# Официален вестник C 43/2010

| | ISSN 1830-365X
  doi:10.3000/1830365X.C_2010.043.bul |
| --- | --- |
| Официален вестник
  на Европейския съюз | C 43 |
| | |
| Издание на български език | Информация и известия | Година 5319 февруари 2010 г. |

ISSN 1830-365X

doi:10.3000/1830365X.C_2010.043.bul

Официален вестник

на Европейския съюз

C 43

Издание на български език

Информация и известия

Година 5319 февруари 2010 г.

---

| Известие No | Съдържание | Страница |
| --- | --- | --- |
| | II   Съобщения |
| | СЪОБЩЕНИЯ НА ИНСТИТУЦИИТЕ, ОРГАНИТЕ, СЛУЖБИТЕ И АГЕНЦИИТЕ НА ЕВРОПЕЙСКИЯ СЪЮЗ |
| | Европейска комисия |
| 2010/C 043/01 | Списък и описание на методите за анализ, посочени в член 120ж, първа алинея от Регламент (ЕО) No 1234/2007 на Съвета (публикувани съгласно член 15, параграф 2 от Регламент (ЕО) No 606/2009 на Комисията от 10 юли 2009 г.
  ) | 1 |

Известие No

Съдържание

Страница

II   Съобщения

СЪОБЩЕНИЯ НА ИНСТИТУЦИИТЕ, ОРГАНИТЕ, СЛУЖБИТЕ И АГЕНЦИИТЕ НА ЕВРОПЕЙСКИЯ СЪЮЗ

Европейска комисия

2010/C 043/01

Списък и описание на методите за анализ, посочени в член 120ж, първа алинея от Регламент (ЕО) No 1234/2007 на Съвета (публикувани съгласно член 15, параграф 2 от Регламент (ЕО) No 606/2009 на Комисията от 10 юли 2009 г.
  )

(публикувани съгласно член 15, параграф 2 от Регламент (ЕО) No 606/2009 на Комисията от 10 юли 2009 г.

)

1

| BG | |
| --- | --- |

BG

---

II Съобщения

СЪОБЩЕНИЯ НА ИНСТИТУЦИИТЕ, ОРГАНИТЕ, СЛУЖБИТЕ И АГЕНЦИИТЕ НА ЕВРОПЕЙСКИЯ СЪЮЗ

Европейска комисия

| 19.2.2010 | BG | Официален вестник на Европейския съюз | C 43/1 |
| --- | --- | --- | --- |

19.2.2010

BG

Официален вестник на Европейския съюз

C 43/1

---

Списък и описание на методите за анализ, посочени в член 120ж, първа алинея от Регламент (ЕО) No 1234/2007 на Съвета (1)

(публикувани съгласно член 15, параграф 2 от Регламент (ЕО) No 606/2009 на Комисията от 10 юли 2009 г.
   (2)
  )

2010/C 43/01

Таблицата по-долу съдържа списък на методите за анализ, които се прилагат за контролиране на граничните стойности и на изискванията, определени в правилата на Общността за производство на лозаро-винарски продукти. В третата колона, за всеки засяган параметър е даден справочният код на съответния метод за анализ, описан в „Сборника с международните методи за анализ на вината и видовете мъст“ на OIV, в последното издание (2009 г.), което е на разположение към датата на настоящата публикация. За всеки параметър са описани само стандартните методи („Тип I“ или „Тип II“ по класификацията на OIV), с изключение на параметрите, за които понастоящем няма утвърден метод от тип I или II. Описанието на методите е дадено в приложението към съобщението.

Внимание:

В приложение А, раздел I на Сборника на OIV се дава определение на различните типове методи за анализ и по-специално на тип I (Стандартен критериен метод ), тип II (Стандартен метод) и на тип IV (Временен метод).

Методите за анализ за оловото и кадмия са описани понастоящем в Регламент (ЕО) No 333/2007 на Комисията от 28 март 2007 г. (приложение В-3) (3). Освен това, в приложение II.4 към Регламент (ЕО) No 401/2006 (4) от 23 февруари 2006 г. се определят общи критерии за методите за анализ за охратоксина А и следователно не е необходимо за това вещество да се описва специфичен за лозаро-винарските продукти метод.

СПИСЪК НА МЕТОДИТЕ ЗА АНАЛИЗ

| No | Параметър | Метод от Сборника на OIV | Тип |
| --- | --- | --- | --- |
| 1 | Плътност | AS-2-01-MASVOL | I |
| 2 | Коефициент на пречупване | AS-2-02-SUCREF | I |
| 3 | Общ сух остатък | AS-2-03-EXTSEC | I |
| 4 | Изотопно отношение 18O/16O на водата на виното | AS-2-09-MOUO18 | II |
| 5 | Индекс на Фолин | AS-2-10-INDFOL | IV |
| 6 | Съдържание на захар (= глюкоза+фруктоза) | AS-311-02-GLUFRU | II |
| 7 | Съдържание на захароза (измерване чрез високоефективна течностна хроматография (HPLC)) | AS-311-03-SUCRES | II |
| 8 | Ядрен магнитен резонанс – деутерият на етанола на виното | AS-311-O5-ENRRMN (преразглежда се) | I |
| 9 | Алкохолно съдържание в обемни % | AS-312-01-TALVOL | I |
| 10 | Изотопно отношение 13C/12C на етанола на виното | AS-312-06-ETHANO | II |
| 11 | Обща киселинност | AS-313-01-ACITOT | I |
| 12 | Летливи киселини | AS-313-02-ACIVOL | I |
| 13 | Лимонена киселина | AS-313-09-ACIENZ | II |
| 14 | Сорбинова киселина | AS-313-14-ACISOR | IV |
| 15 | pH на мъстта | AS-313-15-PH | I |
| 16 | Аскорбинова киселина | AS- 313-22 ACASCO | II |
| 17 | CO2 в g/l | AS-314-01-DIOCAR | II |
| 18 | CO2 в g/l (измерване на налягането) | AS-314-04-CO2MAN | II |
| 19 | Потискане на СO2 | AS-314-02-SURPRES | I |
| 20 | Лизозим | AS-315-14-LYSOZY | IV |
| 21 | Калиев сулфат | AS-321-05-SULFAT | II |
| 22 | Желязо | AS-322-05-FER | IV |
| 23 | Мед | AS-322-06-CUIVRE | IV |
| 24 | Сулфити (SO2) или
  Общ серен двуокис | AS-323-04-DIOSU | II |

No

Параметър

Метод от Сборника на OIV

Тип

1

Плътност

AS-2-01-MASVOL

I

2

Коефициент на пречупване

AS-2-02-SUCREF

I

3

Общ сух остатък

AS-2-03-EXTSEC

I

4

Изотопно отношение 18O/16O на водата на виното

AS-2-09-MOUO18

II

5

Индекс на Фолин

AS-2-10-INDFOL

IV

6

Съдържание на захар (= глюкоза+фруктоза)

AS-311-02-GLUFRU

II

7

Съдържание на захароза (измерване чрез високоефективна течностна хроматография (HPLC))

AS-311-03-SUCRES

II

8

Ядрен магнитен резонанс – деутерият на етанола на виното

AS-311-O5-ENRRMN (преразглежда се)

I

9

Алкохолно съдържание в обемни %

AS-312-01-TALVOL

I

10

Изотопно отношение 13C/12C на етанола на виното

AS-312-06-ETHANO

II

11

Обща киселинност

AS-313-01-ACITOT

I

12

Летливи киселини

AS-313-02-ACIVOL

I

13

Лимонена киселина

AS-313-09-ACIENZ

II

14

Сорбинова киселина

AS-313-14-ACISOR

IV

15

pH на мъстта

AS-313-15-PH

I

16

Аскорбинова киселина

AS- 313-22 ACASCO

II

17

CO2 в g/l

AS-314-01-DIOCAR

II

18

CO2 в g/l (измерване на налягането)

AS-314-04-CO2MAN

II

19

Потискане на СO2

AS-314-02-SURPRES

I

20

Лизозим

AS-315-14-LYSOZY

IV

21

Калиев сулфат

AS-321-05-SULFAT

II

22

Желязо

AS-322-05-FER

IV

23

Мед

AS-322-06-CUIVRE

IV

24

Сулфити (SO2) или

Общ серен двуокис

AS-323-04-DIOSU

II

Описанието на няколко метода за анализ е предмет на актуализиране от органите на OIV. Тези описания ще бъдат публикувани в следващо Съобщение на Комисията, щом OIV публикува актуализиран текст в изданието за 2010 г. на „Сборника с международните методи за анализ на вината и видовете мъст“ на OIV.

---

(1)  JO L 299 du 16.11.2007.

(2)  JO L 193 du 24.07.2009, p. 1.

(3)  ОВ L 88, 29.3.2007 г., стр. 29.

(4)  ОВ L 70, 9.6.2006 г., стр. 12.

---

ПРИЛОЖЕНИЕ

СЪДЪРЖАНИЕ

| 1 | ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ПЛЪТНОСТТА И ОТНОСИТЕЛНАТА ПЛЪТНОСТ ПРИ ТЕМПЕРАТУРА 20 °C (OIV-AS2-01-MASVOL) — Метод Тип I |
| --- | --- |

1

| 2 | ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СЪДЪРЖАНИЕТО НА ЗАХАР В МЪСТ, КОНЦЕНТРИРАНА МЪСТ И РЕКТИФИЦИРАНА ГРОЗДОВА МЪСТ ЧРЕЗ РЕФРАКТОМЕТРИЯ (OIV-AS2-02-SUCREF) — Метод Тип I |
| --- | --- |

2

| 3 | ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ОБЩИЯ СУХ ЕКСТРАКТ (OIV-AS-2-03-EXTSEC) Общо сухо вещество — Метод Тип I |
| --- | --- |

3

| 4 | ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ИЗОТОПНОТО ОТНОШЕНИЕ 18O/16O НА ВОДАТА НА ВИНОТО (OIV-AS-2-09-MOUO18) — Метод Тип II |
| --- | --- |

4

| 5 | ОПРЕДЕЛЯ ИНДЕКСА НА ФОЛИН-ЧИКАЛТЕУ (OIV-AS-2-10-INDFOL) — Метод Тип IV |
| --- | --- |

5

| 6 | ГЛЮКОЗА И ФРУКТОЗА (OIV-AS-311-02-GLUFRU) — Метод Тип II |
| --- | --- |

6

| 7 | ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ЗАХАРТА ЧРЕЗ ВИСОКОЕФЕКТИВНА ТЕЧНОСТНА ХРОМАТОГРАФИЯ (ЗАХАРОЗА) (OIV-AS-311-03-SUCRES) — Метод Тип II |
| --- | --- |

7

| 8 | ОТКРИВАНЕ НА ОБОГАТИТЕЛНИ ДОБАВКИ В ГРОЗДОВА МЪСТ, КОНЦЕНТРИРАНА ГРОЗДОВА МЪСТ, РЕКТИФИЦИРАНА КОНЦЕНТРИРАНА МЪСТ И ВЪВ ВИНА С ПОМОЩТА НА ЯДРЕНО-МАГНИТЕН РЕЗОНАНС НА ДЕУТЕРИЙ (OIV-AS-311-05-ENRRMN) — Метод Тип I |
| --- | --- |

8

| 9 | АЛКОХОЛНО СЪДЪРЖАНИЕ В ОБЕМНИ ПРОЦЕНТИ (OIV-AS-312-01-TALVOL) — Методи Тип I |
| --- | --- |

9

| 10 | ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ИЗОТОПНОТО ОТНОШЕНИЕ 13C/12C ЧРЕЗ МАС-СПЕКТРОМЕТРИЯ НА ЕТАНОЛА НА ВИНОТО ИЛИ НА ЕТАНОЛА, ПОЛУЧЕН ЧРЕЗ ФЕРМЕНТАЦИЯТА НА МЪСТ, КОНЦЕНТРИРАНА МЪСТ И РЕКТИФИЦИРАНА КОНЦЕНТРИРАНА ГРОЗДОВА МЪСТ (OIV-AS-312-06-ETHANO) — Метод Тип II |
| --- | --- |

10

| 11 | ОБЩА КИСЕЛИННОСТ (OIV-AS-313-01-ACITOT) — Метод Тип I |
| --- | --- |

11

| 12 | ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ЛЕТЛИВА КИСЕЛИННОСТ (OIV-AS-313-02-ACIVOL) — Метод Тип I |
| --- | --- |

12

| 13 | ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ЛИМОНЕНА КИСЕЛИНА (-313/C 145/06) — Метод Тип II |
| --- | --- |

13

| 14 | СОРБИНОВА КИСЕЛИНА (OIV-AS-313-14-ACISOR) — Метод Тип IV |
| --- | --- |

14

| 15 | pH (OIV-AS-313-15-PH) — Метод Тип I |
| --- | --- |

15

| 16 | ЕДНОВРЕМЕННО ОПРЕДЕЛЯНЕ НА L-АСКОРБИНОВА КИСЕЛИНА И НА D-ИЗОАСКОРБИНОВА КИСЕЛИНА ЧРЕЗ ВИСОКОЕФЕКТИВНА ТЕЧНОСТНА ХРОМАТОГРАФИЯ И УЛТРАВИОЛЕТОВО ДЕТЕКТИРАНЕ (OIV-AS-313-22-ACASCO) — Метод Тип II |
| --- | --- |

16

| 17 | ВЪГЛЕРОДЕН ДВУОКИС (OIV-AS-314-01-DIOCAR) — Метод Тип II |
| --- | --- |

17

| 18 | ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ВЪГЛЕРОДЕН ДВУОКИС ВЪВ ВИНОТО ПО МАНОМЕТЪРНИЯ МЕТОД (OIV-AS314-04-CO2MAN) — Метод Тип II |
| --- | --- |

18

| 19 | ИЗМЕРВАНЕ НА НАДНАЛЯГАНЕТО В ПЕНЛИВИТЕ И ИСКРЯЩИ ВИНА (OIV-AS-314-02-SURPRES) — Метод Тип I |
| --- | --- |

19

| 20 | Определяне на лизозим във виното чрез високоефективна течностна хроматография (HPLC) (OIV-AS-315-14) — Метод Тип IV |
| --- | --- |

20

| 21 | СУЛФАТИ (OIV- AS-321-05-SULFAT) — Метод Тип II |
| --- | --- |

21

| 22 | ЖЕЛЯЗО (OIV-AS-322-05-FER) — Метод Тип IV |
| --- | --- |

22

| 23 | МЕД (OIV-AS 322-06) — Метод Тип IV |
| --- | --- |

23

| 24 | ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СЯРА (OIV-AS-323-04-DIOSU) — Метод Тип II |
| --- | --- |

24

1.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ПЛЪТНОСТТА И ОТНОСИТЕЛНАТА ПЛЪТНОСТ ПРИ ТЕМПЕРАТУРА 20 °C (OIV - AS201 - MASVOL) — МЕТОД ТИП I

1.   ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Плътността е масата на единица обем вино или мъст при температура 20 °C. Тя се изразява в грамове на милилитър и се означава със символа ρ20 °C.

Относителната плътност при температура 20 °C (или относителната плътност 20 °C/20 °C) е отношението на масата на определен обем вино или мъст при температура 20 °C към масата на същия обем вода при същата температура, изразено като десетично число. Означава се със символа Formula

2.   ПРИНЦИП НА МЕТОДА

Плътността и относителната плътност при температура 20 °C се определят за пробата за анализ:

| | или чрез пикнометър: стандартен метод, |
| --- | --- |

или чрез пикнометър: стандартен метод,

| | или чрез определяне на плътността с използване на хидростатични везни, или чрез електронна дензиметрия. |
| --- | --- |

или чрез определяне на плътността с използване на хидростатични везни, или чрез електронна дензиметрия.

Забележка

За много точно измерване плътността трябва да бъде коригирана с отчитане влиянието на серния двуокис.

| ρ20 °C | = | ρ′20 °C – 0,0006 × S |
| --- | --- | --- |
| ρ20 °C | = | коригирана плътност |
| ρ′20 °C | = | наблюдавана плътност |
| S | = | общо количество серен двуокис в грамове на литър (g/l). |

ρ20 °C

=

ρ′20 °C – 0,0006 × S

ρ20 °C

=

коригирана плътност

ρ′20 °C

=

наблюдавана плътност

S

=

общо количество серен двуокис в грамове на литър (g/l).

3.   ПРЕДВАРИТЕЛНА ОБРАБОТКА НА ПРОБАТА

Ако виното или мъстта съдържа значителни количества въглероден двуокис, по-голямата част от него трябва да бъде отстранена чрез разбъркване на 250 ml от пробата в шише от 1 000 ml или чрез филтриране при понижено налягане с 2 g памучна вата, поставена в тръба-удължител.

4.   СТАНДАРТЕН МЕТОД

4.1.   Апаратура

Обикновена лабораторна апаратура, а именно:

4.1.1.   Пикнометър (1) от стъкло Pyrex с вместимост приблизително 100 ml, с подвижен термометър, прикрепен чрез съединителен елемент от шлифовано стъкло, калибриран в десети от градуса в интервала от 10 °C до 30 °C. Термометърът трябва да бъде проверен (фигура 1).

Image

Пикнометърът има странична тръба с дължина 25 mm и максимален вътрешен диаметър 1 mm, завършваща с конична шлифована част. Върху тази странична тръба може да бъде поставена резервоарна пробка, състояща се от конична тръба с шлифована повърхност и със стесняващ се край. Пробката служи за разширителна камера.

Двете шлифовани повърхности на апарата трябва да бъдат изготвени много грижливо.

4.1.2.   Тегловно шише със същия външен обем (с точност до 1 ml) като този на пикнометъра и с маса, равна на масата на пикнометъра, напълнен с течност с плътност 1,01 (разтвор на натриев хлорид 2,0 % (m/V).

Кожух с термоизолация, който пасва точно към тялото на пикнометъра.

4.1.3.   Двублюдни везни с обхват поне 300 g и с чувствителност десета от милиграма,

или

везни с едно блюдо с обхват най-малко 200 g и с чувствителност десета от милиграма.

4.2.   Калибриране на пикнометъра

Пикнометърът се калибрира чрез определяне на следните параметри:

| — | масата на празния пикнометър, |
| --- | --- |

—

масата на празния пикнометър,

| — | обема при температура 20 °C, |
| --- | --- |

—

обема при температура 20 °C,

| — | масата на пълния с вода пикнометър при температура 20 °C. |
| --- | --- |

—

масата на пълния с вода пикнометър при температура 20 °C.

4.2.1.   Метод с използване на везни с едно блюдо

При тегловно шише, поставено върху лявото блюдо на везните и чист и сух пикнометър с прикрепена резервоарна пробка — върху дясното блюдо, добавяйте теглилки от страната на пикнометъра до постигане на равновесие: С p се означава теглото в грамове.

Напълнете грижливо пикнометъра с дестилирана вода със стайна температура и поставете термометъра; избършете грижливо пикнометъра и го поставете в термоизолиращия кожух; разбъркайте, като обръщате съда, докато показанията на термометъра станат постоянни. Напълнете точно до нивото на горния ръб на страничната тръба. Подсушете страничната тръба и поставете резервоарната пробка; отчетете внимателно температурата t°C и ако е необходимо, я коригирайте според неточността на скалата на термометъра. Претеглете пълния с вода пикнометър, като p′ е масата, при която се постига равновесие.

Изчисления

| | Масата на празния пикнометър:
  Масата на празния пикнометър= p + m
  m= масата на съдържащия се в пикнометъра въздух
  m= 0,0012 (p – p′). |
| --- | --- |

Масата на празния пикнометър:

Масата на празния пикнометър= p + m

m= масата на съдържащия се в пикнометъра въздух

m= 0,0012 (p – p′).

| | Обем при температура 20 °C:
  V20 °C= (p + m – p′) × Ft

  Ft= коефициент, който се взема от таблица I за температура t °C.
  V20 °C трябва да се знае с точност до ± 0,001 ml. |
| --- | --- |

Обем при температура 20 °C:

V20 °C= (p + m – p′) × Ft

Ft= коефициент, който се взема от таблица I за температура t °C.

V20 °C трябва да се знае с точност до ± 0,001 ml.

| | Маса на водата при температура 20 °C:
  M20 °C= V20 °C × 0,998203
  0,998203= плътността на водата при температура 20 °C. |
| --- | --- |

Маса на водата при температура 20 °C:

M20 °C= V20 °C × 0,998203

0,998203= плътността на водата при температура 20 °C.

4.2.2.   Метод с използване на везни с едно блюдо

Определете:

| — | масата на почистения и подсушен пикнометър: P |
| --- | --- |

—

масата на почистения и подсушен пикнометър: P

| — | масата на пълния с вода пикнометър при t°C: P1, като следвате указанията, дадени в точка 4.2.1 |
| --- | --- |

—

масата на пълния с вода пикнометър при t°C: P1, като следвате указанията, дадени в точка 4.2.1

| — | масата на тегловното шише T0. |
| --- | --- |

—

масата на тегловното шише T0.

Изчисления

Масата на празния пикнометър:

| | Масата в празно състояние= P – m
  m= масата на съдържащия се в пикнометъра въздух
  m= 0,0012 (P1 – P) |
| --- | --- |

Масата в празно състояние= P – m

m= масата на съдържащия се в пикнометъра въздух

m= 0,0012 (P1 – P)

| | Обемът при температура 20 °C:
  V20 °C= [P1 – (P – m)] × Ft

  Ft= коефициент, който се взема от таблица I за температура t °C. |
| --- | --- |

Обемът при температура 20 °C:

V20 °C= [P1 – (P – m)] × Ft

Ft= коефициент, който се взема от таблица I за температура t °C.

| | Обемът при температура 20 °C трябва да се знае с точност до ± 0,001 ml. |
| --- | --- |

Обемът при температура 20 °C трябва да се знае с точност до ± 0,001 ml.

| | Маса на водата при температура 20 °C:
  M20 °C= V20 °C × 0,998203
  0,998203= плътността на водата при температура 20 °C |
| --- | --- |

Маса на водата при температура 20 °C:

M20 °C= V20 °C × 0,998203

0,998203= плътността на водата при температура 20 °C

4.3.   Метод на измерване

4.3.1.   Метод с използване на везни с едно блюдо

Претеглете пикнометъра, пълен с подготвената за анализ проба (точка 3), като следвате указанията, дадени в точка 4.2.2.

p′′ е масата в грамове, при която се постига равновесие при температура t °C.

Масата на съдържащата се в пикнометъра течност е p + m – p′′

Определената за температура t °C плътност е:

ρt °C = (p + m – p′′)/V20 °C

Изчислете плътността при температура 20 °C, като се използват дадените корекционни таблици според естеството на изследваната течност: сухо вино (таблица II), естествена или концентрирана мъст (таблица III), сладко вино (таблица IV).

Относителната плътност на виното за 20 °C/20 °C се изчислява, като плътността на виното при температура 20 °C се раздели на 0,998203.

4.3.2.   Метод с използване на везни с едно блюдо

Претеглете тегловното шише, като T1 е масата му

Изчислете dT = T1 – T0

Масата на празния пикнометър по време на измерването е P – m + dT

Претеглете пикнометъра, пълен с подготвената за анализ проба (точка 3), като следвате указанията, дадени в точка 4.2.1. Неговата маса при температура t °C е P2.

