# Úradný vestník L 206/2006

| | ISSN 1725-5147 |
| --- | --- |
| Úradný vestník
  Európskej únie | L 206 |
| | |
| Slovenské vydanie | Právne predpisy | Zväzok 4927. júla 2006 |

ISSN 1725-5147

Úradný vestník

Európskej únie

L 206

Slovenské vydanie

Právne predpisy

Zväzok 4927. júla 2006

---

| Obsah | | I   Akty, ktorých uverejnenie je povinné | Strana |
| --- | --- | --- | --- |
| | * | Smernica Komisie 2006/60/ES zo 7. júla 2006, ktorou sa menia a dopĺňajú prílohy k smernici Rady 90/642/EHS, pokiaľ ide o maximálne hladiny rezíduí trifloxystrobínu, tiabendazolu, abamektínu, benomylu, karbendazímu, metyltiofanátu, myklobutanylu, glyfozátu, trimetylsulfónia, fenpropimorfu a chlormekvátu (
  1
  ) | 1 |
| | * | Smernica Komisie 2006/61/ES zo 7. júla 2006, ktorou sa menia a dopĺňajú smernice Rady 86/362/EHS, 86/363/EHS a 90/642/EHS, pokiaľ ide o maximálne hladiny rezíduí atrazínu, azinfos-etylu, cyflutrínu, etefónu, fentiónu, metamidofosu, metomylu, parakvátu a triazofosu (
  1
  ) | 12 |
| | * | Smernica Komisie 2006/62/ES z 12. júla 2006, ktorou sa menia a dopĺňajú prílohy k smerniciam Rady 76/895/EHS, 86/362/EHS, 86/363/EHS a 90/642/EHS, pokiaľ ide o maximálne hladiny rezíduí pre desmedifam, fenmedifam a chlorfenvinfos (
  1
  ) | 27 |
| | * | Smernica Komisie 2006/63/ES zo 14. júla 2006, ktorou sa menia a dopĺňajú prílohy II až VII k smernici Rady 98/57/ES o potláčaní choroby Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. | 36 |
| | * | Smernica Komisie 2006/64/ES z 18. júla 2006, ktorou sa mení a dopĺňa smernica Rady 91/414/EHS s cieľom zaradiť clopyralid, cyprodinil, fosetyl a trinexapac medzi účinné látky (
  1
  ) | 107 |

Obsah

I   Akty, ktorých uverejnenie je povinné

Strana

*

Smernica Komisie 2006/60/ES zo 7. júla 2006, ktorou sa menia a dopĺňajú prílohy k smernici Rady 90/642/EHS, pokiaľ ide o maximálne hladiny rezíduí trifloxystrobínu, tiabendazolu, abamektínu, benomylu, karbendazímu, metyltiofanátu, myklobutanylu, glyfozátu, trimetylsulfónia, fenpropimorfu a chlormekvátu (
  1
  )

1

1

*

Smernica Komisie 2006/61/ES zo 7. júla 2006, ktorou sa menia a dopĺňajú smernice Rady 86/362/EHS, 86/363/EHS a 90/642/EHS, pokiaľ ide o maximálne hladiny rezíduí atrazínu, azinfos-etylu, cyflutrínu, etefónu, fentiónu, metamidofosu, metomylu, parakvátu a triazofosu (
  1
  )

1

12

*

Smernica Komisie 2006/62/ES z 12. júla 2006, ktorou sa menia a dopĺňajú prílohy k smerniciam Rady 76/895/EHS, 86/362/EHS, 86/363/EHS a 90/642/EHS, pokiaľ ide o maximálne hladiny rezíduí pre desmedifam, fenmedifam a chlorfenvinfos (
  1
  )

1

27

*

Smernica Komisie 2006/63/ES zo 14. júla 2006, ktorou sa menia a dopĺňajú prílohy II až VII k smernici Rady 98/57/ES o potláčaní choroby Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

Ralstonia solanacearum

et al.

36

*

Smernica Komisie 2006/64/ES z 18. júla 2006, ktorou sa mení a dopĺňa smernica Rady 91/414/EHS s cieľom zaradiť clopyralid, cyprodinil, fosetyl a trinexapac medzi účinné látky (
  1
  )

1

107

| | |
| --- | --- |
| | (1)   Text s významom pre EHP. |

---

(1)   Text s významom pre EHP.

1

| SK | Akty, ktoré sú vytlačené obyčajným písmom, sa týkajú každodennej organizácie poľnohospodárskych záležitostí a sú spravidla platné len obmedzenú dobu.
  Názvy všetkých ostatných aktov sú vytlačené tučným písmom a je pred nimi hviezdička. |
| --- | --- |

SK

Akty, ktoré sú vytlačené obyčajným písmom, sa týkajú každodennej organizácie poľnohospodárskych záležitostí a sú spravidla platné len obmedzenú dobu.

Názvy všetkých ostatných aktov sú vytlačené tučným písmom a je pred nimi hviezdička.

---

I Akty, ktorých uverejnenie je povinné

| 27.7.2006 | SK | Úradný vestník Európskej únie | L 206/1 |
| --- | --- | --- | --- |

27.7.2006

SK

Úradný vestník Európskej únie

L 206/1

---

SMERNICA KOMISIE 2006/60/ES

zo 7. júla 2006,

ktorou sa menia a dopĺňajú prílohy k smernici Rady 90/642/EHS, pokiaľ ide o maximálne hladiny rezíduí trifloxystrobínu, tiabendazolu, abamektínu, benomylu, karbendazímu, metyltiofanátu, myklobutanylu, glyfozátu, trimetylsulfónia, fenpropimorfu a chlormekvátu

(Text s významom pre EHP)

KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV,

so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho spoločenstva,

so zreteľom na smernicu Rady 90/642/EHS z 27. novembra 1990 o stanovení maximálnych hladín pre rezíduá pesticídov v a na určitých produktoch rastlinného pôvodu vrátane ovocia a zeleniny (1), a najmä na jej článok 7,

so zreteľom na smernicu Rady 91/414/EHS z 15. júla 1991 o uvádzaní prípravkov na ochranu rastlín na trh (2), a najmä na jej článok 4 ods. 1 písm. f),

keďže:

| (1) | V súlade so smernicou 91/414/EHS sú za povolenia používať prípravky na ochranu rastlín pri osobitných plodinách zodpovedné členské štáty. Takéto povolenia musia byť založené na zhodnotení účinkov na ľudské zdravie a zdravie zvierat a vplyvu na životné prostredie. K faktorom, ktoré treba zohľadniť pri takýchto hodnoteniach, patrí vystavenie pracovníka a iných prítomných osôb pôsobeniu týchto prípravkov, ich vplyv na pôdu, vodu a vzduch, ako aj vplyv na ľudí a zvieratá prostredníctvom požitia rezíduí na ošetrených plodinách. |
| --- | --- |

(1)

V súlade so smernicou 91/414/EHS sú za povolenia používať prípravky na ochranu rastlín pri osobitných plodinách zodpovedné členské štáty. Takéto povolenia musia byť založené na zhodnotení účinkov na ľudské zdravie a zdravie zvierat a vplyvu na životné prostredie. K faktorom, ktoré treba zohľadniť pri takýchto hodnoteniach, patrí vystavenie pracovníka a iných prítomných osôb pôsobeniu týchto prípravkov, ich vplyv na pôdu, vodu a vzduch, ako aj vplyv na ľudí a zvieratá prostredníctvom požitia rezíduí na ošetrených plodinách.

| (2) | Maximálne hladiny rezíduí (MRL) odrážajú použitie minimálnych množstiev pesticídov na dosiahnutie efektívnej ochrany rastlín, ktoré sa aplikujú tak, aby množstvo rezíduí bolo najmä z hľadiska odhadovaného potravinového príjmu prakticky čo najmenšie a toxicky prijateľné. |
| --- | --- |

(2)

Maximálne hladiny rezíduí (MRL) odrážajú použitie minimálnych množstiev pesticídov na dosiahnutie efektívnej ochrany rastlín, ktoré sa aplikujú tak, aby množstvo rezíduí bolo najmä z hľadiska odhadovaného potravinového príjmu prakticky čo najmenšie a toxicky prijateľné.

| (3) | Maximálne hladiny rezíduí pesticídov, na ktoré sa vzťahuje smernica 90/642/EHS, sa majú neustále kontrolovať a môžu sa upravovať, aby sa zohľadnili nové alebo zmenené spôsoby použitia pesticídov. Informácie o nových alebo zmenených spôsoboch použitia pesticídov boli oznámené Komisii, a to bude mať za následok zmeny v hladinách rezíduí trifloxystrobínu, tiabendazolu, abamektínu, skupiny benomylu (benomyl, karbendazím, metyltiofanát), myklobutanylu, glyfozátu, trimetylsulfónia a fenpropimorfu. |
| --- | --- |

(3)

Maximálne hladiny rezíduí pesticídov, na ktoré sa vzťahuje smernica 90/642/EHS, sa majú neustále kontrolovať a môžu sa upravovať, aby sa zohľadnili nové alebo zmenené spôsoby použitia pesticídov. Informácie o nových alebo zmenených spôsoboch použitia pesticídov boli oznámené Komisii, a to bude mať za následok zmeny v hladinách rezíduí trifloxystrobínu, tiabendazolu, abamektínu, skupiny benomylu (benomyl, karbendazím, metyltiofanát), myklobutanylu, glyfozátu, trimetylsulfónia a fenpropimorfu.

| (4) | Pokiaľ ide o chlórmekvát, Komisii boli oznámené informácie, ktoré ju oprávňujú dočasne na obdobie troch rokov stanoviť MRL pre hrušky. |
| --- | --- |

(4)

Pokiaľ ide o chlórmekvát, Komisii boli oznámené informácie, ktoré ju oprávňujú dočasne na obdobie troch rokov stanoviť MRL pre hrušky.

| (5) | Dlhodobé vystavenie spotrebiteľov účinkom týchto pesticídov prostredníctvom potravinových produktov, ktoré môžu obsahovať rezíduá týchto pesticídov, bolo posúdené a vyhodnotené v súlade s postupmi a praktikami používanými v rámci Spoločenstva, pričom sa zohľadnili usmernenia uverejnené Svetovou zdravotníckou organizáciou (3). V tomto vyhodnotení sa vzala do úvahy skutočnosť, že abamektín a tiabendazol sa používajú aj ako veterinárne liečivá určené pre zvieratá na produkciu potravín a že pokiaľ ide o tieto dve látky, maximálne hladiny rezíduí boli stanovené v súlade s ustanoveniami nariadenia Rady (EHS) č. 2377/90 (4). Na základe tohto posúdenia a vyhodnotenia by bolo potrebné stanoviť MRL týchto pesticídov, aby sa zabezpečilo, že ich prijateľný denný príjem sa neprekročí. |
| --- | --- |

(5)

Dlhodobé vystavenie spotrebiteľov účinkom týchto pesticídov prostredníctvom potravinových produktov, ktoré môžu obsahovať rezíduá týchto pesticídov, bolo posúdené a vyhodnotené v súlade s postupmi a praktikami používanými v rámci Spoločenstva, pričom sa zohľadnili usmernenia uverejnené Svetovou zdravotníckou organizáciou (3). V tomto vyhodnotení sa vzala do úvahy skutočnosť, že abamektín a tiabendazol sa používajú aj ako veterinárne liečivá určené pre zvieratá na produkciu potravín a že pokiaľ ide o tieto dve látky, maximálne hladiny rezíduí boli stanovené v súlade s ustanoveniami nariadenia Rady (EHS) č. 2377/90 (4). Na základe tohto posúdenia a vyhodnotenia by bolo potrebné stanoviť MRL týchto pesticídov, aby sa zabezpečilo, že ich prijateľný denný príjem sa neprekročí.

| (6) | Pokiaľ ide o benomyl, karbendazím, metyltiofanát, fenpropimorf a chlórmekvát, ktoré majú stanovenú akútnu referenčnú dávku (ARfD), v súlade s postupmi a praxou, ktoré sa v súčasnosti používajú v Spoločenstve, a so zreteľom na usmernenia, ktoré uverejnila Svetová zdravotnícka organizácia, sa vykonalo posúdenie a vyhodnotenie akútneho vystavenia spotrebiteľov účinkom pesticídov prostredníctvom jednotlivých potravinových produktov s možným obsahom rezíduí. Stanoviská Vedeckého výboru pre rastliny, najmä inštrukcie a odporúčania týkajúce sa ochrany spotrebiteľa potravinových produktov ošetrených pesticídmi (5), sa zohľadnili. Na základe posúdenia potravinového príjmu by bolo potrebné stanoviť MRL týchto pesticídov, aby sa zabezpečilo, že ich akútna referenčná dávka sa neprekročí. Pokiaľ ide o ďalšie látky, posúdenie dostupných informácií preukázalo, že ARfD sa nepožaduje, a preto krátkodobé posúdenie nie je potrebné. |
| --- | --- |

(6)

Pokiaľ ide o benomyl, karbendazím, metyltiofanát, fenpropimorf a chlórmekvát, ktoré majú stanovenú akútnu referenčnú dávku (ARfD), v súlade s postupmi a praxou, ktoré sa v súčasnosti používajú v Spoločenstve, a so zreteľom na usmernenia, ktoré uverejnila Svetová zdravotnícka organizácia, sa vykonalo posúdenie a vyhodnotenie akútneho vystavenia spotrebiteľov účinkom pesticídov prostredníctvom jednotlivých potravinových produktov s možným obsahom rezíduí. Stanoviská Vedeckého výboru pre rastliny, najmä inštrukcie a odporúčania týkajúce sa ochrany spotrebiteľa potravinových produktov ošetrených pesticídmi (5), sa zohľadnili. Na základe posúdenia potravinového príjmu by bolo potrebné stanoviť MRL týchto pesticídov, aby sa zabezpečilo, že ich akútna referenčná dávka sa neprekročí. Pokiaľ ide o ďalšie látky, posúdenie dostupných informácií preukázalo, že ARfD sa nepožaduje, a preto krátkodobé posúdenie nie je potrebné.

| (7) | Maximálne hladiny rezíduí sa na nižšej hranici analytického určenia stanovujú vtedy, keď povolené použitie prípravkov na ochranu rastlín nemá za následok zistiteľné hladiny rezíduí pesticídov v alebo na potravinárskom výrobku, alebo ak takéto použitie nie je povolené, alebo ak použitie, ktoré členské štáty povolili, nebolo podložené potrebnými údajmi, alebo ak použitie v tretích krajinách, ktorých následkom boli rezíduá v alebo na potravinárskych výrobkoch, ktoré sa môžu uviesť do obehu na trhu v rámci Spoločenstva, nebolo podložené potrebnými údajmi. |
| --- | --- |

(7)

Maximálne hladiny rezíduí sa na nižšej hranici analytického určenia stanovujú vtedy, keď povolené použitie prípravkov na ochranu rastlín nemá za následok zistiteľné hladiny rezíduí pesticídov v alebo na potravinárskom výrobku, alebo ak takéto použitie nie je povolené, alebo ak použitie, ktoré členské štáty povolili, nebolo podložené potrebnými údajmi, alebo ak použitie v tretích krajinách, ktorých následkom boli rezíduá v alebo na potravinárskych výrobkoch, ktoré sa môžu uviesť do obehu na trhu v rámci Spoločenstva, nebolo podložené potrebnými údajmi.

| (8) | Preto je vhodné pre tieto pesticídy stanoviť nové MRL. |
| --- | --- |

(8)

Preto je vhodné pre tieto pesticídy stanoviť nové MRL.

| (9) | Stanovenie alebo úpravy prechodných maximálnych hladín rezíduí na úrovni Spoločenstva nezabraňujú členským štátom stanoviť prechodné maximálne hladiny rezíduí pre glyfosát, trimetylsulfónium a trifloxistrobín v súlade s článkom 4 ods. 1 písm. f) smernice 91/414/EHS a jej prílohy VI. Obdobie štyroch rokov sa považuje za postačujúce na povolenie ďalšieho použitia týchto látok. Prechodné MRL Spoločenstva by sa potom mali stať konečnými. |
| --- | --- |

(9)

Stanovenie alebo úpravy prechodných maximálnych hladín rezíduí na úrovni Spoločenstva nezabraňujú členským štátom stanoviť prechodné maximálne hladiny rezíduí pre glyfosát, trimetylsulfónium a trifloxistrobín v súlade s článkom 4 ods. 1 písm. f) smernice 91/414/EHS a jej prílohy VI. Obdobie štyroch rokov sa považuje za postačujúce na povolenie ďalšieho použitia týchto látok. Prechodné MRL Spoločenstva by sa potom mali stať konečnými.

| (10) | Vlčí bôb sa vo viacerých členských štátoch používa ako potravina. Použitie glyfosátu na vlčom bôbe je povolené. Vloženie položky „vlčí bôb“ a stanovenie MRL pre túto plodinu je preto potrebné z hľadiska ochrany spotrebiteľa pred nadmerným obsahom rezíduí pesticídov použitých pri vlčom bôbe. |
| --- | --- |

(10)

Vlčí bôb sa vo viacerých členských štátoch používa ako potravina. Použitie glyfosátu na vlčom bôbe je povolené. Vloženie položky „vlčí bôb“ a stanovenie MRL pre túto plodinu je preto potrebné z hľadiska ochrany spotrebiteľa pred nadmerným obsahom rezíduí pesticídov použitých pri vlčom bôbe.

| (11) | Smernica 90/642/EHS by sa preto mala zodpovedajúcim spôsobom zmeniť a doplniť. |
| --- | --- |

(11)

Smernica 90/642/EHS by sa preto mala zodpovedajúcim spôsobom zmeniť a doplniť.

| (12) | Opatrenia stanovené v tejto smernici sú v súlade so stanoviskom Stáleho výboru pre potravinový reťazec a zdravie zvierat, |
| --- | --- |

(12)

Opatrenia stanovené v tejto smernici sú v súlade so stanoviskom Stáleho výboru pre potravinový reťazec a zdravie zvierat,

PRIJALA TÚTO SMERNICU:

Článok 1

Smernica 90/642/ES sa mení a dopĺňa takto:

| 1. | V prílohe I v skupine „3. Strukoviny“ sa pridáva položka „vlčí bôb“, tak aby sa pojem „celý produkt“ v poslednom stĺpci vzťahoval na všetky štyri položky. |
| --- | --- |

1.

V prílohe I v skupine „3. Strukoviny“ sa pridáva položka „vlčí bôb“, tak aby sa pojem „celý produkt“ v poslednom stĺpci vzťahoval na všetky štyri položky.

| 2. | Príloha II sa mení a dopĺňa v súlade s prílohou k tejto smernici. |
| --- | --- |

2.

Príloha II sa mení a dopĺňa v súlade s prílohou k tejto smernici.

Článok 2

1.   Členské štáty prijmú a uverejnia najneskôr do 20. januára 2007 zákony, iné právne predpisy a správne opatrenia potrebné na dosiahnutie súladu s touto smernicou okrem skupiny benomylu a metyltiofanátu, pre ktoré ich prijmú a uverejnia do 14. septembra 2006, a pre chlórmekvát do 31. júla 2006. Komisii bezodkladne oznámia znenie týchto ustanovení a tabuľku zhody medzi týmito ustanoveniami a touto smernicou.

Tieto ustanovenia uplatňujú od 21. januára 2007 okrem skupiny benomylu a metyltiofanátu, pre ktoré sa uplatňujú do 15. septembra 2006, a chlórmekvát do 1. augusta 2006.

Členské štáty uvedú priamo v prijatých opatreniach alebo pri ich úradnom uverejnení odkaz na túto smernicu. Podrobnosti o odkaze upravia členské štáty.

2.   Členské štáty oznámia Komisii znenie hlavných ustanovení vnútroštátnych právnych predpisov, ktoré prijmú v oblasti pôsobnosti tejto smernice.

Článok 3

Táto smernica nadobúda účinnosť dvadsiatym dňom po jej uverejnení v Úradnom vestníku Európskej únie.

Článok 4

Táto smernica je určená členským štátom.

V Bruseli 7. júla 2006

Za Komisiu

Markos KYPRIANOU

člen Komisie

---

(1)  Ú. v. ES L 350, 14.12.1990, s. 71. Smernica naposledy zmenená a doplnená smernicou Komisie 2006/53/ES (Ú. v. EÚ L 154, 8.6.2006, s. 11).

1

(2)  Ú. v. ES L 230, 19.8.1991, s. 1. Smernica naposledy zmenená a doplnená smernicou Komisie 2006/45/ES (Ú. v. EÚ L 130, 18.5.2006, s. 27).

2

(3)  Usmernenia pre predpoklad potravinového príjmu rezíduí pesticídov (revidované), vypracované v rámci Programu GEMS/potraviny v spolupráci Kódexovým výborom pre rezíduá pesticídov, uverejnené Svetovou zdravotníckou organizáciou v roku 1997 (WHO/FSF/FOS/97.7).

3

(4)  Ú. v. ES L 224, 18.8.1990, s. 1. Nariadenie naposledy zmenené a doplnené nariadením Komisie (ES) č. 205/2006 (Ú. v. EÚ L 34, 7.2.2006, s. 21).

4

(5)  Stanovisko k otázkam týkajúcim sa zmien a doplnení príloh k smerniciam Rady 86/362/EHS, 86/363/EHS a 90/642/EHS (stanovisko poskytol Vedecký výbor pre rastliny 14. júla 1998); stanovisko týkajúce sa rozličných rezíduí pesticídov v ovocí a zelenine (stanovisko poskytol Vedecký výbor pre rastliny 14. júla 1998); http://europa.eu.int/comm/food/fs/sc/scp/outcome_ppp_en.html.

5

---

PRÍLOHA

Príloha II k smernici 90/642/EHS sa mení a dopĺňa takto:

| 1. | poznámka pod čiarou k položke chlórmekvát použitý na hrušky sa nahrádza týmto textom: „Dočasná MRL stanovená na 0,2 mg/kg sa uplatňuje do 31. júla 2009“; |
| --- | --- |

1.

poznámka pod čiarou k položke chlórmekvát použitý na hrušky sa nahrádza týmto textom: „Dočasná MRL stanovená na 0,2 mg/kg sa uplatňuje do 31. júla 2009“;

| 2. | v časti A sa stĺpce týkajúce sa trifloxystrobínu, tiabendazolu, abamektínu, benomylu, karbendazímu, metyltiofanátu, myklobutanylu, glyfozátu, trimetylsulfónia a fenpropimorfu nahrádzajú týmto textom: | Rezíduá pesticídov a maximálna hladina rezíduí (mg/kg) |
| --- | --- | --- |
| Skupiny a príklady jednotlivých výrobkov, na ktoré sa uplatňujú MRL | Trifloxy-strobín | Tiaben-dazol | Abamektín (zmes avarmectínu B 1a, avarmectínu B 1b a delta-8,9 izomér avarmectínu B1a) | Zmes benomylu a karbendazímu vyjadrená ako karbendazím | Metyltiofanát | Myklobutanyl | Glyfozát | Trimetyl-sulfónium, katión ako dôsledok použitia glyfozátu | Fenpro-pimorf |
| „1. | Ovocie čerstvé, sušené alebo nevarené, zachované zmrazením, bez obsahu pridaného cukru; orechy | | | | | | | | | |
| | i) | CITRUSOVÉ PLODY | 0,3 (2) | 5 | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 3 | | | 0,05 (1) |
| | | grapefruity | | | | | | | | | |
| | | citróny | | | | | | | | | |
| | | limety | | | | | | | | | |
| | | mandarínky (vrátane klementínok a iných hybridov) | | | | | | | 0,5 (2) | 0,5 (2) | |
| | | pomaranče | | | | | | | 0,5 (2) | 0,5 (2) | |
| | | pomelá | | | | | | | | | |
| | | iné | | | | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| | ii) | ORECHY STROMOVÉ (nevylúpané alebo vylúpané) | 0,02 (1)
   (2) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1) | 0,2 | 0,05 (1) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | mandle | | | | | | | | | |
| | | para orechy | | | | | | | | | |
| | | kešu orechy | | | | | | | | | |
| | | gaštany | | | | | | | | | |
| | | kokosové orechy | | | | | | | | | |
| | | lieskovce | | | | | | | | | |
| | | makadamové orechy | | | | | | | | | |
| | | pekanové orechy | | | | | | | | | |
| | | píniové oriešky | | | | | | | | | |
| | | pistácie | | | | | | | | | |
| | | vlašské orechy | | | | | | | | | |
| | | iné | | | | | | | | | |
| | iii) | JADROVÉ OVOCIE | 0,5 (2) | | 0,01 (1) | 0,2 | 0,5 | 0,5 | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | jablká | | 5 | | | | | | | |
| | | hrušky | | 5 | | | | | | | |
| | | dule | | | | | | | | | |
| | | iné | | 0,05 (1) | | | | | | | |
| | iv) | KÔSTKOVÉ OVOCIE | | 0,05 (1) | 0,01 (1) | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | marhule | 1 (2) | | | 0,2 | 2 | 0,3 | | | |
| | | čerešne | 1 (2) | | | 0,5 | 0,3 | 1 | | | |
| | | broskyne (vrátane nektáriniek a podobných hybridov) | 1 (2) | | | 0,2 | 2 | 0,5 | | | |
| | | slivky | 0,2 (2) | | | 0,5 | 0,3 | 0,5 | | | |
| | | iné | 0,02 (1)
   (2) | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | |
| | v) | BOBUĽOVÉ A DROBNÉ OVOCIE | | 0,05 (1) | | | | | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | a) | stolové a vínne hrozno | 5 (2) | | 0,01 (1) | | | 1 | 0,5 (2) | | 0,05 (1) |
| | | | stolové hrozno | | | | 0,3 | 0,1 (1) | | | | |
| | | | vínne hrozno | | | | 0,5 | 3 | | | | |
| | | b) | jahody (iné ako divorastúce) | 0,5 (1)
   (2) | | 0,1 | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 1 | 0,1 (1)
   (2) | | 1 |
| | | c) | krovité ovocné druhy (iné ako divorastúce) | 0,02 (1)
   (2) | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | | 1 |
| | | | ostružiny | | | 0,1 | | | 1 | | | |
| | | | ostružinové maliny | | | | | | | | | |
| | | | loganové černice | | | | | | | | | |
| | | | maliny | | | 0,1 | | | 1 | | | |
| | | | iné | | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | d) | iné drobné ovocie a bobuľoviny (iné ako divorastúce) | | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | | 1 |
| | | | čučoriedky | | | | | | | | | |
| | | | brusnice | | | | | | | | | |
| | | | ríbezle (červené, čierne a biele) | 1 (2) | | | | | 1 | | | |
| | | | egreše | 1 (2) | | | | | 1 | | | |
| | | | iné | 0,02 (1)
   (2) | | | | | 0,02 (1) | | | |
| | | e) | divorastúce bobuľoviny a ovocie | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1)
   (2) | | 0,05 (1) |
| | vi) | RÔZNE OVOCIE | | | 0,01 (1) | | | | | | |
| | | avokáda | | 15 | | | | | | | |
| | | banány | 0,05 (2) | 5 | | | | 2 | | | 2 |
| | | datle | | | | | | | | | |
| | | figy | | | | | | | | | |
| | | kivi | | | | | | | | | |
| | | kumkváty | | | | | | | | | |
| | | liči | | | | | | | | | |
| | | mangá | | 5 | | | | | | | |
| | | olivy (stolové) | | | | | | | | | |
| | | olivy (na výrobu oleja) | | | | | | | 1 (2) | 1 (2) | |
| | | papáje | | 10 | | 0,2 | 1 | | | | |
| | | plody mučenky | | | | | | | | | |
| | | ananásy | | | | | | | | | |
| | | granátové jablká | | | | | | | | | |
| | | iné | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| 2. | zelenina čerstvá alebo tepelne neupravená, mrazená alebo sušená | | | | | | | | | |
| | i) | KOREŇOVÁ A HĽUZOVÁ ZELENINA | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | cvikla | | | | | | | | | |
| | | mrkva | | | | | | 0,2 | | | |
| | | maniok (kasava) | | 15 | | | | | | | |
| | | zeler | | | | | | | | | |
| | | chren | | | | | | 0,2 | | | |
| | | topinambury | | | | | | | | | |
| | | paštrnák | | | | | | 0,2 | | | |
| | | koreň petržlenu | | | | | | 0,2 | | | |
| | | reďkovka | | | | | | | | | |
| | | kozia brada | | | | | | | | | |
| | | sladké zemiaky | | 15 | | | | | | | |
| | | kvaka | | | | | | | | | |
| | | okrúhlica | | | | | | | | | |
| | | jamy | | 15 | | | | | | | |
| | | iné | | 0,05 (1) | | | | 0,02 (1) | | | |
| | ii) | CIBUĽOVÁ ZELENINA | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | cesnak | | | | | | | | | |
| | | cibuľa | | | | | | | | | |
| | | šalotka | | | | | | | | | |
| | | cibuľa jarná | | | | | | | | | |
| | | iné | | | | | | | | | |
| | iii) | PLODOVÁ ZELENINA | | 0,05 (1) | | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | a) | ľuľkovité | | | | | | | | | |
| | | | rajčiaky | 0,5 (2) | | 0,02 | 0,5 | 2 | 0,3 | | | |
| | | | papriky | | | 0,05 | | | 0,5 | | | |
| | | | baklažány | | | 0,02 | 0,5 | 2 | 0,3 | | | |
| | | | ibištek jedlý | | | | 2 | 1 | | | | |
| | | | iné | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | |
| | | b) | tekvicovité s jedlou šupou | 0,2 (2) | | 0,02 | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,1 | | | |
| | | | uhorky | | | | | | | | | |
| | | | uhorky nakladačky | | | | | | | | | |
| | | | cukety | | | | | | | | | |
| | | | iné | | | | | | | | | |
| | | c) | tekvicovité s nejedlou šupou | | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,3 | 0,2 | | | |
| | | | melón cukrový | 0,3 (2) | | | | | | | | |
| | | | tekvica | | | | | | | | | |
| | | | melón vodový/dyňa červená | | | | | | | | | |
| | | | iné | 0,02 (1)
   (2) | | | | | | | | |
| | | d) | sladká kukurica | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | |
| | iv) | HLÚBOVÁ ZELENINA | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | a) | hlúbová zelenina tvoriaca ružice | | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | | | 0,05 (1) |
| | | | brokolica (vrátane odrody calabrese) | | 5 | | | | | | | |
| | | | karfiol | | | | | | | | | |
| | | | iné | | 0,05 (1) | | | | | | | |
| | | b) | Hlúbová zelenina hlávková | | 0,05 (1) | | | | | | | |
| | | | ružičkový kel | | | | 0,5 | 1 | | | | 0,5 |
| | | | hlávková kapusta | | | | | | | | | |
| | | | iné | | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | | | 0,05 (1) |
| | | c) | Hlúbová zelenina listová | | 0,05 (1) | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | | | 0,05 (1) |
| | | | čínska kapusta | | | | | | | | | |
| | | | kel kučeravý | | | | | | | | | |
| | | | iné | | | | | | | | | |
| | | d) | kaleráb | | 0,05 (1) | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | | | 0,05 (1) |
| | v) | LISTOVÁ ZELENINA A ČERSTVÉ BYLINKY | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | a) | šalát a podobné plodiny | | | 0,1 | | | | | | |
| | | | žerucha | | | | | | | | | |
| | | | valeriánka poľná | | | | | | 5 | | | |
| | | | šalát | | | | | | | | | |
| | | | endívia (širokolistá) | | | | | | | | | |
| | | | rukola | | | | | | | | | |
| | | | listy a stonky listovej zeleniny | | | | | | | | | |
| | | | iné | | | | | | 0,02 (1) | | | |
| | | b) | špenát a podobné plodiny | | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | | špenát | | | | | | | | | |
| | | | mangold | | | | | | | | | |
| | | | iné | | | | | | | | | |
| | | c) | potočnica lekárska | | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | d) | witloof (belgická čakanka) | | 1 | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | e) | bylinky | | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | | trebuľka | | | | | | | | | |
| | | | cesnak pažítkový | | | | | | | | | |
| | | | petržlenová vňať | | | | | | | | | |
| | | | zelerová vňať | | | | | | | | | |
| | | | iné | | | | | | | | | |
| | vi) | STRUKOVINY (čerstvé) | | 0,05 (1) | 0,01 (1) | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | fazuľa (so strukmi) | 0,5 (2) | | | 0,2 | 0,1 (1) | 0,3 | | | |
| | | fazuľa (bez strukov) | | | | | | | | | |
| | | hrach (so strukmi) | | | | 0,2 | 0,1 (1) | | | | |
| | | hrach (bez strukov) | | | | | | | | | |
| | | iné | 0,02 (1)
   (2) | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | |
| | vii) | STONKOVÁ ZELENINA (čerstvá) | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | špargľa | | | | | | | | | |
| | | artičoky bodliakové (kardy) | | | | | | | | | |
| | | zeler stonkový | | | | | | | | | |
| | | fenikel | | | | | | | | | |
| | | artičoky pravé | | | | | | 0,5 | | | |
| | | pór | | | | | | | | | 1 |
| | | rebarbora | | | | | | | | | |
| | | iné | | | | | | 0,02 (1) | | | 0,05 (1) |
| | viii) | HUBY | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | 0,05 (1) |
| | | a) | pestované huby | | 10 | | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | b) | divorastúce huby | | 0,05 (1) | | | | | 50 (2) | 20 (2) | |
| 3. | Strukoviny | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | fazuľa | | | | | | | 2 (2) | | |
| | šošovica | | | | | | | | | |
| | hrach | | | | | | | 10 (2) | | |
| | vlčí bôb | | | | | | | 10 (2) | | |
| | iné | | | | | | | 0,1 (1)
   (2) | | |
| 4. | Olejnaté semená | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) | 0,02 (1) | | | 0,05 (1) | | | 0,05 (1) |
| | ľanové semeno | | | | | | | 10 (2) | | |
| | arašidy | | | | | | | | | |
| | mak | | | | | | | | | |
| | sezamové semená | | | | | | | | | |
| | slnečnicové semená | | | | | | | 20 (2) | | |
| | semená repky | | | | | | | 10 (2) | | |
| | sójové bôby | | | | 0,2 | 0,3 | | 20 (2) | 10 (2) | |
| | horčicové semená | | | | | | | 10 (2) | | |
| | semená bavlny | | | | | | | 10 (2) | | |
| | semená konope | | | | | | | | | |
| | iné | | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| 5. | Zemiaky | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,5 (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | skoré zemiaky | | 0,05 (1) | | | | | | | |
| | konzumné zemiaky | | 15 | | | | | | | |
| 6. | Čaj (fermentované alebo inak upravené sušené lístky a steblá druhu Camellia sinensis) | 0,05 (1)
   (2) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,05 (1) | 2 (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,1 (1) |
| 7. | Chmeľové šištičky (sušené) vrátane peliet a nekoncentrovaného prášku | 30 (2) | 0,1 (1) | 0,05 | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 2 | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 10 |

2.

v časti A sa stĺpce týkajúce sa trifloxystrobínu, tiabendazolu, abamektínu, benomylu, karbendazímu, metyltiofanátu, myklobutanylu, glyfozátu, trimetylsulfónia a fenpropimorfu nahrádzajú týmto textom:

Rezíduá pesticídov a maximálna hladina rezíduí (mg/kg)

Skupiny a príklady jednotlivých výrobkov, na ktoré sa uplatňujú MRL

Trifloxy-strobín

Tiaben-dazol

Abamektín (zmes avarmectínu B 1a, avarmectínu B 1b a delta-8,9 izomér avarmectínu B1a)

Zmes benomylu a karbendazímu vyjadrená ako karbendazím

Metyltiofanát

Myklobutanyl

Glyfozát

Trimetyl-sulfónium, katión ako dôsledok použitia glyfozátu

Fenpro-pimorf

„1.

Ovocie čerstvé, sušené alebo nevarené, zachované zmrazením, bez obsahu pridaného cukru; orechy

i)

CITRUSOVÉ PLODY

0,3 (2)

5

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

3

0,05 (1)

grapefruity

citróny

limety

mandarínky (vrátane klementínok a iných hybridov)

0,5 (2)

0,5 (2)

pomaranče

0,5 (2)

0,5 (2)

pomelá

iné

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

ii)

ORECHY STROMOVÉ (nevylúpané alebo vylúpané)

0,02 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)

0,2

0,05 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

mandle

para orechy

kešu orechy

gaštany

kokosové orechy

lieskovce

makadamové orechy

pekanové orechy

píniové oriešky

pistácie

vlašské orechy

iné

iii)

JADROVÉ OVOCIE

0,5 (2)

0,01 (1)

0,2

0,5

0,5

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

jablká

5

hrušky

5

dule

iné

0,05 (1)

iv)

KÔSTKOVÉ OVOCIE

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

marhule

1 (2)

0,2

2

0,3

čerešne

1 (2)

0,5

0,3

1

broskyne (vrátane nektáriniek a podobných hybridov)

1 (2)

0,2

2

0,5

slivky

0,2 (2)

0,5

0,3

0,5

iné

0,02 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

v)

BOBUĽOVÉ A DROBNÉ OVOCIE

0,05 (1)

0,05 (1)
   (2)

a)

stolové a vínne hrozno

5 (2)

0,01 (1)

1

0,5 (2)

0,05 (1)

stolové hrozno

0,3

0,1 (1)

vínne hrozno

0,5

3

b)

jahody (iné ako divorastúce)

0,5 (1)
   (2)

0,1

0,1 (1)

0,1 (1)

1

0,1 (1)
   (2)

1

c)

krovité ovocné druhy (iné ako divorastúce)

0,02 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

1

ostružiny

0,1

1

ostružinové maliny

loganové černice

maliny

0,1

1

iné

0,01 (1)

0,02 (1)

d)

iné drobné ovocie a bobuľoviny (iné ako divorastúce)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

1

čučoriedky

brusnice

ríbezle (červené, čierne a biele)

1 (2)

1

egreše

1 (2)

1

iné

0,02 (1)
   (2)

0,02 (1)

e)

divorastúce bobuľoviny a ovocie

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)

vi)

RÔZNE OVOCIE

0,01 (1)

avokáda

15

banány

0,05 (2)

5

2

2

datle

figy

kivi

kumkváty

liči

mangá

5

olivy (stolové)

olivy (na výrobu oleja)

1 (2)

1 (2)

papáje

10

0,2

1

plody mučenky

ananásy

granátové jablká

iné

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

2.

zelenina čerstvá alebo tepelne neupravená, mrazená alebo sušená

i)

KOREŇOVÁ A HĽUZOVÁ ZELENINA

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

cvikla

mrkva

0,2

maniok (kasava)

15

zeler

chren

0,2

topinambury

paštrnák

0,2

koreň petržlenu

0,2

reďkovka

kozia brada

sladké zemiaky

15

kvaka

okrúhlica

jamy

15

iné

0,05 (1)

0,02 (1)

ii)

CIBUĽOVÁ ZELENINA

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

cesnak

cibuľa

šalotka

cibuľa jarná

iné

iii)

PLODOVÁ ZELENINA

0,05 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

a)

ľuľkovité

rajčiaky

0,5 (2)

0,02

0,5

2

0,3

papriky

0,05

0,5

baklažány

0,02

0,5

2

0,3

ibištek jedlý

2

1

iné

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

b)

tekvicovité s jedlou šupou

0,2 (2)

0,02

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1

uhorky

uhorky nakladačky

cukety

iné

c)

tekvicovité s nejedlou šupou

0,01 (1)

0,1 (1)

0,3

0,2

melón cukrový

0,3 (2)

tekvica

melón vodový/dyňa červená

iné

0,02 (1)
   (2)

d)

sladká kukurica

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

iv)

HLÚBOVÁ ZELENINA

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

a)

hlúbová zelenina tvoriaca ružice

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

brokolica (vrátane odrody calabrese)

5

karfiol

iné

0,05 (1)

b)

Hlúbová zelenina hlávková

0,05 (1)

ružičkový kel

0,5

1

0,5

hlávková kapusta

iné

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

c)

Hlúbová zelenina listová

0,05 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

čínska kapusta

kel kučeravý

iné

d)

kaleráb

0,05 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

v)

LISTOVÁ ZELENINA A ČERSTVÉ BYLINKY

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

a)

šalát a podobné plodiny

0,1

žerucha

valeriánka poľná

5

šalát

endívia (širokolistá)

rukola

listy a stonky listovej zeleniny

iné

0,02 (1)

b)

špenát a podobné plodiny

0,01 (1)

0,02 (1)

špenát

mangold

iné

c)

potočnica lekárska

0,01 (1)

0,02 (1)

d)

witloof (belgická čakanka)

1

0,01 (1)

0,02 (1)

e)

bylinky

0,01 (1)

0,02 (1)

trebuľka

cesnak pažítkový

petržlenová vňať

zelerová vňať

iné

vi)

STRUKOVINY (čerstvé)

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

fazuľa (so strukmi)

0,5 (2)

0,2

0,1 (1)

0,3

fazuľa (bez strukov)

hrach (so strukmi)

0,2

0,1 (1)

hrach (bez strukov)

iné

0,02 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

vii)

STONKOVÁ ZELENINA (čerstvá)

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

špargľa

artičoky bodliakové (kardy)

zeler stonkový

fenikel

artičoky pravé

0,5

pór

1

rebarbora

iné

0,02 (1)

0,05 (1)

viii)

HUBY

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,05 (1)

a)

pestované huby

10

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

b)

divorastúce huby

0,05 (1)

50 (2)

20 (2)

3.

Strukoviny

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

fazuľa

2 (2)

šošovica

hrach

10 (2)

vlčí bôb

10 (2)

iné

0,1 (1)
   (2)

4.

Olejnaté semená

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,02 (1)

0,05 (1)

0,05 (1)

ľanové semeno

10 (2)

arašidy

mak

sezamové semená

slnečnicové semená

20 (2)

semená repky

10 (2)

sójové bôby

0,2

0,3

20 (2)

10 (2)

horčicové semená

10 (2)

semená bavlny

10 (2)

semená konope

iné

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

5.

Zemiaky

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,5 (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

skoré zemiaky

0,05 (1)

konzumné zemiaky

15

6.

Čaj (fermentované alebo inak upravené sušené lístky a steblá druhu Camellia sinensis)

0,05 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

2 (2)

0,05 (1)
   (2)

0,1 (1)

7.

Chmeľové šištičky (sušené) vrátane peliet a nekoncentrovaného prášku

30 (2)

0,1 (1)

0,05

0,1 (1)

0,1 (1)

2

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

10

---

(1)  Označuje dolnú hranicu analytického určenia.

(2)  Označuje, že maximálna úroveň rezíduí je stanovená prechodne v súlade s článkom 4 ods. 1 písm. f) smernice 91/414/EHS.“

---

| 27.7.2006 | SK | Úradný vestník Európskej únie | L 206/12 |
| --- | --- | --- | --- |

27.7.2006

SK

Úradný vestník Európskej únie

L 206/12

---

SMERNICA KOMISIE 2006/61/ES

zo 7. júla 2006,

ktorou sa menia a dopĺňajú smernice Rady 86/362/EHS, 86/363/EHS a 90/642/EHS, pokiaľ ide o maximálne hladiny rezíduí atrazínu, azinfos-etylu, cyflutrínu, etefónu, fentiónu, metamidofosu, metomylu, parakvátu a triazofosu

(Text s významom pre EHP)

KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV,

so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho spoločenstva,

so zreteľom na smernicu Rady 86/362/EHS z 24. júla 1986 o stanovení maximálnych hladín rezíduí pesticídov v a na obilninách (1), a najmä na jej článok 10,

so zreteľom na smernicu Rady 86/363/EHS z 24. júla 1986, ktorou sa stanovujú maximálne hladiny rezíduí pesticídov v a na potravinách živočíšneho pôvodu (2), a najmä na jej článok 10,

so zreteľom na smernicu Rady 90/642/EHS z 27. novembra 1990 o stanovení maximálnych hladín pre rezíduá pesticídov v a na určitých produktoch rastlinného pôvodu vrátane ovocia a zeleniny (3), a najmä na jej článok 7,

so zreteľom na smernicu Rady 91/414/EHS z 15. júla 1991 o uvádzaní prípravkov na ochranu rastlín na trh (4), a najmä na jej článok 4 ods. 1 písm. f),

keďže:

| (1) | V prípade obilnín a produktov rastlinného pôvodu vrátane ovocia a zeleniny hladiny rezíduí svedčia o používaní minimálnych množstiev pesticídov potrebných na dosiahnutie účinnej ochrany rastlín aplikovaných takým spôsobom, aby bolo množstvo rezíduí čo najnižšie a zároveň toxikologicky najprijateľnejšie, predovšetkým so zreteľom na ochranu životného prostredia a odhadovaný potravinový príjem spotrebiteľov. V prípade potravín živočíšneho pôvodu hladiny rezíduí svedčia o tom, že zvieratá spotrebúvajú obilniny a produkty rastlinného pôvodu ošetrované pesticídmi a prípadne aj o priamych dôsledkoch používania veterinárnych liečiv. Maximálne hladiny rezíduí (maximum residue levels – MRL) stanovené Spoločenstvom predstavujú hornú hranicu množstva tých rezíduí, ktorých výskyt by sa dal predpokladať v produktoch pri dodržiavaní správnej poľnohospodárskej praxe. |
| --- | --- |

(1)

V prípade obilnín a produktov rastlinného pôvodu vrátane ovocia a zeleniny hladiny rezíduí svedčia o používaní minimálnych množstiev pesticídov potrebných na dosiahnutie účinnej ochrany rastlín aplikovaných takým spôsobom, aby bolo množstvo rezíduí čo najnižšie a zároveň toxikologicky najprijateľnejšie, predovšetkým so zreteľom na ochranu životného prostredia a odhadovaný potravinový príjem spotrebiteľov. V prípade potravín živočíšneho pôvodu hladiny rezíduí svedčia o tom, že zvieratá spotrebúvajú obilniny a produkty rastlinného pôvodu ošetrované pesticídmi a prípadne aj o priamych dôsledkoch používania veterinárnych liečiv. Maximálne hladiny rezíduí (maximum residue levels – MRL) stanovené Spoločenstvom predstavujú hornú hranicu množstva tých rezíduí, ktorých výskyt by sa dal predpokladať v produktoch pri dodržiavaní správnej poľnohospodárskej praxe.

| (2) | Hladiny MRL pre pesticídy sa kontrolujú a upravujú, aby sa zohľadnili nové informácie a údaje. Tieto hladiny rezíduí sú stanovené na spodnej hranici analytického určenia, ak povolený spôsob použitia prípravkov na ochranu rastlín nevedie k zistiteľným hladinám rezíduí pesticídov v alebo na potravinárskom výrobku alebo ak neexistuje povolený spôsob použitia prípravkov, alebo ak daný spôsob použitia prípravkov, ktorý je povolený členskými štátmi, nebol podložený potrebnými údajmi, alebo ak spôsob použitia prípravkov v tretích krajinách, ktorý má za následok prítomnosť rezíduí v alebo na tých potravinárskych výrobkoch, ktoré môžu byť uvedené do obehu na trhu Spoločenstva, neboli doložené potrebnými údajmi. Komisia bola informovaná, že pokiaľ ide o viaceré pesticídy, v súčasnosti platné MRL je pravdepodobne potrebné zmeniť vzhľadom na dostupnosť nových informácií z oblasti toxikológie a príjmu spotrebiteľmi. |
| --- | --- |

(2)

Hladiny MRL pre pesticídy sa kontrolujú a upravujú, aby sa zohľadnili nové informácie a údaje. Tieto hladiny rezíduí sú stanovené na spodnej hranici analytického určenia, ak povolený spôsob použitia prípravkov na ochranu rastlín nevedie k zistiteľným hladinám rezíduí pesticídov v alebo na potravinárskom výrobku alebo ak neexistuje povolený spôsob použitia prípravkov, alebo ak daný spôsob použitia prípravkov, ktorý je povolený členskými štátmi, nebol podložený potrebnými údajmi, alebo ak spôsob použitia prípravkov v tretích krajinách, ktorý má za následok prítomnosť rezíduí v alebo na tých potravinárskych výrobkoch, ktoré môžu byť uvedené do obehu na trhu Spoločenstva, neboli doložené potrebnými údajmi. Komisia bola informovaná, že pokiaľ ide o viaceré pesticídy, v súčasnosti platné MRL je pravdepodobne potrebné zmeniť vzhľadom na dostupnosť nových informácií z oblasti toxikológie a príjmu spotrebiteľmi.

| (3) | Komisia požiadala príslušné spravodajské členské štáty, aby predložili návrhy na úpravu MRL platných v Spoločenstve. Tieto návrhy boli predložené Komisii. |
| --- | --- |

(3)

Komisia požiadala príslušné spravodajské členské štáty, aby predložili návrhy na úpravu MRL platných v Spoločenstve. Tieto návrhy boli predložené Komisii.

| (4) | V súlade s postupmi a praxou Spoločenstva a s prihliadnutím na usmernenia uverejnené Svetovou zdravotníckou organizáciou (5) sa opätovne posúdilo a prehodnotilo celoživotné a krátkodobé vystavenie spotrebiteľov v tejto smernici uvedeným účinkom pesticídov prostredníctvom potravinových produktov. Z uvedeného vyplýva, že je vhodné stanoviť nové hladiny MRL, ktoré zabránia neprijateľnému vystaveniu spotrebiteľov týmto účinkom. |
| --- | --- |

(4)

V súlade s postupmi a praxou Spoločenstva a s prihliadnutím na usmernenia uverejnené Svetovou zdravotníckou organizáciou (5) sa opätovne posúdilo a prehodnotilo celoživotné a krátkodobé vystavenie spotrebiteľov v tejto smernici uvedeným účinkom pesticídov prostredníctvom potravinových produktov. Z uvedeného vyplýva, že je vhodné stanoviť nové hladiny MRL, ktoré zabránia neprijateľnému vystaveniu spotrebiteľov týmto účinkom.

| (5) | Podľa potreby sa v súlade s postupmi a praxou Spoločenstva a s prihliadnutím na usmernenia uverejnené Svetovou zdravotníckou organizáciou vykoná posúdenie a vyhodnotenie akútneho vystavenia spotrebiteľov účinkom pesticídov prostredníctvom jednotlivých potravinových produktov s možným obsahom rezíduí. V tejto súvislosti možno konštatovať, že prítomnosť rezíduí pesticídov na úrovni nových MRL alebo pod touto úrovňou nespôsobuje akútne toxické účinky. |
| --- | --- |

(5)

Podľa potreby sa v súlade s postupmi a praxou Spoločenstva a s prihliadnutím na usmernenia uverejnené Svetovou zdravotníckou organizáciou vykoná posúdenie a vyhodnotenie akútneho vystavenia spotrebiteľov účinkom pesticídov prostredníctvom jednotlivých potravinových produktov s možným obsahom rezíduí. V tejto súvislosti možno konštatovať, že prítomnosť rezíduí pesticídov na úrovni nových MRL alebo pod touto úrovňou nespôsobuje akútne toxické účinky.

| (6) | Prostredníctvom Svetovej obchodnej organizácie sa otázka nových MRL prerokovala s obchodnými partnermi Spoločenstva a ich pripomienky v súvislosti s uvedenými hladinami boli zohľadnené. |
| --- | --- |

(6)

Prostredníctvom Svetovej obchodnej organizácie sa otázka nových MRL prerokovala s obchodnými partnermi Spoločenstva a ich pripomienky v súvislosti s uvedenými hladinami boli zohľadnené.

| (7) | Prílohy k smerniciam 86/362/EHS, 86/363/EHS a 90/642/EHS by preto mali byť zodpovedajúcim spôsobom zmenené a doplnené. |
| --- | --- |

(7)

Prílohy k smerniciam 86/362/EHS, 86/363/EHS a 90/642/EHS by preto mali byť zodpovedajúcim spôsobom zmenené a doplnené.

| (8) | Opatrenia stanovené v tejto smernici sú v súlade so stanoviskom Stáleho výboru pre potravinový reťazec a zdravie zvierat, |
| --- | --- |

(8)

Opatrenia stanovené v tejto smernici sú v súlade so stanoviskom Stáleho výboru pre potravinový reťazec a zdravie zvierat,

PRIJALA TÚTO SMERNICU:

Článok 1

Príloha II k smernici 86/362/EHS sa mení a dopĺňa v súlade s prílohou I k tejto smernici.

Článok 2

Príloha II k smernici 86/363/EHS sa mení a dopĺňa v súlade s prílohou II k tejto smernici.

Článok 3

Príloha II k smernici 90/642/EHS sa mení a dopĺňa v súlade s prílohou III k tejto smernici.

