# Dziennik Urzędowy L 206/2006

| | ISSN 1725-5139 |
| --- | --- |
| Dziennik Urzędowy
  Unii Europejskiej | L 206 |
| | |
| Wydanie polskie | Legislacja | Tom 4927 lipca 2006 |

ISSN 1725-5139

Dziennik Urzędowy

Unii Europejskiej

L 206

Wydanie polskie

Legislacja

Tom 4927 lipca 2006

---

| Spis treści | | I   Akty, których publikacja jest obowiązkowa | Strona |
| --- | --- | --- | --- |
| | * | Dyrektywa Komisji 2006/60/WE z dnia 7 lipca 2006 r. zmieniająca załączniki do dyrektywy Rady 90/642/EWG w odniesieniu do najwyższych dopuszczalnych poziomów pozostałości trifloksystrobiny, tiabendazolu, abamektyny, benomylu, karbendazymu, tiofanatu metylowego, mychlobutanilu, glifosatu, trimetylosulfonium, fenpropimorfu i chlormekwatu (
  1
  ) | 1 |
| | * | Dyrektywa Komisji 2006/61/WE z dnia 7 lipca 2006 r. zmieniająca załączniki do dyrektyw Rady 86/362/EWG, 86/363/EWG i 90/642/EWG w odniesieniu do najwyższych dopuszczalnych poziomów pozostałości atrazyny, azynofosu etylowego, cyflutryny, etefonu, fentionu, metamidofosu, metomylu, parakwatu i triazofosu (
  1
  ) | 12 |
| | * | Dyrektywa Komisji 2006/62/WE z dnia 12 lipca 2006 r. zmieniająca załączniki do dyrektyw Rady 76/895/EWG, 86/362/EWG, 86/363/EWG i 90/642/EWG w odniesieniu do najwyższych dopuszczalnych poziomów pozostałości desmedifamu, fenmedifamu i chlorfenwinfosu (
  1
  ) | 27 |
| | * | Dyrektywa Komisji 2006/63/WE z dnia 14 lipca 2006 r. zmieniająca załączniki II–VII do dyrektywy Rady 98/57/WE w sprawie kontroli organizmu Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. | 36 |
| | * | Dyrektywa Komisji 2006/64/WE z dnia 18 lipca 2006 r. zmieniająca dyrektywę Rady 91/414/EWG w celu włączenia klopyralidu, cyprodynilu, fosetylu i trineksapaku jako substancji czynnych (
  1
  ) | 107 |

Spis treści

I   Akty, których publikacja jest obowiązkowa

Strona

*

Dyrektywa Komisji 2006/60/WE z dnia 7 lipca 2006 r. zmieniająca załączniki do dyrektywy Rady 90/642/EWG w odniesieniu do najwyższych dopuszczalnych poziomów pozostałości trifloksystrobiny, tiabendazolu, abamektyny, benomylu, karbendazymu, tiofanatu metylowego, mychlobutanilu, glifosatu, trimetylosulfonium, fenpropimorfu i chlormekwatu (
  1
  )

1

1

*

Dyrektywa Komisji 2006/61/WE z dnia 7 lipca 2006 r. zmieniająca załączniki do dyrektyw Rady 86/362/EWG, 86/363/EWG i 90/642/EWG w odniesieniu do najwyższych dopuszczalnych poziomów pozostałości atrazyny, azynofosu etylowego, cyflutryny, etefonu, fentionu, metamidofosu, metomylu, parakwatu i triazofosu (
  1
  )

1

12

*

Dyrektywa Komisji 2006/62/WE z dnia 12 lipca 2006 r. zmieniająca załączniki do dyrektyw Rady 76/895/EWG, 86/362/EWG, 86/363/EWG i 90/642/EWG w odniesieniu do najwyższych dopuszczalnych poziomów pozostałości desmedifamu, fenmedifamu i chlorfenwinfosu (
  1
  )

1

27

*

Dyrektywa Komisji 2006/63/WE z dnia 14 lipca 2006 r. zmieniająca załączniki II–VII do dyrektywy Rady 98/57/WE w sprawie kontroli organizmu Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

Ralstonia solanacearum

et al.

