# Euroopa Liidu L 206/2006

| | ISSN 1725-5082 |
| --- | --- |
| Euroopa Liidu
  Teataja | L 206 |
| | |
| Eestikeelne väljaanne | Õigusaktid | 49. köide27. juuli 2006 |

ISSN 1725-5082

Euroopa Liidu

Teataja

L 206

Eestikeelne väljaanne

Õigusaktid

49. köide27. juuli 2006

---

| Sisukord | | I   Aktid, mille avaldamine on kohustuslik | Lehekülg |
| --- | --- | --- | --- |
| | * | Komisjoni direktiiv 2006/60/EÜ, 7. juuli 2006, millega muudetakse nõukogu direktiivi 90/642/EMÜ lisasid seoses trifloksüstrobiini, tiabendasooli, abamektiini, benomüüli, karbendasiimi, metüültiofanaadi, müklobutaniili, glüfosaadi, trimetüülsulfooniumi, fenpropimorfi ja kloromekvaadi jääkide piirnormidega (
  1
  ) | 1 |
| | * | Komisjoni direktiiv 2006/61/EÜ, 7. juuli 2006, millega muudetakse komisjoni direktiivide 86/362/EMÜ, 86/363/EMÜ ja 90/642/EMÜ lisasid seoses atrasiini, etüülasiinfossi, tsüflutriini, etefooni, fentiooni, metamidofossi, metomüüli, parakvaadi ja triasofossi jääkide piirnormidega (
  1
  ) | 12 |
| | * | Komisjoni direktiiv 2006/62/EÜ, 12. juuli 2006, millega muudetakse nõukogu direktiivide 76/895/EMÜ, 86/362/EMÜ, 86/363/EMÜ ja 90/642/EMÜ lisasid seoses desmedifaami, fenmedifaami ja klorofenvinfossi jääkide piirnormidega (
  1
  ) | 27 |
| | * | Komisjoni direktiiv 2006/63/EÜ, 14. juuli 2006, millega muudetakse haigusetekitaja Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. tõrjet käsitleva nõukogu direktiivi 98/57/EÜ II-VII lisa | 36 |
| | * | Komisjoni direktiiv 2006/64/EÜ, 18. juuli 2006, millega muudetakse nõukogu direktiivi 91/414/EMÜ klopüraliidi, tsüprodiniili, fosetüüli ja trineksapaki lisamisega toimeainete hulka (
  1
  ) | 107 |

Sisukord

I   Aktid, mille avaldamine on kohustuslik

Lehekülg

*

Komisjoni direktiiv 2006/60/EÜ, 7. juuli 2006, millega muudetakse nõukogu direktiivi 90/642/EMÜ lisasid seoses trifloksüstrobiini, tiabendasooli, abamektiini, benomüüli, karbendasiimi, metüültiofanaadi, müklobutaniili, glüfosaadi, trimetüülsulfooniumi, fenpropimorfi ja kloromekvaadi jääkide piirnormidega (
  1
  )

1

1

*

Komisjoni direktiiv 2006/61/EÜ, 7. juuli 2006, millega muudetakse komisjoni direktiivide 86/362/EMÜ, 86/363/EMÜ ja 90/642/EMÜ lisasid seoses atrasiini, etüülasiinfossi, tsüflutriini, etefooni, fentiooni, metamidofossi, metomüüli, parakvaadi ja triasofossi jääkide piirnormidega (
  1
  )

1

12

*

Komisjoni direktiiv 2006/62/EÜ, 12. juuli 2006, millega muudetakse nõukogu direktiivide 76/895/EMÜ, 86/362/EMÜ, 86/363/EMÜ ja 90/642/EMÜ lisasid seoses desmedifaami, fenmedifaami ja klorofenvinfossi jääkide piirnormidega (
  1
  )

1

27

*

Komisjoni direktiiv 2006/63/EÜ, 14. juuli 2006, millega muudetakse haigusetekitaja Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. tõrjet käsitleva nõukogu direktiivi 98/57/EÜ II-VII lisa

Ralstonia solanacearum

et al.

36

*

Komisjoni direktiiv 2006/64/EÜ, 18. juuli 2006, millega muudetakse nõukogu direktiivi 91/414/EMÜ klopüraliidi, tsüprodiniili, fosetüüli ja trineksapaki lisamisega toimeainete hulka (
  1
  )

1

107

| | |
| --- | --- |
| | (1)   EMPs kohaldatav tekst. |

---

(1)   EMPs kohaldatav tekst.

1

| ET | Aktid, mille peakiri on trükitud harilikus trükikirjas, käsitlevad põllumajandusküsimuste igapäevast korraldust ning nende kehtivusaeg on üldjuhul piiratud.
  Kõigi ülejäänud aktide pealkirjad on trükitud poolpaksus kirjas ja nende ette on märgitud tärn. |
| --- | --- |

ET

Aktid, mille peakiri on trükitud harilikus trükikirjas, käsitlevad põllumajandusküsimuste igapäevast korraldust ning nende kehtivusaeg on üldjuhul piiratud.

Kõigi ülejäänud aktide pealkirjad on trükitud poolpaksus kirjas ja nende ette on märgitud tärn.

---

I Aktid, mille avaldamine on kohustuslik

| 27.7.2006 | ET | Euroopa Liidu Teataja | L 206/1 |
| --- | --- | --- | --- |

27.7.2006

ET

Euroopa Liidu Teataja

L 206/1

---

KOMISJONI DIREKTIIV 2006/60/EÜ,

7. juuli 2006,

millega muudetakse nõukogu direktiivi 90/642/EMÜ lisasid seoses trifloksüstrobiini, tiabendasooli, abamektiini, benomüüli, karbendasiimi, metüültiofanaadi, müklobutaniili, glüfosaadi, trimetüülsulfooniumi, fenpropimorfi ja kloromekvaadi jääkide piirnormidega

(EMPs kohaldatav tekst)

EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON,

võttes arvesse Euroopa Ühenduse asutamislepingut,

võttes arvesse nõukogu 27. novembri 1990. aasta direktiivi 90/642/EMÜ teatavates taimset päritolu saadustes, sealhulgas puu- ja köögiviljas, sisalduvate ja nende pinnal esinevate pestitsiidide jääkide lubatud piirnormide kehtestamise kohta, (1) eriti selle artiklit 7,

võttes arvesse nõukogu 15. juuli 1991. aasta direktiivi 91/414/EMÜ taimekaitsevahendite turuleviimise kohta, (2) eriti selle artikli 4 lõike 1 punkti f,

ning arvestades järgmist:

| (1) | Vastavalt direktiivile 91/414/EMÜ vastutavad teatavate põllukultuuride puhul kasutatavate taimekaitsevahendite kasutusloa andmise eest liikmesriigid. Selliste kasutuslubade aluseks peab olema inimeste ja loomade tervist ning keskkonda mõjutavate tegurite hinnang. Hinnangu andmisel tuleb arvesse võtta kasutajate ja kõrvalseisjate kokkupuuteid ja mõju maismaa-, vee- ja õhukeskkonnale, samuti töödeldud põllukultuurides sisalduvate jääkainete tarbimise mõju inimestele ja loomadele. |
| --- | --- |

(1)

Vastavalt direktiivile 91/414/EMÜ vastutavad teatavate põllukultuuride puhul kasutatavate taimekaitsevahendite kasutusloa andmise eest liikmesriigid. Selliste kasutuslubade aluseks peab olema inimeste ja loomade tervist ning keskkonda mõjutavate tegurite hinnang. Hinnangu andmisel tuleb arvesse võtta kasutajate ja kõrvalseisjate kokkupuuteid ja mõju maismaa-, vee- ja õhukeskkonnale, samuti töödeldud põllukultuurides sisalduvate jääkainete tarbimise mõju inimestele ja loomadele.

| (2) | Jääkide piirnormid kajastavad tegeliku taimekaitse saavutamiseks vajalikku pestitsiidide miinimumkogust, mida kasutatakse selliselt, et jääkaine kogus on võimalikult väike ja toksikoloogiliselt vastuvõetav, eelkõige hinnangulist toidu kaudu omastamist arvesse võttes. |
| --- | --- |

(2)

Jääkide piirnormid kajastavad tegeliku taimekaitse saavutamiseks vajalikku pestitsiidide miinimumkogust, mida kasutatakse selliselt, et jääkaine kogus on võimalikult väike ja toksikoloogiliselt vastuvõetav, eelkõige hinnangulist toidu kaudu omastamist arvesse võttes.

| (3) | Direktiivis 90/642/EMÜ käsitletud pestitsiidide jääkide piirnorme tuleb pidevalt läbi vaadata ja neid võib muuta, arvestades uusi või muutunud kasutusviise. Komisjonile on edastatud teavet uute või muutunud kasutusviiside kohta, millest tulenevad muudatused trifloksüstrobiini, tiabendasooli, abamektiini, benomüülide rühma (benomüül, karbendasiim ja metüültiofanaat), müklobutaniili, glüfosaadi, trimetüülsulfooniumi ning fenpropimorfi jääkide normides. |
| --- | --- |

(3)

Direktiivis 90/642/EMÜ käsitletud pestitsiidide jääkide piirnorme tuleb pidevalt läbi vaadata ja neid võib muuta, arvestades uusi või muutunud kasutusviise. Komisjonile on edastatud teavet uute või muutunud kasutusviiside kohta, millest tulenevad muudatused trifloksüstrobiini, tiabendasooli, abamektiini, benomüülide rühma (benomüül, karbendasiim ja metüültiofanaat), müklobutaniili, glüfosaadi, trimetüülsulfooniumi ning fenpropimorfi jääkide normides.

| (4) | Kloromekvaadi kohta on komisjonile edastatud teavet, mis lubab kohaldada pirnide puhul kolme aasta jooksul ajutist jääkide piirnormi. |
| --- | --- |

(4)

Kloromekvaadi kohta on komisjonile edastatud teavet, mis lubab kohaldada pirnide puhul kolme aasta jooksul ajutist jääkide piirnormi.

| (5) | Tarbijate eluaegset kokkupuudet kõnealuse pestitsiidiga selliste toiduainete kaudu, mis võivad sisaldada selle pestitsiidi jääke, on hinnatud ja mõõdetud vastavalt ühenduses kasutatavatele menetlustele ja tavadele, võttes arvesse Maailma Terviseorganisatsiooni avaldatud juhiseid (3) Kõnealuses hindamises võeti arvesse, et abamektiini ja tiabendasooli kasutatakse ka veterinaarravimina toiduks tarvitatavate loomade puhul ning et nende kahe aine jääkide piirnormid on kehtestatud kooskõlas nõukogu määruse (EMÜ) nr 2377/90 (4) sätetega. Selle hindamise ja mõõtmise põhjal tuleks määrata kõnealuste pestitsiidide jääkide piirnormid viisil, mis tagab, et ei ületata aktsepteeritavat päevadoosi. |
| --- | --- |

(5)

Tarbijate eluaegset kokkupuudet kõnealuse pestitsiidiga selliste toiduainete kaudu, mis võivad sisaldada selle pestitsiidi jääke, on hinnatud ja mõõdetud vastavalt ühenduses kasutatavatele menetlustele ja tavadele, võttes arvesse Maailma Terviseorganisatsiooni avaldatud juhiseid (3) Kõnealuses hindamises võeti arvesse, et abamektiini ja tiabendasooli kasutatakse ka veterinaarravimina toiduks tarvitatavate loomade puhul ning et nende kahe aine jääkide piirnormid on kehtestatud kooskõlas nõukogu määruse (EMÜ) nr 2377/90 (4) sätetega. Selle hindamise ja mõõtmise põhjal tuleks määrata kõnealuste pestitsiidide jääkide piirnormid viisil, mis tagab, et ei ületata aktsepteeritavat päevadoosi.

| (6) | Benomüüli, karbendasiimi, metüültiofanaadi, fenpropimorfi ja kloromekvaadi puhul, millel on olemas akuutne etalonannus (ARfD), on tarbijate akuutset kokkupuudet selliste toiduainete kaudu, mis võivad sisaldada nende pestitsiidide jääke, hinnatud ja mõõdetud vastavalt Euroopa Ühenduses kasutatavatele menetlustele ja tavadele, võttes arvesse Maailma Terviseorganisatsiooni avaldatud juhiseid. Taimede teaduskomitee arvamusi, eriti nõuandeid ja soovitusi pestitsiididega töödeldud toiduainete tarbijate kaitse osas, (5) on arvesse võetud. Toidu kaudu omastamise hindamise põhjal tuleks kõnealuste pestitsiidide jääkide piirnormid kindlaks määrata viisil, mis tagab, et ei ületata akuutset etalonannust. Teiste ainete puhul on kättesaadava teabe hindamine näidanud, et akuutset etalonannust ei nõuta ja seetõttu ei ole lühiajaline hinnang vajalik. |
| --- | --- |

(6)

Benomüüli, karbendasiimi, metüültiofanaadi, fenpropimorfi ja kloromekvaadi puhul, millel on olemas akuutne etalonannus (ARfD), on tarbijate akuutset kokkupuudet selliste toiduainete kaudu, mis võivad sisaldada nende pestitsiidide jääke, hinnatud ja mõõdetud vastavalt Euroopa Ühenduses kasutatavatele menetlustele ja tavadele, võttes arvesse Maailma Terviseorganisatsiooni avaldatud juhiseid. Taimede teaduskomitee arvamusi, eriti nõuandeid ja soovitusi pestitsiididega töödeldud toiduainete tarbijate kaitse osas, (5) on arvesse võetud. Toidu kaudu omastamise hindamise põhjal tuleks kõnealuste pestitsiidide jääkide piirnormid kindlaks määrata viisil, mis tagab, et ei ületata akuutset etalonannust. Teiste ainete puhul on kättesaadava teabe hindamine näidanud, et akuutset etalonannust ei nõuta ja seetõttu ei ole lühiajaline hinnang vajalik.

| (7) | Kui taimekaitsevahendite lubatud kasutamise tagajärjel ei leita toiduaines või selle pinnal märkimisväärselt pestitsiidijääke või kui nende kasutamine ei ole lubatud või kui liikmesriikide poolt lubatud kasutamiseks ei ole esitatud vajalikke andmeid või kui kolmandates riikides kasutamiseks ei ole esitatud asjaomaseid andmeid ning selle tagajärjel leidub ühenduse turul ringlusse lastavates toiduainetes või nende pinnal pestitsiidide jääke, määratakse jääkide piirnormid kindlaks vastavalt alumisele määramispiirile. |
| --- | --- |

(7)

Kui taimekaitsevahendite lubatud kasutamise tagajärjel ei leita toiduaines või selle pinnal märkimisväärselt pestitsiidijääke või kui nende kasutamine ei ole lubatud või kui liikmesriikide poolt lubatud kasutamiseks ei ole esitatud vajalikke andmeid või kui kolmandates riikides kasutamiseks ei ole esitatud asjaomaseid andmeid ning selle tagajärjel leidub ühenduse turul ringlusse lastavates toiduainetes või nende pinnal pestitsiidide jääke, määratakse jääkide piirnormid kindlaks vastavalt alumisele määramispiirile.

| (8) | Seetõttu on asjakohane määrata kindlaks kõnealuste pestitsiidide uued jääkide piirnormid. |
| --- | --- |

(8)

Seetõttu on asjakohane määrata kindlaks kõnealuste pestitsiidide uued jääkide piirnormid.

| (9) | Ajutiste piirnormide kehtestamine või muutmine ühenduse tasandil ei takista liikmesriikidel kehtestada ajutisi glüfosaadi, trimetüülsulfooniumi ja trifloksüstrobiini jääkide piirnorme vastavalt direktiivi 91/414/EMÜ artikli 4 lõike 1 punktile f ja sama direktiivi VI lisale. Nelja aastat peetakse kõnealuste ainete edasiste kasutusviiside lubamiseks piisavaks. Pärast seda peaksid ühenduse jääkide piirnormid muutuma lõplikuks. |
| --- | --- |

(9)

Ajutiste piirnormide kehtestamine või muutmine ühenduse tasandil ei takista liikmesriikidel kehtestada ajutisi glüfosaadi, trimetüülsulfooniumi ja trifloksüstrobiini jääkide piirnorme vastavalt direktiivi 91/414/EMÜ artikli 4 lõike 1 punktile f ja sama direktiivi VI lisale. Nelja aastat peetakse kõnealuste ainete edasiste kasutusviiside lubamiseks piisavaks. Pärast seda peaksid ühenduse jääkide piirnormid muutuma lõplikuks.

| (10) | Mitmes liikmesriigis kasutatakse lupiine toiduks. Glüfosaadi kasutamine lupiinide puhul on lubatud. Seetõttu on vajalik lisada kirje “lupiinid” ja kehtestada jääkide piirnormid lupiinidele, et kaitsta tarbijaid lupiinide puhul kasutatavate pestitsiidide ülemääraste jääkide eest. |
| --- | --- |

(10)

Mitmes liikmesriigis kasutatakse lupiine toiduks. Glüfosaadi kasutamine lupiinide puhul on lubatud. Seetõttu on vajalik lisada kirje “lupiinid” ja kehtestada jääkide piirnormid lupiinidele, et kaitsta tarbijaid lupiinide puhul kasutatavate pestitsiidide ülemääraste jääkide eest.

| (11) | Seepärast tuleks direktiivi 90/642/EMÜ vastavalt muuta. |
| --- | --- |

(11)

Seepärast tuleks direktiivi 90/642/EMÜ vastavalt muuta.

| (12) | Käesoleva direktiiviga ettenähtud meetmed on kooskõlas toiduahela ja loomatervishoiu alalise komitee arvamusega, |
| --- | --- |

(12)

Käesoleva direktiiviga ettenähtud meetmed on kooskõlas toiduahela ja loomatervishoiu alalise komitee arvamusega,

ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA DIREKTIIVI:

Artikkel 1

Direktiivi 90/642/EMÜ muudetakse järgmiselt.

| 1. | I lisa rühma “3. Kaunviljad” lisatakse kirje “Lupiinid” nii, et väljend “Kogu saadus” viimases tulbas hõlmaks kõiki nelja kannet. |
| --- | --- |

1.

I lisa rühma “3. Kaunviljad” lisatakse kirje “Lupiinid” nii, et väljend “Kogu saadus” viimases tulbas hõlmaks kõiki nelja kannet.

| 2. | II lisa muudetakse vastavalt käesoleva direktiivi lisale. |
| --- | --- |

2.

II lisa muudetakse vastavalt käesoleva direktiivi lisale.

Artikkel 2

1.   Liikmesriigid võtavad vastu ja avaldavad käesoleva direktiivi täitmiseks vajalikud õigusnormid hiljemalt 20. jaanuariks 2007, v.a benomüülide rühm ja metüültiofanaat, mille puhul kõnealused õigusnormid võetakse vastu ja avaldatakse 14. septembriks 2006, ning kloromekvaadi puhul 31. juuliks 2006. Nad edastavad kõnealuste normide teksti ning kõnealuste normide ja käesoleva direktiivi vahelise vastavustabeli viivitamata komisjonile.

Nad kohaldavad kõnealuseid norme alates 21. jaanuarist 2007, v.a benomüülide rühm ja metüültiofanaat, mille puhul neid kohaldatakse 15. septembrist 2006, ning kloromekvaadi puhul 1. augustist 2006.

Kui liikmesriigid need normid vastu võtavad, lisavad nad nendesse või nende normide ametliku avaldamise korral nende juurde viite käesolevale direktiivile. Viitamise viisi näevad ette liikmesriigid.

2.   Liikmesriigid edastavad komisjonile käesoleva direktiiviga reguleeritavas valdkonnas nende poolt vastuvõetud põhiliste siseriiklike õigusnormide teksti.

Artikkel 3

Käesolev direktiiv jõustub kahekümnendal päeval pärast selle avaldamist Euroopa Liidu Teatajas.

Artikkel 4

Käesolev direktiiv on adresseeritud liikmesriikidele.

Brüssel, 7. juuli 2006

Komisjoni nimel

komisjoni liige

Markos KYPRIANOU

---

(1)  EÜT L 350, 14.12.1990, lk 71. Direktiivi on viimati muudetud komisjoni direktiiviga 2006/53/EÜ (ELT L 154, 8.6.2006, lk 11).

1

(2)  EÜT L 230, 19.8.1991, lk 1. Direktiivi on viimati muudetud komisjoni direktiiviga 2006/45/EÜ (ELT L 130, 18.5.2006, lk 27).

2

(3)  Juhised pestitsiidijääkide toidu kaudu omandamise hindamiseks (läbi vaadatud), mille on koostanud GEMS/Food Programme koostöös pestitsiidijääkide Codex komiteega, avaldatud Maailma Terviseorganisatsiooni poolt 1997. aastal (WHO/FSF/FOS.97.7).

3

(4)  EÜT L 224, 18.8.1990, lk 1. Määrust on viimati muudetud komisjoni määrusega (EÜ) nr 205/2006 (ELT L 34, 7.2.2006, lk 21).

4

(5)  Arvamus nõukogu direktiivide 86/362/EMÜ, 86/363/EMÜ ja 90/642/EMÜ lisade muutmisega seotud küsimuste kohta (taimede teaduskomitee avaldatud arvamus, 14. juuli 1998). Arvamus seoses erinevate pestitsiidijääkidega puu- ja köögiviljades (taimede teaduskomitee avaldatud arvamus, 14. juuli 1998) http://europa.eu.int/comm/food/fs/sc/scp/outcome_ppp_en.html.

5

---

LISA

Direktiivi 90/642/EMÜ II lisa muudetakse järgmiselt.

| 1. | Kloromekvaadi kandes asendatakse pirnide puhul märkus t järgmisega: “Ajutine piirnorm 0,2 mg/kg kehtib kuni 31. juulini 2009”. |
| --- | --- |

1.

Kloromekvaadi kandes asendatakse pirnide puhul märkus t järgmisega: “Ajutine piirnorm 0,2 mg/kg kehtib kuni 31. juulini 2009”.

| 2. | A-osas asendatakse trifloksüstrobiini, tiabendasooli, abamektiini, benomüüli, karbendasiimi, metüültiofanaadi, müklobutaniili, glüfosaadi, trimetüülsulfooniumi ja fenpropimorfi tulbad järgmisega: | Pestitsiidide jäägid ja jääkide piirnormid (mg/kg) |
| --- | --- | --- |
| Tooterühmad ja üksiktooted, mille suhtes kohaldatakse jääkide piirnorme | Trifloksüstrobiin | Tiaben-dasool | Abamektiin (avermektiin B1a, avermektiin B1b ja avermektiin B1a isomeeri delta-8,9 summa) | Benomüüli ja karbendasiimi summa, väljendatud karbendasiimina | Metüültiofanaat | Müklobutaniil | Glüfosaat | Trimetüülsulfooniumkatioon glüfosaadi kasutamisest | Fenpro-pimorf |
| “1. | Värsked, kuivatatud või külmutamise teel säilitatud kuumtöötlemata suhkrulisandita puuviljad; pähklid | | | | | | | | | |
| | i) | TSITRUSVILJAD | 0,3 (2) | 5 | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 3 | | | 0,05 (1) |
| | | Greipfruudid | | | | | | | | | |
| | | Sidrunid | | | | | | | | | |
| | | Laimid | | | | | | | | | |
| | | Mandariinid (sh klementiinid ja samalaadsed hübriidid) | | | | | | | 0,5 (2) | 0,5 (2) | |
| | | Apelsinid | | | | | | | 0,5 (2) | 0,5 (2) | |
| | | Pomelod | | | | | | | | | |
| | | Muud | | | | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| | ii) | PÄHKLID (koortega või ilma) | 0,02 (1)
   (2) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1) | 0,2 | 0,05 (1) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Mandlid | | | | | | | | | |
| | | Brasiilia pähklid | | | | | | | | | |
| | | Kašupähklid | | | | | | | | | |
| | | Kastanid | | | | | | | | | |
| | | Kookospähklid | | | | | | | | | |
| | | Sarapuupähklid | | | | | | | | | |
| | | Makadaamiapähklid | | | | | | | | | |
| | | Pekanipähklid | | | | | | | | | |
| | | Piiniapähklid | | | | | | | | | |
| | | Pistaatsiapähklid | | | | | | | | | |
| | | Kreeka pähklid | | | | | | | | | |
| | | Muud | | | | | | | | | |
| | iii) | ÕUNVILJAD | 0,5 (2) | | 0,01 (1) | 0,2 | 0,5 | 0,5 | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Õunad | | 5 | | | | | | | |
| | | Pirnid | | 5 | | | | | | | |
| | | Aivad | | | | | | | | | |
| | | Muud | | 0,05 (1) | | | | | | | |
| | iv) | LUUVILJAD | | 0,05 (1) | 0,01 (1) | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Aprikoosid | 1 (2) | | | 0,2 | 2 | 0,3 | | | |
| | | Kirsid | 1 (2) | | | 0,5 | 0,3 | 1 | | | |
| | | Virsikud (sh nektariinid ja samalaadsed hübriidid) | 1 (2) | | | 0,2 | 2 | 0,5 | | | |
| | | Ploomid | 0,2 (2) | | | 0,5 | 0,3 | 0,5 | | | |
| | | Muud | 0,02 (1)
   (2) | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | |
| | v) | MARJAD JA VÄIKESED PUUVILJAD | | 0,05 (1) | | | | | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | a) | Laua- ja veiniviinamarjad | 5 (2) | | 0,01 (1) | | | 1 | 0,5 (2) | | 0,05 (1) |
| | | | Lauaviinamarjad | | | | 0,3 | 0,1 (1) | | | | |
| | | | Veiniviinamarjad | | | | 0,5 | 3 | | | | |
| | | b) | Maasikad (välja arvatud metsmaasikad) | 0,5 (1)
   (2) | | 0,1 | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 1 | 0,1 (1)
   (2) | | 1 |
| | | c) | Koguviljad (välja arvatud metsamarjad) | 0,02 (1)
   (2) | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | | 1 |
| | | | Murakad | | | 0,1 | | | 1 | | | |
| | | | Põldmurakad | | | | | | | | | |
| | | | Logani murakad | | | | | | | | | |
| | | | Vaarikad | | | 0,1 | | | 1 | | | |
| | | | Muud | | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | d) | Muud väikesed puuviljad ja marjad (v.a metsamarjad) | | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | | 1 |
| | | | Mustikad | | | | | | | | | |
| | | | Jõhvikad | | | | | | | | | |
| | | | Sõstrad (punased, mustad ja valged) | 1 (2) | | | | | 1 | | | |
| | | | Karusmarjad | 1 (2) | | | | | 1 | | | |
| | | | Muud | 0,02 (1)
   (2) | | | | | 0,02 (1) | | | |
| | | e) | Looduses kasvavad marjad ja viljad | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1)
   (2) | | 0,05 (1) |
| | vi) | MUUD VILJAD | | | 0,01 (1) | | | | | | |
| | | Avokaadod | | 15 | | | | | | | |
| | | Banaanid | 0,05 (2) | 5 | | | | 2 | | | 2 |
| | | Datlid | | | | | | | | | |
| | | Viigimarjad | | | | | | | | | |
| | | Kiivid | | | | | | | | | |
| | | Kääbusapelsinid | | | | | | | | | |
| | | Litšid | | | | | | | | | |
| | | Mangod | | 5 | | | | | | | |
| | | Oliivid (lauaoliivid) | | | | | | | | | |
| | | Oliivid (õli ekstraheerimiseks) | | | | | | | 1 (2) | 1 (2) | |
| | | Papaiad | | 10 | | 0,2* | 1 | | | | |
| | | Purpur-kannatuslille viljad (granadillid) | | | | | | | | | |
| | | Ananassid | | | | | | | | | |
| | | Granaatõunad | | | | | | | | | |
| | | Muud | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| 2. | Köögiviljad: värsked või kuumtöötlemata, külmutatud või kuivatatud | | | | | | | | | |
| | i) | JUUR- JA MUGULKÖÖGIVILJAD | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Söögipeet | | | | | | | | | |
| | | Porgand | | | | | | 0,2 | | | |
| | | Kassaava | | 15 | | | | | | | |
| | | Juurseller | | | | | | | | | |
| | | Mädarõigas | | | | | | 0,2 | | | |
| | | Maapirn | | | | | | | | | |
| | | Pastinaak | | | | | | 0,2 | | | |
| | | Juurpetersell | | | | | | 0,2 | | | |
| | | Redis | | | | | | | | | |
| | | Aed-piimjuur | | | | | | | | | |
| | | Bataat | | 15 | | | | | | | |
| | | Kaalikas | | | | | | | | | |
| | | Naeris | | | | | | | | | |
| | | Jamss | | 15 | | | | | | | |
| | | Muud | | 0,05 (1) | | | | 0,02 (1) | | | |
| | ii) | SIBULKÖÖGIVILJAD | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Küüslauk | | | | | | | | | |
| | | Sibul | | | | | | | | | |
| | | Šalott | | | | | | | | | |
| | | Talisibul | | | | | | | | | |
| | | Muud | | | | | | | | | |
| | iii) | VILIKÖÖGIVILJAD | | 0,05 (1) | | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | a) | Maavitsalised | | | | | | | | | |
| | | | Tomatid | 0,5 (2) | | 0,02 | 0,5 | 2 | 0,3 | | | |
| | | | Paprikad | | | 0,05 | | | 0,5 | | | |
| | | | Baklažaanid | | | 0,02 | 0,5 | 2 | 0,3 | | | |
| | | | Okra | | | | 2 | 1 | | | | |
| | | | Muud | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | |
| | | b) | Kõrvitsalised – söödava koorega | 0,2 (2) | | 0,02 | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,1 | | | |
| | | | Kurgid | | | | | | | | | |
| | | | Kornišonid | | | | | | | | | |
| | | | Kabatšokid | | | | | | | | | |
| | | | Muud | | | | | | | | | |
| | | c) | Kõrvitsalised – mittesöödava koorega | | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,3 | 0,2 | | | |
| | | | Melonid | 0,3 (2) | | | | | | | | |
| | | | Taldrikkõrvits | | | | | | | | | |
| | | | Arbuusid | | | | | | | | | |
| | | | Muud | 0,02 (1)
   (2) | | | | | | | | |
| | | d) | Suhkrumais | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | |
| | iv) | KAPSASKÖÖGIVILJAD | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | a) | Õisik-kapsad | | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | | | 0,05 (1) |
| | | | Spargelkapsas (sh asparkapsas) | | 5 | | | | | | | |
| | | | Lillkapsas | | | | | | | | | |
| | | | Muud | | 0,05 (1) | | | | | | | |
| | | b) | Peakapsad | | 0,05 (1) | | | | | | | |
| | | | Rooskapsas | | | | 0,5 | 1 | | | | 0,5 |
| | | | Peakapsas | | | | | | | | | |
| | | | Muud | | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | | | 0,05 (1) |
| | | c) | Lehtkapsad | | 0,05 (1) | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | | | 0,05 (1) |
| | | | Hiina kapsas | | | | | | | | | |
| | | | Lehtkapsas | | | | | | | | | |
| | | | Muud | | | | | | | | | |
| | | d) | Nuikapsas | | 0,05 (1) | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | | | 0,05 (1) |
| | v) | LEHTKÖÖGIVILI JA VÄRSKED MAITSETAIMED | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | a) | Aedsalat jms | | | 0,1 | | | | | | |
| | | | Salatkress | | | | | | | | | |
| | | | Põldkännak | | | | | | 5 | | | |
| | | | Aedsalat | | | | | | | | | |
| | | | Eskariool (sile endiiviasigur) | | | | | | | | | |
| | | | Põld-võõrkapsas (ruccola salat) | | | | | | | | | |
| | | | Kapsalehed ja -leherootsud | | | | | | | | | |
| | | | Muud | | | | | | 0,02 (1) | | | |
| | | b) | Spinat jms | | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | | Aedspinat | | | | | | | | | |
| | | | Lehtpeet (mangold) | | | | | | | | | |
| | | | Muud | | | | | | | | | |
| | | c) | Ürt-allikkerss | | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | d) | Harilik sigur | | 1 | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | e) | Maitsetaimed | | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | | Aed-harakputk | | | | | | | | | |
| | | | Murulauk | | | | | | | | | |
| | | | Petersell | | | | | | | | | |
| | | | Lehtseller | | | | | | | | | |
| | | | Muud | | | | | | | | | |
| | vi) | KAUNVILJAD (värsked) | | 0,05 (1) | 0,01 (1) | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Oad (kaunadega) | 0,5 (2) | | | 0,2 | 0,1 (1) | 0,3 | | | |
| | | Oad (kaunadeta) | | | | | | | | | |
| | | Herned (kaunadega) | | | | 0,2 | 0,1 (1) | | | | |
| | | Herned (kaunadeta) | | | | | | | | | |
| | | Muud | 0,02 (1)
   (2) | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | |
| | vii) | VARSKÖÖGIVILJAD (värsked) | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Porrulauk | | | | | | | | | |
| | | Hispaania artišokk | | | | | | | | | |
| | | Seller | | | | | | | | | |
| | | Apteegitill | | | | | | | | | |
| | | Artišok | | | | | | 0,5 | | | |
| | | Porrulauk | | | | | | | | | 1 |
| | | Rabarber | | | | | | | | | |
| | | Muud | | | | | | 0,02 (1) | | | 0,05 (1) |
| | viii) | SEENED | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | 0,05 (1) |
| | | a) | Kultuurseened | | 10 | | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | b) | Looduses kasvavad seened | | 0,05 (1) | | | | | 50 (2) | 20 (2) | |
| 3 | Kaunviljad (kuivatatud) | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | Oad | | | | | | | 2 (2) | | |
| | Läätsed | | | | | | | | | |
| | Herned | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Lupiinid | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Muud | | | | | | | 0,1 (1)
   (2) | | |
| 4 | Õliseemned | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) | 0,02 (1) | | | 0,05 (1) | | | 0,05 (1) |
| | Linaseemned | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Maapähkel | | | | | | | | | |
| | Mooniseemned | | | | | | | | | |
| | Seesamiseemned | | | | | | | | | |
| | Päevalilleseemned | | | | | | | 20 (2) | | |
| | Rapsiseemned | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Sojaoad | | | | 0,2 | 0,3 | | 20 (2) | 10 (2) | |
| | Sinepiseemned | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Puuvillaseemned | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Kanepiseemned | | | | | | | | | |
| | Muud | | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| 5. | Kartulid | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,5 (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | Varajane kartul | | 0,05 (1) | | | | | | | |
| | Säilituskartul | | 15 | | | | | | | |
| 6. | Tee (kuivatatud lehed ja varred, fermenteeritud või muul viisil töödeldud, Camellia sinensis) | 0,05 (1)
   (2) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,05 (1) | 2 (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,1 (1) |
| 7. | Humal (kuivatatud), sh humalakäbigraanulid ja kontsentreerimata pulber | 30 (2) | 0,1 (1) | 0,05 | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 2 | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 10 |

2.

A-osas asendatakse trifloksüstrobiini, tiabendasooli, abamektiini, benomüüli, karbendasiimi, metüültiofanaadi, müklobutaniili, glüfosaadi, trimetüülsulfooniumi ja fenpropimorfi tulbad järgmisega:

Pestitsiidide jäägid ja jääkide piirnormid (mg/kg)

Tooterühmad ja üksiktooted, mille suhtes kohaldatakse jääkide piirnorme

Trifloksüstrobiin

Tiaben-dasool

Abamektiin (avermektiin B1a, avermektiin B1b ja avermektiin B1a isomeeri delta-8,9 summa)

Benomüüli ja karbendasiimi summa, väljendatud karbendasiimina

Metüültiofanaat

Müklobutaniil

Glüfosaat

Trimetüülsulfooniumkatioon glüfosaadi kasutamisest

Fenpro-pimorf

“1.

Värsked, kuivatatud või külmutamise teel säilitatud kuumtöötlemata suhkrulisandita puuviljad; pähklid

i)

TSITRUSVILJAD

0,3 (2)

5

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

3

0,05 (1)

Greipfruudid

Sidrunid

Laimid

Mandariinid (sh klementiinid ja samalaadsed hübriidid)

0,5 (2)

0,5 (2)

Apelsinid

0,5 (2)

0,5 (2)

Pomelod

Muud

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

ii)

PÄHKLID (koortega või ilma)

0,02 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)

0,2

0,05 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Mandlid

Brasiilia pähklid

Kašupähklid

Kastanid

Kookospähklid

Sarapuupähklid

Makadaamiapähklid

Pekanipähklid

Piiniapähklid

Pistaatsiapähklid

Kreeka pähklid

Muud

iii)

ÕUNVILJAD

0,5 (2)

0,01 (1)

0,2

0,5

0,5

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Õunad

5

Pirnid

5

Aivad

Muud

0,05 (1)

iv)

LUUVILJAD

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Aprikoosid

1 (2)

0,2

2

0,3

Kirsid

1 (2)

0,5

0,3

1

Virsikud (sh nektariinid ja samalaadsed hübriidid)

1 (2)

0,2

2

0,5

Ploomid

0,2 (2)

0,5

0,3

0,5

Muud

0,02 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

v)

MARJAD JA VÄIKESED PUUVILJAD

0,05 (1)

0,05 (1)
   (2)

a)

Laua- ja veiniviinamarjad

5 (2)

0,01 (1)

1

0,5 (2)

0,05 (1)

Lauaviinamarjad

0,3

0,1 (1)

Veiniviinamarjad

0,5

3

b)

Maasikad (välja arvatud metsmaasikad)

0,5 (1)
   (2)

0,1

0,1 (1)

0,1 (1)

1

0,1 (1)
   (2)

1

c)

Koguviljad (välja arvatud metsamarjad)

0,02 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

1

Murakad

0,1

1

Põldmurakad

Logani murakad

Vaarikad

0,1

1

Muud

0,01 (1)

0,02 (1)

d)

Muud väikesed puuviljad ja marjad (v.a metsamarjad)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

1

Mustikad

Jõhvikad

Sõstrad (punased, mustad ja valged)

1 (2)

1

Karusmarjad

1 (2)

1

Muud

0,02 (1)
   (2)

0,02 (1)

e)

Looduses kasvavad marjad ja viljad

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)

vi)

MUUD VILJAD

0,01 (1)

Avokaadod

15

Banaanid

0,05 (2)

5

2

2

Datlid

Viigimarjad

Kiivid

Kääbusapelsinid

Litšid

Mangod

5

Oliivid (lauaoliivid)

Oliivid (õli ekstraheerimiseks)

1 (2)

1 (2)

Papaiad

10

0,2*

1

Purpur-kannatuslille viljad (granadillid)

Ananassid

Granaatõunad

Muud

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

2.

Köögiviljad: värsked või kuumtöötlemata, külmutatud või kuivatatud

i)

JUUR- JA MUGULKÖÖGIVILJAD

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Söögipeet

Porgand

0,2

Kassaava

15

Juurseller

Mädarõigas

0,2

Maapirn

Pastinaak

0,2

Juurpetersell

0,2

Redis

Aed-piimjuur

Bataat

15

Kaalikas

Naeris

Jamss

15

Muud

0,05 (1)

0,02 (1)

ii)

SIBULKÖÖGIVILJAD

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Küüslauk

Sibul

Šalott

Talisibul

Muud

iii)

VILIKÖÖGIVILJAD

0,05 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

a)

Maavitsalised

Tomatid

0,5 (2)

0,02

0,5

2

0,3

Paprikad

0,05

0,5

Baklažaanid

0,02

0,5

2

0,3

Okra

2

1

Muud

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

b)

Kõrvitsalised – söödava koorega

0,2 (2)

0,02

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1

Kurgid

Kornišonid

Kabatšokid

Muud

c)

Kõrvitsalised – mittesöödava koorega

0,01 (1)

0,1 (1)

0,3

0,2

Melonid

0,3 (2)

Taldrikkõrvits

Arbuusid

Muud

0,02 (1)
   (2)

d)

Suhkrumais

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

iv)

KAPSASKÖÖGIVILJAD

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

a)

Õisik-kapsad

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

Spargelkapsas (sh asparkapsas)

5

Lillkapsas

Muud

0,05 (1)

b)

Peakapsad

0,05 (1)

Rooskapsas

0,5

1

0,5

Peakapsas

Muud

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

c)

Lehtkapsad

0,05 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

Hiina kapsas

Lehtkapsas

Muud

d)

Nuikapsas

0,05 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

v)

LEHTKÖÖGIVILI JA VÄRSKED MAITSETAIMED

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

a)

Aedsalat jms

0,1

Salatkress

Põldkännak

5

Aedsalat

Eskariool (sile endiiviasigur)

Põld-võõrkapsas (ruccola salat)

Kapsalehed ja -leherootsud

Muud

0,02 (1)

b)

Spinat jms

0,01 (1)

0,02 (1)

Aedspinat

Lehtpeet (mangold)

Muud

c)

Ürt-allikkerss

0,01 (1)

0,02 (1)

d)

Harilik sigur

1

0,01 (1)

0,02 (1)

e)

Maitsetaimed

0,01 (1)

0,02 (1)

Aed-harakputk

Murulauk

Petersell

Lehtseller

Muud

vi)

KAUNVILJAD (värsked)

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Oad (kaunadega)

0,5 (2)

0,2

0,1 (1)

0,3

Oad (kaunadeta)

Herned (kaunadega)

0,2

0,1 (1)

Herned (kaunadeta)

Muud

0,02 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

vii)

VARSKÖÖGIVILJAD (värsked)

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

Porrulauk

Hispaania artišokk

Seller

Apteegitill

Artišok

0,5

Porrulauk

1

Rabarber

Muud

0,02 (1)

0,05 (1)

viii)

SEENED

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,05 (1)

a)

Kultuurseened

10

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

b)

Looduses kasvavad seened

0,05 (1)

50 (2)

20 (2)

3

Kaunviljad (kuivatatud)

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Oad

2 (2)

Läätsed

Herned

10 (2)

Lupiinid

10 (2)

Muud

0,1 (1)
   (2)

4

Õliseemned

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,02 (1)

0,05 (1)

0,05 (1)

Linaseemned

10 (2)

Maapähkel

Mooniseemned

Seesamiseemned

Päevalilleseemned

20 (2)

Rapsiseemned

10 (2)

Sojaoad

0,2

0,3

20 (2)

10 (2)

Sinepiseemned

10 (2)

Puuvillaseemned

10 (2)

Kanepiseemned

Muud

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

5.

Kartulid

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,5 (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Varajane kartul

0,05 (1)

Säilituskartul

15

6.

Tee (kuivatatud lehed ja varred, fermenteeritud või muul viisil töödeldud, Camellia sinensis)

0,05 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

2 (2)

0,05 (1)
   (2)

0,1 (1)

7.

Humal (kuivatatud), sh humalakäbigraanulid ja kontsentreerimata pulber

30 (2)

0,1 (1)

0,05

0,1 (1)

0,1 (1)

2

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

10

---

(1)  Väljendab alumist määramispiiri.

(2)  Näitab, et jääkide piirnormid on kehtestatud ajutiselt vastavalt direktiivi 91/414/EMÜ artikli 4 lõike 1 punktile f.”

---

| 27.7.2006 | ET | Euroopa Liidu Teataja | L 206/12 |
| --- | --- | --- | --- |

27.7.2006

ET

Euroopa Liidu Teataja

L 206/12

---

KOMISJONI DIREKTIIV 2006/61/EÜ,

7. juuli 2006,

millega muudetakse komisjoni direktiivide 86/362/EMÜ, 86/363/EMÜ ja 90/642/EMÜ lisasid seoses atrasiini, etüülasiinfossi, tsüflutriini, etefooni, fentiooni, metamidofossi, metomüüli, parakvaadi ja triasofossi jääkide piirnormidega

(EMPs kohaldatav tekst)

EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON,

võttes arvesse Euroopa Ühenduse asutamislepingut,

võttes arvesse nõukogu 24. juuli 1986. aasta direktiivi 86/362/EMÜ teraviljas sisalduvate ja selle pinnal esinevate pestitsiidide jääkide lubatud piirnormide kehtestamise kohta, (1) eriti selle artiklit 10,

võttes arvesse nõukogu 24. juuli 1986. aasta direktiivi 86/363/EMÜ loomses toidus sisalduvate ja selle pinnal esinevate pestitsiidijääkide lubatud piirnormide kehtestamise kohta, (2) eriti selle artiklit 10,

võttes arvesse nõukogu 27. novembri 1990. aasta direktiivi 90/642/EMÜ teatavates taimset päritolu saadustes, sealhulgas puu- ja köögiviljas, sisalduvate ja nende pinnal esinevate pestitsiidide jääkide lubatud piirnormide kehtestamise kohta, (3) eriti selle artiklit 7,

võttes arvesse nõukogu 15. juuli 1991. aasta direktiivi 91/414/EMÜ taimekaitsevahendite turuleviimise kohta, (4) eriti selle artikli 4 lõike 1 punkti f,

ning arvestades järgmist:

| (1) | Teravilja ja taimset päritolu toodete, sealhulgas puu- ja juurvilja puhul kajastab jääkide määr tõhusaks taimekaitseks vajaliku pestitsiidide miinimumkoguse kasutamist, nii et jääkaine kogus oleks võimalikult väike ja toksikoloogiliselt vastuvõetav, pidades silmas eelkõige keskkonnakaitset ja jääkide määra, mida tarbijad hinnangulist toidu kaudu omastavad. Loomset päritolu toiduainete puhul kajastab jääkide määr loomade söötmist pestitsiididega töödeldud teravilja ja taimset päritolu toodetega ning mõningatel juhtudel ka veterinaarravimite tarvitamise otseseid tagajärgi. Ühenduses kohaldatavad jääkide piirnormid kajastavad sellist jääkide koguse ülempiiri, mida tooted võivad heade põllumajandustavade järgimise korral sisaldada. |
| --- | --- |

(1)

Teravilja ja taimset päritolu toodete, sealhulgas puu- ja juurvilja puhul kajastab jääkide määr tõhusaks taimekaitseks vajaliku pestitsiidide miinimumkoguse kasutamist, nii et jääkaine kogus oleks võimalikult väike ja toksikoloogiliselt vastuvõetav, pidades silmas eelkõige keskkonnakaitset ja jääkide määra, mida tarbijad hinnangulist toidu kaudu omastavad. Loomset päritolu toiduainete puhul kajastab jääkide määr loomade söötmist pestitsiididega töödeldud teravilja ja taimset päritolu toodetega ning mõningatel juhtudel ka veterinaarravimite tarvitamise otseseid tagajärgi. Ühenduses kohaldatavad jääkide piirnormid kajastavad sellist jääkide koguse ülempiiri, mida tooted võivad heade põllumajandustavade järgimise korral sisaldada.

| (2) | Pestitsiidide jääkide piirnorme jälgitakse pidevalt ning muudetakse uue teabe ja uute andmete arvessevõtmiseks. Jääkide piirnormideks määratakse nende alumine määramispiir, kui taimekaitsevahendite lubatud kasutamise tagajärjel ei leita toiduaines või selle pinnal märkimisväärselt pestitsiidijääke, või kui nende kasutamine ei olnud lubatud, kui liikmesriikide poolt lubatud kasutamiseks ei esitatud vajalikke andmeid või kui kolmandates riikides kasutamiseks ei esitatud asjaomaseid andmeid ning selle tagajärjel leidub ühenduse turul ringlusesse lastavates toiduainetes või nende pinnal pestitsiidide jääke. |
| --- | --- |

(2)

Pestitsiidide jääkide piirnorme jälgitakse pidevalt ning muudetakse uue teabe ja uute andmete arvessevõtmiseks. Jääkide piirnormideks määratakse nende alumine määramispiir, kui taimekaitsevahendite lubatud kasutamise tagajärjel ei leita toiduaines või selle pinnal märkimisväärselt pestitsiidijääke, või kui nende kasutamine ei olnud lubatud, kui liikmesriikide poolt lubatud kasutamiseks ei esitatud vajalikke andmeid või kui kolmandates riikides kasutamiseks ei esitatud asjaomaseid andmeid ning selle tagajärjel leidub ühenduse turul ringlusesse lastavates toiduainetes või nende pinnal pestitsiidide jääke.

| (3) | Komisjonile on teatatud, et mõnede pestitsiidide puhul võivad jääkide kehtivad piirnormid vajada läbivaatamist, võttes arvesse, kuivõrd kättesaadav on uus toksikoloogia ja tarbimise alane teave. Komisjon on palunud asjakohastel referentliikmesriikidel teha ettepanekuid ühenduses jääkide suhtes kohaldatavate piirnormide läbivaatamise kohta. Niisugused ettepanekud edastati komisjonile. |
| --- | --- |

(3)

Komisjonile on teatatud, et mõnede pestitsiidide puhul võivad jääkide kehtivad piirnormid vajada läbivaatamist, võttes arvesse, kuivõrd kättesaadav on uus toksikoloogia ja tarbimise alane teave. Komisjon on palunud asjakohastel referentliikmesriikidel teha ettepanekuid ühenduses jääkide suhtes kohaldatavate piirnormide läbivaatamise kohta. Niisugused ettepanekud edastati komisjonile.

| (4) | Tarbijate eluaegset ja lühiajalist kokkupuudet käesolevas direktiivis osutatud pestitsiididega toiduainete kaudu on uuesti hinnatud ja mõõdetud vastavalt ühenduses kasutatavatele menetlustele ja tavadele, võttes arvesse Maailma Terviseorganisatsiooni avaldatud juhiseid (5) Sellest lähtudes tuleks määrata jääkide uued piirnormid, mis välistaksid tarbijate lubamatu kokkupuute asjaomase ainega. |
| --- | --- |

(4)

Tarbijate eluaegset ja lühiajalist kokkupuudet käesolevas direktiivis osutatud pestitsiididega toiduainete kaudu on uuesti hinnatud ja mõõdetud vastavalt ühenduses kasutatavatele menetlustele ja tavadele, võttes arvesse Maailma Terviseorganisatsiooni avaldatud juhiseid (5) Sellest lähtudes tuleks määrata jääkide uued piirnormid, mis välistaksid tarbijate lubamatu kokkupuute asjaomase ainega.

| (5) | Tarbijate akuutset kokkupuudet kõnealuste pestitsiididega iga toiduaine kaudu, mis võib sisaldada jääke, on vajaduse korral hinnatud ja mõõdetud vastavalt ühenduse menetlustele ja tavadele, võttes arvesse Maailma Terviseorganisatsiooni avaldatud juhiseid. Jõuti järeldusele, et pestitsiidide jääkide esinemine uute piirnormide tasemel või sellest väiksemal tasemel ei avalda ägedat toksilist mõju. |
| --- | --- |

(5)

Tarbijate akuutset kokkupuudet kõnealuste pestitsiididega iga toiduaine kaudu, mis võib sisaldada jääke, on vajaduse korral hinnatud ja mõõdetud vastavalt ühenduse menetlustele ja tavadele, võttes arvesse Maailma Terviseorganisatsiooni avaldatud juhiseid. Jõuti järeldusele, et pestitsiidide jääkide esinemine uute piirnormide tasemel või sellest väiksemal tasemel ei avalda ägedat toksilist mõju.

| (6) | Jääkide uute piirnormide suhtes on konsulteeritud ühenduse kaubanduspartneritega Maailma Kaubandusorganisatsiooni kaudu ja nende arvamusi kõnealuste normide kohta on arvesse võetud. |
| --- | --- |

(6)

Jääkide uute piirnormide suhtes on konsulteeritud ühenduse kaubanduspartneritega Maailma Kaubandusorganisatsiooni kaudu ja nende arvamusi kõnealuste normide kohta on arvesse võetud.

| (7) | Seepärast tuleks direktiivide 86/362/EMÜ, 86/363/EMÜ ja 90/642/EMÜ lisasid vastavalt muuta. |
| --- | --- |

(7)

Seepärast tuleks direktiivide 86/362/EMÜ, 86/363/EMÜ ja 90/642/EMÜ lisasid vastavalt muuta.

| (8) | Käesoleva direktiiviga ettenähtud meetmed on kooskõlas toiduahela ja loomatervishoiu alalise komitee arvamusega, |
| --- | --- |

(8)

Käesoleva direktiiviga ettenähtud meetmed on kooskõlas toiduahela ja loomatervishoiu alalise komitee arvamusega,

ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA DIREKTIIVI:

Artikkel 1

Direktiivi 86/362/EÜ II lisa muudetakse vastavalt käesoleva direktiivi I lisale.

Artikkel 2

Direktiivi 86/363/EÜ II lisa muudetakse vastavalt käesoleva direktiivi II lisale.

Artikkel 3

Direktiivi 90/642/EÜ II lisa muudetakse vastavalt käesoleva direktiivi III lisale.

Artikkel 4

1.   Liikmesriigid võtavad vastu ja avaldavad käesoleva direktiivi täitmiseks vajalikud õigusnormid hiljemalt 20. jaanuariks 2007. Nad edastavad kõnealuste sätete teksti ning kõnesolevate sätete ja käesoleva direktiivi vahelise vastavustabeli viivitamata komisjonile.

Liikmesriigid kohaldavad neid norme alates 21. jaanuarist 2007.