Масата на течността в пикнометъра при t °C е P2 – (P – m + dT)

Определената за температура t °C плътност е:

ρt °C = (P2 – (P – m + dT)/(V20 °C)

Изчислете плътността на изследваната течност при температура 20 °C: сухо вино, естествена или концентрирана мъст, сладко вино, както е указано в точка 4.3.1.

Относителната плътност при температура 20 °C/20 °C се изчислява, като плътността при температура 20 °C се раздели на 0,998203.

4.3.3.   Повторяемост на измерванията за плътност:

за сухи и полусладки вина: r = 0,00010

за сладки вина: r = 0,00018

4.3.4.   Повтаряемост на измерванията за плътност:

за сухи и полусладки вина: R = 0,00037

за сладки вина: R = 0,00045

ТАБЛИЦА I

Коефициент F

с който се умножава масата на водата в пикнометър от стъкло Pyrex, измерена при t °C, за да се изчисли обемът на пикнометъра при температура 20 °C

[Вижте таблица I от приложение II към метода AS2-01, описан в Сборника с международните методи за анализ на OIV]

ТАБЛИЦА II

Температурна корекция (c) на плътността на сухо вино и обезалкохолено вино, измерена в пикнометър от стъкло Pyrex при t °C, за да бъде приведен резултатът към температура 20 °C

[Вижте таблица II от приложение II към метода AS2-01, описан в Сборника с международните методи за анализ на OIV]

| ρ20 = ρ
  t
  ± (c/1 000) | – ако t°C е по-ниска от 20 °C
  - ако t°C е по-висока от 20 °C |
| --- | --- |

ρ20 = ρ
  t
  ± (c/1 000)

– ако t°C е по-ниска от 20 °C

- ако t°C е по-висока от 20 °C

ТАБЛИЦА III

Температурна корекция (c) на плътността на естествена и концентрирана мъст, измерена с пикнометър от стъкло Pyrex при t °C, за привеждане на резултата към температура 20 oC

[Вижте таблица III от приложение II към метода AS2-01, описан в Сборника с международните методи за анализ на OIV]

| ρ20 = ρ
  t
  ± (c/1 000) | – ако t°C е по-ниска от 20 °C
  - ако t°C е по-висока от 20 °C |
| --- | --- |

ρ20 = ρ
  t
  ± (c/1 000)

– ако t°C е по-ниска от 20 °C

- ако t°C е по-висока от 20 °C

ТАБЛИЦА IV

Температурна корекция (с) на плътността на вина с остатъчна захар с алкохолно съдържание, по-голямо или равно на 13 об. %, измерена с пикнометър от стъкло Pyrex при t °C, за привеждане на резултата към температура 20 °C

[Вижте таблица IV от приложение II към метода AS2-01, описан в Сборника с международните методи за анализ на OIV]

| ρ20 = ρ
  t
  ± (c/1 000) | - ако t°C е по-ниска от 20 °C
  - ако t°C е по-висока от 20 °C |
| --- | --- |

ρ20 = ρ
  t
  ± (c/1 000)

- ако t°C е по-ниска от 20 °C

- ако t°C е по-висока от 20 °C

2.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СЪДЪРЖАНИЕТО НА ЗАХАР В МЪСТ, КОНЦЕНТРИРАНА МЪСТ И РЕКТИФИЦИРАНА ГРОЗДОВА МЪСТ ЧРЕЗ РЕФРАКТОМЕТРИЯ (OIV - AS2 - 02- SUCREF) — МЕТОД ТИП I

1.   ПРИНЦИП НА МЕТОДА

Коефициентът на пречупване при температура 20 °C, изразен като абсолютна стойност или като масов процент захароза, е даден в съответната таблица с цел да се определи съдържанието на захар в грамове на литър и в грамове на килограм за мъст, концентрирана мъст и ректифицирана концентрирана гроздова мъст.

2.   АПАРАТУРА

2.1.   Рефрактометър на Abbé

Използваният рефрактометър трябва да има скала, по която да се отчитат:

| — | масовите проценти захароза с точност до 0,1 % или |
| --- | --- |

—

масовите проценти захароза с точност до 0,1 % или

| — | коефициентите на пречупване с точност до четвъртия знак след десетичната запетая. |
| --- | --- |

—

коефициентите на пречупване с точност до четвъртия знак след десетичната запетая.

Рефрактометърът трябва да е снабден с термометър, чиято скала обхваща поне интервала от + 15 °C до + 25 °C, както и с приспособление за циркулиране на водата, което дава възможност за провеждането на измервания при температура 20 °C (± 5 °C).

Инструкциите за работа с този апарат трябва да бъдат строго спазвани особено по отношение на калибрирането и светлинния източник.

3.   ПРИГОТВЯНЕ НА ПРОБАТА

3.1   Мъст и концентрирана мъст

Прекарайте мъстта през суха, прегъната на четири марля и след отстраняването на първите капки от филтрата извършете определянето върху филтрата.

3.2   Ректифицирана и концентрирана мъст

В зависимост от концентрацията се използва или ректифицирана концентрирана мъст, или разтвор, получен чрез разреждане с вода на точно претеглени 200 g ректифицирана концентрирана мъст до 500 g.

4.   МЕТОДИКА

Температурата на пробата се довежда до около 20 °C. Върху долната призма на рефрактометъра се поставя малка проба за анализ, като тъй като призмите са плътно притиснати една към друга, се внимава пробата да покрива равномерно повърхността на стъклото. Измерването се извършва съгласно инструкциите за работа с използвания уред.

Отчитат се масовите проценти захароза с точност до 0,1 % или се определя коефициентът на пречупване до четвъртия знак след запетаята.

Върху една и съща подготвена за анализ проба се провеждат най-малко две определения. Снема се t °C.

5.   ИЗЧИСЛЕНИЯ

5.1.   Температурна корекция

5.1.1.   Уреди, градуирани в масови проценти захароза: за корекция на температурата се използва таблица I.

5.1.2.   Уреди, градуирани в коефициенти на пречупване; коефициентът, измерен при t °C, се намира от таблица II, за да се получи (графа 1) съответната стойност за масовите проценти захароза при t °C. Тази стойност се коригира в зависимост от температурата и се привежда към 20 °C посредством таблица I.

5.2.   Съдържание на захар в мъст и концентрирана мъст

От таблица II се определят масовите проценти захароза при температура 20 °C, за да се получи съдържанието на захар в грамове на литър и грамове на килограм. Съдържанието на захари се изразява като инвертна захар с точност да първия знак след запетаята.

5.3.   Съдържание на захар в ректифицирана концентрирана мъст

От таблица II се определят масовите проценти захароза при температура 20 °C, за да се получи съдържанието на захар в грамове на литър и грамове на килограм. Съдържанието на захар се изразява като инвертна захар с точност да първия знак след запетаята.

Ако измерването е извършено върху разредена ректифицирана концентрирана мъст, полученият резултат се умножава по коефициента на разреждане.

5.4   Коефициент на пречупване за мъст, концентрирана мъст и ректифицирана концентрирана мъст

От таблица II се определят масовите проценти захароза при 20 °C, за да се определи коефициентът на пречупване при 20 °C. Този коефициент се дава с четири знака след запетаята.

Забележка: Потенциалното алкохолно съдържание на мъст, концентрирана мъст и ректифицирана концентрирана мъст, може да бъде определено по таблицата за съответствие, дадена в приложение I към Регламент (ЕО) No 1623/2000 на Комисията от 25 юли 2000 г. (ОВ L 194 от 31 юли 2000 г.)

ТАБЛИЦА I

Корекция, която следва да се направи, когато тегловното съдържание на захарозата в проценти е определено при температура, различна от 20 °C

[Вижте таблица I от приложението към метода AS2-02, описан в Сборника с международните методи за анализ на OIV]

ТАБЛИЦА II

Таблица, в която е дадено съдържанието на захар в мъст и концентрирана мъст в грамове на литър и грамове на килограм, определено с рефрактометър, градуиран или в тегловни проценти захароза при 20 °C или в коефициенти на пречупване при 20 °C. Дадена е съответно и плътността при 20 °C.

[Вижте таблица II от приложението към метода AS2-02, описан в Сборника с международните методи за анализ на OIV]

ТАБЛИЦА III

Таблица, в която е дадено съдържанието на захар в ректифицирана концентрирана мъст в грамове на литър и в грамове на килограм, определено с рефрактометър, градуиран в тегловни проценти захароза при 20 °C или в коефициенти на пречупване при 20 °C. Дадена е съответно и плътността при 20 °C.

[Вижте таблица III от приложението към метода AS2-02, описан в Сборника с международните методи за анализ на OIV]

3.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ОБЩИЯ СУХ ЕКСТРАКТ (OIV-AS-2-03-EXTSEC) ОБЩО СУХО ВЕЩЕСТВО — МЕТОД ТИП I

1.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Общият сух екстракт или общото сухо вещество включва цялото количество вещества, които при определени физически условия са нелетливи. Тези условия трябва да бъдат определени така, че веществата, които съставляват екстракта, да претърпяват минимални изменения при теста.

Беззахарният екстракт е разликата между общия сух екстракт и общото количество захар.

Редуцираният екстракт е общият сух екстракт минус общата захар, надхвърляща 1 g/l, минус калиевия сулфат над 1 g/l, без евентуалното съдържание на манитол, ако има, и без всякакви други химически вещества, които е възможно да са били добавени към виното.

Остатъчният екстракт е разликата между беззахарния екстракт и измерената постоянна киселинност, изразена като винена киселина.

Екстрактът се изразява в грамове на литър с точност до 0,5 g.

2.   ПРИНЦИП НА МЕТОДА

[Описанието на този метод за анализ е предмет на актуализиране от органите на OIV. То ще бъде публикувано в следващо Съобщение на Комисията, щом OIV публикува актуализиран текст в изданието за 2010 г. на „Сборника с международните методи за анализ“ на OIV. В очакване на това публикуване, може информативно да се прави справка с глава 4 от приложението към Регламент (ЕИО) No 2676/90 на Комисията]

4   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ИЗОТОПНОТО ОТНОШЕНИЕ 18O/16O НА ВОДАТА НА ВИНОТО (OIV-AS-2-09-MOUO18) — МЕТОД ТИП II

(pro memoria)

[Описанието на този метод за анализ е предмет на актуализиране от органите на OIV. То ще бъде публикувано в следващо Съобщение на Комисията, щом OIV публикува актуализиран текст в изданието за 2010 г. на „Сборника с международните методи за анализ“ на OIV. В очакване на това публикуване, може информативно да се прави справка с глава 43 от приложението към Регламент (ЕИО) No 2676/90 на Комисията]

5   ОПРЕДЕЛЯ ИНДЕКСА НА ФОЛИН-ЧИКАЛТЕУ (OIV-AS-2-10-INDFOL) — МЕТОД ТИП IV

1.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Индексът на Фолин-Чикалтеу се получава при прилагането на долуописания метод.

2.   ПРИНЦИП

Всички фенолни съединения, съдържащи се във виното, се окисляват в присъствието на реагента на Фолин-Чикалтеу. Този реагент се състои от смес на фосфорно-волфрамова киселина (H3PW12O40) и фосфорно-молибденова киселина (H3РМo12O40), която при окисляване на фенолите се редуцира до смес от сини окиси на волфрама (W8O23) и молибдена (Mo8O23).

Полученото синьо оцветяване има максимално поглъщане за дължина на вълната около 750 nm. То е пропорционално на съдържанието на фенолни съединения.

3.   РЕАКТИВИ

Реагентите трябва да бъдат с чистота, подходяща за аналитични цели. Използваната вода трябва да е дестилирана или да бъде вода с еквивалентна чистота.

3.1.   Реагент на Фолин-Чикалтеу

Този реагент се предлага в готов вид в търговската мрежа. Може да бъде приготвен се по следния начин: в 700 ml дестилирана вода се разтварят 100 g натриев волфрамат (Na2WO4·2H2O) и 25 g натриев молибдат (Na2MoO4·2H2O); Добавят се 50 ml 85 %-на фосфорна киселина (ρ20 = 1,71 g/ml) и 100 ml концентрирана солна киселина (ρ20 = 1,19 g/ml). Разтворът се довежда до кипене и се оставя да ври под обратен хладилник в продължение на 10 часа, след което към него се прибавят 150 g литиев сулфат (Li2SO4·Н2O) и няколко капки бром. Довежда се отново до кипене в продължение на 15 минути. Охлажда се и се долива с дестилирана вода до един литър.

3.2.   Безводен натриев карбонат (Na2CO3) под формата на разтвор 20 % (m/v).

4.   АПАРАТУРА

Обикновена лабораторна апаратура, а именно:

4.1.   Мерителни колби с обем 100 ml.

4.2.   Спектрофотометър, позволяващ работа при дължина на вълната 750 nm.

5.   МЕТОДИКА

5.1.   Червени вина

Като се спазва строго следната последователност, в мерителна колба от 100 ml (точка 4.1) се прехвърлят:

| | 1 ml вино, предварително разредено в съотношение 1:5 |
| --- | --- |

1 ml вино, предварително разредено в съотношение 1:5

| | 50 ml дестилирана вода; |
| --- | --- |

50 ml дестилирана вода;

| | 5 ml реагент на Фолин-Чикалтеу (точка 3.1); |
| --- | --- |

5 ml реагент на Фолин-Чикалтеу (точка 3.1);

| | 20 ml разтвор на натриев карбонат (точка 3.2). |
| --- | --- |

20 ml разтвор на натриев карбонат (точка 3.2).

Допълва се с дестилирана вода до 100 ml.

Хомогенизира се с разклащане. Изчаква се 30 минути, докато се стабилизира реакцията. Определя се оптичната плътност за 750 nm в кювета с дължина на оптичния път един сантиметър спрямо празна проба, приготвена с дестилирана вода вместо вино.

Ако оптичната плътност не е близка до 0,3, пробата се разрежда до подходящо съотношение.

5.2.   Бели вина

Прилага се същият начин на работа, като в пробата се поставя 1 ml неразредено вино.

5.3.   Ректифицирана концентрирана гроздова мъст

5.3.1.   Приготвяне на пробата

Използва се разтворът с концентрация на захар 25 тегловни % (25° по Брикс), приготвен по начина, описан в глава „Определяне на pH“, точка 4.1.2.

5.3.2.   Измерване

Процедира се по начина, описан за червеното вино (точка 5.1), като се използва проба от 5 ml съгласно указанията в точка 5.3.1 и като се измерва оптичната плътност спрямо празна проба, приготвена от 5 ml разтвор на инвертна захар с концентрация 25 тегловни %.

6.   ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

6.1.   Метод на изчисляване

Резултатът се изразява като показател, получен чрез умножаване на оптичната плътност по 100 за червените вина, разредени до съотношение 1/5 (или по коефициента, съответстващ на използваното разреждане) и по 20 за белите вина. За ректифицираната концентрирана мъст резултатът се умножава по 16.

6.2.   Повтаряемост

Разликата между резултатите от две определяния, извършени едновременно или веднага едно след друго от един и същ лаборант-химик, не трябва да е по-голяма от единица.

Добра повторяемост на резултатите се постига с изключително чиста апаратура (мерителни колби и спектрофотометрични кювети).

6   ГЛЮКОЗА И ФРУКТОЗА (OIV-AS-311-02-GLUFRU) — МЕТОД ТИП II

1.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Глюкозата и фруктозата могат да бъдат дозирани поотделно по ензимен метод само с оглед изчисляването на съотношението глюкоза/фруктоза.

2.   ПРИНЦИП

Глюкозата и фруктозата се фосфорилират от аденозинтрифосфат (ATP) по време на ензимна реакция с катализатор хексокиназа (HK), в резултат на което се получават глюкозо-6-фосфат (G6P) и фруктозо-6-фосфат (F6P):

| | глюкоза + ATP←→G6P + ADP |
| --- | --- |

глюкоза + ATP←→G6P + ADP

| | фруктоза + ATP←→F6P + ADP |
| --- | --- |

фруктоза + ATP←→F6P + ADP

Глюкозо-6-фосфатът първо се окислява до глюконат-6-фосфат от никотинамид-аденин-динуклеотид фосфат (NADP) в присъствието на ензима глюкозо-6-фосфат дехидрогеназа (G6PGH). Полученото количество редуциран никотинамид-аденин-динуклеотид-фосфат (NADP) съответства на количеството глюкозо-6-фосфат (G6P), а следователно и на съдържанието на глюкоза.

G6P + NADP+←→глюконат 6-фосфат + NADPH + H+

Редуцираният никотинамид-аденин-динуклеотид-фосфат се определя количествено от поглъщането му за 340 nm.

В края на тази реакция фруктозо-6-фосфатът се превръща в глюкозо-6-фосфат вследствие действието на фосфоглюкозо-изомеразата (PGI):

F6P←→G6P

Глюкоза 6-фосфатът влиза отново в реакция с никотинамид-аденин-динуклеотид-фосфата, в резултат на което се получава глюконат-6-фосфат и редуциран никотинамид-аденин-динуклеотид-фосфат, след което се извършва количествено определяне на последния.

3.   АПАРАТУРА

| — | Спектрофотометър, позволяващ извършването на измервания при 340 nm, т.е. при максимума на поглъщането от NADPH. Тъй като става въпрос за абсолютни стойности (не се използват еталонни криви, а се използва екстинкционният коефициент на NADPH), скалите за дължината на вълната и за коефициентите на поглъщане за тази апаратура трябва да се контролират.
  Когато това не е възможно, може да се използва спектрофотометър с дискретен спектър, позволяващ извършването на измерванията при дължина на вълната от 334 nm или 365 nm. |
| --- | --- |

—

Спектрофотометър, позволяващ извършването на измервания при 340 nm, т.е. при максимума на поглъщането от NADPH. Тъй като става въпрос за абсолютни стойности (не се използват еталонни криви, а се използва екстинкционният коефициент на NADPH), скалите за дължината на вълната и за коефициентите на поглъщане за тази апаратура трябва да се контролират.

Когато това не е възможно, може да се използва спектрофотометър с дискретен спектър, позволяващ извършването на измерванията при дължина на вълната от 334 nm или 365 nm.

| — | Стъклени кювети с оптичен път 1 cm или кювети за еднократна употреба. |
| --- | --- |

—

Стъклени кювети с оптичен път 1 cm или кювети за еднократна употреба.

| — | Пипети за работа с разтвори за ензимни анализи от 0,02 ml - 0,05 ml - 0,1 ml - 0,2 ml. |
| --- | --- |

—

Пипети за работа с разтвори за ензимни анализи от 0,02 ml - 0,05 ml - 0,1 ml - 0,2 ml.

4.   РЕАГЕНТИ

4.1.   Разтвор 1: буферен разтвор (триетаноламин 0,3 M, pH = 7,6; 4 × 10–3 M в Mg2+): разтварят се 11,2 g триетаноламинов хлорхидрат ((C2H5)3N НСl) и 0,2 g (MgSO4·7H2O) в 150 ml двойнодестилирана вода; добавят се около 4 ml разтвор на 5M натриев хидроокис (NaOH) за получаването на pH 7,6 и се долива вода до 200 ml.

Този буферен разтвор се съхранява 4 седмици при температура + 4 °C.

4.2.   Разтвор 2: разтвор на никотинамид-аденин-динуклеотид-фосфат (около 11,5×10–3 M): Разтварят се 50 mg динатриев никотинамид-аденин-динуклеотид-фосфат в 5 ml двойнодестилирана вода.

Този разтвор се съхранява в продължение на 4 седмици при + 4 °C.

4.3.   Разтвор 3: разтвор на аденозин-5′-трифосфат (около 81 × 10–3 M): Разтварят се 250 mg динатриев аденозин-5′-трифосфат и 250 mg натриев хидрогенкарбонат (NaHCO3) в 5 ml двойнодестилирана вода.

Този разтворът се съхранява 4 седмици при + 4 °C.

4.4.   Разтвор 4: хексокиназа/глюкозо-6-фосфат-дехидрогеназа: Смесват се 0,5 ml хексокиназа (2 mg протеин/ml или 280 U/ml) и 0,5 ml глюкозо-6-фосфат-дехидрогеназа (1 mg протеин/ml).

Този разтвор се съхранява в продължение на една година при + 4 °C.

4.5.   Разтвор 5: фосфоглюкозо-изомераза (2 mg протеин/ml или 700 U/ml). Суспензията се използва без разреждане.

Този разтвор може да се съхранява в продължение на една година при + 4 °C.

Забележка:

Всички необходими за това определяне реагенти се предлагат в търговската мрежа.

5.   МЕТОДИКА

5.1.   Приготвяне на пробата

В зависимост от количеството глюкоза + фруктоза на литър пробата се разрежда, както следва:

| Измерване при 340 nm и 334 nm | Измерване при 365 nm | Разреждане с вода | Коефициент F на разреждане |
| --- | --- | --- | --- |
| до 0,4 g/l | 0,8 g/l | — | — |
| до 4,0 g/l | 8,0 g/l | 1 + 9 | 10 |
| до 10,0 g/l | 20,0 g/l | 1 + 24 | 25 |
| до 20,0 g/l | 40,0 g/l | 1 + 49 | 50 |
| до 40,0 g/l | 80,0 g/l | 1 + 99 | 100 |
| над 40,0 g/l | над 80,0 g/l | 1 + 999 | 1 000 |

Измерване при 340 nm и 334 nm

Измерване при 365 nm

Разреждане с вода

Коефициент F на разреждане

до 0,4 g/l

0,8 g/l

—

—

до 4,0 g/l

8,0 g/l

1 + 9

10

до 10,0 g/l

20,0 g/l

1 + 24

25

до 20,0 g/l

40,0 g/l

1 + 49

50

до 40,0 g/l

80,0 g/l

1 + 99

100

над 40,0 g/l

над 80,0 g/l

1 + 999

1 000

5.2.   Количествено определяне

При спектрофотометър, настроен за дължина на вълната 340 nm, се извършват измервания спрямо въздух (без кювети в оптичния път) или спрямо вода като еталони.

Температурата е между 20 и 25 °C.

В две кювети с дължина на оптичния път 1 cm се поставят:

| | Празна проба | Определяне |
| --- | --- | --- |
| Разтвор 1 (4.1) (с температура 20 °C) | 2,50 ml | 2,50 ml |
| Разтвор 2 (4.2) | 0,10 ml | 0,10 ml |
| Разтвор 3 (4.3) | 0,10 ml | 0,10 ml |
| Проба за измерване | | 0,20 ml |
| Двойнодестилирана вода | 0,20 ml | |

Празна проба

Определяне

Разтвор 1 (4.1) (с температура 20 °C)

2,50 ml

2,50 ml

Разтвор 2 (4.2)

0,10 ml

0,10 ml

Разтвор 3 (4.3)

0,10 ml

0,10 ml

Проба за измерване

0,20 ml

Двойнодестилирана вода

0,20 ml

Приготвят се смесите и след около три минути се отчита оптичната плътност (A1) на разтворите. Започва се реакция чрез добавяне на:

| Разтвор 4 (4.4) | 0,02 ml | 0,02 ml |
| --- | --- | --- |

Разтвор 4 (4.4)

0,02 ml

0,02 ml

Сместа се разбърква; изчаква се 15 минути; извършва се измерването на оптичната плътност и след още две минути се проверява дали реакцията е приключила (A2).

