# Den Europæiske Unions C 43/2010

| | ISSN 1725-2393
  doi:10.3000/17252393.C_2010.043.dan |
| --- | --- |
| Den Europæiske Unions
  Tidende | C 43 |
| | |
| Dansk udgave | Meddelelser og oplysninger | 53. årgang19. februar 2010 |

ISSN 1725-2393

doi:10.3000/17252393.C_2010.043.dan

Den Europæiske Unions

Tidende

C 43

Dansk udgave

Meddelelser og oplysninger

53. årgang19. februar 2010

---

| Informationsnummer | Indhold | Side |
| --- | --- | --- |
| | II   Meddelelser |
| | MEDDELELSER FRA DEN EUROPÆISKE UNIONS INSTITUTIONER, ORGANER, KONTORER OG AGENTURER |
| | Europa-Kommissionen |
| 2010/C 043/01 | Fortegnelse over og beskrivelse af de analysemetoder, der er omhandlet i artikel 120g stk. 1, i Rådets forordning (EF) nr. 1234/2007 (offentliggjort i overensstemmelse med artikel 15, stk. 2, i Kommissionens forordning (EF) nr. 606/2009 af 10. juli 2009
  ) | 1 |

Informationsnummer

Indhold

Side

II   Meddelelser

MEDDELELSER FRA DEN EUROPÆISKE UNIONS INSTITUTIONER, ORGANER, KONTORER OG AGENTURER

Europa-Kommissionen

2010/C 043/01

Fortegnelse over og beskrivelse af de analysemetoder, der er omhandlet i artikel 120g stk. 1, i Rådets forordning (EF) nr. 1234/2007 (offentliggjort i overensstemmelse med artikel 15, stk. 2, i Kommissionens forordning (EF) nr. 606/2009 af 10. juli 2009
  )

(offentliggjort i overensstemmelse med artikel 15, stk. 2, i Kommissionens forordning (EF) nr. 606/2009 af 10. juli 2009

)

1

| DA | |
| --- | --- |

DA

---

II Meddelelser

MEDDELELSER FRA DEN EUROPÆISKE UNIONS INSTITUTIONER, ORGANER, KONTORER OG AGENTURER

Europa-Kommissionen

| 19.2.2010 | DA | Den Europæiske Unions Tidende | C 43/1 |
| --- | --- | --- | --- |

19.2.2010

DA

Den Europæiske Unions Tidende

C 43/1

---

Fortegnelse over og beskrivelse af de analysemetoder, der er omhandlet i artikel 120g stk. 1, i Rådets forordning (EF) nr. 1234/2007 (1)

(offentliggjort i overensstemmelse med artikel 15, stk. 2, i Kommissionens forordning (EF) nr. 606/2009 af 10. juli 2009
   (2)
  )

2010/C 43/01

I nedenstående tabel er opstillet en liste over de analysemetoder, der finder anvendelse til kontrol af de grænseværdier og krav, der er fastlagt i fællesskabslovgivningen for produktion af vinprodukter. I tredje kolonne henvises for hvert parameter til den tilsvarende analysemetode, der er beskrevet i den nyeste udgave (2009) af OIV's samling af internationale metoder til analyse af vin og druemost, som foreligger på datoen for denne publikation. For hvert parameter er kun beskrevet referencemetoder (»type I« eller »type II« i OIV's klassifikation), bortset fra parametre, for hvilke der på nuværende tidspunkt ikke foreligger en valideret metode af type I eller II. Metoderne er beskrevet i bilaget til meddelelsen.

Bemærk:

I del I af bilag A til OIV's samling er de forskellige typer analysemetoder defineret, herunder type I (standardreferencemetode), type II (referencemetode) og type IV (foreløbig metode).

Analysemetoder for bly og cadmium er nu beskrevet i Kommissionens forordning (EF) nr. 333/2007 af 28. marts 2007 (bilag C-3) (3). Derudover er der fastlagt generelle kriterier for metoder til analyse af ochratoksin A i bilag II.4 til forordning (EF) nr. 401/2006 af 23. februar 2006 (4), hvorfor der ikke er behov for at beskrive en metode for dette stof specielt med henblik på vinprodukter.

FORTEGNELSE OVER ANALYSEMETODER

| Nr. | Parameter | Metode i OIV's samling | Type |
| --- | --- | --- | --- |
| 1 | Massefylde/densitet | AS2-01-MASVOL | I |
| 2 | Brydningsindeks | AS2-02-SUCREF | I |
| 3 | Totalt tørstofindhold | AS2-03-EXTSEC | I |
| 4 | Isotopforhold 18O/16O i vandet i vinen | AS2-09-MOUO18 | II |
| 5 | Folins indeks | AS2-10-INDFOL | IV |
| 6 | Sukkerindhold (= glucose + fructose) | AS311-02-GLUFRU | II |
| 7 | Saccharoseindhold (bestemt ved HPLC) | AS311-03-SUCRES | II |
| 8 | Bestemmelse af deuterium i ethanol i vinen ved kernemagnetisk resonans | AS311-05-ENRRMN (under revision) | I |
| 9 | Alkoholindhold, % vol. | AS312-01-TALVOL | I |
| 10 | Isotopforhold 13C/12C i ethanol i vinen | AS312-06-ETHANO | II |
| 11 | Totalt syreindhold | AS313-01-ACITOT | I |
| 12 | Flygtigt syreindhold | AS313-02-ACIVOL | I |
| 13 | Citronsyre | AS313-09-ACIENZ | II |
| 14 | Sorbinsyre | AS313-14-ACISOR | IV |
| 15 | pH af most | AS313-15-PH | I |
| 16 | Ascorbinsyre | AS 313-22 ACASCO | II |
| 17 | CO2, g/l | AS314-01-DIOCAR | II |
| 18 | CO2, g/l (trykmåling) | AS314-04-CO2MAN | II |
| 19 | Overtryk af CO2 | AS314-02-SURPRES | I |
| 20 | Lysozym | AS315-14-LYSOZY | IV |
| 21 | Kaliumsulfat | AS321-05-SULFAT | II |
| 22 | Jern | AS322-05-FER | IV |
| 23 | Kobber | AS322-06-CUIVRE | IV |
| 24 | Sulfitter (SO2) eller
  Totalt svovldioxid | AS323-04-DIOSU | II |

Nr.

Parameter

Metode i OIV's samling

Type

1

Massefylde/densitet

AS2-01-MASVOL

I

2

Brydningsindeks

AS2-02-SUCREF

I

3

Totalt tørstofindhold

AS2-03-EXTSEC

I

4

Isotopforhold 18O/16O i vandet i vinen

AS2-09-MOUO18

II

5

Folins indeks

AS2-10-INDFOL

IV

6

Sukkerindhold (= glucose + fructose)

AS311-02-GLUFRU

II

7

Saccharoseindhold (bestemt ved HPLC)

AS311-03-SUCRES

II

8

Bestemmelse af deuterium i ethanol i vinen ved kernemagnetisk resonans

AS311-05-ENRRMN (under revision)

I

9

Alkoholindhold, % vol.

AS312-01-TALVOL

I

10

Isotopforhold 13C/12C i ethanol i vinen

AS312-06-ETHANO

II

11

Totalt syreindhold

AS313-01-ACITOT

I

12

Flygtigt syreindhold

AS313-02-ACIVOL

I

13

Citronsyre

AS313-09-ACIENZ

II

14

Sorbinsyre

AS313-14-ACISOR

IV

15

pH af most

AS313-15-PH

I

16

Ascorbinsyre

AS 313-22 ACASCO

II

17

CO2, g/l

AS314-01-DIOCAR

II

18

CO2, g/l (trykmåling)

AS314-04-CO2MAN

II

19

Overtryk af CO2

AS314-02-SURPRES

I

20

Lysozym

AS315-14-LYSOZY

IV

21

Kaliumsulfat

AS321-05-SULFAT

II

22

Jern

AS322-05-FER

IV

23

Kobber

AS322-06-CUIVRE

IV

24

Sulfitter (SO2) eller

Totalt svovldioxid

AS323-04-DIOSU

II

Beskrivelsen af nogle analysemetoder er under ajourføring af OIV. Disse beskrivelser vil blive offentliggjort i Kommissionens næste meddelelse, når en ajourført tekst er offentliggjort af OIV i 2010-udgaven af OIV's samling af internationale analysemetoder.

---

(1)  EUT L 299 af 16.11.2007.

(2)  EUT L 193 af 24.7.2009, s. 1.

(3)  EUT L 88 af 29.3.2007, s. 29

(4)  EUT L 70 af 9.3.2006, s. 12.

---

BILAG

INDHOLDSFORTEGNELSE

| 1. | MASSEFYLDE VED 20 °C OG RELATIV DENSITET VED 20 °C (OIV-AS2-01-MASVOL) — Metode af type I |
| --- | --- |

1.

| 2. | BESTEMMELSE AF SUKKERINDHOLDET I MOST, KONCENTRERET MOST OG REKTIFICERET KONCENTRERET MOST VED REFRAKTOMETRI (OIV-AS2-02-SUCREF) — Metode af type I |
| --- | --- |

2.

| 3. | TOTALT TØRSTOFINDHOLD (OIV-AS2-03-EXTSEC) Totalindhold af tørstof — Metode af type I |
| --- | --- |

3.

| 4. | BESTEMMELSE AF ISOTOPFORHOLDET 18O/16O I VAND I VIN (OIV-AS2-09-MOUO18) — Metode af type II |
| --- | --- |

4.

| 5. | FOLIN-CIOCALTEU-INDEKS (OIV-AS2-10-INDFOL) — Metode af type IV |
| --- | --- |

5.

| 6. | GLUCOSE OG FRUCTOSE (OIV-AS311-02-GLUFRU) — Metode af type II |
| --- | --- |

6.

| 7. | BESTEMMMELSE AF SUKKERARTER VED HPLC (SACCHAROSE) (OIV-AS311-03-SUCRES) — Metode af type II |
| --- | --- |

7.

| 8. | PÅVISNING AF SUKKERTILSÆTNING TIL DRUEMOST, KONCENTRERET DRUEMOST, REKTIFICERET KONCENTRERET DRUEMOST OG VIN VED KERNEMAGNETISK RESONANS AF DEUTERIUM (OIV-AS311-05-ENRRMN) — Metode af type I |
| --- | --- |

8.

| 9. | ALKOHOLINDHOLD I VOLUMEN (OIV-AS312-01-TALVOL) — Metode af type I |
| --- | --- |

9.

| 10. | BESTEMMELSE VED ISOTOPMASSESPEKTROMETRI AF ISOTOPFORHOLDET 13C/12C I ETHANOL I VIN OG I ETHANOL FREMSTILLET VED GÆRING AF MOST, KONCENTRERET MOST OG REKTIFICERET KONCENTRERET MOST (OIV-AS312-06-ETHANO) — Metode af type II |
| --- | --- |

10.

| 11. | TOTALT SYREINDHOLD (OIV-AS313-01-ACITOT) — Metode af type I |
| --- | --- |

11.

| 12. | FLYGTIGE SYRER (OIV-AS313-02-ACIVOL) — Metode af type I |
| --- | --- |

12.

| 13. | CITRONSYRE (OIV-AS313-09-ACIENZ) — Metode af type II |
| --- | --- |

13.

| 14. | SORBINSYRE (OIV-AS313-14-ACISOR) — Metode af type IV |
| --- | --- |

14.

| 15. | pH (OIV-AS313-15-PH) — Metode af type I |
| --- | --- |

15.

| 16. | SAMTIDIG KVANTITATIV BESTEMMELSE AF L-ASCORBINSYRE OG D-ISOASCORBINSYRE VED HPLC MED UV-DETEKTION (OIV-AS313-22-ACASCO) — Metode af type II |
| --- | --- |

16.

| 17. | KULDIOXID (OIV-AS314-01-DIOCAR) — Metode af type II |
| --- | --- |

17.

| 18. | KVANTITATIV BESTEMMELSE AF KULDIOXID I VIN MED EN MANOMETRISK METODE (OIV-AS314-04-CO2MAN) — Metode af type II |
| --- | --- |

18.

| 19. | MÅLING AF OVERTRYK I MOUSSERENDE VIN OG PERLEVIN (OIV-AS314-02-SURPRES) — Metode af type I |
| --- | --- |

19.

| 20. | Kvantitativ bestemmmelse af lysozym i vin med HPLC (OIV-AS315-14) — Metode af type IV |
| --- | --- |

20.

| 21. | SULFATER (OIV-AS321-05-SULFAT) — Metode af type II |
| --- | --- |

21.

| 22. | JERN (OIV-AS322-05-FER) — Metode af type IV |
| --- | --- |

22.

| 23. | KOBBER (OIV-AS 322-06) — Metode af type IV |
| --- | --- |

23.

| 24. | SVOVLDIOXID (OIV-AS323-04-DIOSU) — Metode af type II |
| --- | --- |

24.

1   MASSEFYLDE VED 20 °C OG RELATIV DENSITET VED 20 °C (OIV-AS2-01-MASVOL) — METODE AF TYPE I

1.   DEFINITIONER

Massefylden er forholdet mellem massen af et givet volumen vin eller most ved 20 °C og dette volumen. Dette angives i gram pr. ml og betegnes ved symbolet ρ20 °C.

Den relative densitet ved 20 °C eller densitet 20 °C/20 °C er forholdet, angivet som decimalbrøk, mellem massefylden af vin eller most ved 20 °C og massefylden af vand ved samme temperatur. Den betegnes ved symbolet Formula

2.   METODERNES PRINCIP

Massefylden og den relative densitet ved 20 °C bestemmes på analyseprøven:

| | enten ved pyknometri, der er referencemetoden, |
| --- | --- |

enten ved pyknometri, der er referencemetoden,

| | eller ved densimetri med hydrostatisk vægt eller ved elektronisk densimetri. |
| --- | --- |

eller ved densimetri med hydrostatisk vægt eller ved elektronisk densimetri.

Bemærk

Ved meget nøjagtige bestemmelser skal massefylden korrigeres for virkningen af svovldioxid.

| ρ20 °C | = | ρ′20 °C – 0,0006 • S |
| --- | --- | --- |
| ρ20 °C | = | korrigeret massefylde |
| ρ′20 °C | = | observeret massefylde |
| S | = | totalt svovldioxid i g/l |

ρ20 °C

=

ρ′20 °C – 0,0006 • S

ρ20 °C

=

korrigeret massefylde

ρ′20 °C

=

observeret massefylde

S

=

totalt svovldioxid i g/l

3.   FORBEHANDLING AF PRØVEN

Hvis vinen eller mosten indeholder nævneværdige mængder kuldioxid, kan hovedparten heraf fjernes ved at omrøre 250 ml vin i en 1 000 ml kolbe eller ved vakuumfiltrering gennem 2 g vat, som er anbragt i en forlænger.

4.   REFERENCEMETODE

4.1.   Apparatur

Sædvanligt laboratorieudstyr, herunder:

4.1.1.   Pyknometer (1) af pyrexglas på ca. 100 ml med aftageligt slibtermometer inddelt i tiendedele grader fra 10 ° til 30 °C. Termometeret skal være kontrolleret (figur 1).

Image

Pyknometerets siderør har en længde af 25 mm, indvendig diameter højst 1 mm og konisk slib i enden. Siderøret kan lukkes med en »opsamlingsprop« bestående af et rør med konisk slib og tilspidset ende. Denne prop fungerer som ekspansionskammer.

De to slib skal være udført meget omhyggeligt.

4.1.2.   Tareringsflaske af samme ydre volumen (med mindre end 1 ml nøjagtighed) som pyknometeret og en masse lig med massen af pyknometeret, fyldt med en væske med massefylden 1,01 [2,0 % m/v natriumchloridopløsning].

Varmeisolerende kappe, der passer nøjagtigt omkring pyknometeret.

4.1.3.   Vægt med to vægtskåle, med en kapacitet på mindst 300 g og en nøjagtighed på 0,1 mg

eller

en vægt med én vægtskål med en kapacitet på mindst 200 g og en nøjagtighed på 0,1 mg.

4.2.   Kalibrering af pyknometeret

Kalibreringen af pyknometeret omfatter bestemmelse af følgende karakteristika:

| — | tara, |
| --- | --- |

—

tara,

| — | volumen ved 20 °C, |
| --- | --- |

—

volumen ved 20 °C,

| — | massen af det vandfyldte pyknometer ved 20 °C. |
| --- | --- |

—

massen af det vandfyldte pyknometer ved 20 °C.

4.2.1.   Med en toskålsvægt

Tareringsflasken anbringes på venstre vægtskål og det rene og tørre pyknometer forsynet med »opsamlingsprop« på højre vægtskål. Vægten bringes derefter i ligevægt ved anbringelse af lodder ved siden af pyknometeret på: i alt p gram.

Pyknometeret fyldes omhyggeligt med destilleret vand ved stuetemperatur, hvorefter termometeret anbringes. Pyknometeret aftørres omhyggeligt og anbringes i den varmeisolerende kappe, og indholdet blandes ved at vende pyknometeret på hovedet flere gange, indtil termometeret viser konstant temperatur. Væskeoverfladen bringes i nøjagtigt niveau med siderørets overkant, som aftørres, hvorefter opsamlingsproppen isættes. Temperaturen t °C aflæses omhyggeligt, og der korrigeres for eventuel unøjagtighed af termometerskalaen. Det vandfyldte pyknometer vejes, og vægten p′ gram, der er nødvendig for at opnå ligevægt, noteres.

Beregninger

| | Tara af det tomme pyknometer:
  Tara af tomt pyknometer= p + m
  m= massen af den i pyknometeret indeholdte luft
  m= 0,0012 (p – p′). |
| --- | --- |

Tara af det tomme pyknometer:

Tara af tomt pyknometer= p + m

m= massen af den i pyknometeret indeholdte luft

m= 0,0012 (p – p′).

| | Volumen ved 20 °C:
  V20 °C= (p + m – p′) • Ft, hvor

  Ft= faktor aflæst i tabel I for temperaturen t °C
  V20 °C skal være kendt med en nøjagtighed på ± 0,001 ml. |
| --- | --- |

Volumen ved 20 °C:

V20 °C= (p + m – p′) • Ft, hvor

Ft= faktor aflæst i tabel I for temperaturen t °C

V20 °C skal være kendt med en nøjagtighed på ± 0,001 ml.

| | Massen af vand ved 20 °C:
  M20 °C= V20 °C • 0,998203
  0,998203= vands massefylde ved 20 °C. |
| --- | --- |

Massen af vand ved 20 °C:

M20 °C= V20 °C • 0,998203

0,998203= vands massefylde ved 20 °C.

4.2.2.   Med en etskålsvægt

Bestem:

| — | massen af det rene og tørre pyknometer: P |
| --- | --- |

—

massen af det rene og tørre pyknometer: P

| — | massen af det vandfyldte pyknometer ved t °C: P1 som beskrevet under 4.2.1 |
| --- | --- |

—

massen af det vandfyldte pyknometer ved t °C: P1 som beskrevet under 4.2.1

| — | massen af tareringsflasken T0 |
| --- | --- |

—

massen af tareringsflasken T0

Beregninger

Tara af det tomme pyknometer:

| | Tara i tom tilstand:= P – m
  m= massen af den i pyknometeret indeholdte luft
  m= 0,0012 (P1 – P) |
| --- | --- |

Tara i tom tilstand:= P – m

m= massen af den i pyknometeret indeholdte luft

m= 0,0012 (P1 – P)

| | Volumen ved 20 °C:
  V20 °C= [P1 – (P – m)] • Ft, hvor
  Ft= faktor aflæst i tabel I for temperaturen t °C. |
| --- | --- |

Volumen ved 20 °C:

V20 °C= [P1 – (P – m)] • Ft, hvor

Ft= faktor aflæst i tabel I for temperaturen t °C.

| | Volumenet ved 20 °C skal være kendt med en nøjagtighed på ± 0,001 ml. |
| --- | --- |

Volumenet ved 20 °C skal være kendt med en nøjagtighed på ± 0,001 ml.

| | Massen af vand ved 20 °C:
  M20 °C= V20 °C • 0,998203
  0,998203= vands massefylde ved 20 °C |
| --- | --- |

Massen af vand ved 20 °C:

M20 °C= V20 °C • 0,998203

0,998203= vands massefylde ved 20 °C

4.3.   Måleteknik

4.3.1.   Med en toskålsvægt

Pyknometeret, fyldt med prøven, forberedt som beskrevet under 3, vejes efter den under 4.2.1 angivne fremgangsmåde.

Massen i gram, som giver ligevægt ved t °C, kaldes p′′.

Massen af den i pyknometeret indeholdte væske = p + m – p′′

Den tilsyneladende massefylde ved t °C:

ρt °C = (p + m – p′′)/V20 °C

Massefylden ved 20 °C beregnes ved hjælp af en af følgende tabeller, afhængigt af arten af den undersøgte væske: tør vin (tabel II), naturlig eller koncentreret most (tabel III), sød vin (tabel IV).

Vinens densitet 20 °C/20 °C fremkommer ved at dividere massefylden ved 20 °C med 0,998203.

4.3.2.   Med en etskålsvægt

Tareringsflasken vejes, og dens masse kaldes T1

dT = T1 – T0 beregnes.

Massen af det tomme pyknometer på måletidspunktet = P – m + dT

Pyknometeret, fyldt med prøven, forberedt som beskrevet under 3, vejes efter den under 4.2.1 angivne fremgangsmåde. Massen ved t °C kaldes P2.

Massen af den i pyknometeret indeholdte væske ved t °C = P2 – (P – m + dT)

Den tilsyneladende massefylde ved t °C:

ρt °C = (P2 – (P – m + dT)/V20 °C

Beregning af massefylden ved 20 °C af den undersøgte væske: tør vin, naturlig og koncentreret most, sød vin, som angivet i 4.3.1.

Densiteten 20 °C/20 °C beregnes ved at dividere massefylden ved 20 °C med 0,998203.