Kui liikmesriigid need normid vastu võtavad, lisavad nad nendesse või nende normide ametliku avaldamise korral nende juurde viite käesolevale direktiivile. Viitamise viisi näevad ette liikmesriigid.

2.   Liikmesriigid teatavad komisjonile vastavalt käesolevale direktiivile kohandatud tähtsamate õigus- ja haldusnormide teksti.

Artikkel 5

Käesolev direktiiv jõustub kahekümnendal päeval pärast selle avaldamist Euroopa Liidu Teatajas.

Artikkel 6

Käesolev direktiiv on adresseeritud liikmesriikidele.

Brüssel, 7. juuli 2006

Komisjoni nimel

komisjoni liige

Markos KYPRIANOU

---

(1)  EÜT L 221, 7.8.1986, lk 37. Direktiivi on viimati muudetud komisjoni direktiiviga 2006/59/EÜ (ELT L 175, 29.6.2006, lk 61).

1

(2)  EÜT L 221, 7.8.1986, lk 43. Direktiivi on viimati muudetud komisjoni 2006/59/EÜ.

2

(3)  EÜT L 350, 14.12.1990, lk 71. Direktiivi on viimati muudetud komisjoni direktiiviga 2006/59/EÜ.

3

(4)  EÜT L 230, 19.8.1991, lk 1. Direktiivi on viimati muudetud komisjoni direktiiviga 2006/45/EÜ (ELT L 130, 18.5.2006, lk 27).

4

(5)  Juhised toidu kaudu pestitsiidijääkide omandamise hindamiseks (läbi vaadatud), mis on koostatud programmi GEMS/Food raames koostöös pestitsiidijääkide Codexi komiteega; avaldanud Maailma Tervishoiuorganisatsioon 1997. aastal (WHO/FSF/FOS.97.7).

5

ex

---

I LISA

Direktiivi 86/362/EMÜ II lisa A-osa muudetakse järgmiselt.

| 1. | Atrasiini puhul lisatakse järgmine rida:






  Pestitsiidide jäägid | Piirnorm mg/kg |
| --- | --- | --- |
| “Atrasiin | 0,05 (1)

  TERAVILI |

1.

Atrasiini puhul lisatakse järgmine rida:

Pestitsiidide jäägid

Piirnorm mg/kg

“Atrasiin

0,05 (1)

TERAVILI

| 2. | Etüülasiinfossi, etefooni ja triasofossi käsitlevad read asendatakse järgmisega:






  Pestitsiidide jäägid | Piirnormid mg/kg |
| --- | --- | --- |
| “Etüülasiinfoss | 0,05 (2)

  TERAVILI |
| Etefoon | 0,5 oder, rukis
  0,2 tritikale, nisu
  0,05 (2) muu teravili |
| Triasofoss | 0,02 (2)

  TERAVILI |

2.

Etüülasiinfossi, etefooni ja triasofossi käsitlevad read asendatakse järgmisega:

Pestitsiidide jäägid

Piirnormid mg/kg

“Etüülasiinfoss

0,05 (2)

TERAVILI

Etefoon

0,5 oder, rukis

0,2 tritikale, nisu

0,05 (2) muu teravili

Triasofoss

0,02 (2)

TERAVILI

---

(1)  Alumine määramispiir.”

(2)  Alumine määramispiir.”

---

II LISA

Direktiivi 86/363/EMÜ II lisa A-osa muudetakse järgmiselt.

| 1. | Direktiivi 86/363/EMÜ II lisa A-osas asendatakse etüülasiinfossi ja triasofossi käsitlevad read järgmisega:








  Pestitsiidide jäägid | Piirnorm mg/kg |
| --- | --- | --- |
| | I lisas rubriikides ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 ja 1602 loetletud lihas, lihavalmististes, rupsis ja loomarasvades sisalduva rasva puhul 1, 4 | I lisas rubriigis 0401 nimetatud lehmatoorpiima ja -täispiima puhul; muude rubriikidesse 0401, 0402, 0405 00 ja 0406 kuuluvate toiduainete puhul 2, 4 | I lisas rubriikides 0407 00 ja 0408 loetletud värskete koorega munade, linnumunade ja munarebude puhul 3, 4 |
| “Etüülasiinfoss | 0,01 (1) | 0,01 (1) | 0,01 (1) |
| Triasofoss | 0,01 (1) | 0,01 (1) | 0,01 (1) |

1.

Direktiivi 86/363/EMÜ II lisa A-osas asendatakse etüülasiinfossi ja triasofossi käsitlevad read järgmisega:

Pestitsiidide jäägid

Piirnorm mg/kg

I lisas rubriikides ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 ja 1602 loetletud lihas, lihavalmististes, rupsis ja loomarasvades sisalduva rasva puhul 1, 4

I lisas rubriigis 0401 nimetatud lehmatoorpiima ja -täispiima puhul; muude rubriikidesse 0401, 0402, 0405 00 ja 0406 kuuluvate toiduainete puhul 2, 4

I lisas rubriikides 0407 00 ja 0408 loetletud värskete koorega munade, linnumunade ja munarebude puhul 3, 4

“Etüülasiinfoss

0,01 (1)

0,01 (1)

0,01 (1)

Triasofoss

0,01 (1)

0,01 (1)

0,01 (1)

| 2. | Direktiivi 86/363/EMÜ II lisa A-osasse lisatakse fentiooni puhul järgmised read:








  Pestitsiidide jäägid | Piirnorm mg/kg |
| --- | --- | --- |
| | I lisas rubriikides ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 ja 1602 loetletud lihas, lihavalmististes, rupsis ja loomarasvades sisalduva rasva puhul 1, 4 | I lisas rubriigis 0401 nimetatud lehmatoorpiima ja -täispiima puhul; muude rubriikidesse 0401, 0402, 0405 00 ja 0406 kuuluvate toiduainete puhul 2, 4 | I lisas rubriikides 0407 00 ja 0408 loetletud värskete koorega munade, linnumunade ja munarebude puhul 3, 4 |
| “Fentioon, selle hapnikuanaloog ning nende sulfoksiidid ja sulfoonid, väljendatud fentioonina | 0,05 (2) | 0,01 (2) | — |

2.

Direktiivi 86/363/EMÜ II lisa A-osasse lisatakse fentiooni puhul järgmised read:

Pestitsiidide jäägid

Piirnorm mg/kg

I lisas rubriikides ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 ja 1602 loetletud lihas, lihavalmististes, rupsis ja loomarasvades sisalduva rasva puhul 1, 4

I lisas rubriigis 0401 nimetatud lehmatoorpiima ja -täispiima puhul; muude rubriikidesse 0401, 0402, 0405 00 ja 0406 kuuluvate toiduainete puhul 2, 4

I lisas rubriikides 0407 00 ja 0408 loetletud värskete koorega munade, linnumunade ja munarebude puhul 3, 4

“Fentioon, selle hapnikuanaloog ning nende sulfoksiidid ja sulfoonid, väljendatud fentioonina

0,05 (2)

0,01 (2)

—

---

(1)  Alumine määramispiir.”

(2)  Alumine määramispiir.”

---

III LISA

Direktiivi 90/642/EMÜ II lisa A-osa muudetakse järgmiselt.

| 1. | Fentiooni puhul lisatakse järgmine veerg:









  Rühmad ja üksiktoodete näited, mille suhtes kohaldatakse jääkide piirnorme | fentioon, selle hapnikuanaloog ning nende sulfoksiidid ja sulfoonid, väljendatud fentioonina |
| --- | --- | --- |
| “1. | Värsked, kuivatatud või külmutamise teel säilitatud kuumtöötlemata suhkrulisandita puuviljad; pähklid | |
| | i) | TSITRUSVILJAD | 3 |
| | | Greibid | |
| | | Sidrunid | |
| | | Laimid | |
| | | Mandariinid (sh klementiinid ja samalaadsed hübriidid) | |
| | | Apelsinid | |
| | | Pomelod | |
| | | Muud | |
| | ii) | PÄHKLIPUUDE VILJAD (kooritud või koorimata) | 0,01 (1) |
| | | Mandlid | |
| | | Brasiilia pähklid | |
| | | Kašupähklid | |
| | | Kastanid | |
| | | Kookospähklid | |
| | | Sarapuupähklid | |
| | | Makadaamiapähklid | |
| | | Pekanipähklid | |
| | | Piiniapähklid | |
| | | Pistaatsiapähklid | |
| | | Kreeka pähklid | |
| | | Muud | |
| | iii) | ÕUNVILJAD | 0,01 (1) |
| | | Õunad | |
| | | Pirnid | |
| | | Küdooniad | |
| | | Muud | |
| | iv) | LUUVILJAD | |
| | | Aprikoosid | |
| | | Kirsid | 2 |
| | | Virsikud (kaasa arvatud nektariinid ja samalaadsed hübriidid) | |
| | | Ploomid | |
| | | Muud | 0,01 (1) |
| | v) | MARJAD JA VÄIKESED PUUVILJAD | 0,01 (1) |
| | | a) | Laua- ja veiniviinamarjad | |
| | | | Lauaviinamarjad | |
| | | | Veiniviinamarjad | |
| | | b) | Maasikad (välja arvatud metsmaasikad) | |
| | | c) | Koguviljad (välja arvatud metsamarjad) | |
| | | | Murakad | |
| | | | Põldmurakad | |
| | | | Logani murakad | |
| | | | Vaarikad | |
| | | | Muud | |
| | | d) | Muud väikesed puuviljad ja marjad (välja arvatud metsamarjad) | |
| | | | Mustikad | |
| | | | Jõhvikad | |
| | | | Sõstrad (punased, mustad ja valged) | |
| | | | Karusmarjad | |
| | | | Muud | |
| | | e) | Looduses kasvavad marjad ja puuviljad | |
| | vi) | MUUD VILJAD | |
| | | Avokaadod | |
| | | Banaanid | |
| | | Datlid | |
| | | Viigimarjad | |
| | | Kiivid | |
| | | Kääbusapelsinid | |
| | | Hiina ploomid | |
| | | Mangod | |
| | | Oliivid (lauaviljad) | 1 |
| | | Oliivid (õliviljad) | 1 |
| | | Papaiad | |
| | | Granadillid (kannatuslille viljad) | |
| | | Ananassid | |
| | | Muud | 0,01 (1) |
| 2. | Köögiviljad: värsked või kuumtöötlemata, külmutatud või kuivatatud | 0,01 (1) |
| | i) | JUUR- JA MUGULKÖÖGIVILI | |
| | | Söögipeet | |
| | | Porgand | |
| | | Maniokk | |
| | | Juurseller | |
| | | Mädarõigas | |
| | | Maapirn | |
| | | Pastinaak | |
| | | Juurpetersell | |
| | | Redis | |
| | | Aed-piimjuur | |
| | | Maguskartul | |
| | | Kaalikas | |
| | | Naeris | |
| | | Jamss | |
| | | Muud | |
| | ii) | SIBULKÖÖGIVILJAD | |
| | | Küüslauk | |
| | | Sibul | |
| | | Šalott | |
| | | Talisibul | |
| | | Muud | |
| | iii) | VILIKÖÖGIVILJAD | |
| | | a) | Maavitsalised | |
| | | | Tomat | |
| | | | Paprika | |
| | | | Baklažaan | |
| | | | Söödav muskushibisk | |
| | | | Muud | |
| | | b) | Kõrvitsalised – söödava koorega | |
| | | | Kurgid | |
| | | | Kornišonid | |
| | | | Rullkõrvitsad | |
| | | | Muud | |
| | | c) | Kõrvitsalised – mittesöödava koorega | |
| | | | Melonid | |
| | | | Patissonid | |
| | | | Arbuusid | |
| | | | Muud | |
| | | d) | Suhkrumais | |
| | iv) | KAPSASKÖÖGIVILJAD | |
| | | a) | Õisikkapsad | |
| | | | Spargelkapsas | |
| | | | Lillkapsas | |
| | | | Muud | |
| | | b) | Peakapsad | |
| | | | Rooskapsas | |
| | | | Peakapsas | |
| | | | Muud | |
| | | c) | Lehtkapsad | |
| | | | Hiina kapsas | |
| | | | Lehtkapsas | |
| | | | Muud | |
| | | d) | Nuikapsas | |
| | v) | LEHTKÖÖGIVILJAD JA VÄRSKED MAITSETAIMED | |
| | | a) | Salat jms | |
| | | | Salatkress | |
| | | | Põldkännak | |
| | | | Aedsalat | |
| | | | Eskariool | |
| | | | Ruccola | |
| | | | Kapsalehed ja leherootsud | |
| | | | Muud | |
| | | b) | Spinat jms | |
| | | | Spinat | |
| | | | Lehtpeet (mangold) | |
| | | | Muud | |
| | | c) | Ürt-allikkress | |
| | | d) | Harilik sigur | |
| | | e) | Ürdid | |
| | | | Aed-harakputk | |
| | | | Murulauk | |
| | | | Petersell | |
| | | | Lehtseller | |
| | | | Muud | |
| | vi) | KAUNVILJAD (värsked) | |
| | | Oad (poetamata) | |
| | | Oad (poetatud) | |
| | | Herned (poetamata) | |
| | | Herned (poetatud) | |
| | | Muud | |
| | vii) | VARSKÖÖGIVILJAD (värsked) | |
| | | Spargel | |
| | | Hispaania artišokk | |
| | | Seller | |
| | | Apteegitill | |
| | | Artišokk | |
| | | Porrulauk | |
| | | Rabarber | |
| | | Muud | |
| | viii) | SEENED | |
| | | a) | Kultuurseened | |
| | | b) | Looduses kasvavad seened | |
| 3. | Kaunviljad (kuivatatud) | 0,01 (1) |
| | Oad | |
| | Läätsed | |
| | Herned | |
| | Muud | |
| 4. | Õliseemned | 0,02 (1) |
| | Linaseemned | |
| | Maapähklid | |
| | Mooniseemned | |
| | Seesamiseemned | |
| | Päevalilleseemned | |
| | Rapsiseemned | |
| | Sojaoad | |
| | Sinepiseemned | |
| | Puuvillaseemned | |
| | Kanepiseemned | |
| | Muud | |
| 5. | Kartulid | 0,01 (1) |
| | Varajane kartul | |
| | Säilituskartul | |
| 6. | Tee (Camellia sinensis, kuivatatud lehed ja varred, fermenteeritud või fermenteerimata) | 0,1 (1) |
| 7. | Humal (kuivatatud), sh humalakäbi graanulid ja kontsentreerimata pulber | 0,1 (1) |

1.

Fentiooni puhul lisatakse järgmine veerg:

Rühmad ja üksiktoodete näited, mille suhtes kohaldatakse jääkide piirnorme

fentioon, selle hapnikuanaloog ning nende sulfoksiidid ja sulfoonid, väljendatud fentioonina

“1.

Värsked, kuivatatud või külmutamise teel säilitatud kuumtöötlemata suhkrulisandita puuviljad; pähklid

i)

TSITRUSVILJAD

3

Greibid

Sidrunid

Laimid

Mandariinid (sh klementiinid ja samalaadsed hübriidid)

Apelsinid

Pomelod

Muud

ii)

PÄHKLIPUUDE VILJAD (kooritud või koorimata)

0,01 (1)

Mandlid

Brasiilia pähklid

Kašupähklid

Kastanid

Kookospähklid

Sarapuupähklid

Makadaamiapähklid

Pekanipähklid

Piiniapähklid

Pistaatsiapähklid

Kreeka pähklid

Muud

iii)

ÕUNVILJAD

0,01 (1)

Õunad

Pirnid

Küdooniad

Muud

iv)

LUUVILJAD

Aprikoosid

Kirsid

2

Virsikud (kaasa arvatud nektariinid ja samalaadsed hübriidid)

Ploomid

Muud

0,01 (1)

v)

MARJAD JA VÄIKESED PUUVILJAD

0,01 (1)

a)

Laua- ja veiniviinamarjad

Lauaviinamarjad

Veiniviinamarjad

b)

Maasikad (välja arvatud metsmaasikad)

c)

Koguviljad (välja arvatud metsamarjad)

Murakad

Põldmurakad

Logani murakad

Vaarikad

Muud

d)

Muud väikesed puuviljad ja marjad (välja arvatud metsamarjad)

Mustikad

Jõhvikad

Sõstrad (punased, mustad ja valged)

Karusmarjad

Muud

e)

Looduses kasvavad marjad ja puuviljad

vi)

MUUD VILJAD

Avokaadod

Banaanid

Datlid

Viigimarjad

Kiivid

Kääbusapelsinid

Hiina ploomid

Mangod

Oliivid (lauaviljad)

1

Oliivid (õliviljad)

1

Papaiad

Granadillid (kannatuslille viljad)

Ananassid

Muud

0,01 (1)

2.

Köögiviljad: värsked või kuumtöötlemata, külmutatud või kuivatatud

0,01 (1)

i)

JUUR- JA MUGULKÖÖGIVILI

Söögipeet

Porgand

Maniokk

Juurseller

Mädarõigas

Maapirn

Pastinaak

Juurpetersell

Redis

Aed-piimjuur

Maguskartul

Kaalikas

Naeris

Jamss

Muud

ii)

SIBULKÖÖGIVILJAD

Küüslauk

Sibul

Šalott

Talisibul

Muud

iii)

VILIKÖÖGIVILJAD

a)

Maavitsalised

Tomat

Paprika

Baklažaan

Söödav muskushibisk

Muud

b)

Kõrvitsalised – söödava koorega

Kurgid

Kornišonid

Rullkõrvitsad

Muud

c)

Kõrvitsalised – mittesöödava koorega

Melonid

Patissonid

Arbuusid

Muud

d)

Suhkrumais

iv)

KAPSASKÖÖGIVILJAD

a)

Õisikkapsad

Spargelkapsas

Lillkapsas

Muud

b)

Peakapsad

Rooskapsas

Peakapsas

Muud

c)

Lehtkapsad

Hiina kapsas

Lehtkapsas

Muud

d)

Nuikapsas

v)

LEHTKÖÖGIVILJAD JA VÄRSKED MAITSETAIMED

a)

Salat jms

Salatkress

Põldkännak

Aedsalat

Eskariool

Ruccola

Kapsalehed ja leherootsud

Muud

b)

Spinat jms

Spinat

Lehtpeet (mangold)

Muud

c)

Ürt-allikkress

d)

Harilik sigur

e)

Ürdid

Aed-harakputk

Murulauk

Petersell

Lehtseller

Muud

vi)

KAUNVILJAD (värsked)

Oad (poetamata)

Oad (poetatud)

Herned (poetamata)

Herned (poetatud)

Muud

vii)

VARSKÖÖGIVILJAD (värsked)

Spargel

Hispaania artišokk

Seller

Apteegitill

Artišokk

Porrulauk

Rabarber

Muud

viii)

SEENED

a)

Kultuurseened

b)

Looduses kasvavad seened

3.

Kaunviljad (kuivatatud)

0,01 (1)

Oad

Läätsed

Herned

Muud

4.

Õliseemned

0,02 (1)

Linaseemned

Maapähklid

Mooniseemned

Seesamiseemned

Päevalilleseemned

Rapsiseemned

Sojaoad

Sinepiseemned

Puuvillaseemned

Kanepiseemned

Muud

5.

Kartulid

0,01 (1)

Varajane kartul

Säilituskartul

6.

Tee (Camellia sinensis, kuivatatud lehed ja varred, fermenteeritud või fermenteerimata)

0,1 (1)

7.

Humal (kuivatatud), sh humalakäbi graanulid ja kontsentreerimata pulber

0,1 (1)

| 2. | Atrasiini, etüülasiinfossi, tsüflutriini, etefooni, metamidofossi, metomüüli, parakvaadi ja triasofossi käsitlevad veerud asendatakse järgmisega:
















  Rühmad ja üksiktoodete näited, mille suhtes kohaldatakse jääkide piirnorme | atrasiin | etüülasiinfoss | tsüflutriin, kaasa arvatud muud seda moodustavate isomeeride segud (isomeeride summa) | etefoon | metamidofoss | metomüül/tiodikarb (summa väljendatud metomüülina) | parakvaat | triasofoss |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| “1. | Värsked, kuivatatud või külmutamise teel säilitatud kuumtöötlemata suhkrulisandita puuviljad; pähklid | 0,05 (2) | 0,02 (2) | | | | | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | i) | TSITRUSVILJAD | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | | | |
| | | Greibid | | | | | | 0,5 | | |
| | | Sidrunid | | | | | | 1 | | |
| | | Laimid | | | | | | 1 | | |
| | | Mandariinid (sh klementiinid ja samalaadsed hübriidid) | | | | | | 1 | | |
| | | Apelsinid | | | | | | 0,5 | | |
| | | Pomelod | | | | | | 0,5 | | |
| | | Muud | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | ii) | PÄHKLIPUUDE VILJAD (kooritud või koorimata) | | | 0,02 (2) | 0,1 | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | Mandlid | | | | | | | | |
| | | Brasiilia pähklid | | | | | | | | |
| | | Kašupähklid | | | | | | | | |
| | | Kastanid | | | | | | | | |
| | | Kookospähklid | | | | | | | | |
| | | Sarapuupähklid | | | | | | | | |
| | | Makadaamiapähklid | | | | | | | | |
| | | Pekanipähklid | | | | | | | | |
| | | Piiniapähklid | | | | | | | | |
| | | Pistaatsiapähklid | | | | | | | | |
| | | Kreeka pähklid | | | | | | | | |
| | | Muud | | | | | | | | |
| | iii) | ÕUNVILJAD | | | 0,2 | | 0,01 (2) | 0,2 | | |
| | | Õunad | | | | 0,5 | | | | |
| | | Pirnid | | | | | | | | |
| | | Küdooniad | | | | | | | | |
| | | Muud | | | | 0,05 (2) | | | | |
| | iv) | LUUVILJAD | | | | | | | | |
| | | Aprikoosid | | | 0,3 | | 0,1 | 0,2 | | |
| | | Kirsid | | | 0,2 | 3 | | 0,1 | | |
| | | Virsikud (kaasa arvatud nektariinid ja samalaadsed hübriidid) | | | 0,3 | | 0,05 | 0,2 | | |
| | | Ploomid | | | 0,2 | | | 0,5 | | |
| | | Muud | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | v) | MARJAD JA VÄIKESED PUUVILJAD | | | | | 0,01 (2) | | | |
| | | a) | Laua- ja veiniviinamarjad | | | 0,3 | 1 | | | | |
| | | | Lauaviinamarjad | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | | | Veiniviinamarjad | | | | | | 1 | | |
| | | b) | Maasikad (välja arvatud metsmaasikad) | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | c) | Koguviljad (välja arvatud metsamarjad) | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | | Murakad | | | | | | | | |
| | | | Põldmurakad | | | | | | | | |
| | | | Logani murakad | | | | | | | | |
| | | | Vaarikad | | | | | | | | |
| | | | Muud | | | | | | | | |
| | | d) | Muud väikesed puuviljad ja marjad (välja arvatud metsamarjad) | | | 0,02 (2) | | | 0,05 (2) | | |
| | | | Mustikad | | | | | | | | |
| | | | Jõhvikad | | | | | | | | |
| | | | Sõstrad (punased, mustad ja valged) | | | | 5 | | | | |
| | | | Karusmarjad | | | | | | | | |
| | | | Muud | | | | 0,05 (2) | | | | |
| | | e) | Looduses kasvavad marjad ja puuviljad | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | vi) | MUUD VILJAD | | | 0,02 (2) | | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | Avokaadod | | | | | | | | |
| | | Banaanid | | | | | | | | |
| | | Datlid | | | | | | | | |
| | | Viigimarjad | | | | | | | | |
| | | Kiivid | | | | | | | | |
| | | Kääbusapelsinid | | | | | | | | |
| | | Hiina ploomid | | | | | | | | |
| | | Mangod | | | | | | | | |
| | | Oliivid (lauaviljad) | | | | | | | | |
| | | Oliivid (õliviljad) | | | | | | | | |
| | | Papaiad | | | | | | | | |
| | | Granadillid (kannatuslille viljad) | | | | | | | | |
| | | Ananassid | | | | 2 | | | | |
| | | Muud | | | | 0,05 (2) | | | | |
| 2. | Köögiviljad: värsked või kuumtöötlemata, külmutatud või kuivatatud | | 0,02 (2) | | | | | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | i) | JUUR- JA MUGULKÖÖGIVILI | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | | | |
| | | Söögipeet | | | | | | | | |
| | | Porgand | | | | | | | | |
| | | Maniokk | | | | | | | | |
| | | Juurseller | | | | | | | | |
| | | Mädarõigas | | | | | | | | |
| | | Maapirn | | | | | | | | |
| | | Pastinaak | | | | | | | | |
| | | Juurpetersell | | | | | | | | |
| | | Redis | | | | | | 0,5 | | |
| | | Aed-piimjuur | | | | | | | | |
| | | Maguskartul | | | | | | | | |
| | | Kaalikas | | | | | | | | |
| | | Naeris | | | | | | | | |
| | | Jamss | | | | | | | | |
| | | Muud | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | ii) | SIBULKÖÖGIVILJAD | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | Küüslauk | | | | | | | | |
| | | Sibul | | | | | | | | |
| | | Šalott | | | | | | | | |
| | | Talisibul | | | | | | | | |
| | | Muud | | | | | | | | |
| | iii) | VILIKÖÖGIVILJAD | | | | | 0,01 (2) | | | |
| | | a) | Maavitsalised | 0,05 (2) | | | | | | | |
| | | | Tomat | | | 0,05 | 1 | | 0,2 | | |
| | | | Paprika | | | 0,3 | 3 | | | | |
| | | | Baklažaan | | | | | | 0,2 | | |
| | | | Söödav muskushibisk | | | | | | | | |
| | | | Muud | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | b) | Kõrvitsalised – söödava koorega | 0,05 (2) | | | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | | Kurgid | | | 0,1 | | | | | |
| | | | Kornišonid | | | | | | | | |
| | | | Rullkõrvitsad | | | | | | | | |
| | | | Muud | | | 0,02 (2) | | | | | |
| | | c) | Kõrvitsalised – mittesöödava koorega | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | | Melonid | | | | | | | | |
| | | | Patissonid | | | | | | | | |
| | | | Arbuusid | | | | | | | | |
| | | | Muud | | | | | | | | |
| | | d) | Suhkrumais | 0,1 | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | iv) | KAPSASKÖÖGI-VILJAD | 0,05 (2) | | | 0,05 (2) | | | | |
| | | a) | Õisikkapsad | | | 0,05 | | 0,02 | | | |
| | | | Spargelkapsas | | | | | | 0,2 | | |
| | | | Lillkapsas | | | | | | | | |
| | | | Muud | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | | b) | Peakapsad | | | 0,2 | | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | | Rooskapsas | | | | | | | | |
| | | | Peakapsas | | | | | | | | |
| | | | Muud | | | | | | | | |
| | | c) | Lehtkapsad | | | 0,3 | | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | | Hiina kapsas | | | | | | | | |
| | | | Lehtkapsas | | | | | | | | |
| | | | Muud | | | | | | | | |
| | | d) | Nuikapsas | | | 0,02 (2) | | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | v) | LEHTKÖÖGIVILJAD JA VÄRSKED MAITSETAIMED | 0,05 (2) | | | 0,05 (2) | 0,01 (2) | | | |
| | | a) | Salat jms | | | 0,5 | | | | | |
| | | | Salatkress | | | | | | | | |
| | | | Põldkännak | | | | | | | | |
| | | | Aedsalat | | | | | | 0,3 | | |
| | | | Eskariool | | | | | | | | |
| | | | Ruccola | | | | | | | | |
| | | | Kapsalehed ja leherootsud | | | | | | | | |
| | | | Muud | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | | b) | Spinat jms | | | 0,02 (2) | | | | | |
| | | | Spinat | | | | | | 0,05 | | |
| | | | Lehtpeet (mangold) | | | | | | | | |
| | | | Muud | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | | c) | Ürt-allikkress | | | 0,02 (2) | | | 0,05 (2) | | |
| | | d) | Harilik sigur | | | 0,02 (2) | | | 0,05 (2) | | |
| | | e) | Ürdid | | | 0,02 (2) | | | 0,3 | | |
| | | | Aed-harakputk | | | | | | | | |
| | | | Murulauk | | | | | | | | |
| | | | Petersell | | | | | | | | |
| | | | Lehtseller | | | | | | | | |
| | | | Muud | | | | | | | | |
| | vi) | KAUNVILJAD (värsked) | 0,05 (2) | | 0,05 | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | Oad (poetamata) | | | | | 0,5 | | | |
| | | Oad (poetatud) | | | | | | | | |
| | | Herned (poetamata) | | | | | 0,5 | | | |
| | | Herned (poetatud) | | | | | | | | |
| | | Muud | | | | | 0,01 (2) | | | |
| | vii) | VARSKÖÖGIVILJAD (värsked) | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | Spargel | | | | | | | | |
| | | Hispaania artišokk | | | | | | | | |
| | | Seller | | | | | | | | |
| | | Apteegitill | | | | | | | | |
| | | Artišokk | | | | | 0,1 | | | |
| | | Porrulauk | | | | | | | | |
| | | Rabarber | | | | | | | | |
| | | Muud | | | | | 0,01 (2) | | | |
| | viii) | SEENED | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | a) | Kultuurseened | | | | | | | | |
| | | b) | Looduses kasvavad seened | | | | | | | | |
| 3. | Kaunviljad (kuivatatud) | 0,05 (2) | 0,02 (2) | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | Oad | | | | | | | | |
| | Läätsed | | | | | | | | |
| | Herned | | | | | | | | |
| | Muud | | | | | | | | |
| 4. | Õliseemned | 0,05 (2) | 0,02 (2) | | | | | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | Linaseemned | | | | | | | | |
| | Maapähklid | | | | | | 0,1 | | |
| | Mooniseemned | | | | | | | | |
| | Seesamiseemned | | | | | | | | |
| | Päevalilleseemned | | | | | | | | |
| | Rapsiseemned | | | 0,05 | | | | | |
| | Sojaoad | | | | | 0,2 | 0,1 | | |
| | Sinepiseemned | | | | | | | | |
| | Puuvillaseemned | | | | 2 | 0,2 | 0,1 | | |
| | Kanepiseemned | | | | | | | | |
| | Muud | | | 0,02 (2) | 0,1 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| 5. | Kartulid | 0,05 (2) | 0,02 (2) | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | Varajane kartul | | | | | | | | |
| | Säilituskartul | | | | | | | | |
| 6. | Tee (Camellia sinensis, kuivatatud lehed ja varred, fermenteeritud või fermenteerimata) | 0,1 (2) | 0,05 (2) | 0,1 (2) | 0,1 (2) | 0,02 (2) | 0,1 (2) | 0,05 (2) | 0,02 (2) |
| 7. | Humal (kuivatatud), sh humalakäbi graanulid ja kontsentreerimata pulber | 0,1 (2) | 0,05 (2) | 20 | 0,1 (2) | 0,02 (2) | 10 | 0,05 (2) | 0,02 (2) |

2.

Atrasiini, etüülasiinfossi, tsüflutriini, etefooni, metamidofossi, metomüüli, parakvaadi ja triasofossi käsitlevad veerud asendatakse järgmisega:

Rühmad ja üksiktoodete näited, mille suhtes kohaldatakse jääkide piirnorme

atrasiin

etüülasiinfoss

tsüflutriin, kaasa arvatud muud seda moodustavate isomeeride segud (isomeeride summa)

etefoon

metamidofoss

metomüül/tiodikarb (summa väljendatud metomüülina)

parakvaat

triasofoss

“1.

Värsked, kuivatatud või külmutamise teel säilitatud kuumtöötlemata suhkrulisandita puuviljad; pähklid

0,05 (2)

0,02 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

i)

TSITRUSVILJAD

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

Greibid

0,5

Sidrunid

1

Laimid

1

Mandariinid (sh klementiinid ja samalaadsed hübriidid)

1

Apelsinid

0,5

Pomelod

0,5

Muud

0,05 (2)

ii)

PÄHKLIPUUDE VILJAD (kooritud või koorimata)

0,02 (2)

0,1

0,01 (2)

0,05 (2)

Mandlid

Brasiilia pähklid

Kašupähklid

Kastanid

Kookospähklid

Sarapuupähklid

Makadaamiapähklid

Pekanipähklid

Piiniapähklid

Pistaatsiapähklid

Kreeka pähklid

Muud

iii)

ÕUNVILJAD

0,2

0,01 (2)

0,2

Õunad

0,5

Pirnid

Küdooniad

Muud

0,05 (2)

iv)

LUUVILJAD

Aprikoosid

0,3

0,1

0,2

Kirsid

0,2

3

0,1

Virsikud (kaasa arvatud nektariinid ja samalaadsed hübriidid)

0,3

0,05

0,2

Ploomid

0,2

0,5

Muud

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

v)

MARJAD JA VÄIKESED PUUVILJAD

0,01 (2)

a)

Laua- ja veiniviinamarjad

0,3

1

Lauaviinamarjad

0,05 (2)

Veiniviinamarjad

1

b)

Maasikad (välja arvatud metsmaasikad)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

c)

Koguviljad (välja arvatud metsamarjad)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

Murakad

Põldmurakad

Logani murakad

Vaarikad

Muud

d)

Muud väikesed puuviljad ja marjad (välja arvatud metsamarjad)

0,02 (2)

0,05 (2)

Mustikad

Jõhvikad

Sõstrad (punased, mustad ja valged)

5

Karusmarjad

Muud

0,05 (2)

e)

Looduses kasvavad marjad ja puuviljad

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

vi)

MUUD VILJAD

0,02 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

Avokaadod

Banaanid

Datlid

Viigimarjad

Kiivid

Kääbusapelsinid

Hiina ploomid

Mangod

Oliivid (lauaviljad)

Oliivid (õliviljad)

Papaiad

Granadillid (kannatuslille viljad)

Ananassid

2

Muud

0,05 (2)

2.

Köögiviljad: värsked või kuumtöötlemata, külmutatud või kuivatatud

0,02 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

i)

JUUR- JA MUGULKÖÖGIVILI

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

Söögipeet

Porgand

Maniokk

Juurseller

Mädarõigas

Maapirn

Pastinaak

Juurpetersell

Redis

0,5

Aed-piimjuur

Maguskartul

Kaalikas

Naeris

Jamss

Muud

0,05 (2)

ii)

SIBULKÖÖGIVILJAD

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

Küüslauk

Sibul

Šalott

Talisibul

Muud

iii)

VILIKÖÖGIVILJAD

0,01 (2)

a)

Maavitsalised

0,05 (2)

Tomat

0,05

1

0,2

Paprika

0,3

3

Baklažaan

0,2

Söödav muskushibisk

Muud

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

b)

Kõrvitsalised – söödava koorega

0,05 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

Kurgid

0,1

Kornišonid

Rullkõrvitsad

Muud

0,02 (2)

c)

Kõrvitsalised – mittesöödava koorega

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

Melonid

Patissonid

Arbuusid

Muud

d)

Suhkrumais

0,1

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

iv)

KAPSASKÖÖGI-VILJAD

0,05 (2)

0,05 (2)

a)

Õisikkapsad

0,05

0,02

Spargelkapsas

0,2

Lillkapsas

Muud

0,05 (2)

b)

Peakapsad

0,2

0,01 (2)

0,05 (2)

Rooskapsas

Peakapsas

Muud

c)

Lehtkapsad

0,3

0,01 (2)

0,05 (2)

Hiina kapsas

Lehtkapsas

Muud

d)

Nuikapsas

0,02 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

v)

LEHTKÖÖGIVILJAD JA VÄRSKED MAITSETAIMED

0,05 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

a)

Salat jms

0,5

Salatkress

Põldkännak

Aedsalat

0,3

Eskariool

Ruccola

Kapsalehed ja leherootsud

Muud

0,05 (2)

b)

Spinat jms

0,02 (2)

Spinat

0,05

Lehtpeet (mangold)

Muud

0,05 (2)

c)

Ürt-allikkress

0,02 (2)

0,05 (2)

d)

Harilik sigur

0,02 (2)

0,05 (2)

e)

Ürdid

0,02 (2)

0,3

Aed-harakputk

Murulauk

Petersell

Lehtseller

Muud

vi)

KAUNVILJAD (värsked)

0,05 (2)

0,05

0,05 (2)

0,05 (2)

Oad (poetamata)

0,5

Oad (poetatud)

Herned (poetamata)

0,5

Herned (poetatud)

Muud

0,01 (2)

vii)

VARSKÖÖGIVILJAD (värsked)

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

Spargel

Hispaania artišokk

Seller

Apteegitill

Artišokk

0,1

Porrulauk

Rabarber

Muud

0,01 (2)

viii)

SEENED

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

a)

Kultuurseened

b)

Looduses kasvavad seened

3.

Kaunviljad (kuivatatud)

0,05 (2)

0,02 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

Oad

Läätsed

Herned

Muud

4.

Õliseemned

0,05 (2)

0,02 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

Linaseemned

Maapähklid

0,1

Mooniseemned

Seesamiseemned

Päevalilleseemned

Rapsiseemned

0,05

Sojaoad

0,2

0,1

Sinepiseemned

Puuvillaseemned

2

0,2

0,1

Kanepiseemned

Muud

0,02 (2)

0,1 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

5.

Kartulid

0,05 (2)

0,02 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

Varajane kartul

Säilituskartul

6.

Tee (Camellia sinensis, kuivatatud lehed ja varred, fermenteeritud või fermenteerimata)

0,1 (2)

0,05 (2)

0,1 (2)

0,1 (2)

0,02 (2)

0,1 (2)

0,05 (2)

0,02 (2)

7.

Humal (kuivatatud), sh humalakäbi graanulid ja kontsentreerimata pulber

0,1 (2)

0,05 (2)

20

0,1 (2)

0,02 (2)

10

0,05 (2)

0,02 (2)

---

(1)  Alumine määramispiir.”

(2)  Alumine määramispiir.”

---

| 27.7.2006 | ET | Euroopa Liidu Teataja | L 206/27 |
| --- | --- | --- | --- |

27.7.2006

ET

Euroopa Liidu Teataja

L 206/27

---

KOMISJONI DIREKTIIV 2006/62/EÜ,

12. juuli 2006,

millega muudetakse nõukogu direktiivide 76/895/EMÜ, 86/362/EMÜ, 86/363/EMÜ ja 90/642/EMÜ lisasid seoses desmedifaami, fenmedifaami ja klorofenvinfossi jääkide piirnormidega

(EMPs kohaldatav tekst)

EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON,

võttes arvesse Euroopa Ühenduse asutamislepingut,

võttes arvesse nõukogu 23. novembri 1976. aasta direktiivi 76/895/EMÜ puu- ja köögiviljas sisalduvate ja nende pinnal esinevate pestitsiidide jääkide lubatud piirnormide kehtestamise kohta, (1) eriti selle artiklit 5,

võttes arvesse nõukogu 24. juuli 1986. aasta direktiivi 86/362/EMÜ teraviljas sisalduvate ja selle pinnal esinevate pestitsiidide jääkide lubatud piirnormide kehtestamise kohta, (2) eriti selle artiklit 10,

võttes arvesse nõukogu 24. juuli 1986. aasta direktiivi 86/363/EMÜ loomses toidus sisalduvate ja selle pinnal esinevate pestitsiidide jääkide lubatud piirnormide kehtestamise kohta, (3) eriti selle artiklit 10,

võttes arvesse nõukogu 27. novembri 1990. aasta direktiivi 90/642/EMÜ teatavates taimset päritolu saadustes, sealhulgas puu- ja köögiviljas, sisalduvate ja nende pinnal esinevate pestitsiidide jääkide lubatud piirnormide kehtestamise kohta, (4) eriti selle artiklit 7,

võttes arvesse nõukogu 15. juuli 1991. aasta direktiivi 91/414/EMÜ taimekaitsevahendite turuleviimise kohta, (5) eriti selle artikli 4 lõike 1 punkti f,

ning arvestades järgmist:

| (1) | Olemasolevad toimeained desmedifaam ja fenmedifaam on kantud komisjoni direktiiviga 2004/58/EÜ (6) direktiivi 91/414/EMÜ I lisasse. |
| --- | --- |

(1)

Olemasolevad toimeained desmedifaam ja fenmedifaam on kantud komisjoni direktiiviga 2004/58/EÜ (6) direktiivi 91/414/EMÜ I lisasse.

| (2) | Asjaomased toimeained on direktiivi 91/414/EMÜ I lisasse lisatud nende kavandatud kasutusviisi kohta esitatud teabe hindamise põhjal. Teatavad liikmesriigid on esitanud seonduva teabe vastavalt direktiivi 91/414/EMÜ artikli 4 lõike 1 punktile f. Olemasolev teave on läbi vaadatud ja see on piisav teatavate jääkide piirnormide kindlaksmääramiseks. |
| --- | --- |

(2)

Asjaomased toimeained on direktiivi 91/414/EMÜ I lisasse lisatud nende kavandatud kasutusviisi kohta esitatud teabe hindamise põhjal. Teatavad liikmesriigid on esitanud seonduva teabe vastavalt direktiivi 91/414/EMÜ artikli 4 lõike 1 punktile f. Olemasolev teave on läbi vaadatud ja see on piisav teatavate jääkide piirnormide kindlaksmääramiseks.

| (3) | Komisjoni määrusega (EÜ) nr 2076/2002 (7) on otsustatud klorofenvinfossi direktiivi 91/414/EMÜ I lisasse mitte lisada. Teatavatel liikmesriikidel lubatakse pikendada teatavate klorofenvinfossi sisaldavate toodete kasutuslubade kehtivust kuni 30. juunini 2007. |
| --- | --- |

(3)

Komisjoni määrusega (EÜ) nr 2076/2002 (7) on otsustatud klorofenvinfossi direktiivi 91/414/EMÜ I lisasse mitte lisada. Teatavatel liikmesriikidel lubatakse pikendada teatavate klorofenvinfossi sisaldavate toodete kasutuslubade kehtivust kuni 30. juunini 2007.

| (4) | Ühenduses on juba kehtestatud jääkide piirnormid klorofenvinfossi jaoks direktiiviga 76/895/EMÜ. Neid tuleks arvesse võtta, kui sätestatakse klorofenvinfossi jääkide piirnormid direktiivis 90/642/EMÜ. |
| --- | --- |

(4)

Ühenduses on juba kehtestatud jääkide piirnormid klorofenvinfossi jaoks direktiiviga 76/895/EMÜ. Neid tuleks arvesse võtta, kui sätestatakse klorofenvinfossi jääkide piirnormid direktiivis 90/642/EMÜ.

| (5) | Komisjoni aruannetes, mis koostati asjaomaste toimeainete lisamiseks direktiivi 91/414/EMÜ I lisasse, määrati kindlaks kõnealuste ainete aktsepteeritavad päevadoosid (ADI) ja vajaduse korral akuutsed standarddoosid (ARfD). Tarbijate kokkupuudet toiduainetega, mida on töödeldud asjaomaste toimeainetega, on hinnatud vastavalt ühenduse menetlustele. Samuti on arvesse võetud Maailma Terviseorganisatsiooni juhiseid (8) ja taimede teaduskomitee arvamust (9) kasutatava metoodika kohta. Järelduste kohaselt ei põhjusta kavandatud jääkide piirnormid kõnealuste aktsepteeritavate päevadooside või akuutsete standarddooside ületamist. |
| --- | --- |

(5)

Komisjoni aruannetes, mis koostati asjaomaste toimeainete lisamiseks direktiivi 91/414/EMÜ I lisasse, määrati kindlaks kõnealuste ainete aktsepteeritavad päevadoosid (ADI) ja vajaduse korral akuutsed standarddoosid (ARfD). Tarbijate kokkupuudet toiduainetega, mida on töödeldud asjaomaste toimeainetega, on hinnatud vastavalt ühenduse menetlustele. Samuti on arvesse võetud Maailma Terviseorganisatsiooni juhiseid (8) ja taimede teaduskomitee arvamust (9) kasutatava metoodika kohta. Järelduste kohaselt ei põhjusta kavandatud jääkide piirnormid kõnealuste aktsepteeritavate päevadooside või akuutsete standarddooside ületamist.

| (6) | Tarbijate nõuetekohaseks kaitsmiseks kokkupuute eest taimekaitsevahendite loata kasutamisest tekkinud jääkainetega kehtestatakse ajutiseks jääkide piirnormiks asjakohaste toote ja pestitsiidi kombinatsioonide suhtes alumine määramispiir. |
| --- | --- |

(6)

Tarbijate nõuetekohaseks kaitsmiseks kokkupuute eest taimekaitsevahendite loata kasutamisest tekkinud jääkainetega kehtestatakse ajutiseks jääkide piirnormiks asjakohaste toote ja pestitsiidi kombinatsioonide suhtes alumine määramispiir.

| (7) | Selliste ajutiste piirnormide kehtestamine ühenduse tasandil ei takista liikmesriikidel kehtestada asjaomaste toimeainete suhtes ajutisi jääkide piirnorme vastavalt direktiivi 91/414/EMÜ artikli 4 lõike 1 punktile f ja kõnealuse direktiivi VI lisale. Nelja aastat peetakse asjaomase toimeaine edasiste kasutusviiside lubamiseks piisavaks. Selle ajavahemiku möödudes peaksid ajutised jääkide piirnormid muutuma lõplikeks. |
| --- | --- |

(7)

Selliste ajutiste piirnormide kehtestamine ühenduse tasandil ei takista liikmesriikidel kehtestada asjaomaste toimeainete suhtes ajutisi jääkide piirnorme vastavalt direktiivi 91/414/EMÜ artikli 4 lõike 1 punktile f ja kõnealuse direktiivi VI lisale. Nelja aastat peetakse asjaomase toimeaine edasiste kasutusviiside lubamiseks piisavaks. Selle ajavahemiku möödudes peaksid ajutised jääkide piirnormid muutuma lõplikeks.

| (8) | Seega tuleb kõik kõnealuste taimekaitsevahendite kasutamisest tekkivate jääkide piirnormid lisada direktiivide 86/362/EMÜ, 86/363/EMÜ ja 90/642/EMÜ lisadesse, et oleks võimalik nõuetekohaselt jälgida ja kontrollida nende kasutust ning kaitsta tarbijat. Kui jääkide piirnorme ei ole seni määratletud, on asjakohane need esmakordselt kehtestada. |
| --- | --- |

(8)

Seega tuleb kõik kõnealuste taimekaitsevahendite kasutamisest tekkivate jääkide piirnormid lisada direktiivide 86/362/EMÜ, 86/363/EMÜ ja 90/642/EMÜ lisadesse, et oleks võimalik nõuetekohaselt jälgida ja kontrollida nende kasutust ning kaitsta tarbijat. Kui jääkide piirnorme ei ole seni määratletud, on asjakohane need esmakordselt kehtestada.

| (9) | Klorofenvinfossi jääkide piirnormid direktiivi 76/895/EMÜ sätetes tuleks seega tühistada. |
| --- | --- |

(9)

Klorofenvinfossi jääkide piirnormid direktiivi 76/895/EMÜ sätetes tuleks seega tühistada.

| (10) | Seepärast tuleks direktiive 76/895/EMÜ, 86/362/EMÜ, 86/363/EMÜ ja 90/642/EMÜ vastavalt muuta. |
| --- | --- |

(10)

Seepärast tuleks direktiive 76/895/EMÜ, 86/362/EMÜ, 86/363/EMÜ ja 90/642/EMÜ vastavalt muuta.

| (11) | Käesoleva direktiiviga ettenähtud meetmed on kooskõlas toiduahela ja loomatervishoiu alalise komitee arvamusega, |
| --- | --- |

(11)

Käesoleva direktiiviga ettenähtud meetmed on kooskõlas toiduahela ja loomatervishoiu alalise komitee arvamusega,

ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA DIREKTIIVI:

Artikkel 1

Direktiivi 76/895/EMÜ II lisast jäetakse välja klorofenvinfossi käsitlev rida.

Artikkel 2

Direktiivi 86/362/EMÜ II lisa muudetakse vastavalt käesoleva direktiivi I lisale.

Artikkel 3

Direktiivi 86/363/EÜ II lisa muudetakse vastavalt käesoleva direktiivi II lisale.

Artikkel 4

Direktiivi 90/642/EÜ II lisa muudetakse vastavalt käesoleva direktiivi III lisale.

Artikkel 5

1.   Liikmesriigid võtavad vastu ja avaldavad käesoleva direktiivi täitmiseks vajalikud õigusnormid hiljemalt 20. jaanuariks 2008. Nad edastavad kõnealuste normide teksti ning kõnealuste normide ja käesoleva direktiivi vahelise vastavustabeli viivitamata komisjonile.

Liikmesriigid kohaldavad neid norme alates 21. jaanuarist 2008.

Kui liikmesriigid need normid vastu võtavad, lisavad nad nendesse normidesse või nende normide ametliku avaldamise korral nende juurde viite käesolevale direktiivile. Sellise viitamise viisi näevad ette liikmesriigid.

2.   Liikmesriigid edastavad komisjonile käesoleva direktiiviga reguleeritavas valdkonnas nende poolt vastuvõetavate põhiliste riiklike õigusnormide teksti.

Artikkel 6

Käesolev direktiiv jõustub kahekümnendal päeval pärast selle avaldamist Euroopa Liidu Teatajas.

Artikkel 7

Käesolev direktiiv on adresseeritud liikmesriikidele.

Brüssel, 12. juuli 2006

Komisjoni nimel

komisjoni liige

Markos KYPRIANOU

---

(1)  EÜT L 340, 9.12.1976, lk 26. Direktiivi on viimati muudetud komisjoni direktiiviga 2006/59/EÜ (ELT L 175, 29.6.2006, lk 61).

1

(2)  EÜT L 221, 7.8.1986, lk 37. Direktiivi on viimati muudetud komisjoni direktiiviga 2006/59/EÜ.

2

(3)  EÜT L 221, 7.8.1986, lk 43. Direktiivi on viimati muudetud komisjoni direktiiviga 2006/59/EÜ.

3

(4)  EÜT L 350, 14.12.1990, lk 71. Direktiivi on viimati muudetud komisjoni direktiiviga 2006/59/EÜ.

4

(5)  EÜT L 230, 19.8.1991, lk 1. Direktiivi on viimati muudetud komisjoni direktiiviga 2006/45/EÜ (ELT L 130, 18.5.2006, lk 27).

5

(6)  ELT L 120, 24.4.2004, lk 26.

6

(7)  ELT L 319, 23.11.2002, lk 3. Määrust on viimati muudetud määrusega (EÜ) nr 1335/2005 (ELT L 211, 13.8.2005, lk 6).

7

(8)  Juhised pestitsiidijääkide toidu kaudu omastamise hindamiseks (läbi vaadatud), mille on koostanud GEMS/Food Programme koostöös Codexi pestitsiidijääkide komiteega, avaldanud Maailma Terviseorganisatsioon 1997. aastal (WHO/FSF/FOS.97.7).

8

ex

(9)  Taimede teaduskomitee arvamus nõukogu direktiivide 86/362/EMÜ, 86/363/EMÜ ja 90/642/EMÜ lisade muutmisega seotud küsimuste kohta (Taimede teaduskomitee arvamus, 14. juuli 1998) (http://europa.eu.int/comm/food/fs/sc/index_en.html).

9

ex

---

I LISA

Direktiivi 86/362/EMÜ II lisa A-osas lisatakse desmedifaami, fenmedifaami ja klorofenvinfossi kohta järgmised read:

| Pestitsiidide jääk | Piirnorm mg/kg |
| --- | --- |
| “Desmedifaam | 0,05 (1)
   (2) teravili |
| Fenmedifaam | 0,05 (1)
   (2) teravili |
| Klorofenvinfoss (E- ja Z-isomeerid kokku) | 0,02 (1) teravili |

Pestitsiidide jääk

Piirnorm mg/kg

“Desmedifaam

0,05 (1)
   (2) teravili

Fenmedifaam

0,05 (1)
   (2) teravili

Klorofenvinfoss (E- ja Z-isomeerid kokku)

0,02 (1) teravili

---

(1)  Väljendab analüütiliselt määratud alammäära.

1

(2)  Näitab, et jääkide piirnormid on kehtestatud ajutiselt vastavalt direktiivi 91/414/EMÜ artikli 4 lõike 1 punktile f.”