36

*

Dyrektywa Komisji 2006/64/WE z dnia 18 lipca 2006 r. zmieniająca dyrektywę Rady 91/414/EWG w celu włączenia klopyralidu, cyprodynilu, fosetylu i trineksapaku jako substancji czynnych (
  1
  )

1

107

| | |
| --- | --- |
| | (1)   Tekst mający znaczenie dla EOG. |

---

(1)   Tekst mający znaczenie dla EOG.

1

| PL | Akty, których tytuły wydrukowano zwykłą czcionką, odnoszą się do bieżącego zarządzania sprawami rolnictwa i generalnie zachowują ważność przez określony czas.
  Tytuły wszystkich innych aktów poprzedza gwiazdka, a drukuje się je czcionką pogrubioną. |
| --- | --- |

PL

Akty, których tytuły wydrukowano zwykłą czcionką, odnoszą się do bieżącego zarządzania sprawami rolnictwa i generalnie zachowują ważność przez określony czas.

Tytuły wszystkich innych aktów poprzedza gwiazdka, a drukuje się je czcionką pogrubioną.

---

I Akty, których publikacja jest obowiązkowa

| 27.7.2006 | PL | Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej | L 206/1 |
| --- | --- | --- | --- |

27.7.2006

PL

Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej

L 206/1

---

DYREKTYWA KOMISJI 2006/60/WE

z dnia 7 lipca 2006 r.

zmieniająca załączniki do dyrektywy Rady 90/642/EWG w odniesieniu do najwyższych dopuszczalnych poziomów pozostałości trifloksystrobiny, tiabendazolu, abamektyny, benomylu, karbendazymu, tiofanatu metylowego, mychlobutanilu, glifosatu, trimetylosulfonium, fenpropimorfu i chlormekwatu

(Tekst mający znaczenie dla EOG)

KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH,

uwzględniając Traktat ustanawiający Wspólnotę Europejską,

uwzględniając dyrektywę Rady 90/642/EWG z dnia 27 listopada 1990 r. w sprawie ustalania najwyższych dopuszczalnych poziomów pozostałości pestycydów w niektórych produktach pochodzenia roślinnego, w tym owocach i warzywach oraz na ich powierzchni (1), w szczególności jej art. 7,

uwzględniając dyrektywę Rady 91/414/EWG z dnia 15 lipca 1991 r. dotyczącą wprowadzania do obrotu środków ochrony roślin (2), w szczególności jej art. 4 ust. 1 lit. f),

a także mając na uwadze, co następuje:

| (1) | Zgodnie z dyrektywą 91/414/EWG państwa członkowskie są odpowiedzialne za udzielanie zezwoleń na środki ochrony roślin stosowane do określonych upraw. Takie zezwolenia muszą być udzielane na podstawie oceny wywoływanych przez nie skutków w zakresie zdrowia ludzi i zwierząt oraz ich wpływu na środowisko. Elementy, które należy uwzględnić podczas przeprowadzania ocen, obejmują narażenie użytkowników i osób postronnych oraz wpływ na środowisko lądowe, wodne i powietrzne, jak również wpływ na ludzi i zwierzęta poprzez konsumpcję pozostałości zalegających w uprawach, wobec których je zastosowano. |
| --- | --- |

(1)

Zgodnie z dyrektywą 91/414/EWG państwa członkowskie są odpowiedzialne za udzielanie zezwoleń na środki ochrony roślin stosowane do określonych upraw. Takie zezwolenia muszą być udzielane na podstawie oceny wywoływanych przez nie skutków w zakresie zdrowia ludzi i zwierząt oraz ich wpływu na środowisko. Elementy, które należy uwzględnić podczas przeprowadzania ocen, obejmują narażenie użytkowników i osób postronnych oraz wpływ na środowisko lądowe, wodne i powietrzne, jak również wpływ na ludzi i zwierzęta poprzez konsumpcję pozostałości zalegających w uprawach, wobec których je zastosowano.

| (2) | Najwyższe dopuszczalne poziomy pozostałości (NDP) odzwierciedlają stosowanie minimalnych ilości pestycydów w celu uzyskania skutecznej ochrony roślin, zastosowanych w ten sposób, aby ilość pozostałości była możliwie najmniejsza i dopuszczalna pod względem toksyczności, szczególnie w odniesieniu do szacowanej ilości pobieranej w pożywieniu. |
| --- | --- |

