# Jornal Oficial L 206/2006

| | ISSN 1725-2601 |
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| Jornal Oficial
  da União Europeia | L 206 |
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| Edição em língua portuguesa | Legislação | 49.o ano27 de Julho de 2006 |

ISSN 1725-2601

Jornal Oficial

da União Europeia

L 206

Edição em língua portuguesa

Legislação

49.o ano27 de Julho de 2006

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| Índice | | I   Actos cuja publicação é uma condição da sua aplicabilidade | Página |
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| | * | Directiva 2006/60/CE da Comissão, de 7 de Julho de 2006, que altera os anexos da Directiva 90/642/CEE do Conselho no respeitante aos teores máximos de resíduos de trifloxistrobina, tiabendazol, abamectina, benomil, carbendazime, tiofanato-metilo, miclobutanil, glifosato, trimetilsulfónio, fenepropimorfe e clormequato (
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  ) | 1 |
| | * | Directiva 2006/61/CE da Comissão, de 7 de Julho de 2006, que altera os anexos das Directivas 86/362/CEE, 86/363/CEE e 90/642/CEE do Conselho, no que diz respeito aos limites máximos de resíduos de atrazina, azinfos-etilo, ciflutrina, etefão, fentião, metamidofos, metomil, paraquato e triazofos (
  1
  ) | 12 |
| | * | Directiva 2006/62/CE da Comissão, de 12 de Julho de 2006, que altera os anexos das Directivas 76/895/CEE, 86/362/CEE, 86/363/CEE e 90/642/CEE do Conselho no que respeita aos limites máximos de resíduos de desmedifame, fenemedifame e clorfenvinfos (
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  ) | 27 |
| | * | Directiva 2006/63/CE da Comissão, de 14 de Julho de 2006, que altera os anexos II a VII da Directiva 98/57/CE do Conselho relativa ao controlo de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. | 36 |
| | * | Directiva 2006/64/CE da Comissão, de 18 de Julho de 2006, que altera a Directiva 91/414/CEE do Conselho com o objectivo de incluir as substâncias activas clopiralide, ciprodinil, fosetil e trinexapace (
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  ) | 107 |

Índice

I   Actos cuja publicação é uma condição da sua aplicabilidade

Página

*

Directiva 2006/60/CE da Comissão, de 7 de Julho de 2006, que altera os anexos da Directiva 90/642/CEE do Conselho no respeitante aos teores máximos de resíduos de trifloxistrobina, tiabendazol, abamectina, benomil, carbendazime, tiofanato-metilo, miclobutanil, glifosato, trimetilsulfónio, fenepropimorfe e clormequato (
  1
  )

1

1

*

Directiva 2006/61/CE da Comissão, de 7 de Julho de 2006, que altera os anexos das Directivas 86/362/CEE, 86/363/CEE e 90/642/CEE do Conselho, no que diz respeito aos limites máximos de resíduos de atrazina, azinfos-etilo, ciflutrina, etefão, fentião, metamidofos, metomil, paraquato e triazofos (
  1
  )

1

12

*

Directiva 2006/62/CE da Comissão, de 12 de Julho de 2006, que altera os anexos das Directivas 76/895/CEE, 86/362/CEE, 86/363/CEE e 90/642/CEE do Conselho no que respeita aos limites máximos de resíduos de desmedifame, fenemedifame e clorfenvinfos (
  1
  )

1

27

*

Directiva 2006/63/CE da Comissão, de 14 de Julho de 2006, que altera os anexos II a VII da Directiva 98/57/CE do Conselho relativa ao controlo de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

Ralstonia solanacearum

et al.

36

*

Directiva 2006/64/CE da Comissão, de 18 de Julho de 2006, que altera a Directiva 91/414/CEE do Conselho com o objectivo de incluir as substâncias activas clopiralide, ciprodinil, fosetil e trinexapace (
  1
  )

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| | (1)   Texto relevante para efeitos do EEE. |

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(1)   Texto relevante para efeitos do EEE.

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| PT | Os actos cujos títulos são impressos em tipo fino são actos de gestão corrente adoptados no âmbito da política agrícola e que têm, em geral, um período de validade limitado.
  Os actos cujos títulos são impressos em tipo negro e precedidos de um asterisco são todos os restantes. |
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PT

Os actos cujos títulos são impressos em tipo fino são actos de gestão corrente adoptados no âmbito da política agrícola e que têm, em geral, um período de validade limitado.

Os actos cujos títulos são impressos em tipo negro e precedidos de um asterisco são todos os restantes.

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I Actos cuja publicação é uma condição da sua aplicabilidade

| 27.7.2006 | PT | Jornal Oficial da União Europeia | L 206/1 |
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27.7.2006

PT

Jornal Oficial da União Europeia

L 206/1

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DIRECTIVA 2006/60/CE DA COMISSÃO

de 7 de Julho de 2006

que altera os anexos da Directiva 90/642/CEE do Conselho no respeitante aos teores máximos de resíduos de trifloxistrobina, tiabendazol, abamectina, benomil, carbendazime, tiofanato-metilo, miclobutanil, glifosato, trimetilsulfónio, fenepropimorfe e clormequato

(Texto relevante para efeitos do EEE)

A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,

Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Europeia,

Tendo em conta a Directiva 90/642/CEE do Conselho, de 27 de Novembro de 1990, relativa à fixação de limites máximos de resíduos de pesticidas nos e sobre determinados produtos de origem vegetal, incluindo frutas e produtos hortícolas (1), nomeadamente o artigo 7.o,

Tendo em conta a Directiva 91/414/CEE do Conselho, de 15 de Julho de 1991, relativa à colocação dos produtos fitofarmacêuticos no mercado (2), nomeadamente a alínea f) do n.o 1, do artigo 4.o,

Considerando o seguinte:

| (1) | Em conformidade com a Directiva 91/414/CEE, as autorizações de produtos fitofarmacêuticos destinados a ser utilizados em culturas específicas são da competência dos Estados-Membros. As autorizações em causa baseiam-se, obrigatoriamente, numa avaliação dos efeitos sobre a saúde humana e animal e da influência sobre o ambiente. A referida avaliação deve ter em conta elementos como a exposição do utilizador e das pessoas que se encontrem nas proximidades, o impacto no ambiente aos níveis terrestre, aquático e atmosférico e os efeitos, sobre as pessoas e os animais, do consumo de resíduos através de culturas tratadas. |
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(1)

Em conformidade com a Directiva 91/414/CEE, as autorizações de produtos fitofarmacêuticos destinados a ser utilizados em culturas específicas são da competência dos Estados-Membros. As autorizações em causa baseiam-se, obrigatoriamente, numa avaliação dos efeitos sobre a saúde humana e animal e da influência sobre o ambiente. A referida avaliação deve ter em conta elementos como a exposição do utilizador e das pessoas que se encontrem nas proximidades, o impacto no ambiente aos níveis terrestre, aquático e atmosférico e os efeitos, sobre as pessoas e os animais, do consumo de resíduos através de culturas tratadas.

| (2) | Os limites máximos de resíduos (LMR) reflectem a utilização da quantidade mínima de pesticida que permite proteger efectivamente a planta, aplicada de modo a que o resíduo seja tão baixo quanto a prática o permitir e também aceitável do ponto de vista toxicológico, nomeadamente à luz das estimativas de ingestão alimentar. |
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(2)

Os limites máximos de resíduos (LMR) reflectem a utilização da quantidade mínima de pesticida que permite proteger efectivamente a planta, aplicada de modo a que o resíduo seja tão baixo quanto a prática o permitir e também aceitável do ponto de vista toxicológico, nomeadamente à luz das estimativas de ingestão alimentar.

| (3) | Os LMR dos pesticidas abrangidos pela Directiva 90/642/CEE mantêm-se sujeitos a reapreciação, podendo ser alterados em função de novas utilizações ou utilizações modificadas. Foram comunicadas à Comissão informações relativas a novas utilizações ou utilizações modificadas, que deverão dar origem a uma alteração dos limites de resíduos de trifloxistrobina, tiabendazol, abamectina, grupo benomil (benomil, carbendazime e tiofanato-metilo), miclobutanil, glifosato, trimetilsulfónio e fenepropimorfe. |
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(3)

Os LMR dos pesticidas abrangidos pela Directiva 90/642/CEE mantêm-se sujeitos a reapreciação, podendo ser alterados em função de novas utilizações ou utilizações modificadas. Foram comunicadas à Comissão informações relativas a novas utilizações ou utilizações modificadas, que deverão dar origem a uma alteração dos limites de resíduos de trifloxistrobina, tiabendazol, abamectina, grupo benomil (benomil, carbendazime e tiofanato-metilo), miclobutanil, glifosato, trimetilsulfónio e fenepropimorfe.

| (4) | No que diz respeito ao clormequato, foram comunicadas à Comissão informações que justificam a adopção de um LMR temporário aplicável às peras durante três anos. |
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(4)

No que diz respeito ao clormequato, foram comunicadas à Comissão informações que justificam a adopção de um LMR temporário aplicável às peras durante três anos.

| (5) | A exposição ao longo da vida dos consumidores aos pesticidas referidos por via dos alimentos que possam conter resíduos dos mesmos foi determinada e avaliada com base nas metodologias e práticas utilizadas na Comunidade e tendo em conta as directrizes publicadas pela Organização Mundial de Saúde (3). Nesta avaliação, teve-se em conta que a abamectina e o tiabendazol também são usados como medicamentos veterinários para animais destinados à produção de alimentos e que foram fixados Limites Máximos de Resíduos para essas duas substâncias nos termos do Regulamento (CEE) n.o 2377/90 do Conselho (4). Com base na apreciação e nas avaliações, os LMR para esses pesticidas devem ser fixados de forma a garantir que a dose diária admissível não será ultrapassada. |
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(5)

A exposição ao longo da vida dos consumidores aos pesticidas referidos por via dos alimentos que possam conter resíduos dos mesmos foi determinada e avaliada com base nas metodologias e práticas utilizadas na Comunidade e tendo em conta as directrizes publicadas pela Organização Mundial de Saúde (3). Nesta avaliação, teve-se em conta que a abamectina e o tiabendazol também são usados como medicamentos veterinários para animais destinados à produção de alimentos e que foram fixados Limites Máximos de Resíduos para essas duas substâncias nos termos do Regulamento (CEE) n.o 2377/90 do Conselho (4). Com base na apreciação e nas avaliações, os LMR para esses pesticidas devem ser fixados de forma a garantir que a dose diária admissível não será ultrapassada.

| (6) | No caso do benomil, carbendazime, tiofanato-metilo, fenepropimorfe e clormequato, para os quais existe uma dose aguda de referência, a exposição aguda dos consumidores, por via de cada produto alimentar que possa conter resíduos destes pesticidas, foi determinada e avaliada com base nas metodologias e práticas utilizadas na Comunidade e tendo em conta as directrizes publicadas pela Organização Mundial de Saúde. Foram tidos em conta os pareceres do Comité Científico das Plantas, nomeadamente a sua opinião e recomendações sobre a protecção dos consumidores de produtos alimentares tratados com pesticidas (5). Com base na apreciação da ingestão diária, os LMR para esses pesticidas devem ser fixados de forma a garantir que a dose aguda de referência não será ultrapassada. No caso das outras substâncias, a avaliação da informação disponível revelou não ser necessária nenhuma dose aguda de referência e que, por conseguinte, não é necessária uma avaliação de curto prazo. |
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(6)

No caso do benomil, carbendazime, tiofanato-metilo, fenepropimorfe e clormequato, para os quais existe uma dose aguda de referência, a exposição aguda dos consumidores, por via de cada produto alimentar que possa conter resíduos destes pesticidas, foi determinada e avaliada com base nas metodologias e práticas utilizadas na Comunidade e tendo em conta as directrizes publicadas pela Organização Mundial de Saúde. Foram tidos em conta os pareceres do Comité Científico das Plantas, nomeadamente a sua opinião e recomendações sobre a protecção dos consumidores de produtos alimentares tratados com pesticidas (5). Com base na apreciação da ingestão diária, os LMR para esses pesticidas devem ser fixados de forma a garantir que a dose aguda de referência não será ultrapassada. No caso das outras substâncias, a avaliação da informação disponível revelou não ser necessária nenhuma dose aguda de referência e que, por conseguinte, não é necessária uma avaliação de curto prazo.

| (7) | Quando as utilizações autorizadas de produtos fitofarmacêuticos não resultarem em níveis detectáveis de resíduos de pesticidas no interior ou à superfície do produto alimentar, quando não houver utilizações autorizadas, quando, em apoio das utilizações autorizadas por determinados Estados-Membros, não tiverem sido facultados os dados requeridos ou ainda quando, em apoio das utilizações em determinados países terceiros de que possam resultar resíduos no interior ou à superfície de produtos alimentares susceptíveis de entrar em circulação no mercado comunitário, não tiverem sido facultados tais dados requeridos, os LMR são fixados no limite inferior da determinação analítica. |
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(7)

Quando as utilizações autorizadas de produtos fitofarmacêuticos não resultarem em níveis detectáveis de resíduos de pesticidas no interior ou à superfície do produto alimentar, quando não houver utilizações autorizadas, quando, em apoio das utilizações autorizadas por determinados Estados-Membros, não tiverem sido facultados os dados requeridos ou ainda quando, em apoio das utilizações em determinados países terceiros de que possam resultar resíduos no interior ou à superfície de produtos alimentares susceptíveis de entrar em circulação no mercado comunitário, não tiverem sido facultados tais dados requeridos, os LMR são fixados no limite inferior da determinação analítica.

| (8) | Por conseguinte, importa estabelecer novos LMR para esses pesticidas. |
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(8)

Por conseguinte, importa estabelecer novos LMR para esses pesticidas.

| (9) | A fixação ou a alteração de LMR provisórios a nível comunitário não impede os Estados-Membros de fixarem LMR provisórios para o glifosato, o trimetilsulfónio e a trifloxistrobina, em conformidade com a alínea f) do n.o 1 do artigo 4.o da Directiva 91/414/CEE e o anexo VI da mesma. Considera-se que um período de quatro anos é suficiente para permitir as outras utilizações dessas substâncias. Os LMR comunitários provisórios devem, então, tornar-se definitivos. |
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(9)

A fixação ou a alteração de LMR provisórios a nível comunitário não impede os Estados-Membros de fixarem LMR provisórios para o glifosato, o trimetilsulfónio e a trifloxistrobina, em conformidade com a alínea f) do n.o 1 do artigo 4.o da Directiva 91/414/CEE e o anexo VI da mesma. Considera-se que um período de quatro anos é suficiente para permitir as outras utilizações dessas substâncias. Os LMR comunitários provisórios devem, então, tornar-se definitivos.

| (10) | Os tremoços são consumidos como alimentos em vários Estados-Membros. A utilização de glifosato é autorizada nos tremoços. A inserção da rubrica «tremoços» e a fixação de LMR para os tremoços são, pois, necessárias para proteger o consumidor dos resíduos de pesticidas excessivos utilizados nos tremoços. |
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(10)

Os tremoços são consumidos como alimentos em vários Estados-Membros. A utilização de glifosato é autorizada nos tremoços. A inserção da rubrica «tremoços» e a fixação de LMR para os tremoços são, pois, necessárias para proteger o consumidor dos resíduos de pesticidas excessivos utilizados nos tremoços.

| (11) | A Directiva 90/642/CEE deve, por conseguinte, ser alterada em conformidade. |
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(11)

A Directiva 90/642/CEE deve, por conseguinte, ser alterada em conformidade.

| (12) | As medidas previstas na presente directiva estão em conformidade com o parecer do Comité Permanente da Cadeia Alimentar e da Saúde Animal, |
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(12)

As medidas previstas na presente directiva estão em conformidade com o parecer do Comité Permanente da Cadeia Alimentar e da Saúde Animal,

ADOPTOU A PRESENTE DIRECTIVA:

Artigo 1.o

A Directiva 90/642/CEE é alterada do seguinte modo:

| 1. | No anexo I, no grupo «3 Leguminosas secas», é aditada a rubrica «Tremoços» de forma a que os termos «Produto inteiro» da última coluna passem a abranger as quatro rubricas. |
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1.

No anexo I, no grupo «3 Leguminosas secas», é aditada a rubrica «Tremoços» de forma a que os termos «Produto inteiro» da última coluna passem a abranger as quatro rubricas.

| 2. | O anexo II é alterado em conformidade com o disposto no anexo da presente directiva. |
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2.

O anexo II é alterado em conformidade com o disposto no anexo da presente directiva.

Artigo 2.o

1.   Os Estados-Membros devem adoptar e publicar, o mais tardar em 27 de Janeiro de 2007, as disposições legislativas, regulamentares e administrativas necessárias para dar cumprimento à presente directiva, excepto as disposições respeitantes ao grupo benomil e ao tiofanato-metilo, que devem ser aplicadas e publicadas o mais tardar em 14 de Setembro de 2006 e as respeitantes ao clormequato, que devem ser aplicadas e publicadas o mais tardar em 31 de Julho de 2006. Os Estados-Membros devem comunicar imediatamente à Comissão o texto das referidas disposições bem como um quadro de correspondência entre essas disposições e a presente directiva.

Os Estados-Membros devem aplicar estas disposições a partir de 28 de Janeiro de 2007, excepto as disposições respeitantes ao grupo benomil e ao tiofanato-metilo, que devem ser aplicadas o mais tardar em 15 de Setembro de 2006 e as respeitantes ao clormequato que devem ser aplicadas o mais tardar em 1 de Agosto de 2006.

As disposições adoptadas pelos Estados-Membros devem fazer referência à presente directiva ou ser acompanhadas da referida referência aquando da sua publicação oficial. As modalidades dessa referência devem ser adoptadas pelos Estados-Membros.

2.   Os Estados-Membros devem comunicar à Comissão o texto das principais disposições de direito interno que aprovarem nas matérias reguladas pela presente directiva.

Artigo 3.o

A presente directiva entra em vigor no vigésimo dia seguinte ao da sua publicação no Jornal Oficial da União Europeia.

Artigo 4.o

Os Estados-Membros são os destinatários da presente directiva.

Feito em Bruxelas, em 7 de Julho de 2006.

Pela Comissão

Markos KYPRIANOU

Membro da Comissão

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(1)  JO L 350 de 14.12.1990, p. 71. Directiva com a última redacção que lhe foi dada pela Directiva 2006/53/CE da Comissão (JO L 154 de 8.6.2006, p. 11).

1

(2)  JO L 230 de 19.8.1991, p. 1. Directiva com a última redacção que lhe foi dada pela Directiva 2006/45/CE da Comissão (JO L 130 de 18.5.2006, p. 27).

2

(3)  «Guidelines for predicting dietary intake of pesticide residues» — Edição revista das directrizes para a estimativa da ingestão de resíduos de pesticidas preparadas pelo grupo GEMS/Programa Alimentar em colaboração com o Comité do Codex para os Resíduos de Pesticidas, publicada pela Organização Mundial de Saúde em 1997 (WHO/FSF/FOS/97.7).

3

(4)  JO L 224 de 18.8.1990, p. 1. Regulamento com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CE) n.o 205/2006 da Comissão (JO L 34 de 7.2.2006, p. 21).

4

o

(5)  Parecer sobre determinadas questões decorrentes da alteração dos anexos das Directivas 86/362/CEE, 86/363/CEE e 90/642/CEE do Conselho (parecer expresso pelo CCP em 14 de Julho de 1998); Parecer sobre resíduos variáveis de pesticidas em frutos e produtos hortícolas (parecer expresso pelo CCP em 14 de Julho de 1998) http://europa.eu.int/comm/food/fs/sc/scp/outcome_ppp_en.html

5

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ANEXO

O anexo II da Directiva 90/642/CEE é alterado do seguinte modo.

| 1. | Na rubrica relativa ao clormequato nas peras, a nota de rodapé (t) passa a ter a seguinte redacção: «O limite máximo de resíduos temporário de 0,2 mg/kg é aplicável até 31 de Julho de 2009.». |
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1.

Na rubrica relativa ao clormequato nas peras, a nota de rodapé (t) passa a ter a seguinte redacção: «O limite máximo de resíduos temporário de 0,2 mg/kg é aplicável até 31 de Julho de 2009.».

| 2. | Na parte A, as colunas referentes às substâncias trifloxistrobina, tiabendazol, abamectina, benomil, carbendazime, tiofanato-metilo, miclobutanil, glifosato, trimetilsulfónio e fenepropimorfe são substituídas pelo seguinte: | Resíduos de pesticidas e limites máximos de resíduos (mg/kg) |
| --- | --- | --- |
| Grupos de produtos e exemplos de produtos a que se aplicam os teores máximos de resíduos | Trifloxis-trobina | Tiaben-dazol | Abamectina (soma da avermectina B1a, da avermectina B1b e do isómero delta-8,9 da avermectina B1a) | Soma de benomil e carbendazime expresso em carbendazime | Tiofanato-metilo | Miclobutanil | Glifosato | Catião trimetilsulfónio, resultante da utilização de glifosato | Fenepro-pimorfe |
| «1. | Frutos, frescos, secos ou não cozidos, congelados, sem adição de açúcar; frutos de casca rija | | | | | | | | | |
| | i) | CITRINOS | 0,3 (2) | 5 | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 3 | | | 0,05 (1) |
| | | Toranjas | | | | | | | | | |
| | | Limões | | | | | | | | | |
| | | Limas | | | | | | | | | |
| | | Tangerinas (incluindo clementinas e híbridos semelhantes) | | | | | | | 0,5 (2) | 0,5 (2) | |
| | | Laranjas | | | | | | | 0,5 (2) | 0,5 (2) | |
| | | Pomelos | | | | | | | | | |
| | | Outros | | | | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| | ii) | FRUTOS DE CASCA RIJA (com ou sem casca) | 0,02 (1)
   (2) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1) | 0,2 | 0,05 (1) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Amêndoas | | | | | | | | | |
| | | Castanhas-do-brasil | | | | | | | | | |
| | | Castanhas de caju | | | | | | | | | |
| | | Castanhas | | | | | | | | | |
| | | Cocos | | | | | | | | | |
| | | Avelãs | | | | | | | | | |
| | | Nozes de macadâmia | | | | | | | | | |
| | | Nozes pecans | | | | | | | | | |
| | | Pinhões | | | | | | | | | |
| | | Pistácios | | | | | | | | | |
| | | Nozes comuns | | | | | | | | | |
| | | Outros | | | | | | | | | |
| | iii) | FRUTOS DE POMÓIDEAS | 0,5 (2) | | 0,01 (1) | 0,2 | 0,5 | 0,5 | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Maçãs | | 5 | | | | | | | |
| | | Peras | | 5 | | | | | | | |
| | | Marmelos | | | | | | | | | |
| | | Outros | | 0,05 (1) | | | | | | | |
| | iv) | FRUTOS DE PRUNÓIDEAS | | 0,05 (1) | 0,01 (1) | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Damascos | 1 (2) | | | 0,2 | 2 | 0,3 | | | |
| | | Cerejas | 1 (2) | | | 0,5 | 0,3 | 1 | | | |
| | | Pêssegos (incluindo nectarinas e híbridos semelhantes) | 1 (2) | | | 0,2 | 2 | 0,5 | | | |
| | | Ameixas | 0,2 (2) | | | 0,5 | 0,3 | 0,5 | | | |
| | | Outros | 0,02 (1)
   (2) | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | |
| | v) | BAGAS E FRUTOS PEQUENOS | | 0,05 (1) | | | | | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | a) | Uvas de mesa e para vinho | 5 (2) | | 0,01 (1) | | | 1 | 0,5 (2) | | 0,05 (1) |
| | | | Uvas de mesa | | | | 0,3 | 0,1 (1) | | | | |
| | | | Uvas para vinho | | | | 0,5 | 3 | | | | |
| | | b) | Morangos (à excepção dos silvestres) | 0,5 (1)
   (2) | | 0,1 | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 1 | 0,1 (1)
   (2) | | 1 |
| | | c) | Frutos de tutor (à excepção dos silvestres) | 0,02 (1)
   (2) | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | | 1 |
| | | | Amoras | | | 0,1 | | | 1 | | | |
| | | | Amoras pretas | | | | | | | | | |
| | | | Framboesas (Rubus loganobaccus) | | | | | | | | | |
| | | | Framboesas | | | 0,1 | | | 1 | | | |
| | | | Outros | | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | d) | Outras bagas e frutos pequenos (à excepção dos silvestres) | | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | | 1 |
| | | | Mirtilos (frutos da espécie Vaccinium myrtillus) | | | | | | | | | |
| | | | Airelas | | | | | | | | | |
| | | | Groselhas (de cachos vermelhos, negros e brancos) | 1 (2) | | | | | 1 | | | |
| | | | Groselhas espinhosas | 1 (2) | | | | | 1 | | | |
| | | | Outros | 0,02 (1)
   (2) | | | | | 0,02 (1) | | | |
| | | e) | Bagas e frutos silvestres | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1)
   (2) | | 0,05 (1) |
| | vi) | DIVERSOS | | | 0,01 (1) | | | | | | |
| | | Abacates | | 15 | | | | | | | |
| | | Bananas | 0,05 (2) | 5 | | | | 2 | | | 2 |
| | | Tâmaras | | | | | | | | | |
| | | Figos | | | | | | | | | |
| | | Quivis | | | | | | | | | |
| | | Cunquatos | | | | | | | | | |
| | | Lichias | | | | | | | | | |
| | | Mangas | | 5 | | | | | | | |
| | | Azeitonas (de mesa) | | | | | | | | | |
| | | Azeitonas (para azeite) | | | | | | | 1 (2) | 1 (2) | |
| | | Papaias | | 10 | | 0,2 | 1 | | | | |
| | | Maracujás | | | | | | | | | |
| | | Ananases | | | | | | | | | |
| | | Romãs | | | | | | | | | |
| | | Outros | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| 2. | Produtos hortícolas, frescos ou não cozidos, congelados ou secos | | | | | | | | | |
| | i) | RAÍZES E TUBÉRCULOS | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Beterrabas | | | | | | | | | |
| | | Cenouras | | | | | | 0,2 | | | |
| | | Mandiocas | | 15 | | | | | | | |
| | | Aipos-rábanos | | | | | | | | | |
| | | Rábanos | | | | | | 0,2 | | | |
| | | Tupinambos | | | | | | | | | |
| | | Pastinagas | | | | | | 0,2 | | | |
| | | Salsa de raiz grossa | | | | | | 0,2 | | | |
| | | Rabanetes | | | | | | | | | |
| | | Salsifis | | | | | | | | | |
| | | Batatas doces | | 15 | | | | | | | |
| | | Rutabagas | | | | | | | | | |
| | | Nabos | | | | | | | | | |
| | | Inhames | | 15 | | | | | | | |
| | | Outros | | 0,05 (1) | | | | 0,02 (1) | | | |
| | ii) | BOLBOS | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Alho comum | | | | | | | | | |
| | | Cebolas | | | | | | | | | |
| | | Chalotas | | | | | | | | | |
| | | Cebolinhas | | | | | | | | | |
| | | Outros | | | | | | | | | |
| | iii) | FRUTOS DE HORTÍCOLAS | | 0,05 (1) | | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | a) | Solanáceas | | | | | | | | | |
| | | | Tomates | 0,5 (2) | | 0,02 | 0,5 | 2 | 0,3 | | | |
| | | | Pimentos | | | 0,05 | | | 0,5 | | | |
| | | | Beringelas | | | 0,02 | 0,5 | 2 | 0,3 | | | |
| | | | Quiabos | | | | 2 | 1 | | | | |
| | | | Outros | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | |
| | | b) | Cucurbitáceas de pele comestível | 0,2 (2) | | 0,02 | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,1 | | | |
| | | | Pepinos | | | | | | | | | |
| | | | Cornichões | | | | | | | | | |
| | | | Abobrinhas | | | | | | | | | |
| | | | Outros | | | | | | | | | |
| | | c) | Cucurbitáceas de pele não comestível: | | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,3 | 0,2 | | | |
| | | | Melões | 0,3 (2) | | | | | | | | |
| | | | Abóboras | | | | | | | | | |
| | | | Melancias | | | | | | | | | |
| | | | Outros | 0,02 (1)
   (2) | | | | | | | | |
| | | d) | Milho doce | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | |
| | iv) | BRÁSSICAS | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | a) | Couves de inflorescência | | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | | | 0,05 (1) |
| | | | Brócolos | | 5 | | | | | | | |
| | | | Couves-flores | | | | | | | | | |
| | | | Outros | | 0,05 (1) | | | | | | | |
| | | b) | Couves de cabeça: | | 0,05 (1) | | | | | | | |
| | | | Couves-de-bruxelas | | | | 0,5 | 1 | | | | 0,5 |
| | | | Couves-repolhos | | | | | | | | | |
| | | | Outros | | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | | | 0,05 (1) |
| | | c) | Couves de folha | | 0,05 (1) | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | | | 0,05 (1) |
| | | | Couves da-china | | | | | | | | | |
| | | | Couves-galegas | | | | | | | | | |
| | | | Outros | | | | | | | | | |
| | | d) | Couves-rábano | | 0,05 (1) | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | | | 0,05 (1) |
| | v) | PRODUTOS HORTÍCOLAS DE FOLHA E PLANTAS AROMÁTICAS FRESCAS | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | a) | Alfaces e semelhantes | | | 0,1 | | | | | | |
| | | | Agriões | | | | | | | | | |
| | | | Alfaces-de-cordeiro | | | | | | 5 | | | |
| | | | Alfaces | | | | | | | | | |
| | | | Escarolas | | | | | | | | | |
| | | | Rúcola | | | | | | | | | |
| | | | Folhas e caules de brássicas | | | | | | | | | |
| | | | Outros | | | | | | 0,02 (1) | | | |
| | | b) | Espinafres e semelhantes | | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | | Espinafres | | | | | | | | | |
| | | | Acelgas | | | | | | | | | |
| | | | Outros | | | | | | | | | |
| | | c) | Agriões-de-água | | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | d) | Endívia | | 1 | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | e) | Plantas aromáticas | | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | | Cerefólio | | | | | | | | | |
| | | | Cebolinho | | | | | | | | | |
| | | | Salsa | | | | | | | | | |
| | | | Folhas de aipo | | | | | | | | | |
| | | | Outros | | | | | | | | | |
| | vi) | LEGUMINOSAS FRESCAS | | 0,05 (1) | 0,01 (1) | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Feijões (com casca) | 0,5 (2) | | | 0,2 | 0,1 (1) | 0,3 | | | |
| | | Feijões (sem casca) | | | | | | | | | |
| | | Ervilhas (com casca) | | | | 0,2 | 0,1 (1) | | | | |
| | | Ervilhas (sem casca) | | | | | | | | | |
| | | Outros | 0,02 (1)
   (2) | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | |
| | vii) | LEGUMES DE CAULE (frescos) | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Espargos | | | | | | | | | |
| | | Cardos | | | | | | | | | |
| | | Aipos | | | | | | | | | |
| | | Funcho | | | | | | | | | |
| | | Alcachofras | | | | | | 0,5 | | | |
| | | Alhos franceses | | | | | | | | | 1 |
| | | Ruibarbos | | | | | | | | | |
| | | Outros | | | | | | 0,02 (1) | | | 0,05 (1) |
| | viii) | FUNGOS | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | 0,05 (1) |
| | | a) | Cogumelos cultivados | | 10 | | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | b) | Cogumelos silvestres | | 0,05 (1) | | | | | 50 (2) | 20 (2) | |
| 3. | Leguminosas secas | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | Feijões | | | | | | | 2 (2) | | |
| | Lentilhas | | | | | | | | | |
| | Ervilhas | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Tremoços | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Outros | | | | | | | 0,1 (1)
   (2) | | |
| 4. | oleaginosas | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) | 0,02 (1) | | | 0,05 (1) | | | 0,05 (1) |
| | Sementes de linho | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Amendoins | | | | | | | | | |
| | Sementes de papoila | | | | | | | | | |
| | Sementes de sésamo | | | | | | | | | |
| | Sementes de girassol | | | | | | | 20 (2) | | |
| | Sementes de colza | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Soja | | | | 0,2 | 0,3 | | 20 (2) | 10 (2) | |
| | Sementes de mostarda | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Sementes de algodão | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Sementes de cânhamo | | | | | | | | | |
| | Outros | | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| 5. | batata | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,5 (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | Batatas novas | | 0,05 (1) | | | | | | | |
| | Batatas de conservação | | 15 | | | | | | | |
| 6. | Chá (folhas e caules, secos, fermentados ou não, de Camellia sinensis) | 0,05 (1)
   (2) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,05 (1) | 2 (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,1 (1) |
| 7. | Lúpulo (seco), incluindo granulados e pó não concentrado | 30 (2) | 0,1 (1) | 0,05 | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 2 | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 10 |

2.

Na parte A, as colunas referentes às substâncias trifloxistrobina, tiabendazol, abamectina, benomil, carbendazime, tiofanato-metilo, miclobutanil, glifosato, trimetilsulfónio e fenepropimorfe são substituídas pelo seguinte:

Resíduos de pesticidas e limites máximos de resíduos (mg/kg)

Grupos de produtos e exemplos de produtos a que se aplicam os teores máximos de resíduos

Trifloxis-trobina

Tiaben-dazol

Abamectina (soma da avermectina B1a, da avermectina B1b e do isómero delta-8,9 da avermectina B1a)

Soma de benomil e carbendazime expresso em carbendazime

Tiofanato-metilo

Miclobutanil

Glifosato

Catião trimetilsulfónio, resultante da utilização de glifosato

Fenepro-pimorfe

«1.

Frutos, frescos, secos ou não cozidos, congelados, sem adição de açúcar; frutos de casca rija

i)

CITRINOS

0,3 (2)

5

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

3

0,05 (1)

Toranjas

Limões

Limas

Tangerinas (incluindo clementinas e híbridos semelhantes)

0,5 (2)

0,5 (2)

Laranjas

0,5 (2)

0,5 (2)

Pomelos

Outros

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

ii)

FRUTOS DE CASCA RIJA (com ou sem casca)

0,02 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)

0,2

0,05 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Amêndoas

Castanhas-do-brasil

Castanhas de caju

Castanhas

Cocos

Avelãs

Nozes de macadâmia

Nozes pecans

Pinhões

Pistácios

Nozes comuns

Outros

iii)

FRUTOS DE POMÓIDEAS

0,5 (2)

0,01 (1)

0,2

0,5

0,5

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Maçãs

5

Peras

5

Marmelos

Outros

0,05 (1)

iv)

FRUTOS DE PRUNÓIDEAS

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Damascos

1 (2)

0,2

2

0,3

Cerejas

1 (2)

0,5

0,3

1

Pêssegos (incluindo nectarinas e híbridos semelhantes)

1 (2)

0,2

2

0,5

Ameixas

0,2 (2)

0,5

0,3

0,5

Outros

0,02 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

v)

BAGAS E FRUTOS PEQUENOS

0,05 (1)

0,05 (1)
   (2)

a)

Uvas de mesa e para vinho

5 (2)

0,01 (1)

1

0,5 (2)

0,05 (1)

Uvas de mesa

0,3

0,1 (1)

Uvas para vinho

0,5

3

b)

Morangos (à excepção dos silvestres)

0,5 (1)
   (2)

0,1

0,1 (1)

0,1 (1)

1

0,1 (1)
   (2)

1

c)

Frutos de tutor (à excepção dos silvestres)

0,02 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

1

Amoras

0,1

1

Amoras pretas

Framboesas (Rubus loganobaccus)

Framboesas

0,1

1

Outros

0,01 (1)

0,02 (1)

d)

Outras bagas e frutos pequenos (à excepção dos silvestres)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

1

Mirtilos (frutos da espécie Vaccinium myrtillus)

Airelas

Groselhas (de cachos vermelhos, negros e brancos)

1 (2)

1

Groselhas espinhosas

1 (2)

1

Outros

0,02 (1)
   (2)

0,02 (1)

e)

Bagas e frutos silvestres

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)

vi)

DIVERSOS

0,01 (1)

Abacates

15

Bananas

0,05 (2)

5

2

2

Tâmaras

Figos

Quivis

Cunquatos

Lichias

Mangas

5

Azeitonas (de mesa)

Azeitonas (para azeite)

1 (2)

1 (2)

Papaias

10

0,2

1

Maracujás

Ananases

Romãs

Outros

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

2.

Produtos hortícolas, frescos ou não cozidos, congelados ou secos

i)

RAÍZES E TUBÉRCULOS

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Beterrabas

Cenouras

0,2

Mandiocas

15

Aipos-rábanos

Rábanos

0,2

Tupinambos

Pastinagas

0,2

Salsa de raiz grossa

0,2

Rabanetes

Salsifis

Batatas doces

15

Rutabagas

Nabos

Inhames

15

Outros

0,05 (1)

0,02 (1)

ii)

BOLBOS

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Alho comum

Cebolas

Chalotas

Cebolinhas

Outros

iii)

FRUTOS DE HORTÍCOLAS

0,05 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

a)

Solanáceas

Tomates

0,5 (2)

0,02

0,5

2

0,3

Pimentos

0,05

0,5

Beringelas

0,02

0,5

2

0,3

Quiabos

2

1

Outros

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

b)

Cucurbitáceas de pele comestível

0,2 (2)

0,02

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1

Pepinos

Cornichões

Abobrinhas

Outros

c)

Cucurbitáceas de pele não comestível:

0,01 (1)

0,1 (1)

0,3

0,2

Melões

0,3 (2)

Abóboras

Melancias

Outros

0,02 (1)
   (2)

d)

Milho doce

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

iv)

BRÁSSICAS

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

a)

Couves de inflorescência

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

Brócolos

5

Couves-flores

Outros

0,05 (1)

b)

Couves de cabeça:

0,05 (1)

Couves-de-bruxelas

0,5

1

0,5

Couves-repolhos

Outros

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

c)

Couves de folha

0,05 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

Couves da-china

Couves-galegas

Outros

d)

Couves-rábano

0,05 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

v)

PRODUTOS HORTÍCOLAS DE FOLHA E PLANTAS AROMÁTICAS FRESCAS

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

a)

Alfaces e semelhantes

0,1

Agriões

Alfaces-de-cordeiro

5

Alfaces

Escarolas

Rúcola

Folhas e caules de brássicas

Outros

0,02 (1)

b)

Espinafres e semelhantes

0,01 (1)

0,02 (1)

Espinafres

Acelgas

Outros

c)

Agriões-de-água

0,01 (1)

0,02 (1)

d)

Endívia

1

0,01 (1)

0,02 (1)

e)

Plantas aromáticas

0,01 (1)

0,02 (1)

Cerefólio

Cebolinho

Salsa

Folhas de aipo

Outros

vi)

LEGUMINOSAS FRESCAS

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Feijões (com casca)

0,5 (2)

0,2

0,1 (1)

0,3

Feijões (sem casca)

Ervilhas (com casca)

0,2

0,1 (1)

Ervilhas (sem casca)

Outros

0,02 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

vii)

LEGUMES DE CAULE (frescos)

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

Espargos

Cardos

Aipos

Funcho

Alcachofras

0,5

Alhos franceses

1

Ruibarbos

Outros

0,02 (1)

0,05 (1)

viii)

FUNGOS

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,05 (1)

a)

Cogumelos cultivados

10

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

b)

Cogumelos silvestres

0,05 (1)

50 (2)

20 (2)

3.

Leguminosas secas

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Feijões

2 (2)

Lentilhas

Ervilhas

10 (2)

Tremoços

10 (2)

Outros

0,1 (1)
   (2)

4.

oleaginosas

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,02 (1)

0,05 (1)

0,05 (1)

Sementes de linho

10 (2)

Amendoins

Sementes de papoila

Sementes de sésamo

Sementes de girassol

20 (2)

Sementes de colza

10 (2)

Soja

0,2

0,3

20 (2)

10 (2)

Sementes de mostarda

10 (2)

Sementes de algodão

10 (2)

Sementes de cânhamo

Outros

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

5.

batata

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,5 (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Batatas novas

0,05 (1)

Batatas de conservação

15

6.

Chá (folhas e caules, secos, fermentados ou não, de Camellia sinensis)

0,05 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

2 (2)

0,05 (1)
   (2)

0,1 (1)

7.

Lúpulo (seco), incluindo granulados e pó não concentrado

30 (2)

0,1 (1)

0,05

0,1 (1)

0,1 (1)

2

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

10

---

(1)  Indica o limite de determinação analítica.

(2)  Indica que o limite máximo de resíduos foi estabelecido provisoriamente em conformidade com a alínea f) do n.o 1 do artigo 4.o da Directiva 91/414/CEE.».

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| 27.7.2006 | PT | Jornal Oficial da União Europeia | L 206/12 |
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27.7.2006

PT

Jornal Oficial da União Europeia

L 206/12

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DIRECTIVA 2006/61/CE DA COMISSÃO

de 7 de Julho de 2006

que altera os anexos das Directivas 86/362/CEE, 86/363/CEE e 90/642/CEE do Conselho, no que diz respeito aos limites máximos de resíduos de atrazina, azinfos-etilo, ciflutrina, etefão, fentião, metamidofos, metomil, paraquato e triazofos

(Texto relevante para efeitos do EEE)

A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,

Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Europeia,

Tendo em conta a Directiva 86/362/CEE do Conselho, de 24 de Julho de 1986, relativa à fixação de teores máximos para os resíduos de pesticidas à superfície e no interior dos cereais (1), nomeadamente o artigo 10.o,

Tendo em conta a Directiva 86/363/CEE do Conselho, de 24 de Julho de 1986, relativa à fixação de limites máximos para os resíduos de pesticidas à superfície e no interior dos géneros alimentícios de origem animal (2), nomeadamente o artigo 10.o,

Tendo em conta a Directiva 90/642/CEE do Conselho, de 27 de Novembro de 1990, relativa à fixação de limites máximos de resíduos de pesticidas nos e sobre determinados produtos de origem vegetal, incluindo frutas e produtos hortícolas (3), nomeadamente o artigo 7.o,

Tendo em conta a Directiva 91/414/CEE do Conselho, de 15 de Julho de 1991, relativa à colocação dos produtos fitofarmacêuticos no mercado (4), nomeadamente a alínea f) do n.o 1 do artigo 4.o,

Considerando o seguinte:

| (1) | No caso dos cereais e dos produtos de origem vegetal, incluindo frutos e produtos hortícolas, os limites de resíduos reflectem a utilização da quantidade mínima de pesticida necessária para proteger eficazmente as plantas, aplicada de modo que o resíduo seja tão baixo quanto a prática o permitir e simultaneamente aceitável do ponto de vista toxicológico, nomeadamente numa perspectiva de protecção do ambiente e com base nas estimativas de ingestão pelos consumidores. No caso dos géneros alimentícios de origem animal, os limites de resíduos reflectem o consumo, pelos animais, de cereais e produtos de origem vegetal tratados com pesticidas e as consequências directas da eventual utilização de medicamentos veterinários. Os limites máximos de resíduos (LMR) comunitários representam a quantidade máxima dos resíduos em causa que será de esperar encontrar nos produtos se as boas práticas agrícolas tiverem sido respeitadas. |
| --- | --- |

(1)

No caso dos cereais e dos produtos de origem vegetal, incluindo frutos e produtos hortícolas, os limites de resíduos reflectem a utilização da quantidade mínima de pesticida necessária para proteger eficazmente as plantas, aplicada de modo que o resíduo seja tão baixo quanto a prática o permitir e simultaneamente aceitável do ponto de vista toxicológico, nomeadamente numa perspectiva de protecção do ambiente e com base nas estimativas de ingestão pelos consumidores. No caso dos géneros alimentícios de origem animal, os limites de resíduos reflectem o consumo, pelos animais, de cereais e produtos de origem vegetal tratados com pesticidas e as consequências directas da eventual utilização de medicamentos veterinários. Os limites máximos de resíduos (LMR) comunitários representam a quantidade máxima dos resíduos em causa que será de esperar encontrar nos produtos se as boas práticas agrícolas tiverem sido respeitadas.

| (2) | Os LMR de pesticidas mantêm-se sujeitos a reapreciação, podendo ser alterados em função de novos dados ou informações. Os LMR são fixados no limite inferior de determinação analítica quando as utilizações autorizadas de produtos fitofarmacêuticos não resultarem em limites detectáveis de resíduos de pesticidas no interior ou à superfície do produto alimentar, quando não houver utilizações autorizadas, quando, em apoio das utilizações autorizadas por determinados Estados-Membros, não tiverem sido facultados os dados requeridos ou ainda quando, em apoio das utilizações em determinados países terceiros de que possam resultar resíduos no interior ou à superfície de produtos alimentares susceptíveis de entrar em circulação no mercado comunitário, não tiverem sido facultados os dados requeridos. |
| --- | --- |

(2)

Os LMR de pesticidas mantêm-se sujeitos a reapreciação, podendo ser alterados em função de novos dados ou informações. Os LMR são fixados no limite inferior de determinação analítica quando as utilizações autorizadas de produtos fitofarmacêuticos não resultarem em limites detectáveis de resíduos de pesticidas no interior ou à superfície do produto alimentar, quando não houver utilizações autorizadas, quando, em apoio das utilizações autorizadas por determinados Estados-Membros, não tiverem sido facultados os dados requeridos ou ainda quando, em apoio das utilizações em determinados países terceiros de que possam resultar resíduos no interior ou à superfície de produtos alimentares susceptíveis de entrar em circulação no mercado comunitário, não tiverem sido facultados os dados requeridos.

| (3) | A Comissão foi informada de que poderá ser necessário rever os actuais LMR de vários pesticidas, dada a existência de novas informações sobre a toxicologia e a ingestão pelos consumidores. A Comissão solicitou aos respectivos Estados-Membros relatores que apresentassem propostas no sentido de rever os LMR comunitários. Essas propostas foram apresentadas à Comissão. |
| --- | --- |

(3)

A Comissão foi informada de que poderá ser necessário rever os actuais LMR de vários pesticidas, dada a existência de novas informações sobre a toxicologia e a ingestão pelos consumidores. A Comissão solicitou aos respectivos Estados-Membros relatores que apresentassem propostas no sentido de rever os LMR comunitários. Essas propostas foram apresentadas à Comissão.

| (4) | A exposição ao longo da vida e a exposição de curta duração dos consumidores a cada um dos pesticidas referidos na presente directiva por via de produtos alimentares foi reavaliada e determinada com base nas metodologias e práticas comunitárias e nas directrizes publicadas pela Organização Mundial de Saúde (5). Nessa base, convém estabelecer novos LMR que garantam a inexistência de uma exposição inaceitável dos consumidores. |
| --- | --- |

(4)

A exposição ao longo da vida e a exposição de curta duração dos consumidores a cada um dos pesticidas referidos na presente directiva por via de produtos alimentares foi reavaliada e determinada com base nas metodologias e práticas comunitárias e nas directrizes publicadas pela Organização Mundial de Saúde (5). Nessa base, convém estabelecer novos LMR que garantam a inexistência de uma exposição inaceitável dos consumidores.

| (5) | Nos casos pertinentes, a exposição aguda dos consumidores aos pesticidas em causa por via de cada produto alimentar que contenha resíduos dos mesmos foi determinada e avaliada com base nas metodologias e práticas comunitárias e nas directrizes publicadas pela Organização Mundial de Saúde. Concluiu-se que a presença de resíduos de pesticidas em quantidades não superiores aos novos LMR não provocará efeitos tóxicos agudos. |
| --- | --- |

(5)

Nos casos pertinentes, a exposição aguda dos consumidores aos pesticidas em causa por via de cada produto alimentar que contenha resíduos dos mesmos foi determinada e avaliada com base nas metodologias e práticas comunitárias e nas directrizes publicadas pela Organização Mundial de Saúde. Concluiu-se que a presença de resíduos de pesticidas em quantidades não superiores aos novos LMR não provocará efeitos tóxicos agudos.

| (6) | Os parceiros comerciais da Comunidade foram consultados, através da Organização Mundial do Comércio, sobre os novos LMR e os comentários produzidos sobre os mesmos foram tidos em conta. |
| --- | --- |

(6)

Os parceiros comerciais da Comunidade foram consultados, através da Organização Mundial do Comércio, sobre os novos LMR e os comentários produzidos sobre os mesmos foram tidos em conta.

| (7) | Os anexos das Directivas 86/362/CEE, 86/363/CEE e 90/642/CEE, devem, pois, ser alterados em conformidade. |
| --- | --- |

(7)

Os anexos das Directivas 86/362/CEE, 86/363/CEE e 90/642/CEE, devem, pois, ser alterados em conformidade.

| (8) | As medidas previstas na presente directiva estão em conformidade com o parecer do Comité Permanente da Cadeia Alimentar e da Saúde Animal, |
| --- | --- |

(8)

As medidas previstas na presente directiva estão em conformidade com o parecer do Comité Permanente da Cadeia Alimentar e da Saúde Animal,

ADOPTOU A PRESENTE DIRECTIVA:

Artigo 1.o

O anexo II da Directiva 86/362/CEE é alterado em conformidade com o anexo I da presente directiva.