2

---

II LISA

Direktiivi 86/363/EMÜ II lisa muudetakse järgmiselt.

| (1) | A-osas lisatakse järgmine rida klorofenvinfossi kohta:








  Pestitsiidide jäägid | Piirnorm mg/kg |
| --- | --- | --- |
| | I lisas rubriikides ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 ja 1602 nimetatud lihas, lihavalmististes, rupsis ja loomarasvades sisalduva rasva puhul 1, 4 | I lisas rubriigis 0401 nimetatud lehmatoorpiima ja -täispiima puhul; muude rubriikidesse 0401, 0402, 0405 00 ja 0406 kuuluvate toiduainete puhul 2, 4 | I lisas rubriikides 0407 00 ja 0408 nimetatud värskete koorega munade, linnumunade ja munarebude puhul 3, 4 |
| “klorofenvinfoss (E- ja Z-isomeerid kokku) | 0,01 (1) | 0,01 (1) | 0,01 (1) |

(1)

A-osas lisatakse järgmine rida klorofenvinfossi kohta:

Pestitsiidide jäägid

Piirnorm mg/kg

I lisas rubriikides ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 ja 1602 nimetatud lihas, lihavalmististes, rupsis ja loomarasvades sisalduva rasva puhul 1, 4

I lisas rubriigis 0401 nimetatud lehmatoorpiima ja -täispiima puhul; muude rubriikidesse 0401, 0402, 0405 00 ja 0406 kuuluvate toiduainete puhul 2, 4

I lisas rubriikides 0407 00 ja 0408 nimetatud värskete koorega munade, linnumunade ja munarebude puhul 3, 4

“klorofenvinfoss (E- ja Z-isomeerid kokku)

0,01 (1)

0,01 (1)

0,01 (1)

| (2) | B-osas lisatakse järgmine rida fenmedifaami kohta:








  Pestitsiidide jäägid | Piirnorm mg/kg |
| --- | --- | --- |
| | I lisas rubriikides ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 ja 1602 nimetatud liha (sh rasv), lihavalmististe, rupsi ja loomarasva puhul | I lisas rubriikides 0401, 0402, 0405 00 ja 0406 nimetatud piima ja piimatoodete puhul | I lisas rubriikides 0407 00 ja 0408 nimetatud värskete koorega munade, linnumunade ja munarebude puhul |
| “fenmedifaam (metüül-N-(3-hüdroksüfenüül) karbamaat (MHPC), väljendatult fenmedifaamina | 0,05 (2)
   (3) | 0,05 (2)
   (3) | 0,05 (2)
   (3) |

(2)

B-osas lisatakse järgmine rida fenmedifaami kohta:

Pestitsiidide jäägid

Piirnorm mg/kg

I lisas rubriikides ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 ja 1602 nimetatud liha (sh rasv), lihavalmististe, rupsi ja loomarasva puhul

I lisas rubriikides 0401, 0402, 0405 00 ja 0406 nimetatud piima ja piimatoodete puhul

I lisas rubriikides 0407 00 ja 0408 nimetatud värskete koorega munade, linnumunade ja munarebude puhul

“fenmedifaam (metüül-N-(3-hüdroksüfenüül) karbamaat (MHPC), väljendatult fenmedifaamina

0,05 (2)
   (3)

0,05 (2)
   (3)

0,05 (2)
   (3)

---

(1)  Väljendab analüütiliselt määratud alammäära.”

(2)  Väljendab analüütiliselt määratud alammäära.

(3)  Väljendab ajutist jääkide piirnormi vastavalt direktiivi 91/414/EMÜ artikli 4 lõike 1 punktile f; kui piirnormi ei muudeta, muutub see lõplikuks 9. augustist 2010.”

---

III LISA

Direktiivi 90/642/EMÜ II lisa A-osas lisatakse järgmised veerud desmedifaami, fenmedifaami ja klorofenvinfossi kohta:

| Pestitsiidide jäägid ja jääkide piirnormid (mg/kg) |
| --- |
| Tooterühmad ja üksiktooted, mille suhtes kohaldatakse jääkide piirnorme | Desmedifaam | Fenmedifaam | Klorofenvinfoss (E- ja Z-isomeerid kokku) |
| “1. | Värske, kuivatatud või kuumtöötlemata, külmutatud suhkrulisandita puuvili; pähklid | 0,05 (1)
   (2) | | 0,02 (1) |
| | (i) | TSITRUSVILJAD | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Greipfruudid | | | |
| | | Sidrunid | | | |
| | | Laimid | | | |
| | | Mandariinid (sh klementiinid ja samalaadsed hübriidid) | | | |
| | | Apelsinid | | | |
| | | Pomelod | | | |
| | | Muud | | | |
| | (ii) | PÄHKLID (koortega või ilma) | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Mandlid | | | |
| | | Brasiilia pähklid | | | |
| | | Kašupähklid | | | |
| | | Kastanid | | | |
| | | Kookospähklid | | | |
| | | Sarapuupähklid | | | |
| | | Makadaamiapähklid | | | |
| | | Pekanipähklid | | | |
| | | Piiniapähklid | | | |
| | | Pistaatsiapähklid | | | |
| | | Kreeka pähklid | | | |
| | | Muud | | | |
| | (iii) | ÕUNVILJAD | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Õunad | | | |
| | | Pirnid | | | |
| | | Küdooniad | | | |
| | | Muud | | | |
| | (iv) | LUUVILJAD | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Aprikoosid | | | |
| | | Kirsid | | | |
| | | Virsikud (sh nektariinid ja samalaadsed hübriidid) | | | |
| | | Ploomid | | | |
| | | Muud | | | |
| | (v) | MARJAD | | | |
| | | (a) | Laua- ja veiniviinamarjad | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | Lauaviinamarjad | | | |
| | | | Veiniviinamarjad | | | |
| | | (b) | Maasikad (v.a metsmaasikad) | | 0,1 (1)
   (2) | |
| | | (c) | Koguviljad (v.a metsamarjad) | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | Murakad | | | |
| | | | Põldmurakad | | | |
| | | | Logani murakad | | | |
| | | | Vaarikad | | | |
| | | | Muud | | | |
| | | (d) | Muud marjad (v.a metsamarjad) | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | Mustikad | | | |
| | | | Jõhvikad | | | |
| | | | Sõstrad (punased, mustad ja valged) | | | |
| | | | Karusmarjad | | | |
| | | | Muud | | | |
| | | (e) | Metsa marjad | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | (vi) | MUUD VILJAD | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Avokaadod | | | |
| | | Banaanid | | | |
| | | Datlid | | | |
| | | Viigimarjad | | | |
| | | Kiivid | | | |
| | | Kääbusapelsinid | | | |
| | | Litšid | | | |
| | | Mangod | | | |
| | | Oliivid (lauaoliivid) | | | |
| | | Oliivid (õli ekstraheerimiseks) | | | |
| | | Papaiad | | | |
| | | Granadillid | | | |
| | | Ananassid | | | |
| | | Granaatõunad | | | |
| | | Muud | | | |
| 2. | Köögiviljad: värsked või kuumtöötlemata, külmutatud või kuivatatud | 0,05 (1)
   (2) | | |
| | (i) | JUUR- JA MUGULKÖÖGIVILI | | | |
| | | Söögipeet | | 0,1 (1)
   (2) | |
| | | Porgand | | | 0,5 |
| | | Kassaava | | | |
| | | Juurseller | | | |
| | | Mädarõigas | | | |
| | | Maapirn | | | |
| | | Pastinaak | | | 0,5 |
| | | Juurpetersell | | | |
| | | Redis | | | 0,5 |
| | | Aed-piimjuur | | | |
| | | Bataat | | | |
| | | Kaalikas | | | 0,5 |
| | | Naeris | | | 0,5 |
| | | Jamss | | | |
| | | Muud | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | (ii) | SIBULKÖÖGIVILI | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Küüslauk | | | 0,5 |
| | | Sibul | | | |
| | | Šalott | | | 0,5 |
| | | Talisibul | | | |
| | | Muud | | | 0,02 (1) |
| | (iii) | VILIKÖÖGIVILI | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | (a) | Maavitsalised | | | 0,02 (1) |
| | | | Tomatid | | | |
| | | | Paprikad | | | |
| | | | Baklažaanid | | | |
| | | | Okra | | | |
| | | | Muud | | | |
| | | (b) | Kõrvitsalised – söödava koorega | | | |
| | | | Kurk | | | |
| | | | Kornišon | | | |
| | | | Kabatšokk | | | 0,1 |
| | | | Muud | | | 0,02 (1) |
| | | (c) | Kõrvitsalised – mittesöödava koorega | | | 0,02 (1) |
| | | | Melonid | | | |
| | | | Patissonid | | | |
| | | | Arbuusid | | | |
| | | | Muud | | | |
| | | (d) | Suhkrumais | | | 0,02 (1) |
| | (iv) | KAPSASKÖÖGIVILI | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | (a) | Õisik-kapsas | | | 0,02 (1) |
| | | | Spargelkapsas (sh asparkapsas) | | | |
| | | | Lillkapsas | | | |
| | | | Muud | | | |
| | | (b) | Peakapsad | | | |
| | | | Rooskapsas | | | 0,1 |
| | | | Peakapsas | | | 0,5 |
| | | | Muud | | | 0,02 (1) |
| | | (c) | Lehtkapsad | | | 0,02 (1) |
| | | | Hiina kapsas | | | |
| | | | Lehtkapsas | | | |
| | | | Muud | | | |
| | | (d) | Nuikapsas | | | 0,3 |
| | (v) | LEHTKÖÖGIVILI JA VÄRSKED MAITSETAIMED | | | |
| | | (a) | Aedsalat jms | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | Salatkress | | | 0,1 |
| | | | Põldkännak | | | 0,1 |
| | | | Salat | | | |
| | | | Eskariool (sile endiiviasigur) | | | |
| | | | Põld-võõrkapsas (ruccola salat) | | | |
| | | | Kapsalehed ja -leherootsud | | | |
| | | | Muud | | | 0,02 (1) |
| | | (b) | Spinat jms | | 0,5 (2) | |
| | | | Aedspinat | | | 0,1 |
| | | | Lehtpeet (mangold) | | | |
| | | | Muud | | | 0,02 (1) |
| | | (c) | Ürt-allikkress | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | | (d) | Harilik sigur | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | | (e) | Maitsetaimed | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | Aed-harakputk | | | |
| | | | Murulauk | | | |
| | | | Petersell | | | 0,5 |
| | | | Lehtseller | | | |
| | | | Muud | | | 0,02 (1) |
| | (vi) | KAUNVILI (värske) | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | | Oad (kaunadega) | | | |
| | | Oad (kaunadeta) | | | |
| | | Herned (kaunadega) | | | |
| | | Herned (kaunadeta) | | | |
| | | Muud | | | |
| | (vii) | VARSKÖÖGIVILI (värske) | | | |
| | | Spargel | | | 0,1 |
| | | Hispaania artišokk | | | |
| | | Seller | | | 0,5 |
| | | Apteegitill | | | |
| | | Kera-artišokk | | 0,2 (2) | |
| | | Porrulauk | | | 0,1 |
| | | Rabarber | | | |
| | | Muud | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | (viii) | SEENED | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | (a) | Kultuurseened | | | 0,05 |
| | | (b) | Metsaseened | | | 0,02 (1) |
| 3. | Kaunviljad | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | Oad | | | |
| | Läätsed | | | |
| | Herned | | | |
| | Muud | | | |
| 4. | Õliseemned | 0,1 (1)
   (2) | 0,1 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | Linaseemned | | | |
| | Maapähklid | | | |
| | Mooniseemned | | | |
| | Seesamiseemned | | | |
| | Päevalilleseemned | | | |
| | Rapsiseemned | | | |
| | Sojaoad | | | |
| | Sinepiseemned | | | |
| | Puuvillaseemned | | | |
| | Kanepiseemned | | | |
| | Muud | | | |
| 5. | Kartulid | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | Varajane kartul | | | |
| | Säilituskartul | | | |
| 6. | Tee (kuivatatud lehed ja varred, fermenteeritud või muul viisil töödeldud, Camellia sinensis) | 0,1 (1)
   (2) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| 7. | Humalad (kuivatatud), sealhulgas humalakäbi graanulid ja kontsentreerimata pulber | 0,1 (1)
   (2) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1) |

Pestitsiidide jäägid ja jääkide piirnormid (mg/kg)

Tooterühmad ja üksiktooted, mille suhtes kohaldatakse jääkide piirnorme

Desmedifaam

Fenmedifaam

Klorofenvinfoss (E- ja Z-isomeerid kokku)

“1.

Värske, kuivatatud või kuumtöötlemata, külmutatud suhkrulisandita puuvili; pähklid

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

(i)

TSITRUSVILJAD

0,05 (1)
   (2)

Greipfruudid

Sidrunid

Laimid

Mandariinid (sh klementiinid ja samalaadsed hübriidid)

Apelsinid

Pomelod

Muud

(ii)

PÄHKLID (koortega või ilma)

0,05 (1)
   (2)

Mandlid

Brasiilia pähklid

Kašupähklid

Kastanid

Kookospähklid

Sarapuupähklid

Makadaamiapähklid

Pekanipähklid

Piiniapähklid

Pistaatsiapähklid

Kreeka pähklid

Muud

(iii)

ÕUNVILJAD

0,05 (1)
   (2)

Õunad

Pirnid

Küdooniad

Muud

(iv)

LUUVILJAD

0,05 (1)
   (2)

Aprikoosid

Kirsid

Virsikud (sh nektariinid ja samalaadsed hübriidid)

Ploomid

Muud

(v)

MARJAD

(a)

Laua- ja veiniviinamarjad

0,05 (1)
   (2)

Lauaviinamarjad

Veiniviinamarjad

(b)

Maasikad (v.a metsmaasikad)

0,1 (1)
   (2)

(c)

Koguviljad (v.a metsamarjad)

0,05 (1)
   (2)

Murakad

Põldmurakad

Logani murakad

Vaarikad

Muud

(d)

Muud marjad (v.a metsamarjad)

0,05 (1)
   (2)

Mustikad

Jõhvikad

Sõstrad (punased, mustad ja valged)

Karusmarjad

Muud

(e)

Metsa marjad

0,05 (1)
   (2)

(vi)

MUUD VILJAD

0,05 (1)
   (2)

Avokaadod

Banaanid

Datlid

Viigimarjad

Kiivid

Kääbusapelsinid

Litšid

Mangod

Oliivid (lauaoliivid)

Oliivid (õli ekstraheerimiseks)

Papaiad

Granadillid

Ananassid

Granaatõunad

Muud

2.

Köögiviljad: värsked või kuumtöötlemata, külmutatud või kuivatatud

0,05 (1)
   (2)

(i)

JUUR- JA MUGULKÖÖGIVILI

Söögipeet

0,1 (1)
   (2)

Porgand

0,5

Kassaava

Juurseller

Mädarõigas

Maapirn

Pastinaak

0,5

Juurpetersell

Redis

0,5

Aed-piimjuur

Bataat

Kaalikas

0,5

Naeris

0,5

Jamss

Muud

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

(ii)

SIBULKÖÖGIVILI

0,05 (1)
   (2)

Küüslauk

0,5

Sibul

Šalott

0,5

Talisibul

Muud

0,02 (1)

(iii)

VILIKÖÖGIVILI

0,05 (1)
   (2)

(a)

Maavitsalised

0,02 (1)

Tomatid

Paprikad

Baklažaanid

Okra

Muud

(b)

Kõrvitsalised – söödava koorega

Kurk

Kornišon

Kabatšokk

0,1

Muud

0,02 (1)

(c)

Kõrvitsalised – mittesöödava koorega

0,02 (1)

Melonid

Patissonid

Arbuusid

Muud

(d)

Suhkrumais

0,02 (1)

(iv)

KAPSASKÖÖGIVILI

0,05 (1)
   (2)

(a)

Õisik-kapsas

0,02 (1)

Spargelkapsas (sh asparkapsas)

Lillkapsas

Muud

(b)

Peakapsad

Rooskapsas

0,1

Peakapsas

0,5

Muud

0,02 (1)

(c)

Lehtkapsad

0,02 (1)

Hiina kapsas

Lehtkapsas

Muud

(d)

Nuikapsas

0,3

(v)

LEHTKÖÖGIVILI JA VÄRSKED MAITSETAIMED

(a)

Aedsalat jms

0,05 (1)
   (2)

Salatkress

0,1

Põldkännak

0,1

Salat

Eskariool (sile endiiviasigur)

Põld-võõrkapsas (ruccola salat)

Kapsalehed ja -leherootsud

Muud

0,02 (1)

(b)

Spinat jms

0,5 (2)

Aedspinat

0,1

Lehtpeet (mangold)

Muud

0,02 (1)

(c)

Ürt-allikkress

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

(d)

Harilik sigur

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

(e)

Maitsetaimed

0,05 (1)
   (2)

Aed-harakputk

Murulauk

Petersell

0,5

Lehtseller

Muud

0,02 (1)

(vi)

KAUNVILI (värske)

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

Oad (kaunadega)

Oad (kaunadeta)

Herned (kaunadega)

Herned (kaunadeta)

Muud

(vii)

VARSKÖÖGIVILI (värske)

Spargel

0,1

Hispaania artišokk

Seller

0,5

Apteegitill

Kera-artišokk

0,2 (2)

Porrulauk

0,1

Rabarber

Muud

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

(viii)

SEENED

0,05 (1)
   (2)

(a)

Kultuurseened

0,05

(b)

Metsaseened

0,02 (1)

3.

Kaunviljad

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

Oad

Läätsed

Herned

Muud

4.

Õliseemned

0,1 (1)
   (2)

0,1 (1)
   (2)

0,02 (1)

Linaseemned

Maapähklid

Mooniseemned

Seesamiseemned

Päevalilleseemned

Rapsiseemned

Sojaoad

Sinepiseemned

Puuvillaseemned

Kanepiseemned

Muud

5.

Kartulid

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

Varajane kartul

Säilituskartul

6.

Tee (kuivatatud lehed ja varred, fermenteeritud või muul viisil töödeldud, Camellia sinensis)

0,1 (1)
   (2)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)

7.

Humalad (kuivatatud), sealhulgas humalakäbi graanulid ja kontsentreerimata pulber

0,1 (1)
   (2)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)

---

(1)  Väljendab analüütiliselt määratud alammäära.

1

(2)  Näitab, et jääkide piirnormid on kehtestatud ajutiselt vastavalt direktiivi 91/414/EMÜ artikli 4 lõike 1 punktile f.”

2

---

| 27.7.2006 | ET | Euroopa Liidu Teataja | L 206/36 |
| --- | --- | --- | --- |

27.7.2006

ET

Euroopa Liidu Teataja

L 206/36

---

KOMISJONI DIREKTIIV 2006/63/EÜ,

14. juuli 2006,

millega muudetakse haigusetekitaja Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. tõrjet käsitleva nõukogu direktiivi 98/57/EÜ II-VII lisa

EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON,

võttes arvesse Euroopa Ühenduse asutamislepingut,

võttes arvesse nõukogu 20. juuli 1998. aasta direktiivi 98/57/EÜ, mis käsitleb haigusetekitaja Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. tõrjet, (1) eriti selle artiklit 11,

ning arvestades järgmist:

| (1) | Üks tähtsamaid kartulile ja tomatile kahjulikke organisme on Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., mis on kartuli pruun-baktermädaniku ning kartulite ja tomatite bakteriaalse närbumistõve haigusetekitaja (edaspidi “organism”). |
| --- | --- |

(1)

Üks tähtsamaid kartulile ja tomatile kahjulikke organisme on Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., mis on kartuli pruun-baktermädaniku ning kartulite ja tomatite bakteriaalse närbumistõve haigusetekitaja (edaspidi “organism”).

| (2) | Organism esineb siiani mõnes ühenduses osas. |
| --- | --- |

(2)

Organism esineb siiani mõnes ühenduses osas.

| (3) | Direktiivis 98/57/EÜ on sätestatud üksikasjalikud meetmed, mida liikmesriigid peavad võtma organismi vastu, et kindlaks teha selle asukoht ja levik, vältida selle esinemist ja levikut, avastamise korral vältida selle levikut ja tõrjuda haigust likvideerimise eesmärgil. |
| --- | --- |

(3)

Direktiivis 98/57/EÜ on sätestatud üksikasjalikud meetmed, mida liikmesriigid peavad võtma organismi vastu, et kindlaks teha selle asukoht ja levik, vältida selle esinemist ja levikut, avastamise korral vältida selle levikut ja tõrjuda haigust likvideerimise eesmärgil.

| (4) | Vahepeal on toimunud märkimisväärne areng bioloogias ning organismi avastamis- ja kindlaksmääramismenetluses, organismi tõrjel saadud praktiliste kogemuste toel tuleks läbi vaadata mitmed tõrjemeetmetega seotud tehnilised sätted. |
| --- | --- |

(4)

Vahepeal on toimunud märkimisväärne areng bioloogias ning organismi avastamis- ja kindlaksmääramismenetluses, organismi tõrjel saadud praktiliste kogemuste toel tuleks läbi vaadata mitmed tõrjemeetmetega seotud tehnilised sätted.

| (5) | Sellise arengu tulemusel on ilmselt vajalik läbi vaadata ja ajakohastada direktiivi 98/57/EÜ teatavates lisades olevad meetmed. |
| --- | --- |

(5)

Sellise arengu tulemusel on ilmselt vajalik läbi vaadata ja ajakohastada direktiivi 98/57/EÜ teatavates lisades olevad meetmed.

| (6) | Avastamis- ja kindlaksmääramismenetlusse on inkorporeeritud moodne avastamismenetlus fluorestsents in situ hübridisatsioon (FISH). Hõlmatud on polümeraasi ahelreaktsioon (polymerase chain reaction – PCR) ning praeguse avastamis- ja kindlaksmääramismenetluse erinevate tehniliste osade täiustused, samuti organismi avastamis- ja kindlaksmääramismeetodid teistes peremeestaimedes peale kartuli ning vees ja mullas. |
| --- | --- |

(6)

Avastamis- ja kindlaksmääramismenetlusse on inkorporeeritud moodne avastamismenetlus fluorestsents in situ hübridisatsioon (FISH). Hõlmatud on polümeraasi ahelreaktsioon (polymerase chain reaction – PCR) ning praeguse avastamis- ja kindlaksmääramismenetluse erinevate tehniliste osade täiustused, samuti organismi avastamis- ja kindlaksmääramismeetodid teistes peremeestaimedes peale kartuli ning vees ja mullas.

| (7) | Tõrjemeetmete tehniliste osade puhul on täiendatud järgmisi osi: laboratoorselt analüüsitud proovide säilitamine nii, et oleks võimalik tagada organismi tagantjärele kindlakstegemine, võimaliku saastumise ulatuse kindlaksmääramiseks vajalikud tegurid, organismi mis tahes kinnitatud esinemisest ja asjaomasest saastunud tsoonist teatamise üksikasjad, saastunuks tunnistatud tootmiskohtades ja piiritletud tsoonides rakendatavad meetmed. Lisaks on inkorporeeritud mõned sätted tomati kohta, et võtta rohkem arvesse selle taime asjakohasust organismi peremeestaimena. |
| --- | --- |

(7)

Tõrjemeetmete tehniliste osade puhul on täiendatud järgmisi osi: laboratoorselt analüüsitud proovide säilitamine nii, et oleks võimalik tagada organismi tagantjärele kindlakstegemine, võimaliku saastumise ulatuse kindlaksmääramiseks vajalikud tegurid, organismi mis tahes kinnitatud esinemisest ja asjaomasest saastunud tsoonist teatamise üksikasjad, saastunuks tunnistatud tootmiskohtades ja piiritletud tsoonides rakendatavad meetmed. Lisaks on inkorporeeritud mõned sätted tomati kohta, et võtta rohkem arvesse selle taime asjakohasust organismi peremeestaimena.

| (8) | Käesoleva direktiiviga ette nähtud meetmed on kooskõlas alalise taimetervise komitee arvamusega, |
| --- | --- |

(8)

Käesoleva direktiiviga ette nähtud meetmed on kooskõlas alalise taimetervise komitee arvamusega,

ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA DIREKTIIVI:

Artikkel 1

Direktiivi 98/57/EÜ II–VII lisa asendatakse käesoleva direktiivi lisas olevate vastavate tekstidega.

Artikkel 2

1.   Liikmesriigid võtavad vastu ja avaldavad käesoleva direktiivi järgimiseks vajalikud õigusnormid hiljemalt 31. märtsiks 2007. Liikmesriigid edastavad nende normide teksti ning normide ja käesoleva direktiivi vastavustabeli viivitamata komisjonile.

Liikmesriigid kohaldavad neid norme alates 1. aprillist 2007.

Kui liikmesriigid need normid vastu võtavad, lisavad nad nendesse normidesse või nende normide ametliku avaldamise korral nende juurde viite käesolevale direktiivile. Viitamise viisi näevad ette liikmesriigid.

2.   Liikmesriigid edastavad viivitamata komisjonile käesoleva direktiiviga reguleeritavas valdkonnas nende poolt vastu võetud põhiliste riigisiseste õigusnormide teksti.

Artikkel 3

Käesolev direktiiv jõustub kolmandal päeval pärast selle avaldamist Euroopa Liidu Teatajas.

Artikkel 4

Käesolev direktiiv on adresseeritud liikmesriikidele.

Brüssel, 14. juuli 2006

Komisjoni nimel

komisjoni liige

Markos KYPRIANOU

---

(1)  EÜT L 235, 21.8.1998, lk 1.

1

---

LISA

II LISA

HAIGUSETEKITAJA RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL. DIAGNOOSIMISE, AVASTAMISE JA KINDLAKSMÄÄRAMISE ANALÜÜSIMETOODIKA

AANALÜÜSIMETOODIA KOHALDAMISALA

Käesoleva metoodikaga kirjeldatakse eri menetlusi, mis on seotud järgmisega:

| i) | pruun-baktermädaniku diagnoosimisega kartulimugulates ja bakteriaalse närbumistõve diagnoosimisega kartulis ja tomatis ja mõnedes teistes peremeestaimedes; |
| --- | --- |

i)

pruun-baktermädaniku diagnoosimisega kartulimugulates ja bakteriaalse närbumistõve diagnoosimisega kartulis ja tomatis ja mõnedes teistes peremeestaimedes;

| ii) | bakteri Ralstonia solanacearum avastamisega kartulimugulates, kartulis ja tomatis ning mõnedes teistes peremeestaimedes, vees ja mullas; |
| --- | --- |

ii)

bakteri Ralstonia solanacearum avastamisega kartulimugulates, kartulis ja tomatis ning mõnedes teistes peremeestaimedes, vees ja mullas;

| iii) | bakteri Ralstonia solanacearum (R. solanacearum) kindlaksmääramisega. |
| --- | --- |

iii)

bakteri Ralstonia solanacearum (R. solanacearum) kindlaksmääramisega.

SISUKORD

| | | Lehekülg |
| --- | --- | --- |
| | Üldpõhimõtted | 40 |
| I JAGU | Analüüsimetoodika rakendamine | 40 |
| | 1. | Avastusmetoodika pruun-baktermädaniku ja bakteriaalse närbumistõve (R. solanacearum) diagnoosimiseks pruun-baktermädaniku või bakteriaalse närbumistõve sümptomitega kartulimugulates ja kartulis, tomatis ja teistes peremeestaimedes | 40 |
| | 2. | Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismetoodika asümptomaatiliste kartulimugulate proovides | 43 |
| | 3. | Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismetoodika asümptomaatiliste kartuli, tomati ja teiste peremeestaimede proovides | 46 |
| II JAGU | Haigusetekitaja R. solanacearum üksikasjalikud avastamismeetodid kartulimugulates ja kartulis, tomatis ja teistes peremeestaimedes, millel on pruun-baktermädaniku või bakteriaalse närbumistõve sümptomid | 48 |
| | 1. | Sümptomid | 48 |
| | 2. | Kiirsõelkatsed | 48 |
| | 3. | Bakterite isoleerimine | 49 |
| | 4. | Haigusetekitaja R. solanacearum identifitseerimisanalüüsid | 49 |
| III JAGU | 1. | Haigusetekitaja R. solanacearum üksikasjalikud avastamis- ja kindlaksmääramismeetodid asümptomaatiliste kartulimugulate proovides | 49 |
| | | 1.1. | Proovi ettevalmistamine | 49 |
| | | 1.2. | Analüüsimine | 51 |
| | 2. | Haigusetekitaja R. solanacearum üksikasjalikud avastamis- ja kindlaksmääramismeetodid asümptomaatiliste kartuli, tomati ja teiste taimede proovides | 51 |
| | | 2.1. | Proovi ettevalmistamine | 51 |
| | | 2.2. | Analüüsimine | 52 |
| IV JAGU | 1. | Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismetoodika vees | 53 |
| | 2. | Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismeetodid vees | 55 |
| | | 2.1. | Proovi ettevalmistamine | 55 |
| | | 2.2. | Analüüsimine | 55 |
| V JAGU | 1. | Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismetoodika mullas | 56 |
| | 2. | Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismeetodid mullas | 58 |
| | | 2.1. | Proovide ettevalmistamine | 58 |
| | | 2.2. | Analüüsimine | 58 |
| VI JAGU | Haigusetekitaja R. solanacearum avastamise ja kindlaksmääramise optimeeritud protokollid | 58 |
| | A. | Diagnostilised ja avastamisanalüüsid | 58 |
| | | 1. | Varrelima test | 58 |
| | | 2. | Polü-β-hüdroksübutüraadi graanulite tuvastamine | 58 |
| | | 3. | Seroloogiline aglutinatsiooni analüüs | 59 |
| | | 4. | Selektiivne isoleerimine | 60 |
| | | | 4.1. | Selektiivsöötmele väljakülvamine | 60 |
| | | | 4.2. | Rikastamismenetlus | 60 |
| | | 5. | Immunofluorestsentstest (IF-analüüs) | 61 |
| | | 6. | Polümeraasi ahelreaktsiooni test (PCR-analüüs) | 64 |
| | | | 6.1. | DNA puhastamismeetodid | 65 |
| | | | | a) | Pastriki (2000) meetod | 65 |
| | | | | b) | Muud meetodid | 65 |
| | | | 6.2. | PCR-test | 66 |
| | | | 6.3. | PCR-produkti analüüs | 66 |
| | | 7. | In situ fluorestsentshübridisatsioon (FISH-analüüs) | 67 |
| | | 8. | Ensüümne immunosorbenttest (ELISA-analüüs) | 69 |
| | | | a) | Kaudne ELISA | 69 |
| | | | b) | DASI ELISA (kaudne ELISA sandwich-meetodil) | 70 |
| | | 9. | Biotest | 71 |
| | B. | Identifitseerimisanalüüsid | 72 |
| | | 1. | Toitumuslikud ja ensümaatilised identifitseerimisanalüüsid | 72 |
| | | 2. | IF-analüüs | 72 |
| | | 3. | ELISA-analüüs | 73 |
| | | 4. | PCR-analüüs | 73 |
| | | 5. | FISH-analüüs | 73 |
| | | 6. | Rasvhapete profileerimine (FAP) | 73 |
| | | 7. | Tüve iseloomustamise meetodid | 73 |
| | | | 7.1. | Biotüübi määramine | 73 |
| | | | 7.2. | Genoomse “sõrmejäljendi” võtmine | 74 |
| | | | 7.3. | PCR-meetodid | 74 |
| | C. | Kinnitusanalüüs | 74 |
| | | 1. liide | Protokollide optimeerimise ja valideerimisega tegelevad laborid | 76 |
| | | 2. liide | Söötmed haigusetekitaja R. solanacearum isoleerimiseks ja kultiveerimiseks | 77 |
| | | 3. liide | A) | Müügil olevad standardiseeritud kontrollmaterjalid | 79 |
| | | | B) | Kontrollide ettevalmistamine | 80 |
| | | 4. liide | Analüüsimenetluste puhvrid | 82 |
| | | 5. liide | Bakterite koguse määramine IF-ja FISH-analüüsides | 85 |
| | | 6. liide | Valideeritud PCR-protokollid ja -reaktiivid | 86 |
| | | 7. liide | FISH-analüüsi valideeritud reaktiivid | 91 |
| | | 8. liide | Baklažaani- ja tomatikultuuride kasvatamistingimused | 93 |
| | | Viited | | 94 |

Lehekülg

Üldpõhimõtted

40

I JAGU

Analüüsimetoodika rakendamine

40

1.

Avastusmetoodika pruun-baktermädaniku ja bakteriaalse närbumistõve (R. solanacearum) diagnoosimiseks pruun-baktermädaniku või bakteriaalse närbumistõve sümptomitega kartulimugulates ja kartulis, tomatis ja teistes peremeestaimedes

40

2.

Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismetoodika asümptomaatiliste kartulimugulate proovides

43

3.

Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismetoodika asümptomaatiliste kartuli, tomati ja teiste peremeestaimede proovides

46

II JAGU

Haigusetekitaja R. solanacearum üksikasjalikud avastamismeetodid kartulimugulates ja kartulis, tomatis ja teistes peremeestaimedes, millel on pruun-baktermädaniku või bakteriaalse närbumistõve sümptomid

48

1.

Sümptomid

48

2.

Kiirsõelkatsed

48

3.

Bakterite isoleerimine

49

4.

Haigusetekitaja R. solanacearum identifitseerimisanalüüsid

49

III JAGU

1.

Haigusetekitaja R. solanacearum üksikasjalikud avastamis- ja kindlaksmääramismeetodid asümptomaatiliste kartulimugulate proovides

49

1.1.

Proovi ettevalmistamine

49

1.2.

Analüüsimine

51

2.

Haigusetekitaja R. solanacearum üksikasjalikud avastamis- ja kindlaksmääramismeetodid asümptomaatiliste kartuli, tomati ja teiste taimede proovides

51

2.1.

Proovi ettevalmistamine

51

2.2.

Analüüsimine

52

IV JAGU

1.

Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismetoodika vees

53

2.

Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismeetodid vees

55

2.1.

Proovi ettevalmistamine

55

2.2.

Analüüsimine

55

V JAGU

1.

Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismetoodika mullas

56

2.

Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismeetodid mullas

58

2.1.

Proovide ettevalmistamine

58

2.2.

Analüüsimine

58

VI JAGU

Haigusetekitaja R. solanacearum avastamise ja kindlaksmääramise optimeeritud protokollid

58

A.

Diagnostilised ja avastamisanalüüsid

58

1.

Varrelima test

58

2.

Polü-β-hüdroksübutüraadi graanulite tuvastamine

58

3.

Seroloogiline aglutinatsiooni analüüs

59

4.

Selektiivne isoleerimine

60

4.1.

Selektiivsöötmele väljakülvamine

60

4.2.

Rikastamismenetlus

60

5.

Immunofluorestsentstest (IF-analüüs)

61

6.

Polümeraasi ahelreaktsiooni test (PCR-analüüs)

64

6.1.

DNA puhastamismeetodid

65

a)

Pastriki (2000) meetod

65

b)

Muud meetodid

65

6.2.

PCR-test

66

6.3.

PCR-produkti analüüs

66

7.

In situ fluorestsentshübridisatsioon (FISH-analüüs)

67

8.

Ensüümne immunosorbenttest (ELISA-analüüs)

69

a)

Kaudne ELISA

69

b)

DASI ELISA (kaudne ELISA sandwich-meetodil)

70

9.

Biotest

71

B.

Identifitseerimisanalüüsid

72

1.

Toitumuslikud ja ensümaatilised identifitseerimisanalüüsid

72

2.

IF-analüüs

72

3.

ELISA-analüüs

73

4.

PCR-analüüs

73

5.

FISH-analüüs

73

6.

Rasvhapete profileerimine (FAP)

73

7.

Tüve iseloomustamise meetodid

73

7.1.

Biotüübi määramine

73

7.2.

Genoomse “sõrmejäljendi” võtmine

74

7.3.

PCR-meetodid

74

C.

Kinnitusanalüüs

74

1. liide

Protokollide optimeerimise ja valideerimisega tegelevad laborid

76

2. liide

Söötmed haigusetekitaja R. solanacearum isoleerimiseks ja kultiveerimiseks

77

3. liide

A)

Müügil olevad standardiseeritud kontrollmaterjalid

79

B)

Kontrollide ettevalmistamine

80

4. liide

Analüüsimenetluste puhvrid

82

5. liide

Bakterite koguse määramine IF-ja FISH-analüüsides

85

6. liide

Valideeritud PCR-protokollid ja -reaktiivid

86

7. liide

FISH-analüüsi valideeritud reaktiivid

91

8. liide

Baklažaani- ja tomatikultuuride kasvatamistingimused

93

Viited

94

ÜLDPÕHIMÕTTED

Erinevate meetodite optimeeritud protokollid, valideeritud reaktiivid ning üksikasjad analüüsi ja kontrollainete ettevalmistuse kohta on sätestatud liidetes. 1. liites on sätestatud nende laborite nimekiri, mis tegelesid protokollide optimeerimise ja valideerimisega.

Kuna protokollid hõlmavad ohtliku organismi avastamist ja bakteri R. solanacearum elujõuliste kultuuride kasutamist kontrollmaterjalina, tuleb menetlus läbi viia sobivates karantiinitingimustes, kus on kohased jäätmete kõrvaldamise seadmed ja ametlike taimekarantiini asutuste välja antud litsentside kohased tingimused.

Analüüsiparameetrid peavad tagama bakteri R. solanacearum järjepideva ja uuesti korratava avastamise valitud meetodites sätestatud piirmäärades.

Oluline on positiivsete kontrollproovide täpne ettevalmistamine.

Analüüside tegemisel vastavalt nõutavatele piirmääradele tuleb tähelepanu pöörata ka seadmete õigele seadistusele, hooldusele ja kalibreerimisele, reaktiivide hoolikale käitlemisele ja säilitamisele ning kõigile meetmetele, mille eesmärk on vältida proovide omavahelist saastumist, s.t positiivsete kontrollproovide eraldamisele analüüsitavatest proovidest. Tuleb kohaldada kvaliteedikontrolli standardeid, et vältida halduslikke ja muid vigu, eelkõige seoses märgistamise ja dokumentidega.

Direktiivi 98/57/EÜ artikli 4 lõikes 2 osutatud haiguse esinemise kahtlus tähendab diagrammides määratletud proovi diagnostiliste või sõelkatsete positiivset tulemust. Esimese sõelkatse (IF-analüüs, PCR/FISH, selektiivne isoleerimine) positiivset tulemust tuleb kinnitada teise sõelkatsega, mis põhineb erineval bioloogilisel põhimõttel.

Kui esimese sõelkatse tulemus on positiivne, kahtlustatakse nakatumist bakteriga R. solanacearum ning tuleb teha teine sõelkatse. Kui teine sõelkatse annab positiivse tulemuse, on kahtlus leidnud kinnituse (haiguse esinemise kahtlus) ning tuleb jätkata analüüside tegemist vastavalt metoodikale. Kui teine sõelkatse annab negatiivse tulemuse, ei peeta proovi bakteriga nakatunuks.

Direktiivi 98/57/EÜ artikli 5 lõikes 1 osutatud kinnitatud organismi olemasolu tähendab bakteri R. solanacearum puhaskultuuri isoleerimist ja identifitseerimist koos patogeensuse kinnitusega.

I JAGU

ANALÜÜSIMETOODIKA RAKENDAMINE

1.   Avastusmetoodika pruun-baktermädaniku ja bakteriaalse närbumistõve (Ralstonia solanacearum) diagnoosimiseks pruun-baktermädaniku ja bakteriaalse närbumistõve sümptomitega kartulimugulates ja kartulis, tomatis ja teistes peremeestaimedes

Analüüsimetoodika on ette nähtud kartulimugulate ja -taimede puhul, millel esinevad tüüpilised või kahtlased pruun-baktermädaniku või bakteriaalse närbumistõve sümptomid. Siia kuuluvad kiiranalüüsid, saastunud juhtkoest patogeeni isoleerimine (selektiiv)söötmele ja positiivse tulemuse korral bakteri Ralstonia solanacearum kindlaksmääramine.

Image

Image

2.   Haigusetekitaja Ralstonia solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismetoodika asümptomaatiliste kartulimugulate proovides

Põhimõte

Analüüsimeetod on mõeldud latentsete nakkuste avastamiseks kartulimugulates. Erinevatel bioloogilistel põhimõtetel põhineva vähemalt kahe sõelkatse positiivse tulemuse korral3 tuleb patogeen isoleerida; kui isoleeritakse tüüpilised kolooniad, peab järgnema bakteri R. solanacearum puhaskultuuri identifitseerimine. Ainult ühe määramismeetodi positiivsest tulemusest ei piisa selleks, et lugeda proov kahtlaseks.

Sõelkatsed ja isolatsioonianalüüsid peavad võimaldama avastada 103 kuni 104 rakku resuspenseeritud bakterisademe milliliitri kohta, mis kuuluvad positiivse kontrollina igasse analüüsiseeriasse.

Image

Image

3.   Haigusetekitaja Ralstonia solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismetoodika asümptomaatiliste kartuli, tomati ja teiste peremeestaimede proovides

Image

Image

II JAGU

HAIGUSETEKITAJA RALSTONIA SOLANACEARUM ÜKSIKASJALIKUD AVASTAMISMEETODID KARTULIMUGULATES JA KARTULIS, TOMATIS JA TEISTES PEREMEESTAIMEDES, MILLEL ON PRUUN-BAKTERMÄDANIKU VÕI BAKTERIAALSE NÄRBUMISTÕVE SÜMPTOMID

1.   Sümptomid (vt veebileht http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

1.1.   Sümptomid kartulil

Kartulitaim. Infektsiooni varajast staadiumit põllul iseloomustab päevaste kõrgete temperatuuride juures närbumine alates alumistest lehtedest taime tipu suunas, kusjuures öösel taim taastub. Närbumise varajastes staadiumides jäävad lehed roheliseks, kuid hiljem muutuvad need kollaseks ja pruuniks ning kärbuvad. Esineb ka lehtede allapoole keerdumist. Ühe võrse või kogu taime närbumine muutub kiiresti pöördumatuks ning lõpeb taime kokkuvarisemise ja hukuga. Närbunud taime varre ristlõike juhtkude on tavaliselt pruuniks muutunud ning piimjas bakterilima immitseb lõikepinnalt või eritub pigistamisel. Kui läbilõigatud taimevars on asetatud vertikaalselt vette, on näha limaniitide väljavoolamist juhtkimpudest.

Kartulimugul. Kartulimugulast tuleb teha ristläbilõige basaalse (stoolonipoolse) tipu lähedalt või lõigata pikisuunaliselt üle stooloni tipu. Infektsiooni varajane staadium on äratuntav juhtkoeringi klaasistumisena ja värvusemuutusena klaasjaskollakast helepruunini ning ringist võib lõikekohal pärast mõne minuti möödumist iseeneslikult erituda kahvatu kreemjas bakteriaalne eritis. Hiljem muutub juhtkoering selgelt eristatavalt pruuniks ning kärbumine võib ulatuda põhikoeni. Edasiarenenud infektsioonifaasis võib bakterilima erituda ka basaalsest tipust või kartulisilmadest, põhjustades mullaosakeste kleepumist mugulale. Juhtkoe sisemise kokkuvajumise tõttu võivad koorel tekkida punakaspruunid sissevajunud kahjustused. Haiguse edasiarenenud faasides on tavapärane sekundaarsete seente ja bakterite põhjustatud pehmete mädanike areng.

1.2.   Sümptomid tomatil

Tomatitaim. Esimeseks nähtavaks sümptomiks on noorimate lehtede longuvajumine. Haigusetekitaja jaoks soodsate keskkonnatingimuste juures (mulla temperatuur umbes 25 °C: küllastunud niiskus) esineb lehtede allapoole keerdumine ja taime osaline või täielik närbumine, millele järgneb kogu taime kokkuvarisemine mõne päeva jooksul. Vähem soodsate tingimuste korral (mulla temperatuur alla 21 °C) esineb närbumist vähem, kuid varrel võib areneda suurel hulgal lisajuuri. Varre alaosal võib märgata vesiseid triipe, mis on juhtkoes esineva nekroosi tunnuseks. Kui varrest teha ristlõige, eritub pruuniks muutunud juhtkoest valget või kollakat bakterilima.

1.3.   Sümptomid teistel peremeestaimedel

Hariliku maavitsa Solanum dulcamara ja musta maavitsa S. nigrum taimed. Kui mulla temperatuur ei ületa 25 °C ja inokulaadi tase ei ole äärmiselt kõrge (st S. nigrum ei kasva haige kartuli- või tomatitaime kõrval), täheldatakse looduslikes tingimustes nendel umbrohtudest peremeestaimedel närbumissümptomeid harva. Kui närbumine ilmneb, on sümptomid samad mis tomatil. Mittenärbunud S. dulcamara taimedel, mille varred ja juured kasvavad vees, võib ilmneda varre ala- või veealuste osade seesmine ristlõikel nähtav juhtkudede helepruuniks muutumine. Kui läbilõigatud taimevars on asetatud vertikaalselt vette, võib läbilõigatud juhtkudedest erituda bakterilima või moodustuda limaniite, seda isegi närbumissümptomite puudumisel.

2.   Kiirsõelkatsed

Kiirmääramismmeetodid võivad hõlbustada oletatava diagnoosi määramist, ent ei ole otsustava tähtsusega. Kasutatakse üht või mitut järgmistest valideeritud analüüsidest:

2.1.   Varrelima test

(Vt VI jao punkt A.1.)

2.2.   Polü-β-hüdroksübutüraadi (PHB) graanulite tuvastamine

Haigusetekitaja R. solanacearum rakkudes esinevaid iseloomulikke polü-β-hüdroksübutüraadi (PHB) graanuleid saab nähtavaks muuta nakatunud koe bakterilima läbi leegi fikseeritud äiete värvimisel mikroskoobi alusklaasil värvainetega Niiluse sinine A ja Sudaani must B (vt V jao punkt A.2.).

2.3.   Seroloogiline aglutinatsiooni analüüs

(Vt VI jao punkt A.3.)

2.4.   Muud analüüsid

Teised sobilikud kiirmääramismeetodid on IF-analüüs (vt VI jao punkt A.5.), FISH-analüüs (vt VI jao punkt A.7.), ELISA-analüüs (vt VI jao punkt A.8.) ja PCR-analüüs (vt VI jao punkt A.6).

3.   Bakterite isoleerimine

| a) | Kartulimugula juhtkoeringi muutunud värvusega osast või kartuli- või tomati- või muu närbunud peremeestaime varre juhtkimpudest eemaldatakse eritist või mõned lõiked. Lahustatakse väikeses koguses steriilses destilleeritud vees või 50 mM fosfaatpuhvris (4. liide) ja jäetakse 5–10 minutiks seisma. |
| --- | --- |

a)

Kartulimugula juhtkoeringi muutunud värvusega osast või kartuli- või tomati- või muu närbunud peremeestaime varre juhtkimpudest eemaldatakse eritist või mõned lõiked. Lahustatakse väikeses koguses steriilses destilleeritud vees või 50 mM fosfaatpuhvris (4. liide) ja jäetakse 5–10 minutiks seisma.

| b) | Suspensioonist valmistatakse rida kümnekordseid lahjendusi. |
| --- | --- |

b)

Suspensioonist valmistatakse rida kümnekordseid lahjendusi.

| c) | Suspensioonist ja selle lahjendustest mõõdetakse 50–100 μl üldsöötmele (NA, YPGA või SPA; vt 2. liide) ja/või Kelmani tetrasooliumsöötmele (2. liide) ja/või valideeritud selektiivsöötmele (nt SMSA; vt 2. liide). Kasutatakse söötmeplaadil joonkülvi tehnikat või vastava lahjenduse laiali külvamist söötmeplaadile. Vajaduse korral valmistatakse eraldi söötmeplaadid positiivse haigusetekitaja kontrolli jaoks, kasutades R. solanacearum’i biotüübi 2 tüve. |
| --- | --- |

c)

Suspensioonist ja selle lahjendustest mõõdetakse 50–100 μl üldsöötmele (NA, YPGA või SPA; vt 2. liide) ja/või Kelmani tetrasooliumsöötmele (2. liide) ja/või valideeritud selektiivsöötmele (nt SMSA; vt 2. liide). Kasutatakse söötmeplaadil joonkülvi tehnikat või vastava lahjenduse laiali külvamist söötmeplaadile. Vajaduse korral valmistatakse eraldi söötmeplaadid positiivse haigusetekitaja kontrolli jaoks, kasutades R. solanacearum’i biotüübi 2 tüve.

| d) | Plaate inkubeeritakse 28 °C juures 2–6 päeva.






  — | Üldsöötmel on virulentse R. solanacearum’i kolooniad kreemikasvalged, lamedad, ebaühtlase kujuga, fluidaalsed ning sageli iseloomulike spiraalsete keeretega keskel. R. solanacearum’i avirulentsed vormid moodustavad väikesi ümmargusi mittevedelaid võilaadseid kolooniaid, mis on täiesti kreemjasvalged. |
| --- | --- | --- |

d)

Plaate inkubeeritakse 28 °C juures 2–6 päeva.

—

Üldsöötmel on virulentse R. solanacearum’i kolooniad kreemikasvalged, lamedad, ebaühtlase kujuga, fluidaalsed ning sageli iseloomulike spiraalsete keeretega keskel. R. solanacearum’i avirulentsed vormid moodustavad väikesi ümmargusi mittevedelaid võilaadseid kolooniaid, mis on täiesti kreemjasvalged.

| — | Kelmani tetrasoolium- või SMSA-söötmel on keerded veripunased. Ralstonia solanacearum’i avirulentsed vormid moodustavad väikesi ümmargusi mittevedelaid võilaadseid kolooniaid, mis on täiesti sügavpunased. |
| --- | --- |

—

Kelmani tetrasoolium- või SMSA-söötmel on keerded veripunased. Ralstonia solanacearum’i avirulentsed vormid moodustavad väikesi ümmargusi mittevedelaid võilaadseid kolooniaid, mis on täiesti sügavpunased.

4.   R. solanacearum’i kindlaksmääramise analüüsid

R. solanacearum’i eeldatavad isolaadid saab kindlaks määrata VI jao punktis B esitatud analüüsidega.

III JAGU

1.   Haigusetekitaja Ralstonia solanacearum üksikasjalikud avastamis- ja kindlaksmääramismeetodid asümptomaatiliste kartulimugulate proovides

1.1.   Proovi ettevalmistamine

Märkus

| — | Standardproovi suurus on 200 mugulat analüüsi kohta. Intensiivsem proovivõtmine eeldab rohkem analüüse, kuid proovi suurus jääb samaks. Suurem mugulate arv proovis põhjustab tulemuste inhibeerimise või nende tõlgendamise keerukuse. Siiski saab meetodit kohaldada ka alla 200 mugulaga proovi puhul, kui rohkem mugulaid ei ole. |
| --- | --- |

—

Standardproovi suurus on 200 mugulat analüüsi kohta. Intensiivsem proovivõtmine eeldab rohkem analüüse, kuid proovi suurus jääb samaks. Suurem mugulate arv proovis põhjustab tulemuste inhibeerimise või nende tõlgendamise keerukuse. Siiski saab meetodit kohaldada ka alla 200 mugulaga proovi puhul, kui rohkem mugulaid ei ole.

| — | Kõigi allpool kirjeldatud avastamismeetodite valideerimine põhineb analüüsidel, mis on tehtud 200 mugulast koosneva prooviga. |
| --- | --- |

—

Kõigi allpool kirjeldatud avastamismeetodite valideerimine põhineb analüüsidel, mis on tehtud 200 mugulast koosneva prooviga.

| — | Allpool kirjeldatud kartuliekstrakti saab kasutada ka kartuli-ringmädaniku bakteri Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus avastamiseks. |
| --- | --- |

—

Allpool kirjeldatud kartuliekstrakti saab kasutada ka kartuli-ringmädaniku bakteri Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus avastamiseks.

Vabatahtlik eeltöötlemine enne proovi valmistamist

| a) | Proove inkubeeritakse 25–30 °C juures kuni kaks nädalat enne analüüsimist, et ergutada R. solanacearum’i populatsioonide paljunemist. |
| --- | --- |

a)

Proove inkubeeritakse 25–30 °C juures kuni kaks nädalat enne analüüsimist, et ergutada R. solanacearum’i populatsioonide paljunemist.

| b) | Mugulad pestakse. Iga proovi järel kasutatakse kohaseid desinfektsioonivahendeid (klooriühendeid, kui kasutatakse PCR-katset, et eemaldada patogeenne DNA) ja pesuaineid. Mugulad kuivatatakse õhu käes. Pesemine on eriti kasulik (kuid mitte nõutav) nende proovide puhul, millel on liiga palju mulda, ning kui tehakse PCR-analüüsi või bakterite otsest isoleerimist. |
| --- | --- |

b)

Mugulad pestakse. Iga proovi järel kasutatakse kohaseid desinfektsioonivahendeid (klooriühendeid, kui kasutatakse PCR-katset, et eemaldada patogeenne DNA) ja pesuaineid. Mugulad kuivatatakse õhu käes. Pesemine on eriti kasulik (kuid mitte nõutav) nende proovide puhul, millel on liiga palju mulda, ning kui tehakse PCR-analüüsi või bakterite otsest isoleerimist.

1.1.1.   Puhta ja desinfitseeritud skalpelli või juurviljanoa abil eemaldatakse koor mugula basaalse (stoolonipoolse) tipu juurest nii, et juhtkude tuleb nähtavale. Basaalse tipu juures lõigatakse väike juhtkoe südamik ettevaatlikult välja nii, et muid kudesid tuleks kaasa võimalikult vähe (vt veebileht http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Märkus: iga pruunmädaniku kahtlase sümptomiga mugul hoitakse alles ja sellega tehakse eraldi analüüsid.