(2)

Najwyższe dopuszczalne poziomy pozostałości (NDP) odzwierciedlają stosowanie minimalnych ilości pestycydów w celu uzyskania skutecznej ochrony roślin, zastosowanych w ten sposób, aby ilość pozostałości była możliwie najmniejsza i dopuszczalna pod względem toksyczności, szczególnie w odniesieniu do szacowanej ilości pobieranej w pożywieniu.

| (3) | NDP dla pestycydów objętych dyrektywą 90/642/EWG powinny być poddawane kontroli i mogą zostać zmienione w celu uwzględnienia nowych lub zmienionych zastosowań. Komisja otrzymała informacje na temat nowych lub zmienionych zastosowań, na skutek czego należy zmienić poziom pozostałości trifloksystrobiny, tiabendazolu, abamektyny, grupy benomylu (benomylu, karbendazymu, tiofanatu metylowego), mychlobutanilu, glifosatu, trimetylosulfonium i fenpropimorfu. |
| --- | --- |

(3)

NDP dla pestycydów objętych dyrektywą 90/642/EWG powinny być poddawane kontroli i mogą zostać zmienione w celu uwzględnienia nowych lub zmienionych zastosowań. Komisja otrzymała informacje na temat nowych lub zmienionych zastosowań, na skutek czego należy zmienić poziom pozostałości trifloksystrobiny, tiabendazolu, abamektyny, grupy benomylu (benomylu, karbendazymu, tiofanatu metylowego), mychlobutanilu, glifosatu, trimetylosulfonium i fenpropimorfu.

| (4) | W odniesieniu do chlormekwatu Komisja otrzymała informacje uzasadniające przyjęcie tymczasowego NDP dla gruszek na okres trzech lat. |
| --- | --- |

(4)

W odniesieniu do chlormekwatu Komisja otrzymała informacje uzasadniające przyjęcie tymczasowego NDP dla gruszek na okres trzech lat.

| (5) | Długotrwałe narażenie konsumentów na działanie tych pestycydów za pośrednictwem produktów spożywczych mogących zawierać pozostałości tych pestycydów zostało oszacowane i ocenione zgodnie z procedurami i praktykami stosowanymi we Wspólnocie, z uwzględnieniem wytycznych opublikowanych przez Światową Organizację Zdrowia (3). W ocenie tej wzięto pod uwagę, że abamektyna i tiabendazol są również stosowane jako leki weterynaryjne dla zwierząt hodowlanych i najwyższy dopuszczalny poziom pozostałości dla tych dwóch substancji został ustalony zgodnie z przepisami rozporządzenia Rady (EWG) nr 2377/90 (4). Na podstawie tych ocen i obliczeń NDP w odniesieniu do tych pestycydów należy ustalić w taki sposób, aby zapewnić nieprzekraczanie akceptowanego dziennego pobrania. |
| --- | --- |

(5)

Długotrwałe narażenie konsumentów na działanie tych pestycydów za pośrednictwem produktów spożywczych mogących zawierać pozostałości tych pestycydów zostało oszacowane i ocenione zgodnie z procedurami i praktykami stosowanymi we Wspólnocie, z uwzględnieniem wytycznych opublikowanych przez Światową Organizację Zdrowia (3). W ocenie tej wzięto pod uwagę, że abamektyna i tiabendazol są również stosowane jako leki weterynaryjne dla zwierząt hodowlanych i najwyższy dopuszczalny poziom pozostałości dla tych dwóch substancji został ustalony zgodnie z przepisami rozporządzenia Rady (EWG) nr 2377/90 (4). Na podstawie tych ocen i obliczeń NDP w odniesieniu do tych pestycydów należy ustalić w taki sposób, aby zapewnić nieprzekraczanie akceptowanego dziennego pobrania.