Artigo 2.o

O anexo II da Directiva 86/363/CEE é alterado em conformidade com o anexo II da presente directiva.

Artigo 3.o

O anexo II da Directiva 90/642/CEE é alterado em conformidade com o anexo III da presente directiva.

Artigo 4.o

1.   Os Estados-Membros devem adoptar e publicar, o mais tardar em 20 de Janeiro de 2007, as disposições legislativas, regulamentares e administrativas necessárias para dar cumprimento à presente directiva. Os Estados-Membros devem comunicar imediatamente à Comissão o texto das referidas disposições bem como um quadro de correspondência entre essas disposições e a presente directiva.

Os Estados-Membros devem aplicar tais disposições a partir de 21 de Janeiro de 2007.

Quando os Estados-Membros adoptarem tais disposições, estas devem incluir uma referência à presente directiva ou ser acompanhadas dessa referência aquando da sua publicação oficial. As modalidades dessa referência devem ser adoptadas pelos Estados-Membros.

2.   Os Estados-Membros devem comunicar à Comissão o texto das principais disposições de direito interno que aprovarem nas matérias reguladas pela presente directiva.

Artigo 5.o

A presente directiva entra em vigor no vigésimo dia seguinte ao da sua publicação no Jornal Oficial da União Europeia.

Artigo 6.o

Os Estados-Membros são os destinatários da presente directiva.

Feito em Bruxelas, em 7 de Julho de 2006.

Pela Comissão

Markos KYPRIANOU

Membro da Comissão

---

(1)  JO L 221 de 7.8.1986, p. 37. Directiva com a última redacção que lhe foi dada pela Directiva 2006/59/CE da Comissão (JO L 175 de 29.6.2006, p. 61).

1

(2)  JO L 221 de 7.8.1986, p. 43. Directiva com a última redacção que lhe foi dada pela Directiva 2006/59/CE da Comissão.

2

(3)  JO L 350 de 14.12.1990, p. 71. Directiva com a última redacção que lhe foi dada pela Directiva 2006/59/CE da Comissão.

3

(4)  JO L 230 de 19.8.1991, p. 1. Directiva com a última redacção que lhe foi dada pela Directiva 2006/45/CE da Comissão (JO L 130 de 18.5.2006, p. 27).

4

(5)  «Guidelines for predicting dietary intake of pesticide residues» — Edição revista das directrizes para a estimativa da ingestão de resíduos de pesticidas preparadas pelo grupo GEMS/programa alimentar em colaboração com o Comité do Codex para os Resíduos de Pesticidas, publicada pela Organização Mundial de Saúde em 1997 (WHO/FSF/FOS/97.7).

5

---

ANEXO I

A parte A do anexo II da Directiva 86/362/CEE é alterada do seguinte modo:

| 1. | É aditada a seguinte linha respeitante à atrazina:






  Resíduos de pesticidas | Teores máximos em mg/kg |
| --- | --- | --- |
| «Atrazina | 0,05 (1)

  CEREAIS |

1.

É aditada a seguinte linha respeitante à atrazina:

Resíduos de pesticidas

Teores máximos em mg/kg

«Atrazina

0,05 (1)

CEREAIS

| 2. | As linhas referentes às substâncias azinfos-etilo, etefão e triazofos são substituídas pelo seguinte:






  Resíduos de pesticidas | Teores máximos em mg/kg |
| --- | --- | --- |
| «Azinfos-etilo | 0,05 (2)

  CEREAIS |
| Etefão | 0,5 Cevada, centeio
  0,2 Triticale, trigo
  0,05 (2) Outros cereais |
| Triazofos | 0,02 (2)

  CEREAIS |

2.

As linhas referentes às substâncias azinfos-etilo, etefão e triazofos são substituídas pelo seguinte:

Resíduos de pesticidas

Teores máximos em mg/kg

«Azinfos-etilo

0,05 (2)

CEREAIS

Etefão

0,5 Cevada, centeio

0,2 Triticale, trigo

0,05 (2) Outros cereais

Triazofos

0,02 (2)

CEREAIS

---

(1)  Indica o limite de determinação analítica.»

(2)  Indica o limite de determinação analítica.»

---

ANEXO II

A parte A do anexo II da Directiva 86/363/CEE é alterada do seguinte modo:

| 1. | Na parte A do anexo II da Directiva 86/363/CEE, as linhas correspondentes ao azinfos-etilo e ao triazofos são substituídas pelo seguinte:








  Resíduos de pesticidas | Teores máximos em mg/kg |
| --- | --- | --- |
| | de gordura contida nas carnes, preparações de carne, miudezas e gorduras animais, incluídas no anexo I, dos códigos NC ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 e 1602 (1) (4) | Para o leite de vaca cru e o leite de vaca completo, incluído no anexo I, no código NC 0401: para outros géneros alimentícios dos códigos NC 0401, 0402, 0405 00 e 0406 de acordo com (2) (4) | de ovos frescos sem casca, para os ovos de aves e gemas de ovos incluídos no anexo I, dos códigos NC 0407 00 e 0408 (3) e (4) |
| «Azinfos-etilo | 0,01 (1) | 0,01 (1) | 0,01 (1) |
| Ttriazofos | 0,01 (1) | 0,01 (1) | 0,01 (1) |

1.

Na parte A do anexo II da Directiva 86/363/CEE, as linhas correspondentes ao azinfos-etilo e ao triazofos são substituídas pelo seguinte:

Resíduos de pesticidas

Teores máximos em mg/kg

de gordura contida nas carnes, preparações de carne, miudezas e gorduras animais, incluídas no anexo I, dos códigos NC ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 e 1602 (1) (4)

Para o leite de vaca cru e o leite de vaca completo, incluído no anexo I, no código NC 0401: para outros géneros alimentícios dos códigos NC 0401, 0402, 0405 00 e 0406 de acordo com (2) (4)

de ovos frescos sem casca, para os ovos de aves e gemas de ovos incluídos no anexo I, dos códigos NC 0407 00 e 0408 (3) e (4)

«Azinfos-etilo

0,01 (1)

0,01 (1)

0,01 (1)

Ttriazofos

0,01 (1)

0,01 (1)

0,01 (1)

| 2. | Na parte A do anexo II da Directiva 86/363/CEE, é aditada a seguinte linha correspondente ao fentião:








  Resíduos de pesticidas | Teores máximos em mg/kg |
| --- | --- | --- |
| | de gordura contida nas carnes, preparações de carne, miudezas e gorduras animais, incluídas no anexo I, dos códigos NC ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 e 1602 (1) (4) | Para o leite de vaca cru e o leite de vaca completo, incluído no anexo I, no código 0401: para outros géneros alimentícios dos códigos NC 0401, 0402, 0405 00 e 0406 de acordo com (2) (4) | de ovos frescos sem casca, para os ovos de aves e gemas de ovos incluídos no anexo I, dos códigos NC 0407 00 e 0408 (3) e (4) |
| «Fentião e seus derivados oxigenados, seus sulfóxidos e sulfonas, expressos como fentião | 0,05 (2) | 0,01 (2) | — |

2.

Na parte A do anexo II da Directiva 86/363/CEE, é aditada a seguinte linha correspondente ao fentião:

Resíduos de pesticidas

Teores máximos em mg/kg

de gordura contida nas carnes, preparações de carne, miudezas e gorduras animais, incluídas no anexo I, dos códigos NC ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 e 1602 (1) (4)

Para o leite de vaca cru e o leite de vaca completo, incluído no anexo I, no código 0401: para outros géneros alimentícios dos códigos NC 0401, 0402, 0405 00 e 0406 de acordo com (2) (4)

de ovos frescos sem casca, para os ovos de aves e gemas de ovos incluídos no anexo I, dos códigos NC 0407 00 e 0408 (3) e (4)

«Fentião e seus derivados oxigenados, seus sulfóxidos e sulfonas, expressos como fentião

0,05 (2)

0,01 (2)

—

---

(1)  Indica o limite de determinação analítica.»

(2)  Indica o limite de determinação analítica.»

---

ANEXO III

A parte A do anexo II da Directiva 90/642/CEE é alterada do seguinte modo:

| 1. | É aditada a seguinte coluna respeitante ao fentião:









  Grupos de produtos e exemplos de produtos a que se aplicam os LMR | Fentião e seus derivados oxigenados, seus sulfóxidos e sulfonas, expressos como fentião |
| --- | --- | --- |
| «1. | Frutos, frescos, secos ou não cozidos, congelados, sem adição de açúcar; frutos de casca rija | |
| | i) | CITRINOS | 3 |
| | | Toranjas | |
| | | Limões | |
| | | Limas | |
| | | Tangerinas (incluindo clementinas e híbridos semelhantes) | |
| | | Laranjas | |
| | | Pomelos | |
| | | Outros | |
| | ii) | FRUTOS DE CASCA RIJA (com ou sem casca) | 0,01 (1) |
| | | Amêndoas | |
| | | Castanhas-do-brasil | |
| | | Castanhas-de-caju | |
| | | Castanhas | |
| | | Cocos | |
| | | Avelãs | |
| | | Nozes-de-macadâmia | |
| | | Nozes-pecan | |
| | | Pinhões | |
| | | Pistácios | |
| | | Nozes-comuns | |
| | | Outros | |
| | iii) | FRUTOS DE POMÓIDEAS | 0,01 (1) |
| | | Maçãs | |
| | | Peras | |
| | | Marmelos | |
| | | Outros | |
| | iv) | FRUTOS DE PRUNÓIDEAS | |
| | | Damascos | |
| | | Cerejas | 2 |
| | | Pêssegos (incluindo nectarinas e híbridos semelhantes) | |
| | | Ameixas | |
| | | Outros | 0,01 (1) |
| | v) | BAGAS E FRUTOS PEQUENOS | 0,01 (1) |
| | | a) | Uvas de mesa e para vinho | |
| | | | Uvas de mesa | |
| | | | Uvas para vinho | |
| | | b) | Morangos (à excepção dos silvestres) | |
| | | c) | Frutos de tutor (à excepção dos silvestres) | |
| | | | Amoras-silvestres | |
| | | | Amoras-pretas | |
| | | | Framboesas (Rubus loganobaccus) | |
| | | | Framboesas | |
| | | | Outros | |
| | | d) | Outras bagas e frutos pequenos (à excepção dos silvestres) | |
| | | | Mirtilos (frutos da espécie Vaccinium myrtillus) | |
| | | | Airelas | |
| | | | Groselhas (vermelhas, pretas e brancas) | |
| | | | Groselhas verdes (espinhosas) | |
| | | | Outros | |
| | | e) | Bagas e frutos silvestres | |
| | vi) | FRUTOS DIVERSOS | |
| | | Abacates | |
| | | Bananas | |
| | | Tâmaras | |
| | | Figos | |
| | | Quivis | |
| | | Cunquatos | |
| | | Lichias | |
| | | Mangas | |
| | | Azeitonas (de mesa) | 1 |
| | | Azeitonas (para produção de azeite) | 1 |
| | | Papaias | |
| | | Maracujás | |
| | | Ananases | |
| | | Outros | 0,01 (1) |
| 2. | Produtos hortícolas, frescos ou não cozidos, congelados ou secos | 0,01 (1) |
| | i) | RAÍZES E TUBÉRCULOS | |
| | | Beterrabas | |
| | | Cenouras | |
| | | Mandiocas | |
| | | Aipos | |
| | | Rábanos silvestres | |
| | | Tupinambos | |
| | | Pastinagas | |
| | | Salsa-de-raiz-grossa | |
| | | Rabanetes | |
| | | Salsifis | |
| | | Batatas-doces | |
| | | Rutabagas | |
| | | Nabos | |
| | | Inhames | |
| | | Outros | |
| | ii) | BOLBOS | |
| | | Alhos | |
| | | Cebolas | |
| | | Chalotas | |
| | | Cebolinhas | |
| | | Outros | |
| | iii) | FRUTOS DE HORTÍCOLAS | |
| | | a) | Solanáceas | |
| | | | Tomates | |
| | | | Pimentos | |
| | | | Beringelas | |
| | | | Quiabos | |
| | | | Outros | |
| | | b) | Cucurbitáceas de pele comestível | |
| | | | Pepinos | |
| | | | Cornichões | |
| | | | Abobrinhas | |
| | | | Outros | |
| | | c) | Cucurbitáceas de pele não comestível: | |
| | | | Melões | |
| | | | Abóboras | |
| | | | Melancias | |
| | | | Outros | |
| | | d) | Milho doce | |
| | iv) | BRÁSSICAS | |
| | | a) | Couves de inflorescências | |
| | | | Brócolos | |
| | | | Couves-flor | |
| | | | Outros | |
| | | b) | Couves de cabeça: | |
| | | | Couves-de-bruxelas | |
| | | | Couves-repolhos | |
| | | | Outros | |
| | | c) | Couves de folha | |
| | | | Couves -chinesas | |
| | | | Couves-galegas | |
| | | | Outros | |
| | | d) | Couves-rábano | |
| | v) | LEGUMES DE FOLHA E PLANTAS AROMÁTICAS FRESCAS | |
| | | a) | Alfaces e semelhantes | |
| | | | Agriões | |
| | | | Alfaces-de-cordeiro | |
| | | | Alfaces | |
| | | | Escarolas | |
| | | | Rúcola | |
| | | | Folhas e caules de brássicas | |
| | | | Outros | |
| | | b) | Espinafres e semelhantes | |
| | | | Espinafres | |
| | | | Acelgas | |
| | | | Outros | |
| | | c) | Agriões-de-água | |
| | | d) | Endívias | |
| | | e) | Plantas aromáticas | |
| | | | Cerefólios | |
| | | | Cebolinhos | |
| | | | Salsa | |
| | | | Aipos (folhas) | |
| | | | Outros | |
| | vi) | LEGUMINOSAS FRESCAS | |
| | | Feijões (com casca) | |
| | | Feijões (sem casca) | |
| | | Ervilhas (com casca) | |
| | | Ervilhas (sem casca) | |
| | | Outros | |
| | vii) | LEGUMES DE CAULE (frescos) | |
| | | Espargos | |
| | | Cardos | |
| | | Aipos | |
| | | Funchos | |
| | | Alcachofras | |
| | | Alhos franceses | |
| | | Ruibarbos | |
| | | Outros | |
| | viii) | COGUMELOS | |
| | | a) | Cogumelos cultivados | |
| | | b) | Cogumelos silvestres | |
| 3. | Leguminosas secas | 0,01 (1) |
| | Feijões | |
| | Lentilhas | |
| | Ervilhas | |
| | Outros | |
| 4. | Sementes de oleaginosas | 0,02 (1) |
| | Sementes de linho | |
| | Amendoins | |
| | Sementes de papoila | |
| | Sementes de sésamo | |
| | Sementes de girassol | |
| | Sementes de colza | |
| | Sementes de soja | |
| | Sementes de mostarda | |
| | Sementes de algodão | |
| | Sementes de cânhamo | |
| | Outros | |
| 5. | Batatas | 0,01 (1) |
| | Batatas novas | |
| | Batatas de conservação | |
| 6. | Chá (folhas e caules, secos, fermentados ou não, de Camellia sinensis) | 0,1 (1) |
| 7. | Lúpulo (seco), incluindo granulados e pó não concentrado | 0,1 (1) |

1.

É aditada a seguinte coluna respeitante ao fentião:

Grupos de produtos e exemplos de produtos a que se aplicam os LMR

Fentião e seus derivados oxigenados, seus sulfóxidos e sulfonas, expressos como fentião

«1.

Frutos, frescos, secos ou não cozidos, congelados, sem adição de açúcar; frutos de casca rija

i)

CITRINOS

3

Toranjas

Limões

Limas

Tangerinas (incluindo clementinas e híbridos semelhantes)

Laranjas

Pomelos

Outros

ii)

FRUTOS DE CASCA RIJA (com ou sem casca)

0,01 (1)

Amêndoas

Castanhas-do-brasil

Castanhas-de-caju

Castanhas

Cocos

Avelãs

Nozes-de-macadâmia

Nozes-pecan

Pinhões

Pistácios

Nozes-comuns

Outros

iii)

FRUTOS DE POMÓIDEAS

0,01 (1)

Maçãs

Peras

Marmelos

Outros

iv)

FRUTOS DE PRUNÓIDEAS

Damascos

Cerejas

2

Pêssegos (incluindo nectarinas e híbridos semelhantes)

Ameixas

Outros

0,01 (1)

v)

BAGAS E FRUTOS PEQUENOS

0,01 (1)

a)

Uvas de mesa e para vinho

Uvas de mesa

Uvas para vinho

b)

Morangos (à excepção dos silvestres)

c)

Frutos de tutor (à excepção dos silvestres)

Amoras-silvestres

Amoras-pretas

Framboesas (Rubus loganobaccus)

Framboesas

Outros

d)

Outras bagas e frutos pequenos (à excepção dos silvestres)

Mirtilos (frutos da espécie Vaccinium myrtillus)

Airelas

Groselhas (vermelhas, pretas e brancas)

Groselhas verdes (espinhosas)

Outros

e)

Bagas e frutos silvestres

vi)

FRUTOS DIVERSOS

Abacates

Bananas

Tâmaras

Figos

Quivis

Cunquatos

Lichias

Mangas

Azeitonas (de mesa)

1

Azeitonas (para produção de azeite)

1

Papaias

Maracujás

Ananases

Outros

0,01 (1)

2.

Produtos hortícolas, frescos ou não cozidos, congelados ou secos

0,01 (1)

i)

RAÍZES E TUBÉRCULOS

Beterrabas

Cenouras

Mandiocas

Aipos

Rábanos silvestres

Tupinambos

Pastinagas

Salsa-de-raiz-grossa

Rabanetes

Salsifis

Batatas-doces

Rutabagas

Nabos

Inhames

Outros

ii)

BOLBOS

Alhos

Cebolas

Chalotas

Cebolinhas

Outros

iii)

FRUTOS DE HORTÍCOLAS

a)

Solanáceas

Tomates

Pimentos

Beringelas

Quiabos

Outros

b)

Cucurbitáceas de pele comestível

Pepinos

Cornichões

Abobrinhas

Outros

c)

Cucurbitáceas de pele não comestível:

Melões

Abóboras

Melancias

Outros

d)

Milho doce

iv)

BRÁSSICAS

a)

Couves de inflorescências

Brócolos

Couves-flor

Outros

b)

Couves de cabeça:

Couves-de-bruxelas

Couves-repolhos

Outros

c)

Couves de folha

Couves -chinesas

Couves-galegas

Outros

d)

Couves-rábano

v)

LEGUMES DE FOLHA E PLANTAS AROMÁTICAS FRESCAS

a)

Alfaces e semelhantes

Agriões

Alfaces-de-cordeiro

Alfaces

Escarolas

Rúcola

Folhas e caules de brássicas

Outros

b)

Espinafres e semelhantes

Espinafres

Acelgas

Outros

c)

Agriões-de-água

d)

Endívias

e)

Plantas aromáticas

Cerefólios

Cebolinhos

Salsa

Aipos (folhas)

Outros

vi)

LEGUMINOSAS FRESCAS

Feijões (com casca)

Feijões (sem casca)

Ervilhas (com casca)

Ervilhas (sem casca)

Outros

vii)

LEGUMES DE CAULE (frescos)

Espargos

Cardos

Aipos

Funchos

Alcachofras

Alhos franceses

Ruibarbos

Outros

viii)

COGUMELOS

a)

Cogumelos cultivados

b)

Cogumelos silvestres

3.

Leguminosas secas

0,01 (1)

Feijões

Lentilhas

Ervilhas

Outros

4.

Sementes de oleaginosas

0,02 (1)

Sementes de linho

Amendoins

Sementes de papoila

Sementes de sésamo

Sementes de girassol

Sementes de colza

Sementes de soja

Sementes de mostarda

Sementes de algodão

Sementes de cânhamo

Outros

5.

Batatas

0,01 (1)

Batatas novas

Batatas de conservação

6.

Chá (folhas e caules, secos, fermentados ou não, de Camellia sinensis)

0,1 (1)

7.

Lúpulo (seco), incluindo granulados e pó não concentrado

0,1 (1)

| 2. | As colunas referentes às substâncias atrazina, azinfos-etilo, ciflutrina, etefão, metamidofos, metomil, paraquato e triazofos são substituídas pelo seguinte:
















  Grupos de produtos e exemplos de produtos a que se aplicam os LMR | Atrazina | Azinfos-etilo | Ciflutrina incluindo outras misturas de isómeros constituintes (soma dos isómeros) | Etefão | Metamidofos | Metomil/Tiodicarbe (soma expressa em metomil) | Paraquato | Triazofos |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| «1. | Frutos, frescos, secos ou não cozidos, congelados, sem adição de açúcar; frutos de casca rija | 0,05 (2) | 0,02 (2) | | | | | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | i) | CITRINOS | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | | | |
| | | Toranjas | | | | | | 0,5 | | |
| | | Limões | | | | | | 1 | | |
| | | Limas | | | | | | 1 | | |
| | | Tangerinas (incluindo clementinas e híbridos semelhantes) | | | | | | 1 | | |
| | | Laranjas | | | | | | 0,5 | | |
| | | Pomelos | | | | | | 0,5 | | |
| | | Outros | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | ii) | FRUTOS DE CASCA RIJA (com ou sem casca) | | | 0,02 (2) | 0,1 | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | Amêndoas | | | | | | | | |
| | | Castanhas-do-brasil | | | | | | | | |
| | | Castanhas-de-caju | | | | | | | | |
| | | Castanhas | | | | | | | | |
| | | Cocos | | | | | | | | |
| | | Avelãs | | | | | | | | |
| | | Nozes-de-macadâmia | | | | | | | | |
| | | Nozes-pecan | | | | | | | | |
| | | Pinhões | | | | | | | | |
| | | Pistácios | | | | | | | | |
| | | Nozes-comuns | | | | | | | | |
| | | Outros | | | | | | | | |
| | iii) | FRUTOS DE POMÓIDEAS | | | 0,2 | | 0,01 (2) | 0,2 | | |
| | | Maçãs | | | | 0,5 | | | | |
| | | Peras | | | | | | | | |
| | | Marmelos | | | | | | | | |
| | | Outros | | | | 0,05 (2) | | | | |
| | iv) | FRUTOS DE PRUNÓIDEAS | | | | | | | | |
| | | Damascos | | | 0,3 | | 0,1 | 0,2 | | |
| | | Cerejas | | | 0,2 | 3 | | 0,1 | | |
| | | Pêssegos (incluindo nectarinas e híbridos semelhantes) | | | 0,3 | | 0,05 | 0,2 | | |
| | | Ameixas | | | 0,2 | | | 0,5 | | |
| | | Outros | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | v) | BAGAS E FRUTOS PEQUENOS | | | | | 0,01 (2) | | | |
| | | a) | Uvas de mesa e para vinho | | | 0,3 | 1 | | | | |
| | | | Uvas de mesa | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | | | Uvas para vinho | | | | | | 1 | | |
| | | b) | Morangos (à excepção dos silvestres) | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | c) | Frutos de tutor (à excepção dos silvestres) | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | | Amoras-silvestres | | | | | | | | |
| | | | Amoras-pretas | | | | | | | | |
| | | | Framboesas (Rubus loganobaccus) | | | | | | | | |
| | | | Framboesas | | | | | | | | |
| | | | Outros | | | | | | | | |
| | | d) | Outras bagas e frutos pequenos (à excepção dos silvestres) | | | 0,02 (2) | | | 0,05 (2) | | |
| | | | Mirtilos (frutos da espécie Vaccinium myrtillus) | | | | | | | | |
| | | | Airelas | | | | | | | | |
| | | | Groselhas (vermelhas, pretas e brancas) | | | | 5 | | | | |
| | | | Groselhas verdes (espinhosas) | | | | | | | | |
| | | | Outros | | | | 0,05 (2) | | | | |
| | | e) | Bagas e frutos silvestres | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | vi) | FRUTOS DIVERSOS | | | 0,02 (2) | | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | Abacates | | | | | | | | |
| | | Bananas | | | | | | | | |
| | | Tâmaras | | | | | | | | |
| | | Figos | | | | | | | | |
| | | Quivis | | | | | | | | |
| | | Cunquatos | | | | | | | | |
| | | Lichias | | | | | | | | |
| | | Mangas | | | | | | | | |
| | | Azeitonas | | | | | | | | |
| | | Azeitonas (para produção de azeite) | | | | | | | | |
| | | Papaias | | | | | | | | |
| | | Maracujás | | | | | | | | |
| | | Ananases | | | | 2 | | | | |
| | | Outros | | | | 0,05 (2) | | | | |
| 2. | Produtos hortícolas, frescos ou não cozidos, congelados ou secos | | 0,02 (2) | | | | | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | i) | RAÍZES E TUBÉRCULOS | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | | | |
| | | Beterrabas | | | | | | | | |
| | | Cenouras | | | | | | | | |
| | | Mandiocas | | | | | | | | |
| | | Aipos | | | | | | | | |
| | | Rábanos silvestres | | | | | | | | |
| | | Tupinambos | | | | | | | | |
| | | Pastinagas | | | | | | | | |
| | | Salsa-de-raiz-grossa | | | | | | | | |
| | | Rabanetes | | | | | | 0,5 | | |
| | | Salsifis | | | | | | | | |
| | | Batatas-doces | | | | | | | | |
| | | Rutabagas | | | | | | | | |
| | | Nabos | | | | | | | | |
| | | Inhames | | | | | | | | |
| | | Outros | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | ii) | BOLBOS | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | Alhos | | | | | | | | |
| | | Cebolas | | | | | | | | |
| | | Chalotas | | | | | | | | |
| | | Cebolinhas | | | | | | | | |
| | | Outros | | | | | | | | |
| | iii) | FRUTOS DE HORTÍCOLAS | | | | | 0,01 (2) | | | |
| | | a) | Solanáceas | 0,05 (2) | | | | | | | |
| | | | Tomates | | | 0,05 | 1 | | 0,2 | | |
| | | | Pimentos | | | 0,3 | 3 | | | | |
| | | | Beringelas | | | | | | 0,2 | | |
| | | | Quiabos | | | | | | | | |
| | | | Outros | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | b) | Cucurbitáceas de pele comestível | 0,05 (2) | | | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | | Pepinos | | | 0,1 | | | | | |
| | | | Cornichões | | | | | | | | |
| | | | Abobrinhas | | | | | | | | |
| | | | Outros | | | 0,02 (2) | | | | | |
| | | c) | Cucurbitáceas de pele não comestível: | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | | Melões | | | | | | | | |
| | | | Abóboras | | | | | | | | |
| | | | Melancias | | | | | | | | |
| | | | Outros | | | | | | | | |
| | | d) | Milho doce | 0,1 | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | iv) | BRÁSSICAS | 0,05 (2) | | | 0,05 (2) | | | | |
| | | a) | Couves de inflorescências | | | 0,05 | | 0,02 | | | |
| | | | Brócolos | | | | | | 0,2 | | |
| | | | Couves-flor | | | | | | | | |
| | | | Outros | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | | b) | Couves de cabeça: | | | 0,2 | | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | | Couves-de-bruxelas | | | | | | | | |
| | | | Couves-repolhos | | | | | | | | |
| | | | Outros | | | | | | | | |
| | | c) | Couves de folha | | | 0,3 | | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | | Couves -chinesas | | | | | | | | |
| | | | Couves-galegas | | | | | | | | |
| | | | Outros | | | | | | | | |
| | | d) | Couves-rábano | | | 0,02 (2) | | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | v) | LEGUMES DE FOLHA E PLANTAS AROMÁTICAS FRESCAS | 0,05 (2) | | | 0,05 (2) | 0,01 (2) | | | |
| | | a) | Alfaces e semelhantes | | | 0,5 | | | | | |
| | | | Agriões | | | | | | | | |
| | | | Alfaces-de-cordeiro | | | | | | | | |
| | | | Alfaces | | | | | | 0,3 | | |
| | | | Escarolas | | | | | | | | |
| | | | Rúcola | | | | | | | | |
| | | | Folhas e caules de brássicas | | | | | | | | |
| | | | Outros | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | | b) | Espinafres e semelhantes | | | 0,02 (2) | | | | | |
| | | | Espinafres | | | | | | 0,05 | | |
| | | | Acelgas | | | | | | | | |
| | | | Outros | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | | c) | Agriões-de-água | | | 0,02 (2) | | | 0,05 (2) | | |
| | | d) | Endívias | | | 0,02 (2) | | | 0,05 (2) | | |
| | | e) | Plantas aromáticas | | | 0,02 (2) | | | 0,3 | | |
| | | | Cerefólios | | | | | | | | |
| | | | Cebolinhos | | | | | | | | |
| | | | Salsa | | | | | | | | |
| | | | Aipos (folhas) | | | | | | | | |
| | | | Outros | | | | | | | | |
| | vi) | LEGUMINOSAS FRESCAS | 0,05 (2) | | 0,05 | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | Feijões (com casca) | | | | | 0,5 | | | |
| | | Feijões (sem casca) | | | | | | | | |
| | | Ervilhas (com casca) | | | | | 0,5 | | | |
| | | Ervilhas (sem casca) | | | | | | | | |
| | | Outros | | | | | 0,01 (2) | | | |
| | vii) | LEGUMES DE CAULE (frescos) | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | Espargos | | | | | | | | |
| | | Cardos | | | | | | | | |
| | | Aipos | | | | | | | | |
| | | Funchos | | | | | | | | |
| | | Alcachofras | | | | | 0,1 | | | |
| | | Alhos franceses | | | | | | | | |
| | | Ruibarbos | | | | | | | | |
| | | Outros | | | | | 0,01 (2) | | | |
| | viii) | COGUMELOS | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | a) | Cogumelos cultivados | | | | | | | | |
| | | b) | Cogumelos silvestres | | | | | | | | |
| 3. | Leguminosas secas | 0,05 (2) | 0,02 (2) | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | Feijões | | | | | | | | |
| | Lentilhas | | | | | | | | |
| | Ervilhas | | | | | | | | |
| | Outros | | | | | | | | |
| 4. | Sementes de oleaginosas | 0,05 (2) | 0,02 (2) | | | | | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | Sementes de linho | | | | | | | | |
| | Amendoins | | | | | | 0,1 | | |
| | Sementes de papoila | | | | | | | | |
| | Sementes de sésamo | | | | | | | | |
| | Sementes de girassol | | | | | | | | |
| | Sementes de colza | | | 0,05 | | | | | |
| | Sementes de soja | | | | | 0,2 | 0,1 | | |
| | Sementes de mostarda | | | | | | | | |
| | Sementes de algodão | | | | 2 | 0,2 | 0,1 | | |
| | Sementes de cânhamo | | | | | | | | |
| | Outros | | | 0,02 (2) | 0,1 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| 5. | Batatas | 0,05 (2) | 0,02 (2) | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | Batatas novas | | | | | | | | |
| | Batatas de conservação | | | | | | | | |
| 6. | Chá (folhas e caules, secos, fermentados ou não, de Camellia sinensis) | 0,1 (2) | 0,05 (2) | 0,1 (2) | 0,1 (2) | 0,02 (2) | 0,1 (2) | 0,05 (2) | 0,02 (2) |
| 7. | Lúpulo (seco), incluindo granulados e pó não concentrado | 0,1 (2) | 0,05 (2) | 20 | 0,1 (2) | 0,02 (2) | 10 | 0,05 (2) | 0,02 (2) |

2.

As colunas referentes às substâncias atrazina, azinfos-etilo, ciflutrina, etefão, metamidofos, metomil, paraquato e triazofos são substituídas pelo seguinte:

Grupos de produtos e exemplos de produtos a que se aplicam os LMR

Atrazina

Azinfos-etilo

Ciflutrina incluindo outras misturas de isómeros constituintes (soma dos isómeros)

Etefão

Metamidofos

Metomil/Tiodicarbe (soma expressa em metomil)

Paraquato

Triazofos

«1.

Frutos, frescos, secos ou não cozidos, congelados, sem adição de açúcar; frutos de casca rija

0,05 (2)

0,02 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

i)

CITRINOS

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

Toranjas

0,5

Limões

1

Limas

1

Tangerinas (incluindo clementinas e híbridos semelhantes)

1

Laranjas

0,5

Pomelos

0,5

Outros

0,05 (2)

ii)

FRUTOS DE CASCA RIJA (com ou sem casca)

0,02 (2)

0,1

0,01 (2)

0,05 (2)

Amêndoas

Castanhas-do-brasil

Castanhas-de-caju

Castanhas

Cocos

Avelãs

Nozes-de-macadâmia

Nozes-pecan

Pinhões

Pistácios

Nozes-comuns

Outros

iii)

FRUTOS DE POMÓIDEAS

0,2

0,01 (2)

0,2

Maçãs

0,5

Peras

Marmelos

Outros

0,05 (2)

iv)

FRUTOS DE PRUNÓIDEAS

Damascos

0,3

0,1

0,2

Cerejas

0,2

3

0,1

Pêssegos (incluindo nectarinas e híbridos semelhantes)

0,3

0,05

0,2

Ameixas

0,2

0,5

Outros

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

v)

BAGAS E FRUTOS PEQUENOS

0,01 (2)

a)

Uvas de mesa e para vinho

0,3

1

Uvas de mesa

0,05 (2)

Uvas para vinho

1

b)

Morangos (à excepção dos silvestres)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

c)

Frutos de tutor (à excepção dos silvestres)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

Amoras-silvestres

Amoras-pretas

Framboesas (Rubus loganobaccus)

Framboesas

Outros

d)

Outras bagas e frutos pequenos (à excepção dos silvestres)

0,02 (2)

0,05 (2)

Mirtilos (frutos da espécie Vaccinium myrtillus)

Airelas

Groselhas (vermelhas, pretas e brancas)

5

Groselhas verdes (espinhosas)

Outros

0,05 (2)

e)

Bagas e frutos silvestres

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

vi)

FRUTOS DIVERSOS

0,02 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

Abacates

Bananas

Tâmaras

Figos

Quivis

Cunquatos

Lichias

Mangas

Azeitonas

Azeitonas (para produção de azeite)

Papaias

Maracujás

Ananases

2

Outros

0,05 (2)

2.

Produtos hortícolas, frescos ou não cozidos, congelados ou secos

0,02 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

i)

RAÍZES E TUBÉRCULOS

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

Beterrabas

Cenouras

Mandiocas

Aipos

Rábanos silvestres

Tupinambos

Pastinagas

Salsa-de-raiz-grossa

Rabanetes

0,5

Salsifis

Batatas-doces

Rutabagas

Nabos

Inhames

Outros

0,05 (2)

ii)

BOLBOS

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

Alhos

Cebolas

Chalotas

Cebolinhas

Outros

iii)

FRUTOS DE HORTÍCOLAS

0,01 (2)

a)

Solanáceas

0,05 (2)

Tomates

0,05

1

0,2

Pimentos

0,3

3

Beringelas

0,2

Quiabos

Outros

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

b)

Cucurbitáceas de pele comestível

0,05 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

Pepinos

0,1

Cornichões

Abobrinhas

Outros

0,02 (2)

c)

Cucurbitáceas de pele não comestível:

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

Melões

Abóboras

Melancias

Outros

d)

Milho doce

0,1

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

iv)

BRÁSSICAS

0,05 (2)

0,05 (2)

a)

Couves de inflorescências

0,05

0,02

Brócolos

0,2

Couves-flor

Outros

0,05 (2)

b)

Couves de cabeça:

0,2

0,01 (2)

0,05 (2)

Couves-de-bruxelas

Couves-repolhos

Outros

c)

Couves de folha

0,3

0,01 (2)

0,05 (2)

Couves -chinesas

Couves-galegas

Outros

d)

Couves-rábano

0,02 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

v)

LEGUMES DE FOLHA E PLANTAS AROMÁTICAS FRESCAS

0,05 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

a)

Alfaces e semelhantes

0,5

Agriões

Alfaces-de-cordeiro

Alfaces

0,3

Escarolas

Rúcola

Folhas e caules de brássicas

Outros

0,05 (2)

b)

Espinafres e semelhantes

0,02 (2)

Espinafres

0,05

Acelgas

Outros

0,05 (2)

c)

Agriões-de-água

0,02 (2)

0,05 (2)

d)

Endívias

0,02 (2)

0,05 (2)

e)

Plantas aromáticas

0,02 (2)

0,3

Cerefólios

Cebolinhos

Salsa

Aipos (folhas)

Outros

vi)

LEGUMINOSAS FRESCAS

0,05 (2)

0,05

0,05 (2)

0,05 (2)

Feijões (com casca)

0,5

Feijões (sem casca)

Ervilhas (com casca)

0,5

Ervilhas (sem casca)

Outros

0,01 (2)

vii)

LEGUMES DE CAULE (frescos)

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

Espargos

Cardos

Aipos

Funchos

Alcachofras

0,1

Alhos franceses

Ruibarbos

Outros

0,01 (2)

viii)

COGUMELOS

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

a)

Cogumelos cultivados

b)

Cogumelos silvestres

3.

Leguminosas secas

0,05 (2)

0,02 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

Feijões

Lentilhas

Ervilhas

Outros

4.

Sementes de oleaginosas

0,05 (2)

0,02 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

Sementes de linho

Amendoins

0,1

Sementes de papoila

Sementes de sésamo

Sementes de girassol

Sementes de colza

0,05

Sementes de soja

0,2

0,1

Sementes de mostarda

Sementes de algodão

2

0,2

0,1

Sementes de cânhamo

Outros

0,02 (2)

0,1 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

5.

Batatas

0,05 (2)

0,02 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

Batatas novas

Batatas de conservação

6.

Chá (folhas e caules, secos, fermentados ou não, de Camellia sinensis)

0,1 (2)

0,05 (2)

0,1 (2)

0,1 (2)

0,02 (2)

0,1 (2)

0,05 (2)

0,02 (2)

7.

Lúpulo (seco), incluindo granulados e pó não concentrado

0,1 (2)

0,05 (2)

20

0,1 (2)

0,02 (2)

10

0,05 (2)

0,02 (2)

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(1)  Indica o limite de determinação analítica.»

(2)  Indica o limite de determinação analítica.»

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| 27.7.2006 | PT | Jornal Oficial da União Europeia | L 206/27 |
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27.7.2006

PT

Jornal Oficial da União Europeia

L 206/27

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DIRECTIVA 2006/62/CE DA COMISSÃO

de 12 de Julho de 2006

que altera os anexos das Directivas 76/895/CEE, 86/362/CEE, 86/363/CEE e 90/642/CEE do Conselho no que respeita aos limites máximos de resíduos de desmedifame, fenemedifame e clorfenvinfos

(Texto relevante para efeitos do EEE)

A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,

Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Europeia,

Tendo em conta a Directiva 76/895/CEE do Conselho, de 23 de Novembro de 1976, relativa à fixação de limites máximos de resíduos de pesticidas nas e sobre as frutas e produtos hortícolas (1), nomeadamente o artigo 5.o,

Tendo em conta a Directiva 86/362/CEE do Conselho, de 24 de Julho de 1986, relativa à fixação de limites máximos para os resíduos de pesticidas à superfície e no interior dos cereais (2), nomeadamente o artigo 10.o,

Tendo em conta a Directiva 86/363/CEE do Conselho, de 24 de Julho de 1986, relativa à fixação de limites máximos para os resíduos de pesticidas à superfície e no interior dos géneros alimentícios de origem animal (3), nomeadamente o artigo 10.o,

Tendo em conta a Directiva 90/642/CEE do Conselho, de 27 de Novembro de 1990, relativa à fixação de limites máximos de resíduos de pesticidas nos e sobre determinados produtos de origem vegetal, incluindo frutas e produtos hortícolas (4), nomeadamente o artigo 7.o,

Tendo em conta a Directiva 91/414/CEE do Conselho, de 15 de Julho de 1991, relativa à colocação dos produtos fitofarmacêuticos no mercado (5), nomeadamente a alínea f) do n.o 1 do artigo 4.o,

Considerando o seguinte:

| (1) | As substâncias activas existentes desmedifame e fenemedifame foram incluídas no anexo I da Directiva 91/414/CEE pela Directiva 2004/58/CE da Comissão (6). |
| --- | --- |

(1)

As substâncias activas existentes desmedifame e fenemedifame foram incluídas no anexo I da Directiva 91/414/CEE pela Directiva 2004/58/CE da Comissão (6).

| (2) | A inclusão das substâncias activas em causa no anexo I da Directiva 91/414/CEE baseou-se numa avaliação das informações apresentadas sobre as utilizações para elas propostas. Alguns Estados-Membros apresentaram informações sobre as referidas utilizações, em conformidade com a alínea f) do n.o 1 do artigo 4.o da Directiva 91/414/CEE. As informações disponíveis foram revistas e são suficientes para que se possam fixar determinados limites máximos de resíduos (LMR). |
| --- | --- |

(2)

A inclusão das substâncias activas em causa no anexo I da Directiva 91/414/CEE baseou-se numa avaliação das informações apresentadas sobre as utilizações para elas propostas. Alguns Estados-Membros apresentaram informações sobre as referidas utilizações, em conformidade com a alínea f) do n.o 1 do artigo 4.o da Directiva 91/414/CEE. As informações disponíveis foram revistas e são suficientes para que se possam fixar determinados limites máximos de resíduos (LMR).

| (3) | Foi decidido, através do Regulamento (CE) n.o 2076/2002 da Comissão (7), não incluir a substância clorfenvinfos no anexo I da Directiva 91/414/CEE. A determinados Estados-Membros é permitido manter em vigor até 30 de Junho de 2007 certas autorizações de utilização de produtos que contenham clorfenvinfos. |
| --- | --- |

(3)

Foi decidido, através do Regulamento (CE) n.o 2076/2002 da Comissão (7), não incluir a substância clorfenvinfos no anexo I da Directiva 91/414/CEE. A determinados Estados-Membros é permitido manter em vigor até 30 de Junho de 2007 certas autorizações de utilização de produtos que contenham clorfenvinfos.

| (4) | A Directiva 76/895/CEE contém já LMR comunitários para o clorfenvinfos. Esses LMR devem ser tidos em conta quando se fixarem os LMR para o clorfenvinfos na Directiva 90/642/CEE. |
| --- | --- |

(4)

A Directiva 76/895/CEE contém já LMR comunitários para o clorfenvinfos. Esses LMR devem ser tidos em conta quando se fixarem os LMR para o clorfenvinfos na Directiva 90/642/CEE.

| (5) | Os relatórios de revisão da Comissão que foram preparados no sentido da inclusão das substâncias activas em causa no anexo I da Directiva 91/414/CEE estabeleceram as doses diárias admissíveis (DDA) e, quando necessário, as doses agudas de referência (DAR) para aquelas substâncias. A exposição dos consumidores a produtos alimentares tratados com as substâncias activas em causa foi avaliada com base nos procedimentos comunitários. Foram igualmente tidas em conta as directrizes publicadas pela Organização Mundial de Saúde (8) e o parecer do Comité Científico das Plantas (9)sobre a metodologia utilizada. Concluiu-se que os LMR propostos não implicarão a superação das DDA e das DAR indicadas. |
| --- | --- |

(5)

Os relatórios de revisão da Comissão que foram preparados no sentido da inclusão das substâncias activas em causa no anexo I da Directiva 91/414/CEE estabeleceram as doses diárias admissíveis (DDA) e, quando necessário, as doses agudas de referência (DAR) para aquelas substâncias. A exposição dos consumidores a produtos alimentares tratados com as substâncias activas em causa foi avaliada com base nos procedimentos comunitários. Foram igualmente tidas em conta as directrizes publicadas pela Organização Mundial de Saúde (8) e o parecer do Comité Científico das Plantas (9)sobre a metodologia utilizada. Concluiu-se que os LMR propostos não implicarão a superação das DDA e das DAR indicadas.

| (6) | Para garantir uma protecção adequada dos consumidores contra a exposição a resíduos resultantes de utilizações não autorizadas de produtos fitofarmacêuticos, importa fixar como LMR provisórios para as combinações produto/pesticida pertinentes os limites inferiores de determinação analítica. |
| --- | --- |

(6)

Para garantir uma protecção adequada dos consumidores contra a exposição a resíduos resultantes de utilizações não autorizadas de produtos fitofarmacêuticos, importa fixar como LMR provisórios para as combinações produto/pesticida pertinentes os limites inferiores de determinação analítica.

| (7) | O facto de serem fixados esses LMR provisórios a nível comunitário não impede os Estados-Membros de fixarem LMR provisórios para as substâncias em causa, em conformidade com a alínea f) do n.o 1 do artigo 4.o da Directiva 91/414/CEE e com o anexo VI da mesma. Considera-se que um período de quatro anos é suficiente para possibilitar outras utilizações da substância activa em causa. Os LMR provisórios deverão, então, tornar-se definitivos. |
| --- | --- |

(7)

O facto de serem fixados esses LMR provisórios a nível comunitário não impede os Estados-Membros de fixarem LMR provisórios para as substâncias em causa, em conformidade com a alínea f) do n.o 1 do artigo 4.o da Directiva 91/414/CEE e com o anexo VI da mesma. Considera-se que um período de quatro anos é suficiente para possibilitar outras utilizações da substância activa em causa. Os LMR provisórios deverão, então, tornar-se definitivos.

| (8) | É, pois, necessário inserir todos os LMR resultantes da utilização destes produtos fitofarmacêuticos nos anexos das Directivas 86/362/CEE, 86/363/CEE e 90/642/CEE, para que a proibição da utilização dos mesmos possa ser convenientemente vigiada e controlada e de modo a proteger os consumidores. Nos casos em que os LMR não tenham ainda sido definidos, há que os estabelecer pela primeira vez. |
| --- | --- |

(8)

É, pois, necessário inserir todos os LMR resultantes da utilização destes produtos fitofarmacêuticos nos anexos das Directivas 86/362/CEE, 86/363/CEE e 90/642/CEE, para que a proibição da utilização dos mesmos possa ser convenientemente vigiada e controlada e de modo a proteger os consumidores. Nos casos em que os LMR não tenham ainda sido definidos, há que os estabelecer pela primeira vez.

| (9) | Assim, importa suprimir as disposições da Directiva 76/895/CEE que estabelecem LMR para a substância clorfenvinfos. |
| --- | --- |

(9)

Assim, importa suprimir as disposições da Directiva 76/895/CEE que estabelecem LMR para a substância clorfenvinfos.

| (10) | Por conseguinte, as Directivas 76/895/CEE, 86/362/CEE, 86/363/CEE e 90/642/CEE devem ser alteradas em conformidade. |
| --- | --- |

(10)

Por conseguinte, as Directivas 76/895/CEE, 86/362/CEE, 86/363/CEE e 90/642/CEE devem ser alteradas em conformidade.

| (11) | As medidas previstas na presente directiva estão em conformidade com o parecer do Comité Permanente da Cadeia Alimentar e da Saúde Animal, |
| --- | --- |

(11)

As medidas previstas na presente directiva estão em conformidade com o parecer do Comité Permanente da Cadeia Alimentar e da Saúde Animal,

ADOPTOU A PRESENTE DIRECTIVA:

Artigo 1.o

No anexo II da Directiva 76/895/CEE é suprimida a entrada relativa ao clorfenvinfos.

Artigo 2.o

O anexo II da Directiva 86/362/CEE é alterado em conformidade com o anexo I da presente directiva.

Artigo 3.o

O anexo II da Directiva 86/363/CEE é alterado em conformidade com o anexo II da presente directiva.

Artigo 4.o

O anexo II da Directiva 90/642/CEE é alterado em conformidade com o anexo III da presente directiva.

Artigo 5.o

1.   Os Estados-Membros adoptarão e publicarão, o mais tardar em 20 de Janeiro de 2008, as disposições legislativas, regulamentares e administrativas necessárias para dar cumprimento à presente directiva. Os Estados-Membros comunicarão imediatamente à Comissão o texto das referidas disposições bem como um quadro de correspondência entre essas disposições e a presente directiva.

Os Estados-Membros aplicarão tais disposições a partir de 21 de Janeiro de 2008.

As disposições adoptadas pelos Estados-Membros devem fazer referência à presente directiva ou ser acompanhadas dessa referência aquando da sua publicação oficial. As modalidades dessa referência incumbem aos Estados-Membros.

2.   Os Estados-Membros comunicarão à Comissão o texto das principais disposições de direito interno que adoptarem no domínio abrangido pela presente directiva.

Artigo 6.o

A presente directiva entra em vigor no vigésimo dia seguinte ao da sua publicação no Jornal Oficial da União Europeia.

Artigo 7.o

Os Estados-Membros são os destinatários da presente directiva.

Feito em Bruxelas, em 12 de Julho de 2006.