4.3.3.   Repeterbarhed af massefyldebestemmelsen:

for tørre og halvsøde vine: r = 0,00010

for søde vine: r = 0,00018

4.3.4.   Reproducerbarhed af massefyldebestemmelsen:

for tørre og halvsøde vine: R = 0,00037

for søde vine: R = 0,00045

TABEL I

Tabel over faktoren F

hvormed massen af vandet i pyrexpyknometeret ved t °C skal ganges for at beregne volumenet af pyknometeret ved 20 °C

[Se tabel I i bilag II til metode AS2-01, der er beskrevet i OIV's samling af internationale analysemetoder]

TABEL II

Tabel over den temperaturkorrektion c, der skal foretages af massefylden af tørre og alkoholfrie tørre vine, bestemt med et pyknometer af pyrexglas ved t °C, for at henføre denne til 20 °C

[Se tabel II i bilag II til metode AS2-01, der er beskrevet i OIV's samling af internationale analysemetoder]

| ρ20 = ρ
  t
  ± (c/1 000) | – hvis t er under 20 °C
  – hvis t er over 20 °C |
| --- | --- |

ρ20 = ρ
  t
  ± (c/1 000)

– hvis t er under 20 °C

– hvis t er over 20 °C

TABEL III

Tabel over den temperaturkorrektion c, der skal foretages af massefylden af naturlig eller koncentreret most, bestemt med et pyknometer af pyrexglas ved t °C, for at henføre denne til 20 °C

[Se tabel III i bilag II til metode AS2-01, der er beskrevet i OIV's samling af internationale analysemetoder]

| ρ20 = ρ
  t
  ± (c/1 000) | – hvis t er under 20 °C
  – hvis t er over 20 °C |
| --- | --- |

ρ20 = ρ
  t
  ± (c/1 000)

– hvis t er under 20 °C

– hvis t er over 20 °C

TABEL IV

Tabel over den temperaturkorrektion c, der henfører en vins massefylde, bestemt ved t °C med et pyknometer af pyrexglas, til 20 °C, for vin på 13 % vol. og derover, som indeholder restsukker

[Se tabel IV i bilag II til metode AS2-01, der er beskrevet i OIV's samling af internationale analysemetoder]

| ρ20 = ρ
  t
  ± (c/1 000) | – hvis t er under 20 °C
  – hvis t er over 20 °C |
| --- | --- |

ρ20 = ρ
  t
  ± (c/1 000)

– hvis t er under 20 °C

– hvis t er over 20 °C

2   BESTEMMELSE AF SUKKERINDHOLDET I MOST, KONCENTRERET MOST OG REKTIFICERET KONCENTRERET MOST VED REFRAKTOMETRI (OIV-AS2-02-SUCREF) — METODE AF TYPE I

1.   METODENS PRINCIP

Brydningsindekset ved 20 °C, udtrykt enten som absolut værdi eller som vægtprocent af saccharose, anvendes til at finde sukkerindholdet i g/l og i g/kg druemost, koncentreret druemost og rektificeret koncentreret druemost i den tilsvarende tabel.

2.   APPARATUR

2.1.   Refraktometer af Abbé-typen

Refraktometerets skala skal vise:

| — | enten vægtprocent saccharose med en nøjagtighed på 0,1 % |
| --- | --- |

—

enten vægtprocent saccharose med en nøjagtighed på 0,1 %

| — | eller brydningsindeks med fire decimaler. |
| --- | --- |

—

eller brydningsindeks med fire decimaler.

Refraktometeret skal have et termometer med en skala, der mindst dækker området + 15 °C til + 25 °C, og skal kunne termostateres til 20 °C ± 5 °C ved vandcirkulation.

Instrumentets brugsanvisning skal følges nøje, navnlig hvad angår kalibrering og lyskilde.

3.   PRØVEFORBEREDELSE

3.1   Most og koncentreret most

Mosten passeres om nødvendigt gennem tør gaze sammenfoldet i fire lag. Idet de første filtrerede dråber kasseres, foretages bestemmelsen på det filtrerede produkt.

3.2   Rektificeret koncentreret most

Afhængigt af koncentrationen anvendes enten selve den rektificerede koncentrerede most eller en opløsning opnået ved at fortynde 200 g rektificeret koncentreret most til 500 g med vand. Alle vejninger skal udføres omhyggeligt.

4.   FREMGANGSMÅDE

Prøven bringes til en temperatur på ca. 20 °C. En lille smule prøve anbringes på refraktometerets nedre prisme, så prøven dækker glasoverfladen ensartet, når prismepladerne presses mod hinanden. Ved målingen følges brugsanvisningen for det anvendte apparat.

Vægtprocenten af saccharose aflæses med en nøjagtighed på 0,1 %, eller brydningsindekset aflæses med fire decimaler.

Der foretages mindst to bestemmelser på den samme forberedte prøve. Temperaturen t °C aflæses.

5.   BEREGNINGER

5.1.   Temperaturkorrektion

5.1.1.   Apparater inddelt i vægtprocent af saccharose: Tabel I anvendes til temperaturkorrektion.

5.1.2.   Apparater inddelt i brydningsindeks: Ved hjælp af indekset, målt ved t °C, findes den tilsvarende vægtprocent af saccharose ved t °C i tabel II (kolonne 1). Denne værdi henføres til 20 °C ved hjælp af tabel I.

5.2.   Sukkerindholdet i most og koncentreret most

Ved hjælp af vægtprocenten af saccharose ved 20 °C findes det tilsvarende sukkerindhold i g/l og g/kg i tabel II. Sukkerindholdet angives som invertsukker med én decimal.

5.3.   Sukkerindholdet i rektificeret koncentreret most

Ved hjælp af vægtprocenten af saccharose ved 20 °C findes det tilsvarende sukkerindhold i g/l og g/kg i tabel III. Sukkerindholdet angives som invertsukker med én decimal.

Er målingen udført på en fortynding, ganges resultatet med fortyndingsfaktoren.

5.4   Brydningsindekset for most, koncentreret most og rektificeret koncentreret most

Ved hjælp af vægtprocenten af saccharose ved 20 °C findes det tilsvarende brydningsindeks ved 20 °C i tabel II. Indekset angives med fire decimaler.

Bemærk: Det potentielle alkoholindhold af most, koncentreret most og rektificeret koncentreret most kan bestemmes ved hjælp af sammenligningstabellen i bilag I til Kommissionens forordning (EF) nr. 1623/2000 af 25. juli 2000 (EUT L 194 af 31. juli 2000).

TABEL I

Korrektion af vægtprocenten af saccharose, når denne er bestemt ved en anden temperatur end 20 °C

[Se tabel I i bilaget til metode AS2-02, der er beskrevet i OIV's samling af internationale analysemetoder]

TABEL II

Tabel over sukkerindholdet i most og koncentreret most i g/l og i g/kg, bestemt ved hjælp af et refraktometer, som enten viser vægtprocent saccharose ved 20 °C eller brydningsindeks ved 20 °C. Tabellen angiver desuden massefylden ved 20 °C.

[Se tabel II i bilaget til metode AS2-02, der er beskrevet i OIV's samling af internationale analysemetoder]

TABEL III

Tabel over sukkerindholdet i rektificeret koncentreret most i g/l og i g/kg, bestemt ved hjælp af et refraktometer, som enten viser vægtprocent saccharose ved 20 °C eller brydningsindeks ved 20 °C. Tabellen angiver desuden massefylden ved 20 °C.

[Se tabel III i bilaget til metode AS2-02, der er beskrevet i OIV's samling af internationale analysemetoder]

3   TOTALT TØRSTOFINDHOLD (OIV-AS2-03-EXTSEC) TOTALINDHOLD AF TØRSTOF — METODE AF TYPE I

1.   DEFINITION

Det totale tørstofindhold er mængden af de stoffer, som ved givne fysiske betingelser ikke forflygtiges. Disse fysiske betingelser skal fastsættes således, at tørstoffets komponenter ændres mindst muligt.

Det ukorrigerede tørstofindhold er det totale tørstofindhold fratrukket totalindholdet af sukker.

Det korrigerede tørstofindhold er det totale tørstofindhold fratrukket totalindholdet af sukker som overstiger 1 g/l, kaliumsulfat som overstiger 1 g/l, et eventuelt indhold af mannitol samt ethvert andet kemisk stof, der måtte være tilsat vinen.

Tørstofresten er det ukorrigerede tørstofindhold fratrukket de ikke-flygtige syrer, beregnet som vinsyre.

Tørstofindholdet angives i g/l og skal bestemmes med en nøjagtighed på 0,5 g.

2.   METODENS PRINCIP

[Beskrivelsen af denne analysemetode er under ajourføring af OIV. Denne beskrivelse vil blive offentliggjort i Kommissionens næste meddelelse, når en ajourført tekst er offentliggjort af OIV i 2010-udgaven af OIV's samling af internationale analysemetoder. Indtil denne publikation foreligger, henvises som orientering til afsnit 4 af bilaget til Kommissionens forordning (EØF) nr. 2676/90.]

4   BESTEMMELSE AF ISOTOPFORHOLDET 18O/16O I VAND I VIN (OIV-AS2-09-MOUO18) — METODE AF TYPE II

(til orientering)

[Beskrivelsen af denne analysemetode er under ajourføring af OIV. Denne beskrivelse vil blive offentliggjort i Kommissionens næste meddelelse, når en ajourført tekst er offentliggjort af OIV i 2010-udgaven af OIV's samling af internationale analysemetoder. Indtil denne publikation foreligger, henvises som orientering til afsnit 43 af bilaget til Kommissionens forordning (EØF) nr. 2676/90.]

5   FOLIN-CIOCALTEU-INDEKS (OIV-AS2-10-INDFOL) — METODE AF TYPE IV

1.   DEFINITION

Folin-Ciocalteu-indekset er det resultat, som opnås ved anvendelse af den nedenfor beskrevne metode.

2.   PRINCIP

Samtlige phenolforbindelser i vinen oxideres af Folin-Ciocalteu-reagens. Dette består af en blanding af phosphorwolfram-syre (H3PW12O40) og phosphormolybdæn-syre (H3PMo12O40), som ved oxidation af phenolerne reduceres til en blanding af blå wolframoxider (W8O23) og molybdænoxider (Mo8O23).

Den dannede blå farve har absorptionsmaksimum ved ca. 750 nm. Farvestyrken er proportional med indholdet af phenolforbindelser.

3.   REAGENSER

Reagenserne skal være analyserene. Vandet skal være destilleret vand eller vand af tilsvarende renhed.

3.1.   Folin-Ciocalteu-reagens

Dette reagens fås i handelen, klar til brug. Det kan fremstilles på følgende måde: 100 g natriumwolframat (Na2WO4 · 2H2O) og 25 g natriummolybdat (Na2MoO4 · 2H2O) opløses i 700 ml destilleret vand. Der tilsættes 50 ml 85 % phosphorsyre (ρ20 = 1,71 g/ml) og 100 ml koncentreret saltsyre (ρ20 = 1,19 g/ml). Blandingen koges under tilbagesvaling i 10 timer og tilsættes derefter 150 g lithiumsulfat (Li2SO4 · H2O) og nogle dråber brom og koges på ny i 15 min. Der afkøles og fyldes op til 1 l med destilleret vand.

3.2.   20 % (m/v) opløsning af vandfrit natriumcarbonat (Na2CO3).

4.   APPARATUR

Sædvanligt laboratorieudstyr, herunder:

4.1.   100 ml målekolber.

4.2.   Spektrofotometer, som kan arbejde ved 750 nm.

5.   FREMGANGSMÅDE

5.1.   Rødvin

I en 100 ml målekolbe (4.1) anbringes i følgende rækkefølge:

| | 1 ml vin fortyndet i forholdet 1:5 |
| --- | --- |

1 ml vin fortyndet i forholdet 1:5

| | 50 ml destilleret vand |
| --- | --- |

50 ml destilleret vand

| | 5 ml Folin-Ciocalteu-reagens (3.1) |
| --- | --- |

5 ml Folin-Ciocalteu-reagens (3.1)

| | 20 ml natriumcarbonatopløsning (3.2) |
| --- | --- |

20 ml natriumcarbonatopløsning (3.2)

Der fyldes op til 100 ml med destilleret vand.

Der blandes ved omrystning. Blandingen lades derefter henstå i 30 minutter, for at reaktionen skal nå til ligevægt. Absorbansen ved 750 nm bestemmes ved en optisk vejlængde på 1 cm i forhold til en blindprøve fremstillet med destilleret vand i stedet for vin.

Er den aflæste absorbans ikke i nærheden af 0,3, må fortyndingen af vinen ændres.

5.2.   Hvidvin

Der bruges samme fremgangsmåde med 1 ml ufortyndet vin.

5.3.   Rektificeret koncentreret most

5.3.1.   Klargøring af prøven

Der anvendes en opløsning med et sukkerindhold på 25 % (m/m) (25° Brix), fremstillet efter anvisningerne i kapitlet »pH«, afsnit 4.1.2.

5.3.2.   Måling

Målingen foretages som beskrevet for rødvin (5.1) med 5 ml prøve fremstillet efter anvisningerne i 5.3.1, idet absorbansen måles i forhold til en referenceprøve fremstillet med 5 ml af en 25 % (m/m) opløsning af invertsukker.

6.   ANGIVELSE AF RESULTATER

6.1.   Beregningsmåde

Resultatet angives i form af et indeks, der fremkommer ved at gange absorbansen med 100 for rødvin fortyndet i forholdet 1:5 (eller med en faktor svarende til den anvendte fortynding) og med 20 for hvidvin. For rektificeret koncentreret most ganges absorbansen med 16.

6.2.   Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to bestemmelser gennemført samtidig eller hurtigt efter hinanden af samme person må ikke overstige 1.

En god repeterbarhed af resultaterne beror på anvendelse af et pinligt rent apparatur (målekolber og spektrofotometerkuvetter).

6   GLUCOSE OG FRUCTOSE (OIV-AS311-02-GLUFRU) — METODE AF TYPE II

1.   DEFINITION

Glucose og fructose kan bestemmes hver for sig ved en enzymatisk metode alene med henblik på at beregne forholdet mellem glucose og fructose.

2.   PRINCIP

Glucose og fructose phosphoryleres med adenosintriphosphat (ATP) ved en enzymatisk reaktion, som katalyseres af hexokinase (HK) og bliver derved til glucose-6-phosphat (G6P) og fructose-6-phosphat (F6P):

| | glucose + ATP←→G6P + ADP |
| --- | --- |

glucose + ATP←→G6P + ADP

| | fructose + ATP←→F6P + ADP |
| --- | --- |

fructose + ATP←→F6P + ADP

Først oxideres glucose-6-phosphat til gluconat-6-phosphat med nikotinamid-adenin-dinukleotid-phosphat (NADP) under tilstedeværelse af enzymet glucose-6-phosphat-dehydrogenase (G6PDH). Den dannede mængde reduceret nikotinamid-adenin-dinukleotid-phosphat (NADPH) svarer til mængden af glucose-6-phosphat og dermed af glucose.

G6P + NADP+←→Gluconat-6-phosphat + NADPH + H+

Det reducerede nikotinamid-adenin-dinukleotid-phosphat bestemmes ud fra absorptionen ved 340 nm.

Når denne reaktion er afsluttet, omdannes fructose-6-phosphat under medvirken af phosphoglucose-isomerase (PGI) til glucose-6-phosphat:

F6P←→G6P

Glucose-6-phosphat reagerer på ny med nikotinamid-adenin-dinukleotid-phosphatet, så der dannes gluconat-6-phosphat og reduceret nikotinamid-adenin-dinukleotid-phosphat, som derefter bestemmes.

3.   APPARATUR

| — | Spektrofotometer, der kan arbejde ved 340 nm, som er absorptionsmaksimum for NADPH. Da der er tale om absolutte målinger (dvs. der bruges ikke kalibreringskurver, men refereres til ekstinktionskoefficienten for NADPH), skal apparatets bølgelængde- og absorbansvisninger være kontrolleret.
  Hvis et sådant spektrofotometer ikke er til rådighed, kan i stedet anvendes et spektrofotometer med diskontinuert spektrum, der kan måle ved 334 nm eller ved 365 nm. |
| --- | --- |

—

Spektrofotometer, der kan arbejde ved 340 nm, som er absorptionsmaksimum for NADPH. Da der er tale om absolutte målinger (dvs. der bruges ikke kalibreringskurver, men refereres til ekstinktionskoefficienten for NADPH), skal apparatets bølgelængde- og absorbansvisninger være kontrolleret.

Hvis et sådant spektrofotometer ikke er til rådighed, kan i stedet anvendes et spektrofotometer med diskontinuert spektrum, der kan måle ved 334 nm eller ved 365 nm.

| — | Glaskuvetter med 1 cm transmissionslængde eller engangskuvetter. |
| --- | --- |

—

Glaskuvetter med 1 cm transmissionslængde eller engangskuvetter.

| — | Pipetter til enzymforsøg, 0,02 ml — 0,05 ml — 0,1 ml — 0,2 ml. |
| --- | --- |

—

Pipetter til enzymforsøg, 0,02 ml — 0,05 ml — 0,1 ml — 0,2 ml.

4.   REAGENSER

4.1.   Opløsning 1: buffer (triethanolamin 0,3 M; pH = 7,6; indhold af Mg2+: 4 × 10-3 M): 11,2 g triethanolaminhydrochlorid (C2H5)3N HCl) og 0,2 g MgSO4 7 H2O opløses i 150 ml dobbeltdestilleret vand. Der tilsættes ca. 4 ml 5 M natriumhydroxidopløsning (NaOH) til pH er 7,6, og fyldes op med vand til 200 ml.

Denne bufferopløsning kan opbevares i fire uger ved + 4 °C.

4.2.   Opløsning 2: opløsning af nikotinamid-adenin-dinukleotid-phosphat (ca. 11,5 × 10–3 M): 50 mg dinatrium-nikotinamid-adenin-dinukleotid-phosphat opløses i 5 ml dobbeltdestilleret vand.

Denne opløsning kan opbevares i fire uger ved + 4 °C.

4.3.   Opløsning 3: opløsning af adenosin-5′-triphosphat (ca. 81 × 10–3 M): 250 mg dinatrium-adenosin-5′-triphosphat og 250 mg natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) opløses i 5 ml dobbeltdestilleret vand.

Denne opløsning kan opbevares i fire uger ved + 4 °C.

4.4.   Opløsning 4: Hexokinase/glucose-6-phosphat-dehydrogenase: 0,5 ml hexokinase (2 mg protein/ml svarende til 280 U/ml) blandes med 0,5 ml glucose-6-phosphat-dehydrogenase (1 mg protein/ml).

Denne opløsning kan opbevares i et år ved + 4 °C.

4.5.   Opløsning 5: Phosphoglucose-isomerase (2 mg protein/ml eller 700 U/ml). Suspensionen anvendes i ufortyndet form.

Denne opløsning kan opbevares i et år ved + 4 °C.

Bemærkning:

Alle reagenser til denne bestemmelse findes i handelen.

5.   FREMGANGSMÅDE

5.1.   Klargøring af prøven

Afhængigt af den anslåede mængde glucose + fructose pr. liter foretages følgende fortyndinger:

| Måling ved 340 og 334 nm | Måling ved 365 nm | Fortynding med vand | Fortyndingsfaktor F |
| --- | --- | --- | --- |
| Indtil 0,4 g/l | Indtil 0,8 g/l | — | — |
| Indtil 4,0 g/l | Indtil 8,0 g/l | 1 + 9 | 10 |
| Indtil 10,0 g/l | Indtil 20,0 g/l | 1 + 24 | 25 |
| Indtil 20,0 g/l | Indtil 40,0 g/l | 1 + 49 | 50 |
| Indtil 40,0 g/l | Indtil 80,0 g/l | 1 + 99 | 100 |
| Over 40,0 g/l | Over 80,0 g/l | 1 + 999 | 1 000 |

Måling ved 340 og 334 nm

Måling ved 365 nm

Fortynding med vand

Fortyndingsfaktor F

Indtil 0,4 g/l

Indtil 0,8 g/l

—

—

Indtil 4,0 g/l

Indtil 8,0 g/l

1 + 9

10

Indtil 10,0 g/l

Indtil 20,0 g/l

1 + 24

25

Indtil 20,0 g/l

Indtil 40,0 g/l

1 + 49

50

Indtil 40,0 g/l

Indtil 80,0 g/l

1 + 99

100

Over 40,0 g/l

Over 80,0 g/l

1 + 999

1 000

5.2.   Bestemmelse

Spektrofotometeret indstilles på bølgelængden 340 nm, og der måles i forhold til luften (ingen kuvette i strålegangen) eller i forhold til vand.

Temperatur 20 til 25 °C.

I to kuvetter med en optisk transmissionslængde på 1 cm fyldes:

| | Blindprøve | Analyse |
| --- | --- | --- |
| Opløsning 1 (4.1) (opvarmet til 20 °C) | 2,50 ml | 2,50 ml |
| Opløsning 2 (4.2) | 0,10 ml | 0,10 ml |
| Opløsning 3 (4.3) | 0,10 ml | 0,10 ml |
| Prøve der skal måles | | 0,20 ml |
| Dobbeltdestilleret vand | 0,20 ml | |

Blindprøve

Analyse

Opløsning 1 (4.1) (opvarmet til 20 °C)

2,50 ml

2,50 ml

Opløsning 2 (4.2)

0,10 ml

0,10 ml

Opløsning 3 (4.3)

0,10 ml

0,10 ml

Prøve der skal måles

0,20 ml

Dobbeltdestilleret vand

0,20 ml

Der blandes, og efter ca. 3 min aflæses opløsningernes absorbans (A1). Reaktionen udløses ved tilsætning af:

| Opløsning 4 (4,4) | 0,02 ml | 0,02 ml |
| --- | --- | --- |

Opløsning 4 (4,4)

0,02 ml

0,02 ml

Der blandes, og væsken lades henstå i 15 minutter, hvorefter absorbansen måles. Efter yderligere 2 minutter kontrolleres, at reaktionen er ophørt (A2).

Der tilsættes straks:

| Opløsning 5 (4.5) | 0,02 ml | 0,02 ml |
| --- | --- | --- |

Opløsning 5 (4.5)

0,02 ml

0,02 ml

Væsken blandes, og der aflæses efter 10 min. Efter yderligere 2 minutter kontrolleres, at reaktionen er ophørt (A3).

Bestem absorbansdifferencerne:

| | A2 – A1 svarende til glucose. |
| --- | --- |

A2 – A1 svarende til glucose.

| | A3 – A2 svarende til fructose. |
| --- | --- |

A3 – A2 svarende til fructose.