| (6) | W przypadku benomylu, karbendazymu, tiofanatu metylowego, fenpropimorfu i chlormekwatu, dla których istnieje określona ostra dawka referencyjna (ARfD), ostre narażenie konsumentów na te pestycydy za pośrednictwem produktów spożywczych mogących zawierać pozostałości tych pestycydów zostało ocenione i obliczone zgodnie z procedurami i praktykami stosowanymi obecnie we Wspólnocie, z uwzględnieniem wytycznych opublikowanych przez Światową Organizację Zdrowia. Uwzględnione zostały opinie Komitetu Naukowego ds. Roślin, w szczególności jego rady i zalecenia dotyczące ochrony konsumentów przed produktami spożywczymi, wobec których stosowane są pestycydy (5). Na podstawie oceny dziennego spożycia NDP w odniesieniu do tych pestycydów należy ustalić w taki sposób, aby zapewnić nieprzekraczanie ostrej dawki referencyjnej. W odniesieniu do innych substancji ocena dostępnych informacji wskazuje, że nie jest wymagana ostra dawka referencyjna, a zatem nie jest potrzebna ocena krótkoterminowa. |
| --- | --- |

(6)

W przypadku benomylu, karbendazymu, tiofanatu metylowego, fenpropimorfu i chlormekwatu, dla których istnieje określona ostra dawka referencyjna (ARfD), ostre narażenie konsumentów na te pestycydy za pośrednictwem produktów spożywczych mogących zawierać pozostałości tych pestycydów zostało ocenione i obliczone zgodnie z procedurami i praktykami stosowanymi obecnie we Wspólnocie, z uwzględnieniem wytycznych opublikowanych przez Światową Organizację Zdrowia. Uwzględnione zostały opinie Komitetu Naukowego ds. Roślin, w szczególności jego rady i zalecenia dotyczące ochrony konsumentów przed produktami spożywczymi, wobec których stosowane są pestycydy (5). Na podstawie oceny dziennego spożycia NDP w odniesieniu do tych pestycydów należy ustalić w taki sposób, aby zapewnić nieprzekraczanie ostrej dawki referencyjnej. W odniesieniu do innych substancji ocena dostępnych informacji wskazuje, że nie jest wymagana ostra dawka referencyjna, a zatem nie jest potrzebna ocena krótkoterminowa.

| (7) | NDP są ustalane na granicy oznaczalności, w przypadku gdy dozwolone stosowanie środków ochrony roślin nie powoduje powstania wykrywalnych poziomów pozostałości pestycydów w produktach spożywczych lub na ich powierzchni lub gdy nie występują dozwolone przypadki stosowania, lub gdy stosowanie dozwolone przez państwa członkowskie nie zostało poparte niezbędnymi danymi, lub gdy stosowanie w państwach trzecich powodujące obecność pozostałości w produktach spożywczych lub na ich powierzchni, które mogą zostać wprowadzone do obrotu we Wspólnocie, nie zostało poparte niezbędnymi danymi. |
| --- | --- |

(7)

NDP są ustalane na granicy oznaczalności, w przypadku gdy dozwolone stosowanie środków ochrony roślin nie powoduje powstania wykrywalnych poziomów pozostałości pestycydów w produktach spożywczych lub na ich powierzchni lub gdy nie występują dozwolone przypadki stosowania, lub gdy stosowanie dozwolone przez państwa członkowskie nie zostało poparte niezbędnymi danymi, lub gdy stosowanie w państwach trzecich powodujące obecność pozostałości w produktach spożywczych lub na ich powierzchni, które mogą zostać wprowadzone do obrotu we Wspólnocie, nie zostało poparte niezbędnymi danymi.

| (8) | Należy zatem ustalić nowe NDP w odniesieniu do tych pestycydów. |
| --- | --- |

(8)

Należy zatem ustalić nowe NDP w odniesieniu do tych pestycydów.

| (9) | Ustalenie lub zmiana tymczasowych najwyższych dopuszczalnych poziomów pozostałości na poziomie Wspólnoty nie wyklucza ustalania przez państwa członkowskie tymczasowych najwyższych dopuszczalnych poziomów pozostałości glifosatu, trimetylosulfoniumi i trifloksystrobiny zgodnie z art. 4. ust. 1 lit. f) dyrektywy 91/414/EWG i załącznika VI do niej. Uznaje się, że okres czterech lat jest wystarczający na dopuszczenie dalszych zastosowań tych substancji. Po upływie tego okresu tymczasowy wspólnotowy najwyższy dopuszczalny poziom pozostałości stanie się definitywny. |
| --- | --- |

(9)