Pela Comissão

Markos KYPRIANOU

Membro da Comissão

---

(1)  JO L 340 de 9.12.1976, p. 26. Directiva com a última redacção que lhe foi dada pela Directiva 2006/59/CE da Comissão (JO L 175 de 29.6.2006, p. 61).

1

(2)  JO L 221 de 7.8.1986, p. 37. Directiva com a última redacção que lhe foi dada pela Directiva 2006/59/CE da Comissão.

2

(3)  JO L 221 de 7.8.1986, p. 43. Directiva com a última redacção que lhe foi dada pela Directiva 2006/59/CE da Comissão.

3

(4)  JO L 350 de 14.12.1990, p. 71. Directiva com a última redacção que lhe foi dada pela Directiva 2006/59/CE da Comissão.

4

(5)  JO L 230 de 19.8.1991, p. 1. Directiva com a última redacção que lhe foi dada pela Directiva 2006/45/CE da Comissão (JO L 130 de 18.5.2006, p. 27).

5

(6)  JO L 120 de 24.4.2004, p. 26.

6

(7)  JO L 319 de 23.11.2002, p. 3. Regulamento com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CE) n.o 1335/2005 (JO L 211 de 13.8.2005, p. 6).

7

o

(8)  «Guidelines for predicting dietary intake of pesticide residues» (Directrizes para a estimativa da ingestão de resíduos de pesticidas) (edição revista), preparadas pelo grupo GEMS/Programa Alimentar em colaboração com o Comité do Codex para os Resíduos de Pesticidas, publicadas pela Organização Mundial de Saúde em 1997 (WHO/FSF/FOS/97.7).

8

Codex

(9)  Parecer do Comité Científico das Plantas sobre determinadas questões decorrentes da alteração dos anexos das Directivas 86/362/CEE, 86/363/CEE e 90/642/CEE do Conselho (Parecer do Comité Científico das Plantas expresso em 14 de Julho de 1998) (http://europa.eu.int/comm/food/fs/sc/index_en.html).

9

---

ANEXO I

À parte A do anexo II da Directiva 86/362/CEE são aditadas as seguintes entradas relativas às substâncias desmedifame, fenemedifame e clorfenvinfos:

| Resíduo de pesticida | Limite máximo em mg/kg |
| --- | --- |
| «Desmedifame | 0,05 (1)
   (2) cereais |
| Fenemedifame | 0,05 (1)
   (2) cereais |
| Clorfenvinfos (soma dos isómeros E e Z) | 0,02 (1) cereais |

Resíduo de pesticida

Limite máximo em mg/kg

«Desmedifame

0,05 (1)
   (2) cereais

Fenemedifame

0,05 (1)
   (2) cereais

Clorfenvinfos (soma dos isómeros E e Z)

0,02 (1) cereais

---

(1)  Indica o limite de determinação analítica.

1

(2)  Indica que o limite máximo de resíduos foi estabelecido provisoriamente em conformidade com a alínea f) do n.o 1 do artigo 4.o da Directiva 91/414/CEE.»

2

o

o

---

ANEXO II

O anexo II da Directiva 86/363/CEE é alterado do seguinte modo:

| 1. | À parte A é aditada a seguinte entrada relativa ao clorfenvinfos:








  Resíduos de pesticidas | Limite máximo em mg/kg |
| --- | --- | --- |
| | De gordura contida nas carnes, preparações de carne, miudezas e gorduras animais, incluídas no anexo I, dos códigos ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 e 1602 (1) (4) | Para o leite de vaca cru e o leite de vaca completo, incluído no anexo I, do código 0401; para os outros géneros alimentícios dos códigos 0401, 0402, 0405 00 e 0406 de acordo com (2) e (4) | De ovos frescos sem casca, para os ovos de aves e gemas de ovos incluídos no anexo I, dos códigos 0407 00 e 0408 (3) e (4) |
| «Clorfenvinfos (soma dos isómeros E e Z) | 0,01 (1) | 0,01 (1) | 0,01 (1) |

1.

À parte A é aditada a seguinte entrada relativa ao clorfenvinfos:

Resíduos de pesticidas

Limite máximo em mg/kg

De gordura contida nas carnes, preparações de carne, miudezas e gorduras animais, incluídas no anexo I, dos códigos ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 e 1602 (1) (4)

Para o leite de vaca cru e o leite de vaca completo, incluído no anexo I, do código 0401; para os outros géneros alimentícios dos códigos 0401, 0402, 0405 00 e 0406 de acordo com (2) e (4)

De ovos frescos sem casca, para os ovos de aves e gemas de ovos incluídos no anexo I, dos códigos 0407 00 e 0408 (3) e (4)

«Clorfenvinfos (soma dos isómeros E e Z)

0,01 (1)

0,01 (1)

0,01 (1)

| 2. | À parte B é aditada a seguinte entrada relativa ao fenemedifame:








  Resíduos de pesticidas | Limite máximo em mg/kg |
| --- | --- | --- |
| | De carne, incluída a gordura, preparações de carne, miudezas e gorduras animais, incluídas no anexo I, dos códigos ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 e 1602 | Para o leite e produtos lácteos, incluídos no anexo I, dos códigos 0401, 0402, 0405 00 e 0406 | De ovos frescos sem casca, para os ovos de aves e gemas de ovos, incluídos no anexo I, dos códigos 0407 00 e 0408 |
| «Fenemedifame (N-(3-hidroxifenil)carbamato de metilo) (MHPC) expresso como fenemedifame) | 0,05 (2)
   (3) | 0,05 (2)
   (3) | 0,05 (2)
   (3) |

2.

À parte B é aditada a seguinte entrada relativa ao fenemedifame:

Resíduos de pesticidas

Limite máximo em mg/kg

De carne, incluída a gordura, preparações de carne, miudezas e gorduras animais, incluídas no anexo I, dos códigos ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 e 1602

Para o leite e produtos lácteos, incluídos no anexo I, dos códigos 0401, 0402, 0405 00 e 0406

De ovos frescos sem casca, para os ovos de aves e gemas de ovos, incluídos no anexo I, dos códigos 0407 00 e 0408

«Fenemedifame (N-(3-hidroxifenil)carbamato de metilo) (MHPC) expresso como fenemedifame)

0,05 (2)
   (3)

0,05 (2)
   (3)

0,05 (2)
   (3)

---

(1)  Indica o limite de determinação analítica.»

(2)  Indica o limite de determinação analítica.

(3)  Indica um limite máximo de resíduos provisório, estabelecido nos termos da alínea f) do n.o 1 do artigo 4.o da Directiva 91/414/CEE: se não for alterado, este limite tornar-se-á definitivo em 9 de Agosto de 2010.»

---

ANEXO III

À parte A do anexo II da Directiva 90/642/CEE são aditadas as seguintes colunas relativas às substâncias desmedifame, fenemedifame e clorfenvinfos:

| Resíduos de pesticidas e limites máximos de resíduos (mg/kg) |
| --- |
| Grupos de produtos e exemplos de produtos a que se aplicam os LMR | Desmedifame | Fenemedifame | Clorfenvinfos (soma dos isómeros E e Z) |
| «1. | Frutos, frescos, secos ou não cozidos, congelados, sem adição de açúcar; frutos de casca rija | 0,05 (1)
   (2) | | 0,02 (1) |
| | i) | CITRINOS | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Toranjas | | | |
| | | Limões | | | |
| | | Limas | | | |
| | | Tangerinas (incluindo clementinas e híbridos semelhantes) | | | |
| | | Laranjas | | | |
| | | Pomelos | | | |
| | | Outros | | | |
| | ii) | FRUTOS DE CASCA RIJA (com ou sem casca) | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Amêndoas | | | |
| | | Castanhas-do-brasil | | | |
| | | Castanhas de caju | | | |
| | | Castanhas | | | |
| | | Cocos | | | |
| | | Avelãs | | | |
| | | Nozes de macadâmia | | | |
| | | Nozes pecans | | | |
| | | Pinhões | | | |
| | | Pistácios | | | |
| | | Nozes comuns | | | |
| | | Outros | | | |
| | iii) | POMÓIDEAS | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Maçãs | | | |
| | | Peras | | | |
| | | Marmelos | | | |
| | | Outros | | | |
| | iv) | PRUNÓIDEAS | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Damascos | | | |
| | | Cerejas | | | |
| | | Pêssegos (incluindo nectarinas e híbridos semelhantes) | | | |
| | | Ameixas | | | |
| | | Outros | | | |
| | v) | BAGAS E FRUTOS PEQUENOS | | | |
| | | a) | Uvas de mesa e para vinho | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | Uvas de mesa | | | |
| | | | Uvas para vinho | | | |
| | | b) | Morangos (à excepção dos silvestres) | | 0,1 (1)
   (2) | |
| | | c) | Frutos de tutor (à excepção dos silvestres) | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | Amoras | | | |
| | | | Amoras pretas | | | |
| | | | Framboesas (Rubus loganobaccus) | | | |
| | | | Framboesas | | | |
| | | | Outros | | | |
| | | d) | Outras bagas e frutos pequenos (à excepção dos silvestres) | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | Mirtilos (frutos da espécie Vaccinium myrtillus) | | | |
| | | | Airelas | | | |
| | | | Groselhas (de cachos vermelhos, negros e brancos) | | | |
| | | | Groselhas espinhosas | | | |
| | | | Outros | | | |
| | | e) | Bagas e frutos silvestres | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | vi) | FRUTOS DIVERSOS | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Abacates | | | |
| | | Bananas | | | |
| | | Tâmaras | | | |
| | | Figos | | | |
| | | Kiwis | | | |
| | | Kumquats | | | |
| | | Lichias | | | |
| | | Mangas | | | |
| | | Azeitonas (de mesa) | | | |
| | | Azeitonas (para azeite) | | | |
| | | Papaias | | | |
| | | Maracujás | | | |
| | | Ananases | | | |
| | | Romãs | | | |
| | | Outros | | | |
| 2. | Produtos hortícolas, frescos ou não cozidos, congelados ou secos | 0,05 (1)
   (2) | | |
| | i) | RAÍZES E TUBÉRCULOS | | | |
| | | Beterrabas | | 0,1 (1)
   (2) | |
| | | Cenouras | | | 0,5 |
| | | Mandiocas | | | |
| | | Aipos-rábanos | | | |
| | | Rábanos | | | |
| | | Tupinambos | | | |
| | | Pastinagas | | | 0,5 |
| | | Salsa de raiz grossa | | | |
| | | Rabanetes | | | 0,5 |
| | | Salsifis | | | |
| | | Batatas doces | | | |
| | | Rutabagas | | | 0,5 |
| | | Nabos | | | 0,5 |
| | | Inhames | | | |
| | | Outros | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | ii) | BOLBOS | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Alhos | | | 0,5 |
| | | Cebolas | | | |
| | | Chalotas | | | 0,5 |
| | | Cebolinhas | | | |
| | | Outros | | | 0,02 (1) |
| | iii) | FRUTOS DE HORTÍCOLAS | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | a) | Solanáceas | | | 0,02 (1) |
| | | | Tomates | | | |
| | | | Pimentos | | | |
| | | | Beringelas | | | |
| | | | Quiabos | | | |
| | | | Outros | | | |
| | | b) | Cucurbitáceas de pele comestível | | | |
| | | | Pepinos | | | |
| | | | Pepininhos | | | |
| | | | Curgetes | | | 0,1 |
| | | | Outros | | | 0,02 (1) |
| | | c) | Cucurbitáceas de pele não comestível | | | 0,02 (1) |
| | | | Melões | | | |
| | | | Abóboras | | | |
| | | | Melancias | | | |
| | | | Outros | | | |
| | | d) | Milho doce | | | 0,02 (1) |
| | iv) | BRÁSSICAS | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | a) | Couves de inflorescência | | | 0,02 (1) |
| | | | Brócolos (incluindo couves-brócolos) | | | |
| | | | Couves-flores | | | |
| | | | Outros | | | |
| | | b) | Couves de cabeça | | | |
| | | | Couves-de-bruxelas | | | 0,1 |
| | | | Couves-repolho | | | 0,5 |
| | | | Outros | | | 0,02 (1) |
| | | c) | Couves de folha | | | 0,02 (1) |
| | | | Couves-da-china | | | |
| | | | Couves galegas | | | |
| | | | Outros | | | |
| | | d) | Couves-rábanos | | | 0,3 |
| | v) | PRODUTOS HORTÍCOLAS DE FOLHA E PLANTAS AROMÁTICAS FRESCAS | | | |
| | | a) | Alfaces e semelhantes | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | Agriões | | | 0,1 |
| | | | Alfaces-de-cordeiro | | | 0,1 |
| | | | Alfaces | | | |
| | | | Escarolas | | | |
| | | | Rúcola | | | |
| | | | Folhas e caules de brássicas | | | |
| | | | Outros | | | 0,02 (1) |
| | | b) | Espinafres e semelhantes | | 0,5 (2) | |
| | | | Espinafres | | | 0,1 |
| | | | Acelgas | | | |
| | | | Outros | | | 0,02 (1) |
| | | c) | Agriões-de-água | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | | d) | Endívias | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | | e) | Plantas aromáticas | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | Cerefólio | | | |
| | | | Cebolinho | | | |
| | | | Salsa | | | 0,5 |
| | | | Folhas de aipo | | | |
| | | | Outros | | | 0,02 (1) |
| | vi) | LEGUMES DE VAGEM (frescos) | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | | Feijões (com vagem) | | | |
| | | Feijões (sem vagem) | | | |
| | | Ervilhas (com vagem) | | | |
| | | Ervilhas (sem vagem) | | | |
| | | Outros | | | |
| | vii) | LEGUMES DE CAULE (frescos) | | | |
| | | Espargos | | | 0,1 |
| | | Cardos | | | |
| | | Aipos | | | 0,5 |
| | | Funcho | | | |
| | | Alcachofras | | 0,2 (2) | |
| | | Alhos franceses | | | 0,1 |
| | | Ruibarbos | | | |
| | | Outros | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | viii) | FUNGOS | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | a) | Cogumelos de cultura | | | 0,05 |
| | | b) | Cogumelos silvestres | | | 0,02 (1) |
| 3. | Leguminosas secas | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | Feijões | | | |
| | Lentilhas | | | |
| | Ervilhas | | | |
| | Outras | | | |
| 4. | Sementes oleaginosas | 0,1 (1)
   (2) | 0,1 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | Sementes de linho | | | |
| | Amendoins | | | |
| | Sementes de papoila | | | |
| | Sementes de sésamo | | | |
| | Sementes de girassol | | | |
| | Sementes de colza | | | |
| | Soja | | | |
| | Mostarda | | | |
| | Sementes de algodão | | | |
| | Sementes de cânhamo | | | |
| | Outros | | | |
| 5. | Batatas | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | Batatas primor e outras | | | |
| | Batatas de conservação | | | |
| 6. | Chá (folhas e caules, secos, fermentados ou não, de Camellia sinensis) | 0,1 (1)
   (2) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| 7. | Lúpulo (seco), incluindo granulados e pó não concentrado | 0,1 (1)
   (2) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1) |

Resíduos de pesticidas e limites máximos de resíduos (mg/kg)

Grupos de produtos e exemplos de produtos a que se aplicam os LMR

Desmedifame

Fenemedifame

Clorfenvinfos (soma dos isómeros E e Z)

«1.

Frutos, frescos, secos ou não cozidos, congelados, sem adição de açúcar; frutos de casca rija

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

i)

CITRINOS

0,05 (1)
   (2)

Toranjas

Limões

Limas

Tangerinas (incluindo clementinas e híbridos semelhantes)

Laranjas

Pomelos

Outros

ii)

FRUTOS DE CASCA RIJA (com ou sem casca)

0,05 (1)
   (2)

Amêndoas

Castanhas-do-brasil

Castanhas de caju

Castanhas

Cocos

Avelãs

Nozes de macadâmia

Nozes pecans

Pinhões

Pistácios

Nozes comuns

Outros

iii)

POMÓIDEAS

0,05 (1)
   (2)

Maçãs

Peras

Marmelos

Outros

iv)

PRUNÓIDEAS

0,05 (1)
   (2)

Damascos

Cerejas

Pêssegos (incluindo nectarinas e híbridos semelhantes)

Ameixas

Outros

v)

BAGAS E FRUTOS PEQUENOS

a)

Uvas de mesa e para vinho

0,05 (1)
   (2)

Uvas de mesa

Uvas para vinho

b)

Morangos (à excepção dos silvestres)

0,1 (1)
   (2)

c)

Frutos de tutor (à excepção dos silvestres)

0,05 (1)
   (2)

Amoras

Amoras pretas

Framboesas (Rubus loganobaccus)

Framboesas

Outros

d)

Outras bagas e frutos pequenos (à excepção dos silvestres)

0,05 (1)
   (2)

Mirtilos (frutos da espécie Vaccinium myrtillus)

Airelas

Groselhas (de cachos vermelhos, negros e brancos)

Groselhas espinhosas

Outros

e)

Bagas e frutos silvestres

0,05 (1)
   (2)

vi)

FRUTOS DIVERSOS

0,05 (1)
   (2)

Abacates

Bananas

Tâmaras

Figos

Kiwis

Kumquats

Lichias

Mangas

Azeitonas (de mesa)

Azeitonas (para azeite)

Papaias

Maracujás

Ananases

Romãs

Outros

2.

Produtos hortícolas, frescos ou não cozidos, congelados ou secos

0,05 (1)
   (2)

i)

RAÍZES E TUBÉRCULOS

Beterrabas

0,1 (1)
   (2)

Cenouras

0,5

Mandiocas

Aipos-rábanos

Rábanos

Tupinambos

Pastinagas

0,5

Salsa de raiz grossa

Rabanetes

0,5

Salsifis

Batatas doces

Rutabagas

0,5

Nabos

0,5

Inhames

Outros

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

ii)

BOLBOS

0,05 (1)
   (2)

Alhos

0,5

Cebolas

Chalotas

0,5

Cebolinhas

Outros

0,02 (1)

iii)

FRUTOS DE HORTÍCOLAS

0,05 (1)
   (2)

a)

Solanáceas

0,02 (1)

Tomates

Pimentos

Beringelas

Quiabos

Outros

b)

Cucurbitáceas de pele comestível

Pepinos

Pepininhos

Curgetes

0,1

Outros

0,02 (1)

c)

Cucurbitáceas de pele não comestível

0,02 (1)

Melões

Abóboras

Melancias

Outros

d)

Milho doce

0,02 (1)

iv)

BRÁSSICAS

0,05 (1)
   (2)

a)

Couves de inflorescência

0,02 (1)

Brócolos (incluindo couves-brócolos)

Couves-flores

Outros

b)

Couves de cabeça

Couves-de-bruxelas

0,1

Couves-repolho

0,5

Outros

0,02 (1)

c)

Couves de folha

0,02 (1)

Couves-da-china

Couves galegas

Outros

d)

Couves-rábanos

0,3

v)

PRODUTOS HORTÍCOLAS DE FOLHA E PLANTAS AROMÁTICAS FRESCAS

a)

Alfaces e semelhantes

0,05 (1)
   (2)

Agriões

0,1

Alfaces-de-cordeiro

0,1

Alfaces

Escarolas

Rúcola

Folhas e caules de brássicas

Outros

0,02 (1)

b)

Espinafres e semelhantes

0,5 (2)

Espinafres

0,1

Acelgas

Outros

0,02 (1)

c)

Agriões-de-água

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

d)

Endívias

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

e)

Plantas aromáticas

0,05 (1)
   (2)

Cerefólio

Cebolinho

Salsa

0,5

Folhas de aipo

Outros

0,02 (1)

vi)

LEGUMES DE VAGEM (frescos)

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

Feijões (com vagem)

Feijões (sem vagem)

Ervilhas (com vagem)

Ervilhas (sem vagem)

Outros

vii)

LEGUMES DE CAULE (frescos)

Espargos

0,1

Cardos

Aipos

0,5

Funcho

Alcachofras

0,2 (2)

Alhos franceses

0,1

Ruibarbos

Outros

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

viii)

FUNGOS

0,05 (1)
   (2)

a)

Cogumelos de cultura

0,05

b)

Cogumelos silvestres

0,02 (1)

3.

Leguminosas secas

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

Feijões

Lentilhas

Ervilhas

Outras

4.

Sementes oleaginosas

0,1 (1)
   (2)

0,1 (1)
   (2)

0,02 (1)

Sementes de linho

Amendoins

Sementes de papoila

Sementes de sésamo

Sementes de girassol

Sementes de colza

Soja

Mostarda

Sementes de algodão

Sementes de cânhamo

Outros

5.

Batatas

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

Batatas primor e outras

Batatas de conservação

6.

Chá (folhas e caules, secos, fermentados ou não, de Camellia sinensis)

0,1 (1)
   (2)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)

7.

Lúpulo (seco), incluindo granulados e pó não concentrado

0,1 (1)
   (2)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)

---

(1)  Indica o limite de determinação analítica.

1

(2)  Indica que o limite máximo de resíduos foi estabelecido provisoriamente em conformidade com a alínea f) do n.o 1 do artigo 4.o da Directiva 91/414/CEE.».

2

o

o

---

| 27.7.2006 | PT | Jornal Oficial da União Europeia | L 206/36 |
| --- | --- | --- | --- |

27.7.2006

PT

Jornal Oficial da União Europeia

L 206/36

---

DIRECTIVA 2006/63/CE DA COMISSÃO

de 14 de Julho de 2006

que altera os anexos II a VII da Directiva 98/57/CE do Conselho relativa ao controlo de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,

Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Europeia,

Tendo em conta a Directiva 98/57/CE do Conselho, de 20 de Julho de 1998, relativa ao controlo de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.
   (1), nomeadamente o artigo 11.o,

Considerando o seguinte:

| (1) | Um dos importantes organismos prejudiciais para a batateira e o tomateiro é a bactéria Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., patogéneo do pus ou mal murcho da batateira e do mal murcho do tomateiro (a seguir designada por «organismo»). |
| --- | --- |

(1)

Um dos importantes organismos prejudiciais para a batateira e o tomateiro é a bactéria Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., patogéneo do pus ou mal murcho da batateira e do mal murcho do tomateiro (a seguir designada por «organismo»).

| (2) | O organismo ainda existe em algumas regiões da Comunidade. |
| --- | --- |

(2)

O organismo ainda existe em algumas regiões da Comunidade.

| (3) | A Directiva 98/57/CE do Conselho estabeleceu medidas circunstanciadas a tomar nos Estados-Membros contra o organismo, a fim de o localizar e determinar a sua distribuição, evitar a sua ocorrência e dispersão e, quando detectado, evitar a sua dispersão e combatê-lo com vista à sua erradicação. |
| --- | --- |

(3)

A Directiva 98/57/CE do Conselho estabeleceu medidas circunstanciadas a tomar nos Estados-Membros contra o organismo, a fim de o localizar e determinar a sua distribuição, evitar a sua ocorrência e dispersão e, quando detectado, evitar a sua dispersão e combatê-lo com vista à sua erradicação.

| (4) | Desde então, registaram-se progressos significativos na compreensão da biologia e nos procedimentos de detecção e de identificação do organismo; além disso, a experiência prática adquirida no combate ao organismo exige a revisão de diversas disposições de ordem técnica relacionadas com as medidas de controlo do organismo. |
| --- | --- |

(4)

Desde então, registaram-se progressos significativos na compreensão da biologia e nos procedimentos de detecção e de identificação do organismo; além disso, a experiência prática adquirida no combate ao organismo exige a revisão de diversas disposições de ordem técnica relacionadas com as medidas de controlo do organismo.

| (5) | Em resultado desses progressos, torna-se necessário rever e actualizar as medidas incluídas em determinados anexos da Directiva 98/57/CE. |
| --- | --- |

(5)

Em resultado desses progressos, torna-se necessário rever e actualizar as medidas incluídas em determinados anexos da Directiva 98/57/CE.

| (6) | Em relação aos procedimentos de detecção e identificação, inclui-se a hibridação fluorescente in situ (FISH), um método de detecção moderno. Foram também incluídas melhorias ao método de reacção em cadeia da polimerase (PCR), bem como melhorias de vários elementos técnicos do actual procedimento de detecção e identificação, e métodos para a detecção e identificação do organismo em outras plantas hospedeiras que não a batateira assim como na água e no solo. |
| --- | --- |

(6)

Em relação aos procedimentos de detecção e identificação, inclui-se a hibridação fluorescente in situ (FISH), um método de detecção moderno. Foram também incluídas melhorias ao método de reacção em cadeia da polimerase (PCR), bem como melhorias de vários elementos técnicos do actual procedimento de detecção e identificação, e métodos para a detecção e identificação do organismo em outras plantas hospedeiras que não a batateira assim como na água e no solo.

| (7) | Quanto aos elementos técnicos das medidas de controlo, são previstas melhores disposições respeitantes: ao modo de conservação de amostras analisadas a fim de assegurar a rastreabilidade do organismo, aos elementos necessários para determinar a extensão da eventual contaminação, aos pormenores da notificação de qualquer presença confirmada do organismo e da zona contaminada e às medidas de implementação em locais de produção designados como estando contaminados e dentro de zonas demarcadas. Foram ainda incluídas algumas disposições respeitantes ao tomateiro, a fim de ter mais em conta a importância desta planta enquanto hospedeira do organismo. |
| --- | --- |

(7)

Quanto aos elementos técnicos das medidas de controlo, são previstas melhores disposições respeitantes: ao modo de conservação de amostras analisadas a fim de assegurar a rastreabilidade do organismo, aos elementos necessários para determinar a extensão da eventual contaminação, aos pormenores da notificação de qualquer presença confirmada do organismo e da zona contaminada e às medidas de implementação em locais de produção designados como estando contaminados e dentro de zonas demarcadas. Foram ainda incluídas algumas disposições respeitantes ao tomateiro, a fim de ter mais em conta a importância desta planta enquanto hospedeira do organismo.

| (8) | As medidas previstas na presente directiva estão em conformidade com o parecer do Comité Fitossanitário Permanente, |
| --- | --- |

(8)

As medidas previstas na presente directiva estão em conformidade com o parecer do Comité Fitossanitário Permanente,

ADOPTOU A PRESENTE DIRECTIVA:

Artigo 1.o

Os anexos II a VII da Directiva 98/57/CE são substituídos pelos textos correspondentes, incluídos no anexo da presente directiva.

Artigo 2.o

1.   Os Estados-Membros adoptarão e publicarão, o mais tardar em 31 de Março de 2007, as disposições legislativas, regulamentares e administrativas necessárias para dar cumprimento à presente directiva. Os Estados-Membros comunicarão imediatamente à Comissão o texto dessas disposições, bem como um quadro de correspondência entre as referidas disposições e a presente directiva.

Os Estados-Membros devem aplicar essas disposições a partir de 1 de Abril de 2007.

Quando os Estados-Membros adoptarem tais disposições, estas devem incluir uma referência à presente directiva ou ser acompanhadas dessa referência aquando da sua publicação oficial. As modalidades dessa referência serão estabelecidas pelos Estados-Membros.

2.   Os Estados-Membros comunicarão imediatamente à Comissão o texto das principais disposições de direito interno que adoptarem no domínio regido pela presente directiva.

Artigo 3.o

A presente directiva entra em vigor no terceiro dia seguinte ao da sua publicação no Jornal Oficial da União Europeia.

Artigo 4.o

Os Estados-Membros são os destinatários da presente directiva.

Feito em Bruxelas, em 14 de Julho de 2006.

Pela Comissão

Markos KYPRIANOU

Membro da Comissão

---

(1)  JO L 235 de 21.8.1998, p. 1.

1

---

ANEXO

ANEXO II

ESQUEMA DE ENSAIO PARA DIAGNÓSTICO, DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL.

CONTEÚDO DO ESQUEMA DE ENSAIO

O esquema de ensaio apresentado descreve os vários procedimentos envolvidos:

| i) | No diagnóstico do pus em tubérculos de batateira e de mal murcho em plantas de batateira, de tomateiro e outras plantas hospedeiras; |
| --- | --- |

i)

No diagnóstico do pus em tubérculos de batateira e de mal murcho em plantas de batateira, de tomateiro e outras plantas hospedeiras;

| ii) | Na detecção de Ralstonia solanacearum em amostras de tubérculos de batateira, em plantas de batateira, de tomateiro e outras plantas hospedeiras, em água e no solo; |
| --- | --- |

ii)

Na detecção de Ralstonia solanacearum em amostras de tubérculos de batateira, em plantas de batateira, de tomateiro e outras plantas hospedeiras, em água e no solo;

| iii) | Na identificação de Ralstonia solanacearum (R. solanacearum). |
| --- | --- |

iii)

Na identificação de Ralstonia solanacearum (R. solanacearum).

ÍNDICE

| | | Página |
| --- | --- | --- |
| | Princípios gerais | 40 |
| SECÇÃO I: | Aplicação do esquema de ensaio | 40 |
| | 1. | Esquema para o diagnóstico do pus e mal murcho (R. solanacearum) em tubérculos de batateira e em plantas de batateira, de tomateiro ou em outras plantas hospedeiras com sintomas pus ou mal murcho | 40 |
| | 2. | Esquema para detecção e identificação de R. solanacearum em amostras de tubérculos de batateira assintomáticos | 43 |
| | 3. | Esquema para detecção e identificação de R. solanacearum em amostras de plantas assintomáticas de batateira, tomateiro ou outras plantas hospedeiras | 46 |
| SECÇÃO II: | Métodos pormenorizados de detecção de R. solanacearum em tubérculos de batateira e em plantas de batateira, tomateiro ou em outras plantas hospedeiras com sintomas de pus ou mal murcho | 48 |
| | 1. | Sintomas | 48 |
| | 2. | Testes rápidos de rastreio | 48 |
| | 3. | Isolamento | 49 |
| | 4. | Testes de identificação de R. solanacearum | 49 |
| SECÇÃO III: | 1. | Métodos pormenorizados de detecção e identificação de R. solanacearum em amostras de tubérculos de batateira assintomáticos | 49 |
| | | 1.1. | Preparação da amostra | 49 |
| | | 1.2. | Ensaio | 51 |
| | 2. | Métodos pormenorizados de detecção e identificação de R. solanacearum em amostras de plantas assintomáticas de batateira, tomateiro ou outras plantas | 51 |
| | | 2.1. | Preparação da amostra | 51 |
| | | 2.2. | Ensaio | 52 |
| SECÇÃO IV: | 1. | Esquema para detecção e identificação de R. solanacearum em água | 53 |
| | 2. | Métodos de detecção e identificação de R. solanacearum em água | 55 |
| | | 2.1. | Preparação da amostra | 55 |
| | | 2.2. | Ensaio | 55 |
| SECÇÃO V: | 1. | Esquema para detecção e identificação de R. solanacearum no solo | 56 |
| | 2. | Métodos de detecção e identificação de R. solanacearum no solo | 58 |
| | | 2.1. | Preparação das amostras | 58 |
| | | 2.2. | Ensaio | 58 |
| SECÇÃO VI: | Protocolos optimizados para detecção e identificação de R. solanacearum | 58 |
| | A. | Testes de diagnóstico e detecção | 58 |
| | | 1. | Teste de exsudação do caule | 58 |
| | | 2. | Detecção de grânulos de poli-β-hidroxibutirato | 58 |
| | | 3. | Testes serológicos de aglutinação | 59 |
| | | 4. | Isolamento selectivo | 60 |
| | | | 4.1. | Diluição em placas com meio selectivo | 60 |
| | | | 4.2. | Enriquecimento selectivo | 60 |
| | | 5. | Teste de imunofluorescência (teste IF) | 61 |
| | | 6. | Teste de reacção em cadeia da polimerase (teste PCR) | 64 |
| | | | 6.1. | Métodos de purificação do ADN | 65 |
| | | | | a) | Método de acordo com Pastrik (2000) | 65 |
| | | | | b) | Outros métodos | 65 |
| | | | 6.2. | PCR | 66 |
| | | | 6.3. | Análise do produto da PCR | 66 |
| | | 7. | Teste de hibridação fluorescente in situ (teste FISH) | 67 |
| | | 8. | Testes de adsorção imunoenzimática (ELISA) | 69 |
| | | | a) | Teste ELISA indirecto | 69 |
| | | | b) | DASI ELISA (teste indirecto de adsorção imunoenzimática por sanduiche de duplo anticorpo) | 70 |
| | | 9. | Bioensaio | 71 |
| | B. | Testes de identificação | 72 |
| | | 1. | Testes nutricionais e enzimáticos | 72 |
| | | 2. | Teste IF | 72 |
| | | 3. | Teste ELISA | 73 |
| | | 4. | Teste PCR | 73 |
| | | 5. | Teste FISH | 73 |
| | | 6. | Perfis de ácidos gordos (FAP) | 73 |
| | | 7. | Métodos para caracterização da estirpe | 73 |
| | | | 7.1. | Determinação do biovar | 73 |
| | | | 7.2. | “Genomic fingerprinting” | 74 |
| | | | 7.3. | Métodos PCR | 74 |
| | C. | Teste de confirmação | 74 |
| | | Apêndice 1 | Laboratórios que participaram na optimização e validação de protocolos | 76 |
| | | Apêndice 2 | Meios para isolamento e cultura de R. solanacearum | 77 |
| | | Apêndice 3 | (A) | Material de controlo normalizado disponível no mercado | 79 |
| | | | (B) | Preparação de controlos | 80 |
| | | Apêndice 4 | Tampões para a realização dos testes | 82 |
| | | Apêndice 5 | Determinação do nível de contaminação em testes IF e FISH | 85 |
| | | Apêndice 6 | Protocolos e reagentes validados para PCR | 86 |
| | | Apêndice 7 | Reagentes validados para o teste FISH | 91 |
| | | Apêndice 8 | Condições de cultivo de beringela e tomateiro | 93 |
| | | Referências bibliográficas | | 94 |

Página

Princípios gerais

40

SECÇÃO I:

Aplicação do esquema de ensaio

40

1.

Esquema para o diagnóstico do pus e mal murcho (R. solanacearum) em tubérculos de batateira e em plantas de batateira, de tomateiro ou em outras plantas hospedeiras com sintomas pus ou mal murcho

40

2.

Esquema para detecção e identificação de R. solanacearum em amostras de tubérculos de batateira assintomáticos

43

3.

Esquema para detecção e identificação de R. solanacearum em amostras de plantas assintomáticas de batateira, tomateiro ou outras plantas hospedeiras

46

SECÇÃO II:

Métodos pormenorizados de detecção de R. solanacearum em tubérculos de batateira e em plantas de batateira, tomateiro ou em outras plantas hospedeiras com sintomas de pus ou mal murcho

48

1.

Sintomas

48

2.

Testes rápidos de rastreio

48

3.

Isolamento

49

4.

Testes de identificação de R. solanacearum

49

SECÇÃO III:

1.

Métodos pormenorizados de detecção e identificação de R. solanacearum em amostras de tubérculos de batateira assintomáticos

49

1.1.

Preparação da amostra

49

1.2.

Ensaio

51

2.

Métodos pormenorizados de detecção e identificação de R. solanacearum em amostras de plantas assintomáticas de batateira, tomateiro ou outras plantas

51

2.1.

Preparação da amostra

51

2.2.

Ensaio

52

SECÇÃO IV:

1.

Esquema para detecção e identificação de R. solanacearum em água

53

2.

Métodos de detecção e identificação de R. solanacearum em água

55

2.1.

Preparação da amostra

55

2.2.

Ensaio

55

SECÇÃO V:

1.

Esquema para detecção e identificação de R. solanacearum no solo

56

2.

Métodos de detecção e identificação de R. solanacearum no solo

58

2.1.

Preparação das amostras

58

2.2.

Ensaio

58

SECÇÃO VI:

Protocolos optimizados para detecção e identificação de R. solanacearum

58

A.

Testes de diagnóstico e detecção

58

1.

Teste de exsudação do caule

58

2.

Detecção de grânulos de poli-β-hidroxibutirato

58

3.

Testes serológicos de aglutinação

59

4.

Isolamento selectivo

60

4.1.

Diluição em placas com meio selectivo

60

4.2.

Enriquecimento selectivo

60

5.

Teste de imunofluorescência (teste IF)

61

6.

Teste de reacção em cadeia da polimerase (teste PCR)

64

6.1.

Métodos de purificação do ADN

65

a)

Método de acordo com Pastrik (2000)

65

b)

Outros métodos

65

6.2.

PCR

66

6.3.

Análise do produto da PCR

66

7.

Teste de hibridação fluorescente in situ (teste FISH)

67

8.

Testes de adsorção imunoenzimática (ELISA)

69

a)

Teste ELISA indirecto

69

b)

DASI ELISA (teste indirecto de adsorção imunoenzimática por sanduiche de duplo anticorpo)

70

9.

Bioensaio

71

B.

Testes de identificação

72

1.

Testes nutricionais e enzimáticos

72

2.

Teste IF

72

3.

Teste ELISA

73

4.

Teste PCR

73

5.

Teste FISH

73

6.

Perfis de ácidos gordos (FAP)

73

7.

Métodos para caracterização da estirpe

73

7.1.

Determinação do biovar

73

7.2.

“Genomic fingerprinting”

74

7.3.

Métodos PCR

74

C.

Teste de confirmação

74

Apêndice 1

Laboratórios que participaram na optimização e validação de protocolos

76

Apêndice 2

Meios para isolamento e cultura de R. solanacearum

77

Apêndice 3

(A)

Material de controlo normalizado disponível no mercado

79

(B)

Preparação de controlos

80

Apêndice 4

Tampões para a realização dos testes

82

Apêndice 5

Determinação do nível de contaminação em testes IF e FISH

85

Apêndice 6

Protocolos e reagentes validados para PCR

86

Apêndice 7

Reagentes validados para o teste FISH

91

Apêndice 8

Condições de cultivo de beringela e tomateiro

93

Referências bibliográficas

94

PRINCÍPIOS GERAIS

Nos apêndices são apresentados protocolos optimizados para os diversos métodos, reagentes validados e pormenores respeitantes à preparação dos materiais para realização dos testes e dos controlos. No apêndice 1 é fornecida uma lista dos laboratórios incluídos na optimização e validação de protocolos.

Uma vez que os protocolos envolvem a detecção de um organismo de quarentena e incluirão a utilização de culturas viáveis de R. solanacearum como materiais de controlo, será necessário realizar os procedimentos em condições de quarentena adequadas, em instalações com sistemas apropriados de eliminação de resíduos e possuindo as licenças adequadas, emitidas pelas autoridades oficiais competentes em matéria de quarentena fitossanitária.

Os parâmetros dos ensaios devem garantir a detecção consistente e reprodutível de níveis de R. solanacearum nos limiares estabelecidos para os métodos seleccionados.

É imperiosa a preparação rigorosa de controlos positivos.

A realização dos ensaios de acordo com os limiares exigidos implica igualmente uma regulação, manutenção e calibração correctas do equipamento, uma manipulação e conservação cuidadosas dos reagentes e estabelecimento de todas as medidas destinadas a evitar contaminações entre amostras, por exemplo, a separação de controlos positivos das amostras a testar. Devem ser aplicadas normas de controlo de qualidade a fim de evitar, nomeadamente, erros administrativos, em especial no tocante à rotulagem e à documentação.

Uma ocorrência suspeita, conforme referido no n.o 2 do artigo 4.o da Directiva 98/57/CE, implica um resultado positivo nos testes de diagnóstico ou de rastreio efectuados numa amostra, conforme especificado nos fluxogramas a seguir indicados. Um primeiro teste de rastreio positivo (teste IF, PCR/FISH, isolamento selectivo) deve ser confirmado por um segundo teste de rastreio baseado num princípio biológico diferente.

Caso o primeiro teste de rastreio seja positivo, suspeitar-se-á de contaminação por R. solanacearum, devendo proceder-se a um segundo teste de rastreio. Caso o segundo teste de rastreio seja positivo, será confirmada a suspeita (ocorrência suspeita), devendo prosseguir-se a verificação de acordo com o esquema. Caso o segundo teste de rastreio seja negativo, considerar-se-á que a amostra não está contaminada por R. solanacearum.

A presença confirmada, conforme referido no n.o 1 do artigo 5.o da Directiva 98/57/CE, implica o isolamento e a identificação de uma cultura pura de R. solanacearum com confirmação de patogenicidade.

SECÇÃO I

APLICAÇÃO DO ESQUEMA DE ENSAIO

1.   Esquema para o diagnóstico do pus e mal murcho (Ralstonia solanacearum) em tubérculos de batateira e em plantas de batateira, tomateiro ou outras plantas hospedeiras com sintomas.

O procedimento laboratorial destina-se a tubérculos de batateira e a plantas com sintomas típicos ou suspeitos de pus ou mal murcho. Implica um teste rápido de rastreio, isolamento do patogéneo a partir do tecido vascular infectado num meio de cultura (selectivo) e, em caso de resultado positivo, identificação da cultura como Ralstonia solanacearum.

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2.   Esquema para detecção e identificação de Ralstonia solanacearum em amostras de tubérculos de batateira assintomáticos

Princípio:

O procedimento laboratorial destina-se a detectar infecções latentes em tubérculos de batateira. Um resultado positivo em, pelo menos, dois testes de rastreio3, com base em princípios biológicos diferentes, deve ser complementado com o isolamento do patogéneo, seguido, em caso de isolamento de colónias típicas, de confirmação da identificação da cultura pura como sendo R. solanacearum. Um resultado positivo em apenas um dos testes de rastreio não é suficiente para considerar a amostra suspeita.

Os testes de rastreio e os testes de isolamento devem permitir detectar 103 a 104 células por ml de sedimento ressuspenso, incluídos como controlos positivos em cada série de testes.

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3.   Esquema para detecção e identificação de Ralstonia solanacearum em amostras de plantas assintomáticas de batateira, tomateiro ou outras plantas hospedeiras

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SECÇÃO II

MÉTODOS PORMENORIZADOS DE DETECÇÃO DE RALSTONIA SOLANACEARUM EM TUBÉRCULOS DE BATATEIRA E EM PLANTAS DE BATATEIRA, TOMATEIRO OU OUTRAS PLANTAS HOSPEDEIRAS COM SINTOMAS DE PUS OU MAL MURCHO

1.   Sintomas (ver http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

1.1.   Sintomas na batateira

Planta da batateira. Na fase inicial de infecção no campo, verifica-se uma murchidão das folhas na parte superior da planta a temperaturas elevadas e durante o dia, com recuperação à noite. Na fase inicial de murchidão, as folhas mantêm-se verdes mas, posteriormente, desenvolve-se uma clorose seguida de necrose. Observa-se também epinastia. A murchidão de um rebento ou de toda a planta torna-se rapidamente irreversível, resultando no colapso e na morte da planta. O tecido vascular dos caules de plantas afectadas cortados transversalmente apresenta-se necrosado e um exsudado bacteriano de cor esbranquiçada emerge da superfície cortada ou pode ser extraído apertando o caule entre os dedos. Quando um caule cortado é colocado verticalmente em água, observa-se a exsudação de um líquido viscoso a partir dos feixes vasculares.

Tubérculo de batateira. Os tubérculos de batateira têm que ser cortados transversalmente junto do hilo (extremidade do estolho) ou longitudinalmente sobre a extremidade do estolho. Na fase inicial de infecção, verifica-se uma coloração amarela vítrea ou castanha clara no anel vascular, pelo qual emerge espontaneamente, após alguns minutos, um exsudado bacteriano de cor creme clara. Mais tarde, a descoloração vascular assume um tom castanho mais nítido e a necrose pode alastrar ao parênquima. Nas fases mais avançadas, a infecção progride a partir do hilo e dos “olhos”, nos quais se pode manifestar exsudação bacteriana que origina a adesão de partículas de terra. Poderão apresentar-se lesões na epiderme de cor vermelha acastanhada, em ligeira depressão, por colapso interno dos tecidos vasculares. Nas fases avançadas da doença, é comum o desenvolvimento de podridões moles secundárias causadas por fungos ou bactérias.

1.2.   Sintomas no tomateiro

Planta de tomateiro. Os primeiros sintomas visíveis são o aspecto flácido das folhas mais jovens. Em condições ambientais favoráveis ao patogéneo (temperatura do solo de 25 °C, humidade saturada), surge dentro de poucos dias a epinastia e a murchidão de um lado ou de toda a planta, conduzindo ao total colapso da planta. Em condições menos favoráveis (temperatura do solo inferior a 21 °C), observa-se uma menor murchidão, mas pode desenvolver-se no caule um grande número de raízes adventícias. Podem observar-se manchas hidrópicas alongadas a partir da base do caule, que evidenciam a necrose do sistema vascular. Quando o caule é cortado transversalmente, os seus tecidos vasculares apresentam uma coloração acastanhada e exsudam gotas de líquido viscoso branco ou amarelado, que contêm células bacterianas.

1.3.   Sintomas noutros hospedeiros

Plantas de Solanum dulcamara e S. nigrum. Em condições naturais, os sintomas de murchidão são raramente observados nestas infestantes hospedeiras, a menos que as temperaturas do solo ultrapassem os 25 °C ou que os níveis de inóculo sejam extremamente elevados (por exemplo, no caso de S. nigrum que cresce junto de plantas de batateira ou de tomateiro doentes). Quando efectivamente ocorre a murchidão, os sintomas são iguais aos descritos para o tomateiro. As plantas de S. dulcamara que não apresentam murchidão e com os caules e raízes imersos em água poderão apresentar uma coloração castanha clara dos tecidos vasculares em secções transversais da base do caule ou de outras partes do caule que se encontrem submersas. Mesmo na ausência de sintomas de murchidão, pode manifestar-se a presença de exsudado bacteriano a partir de cortes de tecido vascular ou observar-se esse exsudado se o caule, cortado transversalmente, for colocado verticalmente em água.

2.   Testes rápidos de rastreio

Os testes rápidos de rastreio poderão facilitar o diagnóstico preliminar, mas não são essenciais. Utilizar um ou mais dos seguintes testes validados:

2.1.   Teste de exsudação do caule

(Ver parte A, ponto 1, da secção VI.)

2.2.   Detecção de grânulos de poli-β-hidroxibutirato (PHB)

Os grânulos característicos de PHB nas células de R. solanacearum são visualizados através da coloração com azul de Nilo A ou com negro de Sudão de esfregaços de exsudado bacteriano provenientes de tecido vegetal infectado fixados pelo calor numa lâmina de microscópio (ver parte A, ponto 2, da secção VI).

2.3.   Testes serológicos de aglutinação

(Ver parte A, ponto 3, da secção VI.)

2.4.   Outros testes

Outros testes rápidos de rastreio considerados apropriados são o teste IF (ver parte A, ponto 5, da secção VI), o teste FISH (ver parte A, ponto 7, da secção VI), os testes ELISA (ver parte A, ponto 8, da secção VI) e os testes PCR (ver parte A, ponto 6, da secção VI).

3.   Isolamento

| a) | Retirar o exsudado ou secções do tecido necrosado do anel vascular do tubérculo ou da zona vascular do caule da planta de batateira, tomateiro ou outras plantas hospedeiras com sintomas de murchidão. Efectuar uma suspensão num pequeno volume de água destilada esterilizada ou de tampão fosfato 50 mM (apêndice 4) e deixar em repouso durante 5 a 10 minutos. |
| --- | --- |

a)

Retirar o exsudado ou secções do tecido necrosado do anel vascular do tubérculo ou da zona vascular do caule da planta de batateira, tomateiro ou outras plantas hospedeiras com sintomas de murchidão. Efectuar uma suspensão num pequeno volume de água destilada esterilizada ou de tampão fosfato 50 mM (apêndice 4) e deixar em repouso durante 5 a 10 minutos.

| b) | Preparar uma série de diluições decimais da suspensão. |
| --- | --- |

b)

Preparar uma série de diluições decimais da suspensão.

| c) | Transferir 50-100 μl da suspensão para um meio nutritivo geral (NA, YPGA ou SPA, ver apêndice 2) e/ou para o meio de tetrazólio de Kelman (apêndice 2) e/ou para um meio selectivo validado (por exemplo, SMSA, ver apêndice 2). Espalhar ou efectuar um reticulado com uma técnica adequada de diluição em placas. Se necessário, preparar um conjunto separado de placas com uma suspensão diluída de células de R. solanacearum Biovar 2 como controlo positivo. |
| --- | --- |

c)

Transferir 50-100 μl da suspensão para um meio nutritivo geral (NA, YPGA ou SPA, ver apêndice 2) e/ou para o meio de tetrazólio de Kelman (apêndice 2) e/ou para um meio selectivo validado (por exemplo, SMSA, ver apêndice 2). Espalhar ou efectuar um reticulado com uma técnica adequada de diluição em placas. Se necessário, preparar um conjunto separado de placas com uma suspensão diluída de células de R. solanacearum Biovar 2 como controlo positivo.

| d) | Incubar as placas durante 2 a 6 dias a 28 °C.






