# Gazzetta ufficiale L 206/2006

| | ISSN 1725-258X |
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| Gazzetta ufficiale
  dell’Unione europea | L 206 |
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| Edizione in lingua italiana | Legislazione | 49o anno27 luglio 2006 |

ISSN 1725-258X

Gazzetta ufficiale

dell’Unione europea

L 206

Edizione in lingua italiana

Legislazione

49o anno27 luglio 2006

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| Sommario | | I   Atti per i quali la pubblicazione è una condizione di applicabilità | pagina |
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| | * | Direttiva 2006/60/CE della Commissione, del 7 luglio 2006, che modifica gli allegati della direttiva 90/642/CEE del Consiglio per quanto riguarda i livelli massimi di residui di trifloxystrobin, tiabendazolo, abamectina, benomil, carbendazim, tiofanato metile, miclobutanil, glifosato, trimethylsulfonium, fenpropimorf e clormequat (
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  ) | 1 |
| | * | Direttiva 2006/61/CE della Commissione, del 7 luglio 2006, che modifica gli allegati delle direttive 86/362/CEE, 86/363/CEE e 90/642/CEE del Consiglio per quanto riguarda i livelli massimi di residui di atrazina, azinfos-etile, ciflutrin, etefon, fention, metamidofos, metomil, paraquat e triazofos (
  1
  ) | 12 |
| | * | Direttiva 2006/62/CE della Commissione, del 12 luglio 2006, che modifica gli allegati delle direttive 76/895/CEE, 86/362/CEE, 86/363/CEE e 90/642/CEE del Consiglio per quanto riguarda i livelli massimi di residui di desmedifam, fenmedifam e clorfenvinfos (
  1
  ) | 27 |
| | * | Direttiva 2006/63/CE della Commissione, del 14 luglio 2006, che modifica gli allegati da II a VII della direttiva 98/57/CE del Consiglio concernente la lotta contro Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. | 36 |
| | * | Direttiva 2006/64/CE della Commissione, del 18 luglio 2006, che modifica la direttiva 91/414/CEE del Consiglio per l'iscrizione delle sostanze attive clopiralid, ciprodinil, fosetil e trinexapac (
  1
  ) | 107 |

Sommario

I   Atti per i quali la pubblicazione è una condizione di applicabilità

pagina

*

Direttiva 2006/60/CE della Commissione, del 7 luglio 2006, che modifica gli allegati della direttiva 90/642/CEE del Consiglio per quanto riguarda i livelli massimi di residui di trifloxystrobin, tiabendazolo, abamectina, benomil, carbendazim, tiofanato metile, miclobutanil, glifosato, trimethylsulfonium, fenpropimorf e clormequat (
  1
  )

1

1

*

Direttiva 2006/61/CE della Commissione, del 7 luglio 2006, che modifica gli allegati delle direttive 86/362/CEE, 86/363/CEE e 90/642/CEE del Consiglio per quanto riguarda i livelli massimi di residui di atrazina, azinfos-etile, ciflutrin, etefon, fention, metamidofos, metomil, paraquat e triazofos (
  1
  )

1

12

*

Direttiva 2006/62/CE della Commissione, del 12 luglio 2006, che modifica gli allegati delle direttive 76/895/CEE, 86/362/CEE, 86/363/CEE e 90/642/CEE del Consiglio per quanto riguarda i livelli massimi di residui di desmedifam, fenmedifam e clorfenvinfos (
  1
  )

1

27

*

Direttiva 2006/63/CE della Commissione, del 14 luglio 2006, che modifica gli allegati da II a VII della direttiva 98/57/CE del Consiglio concernente la lotta contro Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

Ralstonia solanacearum

et al.

36

*

Direttiva 2006/64/CE della Commissione, del 18 luglio 2006, che modifica la direttiva 91/414/CEE del Consiglio per l'iscrizione delle sostanze attive clopiralid, ciprodinil, fosetil e trinexapac (
  1
  )

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107

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| | (1)   Testo rilevante ai fini del SEE. |

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(1)   Testo rilevante ai fini del SEE.

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| IT | Gli atti i cui titoli sono stampati in caratteri chiari appartengono alla gestione corrente. Essi sono adottati nel quadro della politica agricola ed hanno generalmente una durata di validità limitata.
  I titoli degli altri atti sono stampati in grassetto e preceduti da un asterisco. |
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IT

Gli atti i cui titoli sono stampati in caratteri chiari appartengono alla gestione corrente. Essi sono adottati nel quadro della politica agricola ed hanno generalmente una durata di validità limitata.

I titoli degli altri atti sono stampati in grassetto e preceduti da un asterisco.

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I Atti per i quali la pubblicazione è una condizione di applicabilità

| 27.7.2006 | IT | Gazzetta ufficiale dell’Unione europea | L 206/1 |
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27.7.2006

IT

Gazzetta ufficiale dell’Unione europea

L 206/1

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DIRETTIVA 2006/60/CE DELLA COMMISSIONE

del 7 luglio 2006

che modifica gli allegati della direttiva 90/642/CEE del Consiglio per quanto riguarda i livelli massimi di residui di trifloxystrobin, tiabendazolo, abamectina, benomil, carbendazim, tiofanato metile, miclobutanil, glifosato, trimethylsulfonium, fenpropimorf e clormequat

(Testo rilevante ai fini del SEE)

LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,

visto il trattato che istituisce la Comunità europea,

vista la direttiva 90/642/CEE del Consiglio, del 27 novembre 1990, che fissa le quantità massime di residui di antiparassitari su e in alcuni prodotti di origine vegetale, compresi gli ortofrutticoli (1), in particolare l'articolo 7,

vista la direttiva 91/414/CEE del Consiglio, del 15 luglio 1991, relativa all’immissione in commercio dei prodotti fitosanitari (2), in particolare l’articolo 4, paragrafo 1, lettera f),

considerando quanto segue:

| (1) | Conformemente alle disposizioni della direttiva 91/414/CEE le autorizzazioni dei prodotti fitosanitari da utilizzare su colture specifiche sono di competenza degli Stati membri. Tali autorizzazioni devono essere basate sulla valutazione degli effetti sulla salute umana e degli animali nonché sull’ambiente. Tra gli elementi da prendere in considerazione per tali valutazioni si deve tener conto dell’esposizione degli operatori e degli astanti nonché dell’impatto sugli ambienti terrestre, acquatico e atmosferico ed inoltre dell’impatto sulle persone e sugli animali derivante dal consumo di residui presenti nelle colture trattate. |
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(1)

Conformemente alle disposizioni della direttiva 91/414/CEE le autorizzazioni dei prodotti fitosanitari da utilizzare su colture specifiche sono di competenza degli Stati membri. Tali autorizzazioni devono essere basate sulla valutazione degli effetti sulla salute umana e degli animali nonché sull’ambiente. Tra gli elementi da prendere in considerazione per tali valutazioni si deve tener conto dell’esposizione degli operatori e degli astanti nonché dell’impatto sugli ambienti terrestre, acquatico e atmosferico ed inoltre dell’impatto sulle persone e sugli animali derivante dal consumo di residui presenti nelle colture trattate.

| (2) | I livelli massimi di residui (LMR) corrispondono all’uso delle quantità minime di antiparassitari necessarie ad ottenere un’efficace protezione delle piante, applicate in modo tale che la quantità di residui risulti la minima possibile e accettabile dal punto di vista tossicologico, in particolare in termini di quantità stimata assunta con la dieta alimentare. |
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(2)

I livelli massimi di residui (LMR) corrispondono all’uso delle quantità minime di antiparassitari necessarie ad ottenere un’efficace protezione delle piante, applicate in modo tale che la quantità di residui risulti la minima possibile e accettabile dal punto di vista tossicologico, in particolare in termini di quantità stimata assunta con la dieta alimentare.

| (3) | Gli LMR di antiparassitari disciplinati dalla direttiva 90/642/CEE devono essere rivisti periodicamente e possono essere modificati per tener conto di utilizzi nuovi o modificati. Alla Commissione sono state comunicate informazioni su impieghi nuovi o modificati che determineranno variazioni nei livelli dei residui di trifloxystrobin, tiabendazolo, abamectina, gruppo benomil (benomil, carbendazim e tiofanato-metile), miclobutanil, glifosato, trimethylsulfonium e fenpropimorf. |
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(3)

Gli LMR di antiparassitari disciplinati dalla direttiva 90/642/CEE devono essere rivisti periodicamente e possono essere modificati per tener conto di utilizzi nuovi o modificati. Alla Commissione sono state comunicate informazioni su impieghi nuovi o modificati che determineranno variazioni nei livelli dei residui di trifloxystrobin, tiabendazolo, abamectina, gruppo benomil (benomil, carbendazim e tiofanato-metile), miclobutanil, glifosato, trimethylsulfonium e fenpropimorf.

| (4) | Le informazioni relative al clormequat comunicate alla Commissione sono tali da giustificare l’adozione di un LMR provvisorio, ossia per tre anni, per quanto riguarda le pere. |
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(4)

Le informazioni relative al clormequat comunicate alla Commissione sono tali da giustificare l’adozione di un LMR provvisorio, ossia per tre anni, per quanto riguarda le pere.

| (5) | L’esposizione in vita dei consumatori a detti antiparassitari attraverso prodotti alimentari che possono contenere residui di tali antiparassitari è stata esaminata e valutata secondo le procedure e le prassi in uso nella Comunità europea, tenendo conto degli orientamenti pubblicati dall’Organizzazione mondiale della sanità (3). Tale valutazione ha tenuto conto del fatto che l’abamectina e il tiabendazolo sono sostanze impiegate anche come medicinali per uso veterinario impiegati su animali destinati alla produzione di alimenti e che per entrambe sono stati fissati livelli massimi di residui conformemente alle disposizioni di cui al regolamento (CEE) n. 2377/90 del Consiglio (4). Sulla base dei risultati di tali esami e valutazioni occorre stabilire gli LMR di tali antiparassitari per impedire il superamento delle assunzioni giornaliere accettabili. |
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(5)

L’esposizione in vita dei consumatori a detti antiparassitari attraverso prodotti alimentari che possono contenere residui di tali antiparassitari è stata esaminata e valutata secondo le procedure e le prassi in uso nella Comunità europea, tenendo conto degli orientamenti pubblicati dall’Organizzazione mondiale della sanità (3). Tale valutazione ha tenuto conto del fatto che l’abamectina e il tiabendazolo sono sostanze impiegate anche come medicinali per uso veterinario impiegati su animali destinati alla produzione di alimenti e che per entrambe sono stati fissati livelli massimi di residui conformemente alle disposizioni di cui al regolamento (CEE) n. 2377/90 del Consiglio (4). Sulla base dei risultati di tali esami e valutazioni occorre stabilire gli LMR di tali antiparassitari per impedire il superamento delle assunzioni giornaliere accettabili.

| (6) | L’esposizione acuta dei consumatori a benomil, carbendazim, tiofanato metile, fenpropimorf e clormequat, per i quali esiste una dose acuta di riferimento (DAR), attraverso prodotti alimentari che possono contenere residui di tali antiparassitari è stata esaminata e valutata secondo le procedure e le prassi in uso nella Comunità europea, tenendo conto degli orientamenti pubblicati dall’Organizzazione mondiale della sanità. Si è tenuto conto del parere del comitato scientifico per le piante, in particolare del parere e delle raccomandazioni concernenti la tutela dei consumatori di prodotti alimentari trattati con antiparassitari (5). Sulla base della valutazione dell’assunzione giornaliera, occorre stabilire gli LMR di tali antiparassitari per impedire il superamento della DAR. Nel caso delle altre sostanze, l'esame delle informazioni disponibili ha evidenziato che non è necessaria alcuna DAR e che pertanto una valutazione a breve termine non ha motivo di essere. |
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(6)

L’esposizione acuta dei consumatori a benomil, carbendazim, tiofanato metile, fenpropimorf e clormequat, per i quali esiste una dose acuta di riferimento (DAR), attraverso prodotti alimentari che possono contenere residui di tali antiparassitari è stata esaminata e valutata secondo le procedure e le prassi in uso nella Comunità europea, tenendo conto degli orientamenti pubblicati dall’Organizzazione mondiale della sanità. Si è tenuto conto del parere del comitato scientifico per le piante, in particolare del parere e delle raccomandazioni concernenti la tutela dei consumatori di prodotti alimentari trattati con antiparassitari (5). Sulla base della valutazione dell’assunzione giornaliera, occorre stabilire gli LMR di tali antiparassitari per impedire il superamento della DAR. Nel caso delle altre sostanze, l'esame delle informazioni disponibili ha evidenziato che non è necessaria alcuna DAR e che pertanto una valutazione a breve termine non ha motivo di essere.

| (7) | Gli LMR sono fissati al limite inferiore di determinazione analitica, quando gli impieghi autorizzati di prodotti fitosanitari non producono livelli rilevabili di residui di antiparassitari nei o sui prodotti alimentari, quando non vi sono impieghi autorizzati, quando gli impieghi autorizzati dagli Stati membri non sono stati suffragati dai dati necessari oppure quando gli impieghi in paesi terzi che determinano la presenza di residui nei o sui prodotti alimentari commercializzabili sul mercato comunitario non sono stati suffragati dai dati necessari in oggetto. |
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(7)

Gli LMR sono fissati al limite inferiore di determinazione analitica, quando gli impieghi autorizzati di prodotti fitosanitari non producono livelli rilevabili di residui di antiparassitari nei o sui prodotti alimentari, quando non vi sono impieghi autorizzati, quando gli impieghi autorizzati dagli Stati membri non sono stati suffragati dai dati necessari oppure quando gli impieghi in paesi terzi che determinano la presenza di residui nei o sui prodotti alimentari commercializzabili sul mercato comunitario non sono stati suffragati dai dati necessari in oggetto.

| (8) | È opportuno pertanto fissare nuovi LMR per tali antiparassitari. |
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(8)

È opportuno pertanto fissare nuovi LMR per tali antiparassitari.

| (9) | La fissazione o la modifica a livello comunitario di LMR provvisori non impedisce che gli Stati membri stabiliscano LMR provvisori per glifosato, thrimethylsulfonium e trifloxystrobin, conformemente all’articolo 4, paragrafo 1, lettera f), della direttiva 91/414/CEE e al suo allegato VI. Si ritiene che un periodo di quattro anni sia sufficiente per permettere altre utilizzazioni di tali sostanze. Trascorso questo periodo è opportuno che gli LMR provvisori diventino definitivi. |
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(9)

La fissazione o la modifica a livello comunitario di LMR provvisori non impedisce che gli Stati membri stabiliscano LMR provvisori per glifosato, thrimethylsulfonium e trifloxystrobin, conformemente all’articolo 4, paragrafo 1, lettera f), della direttiva 91/414/CEE e al suo allegato VI. Si ritiene che un periodo di quattro anni sia sufficiente per permettere altre utilizzazioni di tali sostanze. Trascorso questo periodo è opportuno che gli LMR provvisori diventino definitivi.

| (10) | I lupini sono consumati in quanto prodotto alimentare in diversi Stati membri. L’impiego di glifosato è autorizzato per la loro coltura. È necessario pertanto aggiungere la voce «lupini» e fissare gli LMR per tale prodotto, al fine di proteggere i consumatori da un eccesso di residui di antiparassitari in esso presenti. |
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(10)

I lupini sono consumati in quanto prodotto alimentare in diversi Stati membri. L’impiego di glifosato è autorizzato per la loro coltura. È necessario pertanto aggiungere la voce «lupini» e fissare gli LMR per tale prodotto, al fine di proteggere i consumatori da un eccesso di residui di antiparassitari in esso presenti.

| (11) | Occorre pertanto modificare di conseguenza la direttiva 90/642/CE. |
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(11)

Occorre pertanto modificare di conseguenza la direttiva 90/642/CE.

| (12) | Le misure di cui alla presente direttiva sono conformi al parere del comitato permanente per la catena alimentare e la salute degli animali, |
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(12)

Le misure di cui alla presente direttiva sono conformi al parere del comitato permanente per la catena alimentare e la salute degli animali,

HA ADOTTATO LA PRESENTE DIRETTIVA:

Articolo 1

La direttiva 90/642/CEE è modificata come segue:

| 1) | nell'allegato I, nel gruppo «3. Legumi da granella», è aggiunta la voce «Lupini», in modo che i termini «Prodotto intero» dell'ultima colonna riguardino tutte e quattro le voci; |
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1)

nell'allegato I, nel gruppo «3. Legumi da granella», è aggiunta la voce «Lupini», in modo che i termini «Prodotto intero» dell'ultima colonna riguardino tutte e quattro le voci;

| 2) | l'allegato II è modificato conformemente all'allegato della presente direttiva. |
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2)

l'allegato II è modificato conformemente all'allegato della presente direttiva.

Articolo 2

1.   Gli Stati membri adottano e pubblicano, entro il 20 gennaio 2007, le disposizioni legislative, regolamentari e amministrative necessarie per conformarsi alla presente direttiva; fanno eccezione il gruppo benomil e il tiofanato metile, per i quali la data ultima prevista per l'adozione e la pubblicazione è il 14 settembre 2006, e il clormequat, per il quale la data ultima prevista per l’adozione e la pubblicazione è il 31 luglio 2006. Essi comunicano immediatamente alla Commissione il testo di tali disposizioni, nonché una tavola di concordanza tra queste ultime e la presente direttiva.

Essi applicano tali disposizioni a decorrere dal 21 gennaio 2007, salvo per il gruppo del benomil e il tiofanato metile, per i quali essi le applicano entro il 15 settembre 2006, e per il clormequat, per il quale essi le applicano entro il 1o agosto 2006.

Quando gli Stati membri adottano tali disposizioni, queste contengono un riferimento alla presente direttiva oppure sono corredate di tale riferimento all’atto della loro pubblicazione ufficiale. Le modalità di tale riferimento sono decise dagli Stati membri.

2.   Gli Stati membri comunicano alla Commissione il testo delle disposizioni essenziali di diritto interno che essi adottano nella materia disciplinata dalla presente direttiva.

Articolo 3

La presente direttiva entra in vigore il ventesimo giorno successivo alla pubblicazione nella Gazzetta ufficiale dell'Unione europea.

Articolo 4

Gli Stati membri sono destinatari della presente direttiva.

Fatto a Bruxelles, il 7 luglio 2006.

Per la Commissione

Markos KYPRIANOU

Membro della Commissione

---

(1)  GU L 350 del 14.12.1990, pag. 71. Direttiva modificata da ultimo dalla direttiva 2006/53/CE della Commissione (GU L 154 dell’8.6.2006, pag. 11).

1

(2)  GU L 230 del 19.8.1991, pag. 1. Direttiva modificata da ultimo dalla direttiva 2006/45/CE della Commissione (GU L 130 del 18.5.2006, pag. 27).

2

(3)  Orientamenti per la stima dell'assunzione di residui di antiparassitari con la dieta alimentare (versione riveduta), a cura del GEMS/Food Programme in collaborazione con il comitato Codex sui residui di antiparassitari; pubblicazione dell'Organizzazione mondiale della sanità, 1997 (WHO/FSF/FOS/97.7).

3

(4)  GU L 224 del 18.8.1990, pag. 1. Regolamento modificato da ultimo dal regolamento (CE) n. 205/2006 della Commissione (GU L 34 del 7.2.2006, pag. 21).

4

(5)  Parere su questioni relative alla modifica degli allegati delle direttive 86/362/CEE, 86/363/CEE e 90/642/CEE del Consiglio (parere espresso dal CSP il 14 luglio 1998); parere sui residui variabili di antiparassitari nella frutta e nella verdura (parere espresso dal CSP il 14 luglio 1998) (http://europa.eu.int/comm/food/fs/sc/scp/outcome_ppp_en.html).

5

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ALLEGATO

L'allegato II della direttiva 90/642/CEE è modificato come segue:

| 1) | alla voce relativa al clormequat sulle pere, il testo della nota (t) è sostituito dal seguente: «Una quantità massima di residui provvisoria di 0,2 mg/kg si applica fino al 31 luglio 2009.»; |
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1)

alla voce relativa al clormequat sulle pere, il testo della nota (t) è sostituito dal seguente: «Una quantità massima di residui provvisoria di 0,2 mg/kg si applica fino al 31 luglio 2009.»;

| 2) | nella parte A, nelle colonne relative ai residui di trifloxystrobin, tiabendazolo, abamectina, benomil, carbendazim, tiofanato metile, miclobutanil, glifosato, trimethylsulfonium e fenpropimorf il testo attuale è sostituito dal seguente: | Residui di antiparassitari e quantità massime di residui (mg/kg) |
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| Categorie ed esempi di singoli prodotti ai quali si applicano le quantità massime di residui | Trifloxy-strobin | Tiaben-dazolo | Abamectina (somma di avermectina B1a, avermectina B1b e delta-8,9 isomero di avermectina B1a) | Somma di benomil e carbendazim, espressa in carbendazim | Tiofanato metile | Miclobutanil | Glifosato | Trimethyl-sulfonium, catione risultante dall’impiego di glifosato | Fenpropi-morf |
| «1. | Frutta fresche, secche o non cotte, conservate mediante congelamento senza zuccheri addizionati; frutta a guscio | | | | | | | | | |
| | i) | AGRUMI | 0,3 (2) | 5 | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 3 | | | 0,05 (1) |
| | | Pompelmi | | | | | | | | | |
| | | Limoni | | | | | | | | | |
| | | Limette | | | | | | | | | |
| | | Mandarini (comprese clementine e altri ibridi) | | | | | | | 0,5 (2) | 0,5 (2) | |
| | | Arance | | | | | | | 0,5 (2) | 0,5 (2) | |
| | | Pomeli | | | | | | | | | |
| | | Altri | | | | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| | ii) | FRUTTA A GUSCIO (con o senza guscio) | 0,02 (1)
   (2) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1) | 0,2 | 0,05 (1) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Mandorle | | | | | | | | | |
| | | Noci del Brasile | | | | | | | | | |
| | | Noci di anacardio | | | | | | | | | |
| | | Castagne e marroni | | | | | | | | | |
| | | Noci di cocco | | | | | | | | | |
| | | Nocciole | | | | | | | | | |
| | | Noci del Queensland | | | | | | | | | |
| | | Noci di pecan | | | | | | | | | |
| | | Pinoli | | | | | | | | | |
| | | Pistacchi | | | | | | | | | |
| | | Noci comuni | | | | | | | | | |
| | | Altri | | | | | | | | | |
| | iii) | POMACEE | 0,5 (2) | | 0,01 (1) | 0,2 | 0,5 | 0,5 | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Mele | | 5 | | | | | | | |
| | | Pere | | 5 | | | | | | | |
| | | Cotogne | | | | | | | | | |
| | | Altri | | 0,05 (1) | | | | | | | |
| | iv) | DRUPACEE | | 0,05 (1) | 0,01 (1) | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Albicocche | 1 (2) | | | 0,2 | 2 | 0,3 | | | |
| | | Ciliege | 1 (2) | | | 0,5 | 0,3 | 1 | | | |
| | | Pesche (comprese pesche noci e altri ibridi) | 1 (2) | | | 0,2 | 2 | 0,5 | | | |
| | | Prugne | 0,2 (2) | | | 0,5 | 0,3 | 0,5 | | | |
| | | Altri | 0,02 (1)
   (2) | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | |
| | v) | BACCHE E PICCOLA FRUTTA | | 0,05 (1) | | | | | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | a) | Uve da tavola e da vino | 5 (2) | | 0,01 (1) | | | 1 | 0,5 (2) | | 0,05 (1) |
| | | | Uve da tavola | | | | 0,3 | 0,1 (1) | | | | |
| | | | Uve da vino | | | | 0,5 | 3 | | | | |
| | | b) | Fragole (escluse le fragole selvatiche) | 0,5 (1)
   (2) | | 0,1 | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 1 | 0,1 (1)
   (2) | | 1 |
| | | c) | Frutti di piante arbustive (escluse le selvatiche) | 0,02 (1)
   (2) | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | | 1 |
| | | | More | | | 0,1 | | | 1 | | | |
| | | | More di rovo | | | | | | | | | |
| | | | More-lamponi | | | | | | | | | |
| | | | Lamponi | | | 0,1 | | | 1 | | | |
| | | | Altri | | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | d) | Altra piccola frutta e bacche (escluse le selvatiche) | | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | | 1 |
| | | | Mirtilli neri | | | | | | | | | |
| | | | Mirtilli rossi | | | | | | | | | |
| | | | Ribes a grappoli (rosso, nero e bianco) | 1 (2) | | | | | 1 | | | |
| | | | Uva spina | 1 (2) | | | | | 1 | | | |
| | | | Altri | 0,02 (1)
   (2) | | | | | 0,02 (1) | | | |
| | | e) | Bacche e frutti selvatici | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1)
   (2) | | 0,05 (1) |
| | vi) | FRUTTA VARIA | | | 0,01 (1) | | | | | | |
| | | Avocadi | | 15 | | | | | | | |
| | | Banane | 0,05 (2) | 5 | | | | 2 | | | 2 |
| | | Datteri | | | | | | | | | |
| | | Fichi | | | | | | | | | |
| | | Kiwi | | | | | | | | | |
| | | Kumquat | | | | | | | | | |
| | | Litchi | | | | | | | | | |
| | | Manghi | | 5 | | | | | | | |
| | | Olive (da tavola) | | | | | | | | | |
| | | Olive (da olio) | | | | | | | 1 (2) | 1 (2) | |
| | | Papaie | | 10 | | 0,2 | 1 | | | | |
| | | Frutti della passione | | | | | | | | | |
| | | Ananassi | | | | | | | | | |
| | | Melagrane | | | | | | | | | |
| | | Altri | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| 2. | Ortaggi, freschi o non cotti, congelati o secchi | | | | | | | | | |
| | i) | ORTAGGI A RADICE E TUBERO | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Bietole rosse (o da orto) | | | | | | | | | |
| | | Carote | | | | | | 0,2 | | | |
| | | Manioca | | 15 | | | | | | | |
| | | Sedani-rapa | | | | | | | | | |
| | | Rafano | | | | | | 0,2 | | | |
| | | Topinambur | | | | | | | | | |
| | | Pastinaca | | | | | | 0,2 | | | |
| | | Prezzemolo a grossa radice | | | | | | 0,2 | | | |
| | | Ravanelli | | | | | | | | | |
| | | Salsefrica o barba di becco | | | | | | | | | |
| | | Patate dolci | | 15 | | | | | | | |
| | | Navoni-rutabaga | | | | | | | | | |
| | | Rape | | | | | | | | | |
| | | Igname | | 15 | | | | | | | |
| | | Altri | | 0,05 (1) | | | | 0,02 (1) | | | |
| | ii) | ORTAGGI A BULBO | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Agli | | | | | | | | | |
| | | Cipolle | | | | | | | | | |
| | | Scalogni | | | | | | | | | |
| | | Cipolline | | | | | | | | | |
| | | Altri | | | | | | | | | |
| | iii) | ORTAGGI A FRUTTO | | 0,05 (1) | | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | a) | Solanacee | | | | | | | | | |
| | | | Pomodori | 0,5 (2) | | 0,02 | 0,5 | 2 | 0,3 | | | |
| | | | Peperoni | | | 0,05 | | | 0,5 | | | |
| | | | Melanzane | | | 0,02 | 0,5 | 2 | 0,3 | | | |
| | | | Gombo | | | | 2 | 1 | | | | |
| | | | Altri | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | |
| | | b) | Cucurbitacee con buccia commestibile | 0,2 (2) | | 0,02 | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,1 | | | |
| | | | Cetrioli | | | | | | | | | |
| | | | Cetriolini | | | | | | | | | |
| | | | Zucchine | | | | | | | | | |
| | | | Altri | | | | | | | | | |
| | | c) | Cucurbitacee con buccia non commestibile | | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,3 | 0,2 | | | |
| | | | Meloni | 0,3 (2) | | | | | | | | |
| | | | Zucche | | | | | | | | | |
| | | | Cocomeri | | | | | | | | | |
| | | | Altri | 0,02 (1)
   (2) | | | | | | | | |
| | | d) | Mais dolce | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | |
| | iv) | CAVOLI | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | a) | Cavoli a infiorescenza | | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | | | 0,05 (1) |
| | | | Cavoli broccoli (compresi calabresi) | | 5 | | | | | | | |
| | | | Cavolfiori | | | | | | | | | |
| | | | Altri | | 0,05 (1) | | | | | | | |
| | | b) | Cavoli a testa | | 0,05 (1) | | | | | | | |
| | | | Cavoletti di Bruxelles | | | | 0,5 | 1 | | | | 0,5 |
| | | | Cavoli cappucci | | | | | | | | | |
| | | | Altri | | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | | | 0,05 (1) |
| | | c) | Cavoli a foglia | | 0,05 (1) | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | | | 0,05 (1) |
| | | | Cavoli cinesi | | | | | | | | | |
| | | | Cavoli ricci | | | | | | | | | |
| | | | Altri | | | | | | | | | |
| | | d) | Cavoli-rapa | | 0,05 (1) | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | | | 0,05 (1) |
| | v) | ORTAGGI A FOGLIA ED ERBE FRESCHE | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | a) | Lattughe e simili | | | 0,1 | | | | | | |
| | | | Crescione | | | | | | | | | |
| | | | Dolcetta | | | | | | 5 | | | |
| | | | Lattuga | | | | | | | | | |
| | | | Scarola (indivia a foglie larghe) | | | | | | | | | |
| | | | Rucola | | | | | | | | | |
| | | | Foglie e steli di brassica | | | | | | | | | |
| | | | Altri | | | | | | 0,02 (1) | | | |
| | | b) | Spinaci e simili | | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | | Spinaci | | | | | | | | | |
| | | | Bietole da foglia e da costa | | | | | | | | | |
| | | | Altri | | | | | | | | | |
| | | c) | Crescione acquatico | | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | d) | Witloof | | 1 | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | e) | Erbe fresche | | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | | Cerfoglio | | | | | | | | | |
| | | | Erba cipollina | | | | | | | | | |
| | | | Prezzemolo | | | | | | | | | |
| | | | Foglie di sedano | | | | | | | | | |
| | | | Altri | | | | | | | | | |
| | vi) | LEGUMI (freschi) | | 0,05 (1) | 0,01 (1) | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Fagioli (non sgranati) | 0,5 (2) | | | 0,2 | 0,1 (1) | 0,3 | | | |
| | | Fagioli (sgranati) | | | | | | | | | |
| | | Piselli (non sgranati) | | | | 0,2 | 0,1 (1) | | | | |
| | | Piselli (sgranati) | | | | | | | | | |
| | | Altri | 0,02 (1)
   (2) | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | |
| | vii) | ORTAGGI A STELO (freschi) | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Asparagi | | | | | | | | | |
| | | Cardi | | | | | | | | | |
| | | Sedani | | | | | | | | | |
| | | Finocchi | | | | | | | | | |
| | | Carciofi | | | | | | 0,5 | | | |
| | | Porri | | | | | | | | | 1 |
| | | Rabarbaro | | | | | | | | | |
| | | Altri | | | | | | 0,02 (1) | | | 0,05 (1) |
| | viii) | FUNGHI | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | 0,05 (1) |
| | | a) | Funghi coltivati | | 10 | | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | b) | Funghi selvatici | | 0,05 (1) | | | | | 50 (2) | 20 (2) | |
| 3. | Legumi da granella (secchi) | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | Fagioli | | | | | | | 2 (2) | | |
| | Lenticchie | | | | | | | | | |
| | Piselli | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Lupini | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Altri | | | | | | | 0,1 (1)
   (2) | | |
| 4. | Semi oleosi | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) | 0,02 (1) | | | 0,05 (1) | | | 0,05 (1) |
| | Semi di lino | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Semi di arachide | | | | | | | | | |
| | Semi di papavero | | | | | | | | | |
| | Semi di sesamo | | | | | | | | | |
| | Semi di girasole | | | | | | | 20 (2) | | |
| | Semi di colza | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Semi di soia | | | | 0,2 | 0,3 | | 20 (2) | 10 (2) | |
| | Semi di senape | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Semi di cotone | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Semi di canapa | | | | | | | | | |
| | Altri | | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| 5. | Patate | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,5 (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | Patate precoci | | 0,05 (1) | | | | | | | |
| | Patate tardive | | 15 | | | | | | | |
| 6. | Tè (foglie e steli essiccati, fermentati o altrimenti lavorati di Camellia sinensis) | 0,05 (1)
   (2) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,05 (1) | 2 (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,1 (1) |
| 7. | Luppolo (essiccato), compresi i panelli di luppolo e la polvere non concentrata | 30 (2) | 0,1 (1) | 0,05 | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 2 | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 10 |

2)

nella parte A, nelle colonne relative ai residui di trifloxystrobin, tiabendazolo, abamectina, benomil, carbendazim, tiofanato metile, miclobutanil, glifosato, trimethylsulfonium e fenpropimorf il testo attuale è sostituito dal seguente:

Residui di antiparassitari e quantità massime di residui (mg/kg)

Categorie ed esempi di singoli prodotti ai quali si applicano le quantità massime di residui

Trifloxy-strobin

Tiaben-dazolo

Abamectina (somma di avermectina B1a, avermectina B1b e delta-8,9 isomero di avermectina B1a)

Somma di benomil e carbendazim, espressa in carbendazim

Tiofanato metile

Miclobutanil

Glifosato

Trimethyl-sulfonium, catione risultante dall’impiego di glifosato

Fenpropi-morf

«1.

Frutta fresche, secche o non cotte, conservate mediante congelamento senza zuccheri addizionati; frutta a guscio

i)

AGRUMI

0,3 (2)

5

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

3

0,05 (1)

Pompelmi

Limoni

Limette

Mandarini (comprese clementine e altri ibridi)

0,5 (2)

0,5 (2)

Arance

0,5 (2)

0,5 (2)

Pomeli

Altri

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

ii)

FRUTTA A GUSCIO (con o senza guscio)

0,02 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)

0,2

0,05 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Mandorle

Noci del Brasile

Noci di anacardio

Castagne e marroni

Noci di cocco

Nocciole

Noci del Queensland

Noci di pecan

Pinoli

Pistacchi

Noci comuni

Altri

iii)

POMACEE

0,5 (2)

0,01 (1)

0,2

0,5

0,5

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Mele

5

Pere

5

Cotogne

Altri

0,05 (1)

iv)

DRUPACEE

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Albicocche

1 (2)

0,2

2

0,3

Ciliege

1 (2)

0,5

0,3

1

Pesche (comprese pesche noci e altri ibridi)

1 (2)

0,2

2

0,5

Prugne

0,2 (2)

0,5

0,3

0,5

Altri

0,02 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

v)

BACCHE E PICCOLA FRUTTA

0,05 (1)

0,05 (1)
   (2)

a)

Uve da tavola e da vino

5 (2)

0,01 (1)

1

0,5 (2)

0,05 (1)

Uve da tavola

0,3

0,1 (1)

Uve da vino

0,5

3

b)

Fragole (escluse le fragole selvatiche)

0,5 (1)
   (2)

0,1

0,1 (1)

0,1 (1)

1

0,1 (1)
   (2)

1

c)

Frutti di piante arbustive (escluse le selvatiche)

0,02 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

1

More

0,1

1

More di rovo

More-lamponi

Lamponi

0,1

1

Altri

0,01 (1)

0,02 (1)

d)

Altra piccola frutta e bacche (escluse le selvatiche)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

1

Mirtilli neri

Mirtilli rossi

Ribes a grappoli (rosso, nero e bianco)

1 (2)

1

Uva spina

1 (2)

1

Altri

0,02 (1)
   (2)

0,02 (1)

e)

Bacche e frutti selvatici

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)

vi)

FRUTTA VARIA

0,01 (1)

Avocadi

15

Banane

0,05 (2)

5

2

2

Datteri

Fichi

Kiwi

Kumquat

Litchi

Manghi

5

Olive (da tavola)

Olive (da olio)

1 (2)

1 (2)

Papaie

10

0,2

1

Frutti della passione

Ananassi

Melagrane

Altri

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

2.

Ortaggi, freschi o non cotti, congelati o secchi

i)

ORTAGGI A RADICE E TUBERO

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Bietole rosse (o da orto)

Carote

0,2

Manioca

15

Sedani-rapa

Rafano

0,2

Topinambur

Pastinaca

0,2

Prezzemolo a grossa radice

0,2

Ravanelli

Salsefrica o barba di becco

Patate dolci

15

Navoni-rutabaga

Rape

Igname

15

Altri

0,05 (1)

0,02 (1)

ii)

ORTAGGI A BULBO

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Agli

Cipolle

Scalogni

Cipolline

Altri

iii)

ORTAGGI A FRUTTO

0,05 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

a)

Solanacee

Pomodori

0,5 (2)

0,02

0,5

2

0,3

Peperoni

0,05

0,5

Melanzane

0,02

0,5

2

0,3

Gombo

2

1

Altri

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

b)

Cucurbitacee con buccia commestibile

0,2 (2)

0,02

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1

Cetrioli

Cetriolini

Zucchine

Altri

c)

Cucurbitacee con buccia non commestibile

0,01 (1)

0,1 (1)

0,3

0,2

Meloni

0,3 (2)

Zucche

Cocomeri

Altri

0,02 (1)
   (2)

d)

Mais dolce

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

iv)

CAVOLI

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

a)

Cavoli a infiorescenza

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

Cavoli broccoli (compresi calabresi)

5

Cavolfiori

Altri

0,05 (1)

b)

Cavoli a testa

0,05 (1)

Cavoletti di Bruxelles

0,5

1

0,5

Cavoli cappucci

Altri

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

c)

Cavoli a foglia

0,05 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

Cavoli cinesi

Cavoli ricci

Altri

d)

Cavoli-rapa

0,05 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

v)

ORTAGGI A FOGLIA ED ERBE FRESCHE

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

a)

Lattughe e simili

0,1

Crescione

Dolcetta

5

Lattuga

Scarola (indivia a foglie larghe)

Rucola

Foglie e steli di brassica

Altri

0,02 (1)

b)

Spinaci e simili

0,01 (1)

0,02 (1)

Spinaci

Bietole da foglia e da costa

Altri

c)

Crescione acquatico

0,01 (1)

0,02 (1)

d)

Witloof

1

0,01 (1)

0,02 (1)

e)

Erbe fresche

0,01 (1)

0,02 (1)

Cerfoglio

Erba cipollina

Prezzemolo

Foglie di sedano

Altri

vi)

LEGUMI (freschi)

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Fagioli (non sgranati)

0,5 (2)

0,2

0,1 (1)

0,3

Fagioli (sgranati)

Piselli (non sgranati)

0,2

0,1 (1)

Piselli (sgranati)

Altri

0,02 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

vii)

ORTAGGI A STELO (freschi)

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

Asparagi

Cardi

Sedani

Finocchi

Carciofi

0,5

Porri

1

Rabarbaro

Altri

0,02 (1)

0,05 (1)

viii)

FUNGHI

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,05 (1)

a)

Funghi coltivati

10

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

b)

Funghi selvatici

0,05 (1)

50 (2)

20 (2)

3.

Legumi da granella (secchi)

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Fagioli

2 (2)

Lenticchie

Piselli

10 (2)

Lupini

10 (2)

Altri

0,1 (1)
   (2)

4.

Semi oleosi

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,02 (1)

0,05 (1)

0,05 (1)

Semi di lino

10 (2)

Semi di arachide

Semi di papavero

Semi di sesamo

Semi di girasole

20 (2)

Semi di colza

10 (2)

Semi di soia

0,2

0,3

20 (2)

10 (2)

Semi di senape

10 (2)

Semi di cotone

10 (2)

Semi di canapa

Altri

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

5.

Patate

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,5 (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Patate precoci

0,05 (1)

Patate tardive

15

6.

Tè (foglie e steli essiccati, fermentati o altrimenti lavorati di Camellia sinensis)

0,05 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

2 (2)

0,05 (1)
   (2)

0,1 (1)

7.

Luppolo (essiccato), compresi i panelli di luppolo e la polvere non concentrata

30 (2)

0,1 (1)

0,05

0,1 (1)

0,1 (1)

2

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

10

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(1)  Indica il limite inferiore di determinazione analitica.

(2)  Indica che la quantità massima di residui è stata fissata provvisoriamente a norma dell’articolo 4, paragrafo 1, lettera f), della direttiva 91/414/CEE.»

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| 27.7.2006 | IT | Gazzetta ufficiale dell’Unione europea | L 206/12 |
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27.7.2006

IT

Gazzetta ufficiale dell’Unione europea

L 206/12

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DIRETTIVA 2006/61/CE DELLA COMMISSIONE

del 7 luglio 2006

che modifica gli allegati delle direttive 86/362/CEE, 86/363/CEE e 90/642/CEE del Consiglio per quanto riguarda i livelli massimi di residui di atrazina, azinfos-etile, ciflutrin, etefon, fention, metamidofos, metomil, paraquat e triazofos

(Testo rilevante ai fini del SEE)

LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,

visto il trattato che istituisce la Comunità europea,

vista la direttiva 86/362/CEE del Consiglio, del 24 luglio 1986, che fissa le quantità massime di residui di antiparassitari sui e nei cereali (1), in particolare l'articolo 10,

vista la direttiva 86/363/CEE del Consiglio, del 24 luglio 1986, che fissa le quantità massime di residui di antiparassitari sui e nei prodotti alimentari di origine animale (2), in particolare l'articolo 10,

vista la direttiva 90/642/CEE del Consiglio, del 27 novembre 1990, che fissa le quantità massime di residui di antiparassitari su e in alcuni prodotti di origine vegetale, compresi gli ortofrutticoli (3), in particolare l'articolo 7,

vista la direttiva 91/414/CEE del Consiglio, del 15 luglio 1991, relativa all’immissione in commercio dei prodotti fitosanitari (4), in particolare l’articolo 4, paragrafo 1, lettera f),

considerando quanto segue:

| (1) | Per quanto riguarda i cereali e i prodotti di origine vegetale, compresi gli ortofrutticoli, i livelli di residui dipendono dall'uso delle quantità minime di antiparassitari necessarie per ottenere un'efficace protezione delle piante, applicate in modo tale che ne risulti un quantitativo di residui quanto più basso e accettabile possibile dal punto di vista tossicologico, con riguardo in particolare alla protezione dell'ambiente e alla quantità stimata assunta dai consumatori con la dieta alimentare. Per quanto riguarda i prodotti alimentari di origine animale, le quantità di residui dipendono dal consumo, da parte degli animali, di cereali e prodotti di origine vegetale trattati con antiparassitari, tenendo conto anche, se del caso, delle conseguenze dirette dell'uso di medicinali veterinari. I livelli massimi di residui (LMR) comunitari rappresentano il limite superiore dei quantitativi di tali residui che possono essere contenuti nei prodotti alimentari quando sono state rispettate le buone pratiche agricole. |
| --- | --- |

(1)

Per quanto riguarda i cereali e i prodotti di origine vegetale, compresi gli ortofrutticoli, i livelli di residui dipendono dall'uso delle quantità minime di antiparassitari necessarie per ottenere un'efficace protezione delle piante, applicate in modo tale che ne risulti un quantitativo di residui quanto più basso e accettabile possibile dal punto di vista tossicologico, con riguardo in particolare alla protezione dell'ambiente e alla quantità stimata assunta dai consumatori con la dieta alimentare. Per quanto riguarda i prodotti alimentari di origine animale, le quantità di residui dipendono dal consumo, da parte degli animali, di cereali e prodotti di origine vegetale trattati con antiparassitari, tenendo conto anche, se del caso, delle conseguenze dirette dell'uso di medicinali veterinari. I livelli massimi di residui (LMR) comunitari rappresentano il limite superiore dei quantitativi di tali residui che possono essere contenuti nei prodotti alimentari quando sono state rispettate le buone pratiche agricole.

| (2) | Gli LMR per gli antiparassitari vengono periodicamente riesaminati e modificati per tener conto dei nuovi dati al riguardo. Tali LMR sono fissati al limite inferiore di determinazione analitica, quando le utilizzazioni autorizzate di prodotti fitosanitari non producono livelli rilevabili di residui di antiparassitari nei o sui prodotti alimentari, quando non vi sono utilizzazioni autorizzate oppure quando le utilizzazioni autorizzate dagli Stati membri non sono state suffragate dai dati necessari oppure quando non sono state suffragate dai dati necessari le utilizzazioni in paesi terzi che determinano la presenza di residui nei o sui prodotti alimentari che possono essere immessi in circolazione nel mercato comunitario. |
| --- | --- |

(2)

Gli LMR per gli antiparassitari vengono periodicamente riesaminati e modificati per tener conto dei nuovi dati al riguardo. Tali LMR sono fissati al limite inferiore di determinazione analitica, quando le utilizzazioni autorizzate di prodotti fitosanitari non producono livelli rilevabili di residui di antiparassitari nei o sui prodotti alimentari, quando non vi sono utilizzazioni autorizzate oppure quando le utilizzazioni autorizzate dagli Stati membri non sono state suffragate dai dati necessari oppure quando non sono state suffragate dai dati necessari le utilizzazioni in paesi terzi che determinano la presenza di residui nei o sui prodotti alimentari che possono essere immessi in circolazione nel mercato comunitario.

| (3) | La Commissione è stata informata del fatto che può rivelarsi necessario rivedere gli attuali LMR di numerosi antiparassitari sulla base dei nuovi dati disponibili sotto il profilo tossicologico e dell’assunzione di tali sostanze da parte dei consumatori con la dieta alimentare. Essa ha invitato gli Stati membri interessati a presentare proposte relative alla revisione degli LMR comunitari. Tali proposte sono state sottoposte all’esame della Commissione. |
| --- | --- |

(3)

La Commissione è stata informata del fatto che può rivelarsi necessario rivedere gli attuali LMR di numerosi antiparassitari sulla base dei nuovi dati disponibili sotto il profilo tossicologico e dell’assunzione di tali sostanze da parte dei consumatori con la dieta alimentare. Essa ha invitato gli Stati membri interessati a presentare proposte relative alla revisione degli LMR comunitari. Tali proposte sono state sottoposte all’esame della Commissione.

| (4) | L'esposizione, nel corso della vita e a breve termine, dei consumatori agli antiparassitari contemplati dalla presente direttiva attraverso prodotti alimentari è stata riesaminata e valutata secondo le procedure e le prassi in uso nella Comunità, tenendo conto degli orientamenti pubblicati dall'Organizzazione mondiale della sanità (5). È opportuno fissare, su queste basi, nuovi LMR, i quali assicurino che non si produca alcuna esposizione inaccettabile dei consumatori. |
| --- | --- |

(4)

L'esposizione, nel corso della vita e a breve termine, dei consumatori agli antiparassitari contemplati dalla presente direttiva attraverso prodotti alimentari è stata riesaminata e valutata secondo le procedure e le prassi in uso nella Comunità, tenendo conto degli orientamenti pubblicati dall'Organizzazione mondiale della sanità (5). È opportuno fissare, su queste basi, nuovi LMR, i quali assicurino che non si produca alcuna esposizione inaccettabile dei consumatori.

| (5) | Ove pertinente, è stata esaminata e valutata, secondo le procedure e le prassi in uso nella Comunità e tenendo conto degli orientamenti pubblicati dall'Organizzazione mondiale della sanità, l'esposizione acuta dei consumatori ai suddetti antiparassitari attraverso i prodotti alimentari che possono contenere residui di tali sostanze. Si è concluso che la presenza di residui di antiparassitari a un livello pari o inferiore ai nuovi LMR proposti nella presente direttiva non è tale da provocare effetti tossici acuti. |
| --- | --- |

(5)

Ove pertinente, è stata esaminata e valutata, secondo le procedure e le prassi in uso nella Comunità e tenendo conto degli orientamenti pubblicati dall'Organizzazione mondiale della sanità, l'esposizione acuta dei consumatori ai suddetti antiparassitari attraverso i prodotti alimentari che possono contenere residui di tali sostanze. Si è concluso che la presenza di residui di antiparassitari a un livello pari o inferiore ai nuovi LMR proposti nella presente direttiva non è tale da provocare effetti tossici acuti.

| (6) | I partner commerciali della Comunità sono stati consultati, tramite l'Organizzazione mondiale del commercio, sui nuovi LMR e le loro osservazioni in merito sono state prese in debita considerazione. |
| --- | --- |

(6)

I partner commerciali della Comunità sono stati consultati, tramite l'Organizzazione mondiale del commercio, sui nuovi LMR e le loro osservazioni in merito sono state prese in debita considerazione.

| (7) | Occorre pertanto modificare di conseguenza gli allegati delle direttive 86/362/CEE, 86/363/CEE e 90/642/CEE. |
| --- | --- |

(7)

Occorre pertanto modificare di conseguenza gli allegati delle direttive 86/362/CEE, 86/363/CEE e 90/642/CEE.

| (8) | Le misure di cui alla presente direttiva sono conformi al parere del comitato permanente per la catena alimentare e la salute degli animali, |
| --- | --- |

(8)

Le misure di cui alla presente direttiva sono conformi al parere del comitato permanente per la catena alimentare e la salute degli animali,

HA ADOTTATO LA PRESENTE DIRETTIVA:

Articolo 1

L’allegato II della direttiva 86/362/CEE è modificato conformemente all’allegato I della presente direttiva.

Articolo 2

L’allegato II della direttiva 86/363/CEE è modificato conformemente all’allegato II della presente direttiva.

Articolo 3

L’allegato II della direttiva 90/642/CEE è modificato conformemente all’allegato III della presente direttiva.

Articolo 4

1.   Gli Stati membri adottano e pubblicano, entro il 20 gennaio 2007, le disposizioni legislative, regolamentari e amministrative necessarie per conformarsi alla presente direttiva. Essi comunicano immediatamente alla Commissione il testo di tali disposizioni nonché una tavola di concordanza tra queste ultime e la presente direttiva.