Článok 4

1.   Členské štáty prijmú a uverejnia najneskôr 20. januára 2007 zákony, iné právne predpisy a správne opatrenia potrebné na dosiahnutie súladu s touto smernicou. Komisii bezodkladne oznámia znenie týchto ustanovení a tabuľku zhody medzi týmito ustanoveniami a touto smernicou.

Tieto ustanovenia sa uplatňujú od 21. januára 2007.

Členské štáty uvedú priamo v prijatých opatreniach alebo pri ich úradnom uverejnení odkaz na túto smernicu. Podrobnosti o odkaze upravia členské štáty.

2.   Členské štáty oznámia Komisii znenie hlavných ustanovení vnútroštátnych právnych predpisov, ktoré prijmú v oblasti pôsobnosti tejto smernice.

Článok 5

Táto smernica nadobúda účinnosť dvadsiatym dňom po jej uverejnení v Úradnom vestníku Európskej únie.

Článok 6

Táto smernica je určená členským štátom.

V Bruseli 7. júla 2006

Za Komisiu

Markos KYPRIANOU

člen Komisie

---

(1)  Ú. v. ES L 221, 7.8.1986, s. 37. Smernica naposledy zmenená a doplnená smernicou Komisie 2006/59/ES (Ú. v. EÚ L 175, 29.6.2006, s. 61).

1

(2)  Ú. v. ES L 221, 7.8.1986, s. 43. Smernica naposledy zmenená a doplnená smernicou Komisie 2006/59/ES.

2

(3)  Ú. v. ES L 350, 14.12.1990, s. 71. Smernica naposledy zmenená a doplnená smernicou Komisie 2006/59/ES.

3

(4)  Ú. v. ES L 230, 19.8.1991, s. 1. Smernica naposledy zmenená a doplnená smernicou Komisie 2006/45/ES (Ú. v. EÚ L 130, 18.5.2006, s. 27).

4

(5)  Usmernenia pre predpoklad potravinového príjmu reziduí pesticídov (revidované) vypracované v rámci Programu GEMS/Potraviny v spolupráci Kódexovým výborom pre rezíduá pesticídov, uverejnené Svetovou zdravotníckou organizáciou v roku 1997 (WHO/FSF/FOS/97.7).

5

---

PRÍLOHA I

Časť A prílohy II k smernici 86/362/EHS sa mení a dopĺňa takto:

| 1. | Pokiaľ ide o atrazín, pridáva sa tento riadok:






  Rezíduá pesticídov | Maximálne hladiny v mg/kg |
| --- | --- | --- |
| „Atrazín | 0,05 (1)

  OBILNINY |

1.

Pokiaľ ide o atrazín, pridáva sa tento riadok:

Rezíduá pesticídov

Maximálne hladiny v mg/kg

„Atrazín

0,05 (1)

OBILNINY

| 2. | Riadky týkajúce sa aznifos-etylu, ethefónu a triazofosu sa nahrádzajú takto:






  Rezíduá pesticídov | Maximálne hladiny v mg/kg |
| --- | --- | --- |
| „Azinfos-etyl | 0,05 (2)

  OBILNINY |
| Etefón | 0,5 jačmeň, raž
  0,2 triticale, pšenica
  0,05 (2) iné obilniny |
| Triazofos | 0,02 (2)

  OBILNINY |

2.

Riadky týkajúce sa aznifos-etylu, ethefónu a triazofosu sa nahrádzajú takto:

Rezíduá pesticídov

Maximálne hladiny v mg/kg

„Azinfos-etyl

0,05 (2)

OBILNINY

Etefón

0,5 jačmeň, raž

0,2 triticale, pšenica

0,05 (2) iné obilniny

Triazofos

0,02 (2)

OBILNINY

---

(1)  Označuje dolnú hranicu analytického určenia.“

(2)  Označuje dolnú hranicu analytického určenia.“

---

PRÍLOHA II

Časť A prílohy II k smernici 86/363/EHS sa mení a dopĺňa takto:

| 1. | V časti A prílohy II k smernici 86/363/EHS sa riadky pre azinfos-etyl a triazofos nahrádzajú takto:








  Rezíduá pesticídov | Maximálne hladiny v mg/kg |
| --- | --- | --- |
| | v prípade mäsa vrátane tuku, mäsových prípravkov, vnútorností a živočíšnych tukov uvedených v prílohe I v položkách č. ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 a 1602 (1) (4) | pre kravské mlieko a plnotučné kravské mlieko uvedené v prílohe I v položke č. 0401: pre iné potraviny uvedené v položkách č. 0401, 0402, 0405 00 a 0406 v súlade s (2) (4) | v prípade čerstvých vajec bez škrupín, vtáčích vajec a vaječných žĺtkov uvedených v prílohe I v položkách č. 0407 00 a 0408 (3) (4) |
| „Azinfos-etyl | 0,01 (1) | 0,01 (1) | 0,01 (1) |
| Triazofos | 0,01 (1) | 0,01 (1) | 0,01 (1) |

1.

V časti A prílohy II k smernici 86/363/EHS sa riadky pre azinfos-etyl a triazofos nahrádzajú takto:

Rezíduá pesticídov

Maximálne hladiny v mg/kg

v prípade mäsa vrátane tuku, mäsových prípravkov, vnútorností a živočíšnych tukov uvedených v prílohe I v položkách č. ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 a 1602 (1) (4)

pre kravské mlieko a plnotučné kravské mlieko uvedené v prílohe I v položke č. 0401: pre iné potraviny uvedené v položkách č. 0401, 0402, 0405 00 a 0406 v súlade s (2) (4)

v prípade čerstvých vajec bez škrupín, vtáčích vajec a vaječných žĺtkov uvedených v prílohe I v položkách č. 0407 00 a 0408 (3) (4)

„Azinfos-etyl

0,01 (1)

0,01 (1)

0,01 (1)

Triazofos

0,01 (1)

0,01 (1)

0,01 (1)

| 2. | V časti A prílohy II k smernici 86/363/EHS sa riadok týkajúci sa fentiónu dopĺňa takto:








  Rezíduá pesticídov | Maximálne hladiny v mg/kg |
| --- | --- | --- |
| | v prípade mäsa vrátane tuku, mäsových prípravkov, vnútorností a živočíšnych tukov uvedených v prílohe I v položkách č. ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 a 1602 (1) (4) | pre kravské mlieko a plnotučné kravské mlieko uvedené v prílohe I v položke č. 0401: pre iné potraviny uvedené v položkách č. 0401, 0402, 0405 00 a 0406 v súlade s (2) (4) | v prípade čerstvých vajec bez škrupín, vtáčích vajec a vaječných žĺtkov uvedených v prílohe I v položkách č. 0407 00 a 0408 (3) (4) |
| „fentión a jeho kyslíkaté analógy, ich sulfoxidy a sulfóny vyjadrené ako fentión | 0,05 (2) | 0,01 (2) | — |

2.

V časti A prílohy II k smernici 86/363/EHS sa riadok týkajúci sa fentiónu dopĺňa takto:

Rezíduá pesticídov

Maximálne hladiny v mg/kg

v prípade mäsa vrátane tuku, mäsových prípravkov, vnútorností a živočíšnych tukov uvedených v prílohe I v položkách č. ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 a 1602 (1) (4)

pre kravské mlieko a plnotučné kravské mlieko uvedené v prílohe I v položke č. 0401: pre iné potraviny uvedené v položkách č. 0401, 0402, 0405 00 a 0406 v súlade s (2) (4)

v prípade čerstvých vajec bez škrupín, vtáčích vajec a vaječných žĺtkov uvedených v prílohe I v položkách č. 0407 00 a 0408 (3) (4)

„fentión a jeho kyslíkaté analógy, ich sulfoxidy a sulfóny vyjadrené ako fentión

0,05 (2)

0,01 (2)

—

---

(1)  Označuje dolnú hranicu analytického určenia.“

(2)  Označuje dolnú hranicu analytického určenia.“

---

PRÍLOHA III

Časť A prílohy II k smernici 90/642/EHS sa mení a dopĺňa takto:

| 1. | Pokiaľ ide o fentión, pridáva sa tento stĺpec:









  Skupiny a príklady jednotlivých výrobkov, na ktoré sa uplatňujú MRL | Fentión a jeho kyslíkaté analógy, ich sulfoxidy a sulfóny vyjadrené ako fentión |
| --- | --- | --- |
| „1. | Ovocie, čerstvé, sušené alebo nevarené, zachované zmrazením, bez obsahu pridaného cukru; orechy | |
| | i) | CITRUSOVÉ PLODY | 3 |
| | | grapefruity | |
| | | citróny | |
| | | limety | |
| | | mandarínky (vrátane klementínok a iných hybridov) | |
| | | pomaranče | |
| | | pomelá | |
| | | iné | |
| | ii) | ORECHY STROMOVÉ (nevylúpané alebo vylúpané) | 0,01 (1) |
| | | mandle | |
| | | para orechy | |
| | | kešu orechy | |
| | | gaštany | |
| | | kokosové orechy | |
| | | lieskovce | |
| | | makadamové orechy | |
| | | pekanové orechy | |
| | | píniové oriešky | |
| | | pistácie | |
| | | vlašské orechy | |
| | | iné | |
| | iii) | JADROVÉ OVOCIE | 0,01 (1) |
| | | jablká | |
| | | hrušky | |
| | | dule | |
| | | iné | |
| | iv) | KÔSTKOVÉ OVOCIE | |
| | | marhule | |
| | | čerešne | 2 |
| | | broskyne (vrátane nektarínok a podobných hybridov) | |
| | | slivky | |
| | | iné | 0,01 (1) |
| | v) | BOBUĽOVÉ A DROBNÉ OVOCIE | 0,01 (1) |
| | | a) | stolové a vínne hrozno | |
| | | | stolové hrozno | |
| | | | vínne hrozno | |
| | | b) | jahody (iné ako divorastúce) | |
| | | c) | krovité ovocné druhy (iné ako divorastúce) | |
| | | | ostružiny | |
| | | | ostružinové maliny | |
| | | | loganove černice | |
| | | | maliny | |
| | | | iné | |
| | | d) | iné drobné ovocie a bobuľoviny (iné ako divorastúce) | |
| | | | čučoriedky | |
| | | | brusnice | |
| | | | ríbezle (červené, čierne a biele) | |
| | | | egreše | |
| | | | iné | |
| | | e) | divorastúce bobuľoviny a ovocie | |
| | vi) | RÔZNE OVOCIE | |
| | | avokáda | |
| | | banány | |
| | | datle | |
| | | figy | |
| | | kivi | |
| | | kumkvaty | |
| | | liči | |
| | | mangá | |
| | | olivy (stolové) | 1 |
| | | olivy (na výrobu oleja) | 1 |
| | | papáje | |
| | | plody mučenky | |
| | | ananásy | |
| | | iné | 0,01 (1) |
| 2. | Zelenina, čerstvá alebo tepelne neupravená, mrazená alebo sušená | 0,01 (1) |
| | i) | KOREŇOVÁ A HĽUZOVÁ ZELENINA | |
| | | cvikla | |
| | | mrkva | |
| | | maniok (kasava) | |
| | | zeler | |
| | | chren | |
| | | topinambury | |
| | | paštrnák | |
| | | koreň petržlenu | |
| | | reďkovka | |
| | | kozia brada | |
| | | sladké zemiaky | |
| | | kvaka | |
| | | okrúhlica | |
| | | jamy | |
| | | iné | |
| | ii) | CIBUĽOVÁ ZELENINA | |
| | | cesnak | |
| | | cibuľa | |
| | | šalotka | |
| | | cibuľa jarná | |
| | | iné | |
| | iii) | PLODOVÁ ZELENINA | |
| | | a) | ľuľkovité | |
| | | | rajčiaky | |
| | | | papriky | |
| | | | baklažány | |
| | | | okra | |
| | | | iné | |
| | | b) | tekvicovité s jedlou šupou | |
| | | | uhorky | |
| | | | uhorky nakladačky | |
| | | | cukety | |
| | | | iné | |
| | | (c) | tekvicovité s nejedlou šupou | |
| | | | melón cukrový | |
| | | | tekvica | |
| | | | melón vodový/dyňa červená | |
| | | | iné | |
| | | d) | sladká kukurica | |
| | iv) | HLÚBOVÁ ZELENINA | |
| | | a) | hlúbová zelenina tvoriaca ružice | |
| | | | brokolica | |
| | | | karfiol | |
| | | | iné | |
| | | b) | hlúbová zelenina hlávková | |
| | | | ružičkový kel | |
| | | | hlávková kapusta | |
| | | | iné | |
| | | c) | hlúbová zelenina listová | |
| | | | čínska kapusta | |
| | | | kel kučeravý | |
| | | | iné | |
| | | d) | kaleráb | |
| | v) | LISTOVÁ ZELENINA A ČERSTVÉ BYLINKY | |
| | | a) | šalát a podobné plodiny | |
| | | | žerucha | |
| | | | valeriánka poľná | |
| | | | šalát | |
| | | | endívia (širokolistá) | |
| | | | rukola | |
| | | | listy a stonky hlúbovej zeleniny | |
| | | | iné | |
| | | b) | špenát a podobné plodiny | |
| | | | špenát | |
| | | | mangold | |
| | | | iné | |
| | | c) | potočnica lekárska | |
| | | d) | witloof (belgická čakanka) | |
| | | e) | bylinky | |
| | | | trebuľka | |
| | | | cesnak pažítkový | |
| | | | petržlenová vňať | |
| | | | zelerová vňať | |
| | | | iné | |
| | vi) | STRUKOVINY (čerstvé) | |
| | | fazuľa (so strukmi) | |
| | | fazuľa (bez strukov) | |
| | | hrach (so strukmi) | |
| | | hrach (bez strukov) | |
| | | iné | |
| | vii) | STONKOVÁ ZELENINA (čerstvá) | |
| | | špargľa | |
| | | artičoky bodliakové (kardy) | |
| | | zeler stonkový | |
| | | fenikel | |
| | | artičoky pravé | |
| | | pór | |
| | | rebarbora | |
| | | iné | |
| | viii) | HUBY | |
| | | a) | pestované huby | |
| | | b) | divorastúce huby | |
| 3. | Strukoviny | 0,01 (1) |
| | fazuľa | |
| | šošovica | |
| | hrach | |
| | iné | |
| 4. | Olejnaté semená | 0,02 (1) |
| | ľanové semeno | |
| | arašidy | |
| | mak | |
| | sezamové semená | |
| | slnečnicové semená | |
| | semená repky | |
| | sójové bôby | |
| | horčicové semená | |
| | semená bavlny | |
| | semená konope | |
| | iné | |
| 5. | Zemiaky | 0,01 (1) |
| | skoré zemiaky | |
| | konzumné zemiaky | |
| 6. | Čaj (fermentované alebo inak upravené sušené lístky a steblá druhu Camellia sinensis) | 0,1 (1) |
| 7. | Chmeľové šištičky (sušené) vrátane peliet a nekoncentrovaného prášku | 0,1 (1) |

1.

Pokiaľ ide o fentión, pridáva sa tento stĺpec:

Skupiny a príklady jednotlivých výrobkov, na ktoré sa uplatňujú MRL

Fentión a jeho kyslíkaté analógy, ich sulfoxidy a sulfóny vyjadrené ako fentión

„1.

Ovocie, čerstvé, sušené alebo nevarené, zachované zmrazením, bez obsahu pridaného cukru; orechy

i)

CITRUSOVÉ PLODY

3

grapefruity

citróny

limety

mandarínky (vrátane klementínok a iných hybridov)

pomaranče

pomelá

iné

ii)

ORECHY STROMOVÉ (nevylúpané alebo vylúpané)

0,01 (1)

mandle

para orechy

kešu orechy

gaštany

kokosové orechy

lieskovce

makadamové orechy

pekanové orechy

píniové oriešky

pistácie

vlašské orechy

iné

iii)

JADROVÉ OVOCIE

0,01 (1)

jablká

hrušky

dule

iné

iv)

KÔSTKOVÉ OVOCIE

marhule

čerešne

2

broskyne (vrátane nektarínok a podobných hybridov)

slivky

iné

0,01 (1)

v)

BOBUĽOVÉ A DROBNÉ OVOCIE

0,01 (1)

a)

stolové a vínne hrozno

stolové hrozno

vínne hrozno

b)

jahody (iné ako divorastúce)

c)

krovité ovocné druhy (iné ako divorastúce)

ostružiny

ostružinové maliny

loganove černice

maliny

iné

d)

iné drobné ovocie a bobuľoviny (iné ako divorastúce)

čučoriedky

brusnice

ríbezle (červené, čierne a biele)

egreše

iné

e)

divorastúce bobuľoviny a ovocie

vi)

RÔZNE OVOCIE

avokáda

banány

datle

figy

kivi

kumkvaty

liči

mangá

olivy (stolové)

1

olivy (na výrobu oleja)

1

papáje

plody mučenky

ananásy

iné

0,01 (1)

2.

Zelenina, čerstvá alebo tepelne neupravená, mrazená alebo sušená

0,01 (1)

i)

KOREŇOVÁ A HĽUZOVÁ ZELENINA

cvikla

mrkva

maniok (kasava)

zeler

chren

topinambury

paštrnák

koreň petržlenu

reďkovka

kozia brada

sladké zemiaky

kvaka

okrúhlica

jamy

iné

ii)

CIBUĽOVÁ ZELENINA

cesnak

cibuľa

šalotka

cibuľa jarná

iné

iii)

PLODOVÁ ZELENINA

a)

ľuľkovité

rajčiaky

papriky

baklažány

okra

iné

b)

tekvicovité s jedlou šupou

uhorky

uhorky nakladačky

cukety

iné

(c)

tekvicovité s nejedlou šupou

melón cukrový

tekvica

melón vodový/dyňa červená

iné

d)

sladká kukurica

iv)

HLÚBOVÁ ZELENINA

a)

hlúbová zelenina tvoriaca ružice

brokolica

karfiol

iné

b)

hlúbová zelenina hlávková

ružičkový kel

hlávková kapusta

iné

c)

hlúbová zelenina listová

čínska kapusta

kel kučeravý

iné

d)

kaleráb

v)

LISTOVÁ ZELENINA A ČERSTVÉ BYLINKY

a)

šalát a podobné plodiny

žerucha

valeriánka poľná

šalát

endívia (širokolistá)

rukola

listy a stonky hlúbovej zeleniny

iné

b)

špenát a podobné plodiny

špenát

mangold

iné

c)

potočnica lekárska

d)

witloof (belgická čakanka)

e)

bylinky

trebuľka

cesnak pažítkový

petržlenová vňať

zelerová vňať

iné

vi)

STRUKOVINY (čerstvé)

fazuľa (so strukmi)

fazuľa (bez strukov)

hrach (so strukmi)

hrach (bez strukov)

iné

vii)

STONKOVÁ ZELENINA (čerstvá)

špargľa

artičoky bodliakové (kardy)

zeler stonkový

fenikel

artičoky pravé

pór

rebarbora

iné

viii)

HUBY

a)

pestované huby

b)

divorastúce huby

3.

Strukoviny

0,01 (1)

fazuľa

šošovica

hrach

iné

4.

Olejnaté semená

0,02 (1)

ľanové semeno

arašidy

mak

sezamové semená

slnečnicové semená

semená repky

sójové bôby

horčicové semená

semená bavlny

semená konope

iné

5.

Zemiaky

0,01 (1)

skoré zemiaky

konzumné zemiaky

6.

Čaj (fermentované alebo inak upravené sušené lístky a steblá druhu Camellia sinensis)

0,1 (1)

7.

Chmeľové šištičky (sušené) vrátane peliet a nekoncentrovaného prášku

0,1 (1)

| 2. | Riadky týkajúce sa atrazínu, aznifos-etylu, cyflutrínu, etefónu, metamidofosu, metomylu, parakvátu a triazofosu sa nahrádzajú takto:
















  Skupiny a príklady jednotlivých výrobkov, na ktoré sa uplatňujú MRL | Atrazín | Azinfos-etyl | Cyflutrín vrátane iných izomérových zmesí (suma izomérov) | Etefón | Metamidofos | Metomyl/tiodikarb (vyjadrený ako metomyl) | Parakvát | Triazofos |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| „1. | Ovocie, čerstvé, sušené alebo nevarené, zachované zmrazením, bez obsahu pridaného cukru; orechy | 0,05 (2) | 0,02 (2) | | | | | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | i) | CITRUSOVÉ PLODY | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | | | |
| | | grapefruity | | | | | | 0,5 | | |
| | | citróny | | | | | | 1 | | |
| | | limety | | | | | | 1 | | |
| | | mandarínky (vrátane klementínok a iných hybridov) | | | | | | 1 | | |
| | | pomaranče | | | | | | 0,5 | | |
| | | pomelá | | | | | | 0,5 | | |
| | | iné | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | ii) | ORECHY STROMOVÉ (nevylúpané alebo vylúpané) | | | 0,02 (2) | 0,1 | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | mandle | | | | | | | | |
| | | para orechy | | | | | | | | |
| | | kešu orechy | | | | | | | | |
| | | gaštany | | | | | | | | |
| | | kokosové orechy | | | | | | | | |
| | | lieskovce | | | | | | | | |
| | | makadamové orechy | | | | | | | | |
| | | pekanové orechy | | | | | | | | |
| | | píniové oriešky | | | | | | | | |
| | | pistácie | | | | | | | | |
| | | vlašské orechy | | | | | | | | |
| | | iné | | | | | | | | |
| | iii) | JADROVÉ OVOCIE | | | 0,2 | | 0,01 (2) | 0,2 | | |
| | | jablká | | | | 0,5 | | | | |
| | | hrušky | | | | | | | | |
| | | dule | | | | | | | | |
| | | iné | | | | 0,05 (2) | | | | |
| | iv) | KÔSTKOVÉ OVOCIE | | | | | | | | |
| | | marhule | | | 0,3 | | 0,1 | 0,2 | | |
| | | čerešne | | | 0,2 | 3 | | 0,1 | | |
| | | broskyne (vrátane nektarínok a podobných hybridov) | | | 0,3 | | 0,05 | 0,2 | | |
| | | slivky | | | 0,2 | | | 0,5 | | |
| | | iné | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | v) | BOBUĽOVÉ A DROBNÉ OVOCIE | | | | | 0,01 (2) | | | |
| | | a) | stolové a vínne hrozno | | | 0,3 | 1 | | | | |
| | | | stolové hrozno | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | | | vínne hrozno | | | | | | 1 | | |
| | | b) | jahody (iné ako divorastúce) | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | c) | krovité ovocné druhy (iné ako divorastúce) | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | | ostružiny | | | | | | | | |
| | | | ostružinové maliny | | | | | | | | |
| | | | loganove černice | | | | | | | | |
| | | | maliny | | | | | | | | |
| | | | iné | | | | | | | | |
| | | d) | iné drobné ovocie a bobuľoviny (iné ako divorastúce) | | | 0,02 (2) | | | 0,05 (2) | | |
| | | | čučoriedky | | | | | | | | |
| | | | brusnice | | | | | | | | |
| | | | ríbezle (červené, čierne a biele) | | | | 5 | | | | |
| | | | egreše | | | | | | | | |
| | | | iné | | | | 0,05 (2) | | | | |
| | | e) | divorastúce bobuľoviny a ovocie | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | vi) | RÔZNE OVOCIE | | | 0,02 (2) | | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | avokáda | | | | | | | | |
| | | banány | | | | | | | | |
| | | datle | | | | | | | | |
| | | figy | | | | | | | | |
| | | kivi | | | | | | | | |
| | | kumkváty | | | | | | | | |
| | | liči | | | | | | | | |
| | | mangá | | | | | | | | |
| | | olivy (stolové) | | | | | | | | |
| | | olivy (na výrobu oleja) | | | | | | | | |
| | | papáje | | | | | | | | |
| | | plody mučenky | | | | | | | | |
| | | ananásy | | | | 2 | | | | |
| | | iné | | | | 0,05 (2) | | | | |
| 2. | Zelenina, čerstvá alebo tepelne neupravená, mrazená alebo sušená | | 0,02 (2) | | | | | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | i) | KOREŇOVÁ A HĽUZOVÁ ZELENINA | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | | | |
| | | cvikla | | | | | | | | |
| | | mrkva | | | | | | | | |
| | | maniok (kasava) | | | | | | | | |
| | | zeler | | | | | | | | |
| | | chren | | | | | | | | |
| | | topinambury | | | | | | | | |
| | | paštrnák | | | | | | | | |
| | | koreň petržlenu | | | | | | | | |
| | | reďkovka | | | | | | 0,5 | | |
| | | kozia brada | | | | | | | | |
| | | sladké zemiaky | | | | | | | | |
| | | kvaka | | | | | | | | |
| | | okrúhlica | | | | | | | | |
| | | jamy | | | | | | | | |
| | | iné | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | ii) | CIBUĽOVÁ ZELENINA | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | cesnak | | | | | | | | |
| | | cibuľa | | | | | | | | |
| | | šalotka | | | | | | | | |
| | | cibuľa jarná | | | | | | | | |
| | | iné | | | | | | | | |
| | iii) | PLODOVÁ ZELENINA | | | | | 0,01 (2) | | | |
| | | a) | ľuľkovité | 0,05 (2) | | | | | | | |
| | | | rajčiaky | | | 0,05 | 1 | | 0,2 | | |
| | | | papriky | | | 0,3 | 3 | | | | |
| | | | baklažány | | | | | | 0,2 | | |
| | | | okra | | | | | | | | |
| | | | iné | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | b) | tekvicovité s jedlou šupou | 0,05 (2) | | | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | | uhorky | | | 0,1 | | | | | |
| | | | uhorky nakladačky | | | | | | | | |
| | | | cukety | | | | | | | | |
| | | | iné | | | 0,02 (2) | | | | | |
| | | c) | tekvicovité s nejedlou šupou | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | | melón cukrový | | | | | | | | |
| | | | tekvica | | | | | | | | |
| | | | melón vodový/dyňa červená | | | | | | | | |
| | | | iné | | | | | | | | |
| | | d) | sladká kukurica | 0,1 | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | iv) | HLÚBOVÁ ZELENINA | 0,05 (2) | | | 0,05 (2) | | | | |
| | | a) | hlúbová zelenina tvoriaca ružice | | | 0,05 | | 0,02 | | | |
| | | | brokolica | | | | | | 0,2 | | |
| | | | karfiol | | | | | | | | |
| | | | iné | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | | b) | hlúbová zelenina hlávková | | | 0,2 | | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | | ružičkový kel | | | | | | | | |
| | | | hlávková kapusta | | | | | | | | |
| | | | iné | | | | | | | | |
| | | c) | hlúbová zelenina listová | | | 0,3 | | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | | čínska kapusta | | | | | | | | |
| | | | kel kučeravý | | | | | | | | |
| | | | iné | | | | | | | | |
| | | d) | kaleráb | | | 0,02 (2) | | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | v) | LISTOVÁ ZELENINA A ČERSTVÉ BYLINKY | 0,05 (2) | | | 0,05 (2) | 0,01 (2) | | | |
| | | a) | šalát a podobné plodiny | | | 0,5 | | | | | |
| | | | žerucha | | | | | | | | |
| | | | valeriánka poľná | | | | | | | | |
| | | | šalát | | | | | | 0,3 | | |
| | | | endívia (širokolistá) | | | | | | | | |
| | | | rukola | | | | | | | | |
| | | | listy a stonky hlúbovej zeleniny | | | | | | | | |
| | | | iné | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | | b) | špenát a podobné plodiny | | | 0,02 (2) | | | | | |
| | | | špenát | | | | | | 0,05 | | |
| | | | mangold | | | | | | | | |
| | | | iné | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | | c) | potočnica lekárska | | | 0,02 (2) | | | 0,05 (2) | | |
| | | d) | witloof (belgická čakanka) | | | 0,02 (2) | | | 0,05 (2) | | |
| | | e) | bylinky | | | 0,02 (2) | | | 0,3 | | |
| | | | trebuľka | | | | | | | | |
| | | | cesnak pažítkový | | | | | | | | |
| | | | petržlenová vňať | | | | | | | | |
| | | | zelerová vňať | | | | | | | | |
| | | | iné | | | | | | | | |
| | vi) | STRUKOVINY (čerstvé) | 0,05 (2) | | 0,05 | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | fazuľa (so strukmi) | | | | | 0,5 | | | |
| | | fazuľa (bez strukov) | | | | | | | | |
| | | hrach (so strukmi) | | | | | 0,5 | | | |
| | | hrach (bez strukov) | | | | | | | | |
| | | iné | | | | | 0,01 (2) | | | |
| | vii) | STONKOVÁ ZELENINA (čerstvá) | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | špargľa | | | | | | | | |
| | | artičoky bodliakové (kardy) | | | | | | | | |
| | | zeler stonkový | | | | | | | | |
| | | fenikel | | | | | | | | |
| | | artičoky pravé | | | | | 0,1 | | | |
| | | pór | | | | | | | | |
| | | rebarbora | | | | | | | | |
| | | iné | | | | | 0,01 (2) | | | |
| | viii) | HUBY | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | a) | pestované huby | | | | | | | | |
| | | b) | divorastúce huby | | | | | | | | |
| 3. | Strukoviny | 0,05 (2) | 0,02 (2) | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | fazuľa | | | | | | | | |
| | šošovica | | | | | | | | |
| | hrach | | | | | | | | |
| | iné | | | | | | | | |
| 4. | Olejnaté semená | 0,05 (2) | 0,02 (2) | | | | | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | ľanové semeno | | | | | | | | |
| | arašidy | | | | | | 0,1 | | |
| | mak | | | | | | | | |
| | sezamové semená | | | | | | | | |
| | slnečnicové semená | | | | | | | | |
| | semená repky | | | 0,05 | | | | | |
| | sójové bôby | | | | | 0,2 | 0,1 | | |
| | horčicové semená | | | | | | | | |
| | semená bavlny | | | | 2 | 0,2 | 0,1 | | |
| | semená konope | | | | | | | | |
| | iné | | | 0,02 (2) | 0,1 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| 5. | Zemiaky | 0,05 (2) | 0,02 (2) | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | skoré zemiaky | | | | | | | | |
| | konzumné zemiaky | | | | | | | | |
| 6. | Čaj (fermentované alebo inak upravené sušené lístky a steblá druhu Camellia sinensis) | 0,1 (2) | 0,05 (2) | 0,1 (2) | 0,1 (2) | 0,02 (2) | 0,1 (2) | 0,05 (2) | 0,02 (2) |
| 7. | Chmeľové šištičky (sušené) vrátane peliet a nekoncentrovaného prášku | 0,1 (2) | 0,05 (2) | 20 | 0,1 (2) | 0,02 (2) | 10 | 0,05 (2) | 0,02 (2) |

2.

Riadky týkajúce sa atrazínu, aznifos-etylu, cyflutrínu, etefónu, metamidofosu, metomylu, parakvátu a triazofosu sa nahrádzajú takto:

Skupiny a príklady jednotlivých výrobkov, na ktoré sa uplatňujú MRL

Atrazín

Azinfos-etyl

Cyflutrín vrátane iných izomérových zmesí (suma izomérov)

Etefón

Metamidofos

Metomyl/tiodikarb (vyjadrený ako metomyl)

Parakvát

Triazofos

„1.

Ovocie, čerstvé, sušené alebo nevarené, zachované zmrazením, bez obsahu pridaného cukru; orechy

0,05 (2)

0,02 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

i)

CITRUSOVÉ PLODY

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

grapefruity

0,5

citróny

1

limety

1

mandarínky (vrátane klementínok a iných hybridov)

1

pomaranče

0,5

pomelá

0,5

iné

0,05 (2)

ii)

ORECHY STROMOVÉ (nevylúpané alebo vylúpané)

0,02 (2)

0,1

0,01 (2)

0,05 (2)

mandle

para orechy

kešu orechy

gaštany

kokosové orechy

lieskovce

makadamové orechy

pekanové orechy

píniové oriešky

pistácie

vlašské orechy

iné

iii)

JADROVÉ OVOCIE

0,2

0,01 (2)

0,2

jablká

0,5

hrušky

dule

iné

0,05 (2)

iv)

KÔSTKOVÉ OVOCIE

marhule

0,3

0,1

0,2

čerešne

0,2

3

0,1

broskyne (vrátane nektarínok a podobných hybridov)

0,3

0,05

0,2

slivky

0,2

0,5

iné

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

v)

BOBUĽOVÉ A DROBNÉ OVOCIE

0,01 (2)

a)

stolové a vínne hrozno

0,3

1

stolové hrozno

0,05 (2)

vínne hrozno

1

b)

jahody (iné ako divorastúce)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

c)

krovité ovocné druhy (iné ako divorastúce)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

ostružiny

ostružinové maliny

loganove černice

maliny

iné

d)

iné drobné ovocie a bobuľoviny (iné ako divorastúce)

0,02 (2)

0,05 (2)

čučoriedky

brusnice

ríbezle (červené, čierne a biele)

5

egreše

iné

0,05 (2)

e)

divorastúce bobuľoviny a ovocie

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

vi)

RÔZNE OVOCIE

0,02 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

avokáda

banány

datle

figy

kivi

kumkváty

liči

mangá

olivy (stolové)

olivy (na výrobu oleja)

papáje

plody mučenky

ananásy

2

iné

0,05 (2)

2.

Zelenina, čerstvá alebo tepelne neupravená, mrazená alebo sušená

0,02 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

i)

KOREŇOVÁ A HĽUZOVÁ ZELENINA

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

cvikla

mrkva

maniok (kasava)

zeler

chren

topinambury

paštrnák

koreň petržlenu

reďkovka

0,5

kozia brada

sladké zemiaky

kvaka

okrúhlica

jamy

iné

0,05 (2)

ii)

CIBUĽOVÁ ZELENINA

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

cesnak

cibuľa

šalotka

cibuľa jarná

iné

iii)

PLODOVÁ ZELENINA

0,01 (2)

a)

ľuľkovité

0,05 (2)

rajčiaky

0,05

1

0,2

papriky

0,3

3

baklažány

0,2

okra

iné

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

b)

tekvicovité s jedlou šupou

0,05 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

uhorky

0,1

uhorky nakladačky

cukety

iné

0,02 (2)

c)

tekvicovité s nejedlou šupou

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

melón cukrový

tekvica

melón vodový/dyňa červená

iné

d)

sladká kukurica

0,1

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

iv)

HLÚBOVÁ ZELENINA

0,05 (2)

0,05 (2)

a)

hlúbová zelenina tvoriaca ružice

0,05

0,02

brokolica

0,2

karfiol

iné

0,05 (2)

b)

hlúbová zelenina hlávková

0,2

0,01 (2)

0,05 (2)

ružičkový kel

hlávková kapusta

iné

c)

hlúbová zelenina listová

0,3

0,01 (2)

0,05 (2)

čínska kapusta

kel kučeravý

iné

d)

kaleráb

0,02 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

v)

LISTOVÁ ZELENINA A ČERSTVÉ BYLINKY

0,05 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

a)

šalát a podobné plodiny

0,5

žerucha

valeriánka poľná

šalát

0,3

endívia (širokolistá)

rukola

listy a stonky hlúbovej zeleniny

iné

0,05 (2)

b)

špenát a podobné plodiny

0,02 (2)

špenát

0,05

mangold

iné

0,05 (2)

c)

potočnica lekárska

0,02 (2)

0,05 (2)

d)

witloof (belgická čakanka)

0,02 (2)

0,05 (2)

e)

bylinky

0,02 (2)

0,3

trebuľka

cesnak pažítkový

petržlenová vňať

zelerová vňať

iné

vi)

STRUKOVINY (čerstvé)

0,05 (2)

0,05

0,05 (2)

0,05 (2)

fazuľa (so strukmi)

0,5

fazuľa (bez strukov)

hrach (so strukmi)

0,5

hrach (bez strukov)

iné

0,01 (2)

vii)

STONKOVÁ ZELENINA (čerstvá)

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

špargľa

artičoky bodliakové (kardy)

zeler stonkový

fenikel

artičoky pravé

0,1

pór

rebarbora

iné

0,01 (2)

viii)

HUBY

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

a)

pestované huby

b)

divorastúce huby

3.

Strukoviny

0,05 (2)

0,02 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

fazuľa

šošovica

hrach

iné

4.

Olejnaté semená

0,05 (2)

0,02 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

ľanové semeno

arašidy

0,1

mak

sezamové semená

slnečnicové semená

semená repky

0,05

sójové bôby

0,2

0,1

horčicové semená

semená bavlny

2

0,2

0,1

semená konope

iné

0,02 (2)

0,1 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

5.

Zemiaky

0,05 (2)

0,02 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

skoré zemiaky

konzumné zemiaky

6.

Čaj (fermentované alebo inak upravené sušené lístky a steblá druhu Camellia sinensis)

0,1 (2)

0,05 (2)

0,1 (2)

0,1 (2)

0,02 (2)

0,1 (2)

0,05 (2)

0,02 (2)

7.

Chmeľové šištičky (sušené) vrátane peliet a nekoncentrovaného prášku

0,1 (2)

0,05 (2)

20

0,1 (2)

0,02 (2)

10

0,05 (2)

0,02 (2)

---

(1)  Označuje dolnú hranicu analytického určenia.“

(2)  Označuje dolnú hranicu analytického určenia.“

---

| 27.7.2006 | SK | Úradný vestník Európskej únie | L 206/27 |
| --- | --- | --- | --- |

27.7.2006

SK

Úradný vestník Európskej únie

L 206/27

---

SMERNICA KOMISIE 2006/62/ES

z 12. júla 2006,

ktorou sa menia a dopĺňajú prílohy k smerniciam Rady 76/895/EHS, 86/362/EHS, 86/363/EHS a 90/642/EHS, pokiaľ ide o maximálne hladiny rezíduí pre desmedifam, fenmedifam a chlorfenvinfos

(Text s významom pre EHP)

KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV,

so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho spoločenstva,

so zreteľom na smernicu Rady 76/895/EHS z 23. novembra 1976 o stanovení maximálnych limitov rezíduí pesticídov v a na ovocí a zelenine (1), a najmä na jej článok 5,

so zreteľom na smernicu Rady 86/362/EHS z 24. júla 1986 o stanovení maximálnych limitov rezíduí pesticídov v a na obilninách (2), a najmä na jej článok 10,

so zreteľom na smernicu Rady 86/363/EHS z 24. júla 1986, ktorou sa stanovujú maximálne úrovne rezíduí pesticídov v a na potravinách živočíšneho pôvodu (3), a najmä na jej článok 10,

so zreteľom na smernicu Rady 90/642/EHS z 27. novembra 1990 o stanovení maximálnych hladín pre rezíduá pesticídov v a na určitých produktoch rastlinného pôvodu vrátane ovocia a zeleniny (4), a najmä na jej článok 7,

so zreteľom na smernicu Rady 91/414/EHS z 15. júla 1991 o uvádzaní prípravkov na ochranu rastlín na trh (5) a najmä jej článok 4 ods. 1 písm. f),

keďže:

| (1) | Existujúce účinné látky desmedifam a fenmedifam boli smernicou Komisie 2004/58/ES (6) zaradené do prílohy I k smernici 91/414/EHS. |
| --- | --- |

(1)

Existujúce účinné látky desmedifam a fenmedifam boli smernicou Komisie 2004/58/ES (6) zaradené do prílohy I k smernici 91/414/EHS.

| (2) | Zaradenie príslušných účinných látok do prílohy I k smernici 91/414/EHS sa zakladalo na vyhodnotení predložených informácií týkajúcich sa ich navrhovaného použitia. Informácie týkajúce sa tohto použitia predložili určité členské štáty v súlade s článkom 4 ods. 1 písm. f) smernice 91/414/EHS. Dostupné informácie sa preskúmali a sú postačujúce na to, aby umožnili stanovenie maximálnych hladín určitých rezíduí. |
| --- | --- |

(2)

Zaradenie príslušných účinných látok do prílohy I k smernici 91/414/EHS sa zakladalo na vyhodnotení predložených informácií týkajúcich sa ich navrhovaného použitia. Informácie týkajúce sa tohto použitia predložili určité členské štáty v súlade s článkom 4 ods. 1 písm. f) smernice 91/414/EHS. Dostupné informácie sa preskúmali a sú postačujúce na to, aby umožnili stanovenie maximálnych hladín určitých rezíduí.

| (3) | Nariadením Komisie (ES) č. 2076/2002 (7) sa rozhodlo nezaradiť chlorfenvinfos do prílohy I k smernici 91/414/EHS. Určitým členským štátom sa povolilo zachovať platnosť určitých povolení na používanie výrobkov obsahujúcich chlorfenvinfos do 30. júna 2007. |
| --- | --- |

(3)

Nariadením Komisie (ES) č. 2076/2002 (7) sa rozhodlo nezaradiť chlorfenvinfos do prílohy I k smernici 91/414/EHS. Určitým členským štátom sa povolilo zachovať platnosť určitých povolení na používanie výrobkov obsahujúcich chlorfenvinfos do 30. júna 2007.

| (4) | V smernici 76/895/EHS sú už uvedené maximálne hladiny rezíduí (MHR) Spoločenstva pre chlorfenvinfos. Mali by sa zohľadniť pri stanovení maximálnych hladín rezíduí pre chlorfenvinfos v smernici 90/642/EHS. |
| --- | --- |

(4)

V smernici 76/895/EHS sú už uvedené maximálne hladiny rezíduí (MHR) Spoločenstva pre chlorfenvinfos. Mali by sa zohľadniť pri stanovení maximálnych hladín rezíduí pre chlorfenvinfos v smernici 90/642/EHS.

| (5) | Revízne správy Komisie, ktoré boli pripravené so zreteľom na zaradenie príslušných účinných látok do prílohy I k smernici 91/414/EHS, stanovili prijateľný denný príjem (Acceptable Daily Intake – ADI) a v prípade potreby aj akútnu referenčnú dávku (ARfD) pre tieto látky. Vystavenie spotrebiteľov potravinárskych výrobkov ošetrených príslušnými účinnými látkami účinkom týchto látok sa vyhodnotilo v súlade s postupmi Spoločenstva. Zohľadnili sa aj usmernenia uverejnené Svetovou zdravotníckou organizáciou (8) a stanovisko Vedeckého výboru pre rastliny (9) k použitej metodike. Prijal sa názor, že navrhované MHR nepovedú k prekročeniu týchto ADI alebo ARfD. |
| --- | --- |

(5)

Revízne správy Komisie, ktoré boli pripravené so zreteľom na zaradenie príslušných účinných látok do prílohy I k smernici 91/414/EHS, stanovili prijateľný denný príjem (Acceptable Daily Intake – ADI) a v prípade potreby aj akútnu referenčnú dávku (ARfD) pre tieto látky. Vystavenie spotrebiteľov potravinárskych výrobkov ošetrených príslušnými účinnými látkami účinkom týchto látok sa vyhodnotilo v súlade s postupmi Spoločenstva. Zohľadnili sa aj usmernenia uverejnené Svetovou zdravotníckou organizáciou (8) a stanovisko Vedeckého výboru pre rastliny (9) k použitej metodike. Prijal sa názor, že navrhované MHR nepovedú k prekročeniu týchto ADI alebo ARfD.

| (6) | V snahe zabezpečiť, aby bol spotrebiteľ primerane chránený pred vystavením účinkom rezíduí následkom neoprávneného používania prípravkov na ochranu rastlín, by sa pre príslušné kombinácie výrobkov/pesticídov mali stanoviť predbežné MHR na nižšiu hodnotu analytického určenia. |
| --- | --- |

(6)

V snahe zabezpečiť, aby bol spotrebiteľ primerane chránený pred vystavením účinkom rezíduí následkom neoprávneného používania prípravkov na ochranu rastlín, by sa pre príslušné kombinácie výrobkov/pesticídov mali stanoviť predbežné MHR na nižšiu hodnotu analytického určenia.

| (7) | Stanovenie takýchto predbežných MHR Spoločenstva nebráni členským štátom, aby stanovili predbežné MHR pre príslušné látky v súlade s článkom 4 ods. 1 písm. f) smernice 91/414/EHS a prílohou VI k tejto smernici. Štvorročné obdobie sa považuje za postačujúce na povolenie ďalšieho použitia príslušných účinných látok. Predbežné MRL by sa potom mali stať konečnými. |
| --- | --- |

(7)

Stanovenie takýchto predbežných MHR Spoločenstva nebráni členským štátom, aby stanovili predbežné MHR pre príslušné látky v súlade s článkom 4 ods. 1 písm. f) smernice 91/414/EHS a prílohou VI k tejto smernici. Štvorročné obdobie sa považuje za postačujúce na povolenie ďalšieho použitia príslušných účinných látok. Predbežné MRL by sa potom mali stať konečnými.

| (8) | Z tohto dôvodu je potrebné pridať všetky MHR, ktoré vznikajú na základe používania týchto výrobkov na ochranu rastlín do príloh smerníc 86/362/EHS, 86/363/EHS a 90/642/EHS, aby sa umožnil náležitý dohľad a kontrola nad zákazom ich používania a ochrana spotrebiteľa. Ak MHR ešte neboli určené, je potrebné ich stanoviť po prvýkrát. |
| --- | --- |

(8)

Z tohto dôvodu je potrebné pridať všetky MHR, ktoré vznikajú na základe používania týchto výrobkov na ochranu rastlín do príloh smerníc 86/362/EHS, 86/363/EHS a 90/642/EHS, aby sa umožnil náležitý dohľad a kontrola nad zákazom ich používania a ochrana spotrebiteľa. Ak MHR ešte neboli určené, je potrebné ich stanoviť po prvýkrát.

| (9) | Ustanovenia smernice 76/895/EHS, ktorými sa stanovujú MHR pre chlorfenvinfos, by sa preto mali vypustiť. |
| --- | --- |

(9)

Ustanovenia smernice 76/895/EHS, ktorými sa stanovujú MHR pre chlorfenvinfos, by sa preto mali vypustiť.

| (10) | Smernice 76/895/EHS, 86/362/EHS, 86/363/EHS a 90/642/EHS by sa preto mali zodpovedajúcim spôsobom zmeniť a doplniť. |
| --- | --- |

(10)

Smernice 76/895/EHS, 86/362/EHS, 86/363/EHS a 90/642/EHS by sa preto mali zodpovedajúcim spôsobom zmeniť a doplniť.

| (11) | Opatrenia ustanovené v tejto smernici sú v súlade so stanoviskom Stáleho výboru pre potravinový reťazec a zdravie zvierat, |
| --- | --- |

(11)

Opatrenia ustanovené v tejto smernici sú v súlade so stanoviskom Stáleho výboru pre potravinový reťazec a zdravie zvierat,

PRIJALA TÚTO SMERNICU:

Článok 1

V prílohe II k smernici 76/895/EHS sa riadok pre chlorfenvinfos vypúšťa.

Článok 2

Príloha II k smernici 86/362/EHS sa mení a dopĺňa v súlade s prílohou I k tejto smernici.

Článok 3

Príloha II k smernici 86/363/EHS sa mení a dopĺňa v súlade s prílohou II k tejto smernici.

Článok 4

Príloha II k smernici 90/642/EHS sa mení a dopĺňa v súlade s prílohou III k tejto smernici.

Článok 5

1.   Členské štáty prijmú a uverejnia najneskôr do 20. januára 2008 zákony, iné právne predpisy a správne opatrenia potrebné na dosiahnutie súladu s touto smernicou. Bezodkladne oznámia Komisii znenie týchto ustanovení a tabuľku zhody medzi takýmito ustanoveniami a touto smernicou.

Tieto ustanovenia sa uplatňujú od 21. januára 2008.

Členské štáty uvedú priamo v prijatých ustanoveniach alebo pri ich úradnom uverejnení odkaz na túto smernicu. Podrobnosti o odkaze upravia členské štáty.

2.   Členské štáty oznámia Komisii znenie hlavných ustanovení vnútroštátneho práva, ktoré prijmú v oblasti upravenej touto smernicou.

Článok 6

Táto smernica nadobúda účinnosť dvadsiatym dňom po jej uverejnení v Úradnom vestníku Európskej únie.

Článok 7

Táto smernica je určená členským štátom.

V Bruseli 12. júla 2006

Za Komisiu

Markos KYPRIANOU

člen Komisie

---

(1)  Ú. v. ES L 340, 9.12.1976, s. 26. Smernica naposledy zmenená a doplnená smernicou Komisie 2006/59/ES (Ú. v. EÚ L 175, 29.6.2006, s. 61).

1

(2)  Ú. v. ES L 221, 7.8.1986, s. 37. Smernica naposledy zmenená a doplnená smernicou 2006/59/ES.

2

(3)  Ú. v. ES L 221, 7.8.1986, s. 43. Smernica naposledy zmenená a doplnená smernicou 2006/59/ES.

3

(4)  Ú. v. ES L 350, 14.12.1990, s. 71. Smernica naposledy zmenená a doplnená smernicou 2006/59/ES.

4

(5)  Ú. v. ES L 230, 19.8.1991, s. 1 Smernica naposledy zmenená a doplnená smernicou Komisie 2006/45/ES (Ú. v. EÚ L 130, 18.5.2006, s. 27).

5

(6)  Ú. v. EÚ L 120, 24.4.2004, s. 26.

6

(7)  Ú. v. EÚ L 319, 23.11.2002, s. 3. Nariadenie naposledy zmenené a doplnené nariadením (ES) č. 1335/2005 (Ú. v. EÚ L 211, 13.8.2005, s. 6).

7

(8)  Usmernenia pre predpokladaný denný príjem rezíduí pesticídov (revidované), ktoré boli pripravené v rámci programu GEMS/Potravinový program v spolupráci s Kódexovým výborom pre rezíduá pesticídov uverejnené Svetovou zdravotníckou organizáciou roku 1997 (WHO/FSF/FOS/97.7).

8

(9)  Stanovisko Vedeckého výboru pre rastliny k otázkam týkajúcim sa zmien a doplnení príloh k smerniciam Rady 86/362/EHS, 86/363/EHS a 90/642/EHS (stanovisko vyjadrené Vedeckým výborom pre rastliny 14. júla 1998) (http://europa.eu.int/comm/food/fs/sc/index_en.html).

9

---

PRÍLOHA I

V časti A prílohy II k smernici 86/362/EHS sa pridávajú tieto riadky pre desmedifam, fenmedifam a chlorfenvinfos:

| Rezíduá pesticídov | Maximálna hladina v mg/kg |
| --- | --- |
| „Desmedifam | 0,05 (1)
   (2) obilniny |
| Fenmedifam | 0,05 (1)
   (2) obilniny |
| Chlorfenvinfos (zmes E- a Z-izomérov) | 0,02 (1) obilniny |

Rezíduá pesticídov

Maximálna hladina v mg/kg

„Desmedifam

0,05 (1)
   (2) obilniny

Fenmedifam

0,05 (1)
   (2) obilniny

Chlorfenvinfos (zmes E- a Z-izomérov)

0,02 (1) obilniny

---

(1)  Označuje dolnú hranicu analytického určenia.

1

(2)  Označuje predbežnú maximálnu hladinu rezíduí v súlade s článkom 4 ods. 1 písm. f) smernice 91/414/EHS.“

2

---

PRÍLOHA II

Príloha II k smernici 86/363/EHS sa mení a dopĺňa takto:

| 1. | V časti A sa pridáva tento riadok týkajúci sa chlorfenvinfosu:








  Rezíduá pesticídov | Maximálna hladina v mg/kg |
| --- | --- | --- |
| | tuku obsiahnutého v mäse, prípravkoch z mäsa, vnútornostiach a živočíšnych tukoch uvedených v prílohe I v rámci položiek č. ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 a 1602 (1) a (4) | kravského mlieka a plnotučného kravského mlieka uvedeného v prílohe I pod položkou č. 0401; pri ostatných potravinách pod položkami č. 0401, 0402, 0405 00 a 0406 v súlade s (2) a (4) | čerstvých vajec bez škrupín, vtáčích vajec a vaječných žĺtkov podľa prílohy I pod položkami č. 0407 00 a 0408 (3) a (4) |
| „Chlorfenvinfos (zmes E- a Z-izomérov) | 0,01 (1) | 0,01 (1) | 0,01 (1) |

1.