  — | Em meios nutritivos gerais, os isolados virulentos de R. solanacearum produzem colónias de cor branco-pérola, achatadas, irregulares e fluidas, exibindo muitas vezes espirais características no centro. Formas avirulentas de R. solanacearum apresentam pequenas colónias butirosas redondas e não fluidas de coloração esbranquiçada. |
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d)

Incubar as placas durante 2 a 6 dias a 28 °C.

—

Em meios nutritivos gerais, os isolados virulentos de R. solanacearum produzem colónias de cor branco-pérola, achatadas, irregulares e fluidas, exibindo muitas vezes espirais características no centro. Formas avirulentas de R. solanacearum apresentam pequenas colónias butirosas redondas e não fluidas de coloração esbranquiçada.

| — | Nos meios de tetrazólio de Kelman e SMSA, as espirais são de cor vermelha viva. As formas avirulentas de R. solanacearum apresentam pequenas colónias butirosas redondas e não fluidas que são completamente vermelho-escuras. |
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—

Nos meios de tetrazólio de Kelman e SMSA, as espirais são de cor vermelha viva. As formas avirulentas de R. solanacearum apresentam pequenas colónias butirosas redondas e não fluidas que são completamente vermelho-escuras.

4.   Testes de identificação de R. solanacearum

Testes para confirmar a identidade de presumíveis isolados de R. solanacearum são descritos na parte B da secção VI.

SECÇÃO III

1.   Métodos pormenorizados de detecção e identificação de Ralstonia solanacearum em amostras de tubérculos de batateira assintomáticos

1.1.   Preparação da amostra

Nota:

| — | A dimensão normal da amostra é de 200 tubérculos por teste. Uma amostragem mais intensiva exige a realização de mais testes em amostras desta dimensão. Uma amostra com um maior número de tubérculos conduzirá à incapacidade ou a uma maior dificuldade de interpretação dos resultados. Contudo, este procedimento pode ser aplicado a amostras com menos de 200 tubérculos, sempre que este número de tubérculos não se encontre disponível. |
| --- | --- |

—

A dimensão normal da amostra é de 200 tubérculos por teste. Uma amostragem mais intensiva exige a realização de mais testes em amostras desta dimensão. Uma amostra com um maior número de tubérculos conduzirá à incapacidade ou a uma maior dificuldade de interpretação dos resultados. Contudo, este procedimento pode ser aplicado a amostras com menos de 200 tubérculos, sempre que este número de tubérculos não se encontre disponível.

| — | A validação de todos os métodos de detecção abaixo descritos tem por base a análise de amostras constituídas por 200 tubérculos. |
| --- | --- |

—

A validação de todos os métodos de detecção abaixo descritos tem por base a análise de amostras constituídas por 200 tubérculos.

| — | O extracto de batata descrito em seguida pode também ser utilizado para a detecção da bactéria Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, responsável pela podridão anelar da batateira. |
| --- | --- |

—

O extracto de batata descrito em seguida pode também ser utilizado para a detecção da bactéria Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, responsável pela podridão anelar da batateira.

Pré-tratamento opcional antes da preparação da amostra:

| a) | Incubação de amostras a uma temperatura de 25-30 °C durante um período de até 2 semanas, para favorecer a multiplicação de quaisquer populações de R. solanacearum. |
| --- | --- |

a)

Incubação de amostras a uma temperatura de 25-30 °C durante um período de até 2 semanas, para favorecer a multiplicação de quaisquer populações de R. solanacearum.

| b) | Lavar os tubérculos. Utilizar desinfectantes (compostos de cloro sempre que se utilizar o teste PCR para destruir ADN de organismos saprófitas) e detergentes adequados entre cada amostra. Secar os tubérculos ao ar. Este procedimento de lavagem é particularmente útil (mas não obrigatório) para amostras que apresentem um excesso de terra e quando se pretende realizar um teste PCR ou um isolamento directo. |
| --- | --- |

b)

Lavar os tubérculos. Utilizar desinfectantes (compostos de cloro sempre que se utilizar o teste PCR para destruir ADN de organismos saprófitas) e detergentes adequados entre cada amostra. Secar os tubérculos ao ar. Este procedimento de lavagem é particularmente útil (mas não obrigatório) para amostras que apresentem um excesso de terra e quando se pretende realizar um teste PCR ou um isolamento directo.

1.1.1.   Remover a epiderme na zona do hilo de cada tubérculo com um bisturi ou faca de cortar legumes, limpos e desinfectados, de forma que o tecido vascular fique visível. Retirar cuidadosamente um pequeno cone de tecido vascular na zona do hilo, reduzindo ao mínimo a quantidade de tecido não vascular (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Nota: Pôr de lado quaisquer tubérculos (com podridões) que exibam sintomas suspeitos de pus e testá-los separadamente.

Caso se observem sintomas suspeitos de pus durante a remoção do cone da zona do hilo, deve proceder-se a uma inspecção visual do tubérculo em questão e este deverá ser cortado próximo do hilo. Qualquer tubérculo cortado exibindo sintomas suspeitos deverá ser mantido durante, pelo menos, dois dias à temperatura ambiente, no sentido de permitir a suberização, e em seguida armazenado numa área refrigerada (entre 4 a 10 °C) em condições de quarentena adequadas. Todos os tubérculos, incluindo os que apresentam sintomas suspeitos, devem ser conservados de acordo com o anexo III.

1.1.2.   Colocar os cones dos hilos em recipientes descartáveis não utilizados que possam ser fechados e/ou selados (caso os recipientes sejam reutilizados devem ser cuidadosamente limpos e desinfectados com compostos de cloro). Os cones dos hilos devem ser, de preferência, processados de imediato. Se tal não for possível, deverão ser mantidos no recipiente, sem adição de tampão, em local refrigerado durante, no máximo, 72 horas, ou 24 horas à temperatura ambiente.

Processar os cones dos hilos de acordo com um dos seguintes procedimentos:

| a) | Cobrir os cones com um volume suficiente (cerca de 40 ml) de tampão de extracção (apêndice 4) e colocá-los num agitador rotativo (50-100 rpm) durante 4 horas a uma temperatura inferior a 24 °C, ou durante 16-24 horas refrigerados,
  ou |
| --- | --- |

a)

Cobrir os cones com um volume suficiente (cerca de 40 ml) de tampão de extracção (apêndice 4) e colocá-los num agitador rotativo (50-100 rpm) durante 4 horas a uma temperatura inferior a 24 °C, ou durante 16-24 horas refrigerados,

ou

| b) | Homogeneizar os cones com um volume suficiente (cerca de 40 ml) de tampão de extracção (apêndice 4) num misturador (por exemplo, Waring Blender ou Ultra Thurrax) ou por esmagamento num saco de maceração descartável selado (por exemplo, Stomacher ou Bioreba, em polietileno resistente, de 150 mm x 250 mm, esterilizado por radiação) utilizando um macete de borracha ou um instrumento de trituração adequado (por exemplo, Homex). |
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b)

Homogeneizar os cones com um volume suficiente (cerca de 40 ml) de tampão de extracção (apêndice 4) num misturador (por exemplo, Waring Blender ou Ultra Thurrax) ou por esmagamento num saco de maceração descartável selado (por exemplo, Stomacher ou Bioreba, em polietileno resistente, de 150 mm x 250 mm, esterilizado por radiação) utilizando um macete de borracha ou um instrumento de trituração adequado (por exemplo, Homex).

Nota: O risco de contaminação cruzada das amostras é elevado quando estas são homogeneizadas com recurso a um misturador. Tomar as precauções necessárias para evitar a formação de aerossóis ou derrames durante o processo de extracção. Assegurar-se de que as lâminas e os recipientes do misturador utilizados para cada amostra foram recentemente esterilizados. Caso se utilize o teste PCR, evitar a contaminação por ADN dos recipientes ou instrumento de trituração. Sempre que se utilize o teste PCR, recomenda-se a trituração em sacos descartáveis e a utilização de tubos descartáveis.

1.1.3.   Decantar o sobrenadante. Caso se encontre excessivamente turvo, clarificar através de centrifugação a baixa velocidade (a não mais de 180 g durante 10 minutos a uma temperatura entre 4 e 10 °C) ou de filtração por vácuo (40-100 μm), lavando o filtro com tampão de extracção adicional (10 ml).

1.1.4.   Concentrar a fracção bacteriana por centrifugação a 7 000g durante 15 minutos (ou 10 000g durante 10 minutos) a uma temperatura entre 4 e 10 °C e desprezar o sobrenadante sem perturbar o sedimento.

1.1.5.   Ressuspender o sedimento em 1,5 ml de tampão de ressuspensão (apêndice 4). Utilizar 500 μl para a R. solanacearum, 500 μl para a Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus e 500 μl para fins de referência. Adicionar glicerol esterilizado até obter uma concentração final de 10-25 % (v/v) aos 500 μl das alíquotas de referência e à alíquota remanescente da amostra em estudo; agitar em vórtice e armazenar entre –16 e –24 °C (semanas) ou entre –68 e –86 °C (meses). Manter a alíquota remanescente da amostra em estudo a uma temperatura entre 4 e 10 °C durante o período de ensaio.

Não se aconselha a congelação e descongelação repetidas.

Caso seja necessário transportar o extracto, garantir a entrega numa caixa refrigerada num prazo de 24 a 48 horas.

1.1.6.   É indispensável que todas as amostras e controlos positivos de R. solanacearum sejam tratados separadamente para evitar contaminações. O mesmo se aplica às lâminas de imunofluorescência e a todos os testes.

1.2.   Ensaio

Ver fluxograma e descrição dos testes e protocolos optimizados nos respectivos apêndices:

| | Isolamento selectivo (Ver parte A, ponto 4, da secção VI) |
| --- | --- |

Isolamento selectivo (Ver parte A, ponto 4, da secção VI)

| | Teste IF (Ver parte A, ponto 5, da secção VI) |
| --- | --- |

Teste IF (Ver parte A, ponto 5, da secção VI)

| | Testes PCR (Ver parte A, ponto 6, da secção VI) |
| --- | --- |

Testes PCR (Ver parte A, ponto 6, da secção VI)

| | Teste FISH (Ver parte A, ponto 7, da secção VI) |
| --- | --- |

Teste FISH (Ver parte A, ponto 7, da secção VI)

| | Testes ELISA (Ver parte A, ponto 8, da secção VI) |
| --- | --- |

Testes ELISA (Ver parte A, ponto 8, da secção VI)

| | Bioensaio (Ver parte A, ponto 9, da secção VI) |
| --- | --- |

Bioensaio (Ver parte A, ponto 9, da secção VI)

2.   Métodos pormenorizados de detecção e identificação de R. solanacearum em amostras de plantas assintomáticas de batateira, tomateiro ou outras plantas hospedeiras

2.1.   Preparação da amostra

Nota: Para a detecção de populações latentes de R. solanacearum, é aconselhável a análise de amostras compostas. O procedimento pode ser aplicado convenientemente a amostras compostas contendo até 200 partes de caule. Sempre que forem realizadas prospecções, estas devem basear-se numa amostra estatisticamente representativa da população de plantas em estudo.

2.1.1.   Recolher segmentos de caule de 1-2 cm num recipiente esterilizado fechado, de acordo com os seguintes procedimentos de amostragem:

Plântulas de tomateiro de viveiro: Com uma faca limpa e desinfectada, remover um segmento de 1 cm da base de cada caule, imediatamente acima do nível do solo.

Plantas de tomateiro cultivadas no campo ou em estufa: Com uma faca limpa e desinfectada, remover o rebento lateral inferior de cada planta, cortando-o imediatamente acima do ponto de junção com o caule principal. Remover o segmento inferior de 1 cm de cada rebento lateral.

Outros hospedeiros: Com uma faca ou uma tesoura de poda limpas e desinfectadas, remover um segmento de 1 cm da base de cada caule, imediatamente acima do nível do solo. No caso da S. dulcamara ou de outras plantas hospedeiras aquáticas, retirar secções de 1-2 cm dos caules ou estolhos que se encontrem submersos com raízes aquáticas.

Ao colher amostras de um determinado local, recomenda-se a análise de uma amostra estatisticamente representativa de, pelo menos, 10 plantas de cada potencial hospedeiro infestante por ponto de amostragem. A detecção do patogéneo será mais fiável no final da Primavera, no Verão e no Outono, embora se possam detectar infecções naturais durante todo o ano em Solanum dulcamara perene que cresce em cursos de água. Alguns hospedeiros conhecidos incluem plantas da batateira espontâneas (zorras), Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium e outros membros da família Solanaceae. Outros hospedeiros são o Pelargonium spp. e Portulaca oleracea. Algumas espécies de infestantes europeias que podem ser potenciais hospedeiros de populações de R. solanacearum Biovar 2/Raça 3 nas raízes e/ou rizosfera, em condições ambientais específicas, incluem Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp., Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra e Urtica dioica.

Nota: O exame visual dos sintomas internos (descoloração vascular ou produção de exsudado bacteriano) pode ser feito nesta fase. Pôr de lado qualquer segmento de caule que exiba sintomas e testá-lo separadamente (ver secção II).

2.1.2.   Desinfectar rapidamente os segmentos de caule com etanol a 70 % e secar imediatamente com papel absorvente. Em seguida, processar os segmentos de caule de acordo com um dos seguintes procedimentos:

| a) | Cobrir os segmentos com um volume suficiente (cerca de 40 ml) de tampão de extracção (apêndice 4) e colocá-los num agitador rotativo (50-100 rpm) durante 4 horas a uma temperatura inferior a 24 °C ou durante 16-24 horas em local refrigerado, ou |
| --- | --- |

a)

Cobrir os segmentos com um volume suficiente (cerca de 40 ml) de tampão de extracção (apêndice 4) e colocá-los num agitador rotativo (50-100 rpm) durante 4 horas a uma temperatura inferior a 24 °C ou durante 16-24 horas em local refrigerado, ou

| b) | Processar imediatamente, esmagando os segmentos num saco de maceração resistente (por exemplo, Stomacher ou Bioreba) com um volume adequado de tampão de extracção (apêndice 4), com recurso a um macete de borracha ou um instrumento de trituração adequado (por exemplo, Homex). Se tal não for possível, armazenar os segmentos de caule refrigerados durante, no máximo, 72 horas, ou 24 horas à temperatura ambiente. |
| --- | --- |

b)

Processar imediatamente, esmagando os segmentos num saco de maceração resistente (por exemplo, Stomacher ou Bioreba) com um volume adequado de tampão de extracção (apêndice 4), com recurso a um macete de borracha ou um instrumento de trituração adequado (por exemplo, Homex). Se tal não for possível, armazenar os segmentos de caule refrigerados durante, no máximo, 72 horas, ou 24 horas à temperatura ambiente.

2.1.3.   Decantar o sobrenadante após 15 minutos de repouso.

2.1.4.   Não é normalmente necessário proceder à clarificação do extracto ou à concentração da fracção bacteriana, mas estes objectivos poderão alcançar-se através de filtração e/ou centrifugação, tal como descrito nos pontos 1.1.3 a 1.1.5 da secção III.

2.1.5.   Dividir o extracto puro ou concentrado da amostra em duas partes iguais. Manter uma metade a uma temperatura de 4 a 10 °C durante a realização dos testes e armazenar a outra metade com 10-25 % (v/v) de glicerol esterilizado a uma temperatura compreendida entre –16 e –24 °C (semanas) ou –68 e –86 °C (meses), caso seja necessário proceder a mais testes.

2.2.   Ensaio

Ver fluxograma e descrição dos testes e protocolos optimizados nos respectivos apêndices:

| | Isolamento selectivo (Ver parte A, ponto 4, da secção VI) |
| --- | --- |

Isolamento selectivo (Ver parte A, ponto 4, da secção VI)

| | Teste IF (Ver parte A, ponto 5, da secção VI) |
| --- | --- |

Teste IF (Ver parte A, ponto 5, da secção VI)

| | Testes PCR (Ver parte A, ponto 6, da secção VI) |
| --- | --- |

Testes PCR (Ver parte A, ponto 6, da secção VI)

| | Teste FISH (Ver parte A, ponto 7, da secção VI) |
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Teste FISH (Ver parte A, ponto 7, da secção VI)

| | Testes ELISA (Ver parte A, ponto 8, da secção VI) |
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Testes ELISA (Ver parte A, ponto 8, da secção VI)

| | Bioensaio (Ver parte A, ponto 9, da secção VI) |
| --- | --- |

Bioensaio (Ver parte A, ponto 9, da secção VI)

SECÇÃO IV

1.   Esquema para detecção e identificação de R. solanacearum em água

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2.   Métodos de detecção e identificação de R. solanacearum em água

Princípio

O esquema de detecção validado descrito nesta secção é aplicável à detecção do patogéneo em amostras de águas superficiais, podendo também ser aplicado a amostras de efluentes de transformação de batata ou de esgotos. Contudo, é importante notar que a sensibilidade de detecção esperada irá variar consoante o substrato. A sensibilidade do teste de isolamento é afectada pelas populações de bactérias saprófitas competidoras, normalmente muito superiores nos efluentes de transformação de batata e de esgotos do que nas águas superficiais. Embora se espere que o esquema a seguir descrito detecte, pelo menos, 103 células por litro nas águas superficiais, a sensibilidade de detecção nos efluentes de transformação de batata e de esgotos deverá ser bastante inferior. Por isso, recomenda-se que se testem os efluentes depois de quaisquer tratamentos de purificação (por exemplo, sedimentação ou filtração), durante os quais os níveis populacionais de bactérias saprófitas diminuem. Devem considerar-se as limitações em termos de sensibilidade do esquema de ensaio, ao avaliar a fiabilidade de eventuais resultados negativos obtidos. Embora este esquema tenha sido usado com êxito em prospecções para determinar a presença ou ausência do patogéneo em águas superficiais, devem reconhecer-se as limitações do seu uso em prospecções semelhantes de efluentes de transformação de batata ou de esgotos.

2.1.   Preparação da amostra

Nota:

| — | A detecção de R. solanacearum em águas superficiais é mais fiável no final da Primavera, no Verão e no Outono, quando a temperatura da água é superior a 15 °C. |
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—

A detecção de R. solanacearum em águas superficiais é mais fiável no final da Primavera, no Verão e no Outono, quando a temperatura da água é superior a 15 °C.

| — | a realização de amostragens repetidas em diferentes momentos do período mencionado anteriormente em pontos de amostragem designados aumentará a fiabilidade da detecção pela redução dos efeitos da variação climática. |
| --- | --- |

—

a realização de amostragens repetidas em diferentes momentos do período mencionado anteriormente em pontos de amostragem designados aumentará a fiabilidade da detecção pela redução dos efeitos da variação climática.

| — | Ter em conta os efeitos das fortes precipitações e a geografia do curso de água, para evitar os efeitos de uma diluição exagerada, que poderão camuflar a presença do patogéneo. |
| --- | --- |

—

Ter em conta os efeitos das fortes precipitações e a geografia do curso de água, para evitar os efeitos de uma diluição exagerada, que poderão camuflar a presença do patogéneo.

| — | Recolher amostras de águas superficiais na proximidade de plantas hospedeiras, caso estas existam. |
| --- | --- |

—

Recolher amostras de águas superficiais na proximidade de plantas hospedeiras, caso estas existam.

2.1.1.   Nos pontos de amostragem seleccionados, recolher amostras de água enchendo tubos ou frascos esterilizados e descartáveis, se possível, a uma profundidade superior a 30 cm e a menos de 2 m da margem. Para os efluentes da transformação de batata e de esgotos, recolher amostras no ponto de descarga dos efluentes. Recomenda-se que o volume das amostras não deverá ultrapassar os 500 ml por ponto de amostragem. Caso se prefiram amostras mais pequenas, é aconselhável recolher amostras, pelo menos, três vezes por ponto de amostragem, devendo cada amostra ser constituída por duas subamostras duplicadas de, pelo menos, 30 ml cada. Para prospecções mais intensivas, seleccionar pelo menos três pontos de amostragem por cada 3 km de curso de água e certificar-se de que são também recolhidas amostras dos afluentes que entram no curso de água.

2.1.2.   Transportar as amostras refrigeradas (4-10 °C) e no escuro e testá-las no prazo de 24 horas.

2.1.3.   Caso seja necessário, a fracção bacteriana pode ser concentrada por um dos seguintes métodos:

| a) | Centrifugar subamostras de 30-50 ml a 10 000g durante 10 minutos (ou a 7 000g durante 15 minutos), de preferência a uma temperatura entre 4 e 10 °C, desprezar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml de tampão de ressuspensão (apêndice 4). |
| --- | --- |

a)

Centrifugar subamostras de 30-50 ml a 10 000g durante 10 minutos (ou a 7 000g durante 15 minutos), de preferência a uma temperatura entre 4 e 10 °C, desprezar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml de tampão de ressuspensão (apêndice 4).

| b) | Filtração com membrana (dimensão mínima do poro de 0,45 μm), seguida de lavagem do filtro com 5-10 ml de tampão de ressuspensão e recuperação das suspensões resultantes da lavagem. Este método é adequado para volumes maiores de água contendo um reduzido número de saprófitas. |
| --- | --- |

b)

Filtração com membrana (dimensão mínima do poro de 0,45 μm), seguida de lavagem do filtro com 5-10 ml de tampão de ressuspensão e recuperação das suspensões resultantes da lavagem. Este método é adequado para volumes maiores de água contendo um reduzido número de saprófitas.

Em geral, não se aconselha a concentração para amostras de efluentes de transformação de batata ou de esgotos, dado que a existência de níveis populacionais mais elevados de bactérias saprófitas competidoras inibirá a detecção da R. solanacearum.

2.2.   Ensaio

Ver fluxograma e descrição dos testes nos respectivos apêndices.

SECÇÃO V

1.   Esquema para detecção e identificação de R. solanacearum no solo

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2.   Métodos de detecção e identificação de R. solanacearum no solo

Princípios

O esquema de detecção validado descrito nesta secção é aplicável à detecção do patogéneo em amostras de solo, embora possa também ser usado para análise de amostras de resíduos sólidos de transformação de batata ou de lamas de depuração. Deve notar-se, porém, que estes métodos não são suficientemente sensíveis para garantir a detecção de populações baixas e/ou dispersas de modo irregular de R. solanacearum que poderão ocorrer em amostras naturalmente contaminadas desses substratos.

Devem considerar-se as limitações em termos de sensibilidade deste esquema de ensaio, ao avaliar a fiabilidade dos resultados negativos obtidos e também quando usado em prospecções para determinar a presença ou ausência do patogéneo em solos ou em lamas. O teste mais fiável para detectar a presença do patogéneo num campo consiste em plantar um hospedeiro susceptível e controlá-lo para detectar uma eventual infecção, mas, mesmo com este método, não serão detectados os baixos níveis de contaminação.

2.1.   Preparação da amostra

2.1.1.   A recolha de amostras de solo de um campo deve seguir os princípios comuns usados para a amostragem de nemátodos. Recolher 0,5-1 kg de solo por amostra de 60 locais por cada 0,3 ha, a uma profundidade de 10-20 cm (ou numa grelha de 7x7 metros). Caso se suspeite de presença do patogéneo, aumentar o número de pontos de recolha para 120 por 0,3 ha. Manter as amostras a 12-15 °C antes do seu processamento. Para as amostras de resíduos provenientes da transformação de batata ou de lamas de depuração, recolher um total de 1 kg dos locais representativos do volume total dos resíduos e lamas a testar. Misturar bem cada uma das amostras antes de efectuar os testes.

2.1.2.   Dispersar subamostras de 10-25 g de solos, resíduos sólidos de transformação de batata ou lamas num agitador rotativo (250 rpm) em 60-150 ml de tampão de extracção (apêndice 4) durante um período máximo de duas horas. Se necessário, pode auxiliar-se a dispersão mediante adição de 0,02 % de Tween-20 e de 10-20 g de cascalho esterilizados.

2.1.3.   Manter a suspensão a 4 °C durante os testes.

2.2.   Ensaio

Ver fluxograma e descrição dos testes nos respectivos apêndices.

SECÇÃO VI

PROTOCOLOS OPTIMIZADOS PARA DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE R. SOLANACEARUM

A.   Testes de diagnóstico e detecção

1.   Teste de exsudação do caule

A presença de R. solanacearum em caules de batateira, tomateiro ou outras plantas hospedeiras com sintomas de murchidão pode ser avaliada através de um simples teste inicial: cortar o caule imediatamente acima do nível do solo. Suspender a superfície cortada num tubo de ensaio com água límpida. Passados alguns minutos, procurar observar uma exsudação bacteriana espontânea característica a partir dos feixes vasculares.

2.   Detecção de grânulos de poli-β-hidroxibutirato

| 1. | Preparar um esfregaço do exsudado bacteriano proveniente do tecido infectado ou de uma cultura de 48 horas em meio YPGA ou SPA (apêndice 2) numa lâmina de microscópio. |
| --- | --- |

1.

Preparar um esfregaço do exsudado bacteriano proveniente do tecido infectado ou de uma cultura de 48 horas em meio YPGA ou SPA (apêndice 2) numa lâmina de microscópio.

| 2. | Preparar esfregaços de controlo positivo com uma estirpe de R. solanacearum Biovar 2 e, se necessário, um esfregaço de uma espécie reconhecidamente negativa no teste PHB como controlo negativo. |
| --- | --- |

2.

Preparar esfregaços de controlo positivo com uma estirpe de R. solanacearum Biovar 2 e, se necessário, um esfregaço de uma espécie reconhecidamente negativa no teste PHB como controlo negativo.

| 3. | Deixar secar ao ar e, em seguida, passar rapidamente a parte inferior de cada lâmina à chama para fixar os esfregaços. |
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3.

Deixar secar ao ar e, em seguida, passar rapidamente a parte inferior de cada lâmina à chama para fixar os esfregaços.

| 4. | Corar a preparação com azul de Nilo ou negro de Sudão e observar ao microscópio de acordo com o procedimento a seguir descrito: |
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4.

Corar a preparação com azul de Nilo ou negro de Sudão e observar ao microscópio de acordo com o procedimento a seguir descrito:

Teste de azul de Nilo

| a) | Cobrir cada lâmina com uma solução aquosa a 1 % de azul de Nilo A e incubar durante 10 minutos a uma temperatura de 55 °C. |
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a)

Cobrir cada lâmina com uma solução aquosa a 1 % de azul de Nilo A e incubar durante 10 minutos a uma temperatura de 55 °C.

| b) | Sacudir as gotas de solução corante. Lavar brevemente e com cuidado em água corrente. Retirar o excesso de água com papel absorvente. |
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b)

Sacudir as gotas de solução corante. Lavar brevemente e com cuidado em água corrente. Retirar o excesso de água com papel absorvente.

| c) | Cobrir o esfregaço com uma solução aquosa a 8 % de ácido acético e incubar durante um minuto à temperatura ambiente. |
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c)

Cobrir o esfregaço com uma solução aquosa a 8 % de ácido acético e incubar durante um minuto à temperatura ambiente.

| d) | Lavar brevemente e com cuidado em água corrente. Retirar o excesso de água com papel absorvente. |
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d)

Lavar brevemente e com cuidado em água corrente. Retirar o excesso de água com papel absorvente.

| e) | Voltar a humedecer com uma gota de água e cobrir com uma lamela. |
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e)

Voltar a humedecer com uma gota de água e cobrir com uma lamela.

| f) | Examinar o esfregaço corado coberto com uma gota de óleo de imersão em microscópio de epifluorescência a 450 nm, utilizando uma objectiva de imersão em óleo ou água e uma ampliação de 600-1 000. |
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f)

Examinar o esfregaço corado coberto com uma gota de óleo de imersão em microscópio de epifluorescência a 450 nm, utilizando uma objectiva de imersão em óleo ou água e uma ampliação de 600-1 000.

| g) | Os grânulos de PHB apresentam uma fluorescência laranja viva. Observar também com luz normal transmitida para verificar se os grânulos são intracelulares e se a morfologia das células é típica de R. solanacearum. |
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g)

Os grânulos de PHB apresentam uma fluorescência laranja viva. Observar também com luz normal transmitida para verificar se os grânulos são intracelulares e se a morfologia das células é típica de R. solanacearum.

Teste do negro de Sudão

| a) | Corar cada lâmina com uma solução a 0,3 % de negro de Sudão B em etanol a 70 % e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente. |
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a)

Corar cada lâmina com uma solução a 0,3 % de negro de Sudão B em etanol a 70 % e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.

| b) | Sacudir as gotas de solução corante e lavar brevemente em água corrente, retirando o excesso de água com papel absorvente. |
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b)

Sacudir as gotas de solução corante e lavar brevemente em água corrente, retirando o excesso de água com papel absorvente.

| c) | Mergulhar as lâminas brevemente em xilol e secar sobre papel absorvente. Cuidado! O xilol é um produto nocivo. Tomar as medidas de segurança necessárias e trabalhar em “hotte”. |
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c)

Mergulhar as lâminas brevemente em xilol e secar sobre papel absorvente. Cuidado! O xilol é um produto nocivo. Tomar as medidas de segurança necessárias e trabalhar em “hotte”.

| d) | Corar as lâminas com uma solução aquosa a 0,5 % (p/v) de safranina e incubar durante 10 segundos à temperatura ambiente. Cuidado! A safranina é um produto nocivo. Tomar as medidas de segurança necessárias e trabalhar em “hotte”. |
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d)

Corar as lâminas com uma solução aquosa a 0,5 % (p/v) de safranina e incubar durante 10 segundos à temperatura ambiente. Cuidado! A safranina é um produto nocivo. Tomar as medidas de segurança necessárias e trabalhar em “hotte”.

| e) | Lavar com cuidado em água corrente, secar em papel absorvente e cobrir com uma lamela. |
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e)

Lavar com cuidado em água corrente, secar em papel absorvente e cobrir com uma lamela.

| f) | Examinar os esfregaços corados cobertos com óleo de imersão em microscópio com luz transmitida e com uma ampliação de 1 000, utilizando uma objectiva de imersão em óleo. |
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f)

Examinar os esfregaços corados cobertos com óleo de imersão em microscópio com luz transmitida e com uma ampliação de 1 000, utilizando uma objectiva de imersão em óleo.

| g) | Os grânulos de PHB em células de R. solanacearum apresentam uma coloração azul negra e as paredes celulares apresentam uma coloração rosa. |
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g)

Os grânulos de PHB em células de R. solanacearum apresentam uma coloração azul negra e as paredes celulares apresentam uma coloração rosa.

3.   Testes serológicos de aglutinação

A melhor forma de observar a aglutinação de células de R. solanacearum em exsudado bacteriano ou extractos de tecido sintomático é mediante a utilização de anticorpos marcados validados (ver apêndice 3), utilizando marcadores corados adequados como, por exemplo, células de Staphylococcus aureus ou partículas de látex coradas. Em caso de utilização de material disponível no mercado (ver apêndice 3), seguir as instruções do fabricante. Caso contrário, aplicar o procedimento seguinte:

| a) | Misturar gotas de uma suspensão de anticorpos marcados e exsudado bacteriano (aproximadamente 5 μl de cada) nos poços de lâminas de poços múltiplos. |
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a)

Misturar gotas de uma suspensão de anticorpos marcados e exsudado bacteriano (aproximadamente 5 μl de cada) nos poços de lâminas de poços múltiplos.

| b) | Preparar controlos positivos e negativos utilizando suspensões de R. solanacearum Biovar 2 e de uma estirpe heteróloga. |
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b)

Preparar controlos positivos e negativos utilizando suspensões de R. solanacearum Biovar 2 e de uma estirpe heteróloga.

| c) | Depois de homogeneizar com cuidado durante 15 segundos, observar a produção de aglutinação nas amostras positivas. |
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c)

Depois de homogeneizar com cuidado durante 15 segundos, observar a produção de aglutinação nas amostras positivas.

4.   Isolamento selectivo

4.1.   Diluição em placas com meio selectivo

Nota: Antes de utilizar este método pela primeira vez, efectuar testes preliminares para garantir a detecção reprodutível de 103 a 104 unidades formadoras de colónias (ufc) de R. solanacearum por ml adicionadas a extractos de amostras que apresentaram anteriormente resultados negativos.

Utilizar um meio selectivo devidamente validado, como o SMSA (alterado por Elphinstone et al., 1996, ver apêndice 2).

É necessário estar atento de forma a diferenciar R. solanacearum de outras bactérias que possam desenvolver colónias no meio. Além disso, as colónias de R. solanacearum podem apresentar morfologia atípica em caso de sobrepopulação das placas ou se estiverem também presentes bactérias antagonistas. Se se suspeitar de efeitos de competição ou antagonismo, a amostra deve ser reanalisada utilizando um teste diferente.

Pode esperar-se a sensibilidade de detecção mais elevada com este método quando se utilizam extractos de amostras recentemente preparados. No entanto, o método pode também ser aplicado a extractos que tenham sido armazenados em glicerol a uma temperatura compreendida entre –68 e –86 °C.

Como controlos positivos, preparar diluições decimais de uma suspensão de 106 ufc por ml de uma estirpe virulenta de R. solanacearum Biovar 2 (por exemplo, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Para evitar qualquer possibilidade de contaminação, os controlos positivos deverão ser sempre preparados à parte das amostras a testar.

A boa qualidade de cada novo lote de meio selectivo para o crescimento do patogéneo deve ser testada antes da sua utilização para a análise de amostras de rotina.

Testar o material de controlo de forma idêntica à da(s) amostra(s).

4.1.1.   Aplicar uma técnica de diluição em placas adequada, a fim de garantir a diluição de eventuais populações saprófitas formadoras de colónias. Espalhar, por placa, 50-100 μl de extracto de amostra por cada diluição.

4.1.2.   Incubar as placas a 28 °C. Observar as placas após 48 horas e em seguida diariamente durante um período de até 6 dias. As colónias típicas de R. solanacearum em SMSA apresentam, de início, uma cor branca leitosa, são achatadas, irregulares e fluidas e após 3 dias de incubação o centro adquire uma coloração rosa a vermelho-vivo com estrias ou espirais internas (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Nota: Neste meio formam-se por vezes colónias atípicas de R. solanacearum, que podem ser pequenas, redondas, completamente vermelhas e não fluidas ou apenas parcialmente fluidas e, portanto, difíceis de distinguir de bactérias saprófitas formadoras de colónias.

4.1.3.   Purificar as presumíveis colónias de R. solanacearum por reticulado ou diluição em placas num meio nutritivo geral a fim de obter colónias isoladas (ver apêndice 2).

4.1.4.   Armazenar as culturas a curto prazo em água desionizada esterilizada (pH 6-8) à temperatura ambiente, na obscuridade, ou a longo prazo num meio crioprotector adequado entre –68 e –86 °C ou liofilizadas.

4.1.5.   Identificar culturas de presumíveis isolados de R. solanacearum (ver parte B da secção VI) e efectuar um teste de patogenicidade (ver parte C da secção VI).

Interpretação dos resultados da diluição em placas com meio selectivo

O teste de diluição em placas com meio selectivo é negativo se não for observada nenhuma colónia bacteriana ao fim de seis dias ou se não forem encontradas colónias presumivelmente características de R. solanacearum, desde que não se suspeite de inibição resultante de concorrência ou antagonismo de outras bactérias e que sejam detectadas colónias características de R. solanacearum nos controlos positivos.

O teste de diluição em placas com meio selectivo é positivo se forem isoladas colónias de presumíveis isolados de R. solanacearum.

4.2.   Operação de enriquecimento

Utilizar um meio de enriquecimento validado, como o caldo Wilbrink modificado (ver apêndice 2).

Este procedimento pode ser utilizado para aumentar selectivamente as populações de R. solanacearum nos extractos de amostras e aumentar a sensibilidade de detecção. Este procedimento também dilui de forma eficaz os inibidores da reacção da PCR (1:100). Importa referir, no entanto, que o enriquecimento de R. solanacearum pode ser infrutífero devido à competição ou ao antagonismo de organismos saprófitas, que em muitos casos são enriquecidos simultaneamente. Por esta razão, o isolamento de R. solanacearum a partir de meios líquidos de cultura enriquecidos pode ser difícil. Além disso, como as populações de saprófitas serologicamente afins podem aumentar, recomenda-se a utilização de anticorpos monoclonais específicos em vez de anticorpos policlonais quando se utilize o teste ELISA.

4.2.1.   Para o teste PCR com enriquecimento, transferir 100 μl de extracto de amostra para 10 ml de meio líquido de enriquecimento (apêndice 2) previamente separado em alíquotas para tubos ou frascos isentos de ADN. Para o teste ELISA com enriquecimento podem utilizar-se diluições mais concentradas do extracto da amostra (por exemplo 100 μl em 1,0 ml de caldo de enriquecimento).

4.2.2.   Incubar durante 72 horas a uma temperatura compreendida entre os 27 e 30 °C em cultura agitada ou estática, mantendo as tampas dos recipientes apertadas frouxamente para permitir o arejamento.

4.2.3.   Misturar bem antes de utilizar nos testes ELISA ou PCR.

4.2.4.   Tratar o meio líquido enriquecido de modo idêntico ao da(s) amostra(s) nos testes acima referidos.

Nota: Se for de prever a inibição do enriquecimento de R. solanacearum devido à existência de grandes populações de certas bactérias saprófitas competidoras, poderão conseguir-se melhores resultados com o enriquecimento dos extractos de amostras antes de se efectuar uma centrifugação ou outros processos de concentração.

5.   Teste IF

Princípio

A utilização do teste IF como teste de rastreio essencial é recomendada, tendo em conta a sua robustez comprovada para alcançar os limiares de detecção exigidos.

Sempre que se utilize o teste IF como teste de rastreio essencial e o seu resultado seja positivo, terá de se realizar o teste de isolamento, o teste PCR ou o teste FISH como segundo teste de rastreio. Sempre que se utilize o teste IF como segundo teste de rastreio e o seu resultado seja positivo, terão de se realizar mais testes de acordo com o fluxograma para completar a análise.

Nota: Utilizar anticorpos validados de R. solanacearum (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Recomenda-se a determinação do título para cada novo lote de anticorpos. O título é definido como a diluição mais elevada para a qual se verifica uma reacção óptima ao testar uma suspensão contendo 105 a 106 células por ml de uma estirpe homóloga de R. solanacearum e recorrendo a um conjugado de isotiocianato de fluoresceína (FITC), de acordo com as recomendações do fabricante. Todos os anti-soros policlonais validados têm um título de IF de 1:2 000 no mínimo. Durante o teste os anticorpos devem ser utilizados em diluições de trabalho próximas do título ou no seu valor exacto.

O teste deve ser realizado com extractos de amostras recentemente preparados. Se necessário, pode ser executado com sucesso com extractos armazenados entre –68 e –86 °C e conservados em glicerol. O glicerol pode ser retirado da amostra através da adição de 1 ml de tampão de ressuspensão (apêndice 4), nova centrifugação durante 15 minutos a 7 000 g e ressuspensão num volume igual de tampão de ressuspensão. Este procedimento é frequentemente desnecessário, em especial se as lâminas forem fixadas à chama.

Preparar lâminas de controlo positivo em separado com uma estirpe homóloga, ou qualquer outra estirpe de referência de R. solanacearum, suspensa em extracto de batata, tal como especificado na parte B do apêndice 3 ou opcionalmente em tampão.

Sempre que possível, deve também ser utilizado material vegetal naturalmente infectado (liofilizado ou congelado a uma temperatura compreendida entre –16 e –24 °C) como controlo positivo na mesma lâmina.

Como controlos negativos, podem ser utilizadas alíquotas de extracto de amostra que se tenham anteriormente revelado negativas relativamente à presença de R. solanacearum.

Os materiais normalizados de controlo positivo e negativo que podem ser utilizados neste teste são referidos no apêndice 3.

Utilizar lâminas de microscópio com vários poços, de preferência 10, com, pelo menos, 6 mm de diâmetro cada.

Testar o material de controlo de forma idêntica à da(s) amostra(s).

5.1.   Preparar as lâminas através de um dos seguintes procedimentos

| i) | Para sedimentos com relativamente pouco amido:
  Pipetar um volume-padrão (15 μl é adequado para poços com 6 mm de diâmetro - aumentar o volume proporcionalmente à dimensão dos poços) de uma diluição de 1/100 do sedimento de batata ressuspenso no primeiro poço. Em seguida, pipetar um volume similar de sedimento não diluído (1/1) nos restantes poços da fila. A segunda fila de poços pode ser utilizada como um duplicado ou para outra amostra, como indicado na figura 1. |
| --- | --- |

i)

Para sedimentos com relativamente pouco amido:

Pipetar um volume-padrão (15 μl é adequado para poços com 6 mm de diâmetro - aumentar o volume proporcionalmente à dimensão dos poços) de uma diluição de 1/100 do sedimento de batata ressuspenso no primeiro poço. Em seguida, pipetar um volume similar de sedimento não diluído (1/1) nos restantes poços da fila. A segunda fila de poços pode ser utilizada como um duplicado ou para outra amostra, como indicado na figura 1.

| ii) | Para outros sedimentos:
  Preparar diluições decimais (1/10, 1/100) do sedimento ressuspenso em tampão de ressuspensão. Pipetar um volume-padrão (15 μl é adequado para poços com 6 mm de diâmetro - aumentar o volume proporcionalmente à dimensão dos poços) do sedimento ressuspenso e de cada uma das diluições numa fila de poços. A segunda fila de poços pode ser utilizada como um duplicado ou para outra amostra, como indicado na figura 2. |
| --- | --- |

ii)

Para outros sedimentos:

Preparar diluições decimais (1/10, 1/100) do sedimento ressuspenso em tampão de ressuspensão. Pipetar um volume-padrão (15 μl é adequado para poços com 6 mm de diâmetro - aumentar o volume proporcionalmente à dimensão dos poços) do sedimento ressuspenso e de cada uma das diluições numa fila de poços. A segunda fila de poços pode ser utilizada como um duplicado ou para outra amostra, como indicado na figura 2.

5.2.   Secar as gotículas à temperatura ambiente ou por aquecimento a uma temperatura compreendida entre 40 e 45 °C. Fixar as células bacterianas na lâmina por aquecimento (15 minutos a 60 °C), à chama, com etanol a 95 %, ou em conformidade com instruções específicas dos fornecedores dos anticorpos.

Se necessário, as lâminas assim tratadas podem ser armazenadas congeladas numa caixa de dessecação durante o menor tempo possível (até um máximo de 3 meses) antes de serem testadas.

5.3.   Procedimento IF

| i) | De acordo com a preparação da lâmina descrita na alínea i) do ponto 5.1:
  Preparar um conjunto de diluições a 1/2 do anti-soro em tampão IF. O primeiro poço deverá ter 1/2 do título (T/2), os restantes 1/4 do título (T/4), 1/2 do título (T/2), o título (T) e o dobro do título (2T). |
| --- | --- |

i)

De acordo com a preparação da lâmina descrita na alínea i) do ponto 5.1:

Preparar um conjunto de diluições a 1/2 do anti-soro em tampão IF. O primeiro poço deverá ter 1/2 do título (T/2), os restantes 1/4 do título (T/4), 1/2 do título (T/2), o título (T) e o dobro do título (2T).

| ii) | De acordo com a preparação da lâmina descrita na alínea ii) do ponto 5.1:
  Preparar a diluição de trabalho (DT) do anticorpo em tampão IF. A diluição de trabalho afecta a especificidade. |
| --- | --- |

ii)

De acordo com a preparação da lâmina descrita na alínea ii) do ponto 5.1:

Preparar a diluição de trabalho (DT) do anticorpo em tampão IF. A diluição de trabalho afecta a especificidade.

Figura 1.   Preparação da lâmina de acordo com os pontos 5.1, alínea i), e 5.3, alínea i)

| | Diluições do sedimento ressuspenso |
| --- | --- |
| 1/100 | 1/1 | 1/1 | 1/1 | 1/1 |  | Diluição do sedimento ressuspenso |
| (T = título) | T/2 | T/4 | T/2 | T | 2T |  | Diluições 1/2 do anti-soro/anticorpo |
| Amostra 1 | | | | | | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Duplicado da amostra 1 ou amostra 2 | | | | | |
| 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |

Diluições do sedimento ressuspenso

1/100

1/1

1/1

1/1

1/1



Diluição do sedimento ressuspenso

(T = título)

T/2

T/4

T/2

T

2T



Diluições 1/2 do anti-soro/anticorpo

Amostra 1

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1

2

3

4

5

Duplicado da amostra 1 ou amostra 2

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6

7

8

9

10

Figura 2.   Preparação da lâmina de acordo com os pontos 5.1, alínea ii), e 5.3, alínea ii)

| | Diluição de trabalho do anti-soro/anticorpo |
| --- | --- |
| 1/1 | 1/10 | 1/100 | Vazio | Vazio |  | Diluição decimal do sedimento ressuspenso |
| Amostra 1 | | | | | | | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Duplicado da amostra 1 ou amostra 2 | | | | | |
| 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |

Diluição de trabalho do anti-soro/anticorpo

1/1

1/10

1/100

Vazio

Vazio



Diluição decimal do sedimento ressuspenso

Amostra 1

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1

2

3

4

5

Duplicado da amostra 1 ou amostra 2

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6

7

8

9

10

5.3.1.   Dispor as lâminas sobre papel absorvente humedecido. Cobrir por completo cada poço a testar com a(s) diluição(ões) de anticorpo. O volume de anticorpo adicionado a cada poço deve ser, pelo menos, igual ao volume de extracto aplicado.

O procedimento seguinte deverá ser efectuado na ausência de instruções específicas dos fornecedores dos anticorpos:

5.3.2.   Incubar as lâminas sobre papel humedecido durante 30 minutos à temperatura ambiente (18 a 25 °C) numa caixa opaca fechada.

5.3.3.   Sacudir as gotículas de cada lâmina e lavar cuidadosamente com tampão IF. Lavar por submersão durante 5 minutos em tampão IF-Tween (apêndice 4) e subsequentemente em tampão IF. Evitar a transferência de aerossóis ou de gotículas, o que poderia dar origem a uma contaminação cruzada. Eliminar cuidadosamente a humidade em excesso, secando suavemente com papel absorvente.

5.3.4.   Dispor as lâminas sobre papel humedecido. Cobrir os poços a testar com a diluição do conjugado FITC utilizada para determinar o título. O volume de conjugado adicionado aos poços deve ser idêntico ao volume de anticorpo utilizado.

5.3.5.   Incubar as lâminas sobre papel humedecido durante 30 minutos à temperatura ambiente (18 a 25 °C) numa caixa opaca fechada.

5.3.6.   Sacudir da lâmina as gotículas de conjugado. Lavar como anteriormente (ponto 5.3.3).

Retirar cuidadosamente o excesso de humidade.

5.3.7.   Pipetar para cada poço 5-10 μl de uma solução de tampão fosfato 0,1 M com glicerol (apêndice 4), ou de um líquido de montagem disponível no mercado que evite a perda rápida de fluorescência, e cobrir com uma lamela.

5.4.   Leitura do teste IF:

5.4.1   Examinar as lâminas do teste num microscópio de epifluorescência, com filtros adequados para excitação do FITC, utilizando uma lente de imersão em óleo ou água, com uma ampliação de 500-1 000. Examinar os poços ao longo de dois diâmetros perpendiculares e à volta do perímetro. Para amostras que não revelem células, ou cujo número seja reduzido, observar, pelo menos, 40 campos do microscópio.

Observar primeiro a lâmina do controlo positivo. As células devem apresentar-se com uma fluorescência brilhante e completamente coradas no título do anticorpo ou diluição de trabalho determinados. O teste IF (parte A, ponto 5, da secção VI) deve ser repetido se a coloração for aberrante.

5.4.2.   Procurar células fluorescentes brilhantes com a morfologia característica de R. solanacearum nos poços em estudo das lâminas a testar (ver http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). A intensidade de fluorescência deve ser equivalente à da estirpe do controlo positivo, para a mesma diluição do anticorpo. As células com coloração incompleta ou com fluorescência fraca não devem ser consideradas.

Caso se suspeite de qualquer contaminação, o teste deve ser repetido. Este poderá ser o caso quando todas as lâminas de um lote revelem células positivas devido à contaminação do tampão ou se forem encontradas células positivas (fora dos poços da lâmina) no revestimento da lâmina.

5.4.3.   Há vários problemas inerentes à especificidade do teste de imunofluorescência. Em sedimentos de cones de hilo e de segmentos de caule da batateira, é possível a ocorrência de populações de células fluorescentes com morfologia atípica e reacções cruzadas de bactérias saprófitas com dimensões e morfologia semelhantes a R. solanacearum.

5.4.4.   Considerar apenas células fluorescentes com dimensões e morfologia típicas no título ou na diluição de trabalho dos anticorpos, tal como descrito em 5.3.