Ustalenie lub zmiana tymczasowych najwyższych dopuszczalnych poziomów pozostałości na poziomie Wspólnoty nie wyklucza ustalania przez państwa członkowskie tymczasowych najwyższych dopuszczalnych poziomów pozostałości glifosatu, trimetylosulfoniumi i trifloksystrobiny zgodnie z art. 4. ust. 1 lit. f) dyrektywy 91/414/EWG i załącznika VI do niej. Uznaje się, że okres czterech lat jest wystarczający na dopuszczenie dalszych zastosowań tych substancji. Po upływie tego okresu tymczasowy wspólnotowy najwyższy dopuszczalny poziom pozostałości stanie się definitywny.

| (10) | W wielu państwach członkowskich spożywa się łubin. Stosowanie glifosatu w odniesieniu do łubinu jest dozwolone. Należy zatem wprowadzić pozycję „łubin” i ustalić NDP dla łubinu, w celu ochrony konsumentów przed zbyt dużymi pozostałościami pestycydów stosowanych w odniesieniu do łubinu. |
| --- | --- |

(10)

W wielu państwach członkowskich spożywa się łubin. Stosowanie glifosatu w odniesieniu do łubinu jest dozwolone. Należy zatem wprowadzić pozycję „łubin” i ustalić NDP dla łubinu, w celu ochrony konsumentów przed zbyt dużymi pozostałościami pestycydów stosowanych w odniesieniu do łubinu.

| (11) | Należy zatem odpowiednio zmienić dyrektywę 90/642/EWG. |
| --- | --- |

(11)

Należy zatem odpowiednio zmienić dyrektywę 90/642/EWG.

| (12) | Środki przewidziane w niniejszej dyrektywie są zgodne z opinią Stałego Komitetu ds. Łańcucha Żywnościowego i Zdrowia Zwierząt, |
| --- | --- |

(12)

Środki przewidziane w niniejszej dyrektywie są zgodne z opinią Stałego Komitetu ds. Łańcucha Żywnościowego i Zdrowia Zwierząt,

PRZYJMUJE NINIEJSZĄ DYREKTYWĘ:

Artykuł 1

W dyrektywie 90/642/EWG wprowadza się następujące zmiany:

| 1) | w załączniku I, w grupie „3 Jadalne nasiona roślin strączkowych”, dodaje się pozycję „Łubin” w taki sposób, aby określenie „Cały produkt”, znajdujące się w ostatniej kolumnie, obejmowało wszystkie cztery pozycje; |
| --- | --- |

1)

w załączniku I, w grupie „3 Jadalne nasiona roślin strączkowych”, dodaje się pozycję „Łubin” w taki sposób, aby określenie „Cały produkt”, znajdujące się w ostatniej kolumnie, obejmowało wszystkie cztery pozycje;

| 2) | w załączniku II wprowadza się zmiany zgodnie z Załącznikiem do niniejszej dyrektywy. |
| --- | --- |

2)

w załączniku II wprowadza się zmiany zgodnie z Załącznikiem do niniejszej dyrektywy.

Artykuł 2

1.   Państwa członkowskie przyjmują i publikują najpóźniej do dnia 20 stycznia 2007 r. przepisy ustawowe, wykonawcze i administracyjne niezbędne do wykonania niniejszej dyrektywy, z wyjątkiem grupy benomylu i tiofanatu metylowego, dla których przyjmują i publikują wymienione przepisy do dnia 14 września 2006 r. oraz chlormekwatu, dla którego przepisy przyjmują i publikują do dnia 31 lipca 2006 r. Niezwłocznie przedstawiają one Komisji teksty tych przepisów oraz tabelę korelacji między tymi przepisami a niniejszą dyrektywą.

Państwa członkowskie stosują wymienione przepisy od dnia 21 stycznia 2007 r., z wyjątkiem przepisów dotyczących grupy benomylu i tiofanatu metylowego, które stosują od dnia 15 września 2006 r. oraz chlormekwatu, które stosują od dnia 1 sierpnia 2006 r.

Przepisy przyjęte przez państwa członkowskie zawierają odesłanie do niniejszej dyrektywy lub odesłanie takie towarzyszy ich urzędowej publikacji. Sposób dokonania takiego odesłania ustalany jest przez państwa członkowskie.

2.   Państwa członkowskie przedstawiają Komisji teksty głównych przepisów prawa krajowego, które przyjmują w obszarze objętym niniejszą dyrektywą.