V časti A sa pridáva tento riadok týkajúci sa chlorfenvinfosu:

Rezíduá pesticídov

Maximálna hladina v mg/kg

tuku obsiahnutého v mäse, prípravkoch z mäsa, vnútornostiach a živočíšnych tukoch uvedených v prílohe I v rámci položiek č. ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 a 1602 (1) a (4)

kravského mlieka a plnotučného kravského mlieka uvedeného v prílohe I pod položkou č. 0401; pri ostatných potravinách pod položkami č. 0401, 0402, 0405 00 a 0406 v súlade s (2) a (4)

čerstvých vajec bez škrupín, vtáčích vajec a vaječných žĺtkov podľa prílohy I pod položkami č. 0407 00 a 0408 (3) a (4)

„Chlorfenvinfos (zmes E- a Z-izomérov)

0,01 (1)

0,01 (1)

0,01 (1)

| 2. | V časti A sa pridáva tento riadok týkajúci sa fenmedifamu:








  Rezíduá pesticídov | Maximálna hladina v mg/kg |
| --- | --- | --- |
| | mäsa, vrátane tuku, prípravkov z mäsa, vnútorností a živočíšneho tuku podľa prílohy I pod položkami č. ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 a 1602 | pre mlieko a mliečne výrobky podľa prílohy I pod položkami č. 0401, 0402, 0405 00 a 0406 | čerstvých vajec bez škrupín, vtáčích vajec a vaječných žĺtkov podľa prílohy I pod položkami č. 0407 00 a 0408 |
| „Fenmedifam [Metyl-N-(3-hydroxyfenyl) karbamát (MHPC) vyjadrené ako fenmedifan] | 0,05 (2)
   (3) | 0,05 (2)
   (3) | 0,05 (2)
   (3) |

2.

V časti A sa pridáva tento riadok týkajúci sa fenmedifamu:

Rezíduá pesticídov

Maximálna hladina v mg/kg

mäsa, vrátane tuku, prípravkov z mäsa, vnútorností a živočíšneho tuku podľa prílohy I pod položkami č. ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 a 1602

pre mlieko a mliečne výrobky podľa prílohy I pod položkami č. 0401, 0402, 0405 00 a 0406

čerstvých vajec bez škrupín, vtáčích vajec a vaječných žĺtkov podľa prílohy I pod položkami č. 0407 00 a 0408

„Fenmedifam [Metyl-N-(3-hydroxyfenyl) karbamát (MHPC) vyjadrené ako fenmedifan]

0,05 (2)
   (3)

0,05 (2)
   (3)

0,05 (2)
   (3)

---

(1)  Označuje dolnú hranicu analytického určenia.“

(2)  Označuje dolnú hranicu analytického určenia.

(3)  Označuje predbežnú maximálnu hladinu rezíduí v súlade s článkom 4 ods. 1 písm. f) smernice 91/414/EHS: pokiaľ nedôjde k jej zmene a doplneniu, táto hodnota sa stane konečnou s účinnosťou od 9. augusta 2010.“

---

PRÍLOHA III

V časti A prílohy II k smernici 90/642/EHS sa pridávajú tieto stĺpce týkajúce sa desmedifamu, fenmedifamu a chlorfenvinfosu:

| Rezíduá pesticídov a maximálne hladiny rezíduí (mg/kg) |
| --- |
| Skupiny a príklady jednotlivých produktov, na ktoré sa vzťahujú MHR | Desmedifam | Fenmedifam | Chlorfenvinfos (zmes E- a Z-izomérov) |
| „1. | Ovocie, čerstvé, sušené alebo tepelne neupravené, konzervované zmrazením, neobsahujúce pridaný cukor; orechy | 0,05 (1)
   (2) | | 0,02 (1) |
| | i) | CITRUSOVÉ PLODY | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | grapefruity | | | |
| | | citróny | | | |
| | | limety | | | |
| | | mandarínky (vrátane klementínok a podobných hybridov) | | | |
| | | pomaranče | | | |
| | | pomelá | | | |
| | | iné | | | |
| | ii) | ORECHY (vylúpané alebo nevylúpané) | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | mandle | | | |
| | | para orechy | | | |
| | | kešu orechy | | | |
| | | jedlé gaštany | | | |
| | | kokosové orechy | | | |
| | | lieskové orechy | | | |
| | | makadamové orechy | | | |
| | | pekanové orechy | | | |
| | | píniové oriešky | | | |
| | | pistácie | | | |
| | | vlašské orechy | | | |
| | | iné | | | |
| | iii) | JADROVÉ OVOCIE | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | jablká | | | |
| | | hrušky | | | |
| | | dule | | | |
| | | iné | | | |
| | iv) | KÔSTKOVÉ OVOCIE | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | marhule | | | |
| | | čerešne | | | |
| | | broskyne (vrátane nektáriniek a podobných hybridov) | | | |
| | | slivky | | | |
| | | iné | | | |
| | v) | BOBUĽOVINY A DROBNÉ OVOCIE | | | |
| | | a) | stolové a muštové hrozno | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | stolové hrozno | | | |
| | | | muštové hrozno | | | |
| | | b) | jahody (okrem voľne rastúcich) | | 0,1 (1)
   (2) | |
| | | c) | krovité ovocné druhy (okrem voľne rastúcich) | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | ostružiny | | | |
| | | | ostružina | | | |
| | | | ostružinové maliny | | | |
| | | | maliny | | | |
| | | | iné | | | |
| | | d) | iné drobné ovocie a bobuľoviny (okrem voľne rastúcich) | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | čučoriedky | | | |
| | | | brusnice | | | |
| | | | ríbezle (červené, čierne a biele) | | | |
| | | | egreše | | | |
| | | | iné | | | |
| | | e) | voľne rastúce bobuľoviny a ovocie | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | vi) | RÔZNE OVOCIE | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | avokádo | | | |
| | | banány | | | |
| | | datle | | | |
| | | figy | | | |
| | | kivi | | | |
| | | kumkváty | | | |
| | | liči | | | |
| | | mango | | | |
| | | olivy (stolové) | | | |
| | | olivy (na výrobu oleja) | | | |
| | | papáje | | | |
| | | plody mučenky | | | |
| | | ananásy | | | |
| | | granátové jablká | | | |
| | | iné | | | |
| 2. | Zelenina, čerstvá alebo tepelne neupravená, mrazená alebo sušená | 0,05 (1)
   (2) | | |
| | i) | KOREŇOVÁ A HĽUZOVÁ ZELENINA | | | |
| | | cvikla | | 0,1 (1)
   (2) | |
| | | mrkva | | | 0,5 |
| | | maniok (kasava) | | | |
| | | zeler | | | |
| | | chren | | | |
| | | topinambury | | | |
| | | paštrnák | | | 0,5 |
| | | petržlen | | | |
| | | reďkovka | | | 0,5 |
| | | kozia brada | | | |
| | | sladké zemiaky | | | |
| | | kvaka | | | 0,5 |
| | | okrúhlica | | | 0,5 |
| | | yamy | | | |
| | | iné | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | ii) | CIBUĽOVÁ ZELENINA | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | cesnak | | | 0,5 |
| | | cibuľa | | | |
| | | šalotka | | | 0,5 |
| | | cibuľa jarná | | | |
| | | iné | | | 0,02 (1) |
| | iii) | PLODOVÁ ZELENINA | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | a) | ľuľkovité | | | 0,02 (1) |
| | | | rajčiaky | | | |
| | | | paprika | | | |
| | | | baklažán | | | |
| | | | okra | | | |
| | | | iné | | | |
| | | b) | tekvicovité s jedlou šupou | | | |
| | | | uhorky | | | |
| | | | uhorky nakladačky | | | |
| | | | cukety | | | 0,1 |
| | | | iné | | | 0,02 (1) |
| | | c) | tekvicovité s nejedlou šupou | | | 0,02 (1) |
| | | | melón cukrový | | | |
| | | | tekvica | | | |
| | | | melón vodový | | | |
| | | | iné | | | |
| | | d) | sladká kukurica | | | 0,02 (1) |
| | iv) | HLÚBOVÁ ZELENINA | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | a) | hlúbová zelenina tvoriaca ružice | | | 0,02 (1) |
| | | | brokolica (vrátane odrody calabrese) | | | |
| | | | karfiol | | | |
| | | | iné | | | |
| | | b) | hlúbová zelenina hlávková | | | |
| | | | ružičkový kel | | | 0,1 |
| | | | hlávková kapusta | | | 0,5 |
| | | | iné | | | 0,02 (1) |
| | | c) | hlúbová zelenina listová | | | 0,02 (1) |
| | | | čínska kapusta | | | |
| | | | kel kučeravý | | | |
| | | | iné | | | |
| | | d) | kaleráb | | | 0,3 |
| | v) | LISTOVÁ ZELENINA A ČERSTVÉ BYLINKY | | | |
| | | a) | šalát a podobné | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | žerucha | | | 0,1 |
| | | | valeriánka poľná | | | 0,1 |
| | | | šalát | | | |
| | | | escarol (endívia širokolistá) | | | |
| | | | rukola | | | |
| | | | listy a stonky hlúbovej zeleniny | | | |
| | | | iné | | | 0,02 (1) |
| | | b) | špenát a podobné plodiny | | 0,5 (2) | |
| | | | špenát | | | 0,1 |
| | | | mangold | | | |
| | | | iné | | | 0,02 (1) |
| | | c) | potočnica | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | | d) | Čakanka | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | | e) | bylinky | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | trebuľka | | | |
| | | | pažítka | | | |
| | | | petržlen | | | 0,5 |
| | | | zelerová vňať | | | |
| | | | iné | | | 0,02 (1) |
| | vi) | STRUKOVINY (čerstvé) | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | | fazuľa (struky) | | | |
| | | fazuľa (vylúpaná) | | | |
| | | hrach (struky) | | | |
| | | hrach (vylúpaný) | | | |
| | | iné | | | |
| | vii) | STONKOVÁ ZELENINA (čerstvá) | | | |
| | | špargľa | | | 0,1 |
| | | artičoky bodliakové (kardy) | | | |
| | | zeler | | | 0,5 |
| | | fenikel | | | |
| | | artičoky | | 0,2 (2) | |
| | | pór | | | 0,1 |
| | | rebarbora | | | |
| | | iné | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | viii) | HUBY | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | a) | huby pestované | | | 0,05 |
| | | b) | huby voľne rastúce | | | 0,02 (1) |
| 3. | Strukoviny | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | fazuľa | | | |
| | šošovica | | | |
| | hrach | | | |
| | iné | | | |
| 4. | Olejnaté semená | 0,1 (1)
   (2) | 0,1 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | ľanové semeno | | | |
| | arašidy | | | |
| | semená maku | | | |
| | sezamové semená | | | |
| | slnečnicové semená | | | |
| | semená repky | | | |
| | sójové bôby | | | |
| | horčičné semená | | | |
| | bavlníkové semená | | | |
| | semená konope | | | |
| | iné | | | |
| 5. | Zemiaky | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | skoré zemiaky | | | |
| | konzumné zemiaky | | | |
| 6. | Čaj (sušené lístky a stonky, fermentované alebo nefermentované, druhu Camellia sinensis) | 0,1 (1)
   (2) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| 7. | Chmeľ (sušený) vrátane chmeľových peliet a nekoncentrovaného prášku | 0,1 (1)
   (2) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1) |

Rezíduá pesticídov a maximálne hladiny rezíduí (mg/kg)

Skupiny a príklady jednotlivých produktov, na ktoré sa vzťahujú MHR

Desmedifam

Fenmedifam

Chlorfenvinfos (zmes E- a Z-izomérov)

„1.

Ovocie, čerstvé, sušené alebo tepelne neupravené, konzervované zmrazením, neobsahujúce pridaný cukor; orechy

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

i)

CITRUSOVÉ PLODY

0,05 (1)
   (2)

grapefruity

citróny

limety

mandarínky (vrátane klementínok a podobných hybridov)

pomaranče

pomelá

iné

ii)

ORECHY (vylúpané alebo nevylúpané)

0,05 (1)
   (2)

mandle

para orechy

kešu orechy

jedlé gaštany

kokosové orechy

lieskové orechy

makadamové orechy

pekanové orechy

píniové oriešky

pistácie

vlašské orechy

iné

iii)

JADROVÉ OVOCIE

0,05 (1)
   (2)

jablká

hrušky

dule

iné

iv)

KÔSTKOVÉ OVOCIE

0,05 (1)
   (2)

marhule

čerešne

broskyne (vrátane nektáriniek a podobných hybridov)

slivky

iné

v)

BOBUĽOVINY A DROBNÉ OVOCIE

a)

stolové a muštové hrozno

0,05 (1)
   (2)

stolové hrozno

muštové hrozno

b)

jahody (okrem voľne rastúcich)

0,1 (1)
   (2)

c)

krovité ovocné druhy (okrem voľne rastúcich)

0,05 (1)
   (2)

ostružiny

ostružina

ostružinové maliny

maliny

iné

d)

iné drobné ovocie a bobuľoviny (okrem voľne rastúcich)

0,05 (1)
   (2)

čučoriedky

brusnice

ríbezle (červené, čierne a biele)

egreše

iné

e)

voľne rastúce bobuľoviny a ovocie

0,05 (1)
   (2)

vi)

RÔZNE OVOCIE

0,05 (1)
   (2)

avokádo

banány

datle

figy

kivi

kumkváty

liči

mango

olivy (stolové)

olivy (na výrobu oleja)

papáje

plody mučenky

ananásy

granátové jablká

iné

2.

Zelenina, čerstvá alebo tepelne neupravená, mrazená alebo sušená

0,05 (1)
   (2)

i)

KOREŇOVÁ A HĽUZOVÁ ZELENINA

cvikla

0,1 (1)
   (2)

mrkva

0,5

maniok (kasava)

zeler

chren

topinambury

paštrnák

0,5

petržlen

reďkovka

0,5

kozia brada

sladké zemiaky

kvaka

0,5

okrúhlica

0,5

yamy

iné

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

ii)

CIBUĽOVÁ ZELENINA

0,05 (1)
   (2)

cesnak

0,5

cibuľa

šalotka

0,5

cibuľa jarná

iné

0,02 (1)

iii)

PLODOVÁ ZELENINA

0,05 (1)
   (2)

a)

ľuľkovité

0,02 (1)

rajčiaky

paprika

baklažán

okra

iné

b)

tekvicovité s jedlou šupou

uhorky

uhorky nakladačky

cukety

0,1

iné

0,02 (1)

c)

tekvicovité s nejedlou šupou

0,02 (1)

melón cukrový

tekvica

melón vodový

iné

d)

sladká kukurica

0,02 (1)

iv)

HLÚBOVÁ ZELENINA

0,05 (1)
   (2)

a)

hlúbová zelenina tvoriaca ružice

0,02 (1)

brokolica (vrátane odrody calabrese)

karfiol

iné

b)

hlúbová zelenina hlávková

ružičkový kel

0,1

hlávková kapusta

0,5

iné

0,02 (1)

c)

hlúbová zelenina listová

0,02 (1)

čínska kapusta

kel kučeravý

iné

d)

kaleráb

0,3

v)

LISTOVÁ ZELENINA A ČERSTVÉ BYLINKY

a)

šalát a podobné

0,05 (1)
   (2)

žerucha

0,1

valeriánka poľná

0,1

šalát

escarol (endívia širokolistá)

rukola

listy a stonky hlúbovej zeleniny

iné

0,02 (1)

b)

špenát a podobné plodiny

0,5 (2)

špenát

0,1

mangold

iné

0,02 (1)

c)

potočnica

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

d)

Čakanka

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

e)

bylinky

0,05 (1)
   (2)

trebuľka

pažítka

petržlen

0,5

zelerová vňať

iné

0,02 (1)

vi)

STRUKOVINY (čerstvé)

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

fazuľa (struky)

fazuľa (vylúpaná)

hrach (struky)

hrach (vylúpaný)

iné

vii)

STONKOVÁ ZELENINA (čerstvá)

špargľa

0,1

artičoky bodliakové (kardy)

zeler

0,5

fenikel

artičoky

0,2 (2)

pór

0,1

rebarbora

iné

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

viii)

HUBY

0,05 (1)
   (2)

a)

huby pestované

0,05

b)

huby voľne rastúce

0,02 (1)

3.

Strukoviny

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

fazuľa

šošovica

hrach

iné

4.

Olejnaté semená

0,1 (1)
   (2)

0,1 (1)
   (2)

0,02 (1)

ľanové semeno

arašidy

semená maku

sezamové semená

slnečnicové semená

semená repky

sójové bôby

horčičné semená

bavlníkové semená

semená konope

iné

5.

Zemiaky

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

skoré zemiaky

konzumné zemiaky

6.

Čaj (sušené lístky a stonky, fermentované alebo nefermentované, druhu Camellia sinensis)

0,1 (1)
   (2)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)

7.

Chmeľ (sušený) vrátane chmeľových peliet a nekoncentrovaného prášku

0,1 (1)
   (2)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)

---

(1)  Označuje dolnú hranicu analytického určenia.

1

(2)  Označuje predbežnú maximálnu hladinu rezíduí v súlade s článkom 4 ods. 1 písm. f) smernice 91/414/EHS.“

2

---

| 27.7.2006 | SK | Úradný vestník Európskej únie | L 206/36 |
| --- | --- | --- | --- |

27.7.2006

SK

Úradný vestník Európskej únie

L 206/36

---

SMERNICA KOMISIE 2006/63/ES

zo 14. júla 2006,

ktorou sa menia a dopĺňajú prílohy II až VII k smernici Rady 98/57/ES o potláčaní choroby Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV,

so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho spoločenstva,

so zreteľom na smernicu Rady 98/57/ES z 20. júla 1998 (1) o potláčaní choroby Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., a najmä na jej článok 11,

keďže:

| (1) | Jedným z významných organizmov, ktoré škodia zemiakom a rajčiakom, je Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., patogén hnedej hniloby zemiakov a baktériového vädnutia zemiakov a rajčiakov (ďalej len „organizmus“). |
| --- | --- |

(1)

Jedným z významných organizmov, ktoré škodia zemiakom a rajčiakom, je Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., patogén hnedej hniloby zemiakov a baktériového vädnutia zemiakov a rajčiakov (ďalej len „organizmus“).

| (2) | Tento organizmus sa ešte stále vyskytuje v určitých častiach Spoločenstva. |
| --- | --- |

(2)

Tento organizmus sa ešte stále vyskytuje v určitých častiach Spoločenstva.

| (3) | V smernici 98/57/ES sa ustanovili podrobné pravidlá, ktoré sa majú proti tomuto organizmu v členských štátoch prijať, na zisťovanie prítomnosti tohto organizmu a jeho rozšírenia; predchádzanie jeho výskytu a šírenia; a v prípade jeho zistenia na zamedzenie jeho šírenia a na jeho potlačenie s cieľom vyhubenia. |
| --- | --- |

(3)

V smernici 98/57/ES sa ustanovili podrobné pravidlá, ktoré sa majú proti tomuto organizmu v členských štátoch prijať, na zisťovanie prítomnosti tohto organizmu a jeho rozšírenia; predchádzanie jeho výskytu a šírenia; a v prípade jeho zistenia na zamedzenie jeho šírenia a na jeho potlačenie s cieľom vyhubenia.

| (4) | Odvtedy sa dosiahol významný pokrok v chápaní biológie, postupov zisťovania a identifikácie tohto organizmu, okrem toho praktické skúsenosti nadobudnuté pri potláčaní tohto organizmu si vyžadujú preskúmanie niekoľkých technických ustanovení súvisiacich s opatreniami na jeho potlačenie. |
| --- | --- |

(4)

Odvtedy sa dosiahol významný pokrok v chápaní biológie, postupov zisťovania a identifikácie tohto organizmu, okrem toho praktické skúsenosti nadobudnuté pri potláčaní tohto organizmu si vyžadujú preskúmanie niekoľkých technických ustanovení súvisiacich s opatreniami na jeho potlačenie.

| (5) | V dôsledku tohto pokroku sa zdá byť potrebné preskúmať a aktualizovať opatrenia obsiahnuté v určitých prílohách k smernici 98/57/ES. |
| --- | --- |

(5)

V dôsledku tohto pokroku sa zdá byť potrebné preskúmať a aktualizovať opatrenia obsiahnuté v určitých prílohách k smernici 98/57/ES.

| (6) | Pokiaľ ide o postupy zisťovania prítomnosti a identifikácie, zavádza sa moderná metóda zisťovania fluorescenčnou hybridáciou in situ (FISH). Zavádza sa aj zdokonalená metóda polymerázovej reťazovej reakcie (PCR), ako aj zdokonalenia rôznych technických prvkov súčasného postupu zisťovania prítomnosti a identifikácie a patria sem metódy zisťovania prítomnosti a identifikácie organizmu v iných hostiteľských rastlinách ako sú zemiaky, vo vode a v pôde. |
| --- | --- |

(6)

Pokiaľ ide o postupy zisťovania prítomnosti a identifikácie, zavádza sa moderná metóda zisťovania fluorescenčnou hybridáciou in situ (FISH). Zavádza sa aj zdokonalená metóda polymerázovej reťazovej reakcie (PCR), ako aj zdokonalenia rôznych technických prvkov súčasného postupu zisťovania prítomnosti a identifikácie a patria sem metódy zisťovania prítomnosti a identifikácie organizmu v iných hostiteľských rastlinách ako sú zemiaky, vo vode a v pôde.

| (7) | Pokiaľ ide o technické prvky ochranných opatrení, zdokonalené ustanovenia sa zameriavajú na: spôsob konzervovania testovaných vzoriek, aby sa zaistilo spätné vystopovanie organizmu, prvky potrebné na stanovenie rozsahu pravdepodobnej kontaminácie, podrobný postup pri oznamovaní akejkoľvek potvrdenej prítomnosti organizmu a relevantnej kontaminovanej oblasti, opatrenia, ktoré sa majú uplatniť na miestach produkcie, ktoré boli označené za kontaminované a nachádzajúce sa v rámci vymedzených oblastí. Zaviedli sa aj určité ustanovenia pre rajčiaky, aby bolo možné viac zohľadniť význam tejto rastliny ako hostiteľa tohto organizmu. |
| --- | --- |

(7)

Pokiaľ ide o technické prvky ochranných opatrení, zdokonalené ustanovenia sa zameriavajú na: spôsob konzervovania testovaných vzoriek, aby sa zaistilo spätné vystopovanie organizmu, prvky potrebné na stanovenie rozsahu pravdepodobnej kontaminácie, podrobný postup pri oznamovaní akejkoľvek potvrdenej prítomnosti organizmu a relevantnej kontaminovanej oblasti, opatrenia, ktoré sa majú uplatniť na miestach produkcie, ktoré boli označené za kontaminované a nachádzajúce sa v rámci vymedzených oblastí. Zaviedli sa aj určité ustanovenia pre rajčiaky, aby bolo možné viac zohľadniť význam tejto rastliny ako hostiteľa tohto organizmu.

| (8) | Opatrenia stanovené v tejto smernici sú v súlade so stanoviskom Stáleho fytosanitárneho výboru, |
| --- | --- |

(8)

Opatrenia stanovené v tejto smernici sú v súlade so stanoviskom Stáleho fytosanitárneho výboru,

PRIJALA TÚTO SMERNICU:

Článok 1

Prílohy II až VII k smernici 98/57/ES sa týmto nahrádzajú zodpovedajúcimi zneniami v prílohe k tejto smernici.

Článok 2

1.   Členské štáty najneskôr do 31. marca 2007 prijmú a uverejnia zákony, iné právne predpisy a správne ustanovenia, ktoré musia byť v súlade s touto smernicou. Bezodkladne oznámia Komisii znenie týchto ustanovení a korelačnú tabuľku medzi týmito ustanoveniami a touto smernicou.

Tieto ustanovenia sa uplatňujú od 1. apríla 2007.

Členské štáty uvedú priamo v prijatých ustanoveniach alebo pri ich úradnom uverejnení odkaz na túto smernicu. Spôsob a formu tohto odkazu upravia členské štáty.

2.   Členské štáty okamžite oznámia Komisii znenie hlavných ustanovení vnútroštátnych zákonov, ktoré prijmú v oblasti pôsobnosti tejto smernice.

Článok 3

Táto smernica nadobúda účinnosť tretím dňom po jej uverejnení v Úradnom vestníku Európskej únie.

Článok 4

Táto smernica je určená členským štátom.

V Bruseli 14. júla 2006

Za Komisiu

Markos KYPRIANOU

člen Komisie

---

(1)  Ú. v. ES L 235, 21.8.1998, s. 1.

1

---

PRÍLOHA

PRÍLOHA II

TESTOVACIA SCHÉMA NA DIAGNOSTIKU, URČOVANIE PRÍTOMNOSTI A IDENTIFIKÁCIU RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL.

ROZSAH TESTOVACEJ SCHÉMY

V tejto schéme sa opisujú rozličné postupy používané pri:

| i) | diagnostike hnedej hniloby v hľuzách zemiakov a baktériového vädnutia rastlín zemiakov, rajčiakov a niektorých iných hostiteľských rastlín; |
| --- | --- |

i)

diagnostike hnedej hniloby v hľuzách zemiakov a baktériového vädnutia rastlín zemiakov, rajčiakov a niektorých iných hostiteľských rastlín;

| ii) | určovaní prítomnosti Ralstonia solanacearum vo vzorkách hľúz zemiakov, v hostiteľských rastlinách zemiakov, rajčiakov a iných vo vode a pôde; |
| --- | --- |

ii)

určovaní prítomnosti Ralstonia solanacearum vo vzorkách hľúz zemiakov, v hostiteľských rastlinách zemiakov, rajčiakov a iných vo vode a pôde;

| iii) | identifikácii Ralstonia solanacearum (R. solanacearum). |
| --- | --- |

iii)

identifikácii Ralstonia solanacearum (R. solanacearum).

OBSAH

| | | Strana |
| --- | --- | --- |
| | Základné princípy | 40 |
| ODDIEL I: | Aplikácia testovacej schémy | 40 |
| | 1. | Schéma určovania prítomnosti hnedej hniloby a baktériového vädnutia (R. solanacearum) hľúz zemiakov a rastlín zemiakov, rajčiakov alebo iných hostiteľských rastlín s príznakmi hnedej hniloby alebo baktériového vädnutia | 40 |
| | 2. | Schéma určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum vo vzorkách hľúz zemiakov bez príznakov | 43 |
| | 3. | Schéma určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum vo vzorkách rastlín zemiakov, rajčiakov alebo iných hostiteľských rastlín bez príznakov | 46 |
| ODDIEL II: | Podrobné metódy určovania prítomnosti R. solanacearum v hľuzách zemiakov a v rastlinách zemiakov, rajčiakov alebo v iných hostiteľských rastlinách s príznakmi hnedej hniloby alebo baktériového vädnutia | 48 |
| | 1. | Príznaky | 48 |
| | 2. | Skríningové testy | 48 |
| | 3. | Postup izolácie | 49 |
| | 4. | Identifikačné testy R. solanacearum | 49 |
| ODDIEL III: | 1. | Podrobné metódy určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum vo vzorkách hľúz zemiakov bez príznakov | 49 |
| | | 1.1. | Príprava vzoriek | 49 |
| | | 1.2. | Testovanie | 51 |
| | 2. | Podrobné metódy určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum vo vzorkách rastlín zemiakov, rajčiakov alebo iných rastlín bez príznakov | 51 |
| | | 2.1. | Príprava vzorky | 51 |
| | | 2.2. | Testovanie | 52 |
| ODDIEL IV: | 1. | Systém určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum vo vode | 53 |
| | 2. | Metódy určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum vo vode | 55 |
| | | 2.1. | Príprava vzorky | 55 |
| | | 2.2. | Testovanie | 55 |
| ODDIEL V: | 1. | Systém určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum v pôde | 56 |
| | 2. | Metódy určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum v pôde | 58 |
| | | 2.1. | Príprava vzorky | 58 |
| | | 2.2. | Testovanie | 58 |
| ODDIEL VI: | Optimalizované protokoly na určovanie prítomnosti a identifikáciu R. solanacearum | 58 |
| | A. | Diagnostické testy a testy na určovanie prítomnosti | 58 |
| | | 1. | Test vytekania baktériového slizu zo stonky | 58 |
| | | 2. | Určovanie prítomnosti granúl poly-β-hydroxybutyrátu | 58 |
| | | 3. | Testy sérologickej aglutinácie | 59 |
| | | 4. | Selektívna izolácia | 60 |
| | | | 4.1. | Selektívny platňový rozter | 60 |
| | | | 4.2. | Obohacovanie | 60 |
| | | 5. | Imunofluorescenčný test (IF test) | 61 |
| | | 6. | Test polymerázovej reťazovej reakcie (test PCR) | 64 |
| | | | 6.1. | Metódy čistenia DNA | 65 |
| | | | | a) | Metóda podľa Pastrika (2000) | 65 |
| | | | | b) | Iné metódy | 65 |
| | | | 6.2. | Test PCR | 66 |
| | | | 6.3. | Analýza produktu PCR | 66 |
| | | 7. | Test flourescenčnej hybridizácie in situ (test FISH) | 67 |
| | | 8. | Testy enzýmovej imunoanalýzy (ELISA) | 69 |
| | | | a) | Nepriamy test ELISA | 69 |
| | | | b) | Test DASI ELISA (sendvičová metóda enzýmovej imunoanalýzy ELISA) | 70 |
| | | 9. | Biotest | 71 |
| | B. | Identifikačné testy | 72 |
| | | 1. | Nutričné a enzymatické identifikačné testy | 72 |
| | | 2. | Test IF | 72 |
| | | 3. | Test ELISA | 73 |
| | | 4. | Test PCR | 73 |
| | | 5. | Test FISH | 73 |
| | | 6. | Profilovanie mastných kyselín (FAP) | 73 |
| | | 7. | Metódy pre charakterizáciu kmeňa | 73 |
| | | | 7.1. | Určenie biovaru | 73 |
| | | | 7.2. | Genómová daktyloskopia | 74 |
| | | | 7.3. | Metódy PCR | 74 |
| | C. | Konfirmačný test | 74 |
| | | Dodatok 1 | Laboratóriá zúčastnené na optimalizácii a validácii protokolov | 76 |
| | | Dodatok 2 | Médiá na izoláciu a kultiváciu R. solanacearum | 77 |
| | | Dodatok 3 | A. | Štandardný komerčne dostupný normalizovaný materiál | 79 |
| | | | B. | Príprava pozitívnych a negatívnych kontrol pre skríningové testy výrezkov PCR/IF a FISH | 80 |
| | | Dodatok 4 | Pufre pre testovacie postupy | 82 |
| | | Dodatok 5 | Určovanie stupňa kontaminácie pri testoch IF a FISH | 85 |
| | | Dodatok 6 | Validované protokoly a reagenty | 86 |
| | | Dodatok 7 | Validované reagenty pre test FISH | 91 |
| | | Dodatok 8 | Pestovanie rajčiakov a baklažánov | 93 |
| | | Bibliografia | | 94 |

Strana

Základné princípy

40

ODDIEL I:

Aplikácia testovacej schémy

40

1.

Schéma určovania prítomnosti hnedej hniloby a baktériového vädnutia (R. solanacearum) hľúz zemiakov a rastlín zemiakov, rajčiakov alebo iných hostiteľských rastlín s príznakmi hnedej hniloby alebo baktériového vädnutia

40

2.

Schéma určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum vo vzorkách hľúz zemiakov bez príznakov

43

3.

Schéma určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum vo vzorkách rastlín zemiakov, rajčiakov alebo iných hostiteľských rastlín bez príznakov

46

ODDIEL II:

Podrobné metódy určovania prítomnosti R. solanacearum v hľuzách zemiakov a v rastlinách zemiakov, rajčiakov alebo v iných hostiteľských rastlinách s príznakmi hnedej hniloby alebo baktériového vädnutia

48

1.

Príznaky

48

2.

Skríningové testy

48

3.

Postup izolácie

49

4.

Identifikačné testy R. solanacearum

49

ODDIEL III:

1.

Podrobné metódy určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum vo vzorkách hľúz zemiakov bez príznakov

49

1.1.

Príprava vzoriek

49

1.2.

Testovanie

51

2.

Podrobné metódy určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum vo vzorkách rastlín zemiakov, rajčiakov alebo iných rastlín bez príznakov

51

2.1.

Príprava vzorky

51

2.2.

Testovanie

52

ODDIEL IV:

1.

Systém určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum vo vode

53

2.

Metódy určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum vo vode

55

2.1.

Príprava vzorky

55

2.2.

Testovanie

55

ODDIEL V:

1.

Systém určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum v pôde

56

2.

Metódy určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum v pôde

58

2.1.

Príprava vzorky

58

2.2.

Testovanie

58

ODDIEL VI:

Optimalizované protokoly na určovanie prítomnosti a identifikáciu R. solanacearum

58

A.

Diagnostické testy a testy na určovanie prítomnosti

58

1.

Test vytekania baktériového slizu zo stonky

58

2.

Určovanie prítomnosti granúl poly-β-hydroxybutyrátu

58

3.

Testy sérologickej aglutinácie

59

4.

Selektívna izolácia

60

4.1.

Selektívny platňový rozter

60

4.2.

Obohacovanie

60

5.

Imunofluorescenčný test (IF test)

61

6.

Test polymerázovej reťazovej reakcie (test PCR)

64

6.1.

Metódy čistenia DNA

65

a)

Metóda podľa Pastrika (2000)

65

b)

Iné metódy

65

6.2.

Test PCR

66

6.3.

Analýza produktu PCR

66

7.

Test flourescenčnej hybridizácie in situ (test FISH)

67

8.

Testy enzýmovej imunoanalýzy (ELISA)

69

a)

Nepriamy test ELISA

69

b)

Test DASI ELISA (sendvičová metóda enzýmovej imunoanalýzy ELISA)

70

9.

Biotest

71

B.

Identifikačné testy

72

1.

Nutričné a enzymatické identifikačné testy

72

2.

Test IF

72

3.

Test ELISA

73

4.

Test PCR

73

5.

Test FISH

73

6.

Profilovanie mastných kyselín (FAP)

73

7.

Metódy pre charakterizáciu kmeňa

73

7.1.

Určenie biovaru

73

7.2.

Genómová daktyloskopia

74

7.3.

Metódy PCR

74

C.

Konfirmačný test

74

Dodatok 1

Laboratóriá zúčastnené na optimalizácii a validácii protokolov

76

Dodatok 2

Médiá na izoláciu a kultiváciu R. solanacearum

77

Dodatok 3

A.

Štandardný komerčne dostupný normalizovaný materiál

79

B.

Príprava pozitívnych a negatívnych kontrol pre skríningové testy výrezkov PCR/IF a FISH

80

Dodatok 4

Pufre pre testovacie postupy

82

Dodatok 5

Určovanie stupňa kontaminácie pri testoch IF a FISH

85

Dodatok 6

Validované protokoly a reagenty

86

Dodatok 7

Validované reagenty pre test FISH

91

Dodatok 8

Pestovanie rajčiakov a baklažánov

93

Bibliografia

94

ZÁKLADNÉ PRINCÍPY

V dodatkoch sa uvádzajú optimalizované protokoly rôznych metód, validované činidlá a podrobné pokyny na prípravu testovaných a kontrolných materiálov. V dodatku 1 sa nachádza zoznam laboratórií, ktoré sa podieľali na optimalizácii a validácii protokolov.

Keďže v protokoloch ide o zisťovanie karanténnych organizmov a zahŕňajú použitie živých kultúr R. solanacearum ako kontrolných materiálov, postupy bude potrebné uskutočňovať vo vhodných karanténnych podmienkach s primeranými zariadeniami na likvidáciu odpadov a za podmienky príslušného povolenia vydaného príslušnými úradmi pre karanténu rastlín.

Parametre testovania musia zabezpečiť konzistentné a reprodukovateľné odhalenie stupňov výskytu R. solanacearum pri stanovených prahových hodnotách zvolenej metódy.

Presná príprava pozitívnej kontroly je nevyhnutná.

Testovanie podľa požadovaných prahových hodnôt zahŕňa aj správne nastavenie, údržbu a kalibráciu zariadení, opatrnú manipuláciu s činidlami a ich starostlivé uchovávanie a dodržiavanie všetkých opatrení na predchádzanie kontaminácie medzi vzorkami, t. j. oddelenia pozitívnej kontroly od testovaných vzoriek. Musia sa uplatňovať normy na kontrolu kvality, aby nedochádzalo k administratívnym a iným omylom, najmä pokiaľ ide o označovanie a dokumentáciu.

Podozrenie na výskyt, ako sa uvádza v článku 4 ods. 2 smernice 98/57/ES, znamená pozitívny výsledok pri diagnostických alebo skríningových testoch uskutočnených na vzorke, ako sa určuje v nižšie uvedených vývojových diagramoch. Pozitívny prvý skríningový test (IF test, PCR/FISH, selektívna izolácia) sa musí potvrdiť druhým skríningovým testom založeným na inom biologickom princípe.

Ak je prvý skríningový test pozitívny, potom je podozrenie na kontamináciu R. solanacearum a musí sa urobiť druhý skríningový test. Ak je pozitívny druhý skríningový test, potom sa podozrenie potvrdí (podozrenie na výskyt) a testovanie podľa systému musí pokračovať. Ak je druhý skríningový test negatívny, vzorka sa nepovažuje za kontaminovanú R. solanacearum.

Potvrdená prítomnosť, ako sa uvádza v článku 5 ods. 1) smernice 98/57/ES, znamená izoláciu a identifikáciu čistej kultúry R. solanacearum s potvrdenou patogenitou.

ODDIEL I

APLIKÁCIA TESTOVACEJ SCHÉMY

1.   Schéma určovania prítomnosti hnedej hniloby a baktériového vädnutia (Ralstonia solanacearum) hľúz zemiakov a rastlín zemiakov, rajčiakov alebo iných hostiteľských rastlín s príznakmi hnedej hniloby alebo baktériového vädnutia

Testovanie je určené pre hľuzy zemiakov a rastliny s typickými príznakmi hnedej hniloby alebo cievneho vädnutia alebo s podozrením na ne. Zahŕňa skríningový test, izoláciu patogénu z infikovaného cievneho pletiva na (selektívnom) médiu a v prípade pozitívneho výsledku identifikáciu kultúry ako Ralstonia solanacearum.

Image

Image

2.   Schéma určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum vo vzorkách hľúz zemiakov bez príznakov

Princíp

Testovanie je zamerané na určenie prítomnosti latentných infekcií v hľuzách zemiakov. Pozitívny výsledok najmenej dvoch skríningových testov3, založených na rôznych biologických princípoch, sa musí doplniť izoláciou patogénu; v prípade izolácie typických kolónií nasleduje potvrdenie čistej kultúry ako R. solanacearum. Pozitívny výsledok iba jedného zo skríningových testov vzorky nestačí na potvrdenie podozrenia.

Skríningové testy a izolačné testy musia umožniť diagnostiku resuspendovaného peletu s hustotou 103 až 104 buniek/ml, ktorý je ako pozitívna kontrola súčasťou každej série testov.

Image

Image

3.   Schéma určovania prítomnosti a identifikácie Ralstonia solanacearum vo vzorkách rastlín zemiakov, rajčiakov alebo iných hostiteľských rastlín bez príznakov

Image

Image

ODDIEL II

PODROBNÉ METÓDY URČOVANIA PRÍTOMNOSTI RALSTONIA SOLANACEARUM V HĽUZÁCH ZEMIAKOV A V RASTLINÁCH ZEMIAKOV, RAJČIAKOV ALEBO INÝCH HOSTITEĽSKÝCH RASTLINÁCH S PRÍZNAKMI HNEDEJ HNILOBY ALEBO BAKTÉRIOVÉHO VÄDNUTIA

1.   Príznaky (pozri internetovú stránku http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

1.1.   Príznaky na zemiakoch

Rastlina zemiaka. V ranom štádiu sa infekcia na poli rozozná podľa uvädnutých listov vo vrchnej časti rastliny pri vysokých teplotách počas dňa, pričom cez noc sa zotavia. V raných štádiách vädnutia listy zostávajú zelené, ale neskôr žltnú a dochádza k hnedému odumieraniu. Vyskytujú sa aj epinastie. Vädnutie jedného výhonku alebo celých rastlín sa rýchlo stane nezvratným a jeho dôsledkom je odumretie rastliny. Cievne zväzky priečne rozrezaných stoniek zvädnutých rastlín sú zvyčajne hnedé a z povrchu rezu sa samovoľne alebo po stlačení vylučuje mliečny baktériový slizovitý exkrét. Ak sa odrezaná stonka umiestni zvislo do vody, z cievnych zväzkov vytekajú vlákna slizu.

Hľuza zemiaka. Hľuzy zemiaka sa musia rozrezať priečne blízko pupkového (stolónového) konca, alebo pozdĺžne cez stolónový koniec. Rané štádium infekcie sa prejavuje sklovito žltým až svetlohnedým sfarbením cievnych zväzkov, z ktorých sa po niekoľkých minútach spontánne vylučuje svetlý smotanový baktériový sliz. Neskôr sa cievne sfarbenie zmení na zreteľnejšie hnedé a odumieranie pletiva sa môže rozšíriť na parenchymatózne pletivo. V pokročilých štádiách infekcia pokračuje smerom od pupkového konca a očiek, z ktorých sa vylučuje baktériový sliz spôsobujúci prilínanie častíc zeminy. Môžu sa objaviť červenkasto hnedé, mierne vtlačené lézie na šupe spôsobené prepadnutím cievnych zväzkov dovnútra. V pokročilých štádiách infekcie sa bežne vyskytuje sekundárna hubová a baktériová mäkká hniloba.

1.2.   Príznaky na rajčiaku

Rastlina rajčiaka. Prvým viditeľným príznakom je ochabnutý vzhľad najmladších listov. V podmienkach priaznivých pre patogény (teplota pôdy okolo 25 °C, nasýtená vlhkosť vzduchu) nasleduje do niekoľkých dní epinastia a vädnutie jednej strany rastliny alebo celej rastliny, čo má za následok kolaps celej rastliny. V menej priaznivých podmienkach (teplota pôdy pod 21 °C) je vädnutie menej výrazné, ale na stonke sa môže vyvinúť veľký počet postranných výhonkov. Pozdĺž stonky možno pozorovať slizovitý pás, ktorý svedčí o odumieraní cievneho systému. Pri priečnom reze stonky sfarbené hnedé cievne zväzky vylučujú biely alebo žltkastý baktériový sliz.

1.3.   Príznaky na iných hostiteľoch

Rastliny Solanum dulcamara a S. nigrum. V normálnych podmienkach, ak teploty pôdy neprekročia 25 °C alebo ak úroveň inokula nie je extrémne vysoká (napr. pri S. nigrum, ktoré rastie vedľa infikovaných rastlín zemiaka alebo rajčiaka), sa príznaky vädnutia u týchto hostiteľských burín vyskytujú zriedka. Ak sa vädnutie vyskytne, príznaky sú rovnaké, ako sa opisujú u rajčiaka. Nezvädnuté rastliny S. dulcamara rastúce so stonkou a koreňmi vo vode môžu mať na priečnom reze spodnej časti stonky alebo časti, ktorá je pod vodou, mierne svetlohnedé sfarbenie cievnych zväzkov. Ak sa odrezaná stonka umiestni zvisle do vody, aj v prípade absencie príznakov vädnutia sa z povrchu rezu cievnych zväzkov vylučuje baktériový sliz alebo vlákna slizu.

2.   Testy vytekania baktériového slizu zo stonky

Testy vytekania baktétiového slizu zo stonky môžu uľahčiť predbežnú diagnostiku, ale nie sú rozhodujúce. Použije sa jeden alebo viacero z týchto validovaných testov:

2.1.   Test vytekania baktériového slizu zo stonky

(Pozri oddiel VI.A.1.)

2.2.   Určovanie prítomnosti granúl poly-β-hydroxybutyrátu (PHB)

Charakteristické granuly PHB v bunkách R. solanacearum sa zviditeľňujú sfarbením teplom fixovaného rozteru baktériového slizu z infikovaného pletiva na podložnom mikroskopickom sklíčku prostredníctvom nílskej modrej A alebo sudánskej čiernej (pozri oddiel VI.A.2).

2.3.   Testy sérologickej aglutinácie

(Pozri oddiel VI.A.3.)

2.4.   Iné testy

K ďalším vhodným skríningovým testom patria test IF (pozri oddiel VI.A.5), test FISH (pozri oddiel VI.A.7), testy ELISA (pozri oddiel VI.A.8) a testy PCR (pozri oddiel VI.A.6).

3.   Postup izolácie

| a) | Odstráňte sliz alebo časti odfarbeného pletiva z cievnych zväzkov hľuzy zemiaka alebo z cievnych pletív stonky rastliny zemiaka, rajčiaka alebo inej vädnúcej hostiteľskej rastliny. Urobí sa suspenzia v malom objeme sterilnej destilovanej vody alebo v 50 mM fosfátovom pufri (dodatok 4) a nechá sa 5 až 10 minút stáť. |
| --- | --- |

a)

Odstráňte sliz alebo časti odfarbeného pletiva z cievnych zväzkov hľuzy zemiaka alebo z cievnych pletív stonky rastliny zemiaka, rajčiaka alebo inej vädnúcej hostiteľskej rastliny. Urobí sa suspenzia v malom objeme sterilnej destilovanej vody alebo v 50 mM fosfátovom pufri (dodatok 4) a nechá sa 5 až 10 minút stáť.

| b) | Zo suspenzie sa pripraví viacero desatinných riedení. |
| --- | --- |

b)

Zo suspenzie sa pripraví viacero desatinných riedení.

| c) | Objem 50 – 100 μl suspenzie a jednotlivých riedení prenesieme na univerzálnu živnú pôdu (NA, YPGA alebo SPA; pozri dodatok 2) a/alebo na Kelmanovo tetrazóliové médium (dodatok 2) a/alebo a validované selektívne médium (napr. SMSA; pozri dodatok 2). Riedenia rozotrieme vhodnou platňovou metódou. Je vhodné pripraviť si samostatné platne so zriedenou kultúrou bunkovej suspenzie biovaru 2 R. solanacearum ako pozitívnu kontrolu. |
| --- | --- |

c)

Objem 50 – 100 μl suspenzie a jednotlivých riedení prenesieme na univerzálnu živnú pôdu (NA, YPGA alebo SPA; pozri dodatok 2) a/alebo na Kelmanovo tetrazóliové médium (dodatok 2) a/alebo a validované selektívne médium (napr. SMSA; pozri dodatok 2). Riedenia rozotrieme vhodnou platňovou metódou. Je vhodné pripraviť si samostatné platne so zriedenou kultúrou bunkovej suspenzie biovaru 2 R. solanacearum ako pozitívnu kontrolu.

| d) | Platne sa nechajú inkubovať pri 28 °C 2 až 6 dní.






  — | Na univerzálnych živných pôdach virulentné izoláty R. solanacearum vytvárajú perlovo biele, ploché, nepravidelné a fluidné kolónie, často s charakteristickými špirálkami v strede. Nevirulentné formy R. solanacearum vytvárajú malé kruhové, nefluidné, maslovité kolónie, ktoré sú celé smotanovo biele. |
| --- | --- | --- |

d)

Platne sa nechajú inkubovať pri 28 °C 2 až 6 dní.

—

Na univerzálnych živných pôdach virulentné izoláty R. solanacearum vytvárajú perlovo biele, ploché, nepravidelné a fluidné kolónie, často s charakteristickými špirálkami v strede. Nevirulentné formy R. solanacearum vytvárajú malé kruhové, nefluidné, maslovité kolónie, ktoré sú celé smotanovo biele.

| — | Na Kelmanovom tetrazóliovom médiu a SMSA médiu majú špirálky krvavočervenú farbu. Nevirulentné formy Ralstonia solanacearum vytvárajú malé kruhové, nefluidné, maslovité kolónie, ktoré sú celé tmavočervené. |
| --- | --- |

—

Na Kelmanovom tetrazóliovom médiu a SMSA médiu majú špirálky krvavočervenú farbu. Nevirulentné formy Ralstonia solanacearum vytvárajú malé kruhové, nefluidné, maslovité kolónie, ktoré sú celé tmavočervené.

4.   Identifikačné testy na R. solanacearum

Testy na potvrdenie identity predpokladaných izolátov R. solanacearum sa uvádzajú v oddiele VI.B.

ODDIEL III

1.   Podrobné metódy určovania prítomnosti a identifikácie Ralstonia solanacearum vo vzorkách hľúz zemiakov bez príznakov

1.1.   Príprava vzoriek

Poznámka:

| — | Štandardná veľkosť vzoriek je 200 hľúz na test. Intenzívnejšie odoberanie vzoriek vyžaduje viac testov na vzorkách tejto veľkosti. Väčší počet hľúz zemiakov vo vzorke vedie k inhibícii alebo k zložitej interpretácii výsledkov. Tento test je však vhodný na použitie aj pri vzorkách s menej ako 200 hľuzami, ak je k dispozícii menej hľúz. |
| --- | --- |

—

Štandardná veľkosť vzoriek je 200 hľúz na test. Intenzívnejšie odoberanie vzoriek vyžaduje viac testov na vzorkách tejto veľkosti. Väčší počet hľúz zemiakov vo vzorke vedie k inhibícii alebo k zložitej interpretácii výsledkov. Tento test je však vhodný na použitie aj pri vzorkách s menej ako 200 hľuzami, ak je k dispozícii menej hľúz.

| — | Validácia všetkých nižšie uvedených metód určovania prítomnosti sa zakladá na skúšaní vzoriek z 200. |
| --- | --- |

—

Validácia všetkých nižšie uvedených metód určovania prítomnosti sa zakladá na skúšaní vzoriek z 200.

| — | Nižšie opísaný extrakt zo zemiaka sa môže použiť aj na určenie prítomnosti baktérie spôsobujúcej krúžkovitosť zemiakov, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. |
| --- | --- |

—

Nižšie opísaný extrakt zo zemiaka sa môže použiť aj na určenie prítomnosti baktérie spôsobujúcej krúžkovitosť zemiakov, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

Nepovinná predúprava pred prípravou vzorky:

| a) | Inkubácia vzoriek pri 25 – 30 °C až do 2 týždňov pred testovaním podporí množenie všetkých populácií R. solanacearum. |
| --- | --- |

a)

Inkubácia vzoriek pri 25 – 30 °C až do 2 týždňov pred testovaním podporí množenie všetkých populácií R. solanacearum.

| b) | Umytie hľúz. Medzi každou vzorkou použite vhodné dezinfekčné prostriedky (ak sa použije test PCR, zlúčeniny chlóru na odstránenie DNA patogénu) a čistidlá. Hľuzy nechajte na vzduchu vyschnúť. Toto umývanie je užitočné (ale nevyžaduje sa) najmä pri vzorkách, na ktorých sa nachádza príliš veľa zeminy, a ak sa má robiť test PCR alebo priama izolácia. |
| --- | --- |

b)

Umytie hľúz. Medzi každou vzorkou použite vhodné dezinfekčné prostriedky (ak sa použije test PCR, zlúčeniny chlóru na odstránenie DNA patogénu) a čistidlá. Hľuzy nechajte na vzduchu vyschnúť. Toto umývanie je užitočné (ale nevyžaduje sa) najmä pri vzorkách, na ktorých sa nachádza príliš veľa zeminy, a ak sa má robiť test PCR alebo priama izolácia.

1.1.1.   Čistým, dezinfikovaným skalpelom alebo zeleninovým nožom odstráňte šupku hľuzy na jej pupkovom (stolónovom) konci tak, aby bolo vidieť cievne pletivo. Z cievneho pletiva na pupkovom konci každej hľuzy opatrne vyrežte malý výrezok cievneho pletiva z pupkového konca tak, aby sa vyrezalo čo najmenej necievnych pletív. (Pozri internetovú stránku http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Poznámka: Vyraďte všetky (hnijúce): ponechajte hľuzy vykazujúce symptómy hnedej hrdze a testujte ich oddelene.

Ak sa pri odstraňovaní pupkového konca zistia vo výrezku príznaky hnedej hniloby, hľuza sa musí vizuálne prehliadnuť a odrezať blízko pupkového konca. Každá rozrezaná hľuza s príznakmi sa uloží aspoň na 2 dni pri izbovej teplote, aby sa umožnila suberizácia (zahojenie reznej rany) a skladuje sa schladená (pri 4 až 10 °C) v primeraných podmienkach karantény. Všetky hľuzy, vrátane hľúz podozrivých na symptómy, sa majú uchovávať podľa prílohy III.

1.1.2.   Výrezky z pupkových koncov hľúz zhromaždite v nepoužitých jednorazových nádobách, ktoré sa dajú uzatvoriť a/alebo utesniť (v prípade opakovaného použitia nádoby musia byť dôkladne očistené a dezinfikované zlúčeninami chlóru). Odporúča sa výrezky z pupkových koncov okamžite spracovať. Ak to nie je možné, skladujte ich v nádobe bez pridania pufra schladené najdlhšie 72 hodín alebo pri izbovej teplote najdlhšie 24 hodín.