5.4.5.   Interpretação da leitura do teste IF:

| i) | Se forem detectadas células fluorescentes brilhantes e com a morfologia característica, determinar o número médio de células típicas por cada campo do microscópio e calcular o número de células típicas por ml de sedimento ressuspenso (apêndice 5).
  A leitura do teste IF revela um resultado positivo para amostras com, pelo menos, 5x103 células típicas por ml de sedimento ressuspenso. A amostra é considerada como potencialmente contaminada, sendo necessário efectuar outros testes. |
| --- | --- |

i)

Se forem detectadas células fluorescentes brilhantes e com a morfologia característica, determinar o número médio de células típicas por cada campo do microscópio e calcular o número de células típicas por ml de sedimento ressuspenso (apêndice 5).

A leitura do teste IF revela um resultado positivo para amostras com, pelo menos, 5x103 células típicas por ml de sedimento ressuspenso. A amostra é considerada como potencialmente contaminada, sendo necessário efectuar outros testes.

| ii) | A leitura do teste IF revela um resultado negativo para amostras com menos de 5x103 células por ml de sedimento ressuspenso sendo a amostra considerada negativa. A realização de outros testes não é obrigatória. |
| --- | --- |

ii)

A leitura do teste IF revela um resultado negativo para amostras com menos de 5x103 células por ml de sedimento ressuspenso sendo a amostra considerada negativa. A realização de outros testes não é obrigatória.

6.   Testes PCR

Princípios

Sempre que se utilize a PCR como teste de rastreio principal e o seu resultado seja positivo, terá de se realizar o teste de isolamento ou o teste IF como segundo teste obrigatório de rastreio. Sempre que se utilize o teste PCR como segundo teste de rastreio e o seu resultado seja positivo, terão de se realizar mais testes de acordo com o fluxograma para completar o diagnóstico.

A exploração completa deste método como teste de rastreio principal é apenas recomendada quando tenham sido adquiridos conhecimentos altamente especializados.

Nota: Os testes preliminares com este método deveriam permitir a detecção reprodutível de 103 a 104 células de R. solanacearum por ml adicionadas a extractos de amostras que apresentaram anteriormente resultados negativos. Poderão ser necessárias experiências de optimização para alcançar os níveis máximos de sensibilidade e especificidade em todos os laboratórios.

Utilizar os reagentes e protocolos PCR validados (ver apêndice 6). Seleccionar, de preferência, um método que disponha de um controlo interno.

Tomar as precauções necessárias para evitar a contaminação da amostra com ADN-alvo. O teste PCR deverá ser realizado por técnicos experimentados, em laboratórios de biologia molecular especializados, no sentido de minimizar a possibilidade de contaminação com ADN-alvo.

Os controlos negativos (para os procedimentos de extracção de ADN e PCR) devem ser sempre manipulados como amostras finais no procedimento, a fim de evidenciar a ocorrência de qualquer contaminação com ADN.

Devem ser incluídos no teste PCR os seguintes controlos negativos:

| — | Extracto de amostra que tenha anteriormente sido testado e se tenha revelado negativo relativamente à presença de R. solanacearum; |
| --- | --- |

—

Extracto de amostra que tenha anteriormente sido testado e se tenha revelado negativo relativamente à presença de R. solanacearum;

| — | Controlos dos tampões utilizados para extrair a bactéria e o ADN da amostra; |
| --- | --- |

—

Controlos dos tampões utilizados para extrair a bactéria e o ADN da amostra;

| — | Mistura de reacção da PCR. |
| --- | --- |

—

Mistura de reacção da PCR.

Devem ser incluídos os seguintes controlos positivos:

| — | Alíquotas de sedimentos ressuspensos às quais se adicionou R. solanacearum (ver preparação na parte B do apêndice 3); |
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—

Alíquotas de sedimentos ressuspensos às quais se adicionou R. solanacearum (ver preparação na parte B do apêndice 3);

| — | Uma suspensão em água contendo 106 células por ml de um isolado virulento de R. solanacearum (por exemplo, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; ver parte B do apêndice 3). |
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—

Uma suspensão em água contendo 106 células por ml de um isolado virulento de R. solanacearum (por exemplo, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; ver parte B do apêndice 3).

| — | Se possível, utilizar também ADN extraído de amostras positivas ao realizar o teste PCR. |
| --- | --- |

—

Se possível, utilizar também ADN extraído de amostras positivas ao realizar o teste PCR.

Para evitar uma potencial contaminação, os controlos positivos deverão ser preparados num ambiente separado do das amostras a serem testadas.

Os extractos de amostras devem estar, o mais possível, isentos de terra. Seria, por isso, prudente, em certos casos, preparar os extractos a partir de batatas lavadas, caso se utilizem os testes PCR.

Os materiais normalizados de controlo positivo e negativo que podem ser utilizados para este teste estão mencionados no apêndice 3.

6.1.   Métodos de purificação do ADN

Utilizar amostras de controlo positivo e negativo, tal como acima descrito (ver apêndice 3).

Testar o material de controlo de forma idêntica à da(s) amostra(s).

Existe uma variedade de métodos para a purificação de ADN-alvo a partir de amostras de substratos complexos, removendo, deste modo, os inibidores da PCR e outras reacções enzimáticas e concentrando o ADN-alvo no extracto de amostra. O método seguinte foi optimizado para utilização com os métodos PCR validados referidos no apêndice 6.

a)   Método de acordo com Pastrik (2000)

| 1) | Pipetar 220 μl de tampão de lise (NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM [pH 8,0], EDTA 1 mM [pH 8,0]) para um tubo Eppendorf de 1,5 ml. |
| --- | --- |

1)

Pipetar 220 μl de tampão de lise (NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM [pH 8,0], EDTA 1 mM [pH 8,0]) para um tubo Eppendorf de 1,5 ml.

| 2) | Adicionar 100 μl de extracto de amostra e colocar num bloco de aquecimento ou em banho-maria a 95 °C durante 10 minutos. |
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2)

Adicionar 100 μl de extracto de amostra e colocar num bloco de aquecimento ou em banho-maria a 95 °C durante 10 minutos.

| 3) | Colocar o tubo em gelo durante 5 minutos. |
| --- | --- |

3)

Colocar o tubo em gelo durante 5 minutos.

| 4) | Adicionar 80 μl de solução concentrada de lisozima (50 mg de lisozima por ml em Tris HCl 10 mM, pH 8,0) e incubar a 37 °C durante 30 minutos. |
| --- | --- |

4)

Adicionar 80 μl de solução concentrada de lisozima (50 mg de lisozima por ml em Tris HCl 10 mM, pH 8,0) e incubar a 37 °C durante 30 minutos.

| 5) | Adicionar 220 μl de solução A Easy DNA® (Invitrogen), misturar bem em vórtice e incubar a 65 °C durante 30 minutos. |
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5)

Adicionar 220 μl de solução A Easy DNA® (Invitrogen), misturar bem em vórtice e incubar a 65 °C durante 30 minutos.

| 6) | Adicionar 100 μl de solução B Easy DNA® (Invitrogen), agitar vigorosamente em vórtice até que o precipitado se desloque livremente no tubo e a amostra esteja uniformemente viscosa. |
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6)

Adicionar 100 μl de solução B Easy DNA® (Invitrogen), agitar vigorosamente em vórtice até que o precipitado se desloque livremente no tubo e a amostra esteja uniformemente viscosa.

| 7) | Adicionar 500 μl de clorofórmio e agitar em vórtice até que a viscosidade diminua e a mistura se torne homogénea. |
| --- | --- |

7)

Adicionar 500 μl de clorofórmio e agitar em vórtice até que a viscosidade diminua e a mistura se torne homogénea.

| 8) | Centrifugar a 15 000 g durante 20 minutos a 4 °C para separar as fases e formar a interfase. |
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8)

Centrifugar a 15 000 g durante 20 minutos a 4 °C para separar as fases e formar a interfase.

| 9) | Transferir a fase superior para um novo tubo Eppendorf. |
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9)

Transferir a fase superior para um novo tubo Eppendorf.

| 10) | Adicionar 1 ml de etanol a 100 % (-20 °C), agitar brevemente em vórtice e incubar no gelo durante 10 minutos. |
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10)

Adicionar 1 ml de etanol a 100 % (-20 °C), agitar brevemente em vórtice e incubar no gelo durante 10 minutos.

| 11) | Centrifugar a 15 000 g durante 20 minutos a 4 °C e remover o etanol do sedimento. |
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11)

Centrifugar a 15 000 g durante 20 minutos a 4 °C e remover o etanol do sedimento.

| 12) | Adicionar 500 μl de etanol a 80 % (-20 °C) e misturar invertendo o tubo. |
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12)

Adicionar 500 μl de etanol a 80 % (-20 °C) e misturar invertendo o tubo.

| 13) | Centrifugar a 15 000 g durante 10 minutos a 4 °C, guardar o sedimento e remover o etanol. |
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13)

Centrifugar a 15 000 g durante 10 minutos a 4 °C, guardar o sedimento e remover o etanol.

| 14) | Deixar secar o sedimento ao ar ou em “DNA speed vac”. |
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14)

Deixar secar o sedimento ao ar ou em “DNA speed vac”.

| 15) | Ressuspender o sedimento em 100 μl de água ultra pura (UPW) esterilizada e deixar à temperatura ambiente durante, pelo menos, 20 minutos. |
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15)

Ressuspender o sedimento em 100 μl de água ultra pura (UPW) esterilizada e deixar à temperatura ambiente durante, pelo menos, 20 minutos.

| 16) | Armazenar a –20 °C até ser necessário para a realização da PCR. |
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16)

Armazenar a –20 °C até ser necessário para a realização da PCR.

| 17) | Centrifugar qualquer precipitado branco até que este se deposite no fundo e utilizar 5 μl do sobrenadante contendo ADN para a PCR. |
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17)

Centrifugar qualquer precipitado branco até que este se deposite no fundo e utilizar 5 μl do sobrenadante contendo ADN para a PCR.

b)   Outros métodos

Podem ser aplicados outros métodos de extracção de ADN, por exemplo o Qiagen DNeasy Plant Kit, desde que esteja provado que são igualmente eficazes na purificação do ADN a partir de amostras de controlo contendo 103 a 104 células do patogéneo por ml.

6.2.   PCR

6.2.1.   Preparar as amostras a testar e controlos para a PCR em conformidade com os protocolos validados (parte A, ponto 6, da secção VI). Preparar uma diluição decimal de extracto de ADN da amostra (1:10 em UPW).

6.2.2.   Preparar a mistura adequada de reacção da PCR num ambiente isento de contaminação, de acordo com os protocolos publicados (apêndice 6). Quando possível, recomenda-se a utilização de um protocolo PCR multiplex que incorpore também um controlo interno da PCR.

6.2.3.   Adicionar 2-5 μl de extracto de ADN à mistura de reacção da PCR de forma a obter um volume final de 25 μl em tubos PCR esterilizados de acordo com os protocolos PCR (ver apêndice 6).

6.2.4.   Incorporar uma amostra de controlo negativa contendo apenas mistura de reacção da PCR e adicionar a mesma fonte de UPW utilizada na mistura da PCR em vez da amostra.

6.2.5.   Colocar os tubos no mesmo termociclador que foi utilizado nos testes preliminares e iniciar o programa devidamente optimizado da PCR (apêndice 6).

6.3.   Análise do produto da PCR

6.3.1.   Proceder à electroforese em gel de agarose dos fragmentos amplificados pela PCR. Correr, pelo menos, 12 μl de mistura de reacção contendo o ADN amplificado de cada uma das amostras, misturados com 3 μl de tampão de carregamento (apêndice 6) em géis de agarose a 2,0 % (p/v) em tampão de tris acetato-EDTA (TAE) (apêndice 6) a 5-8 V por cm. Utilizar um marcador de ADN adequado, por exemplo, “100 bp ladder”.

6.3.2.   Revelar as bandas de ADN através de coloração em brometo de etídio (0,5 mg por l) durante 30-60 minutos, tomando as precauções adequadas para manusear este agente mutagénico.

6.3.3.   Observar o gel corado num transiluminador com UV de ondas curtas (λ = 302 nm) para detecção de produtos amplificados da PCR de tamanho esperado (apêndice 6) e documentar.

6.3.4.   Para todas as novas detecções/situações, verificar a autenticidade do fragmento amplificado pela PCR através da realização de análise de restrição enzimática numa amostra do ADN amplificado restante, por incubação com uma enzima de restrição e um tampão adequados à temperatura e com duração óptimas (ver apêndice 6). Proceder, tal como anteriormente, à electroforese em gel de agarose dos fragmentos digeridos e observar o padrão dos fragmentos de restrição característico num transiluminador com UV, após coloração com brometo de etídio, e comparar com o controlo positivo não digerido e digerido.

Interpretação do resultado do teste PCR

O teste PCR é considerado negativo caso o fragmento amplificado pela PCR de tamanho específico esperado para R. solanacearum não seja detectado para a amostra em estudo, mas seja detectado em todas as amostras de controlo positivo (no caso da PCR multiplex com iniciadores de controlo interno específicos para as plantas, deverá ser detectado um segundo produto da PCR de tamanho esperado na amostra em estudo).

O teste PCR é considerado positivo caso seja detectado o fragmento amplificado pela PCR específico para R. solanacearum de tamanho e padrão de restrição esperados (quando exigido), desde que não seja amplificado a partir de nenhuma das amostras de controlo negativo. A confirmação fiável de um resultado positivo pode também ser obtida mediante a repetição do teste com um segundo conjunto de iniciadores da PCR (apêndice 6).

Nota: Pode suspeitar-se de inibição da PCR se o fragmento amplificado esperado for observado na amostra de controlo positivo de uma suspensão aquosa de R. solanacearum, mas se obtenham resultados negativos de controlos positivos de R. solanacearum em extracto de batata. Nos protocolos da PCR multiplex com controlos internos da PCR, a inibição da reacção é indicada sempre que não se obtenha nenhum dos dois fragmentos amplificados.

Pode suspeitar-se de contaminação caso o fragmento amplificado esperado seja obtido em um ou vários dos controlos negativos.

7.   Teste FISH

Princípio

Sempre que se utilize o teste FISH como primeiro teste de rastreio e o seu resultado seja positivo, terá de se realizar o teste de isolamento ou o teste IF como segundo teste obrigatório de rastreio. Sempre que se utilize o teste FISH como segundo teste de rastreio e o seu resultado seja positivo, terão de se realizar mais testes de acordo com o fluxograma para completar o diagnóstico.

Nota: Utilizar sondas validadas específicas para R. solanacearum (apêndice 7). O teste preliminar com este método deveria permitir a detecção reprodutível de, pelo menos, 103 a 104 células de R. solanacearum por ml adicionadas a extractos de amostras que se revelaram negativos.

O procedimento seguinte deverá ser realizado, de preferência, com um extracto de amostra preparado na altura da utilização, mas pode também ser realizado com sucesso com um extracto de amostra que tenha sido armazenado em glicerol a uma temperatura compreendida entre -16 e –24 °C ou –68 e –86 °C.

Como controlos negativos, utilizar alíquotas de extracto de amostra que tenha anteriormente sido testado com resultado negativo para R. solanacearum.

Como controlos positivos preparar suspensões contendo 105 a, 106 células de R. solanacearum Biovar 2 por ml (por exemplo, estirpe NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, ver apêndice 3) em tampão fosfato (PB) 0,01 M, a partir de uma cultura com 3 a 5 dias. Preparar lâminas de controlo positivo em separado com a estirpe homóloga, ou qualquer outra estirpe de referência de R. solanacearum, suspensa em extracto de batata, tal como especificado na parte B do apêndice 3.

A utilização de sondas para eubacterias marcadas com FITC oferece um controlo para o processo de hibridação, visto que todas as eubactérias presentes na amostra ficarão coradas.

Os materiais normalizados de controlo positivo e negativo que podem ser utilizados para este teste são enumerados na parte A do apêndice 3.

Testar o material de controlo de forma idêntica à da(s) amostra(s).

7.1.   Fixação do extracto de batata

O protocolo seguinte tem por base Wullings et al. (1998):

7.1.1.   Preparar a solução fixadora (ver apêndice 7).

7.1.2.   Pipetar 100 μl de cada extracto de amostra para um tubo Eppendorf e centrifugar durante 7 minutos a 7 000g.

7.1.3.   Remover o sobrenadante e dissolver o sedimento em 200 μl de fixador preparado há menos de 24 horas. Agitar em vórtice e incubar durante 1 hora no frigorífico.

7.1.4.   Centrifugar durante 7 minutos a 7 000g, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 75 μl de PB 0,01M (ver apêndice 7).

7.1.5.   Colocar 16 μl das suspensões fixadas numa lâmina multiteste limpa, tal como demonstrado na figura 7.1. Aplicar duas amostras não diluídas diferentes por lâmina e utilizar 10 μl para obter uma diluição de 1:100 (em PB 0,01 M). A solução de amostra restante (49 μl) pode ser armazenada a –20 °C após adição de 1 volume de etanol a 96 %. Caso o teste FISH exija uma repetição, remover o etanol por centrifugação e adicionar igual volume de PB 0,01 M (agitar em vórtice).

Figura 7.1   Configuração para a lâmina FISH

| Amostra 1 | Branco | Branco | Branco | Amostra 2 |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| | | | | |
| Poço 1 | Poço 2 | Poço 3 | Poço 4 | Poço 5 |
| Amostra 1 | Branco | Branco | Branco | Amostra 2 |
| | | | | |
| Poço 6 | Poço 7 | Poço 8 | Poço 9 | Poço 10 |
| Lamela 1 | | Lamela 2 |

Amostra 1

Branco

Branco

Branco

Amostra 2

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Poço 1

Poço 2

Poço 3

Poço 4

Poço 5

Amostra 1

Branco

Branco

Branco

Amostra 2

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Poço 6

Poço 7

Poço 8

Poço 9

Poço 10

Lamela 1

Lamela 2

7.1.6.   Secar as lâminas ao ar (ou num secador de lâminas a 37 °C) e proceder à sua fixação à chama.

Nesta fase o procedimento pode ser interrompido e a hibridação continuada no dia seguinte. As lâminas devem ser armazenadas em local sem poeiras e seco, à temperatura ambiente.

7.2.   Hibridação

7.2.1.   Desidratar as células num gradiente de concentrações de etanol de 50 %, 80 % e 96 % durante 1 minuto cada. Secar as lâminas ao ar num porta-lâminas.

7.2.2.   Preparar uma câmara de incubação húmida, cobrindo o fundo de uma caixa hermética com papel absorvente ou de filtro embebido em 1x “hybmix” (apêndice 7). Pré-incubar a caixa na estufa de hibridação a 45 °C durante, pelo menos, 10 minutos.

7.2.3.   Juntar 10 μl de solução de hibridação (apêndice 7) a 8 poços (poços 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 e 10; ver figura 7.1) de cada lâmina, deixando vazios os dois poços centrais (3 e 8).

7.2.4.   Cobrir os primeiros e os últimos 4 poços com lamelas (24 x 24 mm) sem retenção de ar. Colocar as lâminas na câmara húmida pré-aquecida e hibridar durante 5 horas na estufa a 45 °C, na obscuridade.

7.2.5.   Preparar 3 copos contendo 1 l de água Milli Q (grau molecular), 1 l de 1x “hybmix” (334 ml 3x “hybmix” e 666 ml água Milli Q) e 1 l de 1/8x de “hybmix” (42 ml 3x “hybmix” e 958 ml água Milli Q). Pré-incubar cada um deles em banho-maria a 45 °C.

7.2.6.   Retirar as lamelas das lâminas e colocar estas últimas no porta-lâminas.

7.2.7.   Remover as sondas em excesso por incubação durante 15 minutos no recipiente com 1x “hybmix” a 45 °C.

7.2.8.   Transferir o porta-lâminas para uma solução de lavagem com 1/8 de “hybmix” e incubar durante mais 15 minutos.

7.2.9.   Mergulhar as lâminas brevemente em água Milli Q e colocá-las sobre papel de filtro. Remover o excesso de humidade cobrindo a superfície suavemente com papel de filtro. Pipetar 5-10 μl de solução de montagem que evite uma rápida perda de fluorescência (por exemplo, Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA ou equivalente) para cada poço e aplicar uma lamela grande (24 x 60 mm) cobrindo toda a lâmina.

7.3.   Leitura do teste FISH

7.3.1.   Observar imediatamente as lâminas com um microscópio equipado para microscopia de epifluorescência, sob lente de imersão em óleo, a uma ampliação de 630 ou 1 000 ×. Com um filtro indicado para isotiocianato de fluoresceína (FITC), as células eubacterianas (incluindo a maior parte das células gram-negativas) presentes na amostra mostram uma coloração verde fluorescente. Com um filtro para isotiocianato-5-tetrametilrodamina, as células de R. solanacearum coradas com Cy3 revelam-se vermelho fluorescente. Comparar a morfologia das células com a dos controlos positivos. As células devem apresentar-se com uma fluorescência brilhante e completamente coradas. O teste FISH (parte A, ponto 7, da secção VI) deve ser repetido se a coloração for aberrante. Examinar os poços ao longo de dois diâmetros perpendiculares e à volta do perímetro. Para amostras que não revelem células, ou cujo número seja reduzido, observar, pelo menos, 40 campos do microscópio.

7.3.2.   Procurar células fluorescentes brilhantes com a morfologia característica de R. solanacearum nos poços das lâminas de teste (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). A intensidade de fluorescência deve ser equivalente ou superior à da estirpe do controlo positivo. As células com coloração incompleta ou com fluorescência fraca não devem ser consideradas.

7.3.3.   Caso se suspeite de qualquer contaminação, o teste deve ser repetido. Este poderá ser o caso quando todas as lâminas de um lote revelem células positivas devido à contaminação do tampão ou se forem encontradas células positivas (fora dos poços da lâmina) no revestimento da lâmina.

7.3.4.   Há vários problemas inerentes à especificidade do teste FISH. Em sedimentos de cones de hilo e de segmentos de caule da batateira, é provável a ocorrência de populações de células fluorescentes com morfologia atípica e reacções cruzadas de bactérias saprófitas com dimensões e morfologia semelhantes às de R. solanacearum, apesar de este fenómeno ser menos frequente do que no teste IF.

7.3.5.   Considerar unicamente as células fluorescentes de dimensões e morfologia típicas.

7.3.6.   Interpretação do resultado do teste FISH

| i) | Obtêm-se resultados válidos para o teste FISH quando se observarem, com um filtro para FITC, células brilhantes com fluorescência verde de dimensões e morfologia típicas de R. solanacearum e, com o filtro para rodamina, células brilhantes com fluorescência vermelha em todos os controlos positivos, as quais deverão estar ausentes em todos os controlos negativos. Se forem detectadas células fluorescentes brilhantes e com a morfologia característica, determinar o número médio de células típicas por cada campo do microscópio e calcular o número de células típicas por ml de sedimento ressuspenso (apêndice 4). As amostras com, pelo menos, 5x 103 células típicas por ml de sedimento ressuspenso são consideradas como potencialmente contaminadas. A realização de outros testes é obrigatória. As amostras com menos de 5x 103 células típicas por ml de sedimento ressuspenso são consideradas negativas. |
| --- | --- |

i)

Obtêm-se resultados válidos para o teste FISH quando se observarem, com um filtro para FITC, células brilhantes com fluorescência verde de dimensões e morfologia típicas de R. solanacearum e, com o filtro para rodamina, células brilhantes com fluorescência vermelha em todos os controlos positivos, as quais deverão estar ausentes em todos os controlos negativos. Se forem detectadas células fluorescentes brilhantes e com a morfologia característica, determinar o número médio de células típicas por cada campo do microscópio e calcular o número de células típicas por ml de sedimento ressuspenso (apêndice 4). As amostras com, pelo menos, 5x 103 células típicas por ml de sedimento ressuspenso são consideradas como potencialmente contaminadas. A realização de outros testes é obrigatória. As amostras com menos de 5x 103 células típicas por ml de sedimento ressuspenso são consideradas negativas.

| ii) | O teste FISH é negativo se, com um filtro para rodamina, não se observarem células brilhantes com fluorescência vermelha e dimensões e morfologia típicas de R. solanacearum, e sejam observadas células típicas brilhantes com fluorescência vermelha nas preparações de controlo positivo. |
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ii)

O teste FISH é negativo se, com um filtro para rodamina, não se observarem células brilhantes com fluorescência vermelha e dimensões e morfologia típicas de R. solanacearum, e sejam observadas células típicas brilhantes com fluorescência vermelha nas preparações de controlo positivo.

8.   Testes ELISA

Princípio

O teste ELISA só pode ser utilizado como teste opcional em complemento de testes IF, PCR ou FISH, devido à sensibilidade relativamente baixa deste teste. Quando se utiliza o teste DAS ELISA, é obrigatório efectuar o enriquecimento e utilizar anticorpos monoclonais (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Pode ser útil efectuar um enriquecimento das amostras antes de utilizar o teste ELISA a fim de aumentar a sensibilidade deste teste, mas esse enriquecimento pode ser infrutífero devido à concorrência de outros organismos presentes na amostra.

Nota: Utilizar anticorpos validados de R. solanacearum (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Recomenda-se a determinação do título para cada novo lote de anticorpos. O título é definido como a diluição mais elevada para a qual se verifica uma reacção óptima ao testar uma suspensão contendo 105 a 106 células por ml da estirpe homóloga de R. solanacearum e recorrendo a conjugados de anticorpos secundários adequados, de acordo com as recomendações do fabricante. Durante os testes, os anticorpos devem ser utilizados em diluições de trabalho próximas ou no título da formulação comercial.

Determinar o título dos anticorpos com uma suspensão de 105 a 106 células por ml da estirpe homóloga de R. solanacearum.

Incluir como controlo negativo um extracto de amostra que tenha anteriormente sido testado com resultado negativo para R. solanacearum e uma suspensão de uma bactéria que não origine reacção cruzada em tampão fosfato salino (PBS).

Como controlo positivo, utilizar alíquotas de extracto de amostra que tenha anteriormente sido testado com resultado negativo, misturadas com 103 a 104 células por ml de R. solanacearum Biovar 2 (por exemplo estirpe NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, ver partes A e B do apêndice 2). Para a comparação dos resultados de cada placa, utilizar uma suspensão padrão de 105 a 106 células de R. solanacearum por ml em PBS. Assegurar-se de que os controlos positivos estão bem separados da(s) amostra(s) em estudo, na microplaca.

Os materiais normalizados de controlo positivo e negativo que podem ser utilizados neste teste são descritos na parte A do apêndice 3.

Testar o material de controlo de forma idêntica à da(s) amostra(s).

Foram validados dois protocolos ELISA.

a)   Teste ELISA indirecto (Robinson Smith et al., 1995)

| 1) | Utilizar alíquotas de 100-200 μl de extracto de amostra. (O aquecimento a 100 °C durante 4 minutos em banho-maria ou num bloco de aquecimento pode, nalguns casos, reduzir os resultados não específicos). |
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1)

Utilizar alíquotas de 100-200 μl de extracto de amostra. (O aquecimento a 100 °C durante 4 minutos em banho-maria ou num bloco de aquecimento pode, nalguns casos, reduzir os resultados não específicos).

| 2) | Adicionar um volume igual de tampão de revestimento 2 x (apêndice 4) e agitar em vórtice. |
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2)

Adicionar um volume igual de tampão de revestimento 2 x (apêndice 4) e agitar em vórtice.

| 3) | Colocar alíquotas de 100 μl em pelo menos dois dos poços de uma microplaca (por exemplo Nunc-Polysorp ou equivalente) e incubar durante 1 hora a 37 °C ou durante a noite a uma temperatura de 4 °C. |
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3)

Colocar alíquotas de 100 μl em pelo menos dois dos poços de uma microplaca (por exemplo Nunc-Polysorp ou equivalente) e incubar durante 1 hora a 37 °C ou durante a noite a uma temperatura de 4 °C.

| 4) | Retirar os extractos dos poços. Lavar os poços três vezes com PBS-Tween (apêndice 4), deixando a última solução de lavagem dentro dos poços durante, pelo menos, 5 minutos. |
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4)

Retirar os extractos dos poços. Lavar os poços três vezes com PBS-Tween (apêndice 4), deixando a última solução de lavagem dentro dos poços durante, pelo menos, 5 minutos.

| 5) | Preparar uma diluição adequada de anticorpos contra R. solanacearum em tampão de bloqueio (apêndice 4). Para anticorpos comerciais validados, utilizar as diluições recomendadas (geralmente uma concentração duas vezes superior ao título). |
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5)

Preparar uma diluição adequada de anticorpos contra R. solanacearum em tampão de bloqueio (apêndice 4). Para anticorpos comerciais validados, utilizar as diluições recomendadas (geralmente uma concentração duas vezes superior ao título).

| 6) | Adicionar 100 μl a cada poço e incubar durante 1 hora a 37 °C. |
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6)

Adicionar 100 μl a cada poço e incubar durante 1 hora a 37 °C.

| 7) | Retirar a solução de anticorpos dos poços e lavar como anteriormente (ponto 4). |
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7)

Retirar a solução de anticorpos dos poços e lavar como anteriormente (ponto 4).

| 8) | Preparar uma diluição adequada de conjugado anticorpo secundário - fosfatase alcalina em tampão de bloqueio. Adicionar 100 μl a cada poço e incubar durante 1 hora a 37 °C. |
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8)

Preparar uma diluição adequada de conjugado anticorpo secundário - fosfatase alcalina em tampão de bloqueio. Adicionar 100 μl a cada poço e incubar durante 1 hora a 37 °C.

| 9) | Retirar o anticorpo conjugado dos poços e lavar como anteriormente (ponto 4). |
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9)

Retirar o anticorpo conjugado dos poços e lavar como anteriormente (ponto 4).

| 10) | Adicionar 100 μl de solução de substrato de fosfatase alcalina (apêndice 4) a cada poço. Incubar na obscuridade à temperatura ambiente e ler a absorvância a 405 nm a intervalos regulares durante 90 minutos. |
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10)

Adicionar 100 μl de solução de substrato de fosfatase alcalina (apêndice 4) a cada poço. Incubar na obscuridade à temperatura ambiente e ler a absorvância a 405 nm a intervalos regulares durante 90 minutos.

b)   DASI ELISA

| 1) | Preparar uma diluição adequada de imunoglobulinas policlonais anti-R. solanacearum em tampão de revestimento, pH 9,6 (apêndice 4). Adicionar 200 μl a cada poço. Incubar a 37 °C durante 4-5 horas ou a 4 °C durante 16 horas. |
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1)

Preparar uma diluição adequada de imunoglobulinas policlonais anti-R. solanacearum em tampão de revestimento, pH 9,6 (apêndice 4). Adicionar 200 μl a cada poço. Incubar a 37 °C durante 4-5 horas ou a 4 °C durante 16 horas.

| 2) | Lavar os poços três vezes com PBS-Tween (apêndice 4).
  Adicionar 190 μl de extracto de amostra em, pelo menos, dois poços. Adicionar também controlos positivos e negativos em dois poços de cada placa. Incubar durante 16 horas a 4 °C. |
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2)

Lavar os poços três vezes com PBS-Tween (apêndice 4).

Adicionar 190 μl de extracto de amostra em, pelo menos, dois poços. Adicionar também controlos positivos e negativos em dois poços de cada placa. Incubar durante 16 horas a 4 °C.

| 3) | Lavar os poços três vezes com PBS-Tween (apêndice 4). |
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3)

Lavar os poços três vezes com PBS-Tween (apêndice 4).

| 4) | Preparar uma diluição adequada de anticorpos monoclonais específicos contra R. solanacearum em PBS (apêndice 4) que contenha também 0,5 % de albumina de soro de bovino (BSA) e adicionar 190 μl a cada poço. Incubar a 37 °C durante 2 horas. |
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4)

Preparar uma diluição adequada de anticorpos monoclonais específicos contra R. solanacearum em PBS (apêndice 4) que contenha também 0,5 % de albumina de soro de bovino (BSA) e adicionar 190 μl a cada poço. Incubar a 37 °C durante 2 horas.

| 5) | Lavar os poços três vezes com PBS-Tween (apêndice 4). |
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5)

Lavar os poços três vezes com PBS-Tween (apêndice 4).

| 6) | Preparar uma diluição adequada de imunoglobulinas anti-rato conjugadas com fosfatase alcalina em PBS. Adicionar 190 μl a cada poço. Incubar a 37 °C durante 2 horas. |
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6)

Preparar uma diluição adequada de imunoglobulinas anti-rato conjugadas com fosfatase alcalina em PBS. Adicionar 190 μl a cada poço. Incubar a 37 °C durante 2 horas.

| 7) | Lavar os poços três vezes com PBS-Tween (apêndice 4). |
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7)

Lavar os poços três vezes com PBS-Tween (apêndice 4).

| 8) | Preparar uma solução de substrato de fosfatase alcalina que contenha 1 mg de fosfato de p-nitrofenilo por ml de tampão de substrato (apêndice 4). Adicionar 200 μl a cada poço. Incubar na obscuridade à temperatura ambiente e ler a absorvância a 40 nm a intervalos regulares durante 90 minutos. |
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8)

Preparar uma solução de substrato de fosfatase alcalina que contenha 1 mg de fosfato de p-nitrofenilo por ml de tampão de substrato (apêndice 4). Adicionar 200 μl a cada poço. Incubar na obscuridade à temperatura ambiente e ler a absorvância a 40 nm a intervalos regulares durante 90 minutos.

Interpretação do resultado do teste ELISA

O teste ELISA é negativo se a média das leituras da densidade óptica (DO) dos poços de amostras duplicadas for < 2x DO do poço de controlo negativo do extracto de amostra, desde que as DO dos controlos positivos sejam todas superiores a 1,0 (após 90 minutos de incubação com o substrato) e sejam superiores ao dobro da DO obtida para os extractos de amostras negativas.

O teste ELISA é positivo se a DO média dos poços de amostras duplicadas for > 2x DO do poço de extracto de amostra negativa, desde que as DO de todos os poços de controlo negativo sejam < 2x as DO dos poços de controlo positivo.

Uma leitura ELISA negativa nos poços de controlo positivo indica que o teste não foi efectuado correctamente ou que ocorreram inibições. Uma leitura ELISA positiva nos poços de controlo negativo indica que ocorreu contaminação cruzada ou uma ligação não específica de anticorpos.

9.   Bioensaio

Nota: Um teste preliminar com este método deveria permitir a detecção reprodutível de 103 a 104 unidades formadoras de colónias de R. solanacearum por ml adicionadas a amostras de extractos para as quais se obtiveram anteriormente resultados negativos (para a preparação, ver apêndice 3).

Pode esperar-se a sensibilidade de detecção mais elevada quando se utiliza uma amostra de extracto recentemente preparada e condições de crescimento óptimas. No entanto, o método pode ser aplicado com sucesso a extractos que tenham sido armazenados em glicerol a uma temperatura compreendida entre –68 e –86 °C.

O protocolo seguinte tem por base Janse (1988):

9.1.   Para cada amostra, utilizar 10 plantas de uma cultivar susceptível de tomateiro (por exemplo Moneymaker ou cultivar com susceptibilidade equivalente, determinada pelo laboratório) no estádio de três folhas verdadeiras. Para os pormenores de cultivo, ver apêndice 8. Em alternativa, utilizar beringelas (por exemplo cultivar Black Beauty ou cultivares com susceptibilidade equivalente), mas apenas plantas que se encontrem no estádio fenológico de duas a três folhas, até que a terceira folha verdadeira esteja completamente expandida. Tem-se observado que os sintomas são menos graves e se desenvolvem mais lentamente na beringela. Recomenda-se, por conseguinte, a utilização de plântulas de tomateiro, sempre que possível.

Distribuir 100 μl de extracto de amostra pelas plantas.

9.2.1.   Inoculação por injecção

Inocular os caules das plantas imediatamente acima dos cotilédones, utilizando uma seringa com uma agulha hipodérmica (não inferior a 23 G). Distribuir a amostra pelas plantas.

9.2.2.   Inoculação por fenda

Segurar a planta entre dois dedos, pipetar uma gota (cerca de 5-10 μl) do sedimento ressuspenso no caule, entre os cotilédones e a primeira folha.

Utilizando um escalpelo esterilizado, fazer uma fenda em diagonal com 1,0 cm de comprimento e com uma profundidade de cerca de 2/3 do diâmetro do caule, começando a incisão a partir da gota de sedimento.

Selar o corte com vaselina esterilizada aplicada com uma seringa.

9.3.   Inocular, através da mesma técnica, 5 plântulas com uma suspensão aquosa de 105 a 106 células por ml preparada a partir de uma cultura de 48 horas de uma estirpe virulenta de R. solanacearum Biovar 2, como controlo positivo, e com tampão de ressuspensão (apêndice 4) como controlo negativo. Separar as plantas de controlo positivo e negativo das outras plantas, a fim de evitar contaminações cruzadas.

9.4.   Deixar crescer as plantas em instalações de quarentena durante um período de até 4 semanas a uma temperatura de 25-30 °C e elevada humidade relativa, regando adequadamente para evitar o alagamento ou a murchidão por falta de água. Para evitar a contaminação, incubar as plantas de controlo positivo e as de controlo negativo em prateleiras claramente separadas numa estufa ou câmara de crescimento ou, caso existam limitações de espaço, garantir uma separação rigorosa. Se as plantas relativas a amostras diferentes tiverem de ser incubadas perto umas das outras, separá-las com as divisórias adequadas. Evitar contaminações cruzadas ao adubar, regar, inspeccionar ou ao proceder a outras manipulações. É essencial manter as estufas ou as câmaras de crescimento isentas de pragas, visto que estas podem promover a transmissão da bactéria entre amostras.

Observar o desenvolvimento de sintomas de murchidão, epinastia, clorose e/ou nanismo.

9.5.   Fazer isolamentos a partir das plantas infectadas (ponto 3 da secção II) e identificar culturas puras de presumíveis colónias de R. solanacearum (parte B da secção VI).

9.6.   Caso não se observem sintomas após 3 semanas, efectuar um teste IF, PCR ou de isolamento numa amostra composta de secções de 1 cm do caule de cada uma das plantas inoculadas com os extractos das amostras, colhidas acima do local da inoculação. Se o teste for positivo, proceder à diluição em placas (ponto 4.1).

9.7.   Identificar culturas puras de presumíveis colónias de R. solanacearum (parte B da secção VI).

Interpretação dos resultados do bioensaio

Obtêm-se resultados válidos no bioensaio quando as plantas do controlo positivo revelam sintomas típicos, é possível isolar novamente bactérias a partir destas plantas e não se observam sintomas nos controlos negativos.

O bioensaio é negativo se as plantas inoculadas com os extractos das amostras não estiverem infectadas por R. solanacearum e se for detectada R. solanacearum nos controlos positivos.

O bioensaio é positivo se as plantas inoculadas com os extractos das amostras estiverem infectadas por R. solanacearum.

B.   TESTES DE IDENTIFICAÇÃO

Identificar culturas puras de presumíveis isolados de R. solanacearum, utilizando, pelo menos, dois dos seguintes testes baseados em princípios biológicos diferentes.

Incluir estirpes de referência conhecidas, sempre que adequado, para cada teste realizado (ver apêndice 3).

1.   Testes nutricionais e enzimáticos

Determinar as seguintes características fenotípicas, que estão universalmente presentes ou ausentes em R. solanacearum, de acordo com os métodos de Lelliott e Stead (1987), Klement et al. (1990), Schaad (2001).

| Teste | Resultado esperado |
| --- | --- |
| Produção de pigmento fluorescente | – |
| Grânulos de poli-β-hidroxibutirato | + |
| Teste de oxidação/fermentação (O/F) | O+/F– |
| Produção da catalase | + |
| Teste de oxidase de Kovac | + |
| Redução dos nitratos | + |
| Utilização de citrato | + |
| Crescimento a 40 °C | – |
| Crescimento em NaCl a 1 % | + |
| Crescimento em NaCl a 2 % | – |
| Produção de arginina di-hidrolase | – |
| Liquefacção da gelatina | – |
| Hidrólise do amido | – |
| Hidrólise da esculina | – |
| Produção de levana | – |

Teste

Resultado esperado

Produção de pigmento fluorescente

–

Grânulos de poli-β-hidroxibutirato

+

Teste de oxidação/fermentação (O/F)

O+/F–

Produção da catalase

+

Teste de oxidase de Kovac

+

Redução dos nitratos

+

Utilização de citrato

+

Crescimento a 40 °C

–

Crescimento em NaCl a 1 %

+

Crescimento em NaCl a 2 %

–

Produção de arginina di-hidrolase

–

Liquefacção da gelatina

–

Hidrólise do amido

–

Hidrólise da esculina

–

Produção de levana

–

2.   Teste IF

2.1.   Preparar uma suspensão com cerca de 106 células por ml em tampão IF (apêndice 4).

2.2.   Preparar uma série de diluições a 1:2 de um anti-soro adequado (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

2.3.   Aplicar o procedimento de IF (parte A, ponto 5, da secção VI).

2.4.   Um resultado positivo no teste IF é alcançado se o título IF da cultura for equivalente ao do controlo positivo.

3.   Teste ELISA

Nota: Se se realizarem apenas dois testes de identificação, não deve utilizar-se outro teste serológico como complemento deste teste.

3.1.   Preparar uma suspensão com cerca de 108 células por ml em 1X PBS (apêndice 4).

3.2.   Utilizar um teste ELISA adequado com um anticorpo monoclonal específico para R. solanacearum.

3.3.   Um resultado positivo no teste ELISA é alcançado se a leitura ELISA obtida para a cultura for, pelo menos, igual a metade da obtida para o controlo positivo.

4.   Testes PCR

4.1.   Preparar uma suspensão com cerca de 106 células por ml em água esterilizada UPW.

4.2.   Aquecer 100 μl da suspensão de células em tubos fechados num bloco de aquecimento ou em banho-maria em ebulição a 100 °C durante 4 minutos. As amostras podem, então, ser armazenadas a uma temperatura compreendida entre –16 e –24 °C até serem necessárias.

4.3.   Aplicar os procedimentos PCR adequados para amplificar os fragmentos específicos de R. solanacearum [por exemplo Seal et al. (1993), Pastrik e Maiss (2000), Pastrik et al. (2002), Boudazin et al. (1999), Opina et al. (1997), Weller et al. (1999)].

4.4.   É alcançada uma identificação positiva para R. solanacearum se os fragmentos de amplificação da PCR tiverem a mesma dimensão e os mesmos polimorfismos dos fragmentos de restrição que a estirpe de controlo positivo.

5.   Teste FISH

5.1.   Preparar uma suspensão de cerca de 106 células por ml em UPW.

5.2.   Aplicar o procedimento FISH (parte A, ponto 7, da secção VI) com, pelo menos, duas sondas específicas para R. solanacearum (apêndice 7).

5.3.   Um resultado positivo no teste FISH é alcançado se a cultura apresentar as mesmas reacções do controlo positivo.

6.   Perfis de ácidos gordos (FAP)

6.1.   Incubar o isolado em agar de soja e tripticase (Oxoid) durante 48 horas a 28 °C.

6.2.   Utilizar um procedimento FAP adequado (Janse, 1991; Stead, 1992).

6.3.   Um resultado positivo no teste FAP é alcançado se o perfil do presumível isolado for idêntico ao do controlo positivo. A presença de ácidos gordos característicos 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH e 18:1 2OH e a ausência de 16:0 3OH são altamente indicativas de Ralstonia sp.

7.   Métodos para caracterização da estirpe

A caracterização da estirpe utilizando um dos métodos seguintes é recomendada para cada novo caso de isolamento de R. solanacearum.

Incluir estirpes de referência conhecidas, sempre que adequado, para cada teste realizado (ver apêndice 3).

7.1.   Determinação do biovar

A espécie R. solanacearum encontra-se dividida em Biovares com base na sua capacidade em utilizar e/ou oxidar três dissacáridos e três álcoois de hexoses (Hayward, 1964 e Hayward et al., 1990). O meio de crescimento para o teste do Biovar é descrito no apêndice 2. O teste pode ser realizado com sucesso mediante a inoculação por picada dos meios de crescimento com culturas puras de isolados de R. solanacearum e incubação a 28 °C. Se os meios forem distribuídos em placas estéreis de cultura de 96 poços (200 μl por poço) pode observar-se uma mudança de cor, de verde azeitona para amarelo, passadas 72 horas, o que indica um resultado positivo.

| | Biovar |
| --- | --- |
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Utilização de: | |
| Maltose | – | + | + | – | + |
| Lactose | – | + | + | – | + |
| D (+) Celobiose | – | + | + | – | + |
| Manitol | – | – | + | + | + |
| Sorbitol | – | – | + | + | – |
| Dulcitol | – | – | + | + | – |

Biovar

1

2

3

4

5

Utilização de:

Maltose

–

+

+

–

+

Lactose

–

+

+

–

+

D (+) Celobiose

–

+

+

–

+

Manitol

–

–

+

+

+

Sorbitol

–

–

+

+

–

Dulcitol

–

–

+

+

–

Testes adicionais diferenciam o Biovar 2 em subfenótipos

| | Biovar 2A
  (Repartição mundial) | Biovar 2A
  (Encontrada no Chile e na Colômbia) | Biovar 2T
  (Encontrada nas áreas tropicais) |
| --- | --- | --- | --- |
| Utilização de Trealose | – | + | + |
| Utilização de meso-Inositol | + | – | + |
| Utilização de D-Ribose | – | – | + |
| Actividade pectolítica (1) | baixa | baixa | alta |

Biovar 2A

(Repartição mundial)

Biovar 2A

(Encontrada no Chile e na Colômbia)

Biovar 2T

(Encontrada nas áreas tropicais)

Utilização de Trealose

–

+

+

Utilização de meso-Inositol

+

–

+

Utilização de D-Ribose

–

–

+

Actividade pectolítica (1)

baixa

baixa

alta

7.2.   “Genomic fingerprinting”

A diferenciação molecular das estirpes do complexo R. solanacearum pode ser efectuada através de várias técnicas, entre as quais são de referir:

7.2.1.   Análise do polimorfismo dos fragmentos de restrição (RFLP) (Cook et al., 1989).

7.2.2.   PCR de sequências repetitivas utilizando iniciadores REP, BOX e ERIC (Louws et al., 1995; Smith et al., 1995).

7.2.3.   Análise do polimorfismo dos fragmentos amplificados (AFLP) (Van der Wolf et al., 1998).

7.3.   Métodos PCR

Podem utilizar-se iniciadores específicos para PCR (Pastrik et al., 2002; ver apêndice 6) para diferenciar estirpes pertencentes à Divisão 1 (Biovares 3, 4 e 5) e Divisão 2 (Biovares 1, 2A e 2T) de R. solanacearum, como definidas inicialmente pela análise RFLP (Cook et al., 1989) e a sequenciação de 16S rADN (Taghavi et al., 1996).

C.   Teste de confirmação

O teste de patogenicidade tem de ser efectuado como confirmação final do diagnóstico de R. solanacearum e para avaliar a virulência dos isolados identificados como R. solanacearum.

| 1) | Preparar um inóculo de aproximadamente 106 células por ml de uma cultura com 24-48 horas do isolado a ser testado e de uma estirpe de R. solanacearum adequada para controlo positivo (por exemplo NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; ver apêndice 3). |
| --- | --- |

1)

Preparar um inóculo de aproximadamente 106 células por ml de uma cultura com 24-48 horas do isolado a ser testado e de uma estirpe de R. solanacearum adequada para controlo positivo (por exemplo NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; ver apêndice 3).

| 2) | Inocular 5-10 plântulas de tomateiro ou beringela susceptíveis no estádio de três folhas verdadeiras (ver parte A, ponto 9, da secção VI). |
| --- | --- |

2)

Inocular 5-10 plântulas de tomateiro ou beringela susceptíveis no estádio de três folhas verdadeiras (ver parte A, ponto 9, da secção VI).

| 3) | Incubar durante, no máximo, 2 semanas a uma temperatura de 25-28 °C e elevada humidade relativa, regando adequadamente para evitar o alagamento ou a seca. Com culturas puras deve observar-se a murchidão típica no período de 14 dias. Se no final deste período não se observarem quaisquer sintomas, não se pode confirmar que a cultura seja uma forma patogénica de R. solanacearum. |
| --- | --- |

3)

Incubar durante, no máximo, 2 semanas a uma temperatura de 25-28 °C e elevada humidade relativa, regando adequadamente para evitar o alagamento ou a seca. Com culturas puras deve observar-se a murchidão típica no período de 14 dias. Se no final deste período não se observarem quaisquer sintomas, não se pode confirmar que a cultura seja uma forma patogénica de R. solanacearum.

| 4) | Observar o desenvolvimento de sintomas de murchidão e/ou epinastia, clorose e nanismo. |
| --- | --- |

4)

Observar o desenvolvimento de sintomas de murchidão e/ou epinastia, clorose e nanismo.

| 5) | Efectuar um isolamento a partir das plantas sintomáticas, retirando-lhes uma secção de cerca de 2 cm de caule acima do ponto de inoculação. Fragmentá-las e suspendê-las num pequeno volume de água destilada esterilizada ou de tampão fosfato 50 mM (apêndice 4). Isolar a partir de diluições apropriadas da suspensão por espalhamento ou reticulado num meio adequado, de preferência selectivo (apêndice 2), incubar durante 48-72 horas a 28 °C e observar a formação de colónias típicas de R. solanacearum. |
| --- | --- |

5)

Efectuar um isolamento a partir das plantas sintomáticas, retirando-lhes uma secção de cerca de 2 cm de caule acima do ponto de inoculação. Fragmentá-las e suspendê-las num pequeno volume de água destilada esterilizada ou de tampão fosfato 50 mM (apêndice 4). Isolar a partir de diluições apropriadas da suspensão por espalhamento ou reticulado num meio adequado, de preferência selectivo (apêndice 2), incubar durante 48-72 horas a 28 °C e observar a formação de colónias típicas de R. solanacearum.