Веднага се добавя:

| Разтвор 5 (4.5) | 0,02 ml | 0,02 ml |
| --- | --- | --- |

Разтвор 5 (4.5)

0,02 ml

0,02 ml

Разбърква се и след 10 минути се прави отчитането; След още две минути се проверява дали реакцията е приключила (A3).

Изчисляват се разликите между оптичните плътности:

| | A2 – A1 съответства на глюкоза, |
| --- | --- |

A2 – A1 съответства на глюкоза,

| | A3 – A2 съответства на фруктоза, |
| --- | --- |

A3 – A2 съответства на фруктоза,

за празната (еталонната) проба и аналитичната проба:

Определя се разликата в оптичните плътности за еталонната проба (ΔАT) и за аналитичната проба (ΔАD), както следва:

| | за глюкоза: ΔАG = ΔАD – ΔАT |
| --- | --- |

за глюкоза: ΔАG = ΔАD – ΔАT

| | за фруктоза: ΔАF = ΔАD – ΔАT |
| --- | --- |

за фруктоза: ΔАF = ΔАD – ΔАT

Забележка:

Времето, необходимо за действието на ензимите, може да варира от партида на партида. Посочената по-горе стойност е само примерна. Препоръчва се тя да бъде определяна за всяка отделна партида

5.3.   Изразяване на резултатите

5.3.1.   Изчисляване

Общата формула за изчисляване на концентрациите е:

C= ((V × PM)/(ε × d × v × 1 000)) × ΔА (g/l)

V= обем на разтвора за анализ (ml);

v= обем на пробата (ml);

PM= молекулно тегло на веществото, подложено на анализ;

d= оптичен път на кюветите (cm);

ε= коефициент на поглъщане на NADPH при 340 nm = 6,3 (mmol–1 × l × cm–1);

V= 2,92 ml за определяне на глюкоза;

V= 2,94 ml за определяне на фруктоза;

v= 0,20 ml

PM= 180

d= 1.

получаваме:

| | за глюкоза: C (g/l) = 0,417 × ΔАG |
| --- | --- |

за глюкоза: C (g/l) = 0,417 × ΔАG

| | за фруктоза: C (g/l)= 0,420 × ΔАF |
| --- | --- |

за фруктоза: C (g/l)= 0,420 × ΔАF

В случай че пробата е била разредена, резултатът се умножава с коефициента на разреждане F.

Забележка:

За измервания, проведени при дължина на вълната 334 nm или 365 nm, са валидни следните изрази:

| — | измерване при 334 nm: ε = 6,2 (mmol–1 × l × cm–1)
  за глюкоза: C (g/l) = 0,425 × ΔАG

  за фруктоза: C (g/l) = 0,428 × ΔАF |
| --- | --- |

—

измерване при 334 nm: ε = 6,2 (mmol–1 × l × cm–1)

за глюкоза: C (g/l) = 0,425 × ΔАG

за фруктоза: C (g/l) = 0,428 × ΔАF

| — | измерване при 365 nm: ε = 3,4 (mmol–1 × l × cm–1)
  за глюкоза: C (g/l) = 0,773 × ΔАG

  за фруктоза: C (g/l) = 0,778 × ΔАF |
| --- | --- |

—

измерване при 365 nm: ε = 3,4 (mmol–1 × l × cm–1)

за глюкоза: C (g/l) = 0,773 × ΔАG

за фруктоза: C (g/l) = 0,778 × ΔАF

5.3.2.   Повторяемост (r)

R= 0,056 xi

5.3.3.   Възпроизводимост (R)

R= 0,12 + 0,076 xi

xi= съдържание на глюкоза или фруктоза в грамове на литър (g/l).

7   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ЗАХАРТА ЧРЕЗ ВИСОКОЕФЕКТИВНА ТЕЧНОСТНА ХРОМАТОГРАФИЯ (ЗАХАРОЗА) (OIV-AS-311-03-SUCRES) — МЕТОД ТИП II

(pro memoria)

[Описанията на тези методи за анализ са предмет на актуализиране от органите на OIV. Те ще бъдат публикувани в следващо Съобщение на Комисията, щом OIV публикува актуализиран текст в изданието за 2010 г. на „Сборника с международните методи за анализ“ на OIV. В очакване на това публикуване, може информативно да се прави справка с глава 6, параграф 3 от приложението към Регламент (ЕИО) No 2676/90 на Комисията.]

8   ОТКРИВАНЕ НА ОБОГАТИТЕЛНИ ДОБАВКИ В ГРОЗДОВА МЪСТ, КОНЦЕНТРИРАНА ГРОЗДОВА МЪСТ, РЕКТИФИЦИРАНА КОНЦЕНТРИРАНА МЪСТ И ВЪВ ВИНА С ПОМОЩТА НА ЯДРЕНО-МАГНИТЕН РЕЗОНАНС НА ДЕУТЕРИЙ (OIV-AS-311-05-ENRRMN) — МЕТОД ТИП I

(pro memoria)

[Описанието на този метод за анализ е предмет на преразглеждане от научните органи на OIV. То ще бъде публикувано в Съобщение на Комисията, щом Общото събрание на OIV приеме окончателния текст. В очакване на това публикуване, може информативно да се прави справка с глава 8 от приложението към Регламент (ЕИО) No 2676/90 на Комисията.]

9   АЛКОХОЛНО СЪДЪРЖАНИЕ В ОБЕМНИ ПРОЦЕНТИ (OIV-AS-312-01-TALVOL) — МЕТОДИ ТИП I

(pro memoria)

[Описанието на този метод за анализ е предмет на актуализиране от органите на OIV. То ще бъде публикувано в следващо Съобщение на Комисията, щом OIV публикува актуализиран текст в изданието за 2010 г. на „Сборника с международните методи за анализ“ на OIV. В очакване на това публикуване, може информативно да се прави справка с глава 3 от приложението към Регламент (ЕИО) No 2676/90 на Комисията.]

10   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ИЗОТОПНОТО ОТНОШЕНИЕ 13C/12C ЧРЕЗ МАС-СПЕКТРОМЕТРИЯ НА ЕТАНОЛА НА ВИНОТО ИЛИ НА ЕТАНОЛА, ПОЛУЧЕН ЧРЕЗ ФЕРМЕНТАЦИЯТА НА МЪСТ, КОНЦЕНТРИРАНА МЪСТ И РЕКТИФИЦИРАНА КОНЦЕНТРИРАНА ГРОЗДОВА МЪСТ (OIV-AS-312-06-ETHANO) — МЕТОД ТИП II

1.   ОБЛАСТ НА ПРИЛОЖЕНИЕ

Методът позволява измерване на отношението 13С/12С на етанола на виното и на етанола, получен след ферментацията на продукти от грозде (мъст, концентрирана мъст и ректифицирана концентрирана гроздова мъст).

2.   ДЕЙСТВАЩИ СТАНДАРТИ

| ISO: | 5725:1994 г. ‘Точност (вярност и точност) на методите за измерване - определяне на повторяемостта и възпроизводимостта на метод за измерване стандартизиран чрез междулабораторни измервания’. |
| --- | --- |
| V-PDB: | Виенски белемнит от геоложкото образувание Пи-Ди (Vienna-Pee-Dee Belemnite (RPDB = 0, 0112372)). |
| Метод OIV AS-311-O5-ENRRMN | „Определяне на обогатяването на мъст, концентрирана мъст, ректифицирана концентрирана мъст и на вина с помощта на ядрен магнитен резонанс на деутерий“. |

ISO:

5725:1994 г. ‘Точност (вярност и точност) на методите за измерване - определяне на повторяемостта и възпроизводимостта на метод за измерване стандартизиран чрез междулабораторни измервания’.

V-PDB:

Виенски белемнит от геоложкото образувание Пи-Ди (Vienna-Pee-Dee Belemnite (RPDB = 0, 0112372)).

Метод OIV AS-311-O5-ENRRMN

„Определяне на обогатяването на мъст, концентрирана мъст, ректифицирана концентрирана мъст и на вина с помощта на ядрен магнитен резонанс на деутерий“.

3.   ТЕРМИНИ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ

| 13C/12C | : | Съотношение на изотопите на въглерод 13 (13С) към въглерод 12 (12С) за дадена проба. |
| --- | --- | --- |
| δ13C | : | съдържание на въглерод 13 (13С), изразено в промили (‰). |
| NMR-SNIF | : | Естествено специфично разделение на изотопите, изследвано чрез ядрен магнитен резонанс. |
| V-PDB | : | Vienna-Pee-Dee Belemnite (Виенски белемнит от геоложкото образувание Пи-Ди) PDB, основният еталон за измерване на естествени отклонения на съдържанието на изотопа на въглерод 13, представлява калциев карбонат от стилет на белемнит от периода Креда на образуванието Pee-Dee в Южна Каролина (САЩ). Неговото изотопно отношение 13С/12С или RPDB e 0,0112372. Резервите от PDB са изчерпани отдавна, но той е останал като основен еталон за изразяване на естествените отклонения на съдържанието на изотопа на въглерод 13, спрямо който се калибрират сравнителните материали, с които разполага Международната агенция за атомна енергия (IAEA) във Виена (Австрия). Изотопните анализи на естественото съдържание на въглерод 13 следователно се изразяват, по уговорка, спрямо V-PDB. |
| m/z | : | Отношение маса къмто заряд. |

13C/12C

:

Съотношение на изотопите на въглерод 13 (13С) към въглерод 12 (12С) за дадена проба.

δ13C

:

съдържание на въглерод 13 (13С), изразено в промили (‰).

NMR-SNIF

:

Естествено специфично разделение на изотопите, изследвано чрез ядрен магнитен резонанс.

V-PDB

:

Vienna-Pee-Dee Belemnite (Виенски белемнит от геоложкото образувание Пи-Ди) PDB, основният еталон за измерване на естествени отклонения на съдържанието на изотопа на въглерод 13, представлява калциев карбонат от стилет на белемнит от периода Креда на образуванието Pee-Dee в Южна Каролина (САЩ). Неговото изотопно отношение 13С/12С или RPDB e 0,0112372. Резервите от PDB са изчерпани отдавна, но той е останал като основен еталон за изразяване на естествените отклонения на съдържанието на изотопа на въглерод 13, спрямо който се калибрират сравнителните материали, с които разполага Международната агенция за атомна енергия (IAEA) във Виена (Австрия). Изотопните анализи на естественото съдържание на въглерод 13 следователно се изразяват, по уговорка, спрямо V-PDB.

m/z

:

Отношение маса къмто заряд.

4.   ПРИНЦИП

По време на фотосинтеза приемането на въглероден двуокис от растенията става чрез две основни форми на метаболизъм, метаболизмът С3 (цикъл на Калвин) и метаболизмът С4 (Hatch и Slack). Тези два механизма за фотосинтеза са с различен вид изотопно разделение. Така например продуктите от растения С4, например захар и алкохол, получен чрез ферментация, имат по-високи нива на въглерод 13, отколкото подобни продукти от растения С3. Повечето растения, включително лозата и захарното цвекло, принадлежат към групата С3. Захарната тръстика и царевицата принадлежат към групата С4. Измерването на съдържанието на въглерод 13 позволява откриването и измерването на захарта от растения С4 (захарна тръстика или царевична изоглюкоза), прибавена към продуктите от грозде (гроздова мъст, вина и др.). Информацията за съдържанието на въглерод 13, комбинирана с получената чрез ядрен магнитен резонанс (NMR-SNIF), позволява да бъдат определени прибавените количества захарни или алкохолни смеси, получени от растения С3 и С4.

Съдържанието на въглерод 13 се определя чрез въглеродния двуокис, освободен при пълното изгаряне на пробата. Наличието на основни изотопомери с маси 44 (12С16О2), 45 (13С16О2 и 12С17О16О) и 46 (12С16О18О), получени от различни възможни комбинации на изотопите 18О, 17О, 16О, 13С и 12С, се определят от йонните токове, измерени на три различни приемника на изотопен мас-спектрометър. Приносите на изотопомерите 13C17O16O и 12C17O2 могат да бъдат пренебрегнати предвид техните ниски съдържания. Йонният ток за m/z = 45 се коригира за приноса на 12C17O16O, което се изчислява в зависимост от големината на тока, измерена за m/z = 46, докато се взимат предвид относителните дялове на 18О и 17О (поправка на Craig). Сравнението със сравнителен материал, калибриран спрямо международния еталон V-PDB, позволява изчисляването на съдържанието на въглерод 13 по относителната скала δ13С.

5.   РЕАГЕНТИ

Материалите и консумативите зависят от апаратурата (точка 6), използвана от лабораторията. Системите, които се използват обикновено, се основават на елементния анализатор. Той може да бъдат конструиран за внасяне на проби, поставени в запечатани метални капсули или инжектирането на течни проби чрез спринцовка през мембрана.

В зависимост от вида на използваните измервателни уреди могат да бъдат използвани следните сравнителни материали, реагенти и консумативи:

| — | сравнителни материали |
| --- | --- |

—

сравнителни материали

| — | на разположение от IAEA:







  Наименование | Материал | δ13C спрямо V-PDB (9) |
| --- | --- | --- | --- |
| — | IAEA-CH-6 |

—

на разположение от IAEA:

Наименование

Материал

δ13C спрямо V-PDB (9)

—

IAEA-CH-6

захароза

–10,4 ‰

| — | IAEA-CH-7 |
| --- | --- |

—

IAEA-CH-7

полиетилен

–31,8 ‰

| — | NBS22 |
| --- | --- |

—

NBS22

масло

–29,7 ‰

| — | USGS24 |
| --- | --- |

—

USGS24

графит

–16,1 ‰

| — | на разположение от Института за сравнителни материали и измервания (IRMM) в Геел (Белгия):







  Наименование | Материал | δ13C спрямо V-PDB (9) |
| --- | --- | --- | --- |
| — | CRM/BCR 656 |

—

на разположение от Института за сравнителни материали и измервания (IRMM) в Геел (Белгия):

Наименование

Материал

δ13C спрямо V-PDB (9)

—

CRM/BCR 656

винен алкохол

–26,93 ‰

| — | CRM/BCR 657 |
| --- | --- |

—

CRM/BCR 657

глюкоза

–10,75 ‰

| — | CRM/BCR 660 |
| --- | --- |

—

CRM/BCR 660

Водно-спиртен разтвор (TAV 12 %)

–26,72 ‰

| — | Стандартна работна проба с известно отношение 13С/12С, калибрирана спрямо международните сравнителни материали. |
| --- | --- |

—

Стандартна работна проба с известно отношение 13С/12С, калибрирана спрямо международните сравнителни материали.

| — | Указателният списък на консумативи по-долу е съставен за системите с постоянен поток:






  — | хелий за анализи (CAS 07440-59-7), |
| --- | --- | --- |

—

Указателният списък на консумативи по-долу е съставен за системите с постоянен поток:

—

хелий за анализи (CAS 07440-59-7),

| — | кислород за анализи (CAS 07782-44-7), |
| --- | --- |

—

кислород за анализи (CAS 07782-44-7),

| — | въглероден двуокис за анализ, използван като втори сравнителен газ за съдържанието на въглерод 13 (CAS 00124-38-9), |
| --- | --- |

—

въглероден двуокис за анализ, използван като втори сравнителен газ за съдържанието на въглерод 13 (CAS 00124-38-9),

| — | реагент за окисляване за пещта на системата за изгаряне, например окис на мед(II) за елементен анализ (CAS 1317-38-0), |
| --- | --- |

—

реагент за окисляване за пещта на системата за изгаряне, например окис на мед(II) за елементен анализ (CAS 1317-38-0),

| — | сикатив за отстраняване на водата, отделена при изгарянето, например анхидрон за елементен анализ (магнезиев перхлорат) (CAS 0034-81-8) (Това не е необходимо за уредите, оборудвани със система за отстраняване на водата чрез използване на криогенни уловители или на капилярка с избирателна пропускливост). |
| --- | --- |

—

сикатив за отстраняване на водата, отделена при изгарянето, например анхидрон за елементен анализ (магнезиев перхлорат) (CAS 0034-81-8) (Това не е необходимо за уредите, оборудвани със система за отстраняване на водата чрез използване на криогенни уловители или на капилярка с избирателна пропускливост).

6.   АПАРАТУРА И ОБОРУДВАНЕ

6.1.   Мас-спектрометър за определяне на изотопно отношение (IRMS)

Мас-спектрометър за определяне на изотопното отношение (IRMS), който може да определя относителното съдържание на 13С на газа СO2 с естествено разпространение, с вътрешна грешка 0,05 ‰ или по-малка, изразено като относителна стойност (точка 9). Вътрешната грешка в този случай се определя като разликата между две измервания на една и съща проба СО2. Мас-спектрометърът, предназначен за имерване на изотопните отношения по принцип е оборудван с тройно приемно устройство за едновременно измерване на токове за m/z = 44, 45 и 46. Мас-спектрометърът за определяне на изотопно отношение трябва или да бъде снабден с двоен вход, за да измерва последователно неизвестната проба и еталонната проба, или да използва интегрирана система, която извършва изгаряне на проби с точни количества и отделя въглеродния двуокис от другите продукти на горенето преди измерването в мас-спектрометъра.

6.2.   Апаратура за изгаряне

Апаратура за изгаряне, която може да преобразува точни количества етанол във въглероден двуокис и да отстранява всички други продукти за горенето, включително водата, без никакво изотопно разделение. Апаратурата може да бъде както система с постоянен поток, интегрирана в измервателния уред за мас-спектрометрия (точка 6.2.1), така и самостоятелна система за изгаряне (точка 6.2.2). Апаратурата трябва да позволява като минимум постигане на точност, която е еквивалентна на посочената в точка 11.

6.2.1.   Системи с постоянен поток

Те включват или елементен анализатор, или газов хроматограф със система за изгаряне в реално време.

За системите, конструирани за внасянето на проби, съхранявани в метални капсули, се използва следното лабораторно оборудване:

| — | микроспринцовка или микропипета с подходящи накрайници, |
| --- | --- |

—

микроспринцовка или микропипета с подходящи накрайници,

| — | везни с точност 1 μg или по-висока, |
| --- | --- |

—

везни с точност 1 μg или по-висока,

| — | пинцети за капсулиране, |
| --- | --- |

—

пинцети за капсулиране,

| — | калаени капсули за течни проби, |
| --- | --- |

—

калаени капсули за течни проби,

| — | калаени капсули за твърди проби. |
| --- | --- |

—

калаени капсули за твърди проби.

Забележка:

с цел намаляване на опасността от изпаряване на етанолните проби в капсулите може да бъде поставен абсорбиращ материал (например Chromosorb водопоглъщаемост 45-60 отвора/инч), който първо е бил проверен чрез измерване на празна проба за съдържание на значително количество въглерод, способно да повлияе на резултатите.

При използването на елементен анализатор, снабден с инжектор за течности или в случаите на система за подготвяне чрез хроматография-изгаряне, се използва следното лабораторно оборудване:

| — | спринцовка за течности, |
| --- | --- |

—

спринцовка за течности,

| — | колби, снабдени със системи за херметично затваряне и с инертни мембрани. |
| --- | --- |

—

колби, снабдени със системи за херметично затваряне и с инертни мембрани.

Лабораторното оборудване, посочено в списъците по-горе е примерно и може да бъде заменено с друго оборудване със същите възможности в зависимост от вида на апаратурата за изгаряне и мас-спектрометрия, използвани от лабораторията.

6.2.2.   Самостоятелни системи за подготовка

В този случай пробите на въглероден двуокис, получен от изгарянето на пробите, които ще се анализират и на еталонната проба се събират в колби, които след това се поставят в двойния вход на спектрометъра с цел извършване на изотопния анализ. Могат да бъдат използвани множество апаратури за изгаряне, описани в литературата:

| — | затворена система за изгаряне, пълна с циркулиращ газ кислород, |
| --- | --- |

—

затворена система за изгаряне, пълна с циркулиращ газ кислород,

| — | елементен анализатор с поток от хелий и кислород, |
| --- | --- |

—

елементен анализатор с поток от хелий и кислород,

| — | запечатана стъклена колба, пълна с окис на мед(II) като окислител. |
| --- | --- |

—

запечатана стъклена колба, пълна с окис на мед(II) като окислител.

7.   ПОДГОТВЯНЕ НА ПРОБИТЕ ЗА ТЕСТВАНЕ

Етанолът трябва да бъде извлечен от виното преди изотопното определяне. Това извличане се извършва чрез дестилиране на виното, както е описано в точка 3.1 на метода с ЯМР (OIV - MA-E-AS311-05-ENRRMN).

В случай на гроздова мъст, концентрирана гроздова мъст и пречистена концентрирана гроздова мъст, захарта трябва първо да бъде ферментирала в етанол, както е описано в точка 3.2 на метода с ЯМР (OIV - MA-E-AS311-05-ENRRMN).

8.   МЕТОДИКА

Всички етапи на подготовката трябва да бъдат извършени без значителни загуби на етанол от изпаряване, което може да промени изотопния състав на пробата.

Следното описание се отнася до процедурите, които по принцип се използват за изгаряне на проба от етанол, като се използват автоматични системи за изгаряне, предлагани на пазара.. Всякакви други методи, които гарантират, че цялата проба от етанол е преобразувана във въглероден двуокис без никакви загуби на етанол от изпаряване, са подходящи за приготвянето на въглероден двуокис за изотопния анализ.