Výrezky z pupkových koncov hľúz spracujete jedným z týchto postupov:

| a) | buď pridajte dostatočný objem (asi 40 ml) maceračného pufra (dodatok 4), aby bol výrezok prekrytý, umiestnite do rotačnej trepačky a inkubujte počas 4 hodín (50 až 100 otáčok/min.) pri teplote pod 24 °C alebo počas 16 až 24 hodín schladené.
  alebo |
| --- | --- |

a)

buď pridajte dostatočný objem (asi 40 ml) maceračného pufra (dodatok 4), aby bol výrezok prekrytý, umiestnite do rotačnej trepačky a inkubujte počas 4 hodín (50 až 100 otáčok/min.) pri teplote pod 24 °C alebo počas 16 až 24 hodín schladené.

alebo

| b) | výrezok homogenizujte dostatočným objemom (asi 40 ml) maceračného pufra (dodatok 4) buď v mixéri (napr. Waring alebo Ultra Thurax) alebo rozdrvením v uzatvorenom jednorazovom maceračnom vrecúšku (napr. Stomacher alebo Bioreba strong guage polythene, 150 mm × 250 mm; sterilizovanom ožiarením) gumeným kladivkom alebo iným vhodným nástrojom na drvenie (napr. Homex). |
| --- | --- |

b)

výrezok homogenizujte dostatočným objemom (asi 40 ml) maceračného pufra (dodatok 4) buď v mixéri (napr. Waring alebo Ultra Thurax) alebo rozdrvením v uzatvorenom jednorazovom maceračnom vrecúšku (napr. Stomacher alebo Bioreba strong guage polythene, 150 mm × 250 mm; sterilizovanom ožiarením) gumeným kladivkom alebo iným vhodným nástrojom na drvenie (napr. Homex).

Poznámka: Keď sa vzorky homogenizujú v mixéri, je riziko krížovej kontaminácie vzoriek vysoké. Počas extrakcie treba urobiť opatrenia, aby nedochádzalo k rozprašovaniu ani k rozlievaniu. Pri každej vzorke použite čerstvo sterilizované čepele v mixéri a nádoby. Ak sa použije test PCR, zabráňte prenosu DNA na nádobách alebo na drviacom zariadení. Keď sa použije test PCR, odporúča sa drvenie v jednorazových vrecúškach..

1.1.3.   Dekantujte supernatant. Ak je príliš kalný, zjasní sa buď odstredením pri nízkej rýchlosti (pri odstredivej sile nie viac ako 180 g počas 10 minút pri teplote od 4 do 10 °C), alebo vákuovou filtráciou (40 až 100 μm), pričom sa filter premyje ďalším maceračným pufrom ( 10 ml).

1.1.4.   Bakteriálnu frakciu koncentrujte odstredením pri odstredivej sile 7 000 g počas 15 minút (alebo 10 000 g počas 10 minút) pri teplote od 4 do 10 °C a supernatant vylejte tak, aby ste neporušili vzniknutý pelet.

1.1.5.   Pelet resuspendujte v 1,5 ml peletového pufra (dodatok 4). Použite 500 μl na test na R. solanacearum, 500 μl pre Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus a 500 μl na referenčné účely. Pridajte 10 – 25 % (v/v) sterilný glycerín do 500 μl referenčného alikvotného podielu a do zostávajúceho testovaného alikvotného podielu, pretrepte a skladujte pri teplote od –16 do –24 °C (niekoľko týždňov) alebo pri teplote od –68 do –86 °C (niekoľko mesiacov). Testované podiely počas testovania uchovávajte pri teplote od 4 do 10 °C.

Opakované zmrazovanie a rozmrazovanie sa neodporúča.

Ak je potrebná doprava extraktu, zabezpečte dodanie v chladiacom boxe do 24 až 48 hodín.

1.1.6.   Je nevyhnutné, aby sa so všetkými pozitívnymi kontrolami a vzorkami R. solanacearum manipulovalo oddelene, aby nedošlo ku kontaminácii. Toto platí aj pre podložné sklíčka pri testoch IF a pri všetkých ostatných testoch.

1.2.   Testovanie

Vývojové diagramy a popis testov a optimalizovaných protokolov sa nachádzajú v príslušných dodatkoch:

| | Selektívna izolácia (pozri oddiel VI.A.4) |
| --- | --- |

Selektívna izolácia (pozri oddiel VI.A.4)

| | Test IF (pozri oddiel VI.A.5) |
| --- | --- |

Test IF (pozri oddiel VI.A.5)

| | Testy PCR (pozri oddiel VI.A.6) |
| --- | --- |

Testy PCR (pozri oddiel VI.A.6)

| | Test FISH (pozri oddiel VI.A.7) |
| --- | --- |

Test FISH (pozri oddiel VI.A.7)

| | Testy ELISA (pozri oddiel VI.A.8) |
| --- | --- |

Testy ELISA (pozri oddiel VI.A.8)

| | Biotest (pozri oddiel VI.A.9) |
| --- | --- |

Biotest (pozri oddiel VI.A.9)

2.   Podrobné metódy určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum vo vzorkách rastlín zemiakov, rajčiakov alebo iných hostiteľských rastlín bez príznakov

2.1.   Príprava vzorky

Poznámka: Pri určovaní prítomnosti latentných populácií R. solanacearum sa odporúča testovať kompozitné vzorky. Postup sa môže vhodným spôsobom uplatniť pri kompozitných vzorkách až z 200 častí stoniek. V prípade prehľadov by sa tieto mali zakladať na štatisticky reprezentatívnej vzorke skúmanej populácie rastlín.

2.1.1.   Vložte 1 – 2 cm dlhé segmenty stonky do uzatvorenej sterilnej nádoby podľa týchto postupov odoberania vzoriek:

Semenáče rajčiaka z pestovateľskej škôlky: Čistým dezinfikovaným nožom oddeľte 1 cm dlhú časť z dolnej časti každej stonky tesne nad úrovňou zeminy.

Rastliny rajčiaka pestované na poli alebo v skleníku: Čistým dezinfikovaným nožom oddeľte rezom tesne nad miestom vyrastania z hlavnej stonky najnižší postranný výhonok z každej rastliny. Odstráňte 1 cm dlhú časť z každého postranného výhonku.

Ostatné hostiteľské rastliny: Čistým dezinfikovaným nožom alebo záhradníckymi nožnicami oddeľte 1 cm dlhý úsek z dolnej časti každej stonky tesne nad úrovňou zeminy. V prípade S. dulcamara alebo iných hostiteľských rastlín rastúcich vo vode oddeľte 1 – 2 cm dlhé časti zo stonky rastúcej pod vodou alebo zo stolónov s vodnými koreňmi.

Pri odoberaní vzoriek z osobitných miest sa odporúča testovať štatisticky reprezentatívnu vzorku najmenej 10 rastlín na miesto odberu každého potenciálneho burinného hostiteľa. Určenie prítomnosti patogénu je najspoľahlivejšie neskoro na jar, v lete alebo v jeseni, hoci v prírode sa infekcie na celoročne vo vode rastúcej Solanum dulcamara dajú určiť po celý rok. K známym hostiteľom patria divoko rastúce rastliny zemiaka (náhodne rastúce zemiaky z minulej úrody), Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium a iní členovia čeľade Solanaceae. Ďalšími hostiteľmi sú Pelargonium spp. a Portulaca oleracea. K niektorým druhom európskych burín, ktoré v určitých environmentálnych podmienkach môžu byť útočiskom populácií R. solanacearum biovaru 2, rasy 3 v koreňoch a/alebo rizosfére patria Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp, Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra and Urtica dioica.

Poznámka: V tomto štádiu sa môže urobiť vizuálna prehliadka vnútorných príznakov (sfarbenie cievnych zväzkov alebo baktériový sliz). Všetky segmenty stonky s príznakmi oddeľte a testujte ich samostatne (pozri oddiel II).

2.1.2.   Segmenty stonky krátko dezinfikujete 70 % etanolom a okamžite osušte jemným pijavým papierom. Potom segmenty stonky spracujte jedným z uvedených postupov:

| a) | Pridajte dostatočné množstvo (približne 40 ml) maceračného pufra (dodatok 4), aby boli odrezky stonky prekryté, a inkubujte na rotačnej trepačke (50 až 100 ot/min) počas 4 hodín pri teplote nižšej ako 24 °C alebo schladené počas 16 až 24 hodín. |
| --- | --- |

a)

Pridajte dostatočné množstvo (približne 40 ml) maceračného pufra (dodatok 4), aby boli odrezky stonky prekryté, a inkubujte na rotačnej trepačke (50 až 100 ot/min) počas 4 hodín pri teplote nižšej ako 24 °C alebo schladené počas 16 až 24 hodín.

| b) | Odrezky okamžite rozdrvte gumeným kladivkom alebo iným vhodným nástrojom na drvenie (napr. Homex) v jednorazovom maceračnom vrecúšku (napr. Stomacher alebo Bioreba) s primeraným množstvom maceračného pufra (dodatok 4). Ak to nie je možné, odrezky skladujte v chlade najdlhšie 72 hodín alebo pri izbovej teplote najdlhšie 24 hodín. |
| --- | --- |

b)

Odrezky okamžite rozdrvte gumeným kladivkom alebo iným vhodným nástrojom na drvenie (napr. Homex) v jednorazovom maceračnom vrecúšku (napr. Stomacher alebo Bioreba) s primeraným množstvom maceračného pufra (dodatok 4). Ak to nie je možné, odrezky skladujte v chlade najdlhšie 72 hodín alebo pri izbovej teplote najdlhšie 24 hodín.

2.1.3.   Supernatant nechajte asi 15 minút usadiť a potom ho dekantujte.

2.1.4.   Ďalšie čistenie extraktu ani koncentrácia baktériovej frakcie sa zvyčajne nevyžadujú, ale môžu sa dosiahnuť filtráciou a/alebo odstredením, ako sa opisuje v oddiele III.1.1.3 až 1.1.5.

2.1.5.   Čistú alebo koncentrovanú vzorku rozdeľte na 2 rovnaké diely. Jeden diel uchovávajte počas testovania pri teplote 4 až 10 °C a v prípade, že je potrebné ďalšie testovanie, druhý diel skladujte s 10 až 25 % (objem/objem) sterilným glycerínom pri teplote od –16 °C do –24 °C (niekoľko týždňov) alebo pri teplote od –68 °C do –86 °C (niekoľko mesiacov).

2.2.   Testovanie

Vývojové diagramy a popis testov a optimalizovaných protokolov sa nachádzajú v príslušných dodatkoch:

| | Selektívna izolácia (pozri oddiel VI.A.4) |
| --- | --- |

Selektívna izolácia (pozri oddiel VI.A.4)

| | Test IF (pozri oddiel VI.A.5) |
| --- | --- |

Test IF (pozri oddiel VI.A.5)

| | Testy PCR (pozri oddiel VI.A.6) |
| --- | --- |

Testy PCR (pozri oddiel VI.A.6)

| | Test FISH (pozri oddiel VI.A.7) |
| --- | --- |

Test FISH (pozri oddiel VI.A.7)

| | Testy ELISA (pozri oddiel VI.A.8) |
| --- | --- |

Testy ELISA (pozri oddiel VI.A.8)

| | Biotest (pozri oddiel VI.A.9) |
| --- | --- |

Biotest (pozri oddiel VI.A.9)

ODDIEL IV

1.   Systém určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum vo vode

Image

Image

2.   Metódy určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum vo vode

Princíp

Validovaný systém určovania prítomnosti popísaný v tomto oddiele je použiteľný aj pri určovaní prítomnosti patogénov vo vzorkách povrchovej vody a môže sa použiť aj pri testovaní vzoriek vody zo spracovania zemiakov alebo odpadovej vody. Je však potrebné poznamenať, že predpokladaná citlivosť určovania prítomnosti sa mení podľa substrátu. Citlivosť izolačného testu ovplyvňujú populácie konkurenčných saprofytických baktérií, ktoré sú zvyčajne oveľa väčšie vo vode zo spracovania zemiakov alebo v odpadovej vode ako v povrchovej vode. Keďže sa očakáva, že nižšie uvedeným systémom sa určí aj také malé množstvo ako 103 buniek na liter povrchovej vody, citlivosť určovania vo vode zo spracovania zemiakov alebo v odpadovej vode je pravdepodobne oveľa nižšia. Z tohto dôvodu sa odporúča testovať odpadovú vodu až po všetkých procesoch úpravy (napr. sedimentácia alebo filtrácia), počas ktorých sa znížia populácie saprofytických baktérií. Obmedzená citlivosť testovacieho systému by sa mala brať do úvahy pri posudzovaní spoľahlivosti dosiahnutých negatívnych výsledkov. Keďže sa tento systém úspešne použil pri výskumných prácach na určenie prítomnosti alebo neprítomnosti patogénov v povrchovej vode, jeho obmedzenia si treba uvedomiť, keď sa použije v podobných výskumných prácach s vodou zo spracovania zemiakov alebo s odpadovou vodou.

2.1.   Príprava vzorky

Poznámka:

| — | Určovanie prítomnosti R. solanacearum v povrchovej vode je najspoľahlivejšie neskoro na jar, v lete a v jeseni, keď sú teploty vody vyššie ako15 °C. |
| --- | --- |

—

Určovanie prítomnosti R. solanacearum v povrchovej vode je najspoľahlivejšie neskoro na jar, v lete a v jeseni, keď sú teploty vody vyššie ako15 °C.

| — | Opakovaným odoberaním vzoriek v uvedených obdobiach v rôznom čase a na určených miestach sa zvýši spoľahlivosť určenia prítomnosti tým, že sa znížia účinky klimatických zmien.. |
| --- | --- |

—

Opakovaným odoberaním vzoriek v uvedených obdobiach v rôznom čase a na určených miestach sa zvýši spoľahlivosť určenia prítomnosti tým, že sa znížia účinky klimatických zmien..

| — | Zohľadnením vplyvu silných dažďov a geografie toku vody sa vylúči účinok prílišného zriedenia, ktorý môže stlmiť prítomnosť patogénu. |
| --- | --- |

—

Zohľadnením vplyvu silných dažďov a geografie toku vody sa vylúči účinok prílišného zriedenia, ktorý môže stlmiť prítomnosť patogénu.

| — | Vzorky povrchovej vody odoberajte v blízkosti hostiteľských rastlín, ak sa tam vyskytujú. |
| --- | --- |

—

Vzorky povrchovej vody odoberajte v blízkosti hostiteľských rastlín, ak sa tam vyskytujú.

2.1.1.   Na vybraných miestach odberu vzoriek odoberte vzorky vody do jednorazových skúmaviek alebo fliaš podľa možnosti v hĺbke 30 cm a do 2 metrov od brehu. Vzorky na spracovanie odpadových vôd odoberajte v mieste výtoku odpadu. Odporúčaná veľkosť vzorky je do 500 ml na odberové miesto. Ak sa uprednostnia menšie vzorky, odporúča sa odoberať vzorky na jednom mieste aspoň na trikrát, pričom každá vzorka sa skladá z 2 opakovaných podvzoriek s objemom najmenej 30 ml. Pri intenzívnej výskumnej práci zvoľte aspoň 3 miesta odberu vzoriek na 3 kilometre vodného toku a zabezpečte odber vzoriek aj z prítokov vodného toku.

2.1.2.   Vzorky prepravujte v chlade a tme (4 °C až 10 °C) a testujte do 24 hodín.

2.1.3.   V prípade potreby sa baktériová frakcia môže koncentrovať niektorou z týchto metód:

| a) | Odstreďte 30 – 50 ml podvzorky pri 10 000 g počas 10 minút (alebo 7 000 g 15 minút) najlepšie pri teplote 4 °C až 10 °C, vylejte supernatant a resuspendujte pelet v 1 ml peletového pufra (dodatok 4). |
| --- | --- |

a)

Odstreďte 30 – 50 ml podvzorky pri 10 000 g počas 10 minút (alebo 7 000 g 15 minút) najlepšie pri teplote 4 °C až 10 °C, vylejte supernatant a resuspendujte pelet v 1 ml peletového pufra (dodatok 4).

| b) | Prefiltrujte cez membránu (minimálna veľkosť pórov 0,45 μm), opláchnite filter v 5 až 10 ml peletového pufra a oplachový pufor zachyťte. Táto metóda je vhodná pre väčšie množstvá vody obsahujúcej malé množstvo saprofytov. |
| --- | --- |

b)

Prefiltrujte cez membránu (minimálna veľkosť pórov 0,45 μm), opláchnite filter v 5 až 10 ml peletového pufra a oplachový pufor zachyťte. Táto metóda je vhodná pre väčšie množstvá vody obsahujúcej malé množstvo saprofytov.

Pri vzorkách vody zo spracovania zemiakov a odpadovej vody sa koncentrácia zvyčajne neodporúča, pretože zvýšené populácie konkurenčných saprofytických baktérií spomaľujú určovanie prítomnosti Ralstonia solanacearum.

2.2.   Testovanie

Pozri vývojový diagram a popis testov v relevantných dodatkoch.

ODDIEL V

1.   Systém určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum v pôde

Image

Image

2.   Metódy určovania prítomnosti a identifikácie R. solanacearum v pôde

Princíp

Validovaný systém určovania prítomnosti, ktorý sa popisuje v tomto oddiele, je použiteľný pri určovaní prítomnosti patogénov vo vzorkách pôdy, ale môže sa použiť aj na testovanie tuhých odpadov zo spracovania zemiakov alebo splaškových kalov. Treba však poznamenať, že tieto metódy nie sú dostatočne citlivé, aby zaručili určenie prítomnosti malých a/alebo nepravidelne roztrúsených populácií Ralstonia solanacearum, ktoré sa môžu vyskytovať v prirodzene zamorených vzorkách týchto substrátov.

Obmedzená citlivosť tohto systému testovania by sa mala brať na zreteľ pri posudzovaní spoľahlivosti všetkých negatívnych výsledkov a aj v prípade, keď sa použije na výskum zameraný na určenie prítomnosti alebo neprítomnosti patogénu v pôdach alebo v kaloch. Najspoľahlivejším testom prítomnosti patogénu v pôde z poľa je zasadiť vnímavého hostiteľa a sledovať, či sa infikuje, ale aj pri tejto metóde môžu nízke úrovne kontaminácie zostať neodhalené.

2.1.   Príprava vzorky

2.1.1.   Pri odoberaní vzoriek pôdy z poľa by sa mali dodržiavať štandardné postupy odoberania vzoriek háďatok. Na vzorku odoberte 0,5 až 1 kg pôdy zo 60 miest na 0,3 ha z hĺbky 10 až 20 cm (alebo v rastri 7 × 7 meter). Ak je podozrenie na prítomnosť patogénu, zvýšte počet miest odberu na 120 na 0,3 ha. Vzorky pred testovaním skladujte pri teplote 12 až 15 °C. Vzorku odpadov zo spracovania zemiakov a splaškových kalov pripravte zozbieraním celkovo 1 kg materiálu z viacerých miest reprezentujúcich celý objem splaškov, ktoré sa majú testovať. Každú vzorku pred testovaním dôkladne zamiešajte.

2.1.2.   Podvzorky z 10 až 25 g pôdy alebo kalu rozptyľujte pomocou rotačnej trepačky (250 ot/min) v 60 až 150 ml maceračného pufra (dodatok 4) počas až 2 hodín. V prípade potreby podporte disperziu pridaním 0,02 % sterilného Tween-20 a 10 až 20 g sterilného štrku.

2.1.3.   Počas testovania udržiavajte suspenziu pri teplote 4 °C.

2.2.   Testovanie

Pozri vývojový diagram a popis testov v relevantných dodatkoch.

ODDIEL VI

OPTIMALIZOVANÉ PROTOKOLY NA URČOVANIE PRÍTOMNOSTI A IDENTIFIKÁCIU R. SOLANACEARUM

A.   DIAGNOSTICKÉ TESTY A TESTY NA URČOVANIE PRÍTOMNOSTI

1.   test vytekania baktériového slizu stonky

Prítomnosť R. solanacearum v stonkách vädnúcich rastlín zemiaka, rajčiaka alebo iných hostiteľských rastlín sa môže určiť týmto jednoduchým predbežným testom: Odrežte stonku v úrovni nad zeminou. Umiestnite povrch rezu do skúmavky s čistou vodou. Po niekoľkých minútach začnú z cievnych zväzkov samovoľne vytekať vlákna baktériového slizu.

2.   Určovanie prítomnosti granúl poly-β-hydroxybutyrátu

| 1. | Pripravte si na podložné mikroskopické sklíčko rozter z baktériového slizu z infikovaného pletiva alebo zo 48-hodinovej kultúry na médiu YPGA alebo SPA (dodatok 2). |
| --- | --- |

1.

Pripravte si na podložné mikroskopické sklíčko rozter z baktériového slizu z infikovaného pletiva alebo zo 48-hodinovej kultúry na médiu YPGA alebo SPA (dodatok 2).

| 2. | Pripravte si pozitívne kontrolné roztery kmeňa biovaru 2 R. solanacearum a v prípade, že to je užitočné, aj negatívny kontrolný rozter známeho druhu, ktorý je PHB negatívny. |
| --- | --- |

2.

Pripravte si pozitívne kontrolné roztery kmeňa biovaru 2 R. solanacearum a v prípade, že to je užitočné, aj negatívny kontrolný rozter známeho druhu, ktorý je PHB negatívny.

| 3. | Nechajte na vzduchu vyschnúť a spodnou stranou sklíčka prejdite niekoľkokrát rýchlo ponad plameň, kým sa rozter nezafixuje. |
| --- | --- |

3.

Nechajte na vzduchu vyschnúť a spodnou stranou sklíčka prejdite niekoľkokrát rýchlo ponad plameň, kým sa rozter nezafixuje.

| 4. | Preparát sfarbite buď nílskou modrou alebo sudánskou čiernou a pozorujte pod mikroskopom podľa tohto popisu: |
| --- | --- |

4.

Preparát sfarbite buď nílskou modrou alebo sudánskou čiernou a pozorujte pod mikroskopom podľa tohto popisu:

Test nílskou modrou

| a) | Každé sklíčko zalejte 1 % vodným roztokom nílskej modrej A a inkubujte 10 minút pri teplote 55 °C. |
| --- | --- |

a)

Každé sklíčko zalejte 1 % vodným roztokom nílskej modrej A a inkubujte 10 minút pri teplote 55 °C.

| b) | Nechajte odtiecť farbiaci roztok. Krátko opláchnite pod slabo tečúcou vodou. Prebytočnú vodu odsajte jemným pijavým papierom. |
| --- | --- |

b)

Nechajte odtiecť farbiaci roztok. Krátko opláchnite pod slabo tečúcou vodou. Prebytočnú vodu odsajte jemným pijavým papierom.

| c) | Zalejte rozter 8 % vodným roztokom kyseliny octovej a inkubujte 1 minútu pri izbovej teplote. |
| --- | --- |

c)

Zalejte rozter 8 % vodným roztokom kyseliny octovej a inkubujte 1 minútu pri izbovej teplote.

| d) | Krátko opláchnite pod slabo tečúcou vodou. Prebytočnú vodu odsajte jemným pijavým papierom. |
| --- | --- |

d)

Krátko opláchnite pod slabo tečúcou vodou. Prebytočnú vodu odsajte jemným pijavým papierom.

| e) | Opätovne zvlhčite kvapkou vody a zakryte krycím sklíčkom. |
| --- | --- |

e)

Opätovne zvlhčite kvapkou vody a zakryte krycím sklíčkom.

| f) | Preskúmajte sfarbený rozter epifluorescenčným mikroskopom pri vlnovej dĺžke 450 nm a s olejovou imerziou pri 600- až 1 000-násobnom zväčšení pomocou objektívu s vodnou alebo olejovou imerziou. |
| --- | --- |

f)

Preskúmajte sfarbený rozter epifluorescenčným mikroskopom pri vlnovej dĺžke 450 nm a s olejovou imerziou pri 600- až 1 000-násobnom zväčšení pomocou objektívu s vodnou alebo olejovou imerziou.

| g) | Všímajte si sýtooranžovú fluorescenciu granúl PHB. Pozorujte aj za prechádzajúceho bežného svetla a uistite sa, či sú granuly vnútrobunkové a či morfológia buniek je typická pre R. solanacearum. |
| --- | --- |

g)

Všímajte si sýtooranžovú fluorescenciu granúl PHB. Pozorujte aj za prechádzajúceho bežného svetla a uistite sa, či sú granuly vnútrobunkové a či morfológia buniek je typická pre R. solanacearum.

Test sudánskou čiernou

| a) | Každé sklíčko zalejte 0,3 % roztokom sudánskej čiernej B v 70 % etanole a inkubujte 10 minút pri izbovej teplote. |
| --- | --- |

a)

Každé sklíčko zalejte 0,3 % roztokom sudánskej čiernej B v 70 % etanole a inkubujte 10 minút pri izbovej teplote.

| b) | Nechajte odtiecť roztok farbiva, krátko opláchnite v tečúcej vode a prebytočnú vodu odsajte jemným pijavým papierom. |
| --- | --- |

b)

Nechajte odtiecť roztok farbiva, krátko opláchnite v tečúcej vode a prebytočnú vodu odsajte jemným pijavým papierom.

| c) | Sklíčka ponorte nakrátko do xylolu a osušte jemným pijavým papierom. Upozornenie: Xylol je zdraviu škodlivý, nevyhnutné sú všetky bezpečnostné opatrenia a musí sa pracovať v digestore. |
| --- | --- |

c)

Sklíčka ponorte nakrátko do xylolu a osušte jemným pijavým papierom. Upozornenie: Xylol je zdraviu škodlivý, nevyhnutné sú všetky bezpečnostné opatrenia a musí sa pracovať v digestore.

| d) | Sklíčka sa zalejú 0,5 % (hmotnosť/objem) vodným roztokom safranínu a nechá sa 10 sekúnd stáť pri izbovej teplote. Upozornenie: Safranín je zdraviu škodlivý, nevyhnutné sú všetky bezpečnostné opatrenia a musí sa pracovať v digestore. |
| --- | --- |

d)

Sklíčka sa zalejú 0,5 % (hmotnosť/objem) vodným roztokom safranínu a nechá sa 10 sekúnd stáť pri izbovej teplote. Upozornenie: Safranín je zdraviu škodlivý, nevyhnutné sú všetky bezpečnostné opatrenia a musí sa pracovať v digestore.

| e) | Sklíčka sa opláchnu v slabo tečúcej vode, osušia sa jemným pijavým papierom a priloží sa krycie sklíčko. |
| --- | --- |

e)

Sklíčka sa opláchnu v slabo tečúcej vode, osušia sa jemným pijavým papierom a priloží sa krycie sklíčko.

| f) | Sfarbené roztery sa pozorujú v mikroskope s prechádzajúcim svetlom s olejovou imerziou pri 1 000-násobnom zväčšení pomocou objektívu s olejovou imerziou. |
| --- | --- |

f)

Sfarbené roztery sa pozorujú v mikroskope s prechádzajúcim svetlom s olejovou imerziou pri 1 000-násobnom zväčšení pomocou objektívu s olejovou imerziou.

| g) | Pozorujte modro-čierne sfarbenie granúl PHB v bunkách R. solanacearum s ružovo sfarbenými bunkovými stenami. |
| --- | --- |

g)

Pozorujte modro-čierne sfarbenie granúl PHB v bunkách R. solanacearum s ružovo sfarbenými bunkovými stenami.

3.   Testy sérologickej aglutinácie

Aglutinácia buniek R. solanacearum v baktériovom slize alebo v extrakte pletiva s príznakmi sa najlepšie pozoruje pomocou validovaných protilátok (pozri dodatok 3) označených príslušnými farebnými značkami ako sú červené bunky Staphylococcus aureus alebo farebnými latexovými časticami. Ak sa použije komerčne dostupná sada (pozri dodatok 3), dodržiavajte pokyny výrobcu. Inak dodržiavajte tento postup:

| a) | Zmiešajte kvapky suspenzie označenej protilátky a baktériový sliz (približne 5 μl z každého) v jamkách viacobjektových testovacích sklíčok. |
| --- | --- |

a)

Zmiešajte kvapky suspenzie označenej protilátky a baktériový sliz (približne 5 μl z každého) v jamkách viacobjektových testovacích sklíčok.

| b) | Pripravte pozitívne a negatívne kontroly pomocou suspenzií R. solanacearum biovaru 2 a jedného nerovnocenného kmeňa. |
| --- | --- |

b)

Pripravte pozitívne a negatívne kontroly pomocou suspenzií R. solanacearum biovaru 2 a jedného nerovnocenného kmeňa.

| c) | Po jemnom miešaní počas 15 sekúnd pozorujte aglutináciu v pozitívnych vzorkách. |
| --- | --- |

c)

Po jemnom miešaní počas 15 sekúnd pozorujte aglutináciu v pozitívnych vzorkách.

4.   Selektívna izolácia

4.1.   Selektívny platňový rozter

Poznámka: Pred prvým použitím tejto metódy urobte predbežné testy na zaistenie opakovateľnosti určenia prítomnosti buniek R. solanacearum tvoriacich kolónie v hodnote 103 až 104 na 1 ml, ktoré sa pridajú do extraktov zo vzoriek, ktoré boli predtým testované s negatívnym výsledkom.

Použite primerane validované selektívne médium ako SMSA (modifikované podľa Elphinstone et al., 1996; pozri dodatok 2).

Je potrebné venovať pozornosť odlíšeniu R. solanacearum od iných baktérií schopných tvoriť v médiu kolónie. Okrem toho, ak sú platňové roztery prerastené alebo ak sú prítomné antagonistické baktérie, kolónie R. solanacearum môžu vykazovať netypickú morfológiu. V prípade podozrenia na konkurenčné alebo antagonistické vplyvy musí sa vzorka pretestovať pomocou iného testu.

Najvyššia citlivosť určenia prítomnosti touto metódou sa dá očakávať, ak sa použijú čerstvo pripravené extrakty vzoriek. Táto metóda je však použiteľná aj pri extraktoch, ktoré boli skladované v glyceríne pri teplote od –68 do –86 °C.

Ako pozitívne kontroly pripravte desatinné riedenia suspenzie s hustotou 106 buniek tvoriacich kolónie na 1 ml virulentného kmeňa R. solanacearum biovaru 2 (napr. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Aby sa vylúčila akákoľvek možnosť kontaminácie, pripravujte pozitívne vzorky úplne oddelene od vzoriek, ktoré sa majú testovať.

Pri každej novopripravenej dávke selektívneho média by sa pred jej použitím pri testovaní bežných vzoriek mala otestovať jej vhodnosť na rast patogénu.

Kontrolný materiál testujte rovnakým spôsobom ako vzorku(-y).

4.1.1.   Použite vhodnú zrieďovaciu platňovú techniku rozteru, ktorou sa zabezpečí, aby sa zriedili všetky nežiaduce saprofytické populácie tvoriace kolónie. Rozotrite 50 až 100 μl extraktu vzorky na platňu a na každé riedenie.

4.1.2.   Platne nechajte inkubovať pri teplote 28 °C. Po 48 hodinách platne skontrolujte a potom každý deň až do 6 dní. Typické kolónie R. solanacearum na médiu SMSA sú mliečne biele, ploché, nepravidelné a fluidné a po 3 dňoch inkubácie sa v strede vytvorí ružové až krvavočervené sfarbenie s vnútornými prúžkami alebo závitmi (pozri internetovú stránku http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Poznámka: Na tomto médiu sa niekedy tvoria netypické kolónie R. solanacearum. Môžu byť malé, kruhové, celé červeno sfarbené a nefluidné alebo iba čiastočne fluidné, a preto ťažko rozoznateľné od saprofytických baktérií tvoriacich kolónie.

4.1.3.   Predpokladané kolónie R. solanacearum po nanesení v prúžkoch alebo po zriedenom roztere na univerzálnu živnú pôdu očistite, aby ste dostali izolované kolónie (pozri dodatok 2).

4.1.4.   Kultúry krátkodobo uchovajte v sterilnej vode (pH 6 – 8, bez chlóru) v tme pri izbovej teplote, alebo dlhodobo vo vhodnom kryogénnom ochrannom prostredí pri teplote od –68 do –86 °C alebo lyofilizované.

4.1.5.   Identifikujte predpokladané kultúry (pozri oddiel VI. B) a urobte test patogenity (pozri oddiel VI. C).

Vyhodnotenie výsledkov testu selektívneho platňového rozteru

Test selektívneho platňového rozteru je negatívny, ak sa po šiestich dňoch nedajú spozorovať žiadne kolónie baktérií, alebo ak sa nezistia žiadne predpokladané typické kolónie R. solanacearum za podmienky, že sa nepredpokladá žiadna inhibícia inými konkurenčnými alebo antagonistickými baktériami a že v pozitívnych kontrolách sa nachádzajú typické kolónie R. solanacearum.

Test selektívneho platňového rozteru je pozitívny, ak sa izolujú predpokladané kolónie R. solanacearum.

4.2.   Obohacovanie

Použite validované obohacovacie médium ako je modifikovaný živný roztok Wilbrink (pozri dodatok 2).

Tento postup sa môže použiť na selektívne zvýšenie populácií R. solanacearum v extraktoch zo vzoriek a na zvýšenie citlivosti pri určovaní ich prítomnosti. Týmto postupom sa zároveň účinne riedia inhibítory reakcie PCR (1:100). Treba však poznamenať, že obohacovanie R. solanacearum môže byť neúspešné kvôli konkurencii alebo antagonizmu saprofytických organizmov, ktoré sa tiež často súčasne obohatia. Z tohto dôvodu môže byť izolácia R. solanacearum z kultúr obohatených v živných roztokoch ťažká. Okrem toho, keďže sa môžu zvýšiť populácie sérologicky príbuzných saprofytov, ak sa má použiť test ELISA, odporúča sa prednostné použitie osobitných monoklonálnych protilátok pred polyklonálnymi protilátkami.

4.2.1.   Pri obohacovaní pre test PCR preneste 100 μl extraktu zo vzorky do 10 ml obohateného živného roztoku (dodatok 2), ktorý ste predtým primerane rozdelili do skúmaviek alebo fliaš bez DNA. Pri obohacovaní pre test ELISA sa môžu použiť vyššie pomery extraktu zo vzorky k živnému roztoku (napr. 100 μl v 1,0 ml obohateného živného roztoku).

4.2.2.   Inkubujte 72 hodín a pri teplote 27 až 30 °C v trepačke alebo staticky s uvoľneným uzáverom, aby bol prístup vzduchu.

4.2.3.   Pred použitím v testoch ELISA alebo PCR dôkladne premiešajte.

4.2.4.   Obohatený živný roztok pripravte rovnakým spôsobom ako vzorku(-y) vo vyššie uvedených testoch.

Poznámka: Ak sa očakáva inhibícia obohacovania R. solanacearum kvôli vysokým populáciám určitých konkurenčných saprofytických baktérií, lepšie výsledky sa dajú dosiahnuť obohatením extraktu vzorky pred akýmkoľvek odstredením alebo inými spôsobmi koncentrácie.

5.   Test IF

Princíp

Použitie testu IF ako hlavného skríningového testu sa odporúča, pretože je dokázaná jeho účinnosť pri dosahovaní požadovaných prahových hodnôt.

Keď sa ako hlavný skríningový test použije test IF a vyhodnotenie je pozitívne, musia sa urobiť testy PCR alebo FISH alebo izolačný test ako druhý skríningový test. Keď sa test IF použije ako druhý skríningový test a odčítavanie IF je pozitívne, na úplnú analýzu sa vyžaduje ďalšie testovanie podľa vývojového diagramu.

Poznámka: Používajte validovaný zdroj protilátok R. solanacearum (pozri internetovú stránku http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Odporúča sa, aby sa pre každú novú dávku protilátok stanovil titer. Titer sa definuje ako najvyššie riedenie, pri ktorom sa pri testovaní suspenzie obsahujúcej 105 to 106 buniek na 1 ml homológneho kmeňa R. solanacearum a s použitím vhodného konjugátu fluorescenčného izotiokyanátu (FITC) podľa pokynov výrobcu, dosahuje optimálna reakcia. Všetky validované polyklonálne antiséra mali titer IF najmenej 1:2 000. Počas testovania by sa mali používať protilátky v pracovnom riedení(-iach) blízkom alebo na úrovni titra.

Test by sa mal urobiť s čerstvo pripravenými extraktmi zo vzoriek. V prípade potreby sa môže úspešne urobiť aj s extraktmi skladovanými pri teplote –68až–86 °C v glyceríne. Glycerín sa môže zo vzorky odstrániť pridaním 1 ml peletového pufra (dodatok 4), opakovaným odstredením počas 15 minút pri odstredivej sile 7 000 g a resuspenzii v rovnakom objeme peletového pufra. Toto však často nie je potrebné, najmä ak sú vzorky fixované na podložné sklíčka flambovaním.

Pripravte samostatné podložné sklíčka s pozitívnou kontrolou z homológneho kmeňa alebo akéhokoľvek iného referenčného kmeňa R. solanacearum, suspendovaného v extrakte zo zemiaka ako je špecifikované v dodatku 3B, a podľa želania v pufri.

Ak je to možné, ako obdobná kontrola by sa na tom istom sklíčku malo použiť prirodzene infikované pletivo (udržiavané lyofilizáciou alebo zmrazením pri teplote –16až–24 °C.

Ako negatívna kontrola sa môžu použiť alikvotné podiely extraktu vzorky, ktorá sa predtým testovala na R. solanacearum s negatívnym výsledkom.

Štandardné pozitívne a negatívne kontrolné materiály, ktoré sú k dispozícii na použitie pri tomto teste, sa uvádzajú v dodatku 3.

Použite viacobjektové podložné sklíčka, najlepšie s 10 jamkami s minimálnym priemerom 6 mm.

Kontrolný materiál testujte rovnakým spôsobom ako vzorku(-y).

5.1.   Podložné sklíčka pripravte jedným z nasledujúcich postupov:

| i) | Pri peletoch s relatívne malým sedimentom škrobu:
  Pipetou naneste odmeraný štandardný objem (15 μl postačuje pre jamku s priemerom 6 mm – pri väčších jamkách treba použiť primerane väčší objem) riedenia 1/100 resuspendovaného zemiakového peletu do prvej jamky. Potom do zostávajúcich jamiek v rade pipetou naneste rovnaký objem neriedeného peletu (1/1). Ďalší rad sa môže použiť ako duplikát alebo pre druhú vzorku, ako je znázornené na obr. 1. |
| --- | --- |

i)

Pri peletoch s relatívne malým sedimentom škrobu:

Pipetou naneste odmeraný štandardný objem (15 μl postačuje pre jamku s priemerom 6 mm – pri väčších jamkách treba použiť primerane väčší objem) riedenia 1/100 resuspendovaného zemiakového peletu do prvej jamky. Potom do zostávajúcich jamiek v rade pipetou naneste rovnaký objem neriedeného peletu (1/1). Ďalší rad sa môže použiť ako duplikát alebo pre druhú vzorku, ako je znázornené na obr. 1.

| ii) | Pri ostatných peletoch:
  Pripravte desatinné riedenia (1/10, 1/100) resuspendovaného peletu v peletovom pufri. Pipetou naneste odmeraný štandardný objem (15 μl postačuje pre jamku s priemerom 6 mm – pri väčších jamkách treba použiť primerane väčší objem) resuspendovaného peletu a každého riedenia do radu jamiek. Ďalší rad sa môže použiť ako duplikát alebo pre druhú vzorku, ako je znázornené na obr. 2. |
| --- | --- |

ii)

Pri ostatných peletoch:

Pripravte desatinné riedenia (1/10, 1/100) resuspendovaného peletu v peletovom pufri. Pipetou naneste odmeraný štandardný objem (15 μl postačuje pre jamku s priemerom 6 mm – pri väčších jamkách treba použiť primerane väčší objem) resuspendovaného peletu a každého riedenia do radu jamiek. Ďalší rad sa môže použiť ako duplikát alebo pre druhú vzorku, ako je znázornené na obr. 2.

5.2.   Kvapky nechajte vyschnúť pri izbovej teplote alebo ohrievaním pri teplote 40 až 45 °C. Baktériové bunky fixujte na podložné sklíčko buď ohrievaním (15 minút pri teplote 60 °C), flambovaním, 95 % etanolom alebo podľa osobitných pokynov od dodávateľa protilátok.

V prípade potreby sa fixované podložné sklíčka pred ďalším testovaním môžu skladovať čo najkratšie (najviac 3 mesiace) zmrazené vo vysušenom boxe.

5.3.   Postup pri teste IF

| i) | Pri príprave podložného sklíčka podľa 5.1.i):
  Pripravte sadu dvojnásobných riedení. Prvá jamka by mala obsahovať 1/2 titra (T/2), ostatné 1/4 titra (T/4), 1/2 titra (T/2), titer (T) a dvojnásobok titra (2T). |
| --- | --- |

i)

Pri príprave podložného sklíčka podľa 5.1.i):

Pripravte sadu dvojnásobných riedení. Prvá jamka by mala obsahovať 1/2 titra (T/2), ostatné 1/4 titra (T/4), 1/2 titra (T/2), titer (T) a dvojnásobok titra (2T).

| ii) | Pri príprave podložného sklíčka podľa 5.1.ii):
  Pripravte pracovné riedenie (PR) protilátky v pufri IF. Pracovné riedenie ovplyvňuje špecifickosť. |
| --- | --- |

ii)

Pri príprave podložného sklíčka podľa 5.1.ii):

Pripravte pracovné riedenie (PR) protilátky v pufri IF. Pracovné riedenie ovplyvňuje špecifickosť.

Obrázok 1   Príprava podložného sklíčka postupom podľa 5.1.i) a 5.3.i)

| | Riedenia resuspendovaného peletu |
| --- | --- |
| 1/100 | 1/1 | 1/1 | 1/1 | 1/1 |  | Riedenie resuspendovaného peletu |
| (T = titer) | T/2 | T/4 | T/2 | T | 2T |  | Dvojnásobné riedenia antisérum/protilátka |
| Vzorka 1 | | | | | | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Duplikát vzorky 1 alebo vzorka 2 | | | | | |
| 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |

Riedenia resuspendovaného peletu

1/100

1/1

1/1

1/1

1/1



Riedenie resuspendovaného peletu

(T = titer)

T/2

T/4

T/2

T

2T



Dvojnásobné riedenia antisérum/protilátka

Vzorka 1

Image

Image

Image

Image

Image

1

2

3

4

5

Duplikát vzorky 1 alebo vzorka 2

Image

Image

Image

Image

Image

6

7

8

9

10

Obrázok 2   Príprava podložného sklíčka postupom podľa 5.1.ii) a 5.3.ii)

| | Pracovné riedenie antiséra/protilátky |
| --- | --- |
| 1/1 | 1/10 | 1/100 | prázdna | prázdna |  | Desatinné riedenie resuspendovaného peletu |
| Vzorka 1 | | | | | | | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Duplikát vzorky 1 alebo vzorka 2 | | | | | |
| 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |

Pracovné riedenie antiséra/protilátky

1/1

1/10

1/100

prázdna

prázdna



Desatinné riedenie resuspendovaného peletu

Vzorka 1

Image

Image

Image

Image

Image

1

2

3

4

5

Duplikát vzorky 1 alebo vzorka 2

Image

Image

Image

Image

Image

6

7

8

9

10

5.3.1.   Podložné sklíčka položte na vlhký hodvábny papier. Všetky testovacie jamky úplne pokryte riedeniami antiséra. Objem antiséra naneseného na každú jamku musí minimálne zodpovedať objemu naneseného extraktu.

Nasledujúci postup by sa mal vykonať v prípade, že chýbajú osobitné pokyny výrobcov protilátok:

5.3.2.   Podložné sklíčka inkubujte 30 minút zakryté na vlhkom papieri pri izbovej teplote (18 až 25 °C).

5.3.3.   Kvapky z každého podložného sklíčka opatrne straste a opláchnite pufrom IF. Preplachujte ponorené 5 minút v roztoku pufra IF-Tween (dodatok 4) a potom v pufri IF. Zabráňte rozprašovaniu alebo kvapkaniu, ktoré by mohli spôsobiť krížovú kontamináciu. Prebytočnú vlhkosť starostlivo odstráňte jemným odsatím pijavým papierom.

5.3.4.   Podložné sklíčka položte na vlhký papier. Testovacie jamky pokryte riedením konjugátu FITC použitím na stanovenie titra. Objem konjugátu naneseného na jamky musí presne zodpovedať objemu nanesenej protilátky.

5.3.5.   Podložné sklíčka inkubujte zakryté na vlhkom papieri 30 minút pri izbovej teplote (18 až 25 °C).

5.3.6.   Kvapky konjugátu opatrne straste z podložného sklíčka. Opláchnite a preplachujte rovnako ako v bode 5.3.3.

Dôkladne odstráňte prebytočnú vlhkosť.

5.3.7.   Na každú jamku napipetujte 5 až 10 μl 0,1M glycerínu pufrovaného fosfátom (dodatok 4) alebo inou komerčnou krycou kvapalinou na udržanie signálu a priložte krycie sklíčko.

5.4.   Hodnotenie testu IF

5.4.1.   Podložné sklíčka prehliadnite pod epifluorescenčným mikroskopom s filtrami vhodnými na excitáciu FITC pod olejovou alebo vodnou imerziou pri zväčšení 500 až 1 000-krát. Každú jamku mikroskopicky prehliadnite vo dvoch navzájom kolmých priemeroch a aj po obvode. Pri vzorkách, v ktorých sa nenachádzajú žiadne bunky alebo len malý počet buniek, pozorujte aspoň 40 mikroskopických políčok.

Najprv skontrolujte podložné sklíčka s pozitívnou kontrolou. Bunky musia pri titrovaní stanovenou protilátkou alebo pracovným riedením jasne fluoreskovať a byť úplne sfarbené. Pri odlišnom sfarbení sa musí test IF (oddiel VI.A.5) zopakovať.

5.4.2.   V testovacích jamkách podložných sklíčok pozorujte jasne fluoreskujúce bunky s charakteristickou morfológiou R. solanacearum (pozri internetovú stránku http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intenzita fluorescencie musí zodpovedať pozitívnemu kontrolnému kmeňu pri rovnakom riedení antiséra. Bunky s neúplným sfarbením alebo so slabou fluorescenciou sa neberú do úvahy.

Ak je akékoľvek podozrenie na kontámináciu, test sa musí zopakovať. Môže to byť v prípade, keď sa na všetkých podložných sklíčkach vo vzorke nájdu pozitívne bunky kvôli kontaminácii pufra, alebo ak sa pozitívne bunky nájdu (mimo jamiek na podložnom sklíčku) na krycom sklíčku.

5.4.3.   So špecifickosťou imunofluorescenčného testu sa spája niekoľko problémov. Nežiaduce populácie fluoreskujúcich buniek s netypickou morfológiou a saprofytické baktérie spôsobujúce krížovú reakciu a podobnou veľkosťou a morfológiou ako R. solanacearum sa zvyčajne vyskytujú v peletoch výrezkov z pupkových koncov a segmentov stonky.

5.4.4.   Pri titrovaní alebo pracovnom riedení protilátok ako sa uvádza v bode 5.3 berte do úvahy len fluoreskujúce bunky s typickou veľkosťou a morfológiou.

5.4.5.   Vyhodnotenie výsledkov testu IF:

| i) | Ak sa nájdu jasne fluoreskujúce bunky s charakteristickou morfológiou, stanovte priemerný počet typických buniek na mikroskopické políčko a vypočítajte počet typických buniek na 1 ml resuspendovaného peletu (dodatok 5).
  Výsledok testu IF je pozitívny pri vzorkách s počtom najmenej 5 × 103 typických buniek na 1 ml resuspendovaného peletu. Vzorka sa považuje za potenciálne kontaminovanú a vyžaduje sa ďalšie testovanie. |
| --- | --- |

i)

Ak sa nájdu jasne fluoreskujúce bunky s charakteristickou morfológiou, stanovte priemerný počet typických buniek na mikroskopické políčko a vypočítajte počet typických buniek na 1 ml resuspendovaného peletu (dodatok 5).

Výsledok testu IF je pozitívny pri vzorkách s počtom najmenej 5 × 103 typických buniek na 1 ml resuspendovaného peletu. Vzorka sa považuje za potenciálne kontaminovanú a vyžaduje sa ďalšie testovanie.

| ii) | Výsledok testu IF je negatívny pri vzorkách s menším počtom ako 5 × 103 buniek na 1 ml resuspendovaného peletu a vzorka sa považuje za negatívnu. Ďalšie testovanie sa nevyžaduje. |
| --- | --- |

ii)

Výsledok testu IF je negatívny pri vzorkách s menším počtom ako 5 × 103 buniek na 1 ml resuspendovaného peletu a vzorka sa považuje za negatívnu. Ďalšie testovanie sa nevyžaduje.

6.   TESTY PCR

Princípy

Keď sa PCR použije ako hlavný skríningový test a je pozitívny, musí sa urobiť izolačný test alebo IF ako druhý povinný skríningový test. Keď sa PCR použije ako druhý skríningový test a je pozitívny, na úplnú diagnostiku sa vyžaduje ďalšie testovanie podľa vývojového diagramu.

Úplné využitie tejto metódy ako hlavného skríningového testu sa odporúča iba v prípade špecializovanej odbornosti.

Poznámka: Predbežné testovanie touto metódou by malo umožniť opakovateľné určenie prítomnosti 103 až 104 buniek R. solanacearum na 1 ml pridaných do extraktov vzoriek, ktoré boli predtým testované s negatívnym výsledkom. Na dosiahnutie maximálnej citlivosti a špecifickosti sa môže vo všetkých laboratóriách vyžadovať optimalizácia experimentov.

Použite validované činidlá a protokoly pre testy PCR (pozri dodatok 6). Prednostne si zvoľte metódu s vnútornou kontrolou.

Prijmite všetky opatrenia na vylúčenie kontaminácie vzorky cieľovou DNA. Test PCR by mali uskutočniť skúsení technici v laboratóriách na molekulárnu biológiu, aby sa na minimum obmedzila možnosť kontaminácie cieľovou DNA.

S negatívnou kontrolou (extrakcie DNA a postupov PCR) by sa malo vždy pracovať ako s poslednou vzorkou celého postupu, aby bolo zrejmé, či sa vyskytol nejaký prenos DNA.

Test PCR by mal zahŕňať túto negatívnu kontrolu:

| — | extrakt zo vzorky, ktorá bola predtým testovaná na R. solanacearum s negatívnym výsledkom, |
| --- | --- |

—

extrakt zo vzorky, ktorá bola predtým testovaná na R. solanacearum s negatívnym výsledkom,

| — | kontrolné pufre použité na extrahovanie baktérie a DNA zo vzorky, |
| --- | --- |

—

kontrolné pufre použité na extrahovanie baktérie a DNA zo vzorky,

| — | reakčná zmes pre PCR. |
| --- | --- |

—

reakčná zmes pre PCR.

Zahrnutá by mala byť táto pozitívna kontrola:

| — | alikvotné podiely resuspendovaných peletov, do ktorých sa pridala R. solanacearum (prípravu pozri v dodatku 3 B), |
| --- | --- |

—

alikvotné podiely resuspendovaných peletov, do ktorých sa pridala R. solanacearum (prípravu pozri v dodatku 3 B),

| — | suspenzia 106 buniek na 1 ml R. solanacearum vo vode z virulentného izolátu (napr. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; pozri dodatok 3 B), |
| --- | --- |

—

suspenzia 106 buniek na 1 ml R. solanacearum vo vode z virulentného izolátu (napr. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; pozri dodatok 3 B),

| — | ak je to možné, použite aj DNA extrahovanú z pozitívnych kontrolných vzoriek pri teste PCR. |
| --- | --- |

—

ak je to možné, použite aj DNA extrahovanú z pozitívnych kontrolných vzoriek pri teste PCR.

Aby sa vylúčila možnosť kontaminácie, pozitívne kontroly pripravujte v prostredí oddelenom od vzoriek, ktoré sa majú testovať.

Extrakty zo vzoriek by mali byť čo najdôkladnejšie zbavené zeminy. Preto ak sa použijú protokoly testu PCR, je v určitých prípadoch vhodné pripravovať extrakty z umytých zemiakov.

Štandardný pozitívny a negatívny kontrolný materiál, ktorý je k dispozícii na použitie pri tomto teste, sa uvádza v dodatku 3.

6.1.   Metódy čistenia DNA

Použite vyššie uvedené pozitívne a negatívne kontrolné vzorky (pozri dodatok 3).

Kontrolný materiál testujte rovnakým spôsobom ako vzorku(-y).