Kui basaalse tipusüdamiku eemaldamisel ilmneb pruun-baktermädaniku kahtlaseid sümptomeid, tuleks teha selle mugula visuaalne kontroll ja mugulat lõigata basaalse tipu juures. Kõiki kahtlaste sümptomitega lõigatud mugulaid tuleks hoida korgistumiseks vähemalt kaks päeva toatemperatuuril ning seejärel säilitada jahutatult (4–10 °C) kohastes karantiinitingimustes. Kõiki mugulaid, sealhulgas kahtlaste sümptomitega, tuleks säilitada vastavalt III lisale.

1.1.2.   Basaalsed tipusüdamikud kogutakse kasutamata ühekordse kasutusega mahutitesse, mida saab sulgeda ja/või pitseerida (kui mahuteid kasutatakse uuesti, tuleks need põhjalikult puhastada ja desinfitseerida, kasutades klooriühendeid). Eelistatult tuleks eemaldatud basaalseid tipusüdamikke töödelda kohe. Kui see ei ole võimalik, hoitakse neid mahutis puhvrit lisamata, jahutatult mitte üle 72 tunni või toatemperatuuril mitte üle 24 tunni.

Basaalseid tipusüdamikke töödeldakse, kasutades üht järgmistest meetoditest.

| a) | Südamikud kaetakse piisava koguse (umbes 40 ml) ekstraktsioonipuhvriga (4. liide) ja segatakse pöörleval loksutil (50–100 pööret minutis) 4 tundi alla 24 °C juures või 16–24 tundi jahutatult. |
| --- | --- |

a)

Südamikud kaetakse piisava koguse (umbes 40 ml) ekstraktsioonipuhvriga (4. liide) ja segatakse pöörleval loksutil (50–100 pööret minutis) 4 tundi alla 24 °C juures või 16–24 tundi jahutatult.

| b) | Südamikud homogeenitakse piisava koguse (umbes 40 ml) ekstraktsioonipuhvriga (4. liide) kas segistis (näiteks Waring või Ultra Thurax) või purustades need suletud ühekordse kasutusega matseratsioonikotis (näiteks Stomacheri või Bioreba tugev kilekott mõõtudega 150 mm × 250 mm; kiirgussteriilne), kasutades kummivasarat või sobivat peenestusseadet (näiteks Homex). |
| --- | --- |

b)

Südamikud homogeenitakse piisava koguse (umbes 40 ml) ekstraktsioonipuhvriga (4. liide) kas segistis (näiteks Waring või Ultra Thurax) või purustades need suletud ühekordse kasutusega matseratsioonikotis (näiteks Stomacheri või Bioreba tugev kilekott mõõtudega 150 mm × 250 mm; kiirgussteriilne), kasutades kummivasarat või sobivat peenestusseadet (näiteks Homex).

Märkus: kui proovid homogeenitakse segistis, on suur proovide ristsaastumise oht. Tuleb võtta ettevaatusabinõusid, et vältida aerosooli tekkimist või proovi lekkimist ekstraktsiooni käigus. Tagatakse äsja steriliseeritud segistiterade ja -anumate kasutamine iga proovi korral. Kui kasutatakse PCR-analüüsi, välditakse DNA ülekandumist mahutites või peenestusseadmes. PCR-analüüsi tegemisel on soovitav purustada ühekordse kasutusega kottides ja kasutada ühekordse kasutusega katseklaase.

1.1.3.   Supernatant dekanteeritakse. Kui lahus on liiga hägune, selitatakse see madalal kiirusel tsentrifuugides (mitte üle 180 g 10 minutit jooksul temperatuuril 4–10 °C) või vaakumfiltreerimisega (40–100 μm), pestes filtrit täiendava ektraktsioonipuhvriga (10 ml).

1.1.4.   Bakterifraktsioon kontsentreeritakse, tsentrifuugides 7 000 g juures 15 minutit (või 10 000 g juures 10 minutit) temperatuuril 4–10 °C, ning supernatant eemaldatakse bakterisadet segamata.

1.1.5.   Bakterisade resuspendeeritakse 1,5 ml bakterisademe puhvris (4. liide). Haigusetekitaja R. solanacearum kontrollimise jaoks kasutatakse 500 μl, haigusetekitaja Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus jaoks 500 μl ja võrdluseesmärgil 500 μl. 500 μl võrdlusalikvoodile ja ülejäänud analüüsialikvoodile lisatakse steriilset glütserooli lõppkontsentratsiooni 10–25 % (v/v) saamiseks, loksutatakse ja säilitatakse temperatuuril –16 kuni –24 °C (nädalaid) või –68 kuni –86 °C (kuid). Analüüside tegemise ajal hoitakse analüüsialikvoote 4–10 °C juures.

Korduv külmutamine ja sulatamine ei ole soovitav.

Kui ekstrakti tuleb transportida, tuleb seda teha külmkastis 24–48 tunni jooksul.

1.1.6.   Kõiki R. solanacearum’i positiivseid kontrolle ja proove tuleb käsitleda eraldi, et vältida saastumist. Seda tuleb järgida IF-objektiklaaside ja kõigi analüüside korral.

1.2.   Analüüsimine

Vaata diagramme ja analüüsikirjeldusi ning optimeeritud protokolle vastavates liidetes.

| | Selektiivne isoleerimine (vt VI jao punkt A.4.) |
| --- | --- |

Selektiivne isoleerimine (vt VI jao punkt A.4.)

| | IF-analüüs (vt VI jao punkt A.5.) |
| --- | --- |

IF-analüüs (vt VI jao punkt A.5.)

| | PCR-analüüs (vt VI jao punkt A.6.) |
| --- | --- |

PCR-analüüs (vt VI jao punkt A.6.)

| | FISH-analüüs (vt VI jao punkt A.7.) |
| --- | --- |

FISH-analüüs (vt VI jao punkt A.7.)

| | ELISA-analüüs (vt VI jao punkt A.8.) |
| --- | --- |

ELISA-analüüs (vt VI jao punkt A.8.)

| | Biotest (vt VI jao punkt A.9.) |
| --- | --- |

Biotest (vt VI jao punkt A.9.)

2.   Haigusetekitaja R. solanacearum üksikasjalikud avastamis- ja kindlaksmääramismeetodid asümptomaatiliste kartuli, tomati ja teiste peremeestaimede proovides

2.1.   Proovi ettevalmistamine

Märkus: haigusetekitaja R. solanacearum latentsete populatsioonide avastamiseks on soovitav kasutada liitproove. Meetodit saab mugavalt kasutada kuni 200 varreosast koosnevate liitproovide puhul. Seirete läbiviimisel peaksid seired põhinema uuritavat taimepopulatsiooni statistiliselt esindaval proovil.

2.1.1.   1–2 cm pikkused varreosad kogutakse suletud streriilsesse mahutisse järgmise proovivõtumenetluse kohaselt.

Tomatiseemikud. Iga varre alaosast, maapinna kohalt, eemaldatakse puhta desinfitseeritud noaga 1 cm pikkune osa.

Avamaal või kasvuhoones kasvatatud tomatitaimed. Puhta desinfitseeritud noaga eemaldatakse iga taime kõige madalam külgvõrse, lõigates vahetult põhivarre ühenduskoha kohal. Eemaldatakse iga külgvõrse kõige alumine 1 cm pikkune osa.

Teised peremeestaimed. Iga varre alaosast, maapinna kohalt, eemaldatakse puhta desinfitseeritud noa või oksakääridega 1 cm pikkune osa. S. dulcamara’l ja teistel vees kasvavatel peremeestaimedel eemaldatakse veealuste varte või stoolonite 1–2 cm pikkused vesijuurtega osad.

Teatavas proovivõtukohas proovi võttes on soovitav analüüsida statistiliselt esindavat proovi, milleks võetakse proovivõtukohast vähemalt 10 iga võimaliku umbrohust peremeestaime taime. Patogeeni avastamine on kõige usaldusväärsem hiliskevadel, suvel ja sügisel, vooluveekogudes kasvava mitmeaastase taime Solanum dulcamara looduslikku nakatumist saab määrata aasta ringi. Teadaolevateks peremeestaimedeks on isekülvanud kartulitaimed, harilik maavits Solanum dulcamara, must maavits S. nigrum, harilik ogaõun Datura stramonium ja teised sugukonna maavitsalised (Solanaceae) liigid. Peremeestaimedeks on ka pelargoon Pelargonium spp. ja harilik portulak Portulaca oleracea. Mõned Euroopas levinud umbrohuliigid, nagu odalehine malts Atriplex hastata, karvane ruse Bidens pilosa, kera-kadakkaer Cerastium glomeratum, valge hanemalts Chenopodium album, harilik vesikanep Eupatorium cannabinum, paljas võõrkakar Galinsoga parviflora, mürktulikas Ranunculus scleratus, kerss Rorippa spp, oblikas Rumex spp., valge põisrohi Silene alba, longus põisrohi S. nutans., paiseleht Tussilago farfara ja kõrvenõges Urtica dioica, võivad varjata teatavate keskkonnatingimuste puhul juurtes ja/või risosfääris R. solanacearum’i biotüübi 2 / rassi 3 populatsioone.

Märkus: selles etapis saab teha sisemiste sümptomite (vaskulaarne värvumine või bakterilima) visuaalse vaatluse. Iga sümptomitega varreosa pannakse kõrvale ja sellega tehakse eraldi analüüsid (vt II jagu).

2.1.2.   Varreosad desinfitseeritakse kergelt 70 % etanooliga ja kuivatakse kohe kuivatuspaberiga. Seejärel töödeldakse varreosasid, kasutades üht järgmistest meetoditest.

| a) | Varreosad kaetakse piisava koguse (umbes 40 ml) ekstraktsioonipuhvriga (4. liide) ja segatakse pöörleval loksutil (50–100 pööret minutis) 4 tundi alla 24 °C juures või 16–24 tundi jahutatult. |
| --- | --- |

a)

Varreosad kaetakse piisava koguse (umbes 40 ml) ekstraktsioonipuhvriga (4. liide) ja segatakse pöörleval loksutil (50–100 pööret minutis) 4 tundi alla 24 °C juures või 16–24 tundi jahutatult.

| b) | Töödeldakse kohe, purustades osad tugevas matseratsioonikotis (näiteks Stomacher või Bioreba) koos sobiva koguse ekstratsioonipuhvriga (4. liide) kas kummivasara või kohase peenestusseadmega (näiteks Homex). Kui see ei ole võimalik, säilitatakse varreosasid jahutatult mitte üle 72 tunni või toatemperatuuril mitte üle 24 tunni. |
| --- | --- |

b)

Töödeldakse kohe, purustades osad tugevas matseratsioonikotis (näiteks Stomacher või Bioreba) koos sobiva koguse ekstratsioonipuhvriga (4. liide) kas kummivasara või kohase peenestusseadmega (näiteks Homex). Kui see ei ole võimalik, säilitatakse varreosasid jahutatult mitte üle 72 tunni või toatemperatuuril mitte üle 24 tunni.

2.1.3.   Kui lahus on seisnud 15 minutit, dekanteeritakse supernatant.

2.1.4.   Ekstrakti täiendavat selitamist või bakterifraktsiooni kontsentreerimist tavaliselt ei nõuta, kuid seda võib filtreerida ja/või tsentrifuugida vastavalt III jao punktidele 1.1.3–1.1.5.

2.1.5.   Lahjendamata või kontsentreeritud proov jagatakse kahte võrdsesse ossa. Üht osa säilitatakse 4–10 °C juures katsete tegemise ajal ja teist osa 10–25 % (v/v) steriilse glütserooliga temperatuuril –16 kuni –24 °C (nädalaid) või –68 kuni –86 °C (kuid) juhuks, kui on vaja teha täiendavaid katseid.

2.2.   Analüüsimine

Vaata diagramme ja analüüsikirjeldusi ja optimeeritud protokolle vastavates liidetes.

| | Selektiivne isoleerimine (vt VI jao punkt A.4.) |
| --- | --- |

Selektiivne isoleerimine (vt VI jao punkt A.4.)

| | IF-analüüs (vt VI jao punkt A.5.) |
| --- | --- |

IF-analüüs (vt VI jao punkt A.5.)

| | PCR-analüüs (vt VI jao punkt A.6.) |
| --- | --- |

PCR-analüüs (vt VI jao punkt A.6.)

| | FISH-analüüs (vt VI jao punkt A.7.) |
| --- | --- |

FISH-analüüs (vt VI jao punkt A.7.)

| | ELISA-analüüs (vt VI jao punkt A.8.) |
| --- | --- |

ELISA-analüüs (vt VI jao punkt A.8.)

| | Biotest (vt VI jao punkt A.9.). |
| --- | --- |

Biotest (vt VI jao punkt A.9.).

IV JAGU

1.   Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismetoodika vees

Image

Image

2.   Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismeetodid vees

Põhimõte

Käesolevas jaos kirjeldatud valideeritud avastusmeetodeid kasutatakse patogeeni avastamiseks pinnavee proovides ning seda võib kohaldada ka kartulitöötlemise heitvee ja reovee proovides. Oluline on märkida, et eeldatav avastustundlikkus sõltub substraadist. Isoleerimisanalüüsi tundlikkust mõjutavad võistlevate saprofüütbakterite populatsioonid, mille sisaldus on üldiselt palju suurem kartulitöötlemisheitvees ja reovees kui pinnavees. Allpool esitatud metoodika avastab pinnavees eeldatavalt 103 rakku liitri kohta, kartulitöötlemise heitvees ja reovees on tundlikkus tõenäoliselt märgatavalt madalam. Seetõttu on soovitav analüüsida heit- ja reovett pärast puhastustoiminguid (nt sadestamist ja filtreerimist), mille käigus vähendatakse saprofüütbakterite populatsioone. Negatiivsete tulemuste usaldusväärsuse hindamisel tuleb arvesse võtta analüüsimeetodite tundlikkuspiiranguid. Käesolevat metoodikat on edukalt kasutatud pinnavees patogeeni olemasolu või puudumise kindlakstegemiseks läbi viidaval seirel, kartulitöötlemise heitvee ja reovee seirel tuleb arvestada selle piiratust.

2.1.   Proovi ettevalmistamine

Märkus

| — | Haigusetekitaja R. solanacearum’i avastamine pinnavees on kõige usaldusväärsem hiliskevadel, suvel ja sügisel, kui veetemperatuur on üle 15 °C. |
| --- | --- |

—

Haigusetekitaja R. solanacearum’i avastamine pinnavees on kõige usaldusväärsem hiliskevadel, suvel ja sügisel, kui veetemperatuur on üle 15 °C.

| — | Korduv proovivõtt määratud proovivõtukohtades eri aegadel eespool nimetatud perioodil vähendab ilmastikutingimuste mõju ja suurendab avastamise usaldusväärsust. |
| --- | --- |

—

Korduv proovivõtt määratud proovivõtukohtades eri aegadel eespool nimetatud perioodil vähendab ilmastikutingimuste mõju ja suurendab avastamise usaldusväärsust.

| — | Arvesse tuleb võtta tugeva vihmasaju ja vooluveekogu geograafia mõju, et vältida patogeeni avastamist segavat ulatuslikku lahjendumist. |
| --- | --- |

—

Arvesse tuleb võtta tugeva vihmasaju ja vooluveekogu geograafia mõju, et vältida patogeeni avastamist segavat ulatuslikku lahjendumist.

| — | Veeproove tuleb võtta peremeestaimede läheduses, kui need on olemas. |
| --- | --- |

—

Veeproove tuleb võtta peremeestaimede läheduses, kui need on olemas.

2.1.1.   Kõigis valitud proovivõtukohtades võetakse veeproove ühekordse kasutusega steriilsetesse katseklaasidesse või pudelitesse võimaluse korral sügavamalt kui 30 cm ja 2 m raadiuses kaldast. Töötlemisheitvee ja reovee proove võetakse ärajuhtimiskohas. Soovitav proovisuurus on kuni 500 ml proovivõtukoha kohta. Väiksemate proovide puhul on soovitav võtta proove proovivõtukohast vähemalt 3 korda, kusjuures iga proov koosneb 2 dubleeritud vähemalt 30 ml suurusest alaproovist. Tõhusaks seireks valitakse vähemalt 3 proovivõtukohta vooluveekogu iga 3 km kohta ning võetakse proove ka vooluveekokku suubuvatest haruveekogudest.

2.1.2.   Proove transporditakse jahedas (4–10 °C) ja pimedas ning analüüsitakse 24 tunni jooksul.

2.1.3.   Vajaduse korral võib bakterifraktsiooni kontsentreerida, kasutades üht järgmistest meetoditest.

| a) | Tsentrifuugitakse 30–50 ml alaproovi 10 000 g juures 10 minutit (või 7 000 g juures 15 minutit), eelistatavalt temperatuuril 4–10 °C, eemaldatakse supernatant ja bakterisade resuspendeeritakse 1 ml fosfaatpuhvris (4. liide). |
| --- | --- |

a)

Tsentrifuugitakse 30–50 ml alaproovi 10 000 g juures 10 minutit (või 7 000 g juures 15 minutit), eelistatavalt temperatuuril 4–10 °C, eemaldatakse supernatant ja bakterisade resuspendeeritakse 1 ml fosfaatpuhvris (4. liide).

| b) | Membraanfiltreerimine (pooride läbimõõt vähemalt 0,45 μm), mille järel pestakse filter 5–10 ml fosfaatpuhvris ja pesuvesi säilitatakse. See meetod on sobiv suurte veekoguste puhul, mis sisaldavad vähe saprofüütbaktereid. |
| --- | --- |

b)

Membraanfiltreerimine (pooride läbimõõt vähemalt 0,45 μm), mille järel pestakse filter 5–10 ml fosfaatpuhvris ja pesuvesi säilitatakse. See meetod on sobiv suurte veekoguste puhul, mis sisaldavad vähe saprofüütbaktereid.

Kontsentreerimine ei ole tavaliselt soovitav kartulitöötlemise heitvee ja reovee proovide puhul, sest võistlevate saprofüütbakterite suurenenud populatsioonid inhibeerivad Ralstonia solanacearum’i avastamist.

2.2.   Analüüsimine

Vaata diagrammi ja analüüsikirjeldusi vastavates liidetes.

V JAGU

1.   Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismetoodika mullas

Image

Image

2.   Haigusetekitaja R. solanacearum avastamis- ja kindlaksmääramismeetodid mullas

Põhimõtted

Käesolevas jaos kirjeldatud valideeritud avastusmeetodeid kohaldatakse patogeeni avastamiseks mullaproovides, kuid seda võib kasutada ka kartuli tahkete töötlemisjäätmete või reoveesetete proovides. Tuleb siiski märkida, et need meetodid ei ole piisavalt tundlikud, et tagada haigusetekitaja Ralstonia solanacearum madalate ja/või ebaühtlaselt hajunud populatsioonide avastamine, mis võivad esineda nende substraatide loomulikult saastunud proovides.

Negatiivsete tulemuste usaldusväärsuse hindamisel ja seire käigus patogeeni olemasolu või puudumise kindlakstegemisel mullas või setteis tuleb arvesse võtta käesoleva metoodika piiratud tundlikkust. Kõige usaldusväärsem analüüs patogeeni olemasolu kindlakstegemiseks põllumullas on vastuvõtliku peremeestaime istutamine ja selle nakatumise jälgimine, ent isegi selle meetodiga ei avastata madalat nakkustaset.

2.1.   Proovi ettevalmistamine

2.1.1.   Põllumullaproovide võtmisel tuleks järgida nematoodiproovi võtmise üldpõhimõtteid. Kogutakse 0,5–1 kg mulda proovi kohta 60 kohast 0,3 ha kohta 10–20 cm sügavuselt (või võrgustikul 7 × 7 meetrit). Kui kahtlustatakse patogeeni olemasolu, suurendatakse kogumiskohtade arvu 120ni 0,3 ha kohta. Enne analüüsimist hoitakse proove temperatuuril 12–15 °C. Kartuli töötlemis- ja reoveesetete proove võetakse kokku 1 kg kohtadest, mis esindavad analüüsitavate setete kogumahtu. Iga proov segatakse enne analüüsimist hoolikalt.

2.1.2.   10–25grammised mulla või sette alaproovid dispergeeritakse pöörleval loksutil (250 pööret minutis) kuni 2 tundi 60–150 milliliitris ekstraktsioonipuhvris (4. liide). 0,02 % Tween-20 ja 10–20 grammi steriilse kruusa lisamine võib vajaduse korral dispersiooni hõlbustada.

2.1.3.   Analüüsimise ajal hoida suspensiooni temperatuuril 4 °C.

2.2.   Analüüsimine

Vaata diagrammi ja analüüsikirjeldusi vastavates liidetes.

VI JAGU

HAIGUSETEKITAJA R. SOLANACEARUM AVASTAMISE JA KINDLAKSMÄÄRAMISE OPTIMEERITUD PROTOKOLLID

A.   DIAGNOSTILISED JA AVASTAMISANALÜÜSID

1.   Varrelima test

Haigusetekitaja R. solanacearum olemasolu närbuvates kartuli-, tomati- ja teiste peremeestaimede vartes saab määrata järgmise lihtsa eelanalüüsiga. Taimevars lõigatakse läbi kohe ülalpool mullapinda. Lõikepind suspendeeritakse puhta veega katseklaasis. Jälgitakse iseloomulikku bakterilima niitide iseeneslikku eritumist lõigatud juhtkimpudest mõne minuti pärast.

2.   Polü-β-hüdroksübutüraadi graanulite tuvastamine

| 1. | Mikroskoobi objektiklaasil valmistatakse äie YPGA- või SPA-söötmel (2. liide) kasvatatud nakatunud koe või 48tunnise kultuuri bakterilimast. |
| --- | --- |

1.

Mikroskoobi objektiklaasil valmistatakse äie YPGA- või SPA-söötmel (2. liide) kasvatatud nakatunud koe või 48tunnise kultuuri bakterilimast.

| 2. | Valmistatakse positiivsed kontrolläiged haigusetekitaja R. solanacearum’i biotüübi 2 tüvega ning vajaduse korral negatiivne kontrolläie teadaoleva PHB negatiivse liigiga. |
| --- | --- |

2.

Valmistatakse positiivsed kontrolläiged haigusetekitaja R. solanacearum’i biotüübi 2 tüvega ning vajaduse korral negatiivne kontrolläie teadaoleva PHB negatiivse liigiga.

| 3. | Lastakse kuivada õhu käes ja klaaside alumine pool tõmmatakse kiiresti läbi leegi, et äie fikseeruks. |
| --- | --- |

3.

Lastakse kuivada õhu käes ja klaaside alumine pool tõmmatakse kiiresti läbi leegi, et äie fikseeruks.

| 4. | Preparaat värvitakse kas Niiluse sinisega või Sudaani mustaga ning vaadeldakse mikroskoobis järgmiselt. |
| --- | --- |

4.

Preparaat värvitakse kas Niiluse sinisega või Sudaani mustaga ning vaadeldakse mikroskoobis järgmiselt.

Värvimine Niiluse sinisega

| a) | Klaasid ujutatakse üle Niiluse sinise A 1 % vesilahusega ja inkubeeritakse 10 minutit 55 °C juures. |
| --- | --- |

a)

Klaasid ujutatakse üle Niiluse sinise A 1 % vesilahusega ja inkubeeritakse 10 minutit 55 °C juures.

| b) | Värvilahus valatakse pealt ära. Loputatakse korraks tasaselt voolava kraanivee all. Liigne vesi eemaldatakse kuivatuspaberiga. |
| --- | --- |

b)

Värvilahus valatakse pealt ära. Loputatakse korraks tasaselt voolava kraanivee all. Liigne vesi eemaldatakse kuivatuspaberiga.

| c) | Äie ujutatakse üle äädikhappe 8 % vesilahusega ja inkubeeritakse 1 minut toatemperatuuril. |
| --- | --- |

c)

Äie ujutatakse üle äädikhappe 8 % vesilahusega ja inkubeeritakse 1 minut toatemperatuuril.

| d) | Loputatakse korraks tasaselt voolava kraanivee all. Liigne vesi eemaldatakse kuivatuspaberiga. |
| --- | --- |

d)

Loputatakse korraks tasaselt voolava kraanivee all. Liigne vesi eemaldatakse kuivatuspaberiga.

| e) | Niisutatakse uuesti veetilgaga ja asetatakse peale katteklaas. |
| --- | --- |

e)

Niisutatakse uuesti veetilgaga ja asetatakse peale katteklaas.

| f) | Värvitud äiet vaadeldakse mikroskoobis, millele on sobitatud epifluorestsentsvalgusallikas, 450 nm juures ning kasutatakse õliimmersiooni 600–1 000kordsel suurendusel ja õli- või veeimmersiooni objektiivi. |
| --- | --- |

f)

Värvitud äiet vaadeldakse mikroskoobis, millele on sobitatud epifluorestsentsvalgusallikas, 450 nm juures ning kasutatakse õliimmersiooni 600–1 000kordsel suurendusel ja õli- või veeimmersiooni objektiivi.

| g) | Vaadeldakse ereoranžilt fluorestseeruvaid PHB graanuleid. Vaadeldakse ka altvalgusega valgusmikroskoobis, et olla kindel, et graanulid on rakusisesed ning et rakumorfoloogia on R. solanacearum’i bakterirakkudele tüüpiline. |
| --- | --- |

g)

Vaadeldakse ereoranžilt fluorestseeruvaid PHB graanuleid. Vaadeldakse ka altvalgusega valgusmikroskoobis, et olla kindel, et graanulid on rakusisesed ning et rakumorfoloogia on R. solanacearum’i bakterirakkudele tüüpiline.

Värvimine Sudaani mustaga

| a) | Klaasid ujutatakse üle Sudaani musta 0,3 % lahusega 70 % etanoolis ja inkubeeritakse 10 minutit toatemperatuuril. |
| --- | --- |

a)

Klaasid ujutatakse üle Sudaani musta 0,3 % lahusega 70 % etanoolis ja inkubeeritakse 10 minutit toatemperatuuril.

| b) | Värvilahus valatakse pealt ära ning loputatakse korraks kraanivee all, eemaldades liigse vee kuivatuspaberiga. |
| --- | --- |

b)

Värvilahus valatakse pealt ära ning loputatakse korraks kraanivee all, eemaldades liigse vee kuivatuspaberiga.

| c) | Klaasid kastetakse lühikeseks ajaks ksülooli ja kuivatatakse kuivatuspaberiga. Ettevaatust: ksülool on ohtlik aine, tuleb rakendada vajalikke ettevaatusabinõusid ja töötada tõmbekapis |
| --- | --- |

c)

Klaasid kastetakse lühikeseks ajaks ksülooli ja kuivatatakse kuivatuspaberiga. Ettevaatust: ksülool on ohtlik aine, tuleb rakendada vajalikke ettevaatusabinõusid ja töötada tõmbekapis

| d) | Klaasid ujutatakse üle 0,5 % (mass/maht) safraniini vesilahusega ja jäetakse 10 sekundiks toatemperatuuril seisma. Ettevaatust: safraniin on ohtlik aine, tuleb rakendada vajalikke ettevaatusabinõusid ja töötada tõmbekapis. |
| --- | --- |

d)

Klaasid ujutatakse üle 0,5 % (mass/maht) safraniini vesilahusega ja jäetakse 10 sekundiks toatemperatuuril seisma. Ettevaatust: safraniin on ohtlik aine, tuleb rakendada vajalikke ettevaatusabinõusid ja töötada tõmbekapis.

| e) | Pestakse tasaselt voolava kraanivee all, kuivatatakse kuivatuspaberiga ning asetatakse peale katteklaas. |
| --- | --- |

e)

Pestakse tasaselt voolava kraanivee all, kuivatatakse kuivatuspaberiga ning asetatakse peale katteklaas.

| f) | Värvitud äigeid vaadeldakse valgusmikroskoobis, millel on ülekantud valgus, ja kasutatakse õliimmersiooni 1 000kordsel suurendusel ja õliimmersiooni objektiivi. |
| --- | --- |

f)

Värvitud äigeid vaadeldakse valgusmikroskoobis, millel on ülekantud valgus, ja kasutatakse õliimmersiooni 1 000kordsel suurendusel ja õliimmersiooni objektiivi.

| g) | Vaadeldakse kahvatupunaseks värvunud rakuseintega R. solanacearum’i rakkudes esinevaid sinakasmusta värvusega PHB graanuleid. |
| --- | --- |

g)

Vaadeldakse kahvatupunaseks värvunud rakuseintega R. solanacearum’i rakkudes esinevaid sinakasmusta värvusega PHB graanuleid.

3.   Seroloogiline aglutinatsiooni analüüs

R. solanacearum’i rakkude aglutinatsioon bakterilimas või sümptomaatilise koe ekstraktides on kõige paremini jälgitav valideeritud antikehi kasutades (vt 3. liide), mis on konjugeeritud asjakohaste värviliste märgistusainetega, nagu punased Staphylococcus aureus’e rakud või värvilised lateksiosakesed. Müügil olevaid komplekte kasutades (vt 3. liide) järgitakse tootja kasutamisjuhendeid. Muul juhul toimitakse järgnevalt:

| a) | konjugeeritud antikehasuspensiooni ja bakterilima tilgad (ligikaudu 5 μl kumbagi) segatakse mitmeaknaliste objektiklaaside aknaväljades; |
| --- | --- |

a)

konjugeeritud antikehasuspensiooni ja bakterilima tilgad (ligikaudu 5 μl kumbagi) segatakse mitmeaknaliste objektiklaaside aknaväljades;

| b) | valmistatakse positiivsed ja negatiivsed kontrollproovid, kasutades R. solanacearum’i biotüübi 2 suspensioone ja heteroloogset tüve; |
| --- | --- |

b)

valmistatakse positiivsed ja negatiivsed kontrollproovid, kasutades R. solanacearum’i biotüübi 2 suspensioone ja heteroloogset tüve;

| c) | pärast 15 sekundit õrna segamist jälgitakse aglutinatsiooni positiivsetes proovides. |
| --- | --- |

c)

pärast 15 sekundit õrna segamist jälgitakse aglutinatsiooni positiivsetes proovides.

4.   Selektiivne isoleerimine

4.1.   Selektiivsöötmele väljakülvamine

Märkus: enne selle meetodi esmakordset kasutamist tehakse eelanalüüsid, et tagada milliliitri kohta R. solanacearum’i 103 kuni 104 kolooniaid moodustavate osakeste taasavastamine, lisatuna varem negatiivsena analüüsitud proovide ekstraktidele.

Kasutatakse nõuetekohaselt valideeritud selektiivsöötmeid, nagu SMSA (muudetud Elphinstone et al., 1996; vt 2. liide).

Suurt tähelepanu nõuab haigusetekitaja R. solanacearum eristamine teistest bakteritest, mille kolooniad võivad kasvusöötmel areneda. Kui söötmeplaadid on bakteritega üleasustatud või leidub antagonistlikke baktereid, võib R. solanacearum’i kolooniatel esineda ebatüüpilist morfoloogiat. Võistlevate või antagonistlike bakterite mõju kahtluse korral tuleks proovi uuesti analüüsida, kasutades erinevat analüüsi.

See meetod on kõige tundlikum värskete prooviekstraktide kasutamisel. Meetodit saab siiski kasutada ka ekstraktidega, mida on säilitatud glütserooli all temperatuuril –68 kuni –86 °C.

Positiivseteks kontrollproovideks valmistatakse kümnekordne lahjendus virulentse Ralstonia solanacearum’i biotüübi 2 suspensioonist, mille sisaldus on 106 kolooniaid moodustavat rakku milliliitri kohta (nt NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Igasuguse saastumise vältimiseks valmistatakse positiivsed kontrollproovid analüüsitavatest proovidest täiesti eraldi.

Iga uuesti valmistatud selektiivsöötme partii kõlblikkust patogeeni kasvatamiseks tuleks enne tavaproovide analüüsimist kontrollida.

Kontrollproove analüüsitakse samamoodi kui analüüsitavat proovi (analüüsitavaid proove).

4.1.1.   Analüüsi läbiviimiseks tehakse uuritava proovi lahjenduste väljakülv söötmeplaatidele tagamaks, et saprofüütbakterite kolooniaid moodustavad populatsioonid on välja lahjendatud. Söötmeplaadile külvatakse 50–100 μl prooviekstrakti ja igat lahjendust.

4.1.2.   Söötmeplaate inkubeeritakse temperatuuril 28 °C. Tulemused loetakse 48 tunni pärast ja seejärel iga päev kuni 6 päeva jooksul. Tüüpilised R. solanacearum’i kolooniad SMSA-söötmel on piimjasvalged, lamedad, ebaühtlase kujuga ja fluidaalsed ning pärast kolmepäevast inkubeerimist on nende värv keskel roosast veripunaseni, keskosas iseloomulike spiraalsete keerdudega. (vt veebileht http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Märkus: mõnikord tekivad sellel söötmel R. solanacearum’i ebatüüpilised kolooniad. Need võivad olla väiksed, ümmargused, täiesti punast värvi ning mittefluidaalsed või vaid osaliselt fluidaalsed, mistõttu on neid raske eristada saprofüütbakterite kolooniatest.

4.1.3.   Eeldatavad R. solanacearum'i kolooniad puhastatakse pärast joonkülvi või lahjenduse laialikülvamist üldsöötmele, et saada isoleeritud kolooniad (vt 2. liide).

4.1.4.   Kultuure säilitatakse lühikest aega steriilses vees (pH 6–8, kloorivaba) toatemperatuuril ja pimedas või pikemat aega krüoprotektantses keskkonnas temperatuuril –68 kuni –86 °C või need lüofiliseeritakse.

4.1.5.   Määratakse kindlaks eeldatavad kultuurid (vt VI jao punkt B) ja tehakse patogeensusanalüüs (vt VI jao punkt C).

Selektiivsöötme analüüsi tulemuste tõlgendamine

Selektiivsöötme analüüsi tulemus on negatiivne, kui pärast kuuepäevast inkubeerimist ei ole kasvanud ühtki bakterkolooniat või kui ei ole isoleeritud tüüpilisi R. solanacearum’i kolooniaid, tingimusel et teised võistlevad või antagonistlikud bakterkolooniad ei pärsi R. solanacearum’i kasvu ning et tüüpilised R. solanacearum’i kolooniad on kasvanud vaid positiivsetel kontrollplaatidel.

Selektiivsöötme analüüsi tulemus on positiivne, kui eraldatakse eeldatavad R. solanacearum’i kolooniad.

4.2.   Rikastamismenetlus

Kasutatakse valideeritud rikastussöödet, näiteks Wilbrinki puljongit (vt 2.liide).

Seda menetlust võib kasutada R. solanacearum’i kolooniate valikuliseks suurendamiseks prooviekstraktides ja avastustundlikkuse tõstmiseks. Samuti lahjendab see menetlus tõhusalt PCR-reaktsiooni inhibiitoreid (1:100). Tuleb siiski märkida, et R. solanacearum’i rikastamine võib ebaõnnestuda sageli samaaegselt rikastatud saprofüütsete organismide võistlemise või antagonismi tõttu. Seepärast võib olla raske R. solanacearum’i isoleerimine rikastuspuljongi kultuuridest. Lisaks on ELISA-analüüside puhul soovitav kasutada pigem mono- kui polüklonaalseid antikehi, sest seroloogiliselt seotud saprofüütbakterite populatsioonid võivad suureneda.

4.2.1.   Rikastamis-PCRi tarvis pannakse 100 μl prooviekstrakti 10 ml rikastuspuljongisse (2. liide), mille alikvoot on DNA-vabas katseklaasis või kolvis. Rikastamis-ELISA tarvis võib kasutada prooviekstrakti suuremat sisaldust (nt 100 μl ekstrakti 1,0 ml rikastuspuljongis).

4.2.2.   Inkubeeritakse 27–30 °C juures 72 tundi loksutatava või staatilise kultuurina, kusjuures kork on lõdvalt peal, et tagada õhu juurdepääs.

4.2.3.   Enne ELISA- või PCR-analüüsi tegemist segatakse hästi.

4.2.4.   Rikastuspuljongit käsitatakse samamoodi kui proove eeltoodud analüüsides.

Märkus: kui teatavate võistlevate saprofüütbakterite suurte populatsioonide tõttu võib eeldada R. solanacearum’i rikastamise inhibitsiooni, võib paremaid tulemusi anda prooviekstraktide rikastamine enne tsentrifuugimist või muid kontsentreerimisetappe.

5.   IF-analüüs

Põhimõte

IF-analüüsi tegemist peamise sõelkatsena soovitatakse sellepärast, et see annab stabiilseid tulemusi nõutavate piirväärtuste raames.

Kui peamise sõelkatsena kasutatakse IF-analüüsi ja IF tulemus on positiivne, tuleb teise sõelkatsena teha PCR- või FISH-analüüs. Kui IF-analüüsi kasutatakse teise sõelkatsena ja IF tulemus on positiivne, tuleb analüüsi lõpule viimiseks teha vastavalt diagrammile täiendavaid analüüse.

Märkus: kasutatakse R. solanacearum’i antikehade valideeritud allikat (vt veebileht http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). On soovitav määrata iga uue antikehapartii tiiter. Tiiter on kõrgeima kontsentratsiooniga lahus, mille juures toimub optimaalne reaktsioon, kui tehakse analüüsi suspensiooniga, mis sisaldab 105 kuni 106 bakteri R. solanacearum 2 000. Analüüside käigus tuleks kasutada antikehade töölahuseid, mis on tiitri lähedal või sellega võrdsed.

Analüüs tuleks teha värskelt tehtud prooviekstraktidega. Vajaduse korral saab seda edukalt teha ekstraktidega, mida on säilitatud –68 kuni –86 °C juures glütserooli all. Glütserooli saab proovist eemaldada nii, et lisatakse 1 ml bakterisademe puhvrit (4. liide), tsentrifuugitakse uuesti 15 minutit 7 000 g juures ja resuspendeeritakse bakterisademe puhvriga võrdesse mahtu. Seda ei ole tihti tarvis, eriti siis, kui proovid kinnitatakse objektiklaasidele leekmeetodil.

Tehakse vastavalt liitele 3B kartuliekstraktis ja soovi korral puhvris suspendeeritud bakteri R. solanacearum homoloogse tüve või mis tahes muu referenttüve eraldi positiivsed kontrollobjektiklaasid.

Võimaluse korral tuleks kasutada looduslikult nakatunud kude (mida on säilitatud lüofiliseerituna või külmutatuna –16 kuni –24 °C juures) samalaadseks kontrolliks samal objektiklaasil.

Negatiivse kontrollina võib kasutada varem bakteri R. solanacearum negatiivse tulemuse andnud proovi alikvoote.

Positiivseid ja negatiivseid standardiseeritud kontrollaineid, mida saab kasutada nende analüüside puhul, on loetletud 3. liites.

Kasutatakse mitmeaknalisi mikroskoobi alusklaase, millel on eelistatult kümme vähemalt 6 mm läbimõõduga aknavälja.

Kontrollproove analüüsitakse samamoodi kui analüüsitavat proovi (analüüsitavaid proove).

5.1.   Valmistatakse ette objektiklaasid, kasutades üht järgmistest meetoditest.

| i) | Bakterisademe puhul, mille tärklisesade on suhteliselt väike:
  pipetitakse standardne kogus (6 mm diameetriga aknavälja jaoks on piisav kogus 15 μl, suuremate aknaväljade puhul suurendatakse kogust) 1/100 uuesti suspendeeritud kartulisadet esimesele aknale. Seejärel pipetitakse samasugune kogus lahustamata bakterisadet (1/1) rea ülejäänud akendele. Teist rida võib kasutada duplikaadina või teise proovi jaoks, nagu on näidatud joonisel 1. |
| --- | --- |

i)

Bakterisademe puhul, mille tärklisesade on suhteliselt väike:

pipetitakse standardne kogus (6 mm diameetriga aknavälja jaoks on piisav kogus 15 μl, suuremate aknaväljade puhul suurendatakse kogust) 1/100 uuesti suspendeeritud kartulisadet esimesele aknale. Seejärel pipetitakse samasugune kogus lahustamata bakterisadet (1/1) rea ülejäänud akendele. Teist rida võib kasutada duplikaadina või teise proovi jaoks, nagu on näidatud joonisel 1.

| ii) | Muude bakterisademete korral:
  valmistatakse uuesti suspendeeritud bakterisademest kümnekordsed lahjendused (1/10 ja 1/100) sademepuhvrisse. Pipetitakse sobiv kogus (6 mm diameetriga aknavälja jaoks on piisav kogus 15 μl, suuremate aknaväljade puhul suurendatakse kogust) uuesti suspendeeritud bakterisadet ja iga lahjendust aknaväljade reale. Teist rida võib kasutada duplikaadina või teise proovi jaoks, nagu on näidatud joonisel 2. |
| --- | --- |

ii)

Muude bakterisademete korral:

valmistatakse uuesti suspendeeritud bakterisademest kümnekordsed lahjendused (1/10 ja 1/100) sademepuhvrisse. Pipetitakse sobiv kogus (6 mm diameetriga aknavälja jaoks on piisav kogus 15 μl, suuremate aknaväljade puhul suurendatakse kogust) uuesti suspendeeritud bakterisadet ja iga lahjendust aknaväljade reale. Teist rida võib kasutada duplikaadina või teise proovi jaoks, nagu on näidatud joonisel 2.

5.2.   Piisad kuivatakse ümbritseva õhu temperatuuril või neid soojendades temperatuurini 40–45 °C. Bakterirakud kinnitatakse objektiklaasile kuumutades (15 minutit 60 °C juures), leekmeetodil, 95 % etanooliga või vastavalt antikehade tarnijate konkreetsetele juhistele.

Vajaduse korral võib kinnitatud objektiklaase säilitada külmutatult kuivatusainet sisaldavas karbis võimalikult vähe aega (kuni kolm kuud) enne järgmist analüüsi.

5.3.   IF-meetod

| i) | Vastavalt punkti 5.1 alapunktis i kirjeldatud objektiklaasi valmistamisele
  Valmistatakse rida kahekordseid lahjendusi. Esimeses augus peaks olema 1/2 tiitrist (T/2), teistes 1/4 tiitrist (T/4), 1/2 tiitrist (T/2), tiiter (T) ja kahekordne tiiter (2T). |
| --- | --- |

i)

Vastavalt punkti 5.1 alapunktis i kirjeldatud objektiklaasi valmistamisele

Valmistatakse rida kahekordseid lahjendusi. Esimeses augus peaks olema 1/2 tiitrist (T/2), teistes 1/4 tiitrist (T/4), 1/2 tiitrist (T/2), tiiter (T) ja kahekordne tiiter (2T).

| ii) | Vastavalt punkti 5.1 alapunktis ii kirjeldatud objektiklaasi valmistamisele
  Valmistatakse antikehade töölahjendus IF-puhvris. Töölahjendus mõjutab spetsiifilisust. Joonis 1. Analüüsi objektiklaaside valmistamine vastavalt punkti 5.1 |
| --- | --- |

ii)

Vastavalt punkti 5.1 alapunktis ii kirjeldatud objektiklaasi valmistamisele

Valmistatakse antikehade töölahjendus IF-puhvris. Töölahjendus mõjutab spetsiifilisust. Joonis 1. Analüüsi objektiklaaside valmistamine vastavalt punkti 5.1

Joonis 1.   Alapunktile i ja punkti 5.3 alapunktile i.

| | Uuesti suspendeeritud bakterisademe lahjendused |
| --- | --- |
| 1/100 | 1/1 | 1/1 | 1/1 | 1/1 |  | Uuesti suspendeeritud bakterisademe lahjendus |
| (T = tiiter) | T/2 | T/4 | T/2 | T | 2T |  | Antiseerumi/antikehade kahekordsed lahjendused |
| Proov 1 | | | | | | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Proovi 1 duplikaat või proov 2 | | | | | |
| 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |

Uuesti suspendeeritud bakterisademe lahjendused

1/100

1/1

1/1

1/1

1/1



Uuesti suspendeeritud bakterisademe lahjendus

(T = tiiter)

T/2

T/4

T/2

T

2T



Antiseerumi/antikehade kahekordsed lahjendused

Proov 1

Image

Image

Image

Image

Image

1

2

3

4

5

Proovi 1 duplikaat või proov 2

Image

Image

Image

Image

Image

6

7

8

9

10

Joonis 2.   Analüüsi objektiklaaside valmistamine vastavalt punkti 5.1 alapunktile ii ja punkti 5.3 alapunktile ii.

| | Antiseerumi/antikehade töölahused |
| --- | --- |
| 1/1 | 1/10 | 1/100 | tühi | tühi |  | Uuesti suspendeeritud bakterisademe kümnendlahjendused |
| Proov 1 | | | | | | | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Proovi 1 duplikaat või proov 2 | | | | | |
| 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |

Antiseerumi/antikehade töölahused

1/1

1/10

1/100

tühi

tühi



Uuesti suspendeeritud bakterisademe kümnendlahjendused

Proov 1

Image

Image

Image

Image

Image

1

2

3

4

5

Proovi 1 duplikaat või proov 2

Image

Image

Image

Image

Image

6

7

8

9

10

5.3.1.   Objektiklaasid asetatakse niiskele kuivatuspaberile. Iga aknaväli kaetakse täielikult antikehade lahjendus(t)ega. Igale aknaväljale lisatud antikehade kogus peab olema vähemalt võrdne objektiklaasile lisatud ekstrakti kogusega.

Kui antikehade tarnijalt ei ole konkreetseid juhiseid, tuleks kasutada järgmist meetodit.

5.3.2.   Objektiklaase inkubeeritakse niiskel paberil katte all 30 minutit ümbritseva õhu temperatuuril (18–25 °C).

5.3.3.   Igalt objektiklaasilt raputatakse piisad ära ja need loputatakse hoolikalt IF-puhvriga. Pestakse 5 minutit IF Tween-puhvris (4. liide) ning seejärel IF-puhvris. Tuleks vältida aerosoolide ja piiskade ülakandumist, mis võiks põhjustada ristsaastumise. Kuivatuspaberiga kergelt kuivatades eemaldatakse ettevaatlikult liigne niiskus.

5.3.4.   Objektiklaasid asetatakse niiskele paberile. Aknaväljad kaetakse FITC-konjugaadi lahjendusega, mida kasutati tiitri määramisel. Aknaväljadele lisatud konjugaadi kogus peab olema sama, mis on antikehade kogus.

5.3.5.   Objektiklaase inkubeeritakse niiskel paberil katte all 30 minutit ümbritseva õhu temperatuuril (18–25 °C).

5.3.6.   Konjugaadi tilgad raputatakse objektiklaasilt maha. Loputatakse ja pestakse nagu eespool kirjeldatud (5.3.3).

Ettevaatlikult eemaldatakse liigne niiskus.

5.3.7.   Igasse aknavälja pipetitakse 5–10 μl 0,1 M fosfaatpuhverdatud glütserooli (4. liide) või kaubanduslikult kättesaadavat pleekimisvastast kattevedelikku ning objektiklaas kaetakse katteklaasiga.

5.4.   IF-analüüsi tulemused

5.4.1.   Objektiklaase vaadeldakse mikroskoobis, millele on paigaldatud epifluorestsentsvalgusallikas ja sobilikud filtrid tööks FITCga, ning kasutatakse õli- või vesiimmersiooni suurendusel 500–1 000 korda. Aknavälju vaadeldakse risti läbi kahe diameetri täisnurga suhtes ja ümber aknavälja välisääre. Proovide puhul, kus ei paista üldse või paistab ainult väga vähe rakke, vaadeldakse vähemalt 40 mikroskoobi vaatevälja.

Esialgu kontrollitakse positiivse tulemusega kontroll-objektiklaasi. Rakud peavad säravalt fluorestseeruma ja olema täielikult värvunud kindlaksmääratud antikehade tiitris või töölahjenduses. Kui fluorestseerumine ei ole täielik, tuleb IF-analüüsi (VI jao punkt A.5) korrata.

5.4.2.   Vaadeldakse bakteri R. solanacearum iseloomuliku morfoloogiaga säravalt fluorestseeruvaid rakke objektiklaaside aknaväljades (vt veebileht http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluorestseerumise intensiivsus peaks olema ekvivalentne positiivse kontrolltüve omaga sama antikeha lahjenduse juures. Lõplikult värvumata või nõrgalt fluorestseeruvad rakud jäetakse kõrvale.

Mis tahes saastumiskahtluse korral tuleb analüüsi korrata. Näiteks siis, kui partii kõigil objektiklaasidel on positiivseid rakke puhvri saastumise tõttu või kui leitakse positiivseid rakke objektiklaasi pinnal (väljaspool aknavälju).

5.4.3.   Immunofluorestsentsanalüüsi spetsiifilisuse tõttu on mitmeid probleeme. Kartuli basaalse tipusüdamiku ja varre sademetes ilmuvad tõenäoliselt ebatüüpilise morfoloogiaga fluorestseerivate rakkude taustpopulatsioonid ning bakteriga R. solanacearum sarnase suuruse ja morfoloogiaga ristuvalt reageerivad saprofüütbakterid.

5.4.4.   Arvesse võetakse ainult tüüpilise suuruse ja morfoloogiaga fluorestseeruvaid rakke punktis 5.3 esitatud antikehade tiitris või töölahjenduses.

5.4.5.   IF-tulemuste tõlgendamine

| i) | Kui objektiklaasi aknaväljal esineb morfoloogiliselt tüüpilisi eredalt fluorestseeruvaid rakke, määratakse keskmine rakkude arv mikroskoobi vaatevälja kohta ja arvutatakse tüüpiliste rakkude arv milliliitris uuesti suspendeeritud bakterisademes (5. liide).
  Proovi IF-tulemus on positiivne, kui seal on vähemalt 5 × 103 tüüpilist rakku uuesti suspendeeritud bakterisademe milliliitris. Proovi loetakse saastumiskahtlusega prooviks ning tuleb teha lisaanalüüse. |
| --- | --- |

i)

Kui objektiklaasi aknaväljal esineb morfoloogiliselt tüüpilisi eredalt fluorestseeruvaid rakke, määratakse keskmine rakkude arv mikroskoobi vaatevälja kohta ja arvutatakse tüüpiliste rakkude arv milliliitris uuesti suspendeeritud bakterisademes (5. liide).

Proovi IF-tulemus on positiivne, kui seal on vähemalt 5 × 103 tüüpilist rakku uuesti suspendeeritud bakterisademe milliliitris. Proovi loetakse saastumiskahtlusega prooviks ning tuleb teha lisaanalüüse.

| ii) | Proovi IF-tulemus on negatiivne, kui seal on alla 5 × 103 rakku uuesti suspendeeritud bakterisademe milliliitris, ning proov loetakse negatiivseks. Lisaanalüüse ei ole vaja teha. |
| --- | --- |

ii)

Proovi IF-tulemus on negatiivne, kui seal on alla 5 × 103 rakku uuesti suspendeeritud bakterisademe milliliitris, ning proov loetakse negatiivseks. Lisaanalüüse ei ole vaja teha.

6.   PCR-analüüs

Põhimõtted

Kui peamise sõelkatsena kasutatakse PCR-analüüsi ja tulemus on positiivne, tuleb teise kohustusliku sõelkatsena teha isolatsiooni- või IF-analüüs. Kui PCR-analüüsi kasutatakse teise sõelkatsena ja tulemus on positiivne, tuleb lõpliku diagnoosi panemiseks teha vastavalt diagrammile täiendavaid analüüse.

Selle meetodi kasutamist peamise sõelkatsena soovitatakse ainult siis, kui on olemas eriteadmised.

Märkus: eelanalüüsid sellel meetodil peaksid võimaldama taasavastada 103 kuni 104 bakteri R. solanacearum rakku milliliitris lisatuna varem negatiivse tulemuse andnud prooviekstraktidele. Maksimaalse tundlikkuse ja spetsiifilisuse saavutamiseks kõigis laborites võib olla vajalik teha optimeerimisanalüüse.

Kasutatakse nõuetekohaselt valideeritud PCR-reaktiive ja protokolle (vt 6. liide). Eelistatavalt valitakse sisekontrolliga meetod.

Proovi sihtmärgi DNAga saastumise vältimiseks kasutatakse kohaseid ettevaatusabinõusid. PCR-analüüsi peaksid tegema kogenud tehnikud spetsiaalsetes molekulaarbioloogia laborites, et minimeerida sihtmärgi DNAga saastumise võimalust.

DNA ekstraheerimise ja PCR-menetluse negatiivseid kontrolle tuleks alati käsitleda menetluses viimaste proovidena, et näidata, kas on toimunud DNA ülekandmist.

PCR-analüüsi tuleks kaasata järgmised negatiivsed kontrollid:

| — | prooviekstrakt, mis andis varem bakteri R. solanacearum osas negatiivse tulemuse, |
| --- | --- |

—

prooviekstrakt, mis andis varem bakteri R. solanacearum osas negatiivse tulemuse,

| — | kontrollpuhvrid, mida kasutati bakterite ja DNA eraldamisel proovist, |
| --- | --- |

—

kontrollpuhvrid, mida kasutati bakterite ja DNA eraldamisel proovist,

| — | PCR-reaktsioonisegu. |
| --- | --- |

—

PCR-reaktsioonisegu.