Artykuł 3

Niniejsza dyrektywa wchodzi w życie dwudziestego dnia po jej opublikowaniu w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej.

Artykuł 4

Niniejsza dyrektywa skierowana jest do państw członkowskich.

Sporządzono w Brukseli, dnia 7 lipca 2006 r.

W imieniu Komisji

Markos KYPRIANOU

Członek Komisji

---

(1)  Dz.U. L 350 z 14.12.1990, str. 71. Dyrektywa ostatnio zmieniona dyrektywą Komisji 2006/53/WE (Dz.U. L 154 z 8.6.2006, str. 11).

1

(2)  Dz.U. L 230 z 19.8.1991, str. 1. Dyrektywa ostatnio zmieniona dyrektywą Komisji 2006/45/WE (Dz.U. L 130 z 18.5.2006, str. 27).

2

(3)  Wytyczne dotyczące przewidywania spożycia w żywności pozostałości pestycydów (poprawione) opracowane przez GEMS/Program Żywnościowy we współpracy z Komitetem Kodeksu ds. Pozostałości Pestycydów, opublikowane przez Światową Organizację Zdrowia w 1997 r. (WHO/FSO/FOS/97.7).

3

(4)  Dz.U. L 224 z 18.8.1990, str. 1. Rozporządzenie ostatnio zmienione rozporządzeniem Komisji (WE) nr 205/2006 (Dz.U. L 34 z 7.2.2006, str. 21).

4

(5)  Opinia dotycząca kwestii zmian załączników do dyrektyw Rady 86/362/EWG, 86/363/EWG oraz 90/642/EWG (Opinia wyrażona przez Komitet Naukowy ds. Roślin w dniu 14 lipca 1998 r.). Opinia na temat zmiennych pozostałości pestycydów w owocach i warzywach (Opinia wyrażona przez Komitet Naukowy ds. Roślin w dniu 14 lipca 1998 r.) http://europa.eu.int/comm/food/fs/sc/scp/outcome_ppp_en.html

5

---

ZAŁĄCZNIK

W załączniku II do dyrektywy 90/642/EWG wprowadza się następujące zmiany:

| 1) | przypis (t) przy pozycji chlormekwat dla gruszek otrzymuje następujące brzmienie: „Tymczasowy NDP 0,2 mg/kg stosuje się do dnia 31 lipca 2009 r.”; |
| --- | --- |

1)

przypis (t) przy pozycji chlormekwat dla gruszek otrzymuje następujące brzmienie: „Tymczasowy NDP 0,2 mg/kg stosuje się do dnia 31 lipca 2009 r.”;