For blindprøven og for analysen:

Blindprøvens absorbansdifference (ΔAT) trækkes fra analyseprøvens (ΔAD), og der beregnes:

| | for glucose: ΔAG = ΔAD – ΔAT |
| --- | --- |

for glucose: ΔAG = ΔAD – ΔAT

| | for fructose: ΔAF = ΔAD – ΔAT |
| --- | --- |

for fructose: ΔAF = ΔAD – ΔAT

Bemærkning:

Den tid, enzymet skal virke i, kan variere fra parti til parti. Det anførte tidsrum er kun vejledende. Det anbefales at foretage bestemmelsen for hvert parti.

5.3.   Angivelse af resultater

5.3.1.   Beregning

Til beregning af koncentrationerne anvendes følgende generelle formel:

C= (V × PM)/(ε × d × v × 1 000) × ΔA (g/l), hvor

V= volumen af prøveopløsning (ml)

v= volumen af prøve (ml)

PM= molekylevægten af det stof, der skal bestemmes

d= kuvettens optiske transmissionslængde (cm)

ε= NADPH's absorptionskoefficient ved 340 nm = 6,3 (mmol–1 × l × cm–1)

V= 2,92 ml ved bestemmelse af glucose

V= 2,94 ml ved bestemmelse af fructose

v= 0,20 ml

PM= 180

d= 1.

Der fås:

| | for glucose: C (g/l) = 0,417 × ΔAG |
| --- | --- |

for glucose: C (g/l) = 0,417 × ΔAG

| | for fructose: C (g/l) = 0,420 × ΔAF |
| --- | --- |

for fructose: C (g/l) = 0,420 × ΔAF

Hvis væsken fortyndes under forberedelsen af prøven, ganges resultatet med faktoren F.

Bemærkning:

Såfremt målingerne foretages ved bølgelængderne 334 eller 365 nm, opnås:

| — | måling ved 334 nm: ε = 6,2 (mmol–1 × l × cm–1)
  for glucose: C (g/l) = 0,425 × ΔAG

  for fructose: C (g/l) = 0,428 × ΔAF |
| --- | --- |

—

måling ved 334 nm: ε = 6,2 (mmol–1 × l × cm–1)

for glucose: C (g/l) = 0,425 × ΔAG

for fructose: C (g/l) = 0,428 × ΔAF

| — | måling ved 365 nm: ε = 3,4 (mmol–1 × l × cm–1)
  for glucose: C (g/l) = 0,773 × ΔAG

  for fructose: C (g/l) = 0,778 × ΔAF |
| --- | --- |

—

måling ved 365 nm: ε = 3,4 (mmol–1 × l × cm–1)

for glucose: C (g/l) = 0,773 × ΔAG

for fructose: C (g/l) = 0,778 × ΔAF

5.3.2.   Repeterbarhed (r)

r= 0,056 xi

5.3.3.   Reproducerbarhed (R)

R= 0,12 + 0,076 xi

xi= indhold af glucose eller fructose i g/l.

7   BESTEMMMELSE AF SUKKERARTER VED HPLC (SACCHAROSE) (OIV-AS311-03-SUCRES) — METODE AF TYPE II

(til orientering)

[Beskrivelsen af denne analysemetode er under ajourføring af OIV. Denne beskrivelse vil blive offentliggjort i Kommissionens næste meddelelse, når en ajourført tekst er offentliggjort af OIV i 2010-udgaven af OIV's samling af internationale analysemetoder. Indtil denne publikation foreligger, henvises som orientering til afsnit 6, punkt 3, i bilaget til Kommissionens forordning (EØF) nr. 2676/90.]

8   PÅVISNING AF SUKKERTILSÆTNING TIL DRUEMOST, KONCENTRERET DRUEMOST, REKTIFICERET KONCENTRERET DRUEMOST OG VIN VED KERNEMAGNETISK RESONANS AF DEUTERIUM (OIV-AS311-05-ENRRMN) — METODE AF TYPE I

(til orientering)

[Beskrivelsen af denne analysemetode er under faglig revision af OIV. Den vil blive offentliggjort i en meddelelse fra Kommissionen, når den endelige tekst er vedtaget af OIV's generalforsamling. Indtil denne publikation foreligger, henvises som orientering til afsnit 8 af bilaget til Kommissionens forordning (EØF) nr. 2676/90.]

9   ALKOHOLINDHOLD I VOLUMEN (OIV-AS312-01-TALVOL) — METODE AF TYPE I

(til orientering)

[Beskrivelsen af disse analysemetoder er under ajourføring af OIV. De vil blive offentliggjort i Kommissionens næste meddelelse, når en ajourført tekst er offentliggjort af OIV i 2010-udgaven af OIV's samling af internationale analysemetoder. Indtil denne publikation foreligger, henvises som orientering til afsnit 3 af bilaget til Kommissionens forordning (EØF) nr. 2676/90.]

10   BESTEMMELSE VED ISOTOPMASSESPEKTROMETRI AF ISOTOPFORHOLDET 13C/12C I ETHANOL I VIN OG I ETHANOL FREMSTILLET VED GÆRING AF MOST, KONCENTRERET MOST OG REKTIFICERET KONCENTRERET MOST (OIV-AS312-06-ETHANO) — METODE AF TYPE II

1.   ANVENDELSESOMRÅDE

Metoden anvendes til bestemmelse af isotopforholdet 13C/12C for ethanol i vin og ethanol fremstillet ved gæring af drueprodukter (most, koncentreret most og rektificeret koncentreret most).

2.   HENVISNINGER TIL STANDARDER

| ISO: | 5725:1994 »Precision of test methods – Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests« [Analyse- og prøvningsmetoders præcision. Bestemmelse af repeterbarhed og reproducerbarhed]. |
| --- | --- |
| V-PDB: | Vienna-Pee-Dee Belemnite (RPDB = 0,0112372). |
| OIV-metode AS311-05-ENRRMN | Påvisning af sukkertilsætning til most, koncentreret most, rektificeret koncentreret most og vin ved anvendelse af kernemagnetisk resonans af deuterium (SNIF-NMR). |

ISO:

5725:1994 »Precision of test methods – Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests« [Analyse- og prøvningsmetoders præcision. Bestemmelse af repeterbarhed og reproducerbarhed].

V-PDB:

Vienna-Pee-Dee Belemnite (RPDB = 0,0112372).

OIV-metode AS311-05-ENRRMN

Påvisning af sukkertilsætning til most, koncentreret most, rektificeret koncentreret most og vin ved anvendelse af kernemagnetisk resonans af deuterium (SNIF-NMR).

3.   TERMER OG DEFINITIONER

| 13C/12C | : | Forholdet mellem isotoperne kulstof-13 (13C) og kulstof-12 (12C) i en given prøve. |
| --- | --- | --- |
| δ13C | : | Indhold af kulstof-13 (13C) i promille (‰). |
| SNIF-NMR | : | Site-Specific Natural Isotope Fractionation studied by Nuclear Magnetic Resonance [lokalitetsspecifik naturlig isotopfraktionering undersøgt ved kernemagnetisk resonans]. |
| V-PDB | : | Vienna-Pee-Dee Belemnite. PDB, der er primær standard for måling af naturlige variationer i indholdet af kulstof-13, var calciumcarbonat fra en belemnitpig fra kridttiden i Pee Dee-formationen i South Carolina (USA). Dens 13C/12C-isotopforhold, RPDB, = 0,0112372. PDB er for længst udtømt, men er stadig den primære standard for angivelse af naturlige variationer i indholdet af kulstof-13 og benyttes til kalibrering af referencematerialer, som kan fås ved henvendelse til Den Internationale Atomenergiorganisation (IAEA) i Wien. Isotopbestemmelser af naturligt forekommende kulstof-13 angives således pr. konvention i forhold til V-PDB. |
| m/z | : | Forholdet mellem masse og ladning. |

13C/12C

:

Forholdet mellem isotoperne kulstof-13 (13C) og kulstof-12 (12C) i en given prøve.

δ13C

:

Indhold af kulstof-13 (13C) i promille (‰).

SNIF-NMR

:

Site-Specific Natural Isotope Fractionation studied by Nuclear Magnetic Resonance [lokalitetsspecifik naturlig isotopfraktionering undersøgt ved kernemagnetisk resonans].

V-PDB

:

Vienna-Pee-Dee Belemnite. PDB, der er primær standard for måling af naturlige variationer i indholdet af kulstof-13, var calciumcarbonat fra en belemnitpig fra kridttiden i Pee Dee-formationen i South Carolina (USA). Dens 13C/12C-isotopforhold, RPDB, = 0,0112372. PDB er for længst udtømt, men er stadig den primære standard for angivelse af naturlige variationer i indholdet af kulstof-13 og benyttes til kalibrering af referencematerialer, som kan fås ved henvendelse til Den Internationale Atomenergiorganisation (IAEA) i Wien. Isotopbestemmelser af naturligt forekommende kulstof-13 angives således pr. konvention i forhold til V-PDB.

m/z

:

Forholdet mellem masse og ladning.

4.   PRINCIP

Ved fotosyntesen sker planternes optagelse af gasformig CO2 hovedsagelig ved to mekanismer, nemlig C3-metabolismen (Calvins cyklus) og C4-metabolismen (Hatch og Slacks cyklus). De to fotosyntesemekanismer resulterer i forskellige isotopforhold. Således er indholdet af kulstof-13 højere i produkter fra C4-planter, f.eks. sukker og alkohol fra gæring heraf, end i tilsvarende produkter fra C3-planter. De fleste planter, såsom druer og roer, hører til C3-gruppen. Sukkerrør og majs hører til C4-gruppen. Ved at måle indholdet af kulstof-13 kan man således påvise og bestemme sukker af C4-oprindelse (rørsukker og majsisoglucose), der er tilsat drueprodukter (druemost, vin, mv.). Ved at sammenholde oplysninger om indholdet af kulstof-13 med SNIF-NMR-data kan man desuden kvantitativt bestemme tilsætningen af blandinger af sukker eller alkohol fra C3- og C4-planter.

Indholdet af kulstof-13 bestemmes i den CO2, der dannes ved fuldstændig forbrænding af prøven. Forekomsten af de vigtigste isotopomerer med massetal 44 (12C16O2), 45 (13C16O2 og 12C17O16O) og 46 (12C16O18O), som kan dannes ved kombination af isotoperne 18O, 17O, 16O, 13C og 12C, bestemmes ud fra de ionstrømme, der måles ved tre forskellige kollektorer i et isotopmassespektrometer. Der kan ses bort fra bidragene fra isotopomererne 13C17O16O og 12C17O2, da de næsten ikke forekommer. Ionstrømmen ved m/z = 45 korrigeres for bidraget fra 12C17O16O, som beregnes af den ionstrøm, der måles ved m/z = 46 ud fra den relative forekomst af 18O og 17O (Craigs korrektion). Ved sammenholdelse med en reference, der er kalibreret mod den internationale reference V–PDB, beregnes indholdet af kulstof-13 på den relative δ13C-skala.

5.   REAGENSER

Materialer og forbrugsmaterialer afhænger af det apparatur (6), der benyttes af laboratoriet. De mest anvendte systemer er baseret på en grundstofanalysator. Denne kan være udstyret enten til indføring af prøven i en forseglet metalkapsel eller til indsprøjtning af en væskeprøve gennem en membran med en injektionssprøjte.

Alt efter den benyttede instrumenttype kan der anvendes følgende referencematerialer, reagenser og forbrugsmaterialer:

| — | Referencematerialer |
| --- | --- |

—

Referencematerialer

| — | til rådighed hos IAEA:







  Navn | Udstyr | δ13C i forhold til V-PDB (9) |
| --- | --- | --- | --- |
| — | IAEA-CH-6 |

—

til rådighed hos IAEA:

Navn

Udstyr

δ13C i forhold til V-PDB (9)

—

IAEA-CH-6

saccharose

-10,4 ‰

| — | IAEA-CH-7 |
| --- | --- |

—

IAEA-CH-7

polyethylen

-31,8 ‰

| — | NBS22 |
| --- | --- |

—

NBS22

olie

-29,7 ‰

| — | USGS24 |
| --- | --- |

—

USGS24

grafit

-16,1 ‰

| — | til rådighed hos IRMM (Institut for Referencematerialer og -målinger) i Geel (Belgien):







  Navn | Udstyr | δ13C i forhold til V-PDB (9) |
| --- | --- | --- | --- |
| — | CRM/BCR 656 |

—

til rådighed hos IRMM (Institut for Referencematerialer og -målinger) i Geel (Belgien):

Navn

Udstyr

δ13C i forhold til V-PDB (9)

—

CRM/BCR 656

vinalkohol

-26,93 ‰

| — | CRM/BCR 657 |
| --- | --- |

—

CRM/BCR 657

glucose

-10,75 ‰

| — | CRM/BCR 660 |
| --- | --- |

—

CRM/BCR 660

vandig alkoholopløsning (alkoholindhold 12 % vol.)

-26,72 ‰

| — | Prøve af arbejdsstandard med kendt 13C/12C-forhold, kalibreret mod internationale referencematerialer. |
| --- | --- |

—

Prøve af arbejdsstandard med kendt 13C/12C-forhold, kalibreret mod internationale referencematerialer.

| — | For gennemstrømningssystemer kan følgende liste over forbrugsmaterialer tjene til vejledning:






  — | helium, analyseren (CAS 07440-59-7), |
| --- | --- | --- |

—

For gennemstrømningssystemer kan følgende liste over forbrugsmaterialer tjene til vejledning:

—

helium, analyseren (CAS 07440-59-7),

| — | oxygen, analyseren (CAS 07782-44-7), |
| --- | --- |

—

oxygen, analyseren (CAS 07782-44-7),

| — | kuldioxid, analyseren, anvendt som sekundær standard for indholdet af kulstof-13 (CAS 00124-38-9), |
| --- | --- |

—

kuldioxid, analyseren, anvendt som sekundær standard for indholdet af kulstof-13 (CAS 00124-38-9),

| — | oxidationsreagens til ovnen i forbrændingssystemet, f.eks. kobber(II)oxid, til grundstofanalyse (CAS 1317-38-0), |
| --- | --- |

—

oxidationsreagens til ovnen i forbrændingssystemet, f.eks. kobber(II)oxid, til grundstofanalyse (CAS 1317-38-0),

| — | tørremiddel til at fjerne vand fra forbrændingen, f.eks. anhydron til grundstofanalyse (magnesiumperchlorat) (CAS 10034-81-8) (ikke nødvendigt til apparatur, hvor vandet fjernes med en frysefælde eller et kapillarrør med selektiv permeabilitet). |
| --- | --- |

—

tørremiddel til at fjerne vand fra forbrændingen, f.eks. anhydron til grundstofanalyse (magnesiumperchlorat) (CAS 10034-81-8) (ikke nødvendigt til apparatur, hvor vandet fjernes med en frysefælde eller et kapillarrør med selektiv permeabilitet).

6.   APPARATUR OG UDSTYR

6.1.   Isotopforholdsmassespektrometer (IRMS)

Isotopforholdsmassespektrometer (IRMS), der kan bestemme det relative indhold af naturligt forekommende 13C i CO2-gas med en mindste indre præcision på 0,05 ‰ relativt (9). Den indre præcision defineres her som forskellen mellem to målinger på samme CO2-prøve. Et massespektrometer til bestemmelse af isotopforhold er normalt forsynet med tredobbelt kollektor til samtidig intensitetsmåling ved m/z 44, 45 og 46. Isotopforholdsmassespektrometeret skal enten have et system med to kanaler, så der måles skiftevis på den ukendte prøve og en referenceprøve, eller et integreret system, hvor prøverne forbrændes kvantitativt, og kuldioxiden fra de øvrige forbrændingsprodukter fjernes inden målingen i massespektrometeret.

6.2.   Forbrændingsapparatur

Forbrændingsapparatur, der kvantitativt kan omdanne ethanol til kuldioxid og fjerne de øvrige forbrændingsprodukter, inklusive vand, uden nogen isotopfraktionering. Apparatet kan enten være et gennemstrømningssystem, der er integreret i massespektrometeret (6.2.1) eller et selvstændigt forbrændingssystem (6.2.2). Apparatet skal give mulighed for mindst samme nøjagtighed som anført i punkt 11.

6.2.1.   Gennemstrømningssystemer

Sådanne systemer består enten i en grundstofanalysator eller en gaskromatograf direkte tilsluttet til et forbrændingssystem.

I forbindelse med systemer til indføring af prøver i metalkapsler anvendes følgende laboratorieudstyr:

| — | mikrosprøjte eller målemikropipette med tilhørende spidser, |
| --- | --- |

—

mikrosprøjte eller målemikropipette med tilhørende spidser,

| — | laboratorievægt med en aflæsningsnøjagtighed på 1 μg eller bedre, |
| --- | --- |

—

laboratorievægt med en aflæsningsnøjagtighed på 1 μg eller bedre,

| — | tang til lukning af kapsler, |
| --- | --- |

—

tang til lukning af kapsler,

| — | tinkapsler til flydende prøvemateriale, |
| --- | --- |

—

tinkapsler til flydende prøvemateriale,

| — | tinkapsler til fast prøvemateriale. |
| --- | --- |

—

tinkapsler til fast prøvemateriale.

Bemærk:

For at mindske risikoen for fordampning af ethanol fra prøven kan man i kapslen anbringe et absorberende materiale (f.eks. Chromosorb W 45-60 mesh), som i forvejen har været underkastet en blindprøve til kontrol af, at det ikke indeholder betydende mængder kulstof, der kan indvirke på målingerne.

Når der benyttes en grundstofanalysator med indsprøjtningsenhed til væsker eller et system med gaskromatograf/forbrændingsenhed, er følgende laboratorieudstyr nødvendigt:

| — | injektionssprøjte til væsker, |
| --- | --- |

—

injektionssprøjte til væsker,

| — | hætteglas med tæt lukning og inert membran. |
| --- | --- |

—

hætteglas med tæt lukning og inert membran.

Laboratorieudstyret på ovenstående lister er kun eksempler og kan erstattes med andet tilsvarende udstyr alt efter det anvendte forbrændingsapparatur og massespektrometer.

6.2.2.   Selvstændige systemer til prøveforberedelse

I dette tilfælde opsamles kuldioxiden fra forbrændingen af analyseprøven og referencen i ampuller, som derefter anbringes i spetrometerets to kanaler til isotopanalyse. Der kan benyttes flere typer forbrændingsapparatur, som er beskrevet i litteraturen:

| — | lukket forbrændingssystem med cirkulerende oxygengas, |
| --- | --- |

—

lukket forbrændingssystem med cirkulerende oxygengas,

| — | grundstofanalysator med helium- og oxygengennemstrømning, |
| --- | --- |

—

grundstofanalysator med helium- og oxygengennemstrømning,

| — | forseglet glasampul påfyldt kobber(II)oxid som oxidationsmiddel. |
| --- | --- |

—

forseglet glasampul påfyldt kobber(II)oxid som oxidationsmiddel.

7.   FORBEREDELSE AF ANALYSEPRØVER

Ethanolen skal være isoleret fra vinen inden isotopbestemmelsen. Isoleringen foretages ved destillation af vinen som beskrevet i punkt 3.1 i SNIF-NMR-metoden (OIV - MA-E-AS311-05-ENRRMN).

For druemost, koncentreret druemost og rektificeret koncentreret druemost skal sukkeret først forgæres til ethanol som beskrevet i punkt 3.2 i SNIF-NMR-metoden (OIV - MA-E-AS311-05-ENRRMN).

8.   FREMGANGSMÅDE

Alle faser i forberedelsen skal udføres uden nævneværdigt tab af ethanol ved fordampning, der vil ændre prøvens isotopsammensætning.

Nedenstående beskrivelse henviser til sædvanlige metoder til forbrænding af ethanolprøver i gængse automatiske forbrændingssystemer. Enhver anden metode til fremstilling af kuldioxid til isotopanalyse kan benyttes, forudsat at den sikrer kvantitativ omdannelse af ethanolprøven til kuldioxid uden tab af ethanol ved fordampning.

Forsøgsprocedure med brug af grundstofanalysator:

| a) | Indkapsling af prøverne:






  — | kapsler, tang og arbejdsbord skal være rene, |
| --- | --- | --- |

a)

Indkapsling af prøverne:

—

kapsler, tang og arbejdsbord skal være rene,

| — | med tangen tages der en kapsel af passende størrelse, |
| --- | --- |

—

med tangen tages der en kapsel af passende størrelse,

| — | med mikropipetten anbringes den fornødne mængde væske i kapslen, |
| --- | --- |

—

med mikropipetten anbringes den fornødne mængde væske i kapslen,

| — | Bemærk:

  For at få 2 mg kulstof kræves 3,84 mg absolut ethanol, svarende til 4,17 mg destillat med et alkoholindhold på 92 % m/m. Den nødvendige mængde destillat beregnes ud fra den mængde kulstof, som massespektrometerets følsomhed kræver. |
| --- | --- |

—

Bemærk:

For at få 2 mg kulstof kræves 3,84 mg absolut ethanol, svarende til 4,17 mg destillat med et alkoholindhold på 92 % m/m. Den nødvendige mængde destillat beregnes ud fra den mængde kulstof, som massespektrometerets følsomhed kræver.

| — | kapslen lukkes med tangen, |
| --- | --- |

—

kapslen lukkes med tangen,

| — | hver enkelt kapsel skal være fuldstændig tæt tillukket. I modsat fald skal den kasseres og erstattes af en ny, |
| --- | --- |

—

hver enkelt kapsel skal være fuldstændig tæt tillukket. I modsat fald skal den kasseres og erstattes af en ny,

| — | der fremstilles to kapsler for hver prøve, |
| --- | --- |

—

der fremstilles to kapsler for hver prøve,

| — | kapslerne anbringes på bordet på grundstofanalysatorens automatiske prøvefremfører. Alle kapsler skal være omhyggeligt mærket med fortløbende numre, |
| --- | --- |

—

kapslerne anbringes på bordet på grundstofanalysatorens automatiske prøvefremfører. Alle kapsler skal være omhyggeligt mærket med fortløbende numre,

| — | der skal altid anbringes kapsler med arbejdsstandarder først og sidst i en serie prøver, |
| --- | --- |

—

der skal altid anbringes kapsler med arbejdsstandarder først og sidst i en serie prøver,

| — | der fordeles kontrolprøver jævnt gennem prøveserien. |
| --- | --- |

—

der fordeles kontrolprøver jævnt gennem prøveserien.

| b) | Kontrol og justering af instrumenter til grundstofanalyse og massespektrometri






  — | temperaturen i grundstofanalysatorens ovn og helium- og oxygenstrømmen indstilles således, at forbrændingen af prøven bliver optimal |
| --- | --- | --- |

b)

Kontrol og justering af instrumenter til grundstofanalyse og massespektrometri

—

temperaturen i grundstofanalysatorens ovn og helium- og oxygenstrømmen indstilles således, at forbrændingen af prøven bliver optimal

| — | det kontrolleres, at der ikke er lækager i grundstofanalysatorens og massespektrometerets system (f.eks. ved kontrol af ionstrømmen for m/z = 28 svarende til N2) |
| --- | --- |

—

det kontrolleres, at der ikke er lækager i grundstofanalysatorens og massespektrometerets system (f.eks. ved kontrol af ionstrømmen for m/z = 28 svarende til N2)

| — | massespektrometeret indstilles til måling af ionstrømmen ved m/z = 44, 45 og 46 |
| --- | --- |

—

massespektrometeret indstilles til måling af ionstrømmen ved m/z = 44, 45 og 46

| — | systemet kontrolleres med kendte kontrolprøver, inden målingen af analyseprøverne påbegyndes. |
| --- | --- |

—

systemet kontrolleres med kendte kontrolprøver, inden målingen af analyseprøverne påbegyndes.

| c) | Gennemførelse af en måleserie
  Prøverne på den automatiske prøvefremfører på grundstofanalysatoren (eller kromatografen) føres ind én ad gangen. Kuldioxiden fra forbrændingen af den enkelte prøve elueres til massespektrometeret, som måler ionstrømmene. Computeren, der er tilkoblet instrumentet, registrerer ionstrømmenes styrke og beregner δ-værdierne for hver prøve (9). |
| --- | --- |

c)

Gennemførelse af en måleserie

Prøverne på den automatiske prøvefremfører på grundstofanalysatoren (eller kromatografen) føres ind én ad gangen. Kuldioxiden fra forbrændingen af den enkelte prøve elueres til massespektrometeret, som måler ionstrømmene. Computeren, der er tilkoblet instrumentet, registrerer ionstrømmenes styrke og beregner δ-værdierne for hver prøve (9).