Tuleks kaasata järgmised positiivsed kontrollid:

| — | resuspendeeritud bakterisegude alikvoodid, millele on lisatud bakterit R. solanacearum (valmistamist vt liites 3 B), |
| --- | --- |

—

resuspendeeritud bakterisegude alikvoodid, millele on lisatud bakterit R. solanacearum (valmistamist vt liites 3 B),

| — | bakteri R. solanacearum virulentse isolaadi (näiteks NCPPB 4156 või PD 2762 või CFBP 3857) vesisuspensioon (106 rakku milliliitris) (vt liide 3 B), |
| --- | --- |

—

bakteri R. solanacearum virulentse isolaadi (näiteks NCPPB 4156 või PD 2762 või CFBP 3857) vesisuspensioon (106 rakku milliliitris) (vt liide 3 B),

| — | võimaluse korral kasutatakse PCR-analüüsis ka positiivsetest kontrollproovidest saadud DNAd. |
| --- | --- |

—

võimaluse korral kasutatakse PCR-analüüsis ka positiivsetest kontrollproovidest saadud DNAd.

Võimaliku saastumise vältimiseks valmistatakse positiivsed kontrollid analüüsitavatest proovidest eraldi keskkonnas.

Prooviekstraktid peaksid olema võimalikult mullavabad. Seepärast on teatavatel juhtudel soovitav valmistada ekstraktid pestud kartulitest, kui soovitakse kasutada PCR-protokolle.

Positiivsed ja negatiivsed standardiseeritud kontrollained, mida saab kasutada nende analüüside puhul, on loetletud 3. liites.

6.1.   DNA puhastamise meetodid

Kasutatakse eespool kirjeldatud positiivseid ja negatiivseid kontrollproove (vt 3. liide).

Kontrollproove analüüsitakse samamoodi kui proovi (proove).

Sihtmärgi DNA eraldamiseks komplekssetest prooviainetest on võimalik kasutada erinevaid meetodeid, mille käigus eemaldatakse PCRi inhibiitorid ja muud ensümaatilised reaktsioonid ning kontsentreeritakse prooviekstraktis sihtmärgi DNA. Järgmiseid meetodeid on optimeeritud 6. liites esitatud valideeritud PCR-meetoditega kasutamiseks.

a)   Pastriki (2000) meetod

| 1) | Pipetitakse 220 μl lüüsipuhvrit (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) 1,5 ml Eppendorfi topsi. |
| --- | --- |

1)

Pipetitakse 220 μl lüüsipuhvrit (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) 1,5 ml Eppendorfi topsi.

| 2) | Lisatakse 100 μl prooviekstrakti ja pannakse 10 minutiks kuumutusplokile või vesivanni 95 °C juures. |
| --- | --- |

2)

Lisatakse 100 μl prooviekstrakti ja pannakse 10 minutiks kuumutusplokile või vesivanni 95 °C juures.

| 3) | Tops pannakse 5 minutiks jääle. |
| --- | --- |

3)

Tops pannakse 5 minutiks jääle.

| 4) | Lisatakse 80 μl lüsosüümi põhilahust (50 mg lüsosüümi ml kohta 10 mM Tris HCl, pH 8,0) ja inkubeeritakse 30 minutit 37 °C juures. |
| --- | --- |

4)

Lisatakse 80 μl lüsosüümi põhilahust (50 mg lüsosüümi ml kohta 10 mM Tris HCl, pH 8,0) ja inkubeeritakse 30 minutit 37 °C juures.

| 5) | Lisatakse 220 μl Easy DNA® lahust A (Invitrogen), segatakse hästi segistil ja inkubeeritakse 30 minutit 65 °C juures. |
| --- | --- |

5)

Lisatakse 220 μl Easy DNA® lahust A (Invitrogen), segatakse hästi segistil ja inkubeeritakse 30 minutit 65 °C juures.

| 6) | Lisatakse 100 μl Easy DNA® lahust B (Invitrogen), segatakse tugevalt, kuni sade valgub topsis vabalt ja proov on ühtlaselt viskoosne. |
| --- | --- |

6)

Lisatakse 100 μl Easy DNA® lahust B (Invitrogen), segatakse tugevalt, kuni sade valgub topsis vabalt ja proov on ühtlaselt viskoosne.

| 7) | Lisatakse 500 μl kloroformi ja segatakse segistil viskoossuse kadumiseni ja homogeense segu saamiseni. |
| --- | --- |

7)

Lisatakse 500 μl kloroformi ja segatakse segistil viskoossuse kadumiseni ja homogeense segu saamiseni.

| 8) | Faaside eraldamiseks ja interfaasi moodustamiseks tsentrifuugitakse 15 000 g juures 20 minutit temperatuuril 4 °C. |
| --- | --- |

8)

Faaside eraldamiseks ja interfaasi moodustamiseks tsentrifuugitakse 15 000 g juures 20 minutit temperatuuril 4 °C.

| 9) | Ülemine faas kantakse üle puhtasse Eppendorfi topsi. |
| --- | --- |

9)

Ülemine faas kantakse üle puhtasse Eppendorfi topsi.

| 10) | Lisatakse 1 ml 100 % etanooli (–20 °C), segatakse lühidalt ja inkubeeritakse jääl 10 minutit. |
| --- | --- |

10)

Lisatakse 1 ml 100 % etanooli (–20 °C), segatakse lühidalt ja inkubeeritakse jääl 10 minutit.

| 11) | Tsentrifuugitakse 20 minutit 15 000 g juures temperatuuril 4 °C ja eemaldatakse etanool bakterisademest. |
| --- | --- |

11)

Tsentrifuugitakse 20 minutit 15 000 g juures temperatuuril 4 °C ja eemaldatakse etanool bakterisademest.

| 12) | Lisatakse 500 μl 80 % etanooli (–20 °C) ja segatakse, pöörates topsi põhjaga ülespoole. |
| --- | --- |

12)

Lisatakse 500 μl 80 % etanooli (–20 °C) ja segatakse, pöörates topsi põhjaga ülespoole.

| 13) | Tsentrifuugitakse 10 minutit 15 000 g juures temperatuuril 4 °C, bakterisade hoitakse alles ja eemaldatakse etanool. |
| --- | --- |

13)

Tsentrifuugitakse 10 minutit 15 000 g juures temperatuuril 4 °C, bakterisade hoitakse alles ja eemaldatakse etanool.

| 14) | Bakterisademel lastakse kuivada õhu käes või seadmes DNA Speed Vac. |
| --- | --- |

14)

Bakterisademel lastakse kuivada õhu käes või seadmes DNA Speed Vac.

| 15) | Bakterisade resuspendeeritakse 100 μl steriilses ultrapuhtas vees ja jäetakse toatemperatuuril seisma vähemalt 20 minutiks. |
| --- | --- |

15)

Bakterisade resuspendeeritakse 100 μl steriilses ultrapuhtas vees ja jäetakse toatemperatuuril seisma vähemalt 20 minutiks.

| 16) | Säilitatakse –20 °C juures kuni PCR-analüüsi tegemiseni. |
| --- | --- |

16)

Säilitatakse –20 °C juures kuni PCR-analüüsi tegemiseni.

| 17) | Igasugune valge sade tsentrifuugitakse alla ja kasutatakse 5 μl supernatanti, mis sisaldab DNAd PCR-analüüsi tarvis. |
| --- | --- |

17)

Igasugune valge sade tsentrifuugitakse alla ja kasutatakse 5 μl supernatanti, mis sisaldab DNAd PCR-analüüsi tarvis.

b)   Muud meetodid

Võib kasutada muid DNA eraldamise meetodeid (näiteks Qiagen DNeasy Plant Kit), eeldusel et need sama tõhusalt puhastuvad välja DNA kontrollproovidest, mis sisaldavad 103 kuni 104 patogeeni rakku milliliitris.

6.2.   PCR-analüüs

6.2.1.   Valmistatakse ette PCR-analüüsi analüüsi- ja kontrollmatriitsid vastavalt valideeritud protokollile (VI jao punkt A.6). Valmistatakse proovi DNA ekstrakti üks kümnendlahjendus (1:10 ultrapuhtas vees).

6.2.2.   Saastevabas keskkonnas valmistatakse kohane PCR-reaktsioonisegu vastavalt avaldatud protokollile (6. liide). Võimaluse korral soovitatakse kasutada mitmekordseid PCR-protokolle sisemise PCR-kontrolliga.

6.2.3.   Lisatakse 2–5 μl DNA ekstrakti 25 μl PCR-reaktsioonisegu kohta steriilsetes PCR-katseklaasides vastavalt PCR-protokollidele (vt 6. liide).

6.2.4.   Võetakse ainult PCR-reaktsioonisegu sisaldav negatiivne kontrollproov ja proovi kohta lisatakse sama ultrapuhta vee allikat, mida kasutati PCR-segus.

6.2.5.   Katseklaasid pannakse samasse termotsüklerisse, mida kasutati eelanalüüsi tegemisel, ning see pannakse tööle kohaselt optimeeritud PCR-programmis (6. liide).

6.3.   PCR-produkti analüüs

6.3.1.   PCR-amplikonid eraldatakse agaroosgeelelektroforeesi teel. Võetakse igast proovist vähemalt 12 μl paljundatud DNA reaktsioonisegu, mis on segatud 3 μl täitepuhvriga (6. liide) 2,0 %lises agaroosgeelis trisatsetaat-EDTA (TAE) puhvris (6. liide) 5-8 V/cm. Kasutatakse kohast DNA markerit, näiteks 100 aluspaari.

6.3.2.   DNA ribad tuuakse esile, värvides neid eetiumbromiidiga (0,5 mg liitris) 30–60 minutit, võttes kohaseid ettevaatusabinõusid selle mutageeni käitlemisel.

6.3.3.   Värvunud geeli vaadeldakse lühilaine ultraviolett valgustusallikaga (λ = 302 nm) oodatava suurusega amplifitseerunud PCR-produktide (6. liide) leidmiseks ja need dokumenteeritakse.

6.3.4.   Kõigi uute leidude/juhtumite korral tõendatakse PCR-amplikoni usaldatavust ülejäänud amplifitseeritud DNA proovi restriktsiooniensüümi analüüsiga, inkubeerides optimaalsel temperatuuril ja optimaalse aja jooksul kohase ensüümi ja puhvriga (vt 6. liide). Lahustunud fragmendid eraldatakse elektroforeesil agaroosgeelis nagu varem ja vaadeldakse pärast värvimist eetiumbromiidiga ultraviolett valgustusallikaga iseloomulikku restriktsioonifragmendi pilti ning võrreldakse seda lahustamata ja lahustunud positiivse kontrolliga.

PCR-analüüsi tulemuse tõlgendamine

PCR-analüüs on negatiivne, kui kõnealuses proovis ei avastata bakterile R. solanacearum spetsiifilist PCR-amplikoni, kuid see avastatakse kõigis positiivse kontrolli proovides (mitmekordse PCR-produkti puhul, millel on taimele spetsiifilised sisekontrolli praimerid: oodatava suurusega teine PCR-produkt peab amplifeeruma kõnealuse prooviga).

PCR-analüüs on positiivne, kui avastatakse oodatava suuruse ja restriktsioonipildiga (kui see on nõutav) bakterile R. solanacearum spetsiifiline PCR-amplikon, eeldusel et see ei amplifitseerunud mõnest negatiivse kontrolli proovist. Positiivse tulemuse usaldusväärse kinnituse saab ka siis, kui analüüsi korratakse teiste PCR-praimeritega (6. liide).

Märkus: PCR inhibeerumist võib kahtlustada siis, kui oodatav amplikon saadakse positiivse kontrolli proovist, mis sisaldab bakterit R. solanacearum vees, kuid negatiivseid tulemusi saadakse positiivsetest kontrollidest, mis sisaldavad bakterit R. solanacearum kartuliekstraktis. Mitmekordsetes PCR-protokollides sisemiste PCR-konrollidega viitab reaktsiooni inhibeerumisele see, kui ei saada kumbagi amplikoni.

Saastumist võib kahtlustada siis, kui oodatav amplikon saadakse ühest või mitmest negatiivsest kontrollist.

7.   FISH-analüüs

Põhimõte

Kui esimese sõelkatsena kasutatakse FISH-analüüsi ja tulemus on positiivne, tuleb teise kohustusliku sõelkatsena teha isolatsiooni- või IF-analüüs. Kui FISH-analüüsi kasutatakse teise sõelkatsena ja tulemus on positiivne, tuleb lõpliku diagnoosi panemiseks teha vastavalt diagrammile täiendavaid analüüse.

Märkus: kasutatakse valideeritud bakterile R. solanacearum spetsiifilisi oligosonde (vt 7. liide). Eelanalüüsid sellel meetodil peaksid võimaldama taasavastada varem negatiivse tulemuse andnud prooviekstraktidele lisatud vähemalt 103–104 bakteri R. solanacearum rakku milliliitris.

Järgmist meetodit tuleks eelistatavalt kasutada värskelt valmistatud prooviekstraktiga, kuid seda võib edukalt kasutada ka prooviekstraktiga, mida on säilitatud glütserooli all temperatuuril –16 kuni –24 °C või –68 kuni –86 °C.

Negatiivse kontrollina kasutatakse sama proovi alikvoote, mis andsid varem bakteri R. solanacearum negatiivse tulemuse.

Positiivseteks kontrollideks valmistatakse 3–5 päeva vanusest bakteri R. solanacearum biotüübi 2 kultuurist (näiteks tüvi NCPPB 4156 või PD 2762 või CFBP 3857, vt 3. liide) suspensioonid, mis sisaldavad 105 kuni 106 rakku milliliitri kohta 0,01 M fosfaatpuhvris. Valmistatakse vastavalt liitele 3 B kartuliekstraktis suspendeeritud bakteri R. solanacearum homoloogse tüve või mis tahes muu referenttüve eraldi positiivsed kontrollobjektiklaasid.

FITC-värvainega konjugeeritud eubakteriaalsete oligoproovide kasutamine võimaldab kontrollida hübridisatsiooniprotsessi, sest see värvib kõik proovis olevad eubakterid.

Positiivne ja negatiivne standardiseeritud kontrollmaterjal, mida saab kasutada nende analüüside puhul, on loetletud 3. liite punktis A.

Kontrollmaterjali analüüsitakse samamoodi kui proovi (proove).

7.1.   Kartuliekstrakti fikseerimine

Järgmine protokoll põhineb allikal Wullings et al. (1998).

7.1.1.   Valmistatakse kinnitilahus (vt 7. liide).

7.1.2.   Igast prooviekstraktist pipetitakse 100 μl Eppendorfi topsi ja tsentrifuugitakse 7 minutit 7 000 g juures.

7.1.3.   Eemaldatakse supernatant ja bakterisade lahustatakse 200 μl kinnitis, mis valmistati kuni 24 tundi varem. Loksutatakse vorteksil ja inkubeeritakse 1 tund külmikus.

7.1.4.   Tsentrifuugitakse 7 minutit 7 000 g juures, eemaldatakse supernatant ja bakterisade resuspendeeritakse 75 μl 0,01 M fosfaatpuhvris (vt 7. liide).

7.1.5.   Fikseeritud suspensioonidest tilgutatakse 16 μl puhtale mitmeaknalisele objektiklaasile vastavalt joonisele 7.1. Igale objektiklaasile pannakse 2 erinevat lahjendamata proovi ning 10 μl kasutatakse 1:100 lahjenduse tegemiseks (0,01 M fosfaatpuhvris). Ülejäänud proovilahust (49 μl), millele on eelnevalt lisatud 1 maht 96 % etanooli, võib säilitada –20 °C juures. Juhul kui FISH-analüüsi tuleb uuesti teha, eemaldatakse etanool tsentrifugeerimise teel ja lisatakse sellega võrdne kogus 0,01 fosfaatpuhvrit (loksutakse vorteksil).

Joonis 7.1.   FISH-objektiklaasi joonis

| Proov 1 | Tühi | Tühi | Tühi | Proov 2 |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| | | | | |
| aknaväli 1 | aknaväli 2 | aknaväli 3 | aknaväli 4 | aknaväli 5 |
| Proov 1 | Tühi | Tühi | Tühi | Proov 2 |
| | | | | |
| aknaväli 6 | aknaväli 7 | aknaväli 8 | aknaväli 9 | aknaväli 10 |
| Katteklaas 1 | | Katteklaas 2 |

Proov 1

Tühi

Tühi

Tühi

Proov 2

Image

Image

Image

Image

Image

aknaväli 1

aknaväli 2

aknaväli 3

aknaväli 4

aknaväli 5

Proov 1

Tühi

Tühi

Tühi

Proov 2

Image

Image

Image

Image

Image

aknaväli 6

aknaväli 7

aknaväli 8

aknaväli 9

aknaväli 10

Katteklaas 1

Katteklaas 2

7.1.6.   Objektiklaasid kuivatatakse õhu käes (või objektiklaaside kuivatis 37 °C juures) ja fikseeritakse, kuumutades klaase läbi leegi.

Selles etapis võib menetluse katkestada ja jätkata hübridiseerimist järgmisel päeval. Objektiklaase tuleb hoida tolmuvabas ja kuivas kohas toatemperatuuril.

7.2.   Hübridiseerimine

7.2.1.   Rakud veetustatakse 50 %, 80 % ja 96 % etanooli reas, igas etapis 1 minut. Objektiklaasid kuivatatakse objektiklaaside hoidikul õhu käes.

7.2.2.   Valmistatakse ette niiske inkubatsioonikamber, kattes õhukindla kasti põhja kuivatus- või filterpaberiga, mis on kastetud 1x hybmix-lahusesse (7. liide). Kast eelinkubeeritakse hübridisatsiooniahjus 45 °C juures vähemalt 10 minutit.

7.2.3.   Pannakse 10 μl hübridisatsioonilahust (7. liide) 8 aknavälja (aknaväljad 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 ja 10, vt joonis 7.1) igale objektiklaasile, jättes kaks keskmist aknavälja (3 ja 8) tühjaks.

7.2.4.   Esimesele ja viimasele neljale aknale asetatakse katteklaas (24 × 24 mm) nii, et vahele ei jää õhku. Objektiklaasid pannakse eelsoojendatud niiskesse kambrisse ja hübridiseeritakse 5 tunni jooksul ahjus 45 °C juures pimedas.

7.2.5.   Valmistatakse ette 3 keeduklaasi, mis sisaldavad 1 l Milli Q (molekulaarbioloogias kasutatava puhtusastmega) vett, 1 l 1x hybmix-lahust (334 ml 3x hybmix-lahust ja 666 ml Milli Q vett) ja 1 l 1/8x hybmix-lahust (42 ml 3x hybmix-lahust ja 958 ml molekulaarbioloogias kasutatavat vett). Iga keeduklaasi eelinkubeeritakse vesivannis 45 °C juures.

7.2.6.   Objektiklaasidelt eemaldatakse katteklaasid ja objektiklaasid asetatakse objektiklaaside hoidikule.

7.2.7.   Ülemäärane oligoproov pestakse ära, inkubeerides 15 minutit 45 °C juures keeduklaasis, milles on 1x hybmix-lahus.

7.2.8.   Objektiklaaside hoidik pannakse 1/8 hybmix-pesulahusesse ja inkubeeritakse veel 15 minutit.

7.2.9.   Objektiklaasid kastetakse lühidalt Milli Q vette ja pannakse filterpaberile. Liigne niiskus eemaldatakse, kattes pinna õrnalt filterpaberiga. Igale aknaväljale pipetitakse 5–10 μl pleekimisvastast kattevedelikku (näiteks Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA või samaväärset) ja üle terve objektiklaasi pannakse suur katteklaas (24 × 60 mm).

7.3.   FISH-analüüsi tulemused

7.3.1.   Objektiklaase vaadeldakse viivitamatult mikroskoobis, millele on paigaldatud epifluorestsentsvalgusallikas ja kasutatakse õliimmersiooni suurendusel 630 või 1 000 korda. Fluorestseiinisotiotsüanaadile (FITC) sobiva filtriga värvuvad proovis olevad eubakterite rakud (sealhulgas enamik gramnegatiivseid rakke) fluorestseeruvroheliseks. Kasutades tetrametüülrodamiin-5-isotiotsüanaadile sobivat filtrit, paistavad bakteri R. solanacearum Cy3-ga värvunud rakud fluorestseeruvpunastena. Raku morfoloogiat võrreldakse positiivsete kontrollidega. Rakukestad peavad eredalt fluorestseeruma ja olema täielikult värvunud. Kui fluorestseerumine ei ole täielik, tuleb FISH-analüüsi (VI jao punkt A.7) korrata. Aknavälju vaadeldakse risti läbi kahe diameetri täisnurga suhtes ja ümber aknavälja välisääre. Proovide puhul, kus ei paista üldse või paistab ainult väga vähe rakke, vaadeldakse vähemalt 40 mikroskoobi vaatevälja.

7.3.2.   Vaadeldakse bakteri R. solanacearum iseloomuliku morfoloogiaga eredalt fluorestseeruvaid rakke objektiklaaside aknaväljades (vt veebileht http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluorestseerumise intensiivsus peab olema positiivse kontrolli fluorestseerumise intensiivsusega võrdne või sellest parem. Lõplikult värvumata või nõrgalt fluorestseeruvad rakud jäetakse kõrvale.

7.3.3.   Mis tahes saastumiskahtluse korral tuleb analüüsi korrata. Näiteks siis, kui partii kõigil objektiklaasidel on positiivseid rakke puhvri saastumise tõttu või kui leitakse positiivseid rakke objektiklaasi pinnal (väljaspool aknavälju).

7.3.4.   FISH-analüüsi spetsiifilisuse tõttu on mitmeid probleeme. Kartuli basaalse tipusüdamiku ja varreosa kontsentreeritud bakterisademetes võib esineda ebatüüpilise morfoloogiaga fluorestseeruvate rakkude taustpopulatsioone ning bakteriga R. solanacearum sarnase suuruse ja morfoloogiaga ristuvalt reageerivaid saprofüütbaktereid, kuigi palju harvem kui IF-analüüsis.

7.3.5.   Arvesse võetakse üksnes tüüpilise suuruse ja morfoloogiaga fluorestseeruvaid rakke.

7.3.6.   FISH-analüüsi tulemuse tõlgendamine

| i) | FISH-analüüsi valiidsed tulemused saadakse siis, kui FITC-filtrit kasutades vaadeldakse bakterile R. solanacearum omase suuruse ja tüüpilise morfoloogiaga ererohelisi fluorestseeruvaid rakke ja rodamiinfiltrit kasutades erepunaseid fluorestseeruvaid rakke kõigis positiivsetes kontrollides ja mitte üheski negatiivses kontrollis. Kui objektiklaasi aknaväljal esineb morfoloogiliselt tüüpilisi eredalt fluorestseeruvaid rakke, määratakse keskmine rakkude arv mikroskoobi vaatevälja kohta ja arvutatakse tüüpiliste rakkude arv resuspendeeritud bakterisademe milliliitris (4. liide). Saastumiskahtlusega proovideks loetakse proove, milles on vähemalt 5 × 103 tüüpilist rakku resuspendeeritud bakterisademe milliliitris. Tuleb teha täiendavaid analüüse. Proovid, milles on alla 5 × 103 tüüpilise raku uuesti suspendeeritud bakterisadema milliliitris, loetakse negatiivseteks. |
| --- | --- |

i)

FISH-analüüsi valiidsed tulemused saadakse siis, kui FITC-filtrit kasutades vaadeldakse bakterile R. solanacearum omase suuruse ja tüüpilise morfoloogiaga ererohelisi fluorestseeruvaid rakke ja rodamiinfiltrit kasutades erepunaseid fluorestseeruvaid rakke kõigis positiivsetes kontrollides ja mitte üheski negatiivses kontrollis. Kui objektiklaasi aknaväljal esineb morfoloogiliselt tüüpilisi eredalt fluorestseeruvaid rakke, määratakse keskmine rakkude arv mikroskoobi vaatevälja kohta ja arvutatakse tüüpiliste rakkude arv resuspendeeritud bakterisademe milliliitris (4. liide). Saastumiskahtlusega proovideks loetakse proove, milles on vähemalt 5 × 103 tüüpilist rakku resuspendeeritud bakterisademe milliliitris. Tuleb teha täiendavaid analüüse. Proovid, milles on alla 5 × 103 tüüpilise raku uuesti suspendeeritud bakterisadema milliliitris, loetakse negatiivseteks.

| ii) | FISH-analüüs on negatiivne siis, kui rodamiinfiltrit kasutades ei vaadelda bakterile R. solanacearum omase suuruse ja tüüpilise morfoloogiaga erepunaseid fluorestseeruvaid rakke, tingimusel et rodamiinfiltrit kasutades vaadeldakse erepunaseid fluorestseeruvaid rakke positiivsete kontrollide preparaatides. |
| --- | --- |

ii)

FISH-analüüs on negatiivne siis, kui rodamiinfiltrit kasutades ei vaadelda bakterile R. solanacearum omase suuruse ja tüüpilise morfoloogiaga erepunaseid fluorestseeruvaid rakke, tingimusel et rodamiinfiltrit kasutades vaadeldakse erepunaseid fluorestseeruvaid rakke positiivsete kontrollide preparaatides.

8.   ELISA-analüüs

Põhimõte

Suhteliselt madala tundlikkuse tõttu võib ELISA-analüüsi kasutada vabatahliku lisana IF-, PCR- või FISH-analüüsile. DASI ELISA kasutamisel on rikastamine ja monokloonsete antikehade kasutamine kohustuslik (vt veebileht http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Proovide rikastamine enne ELISA-analüüsi võib olla analüüsi tundlikkuse tõstmiseks kasulik, kuid see võib ebaõnnestuda teiste võistlevate organismide tõttu proovis.

Märkus: kasutatakse R. solanacearum'i antikehade valideeritud allikat (vt veebileht http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). On soovitav määrata iga uue antikehapartii tiiter. Tiiter on kõrgeima kontsentratsiooniga lahus, mille juures toimub optimaalne reaktsioon, kui tehakse analüüsi suspensiooniga, mis sisaldab 105 kuni 106 bakteri R. solanacearum homoloogse tüve rakku milliliitris, ja kasutatakse kohast sekundaarse antikeha konjugaati vastavalt tootja soovitustele. Analüüside käigus tuleks kasutada antikehade lahjendusi, mis on kaubandusliku valmistise tiitri lähedal või sellega võrdsed.

Määratakse antikehade tiiter, kasutades R. solanacearum’i homoloogse tüve suspensiooni sisaldusega 105 kuni 106 rakku milliliitri kohta.

Negatiivsete kontrollidena kasutatakse prooviekstrakti, mis andis varem bakteri R. solanacearum osas negatiivse tulemuse, ja ristuvalt mittereageeriva bakteri suspensiooni fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahuses (PBS).

Positiivse kontrollina kasutatakse sama proovi alikvoote, mis andsid varem negatiivse tulemuse segatuna bakteri R. solanacearum biotüübi 2 tüvedega 103 kuni 104 rakku milliliitris (näiteks tüvi NCPPB 4156 või PD 2762 või CFBP 3857, vt 2. liite punktid A ja B). Tulemuste võrdlemiseks kasutatakse kõigil söötmeplaatidel R. solanacearum’i standardlahust 105 kuni 106 rakku milliliitris fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahuses (PBS). Positiivsed kontrollid peavad olema mikrotiiterplaadil kindlalt eraldatud analüüsitavast proovist (analüüsitavatest proovidest).

Positiivne ja negatiivne standardiseeritud kontrollmaterjal, mida saab kasutada nende analüüside puhul on loetletud 3. liite punktis A.

Kontrollmaterjali analüüsitakse samamoodi kui proovi (proove).

Valideeritud on kaks ELISA protokolli.

a)   Kaudne ELISA (Robinson-Smith et al., 1995)

| 1) | Võetakse 100–200 μl prooviekstrakti alikvooti. (Kuumutamine 4 minuti jooksul temperatuuril 100 °C vesivannis või kuumutusplokil võib mõnel juhul vähendada mittespetsiifilisi tulemusi.) |
| --- | --- |

1)

Võetakse 100–200 μl prooviekstrakti alikvooti. (Kuumutamine 4 minuti jooksul temperatuuril 100 °C vesivannis või kuumutusplokil võib mõnel juhul vähendada mittespetsiifilisi tulemusi.)

| 2) | Lisatakse samaväärne kogus kahekordset kattepuhvrit (4. liide) ja loksutatakse vorteksil. |
| --- | --- |

2)

Lisatakse samaväärne kogus kahekordset kattepuhvrit (4. liide) ja loksutatakse vorteksil.

| 3) | Igast proovist mõõdetakse vähemalt 100 μl kahte mikrotiiterplaadi auku (nt Nunc-Polysorp või samaväärne) ja inkubeeritakse üks tund 37 °C juures või öö jooksul 4 °C juures. |
| --- | --- |

3)

Igast proovist mõõdetakse vähemalt 100 μl kahte mikrotiiterplaadi auku (nt Nunc-Polysorp või samaväärne) ja inkubeeritakse üks tund 37 °C juures või öö jooksul 4 °C juures.

| 4) | Järsu löögiga raputatakse ekstrakt plaadiaukudest välja. Auke pestakse kolm korda PBS-Tweeniga (4. liide), jättes viimase pesukorra lahuse vähemalt viieks minutiks plaadiaukudesse. |
| --- | --- |

4)

Järsu löögiga raputatakse ekstrakt plaadiaukudest välja. Auke pestakse kolm korda PBS-Tweeniga (4. liide), jättes viimase pesukorra lahuse vähemalt viieks minutiks plaadiaukudesse.

| 5) | Valmistatakse R. solanacearum’i antikehade sobiv lahjendus blokeerimispuhvrisse (4. liide). Valideeritud, müügil olevate antikehade puhul kasutatakse soovitatud lahjendust (tavaliselt kaks korda kontsentreeritum kui tiiter). |
| --- | --- |

5)

Valmistatakse R. solanacearum’i antikehade sobiv lahjendus blokeerimispuhvrisse (4. liide). Valideeritud, müügil olevate antikehade puhul kasutatakse soovitatud lahjendust (tavaliselt kaks korda kontsentreeritum kui tiiter).

| 6) | Lisatakse 100 μl igasse auku ja inkubeeritakse üks tund 37 °C juures. |
| --- | --- |

6)

Lisatakse 100 μl igasse auku ja inkubeeritakse üks tund 37 °C juures.

| 7) | Järsu löögiga raputatakse antikehalahus plaadiaukudest välja, auke pestakse, nagu on eespool kirjeldatud (alapunkt 4). |
| --- | --- |

7)

Järsu löögiga raputatakse antikehalahus plaadiaukudest välja, auke pestakse, nagu on eespool kirjeldatud (alapunkt 4).

| 8) | Valmistatakse sekundaarse antikeha leeliselise fosfataaskonjugaadi sobiv lahjendus blokeerimispuhvrisse. Lisatakse 100 μl igasse auku ja inkubeeritakse üks tund 37 °C juures. |
| --- | --- |

8)

Valmistatakse sekundaarse antikeha leeliselise fosfataaskonjugaadi sobiv lahjendus blokeerimispuhvrisse. Lisatakse 100 μl igasse auku ja inkubeeritakse üks tund 37 °C juures.

| 9) | Järsu löögiga raputatakse konjugeeritud antikeha plaadiaukudest välja, auke pestakse, nagu on eespool kirjeldatud (alapunkt 4). |
| --- | --- |

9)

Järsu löögiga raputatakse konjugeeritud antikeha plaadiaukudest välja, auke pestakse, nagu on eespool kirjeldatud (alapunkt 4).

| 10) | Lisatakse 100 μl leeliselise fosfataassubstraadi lahust (4. liide) igasse auku. Inkubeeritakse pimedas toatemperatuuril ja mõõdetakse neeldumist lainepikkusel 405 nm korrapäraste ajavahemike järel 90 minuti jooksul. |
| --- | --- |

10)

Lisatakse 100 μl leeliselise fosfataassubstraadi lahust (4. liide) igasse auku. Inkubeeritakse pimedas toatemperatuuril ja mõõdetakse neeldumist lainepikkusel 405 nm korrapäraste ajavahemike järel 90 minuti jooksul.

b)   DASI ELISA

| 1) | Valmistatakse R. solanacearum’i määramiseks polükloonsete antikehade sobiv lahjendus kattepuhvris pH 9,6 (4. liide). Igasse auku lisatakse 200 μl. Inkubeeritakse 4–5 tundi 37 °C juures või 16 tundi 4 °C juures. |
| --- | --- |

1)

Valmistatakse R. solanacearum’i määramiseks polükloonsete antikehade sobiv lahjendus kattepuhvris pH 9,6 (4. liide). Igasse auku lisatakse 200 μl. Inkubeeritakse 4–5 tundi 37 °C juures või 16 tundi 4 °C juures.

| 2) | Auke pestakse kolm korda PBS-Tweeniga (4. liide).
  Lisatakse 190 μl prooviekstrakti vähemalt kahte auku. Positiivseid ja negatiivseid kontrolle lisatakse kumbagi kahte auku igal plaadil. Inkubeeritakse 16 tundi 4 °C juures. |
| --- | --- |

2)

Auke pestakse kolm korda PBS-Tweeniga (4. liide).

Lisatakse 190 μl prooviekstrakti vähemalt kahte auku. Positiivseid ja negatiivseid kontrolle lisatakse kumbagi kahte auku igal plaadil. Inkubeeritakse 16 tundi 4 °C juures.

| 3) | Auke pestakse kolm korda PBS-Tweeniga (4. liide). |
| --- | --- |

3)

Auke pestakse kolm korda PBS-Tweeniga (4. liide).

| 4) | Valmistatakse R. solanacearum’i määramiseks spetsiifiliste monokloonsete antikehade sobiv lahjendus fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahuses (PBS) (4. liide), mis sisaldab ka 0,5 % veise albumiinseerumit (BSA), ja lisatakse 190 μl igasse auku. Inkubeeritakse 2 tundi 37 °C juures. |
| --- | --- |

4)

Valmistatakse R. solanacearum’i määramiseks spetsiifiliste monokloonsete antikehade sobiv lahjendus fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahuses (PBS) (4. liide), mis sisaldab ka 0,5 % veise albumiinseerumit (BSA), ja lisatakse 190 μl igasse auku. Inkubeeritakse 2 tundi 37 °C juures.

| 5) | Auke pestakse kolm korda PBS-Tweeniga (4. liide). |
| --- | --- |

5)

Auke pestakse kolm korda PBS-Tweeniga (4. liide).

| 6) | Valmistatakse hiirevastase immunoglobuliini sobiv lahus, mis on konjugeeritud leeliselise fosfataassubstraadiga fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahuses (PBS). Igasse auku lisatakse 190 μl. Inkubeeritakse 2 tundi 37 °C juures. |
| --- | --- |

6)

Valmistatakse hiirevastase immunoglobuliini sobiv lahus, mis on konjugeeritud leeliselise fosfataassubstraadiga fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahuses (PBS). Igasse auku lisatakse 190 μl. Inkubeeritakse 2 tundi 37 °C juures.

| 7) | Auke pestakse kolm korda PBS-Tweeniga (4. liide). |
| --- | --- |

7)

Auke pestakse kolm korda PBS-Tweeniga (4. liide).

| 8) | Valmistatakse leeliseline fosfataassubstraadilahus, mis sisaldab 1 mg p-nitrofenüülfosfaati substraatpuhvri milliliitri kohta (4. liide). Igasse auku lisatakse 200 μl. Inkubeeritakse pimedas toatemperatuuril ja mõõdetakse neeldumist lainepikkusel 40 nm korrapäraste ajavahemike järel 90 minuti jooksul. |
| --- | --- |

8)

Valmistatakse leeliseline fosfataassubstraadilahus, mis sisaldab 1 mg p-nitrofenüülfosfaati substraatpuhvri milliliitri kohta (4. liide). Igasse auku lisatakse 200 μl. Inkubeeritakse pimedas toatemperatuuril ja mõõdetakse neeldumist lainepikkusel 40 nm korrapäraste ajavahemike järel 90 minuti jooksul.

ELISA-analüüsi tulemuste tõlgendamine

ELISA-analüüs on negatiivne, kui kahe proovi augu arvutatud keskmine optiline tihedus on väiksem kui negatiivse kontrolli prooviekstrakti augu kahekordse optilise tiheduse väärtus, tingimusel et kõigi positiivsete kontrollide optiline tihedus on üle 1,0 (pärast 90minutilist inkubatsiooni substraadis) ning see on suurem kui negatiivsete prooviekstraktide kahekordne optiline tihedus.

ELISA-analüüs on positiivne, kui kahe proovi augu arvutatud keskmine optiline tihedus on suurem kui negatiivse kontrolli prooviekstrakti augu kahekordse optilise tiheduse väärtus, tingimusel et kõigi negatiivse kontolli aukude optiline tihedus on väiksem kui positiivse kontrolli aukude kahekordne optiline tihedus.

ELISA-analüüsi positiivse kontrolli aukude negatiivsed näidud osutavad, et analüüs ei ole korrektselt läbi viidud või seda on inhibeeritud. ELISA-analüüsi negatiivse kontrolli aukude positiivsed näidud osutavad, et on toimunud ristsaastumine või mittespetsiifiline antikehade sidumine.

9.   Biotest

Märkus: eelanalüüsid sellel meetodil peaksid võimaldama reprodutseeritavalt avastada varem negatiivse tulemuse andnud prooviekstraktidele lisatud 103 kuni 104 bakteri R. solanacearum kolooniaid moodustavat üksust milliliitris (valmistamist vt 2. liites).

Suurimat avastustundlikkust võib loota siis, kui kasutatakse äsja valmistatud prooviekstrakti ja optimaalseid kasvutingimusi. Meetodit saab siiski kasutada edukalt nende ekstraktidega, mida on säilitatud glütserooli all temperatuuril –68 kuni –86 °C.

Järgneva protokolli aluseks on Janse (1988).

9.1.   Iga proovi kohta võetakse kümme tundliku tomatisordi (nt “Moneymaker” või sort, mille tundlikkuse on testlabor määranud olevat samaväärse) testtaime, millel on välja kasvanud 3. pärisleht. Andmed kultuuris kasvatamise kohta on 8. liites. Teise võimalusena võib kasutada baklažaani (nt sort “Black Beauty” või samasuguse tundlikkusega sort), kasutatakse ainult neid taimi, mis on 2–3 lehe faasis kuni kolmanda pärislehe täieliku väljakasvamiseni. On ilmnenud, et baklažaanil on sümptomid vähem tõsised ja arenevad aeglasemalt. Seetõttu soovitatakse võimaluse korral kasutada tomatiseemikuid.

100 μl prooviekstrakti jagatakse testtaimede vahel.

9.2.1.   Inokulatsioon süstla abil

Taimede varsi inokuleeritakse idulehtede kohal hüpodermilise nõelaga süstlaga (vähemalt 23G). Proov jaotatakse testtaimede vahel.

9.2.2.   Inokulatsioon sisselõike kaudu

Taime kahe sõrme vahel hoides pipetitakse suspendeeritud bakterisademe tilk (ligikaudu 5–10 μl) varrele idulehtede ja esimese lehe vahele.

Steriilse skalpelliga tehakse 1 cm pikkune diagonaalne sisselõige, mille sügavus on ligikaudu 2/3 varre paksusest, alustades sisselõiget bakterisademe tilga kohast.

Sisselõige kaetakse süstla abil steriilse vaseliiniga.

9.3.   Samal viisil nakatatakse viis taime 48tunnise virulentse R. solanacearum biotüübi 2 vesisuspensiooniga 105 kuni 106 rakku milliliitri kohta, mis on positiivseks kontrolliks, ning negatiivseks kontrolliks nakatatakse taimi bakterisademe puhvriga (4. liide). Positiivsed ja negatiivsed kontrolltaimed tuleb teistest taimedest isoleerida, et vältida ristnakatumist.

9.4.   Testtaimi kasvatatakse karantiiniruumides kuni neli nädalat 25–30 °C ja kõrge suhtelise niiskuse juures ja neid kastetakse nii, et ei tekiks ülekastmist või taimede närbumist veepuuduse tõttu. Saastumise vältimiseks inkubeeritakse positiivseid ja negatiivseid kontrolltaimi selgelt eraldatud lavadel kasvuhoones või kasvukambris või, kui ruumi on vähe, tagatakse rangelt eristatus töötlemiste vahel. Kui erinevate proovide taimi tuleb inkubeerida lähestikku, eraldatakse need kohaste varjetega. Väetamisel, kastmisel, kontrollimisel ja mis tahes muude tegevuste juures pööratakse suurt tähelepanu ristsaastumise vältimisele. Oluline on puhastada kasvuhooned ja kasvukambrid kõigist putukkahjureist, sest need võivad kanda bakteri ühelt taimelt teisele.

Jälgitakse närbumise, lehtede keerdumise, kloroosi ja/või kängumise tundemärke.

9.5.   Isoleeritakse haigestunud taimedest (II jao punkt 3) ja identifitseeritakse eeldatavad R. solanacearum’i puhastatud kultuurid (VI jao punkt B).

9.6.   Kui kolme nädala möödumisel sümptomeid ei ilmne, tehakse IF/PCR/isolatsioonianalüüsid liitproovist, mis koosneb igalt katsetaimelt ülalpool inokulatsioonikohta võetud 1 cm varreosadest. Kui analüüsid on positiivsed, valmistatakse lahjendused ja tehakse väljakülvid söötmeplaatidele (punkt 4.1).

9.7.   Määratakse kindlaks bakteri R. solanacearum eeldatavad puhastatud kultuurid.

Biotesti tulemuste tõlgendamine

Valiidsed biotesti tulemused saadakse siis, kui positiivsetel kontrolltaimedel on tüüpilised sümptomid, nendest taimedest saab uuesti isoleerida bakterid ja negatiivsetel kontrollidel ei leita sümptomeid.

Biotesti tulemus on negatiivne, kui testtaimed ei ole saastunud R. solanacearum’i kultuuriga, tingimusel et R. solanacearum on avastatud positiivsetes kontrolltaimedes. Biotest on positiivne, kui testtaimed on R. solanacearum’i kultuuriga saastunud.

B.   IDENTIFITSEERIMISANALÜÜSID

Bakteri R. solanacearum eeldatavad puhaskultuurid määratakse kindlaks, kasutades vähemalt kaht järgmistest analüüsidest, mis põhinevad erinevatel bioloogilistel põhimõtetel.

Igasse tehtavasse analüüsi kaasatakse tuntud referenttüved, kui see on asjakohane (vt 3. liide).

1.   Toitumuslikud ja ensümaatilised identifitseerimisanalüüsid

Määratakse järgmised fenotüübilised omadused, mis esinevad või puuduvad bakteril R. solanacearum, kasutades järgmistes allikates kirjeldatud meetodeid: Lelliott ja Stead (1987), Klement et al. (1990), Schaad (2001).

| Analüüs | Oodatav tulemus |
| --- | --- |
| Fluorestseeruv pigment | – |
| Polü-β-hüdroksübutüraadi esinemine | + |
| Oksüdatsiooni/fermentatsioonianalüüs (O/F-analüüs) | O+/F– |
| Katalaasi aktiivsus | + |
| Kovaci oksüdaasianalüüs | + |
| Nitraatide redutseerimine | + |
| Tsitraadi kasutamine | + |
| Kasv 40 °C juures | – |
| Kasv 1 % NaCl-s | + |
| Kasv 2 % NaCl-s | – |
| Arginiini dihüdrolaas | – |
| Želatiini veeldamine | – |
| Tärklise hüdrolüüs | – |
| Aesuliini hüdrolüüs | – |
| Levani tootmine | – |

Analüüs

Oodatav tulemus

Fluorestseeruv pigment

–

Polü-β-hüdroksübutüraadi esinemine

+

Oksüdatsiooni/fermentatsioonianalüüs (O/F-analüüs)

O+/F–

Katalaasi aktiivsus

+

Kovaci oksüdaasianalüüs

+

Nitraatide redutseerimine

+

Tsitraadi kasutamine

+

Kasv 40 °C juures

–

Kasv 1 % NaCl-s

+

Kasv 2 % NaCl-s

–

Arginiini dihüdrolaas

–

Želatiini veeldamine

–

Tärklise hüdrolüüs

–

Aesuliini hüdrolüüs

–

Levani tootmine

–

2.   IF-analüüs

2.1.   Valmistatakse suspensioon, milles on umbes 106 rakku milliliitris IF-puhvris (4. liide).

2.2.   Valmistatakse kohase antiseerumi kahekordsete lahjenduste rida (vt veebileht http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

2.3.   Tehakse IF-analüüs (VI jao punkt A.5).

2.4.   IF-analüüsi tulemus on positiivne siis, kui kultuuri IF-tiiter võrdub positiivse kontrolli tiitriga.

3.   ELISA-analüüs

Märkus: kui kasutatakse vaid kaht määramisanalüüsi, ei tohi lisaks sellele meetodile kasutada teist seroloogilist analüüsi.

3.1.   Valmistatakse suspensioon, milles on umbes 108 rakku milliliitris 1X PBS-puhvris (4. liide).

3.2.   Tehakse sobiv ELISA-analüüs R. solanacearum’i spetsiifilise monoklonaalse antikehaga.

3.3.   ELISA-analüüs on positiivne, kui kultuuri ELISA-analüüsi tulemus on vähemalt pool positiivse kontrolli tulemusest.

4.   PCR-analüüs

4.1.   Valmistatakse suspensioon, milles on umbes 106 rakku milliliitris molekulaarbioloogias kasutatava puhtusastmega steriilses vees.

4.2.   100 μl suletud katseklaasides olevat rakususpensiooni kuumutatakse kuumutusplokil või keevas veevannis 100 °C juures 4 minutit. Seejärel võib proove säilitada –16 kuni –24 °C juures, kuni neid on tarvis.

4.3.   Bakteri R. solanacearum spetsiifiliste amplikonide amplifitseerimiseks tehakse kohane PCR-analüüs (nt Seal et al. (1993, Pastrik ja Maiss (2000), Pastrik et al. (2002), Boudazin et al. (1999), Opina et al. (1997), Weller et al. (1999)).

4.4.   Bakterit R. solanacearum saab positiivselt kindlaks määrata siis, kui PCR-amplikonidel on positiivse kontrolli tüvega sama suurus ja neil esineb sama pikkusega restriktsioonifragmentide polümorfism.

5.   FISH-analüüs

5.1.   Valmistatakse suspensioon, milles on umbes 106 rakku milliliitris ultrapuhtas vees.

5.2.   Tehakse FISH-analüüs (VI jao punkt A.7) vähemalt kahe R. solanacearum-spetsiifilise oligoprooviga (7. liide).

5.3.   FISH-analüüsi tulemus on positiivne siis, kui kultuur ja positiivne kontroll annavad samad reaktsioonid.

6.   Rasvhapete profileerimine (FAP)

6.1.   Kultuuri kasvatatakse trüptikaas-sojaagaril (Oxoid) 48 tundi temperatuuril 28 °C.

6.2.   Tehakse kohane FAP-analüüs (Janse, 1991; Stead, 1992).

6.3.   FAP-analüüsi tulemus on positiivne siis, kui eeldatava kultuuri profiil on identne positiivse kontrolli profiiliga. Tüüpiline rasvhapete esinemine on järgmine: 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH ja 18:1 2OH ning tüüpiline on 16:0 3OH puudumine. Selline profiil osutab suure tõenäosusega bakterile Ralstonia sp.

7.   Tüve iseloomustamise meetodid

R. solanacearum’i iga uue isoleerimisjuhtumi puhul on soovitav kasutada üht järgmistest tüve iseloomustamise meetoditest.

Igasse tehtavasse analüüsi kaasatakse tuntud referenttüved, kui see on asjakohane (vt 3. liide).

7.1.   Biotüübi määramine

R. solanacearum jagatakse biotüüpidesse selle põhjal, kuidas see suudab kasutada ja/või oksüdeerida kolme disahhariidi ja kolme heksoosalkoholi (Hayward, 1964 ja Hayward et al., 1990). Biotüübi kasvusöödet kirjeldatakse 2. liites. Analüüsi saab edukalt teha, inokuleerides söödet R. solanacearum’i puhaskultuuridega ja inkubeerides 28 °C juures. Kui steriilsele 96 auguga rakukultuuri söötmeplaadile (200 μl augu kohta) jaotatud sööde muutub 72 tunni jooksul oliivrohelisest kollaseks, on analüüsi tulemus positiivne.

| | Biotüüp |
| --- | --- |
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Järgmiste ainete kasutamine: | |
| maltoos | – | + | + | – | + |
| laktoos | – | + | + | – | + |
| D (+) tsellobioos | – | + | + | – | + |
| mannitool | – | – | + | + | + |
| sorbitool | – | – | + | + | – |
| dultsitool | – | – | + | + | – |

Biotüüp

1

2

3

4

5

Järgmiste ainete kasutamine:

maltoos

–

+

+

–

+

laktoos

–

+

+

–

+

D (+) tsellobioos

–

+

+

–

+

mannitool

–

–

+

+

+

sorbitool

–

–

+

+

–

dultsitool

–

–

+

+

–

Lisaanalüüsidega eristatakse biotüübi 2 alamfenotüüpe

| | Biotüüp 2A
  (Levinud üle maailma) | Biotüüp 2A
  (Leitud Tšiilis ja Kolumbias) | Biotüüp 2T
  (Leitud troopilistel aladel) |
| --- | --- | --- | --- |
| Trehhaloosi kasutamine | – | + | + |
| Meso-inositooli kasutamine | + | – | + |
| D-riboosi kasutamine | – | – | + |
| Pektolüütiline aktiivsus (1) | madal | madal | kõrge |

Biotüüp 2A

(Levinud üle maailma)

Biotüüp 2A

(Leitud Tšiilis ja Kolumbias)

Biotüüp 2T

(Leitud troopilistel aladel)

Trehhaloosi kasutamine

–

+

+

Meso-inositooli kasutamine

+

–

+

D-riboosi kasutamine

–

–

+

Pektolüütiline aktiivsus (1)

madal

madal

kõrge

7.2.   Genoomse “sõrmejäljendi” võtmine

Haigusetekitaja R. solanacearum liittüvede molekulaarseks eristamiseks võib kasutada erinevaid meetodeid, sealhulgas järgmised.

7.2.1.   Restriktsioonifragmentide pikkuse polümorfismi (RFLP) analüüs (Cook et al., 1989).

7.2.2.   Korduvjärjestusega PCR, kasutades REP, BOX ja ERIC praimereid (Louws et al., 1995; Smith et al., 1995).

7.2.3.   Amplifitseeritud fragmentide pikkuse polümorfismi (AFLP) analüüs (Van der Wolf et al., 1998).

7.3.   PCR-meetodid

Eristamaks tüvesid, mis kuuluvad RFLP analüüsi (Cook et al., 1989) ja 16S rDNA järjestuse määramise (Taghavi et al., 1996) kohaselt R. solanacearum’i 1. (biotüübid 3, 4 ja 5) ja 2. rühma (biotüübid 1, 2A ja 2T), võib kasutada spetsiifilisi PCR-praimerid (Pastrik et al, 2002; vt 6. liide).