| 2) | w części A kolumny dotyczące trifloksystrobiny, tiabendazolu, abamektyny, benomylu, karbendazymu, tiofanatu metylowego, mychlobutanilu, glifosatu, trimetylosulfonium i fenpropimorfu otrzymują następujące brzmienie: | Pozostałości pestycydów i najwyższy dopuszczalny poziom (w mg/kg) |
| --- | --- | --- |
| Grupy i przykłady poszczególnych produktów, do których stosuje się najwyższe dopuszczalne poziomy pozostałości | Trifloksystrobina | Tiabendazol | Abamektyna (suma awermektyny B1a, awermektyny B1b i izomeru delta-8,9 awermektyny B1a) | Suma benomylu i karbendazymu wyrażona jako karbendazym | Tiofanat metylowy | Mychlobutanil | Glifosat | Trimetylosulfonium, kation wynikającyc z zastosowania glifosatu | Fenpropimorf |
| „1. | Owoce, świeże, suszone lub niegotowane, zakonserwowane przez zamrażanie, niezawierające dodatku cukru; orzechy | | | | | | | | | |
| | i) | OWOCE CYTRUSOWE | 0,3 (2) | 5 | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 3 | | | 0,05 (1) |
| | | Grejpfrut | | | | | | | | | |
| | | Cytryny | | | | | | | | | |
| | | Limonki | | | | | | | | | |
| | | Mandarynki (łącznie z klementynkami i innymi mieszańcami) | | | | | | | 0,5 (2) | 0,5 (2) | |
| | | Pomarańcze | | | | | | | 0,5 (2) | 0,5 (2) | |
| | | Pomelo | | | | | | | | | |
| | | Pozostałe | | | | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| | ii) | ORZECHY Z DRZEW ORZECHOWYCH (w łupinach lub bez) | 0,02 (1)
   (2) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1) | 0,2 | 0,05 (1) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Migdały | | | | | | | | | |
| | | Orzechy brazylijskie | | | | | | | | | |
| | | Orzechy nerkowca | | | | | | | | | |
| | | Kasztany jadalne | | | | | | | | | |
| | | Orzechy kokosowe | | | | | | | | | |
| | | Orzechy laskowe | | | | | | | | | |
| | | Orzechy makadamia | | | | | | | | | |
| | | Orzeszki pekan | | | | | | | | | |
| | | Orzeszki sosnowe | | | | | | | | | |
| | | Pistacje | | | | | | | | | |
| | | Orzechy włoskie | | | | | | | | | |
| | | Pozostałe | | | | | | | | | |
| | iii) | OWOCE ZIARNKOWE | 0,5 (2) | | 0,01 (1) | 0,2 | 0,5 | 0,5 | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Jabłka | | 5 | | | | | | | |
| | | Gruszki | | 5 | | | | | | | |
| | | Pigwy | | | | | | | | | |
| | | Pozostałe | | 0,05 (1) | | | | | | | |
| | iv) | OWOCE PESTKOWE | | 0,05 (1) | 0,01 (1) | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Morele | 1 (2) | | | 0,2 | 2 | 0,3 | | | |
| | | Wiśnie i czereśnie | 1 (2) | | | 0,5 | 0,3 | 1 | | | |
| | | Brzoskwinie (łącznie z nektarynami i podobnymi mieszańcami) | 1 (2) | | | 0,2 | 2 | 0,5 | | | |
| | | Śliwki | 0,2 (2) | | | 0,5 | 0,3 | 0,5 | | | |
| | | Pozostałe | 0,02 (1)
   (2) | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | |
| | v) | JAGODY I DROBNE OWOCE | | 0,05 (1) | | | | | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | a) | Winogrona stołowe i do produkcji wina | 5 (2) | | 0,01 (1) | | | 1 | 0,5 (2) | | 0,05 (1) |
| | | | Winogrona stołowe | | | | 0,3 | 0,1 (1) | | | | |
| | | | Winogrona do produkcji wina | | | | 0,5 | 3 | | | | |
| | | b) | Truskawki (inne niż dzikie) | 0,5 (1)
   (2) | | 0,1 | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 1 | 0,1 (1)
   (2) | | 1 |
| | | c) | Owoce leśne (inne niż dzikie) | 0,02 (1)
   (2) | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | | 1 |
| | | | Jeżyny | | | 0,1 | | | 1 | | | |
| | | | Jeżyna popielica | | | | | | | | | |
| | | | Krzyżówka maliny z jeżyną | | | | | | | | | |
| | | | Maliny | | | 0,1 | | | 1 | | | |
| | | | Pozostałe | | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | d) | Inne drobne owoce i jagody (inne niż dzikie) | | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | | 1 |
| | | | Borówki czarne | | | | | | | | | |
| | | | Żurawina | | | | | | | | | |
| | | | Porzeczka (czerwona, biała i czarna) | 1 (2) | | | | | 1 | | | |
| | | | Agrest | 1 (2) | | | | | 1 | | | |
| | | | Pozostałe | 0,02 (1)
   (2) | | | | | 0,02 (1) | | | |