9.   BEREGNING

Med metoden måles isotopforholdet 13C/12C i ethanol, der er isoleret fra vin eller fra produkter fremstillet af druer efter gæring. Isotopforholdet 13C/12C kan udtrykkes som afvigelsen i forhold til en arbejdsstandard. Afvigelsen for isotopen kulstof-13 (δ13C) beregnes således på en delta-promilleskala (δ/1000) ved sammenholdelse af resultaterne for analyseprøven med resultaterne for den arbejdsstandard, der i forvejen er kalibreret efter den primære internationale standard (V-PDB). δ13C-værdierne angives i forhold til arbejdsstandarden efter følgende formel:

δ13Cprøve/std ‰ = 1 000 × (Rprøve- Rstd)/Rstd ,

hvor Rprøve og Rstd er isotopforholdet 13C/12C for henholdsvis prøven og den kuldioxid, der benyttes som standardgas.

δ 13C-værdierne beregnes derefter i forhold til V-PDB efter følgende formel:

δ13Cprøve/V-PDB ‰ = δ13Cprøve/std + δ13Cstd/V-PDB + (δ13Cprøve/std × δ13Cstd/V-PDB)/1 000 ,

hvor δ13Cstd/V-PDB er den isotopafvigelse, der tidligere er bestemt for arbejdsstandarden i forhold til V-PDB.

I løbet af måleserien kan der forekomme en svag drift som følge af ændringer i instrumenternes arbejdsbetingelser. I så fald må δ13C-værdierne for prøverne korrigeres efter forskellen mellem den målte δ13C-værdi for arbejdsstandarden og dens sande værdi, der er fundet ved forudgående kalibrering mod V-PDB ved sammenholdelse med et internationalt referencemateriale. Mellem to målinger på arbejdsstandarden kan driften og dermed korrektionen af prøveresultaterne antages at være lineær. Prøven med arbejdsstandard skal måles først og sidst i hver måleserie. Derudfra kan korrektionen for den enkelte prøve beregnes ved lineær interpolation.

10.   KVALITETSSIKRING OG -KONTROL

Det kontrolleres, at 13C-værdien for arbejdsstandarden højst afviger 0,5 ‰ fra den sande værdi. I modsat fald må spektrometerets indstilling kontrolleres og eventuelt justeres.

For hver prøve kontrolleres, at forskellen mellem resultaterne for de to kapsler, der er målt efter hinanden, er under 0,3 ‰. Det endelige resultat for en given prøve er da gennemsnittet af de to kapsler. Er afvigelsen større end 0,3 ‰, må målingen gentages.

At målingen fungerer korrekt, kan kontrolleres ud fra intensiteten af ionstrømmen ved m/z = 44, som er proportional med den kulstofmængde, der er indsprøjtet i grundstofanalysatoren. Typisk vil intensiteten af denne ionstrøm være praktisk taget konstant for de analyserede prøver. En væsentlig afvigelse kan skyldes fordampning af ethanol (f.eks. fra en kapsel, der ikke er lukket helt tæt) eller ustabilitet af grundstofanalysator eller massespektrometer.

11.   METODENS KVALITETSPARAMETRE (NØJAGTIGHED)

Der er foretaget en ringundersøgelse (11.1) med destillater indeholdende alkohol fra vin, fra sukkerrør og fra sukkerroer samt forskellige blandinger heraf. I denne undersøgelse er ikke taget højde for selve destillationstrinnet, hvorfor supplerende oplysninger fra andre ringanalyser vedrørende vin (11.2), herunder serier af egnethedsprøver (11.3), for isotopmålingerne også er taget i betragtning. Resultaterne viser, at de forskellige destillationssystemer, specielt de, der anvendes til SNIF-NMR-målinger, ikke bidrager væsentligt til variationer i bestemmelsen af δ13C for ethanol i vin, når de anvendes under passende betingelser. De nøjagtighedsparametre, der er fundet for vin, er næsten de samme som dem, der er fundet ved ringanalysen (11.1) af destillater.

11.1.   Ringanalyse af destillater

| År for ringanalysen: | 1996 |
| --- | --- |
| Antal laboratorier: | 20 |
| Antal prøver: | 6 dobbeltblindprøver |
| Analysand: | δ13C for ethanol |

År for ringanalysen:

1996

Antal laboratorier:

20

Antal prøver:

6 dobbeltblindprøver

Analysand:

δ13C for ethanol

| Prøvekode | Alkohol fra vin | Alkohol fra sukkerroer | Alkohol fra sukkerrør |
| --- | --- | --- | --- |
| A & G | 80 % | 10 % | 10 % |
| B & C | 90 % | 10 % | 0 % |
| D & F | 0 % | 100 % | 0 % |
| E & I | 90 % | 0 % | 10 % |
| H & K | 100 % | 0 % | 0 % |
| J & L | 0 % | 0 % | 100 % |

Prøvekode

Alkohol fra vin

Alkohol fra sukkerroer

Alkohol fra sukkerrør

A & G

80 %

10 %

10 %

B & C

90 %

10 %

0 %

D & F

0 %

100 %

0 %

E & I

90 %

0 %

10 %

H & K

100 %

0 %

0 %

J & L

0 %

0 %

100 %

| Prøveemner | A/G | B/C | D/F | E/I | H/K | J/L |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Antal laboratorier efter eliminering af outliers | 19 | 18 | 17 | 19 | 19 | 19 |
| Antal accepterede resultater | 38 | 36 | 34 | 38 | 38 | 38 |
| Gennemsnitsværdi (δ13C), ‰ | -25,32 | -26,75 | -27,79 | -25,26 | -26,63 | -12,54 |
| Sr
  2 | 0,0064 | 0,0077 | 0,0031 | 0,0127 | 0,0069 | 0,0041 |
| Standardafvigelse på repeterbarhed (Sr), ‰ | 0,08 | 0,09 | 0,06 | 0,11 | 0,08 | 0,06 |
| Repeterbarhedsgrænse r (2,8 × Sr), ‰ | 0,22 | 0,25 | 0,16 | 0,32 | 0,23 | 0,18 |
| Sr
  2 | 0,0389 | 0,0309 | 0,0382 | 0,0459 | 0,0316 | 0,0584 |
| Standardafvigelse på reproducerbarhed (samlerum), ‰ | 0,20 | 0,18 | 0,20 | 0,21 | 0,18 | 0,24 |
| Reproducerbarhedsgrænse R (2,8 × SR), ‰ | 0,55 | 0,49 | 0,55 | 0,60 | 0,50 | 0,68 |

Prøveemner

A/G

B/C

D/F

E/I

H/K

J/L

Antal laboratorier efter eliminering af outliers

19

18

17

19

19

19

Antal accepterede resultater

38

36

34

38

38

38

Gennemsnitsværdi (δ13C), ‰

-25,32

-26,75

-27,79

-25,26

-26,63

-12,54

Sr
  2

0,0064

0,0077

0,0031

0,0127

0,0069

0,0041

Standardafvigelse på repeterbarhed (Sr), ‰

0,08

0,09

0,06

0,11

0,08

0,06

Repeterbarhedsgrænse r (2,8 × Sr), ‰

0,22

0,25

0,16

0,32

0,23

0,18

Sr
  2

0,0389

0,0309

0,0382

0,0459

0,0316

0,0584

Standardafvigelse på reproducerbarhed (samlerum), ‰

0,20

0,18

0,20

0,21

0,18

0,24

Reproducerbarhedsgrænse R (2,8 × SR), ‰

0,55

0,49

0,55

0,60

0,50

0,68

11.2.   Ringanalyse med to vine og en alkohol

| År for ringanalysen: | 1996 |
| --- | --- |
| Antal laboratorier: | 14 til destillation af vin, heraf 7 desuden til måling af δ13C for ethanol i vin 8 til måling af δ13C for alkoholprøven |
| Antal prøver: | 3 (hvidvin med 9,3 % vol. alkohol, hvidvin med 9,6 % vol. alkohol, og alkohol med et alkoholindhold på 93 % m/m) |
| Analysand: | δ13C for ethanol |

År for ringanalysen:

1996

Antal laboratorier:

14 til destillation af vin, heraf 7 desuden til måling af δ13C for ethanol i vin 8 til måling af δ13C for alkoholprøven

Antal prøver:

3 (hvidvin med 9,3 % vol. alkohol, hvidvin med 9,6 % vol. alkohol, og alkohol med et alkoholindhold på 93 % m/m)

Analysand:

δ13C for ethanol

| Prøveemner | Rødvin | Hvidvin | Alkohol |
| --- | --- | --- | --- |
| Antal laboratorier | 7 | 7 | 8 |
| Antal accepterede resultater | 7 | 7 | 8 |
| Gennemsnit (δ13C), ‰ | -26,20 | -26,20 | -25,08 |
| Varians af reproducerbarhed SR
  2 | 0,0525 | 0,0740 | 0,0962 |
| Standardafvigelse på reproducerbarhed (SR), ‰ | 0,23 | 0,27 | 0,31 |
| Reproducerbarhedsgrænse R (2,8 × SR), ‰ | 0,64 | 0,76 | 0,87 |

Prøveemner

Rødvin

Hvidvin

Alkohol

Antal laboratorier

7

7

8

Antal accepterede resultater

7

7

8

Gennemsnit (δ13C), ‰

-26,20

-26,20

-25,08

Varians af reproducerbarhed SR
  2

0,0525

0,0740

0,0962

Standardafvigelse på reproducerbarhed (SR), ‰

0,23

0,27

0,31

Reproducerbarhedsgrænse R (2,8 × SR), ‰

0,64

0,76

0,87

De deltagende laboratorier har benyttet forskellige destillationsanlæg. De isotopbestemmelser af δ13C, som ét laboratorium har udført på alle de destillater, deltagerne sendte tilbage, viser hverken afvigende værdier eller værdier, der adskiller sig væsentligt fra gennemsnittet. Variansen på resultaterne (S2 = 0,0059) er af samme størrelsesorden som variansen på repeterbarheden Sr
  2 ved ringtesten på destillater (11.1).

11.3.   Resultaterne af prøveserierne for egnethed til isotopanalyser

Siden december 1994 har der regelmæssigt været afholdt internationale egnethedsprøver vedrørende isotopbestemmelser af vin og alkohol (destillater med 96 % vol. alkohol). Resultaterne giver de deltagende laboratorier mulighed for at kontrollere kvaliteten af deres analyser. Ved statistisk behandling af resultaterne kan man bestemme målingernes variation under reproducerbarhedsbetingelser og dermed estimere parametrene varians og reproducerbarhedsgrænse. Nedenstående tabel indeholder en oversigt over resultaterne af bestemmelse af δ13C for ethanol i vine og destillater:

| Dato | Vin | Destillater |
| --- | --- | --- |
| N | SR | SR
  2 | R | N | SR | SR
  2 | R |
| December 1994 | 6 | 0,210 | 0,044 | 0,59 | 6 | 0,151 | 0,023 | 0,42 |
| Juni 1995 | 8 | 0,133 | 0,018 | 0,37 | 8 | 0,147 | 0,021 | 0,41 |
| December 1995 | 7 | 0,075 | 0,006 | 0,21 | 8 | 0,115 | 0,013 | 0,32 |
| Marts 1996 | 9 | 0,249 | 0,062 | 0,70 | 11 | 0,278 | 0,077 | 0,78 |
| Juni 1996 | 8 | 0,127 | 0,016 | 0,36 | 8 | 0,189 | 0,036 | 0,53 |
| September 1996 | 10 | 0,147 | 0,022 | 0,41 | 11 | 0,224 | 0,050 | 0,63 |
| December 1996 | 10 | 0,330 | 0,109 | 0,92 | 9 | 0,057 | 0,003 | 0,16 |
| Marts 1997 | 10 | 0,069 | 0,005 | 0,19 | 8 | 0,059 | 0,003 | 0,16 |
| Juni 1997 | 11 | 0,280 | 0,079 | 0,78 | 11 | 0,175 | 0,031 | 0,49 |
| September 1997 | 12 | 0,237 | 0,056 | 0,66 | 11 | 0,203 | 0,041 | 0,57 |
| December 1997 | 11 | 0,127 | 0,016 | 0,36 | 12 | 0,156 | 0,024 | 0,44 |
| Marts 1998 | 12 | 0,285 | 0,081 | 0,80 | 13 | 0,245 | 0,060 | 0,69 |
| Juni 1998 | 12 | 0,182 | 0,033 | 0,51 | 12 | 0,263 | 0,069 | 0,74 |
| September 1998 | 11 | 0,264 | 0,070 | 0,74 | 12 | 0,327 | 0,107 | 0,91 |
| Vægtet gennemsnit | | 0,215 | 0,046 | 0,60 | | 0,209 | 0,044 | 0,59 |
| N | antal deltagende laboratorier. |

Dato

Vin

Destillater

N

SR

SR
  2

R

N

SR

SR
  2

R

December 1994

6

0,210

0,044

0,59

6

0,151

0,023

0,42

Juni 1995

8

0,133

0,018

0,37

8

0,147

0,021

0,41

December 1995

7

0,075

0,006

0,21

8

0,115

0,013

0,32

Marts 1996

9

0,249

0,062

0,70

11

0,278

0,077

0,78

Juni 1996

8

0,127

0,016

0,36

8

0,189

0,036

0,53

September 1996

10

0,147

0,022

0,41

11

0,224

0,050

0,63

December 1996

10

0,330

0,109

0,92

9

0,057

0,003

0,16

Marts 1997

10

0,069

0,005

0,19

8

0,059

0,003

0,16

Juni 1997

11

0,280

0,079

0,78

11

0,175

0,031

0,49

September 1997

12

0,237

0,056

0,66

11

0,203

0,041

0,57

December 1997

11

0,127

0,016

0,36

12

0,156

0,024

0,44

Marts 1998

12

0,285

0,081

0,80

13

0,245

0,060

0,69

Juni 1998

12

0,182

0,033

0,51

12

0,263

0,069

0,74

September 1998

11

0,264

0,070

0,74

12

0,327

0,107

0,91

Vægtet gennemsnit

0,215

0,046

0,60

0,209

0,044

0,59

N

antal deltagende laboratorier.

11.4.   Repeterbarheds- og reproducerbarhedsgrænser

På grundlag af de forskellige interkalibreringer i ovenstående tabeller kan der fastlægges følgende repeterbarheds- og reproducerbarhedsgrænser for metoden, inklusive destillationsfasen:

| | Repeterbarhedsgrænse r: 0,24 |
| --- | --- |

Repeterbarhedsgrænse r: 0,24

| | Reproducerbarhedsgrænse R: 0,6. |
| --- | --- |

Reproducerbarhedsgrænse R: 0,6.

11   TOTALT SYREINDHOLD (OIV-AS313-01-ACITOT) — METODE AF TYPE I

1.   DEFINITION

Vinens totale syreindhold er summen af titrerbare syrer, bestemt ved titrering til pH 7 med en indstillet basisk opløsning.

Kuldioxid er ikke omfattet af det totale syreindhold.

2.   METODENS PRINCIP

Potentiometrisk titrering, eller titrering under tilstedeværelse af bromthymolblåt som indikator og sammenligning med en farveprøve.

3.   REAGENSER

3.1.   Bufferopløsning, pH 7,0:

| | Monokaliumphosphat (KH2PO4): 107,3 g |
| --- | --- |

Monokaliumphosphat (KH2PO4): 107,3 g

| | 1 M opløsning af natriumhydroxid (NaOH): 500 ml |
| --- | --- |

1 M opløsning af natriumhydroxid (NaOH): 500 ml

| | Vand til 1 000 ml. |
| --- | --- |

Vand til 1 000 ml.

Standardbufferopløsninger, som fås i handelen, kan også anvendes.

3.2.   0,1 M opløsning af natriumhydroxid (NaOH).

3.3.   Bromthymolblåt-opløsning, 4 g/l.

| Bromthymolblåt (C27H28Br2O5S) ... | 4 g |
| --- | --- |
| Neutral ethanol, 96 % vol. ... | 200 ml |
| Efter opløsning tilsættes: | |
| Vand, CO2-frit ... | 200 ml |
| 1 M natriumhydroxidopløsning | |
| Tilstrækkeligt til blågrøn farvereaktion (pH 7) ... | 7,5 ml |
| Vand til ... | 1 000 ml |

Bromthymolblåt (C27H28Br2O5S) ...

4 g

Neutral ethanol, 96 % vol. ...

200 ml

Efter opløsning tilsættes:

Vand, CO2-frit ...

200 ml

1 M natriumhydroxidopløsning

Tilstrækkeligt til blågrøn farvereaktion (pH 7) ...

7,5 ml

Vand til ...

1 000 ml

4.   APPARATUR

4.1.   Vandstrålepumpe.

4.2.   Sugekolbe, 500 ml.

4.3.   Potentiometer med skalainddeling i pH-enheder og med elektroder. Glaselektroden skal opbevares i destilleret vand. Elektroden med calomel/mættet kaliumchlorid skal opbevares i en mættet opløsning af kaliumchlorid. Oftest anvendes en kombineret elektrode, som skal opbevares i destilleret vand.

4.4.   Bægerglas henholdsvis 50 ml (vin) og 100 ml (rektificeret koncentreret most).

5.   FREMGANGSMÅDE

5.1.   Klargøring af prøven

5.1.1.   Vin

Fjernelse af kuldioxiden. Ca. 50 ml vin anbringes i en sugekolbe, og kolben omrøres, samtidig med at der suges med vandstrålepumpen. Omrøringen skal vare 1-2 minutter.

5.1.2.   Rektificeret koncentreret most

200 g rektificeret koncentreret most afvejes nøjagtigt i en 500 ml målekolbe. Der fyldes op til mærket med vand. Opløsningen blandes.

5.2.   Potentiometrisk titrering

5.2.1.   Kalibrering af pH-meteret

pH-meteret kalibreres ved 20 °C med en bufferopløsning med pH 7,00 ved 20 °C, idet brugsanvisningen for det anvendte apparat følges.

5.2.2.   Måleteknik

I et bægerglas (4.4) anbringes et volumen prøve, forberedt som angivet under 5.1, på henholdsvis 10 ml ved måling på vin og 50 ml ved måling på rektificeret koncentreret most. Der tilsættes ca. 10 ml destilleret vand, og fra buretten tilsættes 0,1 M natriumhydroxid (3.2), indtil pH er 7 ved 20 °C. Basetilsætningen skal ske langsomt og under stadig omrøring. Antal ml forbrugt 0,1 M NaOH betegnes n.

5.3.   Titrering med indikator (bromthymolblåt)

5.3.1.   Indledende prøve: fremstilling af farvestandard

I et bægerglas (4.4) fyldes 25 ml kogt destilleret vand, 1 ml bromthymolblåt (3.3) og et volumen prøve, forberedt som angivet under 5.1, på henholdsvis 10 ml vin og 50 ml rektificeret koncentreret most. Der tilsættes 0,1 M natriumhydroxid (3.2), indtil opløsningen bliver blågrøn. Der tilsættes 5 ml buffer, pH 7 (3.1).

5.3.2.   Bestemmelse

I et bægerglas (4.4) anbringes 30 ml kogt destilleret vand, 1 ml bromthymolblåt (3.3) og et volumen prøve, forberedt som angivet under 5.1, på henholdsvis 10 ml vin og 50 ml rektificeret koncentreret most. Der tilsættes 0,1 M natriumhydroxid (3.2), indtil farven er identisk med farven af den indledende prøve (5.3.1). Antal ml forbrugt 0,1 M natriumhydroxidopløsning betegnes n.

6.   ANGIVELSE AF RESULTATER

6.1.   Beregningsmåde

6.1.1.   Vin

Det totale syreindhold i milliækvivalenter pr. liter bliver:

A = 10 n

Dette angives med én decimal.

Det totale syreindhold i g vinsyre pr. liter bliver:

A′ = 0,075 • A

Dette angives med én decimal.

6.1.2.   Rektificeret koncentreret most

| — | Det totale syreindhold i milliækvivalenter pr. kilogram rektificeret koncentreret most: a = 5 • n |
| --- | --- |

—

Det totale syreindhold i milliækvivalenter pr. kilogram rektificeret koncentreret most: a = 5 • n

| — | Det totale syreindhold i milliækvivalenter pr. kilogram totalsukker:






  — | A = (500 • n)/P |
| --- | --- | --- |

—

Det totale syreindhold i milliækvivalenter pr. kilogram totalsukker:

—

A = (500 • n)/P

| — | P = totalt sukkerindhold i % m/m. |
| --- | --- |

—

P = totalt sukkerindhold i % m/m.

| — | Dette angives med én decimal. |
| --- | --- |

—

Dette angives med én decimal.