C.   KINNITUSANALÜÜS

R. solanacearum’i diagnoosi lõplikuks kinnitamiseks ning R. solanacearum’ina identifitseeritud bakterkultuuri virulentsuse hindamiseks tuleb teha patogeensusanalüüs.

| 1) | Analüüsitava isolaadi 24–28 tunni vanusest isolaadist ja bakteri R. solanacearum kohasest positiivse kontrolli tüvest (nt NCPPB 4156 või PD 2762 või CFBP 3857; vt 3. liide) tehakse inokulaat, milles on umbes 106 rakku milliliitris. |
| --- | --- |

1)

Analüüsitava isolaadi 24–28 tunni vanusest isolaadist ja bakteri R. solanacearum kohasest positiivse kontrolli tüvest (nt NCPPB 4156 või PD 2762 või CFBP 3857; vt 3. liide) tehakse inokulaat, milles on umbes 106 rakku milliliitris.

| 2) | Inokuleeritakse 5–10 tundlikku tomati- või baklažaaniseemikut, millel on välja kasvanud kolmas pärisleht (vt VI jao punkt A.9). |
| --- | --- |

2)

Inokuleeritakse 5–10 tundlikku tomati- või baklažaaniseemikut, millel on välja kasvanud kolmas pärisleht (vt VI jao punkt A.9).

| 3) | Inkubeeritakse kuni kaks nädalat temperatuuril 25–28 °C ning kõrge suhtelise niiskuse juures ja kastetakse parajal määral, et oleks välditud ülekastmine ja kuivamine. Puhaskultuuriga taimedel peaksid tekkima tüüpilised närbumissümptomid 15 päeva jooksul. Kui selle aja jooksul ei ole sümptomeid, ei saa kultuuri pidada R. solanacearum’i patogeenseks vormiks. |
| --- | --- |

3)

Inkubeeritakse kuni kaks nädalat temperatuuril 25–28 °C ning kõrge suhtelise niiskuse juures ja kastetakse parajal määral, et oleks välditud ülekastmine ja kuivamine. Puhaskultuuriga taimedel peaksid tekkima tüüpilised närbumissümptomid 15 päeva jooksul. Kui selle aja jooksul ei ole sümptomeid, ei saa kultuuri pidada R. solanacearum’i patogeenseks vormiks.

| 4) | Jälgitakse närbumise ja/või lehtede keerdumise, kloroosi ja kängumise tundemärke. |
| --- | --- |

4)

Jälgitakse närbumise ja/või lehtede keerdumise, kloroosi ja kängumise tundemärke.

| 5) | Isoleeritakse sümptomitega taimedest, eraldades varreosa umbes 2 cm kõrguselt inokulatsioonipunktist. Purustatakse ja lahustatakse väikeses koguses steriilses destilleeritud vees või 50 mM fosfaatpuhvris (4. liide). Isoleeritakse suspensioonist, lahjendused hõõrutakse spaatliga laiali või tehakse joonkülv sobival söötmel, eelistatavalt selektiivsöötmel (2. liide), inkubeeritakse 48–72 tundi temperatuuril 28 °C ja jälgitakse bakterile R. solanacearum tüüpiliste kolooniate tekkimist. |
| --- | --- |

5)

Isoleeritakse sümptomitega taimedest, eraldades varreosa umbes 2 cm kõrguselt inokulatsioonipunktist. Purustatakse ja lahustatakse väikeses koguses steriilses destilleeritud vees või 50 mM fosfaatpuhvris (4. liide). Isoleeritakse suspensioonist, lahjendused hõõrutakse spaatliga laiali või tehakse joonkülv sobival söötmel, eelistatavalt selektiivsöötmel (2. liide), inkubeeritakse 48–72 tundi temperatuuril 28 °C ja jälgitakse bakterile R. solanacearum tüüpiliste kolooniate tekkimist.

1. liide

Protokollide optimeerimise ja valideerimisega tegelevad laborid

| Labor (2) | Asukoht | Riik |
| --- | --- | --- |
| Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit | Viin ja Linz | Austria |
| Departement Gewasbescherming | Merelbeke | Belgia |
| Plantedirektoratet | Lyngby | Taani |
| Central Science Laboratory | York | Inglismaa |
| Scottish Agricultural Science Agency | Edinburgh | Šotimaa |
| Laboratoire national de la protection des végétaux, Unité de Bactériologie | Angers | Prantsusmaa |
| Laboratoire national de la protection des végétaux, Station de quarantaine de la pomme de terre | Le Rheu | Prantsusmaa |
| Biologische Bundesanstalt | Kleinmachnow | Saksamaa |
| Pflanzenschutzamt Hannover | Hannover | Saksamaa |
| State Laboratory | Dublin | Iirimaa |
| Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali | Bologna | Itaalia |
| Regione Veneto Unità Periferica per i Servizi Fitosanitari | Verona | Itaalia |
| Nederlandse Algemene Keuringsdienst | Emmeloord | Madalmaad |
| Plantenziektenkundige Dienst | Wageningen | Madalmaad |
| Direcção-Geral de Protecção das Culturas | Lissabon | Portugal |
| Centro de Diagnóstico de Aldearrubia | Salamanca | Hispaania |
| Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias | Valencia | Hispaania |
| Swedish University of Agricultural Sciences | Uppsala | Rootsi |

Labor (2)

Asukoht

Riik

Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit

Viin ja Linz

Austria

Departement Gewasbescherming

Merelbeke

Belgia

Plantedirektoratet

Lyngby

Taani

Central Science Laboratory

York

Inglismaa

Scottish Agricultural Science Agency

Edinburgh

Šotimaa

Laboratoire national de la protection des végétaux, Unité de Bactériologie

Angers

Prantsusmaa

Laboratoire national de la protection des végétaux, Station de quarantaine de la pomme de terre

Le Rheu

Prantsusmaa

Biologische Bundesanstalt

Kleinmachnow

Saksamaa

Pflanzenschutzamt Hannover

Hannover

Saksamaa

State Laboratory

Dublin

Iirimaa

Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali

Bologna

Itaalia

Regione Veneto Unità Periferica per i Servizi Fitosanitari

Verona

Itaalia

Nederlandse Algemene Keuringsdienst

Emmeloord

Madalmaad

Plantenziektenkundige Dienst

Wageningen

Madalmaad

Direcção-Geral de Protecção das Culturas

Lissabon

Portugal

Centro de Diagnóstico de Aldearrubia

Salamanca

Hispaania

Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias

Valencia

Hispaania

Swedish University of Agricultural Sciences

Uppsala

Rootsi

2. liide

Söötmed haigusetekitaja R. solanacearum isoleerimiseks ja kultiveerimiseks

a)   Üldised kasvusöötmed

Toiteagar

| Toiteagar (Difco) | 23,0 g |
| --- | --- |
| Destilleeritud vesi | 1,0 l |

Toiteagar (Difco)

23,0 g

Destilleeritud vesi

1,0 l

Ained lahustatakse ja steriliseeritakse autoklaavis 121 °C juures 15 minutit.

Pärmiekstraktiga glükoospeptoonagar (YPGA)

| Pärmiekstrakt (Difco) | 5,0 g |
| --- | --- |
| Bacto-peptoon (Difco) | 5,0 g |
| D(+)-glükoos (monohüdraat) | 10,0 g |
| Bacto-agar (Difco) | 15,0 g |
| Destilleeritud vesi | 1,00 l |

Pärmiekstrakt (Difco)

5,0 g

Bacto-peptoon (Difco)

5,0 g

D(+)-glükoos (monohüdraat)

10,0 g

Bacto-agar (Difco)

15,0 g

Destilleeritud vesi

1,00 l

Ained lahustatakse ja steriliseeritakse autoklaavis 121 °C juures 15 minutit.

Sahharoos-peptoonagar (SPA)

| Sahharoos | 20,0 g |
| --- | --- |
| Bacto-peptoon (Difco) | 5,0 g |
| K2HPO4 | 0,5 g |
| MgSO4.7H2O | 0,25 g |
| Bacto-agar (Difco) | 15,0 g |
| Destilleeritud vesi | 1,0 l |
| pH 7,2–7,4 | |

Sahharoos

20,0 g

Bacto-peptoon (Difco)

5,0 g

K2HPO4

0,5 g

MgSO4.7H2O

0,25 g

Bacto-agar (Difco)

15,0 g

Destilleeritud vesi

1,0 l

pH 7,2–7,4

Ained lahustatakse ja steriliseeritakse autoklaavis 121 °C juures 15 minutit.

Kelmani tetrasooliumsööde

| Kasaminohapped (Difco) | 1,0 g |
| --- | --- |
| Bacto-peptoon (Difco) | 10,0 g |
| Dekstroos | 5,0 g |
| Bacto-agar (Difco) | 15,0 g |
| Destilleeritud vesi | 1,0 l |

Kasaminohapped (Difco)

1,0 g

Bacto-peptoon (Difco)

10,0 g

Dekstroos

5,0 g

Bacto-agar (Difco)

15,0 g

Destilleeritud vesi

1,0 l

Ained lahustatakse ja steriliseeritakse autoklaavis 121 °C juures 15 minutit.

Jahutatakse temperatuurini 50 °C ning läbi steriilse filtri lisatakse 2,3,5-trifenüültetrasooliumkloriidi (Sigma) vesilahust, nii et lõplik kontsentratsioon lahuses on 50 mg/l.

b)   Valideeritud selektiivsed kasvusöötmed

SMSA-sööde (Engelbrecht, 1994, muudetud Elphinstone et al., 1996).

| Põhisööde | |
| --- | --- |
| Kasaminohapped (Difco) | 1,0 g |
| Bacto-peptoon (Difco) | 10,0 g |
| Glütserool | 5,0 ml |
| Bacto-agar (Difco); vt Märkus 2. | 15,0 g |
| Destilleeritud vesi | 1,00 l |

Põhisööde

Kasaminohapped (Difco)

1,0 g

Bacto-peptoon (Difco)

10,0 g

Glütserool

5,0 ml

Bacto-agar (Difco); vt Märkus 2.

15,0 g

Destilleeritud vesi

1,00 l

Ained lahustatakse ja steriliseeritakse autoklaavis 121 °C juures 15 minutit.

Jahutatakse temperatuurini 50 °C ning läbi steriilse filtri lisatakse järgmiste koostisosade põhivesilahust, et saada täpselt määratletud lõppkontsentratsioonid.

| Kristallviolett (Sigma) | 5 mg/l |
| --- | --- |
| Polümüksiin-B-sulfaat | (Sigma P-1004) 600 000 U (ligikaudu 100 mg)/l |
| Batsitratsiin (Sigma B-0125) | 1 250 U (ligikaudu 25 mg)/l |
| Klooramfenikool (Sigma C-3175) | 5 mg/l |
| Penitsiliin-G (Sigma P-3032) | 825 U (ligikaudu 0,5 mg)/l |
| 2,3,5-trifenüültetrasooliumkloriid (Sigma) | 50 mg/l |

Kristallviolett (Sigma)

5 mg/l

Polümüksiin-B-sulfaat

(Sigma P-1004) 600 000 U (ligikaudu 100 mg)/l

Batsitratsiin (Sigma B-0125)

1 250 U (ligikaudu 25 mg)/l

Klooramfenikool (Sigma C-3175)

5 mg/l

Penitsiliin-G (Sigma P-3032)

825 U (ligikaudu 0,5 mg)/l

2,3,5-trifenüültetrasooliumkloriid (Sigma)

50 mg/l

MÄRKUS

| 1. | Muude reaktiivide kasutamine peale ülalloetletute võib mõjutada R. solanacearum’i kasvu. |
| --- | --- |

1.

Muude reaktiivide kasutamine peale ülalloetletute võib mõjutada R. solanacearum’i kasvu.

| 2. | Bacto-agari (Difco) asemel võib kasutada Oxoid-agarit nr 1. Sel juhul on R. solanacearum’i kasv aeglasem, ehkki võib redutseeruda ka võistlevate saprofüütbakterite kasv. R. solanacearum’i tüüpilised kolooniad võivad kujuneda 1–2 päeva hiljem ning punane värvus võib olla heledam ja hajusam kui Bacto-agaril. |
| --- | --- |

2.

Bacto-agari (Difco) asemel võib kasutada Oxoid-agarit nr 1. Sel juhul on R. solanacearum’i kasv aeglasem, ehkki võib redutseeruda ka võistlevate saprofüütbakterite kasv. R. solanacearum’i tüüpilised kolooniad võivad kujuneda 1–2 päeva hiljem ning punane värvus võib olla heledam ja hajusam kui Bacto-agaril.

| 3. | Batsitratsiini kontsentratsiooni suurendamine kuni 2 500 U/l võib vähendada võistlevate bakterite populatsioone, mõjutamata Ralstonia solanacearum’i kasvu. |
| --- | --- |

3.

Batsitratsiini kontsentratsiooni suurendamine kuni 2 500 U/l võib vähendada võistlevate bakterite populatsioone, mõjutamata Ralstonia solanacearum’i kasvu.

Söötmeid ja antibiootikumide põhilahuseid säilitatakse temperatuuril 4 °C pimedas ja kasutatakse kuu aja jooksul.

Söötmeplaatidel pinnal ei tohi enne kasutamist olla kondenseerumist.

Välditakse söötmeplaatide liigset kuivamist.

Pärast iga uue söötmepartii valmistamist tuleb teha kvaliteedikontroll, tehes R. solanacearum’i referentskultuuri väljakülvi söötmeplaadile (vt 3. liide) ja jälgides tüüpiliste kolooniate kujunemist pärast 2–5päevast inkubeerimist temperatuuril 28 °C.

c)   Valideeritud rikastussöötmed

SMSA-puljong (Elphinstone et al., 1996)

Valmistatakse samamoodi kui SMSA-selektiivsööde, kuid jäetakse välja Bacto-agar ja 2,3,5-tetratsooliumkloriid.

Modifitseeritud Wilbrinki puljong (Caruso et al., 2002)

| Sahharoos | 10 g |
| --- | --- |
| Proteoospeptoon | 5 g |
| K2HPO4 | 0,5 g |
| MgSO4 | 0,25 g |
| NaNO3 | 0,25 g |
| Destilleeritud vesi | 1,0 l |

Sahharoos

10 g

Proteoospeptoon

5 g

K2HPO4

0,5 g

MgSO4

0,25 g

NaNO3

0,25 g

Destilleeritud vesi

1,0 l

Steriliseeritakse autoklaavis 121 °C juures 15 minutit ja jahutatakse maha 50 °C.

Lisatakse antibiootilised põhilahused nagu SMSA-puljongi puhul.

3. liide

A.   Müügil olevad standardiseeritud kontrollmaterjalid

a)   Bakterikolooniad

Positiivsete kontrollidena (tabel 1) või analüüside optimeerimisel (tabel 2) soovitatakse ristreaktsioonide vältimiseks kasutada standardse võrdlusmaterjalina järgmisi isoleeritud bakteritüvesid. Kõiki tüvesid saab osta järgmistest kohtadest:

| 1. | National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Central Science Laboratory, York, Ühendkuningriik |
| --- | --- |

1.

National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Central Science Laboratory, York, Ühendkuningriik

| 2. | Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen, Madalmaad |
| --- | --- |

2.

Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen, Madalmaad

| 3. | Collection française de bactéries phytopathogènes (CFBP), INRA – Station de phytobactériologie, Angers, Prantsusmaa |
| --- | --- |

3.

Collection française de bactéries phytopathogènes (CFBP), INRA – Station de phytobactériologie, Angers, Prantsusmaa

Tabel 1.   R. solanacearum’i tüvede SMT viitenumbrid

| NCPPB-kood | SMT
  nr | Muud koodid | Päritoluriik | Biotüüp |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| NCPPB 4153 | 6 | CFBP 4582, Pr 3020, EURS11 | Egiptus | 2 |
| NCPPB 4154 | 10 | CFBP 4585, 550, EURS21 | Türgi | 2 |
| NCPPB 3857 | 12 | CFBP 4587, Pr 1140, EURS26 | Inglismaa | 2 |
| NCPPB 1584 | 23 | CFBP 4598, EURS49 | Küpros | 2 |
| NCPPB 2505 | 24 | CFBP 4599, EURS50 | Rootsi | 2 |
| NCPPB 4155 | 26 | CFBP 4601, 502, EURS55 | Belgia | 2 |
| NCPPB 4156 (3) | 71 (3) | PD 2762, CFBP 3857 | Madalmaad | 2 |
| NCPPB 4157 | 66 | LNPV 15.59 | Prantsusmaa | 2 |
| NCPPB 4158 | 39 | CFBP 4608, Port 448, EURS80, NCPPB 4066 | Portugal | 2 |
| NCPPB 4160 | 69 | IVIA-1632-2 | Hispaania | 2 |
| NCPPB 4161 | 76 | B3B | Saksamaa | 2 |
| NCPPB 325 | 41 | CFBP 2047, KEL60-1, R842 | USA | 1 |
| NCPPB 3967 | 42 | CFBP 4610, R285, GONg7 | Costa Rica | 1 |
| NCPPB 4028 | 43 | CFBP 4611, R303/571, CIP310, SEQ205 | Colombia | 2 |
| NCPPB 3985 | 44 | CFBP 4612, R578, CIP312 | Peruu | 2T |
| NCPPB 3989 | 45 | CFBP 4613, R568, CIP226 | Brasiilia | 2T |
| NCPPB 3996 | 46 | CFBP 3928, R276/355, CIP72, SEQ225 | Peruu | 3 |
| NCPPB 3997 | 47 | CFBP 4614, R280/363, CIP49, HAY0131a | Austraalia | 3 |
| NCPPB 4029 | 48 | CFBP 4615, R297/349, CIP121, CMIb2861 | Sri Lanka | 4 |
| NCPPB 4005 | 49 | CFBP 4616, R470 | Filipiinid | 4 |
| NCPPB 4011 | 50 | CFBP 4617, R288, HEmps2 | Hiina | 5 |

NCPPB-kood

SMT

nr

Muud koodid

Päritoluriik

Biotüüp

NCPPB 4153

6

CFBP 4582, Pr 3020, EURS11

Egiptus

2

NCPPB 4154

10

CFBP 4585, 550, EURS21

Türgi

2

NCPPB 3857

12

CFBP 4587, Pr 1140, EURS26

Inglismaa

2

NCPPB 1584

23

CFBP 4598, EURS49

Küpros

2

NCPPB 2505

24

CFBP 4599, EURS50

Rootsi

2

NCPPB 4155

26

CFBP 4601, 502, EURS55

Belgia

2

NCPPB 4156 (3)

71 (3)

PD 2762, CFBP 3857

Madalmaad

2

NCPPB 4157

66

LNPV 15.59

Prantsusmaa

2

NCPPB 4158

39

CFBP 4608, Port 448, EURS80, NCPPB 4066

Portugal

2

NCPPB 4160

69

IVIA-1632-2

Hispaania

2

NCPPB 4161

76

B3B

Saksamaa

2

NCPPB 325

41

CFBP 2047, KEL60-1, R842

USA

1

NCPPB 3967

42

CFBP 4610, R285, GONg7

Costa Rica

1

NCPPB 4028

43

CFBP 4611, R303/571, CIP310, SEQ205

Colombia

2

NCPPB 3985

44

CFBP 4612, R578, CIP312

Peruu

2T

NCPPB 3989

45

CFBP 4613, R568, CIP226

Brasiilia

2T

NCPPB 3996

46

CFBP 3928, R276/355, CIP72, SEQ225

Peruu

3

NCPPB 3997

47

CFBP 4614, R280/363, CIP49, HAY0131a

Austraalia

3

NCPPB 4029

48

CFBP 4615, R297/349, CIP121, CMIb2861

Sri Lanka

4

NCPPB 4005

49

CFBP 4616, R470

Filipiinid

4

NCPPB 4011

50

CFBP 4617, R288, HEmps2

Hiina

5

Märkus: eelloetletud tüvede autentsus on tagatud vaid siis, kui need saadakse autentsest kultuuride kogust.

Tabel 2.   Määramisanalüüside optimeerimisel kasutatavate seroloogiliselt võigeneetiliselt seotud bakterite SMT viitenumber.

| NCPPB-kood | SMT
  nr | Muu kood | Eristus |
| --- | --- | --- | --- |
| NCPPB 4162 | 51 | CFBP 1954 | Bacillus polymyxa
   (4) |
| NCPPB 4163 | 52 | CFBP 1538 | Pseudomonas marginalis pv. marginalis
   (4) |
| NCPPB 4164 | — | CFBP 2227 | Burkholderia cepacia
   (5) |
| NCPPB 4165 | — | CFBP 2459 | Ralstonia pickettii
   (5) |
| NCPPB 4166 | 58 | CFBP 3567
  CSL Pr1150 | Ralstonia pickettii
   (4) |
| NCPPB 4167 | 60 | CFBP 4618
  PD 2778 | Ralstonia sp. (4) |
| NCPPB 1127 | 53 | CFBP 3575 | Burkholderia andropogonis
   (4) |
| NCPPB 353 | 54 | CFBP 3572 | Burkholderia caryophylli
   (4) |
| NCPPB 945 | 55 | CFBP 3569 | Burkholderia cepacia
   (4) |
| NCPPB 3708 | 56 | CFBP 3574 | Burkholderia glumae
   (4) |
| NCPPB 3590 | 57 | CFBP 3573 | Burkholderia plantarii
   (4) |
| NCPPB 3726 | 59 | CFBP 3568 | Banana Blood Disease Bacterium
   (4)
   (5)
   (6) |
| NCPPB 4168 | 61 | CFBP 4619
  IPO S339 | Enterobacter sp. (4) |
| NCPPB 4169 | 62 | IPO 1695 | Enterobacter sp. (4) |
| NCPPB 4170 | 63 | CFBP 4621
  IPO S306 | Ochrobactrum anthropi
   (4)
   (5) |
| NCPPB 4171 | 64 | CFBP 4622
  IPO 1693 | Curtobacterium sp. (4)
   (5) |
| NCPPB 4172 | 65 | IPO 1696a | Pseudomonas sp. (4) |
| NCPPB 4173 | — | PD 2318 | Aureobacterium sp. (5) |
| NCPPB 4174 | 81 | IVIA 1844.06 | Flavobacterium sp. (4)
   (5) |

NCPPB-kood

SMT

nr

Muu kood

Eristus

NCPPB 4162

51

CFBP 1954

Bacillus polymyxa
   (4)

NCPPB 4163

52

CFBP 1538

Pseudomonas marginalis pv. marginalis
   (4)

NCPPB 4164

—

CFBP 2227

Burkholderia cepacia
   (5)

NCPPB 4165

—

CFBP 2459

Ralstonia pickettii
   (5)

NCPPB 4166

58

CFBP 3567

CSL Pr1150

Ralstonia pickettii
   (4)

NCPPB 4167

60

CFBP 4618

PD 2778

Ralstonia sp. (4)

NCPPB 1127

53

CFBP 3575

Burkholderia andropogonis
   (4)

NCPPB 353

54

CFBP 3572

Burkholderia caryophylli
   (4)

NCPPB 945

55

CFBP 3569

Burkholderia cepacia
   (4)

NCPPB 3708

56

CFBP 3574

Burkholderia glumae
   (4)

NCPPB 3590

57

CFBP 3573

Burkholderia plantarii
   (4)

NCPPB 3726

59

CFBP 3568

Banana Blood Disease Bacterium
   (4)
   (5)
   (6)

NCPPB 4168

61

CFBP 4619

IPO S339

Enterobacter sp. (4)

NCPPB 4169

62

IPO 1695

Enterobacter sp. (4)

NCPPB 4170

63

CFBP 4621

IPO S306

Ochrobactrum anthropi
   (4)
   (5)

NCPPB 4171

64

CFBP 4622

IPO 1693

Curtobacterium sp. (4)
   (5)

NCPPB 4172

65

IPO 1696a

Pseudomonas sp. (4)

NCPPB 4173

—

PD 2318

Aureobacterium sp. (5)

NCPPB 4174

81

IVIA 1844.06

Flavobacterium sp. (4)
   (5)

b)   Müügil olevad standardiseeritud kontrollmaterjalid

Järgmisi standardiseeritud kontrollmaterjale saab NCPPB kultuuride kogust.

200 terve kartulimugula kartuliekstrakti külmkuivatatud kontsentreeritud bakterisade külmutatakse kõikide analüüside negatiivseks kontrolliks.

200 terve kartulimugula kartuliekstrakti külmkuivatatud kontsentreeritud bakterisade, mis sisaldab R. solanacearum’i biotüüp 2 (tüvi NCPPB 4156 või PD 2762 või CFBP 3857) 103 kuni 104 ja 104 kuni 106 rakku seroloogiliste ja PCR-analüüside positiivseks kontrolliks. Kuna külmkuivatamise käigus mõjutatakse rakkude eluvõimelisust, ei sobi need isolatsiooni- ja biotesti standardkontrollideks.

Seroloogiliste analüüside positiivseteks kontrollideks on R. solanacearum’i biotüüp 2 (tüvi NCPPB 4156 või PD 2762 või CFBP 3857) formaliiniga fikseeritud suspensioonid 106 rakku milliliitri kohta.

B.   Positiivsete ja negatiivsete kontrollide valmistamine

Tehakse bakteri R. solanacearum’i rassi 3/biotüübi 2 virulentse tüve (nt tüvi NCPPB 4156 või PD 2762 või CFBP 3857) 48tunnine kultuur SMSA-põhisöötmel ja suspendeeritakse 10 mM fosfaatpuhvris, et saada rakkude tiheduseks umbes 2 × 108 kolooniaid moodustavat osakest milliliitris. See saadakse tavaliselt veidi häguses suspensioonis, mis vastab 0,15 optilisele tihedusele 600 nanomeetris.

Eemaldatakse basaalsed tipusüdamikud 200 mugulalt, mis on pärit valgekoorelise sordi saagist, mille kohta on teada, et selles ei ole bakterit R. solanacearum.

Basaalseid tipusüdamikke töödeldakse tavaliselt ja bakterisade resuspendeeritakse 10 milliliitris.

Valmistatakse 10 steriilset 1,5 ml mikroampulli 900 μl resuspendeeritud bakterisademega.

100 μl bakteri R. solanacearum suspensiooni pannakse esimesse mikroampulli. Loksutatakse vorteksil.

Saastetase määratakse lahjenduste kümnendreaga järgmises viies mikroampullis.

Kuut saastunud mikroampulli kasutatakse positiivsete kontrollidena. Nelja saastumata mikroampulli kasutatakse negatiivsete kontrollidena. Mikroampullid märgistatakse vastavalt.

Steriilsetes 1,5 ml mikroampullides valmistatakse 100 μl alikvoodid ning saadakse seega iga kontrollproovi 9 replikoni. Säilitatakse –16 kuni –24 °C juures kuni kasutamiseni.

Bakteri R. solanacearum olemasolu ja kvantifikatsioon kontrollproovides tuleks esmalt kinnitada IF-analüüsiga.

PCR-analüüsiks ekstraheeritakse DNA positiivsetest ja negatiivsetest kontrollproovidest iga katseproovide seeria puhul.

IF- ja FISH-analüüsideks analüüsitakse positiivseid ja negatiivseid kontrollproove iga analüüsitavate proovide seeria puhul.

IF-, FISH- ja PCR-analüüsides tuleb avastada bakteri R. solanacearum vähemalt 106 ja 104 rakku milliliitris positiivsetes kontrollides ning bakterit ei tohi olla üheski negatiivses kontrollis.

4. liide

Analüüsimenetluste puhvrid

ÜLDNÕUE: avamata steriilseid puhvreid võib säilitada kuni ühe aasta.

1.   Ekstraktsioonimenetluse puhvrid

1.1.   Ekstraktsioonipuhver (50 mM fosfaatpuhver, pH 7,0)

Seda puhvrit kasutatakse bakteri eraldamiseks taimekudedest homogeenimise või loksutamise teel.

| Na2HPO4 (veevaba) | 4,26 g |
| --- | --- |
| KH2PO4 | 2,72 g |
| Destilleeritud vesi | 1,00 l |

Na2HPO4 (veevaba)

4,26 g

KH2PO4

2,72 g

Destilleeritud vesi

1,00 l

Ained lahustatakse, kontrollitakse pH ja steriliseeritakse autoklaavis 121 °C juures 15 minutit.

Võib lisada muid aineid järgmiselt.

| | Eesmärk | Kogus (liitri kohta) |
| --- | --- | --- |
| Lubrol-helbed | Deflokulant (7) | 0,5 g |
| DC-silikooniga vahutamisvastane aine | Vahutamisvastane aine (7) | 1,0 ml |
| Tetranaatriumpürofosfaat | Antioksüdant | 1,0 g |
| Polüvinüülpürrolidoon-40 000 (PVP-40) | PCR-inhibiitorite siduja | 50 g |

Eesmärk

Kogus (liitri kohta)

Lubrol-helbed

Deflokulant (7)

0,5 g

DC-silikooniga vahutamisvastane aine

Vahutamisvastane aine (7)

1,0 ml

Tetranaatriumpürofosfaat

Antioksüdant

1,0 g

Polüvinüülpürrolidoon-40 000 (PVP-40)

PCR-inhibiitorite siduja

50 g

1.2.   Bakterisademe puhver (10 mM fosfaatpuhver, pH 7,2)

Seda puhvrit kasutatakse kartulimugula basaalsete tipusüdamike ekstraktide resuspendeerimiseks pärast kontsentreerimist bakterisademeks tsentrifuugimise teel.

| Na2HPO4.12H2O | 2,7 g |
| --- | --- |
| NaH2PO4.2H2O | 0,4 g |
| Destilleeritud vesi | 1,00 l |

Na2HPO4.12H2O

2,7 g

NaH2PO4.2H2O

0,4 g

Destilleeritud vesi

1,00 l

Ained lahustatakse, kontrollitakse pH ja steriliseeritakse autoklaavis 121 °C juures 15 minutit.

2.   IF-analüüsi puhvrid

2.1.   IF-puhver (10 mM fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahus (PBS), pH 7,2)

Seda puhvrit kasutatakse antikehade lahjendamiseks.

| Na2HPO4.12H2O | 2,7 g |
| --- | --- |
| NaH2PO4.2H2O | 0,4 g |
| NaCl | 8,0 g |
| Destilleeritud vesi | 1,00 l |

Na2HPO4.12H2O

2,7 g

NaH2PO4.2H2O

0,4 g

NaCl

8,0 g

Destilleeritud vesi

1,00 l

Ained lahustatakse, kontrollitakse pH ja steriliseeritakse autoklaavis 121 °C juures 15 minutit.

2.2.   IF-puhver Tweeniga

Seda puhvrit kasutatakse objektiklaaside pesemiseks.

IF-puhvrile lisatakse 0,1 % Tween 20.

2.3.   Fosfaatpuhvri lisandiga glütserool, pH 7,6

Seda puhvrit kasutatakse kattevedelikuna fluorestseerumise suurendamiseks IF-objektiklaaside aknaväljades.

| Na2HPO4.12H2O | 3,2 g |
| --- | --- |
| NaH2PO4.2H2O | 0,15 g |
| Glütserool | 50 ml |
| Destilleeritud vesi | 100 ml |

Na2HPO4.12H2O

3,2 g

NaH2PO4.2H2O

0,15 g

Glütserool

50 ml

Destilleeritud vesi

100 ml

Pleekimisvastased kattevedelikud on müügil, näiteks Vectashield® (Vector Laboratories) või Citifluor® (Leica).

3.   Kaudse ELISA-analüüsi puhvrid

3.1.   Kahekordne kattepuhver, pH 9,6

| Na2CO3 | 6,36 g |
| --- | --- |
| NaHCO3 | 11,72 g |
| Destilleeritud vesi | 1,00 l |

Na2CO3

6,36 g

NaHCO3

11,72 g

Destilleeritud vesi

1,00 l

Ained lahustatakse, kontrollitakse pH ja steriliseeritakse autoklaavis 121 °C juures 15 minutit.

Antioksüdandina võib lisada naatriumsulfitit (0,2 %), et vältida oksüdeerunud aromaatsete ühendite tekkimist.

3.2.   10 X fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahus (PBS), pH 7,4

| NaCl | 80,0 g |
| --- | --- |
| KH2PO4 | 2,0 g |
| Na2HPO4.12H2O | 29,0 g |
| KCl | 2,0 g |
| Destilleeritud vesi | 1,00 l |

NaCl

80,0 g

KH2PO4

2,0 g

Na2HPO4.12H2O

29,0 g

KCl

2,0 g

Destilleeritud vesi

1,00 l

3.3.   PBS-Tween

| 10 X PBS | 100 ml |
| --- | --- |
| 10 % Tween 20 | 5 ml |
| Destilleeritud vesi | 895 ml |

10 X PBS

100 ml

10 % Tween 20

5 ml

Destilleeritud vesi

895 ml

3.4.   Blokeeriv (antikeha) puhver (puhver tuleb valmistada vahetult enne töö alustamist)

| 10 X PBS | 10,0 ml |
| --- | --- |
| Polüvinüülpürrolidoon-44 000 (PVP-44) | 2,0 g |
| 10 % Tween 20 | 0,5 ml |
| Piimapulber | 0,5 g |
| Destilleeritud vesi | Täiendatakse 100 ml-ni |

10 X PBS

10,0 ml

Polüvinüülpürrolidoon-44 000 (PVP-44)

2,0 g

10 % Tween 20

0,5 ml

Piimapulber

0,5 g

Destilleeritud vesi

Täiendatakse 100 ml-ni

3.5.   Leeliseline fosfataassubstraadi lahus, pH 9,8

| Dietanoolamiin | 97 ml |
| --- | --- |
| Destilleeritud vesi | 800 ml |

Dietanoolamiin

97 ml

Destilleeritud vesi

800 ml

Segatakse ja kontsentreeritud HCl-ga reguleeritakse pH 9,8ni.

Maht täiendatakse destilleeritud veega 1 liitrini.

Lisatakse 0,2 g MgCl2.

Kaks fosfataassubstraadi 5 mg tabletti (Sigma) lahustatakse 15 ml lahuses.

4.   DASI ELISA analüüsi puhvrid

4.1.   Kattepuhver, pH 9,6

| Na2CO3 | 1,59 g |
| --- | --- |
| NaHCO3 | 2,93 g |
| Destilleeritud vesi | 1 000 ml |

Na2CO3

1,59 g

NaHCO3

2,93 g

Destilleeritud vesi

1 000 ml

Ained lahustatakse ja kontrollitakse pH 9,6.

4.2.   10 X fosfaatpuhvri lisandiga keedusoolalahus (PBS), pH 7,2–7,4

| NaCl | 80,0 g |
| --- | --- |
| NaH2PO4.2 H2O | 4,0 g |
| Na2HPO4.12H2O | 27,0 g |
| Destilleeritud vesi | 1 000 ml |

NaCl

80,0 g

NaH2PO4.2 H2O

4,0 g

Na2HPO4.12H2O

27,0 g

Destilleeritud vesi

1 000 ml

4.3.   PBS-Tween

| 10 X PBS | 50 ml |
| --- | --- |
| 10 % Tween 20 | 5 ml |
| Destilleeritud vesi | 950 ml |

10 X PBS

50 ml

10 % Tween 20

5 ml

Destilleeritud vesi

950 ml

4.4.   Substraatpuhver, pH 9,8

| Dietanoolamiin | 100 ml |
| --- | --- |
| Destilleeritud vesi | 900 ml |

Dietanoolamiin

100 ml

Destilleeritud vesi

900 ml

Segatakse ja kontsentreeritud HCl-ga reguleeritakse pH 9,8ni.

5. liide

Bakterite koguse määramine IF-ja FISH-analüüsides

| 1. | Loendatakse keskmine tüüpiliste fluorestseeruvate rakkude arv välja kohta (c). |
| --- | --- |

1.

Loendatakse keskmine tüüpiliste fluorestseeruvate rakkude arv välja kohta (c).

| 2. | Arvutatakse tüüpiliste fluorestseeruvate rakkude arv objektiklaasi akna kohta (C).
  C = c × S/s








  kus | S | = | mitmekohalise objektiklaasi aknavälja pindala |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| ja | s | = | objektiivi pindala |

2.

Arvutatakse tüüpiliste fluorestseeruvate rakkude arv objektiklaasi akna kohta (C).

C = c × S/s

kus

S

=

mitmekohalise objektiklaasi aknavälja pindala

ja

s

=

objektiivi pindala

| s = πi2/4G2K2 | kus | i | = | välja koefitisient (sõltub okulaari tüübist ja on 8-24) |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| | | K | = | toru koefitsient (1 või 1,25) |
| | | G | = | objektiivi suurendus (100 korda, 40 korda jne). |

s = πi2/4G2K2

kus

i

=

välja koefitisient (sõltub okulaari tüübist ja on 8-24)

K

=

toru koefitsient (1 või 1,25)

G

=

objektiivi suurendus (100 korda, 40 korda jne).

| 3. | Arvutatakse tüüpiliste fluorestseeruvate rakkude arv milliliitri resuspendeeritud bakterisademe kohta (N).
  N = C × 1 000/y × F








  kus | y | = | resuspendeeritud bakterisademe maht igas aknas |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| ja | F | = | resuspendeeritud bakterisademe lahjendustegur. |

3.

Arvutatakse tüüpiliste fluorestseeruvate rakkude arv milliliitri resuspendeeritud bakterisademe kohta (N).

N = C × 1 000/y × F

kus

y

=

resuspendeeritud bakterisademe maht igas aknas

ja

F

=

resuspendeeritud bakterisademe lahjendustegur.

6. liide

Valideeritud PCR-protokollid ja -reaktiivid

Märkus: eelanalüüsid peaksid võimaldama reprodutseeritavalt avastada vähemalt 103 kuni 104 bakteri R. solanacearum rakku prooviekstrakti milliliitris.

Eelanalüüsid ei tohiks anda valepositiivseid tulemusi valitud bakteritüvedega (vt 3. liide).

1.   PCR-protokoll, Seal et al. (1993)

1.1.   Oligonukleotiidpraimerid

| Päripidine praimer OLI-1 | 5′-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3′ |
| --- | --- |
| Äraspidine praimer Y-2 | 5′-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3′ |

Päripidine praimer OLI-1

5′-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3′

Äraspidine praimer Y-2

5′-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3′

Bakteri R. solanacearum maatriks-DNA eeldatav amplikonipikkus on 288 aluspaari.

1.2.   PCR-reaktsioonisegu

| Reaktiiv | Kogus reaktsiooni kohta | Lõppkontsentratsioon |
| --- | --- | --- |
| Steriilne ultrapuhas vesi | 17,65 μl | |
| 10X PCR puhver (8) (15 mM MgCl2) | 2,5 μl | 1X (1,5 mM MgCl2) |
| dNTP-segu (20 mM) | 0,25 μl | 0,2 mM |
| Praimer OLI-1 (20 μM) | 1,25 μl | 1 μM |
| Praimer Y-2 (20 μM) | 1,25 μl | 1 μM |
| Taq-polümeraas (5 U/μl) (8) | 0,1 μl | 0,5 U |
| Proovi maht | 2,0 μl | |
| Kogumaht | 25 μl | |

Reaktiiv

Kogus reaktsiooni kohta

Lõppkontsentratsioon

Steriilne ultrapuhas vesi

17,65 μl

10X PCR puhver (8) (15 mM MgCl2)

2,5 μl

1X (1,5 mM MgCl2)

dNTP-segu (20 mM)

0,25 μl

0,2 mM

Praimer OLI-1 (20 μM)

1,25 μl

1 μM

Praimer Y-2 (20 μM)

1,25 μl

1 μM

Taq-polümeraas (5 U/μl) (8)

0,1 μl

0,5 U

Proovi maht

2,0 μl

Kogumaht

25 μl

1.3.   PCR-reaktsiooni tingimused

Järgitakse järgmist menetlust:

| 1 tsükkel: | i) | 2 minutit 96 °C juures (maatriks-DNA denaturatsioon) |
| --- | --- | --- |
| 35 tsüklit: | ii) | 20 sekundit 94 °C juures (maatriks-DNA denaturatsioon) |
| | iii) | 20 sekundit 68 °C juures (praimerite anniilimine) |
| | iv) | 30 sekundit 72 °C juures (koopia ekstensioon) |
| 1 tsükkel: | v) | 10 minutit 72 °C juures (lõplik ekstensioon) |
| | vi) | hoitakse 4 °C juures. |

1 tsükkel:

i)

2 minutit 96 °C juures (maatriks-DNA denaturatsioon)

35 tsüklit:

ii)

20 sekundit 94 °C juures (maatriks-DNA denaturatsioon)

iii)

20 sekundit 68 °C juures (praimerite anniilimine)

iv)

30 sekundit 72 °C juures (koopia ekstensioon)

1 tsükkel:

v)

10 minutit 72 °C juures (lõplik ekstensioon)

vi)

hoitakse 4 °C juures.

Märkus: see programm optimeeriti termotsükleri Perkin Elmer 9600 kasutamiseks. Muude mudelite kasutamisel võib olla vaja muuta tsüklite ii, iii ja iv kestust.

1.4.   Amplikoni restriktsioonensüümi analüüs

Bakteri R. solanacearum DNAst amplifitseeritud PCR-produktid võivad ensüümiga Ava II anda tüüpilise pikkusega restriktsioonifragmentide polümorfismi, kui neid on inkubeeritud 37 °C juures.

2.   PCR-protokoll, Pastrik ja Maiss (2000)

2.1.   Oligonukleotiidpraimerid

| Päripidine praimer Ps-1 | 5′- agt cga acg gca gcg ggg g -3′ |
| --- | --- |
| Äraspidine praimer Ps-2 | 5′- ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca -3′ |

Päripidine praimer Ps-1

5′- agt cga acg gca gcg ggg g -3′

Äraspidine praimer Ps-2

5′- ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca -3′

Bakteri R. solanacearum maatriks-DNA eeldatav amplikonipikkus on 553 aluspaari.

2.2.   PCR-reaktsioonisegu

| Reaktiiv | Kogus reaktsiooni kohta | Lõppkontsentratsioon |
| --- | --- | --- |
| Steriilne ultrapuhas vesi | 16,025 μl | |
| 10X PCR puhver (9) | 2,5 μl | 1X (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (fraktsioon V) (10 %) | 0,25 μl | 0,1 % |
| dNTP-segu (20 mM) | 0,125 μl | 0,1 mM |
| Praimer Ps-1 (10 μM) | 0,5 μl | 0,2 μM |
| Praimer Ps-2 (10 μM) | 0,5 μl | 0,2 μM |
| Taq-polümeraas (5 U/μl) (9) | 0,1 μl | 0,5 U |
| Proovi maht | 5,0 μl | |
| Kogumaht | 25,0 μl | |
| Märkus: Algselt optimeeritud kasutamiseks Gibco Taq-polümeraasiga termotsükleris MJ Research PTC 200.
  Kasutada võib ka Perkin Elmer AmpliTaqi ja puhvrit samades kontsentratsioonides. |

Reaktiiv

Kogus reaktsiooni kohta

Lõppkontsentratsioon

Steriilne ultrapuhas vesi

16,025 μl

10X PCR puhver (9)

2,5 μl

1X (1,5 mM MgCl2)

BSA (fraktsioon V) (10 %)

0,25 μl

0,1 %

dNTP-segu (20 mM)

0,125 μl

0,1 mM

Praimer Ps-1 (10 μM)

0,5 μl

0,2 μM

Praimer Ps-2 (10 μM)

0,5 μl

0,2 μM

Taq-polümeraas (5 U/μl) (9)

0,1 μl

0,5 U

Proovi maht

5,0 μl

Kogumaht

25,0 μl

Märkus: Algselt optimeeritud kasutamiseks Gibco Taq-polümeraasiga termotsükleris MJ Research PTC 200.

Kasutada võib ka Perkin Elmer AmpliTaqi ja puhvrit samades kontsentratsioonides.

2.3.   PCR-reaktsiooni tingimused

Järgitakse järgmist menetlust:

| 1 tsükkel: | i) | 5 minutit 95 °C juures (maatriks-DNA denaturatsioon) |
| --- | --- | --- |
| 35 tsüklit: | ii) | 30 sekundit 95 °C juures (maatriks-DNA denaturatsioon) |
| | iii) | 30 sekundit 68 °C juures (praimerite anniilimine) |
| | iv) | 45 sekundit 72 °C juures (koopia ekstensioon) |
| 1 tsükkel: | v) | 5 minutit 72 °C juures (lõplik ekstensioon) |
| | vi) | hoitakse 4 °C juures. |

1 tsükkel:

i)

5 minutit 95 °C juures (maatriks-DNA denaturatsioon)

35 tsüklit:

ii)

30 sekundit 95 °C juures (maatriks-DNA denaturatsioon)

iii)

30 sekundit 68 °C juures (praimerite anniilimine)

iv)

45 sekundit 72 °C juures (koopia ekstensioon)

1 tsükkel:

v)

5 minutit 72 °C juures (lõplik ekstensioon)

vi)

hoitakse 4 °C juures.

Märkus: programm on optimeeritud kasutamiseks termotsükleriga MJ Research PTC 200. Muude mudelite kasutamisel võib olla vaja muuta tsüklite ii, iii ja iv kestust.

2.4.   Amplikoni restriktsioonensüümi analüüs

Bakteri R. solanacearum DNAst amplifitseeritud PCR-produktid võivad ensüümiga Taq I anda tüüpilise pikkusega restriktsioonifragmentide polümorfismi, kui neid on inkubeeritud 65 °C juures 30 minutit. Bakterile R. solanacearum tüüpilisest fragmendist saadud restriktsioonifragmentide pikkus on 457 ja 96 aluspaari.

3.   Mitmeetapiline PCR-protokoll sisemise PCR-kontrolliga (Pastrik et al., 2002)

3.1.   Oligonukleotiidpraimerid

| Päripidine praimer Rs-1-F | 5′- ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA -3′ |
| --- | --- |
| Äraspidine praimer Rs-1-R | 5′- CCC AGT CAC GGC AGA GAC T -3′ |
| Päripidine praimer Ns-5-F | 5′- AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G -3′ |
| Äraspidine praimer Ns-6-R | 5′- GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC -3′ |

Päripidine praimer Rs-1-F

5′- ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA -3′

Äraspidine praimer Rs-1-R

5′- CCC AGT CAC GGC AGA GAC T -3′

Päripidine praimer Ns-5-F

5′- AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G -3′

Äraspidine praimer Ns-6-R

5′- GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC -3′

Bakteri R. solanacearum maatriks-DNA eeldatav amplikonipikkus on 718 aluspaari (Rs-praimerite komplekt)

18S rRNA sisemise PCR-kontrolli eeldatav amplikonipikkus on 310 aluspaari (Ns-praimerite komplekt)

3.2.   PCR-reaktsioonisegu

| Reaktiiv | Kogus reaktsiooni kohta | Lõppkontsentratsioon |
| --- | --- | --- |
| Steriilne ultrapuhas vesi | 12,625 μl | |
| 10X PCR-puhver (10) (15 mM MgCl2) | 2,5 μl | 1X (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (fraktsioon V) (10 %) | 0,25 μl | 0,1 % |
| dNTP-segu (20 mM) | 0,125 μl | 0,1 mM |
| Praimer Rs-1-F (10 μM) | 2,0 μl | 0,8 μM |
| Praimer Rs-1-R (10 μM) | 2,0 μl | 0,8 μM |
| Praimer Ns-5-F (10 μM) (11) | 0,15 μl | 0,06 μM |
| Praimer Ns-6-F (10 μM) (11) | 0,15 μl | 0,06 μM |
| Taq-polümeraas (5 U/μl) (10) | 0,2 μl | 1,0 U |
| Proovi maht | 5,0 μl | |
| Kogumaht | 25,0 μl | |

Reaktiiv

Kogus reaktsiooni kohta

Lõppkontsentratsioon

Steriilne ultrapuhas vesi

12,625 μl

10X PCR-puhver (10) (15 mM MgCl2)

2,5 μl

1X (1,5 mM MgCl2)

BSA (fraktsioon V) (10 %)

0,25 μl

0,1 %

dNTP-segu (20 mM)

0,125 μl

0,1 mM

Praimer Rs-1-F (10 μM)

2,0 μl

0,8 μM

Praimer Rs-1-R (10 μM)

2,0 μl

0,8 μM

Praimer Ns-5-F (10 μM) (11)

0,15 μl

0,06 μM

Praimer Ns-6-F (10 μM) (11)

0,15 μl

0,06 μM

Taq-polümeraas (5 U/μl) (10)

0,2 μl

1,0 U

Proovi maht

5,0 μl

Kogumaht

25,0 μl

3.3.   PCR-reaktsiooni tingimused

Järgitakse järgmist menetlust:

| 1 tsükkel: | i) | 5 minutit 95 °C juures (maatriks-DNA denaturatsioon) |
| --- | --- | --- |
| 35 tsüklit: | ii) | 30 sekundit 95 °C juures (maatriks-DNA denaturatsioon) |
| | iii) | 30 sekundit 58 °C juures (praimerite anniilimine) |
| | iv) | 45 sekundit 72 °C juures (koopia ekstensioon) |
| 1 tsükkel: | v) | 5 minutit 72 °C juures (lõplik ekstensioon) |
| | vi) | hoitakse 4 °C juures |

1 tsükkel:

i)

5 minutit 95 °C juures (maatriks-DNA denaturatsioon)

35 tsüklit:

ii)

30 sekundit 95 °C juures (maatriks-DNA denaturatsioon)

iii)

30 sekundit 58 °C juures (praimerite anniilimine)

iv)

45 sekundit 72 °C juures (koopia ekstensioon)

1 tsükkel:

v)

5 minutit 72 °C juures (lõplik ekstensioon)

vi)

hoitakse 4 °C juures

Märkus: programm on optimeeritud kasutamiseks termotsükleriga MJ Research PTC 200. Muude mudelite kasutamisel võib olla vaja muuta tsüklite ii, iii ja iv kestust.

3.4.   Amplikoni restriktsioonensüümi analüüs

Bakteri R. solanacearum DNAst amplifitseeritud PCR-produktid võivad ensüümiga Bsm I või isoskisomeeriga (nt Mva 1269 I) anda tüüpilise pikkusega restriktsioonifragmentide polümorfismi, kui neid on inkubeeritud 65 °C juures 30 minutit.

4.   R. solanacearum′i biotüübispetsiifiline PCR-protokoll (Pastrik et al., 2001)

4.1.   Oligonukleotiidpraimerid

| Päripidine praimer Rs-1-F | 5′- ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA -3′ |
| --- | --- |
| Äraspidine praimer Rs-1-R | 5′- CCC AGT CAC GGC AGA GAC T -3′ |
| Äraspidine praimer Rs-3-R | 5′- TTC ACG GCA AGA TCG CTC -3′ |

Päripidine praimer Rs-1-F

5′- ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA -3′

Äraspidine praimer Rs-1-R

5′- CCC AGT CAC GGC AGA GAC T -3′

Äraspidine praimer Rs-3-R

5′- TTC ACG GCA AGA TCG CTC -3′

Bakteri R. solanacearum maatriks-DNA eeldatav amplikonipikkus:

praimeriga Rs-1-F/Rs-1-R on 718 aluspaari

praimeriga Rs-1-F/Rs-3-R on 716 aluspaari

4.2.   PCR-reaktsioonisegu

| a) | Biotüübi 1/2 spetsiifiline PCR







  Reaktiiv | Kogus reaktsiooni kohta | Lõppkontsentratsioon |
| --- | --- | --- | --- |
| Steriilne ultrapuhas vesi | 12,925 μl | |
| 10X PCR-puhver (12) | 2,5 μl | 1X (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (fraktsioon V) (10 %) | 0,25 μl | 0,1 % |
| dNTP-segu (20 mM) | 0,125 μl | 0,1 mM |
| Praimer Rs-1-F (10 μM) | 2 μl | 0,8 μM |
| Praimer Rs-1-R (10 μM) | 2 μl | 0,8 μM |
| Taq-polümeraas (5 U/μl) (12) | 0,2 μl | 1 U |
| Proovi maht | 5,0 μl | |
| Kogumaht | 25,0 μl | |

a)

Biotüübi 1/2 spetsiifiline PCR

Reaktiiv

Kogus reaktsiooni kohta

Lõppkontsentratsioon

Steriilne ultrapuhas vesi

12,925 μl

10X PCR-puhver (12)

2,5 μl

1X (1,5 mM MgCl2)

BSA (fraktsioon V) (10 %)

0,25 μl

0,1 %

dNTP-segu (20 mM)

0,125 μl

0,1 mM

Praimer Rs-1-F (10 μM)

2 μl

0,8 μM

Praimer Rs-1-R (10 μM)

2 μl

0,8 μM

Taq-polümeraas (5 U/μl) (12)

0,2 μl

1 U

Proovi maht

5,0 μl

Kogumaht

25,0 μl

| b) | Biotüübi 3/4/5 spetsiifiline PCR







  Reaktiiv | Kogus reaktsiooni kohta | Lõppkontsentratsioon |
| --- | --- | --- | --- |
| Steriilne ultrapuhas vesi | 14,925 μl | |
| 10X PCR puhver (13) | 2,5 μl | 1X (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (fraktsioon V) (10 %) | 0,25 μl | 0,1 % |
| dNTP-segu (20 mM) | 0,125 μl | 0,1 mM |
| Praimer Rs-1-F (10 μM) | 1 μl | 0,4 μM |
| Praimer Rs-3-R (10 μM) | 1 μl | 0,4 μM |
| Taq-polümeraas (5 U/μl) (13) | 0,2 μl | 1 U |
| Proovi maht | 5,0 μl | |
| Kogumaht | 25,0 μl | |

b)

Biotüübi 3/4/5 spetsiifiline PCR

Reaktiiv

Kogus reaktsiooni kohta

Lõppkontsentratsioon

Steriilne ultrapuhas vesi

14,925 μl

10X PCR puhver (13)

2,5 μl

1X (1,5 mM MgCl2)

BSA (fraktsioon V) (10 %)

0,25 μl

0,1 %

dNTP-segu (20 mM)

0,125 μl

0,1 mM

Praimer Rs-1-F (10 μM)

1 μl

0,4 μM

Praimer Rs-3-R (10 μM)

1 μl

0,4 μM

Taq-polümeraas (5 U/μl) (13)

0,2 μl

1 U

Proovi maht

5,0 μl

Kogumaht

25,0 μl

4.3.   PCR-reaktsiooni tingimused

Nii biotüübi 1/2 kui ka 3/4/5 spetsiifiliste reaktsioonide puhul järgitakse järgmist menetlust:

| 1 tsükkel: | i) | 5 minutit 95 °C juures (maatriks-DNA denaturatsioon) |
| --- | --- | --- |
| 35 tsüklit: | ii) | 30 sekundit 95 °C juures (maatriks-DNA denaturatsioon) |
| | iii) | 30 sekundit 58 °C juures (praimerite anniilimine) |
| | iv) | 45 sekundit 72 °C juures (koopia ekstensioon) |
| 1 tsükkel: | v) | 5 minutit 72 °C juures (lõplik ekstensioon) |
| | vi) | hoitakse 4 °C juures |

1 tsükkel:

i)

5 minutit 95 °C juures (maatriks-DNA denaturatsioon)

35 tsüklit:

ii)

30 sekundit 95 °C juures (maatriks-DNA denaturatsioon)

iii)

30 sekundit 58 °C juures (praimerite anniilimine)

iv)

45 sekundit 72 °C juures (koopia ekstensioon)

1 tsükkel:

v)

5 minutit 72 °C juures (lõplik ekstensioon)

vi)

hoitakse 4 °C juures

Märkus: programm optimeeriti kasutamiseks termotsükleriga MJ Research PTC 200. Muude mudelite kasutamisel võib olla vaja muuta tsüklite ii, iii ja iv kestust.