Essi applicano tali disposizioni a decorrere dal 21 gennaio 2007.

Quando gli Stati membri adottano tali disposizioni, queste contengono un riferimento alla presente direttiva oppure sono corredate di tale riferimento all'atto della loro pubblicazione ufficiale. Le modalità del riferimento sono stabilite dagli Stati membri.

2.   Gli Stati membri comunicano alla Commissione il testo delle disposizioni essenziali di diritto interno che essi adottano nel settore disciplinato dalla presente direttiva.

Articolo 5

La presente direttiva entra in vigore il ventesimo giorno successivo alla pubblicazione nella Gazzetta ufficiale dell’Unione europea.

Articolo 6

Gli Stati membri sono destinatari della presente direttiva.

Fatto a Bruxelles, il 7 luglio 2006.

Per la Commissione

Markos KYPRIANOU

Membro della Commissione

---

(1)  GU L 221 del 7.8.1986, pag. 37. Direttiva modificata da ultimo dalla direttiva 2006/59/CE della Commissione (GU L 175 del 29.6.2006, pag. 61).

1

(2)  GU L 221 del 7.8.1986, pag. 43. Direttiva modificata da ultimo dalla direttiva 2006/59/CE della Commissione.

2

(3)  GU L 350 del 14.12.1990, pag. 71. Direttiva modificata da ultimo dalla direttiva 2006/59/CE della Commissione.

3

(4)  GU L 230 del 19.8.1991, pag. 1. Direttiva modificata da ultimo dalla direttiva 2006/45/CE della Commissione (GU L 130 del 18.5.2006, pag. 27).

4

(5)  Orientamenti per la stima dell'assunzione di residui di antiparassitari con la dieta alimentare (versione riveduta), a cura del GEMS/Food Programme in collaborazione con il comitato Codex sui residui di antiparassitari; pubblicazione dell'Organizzazione mondiale della sanità, 1997 (WHO/FSF/FOS/97.7).

5

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ALLEGATO I

L’allegato II, parte A, della direttiva 86/362/CEE è modificato come segue:

| 1) | è aggiunta la riga seguente relativa all’atrazina:






  Residui di antiparassitari | Quantità massime in mg/kg |
| --- | --- | --- |
| «Atrazina | 0,05 (1)

  CEREALI |

1)

è aggiunta la riga seguente relativa all’atrazina:

Residui di antiparassitari

Quantità massime in mg/kg

«Atrazina

0,05 (1)

CEREALI

| 2) | il testo delle righe relative ad azinfos-etile, etefon e triazofos è sostituito dal testo seguente:






  Residui di antiparassitari | Quantità massime in mg/kg |
| --- | --- | --- |
| «Azinfos-etile | 0,05 (2)

  CEREALI |
| Etefon | 0,5 orzo, segala
  0,2 triticale, frumento
  0,05 (2) altri cereali |
| Triazofos | 0,02 (2)

  CEREALI |

2)

il testo delle righe relative ad azinfos-etile, etefon e triazofos è sostituito dal testo seguente:

Residui di antiparassitari

Quantità massime in mg/kg

«Azinfos-etile

0,05 (2)

CEREALI

Etefon

0,5 orzo, segala

0,2 triticale, frumento

0,05 (2) altri cereali

Triazofos

0,02 (2)

CEREALI

---

(1)  Indica il limite inferiore di determinazione analitica.»

(2)  Indica il limite inferiore di determinazione analitica.»

---

ALLEGATO II

L’allegato II, parte A, della direttiva 86/363/CEE è modificato come segue:

| 1) | nell'allegato II, parte A, della direttiva 86/363/CEE il testo delle righe relative all’azinfos-etile e al triazofos è sostituito dal testo seguente:








  Residui di antiparassitari | Quantità massime in mg/kg |
| --- | --- | --- |
| | nel grasso contenuto nelle carni, nelle preparazioni di carni, nelle frattaglie e nei grassi animali elencati nell'allegato I ai codici ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 e 1602 (1) (4) | per il latte vaccino e il latte vaccino intero figuranti nell'allegato I, al codice 0401; per altri prodotti alimentari di cui ai codici 0401, 0402, 0405 00 e 0406 conformemente a (2) (4) | nelle uova fresche sgusciate, nelle uova di volatili e nei tuorli elencati nell'allegato I alle voci 0407 00 e 0408 (3) (4) |
| «Azinfos-etile | 0,01 (1) | 0,01 (1) | 0,01 (1) |
| Triazofos | 0,01 (1) | 0,01 (1) | 0,01 (1) |

1)

nell'allegato II, parte A, della direttiva 86/363/CEE il testo delle righe relative all’azinfos-etile e al triazofos è sostituito dal testo seguente:

Residui di antiparassitari

Quantità massime in mg/kg

nel grasso contenuto nelle carni, nelle preparazioni di carni, nelle frattaglie e nei grassi animali elencati nell'allegato I ai codici ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 e 1602 (1) (4)

per il latte vaccino e il latte vaccino intero figuranti nell'allegato I, al codice 0401; per altri prodotti alimentari di cui ai codici 0401, 0402, 0405 00 e 0406 conformemente a (2) (4)

nelle uova fresche sgusciate, nelle uova di volatili e nei tuorli elencati nell'allegato I alle voci 0407 00 e 0408 (3) (4)

«Azinfos-etile

0,01 (1)

0,01 (1)

0,01 (1)

Triazofos

0,01 (1)

0,01 (1)

0,01 (1)

| 2) | nell’allegato II, parte A, della direttiva 86/363/CEE il testo della riga relativa al fention è sostituito dal seguente:








  Residui di antiparassitari | Quantità massime in mg/kg |
| --- | --- | --- |
| | nel grasso contenuto nelle carni, nelle preparazioni di carni, nelle frattaglie e nei grassi animali elencati nell'allegato I ai codici ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 e 1602 (1) (4) | per il latte vaccino e il latte vaccino intero figuranti nell'allegato I, al codice 0401; per altri prodotti alimentari di cui ai codici 0401, 0402, 0405 00 e 0406 conformemente a (2) (4) | nelle uova fresche sgusciate, nelle uova di volatili e nei tuorli elencati nell'allegato I alle voci 0407 00 e 0408 (3) (4) |
| «Fention e il suo analogo ossigenato, i loro sulfossidi e sulfoni espressi in fention | 0,05 (2) | 0,01 (2) | — |

2)

nell’allegato II, parte A, della direttiva 86/363/CEE il testo della riga relativa al fention è sostituito dal seguente:

Residui di antiparassitari

Quantità massime in mg/kg

nel grasso contenuto nelle carni, nelle preparazioni di carni, nelle frattaglie e nei grassi animali elencati nell'allegato I ai codici ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 e 1602 (1) (4)

per il latte vaccino e il latte vaccino intero figuranti nell'allegato I, al codice 0401; per altri prodotti alimentari di cui ai codici 0401, 0402, 0405 00 e 0406 conformemente a (2) (4)

nelle uova fresche sgusciate, nelle uova di volatili e nei tuorli elencati nell'allegato I alle voci 0407 00 e 0408 (3) (4)

«Fention e il suo analogo ossigenato, i loro sulfossidi e sulfoni espressi in fention

0,05 (2)

0,01 (2)

—

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(1)  Indica il limite inferiore di determinazione analitica.»

(2)  Indica il limite inferiore di determinazione analitica.»

---

ALLEGATO III

L’allegato II, parte A, della direttiva 90/642/CEE è modificato come segue.

| 1) | È aggiunta la colonna seguente relativa al fention:









  Gruppi ed esempi di prodotti singoli ai quali si applicano le quantità massime di residui | Fention e il suo analogo ossigenato, i loro sulfossidi e sulfoni espressi in fention |
| --- | --- | --- |
| «1. | Frutta fresche, secche o non cotte, conservate mediante congelamento senza zuccheri addizionati; frutta a guscio | |
| | i) | AGRUMI | 3 |
| | | Pompelmi | |
| | | Limoni | |
| | | Limette | |
| | | Mandarini (comprese clementine e ibridi simili) | |
| | | Arance | |
| | | Pomeli | |
| | | Altro | |
| | ii) | FRUTTA A GUSCIO (con o senza guscio) | 0,01 (1) |
| | | Mandorle | |
| | | Noci del Brasile | |
| | | Noci di anacardio | |
| | | Castagne e marroni | |
| | | Noci di cocco | |
| | | Nocciole | |
| | | Noci del Queensland | |
| | | Noci di pecan | |
| | | Pinoli | |
| | | Pistacchi | |
| | | Noci comuni | |
| | | Altro | |
| | iii) | POMACEE | 0,01 (1) |
| | | Mele | |
| | | Pere | |
| | | Cotogne | |
| | | Altro | |
| | iv) | DRUPACEE | |
| | | Albicocche | |
| | | Ciliege | 2 |
| | | Pesche (comprese pesche noci e altri ibridi) | |
| | | Prugne | |
| | | Altro | 0,01 (1) |
| | v) | BACCHE E PICCOLA FRUTTA | 0,01 (1) |
| | | a) | Uve da tavola e da vino | |
| | | | Uve da tavola | |
| | | | Uve da vino | |
| | | b) | Fragole (escluse le fragole selvatiche) | |
| | | c) | Frutti di piante arbustive (escluse le selvatiche) | |
| | | | More | |
| | | | More palustri | |
| | | | More-lamponi | |
| | | | Lamponi | |
| | | | Altro | |
| | | d) | Altra piccola frutta e bacche (escluse le selvatiche) | |
| | | | Mirtilli neri | |
| | | | Mirtilli di palude | |
| | | | Ribes (rosso, nero e bianco) | |
| | | | Uva spina | |
| | | | Altro | |
| | | e) | Bacche e frutti selvatici | |
| | vi) | FRUTTA VARIA | |
| | | Avocadi | |
| | | Banane | |
| | | Datteri | |
| | | Fichi | |
| | | Kiwi | |
| | | Kumquat | |
| | | Litchi | |
| | | Manghi | |
| | | Olive (da tavola) | 1 |
| | | Olive (da olio) | 1 |
| | | Papaie | |
| | | Passiflore | |
| | | Ananas | |
| | | Altro | 0,01 (1) |
| 2. | Ortaggi, freschi o non cotti, congelati o secchi | 0,01 (1) |
| | i) | ORTAGGI A RADICE E TUBERO | |
| | | Barbabietola rossa (o da orto) | |
| | | Carote | |
| | | Manioca | |
| | | Sedani-rapa | |
| | | Barbaforte | |
| | | Topinambur | |
| | | Pastinaca | |
| | | Prezzemolo a grossa radice | |
| | | Ramolaccio | |
| | | Salsefrica | |
| | | Patate dolci | |
| | | Rutabaga | |
| | | Navoni | |
| | | Igname | |
| | | Altro | |
| | ii) | ORTAGGI A BULBO | |
| | | Agli | |
| | | Cipolle | |
| | | Scalogni | |
| | | Cipolline | |
| | | Altro | |
| | iii) | ORTAGGI A FRUTTO | |
| | | a) | Solanacee | |
| | | | Pomodori | |
| | | | Peperoni | |
| | | | Melanzane | |
| | | | Okra (gombo) | |
| | | | Altro | |
| | | b) | Cucurbitacee (con buccia commestibile) | |
| | | | Cetrioli | |
| | | | Cetriolini | |
| | | | Zucchine | |
| | | | Altro | |
| | | c) | Cucurbitacee con buccia non commestibile | |
| | | | Meloni | |
| | | | Zucche | |
| | | | Cocomeri | |
| | | | Altro | |
| | | d) | Mais dolce | |
| | iv) | CAVOLI | |
| | | a) | Cavoli a infiorescenza | |
| | | | Cavoli broccoli | |
| | | | Cavolfiori | |
| | | | Altro | |
| | | b) | Cavoli da testa | |
| | | | Cavoletti di Bruxelles | |
| | | | Cavoli cappucci | |
| | | | Altro | |
| | | c) | Cavoli a foglia | |
| | | | Cavoli cinesi | |
| | | | Cavoli ricci | |
| | | | Altro | |
| | | d) | Cavoli rapa | |
| | v) | ORTAGGI A FOGLIA ED ERBE FRESCHE | |
| | | a) | Lattughe e simili | |
| | | | Crescione | |
| | | | Dolcetta | |
| | | | Lattughe | |
| | | | Scarola | |
| | | | Rucola | |
| | | | Foglie e steli di brassica | |
| | | | Altro | |
| | | b) | Spinaci e simili | |
| | | | Spinaci | |
| | | | Foglie di rapa (bieta da coste) | |
| | | | Altro | |
| | | c) | Crescione acquatico | |
| | | d) | Witloof | |
| | | e) | Erbe fresche | |
| | | | Cerfoglio | |
| | | | Erba cipollina | |
| | | | Prezzemolo | |
| | | | Foglie di sedano | |
| | | | Altro | |
| | vi) | LEGUMI (freschi) | |
| | | Fagioli (con baccello) | |
| | | Fagioli (senza baccello) | |
| | | Piselli (con baccello) | |
| | | Piselli (senza baccello) | |
| | | Altro | |
| | vii) | ORTAGGI A STELO (freschi) | |
| | | Asparagi | |
| | | Cardi | |
| | | Sedani | |
| | | Finocchi | |
| | | Carciofi | |
| | | Porri | |
| | | Rabarbaro | |
| | | Altro | |
| | viii) | FUNGHI | |
| | | a) | Funghi coltivati | |
| | | b) | Funghi selvatici | |
| 3. | Legumi da granella | 0,01 (1) |
| | Fagioli | |
| | Lenticchie | |
| | Piselli | |
| | Altro | |
| 4. | Semi oleosi | 0,02 (1) |
| | Semi di lino | |
| | Semi di arachide | |
| | Semi di papavero | |
| | Semi di sesamo | |
| | Semi di girasole | |
| | Semi di colza | |
| | Semi di soia | |
| | Semi di senape | |
| | Semi di cotone | |
| | Semi di canapa | |
| | Altro | |
| 5. | Patate | 0,01 (1) |
| | Patate precoci | |
| | Patate tardive | |
| 6. | Tè (foglie e steli di Camellia sinensis essiccati, fermentati o altrimenti lavorati) | 0,1 (1) |
| 7. | Luppolo (essiccato), compresi i panelli di luppolo e la polvere non concentrata | 0,1 (1) |

1)

È aggiunta la colonna seguente relativa al fention:

Gruppi ed esempi di prodotti singoli ai quali si applicano le quantità massime di residui

Fention e il suo analogo ossigenato, i loro sulfossidi e sulfoni espressi in fention

«1.

Frutta fresche, secche o non cotte, conservate mediante congelamento senza zuccheri addizionati; frutta a guscio

i)

AGRUMI

3

Pompelmi

Limoni

Limette

Mandarini (comprese clementine e ibridi simili)

Arance

Pomeli

Altro

ii)

FRUTTA A GUSCIO (con o senza guscio)

0,01 (1)

Mandorle

Noci del Brasile

Noci di anacardio

Castagne e marroni

Noci di cocco

Nocciole

Noci del Queensland

Noci di pecan

Pinoli

Pistacchi

Noci comuni

Altro

iii)

POMACEE

0,01 (1)

Mele

Pere

Cotogne

Altro

iv)

DRUPACEE

Albicocche

Ciliege

2

Pesche (comprese pesche noci e altri ibridi)

Prugne

Altro

0,01 (1)

v)

BACCHE E PICCOLA FRUTTA

0,01 (1)

a)

Uve da tavola e da vino

Uve da tavola

Uve da vino

b)

Fragole (escluse le fragole selvatiche)

c)

Frutti di piante arbustive (escluse le selvatiche)

More

More palustri

More-lamponi

Lamponi

Altro

d)

Altra piccola frutta e bacche (escluse le selvatiche)

Mirtilli neri

Mirtilli di palude

Ribes (rosso, nero e bianco)

Uva spina

Altro

e)

Bacche e frutti selvatici

vi)

FRUTTA VARIA

Avocadi

Banane

Datteri

Fichi

Kiwi

Kumquat

Litchi

Manghi

Olive (da tavola)

1

Olive (da olio)

1

Papaie

Passiflore

Ananas

Altro

0,01 (1)

2.

Ortaggi, freschi o non cotti, congelati o secchi

0,01 (1)

i)

ORTAGGI A RADICE E TUBERO

Barbabietola rossa (o da orto)

Carote

Manioca

Sedani-rapa

Barbaforte

Topinambur

Pastinaca

Prezzemolo a grossa radice

Ramolaccio

Salsefrica

Patate dolci

Rutabaga

Navoni

Igname

Altro

ii)

ORTAGGI A BULBO

Agli

Cipolle

Scalogni

Cipolline

Altro

iii)

ORTAGGI A FRUTTO

a)

Solanacee

Pomodori

Peperoni

Melanzane

Okra (gombo)

Altro

b)

Cucurbitacee (con buccia commestibile)

Cetrioli

Cetriolini

Zucchine

Altro

c)

Cucurbitacee con buccia non commestibile

Meloni

Zucche

Cocomeri

Altro

d)

Mais dolce

iv)

CAVOLI

a)

Cavoli a infiorescenza

Cavoli broccoli

Cavolfiori

Altro

b)

Cavoli da testa

Cavoletti di Bruxelles

Cavoli cappucci

Altro

c)

Cavoli a foglia

Cavoli cinesi

Cavoli ricci

Altro

d)

Cavoli rapa

v)

ORTAGGI A FOGLIA ED ERBE FRESCHE

a)

Lattughe e simili

Crescione

Dolcetta

Lattughe

Scarola

Rucola

Foglie e steli di brassica

Altro

b)

Spinaci e simili

Spinaci

Foglie di rapa (bieta da coste)

Altro

c)

Crescione acquatico

d)

Witloof

e)

Erbe fresche

Cerfoglio

Erba cipollina

Prezzemolo

Foglie di sedano

Altro

vi)

LEGUMI (freschi)

Fagioli (con baccello)

Fagioli (senza baccello)

Piselli (con baccello)

Piselli (senza baccello)

Altro

vii)

ORTAGGI A STELO (freschi)

Asparagi

Cardi

Sedani

Finocchi

Carciofi

Porri

Rabarbaro

Altro

viii)

FUNGHI

a)

Funghi coltivati

b)

Funghi selvatici

3.

Legumi da granella

0,01 (1)

Fagioli

Lenticchie

Piselli

Altro

4.

Semi oleosi

0,02 (1)

Semi di lino

Semi di arachide

Semi di papavero

Semi di sesamo

Semi di girasole

Semi di colza

Semi di soia

Semi di senape

Semi di cotone

Semi di canapa

Altro

5.

Patate

0,01 (1)

Patate precoci

Patate tardive

6.

Tè (foglie e steli di Camellia sinensis essiccati, fermentati o altrimenti lavorati)

0,1 (1)

7.

Luppolo (essiccato), compresi i panelli di luppolo e la polvere non concentrata

0,1 (1)

| 2) | Il testo delle colonne relative ad atrazina, azinfos-etile, ciflutrin, etefon, metamidofos, metomil, paraquat e triazofos è sostituito dal testo seguente:
















  Gruppi ed esempi di prodotti singoli ai quali si applicano le quantità massime di residui | Atrazina | Azinfos-etile | Ciflutrin compresi altri miscugli di costituenti isomeri (somma degli isomeri) | Etefon | Metamidofos | Metomil/tiodicarb (somma espressa come metomil) | Paraquat | Triazofos |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| «1. | Frutta fresche, secche o non cotte, conservate mediante congelamento senza zuccheri addizionati; frutta a guscio | 0,05 (2) | 0,02 (2) | | | | | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | i) | AGRUMI | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | | | |
| | | Pompelmi | | | | | | 0,5 | | |
| | | Limoni | | | | | | 1 | | |
| | | Limette | | | | | | 1 | | |
| | | Mandarini (comprese clementine e ibridi simili) | | | | | | 1 | | |
| | | Arance | | | | | | 0,5 | | |
| | | Pomeli | | | | | | 0,5 | | |
| | | Altro | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | ii) | FRUTTA A GUSCIO (con o senza guscio) | | | 0,02 (2) | 0,1 | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | Mandorle | | | | | | | | |
| | | Noci del Brasile | | | | | | | | |
| | | Noci di anacardio | | | | | | | | |
| | | Castagne e marroni | | | | | | | | |
| | | Noci di cocco | | | | | | | | |
| | | Nocciole | | | | | | | | |
| | | Noci del Queensland | | | | | | | | |
| | | Noci di pecan | | | | | | | | |
| | | Pinoli | | | | | | | | |
| | | Pistacchi | | | | | | | | |
| | | Noci comuni | | | | | | | | |
| | | Altro | | | | | | | | |
| | iii) | POMACEE | | | 0,2 | | 0,01 (2) | 0,2 | | |
| | | Mele | | | | 0,5 | | | | |
| | | Pere | | | | | | | | |
| | | Cotogne | | | | | | | | |
| | | Altro | | | | 0,05 (2) | | | | |
| | iv) | DRUPACEE | | | | | | | | |
| | | Albicocche | | | 0,3 | | 0,1 | 0,2 | | |
| | | Ciliege | | | 0,2 | 3 | | 0,1 | | |
| | | Pesche (comprese pesche noci e altri ibridi) | | | 0,3 | | 0,05 | 0,2 | | |
| | | Prugne | | | 0,2 | | | 0,5 | | |
| | | Altro | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | v) | BACCHE E PICCOLA FRUTTA | | | | | 0,01 (2) | | | |
| | | a) | Uve da tavola e da vino | | | 0,3 | 1 | | | | |
| | | | Uve da tavola | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | | | Uve da vino | | | | | | 1 | | |
| | | b) | Fragole (escluse le fragole selvatiche) | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | c) | Frutti di piante arbustive (escluse le selvatiche) | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | | More | | | | | | | | |
| | | | More palustri | | | | | | | | |
| | | | More-lamponi | | | | | | | | |
| | | | Lamponi | | | | | | | | |
| | | | Altro | | | | | | | | |
| | | d) | Altra piccola frutta e bacche (escluse le selvatiche) | | | 0,02 (2) | | | 0,05 (2) | | |
| | | | Mirtilli neri | | | | | | | | |
| | | | Mirtilli di palude | | | | | | | | |
| | | | Ribes (rosso, nero e bianco) | | | | 5 | | | | |
| | | | Uva spina | | | | | | | | |
| | | | Altro | | | | 0,05 (2) | | | | |
| | | e) | Bacche e frutti selvatici | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | vi) | FRUTTA VARIA | | | 0,02 (2) | | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | Avocadi | | | | | | | | |
| | | Banane | | | | | | | | |
| | | Datteri | | | | | | | | |
| | | Fichi | | | | | | | | |
| | | Kiwi | | | | | | | | |
| | | Kumquat | | | | | | | | |
| | | Litchi | | | | | | | | |
| | | Manghi | | | | | | | | |
| | | Olive (da tavola) | | | | | | | | |
| | | Olive (da olio) | | | | | | | | |
| | | Papaie | | | | | | | | |
| | | Passiflore | | | | | | | | |
| | | Ananas | | | | 2 | | | | |
| | | Altro | | | | 0,05 (2) | | | | |
| 2. | Ortaggi, freschi o non cotti, congelati o secchi | | 0,02 (2) | | | | | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | i) | ORTAGGI A RADICE E TUBERO | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | | | |
| | | Barbabietola rossa (o da orto) | | | | | | | | |
| | | Carote | | | | | | | | |
| | | Manioca | | | | | | | | |
| | | Sedani-rapa | | | | | | | | |
| | | Barbaforte | | | | | | | | |
| | | Topinambur | | | | | | | | |
| | | Pastinaca | | | | | | | | |
| | | Prezzemolo a grossa radice | | | | | | | | |
| | | Ramolaccio | | | | | | 0,5 | | |
| | | Salsefrica | | | | | | | | |
| | | Patate dolci | | | | | | | | |
| | | Rutabaga | | | | | | | | |
| | | Navoni | | | | | | | | |
| | | Igname | | | | | | | | |
| | | Altro | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | ii) | ORTAGGI A BULBO | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | Agli | | | | | | | | |
| | | Cipolle | | | | | | | | |
| | | Scalogni | | | | | | | | |
| | | Cipolline | | | | | | | | |
| | | Altro | | | | | | | | |
| | iii) | ORTAGGI A FRUTTO | | | | | 0,01 (2) | | | |
| | | a) | Solanacee | 0,05 (2) | | | | | | | |
| | | | Pomodori | | | 0,05 | 1 | | 0,2 | | |
| | | | Peperoni | | | 0,3 | 3 | | | | |
| | | | Melanzane | | | | | | 0,2 | | |
| | | | Okra (gombo) | | | | | | | | |
| | | | Altro | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | b) | Cucurbitacee (con buccia commestibile) | 0,05 (2) | | | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | | Cetrioli | | | 0,1 | | | | | |
| | | | Cetriolini | | | | | | | | |
| | | | Zucchine | | | | | | | | |
| | | | Altro | | | 0,02 (2) | | | | | |
| | | c) | Cucurbitacee con buccia non commestibile | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | | Meloni | | | | | | | | |
| | | | Zucche | | | | | | | | |
| | | | Cocomeri | | | | | | | | |
| | | | Altro | | | | | | | | |
| | | d) | Mais dolce | 0,1 | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | iv) | CAVOLI | 0,05 (2) | | | 0,05 (2) | | | | |
| | | a) | Cavoli a infiorescenza | | | 0,05 | | 0,02 | | | |
| | | | Cavoli broccoli | | | | | | 0,2 | | |
| | | | Cavolfiori | | | | | | | | |
| | | | Altro | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | | b) | Cavoli da testa | | | 0,2 | | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | | Cavoletti di Bruxelles | | | | | | | | |
| | | | Cavoli cappucci | | | | | | | | |
| | | | Altro | | | | | | | | |
| | | c) | Cavoli a foglia | | | 0,3 | | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | | Cavoli cinesi | | | | | | | | |
| | | | Cavoli ricci | | | | | | | | |
| | | | Altro | | | | | | | | |
| | | d) | Cavoli rapa | | | 0,02 (2) | | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | v) | ORTAGGI A FOGLIA ED ERBE FRESCHE | 0,05 (2) | | | 0,05 (2) | 0,01 (2) | | | |
| | | a) | Lattughe e simili | | | 0,5 | | | | | |
| | | | Crescione | | | | | | | | |
| | | | Dolcetta | | | | | | | | |
| | | | Lattughe | | | | | | 0,3 | | |
| | | | Scarola | | | | | | | | |
| | | | Rucola | | | | | | | | |
| | | | Foglie e steli di brassica | | | | | | | | |
| | | | Altro | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | | b) | Spinaci e simili | | | 0,02 (2) | | | | | |
| | | | Spinaci | | | | | | 0,05 | | |
| | | | Foglie di rapa (bieta da coste) | | | | | | | | |
| | | | Altro | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | | c) | Crescione acquatico | | | 0,02 (2) | | | 0,05 (2) | | |
| | | d) | Witloof | | | 0,02 (2) | | | 0,05 (2) | | |
| | | e) | Erbe fresche | | | 0,02 (2) | | | 0,3 | | |
| | | | Cerfoglio | | | | | | | | |
| | | | Erba cipollina | | | | | | | | |
| | | | Prezzemolo | | | | | | | | |
| | | | Foglie di sedano | | | | | | | | |
| | | | Altro | | | | | | | | |
| | vi) | LEGUMI (freschi) | 0,05 (2) | | 0,05 | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | Fagioli (con baccello) | | | | | 0,5 | | | |
| | | Fagioli (senza baccello) | | | | | | | | |
| | | Piselli (con baccello) | | | | | 0,5 | | | |
| | | Piselli (senza baccello) | | | | | | | | |
| | | Altro | | | | | 0,01 (2) | | | |
| | vii) | ORTAGGI A STELO (freschi) | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | Asparagi | | | | | | | | |
| | | Cardi | | | | | | | | |
| | | Sedani | | | | | | | | |
| | | Finocchi | | | | | | | | |
| | | Carciofi | | | | | 0,1 | | | |
| | | Porri | | | | | | | | |
| | | Rabarbaro | | | | | | | | |
| | | Altro | | | | | 0,01 (2) | | | |
| | viii) | FUNGHI | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | a) | Funghi coltivati | | | | | | | | |
| | | b) | Funghi selvatici | | | | | | | | |
| 3. | Legumi da granella | 0,05 (2) | 0,02 (2) | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | Fagioli | | | | | | | | |
| | Lenticchie | | | | | | | | |
| | Piselli | | | | | | | | |
| | Altro | | | | | | | | |
| 4. | Semi oleosi | 0,05 (2) | 0,02 (2) | | | | | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | Semi di lino | | | | | | | | |
| | Semi di arachide | | | | | | 0,1 | | |
| | Semi di papavero | | | | | | | | |
| | Semi di sesamo | | | | | | | | |
| | Semi di girasole | | | | | | | | |
| | Semi di colza | | | 0,05 | | | | | |
| | Semi di soia | | | | | 0,2 | 0,1 | | |
| | Semi di senape | | | | | | | | |
| | Semi di cotone | | | | 2 | 0,2 | 0,1 | | |
| | Semi di canapa | | | | | | | | |
| | Altro | | | 0,02 (2) | 0,1 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| 5. | patate | 0,05 (2) | 0,02 (2) | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | Patate precoci | | | | | | | | |
| | Patate tardive | | | | | | | | |
| 6. | Tè (foglie e steli di Camellia sinensis essiccati, fermentati o altrimenti lavorati) | 0,1 (2) | 0,05 (2) | 0,1 (2) | 0,1 (2) | 0,02 (2) | 0,1 (2) | 0,05 (2) | 0,02 (2) |
| 7. | Luppolo (essiccato), compresi i panelli di luppolo e la polvere non concentrata | 0,1 (2) | 0,05 (2) | 20 | 0,1 (2) | 0,02 (2) | 10 | 0,05 (2) | 0,02 (2) |

2)

Il testo delle colonne relative ad atrazina, azinfos-etile, ciflutrin, etefon, metamidofos, metomil, paraquat e triazofos è sostituito dal testo seguente:

Gruppi ed esempi di prodotti singoli ai quali si applicano le quantità massime di residui

Atrazina

Azinfos-etile

Ciflutrin compresi altri miscugli di costituenti isomeri (somma degli isomeri)

Etefon

Metamidofos

Metomil/tiodicarb (somma espressa come metomil)

Paraquat

Triazofos

«1.

Frutta fresche, secche o non cotte, conservate mediante congelamento senza zuccheri addizionati; frutta a guscio

0,05 (2)

0,02 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

i)

AGRUMI

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

Pompelmi

0,5

Limoni

1

Limette

1

Mandarini (comprese clementine e ibridi simili)

1

Arance

0,5

Pomeli

0,5

Altro

0,05 (2)

ii)

FRUTTA A GUSCIO (con o senza guscio)

0,02 (2)

0,1

0,01 (2)

0,05 (2)

Mandorle

Noci del Brasile

Noci di anacardio

Castagne e marroni

Noci di cocco

Nocciole

Noci del Queensland

Noci di pecan

Pinoli

Pistacchi

Noci comuni

Altro

iii)

POMACEE

0,2

0,01 (2)

0,2

Mele

0,5

Pere

Cotogne

Altro

0,05 (2)

iv)

DRUPACEE

Albicocche

0,3

0,1

0,2

Ciliege

0,2

3

0,1

Pesche (comprese pesche noci e altri ibridi)

0,3

0,05

0,2

Prugne

0,2

0,5

Altro

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

v)

BACCHE E PICCOLA FRUTTA

0,01 (2)

a)

Uve da tavola e da vino

0,3

1

Uve da tavola

0,05 (2)

Uve da vino

1

b)

Fragole (escluse le fragole selvatiche)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

c)

Frutti di piante arbustive (escluse le selvatiche)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

More

More palustri

More-lamponi

Lamponi

Altro

d)

Altra piccola frutta e bacche (escluse le selvatiche)

0,02 (2)

0,05 (2)

Mirtilli neri

Mirtilli di palude

Ribes (rosso, nero e bianco)

5

Uva spina

Altro

0,05 (2)

e)

Bacche e frutti selvatici

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

vi)

FRUTTA VARIA

0,02 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

Avocadi

Banane

Datteri

Fichi

Kiwi

Kumquat

Litchi

Manghi

Olive (da tavola)

Olive (da olio)

Papaie

Passiflore

Ananas

2

Altro

0,05 (2)

2.

Ortaggi, freschi o non cotti, congelati o secchi

0,02 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

i)

ORTAGGI A RADICE E TUBERO

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

Barbabietola rossa (o da orto)

Carote

Manioca

Sedani-rapa

Barbaforte

Topinambur

Pastinaca

Prezzemolo a grossa radice

Ramolaccio

0,5

Salsefrica

Patate dolci

Rutabaga

Navoni

Igname

Altro

0,05 (2)

ii)

ORTAGGI A BULBO

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

Agli

Cipolle

Scalogni

Cipolline

Altro

iii)

ORTAGGI A FRUTTO

0,01 (2)

a)

Solanacee

0,05 (2)

Pomodori

0,05

1

0,2

Peperoni

0,3

3

Melanzane

0,2

Okra (gombo)

Altro

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

b)

Cucurbitacee (con buccia commestibile)

0,05 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

Cetrioli

0,1

Cetriolini

Zucchine

Altro

0,02 (2)

c)

Cucurbitacee con buccia non commestibile

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

Meloni

Zucche

Cocomeri

Altro

d)

Mais dolce

0,1

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

iv)

CAVOLI

0,05 (2)

0,05 (2)

a)

Cavoli a infiorescenza

0,05

0,02

Cavoli broccoli

0,2

Cavolfiori

Altro

0,05 (2)

b)

Cavoli da testa

0,2

0,01 (2)

0,05 (2)

Cavoletti di Bruxelles

Cavoli cappucci

Altro

c)

Cavoli a foglia

0,3

0,01 (2)

0,05 (2)

Cavoli cinesi

Cavoli ricci

Altro

d)

Cavoli rapa

0,02 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

v)

ORTAGGI A FOGLIA ED ERBE FRESCHE

0,05 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

a)

Lattughe e simili

0,5

Crescione

Dolcetta

Lattughe

0,3

Scarola

Rucola

Foglie e steli di brassica

Altro

0,05 (2)

b)

Spinaci e simili

0,02 (2)

Spinaci

0,05

Foglie di rapa (bieta da coste)

Altro

0,05 (2)

c)

Crescione acquatico

0,02 (2)

0,05 (2)

d)

Witloof

0,02 (2)

0,05 (2)

e)

Erbe fresche

0,02 (2)

0,3

Cerfoglio

Erba cipollina

Prezzemolo

Foglie di sedano

Altro

vi)

LEGUMI (freschi)

0,05 (2)

0,05

0,05 (2)

0,05 (2)

Fagioli (con baccello)

0,5

Fagioli (senza baccello)

Piselli (con baccello)

0,5

Piselli (senza baccello)

Altro

0,01 (2)

vii)

ORTAGGI A STELO (freschi)

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

Asparagi

Cardi

Sedani

Finocchi

Carciofi

0,1

Porri

Rabarbaro

Altro

0,01 (2)

viii)

FUNGHI

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

a)

Funghi coltivati

b)

Funghi selvatici

3.

Legumi da granella

0,05 (2)

0,02 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

Fagioli

Lenticchie

Piselli

Altro

4.

Semi oleosi

0,05 (2)

0,02 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

Semi di lino

Semi di arachide

0,1

Semi di papavero

Semi di sesamo

Semi di girasole

Semi di colza

0,05

Semi di soia

0,2

0,1

Semi di senape

Semi di cotone

2

0,2

0,1

Semi di canapa

Altro

0,02 (2)

0,1 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

5.

patate

0,05 (2)

0,02 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

Patate precoci

Patate tardive

6.

Tè (foglie e steli di Camellia sinensis essiccati, fermentati o altrimenti lavorati)

0,1 (2)

0,05 (2)

0,1 (2)

0,1 (2)

0,02 (2)

0,1 (2)

0,05 (2)

0,02 (2)

7.

Luppolo (essiccato), compresi i panelli di luppolo e la polvere non concentrata

0,1 (2)

0,05 (2)

20

0,1 (2)

0,02 (2)

10

0,05 (2)

0,02 (2)

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(1)  Indica il limite inferiore di determinazione analitica.»

(2)  Indica il limite inferiore di determinazione analitica.»

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| 27.7.2006 | IT | Gazzetta ufficiale dell’Unione europea | L 206/27 |
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27.7.2006

IT

Gazzetta ufficiale dell’Unione europea

L 206/27

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DIRETTIVA 2006/62/CE DELLA COMMISSIONE

del 12 luglio 2006

che modifica gli allegati delle direttive 76/895/CEE, 86/362/CEE, 86/363/CEE e 90/642/CEE del Consiglio per quanto riguarda i livelli massimi di residui di desmedifam, fenmedifam e clorfenvinfos

(Testo rilevante ai fini del SEE)

LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,

visto il trattato che istituisce la Comunità europea,

vista la direttiva 76/895/CEE del Consiglio, del 23 novembre 1976, che fissa le quantità massime di residui di antiparassitari consentite sugli e negli ortofrutticoli (1), in particolare l'articolo 5,

vista la direttiva 86/362/CEE del Consiglio, del 24 luglio 1986, che fissa le quantità massime di residui di antiparassitari sui e nei cereali (2), in particolare l'articolo 10,

vista la direttiva 86/363/CEE del Consiglio, del 24 luglio 1986, che fissa le quantità massime di residui di antiparassitari sui e nei prodotti alimentari di origine animale (3), in particolare l'articolo 10,

vista la direttiva 90/642/CEE del Consiglio, del 27 novembre 1990, che fissa le quantità massime di residui di antiparassitari su e in alcuni prodotti di origine vegetale, compresi gli ortofrutticoli (4), in particolare l'articolo 7,

vista la direttiva 91/414/CEE del Consiglio, del 15 luglio 1991, relativa all’immissione in commercio dei prodotti fitosanitari (5), in particolare l’articolo 4, paragrafo 1, lettera f),

considerando quanto segue:

| (1) | Le sostanze attive esistenti desmedifam e fenmedifam sono state iscritte nell'allegato I della direttiva 91/414/CEE dalla direttiva 2004/58/CE della Commissione (6). |
| --- | --- |

(1)

Le sostanze attive esistenti desmedifam e fenmedifam sono state iscritte nell'allegato I della direttiva 91/414/CEE dalla direttiva 2004/58/CE della Commissione (6).

| (2) | L'iscrizione nell'allegato I della direttiva 91/414/CEE delle sostanze attive in questione si è basata sulla valutazione delle informazioni fornite in merito all’impiego proposto. Alcuni Stati membri hanno trasmesso informazioni relative a tale impiego, conformemente all'articolo 4, paragrafo 1, lettera f), della direttiva 91/414/CEE. Le informazioni disponibili sono state riesaminate e risultano sufficienti per fissare alcuni limiti massimi di residui (LMR). |
| --- | --- |

(2)

L'iscrizione nell'allegato I della direttiva 91/414/CEE delle sostanze attive in questione si è basata sulla valutazione delle informazioni fornite in merito all’impiego proposto. Alcuni Stati membri hanno trasmesso informazioni relative a tale impiego, conformemente all'articolo 4, paragrafo 1, lettera f), della direttiva 91/414/CEE. Le informazioni disponibili sono state riesaminate e risultano sufficienti per fissare alcuni limiti massimi di residui (LMR).

| (3) | Per quanto riguarda il clorfenvinfos, il regolamento (CE) n. 2076/2002 della Commissione (7), prevede che tale sostanza non sia iscritta nell’allegato I della direttiva 91/414/CEE. In taluni Stati membri possono essere mantenute determinate autorizzazioni relative all’impiego di prodotti contenenti clorfenvinfos fino al 30 giugno 2007. |
| --- | --- |

(3)

Per quanto riguarda il clorfenvinfos, il regolamento (CE) n. 2076/2002 della Commissione (7), prevede che tale sostanza non sia iscritta nell’allegato I della direttiva 91/414/CEE. In taluni Stati membri possono essere mantenute determinate autorizzazioni relative all’impiego di prodotti contenenti clorfenvinfos fino al 30 giugno 2007.

| (4) | Per il clorfenvinfos sono già stati fissati LMR comunitari nella direttiva 76/895/CEE. Occorre che tali LMR siano presi in considerazione nel fissare gli LMR per il clorfenvinfos nella direttiva 90/642/CEE. |
| --- | --- |

(4)

Per il clorfenvinfos sono già stati fissati LMR comunitari nella direttiva 76/895/CEE. Occorre che tali LMR siano presi in considerazione nel fissare gli LMR per il clorfenvinfos nella direttiva 90/642/CEE.

| (5) | Le relazioni d’esame della Commissione, elaborate ai fini dell’iscrizione delle sostanze attive in questione nell’allegato I della direttiva 91/414/CEE, fissano la dose giornaliera ammissibile (DGA) e, ove necessario, la dose acuta di riferimento (DAR) per tali sostanze. L'esposizione dei consumatori di prodotti alimentari trattati con le sostanze attive in questione è stata esaminata e valutata conformemente alle procedure comunitarie. Si è inoltre tenuto conto degli orientamenti pubblicati dall'Organizzazione mondiale della sanità (8) nonché del parere del comitato scientifico per le piante (9) sulla metodologia applicata. Si è concluso che gli LMR proposti non comporteranno il superamento di dette DGA o DAR. |
| --- | --- |

(5)

Le relazioni d’esame della Commissione, elaborate ai fini dell’iscrizione delle sostanze attive in questione nell’allegato I della direttiva 91/414/CEE, fissano la dose giornaliera ammissibile (DGA) e, ove necessario, la dose acuta di riferimento (DAR) per tali sostanze. L'esposizione dei consumatori di prodotti alimentari trattati con le sostanze attive in questione è stata esaminata e valutata conformemente alle procedure comunitarie. Si è inoltre tenuto conto degli orientamenti pubblicati dall'Organizzazione mondiale della sanità (8) nonché del parere del comitato scientifico per le piante (9) sulla metodologia applicata. Si è concluso che gli LMR proposti non comporteranno il superamento di dette DGA o DAR.

| (6) | Per un'adeguata tutela del consumatore contro l'esposizione a residui derivanti da impieghi non autorizzati di prodotti fitosanitari, occorre fissare LMR provvisori per le corrispondenti combinazioni prodotto/antiparassitario al limite inferiore di determinazione analitica. |
| --- | --- |

(6)

Per un'adeguata tutela del consumatore contro l'esposizione a residui derivanti da impieghi non autorizzati di prodotti fitosanitari, occorre fissare LMR provvisori per le corrispondenti combinazioni prodotto/antiparassitario al limite inferiore di determinazione analitica.

| (7) | La fissazione a livello comunitario di tali LMR provvisori non impedisce che gli Stati membri stabiliscano LMR provvisori per le sostanze in questione, conformemente all'articolo 4, paragrafo 1, lettera f), della direttiva 91/414/CEE e al suo allegato VI. Si ritiene che un periodo di quattro anni sia sufficiente per permettere altre utilizzazioni della sostanza attiva in questione. Dopodiché gli LMR provvisori dovrebbero diventare definitivi. |
| --- | --- |

(7)

La fissazione a livello comunitario di tali LMR provvisori non impedisce che gli Stati membri stabiliscano LMR provvisori per le sostanze in questione, conformemente all'articolo 4, paragrafo 1, lettera f), della direttiva 91/414/CEE e al suo allegato VI. Si ritiene che un periodo di quattro anni sia sufficiente per permettere altre utilizzazioni della sostanza attiva in questione. Dopodiché gli LMR provvisori dovrebbero diventare definitivi.

| (8) | È quindi necessario inserire negli allegati delle direttive 86/362/CEE, 86/363/CEE e 90/642/CEE tutti gli LMR derivanti dall'impiego di detti prodotti fitosanitari, per consentire una sorveglianza e un controllo adeguati dell’osservanza del divieto del loro impiego e proteggere il consumatore. Qualora gli LMR non siano ancora stati definiti, occorre fissarli per la prima volta. |
| --- | --- |

(8)

È quindi necessario inserire negli allegati delle direttive 86/362/CEE, 86/363/CEE e 90/642/CEE tutti gli LMR derivanti dall'impiego di detti prodotti fitosanitari, per consentire una sorveglianza e un controllo adeguati dell’osservanza del divieto del loro impiego e proteggere il consumatore. Qualora gli LMR non siano ancora stati definiti, occorre fissarli per la prima volta.

| (9) | Occorre di conseguenza sopprimere le disposizioni della direttiva 76/895/CEE che fissano gli LMR per il clorfenvinfos. |
| --- | --- |

(9)

Occorre di conseguenza sopprimere le disposizioni della direttiva 76/895/CEE che fissano gli LMR per il clorfenvinfos.

| (10) | È pertanto opportuno modificare di conseguenza le direttive 76/895/CEE, 86/362/CEE, 86/363/CEE e 90/642/CEE. |
| --- | --- |

(10)

È pertanto opportuno modificare di conseguenza le direttive 76/895/CEE, 86/362/CEE, 86/363/CEE e 90/642/CEE.

| (11) | Le misure previste dalla presente direttiva sono conformi al parere del comitato permanente per la catena alimentare e la salute degli animali, |
| --- | --- |

(11)

Le misure previste dalla presente direttiva sono conformi al parere del comitato permanente per la catena alimentare e la salute degli animali,

HA ADOTTATO LA PRESENTE DIRETTIVA:

Articolo 1

Nell'allegato II della direttiva 76/895/CEE la riga corrispondente al clorfenvinfos è soppressa.

Articolo 2

L’allegato II della direttiva 86/362/CEE è modificato conformemente all’allegato I della presente direttiva.

Articolo 3

L’allegato II della direttiva 86/363/CEE è modificato conformemente all’allegato II della presente direttiva.

Articolo 4

L’allegato II della direttiva 90/642/CEE è modificato conformemente all’allegato III della presente direttiva.

Articolo 5

1.   Gli Stati membri adottano e pubblicano le disposizioni legislative, regolamentari e amministrative necessarie per conformarsi alla presente direttiva entro il 20 gennaio 2008. Essi comunicano immediatamente alla Commissione il testo di tali disposizioni, nonché una tavola di concordanza tra queste ultime e la presente direttiva.

Essi applicano tali disposizioni a decorrere dal 21 gennaio 2008.

Quando gli Stati membri adottano tali disposizioni, queste contengono un riferimento alla presente direttiva oppure sono corredate di tale riferimento all'atto della loro pubblicazione ufficiale. Le modalità del riferimento sono decise dagli Stati membri.

2.   Gli Stati membri comunicano alla Commissione il testo delle disposizioni essenziali di diritto interno che essi adottano nel settore disciplinato dalla presente direttiva.

Articolo 6

La presente direttiva entra in vigore il ventesimo giorno successivo alla pubblicazione nella Gazzetta ufficiale dell’Unione europea.

Articolo 7

Gli Stati membri sono destinatari della presente direttiva.

Fatto a Bruxelles, il 12 luglio 2006.

Per la Commissione

Markos KYPRIANOU

Membro della Commissione

---

(1)  GU L 340 del 9.12.1976, pag. 26. Direttiva modificata da ultimo dalla direttiva 2006/59/CE della Commissione (GU L 175 del 29.6.2006, pag. 61).

1

(2)  GU L 221 del 7.8.1986, pag. 37. Direttiva modificata da ultimo dalla direttiva 2006/59/CE della Commissione.

2

(3)  GU L 221 del 7.8.1986, pag. 43. Direttiva modificata da ultimo dalla direttiva 2006/59/CE della Commissione.

3

(4)  GU L 350 del 14.12.1990, pag. 71. Direttiva modificata da ultimo dalla direttiva 2006/59/CE della Commissione.

4

(5)  GU L 230 del 19.8.1991, pag. 1. Direttiva modificata da ultimo dalla direttiva 2006/45/CE della Commissione (GU L 130 del 18.5.2006, pag. 27).

5

(6)  GU L 120 del 24.4.2004, pag. 26.

6

(7)  GU L 319 del 23.11.2002, pag. 3. Regolamento modificato da ultimo dal regolamento (CE) n. 1335/2005 (GU L 211 del 13.8.2005, pag. 6).

7

(8)  Orientamenti per la stima dell'assunzione di residui di antiparassitari con gli alimenti (versione riveduta), a cura del GEMS/Food Programme in collaborazione con il Comitato Codex sui residui di antiparassitari; pubblicazione dell'Organizzazione mondiale della sanità, 1997 (WHO/FSF/FOS/97.7).

8

(9)  Parere del comitato scientifico per le piante sui problemi riguardanti la modificazione degli allegati delle direttive 86/362/CEE, 86/363/CEE e 90/642/CEE del Consiglio (parere del comitato scientifico per le piante del 14 luglio 1998) (http://europa.eu.int/comm/food/fs/sc/index_it.html).

9

---

ALLEGATO I

Nell'allegato II, parte A, della direttiva 86/362/CEE sono aggiunte le righe seguenti relative alle sostanze desmedifam, fenmedifam e clorfenvinfos:

| Residui di antiparassitari | Quantità massime in mg/kg |
| --- | --- |
| «Desmedifam | 0,05 (1)
   (2) cereali |
| Fenmedifam | 0,05 (1)
   (2) cereali |
| Clorfenvinfos (somma degli isomeri E e Z) | 0,02 (1) cereali |

Residui di antiparassitari

Quantità massime in mg/kg

«Desmedifam

0,05 (1)
   (2) cereali

Fenmedifam

0,05 (1)
   (2) cereali

Clorfenvinfos (somma degli isomeri E e Z)

0,02 (1) cereali

---

(1)  Indica il limite inferiore di determinazione analitica.