K dispozícii je viacero metód čistenia cieľovej DNA zo substrátov komplexných vzoriek, čím sa odstránia inhibítory PCR a iné enzymatické reakcie a skoncentruje sa cieľová DNA v extrakte vzorky. Na použitie pri validovaných metódach PCR, ktoré sú uvedené v dodatku 6, sa optimalizovala nasledujúca metóda.

a)   Metóda podľa Pastrika (2000)

| 1. | Pipetou naneste 220 μl lyzovacieho pufra [100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)] do Eppendorfovej skúmavky s objemom 1,5 ml. |
| --- | --- |

1.

Pipetou naneste 220 μl lyzovacieho pufra [100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)] do Eppendorfovej skúmavky s objemom 1,5 ml.

| 2. | Pridajte 100 μl extraktu vzorky a umiestnite na 10 minút do ohrievacieho bloku alebo do vodného kúpeľa s teplotou 95 °C. |
| --- | --- |

2.

Pridajte 100 μl extraktu vzorky a umiestnite na 10 minút do ohrievacieho bloku alebo do vodného kúpeľa s teplotou 95 °C.

| 3. | Skúmavku premiestnite na 5 minút na ľad. |
| --- | --- |

3.

Skúmavku premiestnite na 5 minút na ľad.

| 4. | Pridajte 80 μl koncentrovaného roztoku lyzozýmu (50 mg lyzozýmu na 1 ml v 10 mM Tris HCl, pH 8,0) a inkubujte 30 minút pri teplote 37 °C. |
| --- | --- |

4.

Pridajte 80 μl koncentrovaného roztoku lyzozýmu (50 mg lyzozýmu na 1 ml v 10 mM Tris HCl, pH 8,0) a inkubujte 30 minút pri teplote 37 °C.

| 5. | Pridajte 220 μl roztoku Easy DNA® solution A (Invitrogen), dobre pretrepte a 30 minút inkubujte pri teplote 65 °C. |
| --- | --- |

5.

Pridajte 220 μl roztoku Easy DNA® solution A (Invitrogen), dobre pretrepte a 30 minút inkubujte pri teplote 65 °C.

| 6. | Pridajte 100 μl roztoku Easy DNA® solution B (Invitrogen), dôkladne pretrepte, až kým precipitát voľne nepláva v skúmavke a vzorka nemá jednotnú viskozitu. |
| --- | --- |

6.

Pridajte 100 μl roztoku Easy DNA® solution B (Invitrogen), dôkladne pretrepte, až kým precipitát voľne nepláva v skúmavke a vzorka nemá jednotnú viskozitu.

| 7. | Pridajte 500 μl chloroformu a pretrepávajte, až kým viskozita klesne a zmes nie je homogénna. |
| --- | --- |

7.

Pridajte 500 μl chloroformu a pretrepávajte, až kým viskozita klesne a zmes nie je homogénna.

| 8. | Odstreďujte 20 minút pri odstredivej sile 15 000 g pri teplote 4 °C, aby sa oddelili fázy a vytvorilo sa rozhranie. |
| --- | --- |

8.

Odstreďujte 20 minút pri odstredivej sile 15 000 g pri teplote 4 °C, aby sa oddelili fázy a vytvorilo sa rozhranie.

| 9. | Hornú fázu premiestnite do čistej Eppendorfovej skúmavky. |
| --- | --- |

9.

Hornú fázu premiestnite do čistej Eppendorfovej skúmavky.

| 10. | Pridajte 1 ml 100 % etanolu (–20 °C), krátko pretrepte a inkubujte na ľade 10 minút. |
| --- | --- |

10.

Pridajte 1 ml 100 % etanolu (–20 °C), krátko pretrepte a inkubujte na ľade 10 minút.

| 11. | Odstreďujte 20 minút pri odstredivej rýchlosti 15 000 g pri teplote 4 °C a odstráňte etanol z peletu. |
| --- | --- |

11.

Odstreďujte 20 minút pri odstredivej rýchlosti 15 000 g pri teplote 4 °C a odstráňte etanol z peletu.

| 12. | Pridajte 500 μl 80 % etanolu (–20 °C) a premiešajte otočením skúmavky hore dnom. |
| --- | --- |

12.

Pridajte 500 μl 80 % etanolu (–20 °C) a premiešajte otočením skúmavky hore dnom.

| 13. | Odstreďujte 10 minút pri odstredivej rýchlosti 15 000 g pri teplote 4 °C, zachyťte pelet a odstráňte etanol. |
| --- | --- |

13.

Odstreďujte 10 minút pri odstredivej rýchlosti 15 000 g pri teplote 4 °C, zachyťte pelet a odstráňte etanol.

| 14. | Pelet nechajte vyschnúť na vzduchu alebo v DNA Speed Vac. |
| --- | --- |

14.

Pelet nechajte vyschnúť na vzduchu alebo v DNA Speed Vac.

| 15. | Resuspendujte pelet v 100 μl sterilnej ultračistej vody (UPW) a nechajte stáť pri izbovej teplote najmenej 20 minút. |
| --- | --- |

15.

Resuspendujte pelet v 100 μl sterilnej ultračistej vody (UPW) a nechajte stáť pri izbovej teplote najmenej 20 minút.

| 16. | Do použitia na test PCR skladujte pri teplote –20 °C. |
| --- | --- |

16.

Do použitia na test PCR skladujte pri teplote –20 °C.

| 17. | Odstredením odstráňte všetok biely precipitát a na test PCR použite 5 μl supernatantu obsahujúceho DNA. |
| --- | --- |

17.

Odstredením odstráňte všetok biely precipitát a na test PCR použite 5 μl supernatantu obsahujúceho DNA.

b)   Iné metódy

Iné metódy extrakcie DNA, napr. súprava Qiagen DNeasy Plant Kit, by sa mohli použiť za podmienky, že sa dokáže, že sú rovnako účinné pri čistení DNA z kontrolných vzoriek obsahujúcich 103 až 104 buniek patogénu na 1 ml.

6.2.   Test PCR

6.2.1.   Podľa validovaných protokolov pripravte pre test PCR testovacie a kontrolné matrice (oddiel VI.A.6). Pripravte jedno desatinné riedenie extraktu zo vzorky DNA (1:10 v UPW).

6.2.2.   Podľa uverejnených protokolov (dodatok 6) pripravte v prostredí, v ktorom nedôjde ku kontaminácii, pre test PCR vhodnú reakčnú zmes. Odporúča sa v prípade, ak to je možné, používať viacnásobný protokol PCR, ktorý obsahuje aj vnútornú kontrolu testu PCR.

6.2.3.   Podľa protokolov PCR (pozri dodatok 6) pridajte do sterilných PCR skúmaviek 2 až 5 μl extraktu DNA na 25 μl reakčnej zmesi pre PCR.

6.2.4.   Vytvorte negatívnu kontrolnú vzorku obsahujúcu iba reakčnú zmes PCR a namiesto vzorky pridajte ultračistú vodu (UPW) z toho istého zdroja, ktorý ste použili pri zmesi PCR.

6.2.5.   Skúmavky umiestnite do toho istého termocykléra, ktorý sa použil pri predbežnom testovaní, a spustite vhodne optimalizovaný program PCR (dodatok 6).

6.3.   Analýza produktu PCR

6.3.1.   Dekódujte amplikóny PCR agarózovou gélovou elektroforézou. Elektroforézu vykonajte na aspoň 12 μl zosilnenej reakčnej zmesi DNA z každej vzorky zmiešanej s 3 μl nanášacieho pufra (dodatok 6) v 2,0 % (hmotnosť/objem) agarózového gélu v tris-octanovom-EDTA pufri (TAE) (dodatok 6) pri napätí 5 až 8 V/cm. Použite vhodný markér DNA, napr. 100 bp ladder.

6.3.2.   Zviditeľnite pásiky DNA sfarbením pomocou etidiumbromidu (0,5 mg/l) počas 30 až 60 minút, pričom pri manipulácii s touto mutagénnou látkou je potrebné použiť ochranné opatrenia.

6.3.3.   V sfarbenom géle pozorujte krátkovlnnou ultrafialovou transilumináciou (λ = 302 nm) zosilnené produkty PCR predpokladanej veľkosti (dodatok 6) a zdokumentujte ich.

6.3.4.   Pri všetkých nových zisteniach/prípadoch si overte autentickosť amplikónu PCR pomocou analýzy reštrikčných enzýmov na vzorke zvyšnej zosilnenej DNA inkubovaním pri optimálnej teplote a optimálne dlhý čas s vhodným enzýmom a pufrom (pozri dodatok 6). Digerované fragmenty oddeľte agarózovou gélovou elektroforézou ako prv a sledujte charakteristický vzor reštrikčného fragmentu pri ultrafialovej transiluminácii po sfarbení etidium bromidom a porovnajte s digerovanou a nedigerovanou pozitívnou kontrolou.

Vyhodnotenie výsledku testu PCR

Test PCR je negatívny, ak v príslušnej vzorke nebol zistený špecifický amplikón PCR R. solanacearum očakávanej veľkosti, ale zistí sa vo všetkých pozitívnych kontrolných vzorkách (v prípade viacnásobných testov PCR so špecifickými rastlinnými vnútornými kontrolnými primermi: druhý produkt PCR predpokladanej veľkosti sa musí zosilniť príslušnou vzorkou).

Test PCR je pozitívny, ak sa zistí špecifický amplicon PCR R. solanacearum s predpokladanou veľkosťou a reštrikčným vzorom (ak sa vyžaduje), za podmienky, že sa nezosilňuje zo žiadnej negatívnej kontrolnej vzorky. Spoľahlivé potvrdenie pozitívneho výsledku sa dosiahne aj opakovaním testu s druhou sadou primerov PCR (dodatok 6).

Poznámka: Ak sa z pozitívnej kontrolnej vzorky obsahujúcej R. solanacearum vo vode získa predpokladaný amplicon, ale z pozitívnych kontrol s R. solanacearum v extrakte zo zemiaka sa získajú negatívne výsledky, môže byť podozrenie na inhibíciu PCR. Pri viacnásobných protokoloch PCR s vnútornými kontrolami sa inhibícia reakcie indikuje, ak sa nezíska žiadny z týchto dvoch amplikónov.

Podozrenie na kontamináciu môže byť aj vtedy, ak sa predpokladaný amplicon získa z jednej alebo viacerých negatívnych kontrol.

7.   Test FISH

Princíp

Keď sa test FISH použije ako prvý skríningový test a zistí sa, že je pozitívny, musí sa ako druhý povinný skríningový test vykonať izolačný test alebo test IF. Keď sa test FISH použije ako druhý skríningový test a zistí sa, že je pozitívny, na stanovenie úplnej diagnózy sa vyžaduje ďalšie testovanie podľa vývojového diagramu.

Poznámka: Použite validované špecifické oligopróby pre R. solanacearum (pozri dodatok 7). Predbežné testovanie touto metódou by malo umožniť opakovateľné určenie prítomnosti najmenej 103 až 104 buniek R. solanacearum na 1 ml pridaných do extraktov vzoriek, ktoré boli predtým testované s negatívnym výsledkom.

Nasledujúce postupy by sa mali prednostne vykonávať na čerstvo pripravených extraktoch zo vzoriek, ale úspešne sa môžu použiť aj pri extrakte zo vzorky, ktorý sa skladoval v glyceríne pri teplote od –16 do –24 °Calebo od –68 do –86 °C.

Ako negatívnu kontrolu použite alikvotný podiel extraktu vzorky, ktorá bola predtým testovaná na R. solanacearum s negatívnym výsledkom.

Ako pozitívne kontroly si pripravte suspenzie obsahujúce na 1 ml 105 až 106 buniek R. solanacearum biovar 2 (napr. kmeň NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, pozri dodatok 3) v 0,01M fosfátového pufra (PB) z 3 až 5-dňovej kultúry. Samostatne pripravte podložné sklíčka s pozitívnou kontrolou z homologického kmeňa alebo akéhokoľvek iného referenčného kmeňa R. solanacearum suspendovanou v extrakte zo zemiaka podľa špecifikácie v dodatku 3B.

Použitie eubaktériovej oligopróby s označením FITC umožňuje kontrolu procesu hybridizácie, pretože sfarbí všetky eubaktérie, ktoré sú prítomné vo vzorke.

Štandardný pozitívny a negatívny kontrolný materiál, ktorý je k dispozícii na použitie pri tomto teste, sa uvádza v dodatku 3 bode A.

Kontrolný materiál testujte presne tým istým spôsobom ako vzorku(-y).

7.1.   Fixácia extraktu zo zemiaka

Tento protokol je podľa Wullings et al. (1998):

7.1.1.   Pripravte fixačný roztok (pozri dodatok 7).

7.1.2.   Pipetou preneste 100 μl každého extraktu zo vzorky do Eppendorfovej skúmavky a 7 minút odstreďujte pri odstredivej sile 7 000 g.

7.1.3.   Dekantujte supernatant a rozpustite pelet v 200 μl fixatívu pripraveného < 24 hodín vopred. Pretrepte a 1 hodinu inkubujte v chladničke.

7.1.4.   Odstreďujte 7 minút pri odstredivej rýchlosti 7 000 g, dekantujte supernatant a resuspendujte pelet v 75 μl 0,01M PB (pozri dodatok 7).

7.1.5.   Naneste 16 μl zafixovanej suspenzie na čisté viacobjektové podložné sklíčko podľa obr. 7.1. Na každé podložné sklíčko naneste 2 rôzne nezriedené vzorky a použite 10 μl na prípravu roztoku 1:100 (v 0,01 M PB). Zvyšná vzorka roztoku (49 μl) sa po pridaní 1 objemovej jednotky 96 % etanolu môže skladovať pri teplote –20 °C. V prípade, že sa skúška FISH musí opakovať, odstráňte etanol odstredením a pridajte rovnaký objem 0,01 PB (zmiešajte pretrepaním).

Obr. 7.1   Schéma podložného sklíčka pri teste FISH

| Vzorka 1 | Prázdna | Prázdna | Prázdna | Vzorka 2 |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| | | | | |
| jamka 1 | jamka 2 | jamka 3 | jamka 4 | jamka 5 |
| Vzorka 1 | Prázdna | Prázdna | Prázdna | Vzorka 2 |
| | | | | |
| jamka 6 | jamka 7 | jamka 8 | jamka 9 | jamka 10 |
| Krycie sklíčko 1 | | Krycie sklíčko 2 |

Vzorka 1

Prázdna

Prázdna

Prázdna

Vzorka 2

Image

Image

Image

Image

Image

jamka 1

jamka 2

jamka 3

jamka 4

jamka 5

Vzorka 1

Prázdna

Prázdna

Prázdna

Vzorka 2

Image

Image

Image

Image

Image

jamka 6

jamka 7

jamka 8

jamka 9

jamka 10

Krycie sklíčko 1

Krycie sklíčko 2

7.1.6.   Podložné sklíčka osušte na vzduchu (alebo v sušičke pri teplote 37 °C) a zafixujte ich flambovaním.

V tomto štádiu sa proces môže prerušiť a hybridizácia môže pokračovať nasledujúci deň. Podložné sklíčka by sa mali skladovať v bezprašnom prostredí, v suchu a pri izbovej teplote.

7.2.   Hybridizácia

7.2.1.   Bunky dehydrujte ich postupným ponorením do 50 %, 80 % a 96 % etanolu, do každého na 1 minútu. Podložné sklíčka osušte na vzduchu umiestnené v stojane.

7.2.2.   Pripravte vlhkú inkubačnú komoru tak, že dno vzduchotesnej nádoby prikryjete hodvábnym alebo filtrovacím papierom nasiaknutým hybmixom 1x (dodatok 7). Box predinkubujte v hybridizačnej peci pri teplote 45 °C najmenej 10 minút.

7.2.3.   Do 8 jamiek každého podložného sklíčka (jamky 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 a 10; pozri obr. 7.1) dajte 10 μl hybridizačného roztoku (dodatok 7) a dve stredné jamky (3 a 8) nechajte prázdne.

7.2.4.   Na prvé a posledné 4 jamky priložte krycie sklíčka (24 × 24 mm) tak, aby v nich nezostal vzduch. Podložné sklíčka vložte do predhriatej vlhkej komory a 5 hodín hybridizujte v tme v peci pri teplote 45 °C.

7.2.5.   Pripravte 3 kadičky obsahujúce 1 l vody Mili Q (molekulárny gradient), 1 l hybmixu 1x (334 ml 3x hybmixu a 666 ml vody Mili Q) a 1 l hybmixu 1/8x (42 ml 3x hybmixu a 958 ml vody Mili Q). Každú kadičku predinkubujte vo vodnom kúpeli pri teplote 45 °C.

7.2.6.   Z podložných sklíčok odložte krycie sklíčka a podložné sklíčka umiestnite do stojana.

7.2.7.   Prebytočnú sondu vyplavte inkubovaním 15 minút v kadičke s hybromixom 1x pri teplote 45 °C.

7.2.8.   Držiak s podložnými sklíčkami premiestnite do premývacieho roztoku hybmixu 1/8x a inkubujte ďalších 15 minút.

7.2.9.   Podložné sklíčka krátko ponorte do vody Mili Q a položte ich na filtrovací papier. Prebytočnú vodu odstráňte jemným priložením filtrovacieho papiera na povrch. Pipetou pridajte do každej jamky 5 až 10 μl roztoku krycej kvapaliny na udržanie signálu (napr. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA alebo rovnocennú) a na celé podložné sklíčko priložte veľké krycie sklíčko (24 × 60 mm).

7.3.   Vyhodnotenie výsledkov testu FISH

7.3.1.   Podložné sklíčka okamžite prehliadnite pod vhodným epifluorescenčným mikroskopom s olejovou imerziou pri 630- alebo 1 000-násobnom zväčšení. S filtrom, ktorý je vhodný na fluorescenčný izotiokyanát (FITC), sú eubaktériové bunky (vrátane väčšiny gram-negatívnych buniek) vo vzorke sfarbené a fluoreskujú na zeleno. Ak sa použije filter na tetrametylrodamín-5-izotiokyanát, bunky R. solanacearum sfarbené Cy3 fluoreskujú na červeno. Morfológiu buniek porovnajte s morfológiou pozitívnej kontroly. Bunky musia jasno fluoreskovať a byť úplne sfarbené. Ak je sfarbenie odchylné, test FISH (oddiel VI.A.7) sa musí zopakovať. Jamky prehliadnite vo dvoch navzájom kolmých priemeroch a po obvode. Pri vzorkách vykazujúcich malý počet buniek alebo nevykazujúcich žiadne bunky prehliadnite najmenej 40 mikroskopických políčok.

7.3.2.   V testovacích jamkách testovacích podložných sklíčok (pozri internetovú stránku http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main) pozorujte jasne fluoreskujúce bunky s charakteristickou morfológiou R. solanacearum. Intenzita fluorescencie musí byť rovnaká alebo vyššia ako fluorescencia kmeňa pozitívnej kontroly. Bunky s neúplným sfarbením alebo slabou fluorescenciou sa neberú do úvahy.

7.3.3.   Ak je akékoľvek podozrenie na kontamináciu, test sa musí zopakovať. Môže to byť v prípade, keď sa na všetkých podložných sklíčkach v dávke nachádzajú pozitívne bunky kvôli kontaminácii pufra, alebo ak sa pozitívne bunky zistia (mimo jamiek) na podložných sklíčkach.

7.3.4.   So špecifickosťou testu FISH sa spája niekoľko problémov. Vo výrezkoch z pupkových koncov hľúz a v peletoch zo segmentov stonky sa môžu vyskytnúť nežiadúce populácie fluoreskujúcich buniek s netypickou morfológiou a saprofytické baktérie s krížovou reakciou podobnej veľkosti a morfológie ako R. solanacearum, hoci zriedkavejšie ako pri teste IF.

7.3.5.   Do úvahy vezmite len fluoreskujúce bunky s typickou veľkosťou a morfológiou.

7.3.6.   Vyhodnotenie výsledkov testu FISH:

| i) | Platné výsledky testu FISH sa dosiahnu, ak sa s použitím filtra FITC pozorujú jasne zelené fluoreskujúce bunky s veľkosťou a morfológiou typickou pre R. solanacearum a rhodaminového filtra červené fluoreskujúce bunky vo všetkých pozitívnych kontrolách, ale v žiadnej negatívnej kontrole. Ak sa zistia jasné fluoreskujúce bunky s charakteristickou morfológiou, odhadnite priemerný počet typických buniek na mikroskopické políčko a vypočítajte počet typických buniek na 1 ml resuspendovaného peletu (dodatok 4). Vzorky s najmenej 5 × 103 typických buniek na 1 ml resuspendovaného peletu sa považujú za potenciálne kontaminované. Vyžaduje sa ďalšie testovanie. Vzorky s menej ako 5 × 103 typických buniek na 1 ml resuspendovaného peletu sa považujú za negatívne. |
| --- | --- |

i)

Platné výsledky testu FISH sa dosiahnu, ak sa s použitím filtra FITC pozorujú jasne zelené fluoreskujúce bunky s veľkosťou a morfológiou typickou pre R. solanacearum a rhodaminového filtra červené fluoreskujúce bunky vo všetkých pozitívnych kontrolách, ale v žiadnej negatívnej kontrole. Ak sa zistia jasné fluoreskujúce bunky s charakteristickou morfológiou, odhadnite priemerný počet typických buniek na mikroskopické políčko a vypočítajte počet typických buniek na 1 ml resuspendovaného peletu (dodatok 4). Vzorky s najmenej 5 × 103 typických buniek na 1 ml resuspendovaného peletu sa považujú za potenciálne kontaminované. Vyžaduje sa ďalšie testovanie. Vzorky s menej ako 5 × 103 typických buniek na 1 ml resuspendovaného peletu sa považujú za negatívne.

| ii) | Test FISH je negatívny, ak sa pomocou rodamínového filtra nezistia jasnočervené fluoreskujúce bunky s veľkosťou a morfológiou typickou pre R. solanacearum za predpokladu, že v pozitívnych kontrolných preparátoch sa s použitím rodamínového filtra pozorujú typické jasnočervené fluoreskujúce bunky. |
| --- | --- |

ii)

Test FISH je negatívny, ak sa pomocou rodamínového filtra nezistia jasnočervené fluoreskujúce bunky s veľkosťou a morfológiou typickou pre R. solanacearum za predpokladu, že v pozitívnych kontrolných preparátoch sa s použitím rodamínového filtra pozorujú typické jasnočervené fluoreskujúce bunky.

8.   Testy ELISA

Princíp

Test ELISA sa môže používať len ako nepovinný test popri teste IF, PCR alebo FISH z dôvodu relatívne nízkej citlivosti tohto testu. Pri použití testu DAS ELISA je obohacovanie a použitie monoklónnych protilátok povinné (pozri internetovú stránku http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Obohacovanie vzoriek pred použitím testu ELISA môže byť užitočné z dôvodu zvýšenia citlivosti testu, ale môže byť neúspešné v dôsledku konkurenčného pôsobenia iných organizmov vo vzorke.

Poznámka: Použite validovaný zdroj protilátok pre R. solanacearum (pozri internetovú stránku http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Odporúča sa, aby sa pre každú novú dávku protilátok určil titer. Titer sa definuje ako najvyššie riedenie pri ktorom sa optimálne reakcie objavujú, keď sa testuje suspenzia obsahujúca105 až 106 buniek na ml homologického kmeňa R. solanacearum a keď sa použijú primerané sekundárne protilátkové konjugáty podľa odporúčaní výrobcu. Počas testovania by sa protilátky mali použiť v pracovnom riedení podobnom titri alebo v titri komerčnej receptúry.

Na suspenzii s 105 až 106 bunkami na ml homologického kmeňa R. solanacearum určite titer protilátok.

Zahrňte extrakt vzorky, ktorá bola pri predchádzajúcom teste na R. solanacearum negatívna a suspenziu baktérie, pri ktorej nedochádza k vzájomným reakciám vo fosfátovom pufrovanom roztoku (STP), ako negatívne kontroly.

Ako pozitívnu kontrolu použite alikvotný podiel vzorkového extraktu, ktorý bol pri predchádzajúcom teste negatívny, zmiešajte ho s 103 až 104 bunkami na ml biovaru 2 R. solanacearum (napr. kmeň NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, pozri dodatok 2A a B). Na porovnanie výsledkov na každej platni použite štandardnú suspenziu z 105 až 106 buniek na ml vo fosfátovom pufrovanom roztoku (STP) R. solanacearum. Zabezpečte, aby boli pozitívne kontroly dobre oddelené na mikrotitračnej platni od testovanej vzorky (vzoriek).

Normalizované kontrolné materiály pre pozitívne a negatívne kontroly, ktoré sú dostupné pre tento test, sa uvádzajú v dodatku 3 bode A.

Kontrolný materiál otestujte úplne rovnakým spôsobom ako pri vzorke/vzorkách.

Boli validované dva ELISA protokoly.

a)   Nepriamy test ELISA (Robinson Smith a kol., 1995)

| 1. | Použite 100 – 200 μl alikvotného podielu vzorkového extraktu. (Zahriatím na 100 °C na 4 minúty vo vodnom kúpeli alebo zahrievacom bloku môžete v niektorých prípadoch znížiť nešpecifické výsledky). |
| --- | --- |

1.

Použite 100 – 200 μl alikvotného podielu vzorkového extraktu. (Zahriatím na 100 °C na 4 minúty vo vodnom kúpeli alebo zahrievacom bloku môžete v niektorých prípadoch znížiť nešpecifické výsledky).

| 2. | Pridajte alikvotný objem dvojnásobne silného krycieho pufra (dodatok 4) a premiešajte. |
| --- | --- |

2.

Pridajte alikvotný objem dvojnásobne silného krycieho pufra (dodatok 4) a premiešajte.

| 3. | Použite 100 μl alikvotného podielu pre každú z najmenej 2 jamiek mikrotitračnej platne (napr. Nunc-Polysorp alebo ekvivalent) a inkubujte 1 hodinu pri teplote 37 °C alebo cez noc pri teplote 4 °C. |
| --- | --- |

3.

Použite 100 μl alikvotného podielu pre každú z najmenej 2 jamiek mikrotitračnej platne (napr. Nunc-Polysorp alebo ekvivalent) a inkubujte 1 hodinu pri teplote 37 °C alebo cez noc pri teplote 4 °C.

| 4. | Extrakty z jamiek celkom odstráňte. Jamky vymyte trikrát fosfátovým pufrom (PBS) s tvínom (dodatok 4), pričom by posledný premývací roztok mal v jamkách zostať aspoň 5 minút. |
| --- | --- |

4.

Extrakty z jamiek celkom odstráňte. Jamky vymyte trikrát fosfátovým pufrom (PBS) s tvínom (dodatok 4), pričom by posledný premývací roztok mal v jamkách zostať aspoň 5 minút.

| 5. | Pripravte vhodné riedenie protilátok pre R. solanacearum v blokačnom (protilátkovom) pufri (dodatok 4). Pre validované komerčné protilátky použite odporúčané riedenie (obyčajne s dvojnásobne vyššou koncentráciou ako má titer). |
| --- | --- |

5.

Pripravte vhodné riedenie protilátok pre R. solanacearum v blokačnom (protilátkovom) pufri (dodatok 4). Pre validované komerčné protilátky použite odporúčané riedenie (obyčajne s dvojnásobne vyššou koncentráciou ako má titer).

| 6. | Pridajte 100 μl do každej jamky a inkubujte 1 hodinu pri teplote 37 °C. |
| --- | --- |

6.

Pridajte 100 μl do každej jamky a inkubujte 1 hodinu pri teplote 37 °C.

| 7. | Z jamiek celkom odstráňte protilátkový roztok a umyte ich ako pri predchádzajúcom postupe (bod 4). |
| --- | --- |

7.

Z jamiek celkom odstráňte protilátkový roztok a umyte ich ako pri predchádzajúcom postupe (bod 4).

| 8. | Pripravte vhodné riedenie sekundárneho konjugátu alkalickej fosfatázy v blokačnom pufri. Pridajte 100 μl do každej jamky a inkubujte 1 hodinu pri teplote 37 °C. |
| --- | --- |

8.

Pripravte vhodné riedenie sekundárneho konjugátu alkalickej fosfatázy v blokačnom pufri. Pridajte 100 μl do každej jamky a inkubujte 1 hodinu pri teplote 37 °C.

| 9. | Z jamiek celkom odstráňte konjugátovú protilátku a umyte ich ako pri predchádzajúcom postupe (bod 4). |
| --- | --- |

9.

Z jamiek celkom odstráňte konjugátovú protilátku a umyte ich ako pri predchádzajúcom postupe (bod 4).

| 10. | Do každej jamky pridajte 100 μl substrátového alkalického roztoku fosfatázy (dodatok 4). Inkubujte na tmavom mieste pri priaznivej teplote a absorbanciu odčítajte pri vlnovej dĺžke 405 nm v pravidelných intervaloch v rozsahu 90 min. |
| --- | --- |

10.

Do každej jamky pridajte 100 μl substrátového alkalického roztoku fosfatázy (dodatok 4). Inkubujte na tmavom mieste pri priaznivej teplote a absorbanciu odčítajte pri vlnovej dĺžke 405 nm v pravidelných intervaloch v rozsahu 90 min.

b)   Test DASI ELISA

| 1. | Pripravte primeraný roztok anti-R. solanacearum polykonálnych immunoglobulínov v krycom pufri pH 9,6 (dodatok 4). Pridajte 200 μl do každej jamky. Inkubujte pri teplote 37 °C počas 4 – 5 hodín alebo pri teplote 4 °C počas 16 hodín. |
| --- | --- |

1.

Pripravte primeraný roztok anti-R. solanacearum polykonálnych immunoglobulínov v krycom pufri pH 9,6 (dodatok 4). Pridajte 200 μl do každej jamky. Inkubujte pri teplote 37 °C počas 4 – 5 hodín alebo pri teplote 4 °C počas 16 hodín.

| 2. | Jamky umyte trikrát s PBS-tvínom (dodatok 4).
  Pridajte 190 μl vzorkového extraktu do najmenej 2 jamiek. Pridajte tiež pozitívne a negatívne kontroly do dvoch jamiek na každej platni. Inkubujte 16 hodín pri teplote 4 °C. |
| --- | --- |

2.

Jamky umyte trikrát s PBS-tvínom (dodatok 4).

Pridajte 190 μl vzorkového extraktu do najmenej 2 jamiek. Pridajte tiež pozitívne a negatívne kontroly do dvoch jamiek na každej platni. Inkubujte 16 hodín pri teplote 4 °C.

| 3. | Jamky umyte trikrát s PBS-tvínom (dodatok 4). |
| --- | --- |

3.

Jamky umyte trikrát s PBS-tvínom (dodatok 4).

| 4. | Pripravte vhodné riedenie R. solanacearum-špecifické monokolónne protilátky v PBS (dodatok 4), ktoré tiež obsahujú 0,5 % albumínu hovädzieho séra (BSA) a pridajte 190 μl do každej jamky. Inkubujte pri teplote 37 °C počas 2 hod. |
| --- | --- |

4.

Pripravte vhodné riedenie R. solanacearum-špecifické monokolónne protilátky v PBS (dodatok 4), ktoré tiež obsahujú 0,5 % albumínu hovädzieho séra (BSA) a pridajte 190 μl do každej jamky. Inkubujte pri teplote 37 °C počas 2 hod.

| 5. | Jamky umyte trikrát s PBS-tvínom (dodatok 4). |
| --- | --- |

5.

Jamky umyte trikrát s PBS-tvínom (dodatok 4).

| 6. | Pripravte vhodné riedenie protimyších imunoglobulínov konjugovaných s alkalickou fosfatázou v PBS. Pridajte 190 μl do každej jamky. Inkubujte pri teplote 37 °C počas 2 hod. |
| --- | --- |

6.

Pripravte vhodné riedenie protimyších imunoglobulínov konjugovaných s alkalickou fosfatázou v PBS. Pridajte 190 μl do každej jamky. Inkubujte pri teplote 37 °C počas 2 hod.

| 7. | Jamky umyte trikrát s PBS-tvínom (dodatok 4). |
| --- | --- |

7.

Jamky umyte trikrát s PBS-tvínom (dodatok 4).

| 8. | Pripravte substrátový alkalický roztok fosfatázy obsahujúci 1 mg p-nitrofenylfosfátu na ml substrátového pufra (dodatok 4). Pridajte 200 μl do každej jamky. Inkubujte na tmavom mieste pri priaznivej teplote a absorbanciu odčítajte pri vlnovej dĺžke 405 nm v pravidelných intervaloch v rozsahu 90 min. |
| --- | --- |

8.

Pripravte substrátový alkalický roztok fosfatázy obsahujúci 1 mg p-nitrofenylfosfátu na ml substrátového pufra (dodatok 4). Pridajte 200 μl do každej jamky. Inkubujte na tmavom mieste pri priaznivej teplote a absorbanciu odčítajte pri vlnovej dĺžke 405 nm v pravidelných intervaloch v rozsahu 90 min.

Vyhodnotenie výsledkov testu ELISA:

Test ELISA je negatívny, ak hodnota priemernej optickej hustoty (OH) z jamiek s duplikátom vzorky je < 2x OH kontrolnej jamky negatívneho vzorkového extraktu pod podmienkou, že OH pre pozitívne kontroly je vyššia ako 1,0 (po 90 minútach inkubácie so substrátom) a je väčšia ako dvojnásobná OH získaná pre negatívne vzorkové extrakty.

Test ELISA je pozitívny, ak priemerné hodnoty OH z jamiek s duplikátom vzorky sú > 2x OH v jamke s negatívny vzorkovým extraktom pod podmienkou, že OH hodnoty vo všetkých jamkách s negatívnou kontrolou sú < 2x OH hodnoty v jamkách s pozitívnou kontrolou.

Negatívne hodnoty testu ELISA v jamkách pre pozitívnu kontrolu naznačujú, že test nebol urobený správne alebo bol inhibovaný. Pozitívne hodnoty testu ELISA v jamkách pre negatívnu kontrolu naznačujú, že došlo ku vzájomnej kontaminácii alebo k nešpecifickej protilátkovej väzbe.

9.   Biotest

Poznámka: Predbežné testovanie s touto metódou by malo umožniť reprodukovateľné zistenie 103 až 104 kolónotvorných jednotiek R. solanacearum na ml pridaných do vzorkových extraktov, ktoré boli v predchádzajúcich testoch negatívne (prípravu pozri v dodatku 3).

Najvyššiu citlivosť zistenia môžete očakávať, keď použijete čerstvo pripravený vzorkový extrakt a podmienky pre optimálny rast. Metóda sa však môže úspešne použiť pri extraktoch, ktoré boli uskladnené pod glycerínom pri teplote –68 to –86 °C.

Nasledujúci protokol vychádza z metódy podľa Jansea (1988):

9.1.   Použite 10 testovacích rastlín a citlivý rajčiakový kultivar (napr. Moneymaker alebo kultivar s rovnakou citlivosťou, aká bola určená v testujúcom laboratóriu) v tretej skutočnej rastovej fáza pre každú vzorku. Ohľadom podrobností o kultivácii, pozri dodatok 8. Alternatívne použite baklažány (napr. kultivar Black Beauty alebo kultivary s rovnakou vnímavosťou), použite len rastliny v rastovej fáze 2 – 3 až do úplnej expanzie tretej skutočnej rastovej fázy. Symptómy sa prejavili ako menej vážne a ich vývoj v baklažáne je pomalší. V možných prípadoch sa preto odporúča použiť rajčiakové semenáče.

Medzi testované rastliny rozdelíme 100 μl vzorkového extraktu.

9.2.1.   Naočkovanie injekčnou striekačkou

Stopky rastlín naočkujte presne nad klíčnymi listami pomocou injekčnej striekačky vybavenej hypodermickou ihlou (najmenej 23 G). Vzorku rozdeľte medzi testované rastliny.

9.2.2.   Naočkovanie pozdĺžneho rezu

Rastlinu uchopte medzi dva prsty a napipetujte kvapku (asi 5 až 10 μl) rozptýleného peletu na stonku medzi klíčne listy a prvý list.

Skalpelom urobte do stonky priečny rez asi 1 cm dlhý, približne do hĺbky 2/3 hrúbky stonky, počnúc pri kvapke rozptýleného peletu.

Rez uzavrite sterilnou vazelínou z injekčnej striekačky.

9.3.   Rovnakým postupom naočkujte 5 semenáčov s vodnou suspenziou 105 až 106 buniek na ml pripravenou zo 48 hodinovej kultúry virulentného kmeňa biovaru 2 R. solanacearum ako pozitívnou kontrolou a s pufrom peletu (dodatok 4) ako negatívnou kontrolou. Oddeľte rastliny s pozitívnou a negatívnou kontrolou od ostatných rastlín, aby nedochádzalo ku vzájomnej kontaminácii.

9.4.   Testovacie rastliny pestujte v karanténnych zariadeniach najdlhšie 4 týždne pri teplote 25 – 30 °C a vysokej relatívnej vlhkosti s príslušným zalievaním, aby nedochádzalo k podmokaniu alebo vädnutiu v dôsledku nedostatku vody. Aby ste zabránili kontaminácii, inkubujte rastliny s pozitívnou a negatívnou kontrolou na jasne oddelených častiach v skleníku alebo v miestnosti na pestovanie, alebo v prípade obmedzeného priestoru, zabezpečte prísne oddelenie medzi jednotlivými postupmi. Ak musia byť rastliny na rôzne vzorky inkubované v tesnej blízkosti, oddeľte ich vhodnými clonami. Pri oplodňovaní, zalievaní, kontrole a iných manipuláciách musíte dávať veľký pozor, aby nedošlo ku vzájomnej kontaminácii. Je potrebné, aby sa skleníky a miestnosti na pestovanie udržiavali chránené pred pesticídami hmyzu, ktoré môžu preniesť baktériu zo vzorky na vzorku.

Pozorujte symptómy vädnutia, epinastie, chlorózy a/alebo zakrpatenia.

9.5.   Izolujte od infikovaných rastlín (kapitola II.3) a určite vyčistené kultúry predpokladaného R. solanacearum (kapitola VI. B).

9.6.   Ak po 3 týždňoch nepozorujete žiadne symptómy, uskutočnite IF/PCR/izoláciu na zmiešanej vzorke z centimetrových častí stonky každej testovanej rastliny, ktoré odoberiete nad miestom očkovania. Ak je test pozitívny, vykonajte riedenie na platničke (kapitola 4.1).

9.7.   Určite akékoľvek vyčistené kultúry predpokladaného R. solanacearum (kapitola VI. B).

Zhodnotenie výsledkov biotestu

Platné výsledky biotestu získate, keď sa na rastlinách s pozitívnou kontrolou prejavujú typické symptómy, baktéria sa môže opätovne izolovať z týchto rastlín a neprejavujú sa žiadne symptómy pri negatívnych kontrolách.

Biotest je negatívny, ak testované rastliny nie sú infikované R. solanacearum a pod podmienkou, že R. solanacearum sa zistí pri pozitívnych kontrolách.

Biotest je pozitívny, ak sú testované rastliny nainfikované baktériou R. solanacearum.

B.   IDENTIFIKAČNÉ TESTY

Pomocou najmenej dvoch z nasledujúcich testov založených na rozličných biologických princípoch identifikujte čisté kultúry izolátov predpokladaného R. solanacearum.

V potrebných prípadoch pre každý uskutočňovaný test zahrňte známe referenčné kmene (pozri dodatok 3).

1.   Nutričné a enzymatické identifikačné testy

Určite nasledujúce fenotypické vlastnosti, ktoré sú všeobecne prítomné alebo neprítomné v R. solanacearum na základe metód podľa Lelliotta a Steada (1987), Klement a kol. (1990), Schaad (2001).

| Test | Očakávaný výsledok |
| --- | --- |
| Produkcia fluoreskujúceho pigmentu | – |
| Prítomnosť poly-β-hydroxybutyratu | + |
| Oxidačno-fermentačný test (O/F) | O+/F– |
| Katalázová aktivita | + |
| Kováčov oxidačný test | + |
| Redukcia dusíka | + |
| Použitie citrátu | + |
| Rast pri 40 °C | – |
| Rast v 1 % NaCl | + |
| Rast v 2 % NaCl | – |
| Arginín dihydrolázová aktivita | – |
| Skvapalňovanie želatíny | – |
| Hydrolýza škrobu | – |
| Hydrolýza eskulínu | – |
| Produkcia levanu | – |

Test

Očakávaný výsledok

Produkcia fluoreskujúceho pigmentu

–

Prítomnosť poly-β-hydroxybutyratu

+

Oxidačno-fermentačný test (O/F)

O+/F–

Katalázová aktivita

+

Kováčov oxidačný test

+

Redukcia dusíka

+

Použitie citrátu

+

Rast pri 40 °C

–

Rast v 1 % NaCl

+

Rast v 2 % NaCl

–

Arginín dihydrolázová aktivita

–

Skvapalňovanie želatíny

–

Hydrolýza škrobu

–

Hydrolýza eskulínu

–

Produkcia levanu

–

2.   Test IF

2.1.   Pripravte suspenziu približne z 106 buniek na ml v pufri IF (dodatok 4).

2.2.   Pripravte sériu dvojnásobného riedenia príslušného antiséra (pozri internetovú stránku http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

2.3.   Použite postup IF (kapitola VI.A.5).

2.4.   Pozitívny test IF dosiahnete, ak je IF titer kultúry ekvivalentný s titrom pozitívnej kontroly.

3.   Test ELISA

Poznámka: Ak robíte len 2 identifikačné testy, k tejto metóde nepoužite žiadny dodatočný serologický test.

3.1.   Pripravte suspenziu z približne 108 buniek na ml v 1X STP (PBS) (dodatok 4).

3.2.   Uskutočnite príslušný postup ELISA so špecifickou monoklonálnou protilátkou pre R. solanacearum.

3.3.   Pozitívny test ELISA dosiahnete, ak hodnota testu ELISA získaná z kultúry je aspoň polovičná v porovnaní s hodnotou získanou pri pozitívnej kontrole.

4.   Testy PCR

4.1.   Pripravte suspenziu približne z 106 buniek na ml v sterilnej vode molekulárneho gradientu.

4.2.   Zahrejte 100 μl bunkovej suspenzie v uzavretých skúmavkách 4 minúty v zahrievacom bloku alebo vo vriacom vodnom kúpeli pri teplote 100 °C. Vzorky môžete následne uložiť pri teplote –16 až –24 °C, až kým ich nebudete potrebovať.

4.3.   Použite príslušné postupy PCR na zdôraznenie špecifických amplikónov R. solanacearum [napr. Seal a kol. (1993); Pastrik a Maiss (2000); Pastrik a kol. (2002); Boudazin a kol. (1999); Opina a kol. (1997), Weller a kol. (1999)].

4.4.   Pozitívnu identifikáciu R. solanacearum dosiahnete, ak majú PCR amplikóny rovnakú veľkosť a vyznačujú sa rovnakým polymorfizmom s obmedzenou dĺžkou fragmentu.

5.   Test FISH

5.1.   Pripravte suspenziu približne z 106 buniek na ml v UPW.

5.2.   Uskutočnite postupy FISH (kapitola VI.A.7) s najmenej dvomi R. solanacearum – špecifickými oligopróbami (dodatok 7).

5.3.   Pozitívny test FISH dosiahnete, ak sa rovnaké reakcie dosiahnú pri kultúre aj pri pozitívnej kontrole.

6.   Analýza mastných kyselín (FAP)

6.1.   Kultúru pestujte na tryptikázovom sójovom agare (Oxoid) 48 hodín pri teplote 28 °C.

6.2.   Uskutočnite príslušné postupy FAP (Janse, 1991; Stead, 1992).

6.3.   Pozitívny test FAP dosiahnete, ak je profil predpokladanej kultúry totožný s profilom pozitívnej kontroly. Prítomnosť charakteristických mastných kyselín je 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH a 18:1 2OH a absencia 16:0 3OH je významným určovateľom Ralstonia sp.

7.   Metódy pre charakterizáciu kmeňa

Charakterizácia kmeňa pomocou jednej z nasledujúcich metód sa odporúča pre každý nový prípad izolácie R. solanacearum.

V potrebných prípadoch zahrňte pre každý uskutočňovaný test známe referenčné kmene (pozri dodatok 3).

7.1.   Určenie biovaru

R. solanacearum sa rozdeľuje do biovarov na základe schopnosti použiť a/alebo oxidovať tri disacharidy a tri alkoholy hexózy (Hayward, 1964 a Hayward a kol., 1990). Médiá rastu pre biovarový test sú popísané v dodatku 2. Test sa môže úspešne uskutočniť naočkovaním média vstreknutím čistých kultúr izolátov R. solanacearum a inkubovaním pri teplote 28 °C. Ak sa médiá rozdelia do sterilných platní s bunkovou kultúrou s 96 jamkami (200 μl na jamku), môžete pozorovať zmenu farby z olivovo zelenej na žltú v priebehu 72 hodín, ktorá znamená pozitívny výsledok testu.

| | Biovar |
| --- | --- |
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Použitie: | |
| Maltózy | – | + | + | – | + |
| Laktózy | – | + | + | – | + |
| D (+) Cellobiózy | – | + | + | – | + |
| Manitu | – | – | + | + | + |
| Sorbitu | – | – | + | + | – |
| Dulcitu | – | – | + | + | – |

Biovar

1

2

3

4

5

Použitie:

Maltózy

–

+

+

–

+

Laktózy

–

+

+

–

+

D (+) Cellobiózy

–

+

+

–

+

Manitu

–

–

+

+

+

Sorbitu

–

–

+

+

–

Dulcitu

–

–

+

+

–

Dodatočné testy diferencujú 2 sub-fenotypy biovaru

| | Biovar 2A
  (Celosvetové rozšírenie) | Biovar 2A
  (Zistený v Čile a Kolumbii) | Biovar 2T
  (Zistený v tropických oblastiach) |
| --- | --- | --- | --- |
| Použitie trehalózy | – | + | + |
| Použitie mezo-inozitolu | + | – | + |
| Použitie ribózy D | – | – | + |
| Pektolytická aktivita (1) | nízka | nízka | vysoká |

Biovar 2A

(Celosvetové rozšírenie)

Biovar 2A

(Zistený v Čile a Kolumbii)

Biovar 2T

(Zistený v tropických oblastiach)

Použitie trehalózy

–

+

+

Použitie mezo-inozitolu

+

–

+

Použitie ribózy D

–

–

+

Pektolytická aktivita (1)

nízka

nízka

vysoká

7.2.   Genomic fingerprinting

Molekulárna diferenciácia kmeňov v komplexe R. solanacearum sa môže dosiahnuť pomocou viacerých techník, vrátane:

7.2.1.   analýzy polymorfizmu s obmedzenou dĺžkou fragmentov (RFLP) (Cook a kol., 1989);

7.2.2.   opakovanej sekvencie PCR pomocou iniciátorov REP, BOX a ERIC (Louws a kol., 1995; Smith a kol., 1995);

7.2.3.   analýzy polymorfizmu s obmedzenou dĺžkou fragmentov (AFLP) (Van der Wolf a kol., 1998).

7.3.   Metódy PCR

Špecifické iniciátory PCR (Pastrik a kol, 2002; pozri dodatok 6) sa môžu použiť na diferenciáciu kmeňov patriacich do oddielu 1 (biovary 3, 4 a 5) a oddielu 2 (biovary 1, 2A a 2T) R. solanacearum na základe pôvodnej definície podľa analýzy RFLP (Cook a kol., 1989) a 16S rDNA sekvencovania (Taghavi a kol., 1996).

C.   KONFIRMAČNÝ TEST

Test patogenity sa musí vykonať ako konečné potvrdenie diagnózy R. solanacearum a na zhodnotenie virulencie kultúr identifikovaných ako R. solanacearum.

| 1. | Pripravte očkovaciu látku z približne 106 buniek na ml z 24 – 28 hodinovej kultúry izolátu určeného na testovanie a príslušný kmeň R. solanacearum s pozitívnou kontrolou (napr. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; pozri dodatok 3). |
| --- | --- |

1.

Pripravte očkovaciu látku z približne 106 buniek na ml z 24 – 28 hodinovej kultúry izolátu určeného na testovanie a príslušný kmeň R. solanacearum s pozitívnou kontrolou (napr. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; pozri dodatok 3).

| 2. | Naočkujte 5 – 10 vnímavých rajčinových alebo baklažánových semenáčov v tretej skutočnej rastovej fáze (pozri kapitolu VI.A.9). |
| --- | --- |

2.

Naočkujte 5 – 10 vnímavých rajčinových alebo baklažánových semenáčov v tretej skutočnej rastovej fáze (pozri kapitolu VI.A.9).

| 3. | Inkubujte najviac 2 týždne pri teplote 25 – 28 °C a vysokej relatívnej vlhkosti s vhodným zalievaním, aby nedochádzalo k podmokaniu alebo stresu zo sucha. Pri čistých kultúrach by sa typické vädnutie malo prejaviť do 14 dní. Ak sa po tomto období neprejavia príznaky tohto ochorenia, kultúra sa nemôže označiť za patogénnu formu R. solanacearum. |
| --- | --- |

3.

Inkubujte najviac 2 týždne pri teplote 25 – 28 °C a vysokej relatívnej vlhkosti s vhodným zalievaním, aby nedochádzalo k podmokaniu alebo stresu zo sucha. Pri čistých kultúrach by sa typické vädnutie malo prejaviť do 14 dní. Ak sa po tomto období neprejavia príznaky tohto ochorenia, kultúra sa nemôže označiť za patogénnu formu R. solanacearum.

| 4. | Pozorujte symptómy vädnutia a/alebo epinastie, chlorózy a zakrpatenia. |
| --- | --- |

4.

Pozorujte symptómy vädnutia a/alebo epinastie, chlorózy a zakrpatenia.

| 5. | Izolujte zo symptomatických rastlín časť stopky asi 2 cm nad bodom očkovania. Pokračujte a rozptýľte v malom množstve sterilnej destilovanej vody alebo 50mM fosforečnanového pufra (dodatok 4). Izolujte zo suspenzie rozstreknutím alebo vstreknutím roztoku na vhodné médium preferenčne na selektívne médium (dodatok 2), inkubujte 48 – 72 hodín pri teplote 28 °C a pozorujte vytváranie kolónií typických pre R. solanacearum. |
| --- | --- |

5.

Izolujte zo symptomatických rastlín časť stopky asi 2 cm nad bodom očkovania. Pokračujte a rozptýľte v malom množstve sterilnej destilovanej vody alebo 50mM fosforečnanového pufra (dodatok 4). Izolujte zo suspenzie rozstreknutím alebo vstreknutím roztoku na vhodné médium preferenčne na selektívne médium (dodatok 2), inkubujte 48 – 72 hodín pri teplote 28 °C a pozorujte vytváranie kolónií typických pre R. solanacearum.

Dodatok 1

Laboratóriá zúčastnené na optimalizácii a validácii protokolov

| Laboratórium (2) | Miesto | Krajina |
| --- | --- | --- |
| Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit | Viedeň a Linz | Rakúsko |
| Departement Gewasbescherming | Merelbeke | Belgicko |
| Plantedirektoratet | Lyngby | Dánsko |
| Central Science Laboratory | York | Anglicko |
| Scottish Agricultural Science Agency | Edinburgh | Škótsko |
| Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Unité de Bactériologie | Angers | Francúzsko |
| Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme de Terre | Le Rheu | Francúzsko |
| Biologische Bundesanstalt | Kleinmachnow | Nemecko |
| Pflanzenschutzamt Hannover | Hannover | Nemecko |
| State Laboratory | Dublin | Írsko |
| Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali | Bologna | Taliansko |
| Regione Veneto Unità Periferica per i Servizi Fitosanitari | Verona | Taliansko |
| Nederlandse Algemene Keuringsdienst | Emmeloord | Holandsko |
| Plantenziektenkundige Dienst | Wageningen | Holandsko |
| Direcção-Geral de Protecção das Culturas | Lisabon | Portugalsko |
| Centro de Diagnostico de Aldearrubia | Salamanca | Španielsko |
| Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias | Valencia | Španielsko |
| Swedish University of Agricultural Sciences | Uppsala | Švédsko |

Laboratórium (2)

Miesto

Krajina

Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit

Viedeň a Linz

Rakúsko

Departement Gewasbescherming

Merelbeke

Belgicko

Plantedirektoratet

Lyngby

Dánsko

Central Science Laboratory

York

Anglicko

Scottish Agricultural Science Agency

Edinburgh

Škótsko

Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Unité de Bactériologie

Angers

Francúzsko

Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme de Terre

Le Rheu

Francúzsko

Biologische Bundesanstalt

Kleinmachnow

Nemecko

Pflanzenschutzamt Hannover

Hannover

Nemecko

State Laboratory

Dublin

Írsko

Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali

Bologna

Taliansko

Regione Veneto Unità Periferica per i Servizi Fitosanitari

Verona

Taliansko

Nederlandse Algemene Keuringsdienst

Emmeloord

Holandsko

Plantenziektenkundige Dienst

Wageningen

Holandsko

Direcção-Geral de Protecção das Culturas

Lisabon

Portugalsko

Centro de Diagnostico de Aldearrubia

Salamanca

Španielsko

Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias

Valencia

Španielsko

Swedish University of Agricultural Sciences

Uppsala

Švédsko

Dodatok 2

Médiá na izoláciu a kultiváciu R. solanacearum

a)   Všeobecné médiá rastu

Živný agar (NA)

| Živný agar (Difco) | 23,0 g |
| --- | --- |
| Destilovaná voda | 1,0 l |

Živný agar (Difco)

23,0 g

Destilovaná voda

1,0 l

Rozpustite prísady a sterilizujeme v autokláve pri 121 °C počas 15 min.