Експериментална процедура, основана на използването на елементен анализатор:

| а) | поставяне на пробите в капсули:






  — | използват се капсули, пинцети и плосък съд, които трябва да бъдат чисти, |
| --- | --- | --- |

а)

поставяне на пробите в капсули:

—

използват се капсули, пинцети и плосък съд, които трябва да бъдат чисти,

| — | взима се капсула с подходящ размер, като се използват пинцетите, |
| --- | --- |

—

взима се капсула с подходящ размер, като се използват пинцетите,

| — | с помощта на микропипета в капсулата се вкарва необходимото количество течност, |
| --- | --- |

—

с помощта на микропипета в капсулата се вкарва необходимото количество течност,

| — | Забележка:

  за получаване на 2 mg въглерод са необходими 3,84 mg чист етанол или 4,17 mg дестилат с тегловно алкохолно съдържание 92 %. Подходящото количество дестилат трябва да бъде изчислено по същия начин, в зависимост от необходимото количество въглерод според чувствителността на апаратурата за мас-спектрометрия. |
| --- | --- |

—

Забележка:

за получаване на 2 mg въглерод са необходими 3,84 mg чист етанол или 4,17 mg дестилат с тегловно алкохолно съдържание 92 %. Подходящото количество дестилат трябва да бъде изчислено по същия начин, в зависимост от необходимото количество въглерод според чувствителността на апаратурата за мас-спектрометрия.

| — | капсулата се затваря с пинцетите, |
| --- | --- |

—

капсулата се затваря с пинцетите,

| — | всяка капсула трябва да бъде затворена напълно херметично. В противен случай тя трябва да се изхвърли и да се приготви нова капсула, |
| --- | --- |

—

всяка капсула трябва да бъде затворена напълно херметично. В противен случай тя трябва да се изхвърли и да се приготви нова капсула,

| — | за всяка проба трябва да бъдат приготвени две капсули, |
| --- | --- |

—

за всяка проба трябва да бъдат приготвени две капсули,

| — | капсулите се поставят на подходящото място върху плоския съд на автоматичния пробоподавач на елементния анализатор. Всяка капсула трябва да бъде грижлива означена с пореден номер за разпознаване, |
| --- | --- |

—

капсулите се поставят на подходящото място върху плоския съд на автоматичния пробоподавач на елементния анализатор. Всяка капсула трябва да бъде грижлива означена с пореден номер за разпознаване,

| — | систематично се поставят капсули, съдържащи работните еталонни проби в началото и в края на поредицата от проби, |
| --- | --- |

—

систематично се поставят капсули, съдържащи работните еталонни проби в началото и в края на поредицата от проби,

| — | през равни интервали в поредицата от проби се внасят контролни проби; |
| --- | --- |

—

през равни интервали в поредицата от проби се внасят контролни проби;

| б) | проверка и настройка на апаратурата за елементен анализ и мас-спектрометрия:






  — | настройват се температурата на пещите на елементния анализатор и потоците от хелий и кислород за оптимално изгаряне на пробата, |
| --- | --- | --- |

б)

проверка и настройка на апаратурата за елементен анализ и мас-спектрометрия:

—

настройват се температурата на пещите на елементния анализатор и потоците от хелий и кислород за оптимално изгаряне на пробата,

| — | проверява се системата за елементен анализ и мас-спектрометрия за течове (например чрез проверка на йонния ток при m/z = 28, което съответства на N2), |
| --- | --- |

—

проверява се системата за елементен анализ и мас-спектрометрия за течове (например чрез проверка на йонния ток при m/z = 28, което съответства на N2),

| — | настройва се мас-спектрометърът за измерване на големините на йонните токове за m/z = 44, 45 и 46, |
| --- | --- |

—

настройва се мас-спектрометърът за измерване на големините на йонните токове за m/z = 44, 45 и 46,

| — | проверява се системата, като се използват предварително известни контролни проби, преди да започне измерването на пробите; |
| --- | --- |

—

проверява се системата, като се използват предварително известни контролни проби, преди да започне измерването на пробите;

| в) | извършване на поредица от измервания
  Пробите, поставени на автоматичния пробоподавач на елементния анализатор (или на хроматографа), се внасят една след друга. Въглеродният двуокис от изгарянето на всяка проба се отмива чрез разтворител (елюира) по посока на мас-спектрометъра, който измерва йонните токове. Компютърът, свързан към измервателната апаратура, записва големините на йонните токове и изчислява стойността δ за всяка проба (точка 9). |
| --- | --- |

в)

извършване на поредица от измервания

Пробите, поставени на автоматичния пробоподавач на елементния анализатор (или на хроматографа), се внасят една след друга. Въглеродният двуокис от изгарянето на всяка проба се отмива чрез разтворител (елюира) по посока на мас-спектрометъра, който измерва йонните токове. Компютърът, свързан към измервателната апаратура, записва големините на йонните токове и изчислява стойността δ за всяка проба (точка 9).

9.   ИЗЧИСЛЕНИЕ

Целта на метода е да се измери изотопното отношение 13С/12С на етанола, извлечен от виното или от продуктите, получени от гроздето след ферментация. Изотопното отношение 13С/12С може да бъде изразено чрез неговото отклонение от работна еталонна проба. Изотопното отклонение на въглерод 13 (δ13С) се изчислява след това в размерност делта към хиляда (δ/1 000) чрез сравняване на резултатите, получени за пробата, подлежаща на измерване, с тези от работната еталонна проба, която е била предварително калибрирана спрямо първичния международен еталон (V-PDB). Стойностите на δ13С се изразяват по отношение работната еталонна проба, както следва:

δ13Cпроба/етал.проба ‰ = 1 000 × (Rпроба-Rетал.проба)/Rетал.проба

където Rпроба Rетал.проба са съответно изотопните отношения 13C/12C на пробата и на въглеродния двуокис, използван като сравнителен газ.

Стойностите на δ13С се изразяват спрямо V-PDB както следва:

δ13Cпроба/V-PDB ‰ = δ13Cпроба/етал. + δ13Cетал./V-PDB + (δ13Cпроба/етал. × δ13Cпроба/V-PDB)/1 000

където δ13Сетал./V-PDB е предварително определеното изотопно отклонение на работната еталонна проба спрямо V-PDB.

По време на измерването може да се получат малки отклонения, които се дължат на промени в условията на измерване. В този случай стойностите за δ13С от пробите трябва да бъдат поправени в съответствие с разликата между измерената за работната еталонна проба стойност за δ13С и действителната стойност, калибрирана предварително спрямо V-PDB чрез сравнение с един от международните сравнителни материали. Между две измервания на работната еталонна проба отклонението и следователно поправката, която следва да се приложи към резултатите, получени от пробите, могат да бъдат приети за линейни. Работната еталонна проба трябва да бъде измервана в началото и в края на всяка поредици от проби. След това може да бъде изчислена поправка за всяка проба, като се използва линейна интерполация.

10.   ОСИГУРЯВАНЕ И КОНТРОЛ НА КАЧЕСТВОТО

Проверява се дали стойността за 13С за работната еталонна проба не се различава с повече от 0,5 ‰ от допустимата стойност. В случай че това не е изпълнено, трябва да бъдат проверени настройките на измервателната част на спектрометъра и при необходимост да бъдат извършени повторно.

За всяка проба се проверява дали разликата в резултатите за две капсули, измерени една след друга, е по-малка от 0,3 ‰. Окончателният резултат за дадена проба е средноаритметичната стойност от двете капсули. В случай че отклонението е по-голямо от 0,3 ‰, измерването трябва да бъде повторено.

Проверката на правилното протичане на измерването може да се основава на йонния ток при m/z = 44, който е пропорционален на количеството въглерод, инжектиран в елементния анализатор. При стандартни условия големината на йонния ток трябва да бъде практически постоянна за анализираните проби. Значително отклонение следва да наведе на мисълта, че има изпаряване на етанола (например неплътно запечатана капсула) или нестабилност в елементния анализатор или в мас-спектрометъра.

11.   РАБОТНИ ХАРАКТЕРИСТИКИ НА МЕТОДА (ГРЕШКА)

Беше направено първоначално съвместно изследване (точка 11.1) върху дестилати, съдържащи алкохол от грозде и алкохоли от захарна тръстика и цвекло, както и различни смеси от трите вида алкохол. Тъй като при това изследване не е взет предвид етапът на дестилация, съответно са разгледани допълнителни данни от други междулабораторни изотопни измервания върху вина (точка 11.2) и по-специално от проверките на годността за извършване на изотопни измервания (точка 11.3). Резултатите показват, че при задоволителни условия и в частност при условията за измерване чрез ядрен магнитен резонанс (SNIF-NMR), различните системи за дестилация не дават значителни отклонения при определянето на стойността за δ13С за етанола от вино. Параметрите за надеждност, наблюдавани при вината, са почти същите като получените при съвместното изследване на дестилати (точка 11.1).

11.1.   Съвместно изследване на дестилати

| Година на междулабораторния тест | 1996 |
| --- | --- |
| Брой на лабораториите: | 20 |
| Брой на пробите: | 6 проби по двойно сляп метод |
| Обект на анализа: | δ13C за етанола |

Година на междулабораторния тест

1996

Брой на лабораториите:

20

Брой на пробите:

6 проби по двойно сляп метод

Обект на анализа:

δ13C за етанола

| Код на пробите | Алкохол, получен от грозде | Алкохол, получен от цвекло | Алкохол, получен от захарна тръстика |
| --- | --- | --- | --- |
| A & G | 80 % | 10 % | 10 % |
| B & C | 90 % | 10 % | 0 % |
| D & F | 0 % | 100 % | 0 % |
| E & I | 90 % | 0 % | 10 % |
| H & K | 100 % | 0 % | 0 % |
| J & L | 0 % | 0 % | 100 % |

Код на пробите

Алкохол, получен от грозде

Алкохол, получен от цвекло

Алкохол, получен от захарна тръстика

A & G

80 %

10 %

10 %

B & C

90 %

10 %

0 %

D & F

0 %

100 %

0 %

E & I

90 %

0 %

10 %

H & K

100 %

0 %

0 %

J & L

0 %

0 %

100 %

| Проби | A/G | B/C | D/F | E/I | H/K | J/L |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Брой на лабораториите, останали след отстраняването на резултатите с големи отклонения | 19 | 18 | 17 | 19 | 19 | 19 |
| Брой на приетите резултати | 38 | 36 | 34 | 38 | 38 | 38 |
| Средна стойност (δ13C) ‰ | –25,32 | –26,75 | –27,79 | –25,26 | –26,63 | –12,54 |
| Sr
  2 | 0,0064 | 0,0077 | 0,0031 | 0,0127 | 0,0069 | 0,0041 |
| Средноквадратично отклонение на повторяемостта (Sr) ‰ | 0,08 | 0,09 | 0,06 | 0,11 | 0,08 | 0,06 |
| Граница на повторяемост r (2.8 × Sr) ‰ | 0,22 | 0,25 | 0,16 | 0,32 | 0,23 | 0,18 |
| SR
  2 | 0,0389 | 0,0309 | 0,0382 | 0,0459 | 0,0316 | 0,0584 |
| Средноквадратично отклонение на възпроизводимостта (SR) ‰ | 0,20 | 0,18 | 0,20 | 0,21 | 0,18 | 0,24 |
| Граница на възпроизводимост R (2.8 × SR) ‰ | 0,55 | 0,49 | 0,55 | 0,60 | 0,50 | 0,68 |

Проби

A/G

B/C

D/F

E/I

H/K

J/L

Брой на лабораториите, останали след отстраняването на резултатите с големи отклонения

19

18

17

19

19

19

Брой на приетите резултати

38

36

34

38

38

38

Средна стойност (δ13C) ‰

–25,32

–26,75

–27,79

–25,26

–26,63

–12,54

Sr
  2

0,0064

0,0077

0,0031

0,0127

0,0069

0,0041

Средноквадратично отклонение на повторяемостта (Sr) ‰

0,08

0,09

0,06

0,11

0,08

0,06

Граница на повторяемост r (2.8 × Sr) ‰

0,22

0,25

0,16

0,32

0,23

0,18

SR
  2

0,0389

0,0309

0,0382

0,0459

0,0316

0,0584

Средноквадратично отклонение на възпроизводимостта (SR) ‰

0,20

0,18

0,20

0,21

0,18

0,24

Граница на възпроизводимост R (2.8 × SR) ‰

0,55

0,49

0,55

0,60

0,50

0,68

11.2.   Междулабораторно изследване на две вина и един алкохол

| Година на междулабораторния тест | 1996 |
| --- | --- |
| Брой на лабораториите: | 14 за дестилация на вино, седем от които са измерили също δ13С на етанола на виното, 8 за измерване на δ13С на алкохолна проба |
| Брой на пробите: | Три (бяло вино с обемно алкохолно съдържание 9,3 %, бяло вино с обемно алкохолно съдържание 9,6 % и алкохол с тегловно алкохолно съдържание 93 %). |
| Обект на анализа: | δ13C за етанола |

Година на междулабораторния тест

1996

Брой на лабораториите:

14 за дестилация на вино, седем от които са измерили също δ13С на етанола на виното, 8 за измерване на δ13С на алкохолна проба

Брой на пробите:

Три (бяло вино с обемно алкохолно съдържание 9,3 %, бяло вино с обемно алкохолно съдържание 9,6 % и алкохол с тегловно алкохолно съдържание 93 %).

Обект на анализа:

δ13C за етанола

| Проби | Червено вино Бяло вино | Бяло вино | Алкохол |
| --- | --- | --- | --- |
| Брой на лабораториите | 7 | 7 | 8 |
| Брой на приетите резултати | 7 | 7 | 8 |
| Средна стойност (δ13С) ‰ | –26,20 | –26,20 | –25,08 |
| Дисперсия на възпроизводимостта SR
  2 | 0,0525 | 0,0740 | 0,0962 |
| Средноквадратично отклонение на възпроизводимостта (SR) ‰ | 0,23 | 0,27 | 0,31 |
| Граница на възпроизводимост R (2.8 × SR) ‰ | 0,64 | 0,76 | 0,87 |

Проби

Червено вино Бяло вино

Бяло вино

Алкохол

Брой на лабораториите

7

7

8

Брой на приетите резултати

7

7

8

Средна стойност (δ13С) ‰

–26,20

–26,20

–25,08

Дисперсия на възпроизводимостта SR
  2

0,0525

0,0740

0,0962

Средноквадратично отклонение на възпроизводимостта (SR) ‰

0,23

0,27

0,31

Граница на възпроизводимост R (2.8 × SR) ‰

0,64

0,76

0,87

От участващите лаборатории са били използвани различни системи за дестилация. Изотопните определяния (δ13С), направени в една единствена лаборатория за всички дестилати, върнати от участниците, не показват нито нетипични стойности, нито стойности, които се различават значително от средните стойности. Дисперсията на резултатите (S2 = 0,0059) е сравнима с дисперсиите на повторяемостта Sr
  2 от съвместното изследване на дестилатите (точка 11.1).

11.3.   Резултати от проверките на годността за извършване на изотопни изпитвания

От декември 1994 г. редовно се организират международни проверки на годността за извършване на изпитвания за изотопно определяне върху вино и алкохол (дестилати с обемно алкохолно съдържание 96 %). Резултатите позволяват на участващите лаборатории да контролират качеството на своите анализи. Статистическият анализ на резултатите позволява оценяване на изменчивостта на резултатите от измерванията при условия на възпроизводимост и следователно оценяване на параметрите дисперсия и граница на възпроизводимост. Получените резултати за определянето на δ13С за етанола на виното и дестилатите са обобщени в следната таблица:

| Дата | Вина | Дестилати |
| --- | --- | --- |
| N | S R | SR
  2 | R | N | S R | SR
  2 | R |
| декември 1994 г. | 6 | 0,210 | 0,044 | 0,59 | 6 | 0,151 | 0,023 | 0,42 |
| юни 1995 г. | 8 | 0,133 | 0,018 | 0,37 | 8 | 0,147 | 0,021 | 0,41 |
| декември 1995 г. | 7 | 0,075 | 0,006 | 0,21 | 8 | 0,115 | 0,013 | 0,32 |
| март 1996 г. | 9 | 0,249 | 0,062 | 0,70 | 11 | 0,278 | 0,077 | 0,78 |
| юни 1996 г. | 8 | 0,127 | 0,016 | 0,36 | 8 | 0,189 | 0,036 | 0,53 |
| септември 1996 г. | 10 | 0,147 | 0,022 | 0,41 | 11 | 0,224 | 0,050 | 0,63 |
| декември 1996 г. | 10 | 0,330 | 0,109 | 0,92 | 9 | 0,057 | 0,003 | 0,16 |
| март 1997 г. | 10 | 0,069 | 0,005 | 0,19 | 8 | 0,059 | 0,003 | 0,16 |
| юни 1997 г. | 11 | 0,280 | 0,079 | 0,78 | 11 | 0,175 | 0,031 | 0,49 |
| септември 1997 г. | 12 | 0,237 | 0,056 | 0,66 | 11 | 0,203 | 0,041 | 0,57 |
| декември 1997 г. | 11 | 0,127 | 0,016 | 0,36 | 12 | 0,156 | 0,024 | 0,44 |
| март 1998 г. | 12 | 0,285 | 0,081 | 0,80 | 13 | 0,245 | 0,060 | 0,69 |
| юни 1998 г. | 12 | 0,182 | 0,033 | 0,51 | 12 | 0,263 | 0,069 | 0,74 |
| септември 1998 г. | 11 | 0,264 | 0,070 | 0,74 | 12 | 0,327 | 0,107 | 0,91 |
| Средна претеглена стойност | | 0,215 | 0,046 | 0,60 | | 0,209 | 0,044 | 0,59 |
| N | : | брой на участващите лаборатории. |

Дата

Вина

Дестилати

N

S R

SR
  2

R

N

S R

SR
  2

R

декември 1994 г.

6

0,210

0,044

0,59

6

0,151

0,023

0,42

юни 1995 г.

8

0,133

0,018

0,37

8

0,147

0,021

0,41

декември 1995 г.

7

0,075

0,006

0,21

8

0,115

0,013

0,32

март 1996 г.

9

0,249

0,062

0,70

11

0,278

0,077

0,78

юни 1996 г.

8

0,127

0,016

0,36

8

0,189

0,036

0,53

септември 1996 г.

10

0,147

0,022

0,41

11

0,224

0,050

0,63

декември 1996 г.

10

0,330

0,109

0,92

9

0,057

0,003

0,16

март 1997 г.

10

0,069

0,005

0,19

8

0,059

0,003

0,16

юни 1997 г.

11

0,280

0,079

0,78

11

0,175

0,031

0,49

септември 1997 г.

12

0,237

0,056

0,66

11

0,203

0,041

0,57

декември 1997 г.

11

0,127

0,016

0,36

12

0,156

0,024

0,44

март 1998 г.

12

0,285

0,081

0,80

13

0,245

0,060

0,69

юни 1998 г.

12

0,182

0,033

0,51

12

0,263

0,069

0,74

септември 1998 г.

11

0,264

0,070

0,74

12

0,327

0,107

0,91

Средна претеглена стойност

0,215

0,046

0,60

0,209

0,044

0,59

N

:

брой на участващите лаборатории.

11.4.   Граници на повторяемост и възпроизводимост

Данните от различните междулабораторни изпитвания, представени в горните таблици, позволяват за този метод, включително за етапа на дестилация, да бъдат установени следните граници на повторяемост и възпроизводимост:

| | Граница на повторяемост r: 0,24 |
| --- | --- |

Граница на повторяемост r: 0,24

| | Граница на възпроизводимост R: 0,6. |
| --- | --- |

Граница на възпроизводимост R: 0,6.

11   ОБЩА КИСЕЛИННОСТ (OIV-AS-313-01-ACITOT) — МЕТОД ТИП I

1.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Общата киселинност е равна на сумата от титруеми киселини в момента на постигане на pH 7 чрез добавяне на стандартен алкален разтвор.

Въглеродният двуокис не се включва в общата киселинност.

2.   ПРИНЦИП НА МЕТОДА

Потенциометрично титруване или титруване с бромтимолово синьо като индикатор за край на реакцията чрез сравняване с еталон за оцветяване.

3.   РЕАГЕНТИ

3.1.   Буферен разтвор pH 7,0:

| | Монокалиев фосфат KH2PO4: 107,3 g |
| --- | --- |

Монокалиев фосфат KH2PO4: 107,3 g

| | разтвор 1 M на натриев хидроокис (NaOH): 500 ml |
| --- | --- |

разтвор 1 M на натриев хидроокис (NaOH): 500 ml

| | вода до: 1 000 ml. |
| --- | --- |

вода до: 1 000 ml.

Могат да бъдат използвани и стандартни буферни разтвори, предлагани в търговската мрежа.

3.2.   Разтвор 0,1 M на натриев хидроокис (NaOH)

3.3.   Разтвор 4 g/l на бромтимолово синьо.

| Бромтимолово синьо (C27H28Br2O5S) ... | 4 g |
| --- | --- |
| Неутрален спирт 96 обемни % ... | 200 ml |
| След разтваряне се добавя: | |
| Вода без съдържание на CO2 ... | 200 ml |
| Разтвор 1 М на натриев хидроокис | |
| до синьозелено оцветяване (pH 7) ... | 7,5 ml |
| Вода до ... | 1 000 ml |

Бромтимолово синьо (C27H28Br2O5S) ...

4 g

Неутрален спирт 96 обемни % ...

200 ml

След разтваряне се добавя:

Вода без съдържание на CO2 ...

200 ml

Разтвор 1 М на натриев хидроокис

до синьозелено оцветяване (pH 7) ...

7,5 ml

Вода до ...

1 000 ml

4.   АПАРАТУРА

4.1.   Водоструйна вакуумпомпа.

4.2.   Колба за филтруване с обем 500 ml.

4.3.   Потенциометър с градуирана в рН единици скала и електроди. Стъкленият електрод се съхранява в дестилирана вода. Електродът каломел-калиев хлорид се съхранява в наситен разтвор на калиев хлорид. По-често се използва комбиниран електрод, който се съхранява в дестилирана вода.

4.4.   Мерителни цилиндри: с вместимост 50 ml (за виното) и 100 ml (за ректифицираната концентрирана мъст).

5.   МЕТОДИКА

5.1.   Приготвяне на пробата

5.1.1.   За вино

Отстраняване на въглеродния двуокис: В колба за филтруване се поставят около 50 ml вино, разклащат се, като в същото време се създава вакуум чрез водоструйната помпа. Разклащането трябва да продължи 1 до 2 минути.

5.1.2.   Ректифицирана концентрирана гроздова мъст

В мерителна колба 500 ml се поставят 200 g ректифицирана концентрирана мъст. Долива се до чертата с вода. Размесва се.

5.2.   Потенциометрично титруване

5.2.1.   Калибриране на pH-метъра

Калибрирането на pH-метъра се извършва при 20 °C съгласно инструкциите към уреда с буферен разтвор с pH 7,00 при 20 °C.

5.2.2.   Метод на измерване

В мерителен цилиндър (точка 4.4) се поставя определен обем от пробата, подготвена, както е описано в точка 5.1, равен на 10 ml за анализ на виното и 50 ml за анализ на ректифицираната концентрирана гроздова мъст. Добавят се около 10 ml дестилирана вода и след това разтвор 0,1 М на натриев хидроокис (точка 3.2) с бюрета, докато рН достигне стойност 7,0 при 20 °C. Алкалният разтвор трябва да се прибавя бавно, а полученият разтвор постоянно да се разклаща. С n ml се обозначава обемът на добавения NaOH с моларност 0,1 M.

5.3.   Титруване с индикатор (бромтимолово синьо)

5.3.1.   Предварителен тест: определяне на еталона за оцветяване

В мерителен цилиндър (точка 4.4) се поставят 25 ml преварена дестилирана вода, 1 ml разтвор на бромтимолово синьо (точка 3.3) и обем, получен съгласно указанията в точка 5.1, равен на 10 ml за анализ на виното и 50 ml за анализ на ректифицираната концентрирана гроздова мъст. Добавя се разтвор 0,1 М на натриев хидроокис (точка 3.2), докато се получи синьо-зелено оцветяване. Добавят се 5 милилитра от буферния разтвор с pH 7 (3.1).

5.3.2.   Определяне

В мерителен цилиндър (точка 4.4) се поставят 30 ml преварена дестилирана вода, 1 ml разтвор на бромтимолово синьо (точка 3.3) и проба с обем, получен съгласно указанията в точка 5.1, равен на 10 ml за анализ на виното и 50 ml за анализ на ректифицираната концентрирана гроздова мъст. Добавя се разтвор 0,1 М на натриев хидроокис (точка 3.2) до получаване на същото оцветяване като това в предварителния тест (5.3.1). Добавеният обем на натриев хидроокис 0,1 M се обозначава с n.

6.   ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

6.1.   Метод на изчисляване

6.1.1.   За вино

Общата киселинност се изразява в милиеквиваленти на литър и се изчислява по формулата:

A = 10 n

Изчислява се с точност до първия знак след запетаята.