1

(2)  Indica che la quantità massima di residui è stata fissata provvisoriamente a norma dell’articolo 4, paragrafo 1, lettera f), della direttiva 91/414/CEE.»

2

---

ALLEGATO II

L'allegato II della direttiva 86/363/CEE è modificato come segue:

| 1) | nella parte A è aggiunta la seguente riga per il clorfenvinfos:








  Residui di antiparassitari | Quantità massime in mg/kg |
| --- | --- | --- |
| | di grasso contenuto in carni, preparazioni a base di carne, frattaglie e grassi animali elencati nell'allegato I, di cui ai codici NC ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 e 1602 (1) (4) | per il latte vaccino e il latte vaccino intero figuranti nell'allegato I, di cui al codice NC 0401; per altri prodotti alimentari di cui ai codici 0401, 0402, 0405 00 e 0406 conformemente a (2) (4) | di uova fresche in guscio, uova di volatili e tuorli d'uovo elencati nell'allegato I, di cui ai codici NC 0407 00 e 0408 (3) (4) |
| «Clorfenvinfos (somma degli isomeri E e Z) | 0,01 (1) | 0,01 (1) | 0,01 (1) |

1)

nella parte A è aggiunta la seguente riga per il clorfenvinfos:

Residui di antiparassitari

Quantità massime in mg/kg

di grasso contenuto in carni, preparazioni a base di carne, frattaglie e grassi animali elencati nell'allegato I, di cui ai codici NC ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 e 1602 (1) (4)

per il latte vaccino e il latte vaccino intero figuranti nell'allegato I, di cui al codice NC 0401; per altri prodotti alimentari di cui ai codici 0401, 0402, 0405 00 e 0406 conformemente a (2) (4)

di uova fresche in guscio, uova di volatili e tuorli d'uovo elencati nell'allegato I, di cui ai codici NC 0407 00 e 0408 (3) (4)

«Clorfenvinfos (somma degli isomeri E e Z)

0,01 (1)

0,01 (1)

0,01 (1)

| 2) | nella parte B è aggiunta la seguente riga per il fenmedifam:








  Residui di antiparassitari | Quantità massime in mg/kg |
| --- | --- | --- |
| | di carni, inclusi i grassi, preparazioni a base di carne, frattaglie e grassi animali elencati nell'allegato I, di cui ai codici NC 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 e 1602 | per il latte e i prodotti lattiero-caseari dell'allegato I, di cui ai codici NC 0401, 0402, 0405 00 e 0406 | di uova fresche in guscio, uova di volatili e tuorli d'uovo elencati nell'allegato I, di cui ai codici NC 0407 00 e 0408 |
| «Fenmedifam [metil-N-(3-idrossifenil) carbammato (MHPC) espresso in fenmedifam] | 0,05 (2)
   (3) | 0,05 (2)
   (3) | 0,05 (2)
   (3) |

2)

nella parte B è aggiunta la seguente riga per il fenmedifam:

Residui di antiparassitari

Quantità massime in mg/kg

di carni, inclusi i grassi, preparazioni a base di carne, frattaglie e grassi animali elencati nell'allegato I, di cui ai codici NC 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 e 1602

per il latte e i prodotti lattiero-caseari dell'allegato I, di cui ai codici NC 0401, 0402, 0405 00 e 0406

di uova fresche in guscio, uova di volatili e tuorli d'uovo elencati nell'allegato I, di cui ai codici NC 0407 00 e 0408

«Fenmedifam [metil-N-(3-idrossifenil) carbammato (MHPC) espresso in fenmedifam]

0,05 (2)
   (3)

0,05 (2)
   (3)

0,05 (2)
   (3)

---

(1)  Indica il limite inferiore di determinazione analitica.»

(2)  Indica il limite inferiore di determinazione analitica.

(3)  Indica che la quantità massima di residui è stata fissata provvisoriamente a norma dell’articolo 4, paragrafo 1, lettera f), della direttiva 91/414/CEE. Salvo modifica, tale quantità massima diverrà definitiva il 9 agosto 2010.»

---

ALLEGATO III

Nell'allegato II, parte A, della direttiva 90/642/CEE sono aggiunte le colonne seguenti, relative alle sostanze desmedifam, fenmedifam e clorfenvinfos:

| Residui di antiparassitari e percentuali massime di residui (mg/kg) |
| --- |
| Categorie e esempi di singoli prodotti ai quali si applicano le quantità massime di residui | Desmedifam | Fenmedifam | Clorfenvinfos (somma degli isomeri E e Z) |
| «1. | Frutta fresche, secche o non cotte, conservate mediante congelamento senza zuccheri addizionati; frutta a guscio | 0,05 (1)
   (2) | | 0,02 (1) |
| | i) | AGRUMI | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Pompelmi | | | |
| | | Limoni | | | |
| | | Limette | | | |
| | | Mandarini (comprese clementine e ibridi simili) | | | |
| | | Arance | | | |
| | | Pomeli | | | |
| | | Altri | | | |
| | ii) | FRUTTA A GUSCIO (con o senza guscio) | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Mandorle | | | |
| | | Noci del Brasile | | | |
| | | Noci di anacardio | | | |
| | | Castagne e marroni | | | |
| | | Noci di cocco | | | |
| | | Nocciole | | | |
| | | Noci del Queensland | | | |
| | | Noci di pecàn | | | |
| | | Pinoli | | | |
| | | Pistacchi | | | |
| | | Noci comuni | | | |
| | | Altri | | | |
| | iii) | POMACEE | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Mele | | | |
| | | Pere | | | |
| | | Cotogne | | | |
| | | Altri | | | |
| | iv) | DRUPACEE | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Albicocche | | | |
| | | Ciliege | | | |
| | | Pesche (comprese pesche noci e altri ibridi) | | | |
| | | Prugne | | | |
| | | Altri | | | |
| | v) | BACCHE E PICCOLA FRUTTA | | | |
| | | a) | Uve da tavola e da vino | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | Uve da tavola | | | |
| | | | Uve da vino | | | |
| | | b) | Fragole (escluse le fragole selvatiche) | | 0,1 (1)
   (2) | |
| | | c) | Frutti di piante arbustive (escluse le selvatiche) | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | More | | | |
| | | | More di rovo | | | |
| | | | More-lamponi | | | |
| | | | Lamponi | | | |
| | | | Altri | | | |
| | | d) | Altra piccola frutta e bacche (escluse le selvatiche) | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | Mirtilli neri | | | |
| | | | Mirtilli rossi | | | |
| | | | Ribes a grappoli (rosso, nero e bianco) | | | |
| | | | Uva spina | | | |
| | | | Altri | | | |
| | | e) | Bacche e frutti selvatici | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | vi) | FRUTTA VARIA | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Avocadi | | | |
| | | Banane | | | |
| | | Datteri | | | |
| | | Fichi | | | |
| | | Kiwi | | | |
| | | Kumquat | | | |
| | | Litchi | | | |
| | | Manghi | | | |
| | | Olive (da tavola) | | | |
| | | Olive (da olio) | | | |
| | | Papaie | | | |
| | | Frutti della passione | | | |
| | | Ananassi | | | |
| | | Melagrane | | | |
| | | Altri | | | |
| 2. | Ortaggi, freschi o non cotti, congelati o secchi | 0,05 (1)
   (2) | | |
| | i) | ORTAGGI A RADICE E TUBERO | | | |
| | | Bietole rosse (o da orto) | | 0,1 (1)
   (2) | |
| | | Carote | | | 0,5 |
| | | Manioca | | | |
| | | Sedani-rapa | | | |
| | | Rafano | | | |
| | | Topinambur | | | |
| | | Pastinaca | | | 0,5 |
| | | Prezzemolo a grossa radice | | | |
| | | Ravanelli | | | 0,5 |
| | | Salsefrica o barba di becco | | | |
| | | Patate dolci | | | |
| | | Navoni-rutabaga | | | 0,5 |
| | | Rape | | | 0,5 |
| | | Igname | | | |
| | | Altri | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | ii) | ORTAGGI A BULBO | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Agli | | | 0,5 |
| | | Cipolle | | | |
| | | Scalogni | | | 0,5 |
| | | Cipolline | | | |
| | | Altri | | | 0,02 (1) |
| | iii) | ORTAGGI A FRUTTO | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | a) | Solanacee | | | 0,02 (1) |
| | | | Pomodori | | | |
| | | | Peperoni | | | |
| | | | Melanzane | | | |
| | | | Gombo | | | |
| | | | Altri | | | |
| | | b) | Cucurbitacee con buccia commestibile | | | |
| | | | Cetrioli | | | |
| | | | Cetriolini | | | |
| | | | Zucchine | | | 0,1 |
| | | | Altri | | | 0,02 (1) |
| | | c) | Cucurbitacee con buccia non commestibile | | | 0,02 (1) |
| | | | Meloni | | | |
| | | | Zucche | | | |
| | | | Cocomeri | | | |
| | | | Altri | | | |
| | | d) | Mais dolce | | | 0,02 (1) |
| | iv) | CAVOLI | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | a) | Cavoli a infiorescenza | | | 0,02 (1) |
| | | | Cavoli broccoli (compresi i calabresi) | | | |
| | | | Cavolfiori | | | |
| | | | Altri | | | |
| | | b) | Cavoli a testa | | | |
| | | | Cavoletti di Bruxelles | | | 0,1 |
| | | | Cavoli cappucci | | | 0,5 |
| | | | Altri | | | 0,02 (1) |
| | | c) | Cavoli a foglia | | | 0,02 (1) |
| | | | Cavoli cinesi | | | |
| | | | Cavoli ricci | | | |
| | | | Altri | | | |
| | | d) | Cavoli-rapa | | | 0,3 |
| | v) | ORTAGGI A FOGLIA ED ERBE FRESCHE | | | |
| | | a) | Lattughe e simili | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | Crescione | | | 0,1 |
| | | | Dolcetta | | | 0,1 |
| | | | Lattuga | | | |
| | | | Scarola (indivia a foglie larghe) | | | |
| | | | Rucola | | | |
| | | | Foglie e steli di brassica | | | |
| | | | Altri | | | 0,02 (1) |
| | | b) | Spinaci e simili | | 0,5 (2) | |
| | | | Spinaci | | | 0,1 |
| | | | Bietole da foglia e da costa | | | |
| | | | Altri | | | 0,02 (1) |
| | | c) | Crescione acquatico | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | | d) | Witloof | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | | e) | Erbe fresche | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | Cerfoglio | | | |
| | | | Erba cipollina | | | |
| | | | Prezzemolo | | | 0,5 |
| | | | Foglie di sedano | | | |
| | | | Altri | | | 0,02 (1) |
| | vi) | LEGUMI (freschi) | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | | Fagioli (non sgranati) | | | |
| | | Fagioli (sgranati) | | | |
| | | Piselli (non sgranati) | | | |
| | | Piselli (sgranati) | | | |
| | | Altri | | | |
| | vii) | ORTAGGI A STELO (freschi) | | | |
| | | Asparagi | | | 0,1 |
| | | Cardi | | | |
| | | Sedani | | | 0,5 |
| | | Finocchi | | | |
| | | Carciofi | | 0,2 (2) | |
| | | Porri | | | 0,1 |
| | | Rabarbaro | | | |
| | | Altri | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | viii) | FUNGHI | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | a) | Funghi coltivati | | | 0,05 |
| | | b) | Funghi selvatici | | | 0,02 (1) |
| 3. | Legumi da granella (secchi) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | Fagioli | | | |
| | Lenticchie | | | |
| | Piselli | | | |
| | Altri | | | |
| 4. | Semi oleosi | 0,1 (1)
   (2) | 0,1 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | Semi di lino | | | |
| | Semi di arachide | | | |
| | Semi di papavero | | | |
| | Semi di sesamo | | | |
| | Semi di girasole | | | |
| | Semi di colza | | | |
| | Semi di soia | | | |
| | Semi di senape | | | |
| | Semi di cotone | | | |
| | Semi di canapa | | | |
| | Altri | | | |
| 5. | Patate | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | Patate precoci | | | |
| | Patate tardive | | | |
| 6. | Tè (foglie e steli essiccati, fermentati o altrimenti lavorati di Camellia sinensis) | 0,1 (1)
   (2) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| 7. | Luppolo (essiccato), compresi i panelli di luppolo e la polvere non concentrata | 0,1 (1)
   (2) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1) |

Residui di antiparassitari e percentuali massime di residui (mg/kg)

Categorie e esempi di singoli prodotti ai quali si applicano le quantità massime di residui

Desmedifam

Fenmedifam

Clorfenvinfos (somma degli isomeri E e Z)

«1.

Frutta fresche, secche o non cotte, conservate mediante congelamento senza zuccheri addizionati; frutta a guscio

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

i)

AGRUMI

0,05 (1)
   (2)

Pompelmi

Limoni

Limette

Mandarini (comprese clementine e ibridi simili)

Arance

Pomeli

Altri

ii)

FRUTTA A GUSCIO (con o senza guscio)

0,05 (1)
   (2)

Mandorle

Noci del Brasile

Noci di anacardio

Castagne e marroni

Noci di cocco

Nocciole

Noci del Queensland

Noci di pecàn

Pinoli

Pistacchi

Noci comuni

Altri

iii)

POMACEE

0,05 (1)
   (2)

Mele

Pere

Cotogne

Altri

iv)

DRUPACEE

0,05 (1)
   (2)

Albicocche

Ciliege

Pesche (comprese pesche noci e altri ibridi)

Prugne

Altri

v)

BACCHE E PICCOLA FRUTTA

a)

Uve da tavola e da vino

0,05 (1)
   (2)

Uve da tavola

Uve da vino

b)

Fragole (escluse le fragole selvatiche)

0,1 (1)
   (2)

c)

Frutti di piante arbustive (escluse le selvatiche)

0,05 (1)
   (2)

More

More di rovo

More-lamponi

Lamponi

Altri

d)

Altra piccola frutta e bacche (escluse le selvatiche)

0,05 (1)
   (2)

Mirtilli neri

Mirtilli rossi

Ribes a grappoli (rosso, nero e bianco)

Uva spina

Altri

e)

Bacche e frutti selvatici

0,05 (1)
   (2)

vi)

FRUTTA VARIA

0,05 (1)
   (2)

Avocadi

Banane

Datteri

Fichi

Kiwi

Kumquat

Litchi

Manghi

Olive (da tavola)

Olive (da olio)

Papaie

Frutti della passione

Ananassi

Melagrane

Altri

2.

Ortaggi, freschi o non cotti, congelati o secchi

0,05 (1)
   (2)

i)

ORTAGGI A RADICE E TUBERO

Bietole rosse (o da orto)

0,1 (1)
   (2)

Carote

0,5

Manioca

Sedani-rapa

Rafano

Topinambur

Pastinaca

0,5

Prezzemolo a grossa radice

Ravanelli

0,5

Salsefrica o barba di becco

Patate dolci

Navoni-rutabaga

0,5

Rape

0,5

Igname

Altri

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

ii)

ORTAGGI A BULBO

0,05 (1)
   (2)

Agli

0,5

Cipolle

Scalogni

0,5

Cipolline

Altri

0,02 (1)

iii)

ORTAGGI A FRUTTO

0,05 (1)
   (2)

a)

Solanacee

0,02 (1)

Pomodori

Peperoni

Melanzane

Gombo

Altri

b)

Cucurbitacee con buccia commestibile

Cetrioli

Cetriolini

Zucchine

0,1

Altri

0,02 (1)

c)

Cucurbitacee con buccia non commestibile

0,02 (1)

Meloni

Zucche

Cocomeri

Altri

d)

Mais dolce

0,02 (1)

iv)

CAVOLI

0,05 (1)
   (2)

a)

Cavoli a infiorescenza

0,02 (1)

Cavoli broccoli (compresi i calabresi)

Cavolfiori

Altri

b)

Cavoli a testa

Cavoletti di Bruxelles

0,1

Cavoli cappucci

0,5

Altri

0,02 (1)

c)

Cavoli a foglia

0,02 (1)

Cavoli cinesi

Cavoli ricci

Altri

d)

Cavoli-rapa

0,3

v)

ORTAGGI A FOGLIA ED ERBE FRESCHE

a)

Lattughe e simili

0,05 (1)
   (2)

Crescione

0,1

Dolcetta

0,1

Lattuga

Scarola (indivia a foglie larghe)

Rucola

Foglie e steli di brassica

Altri

0,02 (1)

b)

Spinaci e simili

0,5 (2)

Spinaci

0,1

Bietole da foglia e da costa

Altri

0,02 (1)

c)

Crescione acquatico

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

d)

Witloof

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

e)

Erbe fresche

0,05 (1)
   (2)

Cerfoglio

Erba cipollina

Prezzemolo

0,5

Foglie di sedano

Altri

0,02 (1)

vi)

LEGUMI (freschi)

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

Fagioli (non sgranati)

Fagioli (sgranati)

Piselli (non sgranati)

Piselli (sgranati)

Altri

vii)

ORTAGGI A STELO (freschi)

Asparagi

0,1

Cardi

Sedani

0,5

Finocchi

Carciofi

0,2 (2)

Porri

0,1

Rabarbaro

Altri

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

viii)

FUNGHI

0,05 (1)
   (2)

a)

Funghi coltivati

0,05

b)

Funghi selvatici

0,02 (1)

3.

Legumi da granella (secchi)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

Fagioli

Lenticchie

Piselli

Altri

4.

Semi oleosi

0,1 (1)
   (2)

0,1 (1)
   (2)

0,02 (1)

Semi di lino

Semi di arachide

Semi di papavero

Semi di sesamo

Semi di girasole

Semi di colza

Semi di soia

Semi di senape

Semi di cotone

Semi di canapa

Altri

5.

Patate

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

Patate precoci

Patate tardive

6.

Tè (foglie e steli essiccati, fermentati o altrimenti lavorati di Camellia sinensis)

0,1 (1)
   (2)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)

7.

Luppolo (essiccato), compresi i panelli di luppolo e la polvere non concentrata

0,1 (1)
   (2)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)

---

(1)  Indica il limite inferiore di determinazione analitica.

1

(2)  Indica che la quantità massima di residui è stata fissata provvisoriamente a norma dell’articolo 4, paragrafo 1, lettera f), della direttiva 91/414/CEE.»

2

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| 27.7.2006 | IT | Gazzetta ufficiale dell’Unione europea | L 206/36 |
| --- | --- | --- | --- |

27.7.2006

IT

Gazzetta ufficiale dell’Unione europea

L 206/36

---

DIRETTIVA 2006/63/CE DELLA COMMISSIONE

del 14 luglio 2006

che modifica gli allegati da II a VII della direttiva 98/57/CE del Consiglio concernente la lotta contro Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,

visto il trattato che istituisce la Comunità europea,

vista la direttiva 98/57/CE del Consiglio, del 20 luglio 1998 (1), concernente la lotta contro Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., in particolare l’articolo 11,

considerando quanto segue:

| (1) | Uno dei principali organismi nocivi per la patata e il pomodoro è Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., agente patogeno del marciume bruno della patata e dell’avvizzimento batterico delle solanacee (denominato nel seguito «l’organismo nocivo»). |
| --- | --- |

(1)

Uno dei principali organismi nocivi per la patata e il pomodoro è Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., agente patogeno del marciume bruno della patata e dell’avvizzimento batterico delle solanacee (denominato nel seguito «l’organismo nocivo»).

| (2) | L’organismo nocivo è ancora presente in alcune parti della Comunità. |
| --- | --- |

(2)

L’organismo nocivo è ancora presente in alcune parti della Comunità.

| (3) | La direttiva 98/57/CE ha stabilito i provvedimenti da adottare negli Stati membri contro il suddetto organismo nocivo per localizzarlo, determinarne la distribuzione, prevenirne la comparsa e la propagazione e, qualora venga individuato, impedirne la propagazione e combatterlo ai fini della sua eradicazione. |
| --- | --- |

(3)

La direttiva 98/57/CE ha stabilito i provvedimenti da adottare negli Stati membri contro il suddetto organismo nocivo per localizzarlo, determinarne la distribuzione, prevenirne la comparsa e la propagazione e, qualora venga individuato, impedirne la propagazione e combatterlo ai fini della sua eradicazione.

| (4) | Da allora sono state acquisite importanti conoscenze in merito alla biologia dell’organismo nocivo nonché alle procedure di rilevamento e identificazione del medesimo; l’esperienza pratica acquisita nella lotta contro tale organismo impone inoltre la revisione di alcune disposizioni tecniche connesse alle misure di controllo. |
| --- | --- |

(4)

Da allora sono state acquisite importanti conoscenze in merito alla biologia dell’organismo nocivo nonché alle procedure di rilevamento e identificazione del medesimo; l’esperienza pratica acquisita nella lotta contro tale organismo impone inoltre la revisione di alcune disposizioni tecniche connesse alle misure di controllo.

| (5) | In seguito a tali sviluppi appare necessario rivedere e aggiornare le misure previste dagli allegati della direttiva 98/57/CE. |
| --- | --- |

(5)

In seguito a tali sviluppi appare necessario rivedere e aggiornare le misure previste dagli allegati della direttiva 98/57/CE.

| (6) | Per quanto riguarda le procedure di rilevamento e identificazione viene introdotto un moderno metodo di rilevamento, l’ibridazione fluorescente in situ (FISH). Sono stati inoltre introdotti miglioramenti del metodo della reazione a catena della polimerasi (PCR) come pure di vari elementi tecnici della procedura di rilevamento e identificazione attualmente in uso, nonché metodi per il rilevamento e l’identificazione dell’organismo nocivo in piante ospiti diverse dalla patata, nell’acqua e nel suolo. |
| --- | --- |

(6)

Per quanto riguarda le procedure di rilevamento e identificazione viene introdotto un moderno metodo di rilevamento, l’ibridazione fluorescente in situ (FISH). Sono stati inoltre introdotti miglioramenti del metodo della reazione a catena della polimerasi (PCR) come pure di vari elementi tecnici della procedura di rilevamento e identificazione attualmente in uso, nonché metodi per il rilevamento e l’identificazione dell’organismo nocivo in piante ospiti diverse dalla patata, nell’acqua e nel suolo.

| (7) | Per quanto riguarda gli elementi tecnici delle misure di controllo, sono introdotti miglioramenti relativi al metodo di conservazione dei campioni analizzati (in modo da garantire la tracciabilità dell’organismo nocivo), agli elementi necessari per determinare l’estensione della probabile contaminazione, ai dettagli della notifica di ogni presenza confermata dell’organismo nocivo e della zona contaminata corrispondente, alle misure da attuare nelle zone di produzione designate come contaminate e all’interno delle zone delimitate. Sono state altresì introdotte alcune disposizioni relative ai pomodori, al fine di tenere maggiormente conto del ruolo di questa pianta quale ospite per l’organismo. |
| --- | --- |

(7)

Per quanto riguarda gli elementi tecnici delle misure di controllo, sono introdotti miglioramenti relativi al metodo di conservazione dei campioni analizzati (in modo da garantire la tracciabilità dell’organismo nocivo), agli elementi necessari per determinare l’estensione della probabile contaminazione, ai dettagli della notifica di ogni presenza confermata dell’organismo nocivo e della zona contaminata corrispondente, alle misure da attuare nelle zone di produzione designate come contaminate e all’interno delle zone delimitate. Sono state altresì introdotte alcune disposizioni relative ai pomodori, al fine di tenere maggiormente conto del ruolo di questa pianta quale ospite per l’organismo.

| (8) | I provvedimenti di cui alla presente direttiva risultano conformi al parere del comitato fitosanitario permanente, |
| --- | --- |

(8)

I provvedimenti di cui alla presente direttiva risultano conformi al parere del comitato fitosanitario permanente,

HA ADOTTATO LA PRESENTE DIRETTIVA:

Articolo 1

Gli allegati da II a VII della direttiva 98/57/CE sono sostituiti dai testi corrispondenti che figurano nell’allegato della presente direttiva.

Articolo 2

1.   Gli Stati membri adottano e pubblicano entro il 31 marzo 2007 le disposizioni legislative, regolamentari e amministrative necessarie per conformarsi alla presente direttiva e comunicano immediatamente alla Commissione il testo di tali disposizioni nonché una tabella di correlazione tra dette disposizioni e la direttiva.

Essi applicano tali disposizioni a decorrere dal 1o aprile 2007.

Quando vengono adottate dagli Stati membri tali disposizioni contengono un riferimento alla presente direttiva e sono corredate di un siffatto riferimento all’atto della pubblicazione ufficiale. Le modalità del riferimento sono decise dagli Stati membri.

2.   Gli Stati membri comunicano senza indugio alla Commissione tutte le disposizioni del diritto interno emanate nella materia disciplinata dalla presente direttiva.

Articolo 3

La presente direttiva entra in vigore il terzo giorno successivo alla pubblicazione nella Gazzetta ufficiale dell’Unione europea.

Articolo 4

Gli Stati membri sono destinatari della presente direttiva.

Fatto a Bruxelles, il 14 luglio 2006.

Per la Commissione

Markos KYPRIANOU

Membro della Commissione

---

(1)  GU L 235 del 21.8.1998, pag. 1.

1

---

ALLEGATO

ALLEGATO II

SCHEMA PER LA DIAGNOSI, IL RILEVAMENTO E L’IDENTIFICAZIONE DI RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL.

CAMPO DI APPLICAZIONE DELLO SCHEMA DIAGNOSTICO

Lo schema presentato descrive i procedimenti da utilizzare per:

| i) | la diagnosi del marciume bruno nei tuberi di patata e dell’avvizzimento batterico nelle piante di patata e di pomodoro e in alcune altre piante ospiti; |
| --- | --- |

i)

la diagnosi del marciume bruno nei tuberi di patata e dell’avvizzimento batterico nelle piante di patata e di pomodoro e in alcune altre piante ospiti;

| ii) | il rilevamento di Ralstonia solanacearum in campioni di tuberi di patata, di piante di patata, di pomodoro e in altre piante ospiti, nonché in campioni di acqua e di terreno; |
| --- | --- |

ii)

il rilevamento di Ralstonia solanacearum in campioni di tuberi di patata, di piante di patata, di pomodoro e in altre piante ospiti, nonché in campioni di acqua e di terreno;

| iii) | l’identificazione di Ralstonia solanacearum (R. solanacearum). |
| --- | --- |

iii)

l’identificazione di Ralstonia solanacearum (R. solanacearum).

INDICE

| | | Pagina |
| --- | --- | --- |
| | Principi generali | 40 |
| SEZIONE I: | Schemi applicativi | 40 |
| | 1. | Schema di rilevamento per la diagnosi del marciume bruno e dell’avvizzimento batterico (R. solanacearum) nei tuberi di patata, nelle piante di patata e di pomodoro o in altre piante ospiti che presentano sintomi di queste malattie | 40 |
| | 2. | Schema per il rilevamento e l’identificazione di R. solanacearum in campioni di tuberi di patata asintomatici | 43 |
| | 3. | Schema per il rilevamento e l’identificazione di R. solanacearum in campioni di piante di patata e di pomodoro o di altre piante ospiti asintomatiche | 46 |
| SEZIONE II: | Metodi dettagliati per il rilevamento di R. solanacearum nei tuberi di patata, nelle piante di patata e di pomodoro o in altre piante ospiti che presentano sintomi di marciume bruno o di avvizzimento batterico | 48 |
| | 1. | Sintomi | 48 |
| | 2. | Saggi rapidi di selezione preliminare | 48 |
| | 3. | Metodo di isolamento | 49 |
| | 4. | Saggi per l’identificazione di R. solanacearum | 49 |
| SEZIONE III: | 1. | Metodi dettagliati per il rilevamento e l’identificazione di R. solanacearum in campioni di tuberi di patata asintomatici | 49 |
| | | 1.1. | Preparazione del campione | 49 |
| | | 1.2. | Saggi analitici | 51 |
| | 2. | Metodi dettagliati per il rilevamento e l’identificazione di R. solanacearum in campioni di piante di patata e di pomodoro o di altre piante asintomatiche | 51 |
| | | 2.1. | Preparazione del campione | 51 |
| | | 2.2. | Saggi analitici | 52 |
| SEZIONE IV: | 1. | Schema per il rilevamento e l’identificazione di R. solanacearum nell’acqua | 53 |
| | 2. | Metodi per il rilevamento e l’identificazione di R. solanacearum nell’acqua | 55 |
| | | 2.1. | Preparazione del campione | 55 |
| | | 2.2. | Saggi analitici | 55 |
| SEZIONE V: | 1. | Schema per il rilevamento e l’identificazione di R. solanacearum nel terreno | 56 |
| | 2. | Metodi per il rilevamento e l’identificazione di R. solanacearum nel terreno | 58 |
| | | 2.1. | Preparazione del campione | 58 |
| | | 2.2. | Saggi analitici | 58 |
| SEZIONE VI: | Protocolli ottimizzati per il rilevamento e l’identificazione di R. solanacearum | 58 |
| | A. | Saggi analitici per la diagnosi e il rilevamento | 58 |
| | | 1. | Prova di fuoriuscita di essudato dal fusto | 58 |
| | | 2. | Rilevamento dei granuli di poli-beta-idrossibutirrato | 58 |
| | | 3. | Saggio sierologico di agglutinazione | 59 |
| | | 4. | Isolamento selettivo | 60 |
| | | | 4.1. | Isolamento selettivo in piastra | 60 |
| | | | 4.2. | Procedura di arricchimento | 60 |
| | | 5. | Saggio di immunofluorescenza (saggio IF) | 61 |
| | | 6. | Saggio di reazione a catena della polimerasi (saggio PCR) | 64 |
| | | | 6.1. | Metodi di purificazione del DNA | 65 |
| | | | | a) | Metodo di Pastrik (2000) | 65 |
| | | | | b) | Altri metodi | 65 |
| | | | 6.2. | PCR | 66 |
| | | | 6.3. | Analisi del prodotto della PCR | 66 |
| | | 7. | Saggio di ibridazione in situ fluorescente (saggio FISH) | 67 |
| | | 8. | Saggio di immunoassorbimento enzimatico (saggi ELISA) | 69 |
| | | | a) | ELISA indiretto | 69 |
| | | | b) | DASI (Double-Antibody Sandwich Indirect)-ELISA | 70 |
| | | 9. | Saggio biologico | 71 |
| | B. | Saggi di identificazione | 72 |
| | | 1. | Saggio di identificazione nutrizionale ed enzimatico | 72 |
| | | 2. | Saggio IF | 72 |
| | | 3. | Saggio Elisa | 73 |
| | | 4. | Saggio PCR | 73 |
| | | 5. | Saggio FISH | 73 |
| | | 6. | Profilo degli acidi grassi (FAP) | 73 |
| | | 7. | Metodi di caratterizzazione del ceppo | 73 |
| | | | 7.1. | Determinazione delle biovar | 73 |
| | | | 7.2. | Impronte genomiche | 74 |
| | | | 7.3. | Metodi PCR | 74 |
| | C. | Saggio di conferma | 74 |
| | | Appendice 1 | Laboratori coinvolti nell’ottimizzazione e nella convalida dei protocolli | 76 |
| | | Appendice 2 | Terreni nutritivi per l’isolamento e la coltura di R. solanacearum | 77 |
| | | Appendice 3 | A) | Materiale di controllo standardizzato disponibile in commercio | 79 |
| | | | B) | Preparazione dei controlli | 80 |
| | | Appendice 4 | Tamponi per i saggi analitici | 82 |
| | | Appendice 5 | Determinazione del livello di contaminazione nei saggi IF e FISH | 85 |
| | | Appendice 6 | Protocolli e reagenti PCR convalidati | 86 |
| | | Appendice 7 | Reagenti convalidati per il saggio FISH | 91 |
| | | Appendice 8 | Condizioni di coltura per i pomodori e le melanzane | 93 |
| | | Bibliografia | | 94 |

Pagina

Principi generali

40

SEZIONE I:

Schemi applicativi

40

1.

Schema di rilevamento per la diagnosi del marciume bruno e dell’avvizzimento batterico (R. solanacearum) nei tuberi di patata, nelle piante di patata e di pomodoro o in altre piante ospiti che presentano sintomi di queste malattie

40

2.

Schema per il rilevamento e l’identificazione di R. solanacearum in campioni di tuberi di patata asintomatici

43

3.

Schema per il rilevamento e l’identificazione di R. solanacearum in campioni di piante di patata e di pomodoro o di altre piante ospiti asintomatiche

46

SEZIONE II:

Metodi dettagliati per il rilevamento di R. solanacearum nei tuberi di patata, nelle piante di patata e di pomodoro o in altre piante ospiti che presentano sintomi di marciume bruno o di avvizzimento batterico

48

1.

Sintomi

48

2.

Saggi rapidi di selezione preliminare

48

3.

Metodo di isolamento

49

4.

Saggi per l’identificazione di R. solanacearum

49

SEZIONE III:

1.

Metodi dettagliati per il rilevamento e l’identificazione di R. solanacearum in campioni di tuberi di patata asintomatici

49

1.1.

Preparazione del campione

49

1.2.

Saggi analitici

51

2.

Metodi dettagliati per il rilevamento e l’identificazione di R. solanacearum in campioni di piante di patata e di pomodoro o di altre piante asintomatiche

51

2.1.

Preparazione del campione

51

2.2.

Saggi analitici

52

SEZIONE IV:

1.

Schema per il rilevamento e l’identificazione di R. solanacearum nell’acqua

53

2.

Metodi per il rilevamento e l’identificazione di R. solanacearum nell’acqua

55

2.1.

Preparazione del campione

55

2.2.

Saggi analitici

55

SEZIONE V:

1.

Schema per il rilevamento e l’identificazione di R. solanacearum nel terreno

56

2.

Metodi per il rilevamento e l’identificazione di R. solanacearum nel terreno

58

2.1.

Preparazione del campione

58

2.2.

Saggi analitici

58

SEZIONE VI:

Protocolli ottimizzati per il rilevamento e l’identificazione di R. solanacearum

58

A.

Saggi analitici per la diagnosi e il rilevamento

58

1.

Prova di fuoriuscita di essudato dal fusto

58

2.

Rilevamento dei granuli di poli-beta-idrossibutirrato

58

3.

Saggio sierologico di agglutinazione

59

4.

Isolamento selettivo

60

4.1.

Isolamento selettivo in piastra

60

4.2.

Procedura di arricchimento

60

5.

Saggio di immunofluorescenza (saggio IF)

61

6.

Saggio di reazione a catena della polimerasi (saggio PCR)

64

6.1.

Metodi di purificazione del DNA

65

a)

Metodo di Pastrik (2000)

65

b)

Altri metodi

65

6.2.

PCR

66

6.3.

Analisi del prodotto della PCR

66

7.

Saggio di ibridazione in situ fluorescente (saggio FISH)

67

8.

Saggio di immunoassorbimento enzimatico (saggi ELISA)

69

a)

ELISA indiretto

69

b)

DASI (Double-Antibody Sandwich Indirect)-ELISA

70

9.

Saggio biologico

71

B.

Saggi di identificazione

72

1.

Saggio di identificazione nutrizionale ed enzimatico

72

2.

Saggio IF

72

3.

Saggio Elisa

73

4.

Saggio PCR

73

5.

Saggio FISH

73

6.

Profilo degli acidi grassi (FAP)

73

7.

Metodi di caratterizzazione del ceppo

73

7.1.

Determinazione delle biovar

73

7.2.

Impronte genomiche

74

7.3.

Metodi PCR

74

C.

Saggio di conferma

74

Appendice 1

Laboratori coinvolti nell’ottimizzazione e nella convalida dei protocolli

76

Appendice 2

Terreni nutritivi per l’isolamento e la coltura di R. solanacearum

77

Appendice 3

A)

Materiale di controllo standardizzato disponibile in commercio

79

B)

Preparazione dei controlli

80

Appendice 4

Tamponi per i saggi analitici

82

Appendice 5

Determinazione del livello di contaminazione nei saggi IF e FISH

85

Appendice 6

Protocolli e reagenti PCR convalidati

86

Appendice 7

Reagenti convalidati per il saggio FISH

91

Appendice 8

Condizioni di coltura per i pomodori e le melanzane

93

Bibliografia

94

PRINCIPI GENERALI

I protocolli ottimizzati per i vari metodi, i reagenti convalidati e i dettagli per la preparazione del materiale per i saggi ed i controlli figurano nelle appendici. Un elenco dei laboratori coinvolti nell’ottimizzazione e convalida dei protocolli figura nell’appendice 1.

Dato che i protocolli comportano il rilevamento di un organismo da quarantena e prevedono l’uso di colture vitali di R. solanacearum come materiale di controllo, le procedure dovranno essere svolte in opportune condizioni di quarantena, con adeguate strutture per lo smaltimento dei rifiuti e secondo le modalità e le condizioni previste da appropriate autorizzazioni rilasciate dalle autorità ufficiali per la quarantena dei vegetali.

I parametri dei saggi devono garantire un rilevamento certo e riproducibile dei livelli di R. solanacearum ai valori di soglia dei metodi prescelti.

È indispensabile un’accurata preparazione dei controlli positivi.

La realizzazione dei saggi sulla base delle soglie richieste implica inoltre la corretta regolazione, manutenzione e taratura degli strumenti, una corretta manipolazione e conservazione dei reagenti nonché l’applicazione di tutte le misure atte ad impedire la contaminazione tra i campioni, come ad esempio la separazione dei controlli positivi dai campioni da saggiare. Per evitare errori amministrativi e di altro genere devono essere applicate misure uniformi per il controllo della qualità, in particolare per quanto riguarda l’etichettatura e la documentazione.

Una manifestazione sospetta ai sensi dell’articolo 4, paragrafo 2, della direttiva 98/57/CE implica un risultato positivo nei saggi diagnostici o di selezione preliminare fatti su un campione secondo quanto indicato nei diagrammi di flusso. Se il primo saggio di selezione preliminare (IF, PCR/FISH o isolamento selettivo) risulta positivo, esso deve essere confermato da un secondo saggio di selezione preliminare basato su un principio biologico differente.

Se il primo saggio di selezione preliminare risulta positivo, si sospetta una contaminazione da R. solanacearum ed occorre procedere ad un secondo saggio. Se il secondo saggio di selezione preliminare è positivo, il sospetto è confermato (manifestazione sospetta) ed occorre procedere ai saggi analitici successivi, secondo quanto previsto dallo schema. Se il secondo saggio di selezione preliminare è negativo, il campione non si considera contaminato da R. solanacearum.

Per confermare la presenza di R. solanacearum ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, della direttiva 98/57/CE è necessario isolare e identificare l’organismo in coltura pura e verificarne la patogenicità.

SEZIONE I

APPLICAZIONE DELLO SCHEMA

1.   Schema di rilevamento per la diagnosi del marciume bruno e dell’avvizzimento batterico (Ralstonia solanacearum) nei tuberi di patata, nelle piante di patata e di pomodoro o in altre piante ospiti che presentano sintomi di queste malattie.

Il procedimento sottoindicato deve essere applicato ai tuberi e alle piante di patata che presentano sintomi tipici o sospetti di marciume bruno o di avvizzimento associato ad alterazioni vascolari. Esso comporta un saggio rapido di selezione preliminare, l’isolamento dell’agente patogeno dal tessuto vascolare infetto su terreni di coltura (selettivi) e, in caso di esito positivo, l’identificazione della coltura come Ralstonia solanacearum.

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2.   Schema di rilevamento e identificazione di Ralstonia solanacearum in campioni di tuberi di patata asintomatici

Principi

Il procedimento è diretto a rilevare le infezioni latenti nei tuberi di patata. Un risultato positivo ottenuto da almeno due saggi di selezione preliminare3, basati su principi biologici differenti, deve essere confermato dall’isolamento del patogeno e quindi, in caso di isolamento di colonie tipiche, dall’identificazione di una coltura pura di R. solanacearum. Il fatto che uno solo dei saggi di selezione preliminare risulti positivo non è sufficiente per far considerare sospetto il campione.

I saggi di selezione preliminare e i saggi di isolamento devono consentire soglie di rilevamento comprese tra 103 e 104 cellule per ml di sedimento risospeso, incluse come controllo positivo in ciascuna serie di saggi analitici.

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3.   Schema di rilevamento e identificazione di Ralstonia solanacearum in campioni di piante di patata e di pomodoro o di altre piante ospiti asintomatiche

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SEZIONE II

METODI DETTAGLIATI PER IL RILEVAMENTO DI RALSTONIA SOLANACEARUM NEI TUBERI DI PATATA, NELLE PIANTE DI PATATA E DI POMODORO O IN ALTRE PIANTE OSPITI CHE PRESENTANO SINTOMI DI MARCIUME BRUNO O DI AVVIZZIMENTO BATTERICO.

1.   Sintomi (cfr. il sito web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

1.1.   Sintomi nella patata

Pianta di patata. La fase iniziale dell’infezione in pieno campo si riconosce dalla perdita di turgore delle foglie della parte superiore della pianta con le alte temperature diurne, reversibile durante la notte. Nelle prime fasi dell’avvizzimento le foglie rimangono verdi, successivamente compaiono ingiallimento, necrosi brune nonché epinastia. L’avvizzimento di un germoglio o della pianta intera si aggrava, diventa presto irreversibile e porta a collasso e morte della pianta. Il tessuto vascolare dei fusti di piante avvizzite tagliato trasversalmente di solito si presenta bruno e gocciole di un liquido lattiginoso possono essudare dalla superficie tagliata o essere facilmente fatte uscire per compressione. Quando un fusto tagliato trasversalmente viene immerso verticalmente nell’acqua limpida e in quiete di un bicchiere, filamenti biancastri scendono dai tessuti vascolari verso il fondo.

Tubero di patata. I tuberi di patata devono essere tagliati trasversalmente vicino all’ombelico (punto di attacco dello stolone) oppure longitudinalmente sopra al punto di attacco dello stolone. La fase iniziale dell’infezione consiste in un’alterazione di colore da giallo vitreo a marrone chiaro dell’anello vascolare, da cui dopo pochi minuti fuoriesce spontaneamente un liquido batterico color crema chiaro. In seguito la decolorazione vascolare diventa di un marrone più netto e la necrosi può estendersi al tessuto parenchimatico. Nelle fasi avanzate l’infezione si espande centrifugamente sino ad emergere in corrispondenza dell’ombelico e degli occhi dai quali può fuoriuscire essudato batterico cui rimangono aderenti particelle di terreno. Sulla superficie dei tuberi possono comparire tacche bruno-rossastre, leggermente infossate, dovute al collasso interno dei tessuti vascolari. Nelle fasi avanzate della malattia è frequente lo sviluppo secondario di marciume molle causato da funghi e batteri.

1.2.   Sintomi nel pomodoro

Pianta di pomodoro. Il primo sintomo visibile è l’aspetto flaccido delle foglie più giovani. In condizioni ambientali favorevoli per l’agente patogeno (temperature del suolo di circa 25 °C, umidità satura) in pochi giorni seguono epinastia e flaccidezza di un lato della pianta o dell’intera pianta, portando la stessa al collasso totale. In condizioni meno favorevoli (temperatura del suolo inferiore a 21 °C) l’avvizzimento ha evoluzione più lenta, ma sul fusto possono svilupparsi numerose radici avventizie. Si possono osservare striature idropiche che partono dalla base del fusto, indice di necrosi del sistema vascolare. Quando il fusto è tagliato trasversalmente, dai tessuti vascolari bruni scoloriti essudano gocce di liquido batterico bianco o giallastro.

1.3.   Sintomi in altre piante ospiti

Piante di Solanum dulcamara e S. nigrum. In condizioni naturali è raro rilevare sintomi di collasso e avvizzimento in queste piante erbacee ospiti, tranne nel caso in cui le temperature del suolo siano superiori a 25 °C o i livelli di inoculo siano assai elevati (come ad esempio per un S. nigrum che cresca in prossimità di piante infette di patata o di pomodoro). Qualora compaia avvizzimento, i sintomi sono gli stessi descritti per le piante di pomodoro. Le piante di S. dulcamara che non presentano segni di avvizzimento e che si sviluppano con radici e fusti in acqua possono presentare uno scolorimento interno color marrone chiaro dei tessuti vascolari nella sezione trasversale della base del fusto o di sue parti subacquee. Può esservi fuoriuscita di essudato batterico dai tessuti vascolari recisi o formazione di filamenti di essudato se il fusto reciso viene collocato verticalmente in acqua, anche in assenza di sintomi di avvizzimento.

2.   Saggi rapidi di selezione preliminare

I saggi rapidi di selezione preliminare facilitano la formulazione di una diagnosi presunta, ma non sono fondamentali. Effettuare uno o più dei seguenti saggi convalidati:

2.1.   Prova di fuoriuscita di essudato dal fusto

(cfr. sezione VI.A.1)

2.2.   Rilevamento dei granuli di poli-beta-idrossibutirrato (PHB)

I caratteristici granuli di PHB nelle cellule di Ralstonia solanacearum sono resi visibili colorando con blu Nilo A o nero Sudan B strisci di essudato batterico provenienti da tessuto infetto, fissati mediante calore su un vetrino da microscopio (cfr. sezione VI.A.2).

2.3.   Prove di sieroagglutinazione

(cfr. sezione VI.A.3)

2.4.   Altri saggi

Altri saggi rapidi appropriati per la selezione preliminare sono il saggio IF (sezione VI.A.5), il saggio FISH (sezione VI.A.7), i saggi ELISA (sezione VI.A.8) e i saggi PCR (sezione VI.A.6).

3.   Metodo di isolamento

| a) | Rimuovere l’essudato o le parti di tessuto cromaticamente alterate dall’anello vascolare del tubero di patata e dai fasci vascolari del fusto delle piante di patata, di pomodoro o di altre piante ospiti che presentano segni di avvizzimento. Sospenderlo in una piccola quantità di acqua distillata sterile o in tampone fosfato 50 mM (appendice 4) e lasciar riposare per 5-10 minuti. |
| --- | --- |

a)

Rimuovere l’essudato o le parti di tessuto cromaticamente alterate dall’anello vascolare del tubero di patata e dai fasci vascolari del fusto delle piante di patata, di pomodoro o di altre piante ospiti che presentano segni di avvizzimento. Sospenderlo in una piccola quantità di acqua distillata sterile o in tampone fosfato 50 mM (appendice 4) e lasciar riposare per 5-10 minuti.

| b) | Preparare una serie di diluizioni decimali della sospensione. |
| --- | --- |

b)

Preparare una serie di diluizioni decimali della sospensione.

| c) | Trasferire 50-100 μl della sospensione e delle diluizioni su un terreno nutritivo generale (NA, YPGA o SPA; cfr. appendice 2) e/o sul substrato di Kelman al tetrazolio (cfr. appendice 2) e/o su di un terreno selettivo convalidato (SMSA; cfr. appendice 2). Inseminare le piastre distribuendo le sospensioni in modo decrescente sulla superficie. Se utile, preparare a parte una serie di piastre con sospensioni diluite di Ralstonia solanacearum biovar 2 come controllo positivo. |
| --- | --- |

c)

Trasferire 50-100 μl della sospensione e delle diluizioni su un terreno nutritivo generale (NA, YPGA o SPA; cfr. appendice 2) e/o sul substrato di Kelman al tetrazolio (cfr. appendice 2) e/o su di un terreno selettivo convalidato (SMSA; cfr. appendice 2). Inseminare le piastre distribuendo le sospensioni in modo decrescente sulla superficie. Se utile, preparare a parte una serie di piastre con sospensioni diluite di Ralstonia solanacearum biovar 2 come controllo positivo.

| d) | Mantenere le piastre in incubazione per 2-6 giorni a 28 °C.






  — | Sul terreno nutritivo non selettivo gli isolati virulenti di R. solanacearum sviluppano colonie di colore bianco perlaceo, piatte, irregolari e fluide, spesso con caratteristici vortici al centro. Le forme avirulente di R. solanacearum sviluppano piccole colonie tonde, non fluide e butirrose, di colore uniforme bianco panna. |
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d)

Mantenere le piastre in incubazione per 2-6 giorni a 28 °C.

—

Sul terreno nutritivo non selettivo gli isolati virulenti di R. solanacearum sviluppano colonie di colore bianco perlaceo, piatte, irregolari e fluide, spesso con caratteristici vortici al centro. Le forme avirulente di R. solanacearum sviluppano piccole colonie tonde, non fluide e butirrose, di colore uniforme bianco panna.

| — | Sul substrato di Kelman e sul substrato SMSA i vortici sono di color rosso sangue. Le forme avirulente di R. solanacearum sviluppano piccole colonie tonde, non fluide e butirrose, di colore uniforme rosso scuro. |
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—

Sul substrato di Kelman e sul substrato SMSA i vortici sono di color rosso sangue. Le forme avirulente di R. solanacearum sviluppano piccole colonie tonde, non fluide e butirrose, di colore uniforme rosso scuro.

4.   Saggi di identificazione di R. solanacearum

I saggi di conferma dell’identificazione di presunti isolati di R. solanacearum sono elencati nella sezione VI.B.

SEZIONE III

1.   Metodi dettagliati per il rilevamento e l’identificazione di Ralstonia solanacearum in campioni di tuberi di patata asintomatici

1.1.   Preparazione del campione

Nota:

| — | Il campione standard è di 200 tuberi per analisi. Un campionamento più ampio richiede l’effettuazione di più analisi su campioni di queste dimensioni. Un maggior numero di tuberi nel campione è causa di inibizione o difficile interpretazione dei risultati. Il metodo di analisi può essere tuttavia applicato efficacemente anche a campioni di dimensioni inferiori, qualora non si disponga di 200 tuberi. |
| --- | --- |

—

Il campione standard è di 200 tuberi per analisi. Un campionamento più ampio richiede l’effettuazione di più analisi su campioni di queste dimensioni. Un maggior numero di tuberi nel campione è causa di inibizione o difficile interpretazione dei risultati. Il metodo di analisi può essere tuttavia applicato efficacemente anche a campioni di dimensioni inferiori, qualora non si disponga di 200 tuberi.

| — | La convalida di tutti i metodi di rilevamento descritti di seguito è basata su analisi effettuate su campioni di 200 tuberi. |
| --- | --- |

—

La convalida di tutti i metodi di rilevamento descritti di seguito è basata su analisi effettuate su campioni di 200 tuberi.

| — | L’estratto di patata descritto di seguito può essere anche usato per il rilevamento del batterio del marciume anulare della patata (Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus). |
| --- | --- |

—

L’estratto di patata descritto di seguito può essere anche usato per il rilevamento del batterio del marciume anulare della patata (Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus).