4.4.   Amplikoni restriktsioonensüümi analüüs

Bakteri R. solanacearum DNAst praimeritega Rs-1-F ja Rs-1-R amplifitseeritud PCR-produktid võivad ensüümiga Bsm I või isoskisomeeriga (nt Mva 1269 I) anda tüüpilise pikkusega restriktsioonifragmentide polümorfismi, kui neid on inkubeeritud 65 °C juures 30 minutit. Bakteri R. solanacearum DNAst praimeritega Rs-1-F ja Rs-3-R amplifitseeritud PCR-produktidel ei ole restriktsioonikohti.

5.   Täitepuhvri valmistamine

5.1.   Bromofenoolsisnine (10 % põhilahus)

| Bromofenoolsinine | 5 g |
| --- | --- |
| Kaks korda destilleeritud vesi | 50 ml |

Bromofenoolsinine

5 g

Kaks korda destilleeritud vesi

50 ml

5.2.   Täitepuhver

| Glütserool (86 %) | 3,5 ml |
| --- | --- |
| Bromofenoolsinine (5.1) | 300 μl |
| Kaks korda destilleeritud vesi | 6,2 ml |

Glütserool (86 %)

3,5 ml

Bromofenoolsinine (5.1)

300 μl

Kaks korda destilleeritud vesi

6,2 ml

6.   10 X trisatsetaat EDTA puhver, pH 8,0

| Tris-puhver | 48,40 g |
| --- | --- |
| Jää-äädikas | 11,42 ml |
| EDTA (dinaatriumsool) | 3,72 g |
| Destilleeritud vesi | 1,00 l |

Tris-puhver

48,40 g

Jää-äädikas

11,42 ml

EDTA (dinaatriumsool)

3,72 g

Destilleeritud vesi

1,00 l

Enne kasutamist lahjendatakse üks kord.

On ka müügil (näiteks Invitrogen või samaväärne).

7. liide

FISH-analüüsi valideeritud reaktiivid

1.   Oligoproovid

R. solanacearum-spetsiifiline oligoproov OLI-1-CY3 5′- ggc agg tag caa gct acc ccc-3′

Mittespetsiifiline eubakteriaalne oligoproov EUB-338-FITC 5′- gct gcc tcc cgt agg agt-3′

2.   Kinnitilahus

(HOIATUS! KINNITI SISALDAB PARAFORMALDEHÜÜDI, MIS ON MÜRGINE. TULEB KANDA KINDAID, AINET EI TOHI SISSE HINGATA. ON SOOVITAV TÖÖTADA TÕMBEKAPIS.)

| i) | 9 ml molekulaarbioloogias kasutatavat vett (näiteks ultrapuhast vett) kuumutatakse umbes 60 °C ja lisatakse 0,4 g paraformaldehüüdi. Paraformaldehüüd lahustub pärast seda, kui on lisatud 5 tilka 1N NaOH ja segatud magnetsegajaga. |
| --- | --- |

i)

9 ml molekulaarbioloogias kasutatavat vett (näiteks ultrapuhast vett) kuumutatakse umbes 60 °C ja lisatakse 0,4 g paraformaldehüüdi. Paraformaldehüüd lahustub pärast seda, kui on lisatud 5 tilka 1N NaOH ja segatud magnetsegajaga.

| ii) | pH reguleeritakse 7,0, lisades 1 ml 0,1 M fosfaatpuhvrit (PB; pH 7,0) ja 5 tilka 1N HCl. pH-d kontrollitakse indikaatorribadega ja vajaduse korral reguleeritakse HCl või NaOH-ga. (HOIATUS! PARAFORMALDEHÜÜDI LAHUSTE PUHUL EI TOHI KASUTADA PH-MEETRIT.) |
| --- | --- |

ii)

pH reguleeritakse 7,0, lisades 1 ml 0,1 M fosfaatpuhvrit (PB; pH 7,0) ja 5 tilka 1N HCl. pH-d kontrollitakse indikaatorribadega ja vajaduse korral reguleeritakse HCl või NaOH-ga. (HOIATUS! PARAFORMALDEHÜÜDI LAHUSTE PUHUL EI TOHI KASUTADA PH-MEETRIT.)

| iii) | Lahus filtreeritakse läbi 0,22 μm membraanfiltri ja säilitatakse edasiseks kasutamiseks tolmuvabalt 4 °C juures. |
| --- | --- |

iii)

Lahus filtreeritakse läbi 0,22 μm membraanfiltri ja säilitatakse edasiseks kasutamiseks tolmuvabalt 4 °C juures.

3.   3 X Hybmix-lahus

| NaCl | 2,7 M |
| --- | --- |
| Tris-HCl | 60 mM (pH 7,4) |
| EDTA (filter-steriliseeritud ja autoklaavitud) | 15 mM |

NaCl

2,7 M

Tris-HCl

60 mM (pH 7,4)

EDTA (filter-steriliseeritud ja autoklaavitud)

15 mM

Lahjendatakse üks kord vastavalt vajadusele.

4.   Hübridisatsioonilahus

| 1 X Hybmix-lahus | |
| --- | --- |
| Naatriumdodetsüülsulfaat | 0,01 % |
| Formamiid | 30 % |
| Oligoproov EUB 338 | 5 ng/μl |
| Oligoproov OLI-1 või OLI-2 | 5 ng/μl |

1 X Hybmix-lahus

Naatriumdodetsüülsulfaat

0,01 %

Formamiid

30 %

Oligoproov EUB 338

5 ng/μl

Oligoproov OLI-1 või OLI-2

5 ng/μl

Hübridisatsioonilahused valmistatakse vastavalt tabelis 1 arvutatud kogustele. Iga objektiklaasi jaoks (millel on kaks erinevat proovi kaks korda) on tarvis 90 μl hübridisatsioonilahust. TÄHTIS! FORMAMIID ON VÄGA MÜRGINE, SEETÕTTU TULEB KANDA KINDAID JA RAKENDADA VAJALIKKE ETTEVAATUSABINÕUSID!

Tabel.   Hübridisatsioonisegu valmistamiseks soovitatavad kogused

| Objektiklaaside hulk | 1 | 4 | 6 | 8 | 10 |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Steriilne ultrapuhas vesi | 23,1 | 92,4 | 138,6 | 184,8 | 231,0 |
| 3 X Hybmix-lahus | 30,0 | 120,0 | 180,0 | 240,0 | 300,0 |
| 1 % SDS | 0,9 | 3,6 | 5,4 | 7,2 | 9,0 |
| Formamiid | 27,0 | 108,0 | 162,0 | 216,0 | 270,0 |
| Oligoproov EUB 338 (100 ng/μl) | 4,5 | 18,0 | 27,0 | 36,0 | 45,0 |
| Oligoproov OLI-1 või OLI-2 (100 ng/μl) | 4,5 | 18,0 | 27,0 | 36,0 | 45,0 |
| Kogumaht (μl) | 90,0 | 360,0 | 540,0 | 720,0 | 900,0 |
| Märkus: kõiki valgustundlikke oligoproove sisaldavaid lahuseid säilitatakse pimedas –20 °C juures.
  Kasutamise ajal välditakse otsest päikese- või elektrivalgust. |

Objektiklaaside hulk

1

4

6

8

10

Steriilne ultrapuhas vesi

23,1

92,4

138,6

184,8

231,0

3 X Hybmix-lahus

30,0

120,0

180,0

240,0

300,0

1 % SDS

0,9

3,6

5,4

7,2

9,0

Formamiid

27,0

108,0

162,0

216,0

270,0

Oligoproov EUB 338 (100 ng/μl)

4,5

18,0

27,0

36,0

45,0

Oligoproov OLI-1 või OLI-2 (100 ng/μl)

4,5

18,0

27,0

36,0

45,0

Kogumaht (μl)

90,0

360,0

540,0

720,0

900,0

Märkus: kõiki valgustundlikke oligoproove sisaldavaid lahuseid säilitatakse pimedas –20 °C juures.

Kasutamise ajal välditakse otsest päikese- või elektrivalgust.

5.   0,1 M fosfaatpuhver, pH 7,0

| Na2HPO4 | 8,52 g |
| --- | --- |
| KH2PO4 | 5,44 g |
| Destilleeritud vesi | 1,00 l |

Na2HPO4

8,52 g

KH2PO4

5,44 g

Destilleeritud vesi

1,00 l

Ained lahustatakse, kontrollitakse pH ja steriliseeritakse autoklaavis 121 °C juures 15 minutit.

8. liide

Baklažaani- ja tomatikultuuride kasvatamistingimused

Tomati (Lycopersicon esculentum) või baklažaani (Solanum melongena) seemned külvatakse pastöriseeritud külvikomposti. Täielikult avanenud idulehtedega (10–14 päeva) seemikud istutatakse ümber pastöriseeritud istutuskomposti.

Baklažaani- või tomatitaimed peaksid olema kasvatatud kasvuhoones järgmistel keskkonnatingimustel:

| päeva pikkus: | 14 tundi või looduslik päevapikkus, kui see on pikem, |
| --- | --- |
| temperatuur: | päeval: 21–24 °C,
  öösel: 14–18 °C. |
| Haigusele vastuvõtlik tomatisort: | “Moneymaker” |
| Haigusele vastuvõtlik baklažaanisort: | “Black Beauty” |
| Tarnijad: | vt veebileht http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main. |

päeva pikkus:

14 tundi või looduslik päevapikkus, kui see on pikem,

temperatuur:

päeval: 21–24 °C,

öösel: 14–18 °C.

Haigusele vastuvõtlik tomatisort:

“Moneymaker”

Haigusele vastuvõtlik baklažaanisort:

“Black Beauty”

Tarnijad:

vt veebileht http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

VIITED

| 1. | Amann, R.I., L. Krumholz and D.A. Stahl. 1990. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology. J. Bacteriol. 172: 762-770. |
| --- | --- |

1.

Amann, R.I., L. Krumholz and D.A. Stahl. 1990. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology. J. Bacteriol. 172: 762-770.

| 2. | Anon. 1998. Council Directive 98/57/EC of 20 July 1998 on the control of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Official Journal of the European Communities L235, 1-39. |
| --- | --- |

2.

Anon. 1998. Council Directive 98/57/EC of 20 July 1998 on the control of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Official Journal of the European Communities L235, 1-39.

| 3. | Boudazin, G., A.C. Le Roux, K. Josi, P. Labarre and B. Jouan. 1999. Design of division specific primers of Ralstonia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology 105; 373-380. |
| --- | --- |

3.

Boudazin, G., A.C. Le Roux, K. Josi, P. Labarre and B. Jouan. 1999. Design of division specific primers of Ralstonia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology 105; 373-380.

| 4. | Caruso, P., Gorris, M.T., Cambra, M., Palomo, J.L., Collar, J and Lopez, M.M. 2002. Enrichment Double-Antibody Sandwich Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal Antibody for sensitive Detection of Ralstonia solanacearum in Asymptomatic Potato Tubers. Applied and Environmental Microbiology, 68, 3634-3638. |
| --- | --- |

4.

Caruso, P., Gorris, M.T., Cambra, M., Palomo, J.L., Collar, J and Lopez, M.M. 2002. Enrichment Double-Antibody Sandwich Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal Antibody for sensitive Detection of Ralstonia solanacearum in Asymptomatic Potato Tubers. Applied and Environmental Microbiology, 68, 3634-3638.

| 5. | Cook, D., Barlow, E. and Sequeira, L. 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphisms with DNA probes that specify virulence and the hypersensitive response. Molecular Plant-Microbe Interactions 1:113-121. |
| --- | --- |

5.

Cook, D., Barlow, E. and Sequeira, L. 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphisms with DNA probes that specify virulence and the hypersensitive response. Molecular Plant-Microbe Interactions 1:113-121.

| 6. | Elphinstone, J.G., Hennessy, J., Wilson, J.K. and Stead, D.E. 1996. Sensitivity of detection of Ralstonia solanacearum in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26; 663-678. |
| --- | --- |

6.

Elphinstone, J.G., Hennessy, J., Wilson, J.K. and Stead, D.E. 1996. Sensitivity of detection of Ralstonia solanacearum in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26; 663-678.

| 7. | Englebrecht, M.C. (1994) Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. In: A.C. Hayward (ed.) Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Australian Centre for International Agricultural Research, Canberra, Australia. |
| --- | --- |

7.

Englebrecht, M.C. (1994) Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. In: A.C. Hayward (ed.) Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Australian Centre for International Agricultural Research, Canberra, Australia.

| 8. | Hayward, A.C. 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27; 265-277. |
| --- | --- |

8.

Hayward, A.C. 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27; 265-277.

| 9. | Hayward, A.C., El-Nashaar, H.M., Nydegger, U. and De Lindo, L. 1990. Variation in nitrate metabolism in biovars of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 69; 269-280. |
| --- | --- |

9.

Hayward, A.C., El-Nashaar, H.M., Nydegger, U. and De Lindo, L. 1990. Variation in nitrate metabolism in biovars of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 69; 269-280.

| 10. | Ito, S., Y. Ushijima, T. Fujii, S. Tanaka, M. Kameya-Iwaki, S. Yoshiwara and F. Kishi. 1998. Detection of viable cells of Ralstonia solanacearum in soil using a semi-selective medium and a PCR technique. J. Phytopathology 146; 379-384. |
| --- | --- |

10.

Ito, S., Y. Ushijima, T. Fujii, S. Tanaka, M. Kameya-Iwaki, S. Yoshiwara and F. Kishi. 1998. Detection of viable cells of Ralstonia solanacearum in soil using a semi-selective medium and a PCR technique. J. Phytopathology 146; 379-384.

| 11. | Janse, J.D. (1988) A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 18, 343-351. |
| --- | --- |

11.

Janse, J.D. (1988) A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 18, 343-351.

| 12. | Janse, J.D. 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacaerum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335-345. |
| --- | --- |

12.

Janse, J.D. 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacaerum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335-345.

| 13. | Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity of Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 44; 693-695. |
| --- | --- |

13.

Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity of Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 44; 693-695.

| 14. | Klement Z.; Rudolph, K and D.C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp. |
| --- | --- |

14.

Klement Z.; Rudolph, K and D.C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp.

| 15. | Lelliott, R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd., Oxford. 216 pp. |
| --- | --- |

15.

Lelliott, R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd., Oxford. 216 pp.

| 16. | Lopez, M.M., Gorris, M.T., Llop, P., Cubero, J., Vicedo, B., Cambra, M., 1997. Selective enrichment improves selective isolation, serological and molecular detection of plant pathogenic bacteria. In: H.W. Dehne et al., (eds). Klewer Academic Publishers. pp. 117-121. |
| --- | --- |

16.

Lopez, M.M., Gorris, M.T., Llop, P., Cubero, J., Vicedo, B., Cambra, M., 1997. Selective enrichment improves selective isolation, serological and molecular detection of plant pathogenic bacteria. In: H.W. Dehne et al., (eds). Klewer Academic Publishers. pp. 117-121.

| 17. | Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1994. Specific genomic fingerprints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR. Applied and Environmental Microbiology, 60, 2286-2295. |
| --- | --- |

17.

Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1994. Specific genomic fingerprints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR. Applied and Environmental Microbiology, 60, 2286-2295.

| 18. | Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J. 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85; 528-536. |
| --- | --- |

18.

Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J. 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85; 528-536.

| 19. | Opina, N., F. Tavner, G. Holloway, J.-F Wang, T.-H Li, R. Maghirang, M. Fegan, A.C. Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W. Holloway, J.N. Timmis. 1997. A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 5; 19-33. |
| --- | --- |

19.

Opina, N., F. Tavner, G. Holloway, J.-F Wang, T.-H Li, R. Maghirang, M. Fegan, A.C. Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W. Holloway, J.N. Timmis. 1997. A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 5; 19-33.

| 20. | Pastrik, K.H. and Maiss, E. 2000. Detection of R. solanacearum in potato tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148; 619-626. |
| --- | --- |

20.

Pastrik, K.H. and Maiss, E. 2000. Detection of R. solanacearum in potato tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148; 619-626.

| 21. | Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831-842. |
| --- | --- |

21.

Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831-842.

| 22. | Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D. (1995) Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79. |
| --- | --- |

22.

Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D. (1995) Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79.

| 23. | Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. - 3. ed.; St. Paul, Minnesota: 373 pp. |
| --- | --- |

23.

Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. - 3. ed.; St. Paul, Minnesota: 373 pp.

| 24. | Seal, S.E., L.A. Jackson, J.P.W. Young, and M.J. Daniels. 1993. Detection of Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii and Blood Disease Bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. J. Gen. Microbiol. 139: 1587-1594. |
| --- | --- |

24.

Seal, S.E., L.A. Jackson, J.P.W. Young, and M.J. Daniels. 1993. Detection of Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii and Blood Disease Bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. J. Gen. Microbiol. 139: 1587-1594.

| 25. | Smith, J.J., Offord, L.C., Holderness, M. and Saddler, G.S. 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61; 4262-4268. |
| --- | --- |

25.

Smith, J.J., Offord, L.C., Holderness, M. and Saddler, G.S. 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61; 4262-4268.

| 26. | Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281-295. |
| --- | --- |

26.

Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281-295.

| 27. | Taghavi, M., Hayward, A.C., Sly, L.I., Fegan, M. 1996. Analysiss of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46; 10-15. |
| --- | --- |

27.

Taghavi, M., Hayward, A.C., Sly, L.I., Fegan, M. 1996. Analysiss of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46; 10-15.

| 28. | Van Der Wolf, J.M., Bonants, P.J.M., Smith, J.J., Hagenaar, M., Nijhuis, E., Van Beckhoven, J.R.C., Saddler, G.S., Trigalet, A., Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 in Western Europe as determined by AFLP, RC-PFGE and rep-PCR. In: Prior, P., Allen, C. and Elphinstone, J. (eds.) Bacterial wilt disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 44-49. |
| --- | --- |

28.

Van Der Wolf, J.M., Bonants, P.J.M., Smith, J.J., Hagenaar, M., Nijhuis, E., Van Beckhoven, J.R.C., Saddler, G.S., Trigalet, A., Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 in Western Europe as determined by AFLP, RC-PFGE and rep-PCR. In: Prior, P., Allen, C. and Elphinstone, J. (eds.) Bacterial wilt disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 44-49.

| 29. | Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., Stead, D.E. and Boonham, N. 1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an automated and quantitative flourogenic 5’ nuclease TaqMan assay. Applied and Environmental Microbiology 66; 2853-2858. |
| --- | --- |

29.

Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., Stead, D.E. and Boonham, N. 1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an automated and quantitative flourogenic 5’ nuclease TaqMan assay. Applied and Environmental Microbiology 66; 2853-2858.

| 30. | Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A.D.L. Akkermans. 1998. Detection of R. solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4546-4554. |
| --- | --- |

30.

Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A.D.L. Akkermans. 1998. Detection of R. solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4546-4554.

III LISA

| 1. | Iga haigusetekitaja esinemise kahtluse korral, mille kohta on saadud loetletud taimse materjali või muu materjali kohta positiivne tulemus vastavalt III lisas esitatud asjakohasele meetodile läbi viidud sõelkatse(te)s ja oodatakse tulemuste kinnitamist või ümberlükkamist, tuleb kuni eespool nimetatud meetodi lõpuleviimiseni kinni pidada ja nõuetekohaselt säilitada






  — | kõik mugulad, millest proov on võetud, ning võimaluse korral kõik taimed, millelt proov on võetud, |
| --- | --- | --- |

1.

Iga haigusetekitaja esinemise kahtluse korral, mille kohta on saadud loetletud taimse materjali või muu materjali kohta positiivne tulemus vastavalt III lisas esitatud asjakohasele meetodile läbi viidud sõelkatse(te)s ja oodatakse tulemuste kinnitamist või ümberlükkamist, tuleb kuni eespool nimetatud meetodi lõpuleviimiseni kinni pidada ja nõuetekohaselt säilitada

—

kõik mugulad, millest proov on võetud, ning võimaluse korral kõik taimed, millelt proov on võetud,

| — | kõik järelejäänud ekstraktid ja sõelkatse(te)ks valmistatud lisamaterjalid, nt immunofluorestsents-objektiklaasid,
  ning |
| --- | --- |

—

kõik järelejäänud ekstraktid ja sõelkatse(te)ks valmistatud lisamaterjalid, nt immunofluorestsents-objektiklaasid,

ning

| — | kõik asjakohased dokumendid kuni kõnealus(t)e meetodi(te) lõpuleviimiseni. |
| --- | --- |

—

kõik asjakohased dokumendid kuni kõnealus(t)e meetodi(te) lõpuleviimiseni.

Mugulate säilitamine võimaldab teha sordikatseid, kui see on asjakohane.

| 2. | Organismi olemasolu kinnituse puhul tuleks alles hoida ja nõuetekohaselt säilitada






  — | lõikes 1 määratletud materjal,
  ja |
| --- | --- | --- |

2.

Organismi olemasolu kinnituse puhul tuleks alles hoida ja nõuetekohaselt säilitada

—

lõikes 1 määratletud materjal,

ja

| — | vajaduse korral mugula- või taimeekstraktiga nakatatud tomati- või baklažaanitaime proov
  ning |
| --- | --- |

—

vajaduse korral mugula- või taimeekstraktiga nakatatud tomati- või baklažaanitaime proov

ning

| — | organismi isoleeritud kultuur |
| --- | --- |

—

organismi isoleeritud kultuur

vähemalt ühe kuu jooksul pärast teatamist vastavalt artikli 5 lõikele 2.

IV LISA

Artikli 5 lõike 1 punkti a alapunktis i osutatud uurimisel võetakse vajaduse korral arvesse järgmised tegurid:

| i) | tootmiskohad,






  — | kus kasvatatakse või on kasvatatud kartuleid, mis pärinevad samast kloonist kui kartulid, mis on osutunud organismiga saastunuks, |
| --- | --- | --- |

i)

tootmiskohad,

—

kus kasvatatakse või on kasvatatud kartuleid, mis pärinevad samast kloonist kui kartulid, mis on osutunud organismiga saastunuks,

| — | kus kasvatatakse või on kasvatatud tomateid, mis pärinevad samast algallikast kui tomatid, mis on osutunud organismiga saastunuks, |
| --- | --- |

—

kus kasvatatakse või on kasvatatud tomateid, mis pärinevad samast algallikast kui tomatid, mis on osutunud organismiga saastunuks,

| — | kus kasvatatakse või on kasvatatud kartuleid või tomateid, mis on ametliku kontrolli all organismi oletatava esinemise tõttu, |
| --- | --- |

—

kus kasvatatakse või on kasvatatud kartuleid või tomateid, mis on ametliku kontrolli all organismi oletatava esinemise tõttu,

| — | kus kasvatatakse või on kasvatatud kartuleid, mis pärinevad samast kloonist kui kartulid, mis on kasvatatud organismiga saastunuks osutunud tootmiskohtades, |
| --- | --- |

—

kus kasvatatakse või on kasvatatud kartuleid, mis pärinevad samast kloonist kui kartulid, mis on kasvatatud organismiga saastunuks osutunud tootmiskohtades,

| — | kus kasvatatakse kartuleid või tomateid ja mis asetsevad saastunud tootmiskoha naabruses, k.a sellised tootmiskohad, kus tootmisseadmeid ja -rajatisi jagatakse omavahel otseselt või ühise lepingulise tööettevõtja kaudu, |
| --- | --- |

—

kus kasvatatakse kartuleid või tomateid ja mis asetsevad saastunud tootmiskoha naabruses, k.a sellised tootmiskohad, kus tootmisseadmeid ja -rajatisi jagatakse omavahel otseselt või ühise lepingulise tööettevõtja kaudu,

| — | kus kastmiseks või niisutamiseks kasutatakse pinnavett, mille lähtekohas on organismi esinemine kinnitatud või milles oletatakse organismi esinemist, |
| --- | --- |

—

kus kastmiseks või niisutamiseks kasutatakse pinnavett, mille lähtekohas on organismi esinemine kinnitatud või milles oletatakse organismi esinemist,

| — | kus kastmiseks või niisutamiseks kasutatakse pinnavett, mille lähtekoht on ühises kasutuses tootmiskohtadega, kus on organismi esinemine kinnitatud või kus oletatakse organismi esinemist, |
| --- | --- |

—

kus kastmiseks või niisutamiseks kasutatakse pinnavett, mille lähtekoht on ühises kasutuses tootmiskohtadega, kus on organismi esinemine kinnitatud või kus oletatakse organismi esinemist,

| — | mis on või mis on olnud üle ujutatud pinnaveega, milles on organismi esinemine kinnitatud või milles oletatakse organismi esinemist, |
| --- | --- |

—

mis on või mis on olnud üle ujutatud pinnaveega, milles on organismi esinemine kinnitatud või milles oletatakse organismi esinemist,

ja

| ii) | organismiga saastunud pinnavesi, mida on kasutatud tootmiskoha kastmiseks ja niisutamiseks või mis on üle ujutanud põllu(d) või tootmiskoha(d). |
| --- | --- |

ii)

organismiga saastunud pinnavesi, mida on kasutatud tootmiskoha kastmiseks ja niisutamiseks või mis on üle ujutanud põllu(d) või tootmiskoha(d).

V LISA

| 1. | Tõenäolise saastumise ulatuse kindlaksmääramiseks artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti iii ja punkti 5 lõike 1 punkti c alapunkti iii alusel võetakse vajaduse korral arvesse järgmisi tegureid:






  — | artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel saastunuks tunnistatud tootmiskohas kasvatatav loetletud taimne materjal, |
| --- | --- | --- |

1.

Tõenäolise saastumise ulatuse kindlaksmääramiseks artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti iii ja punkti 5 lõike 1 punkti c alapunkti iii alusel võetakse vajaduse korral arvesse järgmisi tegureid:

—

artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel saastunuks tunnistatud tootmiskohas kasvatatav loetletud taimne materjal,

| — | tootmiskoht või -kohad, mis mõnes tootmislülis on seotud artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel saastunuks tunnistatud loetletud taimse materjaliga, k.a tootmiskohad, kus tootmisseadmeid ja -rajatisi jagatakse omavahel otseselt või ühise lepingulise tööettevõtja kaudu, |
| --- | --- |

—

tootmiskoht või -kohad, mis mõnes tootmislülis on seotud artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel saastunuks tunnistatud loetletud taimse materjaliga, k.a tootmiskohad, kus tootmisseadmeid ja -rajatisi jagatakse omavahel otseselt või ühise lepingulise tööettevõtja kaudu,

| — | loetletud taimne materjal, mida kasvatati või mis oli eelmises taandes osutatud tootmiskohas või -kohtades ajavahemikul, mil esimeses taandes osutatud tootmiskohas oli vastavalt artikli 5 lõike 1 punkti a alapunktile ii saastunuks tunnistatud taimne materjal, |
| --- | --- |

—

loetletud taimne materjal, mida kasvatati või mis oli eelmises taandes osutatud tootmiskohas või -kohtades ajavahemikul, mil esimeses taandes osutatud tootmiskohas oli vastavalt artikli 5 lõike 1 punkti a alapunktile ii saastunuks tunnistatud taimne materjal,

| — | eelmistes taanetes osutatud tootmiskohtadest pärit loetletud taimset materjali käitlevad ettevõtted, |
| --- | --- |

—

eelmistes taanetes osutatud tootmiskohtadest pärit loetletud taimset materjali käitlevad ettevõtted,

| — | mis tahes seadmed, veokid, anumad, laod või nende osad ning mis tahes muud objektid, sealhulgas pakkematerjal, mis on võinud olla kontaktis loetletud taimse materjaliga, mis on tunnistatud saastunuks artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel, |
| --- | --- |

—

mis tahes seadmed, veokid, anumad, laod või nende osad ning mis tahes muud objektid, sealhulgas pakkematerjal, mis on võinud olla kontaktis loetletud taimse materjaliga, mis on tunnistatud saastunuks artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel,

| — | kogu loetletud taimne materjal, mida on hoitud eelmises taandes loetletud ehitiste või objektide sees või nendega kokkupuutes enne nende ehitiste või objektide puhastamist ja desinfitseerimist, |
| --- | --- |

—

kogu loetletud taimne materjal, mida on hoitud eelmises taandes loetletud ehitiste või objektide sees või nendega kokkupuutes enne nende ehitiste või objektide puhastamist ja desinfitseerimist,

| — | artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti i alusel toimunud uurimise ja laboratoorse analüüsimise tulemusel artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel organismiga saastunuks tunnistatud loetletud taimse materjaliga samast kloonist pärinevad kartulimugulad või -taimed ja saastunuks tunnistatud taimse materjaliga samast allikast pärinevad tomatitaimed, mille saastumine on tõenäoline taime kloonide kaudu, kuigi analüüsi tulemused on võinud olla negatiivsed. Saastunud ja klooni kaudu seotud mugulate või taimede suguluse tõendamiseks võib teha sordikatseid, |
| --- | --- |

—

artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti i alusel toimunud uurimise ja laboratoorse analüüsimise tulemusel artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel organismiga saastunuks tunnistatud loetletud taimse materjaliga samast kloonist pärinevad kartulimugulad või -taimed ja saastunuks tunnistatud taimse materjaliga samast allikast pärinevad tomatitaimed, mille saastumine on tõenäoline taime kloonide kaudu, kuigi analüüsi tulemused on võinud olla negatiivsed. Saastunud ja klooni kaudu seotud mugulate või taimede suguluse tõendamiseks võib teha sordikatseid,

| — | eelmises taandes osutatud taimse materjali tootmiskoht või -kohad, |
| --- | --- |

—

eelmises taandes osutatud taimse materjali tootmiskoht või -kohad,

| — | loetletud taimse materjali tootmiskoht või -kohad, kus kasutatakse artikli 5 lõike 1 punkti c alapunkti ii alusel organismiga saastunuks osutunud kastmis- ja niisutusvett, |
| --- | --- |

—

loetletud taimse materjali tootmiskoht või -kohad, kus kasutatakse artikli 5 lõike 1 punkti c alapunkti ii alusel organismiga saastunuks osutunud kastmis- ja niisutusvett,

| — | loetletud taimne materjal, mis on kasvatatud põldudel, mis on üle ujutatud saastunud pinnaveega. |
| --- | --- |

—

loetletud taimne materjal, mis on kasvatatud põldudel, mis on üle ujutatud saastunud pinnaveega.

| 2. | Organismi võimaliku leviku kindlaksmääramine artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti iv ja artikli 5 lõike 1 punkti c alapunkti iii alusel hõlmab






  i) | artikli 5 lõike 1 punkti a alapunktis iv osutatud juhtudel






  — | loetletud taimse materjali muude tootmiskohtade lähedust, |
| --- | --- | --- | --- |

2.

Organismi võimaliku leviku kindlaksmääramine artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti iv ja artikli 5 lõike 1 punkti c alapunkti iii alusel hõlmab

i)

artikli 5 lõike 1 punkti a alapunktis iv osutatud juhtudel

—

loetletud taimse materjali muude tootmiskohtade lähedust,

| — | seemnekartulivarude ühist tootmist ja kasutamist, |
| --- | --- |

—

seemnekartulivarude ühist tootmist ja kasutamist,

| — | tootmiskohti, kus kasutatakse pinnavett taimse materjali kastmiseks või niisutamiseks juhtudel, kus artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel organismiga saastunuks osutunud tootmiskohas (tootmiskohtades) esineb või on esinenud pinnavee äravoolu või üleujutuse ohtu; |
| --- | --- |

—

tootmiskohti, kus kasutatakse pinnavett taimse materjali kastmiseks või niisutamiseks juhtudel, kus artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel organismiga saastunuks osutunud tootmiskohas (tootmiskohtades) esineb või on esinenud pinnavee äravoolu või üleujutuse ohtu;

| ii) | juhtudel, mil pinnavesi on artikli 5 lõike 1 punkti c alapunkti ii alusel tunnistatud organismiga saastunuks,






  — | loetletud taimse materjali tootmiskohta (tootmiskohti), mis asuvad organismiga saastunuks tunnistatud pinnavee lähedal või kus esineb üleujutusoht, |
| --- | --- | --- |

ii)

juhtudel, mil pinnavesi on artikli 5 lõike 1 punkti c alapunkti ii alusel tunnistatud organismiga saastunuks,

—

loetletud taimse materjali tootmiskohta (tootmiskohti), mis asuvad organismiga saastunuks tunnistatud pinnavee lähedal või kus esineb üleujutusoht,

| — | iga eraldatud vesikonda, mis on ühenduses saastunuks tunnistatud pinnaveega, |
| --- | --- |

—

iga eraldatud vesikonda, mis on ühenduses saastunuks tunnistatud pinnaveega,

| — | veekogud, mis on ühenduses saastunuks tunnistatud pinnaveega, võttes arvesse






  — | saastunuks tunnistatud vee voolusuunda ja -hulka, |
| --- | --- | --- |

—

veekogud, mis on ühenduses saastunuks tunnistatud pinnaveega, võttes arvesse

—

saastunuks tunnistatud vee voolusuunda ja -hulka,

| — | looduslike maavitsaliste peremeestaimede esinemist. |
| --- | --- |

—

looduslike maavitsaliste peremeestaimede esinemist.

| 3. | Artikli 5 lõike 2 esimeses lõigus osutatud teatis esitatakse järgmiselt:






  — | kohe pärast organismi olemasolu kinnitamist laborianalüüsidega, kasutades II lisas sätestatud meetodeid, esitades vähemalt järgmised andmed:






  — | kartulite puhul,






  a) | partii sordi nimi; |
| --- | --- | --- | --- | --- |

3.

Artikli 5 lõike 2 esimeses lõigus osutatud teatis esitatakse järgmiselt:

—

kohe pärast organismi olemasolu kinnitamist laborianalüüsidega, kasutades II lisas sätestatud meetodeid, esitades vähemalt järgmised andmed:

—

kartulite puhul,

a)

partii sordi nimi;

| b) | kasutusotstarve (söögikartul, seemnekartul jne) ja seemnekartuli kategooria, kui see on kohaldatav, |
| --- | --- |

b)

kasutusotstarve (söögikartul, seemnekartul jne) ja seemnekartuli kategooria, kui see on kohaldatav,

| — | tomatitaimede puhul partii sordi nimi ja kategooria, kui see on kohaldatav, |
| --- | --- |

—

tomatitaimede puhul partii sordi nimi ja kategooria, kui see on kohaldatav,

| — | ilma et see piiraks artikli 4 punkti 3 esinemise kahtluse teatamise nõudeid, peab asjaomane liikmesriik, kus saastumine on avastatud ja on olemas teisest liikmesriigist (teistest liikmesriikidest) pärit või teise liikmesriiki (teistesse liikmesriikidesse) viidava loetletud taimse materjali saastumisoht, viivitamata teatama asjassepuutuvale liikmesriigile (asjassepuutuvatele liikmesriikidele) artikli 5 lõike 3 kohaselt järgmised andmed:






  a) | kartuli- või tomatipartii sordi nimi; |
| --- | --- | --- |

—

ilma et see piiraks artikli 4 punkti 3 esinemise kahtluse teatamise nõudeid, peab asjaomane liikmesriik, kus saastumine on avastatud ja on olemas teisest liikmesriigist (teistest liikmesriikidest) pärit või teise liikmesriiki (teistesse liikmesriikidesse) viidava loetletud taimse materjali saastumisoht, viivitamata teatama asjassepuutuvale liikmesriigile (asjassepuutuvatele liikmesriikidele) artikli 5 lõike 3 kohaselt järgmised andmed:

a)

kartuli- või tomatipartii sordi nimi;

| b) | kaubasaatja ja kaubasaaja nimi ja aadress; |
| --- | --- |

b)

kaubasaatja ja kaubasaaja nimi ja aadress;

| c) | kartuli- või tomatipartii tarnekuupäev; |
| --- | --- |

c)

kartuli- või tomatipartii tarnekuupäev;

| d) | tarnitud kartuli- või tomatipartii suurus; |
| --- | --- |

d)

tarnitud kartuli- või tomatipartii suurus;

| e) | taimepassi koopia või vähemalt taimepassi number, kui see on asjakohane, või kasvataja või turustaja registreerimisnumber, kui see on asjakohane, ja saatedokumendi koopia. |
| --- | --- |

e)

taimepassi koopia või vähemalt taimepassi number, kui see on asjakohane, või kasvataja või turustaja registreerimisnumber, kui see on asjakohane, ja saatedokumendi koopia.

Kui sellist teavet esitatakse, teatatakse sellest viivitamata komisjonile.

| 4. | Artikli 5 lõike 2 teises lõigus osutatud lisateave esitatakse järgmiselt:
  pärast kõigi uuringute lõppu teatatakse iga juhtumi puhul järgmised andmed:






  a) | kuupäev, millal saastumine kinnitati; |
| --- | --- | --- |

4.

Artikli 5 lõike 2 teises lõigus osutatud lisateave esitatakse järgmiselt:

pärast kõigi uuringute lõppu teatatakse iga juhtumi puhul järgmised andmed:

a)

kuupäev, millal saastumine kinnitati;

| b) | lühikirjeldus tehtud uurimisest saasteallika kindlaksmääramise ja saastumise võimaliku leviku kohta, sealhulgas läbiviidud proovivõtu taseme kohta; |
| --- | --- |

b)

lühikirjeldus tehtud uurimisest saasteallika kindlaksmääramise ja saastumise võimaliku leviku kohta, sealhulgas läbiviidud proovivõtu taseme kohta;

| c) | teave kindlakstehtud või oletatava(te) saasteallika(te) kohta; |
| --- | --- |

c)

teave kindlakstehtud või oletatava(te) saasteallika(te) kohta;

| d) | täpne teave saastunuks tunnistamise ulatuse kohta, sealhulgas tootmiskohtade arv ja kartulite korral partiide arv koos sordi nime ja seemnekartuli puhul kategooriaga; |
| --- | --- |

d)

täpne teave saastunuks tunnistamise ulatuse kohta, sealhulgas tootmiskohtade arv ja kartulite korral partiide arv koos sordi nime ja seemnekartuli puhul kategooriaga;

| e) | üksikasjad tsooni piiritlemise kohta, sealhulgas nende tootmiskohtade arv, mis ei ole tunnistatud saastunuks, kuid mida tsoon hõlmab; |
| --- | --- |

e)

üksikasjad tsooni piiritlemise kohta, sealhulgas nende tootmiskohtade arv, mis ei ole tunnistatud saastunuks, kuid mida tsoon hõlmab;

| f) | üksikasjad veealade saastunuks tunnistamise kohta, sealhulgas veekogu nimi ja asukoht ning saastumuse/niisutamiskeelu ulatus; |
| --- | --- |

f)

üksikasjad veealade saastunuks tunnistamise kohta, sealhulgas veekogu nimi ja asukoht ning saastumuse/niisutamiskeelu ulatus;

| g) | saastunuks tunnistatud tomatitaimede saadetise või partii puhul direktiivi 2000/29/EÜ artikli 13 lõike 1 alapunktis ii ette nähtud sertifikaadid ning vastavalt direktiivi 2000/29/EÜ V lisa A osa I jao punktis 2.2 esitatud loetelule väljastatud taimepassi number; |
| --- | --- |

g)

saastunuks tunnistatud tomatitaimede saadetise või partii puhul direktiivi 2000/29/EÜ artikli 13 lõike 1 alapunktis ii ette nähtud sertifikaadid ning vastavalt direktiivi 2000/29/EÜ V lisa A osa I jao punktis 2.2 esitatud loetelule väljastatud taimepassi number;

| h) | muud teavet, mis on seotud kinnitatud haiguspuhanguga (haiguspuhangutega) ja mida komisjon võib nõuda. |
| --- | --- |

h)

muud teavet, mis on seotud kinnitatud haiguspuhanguga (haiguspuhangutega) ja mida komisjon võib nõuda.

VI LISA

| 1. | Artikli 6 punktis 1 osutatud sätted on järgmised:






  — | loomasöödana kasutamine pärast kuumtöötlemist, nii et puudub organismi ellujäämise oht,
  või |
| --- | --- | --- |

1.

Artikli 6 punktis 1 osutatud sätted on järgmised:

—

loomasöödana kasutamine pärast kuumtöötlemist, nii et puudub organismi ellujäämise oht,

või

| — | kõrvaldamine ametlikult heaks kiidetud jäätmekäitluskohas, kus ei teki organismi keskkonda pääsemise identifitseeritavat riski nt põllumajandusmaadesse imbumise või põllumaa kastmiseks kasutatava veega kokkupuutumise kaudu,
  või |
| --- | --- |

—

kõrvaldamine ametlikult heaks kiidetud jäätmekäitluskohas, kus ei teki organismi keskkonda pääsemise identifitseeritavat riski nt põllumajandusmaadesse imbumise või põllumaa kastmiseks kasutatava veega kokkupuutumise kaudu,

või

| — | tuhastamine
  või |
| --- | --- |

—

tuhastamine

või

| — | tööstuslikuks töötlemiseks kasutamine otsese ja vahetu tarnimisega töötlevasse tehasesse, kus on ametlikult heaks kiidetud jäätmete kõrvaldamise seadmed, mille puhul on kindlaks tehtud, et ei ole organismi leviku identifitseeritavat ohtu, ning vähemalt väljuvate sõidukite puhastamis- ja desinfitseerimissüsteem,
  või |
| --- | --- |

—

tööstuslikuks töötlemiseks kasutamine otsese ja vahetu tarnimisega töötlevasse tehasesse, kus on ametlikult heaks kiidetud jäätmete kõrvaldamise seadmed, mille puhul on kindlaks tehtud, et ei ole organismi leviku identifitseeritavat ohtu, ning vähemalt väljuvate sõidukite puhastamis- ja desinfitseerimissüsteem,

või

| — | muud meetmed, tingimusel et on kindlaks tehtud, et ei ole organismi leviku identifitseeritavat ohtu; sellistest meetmetest ja nende põhjendustest tuleb teatada komisjonile ja teistele liikmesriikidele. |
| --- | --- |

—

muud meetmed, tingimusel et on kindlaks tehtud, et ei ole organismi leviku identifitseeritavat ohtu; sellistest meetmetest ja nende põhjendustest tuleb teatada komisjonile ja teistele liikmesriikidele.

Mis tahes muud jäätmed, mis on seotud eespool nimetatud tingimustega või mis tekivad nende tõttu, kõrvaldatakse ametlikult heaks kiidetud meetoditel vastavalt käesoleva direktiivi VII lisale.

| 2. | Artikli 6 lõikes 2 osutatud loetletud taimse materjali asjakohane kasutamine või kõrvaldamine vastava liikmesriigi (vastavate liikmesriikide) vastutavate ametiasutuste kontrolli all koos vastutavate ametiasutuste vahelise teabevahetusega, et tagada pidev kontroll ja selle liikmesriigi vastutavate ametiasutuste heakskiit, kus kartulid pakendatakse või kus neid töödeldakse esimeses ja teises taandes osutatud jäätmete kõrvaldamise seadmete jaoks, on järgmine:






  i) | kartulimugulate puhul






  — | kasutamine toiduks ette nähtud tarbekartulina, mis on valmis pakendatud otsetarnimiseks ja kasutamiseks ümberpakendamata kohas, kus on asjakohased jäätmete kõrvaldamise seadmed. Seemnekartuliks ette nähtud kartuleid võib töödelda samas kohas ainult siis, kui seda tehakse eraldi või pärast puhastamist ja desinfitseerimist,
  või |
| --- | --- | --- | --- |

2.

Artikli 6 lõikes 2 osutatud loetletud taimse materjali asjakohane kasutamine või kõrvaldamine vastava liikmesriigi (vastavate liikmesriikide) vastutavate ametiasutuste kontrolli all koos vastutavate ametiasutuste vahelise teabevahetusega, et tagada pidev kontroll ja selle liikmesriigi vastutavate ametiasutuste heakskiit, kus kartulid pakendatakse või kus neid töödeldakse esimeses ja teises taandes osutatud jäätmete kõrvaldamise seadmete jaoks, on järgmine:

i)

kartulimugulate puhul

—

kasutamine toiduks ette nähtud tarbekartulina, mis on valmis pakendatud otsetarnimiseks ja kasutamiseks ümberpakendamata kohas, kus on asjakohased jäätmete kõrvaldamise seadmed. Seemnekartuliks ette nähtud kartuleid võib töödelda samas kohas ainult siis, kui seda tehakse eraldi või pärast puhastamist ja desinfitseerimist,

või

| — | kasutamine tööstuslikuks töötlemiseks ette nähtud tarbekartulina, mis tuleb otse ja vahetult tarnida töötlemisettevõttesse, kus on nõuetekohased jäätmete kõrvaldamisseadmed ja vähemalt lahkuvate sõidukite puhastamis- ja desinfitseerimissüsteem,
  või |
| --- | --- |

—

kasutamine tööstuslikuks töötlemiseks ette nähtud tarbekartulina, mis tuleb otse ja vahetult tarnida töötlemisettevõttesse, kus on nõuetekohased jäätmete kõrvaldamisseadmed ja vähemalt lahkuvate sõidukite puhastamis- ja desinfitseerimissüsteem,

või

| — | muu kasutamine või kõrvaldamine, tingimusel et ei esine organismi leviku identifitseeritavat ohtu ning selle on heaks kiitnud kõnealused vastutavad ametiasutused; |
| --- | --- |

—

muu kasutamine või kõrvaldamine, tingimusel et ei esine organismi leviku identifitseeritavat ohtu ning selle on heaks kiitnud kõnealused vastutavad ametiasutused;

| ii) | teiste taimeosade, k.a varre- ja leheprahi puhul,






  — | hävitamine
  või |
| --- | --- | --- |

ii)

teiste taimeosade, k.a varre- ja leheprahi puhul,

—

hävitamine

või

| — | muu kasutamine või kõrvaldamine, tingimusel et ei esine organismi leviku identifitseeritavat ohtu; ning selle on heaks kiitnud kõnealused vastutavad ametiasutused. |
| --- | --- |

—

muu kasutamine või kõrvaldamine, tingimusel et ei esine organismi leviku identifitseeritavat ohtu; ning selle on heaks kiitnud kõnealused vastutavad ametiasutused.

| 3. | Artikli 6 lõikes 3 osutatud objektide saastumisest puhastamise asjakohased meetodid on puhastamine ja vajaduse korral desinfitseerimine nii, et ei ole organismi leviku identifitseeritavat ohtu, ning seda tehakse liikmesriikide vastutavate ametiasutuste järelevalve all. |
| --- | --- |

3.

Artikli 6 lõikes 3 osutatud objektide saastumisest puhastamise asjakohased meetodid on puhastamine ja vajaduse korral desinfitseerimine nii, et ei ole organismi leviku identifitseeritavat ohtu, ning seda tehakse liikmesriikide vastutavate ametiasutuste järelevalve all.

| 4. | Liikmesriikide rakendatavad meetmed artikli 5 lõike 1 punkti a alapunktis iv ja punkti c alapunktis iii kehtestatud ja artikli 6 lõikes 4 osutatud piiritletud tsooni(de)s on järgmised. |
| --- | --- |

4.

Liikmesriikide rakendatavad meetmed artikli 5 lõike 1 punkti a alapunktis iv ja punkti c alapunktis iii kehtestatud ja artikli 6 lõikes 4 osutatud piiritletud tsooni(de)s on järgmised.

| 4.1. | Nendel juhtudel, kui tootmiskohad on tunnistatud organismiga saastunuks artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel






  a) | kaitstud tootmisalade põldudel või põlluosadel, mis on tunnistatud saastunuks artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel






  i) | vähemalt nelja kasvatusaasta jooksul pärast saastunuks tunnistamise aastat,






  — | võetakse meetmed iseeneslikult kasvama läinud kartuli- ja tomatitaimede ja muude organismi peremeestaimede, sh maavitsaliste sugukonda kuuluvate umbrohtude kõrvaldamiseks
  ning |
| --- | --- | --- | --- | --- |

4.1.