6.2.   Repeterbarhed (r) for titrering med indikator (5.3)

| r | = | 0,9 mækv/l |
| --- | --- | --- |
| r | = | 0,07 g vinsyre/l |

r

=

0,9 mækv/l

r

=

0,07 g vinsyre/l

for hvidvine, rosévine og rødvine.

6.3.   Reproducerbarhed (R) for titrering med indikator (5.3)

| | For hvidvine og rosévine:







  R | = | 3,6 mækv/l |
| --- | --- | --- | --- |
| R | = | 0,3 g vinsyre/l |

For hvidvine og rosévine:

R

=

3,6 mækv/l

R

=

0,3 g vinsyre/l

| | For rødvine:







  R | = | 5,1 mækv/l |
| --- | --- | --- | --- |
| R | = | 0,4 g vinsyre/l |

For rødvine:

R

=

5,1 mækv/l

R

=

0,4 g vinsyre/l

12   FLYGTIGE SYRER (OIV-AS313-02-ACIVOL) — METODE AF TYPE I

1.   DEFINITION

Indholdet af flygtige syrer er syrer tilhørende eddikesyrens homologe række, der findes i vinen i fri form og som salte.

2.   METODENS PRINCIP

Titrering af indholdet af flygtige syrer, som er adskilt fra vinen ved vanddampdestillation og rektifikation af dampene.

Vinen befries først for kuldioxid.

Mængden af fri og bunden svovldioxid, som destilleres under disse betingelser, skal fratrækkes destillatets syreindhold.

Mængden af eventuel sorbinsyre, der er tilsat vinen, skal ligeledes fratrækkes.

Bemærkning:

Den salicylsyre, som i visse lande anvendes til at stabilisere vinen forud for analyse, genfindes delvis i destillatet. Den skal bestemmes og trækkes fra syreindholdet. Metoden er angivet i punkt 7 i dette kapitel.

3.   REAGENSER

3.1.   Krystallinsk vinsyre (C4H6O6)

3.2.   0,1 M opløsning af natriumhydroxid (NaOH)

3.3.   1 % opløsning af phenolphthalein i neutral alkohol, 96 % vol.

3.4.   Saltsyre (ρ20 = 1,18-1,19 g/ml), fortyndet i forholdet 1:4 (v/v)

3.5.   0,005 M iodopløsning (I2)

3.6.   Krystallinsk kaliumiodid (KI)

3.7.   Stivelsesopløsning, 5 g/l:

5 g stivelse opslæmmes i ca. 500 ml vand. Opslæmningen bringes i kog under omrøring og holdes kogende i 10 minutter. Der tilsættes 200 g natriumchlorid. Efter afkøling fyldes op til 1 l med vand.

3.8.   Mættet opløsning af natriumborat (Na2B4O7 • 10 H2O), svarende til ca. 55 g/l ved 20 °C.

4.   APPARATUR

4.1.   Vanddampsdestillationsapparat, bestående af:

| 1) | vanddampgenerator – den dannede vanddamp skal være fri for kuldioxid |
| --- | --- |

1)

vanddampgenerator – den dannede vanddamp skal være fri for kuldioxid

| 2) | en destillationskolbe |
| --- | --- |

2)

en destillationskolbe

| 3) | en destillationskolonne |
| --- | --- |

3)

en destillationskolonne

| 4) | en svaler. |
| --- | --- |

4)

en svaler.

Dette apparat skal kunne bestå følgende tre prøver:

| a) | I destillationskolben fyldes 20 ml kogt vand. Der opsamles 250 ml destillat, som tilsættes 0,1 ml 0,1 M natriumhydroxidopløsning (3.2) og 2 dråber phenolphthaleinopløsning (3.3). Den fremkomne rosa farve skal være stabil i mindst 10 sek. (vanddamp fri for kuldioxid). |
| --- | --- |

a)

I destillationskolben fyldes 20 ml kogt vand. Der opsamles 250 ml destillat, som tilsættes 0,1 ml 0,1 M natriumhydroxidopløsning (3.2) og 2 dråber phenolphthaleinopløsning (3.3). Den fremkomne rosa farve skal være stabil i mindst 10 sek. (vanddamp fri for kuldioxid).

| b) | I destillationskolben afpipetteres 20 ml 0,1 M eddikesyre. Der opsamles 250 ml destillat, som titreres med 0,1 M natriumhydroxidopløsning (3.2). Den forbrugte mængde skal være mindst 19,9 ml (medrevet eddikesyre ≥ 99,5 %). (Acide acétique entraîné ≥ 99,5 %). |
| --- | --- |

b)

I destillationskolben afpipetteres 20 ml 0,1 M eddikesyre. Der opsamles 250 ml destillat, som titreres med 0,1 M natriumhydroxidopløsning (3.2). Den forbrugte mængde skal være mindst 19,9 ml (medrevet eddikesyre ≥ 99,5 %). (Acide acétique entraîné ≥ 99,5 %).

| c) | I destillationskolben fyldes 20 ml 1 M mælkesyre, der opsamles 250 ml destillat, og syreindholdet titreres med 0,1 M natriumhydroxidopløsning (3.2). |
| --- | --- |

c)

I destillationskolben fyldes 20 ml 1 M mælkesyre, der opsamles 250 ml destillat, og syreindholdet titreres med 0,1 M natriumhydroxidopløsning (3.2).

Den forbrugte mængde må højst være 1,0 ml (destilleret mælkesyre ≤ 0,5 %).

Hvis apparatet og den anvendte teknik holder disse prøver, er kravene til et officielt internationalt apparat eller en officiel international teknik opfyldt.

4.2.   Vandstrålepumpe.

4.3.   Sugekolbe.

5.   FREMGANGSMÅDE

5.1.   Klargøring af prøven: fjernelse af kuldioxid.

Ca. 50 ml vin hældes i en sugekolbe. Der omrøres, mens der suges med vandstrålepumpen. Omrøringen skal vare 1-2 minutter.

5.2.   Vanddampdestillation

20 ml vin, befriet for kuldioxid som beskrevet under 5.1, fyldes i destillationskolben, og der tilsættes ca. 0,5 g vinsyre (3.1). Der opsamles mindst 250 ml destillat.

5.3.   Titrering

Der titreres med 0,1 M natriumhydroxidopløsning (3.2) under tilstedeværelse af 2 dråber phenolphthaleinopløsning (3.3), og det forbrugte volumen natriumhydroxidopløsning betegnes n ml.

Der tilsættes 4 dråber saltsyre, fortyndet i forholdet 1:4 (3.4), 2 ml stivelse (3.7) og nogle krystaller af kaliumiodid (3.6). Den frie svovldioxid titreres med 0,005 M iodopløsning (3.5), og det forbrugte volumen betegnes n′ ml.

Derefter tilsættes mættet natriumboratopløsning (3.8), indtil den rosa farve igen fremkommer. Det bundne svovldioxid titreres med 0,005 M iodopløsning (3.5), og det forbrugte volumen betegnes n′′ ml.

6.   ANGIVELSE AF RESULTATER

6.1.   Beregningsmåde

Flygtige syrer angivet i milliækvivalenter pr. liter med én decimal bliver:

A = 5 (n – 0,1 n′ – 0,05 n′′)

Flygtige syrer, angivet i g eddikesyre pr. liter med to decimaler, bliver:

0,300 (n – 0,1 n′ – 0,05 n′′)

6.2.   Repeterbarhed (r)

| r | = | 0,7 mækv/l |
| --- | --- | --- |
| r | = | 0,04 g eddikesyre/l. |

r

=

0,7 mækv/l

r

=

0,04 g eddikesyre/l.

6.3.   Reproducerbarhed (R)

| R | = | 1,3 mækv/l |
| --- | --- | --- |
| R | = | 0,08 g eddikesyre/l. |

R

=

1,3 mækv/l

R

=

0,08 g eddikesyre/l.

6.4.   Vin tilsat sorbinsyre

Da sorbinsyre medrives 96 % af vanddamp ved et destillatvolumen på 250 ml, skal denne syre fratrækkes de flygtige syrer, idet 100 mg sorbinsyre svarer til et syreindhold på 0,89 milliækvivalenter eller 0,053 g eddikesyre, og idet indholdet af sorbinsyre (mg/l) er bestemt andetsteds.

7.   BESTEMMELSE AF SALICYLSYRE, DER MEDRIVES I DESTILLATET AF FLYGTIGE SYRER

7.1.   Princip

Efter bestemmelse af de flygtige syrer og korrektion for svovldioxid påvises tilstedeværelsen af salicylsyre ved dannelse af violet farve efter at prøven er gjort sur og tilsat et jern(III)salt.

Bestemmelse af salicylsyre, som medrives i destillatet med flygtige syrer, sker i endnu et destillat med samme volumen som det, der blev brugt til bestemmelse af flygtige syrer. I dette destillat bestemmes salicylsyren ved sammenlignende kolorimetri og trækkes fra surhedsgraden i destillatet af flygtige syrer.

7.2.   Reagenser

7.2.1.   Saltsyre (HCl) (ρ20 = 1,18 til 1,19 g/ml).

7.2.2.   Natriumthiosulfat (Na2S2O3 • 5 H2O), 0,1 M.

7.2.3.   Opløsning af jern(III)ammoniumsulfat (Fe2(SO4)3 • (NH4)2SO4 • 24 H2O), 10 % (m/v).

7.2.4.   Natriumsalicylat, 0,01 M. Opløsningen indeholder 1,60 g/l natriumsalicylat (NaC7H5O3).

7.3.   Fremgangsmåde

7.3.1.   Identifikation af salicylsyre i destillatet af flygtige syrer.

Straks efter bestemmelsen af de flygtige syrer og korrektion for fri og bunden svovldioxid blandes 0,5 ml saltsyre (7.2.1), 3 ml 0,1 M natriumthiosulfat (7.2.2) og 1 ml af opløsningen af jern(III)ammoniumsulfat (7.2.3) i en konisk kolbe.

Under tilstedeværelse af salicylsyre fremkommer der en violet farve.

7.3.2.   Bestemmelse af salicylsyre

På ovennævnte kolbe markeres destillatets volumen. Kolben tømmes og skylles.

En ny prøve af 20 ml vin vanddampdestilleres, og destillatet samles i kolben (op til mærket). Der tilsættes 0,3 ml koncentreret saltsyre (7.2.1) og 1 ml jern(III)ammoniumsulfatopløsning (7.2.3). Indholdet i den koniske kolbe får en violet farve.

I en konisk kolbe mage til kolben med mærket hældes destilleret vand op til samme niveau som destillatet. Der tilsættes 0,3 ml koncentreret saltsyre (7.2.1) og 1 ml jern(III)ammoniumsulfatopløsning (7.2.3). 0,01 M natriumsalicylatopløsning (7.2.4) tilsættes fra burette, indtil der fremkommer en violet farve af samme styrke som den, der er i den koniske kolbe med vindestillatet.

n′′′ betegner det tilsatte antal milliliter.

7.4.   Korrektion for flygtige syrer

Volumenet 0,1 • n′′′ ml trækkes fra volumenet n ml 0,1 M natriumhydroxidopløsning, der blev anvendt til titrering af destillatets surhedsgrad under bestemmelsen af flygtige syrer.

13   CITRONSYRE (OIV-AS313-09-ACIENZ) — METODE AF TYPE II

1.   METODENS PRINCIP

Citronsyre omdannes til oxaloacetat og acetat i en reaktion katalyseret af citratlyase (CL):

Citrat ←→ oxaloacetat + acetat

Under tilstedeværelse af malatdehydrogenase (MDH) og lactatdehydrogenase (LHD) reduceres oxaloacetat og dets decarboxyleringsderivat, pyruvat, til L-malat og L-lactat af reduceret nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH):

| | Oxaloacetat + NADH + H+ ←→ L-malat + NAD+ |
| --- | --- |

Oxaloacetat + NADH + H+ ←→ L-malat + NAD+

| | Pyruvat + NADH + H+ ←→ L-lactat + NAD+ |
| --- | --- |

Pyruvat + NADH + H+ ←→ L-lactat + NAD+

Mængden af NADH, der oxideres til NAD+ i disse reaktioner, er proportional med den tilstedeværende mængde citrat. Oxidationen af NADH måles ved formindskelsen af stoffets absorbans ved bølgelængden 340 nm.

2.   REAGENSER

2.1.   Bufferopløsning pH 7,8

(glycylglycin 0,51 M; pH = 7,8; Zn2+: 0,6 × 10- 3 M):

7,13 g glycylglycin opløses i ca. 70 ml dobbeltdestilleret vand.

pH indstilles til 7,8 med ca. 13 ml 5 M natriumhydroxidopløsning. Der tilsættes 10 ml opløsning af zinkchlorid (ZnCl2) (80 mg/100 ml) og fyldes op til 100 ml med dobbeltdestilleret vand.

Opløsningen kan opbevares i mindst fire uger ved + 4 °C.

2.2.   Opløsning af reduceret nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH), ca. 6 × 10- 3 M: 30 mg NADH og 60 mg NaHCO3 opløses i 6 ml dobbeltdestilleret vand.

2.3.   Opløsning af malatdehydrogenase/lactatdehydrogenase (MDH/LDH), 0,5 mg MDH/ml; 2,5 mg LDH/ml):

0,1 ml MDH (5 mg MDH/ml) blandes med 0,4 ml 3,2 M ammoniumsulfatopløsning og 0,5 ml LDH (5 mg/ml). Denne suspension er holdbar i mindst et år ved + 4 °C.

2.4.   Citratlyase CL (5 mg protein/ml): 168 mg lyofilisat opløses i 1 ml isvand. Opløsningen er holdbar i mindst en uge ved + 4 °C og i mindst fire uger i frosset tilstand.

Det anbefales at foretage en kontrol af enzymaktiviteten inden bestemmelsen.

2.5.   Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP)

Bemærkning: Alle reagenser til denne bestemmelse findes i handelen.

3.   APPARATUR

3.1.   Spektrofotometer, der kan måle ved 340 nm, som er absorptionsmaksimum for NADH.

Hvis et sådant spektrofotometer ikke er til rådighed, kan i stedet anvendes et spektrofotometer med diskontinuert spektrum, der kan måle ved 334 nm eller ved 365 nm. Da der er tale om absolutte målinger (dvs. der bruges ikke kalibreringskurver, men refereres til ekstinktionskoefficienten for NADPH), skal apparatets bølgelængde- og absorbansvisning være kontrolleret.

3.2.   Glaskuvetter med 1 cm transmissionslængde eller engangskuvetter.

3.3.   Mikropipetter til udtagning af volumener fra 0,02 til 2 ml.

4.   PRØVEFORBEREDELSE

Kvantitativ citratbestemmelse foretages sædvanligvis direkte på vinen uden forudgående affarvning og uden fortynding, forudsat at citronsyreindholdet er under 400 mg/l. I modsat fald fortyndes vinen til et citratindhold mellem 20 og 400 mg/l (dvs. en citratmængde i prøven mellem 5 μg og 80 μg).

For rødvin rig på phenolforbindelser anbefales forbehandling med PVPP:

0,2 g PVPP opslæmmes i vand, lades henstå i 15 minutter og filtreres på et foldet filter.

Til 10 ml vin, anbragt i en konisk kolbe på 50 ml, tilsættes den fugtige PVPP, som fjernes fra filteret med en spatel. Der omrøres i 2-3 minutter og filtreres.

5.   FREMGANGSMÅDE

Med spektrofotometeret indstillet på bølgelængden 340 nm måles absorbansen med 1 cm kuvetter, efter at nulabsorbansen er indstillet i forhold til luft (ingen kuvette i strålegangen). Følgende anbringes i to 1 cm kuvetter:

| | Blindprøve | Analyse |
| --- | --- | --- |
| Opløsning 2.1 | 1,00 ml | 1,00 ml |
| Opløsning 2.2 | 0,10 ml | 0,10 ml |
| Prøve | — | 0,20 ml |
| Dobbeltdestilleret vand | 2,00 ml | 1,80 ml |
| Opløsning 2.3 | 0,02 ml | 0,02 ml |

Blindprøve

Analyse

Opløsning 2.1

1,00 ml

1,00 ml

Opløsning 2.2

0,10 ml

0,10 ml

Prøve

—

0,20 ml

Dobbeltdestilleret vand

2,00 ml

1,80 ml

Opløsning 2.3

0,02 ml

0,02 ml

Der blandes, og efter ca. 5 minutter aflæses absorbansen af blindprøven og af analyseprøven (A1).

Der tilsættes:

| Opløsning 2.4 | 0,02 ml | 0,02 ml |
| --- | --- | --- |

Opløsning 2.4

0,02 ml

0,02 ml

Der blandes, og der ventes, til reaktionen er løbet til ende (ca. 5 min), hvorefter absorbansen af blindprøven og af analyseprøven (A2) aflæses.

Absorbansforskellen (A1–A2) for henholdsvis blindprøven og analyseprøven beregnes.

Absorbansforskellen for blindprøven fratrækkes absorbansforskellen for analyseprøven:

ΔA = ΔA D – ΔAT

Bemærkning: Den tid, enzymet skal virke i, kan variere fra parti til parti. Det anførte tidsrum er kun vejledende. Det anbefales at foretage bestemmelsen for hvert parti.

6.   ANGIVELSE AF RESULTATER

Indholdet af citronsyre angives i milligram pr. liter (mg/l) uden decimaler.

6.1.   Beregningsmåde

Koncentrationen i milligram pr. liter er givet ved den generelle formel:

C = (V × PM)/(ε × d × v) × ΔA , hvor:

| V | = | volumen af forsøgsopløsningen i ml (her 3,14 ml) |
| --- | --- | --- |
| v | = | volumen af prøven i ml (her 0,2 ml) |
| PM | = | molekylvægten af det stof, som skal bestemmes (her vandfri citronsyre = 192,1) |
| d | = | transmissionslængden for kuvetten i cm (her 1 cm) |
| ε | = | NADH's ekstinktionkoefficient ved 340 nm: |
| ε | = | 6,3 mmol– 1 × l × cm– 1. |

V

=

volumen af forsøgsopløsningen i ml (her 3,14 ml)

v

=

volumen af prøven i ml (her 0,2 ml)

PM

=

molekylvægten af det stof, som skal bestemmes (her vandfri citronsyre = 192,1)

d

=

transmissionslængden for kuvetten i cm (her 1 cm)

ε

=

NADH's ekstinktionkoefficient ved 340 nm:

ε

=

6,3 mmol– 1 × l × cm– 1.

Der fås:

C = 479 × ΔA

Hvis prøven er fortyndet under prøveforberedelsen, ganges resultatet med fortyndingsfaktoren F.

Bemærkning: ved 334 nm: C = 488 × ΔA (ε = 6,2 mmol- 1 × l × cm- 1)

ved 365 nm: C = 887 × ΔA (ε = 3,4 mmol- 1 × l × cm- 1)

6.2.   Repeterbarhed (r)

Ved et citronsyreindhold under 400 mg/l: r = 14 mg/l.

Ved et citronsyreindhold over 400 mg/l: r = 28 mg/l.

6.3.   Reproducerbarhed (R)

Ved et citronsyreindhold under 400 mg/l: R = 39 mg/l.

Ved et citronsyreindhold over 400 mg/l: R = 65 mg/l.

14   SORBINSYRE (OIV-AS313-14-ACISOR) — METODE AF TYPE IV

1.   METODERNES PRINCIP

1.1.   Metode til kvantitativ bestemmelse med ultraviolet absorptionsspektrofotometri

Sorbinsyre (trans,trans-2,4-hexadiensyre), som er isoleret ved vanddampdestillation, bestemmes i vindestillat ved ultraviolet absorptionsspektrofotometri. Stoffer, der interfererer med absorptionsmålingen i den ultraviolette del af spektret, fjernes ved at gøre destillatet let alkalisk med calciumhydroxidopløsning og inddampe til tørhed. Indhold på under 20 mg/l skal verificeres ved identifikation ved tyndtlagskromatografi (følsomhed: 1 mg/l).

1.2.   Metode til kvantitativ bestemmelse med gaskromatografi

Sorbinsyre ekstraheres i ethylether og bestemmes ved gaskromatografi ved hjælp af intern standard.

1.3.   Metode til påvisning af spor med tyndtlagskromatografi

Sorbinsyre ekstraheres i ethylether og separeres med tyndtlagskromatografi, og koncentrationen bestemmes semikvantitativt.

2.   METODE TIL KVANTITATIV BESTEMMELSE VED ULTRAVIOLET ABSORPTIONSSPEKTROFOTOMETRI

2.1.   Reagenser

2.1.1.   Krystallinsk vinsyre (C4H6O6).

2.1.2.   Opløsning af calciumhydroxid (Ca (OH)2), ca. 0,02 M.

2.1.3.   Standardopløsning af sorbinsyre, 20 mg/l:

20 mg sorbinsyre (C6H8O2) opløses i ca. 2 ml 0,1 M natriumhydroxidopløsning. Opløsningen hældes i en 1 000 ml målekolbe, og der fyldes op til mærket med vand. I stedet kan 26,8 mg kaliumsorbat (C6H7KO2) opløses i vand, hvorefter der fyldes op til 1 000 ml med vand.

2.2.   Apparatur

2.2.1.   Apparat til vanddampdestillation (se »Flygtige syrer«).

2.2.2.   Vandbad på 100 °C.

2.2.3.   Spektrofotometer, der kan arbejde ved 256 nm med kvartskuvetter med 1 cm transmissionslængde.

2.3.   Fremgangsmåde

2.3.1.   Destillation

I vanddampdestillationsapparatets destillationskolbe fyldes 10 ml vin, og der tilsættes 1–2 g vinsyre (2.1.1). Der opsamles 250 ml destillat.

2.3.2.   Kalibreringskurve

Ved at fortynde standardopløsningen (2.1.3) med vand fremstilles fire fortyndede standardopløsninger med henholdsvis 0,5 - 1 - 2,5 og 5 mg sorbinsyre pr. liter. Deres respektive absorbans måles med spektrofotometeret ved 256 nm i forhold til destilleret vand. Der optegnes en kurve over de fundne absorbanser som funktion af opløsningernes koncentration. Kurven er lineær.