Общата киселинност, изразена в грамове винена киселина на литър, се изчислява по формулата:

A′ = 0,075 × A

Изчислява се с точност до първия знак след запетаята.

6.1.2.   Ректифицирана концентрирана гроздова мъст

| — | Общата киселинност, изразена в милиеквиваленти на килограм ректифицирана концентрирана мъст, се определя по формулата: a = 5 × n |
| --- | --- |

—

Общата киселинност, изразена в милиеквиваленти на килограм ректифицирана концентрирана мъст, се определя по формулата: a = 5 × n

| — | Общата киселинност, изразена в милиеквиваленти на килограм обща захар, се изчислява по формулата:






  — | A = (500 × n)/P |
| --- | --- | --- |

—

Общата киселинност, изразена в милиеквиваленти на килограм обща захар, се изчислява по формулата:

—

A = (500 × n)/P

| — | P = обща захар, изразена в тегловни проценти. |
| --- | --- |

—

P = обща захар, изразена в тегловни проценти.

Величината се определя с точност до първия знак след запетаята.

6.2.   Повторяемост (r) за титруване с индикатор(5.3)

| r | = | 0,9 me/l |
| --- | --- | --- |
| r | = | 0,07 g винена киселина/литър |

r

=

0,9 me/l

r

=

0,07 g винена киселина/литър

За бели вина, вина розé и червени вина.

6.3.   Възпроизводимост (R) за титруване с индикатор (точка 5.3)

| | За бели вина и вина розé:







  R | = | 3,6 me/l |
| --- | --- | --- | --- |
| R | = | 0,3 g винена киселина/литър. |

За бели вина и вина розé:

R

=

3,6 me/l

R

=

0,3 g винена киселина/литър.

| | За червено вино:







  R | = | 5,1 me/l |
| --- | --- | --- | --- |
| R | = | 0,4 g винена киселина/литър. |

За червено вино:

R

=

5,1 me/l

R

=

0,4 g винена киселина/литър.

12   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ЛЕТЛИВА КИСЕЛИННОСТ (OIV-AS-313-02-ACIVOL) — МЕТОД ТИП I

1.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Летливата киселинност се образува от киселините от реда на оцетната киселина, които се намират във виното в свободно състояние или свързани във вид на соли.

2.   ПРИНЦИП НА МЕТОДА

Титруване на летливите киселини, отделени от виното чрез дестилация с водна пара и ректификация на парите.

Въглеродният двуокис се отстранява от виното предварително.

Киселинността на свободния и свързания серен двуокис, дестилирани при тези условия, се изважда от киселинността на дестилата.

Киселинността на сорбиновата киселина, която евентуално е била добавена към виното, също трябва да се приспадне.

Забележка:

Част от салициловата киселина, използвана в някои страни за стабилизиране на виното преди анализ, присъства в дестилата. Тя трябва да бъде определена и да бъде приспадната от киселинността. Методиката за нейното определяне е описана в точка 7 от настоящата глава.

3.   РЕАГЕНТИ

3.1.   Винена киселина на кристали (C4H6O6)

3.2.   Разтвор 0,1 M на натриев хидроокис (NaOH)

3.3.   1 %-ен разтвор на фенолфталеин в неутрален алкохол 96 % об.

3.4.   Солна киселина (ρ20 =1,18 до 1,19 g/ml), разредена 1:4 обемни части

3.5.   Разтвор 0,005 M на йод (I2).

3.6.   Калиев йодид на кристали (KI)

3.7.   Разтвор на нишесте 5 g/l:

Разреждат се 5 g нишесте с около 500 ml вода. Довеждат се до кипене при постоянно разбъркване и се оставят да врят в продължение на 10 минути; Добавят се 200 g натриев хлорид. След охлаждане сместа се долива до един литър.

3.8.   Наситен разтвор на натриев борат (Na2B4O7, 10 H2O) - 55 g/l при 20 °C.

4.   АПАРАТУРА

4.1.   Апарат за дестилация с водна пара, състоящ се от:

| 1) | парогенератор: произведената пара не трябва да съдържа въглероден двуокис; |
| --- | --- |

1)

парогенератор: произведената пара не трябва да съдържа въглероден двуокис;

| 2) | барботьор; |
| --- | --- |

2)

барботьор;

| 3) | ректификационна колона; |
| --- | --- |

3)

ректификационна колона;

| 4) | хладник. |
| --- | --- |

4)

хладник.

Този уред трябва да е преминал през следните три изпитвания:

| а) | в барботьора се поставят 20 ml преварена вода; Вземат се 250 ml от дестилата и към тях се прибавят 0,1 ml разтвор 0,1 M на натриев хидроокис (точка 3.2) и две капки от разтвора на фенолфталеин (точка 3.3). Розовото оцветяване трябва да остане стабилно за не по-малко от 10 секунди (т.е. парата да е без съдържание на въглероден двуокис). |
| --- | --- |

а)

в барботьора се поставят 20 ml преварена вода; Вземат се 250 ml от дестилата и към тях се прибавят 0,1 ml разтвор 0,1 M на натриев хидроокис (точка 3.2) и две капки от разтвора на фенолфталеин (точка 3.3). Розовото оцветяване трябва да остане стабилно за не по-малко от 10 секунди (т.е. парата да е без съдържание на въглероден двуокис).

| б) | в барботьора се поставят 20 ml разтвор 0,1 M на оцетна киселина. Вземат се 250 ml от дестилата. Титруват се с разтвор 0,1 M на натриев хидроокис (точка 3.2). Добавеният обем трябва да бъде не по-малко от 19,9 ml. (Оцетна киселина, транспортирана с парата ≥ 99,5 %). |
| --- | --- |

б)

в барботьора се поставят 20 ml разтвор 0,1 M на оцетна киселина. Вземат се 250 ml от дестилата. Титруват се с разтвор 0,1 M на натриев хидроокис (точка 3.2). Добавеният обем трябва да бъде не по-малко от 19,9 ml. (Оцетна киселина, транспортирана с парата ≥ 99,5 %).

| в) | В барботьора се поставят 20 ml разтвор 1 M на млечна киселина. Взимат се 250 ml от дестилата и киселината се титрува с разтвор 0,1 M на натриев хидроокис (точка 3.2). |
| --- | --- |

в)

В барботьора се поставят 20 ml разтвор 1 M на млечна киселина. Взимат се 250 ml от дестилата и киселината се титрува с разтвор 0,1 M на натриев хидроокис (точка 3.2).

Обемът на добавения разтвор трябва да бъде по-малък или равен на 1,0 ml (дестилирана млечна киселина ≤ 0,5 %).

Всеки уред или метод, успешно преминал тези изпитвания, е уред или метод, отговарящ на официалните международни изисквания.

4.2.   Водоструйна вакуумпомпа.

4.3.   Колба за филтруване.

5.   МЕТОДИКА

5.1.   Приготвяне на пробата: отстраняване на въглеродния двуокис.

В колба за филтруване се поставят около 50 ml вино; разклащат се, като в същото време се създава вакуум чрез водоструйната помпа. Разклащането трябва да продължи от 1 до 2 минути.

5.2.   Дестилация с водна пара.

В барботьора се поставят 20 ml вино, свободно от въглероден двуокис, както е описано в точка 5.1. Добавя се около 0,5 g винена киселина (точка 3.1). Събират се не по-малко от 250 ml от дестилата.

5.3.   Титруване

Титрува се с разтвор 0,1 M на натриев хидроокис (точка 3.2), като се поставят две капки разтвор на фенолфталеин (точка 3.3) като индикатор, като добавеният обем натриев хидроокис се обозначава с n ml.

Добавят се четири капки от разредената в съотношение 1:4 солна киселина (точка 3.4), 2 ml от разтвора на нишесте (точка 3.3) и няколко кристалчета калиев йодид (точка 3.6). Свободният серен двуокис се титрува с разтвор 0,005 M на йод (точка 3.5). Добавеният обем се обозначава с n′ ml.

Добавя се наситен разтвор на натриев борат (точка 3.8) до повторната поява на розово оцветяване. Свързаният серен двуокис се титрува с разтвор 0,005 M на йод (точка 3.5). Добавеният обем се обозначава с n′′ ml.

6.   ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

6.1.   Метод на изчисляване

Летливата киселинност, изразена в милиеквиваленти на литър и определена с точност до първия десетичен знак, се изчислява по формулата:

A = 5 (n – 0,1 n′ – 0,05 n′′)

Летливата киселинност, изразена в грамове оцетна киселина на литър и определена с точност до втория десетичен знак, се изчислява по формулата:

0,300 (n – 0,1 n′ – 0,05 n′′)

6.2.   Повторяемост

| r | = | 0,7 me/l |
| --- | --- | --- |
| r | = | 0,04 g оцетна киселина/литър. |

r

=

0,7 me/l

r

=

0,04 g оцетна киселина/литър.

6.3.   Възпроизводимост (R)

| R | = | 1,3 me/l |
| --- | --- | --- |
| R | = | 0,08 g оцетна киселина/литър. |

R

=

1,3 me/l

R

=

0,08 g оцетна киселина/литър.

6.4.   Вино с добавена сорбинова киселина

Тъй като 96 % от сорбиновата киселина се подлагат на дестилация с водна пара при обем на дестилата 250 ml, нейната киселинност се изважда от летливата киселинност, като се вземе предвид, че 100 mg сорбинова киселина отговарят на 0,89 милиеквивалента или 0,053 g оцетна киселина и като се знае концентрацията на сорбиновата киселина в mg/l, определена чрез други методи.

7.   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА САЛИЦИЛОВА КИСЕЛИНА, ПОСТЪПИЛА В ДЕСТИЛАТА ОТ ЛЕТЛИВАТА КИСЕЛИННОСТ

7.1.   Принцип

След определянето на летливата киселинност и направената корекция за серния двуокис присъствието на салициловата киселина се определя след подкиселяване чрез появата на виолетово оцветяване с добавяне на ферисол.

Определянето на уловената в дестилата салицилова киселина заедно с летливата киселинност се осъществява във втори дестилат със същия обем както при анализа на летливата киселинност. В този дестилат салициловата киселина се определя по метод на колориметрично сравнение. Тя се изважда от киселинността на дестилата от определянето на летливата киселинност.

7.2.   Реагенти

7.2.1.   Солна киселина (HCl) (ρ20 = 1,18 до 1,19 g/ml).

7.2.2.   Натриев тиосулфат (Na2S2O3·5H2O) разтвор 0,1 M.

7.2.3.   10 %-ен разтвор (m/v) на железен(III) сулфат и амониев сулфат [Fe2(SO4)3, (NH4)2SO4·24H2O].

7.2.4.   Разтвор 0,01 M на натриев салицилат. Разтворът съдържа 1,60 g/l натриев салицилат (NaC7H5O3).

7.3.   Методика

7.3.1.   Установяване наличието на салицилова киселина, увлечена в дестилата от летливи киселини.

Веднага след определянето на летливата киселинност и направената поправка за свободен и свързан серен двуокис в ерленмайерова колба се поставят 0,5 ml солна киселина (точка 7.2.1), 3 ml от разтвора 0,1 М на натриев тиосулфат (точка 7.2.2) и 1 ml от разтвора на железен(III) сулфат и амониев сулфат (точка 7. 2.3).

При наличие на салицилова киселина се появява виолетово оцветяване.

7.3.2.   Определяне на салицилова киселина

В гореспомената ерленмайерова колба се отбелязва обемът на дестилата, като се поставя съответна марка. Колбата се изпразва и се измива.

На дестилация с водна пара се поставя нова проба от 20 ml вино и дестилатът се събира в ерленмайеровата колба до достигане на марката. Добавят се 0,3 ml чиста солна киселина (точка 7.2.1) и 1 ml от разтвора на железен(III) сулфат и амониев сулфат (точка 7.2.3). Съдържанието на ерленмайеровата колба се оцветява във виолетово.

В ерленмайерова колба, която е еднаква с маркираната, се поставя дестилирана вода до същото ниво както това на дестилата. Добавят се 0,3 ml чиста солна киселина (точка 7.2.1), 1 ml от разтвора на железен(III) сулфат и амониев сулфат (точка 7.2.3). От бюрета се подава разтвор 0,01 М на натриев салицилат (точка 7.2.4) до появата на виолетово оцветяване със същата наситеност като тази в ерленмайеровата колба с винения дестилат.

Добавените милилитри се означават с n′′′.

7.4.   Поправка за летливата киселинност

Обемът 0,1· n′′′ ml се изважда от обема n ml на разтвора 0,1 М на натриев хидроокис, използван за титруване на киселинността на дестилата по време на определянето на летливата киселинност.

13   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ЛИМОНЕНА КИСЕЛИНА (-313/C 145/06) — МЕТОД ТИП II

1.   ПРИНЦИП НА МЕТОДА

Лимонената киселина се превръща в оксалоацетат и ацетат по време на реакция с катализатор цитратлиаза (CL):

цитрат ←→ оксалоацетат + ацетат

В присъствието на малат-дехидрогеназа (MDH) и лактат-дехидрогеназа (LDH) оксалоацетатът и неговото производно от декарбоксилиране (пируват) се редуцират до L-малат и L-лактат чрез редуциран никотинамид-аденин-динуклеотид (NADH):

| | оксалоацетат + NADH + H+ ←→ L-малат + NAD+ |
| --- | --- |

оксалоацетат + NADH + H+ ←→ L-малат + NAD+

| | пируват + NADH + H+ ←→ L-лактат + NAD+ |
| --- | --- |

пируват + NADH + H+ ←→ L-лактат + NAD+

Количеството NADH, окислено до NAD+, в тези реакции е пропорционално на количеството на присъстващия цитрат. Окисляването на NADH се измерва чрез намаляването на оптичната плътност при 340 nm.

2.   РЕАГЕНТИ

2.1.   Буферен разтвор с pH 7,8.

(глицилглицин 0,51 M; H = 7,8; Zn2+: 0,6 × 10- 3M):

Разтварят се 7,13 g глицилглицин в около 70 ml двойнодестилирана вода.

pH се довежда до 7,8, като се използват около 13 ml разтвор 5 M на натриев хидроокис; Добавят се 10 ml разтвор на цинков хлорид ZnCl2 (80 mg в 100 ml H2O) и се долива до 100 ml с двойно дестилирана вода.

Разтворът е годен за употреба в продължение на поне 4 седмици при 4 °C.

2.2.   Разтвор на редуциран никотинамид-аденин-динуклеотид (NADH) (приблизително 6 × 10–3 M): разтварят се 30 mg NADH и 60 mg NaHCO3 в 6 ml двойно дестилирана вода.

2.3.   Разтвор на малатдехидрогеназа (лактатдехидрогеназа (MDH/LDH, 0,5 mg MDH/ml, 2,5 mg LDH/ml):

смесват се 0,1 ml MDH (5 mg MDH/ml) и 0,4 ml разтвор на амониев сулфат (3,2 M) и 0,5 ml LDH (5 mg/ml). Суспензията е годна за употреба в продължение на поне една година при 4 °C.

2.4.   Цитратлиаза CL (5 mg протеин/ml): Разтварят се 168 mg лиофилизирана цитратлиаза в един милилитър леденостудена вода. Разтворът е годен за употреба в продължение на поне една седмица при 4o и поне 4 седмици в замразено състояние.

Препоръчва се преди извършване на определянето да се провери ензимната активност.

2.5.   Поливинилполипиролидон (PVPP)

Забележка: Всички необходими за това определяне реагенти се предлагат в търговската мрежа.

3.   АПАРАТУРА

3.1.   Спектрофотометър, позволяващ измерванията да бъдат извършвани при 340 nm — дължината на вълната, при която оптичната плътност на NADH е максимална.

В отсъствието на такъв се използва спектрофотометър с дискретен спектър, позволяващ измерванията да се извършват при дължина на вълната 334 или 365 nm. Тъй като методът включва абсолютни измервания на оптичната плътност (т.е. не се използват еталонни криви, а екстинкционният коефициент на NADH), скалите на уреда, показващи дължината на вълната и оптичната плътност, трябва да се контролират.

3.2.   Стъклени кювети с оптичен път 1 cm или кювети за еднократна употреба.

3.3.   Микропипети позволяват отмерване на обеми от 0,02 ml до 2 ml.

4.   ПРИГОТВЯНЕ НА ПРОБАТА

Съдържанието на цитрат обикновено се определя директно от виното без предварително отстраняване на оцветяването и без разреждане, при условие че съдържанието на лимонена киселина е по-малко от 400 mg/l. В противен случай виното се разрежда, докато концентрацията на цитрата достигне стойности между 20 и 400 mg/l (съдържание на цитрат в пробата между 5 и 80 μg).

Препоръчва се богатите на фенолни съединения червени вина да бъдат предварително обработени с PVPP:

Приготвя се суспензия от около 0,2 g PVPP във вода и се оставя да престои 15 минути. След това се филтрува през нагънат филтър.

В ерленмайерова колба с обем 50 ml се поставят 10 ml от виното и с помощта на шпатула се добавя влажният PVPP, отделен от филтъра. Сместа се разклаща в продължение на 2 до 3 минути. Филтрува се.

5.   МЕТОДИКА

Със спектрофотометъра, настроен на дължина на вълната 340 nm, се извършват измерванията на оптичната плътност, като се използват кюветите от 1 cm, а оптична плътност „нула“ е определена за въздух (без кювета в оптичния път). В кюветите с широчина 1 cm се поставят:

| | Еталонна проба | Определяне |
| --- | --- | --- |
| Разтвор 2.1 | 1,00 ml | 1,00 ml |
| Разтвор 2.2 | 0,10 ml | 0,10 ml |
| Проба | — | 0,20 ml |
| Двойнодестилирана вода | 2,00 ml | 1,80 ml |
| Разтвор 2.3 | 0,02 ml | 0,02 ml |

Еталонна проба

Определяне

Разтвор 2.1

1,00 ml

1,00 ml

Разтвор 2.2

0,10 ml

0,10 ml

Проба

—

0,20 ml

Двойнодестилирана вода

2,00 ml

1,80 ml

Разтвор 2.3

0,02 ml

0,02 ml

Смесват се и след около 5 минути се отчитат оптичните плътности на разтворите в еталонната и аналитична проба (A1).

Прибавя се:

| Разтвор 2.4 | 0,02 ml | 0,02 ml |
| --- | --- | --- |

Разтвор 2.4

0,02 ml

0,02 ml

Разбърква се; изчаква се до приключването на реакцията (около 5 минути) и се отчитат оптичните плътности на разтворите в еталонната и аналитичната проба (A2).

Изчислява се разликата между оптичните плътности (A1–A2) на еталонната и аналитичната проби.

Намира се разликата между оптичната плътност на еталонната проба и разликата между различните оптични плътности от измерванията:

ΔА = ΔА D – ΔАT

Забележка: Времето, необходимо за действието на ензимите, може да бъде различно от партида на партида. Посочената по-горе стойност е само примерна. Препоръчва се тя да бъде определяна за всяка отделна партида

6.   ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Концентрацията на лимонена киселина се изразява в милиграми на литър (mg/l) с точност до най-близкото цяло число.

6.1.   Метод на изчисляване

Обща формула за изчисляване на концентрацията в милиграми на литър:

C = ((V × PM)/(ε × d × v)) x ΔА

| V | = | обем на изпитвания разтвора в милилитри (в този случай 3,14 ml) |
| --- | --- | --- |
| v | = | обем на пробата в милилитри (в случая 0,2 ml) |
| P.M | = | молекулна маса на подлежащото на определяне вещество (в този случай за безводната лимонена киселина = 192,1) |
| d | = | оптичен път на кюветата в сантиметри (в този случай 1 cm) |
| ε | = | коефициент на поглъщане на NADH (при 340 nm), |
| ε | = | 6,3 mmol– 1 × l × cm– 1. |

V

=

обем на изпитвания разтвора в милилитри (в този случай 3,14 ml)

v

=

обем на пробата в милилитри (в случая 0,2 ml)

P.M

=

молекулна маса на подлежащото на определяне вещество (в този случай за безводната лимонена киселина = 192,1)

d

=

оптичен път на кюветата в сантиметри (в този случай 1 cm)

ε

=

коефициент на поглъщане на NADH (при 340 nm),

ε

=

6,3 mmol– 1 × l × cm– 1.

Получаваме:

C = 479 × ΔА

Ако по време на приготвянето пробата е била разредена, резултатът се умножава по коефициента на разреждане.

Забележка: при 334 nm: C = 488 × Δ A (ε = 6,2 mmol- 1 × l × cm- 1)

при 365 nm: C = 887 × ΔА (ε = 3,4 mmol- 1 × l × cm- 1)

6.2.   Повторяемост (r)

За концентрация на лимонена киселина, по-малка от 400 mg/l: r = 14 mg/l.

За концентрация на лимонена киселина, по-голяма от 400 mg/l: r = 28 mg/l.

6.3.   Възпроизводимост (R)

За концентрация на лимонена киселина, по-малка от 400 mg/l: R = 39 mg/l.

За концентрация на лимонена киселина, по-голяма от 400 mg/l: R = 65 mg/l.

14   СОРБИНОВА КИСЕЛИНА (OIV - AS-313-14-ACISOR) — МЕТОД ТИП IV

1.   ПРИНЦИП НА МЕТОДА

1.1.   Определяне с ултравиолетова спектрофотометрия

Сорбиновата киселина (транс, транс, 2,4-хексадиенова киселина), извлечена чрез дестилация с водна пара, се определя количествено от винения дестилат чрез спектрофотометрия с поглъщане в ултравиолетовата област. Вещества, които смущават измерването на поглъщането в ултравиолетовата област, се отстраняват чрез изпаряване до сухо на пробата с помощта на слабо алкализиран калциев хидроокис. Наличието на количества, по-малки от 20 mg/l, се установяват с тънкослойна хроматография (чувствителност: 1 mg/l).

1.2.   Определяне с газова хроматография

Извлечената с диетилов етер сорбинова киселина се определя чрез газова хроматография с вътрешен стандарт.

1.3.   Определяне на следи от сорбинова киселина с тънкослойна хроматография

Сорбиновата киселина, извлечена с диетилов етер, се разделя чрез тънкослойна хроматография и концентрацията ѝ се определя полуколичествено.

2.   МЕТОД НА КОЛИЧЕСТВЕНО ОПРЕДЕЛЯНЕ ЧРЕЗ УЛТРАВИОЛЕТОВА СПЕКТРОМЕТРИЯ

2.1.   Реагенти

2.1.1.   Винена киселина (C4H6O6) на кристали.

2.1.2.   Разтвор на калциев хидроокис (Ca(OH)2), приблизително 0,02 M.

2.1.3.   Еталонен разтвор на сорбинова киселина (20 mg/l).

Разтварят се 20 mg сорбинова киселина (C6H8O2) в около 2 ml разтвор 0,1 M на натриев хидроокис. Съдържанието се прехвърля в мерителна колба с обем 1 000 ml и се долива до марката с вода. Възможно е също така да се разтворят 26,8 mg калиев сорбат (C6H7KO2) във вода и да се допълнят до 1 000 ml с вода.

2.2.   Апаратура

2.2.1.   Апарат за дестилация с водна пара (виж глава „Летлива киселинност“).