Trattamento preliminare facoltativo da far precedere alla preparazione del campione:

| a) | Incubare i campioni a 25-30 °C per un massimo di due settimane prima di iniziare i saggi analitici, per favorire la moltiplicazione di eventuali popolazioni di R. solanacearum. |
| --- | --- |

a)

Incubare i campioni a 25-30 °C per un massimo di due settimane prima di iniziare i saggi analitici, per favorire la moltiplicazione di eventuali popolazioni di R. solanacearum.

| b) | Lavare i tuberi. Usare disinfettanti appropriati (composti clorurati qualora si proceda al saggio PCR, al fine di eliminare l’eventuale DNA del patogeno) e detergenti tra un campione e l’altro. Far asciugare i tuberi all’aria. Questo procedimento di lavaggio non è obbligatorio, ma risulta particolarmente utile per i campioni che presentano residui di terra e nel caso in cui si debba effettuare un saggio PCR o un isolamento diretto. |
| --- | --- |

b)

Lavare i tuberi. Usare disinfettanti appropriati (composti clorurati qualora si proceda al saggio PCR, al fine di eliminare l’eventuale DNA del patogeno) e detergenti tra un campione e l’altro. Far asciugare i tuberi all’aria. Questo procedimento di lavaggio non è obbligatorio, ma risulta particolarmente utile per i campioni che presentano residui di terra e nel caso in cui si debba effettuare un saggio PCR o un isolamento diretto.

1.1.1.   Rimuovere con un bisturi o con un pelapatate pulito e disinfettato la buccia intorno all’ombelico (punto di attacco dello stolone) di ciascun tubero, in modo da rendere visibile il tessuto vascolare. Asportare accuratamente un piccolo cono di tessuto vascolare dall’ombelico di ciascun tubero, riducendo al minimo la quantità di tessuto non vascolare (cfr. il sito web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

NB: Mettere da parte i tuberi (marcescenti) con sintomi sospetti e saggiarli individualmente.

Se nel corso dell’asportazione del cono ombelicale si osservano sintomi sospetti di marciume bruno, è necessario procedere ad un’indagine visiva del tubero tagliando quest’ultimo vicino all’ombelico. I tuberi tagliati che presentano sintomi sospetti devono essere tenuti per almeno 2 giorni a temperatura ambiente in modo da consentire la suberificazione e quindi conservati ad una temperatura compresa tra 4 e 10 °C in adeguate condizioni di quarantena. Tutti i tuberi, compresi quelli sospetti, devono essere conservati secondo quanto previsto all’allegato III.

1.1.2.   Raccogliere i coni ombelicali in contenitori monouso nuovi che possano essere chiusi e/o sigillati (qualora vengano riutilizzati, i contenitori devono essere puliti e disinfettati accuratamente mediante composti clorurati). I coni ombelicali andrebbero di preferenza trattati immediatamente. Se ciò non fosse possibile, conservarli nel contenitore, senza aggiunta di tampone, refrigerati per non più di 72 ore o a temperatura ambiente per non più di 24 ore.

Trattare i coni ombelicali secondo una delle seguenti procedure:

| a) | Coprire i coni con un volume sufficiente (circa 40 ml) di tampone di estrazione (appendice 4) e porre in un agitatore rotativo (50-100 giri/m) per 4 ore a non più di 24 °C o per 16-24 ore se refrigerati. |
| --- | --- |

a)

Coprire i coni con un volume sufficiente (circa 40 ml) di tampone di estrazione (appendice 4) e porre in un agitatore rotativo (50-100 giri/m) per 4 ore a non più di 24 °C o per 16-24 ore se refrigerati.

| b) | Omogeneizzare i coni con un volume sufficiente (circa 40 ml) di tampone di estrazione (appendice 4) in un mixer (p. es. Waring o Ultra Thurax) o schiacciandoli in un sacchetto di macerazione monouso sigillato (p. es. Stomacher o Bioreba in polietilene di elevato spessore, 150 mm × 250 mm, sterile per irradiazione) usando un martello di gomma o uno strumento di macinazione appropriato (p. es. Homex). |
| --- | --- |

b)

Omogeneizzare i coni con un volume sufficiente (circa 40 ml) di tampone di estrazione (appendice 4) in un mixer (p. es. Waring o Ultra Thurax) o schiacciandoli in un sacchetto di macerazione monouso sigillato (p. es. Stomacher o Bioreba in polietilene di elevato spessore, 150 mm × 250 mm, sterile per irradiazione) usando un martello di gomma o uno strumento di macinazione appropriato (p. es. Homex).

NB: L’omogeneizzazione dei campioni per mezzo di un mixer comporta un rischio elevato di contaminazione incrociata. Prendere opportune precauzioni per evitare versamenti o generazione di aerosol nel corso del processo di estrazione. Assicurarsi che per ogni campione vengano usati lame e contenitori appena sterilizzati. Qualora si debba effettuare un saggio PCR, evitare i residui di DNA sui contenitori o gli apparecchi di macinazione. Per il saggio PCR si raccomanda lo schiacciamento in sacchetti monouso e l’impiego di provette monouso.

1.1.3.   Far decantare il supernatante. Se eccessivamente torbido, chiarificare mediante centrifugazione a bassa velocità (non oltre 180 g per 10 minuti a una temperatura compresa tra 4 e 10 °C) o filtrazione sotto vuoto (40-100 μm), lavando il filtro con una dose supplementare ( 10 ml) di tampone di estrazione.

1.1.4.   Concentrare la frazione batterica mediante centrifugazione a 7 000 g per 15 minuti (o 10 000 g per 10 minuti) a una temperatura compresa tra 4 e 10 °C e scartare il supernatante senza far muovere il sedimento.

1.1.5.   Risospendere il sedimento in 1,5 ml di tampone per sedimento da centrifuga (appendice 4). Usare 500 μl per R. solanacearum, 500 μl per Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus e 500 μl a fini di riferimento. Aggiungere glicerolo sterile a una concentrazione finale del 10-25 % (v/v) ai 500 μl del quantitativo di riferimento e al resto del quantitativo da saggiare, mescolare nel vortex e conservare ad una temperatura compresa tra –16 e –24 °C (settimane) o tra –68 e –86° C (mesi). Mantenere i quantitativi da saggiare a una temperatura compresa tra 4 e 10 °C durante il saggio.

Non è consigliabile procedere a cicli ripetuti di congelamento e scongelamento.

Qualora sia richiesto un trasporto dell’estratto, la consegna deve essere effettuata in un contenitore refrigerato entro un massimo di 24-48 ore.

1.1.6.   È indispensabile che tutti i campioni e i controlli positivi di R. solanacearum siano trattati separatamente per evitare contaminazioni. Ciò vale per i vetrini di immunofluorescenza e per tutti i saggi.

1.2.   Saggi analitici

Cfr. il diagramma di flusso e la descrizione dei saggi e dei protocolli ottimizzati nelle relative appendici:

| | Isolamento selettivo (cfr. sezione VI.A.4) |
| --- | --- |

Isolamento selettivo (cfr. sezione VI.A.4)

| | Saggio IF (cfr. sezione VI.A.5) |
| --- | --- |

Saggio IF (cfr. sezione VI.A.5)

| | Saggi PCR (cfr. sezione VI.A.6) |
| --- | --- |

Saggi PCR (cfr. sezione VI.A.6)

| | Saggio FISH (cfr. sezione VI.A.7) |
| --- | --- |

Saggio FISH (cfr. sezione VI.A.7)

| | Saggi ELISA (cfr. sezione VI.A.8) |
| --- | --- |

Saggi ELISA (cfr. sezione VI.A.8)

| | Saggio biologico (cfr. sezione VI.A.9) |
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Saggio biologico (cfr. sezione VI.A.9)

2.   Metodi dettagliati per il rilevamento e l’identificazione di R. solanacearum in campioni di piante di patata e di pomodoro o di altre piante ospiti asintomatiche

2.1.   Preparazione del campione

NB: Ai fini del rilevamento delle infezioni latenti di R. solanacearum si consiglia di saggiare campioni compositi. Il procedimento può essere applicato efficacemente a campioni compositi comprendenti fino a un massimo di 200 parti di fusto. Qualora si effettuino campagne di monitoraggio a fini di sorveglianza, esse devono basarsi su un campione statisticamente rappresentativo della popolazione di piante in esame.

2.1.1.   Raccogliere segmenti di fusto lunghi 1-2 cm in un recipiente sterile chiuso secondo le procedure di campionamento di seguito indicate.

Piantine di pomodoro da vivaio. Servendosi di un coltello pulito e disinfettato, asportare un segmento di 1 cm dalla base di ciascun fusto, appena al di sopra del livello del suolo.

Piante di pomodoro coltivate in campo o in serra. Servendosi di un coltello pulito e disinfettato, asportare il germoglio laterale più basso da ciascuna piantina incidendo appena sopra il punto di giuntura con il fusto principale. Asportare il segmento di 1 cm più basso da ciascun germoglio laterale.

Altre piante ospiti. Servendosi di un coltello o di un paio di forbici da giardinaggio pulite e disinfettate, asportare un segmento di 1 cm dalla base di ciascun fusto, appena al di sopra del livello del suolo. Per S. dulcamara o altre piante ospiti che crescono in acqua, asportare segmenti di 1-2 cm dai fusti subacquei o dagli stoloni con radici acquatiche.

Si consiglia, nel campionare un determinato luogo, di saggiare un campione rappresentativo di almeno 10 piante per punto di campionamento di ciascuna pianta erbacea potenzialmente ospite. Il rilevamento del patogeno è più attendibile nella tarda primavera, in estate e in autunno, sebbene nel Solanum dulcamara che cresce lungo i corsi d’acqua le infezioni naturali possano essere rilevate durante tutto l’anno. Tra le piante ospiti note figurano le piante di patata spontanee, Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium e altri membri della famiglia delle solanacee. Altre piante ospiti sono Pelargonium spp. e Portulaca oleracea. Tra le erbacee europee note o potenziali ospiti di popolazioni di R. solanacearum razza 3 biovar 2 nelle radici e/o nelle rizosfere, in particolari condizioni ambientali, figurano Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp., Rumex spp., Silene alba, S. nutans, Tussilago farfara e Urtica dioica.

NB: In questa fase può essere effettuato un esame visivo per individuare sintomi interni (colorazione vascolare o essudato batterico). Mettere da parte i segmenti di fusto che presentano sintomi sospetti e saggiarli individualmente (cfr. sezione II).

2.1.2.   Disinfettare brevemente i segmenti di fusto con etanolo al 70 % e asciugare immediatamente tamponando con carta bibula. Trattare poi i segmenti di fusto con uno dei metodi seguenti:

| a) | coprire i segmenti con un volume sufficiente (circa 40 ml) di tampone di estrazione (appendice 4) e porre in un agitatore rotativo (50-100 rpm) per 4 ore a non più di 24 °C o per 16-24 ore se refrigerati; oppure |
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a)

coprire i segmenti con un volume sufficiente (circa 40 ml) di tampone di estrazione (appendice 4) e porre in un agitatore rotativo (50-100 rpm) per 4 ore a non più di 24 °C o per 16-24 ore se refrigerati; oppure

| b) | trattare i segmenti immediatamente schiacciandoli in un sacchetto di macerazione resistente (p. es. Stomacher o Bioreba) con un volume adeguato di tampone di estrazione (appendice 4) usando un martello di gomma o uno strumento di macinazione appropriato (p. es. Homex). Se ciò non fosse possibile, conservare i segmenti di fusto refrigerati per non più di 72 ore o a temperatura ambiente per non più di 24 ore. |
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b)

trattare i segmenti immediatamente schiacciandoli in un sacchetto di macerazione resistente (p. es. Stomacher o Bioreba) con un volume adeguato di tampone di estrazione (appendice 4) usando un martello di gomma o uno strumento di macinazione appropriato (p. es. Homex). Se ciò non fosse possibile, conservare i segmenti di fusto refrigerati per non più di 72 ore o a temperatura ambiente per non più di 24 ore.

2.1.3.   Decantare il supernatante dopo averlo lasciato riposare per 15 minuti.

2.1.4.   Non è in genere necessario procedere a un’ulteriore chiarificazione dell’estratto o concentrazione della frazione batterica, ma esse possono essere ottenute mediante filtrazione e/o centrifugazione secondo quanto descritto nelle sezioni III.1.1.3-1.1.5.

2.1.5.   Dividere l’estratto del campione puro o concentrato in due parti uguali. Mantenerne una metà a 4-10 °C durante il saggio e conservare l’altra metà con glicerolo sterile al 10-25 % (v/v) a una temperatura compresa tra –16 e –24 °C (settimane) o tra –68 e –86 °C (mesi) qualora siano necessari ulteriori saggi.

2.2.   Saggi analitici

Cfr. il diagramma di flusso e la descrizione delle prove e dei protocolli ottimizzati nelle relative appendici:

| | Isolamento selettivo (cfr. sezione VI.A.4) |
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Isolamento selettivo (cfr. sezione VI.A.4)

| | Saggio IF (cfr. sezione VI.A.5) |
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Saggio IF (cfr. sezione VI.A.5)

| | Saggi PCR (cfr. sezione VI.A.6) |
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Saggi PCR (cfr. sezione VI.A.6)

| | Saggio FISH (cfr. sezione VI.A.7) |
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Saggio FISH (cfr. sezione VI.A.7)

| | Saggi ELISA (cfr. sezione VI.A.8) |
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Saggi ELISA (cfr. sezione VI.A.8)

| | Saggio biologico (cfr. sezione VI.A.9) |
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Saggio biologico (cfr. sezione VI.A.9)

SEZIONE IV

1.   Schema di rilevamento e identificazione di R. solanacearum nell’acqua.

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2.   Metodi di rilevamento e identificazione di R. solanacearum nell’acqua

Principi

Lo schema di rilevamento convalidato descritto nella presente sezione può essere usato per il rilevamento del patogeno in campioni di acque superficiali nonché per saggiare campioni di acque reflue o di reflui di lavorazione delle patate. Tuttavia è importante tener conto del fatto che la sensibilità prevista di rilevamento varia a seconda del substrato. La sensibilità del saggio di isolamento è condizionata dalle popolazioni di batteri saprofiti competitori, generalmente assai più numerose nelle acque reflue e nei reflui di lavorazione delle patate che nelle acque superficiali. Mentre nel caso delle acque superficiali la soglia di sensibilità dello schema sotto descritto arriva a 103 cellule per litro, nel caso delle acque reflue o dei reflui di lavorazione delle patate la soglia è assai superiore. È pertanto consigliabile effettuare i saggi sui reflui dopo eventuali trattamenti di depurazione (sedimentazione o filtrazione), che determinano una riduzione delle popolazioni di batteri saprofiti. Nel valutare l’affidabilità degli eventuali risultati negativi ottenuti si deve tener conto dei limiti di sensibilità dello schema diagnostico. Nonostante sia stato usato efficacemente in monitoraggi ed esami volti a stabilire la presenza o l’assenza del patogeno in acque superficiali, lo schema presenta alcuni limiti di cui è necessario tener conto nell’ambito di analoghi monitoraggi su acque reflue o su reflui di lavorazione delle patate.

2.1.   Preparazione del campione

Nota:

| — | Il rilevamento di R. solanacearum nelle acque superficiali è più attendibile nella tarda primavera, in estate e in autunno, quando le temperature dell’acqua sono superiori a 15 °C. |
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Il rilevamento di R. solanacearum nelle acque superficiali è più attendibile nella tarda primavera, in estate e in autunno, quando le temperature dell’acqua sono superiori a 15 °C.

| — | Prelevando i campioni in diversi momenti nel periodo summenzionato in punti di prelievo designati si potrà aumentare l’affidabilità del rilevamento e ridurre le conseguenze delle variazioni climatiche. |
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—

Prelevando i campioni in diversi momenti nel periodo summenzionato in punti di prelievo designati si potrà aumentare l’affidabilità del rilevamento e ridurre le conseguenze delle variazioni climatiche.

| — | Occorre tener conto degli effetti delle precipitazioni abbondanti e della geografia dei corsi d’acqua, al fine di evitare una eccessiva diluizione che potrebbe occultare la presenza del patogeno. |
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—

Occorre tener conto degli effetti delle precipitazioni abbondanti e della geografia dei corsi d’acqua, al fine di evitare una eccessiva diluizione che potrebbe occultare la presenza del patogeno.

| — | Prelevare i campioni di acque superficiali in prossimità delle piante ospiti, se queste ultime sono presenti. |
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—

Prelevare i campioni di acque superficiali in prossimità delle piante ospiti, se queste ultime sono presenti.

2.1.1.   Nei punti di prelievo designati, riempire provette o bottiglie sterili monuso con campioni di acqua, attingendo a una profondità possibilmente superiore a 30 cm e a non oltre 2 metri dalla riva. Per le acque reflue o i reflui di lavorazione, prelevare i campioni nel punto di scarico delle acque. La dimensione massima raccomandata dei campioni per punto di prelievo è di 500 ml. Se si opta per campioni di dimensioni più piccole, è consigliabile prelevare i campioni ad almeno 3 riprese per punto di prelievo; ogni campione deve consistere di 2 sottocampioni duplicati di almeno 30 ml. Per monitoraggi estesi, selezionare almeno 3 punti di prelievo per 3 km di corso d’acqua e assicurarsi che vengano prelevati campioni anche dagli affluenti.

2.1.2.   Trasportare i campioni in condizioni di oscurità e a bassa temperatura (4-10 °C) ed analizzarli entro 24 ore.

2.1.3.   Se necessario la frazione batterica può essere concentrata usando uno dei seguenti metodi:

| a) | Centrifugare i sottocampioni di 30-50 ml a 10 000 g per 10 minuti (o a 7 000 g per 15 minuti), preferibilmente a una temperatura di 4-10 °C, scartare il sopranatante e risospendere il sedimento in 1 ml di tampone per sedimento (appendice 4). |
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a)

Centrifugare i sottocampioni di 30-50 ml a 10 000 g per 10 minuti (o a 7 000 g per 15 minuti), preferibilmente a una temperatura di 4-10 °C, scartare il sopranatante e risospendere il sedimento in 1 ml di tampone per sedimento (appendice 4).

| b) | Filtrare attraverso una membrana (dimensioni minime dei pori 0,45 μm) e successivamente lavare quest’ultima in 5-10 ml di tampone per sedimento, conservando le soluzioni di lavaggio. Questo metodo è consigliato per grandi quantità di acqua che contengono un numero ridotto di saprofiti. |
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b)

Filtrare attraverso una membrana (dimensioni minime dei pori 0,45 μm) e successivamente lavare quest’ultima in 5-10 ml di tampone per sedimento, conservando le soluzioni di lavaggio. Questo metodo è consigliato per grandi quantità di acqua che contengono un numero ridotto di saprofiti.

In generale non si consiglia di effettuare la concentrazione sui campioni di acque reflue o di reflui di lavorazione della patata, giacché la presenza di popolazioni più numerose di batteri saprofiti competitori inibisce il rilevamento di R. solanacearum.

2.2.   Saggi analitici

Cfr. il diagramma di flusso e la descrizione delle prove nelle relative appendici.

SEZIONE V

1.   Schema di rilevamento e identificazione di R. solanacearum nel terreno

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2.   Metodi di rilevamento e identificazione di R. solanacearum nel terreno

Principi

Lo schema di rilevamento convalidato, descritto nella presente sezione, viene usato per rilevare la presenza del patogeno nei campioni di terreno oltre che per saggiare campioni di scarti solidi di lavorazione della patata o di fanghi di depurazione. La sensibilità di tali metodi non risulta tuttavia sufficiente a garantire il rilevamento di popolazioni ridotte e/o irregolarmente distribuite di R. solanacearum, che possono essere presenti nei campioni naturalmente contaminati di questi materiali.

Nel valutare l’affidabilità degli eventuali risultati negativi ottenuti, come pure nell’ambito di monitoraggi volti a determinare la presenza o l’assenza del patogeno nel terreno o nei fanghi di depurazione, occorre tener conto dei limiti di sensibilità di questo schema diagnostico. La prova più affidabile per rilevare la presenza del patogeno nel terreno di un appezzamento è di piantare una pianta ospite sensibile e di monitorare l’eventuale infezione, sebbene anche con questo metodo possano sfuggire bassi livelli di contaminazione.

2.1.   Preparazione del campione

2.1.1.   Per la preparazione del campione di terra di un appezzamento attenersi alle norme di base usate per il campionamento dei nematodi. Prelevare 0,5-1 kg di terra per campione da 60 punti di prelievo per 0,3 ha, a una profondità di 10-20 cm (o in una griglia di 7 × 7metri). Se si sospetta la presenza del patogeno, aumentare il numero di punti di prelievo a 120 per 0,3 ha. Conservare i campioni a una temperatura di 12-15 °C prima di saggiare. Prelevare un totale di 1 kg di fanghi di depurazione e fanghi provenienti dalla lavorazione della patata da siti rappresentativi del volume totale dei fanghi da esaminare. Mescolare bene ciascun campione prima di saggiare.

2.1.2.   Disperdere i sottocampioni di 10-25 g di terra o di fanghi con un agitatore rotativo (250 rpm) in 60-150 ml di tampone di estrazione (appendice 4) per un massimo di 2 ore. Se necessario aggiungere lo 0,02 % di Tween 20 e 10-20 g di ghiaia sterile per agevolare la dispersione.

2.1.3.   Conservare la sospensione a 4 °C durante il saggio.

2.2.   Saggi diagnostici

Cfr. il diagramma di flusso e la descrizione dei saggi nelle relative appendici.

SEZIONE VI

PROTOCOLLI OTTIMIZZATI PER IL RILEVAMENTO E L’IDENTIFICAZIONE DI R. SOLANACEARUM

A.   SAGGI DIAGNOSTICI E DI RILEVAMENTO

1.   Prova di fuoriuscita dell’essudato dal fusto

La presenza di R. solanacearum nei fusti di piante di patata e di pomodoro e in altre piante ospiti con sintomi di avvizzimento può essere rilevata presuntivamente mediante la seguente prova: tagliare il fusto appena sopra il livello del terreno; sospendere la superficie sezionata in una provetta di acqua limpida e in quiete; osservare se dopo pochi minuti si verifica la caratteristica fuoriuscita di filamenti biancastri di essudato batterico dai fasci fibrovascolari tagliati.

2.   Rilevamento dei granuli di poli-beta-idrossibutirrato

| 1. | Preparare uno striscio di essudato batterico proveniente da tessuto infetto o da una coltura di 48 ore su YPGA o SPA (appendice 2) su un vetrino da microscopio. |
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1.

Preparare uno striscio di essudato batterico proveniente da tessuto infetto o da una coltura di 48 ore su YPGA o SPA (appendice 2) su un vetrino da microscopio.

| 2. | Preparare strisci di controllo positivo di un ceppo biovar 2 di R. solanacearum e, se ritenuto utile, uno striscio di controllo negativo di una specie batterica conosciuta come PHB-negativa. |
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2.

Preparare strisci di controllo positivo di un ceppo biovar 2 di R. solanacearum e, se ritenuto utile, uno striscio di controllo negativo di una specie batterica conosciuta come PHB-negativa.

| 3. | Fare asciugare all’aria e passare la superficie inferiore di ciascun vetrino rapidamente sopra una fiamma per fissare gli strisci. |
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3.

Fare asciugare all’aria e passare la superficie inferiore di ciascun vetrino rapidamente sopra una fiamma per fissare gli strisci.

| 4. | Colorare la preparazione con blu Nilo o nero Sudan e osservare al microscopio come descritto di seguito: |
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4.

Colorare la preparazione con blu Nilo o nero Sudan e osservare al microscopio come descritto di seguito:

Colorazione blu Nilo

| a) | Bagnare il vetrino con una soluzione acquosa all’1 % di blu Nilo A e incubare per 10 minuti a 55 °C. |
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a)

Bagnare il vetrino con una soluzione acquosa all’1 % di blu Nilo A e incubare per 10 minuti a 55 °C.

| b) | Far sgocciolare la soluzione colorante. Lavare rapidamente sotto un getto leggero di acqua corrente. Eliminare l’acqua in eccesso con carta bibula. |
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b)

Far sgocciolare la soluzione colorante. Lavare rapidamente sotto un getto leggero di acqua corrente. Eliminare l’acqua in eccesso con carta bibula.

| c) | Bagnare lo striscio con una soluzione di acido acetico all’8 % e mantenere in incubazione per 1 minuto a temperatura ambiente. |
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c)

Bagnare lo striscio con una soluzione di acido acetico all’8 % e mantenere in incubazione per 1 minuto a temperatura ambiente.

| d) | Lavare rapidamente sotto un getto leggero di acqua corrente. Eliminare l’acqua in eccesso con carta bibula. |
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d)

Lavare rapidamente sotto un getto leggero di acqua corrente. Eliminare l’acqua in eccesso con carta bibula.

| e) | Riumidificare con una goccia d’acqua e applicare un vetrino coprioggetti. |
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e)

Riumidificare con una goccia d’acqua e applicare un vetrino coprioggetti.

| f) | Esaminare lo striscio colorato con un microscopio a epifluorescenza a 450 nm in olio da immersione a 600-1 000 ingrandimenti con un obiettivo a immersione in olio o acqua. |
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f)

Esaminare lo striscio colorato con un microscopio a epifluorescenza a 450 nm in olio da immersione a 600-1 000 ingrandimenti con un obiettivo a immersione in olio o acqua.

| g) | Osservare se vi sia una fluorescenza arancio vivo dei granuli PHB. Osservare anche a normale luce trasmessa per accertare che i granuli siano intracellulari e che la morfologia della cellula sia tipica di R. solanacearum. |
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g)

Osservare se vi sia una fluorescenza arancio vivo dei granuli PHB. Osservare anche a normale luce trasmessa per accertare che i granuli siano intracellulari e che la morfologia della cellula sia tipica di R. solanacearum.

Colorazione nero Sudan

| a) | Coprire ciascun vetrino con una soluzione allo 0,3 % di nero Sudan B in etanolo al 70 % e mantenere in incubazione a temperatura ambiente per 10 minuti. |
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a)

Coprire ciascun vetrino con una soluzione allo 0,3 % di nero Sudan B in etanolo al 70 % e mantenere in incubazione a temperatura ambiente per 10 minuti.

| b) | Far sgocciolare la soluzione colorante e lavare rapidamente in acqua corrente, eliminando l’acqua in eccesso con carta bibula. |
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b)

Far sgocciolare la soluzione colorante e lavare rapidamente in acqua corrente, eliminando l’acqua in eccesso con carta bibula.

| c) | Immergere rapidamente i vetrini in xilolo e asciugare tamponando con carta bibula. Attenzione: lo xilolo è un prodotto nocivo, prendere opportune precauzioni per la sicurezza e operare in ambiente provvisto di cappa a tiraggio forzato. |
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c)

Immergere rapidamente i vetrini in xilolo e asciugare tamponando con carta bibula. Attenzione: lo xilolo è un prodotto nocivo, prendere opportune precauzioni per la sicurezza e operare in ambiente provvisto di cappa a tiraggio forzato.

| d) | Coprire i vetrini con una soluzione acquosa di safranina allo 0,5 % (p/v) e lasciare per 10 secondi a temperatura ambiente. Attenzione: la safranina è un prodotto nocivo, prendere opportune precauzioni per la sicurezza e operare in ambiente provvisto di cappa a tiraggio forzato. |
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d)

Coprire i vetrini con una soluzione acquosa di safranina allo 0,5 % (p/v) e lasciare per 10 secondi a temperatura ambiente. Attenzione: la safranina è un prodotto nocivo, prendere opportune precauzioni per la sicurezza e operare in ambiente provvisto di cappa a tiraggio forzato.

| e) | Lavare sotto un getto leggero di acqua corrente, asciugare tamponando con carta bibula e applicare un vetrino coprioggetti. |
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e)

Lavare sotto un getto leggero di acqua corrente, asciugare tamponando con carta bibula e applicare un vetrino coprioggetti.

| f) | Esaminare gli strisci colorati con un microscopio ottico a luce trasmessa usando un obiettivo per immersione in olio a 1 000 ingrandimenti. |
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f)

Esaminare gli strisci colorati con un microscopio ottico a luce trasmessa usando un obiettivo per immersione in olio a 1 000 ingrandimenti.

| g) | Osservare se i granuli di PHB nelle cellule di R. solanacearum si colorano di blu-nero e le pareti della cellula si colorano di rosa. |
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g)

Osservare se i granuli di PHB nelle cellule di R. solanacearum si colorano di blu-nero e le pareti della cellula si colorano di rosa.

3.   Saggio sierologico di agglutinazione

Il metodo migliore per osservare l’agglutinazione di cellule di R. solanacearum nell’essudato batterico o in estratti di tessuto sintomatico consiste nel servirsi di anticorpi convalidati (appendice 3) legati ad opportuni marcatori colorati quali cellule rosse di Staphylococcus aureus o particelle di lattice colorate. Se si utilizza un kit disponibile in commercio (appendice 3) seguire le istruzioni del fabbricante. In caso contrario seguire la seguente procedura:

| a) | Mescolare alcune gocce di una sospensione di anticorpi legati a particelle marcatrici ed essudato batterico (circa 5 μl di ciascuno) su vetrini a pozzetti multipli. |
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a)

Mescolare alcune gocce di una sospensione di anticorpi legati a particelle marcatrici ed essudato batterico (circa 5 μl di ciascuno) su vetrini a pozzetti multipli.

| b) | Preparare controlli positivi e negativi usando sospensioni di R. solanacearum biovar 2 e un ceppo eterologo. |
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b)

Preparare controlli positivi e negativi usando sospensioni di R. solanacearum biovar 2 e un ceppo eterologo.

| c) | Mescolare delicatamente per 15 secondi e osservare se si verifica l’agglutinazione nei campioni positivi. |
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c)

Mescolare delicatamente per 15 secondi e osservare se si verifica l’agglutinazione nei campioni positivi.

4.   Isolamento selettivo

4.1.   Isolamento selettivo in piastra

NB: Prima di usare questo metodo per la prima volta, effettuare saggi preliminari per garantire il rilevamento riproducibile di almeno 103-104 unità formanti colonia di R. solanacearum per ml aggiunte a estratti dei campioni precedentemente risultati negativi.

Servirsi di un substrato selettivo adeguatamente convalidato come il substrato SMSA (modificato da Elphinstone et al., 1996; cfr. l’appendice 2).

Occorre particolare attenzione anche per distinguere R. solanacearum da altri batteri che potrebbero sviluppare colonie sul terreno di coltura. Inoltre, le colonie di R. solanacearum possono presentare una morfologia atipica se le piastre sono sovrappopolate o se sono presenti anche batteri antagonisti. Qualora si sospettino effetti di competizione o antagonismo, il campione deve essere sottoposto a un saggio di tipo diverso.

Per ottenere la massima sensibilità di rilevamento con questo metodo è preferibile disporre di estratto del campione preparato al momento. Tuttavia, esso può essere eseguito anche su estratti conservati in glicerolo ad una temperatura compresa tra –68 e –86 °C.

Come controllo positivo, preparare diluizioni decimali di una sospensione di 106 cfu/ml di un ceppo virulento di biovar 2 di R. solanacearum (p. es. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Per evitare possibili contaminazioni, preparare i controlli positivi in un ambiente totalmente separato da quello dei campioni da saggiare.

Per ogni nuovo lotto di un substrato selettivo preparato, l’idoneità per lo sviluppo del patogeno andrebbe verificata prima che il lotto venga usato per saggiare campioni ordinari.

Saggiare il materiale di controllo con lo stesso metodo utilizzato per il/i campione/i.

4.1.1.   Predisporre le sospensioni da inseminare sulle piastre a diluizioni tali da rendere minimo l'effetto di eventuali popolazioni batteriche saprofite formanti colonia associate al materiale. Inseminare 50-100 μl per piastra di estratto del campione e di ogni diluizione.

4.1.2.   Mantenere le piastre in incubazione a una temperatura di 28 °C. Osservare le piastre dopo 48 ore e in seguito quotidianamente per un periodo fino a 6 giorni. Le colonie tipiche di R. solanacearum su SMSA sono di color bianco-latte, piatte, irregolari e fluide e dopo 3 giorni di incubazione sviluppano una colorazione da rosa a rosso sangue al centro, con striature interne e vortici (cfr. il sito web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

NB: Su questo substrato possono formarsi colonie atipiche di R. solanacearum. Esse possono essere piccole, tonde, di un colore uniforme rosso e non fluide o soltanto in parte fluide e quindi difficili da distinguere dai batteri saprofiti formatori di colonie.

4.1.3.   Purificare le presunte colonie di R. solanacearum dopo avere effettuato uno striscio o una diluizione in piastra su un mezzo nutritivo generale per ottenere colonie isolate (appendice 2).

4.1.4.   Le colture possono essere conservate a breve termine in acqua sterile (pH 6-8, senza cloruri) a temperatura ambiente e in condizioni di oscurità, oppure a lungo termine in un mezzo crioprotettivo adeguato a una temperatura compresa tra –68 e –86 °C o liofilizzate.

4.1.5.   Identificare le presunte colonie (cfr. sezione VI.B) ed effettuare un saggio di patogenicità (cfr. sezione VI.C).

Interpretazione del risultato dell’isolamento selettivo in piastra

L’isolamento selettivo in piastra è negativo se non si osservano colonie dopo sei giorni o se non si trovano colonie presunte tipiche di R. solanacearum, purché non si sospetti inibizione causata da competizione o antagonismo da parte di altri batteri e nel controllo positivo si trovino le caratteristiche colonie di R. solanacearum.

L’isolamento in piastra è positivo se vengono rilevate colonie presunte di R. solanacearum.

4.2.   Procedura di arricchimento

Servirsi di un substrato di arricchimento convalidato come il brodo di Wilbrink modificato (cfr. appendice 2).

Questa procedura può essere usata per aumentare selettivamente le popolazioni di R. solanacearum negli estratti del campione e per aumentare la sensibilità di rilevamento. La procedura è anche efficace per diluire gli inibitori della reazione PCR (1:100). Va notato comunque che l’arricchimento di R. solanacearum può essere compromesso a causa di una competizione o di un antagonismo da parte di organismi saprofiti che spesso vengono arricchiti allo stesso tempo. L’isolamento di R. solanacearum da brodi di coltura arricchiti può pertanto rivelarsi difficile. Inoltre, dato che le popolazioni di saprofiti sierologicamente affini possono aumentare, è consigliabile servirsi di anticorpi monoclonali specifici anziché di anticorpi policlonali qualora si debba effettuare il saggio ELISA.

4.2.1.   Per il PCR post-arricchimento trasferire 100 μl di estratto del campione in 10 ml di brodo di arricchimento (appendice 2), precedentemente frazionato in provette o bottiglie esenti da DNA. Per l’ELISA post-arricchimento possono essere aggiunte proporzioni maggiori di estratto del campione nel brodo (p. es. 100 μl in 1,0 ml di brodo di arricchimento).

4.2.2.   Mantenere in incubazione per 72 ore a una temperatura di 27-30 °C in coltura agitata o statica, senza chiudere ermeticamente i tappi al fine di consentire l’aerazione.

4.2.3.   Mescolare bene prima di usare nei saggi ELISA o PCR.

4.2.4.   Trattare il brodo arricchito secondo lo stesso metodo usato per i campioni nei saggi precedenti.

NB: Se si prevede un’inibizione dell’arricchimento di R. solanacearum a causa di elevate popolazioni di determinati batteri saprofiti competitori, l’arricchimento dagli estratti dei campioni prima dell’eventuale centrifugazione o di altre procedure di concentrazione può dare risultati migliori.

5.   saggio IF

Principi

Tenuto conto della sua comprovata capacità di garantire il rilevamento delle soglie richieste, si raccomanda l’uso del saggio IF come saggio di selezione preliminare principale.

Quando il saggio IF è usato come saggio di selezione preliminare principale e l’esito è positivo, occorre procedere ad un secondo saggio che può essere l’isolamento, la PCR o il FISH. Quando il saggio IF è usato come secondo saggio di selezione preliminare e l’esito è positivo, per completare l’analisi occorre procedere ad ulteriori saggi sulla base del diagramma di flusso.

NB: Servirsi di una fonte convalidata di anticorpi per R. solanacearum (cfr. il sito web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Si consiglia di determinare il titolo di ciascun nuovo lotto di anticorpi. Il titolo si definisce come la più alta diluizione alla quale si verifica una reazione ottimale saggiando una sospensione contenente da 105 a 106 cellule per ml del ceppo omologo di R. solanacearum e usando un’appropriata diluizione del coniugato di isotiocianato di fluoresceina (FITC), secondo le istruzioni del produttore. Gli antisieri policlonali convalidati hanno tutti un titolo IF di almeno 1:2 000. Durante il saggio, gli anticorpi dovrebbero essere usati a diluizioni di lavoro prossime o corrispondenti a tale titolo.

Il saggio va effettuato su estratti di campione preparati al momento dell’uso. Se necessario, esso può essere eseguito efficacemente su estratti conservati in glicerolo ad una temperatura compresa tra –68 e –86 °C. Il glicerolo può essere rimosso dal campione mediante aggiunta di 1 ml di tampone per sedimento da centrifuga (appendice 4), ricentrifugazione per 15 minuti a 7 000 g e risospensione in un volume uguale di tampone per sedimento da centrifuga. Questa operazione non sempre è necessaria, soprattutto se i campioni vengono fissati ai vetrini mediante esposizione alla fiamma.

Preparare vetrini separati di controllo positivo del ceppo omologo o di qualunque altro ceppo di riferimento di R. solanacearum sospeso in estratto di patata, come specificato nell’appendice 3, e facoltativamente in tampone.

Ove possibile si dovrebbe usare tessuto contaminato naturalmente (conservato mediante liofilizzazione o congelamento a una temperatura compresa tra –16 e –24 °C) come controllo analogo nello stesso vetrino.

Come controllo negativo, usare aliquote di estratto di campione precedentemente risultato negativo per R. solanacearum.

I materiali di controllo positivi e negativi standardizzati che possono essere impiegati per questa prova figurano nell’appendice 3.

Usare vetrini per microscopio con più pozzetti, preferibilmente con 10 pozzetti di almeno 6 mm di diametro.

Eseguire il saggio sul materiale di controllo secondo lo stesso metodo usato per il/i campione/i.

5.1.   Preparare i vetrini di saggio con uno dei seguenti procedimenti.

| i) | Per sedimenti contenenti una quantità relativamente ridotta di amido:
  Trasferire con una pipetta sul primo pozzetto un volume standard misurato (15 μl è un valore adeguato per un pozzetto di 6 mm di diametro — aumentare il volume per pozzetti più grandi) di una diluizione 1:100 del sedimento risospeso. Successivamente trasferire con la pipetta un volume analogo di sedimento non diluito (1:1) sugli altri pozzetti della fila. La seconda fila può essere usata come duplicato o per un secondo campione, come illustrato nella figura 1. |
| --- | --- |

i)

Per sedimenti contenenti una quantità relativamente ridotta di amido:

Trasferire con una pipetta sul primo pozzetto un volume standard misurato (15 μl è un valore adeguato per un pozzetto di 6 mm di diametro — aumentare il volume per pozzetti più grandi) di una diluizione 1:100 del sedimento risospeso. Successivamente trasferire con la pipetta un volume analogo di sedimento non diluito (1:1) sugli altri pozzetti della fila. La seconda fila può essere usata come duplicato o per un secondo campione, come illustrato nella figura 1.

| ii) | Per gli altri sedimenti:
  Preparare diluizioni decimali (1:10 e 1:100) del sedimento risospeso nel tampone per sedimento. Trasferire con una pipetta su una fila di pozzetti un volume standard misurato (15 μl è un valore adeguato per un pozzetto di 6 mm di diametro — aumentare il volume per pozzetti più grandi) di sedimento risospeso e di ogni diluizione. La seconda fila può essere usata come duplicato o per un secondo campione, come illustrato nella figura 2. |
| --- | --- |

ii)

Per gli altri sedimenti:

Preparare diluizioni decimali (1:10 e 1:100) del sedimento risospeso nel tampone per sedimento. Trasferire con una pipetta su una fila di pozzetti un volume standard misurato (15 μl è un valore adeguato per un pozzetto di 6 mm di diametro — aumentare il volume per pozzetti più grandi) di sedimento risospeso e di ogni diluizione. La seconda fila può essere usata come duplicato o per un secondo campione, come illustrato nella figura 2.

5.2.   Far evaporare il liquido delle goccioline a temperatura ambiente o mediante riscaldamento a una temperatura compresa tra 40 e 45 °C. Fissare le cellule batteriche al vetrino scaldandolo (15 minuti a 60 °C), passandolo alla fiamma, con etanolo al 95 % o seguendo le istruzioni specifiche fornite dal produttore degli anticorpi.

Se necessario, i vetrini fissati possono essere quindi conservati congelati in un contenitore ben asciutto per il tempo minimo necessario (fino a un massimo di tre mesi) prima di essere usati per ulteriori saggi.

5.3.   Procedimento IF

| i) | Se il vetrino di saggio è stato preparato secondo il procedimento di cui al punto 5.1.i):
  Preparare una serie di diluizioni decimali. Il primo pozzetto dovrebbe avere 1/2 del titolo (T/2), gli altri rispettivamente 1/4 del titolo (T/4), 1/2 del titolo (T/2), il titolo (T) e il doppio del titolo (2T). |
| --- | --- |

i)

Se il vetrino di saggio è stato preparato secondo il procedimento di cui al punto 5.1.i):

Preparare una serie di diluizioni decimali. Il primo pozzetto dovrebbe avere 1/2 del titolo (T/2), gli altri rispettivamente 1/4 del titolo (T/4), 1/2 del titolo (T/2), il titolo (T) e il doppio del titolo (2T).

| ii) | Se il vetrino di saggio è stato preparato secondo il procedimento di cui al punto 5.1.ii):
  Preparare la diluizione di lavoro (WD) dell’anticorpo nel tampone IF. La diluizione di lavoro incide sulla specificità. |
| --- | --- |

ii)

Se il vetrino di saggio è stato preparato secondo il procedimento di cui al punto 5.1.ii):

Preparare la diluizione di lavoro (WD) dell’anticorpo nel tampone IF. La diluizione di lavoro incide sulla specificità.

Figura 1.   Preparazione del vetrino di saggio secondo i punti 5.1.i) e 5.3.i)

| | Diluizione del sedimento risospeso |
| --- | --- |
| 1/100 | 1/1 | 1/1 | 1/1 | 1/1 |  | Diluizione del sedimento risospeso |
| (T = titolo) | T/2 | T/4 | T/2 | T | 2T |  | Diluizioni 1:2 dell’antisiero/anticorpo |
| Campione 1 | | | | | | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Duplicato del campione 1 o campione 2 | | | | | |
| 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |

Diluizione del sedimento risospeso

1/100

1/1

1/1

1/1

1/1



Diluizione del sedimento risospeso

(T = titolo)

T/2

T/4

T/2

T

2T



Diluizioni 1:2 dell’antisiero/anticorpo

Campione 1

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Image

Image

Image

Image

1

2

3

4

5

Duplicato del campione 1 o campione 2

Image

Image

Image

Image

Image

6

7

8

9

10

Figura 2.   Preparazione del vetrino di saggio secondo i punti 5.1.ii) e 5.3.ii)

| | Diluizione di lavoro dell’antisiero/anticorpo |
| --- | --- |
| 1/1 | 1/10 | 1/100 | vuoto | vuoto |  | Diluizione decimale del sedimento risospeso |
| Campione 1 | | | | | | | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Duplicato del campione 1 o campione 2 | | | | | |
| 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |

Diluizione di lavoro dell’antisiero/anticorpo

1/1

1/10

1/100

vuoto

vuoto



Diluizione decimale del sedimento risospeso

Campione 1

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Image

Image

Image

Image

1

2

3

4

5

Duplicato del campione 1 o campione 2

Image

Image

Image

Image

Image

6

7

8

9

10

5.3.1.   Disporre i vetrini su carta bibula umida. Coprire completamente ciascun pozzetto di saggio con la/le diluizione/i di anticorpo. Il volume di anticorpo messo su ciascun pozzetto deve essere almeno equivalente al volume di estratto.

In assenza di istruzioni specifiche da parte del fornitore degli anticorpi, si proceda come segue:

5.3.2.   Mantenere in incubazione i vetrini su carta umida in un contenitore chiuso per 30 minuti a temperatura ambiente (18-25 °C).

5.3.3.   Scuotere via le goccioline da ciascun vetrino e sciacquare accuratamente con tampone IF. Lavare immergendo per 5 minuti nel tampone IF-Tween (appendice 4) e poi nel tampone IF. Evitare la produzione di aerosol o il trasferimento di goccioline, che potrebbero provocare una contaminazione incrociata. Rimuovere accuratamente l’umidità in eccesso tamponando delicatamente con carta bibula.

5.3.4.   Disporre i vetrini su carta bibula umida. Coprire i pozzetti di saggio con la diluizione di coniugato di FITC usato per determinare la concentrazione. Il volume di coniugato messo sui pozzetti deve essere identico al volume dell’anticorpo.

5.3.5.   Mantenere in incubazione i vetrini su carta umida sotto copertura per 30 minuti a temperatura ambiente (18-25 °C).

5.3.6.   Scuotere via le goccioline di coniugato dal vetrino. Sciacquare e lavare come in precedenza (paragrafo 5.3.3).

Rimuovere accuratamente l’umidità in eccesso.

5.3.7.   Trasferire con una pipetta 5-10 μl di tampone glicerol-fosfato 0,1 M (appendice 4) o di un liquido di montaggio commerciale antiscolorimento in ciascun pozzetto e chiudere con un vetrino coprioggetti.

5.4.   Lettura della colorazione IF

5.4.1   Esaminare i vetrini con un microscopio a epifluorescenza dotato di filtri idonei all’eccitazione del FITC, in olio o liquido di immersione, a 500-1 000 ingrandimenti. Esaminare attentamente i pozzetti lungo due diametri ortogonali e lungo il perimetro. Per i campioni che presentano assenza o un basso numero di cellule, osservare almeno 40 campi microscopici.

Esaminare anzitutto il vetrino del controllo positivo. Le cellule devono avere fluorescenza brillante ed essere interamente colorate al titolo o alla diluizione di lavoro determinati dell’anticorpo. Il saggio IF (sezione VI.A.5) deve essere ripetuto se la colorazione è anomala.

5.4.2.   Verificare la presenza di cellule fluorescenti brillanti con morfologia caratteristica di R. solanacearum nei pozzetti di saggio dei vetrini (cfr. il sito web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). L’intensità della fluorescenza deve essere equivalente al ceppo di controllo positivo con la stessa diluizione di anticorpi. Le cellule che presentano una colorazione incompleta o una debole fluorescenza devono essere ignorate.

In caso di sospetta contaminazione occorre ripetere il saggio. Tale sospetto può sorgere ad esempio se tutti i vetrini di un lotto presentano cellule positive dovute alla contaminazione del tampone o se vengono rilevate cellule positive (al di fuori dei pozzetti) sul rivestimento dei vetrini.

5.4.3.   La prova di immunofluorescenza presenta alcuni problemi inerenti alla sua specificità. Nei precipitati di coni ombelicali e frammenti di fusto di patata è possibile che si manifesti la presenza di una popolazione di fondo di cellule fluorescenti con morfologia atipica e di batteri saprofiti a reazione incrociata simili per dimensioni e morfologia a R. solanacearum.

5.4.4.   Considerare soltanto le cellule fluorescenti aventi dimensioni e morfologia tipica al titolo o alla diluizione di lavoro degli anticorpi secondo quanto indicato alla sezione 5.3.

5.4.5.   Interpretazione della lettura della colorazione IF

| i) | Per ciascun campione in cui vengono trovate cellule fluorescenti brillanti con morfologia caratteristica, stimare il numero medio di cellule tipiche per campo microscopico e calcolare il numero di cellule tipiche per ml di sedimento di centrifuga risospeso (appendice 5).
  La lettura della colorazione IF è positiva per i campioni che presentano almeno 5 × 103 cellule tipiche per ml di sedimento di centrifuga risospeso. Il campione si considera potenzialmente contaminato ed occorre procedere ad ulteriori saggi. |
| --- | --- |

i)

Per ciascun campione in cui vengono trovate cellule fluorescenti brillanti con morfologia caratteristica, stimare il numero medio di cellule tipiche per campo microscopico e calcolare il numero di cellule tipiche per ml di sedimento di centrifuga risospeso (appendice 5).

La lettura della colorazione IF è positiva per i campioni che presentano almeno 5 × 103 cellule tipiche per ml di sedimento di centrifuga risospeso. Il campione si considera potenzialmente contaminato ed occorre procedere ad ulteriori saggi.

| ii) | La lettura della colorazione IF è negativa per i campioni che presentano meno di 5 × 103 cellule per ml di sedimento di centrifuga risospeso. Il campione si considera negativo e non sono necessari ulteriori saggi. |
| --- | --- |

ii)

La lettura della colorazione IF è negativa per i campioni che presentano meno di 5 × 103 cellule per ml di sedimento di centrifuga risospeso. Il campione si considera negativo e non sono necessari ulteriori saggi.