Apêndice 1

Laboratórios que participaram na validação e optimização de protocolos

| Laboratório (2) | Localização | País |
| --- | --- | --- |
| Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit | Viena e Linz | Áustria |
| Departement Gewasbescherming | Merelbeke | Bélgica |
| Plantedirektoratet | Lyngby | Dinamarca |
| Central Science Laboratory | York | Inglaterra |
| Scottish Agricultural Science Agency | Edimburgo | Escócia |
| Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Unité de Bactériologie | Angers | França |
| Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme de Terre | Le Rheu | França |
| Biologische Bundesanstalt | Kleinmachnow | Alemanha |
| Pflanzenschutzamt Hannover | Hanover | Alemanha |
| State Laboratory | Dublin | Irlanda |
| Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali | Bolonha | Itália |
| Regione Veneto Unità Periferica per i Servizi Fitosanitari | Verona | Itália |
| Nederlandse Algemene Keuringsdienst | Emmeloord | Países Baixos |
| Plantenziektenkundige Dienst | Wageningen | Países Baixos |
| Direcção-Geral de Protecção das Culturas | Lisboa | Portugal |
| Centro de Diagnóstico de Aldearrubia | Salamanca | Espanha |
| Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias | Valência | Espanha |
| Swedish University of Agricultural Sciences | Uppsala | Suécia |

Laboratório (2)

Localização

País

Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit

Viena e Linz

Áustria

Departement Gewasbescherming

Merelbeke

Bélgica

Plantedirektoratet

Lyngby

Dinamarca

Central Science Laboratory

York

Inglaterra

Scottish Agricultural Science Agency

Edimburgo

Escócia

Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Unité de Bactériologie

Angers

França

Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme de Terre

Le Rheu

França

Biologische Bundesanstalt

Kleinmachnow

Alemanha

Pflanzenschutzamt Hannover

Hanover

Alemanha

State Laboratory

Dublin

Irlanda

Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali

Bolonha

Itália

Regione Veneto Unità Periferica per i Servizi Fitosanitari

Verona

Itália

Nederlandse Algemene Keuringsdienst

Emmeloord

Países Baixos

Plantenziektenkundige Dienst

Wageningen

Países Baixos

Direcção-Geral de Protecção das Culturas

Lisboa

Portugal

Centro de Diagnóstico de Aldearrubia

Salamanca

Espanha

Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias

Valência

Espanha

Swedish University of Agricultural Sciences

Uppsala

Suécia

Apêndice 2

Meios para isolamento e cultura de R. solanacearum

a)   Meio geral de crescimento

Agar nutritivo (NA)

| Agar nutritivo (Difco) | 23,0 g |
| --- | --- |
| Água destilada | 1,0 l |

Agar nutritivo (Difco)

23,0 g

Água destilada

1,0 l

Dissolver os ingredientes e esterilizar em autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

Agar com extracto de levedura, peptona e glucose (YPGA)

| Extracto de levedura (Difco) | 5,0 g |
| --- | --- |
| Bacto-Peptona (Difco) | 5,0 g |
| D(+)glucose mono-hidratada | 10,0 g |
| Bacto-Agar (Difco) | 15,0 g |
| Água destilada | 1,0 l |

Extracto de levedura (Difco)

5,0 g

Bacto-Peptona (Difco)

5,0 g

D(+)glucose mono-hidratada

10,0 g

Bacto-Agar (Difco)

15,0 g

Água destilada

1,0 l

Dissolver os ingredientes e esterilizar em autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

Agar de sacarose e peptona (SPA)

| Sacarose | 20,0 g |
| --- | --- |
| Bacto-Peptona (Difco) | 5,0 g |
| K2HPO4 | 0,5 g |
| MgSO4.7H2O | 0,25 g |
| Bacto-Agar (Difco) | 15,0 g |
| Água destilada | 1,0 l |
| pH 7,2-7,4 | |

Sacarose

20,0 g

Bacto-Peptona (Difco)

5,0 g

K2HPO4

0,5 g

MgSO4.7H2O

0,25 g

Bacto-Agar (Difco)

15,0 g

Água destilada

1,0 l

pH 7,2-7,4

Dissolver os ingredientes e esterilizar em autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

Meio de tetrazólio de Kelman

| Casaminoácidos (Difco) | 1,0 g |
| --- | --- |
| Bacto-Peptona (Difco) | 10,0 g |
| Dextrose | 5,0 g |
| Bacto-Agar (Difco) | 15,0 g |
| Água destilada | 1,0 l |

Casaminoácidos (Difco)

1,0 g

Bacto-Peptona (Difco)

10,0 g

Dextrose

5,0 g

Bacto-Agar (Difco)

15,0 g

Água destilada

1,0 l

Dissolver os ingredientes e esterilizar em autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

Arrefecer até 50 °C e adicionar o volume necessário de solução de cloreto de 2,3,5-trifenil-tetrazólio (Sigma), esterilizada por filtração, para obter uma concentração final de 50 mg por l.

b)   Meios de crescimento selectivo validados

Meio SMSA (Englebrecht, 1994 modificado por Elphinstone et al., 1996)

| Meio basal | |
| --- | --- |
| Casaminoácidos (Difco) | 1,0 g |
| Bacto-Peptona (Difco) | 10,0 g |
| Glicerol | 5,0 ml |
| Bacto-Agar (Difco), ver Nota 2. | 15,0 g |
| Água destilada | 1,0 l |

Meio basal

Casaminoácidos (Difco)

1,0 g

Bacto-Peptona (Difco)

10,0 g

Glicerol

5,0 ml

Bacto-Agar (Difco), ver Nota 2.

15,0 g

Água destilada

1,0 l

Dissolver os ingredientes e esterilizar em autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

Arrefecer até 50 °C e adicionar o volume necessário de soluções aquosas concentradas, esterilizadas por filtração, dos seguintes ingredientes para obter as concentrações finais especificadas:

| Violeta cristal (Sigma) | 5 mg por l |
| --- | --- |
| Sulfato de polimixina B (Sigma P-1004) | 600 000 U (aproximadamente 100 mg) por l |
| Bacitracina (Sigma B-0125) | 1 250 U (aproximadamente 25 mg) por l |
| Cloranfenicol (Sigma C-3175) | 5 mg por l |
| Penicilina-G (Sigma P-3032) | 825 U (aproximadamente 0,5 mg) |
| cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio (Sigma) | 50 mg por l |

Violeta cristal (Sigma)

5 mg por l

Sulfato de polimixina B (Sigma P-1004)

600 000 U (aproximadamente 100 mg) por l

Bacitracina (Sigma B-0125)

1 250 U (aproximadamente 25 mg) por l

Cloranfenicol (Sigma C-3175)

5 mg por l

Penicilina-G (Sigma P-3032)

825 U (aproximadamente 0,5 mg)

cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio (Sigma)

50 mg por l

Nota:

| 1. | A utilização de reagentes diferentes dos acima especificados pode afectar o crescimento de R. solanacearum. |
| --- | --- |

1.

A utilização de reagentes diferentes dos acima especificados pode afectar o crescimento de R. solanacearum.

| 2. | Pode utilizar-se agar Oxoid #1 em vez de Bacto-agar (Difco). Neste caso, o crescimento de R. solanacearum será mais lento, embora o crescimento dos saprófitas competidores possa também ser reduzido. A formação de colónias típicas de R. solanacearum pode demorar mais 1-2 dias e a coloração vermelha pode ser mais clara e mais difusa do que em Bacto-agar. |
| --- | --- |

2.

Pode utilizar-se agar Oxoid #1 em vez de Bacto-agar (Difco). Neste caso, o crescimento de R. solanacearum será mais lento, embora o crescimento dos saprófitas competidores possa também ser reduzido. A formação de colónias típicas de R. solanacearum pode demorar mais 1-2 dias e a coloração vermelha pode ser mais clara e mais difusa do que em Bacto-agar.

| 3. | O aumento da concentração de bacitracina para 2 500 U por l pode reduzir as populações de bactérias competidoras sem afectar o crescimento de R. solanacearum. |
| --- | --- |

3.

O aumento da concentração de bacitracina para 2 500 U por l pode reduzir as populações de bactérias competidoras sem afectar o crescimento de R. solanacearum.

Armazenar os meios e as soluções concentradas de antibióticos a 4 °C, na obscuridade, e utilizar no prazo de um mês.

As placas devem estar livres de condensação superficial antes da utilização.

Evitar a secagem excessiva das placas.

Após a preparação de cada novo lote de meio deve efectuar-se um controlo de qualidade mediante o espalhamento de uma suspensão de uma cultura de referência de R. solanacearum (ver apêndice 3), observando a formação de colónias típicas após incubação a 28 °C durante 2-5 dias.

c)   Meios de enriquecimento validados

Meio líquido SMSA (Elphinstone et al., 1996)

Preparar de forma idêntica à do meio selectivo SMSA contendo agar, mas excluindo o Bacto-agar e o cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio.

Meio líquido de Wilbrink modificado (Caruso et al., 2002)

| Sacarose | 10g |
| --- | --- |
| Proteose peptona | 5 g |
| K2HPO4 | 0,5g |
| MgSO4 | 0,25g |
| NaNO3 | 0,25g |
| Água destilada | 1 l |

Sacarose

10g

Proteose peptona

5 g

K2HPO4

0,5g

MgSO4

0,25g

NaNO3

0,25g

Água destilada

1 l

Esterilizar em autoclave a 121 °C durante 15 minutos e arrefecer até 50 °C.

Adicionar soluções concentradas de antibióticos como para o meio líquido SMSA.

Apêndice 3

A.   Material de controlo normalizado disponível no mercado

a)   Isolados bacterianos

Recomenda-se a utilização dos seguintes isolados bacterianos como material de referência normalizado, quer como controlos positivos (quadro 1) quer durante a optimização de testes para evitar reacções cruzadas (quadro 2). Todas as estirpes são comercializadas por:

| 1. | National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Central Science Laboratory, York, Reino Unido. |
| --- | --- |

1.

National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Central Science Laboratory, York, Reino Unido.

| 2. | Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen, Países Baixos. |
| --- | --- |

2.

Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen, Países Baixos.

| 3. | Collection Française de Bactéries Phytopathogènes (CFBP), INRA Station Phytobactériologie, Angers, França. |
| --- | --- |

3.

Collection Française de Bactéries Phytopathogènes (CFBP), INRA Station Phytobactériologie, Angers, França.

Quadro 1   Tabela de referência SMT de isolados de R. solanacearum

| Código NCPPB | SMT
  # | Outros códigos | País de origem | Biovar |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| NCPPB 4153 | 6 | CFBP 4582, Pr 3020, EURS11 | Egipto | 2 |
| NCPPB 4154 | 10 | CFBP 4585, 550, EURS21 | Turquia | 2 |
| NCPPB 3857 | 12 | CFBP 4587, Pr 1140, EURS26 | Inglaterra | 2 |
| NCPPB 1584 | 23 | CFBP 4598, EURS49 | Chipre | 2 |
| NCPPB 2505 | 24 | CFBP 4599, EURS50 | Suécia | 2 |
| NCPPB 4155 | 26 | CFBP 4601, 502, EURS55 | Bélgica | 2 |
| NCPPB 4156 (3) | 71 (3) | PD 2762, CFBP 3857 | Países Baixos | 2 |
| NCPPB 4157 | 66 | LNPV 15.59 | França | 2 |
| NCPPB 4158 | 39 | CFBP 4608, Port 448, EURS80 | Portugal | 2 |
| NCPPB 4160 | 69 | IVIA-1632-2 | Espanha | 2 |
| NCPPB 4161 | 76 | B3B | Alemanha | 2 |
| NCPPB 325 | 41 | CFBP 2047, KEL60-1, R842 | EUA | 1 |
| NCPPB 3967 | 42 | CFBP 4610, R285, GONg7 | Costa Rica | 1 |
| NCPPB 4028 | 43 | CFBP 4611, R303/571, CIP310, SEQ205 | Colômbia | 2 |
| NCPPB 3985 | 44 | CFBP 4612, R578, CIP312 | Peru | 2T |
| NCPPB 3989 | 45 | CFBP 4613, R568, CIP226 | Brasil | 2T |
| NCPPB 3996 | 46 | CFBP 3928, R276/355, CIP72, SEQ225 | Peru | 3 |
| NCPPB 3997 | 47 | CFBP 4614, R280/363, CIP49, HAY0131a | Austrália | 3 |
| NCPPB 4029 | 48 | CFBP 4615, R297/349, CIP121, CMIb2861 | Sri Lanca | 4 |
| NCPPB 4005 | 49 | CFBP 4616, R470 | Filipinas | 4 |
| NCPPB 4011 | 50 | CFBP 4617, R288, HEmps2 | China | 5 |

Código NCPPB

SMT

#

Outros códigos

País de origem

Biovar

NCPPB 4153

6

CFBP 4582, Pr 3020, EURS11

Egipto

2

NCPPB 4154

10

CFBP 4585, 550, EURS21

Turquia

2

NCPPB 3857

12

CFBP 4587, Pr 1140, EURS26

Inglaterra

2

NCPPB 1584

23

CFBP 4598, EURS49

Chipre

2

NCPPB 2505

24

CFBP 4599, EURS50

Suécia

2

NCPPB 4155

26

CFBP 4601, 502, EURS55

Bélgica

2

NCPPB 4156 (3)

71 (3)

PD 2762, CFBP 3857

Países Baixos

2

NCPPB 4157

66

LNPV 15.59

França

2

NCPPB 4158

39

CFBP 4608, Port 448, EURS80

Portugal

2

NCPPB 4160

69

IVIA-1632-2

Espanha

2

NCPPB 4161

76

B3B

Alemanha

2

NCPPB 325

41

CFBP 2047, KEL60-1, R842

EUA

1

NCPPB 3967

42

CFBP 4610, R285, GONg7

Costa Rica

1

NCPPB 4028

43

CFBP 4611, R303/571, CIP310, SEQ205

Colômbia

2

NCPPB 3985

44

CFBP 4612, R578, CIP312

Peru

2T

NCPPB 3989

45

CFBP 4613, R568, CIP226

Brasil

2T

NCPPB 3996

46

CFBP 3928, R276/355, CIP72, SEQ225

Peru

3

NCPPB 3997

47

CFBP 4614, R280/363, CIP49, HAY0131a

Austrália

3

NCPPB 4029

48

CFBP 4615, R297/349, CIP121, CMIb2861

Sri Lanca

4

NCPPB 4005

49

CFBP 4616, R470

Filipinas

4

NCPPB 4011

50

CFBP 4617, R288, HEmps2

China

5

Nota: A autenticidade das estirpes acima indicadas só pode ser garantida se estas forem obtidas a partir de uma colecção de culturas autênticas.

Quadro 2   Tabela de referência SMT de bactérias serológica ou geneticamente relacionadas para utilização na optimização de testes de detecção

| Código NCPPB | SMT
  # | Outro código | Identificação |
| --- | --- | --- | --- |
| NCPPB 4162 | 51 | CFBP 1954 | Bacillus polymyxa
   (4) |
| NCPPB 4163 | 52 | CFBP 1538 | Pseudomonas marginalis pv. marginalis
   (4) |
| NCPPB 4164 | — | CFBP 2227 | Burkholderia cepacia
   (5) |
| NCPPB 4165 | — | CFBP 2459 | Ralstonia pickettii
   (5) |
| NCPPB 4166 | 58 | CFBP 3567
  CSL Pr1150 | Ralstonia pickettii
   (4) |
| NCPPB 4167 | 60 | CFBP 4618
  PD 2778 | Ralstonia sp. (4) |
| NCPPB 127 | 53 | CFBP 3575 | Burkholderia andropogonis
   (4) |
| NCPPB 353 | 54 | CFBP 3572 | Burkholderia caryophylli
   (4) |
| NCPPB 945 | 55 | CFBP 3569 | Burkholderia cepacia
   (4) |
| NCPPB 3708 | 56 | CFBP 3574 | Burkholderia glumae
   (4) |
| NCPPB 3590 | 57 | CFBP 3573 | Burkholderia plantarii
   (4) |
| PPB 3726 | 59 | CFBP 3568 | Banana Blood Disease Bacterium
   (4)
   (5)
   (6) |
| NCPPB 4168 | 61 | CFBP 4619
  IPO S339 | Enterobacter sp. (4) |
| NCPPB 4169 | 62 | IPO 1695 | Enterobacter sp. (4) |
| NCPPB 4170 | 63 | CFBP 4621
  IPO S306 | Ochrobactrum anthropi
   (4)
   (5) |
| NCPPB 4171 | 64 | CFBP 4622
  IPO 1693 | Curtobacterium sp. (4)
   (5) |
| NCPPB 4172 | 65 | IPO 1696a | Pseudomonas sp. (4) |
| NCPPB 4173 | — | PD 2318 | Aureobacterium sp. (5) |
| NCPPB 4174 | 81 | IVIA 1 844,06 | Flavobacterium sp. (4)
   (5) |

Código NCPPB

SMT

#

Outro código

Identificação

NCPPB 4162

51

CFBP 1954

Bacillus polymyxa
   (4)

NCPPB 4163

52

CFBP 1538

Pseudomonas marginalis pv. marginalis
   (4)

NCPPB 4164

—

CFBP 2227

Burkholderia cepacia
   (5)

NCPPB 4165

—

CFBP 2459

Ralstonia pickettii
   (5)

NCPPB 4166

58

CFBP 3567

CSL Pr1150

Ralstonia pickettii
   (4)

NCPPB 4167

60

CFBP 4618

PD 2778

Ralstonia sp. (4)

NCPPB 127

53

CFBP 3575

Burkholderia andropogonis
   (4)

NCPPB 353

54

CFBP 3572

Burkholderia caryophylli
   (4)

NCPPB 945

55

CFBP 3569

Burkholderia cepacia
   (4)

NCPPB 3708

56

CFBP 3574

Burkholderia glumae
   (4)

NCPPB 3590

57

CFBP 3573

Burkholderia plantarii
   (4)

PPB 3726

59

CFBP 3568

Banana Blood Disease Bacterium
   (4)
   (5)
   (6)

NCPPB 4168

61

CFBP 4619

IPO S339

Enterobacter sp. (4)

NCPPB 4169

62

IPO 1695

Enterobacter sp. (4)

NCPPB 4170

63

CFBP 4621

IPO S306

Ochrobactrum anthropi
   (4)
   (5)

NCPPB 4171

64

CFBP 4622

IPO 1693

Curtobacterium sp. (4)
   (5)

NCPPB 4172

65

IPO 1696a

Pseudomonas sp. (4)

NCPPB 4173

—

PD 2318

Aureobacterium sp. (5)

NCPPB 4174

81

IVIA 1 844,06

Flavobacterium sp. (4)
   (5)

b)   Material de controlo normalizado disponível no mercado

O material de controlo seguidamente indicado está disponível na colecção de culturas NCPPB.

Sedimento liofilizado de extracto de batata proveniente de 200 tubérculos de batatas sãs como controlo negativo para todos os testes.

Sedimento liofilizado de extracto de batata proveniente de 200 tubérculos de batatas sãs com 103 a 104 e 104 a 106células de R. solanacearum Biovar 2 (estirpe NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) como controlo positivo para testes serológicos e PCR. Visto que a viabilidade das células é afectada durante a liofilização, estes controlos não são adequados como controlos normalizados para testes de isolamento ou bioensaio.

Suspensões fixadas em formalina de R. solanacearum Biovar 2 (estirpe NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) com 106 células por ml como controlos positivos para testes serológicos.

B.   Preparação de controlos positivos e negativos para os testes essenciais de rastreio PCR/IF e FISH

Preparar uma suspensão a partir do crescimento de uma cultura com 48 horas em meio basal SMSA de uma estirpe virulenta de R. solanacearum Biovar 2/raça 3 (por exemplo estirpe NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3 857) em tampão fosfato 10 mM, de modo a obter uma concentração de, aproximadamente, 2x108 ufc por ml. Esta é obtida, normalmente, com uma suspensão ligeiramente turva equivalente a uma densidade óptica de 0,15 a 600 nm.

Remover os cones dos hilos de 200 tubérculos colhidos de uma variedade de epiderme branca, isenta de R. solanacearum.

Processar os hilos como habitualmente e ressuspender o sedimento em 10 ml.

Preparar 10 microtubos esterilizados de 1,5 ml com 900 μl de sedimento ressuspenso.

Transferir 100 μl da suspensão de R. solanacearum para o primeiro microtubo. Agitar em vórtice.

Utilizar os cinco microtubos seguintes para efectuar uma série de cinco diluições decimais.

Os seis microtubos contaminados serão utilizados como controlos positivos. Os quatro microtubos não contaminados serão utilizados como controlos negativos. Rotular os microtubos em conformidade.

Preparar alíquotas de 100 μl em microtubos esterilizados de 1,5 ml, obtendo assim nove réplicas de cada amostra de controlo. Armazenar a uma temperatura compreendida entre –16 e –24 °C até à sua utilização.

A presença e a quantificação de R. solanacearum nas amostras de controlo deverão ser primeiro confirmadas por IF.

Para o teste PCR efectuar a extracção de ADN das amostras de controlo positivo e negativo para cada série de amostras a testar.

Para os testes IF e FISH efectuar ensaios nas amostras de controlo positivo e negativo para cada série de amostras a testar.

Para os testes IF, FISH e PCR, deverá detectar-se R. solanacearum, pelo menos, nas amostras de controlo positivo com 106 e 104 células por ml e não deverá ser detectada em nenhum controlo negativo.

Apêndice 4

Tampões para a realização dos testes

GERAL: Os tampões esterilizados não abertos podem ser armazenados durante 1 ano.

1.   Tampões para extracção

1.1.   Tampão de extracção (tampão fosfato 50 mM, pH 7,0)

Este tampão é utilizado para a extracção da bactéria dos tecidos vegetais por homogeneização ou agitação.

| Na2HPO4 (anidro) | 4,26 g |
| --- | --- |
| KH2PO4 | 2,72 g |
| Água destilada | 1,00 l |

Na2HPO4 (anidro)

4,26 g

KH2PO4

2,72 g

Água destilada

1,00 l

Dissolver os ingredientes, verificar o pH e esterilizar em autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

Os seguintes componentes adicionais podem também ser úteis:

| | Finalidade | Quantidade (por l) |
| --- | --- | --- |
| Flocos de Lubrol | Antifloculante (7) | 0,5 g |
| Antiespuma DC silicone | Antiespumante (7) | 1,0 ml |
| Pirofosfato tetrassódico | Antioxidante | 1,0 g |
| Polivinilpirrolidona-40 000 (PVP-40) | Complexante de inibidores da PCR | 50 g |

Finalidade

Quantidade (por l)

Flocos de Lubrol

Antifloculante (7)

0,5 g

Antiespuma DC silicone

Antiespumante (7)

1,0 ml

Pirofosfato tetrassódico

Antioxidante

1,0 g

Polivinilpirrolidona-40 000 (PVP-40)

Complexante de inibidores da PCR

50 g

1.2.   Tampão de ressuspensão (tampão fosfato 10 mM, pH 7,2)

Este tampão é utilizado para a ressuspensão e diluição dos extractos dos hilos do tubérculo da batateira após a sua concentração por centrifugação.

| Na2HPO4.12H2O | 2,7 g |
| --- | --- |
| NaH2PO4.2H2O | 0,4 g |
| Água destilada | 1,0 l |

Na2HPO4.12H2O

2,7 g

NaH2PO4.2H2O

0,4 g

Água destilada

1,0 l

Dissolver os ingredientes, verificar o pH e esterilizar em autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

2.   Tampões para o teste IF

2.1.   Tampão IF (tampão fosfato salino (PBS) 10 mM, pH 7,2)

Este tampão é utilizado para a diluição dos anticorpos.

| Na2HPO4.12H2O | 2,7 g |
| --- | --- |
| NaH2PO4.2H2O | 0,4 g |
| NaCL | 8,0 g |
| Água destilada | 1,0 l |

Na2HPO4.12H2O

2,7 g

NaH2PO4.2H2O

0,4 g

NaCL

8,0 g

Água destilada

1,0 l

Dissolver os ingredientes, verificar o pH e esterilizar em autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

2.2.   Tampão IF-Tween

Este tampão é utilizado para lavagem das lâminas.

Adicionar 0,1 % de Tween 20 ao tampão IF.

2.3.   Tampão fosfato com glicerol, pH 7,6

Este tampão é utilizado como líquido de montagem nos poços das lâminas de IF para aumentar a fluorescência.

| Na2HPO4.12H2O | 3,2 g |
| --- | --- |
| NaH2PO4.2H2O | 0,15 g |
| Glicerol | 50 ml |
| Água destilada | 100 ml |

Na2HPO4.12H2O

3,2 g

NaH2PO4.2H2O

0,15 g

Glicerol

50 ml

Água destilada

100 ml

Estão disponíveis no mercado soluções de montagem para evitar a rápida perda de fluorescência, como sejam, por exemplo, Vectashield® (Vector Laboratories) ou Citifluor® (Leica).

3.   Tampões para o teste ELISA indirecto

3.1.   Tampão de revestimento de dupla concentração, pH 9,6

| Na2CO3 | 6,36 g |
| --- | --- |
| NaHCO3 | 11,72 g |
| Água destilada | 1,00 l |

Na2CO3

6,36 g

NaHCO3

11,72 g

Água destilada

1,00 l

Dissolver os ingredientes, verificar o pH e esterilizar em autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

Pode ser acrescentado sulfito de sódio (0,2 %) como antioxidante, se for necessário para evitar a acumulação de compostos aromáticos oxidados.

3.2.   Tampão fosfato salino (PBS) 10x, pH 7,4

| NaCL | 80,0 g |
| --- | --- |
| KH2PO4 | 2,0 g |
| Na2HPO4.12H2O | 29,0 g |
| KCL | 2,0 g |
| Água destilada | 1,0 l |

NaCL

80,0 g

KH2PO4

2,0 g

Na2HPO4.12H2O

29,0 g

KCL

2,0 g

Água destilada

1,0 l

3.3.   PBS-Tween

| PBS 10x | 100 ml |
| --- | --- |
| Tween 20 a 10 % | 5 ml |
| Água destilada | 895 ml |

PBS 10x

100 ml

Tween 20 a 10 %

5 ml

Água destilada

895 ml

3.4.   Tampão de bloqueio (anticorpo) - deve ser preparado na altura da utilização

| PBS 10x | 10,0 ml |
| --- | --- |
| Polivinilpirrolidona-44000 (PVP-44) | 2,0 g |
| Tween 20 a 10 % | 0,5 ml |
| Leite em pó | 0,5 g |
| Água destilada | perfazer 100 ml |

PBS 10x

10,0 ml

Polivinilpirrolidona-44000 (PVP-44)

2,0 g

Tween 20 a 10 %

0,5 ml

Leite em pó

0,5 g

Água destilada

perfazer 100 ml

3.5.   Solução de substrato de fosfatase alcalina, pH 9,8

| Dietanolamina | 97 ml |
| --- | --- |
| Água destilada | 800 ml |

Dietanolamina

97 ml

Água destilada

800 ml

Misturar e acertar a pH 9,8 com HC1 concentrado.

Perfazer o volume até 1 1 com água destilada.

Juntar 0,2 g de MgCl2.

Dissolver duas pastilhas de 5 mg cada de substrato de fosfatase alcalina (Sigma) por cada 15 ml de solução.

4.   Tampões para o teste DASI ELISA

4.1.   Tampão de revestimento, pH 9,6

| Na2CO3 | 1,59 g |
| --- | --- |
| NaHCO3 | 2,93 g |
| Água destilada | 1 000 ml |

Na2CO3

1,59 g

NaHCO3

2,93 g

Água destilada

1 000 ml

Dissolver os ingredientes e verificar o pH 9,6.

4.2.   Tampão fosfato salino (PBS) 10x, pH 7,2-7,4

| NaCL | 80,0 g |
| --- | --- |
| NaH2PO4.2 H2O | 4,0 g |
| Na2HPO4.12H2O | 27,0 g |
| Água destilada | 1 000 ml |

NaCL

80,0 g

NaH2PO4.2 H2O

4,0 g

Na2HPO4.12H2O

27,0 g

Água destilada

1 000 ml

4.3.   PBS-Tween

| PBS 10x | 50 ml |
| --- | --- |
| Tween 20 a 10 % | 5 ml |
| Água destilada | 950 ml |

PBS 10x

50 ml

Tween 20 a 10 %

5 ml

Água destilada

950 ml

4.4.   Tampão de substrato, pH 9,8

| Dietanolamina | 100 ml |
| --- | --- |
| Água destilada | 900 ml |

Dietanolamina

100 ml

Água destilada

900 ml

Misturar e acertar a pH 9,8 com HC1 concentrado.

Apêndice 5

Determinação do nível de contaminação em testes IF e FISH

| 1. | Determinar o número médio de células fluorescentes típicas por campo de observação (c). |
| --- | --- |

1.

Determinar o número médio de células fluorescentes típicas por campo de observação (c).

| 2. | Calcular o número de células fluorescentes típicas por poço de lâmina de microscópio (C).
  C = c × S/s








  em que | S | = | área da superfície de cada poço da lâmina de multipoços |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| e | s | = | área da superfície do campo da objectiva |

2.

Calcular o número de células fluorescentes típicas por poço de lâmina de microscópio (C).

C = c × S/s

em que

S

=

área da superfície de cada poço da lâmina de multipoços

e

s

=

área da superfície do campo da objectiva

| s = πi2/4G2K2 | em que | i | = | coeficiente de campo (varia entre 8 e 24, dependendo do tipo de ocular) |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| | | K | = | coeficiente do tubo (1 ou 1,25) |
| | | G | = | ampliação da objectiva (100x, 40x, etc.) |

s = πi2/4G2K2

em que

i

=

coeficiente de campo (varia entre 8 e 24, dependendo do tipo de ocular)

K

=

coeficiente do tubo (1 ou 1,25)

G

=

ampliação da objectiva (100x, 40x, etc.)

| 3. | Calcular o número de células fluorescentes típicas por ml de sedimento ressuspenso (N).
  N = C × 1 000/y × F








  em que | y | = | volume de sedimento ressuspenso em cada poço |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| e | F | = | factor de diluição do sedimento ressuspenso. |

3.

Calcular o número de células fluorescentes típicas por ml de sedimento ressuspenso (N).

N = C × 1 000/y × F

em que

y

=

volume de sedimento ressuspenso em cada poço

e

F

=

factor de diluição do sedimento ressuspenso.

Apêndice 6

Protocolos e reagentes validados para PCR

Nota: Os testes preliminares deveriam permitir a detecção reprodutível de 103 a 104 células de R. solanacearum por ml de extracto de amostra.

Os testes preliminares não deveriam ainda revelar nenhum resultado falso positivo com um painel de estirpes bacterianas seleccionadas (ver apêndice 3).

1.   Protocolo PCR de Seal et al. (1993)

1.1.   Iniciadores

| Iniciador directo OLI-1 | 5’-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3’ |
| --- | --- |
| Iniciador inverso Y-2 | 5’-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3’ |

Iniciador directo OLI-1

5’-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3’

Iniciador inverso Y-2

5’-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3’

Tamanho esperado do fragmento amplificado do ADN-alvo de R. solanacearum = 288 bp

1.2.   Mistura de reacção da PCR

| Reagentes | Volume por reacção | Concentração final |
| --- | --- | --- |
| UPW esterilizada | 17,65 μl | |
| Tampão PCR (8) 10x (MgCl2 15 mM) | 2,5 μl | 1x (MgCl2 1,5 mM) |
| Mistura dNTP (20 mM) | 0,25 μl | 0,2 mM |
| Iniciador OLI-1 (20 μM) | 1,25 μl | 1μM |
| Iniciador Y-2 (20 μM) | 1,25 μl | 1μM |
| Taq Polimerase (5U/μl) (8) | 0,1 μl | 0,5 U |
| Volume da amostra | 2,0 μl | |
| Volume total: | 25 μl | |

Reagentes

Volume por reacção

Concentração final

UPW esterilizada

17,65 μl

Tampão PCR (8) 10x (MgCl2 15 mM)

2,5 μl

1x (MgCl2 1,5 mM)

Mistura dNTP (20 mM)

0,25 μl

0,2 mM

Iniciador OLI-1 (20 μM)

1,25 μl

1μM

Iniciador Y-2 (20 μM)

1,25 μl

1μM

Taq Polimerase (5U/μl) (8)

0,1 μl

0,5 U

Volume da amostra

2,0 μl

Volume total:

25 μl

1.3.   Condições de reacção da PCR

Correr o seguinte programa:

| 1 ciclo de: | i) | 2 minutos a 96 °C (desnaturação do ADN-alvo) |
| --- | --- | --- |
| 35 ciclos de: | ii) | 20 segundos a 94 °C (desnaturação do ADN-alvo) |
| | iii) | 20 segundos a 68 °C (emparelhamento dos iniciadores) |
| | iv) | 30 segundos a 72 °C (extensão da cópia) |
| 1 ciclo de: | v) | 10 minutos a 72 °C (extensão final) |
| | vi) | manter a uma temperatura de 4 °C |

1 ciclo de:

i)

2 minutos a 96 °C (desnaturação do ADN-alvo)

35 ciclos de:

ii)

20 segundos a 94 °C (desnaturação do ADN-alvo)

iii)

20 segundos a 68 °C (emparelhamento dos iniciadores)

iv)

30 segundos a 72 °C (extensão da cópia)

1 ciclo de:

v)

10 minutos a 72 °C (extensão final)

vi)

manter a uma temperatura de 4 °C

Nota: Este programa foi optimizado para utilização com um termociclador Perkin Elmer 9600. Para a utilização com outros modelos pode ser necessária a alteração da duração das fases dos ciclos ii), iii) e iv).

1.4.   Análise de restrição enzimática do fragmento amplificado

Os produtos da PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum produzem um polimorfismo dos fragmentos de restrição característico com a enzima Ava II após incubação a 37 °C.

2.   Protocolo PCR de Pastrik e Maiss (2000)

2.1.   Iniciadores

| Iniciador directo Ps-1 | 5’-agt cga acg gca gcg ggg g-3’ |
| --- | --- |
| Iniciador inverso Ps-2 | 5’-ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca-3’ |

Iniciador directo Ps-1

5’-agt cga acg gca gcg ggg g-3’

Iniciador inverso Ps-2

5’-ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca-3’

Tamanho esperado do fragmento amplificado de ADN-alvo de R. solanacearum = 553 bp.

2.2.   Mistura de reacção da PCR

| Reagentes | Volume por reacção | Concentração final |
| --- | --- | --- |
| UPW esterilizada | 16,025 μl | |
| Tampão PCR (9) 10x | 2,5 μl | 1x (MgCl2 1,5 mM) |
| BSA (fracção V) (10 %) | 0,25 μl | 0,1 % |
| Mistura d-NTP (20 mM) | 0,125 μl | 0,1 mM |
| Iniciador Ps-1 (10 μM) | 0,5 μl | 0,2 μM |
| Iniciador Ps-2 (10 μM) | 0,5 μl | 0,2 μM |
| Taq Polimerase (5U/μl) (9) | 0,1 μl | 0,5 U |
| Volume da amostra | 5,0 μl | |
| Volume total: | 25,0 μl | |
| Nota: Originalmente optimizado para termociclador MJ Research PTC 200 com Taq Polymerase da Gibco.
  Pode também utilizar-se AmpliTaq e tampão Perkin Elmer, com as mesmas concentrações. |

Reagentes

Volume por reacção

Concentração final

UPW esterilizada

16,025 μl

Tampão PCR (9) 10x

2,5 μl

1x (MgCl2 1,5 mM)

BSA (fracção V) (10 %)

0,25 μl

0,1 %

Mistura d-NTP (20 mM)

0,125 μl

0,1 mM

Iniciador Ps-1 (10 μM)

0,5 μl

0,2 μM

Iniciador Ps-2 (10 μM)

0,5 μl

0,2 μM

Taq Polimerase (5U/μl) (9)

0,1 μl

0,5 U

Volume da amostra

5,0 μl

Volume total:

25,0 μl

Nota: Originalmente optimizado para termociclador MJ Research PTC 200 com Taq Polymerase da Gibco.

Pode também utilizar-se AmpliTaq e tampão Perkin Elmer, com as mesmas concentrações.

2.3.   Condições de reacção da PCR

Correr o seguinte programa:

| 1 ciclo de: | i) | 5 minutos a 95 °C (desnaturação do ADN-alvo) |
| --- | --- | --- |
| 35 ciclos de: | ii) | 30 segundos a 95 °C (desnaturação do ADN-alvo) |
| | iii) | 30 a 68 °C (emparelhamento dos iniciadores) |
| | iv) | 45 segundos a 72 °C (extensão da cópia) |
| 1 ciclo de: | v) | 5 minutos a 72 °C (extensão final) |
| | vi) | manter a uma temperatura de 4 °C. |

1 ciclo de:

i)

5 minutos a 95 °C (desnaturação do ADN-alvo)

35 ciclos de:

ii)

30 segundos a 95 °C (desnaturação do ADN-alvo)

iii)

30 a 68 °C (emparelhamento dos iniciadores)

iv)

45 segundos a 72 °C (extensão da cópia)

1 ciclo de:

v)

5 minutos a 72 °C (extensão final)

vi)

manter a uma temperatura de 4 °C.

Nota: Este programa foi optimizado para utilização com um termociclador MJ Research PTC 200. Para a utilização com outros modelos pode ser necessária a alteração da duração das fases dos ciclos ii), iii) e iv).

2.4.   Análise de restrição enzimática do fragmento amplificado.

Os produtos da PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum produzem um polimorfismo do fragmento de restrição característico com a enzima Taq I após incubação a 65 °C durante 30 minutos. Os fragmentos de restrição obtidos de um fragmento específico de R. solanacearum têm tamanhos de 457 bp e 96 bp.

3.   Protocolo PCR Multiplex com controlo interno (Pastrik et al., 2002)

3.1.   Iniciadores

| Iniciador directo RS-1-F | 5’-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3’ |
| --- | --- |
| Iniciador inverso RS-1-R | 5’-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3’ |
| Iniciador directo NS-5-F | 5’-AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G-3’ |
| Iniciador inverso NS-6-R | 5’-GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC-3’ |

Iniciador directo RS-1-F

5’-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3’

Iniciador inverso RS-1-R

5’-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3’

Iniciador directo NS-5-F

5’-AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G-3’

Iniciador inverso NS-6-R

5’-GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC-3’

Tamanho esperado do fragmento amplificado de ADN-alvo de R. solanacearum = 718 bp (conjunto iniciador RS)

Tamanho esperado do fragmento amplificado do controlo interno da PCR de 18S rARN = 310 bp (conjunto iniciador NS).

3.2.   Mistura de reacção da PCR

| Reagentes | Volume por reacção | Concentração final |
| --- | --- | --- |
| UPW esterilizada | 12,625 μl | |
| Tampão PCR (10) 10x (MgCl2 15 mM) | 2,5 μl | 1x (MgCl2 1,5 mM) |
| BSA (fracção V) (10 %) | 0,25 μl | 0,1 % |
| Mistura d-NTP (20 mM) | 0,125 μl | 0,1 mM |
| Iniciador RS-1-F (10 μM) | 2,0 μl | 0,8 μM |
| Iniciador RS-1-R (10 μM) | 2,0 μl | 0,8 μM |
| Iniciador NS-5-F (10 μM) (11) | 0,15 μl | 0,06 μM |
| Iniciador NS-6-R (10 μM) (11) | 0,15 μl | 0,06 μM |
| Taq polimerase (5U/μl) (10) | 0,2 μl | 1,0 U |
| Volume da amostra | 5,0 μl | |
| Volume total: | 25,0 μl | |

Reagentes

Volume por reacção

Concentração final

UPW esterilizada

12,625 μl

Tampão PCR (10) 10x (MgCl2 15 mM)

2,5 μl

1x (MgCl2 1,5 mM)

BSA (fracção V) (10 %)

0,25 μl

0,1 %

Mistura d-NTP (20 mM)

0,125 μl

0,1 mM

Iniciador RS-1-F (10 μM)

2,0 μl

0,8 μM

Iniciador RS-1-R (10 μM)

2,0 μl

0,8 μM

Iniciador NS-5-F (10 μM) (11)

0,15 μl

0,06 μM

Iniciador NS-6-R (10 μM) (11)

0,15 μl

0,06 μM

Taq polimerase (5U/μl) (10)

0,2 μl

1,0 U

Volume da amostra

5,0 μl

Volume total:

25,0 μl

3.3.   Condições de reacção da PCR

Correr o seguinte programa:

| 1 ciclo de: | i) | 5 minutos a 95 °C (desnaturação do ADN-alvo) |
| --- | --- | --- |
| 35 ciclos de: | ii) | 30 segundos a 95 °C (desnaturação do ADN-alvo) |
| | iii) | 30 segundos a 58 °C (emparelhamento dos iniciadores) |
| | iv) | 45 segundos a 72 °C (extensão da cópia) |
| 1 ciclo de: | v) | 5 minutos a 72 °C (extensão final) |
| | vi) | manter a uma temperatura de 4 °C |

1 ciclo de:

i)

5 minutos a 95 °C (desnaturação do ADN-alvo)

35 ciclos de:

ii)

30 segundos a 95 °C (desnaturação do ADN-alvo)

iii)

30 segundos a 58 °C (emparelhamento dos iniciadores)

iv)

45 segundos a 72 °C (extensão da cópia)

1 ciclo de:

v)

5 minutos a 72 °C (extensão final)

vi)

manter a uma temperatura de 4 °C

Nota: Este programa foi optimizado para utilização com um termociclador MJ Research PTC 200. Para a utilização com outros modelos pode ser necessária a alteração da duração das fases dos ciclos ii), iii) e iv).

3.4.   Análise de restrição enzimática do fragmento amplificado

Os produtos da PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum produzem um polimorfismo do fragmento de restrição característico com a enzima Bsm I ou um isosquizómero (e.g. Mva 1269 I) após incubação a 65 °C durante 30 minutos.

4.   Protocolo PCR específico para os Biovares de R. solanacearum (Pastrik et al, 2001)

4.1.   Iniciadores

| Iniciador directo Rs-1-F | 5’-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3’ |
| --- | --- |
| Iniciador inverso Rs-1-R | 5’-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3’ |
| Iniciador inverso Rs-3-R | 5’-TTC ACG GCA AGA TCG CTC-3’ |

Iniciador directo Rs-1-F

5’-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3’

Iniciador inverso Rs-1-R

5’-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3’

Iniciador inverso Rs-3-R

5’-TTC ACG GCA AGA TCG CTC-3’

Tamanho esperado do fragmento amplificado de ADN-alvo de R. solanacearum:

com Rs-1-F/Rs-1-R = 718 bp

com Rs-1-F/Rs-3-R = 716 bp.

4.2.   Mistura de reacção da PCR

| a) | PCR específica para os Biovares 1 e 2







  Reagentes | Volume por reacção | Concentração final |
| --- | --- | --- | --- |
| UPW esterilizada | 12,925 μl | |
| tampão PCR (12) 10x | 2,5 μl | 1x (MgCl2 1,5 mM) |
| BSA (fracção V) (10 %) | 0,25 μl | 0,1 % |
| Mistura d-NTP (20 mM) | 0,125 μl | 0,1 mM |
| Iniciador Rs-1-F (10 μM) | 2 μl | 0,8 μM |
| Iniciador Rs-1-R (10 μM) | 2 μl | 0,8 μM |
| Taq polimerase (5U/μl) (12) | 0,2 μl | 1 U |
| Volume da amostra | 5,0 μl | |
| Volume total: | 25,0 μl | |

a)

PCR específica para os Biovares 1 e 2

Reagentes

Volume por reacção

Concentração final

UPW esterilizada

12,925 μl

tampão PCR (12) 10x

2,5 μl

1x (MgCl2 1,5 mM)

BSA (fracção V) (10 %)

0,25 μl

0,1 %

Mistura d-NTP (20 mM)

0,125 μl

0,1 mM

Iniciador Rs-1-F (10 μM)

2 μl

0,8 μM

Iniciador Rs-1-R (10 μM)

2 μl

0,8 μM

Taq polimerase (5U/μl) (12)

0,2 μl

1 U

Volume da amostra

5,0 μl

Volume total:

25,0 μl

| b) | PCR específica para os Biovares 3, 4 e 5







  Reagentes | Volume por reacção | Concentração final |
| --- | --- | --- | --- |
| UPW esterilizada | 14,925 μl | |
| Tampão PCR (13) 10x | 2,5 μl | 1x (MgCl2 1,5 mM) |
| BSA (fracção V) (10 %) | 0,25 μl | 0,1 % |
| Mistura d-NTP (20 mM) | 0,125 μl | 0,1 mM |
| Iniciador Rs-1-F (10 μM) | 1 μl | 0,4 μM |
| Iniciador Rs-3-R (10 μM) | 1 μl | 0,4 μM |
| Taq polimerase (5U/μl) (13) | 0,2 μl | 1 U |
| Volume da amostra | 5,0 μl | |
| Volume total: | 25,0 μl | |

b)

PCR específica para os Biovares 3, 4 e 5

Reagentes

Volume por reacção

Concentração final

UPW esterilizada

14,925 μl

Tampão PCR (13) 10x

2,5 μl

1x (MgCl2 1,5 mM)

BSA (fracção V) (10 %)

0,25 μl

0,1 %

Mistura d-NTP (20 mM)

0,125 μl

0,1 mM

Iniciador Rs-1-F (10 μM)

1 μl

0,4 μM

Iniciador Rs-3-R (10 μM)

1 μl

0,4 μM

Taq polimerase (5U/μl) (13)

0,2 μl

1 U

Volume da amostra

5,0 μl

Volume total:

25,0 μl

4.3.   Condições de reacção da PCR

Correr o seguinte programa para as reacções específicas dos Biovares 1/2 e 3/4/5:

| 1 ciclo de: | i) | 5 minutos a 95 °C (desnaturação do ADN-alvo) |
| --- | --- | --- |
| 35 ciclos de: | ii) | 30 segundos a 95 °C (desnaturação do ADN-alvo) |
| | iii) | 30 segundos a 58 °C (emparelhamento dos iniciadores) |
| | iv) | 45 segundos a 72 °C (extensão da cópia) |
| 1 ciclo de: | v) | 5 minutos a 72 °C (extensão final) |
| | vi) | manter a uma temperatura de 4 °C |

1 ciclo de:

i)

5 minutos a 95 °C (desnaturação do ADN-alvo)

35 ciclos de:

ii)

30 segundos a 95 °C (desnaturação do ADN-alvo)

iii)

30 segundos a 58 °C (emparelhamento dos iniciadores)

iv)

45 segundos a 72 °C (extensão da cópia)

1 ciclo de:

v)

5 minutos a 72 °C (extensão final)

vi)

manter a uma temperatura de 4 °C

Nota: Este programa foi optimizado para utilização com um termociclador MJ Research PTC 200. Para a utilização com outros modelos pode ser necessária a alteração da duração das fases dos ciclos ii), iii) e iv).

4.4.   Análise de restrição enzimática do fragmento amplificado

Os produtos da PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum utilizando os iniciadores Rs-1-F e Rs-1-R produzem um polimorfismo do fragmento de restrição característico com a enzima Bsm I ou um isosquizómero (por exemplo Mva 1269 I) após incubação a 65 °C durante 30 minutos. Os produtos da PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum utilizando os iniciadores Rs-1-F e Rs-3-R não apresentam locais de restrição.

