroxideoplossing (2.2.2.4). Sluit het borrelvat op de opstelling aan. |
| --- | --- |

—

Breng 2-3 ml waterstofperoxideoplossing (2.2.2.2) en 2 druppels indicatoroplossing (2.2.2.3) in het borrelvat B en neutraliseer de waterstofperoxideoplossing met 0,01 M natriumhydroxideoplossing (2.2.2.4). Sluit het borrelvat op de opstelling aan.

| — | Breng 50 ml monster en 15 ml fosforzuur (2.2.2.1) in kolf A van de opstelling (250 ml). Breng de kolf aan. |
| --- | --- |

—

Breng 50 ml monster en 15 ml fosforzuur (2.2.2.1) in kolf A van de opstelling (250 ml). Breng de kolf aan.

| — | Leid vervolgens gedurende 15 minuten lucht (of stikstof) door. Het gestripte vrije zwaveldioxide wordt geoxideerd tot zwavelzuur. Verwijder het borrelvat van de opstelling en titreer het gevormde zuur met 0,01 M natriumhydroxideoplossing (2.2.2.4). Zij n het verbruikte volume in milliliter. |
| --- | --- |

—

Leid vervolgens gedurende 15 minuten lucht (of stikstof) door. Het gestripte vrije zwaveldioxide wordt geoxideerd tot zwavelzuur. Verwijder het borrelvat van de opstelling en titreer het gevormde zuur met 0,01 M natriumhydroxideoplossing (2.2.2.4). Zij n het verbruikte volume in milliliter.

2.2.3.2.   Weergave van de resultaten

Het gehalte aan vrij zwaveldioxide wordt uitgedrukt in milligram per liter (mg/l) zonder decimalen.

2.2.3.2.1.   Wijze van berekening

Vrij zwaveldioxide in milligram per liter: 6,4 n.

2.2.4.   Bepaling van totaal zwaveldioxide

2.2.4.1   Werkwijze

2.2.4.1.1.   Voor gerectificeerde geconcentreerde most wordt de oplossing gebruikt die is verkregen door het monster tot 40 % (m/v) te verdunnen, zoals aangegeven onder punt 5.1.2 van het hoofdstuk „Totaal zuurgehalte”. Breng 50 ml van deze oplossing en 5 ml fosforzuur (2.2.2.1) in kolf A van de opstelling (250 ml). Breng de kolf aan.

2.2.4.1.2.   Wijn en most

Geschat gehalte van het monster ≤ 50 mg SO2 totaal/l. Breng 50 ml monster en 15 ml fosforzuur (2.2.2.1) in kolf A van de opstelling (250 ml). Breng de kolf aan.

Geschat gehalte van het monster ≥ 50 mg SO2 totaal/l. Breng 20 ml monster en 5 ml fosforzuur (2.2.2.1) in kolf A van de opstelling (100 ml). Breng de kolf aan.

Breng 2-3 ml waterstofperoxideoplossing (2.2.2.2) in het borrelvat B, neutraliseer zoals in het voorgaande aangegeven en breng de wijn in kolf A met een kleine vlam van 4-5 cm hoogte, die de bodem van de kolf moet raken, aan de kook. Plaats geen metaalgaas onder de kolf, maar laat deze rusten op een schijf met een opening van 30 mm diameter. Hierdoor wordt verbranding van de uit de wijn te extraheren stoffen aan de wand van de kolf voorkomen.

Houd de vloeistof tijdens het doorleiden van lucht (of stikstof) aan de kook. In 15 minuten is het totale zwaveldioxide gestript en geoxideerd. Bepaal het gevormde zwavelzuur door titratie met 0,01 M natriumhydroxideoplossing (2.2.2.4).

Zij n het verbruikte volume in milliliter.

2.2.4.2.   Weergave van de resultaten

Zwaveldioxide totaal wordt uitgedrukt in milligram per liter (mg/l), respectievelijk in milligram per kilogram (mg/kg) totaal suiker, zonder decimalen.

2.2.4.2.1.   Wijze van berekening

| — | Wijn en most:
  Totaal zwaveldioxide in milligram per liter:






  — | monsters die arm zijn aan zwaveldioxide (50 ml monster):
  6,4 × n |
| --- | --- | --- |

—

Wijn en most:

Totaal zwaveldioxide in milligram per liter:

—

monsters die arm zijn aan zwaveldioxide (50 ml monster):

6,4 × n

| — | andere monsters (20 ml monster):
  16 × n |
| --- | --- |

—

andere monsters (20 ml monster):

16 × n

| — | Gerectificeerde geconcentreerde most
  Zwaveldioxide in milligram per kilogram totaal suiker (50 ml voorbehandeld monster) (2.2.4.1.1):
  (1,600 × n)/(P)
  P = totaal suikergehalte in % (m/m). |
| --- | --- |

—

Gerectificeerde geconcentreerde most

Zwaveldioxide in milligram per kilogram totaal suiker (50 ml voorbehandeld monster) (2.2.4.1.1):

(1,600 × n)/(P)

P = totaal suikergehalte in % (m/m).

2.2.3.4.2.   Herhaalbaarheid (r)

Gehalte < 50 mg/l (50 ml monster): r = 1 mg/l.

Gehalte > 50 mg/l (20 ml monster): r = 6 mg/l.

2.2.3.4.3.   Reproduceerbaarheid (R)

Gehalte < 50 mg/l (50 ml monster): R = 9 mg/l.

Gehalte > 50 mg/l (20 ml monster): R = 15 mg/l.

---

(1)  Elke pyknometer met gelijkwaardige kenmerken kan worden gebruikt.

(2)  105 pascal (Pa) = 1 bar.

---