6.   Saggi PCR

Principi

Quando il saggio PCR è usato come saggio di selezione preliminare principale e l’esito è positivo, occorre procedere all’isolamento o alla colorazione IF come secondo saggio di selezione preliminare obbligatorio. Quando il saggio PCR è utilizzato come secondo saggio di selezione preliminare e l’esito è positivo, per completare la diagnosi devono essere effettuati i saggi previsti dal diagramma di flusso.

Si raccomanda di usare questo metodo come saggio di selezione preliminare principale solo dopo aver acquisito una competenza specializzata.

NB: Un saggio preliminare con questo metodo dovrebbe permettere il rilevamento riproducibile di 103-104 cellule di R. solanacearum per ml aggiunte a estratti di un campione precedentemente risultato negativo. Può essere necessario condurre esperimenti di ottimizzazione per raggiungere livelli massimi di sensibilità e specificità in tutti i laboratori.

Servirsi di reagenti e protocolli PCR convalidati (cfr. appendice 6). Scegliere preferibilmente un metodo con controllo interno.

Prendere le opportune precauzioni per evitare la contaminazione del campione con il DNA bersaglio. Per ridurre al minimo la possibilità di contaminazione con il DNA bersaglio, il saggio PCR andrebbe eseguito da tecnici esperti, in laboratori di biologia molecolare specializzati.

I controlli negativi (per procedure di estrazione del DNA e PCR) devono essere sempre trattati come campione finale nel procedimento, al fine di evidenziare la presenza di eventuale disseminazione di DNA.

Nel saggio PCR devono essere inclusi i seguenti controlli negativi:

| — | estratto del campione precedentemente risultato negativo per R. solanacaearum; |
| --- | --- |

—

estratto del campione precedentemente risultato negativo per R. solanacaearum;

| — | controlli del tampone usato per estrarre il batterio e il DNA dal campione; |
| --- | --- |

—

controlli del tampone usato per estrarre il batterio e il DNA dal campione;

| — | miscela di reazione PCR. |
| --- | --- |

—

miscela di reazione PCR.

Devono essere inoltre inclusi i seguenti controlli positivi:

| — | aliquote del precipitato risospeso a cui è stato aggiunto R. solanacearum (per la preparazione cfr. l’appendice 3B); |
| --- | --- |

—

aliquote del precipitato risospeso a cui è stato aggiunto R. solanacearum (per la preparazione cfr. l’appendice 3B);

| — | una sospensione di 106 cellule per ml di R. solanacearum in acqua provenienti da un isolato virulento (p. es. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; cfr. l’appendice 3B). |
| --- | --- |

—

una sospensione di 106 cellule per ml di R. solanacearum in acqua provenienti da un isolato virulento (p. es. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; cfr. l’appendice 3B).

| — | se possibile, servirsi anche di DNA proveniente da campioni di controllo positivi nella PCR. |
| --- | --- |

—

se possibile, servirsi anche di DNA proveniente da campioni di controllo positivi nella PCR.

Per evitare potenziali contaminazioni, preparare i controlli positivi in un ambiente separato da quello dei campioni da saggiare.

Nella misura del possibile, gli estratti del campione devono essere privi di residui di terra. In taluni casi può essere pertanto consigliabile, in previsione dell’utilizzo di protocolli PRC, preparare gli estratti a partire da patate lavate.

I materiali di controllo positivi e negativi standardizzati che possono essere impiegati per questa prova sono elencati nell’appendice 3.

6.1.   Metodi di purificazione del DNA

Servirsi di campioni di controllo positivi e negativi, come sopra indicato (cfr. appendice 3).

Eseguire il saggio sul materiale di controllo secondo lo stesso metodo usato per il/i campione/i.

Esistono vari metodi per purificare il DNA bersaglio da substrati di campioni complessi, eliminando in tal modo gli inibitori della PCR e di altre reazioni enzimatiche e concentrando il DNA bersaglio nell’estratto del campione. Il metodo seguente è stato ottimizzato per l’impiego con i metodi PCR convalidati che figurano all’appendice 6.

a)   Metodo di Pastrik (2000)

| 1) | Trasferire con una pipetta 220 μl di tampone di lisi [NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM (pH 8,0)] in una provetta Eppendorf da 1,5 ml. |
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1)

Trasferire con una pipetta 220 μl di tampone di lisi [NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM (pH 8,0)] in una provetta Eppendorf da 1,5 ml.

| 2) | Aggiungere 100 μl di estratto del campione e porre su una piastra riscaldante o a bagnomaria a 95 °C per 10 minuti. |
| --- | --- |

2)

Aggiungere 100 μl di estratto del campione e porre su una piastra riscaldante o a bagnomaria a 95 °C per 10 minuti.

| 3) | Mettere la provetta in ghiaccio per 5 minuti. |
| --- | --- |

3)

Mettere la provetta in ghiaccio per 5 minuti.

| 4) | Aggiungere 80 μl di soluzione madre di lisozima (50 mg di lisozima/ml in Tris HCl 10 mM, pH 8,0) e incubare a 37 °C per 30 minuti. |
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4)

Aggiungere 80 μl di soluzione madre di lisozima (50 mg di lisozima/ml in Tris HCl 10 mM, pH 8,0) e incubare a 37 °C per 30 minuti.

| 5) | Aggiungere 220 μl di Easy DNA®, soluzione A (Invitrogen), mescolare bene nel vortex e incubare a 65 °C per 30 minuti. |
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5)

Aggiungere 220 μl di Easy DNA®, soluzione A (Invitrogen), mescolare bene nel vortex e incubare a 65 °C per 30 minuti.

| 6) | Aggiungere 100 μl di Easy DNA®, soluzione B (Invitrogen), mescolare vigorosamente nel vortex fino a quando il precipitato non circoli liberamente nella provetta e il campione non presenti una viscosità uniforme. |
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6)

Aggiungere 100 μl di Easy DNA®, soluzione B (Invitrogen), mescolare vigorosamente nel vortex fino a quando il precipitato non circoli liberamente nella provetta e il campione non presenti una viscosità uniforme.

| 7) | Aggiungere 500 μl di cloroformio e mescolare nel vortex fino a quando la viscosità non diminuisca e la miscela non risulti omogenea. |
| --- | --- |

7)

Aggiungere 500 μl di cloroformio e mescolare nel vortex fino a quando la viscosità non diminuisca e la miscela non risulti omogenea.

| 8) | Centrifugare a 15 000 g per 20 minuti a 4 °C per separare le fasi e formare l’interfase. |
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8)

Centrifugare a 15 000 g per 20 minuti a 4 °C per separare le fasi e formare l’interfase.

| 9) | Trasferire la fase superiore in una nuova provetta Eppendorf. |
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9)

Trasferire la fase superiore in una nuova provetta Eppendorf.

| 10) | Aggiungere 1 ml di etanolo al 100 % (–20 °C), mescolare brevemente nel vortex e incubare in ghiaccio per 10 minuti. |
| --- | --- |

10)

Aggiungere 1 ml di etanolo al 100 % (–20 °C), mescolare brevemente nel vortex e incubare in ghiaccio per 10 minuti.

| 11) | Centrifugare a 15 000 g per 20 minuti a 4 °C ed eliminare l’etanolo dal precipitato. |
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11)

Centrifugare a 15 000 g per 20 minuti a 4 °C ed eliminare l’etanolo dal precipitato.

| 12) | Aggiungere 500 μl di etanolo all’80 % (–20 °C) e mescolare capovolgendo la provetta. |
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12)

Aggiungere 500 μl di etanolo all’80 % (–20 °C) e mescolare capovolgendo la provetta.

| 13) | Centrifugare a 15 000 g per 10 minuti a 4 °C, conservare il precipitato ed eliminare l’etanolo. |
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13)

Centrifugare a 15 000 g per 10 minuti a 4 °C, conservare il precipitato ed eliminare l’etanolo.

| 14) | Lasciar seccare il precipitato all’aria o in una speed vac per DNA. |
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14)

Lasciar seccare il precipitato all’aria o in una speed vac per DNA.

| 15) | Risospendere il precipitato in 100 μl di UPW sterile e lasciare a temperatura ambiente per almeno 20 minuti. |
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15)

Risospendere il precipitato in 100 μl di UPW sterile e lasciare a temperatura ambiente per almeno 20 minuti.

| 16) | Conservare a –20 °C fino al momento di effettuare la PCR. |
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16)

Conservare a –20 °C fino al momento di effettuare la PCR.

| 17) | Isolare l’eventuale precipitato bianco mediante centrifugazione e usare 5 μl del supernatante contenente DNA per la PCR. |
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17)

Isolare l’eventuale precipitato bianco mediante centrifugazione e usare 5 μl del supernatante contenente DNA per la PCR.

b)   Altri metodi

È possibile applicare altri metodi di estrazione del DNA (p. es. Qiagen DNeasy Plant Kit), purché essi diano prova di un’efficacia equivalente nel purificare il DNA da campioni di controllo contenenti da 103 a 104 cellule del patogeno per ml.

6.2.   PCR

6.2.1.   Preparare la sequenza di nucleotidi di riferimento (primer) per la prova e il controllo, secondo i protocolli convalidati (sezione VI.A.6). Preparare una diluizione decimale dell’estratto di DNA proveniente dal campione (1:10 in UPW).

6.2.2.   Preparare la miscela di reazione PCR in un ambiente privo di contaminazione secondo i protocolli pubblicati (appendice 6). Ove possibile si consiglia di usare un protocollo PCR multiplex che includa anche un controllo interno della PCR.

6.2.3.   Aggiungere 2-5 μl di estratto di DNA per 25 μl di miscela di reazione PCR in provette da PCR sterili, conformemente ai protocolli PCR (appendice 6).

6.2.4.   Includere un campione di controllo negativo contenente unicamente la miscela di reazione PCR e aggiungere la stessa fonte di UPW usata nella miscela PCR al posto del campione.

6.2.5.   Porre le provette nello stesso termociclatore usato nei saggi preliminari ed eseguire il programma PCR opportunamente ottimizzato (appendice 6).

6.3.   Analisi del prodotto della PCR

6.3.1.   Separare gli ampliconi della PCR mediante elettroforesi in gel di agarosio. Far correre almeno 12 μl di miscela di reazione del DNA amplificato proveniente da ciascun campione mescolata con 3 μl di tampone di caricamento (appendice 6) in gel di agarosio al 2,0 % (p/v) in tampone TAE (tris-acetato-EDTA) (appendice 6) a una tensione di 5-8 V per cm. Usare un marcatore DNA adeguato, ad esempio un ladder a 100 bp.

6.3.2.   Visualizzare le bande di DNA mediante colorazione con etidio bromuro (0,5 mg/l) per 30-60 minuti adottando opportune precauzioni nella manipolazione di questo mutagene.

6.3.3.   Osservare il gel colorato con transilluminazione UV a onde corte (p. es. λ = 302 nm) per individuare prodotti della PCR amplificati delle dimensioni previste (appendice 6) e documentare i risultati.

6.3.4.   Per ogni nuovo risultato positivo, verificare l’autenticità dell’amplicone della PCR effettuando un’analisi di restrizione enzimatica su un campione del DNA amplificato rimasto, incubando alla temperatura e per il tempo ottimale con un enzima e un tampone adeguati (cfr. appendice 6). Separare i frammenti digeriti mediante elettroforesi in gel di agarosio come in precedenza, osservare il profilo caratteristico di restrizione dei frammenti con transilluminazione UV previa colorazione con etidio bromuro e confrontare con il controllo positivo non digerito e digerito.

Interpretazione del risultato della colorazione PCR

Il saggio PCR è negativo se la presenza dell’amplicone PCR delle dimensioni previste, specifico per R. solanacearum, viene evidenziata in tutti i campioni del controllo positivo ma non nel campione in esame (in caso di PCR multiplex con primer di controllo interno specifici per le piante: un secondo prodotto PCR delle dimensioni previste deve essere amplificato con il campione in questione).

Il saggio PCR è positivo se si evidenzia l’amplicone PCR specifico per R. solanacearum, delle dimensioni previste e (ove necessario) con il profilo di restrizione caratteristico, a condizione che esso non si manifesti in nessuno dei campioni di controllo negativo. La conferma affidabile di un risultato positivo può essere inoltre ottenuta ripetendo la prova con una seconda serie di primer PCR (appendice 6).

NB: Si può sospettare un’inibizione della PCR se il campione di controllo positivo contenente R. solanacearum in acqua produce l’amplicone previsto ma i controlli positivi contenenti R. solanacearum in estratto di patata danno risultati negativi. Nei protocolli di multiplex PCR con controlli interni della PCR, l’inibizione della reazione è probabile quando non si ottiene nessuno dei due ampliconi.

Se l’amplicone previsto si manifesta in almeno uno dei controlli negativi si può sospettare una contaminazione.

7.   Saggio FISH

Principi

Quando il saggio FISH è usato come primo saggio di selezione preliminare e l’esito è positivo, come secondo saggio di selezione preliminare obbligatorio dovrà essere effettuato il saggio di isolamento o la colorazione IF. Quando il saggio FISH è usato come secondo saggio di selezione preliminare e l’esito è positivo, per completare la diagnosi devono essere effettuati i saggi previsti dal diagramma di flusso.

NB: Usare oligosonde convalidate specifiche per R. solanacearum (appendice 7). Un saggio preliminare con questo metodo dovrebbe permettere il rilevamento riproducibile di almeno 103-104 cellule di R. solanacearum per ml aggiunte a estratti del campione precedentemente risultati negativi.

Il seguente procedimento andrebbe preferibilmente eseguito su estratti di campione preparati al momento dell’uso, ma può essere effettuato con successo su estratti conservati in glicerolo a una temperatura compresa tra –16 e –24 °C o tra –68 e –86 °C.

Come controllo negativo, usare aliquote di estratto di campione precedentemente risultato negativo per R. solanacearum.

Come controllo positivo preparare sospensioni contenenti 105-106 cellule per ml di R. solanacearum biovar 2 (p. es. ceppo NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, cfr. appendice 3) in tampone fosfato 0,01 M provenienti da una coltura di 3-5 giorni. Preparare vetrini separati di controllo positivo del ceppo omologo o di qualunque altro ceppo di riferimento di R. solanacearum sospeso in estratto di patata, come specificato nell’appendice 3, punto B.

L’uso di un’oligosonda eubatterica marcata con FITC fornisce un controllo per il processo di ibridizzazione, poiché verranno colorati tutti gli eubatteri presenti nel campione.

I materiali di controllo positivi e negativi standardizzati che possono essere impiegati per questa prova sono elencati nell’appendice 3, punto A.

Eseguire il saggio sul materiale di controllo secondo lo stesso metodo usato per il/i campione/i.

7.1.   Fissazione dell’estratto da patata

Protocollo secondo Wullings et al. (1998)

7.1.1.   Preparare la soluzione fissativa (appendice 7).

7.1.2.   Trasferire con una pipetta 100 μl di ciascun estratto del campione in una provetta Eppendorf e centrifugare per 7 minuti a 7 000 g.

7.1.3.   Rimuovere il supernatante e sciogliere il precipitato in 200 μl di fissativo preparato meno di 24 ore prima. Mescolare nel vortex e incubare per 1 ora in frigorifero.

7.1.4.   Centrifugare per 7 minuti a 7 000 g, rimuovere il supernatante e risospendere il precipitato in 75 μl di tampone fosfato 0,01 M (appendice 7).

7.1.5.   Distribuire 16 μl delle sospensioni fissate su un vetrino multitest pulito, come indicato nella figura 7.1. Applicare 2 diversi campioni per vetrino, non diluiti, e utilizzarne 10 μl per fare una diluizione 1:100 (in tampone fosfato 0,01 M). Il resto della soluzione campione (49 μl) può essere conservato a –20 °C previa aggiunta di 1 volume di etanolo al 96 %. Qualora il saggio FISH debba essere ripetuto, rimuovere l’etanolo mediante centrifugazione ed aggiungere un volume equivalente di tampone fosfato 0,01 M (mescolare nel vortex).

Figura 7.1   Schema del vetrino FISH.

| Campione 1 | Bianco | Bianco | Bianco | Campione 2 |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| | | | | |
| pozzetto 1 | pozzetto 2 | pozzetto 3 | pozzetto 4 | pozzetto 5 |
| Campione 1 | Bianco | Bianco | Bianco | Campione 2 |
| | | | | |
| pozzetto 6 | pozzetto 7 | pozzetto 8 | pozzetto 9 | pozzetto 10 |
| Coprioggetti 1 | | Coprioggetti 2 |

Campione 1

Bianco

Bianco

Bianco

Campione 2

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pozzetto 1

pozzetto 2

pozzetto 3

pozzetto 4

pozzetto 5

Campione 1

Bianco

Bianco

Bianco

Campione 2

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pozzetto 6

pozzetto 7

pozzetto 8

pozzetto 9

pozzetto 10

Coprioggetti 1

Coprioggetti 2

7.1.6.   Far asciugare i vetrini all’aria (o su un essiccatore per vetrini a 37 °C) e fissarli mediante esposizione alla fiamma.

A questo punto il procedimento può essere interrotto e l’ibridazione continuata il giorno successivo. I vetrini devono essere conservati asciutti e al riparo dalla polvere a temperatura ambiente.

7.2.   Ibridazione

7.2.1.   Disidratare le cellule in una serie graduata di etanolo (50 %, 80 % e 96 %), un minuto per ciascuna gradazione. Far asciugare i vetrini all’aria in un portavetrini.

7.2.2.   Preparare una camera di incubazione umida coprendo il fondo di un recipiente ermetico con carta bibula o carta da filtro immersa in 1x hybmix (appendice 7). Procedere alla pre-incubazione nel forno di ibridazione a 45 °C per almeno 10 minuti.

7.2.3.   Applicare 10 μl di soluzione di ibridazione (appendice 7) a 8 pozzetti (1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 e 10, cfr. figura 7.1) di ciascun vetrino, lasciando vuoti i due pozzetti centrali (3 e 8).

7.2.4.   Applicare i coprioggetti (24 × 24 mm) al primo e agli ultimi 4 pozzetti evitando di imprigionare aria all’interno. Porre i vetrini nella camera umida preriscaldata e lasciar ibridare al buio per 5 ore nel forno a 45 °C.

7.2.5.   Preparare 3 bicchieri contenenti 1 l di acqua molecolare Milli-Q, 1 l di 1x hybmix (334 ml di 3x hybmix e 666 ml di acqua Milli-Q) e 1 l di 1/8x hybmix (42 ml di 3x hybmix e 958 ml di acqua Milli-Q). Mettere in pre-incubazione a bagnomaria a 45 °C.

7.2.6.   Togliere i coprioggetti dai vetrini e porre questi ultimi in un portavetrini.

7.2.7.   Sciacquare via la sonda in eccesso mediante incubazione per 15 minuti nel bicchiere con 1x hybmix a 45 °C.

7.2.8.   Trasferire il portavetrini in una soluzione di lavaggio costituita da 1/8 hybmix e lasciar incubare per altri 15 minuti.

7.2.9.   Immergere rapidamente i vetrini in acqua Milli-Q e porli su carta da filtro. Rimuovere l’umidità in eccesso coprendo delicatamente la superficie con carta da filtro. Trasferire con una pipetta 5-10 μl di soluzione di montaggio antiscolorimento (p. es. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA o equivalente) su ciascun pozzetto e applicare un largo coprioggetti (24 × 60 mm) sull’intero vetrino.

7.3.   Lettura del saggio FISH

7.3.1.   Osservare immediatamente i vetrini con un microscopio predisposto per l’epifluorescenza a 630 o 1 000 × ingrandimenti in olio da immersione. Con un filtro idoneo per l’isotiocianato di fluoresceina (FITC), le cellule eubatteriche del campione (inclusa la maggior parte delle cellule Gram-negative) appaiono colorate di un verde fluorescente. Usando un filtro per la tetrametilrodamina-5-isotiocianato, le cellule di R. solanacaearum marcate con Cy3 appaiono colorate di un rosso fluorescente. Confrontare la morfologia delle cellule con quella dei controlli positivi. Le cellule devono avere fluorescenza brillante ed essere interamente colorate. Il saggio FISH (sezione VI.A.7) deve essere ripetuto se la colorazione è anomala. Esaminare attentamente i pozzetti lungo due diametri ortogonali e lungo il perimetro. Per i campioni che presentano assenza o un basso numero di cellule, osservare almeno 40 campi microscopici.

7.3.2.   Verificare la presenza di cellule fluorescenti brillanti con morfologia caratteristica di R. solanacearum nei pozzetti di saggio dei vetrini (cfr. il sito web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). L’intensità della fluorescenza deve essere equivalente o maggiore rispetto a quella del ceppo di controllo positivo. Le cellule che presentano una colorazione incompleta o una debole fluorescenza devono essere ignorate.

7.3.3.   In caso di sospetta contaminazione occorre ripetere il saggio. Tale sospetto può sorgere, ad esempio, se tutti i vetrini di un lotto presentano cellule positive dovute alla contaminazione del tampone o se vengono rilevate cellule positive (al di fuori dei pozzetti) sul rivestimento dei vetrini.

7.3.4.   Il saggio FISH presenta una serie di inconvenienti legati alla sua specificità. Nei precipitati di coni ombelicali e frammenti di fusto di patata è possibile che si manifesti, sia pure con minor frequenza rispetto al saggio IF, la presenza di una popolazione di fondo di cellule fluorescenti con morfologia atipica e di batteri saprofiti a reazione incrociata simili per dimensioni e morfologia a R. solanacearum.

7.3.5.   Considerare soltanto le cellule fluorescenti aventi dimensioni e morfologia tipiche.

7.3.6.   Interpretazione del risultato del saggio FISH:

| i) | I risultati del saggio FISH sono considerati validi quando in tutti i controlli positivi e in nessuno dei controlli negativi si osservano cellule fluorescenti brillanti di colore verde con dimensioni e morfologia caratteristiche di R. solanacearum usando il filtro FITC e cellule fluorescenti brillanti di colore rosso usando il filtro rodamina. Per ciascun campione in cui vengono trovate cellule fluorescenti brillanti con morfologia caratteristica, stimare il numero medio di cellule tipiche per campo ottico e calcolare il numero di cellule tipiche per ml di sedimento centrifuga risospeso (appendice 4). I campioni che presentano almeno 5 × 103 cellule per ml di sedimento risospeso si considerano potenzialmente contaminati e rendono necessari ulteriori saggi. I campioni che presentano meno di 5 × 103 cellule per ml di sedimento risospeso si considerano negativi. |
| --- | --- |

i)

I risultati del saggio FISH sono considerati validi quando in tutti i controlli positivi e in nessuno dei controlli negativi si osservano cellule fluorescenti brillanti di colore verde con dimensioni e morfologia caratteristiche di R. solanacearum usando il filtro FITC e cellule fluorescenti brillanti di colore rosso usando il filtro rodamina. Per ciascun campione in cui vengono trovate cellule fluorescenti brillanti con morfologia caratteristica, stimare il numero medio di cellule tipiche per campo ottico e calcolare il numero di cellule tipiche per ml di sedimento centrifuga risospeso (appendice 4). I campioni che presentano almeno 5 × 103 cellule per ml di sedimento risospeso si considerano potenzialmente contaminati e rendono necessari ulteriori saggi. I campioni che presentano meno di 5 × 103 cellule per ml di sedimento risospeso si considerano negativi.

| ii) | Il saggio FISH è negativo quando usando il filtro rodamina non si osservano cellule fluorescenti brillanti di colore rosso con dimensioni e morfologia caratteristiche di R. solanacearum, a condizione che, con lo stesso filtro, tali cellule brillanti tipiche di colore rosso appaiano nelle preparazioni dei controlli positivi. |
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ii)

Il saggio FISH è negativo quando usando il filtro rodamina non si osservano cellule fluorescenti brillanti di colore rosso con dimensioni e morfologia caratteristiche di R. solanacearum, a condizione che, con lo stesso filtro, tali cellule brillanti tipiche di colore rosso appaiano nelle preparazioni dei controlli positivi.

8.   Saggi ELISA

Principi

A motivo della sua sensibilità piuttosto bassa, il saggio ELISA può essere usato unicamente come saggio facoltativo in aggiunta ai saggi IF, PCR o FISH. Quando si usa il saggio DAS-ELISA è obbligatorio l’arricchimento e l’impiego di anticorpi monoclonali (cfr. il sito web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). L’arricchimento dei campioni prima del saggio ELISA può rivelarsi utile per aumentare la sensibilità del saggio, ma può avere insuccesso a causa della competizione da parte di altri organismi presenti nel campione.

NB: Servirsi di una fonte convalidata di anticorpi per R. solanacearum (cfr. il sito web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Si consiglia di determinare il titolo di ciascun nuovo lotto di anticorpi. Il titolo si definisce come la più alta diluizione alla quale si verifica una reazione ottimale saggiando una sospensione contenente da 105 a 106 cellule per ml del ceppo omologo di R. solanacearum e usando opportuni coniugati di anticorpi secondari, secondo le istruzioni del produttore. Durante il saggio, gli anticorpi dovrebbero essere usati a diluizioni di lavoro prossime o corrispondenti al titolo della formulazione commerciale.

Determinare il titolo degli anticorpi su una sospensione di 105-106 cellule per ml del ceppo omologo di R. solanacearum.

Come controlli negativi, includere un estratto di campione precedentemente risultato negativo per R. solanacearum e una sospensione di un batterio non avente reazione incrociata in soluzione fisiologica tamponata al fosfato (PBS).

Come controllo positivo usare aliquote di estratto del campione precedentemente risultato negativo, miscelato con 103-106 cellule per ml di R. solanacearum biovar 2 (p. es. ceppo NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, vedi appendice 2 A e 2 B). Per confrontare i risultati su ciascuna piastra usare una sospensione standard di 105-106 cellule per ml in tampone PBS di R. solanacearum. Assicurarsi che i controlli positivi siano nettamente separati dal campione o dai campioni da saggiare sulla piastra da microtitolazione.

I materiali di controllo positivi e negativi standardizzati che possono essere impiegati per questo saggio sono elencati nell’appendice 3, punto A.

Saggiare il materiale di controllo con lo stesso metodo usato per il/i campione/i.

Sono stati convalidati due protocolli ELISA.

a)   ELISA indiretto (secondo Robinson Smith et al., 1995)

| 1) | Usare aliquote di 100-200 μl di estratto del campione. (In alcuni casi, il riscaldamento a 100 °C per 4 minuti a bagnomaria o su una piastra riscaldante può ridurre i risultati non specifici). |
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1)

Usare aliquote di 100-200 μl di estratto del campione. (In alcuni casi, il riscaldamento a 100 °C per 4 minuti a bagnomaria o su una piastra riscaldante può ridurre i risultati non specifici).

| 2) | Aggiungere un volume equivalente di tampone di rivestimento a doppia forza (appendice 4) e mescolare nel vortex. |
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2)

Aggiungere un volume equivalente di tampone di rivestimento a doppia forza (appendice 4) e mescolare nel vortex.

| 3) | Applicare aliquote di 100 μl ad almeno due pozzetti della piastra da microtitolazione (p. es. Nunc-Polysorp o equivalente) e mantenere in incubazione per 1 ora a 37 °C o per una notte a 4 °C. |
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3)

Applicare aliquote di 100 μl ad almeno due pozzetti della piastra da microtitolazione (p. es. Nunc-Polysorp o equivalente) e mantenere in incubazione per 1 ora a 37 °C o per una notte a 4 °C.

| 4) | Rovesciare la piastra con un colpo secco e dare dei colpetti per espellere gli estratti dai pozzetti. Lavare i pozzetti tre volte con PBS-Tween (appendice 4), lasciando l’ultima soluzione di lavaggio nei pozzetti per almeno 5 minuti. |
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4)

Rovesciare la piastra con un colpo secco e dare dei colpetti per espellere gli estratti dai pozzetti. Lavare i pozzetti tre volte con PBS-Tween (appendice 4), lasciando l’ultima soluzione di lavaggio nei pozzetti per almeno 5 minuti.

| 5) | Preparare la diluizione appropriata di anticorpi per R. solanacearum in un tampone di bloccaggio (appendice 4). Per gli anticorpi commerciali convalidati, usare le diluizioni raccomandate (di norma a concentrazione doppia rispetto al titolo). |
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5)

Preparare la diluizione appropriata di anticorpi per R. solanacearum in un tampone di bloccaggio (appendice 4). Per gli anticorpi commerciali convalidati, usare le diluizioni raccomandate (di norma a concentrazione doppia rispetto al titolo).

| 6) | Aggiungere 100 μl a ciascun pozzetto e mantenere in incubazione per 1 ora a 37 °C. |
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6)

Aggiungere 100 μl a ciascun pozzetto e mantenere in incubazione per 1 ora a 37 °C.

| 7) | Rovesciare la piastra con un colpo secco, dare dei colpetti per espellere la soluzione di anticorpi dai pozzetti e lavare come in precedenza (punto 4). |
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7)

Rovesciare la piastra con un colpo secco, dare dei colpetti per espellere la soluzione di anticorpi dai pozzetti e lavare come in precedenza (punto 4).

| 8) | Preparare la diluizione appropriata di coniugati secondari di anticorpi e di fosfatasi alcalina nel tampone di bloccaggio. Aggiungere 100 μl a ciascun pozzetto e mantenere in incubazione per 1 ora a 37 °C. |
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8)

Preparare la diluizione appropriata di coniugati secondari di anticorpi e di fosfatasi alcalina nel tampone di bloccaggio. Aggiungere 100 μl a ciascun pozzetto e mantenere in incubazione per 1 ora a 37 °C.

| 9) | Rovesciare la piastra con un colpo secco, dare dei colpetti per espellere i coniugati di anticorpi dai pozzetti e lavare come in precedenza (punto 4). |
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9)

Rovesciare la piastra con un colpo secco, dare dei colpetti per espellere i coniugati di anticorpi dai pozzetti e lavare come in precedenza (punto 4).

| 10) | Aggiungere 100 μl di soluzione di substrato per la fosfatasi alcalina (appendice 4) a ciascun pozzetto. Mantenere in incubazione al buio a temperatura ambiente e leggere l’assorbanza a 405 nm a intervalli regolari entro un periodo di 90 minuti. |
| --- | --- |

10)

Aggiungere 100 μl di soluzione di substrato per la fosfatasi alcalina (appendice 4) a ciascun pozzetto. Mantenere in incubazione al buio a temperatura ambiente e leggere l’assorbanza a 405 nm a intervalli regolari entro un periodo di 90 minuti.

b)   DASI-ELISA

| 1) | Preparare la diluizione appropriata di immunoglobuline policlonali contro R. solanacearum in un tampone di rivestimento a pH 9,6 (appendice 4). Aggiungere 200 μl a ciascun pozzetto. Mantenere in incubazione per 4-5 ore a 37 °C o per 16 ore a 4 °C. |
| --- | --- |

1)

Preparare la diluizione appropriata di immunoglobuline policlonali contro R. solanacearum in un tampone di rivestimento a pH 9,6 (appendice 4). Aggiungere 200 μl a ciascun pozzetto. Mantenere in incubazione per 4-5 ore a 37 °C o per 16 ore a 4 °C.

| 2) | Lavare i pozzetti tre volte con PBS-Tween (appendice 4).
  Aggiungere ad almeno 2 pozzetti 190 μl di estratto del campione. Aggiungere anche i controlli positivi e negativi in due pozzetti per piastra. Mantenere in incubazione per 16 ore a 4 °C. |
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2)

Lavare i pozzetti tre volte con PBS-Tween (appendice 4).

Aggiungere ad almeno 2 pozzetti 190 μl di estratto del campione. Aggiungere anche i controlli positivi e negativi in due pozzetti per piastra. Mantenere in incubazione per 16 ore a 4 °C.

| 3) | Lavare i pozzetti tre volte con PBS-Tween (appendice 4). |
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3)

Lavare i pozzetti tre volte con PBS-Tween (appendice 4).

| 4) | Preparare una diluizione appropriata di anticorpi monoclonali specifici di R. solanacearum in PBS (appendice 4) contenente anche lo 0,5 % di albumina di siero bovino (BSA) e aggiungere 190 μl a ciascun pozzetto. Mantenere in incubazione per 2 ore a 37 °C. |
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4)

Preparare una diluizione appropriata di anticorpi monoclonali specifici di R. solanacearum in PBS (appendice 4) contenente anche lo 0,5 % di albumina di siero bovino (BSA) e aggiungere 190 μl a ciascun pozzetto. Mantenere in incubazione per 2 ore a 37 °C.

| 5) | Lavare i pozzetti tre volte con PBS-Tween (appendice 4). |
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5)

Lavare i pozzetti tre volte con PBS-Tween (appendice 4).

| 6) | Preparare una diluizione appropriata di immunoglobuline anti-topo coniugate con fosfatasi alcalina in PBS. Aggiungere 190 μl a ciascun pozzetto. Mantenere in incubazione per 2 ore a 37 °C. |
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6)

Preparare una diluizione appropriata di immunoglobuline anti-topo coniugate con fosfatasi alcalina in PBS. Aggiungere 190 μl a ciascun pozzetto. Mantenere in incubazione per 2 ore a 37 °C.

| 7) | Lavare i pozzetti tre volte con PBS-Tween (appendice 4). |
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7)

Lavare i pozzetti tre volte con PBS-Tween (appendice 4).

| 8) | Preparare una soluzione di substrato della fosfatasi alcalina contenente 1 mg di fosfato di p-nitrofenil per ml di tampone substrato (appendice 4). Aggiungere 200 μl a ciascun pozzetto. Mantenere in incubazione al buio a temperatura ambiente e leggere l’assorbanza a 405 nm a intervalli regolari entro un lasso di tempo di 90 minuti. |
| --- | --- |

8)

Preparare una soluzione di substrato della fosfatasi alcalina contenente 1 mg di fosfato di p-nitrofenil per ml di tampone substrato (appendice 4). Aggiungere 200 μl a ciascun pozzetto. Mantenere in incubazione al buio a temperatura ambiente e leggere l’assorbanza a 405 nm a intervalli regolari entro un lasso di tempo di 90 minuti.

Interpretazione dei risultati dei saggi ELISA

Il saggio Elisa è negativo se la densità ottica (D.O.) media dei pozzetti del campione duplicato è inferiore al doppio della D.O. del pozzetto di controllo negativo dell’estratto del campione, a condizione che la D.O. per tutti i controlli positivi sia superiore a 1,0 (dopo incubazione di 90 minuti con il substrato) e superiore al doppio della D.O. ottenuta per gli estratti del campione negativo.

Il saggio ELISA è positivo se la D.O. media dei pozzetti del campione duplicato è superiore al doppio della D.O. del pozzetto dell’estratto del campione negativo, a condizione che la D.O. per tutti i pozzetti di controllo negativo sia inferiore al doppio della D.O. dei pozzetti di controllo positivi.

Una lettura negativa del saggio ELISA nei pozzetti di controllo positivi indica che il saggio non è stato effettuato correttamente oppure che è stato inibito. Una lettura positiva del saggio ELISA nei pozzetti di controllo negativi indica che si è verificata una contaminazione incrociata o un legame di anticorpi non specifico.

9.   Saggio biologico

NB: Un saggio preliminare svolto con questo metodo deve permettere il rilevamento riproducibile di 103-104 unità formanti colonia di R. solanacearum per ml aggiunte agli estratti dei campioni precedentemente risultati negativi (per la preparazione cfr. l’appendice 3).

La massima sensibilità di rilevamento si può avere usando estratto del campione preparato al momento e disponendo di condizioni di crescita ottimali. Tuttavia, il metodo può essere efficacemente applicato ad estratti conservati in glicerolo ad una temperatura compresa tra –68 e –86 °C.

Il protocollo descritto sotto si basa su Janse (1988):

9.1.   Usare 10 piante di una cultivar di pomodoro adeguata (p. es. Moneymaker o cultivar di equivalente sensibilità constatata in saggi di laboratorio), ciascuna allo stadio di tre foglie vere. Per i dettagli relativi alla coltura cfr. l’appendice 8. Alternativamente usare le melanzane (p.es Black Beauty o cultivar di sensibilità equivalente), ma esclusivamente piante allo stadio di 2-3 foglie fino al pieno sviluppo della terza foglia vera. Si è osservato che nella melanzana i sintomi sono meno gravi e compaiono più lentamente. Ove possibile si raccomanda quindi di usare le piantine di pomodoro.

Distribuire 100 μl di estratto del campione tra le piantine da saggiare.

9.2.1.   Inoculazione mediante siringa

Inoculare i fusti della piantina immediatamente sopra i cotiledoni usando una siringa con ago ipodermico (non inferiore a 23G). Distribuire il campione tra le piantine.

9.2.2.   Inoculazione per incisione

Tenendo la pianta con due dita, versare mediante una pipetta una goccia (5-10 μl circa) del precipitato sospeso sul fusto tra i cotiledoni e la prima foglia.

Usando un bisturi sterile, praticare un’incisione diagonale di circa 1,0 cm e di profondità pari a circa 2/3 dello spessore del fusto. Il taglio deve iniziare dalla goccia di precipitato.

Sigillare il taglio con vaselina sterile mediante siringa.

9.3.   Inoculare, con la stessa tecnica, 5 piantine con una sospensione acquosa di 105 – 106 cellule per ml preparata da una coltura di 48 ore di un ceppo virulento di R. solanacearum biovar 2 come controllo positivo e con un tampone per sedimento come controllo negativo. Separare le piante del controllo positivo e negativo dalle altre per evitare contaminazione.

9.4.   Far crescere le piantine in locali di quarantena fino a un massimo di 4 settimane a una temperatura di 25-30 °C ad alta umidità relativa con annaffiature adeguate per evitare un eccesso di acqua o un avvizzimento causato da mancanza di acqua. Per evitare la contaminazione, incubare le piante per il controllo positivo e quelle per il controllo negativo su ripiani chiaramente separati all’interno di una serra o di una camera di crescita o, qualora si disponga di uno spazio limitato, garantire una rigida separazione fra i trattamenti. Se le piante usate per diversi campioni devono essere messe in incubazione insieme, separarle con schermi adeguati. Nel concimare, innaffiare, esaminare ed eseguire ogni atto, fare molta attenzione per evitare una contaminazione incrociata. È di fondamentale importanza tenere le serre e le camere di crescita libere da fitofagi che potrebbero trasmettere il batterio da un campione all’altro.

Vedere se si sviluppano sintomi di perdita di turgore, epinastia, clorosi e/o arresto della crescita.

9.5.   Isolare dalle piante infette (cfr. sezione II.3) presunte colonie di R. solanacearum e identificarle in coltura pura (cfr. sezione VI.B).

9.6.   Se dopo 3 settimane non si osservano sintomi, procedere a un saggio di isolamento/IF/PCR su un campione multiplo di sezioni di 1 cm di fusto prelevate da ciascuna pianta al di sopra del punto di inoculazione. Se la prova è positiva effettuare l’isolamento diretto in piastra (sezione 4.1).

9.7.   Identificare presunte colture purificate di R. solanacearum (cfr. sezione VI.B).

Interpretazione dei risultati del saggio biologico

I risultati del saggio biologico possono considerarsi validi se le piante del controllo positivo presentano sintomi tipici, se il batterio può essere reisolato a partire da queste piante e se nessun sintomo viene riscontrato sui controlli negativi.

Il saggio biologico è negativo se le piante inoculate non risultano infettate da R. solanacearum e a condizione che quest’ultimo venga individuato nei controlli positivi.

Il saggio biologico è positivo se le piante inoculate risultano infettate da R. solanacearum.

B.   Saggi di identificazione

Identificare le colture pure di presunti isolati di R. solanacearum utilizzando almeno due dei saggi seguenti, basati su principi biologici diversi.

Se opportuno, per ciascun saggio effettuato includere ceppi di riferimento conosciuti (appendice 3).

1.   Saggi di identificazione nutrizionali ed enzimatici

Determinare le seguenti proprietà fenotipiche, sistematicamente presenti o assenti in R. solanacearum secondo i metodi di Lelliott e Stead (1987), Klement et al. (1990), Schaad (2001)

| Saggio | Risultato atteso |
| --- | --- |
| Produzione di pigmento fluorescente | – |
| Inclusioni di poli-beta-idrossibutirrato | + |
| Saggio di metabolismo fermentativo/ossidativo (O/F) | O+/F– |
| Attività catalasica | + |
| Saggio dell’ossidasi di Kovacs | + |
| Riduzione dei nitrati | + |
| Utilizzazione del citrato | + |
| Crescita a 40 °C | – |
| Crescita in NaCl dell’1 % | + |
| Crescita in NaCl del 2 % | – |
| Attività arginina deidrolasica | – |
| Liquefazione della gelatina | – |
| Idrolisi dell’amido | – |
| Idrolisi dell’esculina | – |
| Produzione di levano | – |

Saggio

Risultato atteso

Produzione di pigmento fluorescente

–

Inclusioni di poli-beta-idrossibutirrato

+

Saggio di metabolismo fermentativo/ossidativo (O/F)

O+/F–

Attività catalasica

+

Saggio dell’ossidasi di Kovacs

+

Riduzione dei nitrati

+

Utilizzazione del citrato

+

Crescita a 40 °C

–

Crescita in NaCl dell’1 %

+

Crescita in NaCl del 2 %

–

Attività arginina deidrolasica

–

Liquefazione della gelatina

–

Idrolisi dell’amido

–

Idrolisi dell’esculina

–

Produzione di levano

–

2.   Saggio IF

2.1.   Preparare una sospensione di circa 106 cellule per ml in tampone IF (appendice 4).

2.2.   Preparare una serie di diluizioni 1:2 di un antisiero adeguato (cfr. il sito web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

2.3.   Applicare il procedimento IF (sezione VI.A.5).

2.4.   Il risultato del saggio è positivo se il titolo IF della coltura in esame è equivalente a quello del controllo positivo.

3.   Saggio Elisa

NB: Se si effettuano soltanto 2 saggi di identificazione, non utilizzare altri saggi sierologici in aggiunta a questo metodo.

3.1.   Preparare una sospensione di circa 108 cellule per ml in 1X tampone PBS (appendice 4).

3.2.   Effettuare una procedura ELISA adeguata con un anticorpo monoclonale specifico per R. solanacearum.

3.3.   Il risultato del saggio è positivo se la lettura ELISA ottenuta dalla coltura è equivalente ad almeno la metà di quella del controllo positivo.

4.   Saggio PCR

4.1.   Preparare una sospensione di circa 106 cellule per ml in acqua distillata al grado molecolare sterile.

4.2.   Riscaldare 100 μl della sospensione di cellule in provette chiuse su una piastra riscaldante o a bagnomaria a 100 °C per 4 minuti. I campioni possono quindi essere conservati a una temperatura compresa tra –16 e –24 °C fino al momento d’uso.

4.3.   Applicare procedimenti PCR adeguati per amplificare gli ampliconi specifici per R. solanacearum [p. es. Seal et al. (1993); Pastrik e Maiss (2000); Pastrik et al. (2002); Boudazin et al. (1999); Opina et al. (1997), Weller et al. (1999)].

4.4.   L’identificazione di R. solanacearum è positiva se gli ampliconi della PCR presentano le stesse dimensioni e gli stessi polimorfismi di restrizione dei frammenti che si osservano nel ceppo di controllo positivo.

5.   Saggio FISH

5.1.   Preparare una sospensione di circa 106 cellule per ml in acqua ultrapura.

5.2.   Applicare il procedimento FISH (sezione VI.A.7) con almeno 2 oligosonde specifiche per R. solanacearum (appendice 7).

5.3.   Il risultato del saggio FISH è positivo se si ottengono le stesse reazioni sia nella coltura che nel controllo positivo.

6.   Profilo degli acidi grassi (FAP)

6.1.   Far crescere la coltura in esame su triptone-soia-agar (Oxoid) per 48 ore a 28 °C.

6.2.   Applicare un procedimento FAP di tipo adeguato (Janse, 1991; Stead, 1992).

6.3.   Il saggio FAP è positivo se il profilo della coltura in esame è identico a quello del controllo positivo. La presenza degli acidi grassi caratteristici 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH e 18:1 2OH e l’assenza di 16:0 3OH sono altamente indicative della presenza della specie Ralstonia.

7.   Metodi di caratterizzazione del ceppo

La caratterizzazione del ceppo tramite uno dei seguenti metodi è consigliabile per ogni nuovo caso di isolamento di R. solanacearum.

Se appropriato, per ciascun saggio effettuato includere ceppi di riferimento conosciuti (appendice 3).

7.1.   Determinazione della biovar

Ralstonia solanacearum è suddiviso in biovar in base alla capacità di utilizzare e/o ossidare tre disaccaridi e tre alcoli esosi (Hayward, 1964 e Hayward et al., 1990). Il terreno nutritivo per il saggio della biovar è descritto nell’appendice 2. Il saggio può essere effettuato efficacemente inoculando per infissione i terreni con colture pure di isolati di R. solanacearum e mantenendo in incubazione a 28 °C. Se i terreni sono ripartiti in 96 pozzetti sterili di piastre da coltura cellulare (200 μl per pozzetto), un cambiamento di colore dal verde oliva al giallo osservato entro 72 ore indica che il saggio è positivo.

| | Biovar |
| --- | --- |
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Impiego di: | |
| Maltosio | – | + | + | – | + |
| Lattosio | – | + | + | – | + |
| Cellobiosio D (+) | – | + | + | – | + |
| Mannitolo | – | – | + | + | + |
| Sorbitolo | – | – | + | + | – |
| Dulcitolo | – | – | + | + | – |

Biovar

1

2

3

4

5

Impiego di:

Maltosio

–

+

+

–

+

Lattosio

–

+

+

–

+

Cellobiosio D (+)

–

+

+

–

+

Mannitolo

–

–

+

+

+

Sorbitolo

–

–

+

+

–

Dulcitolo

–

–

+

+

–

Ulteriori saggi differenziano la biovar 2 in subfenotipi

| | Biovar 2A
  (Diffuso in tutto il mondo) | Biovar 2A
  (Trovato in Cile e in Colombia) | Biovar 2T
  (Trovato in zone tropicali) |
| --- | --- | --- | --- |
| Utilizzo di trealosio | – | + | + |
| Utilizzo di meso-inositolo | + | – | + |
| Utilizzo di D-ribosio | – | – | + |
| Attività pectolitica (1) | bassa | bassa | alta |

Biovar 2A

(Diffuso in tutto il mondo)

Biovar 2A

(Trovato in Cile e in Colombia)

Biovar 2T

(Trovato in zone tropicali)

Utilizzo di trealosio

–

+

+

Utilizzo di meso-inositolo

+

–

+

Utilizzo di D-ribosio

–

–

+

Attività pectolitica (1)

bassa

bassa

alta

7.2.   Impronte genomiche

La differenziazione molecolare dei ceppi nel complesso di R. solanacearum può essere effettuata mediante diverse tecniche, tra cui:

7.2.1.   Analisi del polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione (RFLP) (Cook et al., 1989).

7.2.2.   PCR su sequenze ripetute usando i primer REP, BOX e ERIC (Louws et al., 1995; Smith et al., 1995).

7.2.3.   Analisi del polimorfismo della lunghezza del frammento di amplificazione (AFLP) (Van der Wolf et al., 1998).

7.3.   Metodi PCR

Primer specifici PCR (Pastrik et al., 2002; cfr. appendice 6) possono essere usati per differenziare ceppi appartenenti alla divisione 1 (biovar 3, 4 e 5) e alla divisione 2 (biovar 1, 2A e 2T) di R. solanacearum, quali originariamente definite dall’analisi RFLP (Cook et al., 1989) e dal sequenziamento del 16S rDNA (Taghavi et al., 1996).

C.   Saggio di conferma

La prova di patogenicità deve essere effettuata come conferma finale di una diagnosi di R. solanacearum e per valutare la virulenza delle colture identificate come R. solanacearum.

| 1) | Preparare un inoculo di circa 106 cellule per ml da colture di 24-48 ore dell’isolato da saggiare e da un ceppo di controllo positivo di R. solanacearum (p. es. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; cfr. appendice 3). |
| --- | --- |

1)

Preparare un inoculo di circa 106 cellule per ml da colture di 24-48 ore dell’isolato da saggiare e da un ceppo di controllo positivo di R. solanacearum (p. es. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; cfr. appendice 3).

| 2) | Inoculare 5-10 piantine di pomodoro o melanzana di varietà sensibile allo stadio fogliare della terza foglia vera (sezione VI.A.9). |
| --- | --- |

2)

Inoculare 5-10 piantine di pomodoro o melanzana di varietà sensibile allo stadio fogliare della terza foglia vera (sezione VI.A.9).

| 3) | Mantenere in incubazione per un massimo di due settimane a temperatura tra 25 °C e 28 °C ad alta umidità relativa, innaffiando adeguatamente per evitare un accumulo d’acqua o uno stress dovuto a siccità. Nel caso di colture pure il tipico avvizzimento dovrebbe manifestarsi entro 14 giorni. Se, trascorso tale periodo, non si manifestano sintomi di infezione, non è possibile confermare che la coltura sia una forma patogena di R. solanacearum. |
| --- | --- |

3)

Mantenere in incubazione per un massimo di due settimane a temperatura tra 25 °C e 28 °C ad alta umidità relativa, innaffiando adeguatamente per evitare un accumulo d’acqua o uno stress dovuto a siccità. Nel caso di colture pure il tipico avvizzimento dovrebbe manifestarsi entro 14 giorni. Se, trascorso tale periodo, non si manifestano sintomi di infezione, non è possibile confermare che la coltura sia una forma patogena di R. solanacearum.

| 4) | Tenere in osservazione per sintomi di avvizzimento e/o epinastia, clorosi e arresto della crescita. |
| --- | --- |

4)

Tenere in osservazione per sintomi di avvizzimento e/o epinastia, clorosi e arresto della crescita.

| 5) | Isolare da ciascuna pianta sintomatica una sezione di fusto prelevata circa 2 cm al di sopra del punto di inoculazione. Sminuzzarla e sospenderla in una piccola quantità di acqua distillata sterile o in tampone fosfato 50 mM (appendice 4). Inseminare piastre di terreno nutritivo appropriato avendo cura di distribuire quantità decrescenti sulla superficie (appendice 2), incubare per 48-72 ore a una temperatura di 28 °C e osservare il formarsi di colonie tipiche di R. solanacearum. |
| --- | --- |

5)

Isolare da ciascuna pianta sintomatica una sezione di fusto prelevata circa 2 cm al di sopra del punto di inoculazione. Sminuzzarla e sospenderla in una piccola quantità di acqua distillata sterile o in tampone fosfato 50 mM (appendice 4). Inseminare piastre di terreno nutritivo appropriato avendo cura di distribuire quantità decrescenti sulla superficie (appendice 2), incubare per 48-72 ore a una temperatura di 28 °C e osservare il formarsi di colonie tipiche di R. solanacearum.