5.   Preparação do tampão de carregamento

5.1.   Azul de bromofenol (solução concentrada a 10 %)

| Azul de bromofenol | 5 g |
| --- | --- |
| Água destilada (bidest) | 50 ml |

Azul de bromofenol

5 g

Água destilada (bidest)

50 ml

5.2.   Tampão de carregamento

| Glicerol (86 %) | 3,5 ml |
| --- | --- |
| Azul de bromofenol (5.1) | 300 μl |
| Água destilada (bidest) | 6,2 ml |

Glicerol (86 %)

3,5 ml

Azul de bromofenol (5.1)

300 μl

Água destilada (bidest)

6,2 ml

6.   Tampão de tris acetato EDTA (TAE) 10X, pH 8,0

| Tampão tris | 48,40 g |
| --- | --- |
| Ácido acético glacial | 11,42 ml |
| EDTA (sal dissódico) | 3,72 g |
| Água destilada | 1,00 l |

Tampão tris

48,40 g

Ácido acético glacial

11,42 ml

EDTA (sal dissódico)

3,72 g

Água destilada

1,00 l

Diluir até 1x antes de utilizar.

Também disponível comercialmente (por exemplo, Invitrogen ou equivalente).

Apêndice 7

Reagentes validados para o teste FISH

1.   Sondas

Sonda específica para R. solanacearum OLI-1-CY3: 5′-ggc agg tag caa gct acc ccc-3′

Sonda para eubactérias (não específica) EUB-338-FITC: 5′-gct gcc tcc cgt agg agt-3′

2.   Solução fixadora

[ATENÇÃO! O FIXADOR CONTÉM PARAFORMALDEÍDO, UM PRODUTO TÓXICO. UTILIZAR LUVAS E NÃO INALAR. É ACONSELHÁVEL TRABALHAR EM “HOTTE”]

| i) | Aquecer 9 ml de água de grau molecular [por exemplo água ultra pura (UPW)] a cerca de 60 °C e adicionar 0,4 g de paraformaldeído. O paraformaldeído dissolve-se após a adição de 5 gotas de NaOH 1N e a agitação com um agitador magnético. |
| --- | --- |

i)

Aquecer 9 ml de água de grau molecular [por exemplo água ultra pura (UPW)] a cerca de 60 °C e adicionar 0,4 g de paraformaldeído. O paraformaldeído dissolve-se após a adição de 5 gotas de NaOH 1N e a agitação com um agitador magnético.

| ii) | Ajustar o pH a 7,0 mediante adição de 1 ml de tampão fosfato 0,1 M (PB, pH 7,0) e 5 gotas de HCl 1N. Verificar o pH com papel indicador e ajustar, se necessário, com HCl ou NaOH. [ATENÇÃO! NÃO UTILIZAR UM MEDIDOR DE PH EM SOLUÇÕES CONTENDO PARAFORMALDEÍDO] |
| --- | --- |

ii)

Ajustar o pH a 7,0 mediante adição de 1 ml de tampão fosfato 0,1 M (PB, pH 7,0) e 5 gotas de HCl 1N. Verificar o pH com papel indicador e ajustar, se necessário, com HCl ou NaOH. [ATENÇÃO! NÃO UTILIZAR UM MEDIDOR DE PH EM SOLUÇÕES CONTENDO PARAFORMALDEÍDO]

| iii) | Filtrar a solução através de um filtro de membrana de 0,22 μm e manter ao abrigo da poeira a 4 °C até à sua utilização. |
| --- | --- |

iii)

Filtrar a solução através de um filtro de membrana de 0,22 μm e manter ao abrigo da poeira a 4 °C até à sua utilização.

3.   “Hybmix” 3x

| NaCl | 2,7 M |
| --- | --- |
| Tris-HCl | 60 mM (pH 7,4) |
| EDTA (esterilizado por filtração e autoclavado) | 15 mM |

NaCl

2,7 M

Tris-HCl

60 mM (pH 7,4)

EDTA (esterilizado por filtração e autoclavado)

15 mM

Diluir até 1x, conforme necessário.

4.   Solução de hibridação

| “Hybmix” 1x | |
| --- | --- |
| Dodecilsulfato de sódio (SDS) | 0,01 % |
| Formamida | 30 %, |
| Sonda EUB 338 | 5 ng/μl |
| Sonda OLI-1 ou OLI-2 | 5 ng/μl |

“Hybmix” 1x

Dodecilsulfato de sódio (SDS)

0,01 %

Formamida

30 %,

Sonda EUB 338

5 ng/μl

Sonda OLI-1 ou OLI-2

5 ng/μl

Preparar quantidades de solução de hibridação de acordo com os cálculos do quadro 1. Para cada lâmina (contendo 2 amostras diferentes em duplicado) são necessários 90 μl de solução de hibridação. IMPORTANTE: A FORMAMIDA É MUITO TÓXICA. USAR LUVAS E TOMAR AS MEDIDAS DE SEGURANÇA NECESSÁRIAS!

Quadro 1   Quantidades sugeridas para a preparação da solução de hibridação.

| Número de lâminas: | 1 | 4 | 6 | 8 | 10 |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| UPW esterilizada | 23,1 | 92,4 | 138,6 | 184,8 | 231,0 |
| Hybmix 3x | 30,0 | 120,0 | 180,0 | 240,0 | 300,0 |
| SDS 1 % | 0,9 | 3,6 | 5,4 | 7,2 | 9,0 |
| Formamida | 27,0 | 108,0 | 162,0 | 216,0 | 270,0 |
| Sonda EUB 338 (100 ng/μl) | 4,5 | 18,0 | 27,0 | 36,0 | 45,0 |
| Sonda OLI-1 ou OLI-2 (100 ng/μl) | 4,5 | 18,0 | 27,0 | 36,0 | 45,0 |
| Volume total (μl) | 90,0 | 360,0 | 540,0 | 720,0 | 900,0 |
| NB.: Armazenar todas as soluções contendo sondas fotossensíveis na obscuridade a uma temperatura de –20 °C.
  Proteger da exposição directa à luz solar ou eléctrica durante a utilização. |

Número de lâminas:

1

4

6

8

10

UPW esterilizada

23,1

92,4

138,6

184,8

231,0

Hybmix 3x

30,0

120,0

180,0

240,0

300,0

SDS 1 %

0,9

3,6

5,4

7,2

9,0

Formamida

27,0

108,0

162,0

216,0

270,0

Sonda EUB 338 (100 ng/μl)

4,5

18,0

27,0

36,0

45,0

Sonda OLI-1 ou OLI-2 (100 ng/μl)

4,5

18,0

27,0

36,0

45,0

Volume total (μl)

90,0

360,0

540,0

720,0

900,0

NB.: Armazenar todas as soluções contendo sondas fotossensíveis na obscuridade a uma temperatura de –20 °C.

Proteger da exposição directa à luz solar ou eléctrica durante a utilização.

5.   Tampão fosfato 0,1 M, pH 7,0

| Na2HPO4 | 8,52 g |
| --- | --- |
| KH2PO4 | 5,44 g |
| Água destilada | 1,00 l |

Na2HPO4

8,52 g

KH2PO4

5,44 g

Água destilada

1,00 l

Dissolver os ingredientes, verificar o pH e esterilizar em autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

Apêndice 8

Condições de Cultivo de beringela e tomateiro

Semear tomateiros (Lycopersicon esculentum) ou beringelas (Solanum melongena) em tabuleiros com substrato pasteurizado. O transplante das plântulas faz-se quando os cotilédones estão completamente expandidos (10 a 14 dias), para substrato de cultura pasteurizado.

As beringelas ou os tomateiros devem ser cultivados em estufa nas seguintes condições ambientais antes da inoculação:

| Fotoperíodo | 14 horas ou duração do dia natural se esta for superior; |
| --- | --- |
| Temperatura | diurna: 21 a 24 °C
  nocturna: 14 a 18 °C |
| Variedade de tomateiro susceptível | “Moneymaker” |
| Variedade de beringela susceptível | “Black Beauty” |
| Fornecedores: | ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main |

Fotoperíodo

14 horas ou duração do dia natural se esta for superior;

Temperatura

diurna: 21 a 24 °C

nocturna: 14 a 18 °C

Variedade de tomateiro susceptível

“Moneymaker”

Variedade de beringela susceptível

“Black Beauty”

Fornecedores:

ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

REFERÊNCIAS

| 1. | Amann, R.I., L. Krumholz and D.A. Stahl. 1990. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology. J. Bacteriol. 172: 762-770. |
| --- | --- |

1.

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| 2. | Anon. 1998. Council Directive 98/57/EC of 20 July 1998 on the control of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Official Journal of the European Communities L235, 1-39. |
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2.

Anon. 1998. Council Directive 98/57/EC of 20 July 1998 on the control of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Official Journal of the European Communities L235, 1-39.

| 3. | Boudazin, G., A.C. Le Roux, K. Josi, P. Labarre and B. Jouan. 1999. Design of division specific primers of Ralstonia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology 105; 373-380. |
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| 4. | Caruso, P., Gorris, M.T., Cambra, M., Palomo, J.L., Collar, J and Lopez, M.M. 2002. Enrichment Double-Antibody Sandwich Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal Antibody for sensitive Detection of Ralstonia solanacearum in Asymptomatic Potato Tubers. Applied and Environmental Microbiology, 68, 3634-3638. |
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Caruso, P., Gorris, M.T., Cambra, M., Palomo, J.L., Collar, J and Lopez, M.M. 2002. Enrichment Double-Antibody Sandwich Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal Antibody for sensitive Detection of Ralstonia solanacearum in Asymptomatic Potato Tubers. Applied and Environmental Microbiology, 68, 3634-3638.

| 5. | Cook, D., Barlow, E. and Sequeira, L. 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphisms with DNA probes that specify virulence and the hypersensitive response. Molecular Plant-Microbe Interactions 1:113-121. |
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| 6. | Elphinstone, J.G., Hennessy, J., Wilson, J.K. and Stead, D.E. 1996. Sensitivity of detection of Ralstonia solanacearum in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26; 663-678. |
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| 9. | Hayward, A.C., El-Nashaar, H.M., Nydegger, U. and De Lindo, L. 1990. Variation in nitrate metabolism in biovars of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 69; 269-280. |
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| 10. | Ito, S., Y. Ushijima, T. Fujii, S. Tanaka, M. Kameya-Iwaki, S. Yoshiwara and F. Kishi. 1998. Detection of viable cells of Ralstonia solanacearum in soil using a semi-selective medium and a PCR technique. J. Phytopathology 146; 379-384. |
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| 11. | Janse, J.D. (1988) A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 18, 343-351. |
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| 12. | Janse, J.D. 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacaerum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335-345. |
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| 13. | Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity of Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 44; 693-695. |
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Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity of Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 44; 693-695.

| 14. | Klement Z.; Rudolph, K and D.C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp. |
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| 15. | Lelliott, R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd., Oxford. 216 pp. |
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15.

Lelliott, R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd., Oxford. 216 pp.

| 16. | Lopez, M.M., Gorris, M.T., Llop, P., Cubero, J., Vicedo, B., Cambra, M., 1997. Selective enrichment improves selective isolation, serological and molecular detection of plant pathogenic bacteria. In: H.W. Dehne et al., (eds). Klewer Academic Publishers. pp. 117-121. |
| --- | --- |

16.

Lopez, M.M., Gorris, M.T., Llop, P., Cubero, J., Vicedo, B., Cambra, M., 1997. Selective enrichment improves selective isolation, serological and molecular detection of plant pathogenic bacteria. In: H.W. Dehne et al., (eds). Klewer Academic Publishers. pp. 117-121.

| 17. | Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1994. Specific genomic fingerprints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR. Applied and Environmental Microbiology, 60, 2286-2295. |
| --- | --- |

17.

Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1994. Specific genomic fingerprints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR. Applied and Environmental Microbiology, 60, 2286-2295.

| 18. | Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J. 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85; 528-536. |
| --- | --- |

18.

Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J. 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85; 528-536.

| 19. | Opina, N., F. Tavner, G. Holloway, J.-F Wang, T.-H Li, R. Maghirang, M. Fegan, A.C. Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W. Holloway, J.N. Timmis. 1997. A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 5; 19-33. |
| --- | --- |

19.

Opina, N., F. Tavner, G. Holloway, J.-F Wang, T.-H Li, R. Maghirang, M. Fegan, A.C. Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W. Holloway, J.N. Timmis. 1997. A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 5; 19-33.

| 20. | Pastrik, K.H. and Maiss, E. 2000. Detection of R. solanacearum in potato tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148; 619-626. |
| --- | --- |

20.

Pastrik, K.H. and Maiss, E. 2000. Detection of R. solanacearum in potato tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148; 619-626.

| 21. | Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831-842. |
| --- | --- |

21.

Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831-842.

| 22. | Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D. (1995) Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79. |
| --- | --- |

22.

Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D. (1995) Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79.

| 23. | Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. - 3. ed.; St. Paul, Minnesota: 373 pp. |
| --- | --- |

23.

Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. - 3. ed.; St. Paul, Minnesota: 373 pp.

| 24. | Seal, S.E., L.A. Jackson, J.P.W. Young, and M.J. Daniels. 1993. Detection of Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii and Blood Disease Bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. J. Gen. Microbiol. 139: 1587-1594. |
| --- | --- |

24.

Seal, S.E., L.A. Jackson, J.P.W. Young, and M.J. Daniels. 1993. Detection of Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii and Blood Disease Bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. J. Gen. Microbiol. 139: 1587-1594.

| 25. | Smith, J.J., Offord, L.C., Holderness, M. and Saddler, G.S. 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61; 4262-4268. |
| --- | --- |

25.

Smith, J.J., Offord, L.C., Holderness, M. and Saddler, G.S. 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61; 4262-4268.

| 26. | Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281-295. |
| --- | --- |

26.

Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281-295.

| 27. | Taghavi, M., Hayward, A.C., Sly, L.I., Fegan, M. 1996. Analysiss of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46; 10-15. |
| --- | --- |

27.

Taghavi, M., Hayward, A.C., Sly, L.I., Fegan, M. 1996. Analysiss of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46; 10-15.

| 28. | Van Der Wolf, J.M., Bonants, P.J.M., Smith, J.J., Hagenaar, M., Nijhuis, E., Van Beckhoven, J.R.C., Saddler, G.S., Trigalet, A., Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 in Western Europe as determined by AFLP, RC-PFGE and rep-PCR. In: Prior, P., Allen, C. and Elphinstone, J. (eds.) Bacterial wilt disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 44-49. |
| --- | --- |

28.

Van Der Wolf, J.M., Bonants, P.J.M., Smith, J.J., Hagenaar, M., Nijhuis, E., Van Beckhoven, J.R.C., Saddler, G.S., Trigalet, A., Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 in Western Europe as determined by AFLP, RC-PFGE and rep-PCR. In: Prior, P., Allen, C. and Elphinstone, J. (eds.) Bacterial wilt disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 44-49.

| 29. | Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., Stead, D.E. and Boonham, N. 1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an automated and quantitative flourogenic 5’ nuclease TaqMan assay. Applied and Environmental Microbiology 66; 2853-2858. |
| --- | --- |

29.

Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., Stead, D.E. and Boonham, N. 1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an automated and quantitative flourogenic 5’ nuclease TaqMan assay. Applied and Environmental Microbiology 66; 2853-2858.

| 30. | Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A.D.L. Akkermans. 1998. Detection of R. solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4546-4554. |
| --- | --- |

30.

Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A.D.L. Akkermans. 1998. Detection of R. solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4546-4554.

ANEXO III

| 1. | Sempre que, em caso de ocorrência suspeita, para os materiais vegetais da lista e para todos os outros casos, surja um resultado positivo no(s) teste(s) de rastreio efectuado(s) em conformidade com os métodos pertinentes constantes do anexo II, e se aguarde a confirmação ou refutação através da conclusão dos referidos métodos, deve-se proceder à retenção e conservação adequada de:






  — | todos os tubérculos e, sempre que possível, todas as plantas sujeitos a amostragem, |
| --- | --- | --- |

1.

Sempre que, em caso de ocorrência suspeita, para os materiais vegetais da lista e para todos os outros casos, surja um resultado positivo no(s) teste(s) de rastreio efectuado(s) em conformidade com os métodos pertinentes constantes do anexo II, e se aguarde a confirmação ou refutação através da conclusão dos referidos métodos, deve-se proceder à retenção e conservação adequada de:

—

todos os tubérculos e, sempre que possível, todas as plantas sujeitos a amostragem,

| — | qualquer extracto restante e outro material preparado para o(s) teste(s) de rastreio como, por exemplo, lâminas de imunofluorescência,
  e |
| --- | --- |

—

qualquer extracto restante e outro material preparado para o(s) teste(s) de rastreio como, por exemplo, lâminas de imunofluorescência,

e

| — | toda a documentação relevante, |
| --- | --- |

—

toda a documentação relevante,

até à conclusão dos referidos métodos.

A retenção dos tubérculos permitirá a realização, sempre que necessário, do teste de variedade.

| 2. | Em caso de confirmação da presença do organismo, deve proceder-se à retenção e à conservação adequada durante pelo menos um mês após a notificação nos termos do n.o 2 do artigo 5.o:






  — | do material referido no n.o 1, |
| --- | --- | --- |

2.

Em caso de confirmação da presença do organismo, deve proceder-se à retenção e à conservação adequada durante pelo menos um mês após a notificação nos termos do n.o 2 do artigo 5.o:

—

do material referido no n.o 1,

| — | de uma amostra do material contaminado de tomateiro ou de beringela inoculada com o extracto do tubérculo ou da planta, se for caso disso,
  e |
| --- | --- |

—

de uma amostra do material contaminado de tomateiro ou de beringela inoculada com o extracto do tubérculo ou da planta, se for caso disso,

e

| — | de uma cultura isolada do organismo. |
| --- | --- |

—

de uma cultura isolada do organismo.

ANEXO IV

Os elementos da investigação referida no n.o 1, alínea a), subalínea i), do artigo 5.o, deverão incluir, sempre que relevante:

| i) | Locais de produção:






  — | em que se cultive ou se tenha cultivado batata que tenha uma relação clonal com batata que se verificou estar infectada pelo organismo, |
| --- | --- | --- |

i)

Locais de produção:

—

em que se cultive ou se tenha cultivado batata que tenha uma relação clonal com batata que se verificou estar infectada pelo organismo,

| — | em que se cultive ou se tenha cultivado tomate da mesma origem que o tomate que se verificou estar infectado pelo organismo, |
| --- | --- |

—

em que se cultive ou se tenha cultivado tomate da mesma origem que o tomate que se verificou estar infectado pelo organismo,

| — | em que se cultive ou se tenha cultivado batata ou tomate que tenham sido colocados sob controlo oficial por se suspeitar da ocorrência do organismo, |
| --- | --- |

—

em que se cultive ou se tenha cultivado batata ou tomate que tenham sido colocados sob controlo oficial por se suspeitar da ocorrência do organismo,

| — | em que se cultive ou se tenha cultivado batata que tenha uma relação clonal com batata cultivada em locais de produção que se verificou estarem contaminados pelo organismo, |
| --- | --- |

—

em que se cultive ou se tenha cultivado batata que tenha uma relação clonal com batata cultivada em locais de produção que se verificou estarem contaminados pelo organismo,

| — | em que se cultive batata ou tomate e que estejam localizados na vizinhança de locais de produção contaminados pelo organismo, incluindo os locais de produção que partilhem entre si equipamentos e instalações de produção, directamente ou através de um contratante comum, |
| --- | --- |

—

em que se cultive batata ou tomate e que estejam localizados na vizinhança de locais de produção contaminados pelo organismo, incluindo os locais de produção que partilhem entre si equipamentos e instalações de produção, directamente ou através de um contratante comum,

| — | em que se utilizem, para irrigação ou aspersão, águas superficiais provenientes de qualquer ponto de água de que se suspeite ou esteja confirmada a contaminação pelo organismo, |
| --- | --- |

—

em que se utilizem, para irrigação ou aspersão, águas superficiais provenientes de qualquer ponto de água de que se suspeite ou esteja confirmada a contaminação pelo organismo,

| — | em que se utilizem, para irrigação ou aspersão, águas superficiais provenientes de um ponto de água partilhado com locais de produção de que se suspeite ou esteja confirmada a contaminação pelo organismo, |
| --- | --- |

—

em que se utilizem, para irrigação ou aspersão, águas superficiais provenientes de um ponto de água partilhado com locais de produção de que se suspeite ou esteja confirmada a contaminação pelo organismo,

| — | que estejam, ou tenham sido, inundados por águas superficiais de que se suspeite ou esteja confirmada a contaminação pelo organismo, |
| --- | --- |

—

que estejam, ou tenham sido, inundados por águas superficiais de que se suspeite ou esteja confirmada a contaminação pelo organismo,

e

| ii) | Águas superficiais utilizadas para irrigação ou aspersão do(s) campo(s) ou local(is) de produção de que esteja confirmada a contaminação pelo organismo, ou que tenham inundado os mesmos. |
| --- | --- |

ii)

Águas superficiais utilizadas para irrigação ou aspersão do(s) campo(s) ou local(is) de produção de que esteja confirmada a contaminação pelo organismo, ou que tenham inundado os mesmos.

ANEXO V

| 1. | Os elementos a considerar para determinar a extensão da contaminação provável nos termos do n.o 1, alínea a), subalínea iii), e alínea c), subalínea iii), do artigo 5.o deverão incluir:






  — | os materiais vegetais da lista cultivados num local de produção que tenha sido declarado contaminado ao abrigo do n.o 1, alínea a), subalínea ii), do artigo 5.o, |
| --- | --- | --- |

1.

Os elementos a considerar para determinar a extensão da contaminação provável nos termos do n.o 1, alínea a), subalínea iii), e alínea c), subalínea iii), do artigo 5.o deverão incluir:

—

os materiais vegetais da lista cultivados num local de produção que tenha sido declarado contaminado ao abrigo do n.o 1, alínea a), subalínea ii), do artigo 5.o,

| — | local(is) de produção com alguma relação de produção com os materiais vegetais da lista declarados contaminados ao abrigo do n.o 1, alínea a), subalínea ii), do artigo 5.o, incluindo os que partilham equipamentos e instalações de produção, directamente ou através de um contratante comum, |
| --- | --- |

—

local(is) de produção com alguma relação de produção com os materiais vegetais da lista declarados contaminados ao abrigo do n.o 1, alínea a), subalínea ii), do artigo 5.o, incluindo os que partilham equipamentos e instalações de produção, directamente ou através de um contratante comum,

| — | os materiais vegetais da lista produzidos no(s) local(is) de produção referido(s) no travessão anterior, ou que tenham estado presentes nesse(s) local(is) durante o período em que os materiais vegetais da lista declarados contaminados ao abrigo do n.o 1, alínea a), subalínea ii), do artigo 5.o se encontravam no local de produção referido no primeiro travessão, |
| --- | --- |

—

os materiais vegetais da lista produzidos no(s) local(is) de produção referido(s) no travessão anterior, ou que tenham estado presentes nesse(s) local(is) durante o período em que os materiais vegetais da lista declarados contaminados ao abrigo do n.o 1, alínea a), subalínea ii), do artigo 5.o se encontravam no local de produção referido no primeiro travessão,

| — | instalações nas quais se manuseiem os materiais vegetais da lista provenientes dos locais de produção referidos nos travessões anteriores, |
| --- | --- |

—

instalações nas quais se manuseiem os materiais vegetais da lista provenientes dos locais de produção referidos nos travessões anteriores,

| — | quaisquer máquinas, veículos, recipientes, armazéns ou respectivas partes e quaisquer outros objectos, incluindo material de embalagem, que possam ter estado em contacto com os materiais vegetais da lista declarados contaminados ao abrigo do n.o 1, alínea a), subalínea ii), do artigo 5.o, |
| --- | --- |

—

quaisquer máquinas, veículos, recipientes, armazéns ou respectivas partes e quaisquer outros objectos, incluindo material de embalagem, que possam ter estado em contacto com os materiais vegetais da lista declarados contaminados ao abrigo do n.o 1, alínea a), subalínea ii), do artigo 5.o,

| — | quaisquer materiais vegetais da lista que tenham estado armazenados em, ou em contacto com, qualquer das estruturas ou objectos referidos no travessão anterior, antes da limpeza e desinfecção dessas estruturas e objectos, |
| --- | --- |

—

quaisquer materiais vegetais da lista que tenham estado armazenados em, ou em contacto com, qualquer das estruturas ou objectos referidos no travessão anterior, antes da limpeza e desinfecção dessas estruturas e objectos,

| — | em resultado das investigações e testes referidos no n.o 1, alínea a), subalínea i), do artigo 5.o, no caso da batata, os tubérculos ou plantas que tenham uma relação clonal colateral ou parental e, no caso do tomate, as plantas que tenham a mesma origem que os materiais vegetais da lista declarados contaminados ao abrigo do n.o 1, alínea a), subalínea ii), do artigo 5.o e em relação aos quais, embora os testes se tenham revelado negativos no que diz respeito ao organismo, a contaminação se afigure provável através de uma ligação clonal. O teste de variedade pode ser efectuado no sentido de verificar a identidade dos tubérculos ou plantas contaminados que tenham uma relação clonal, |
| --- | --- |

—

em resultado das investigações e testes referidos no n.o 1, alínea a), subalínea i), do artigo 5.o, no caso da batata, os tubérculos ou plantas que tenham uma relação clonal colateral ou parental e, no caso do tomate, as plantas que tenham a mesma origem que os materiais vegetais da lista declarados contaminados ao abrigo do n.o 1, alínea a), subalínea ii), do artigo 5.o e em relação aos quais, embora os testes se tenham revelado negativos no que diz respeito ao organismo, a contaminação se afigure provável através de uma ligação clonal. O teste de variedade pode ser efectuado no sentido de verificar a identidade dos tubérculos ou plantas contaminados que tenham uma relação clonal,

| — | local(is) de produção dos materiais vegetais da lista referidos no travessão anterior, |
| --- | --- |

—

local(is) de produção dos materiais vegetais da lista referidos no travessão anterior,

| — | local(is) de produção dos materiais vegetais da lista que tenham usado, para irrigação ou aspersão, águas declaradas contaminadas ao abrigo do n.o 1, alínea c), subalínea ii), do artigo 5.o, |
| --- | --- |

—

local(is) de produção dos materiais vegetais da lista que tenham usado, para irrigação ou aspersão, águas declaradas contaminadas ao abrigo do n.o 1, alínea c), subalínea ii), do artigo 5.o,

| — | materiais vegetais da lista produzidos em campos inundados por águas superficiais de que esteja confirmada a contaminação. |
| --- | --- |

—

materiais vegetais da lista produzidos em campos inundados por águas superficiais de que esteja confirmada a contaminação.

| 2. | Os elementos a considerar para determinar a possível dispersão, ao abrigo do n.o 1, alínea a), subalínea iv), e alínea c), subalínea iii), do artigo 5.o, deverão incluir:






  i) | nos casos abrangidos pelo n.o 1, alínea a), subalínea iv), do artigo 5.o,






  — | a proximidade de outros locais de produção que cultivem materiais vegetais da lista, |
| --- | --- | --- | --- |

2.

Os elementos a considerar para determinar a possível dispersão, ao abrigo do n.o 1, alínea a), subalínea iv), e alínea c), subalínea iii), do artigo 5.o, deverão incluir:

i)

nos casos abrangidos pelo n.o 1, alínea a), subalínea iv), do artigo 5.o,

—

a proximidade de outros locais de produção que cultivem materiais vegetais da lista,

| — | a produção ou utilização comuns de lotes de batata de semente, |
| --- | --- |

—

a produção ou utilização comuns de lotes de batata de semente,

| — | os locais de produção que utilizem águas superficiais para irrigação ou aspersão dos materiais vegetais da lista, nos casos em que haja ou tenha havido risco de escorrência ou de inundação por essas águas a partir de locais de produção declarados contaminados ao abrigo do n.o 1, alínea a), subalínea ii), do artigo 5.o; |
| --- | --- |

—

os locais de produção que utilizem águas superficiais para irrigação ou aspersão dos materiais vegetais da lista, nos casos em que haja ou tenha havido risco de escorrência ou de inundação por essas águas a partir de locais de produção declarados contaminados ao abrigo do n.o 1, alínea a), subalínea ii), do artigo 5.o;

| ii) | nos casos em que as águas superficiais tenham sido declaradas contaminadas ao abrigo do n.o 1, alínea c), subalínea ii), do artigo 5.o:






  — | o(s) local(is) de produção em que sejam produzidos materiais vegetais da lista adjacente(s) a, ou que esteja(m) em perigo de ser inundado(s) por, águas superficiais declaradas contaminadas, |
| --- | --- | --- |

ii)

nos casos em que as águas superficiais tenham sido declaradas contaminadas ao abrigo do n.o 1, alínea c), subalínea ii), do artigo 5.o:

—

o(s) local(is) de produção em que sejam produzidos materiais vegetais da lista adjacente(s) a, ou que esteja(m) em perigo de ser inundado(s) por, águas superficiais declaradas contaminadas,

| — | qualquer bacia de irrigação distinta que esteja associada às águas superficiais declaradas contaminadas, |
| --- | --- |

—

qualquer bacia de irrigação distinta que esteja associada às águas superficiais declaradas contaminadas,

| — | massas de água ligadas às águas superficiais declaradas contaminadas, tendo em conta:






  — | a direcção e o caudal das águas declaradas contaminadas, |
| --- | --- | --- |

—

massas de água ligadas às águas superficiais declaradas contaminadas, tendo em conta:

—

a direcção e o caudal das águas declaradas contaminadas,

| — | a presença de plantas solanáceas silvestres hospedeiras. |
| --- | --- |

—

a presença de plantas solanáceas silvestres hospedeiras.

| 3. | A notificação a que se refere o n.o 2, primeiro parágrafo, do artigo 5.o conterá os seguintes dados:






  — | imediatamente após a presença do organismo ter sido confirmada por testes laboratoriais, com recurso aos métodos estabelecidos no anexo II, pelo menos:






  — | no caso da batata,






  a) | o nome da variedade do lote, |
| --- | --- | --- | --- | --- |

3.

A notificação a que se refere o n.o 2, primeiro parágrafo, do artigo 5.o conterá os seguintes dados:

—

imediatamente após a presença do organismo ter sido confirmada por testes laboratoriais, com recurso aos métodos estabelecidos no anexo II, pelo menos:

—

no caso da batata,

a)

o nome da variedade do lote,

| b) | o tipo (de consumo, de semente, etc.) e, sempre que aplicável, a categoria das sementes, |
| --- | --- |

b)

o tipo (de consumo, de semente, etc.) e, sempre que aplicável, a categoria das sementes,

| — | no caso das plantas de tomateiro, o nome da variedade do lote e, sempre que aplicável, a categoria, |
| --- | --- |

—

no caso das plantas de tomateiro, o nome da variedade do lote e, sempre que aplicável, a categoria,

| — | sem prejuízo da exigência de notificação dos casos de ocorrência suspeita prevista no n.o 3 do artigo 4.o, o Estado-Membro em que a ocorrência tenha sido confirmada deve, sempre que exista um risco de contaminação dos materiais vegetais da lista provenientes ou com destino a outro(s) Estado(s)-Membro(s), transmitir imediatamente ao(s) Estado(s)-Membro(s) em questão as informações que lhe(s) permitam cumprir o disposto no n.o 3 do artigo 5.o, tais como:






  a) | o nome da variedade do lote de batata ou tomate, |
| --- | --- | --- |

—

sem prejuízo da exigência de notificação dos casos de ocorrência suspeita prevista no n.o 3 do artigo 4.o, o Estado-Membro em que a ocorrência tenha sido confirmada deve, sempre que exista um risco de contaminação dos materiais vegetais da lista provenientes ou com destino a outro(s) Estado(s)-Membro(s), transmitir imediatamente ao(s) Estado(s)-Membro(s) em questão as informações que lhe(s) permitam cumprir o disposto no n.o 3 do artigo 5.o, tais como:

a)

o nome da variedade do lote de batata ou tomate,

| b) | o nome e o endereço do expedidor e do destinatário, |
| --- | --- |

b)

o nome e o endereço do expedidor e do destinatário,

| c) | a data da entrega do lote de batata ou tomate, |
| --- | --- |

c)

a data da entrega do lote de batata ou tomate,

| d) | a dimensão do lote de batata ou tomate entregue, |
| --- | --- |

d)

a dimensão do lote de batata ou tomate entregue,

| e) | uma cópia do passaporte fitossanitário ou, pelo menos, o número do passaporte fitossanitário, sempre que adequado, ou, se for o caso, o número de registo do produtor ou comerciante e uma cópia da nota de entrega. |
| --- | --- |

e)

uma cópia do passaporte fitossanitário ou, pelo menos, o número do passaporte fitossanitário, sempre que adequado, ou, se for o caso, o número de registo do produtor ou comerciante e uma cópia da nota de entrega.

A Comissão deve ser notificada imediatamente sempre que tal informação seja fornecida.

| 4. | A notificação adicional a que se refere o n.o 2, segundo parágrafo, do artigo 5.o conterá os seguintes dados:
  Para cada caso e após a conclusão de todas as investigações:






  a) | a data de confirmação da contaminação, |
| --- | --- | --- |

4.

A notificação adicional a que se refere o n.o 2, segundo parágrafo, do artigo 5.o conterá os seguintes dados:

Para cada caso e após a conclusão de todas as investigações:

a)

a data de confirmação da contaminação,

| b) | uma descrição sucinta da investigação efectuada para identificar a fonte e a possível propagação da contaminação, incluindo o nível da amostragem efectuada, |
| --- | --- |

b)

uma descrição sucinta da investigação efectuada para identificar a fonte e a possível propagação da contaminação, incluindo o nível da amostragem efectuada,

| c) | informação sobre a(s) fonte(s) de contaminação identificada(s) ou presumida(s), |
| --- | --- |

c)

informação sobre a(s) fonte(s) de contaminação identificada(s) ou presumida(s),

| d) | pormenores sobre a extensão da contaminação declarada, incluindo o número de locais de produção e, no caso da batata, o número de lotes, com a indicação da variedade e, caso se trate de batata para semente, da categoria, |
| --- | --- |

d)

pormenores sobre a extensão da contaminação declarada, incluindo o número de locais de produção e, no caso da batata, o número de lotes, com a indicação da variedade e, caso se trate de batata para semente, da categoria,

| e) | pormenores relativos à demarcação da zona, incluindo o número de locais de produção não declarados como contaminados mas incluídos na zona, |
| --- | --- |

e)

pormenores relativos à demarcação da zona, incluindo o número de locais de produção não declarados como contaminados mas incluídos na zona,

| f) | pormenores relativos às águas declaradas, incluindo o nome e a localização da massa de água e a extensão das águas declaradas/proibidas para irrigação, |
| --- | --- |

f)

pormenores relativos às águas declaradas, incluindo o nome e a localização da massa de água e a extensão das águas declaradas/proibidas para irrigação,

| g) | para qualquer remessa ou lote de plantas de tomateiro declarado contaminado, os certificados previstos no n.o 1, alínea ii), do artigo 13.o da Directiva 2000/29/CE e o número de passaporte, em conformidade com a lista incluída na parte A, secção 1, ponto 2.2, do anexo V da Directiva 2000/29/CE, |
| --- | --- |

g)

para qualquer remessa ou lote de plantas de tomateiro declarado contaminado, os certificados previstos no n.o 1, alínea ii), do artigo 13.o da Directiva 2000/29/CE e o número de passaporte, em conformidade com a lista incluída na parte A, secção 1, ponto 2.2, do anexo V da Directiva 2000/29/CE,

| h) | quaisquer outras informações relacionadas com o(s) surto(s) confirmado(s) que a Comissão venha a solicitar. |
| --- | --- |

h)

quaisquer outras informações relacionadas com o(s) surto(s) confirmado(s) que a Comissão venha a solicitar.

ANEXO VI

| 1. | As disposições a que se refere o n.o 1 do artigo 6.o consistirão:






  — | na utilização para a alimentação animal após tratamento térmico que garanta a impossibilidade de sobrevivência do organismo,
  ou |
| --- | --- | --- |

1.

As disposições a que se refere o n.o 1 do artigo 6.o consistirão:

—

na utilização para a alimentação animal após tratamento térmico que garanta a impossibilidade de sobrevivência do organismo,

ou

| — | na eliminação num local de eliminação de resíduos destinado especificamente a esse efeito e aprovado oficialmente em que não existam riscos identificáveis de fuga do organismo para o meio ambiente, por exemplo através da escorrência para terras agrícolas ou do contacto com pontos de água que possam ser utilizados para a irrigação de terras agrícolas,
  ou |
| --- | --- |

—

na eliminação num local de eliminação de resíduos destinado especificamente a esse efeito e aprovado oficialmente em que não existam riscos identificáveis de fuga do organismo para o meio ambiente, por exemplo através da escorrência para terras agrícolas ou do contacto com pontos de água que possam ser utilizados para a irrigação de terras agrícolas,

ou

| — | na incineração,
  ou |
| --- | --- |

—

na incineração,

ou

| — | na transformação industrial através de entrega directa e imediata a uma unidade de transformação com instalações de eliminação de resíduos oficialmente aprovadas, relativamente às quais se tenha concluído pela não existência de qualquer risco identificável de dispersão do organismo, e dotadas de um sistema de limpeza e desinfecção, pelo menos, dos veículos de transporte que saem da referida unidade,
  ou |
| --- | --- |

—

na transformação industrial através de entrega directa e imediata a uma unidade de transformação com instalações de eliminação de resíduos oficialmente aprovadas, relativamente às quais se tenha concluído pela não existência de qualquer risco identificável de dispersão do organismo, e dotadas de um sistema de limpeza e desinfecção, pelo menos, dos veículos de transporte que saem da referida unidade,

ou

| — | noutras medidas, desde que se tenha concluído que não existe qualquer risco identificável de dispersão do organismo; essas medidas, bem como a respectiva justificação, devem ser notificadas à Comissão e aos restantes Estados-Membros. |
| --- | --- |

—

noutras medidas, desde que se tenha concluído que não existe qualquer risco identificável de dispersão do organismo; essas medidas, bem como a respectiva justificação, devem ser notificadas à Comissão e aos restantes Estados-Membros.

Quaisquer resíduos remanescentes associados às opções acima indicadas e que resultem das mesmas serão eliminados por métodos oficialmente aprovados em conformidade com o anexo VII da presente directiva.

| 2. | A utilização ou eliminação adequada dos materiais vegetais da lista a que se refere o n.o 2 do artigo 6.o, sob controlo dos organismos oficiais responsáveis do(s) Estado(s)-Membro(s) em causa, com a devida comunicação entre organismos oficiais responsáveis para garantir esse controlo a todo o momento e a aprovação pelo organismo oficial responsável do Estado-Membro em que a batata irá ser embalada ou transformada no que diz respeito às instalações de eliminação de resíduos a que se referem os primeiro e segundo travessões, será:






  i) | Para os tubérculos de batata:






  — | utilização como batata de consumo, embalada para entrega e utilização directa sem mudança de embalagem, num local com instalações de eliminação de resíduos adequadas. As batatas destinadas à plantação apenas podem ser manuseadas no mesmo local se tal for feito separadamente ou após limpeza e desinfecção,
  ou |
| --- | --- | --- | --- |

2.

A utilização ou eliminação adequada dos materiais vegetais da lista a que se refere o n.o 2 do artigo 6.o, sob controlo dos organismos oficiais responsáveis do(s) Estado(s)-Membro(s) em causa, com a devida comunicação entre organismos oficiais responsáveis para garantir esse controlo a todo o momento e a aprovação pelo organismo oficial responsável do Estado-Membro em que a batata irá ser embalada ou transformada no que diz respeito às instalações de eliminação de resíduos a que se referem os primeiro e segundo travessões, será:

i)

Para os tubérculos de batata:

—

utilização como batata de consumo, embalada para entrega e utilização directa sem mudança de embalagem, num local com instalações de eliminação de resíduos adequadas. As batatas destinadas à plantação apenas podem ser manuseadas no mesmo local se tal for feito separadamente ou após limpeza e desinfecção,

ou

| — | utilização como batata de consumo para transformação industrial e destinada a entrega directa e imediata a uma unidade de transformação com instalações adequadas de eliminação de resíduos e um sistema de limpeza e desinfecção, pelo menos, dos veículos de transporte que saem da referida unidade,
  ou |
| --- | --- |

—

utilização como batata de consumo para transformação industrial e destinada a entrega directa e imediata a uma unidade de transformação com instalações adequadas de eliminação de resíduos e um sistema de limpeza e desinfecção, pelo menos, dos veículos de transporte que saem da referida unidade,

ou

| — | qualquer outra utilização ou forma de eliminação, desde que seja comprovado que não existe qualquer risco reconhecido de dispersão do organismo e sob reserva de aprovação pelos referidos organismos oficiais responsáveis; |
| --- | --- |

—

qualquer outra utilização ou forma de eliminação, desde que seja comprovado que não existe qualquer risco reconhecido de dispersão do organismo e sob reserva de aprovação pelos referidos organismos oficiais responsáveis;

| ii) | Para outras partes das plantas, incluindo resíduos de caules e folhas,






  — | destruição,
  ou |
| --- | --- | --- |

ii)

Para outras partes das plantas, incluindo resíduos de caules e folhas,

—

destruição,

ou

| — | qualquer outra utilização ou forma de eliminação, desde que seja comprovado que não existe qualquer risco reconhecido de dispersão do organismo, e sob reserva de aprovação pelos referidos organismos oficiais responsáveis. |
| --- | --- |

—

qualquer outra utilização ou forma de eliminação, desde que seja comprovado que não existe qualquer risco reconhecido de dispersão do organismo, e sob reserva de aprovação pelos referidos organismos oficiais responsáveis.

| 3. | Os métodos adequados para a descontaminação dos objectos referidos no n.o 3 do artigo 6.o serão a limpeza e, quando necessário, desinfecção, de forma a garantir que não existe qualquer risco reconhecido de dispersão do organismo. A sua aplicação terá lugar sob supervisão dos organismos oficiais responsáveis dos Estados-Membros. |
| --- | --- |

3.

Os métodos adequados para a descontaminação dos objectos referidos no n.o 3 do artigo 6.o serão a limpeza e, quando necessário, desinfecção, de forma a garantir que não existe qualquer risco reconhecido de dispersão do organismo. A sua aplicação terá lugar sob supervisão dos organismos oficiais responsáveis dos Estados-Membros.

| 4. | A série de medidas a aplicar pelos Estados-Membros na(s) zona(s) demarcada(s) ao abrigo do n.o 1, alínea a), subalínea iv), e alínea c), subalínea iii), do artigo 5.o, a que se refere o n.o 4 do artigo 6.o deverá incluir: |
| --- | --- |

4.

A série de medidas a aplicar pelos Estados-Membros na(s) zona(s) demarcada(s) ao abrigo do n.o 1, alínea a), subalínea iv), e alínea c), subalínea iii), do artigo 5.o, a que se refere o n.o 4 do artigo 6.o deverá incluir:

| 4.1. | Nos casos em que os locais de produção tenham sido declarados contaminados ao abrigo do n.o 1, alínea a), subalínea ii), do artigo 5.o:






  a) | Nos campos ou unidades de produção de culturas protegidas declarados contaminados ao abrigo do n.o 1, alínea a), subalínea ii), do artigo 5.o, será aplicada uma das seguintes opções:






  i) | Durante pelo menos os quatro períodos de cultura subsequentes à declaração de contaminação:






  — | serão tomadas medidas para eliminar as plantas espontâneas de batateira ou de tomateiro, bem como outras plantas hospedeiras do organismo, incluindo solanáceas infestantes,
  e |
| --- | --- | --- | --- | --- |

4.1.