Kvasnicovo-peptónovo-glukózový agar (YPGA)

| Kvasnicový extrakt (Difco) | 5,0 g |
| --- | --- |
| Peptón bacto (Difco) | 5,0 g |
| Monohydrát D(+) glukózy | 10,0 g |
| Bacto-agar (Difco) | 15,0 g |
| Destilovaná voda | 1,0 l |

Kvasnicový extrakt (Difco)

5,0 g

Peptón bacto (Difco)

5,0 g

Monohydrát D(+) glukózy

10,0 g

Bacto-agar (Difco)

15,0 g

Destilovaná voda

1,0 l

Rozpustite prísady a sterilizujeme v autokláve pri 121 °C počas 15 min.

Sacharózovo-peptónový agar (SPA)

| Sacharóza | 20,0 g |
| --- | --- |
| Peptón bacto (Difco) | 5,0 g |
| K2HPO4 | 0,5 g |
| MgSO4.7H2O | 0,25 g |
| Bacto-agar (Difco) | 15,0 g |
| Destilovaná voda | 1,0 l |
| pH 7,2–7,4 | |

Sacharóza

20,0 g

Peptón bacto (Difco)

5,0 g

K2HPO4

0,5 g

MgSO4.7H2O

0,25 g

Bacto-agar (Difco)

15,0 g

Destilovaná voda

1,0 l

pH 7,2–7,4

Rozpustite prísady a sterilizujeme v autokláve pri 121 °C počas 15 min.

Kelmanovo médium tetrazolium

| Kyseliny Casamino (Difco) | 1,0 g |
| --- | --- |
| Peptón bacto (Difco) | 10,0 g |
| Dextróza | 5,0 g |
| Bacto-agar (Difco) | 15,0 g |
| Destilovaná voda | 1,0 l |

Kyseliny Casamino (Difco)

1,0 g

Peptón bacto (Difco)

10,0 g

Dextróza

5,0 g

Bacto-agar (Difco)

15,0 g

Destilovaná voda

1,0 l

Rozpustite prísady a sterilizujeme v autokláve pri 121 °C počas 15 min.

Ochlaďte na 50 °C a pridáme filtrom sterilizovaný roztok 2,3,5-trifenyl tetrazolium chloridu (Sigma), aby ste dosiahli konečnú koncentráciu 50 mg na l.

b)   Validované selektívne médiá rastu

Médium SMSA (Englebrecht, 1994, upravené podľa Elphinstonea a kol., 1996)

| Základné médium | |
| --- | --- |
| Kyseliny Casamino (Difco) | 1,0 g |
| Peptón bacto (Difco) | 10,0 g |
| Glycerín | 5,0 ml |
| Bacto-agar (Difco) (pozri poznámku 2). | 15,0 g |
| Destilovaná voda | 1,0 l |

Základné médium

Kyseliny Casamino (Difco)

1,0 g

Peptón bacto (Difco)

10,0 g

Glycerín

5,0 ml

Bacto-agar (Difco) (pozri poznámku 2).

15,0 g

Destilovaná voda

1,0 l

Rozpustite prísady a sterilizujte v autokláve pri 121 °C počas 15 min.

Ochlaďte na 50 °C a pridajte filtrom sterilizované vodné zásobné roztoky nasledujúcich prísad, aby ste získali špecifické konečné koncentrácie:

| Kryštálová violeť (Sigma) | 5 mg na l |
| --- | --- |
| Polymixin-B-sulfát (Sigma P-1004) | 600 000 U (približne 100 mg) na l |
| Bacitracín (Sigma B-0125) | 1 250 U (približne 25 mg) na l |
| Chloramfenikol (Sigma C-3175) | 5 mg na l |
| Penicilín-G (Sigma P-3032) | 825 U (približne 0,5 mg) na l |
| 2,3,5-trifenyl tetrazolium chlorid (Sigma) | 50 mg na l |

Kryštálová violeť (Sigma)

5 mg na l

Polymixin-B-sulfát (Sigma P-1004)

600 000 U (približne 100 mg) na l

Bacitracín (Sigma B-0125)

1 250 U (približne 25 mg) na l

Chloramfenikol (Sigma C-3175)

5 mg na l

Penicilín-G (Sigma P-3032)

825 U (približne 0,5 mg) na l

2,3,5-trifenyl tetrazolium chlorid (Sigma)

50 mg na l

Poznámka:

| 1. | Používanie reagentov iných ako tie, ktoré sú špecifikované vyššie, môže ovplyvniť rast R. solanacearum. |
| --- | --- |

1.

Používanie reagentov iných ako tie, ktoré sú špecifikované vyššie, môže ovplyvniť rast R. solanacearum.

| 2. | Oxoid Agar #1 sa môže použiť namiesto Bacto-agaru (Difco). V takom prípade sa rast R. solanacearum spomalí, aj keď rast konkurujúcich saprofytov sa môže tiež znížiť. Typické kolónie R. solanacearum sa môžu formovať o 1–2 dni dlhšie a červené sfarbenie môže byť svetlejšie a rozptýlenejšie ako pri Bacto-agare. |
| --- | --- |

2.

Oxoid Agar #1 sa môže použiť namiesto Bacto-agaru (Difco). V takom prípade sa rast R. solanacearum spomalí, aj keď rast konkurujúcich saprofytov sa môže tiež znížiť. Typické kolónie R. solanacearum sa môžu formovať o 1–2 dni dlhšie a červené sfarbenie môže byť svetlejšie a rozptýlenejšie ako pri Bacto-agare.

| 3. | Rastúca koncentrácia bacitracínu až do výšky 2 500 U na l môže znížiť populácie súťažiacich baktérií bez toho, aby sa ovplyvnil rast Ralstonia solanacearum. |
| --- | --- |

3.

Rastúca koncentrácia bacitracínu až do výšky 2 500 U na l môže znížiť populácie súťažiacich baktérií bez toho, aby sa ovplyvnil rast Ralstonia solanacearum.

Médiá uskladnite a roztoky antibiotík uložíme pri teplote 4 °C na tmavom mieste a použite v priebehu 1 mesiaca.

Podložné sklíčka by sa mali pred použitím zbaviť povrchovej kondenzácie.

Vyhnite sa priamemu vysušovaniu podložných sklíčok.

Kontrola kvality by sa mala uskutočniť po príprave každej novej dávky média platničkovaním suspenzie referenčnej kultúry R. solanacearum (pozri dodatok 3) a pozorovaním vytvárania typických kolónií po inkubovaní pri teplote 28 °C na 2 až 5 dní.

c)   Validované obohacovacie médiá

Roztok SMSA (Elphinstone a kol., 1996)

Pripravte ako pre selektívne agarové médium, ale vynechajte Bacto-agar a 2,3,5-tetrazolium chlorid.

Modifikovaný Wilbrinkov roztok (Caruso a kol., 2002)

| Sacharóza | 10g |
| --- | --- |
| Proteózny peptón | 5g |
| K2HPO4 | 0,5g |
| MgSO4 | 0,25g |
| NaNO3 | 0,25g |
| Destilovaná voda | 1 l |

Sacharóza

10g

Proteózny peptón

5g

K2HPO4

0,5g

MgSO4

0,25g

NaNO3

0,25g

Destilovaná voda

1 l

Sterilizujte v autokláve pri teplote 121 °C počas 15 minút a ochlaďte na 50 °C.

Pridajte antibiotické uskladnené roztoky ako pri roztoku SMSA.

Dodatok 3

A.   Komerčne dostupný normalizovaný kontrolný materiál

a)   Bakteriálne izoláty

Nasledujúce bakteriálne izoláty sa odporúčajú na použitie ako štandardný referenčný materiál buď ako pozitívne kontroly (tauľka 1), alebo počas optimalizácie testov, aby nedošlo ku vzájomným reakciám (tabuľka 2). Všetky kmene sú komerčne dostupné v:

| 1. | National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Central Science Laboratory, York, Veľká Británia; |
| --- | --- |

1.

National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Central Science Laboratory, York, Veľká Británia;

| 2. | Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen, Holandsko; |
| --- | --- |

2.

Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen, Holandsko;

| 3. | Collection Française de Bactéries Phytopathogènes (CFBP), INRA Station Phytobactériologie, Angers, Francúzsko. |
| --- | --- |

3.

Collection Française de Bactéries Phytopathogènes (CFBP), INRA Station Phytobactériologie, Angers, Francúzsko.

Tabuľka 1   Referenčný SMT panel izolátov R. solanacearum

| Kód NCPPB | SMT
  # | Ďalšie kódy | Krajina pôvodu | Biovar |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| NCPPB 4153 | 6 | CFBP 4582, Pr 3020, EURS11 | Egypt | 2 |
| NCPPB 4154 | 10 | CFBP 4585, 550, EURS21 | Turecko | 2 |
| NCPPB 3857 | 12 | CFBP 4587, Pr 1140, EURS26 | Anglicko | 2 |
| NCPPB 1584 | 23 | CFBP 4598, EURS49 | Cyprus | 2 |
| NCPPB 2505 | 24 | CFBP 4599, EURS50 | Švédsko | 2 |
| NCPPB 4155 | 26 | CFBP 4601, 502, EURS55 | Belgicko | 2 |
| NCPPB 4156 (3) | 71 (3) | PD 2762, CFBP 3857 | Holandsko | 2 |
| NCPPB 4157 | 66 | LNPV 15.59 | Francúzsko | 2 |
| NCPPB 4158 | 39 | CFBP 4608, Port 448, EURS80, NCPPB 4066 | Portugalsko | 2 |
| NCPPB 4160 | 69 | IVIA-1632-2 | Španielsko | 2 |
| NCPPB 4161 | 76 | B3B | Nemecko | 2 |
| NCPPB 325 | 41 | CFBP 2047, KEL60-1, R842 | USA | 1 |
| NCPPB 3967 | 42 | CFBP 4610, R285, GONg7 | Kostarika | 1 |
| NCPPB 4028 | 43 | CFBP 4611, R303/571, CIP310, SEQ205 | Kolumbia | 2 |
| NCPPB 3985 | 44 | CFBP 4612, R578, CIP312 | Peru | 2T |
| NCPPB 3989 | 45 | CFBP 4613, R568, CIP312 | Brazília | 2T |
| NCPPB 3996 | 46 | CFBP 3928, R276/355, CIP72, SEQ225 | Peru | 3 |
| NCPPB 3997 | 47 | CFBP 4614, R280/363, CIP49, HAY0131a | Austrália | 3 |
| NCPPB 4029 | 48 | CFBP 4615, R297/349, CIP121, CMIb2861 | Srí Lanka | 4 |
| NCPPB 4005 | 49 | CFBP 4616, R470 | Filipíny | 4 |
| NCPPB 4011 | 50 | CFBP 4617, R288, HEmps2 | Čína | 5 |

Kód NCPPB

SMT

#

Ďalšie kódy

Krajina pôvodu

Biovar

NCPPB 4153

6

CFBP 4582, Pr 3020, EURS11

Egypt

2

NCPPB 4154

10

CFBP 4585, 550, EURS21

Turecko

2

NCPPB 3857

12

CFBP 4587, Pr 1140, EURS26

Anglicko

2

NCPPB 1584

23

CFBP 4598, EURS49

Cyprus

2

NCPPB 2505

24

CFBP 4599, EURS50

Švédsko

2

NCPPB 4155

26

CFBP 4601, 502, EURS55

Belgicko

2

NCPPB 4156 (3)

71 (3)

PD 2762, CFBP 3857

Holandsko

2

NCPPB 4157

66

LNPV 15.59

Francúzsko

2

NCPPB 4158

39

CFBP 4608, Port 448, EURS80, NCPPB 4066

Portugalsko

2

NCPPB 4160

69

IVIA-1632-2

Španielsko

2

NCPPB 4161

76

B3B

Nemecko

2

NCPPB 325

41

CFBP 2047, KEL60-1, R842

USA

1

NCPPB 3967

42

CFBP 4610, R285, GONg7

Kostarika

1

NCPPB 4028

43

CFBP 4611, R303/571, CIP310, SEQ205

Kolumbia

2

NCPPB 3985

44

CFBP 4612, R578, CIP312

Peru

2T

NCPPB 3989

45

CFBP 4613, R568, CIP312

Brazília

2T

NCPPB 3996

46

CFBP 3928, R276/355, CIP72, SEQ225

Peru

3

NCPPB 3997

47

CFBP 4614, R280/363, CIP49, HAY0131a

Austrália

3

NCPPB 4029

48

CFBP 4615, R297/349, CIP121, CMIb2861

Srí Lanka

4

NCPPB 4005

49

CFBP 4616, R470

Filipíny

4

NCPPB 4011

50

CFBP 4617, R288, HEmps2

Čína

5

Poznámka: Autenticita vyššie uvedených kmeňov môže byť zaručená len vtedy, ak sú získané z autentickej kultivačnej zbierky.

Tabuľka 2   Referenčný SMT panel serologicky alebo geneticky príbuzných baktérií na použitie pri optimalizácii detekčných testov

| NCPPB Kód | SMT
  # | Ďalší kód | Identifikácia |
| --- | --- | --- | --- |
| NCPPB 4162 | 51 | CFBP 1954 | Bacillus polymyxa
   (4) |
| NCPPB 4163 | 52 | CFBP 1538 | Pseudomonas marginalis pv. marginalis
   (4) |
| NCPPB 4164 | — | CFBP 2227 | Burkholderia cepacia
   (5) |
| NCPPB 4165 | — | CFBP 2459 | Ralstonia pickettii
   (5) |
| NCPPB 4166 | 58 | CFBP 3567
  CSL Pr1150 | Ralstonia pickettii
   (4) |
| NCPPB 4167 | 60 | PCFBP 4618
  D 2778 | Ralstonia sp. (4) |
| NCPPB 1127 | 53 | CFBP 3575 | Burkholderia andropogonis
   (4) |
| NCPPB 353 | 54 | CFBP 3572 | Burkholderia caryophylli
   (4) |
| NCPPB 945 | 55 | CFBP 3569 | Burkholderia cepacia
   (4) |
| NCPPB 3708 | 56 | CFBP 3574 | Burkholderia glumae
   (4) |
| NCPPB 3590 | 57 | CFBP 3573 | Burkholderia plantarii
   (4) |
| NCPPB 3726 | 59 | CFBP 3568 | Banana Blood Disease Bacterium
   (4)
   (5)
   (6) |
| NCPPB 4168 | 61 | CFBP 4619
  IPO S339 | Enterobacter sp. (4) |
| NCPPB 4169 | 62 | IPO 1695 | Enterobacter sp. (4) |
| NCPPB 4170 | 63 | CFBP4621
  IPO S306 | Ochrobactrum anthropi
   (4)
   (5) |
| NCPPB 4171 | 64 | CFBP4622
  IPO 1693 | Curtobacterium sp. (4)
   (5) |
| NCPPB 4172 | 65 | IPO 1696a | Pseudomonas sp. (4) |
| NCPPB 4173 | – | PD 2318 | Aureobacterium sp. (5) |
| NCPPB 4174 | 81 | IVIA 1844.06 | Flavobacterium sp. (4)
   (5) |

NCPPB Kód

SMT

#

Ďalší kód

Identifikácia

NCPPB 4162

51

CFBP 1954

Bacillus polymyxa
   (4)

NCPPB 4163

52

CFBP 1538

Pseudomonas marginalis pv. marginalis
   (4)

NCPPB 4164

—

CFBP 2227

Burkholderia cepacia
   (5)

NCPPB 4165

—

CFBP 2459

Ralstonia pickettii
   (5)

NCPPB 4166

58

CFBP 3567

CSL Pr1150

Ralstonia pickettii
   (4)

NCPPB 4167

60

PCFBP 4618

D 2778

Ralstonia sp. (4)

NCPPB 1127

53

CFBP 3575

Burkholderia andropogonis
   (4)

NCPPB 353

54

CFBP 3572

Burkholderia caryophylli
   (4)

NCPPB 945

55

CFBP 3569

Burkholderia cepacia
   (4)

NCPPB 3708

56

CFBP 3574

Burkholderia glumae
   (4)

NCPPB 3590

57

CFBP 3573

Burkholderia plantarii
   (4)

NCPPB 3726

59

CFBP 3568

Banana Blood Disease Bacterium
   (4)
   (5)
   (6)

NCPPB 4168

61

CFBP 4619

IPO S339

Enterobacter sp. (4)

NCPPB 4169

62

IPO 1695

Enterobacter sp. (4)

NCPPB 4170

63

CFBP4621

IPO S306

Ochrobactrum anthropi
   (4)
   (5)

NCPPB 4171

64

CFBP4622

IPO 1693

Curtobacterium sp. (4)
   (5)

NCPPB 4172

65

IPO 1696a

Pseudomonas sp. (4)

NCPPB 4173

–

PD 2318

Aureobacterium sp. (5)

NCPPB 4174

81

IVIA 1844.06

Flavobacterium sp. (4)
   (5)

b)   Komerčne dostupný normalizovaný kontrolný materiál

Nasledujúci štandardný kontrolný materiál je dostupný zo zbierky kultúr NCPPB.

Zmrazte vysušený pelet zemiakového extraktu z 200 zdravých zemiakových hľúz ako negatívnu kontrolu pre všetky testy.

Zmrazte vysušený pelet zemiakového extraktu z 200 zdravých zemiakových hľúz obsahujúci 103 až 104 a 104 až 106 buniek biovaru 2 R. solanacearum (kmeň NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) ako pozitívne kontroly pre serologický test a test PCR. Keďže životnosť bunky sa počas zmrazovania a vysušovania narúša, nie sú to vhodné štandardné kontroly pre izolačné alebo biologické testy.

Formalín zachycujúce suspenzie biovaru 2 R. solanacearum (kmeň NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) pri 106 bunkách na ml ako pozitívne kontroly pre serologické testy.

B.   Príprava pozitívnych a negatívnych kontrol pre skríningové testy výrezkov PCR/IF a FISH

Vyrobte 48 hodinovú kultúru virulentného kmeňa R. solanacearum rasa 3/biovar 2 (napr. kmeň NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) na základnom médiu SMSA a suspendujte v 10 mM fosfátového pufra, aby ste dosiahli bunkovú hustotu približne 2 × 108 cfu na ml. Toto sa obyčajne dosiahne pomocou slabo zakalenej suspenzie, ktorá je ekvivalentná s optickou hustotou 0,15 pri 600 nm.

Odstráňte kužeľovité výrezky pupkových koncov z 200 hľúz pochádzajúcich z produkcie odrody s bielou šupkou, o ktorej vieme, že neobsahuje R. solanacearum.

Pupkové konce upravte ako obyčajne a pelet resuspendujeme v 10 ml.

Pripravte 10 sterilných 1,5 ml mikroskúmaviek s 900 μl resuspendovaného peletu.

Umiestnite 100 μl suspenzie R. solanacearum do prevej mikroskúmavky. Pretrepte.

Stanovte desiatkové úrovne kontaminácie pomocou ďalšieho riedenia v ďalších piatich mikroskúmavkách.

Šesť kontaminových mikroskúmaviek použite ako pozitívne kontroly. Štyri nekontaminové mikroskúmavky použite ako negatívne kontroly. Mikroskúmavky príslušne označte.

Pripravte alikvotný podiel 100 μl v sterilných mikroskúmavkách s objemom 1,5 ml a získate tak 9 replík každej kontrolnej vzorky. Uskladnite pri teplote –16 až –24 °C až do použitia.

Prítomnosť a kvantifikácia R. solanacearum v kontrolných vzorkách by sa mala najskôr potvrdiť pomocou testu IF.

Pre test PCR uskutočnite extrakciu DNA zo vzoriek pozitívnej a negatívnej kontroly pre každú sériu testovaných vzoriek.

Pre testy IF a FISH uskutočnite skúšky na vzorkách pozitívnej a negatívnej kontroly pre každú sériu testovaných vzoriek.

Pre skúšky IF, FISH a PCR sa R. solanacearum musí identifikovať v najmenej 106 a 104 bunkách/ml pozitívnych kontrol a nesmie byť v žiadnej negatívnej kontrole.

Dodatok 4

Pufre pre testovacie postupy

VŠEOBECNÉ PRAVIDLO: Neotvorené sterilizované pufre sa môžu skladovať až jeden rok.

1.   Pufre pre extrakčný postup

1.1.   Extrakčný pufor (50 mM fosforečnanový pufor, pH 7,0)

Tento pufor sa používa na extrakciu baktérie z rastlinného tkaniva pomocou homogenizácie alebo pretrepaním.

| Na2HPO4 (bezvodný) | 4,26 g |
| --- | --- |
| KH2PO4 | 2,72 g |
| Destilovaná voda | 1,00 l |

Na2HPO4 (bezvodný)

4,26 g

KH2PO4

2,72 g

Destilovaná voda

1,00 l

Rozpustite prísady, skontrolujeme pH a sterilizujte v autokláve pri 121 °C počas 15 min.

Dodatočné zložky môžu byť užitočné nasledujúcim spôsobom:

| | Účel | Množstvo (na l) |
| --- | --- | --- |
| Vločky Lubrol | Antivločkovací prípravok (7) | 0,5 g |
| DC silicone antifoam (protipenový prípravok) | Protipenové činidlo (7) | 1,0 ml |
| Tetrasodium pyrofosfát | Antioxidant | 1,0 g |
| Polyvinylpyrrolidone-40000 (PVP-40) | Viazanie inhibítorov PCR | 50 g |

Účel

Množstvo (na l)

Vločky Lubrol

Antivločkovací prípravok (7)

0,5 g

DC silicone antifoam (protipenový prípravok)

Protipenové činidlo (7)

1,0 ml

Tetrasodium pyrofosfát

Antioxidant

1,0 g

Polyvinylpyrrolidone-40000 (PVP-40)

Viazanie inhibítorov PCR

50 g

1.2.   Peletový pufor (10 mM fosforečnanový pufor, pH 7,2)

Tento pufor sa používa pri resuspenzácii a riedení extraktov pupkových koncov zemiakových hľúz podľa koncentrácie do peletu pomocou odstreďovania.

| Na2HPO4.12H2O | 2,7 g |
| --- | --- |
| NaH2PO4.2H2O | 0,4 g |
| Destilovaná voda | 1,0 l |

Na2HPO4.12H2O

2,7 g

NaH2PO4.2H2O

0,4 g

Destilovaná voda

1,0 l

Rozpustite prísady, skontrolujeme pH a sterilizujte v autokláve pri 121 °C počas 15 min.

2.   Pufre pre test IF

2.1.   Pufor IF (10 mM fosfátového pufrovaného roztoku (STP), pH 7,2)

Tento pufor sa používa na riedenie protilátok

| Na2HPO4.12H2O | 2,7 g |
| --- | --- |
| NaH2PO4.2H2O | 0,4 g |
| NaCL | 8,0 g |
| Destilovaná voda | 1,0 l |

Na2HPO4.12H2O

2,7 g

NaH2PO4.2H2O

0,4 g

NaCL

8,0 g

Destilovaná voda

1,0 l

Rozpustite prísady, skontrolujeme pH a sterilizujte v autokláve pri 121 °C počas 15 min.

2.2.   IF-pufor-tvín

Tento pufor sa používa na umývanie podložných sklíčok.

Pridáme 0,1 % tvín 20 do pufra IF.

2.3.   Glycerín pufrovaný fosfátom, pH 7,6

Tento pufor sa používa ako krycia kvapalina v jamkách podložných sklíčkach IF na podporu fluorescencie.

| Na2HPO4.12H2O | 3,2 g |
| --- | --- |
| NaH2PO4.2H2O | 0,15 g |
| Glycerín | 50 ml |
| Destilovaná voda | 100 ml |

Na2HPO4.12H2O

3,2 g

NaH2PO4.2H2O

0,15 g

Glycerín

50 ml

Destilovaná voda

100 ml

Roztoky krycích kvapalín sú komerčne dostupné napr. vo Vectashield® (Vector Laboratories) alebo Citifluor® (Leica).

3.   Pufre pre nepriamy test ELISA

3.1.   Dvojnásobne silný krycí pufor, pH 9,6.

| Na2CO3 | 6,36 g |
| --- | --- |
| NaHCO3 | 11,72 g |
| Destilovaná voda | 1,00 l |

Na2CO3

6,36 g

NaHCO3

11,72 g

Destilovaná voda

1,00 l

Rozpustite prísady, skontrolujeme pH a sterilizujte v autokláve pri 121 °C počas 15 min.

Siričitan sodný (0,2 %) sa môže pridať ako antioxidant, ak je to potrebné na prevenciu vytvárania oxidovaných aromatických zložiek.

3.2.   10x roztok chloridu sodného pufrovaného fosfátom (PBS), pH 7,4

| NaCL | 80,0 g |
| --- | --- |
| KH2PO4 | 2,0 g |
| Na2HPO4.12H2O | 29,0 g |
| KCl | 2,0 g |
| Destilovaná voda | 1,0 l |

NaCL

80,0 g

KH2PO4

2,0 g

Na2HPO4.12H2O

29,0 g

KCl

2,0 g

Destilovaná voda

1,0 l

3.3.   PBS-tvín

| 10X PBS | 100 ml |
| --- | --- |
| 10 % tvín 20 | 5 ml |
| Destilovaná voda | 895 ml |

10X PBS

100 ml

10 % tvín 20

5 ml

Destilovaná voda

895 ml

3.4.   Blokovací (protilátkový) pufor (musí byť čerstvo pripravený).

| 10X PBS | 10,0 ml |
| --- | --- |
| Polyvinylpyrrolidon-44000 (PVP-44) | 2,0 g |
| 10 % tvín 20 | 0,5 ml |
| Sušené mlieko | 0,5 g |
| Destilovaná voda | doplníme do 100 ml |

10X PBS

10,0 ml

Polyvinylpyrrolidon-44000 (PVP-44)

2,0 g

10 % tvín 20

0,5 ml

Sušené mlieko

0,5 g

Destilovaná voda

doplníme do 100 ml

3.5.   Substrátový roztok alkalickej fosfatázy, pH 9,8

| Dietanolamín | 97 ml |
| --- | --- |
| Destilovaná voda | 800 ml |

Dietanolamín

97 ml

Destilovaná voda

800 ml

Zmiešajte a koncentrovanou HCl ustáľte na pH 9,8.

Doplňte destilovanou vodou na objem 1 litra.

Pridajte 0,2 g MgCl2.

V každých 15 ml roztoku rozpustite dve tablety s hmotnosťou 5mg substrátovej fosfatázy (Sigma).

4.   Pufre pre test DASI ELISA

4.1.   Krycí pufor, pH 9,6

| Na2CO3 | 1,59 g |
| --- | --- |
| NaHCO3 | 2,93 g |
| Destilovaná voda | 1 000 ml |

Na2CO3

1,59 g

NaHCO3

2,93 g

Destilovaná voda

1 000 ml

Rozpustite prísady a skontrolujte pH 9,6.

4.2.   10x fosfátový pufrovaný roztok (STP), pH 7,2 – 7,4

| NaCl | 80,0 g |
| --- | --- |
| NaH2PO4.2 H2O | 4,0 g |
| Na2HPO4.12H2O | 27,0 g |
| Destilovaná voda | 1 000 ml |

NaCl

80,0 g

NaH2PO4.2 H2O

4,0 g

Na2HPO4.12H2O

27,0 g

Destilovaná voda

1 000 ml

4.3.   PBS-tvín

| 10X PBS | 50 ml |
| --- | --- |
| 10 % tvín 20 | 5 ml |
| Destilovaná voda | 950 ml |

10X PBS

50 ml

10 % tvín 20

5 ml

Destilovaná voda

950 ml

4.4.   Pufrový substrát, pH 9,8

| Dietanolamín | 100 ml |
| --- | --- |
| Destilovaná voda | 900 ml |

Dietanolamín

100 ml

Destilovaná voda

900 ml

Zmiešajte a koncentrovanou HCl ustáľte na pH 9,8.

Dodatok 5

Určovanie stupňa kontaminácie pri testoch IF a FISH

| 1. | Vypočítajte priemerný počet typických fluoreskujúcich buniek na zorné pole (c). |
| --- | --- |

1.

Vypočítajte priemerný počet typických fluoreskujúcich buniek na zorné pole (c).

| 2. | Vypočítajte počet typických fluoreskujúcich buniek v poli mikroskopického sklíčka (C).
  C = c × S/s








  kde | S | = | povrchová plocha poľa viacjamkového podložného sklíčka |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| a | s | = | plocha s poľa objektívu: |

2.

Vypočítajte počet typických fluoreskujúcich buniek v poli mikroskopického sklíčka (C).

C = c × S/s

kde

S

=

povrchová plocha poľa viacjamkového podložného sklíčka

a

s

=

plocha s poľa objektívu:

| s = πi2/4G2K2 | kde | i | = | koeficient poľa (v rozsahu 8-24 v závislosti od optického typu) |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| | | K | = | tubusový koeficient (1 alebo 1,25) |
| | | G | = | zväčšenie objektívu (100x, 40x atď.) |

s = πi2/4G2K2

kde

i

=

koeficient poľa (v rozsahu 8-24 v závislosti od optického typu)

K

=

tubusový koeficient (1 alebo 1,25)

G

=

zväčšenie objektívu (100x, 40x atď.)

| 3. | Vypočítajte počet typických fluoreskujúcich buniek na jeden ml resuspendovaného peletu (N).
  N = C × 1 000/y × F








  kde | y | = | množstvo resuspendovaného peletu na každom poli |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| a | F | = | dilučný faktor resuspendovaného peletu |

3.

Vypočítajte počet typických fluoreskujúcich buniek na jeden ml resuspendovaného peletu (N).

N = C × 1 000/y × F

kde

y

=

množstvo resuspendovaného peletu na každom poli

a

F

=

dilučný faktor resuspendovaného peletu

Dodatok 6

Validované PCR protokoly a reagenty

Poznámka: Predbežné testovanie by malo umožniť reprodukvateľné zistenie 103 až 104 buniek R. solanacearum na ml vzorkového extraktu.

Predbežné testovanie by rovnako nemalo ukázať žiadne nesprávne pozitívne výsledky pre panel vybraných bakteriálnych kmeňov (pozri dodatok 3).

1.   Protokol PCR podľa Seala a kol. (1993)

1.1.   Oligonukleotídne primery

| Progresívny primer OLI-1 | 5′-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3′ |
| --- | --- |
| Reverzný primer Y-2 | 5′-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3′ |

Progresívny primer OLI-1

5′-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3′

Reverzný primer Y-2

5′-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3′

Predpokladaná veľkosť amplikónu z matrice DNA R. solanacearum = 288 bp

1.2.   PCR reakčná zmes

| Reagent | Množstvo na reakciu | Konečná koncentrácia |
| --- | --- | --- |
| Sterilné UPW | 17,65 μl | |
| 10X PCR pufor (8) (15 mM MgCl2) | 2,5 μl | 1X (1,5 mM MgCl2) |
| dNTP zmes (20mM) | 0,25 μl | 0,2 mM |
| Primer OLI-1 (20 μM) | 1,25 μl | 1μM |
| Primer OLI-2 (20 μM) | 1,25 μl | 1μM |
| Taq polymeráza (5U/μl) (8) | 0,1 μl | 0,5 U |
| Objem vzorky | 2,0 μl | |
| Celkový objem | 25 μl | |

Reagent

Množstvo na reakciu

Konečná koncentrácia

Sterilné UPW

17,65 μl

10X PCR pufor (8) (15 mM MgCl2)

2,5 μl

1X (1,5 mM MgCl2)

dNTP zmes (20mM)

0,25 μl

0,2 mM

Primer OLI-1 (20 μM)

1,25 μl

1μM

Primer OLI-2 (20 μM)

1,25 μl

1μM

Taq polymeráza (5U/μl) (8)

0,1 μl

0,5 U

Objem vzorky

2,0 μl

Celkový objem

25 μl

1.3.   Reakčné podmienky PCR

Spustite nasledujúci program:

| 1 cyklus: | i) | 2 minúty pri teplote 96 °C (denaturácia matrice DNA), |
| --- | --- | --- |
| 35 cyklov: | ii) | 20 minút pri teplote 94 °C (denaturácia matrice DNA), |
| | iii) | 20 sekúnd pri teplote 68 °C (pripájanie primerov), |
| | iv) | 30 sekúnd pri teplote 72 °C (predlžovanie kópie), |
| 1 cyklus: | v) | 10 minút pri teplote 72 °C (konečné predĺženie), |
| | vi) | držte pri teplote 4 °C. |

1 cyklus:

i)

2 minúty pri teplote 96 °C (denaturácia matrice DNA),

35 cyklov:

ii)

20 minút pri teplote 94 °C (denaturácia matrice DNA),

iii)

20 sekúnd pri teplote 68 °C (pripájanie primerov),

iv)

30 sekúnd pri teplote 72 °C (predlžovanie kópie),

1 cyklus:

v)

10 minút pri teplote 72 °C (konečné predĺženie),

vi)

držte pri teplote 4 °C.

Poznámka: Tento program bol optimalizovaný na použitie s teplotným cyklérom Perkin Elmer 9600. Zmena v trvaní krokov cyklov ii), iii) a iv) sa môže vyžadovať pri použití iných modelov.

1.4.   Analýza enzýmovej reštrikcie amplikónu.

Produkty PCR amplifikované z DNA R. solanacearum tvoria charakteristickú reštrikciu dĺžky polymorfného fragmentu s enzýmom Ava II po inkubácii pri teplote 37 °C.

2.   Protokol PCR podľa Pastrika a Maissa (2000)

2.1.   Oligonukleotídne primery

| Progresívny primer Ps-1 | 5′-agt cga acg gca gcg ggg g-3′ |
| --- | --- |
| Reverzný primer Ps-2 | 5′-ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca-3′ |

Progresívny primer Ps-1

5′-agt cga acg gca gcg ggg g-3′

Reverzný primer Ps-2

5′-ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca-3′

Predpokladaná veľkosť amplikónu z matrice DNA R. solanacearum = 553 bp.

2.2.   Reakčná zmes PCR

| Reagent | Množstvo na reakciu | Konečná koncentrácia |
| --- | --- | --- |
| Sterilné UPW | 16,025 μl | |
| 10X PCR pufor (9) | 2,5 μl | 1X (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (frakcia V) (10 %) | 0,25 μl | 0,1 % |
| d-nTP zmes (20mM) | 0,125 μl | 0,1 mM |
| Primer Ps-1 (10 μM) | 0,5 μl | 0,2 μM |
| Primer Ps-2 (10 μM) | 0,5 μl | 0,2 μM |
| Taq polymeráza (5U/μl) (9) | 0,1 μl | 0,5 U |
| Objem vzorky | 5,0 μl | |
| Celkový objem: | 25,0 μl | |
| Poznámka: Pôvodne optimalizované pre teplotný cyklér MJ Research PTC 200 s Gibco Taq Polymerázou.
  Perkin Elmer AmpliTaq a pufor sa môžu rovnako používať pri rovnakých koncentráciách. |

Reagent

Množstvo na reakciu

Konečná koncentrácia

Sterilné UPW

16,025 μl

10X PCR pufor (9)

2,5 μl

1X (1,5 mM MgCl2)

BSA (frakcia V) (10 %)

0,25 μl

0,1 %

d-nTP zmes (20mM)

0,125 μl

0,1 mM

Primer Ps-1 (10 μM)

0,5 μl

0,2 μM

Primer Ps-2 (10 μM)

0,5 μl

0,2 μM

Taq polymeráza (5U/μl) (9)

0,1 μl

0,5 U

Objem vzorky

5,0 μl

Celkový objem:

25,0 μl

Poznámka: Pôvodne optimalizované pre teplotný cyklér MJ Research PTC 200 s Gibco Taq Polymerázou.

Perkin Elmer AmpliTaq a pufor sa môžu rovnako používať pri rovnakých koncentráciách.

2.3.   Reakčné podmienky PCR

Spustite nasledujúci program:

| 1 cyklus: | i) | 5 minút pri teplote 95 °C (denaturácia matrice DNA), |
| --- | --- | --- |
| 35 cyklov: | ii) | 30 minút pri teplote 95 °C (denaturácia matrice DNA), |
| | iii) | 30 sekúnd pri teplote 68 °C (pripájanie primerov), |
| | iv) | 45 sekúnd pri teplote 72 °C (predlžovanie kópie), |
| 1 cyklus: | v) | 5 minút pri teplote 72 °C (konečné predĺženie), |
| | vi) | držte pri teplote 4 °C. |

1 cyklus:

i)

5 minút pri teplote 95 °C (denaturácia matrice DNA),

35 cyklov:

ii)

30 minút pri teplote 95 °C (denaturácia matrice DNA),

iii)

30 sekúnd pri teplote 68 °C (pripájanie primerov),

iv)

45 sekúnd pri teplote 72 °C (predlžovanie kópie),

1 cyklus:

v)

5 minút pri teplote 72 °C (konečné predĺženie),

vi)

držte pri teplote 4 °C.

Poznámka: Tento program je optimalizovaný na použitie s teplotným cyklérom MJ Research PTC 200. Zmena v trvaní krokov cyklov ii), iii) a iv) sa môže vyžadovať pri použití iných modelov.

2.4.   Analýza enzýmovej reštrikcie amplikónu.

Produkty PCR amplifikované z DNA R. solanacearum tvoria charakteristickú reštrikciu dĺžky polymorfného fragmentu s enzýmom Taq I po inkubácii pri teplote 65 °C počas 30 minút. Obmedzené fragmenty získané z R. solanacearum-špecifického fragmentu majú veľkosť 457 bp a 96 bp.

3.   Viacnásobný protokol PCR s internou kontrolou PCR (Pastrik a kol., 2002)

3.1.   Oligonukleotídne primery

| Progresívny primer RS-1-F | 5′-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3′ |
| --- | --- |
| Reverzný primer RS-1-R | 5′-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3′ |
| Progresívny primer NS-5-F | 5′-AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G-3′ |
| Reverzný primer NS-6-R | 5′-GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC-3′ |

Progresívny primer RS-1-F

5′-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3′

Reverzný primer RS-1-R

5′-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3′

Progresívny primer NS-5-F

5′-AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G-3′

Reverzný primer NS-6-R

5′-GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC-3′

Predpokladaná veľkosť amplikónu z matrice DNA R. solanacearum = 718 bp (RS-primer)

Predpokladaná veľkosť amplikónu z 18S rRNA internej kontroly PCR = 310 bp (NS-primer).

3.2.   Reakčná zmes PCR

| Reagent | Množstvo na reakciu | Konečná koncentrácia |
| --- | --- | --- |
| Sterilné UPW | 12,625 μl | |
| 10X PCR pufor (10) (15 mM MgCl2) | 2,5 μl | 1X (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (frakcia V) (10 %) | 0,25 μl | 0,1 % |
| d-nTP zmes (20 mM) | 0,125 μl | 0,1 mM |
| Primer RS-1-F (10 μM) | 2,0 μl | 0,8 μM |
| Primer RS-1-R (10 μM) | 2,0 μl | 0,8 μM |
| Primer NS-5-F (10 μM) (11) | 0,15 μl | 0,06 μM |
| Primer NS-6-R (10 μM) (11) | 0,15 μl | 0,06 μM |
| Taq polymeráza (5 U/μl) (10) | 0,2 μl | 1,0 U |
| Objem vzorky | 5,0 μl | |
| Celkový objem | 25,0 μl | |

Reagent

Množstvo na reakciu

Konečná koncentrácia

Sterilné UPW

12,625 μl

10X PCR pufor (10) (15 mM MgCl2)

2,5 μl

1X (1,5 mM MgCl2)

BSA (frakcia V) (10 %)

0,25 μl

0,1 %

d-nTP zmes (20 mM)

0,125 μl

0,1 mM

Primer RS-1-F (10 μM)

2,0 μl

0,8 μM

Primer RS-1-R (10 μM)

2,0 μl

0,8 μM

Primer NS-5-F (10 μM) (11)

0,15 μl

0,06 μM

Primer NS-6-R (10 μM) (11)

0,15 μl

0,06 μM

Taq polymeráza (5 U/μl) (10)

0,2 μl

1,0 U

Objem vzorky

5,0 μl

Celkový objem

25,0 μl

3.3.   Reakčné podmienky PCR

Spustite nasledujúci program:

| 1 cyklus: | i) | 5 minút pri teplote 95 °C (denaturácia matrice DNA), |
| --- | --- | --- |
| 35 cyklov: | ii) | 30 minút pri teplote 95 °C (denaturácia matrice DNA), |
| | iii) | 30 sekúnd pri teplote 58 °C (pripájanie primerov), |
| | iv) | 45 sekúnd pri teplote 72 °C (predlžovanie kópie), |
| 1 cyklus: | v) | 5 minút pri teplote 72 °C (konečné predĺženie), |
| | (vi) | držte pri teplote 4 °C. |

1 cyklus:

i)

5 minút pri teplote 95 °C (denaturácia matrice DNA),

35 cyklov:

ii)

30 minút pri teplote 95 °C (denaturácia matrice DNA),

iii)

30 sekúnd pri teplote 58 °C (pripájanie primerov),

iv)

45 sekúnd pri teplote 72 °C (predlžovanie kópie),

1 cyklus:

v)

5 minút pri teplote 72 °C (konečné predĺženie),

(vi)

držte pri teplote 4 °C.

Poznámka: Tento program je optimalizovaný na použitie s teplotným cyklérom MJ Research PTC 200. Zmena v trvaní krokov cyklov ii), iii) a iv) sa môže vyžadovať pri použití iných modelov.

3.4.   Analýza enzýmovej reštrikcie amplikónu.

Produkty PCR amplifikované z DNA R. solanacearum tvoria charakteristickú reštrikciu dĺžky polymorfného fragmentu s enzýmom Bsm I alebo s izoschizomérom (napr. Mva 1269 I) po inkubácii pri teplote 65 °C počas 30 minút.

4.   R. solanacearum biovar – špecifický protokol PCR (Pastrik a kol., 2001)

4.1.   Oligonukleotídne primery

| Progresívny primer Rs-1-F | 5′-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3′ |
| --- | --- |
| Reverzný primer Rs-1-R | 5′-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3′ |
| Reverzný primer Rs-3-R | 5′-TTC ACG GCA AGA TCG CTC-3′ |

Progresívny primer Rs-1-F

5′-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3′

Reverzný primer Rs-1-R

5′-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3′

Reverzný primer Rs-3-R

5′-TTC ACG GCA AGA TCG CTC-3′

Predpokladaná veľkosť amplikónu z matrice DNA R. solanacearum:

s Rs-1-F/Rs-1-R = 718 bp

s Rs-1-F/Rs-3-R = 716 bp

4.2.   Reakčná zmes PCR

| a) | Biovar 1/2 – špecifický PCR







  Reagent | Množstvo na reakciu | Konečná koncentrácia |
| --- | --- | --- | --- |
| Sterilné UPW | 12,925 μl | |
| 10X PCR Buffer (12) | 2,5 μl | 1X (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (frakcia V) (10 %) | 0,25 μl | 0,1 % |
| d-NTP zmes (20 mM) | 0,125 μl | 0,1 mM |
| Primer Rs-1-F (10 μM) | 2 μl | 0,8 μM |
| Primer Rs-1-R (10 μM) | 2 μl | 0,8 μM |
| Taq polymeráza (5 U/μl) (12) | 0,2 μl | 1 U |
| Objem vzorky | 5,0 μl | |
| Celkový objem: | 25,0 μl | |

a)

Biovar 1/2 – špecifický PCR

Reagent

Množstvo na reakciu

Konečná koncentrácia

Sterilné UPW

12,925 μl

10X PCR Buffer (12)

2,5 μl

1X (1,5 mM MgCl2)

BSA (frakcia V) (10 %)

0,25 μl

0,1 %

d-NTP zmes (20 mM)

0,125 μl

0,1 mM

Primer Rs-1-F (10 μM)

2 μl

0,8 μM

Primer Rs-1-R (10 μM)

2 μl

0,8 μM

Taq polymeráza (5 U/μl) (12)

0,2 μl

1 U

Objem vzorky

5,0 μl

Celkový objem:

25,0 μl

| b) | Biovar 3/4/5 – špecifický PCR







  Reagent | Množstvo na reakciu | Konečná koncentrácia |
| --- | --- | --- | --- |
| Sterilné UPW | 14,925 μl | |
| 10X PCR pufor (13) | 2,5 μl | 1X (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (frakcia V) (10 %) | 0,25 μl | 0,1 % |
| dNTP zmes (20mM) | 0,125 μl | 0,1 mM |
| Primer Rs-1-F (10 μM) | 1 μl | 0,4 μM |
| Primer Rs-3-R (10 μM) | 1 μl | 0,4 μM |
| Taq polymeráza (5 U/μl) (13) | 0,2 μl | 1 U |
| Objem vzorky | 5,0 μl | |
| Celkový objem: | 25,0 μl | |

b)

Biovar 3/4/5 – špecifický PCR

Reagent

Množstvo na reakciu

Konečná koncentrácia

Sterilné UPW

14,925 μl

10X PCR pufor (13)

2,5 μl

1X (1,5 mM MgCl2)

BSA (frakcia V) (10 %)

0,25 μl

0,1 %

dNTP zmes (20mM)

0,125 μl

0,1 mM

Primer Rs-1-F (10 μM)

1 μl

0,4 μM

Primer Rs-3-R (10 μM)

1 μl

0,4 μM

Taq polymeráza (5 U/μl) (13)

0,2 μl

1 U

Objem vzorky

5,0 μl

Celkový objem:

25,0 μl

4.3.   Reakčné podmienky PCR

Spustite nasledujúci program pre biovar 1/2- a biovar 3/4/5-špecifické reakcie:

| 1 cyklus: | i) | 5 minút pri teplote 95 °C (denaturácia matrice DNA), |
| --- | --- | --- |
| 35 cyklov: | ii) | 30 minút pri teplote 95 °C (denaturácia matrice DNA), |
| | iii) | 30 sekúnd pri teplote 58 °C (pripájanie primerov), |
| | iv) | 45 sekúnd pri teplote 72 °C (predlžovanie kópie), |
| 1 cyklus: | v) | 5 minút pri teplote 72 °C (konečné predĺženie), |
| | vi) | držte pri teplote 4 °C. |

1 cyklus:

i)

5 minút pri teplote 95 °C (denaturácia matrice DNA),

35 cyklov:

ii)

30 minút pri teplote 95 °C (denaturácia matrice DNA),

iii)

30 sekúnd pri teplote 58 °C (pripájanie primerov),

iv)

45 sekúnd pri teplote 72 °C (predlžovanie kópie),

1 cyklus:

v)

5 minút pri teplote 72 °C (konečné predĺženie),

vi)

držte pri teplote 4 °C.

Poznámka: Tento program bol optimalizovaný na použitie s teplotným cyklérom MJ Research PTC 200. Zmena v trvaní krokov cyklov (ii), (iii) a (iv) sa môže vyžadovať pri použití iných modelov.

4.4.   Analýza enzýmovej reštrikcie amplikónu.

Produkty PCR amplifikované z DNA R. solanacearum pomocou primerov Rs-1-F a Rs-1-R tvoria charakteristickú reštrikciu dĺžky polymorfného fragmentu s enzýmom Bsm I alebo izoschizomérom (napr. Mva 1269 I) po inkubácii pri teplote 65 °C počas 30 minút. Produkty PCR amplifikované z DNA R. solanacearum pomocou primerov Rs-1-F a Rs-3-R netvoria reštrikciu.

5.   Príprava nanášacieho pufra

5.1.   Bromfenolová modrá (10 % zásobný roztok)

| Bromfenolová modrá | 5 g |
| --- | --- |
| Destilovaná voda (bidest) | 50 ml |

Bromfenolová modrá

5 g

Destilovaná voda (bidest)

50 ml

5.2.   Nanášací pufor

| Glycerín (86 %) | 3,5 ml |
| --- | --- |
| Bromfenolová modrá (5,1) | 300 μl |
| Destilovaná voda (bidest) | 6,2 ml |

Glycerín (86 %)

3,5 ml

Bromfenolová modrá (5,1)

300 μl

Destilovaná voda (bidest)

6,2 ml

6.   10X Tris acetát EDTA (TAE) pufor, pH 8,0

| Tris pufor | 48,40 g |
| --- | --- |
| Glaciálna kyselina octová | 11,42 ml |
| EDTA (disodná soľ) | 3,72 g |
| Destilovaná voda | 1,00 l |

Tris pufor

48,40 g

Glaciálna kyselina octová

11,42 ml

EDTA (disodná soľ)

3,72 g

Destilovaná voda

1,00 l

Zriedime na 1X pred použitím.

Tiež komerčne dostupný (napr. invitrogén alebo ekvivalent).

Dodatok 7

Validované reagenty pre FISH test

1.   Oligopróby

R. solanacearum – špecifická próbaOLI-1-CY3 5′- ggc agg tag caa gct acc ccc-3′

Nešpecifická eubakteriálna próba EUB-338-FITC 5′- gct gcc tcc cgt agg agt -3′

2.   Fixatívny roztok

[UPOZORNENIE! FIXATÍVUM OBSAHUJE PARAFORMALDEHYD, KTORÝ JE TOXICKÝ. NASAĎTE SI RUKAVICE A NEVDYCHUJTE. ODPORÚČAME PRACOVAŤ V DIGESTORE.]

| i) | Zahrejte 9 ml vody molekulárneho gradientu (napr. ultra čistá voda – UČV) na teplotu asi 60 °C a pridáme 0,4 g paraformaldehydu. Paraformaldehyd sa rozpúšťa po pridaní 5 kvapiek 1N NaOH a miešaním s magnetickým miešadlom. |
| --- | --- |

i)

Zahrejte 9 ml vody molekulárneho gradientu (napr. ultra čistá voda – UČV) na teplotu asi 60 °C a pridáme 0,4 g paraformaldehydu. Paraformaldehyd sa rozpúšťa po pridaní 5 kvapiek 1N NaOH a miešaním s magnetickým miešadlom.

| ii) | Upravte pH na 7,0 pridaním 1 ml 0,1M fosforečnanového pufru (PB; pH 7,0) a 5 kvapiek 1N HCl. Skontrolujte pH pomocou indikačných pásikov a podľa potreby upravte pomocou HCl alebo NaOH. [UPOZORNENIE! NEPOUŽÍVAJTE PH METER V ROZTOKOCH S PARAFORMALDEHYDOM.] |
| --- | --- |

ii)

Upravte pH na 7,0 pridaním 1 ml 0,1M fosforečnanového pufru (PB; pH 7,0) a 5 kvapiek 1N HCl. Skontrolujte pH pomocou indikačných pásikov a podľa potreby upravte pomocou HCl alebo NaOH. [UPOZORNENIE! NEPOUŽÍVAJTE PH METER V ROZTOKOCH S PARAFORMALDEHYDOM.]

| iii) | Roztok prefiltrujte cez 0,22 μm membránový filter, zamedzte prístupu prachu a uložte pri teplote 4 °C na ďalšie použitie. |
| --- | --- |

iii)

Roztok prefiltrujte cez 0,22 μm membránový filter, zamedzte prístupu prachu a uložte pri teplote 4 °C na ďalšie použitie.

3.   3X Hybmix

| NaCl | 2,7 M |
| --- | --- |
| Tris-HCl | 60 mM (pH 7,4) |
| EDTA (sterilizované cez filter a v autokláve) | 15 mM |

NaCl

2,7 M

Tris-HCl

60 mM (pH 7,4)

EDTA (sterilizované cez filter a v autokláve)

15 mM

Zrieďte na 1X ako sa vyžaduje.

4.   Hybridizačný roztok

| 1X Hybmix | |
| --- | --- |
| Sódium dodecyl sulfát (SDS) | 0,01 % |
| Formamid | 30 %, |
| próba EUB 338 | 5 ng/μl |
| próba OLI-1 alebo OLI-2 | 5 ng/μl |

1X Hybmix

Sódium dodecyl sulfát (SDS)

0,01 %

Formamid

30 %,

próba EUB 338

5 ng/μl

próba OLI-1 alebo OLI-2

5 ng/μl

Pripravte množstvá hybridizačného roztoku na základe výpočtov v tabuľke 1. Pre každé podložné sklíčko (obsahujúce 2 rôzne vzorky dvojmo) treba 90 μl hybridizačného roztoku. DÔLEŽITÉ: FORMAMID JE LEĽMI TOXICKÝ, PRETO SI NASAĎTE RUKAVICE A UROBTE VŠETKY POTREBNÉ PREVENTÍVNE OPATRENIA!