Appendice 1

Laboratori coinvolti nell’ottimizzazione e nella convalida dei protocolli

| Laboratorio (2) | Ubicazione | Paese |
| --- | --- | --- |
| Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit | Vienna e Linz | Austria |
| Departement Gewasbescherming | Merelbeke | Belgio |
| Plantedirektoratet | Lyngby | Danimarca |
| Central Science Laboratory | York | Inghilterra |
| Scottish Agricultural Science Agency | Edimburgo | Scozia |
| Laboratoire national de la protection des végétaux, unité de bactériologie | Angers | Francia |
| Laboratoire national de la protection des végétaux, station de quarantaine de la pomme de terre | Le Rheu | Francia |
| Biologische Bundesanstalt | Kleinmachnow | Germania |
| Pflanzenschutzamt Hannover | Hannover | Germania |
| State Laboratory | Dublin | Irlanda |
| Dipartimento di scienze e tecnologie agroambientali | Bologna | Italia |
| Regione Veneto, Unità periferica per i servizi fitosanitari | Verona | Italia |
| Nederlandse Algemene Keuringsdienst | Emmeloord | Paesi Bassi |
| Plantenziektenkundige Dienst | Wageningen | Paesi Bassi |
| Direcção-Geral de Protecção das Culturas | Lisbona | Portogallo |
| Centro de Diagnóstico de Aldearrubia | Salamanca | Spagna |
| Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias | Valencia | Spagna |
| Swedish University of Agricultural Sciences | Uppsala | Svezia |

Laboratorio (2)

Ubicazione

Paese

Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit

Vienna e Linz

Austria

Departement Gewasbescherming

Merelbeke

Belgio

Plantedirektoratet

Lyngby

Danimarca

Central Science Laboratory

York

Inghilterra

Scottish Agricultural Science Agency

Edimburgo

Scozia

Laboratoire national de la protection des végétaux, unité de bactériologie

Angers

Francia

Laboratoire national de la protection des végétaux, station de quarantaine de la pomme de terre

Le Rheu

Francia

Biologische Bundesanstalt

Kleinmachnow

Germania

Pflanzenschutzamt Hannover

Hannover

Germania

State Laboratory

Dublin

Irlanda

Dipartimento di scienze e tecnologie agroambientali

Bologna

Italia

Regione Veneto, Unità periferica per i servizi fitosanitari

Verona

Italia

Nederlandse Algemene Keuringsdienst

Emmeloord

Paesi Bassi

Plantenziektenkundige Dienst

Wageningen

Paesi Bassi

Direcção-Geral de Protecção das Culturas

Lisbona

Portogallo

Centro de Diagnóstico de Aldearrubia

Salamanca

Spagna

Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias

Valencia

Spagna

Swedish University of Agricultural Sciences

Uppsala

Svezia

Appendice 2

Terreni nutritivi per l’isolamento e la coltura di R. solanacearum

a)   Terreni nutritivi generali

Agar nutritivo (NA)

| Agar nutritivo (Difco) | 23,0 g |
| --- | --- |
| Acqua distillata | 1,00 l |

Agar nutritivo (Difco)

23,0 g

Acqua distillata

1,00 l

Sciogliere gli ingredienti e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.

Lievito peptone glucosio agar (YPGA)

| Estratto di lievito (Difco) | 5,0 g |
| --- | --- |
| Bacto-peptone (Difco) | 5,0 g |
| D(+)-glucosio (monoidrato) | 10,0 g |
| Bacto-agar (Difco) | 15,0 g |
| Acqua distillata | 1,00 l |

Estratto di lievito (Difco)

5,0 g

Bacto-peptone (Difco)

5,0 g

D(+)-glucosio (monoidrato)

10,0 g

Bacto-agar (Difco)

15,0 g

Acqua distillata

1,00 l

Sciogliere gli ingredienti e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.

Saccarosio-peptone-agar (SPA)

| Saccarosio | 20,0 g |
| --- | --- |
| Bacto-peptone (Difco) | 5,0 g |
| K2HPO4 | 0,5 g |
| MgSO4.7H2O | 0,25 g |
| Bacto-agar (Difco) | 15,0 g |
| Acqua distillata | 1,00 l |
| pH 7,2-7,4 | |

Saccarosio

20,0 g

Bacto-peptone (Difco)

5,0 g

K2HPO4

0,5 g

MgSO4.7H2O

0,25 g

Bacto-agar (Difco)

15,0 g

Acqua distillata

1,00 l

pH 7,2-7,4

Sciogliere gli ingredienti e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.

Substrato al tetrazolio di Kelman

| Casaminoacidi (Difco) | 1,0 g |
| --- | --- |
| Bacto-peptone (Difco) | 10,0 g |
| Destrosio | 5,0 g |
| Bacto-agar (Difco) | 15,0 g |
| Acqua distillata | 1,00 l |

Casaminoacidi (Difco)

1,0 g

Bacto-peptone (Difco)

10,0 g

Destrosio

5,0 g

Bacto-agar (Difco)

15,0 g

Acqua distillata

1,00 l

Sciogliere gli ingredienti e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.

Raffreddare a 50 °C e aggiungere una soluzione di cloruro di trifeniltetrazolio (Sigma), sterilizzata per filtrazione, fino a concentrazione finale di 50 mg/litro.

b)   Terreni di coltura selettivi convalidati

Substrato SMSA (Englebrecht, 1994 modificato da Elphinstone et al., 1996)

| Substrato base | |
| --- | --- |
| Casaminoacidi (Difco) | 1,0 g |
| Bacto-peptone (Difco) | 10,0 g |
| Glicerolo | 5,0 ml |
| Bacto-agar (Difco) (cfr. nota 2) | 15,0 g |
| Acqua distillata | 1,00 l |

Substrato base

Casaminoacidi (Difco)

1,0 g

Bacto-peptone (Difco)

10,0 g

Glicerolo

5,0 ml

Bacto-agar (Difco) (cfr. nota 2)

15,0 g

Acqua distillata

1,00 l

Sciogliere gli ingredienti e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.

Raffreddare a 50 °C e aggiungere soluzioni madre acquose dei seguenti ingredienti, sterilizzate per filtrazione, fino a ottenere le concentrazioni finali specificate:

| Cristalvioletto (Sigma) | 5 mg/l |
| --- | --- |
| Polimixina B solfato | (Sigma P-1004) 600 000 U(circa 100 mg)/l |
| Bacitracina (Sigma B-0125) | 1 250 U (circa 25 mg)/l |
| Cloramfenicolo (Sigma C-3175) | 5 mg/l |
| Penicillina G (Sigma P-3032) | 825 U (circa 0,5 mg)/l |
| Cloruro di trifeniltetrazolo (Sigma) | 50 mg/l |

Cristalvioletto (Sigma)

5 mg/l

Polimixina B solfato

(Sigma P-1004) 600 000 U(circa 100 mg)/l

Bacitracina (Sigma B-0125)

1 250 U (circa 25 mg)/l

Cloramfenicolo (Sigma C-3175)

5 mg/l

Penicillina G (Sigma P-3032)

825 U (circa 0,5 mg)/l

Cloruro di trifeniltetrazolo (Sigma)

50 mg/l

NB:

| 1. | L’impiego di reagenti diversi da quelli indicati può interferire con la crescita di R. solanacearum. |
| --- | --- |

1.

L’impiego di reagenti diversi da quelli indicati può interferire con la crescita di R. solanacearum.

| 2. | Il Bacto-agar (Difco) può essere sostituito da Oxoid Agar #1. In questo caso la crescita di R. solanacearum sarà più lenta, ma anche la crescita di saprofiti competitori può essere ridotta. La formazione delle tipiche colonie di R. solanacearum può richiedere 1-2 giorni in più e la colorazione rossa può essere più attenuata e diffusa rispetto al Bacto-agar. |
| --- | --- |

2.

Il Bacto-agar (Difco) può essere sostituito da Oxoid Agar #1. In questo caso la crescita di R. solanacearum sarà più lenta, ma anche la crescita di saprofiti competitori può essere ridotta. La formazione delle tipiche colonie di R. solanacearum può richiedere 1-2 giorni in più e la colorazione rossa può essere più attenuata e diffusa rispetto al Bacto-agar.

| 3. | Un aumento della concentrazione di bacitracina a 2 500 U/l può ridurre le popolazione di batteri competitori senza condizionare la crescita di R. solanacearum. |
| --- | --- |

3.

Un aumento della concentrazione di bacitracina a 2 500 U/l può ridurre le popolazione di batteri competitori senza condizionare la crescita di R. solanacearum.

Conservare i terreni di coltura e le soluzioni madri di antibiotici a 4 °C al buio e usarli entro un mese.

La piastre devono essere esenti da condensa superficiale prima dell’uso.

Evitare di far asciugare eccessivamente le piastre.

Il controllo della qualità dovrebbe essere fatto per ogni nuovo lotto di substrato inseminando sulle piastre una sospensione di una coltura di riferimento di R. solanacearum (cfr. appendice 3) e osservando la formazione delle tipiche colonie dopo un’incubazione di 2-5 giorni a 28 °C.

c)   Terreni di arricchimento convalidati

Brodo SMSA (Elphinstone et al., 1996)

Preparare come per il terreno selettivo SMSA all’agar, eliminando il Bacto-agar e il cloruro di trifeniltetrazolo.

Brodo di Wilbrink modificato (Caruso et al., 2002)

| Saccarosio | 10 g |
| --- | --- |
| Proteose peptone | 5 g |
| K2HPO4 | 0,5 g |
| MgSO4 | 0,25 g |
| NaNO3 | 0,25 g |
| Acqua distillata | 1 l |

Saccarosio

10 g

Proteose peptone

5 g

K2HPO4

0,5 g

MgSO4

0,25 g

NaNO3

0,25 g

Acqua distillata

1 l

Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti e raffreddare a 50 °C.

Aggiungere le soluzioni madre di antibiotici come per il brodo SMSA.

Appendice 3

A.   Materiale di controllo standardizzato disponibile in commercio

a)   Isolati batterici

Si consiglia di usare i seguenti isolati batterici come materiale standard di riferimento per i controlli positivi (tabella 1) o durante l’ottimizzazione dei saggi per evitare reazioni incrociate (tabella 2). Tutti i ceppi sono disponibili in commercio presso:

| 1. | National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Central Science Laboratory, York, Regno Unito. |
| --- | --- |

1.

National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Central Science Laboratory, York, Regno Unito.

| 2. | Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen, Paesi Bassi. |
| --- | --- |

2.

Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen, Paesi Bassi.

| 3. | Collection française de bactéries phytopathogènes (CFBP), INRA — Station de phytobactériologie, Angers, Francia. |
| --- | --- |

3.

Collection française de bactéries phytopathogènes (CFBP), INRA — Station de phytobactériologie, Angers, Francia.

Tabella 1.   Colture SMT di riferimento di R. solanacearum

| Codice NCPPB | SMT
  # | Altri codici | Paese di origine | Biovar |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| NCPPB 4153 | 6 | CFBP 4582, Pr 3020, EURS11 | Egitto | 2 |
| NCPPB 4154 | 10 | CFBP 4585, 550, EURS21 | Turchia | 2 |
| NCPPB 3857 | 12 | CFBP 4587, Pr 1140, EURS26 | Inghilterra | 2 |
| NCPPB 1584 | 23 | CFBP 4598, EURS49 | Cipro | 2 |
| NCPPB 2505 | 24 | CFBP 4599, EURS50 | Svezia | 2 |
| NCPPB 4155 | 26 | CFBP 4601, 502, EURS55 | Belgio | 2 |
| NCPPB 4156 (3) | 71 (3) | PD 2762, CFBP 3857 | Paesi Bassi | 2 |
| NCPPB 4157 | 66 | LNPV 15.59 | Francia | 2 |
| NCPPB 4158 | 39 | CFBP 4608, Port 448, EURS80 | Portogallo | 2 |
| NCPPB 4160 | 69 | IVIA-1632-2 | Spagna | 2 |
| NCPPB 4161 | 76 | B3B | Germania | 2 |
| NCPPB 325 | 41 | CFBP 2047, KEL60-1, R842 | USA | 1 |
| NCPPB 3967 | 42 | CFBP 4610, R285, GONg7 | Costa Rica | 1 |
| NCPPB 4028 | 43 | CFBP 4611, R303/571, CIP310, SEQ205 | Colombia | 2 |
| NCPPB 3985 | 44 | CFBP 4612, R578, CIP312 | Perù | 2T |
| NCPPB 3989 | 45 | CFBP 4613, R568, CIP226 | Brasile | 2T |
| NCPPB 3996 | 46 | CFBP 3928, R276/355, CIP72, SEQ225 | Perù | 3 |
| NCPPB 3997 | 47 | CFBP 4614, R280/363, CIP49, HAY0131a | Australia | 3 |
| NCPPB 4029 | 48 | CFBP 4615, R297/349, CIP121, CMIb2861 | Sri Lanka | 4 |
| NCPPB 4005 | 49 | CFBP 4616, R470 | Filippine | 4 |
| NCPPB 4011 | 50 | CFBP 4617, R288, HEmps2 | Cina | 5 |

Codice NCPPB

SMT

#

Altri codici

Paese di origine

Biovar

NCPPB 4153

6

CFBP 4582, Pr 3020, EURS11

Egitto

2

NCPPB 4154

10

CFBP 4585, 550, EURS21

Turchia

2

NCPPB 3857

12

CFBP 4587, Pr 1140, EURS26

Inghilterra

2

NCPPB 1584

23

CFBP 4598, EURS49

Cipro

2

NCPPB 2505

24

CFBP 4599, EURS50

Svezia

2

NCPPB 4155

26

CFBP 4601, 502, EURS55

Belgio

2

NCPPB 4156 (3)

71 (3)

PD 2762, CFBP 3857

Paesi Bassi

2

NCPPB 4157

66

LNPV 15.59

Francia

2

NCPPB 4158

39

CFBP 4608, Port 448, EURS80

Portogallo

2

NCPPB 4160

69

IVIA-1632-2

Spagna

2

NCPPB 4161

76

B3B

Germania

2

NCPPB 325

41

CFBP 2047, KEL60-1, R842

USA

1

NCPPB 3967

42

CFBP 4610, R285, GONg7

Costa Rica

1

NCPPB 4028

43

CFBP 4611, R303/571, CIP310, SEQ205

Colombia

2

NCPPB 3985

44

CFBP 4612, R578, CIP312

Perù

2T

NCPPB 3989

45

CFBP 4613, R568, CIP226

Brasile

2T

NCPPB 3996

46

CFBP 3928, R276/355, CIP72, SEQ225

Perù

3

NCPPB 3997

47

CFBP 4614, R280/363, CIP49, HAY0131a

Australia

3

NCPPB 4029

48

CFBP 4615, R297/349, CIP121, CMIb2861

Sri Lanka

4

NCPPB 4005

49

CFBP 4616, R470

Filippine

4

NCPPB 4011

50

CFBP 4617, R288, HEmps2

Cina

5

NB: L’autenticità dei ceppi summenzionati può essere garantita soltanto se gli stessi sono ottenuti da una coltura autentica di collezione.

Tabella 2.   Lista di colture SMT autentiche di collezione di batteri sierologicamente o geneticamente affini da usare per rendere ottimali i saggi di rilevamento.

| Codice NCPPB | SMT
  # | Altro codice | Identificazione |
| --- | --- | --- | --- |
| NCPPB 4162 | 51 | CFBP 1954 | Bacillus polymyxa (4) |
| NCPPB 4163 | 52 | CFBP 1538 | Pseudomonas marginalis pv. marginalis
   (4) |
| NCPPB 4164 | – | CFBP 2227 | Burkholderia cepacia
   (5) |
| NCPPB 4165 | – | CFBP 2459 | Ralstonia pickettii
   (5) |
| NCPPB 4166 | 58 | CFBP 3567
  CSL Pr1150 | Ralstonia pickettii
   (4) |
| NCPPB 4167 | 60 | CFBP 4618
  PD 2778 | Ralstoniasp. (4) |
| NCPPB 1127 | 53 | CFBP 3575 | Burkholderia andropogonis
   (4) |
| NCPPB 353 | 54 | CFBP 3572 | Burkholderia caryophylli
   (4) |
| NCPPB 945 | 55 | CFBP 3569 | Burkholderia cepacia
   (4) |
| NCPPB 3708 | 56 | CFBP 3574 | Burkholderia glumae
   (4) |
| NCPPB 3590 | 57 | CFBP 3573 | Burkholderia plantarii
   (4) |
| NCPPB 3726 | 59 | CFBP 3568 | Banana Blood Disease Bacterium
   (4)
   (5)
   (6) |
| NCPPB 4168 | 61 | CFBP 4619
  IPO S339 | Enterobacter sp. (4) |
| NCPPB 4169 | 62 | IPO 1695 | Enterobacter sp. (4) |
| NCPPB 4170 | 63 | CFBP 4621
  IPO S306 | Ochrobacterium anthropi
   (4)
   (5) |
| NCPPB 4171 | 64 | CFBP 4622
  IPO 1693 | Curtobacterium sp. (4)
   (5) |
| NCPPB 4172 | 65 | IPO 1 696a | Pseudomonas sp. (4) |
| NCPPB 4173 | – | PD 2318 | Aureobacterium sp. (5) |
| NCPPB 4174 | 81 | IVIA 1844.06 | Flavobacterium sp. (4)
   (5) |

Codice NCPPB

SMT

#

Altro codice

Identificazione

NCPPB 4162

51

CFBP 1954

Bacillus polymyxa (4)

NCPPB 4163

52

CFBP 1538

Pseudomonas marginalis pv. marginalis
   (4)

NCPPB 4164

–

CFBP 2227

Burkholderia cepacia
   (5)

NCPPB 4165

–

CFBP 2459

Ralstonia pickettii
   (5)

NCPPB 4166

58

CFBP 3567

CSL Pr1150

Ralstonia pickettii
   (4)

NCPPB 4167

60

CFBP 4618

PD 2778

Ralstoniasp. (4)

NCPPB 1127

53

CFBP 3575

Burkholderia andropogonis
   (4)

NCPPB 353

54

CFBP 3572

Burkholderia caryophylli
   (4)

NCPPB 945

55

CFBP 3569

Burkholderia cepacia
   (4)

NCPPB 3708

56

CFBP 3574

Burkholderia glumae
   (4)

NCPPB 3590

57

CFBP 3573

Burkholderia plantarii
   (4)

NCPPB 3726

59

CFBP 3568

Banana Blood Disease Bacterium
   (4)
   (5)
   (6)

NCPPB 4168

61

CFBP 4619

IPO S339

Enterobacter sp. (4)

NCPPB 4169

62

IPO 1695

Enterobacter sp. (4)

NCPPB 4170

63

CFBP 4621

IPO S306

Ochrobacterium anthropi
   (4)
   (5)

NCPPB 4171

64

CFBP 4622

IPO 1693

Curtobacterium sp. (4)
   (5)

NCPPB 4172

65

IPO 1 696a

Pseudomonas sp. (4)

NCPPB 4173

–

PD 2318

Aureobacterium sp. (5)

NCPPB 4174

81

IVIA 1844.06

Flavobacterium sp. (4)
   (5)

b)   1Materiale di controllo standardizzato disponibile in commercio

Il materiale di controllo standard sottoelencato è disponibile presso la collezione di colture NCPPB:

Sedimento di centrifuga liofilizzato estratto da 200 tuberi di patata sani come controllo negativo per tutti i saggi.

Sedimento di centrifuga liofilizzato estratto da 200 tuberi di patata sani contenenti da 103 a 104 e da 104 a 106 cellule di R. solanacearum biovar 2 (ceppo NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) come controlli positivi per i saggi sierologici e per i saggi PCR. Dato che il processo di liofilizzazione può condizionare la vitalità delle cellule, i sedimenti liofilizzati non si prestano ad essere usati come controlli standard nei saggi di isolamento o nei saggi biologici.

Sospensioni fissate in formalina di R. solanacearum biovar 2 (ceppo NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) a 106 cellule per ml come controlli positivi per i saggi sierologici.

B.   Preparazione di controlli positivi e negativi

Preparare una coltura di 48 ore di un ceppo virulento di R. solanacearum razza 3 biovar 2 (p. es. ceppo NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) su substrato base SMSA e sospendere in tampone fosfato 10 mM per ottenere una densità cellulare di circa 2 × 108 cfu/ml. Questa concentrazione si ottiene comunemente con una sospensione lievemente torbida equivalente a una densità ottica di 0,15 a 600 nm.

Asportare il cono ombelicale di 200 tuberi di una varietà a buccia bianca in cui sia stata accertata assenza di R. solanacearum.

Trattare i coni ombelicali come di consueto e risospendere il sedimento in 10 ml.

Preparare 10 microprovette sterili da 1,5 ml con 900 μl del sedimento risospeso.

Trasferire 100 μl della sospensione di R. solanacearum nella prima microprovetta. Mescolare nel vortex.

Stabilire livelli decimali di contaminazione mediante ulteriori diluizioni nelle altre cinque microprovette.

Le sei microprovette contaminate verranno usate come controlli positivi. Le quattro microprovette non contaminate verranno utilizzate come controlli negativi. Etichettare le microprovette di conseguenza.

Preparare aliquote di 100 μl in microprovette sterili da 1,5 ml, ottenendo così 9 copie di ciascun campione di controllo. Conservare a una temperatura compresa fra –16 e –24 °C fino all’uso.

La presenza e la quantificazione di R. solanacearum nei campioni di controllo deve essere in primo luogo confermata dal saggio IF.

Per il saggio PCR procedere all’estrazione del DNA dai campioni di controllo positivi e negativi per ciascuna serie di campioni da saggiare.

Per i saggi IF e FISH effettuare prove sui campioni di controllo positivi e negativi per ciascuna serie di campioni da saggiare.

Per i saggi IF, FISH e PCR la presenza di R. solanacearum deve essere rilevata in almeno 106 e 104 cellule/ml dei controlli positivi e non deve essere rilevata in nessuno dei controlli negativi.

Appendice 4

Tamponi per le procedure dei saggi

INDICAZIONE GENERALE: i tamponi sterilizzati non aperti possono essere conservati fino a un anno.

1.   Tamponi per procedura di estrazione

1.1.   Tampone di estrazione (tampone fosfato 50 mM, pH 7,0)

Questo tampone è utilizzato per l’estrazione del batterio dai tessuti vegetali mediante omogeneizzazione o agitazione.

| Na2HPO4 (anidro) | 4,26 g |
| --- | --- |
| KH2PO4 | 2,72 g |
| Acqua distillata | 1,00 l |

Na2HPO4 (anidro)

4,26 g

KH2PO4

2,72 g

Acqua distillata

1,00 l

Sciogliere gli ingredienti, controllare il pH e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 min.

Possono risultare utili i seguenti componenti supplementari:

| | Finalità | Quantità (per l) |
| --- | --- | --- |
| Lubrol in scaglie | Deflocculante (7) | 0,5 g |
| Antischiuma al silicone DC | Antischiumogeno (7) | 1,0 ml |
| Pirofosfato tetrasodico | Antiossidante | 1,0 g |
| Polivinilpirrolidone-40000 (PVP-40) | Legame con gli inibitori della PCR | 50 g |

Finalità

Quantità (per l)

Lubrol in scaglie

Deflocculante (7)

0,5 g

Antischiuma al silicone DC

Antischiumogeno (7)

1,0 ml

Pirofosfato tetrasodico

Antiossidante

1,0 g

Polivinilpirrolidone-40000 (PVP-40)

Legame con gli inibitori della PCR

50 g

1.2.   Tampone per sedimento (tampone fosfato 10 mM, pH 7,2)

Questo tampone è impiegato per risospendere e diluire l’estratto di coni ombelicali di patate concentrato nel sedimento di centrifugazione.

| Na2HPO4.12H2O | 2,7 g |
| --- | --- |
| NaH2PO4.2H2O | 0,4 g |
| Acqua distillata | 1,0 l |

Na2HPO4.12H2O

2,7 g

NaH2PO4.2H2O

0,4 g

Acqua distillata

1,0 l

Sciogliere gli ingredienti, controllare il pH e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.

2.   Tamponi per il saggio IF

2.1.   Tampone IF: soluzione fisiologica tamponata al fosfato (PBS) 10 mM, pH 7,2

Questo tampone viene impiegato per la diluizione degli anticorpi.

| Na2HPO4.12H2O | 2,7 g |
| --- | --- |
| NaH2PO4.2H2O | 0,4 g |
| NaCl | 8,0 g |
| Acqua distillata | 1,0 l |

Na2HPO4.12H2O

2,7 g

NaH2PO4.2H2O

0,4 g

NaCl

8,0 g

Acqua distillata

1,0 l

Sciogliere gli ingredienti, controllare il pH e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.

2.2.   Tampone IF-Tween

Questo tampone è usato per lavare i vetrini.

Aggiungere lo 0,1 % di Tween 20 al tampone IF.

2.3.   Glicerolo tamponato al fosfato, pH 7,6

Questo tampone viene impiegato come liquido di montaggio sui pozzetti dei vetrini IF per incrementare la fluorescenza.

| Na2HPO4.12H2O | 3,2 g |
| --- | --- |
| NaH2PO4.2H2O | 0,15 g |
| Glicerolo | 50 ml |
| Acqua distillata | 100 ml |

Na2HPO4.12H2O

3,2 g

NaH2PO4.2H2O

0,15 g

Glicerolo

50 ml

Acqua distillata

100 ml

Soluzioni di montaggio antiscolorimento sono disponibili in commercio, p. es. Vectashield® (Laboratori Vector) o Citifluor® (Leica).

3.   Tamponi per il saggio ELISA indiretto

3.1.   Tampone di rivestimento a doppia forza (pH 9,6).

| Na2CO3 | 6,36 g |
| --- | --- |
| NaHCO3 | 11,72 g |
| Acqua distillata | 1,00 l |

Na2CO3

6,36 g

NaHCO3

11,72 g

Acqua distillata

1,00 l

Sciogliere gli ingredienti, controllare il pH e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.

Si può aggiungere solfito sodico (0,2 %) come antiossidante se necessario per impedire la formazione di composti aromatici ossidati.

3.2.   Soluzione fisiologica tamponata al fosfato (PBS) 10X, pH 7,4

| NaCl | 80,0 g |
| --- | --- |
| KH2PO4 | 2,0 g |
| Na2HPO4.12H2O | 29,0 g |
| KCl | 2,0 g |
| Acqua distillata | 1,0 l |

NaCl

80,0 g

KH2PO4

2,0 g

Na2HPO4.12H2O

29,0 g

KCl

2,0 g

Acqua distillata

1,0 l

3.3.   Tampone PBS-Tween

| 10X PBS | 100 ml |
| --- | --- |
| 10 % Tween 20 | 5 ml |
| Acqua distillata | 895 ml |

10X PBS

100 ml

10 % Tween 20

5 ml

Acqua distillata

895 ml

3.4.   Tampone bloccante (anticorpi) (da preparare al momento dell’uso)

| 10X PBS | 10,0 ml |
| --- | --- |
| Polivinilpirrolidone-44000 (PVP-44) | 2,0 g |
| 10 % Tween 20 | 0,5 ml |
| Latte in polvere | 0,5 g |
| Acqua distillata | Portare a 100 ml |

10X PBS

10,0 ml

Polivinilpirrolidone-44000 (PVP-44)

2,0 g

10 % Tween 20

0,5 ml

Latte in polvere

0,5 g

Acqua distillata

Portare a 100 ml

3.5.   Soluzione substrato fosfatasi alcalina, pH 9,8

| Dietanolammina | 97 ml |
| --- | --- |
| Acqua distillata | 800 ml |

Dietanolammina

97 ml

Acqua distillata

800 ml

Mescolare e regolare a pH 9,8 con HCI concentrato.

Portare a 1 litro con acqua distillata.

Aggiungere 0,2 g di MgCl2.

Sciogliere due compresse da 5 mg di substrato per la fosfatasi (Sigma) per ogni 15 ml di soluzione.

4.   Tamponi per il saggio DASI-ELISA

4.1.   Tampone di rivestimento (pH 9,6)

| Na2CO3 | 1,59 g |
| --- | --- |
| NaHCO3 | 2,93 g |
| Acqua distillata | 1 000 ml |

Na2CO3

1,59 g

NaHCO3

2,93 g

Acqua distillata

1 000 ml

Sciogliere gli ingredienti e controllare il pH.

4.2.   Soluzione fisiologica tamponata al fosfato (PBS) pH 7,2-7,4

| NaCl | 80,0 g |
| --- | --- |
| NaH2PO4.2H2O | 4,0 g |
| Na2HPO4.12H2O | 27,0 g |
| Acqua distillata | 1 000 ml |

NaCl

80,0 g

NaH2PO4.2H2O

4,0 g

Na2HPO4.12H2O

27,0 g

Acqua distillata

1 000 ml

4.3.   Tampone PBS-Tween

| 10X PBS | 50 ml |
| --- | --- |
| 10 % Tween 20 | 5 ml |
| Acqua distillata | 950 ml |

10X PBS

50 ml

10 % Tween 20

5 ml

Acqua distillata

950 ml

4.4.   Tampone per il substrato (pH 9,8).

| Dietanolammina | 100 ml |
| --- | --- |
| Acqua distillata | 900 ml |

Dietanolammina

100 ml

Acqua distillata

900 ml

Mescolare e regolare a pH 9,8 con HCI concentrato.

Appendice 5

Determinazione del livello di contaminazione nei saggi IF e FISH

| 1. | Conteggiare il numero medio di cellule fluorescenti tipiche per campo microscopico (c). |
| --- | --- |

1.

Conteggiare il numero medio di cellule fluorescenti tipiche per campo microscopico (c).

| 2. | Calcolare il numero di cellule fluorescenti tipiche per pozzetto di vetrino da microscopio (C).
  C = c × S/s








  in cui | S | = | superficie del pozzetto del vetrino multiplo |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| e | s | = | superficie del campo dell’obiettivo |

2.

Calcolare il numero di cellule fluorescenti tipiche per pozzetto di vetrino da microscopio (C).

C = c × S/s

in cui

S

=

superficie del pozzetto del vetrino multiplo

e

s

=

superficie del campo dell’obiettivo

| s = πi2/4G2K2 | in cui | i) | = | coefficiente di campo (dipende dal tipo di oculare e varia fra 8 e 24) |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| | | K | = | coefficiente del microscopio (1 o 1,25) |
| | | G | = | ingrandimento dell’obiettivo (100 ×, 40 × ecc.) |

s = πi2/4G2K2

in cui

i)

=

coefficiente di campo (dipende dal tipo di oculare e varia fra 8 e 24)

K

=

coefficiente del microscopio (1 o 1,25)

G

=

ingrandimento dell’obiettivo (100 ×, 40 × ecc.)

| 3. | Calcolare il numero di cellule fluorescenti tipiche per ml di precipitato riportato in sospensione (N).
  N = C × 1 000/y × F








  in cui | y | = | volume del precipitato risospeso messo su ciascun pozzetto |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| e | F | = | fattore di diluizione del precipitato risospeso. |

3.

Calcolare il numero di cellule fluorescenti tipiche per ml di precipitato riportato in sospensione (N).

N = C × 1 000/y × F

in cui

y

=

volume del precipitato risospeso messo su ciascun pozzetto

e

F

=

fattore di diluizione del precipitato risospeso.

Appendice 6

Protocolli e reagenti PCR convalidati

NB: I saggi preliminari dovrebbero consentire il rilevamento riproducibile di 103-104 cellule di R. solanacearum per ml di estratto del campione.

I saggi preliminari, inoltre, non dovrebbero presentare falsi positivi in una serie di ceppi batterici selezionati (cfr. appendice 3).

1.   Protocollo PCR di Seal et al. (1993)

1.1.   Primer oligonucleotidici

| Forward primer OLI-1 | 5′-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3′ |
| --- | --- |
| Reverse primer Y-2 | 5′-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3′ |

Forward primer OLI-1

5′-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3′

Reverse primer Y-2

5′-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3′

Dimensioni attese degli ampliconi del DNA stampo di R. solanacearum = 288 bp

1.2.   Miscela di reazione PCR

| Reagente | Quantità per reazione | Concentrazione finale |
| --- | --- | --- |
| UPW sterile | 17,65 μl | |
| 10X tampone PCR (8) (15 mM MgCl2) | 2,5 μl | 1X (1,5 mM MgCl2) |
| miscela d-nTP (20 mM) | 0,25 μl | 0,2 mM |
| Primer OLI-1 (20 μM) | 1,25 μl | 1 μM |
| Primer Y-2 (20 μM) | 1,25 μl | 1 μM |
| Taq polimerasi (5 U/μl (8)) | 0,1 μl | 0,5 U |
| Volume del campione | 2,0 μl | |
| Volume totale: | 25 μl | |

Reagente

Quantità per reazione

Concentrazione finale

UPW sterile

17,65 μl

10X tampone PCR (8) (15 mM MgCl2)

2,5 μl

1X (1,5 mM MgCl2)

miscela d-nTP (20 mM)

0,25 μl

0,2 mM

Primer OLI-1 (20 μM)

1,25 μl

1 μM

Primer Y-2 (20 μM)

1,25 μl

1 μM

Taq polimerasi (5 U/μl (8))

0,1 μl

0,5 U

Volume del campione

2,0 μl

Volume totale:

25 μl

1.3.   Condizioni di reazione della PCR

Eseguire il seguente programma:

| 1 ciclo di: | i) | 2 minuti a 96 °C (denaturazione del DNA stampo) |
| --- | --- | --- |
| 35 cicli di: | ii) | 20 secondi a 94 °C (denaturazione del DNA stampo) |
| | iii) | 20 secondi a 68 °C (appaiamento dei primer) |
| | iv) | 30 secondi a 72 °C (estensione della copia) |
| 1 ciclo di: | v) | 10 minuti a 72 °C (estensione finale) |
| | vi) | mantenere a 4 °C |

1 ciclo di:

i)

2 minuti a 96 °C (denaturazione del DNA stampo)

35 cicli di:

ii)

20 secondi a 94 °C (denaturazione del DNA stampo)

iii)

20 secondi a 68 °C (appaiamento dei primer)

iv)

30 secondi a 72 °C (estensione della copia)

1 ciclo di:

v)

10 minuti a 72 °C (estensione finale)

vi)

mantenere a 4 °C

NB: Questo programma è ottimizzato per l'impiego con un termociclatore Perkin Elmer 9600. Qualora vengano usati altri modelli potrà essere necessario modificare la durata delle fasi ii), iii) e iv).

1.4.   Analisi di restrizione enzimatica degli ampliconi

I prodotti della PCR amplificati a partire dal DNA di R. solanacearum producono uno specifico polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione dopo essere stati incubati a 37 °C con enzima Ava II.

2.   Protocollo PCR di Pastrik e Maiss (2000)

2.1.   Primer oligonucleotidici

| Forward primer Ps-1 | 5′-agt cga acg gca gcg ggg g-3′ |
| --- | --- |
| Reverse primer Ps-2 | 5′-ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca-3′ |

Forward primer Ps-1

5′-agt cga acg gca gcg ggg g-3′

Reverse primer Ps-2

5′-ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca-3′

Dimensioni attese degli ampliconi del DNA stampo di R. solanacearum = 553 bp

2.2.   Miscela di reazione PCR

| Reagente | Quantità per reazione | Concentrazione finale |
| --- | --- | --- |
| UPW sterile | 16,025 μl | |
| Tampone 10X PCR (9) | 2,5 μl | 1X (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (frazione V) (10 %) | 0,25 μl | 0,1 % |
| miscela d-nTP (20 mM) | 0,125 μl | 0,1 mM |
| Primer Ps-1 (10 μM) | 0,5 μl | 0,2 μM |
| Primer Ps-2 (10 μM) | 0,5 μl | 0,2 μM |
| Taq polimerasi (5 U/μl) (9) | 0,1 μl | 0,5 U |
| Volume del campione | 5,0 μl | |
| Volume totale: | 25,0 μl | |
| NB: Inizialmente ottimizzati per termociclatore MJ Research PTC 200 con Taq polimerasi Gibco.
  È ugualmente possibile usare AmpliTaq e tampone Perkin Elmer alle stesse concentrazioni. |

Reagente

Quantità per reazione

Concentrazione finale

UPW sterile

16,025 μl

Tampone 10X PCR (9)

2,5 μl

1X (1,5 mM MgCl2)

BSA (frazione V) (10 %)

0,25 μl

0,1 %

miscela d-nTP (20 mM)

0,125 μl

0,1 mM

Primer Ps-1 (10 μM)

0,5 μl

0,2 μM

Primer Ps-2 (10 μM)

0,5 μl

0,2 μM

Taq polimerasi (5 U/μl) (9)

0,1 μl

0,5 U

Volume del campione

5,0 μl

Volume totale:

25,0 μl

NB: Inizialmente ottimizzati per termociclatore MJ Research PTC 200 con Taq polimerasi Gibco.

È ugualmente possibile usare AmpliTaq e tampone Perkin Elmer alle stesse concentrazioni.

2.3.   Condizioni di reazione della PCR

Eseguire il seguente programma:

| 1 ciclo di: | i) | 5 minuti a 95 °C (denaturazione del DNA stampo) |
| --- | --- | --- |
| 35 cicli di: | ii) | 30 secondi a 95 °C (denaturazione del DNA stampo) |
| | iii) | 30 secondi a 68 °C (appaiamento dei primer) |
| | iv) | 45 secondi a 72 °C (estensione della copia) |
| 1 ciclo di: | v) | 5 minuti a 72 °C (estensione finale) |
| | vi) | mantenere a 4 °C |

1 ciclo di:

i)

5 minuti a 95 °C (denaturazione del DNA stampo)

35 cicli di:

ii)

30 secondi a 95 °C (denaturazione del DNA stampo)

iii)

30 secondi a 68 °C (appaiamento dei primer)

iv)

45 secondi a 72 °C (estensione della copia)

1 ciclo di:

v)

5 minuti a 72 °C (estensione finale)

vi)

mantenere a 4 °C

NB: Questo programma è ottimizzato per l'impiego con un termociclatore MJ Research PTC 200. Qualora vengano usati altri modelli potrà essere necessario modificare la durata delle fasi ii), iii) e iv).

2.4.   Analisi di restrizione enzimatica degli ampliconi

I prodotti della PCR amplificati a partire dal DNA di R. solanacearum producono uno specifico polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione con l'enzima Taq I dopo essere stati incubati a 65 °C per 30 minuti. I frammenti di restrizione ottenuti dal frammento specifico di R. solanacearum hanno dimensioni di 457 bp e 96 bp.

3.   Protocollo PCR multiplex con controllo interno della PCR (Pastrik et al., 2002)

3.1.   Primer oligonucleotidici

| Forward primer RS-1-F | 5′-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3′ |
| --- | --- |
| Reverse primer RS-1-R | 5′-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3′ |
| Forward primer NS-5-F | 5′-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3′ |
| Reverse primer NS-6-R | 5′-GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC-3′ |

Forward primer RS-1-F

5′-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3′

Reverse primer RS-1-R

5′-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3′

Forward primer NS-5-F

5′-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3′

Reverse primer NS-6-R

5′-GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC-3′

Dimensioni attese degli ampliconi del DNA stampo di R. solanacearum = 718 bp (set di primer RS)

Dimensioni attese degli ampliconi del controllo interno PCR 18S rRNA = 310 bp (set di primer NS)

3.2.   Miscela di reazione PCR

| Reagente | Quantità per reazione | Concentrazione finale |
| --- | --- | --- |
| UPW sterile | 12,625 μl | |
| 10X tampone PCR (10) (15 mM MgCl2) | 2,5 μl | 1X (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (frazione V) (10 %) | 0,25 μl | 0,1 % |
| miscela d-nTP (20 mM) | 0,125 μl | 0,1 mM |
| Primer RS-1-F (10 μM) | 2,0 μl | 0,8 μM |
| Primer RS-1-R (10 μM) | 2,0 μl | 0,8 μM |
| Primer NS-5-F (10 μM) (11) | 0,15 μl | 0,06 μM |
| Primer NS-6-R (10 μM) (11) | 0,15 μl | 0,06 μM |
| Taq polimerasi (5 U/μl (10)) | 0,2 μl | 1,0 U |
| Volume del campione | 5,0 μl | |
| Volume totale: | 25,0 μl | |

Reagente

Quantità per reazione

Concentrazione finale

UPW sterile

12,625 μl

10X tampone PCR (10) (15 mM MgCl2)

2,5 μl

1X (1,5 mM MgCl2)

BSA (frazione V) (10 %)

0,25 μl

0,1 %

miscela d-nTP (20 mM)

0,125 μl

0,1 mM

Primer RS-1-F (10 μM)

2,0 μl

0,8 μM

Primer RS-1-R (10 μM)

2,0 μl

0,8 μM

Primer NS-5-F (10 μM) (11)

0,15 μl

0,06 μM

Primer NS-6-R (10 μM) (11)

0,15 μl

0,06 μM

Taq polimerasi (5 U/μl (10))

0,2 μl

1,0 U

Volume del campione

5,0 μl

Volume totale:

25,0 μl

3.3.   Condizioni di reazione della PCR

Eseguire il seguente programma:

| 1 ciclo di: | i) | 5 minuti a 95 °C (denaturazione del DNA stampo) |
| --- | --- | --- |
| 35 cicli di: | ii) | 30 secondi a 95 °C (denaturazione del DNA stampo) |
| | iii) | 30 secondi a 58 °C (appaiamento dei primer) |
| | iv) | 45 secondi a 72 °C (estensione della copia) |
| 1 ciclo di: | v) | 5 minuti a 72 °C (estensione finale) |
| | vi) | mantenere a 4 °C |

1 ciclo di:

i)

5 minuti a 95 °C (denaturazione del DNA stampo)

35 cicli di:

ii)

30 secondi a 95 °C (denaturazione del DNA stampo)

iii)

30 secondi a 58 °C (appaiamento dei primer)

iv)

45 secondi a 72 °C (estensione della copia)

1 ciclo di:

v)

5 minuti a 72 °C (estensione finale)

vi)

mantenere a 4 °C

NB: Questo programma è ottimizzato per l'impiego con un termociclatore MJ Research PTC 200. Qualora vengano utilizzati altri modelli potrà essere necessario modificare la durata delle fasi ii), iii) e iv).

3.4.   Analisi di restrizione enzimatica degli ampliconi

I prodotti della PCR amplificati a partire dal DNA di R. solanacearum producono uno specifico polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione con l'enzima Bsm I o un isoschizomero (p. es. Mva 1269 I) dopo essere stati incubati a 65 °C per 30 minuti.

4.   Protocollo PCR specifico per le biovar di R. solanacearum (Pastrik et al., 2001)

4.1.   Primer oligonucleotidici

| Forward primer Rs-1-F | 5′-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3′ |
| --- | --- |
| Reverse primer Rs-1-R | 5′-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3′ |
| Reverse primer Rs-3-R | 5′-TTC ACG GCA AGA TCG CTC-3′ |

Forward primer Rs-1-F

5′-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3′

Reverse primer Rs-1-R

5′-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3′

Reverse primer Rs-3-R

5′-TTC ACG GCA AGA TCG CTC-3′

Dimensioni attese degli ampliconi del DNA stampo di R. solanacearum:

con Rs-1-F/Rs-1-R = 718 bp

con Rs-1-F/Rs-3-R = 716 bp

4.2.   Miscela di reazione PCR

| a) | PCR specifica per le biovar 1/2







  Reagente | Quantità per reazione | Concentrazione finale |
| --- | --- | --- | --- |
| UPW sterile | 12,925 μl | |
| 10X tampone PCR (12) | 2,5 μl | 1X (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (frazione V) (10 %) | 0,25 μl | 0,1 % |
| miscela d-nTP (20 mM) | 0,125 μl | 0,1 mM |
| Primer Rs-1-F (10 μM) | 2 μl | 0,8 μM |
| Primer Rs-1-R (10 μM) | 2 μl | 0,8 μM |
| Taq polimerasi (5 U/μl) (12) | 0,2 μl | 1 U |
| Volume del campione | 5,0 μl | |
| Volume totale: | 25,0 μl | |

a)

PCR specifica per le biovar 1/2

Reagente

Quantità per reazione

Concentrazione finale

UPW sterile

12,925 μl

10X tampone PCR (12)

2,5 μl

1X (1,5 mM MgCl2)

BSA (frazione V) (10 %)

0,25 μl

0,1 %

miscela d-nTP (20 mM)

0,125 μl

0,1 mM

Primer Rs-1-F (10 μM)

2 μl

0,8 μM

Primer Rs-1-R (10 μM)

2 μl

0,8 μM

Taq polimerasi (5 U/μl) (12)

0,2 μl

1 U

Volume del campione

5,0 μl

Volume totale:

25,0 μl

| b) | PCR specifica per le biovar 3/4/5







  Reagente | Quantità per reazione | Concentrazione finale |
| --- | --- | --- | --- |
| UPW sterile | 14,925 μl | |
| 10X tampone PCR (13) | 2,5 μl | 1X (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (frazione V) (10 %) | 0,25 μl | 0,1 % |
| miscela d-nTP (20 mM) | 0,125 μl | 0,1 mM |
| Primer Rs-1-F (10 μM) | 1 μl | 0,4 μM |
| Primer Rs-3-R (10 μM) | 1 μl | 0,4 μM |
| Taq polimerasi (5 U/μl) (13) | 0,2 μl | 1 U |
| Volume del campione | 5,0 μl | |
| Volume totale: | 25,0 μl | |

b)

PCR specifica per le biovar 3/4/5

Reagente

Quantità per reazione

Concentrazione finale

UPW sterile

14,925 μl

10X tampone PCR (13)

2,5 μl

1X (1,5 mM MgCl2)

BSA (frazione V) (10 %)

0,25 μl

0,1 %

miscela d-nTP (20 mM)

0,125 μl

0,1 mM

Primer Rs-1-F (10 μM)

1 μl

0,4 μM

Primer Rs-3-R (10 μM)

1 μl

0,4 μM

Taq polimerasi (5 U/μl) (13)

0,2 μl

1 U

Volume del campione

5,0 μl

Volume totale:

25,0 μl

4.3.   Condizioni di reazione della PCR

Eseguire il seguente programma sia per le reazioni specifiche per le biovar 1/2 che per quelle specifiche per le biovar 3/4/5:

| 1 ciclo di: | i) | 5 minuti a 95 °C (denaturazione del DNA stampo) |
| --- | --- | --- |
| 35 cicli di: | ii) | 30 secondi a 95 °C (denaturazione del DNA stampo) |
| | iii) | 30 secondi a 58 °C (appaiamento dei primer) |
| | iv) | 45 secondi a 72 °C (estensione della copia) |
| 1 ciclo di: | v) | 5 minuti a 72 °C (estensione finale) |
| | vi) | mantenere a 4 °C |

1 ciclo di:

i)

5 minuti a 95 °C (denaturazione del DNA stampo)

35 cicli di:

ii)

30 secondi a 95 °C (denaturazione del DNA stampo)

iii)

30 secondi a 58 °C (appaiamento dei primer)

iv)

45 secondi a 72 °C (estensione della copia)

1 ciclo di:

v)

5 minuti a 72 °C (estensione finale)

vi)

mantenere a 4 °C

NB: Questo programma è ottimizzato per l'impiego con un termociclatore MJ Research PTC 200. Qualora vengano usati altri modelli potrà essere necessario modificare la durata delle fasi ii), iii) e iv).

4.4.   Analisi di restrizione enzimatica degli ampliconi

I prodotti della PCR amplificati a partire dal DNA di R. solanacearum usando i primer Rs-1-F e Rs-1-R producono uno specifico polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione con l'enzima Bsm I o un isoschizomero (p. es. Mva 1269 I) dopo essere stati incubati a 65 °C per 30 minuti. I prodotti della PCR amplificati a partire dal DNA di R. solanacearum usando i primer Rs-1-F e Rs-3-R non hanno punti di restrizione.

5.   Preparazione del tampone di caricamento

5.1.   Blu di bromofenolo (soluzione madre al 10 %)

| Blu di bromofenolo | 5 g |
| --- | --- |
| Acqua distillata (bidistillata) | 50 ml |

Blu di bromofenolo

5 g

Acqua distillata (bidistillata)

50 ml

5.2.   Tampone di caricamento

| Glicerolo (86 %) | 3,5 ml |
| --- | --- |
| Blu di bromofenolo (5,1) | 300 μl |
| Acqua distillata (bidistillata) | 6,2 ml |

Glicerolo (86 %)

3,5 ml

Blu di bromofenolo (5,1)

300 μl

Acqua distillata (bidistillata)

6,2 ml

6.   10X tampone tris-acetato-EDTA (TAE), pH 8,0

| Tampone tris-acetato | 48,40 g |
| --- | --- |
| Acido acetico glaciale | 11,42 ml |
| EDTA (sale disodico) | 3,72 g |
| Acqua distillata | 1,00 l |

Tampone tris-acetato

48,40 g

Acido acetico glaciale

11,42 ml

EDTA (sale disodico)

3,72 g

Acqua distillata

1,00 l

Diluire a 1X prima dell'impiego.