2.3.3.   Bestemmelse

5 ml destillat anbringes i en inddampningsskål med en diameter på 55 mm. Der tilsættes 1 ml calciumhydroxidopløsning (2.1.2). Der inddampes til tørhed på kogende vandbad.

Remanensen opløses i nogle milliliter destilleret vand og overføres kvantitativt til en 20 ml målekolbe. Der fyldes op til mærket med vand fra skylningen. Absorbansen måles ved 256 nm ved spektrofotometri over for en referenceopløsning fremstillet af 1 ml calciumhydroxidopløsning (2.1.2) fortyndet med vand til 20 ml.

Den målte absorbans afsættes på den retlinede kalibreringskurve, og koncentrationen C af sorbinsyre i opløsningen aflæses.

Bemærkning: I gængs praksis kan inddampningen undlades. Absorbansmålingen foretages direkte på destillatet, der er fortyndet i forholdet 1:4 med destilleret vand.

2.4.   Angivelse af resultater

2.4.1.   Beregningsmåde

Koncentrationen af sorbinsyre i vinen i mg/l er lig med:

100 × C

C = koncentrationen af sorbinsyre i opløsningen målt ved spektrofotometri og angivet i mg/l.

3.   METODE TIL KVANTITATIV BESTEMMELSE VED GASKROMATOGRAFI

3.1.   Reagenser

3.1.1.   Ethylether (C2H5)2O) destilleret lige inden anvendelsen.

3.1.2.   Opløsning af intern standard: opløsning af undekansyre (C11H22O2), 1 g/l i ethanol, 95 % vol.

3.1.3.   Vandig opløsning af svovlsyre H2SO4 (ρ20 = 1,84 g/ml), fortyndet i forholdet 1:3 (v/v).

3.2.   Apparatur

3.2.1.   Gaskromatograf med flammeiondetektor og kolonne af rustfrit stål (4 m × 1/8 tomme), der er forbehandlet med dimethyldichlorsilan og pakket med stationær fase bestående af en blanding af diethylenglycolsuccinat (5 %) og phosphorsyre (1 %) (DEGS-H3PO4) eller en blanding af diethylenglycoladipat (7 %) og phosphorsyre (1 %) (DEGA–H3PO4) bundet til Gaschrom Q80-100 mesh.

Behandlingen med dimethyldichlorsilan (DMDCS) foretages ved lade kolonnen gennemstrømme af en opløsning af 2-3 g DMDCS i toluen. Kolonnen skylles straks efter med methanol. Derefter gennemstrømmes kolonnen med nitrogen, efterfulgt af hexan og derefter igen nitrogen. Derpå pakkes den.

Driftsbetingelser:

| | Ovntemperatur: 175 °C. |
| --- | --- |

Ovntemperatur: 175 °C.

| | Injektor- og detektortemperatur: 230 °C. |
| --- | --- |

Injektor- og detektortemperatur: 230 °C.

| | Bæregas: kvælstof (flow 20 ml/min). |
| --- | --- |

Bæregas: kvælstof (flow 20 ml/min).

3.2.2.   Mikrosprøjte, 10 mikroliter, med 0,1 mikroliter inddeling.

Bemærkning: Der kan anvendes andre typer kolonner, som giver en god adskillelse, især kapillærkolonner (f.eks. FFAP).

Følgende metode er givet som eksempel.

3.3.   Fremgangsmåde

3.3.1.   Klargøring af analyseprøven

20 ml vin fyldes i et reagensglas på ca. 40 ml med slibprop, og der tilsættes 2 ml intern standardopløsning (3.1.2) og 1 ml fortyndet svovlsyre (3.1.3).

Efter at indholdet er blandet ved gentagne vendinger af glasset, tilsættes 10 ml ethylether (3.1.1). Glasset omrystes i 5 min for at ekstrahere sorbinsyren over i den organiske fase. Derefter lades faserne skille.

3.3.2.   Fremstilling af referenceopløsning

Der vælges en vin, hvis kromatogram af etherekstrakten ikke viser nogen top svarende til eluering af sorbinsyre. Vinen overmættes med sorbinsyre til en koncentration på 100 mg/l. 20 ml af den således fremstillede prøve behandles efter anvisningerne i 3.3.1.

3.3.3.   Kromatografi

I kromatografen indsprøjtes med mikrosprøjte 2 μl af etherfasen fremstillet efter anvisningerne i 3.3.2 efterfulgt af 2 μl af etherfasen fremstillet efter anvisningerne i 3.3.1.

Kromatogrammerne optages, og identiteten af retentionstiderne for henholdsvis sorbinsyre og den interne standard kontrolleres. Højden (eller arealet) af hver top måles.

3.4.   Angivelse af resultater

3.4.1.   Beregningsmåde

Koncentrationen af sorbinsyre i den analyserende vin i milligram/liter er:

100 × (h/H) × (l/i), hvor:

H= højde af toppen for sorbinsyre i referenceopløsningen

h= højde af toppen for sorbinsyre i prøven

l= højde af toppen for den interne standard i referenceopløsningen

i= højde af toppen for den interne standard i prøven.

Bemærk: Koncentrationen af sorbinsyre kan bestemmes på samme måde ved måling af arealet af de respektive kurvetoppe.

15   PH (OIV-AS313-15-PH) — METODE AF TYPE I

1.   PRINCIP

Metoden består i måling af potentialeforskellen mellem to elektroder, der er nedsænket i analysevæsken. Den ene elektrode har et potentiale som er en kendt funktion af væskens pH, mens den anden, der har et kendt, fast potentiale, udgør referenceelektroden.

2.   APPARATUR

2.1.   Kalibreret pH-meter med en skala, der tillader måling med mindst 0,05 pH-enheders nøjagtighed.

2.2.   Elektroder:

2.2.1.   Glaselektrode, der opbevares i destilleret vand.

2.2.2.   Kalomelmættet kaliumchlorid-referenceelektrode, der opbevares i en mættet kaliumchloridopløsning.

2.2.3.   Eller kombineret elektrode, der opbevares i destilleret vand.

3.   REAGENSER

3.1.   Bufferopløsninger:

3.1.1.   Mættet opløsning af surt kaliumtartrat. Opløsning indeholdende mindst 5,7 g/l surt kaliumtartrat (C4H5KO6) ved 20 °C. Opløsningen kan opbevares i 2 måneder under tilstedeværelse af 0,1 g thymol pr. 200 ml.

| pH | 3,57 ved 20 °C
  3,56 ved 25 °C
  3,55 ved 30 °C |
| --- | --- |

pH

3,57 ved 20 °C

3,56 ved 25 °C

3,55 ved 30 °C

3.1.2.   0,05 M opløsning af kaliumhydrogenphthalat. Opløsningen indeholder 10,211 g kaliumhydrogenphthalat (C8H5KO4) pr. liter ved 20 °C (holdbarhed: 2 måneder).

| pH | 3,999 ved 15 °C
  4,003 ved 20 °C
  4,008 ved 25 °C
  4,015 ved 30 °C |
| --- | --- |

pH

3,999 ved 15 °C

4,003 ved 20 °C

4,008 ved 25 °C

4,015 ved 30 °C

3.1.3.   Opløsning indeholdende:

| Monokaliumphosphat (KH2PO4) ... | 3,402 g |
| --- | --- |
| Dikaliumphosphat (K2HPO4) ... | 4,354 g |
| Vand til ... | 1 l |

Monokaliumphosphat (KH2PO4) ...

3,402 g

Dikaliumphosphat (K2HPO4) ...

4,354 g

Vand til ...

1 l

(Holdbarhed højst: 2 måneder)

| pH | 6,90 ved 15 °C
  6,88 ved 20 °C
  6,86 ved 25 °C
  6,85 ved 30 °C |
| --- | --- |

pH

6,90 ved 15 °C

6,88 ved 20 °C

6,86 ved 25 °C

6,85 ved 30 °C

Bemærkning: Standardbufferopløsninger, som fås i handelen, kan også anvendes.

4.   FREMGANGSMÅDE

4.1   Klargøring af analyseprøven

4.1.1.   Most og vin

Der måles direkte på mosten eller vinen.

4.1.2.   Rektificeret koncentreret most

Rektificeret koncentreret most fortyndes med vand til en koncentration på 25 % ± 0,5 % (m/m) totalsukker (25 o Brix).

Hvis P er den rektificerede koncentrerede mosts totale sukkerindhold i % (m/m), afvejes en mængde svarende til 2 500/P,

og der fyldes op til 100 g med vand. Ledningsevnen af det anvendte vand skal være under 2 mikrosiemens pr. cm.

4.2   Nulstilling af apparatet

Nulstilling foretages før hver måling, idet brugsanvisningen for det anvendte apparat følges.

4.3.   Kalibrering af pH-meteret

Kalibreringen sker ved 20 °C med bufferopløsningerne med pH 6,88 og 3,57 ved 20 °C, idet brugsanvisningen for det anvendte apparat følges.

Skalaens kalibrering kontrolleres ved hjælp af bufferopløsningen med pH 4,00 ved 20 °C.

4.4.   Måling

Elektroden nedsænkes i analyseprøven, hvis temperatur er mellem 20 og 25 °C og så tæt på 20 °C som muligt. pH aflæses direkte på skalaen.

Der udføres mindst to bestemmelser på samme prøve.

Resultatet er den aritmetiske middelværdi af målingerne.

5.   ANGIVELSE AF RESULTATER

pH af most, af vin eller af 25 % (m/m) (25 o Brix) opløsningen af rektificeret koncentreret most angives med to decimaler.

16   SAMTIDIG KVANTITATIV BESTEMMELSE AF L-ASCORBINSYRE OG D-ISOASCORBINSYRE VED HPLC MED UV-DETEKTION (OIV-AS313-22-ACASCO) — METODE AF TYPE II

1.   INDLEDNING

Ascorbinsyre er en antioxidant, der forekommer naturligt i en række fødevarer. Druernes normale indhold af ascorbinsyre mindskes ved fremstillingen af most og omdannelsen til vin. Ascorbinsyre kan tilsættes til most og vin inden for visse grænser.

Den beskrevne metode er valideret ved ringanalyser af vinprøver tilsat L-ascorbinsyre og D-isoascorbinsyre i en mængde på henholdsvis 30-150 mg/l og 10-100 mg/l.

2.   ANVENDELSESOMRÅDE

Metoden er velegnet til samtidig bestemmelse af L-ascorbinsyre og D-isoascorbinsyre (erythorbinsyre) i vin ved high performance liquid chromatography (HPLC) med UV-detektion i området 3-150 mg/l.

Er indholdet over 150 mg/l, skal prøven fortyndes.

3.   PRINCIP

Prøverne injiceres efter filtrering gennem membranfilter direkte i HPLC-systemet. Analysanderne separeres på en kolonne med omvendt fase og UV-detektion ved 266 nm. Den kvantitative bestemmelse af L-ascorbinsyre og D-isoascorbinsyre sker i forhold til en ekstern standard.

Bemærkning: De nedenfor beskrevne kolonner og arbejdsbetingelser er givet som eksempel. Også andre typer kolonner kan give god separation.

4.   REAGENSER OG PRODUKTER

4.1   Reagenser

4.1.1   n-octylamin, renhed ≥ 99,0 %

4.1.2   Natriumacetat • 3 H2O, renhed ≥ 99,0 %

4.1.3   Eddikesyre, koncentreret, 100 %

4.1.4   Phosphorsyre, ca. 25 %

4.1.5   Oxalsyre, renhed ≥ 99,0 %

4.1.6   Ascorbatoxydase

4.1.7   L-ascorbinsyre, ultra ≥ 99,5 %

4.1.8   D-isoascorbinsyre, renhed ≥ 99,0 %

4.1.9   Dobbeltdestilleret vand

4.1.10   Methanol p.a., 99,8 %

4.2   Klargøring af den mobile fase

4.2.1   Opløsninger til den mobile fase

Der fremstilles følgende opløsninger til den mobile fase:

4.2.1.1   12,93 g n-octylamin i 100 ml methanol

4.2.1.2   68,05 g natriumacetat × 3 H2O i 500 ml dobbeltdestilleret vand

4.2.1.3   12,01 g eddikesyre i 200 ml dobbeltdestilleret vand

4.2.1.4   Bufferopløsning, pH 5,4: 430 ml natriumacetatopløsning (4.2.1.2) og 70 ml eddikesyreopløsning (4.2.1.3)

4.2.2   Klargøring af den mobile fase

5 ml n-octylaminopløsning (4.2.1.1) tilsættes til ca. 400 ml dobbeltdestilleret vand i et bægerglas. Denne opløsning bringes til pH 5,4 til 5,6 ved dråbevis tilsætning af 25 % phosphorsyre (4.1.4). Der tilsættes 50 ml af bufferopløsningen (4.2.1.4), hvorefter blandingen overføres til en 1 000 ml målekolbe, og der fyldes op til stregen med dobbeltdestilleret vand. Før anvendelsen skal den mobile fase filtreres gennem en membran (regenereret cellulose 0,2 μm), og om muligt afgasses med helium (i ca. 10 minutter), afhængigt af de krav, der stilles af det anvendte HPLC-system.

4.3   Fremstilling af standardopløsning

Bemærkning:

Alle standardopløsninger (stamopløsning 4.3.1. og arbejdsopløsninger 4.3.2) skal friskfremstilles hver dag og helst opbevares i køleskab inden injektion.

4.3.1   Fremstilling af stamopløsning (1 mg/ml)

Fremstil en 2 % vandig oxalsyreopløsning, og fjern opløst oxygen i opløsningen ved gennembobling med nitrogen.

Afvej nøjagtigt 100 mg L-ascorbinsyre og 100 mg D-isoascorbinsyre i en 100 ml målekolbe, og fyld op til stregen med 2 % vandig oxalsyreopløsning.

4.3.2   Fremstilling af arbejdsopløsninger

Til arbejdsopløsninger fortyndes stamopløsningen (4.3.1) til de ønskede koncentrationer med 2 % oxalsyreopløsning. Koncentrationer mellem 10 mg/l og 120 mg/l anbefales. For eksempel kan anvendes 100 μl, 200 μl, 400 μl, 800 μl og 1 200 μl til 10 ml, svarende til 10, 20, 40, 80 og 120 mg/l.

5.   APPARATUR

Sædvanligt laboratorieudstyr, herunder:

5.1   HPLC-pumpe

5.2   Loop-injektor 20 μl

5.3   UV-detektor

6.   PRØVETAGNING

Inden injektionen filtreres vinprøverne gennem et membranfilter med porestørrelse 0,2 μm.

Er indholdet over 150 mg/l, skal prøven fortyndes.

7.   FREMGANGSMÅDE

7.1   Arbejdsbetingelser for HPLC-systemet

I kromatografen injiceres 20 μl prøve, der er filtreret gennem membranfilteret.

| Forkolonne | : | f.eks. Nucleosil 120 C18 (4 cm × 4 mm × 7 μm) |
| --- | --- | --- |
| Kolonne | : | f.eks. Nucleosil 120 C18 (25 cm × 4 mm × 7 μm) |
| Injektionsvolumen | : | 20 μl |
| Mobil fase | : | se 4.2.2, isokratisk |
| Flow | : | 1 ml/min |
| UV-detektion | : | 266 nm |
| Skylning | : | mindst 30 ml dobbeltdestilleret vand, efterfulgt af 30 ml methanol og 30 ml acetonitril |

Forkolonne

:

f.eks. Nucleosil 120 C18 (4 cm × 4 mm × 7 μm)

Kolonne

:

f.eks. Nucleosil 120 C18 (25 cm × 4 mm × 7 μm)

Injektionsvolumen

:

20 μl

Mobil fase

:

se 4.2.2, isokratisk

Flow

:

1 ml/min

UV-detektion

:

266 nm

Skylning

:

mindst 30 ml dobbeltdestilleret vand, efterfulgt af 30 ml methanol og 30 ml acetonitril

7.2   Identifikation/bekræftelse

Identifikation af toppe sker ved sammenholdelse af retentionstiderne for standarder og prøver. Med det kromatografisystem, der er beskrevet som eksempel, er retentionstiderne henholdsvis 7,7 min for L-ascorbinsyre og 8,3 min for D-isoascorbinsyre (se figur 1, kromatogram A).

Positive resultater skal bekræftes ved, at prøverne behandles med en spatel ascorbatoxidase, og bestemmelsen gentages (se figur 1, kromatogram B).

På grund af nedbrydningen af L-ascorbinsyre og D-isoascorbinsyre ved indvirkning af ascorbatoxidase må der ikke komme noget signal svarende til retentionstiden for L-ascorbinsyre og D-isoascorbinsyre. Hvis der detekteres interfererende toppe, skal disses areal tages i betragtning ved beregning af analysandernes koncentration.

Image

Bemærkning: Det anbefales, at prøver behandlet med ascorbatoxidase analyseres ved slutningen af en prøveserie, hvorefter der udføres en skylleproces for at fjerne rester af ascorbatoxidase fra kolonnen. I modsat fald vil rester af ascorbatoxidase kunne omdanne L-ascorbinsyre og D–isoascorbinsyre ved HPLC-bestemmelsen, så resultaterne påvirkes.

8.   BEREGNINGER

Der optegnes en kalibreringskurve ved hjælp af arbejdsopløsningerne (4.3.2). Ved anvendelse af ekstern standard foretages den kvantitative bestemmelse af L-ascorbinsyre og D-isoascorbinsyre ved måling af toppenes areal og aflæsning af den tilsvarende koncentration på kalibreringskurven.

Angivelse af resultaterne

Resultaterne angives med én decimal i mg/l af henholdsvis L-ascorbinsyre og D-isoascorbinsyre (f.eks. 51,3 mg/l).

Er indholdet over 150 mg/l, skal den foretagne fortynding tages i betragtning.

9.   NØJAGTIGHED

Metoden er afprøvet i en ringtest, der blev afholdt i 1994 af den daværende tyske sundhedsstyrelse (Bundesgesundheitsamt) med deltagelse af 27 laboratorier. Ringtest-programmet fandt sted i medfør af § 35 i den tyske fødevarelov og blev godkendt af OIV indtil indførelsen af den nye protokol (OENO 6/2000).

Undersøgelsen omfattede fire forskellige vinprøver – to hvidvine og to rødvine – og der blev anmodet om fem gentagelser på hver prøve. Da det ikke var muligt at fremstille prøver med tilstrækkelig stabilitet af analysanderne (forskellig nedbrydningshastighed), fik deltagerne tilsendt bestemte mængder rene standardstoffer foruden vinprøverne. Laboratorierne blev instrueret om at overføre standardstofferne kvantitativt til vinprøverne og at analysere dem straks. Der blev analyseret mængder på 30 til 150 mg/l for L-ascorbinsyre og 10 til 100 mg/l for D-isoascorbinsyre. Detaljerede resultater af undersøgelsen er givet i bilaget som er offentliggjort af OIV. Vurderingen er udført i overensstemmelse med DIN/ISO 5725 (version 1988).

Standardafvigelsen på repeterbarhed (sr) og på reproducerbarhed (sR) var i overensstemmelse med koncentrationerne af L-ascorbinsyre og D-isoascorbinsyre. Den reelle nøjagtighedsparameter kan beregnes af følgende ligninger:

| | L-ascorbinsyre
  sr = 0,011 x + 0,31
  sR = 0,064 x + 1,39 , hvor:
  x er koncentrationen af L-ascorbinsyre (mg/l) |
| --- | --- |

L-ascorbinsyre

sr = 0,011 x + 0,31

sR = 0,064 x + 1,39 , hvor:

x er koncentrationen af L-ascorbinsyre (mg/l)

| | D-isoascorbinsyre
  sr = 0,014 x + 0,31
  sR = 0,079 x + 1,29 , hvor:
  x er koncentrationen af D-isoascorbinsyre (mg/l) |
| --- | --- |

D-isoascorbinsyre

sr = 0,014 x + 0,31

sR = 0,079 x + 1,29 , hvor:

x er koncentrationen af D-isoascorbinsyre (mg/l)

Eksempel:

| | 50 mg/l D-isoascorbinsyre sr = 1,0 mg/l |
| --- | --- |

50 mg/l D-isoascorbinsyre sr = 1,0 mg/l

| | sR = 5,2 mg/l |
| --- | --- |

sR = 5,2 mg/l

10.   ANDRE SPECIFIKATIONER FOR ANALYSEN

10.1   Detektionsgrænse

Detektionsgrænsen for denne metode estimeredes til 3 mg/l for L-ascorbinsyre og D-isoascorbinsyre.

10.2   Korrekthed

Den gennemsnitlige genfindingsgrad, beregnet på grundlag af ringtesten på fire prøver (se BILAG offentliggjort i OIV's samling) var:

| — | 100,6 % for L-ascorbinsyre |
| --- | --- |

—

100,6 % for L-ascorbinsyre

| — | 103,3 % for D-isoascorbinsyre |
| --- | --- |

—

103,3 % for D-isoascorbinsyre

17   KULDIOXID (OIV-AS314-01-DIOCAR) — METODE AF TYPE II

1.   METODENS PRINCIP

1.1.   Stille vine (overtryk af CO2 ≤ 0,5 × 105 Pa)
   (2)

Det volumen vin, der udtages af den til ca. 0 °C afkølede prøve, hældes i et tilstrækkeligt overskud af en indstillet natriumhydroxidopløsning til at opnå et pH på 10-11. Der titreres med en syreopløsning under tilstedeværelse af kulsyreanhydrase. Kuldioxidindholdet beregnes ud fra det volumen, som tilsættes for at bringe pH fra 8,6 (hydrogencarbonatform) til 4,0 (kulsyre). Ved hjælp af en blindprøve, som udføres under samme betingelser på den decarboniserede vin, kan der korrigeres for den mængde natriumhydroxidopløsning, som er forbrugt af vinens indhold af syrer.

1.2.   Perlevine og mousserende vine

Vinprøven til analyse afkøles til nær sit frysepunkt. Efter udtagning af en mængde til blindprøveforsøg efter decarbonisering gøres resten af flaskens indhold alkalisk for at binde al CO2 som Na2CO3. Der titreres med en syreopløsning under tilstedeværelse af kulsyreanhydrase. Kuldioxidindholdet beregnes ud fra det volumen syreopløsning, der skal tilsættes for at bringe pH fra 8,6 (hydrogencarbonatform) til 4,0 (kulsyre). Ved hjælp af en blindprøve, som udføres under samme betingelser på den decarboniserede vin, kan der korrigeres for den mængde natriumhydroxidopløsning, som er forbrugt af vinens indhold af syrer.