2.2.2.   Водна баня с температура 100 °С.

2.2.3.   Спектрофотометър, позволяващ измерване при дължина на вълната 256 nm, с кварцови кювети с оптичен път 1 cm.

2.3.   Методика

2.3.1.   Дестилация

В барботьора на апарата за дестилация с водна пара се прехвърлят 10 ml вино и се прибавят 1до 2 g винена киселина (точка 2.1.1). Вземат се 250 ml от дестилата.

2.3.2.   Еталонна крива

Чрез разреждане на еталонния разтвор (точка 2.1.3) с вода се подготвят четири еталонни разтвора, съдържащи съответно 0,5, 1, 2,5 и 5 mg сорбинова киселина на литър; Техните оптични плътности се измерват със спектрофотометъра при 256 nm спрямо дестилирана вода. Начертава се крива, показваща изменението на оптичната плътност като функция на концентрациите на разтворите. Зависимостта е линейна.

2.3.3.   Определяне

5 ml от дестилата се поставят в изпарителен съд с диаметър 55 mm и се прибавя 1 ml разтвор на калциев хидроокис (точка 2.1.2). Изпарява се във водна баня до сухо.

Остатъкът се разтваря в няколко милилитра дестилирана вода и се пренася цялото количество в мерителна колба 20 ml и се добавя вода до марката. Измерва се оптичната плътност със спектрофотометър при 256 nm спрямо еталонен разтвор, получен чрез разреждане на 1 ml разтвор на калциев хидроокис (точка 2.1.2) до 20 ml.

Измерената стойност за оптичната плътност се нанася върху еталонната крива и оттук се отчита концентрацията C на сорбинова киселина в разтвора.

Забележка: В практиката това изпаряване до сухо може да бъде пренебрегнато. Извършва се пряко измерване на оптичната плътност на дестилата, разреден с в съотношение 1:4, спрямо дестилирана вода.

2.4.   Изразяване на резултатите

2.4.1.   Метод на изчисляване

Концентрацията на сорбинова киселина във виното, изразена в милиграми на литър, е равна на:

100 × C

C = концентрация на сорбиновата киселина в разтвора (изразена в милиграми на литър), анализиран чрез спектрофотометрия,.

3.   МЕТОД НА КОЛИЧЕСТВЕНО ОПРЕДЕЛЯНЕ ЧРЕЗ ГАЗОВА ХРОМАТОГРАФИЯ

3.1.   Реагенти

3.1.1.   Диетилов етер, (C2H5)2O, дестилиран непосредствено преди употреба.

3.1.2.   Вътрешен стандартен разтвор: разтвор на ундеканова киселина (C11H22O2) и етанол 95 обемни %. в концентрация 1 g на литър.

3.1.3.   Воден разтвор на сярна киселина (H2SO4) (ρ20 = 1,84 g) ml), разреден в обемно съотношение 1:3.

3.2.   Апаратура

3.2.1.   Газов хроматограф, снабден с пламъчнойонизационен детектор и колона от неръждаема стомана (4 m × 1/8"), предварително обработена с диметилхлоросилан и напълнена със стационарна фаза, състояща се от смес на диетиленгликол сукцинат (5 %) и фосфорна киселина (1 %, DEGS-H3PO4) или диетиленгликол адипат (7 %) и фосфорна киселина (1 %, DEGA-H3PO4), фиксирана върху Gaschrom Q80 - 100 отвора/инч.

За обработването с диметилхлоросилан (DMDCS) през колоната се пропуска разтвор, съдържащ 2—3 g DMDCS в толуол. Колоната се измива незабавно с метанол; пропуска се поток от азот, след това хексан и отново поток от азот. След това може да бъде напълнена.

Условия на работа:

| | Температура на сушилнята: 175 °C. |
| --- | --- |

Температура на сушилнята: 175 °C.

| | Температура на инжектора и на детектора: 230 °C. |
| --- | --- |

Температура на инжектора и на детектора: 230 °C.

| | Газ носител: азот (дебит 200 ml/min). |
| --- | --- |

Газ носител: азот (дебит 200 ml/min).

3.2.2.   Микроспринцовка с обем 10 μl, градуира през 0,1 μl.

Забележка: Могат да бъдат използвани и други видове колони, които имат добра способност за разделяне, в частност капилярни колони (например FFAP).

Описаната методика е дадена по-долу като пример.

3.3.   Методика

3.3.1.   Подготовка на пробата за анализ

В стъклена епруветка с вместимост от около 40 ml, снабдена с шлифована запушалка, се прехвърлят 20 ml вино, прибавят се 2 ml от вътрешния стандартен разтвор (точка 3.1.2) и 1 ml от разредената сярна киселина (точка 3.1.3).

След разбъркване чрез последователни обръщания на епруветката към разтвора се добавят 10 ml диетилов етер (точка 3.1.1). Сорбиновата киселина се извлича в органичната фаза посредством разклащане на епруветката в продължение на 5 минути. Оставя се да се утаи.

3.3.2.   Приготвяне на еталонния разтвор

Избира се вино, чийто етеров екстракт не оформя максимум върху хроматограмата, съответстващ на елюирането на сорбиновата киселина; Във виното се добавя сорбинова киселина с концентрация 100 mg на литър. След това 20 ml от пробата за анализ се обработват съгласно методиката, описана в точка 3.3.1.

3.3.3.   Хроматография

С микроспринцовка се инжектират 2 μl от извлечената с етер фаза, получена, както е указано в точка 3.3.2 и 2 μl от извлечената с етер фаза, получена както е указано в точка 3.3.1.

Записват се съответните хроматограми; проверява се еднаквостта на съответните времена на задържане на сорбиновата киселина и на вътрешния стандарт. Измерва се височината (или площта) на всеки от записаните максимуми.

3.4.   Изразяване на резултатите

3.4.1.   Метод на изчисляване

Концентрацията на сорбинова киселина в анализираното вино, изразена в милиграми на литър, се изчислява по формулата:

100 x (h/H) x (l/i)

H= височина на максимума на сорбиновата киселина в еталонния разтвор

h= височина на максимума на сорбиновата киселина в пробата за анализ

l= височина на максимума на вътрешния стандарт в еталонния разтвор

i= височина на максимума на вътрешния стандарт в пробата за анализ

Забележка: Концентрацията на сорбиновата киселина може да бъде определена по същия начин, но чрез измерване на площите на съответните максимуми.

15   (OIV - AS-313-15-PH) — МЕТОД ТИП I

1.   ПРИНЦИП

Измерва се потенциалната разлика между два електрода, потопени в анализираната течност. Единият електрод има потенциал, който е функция от рН на течността, докато другият е с постоянен потенциал, който е известен, и служи като сравнителен електрод.

2.   АПАРАТУРА

2.1.   калибриран рН-метър със скала в рН единици, позволяващ провеждането на измервания минимум с точност ± 0,05.

2.2.   Електроди:

2.2.1.   Стъклен електрод, съхраняван в дестилирана вода.

2.2.2.   Еталонен електрод с каломел и наситен калиев хлорид, съхраняван в наситен разтвор на калиев хлорид.

2.2.3.   Комбиниран електрод, съхраняван в дестилирана вода.

3.   РЕАГЕНТИ

3.1.   Буферни разтвори:

3.1.1.   Наситен разтвор на кисел калиев тартрат. Разтвор, съдържащ най-малко 5,7 g/l кисел калиев тартрат (C4H5KO6), при 20 °C. Този разтвор може да съхранява в продължение на два месеца, ако се добави 0,1 g тимол на 200 ml.)

| pH | 3,57 до 20 °C
  3,56 до 25 °C
  3,55 до 30 °C |
| --- | --- |

pH

3,57 до 20 °C

3,56 до 25 °C

3,55 до 30 °C

3.1.2.   Разтвор 0,05 М на кисел калиев фталат. Разтвор, съдържащ 10,211 g/l кисел калиев фталат (C8H5KO4), при 20 °C. (Максимален срок на съхранение — два месеца.)

| pH | 3,999 до 15 °C
  4,003 до 20 °C
  4,008 до 25 °C
  4,015 до 30 °C |
| --- | --- |

pH

3,999 до 15 °C

4,003 до 20 °C

4,008 до 25 °C

4,015 до 30 °C

3.1.3.   Разтвор, съдържащ:

| монокалиев фосфат, (KH2PO4)... | 3,402 g |
| --- | --- |
| дикалиев фосфат (K2HPO4)... | 4,354 g |
| вода до ... | 1 l |

монокалиев фосфат, (KH2PO4)...

3,402 g

дикалиев фосфат (K2HPO4)...

4,354 g

вода до ...

1 l

(Максималният срок на съхранение на разтвора е два месеца.)

| pH | 6,90 до 15 °C
  6,88 до 20 °C
  6,86 до 25 °C
  6,85 до 30 °C |
| --- | --- |

pH

6,90 до 15 °C

6,88 до 20 °C

6,86 до 25 °C

6,85 до 30 °C

Забележка: Може да се използват и буферни разтвори, предлагани в търговската мрежа.

4.   МЕТОДИКА

4.1   Подготовка на пробата за анализ

4.1.1.   За гроздовата мъст и виното:

работи се директно с мъстта или виното.

4.1.2.   За ректифицираната концентрирана мъст:

ректифицираната концентрирана мъст се разрежда с вода до получаването на концентрация от 25 ± 0,5 % (тегловни) на общата захар (25 °по Брикс).

Ако P е концентрацията в тегловни (m/m) проценти на общата захар в ректифицираната концентрирана мъст, измерва се маса, равна на 2 500)/P.

и се допълва с вода до 100 g. Използваната вода трябва да има проводимост, по-малка от 2 микросименса на сантиметър.

4.2   Нулиране на уреда

Нулирането се извършва преди всяко измерване съгласно инструкциите за работа с уреда.

4.3.   Калибриране на pH-метъра

pH-метърът се калибрира при 20 °C, като се спазват инструкциите за работа с уреда при използване буферни разтвори с pH 6,88 и 3,57 при 20 °C.

За проверка на калибрирането на скалата се използва буферен разтвор с pH 4,00 при 20 °C.

4.4.   Измерване

Електродът се потапя в анализираната проба, чиято температура трябва да бъде между 20 и 25 °C и възможно най-близо до 20 °C. Стойността на pH се отчита директно от скалата.

Извършват се най-малко две определяния на една и съща проба.

Като резултат се взема средноаритметичната стойност от определянията.

5.   ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

pH на мъстта, виното или разтвора 25 % (m/m) (25 °по Брикс) на ректифицираната концентрирана мъст се дава с точност до втория десетичен знак.

16   ЕДНОВРЕМЕННО ОПРЕДЕЛЯНЕ НА L-АСКОРБИНОВА КИСЕЛИНА И НА D-ИЗОАСКОРБИНОВА КИСЕЛИНА ЧРЕЗ ВИСОКОЕФЕКТИВНА ТЕЧНОСТНА ХРОМАТОГРАФИЯ И УЛТРАВИОЛЕТОВО ДЕТЕКТИРАНЕ (OIV-AS-313-22-ACASCO) — МЕТОД ТИП II

1.   ВЪВЕДЕНИЕ

Аскорбиновата киселина е антиоксидант, който се съдържа естествено в цял ред хранителни продукти. Нормалното количество на аскорбиновата киселина в гроздето намалява при производството на мъстта и в процеса на винопроизводството. Тя може да бъде добавена към мъстта и виното в определени граници.

Описаният метод е утвърден в рамките на междулабораторни изпитвания чрез анализи на проби от вино с количества на добавените L-аскорбинова киселина и D-изоаскорбинова киселина съответно 30 mg/l - 150 mg/l и 10 mg/l - 100 mg/l.

2.   ОБЛАСТ НА ПРИЛОЖЕНИЕ

Този метод е подходящ за едновременно определяне на L-аскорбинова и на D-изоаскорбинова киселина (ериторбинова киселина) във виното чрез високоефективна течностна хроматография и ултравиолетово детектиране в интервала 3 до 150 mg/l.

За концентрации, по-големи от 150 mg/l, е необходимо разреждане на пробата.

3.   ПРИНЦИП

Пробите се инжектират директно в системата за високоефективна течностна хроматография след филтриране с мембрана. Веществата, предмет на анализ, се разделят в колона с обърнати фази и се подлагат на ултравиолетово детектиране при 266 nm. Количественото определяне на L-аскорбиновата и на D-изоаскорбиновата киселина се извършва спрямо външен стандарт.

Забележка: Колоните и работните условия са дадени като пример. Други видове колони могат също да осигурят добро разделяне.

4.   РЕАГЕНТИ И ПРОДУКТИ

4.1   Реагенти

4.1.1   n-октиламин с чистота ≥ 99,0 %

4.1.2   Натриев ацетат х 3 H2O с чистота ≥ 99,0 %

4.1.3   Безводна оцетна киселина, 100 %

4.1.4   Фосфорна киселина, прибл. 25 %

4.1.5   Оксалова киселина с чистота ≥ 99,0 %

4.1.6   Аскорбат оксидаза

4.1.7   L-аскорбинова киселина, свръхчиста, ≥ 99,5 %

4.1.8   D-изоаскорбиновата киселина с чистота ≥ 99,0 %

4.1.9   Двойнодестилирана вода

4.1.10   Метанол, p.A. 99,8 %

4.2   Приготвяне на подвижната фаза

4.2.1   Разтвори за подвижната фаза

За подвижната фаза се приготвят следните разтвори:

4.2.1.1   12,93 g n-октиламин в 100 ml метанол

4.2.1.2   68,05 g натриев ацетат x 3 H2O в 500 ml двойнодестилирана вода

4.2.1.3   12,01 g безводна оцетна киселина в 200 ml двойнодестилирана вода

4.2.1.4   Буферен разтвор pH 5,4: 430 ml разтвор на натриев ацетат (4.2.1.2) и 70 ml разтвор на оцетна киселина (4.2.1.3)

4.2.2   Приготвяне на подвижната фаза

Добавят се 5 ml разтвор на n-октиламин (4.2.1.1) към около 400 ml двойнодестилирана вода в бехерова чаша. Разтворът се довежда до рН 5,4 до 5,6 чрез добавяне на разтвор на 25 %-на фосфорна киселина (4.1.4) капка по капка. Добавят се 50 ml от буферния разтвор (4.2.1.4) и сместа се прехвърля в мерителна колба с обем 1 000 ml, след което се допълва до пълния обем на колбата с двойнодестилирана вода. Преди употреба подвижната фаза трябва да бъде филтрувана с помощта на мембрана (регенерирана целулоза 0,2 μm) и по възможност дегазирана с хелий (в продължение на 10 минути) според нуждите на използваната система за високоефективна течностна хроматография.

4.3   Приготвяне на стандартния разтвор

Забележка:

Всички стандартни разтвори (основен разтвор 4.3.1 и работни разтвори 4.3.2) трябва да бъдат приготвяни всеки ден и за предпочитане съхранявани в хладилник преди инжектиране.

4.3.1   Приготвяне на основния разтвор (1 mg/ml)

Приготвя се воден разтвор на оксалова киселина (2 %) и се отстранява разтвореният кислород чрез барботиране с азот.

Отмерват се точно 100 mg L-аскорбинова и на D-изоаскорбинова киселина в мерителна колба 100 ml и тя се напълва с воден разтвор на оксалова киселина (2 %).

4.3.2   Приготвяне на работните разтвори

По отношение на работните разтвори, основният разтвор (4.3.1) се разрежда до желаните концентрации с разтвора на солна киселина (2 %). Препоръчват се концентрации между 10 mg/l и 120 mg/l. Например 100 μl, 200 μl, 400 μl, 800 μl 1200μl до 10 ml, съответстващи на 10, 20, 40, 80 и 120 mg/l.

5.   АПАРАТУРА

Обичайна лабораторна апаратура, и по-специално следното оборудване:

5.1   Помпа за високоефективна течностна хроматография

5.2   Инжектор с контур за пробата, 20 μl;

5.3   Детектор на ултравиолетови лъчи

6.   ВЗЕМАНЕ НА ПРОБИ

Преди инжектиране се филтруват винени проби през мембрана с диаметър на порите 0,2 μm

За концентрации, по-големи от 150 mg/L, е необходимо разреждане на пробата.

7.   МЕТОДИКА

7.1   Условия за работа със системата за високоефективна течностна хроматография

В хроматографа се инжектират 20 μl от филтруваната през мембрана проба.

| Предколона | : | например Nucleosil 120 C18 (4 cm x 4 mm x 7 μm) |
| --- | --- | --- |
| Колона | : | например Nucleosil 120 C18 (25 cm x 4 mm x 7 μm) |
| Обем на инжектиране | : | 20 μl |
| Подвижна фаза | : | виж 4.2.2, изократична |
| Дебит | : | 1ml/min |
| Детектиране на УВ лъчи | : | 266 nm |
| Цикъл на изплакване | : | минимум 30 ml двойнодестилирана вода, следвани от 20 ml метанол и 30 ml ацетонитрил |

Предколона

:

например Nucleosil 120 C18 (4 cm x 4 mm x 7 μm)

Колона

:

например Nucleosil 120 C18 (25 cm x 4 mm x 7 μm)

Обем на инжектиране

:

20 μl

Подвижна фаза

:

виж 4.2.2, изократична

Дебит

:

1ml/min

Детектиране на УВ лъчи

:

266 nm

Цикъл на изплакване

:

минимум 30 ml двойнодестилирана вода, следвани от 20 ml метанол и 30 ml ацетонитрил

7.2   Разпознаване/Потвърждаване

Разпознаването на максимумите се извършва чрез сравняване на времената на задържане на стандартите и на пробите. С хроматографската система, описана в примера, времената на задържане са съответно 7,7 min за L-аскорбиновата киселина и 8,3 min за D-изоаскорбиновата киселина (виж фигура 1, хроматограма А).

С оглед на потвърждаване на положителни резултати, тези проби трябва да бъдат обработени с шпатула от аскорбат оксидаза и измерени отново (виж фигура 1, хроматограма B).

Поради разграждането на L-аскорбиновата киселина и на D-изоаскорбиновата киселина, предизвикано от аскорбат-оксидазата, по време на задържането на L-аскорбиновата киселина и на D-изоаскорбиновата киселина не трябва да има никакъв сигнал. В случай на откриване на паразитни максимуми тяхната площ трябва да бъде взета предвид при изчисляването на концентрацията на анализираните вещества.

Image

Забележка: Препоръчва се пробите, обработени с аскорбат-оксидаза, да бъдат анализирани в края на непрекъснат цикъл на изплакване, за да бъдат отстранени остатъците от аскорбат-оксидаза от колоната, без което L-аскорбиновата киселина и на D-изоаскорбиновата киселина може да бъдат преобразувани от остатъците от аскорбат-оксидаза при измерването с високоефективна течностна хроматография и резултатът може да се окаже повлиян.

8.   ИЗЧИСЛЕНИЯ

На базата на работните разтвори се изготвя еталонна крива (4.3.2).Според метода на външния стандарт, количественото определяне на L-аскорбиновата киселина и на D-изоаскорбиновата киселина се прави чрез измерване на площите на максимумите и сравняването им със съответната концентрация върху еталонната крива.

Изразяване на резултатите

Резултатите се дават с точност до един десетичен знак в mg/l съответно за L-аскорбиновата киселина и за D-изоаскорбиновата киселина (например 51,3 mg/l).

За концентрации, по-големи от 150 mg/l, се взема предвид разреждането.

9.   НАДЕЖДНОСТ

Методът е изпитан в рамките на междулабораторно изпитване, организирано през 1994 г. от бившата Федерална служба по хигиената (Bundesgesundheitsamt, Германия), в което участваха 27 лаборатории. Програмата на междулабораторното изпитване бе в съответствие с параграф 35 от германския закон относно хранителните продукти, който е приет от OIV до въвеждането на новия протокол (OENO 6/2000).

Проучването обхвана четири отделни проби от вино – две бели вина и две червени вина – с изисквани пет повторения за всяка проба. Тъй като не беше възможно да бъдат приготвени проби с достатъчна стабилност на анализираните вещества (различни скорости на разграждане), бе решено на участниците да бъдат изпратени определени количества чисти вещества – стандарти, както и пробите от виното. Лабораториите получиха като задание да прехвърлят цялото количество на стандартите в пробите от виното и да ги анализират незабавно. Бяха анализирани концентрации от 30 до 150 mg/l за L-аскорбиновата киселина и от 10 до 100 mg/l за D-изоаскорбиновата киселина. Подробните резултати от това проучване са представени в ПРИЛОЖЕНИЕТО, публикувано от OIV. Оценяването бе направено съгласно DIN/ISO 5725 (версия 1988 г.).

Средноквадратичните отклонения за повторяемостта (sr) и за възпроизводимостта (sR) бяха адекватни на концентрациите на L-аскорбиновата киселина и D-изоаскорбиновата киселина. Параметърът „действителна грешка“ може да бъде изчислен с помощта на следните уравнения:

| | L-аскорбинова киселина
  sr = 0,011 x + 0,31
  sR = 0,064 x + 1,39
  x: концентрация на L-аскорбинова киселина (mg/l) |
| --- | --- |

L-аскорбинова киселина

sr = 0,011 x + 0,31

sR = 0,064 x + 1,39

x: концентрация на L-аскорбинова киселина (mg/l)

| | D-изоаскорбинова киселина
  sr = 0,014 x + 0,31
  sR = 0,079 x + 1,29
  x: концентрация на D-изоаскорбинова киселина (mg/l) |
| --- | --- |

D-изоаскорбинова киселина

sr = 0,014 x + 0,31

sR = 0,079 x + 1,29

x: концентрация на D-изоаскорбинова киселина (mg/l)

Пример:

| | 50 mg/l D-изоаскорбинова киселина sr = 1,0 mg/L |
| --- | --- |

50 mg/l D-изоаскорбинова киселина sr = 1,0 mg/L

| | sR = 5,2 mg/L |
| --- | --- |

sR = 5,2 mg/L

10.   ДРУГИ ХАРАКТЕРИСТИКИ НА АНАЛИЗА

10.1   Граница на откриване

Границата на откриване при този метод бе оценена на 3 mg/l за L-аскорбиновата киселина и D-изоаскорбиновата киселина.

10.2   Вярност

Средният добив, изчислен въз основа на междулабораторното изпитване, проведено върху четири проби (виж ПРИЛОЖЕНИЕТО, публикувано в Сборника на OIV), e:

| — | 100,6 % за L-аскорбиновата киселина |
| --- | --- |

—

100,6 % за L-аскорбиновата киселина

| — | 103,3 % за D-изоаскорбиновата киселина |
| --- | --- |

—

103,3 % за D-изоаскорбиновата киселина

17   ВЪГЛЕРОДЕН ДВУОКИС (OIV - AS-314-01-DIOCAR) — МЕТОД ТИП II

1.   ПРИНЦИП НА МЕТОДА

1.1.   Негазирани вина (надналягане на CO2 ≤ 0,5 × 105 Pa) (2).

Обемът вино, взет от пробата, се охлажда до около 0 oС и се смесва с необходимото количество титрувален разтвор натриев хидроокис, което да доведе до рН 10-11. Титрува се с разтвор на киселина в присъствието на карбоанхидраза. Съдържанието на въглероден двуокис се изчислява от долетия обем, необходим за довеждането на рН от 8,6 (бикарбонатна форма) до 4,0 (въглена киселина). Титруването на еталонната проба се провежда при същите условия с вино, свободно от въглероден двуокис, за да се отчете обемът на разтвора на натриев хидроокис, необходим за неутрализирането на киселините във виното.