Disponibile anche in commercio (p es. Invitrogen o equivalente).

Appendice 7

Reagenti convalidati per il saggio FISH

1.   Oligosonde

Sonda specifica per R. solanacearum OLI-1-CY3: 5′-ggc agg tag caa gct acc ccc-3′

Sonda eubatterica non specifica EUB-338-FITC: 5′-gct gcc tcc cgt agg agt-3′

2.   Soluzione fissativa

[ATTENZIONE! IL FISSATIVO CONTIENE PARAFORMALDEIDE, CHE È TOSSICA. INDOSSARE GUANTI E NON INALARE. SI CONSIGLIA DI LAVORARE SOTTO CAPPA CHIMICA].

| i) | Riscaldare 9 ml di acqua ultrapura (grado molecolare) (p es. acqua ultrapura, UPW) a circa 60 °C e aggiungere 0,4 g di paraformaldeide. La paraformaldeide si scioglie aggiungendo 5 gocce di NaOH 1N e mescolando con un agitatore magnetico. |
| --- | --- |

i)

Riscaldare 9 ml di acqua ultrapura (grado molecolare) (p es. acqua ultrapura, UPW) a circa 60 °C e aggiungere 0,4 g di paraformaldeide. La paraformaldeide si scioglie aggiungendo 5 gocce di NaOH 1N e mescolando con un agitatore magnetico.

| ii) | Regolare il pH a 7,0 aggiungendo 1 ml di tampone fosfato 0,1 M (PB; pH 7,0) e 5 gocce di HCl 1N. Controllare il pH con cartine indicatrici e, se necessario, regolare con HCl o NaOH. [ATTENZIONE! NON USARE UN MISURATORE DI PH IN SOLUZIONI CONTENENTI PARAFORMALDEIDE]. |
| --- | --- |

ii)

Regolare il pH a 7,0 aggiungendo 1 ml di tampone fosfato 0,1 M (PB; pH 7,0) e 5 gocce di HCl 1N. Controllare il pH con cartine indicatrici e, se necessario, regolare con HCl o NaOH. [ATTENZIONE! NON USARE UN MISURATORE DI PH IN SOLUZIONI CONTENENTI PARAFORMALDEIDE].

| iii) | Filtrare la soluzione attraverso una membrana con porosità 0,22 μm e conservare al riparo dalla polvere a 4 °C fino all'uso successivo. |
| --- | --- |

iii)

Filtrare la soluzione attraverso una membrana con porosità 0,22 μm e conservare al riparo dalla polvere a 4 °C fino all'uso successivo.

3.   3X Hybmix

| NaCl | 2,7 M |
| --- | --- |
| Tris-HCl | 60 mM (pH 7,4) |
| EDTA (sterilizzato per filtrazione e autoclavato) | 15 mM |

NaCl

2,7 M

Tris-HCl

60 mM (pH 7,4)

EDTA (sterilizzato per filtrazione e autoclavato)

15 mM

Diluire a 1X come prescritto.

4.   Soluzione di ibridazione

| 1 X Hybmix | |
| --- | --- |
| Sodio dodecil solfato (SDS) | 0,01 % |
| Formammide | 30 % |
| Sonda EUB 338 | 5 ng/μl |
| Sonda OLI-1 o OLI-2 | 5 ng/μl |

1 X Hybmix

Sodio dodecil solfato (SDS)

0,01 %

Formammide

30 %

Sonda EUB 338

5 ng/μl

Sonda OLI-1 o OLI-2

5 ng/μl

Preparare quantità di soluzione d'ibridazione secondo i calcoli di cui alla tabella 1. Per ciascun vetrino (contenente 2 campioni diversi in duplicato) sono necessari 90 μl di soluzione di ibridazione. IMPORTANTE: LA FORMAMMIDE È ESTREMAMENTE TOSSICA, INDOSSARE GUANTI E PRENDERE OPPORTUNE PRECAUZIONI!

Tabella 1.   Quantità consigliate per la preparazione della miscela di ibridazione

| Numero di vetrini: | 1 | 4 | 6 | 8 | 10 |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| UPW sterile | 23,1 | 92,4 | 138,6 | 184,8 | 231,0 |
| 3x Hybmix | 30,0 | 120,0 | 180,0 | 240,0 | 300,0 |
| 1 % SDS | 0,9 | 3,6 | 5,4 | 7,2 | 9,0 |
| Formammide | 27,0 | 108,0 | 162,0 | 216,0 | 270,0 |
| Sonda EUB 338 (100 ng/μl) | 4,5 | 18,0 | 27,0 | 36,0 | 45,0 |
| Sonda OLI-1 o OLI-2 (100 ng/μl) | 4,5 | 18,0 | 27,0 | 36,0 | 45,0 |
| Volume totale (μl) | 90,0 | 360,0 | 540,0 | 720,0 | 900,0 |
| NB: Conservare al buio a una temperatura di –20 °C tutte le soluzioni contenenti oligosonde sensibili alla luce.
  Durante l'impiego proteggere dalla luce solare diretta o dalla luce elettrica. |

Numero di vetrini:

1

4

6

8

10

UPW sterile

23,1

92,4

138,6

184,8

231,0

3x Hybmix

30,0

120,0

180,0

240,0

300,0

1 % SDS

0,9

3,6

5,4

7,2

9,0

Formammide

27,0

108,0

162,0

216,0

270,0

Sonda EUB 338 (100 ng/μl)

4,5

18,0

27,0

36,0

45,0

Sonda OLI-1 o OLI-2 (100 ng/μl)

4,5

18,0

27,0

36,0

45,0

Volume totale (μl)

90,0

360,0

540,0

720,0

900,0

NB: Conservare al buio a una temperatura di –20 °C tutte le soluzioni contenenti oligosonde sensibili alla luce.

Durante l'impiego proteggere dalla luce solare diretta o dalla luce elettrica.

5.   Tampone fosfato 0,1 M, pH 7,0

| Na2HPO4 | 8,52 g |
| --- | --- |
| KH2PO4 | 5,44 g |
| Acqua distillata | 1,00 l |

Na2HPO4

8,52 g

KH2PO4

5,44 g

Acqua distillata

1,00 l

Sciogliere gli ingredienti, controllare il pH e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.

Appendice 8

Condizioni di coltura per le melanzane e i pomodori

Seminare i semi di pomodoro (Lycopersicon esculentum) o di melanzana (Solanum melongena) in terra da semina pastorizzata. Trapiantare le piantine con cotiledoni completamente sviluppati (10-14 giorni) in terra da vaso pastorizzata.

Le melanzane o i pomodori dovrebbero essere coltivati in una serra nelle seguenti condizioni ambientali prima dell’inoculazione:

| Luce: | 14 ore o lunghezza naturale del giorno se maggiore |
| --- | --- |
| Temperatura: | diurna: da 21 a 24 °C
  notturna: da 14 a 18 °C |
| Varietà di pomodoro sensibile: | “Moneymaker” |
| Varietà di melanzana sensibile: | “Black Beauty” |
| Fornitori: | cfr. il sito web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main |

Luce:

14 ore o lunghezza naturale del giorno se maggiore

Temperatura:

diurna: da 21 a 24 °C

notturna: da 14 a 18 °C

Varietà di pomodoro sensibile:

“Moneymaker”

Varietà di melanzana sensibile:

“Black Beauty”

Fornitori:

cfr. il sito web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI

| 1. | Amann, R.I., L. Krumholz and D.A. Stahl. 1990. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology. J. Bacteriol. 172: 762-770. |
| --- | --- |

1.

Amann, R.I., L. Krumholz and D.A. Stahl. 1990. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology. J. Bacteriol. 172: 762-770.

| 2. | Anon. 1998. Council Directive 98/57/EC of 20 July 1998 on the control of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Official Journal of the European Communities L235, 1-39. |
| --- | --- |

2.

Anon. 1998. Council Directive 98/57/EC of 20 July 1998 on the control of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Official Journal of the European Communities L235, 1-39.

| 3. | Boudazin, G., A.C. Le Roux, K. Josi, P. Labarre and B. Jouan. 1999. Design of division specific primers of Ralstonia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology 105; 373-380. |
| --- | --- |

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Boudazin, G., A.C. Le Roux, K. Josi, P. Labarre and B. Jouan. 1999. Design of division specific primers of Ralstonia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology 105; 373-380.

| 4. | Caruso, P., Gorris, M.T., Cambra, M., Palomo, J.L., Collar, J and Lopez, M.M. 2002. Enrichment Double-Antibody Sandwich Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal Antibody for sensitive Detection of Ralstonia solanacearum in Asymptomatic Potato Tubers. Applied and Environmental Microbiology, 68, 3634-3638. |
| --- | --- |

4.

Caruso, P., Gorris, M.T., Cambra, M., Palomo, J.L., Collar, J and Lopez, M.M. 2002. Enrichment Double-Antibody Sandwich Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal Antibody for sensitive Detection of Ralstonia solanacearum in Asymptomatic Potato Tubers. Applied and Environmental Microbiology, 68, 3634-3638.

| 5. | Cook, D., Barlow, E. and Sequeira, L. 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphisms with DNA probes that specify virulence and the hypersensitive response. Molecular Plant-Microbe Interactions 1:113-121. |
| --- | --- |

5.

Cook, D., Barlow, E. and Sequeira, L. 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphisms with DNA probes that specify virulence and the hypersensitive response. Molecular Plant-Microbe Interactions 1:113-121.

| 6. | Elphinstone, J.G., Hennessy, J., Wilson, J.K. and Stead, D.E. 1996. Sensitivity of detection of Ralstonia solanacearum in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26; 663-678. |
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6.

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| 7. | Englebrecht, M.C. (1994) Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. In: A.C. Hayward (ed.) Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Australian Centre for International Agricultural Research, Canberra, Australia. |
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7.

Englebrecht, M.C. (1994) Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. In: A.C. Hayward (ed.) Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Australian Centre for International Agricultural Research, Canberra, Australia.

| 8. | Hayward, A.C. 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27; 265-277. |
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| 9. | Hayward, A.C., El-Nashaar, H.M., Nydegger, U. and De Lindo, L. 1990. Variation in nitrate metabolism in biovars of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 69; 269-280. |
| --- | --- |

9.

Hayward, A.C., El-Nashaar, H.M., Nydegger, U. and De Lindo, L. 1990. Variation in nitrate metabolism in biovars of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 69; 269-280.

| 10. | Ito, S., Y. Ushijima, T. Fujii, S. Tanaka, M. Kameya-Iwaki, S. Yoshiwara and F. Kishi. 1998. Detection of viable cells of Ralstonia solanacearum in soil using a semi-selective medium and a PCR technique. J. Phytopathology 146; 379-384. |
| --- | --- |

10.

Ito, S., Y. Ushijima, T. Fujii, S. Tanaka, M. Kameya-Iwaki, S. Yoshiwara and F. Kishi. 1998. Detection of viable cells of Ralstonia solanacearum in soil using a semi-selective medium and a PCR technique. J. Phytopathology 146; 379-384.

| 11. | Janse, J.D. (1988) A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 18, 343-351. |
| --- | --- |

11.

Janse, J.D. (1988) A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 18, 343-351.

| 12. | Janse, J.D. 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacaerum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335-345. |
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12.

Janse, J.D. 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacaerum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335-345.

| 13. | Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity of Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 44; 693-695. |
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13.

Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity of Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 44; 693-695.

| 14. | Klement Z.; Rudolph, K and D.C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp. |
| --- | --- |

14.

Klement Z.; Rudolph, K and D.C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp.

| 15. | Lelliott, R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd., Oxford. 216 pp. |
| --- | --- |

15.

Lelliott, R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd., Oxford. 216 pp.

| 16. | Lopez, M.M., Gorris, M.T., Llop, P., Cubero, J., Vicedo, B., Cambra, M., 1997. Selective enrichment improves selective isolation, serological and molecular detection of plant pathogenic bacteria. In: H.W. Dehne et al., (eds). Klewer Academic Publishers. pp. 117-121. |
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16.

Lopez, M.M., Gorris, M.T., Llop, P., Cubero, J., Vicedo, B., Cambra, M., 1997. Selective enrichment improves selective isolation, serological and molecular detection of plant pathogenic bacteria. In: H.W. Dehne et al., (eds). Klewer Academic Publishers. pp. 117-121.

| 17. | Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1994. Specific genomic fingerprints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR. Applied and Environmental Microbiology, 60, 2286-2295. |
| --- | --- |

17.

Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1994. Specific genomic fingerprints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR. Applied and Environmental Microbiology, 60, 2286-2295.

| 18. | Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J. 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85; 528-536. |
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18.

Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J. 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85; 528-536.

| 19. | Opina, N., F. Tavner, G. Holloway, J.-F Wang, T.-H Li, R. Maghirang, M. Fegan, A.C. Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W. Holloway, J.N. Timmis. 1997. A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 5; 19-33. |
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19.

Opina, N., F. Tavner, G. Holloway, J.-F Wang, T.-H Li, R. Maghirang, M. Fegan, A.C. Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W. Holloway, J.N. Timmis. 1997. A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 5; 19-33.

| 20. | Pastrik, K.H. and Maiss, E. 2000. Detection of R. solanacearum in potato tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148; 619-626. |
| --- | --- |

20.

Pastrik, K.H. and Maiss, E. 2000. Detection of R. solanacearum in potato tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148; 619-626.

| 21. | Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831-842. |
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21.

Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831-842.

| 22. | Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D. (1995) Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79. |
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22.

Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D. (1995) Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79.

| 23. | Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. - 3. ed.; St. Paul, Minnesota: 373 pp. |
| --- | --- |

23.

Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. - 3. ed.; St. Paul, Minnesota: 373 pp.

| 24. | Seal, S.E., L.A. Jackson, J.P.W. Young, and M.J. Daniels. 1993. Detection of Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii and Blood Disease Bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. J. Gen. Microbiol. 139: 1587-1594. |
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24.

Seal, S.E., L.A. Jackson, J.P.W. Young, and M.J. Daniels. 1993. Detection of Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii and Blood Disease Bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. J. Gen. Microbiol. 139: 1587-1594.

| 25. | Smith, J.J., Offord, L.C., Holderness, M. and Saddler, G.S. 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61; 4262-4268. |
| --- | --- |

25.

Smith, J.J., Offord, L.C., Holderness, M. and Saddler, G.S. 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61; 4262-4268.

| 26. | Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281-295. |
| --- | --- |

26.

Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281-295.

| 27. | Taghavi, M., Hayward, A.C., Sly, L.I., Fegan, M. 1996. Analysiss of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46; 10-15. |
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27.

Taghavi, M., Hayward, A.C., Sly, L.I., Fegan, M. 1996. Analysiss of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46; 10-15.

| 28. | Van Der Wolf, J.M., Bonants, P.J.M., Smith, J.J., Hagenaar, M., Nijhuis, E., Van Beckhoven, J.R.C., Saddler, G.S., Trigalet, A., Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 in Western Europe as determined by AFLP, RC-PFGE and rep-PCR. In: Prior, P., Allen, C. and Elphinstone, J. (eds.) Bacterial wilt disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 44-49. |
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28.

Van Der Wolf, J.M., Bonants, P.J.M., Smith, J.J., Hagenaar, M., Nijhuis, E., Van Beckhoven, J.R.C., Saddler, G.S., Trigalet, A., Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 in Western Europe as determined by AFLP, RC-PFGE and rep-PCR. In: Prior, P., Allen, C. and Elphinstone, J. (eds.) Bacterial wilt disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 44-49.

| 29. | Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., Stead, D.E. and Boonham, N. 1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an automated and quantitative flourogenic 5’ nuclease TaqMan assay. Applied and Environmental Microbiology 66; 2853-2858. |
| --- | --- |

29.

Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., Stead, D.E. and Boonham, N. 1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an automated and quantitative flourogenic 5’ nuclease TaqMan assay. Applied and Environmental Microbiology 66; 2853-2858.

| 30. | Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A.D.L. Akkermans. 1998. Detection of R. solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4546-4554. |
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30.

Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A.D.L. Akkermans. 1998. Detection of R. solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4546-4554.

ALLEGATO III

| 1. | Per ogni caso sospetto per il quale sia stato rilevato un risultato positivo nel saggio/nei saggi di selezione preliminare secondo i metodi di cui all’allegato II per il materiale vegetale elencato e per il quale si attenda la conferma o la smentita attraverso i suddetti metodi, è necessario mantenere e conservare in condizioni adeguate:






  — | tutti i campioni di tuberi e, ove possibile, tutti i campioni di piante, |
| --- | --- | --- |

1.

Per ogni caso sospetto per il quale sia stato rilevato un risultato positivo nel saggio/nei saggi di selezione preliminare secondo i metodi di cui all’allegato II per il materiale vegetale elencato e per il quale si attenda la conferma o la smentita attraverso i suddetti metodi, è necessario mantenere e conservare in condizioni adeguate:

—

tutti i campioni di tuberi e, ove possibile, tutti i campioni di piante,

| — | ogni estratto residuo ed ogni materiale supplementare (p. es.: vetrini di immunofluorescenza) preparato per i saggi di selezione preliminare,
  e |
| --- | --- |

—

ogni estratto residuo ed ogni materiale supplementare (p. es.: vetrini di immunofluorescenza) preparato per i saggi di selezione preliminare,

e

| — | tutta la documentazione pertinente fino al termine delle prove condotte secondo i suddetti metodi. |
| --- | --- |

—

tutta la documentazione pertinente fino al termine delle prove condotte secondo i suddetti metodi.

La conservazione dei tuberi consentirà di effettuare, ove necessario, prove varietali.

| 2. | Qualora venga confermata la presenza dell’organismo nocivo, è necessario mantenere e conservare in condizioni adeguate:






  — | il materiale di cui al paragrafo 1, |
| --- | --- | --- |

2.

Qualora venga confermata la presenza dell’organismo nocivo, è necessario mantenere e conservare in condizioni adeguate:

—

il materiale di cui al paragrafo 1,

| — | un campione del materiale di pomodoro o di melanzana infetto inoculato con l’estratto di tubero o di pianta, ove necessario,
  e |
| --- | --- |

—

un campione del materiale di pomodoro o di melanzana infetto inoculato con l’estratto di tubero o di pianta, ove necessario,

e

| — | la coltura isolata dell’organismo nocivo per almeno un mese dalla procedura di notifica di cui all’articolo 5, paragrafo 2. |
| --- | --- |

—

la coltura isolata dell’organismo nocivo per almeno un mese dalla procedura di notifica di cui all’articolo 5, paragrafo 2.

ALLEGATO IV

Gli accertamenti di cui all’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto i), comprendono, secondo il caso, i seguenti elementi:

| i) | luoghi di produzione






  — | dove sono o sono state coltivate patate in relazione clonale con patate risultate infette dall’organismo nocivo, |
| --- | --- | --- |

i)

luoghi di produzione

—

dove sono o sono state coltivate patate in relazione clonale con patate risultate infette dall’organismo nocivo,

| — | dove sono o sono stati coltivati pomodori che provengono dalla stessa fonte dei pomodori risultati infetti dall’organismo nocivo, |
| --- | --- |

—

dove sono o sono stati coltivati pomodori che provengono dalla stessa fonte dei pomodori risultati infetti dall’organismo nocivo,

| — | dove sono o sono stati coltivati patate o pomodori posti sotto controllo ufficiale per sospetta presenza dell’organismo nocivo, |
| --- | --- |

—

dove sono o sono stati coltivati patate o pomodori posti sotto controllo ufficiale per sospetta presenza dell’organismo nocivo,

| — | dove sono o sono state coltivate patate in relazione clonale con patate coltivate in luoghi di produzione risultati contaminati da parte dell’organismo nocivo, |
| --- | --- |

—

dove sono o sono state coltivate patate in relazione clonale con patate coltivate in luoghi di produzione risultati contaminati da parte dell’organismo nocivo,

| — | dove vengono coltivati patate o pomodori e situati in vicinanza di luoghi di produzione contaminati, compresi quelli dove vengono condivisi attrezzature di produzione e impianti, sia direttamente, sia attraverso un imprenditore comune, |
| --- | --- |

—

dove vengono coltivati patate o pomodori e situati in vicinanza di luoghi di produzione contaminati, compresi quelli dove vengono condivisi attrezzature di produzione e impianti, sia direttamente, sia attraverso un imprenditore comune,

| — | dove l’irrigazione o l’irrorazione siano praticate con acque superficiali originarie di qualunque fonte confermata o sospetta di contaminazione da parte dell’organismo nocivo, |
| --- | --- |

—

dove l’irrigazione o l’irrorazione siano praticate con acque superficiali originarie di qualunque fonte confermata o sospetta di contaminazione da parte dell’organismo nocivo,

| — | che per l’irrigazione o l’irrorazione condividono la fonte delle acque superficiali con luoghi di produzione dove la contaminazione da parte dell’organismo nocivo è stata confermata o si sospetta, |
| --- | --- |

—

che per l’irrigazione o l’irrorazione condividono la fonte delle acque superficiali con luoghi di produzione dove la contaminazione da parte dell’organismo nocivo è stata confermata o si sospetta,

| — | che sono inondati o sono stati inondati con acque superficiali per le quali è stata confermata o si sospetta la contaminazione da parte dell’organismo nocivo, |
| --- | --- |

—

che sono inondati o sono stati inondati con acque superficiali per le quali è stata confermata o si sospetta la contaminazione da parte dell’organismo nocivo,

e

| ii) | acque superficiali impiegate per l’irrigazione, l’irrorazione o l’inondazione di uno o più terreni o luoghi di produzione in cui è confermata la contaminazione da parte dell’organismo nocivo. |
| --- | --- |

ii)

acque superficiali impiegate per l’irrigazione, l’irrorazione o l’inondazione di uno o più terreni o luoghi di produzione in cui è confermata la contaminazione da parte dell’organismo nocivo.

ALLEGATO V

| 1. | Per determinare l’entità della contaminazione probabile di cui all’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto iii), e lettera c), punto iii), è necessario tener conto dei seguenti elementi:






  — | materiale vegetale elencato coltivato in un luogo di produzione dichiarato contaminato ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto ii), |
| --- | --- | --- |

1.

Per determinare l’entità della contaminazione probabile di cui all’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto iii), e lettera c), punto iii), è necessario tener conto dei seguenti elementi:

—

materiale vegetale elencato coltivato in un luogo di produzione dichiarato contaminato ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto ii),

| — | luoghi di produzione associati al ciclo produttivo del materiale vegetale elencato dichiarato contaminato ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto ii), compresi quelli dove vengono condivisi macchinari e dispositivi di produzione direttamente o attraverso un imprenditore comune, |
| --- | --- |

—

luoghi di produzione associati al ciclo produttivo del materiale vegetale elencato dichiarato contaminato ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto ii), compresi quelli dove vengono condivisi macchinari e dispositivi di produzione direttamente o attraverso un imprenditore comune,

| — | materiale vegetale elencato prodotto nel luogo o nei luoghi di produzione di cui al precedente trattino, o presenti in tali luoghi di produzione nel periodo in cui il materiale vegetale elencato dichiarato contaminato ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto ii), era presente nei luoghi di produzione di cui al primo trattino, |
| --- | --- |

—

materiale vegetale elencato prodotto nel luogo o nei luoghi di produzione di cui al precedente trattino, o presenti in tali luoghi di produzione nel periodo in cui il materiale vegetale elencato dichiarato contaminato ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto ii), era presente nei luoghi di produzione di cui al primo trattino,

| — | locali adibiti alla manipolazione del materiale vegetale elencato proveniente dai luoghi di produzione di cui sopra, |
| --- | --- |

—

locali adibiti alla manipolazione del materiale vegetale elencato proveniente dai luoghi di produzione di cui sopra,

| — | macchinari, veicoli, contenitori, magazzini, o relative parti, e qualsiasi altro oggetto, compresi i materiali d’imballaggio, che possano essere venuti a contatto con il materiale vegetale elencato dichiarato contaminato ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto ii), |
| --- | --- |

—

macchinari, veicoli, contenitori, magazzini, o relative parti, e qualsiasi altro oggetto, compresi i materiali d’imballaggio, che possano essere venuti a contatto con il materiale vegetale elencato dichiarato contaminato ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto ii),

| — | materiale vegetale elencato immagazzinato o entrato in contatto con una qualsiasi delle strutture o degli oggetti elencati nel precedente trattino prima della pulizia e della disinfezione di tali strutture od oggetti, |
| --- | --- |

—

materiale vegetale elencato immagazzinato o entrato in contatto con una qualsiasi delle strutture o degli oggetti elencati nel precedente trattino prima della pulizia e della disinfezione di tali strutture od oggetti,

| — | in esito agli accertamenti ed alle prove di cui all’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto i), nel caso delle patate, tuberi o piante con una relazione clonale parentale o collaterale e, nel caso dei pomodori, piante con la stessa fonte del materiale vegetale elencato dichiarato contaminato ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto ii), e per le quali, malgrado i risultati negativi nei saggi per l’individuazione dell’organismo nocivo, la contaminazione risulti probabile per legami di carattere clonale (per verificare l’identità di tuberi o piante contaminati ed aventi una relazione clonale può essere effettuata una prova varietale), |
| --- | --- |

—

in esito agli accertamenti ed alle prove di cui all’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto i), nel caso delle patate, tuberi o piante con una relazione clonale parentale o collaterale e, nel caso dei pomodori, piante con la stessa fonte del materiale vegetale elencato dichiarato contaminato ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto ii), e per le quali, malgrado i risultati negativi nei saggi per l’individuazione dell’organismo nocivo, la contaminazione risulti probabile per legami di carattere clonale (per verificare l’identità di tuberi o piante contaminati ed aventi una relazione clonale può essere effettuata una prova varietale),

| — | luoghi di produzione del materiale vegetale di cui al precedente trattino, |
| --- | --- |

—

luoghi di produzione del materiale vegetale di cui al precedente trattino,

| — | luoghi di produzione del materiale vegetale elencato, che per l’irrigazione o l’irrorazione impiegano acque dichiarate contaminate ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera c), punto ii), |
| --- | --- |

—

luoghi di produzione del materiale vegetale elencato, che per l’irrigazione o l’irrorazione impiegano acque dichiarate contaminate ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera c), punto ii),

| — | materiale vegetale elencato prodotto in appezzamenti inondati con acque superficiali per le quali è confermata la contaminazione. |
| --- | --- |

—

materiale vegetale elencato prodotto in appezzamenti inondati con acque superficiali per le quali è confermata la contaminazione.

| 2. | Per determinare la potenziale disseminazione di cui all’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto iv), e lettera c), punto iii), è necessario tenere conto dei seguenti elementi:






  i) | nei casi di cui all’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto iv):






  — | la vicinanza di altri luoghi di produzione in cui è coltivato il materiale vegetale elencato, |
| --- | --- | --- | --- |

2.

Per determinare la potenziale disseminazione di cui all’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto iv), e lettera c), punto iii), è necessario tenere conto dei seguenti elementi:

i)

nei casi di cui all’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto iv):

—

la vicinanza di altri luoghi di produzione in cui è coltivato il materiale vegetale elencato,

| — | produzione e utilizzo comuni di scorte di tuberi-seme di patate, |
| --- | --- |

—

produzione e utilizzo comuni di scorte di tuberi-seme di patate,

| — | luoghi di produzione che per l’irrigazione o l’irrorazione del materiale vegetale elencato impiegano acque superficiali, nei casi in cui esiste od è esistito un rischio di fughe di acque superficiali o di inondazione dal luogo o dai luoghi di produzione dichiarati contaminati ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto ii); |
| --- | --- |

—

luoghi di produzione che per l’irrigazione o l’irrorazione del materiale vegetale elencato impiegano acque superficiali, nei casi in cui esiste od è esistito un rischio di fughe di acque superficiali o di inondazione dal luogo o dai luoghi di produzione dichiarati contaminati ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto ii);

| ii) | nei casi in cui le acque superficiali sono state dichiarate contaminate ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera c), punto ii):






  — | luogo o luoghi di produzione del materiale vegetale elencato adiacenti alle acque superficiali dichiarate contaminate, o a rischio di inondazione da parte delle stesse, |
| --- | --- | --- |

ii)

nei casi in cui le acque superficiali sono state dichiarate contaminate ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera c), punto ii):

—

luogo o luoghi di produzione del materiale vegetale elencato adiacenti alle acque superficiali dichiarate contaminate, o a rischio di inondazione da parte delle stesse,

| — | bacini di irrigazione separati associati alle acque superficiali dichiarate contaminate, |
| --- | --- |

—

bacini di irrigazione separati associati alle acque superficiali dichiarate contaminate,

| — | corpi idrici comunicanti con le acque superficiali dichiarate contaminate, tenuto conto di quanto segue:






  — | la direzione e la portata delle acque dichiarate contaminate, |
| --- | --- | --- |

—

corpi idrici comunicanti con le acque superficiali dichiarate contaminate, tenuto conto di quanto segue:

—

la direzione e la portata delle acque dichiarate contaminate,

| — | la presenza di solanacee selvatiche ospiti. |
| --- | --- |

—

la presenza di solanacee selvatiche ospiti.

| 3. | La notifica di cui all’articolo 5, paragrafo 2, primo comma, va fornita con le seguenti modalità:






  — | non appena la presenza dell’organismo nocivo è stata confermata da prove di laboratorio che impiegano i metodi di cui all’allegato II, indicare almeno:






  — | per le patate:






  a) | la varietà della partita, |
| --- | --- | --- | --- | --- |

3.

La notifica di cui all’articolo 5, paragrafo 2, primo comma, va fornita con le seguenti modalità:

—

non appena la presenza dell’organismo nocivo è stata confermata da prove di laboratorio che impiegano i metodi di cui all’allegato II, indicare almeno:

—

per le patate:

a)

la varietà della partita,

| b) | il tipo (da consumo, da semina, ecc.) e all’occorrenza la categoria dei tuberi-seme; |
| --- | --- |

b)

il tipo (da consumo, da semina, ecc.) e all’occorrenza la categoria dei tuberi-seme;

| — | per le piante di pomodoro, la denominazione varietale della partita e all’occorrenza la categoria; |
| --- | --- |

—

per le piante di pomodoro, la denominazione varietale della partita e all’occorrenza la categoria;

| — | fatte salve le disposizioni per la notifica di una manifestazione sospetta ai sensi dell’articolo 4, paragrafo 3, ove sussista un rischio di contaminazione di materiale vegetale elencato proveniente da o diretto in altri Stati membri lo Stato membro nel quale è stata confermata la manifestazione notifica immediatamente allo Stato o agli Stati membri interessati le informazioni che consentano di rispettare l’articolo 5, paragrafo 3, ossia:






  a) | la varietà della partita di patate o di pomodori, |
| --- | --- | --- |

—

fatte salve le disposizioni per la notifica di una manifestazione sospetta ai sensi dell’articolo 4, paragrafo 3, ove sussista un rischio di contaminazione di materiale vegetale elencato proveniente da o diretto in altri Stati membri lo Stato membro nel quale è stata confermata la manifestazione notifica immediatamente allo Stato o agli Stati membri interessati le informazioni che consentano di rispettare l’articolo 5, paragrafo 3, ossia:

a)

la varietà della partita di patate o di pomodori,

| b) | il nominativo e l’indirizzo dell’esportatore e del destinatario, |
| --- | --- |

b)

il nominativo e l’indirizzo dell’esportatore e del destinatario,

| c) | la data di consegna della partita di patate o di pomodori, |
| --- | --- |

c)

la data di consegna della partita di patate o di pomodori,

| d) | l’entità della partita di patate o di pomodori consegnata, |
| --- | --- |

d)

l’entità della partita di patate o di pomodori consegnata,

| e) | una copia del passaporto delle piante o almeno il numero dello stesso nonché all’occorrenza il numero di registrazione del coltivatore o del grossista e una copia dell’avviso di consegna. |
| --- | --- |

e)

una copia del passaporto delle piante o almeno il numero dello stesso nonché all’occorrenza il numero di registrazione del coltivatore o del grossista e una copia dell’avviso di consegna.

La Commissione va immediatamente informata dell’avvenuta trasmissione di tali informazioni.

| 4. | I dati della notifica supplementare di cui all’articolo 5, paragrafo 2, primo comma, vanno forniti con le seguenti modalità:
  una volta concluse le indagini, indicare per ogni caso:






  a) | la data di conferma della notifica, |
| --- | --- | --- |

4.

I dati della notifica supplementare di cui all’articolo 5, paragrafo 2, primo comma, vanno forniti con le seguenti modalità:

una volta concluse le indagini, indicare per ogni caso:

a)

la data di conferma della notifica,

| b) | una breve descrizione dell’indagine effettuata per identificare la fonte e la possibile diffusione della contaminazione, incluso il livello del campionamento effettuato, |
| --- | --- |

b)

una breve descrizione dell’indagine effettuata per identificare la fonte e la possibile diffusione della contaminazione, incluso il livello del campionamento effettuato,

| c) | informazioni sul le fonti identificate o presunte della contaminazione, |
| --- | --- |

c)

informazioni sul le fonti identificate o presunte della contaminazione,

| d) | dati sull’estensione della contaminazione dichiarata, compreso il numero di luoghi di produzione e, per le patate, il numero di partite, con l’indicazione della varietà e, nel caso dei tuberi-seme, della categoria, |
| --- | --- |

d)

dati sull’estensione della contaminazione dichiarata, compreso il numero di luoghi di produzione e, per le patate, il numero di partite, con l’indicazione della varietà e, nel caso dei tuberi-seme, della categoria,

| e) | particolari relativi alla delimitazione della zona, incluso il numero di luoghi di produzione non dichiarati contaminati, ma compresi nella zona, |
| --- | --- |

e)

particolari relativi alla delimitazione della zona, incluso il numero di luoghi di produzione non dichiarati contaminati, ma compresi nella zona,

| f) | particolari relativi alle acque dichiarate, compresi il nome e l’ubicazione del corpo idrico e la portata della dichiarazione o del divieto di irrigazione, |
| --- | --- |

f)

particolari relativi alle acque dichiarate, compresi il nome e l’ubicazione del corpo idrico e la portata della dichiarazione o del divieto di irrigazione,

| g) | per ogni spedizione o partita di piante di pomodoro dichiarate contaminate, i certificati di cui all’articolo 13, paragrafo 1, punto ii), della direttiva 2000/29/CE ed il numero di passaporto, a norma dell’elenco di cui all’allegato V, parte A, sezione I, paragrafo 2.2, della direttiva 2000/29/CE, |
| --- | --- |

g)

per ogni spedizione o partita di piante di pomodoro dichiarate contaminate, i certificati di cui all’articolo 13, paragrafo 1, punto ii), della direttiva 2000/29/CE ed il numero di passaporto, a norma dell’elenco di cui all’allegato V, parte A, sezione I, paragrafo 2.2, della direttiva 2000/29/CE,

| h) | ogni altra informazione eventualmente richiesta dalla Commissione sulla confermata comparsa della malattia. |
| --- | --- |

h)

ogni altra informazione eventualmente richiesta dalla Commissione sulla confermata comparsa della malattia.

ALLEGATO VI

| 1. | Le disposizioni di cui all’articolo 6, paragrafo 1, sono le seguenti:






  — | impiego per l’alimentazione animale, previo idoneo trattamento termico, tale che non sussista alcun rischio di sopravvivenza dell’organismo nocivo,
  o |
| --- | --- | --- |

1.

Le disposizioni di cui all’articolo 6, paragrafo 1, sono le seguenti:

—

impiego per l’alimentazione animale, previo idoneo trattamento termico, tale che non sussista alcun rischio di sopravvivenza dell’organismo nocivo,

o

| — | smaltimento in un sito apposito, ufficialmente approvato e destinato a tale scopo, in cui non siano identificabili rischi di dispersione dell’organismo nell’ambiente, ad esempio in seguito ad infiltrazione nel terreno agricolo o contatti con sorgenti d’acqua che potrebbero essere usate per l’irrigazione di terreni agricoli,
  o |
| --- | --- |

—

smaltimento in un sito apposito, ufficialmente approvato e destinato a tale scopo, in cui non siano identificabili rischi di dispersione dell’organismo nell’ambiente, ad esempio in seguito ad infiltrazione nel terreno agricolo o contatti con sorgenti d’acqua che potrebbero essere usate per l’irrigazione di terreni agricoli,

o

| — | incenerimento,
  o |
| --- | --- |

—

incenerimento,

o

| — | destinazione alla trasformazione industriale, attraverso la consegna diretta e immediata a uno stabilimento dotato di strutture ufficialmente approvate per l’eliminazione dei rifiuti che escludano qualsiasi rischio identificabile di disseminazione dell’organismo nocivo e provvisto di dispositivi per la pulizia e la disinfezione almeno dei veicoli in uscita,
  o |
| --- | --- |

—

destinazione alla trasformazione industriale, attraverso la consegna diretta e immediata a uno stabilimento dotato di strutture ufficialmente approvate per l’eliminazione dei rifiuti che escludano qualsiasi rischio identificabile di disseminazione dell’organismo nocivo e provvisto di dispositivi per la pulizia e la disinfezione almeno dei veicoli in uscita,

o

| — | altri interventi, sempreché sia stato accertato che non esiste alcun rischio identificabile di disseminazione dell’organismo nocivo; tali interventi, debitamente motivati, vengono notificati alla Commissione e agli altri Stati membri. |
| --- | --- |

—

altri interventi, sempreché sia stato accertato che non esiste alcun rischio identificabile di disseminazione dell’organismo nocivo; tali interventi, debitamente motivati, vengono notificati alla Commissione e agli altri Stati membri.

Qualsiasi materiale di rifiuto associato alle alternative sopra descritte e da esse prodotto verrà eliminato secondo metodi ufficialmente approvati a norma di quanto disposto nell’allegato VII della presente direttiva.

| 2. | L’utilizzazione o l’eliminazione idonee del materiale vegetale elencato di cui all’articolo 6, paragrafo 2, da effettuarsi sotto il controllo degli organismi ufficiali competenti dello Stato o degli Stati membri interessati, prevedendo uno scambio di informazioni fra gli organismi ufficiali tale da assicurare la costanza di tale controllo, e l’approvazione da parte degli organismi ufficiali competenti degli Stati membri dove le patate sono imballate o trattate in relazione agli impianti destinati all’eliminazione dei rifiuti di cui al primo e secondo trattino, comprendono:






  i) | per i tuberi di patata:






  — | l’impiego come patate da consumo, in imballaggi pronti per la consegna diretta e l’utilizzo senza necessità di riconfezionamento, in uno stabilimento dotato degli idonei impianti di eliminazione dei rifiuti; le patate destinate alla piantagione possono essere manipolate presso lo stesso stabilimento solo se tale operazione avviene separatamente dalla manipolazione delle patate da consumo o previa pulizia e disinfezione,
  o |
| --- | --- | --- | --- |

2.

L’utilizzazione o l’eliminazione idonee del materiale vegetale elencato di cui all’articolo 6, paragrafo 2, da effettuarsi sotto il controllo degli organismi ufficiali competenti dello Stato o degli Stati membri interessati, prevedendo uno scambio di informazioni fra gli organismi ufficiali tale da assicurare la costanza di tale controllo, e l’approvazione da parte degli organismi ufficiali competenti degli Stati membri dove le patate sono imballate o trattate in relazione agli impianti destinati all’eliminazione dei rifiuti di cui al primo e secondo trattino, comprendono:

i)

per i tuberi di patata:

—

l’impiego come patate da consumo, in imballaggi pronti per la consegna diretta e l’utilizzo senza necessità di riconfezionamento, in uno stabilimento dotato degli idonei impianti di eliminazione dei rifiuti; le patate destinate alla piantagione possono essere manipolate presso lo stesso stabilimento solo se tale operazione avviene separatamente dalla manipolazione delle patate da consumo o previa pulizia e disinfezione,

o

| — | l’impiego come patate da consumo destinate alla trasformazione industriale e consegnate direttamente e immediatamente ad uno stabilimento dotato di strutture apposite per l’eliminazione dei rifiuti e di un dispositivo per la pulizia e la disinfezione almeno dei veicoli in uscita,
  o |
| --- | --- |

—

l’impiego come patate da consumo destinate alla trasformazione industriale e consegnate direttamente e immediatamente ad uno stabilimento dotato di strutture apposite per l’eliminazione dei rifiuti e di un dispositivo per la pulizia e la disinfezione almeno dei veicoli in uscita,

o

| — | altri impieghi o forme di eliminazione, sempre che sia accertato che non esiste alcun rischio identificabile di disseminazione dell’organismo nocivo, e fatta salva l’approvazione degli organismi ufficiali competenti di cui sopra; |
| --- | --- |

—

altri impieghi o forme di eliminazione, sempre che sia accertato che non esiste alcun rischio identificabile di disseminazione dell’organismo nocivo, e fatta salva l’approvazione degli organismi ufficiali competenti di cui sopra;

| ii) | per altre parti di piante, compresi gli steli e i cascami del fogliame:






  — | la distruzione,
  o |
| --- | --- | --- |

ii)

per altre parti di piante, compresi gli steli e i cascami del fogliame:

—

la distruzione,

o

| — | altri impieghi o forme di eliminazione, sempre che sia accertato che non esiste alcun rischio identificabile di disseminazione dell’organismo nocivo, e fatta salva l’approvazione degli organismi ufficiali competenti di cui sopra. |
| --- | --- |

—

altri impieghi o forme di eliminazione, sempre che sia accertato che non esiste alcun rischio identificabile di disseminazione dell’organismo nocivo, e fatta salva l’approvazione degli organismi ufficiali competenti di cui sopra.

| 3. | I metodi adeguati per la decontaminazione degli oggetti di cui all’articolo 6, paragrafo 3, consistono nella pulizia e all’occorrenza nella disinfezione, in modo da escludere qualsiasi rischio identificabile di disseminazione dell’organismo nocivo, e sono applicati sotto la sorveglianza degli organismi ufficiali responsabili degli Stati membri. |
| --- | --- |

3.

I metodi adeguati per la decontaminazione degli oggetti di cui all’articolo 6, paragrafo 3, consistono nella pulizia e all’occorrenza nella disinfezione, in modo da escludere qualsiasi rischio identificabile di disseminazione dell’organismo nocivo, e sono applicati sotto la sorveglianza degli organismi ufficiali responsabili degli Stati membri.

| 4. | La serie di interventi che gli Stati membri attuano nella zona o nelle zone delimitate ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto iv), e lettera c), punto iii), e di cui all’articolo 6, paragrafo 4, comprende quanto segue: |
| --- | --- |

4.

La serie di interventi che gli Stati membri attuano nella zona o nelle zone delimitate ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto iv), e lettera c), punto iii), e di cui all’articolo 6, paragrafo 4, comprende quanto segue:

| 4.1. | Nei casi in cui i luoghi di produzione sono stati dichiarati contaminati ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto ii):






  a) | in un appezzamento o un’unità di produzione protetta della coltura dichiarati contaminati ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto ii),






  i) | per almeno i quattro anni vegetativi successivi a quello in cui la contaminazione è stata dichiarata:






  — | si attuano interventi intesi ad eliminare le piante di patate o di pomodoro spontanee e altre piante ospiti dell’organismo nocivo, comprese le solanacee selvatiche,
  e |
| --- | --- | --- | --- | --- |

4.1.