Tabuľka.   Navrhované množstvá na prípravu hybridizačnej zmesi.

| Počet podložných sklíčiek: | 1 | 4 | 6 | 8 | 10 |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Sterilné UPW | 23,1 | 92,4 | 138,6 | 184,8 | 231,0 |
| 3x hybmix | 30,0 | 120,0 | 180,0 | 240,0 | 300,0 |
| 1 % SDS | 0,9 | 3,6 | 5,4 | 7,2 | 9,0 |
| Formamid | 27,0 | 108,0 | 162,0 | 216,0 | 270,0 |
| Próba EUB 338 (100 ng/μl) | 4,5 | 18,0 | 27,0 | 36,0 | 45,0 |
| Probe OLI-1 alebo OLI-2 (100 ng/μl) | 4,5 | 18,0 | 27,0 | 36,0 | 45,0 |
| Celkový objem (μl) | 90,0 | 360,0 | 540,0 | 720,0 | 900,0 |
| Poznámka: Všetky roztoky, ktoré obsahujú ľahké citlivé oligopróby, uložte na tmavom mieste pri teplote –20 °C.
  Počas používania ich chráňte ich pred priamym slnečným svetlom a elektrickým svetlom. |

Počet podložných sklíčiek:

1

4

6

8

10

Sterilné UPW

23,1

92,4

138,6

184,8

231,0

3x hybmix

30,0

120,0

180,0

240,0

300,0

1 % SDS

0,9

3,6

5,4

7,2

9,0

Formamid

27,0

108,0

162,0

216,0

270,0

Próba EUB 338 (100 ng/μl)

4,5

18,0

27,0

36,0

45,0

Probe OLI-1 alebo OLI-2 (100 ng/μl)

4,5

18,0

27,0

36,0

45,0

Celkový objem (μl)

90,0

360,0

540,0

720,0

900,0

Poznámka: Všetky roztoky, ktoré obsahujú ľahké citlivé oligopróby, uložte na tmavom mieste pri teplote –20 °C.

Počas používania ich chráňte ich pred priamym slnečným svetlom a elektrickým svetlom.

5.   0,1M fosforečnanový pufor, pH 7,0

| Na2HPO4 | 8,52 g |
| --- | --- |
| KH2PO4 | 5,44 g |
| Destilovaná voda | 1,00 l |

Na2HPO4

8,52 g

KH2PO4

5,44 g

Destilovaná voda

1,00 l

Rozpustite prísady, skontrolujte pH a sterilizujte v autokláve pri 121 °C počas 15 min.

Dodatok 8

Pestovanie baklažánu a rajčiaka

Semienka rajčiaka (Lycopersicon esculentum) alebo baklažánu (Solanum melongena) zasejte do pasterizovaného sadbového kompostu. Semenáče s plne vyvinutými klíčnymi listami (10 až 14 dní staré) presaďte do kvetináčov s pasterizovaným kompostom.

Baklažány by sa mali pestovať v skleníkoch pri zachovaní nasledujúcich klimatických podmienok pred naočkovaním:

| Dĺžka dňa | 14 hodín alebo prirodzená dĺžka dňa, ak je väčšia, |
| --- | --- |
| Teplota | deň 21 až 24 °C,
  noc 14 až 18 °C, |
| Vnímavé odrody rajčiaka | ‚Moneymaker’ |
| Vnímavé odrody baklažánu | ‚Black Beauty’ |
| Dodávatelia | pozri internetovú stránku http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main. |

Dĺžka dňa

14 hodín alebo prirodzená dĺžka dňa, ak je väčšia,

Teplota

deň 21 až 24 °C,

noc 14 až 18 °C,

Vnímavé odrody rajčiaka

‚Moneymaker’

Vnímavé odrody baklažánu

‚Black Beauty’

Dodávatelia

pozri internetovú stránku http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

BIBLIOGRAFIA

| 1. | Amann, R.I., L. Krumholz and D.A. Stahl. 1990. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology. J. Bacteriol. 172: 762-770. |
| --- | --- |

1.

Amann, R.I., L. Krumholz and D.A. Stahl. 1990. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology. J. Bacteriol. 172: 762-770.

| 2. | Anon. 1998. Council Directive 98/57/EC of 20 July 1998 on the control of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Official Journal of the European Communities L235, 1-39. |
| --- | --- |

2.

Anon. 1998. Council Directive 98/57/EC of 20 July 1998 on the control of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Official Journal of the European Communities L235, 1-39.

| 3. | Boudazin, G., A.C. Le Roux, K. Josi, P. Labarre and B. Jouan. 1999. Design of division specific primers of Ralstonia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology 105; 373-380. |
| --- | --- |

3.

Boudazin, G., A.C. Le Roux, K. Josi, P. Labarre and B. Jouan. 1999. Design of division specific primers of Ralstonia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology 105; 373-380.

| 4. | Caruso, P., Gorris, M.T., Cambra, M., Palomo, J.L., Collar, J and Lopez, M.M. 2002. Enrichment Double-Antibody Sandwich Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal Antibody for sensitive Detection of Ralstonia solanacearum in Asymptomatic Potato Tubers. Applied and Environmental Microbiology, 68, 3634-3638. |
| --- | --- |

4.

Caruso, P., Gorris, M.T., Cambra, M., Palomo, J.L., Collar, J and Lopez, M.M. 2002. Enrichment Double-Antibody Sandwich Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal Antibody for sensitive Detection of Ralstonia solanacearum in Asymptomatic Potato Tubers. Applied and Environmental Microbiology, 68, 3634-3638.

| 5. | Cook, D., Barlow, E. and Sequeira, L. 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphisms with DNA probes that specify virulence and the hypersensitive response. Molecular Plant-Microbe Interactions 1:113-121. |
| --- | --- |

5.

Cook, D., Barlow, E. and Sequeira, L. 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphisms with DNA probes that specify virulence and the hypersensitive response. Molecular Plant-Microbe Interactions 1:113-121.

| 6. | Elphinstone, J.G., Hennessy, J., Wilson, J.K. and Stead, D.E. 1996. Sensitivity of detection of Ralstonia solanacearum in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26; 663-678. |
| --- | --- |

6.

Elphinstone, J.G., Hennessy, J., Wilson, J.K. and Stead, D.E. 1996. Sensitivity of detection of Ralstonia solanacearum in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26; 663-678.

| 7. | Englebrecht, M.C. (1994) Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. In: A.C. Hayward (ed.) Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Australian Centre for International Agricultural Research, Canberra, Australia. |
| --- | --- |

7.

Englebrecht, M.C. (1994) Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. In: A.C. Hayward (ed.) Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Australian Centre for International Agricultural Research, Canberra, Australia.

| 8. | Hayward, A.C. 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27; 265-277. |
| --- | --- |

8.

Hayward, A.C. 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27; 265-277.

| 9. | Hayward, A.C., El-Nashaar, H.M., Nydegger, U. and De Lindo, L. 1990. Variation in nitrate metabolism in biovars of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 69; 269-280. |
| --- | --- |

9.

Hayward, A.C., El-Nashaar, H.M., Nydegger, U. and De Lindo, L. 1990. Variation in nitrate metabolism in biovars of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 69; 269-280.

| 10. | Ito, S., Y. Ushijima, T. Fujii, S. Tanaka, M. Kameya-Iwaki, S. Yoshiwara and F. Kishi. 1998. Detection of viable cells of Ralstonia solanacearum in soil using a semi-selective medium and a PCR technique. J. Phytopathology 146; 379-384. |
| --- | --- |

10.

Ito, S., Y. Ushijima, T. Fujii, S. Tanaka, M. Kameya-Iwaki, S. Yoshiwara and F. Kishi. 1998. Detection of viable cells of Ralstonia solanacearum in soil using a semi-selective medium and a PCR technique. J. Phytopathology 146; 379-384.

| 11. | Janse, J.D. (1988) A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 18, 343-351. |
| --- | --- |

11.

Janse, J.D. (1988) A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 18, 343-351.

| 12. | Janse, J.D. 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacaerum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335-345. |
| --- | --- |

12.

Janse, J.D. 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacaerum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335-345.

| 13. | Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity of Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 44; 693-695. |
| --- | --- |

13.

Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity of Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 44; 693-695.

| 14. | Klement Z.; Rudolph, K and D.C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp. |
| --- | --- |

14.

Klement Z.; Rudolph, K and D.C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp.

| 15. | Lelliott, R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd., Oxford. 216 pp. |
| --- | --- |

15.

Lelliott, R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd., Oxford. 216 pp.

| 16. | Lopez, M.M., Gorris, M.T., Llop, P., Cubero, J., Vicedo, B., Cambra, M., 1997. Selective enrichment improves selective isolation, serological and molecular detection of plant pathogenic bacteria. In: H.W. Dehne et al., (eds). Klewer Academic Publishers. pp. 117-121. |
| --- | --- |

16.

Lopez, M.M., Gorris, M.T., Llop, P., Cubero, J., Vicedo, B., Cambra, M., 1997. Selective enrichment improves selective isolation, serological and molecular detection of plant pathogenic bacteria. In: H.W. Dehne et al., (eds). Klewer Academic Publishers. pp. 117-121.

| 17. | Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1994. Specific genomic fingerprints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR. Applied and Environmental Microbiology, 60, 2286-2295. |
| --- | --- |

17.

Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1994. Specific genomic fingerprints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR. Applied and Environmental Microbiology, 60, 2286-2295.

| 18. | Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J. 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85; 528-536. |
| --- | --- |

18.

Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J. 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85; 528-536.

| 19. | Opina, N., F. Tavner, G. Holloway, J.-F Wang, T.-H Li, R. Maghirang, M. Fegan, A.C. Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W. Holloway, J.N. Timmis. 1997. A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 5; 19-33. |
| --- | --- |

19.

Opina, N., F. Tavner, G. Holloway, J.-F Wang, T.-H Li, R. Maghirang, M. Fegan, A.C. Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W. Holloway, J.N. Timmis. 1997. A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 5; 19-33.

| 20. | Pastrik, K.H. and Maiss, E. 2000. Detection of R. solanacearum in potato tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148; 619-626. |
| --- | --- |

20.

Pastrik, K.H. and Maiss, E. 2000. Detection of R. solanacearum in potato tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148; 619-626.

| 21. | Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831-842. |
| --- | --- |

21.

Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831-842.

| 22. | Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D. (1995) Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79. |
| --- | --- |

22.

Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D. (1995) Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79.

| 23. | Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. – 3. ed.; St. Paul, Minnesota: 373 pp. |
| --- | --- |

23.

Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. – 3. ed.; St. Paul, Minnesota: 373 pp.

| 24. | Seal, S.E., L.A. Jackson, J.P.W. Young, and M.J. Daniels. 1993. Detection of Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii and Blood Disease Bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. J. Gen. Microbiol. 139: 1587-1594. |
| --- | --- |

24.

Seal, S.E., L.A. Jackson, J.P.W. Young, and M.J. Daniels. 1993. Detection of Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii and Blood Disease Bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. J. Gen. Microbiol. 139: 1587-1594.

| 25. | Smith, J.J., Offord, L.C., Holderness, M. and Saddler, G.S. 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61; 4262-4268. |
| --- | --- |

25.

Smith, J.J., Offord, L.C., Holderness, M. and Saddler, G.S. 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61; 4262-4268.

| 26. | Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281-295. |
| --- | --- |

26.

Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281-295.

| 27. | Taghavi, M., Hayward, A.C., Sly, L.I., Fegan, M. 1996. Analysiss of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46; 10-15. |
| --- | --- |

27.

Taghavi, M., Hayward, A.C., Sly, L.I., Fegan, M. 1996. Analysiss of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46; 10-15.

| 28. | Van Der Wolf, J.M., Bonants, P.J.M., Smith, J.J., Hagenaar, M., Nijhuis, E., Van Beckhoven, J.R.C., Saddler, G.S., Trigalet, A., Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 in Western Europe as determined by AFLP, RC-PFGE and rep-PCR. In: Prior, P., Allen, C. and Elphinstone, J. (eds.) Bacterial wilt disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 44-49. |
| --- | --- |

28.

Van Der Wolf, J.M., Bonants, P.J.M., Smith, J.J., Hagenaar, M., Nijhuis, E., Van Beckhoven, J.R.C., Saddler, G.S., Trigalet, A., Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 in Western Europe as determined by AFLP, RC-PFGE and rep-PCR. In: Prior, P., Allen, C. and Elphinstone, J. (eds.) Bacterial wilt disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 44-49.

| 29. | Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., Stead, D.E. and Boonham, N. 1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an automated and quantitative flourogenic 5’ nuclease TaqMan assay. Applied and Environmental Microbiology 66; 2853-2858. |
| --- | --- |

29.

Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., Stead, D.E. and Boonham, N. 1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an automated and quantitative flourogenic 5’ nuclease TaqMan assay. Applied and Environmental Microbiology 66; 2853-2858.

| 30. | Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A.D.L. Akkermans. 1998. Detection of R. solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4546-4554. |
| --- | --- |

30.

Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A.D.L. Akkermans. 1998. Detection of R. solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4546-4554.

PRÍLOHA III

| 1. | Pri každom podozrení na výskyt, pri ktorom priniesli pozitívne výsledky skríningové testy vykonané, pre uvedený rastlinný materiál a pri všetkých ďalších prípadoch, podľa príslušných postupov uvedených v prílohe II a úradne schválenej metódy pred ukončením uvedenej metódy a na potvrdenie alebo vyvrátenie výskytu sa do dokončenia tejto metódy zadržia a zachovajú:






  — | všetky hľuzy zemiakov a v prípade možnosti všetky testované rastliny, |
| --- | --- | --- |

1.

Pri každom podozrení na výskyt, pri ktorom priniesli pozitívne výsledky skríningové testy vykonané, pre uvedený rastlinný materiál a pri všetkých ďalších prípadoch, podľa príslušných postupov uvedených v prílohe II a úradne schválenej metódy pred ukončením uvedenej metódy a na potvrdenie alebo vyvrátenie výskytu sa do dokončenia tejto metódy zadržia a zachovajú:

—

všetky hľuzy zemiakov a v prípade možnosti všetky testované rastliny,

| — | všetky zostávajúce extrakty a dodatočný pripravený materiál pre skríningový(-é) test(-y) napr. imunofluorescenčné podložné sklíčka,
  a |
| --- | --- |

—

všetky zostávajúce extrakty a dodatočný pripravený materiál pre skríningový(-é) test(-y) napr. imunofluorescenčné podložné sklíčka,

a

| — | každá príslušná dokumentácia, až do ukončenia spomínaných metód. |
| --- | --- |

—

každá príslušná dokumentácia, až do ukončenia spomínaných metód.

Zadržanie zemiakových hľúz umožní v potrebných prípadoch uskutočniť rôzne testy.

| 2. | V prípade pozitívneho potvrdenia tohto organizmu by sa mali zadržať alebo primeraným spôsobom zachovať počas minimálne jeného mesiaca po oznámení postupu podľa článku 5 ods. 2:






  — | materiály uvedené v odseku 1, |
| --- | --- | --- |

2.

V prípade pozitívneho potvrdenia tohto organizmu by sa mali zadržať alebo primeraným spôsobom zachovať počas minimálne jeného mesiaca po oznámení postupu podľa článku 5 ods. 2:

—

materiály uvedené v odseku 1,

| — | vzorka infikovaného materiálu z rajčiaka alebo baklažánu, ktorý bol naočkovaný extraktom z hľúz alebo extraktom rastlín, v potrebných prípadoch,
  a |
| --- | --- |

—

vzorka infikovaného materiálu z rajčiaka alebo baklažánu, ktorý bol naočkovaný extraktom z hľúz alebo extraktom rastlín, v potrebných prípadoch,

a

| — | izolovaná kultúra organizmu. |
| --- | --- |

—

izolovaná kultúra organizmu.

PRÍLOHA IV

Prvky vo vyšetrovaní uvedené v článku 5 ods. 1 písm. a) bodu i) budú podľa príslušných prípadov zahŕňať:

| i) | miesta produkcie,






  — | kde sa pestujú, alebo sa pestovali zemiaky, ktoré sú klonovo príbuzné so zemiakmi, pri ktorých sa dokázalo napadnutie škodlivým organizmom, |
| --- | --- | --- |

i)

miesta produkcie,

—

kde sa pestujú, alebo sa pestovali zemiaky, ktoré sú klonovo príbuzné so zemiakmi, pri ktorých sa dokázalo napadnutie škodlivým organizmom,

| — | kde sa pestujú, alebo sa pestovali rajčiaky pochádzajúce z rovnakého zdroja ako rajčiaky, pri ktorých bolo dokázané napadnutie škodlivým organizmom, |
| --- | --- |

—

kde sa pestujú, alebo sa pestovali rajčiaky pochádzajúce z rovnakého zdroja ako rajčiaky, pri ktorých bolo dokázané napadnutie škodlivým organizmom,

| — | kde sa pestujú alebo sa pestovali rajčiaky alebo zemiaky, ktoré boli z dôvodu podozrenia na výskyt škodlivého organizmu podrobené úradnému dohľadu, |
| --- | --- |

—

kde sa pestujú alebo sa pestovali rajčiaky alebo zemiaky, ktoré boli z dôvodu podozrenia na výskyt škodlivého organizmu podrobené úradnému dohľadu,

| — | kde sa pestujú alebo sa pestovali zemiaky, ktoré sú klonovo príbuzné so zemiakmi, ktoré boli pestované na miestach produkcie, pri ktorých bolo zistené zamorenie škodlivým organizmom, |
| --- | --- |

—

kde sa pestujú alebo sa pestovali zemiaky, ktoré sú klonovo príbuzné so zemiakmi, ktoré boli pestované na miestach produkcie, pri ktorých bolo zistené zamorenie škodlivým organizmom,

| — | kde sa pestujú alebo sa pestovali rajčiaky alebo zemiaky a miesta produkcie, ktoré ležia v susedstve zamorených miest produkcie vrátane tých, kde boli priamo alebo prostredníctvom spoločného zmluvného partnera zdieľané poľnohospodárske stroje alebo zariadenia, |
| --- | --- |

—

kde sa pestujú alebo sa pestovali rajčiaky alebo zemiaky a miesta produkcie, ktoré ležia v susedstve zamorených miest produkcie vrátane tých, kde boli priamo alebo prostredníctvom spoločného zmluvného partnera zdieľané poľnohospodárske stroje alebo zariadenia,

| — | na ktorých bola na zavlažovanie alebo postrekovanie používaná povrchová voda zo zdrojov, pri ktorých bola dokázaná kontaminácia škodlivým organizmom alebo pri ktorých existuje podozrenie na kontamináciu škodlivým organizmom, |
| --- | --- |

—

na ktorých bola na zavlažovanie alebo postrekovanie používaná povrchová voda zo zdrojov, pri ktorých bola dokázaná kontaminácia škodlivým organizmom alebo pri ktorých existuje podozrenie na kontamináciu škodlivým organizmom,

| — | na ktorých bola na zavlažovanie alebo postrekovanie používaná povrchová voda zo zdrojov používaných aj miestami produkcie, pri ktorých bolo dokázané zamorenie škodlivým organizmom, alebo pri ktorých existuje podozrenie na zamorenie škodlivým organizmom, |
| --- | --- |

—

na ktorých bola na zavlažovanie alebo postrekovanie používaná povrchová voda zo zdrojov používaných aj miestami produkcie, pri ktorých bolo dokázané zamorenie škodlivým organizmom, alebo pri ktorých existuje podozrenie na zamorenie škodlivým organizmom,

| — | ktoré sú zaplavené alebo boli zaplavené povrchovými vodami, pri ktorých sa potvrdilo, že sú kontaminované škodlivým organizmom, alebo pri ktorých existuje podozrenie na kontamináciu škodlivým organizmom |
| --- | --- |

—

ktoré sú zaplavené alebo boli zaplavené povrchovými vodami, pri ktorých sa potvrdilo, že sú kontaminované škodlivým organizmom, alebo pri ktorých existuje podozrenie na kontamináciu škodlivým organizmom

a

| ii) | povrchovú vodu používanú na zavlažovanie alebo postrek poľa/polí a miesta/miest produkcie, pri ktorých sa dokázalo zamorenie škodlivým organizmom, alebo ktorá tieto polia a miesta produkcie zaplavila. |
| --- | --- |

ii)

povrchovú vodu používanú na zavlažovanie alebo postrek poľa/polí a miesta/miest produkcie, pri ktorých sa dokázalo zamorenie škodlivým organizmom, alebo ktorá tieto polia a miesta produkcie zaplavila.

PRÍLOHA V

| 1. | Pri stanovení pravdepodobného rozsahu kontaminácie podľa článku 5 ods. 1 písm. a) bodu iii) a článku 5 ods.1 písm. c) bodu iii) by sa mali zvážiť nasledujúce prvky:






  — | rastlinný materiál pestovaný na mieste produkcie, ktoré bolo v zmysle článku 5 ods.1 písm. a) bodu ii)označené za kontaminované, |
| --- | --- | --- |

1.

Pri stanovení pravdepodobného rozsahu kontaminácie podľa článku 5 ods. 1 písm. a) bodu iii) a článku 5 ods.1 písm. c) bodu iii) by sa mali zvážiť nasledujúce prvky:

—

rastlinný materiál pestovaný na mieste produkcie, ktoré bolo v zmysle článku 5 ods.1 písm. a) bodu ii)označené za kontaminované,

| — | miesta produkcie výrobným spôsobom spojené s hľuzami alebo rastlinami označenými v zmysle článku 5 ods. 1 písm. a) bodu ii) za kontaminované vrátane tých, ktoré s nimi užívajú spoločnú mechanizáciu alebo výrobné zariadenia, a to buď priamo, alebo prostredníctvom spoločného dodávateľa, |
| --- | --- |

—

miesta produkcie výrobným spôsobom spojené s hľuzami alebo rastlinami označenými v zmysle článku 5 ods. 1 písm. a) bodu ii) za kontaminované vrátane tých, ktoré s nimi užívajú spoločnú mechanizáciu alebo výrobné zariadenia, a to buď priamo, alebo prostredníctvom spoločného dodávateľa,

| — | rastlinný materiál vypestovaný v miestach produkcie, ktoré sa uvádzajú v predchádzajúcej zarážke, alebo ktoré sa nachádzajú na takýchto miestach produkcie v období, keď sa v budovách alebo na mieste produkcie nachádzali hľuzy alebo rastliny uvedené v prvej zarážke označené v zmysle článku 5 ods. 1 písm. a) bodu ii) za kontaminované, |
| --- | --- |

—

rastlinný materiál vypestovaný v miestach produkcie, ktoré sa uvádzajú v predchádzajúcej zarážke, alebo ktoré sa nachádzajú na takýchto miestach produkcie v období, keď sa v budovách alebo na mieste produkcie nachádzali hľuzy alebo rastliny uvedené v prvej zarážke označené v zmysle článku 5 ods. 1 písm. a) bodu ii) za kontaminované,

| — | priestory, v ktorých sa manipulovalo s uvedeným rastlinným materiálom z miest produkcie uvedených v predchádzajúcich zarážkach, |
| --- | --- |

—

priestory, v ktorých sa manipulovalo s uvedeným rastlinným materiálom z miest produkcie uvedených v predchádzajúcich zarážkach,

| — | všetky strojové zariadenia, vozidlá, lode, skladovacie priestory alebo ich časti a akékoľvek iné predmety vrátane obalového materiálu, ktoré mohli prísť do styku s uvedeným rastlinným materiálom, ktorý bol podľa článku 5 ods. 1 písm. a) bodu ii) označený za kontaminovaný, |
| --- | --- |

—

všetky strojové zariadenia, vozidlá, lode, skladovacie priestory alebo ich časti a akékoľvek iné predmety vrátane obalového materiálu, ktoré mohli prísť do styku s uvedeným rastlinným materiálom, ktorý bol podľa článku 5 ods. 1 písm. a) bodu ii) označený za kontaminovaný,

| — | akýkoľvek rastlinný materiál, ktorý bol v styku so zariadeniami alebo objektmi uvedenými v predchádzajúcej zarážke, alebo v nich bol uskladnený pred ich dezinfekciou alebo vyčistením, |
| --- | --- |

—

akýkoľvek rastlinný materiál, ktorý bol v styku so zariadeniami alebo objektmi uvedenými v predchádzajúcej zarážke, alebo v nich bol uskladnený pred ich dezinfekciou alebo vyčistením,

| — | v dôsledku vyšetrovania a testov podľa článku 5 ods.1 písm. a) bodu i) v prípade zemiakov, tie hľuzy alebo rastliny, ktoré majú súrodenecký alebo rodičovský klonový vzťah k uvedenému rastlinnému materiálu, ktorý bol podľa článku 5 ods. 1 písm. a) bodu ii) označený za kontaminovaný, a v prípade rajčiakov tie rastliny, ktoré pochádzajú z rovnakého osiva ako daný uvedený rastlinný materiál a pri ktorých sa i v prípade negatívneho výsledku skúmania prítomnosti patogénu na základe klonovej príbuznosti kontaminácia zdá byť pravdepodobnou; Testovanie odrôd sa môže uskutočniť, aby sa overila identita kontaminovaných a klonovo príbuzných hľúz alebo rastlín, |
| --- | --- |

—

v dôsledku vyšetrovania a testov podľa článku 5 ods.1 písm. a) bodu i) v prípade zemiakov, tie hľuzy alebo rastliny, ktoré majú súrodenecký alebo rodičovský klonový vzťah k uvedenému rastlinnému materiálu, ktorý bol podľa článku 5 ods. 1 písm. a) bodu ii) označený za kontaminovaný, a v prípade rajčiakov tie rastliny, ktoré pochádzajú z rovnakého osiva ako daný uvedený rastlinný materiál a pri ktorých sa i v prípade negatívneho výsledku skúmania prítomnosti patogénu na základe klonovej príbuznosti kontaminácia zdá byť pravdepodobnou; Testovanie odrôd sa môže uskutočniť, aby sa overila identita kontaminovaných a klonovo príbuzných hľúz alebo rastlín,

| — | miesto(-a) produkcie uvedeného rastlinného materiálu, ktorý sa spomína v predchádzajúcej zarážke, |
| --- | --- |

—

miesto(-a) produkcie uvedeného rastlinného materiálu, ktorý sa spomína v predchádzajúcej zarážke,

| — | miesto(-a) produkcie uvedeného rastlinného materiálu, na ktorom sa na zavlažovanie alebo postrek používala voda, ktorá bola podľa článku 5 ods. 1 písm. c) bodu ii) označená za kontaminovanú, |
| --- | --- |

—

miesto(-a) produkcie uvedeného rastlinného materiálu, na ktorom sa na zavlažovanie alebo postrek používala voda, ktorá bola podľa článku 5 ods. 1 písm. c) bodu ii) označená za kontaminovanú,

| — | uvedený rastlinný materiál vyprodukovaný na poliach, ktoré boli zaplavené povrchovou vodou, v ktorej sa dokázala kontaminácia. |
| --- | --- |

—

uvedený rastlinný materiál vyprodukovaný na poliach, ktoré boli zaplavené povrchovou vodou, v ktorej sa dokázala kontaminácia.

| 2. | Pri stanovení pravdepodobného rozšírenia podľa článku 5 ods. 1 písm. a) bodu iv) a článku 5 ods. 1 písm. c) bodu iii) by sa mali zvážiť nasledujúce prvky:






  i) | v prípadoch podľa článku 5 ods. 1 písm. a) bodu iv),






  — | blízkosť k iným miestam produkcie, na ktorých sa uvedený rastlinný materiál pestuje, |
| --- | --- | --- | --- |

2.

Pri stanovení pravdepodobného rozšírenia podľa článku 5 ods. 1 písm. a) bodu iv) a článku 5 ods. 1 písm. c) bodu iii) by sa mali zvážiť nasledujúce prvky:

i)

v prípadoch podľa článku 5 ods. 1 písm. a) bodu iv),

—

blízkosť k iným miestam produkcie, na ktorých sa uvedený rastlinný materiál pestuje,

| — | bežná produkcia a použitie porastov sadivových zemiakov, |
| --- | --- |

—

bežná produkcia a použitie porastov sadivových zemiakov,

| — | miesta produkcie, na ktorých sa uvedený rastlinný materiál zavlažuje alebo postrekuje povrchovou vodou v prípadoch, keď existuje alebo existovalo nebezpečenstvo odplavenia povrchovej vody alebo zaplavenia povrchovou vodou z miest produkcie, ktoré boli podľa článku 5 ods. 1 písm. a) bodu ii) označené za kontaminované; |
| --- | --- |

—

miesta produkcie, na ktorých sa uvedený rastlinný materiál zavlažuje alebo postrekuje povrchovou vodou v prípadoch, keď existuje alebo existovalo nebezpečenstvo odplavenia povrchovej vody alebo zaplavenia povrchovou vodou z miest produkcie, ktoré boli podľa článku 5 ods. 1 písm. a) bodu ii) označené za kontaminované;

| ii) | v prípadoch, keď bola povrchová voda označená za kontaminovanú podľa článku 5 ods. 1 písm. c) bodu ii):






  — | miesto(-a) produkcie, kde sa uvedený rastlinný materiál pestuje v priľahlých oblastiach k povrchovej vode označenej za kontaminovanú, alebo ktoré môže byť touto povrchovou vodou zaplavené, |
| --- | --- | --- |

ii)

v prípadoch, keď bola povrchová voda označená za kontaminovanú podľa článku 5 ods. 1 písm. c) bodu ii):

—

miesto(-a) produkcie, kde sa uvedený rastlinný materiál pestuje v priľahlých oblastiach k povrchovej vode označenej za kontaminovanú, alebo ktoré môže byť touto povrchovou vodou zaplavené,

| — | každú samostatnú zavlažovaciu nádrž, ktorá je spojená s povrchovou vodou označenou za kontaminovanú. |
| --- | --- |

—

každú samostatnú zavlažovaciu nádrž, ktorá je spojená s povrchovou vodou označenou za kontaminovanú.

| — | vodné útvary, ktoré sú spojené s povrchovou vodou označenou za kontaminovanú, so zreteľom na:






  — | smer a silu toku vody označenej za kontaminovanú, |
| --- | --- | --- |

—

vodné útvary, ktoré sú spojené s povrchovou vodou označenou za kontaminovanú, so zreteľom na:

—

smer a silu toku vody označenej za kontaminovanú,

| — | prítomnosť divo rastúcich hostiteľských rastlín z čeľade ľuľkovitých. |
| --- | --- |

—

prítomnosť divo rastúcich hostiteľských rastlín z čeľade ľuľkovitých.

| 3. | Oznámenie uvedené v prvom pododseku článku 5 ods. 2 musí byť podané takto:






  — | okamžite po potvrdení prítomnosti organizmu laboratórnymi testmi pomocou metód uvedených v prílohe II minimálne:






  — | pre zemiaky,






  a) | názov odrody danej partie, |
| --- | --- | --- | --- | --- |

3.

Oznámenie uvedené v prvom pododseku článku 5 ods. 2 musí byť podané takto:

—

okamžite po potvrdení prítomnosti organizmu laboratórnymi testmi pomocou metód uvedených v prílohe II minimálne:

—

pre zemiaky,

a)

názov odrody danej partie,

| b) | typ (sadivové, konzumné, atď.) a v potrebnom prípade kategória sadivových zemiakov, |
| --- | --- |

b)

typ (sadivové, konzumné, atď.) a v potrebnom prípade kategória sadivových zemiakov,

| — | pre rastliny rajčiakov, názov odrody danej partie a v potrebnom prípade kategória, |
| --- | --- |

—

pre rastliny rajčiakov, názov odrody danej partie a v potrebnom prípade kategória,

| — | bez toho, aby boli dotknuté požiadavky pre oznámenie podozrenia na výskyt v článku 4 ods. 3, členský štát, v ktorom sa výskyt potvrdil, v prípade rizika kontaminácie uvedeného rastlinného materiálu pochádzajúceho z/alebo vyvezeného do iného členského štátu(-ov) okamžite oznámi príslušnému členskému štátu(-om) informácie potrebné na dodržanie článku 5 ods. 3, ako napr.:






  a) | názov odrody danej partie zemiakov alebo rajčiakov; |
| --- | --- | --- |

—

bez toho, aby boli dotknuté požiadavky pre oznámenie podozrenia na výskyt v článku 4 ods. 3, členský štát, v ktorom sa výskyt potvrdil, v prípade rizika kontaminácie uvedeného rastlinného materiálu pochádzajúceho z/alebo vyvezeného do iného členského štátu(-ov) okamžite oznámi príslušnému členskému štátu(-om) informácie potrebné na dodržanie článku 5 ods. 3, ako napr.:

a)

názov odrody danej partie zemiakov alebo rajčiakov;

| b) | názov a adresa odosielateľa a príjemcu; |
| --- | --- |

b)

názov a adresa odosielateľa a príjemcu;

| c) | dátum doručenia partie zemiakov alebo rajčiakov; |
| --- | --- |

c)

dátum doručenia partie zemiakov alebo rajčiakov;

| d) | objem doručenej partie zemiakov alebo rajčiakov; |
| --- | --- |

d)

objem doručenej partie zemiakov alebo rajčiakov;

| e) | kópiu pasu rastlinného materiálu alebo v potrebnom prípade minimálne číslo pasu rastlinného materiálu alebo v potrebnom prípade registračné číslo pestovateľa alebo obchodujúceho a kópiu oznámenia o doručení. |
| --- | --- |

e)

kópiu pasu rastlinného materiálu alebo v potrebnom prípade minimálne číslo pasu rastlinného materiálu alebo v potrebnom prípade registračné číslo pestovateľa alebo obchodujúceho a kópiu oznámenia o doručení.

Komisia bude informovaná ihneď po tom, ako budú tieto informácie poskytnuté.

| 4. | Podrobné údaje dodatočného oznámenia uvedeného v druhom pododseku článku 5 ods. 2 budú obsahovať:
  Po ukončení všetkých vyšetrovaní, pre každý prípad:






  a) | dátum, kedy sa kontaminácia potvrdila; |
| --- | --- | --- |

4.

Podrobné údaje dodatočného oznámenia uvedeného v druhom pododseku článku 5 ods. 2 budú obsahovať:

Po ukončení všetkých vyšetrovaní, pre každý prípad:

a)

dátum, kedy sa kontaminácia potvrdila;

| b) | stručný popis vyšetrovania, ktoré prebehlo s cieľom určiť zdroj a možné rozšírenie kontaminácie vrátane stupňa uskutočneného odberu vzorky; |
| --- | --- |

b)

stručný popis vyšetrovania, ktoré prebehlo s cieľom určiť zdroj a možné rozšírenie kontaminácie vrátane stupňa uskutočneného odberu vzorky;

| c) | informácie o zistených alebo predpokladaných zdrojoch kontaminácie; |
| --- | --- |

c)

informácie o zistených alebo predpokladaných zdrojoch kontaminácie;

| d) | podrobné informácie o rozsahu označenej kontaminácie, vrátane počtu miest produkcie a pri zemiakoch počtu partií s označením odrody a pri sadivových zemiakoch, kategória; |
| --- | --- |

d)

podrobné informácie o rozsahu označenej kontaminácie, vrátane počtu miest produkcie a pri zemiakoch počtu partií s označením odrody a pri sadivových zemiakoch, kategória;

| e) | podrobné informácie o bezpečnostnom pásme, vrátane počtu miest výroby, ktoré neboli označené za kontaminované, ale ktoré sú zahrnuté v pásme; |
| --- | --- |

e)

podrobné informácie o bezpečnostnom pásme, vrátane počtu miest výroby, ktoré neboli označené za kontaminované, ale ktoré sú zahrnuté v pásme;

| f) | podrobné informácie o označení vody, vrátane názvu a lokality vodného útvaru a rozsahu označenia/zákazu zavlažovania; |
| --- | --- |

f)

podrobné informácie o označení vody, vrátane názvu a lokality vodného útvaru a rozsahu označenia/zákazu zavlažovania;

| g) | pre každú zásielku alebo partiu rajčiakov označenú za kontaminovanú osvedčenia podľa článku 13 ods.1 bodu ii) smernice 2000/29/ES a číslo pasu rastlinného materiálu v súlade so zoznamom uvedeným v prílohe V časti A oddiele 1.2.2 k smernici 2000/29/ES; |
| --- | --- |

g)

pre každú zásielku alebo partiu rajčiakov označenú za kontaminovanú osvedčenia podľa článku 13 ods.1 bodu ii) smernice 2000/29/ES a číslo pasu rastlinného materiálu v súlade so zoznamom uvedeným v prílohe V časti A oddiele 1.2.2 k smernici 2000/29/ES;

| h) | iné údaje týkajúce sa potvrdeného výskytu škodlivého organizmu, ktoré môže Komisia požadovať. |
| --- | --- |

h)

iné údaje týkajúce sa potvrdeného výskytu škodlivého organizmu, ktoré môže Komisia požadovať.

PRÍLOHA VI

| 1. | Ustanovenia, ktoré sa uvádzajú v článku 6. ods. 1, budú tieto:






  — | použitie ako krmivo pre zvieratá po tepelnom spracovaní, ktoré vylučuje nebezpečenstvo prežitia škodlivého organizmu,
  alebo |
| --- | --- | --- |

1.

Ustanovenia, ktoré sa uvádzajú v článku 6. ods. 1, budú tieto:

—

použitie ako krmivo pre zvieratá po tepelnom spracovaní, ktoré vylučuje nebezpečenstvo prežitia škodlivého organizmu,

alebo

| — | zneškodnenie materiálu na úradne schválených skládkach odpadu, pri ktorých neexistuje identifikovateľné riziko úniku organizmu do okolia priesakom na poľnohospodársky využívané plochy alebo do vodných zdrojov, ktoré sa využívajú na zavlažovanie poľnohospodárskej pôdy,
  alebo |
| --- | --- |

—

zneškodnenie materiálu na úradne schválených skládkach odpadu, pri ktorých neexistuje identifikovateľné riziko úniku organizmu do okolia priesakom na poľnohospodársky využívané plochy alebo do vodných zdrojov, ktoré sa využívajú na zavlažovanie poľnohospodárskej pôdy,

alebo

| — | spálenie,
  alebo |
| --- | --- |

—

spálenie,

alebo

| — | priemyselné spracovanie a to priamou a bezprostrednou dodávkou spracovateľskému závodu vybavenému úradne schváleným zariadením odpadového hospodárstva, pre ktoré sa stanovilo, že neexistuje žiadne rozpoznateľné riziko šírenia tohto organizmu a ktoré je vybavené systémom čistenia a dezinfekcie minimálne odchádzajúcich vozidiel,
  alebo |
| --- | --- |

—

priemyselné spracovanie a to priamou a bezprostrednou dodávkou spracovateľskému závodu vybavenému úradne schváleným zariadením odpadového hospodárstva, pre ktoré sa stanovilo, že neexistuje žiadne rozpoznateľné riziko šírenia tohto organizmu a ktoré je vybavené systémom čistenia a dezinfekcie minimálne odchádzajúcich vozidiel,

alebo

| — | iné opatrenia, ak preukázateľne neexistuje žiadne rozpoznateľné riziko šírenia škodlivého organizmu; takéto opatrenia a ich odôvodnenie sa bezodkladne oznámi Komisii a ostatným členským štátom. |
| --- | --- |

—

iné opatrenia, ak preukázateľne neexistuje žiadne rozpoznateľné riziko šírenia škodlivého organizmu; takéto opatrenia a ich odôvodnenie sa bezodkladne oznámi Komisii a ostatným členským štátom.

Akýkoľvek zostávajúci odpad, ktorý vznikol na základe jedného z vyššie uvedených variantov, sa zneškodní úradne schválenými metódami v súlade s prílohou VII k tejto smernici.

| 2. | Za vhodné využitie alebo zneškodnenie uvedeného rastlinného materiálu podľa článku 6 ods. 2 pod dohľadom zodpovedných orgánov príslušných členských štátov pri vzájomnom informovaní zodpovedných orgánov s cieľom zabezpečiť takýto dohľad v ktoromkoľvek okamihu a so súhlasom zodpovedného orgánu členského štátu, v ktorom sa zemiaky majú baliť alebo spracovávať v zariadeniach na zneškodňovanie odpadu uvedených v prvej a druhej zarážke, sa považuje:






  i) | v prípade zemiakových hľúz:






  — | použitie ako konzumných zemiakov pestovaných pre konzumáciu, už zabalených na priame doručenie a použitie bez opätovného balenia, v mieste s vhodným odpadovým hospodárstvom. So zemiakmi pestovanými na sadbu sa môže manipulovať len na rovnakom mieste, ak sa tak robí oddelene alebo po čistení a dezinfekcii,
  alebo |
| --- | --- | --- | --- |

2.

Za vhodné využitie alebo zneškodnenie uvedeného rastlinného materiálu podľa článku 6 ods. 2 pod dohľadom zodpovedných orgánov príslušných členských štátov pri vzájomnom informovaní zodpovedných orgánov s cieľom zabezpečiť takýto dohľad v ktoromkoľvek okamihu a so súhlasom zodpovedného orgánu členského štátu, v ktorom sa zemiaky majú baliť alebo spracovávať v zariadeniach na zneškodňovanie odpadu uvedených v prvej a druhej zarážke, sa považuje:

i)

v prípade zemiakových hľúz:

—

použitie ako konzumných zemiakov pestovaných pre konzumáciu, už zabalených na priame doručenie a použitie bez opätovného balenia, v mieste s vhodným odpadovým hospodárstvom. So zemiakmi pestovanými na sadbu sa môže manipulovať len na rovnakom mieste, ak sa tak robí oddelene alebo po čistení a dezinfekcii,

alebo

| — | použitie konzumných zemiakov na priemyselné spracovanie a ich určenie na priame a bezprostredné dodanie spracovateľskému závodu vybavenému primeranými zariadeniami odpadového hospodárstva a systémom čistenia a dezinfekcie minimálne odchádzajúcich vozidiel,
  alebo |
| --- | --- |

—

použitie konzumných zemiakov na priemyselné spracovanie a ich určenie na priame a bezprostredné dodanie spracovateľskému závodu vybavenému primeranými zariadeniami odpadového hospodárstva a systémom čistenia a dezinfekcie minimálne odchádzajúcich vozidiel,

alebo

| — | iné využitie alebo zneškodnenie, ak preukázateľne neexistuje žiadne rozpoznateľné riziko šírenia škodlivého organizmu a po schválení uvedenými zodpovednými orgánmi; |
| --- | --- |

—

iné využitie alebo zneškodnenie, ak preukázateľne neexistuje žiadne rozpoznateľné riziko šírenia škodlivého organizmu a po schválení uvedenými zodpovednými orgánmi;

| ii) | v prípade iných častí rastlín vrátane stoniek a listového odpadu,






  — | zničenie,
  alebo |
| --- | --- | --- |

ii)

v prípade iných častí rastlín vrátane stoniek a listového odpadu,

—

zničenie,

alebo

| — | iné využitie alebo zneškodnenie, ak preukázateľne neexistuje žiadne rozpoznateľné riziko šírenia škodlivého organizmu a po schválení uvedenými zodpovednými orgánmi. |
| --- | --- |

—

iné využitie alebo zneškodnenie, ak preukázateľne neexistuje žiadne rozpoznateľné riziko šírenia škodlivého organizmu a po schválení uvedenými zodpovednými orgánmi.

| 3. | Medzi vhodné metódy dekontaminácie objektov uvedených v článku 6 ods. 3 patrí čistenie, a ak je to vhodné dezinfekcia, pri ktorých neexistuje rozpoznateľné riziko šírenia organizmu a používajú sa pod dohľadom zodpovedných úradných orgánov členských štátov. |
| --- | --- |

3.

Medzi vhodné metódy dekontaminácie objektov uvedených v článku 6 ods. 3 patrí čistenie, a ak je to vhodné dezinfekcia, pri ktorých neexistuje rozpoznateľné riziko šírenia organizmu a používajú sa pod dohľadom zodpovedných úradných orgánov členských štátov.

| 4. | Do radu opatrení, ktoré členské štáty v rámci bezpečnostného pásma/pásiem vyznačeného v zmysle článku 5 ods. 1 písm. a) bodu iv) a článku 5 ods. 1 písm. c) bodu iii), a ktoré sa uvádza v článku 6 ods. 4, sa zahrnie: |
| --- | --- |

4.

Do radu opatrení, ktoré členské štáty v rámci bezpečnostného pásma/pásiem vyznačeného v zmysle článku 5 ods. 1 písm. a) bodu iv) a článku 5 ods. 1 písm. c) bodu iii), a ktoré sa uvádza v článku 6 ods. 4, sa zahrnie:

| 4.1. | V prípadoch, keď miesta produkcie boli označené za kontaminované podľa článku 5 ods. 1 písm. a) bodu ii):






  a) | na poli alebo v jednotke chránenej rastlinnej produkcie, ktorá bola podľa článku 5 ods. 1 písm. a)bodu ii) označená za kontaminovanú, buď






  i) | minimálne počas štyroch rokov nasledujúcich po roku označenia kontaminácie:






  — | opatrenia na elimináciu samovýsadby/samovýsevu rastlín zemiakov a rajčiakov, ako aj iných hostiteľských rastlín škodlivého organizmu vrátane burinného spoločenstva patriaceho do čeľade ľuľkovitých,
  a |
| --- | --- | --- | --- | --- |

4.1.