1.2.   Искрящи и пенливи вина

Пробата с виното за анализ се охлажда почти до точката на замръзване. След като се отдели известно количество вино за еталонната проба след разгазиране, останалата част от съдържанието в бутилката се алкализира, за да бъде фиксиран всичкият въглероден двуокис под формата на Na2CO3. Титрува се с разтвор на киселина в присъствието на карбоанхидраза. Съдържанието на въглеродния двуокис се намира от обема на разтвора на киселината, долят за промяна на рН от 8,6 (бикарбонатна форма) до 4,0 (въглена киселина). Титруване на еталонната проба при същите условия с вино, свободно от въглероден двуокис, позволява да бъде взет предвид обемът на разтвора на натриев хидроокис, необходим за неутрализирането на киселините във виното.

2.   ОПИСАНИЕ НА МЕТОДА

2.1.   Негазирани вина (надналягане на въглеродния двуокис ≤ 0,5×105 Pa).

2.1.1.   Апаратура

2.1.1.1.   Магнитна бъркалка.

2.1.1.2.   pH-метър.

2.1.2.   Реагенти

2.1.2.1.   Разтвор 0,1 M на натриев хидроокис (NaOH).

2.1.2.2.   Разтвор 0,05M на сярна киселина (H2SO4).

2.1.2.3.   Разтвор на карбоанхидраза (1 грам на литър).

2.1.3.   Методика

Пробата с виното, както и пипетата от 10 ml, използвана за взимането ѝ, се охлаждат до около 0 °C.

В цилиндричен съд с обем 100 ml се поставят 25 ml разтвор на натриев хидроокис (точка 2.1.2.1.); добавят се 2 капки воден разтвор на карбоанхидраза (точка 2.1.2.). С помощта на пипета, охладена до 0 °С, се добавят 10 ml от виното.

Цилиндричният съд се поставя на магнитната бъркалка, поставя се електродът и магнитният щифт и се прилага разбъркване с умерено темпо.

Когато течността достигне стайна температура, чрез бавно обливане се налива разтворът на сярна киселина (точка 2.1.2.2.) до рН 8,6.

Продължава се с обливанията със сярна киселина (точка 2.1.2.2.) до достигане на рН до 4,0. С n ml се обознача обемът киселина, изразходван за промяна на рН от 8,6 до 4,0.

Освен това посредством разбъркване във вакуум за около 3 минути, се отстранява СО2 от около 50 ml от винената проба, като колбата се загрява във водна баня до около 25 °С.

Същата процедура се повтаря и с 10 ml от разгазираното вино. С n′ ml се обозначава използвания обем.

2.1.4.   Изразяване на резултатите

1 ml от титрувалния разтвор на 0,05 М сярна киселина отговаря на 4,4 mg въглероден двуокис.

Количеството CO2 в грамове на литър вино е равно на:

0,44 (n - n′)

Дава се с точност до втория десетичен знак.

Забележка: При вина с ниско съдържание на CO2 (CO2 < 1 g/l), добавянето на карбоанхидраза като катализатор на хидратацията на CO2 не е необходимо.

2.2.   Искрящи и пенливи вина

2.2.1.   Апаратура

2.2.1.1.   Магнитна бъркалка.

2.2.1.2.   pH-метър.

2.2.2.   Реагенти

2.2.2.1.   Натриев хидроокис (NaOH), 50 тегловни %

2.2.2.2.   Разтвор 0,05M на сярна киселина (H2SO4).

2.2.2.3.   Разтвор на карбоанхидраза (1 грам на литър).

2.2.3.   Методика

Бутилката с виното, подлежащо на анализиране, се маркира на нивото на напълване и след това се охлажда до започване на замръзването.

Бутилката се оставя леко да се затопли при разклащане, до изчезване на ледените кристали.

Тапата се отстранява бързо и 45 до 50 ml от виното се пренасят в мензура за целите на еталонното определяне. Точният обем на тази проба, v ml, се определя от скалата на мензурата, след връщане към околната температура.

Веднага щом бъде взета тази проба, в бутилката към съдържание с обем 750 ml се добавят 20 ml от разтвора на натриев хидроокис (точка 2.2.2.1.).

Изчаква се, докато виното се върне към стайна температура.

В цилиндричен съд от 100 ml се прехвърлят 30 ml преварена дестилирана вода и 2 капки от разтвора на карбоанхидраза (точка 2.2.2.3.). Добавят се 10 ml от предварително алкализираното вино.

Съдът се поставя върху магнитната бъркалка, поставят се електродът и магнитният щифт и се прилага разбъркване с умерено темпо.

Чрез бавно обливане се налива разтворът на сярна киселина (точка 2.1.2.2.) до достигане на рН 8,6.

Продължава се с обливанията със сярна киселина (точка 2.2.2.2.) до достигане на рН 4,0. С n ml се обознача обемът киселина, използван за променяне на рН от 8,6 до 4,0.

Освен това посредством разбъркване във вакуум за около 3 минути, се отстранява СО2 от около 50 ml от винената проба като колбата се загрява във водна баня до около 25 oС. 10 ml от разгазираното вино се поставят в 30 ml преварена дестилирана вода, добавят се 2 - 3 капки разтвор на натриев хидроокис (точка 2.2.2.1.), за да се доведе рН до 10 - 11. След това се прилага гореописаната логика. С n′ ml се обозначава обемът на добавената 0,05 М сярна киселина.

2.2.4.   Изразяване на резултатите

1 ml разтвор на сярна киселина 0,05 M съответства на 4,4 mg CO2.

Бутилката с алкализираното вино се изпразва и първоначалният обем на виното (V ml) се определя с точност 1 ml чрез доливане до марката.

Количеството CO2, изразено в грамове на литър вино, се изчислява по следната формула:

0,44(n – n′) x ((V – v + 20)/(V – v))

Дава се с точност до втория десетичен знак.

2.3.   Изчисляване на теоретичното надналягане

Надналягането при 20 °C (Paph20), изразено в паскали, се изчислява по следната формула:

Paph20 = ((Q)/(1,951 × 10–5(0,86 - 0,01 A)(1 - 0,00144 S))) - Patm

където:

| Q | : | съдържание на CO2 във виното (g/l) |
| --- | --- | --- |
| A | : | алкохолно съдържание на виното при 20 °C |
| S | : | съдържание на захар във виното (g/l) |
| Patm | : | атмосферното налягане в паскали. |

Q

:

съдържание на CO2 във виното (g/l)

A

:

алкохолно съдържание на виното при 20 °C

S

:

съдържание на захар във виното (g/l)

Patm

:

атмосферното налягане в паскали.

18   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ВЪГЛЕРОДЕН ДВУОКИС ВЪВ ВИНОТО ПО МАНОМЕТЪРНИЯ МЕТОД (OIV – AS314-04-CO2MAN) — МЕТОД ТИП II

(pro memoria)

[Описанието на този метод за анализ е предмет на актуализиране от органите на OIV. То ще бъде публикувано в следващо Съобщение на Комисията, щом OIV публикува актуализиран текст в изданието за 2010 г. на „Сборника с международните методи за анализ“ на OIV.]

19   ИМЕРВАНЕ НА НАДНАЛЯГАНЕТО В ПЕНЛИВИТЕ И ИСКРЯЩИ ВИНА (OIV - AS-314-02-SURPRES) — МЕТОД ТИП I

1.   ПРИНЦИП

След стабилизиране на температурата и разклащане на бутилката надналягането се измерва с помощта на афрометър (манометър). То се изразява в паскали (Pa) (метод тип I). Методът се прилага също и за газирани пенливи вина и за газирани искрящи вина.

2.   АПАРАТУРА

Апаратът, с който се измерва надналягането в бутилките с пенливо и искрящо вино, се нарича афрометър. Той може да бъде с различен в зависимост от начина на затваряне на бутилката (с метална капачка, кроненкоркова капачка, коркова тапа или пластмасова запушалка).

2.1.   Бутилки, затворени с капачка

Афрометърът е съставен от три части (фигура 1):

| — | горната част (винтов иглодържател) е съставена от манометър, пръстен за ръчно затягане, безконечен винт, който се мести по средната част, и игла, която минава през капачката. В иглата има страничен отвор, който предава налягането към манометъра. Уплътнение осигурява непроницаемостта на съединението на целия уред към капачката на бутилката, |
| --- | --- |

—

горната част (винтов иглодържател) е съставена от манометър, пръстен за ръчно затягане, безконечен винт, който се мести по средната част, и игла, която минава през капачката. В иглата има страничен отвор, който предава налягането към манометъра. Уплътнение осигурява непроницаемостта на съединението на целия уред към капачката на бутилката,

| — | като средната част (гайката) служи за центриране на горната част. Тя се завинтва в долната част, като държи целия уред здраво върху бутилката, |
| --- | --- |

—

като средната част (гайката) служи за центриране на горната част. Тя се завинтва в долната част, като държи целия уред здраво върху бутилката,

| — | долната част (опората) е снабдена с един издатък, който се плъзга под пръстена на бутилката, като по този начин държи целия апарат. Има пръстени, които са предвидени да пасват на всякакъв тип бутилки. |
| --- | --- |

—

долната част (опората) е снабдена с един издатък, който се плъзга под пръстена на бутилката, като по този начин държи целия апарат. Има пръстени, които са предвидени да пасват на всякакъв тип бутилки.

2.2.   Бутилки с коркови тапи

Афрометътрът е съставен от две части (фигура 2):

| — | Горната част е еднаква с тази от предходния уред, но иглата е по-дълга. Тя е съставена от дълга куха тръба, в края на която има острие, което спомага за преминаването през корковата тапа. Това острие се отделя и пада във виното след като пробие корковата тапа |
| --- | --- |

—

Горната част е еднаква с тази от предходния уред, но иглата е по-дълга. Тя е съставена от дълга куха тръба, в края на която има острие, което спомага за преминаването през корковата тапа. Това острие се отделя и пада във виното след като пробие корковата тапа

| — | долната част е съставена от гайката и от основа, която намира опора върху тапата. Тя е снабдена с четири затягащи винта, които служат да държат целия уред върху тапата. |
| --- | --- |

—

долната част е съставена от гайката и от основа, която намира опора върху тапата. Тя е снабдена с четири затягащи винта, които служат да държат целия уред върху тапата.

| | |
| --- | --- |

Image

Image

Забележки относно манометрите, с които са снабдени тези два вида уреди:

| — | те могат да бъдат или механични с бурдонова тръба, или цифрови с пиезоелектричен датчик. В първия случай бурдоновата тръба трябва да е изработена от неръждаема стомана |
| --- | --- |

—

те могат да бъдат или механични с бурдонова тръба, или цифрови с пиезоелектричен датчик. В първия случай бурдоновата тръба трябва да е изработена от неръждаема стомана

| — | те са градуирани в паскали (съкр. Ра). За пенливи вина е по-практично като измервателни единици да се използват паскали х 105 (105 Ра), или килопаскали (kРа) |
| --- | --- |

—

те са градуирани в паскали (съкр. Ра). За пенливи вина е по-практично като измервателни единици да се използват паскали х 105 (105 Ра), или килопаскали (kРа)

| — | те могат да бъдат различни класове. Класът на точност на един манометър е грешката на отчета, отнесена към цялата скала, изразена в проценти (напр.: манометър 1 000 kPa с клас 1 означава максимално работно налягане 1 000 kPa, отчет ± 10 kPa). За точни измервания се препоръчват уреди с клас 1. |
| --- | --- |

—

те могат да бъдат различни класове. Класът на точност на един манометър е грешката на отчета, отнесена към цялата скала, изразена в проценти (напр.: манометър 1 000 kPa с клас 1 означава максимално работно налягане 1 000 kPa, отчет ± 10 kPa). За точни измервания се препоръчват уреди с клас 1.

3.   МЕТОДИКА

Измерванията трябва да се извършват върху бутилки, чиято температура е стабилизирана в продължение минимум на 24 часа. След пробиване на кроненкорковата капачка, корковата тапа или пластмасовата запушалка, бутилката се разклаща силно до достигане на постоянно налягане, за да се снеме отчет.

3.1.   Бутилки с капачки

Издатъкът на основата се плъзва под пръстена на бутилката. Гайката се затяга, докато целият уред бъде добре затегнат върху бутилката. След това горната част се завинтва в гайката. За избягване на загубите на газ капачката трябва да бъде пробита възможно най-бързо, за да бъде приведено уплътнението в контакт с капачката. След това бутилката трябва да се разклати силно до достигане на постоянно налягане, за да се снеме отчет.

3.2.   Бутилки с коркова тапа

В края на иглата се поставя острие. Целият уред се поставя върху корковата тапа. Затягат се четирите винта върху корковата тапа. Затяга се горната част (след това иглата преминава през тапата). Острието трябва да падне в бутилката, за да може налягането да се предаде към манометъра. Снемането на отчет се прави след разклащане на бутилката до достигане до постоянно налягане. След снемането на отчет острието се прибира обратно.

4.   ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Надналягането при 20 °С (Paph20) се изразява в паскали (Ра) или в килопаскали (kРа). То трябва да бъде в съответствие с грешката на манометъра (например: 6,3 × 105 Pa или 630 kPa, а не 6,33 × 105 Pa или 633 kPa за манометър клас 1 с обхват 1 000 kРа).

Когато температурата, при която се измерва, е различна от 20 °С, трябва да бъде въведена корекция, като измереното налягане бъде умножено по съответния коефициент (виж таблица 1).

Таблица 1

Отношение на надналягането Paph20 при пенливи или искрящи вина при 20 °С къмто надналягането Paph
  t
  при температура t

| °C | |
| --- | --- |
| 0 | 1,85 |
| 1 | 1,80 |
| 2 | 1,74 |
| 3 | 1,68 |
| 4 | 1,64 |
| 5 | 1,59 |
| 6 | 1,54 |
| 7 | 1,50 |
| 8 | 1,45 |
| 9 | 1,40 |
| 10 | 1,36 |
| 11 | 1,32 |
| 12 | 1,28 |
| 13 | 1,24 |
| 14 | 1,20 |
| 15 | 1,16 |
| 16 | 1,13 |
| 17 | 1,09 |
| 18 | 1,06 |
| 19 | 1,03 |
| 20 | 1,00 |
| 21 | 0,97 |
| 22 | 0,95 |
| 23 | 0,93 |
| 24 | 0,91 |
| 25 | 0,88 |

°C

0

1,85

1

1,80

2

1,74

3

1,68

4

1,64

5

1,59

6

1,54

7

1,50

8

1,45

9

1,40

10

1,36

11

1,32

12

1,28

13

1,24

14

1,20

15

1,16

16

1,13

17

1,09

18

1,06

19

1,03

20

1,00

21

0,97

22

0,95

23

0,93

24

0,91

25

0,88

5.   КОНТРОЛ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Метод за директно определяне на физичните параметри (метод по критерии тип I)

Проверка на афрометрите

Афрометрите трябва да бъдат проверявани редовно (най-малко веднъж годишно)

Проверката се извършва с помощта на калибриращ стенд. Тя позволява манометърът, който се проверява, да бъде сравнен с еталонен еталонен манометър от по-висок клас, проследими към националните еталони и свързан успоредно на първия. С проверката се сравняват стойностите, които отчитат двата уреда при нарастващи и намаляващи налягания. Ако между двата има разлика, има предвиден регулиращ винт за извършване на необходимите корекции.

Всички лаборатории и упълномощени организации са оборудвани с такива калибриращи стендове; такива се предлагат също и от производителите на манометри.

20   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ЛИЗОЗИМ ВЪВ ВИНОТО ЧРЕЗ ВИСОКОЕФЕКТИВНА ТЕЧНОСТНА ХРОМАТОГРАФИЯ (HPLC) (OIV-AS-315-14) — МЕТОД ТИП IV

1.   ВЪВЕДЕНИЕ

За предпочитане е при лизозима да се използва аналитичен метод, който не се основава на ензимната активност.

2.   ОБЛАСТ НА ПРИЛОЖЕНИЕ

Този метод позволява количествено определяне на лизозима (mg протеин / литър) в белите и червените вина, независимо от ензимната активност (която може да бъде влошена от частично денатуриране или от явленията образуване на комплексни съединения и съутаяване) на матрицата.

3.   ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Високоефективната течностна хроматография предлага аналитичен метод, основаващ се на взаимодействие от пространствен, полярен или адсорбционен тип между неподвижната фаза и анализираното вещество и, следователно, без връзка с действителната ензимна активност на протеина.

4.   ПРИНЦИП

Анализът се извършва с високоефективната течностна хроматография, като се комбинира спектрофотометричен детектор със спектрофлуориметричен детектор. Неизвестното съдържание на винената проба се изчислява в зависимост от площта на хроматографския максимум, като се използва методът на външното калибриране.

5.   РЕАГЕНТИ

5.1.   Разтворители и разтвори

Ацетонитрил (CH3CN) за анализ чрез HPLC

Чиста трифлуороцетна киселина (TFA)

Дейонизирана вода за анализ чрез HPLC

Стандартен разтвор: винена киселина 1 g/l, етилов алкохол 10 обемни % (v/v), доведен до pH 3,2 с неутрален калиев тартрат

5.2.   Елюиращи агенти

| A | : | CH3CN 1 %, TFA 0,2 %, H2O= 98,8 % |
| --- | --- | --- |
| B | : | CH3CN 70 %, TFA 0,2 %, H2O= 29,8 % |

A

:

CH3CN 1 %, TFA 0,2 %, H2O= 98,8 %

B

:

CH3CN 70 %, TFA 0,2 %, H2O= 29,8 %

5.3.   Еталонни разтвори

От 1 до 250 mg/l стандартен лизозим, разтворен в разтвор-образец чрез продължително разклащане в продължение на поне 12 часа.

6.   АПАРАТНА ЧАСТ

6.1.   Уред за високоефективна течностна хроматография със система за помпане, предвидено за осъществяването на градиент на отмиване

6.2.   Гнездо за термостатирана колона (пещ)

6.3.   Спектрофотометричен детектор, комбиниран със спектрофлуориметричен детектор

6.4.   Контур за инжектиране, 20 μl

6.5.   Полимерна колона с обърнати фази с фенилни функционални групи (диаметър на порите 1 000 Å, граница на проникване = 1 000 000 Da), например Tosoh Bioscience TSK-gel Phényl 5PW RP 7,5 cm x 4,6 mm (вътр. диам.)

6.6.   Предколона в същия материал като колоната, например, Tosoh Bioscience TSK-gel Phényl 5PW RP Guardgel 1,5 cm x 3,2mm вътр. диам.

7.   ПРИГОТВЯНЕ НА ПРОБАТА

Пробите от вино се подкиселяват с HCl (10 М), разредена в съотношение 1/10, и 5 минути след добавянето биват филтрувани с филтър от полиамид, чиито пори са с диаметър 0,22 μm. Хроматографският анализ се извършва веднага след филтруването.

8.   УСЛОВИЯ НА РАБОТА

8.1.   Дебит на елюиращия агент: 1ml/min

8.2.   Температура на колоната: 30 °C

8.3.   Спектрофотометрично детектиране: 280 nm

8.4.   Спектрофлуориметрично детектиране: λ ex = 276 nm ; λ em = 345 nm ; Усилване = 10

8.5.   Програма за градиента на елюиране

| Време (минимум) | Разтв. А % | Разтв B % | нарастване |
| --- | --- | --- | --- |
| 0 | 100 | 0 | |
| | | | изократично |
| 3 | 100 | 0 | |
| | | | линейно |
| 10 | 65 | 35 | |
| | | | изократично |
| 15 | 65 | 35 | |
| | | | линейно |
| 27 | 40,5 | 59,5 | |
| | | | линейно |
| 29 | 0 | 100 | |
| | | | изократично |
| 34 | 0 | 100 | |
| | | | линейно |
| 36 | 100 | 0 | |
| | | | изократично |
| 40 | 100 | 0 | |

Време (минимум)

Разтв. А %

Разтв B %

нарастване

0

100

0

изократично

3

100

0

линейно

10

65

35

изократично

15

65

35

линейно

27

40,5

59,5

линейно

29

0

100

изократично

34

0

100

линейно

36

100

0

изократично

40

100

0

8.6.   Средно време на задържане на лизозима: 25,50 минути

9.   ИЗЧИСЛЯВАНЕ

Еталонните разтвори със следните концентрации на лизозим се анализират трикратно: 1; 5; 10; 50; 100; 200; 250 mg/l. На всяка хроматограма площите на съответстващия на лизозима максимум, се нанасят на диаграма в зависимост от съответните концентрации с цел да се получат правите на линейна регресия, определени с уравнението Y=ax+b. Коефициентът на определяне r2 трябва да бъде > 0,999.

10.   ХАРАКТЕРИСТИКИ НА МЕТОДА

С оглед оценяване на годността на метода за формулираната цел беше направено проучване за утвърждаване при отчитане на линейността, границите на откриване и количественото определяне, както и на грешката на метода. Последният параметър беше определен чрез дефиниране на нивото на погрешност и точност на метода.

| | Област на линейност
  (mg/l) | Наклон на правата | Коефициент на определяне
  (r2) | ГО (mg/l) | ГКО (mg/l) | Повторяемост (n=5) RSD % | Повторяемост (n=5) RSD % |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Ст.р-р1 | Ч.В.2 | Б.В.3 | Ст.р-р1 |
| Детектор на УВ лъчи | 5-250 | 3,786 | 0,9993 | 1,86 | 6,20 | 4,67 | 5,54 | 0,62 | 1,93 |
| Детектор на флуоресценция | 1-250 | 52,037 | 0,9990 | 0,18 | 0,59 | 2,61 | 2,37 | 0,68 | 2,30 |

Област на линейност

(mg/l)

Наклон на правата

Коефициент на определяне

(r2)

ГО (mg/l)

ГКО (mg/l)

Повторяемост (n=5) RSD %

Повторяемост (n=5) RSD %

Ст.р-р1

Ч.В.2

Б.В.3

Ст.р-р1

Детектор на УВ лъчи

5-250

3,786

0,9993

1,86

6,20

4,67

5,54

0,62

1,93

Детектор на флуоресценция

1-250

52,037

0,9990

0,18

0,59

2,61

2,37

0,68

2,30

Таблица 1: Данни относно характеристиките на метода: Ст.р-р1 - стандартен разтвор; Ч.В.2 – червено вино; Б.В.3—бяло вино

10.1.   Линейност на метода

Въз основа на резултатите, получени благодарение на линейния регресионен анализ, методът се оказва линеен за областите, посочени в таблица 1.

10.2.   Граница на откриване и на количествено определяне

Границата на откриване (ГО) и границата на количествено определяне (ГКО) са изчислени като сигнал, еквивалентен съответно на 3 пъти и 10 пъти фоновия хроматографски шум при работни условия върху действително матрица (таблица 1).

10.3.   Грешка на метода

Отчитаните параметри са повторяемост и възпроизводимост. Таблица 1 съдържа стойностите на тези параметри (изразени в % средноквадратично отклонение при многократни измервания при различни концентрации), снети за стандартния разтвор за бяло вино и червено вино.