Nendel juhtudel, kui tootmiskohad on tunnistatud organismiga saastunuks artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel

a)

kaitstud tootmisalade põldudel või põlluosadel, mis on tunnistatud saastunuks artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel

i)

vähemalt nelja kasvatusaasta jooksul pärast saastunuks tunnistamise aastat,

—

võetakse meetmed iseeneslikult kasvama läinud kartuli- ja tomatitaimede ja muude organismi peremeestaimede, sh maavitsaliste sugukonda kuuluvate umbrohtude kõrvaldamiseks

ning

| — | ei panda maha, istutata ega külvata järgmist:






  — | kartulimugulaid, -taimi ega -seemneid, |
| --- | --- | --- |

—

ei panda maha, istutata ega külvata järgmist:

—

kartulimugulaid, -taimi ega -seemneid,

| — | tomatitaimi ega -seemneid, |
| --- | --- |

—

tomatitaimi ega -seemneid,

| — | võttes arvesse organismi bioloogiat, |
| --- | --- |

—

võttes arvesse organismi bioloogiat,

| — | teisi organismi peremeestaimi, |
| --- | --- |

—

teisi organismi peremeestaimi,

| — | taimeliike perekonnast kapsasrohi Brassica, mille puhul on identifitseeritav organismi ellujäämise oht, |
| --- | --- |

—

taimeliike perekonnast kapsasrohi Brassica, mille puhul on identifitseeritav organismi ellujäämise oht,

| — | teisi põllukultuure, millel on identifitseeritav organismi levitamise oht, |
| --- | --- |

—

teisi põllukultuure, millel on identifitseeritav organismi levitamise oht,

| — | esimesel kartuli või tomati kasvuaastal, mis järgneb eelmises taandes määratletud ajavahemikule, ja tingimusel, et põld on vähemalt kahel järjestikusel kasvuaastal enne taimede istutamist olnud ametliku kontrolli ajal vaba iseeneslikult kasvama läinud kartuli- ja tomatitaimedest ja muudest peremeestaimedest, sh maavitsaliste sugukonda kuuluvatest umbrohtudest, tuleb






  — | kartuli puhul lubada vaid tarbekartuli tootmist, |
| --- | --- | --- |

—

esimesel kartuli või tomati kasvuaastal, mis järgneb eelmises taandes määratletud ajavahemikule, ja tingimusel, et põld on vähemalt kahel järjestikusel kasvuaastal enne taimede istutamist olnud ametliku kontrolli ajal vaba iseeneslikult kasvama läinud kartuli- ja tomatitaimedest ja muudest peremeestaimedest, sh maavitsaliste sugukonda kuuluvatest umbrohtudest, tuleb

—

kartuli puhul lubada vaid tarbekartuli tootmist,

| — | kartuli ja tomati puhul analüüsida vastavalt koristatud mugulaid või tomatitaimi II lisas esitatud menetluse kohaselt, |
| --- | --- |

—

kartuli ja tomati puhul analüüsida vastavalt koristatud mugulaid või tomatitaimi II lisas esitatud menetluse kohaselt,

| — | hooajal, mis järgneb eelmises taandes osutatud kartuli- või tomatikasvatushooajale ja asjakohasele külvikordade tsüklile (mis seemnekartuli kasvatamise puhul on vähemalt kaks aastat), viia läbi artikli 2 lõikes 1 määratletud ametlik kontroll, |
| --- | --- |

—

hooajal, mis järgneb eelmises taandes osutatud kartuli- või tomatikasvatushooajale ja asjakohasele külvikordade tsüklile (mis seemnekartuli kasvatamise puhul on vähemalt kaks aastat), viia läbi artikli 2 lõikes 1 määratletud ametlik kontroll,

või

| ii) | saastunuks tunnistamise aastale järgneva viie kasvatusaasta jooksul






  — | võetakse meetmed iseeneslikult kasvama läinud kartuli- ja tomatitaimede ja muude organismi looduslikult esinevate peremeestaimede, sh maavitsaliste sugukonda kuuluvate umbrohtude kõrvaldamiseks
  ning |
| --- | --- | --- |

ii)

saastunuks tunnistamise aastale järgneva viie kasvatusaasta jooksul

—

võetakse meetmed iseeneslikult kasvama läinud kartuli- ja tomatitaimede ja muude organismi looduslikult esinevate peremeestaimede, sh maavitsaliste sugukonda kuuluvate umbrohtude kõrvaldamiseks

ning

| — | tuleb esimese kolme aasta jooksul põld vastavalt identifitseeritavale ohule kas sööti jätta või külvata sinna teravilja või kasutada püsikarjamaana, mida sagedasti madalalt niidetakse või kasutatakse intensiivselt karjatamiseks, või kasutada heintaimede seemne tootmiseks ja kahe järgneva aasta jooksul järgneb muude kui organismi peremeestaimede kasvatamine, mille puhul ei ole organismi ellujäämise või leviku identifitseeritavat ohtu, |
| --- | --- |

—

tuleb esimese kolme aasta jooksul põld vastavalt identifitseeritavale ohule kas sööti jätta või külvata sinna teravilja või kasutada püsikarjamaana, mida sagedasti madalalt niidetakse või kasutatakse intensiivselt karjatamiseks, või kasutada heintaimede seemne tootmiseks ja kahe järgneva aasta jooksul järgneb muude kui organismi peremeestaimede kasvatamine, mille puhul ei ole organismi ellujäämise või leviku identifitseeritavat ohtu,

| — | esimesel kartuli või tomati kasvuaastal, mis järgneb eelmises taandes määratletud ajavahemikule, ja tingimusel, et põld on vähemalt kahel järjestikusel kasvuaastal enne taimede istutamist olnud ametliku kontrolli ajal vaba iseeneslikult kasvama läinud kartuli- ja tomatitaimedest ja muudest peremeestaimedest, sh maavitsaliste sugukonda kuuluvatest umbrohtudest, tuleb






  — | kartuli puhul lubada seemne- või tarbekartuli tootmist, |
| --- | --- | --- |

—

esimesel kartuli või tomati kasvuaastal, mis järgneb eelmises taandes määratletud ajavahemikule, ja tingimusel, et põld on vähemalt kahel järjestikusel kasvuaastal enne taimede istutamist olnud ametliku kontrolli ajal vaba iseeneslikult kasvama läinud kartuli- ja tomatitaimedest ja muudest peremeestaimedest, sh maavitsaliste sugukonda kuuluvatest umbrohtudest, tuleb

—

kartuli puhul lubada seemne- või tarbekartuli tootmist,

| — | kartuli ja tomati puhul analüüsida vastavalt koristatud mugulaid või tomatitaimi vastavalt II lisas esitatud menetlusele; |
| --- | --- |

—

kartuli ja tomati puhul analüüsida vastavalt koristatud mugulaid või tomatitaimi vastavalt II lisas esitatud menetlusele;

| b) | kõigil muudel saastunud tootmiskoha põldudel ning tingimusel, et vastutavad ametiasutused on kindlaks teinud, et iseeneslikult kasvama läinud kartuli- ja tomatitaimede ja muude organismi looduslikult esinevate peremeestaimede, sealhulgas maavitsaliste sugukonda kuuluvate umbrohtude oht on kõrvaldatud,






  — | tootmiskoha saastunuks tunnistamise aastale järgneval kasvatusaastal






  — | kartulimugulaid, -taimi või seemneid ega muid organismi peremeestaimi ei panda maha, istutata ega külvata,
  või |
| --- | --- | --- | --- |

b)

kõigil muudel saastunud tootmiskoha põldudel ning tingimusel, et vastutavad ametiasutused on kindlaks teinud, et iseeneslikult kasvama läinud kartuli- ja tomatitaimede ja muude organismi looduslikult esinevate peremeestaimede, sealhulgas maavitsaliste sugukonda kuuluvate umbrohtude oht on kõrvaldatud,

—

tootmiskoha saastunuks tunnistamise aastale järgneval kasvatusaastal

—

kartulimugulaid, -taimi või seemneid ega muid organismi peremeestaimi ei panda maha, istutata ega külvata,

või

| — | kartulimugulate puhul tohib sertifitseeritud seemnekartulit kasutada üksnes tarbekartuli tootmiseks, |
| --- | --- |

—

kartulimugulate puhul tohib sertifitseeritud seemnekartulit kasutada üksnes tarbekartuli tootmiseks,

| — | tomatitaimede puhul võib direktiivi 2000/29/EÜ nõuetele vastavast seemnest kasvatatud tomatitaimi kasutada üksnes viljade tootmiseks, |
| --- | --- |

—

tomatitaimede puhul võib direktiivi 2000/29/EÜ nõuetele vastavast seemnest kasvatatud tomatitaimi kasutada üksnes viljade tootmiseks,

| — | saastunuks tunnistamise aastale järgneval teisel kasvatusaastal






  — | kartulite puhul kasutatakse seemne- või tarbekartuli tootmiseks üksnes sertifitseeritud seemnekartulit või seemnekartulit, mida on pruunmädaniku puudumise suhtes ametlikult analüüsitud ning mis on kasvatatud ametliku kontrolli all muudes kui artiklis 4.1 osutatud tootmiskohtades, |
| --- | --- | --- |

—

saastunuks tunnistamise aastale järgneval teisel kasvatusaastal

—

kartulite puhul kasutatakse seemne- või tarbekartuli tootmiseks üksnes sertifitseeritud seemnekartulit või seemnekartulit, mida on pruunmädaniku puudumise suhtes ametlikult analüüsitud ning mis on kasvatatud ametliku kontrolli all muudes kui artiklis 4.1 osutatud tootmiskohtades,

| — | tomatite puhul kasutatakse nii taimede kui ka viljade tootmiseks üksnes tomatitaimi, mis on kasvatatud direktiivi 2000/29/EÜ nõuetele vastavast seemnest või, vegetatiivse paljundusviisi puhul, toodetud niisugusest seemnest saadud taimedest ja kasvatatud ametliku kontrolli all muudes kui artiklis 4.1 osutatud tootmiskohtades, |
| --- | --- |

—

tomatite puhul kasutatakse nii taimede kui ka viljade tootmiseks üksnes tomatitaimi, mis on kasvatatud direktiivi 2000/29/EÜ nõuetele vastavast seemnest või, vegetatiivse paljundusviisi puhul, toodetud niisugusest seemnest saadud taimedest ja kasvatatud ametliku kontrolli all muudes kui artiklis 4.1 osutatud tootmiskohtades,

| — | saastunuks tunnistamise aastale järgneval vähemalt kolmandal kasvatusaastal






  — | kartulite puhul kasutatakse nii seemne- kui ka tarbekartuli tootmiseks üksnes sertifitseeritud seemnekartulit või sertifitseeritud seemnekartulist ametliku kontrolli all kasvatatud seemnekartulit, |
| --- | --- | --- |

—

saastunuks tunnistamise aastale järgneval vähemalt kolmandal kasvatusaastal

—

kartulite puhul kasutatakse nii seemne- kui ka tarbekartuli tootmiseks üksnes sertifitseeritud seemnekartulit või sertifitseeritud seemnekartulist ametliku kontrolli all kasvatatud seemnekartulit,

| — | tomatite puhul kasutatakse nii taimede kui ka viljade tootmiseks üksnes tomatitaimi, mis on kasvatatud direktiivi 2000/29/EÜ nõuetele vastavast seemnest, või niisugustest taimedest ametliku kontrolli all kasvatatud taimi, |
| --- | --- |

—

tomatite puhul kasutatakse nii taimede kui ka viljade tootmiseks üksnes tomatitaimi, mis on kasvatatud direktiivi 2000/29/EÜ nõuetele vastavast seemnest, või niisugustest taimedest ametliku kontrolli all kasvatatud taimi,

| — | kõigil eelmistes taanetes viidatud kasvatusaastatel võetakse meetmed iseeneslikult kasvama läinud kartuli- ja tomatitaimede ja muude organismi looduslikult esinevate peremeestaimede kõrvaldamiseks, kui neid esineb, ning viiakse sobival ajal läbi kasvavate taimede ametlik kontroll, samuti tehakse kartuli puhul koristatud mugulate ametlik analüüsimine vastavalt II lisas esitatud menetlusele; |
| --- | --- |

—

kõigil eelmistes taanetes viidatud kasvatusaastatel võetakse meetmed iseeneslikult kasvama läinud kartuli- ja tomatitaimede ja muude organismi looduslikult esinevate peremeestaimede kõrvaldamiseks, kui neid esineb, ning viiakse sobival ajal läbi kasvavate taimede ametlik kontroll, samuti tehakse kartuli puhul koristatud mugulate ametlik analüüsimine vastavalt II lisas esitatud menetlusele;

| c) | viivitamata pärast saastunuks tunnistamist vastavalt artikli 5 lõike 1 punkti a alapunktile ii ning pärast esimest sellele järgnevat kasvuaastat,






  — | kõik tootmiskohas ja kartuli- või tomatikasvatusel kasutatud masinad ja ladustamisrajatised puhastatakse ning vajaduse korral desinfitseeritakse, kasutades nõuetekohaseid meetodeid, mida on kirjeldatud punktis 3, |
| --- | --- | --- |

c)

viivitamata pärast saastunuks tunnistamist vastavalt artikli 5 lõike 1 punkti a alapunktile ii ning pärast esimest sellele järgnevat kasvuaastat,

—

kõik tootmiskohas ja kartuli- või tomatikasvatusel kasutatud masinad ja ladustamisrajatised puhastatakse ning vajaduse korral desinfitseeritakse, kasutades nõuetekohaseid meetodeid, mida on kirjeldatud punktis 3,

| — | ametlikult kontrollitakse kastmis- ja niisutamiskavasid ning vajaduse korral need keelatakse, et vältida organismi levikut; |
| --- | --- |

—

ametlikult kontrollitakse kastmis- ja niisutamiskavasid ning vajaduse korral need keelatakse, et vältida organismi levikut;

| d) | artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel saastunuks tunnistatud kaitstud tootmisala osal, kus on võimalik kasvusubstraadi täielik vahetus,






  — | on kartulimugulate, -taimede ja -seemnete või muude organismi peremeestaimede, sh tomatitaimede ja -seemnete mahapanek, istutamine või külvamine lubatud, kui tootmisala osal on kehtestatud ametlikud järelevalvemeetmed organismi kõrvaldamiseks ja kõikide organismi peremeestaimede kõrvaldamiseks, sh täielikuks kasvusubstraadi vahetamiseks ja kõnealuse tootmisala osa ja kõikide seadmete põhjalikuks puhastamiseks ning vajaduse korral desinfitseerimiseks, ning millel seejärel on vastutavad ametiasutused lubanud toota kartuleid või tomateid,
  ning |
| --- | --- | --- |

d)

artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel saastunuks tunnistatud kaitstud tootmisala osal, kus on võimalik kasvusubstraadi täielik vahetus,

—

on kartulimugulate, -taimede ja -seemnete või muude organismi peremeestaimede, sh tomatitaimede ja -seemnete mahapanek, istutamine või külvamine lubatud, kui tootmisala osal on kehtestatud ametlikud järelevalvemeetmed organismi kõrvaldamiseks ja kõikide organismi peremeestaimede kõrvaldamiseks, sh täielikuks kasvusubstraadi vahetamiseks ja kõnealuse tootmisala osa ja kõikide seadmete põhjalikuks puhastamiseks ning vajaduse korral desinfitseerimiseks, ning millel seejärel on vastutavad ametiasutused lubanud toota kartuleid või tomateid,

ning

| — | kasvatatakse kartuleid sertifitseeritud seemnekartulist või minimugulatest või mikrotaimedest, mis pärinevad kontrollitud allikatest, |
| --- | --- |

—

kasvatatakse kartuleid sertifitseeritud seemnekartulist või minimugulatest või mikrotaimedest, mis pärinevad kontrollitud allikatest,

| — | kasvatatakse tomateid direktiivi 2000/29/EÜ nõuetele vastavast seemnest või, vegetatiivse paljundusviisi puhul, niisugusest seemnest saadud ja ametliku kontrolli all kasvatatud taimedest, |
| --- | --- |

—

kasvatatakse tomateid direktiivi 2000/29/EÜ nõuetele vastavast seemnest või, vegetatiivse paljundusviisi puhul, niisugusest seemnest saadud ja ametliku kontrolli all kasvatatud taimedest,

| — | kontrollitakse ametlikult kastmis- ja niisutamiskavasid ning vajaduse korral need keelatakse, et vältida organismi levikut. |
| --- | --- |

—

kontrollitakse ametlikult kastmis- ja niisutamiskavasid ning vajaduse korral need keelatakse, et vältida organismi levikut.

| 4.2. | Ilma et see piiraks punktis 4.1 määratletud meetmeid, peavad liikmesriigid piiritletud tsoonis






  a) | tagama, et vahetult pärast saastunuks tunnistamist kõik niisuguste kartuli- või tomatikasvatusettevõtete masinad ja ladustamisseadmed nõuetekohaselt puhastatakse ja desinfitseeritakse, kasutades punktis 3 määratletud asjakohaseid meetodeid; |
| --- | --- | --- |

4.2.

Ilma et see piiraks punktis 4.1 määratletud meetmeid, peavad liikmesriigid piiritletud tsoonis

a)

tagama, et vahetult pärast saastunuks tunnistamist kõik niisuguste kartuli- või tomatikasvatusettevõtete masinad ja ladustamisseadmed nõuetekohaselt puhastatakse ja desinfitseeritakse, kasutades punktis 3 määratletud asjakohaseid meetodeid;

| b) | viivitamata ja vähemalt kolme kasvatushooaja jooksul pärast saastunuks tunnistamist






  ba) | juhtudel, kui piiritletud tsoon on kindlaks määratud artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti iv alusel,






  — | tagama oma vastutavate ametiasutuste järelevalve kartulimugulate või tomatite kasvatus-, ladustamis- või käitlemisettevõtetes ning ettevõtetes, kus kasutatakse kartuli- või tomatikasvatusseadmeid lepingu alusel, |
| --- | --- | --- | --- |

b)

viivitamata ja vähemalt kolme kasvatushooaja jooksul pärast saastunuks tunnistamist

ba)

juhtudel, kui piiritletud tsoon on kindlaks määratud artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti iv alusel,

—

tagama oma vastutavate ametiasutuste järelevalve kartulimugulate või tomatite kasvatus-, ladustamis- või käitlemisettevõtetes ning ettevõtetes, kus kasutatakse kartuli- või tomatikasvatusseadmeid lepingu alusel,

| — | nõudma selles tsoonis kartuli tootmiseks ainult sertifitseeritud seemnekartuli või sellise seemnekartuli mahapanemist, mida on kasvatatud ametliku kontrolli all, ning pärast saagikoristust selle seemnekartuli analüüsimist, mis on kasvatatud artikli 5 lõike 1 punkti a alapunktile iii alusel tõenäoliselt saastunuks tunnistatud kohtades, |
| --- | --- |

—

nõudma selles tsoonis kartuli tootmiseks ainult sertifitseeritud seemnekartuli või sellise seemnekartuli mahapanemist, mida on kasvatatud ametliku kontrolli all, ning pärast saagikoristust selle seemnekartuli analüüsimist, mis on kasvatatud artikli 5 lõike 1 punkti a alapunktile iii alusel tõenäoliselt saastunuks tunnistatud kohtades,

| — | nõudma koristatud seemnekartuli varude tarbekartulist eraldi käitlemist kõikides ettevõtetes selles tsoonis või seemnekartuli ja tarbekartuli käitlemise vahel puhastamist ja vajaduse korral desinfitseerimist, |
| --- | --- |

—

nõudma koristatud seemnekartuli varude tarbekartulist eraldi käitlemist kõikides ettevõtetes selles tsoonis või seemnekartuli ja tarbekartuli käitlemise vahel puhastamist ja vajaduse korral desinfitseerimist,

| — | nõudma, et kõnealuses tsoonis istutataks kogu saagi saamiseks üksnes selliseid tomatitaimi, mis on kasvatatud direktiivi 2000/29/EÜ nõuetele vastavast seemnest või, vegetatiivse paljundusviisi puhul, toodetud niisugusest seemnest saadud taimedest ja kasvatatud ametliku kontrolli all, |
| --- | --- |

—

nõudma, et kõnealuses tsoonis istutataks kogu saagi saamiseks üksnes selliseid tomatitaimi, mis on kasvatatud direktiivi 2000/29/EÜ nõuetele vastavast seemnest või, vegetatiivse paljundusviisi puhul, toodetud niisugusest seemnest saadud taimedest ja kasvatatud ametliku kontrolli all,

| — | viima läbi artikli 2 lõikes 1 määratletud ametliku seire; |
| --- | --- |

—

viima läbi artikli 2 lõikes 1 määratletud ametliku seire;

| bb) | juhtudel, kui pinnavesi on saastunuks tunnistatud artikli 5 lõike 1 punkti c alapunkti ii alusel või on organismi võimaliku leviku allikaks vastavalt V lisa punktile 2,






  — | viima läbi iga-aastase seire asjakohasel ajal, sh proovide võtmise pinnaveest ja vastavatest organismi maavitsalistest peremeestaimedest, mis on seotud vastavate veeallikatega, ja tegema analüüsid kooskõlas II lisas sätestatud asjakohaste meetoditega loetletud taimematerjali puhul ja muudel juhtudel, |
| --- | --- | --- |

bb)

juhtudel, kui pinnavesi on saastunuks tunnistatud artikli 5 lõike 1 punkti c alapunkti ii alusel või on organismi võimaliku leviku allikaks vastavalt V lisa punktile 2,

—

viima läbi iga-aastase seire asjakohasel ajal, sh proovide võtmise pinnaveest ja vastavatest organismi maavitsalistest peremeestaimedest, mis on seotud vastavate veeallikatega, ja tegema analüüsid kooskõlas II lisas sätestatud asjakohaste meetoditega loetletud taimematerjali puhul ja muudel juhtudel,

| — | kehtestama kastmis- ja niisutuskavade ametliku kontrolli, sh keelama saastunuks tunnistatud vee kasutamise loetletud taimse materjali ja vajaduse korral muude peremeestaimede kastmiseks ja niisutamiseks, et vältida organismi levikut. Selle keelu võib uuesti läbi vaadata, toetudes iga-aastasel seirel saadud tulemustele ning tühistamisotsustele, kui vastutavad ametiasutused leiavad, et pinnavesi ei ole enam saastunud. Keelu all olevat vett võib ametliku kontrolli all kasutada peremeestaimede kastmiseks ja niisutamiseks, kui kasutatakse ametlikult heaks kiidetud meetodeid, mis kõrvaldavad organismi ja väldivad tema levikut, |
| --- | --- |

—

kehtestama kastmis- ja niisutuskavade ametliku kontrolli, sh keelama saastunuks tunnistatud vee kasutamise loetletud taimse materjali ja vajaduse korral muude peremeestaimede kastmiseks ja niisutamiseks, et vältida organismi levikut. Selle keelu võib uuesti läbi vaadata, toetudes iga-aastasel seirel saadud tulemustele ning tühistamisotsustele, kui vastutavad ametiasutused leiavad, et pinnavesi ei ole enam saastunud. Keelu all olevat vett võib ametliku kontrolli all kasutada peremeestaimede kastmiseks ja niisutamiseks, kui kasutatakse ametlikult heaks kiidetud meetodeid, mis kõrvaldavad organismi ja väldivad tema levikut,

| — | juhtudel, kui vedelate jäätmete äravoolukohad on saastunud, tuleb kehtestada ametlik kontroll loetletud taimset materjali kasutava töötleva tööstuse või pakendamiskohtade tahkete või vedelate jäätmete kõrvaldamiseks; |
| --- | --- |

—

juhtudel, kui vedelate jäätmete äravoolukohad on saastunud, tuleb kehtestada ametlik kontroll loetletud taimset materjali kasutava töötleva tööstuse või pakendamiskohtade tahkete või vedelate jäätmete kõrvaldamiseks;

| c) | kehtestama vajaduse korral kava kõikide seemnekartulivarude asendamiseks asjakohase ajavahemiku jooksul. |
| --- | --- |

c)

kehtestama vajaduse korral kava kõikide seemnekartulivarude asendamiseks asjakohase ajavahemiku jooksul.

VII LISA

Ametlikult heaks kiidetud jäätmete kõrvaldamise meetodid, millele on osutatud VI lisa lõike 1 neljandas taandes, peavad organismi levikuohu vältimiseks vastama järgmistele tingimustele:

| i) | kartulite ja tomatite töötlemisjäätmed (sh väljapraagitud kartulid, kartulikoored ja tomatid) ning muud kartulite ja tomatitega seotud tahked jäätmed (sh pinnas, kivid ja muu prügi) tuleb kas






  — | kõrvaldada ametlikult heaks kiidetud jäätmekäitluskohas, kus ei teki organismi keskkonda pääsemise identifitseeritavat riski nt põllumajandusmaasse imbumise või põllumaa kastmiseks kasutatava veega kokkupuutumise kaudu. Jäätmed tuleb toimetada otse jäätmekäitluskohta sellistes isoleeritud tingimustes, et ei ole ohtu jäätmete kadumiseks,
  või |
| --- | --- | --- |

i)

kartulite ja tomatite töötlemisjäätmed (sh väljapraagitud kartulid, kartulikoored ja tomatid) ning muud kartulite ja tomatitega seotud tahked jäätmed (sh pinnas, kivid ja muu prügi) tuleb kas

—

kõrvaldada ametlikult heaks kiidetud jäätmekäitluskohas, kus ei teki organismi keskkonda pääsemise identifitseeritavat riski nt põllumajandusmaasse imbumise või põllumaa kastmiseks kasutatava veega kokkupuutumise kaudu. Jäätmed tuleb toimetada otse jäätmekäitluskohta sellistes isoleeritud tingimustes, et ei ole ohtu jäätmete kadumiseks,

või

| — | tuhastada
  või |
| --- | --- |

—

tuhastada

või

| — | kõrvaldada muid meetmeid kasutades, tingimusel et on kindlaks tehtud, et ei ole organismi leviku identifitseeritavat ohtu; sellistest meetmetest ja nende põhjendustest tuleb teatada komisjonile ja teistele liikmesriikidele; |
| --- | --- |

—

kõrvaldada muid meetmeid kasutades, tingimusel et on kindlaks tehtud, et ei ole organismi leviku identifitseeritavat ohtu; sellistest meetmetest ja nende põhjendustest tuleb teatada komisjonile ja teistele liikmesriikidele;

| ii) | vedelad jäätmed: enne äravoolu tuleb hõljuvaineid sisaldavad vedelad jäätmed filtreerida või setitada selliste ainete eemaldamiseks. Need ained tuleb kõrvaldada vastavalt lõigus i sätestatule.
  Vedelad jäätmed tuleb seejärel kas






  — | enne kõrvaldamist kuumutada vähemalt temperatuurini 60 °C vähemalt 30 minuti jooksul
  või |
| --- | --- | --- |

ii)

vedelad jäätmed: enne äravoolu tuleb hõljuvaineid sisaldavad vedelad jäätmed filtreerida või setitada selliste ainete eemaldamiseks. Need ained tuleb kõrvaldada vastavalt lõigus i sätestatule.

Vedelad jäätmed tuleb seejärel kas

—

enne kõrvaldamist kuumutada vähemalt temperatuurini 60 °C vähemalt 30 minuti jooksul

või

| — | kõrvaldada muul ametlikult heaks kiidetud viisil ja ametliku järelevalve all, nii et ei ole identifitseeritavat riski jäätmete kokkupuuteks põllumajandusmaaga või veega, mida võidakse kasutada põllumajandusmaade kastmiseks. Nende meetmete üksikasjadest teavitatakse teisi liikmesriike ja komisjoni. |
| --- | --- |

—

kõrvaldada muul ametlikult heaks kiidetud viisil ja ametliku järelevalve all, nii et ei ole identifitseeritavat riski jäätmete kokkupuuteks põllumajandusmaaga või veega, mida võidakse kasutada põllumajandusmaade kastmiseks. Nende meetmete üksikasjadest teavitatakse teisi liikmesriike ja komisjoni.

Käesolevas lisas kirjeldatud võimalusi kohaldatakse ka saastunud partiide käitlemise, kõrvaldamise ja töötlemisega seotud jäätmete suhtes.

---

(1)  Vt Lelliott ja Stead (1987).

1

(2)  Kontaktteadurid – vt veebileht http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

2

http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

(3)  Kasutatakse R. solanacearum’i biotüübi 2 (rassi 3) standardse referenttüvena.

3

R. solanacearum

(4)  Seroloogilistes analüüsides (IF ja/või ELISA) võimalik tüve ristuv reageerimine polüklonaalsete antiseerumitega.

4

(5)  Tüvi, millest mõnes laboris võib amplifitseerida sama suurusega PCR produkte kui spetsiifiliste praimerite OLI-1 ja Y-2 kasutamisel (vt 6. liide).

5

(6)  Reageerib ristuvalt tõenäoliselt enamikus analüüsides, kuid teadaolevalt esineb vaid banaanidel Indoneesias.

6

(7)  Kasutamiseks ekstraktsioonimenetluses homogeenimise teel.

7

(8)  Meetod valideeriti, kasutades Perkin Elmeri (AmpliTaq) ja Gibco BRL Taq-polümeraasi.

8

(9)  Meetodid valideeriti, kasutades Perkin Elmeri (AmpliTaq) ja Gibco BRL Taq-polümeraasi.

9

Märkus: Algselt optimeeritud kasutamiseks Gibco Taq-polümeraasiga termotsükleris MJ Research PTC 200.

Märkus:

Kasutada võib ka Perkin Elmer AmpliTaqi ja puhvrit samades kontsentratsioonides.

(10)  Meetodid valideeriti, kasutades Perkin Elmeri (AmpliTaq) ja Gibco BRL Taq-polümeraasi.

10

(11)  Kartuli basaalsete tipusüdamike ekstrakti puhul optimeeriti praimerite Ns-5-F ja Ns-6-R kontsentratsioonid, kasutades homogeenimismeetodit ja DNA puhastamist vastavalt Pastrikule (2000) (vt VI jao punkt A.6.1.a). Kui kasutatakse loksutamise teel DNA ekstraheerimist või muid isoleerimismeetodeid, on vaja reaktiivikontsentratsioonid uuesti optimeerida.

11

(12)  Meetodid on valideeritud, kasutades Perkin Elmeri (AmpliTaq) ja Gibco BRL Taq-polümeraasi.

12

(13)  Meetodid on valideeritud, kasutades Perkin Elmeri (AmpliTaq) ja Gibco BRL Taq-polümeraasi.

13

---

| 27.7.2006 | ET | Euroopa Liidu Teataja | L 206/107 |
| --- | --- | --- | --- |

27.7.2006

ET

Euroopa Liidu Teataja

L 206/107

---

KOMISJONI DIREKTIIV 2006/64/EÜ,

18. juuli 2006,

millega muudetakse nõukogu direktiivi 91/414/EMÜ klopüraliidi, tsüprodiniili, fosetüüli ja trineksapaki lisamisega toimeainete hulka

(EMPs kohaldatav tekst)

EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON,

võttes arvesse Euroopa Ühenduse asutamislepingut,

võttes arvesse nõukogu 15. juuli 1991. aasta direktiivi 91/414/EMÜ taimekaitsevahendite turuleviimise kohta, (1) eriti selle artikli 6 lõiget 1,

ning arvestades järgmist:

| (1) | Komisjoni määrustega (EÜ) nr 451/2000 (2) ja (EÜ) nr 703/2001 (3) on sätestatud direktiivi 91/414/EMÜ artikli 8 lõikes 2 nimetatud tööprogrammi teise etapi üksikasjalikud rakenduseeskirjad ning kehtestatud hindamisele kuuluvate toimeainete nimekiri nende võimalikuks kandmiseks direktiivi 91/414/EMÜ I lisasse. Selles nimekirjas on ka klopüraliid, tsüprodiniil, fosetüül ja trineksapak. |
| --- | --- |

(1)

Komisjoni määrustega (EÜ) nr 451/2000 (2) ja (EÜ) nr 703/2001 (3) on sätestatud direktiivi 91/414/EMÜ artikli 8 lõikes 2 nimetatud tööprogrammi teise etapi üksikasjalikud rakenduseeskirjad ning kehtestatud hindamisele kuuluvate toimeainete nimekiri nende võimalikuks kandmiseks direktiivi 91/414/EMÜ I lisasse. Selles nimekirjas on ka klopüraliid, tsüprodiniil, fosetüül ja trineksapak.

| (2) | Nende toimeainete mõju inimese tervisele ja keskkonnale on hinnatud vastavalt määrustes (EÜ) nr 451/2000 ja (EÜ) nr 703/2001 sätestatud korrale mitmete teavitaja kavandatud kasutusalade puhul. Kõnealuste määrustega on määratud ka referentliikmesriigid, kes esitavad asjaomased hindamisaruanded ja soovitused Euroopa Toiduohutusametile (EFSA) vastavalt määruse (EÜ) nr 451/2000 artikli 8 lõikele 1. Klopüraliidi puhul oli referentliikmesriik Soome ja kogu asjaomane teave esitati 2. detsembril 2003. Tsüprodiniili ja fosetüüli puhul oli referentliikmesriik Prantsusmaa ja kogu asjaomane teave esitati vastavalt 16. jaanuaril 2004 ja 20. oktoobril 2003. Trineksapaki puhul oli referentliikmesriik Madalmaad ja kogu asjaomane teave esitati 7. novembril 2003. |
| --- | --- |

(2)

Nende toimeainete mõju inimese tervisele ja keskkonnale on hinnatud vastavalt määrustes (EÜ) nr 451/2000 ja (EÜ) nr 703/2001 sätestatud korrale mitmete teavitaja kavandatud kasutusalade puhul. Kõnealuste määrustega on määratud ka referentliikmesriigid, kes esitavad asjaomased hindamisaruanded ja soovitused Euroopa Toiduohutusametile (EFSA) vastavalt määruse (EÜ) nr 451/2000 artikli 8 lõikele 1. Klopüraliidi puhul oli referentliikmesriik Soome ja kogu asjaomane teave esitati 2. detsembril 2003. Tsüprodiniili ja fosetüüli puhul oli referentliikmesriik Prantsusmaa ja kogu asjaomane teave esitati vastavalt 16. jaanuaril 2004 ja 20. oktoobril 2003. Trineksapaki puhul oli referentliikmesriik Madalmaad ja kogu asjaomane teave esitati 7. novembril 2003.

| (3) | Liikmesriikide ja Euroopa Toiduohutusameti eksperdid on hindamisaruanded läbi vaadanud ning esitanud need komisjonile 14. detsembril 2005 Euroopa Toiduohutusameti teaduslike aruannetena klopüraliidi, tsüprodiniili, fosetüüli ja trineksapaki kohta (4) Liikmesriigid ja komisjon vaatasid kõnealused aruanded läbi toiduahela ja loomatervishoiu alalises komitees ning need vormistati 4. aprillil 2006 komisjoni läbivaatamisaruandena klopüraliidi, tsüprodiniili, fosetüüli ja trineksapaki kohta. |
| --- | --- |

(3)

Liikmesriikide ja Euroopa Toiduohutusameti eksperdid on hindamisaruanded läbi vaadanud ning esitanud need komisjonile 14. detsembril 2005 Euroopa Toiduohutusameti teaduslike aruannetena klopüraliidi, tsüprodiniili, fosetüüli ja trineksapaki kohta (4) Liikmesriigid ja komisjon vaatasid kõnealused aruanded läbi toiduahela ja loomatervishoiu alalises komitees ning need vormistati 4. aprillil 2006 komisjoni läbivaatamisaruandena klopüraliidi, tsüprodiniili, fosetüüli ja trineksapaki kohta.

| (4) | Mitmest senisest uuringust on ilmnenud, et klopüraliidi, tsüprodiniili, fosetüüli ja trineksapakki sisaldavad taimekaitsevahendid võivad eeldatavalt üldjoontes vastata direktiivi 91/414/EMÜ artikli 5 lõike 1 punktides a ja b sätestatud nõuetele eelkõige komisjoni läbivaatamisaruannetes uuritud ja üksikasjalikult kirjeldatud kasutusviiside puhul. Seetõttu on asjakohane lisada kõnealused toimeained I lisasse, et kõigis liikmesriikides oleks võimalik kõnealuse direktiivi sätete alusel anda välja load neid toimeaineid sisaldavate taimekaitsevahendite kasutamiseks. |
| --- | --- |

(4)

Mitmest senisest uuringust on ilmnenud, et klopüraliidi, tsüprodiniili, fosetüüli ja trineksapakki sisaldavad taimekaitsevahendid võivad eeldatavalt üldjoontes vastata direktiivi 91/414/EMÜ artikli 5 lõike 1 punktides a ja b sätestatud nõuetele eelkõige komisjoni läbivaatamisaruannetes uuritud ja üksikasjalikult kirjeldatud kasutusviiside puhul. Seetõttu on asjakohane lisada kõnealused toimeained I lisasse, et kõigis liikmesriikides oleks võimalik kõnealuse direktiivi sätete alusel anda välja load neid toimeaineid sisaldavate taimekaitsevahendite kasutamiseks.

| (5) | Ilma et see piiraks seda järeldust, on klopüraliidi, tsüprodiniili ja fosetüüli puhul vaja koguda edasist teavet üksikute küsimuste kohta. Direktiivi 91/414/EMÜ artikli 6 lõikes 1 on sätestatud, et toimeaine kandmisel I lisasse võib kohaldada tingimusi. Seetõttu on asjakohane nõuda, et klopüraliidi, tsüprodiniili, fosetüüli ja trineksapakki tuleks veel edasi uurida, et kinnitada ohuhinnangu mõnda punkti, ja teavitajad peaksid esitama vastavad uuringud. |
| --- | --- |

(5)

Ilma et see piiraks seda järeldust, on klopüraliidi, tsüprodiniili ja fosetüüli puhul vaja koguda edasist teavet üksikute küsimuste kohta. Direktiivi 91/414/EMÜ artikli 6 lõikes 1 on sätestatud, et toimeaine kandmisel I lisasse võib kohaldada tingimusi. Seetõttu on asjakohane nõuda, et klopüraliidi, tsüprodiniili, fosetüüli ja trineksapakki tuleks veel edasi uurida, et kinnitada ohuhinnangu mõnda punkti, ja teavitajad peaksid esitama vastavad uuringud.

| (6) | Tuleks ette näha mõistlik ajavahemik enne toimeaine I lisasse kandmist, et liikmesriigid ja huvitatud isikud saaksid valmistuda sellest tulenevate uute tingimuste täitmiseks. |
| --- | --- |

(6)

Tuleks ette näha mõistlik ajavahemik enne toimeaine I lisasse kandmist, et liikmesriigid ja huvitatud isikud saaksid valmistuda sellest tulenevate uute tingimuste täitmiseks.

| (7) | Ilma et see piiraks direktiiviga 91/414/EMÜ kindlaks määratud kohustusi, mis kaasnevad toimeaine kandmisega I lisasse, tuleks pärast toimeaine loetelusse kandmist anda liikmesriikidele kuus kuud klopüraliidi, tsüprodiniili, fosetüüli ja trineksapakki sisaldavate taimekaitsevahendite kehtivate kasutuslubade läbivaatamiseks, et tagada direktiivis 91/414/EMÜ, eriti selle artiklis 13 sätestatud nõuete ja I lisas esitatud tingimuste täitmine. Liikmesriigid peaksid kehtivaid kasutuslube direktiivi 91/414/EMÜ kohaselt muutma, need asendama või tühistama. Eespool esitatud tähtaja erandina tuleks ette näha pikem ajavahemik täieliku III lisas ettenähtud toimiku esitamiseks iga taimekaitsevahendi iga kavandatud kasutusviisi kohta ja nende toimikute hindamiseks direktiivis 91/414/EMÜ sätestatud ühtsete põhimõtete alusel. |
| --- | --- |

(7)

Ilma et see piiraks direktiiviga 91/414/EMÜ kindlaks määratud kohustusi, mis kaasnevad toimeaine kandmisega I lisasse, tuleks pärast toimeaine loetelusse kandmist anda liikmesriikidele kuus kuud klopüraliidi, tsüprodiniili, fosetüüli ja trineksapakki sisaldavate taimekaitsevahendite kehtivate kasutuslubade läbivaatamiseks, et tagada direktiivis 91/414/EMÜ, eriti selle artiklis 13 sätestatud nõuete ja I lisas esitatud tingimuste täitmine. Liikmesriigid peaksid kehtivaid kasutuslube direktiivi 91/414/EMÜ kohaselt muutma, need asendama või tühistama. Eespool esitatud tähtaja erandina tuleks ette näha pikem ajavahemik täieliku III lisas ettenähtud toimiku esitamiseks iga taimekaitsevahendi iga kavandatud kasutusviisi kohta ja nende toimikute hindamiseks direktiivis 91/414/EMÜ sätestatud ühtsete põhimõtete alusel.

| (8) | Kogemused komisjoni määruse (EMÜ) nr 3600/92 (5) raames hinnatud toimeainete direktiivi 91/414/EMÜ I lisasse kandmisega näitavad, et võib tekkida raskusi küsimuses, kuidas tõlgendada kehtiva kasutusloa valdaja kohustust võimaldada juurdepääs andmetele. Raskuste vältimiseks tulevikus on vaja täpsustada liikmesriikide kohustusi, eelkõige kohustust kontrollida, et loaomanik võimaldab juurdepääsu toimikule, mis vastab kõnealuse direktiivi II lisa nõuetele. Täpsustamine ei too siiski liikmesriikidele ega loaomanikele kaasa uusi kohustusi, võrreldes I lisa muutmiseks seni vastu võetud direktiividega. |
| --- | --- |

(8)

Kogemused komisjoni määruse (EMÜ) nr 3600/92 (5) raames hinnatud toimeainete direktiivi 91/414/EMÜ I lisasse kandmisega näitavad, et võib tekkida raskusi küsimuses, kuidas tõlgendada kehtiva kasutusloa valdaja kohustust võimaldada juurdepääs andmetele. Raskuste vältimiseks tulevikus on vaja täpsustada liikmesriikide kohustusi, eelkõige kohustust kontrollida, et loaomanik võimaldab juurdepääsu toimikule, mis vastab kõnealuse direktiivi II lisa nõuetele. Täpsustamine ei too siiski liikmesriikidele ega loaomanikele kaasa uusi kohustusi, võrreldes I lisa muutmiseks seni vastu võetud direktiividega.

| (9) | Seepärast on asjakohane direktiivi 91/414/EMÜ vastavalt muuta. |
| --- | --- |

(9)

Seepärast on asjakohane direktiivi 91/414/EMÜ vastavalt muuta.

| (10) | Käesoleva direktiiviga ettenähtud meetmed on kooskõlas toiduahela ja loomatervishoiu alalise komitee arvamusega, |
| --- | --- |

(10)

Käesoleva direktiiviga ettenähtud meetmed on kooskõlas toiduahela ja loomatervishoiu alalise komitee arvamusega,

ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA DIREKTIIVI:

Artikkel 1

Direktiivi 91/414/EMÜ I lisa muudetakse vastavalt käesoleva direktiivi lisale.

Artikkel 2

Liikmesriigid võtavad vastu ja avaldavad käesoleva direktiivi järgimiseks vajalikud õigusnormid hiljemalt 31. oktoobriks 2007. Nad edastavad kõnealuste õigusnormide teksti ning kõnealuste normide ja käesoleva direktiivi vahelise vastavustabeli viivitamata komisjonile.

Liikmesriigid kohaldavad neid sätteid alates 1. novembrist 2007.

Kui liikmesriigid need normid vastu võtavad, lisavad nad nendesse või nende ametliku avaldamise korral nende juurde viite käesolevale direktiivile. Sellise viitamise viisi näevad ette liikmesriigid.

Artikkel 3

1.   Liikmesriigid muudavad või tühistavad vajaduse korral direktiivi 91/414/EMÜ kohaselt toimeainetena klopüraliidi, tsüprodiniili, fosetüüli ja trineksapakki sisaldavate taimekaitsevahendite praegused load 31. oktoobriks 2007.

Eelkõige kontrollivad nad nimetatud tähtpäevaks, kas kõnealuse direktiivi I lisas klopüraliidi, tsüprodiniili, fosetüüli ja trineksapaki suhtes sätestatud tingimused on täidetud, välja arvatud kõnealuseid toimeaineid käsitleva kande B-osas nimetatud tingimused, ning kas loa valdajal on kõnealuse direktiivi artikli 13 tingimuste kohaselt olemas II lisa nõuetele vastav toimik või juurdepääs sellele.

2.   Erandina lõikest 1 viivad liikmesriigid iga lubatud taimekaitsevahendi puhul, mis sisaldab klopüraliidi, tsüprodiniili, fosetüüli või trineksapakki ainsa toimeainena või ühena mitmest toimeainest, mis kõik on hiljemalt 30. aprilliks 2007 kantud direktiivi 91/414/EMÜ I lisa loetelusse, läbi toote uue hindamise direktiivi 91/414/EMÜ VI lisas sätestatud ühtsete põhimõtete alusel, kõnealuse direktiivi III lisa nõuetele vastava toimiku põhjal ning arvestades kõnealuse direktiivi I lisa klopüraliidi, tsüprodiniili, fosetüüli ja trineksapakki käsitlevate kannete B-osa. Kõnealuse hindamise põhjal määravad nad kindlaks, kas toode vastab direktiivi 91/414/EMÜ artikli 4 lõike 1 punktides b, c, d ja e sätestatud tingimustele.

Pärast kindlaksmääramist liikmesriigid:

| a) | muudavad või tühistavad vajaduse korral klopüraliidi, tsüprodiniili, fosetüüli või trineksapakki kui ainsat toimeainet sisaldava toote puhul toote kasutusloa hiljemalt 30. aprilliks 2011,
  või |
| --- | --- |

a)

muudavad või tühistavad vajaduse korral klopüraliidi, tsüprodiniili, fosetüüli või trineksapakki kui ainsat toimeainet sisaldava toote puhul toote kasutusloa hiljemalt 30. aprilliks 2011,

või

| b) | kui vahend sisaldab klopüraliidi, tsüprodiniili, fosetüüli või trineksapakki ühena mitmest toimeainest, muudavad vajaduse korral luba või tühistavad selle hiljemalt 30. aprilliks 2011 või kuupäevaks, mis on ette nähtud loa muutmiseks või tühistamiseks vastavas direktiivis või vastavates direktiivides, millega asjaomane toimeaine või asjaomased toimeained on kantud direktiivi 91/414/EMÜ I lisasse, olenevalt sellest, kumb kuupäev on hilisem. |
| --- | --- |

b)

kui vahend sisaldab klopüraliidi, tsüprodiniili, fosetüüli või trineksapakki ühena mitmest toimeainest, muudavad vajaduse korral luba või tühistavad selle hiljemalt 30. aprilliks 2011 või kuupäevaks, mis on ette nähtud loa muutmiseks või tühistamiseks vastavas direktiivis või vastavates direktiivides, millega asjaomane toimeaine või asjaomased toimeained on kantud direktiivi 91/414/EMÜ I lisasse, olenevalt sellest, kumb kuupäev on hilisem.

Artikkel 4

Käesolev direktiiv jõustub 1. mail 2007.

Artikkel 5

Käesolev direktiiv on adresseeritud liikmesriikidele.

Brüssel, 18. juuli 2006

Komisjoni nimel

komisjoni liige

Markos KYPRIANOU

---

(1)  EÜT L 230, 19.8.1991, lk 1. Direktiivi on viimati muudetud komisjoni direktiiviga 2006/45/EÜ (ELT L 130, 18.5.2006, lk 27).

1

(2)  EÜT L 55, 29.2.2000, lk 25. Määrust on viimati muudetud määrusega (EÜ) nr 1044/2003 (ELT L 151, 19.6.2003, lk 32).

2

(3)  EÜT L 98, 7.4.2001, lk 6.

3

(4)  EFSA teaduslik aruanne (2005) 50, 1-65, kokkuvõte pestitsiidse toimeaine klopüraliidi ohuanalüüsi hindamisest ekspertide poolt (valmimiskuupäev: 14. detsember 2005).

4

EFSA teaduslik aruanne (2005) 51, 1-78, kokkuvõte pestitsiidse toimeaine tsüprodiniili ohuanalüüsi hindamisest ekspertide poolt (valmimiskuupäev: 14. detsember 2005).

EFSA teaduslik aruanne (2005) 54, 1-79, kokkuvõte pestitsiidse toimeaine fosetüüli ohuanalüüsi hindamisest ekspertide poolt (valmimiskuupäev: 14. detsember 2005).

EFSA teaduslik aruanne (2005) 57, 1-70, kokkuvõte pestitsiidse toimeaine trineksapaki ohuanalüüsi hindamisest ekspertide poolt (valmimiskuupäev: 14. detsember 2005).

(5)  EÜT L 366, 15.12.1992, lk 10. Määrust on viimati muudetud määrusega (EÜ) nr 2266/2000 (EÜT L 259, 13.10.2000, lk 27).

5

---

LISA

Direktiivi 91/414/EMÜ I lisa tabeli lõppu lisatakse järgmine kanne.

| Nr | Tavanimetus, tunnuskoodid | Rahvusvahelise Puhta Keemia ja Rakenduskeemia Liidu (IUPAC) nimetus | Puhtus (1) | Jõustumiskuupäev | Loetellu kuulumise lõpptähtaeg | Erisätted |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| “131 | Klopüraliid
  CASi nr 1702-17-6
  CIPACi nr 455 | 3,6-dikloropüridiin-2-karboksüülhape | ≥ 950 g/kg | 1. mai 2007 | 30. aprill 2017 | A-OSA
  Lubatakse kasutada ainult herbitsiidina.
  B-OSA
  Kui liikmesriigid hindavad taotlust lubada kasutada klopüraliidi sisaldavat taimekaitsevahendit muuks otstarbeks kui kevadiseks kasutamiseks, pööravad nad erilist tähelepanu artikli 4 lõike 1 punktis b nimetatud kriteeriumidele ja tagavad, et enne kasutusloa andmist oleks esitatud kogu vajalik teave.
  VI lisa ühtsete põhimõtete rakendamisel võetakse arvesse 4. aprillil 2006 toiduahela ja loomatervishoiu alalises komitees klopüraliidi kohta koostatud hindamise aruande järeldusi, eelkõige selle I ja II lisa.
  Üldhindamisel peavad liikmesriigid pöörama erilist tähelepanu






  — | muude kui sihtrühma taimede ja põhjavee kaitsele ohualtides tingimustes. Vajaduse korral peaksid loa tingimused sisaldama riskide vähendamise meetmeid ning ohualtite alade suhtes tuleb käivitada kontrolliprogramme, et kontrollida kõnealuse aine sattumist põhjavette. |

Nr

Tavanimetus, tunnuskoodid

Rahvusvahelise Puhta Keemia ja Rakenduskeemia Liidu (IUPAC) nimetus

Puhtus (1)

Jõustumiskuupäev

Loetellu kuulumise lõpptähtaeg

Erisätted

“131

Klopüraliid

CASi nr 1702-17-6

CIPACi nr 455

3,6-dikloropüridiin-2-karboksüülhape

≥ 950 g/kg

1. mai 2007

30. aprill 2017

A-OSA

Lubatakse kasutada ainult herbitsiidina.

B-OSA

Kui liikmesriigid hindavad taotlust lubada kasutada klopüraliidi sisaldavat taimekaitsevahendit muuks otstarbeks kui kevadiseks kasutamiseks, pööravad nad erilist tähelepanu artikli 4 lõike 1 punktis b nimetatud kriteeriumidele ja tagavad, et enne kasutusloa andmist oleks esitatud kogu vajalik teave.

VI lisa ühtsete põhimõtete rakendamisel võetakse arvesse 4. aprillil 2006 toiduahela ja loomatervishoiu alalises komitees klopüraliidi kohta koostatud hindamise aruande järeldusi, eelkõige selle I ja II lisa.

Üldhindamisel peavad liikmesriigid pöörama erilist tähelepanu

—

muude kui sihtrühma taimede ja põhjavee kaitsele ohualtides tingimustes. Vajaduse korral peaksid loa tingimused sisaldama riskide vähendamise meetmeid ning ohualtite alade suhtes tuleb käivitada kontrolliprogramme, et kontrollida kõnealuse aine sattumist põhjavette.

Asjaomased liikmesriigid nõuavad lisauuringuid, et kinnitada tulemusi klopüraliidi metabolismi kohta loomade organismis. Nad tagavad, et teavitajad, kelle taotlusel lisati klopüraliid kõnealusesse lisasse, esitavad sellised uuringud komisjonile kahe aasta jooksul pärast käesoleva direktiivi jõustumist.

132

Tsüprodiniil

CASi nr 121522-61-2

CIPACi nr 511

(4-tsüklopropüül-6-metüül-pürimidiin-2-üül)fenüülamiin

≥ 980 g/kg

1. mai 2007

30. aprill 2017

A-OSA

Lubatakse kasutada üksnes fungitsiidina.

B-OSA

VI lisa ühtsete põhimõtete rakendamisel võetakse arvesse 4. aprillil 2006 toiduahela ja loomatervishoiu alalises komitees tsüprodiniili kohta koostatud hindamise aruande järeldusi, eelkõige selle I ja II lisa.

Üldhindamisel peavad liikmesriigid:

| — | pöörama erilist tähelepanu käitajate turvalisusele ja tagama, et kasutustingimustega nähtaks ette piisavad isikukaitsevahendid, |
| --- | --- |

—

pöörama erilist tähelepanu käitajate turvalisusele ja tagama, et kasutustingimustega nähtaks ette piisavad isikukaitsevahendid,

| — | pöörama erilist tähelepanu lindude, imetajate ja veeorganismide kaitsele. Loa väljaandmise tingimused peaksid sisaldama riskide vähendamise meetmeid, näiteks puhvervööndeid. |
| --- | --- |

—

pöörama erilist tähelepanu lindude, imetajate ja veeorganismide kaitsele. Loa väljaandmise tingimused peaksid sisaldama riskide vähendamise meetmeid, näiteks puhvervööndeid.

Asjaomased liikmesriigid nõuavad lisauuringuid selle kohta, kas on õigesti hinnatud riski lindudele ja imetajatele ning metaboliit CGA 304075 jääkide võimalikku esinemist loomset päritolu toidus. Nad tagavad, et teavitajad, kelle taotlusel lisati tsüprodiniil kõnealusesse lisasse, esitavad sellised uuringud komisjonile kahe aasta jooksul pärast käesoleva direktiivi jõustumist.

133

Fosetüül

CASi nr 15845-66-6

CIPACi nr 384

etüülvesinikfosfonaat

≥ 960 g/kg (väljendatuna fosetüül Al-na)

1. mai 2007

30. aprill 2017

A-OSA

Lubatakse kasutada üksnes fungitsiidina.

B-OSA

VI lisa ühtsete põhimõtete rakendamisel võetakse arvesse 4.aprillil 2006 toiduahela ja loomatervishoiu alalises komitees fosetüüli kohta koostatud hindamise aruande järeldusi, eelkõige selle I ja II lisa.

Üldhindamisel peavad liikmesriigid:

| — | pöörama erilist tähelepanu lindude, imetajate, veeorganismide ning lülijalgsete kaitsmisele. |
| --- | --- |

—

pöörama erilist tähelepanu lindude, imetajate, veeorganismide ning lülijalgsete kaitsmisele.

Loa väljaandmise tingimused peaksid vajaduse korral sisaldama riskide vähendamise meetmeid, näiteks puhvervööndeid.

Asjaomased liikmesriigid taotlevad edasiste uuringute tegemist, et kinnitada lülijalgsete (eelkõige nende välitingimustes taastumise kohta), ning taimtoiduliste imetajate suhtes tehtud ohuhinnangut. Nad tagavad, et teavitaja, kelle palvel fosetüül on kantud käesolevasse lisasse, esitab komisjonile sellised uuringud 2 aasta jooksul pärast selle direktiivi jõustumist.

134

Trineksapak

CASi nr 104273-73-6

CIPACi nr 732

4-(tsüklopropüül-hüdroksümetüleen)-3,5-diokso-tsükloheksaankarboksüülhape

≥ 940g/kg (väljendatuna etüül-trineksapakina)

1. mai 2007

30.aprill 2017

A-OSA

Lubatud kasutada ainult taimekasvuregulaatorina.

B-OSA

VI lisa ühtsete põhimõtete rakendamisel võetakse arvesse 4. aprillil 2006 toiduahela ja loomatervishoiu alalises komitees trineksapaki kohta koostatud hindamise aruande järeldusi, eelkõige selle I ja II lisa.

Sellisel üldisel hindamisel peavad liikmesriigid:

| — | pöörama erilist tähelepanu lindude ja imetajate kaitsele. |
| --- | --- |

—

pöörama erilist tähelepanu lindude ja imetajate kaitsele.

Loa tingimustes peab olema nõutud riskide vähendamise meetmete võtmist vajaduse korral.

---

(1)  Täiendavad andmed toimeainete identifitseerimiseks ja piiritlemiseks on esitatud hindamise aruandes.”

1

---