V prípadoch, keď miesta produkcie boli označené za kontaminované podľa článku 5 ods. 1 písm. a) bodu ii):

a)

na poli alebo v jednotke chránenej rastlinnej produkcie, ktorá bola podľa článku 5 ods. 1 písm. a)bodu ii) označená za kontaminovanú, buď

i)

minimálne počas štyroch rokov nasledujúcich po roku označenia kontaminácie:

—

opatrenia na elimináciu samovýsadby/samovýsevu rastlín zemiakov a rajčiakov, ako aj iných hostiteľských rastlín škodlivého organizmu vrátane burinného spoločenstva patriaceho do čeľade ľuľkovitých,

a

| — | vynechanie výsadby/výsevu:






  — | hľúz zemiakov alebo rastlín zemiakov alebo pravého osiva, |
| --- | --- | --- |

—

vynechanie výsadby/výsevu:

—

hľúz zemiakov alebo rastlín zemiakov alebo pravého osiva,

| — | rastlín rajčiakov a osiva rajčiaka, |
| --- | --- |

—

rastlín rajčiakov a osiva rajčiaka,

| — | prihliadajúc na biológiu organizmu, |
| --- | --- |

—

prihliadajúc na biológiu organizmu,

| — | iných hostiteľských rastlín organizmu, |
| --- | --- |

—

iných hostiteľských rastlín organizmu,

| — | rastlinných druhov z rodu Brassica, pri ktorých preukázateľne existuje riziko prežívania škodlivého organizmu, |
| --- | --- |

—

rastlinných druhov z rodu Brassica, pri ktorých preukázateľne existuje riziko prežívania škodlivého organizmu,

| — | plodín, pri ktorých preukázateľne existuje riziko šírenia škodlivého organizmu, |
| --- | --- |

—

plodín, pri ktorých preukázateľne existuje riziko šírenia škodlivého organizmu,

| — | v prvom vegetačnom období zemiakov a rajčiakov nasledujúcom po období uvedenom v predchádzajúcej zarážke a za podmienky, že pole bolo minimálne počas dvoch pestovateľských rokov pred rokom vysadenia bez rastlín zemiakov alebo rajčiakov vyrastených zo samovýsadby/samovýsevu, ako i bez iných hostiteľských rastlín vrátane burinného spoločenstva patriaceho do čeľade ľuľkovitých,






  — | v prípade zemiakov sa povoľuje len produkcia konzumných zemiakov, |
| --- | --- | --- |

—

v prvom vegetačnom období zemiakov a rajčiakov nasledujúcom po období uvedenom v predchádzajúcej zarážke a za podmienky, že pole bolo minimálne počas dvoch pestovateľských rokov pred rokom vysadenia bez rastlín zemiakov alebo rajčiakov vyrastených zo samovýsadby/samovýsevu, ako i bez iných hostiteľských rastlín vrátane burinného spoločenstva patriaceho do čeľade ľuľkovitých,

—

v prípade zemiakov sa povoľuje len produkcia konzumných zemiakov,

| — | v prípade zemiakov a rajčiakov, zozbierané zemiakové hľuzy alebo rastliny rajčiaka, podľa potreby, sa budú testovať podľa postupov podrobne popísaných v prílohe II, |
| --- | --- |

—

v prípade zemiakov a rajčiakov, zozbierané zemiakové hľuzy alebo rastliny rajčiaka, podľa potreby, sa budú testovať podľa postupov podrobne popísaných v prílohe II,

| — | vo vegetačnom období zemiakov a rajčiakov nasledujúcom po vegetačnom období uvedenom v predchádzajúcej zarážke a pri dodržaní vhodného osevného postupu, ktoré trvá najmenej dva roky ak sa majú pestovať sadivové zemiaky, sa vykoná úradný prieskum podľa podrobných ustanovení v článku 2 ods. 1, |
| --- | --- |

—

vo vegetačnom období zemiakov a rajčiakov nasledujúcom po vegetačnom období uvedenom v predchádzajúcej zarážke a pri dodržaní vhodného osevného postupu, ktoré trvá najmenej dva roky ak sa majú pestovať sadivové zemiaky, sa vykoná úradný prieskum podľa podrobných ustanovení v článku 2 ods. 1,

alebo

| ii) | počas piatich pestovateľských rokov nasledujúcich po roku označenia pozemkov za kontaminované:






  — | opatrenia na potláčanie samovýsadby/samovýsevu rastlín zemiakov a rajčiakov, ako aj iných prirodzene zistených hostiteľských rastlín škodlivého organizmu vrátane burinného spoločenstva patriaceho do čeľade ľuľkovitých,
  a |
| --- | --- | --- |

ii)

počas piatich pestovateľských rokov nasledujúcich po roku označenia pozemkov za kontaminované:

—

opatrenia na potláčanie samovýsadby/samovýsevu rastlín zemiakov a rajčiakov, ako aj iných prirodzene zistených hostiteľských rastlín škodlivého organizmu vrátane burinného spoločenstva patriaceho do čeľade ľuľkovitých,

a

| — | počas prvých troch rokov tohto obdobia čierny úhor alebo pestovanie obilnín podľa zisteného rizika alebo trvalá pastvina s častým kosením alebo intenzívnym spásaním alebo pestovanie tráv s cieľom získania semennej produkcie, po ktorých nasledujú dva roky pestovania nehostiteľských rastlín, ktoré preukázateľne nepredstavujú žiadne riziko prežitia alebo šírenia škodlivého organizmu, |
| --- | --- |

—

počas prvých troch rokov tohto obdobia čierny úhor alebo pestovanie obilnín podľa zisteného rizika alebo trvalá pastvina s častým kosením alebo intenzívnym spásaním alebo pestovanie tráv s cieľom získania semennej produkcie, po ktorých nasledujú dva roky pestovania nehostiteľských rastlín, ktoré preukázateľne nepredstavujú žiadne riziko prežitia alebo šírenia škodlivého organizmu,

| — | v prvom vegetačnom období zemiakov a rajčiakov nasledujúcom po období uvedenom v predchádzajúcej zarážke a pod podmienkou, že pole bolo minimálne počas dvoch pestovateľských po sebe nasledujúcich rokov pred rokom vysadenia bez rastlín zemiakov alebo rajčiakov vyrastených zo samovýsadby/samovýsevu, ako i bez iných hostiteľských rastlín, vrátane burinného spoločenstva patriaceho do čeľade ľuľkovitých,






  — | v prípade zemiakov sa povoľuje pestovanie sadivových alebo konzumných zemiakov, |
| --- | --- | --- |

—

v prvom vegetačnom období zemiakov a rajčiakov nasledujúcom po období uvedenom v predchádzajúcej zarážke a pod podmienkou, že pole bolo minimálne počas dvoch pestovateľských po sebe nasledujúcich rokov pred rokom vysadenia bez rastlín zemiakov alebo rajčiakov vyrastených zo samovýsadby/samovýsevu, ako i bez iných hostiteľských rastlín, vrátane burinného spoločenstva patriaceho do čeľade ľuľkovitých,

—

v prípade zemiakov sa povoľuje pestovanie sadivových alebo konzumných zemiakov,

| — | zozbierané zemiakové hľuzy alebo rastliny rajčiaka, podľa potreby, sa budú testovať podľa postupov podrobne popísaných v prílohe II; |
| --- | --- |

—

zozbierané zemiakové hľuzy alebo rastliny rajčiaka, podľa potreby, sa budú testovať podľa postupov podrobne popísaných v prílohe II;

| b) | na všetkých ďalších poliach s kontaminovaným miestom produkcie- pod podmienkou, že zodpovedné úradné orgány súhlasia s tým, že riziko samovysadených rastlín zemiaka a rastlín rajčiaka a ďalších prirodzene sa vyskytujúcich hostiteľských rastlín tohto organizmu, vrátane burinného spoločenstva patriaceho do čeľade ľuľkovitých, podľa potreby, bolo eliminované:






  — | v roku pestovania po roku označenia kontaminácie,






  — | žiadne zemiakové hľuzy alebo pravé semená zemiaka alebo iné hostiteľské rastliny daného organizmu sa nezasadania,
  alebo |
| --- | --- | --- | --- |

b)

na všetkých ďalších poliach s kontaminovaným miestom produkcie- pod podmienkou, že zodpovedné úradné orgány súhlasia s tým, že riziko samovysadených rastlín zemiaka a rastlín rajčiaka a ďalších prirodzene sa vyskytujúcich hostiteľských rastlín tohto organizmu, vrátane burinného spoločenstva patriaceho do čeľade ľuľkovitých, podľa potreby, bolo eliminované:

—

v roku pestovania po roku označenia kontaminácie,

—

žiadne zemiakové hľuzy alebo pravé semená zemiaka alebo iné hostiteľské rastliny daného organizmu sa nezasadania,

alebo

| — | v prípade zemiakových hľúz, certifikované sadivové zemiaky sa môžu sadiť len pre konzumnú spotrebu, |
| --- | --- |

—

v prípade zemiakových hľúz, certifikované sadivové zemiaky sa môžu sadiť len pre konzumnú spotrebu,

| — | v prípade rastlín rajčiakov sa rastliny rajčiakov pestované z osiva, ktoré spĺňa požiadavky smernice 2000/29/ES, môžu sadiť v rámci ovocinárskej produkcie, |
| --- | --- |

—

v prípade rastlín rajčiakov sa rastliny rajčiakov pestované z osiva, ktoré spĺňa požiadavky smernice 2000/29/ES, môžu sadiť v rámci ovocinárskej produkcie,

| — | v druhom pestovateľskom roku, ktorý nasleduje po roku, kedy bola označená kontaminácia:






  — | v prípade zemiakov, len úradne potvrdené sadivové zemiaky alebo sadivové zemiaky, ktoré boli úradne testované na neprítomnosť hnedej hniloby a pestované pod úradnou kontrolou na miestach produkcie iných ako tie, ktoré sa uvádzajú v bode 4.1 sa budú sadiť buď pre produkciu sadivových alebo konzumných zemiakov, |
| --- | --- | --- |

—

v druhom pestovateľskom roku, ktorý nasleduje po roku, kedy bola označená kontaminácia:

—

v prípade zemiakov, len úradne potvrdené sadivové zemiaky alebo sadivové zemiaky, ktoré boli úradne testované na neprítomnosť hnedej hniloby a pestované pod úradnou kontrolou na miestach produkcie iných ako tie, ktoré sa uvádzajú v bode 4.1 sa budú sadiť buď pre produkciu sadivových alebo konzumných zemiakov,

| — | v prípade rajčiakov sa pestujú len rastliny rajčiakov z osiva, ktoré spĺňa požiadavky smernice 2000/29/ES alebo v prípade vegetatívneho množenia z rastlín rajčiakov takého osiva a pestujú sa pod úradnou kontrolou na miestach produkcie inej ako je uvedené v bode 4.1 v rámci rastlinnej alebo ovocinárskej produkcie, |
| --- | --- |

—

v prípade rajčiakov sa pestujú len rastliny rajčiakov z osiva, ktoré spĺňa požiadavky smernice 2000/29/ES alebo v prípade vegetatívneho množenia z rastlín rajčiakov takého osiva a pestujú sa pod úradnou kontrolou na miestach produkcie inej ako je uvedené v bode 4.1 v rámci rastlinnej alebo ovocinárskej produkcie,

| — | minimálne v treťom pestovateľskom roku po roku označenia kontaminácie,






  — | v prípade zemiakov, vysádzať výlučne úradne certifikované sadivo zemiakov alebo sadivo, ktoré bolo vypestované pod úradným dohľadom z úradne certifikovaného sadiva zemiakov, a to s cieľom produkcie sadivových zemiakov alebo konzumných zemiakov, |
| --- | --- | --- |

—

minimálne v treťom pestovateľskom roku po roku označenia kontaminácie,

—

v prípade zemiakov, vysádzať výlučne úradne certifikované sadivo zemiakov alebo sadivo, ktoré bolo vypestované pod úradným dohľadom z úradne certifikovaného sadiva zemiakov, a to s cieľom produkcie sadivových zemiakov alebo konzumných zemiakov,

| — | v prípade rajčiakov len rastliny rajčiakov pestované z osiva, ktoré spĺňa požiadavky smernice 2000/29/ES alebo rastliny rajčiakov pestované pod úradnou kontrolou z takýchto rastlín sa môžu sadiť v rámci rastlinnej alebo ovocinárskej produkcie, |
| --- | --- |

—

v prípade rajčiakov len rastliny rajčiakov pestované z osiva, ktoré spĺňa požiadavky smernice 2000/29/ES alebo rastliny rajčiakov pestované pod úradnou kontrolou z takýchto rastlín sa môžu sadiť v rámci rastlinnej alebo ovocinárskej produkcie,

| — | v každom pestovateľskom roku, ktorý sa uvádza v predchádzajúcich zarážkach, sa prijímajú opatrenia na elimináciu rastlín zemiakov vyrastených zo samovýsadby/samovýsevu a iných prirodzene zistených hosťujúcich rastlín organizmu v prípade jeho prítomnosti a uskutoční sa úradná inšpekcia pestovanej úrody vo vhodných obdobiach a na každom zemiakovom poli sa zozbierané zemiaky úradne otestujú podľa postupov podrobne popísaných v prílohe II; |
| --- | --- |

—

v každom pestovateľskom roku, ktorý sa uvádza v predchádzajúcich zarážkach, sa prijímajú opatrenia na elimináciu rastlín zemiakov vyrastených zo samovýsadby/samovýsevu a iných prirodzene zistených hosťujúcich rastlín organizmu v prípade jeho prítomnosti a uskutoční sa úradná inšpekcia pestovanej úrody vo vhodných obdobiach a na každom zemiakovom poli sa zozbierané zemiaky úradne otestujú podľa postupov podrobne popísaných v prílohe II;

| c) | ihneď po označení kontaminácie podľa článku 5 ods. 1 písm. a) bodu ii) a po prvom nasledujúcom pestovateľskom roku:






  — | riadne vyčistenie a dezinfekcia, podľa potreby, všetkých strojov a skladovacích zariadení nachádzajúcich sa na mieste produkcie, ktoré sa používajú pri produkcii zemiakov alebo rajčiakov, podľa príslušných metód podrobne popísaných v bode 3, |
| --- | --- | --- |

c)

ihneď po označení kontaminácie podľa článku 5 ods. 1 písm. a) bodu ii) a po prvom nasledujúcom pestovateľskom roku:

—

riadne vyčistenie a dezinfekcia, podľa potreby, všetkých strojov a skladovacích zariadení nachádzajúcich sa na mieste produkcie, ktoré sa používajú pri produkcii zemiakov alebo rajčiakov, podľa príslušných metód podrobne popísaných v bode 3,

| — | úradné kontroly zavlažovacích a postrekových programov vrátane, podľa potreby, vyhlásenia zákazu zavlažovania a postrekov s cieľom zabrániť šíreniu škodlivého organizmu; |
| --- | --- |

—

úradné kontroly zavlažovacích a postrekových programov vrátane, podľa potreby, vyhlásenia zákazu zavlažovania a postrekov s cieľom zabrániť šíreniu škodlivého organizmu;

| d) | v jednotke chránenej rastlinnej produkcie, ktorá bola podľa článku 5 ods. 1 písm. a) bodu ii) označená za kontaminovanú a pri ktorej je možná úplná výmena pestovateľského substrátu:






  — | vynechanie výsadby zemiakových hľúz alebo rastlín zemiakov alebo pravého osiva alebo iných hostiteľských rastlín škodlivého organizmu vrátane rastlín rajčiakov a výsevu semien rajčiakov dovtedy, pokiaľ sa príslušná prevádzková jednotka pod úradným dozorom nepodrobí opatreniam na zničenie škodlivého organizmu a na odstránenie všetkého materiálu hostiteľských rastlín vrátane minimálne jednej úplnej výmeny pestovateľského substrátu, vyčistenia a, podľa potreby, dezinfekcie uvedenej jednotky a všetkých zariadení a pokiaľ nebude potom zodpovednými orgánmi udelený súhlas na pestovanie rajčiakov a zemiakov,
  a |
| --- | --- | --- |

d)

v jednotke chránenej rastlinnej produkcie, ktorá bola podľa článku 5 ods. 1 písm. a) bodu ii) označená za kontaminovanú a pri ktorej je možná úplná výmena pestovateľského substrátu:

—

vynechanie výsadby zemiakových hľúz alebo rastlín zemiakov alebo pravého osiva alebo iných hostiteľských rastlín škodlivého organizmu vrátane rastlín rajčiakov a výsevu semien rajčiakov dovtedy, pokiaľ sa príslušná prevádzková jednotka pod úradným dozorom nepodrobí opatreniam na zničenie škodlivého organizmu a na odstránenie všetkého materiálu hostiteľských rastlín vrátane minimálne jednej úplnej výmeny pestovateľského substrátu, vyčistenia a, podľa potreby, dezinfekcie uvedenej jednotky a všetkých zariadení a pokiaľ nebude potom zodpovednými orgánmi udelený súhlas na pestovanie rajčiakov a zemiakov,

a

| — | produkcia zemiakov sa musí uskutočňovať zo zemiakovej sadby alebo z minihľúz alebo minirastlín pochádzajúcich z testovaných zdrojov, |
| --- | --- |

—

produkcia zemiakov sa musí uskutočňovať zo zemiakovej sadby alebo z minihľúz alebo minirastlín pochádzajúcich z testovaných zdrojov,

| — | produkcia rajčiakov sa uskutočňuje z osiva, ktoré spĺňa požiadavky smernice 2000/29/ES alebo, v prípade vegetatívneho množenia, z rastlín rajčiakov takéhoto osiva a pestuje sa pod úradnou kontrolou, |
| --- | --- |

—

produkcia rajčiakov sa uskutočňuje z osiva, ktoré spĺňa požiadavky smernice 2000/29/ES alebo, v prípade vegetatívneho množenia, z rastlín rajčiakov takéhoto osiva a pestuje sa pod úradnou kontrolou,

| — | úradné kontroly zavlažovacích a postrekových programov, vrátane, podľa potreby, vyhlásenia zákazu zavlažovania a postrekov s cieľom zabrániť šíreniu škodlivého organizmu; |
| --- | --- |

—

úradné kontroly zavlažovacích a postrekových programov, vrátane, podľa potreby, vyhlásenia zákazu zavlažovania a postrekov s cieľom zabrániť šíreniu škodlivého organizmu;

| 4.2. | V rámci vyznačeného bezpečnostného pásma, bez toho, aby boli dotknuté opatrenia podrobne popísané v odseku 4.1 sú členské štáty povinné:






  a) | ihneď po označení kontaminácie zabezpečiť primerané vyčistenie a dezinfekciu, všetkých prístrojov a skladovacích zariadení v týchto priestoroch, ktoré sa používajú v súvislosti s produkciou rajčiakov alebo zemiakov, pričom sa použijú príslušné metódy, ako sa uvádza v bode 3, |
| --- | --- | --- |

4.2.

V rámci vyznačeného bezpečnostného pásma, bez toho, aby boli dotknuté opatrenia podrobne popísané v odseku 4.1 sú členské štáty povinné:

a)

ihneď po označení kontaminácie zabezpečiť primerané vyčistenie a dezinfekciu, všetkých prístrojov a skladovacích zariadení v týchto priestoroch, ktoré sa používajú v súvislosti s produkciou rajčiakov alebo zemiakov, pričom sa použijú príslušné metódy, ako sa uvádza v bode 3,

| b) | bezprostredne po označenej kontaminácii a v priebehu najmenej troch po nej nasledujúcich vegetačných období:






  ba) | v prípadoch, kedy bolo bezpečnostné pásmo vymedzené podľa článku 5 ods. 1 písm. a) bodu iv):






  — | zabezpečiť zo strany zodpovedných úradných orgánov dozor nad podnikmi, ktoré pestujú zemiaky a skladujú zemiakové hľuzy alebo rajčiaky a ktoré manipulujú s nimi, ako aj podnikmi, ktoré poskytujú zemiakársku alebo rajčiakovú mechanizáciu dodávateľským spôsobom, |
| --- | --- | --- | --- |

b)

bezprostredne po označenej kontaminácii a v priebehu najmenej troch po nej nasledujúcich vegetačných období:

ba)

v prípadoch, kedy bolo bezpečnostné pásmo vymedzené podľa článku 5 ods. 1 písm. a) bodu iv):

—

zabezpečiť zo strany zodpovedných úradných orgánov dozor nad podnikmi, ktoré pestujú zemiaky a skladujú zemiakové hľuzy alebo rajčiaky a ktoré manipulujú s nimi, ako aj podnikmi, ktoré poskytujú zemiakársku alebo rajčiakovú mechanizáciu dodávateľským spôsobom,

| — | vyžadovať, aby v takomto bezpečnostnom pásme boli všetky porasty zemiakov vysádzané výlučne z úradne certifikovaného sadiva alebo aby bolo používané sadivo vypestované pod úradným dozorom a aby sadivové zemiaky, ktoré boli pestované na miestach produkcie, ktoré boli podľa článku 5 ods. 1 písm. a) bodu iii) označené za pravdepodobne napadnuté, boli po zbere testované, |
| --- | --- |

—

vyžadovať, aby v takomto bezpečnostnom pásme boli všetky porasty zemiakov vysádzané výlučne z úradne certifikovaného sadiva alebo aby bolo používané sadivo vypestované pod úradným dozorom a aby sadivové zemiaky, ktoré boli pestované na miestach produkcie, ktoré boli podľa článku 5 ods. 1 písm. a) bodu iii) označené za pravdepodobne napadnuté, boli po zbere testované,

| — | požadovať osobitnú manipuláciu s uskladnenými sadivovými zemiakmi a konzumnými zemiakmi vo všetkých priestoroch v rámci pásma, alebo systém čistenia a v potrebnom prípade, dezinfekciu, ktorá sa uskutoční medzi manipuláciou so sadivovými a konzumnými skladovanými zemiakmi, |
| --- | --- |

—

požadovať osobitnú manipuláciu s uskladnenými sadivovými zemiakmi a konzumnými zemiakmi vo všetkých priestoroch v rámci pásma, alebo systém čistenia a v potrebnom prípade, dezinfekciu, ktorá sa uskutoční medzi manipuláciou so sadivovými a konzumnými skladovanými zemiakmi,

| — | požadovať pestovanie len rajčiakových rastlín pestovaných z osiva, ktoré spĺňa požiadavky smernice 2000/29/ES, alebo v prípade vegetatívneho množenia z rastlín rajčiakov z takého osiva a pestovanie pod úradnou kontrolou, čo platí pre všetku úrodu v rámci tejto zóny, |
| --- | --- |

—

požadovať pestovanie len rajčiakových rastlín pestovaných z osiva, ktoré spĺňa požiadavky smernice 2000/29/ES, alebo v prípade vegetatívneho množenia z rastlín rajčiakov z takého osiva a pestovanie pod úradnou kontrolou, čo platí pre všetku úrodu v rámci tejto zóny,

| — | v zmysle článku 2 ods. 1 vykonávať úradné prieskumy; |
| --- | --- |

—

v zmysle článku 2 ods. 1 vykonávať úradné prieskumy;

| bb) | v prípadoch, keď bola povrchová voda označená za kontaminovanú podľa článku 5 ods. 1 písm. c) bodu ii) alebo keď sa na povrchovú vodu prihliada pri stanovení možného šírenia škodlivého organizmu podľa bodu 2 prílohy V:






  — | uskutočniť každoročný prieskum vo vhodnom čase vrátane odobratia vzoriek povrchovej vody a v potrebných prípadoch hostiteľských rastlín z čeľade ľuľkovitých v príslušných vodných zdrojoch a testovanie v súlade s príslušnými metódami uvedenými v prílohe II pre uvedený rastlinný materiál a pre ďalšie prípady, |
| --- | --- | --- |

bb)

v prípadoch, keď bola povrchová voda označená za kontaminovanú podľa článku 5 ods. 1 písm. c) bodu ii) alebo keď sa na povrchovú vodu prihliada pri stanovení možného šírenia škodlivého organizmu podľa bodu 2 prílohy V:

—

uskutočniť každoročný prieskum vo vhodnom čase vrátane odobratia vzoriek povrchovej vody a v potrebných prípadoch hostiteľských rastlín z čeľade ľuľkovitých v príslušných vodných zdrojoch a testovanie v súlade s príslušnými metódami uvedenými v prílohe II pre uvedený rastlinný materiál a pre ďalšie prípady,

| — | zaviesť úradné kontroly programov zavlažovania a postrekovania vrátane vyhlásenia zákazu zavlažovania a postrekovania uvedeného rastlinného materiálu a podľa potreby iných hostiteľských rastlín vodou označenou za kontaminovanú s cieľom zabrániť šíreniu škodlivého organizmu. Tento zákaz sa môže preskúmať na základe výsledkov dosiahnutých pri uvedenom ročnom prieskume a označenia sa môžu zrušiť, keď zodpovedné úradné orgány súhlasia s tým, že povrchová voda už nie je kontaminovaná. Používanie vody, ktorá podlieha zákazu, sa môže povoliť na základe úradnej kontroly na zavlažovanie a postrekovanie hostiteľských rastlín, keď sa použijú úradne schválené techniky, ktoré zaručia elimináciu organizmu a prevenciu jeho šírenia, |
| --- | --- |

—

zaviesť úradné kontroly programov zavlažovania a postrekovania vrátane vyhlásenia zákazu zavlažovania a postrekovania uvedeného rastlinného materiálu a podľa potreby iných hostiteľských rastlín vodou označenou za kontaminovanú s cieľom zabrániť šíreniu škodlivého organizmu. Tento zákaz sa môže preskúmať na základe výsledkov dosiahnutých pri uvedenom ročnom prieskume a označenia sa môžu zrušiť, keď zodpovedné úradné orgány súhlasia s tým, že povrchová voda už nie je kontaminovaná. Používanie vody, ktorá podlieha zákazu, sa môže povoliť na základe úradnej kontroly na zavlažovanie a postrekovanie hostiteľských rastlín, keď sa použijú úradne schválené techniky, ktoré zaručia elimináciu organizmu a prevenciu jeho šírenia,

| — | v prípadoch kontaminácie odpadových vôd zaviesť úradné kontroly zneškodňovania pevného alebo tekutého odpadu z prevádzkových priestorov podnikov priemyselného spracovania alebo balenia, ktoré manipulujú s uvedeným rastlinným materiálom; |
| --- | --- |

—

v prípadoch kontaminácie odpadových vôd zaviesť úradné kontroly zneškodňovania pevného alebo tekutého odpadu z prevádzkových priestorov podnikov priemyselného spracovania alebo balenia, ktoré manipulujú s uvedeným rastlinným materiálom;

| c) | v priebehu primeraného obdobia a podľa potreby zaviesť program výmeny všetkého zemiakového sadivového materiálu. |
| --- | --- |

c)

v priebehu primeraného obdobia a podľa potreby zaviesť program výmeny všetkého zemiakového sadivového materiálu.

PRÍLOHA VII

Úradne schválené metódy zneškodnenia odpadu uvedené v prílohe VI odsek 1 sú v súlade s týmito ustanoveniami a tak sa odstraňuje každé identifikovateľné riziko šírenia organizmu:

| i) | Odpad zo zemiakov a rajčiakov (vrátane zamietnutých zemiakov, šúp a rajčiakov) a akéhokoľvek pevného odpadu súvisiaceho so zemiakmi a rajčiakmi (vrátane pôdy, kameňov a sutiny) sa zneškodní buď:






  — | zneškodnením na úradne schválenej skládke odpadu, na ktorej nie je identifikovateľné riziko úniku organizmu do okolia, napr. priesakom do poľnohospodársky využívanej plochy alebo kontaktu s vodnými zdrojmi, ktoré by sa mohli využívať na zavlažovanie poľnohospodárskej pôdy. Odpad sa prepraví priamo na skládku za dodržania kontrolných podmienok, čím sa zabezpečí, že nedôjde k strate odpadu,
  alebo |
| --- | --- | --- |

i)

Odpad zo zemiakov a rajčiakov (vrátane zamietnutých zemiakov, šúp a rajčiakov) a akéhokoľvek pevného odpadu súvisiaceho so zemiakmi a rajčiakmi (vrátane pôdy, kameňov a sutiny) sa zneškodní buď:

—

zneškodnením na úradne schválenej skládke odpadu, na ktorej nie je identifikovateľné riziko úniku organizmu do okolia, napr. priesakom do poľnohospodársky využívanej plochy alebo kontaktu s vodnými zdrojmi, ktoré by sa mohli využívať na zavlažovanie poľnohospodárskej pôdy. Odpad sa prepraví priamo na skládku za dodržania kontrolných podmienok, čím sa zabezpečí, že nedôjde k strate odpadu,

alebo

| — | spálením,
  alebo |
| --- | --- |

—

spálením,

alebo

| — | na základe iných opatrení za predpokladu dôkazu o tom, že neexistuje identifikovateľné riziko šírenia organizmu; tieto opatrenia sa oznámia Komisii a členským štátom. |
| --- | --- |

—

na základe iných opatrení za predpokladu dôkazu o tom, že neexistuje identifikovateľné riziko šírenia organizmu; tieto opatrenia sa oznámia Komisii a členským štátom.

| ii) | Tekutý odpad: pred zneškodnením podlieha tekutý odpad s obsahom nerozpustných tuhých látok filtrácii alebo procesu usádzania s cieľom odstrániť tieto tuhé látky. Tieto tuhé látky sa zneškodňujú tak, ako je uvedené v bode i).
  Tekutý odpad sa buď:






  — | zahreje v celom objeme na minimálne 60 °C v priebehu 30 minút pred zneškodnením,
  alebo |
| --- | --- | --- |

ii)

Tekutý odpad: pred zneškodnením podlieha tekutý odpad s obsahom nerozpustných tuhých látok filtrácii alebo procesu usádzania s cieľom odstrániť tieto tuhé látky. Tieto tuhé látky sa zneškodňujú tak, ako je uvedené v bode i).

Tekutý odpad sa buď:

—

zahreje v celom objeme na minimálne 60 °C v priebehu 30 minút pred zneškodnením,

alebo

| — | inak zneškodní na základe úradného schválenia a pod úradnou kontrolou tak, že neexistuje identifikovateľné riziko, že by odpad mohol prísť do kontaktu s poľnohospodársky využívanými plochami alebo vodnými zdrojmi, ktoré by sa mohli využívať na zavlažovanie poľnohospodárskej pôdy. Podrobnosti o tomto spôsobe sa oznámia ostatným členským štátom a Komisii. |
| --- | --- |

—

inak zneškodní na základe úradného schválenia a pod úradnou kontrolou tak, že neexistuje identifikovateľné riziko, že by odpad mohol prísť do kontaktu s poľnohospodársky využívanými plochami alebo vodnými zdrojmi, ktoré by sa mohli využívať na zavlažovanie poľnohospodárskej pôdy. Podrobnosti o tomto spôsobe sa oznámia ostatným členským štátom a Komisii.

Varianty uvedené v tejto prílohe sa taktiež uplatňujú na odpad súvisiaci s manipuláciou a spracovaním kontaminovaných partií.

---

(1)  Pozri Lelliott a Stead (1987).

1

(2)  Kontaktní vedeckí odborníci: pozri internetovú stránku http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

2

http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

(3)  Použite ako štandardný referenčný kmeň biovaru 2 R. solanacearum (rasa 3).

3

R. solanacearum

(4)  Potenciálny vzájomne reagujúci kmeň pri serologickom teste (IF a/alebo ELISA) s polyklónnymi antisérami.

4

(5)  Kmeň, z ktorého sa môže amplifikovať produkt PCR v niektorých laboratóriách rovnakej veľkosti, aká sa očakáva pri použití špecifických primerov OLI-1 a Y-2 (pozri dodatok 6).

5

(6)  Náklonný na vzájomnú reakciu pri väčšine testov, ale podľa doterajších zistení sa vyskytuje len na banánoch v Indonézii.

6

(7)  Na použitie pri homogenizačnej extrakčnej metóde

7

(8)  Metóda bola validovaná pomocou Taq polymerázy od Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL.

8

(9)  Metódy boli validované pomocou Taq polymerázy od Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL.

9

Poznámka: Pôvodne optimalizované pre teplotný cyklér MJ Research PTC 200 s Gibco Taq Polymerázou.

Poznámka:

Perkin Elmer AmpliTaq a pufor sa môžu rovnako používať pri rovnakých koncentráciách.

(10)  Metódy boli validované pomocou Taq polymerázy od Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL.

10

(11)  Koncentrácie primerov NS-5-F a NS-6-R boli optimalizované pre extrakciu pupkových koncov zemiakových hľúz pomocou metódy homogenizácie a čistenia DNA podľa Pastrika (2000) (pozri kapitolu VI.A.6.1.a). Reoptimalizácia koncentrácií reagentov sa bude vyžadovať, ak sa použije extrakcia potrepaním alebo iné metódy izolácie DNA.

11

(12)  Metódy boli validované pomocou Taq polymerázy od Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL.

12

(13)  Metódy boli validované pomocou Taq polymerázy od Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL.

13

---

| 27.7.2006 | SK | Úradný vestník Európskej únie | L 206/107 |
| --- | --- | --- | --- |

27.7.2006

SK

Úradný vestník Európskej únie

L 206/107

---

SMERNICA KOMISIE 2006/64/ES

z 18. júla 2006,

ktorou sa mení a dopĺňa smernica Rady 91/414/EHS s cieľom zaradiť clopyralid, cyprodinil, fosetyl a trinexapac medzi účinné látky

(Text s významom pre EHP)

KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV,

so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho spoločenstva,

so zreteľom na smernicu Rady 91/414/EHS z 15. júla 1991 o uvádzaní prípravkov na ochranu rastlín na trh (1), a najmä na jej článok 6 ods. 1,

keďže:

| (1) | V nariadeniach Komisie (ES) č. 451/2000 (2) a (ES) č. 703/2001 (3) sa ustanovujú podrobné pravidlá vykonávania druhej etapy pracovného programu uvedeného v článku 8 ods. 2 smernice 91/414/EHS a ustanovuje sa zoznam účinných látok, ktoré sa majú posúdiť s cieľom ich možného zaradenia do prílohy I k smernici 91/414/EHS. Tento zoznam obsahuje clopyralid, cyprodinil, fosetyl a trinexapac. |
| --- | --- |

(1)

V nariadeniach Komisie (ES) č. 451/2000 (2) a (ES) č. 703/2001 (3) sa ustanovujú podrobné pravidlá vykonávania druhej etapy pracovného programu uvedeného v článku 8 ods. 2 smernice 91/414/EHS a ustanovuje sa zoznam účinných látok, ktoré sa majú posúdiť s cieľom ich možného zaradenia do prílohy I k smernici 91/414/EHS. Tento zoznam obsahuje clopyralid, cyprodinil, fosetyl a trinexapac.

| (2) | Účinky týchto účinných látok na ľudské zdravie a životné prostredie boli posúdené v súlade s ustanoveniami nariadení (ES) č. 451/2000 a (ES) č. 703/2001 na rad použití, ktoré navrhol oznamovateľ. Okrem toho sa v týchto nariadeniach určujú spravodajské členské štáty, ktoré musia Európskemu úradu pre bezpečnosť potravín (EÚBP) predložiť príslušné hodnotiace správy a odporúčania v súlade s článkom 8 ods. 1 nariadenia (ES) č. 451/2000. Pre clopyralid bolo spravodajským členským štátom Fínsko a všetky príslušné informácie boli predložené 2. decembra 2003. Pre cyprodinil a fosetyl bolo spravodajským členským štátom Francúzsko a všetky príslušné informácie boli predložené 16. januára 2004, pokiaľ ide o cyprodinil, a 20. októbra 2003, pokiaľ ide o fosetyl. Pre trinexapac bolo spravodajským členským štátom Holandsko a všetky príslušné informácie boli predložené 7. novembra 2003. |
| --- | --- |

(2)

Účinky týchto účinných látok na ľudské zdravie a životné prostredie boli posúdené v súlade s ustanoveniami nariadení (ES) č. 451/2000 a (ES) č. 703/2001 na rad použití, ktoré navrhol oznamovateľ. Okrem toho sa v týchto nariadeniach určujú spravodajské členské štáty, ktoré musia Európskemu úradu pre bezpečnosť potravín (EÚBP) predložiť príslušné hodnotiace správy a odporúčania v súlade s článkom 8 ods. 1 nariadenia (ES) č. 451/2000. Pre clopyralid bolo spravodajským členským štátom Fínsko a všetky príslušné informácie boli predložené 2. decembra 2003. Pre cyprodinil a fosetyl bolo spravodajským členským štátom Francúzsko a všetky príslušné informácie boli predložené 16. januára 2004, pokiaľ ide o cyprodinil, a 20. októbra 2003, pokiaľ ide o fosetyl. Pre trinexapac bolo spravodajským členským štátom Holandsko a všetky príslušné informácie boli predložené 7. novembra 2003.

| (3) | Hodnotiace správy boli preskúmané spôsobom peer review členskými štátmi a EÚBP a predložené Komisii 14. decembra 2005 vo forme vedeckých správ EÚBP týkajúcich sa clopyralidu, cyprodinilu, fosetylu a trinexapacu (4). Tieto správy preskúmali členské štáty a Komisia v rámci Stáleho výboru pre potravinový reťazec a zdravie zvierat a boli finalizované 4. apríla 2006 vo forme revíznych správ Komisie týkajúcich sa clopyralidu, cyprodinilu, fosetylu a trinexapacu. |
| --- | --- |

(3)

Hodnotiace správy boli preskúmané spôsobom peer review členskými štátmi a EÚBP a predložené Komisii 14. decembra 2005 vo forme vedeckých správ EÚBP týkajúcich sa clopyralidu, cyprodinilu, fosetylu a trinexapacu (4). Tieto správy preskúmali členské štáty a Komisia v rámci Stáleho výboru pre potravinový reťazec a zdravie zvierat a boli finalizované 4. apríla 2006 vo forme revíznych správ Komisie týkajúcich sa clopyralidu, cyprodinilu, fosetylu a trinexapacu.

| (4) | Z rôznych vykonaných preskúmaní vyplýva, že možno očakávať, že prípravky na ochranu rastlín, ktoré obsahujú clopyralid, cyprodinil, fosetyl a trinexapac, vo všeobecnosti splnia požiadavky ustanovené v článku 5 ods. 1 písm. a) a b) smernice 91/414/EHS, najmä pokiaľ ide o použitia, ktoré boli preskúmané a podrobne opísané v revíznych správach Komisie. Je preto vhodné zaradiť tieto účinné látky do prílohy I, aby sa zabezpečilo, že vo všetkých členských štátoch sa povolenia týkajúce sa prípravkov na ochranu rastlín, ktoré obsahujú tieto účinné látky, môžu udeľovať v súlade s ustanoveniami tejto smernice. |
| --- | --- |

(4)

Z rôznych vykonaných preskúmaní vyplýva, že možno očakávať, že prípravky na ochranu rastlín, ktoré obsahujú clopyralid, cyprodinil, fosetyl a trinexapac, vo všeobecnosti splnia požiadavky ustanovené v článku 5 ods. 1 písm. a) a b) smernice 91/414/EHS, najmä pokiaľ ide o použitia, ktoré boli preskúmané a podrobne opísané v revíznych správach Komisie. Je preto vhodné zaradiť tieto účinné látky do prílohy I, aby sa zabezpečilo, že vo všetkých členských štátoch sa povolenia týkajúce sa prípravkov na ochranu rastlín, ktoré obsahujú tieto účinné látky, môžu udeľovať v súlade s ustanoveniami tejto smernice.

| (5) | Bez toho, aby bol dotknutý tento záver, je vhodné získať ďalšie informácie o určitých špecifických bodoch týkajúcich sa clopyralidu, cyprodinilu and fosetylu. V článku 6 ods. 1 smernice 91/414/ES sa ustanovuje, že zaradenie látky do prílohy I môže podliehať určitým podmienkam. Je preto vhodné vyžadovať, aby clopyralid, cyprodinil a fosetyl boli podrobené ďalšiemu testovaniu s cieľom potvrdiť posúdenie rizika v súvislosti s niektorými otázkami a aby takéto štúdie predložili oznamovatelia. |
| --- | --- |

(5)

Bez toho, aby bol dotknutý tento záver, je vhodné získať ďalšie informácie o určitých špecifických bodoch týkajúcich sa clopyralidu, cyprodinilu and fosetylu. V článku 6 ods. 1 smernice 91/414/ES sa ustanovuje, že zaradenie látky do prílohy I môže podliehať určitým podmienkam. Je preto vhodné vyžadovať, aby clopyralid, cyprodinil a fosetyl boli podrobené ďalšiemu testovaniu s cieľom potvrdiť posúdenie rizika v súvislosti s niektorými otázkami a aby takéto štúdie predložili oznamovatelia.

| (6) | Pred zaradením účinnej látky do prílohy I by mala byť poskytnutá primeraná lehota s cieľom umožniť členským štátom a zainteresovaným stranám pripraviť sa na splnenie nových požiadaviek, ktoré vyplynú z tohto zaradenia. |
| --- | --- |

(6)

Pred zaradením účinnej látky do prílohy I by mala byť poskytnutá primeraná lehota s cieľom umožniť členským štátom a zainteresovaným stranám pripraviť sa na splnenie nových požiadaviek, ktoré vyplynú z tohto zaradenia.

| (7) | Bez toho, aby boli dotknuté povinnosti stanovené v smernici 91/414/EHS v dôsledku zaradenia účinnej látky do prílohy I, by sa po zaradení mala členským štátom poskytnúť lehota šiestich mesiacov na preskúmanie existujúcich povolení týkajúcich sa prípravkov na ochranu rastlín s obsahom clopyralidu, cyprodinilu, fosetylu a trinexapacu, aby sa zabezpečilo splnenie požiadaviek ustanovených v smernici 91/414/EHS, najmä v jej článku 13, a príslušných podmienok stanovených v prílohe I. Členské štáty by mali v prípade potreby zmeniť, nahradiť alebo odobrať existujúce povolenia v súlade s ustanoveniami smernice 91/414/EHS. Odchylne od uvedeného termínu by malo byť poskytnuté dlhšie obdobie na predloženie a posúdenie úplnej dokumentácie prílohy III pre každý prípravok na ochranu rastlín pre každé plánované použitie v súlade s jednotnými zásadami ustanovenými v smernici 91/414/EHS. |
| --- | --- |

(7)

Bez toho, aby boli dotknuté povinnosti stanovené v smernici 91/414/EHS v dôsledku zaradenia účinnej látky do prílohy I, by sa po zaradení mala členským štátom poskytnúť lehota šiestich mesiacov na preskúmanie existujúcich povolení týkajúcich sa prípravkov na ochranu rastlín s obsahom clopyralidu, cyprodinilu, fosetylu a trinexapacu, aby sa zabezpečilo splnenie požiadaviek ustanovených v smernici 91/414/EHS, najmä v jej článku 13, a príslušných podmienok stanovených v prílohe I. Členské štáty by mali v prípade potreby zmeniť, nahradiť alebo odobrať existujúce povolenia v súlade s ustanoveniami smernice 91/414/EHS. Odchylne od uvedeného termínu by malo byť poskytnuté dlhšie obdobie na predloženie a posúdenie úplnej dokumentácie prílohy III pre každý prípravok na ochranu rastlín pre každé plánované použitie v súlade s jednotnými zásadami ustanovenými v smernici 91/414/EHS.

| (8) | Skúsenosti získané z predchádzajúcich zaradení účinných látok posúdených v rámci nariadenia Komisie (EHS) č. 3600/92 (5) do prílohy I k smernici 91/414/EHS ukázali, že pri výklade povinností držiteľov existujúcich povolení môžu vzniknúť ťažkosti, pokiaľ ide o prístup k údajom. S cieľom predísť ďalším ťažkostiam sa preto zdá, že je potrebné objasniť povinnosti členských štátov, najmä povinnosť overiť, či držiteľ povolenia preukáže prístup k dokumentácii spĺňajúcej požiadavky prílohy II k tejto smernici. Týmto objasnením sa však neustanovujú žiadne nové povinnosti pre členské štáty alebo držiteľov povolení v porovnaní so smernicami, ktoré boli doteraz prijaté a ktorými sa mení a dopĺňa príloha I. |
| --- | --- |

(8)

Skúsenosti získané z predchádzajúcich zaradení účinných látok posúdených v rámci nariadenia Komisie (EHS) č. 3600/92 (5) do prílohy I k smernici 91/414/EHS ukázali, že pri výklade povinností držiteľov existujúcich povolení môžu vzniknúť ťažkosti, pokiaľ ide o prístup k údajom. S cieľom predísť ďalším ťažkostiam sa preto zdá, že je potrebné objasniť povinnosti členských štátov, najmä povinnosť overiť, či držiteľ povolenia preukáže prístup k dokumentácii spĺňajúcej požiadavky prílohy II k tejto smernici. Týmto objasnením sa však neustanovujú žiadne nové povinnosti pre členské štáty alebo držiteľov povolení v porovnaní so smernicami, ktoré boli doteraz prijaté a ktorými sa mení a dopĺňa príloha I.

| (9) | Je preto vhodné smernicu 91/414/EHS zodpovedajúcim spôsobom zmeniť a doplniť. |
| --- | --- |

(9)

Je preto vhodné smernicu 91/414/EHS zodpovedajúcim spôsobom zmeniť a doplniť.

| (10) | Opatrenia ustanovené v tejto smernici sú v súlade so stanoviskom Stáleho výboru pre potravinový reťazec a zdravie zvierat, |
| --- | --- |

(10)

Opatrenia ustanovené v tejto smernici sú v súlade so stanoviskom Stáleho výboru pre potravinový reťazec a zdravie zvierat,

PRIJALA TÚTO SMERNICU:

Článok 1

Príloha I k smernici 91/414/ES sa mení a dopĺňa tak, ako je stanovené v prílohe k tejto smernici.

Článok 2

Členské štáty prijmú a uverejnia najneskôr do 31. októbra 2007 zákony, iné právne predpisy a správne opatrenia potrebné na dosiahnutie súladu s touto smernicou. Komisii bezodkladne oznámia znenie týchto ustanovení a tabuľku zhody medzi týmito ustanoveniami a touto smernicou.

Tieto ustanovenia uplatňujú od 1. novembra 2007.

Členské štáty uvedú priamo v prijatých ustanoveniach alebo pri ich úradnom uverejnení odkaz na túto smernicu. Podrobnosti o odkaze upravia členské štáty.

Článok 3

1.   V súlade so smernicou 91/414/EHS členské štáty v prípade potreby do 31. októbra 2007 zmenia alebo odoberú existujúce povolenia týkajúce sa prípravkov na ochranu rastlín s obsahom clopyralidu, cyprodinilu, fosetylu a trinexapacu ako účinných látok.

Do tohto dátumu overia najmä to, či podmienky prílohy I k tejto smernici týkajúce sa clopyralidu, cyprodinilu, fosetylu a trinexapacu sú splnené, s výnimkou tých, ktoré sú stanovené v časti B položiek týkajúcich sa týchto účinných látok, a či držiteľ povolenia má dokumentáciu spĺňajúcu požiadavky prílohy II k tejto smernici alebo má k nej prístup v súlade s podmienkami článku 13 tejto smernice.

2.   Odchylne od odseku 1 členské štáty prehodnotia každý povolený prípravok na ochranu rastlín s obsahom clopyralidu, cyprodinilu, fosetylu a trinexapacu ako jedinej účinnej látky alebo jednej z viacerých účinných látok, z ktorých všetky sú uvedené v prílohe I k smernici 91/414/EHS, najneskôr do 30. apríla 2007 v súlade s jednotnými zásadami ustanovenými v prílohe VI k smernici 91/414/EHS, na základe dokumentácie spĺňajúcej požiadavky prílohy III k tejto smernici a s prihliadnutím na časť B položiek v prílohe I k tejto smernici týkajúcich sa látok clopyralid, cyprodinil, fosetyl a trinexapac. Na základe tohto hodnotenia určia, či prípravok spĺňa podmienky stanovené v článku 4 ods. 1 písm. b), c), d) a e) smernice 91/414/EHS.

Po tomto určení členské štáty:

| a) | v prípade prípravku s obsahom niektorej z látok clopyralid, cyprodinil, fosetyl a trinexapac ako jedinej účinnej látky v prípade potreby zmenia alebo odoberú povolenie najneskôr do 30. apríla 2011,
  alebo |
| --- | --- |

a)

v prípade prípravku s obsahom niektorej z látok clopyralid, cyprodinil, fosetyl a trinexapac ako jedinej účinnej látky v prípade potreby zmenia alebo odoberú povolenie najneskôr do 30. apríla 2011,

alebo

| b) | v prípade prípravku s obsahom niektorej z látok clopyralid, cyprodinil, fosetyl a trinexapac ako jednej z viacerých účinných látok v prípade potreby zmenia alebo odoberú povolenie do 30. apríla 2011 alebo do dátumu určeného na takúto zmenu alebo odobratie v príslušnej smernici alebo smerniciach, ktorými sa príslušná látka alebo látky dopĺňajú do prílohy I k smernici 91/414/EHS, podľa toho, ktorý z týchto dátumov nastane neskôr. |
| --- | --- |

b)

v prípade prípravku s obsahom niektorej z látok clopyralid, cyprodinil, fosetyl a trinexapac ako jednej z viacerých účinných látok v prípade potreby zmenia alebo odoberú povolenie do 30. apríla 2011 alebo do dátumu určeného na takúto zmenu alebo odobratie v príslušnej smernici alebo smerniciach, ktorými sa príslušná látka alebo látky dopĺňajú do prílohy I k smernici 91/414/EHS, podľa toho, ktorý z týchto dátumov nastane neskôr.

Článok 4

Táto smernica nadobúda účinnosť 1. mája 2007.

Článok 5

Táto smernica je určená členským štátom.

V Bruseli 18. júla 2006

Za Komisiu

Markos KYPRIANOU

člen Komisie

---

(1)  Ú. v. ES L 230, 19.8.1991, s. 1. Smernica naposledy zmenená a doplnená smernicou Komisie 2006/45/ES (Ú. v. EÚ L 130, 18.5.2006, s. 27).

1

(2)  Ú. v. ES L 55, 29.2.2000, s. 25. Nariadenie naposledy zmenené a doplnené nariadením (ES) č. 1 044/2003 (Ú. v. EÚ L 151, 19.6.2003, s. 32).

2

(3)  Ú. v. ES L 98, 7.4.2001, s. 6.

3

(4)  Vedecká správa EÚBP (2005) 50, 1 - 65, Záver preskúmania spôsobom peer review účinnej látky clopyralid z hľadiska posúdenia rizika pesticídov (finalizovaná 14. decembra 2005).

4

Vedecká správa EÚBP (2005) 51, 1 - 78, Záver preskúmania spôsobom peer review účinnej látky cyprodinil z hľadiska posúdenia rizika pesticídov (finalizovaná 14. decembra 2005).

Vedecká správa EÚBP (2005) 54, 1 - 79, Záver preskúmania spôsobom peer review účinnej látky fosetyl z hľadiska posúdenia rizika pesticídov (finalizovaná 14. decembra 2005).

Vedecká správa EÚBP (2005) 57, 1 - 70, Záver preskúmania spôsobom peer review účinnej látky trinexapac z hľadiska posúdenia rizika pesticídov (finalizovaná 14. decembra 2005).

(5)  Ú. v. ES L 366, 15.12.1992, s. 10. Nariadenie naposledy zmenené a doplnené nariadením (ES) č. 2266/2000 (Ú. v. ES L 259, 13.10.2000, s. 27).

5

---

PRÍLOHA

Na koniec tabuľky v prílohe I k smernici 91/414/ES sa dopĺňa táto položka:

| Č. | Bežný názov, identifikačné čísla | Názov IUPAC | Čistota (1) | Nadobudnutie účinnosti | Skončenie platnosti zaradenia | Osobitné ustanovenia |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| „131 | Clopyralid
  č. CAS 1702-17-6
  č. CIPAC 455 | kyselina 3,6-dichlórpyridín-2-karboxylová | ≥ 950 g/kg | 1. mája 2007 | 30. apríla 2017 | ČASŤ A
  Povolené môžu byť len použitia ako herbicíd.
  ČASŤ B
  Pri posudzovaní žiadostí o povolenie prípravkov na ochranu rastlín, ktoré obsahujú clopyralid, na iné použitia ako na jarné aplikácie členské štáty venujú osobitnú pozornosť kritériám v článku 4 ods. 1 písm. b) a zabezpečia, aby pred udelením takéhoto povolenia boli poskytnuté všetky potrebné údaje a informácie.
  Na implementáciu jednotných zásad prílohy VI sa zohľadnia závery revíznej správy týkajúcej sa clopyralidu finalizovanej Stálym výborom pre potravinový reťazec a zdravie zvierat 4. apríla 2006 a najmä jej dodatky I a II.
  Pri tomto celkovom hodnotení musia členské štáty venovať osobitnú pozornosť:






  — | ochrane necielených rastlín a podzemnej vody v citlivých oblastiach. Podmienky povolenia by mali zahŕňať opatrenia na zníženie rizika a v prípade potreby by sa mali začať monitorovacie programy na overenie potenciálnej kontaminácie podzemnej vody v citlivých oblastiach. |

Č.

Bežný názov, identifikačné čísla

Názov IUPAC

Čistota (1)

Nadobudnutie účinnosti

Skončenie platnosti zaradenia

Osobitné ustanovenia

„131

Clopyralid

č. CAS 1702-17-6

č. CIPAC 455

kyselina 3,6-dichlórpyridín-2-karboxylová

≥ 950 g/kg

1. mája 2007

30. apríla 2017

ČASŤ A

Povolené môžu byť len použitia ako herbicíd.

ČASŤ B

Pri posudzovaní žiadostí o povolenie prípravkov na ochranu rastlín, ktoré obsahujú clopyralid, na iné použitia ako na jarné aplikácie členské štáty venujú osobitnú pozornosť kritériám v článku 4 ods. 1 písm. b) a zabezpečia, aby pred udelením takéhoto povolenia boli poskytnuté všetky potrebné údaje a informácie.

Na implementáciu jednotných zásad prílohy VI sa zohľadnia závery revíznej správy týkajúcej sa clopyralidu finalizovanej Stálym výborom pre potravinový reťazec a zdravie zvierat 4. apríla 2006 a najmä jej dodatky I a II.

Pri tomto celkovom hodnotení musia členské štáty venovať osobitnú pozornosť:

—

ochrane necielených rastlín a podzemnej vody v citlivých oblastiach. Podmienky povolenia by mali zahŕňať opatrenia na zníženie rizika a v prípade potreby by sa mali začať monitorovacie programy na overenie potenciálnej kontaminácie podzemnej vody v citlivých oblastiach.

Príslušné členské štáty požiadajú o predloženie ďalších štúdií s cieľom potvrdiť výsledky týkajúce sa metabolizmu živočíchov. Zabezpečia, aby oznamovatelia, na ktorých žiadosť bol clopyralid zaradený do tejto prílohy, predložili Komisii takéto štúdie do 2 rokov od nadobudnutia účinnosti tejto smernice.

132

Cyprodinil

č. CAS 121522-61-2

č. CIPAC 511

4-cyklopropyl-6-metyl-N-fenylpyrimidín-2-amín

≥ 980 g/kg

1. mája 2007

30. apríla 2017

ČASŤ A

Povolené môžu byť len použitia ako fungicíd.

ČASŤ B

Na implementáciu jednotných zásad prílohy VI sa zohľadnia závery revíznej správy týkajúcej sa cyprodinilu finalizovanej Stálym výborom pre potravinový reťazec a zdravie zvierat 4. apríla 2006, a najmä jej dodatky I a II.

Pri tomto celkovom hodnotení členské štáty:

| — | musia venovať osobitnú pozornosť bezpečnosti používateľov a zabezpečiť, aby v podmienkach používania bolo predpísané používanie primeraného osobného ochranného výstroja, |
| --- | --- |

—

musia venovať osobitnú pozornosť bezpečnosti používateľov a zabezpečiť, aby v podmienkach používania bolo predpísané používanie primeraného osobného ochranného výstroja,

| — | musia venovať osobitnú pozornosť ochrane vtákov, cicavcov a vodných organizmov. Podmienky povolenia by mali zahŕňať opatrenia na zníženie rizika, ako sú ochranné zóny. |
| --- | --- |

—

musia venovať osobitnú pozornosť ochrane vtákov, cicavcov a vodných organizmov. Podmienky povolenia by mali zahŕňať opatrenia na zníženie rizika, ako sú ochranné zóny.

Príslušné členské štáty požiadajú o predloženie ďalších štúdií s cieľom potvrdiť posúdenie rizika týkajúce sa vtákov a cicavcov a možnej prítomnosti rezíduí metabolitu CGA 304075 v potravinách živočíšneho pôvodu. Zabezpečia, aby oznamovatelia, na ktorých žiadosť bol cyprodinil zaradený do tejto prílohy, predložili Komisii takéto štúdie do 2 rokov od nadobudnutia účinnosti tejto smernice.

133

Fosetyl

č. CAS 15845-66-6

č. CIPAC 384

etyl-hydrogénfosfonát

≥ 960 g/kg vyjadrený ako alumínium-fosetyl

1. mája 2007

30. apríla 2017

ČASŤ A

Povolené môžu byť len použitia ako fungicíd.

ČASŤ B

Na implementáciu jednotných zásad prílohy VI sa zohľadnia závery revíznej správy týkajúcej sa fosetylu finalizovanej Stálym výborom pre potravinový reťazec a zdravie zvierat 4. apríla 2006 a najmä jej dodatky I a II.

Pri tomto celkovom hodnotení členské štáty:

| — | musia venovať osobitnú pozornosť ochrane vtákov, cicavcov, vodných organizmov a necielených článkonožcov. |
| --- | --- |

—

musia venovať osobitnú pozornosť ochrane vtákov, cicavcov, vodných organizmov a necielených článkonožcov.

Podmienky povolenia by, v prípade potreby, mali zahŕňať opatrenia na zníženie rizika, ako sú ochranné zóny.

Príslušné členské štáty požiadajú o predloženie ďalších štúdií s cieľom potvrdiť posúdenie rizika týkajúce sa necielených článkonožcov, najmä pokiaľ ide o ich regeneráciu na mieste použitia, a bylinožravých cicavcov. Zabezpečia, aby oznamovateľ, na ktorého žiadosť bol fosetyl zaradený do tejto prílohy, predložil Komisii takéto štúdie do 2 rokov od nadobudnutia účinnosti tejto smernice.

134

Trinexapac

č. CAS 104273-73-6

č. CIPAC 732

kyselina (RS)-4-cyklopropyl(hydroxy)metylén-3,5-dioxocyklohexánkarboxylová

≥ 940 g/kg (vyjadrený ako etyl-trinexapac)

1. mája 2007

30. apríla 2017

ČASŤ A

Povolené môžu byť len použitia ako rastový regulátor rastlín.

ČASŤ B

Na implementáciu jednotných zásad prílohy VI sa zohľadnia závery revíznej správy týkajúcej sa trinexapacu finalizovanej Stálym výborom pre potravinový reťazec a zdravie zvierat 4. apríla 2006, a najmä jej dodatky I a II.

Pri tomto celkovom hodnotení členské štáty:

| — | musia venovať osobitnú pozornosť ochrane vtákov a cicavcov. |
| --- | --- |

—

musia venovať osobitnú pozornosť ochrane vtákov a cicavcov.

Podmienky povolenia by, v prípade potreby, mali zahŕňať opatrenia na zníženie rizika.

---

(1)  Ďalšie podrobnosti o totožnosti a špecifikácii účinnej látky sú uvedené v revíznej správe.“

1

---