10.4.   Точност на метода

Процентният добив е изчислен за стандартните разтвори, съдържащи 5 и 50 mg/l лизозим, с добавено към тях определено количество лизозим, както е посочено в следната таблица.

| | [C] първоначална, номинална (mg/l) | Добавено (mg/l) | [C] теоретична
  (mg/l) | [C] определена
  (mg/l) | Средноквадратично отклонение | Добив |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| детектор за УВ лъчи 280 nm | 50 | 13,1 | 63,1 | 62,3 | 3,86 | 99 |
| Детектор на флуоресценция | 50 | 13,1 | 63,1 | 64,5 | 5,36 | 102 |
| детектор за УВ лъчи 280 nm | 5 | 14,4 | 19,4 | 17,9 | 1,49 | 92,1 |
| Детектор на флуоресценция | 5 | 14,4 | 19,4 | 19,0 | 1,61 | 97,7 |

[C] първоначална, номинална (mg/l)

Добавено (mg/l)

[C] теоретична

(mg/l)

[C] определена

(mg/l)

Средноквадратично отклонение

Добив

детектор за УВ лъчи 280 nm

50

13,1

63,1

62,3

3,86

99

Детектор на флуоресценция

50

13,1

63,1

64,5

5,36

102

детектор за УВ лъчи 280 nm

5

14,4

19,4

17,9

1,49

92,1

Детектор на флуоресценция

5

14,4

19,4

19,0

1,61

97,7

Image

21   СУЛФАТИ (OIV- AS-321-05-SULFAT) — МЕТОД ТИП II

1.   ПРИНЦИП НА МЕТОДИТЕ

1.1.   Стандартен метод

Утаяване на бариевия сулфат и претегляне. Утаеният при същите условия бариев сулфат се отстранява чрез промиване на утайката със солна киселина.

Когато се анализират гроздова мъст или вино, богати на серен двуокис, се препоръчва предварителна десулфитация чрез кипене в затворен съд.

1.2.   Бърз метод за изследване

Вината се класифицират в няколко категории, като се използва т.нар. метод на граничните стойности, който се основава на утаяването на бариевия сулфат чрез титруване с титрувален разтвор на бариеви йони.

2.   СТАНДАРТЕН МЕТОД

2.1.   Реагенти

2.1.1.   Разтвор 2 M на солна киселина.

2.1.2.   Разтвор на бариев хлорид (BaCl2 · 2H2O), 200 g/l.

2.2.   Методика

2.2.1.   Общ случай

В 50 ml-ва епруветка за центрофугиране се отливат 40 ml от пробата за анализ; добавят се 2 ml солна киселина 2 M и 2 ml разтвор на бариев хлорид 200 g/l; разбърква се със стъклена бъркалка; бъркалката се изплаква с малко дестилирана вода и се оставя да престои 5 минути. Центрофугира в продължение на 5 минути, след което се отделя внимателно надпреципитатната течност.

След това утайката от бариев сулфат се промива, като се процедира, както следва: Добавят се 5 ml солна киселина 2 М, утайката се привежда в суспензия и се центрофугира продължение на 5 минути. Внимателно се отделя надпреципитатната течност. Промиването се повтаря два пъти при същите условия, като всеки път се използват по 15 ml дестилирана вода.

Цялото количество на утайката се прехвърля с промиване с дестилирана вода в плътно затворен тариран платинен тигел, след което се поставя във водна баня при температура 100 °С до пълно изпаряване. Сухата утайка се накалява няколко пъти за кратко време на пламък до получаването на бял остатък. Оставя се да се охлади в сушилен шкаф и се претегля.

Получената маса на бариевия сулфат в милиграми се означава с m.

2.2.2.   Частен случай: сулфитирана мъст и вино с високо съдържание на серен двуокис

Серният двуокис се отстранява предварително.

В ерленмайерова колба с вместимост 500 ml, снабдена с делителна фуния и епруветка за отвеждане на течността, се отмерват 25 ml вода и 1 ml чиста солна киселина (ρ20 = 1,15—1,18 g) ml). Разтворът се довежда до кипене, за да се отстрани въздухът, и се добавят 100 ml вино през делителната фуния при поддържане на кипенето. Кипенето продължава, докато обемът на течността в колбата намалее до около 75 ml, като след охлаждане цялото количество се прехвърля в мерителна колба от 100 ml. Долива се с вода до марката за нивото. Пристъпва се към определянето на сулфати в проба от 40 ml в съответствие с точка 2.2.1.

2.3.   Изразяване на резултатите

2.3.1.   Изчисления

Съдържанието на сулфати, изразено в милиграми на литър калиев сулфат K2SO4, е:

18,67 × m

Съдържанието на сулфати в мъст или вино се изразява в милиграми на литър калиев сулфат с точност до цяло число.

2.3.2.   Повторяемост

до 1 000 mg/l: r = 27 mg/l

около 1 500 mg/l: r = 41 mg/l

2.3.3.   Възпроизводимост

до 1 000 mg/l: R = 51 mg/l

около 1 500 mg/l: R = 81 mg/l

22   ЖЕЛЯЗО (OIV - AS-322-05-FER) — МЕТОД ТИП IV

1.   ПРИНЦИП НА МЕТОДИТЕ

СТАНДАРТЕН МЕТОД

След подходящо разреждане на виното и отстраняване на алкохола съдържанието на желязо се определя директно чрез атомноабсорбционна спектрофотометрия.

ОБИКНОВЕН МЕТОД

След минерализиране на виното с перхидрол, желязото, което е със степен на окисление III, бива редуцирано до степен на окисление II и се определя въз основа на червеното оцветяване, получено при взаимодействието му с ортофенантролин.

2.   СТАНДАРТЕН МЕТОД

2.1.   Реагенти

2.1.1.   Концентриран стандартен разтвор на Fe(III), 1 g на литър.

Използва се стандартен разтвор 1 g/l от търговската мрежа. Този разтвор може да бъде приготвен, като се разтворят 8,6341 g фериамониев сулфат (FeNH4(SO4)2 12H2O) в дестилирана вода, леко подкиселена със солна киселина 1М, като обемът се довежда до 1 литър.

2.1.2.   Разреден стандартен разтвор на желязо с концентрация 100 mg/l.

2.2.   Апаратура

2.2.1.   Ротационен изпарител с термостатирана водна баня.

2.2.2.   Атомноабсорбционен спектрофотометър с горелка, захранвана с въздух и ацетилен.

2.2.3.   Лампа с кух катод от желязо.

2.3.   Методика

2.3.1.   Приготвяне на пробата

Алкохолът се отстранява от виното, като се намали обемът на пробата наполовина с ротационен изпарител (50 - 60 °C). Допълва се до първоначалния обем с дестилирана вода.

Ако е необходимо, преди определянето пробата се разрежда.

2.3.2.   Калибриране

В пет мерителни колби от 100 ml се поставят съответно 1, 2, 3, 4 и 5 ml от разтвора, съдържащ 100 mg желязо на литър (точка 2.1.2.), като съдържанието се допълва до 100 ml с дестилирана вода. Така приготвените разтвори съдържат съответно 1, 2, 3, 4 и 5 mg желязо на литър.

Тези разтвори се съхраняват в шишета от полиетилен.

2.3.3.   Определяне

Избира се дължина на вълната 248,3 nm. Нулата на скалата за отчитане на оптична плътност се настройва, като се използва дестилирана вода. Разредената проба се подава директно в горелката на спектрофотометъра, а след това последователно петте стандартни разтвора, приготвени както е указано в точка 2.3.2. Отчитат се оптичните плътности. Всяко определяне се извършва два пъти.

2.4.   Изразяване на резултатите

2.4.1.   Метод на изчисляване

Построява се кривата на зависимостта на оптичната плътност от концентрацията на желязо в стандартните разтвори. Върху тази крива се нанася средната стойност на оптичната плътност, получена за пробата с разредено вино, и се определя концентрацията на желязо С.

Концентрацията на желязо, изразена в милиграми на литър вино с точност до един десетичен знак, е равна на:

C x F

F = коефициент на разреждане.

23   МЕД (OIV – AS 322-06) — МЕТОД ТИП IV

1.   ПРИНЦИП НА МЕТОДА

Използва се атомноабсорбционна спектрофотометрия.

2.   АПАРАТУРА

2.1.   Платинен тигел.

2.2.   Атомноабсорбционен спектрофотометър

2.3.   Лампа с кух катод от мед.

2.4.   Захранване с газ: въздух/ацетилен или азотен двуокис/ацетилен.

3.   РЕАГЕНТИ

3.1.   Метална мед.

3.2.   Концентрирана азотна киселина 65 % (HNO3, ρ20 = 1,38 g/ml).

3.3.   Разредена азотна киселина, 1:2 (v/v).

3.4.   Разтвор на мед 1 g/l.

Използва се стандартен разтвор на мед 1 g/l от търговската мрежа. Такъв разтвор може да се приготви, като се отмери 1 g метална мед и това количество се прехвърли в мерителна колба от 1 000 ml. Добавя се разредена азотна киселина в съотношение 1:2 (точка 3.3) в точното количество, достатъчно да разтвори метала. Добавят се 10 ml от концентрираната азотна киселина (точка 3.2) и с двойнодестилирана вода се допълва до марката.

3.5.   Разтвор на мед, 100 mg/l.

В мерителна колба с обем 100 ml се поставят 10 ml от разтвора, приготвен по точка 3.4, и с двойнодестилирана вода колбата се допълва до пълния ѝ обем.

4.   МЕТОДИКА

4.1.   Приготвяне на пробата и определяне съдържанието на мед

В мерителна колба с обем 100 ml се поставят 20 ml от пробата и се допълва до марката с двойнодестилирана вода. Ако е необходимо, се променя разреждането.

От атомноабсорбционния спектрофотометър се отчита оптичната плътност на разредената проба при дължина на вълната 324,8 nm, след като с дестилирана вода е настроена нулата на скалата за отчитане на оптична плътност. При необходимост с двойнодестилирана вода се приготвя подходящо разреден разтвор.

4.2.   Определяне на еталонната крива

В мерителни колби с обем 100 ml се отмерват съответно 0,5, 1 и 2 ml от разтвора по точка 3.5. (100 mg мед на литър) и обемът им се допълва до 100 ml с двойнодестилирана вода; така приготвените разтвори съдържат съответно по 0,5, 1 и 2 mg мед на литър. Със стойностите за оптичните плътности на тези разтвори, измерени както е описано в точка 4.1, се построява еталонната крива.

5.   ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

Върху еталонната крива се нанася измерената оптична плътност за пробата с разредено вино и се отчита концентрацията С в mg/l.

Ако F е коефициентът на разреждане, съдържанието на мед в милиграми на литър се изчислява по формулата: F x C.

То се изчислява с точност до два десетични знака.

Забележки:

| a) | Разтворите за построяване на еталонната крива и разрежданията на пробата трябва обаче да бъдат избрани в зависимост от чувствителността на използвания уред и от концентрацията на мед в пробата. |
| --- | --- |

a)

Разтворите за построяване на еталонната крива и разрежданията на пробата трябва обаче да бъдат избрани в зависимост от чувствителността на използвания уред и от концентрацията на мед в пробата.

| б) | При много ниски концентрации на мед в пробата методиката е както следва: в платинен тигел се поставят 100 ml от пробата; изпарява се във водна баня при 100 °С, до получаване на гъстота на сироп, добавя се на капки 2,5 ml концентрирана азотна киселина (точка 3.2), като трябва да има стремеж да се покрие на цялото дъно на тигела. Остатъкът се изгаря внимателно до пепел на електрически котлон или слаб пламък; след това тигелът се вкарва в муфелна пещ, регулирана на 500 °С ± 25 °С, и се оставя в продължение на около час. След като бъде охладена, пепелта се овлажнява с 1 ml концентрирана азотна киселина (точка 3.2.), докато се размачква с малка стъклена пръчка; оставя се да се изпари и отново се изгаря като предходния път. Тигелът се поставя отново в пещта за 15 минути; тази обработка с концентрирана азотна киселина се повтаря най-малко три пъти. Пепелта се разтваря, като в съда се добавят 1 ml концентрирана азотна киселина (точка 3.2.) и 2 ml двойнодестилирана вода; прехвърля се в колба от 10 ml. Тигелът се измива три пъти, като всеки път се използват по 2 ml двойнодестилирана вода; обемът на колбата се допълва до марката с двойнодестилирана вода.. Процедира се с количественото определяне, както е указано в 4.1, като се използват 10 ml разтвор; за изразяването на резултатите се държи сметка за коефициента на концентрация. |
| --- | --- |

б)

При много ниски концентрации на мед в пробата методиката е както следва: в платинен тигел се поставят 100 ml от пробата; изпарява се във водна баня при 100 °С, до получаване на гъстота на сироп, добавя се на капки 2,5 ml концентрирана азотна киселина (точка 3.2), като трябва да има стремеж да се покрие на цялото дъно на тигела. Остатъкът се изгаря внимателно до пепел на електрически котлон или слаб пламък; след това тигелът се вкарва в муфелна пещ, регулирана на 500 °С ± 25 °С, и се оставя в продължение на около час. След като бъде охладена, пепелта се овлажнява с 1 ml концентрирана азотна киселина (точка 3.2.), докато се размачква с малка стъклена пръчка; оставя се да се изпари и отново се изгаря като предходния път. Тигелът се поставя отново в пещта за 15 минути; тази обработка с концентрирана азотна киселина се повтаря най-малко три пъти. Пепелта се разтваря, като в съда се добавят 1 ml концентрирана азотна киселина (точка 3.2.) и 2 ml двойнодестилирана вода; прехвърля се в колба от 10 ml. Тигелът се измива три пъти, като всеки път се използват по 2 ml двойнодестилирана вода; обемът на колбата се допълва до марката с двойнодестилирана вода.. Процедира се с количественото определяне, както е указано в 4.1, като се използват 10 ml разтвор; за изразяването на резултатите се държи сметка за коефициента на концентрация.

24   ОПРЕДЕЛЯНЕ НА СЯРА (OIV - AS-323-04-DIOSU) — МЕТОД ТИП II

1.   ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Под серен двуокис се разбира присъстващият в мъстта или виното серен двуокис в следните форми: H2SO3, H SO3, равновесието между които е функция на pH и температурата:

H2SO3 ←→ H+ + HSO3
  -

H2SO3 представлява молекулният серен двуокис.

Под общ серен двуокис се разбира съвкупността от различните форми на серен двуокис, намиращи се във виното в свободно състояние или свързани с неговите съставки.

2.   СВОБОДЕН И ОБЩ СЕРЕН ДВУОКИС

2.1.   Принцип на методите

2.1.1.   Стандартен метод

2.1.1.1.   Вино и мъст

Серният двуокис се увлича в поток на въздух или азот; той се фиксира и или окислява чрез барботиране в разреден и неутрален разтвор на водороден прекис. Образувалата се сярна киселина се определя чрез титруване със стандартен разтвор на натриев хидроокис. Свободният серен двуокис се извлича от виното чрез увличане при ниска температура (10 °C).

Общият серен двуокис във виното се извлича чрез увличане при висока температура (около 100 °C).

2.1.1.2.   Ректифицирана концентрирана гроздова мъст

Общият серен двуокис се извлича от предварително разредена ректифицирана концентрирана мъст чрез увличане при висока температура (около 100 °C).

2.1.2.   Бърз метод за определяне (вино и мъст)

Свободният серен двуокис се определя чрез директно йодометрично титруване.

Свързаният серен двуокис след това се определя чрез йодометрично титруване след алкална хидролиза. Когато се добави към свободния серен двуокис, се получава общият серен двуокис.

2.2.   Стандартен метод

2.2.1.   Апаратура

2.2.1.1.   Използваният уред трябва да е в съответствие с показаната по-долу схема и по-специално с изискванията за хладника.

Image

Тръбата за отвеждане на газовете в барботьора „B“ завършва с малка сфера с диаметър 1 cm, която по хоризонталния си голям кръг има 20 отвора с големина 0,2 mm. Тя може също така да завършва с плака от синтеровано стъкло (шотов филтър), която осигурява образуването на голям брой малки мехурчета, осъществяващи добър контакт между течната и газовата фаза.

Дебитът на газовете през уреда, трябва да бъде около 40 l/h. Шишето, разположено отдясно на уреда, е предназначено да ограничава подналягането, породено от водоструйната помпа, на 20 до 30 cm воден стълб. С цел да може това подналягане да се регулира, така че да се осигурява подходящ дебит, е от полза да се постави дебитомер с капилярна тръба между барботьора и шишето.

2.2.1.2.   Микробюрета.

2.2.2.   Реагенти

2.2.2.1.   85 %-на фосфорна киселина (H3PO4), ρ20 = 1,71 g/ml.

2.2.2.2.   Разтвор на водороден прекис (H2O2), 9,1 g/l (три обема).

2.2.2.3.   Индикаторен реагент:

| метилово червено ... | 100 mg |
| --- | --- |
| метиленово синьо ... | 50 mg |
| спирт, 50 % об. ... | 100 ml |

метилово червено ...

100 mg

метиленово синьо ...

50 mg

спирт, 50 % об. ...

100 ml

2.2.2.4.   Разтвор на натриев хидроокис (NaOH), 0,01M.

2.2.3.   Определяне на свободен серен двуокис

2.2.3.1.   Методика

Виното трябва да бъде съхранявано в пълно и затворено шише при температура 20 °С в продължение на два дни преди измерването.

| — | В барботьора „B“ се поставят 2 до 3 ml от разтвора на водороден прекис (точка 2.2.2.2) и 2 капки от индикатора; разтворът на водороден прекис се неутрализира с разтвор на натриев хидроокис 0,01 М (точка 2.2.2.4). Барботьорът се свързва с уреда. |
| --- | --- |

—

В барботьора „B“ се поставят 2 до 3 ml от разтвора на водороден прекис (точка 2.2.2.2) и 2 капки от индикатора; разтворът на водороден прекис се неутрализира с разтвор на натриев хидроокис 0,01 М (точка 2.2.2.4). Барботьорът се свързва с уреда.

| — | В облодънната колба „А“ от 250 ml, принадлежаща към уреда за увличане, се поставят 50 ml от пробата и 15 ml фосфорна киселина (точка 2.2.2.1). Облодънната колба се свързва с уреда. |
| --- | --- |

—

В облодънната колба „А“ от 250 ml, принадлежаща към уреда за увличане, се поставят 50 ml от пробата и 15 ml фосфорна киселина (точка 2.2.2.1). Облодънната колба се свързва с уреда.

| — | След това в продължение на 15 минути се оставя да барботира въздух (или азот). Увлеченият серен двуокис се окислява до сярна киселина. Барботьорът „Б“ се отстранява от уреда и получената киселина се титрува с разтвор на натриев хидроокис 0,01 М (точка 2.2.2.4). Използваният обем се означава с n ml. |
| --- | --- |

—

След това в продължение на 15 минути се оставя да барботира въздух (или азот). Увлеченият серен двуокис се окислява до сярна киселина. Барботьорът „Б“ се отстранява от уреда и получената киселина се титрува с разтвор на натриев хидроокис 0,01 М (точка 2.2.2.4). Използваният обем се означава с n ml.

2.2.3.2.   Изразяване на резултатите

Свободният серен двуокис се изразява в милиграми на литър (mg/l) с точност до цяло число.

2.2.3.2.1.   Изчисляване

Свободен серен двуокис в милиграми на литър: 6,4 n.

2.2.4.   Определяне на общ серен двуокис

2.2.4.1   Методика

2.2.4.1.1.   За ректифицираната концентрирана мъст се използва разтворът, получен чрез разреждане на пробата за анализ до 40 % (m/v) съгласно указаното в глава „Обща киселинност“, точка 5.1.2. В облодънната колба „А“ с обем 250 ml, принадлежаща към уреда за увличане, се прехвърлят 50 ml от този разтвор, както и 5 ml фосфорна киселина (точка 2.2.2.1). Облодънната колба се свързва към уреда.

2.2.4.1.2.   Вино и мъст

Очаквано съдържание на пробата = 50 mg/l общ SO2. В облодънната колба „А“ от 250 ml, принадлежаща към уреда за увличане, се поставят 50 ml от пробата и 15 ml фосфорна киселина (точка 2.2.2.1). Облодънната колба се свързва към уреда.

Очаквано съдържание на пробата = 50 mg/l общ SO2. В облодънната колба „А“ от 100 ml, принадлежаща към уреда за увличане, се поставят 20 ml от пробата и 5 ml фосфорна киселина (точка 2.2.2.1). Облодънната колба се свързва към уреда.

В барботьора „B“ се поставят 2 до 3 ml от разтвора на водороден прекис (точка 2.2.2.2), който се неутрализира по гореописания начин; виното в облодънната колба „А“ се загрява до кипене с помощта на малък пламък с височина 4—5 cm, който трябва непосредствено да обгръща дъното на колбата. Под облодънната колба не трябва да се поставя метална плоча, а диск с отвор с диаметър 30 mm. Така по стените на колбата се избягват пирогенни процеси с извличаните от виното вещества.

Кипенето се поддържа, докато се подава въздушната (или азотна) струя. Общият серен двуокис бива увлечен и окислен за 15 минути. Образувалата се сярна киселина се определя чрез титруване с разтвор на натриев хидроокис 0,01 М (точка 2.2.2.4).

Добавените милилитри се означават с n ml.

2.2.4.2.    Изразяване на резултатите

Общият серен двуокис се изразява в милиграми на литър (mg/l) и съответно в милиграми на килограм (mg/kg) обща захар, с цяло число.

2.2.4.2.1.   Изчисляване

| — | Вино и мъст
  Общ серен двуокис в милиграми на литър.






  — | Проби, бедни на серен двуокис (проба от 50 ml):
  6,4 x n |
| --- | --- | --- |

—

Вино и мъст

Общ серен двуокис в милиграми на литър.

—

Проби, бедни на серен двуокис (проба от 50 ml):

6,4 x n

| — | Други проби (проба от 20 ml):
  16 x n |
| --- | --- |

—

Други проби (проба от 20 ml):

16 x n

| — | Ректифицирана концентрирана мъст
  Серен двуокис в милиграми на килограм обща захар (50 ml от приготвена проба, точка 2. (2.2.4.1.1):
  (1 600 x n)/P P
  P = съдържание на обща захар в тегловни проценти (m/m) |
| --- | --- |

—

Ректифицирана концентрирана мъст

Серен двуокис в милиграми на килограм обща захар (50 ml от приготвена проба, точка 2. (2.2.4.1.1):

(1 600 x n)/P P

P = съдържание на обща захар в тегловни проценти (m/m)

2.2.3.4.2.   Повторяемост (r)

съдържание < 50 mg/l (за проба от 50 ml), r = 1 mg/l

съдържание > 50 mg/l (за проба от 20 ml), r = 6 mg/l

2.2.3.4.3.   Възпроизводимост (R)

съдържание < 50 mg/l (за проба от 50 ml), R = 9 mg/l

съдържание > 50 mg/l (за проба от 20 ml), R = 15 mg/l

---

(1)  Може да се използва всеки вид пикнометър с еквивалентни характеристики.

(2)  105 паскала (Pa)= 1 bar.

---