Nos casos em que os locais de produção tenham sido declarados contaminados ao abrigo do n.o 1, alínea a), subalínea ii), do artigo 5.o:

a)

Nos campos ou unidades de produção de culturas protegidas declarados contaminados ao abrigo do n.o 1, alínea a), subalínea ii), do artigo 5.o, será aplicada uma das seguintes opções:

i)

Durante pelo menos os quatro períodos de cultura subsequentes à declaração de contaminação:

—

serão tomadas medidas para eliminar as plantas espontâneas de batateira ou de tomateiro, bem como outras plantas hospedeiras do organismo, incluindo solanáceas infestantes,

e

| — | não poderão ser plantados:






  — | tubérculos, plantas nem sementes verdadeiras de batateira, |
| --- | --- | --- |

—

não poderão ser plantados:

—

tubérculos, plantas nem sementes verdadeiras de batateira,

| — | sementes nem plantas de tomateiro, |
| --- | --- |

—

sementes nem plantas de tomateiro,

| — | tendo em conta a biologia do organismo: |
| --- | --- |

—

tendo em conta a biologia do organismo:

| — | outras plantas hospedeiras, |
| --- | --- |

—

outras plantas hospedeiras,

| — | plantas de espécies do género Brassica para as quais exista um risco reconhecido de sobrevivência do organismo, |
| --- | --- |

—

plantas de espécies do género Brassica para as quais exista um risco reconhecido de sobrevivência do organismo,

| — | culturas para as quais exista um risco reconhecido de dispersão do organismo; |
| --- | --- |

—

culturas para as quais exista um risco reconhecido de dispersão do organismo;

| — | na primeira época de colheita de batata ou tomate subsequente ao período especificado no travessão anterior, e sob condição de o campo ter sido considerado livre de plantas espontâneas de batateira ou de tomateiro e de outras plantas hospedeiras, incluindo solanáceas infestantes, durante inspecções oficiais em, pelo menos, dois períodos de cultura consecutivos anteriores à plantação:






  — | no caso da batata, apenas será permitida a produção de batata para consumo, |
| --- | --- | --- |

—

na primeira época de colheita de batata ou tomate subsequente ao período especificado no travessão anterior, e sob condição de o campo ter sido considerado livre de plantas espontâneas de batateira ou de tomateiro e de outras plantas hospedeiras, incluindo solanáceas infestantes, durante inspecções oficiais em, pelo menos, dois períodos de cultura consecutivos anteriores à plantação:

—

no caso da batata, apenas será permitida a produção de batata para consumo,

| — | no caso da batata e do tomate, os tubérculos de batata colhidos ou as plantas de tomateiro, conforme adequado, deverão ser testados em conformidade com o procedimento referido no anexo II; |
| --- | --- |

—

no caso da batata e do tomate, os tubérculos de batata colhidos ou as plantas de tomateiro, conforme adequado, deverão ser testados em conformidade com o procedimento referido no anexo II;

| — | na época de colheita de batata ou de tomate seguinte à referida no travessão anterior e após um ciclo de rotação adequado, que será de dois anos, no mínimo, se se pretender cultivar batata de semente, será efectuada uma prospecção oficial nos termos do n.o 1 do artigo 2.o; |
| --- | --- |

—

na época de colheita de batata ou de tomate seguinte à referida no travessão anterior e após um ciclo de rotação adequado, que será de dois anos, no mínimo, se se pretender cultivar batata de semente, será efectuada uma prospecção oficial nos termos do n.o 1 do artigo 2.o;

ou

| ii) | Durante os cinco anos de cultura subsequentes ao da declaração de contaminação,






  — | serão tomadas medidas para eliminar as plantas espontâneas de batateira ou de tomateiro, bem como outras plantas hospedeiras naturais do organismo, incluindo solanáceas infestantes,
  e |
| --- | --- | --- |

ii)

Durante os cinco anos de cultura subsequentes ao da declaração de contaminação,

—

serão tomadas medidas para eliminar as plantas espontâneas de batateira ou de tomateiro, bem como outras plantas hospedeiras naturais do organismo, incluindo solanáceas infestantes,

e

| — | o campo será tratado e mantido, durante os primeiros três anos, em pousio completo ou plantado com cereais de acordo com o risco reconhecido, ou como pastagem permanente, com frequentes cortes ou com pastorícia intensiva, ou plantado com gramíneas destinadas à produção de semente, a que se seguirão dois anos em que serão plantadas plantas que não sejam hospedeiras do organismo e para as quais não exista um risco reconhecido de sobrevivência ou dispersão do organismo, |
| --- | --- |

—

o campo será tratado e mantido, durante os primeiros três anos, em pousio completo ou plantado com cereais de acordo com o risco reconhecido, ou como pastagem permanente, com frequentes cortes ou com pastorícia intensiva, ou plantado com gramíneas destinadas à produção de semente, a que se seguirão dois anos em que serão plantadas plantas que não sejam hospedeiras do organismo e para as quais não exista um risco reconhecido de sobrevivência ou dispersão do organismo,

| — | na primeira época de colheita de batata ou tomate subsequente ao período especificado no travessão anterior, e sob condição de o campo ter sido considerado livre de plantas espontâneas de batateira ou de tomateiro e de outras plantas hospedeiras do organismo, incluindo solanáceas infestantes, durante inspecções oficiais, pelo menos nos dois anos de cultura consecutivos anteriores à plantação,






  — | no caso da batata, será permitida a produção de batata de semente ou de batata para consumo, |
| --- | --- | --- |

—

na primeira época de colheita de batata ou tomate subsequente ao período especificado no travessão anterior, e sob condição de o campo ter sido considerado livre de plantas espontâneas de batateira ou de tomateiro e de outras plantas hospedeiras do organismo, incluindo solanáceas infestantes, durante inspecções oficiais, pelo menos nos dois anos de cultura consecutivos anteriores à plantação,

—

no caso da batata, será permitida a produção de batata de semente ou de batata para consumo,

| — | os tubérculos de batata colhidos ou as plantas de tomateiro, conforme adequado, deverão ser testados em conformidade com o procedimento referido no anexo II; |
| --- | --- |

—

os tubérculos de batata colhidos ou as plantas de tomateiro, conforme adequado, deverão ser testados em conformidade com o procedimento referido no anexo II;

| b) | Em todos os restantes campos do local de produção contaminado e sob condição de os organismos oficiais responsáveis obterem a garantia de que foi eliminado o risco de aparecimento de plantas espontâneas de batateira e de tomateiro e de outras plantas hospedeiras naturais do organismo incluindo solanáceas infestantes, quando apropriado:






  — | no ano de cultura subsequente ao da declaração de contaminação,






  — | não serão plantados tubérculos, plantas ou sementes verdadeiras de batateira nem qualquer outra planta que possa constituir um hospedeiro do organismo,
  ou |
| --- | --- | --- | --- |

b)

Em todos os restantes campos do local de produção contaminado e sob condição de os organismos oficiais responsáveis obterem a garantia de que foi eliminado o risco de aparecimento de plantas espontâneas de batateira e de tomateiro e de outras plantas hospedeiras naturais do organismo incluindo solanáceas infestantes, quando apropriado:

—

no ano de cultura subsequente ao da declaração de contaminação,

—

não serão plantados tubérculos, plantas ou sementes verdadeiras de batateira nem qualquer outra planta que possa constituir um hospedeiro do organismo,

ou

| — | no caso de tubérculos de batata, só poderão ser plantados tubérculos de batata de semente certificada, unicamente para produção de bata de consumo, |
| --- | --- |

—

no caso de tubérculos de batata, só poderão ser plantados tubérculos de batata de semente certificada, unicamente para produção de bata de consumo,

| — | no caso de plantas de tomateiro, só poderão ser plantadas, unicamente para produção de tomate, plantas de tomateiro obtidas de sementes que cumpram as exigências da Directiva 2000/29/CE; |
| --- | --- |

—

no caso de plantas de tomateiro, só poderão ser plantadas, unicamente para produção de tomate, plantas de tomateiro obtidas de sementes que cumpram as exigências da Directiva 2000/29/CE;

| — | no segundo ano de cultura subsequente ao da declaração de contaminação,






  — | no caso da batata, só serão plantadas, para produção de batata de semente ou para consumo, batatas de semente certificadas ou oficialmente testadas para determinar a ausência do mal murcho e cultivadas sob controlo oficial em locais de produção à excepção dos enumerados em 4.1, |
| --- | --- | --- |

—

no segundo ano de cultura subsequente ao da declaração de contaminação,

—

no caso da batata, só serão plantadas, para produção de batata de semente ou para consumo, batatas de semente certificadas ou oficialmente testadas para determinar a ausência do mal murcho e cultivadas sob controlo oficial em locais de produção à excepção dos enumerados em 4.1,

| — | no caso do tomate, só serão plantadas, para produção de plantas ou de tomate, plantas de tomateiro obtidas de sementes que cumpram as exigências da Directiva 2000/29/CE ou, no caso de propagação vegetativa, de plantas de tomateiro produzidas a partir dessas sementes e cultivadas sob controlo oficial em locais de produção à excepção dos enumerados em 4.1; |
| --- | --- |

—

no caso do tomate, só serão plantadas, para produção de plantas ou de tomate, plantas de tomateiro obtidas de sementes que cumpram as exigências da Directiva 2000/29/CE ou, no caso de propagação vegetativa, de plantas de tomateiro produzidas a partir dessas sementes e cultivadas sob controlo oficial em locais de produção à excepção dos enumerados em 4.1;

| — | pelo menos no terceiro ano de cultura subsequente ao da declaração de contaminação,






  — | no caso da batata, só serão plantadas, para produção de batata de semente ou batata de consumo, batatas de semente certificadas ou produzidas, sob controlo oficial, a partir de batatas de semente certificadas, |
| --- | --- | --- |

—

pelo menos no terceiro ano de cultura subsequente ao da declaração de contaminação,

—

no caso da batata, só serão plantadas, para produção de batata de semente ou batata de consumo, batatas de semente certificadas ou produzidas, sob controlo oficial, a partir de batatas de semente certificadas,

| — | no caso do tomate, só poderão ser plantadas, para produção de plantas ou de tomate, plantas de tomateiro obtidas de sementes que cumpram as exigências da Directiva 2000/29/CE ou plantas de tomateiro produzidas sob controlo oficial a partir dessas plantas; |
| --- | --- |

—

no caso do tomate, só poderão ser plantadas, para produção de plantas ou de tomate, plantas de tomateiro obtidas de sementes que cumpram as exigências da Directiva 2000/29/CE ou plantas de tomateiro produzidas sob controlo oficial a partir dessas plantas;

| — | em cada um dos anos de cultivo referidos nos travessões anteriores serão tomadas medidas para eliminar as plantas espontâneas de batateira e outras plantas hospedeiras naturais do organismo, caso estejam presentes, e proceder-se-á, em alturas apropriadas, a uma inspecção oficial da cultura em desenvolvimento e, em cada campo de cultivo de batata, ao teste oficial das batatas colhidas, em conformidade com o procedimento estabelecido no anexo II; |
| --- | --- |

—

em cada um dos anos de cultivo referidos nos travessões anteriores serão tomadas medidas para eliminar as plantas espontâneas de batateira e outras plantas hospedeiras naturais do organismo, caso estejam presentes, e proceder-se-á, em alturas apropriadas, a uma inspecção oficial da cultura em desenvolvimento e, em cada campo de cultivo de batata, ao teste oficial das batatas colhidas, em conformidade com o procedimento estabelecido no anexo II;

| c) | Imediatamente após a declaração de contaminação ao abrigo do n.o 1, alínea a), subalínea ii), do artigo 5.o, e após o primeiro ano de cultura subsequente:






  — | todas as máquinas e instalações de armazenamento do local de produção que estejam envolvidas na produção de batata ou tomate devem ser limpas e, quando necessário, desinfectadas através de métodos apropriados conforme especificado no ponto 3, |
| --- | --- | --- |

c)

Imediatamente após a declaração de contaminação ao abrigo do n.o 1, alínea a), subalínea ii), do artigo 5.o, e após o primeiro ano de cultura subsequente:

—

todas as máquinas e instalações de armazenamento do local de produção que estejam envolvidas na produção de batata ou tomate devem ser limpas e, quando necessário, desinfectadas através de métodos apropriados conforme especificado no ponto 3,

| — | serão estabelecidos, quando necessário, controlos oficiais dos programas de irrigação e aspersão, que poderão conduzir à sua proibição, para evitar a dispersão do organismo; |
| --- | --- |

—

serão estabelecidos, quando necessário, controlos oficiais dos programas de irrigação e aspersão, que poderão conduzir à sua proibição, para evitar a dispersão do organismo;

| d) | Numa unidade de produção de culturas protegidas declarada contaminada ao abrigo do n.o 1, alínea a), subalínea ii), do artigo 5.o, nos casos em que seja possível a total substituição do meio de cultura,






  — | não serão plantados tubérculos nem plantas ou sementes verdadeiras de batateira, nem nenhuma outra planta hospedeira do organismo, incluindo plantas e sementes de tomateiro, a não ser quando a unidade de produção tiver sido sujeita, sob supervisão oficial, a medidas destinadas a eliminar o organismo e a remover todo o material vegetal hospedeiro, incluindo, no mínimo, a renovação completa do meio de cultura e a limpeza e, quando necessário, desinfecção da unidade e de todo o equipamento, e quando os organismos oficiais responsáveis tiverem concedido a sua aprovação para fins de produção de batata ou de tomate,
  e |
| --- | --- | --- |

d)

Numa unidade de produção de culturas protegidas declarada contaminada ao abrigo do n.o 1, alínea a), subalínea ii), do artigo 5.o, nos casos em que seja possível a total substituição do meio de cultura,

—

não serão plantados tubérculos nem plantas ou sementes verdadeiras de batateira, nem nenhuma outra planta hospedeira do organismo, incluindo plantas e sementes de tomateiro, a não ser quando a unidade de produção tiver sido sujeita, sob supervisão oficial, a medidas destinadas a eliminar o organismo e a remover todo o material vegetal hospedeiro, incluindo, no mínimo, a renovação completa do meio de cultura e a limpeza e, quando necessário, desinfecção da unidade e de todo o equipamento, e quando os organismos oficiais responsáveis tiverem concedido a sua aprovação para fins de produção de batata ou de tomate,

e

| — | para a produção de batata, apenas serão utilizadas batatas de semente certificadas ou minitubérculos ou microplantas provenientes de origens testadas, |
| --- | --- |

—

para a produção de batata, apenas serão utilizadas batatas de semente certificadas ou minitubérculos ou microplantas provenientes de origens testadas,

| — | para a produção de tomate, apenas serão utilizadas sementes que cumpram as exigências da Directiva 2000/29/CE ou, no caso de propagação vegetativa, plantas de tomateiro obtidas a partir dessas sementes e cultivadas sob controlo oficial, |
| --- | --- |

—

para a produção de tomate, apenas serão utilizadas sementes que cumpram as exigências da Directiva 2000/29/CE ou, no caso de propagação vegetativa, plantas de tomateiro obtidas a partir dessas sementes e cultivadas sob controlo oficial,

| — | serão estabelecidos, quando necessário, controlos oficiais dos programas de irrigação e aspersão, que poderão conduzir à sua proibição, para evitar a dispersão do organismo. |
| --- | --- |

—

serão estabelecidos, quando necessário, controlos oficiais dos programas de irrigação e aspersão, que poderão conduzir à sua proibição, para evitar a dispersão do organismo.

| 4.2. | Dentro da zona demarcada, sem prejuízo das medidas definidas no ponto 4.1, os Estados-Membros deverão:






  a) | Imediatamente após a declaração de contaminação, assegurar a limpeza e desinfecção, consoante for apropriado, de toda a maquinaria e armazéns das referidas instalações que estejam envolvidos na produção de batata ou tomate, utilizando métodos adequados, tal como disposto no ponto 3; |
| --- | --- | --- |

4.2.

Dentro da zona demarcada, sem prejuízo das medidas definidas no ponto 4.1, os Estados-Membros deverão:

a)

Imediatamente após a declaração de contaminação, assegurar a limpeza e desinfecção, consoante for apropriado, de toda a maquinaria e armazéns das referidas instalações que estejam envolvidos na produção de batata ou tomate, utilizando métodos adequados, tal como disposto no ponto 3;

| b) | Imediatamente, e pelo menos durante os três anos de cultura subsequentes à declaração de contaminação:






  ba) | Nos casos em que a zona tenha sido demarcada ao abrigo do n.o 1, alínea a), subalínea iv), do artigo 5.o,






  — | garantir, através dos seus organismos oficiais responsáveis, o controlo das instalações em que se cultivem, armazenem ou manuseiem tubérculos de batata ou tomate, e também das instalações em que sejam utilizadas máquinas destinadas à produção de batata ou tomate sob contrato, |
| --- | --- | --- | --- |

b)

Imediatamente, e pelo menos durante os três anos de cultura subsequentes à declaração de contaminação:

ba)

Nos casos em que a zona tenha sido demarcada ao abrigo do n.o 1, alínea a), subalínea iv), do artigo 5.o,

—

garantir, através dos seus organismos oficiais responsáveis, o controlo das instalações em que se cultivem, armazenem ou manuseiem tubérculos de batata ou tomate, e também das instalações em que sejam utilizadas máquinas destinadas à produção de batata ou tomate sob contrato,

| — | exigir, para todas as culturas de batata da zona, que só sejam plantadas batatas de semente certificadas ou sementes cultivadas sob controlo oficial, e que sejam analisadas após colheita as culturas de batata de semente efectuadas em locais de produção declarados como provavelmente contaminados nos termos do n.o 1, alínea a), subalínea iii), do artigo 5.o, |
| --- | --- |

—

exigir, para todas as culturas de batata da zona, que só sejam plantadas batatas de semente certificadas ou sementes cultivadas sob controlo oficial, e que sejam analisadas após colheita as culturas de batata de semente efectuadas em locais de produção declarados como provavelmente contaminados nos termos do n.o 1, alínea a), subalínea iii), do artigo 5.o,

| — | exigir que os lotes de batata de semente e de batata para consumo colhidos na zona sejam manuseados separadamente ou a intervenção de um sistema de limpeza e, quando necessário, desinfecção entre o manuseamento de lotes de bata de semente e de consumo, |
| --- | --- |

—

exigir que os lotes de batata de semente e de batata para consumo colhidos na zona sejam manuseados separadamente ou a intervenção de um sistema de limpeza e, quando necessário, desinfecção entre o manuseamento de lotes de bata de semente e de consumo,

| — | exigir, para todas as culturas de tomate da zona, que só sejam plantadas plantas de tomateiro obtidas a partir de sementes que cumpram as exigências da Directiva 2000/29/CE ou, no caso de propagação vegetativa, de plantas de tomateiro produzidas a partir dessas sementes e cultivadas sob controlo oficial, |
| --- | --- |

—

exigir, para todas as culturas de tomate da zona, que só sejam plantadas plantas de tomateiro obtidas a partir de sementes que cumpram as exigências da Directiva 2000/29/CE ou, no caso de propagação vegetativa, de plantas de tomateiro produzidas a partir dessas sementes e cultivadas sob controlo oficial,

| — | realizar uma prospecção oficial, nos termos do n.o 1 do artigo 2.o; |
| --- | --- |

—

realizar uma prospecção oficial, nos termos do n.o 1 do artigo 2.o;

| bb) | Nos casos em que as águas superficiais tenham sido declaradas contaminadas ao abrigo do n.o 1, alínea c), subalínea ii), do artigo 5.o, ou incluídas entre os elementos que eventualmente possam contribuir para a dispersão do organismo, nos termos do ponto 2 do anexo V,






  — | realizar, nas alturas apropriadas, uma prospecção anual, incluindo uma amostragem das águas superficiais e, quando necessário, de solanáceas hospedeiras que se encontrem junto dos pontos de água e, para os materiais vegetais da lista e noutros casos, a realização de testes de acordo com os métodos pertinentes previstos no anexo II, |
| --- | --- | --- |

bb)

Nos casos em que as águas superficiais tenham sido declaradas contaminadas ao abrigo do n.o 1, alínea c), subalínea ii), do artigo 5.o, ou incluídas entre os elementos que eventualmente possam contribuir para a dispersão do organismo, nos termos do ponto 2 do anexo V,

—

realizar, nas alturas apropriadas, uma prospecção anual, incluindo uma amostragem das águas superficiais e, quando necessário, de solanáceas hospedeiras que se encontrem junto dos pontos de água e, para os materiais vegetais da lista e noutros casos, a realização de testes de acordo com os métodos pertinentes previstos no anexo II,

| — | estabelecer controlos oficiais dos programas de irrigação e aspersão, incluindo a proibição de utilização das águas declaradas contaminadas para irrigação ou aspersão dos materiais vegetais da lista e, quando necessário, de outras plantas hospedeiras, para evitar a dispersão do organismo. Essa proibição poderá ser objecto de uma revisão com base nos resultados da citada prospecção anual e as declarações revogadas, sob condição de os organismos oficiais responsáveis obterem a garantia de que as águas superficiais já não se encontram contaminadas. A utilização das águas sujeitas a proibição poderá ser permitida, mediante controlo oficial, para irrigação ou aspersão de plantas hospedeiras, nos casos em que haja recurso a técnicas oficialmente aprovadas para eliminação do organismo e prevenção da sua dispersão, |
| --- | --- |

—

estabelecer controlos oficiais dos programas de irrigação e aspersão, incluindo a proibição de utilização das águas declaradas contaminadas para irrigação ou aspersão dos materiais vegetais da lista e, quando necessário, de outras plantas hospedeiras, para evitar a dispersão do organismo. Essa proibição poderá ser objecto de uma revisão com base nos resultados da citada prospecção anual e as declarações revogadas, sob condição de os organismos oficiais responsáveis obterem a garantia de que as águas superficiais já não se encontram contaminadas. A utilização das águas sujeitas a proibição poderá ser permitida, mediante controlo oficial, para irrigação ou aspersão de plantas hospedeiras, nos casos em que haja recurso a técnicas oficialmente aprovadas para eliminação do organismo e prevenção da sua dispersão,

| — | nos casos em que haja contaminação de descargas de resíduos líquidos, estabelecer controlos oficiais da eliminação de descargas de resíduos sólidos ou líquidos provenientes de instalações de transformação industrial ou de embalagem que manuseiem materiais vegetais da lista; |
| --- | --- |

—

nos casos em que haja contaminação de descargas de resíduos líquidos, estabelecer controlos oficiais da eliminação de descargas de resíduos sólidos ou líquidos provenientes de instalações de transformação industrial ou de embalagem que manuseiem materiais vegetais da lista;

| c) | Estabelecer, quando necessário, um programa de substituição de todos os lotes de batata de semente ao longo de um período de tempo adequado. |
| --- | --- |

c)

Estabelecer, quando necessário, um programa de substituição de todos os lotes de batata de semente ao longo de um período de tempo adequado.

ANEXO VII

Os métodos de eliminação de resíduos oficialmente aprovados a que se refere o ponto 1 do anexo VI deverão obedecer às seguintes disposições, por forma a obviar a quaisquer riscos identificáveis de propagação do organismo:

| i) | Os resíduos de batata e tomate (incluindo cascas de batata e batatas e tomates rejeitados) e qualquer outro resíduo sólido associado à batata e ao tomate (incluindo terra, pedras e outros detritos) serão sujeitos a:






  — | eliminação num local de eliminação de resíduos destinado especificamente a esse efeito e aprovado oficialmente em que não existam riscos identificáveis de fuga do organismo para o meio ambiente, por exemplo através da escorrência para terras agrícolas ou de contacto com pontos de água que possam ser utilizados para a irrigação de terras agrícolas. Os resíduos serão directamente transportados para esses locais em condições de confinamento de forma a que não exista risco de perda de resíduos,
  ou |
| --- | --- | --- |

i)

Os resíduos de batata e tomate (incluindo cascas de batata e batatas e tomates rejeitados) e qualquer outro resíduo sólido associado à batata e ao tomate (incluindo terra, pedras e outros detritos) serão sujeitos a:

—

eliminação num local de eliminação de resíduos destinado especificamente a esse efeito e aprovado oficialmente em que não existam riscos identificáveis de fuga do organismo para o meio ambiente, por exemplo através da escorrência para terras agrícolas ou de contacto com pontos de água que possam ser utilizados para a irrigação de terras agrícolas. Os resíduos serão directamente transportados para esses locais em condições de confinamento de forma a que não exista risco de perda de resíduos,

ou

| — | incineração,
  ou |
| --- | --- |

—

incineração,

ou

| — | outras medidas, desde que se tenha concluído que não existe qualquer risco identificável de dispersão do organismo; essas medidas devem ser notificadas à Comissão e aos demais Estados-Membros. |
| --- | --- |

—

outras medidas, desde que se tenha concluído que não existe qualquer risco identificável de dispersão do organismo; essas medidas devem ser notificadas à Comissão e aos demais Estados-Membros.

| ii) | Resíduos líquidos: antes de serem eliminados, os resíduos líquidos que contenham sólidos em suspensão serão sujeitos a processos de filtração ou decantação para remoção dos mesmos. Os sólidos removidos serão eliminados em conformidade com a alínea i).
  Os resíduos líquidos serão depois:






  — | aquecidos a, no mínimo, 60 °C em todo o seu volume durante pelo menos 30 minutos antes de serem eliminados,
  ou |
| --- | --- | --- |

ii)

Resíduos líquidos: antes de serem eliminados, os resíduos líquidos que contenham sólidos em suspensão serão sujeitos a processos de filtração ou decantação para remoção dos mesmos. Os sólidos removidos serão eliminados em conformidade com a alínea i).

Os resíduos líquidos serão depois:

—

aquecidos a, no mínimo, 60 °C em todo o seu volume durante pelo menos 30 minutos antes de serem eliminados,

ou

| — | eliminados de outro modo, sujeito a aprovação e controlo oficial, de forma a que não exista qualquer risco identificável de que os resíduos venham a entrar em contacto com terras agrícolas ou com pontos de água que possam ser utilizados para a irrigação de terras agrícolas. Os pormenores relativos a esse método serão notificados aos restantes Estados-Membros e à Comissão. |
| --- | --- |

—

eliminados de outro modo, sujeito a aprovação e controlo oficial, de forma a que não exista qualquer risco identificável de que os resíduos venham a entrar em contacto com terras agrícolas ou com pontos de água que possam ser utilizados para a irrigação de terras agrícolas. Os pormenores relativos a esse método serão notificados aos restantes Estados-Membros e à Comissão.

As opções descritas no presente anexo são igualmente aplicáveis aos resíduos associados ao manuseamento, à eliminação e à transformação de lotes contaminados.

---

(1)  Ver Lelliott e Stead (1987).

1

(2)  Cientistas de contacto: ver sítio web
  http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

2

web

http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

(3)  Utilizar como estirpe de referência normalizada de R. solanacearum Biovar 2 (raça 3).

3

R. solanacearum

(4)  Estirpe que pode produzir uma reacção cruzada em testes serológicos (IF e/ou ELISA) com anti-soros policlonais.

4

(5)  Estirpe a partir da qual, nalguns laboratórios, o produto da PCR pode ser amplificado com um tamanho idêntico ao esperado utilizando iniciadores específicos OLI-1 e Y-2 (ver apêndice 6).

5

(6)  Susceptível de provocar reacções cruzadas na maior parte dos testes, mas apenas é conhecida a sua ocorrência em bananeira na Indonésia.

6

(7)  Para utilização com o método de extracção por homogeneização.

7

(8)  O método foi validado utilizando Taq polimerase da Perkin Elmer (AmpliTaq) e Gibco BRL.

8

Taq

(9)  O método foi validado utilizando Taq polimerase da Perkin Elmer (AmpliTaq) e Gibco BRL.

9

Taq

Nota: Originalmente optimizado para termociclador MJ Research PTC 200 com Taq Polymerase da Gibco.

Nota:

Taq

Pode também utilizar-se AmpliTaq e tampão Perkin Elmer, com as mesmas concentrações.

(10)  O método foi validado utilizando Taq polimerase da Perkin Elmer (AmpliTaq) e Gibco BRL.

10

Taq

(11)  A concentração de iniciadores NS-5-F e NS-6-R foi optimizada para a extracção da bactéria a partir dos cones dos hilos da batateira, utilizando o método de homogeneização bem como o de purificação do ADN de acordo com Pastrik (2000) (ver parte A, ponto 6.1, alínea a), da secção VI). Será necessária a re-optimização das concentrações do reagente se se utilizar a extracção por agitação ou outros métodos de isolamento do ADN.

11

(12)  O método foi validado utilizando Taq polimerase da Perkin Elmer (AmpliTaq) e Gibco BRL.

12

Taq

(13)  O método foi validado utilizando Taq polimerase da Perkin Elmer (AmpliTaq) e Gibco BRL.

13

Taq

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| 27.7.2006 | PT | Jornal Oficial da União Europeia | L 206/107 |
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27.7.2006

PT

Jornal Oficial da União Europeia

L 206/107

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DIRECTIVA 2006/64/CE DA COMISSÃO

de 18 de Julho de 2006

que altera a Directiva 91/414/CEE do Conselho com o objectivo de incluir as substâncias activas clopiralide, ciprodinil, fosetil e trinexapace

(Texto relevante para efeitos do EEE)

A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,

Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Europeia,

Tendo em conta a Directiva 91/414/CEE do Conselho, de 15 de Julho de 1991, relativa à colocação dos produtos fitofarmacêuticos no mercado (1), nomeadamente o n.o 1 do artigo 6.o,

Considerando o seguinte:

| (1) | Os Regulamentos (CE) n.o 451/2000 (2) e (CE) n.o 703/2001 (3) da Comissão estabelecem normas de execução para a segunda fase do programa de trabalho referido no n.o 2 do artigo 8.o da Directiva 91/414/CEE e estabelecem uma lista de substâncias activas a avaliar, com vista à possível inclusão das mesmas no anexo I da Directiva 91/414/CEE. Esta lista inclui as substâncias activas clopiralide, ciprodinil, fosetil e trinexapace. |
| --- | --- |

(1)

Os Regulamentos (CE) n.o 451/2000 (2) e (CE) n.o 703/2001 (3) da Comissão estabelecem normas de execução para a segunda fase do programa de trabalho referido no n.o 2 do artigo 8.o da Directiva 91/414/CEE e estabelecem uma lista de substâncias activas a avaliar, com vista à possível inclusão das mesmas no anexo I da Directiva 91/414/CEE. Esta lista inclui as substâncias activas clopiralide, ciprodinil, fosetil e trinexapace.

| (2) | Os efeitos destas substâncias activas na saúde humana e no ambiente foram avaliados em conformidade com o disposto nos Regulamentos (CE) n.o 451/2000 e (CE) n.o 703/2001 no que respeita a uma certa gama de utilizações, proposta pelo notificador. Por outro lado, estes regulamentos designam os Estados-Membros relatores que devem apresentar os respectivos relatórios de avaliação e recomendações à Autoridade Europeia para a Segurança dos Alimentos (AESA), em conformidade com o n.o 1 do artigo 8.o do Regulamento (CE) n.o 451/2000. No respeitante ao clopiralide, a Finlândia foi designada Estado-Membro relator, tendo apresentado todas as informações devidas em 2 de Dezembro de 2003. Para o ciprodinil e o fosetil, o Estado-Membro relator foi a França, tendo todas as informações pertinentes sido apresentadas em 16 de Janeiro de 2004 e 20 de Outubro de 2003, respectivamente. Os Países Baixos foram designados Estado-Membro relator para o trinexapace e todas as informações pertinentes foram apresentadas em 7 de Novembro de 2003. |
| --- | --- |

(2)

Os efeitos destas substâncias activas na saúde humana e no ambiente foram avaliados em conformidade com o disposto nos Regulamentos (CE) n.o 451/2000 e (CE) n.o 703/2001 no que respeita a uma certa gama de utilizações, proposta pelo notificador. Por outro lado, estes regulamentos designam os Estados-Membros relatores que devem apresentar os respectivos relatórios de avaliação e recomendações à Autoridade Europeia para a Segurança dos Alimentos (AESA), em conformidade com o n.o 1 do artigo 8.o do Regulamento (CE) n.o 451/2000. No respeitante ao clopiralide, a Finlândia foi designada Estado-Membro relator, tendo apresentado todas as informações devidas em 2 de Dezembro de 2003. Para o ciprodinil e o fosetil, o Estado-Membro relator foi a França, tendo todas as informações pertinentes sido apresentadas em 16 de Janeiro de 2004 e 20 de Outubro de 2003, respectivamente. Os Países Baixos foram designados Estado-Membro relator para o trinexapace e todas as informações pertinentes foram apresentadas em 7 de Novembro de 2003.

| (3) | Os relatórios de avaliação foram revistos por peritos avaliadores dos Estados-Membros e da AESA e foram apresentados à Comissão em 14 de Dezembro de 2005, no formato de relatórios científicos da AESA sobre o clopiralide, o ciprodinil, o fosetil e o trinexapace (4). Estes relatórios foram revistos pelos Estados-Membros e pela Comissão no âmbito do Comité Permanente da Cadeia Alimentar e da Saúde Animal e concluídos, em 4 de Abril de 2006, no formato de relatórios de revisão da Comissão sobre o clopiralide, o ciprodinil, o fosetil e o trinexapace. |
| --- | --- |

(3)

Os relatórios de avaliação foram revistos por peritos avaliadores dos Estados-Membros e da AESA e foram apresentados à Comissão em 14 de Dezembro de 2005, no formato de relatórios científicos da AESA sobre o clopiralide, o ciprodinil, o fosetil e o trinexapace (4). Estes relatórios foram revistos pelos Estados-Membros e pela Comissão no âmbito do Comité Permanente da Cadeia Alimentar e da Saúde Animal e concluídos, em 4 de Abril de 2006, no formato de relatórios de revisão da Comissão sobre o clopiralide, o ciprodinil, o fosetil e o trinexapace.

| (4) | Os diversos exames efectuados permitiram concluir poder presumir-se que os produtos fitofarmacêuticos que contêm clopiralide, ciprodinil, fosetil ou trinexapace satisfazem, em geral, as condições definidas nas alíneas a) e b) do n.o 1 do artigo 5.o da Directiva 91/414/CEE, designadamente no que respeita às utilizações examinadas e detalhadas nos relatórios de revisão da Comissão. É, portanto, adequado incluir as substâncias activas em causa no anexo I, para assegurar que, em cada Estado-Membro, as autorizações de produtos fitofarmacêuticos que as contenham possam ser concedidas em conformidade com o disposto na referida directiva. |
| --- | --- |

(4)

Os diversos exames efectuados permitiram concluir poder presumir-se que os produtos fitofarmacêuticos que contêm clopiralide, ciprodinil, fosetil ou trinexapace satisfazem, em geral, as condições definidas nas alíneas a) e b) do n.o 1 do artigo 5.o da Directiva 91/414/CEE, designadamente no que respeita às utilizações examinadas e detalhadas nos relatórios de revisão da Comissão. É, portanto, adequado incluir as substâncias activas em causa no anexo I, para assegurar que, em cada Estado-Membro, as autorizações de produtos fitofarmacêuticos que as contenham possam ser concedidas em conformidade com o disposto na referida directiva.

| (5) | Sem prejuízo dessa conclusão, é adequado obter informações suplementares relativamente a determinados pontos específicos sobre o clopiralide, o ciprodinil e o fosetil. O n.o 1 do artigo 6.o da Directiva 91/414/CEE determina que a inclusão de uma substância no anexo I pode estar sujeita a condições. Assim, é adequado exigir que o clopiralide, o ciprodinil e o fosetil sejam submetidos a testes suplementares para confirmação da avaliação dos riscos no que respeita a alguns aspectos, cabendo aos notificadores apresentar esses estudos. |
| --- | --- |

(5)

Sem prejuízo dessa conclusão, é adequado obter informações suplementares relativamente a determinados pontos específicos sobre o clopiralide, o ciprodinil e o fosetil. O n.o 1 do artigo 6.o da Directiva 91/414/CEE determina que a inclusão de uma substância no anexo I pode estar sujeita a condições. Assim, é adequado exigir que o clopiralide, o ciprodinil e o fosetil sejam submetidos a testes suplementares para confirmação da avaliação dos riscos no que respeita a alguns aspectos, cabendo aos notificadores apresentar esses estudos.

| (6) | Deve prever-se um prazo razoável antes da inclusão de uma substância activa no anexo I para que os Estados-Membros e as partes interessadas possam preparar-se para cumprir os novos requisitos daí resultantes. |
| --- | --- |

(6)

Deve prever-se um prazo razoável antes da inclusão de uma substância activa no anexo I para que os Estados-Membros e as partes interessadas possam preparar-se para cumprir os novos requisitos daí resultantes.

| (7) | Sem prejuízo das obrigações definidas pela Directiva 91/414/CEE em consequência da inclusão de uma substância activa no anexo I, os Estados-Membros devem dispor de um período de seis meses após a inclusão para rever as autorizações existentes de produtos fitofarmacêuticos que contenham clopiralide, ciprodinil, fosetil ou trinexapace, a fim de garantir o respeito das exigências previstas na Directiva 91/414/CEE, nomeadamente no artigo 13.o, e as condições aplicáveis estabelecidas no anexo I. Os Estados-Membros devem alterar, substituir ou retirar, consoante o caso, as autorizações existentes, em conformidade com o disposto na Directiva 91/414/CEE. Em derrogação ao prazo mencionado, deve ser previsto um período mais longo para a apresentação e avaliação do processo completo, previsto no anexo III, de cada produto fitofarmacêutico para cada utilização prevista, em conformidade com os princípios uniformes enunciados na Directiva 91/414/CEE. |
| --- | --- |

(7)

Sem prejuízo das obrigações definidas pela Directiva 91/414/CEE em consequência da inclusão de uma substância activa no anexo I, os Estados-Membros devem dispor de um período de seis meses após a inclusão para rever as autorizações existentes de produtos fitofarmacêuticos que contenham clopiralide, ciprodinil, fosetil ou trinexapace, a fim de garantir o respeito das exigências previstas na Directiva 91/414/CEE, nomeadamente no artigo 13.o, e as condições aplicáveis estabelecidas no anexo I. Os Estados-Membros devem alterar, substituir ou retirar, consoante o caso, as autorizações existentes, em conformidade com o disposto na Directiva 91/414/CEE. Em derrogação ao prazo mencionado, deve ser previsto um período mais longo para a apresentação e avaliação do processo completo, previsto no anexo III, de cada produto fitofarmacêutico para cada utilização prevista, em conformidade com os princípios uniformes enunciados na Directiva 91/414/CEE.

| (8) | A experiência adquirida com as anteriores inclusões no anexo I da Directiva 91/414/CEE de substâncias activas avaliadas no âmbito do Regulamento (CEE) n.o 3600/92 da Comissão (5) mostrou que podem surgir dificuldades com a interpretação das obrigações dos titulares das autorizações existentes no que respeita ao acesso aos dados. Assim, para evitar mais dificuldades, importa clarificar as obrigações dos Estados-Membros, especialmente a de verificar se o titular de uma autorização demonstra ter acesso a um processo que cumpre as exigências do anexo II daquela directiva. Contudo, esta clarificação não impõe, nem aos Estados-Membros nem aos titulares de autorizações, mais obrigações do que as previstas nas directivas adoptadas até agora que alteram o anexo I. |
| --- | --- |

(8)

A experiência adquirida com as anteriores inclusões no anexo I da Directiva 91/414/CEE de substâncias activas avaliadas no âmbito do Regulamento (CEE) n.o 3600/92 da Comissão (5) mostrou que podem surgir dificuldades com a interpretação das obrigações dos titulares das autorizações existentes no que respeita ao acesso aos dados. Assim, para evitar mais dificuldades, importa clarificar as obrigações dos Estados-Membros, especialmente a de verificar se o titular de uma autorização demonstra ter acesso a um processo que cumpre as exigências do anexo II daquela directiva. Contudo, esta clarificação não impõe, nem aos Estados-Membros nem aos titulares de autorizações, mais obrigações do que as previstas nas directivas adoptadas até agora que alteram o anexo I.

| (9) | Por conseguinte, a Directiva 91/414/CEE deve ser alterada em conformidade. |
| --- | --- |

(9)

Por conseguinte, a Directiva 91/414/CEE deve ser alterada em conformidade.

| (10) | As medidas previstas na presente directiva estão em conformidade com o parecer do Comité Permanente da Cadeia Alimentar e da Saúde Animal, |
| --- | --- |

(10)

As medidas previstas na presente directiva estão em conformidade com o parecer do Comité Permanente da Cadeia Alimentar e da Saúde Animal,

ADOPTOU A PRESENTE DIRECTIVA:

Artigo 1.o

O anexo I da Directiva 91/414/CEE é alterado nos termos do anexo da presente directiva.

Artigo 2.o

Os Estados-Membros devem adoptar e publicar, até 31 de Outubro de 2007, as disposições legislativas, regulamentares e administrativas necessárias para dar cumprimento à presente directiva. Os Estados-Membros devem comunicar imediatamente à Comissão o texto das referidas disposições bem como um quadro de correspondência entre essas disposições e a presente directiva.

Os Estados-Membros devem aplicar as referidas disposições a partir de 1 de Novembro de 2007.

As disposições adoptadas pelos Estados-Membros devem fazer referência à presente directiva ou ser acompanhadas da referida referência aquando da sua publicação oficial. As modalidades dessa referência incumbem aos Estados-Membros.

Artigo 3.o

1.   Em conformidade com a Directiva 91/414/CEE, até 31 de Outubro de 2007, os Estados-Membros devem alterar ou retirar, se necessário, as autorizações existentes de produtos fitofarmacêuticos que contenham as substâncias activas clopiralide, ciprodinil, fosetil ou trinexapace.

Até essa data, devem verificar, em especial, o cumprimento das condições do anexo I dessa directiva respeitantes ao clopiralide, ciprodinil, fosetil ou trinexapace, com excepção das identificadas na parte B da entrada relativa a essa substância activa, e que o titular da autorização detém ou tem acesso a um processo que cumpra os requisitos do anexo II da directiva, em conformidade com as condições do artigo 13.o da mesma.

2.   Em derrogação ao n.o 1, os Estados-Membros devem reavaliar cada produto fitofarmacêutico autorizado que contenha clopiralide, ciprodinil, fosetil ou trinexapace como única substância activa ou acompanhado de outras substâncias activas, todas elas incluídas no anexo I da Directiva 91/414/CEE, até 30 de Abril de 2007, em conformidade com os princípios uniformes estabelecidos no anexo VI da Directiva 91/414/CEE, com base num processo que cumpra os requisitos do anexo III da mesma directiva e tendo em conta a parte B da entrada do seu anexo I respeitante ao clopiralide, ao ciprodinil, ao fosetil ou ao trinexapace. Com base nessa avaliação, os Estados-Membros devem determinar se o produto satisfaz as condições estabelecidas nas alíneas b), c), d) e e) do n.o 1 do artigo 4.o da Directiva 91/414/CEE.

Na sequência dessa determinação, os Estados-Membros:

| a) | No caso de um produto que contenha clopiralide, ciprodinil, fosetil ou trinexapace como única substância activa, devem, se necessário, alterar ou retirar a autorização até 30 de Abril de 2011;
  ou |
| --- | --- |

a)

No caso de um produto que contenha clopiralide, ciprodinil, fosetil ou trinexapace como única substância activa, devem, se necessário, alterar ou retirar a autorização até 30 de Abril de 2011;

ou

| b) | No caso de um produto que contenha clopiralide, ciprodinil, fosetil ou trinexapace acompanhado de outras substâncias activas, devem, se necessário, alterar ou retirar a autorização até 30 de Abril de 2011 ou até à data fixada para essa alteração ou retirada na respectiva directiva ou directivas que acrescentaram a substância ou as substâncias relevantes ao anexo I da Directiva 91/414/CEE, caso esta última data seja posterior. |
| --- | --- |

b)

No caso de um produto que contenha clopiralide, ciprodinil, fosetil ou trinexapace acompanhado de outras substâncias activas, devem, se necessário, alterar ou retirar a autorização até 30 de Abril de 2011 ou até à data fixada para essa alteração ou retirada na respectiva directiva ou directivas que acrescentaram a substância ou as substâncias relevantes ao anexo I da Directiva 91/414/CEE, caso esta última data seja posterior.

Artigo 4.o

A presente directiva entra em vigor em 1 de Maio de 2007.

Artigo 5.o

Os Estados-Membros são os destinatários da presente directiva.

Feito em Bruxelas, em 18 de Julho de 2006.

Pela Comissão

Markos KYPRIANOU

Membro da Comissão

---

(1)  JO L 230 de 19.8.1991, p. 1. Directiva com a última redacção que lhe foi dada pela Directiva 2006/45/CE da Comissão (JO L 130 de 18.5.2006, p. 27).

1

(2)  JO L 55 de 29.2.2000, p. 25. Regulamento com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CE) n.o1 044/2003 (JO L 151 de 19.6.2003, p. 32).

2

o

(3)  JO L 98 de 7.4.2001, p. 6.

3

(4)  EFSA Scientific Report (2005) 50, 1-65, Conclusion regarding the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance clopyralid (Relatório científico da AESA: Conclusões da revisão dos peritos avaliadores sobre a avaliação dos riscos de pesticidas da substância activa clopiralide) (concluído em 14 de Dezembro de 2005).

4

EFSA Scientific Report (2005) 51, 1-78, Conclusion regarding the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance cyprodinil (Relatório científico da AESA: Conclusões da revisão dos peritos avaliadores sobre a avaliação dos riscos de pesticidas da substância activa ciprodinil) (concluído em 14 de Dezembro de 2005).

EFSA Scientific Report (2005) 54, 1-79, Conclusion regarding the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance fosethyl (Relatório científico da AESA: Conclusões da revisão dos peritos avaliadores sobre a avaliação dos riscos de pesticidas da substância activa fosetil) (concluído em 14 de Dezembro de 2005).

EFSA Scientific Report (2005) 57, 1-70, Conclusion regarding the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance trinexapac (Relatório científico da AESA: Conclusões da revisão dos peritos avaliadores sobre a avaliação dos riscos de pesticidas da substância activa trinexapace) (concluído em 14 de Dezembro de 2005).

(5)  JO L 366 de 15.12.1992, p. 10. Regulamento com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CE) n.o 2266/2000 (JO L 259 de 13.10.2000, p. 27).

5

o

---

ANEXO

Aditar o seguinte no final do quadro do anexo I da Directiva 91/414/CEE:

| Número | Denominação comum, números de identificação | Denominação IUPAC | Pureza (1) | Entrada em vigor | Termo da inclusão | Disposições específicas |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| «131 | Clopiralide
  N.o CAS: 1702-17-6
  N.o CIPAC: 455 | Ácido 3,6-dicloropiridina-2-carboxílico | ≥ 950 g/kg | 1 de Maio de 2007 | 30 de Abril de 2017 | PARTE A
  Só serão autorizadas as utilizações como herbicida.
  PARTE B
  Na avaliação dos pedidos de autorização de produtos fitofarmacêuticos que contenham clopiralide para outras utilizações que não as aplicações na Primavera, os Estados-Membros devem estar particularmente atentos aos critérios constantes na alínea b) do n.o 1 do artigo 4.o e garantir que os dados e a informação necessários são fornecidos antes da concessão de tal autorização.
  Na aplicação dos princípios uniformes enunciados no anexo VI, devem ser tidas em conta as conclusões da versão final, de 4 de Abril de 2006, do relatório de revisão do clopiralide elaborado no quadro do Comité Permanente da Cadeia Alimentar e da Saúde Animal, nomeadamente os apêndices I e II do relatório.
  Nessa avaliação global, os Estados-Membros devem estar particularmente atentos:






  — | à protecção das plantas não visadas e das águas subterrâneas que se encontrem em condições de vulnerabilidade. As condições de autorização devem incluir medidas de redução dos riscos e devem ser iniciados programas de vigilância para detectar a potencial contaminação das águas subterrâneas em zonas vulneráveis, quando necessário. |

Número

Denominação comum, números de identificação

Denominação IUPAC

Pureza (1)

Entrada em vigor

Termo da inclusão

Disposições específicas

«131

Clopiralide

N.o CAS: 1702-17-6

N.o CIPAC: 455

Ácido 3,6-dicloropiridina-2-carboxílico

≥ 950 g/kg

1 de Maio de 2007

30 de Abril de 2017

PARTE A

Só serão autorizadas as utilizações como herbicida.

PARTE B

Na avaliação dos pedidos de autorização de produtos fitofarmacêuticos que contenham clopiralide para outras utilizações que não as aplicações na Primavera, os Estados-Membros devem estar particularmente atentos aos critérios constantes na alínea b) do n.o 1 do artigo 4.o e garantir que os dados e a informação necessários são fornecidos antes da concessão de tal autorização.

Na aplicação dos princípios uniformes enunciados no anexo VI, devem ser tidas em conta as conclusões da versão final, de 4 de Abril de 2006, do relatório de revisão do clopiralide elaborado no quadro do Comité Permanente da Cadeia Alimentar e da Saúde Animal, nomeadamente os apêndices I e II do relatório.

Nessa avaliação global, os Estados-Membros devem estar particularmente atentos:

—

à protecção das plantas não visadas e das águas subterrâneas que se encontrem em condições de vulnerabilidade. As condições de autorização devem incluir medidas de redução dos riscos e devem ser iniciados programas de vigilância para detectar a potencial contaminação das águas subterrâneas em zonas vulneráveis, quando necessário.

Os Estados-Membros em causa devem solicitar a apresentação de estudos suplementares que confirmem os resultados relativos ao metabolismo animal. Devem assegurar que os notificadores que solicitaram a inclusão do clopiralide no presente anexo forneçam esses estudos à Comissão no prazo de dois anos a contar da entrada em vigor da presente directiva.

132

Ciprodinil

N.o CAS: 121522-61-2

N.o CIPAC: 511

(4-ciclopropil-6-metil-pirimidin-2-il)-fenil-amina

≥ 980 g/kg

1 de Maio de 2007

30 de Abril de 2017

PARTE A

Só serão autorizadas as utilizações como fungicida.

PARTE B

Na aplicação dos princípios uniformes enunciados no anexo VI, devem ser tidas em conta as conclusões da versão final, de 4 de Abril de 2006, do relatório de revisão do ciprodinil elaborado no quadro do Comité Permanente da Cadeia Alimentar e da Saúde Animal, nomeadamente os apêndices I e II do relatório.

Nessa avaliação global, os Estados-Membros:

| — | devem estar particularmente atentos à segurança dos operadores e garantir que as condições de utilização prescrevem o uso de equipamento de protecção individual adequado; |
| --- | --- |

—

devem estar particularmente atentos à segurança dos operadores e garantir que as condições de utilização prescrevem o uso de equipamento de protecção individual adequado;

| — | devem estar particularmente atentos à protecção das aves, dos mamíferos e dos organismos aquáticos. As condições de autorização devem incluir medidas de redução dos riscos, tais como zonas-tampão. |
| --- | --- |

—

devem estar particularmente atentos à protecção das aves, dos mamíferos e dos organismos aquáticos. As condições de autorização devem incluir medidas de redução dos riscos, tais como zonas-tampão.

Os Estados-Membros em causa devem solicitar a apresentação de estudos suplementares que confirmem a avaliação dos riscos para as aves e os mamíferos bem como a eventual presença de resíduos do metabolito CGA 304075 em alimentos de origem animal. Devem assegurar que os notificadores que solicitaram a inclusão do ciprodinil no presente anexo forneçam esses estudos à Comissão no prazo de dois anos a contar da entrada em vigor da presente directiva.

133

Fosetil

N.o CAS: 15845-66-6

N.o CIPAC: 384

Hidrogenofosfonato de etilo

≥ 960 g/kg (expresso como fosetil-Al)

1 de Maio de 2007

30 de Abril de 2017

PARTE A

Só serão autorizadas as utilizações como fungicida.

PARTE B

Na aplicação dos princípios uniformes enunciados no anexo VI, devem ser tidas em conta as conclusões da versão final, de 4 de Abril de 2006, do relatório de revisão do fosetil elaborado no quadro do Comité Permanente da Cadeia Alimentar e da Saúde Animal, nomeadamente os apêndices I e II do relatório.

Nessa avaliação global, os Estados-Membros:

| — | devem estar particularmente atentos à protecção das aves, dos mamíferos, dos organismos aquáticos e dos artrópodes não visados. |
| --- | --- |

—

devem estar particularmente atentos à protecção das aves, dos mamíferos, dos organismos aquáticos e dos artrópodes não visados.

As condições de autorização devem incluir, se necessário, medidas de redução dos riscos, tais como zonas-tampão.

Os Estados-Membros em causa devem solicitar a apresentação de estudos suplementares que confirmem a avaliação dos riscos para os artrópodes não visados, em especial no que respeita à sua capacidade de recuperação dentro da cultura, bem como para os mamíferos herbívoros. Devem assegurar que o notificador que solicitou a inclusão do fosetil no presente anexo forneça esses estudos à Comissão no prazo de dois anos a contar da entrada em vigor da presente directiva.

134

Trinexapace

N.o CAS: 104273-73-6

N.o CIPAC: 732

Ácido 4-(ciclopropil-hidroximetileno)-3,5-dioxo-ciclohexanocarboxílico

≥ 940 g/kg (expresso como trinexapace-etilo)

1 de Maio de 2007

30 de Abril de 2017

PARTE A

Só serão autorizadas as utilizações como regulador do crescimento de plantas.

PARTE B

Na aplicação dos princípios uniformes enunciados no anexo VI, devem ser tidas em conta as conclusões da versão final, de 4 de Abril de 2006, do relatório de revisão do trinexapace elaborado no quadro do Comité Permanente da Cadeia Alimentar e da Saúde Animal, nomeadamente os apêndices I e II do relatório.

Nessa avaliação global, os Estados-Membros:

| — | devem estar particularmente atentos à protecção das aves e dos mamíferos. |
| --- | --- |

—

devem estar particularmente atentos à protecção das aves e dos mamíferos.

As condições de autorização devem incluir, se necessário, medidas de redução dos riscos.

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(1)  O relatório de revisão fornece mais pormenores sobre a identidade e as especificações da substância activa.»

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