2.   BESKRIVELSE AF METODEN

2.1.   Stille vine (overtryk af kuldioxid ≤ 0,5 × 105 Pa).

2.1.1.   Apparatur

2.1.1.1.   Magnetomrører

2.1.1.2.   pH-meter

2.1.2.   Reagenser

2.1.2.1.   0,1 M opløsning af natriumhydroxid (NaOH).

2.1.2.2.   0,05 M opløsning af svovlsyre (H2SO4).

2.1.2.3.   Kulsyreanhydraseopløsning, 1 g/l.

2.1.3.   Fremgangsmåde

Vinprøven og den pipette på 10 ml, som prøven skal udtages med, afkøles til ca. 0 °C.

I et 100 ml bægerglas hældes 25 ml natriumhydroxidopløsning (2.1.2.1), og der tilsættes 2 dråber vandig kulsyreanhydraseopløsning (2.1.2.3). Dertil sættes 10 ml vin ved hjælp af pipetten, som er afkølet til 0 °C.

Bægerglasset anbringes på magnetomrørerpladen, elektroden og magnetstaven anbringes, og omrøreren startes med moderat hastighed.

Når væsken har nået stuetemperatur, tilsættes langsomt svovlsyreopløsning (2.1.2.2) til pH 8,6.

Tilsætningen af svovlsyre (2.1.2.2) fortsættes til pH 4,0. Det volumen, der er tilsat mellem pH 8,6 og 4,0, betegnes n ml.

CO2 fjernes fra ca. 50 ml vin ved omrøring under vakuum i 3 minutter, mens kolben er anbragt i vandbad ved ca. 25 °C.

10 ml af den decarboniserede vin behandles efter ovenstående fremgangsmåde. Det anvendte volumen betegnes n′ ml.

2.1.4.   Angivelse af resultater

1 ml indstillet 0,05 M svovlsyre svarer til 4,4 mg CO2.

CO2-mængden i g pr. l vin er givet ved:

0,44 (n – n′)

Dette angives med to decimaler.

Bemærkning: For vine med lavt CO2-indhold (CO2 < 1 g/l) behøver der ikke tilsættes kulsyreanhydrase til katalyse af CO2-hydratiseringen.

2.2.   Perlevine og mousserende vine

2.2.1.   Apparatur

2.2.1.1.   Magnetomrører

2.2.1.2.   pH-meter

2.2.2.   Reagenser

2.2.2.1.   50 % (m/m) opløsning af natriumhydroxid (NaOH).

2.2.2.2.   0,05 M opløsning af svovlsyre (H2SO4).

2.2.2.3.   Kulsyreanhydraseopløsning, 1 g/l.

2.2.3.   Fremgangsmåde

På den flaske vin, der skal analyseres, afmærkes væskestanden, og flasken afkøles til begyndende frysning.

Under omrystning opvarmes flasken svagt, indtil iskrystallerne er forsvundet.

Flasken åbnes hurtigt, og i et måleglas hældes 45 til 50 ml vin, som skal anvendes til blindprøven. Det nøjagtige volumen af denne prøve, v ml, aflæses på måleglasset, når prøven atter har nået stuetemperatur.

Straks efter udtagning af prøven tilsættes 20 ml natriumhydroxidopløsning (2.2.2.1) til flasken (for en 750 ml flaske).

Vinen lades nå stuetemperatur igen.

I et 100 ml bægerglas hældes 30 ml kogt, destilleret vand og 2 dråber kulsyreanhydraseopløsning (2.2.2.3). Der tilsættes 10 ml alkaliniseret vin.

Bægerglasset sættes på magnetomrørerpladen, elektroden og magnetpinden anbringes, og omrøreren startes med moderat hastighed.

Svovlsyreopløsning (2.2.2.2) tilsættes langsomt til pH 8,6.

Tilsætningen af svovlsyre (2.2.2.2) fortsættes til pH 4,0. Det volumen, der er tilsat mellem pH 8,6 og 4,0, betegnes n ml.

CO2 fjernes fra de v ml vin, som er udtaget til blindprøven, ved omrøring under vakuum i 3 minutter, medens kolben er anbragt i vandbad ved ca. 25 °C. 10 ml af den decarboniserede vin sættes til 30 ml kogt destilleret vand, og der tilsættes 2-3 dråber natriumhydroxidopløsning (2.2.2.1) til pH 10-11. Derefter følges ovenstående anvisninger. Den tilsatte mængde 0,05 M svovlsyre betegnes n′ ml.

2.2.4.   Angivelse af resultater

1 ml 0,05 M svovlsyreopløsning svarer til 4,4 mg CO2.

Flasken tømmes for den alkaliserede vin, og med 1 ml's nøjagtighed bestemmes det oprindelige volumen vin ved at fylde op med vand til det afsatte mærke. Dette volumen betegnes V ml.

CO2-indholdet i g pr. l vin er givet ved:

0,44(n – n′) × (V – v + 20)/(V – v)

Dette angives med to decimaler.

2.3.   Beregning af det teoretiske overtryk

Overtrykket ved 20 °C, Paph20, angivet i pascal, er givet ved følgende formel:

Paph20 = Q/1,951 × 10-5 × (0,86 – 0,01 A) × (1 – 0,00144 S) – Patm

hvor:

| Q | : | CO2-indholdet i g pr. l vin |
| --- | --- | --- |
| A | : | vinens alkoholindhold ved 20 °C |
| S | : | vinens sukkerindhold i g pr. l |
| Patm | : | atmosfæretrykket i pascal |

Q

:

CO2-indholdet i g pr. l vin

A

:

vinens alkoholindhold ved 20 °C

S

:

vinens sukkerindhold i g pr. l

Patm

:

atmosfæretrykket i pascal

18   KVANTITATIV BESTEMMELSE AF KULDIOXID I VIN MED EN MANOMETRISK METODE (OIV-AS314-04-CO2MAN) — METODE AF TYPE II

(til orientering)

[Beskrivelsen af denne analysemetode er under ajourføring af OIV. Denne beskrivelse vil blive offentliggjort i Kommissionens næste meddelelse, når en ajourført tekst offentliggøres af OIV i 2010-udgaven af OIV's samling af internationale analysemetoder.]

19   MÅLING AF OVERTRYK I MOUSSERENDE VIN OG PERLEVIN (OIV-AS314-02-SURPRES) — METODE AF TYPE I

1.   PRINCIP

Efter temperaturstabilisering og omrystning af flasken måles trykket med afrometer (trykmåler). Trykket angives i pascal (Pa) (metode af type I). Metoden finder også anvendelse på mousserende vin tilsat kulsyre og perlevin tilsat kulsyre.

2.   APPARATUR

Apparatet til måling af overtrykket i flasker med mousserende vin og perlevin betegnes afrometer. Det kan være udformet forskelligt alt efter, hvordan flasken er lukket (skruekapsel, crown cork, korkprop eller plastprop).

2.1.   Flasker med metalkapsel

Afrometeret består af tre dele (se fig. 1):

| — | En øvre del (skrue med hulnål), som består af manometer, håndskruegreb, gevindstykke, som passer ind i midterdelen, og hulnål til gennemboring af kapslen. Hulnålen er i siden forsynet med et hul, der er tilsluttet manometeret. En pakning sørger for, at enheden slutter tæt mod kapslen på flasken. |
| --- | --- |

—

En øvre del (skrue med hulnål), som består af manometer, håndskruegreb, gevindstykke, som passer ind i midterdelen, og hulnål til gennemboring af kapslen. Hulnålen er i siden forsynet med et hul, der er tilsluttet manometeret. En pakning sørger for, at enheden slutter tæt mod kapslen på flasken.

| — | En midterdel (eller møtrik) tjener til centrering af den øvre del. Når den skrues ned i den nedre del, fastholdes enheden mod flasken. |
| --- | --- |

—

En midterdel (eller møtrik) tjener til centrering af den øvre del. Når den skrues ned i den nedre del, fastholdes enheden mod flasken.

| — | En nedre del (bøjle) med en klemanordning, der kan skydes ind under flaskekraven, så bøjlen holdes fast. Med adaptere kan den tilpasses forskellige flasketyper. |
| --- | --- |

—

En nedre del (bøjle) med en klemanordning, der kan skydes ind under flaskekraven, så bøjlen holdes fast. Med adaptere kan den tilpasses forskellige flasketyper.

2.2.   Flasker med prop

Afrometeret består af to dele (se fig. 2):

| — | Den øverste del er identisk med det foregående apparat, dog er nålen længere. Hulnålen er et langt tyndt rør, som i enden er forsynet med en spids, der letter gennemtrængningen af proppen. Spidsen er aftagelig og falder ned i vinen, når proppen er gennemboret. |
| --- | --- |

—

Den øverste del er identisk med det foregående apparat, dog er nålen længere. Hulnålen er et langt tyndt rør, som i enden er forsynet med en spids, der letter gennemtrængningen af proppen. Spidsen er aftagelig og falder ned i vinen, når proppen er gennemboret.

| — | Den nedre del dannes af møtrikken og et bundstykke, der hviler mod proppen. Bundstykket har fire skruer, der fastholder hele enheden på proppen. |
| --- | --- |

—

Den nedre del dannes af møtrikken og et bundstykke, der hviler mod proppen. Bundstykket har fire skruer, der fastholder hele enheden på proppen.

| | |
| --- | --- |

Image

Image

Bemærkninger vedrørende manometrene på de to apparattyper:

| — | De kan være mekaniske af bourdonrørstypen eller digitale med piezoelektrisk tryktransducer. Hvis der anvendes bourdonrør, skal dette være af rustfrit stål. |
| --- | --- |

—

De kan være mekaniske af bourdonrørstypen eller digitale med piezoelektrisk tryktransducer. Hvis der anvendes bourdonrør, skal dette være af rustfrit stål.

| — | Skalaen skal være i pascal (forkortet Pa). For mousserende vin er det mest praktisk at anvende måleenheden 105 pascal (105 Pa) eller kilopascal (kPa). |
| --- | --- |

—

Skalaen skal være i pascal (forkortet Pa). For mousserende vin er det mest praktisk at anvende måleenheden 105 pascal (105 Pa) eller kilopascal (kPa).

| — | Apparaterne er inddelt i forskellige klasser. Et manometers klasse er aflæsningens nøjagtighed angivet i procent af fuld skala (eksempel: et manometer på 1 000 kPa, klasse 1, har et største anvendelsestryk på 1 000 kPa, og aflæsningens nøjagtighed er ± 10 kPa). Det anbefales at anvende apparater af klasse 1 for at opnå nøjagtige målinger. |
| --- | --- |

—

Apparaterne er inddelt i forskellige klasser. Et manometers klasse er aflæsningens nøjagtighed angivet i procent af fuld skala (eksempel: et manometer på 1 000 kPa, klasse 1, har et største anvendelsestryk på 1 000 kPa, og aflæsningens nøjagtighed er ± 10 kPa). Det anbefales at anvende apparater af klasse 1 for at opnå nøjagtige målinger.

3.   FREMGANGSMÅDE

Målingen foretages på flasker, hvis temperatur har været stabil i mindst 24 timer. Når kapsel eller prop (kork eller plast) er gennemboret, skal flasken straks omrystes kraftigt, indtil der er opnået konstant tryk, hvorefter aflæsningen kan foretages.

3.1.   Flasker med kapsel

Bøjlens klemanordning skydes ind under flaskekraven. Møtrikken skrues i, så enheden spændes fast på flasken. Derefter skrues den øvre del ned i møtrikken. For at undgå gastab skal gennemboringen af kapslen ske hurtigst muligt, så pakningen ligger an mod kapslen. Derefter omrystes flasken kraftigt, indtil trykket er konstant, hvorefter der aflæses.

3.2.   Flasker med prop

Der anbringes en spids på enden af hulnålen. Den samlede enhed anbringes på proppen. De fire skruer strammes om proppen. Den øvre del skrues i (hvorved nålen presses igennem proppen). Spidsen skal falde ned i flasken, før trykket kan forplante sig til manometeret. Der aflæses, når flasken er omrystet, til trykket er konstant. Efter aflæsningen samles spidsen op igen.

4.   ANGIVELSE AF RESULTATER

Overtrykket ved 20 °C (Paph20) angives i pascal (Pa) eller i kilopascal (kPa). Trykket skal angives i overensstemmelse med manometerets nøjagtighed (f.eks. 6,3 × 105 Pa eller 630 kPa, ikke 6,33 × 105 Pa eller 633 kPa, for et manometer af klasse 1 med fuld skala 1 000 kPa).

Når måletemperaturen er forskellig fra 20 °C, korrigeres resultatet ved at gange det målte tryk med den pågældende koefficient (se tabel 1).

Tabel 1

Forhold mellem overtryk Paph20 i perlevine eller mousserende vine ved 20 °C og overtryk Paph
  t
  ved temperaturen t

| °C | |
| --- | --- |
| 0 | 1,85 |
| 1 | 1,80 |
| 2 | 1,74 |
| 3 | 1,68 |
| 4 | 1,64 |
| 5 | 1,59 |
| 6 | 1,54 |
| 7 | 1,50 |
| 8 | 1,45 |
| 9 | 1,40 |
| 10 | 1,36 |
| 11 | 1,32 |
| 12 | 1,28 |
| 13 | 1,24 |
| 14 | 1,20 |
| 15 | 1,16 |
| 16 | 1,13 |
| 17 | 1,09 |
| 18 | 1,06 |
| 19 | 1,03 |
| 20 | 1,00 |
| 21 | 0,97 |
| 22 | 0,95 |
| 23 | 0,93 |
| 24 | 0,91 |
| 25 | 0,88 |

°C

0

1,85

1

1,80

2

1,74

3

1,68

4

1,64

5

1,59

6

1,54

7

1,50

8

1,45

9

1,40

10

1,36

11

1,32

12

1,28

13

1,24

14

1,20

15

1,16

16

1,13

17

1,09

18

1,06

19

1,03

20

1,00

21

0,97

22

0,95

23

0,93

24

0,91

25

0,88

5.   KONTROL AF RESULTATERNE

Metode til direkte bestemmelse af fysiske parametre (standardreferencemetode af type I).

Kontrol af afrometre

Afrometre skal kontrolleres regelmæssigt (mindst én gang årligt).

Kontrollen udføres på prøvebænk. Derved kan det afprøvede manometer sammenlignes med et parallelt monteret referencemanometer af højere klasse, som er i overensstemmelse med nationale standarder. Ved kontrollen sammenholdes de to apparaters visning først ved stigende, derefter ved faldende tryk. Viser de to apparater forskelligt, kan de nødvendige korrektioner foretages ved hjælp af en stilleskrue.

Autoriserede laboratorier og institutioner råder alle over sådanne prøvebænke, hvilket ligeledes gælder fabrikanterne af manometre.

20   KVANTITATIV BESTEMMMELSE AF LYSOZYM I VIN MED HPLC (OIV-AS315-14) — METODE AF TYPE IV

1.   INDLEDNING

Til bestemmelse af lysozym må en metode baseret på enzymaktivitet foretrækkes.

2.   ANVENDELSESOMRÅDE

Metoden anvendes til kvantitativ bestemmelse af lysozym (i mg protein/l) i hvidvin og rødvin, uafhængigt af enzymaktiviteten (som kan nedsættes ved delvis denaturering eller ved kompleksdannelse og medudfældning) i matricen.

3.   DEFINITION

Ved high performance liquid chromatography (HPLC) baseres analysen på sterisk, polær eller adsorptiv interaktion mellem den stationære fase og analysanden, hvorfor metoden er uafhængig af proteinets faktiske enzymaktivitet.

4.   PRINCIP

Analysen finder sted ved high performance liquid chromatography (HPLC), hvor en spektrofotometrisk detektor kobles sammen med en spektrofluorimetrisk detektor. Det ukendte indhold i vinprøven beregnes som funktion af arealet af toppen i kromatogrammet, idet der anvendes en ekstern standard.

5.   REAGENSER

5.1.   Væsker og opløsninger

Acetonitril (CH3CN) til HPLC

Trifluoreddikesyre (TFA), koncentreret

Deioniseret vand til HPLC

Standardopløsning: Vinsyre, 1 g/l, ethanol 10 % v/v, justeret til pH 3,2 med neutralt kaliumtartrat

5.2.   Elueringsvæsker

| A | : | CH3CN 1 %, TFA 0,2 %, H2O = 98,8 % |
| --- | --- | --- |
| B | : | CH3CN 70 %, TFA 0,2 %, H2O = 29,8 % |

A

:

CH3CN 1 %, TFA 0,2 %, H2O = 98,8 %

B

:

CH3CN 70 %, TFA 0,2 %, H2O = 29,8 %

5.3.   Referenceopløsninger

Fra 1 til 250 mg/l lysozymstandard, opløst i modelopløsningen ved uafbrudt omrøring i mindst 12 timer.

6.   UDSTYR

6.1.   HPLC-apparat med pumpesystem til gradienteluering

6.2.   Plads til termostateret kolonne (ovn)

6.3.   Spektrofotometrisk detektor koblet til spektrofluorimetrisk detektor

6.4.   Loop-injektor, 20 μl

6.5.   Kolonne med omvendt fase-polymer med phenyl som funktionelle grupper (porediameter = 1 000 Å, afskæringsgrænse = 1 000 000 Da), f.eks. Tosoh Bioscience TSK-gel Phenyl 5PW RP 7,5 cm × 4,6 mm ID

6.6.   Forkolonne i samme materiale som kolonnen, f.eks. Tosoh Bioscience TSK-gel Phenyl 5PW RP Guardgel 1,5 cm × 3,2 mm ID

7.   PRØVEFORBEREDELSE

Vinprøverne gøres sure med HCl (10 M), der er fortyndet 1:10, og filtreres 5 minutter efter tilsætningen gennem et polyamidfilter med porediameter 0,22 μm. Den kromatografiske analyse udføres straks efter filtreringen.

8.   DRIFTSBETINGELSER

8.1.   Elueringsvæskeflow: 1 ml/min

8.2.   Kolonnetemperatur: 30 °C

8.3.   Spektrofotometrisk detektion: 280 nm

8.4.   Spektrofluorimetrisk detektion : λex = 276 nm; λem = 345 nm; forstærkning = 10

8.5.   Program for gradienteluering

| Tid (min) | Opl. A % | Opl. B % | gradient |
| --- | --- | --- | --- |
| 0 | 100 | 0 | |
| | | | isokratisk |
| 3 | 100 | 0 | |
| | | | lineær |
| 10 | 65 | 35 | |
| | | | isokratisk |
| 15 | 65 | 35 | |
| | | | lineær |
| 27 | 40,5 | 59,5 | |
| | | | lineær |
| 29 | 0 | 100 | |
| | | | isokratisk |
| 34 | 0 | 100 | |
| | | | lineær |
| 36 | 100 | 0 | |
| | | | isokratisk |
| 40 | 100 | 0 | |

Tid (min)

Opl. A %

Opl. B %

gradient

0

100

0

isokratisk

3

100

0

lineær

10

65

35

isokratisk

15

65

35

lineær

27

40,5

59,5

lineær

29

0

100

isokratisk

34

0

100

lineær

36

100

0

isokratisk

40

100

0

8.6.   Gennemsnitlig retentionstid for lysozym: 25,50 minutter

9.   BEREGNING

Referenceopløsninger med følgende koncentrationer af lysozym analyseres tredobbelt: 1; 5; 10; 50; 100; 200; 250 mg/l. På hvert kromatogram angives arealerne af toppen svarende til lysozym som funktion af den tilsvarende koncentration, hvorved der fås lineære regressionslinjer svarende til ligningen Y = ax + b. Determinationskoefficienten r2 skal være > 0,999.

10.   METODENS KARAKTERISTIKA

For at vurdere metodens egnethed til formålet er der foretaget en validering, hvor metodens linearitet, detektions- og kvantificeringsgrænser samt nøjagtighed er undersøgt. Sidstnævnte parameter er bestemt ved fastlæggelse af metodens præcision og korrekthed.

| | Linearitetsområde
  (mg/l) | Linjens hældning | Determinationskoefficient
  (r2) | LD (mg/l) | LQ (mg/l) | Repeterbarhed (n=5) RSD % | Reproducerbarhed (n=5) RSD % |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Std1 | V.R.2 | V.B.3 | Std1 |
| UV | 5-250 | 3 786 | 0,9993 | 1,86 | 6,20 | 4,67 | 5,54 | 0,62 | 1,93 |
| FLD | 1-250 | 52 037 | 0,9990 | 0,18 | 0,59 | 2,61 | 2,37 | 0,68 | 2,30 |

Linearitetsområde

(mg/l)

Linjens hældning

Determinationskoefficient

(r2)

LD (mg/l)

LQ (mg/l)

Repeterbarhed (n=5) RSD %

Reproducerbarhed (n=5) RSD %

Std1

V.R.2

V.B.3

Std1

UV

5-250

3 786

0,9993

1,86

6,20

4,67

5,54

0,62

1,93

FLD

1-250

52 037

0,9990

0,18

0,59

2,61

2,37

0,68

2,30

Tabel 1: Data vedrørende metodens karakteristika: Std1 standardopløsning; V.R.2 rødvin; V.B.3 hvidvin

10.1.   Metodens linearitet

Ved lineær regressionsanalyse er metoden påvist at være lineær inden for de i tabel 1 angivne områder.

10.2.   Detektions- og kvantificeringsgrænser

Detektionsgrænsen (LD) og kvantificeringsgrænsen (LQ) er beregnet som signalet svarende til henholdsvis 3 og 10 gange den kromatografiske baggrundsstøj, der optræder med den faktisk anvendte matrix (tabel 1).

10.3.   Metodens præcision

De undersøgte parametre er repeterbarhed og reproducerbarhed. Værdierne af disse parametre er angivet i tabel 1 (angivet som standardafvigelse i procent for gentagne målinger ved forskellige koncentrationer) for standardopløsning, hvidvin og rødvin.