Nei casi in cui i luoghi di produzione sono stati dichiarati contaminati ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto ii):

a)

in un appezzamento o un’unità di produzione protetta della coltura dichiarati contaminati ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto ii),

i)

per almeno i quattro anni vegetativi successivi a quello in cui la contaminazione è stata dichiarata:

—

si attuano interventi intesi ad eliminare le piante di patate o di pomodoro spontanee e altre piante ospiti dell’organismo nocivo, comprese le solanacee selvatiche,

e

| — | è vietato mettere a dimora:






  — | tuberi, piante o semi propriamente detti di patata, |
| --- | --- | --- |

—

è vietato mettere a dimora:

—

tuberi, piante o semi propriamente detti di patata,

| — | piante o semi di pomodoro, |
| --- | --- |

—

piante o semi di pomodoro,

| — | tenendo conto della biologia dell’organismo nocivo: |
| --- | --- |

—

tenendo conto della biologia dell’organismo nocivo:

| — | altre piante ospiti, |
| --- | --- |

—

altre piante ospiti,

| — | piante della specie Brassica per le quali sussiste un rischio effettivo di sopravvivenza di detto organismo, |
| --- | --- |

—

piante della specie Brassica per le quali sussiste un rischio effettivo di sopravvivenza di detto organismo,

| — | colture per le quali sussiste un rischio effettivo di disseminazione dell’organismo nocivo; |
| --- | --- |

—

colture per le quali sussiste un rischio effettivo di disseminazione dell’organismo nocivo;

| — | nel primo periodo di raccolta delle patate o dei pomodori che segue il periodo indicato al trattino precedente, e a condizione che il terreno sia risultato esente da piante spontanee di patata e di pomodoro e da altre piante ospiti, comprese le solanacee selvatiche, nel corso di ispezioni ufficiali per almeno due anni vegetativi consecutivi precedenti alla messa a dimora:






  — | nel caso delle patate, è autorizzata soltanto la produzione di patate da consumo, |
| --- | --- | --- |

—

nel primo periodo di raccolta delle patate o dei pomodori che segue il periodo indicato al trattino precedente, e a condizione che il terreno sia risultato esente da piante spontanee di patata e di pomodoro e da altre piante ospiti, comprese le solanacee selvatiche, nel corso di ispezioni ufficiali per almeno due anni vegetativi consecutivi precedenti alla messa a dimora:

—

nel caso delle patate, è autorizzata soltanto la produzione di patate da consumo,

| — | nel caso delle patate e dei pomodori, i tuberi delle patate dopo il raccolto o le piante di pomodoro, secondo il caso, sono controllati secondo la procedura descritta nell’allegato II; |
| --- | --- |

—

nel caso delle patate e dei pomodori, i tuberi delle patate dopo il raccolto o le piante di pomodoro, secondo il caso, sono controllati secondo la procedura descritta nell’allegato II;

| — | nel periodo di raccolta delle patate o dei pomodori che segue quello indicato al trattino precedente e applicando un ciclo di rotazione idoneo, della durata di almeno due anni laddove si tratti di mettere a dimora patate da semina, viene effettuato un accertamento ufficiale come indicato all’articolo 2, paragrafo 1; |
| --- | --- |

—

nel periodo di raccolta delle patate o dei pomodori che segue quello indicato al trattino precedente e applicando un ciclo di rotazione idoneo, della durata di almeno due anni laddove si tratti di mettere a dimora patate da semina, viene effettuato un accertamento ufficiale come indicato all’articolo 2, paragrafo 1;

oppure

| ii) | nei cinque anni vegetativi successivi a quello in cui la contaminazione è stata dichiarata:






  — | si attuano interventi intesi ad eliminare le piante di patata o di pomodoro spontanee e altre piante ospiti naturali dell’organismo nocivo, comprese le solanacee selvatiche,
  e |
| --- | --- | --- |

ii)

nei cinque anni vegetativi successivi a quello in cui la contaminazione è stata dichiarata:

—

si attuano interventi intesi ad eliminare le piante di patata o di pomodoro spontanee e altre piante ospiti naturali dell’organismo nocivo, comprese le solanacee selvatiche,

e

| — | per i primi tre anni l’appezzamento viene messo e tenuto a maggese completo, oppure a cereali conformemente al rischio identificato, oppure a pascolo permanente e si effettuano frequenti falciature a raso, oppure l’appezzamento viene adibito a pascolo intensivo, oppure ad erba per la produzione di sementi, e nei due anni successivi viene piantato con piante che non ospitano l’organismo nocivo e non comportano rischio identificato di sopravvivenza o disseminazione dell’organismo nocivo, |
| --- | --- |

—

per i primi tre anni l’appezzamento viene messo e tenuto a maggese completo, oppure a cereali conformemente al rischio identificato, oppure a pascolo permanente e si effettuano frequenti falciature a raso, oppure l’appezzamento viene adibito a pascolo intensivo, oppure ad erba per la produzione di sementi, e nei due anni successivi viene piantato con piante che non ospitano l’organismo nocivo e non comportano rischio identificato di sopravvivenza o disseminazione dell’organismo nocivo,

| — | nel primo periodo di raccolta delle patate o dei pomodori che segue quello indicato al trattino precedente, e a condizione che il terreno sia risultato esente da piante spontanee di patata e di pomodoro e da altre piante ospiti, comprese le solanacee selvatiche, nel corso di ispezioni ufficiali per almeno due anni vegetativi consecutivi precedenti alla messa a dimora:






  — | nel caso delle patate, è autorizzata la produzione di patate da semina o da consumo, |
| --- | --- | --- |

—

nel primo periodo di raccolta delle patate o dei pomodori che segue quello indicato al trattino precedente, e a condizione che il terreno sia risultato esente da piante spontanee di patata e di pomodoro e da altre piante ospiti, comprese le solanacee selvatiche, nel corso di ispezioni ufficiali per almeno due anni vegetativi consecutivi precedenti alla messa a dimora:

—

nel caso delle patate, è autorizzata la produzione di patate da semina o da consumo,

| — | i tuberi delle patate dopo il raccolto o le piante di pomodoro, secondo i casi, sono controllati conformemente alla procedura descritta nell’allegato II; |
| --- | --- |

—

i tuberi delle patate dopo il raccolto o le piante di pomodoro, secondo i casi, sono controllati conformemente alla procedura descritta nell’allegato II;

| b) | in tutti gli altri appezzamenti del luogo di produzione contaminato e a condizione che gli organismi ufficiali competenti abbiano la ragionevole certezza che il rischio di piante spontanee di patate e di pomodoro e di altre piante ospiti naturali dell’organismo nocivo, comprese le solanacee selvatiche, sia stato eliminato:






  — | nell’anno vegetativo successivo a quello in cui la contaminazione è stata dichiarata,






  — | è vietato mettere a dimora tuberi, piante o semi propriamente detti di patata o altre piante ospiti dell’organismo nocivo,
  o |
| --- | --- | --- | --- |

b)

in tutti gli altri appezzamenti del luogo di produzione contaminato e a condizione che gli organismi ufficiali competenti abbiano la ragionevole certezza che il rischio di piante spontanee di patate e di pomodoro e di altre piante ospiti naturali dell’organismo nocivo, comprese le solanacee selvatiche, sia stato eliminato:

—

nell’anno vegetativo successivo a quello in cui la contaminazione è stata dichiarata,

—

è vietato mettere a dimora tuberi, piante o semi propriamente detti di patata o altre piante ospiti dell’organismo nocivo,

o

| — | nel caso dei tuberi di patata, vengono messi a dimora unicamente tuberi-seme certificati per la produzione di patate da consumo, |
| --- | --- |

—

nel caso dei tuberi di patata, vengono messi a dimora unicamente tuberi-seme certificati per la produzione di patate da consumo,

| — | nel caso delle piante di pomodoro, possono venir messe a dimora piante di pomodoro rispondenti alle prescrizioni della direttiva 2000/29/CE unicamente per la produzione di frutti; |
| --- | --- |

—

nel caso delle piante di pomodoro, possono venir messe a dimora piante di pomodoro rispondenti alle prescrizioni della direttiva 2000/29/CE unicamente per la produzione di frutti;

| — | nel secondo anno vegetativo successivo a quello in cui la contaminazione è stata dichiarata,






  — | nel caso delle patate, vengono messi a dimora per la produzione di patate da semina o da consumo esclusivamente i tuberi-seme certificati o i tuberi-seme di patate ufficialmente sottoposti a un esame volto ad accertare l’assenza di marciume bruno e coltivati sotto controllo ufficiale in luoghi di produzione diversi da quelli indicati al punto 4.1, |
| --- | --- | --- |

—

nel secondo anno vegetativo successivo a quello in cui la contaminazione è stata dichiarata,

—

nel caso delle patate, vengono messi a dimora per la produzione di patate da semina o da consumo esclusivamente i tuberi-seme certificati o i tuberi-seme di patate ufficialmente sottoposti a un esame volto ad accertare l’assenza di marciume bruno e coltivati sotto controllo ufficiale in luoghi di produzione diversi da quelli indicati al punto 4.1,

| — | nel caso dei pomodori, possono venir messe a dimora per la produzione di piante o di frutti esclusivamente le piante di pomodoro cresciute da semi che rispondono alle prescrizioni della direttiva 2000/29/CE ovvero, nel caso di piante ottenute per riproduzione vegetativa, da piante di pomodoro prodotte a partire da tali semi e coltivate sotto controllo ufficiale in luoghi di produzione diversi da quelli indicati al punto 4.1; |
| --- | --- |

—

nel caso dei pomodori, possono venir messe a dimora per la produzione di piante o di frutti esclusivamente le piante di pomodoro cresciute da semi che rispondono alle prescrizioni della direttiva 2000/29/CE ovvero, nel caso di piante ottenute per riproduzione vegetativa, da piante di pomodoro prodotte a partire da tali semi e coltivate sotto controllo ufficiale in luoghi di produzione diversi da quelli indicati al punto 4.1;

| — | per almeno il terzo anno vegetativo successivo a quello in cui la contaminazione è stata dichiarata,






  — | nel caso delle patate, per la produzione di patate da semina o da consumo vengono messi a dimora esclusivamente tuberi-seme certificati ovvero tuberi-seme di patate coltivati sotto sorveglianza ufficiale e derivanti da tuberi-seme certificati, |
| --- | --- | --- |

—

per almeno il terzo anno vegetativo successivo a quello in cui la contaminazione è stata dichiarata,

—

nel caso delle patate, per la produzione di patate da semina o da consumo vengono messi a dimora esclusivamente tuberi-seme certificati ovvero tuberi-seme di patate coltivati sotto sorveglianza ufficiale e derivanti da tuberi-seme certificati,

| — | nel caso dei pomodori, possono venir messe a dimora per la produzione di piante o di frutti esclusivamente le piante di pomodoro cresciute da semi che rispondono alle prescrizioni della direttiva 2000/29/CE ovvero piante di pomodoro prodotte a partire da tali piante e coltivate sotto controllo ufficiale; |
| --- | --- |

—

nel caso dei pomodori, possono venir messe a dimora per la produzione di piante o di frutti esclusivamente le piante di pomodoro cresciute da semi che rispondono alle prescrizioni della direttiva 2000/29/CE ovvero piante di pomodoro prodotte a partire da tali piante e coltivate sotto controllo ufficiale;

| — | in ciascuno degli anni vegetativi di cui ai trattini precedenti si prendono provvedimenti per eliminare le piante spontanee di patata e le altre piante ospiti naturali dell’organismo nocivo eventualmente presenti; viene inoltre effettuata un’ispezione ufficiale in ogni appezzamento di patate o pomodori durante la stagione di crescita a momenti appropriati nonché, per per ogni appezzamento di patate, un controllo ufficiale dei tuberi raccolti secondo la procedura descritta nell’allegato II; |
| --- | --- |

—

in ciascuno degli anni vegetativi di cui ai trattini precedenti si prendono provvedimenti per eliminare le piante spontanee di patata e le altre piante ospiti naturali dell’organismo nocivo eventualmente presenti; viene inoltre effettuata un’ispezione ufficiale in ogni appezzamento di patate o pomodori durante la stagione di crescita a momenti appropriati nonché, per per ogni appezzamento di patate, un controllo ufficiale dei tuberi raccolti secondo la procedura descritta nell’allegato II;

| c) | non appena avvenuta la dichiarazione di contaminazione ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), e dopo il primo anno vegetativo successivo:






  — | tutti i macchinari e le strutture di magazzinaggio presenti sul luogo di produzione e associati al ciclo produttivo delle patate o dei pomodori sono opportunamente puliti e all’occorrenza disinfettati con metodi adeguati, conformemente al punto 3, |
| --- | --- | --- |

c)

non appena avvenuta la dichiarazione di contaminazione ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), e dopo il primo anno vegetativo successivo:

—

tutti i macchinari e le strutture di magazzinaggio presenti sul luogo di produzione e associati al ciclo produttivo delle patate o dei pomodori sono opportunamente puliti e all’occorrenza disinfettati con metodi adeguati, conformemente al punto 3,

| — | per prevenire la disseminazione dell’organismo nocivo, sono effettuati controlli ufficiali sui programmi di irrigazione ed irrorazione, che possono arrivare al divieto; |
| --- | --- |

—

per prevenire la disseminazione dell’organismo nocivo, sono effettuati controlli ufficiali sui programmi di irrigazione ed irrorazione, che possono arrivare al divieto;

| d) | nelle unità di produzione protetta dichiarate contaminate ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto ii), dove è possibile la sostituzione completa del substrato colturale:






  — | è vietato mettere a dimora tuberi-seme, piante o semi propriamente detti di patata, ovvero altre piante ospiti dell’organismo nocivo comprese le piante e i semi di pomodoro, a meno che l’unità sia stata sottoposta sotto controllo ufficiale a provvedimenti diretti ad eliminare l’organismo nocivo ed a rimuovere tutto il materiale vegetale ospite elencato e comprendenti almeno la sostituzione completa del substrato colturale nonché la pulizia, e all’occorrenza la disinfezione dell’unità di produzione e di tutte le attrezzature, e purché gli organismi ufficiali competenti abbiano successivamente autorizzato la produzione di patate o pomodori, |
| --- | --- | --- |

d)

nelle unità di produzione protetta dichiarate contaminate ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto ii), dove è possibile la sostituzione completa del substrato colturale:

—

è vietato mettere a dimora tuberi-seme, piante o semi propriamente detti di patata, ovvero altre piante ospiti dell’organismo nocivo comprese le piante e i semi di pomodoro, a meno che l’unità sia stata sottoposta sotto controllo ufficiale a provvedimenti diretti ad eliminare l’organismo nocivo ed a rimuovere tutto il materiale vegetale ospite elencato e comprendenti almeno la sostituzione completa del substrato colturale nonché la pulizia, e all’occorrenza la disinfezione dell’unità di produzione e di tutte le attrezzature, e purché gli organismi ufficiali competenti abbiano successivamente autorizzato la produzione di patate o pomodori,

| — | la produzione di patate si effettua a partire da tuberi-seme certificati, o da minituberi o piantine ottenute da fonti controllate, |
| --- | --- |

—

la produzione di patate si effettua a partire da tuberi-seme certificati, o da minituberi o piantine ottenute da fonti controllate,

| — | la produzione di pomodori si effettua a partire da semi che rispondono alle prescrizioni della direttiva 2000/29/CE ovvero, nel caso di piante ottenute per riproduzione vegetativa, da piante di pomodoro prodotte a partire da tali semi e coltivate sotto controllo ufficiale, |
| --- | --- |

—

la produzione di pomodori si effettua a partire da semi che rispondono alle prescrizioni della direttiva 2000/29/CE ovvero, nel caso di piante ottenute per riproduzione vegetativa, da piante di pomodoro prodotte a partire da tali semi e coltivate sotto controllo ufficiale,

| — | per prevenire la disseminazione dell’organismo nocivo vengono attuati secondo necessità controlli ufficiali sui programmi di irrigazione ed irrorazione, che possono arrivare al divieto. |
| --- | --- |

—

per prevenire la disseminazione dell’organismo nocivo vengono attuati secondo necessità controlli ufficiali sui programmi di irrigazione ed irrorazione, che possono arrivare al divieto.

| 4.2. | All’interno della zona delimitata, fatti salvi gli interventi previsti al punto 4.1, gli Stati membri:






  a) | non appena è avvenuta la dichiarazione di contaminazione, garantiscono che tutti i macchinari e le strutture di magazzinaggio presenti nelle imprese della zona e impiegati nella produzione di patate o pomodori siano opportunamente puliti e disinfettati con metodi appropriati conformemente al punto 3; |
| --- | --- | --- |

4.2.

All’interno della zona delimitata, fatti salvi gli interventi previsti al punto 4.1, gli Stati membri:

a)

non appena è avvenuta la dichiarazione di contaminazione, garantiscono che tutti i macchinari e le strutture di magazzinaggio presenti nelle imprese della zona e impiegati nella produzione di patate o pomodori siano opportunamente puliti e disinfettati con metodi appropriati conformemente al punto 3;

| b) | non appena avvenuta la dichiarazione di contaminazione e per almeno tre periodi vegetativi:






  ba) | nei casi in cui la zona delimitata è stata determinata ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto iv):






  — | garantiscono il controllo, attraverso i propri organismi ufficiali responsabili, delle imprese in cui viene effettuata la coltivazione, il magazzinaggio o la manipolazione dei tuberi di patata o dei pomodori, nonché delle imprese che gestiscono su base contrattuale i macchinari occorrenti, |
| --- | --- | --- | --- |

b)

non appena avvenuta la dichiarazione di contaminazione e per almeno tre periodi vegetativi:

ba)

nei casi in cui la zona delimitata è stata determinata ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto iv):

—

garantiscono il controllo, attraverso i propri organismi ufficiali responsabili, delle imprese in cui viene effettuata la coltivazione, il magazzinaggio o la manipolazione dei tuberi di patata o dei pomodori, nonché delle imprese che gestiscono su base contrattuale i macchinari occorrenti,

| — | esigono l’impiego esclusivo di semi certificati o semi coltivati sotto controllo ufficiale per tutte le colture di patata comprese in tale zona, e l’esecuzione di analisi dopo il raccolto di tuberi-seme di patate coltivati in luoghi di produzione dichiarati probabilmente contaminati ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto iii), |
| --- | --- |

—

esigono l’impiego esclusivo di semi certificati o semi coltivati sotto controllo ufficiale per tutte le colture di patata comprese in tale zona, e l’esecuzione di analisi dopo il raccolto di tuberi-seme di patate coltivati in luoghi di produzione dichiarati probabilmente contaminati ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto iii),

| — | prescrivono che la manipolazione delle patate da semina raccolte sia separata da quella delle patate da consumo in tutte le imprese della zona oppure che la pulizia e all’occorrenza la disinfezione siano effettuate tra la manipolazione delle patate da semina e quella delle patate da consumo, |
| --- | --- |

—

prescrivono che la manipolazione delle patate da semina raccolte sia separata da quella delle patate da consumo in tutte le imprese della zona oppure che la pulizia e all’occorrenza la disinfezione siano effettuate tra la manipolazione delle patate da semina e quella delle patate da consumo,

| — | per tutti i raccolti di pomodoro effettuati in tale zona esigono l’impiego esclusivo di piante di pomodoro cresciute da semi che rispondono alle prescrizioni della direttiva 2000/29/CE ovvero, nel caso di piante ottenute per riproduzione vegetativa, da piante di pomodoro prodotte a partire da tali semi e coltivate sotto controllo ufficiale, |
| --- | --- |

—

per tutti i raccolti di pomodoro effettuati in tale zona esigono l’impiego esclusivo di piante di pomodoro cresciute da semi che rispondono alle prescrizioni della direttiva 2000/29/CE ovvero, nel caso di piante ottenute per riproduzione vegetativa, da piante di pomodoro prodotte a partire da tali semi e coltivate sotto controllo ufficiale,

| — | eseguono gli accertamenti ufficiali di cui all’articolo 2, paragrafo 1; |
| --- | --- |

—

eseguono gli accertamenti ufficiali di cui all’articolo 2, paragrafo 1;

| bb) | nei casi in cui le acque superficiali sono state dichiarate contaminate ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera c), punto ii), ovvero incluse fra i fattori di una possibile disseminazione dell’organismo nocivo conformemente all’allegato V, punto 2:






  — | procedono in momenti appropriati ad accertamenti annuali comprendenti il prelievo di campioni di acque superficiali e delle eventuali piante solanacee ospiti nelle sorgenti d’acqua in esame, nonché ad analisi eseguite in conformità del metodo appropriato di cui all’allegato II per il materiale vegetale elencato e in tutti gli altri casi, |
| --- | --- | --- |

bb)

nei casi in cui le acque superficiali sono state dichiarate contaminate ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, lettera c), punto ii), ovvero incluse fra i fattori di una possibile disseminazione dell’organismo nocivo conformemente all’allegato V, punto 2:

—

procedono in momenti appropriati ad accertamenti annuali comprendenti il prelievo di campioni di acque superficiali e delle eventuali piante solanacee ospiti nelle sorgenti d’acqua in esame, nonché ad analisi eseguite in conformità del metodo appropriato di cui all’allegato II per il materiale vegetale elencato e in tutti gli altri casi,

| — | per prevenire la disseminazione dell’organismo nocivo, attuano controlli sui programmi di irrigazione ed irrorazione, che possono arrivare al divieto d’impiegare l’acqua dichiarata contaminata per l’irrigazione e l’irrorazione del materiale vegetale elencato, nonché all’occorrenza di altre piante ospiti; questo divieto può essere riveduto sulla base dei risultati dell’accertamento annuale di cui sopra e le dichiarazioni di contaminazione possono essere revocate a condizione che gli organismi ufficiali competenti ritengano che le acque superficiali non siano più contaminate. L’impiego dell’acqua soggetta a divieto può essere autorizzato, sotto controllo ufficiale, per l’irrigazione e l’irrorazione delle piante ospiti qualora vengano impiegate tecniche ufficialmente approvate che eliminano l’organismo e ne impediscono la propagazione, |
| --- | --- |

—

per prevenire la disseminazione dell’organismo nocivo, attuano controlli sui programmi di irrigazione ed irrorazione, che possono arrivare al divieto d’impiegare l’acqua dichiarata contaminata per l’irrigazione e l’irrorazione del materiale vegetale elencato, nonché all’occorrenza di altre piante ospiti; questo divieto può essere riveduto sulla base dei risultati dell’accertamento annuale di cui sopra e le dichiarazioni di contaminazione possono essere revocate a condizione che gli organismi ufficiali competenti ritengano che le acque superficiali non siano più contaminate. L’impiego dell’acqua soggetta a divieto può essere autorizzato, sotto controllo ufficiale, per l’irrigazione e l’irrorazione delle piante ospiti qualora vengano impiegate tecniche ufficialmente approvate che eliminano l’organismo e ne impediscono la propagazione,

| — | nei casi in cui gli scarichi di reflui sono contaminati, effettuano controlli ufficiali sull’eliminazione dei rifiuti o degli scarichi di reflui derivanti da stabilimenti industriali di trasformazione o imballaggio che manipolano il materiale vegetale elencato; |
| --- | --- |

—

nei casi in cui gli scarichi di reflui sono contaminati, effettuano controlli ufficiali sull’eliminazione dei rifiuti o degli scarichi di reflui derivanti da stabilimenti industriali di trasformazione o imballaggio che manipolano il materiale vegetale elencato;

| c) | stabiliscono all’occorrenza un programma volto a sostituire tutte le scorte di tuberi-seme in un lasso di tempo adeguato. |
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c)

stabiliscono all’occorrenza un programma volto a sostituire tutte le scorte di tuberi-seme in un lasso di tempo adeguato.

ALLEGATO VII

I metodi ufficialmente approvati di eliminazione dei rifiuti di cui all’allegato VI, paragrafo 1, si uniformano alle disposizioni seguenti in modo da escludere qualsiasi rischio identificabile di disseminazione dell’organismo nocivo:

| i) | i rifiuti di patate e pomodori (inclusi le bucce di patata come pure patate e pomodori scartati) nonché ogni altro rifiuto solido associato a patate e pomodori (inclusi terreno, pietre ed altri detriti) verranno eliminati avvalendosi di una delle seguenti alternative:






  — | smaltimento in un sito apposito, ufficialmente approvato e destinato a tale scopo, in cui non siano identificabili rischi di dispersione dell’organismo nell’ambiente, ad esempio in seguito ad infiltrazione del terreno agricolo o contatti con sorgenti d’acqua che potrebbero essere usate per l’irrigazione di terreni agricoli. Il trasporto dei rifiuti in tale sito va effettuato servendosi di contenitori idonei ad eliminare ogni rischio di perdita dei rifiuti stessi, |
| --- | --- | --- |

i)

i rifiuti di patate e pomodori (inclusi le bucce di patata come pure patate e pomodori scartati) nonché ogni altro rifiuto solido associato a patate e pomodori (inclusi terreno, pietre ed altri detriti) verranno eliminati avvalendosi di una delle seguenti alternative:

—

smaltimento in un sito apposito, ufficialmente approvato e destinato a tale scopo, in cui non siano identificabili rischi di dispersione dell’organismo nell’ambiente, ad esempio in seguito ad infiltrazione del terreno agricolo o contatti con sorgenti d’acqua che potrebbero essere usate per l’irrigazione di terreni agricoli. Il trasporto dei rifiuti in tale sito va effettuato servendosi di contenitori idonei ad eliminare ogni rischio di perdita dei rifiuti stessi,

| — | incenerimento, |
| --- | --- |

—

incenerimento,

| — | altri interventi, sempreché sia stato accertato che non esiste alcun rischio effettivo di disseminazione dell’organismo nocivo; tali interventi vengono notificati alla Commissione e agli altri Stati membri; |
| --- | --- |

—

altri interventi, sempreché sia stato accertato che non esiste alcun rischio effettivo di disseminazione dell’organismo nocivo; tali interventi vengono notificati alla Commissione e agli altri Stati membri;

| ii) | rifiuti liquidi: prima dell’eliminazione i rifiuti liquidi che contengano materiale solido in sospensione vanno sottoposti a procedimenti di filtraggio o decantazione per rimuovere il materiale solido in questione, per la cui eliminazione si applicano le disposizioni di cui al precedente sottoparagrafo i).
  Fatto questo, i rifiuti liquidi vengono:






  — | riscaldati fino ad una temperatura uniforme minima di 60 °C per almeno 30 minuti e successivamente eliminati,
  ovvero |
| --- | --- | --- |

ii)

rifiuti liquidi: prima dell’eliminazione i rifiuti liquidi che contengano materiale solido in sospensione vanno sottoposti a procedimenti di filtraggio o decantazione per rimuovere il materiale solido in questione, per la cui eliminazione si applicano le disposizioni di cui al precedente sottoparagrafo i).

Fatto questo, i rifiuti liquidi vengono:

—

riscaldati fino ad una temperatura uniforme minima di 60 °C per almeno 30 minuti e successivamente eliminati,

ovvero

| — | eliminati in altri modi ufficialmente approvati e soggetti a controlli ufficiali tali da garantire che non sussistano rischi identificabili che tali rifiuti possano entrare in contatto con il terreno agricolo o con sorgenti d’acqua che potrebbero essere usate per l’irrigazione di terreni agricoli. I relativi particolari vengono notificati alla Commissione e agli altri Stati membri. |
| --- | --- |

—

eliminati in altri modi ufficialmente approvati e soggetti a controlli ufficiali tali da garantire che non sussistano rischi identificabili che tali rifiuti possano entrare in contatto con il terreno agricolo o con sorgenti d’acqua che potrebbero essere usate per l’irrigazione di terreni agricoli. I relativi particolari vengono notificati alla Commissione e agli altri Stati membri.

Le alternative descritte nel presente allegato valgono parimenti per i rifiuti associati alla manipolazione, allo smaltimento ed alla lavorazione di lotti di prodotto contaminati.

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(1)  Cfr. Lelliott e Stead (1987).

1

(2)  Per prendere contatto con i ricercatori cfr. il sito web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

2

http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

(3)  Utilizzare come ceppo di riferimento standard di R. solanacearum razza 3 biovar 2.

3

R. solanacearum

(4)  Ceppo che può determinare una reazione incrociata nei saggi sierologici (IF e/o ELISA) con gli antisieri policlonali.

4

(5)  Ceppo dal quale il prodotto della PCR può essere amplificato in alcuni laboratori di dimensioni simili a quelle previste usando i primer specifici OLI-1 e Y-2 (cfr. appendice 6).

5

(6)  Potrebbe determinare una reazione incrociata nella maggior parte dei saggi, che tuttavia è stata riscontrata soltanto sulle banane in Indonesia.

6

(7)  Da usare con il metodo di estrazione per omogeneizzazione.

7

(8)  Il metodo è stato convalidato utilizzando Taq polimerasi Perkin Elmer (AmpliTaq) e Gibco BRL.

8

(9)  I metodi sono stati convalidati usando Taq polimerasi Perkin Elmer (AmpliTaq) e Gibco BRL.

9

NB: Inizialmente ottimizzati per termociclatore MJ Research PTC 200 con Taq polimerasi Gibco.

NB:

È ugualmente possibile usare AmpliTaq e tampone Perkin Elmer alle stesse concentrazioni.

(10)  I metodi sono stati convalidati usando Taq polimerasi Perkin Elmer (AmpliTaq) e Gibco BRL.

10

(11)  Le concentrazioni dei primer NS-5 F e NS-6-R sono state ottimizzate per l'estrazione dei coni ombelicali usando il metodo di omogeneizzazione e la purificazione del DNA secondo Pastrik (2000) (cfr. sezione VI.6.1.a). Sarà necessario riottimizzare le concentrazioni dei reagenti se sono impiegati metodi di estrazione mediante agitazione o altri metodi di isolamento del DNA.

11

(12)  I metodi sono stati convalidati usando Taq polimerasi Perkin Elmer (AmpliTaq) e Gibco BRL.

12

(13)  I metodi sono stati convalidati usando Taq polimerasi Perkin Elmer (AmpliTaq) e Gibco BRL.

13

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| 27.7.2006 | IT | Gazzetta ufficiale dell’Unione europea | L 206/107 |
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27.7.2006

IT

Gazzetta ufficiale dell’Unione europea

L 206/107

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DIRETTIVA 2006/64/CE DELLA COMMISSIONE

del 18 luglio 2006

che modifica la direttiva 91/414/CEE del Consiglio per l'iscrizione delle sostanze attive clopiralid, ciprodinil, fosetil e trinexapac

(Testo rilevante ai fini del SEE)

LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE,

visto il trattato che istituisce la Comunità europea,

vista la direttiva 91/414/CEE del Consiglio, del 15 luglio 1991, relativa all'immissione in commercio dei prodotti fitosanitari (1), in particolare l'articolo 6, paragrafo 1,

considerando quanto segue:

| (1) | I regolamenti (CE) n. 451/2000 (2) e (CE) n. 703/2001 (3) della Commissione stabiliscono le modalità attuative della seconda fase del programma di lavoro di cui all'articolo 8, paragrafo 2, della direttiva 91/414/CEE e stabiliscono un elenco di sostanze attive da valutare ai fini della loro eventuale iscrizione nell'allegato I della direttiva 91/414/CEE. Tale elenco comprende le sostanze clopiralid, ciprodinil, fosetil e trinexapac. |
| --- | --- |

(1)

I regolamenti (CE) n. 451/2000 (2) e (CE) n. 703/2001 (3) della Commissione stabiliscono le modalità attuative della seconda fase del programma di lavoro di cui all'articolo 8, paragrafo 2, della direttiva 91/414/CEE e stabiliscono un elenco di sostanze attive da valutare ai fini della loro eventuale iscrizione nell'allegato I della direttiva 91/414/CEE. Tale elenco comprende le sostanze clopiralid, ciprodinil, fosetil e trinexapac.

| (2) | Gli effetti di tali sostanze attive sulla salute umana e sull'ambiente sono stati valutati in conformità dei regolamenti (CE) n. 451/2000 e (CE) n. 703/2001 per diversi impieghi proposti dai notificanti. Tali regolamenti designano inoltre gli Stati membri relatori tenuti a presentare all'Autorità europea per la sicurezza alimentare (EFSA) le relazioni di valutazione e le raccomandazioni pertinenti, conformemente all'articolo 8, paragrafo 1, del regolamento (CE) n. 451/2000. Per il clopiralid, lo Stato membro relatore era la Finlandia e tutte le informazioni pertinenti sono state presentate il 2 dicembre 2003. Per il ciprodinil e il fosetil, lo Stato membro relatore era la Francia e tutte le informazioni pertinenti sono state presentate, rispettivamente, il 16 gennaio 2004 e il 20 ottobre 2003. Per il trinexapac lo Stato membro relatore erano i Paesi Bassi e tutte le informazioni pertinenti sono state presentate il 7 novembre 2003. |
| --- | --- |

(2)

Gli effetti di tali sostanze attive sulla salute umana e sull'ambiente sono stati valutati in conformità dei regolamenti (CE) n. 451/2000 e (CE) n. 703/2001 per diversi impieghi proposti dai notificanti. Tali regolamenti designano inoltre gli Stati membri relatori tenuti a presentare all'Autorità europea per la sicurezza alimentare (EFSA) le relazioni di valutazione e le raccomandazioni pertinenti, conformemente all'articolo 8, paragrafo 1, del regolamento (CE) n. 451/2000. Per il clopiralid, lo Stato membro relatore era la Finlandia e tutte le informazioni pertinenti sono state presentate il 2 dicembre 2003. Per il ciprodinil e il fosetil, lo Stato membro relatore era la Francia e tutte le informazioni pertinenti sono state presentate, rispettivamente, il 16 gennaio 2004 e il 20 ottobre 2003. Per il trinexapac lo Stato membro relatore erano i Paesi Bassi e tutte le informazioni pertinenti sono state presentate il 7 novembre 2003.

| (3) | Le relazioni di valutazione sono state esaminate con un processo inter pares dagli Stati membri e dall'EFSA e presentate alla Commissione il 14 dicembre 2005 sotto forma di rapporti scientifici dell'EFSA concernenti il clopiralid, il ciprodinil, il fosetil e il trinexapac (4). Tali rapporti sono stati esaminati dagli Stati membri e dalla Commissione nell’ambito del comitato permanente per la catena alimentare e la salute degli animali e adottati il 4 aprile 2006 sotto forma di rapporti di riesame della Commissione sul clopiralid, ciprodinil, fosetil e trinexapac. |
| --- | --- |

(3)

Le relazioni di valutazione sono state esaminate con un processo inter pares dagli Stati membri e dall'EFSA e presentate alla Commissione il 14 dicembre 2005 sotto forma di rapporti scientifici dell'EFSA concernenti il clopiralid, il ciprodinil, il fosetil e il trinexapac (4). Tali rapporti sono stati esaminati dagli Stati membri e dalla Commissione nell’ambito del comitato permanente per la catena alimentare e la salute degli animali e adottati il 4 aprile 2006 sotto forma di rapporti di riesame della Commissione sul clopiralid, ciprodinil, fosetil e trinexapac.

| (4) | Dalle valutazioni effettuate è lecito supporre che i prodotti fitosanitari contenenti clopiralid, ciprodinil, fosetil e trinexapac possano ottemperare in linea di massima alle prescrizioni di cui all'articolo 5, paragrafo 1, lettere a) e b), della direttiva 91/414/CEE, in particolare per quanto riguarda gli usi presi in considerazione e specificati nei rapporti di riesame della Commissione. È quindi opportuno iscrivere le sostanze attive di cui trattasi nell'allegato I affinché in tutti gli Stati membri si possa procedere al rilascio delle autorizzazioni dei prodotti fitosanitari contenenti dette sostanze attive conformemente alla summenzionata direttiva. |
| --- | --- |

(4)

Dalle valutazioni effettuate è lecito supporre che i prodotti fitosanitari contenenti clopiralid, ciprodinil, fosetil e trinexapac possano ottemperare in linea di massima alle prescrizioni di cui all'articolo 5, paragrafo 1, lettere a) e b), della direttiva 91/414/CEE, in particolare per quanto riguarda gli usi presi in considerazione e specificati nei rapporti di riesame della Commissione. È quindi opportuno iscrivere le sostanze attive di cui trattasi nell'allegato I affinché in tutti gli Stati membri si possa procedere al rilascio delle autorizzazioni dei prodotti fitosanitari contenenti dette sostanze attive conformemente alla summenzionata direttiva.

| (5) | Fatte salve queste conclusioni, è opportuno ottenere ulteriori informazioni su alcuni punti specifici riguardanti il clopiralid, il ciprodinil e il fosetil. A norma dell'articolo 6, paragrafo 1, della direttiva 91/414/CEE l'iscrizione di una sostanza nell'allegato I può essere subordinata a condizioni. È pertanto opportuno richiedere che ulteriori esami vengano effettuati per il clopiralid, il ciprodinil e il fosetil al fine di avere una conferma della valutazione del rischio relativamente ad alcuni aspetti e che tali studi siano presentati dai notificanti. |
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(5)

Fatte salve queste conclusioni, è opportuno ottenere ulteriori informazioni su alcuni punti specifici riguardanti il clopiralid, il ciprodinil e il fosetil. A norma dell'articolo 6, paragrafo 1, della direttiva 91/414/CEE l'iscrizione di una sostanza nell'allegato I può essere subordinata a condizioni. È pertanto opportuno richiedere che ulteriori esami vengano effettuati per il clopiralid, il ciprodinil e il fosetil al fine di avere una conferma della valutazione del rischio relativamente ad alcuni aspetti e che tali studi siano presentati dai notificanti.

| (6) | È opportuno prevedere un lasso di tempo ragionevole prima dell'iscrizione di una sostanza attiva nell'allegato I, onde consentire agli Stati membri e alle parti interessate di prepararsi a ottemperare alle nuove prescrizioni derivanti dall'iscrizione. |
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(6)

È opportuno prevedere un lasso di tempo ragionevole prima dell'iscrizione di una sostanza attiva nell'allegato I, onde consentire agli Stati membri e alle parti interessate di prepararsi a ottemperare alle nuove prescrizioni derivanti dall'iscrizione.

| (7) | Fermi restando gli obblighi stabiliti dalla direttiva 91/414/CEE come conseguenza dell'iscrizione di una sostanza attiva nell'allegato I, agli Stati membri va concesso un periodo di sei mesi a decorrere dall'iscrizione affinché possano rivedere le autorizzazioni esistenti per i prodotti fitosanitari contenenti clopiralid, ciprodinil, fosetil e trinexapac in modo da garantire il rispetto delle prescrizioni di cui alla direttiva 91/414/CEE, in particolare dell'articolo 13 e delle pertinenti condizioni elencate nell'allegato I. È opportuno che gli Stati membri modifichino, sostituiscano o revochino, se del caso, le autorizzazioni esistenti secondo le disposizioni della direttiva 91/414/CEE. In deroga al suddetto termine occorre prevedere un periodo più lungo per la presentazione e la valutazione del fascicolo completo, previsto dall'allegato III, relativo a ciascun prodotto fitosanitario e ad ogni suo impiego previsto, conformemente ai principi uniformi di cui alla direttiva 91/414/CEE. |
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(7)

Fermi restando gli obblighi stabiliti dalla direttiva 91/414/CEE come conseguenza dell'iscrizione di una sostanza attiva nell'allegato I, agli Stati membri va concesso un periodo di sei mesi a decorrere dall'iscrizione affinché possano rivedere le autorizzazioni esistenti per i prodotti fitosanitari contenenti clopiralid, ciprodinil, fosetil e trinexapac in modo da garantire il rispetto delle prescrizioni di cui alla direttiva 91/414/CEE, in particolare dell'articolo 13 e delle pertinenti condizioni elencate nell'allegato I. È opportuno che gli Stati membri modifichino, sostituiscano o revochino, se del caso, le autorizzazioni esistenti secondo le disposizioni della direttiva 91/414/CEE. In deroga al suddetto termine occorre prevedere un periodo più lungo per la presentazione e la valutazione del fascicolo completo, previsto dall'allegato III, relativo a ciascun prodotto fitosanitario e ad ogni suo impiego previsto, conformemente ai principi uniformi di cui alla direttiva 91/414/CEE.

| (8) | L'esperienza acquisita con le precedenti iscrizioni nell'allegato I della direttiva 91/414/CEE di sostanze attive valutate nel quadro del regolamento (CEE) n. 3600/92 della Commissione (5) ha dimostrato che possono presentarsi difficoltà di interpretazione per quanto riguarda gli obblighi dei titolari delle autorizzazioni esistenti in relazione all'accesso ai dati. Per evitare ulteriori difficoltà è quindi necessario chiarire gli obblighi degli Stati membri, specialmente quello di verificare che il titolare di un'autorizzazione dimostri di avere accesso a un fascicolo conforme alle prescrizioni dell'allegato II della direttiva stessa. Tale chiarimento non impone tuttavia alcun nuovo obbligo agli Stati membri o ai titolari delle autorizzazioni rispetto alle direttive finora adottate a modifica dell'allegato I. |
| --- | --- |

(8)

L'esperienza acquisita con le precedenti iscrizioni nell'allegato I della direttiva 91/414/CEE di sostanze attive valutate nel quadro del regolamento (CEE) n. 3600/92 della Commissione (5) ha dimostrato che possono presentarsi difficoltà di interpretazione per quanto riguarda gli obblighi dei titolari delle autorizzazioni esistenti in relazione all'accesso ai dati. Per evitare ulteriori difficoltà è quindi necessario chiarire gli obblighi degli Stati membri, specialmente quello di verificare che il titolare di un'autorizzazione dimostri di avere accesso a un fascicolo conforme alle prescrizioni dell'allegato II della direttiva stessa. Tale chiarimento non impone tuttavia alcun nuovo obbligo agli Stati membri o ai titolari delle autorizzazioni rispetto alle direttive finora adottate a modifica dell'allegato I.

| (9) | È pertanto opportuno modificare la direttiva 91/414/CEE di conseguenza. |
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(9)

È pertanto opportuno modificare la direttiva 91/414/CEE di conseguenza.

| (10) | Le misure di cui alla presente direttiva sono conformi al parere del comitato permanente per la catena alimentare e la salute degli animali, |
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(10)

Le misure di cui alla presente direttiva sono conformi al parere del comitato permanente per la catena alimentare e la salute degli animali,

HA ADOTTATO LA PRESENTE DIRETTIVA:

Articolo 1

L’allegato I della direttiva 91/414/CEE è modificato conformemente all'allegato della presente direttiva.

Articolo 2

Gli Stati membri adottano e pubblicano, entro il 31 ottobre 2007, le disposizioni legislative, regolamentari e amministrative necessarie per conformarsi alla presente direttiva. Essi comunicano immediatamente alla Commissione il testo di tali disposizioni nonché una tavola di concordanza tra queste ultime e la presente direttiva.

Essi applicano tali disposizioni a decorrere dal 1o novembre 2007.

Quando gli Stati membri adottano tali disposizioni, queste contengono un riferimento alla presente direttiva o sono corredate di un siffatto riferimento all'atto della pubblicazione ufficiale. Le modalità del riferimento sono decise dagli Stati membri.

Articolo 3

1.   In applicazione della direttiva 91/414/CEE gli Stati membri modificano o revocano, se del caso, le autorizzazioni esistenti per prodotti fitosanitari contenenti clopiralid, ciprodinil, fosetil e trinexapac come sostanze attive entro il 31 ottobre 2007.

Entro tale data essi verificano in particolare il rispetto delle condizioni di cui all’allegato I della suddetta direttiva per quanto riguarda il clopiyralid, ciprodinil, fosetil e trinexapac, ad eccezione di quelle della parte B dell’iscrizione relativa alla sostanza attiva in questione; gli Stati membri verificano anche che il titolare dell'autorizzazione possegga o possa accedere ad un fascicolo conforme alle prescrizioni dell'allegato II della direttiva, conformemente alle condizioni dell’articolo 13 della stessa.

2.   In deroga al paragrafo 1, per ogni prodotto fitosanitario autorizzato contenente clopiralid, ciprodinil, fosetil e trinexapac come sostanza attiva unica o come una tra varie sostanze attive, elencate nell’allegato I della direttiva 91/414/CEE entro il 30 aprile 2007, gli Stati membri devono effettuare una nuova valutazione del prodotto secondo i principi uniformi di cui all’allegato VI della direttiva 91/414/CEE, sulla base di una documentazione conforme alle prescrizioni dell’allegato III di tale direttiva e tenendo conto della parte B delle voci nel suo allegato I riguardanti, rispettivamente, il clopiralid, il ciprodinil, il fosetil e il trinexapac. In base a tale valutazione essi stabiliscono se il prodotto sia conforme alle condizioni di cui all'articolo 4, paragrafo 1, lettere b), c), d) ed e), della direttiva 91/414/CEE.

Una volta assicurato il rispetto di tali condizioni, gli Stati membri:

| a) | nel caso di un prodotto contenente clopiralid, ciprodinil, fosetil e trinexapac come unica sostanza attiva modificano o revocano, se necessario, l’autorizzazione entro il 30 aprile 2011;
  oppure |
| --- | --- |

a)

nel caso di un prodotto contenente clopiralid, ciprodinil, fosetil e trinexapac come unica sostanza attiva modificano o revocano, se necessario, l’autorizzazione entro il 30 aprile 2011;

oppure

| b) | nel caso di un prodotto contenente clopiralid, ciprodinil, fosetil e trinexapac come una di più sostanze attive, ove necessario, modificano o revocano l'autorizzazione entro il 30 aprile 2011 ovvero entro il termine, qualora più esteso, fissato per la modifica o la revoca in parola rispettivamente nella direttiva o nelle direttive che hanno iscritto la sostanza o le sostanze nell'allegato I della direttiva 91/414/CEE. |
| --- | --- |

b)

nel caso di un prodotto contenente clopiralid, ciprodinil, fosetil e trinexapac come una di più sostanze attive, ove necessario, modificano o revocano l'autorizzazione entro il 30 aprile 2011 ovvero entro il termine, qualora più esteso, fissato per la modifica o la revoca in parola rispettivamente nella direttiva o nelle direttive che hanno iscritto la sostanza o le sostanze nell'allegato I della direttiva 91/414/CEE.

Articolo 4

La presente direttiva entra in vigore il 1o maggio 2007.

Articolo 5

Gli Stati membri sono destinatari della presente direttiva.

Fatto a Bruxelles, il 18 luglio 2006.

Per la Commissione

Markos KYPRIANOU

Membro della Commissione

---

(1)  GU L 230 del 19.8.1991, pag. 1. Direttiva modificata da ultimo dalla direttiva 2006/45/CE (GU L 130 del 18.5.2006, pag. 27).

1

(2)  GU L 55 del 29.2.2000, pag. 25. Regolamento modificato da ultimo dal regolamento (CE) n. 1044/2003 (GU L 151 del 19.6.2003, pag. 32).

2

(3)  GU L 98 del 7.4.2001, pag. 6.

3

(4)  Rapporto scientifico EFSA (2005) 50, 1-65, Conclusion regarding the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance clopyralid (ultimato il 14 dicembre 2005).

4

Rapporto scientifico EFSA (2005) 51, 1-78, Conclusion regarding the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance cyprodinil (ultimato il 14 dicembre 2005).

Rapporto scientifico EFSA (2005) 54, 1-79, Conclusion regarding the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance fosethyl (ultimato il 14 dicembre 2005).

Rapporto scientifico EFSA (2005) 57, 1-70, Conclusion regarding the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance trinexapac (ultimato il 14 dicembre 2005).

(5)  GU L 366 del 15.12.1992, pag. 10. Regolamento modificato da ultimo dal regolamento (CE) n. 2266/2000 (GU L 259 del 13.10.2000, pag. 27).

5

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ALLEGATO

Voci da aggiungere alla fine della tabella dell'allegato I della direttiva 91/414/CEE

| Nu-mero | Nome comune, mumeri d'identificazione | Denominazione IUPAC | Purezza (1) | Entrata in vigore | Scadenza dell'iscri-zione | Disposizioni specifiche |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| «131 | Clopiralid
  CAS n. 1702-17-6
  CIPAC 455 | acido 3,6-dicloropiridina-2-carbossilico | ≥ 950 g/kg | 1 maggio 2007 | 30 aprile 2017 | PARTE A
  Possono essere autorizzate solo le utilizzazioni come erbicida.
  PARTE B
  Nel valutare le richieste di autorizzazione di prodotti fitosanitari contenenti clopiralid per usi diversi dai trattamenti primaverili, gli Stati membri prestano particolare attenzione ai criteri di cui all'articolo 4, paragrafo 1, lettera b), e garantiscono che tutte le informazioni e i dati necessari siano forniti prima del rilascio della relativa autorizzazione.
  Per l'applicazione dei principi uniformi dell'allegato VI occorre tener conto delle conclusioni del rapporto di riesame sul clopiralid, in particolare delle relative appendici I e II, nella versione definitiva adottata dal comitato permanente per la catena alimentare e la salute degli animali il 4 aprile 2006.
  Ai fini di tale valutazione generale, gli Stati membri devono prestare particolare attenzione:






  — | alla protezione di piante non bersaglio e alle acque sotterranee che si trovano in situazione di vulnerabilità. Le condizioni di autorizzazione devono comprendere misure di attenuazione dei rischi e programmi di monitoraggio vanno introdotti nelle zone vulnerabili, ove necessario, per verificare la potenziale contaminazione delle acque sotterranee. |

Nu-mero

Nome comune, mumeri d'identificazione

Denominazione IUPAC

Purezza (1)

Entrata in vigore

Scadenza dell'iscri-zione

Disposizioni specifiche

«131

Clopiralid

CAS n. 1702-17-6

CIPAC 455

acido 3,6-dicloropiridina-2-carbossilico

≥ 950 g/kg

1 maggio 2007

30 aprile 2017

PARTE A

Possono essere autorizzate solo le utilizzazioni come erbicida.

PARTE B

Nel valutare le richieste di autorizzazione di prodotti fitosanitari contenenti clopiralid per usi diversi dai trattamenti primaverili, gli Stati membri prestano particolare attenzione ai criteri di cui all'articolo 4, paragrafo 1, lettera b), e garantiscono che tutte le informazioni e i dati necessari siano forniti prima del rilascio della relativa autorizzazione.

Per l'applicazione dei principi uniformi dell'allegato VI occorre tener conto delle conclusioni del rapporto di riesame sul clopiralid, in particolare delle relative appendici I e II, nella versione definitiva adottata dal comitato permanente per la catena alimentare e la salute degli animali il 4 aprile 2006.

Ai fini di tale valutazione generale, gli Stati membri devono prestare particolare attenzione:

—

alla protezione di piante non bersaglio e alle acque sotterranee che si trovano in situazione di vulnerabilità. Le condizioni di autorizzazione devono comprendere misure di attenuazione dei rischi e programmi di monitoraggio vanno introdotti nelle zone vulnerabili, ove necessario, per verificare la potenziale contaminazione delle acque sotterranee.

Gli Stati membri interessati richiedono la presentazione di altri studi che confermino i risultati relativi al metabolismo degli animali. Essi garantiscono che i notificanti, su richiesta dei quali il clopiralid è stato iscritto nel presente allegato, forniscano tali studi alla Commissione entro due anni dall’entrata in vigore della presente direttiva.

132

Ciprodinil

CAS 121522-61-2

CIPAC 511

(4-ciclopropil-6-metil-pirimidin-2-il)-fenil-ammina

≥ 980 g/kg

1o maggio 2007

30 aprile 2017

PARTE A

Può essere autorizzata solo l'utilizzazione come fungicida.

PARTE B

Per l'applicazione dei principi uniformi dell'allegato VI occorre tener conto delle conclusioni del rapporto di riesame sul ciprodinil, in particolare delle relative appendici I e II, nella versione definitiva adottata dal comitato permanente per la catena alimentare e la salute degli animali il 4 aprile 2006.

Ai fini di tale valutazione generale, gli Stati membri devono:

| — | prestare particolare attenzione alla sicurezza degli operatori e garantire che le condizioni di impiego prescrivano l'uso di dispositivi di protezione individuale adeguati. |
| --- | --- |

—

prestare particolare attenzione alla sicurezza degli operatori e garantire che le condizioni di impiego prescrivano l'uso di dispositivi di protezione individuale adeguati.

| — | rivolgere particolare attenzione alla protezione degli uccelli, dei mammiferi e degli organismi acquatici. Le condizioni di autorizzazione devono comprendere, ove necessario, provvedimenti di attenuazione dei rischi, ad esempio zone tampone. |
| --- | --- |

—

rivolgere particolare attenzione alla protezione degli uccelli, dei mammiferi e degli organismi acquatici. Le condizioni di autorizzazione devono comprendere, ove necessario, provvedimenti di attenuazione dei rischi, ad esempio zone tampone.

Gli Stati membri interessati richiedono la presentazione di altri studi che confermino la valutazione dei rischi per gli uccelli e i mammiferi e verifichino l’eventuale presenza di residui del metabolita CGA 304075 in prodotti alimentari di origine animale. Essi garantiscono che i notificanti, su richiesta dei quali il ciprodinil è stato iscritto nel presente allegato, forniscano tali studi alla Commissione entro due anni dall’entrata in vigore della presente direttiva.

133

Fosetil

CAS 15845-66-6

CIPAC 384

Idrogenofosfonato di etile

≥ 960 g/kg (espresso in fosetil-Al)

1o maggio 2007

30 aprile 2017

PARTE A

Può essere autorizzata solo l'utilizzazione come fungicida.

PARTE B

Per l'applicazione dei principi uniformi dell'allegato VI occorre tener conto delle conclusioni del rapporto di riesame sul fosetil, in particolare delle relative appendici I e II, nella versione definitiva adottata dal comitato permanente per la catena alimentare e la salute degli animali il 4 aprile 2006.

Ai fini di tale valutazione generale, gli Stati membri devono:

| — | prestare particolare attenzione alla protezione degli uccelli, dei mammiferi e degli organismi acquatici, nonché degli artropodi non bersaglio. |
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—

prestare particolare attenzione alla protezione degli uccelli, dei mammiferi e degli organismi acquatici, nonché degli artropodi non bersaglio.

Le condizioni di autorizzazione devono comprendere, ove necessario, provvedimenti di attenuazione dei rischi, ad esempio zone tampone.

Gli Stati membri interessati richiedono la presentazione di altri studi che confermino la valutazione dei rischi per gli artropodi non bersaglio, in particolare per quanto riguarda la ricostituzione della popolazione nelle zone trattate, e per i mammiferi erbivori. Essi garantiscono che i notificanti, su richiesta dei quali il fosetil è stato iscritto nel presente allegato, presentino tali studi alla Commissione entro due anni dall'entrata in vigore della presente direttiva.

134

Trinexapac

CAS n. 104273-73-6

CIPAC 732

acido 4-(ciclopropil-idrossimetilene)-3,5-diosso- cicloesanocarbossilico

≥ 940g/kg (espresso in trinexapac-etile)

1o maggio 2007

30 aprile 2017

PARTE A

Possono essere autorizzate solo le utilizzazioni come fitoregolatore.

PARTE B

Per l'applicazione dei principi uniformi dell'allegato VI occorre tener conto delle conclusioni del rapporto di riesame sul trinexapac, in particolare delle relative appendici I e II, nella versione definitiva adottata dal comitato permanente per la catena alimentare e la salute degli animali il 4 aprile 2006.

Ai fini di tale valutazione generale, gli Stati membri devono:

| — | prestare particolare attenzione alla protezione degli uccelli e dei mammiferi. |
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—

prestare particolare attenzione alla protezione degli uccelli e dei mammiferi.

Le condizioni di autorizzazione devono comprendere, ove necessario, misure di attenuazione dei rischi.

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(1)  Ulteriori dettagli sull'identità e la specificazione delle sostanze attive sono contenuti nei relativi rapporti di riesame.»

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