10.4.   Metodens korrekthed

Genfindelsesprocenten er beregnet for standardopløsninger indeholdende 5 og 50 mg/l af lysozym, som er tilsat en given mængde lysozym som angivet i nedenstående tabel.

| | [C] initial nominel (mg/l) | Tilsat (mg/l) | [C] teoretisk
  (mg/l) | [C] fundet
  (mg/l) | Standardafvigelse | Genfinding (%) |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| UV 280 nm | 50 | 13,1 | 63,1 | 62,3 | 3,86 | 99 |
| FD | 50 | 13,1 | 63,1 | 64,5 | 5,36 | 102 |
| UV 280 nm | 5 | 14,4 | 19,4 | 17,9 | 1,49 | 92,1 |
| FD | 5 | 14,4 | 19,4 | 19,0 | 1,61 | 97,7 |

[C] initial nominel (mg/l)

Tilsat (mg/l)

[C] teoretisk

(mg/l)

[C] fundet

(mg/l)

Standardafvigelse

Genfinding (%)

UV 280 nm

50

13,1

63,1

62,3

3,86

99

FD

50

13,1

63,1

64,5

5,36

102

UV 280 nm

5

14,4

19,4

17,9

1,49

92,1

FD

5

14,4

19,4

19,0

1,61

97,7

Image

21   SULFATER (OIV-AS321-05-SULFAT) — METODE AF TYPE II

1.   METODERNES PRINCIP

1.1.   Referencemetode

Udfældning af bariumsulfat og vejning. Bariumphosphat udfældet under de samme betingelser fjernes ved vaskning af bundfaldet med saltsyre.

For most eller vine med stort svovldioxidindhold foreskrives en forudgående afsvovlning ved kogning uden luftens adgang.

1.2.   Hurtig bestemmelsesmetode

Klassificering af vine i flere kategorier ved en såkaldt grænsemetode baseret på udfældning af bariumsulfat med en titreret bariumionopløsning.

2.   REFERENCEMETODE

2.1.   Reagenser

2.1.1.   2 M saltsyreopløsning

2.1.2.   Bariumchloridopløsning, 200 g/l BaCl2 • 2 H2O

2.2.   Fremgangsmåde

2.2.1.   Det generelle tilfælde:

I et 50 ml centrifugeglas anbringes 40 ml analyseprøve, som tilsættes 2 ml 2 M saltsyre og 2 ml bariumchloridopløsning på 200 g/l. Der omrøres med en glasspatel, og spatelen skylles med en smule destilleret vand, hvorefter opløsningen henstår i 5 min. Derefter centrifugeres i 5 min, hvorefter supernatanten dekanteres forsigtigt.

Bundfaldet af bariumsulfat vaskes på følgende måde: der tilsættes 10 ml 2 M saltsyre, bundfaldet opslæmmes og centrifugeres i 5 min, hvorefter supernatanten forsigtigt hældes fra. Bundfaldet vaskes yderligere to gange under samme betingelser med 15 ml destilleret vand hver gang.

Bundfaldet overføres ved skylning med destilleret vand kvantitativt til en tareret platinkapsel og anbringes på vandbad ved 100 °C til fuldstændig inddampning. Det tørrede bundfald kalcineres flere gange kortvarigt over en flamme, indtil der opnås en hvid rest. Denne lades afkøle i exsikkator, hvorefter den vejes.

Massen i mg af det fremkomne bariumsulfat betegnes m.

2.2.2.   Specialtilfælde: Specielt for sulfitholdig most og vin med højt indhold af svovldioxid.

Først fjernes svovldioxiden.

I en 500 ml konisk kolbe, forsynet med en tragt med hane og et afledningsrør, fyldes 25 ml vand og 1 ml koncentreret saltsyre (ρ20 = 1,15-1,18 g/ml). Denne opløsning bringes i kog for at fjerne luftindholdet, og der tilsættes 100 ml vin via tragten med hane, samtidig med at kogningen opretholdes. Væsken i den koniske kolbe koges ind til et volumen på ca. 75 ml, hvorefter den afkøles og overføres kvantitativt til en 100 ml målekolbe. Der fyldes op til stregen med vand. Bestemmelsen af sulfater i en prøvemængde på 40 ml foretages som angivet under 2.2.1.

2.3.   Angivelse af resultater

2.3.1.   Beregninger

Sulfatindholdet, angivet som mg/l kaliumsulfat, K2SO4, er:

18,67 × m

Sulfatindholdet i most eller vin angives i mg kaliumsulfat pr. l uden decimal.

2.3.2.   Repeterbarhed

indtil 1 000 mg/l: r = 27 mg/l

cirka 1 500 mg/l: r = 41 mg/l

2.3.3.   Reproducerbarhed

indtil 1 000 mg/l: R = 51 mg/l

cirka 1 500 mg/l: R = 81 mg/l

22   JERN (OIV-AS322-05-FER) — METODE AF TYPE IV

1.   METODERNES PRINCIP

REFERENCEMETODE

Efter passende fortynding af vinen og fjernelse af alkoholindholdet bestemmes jernindholdet direkte ved atomabsorptionsspektrofotometri.

SÆDVANLIG METODE

Efter foraskning af vinen med brintoverilte reduceres det jern, der findes som jern(III), til jern(II) og bestemmes ved den røde farve, som det giver med orthophenanthrolin.

2.   REFERENCEMETODE

2.1.   Reagenser

2.1.1.   Koncentreret kalibreringsopløsning af jern(III), 1 g pr. l.

Anvend en standardopløsning på 1 g/l, der fås i handelen. Denne opløsning kan tilberedes ved at opløse 8,6341 g jern(III)ammoniumsulfat (FeNH4(SO4)2 • 12 H2O) i destilleret vand, som er gjort svagt surt ved tilsætning af 1 M saltsyre, og fylde op med vand til 1 l.

2.1.2.   Fortyndet kalibreringsopløsning af jern, 100 mg pr. l.

2.2.   Apparatur

2.2.1.   Roterende fordamper med termostatreguleret vandbad.

2.2.2.   Atomabsorptionsspektrofotometer udstyret med en luft-acetylenbrænder.

2.2.3.   Jernhulkatodelampe.

2.3.   Fremgangsmåde

2.3.1.   Klargøring af prøven

Vinens alkoholindhold fjernes ved at koncentrere prøvens volumen til det halve ved hjælp af en roterende fordamper (50-60 °C). Der fyldes op til det oprindelige volumen med destilleret vand.

Om nødvendigt foretages en fortynding forud for bestemmelsen.

2.3.2.   Kalibrering

I fem 100 ml målekolber afpipetteres henholdsvis 1 - 2 - 3 - 4 - 5 ml jernopløsning, 100 mg/l (2.1.8) og der fyldes op til 100 ml med destilleret vand. De fremstillede opløsninger indeholder henholdsvis 1 - 2 - 3 - 4 - 5 mg jern pr. l.

Disse opløsninger opbevares i polyethylenflasker.

2.3.3.   Bestemmelse

Bølgelængden indstilles på 248,3 nm. Absorbansskalaen nulstilles med destilleret vand. Den fortyndede prøve suges direkte ind i spektrofotometerets brænder, efterfulgt en efter en af kalibreringsopløsningerne, der blev fremstillet under 2.3.2, og absorbanserne aflæses. Der foretages dobbeltbestemmelser.

2.4.   Angivelse af resultater

2.4.1.   Beregningsmåde

Der optegnes en kurve over absorbansen som funktion af jernkoncentrationen i kalibreringsopløsningerne. Gennemsnitsværdien af absorbansen for den fortyndede vinprøve afsættes på kurven, og den tilsvarende jernkoncentration C aflæses.

Jernkoncentrationen, angivet i milligram pr. l vin med én decimal, bliver:

C × F, hvor

F = fortyndingsfaktoren.

23   KOBBER (OIV-AS 322-06) — METODE AF TYPE IV

1.   METODENS PRINCIP

Anvendelse af atomabsorptionsspektrofotometri.

2.   APPARATUR

2.1.   Platindigel.

2.2.   Atomabsorptionsspektrofotometer.

2.3.   Kobberhulkatodelampe.

2.4.   Gasforsyning: luft/acetylen eller dinitrogenoxid/acetylen.

3.   REAGENSER

3.1.   Metallisk kobber.

3.2.   Koncentreret salpetersyre 65 % (HNO3, ρ20 = 1,38 g/ml).

3.3.   Fortyndet salpetersyre 1:2 (v/v).

3.4.   Kobberopløsning 1 g/l.

Benyt en kobberstandardopløsning på 1 g/l, der fås i handelen. En sådan opløsning kan fremstilles ved afvejning af 1,000 g metallisk kobber, der kvantitativt overføres til en 1 000 ml målekolbe. Der tilsættes salpetersyre, fortyndet i forholdet 1:2 (3.3), i en fuldt tilstrækkelig mængde til at opløse metallet, hvorefter der tilsættes 10 ml koncentreret salpetersyre (3.2) og fyldes op til stregen med dobbeltdestilleret vand.

3.5.   Kobberopløsning 100 mg/l.

Der udtages 10 ml af opløsning 3.4, som fyldes i en 100 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op med dobbeltdestilleret vand.

4.   FREMGANGSMÅDE

4.1.   Prøvefremstilling og bestemmelse af kobber

20 ml af prøven fyldes i en 100 ml målekolbe, hvorefter der fyldes op med dobbeltdestilleret vand. Om nødvendigt benyttes et andet fortyndingsforhold.

På atomabsorptionsspektrofotometeret aflæses absorbansen af den fortyndede prøve ved en bølgelængde på 324,8 nm efter forudgående nulstilling af absorbansskalaen med destilleret vand. Om nødvendigt fremstilles en passende fortynding med dobbeltdestilleret vand.

4.2.   Optegning af kalibreringskurve

0,5 - 1 - 2 ml af opløsning 3.5 (100 mg kobber pr. liter) fyldes i 100 ml målekolber, som fyldes op til mærket med dobbeltdestilleret vand. De således fremstillede opløsninger indeholder henholdsvis 0,5 - 1 - 2 mg kobber pr l. Kalibreringskurven optegnes ved hjælp af absorbanserne for disse opløsninger, målt som beskrevet i punkt 4.1.

5.   ANGIVELSE AF RESULTATER

Absorbansen af prøven af fortyndet vin afsættes på kalibreringskurven, og koncentrationen C i mg/l aflæses.

Hvis F er fortyndingsfaktoren, er vinens indhold af kobber i milligram pr. l: F × C.

Dette angives med to decimaler.

Bemærkninger:

| a) | Opløsningerne til optegning af kalibreringskurven og fortyndingerne af prøven skal vælges, så de svarer dels til apparatets følsomhed, dels prøvens kobberkoncentration. |
| --- | --- |

a)

Opløsningerne til optegning af kalibreringskurven og fortyndingerne af prøven skal vælges, så de svarer dels til apparatets følsomhed, dels prøvens kobberkoncentration.

| b) | Er prøvens kobberkoncentration meget lav, benyttes følgende fremgangsmåde: 100 ml prøve hældes i en platinskål og inddampes over vandbad ved 100 °C til en sirupsagtig konsistens, hvorefter der dråbevis tilsættes 2,5 ml koncentreret salpetersyre (3.2), idet det tilstræbes at dække hele skålens bund. Derefter glødes remanensen forsigtigt på en elektrisk kogeplade eller over en lille flamme. Derefter sættes skålen ind i en muffelovn, som er indstillet til temperaturen 500 °C ± 25 °C. Her forbliver prøven i ca. en time. Efter afkøling fugtes asken med 1 ml koncentreret salpetersyre (3.2) og smuldres med en lille glasstang. Derefter inddampes og glødes igen på samme måde som før. Skålen anbringes på ny i muffelovnen i 15 minutter. Denne behandling med koncentreret salpetersyre gentages mindst tre gange. Asken opløses ved at tilsætte 1 ml koncentreret salpetersyre (3.2) og 2 ml dobbeltdestilleret vand til skålen. Opløsningen overføres til en 10 ml målekolbe. Skålen skylles med tre gange 2 ml dobbeltdestilleret vand, hvorefter der fyldes op til mærket med dobbeltdestilleret vand. Den kvantitative bestemmelse foretages som beskrevet i 4.1., idet der bruges 10 ml opløsning. Der tages hensyn til koncentrationsfaktoren ved angivelse af resultaterne. |
| --- | --- |

b)

Er prøvens kobberkoncentration meget lav, benyttes følgende fremgangsmåde: 100 ml prøve hældes i en platinskål og inddampes over vandbad ved 100 °C til en sirupsagtig konsistens, hvorefter der dråbevis tilsættes 2,5 ml koncentreret salpetersyre (3.2), idet det tilstræbes at dække hele skålens bund. Derefter glødes remanensen forsigtigt på en elektrisk kogeplade eller over en lille flamme. Derefter sættes skålen ind i en muffelovn, som er indstillet til temperaturen 500 °C ± 25 °C. Her forbliver prøven i ca. en time. Efter afkøling fugtes asken med 1 ml koncentreret salpetersyre (3.2) og smuldres med en lille glasstang. Derefter inddampes og glødes igen på samme måde som før. Skålen anbringes på ny i muffelovnen i 15 minutter. Denne behandling med koncentreret salpetersyre gentages mindst tre gange. Asken opløses ved at tilsætte 1 ml koncentreret salpetersyre (3.2) og 2 ml dobbeltdestilleret vand til skålen. Opløsningen overføres til en 10 ml målekolbe. Skålen skylles med tre gange 2 ml dobbeltdestilleret vand, hvorefter der fyldes op til mærket med dobbeltdestilleret vand. Den kvantitative bestemmelse foretages som beskrevet i 4.1., idet der bruges 10 ml opløsning. Der tages hensyn til koncentrationsfaktoren ved angivelse af resultaterne.

24   SVOVLDIOXID (OIV-AS323-04-DIOSU) — METODE AF TYPE II

1.   DEFINITIONER

Ved svovldioxid forstås svovldioxid, der findes i mosten eller i vinen i følgende former: H2SO3 og HSO3–, hvis indbyrdes ligevægt er pH- og temperaturafhængig:

H2SO3 ←→ H+ + HSO3–

H2SO3 repræsenterer molekylær svovldioxid.

Ved total svovldioxid forstås den samlede mængde af de forskellige former for svovldioxid, der findes i vinen, enten i fri tilstand eller bundet til dennes bestanddele.

2.   FRI SVOVLDIOXID OG TOTAL SVOVLDIOXID

2.1.   Metodernes princip

2.1.1.   Referencemetode

2.1.1.1.   Vin og most

Svovldioxiden medrives af en luft- eller nitrogenstrøm. Den bindes og oxideres ved gennembobling gennem en fortyndet, neutral opløsning af hydrogenperoxid. Den dannede svovlsyre bestemmes med en indstillet opløsning af natriumhydroxid. Den frie svovldioxid ekstraheres fra vinen ved medrivning ved lav temperatur (10 °C).

Den totale svovldioxid ekstraheres fra vinen ved varm medrivning (ca. 100 °C).

2.1.1.2.   Rektificeret koncentreret most

Den totale svovldioxid ekstraheres fra vinen ved varm medrivning (ca. 100 °C) fra den forinden fortyndede rektificerede koncentrerede most.

2.1.2.   Hurtig bestemmelse (vin og most)

Den frie svovldioxid bestemmes ved direkte jodtitrering.

Derefter bestemmes den bundne svovldioxid ved jodtitrering efter alkalisk hydrolyse. Ved sammenlægning heraf med den frie svovldioxid fås det totale svovldioxidindhold.

2.2.   Referencemetode

2.2.1.   Apparatur

2.2.1.1.   Det benyttede apparatur skal være udformet som på nedenstående tegning, først og fremmest hvad angår svaleren.

Image

Gastilledningsrøret i gennemboblingsflasken »B« ender i en lille kugle med diameteren 1 cm, som på sin største vandrette omkreds har 20 huller med en diameter på 0,2 mm. Røret kan også ende i en plade af sintret glas, der sikrer dannelse af et stort antal små bobler og dermed en god kontakt mellem gas- og væskefasen.

Gasflowet gennem apparatet skal være ca. 40 l/t. Kolben på apparatets højre side har til formål at begrænse vakuum fra vandstrålepumpen til 20-30 cm vandsøjle. For at dette vakuum kan reguleres, så flowet bliver korrekt, kan der med fordel anbringes et semi-kapillært flowmeter mellem gennemboblingsflasken og kolben.

2.2.1.2.   Mikroburette

2.2.2.   Reagenser

2.2.2.1.   85 % phosphorsyre (H3PO4) (ρ20 = 1,71 g/ml).

2.2.2.2.   Hydrogenperoxidopløsning, 9,1 g H2O2/l (tre volumener).

2.2.2.3.   Indikatorreagens:

| methylrødt ... | 100 mg |
| --- | --- |
| methylenblåt ... | 50 mg |
| alkohol 50 % vol. ... | 100 ml |

methylrødt ...

100 mg

methylenblåt ...

50 mg

alkohol 50 % vol. ...

100 ml

2.2.2.4.   0,01 M opløsning af natriumhydroxid (NaOH).

2.2.3.   Bestemmelse af fri svovldioxid

2.2.3.1.   Fremgangsmåde

Vinen skal henstå ved 20 °C i en fyldt, tilproppet kolbe i to dage før bestemmelsen.

| — | I gennemboblingsflasken »B« hældes 2-3 ml hydrogenperoxidopløsning (2.2.2.2) og 2 dråber indikatorreagens, og hydrogenperoxidopløsningen neutraliseres med 0,01 M natriumhydroxid (2.2.2.4). Gennemboblingsflasken monteres på apparatet. |
| --- | --- |

—

I gennemboblingsflasken »B« hældes 2-3 ml hydrogenperoxidopløsning (2.2.2.2) og 2 dråber indikatorreagens, og hydrogenperoxidopløsningen neutraliseres med 0,01 M natriumhydroxid (2.2.2.4). Gennemboblingsflasken monteres på apparatet.

| — | I medrivningsapparatets 250 ml kolbe A hældes 50 ml prøve og 15 ml phosphorsyre (2.2.2.1). Kolben sættes på plads i apparatet. |
| --- | --- |

—

I medrivningsapparatets 250 ml kolbe A hældes 50 ml prøve og 15 ml phosphorsyre (2.2.2.1). Kolben sættes på plads i apparatet.

| — | Der gennembobles med luft (eller nitrogen) i 15 minutter. Den medrevne frie svovldioxid oxideres til svovlsyre. Gennemboblingsflasken fjernes fra apparatet, og den dannede syre titreres med 0,01 M natriumhydroxid (2.2.2.4). Hertil forbruges n ml. |
| --- | --- |

—

Der gennembobles med luft (eller nitrogen) i 15 minutter. Den medrevne frie svovldioxid oxideres til svovlsyre. Gennemboblingsflasken fjernes fra apparatet, og den dannede syre titreres med 0,01 M natriumhydroxid (2.2.2.4). Hertil forbruges n ml.

2.2.3.2.   Angivelse af resultater

Den frie svovldioxid angives i milligram pr. liter (mg/l) uden decimaler.

2.2.3.2.1.   Beregning

Fri svovldioxid i milligram pr. liter: 6,4 × n.

2.2.4.   Bestemmelse af total svovldioxid

2.2.4.1   Fremgangsmåde

2.2.4.1.1.   Til rektificeret koncentreret most anvendes en opløsning fremstillet ved fortynding af analyseprøven til 40 % (m/v) efter anvisningerne i kapitlet »Totalt syreindhold«, afsnit 5.1.2. I medrivningsapparatets 250 ml kolbe A hældes 50 ml af denne opløsning og 5 ml phosphorsyre (2.2.2.1). Kolben sættes på plads i apparatet.

2.2.4.1.2.   Vin og most

Hvis prøven antages at indeholde ≤ 50 mg/l total SO2: I medrivningsapparatets 250 ml kolbe A hældes 50 ml prøve og 15 ml phosphorsyre (2.2.2.1). Kolben sættes på plads i apparatet.

Hvis prøven antages at indeholde ≥ 50 mg/l total SO2: I medrivningsapparatets 100 ml kolbe A hældes 20 ml prøve og 5 ml phosphorsyre (2.2.2.1). Kolben sættes på plads i apparatet.

I gennemboblingsflasken B anbringes 2-3 ml hydrogenperoxidopløsning (2.2.2.2), som neutraliseres som ovenfor, og vinen i kolbe A bringes i kog ved hjælp af en 4-5 cm høj flamme, som direkte rører ved kolbens bund. Læg ikke et metaltrådnet under kolben, men anbring denne på en plade med et rundt hul på ca. 30 mm i diameter. Herved undgås varmeomdannelse af tørstof fra vinen, der afsættes på kolbens sider.

Kogningen holdes i gang, mens der gennemledes luft (eller nitrogen). Efter 15 minutter er det totale indhold af svovldioxid medrevet og oxideret. Den dannede svovlsyre titreres med 0,01 M natriumhydroxidopløsning (2.2.2.4).

Hertil forbruges n ml.

2.2.4.2.   Angivelse af resultater

Det totale indhold af svovldioxid angives i milligram pr. liter (mg/l) eller i milligram pr. kilogram (mg/kg) totalsukker uden decimal.

2.2.4.2.1.   Beregning

| — | Vin og most
  Totalt indhold af svovldioxid i milligram pr. liter.






  — | Prøver, der er fattige på svovldioxid (prøvevolumen 50 ml):
  6,4 × n |
| --- | --- | --- |

—

Vin og most

Totalt indhold af svovldioxid i milligram pr. liter.

—

Prøver, der er fattige på svovldioxid (prøvevolumen 50 ml):

6,4 × n

| — | Andre prøver (prøvevolumen 20 ml):
  16 × n |
| --- | --- |

—

Andre prøver (prøvevolumen 20 ml):

16 × n

| — | Rektificeret koncentreret most
  Svovldioxid i milligram pr. kilo totalsukker (prøvevolumen 50 ml af den fremstillede prøve (2.2.4.1.1):
  (1600 × n)/P, hvor:
  P = totalt sukkerindhold i procent (m/m). |
| --- | --- |

—

Rektificeret koncentreret most

Svovldioxid i milligram pr. kilo totalsukker (prøvevolumen 50 ml af den fremstillede prøve (2.2.4.1.1):

(1600 × n)/P, hvor:

P = totalt sukkerindhold i procent (m/m).

2.2.3.4.2.   Repeterbarhed (r)

Indhold < 50 mg/l (prøvevolumen 50 ml): r = 1 mg/l

Indhold > 50 mg/l (prøvevolumen 20 ml): r = 6 mg/l

2.2.3.4.3.   Reproducerbarhed (R)

Indhold < 50 mg/l (prøvevolumen 50 ml): R = 9 mg/l

Indhold > 50 mg/l (prøvevolumen 20 ml): R = 15 mg/l

---

(1)  Ethvert pyknometer med tilsvarende specifikationer kan anvendes.

(2)  105 Pascal (Pa) = 1 bar.

---