| | | e) | Dzikie jagody i dzikie owoce | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1)
   (2) | | 0,05 (1) |
| | vi) | OWOCE RÓŻNE | | | 0,01 (1) | | | | | | |
| | | Awokado | | 15 | | | | | | | |
| | | Banany | 0,05 (2) | 5 | | | | 2 | | | 2 |
| | | Daktyle | | | | | | | | | |
| | | Figi | | | | | | | | | |
| | | Kiwi | | | | | | | | | |
| | | Kumkwat | | | | | | | | | |
| | | Liczi | | | | | | | | | |
| | | Mango | | 5 | | | | | | | |
| | | Oliwki (stołowe) | | | | | | | | | |
| | | Oliwki (do produkcji oliwy) | | | | | | | 1 (2) | 1 (2) | |
| | | Papaja | | 10 | | 0,2 | 1 | | | | |
| | | Owoce męczennicy | | | | | | | | | |
| | | Ananasy | | | | | | | | | |
| | | Granaty | | | | | | | | | |
| | | Pozostałe | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| 2. | Warzywa świeże lub niegotowane, mrożone lub suszone | | | | | | | | | |
| | i) | WARZYWA KORZENIOWE I BULWIASTE | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Buraki | | | | | | | | | |
| | | Marchew | | | | | | 0,2 | | | |
| | | Maniok | | 15 | | | | | | | |
| | | Seler | | | | | | | | | |
| | | Chrzan | | | | | | 0,2 | | | |
| | | Karczoch jerozolimski | | | | | | | | | |
| | | Pasternak | | | | | | 0,2 | | | |
| | | Pietruszka - korzeń | | | | | | 0,2 | | | |
| | | Rzodkiewka | | | | | | | | | |
| | | Salsefia | | | | | | | | | |
| | | Słodki ziemniak | | 15 | | | | | | | |
| | | Brukiew | | | | | | | | | |
| | | Rzepa | | | | | | | | | |
| | | Pochrzyn | | 15 | | | | | | | |
| | | Pozostałe | | 0,05 (1) | | | | 0,02 (1) | | | |
| | ii) | WARZYWA CEBULOWE | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Czosnek | | | | | | | | | |
| | | Cebula | | | | | | | | | |
| | | Szalotka | | | | | | | | | |
| | | Dymka | | | | | | | | | |
| | | Pozostałe | | | | | | | | | |
| | iii) | WARZYWA OWOCOWE | | 0,05 (1) | | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | a) | Rośliny psiankowate | | | | | | | | | |
| | | | Pomidory | 0,5 (2) | | 0,02 | 0,5 | 2 | 0,3 | | | |
| | | | Papryka | | | 0,05 | | | 0,5 | | | |
| | | | Bakłażan | | | 0,02 | 0,5 | 2 | 0,3 | | | |
| | | | Ketmia jadalna | | | | 2 | 1 | | | | |
| | | | Pozostałe | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | |
| | | b) | Dyniowate – z jadalną skórką | 0,2 (2) | | 0,02 | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,1 | | | |
| | | | Ogórek | | | | | | | | | |
| | | | Korniszon | | | | | | | | | |
| | | | Cukinia | | | | | | | | | |
| | | | Pozostałe | | | | | | | | | |
| | | c) | Dyniowate – z niejadalną skórką | | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,3 | 0,2 | | | |
| | | | Melony | 0,3 (2) | | | | | | | | |
| | | | Dynie | | | | | | | | | |
| | | | Arbuzy | | | | | | | | | |
| | | | Pozostałe | 0,02 (1)
   (2) | | | | | | | | |
| | | d) | Kukurydza cukrowa | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | |
| | iv) | WARZYWA KAPUSTNE | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | a) | Kapustne kwitnące | | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | | | 0,05 (1) |
| | | | Brokuły | | 5 | | | | | | | |
| | | | Kalafior | | | | | | | | | |
| | | | Pozostałe | | 0,05 (1) | | | | | | | |
| | | b) | Kapustne głowiaste | | 0,05 (1) | | | | | | | |
| | | | Brukselka | | | | 0,5 | 1 | | | | 0,5 |
| | | | Kapusta głowiasta | | | | | | | | | |
| | | | Pozostałe | | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | | | 0,05 (1) |
| | | c) | Kapustne liściowe | | 0,05 (1) | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | | | 0,05 (1) |
| | | | Kapusta pekińska | | | | | | | | | |
| | | | Jarmuż | | | | | | | | | |
| | | | Pozostałe | | | | | | | | | |
| | | d) | Kalarepa | | 0,05 (1) | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | | | 0,05 (1) |
| | v) | WARZYWA LIŚCIOWE I ŚWIEŻE ZIOŁA | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | a) | Sałata i podobne | | | 0,1 | | | | | | |
| | | | Rzeżucha | | | | | | | | | |
| | | | Roszpunka jadalna | | | | | | 5 | | | |
| | | | Sałata | | | | | | | | | |
| | | | Endywia (cykoria endywia) | | | | | | | | | |
| | | | Rokietta siewna (rukola) | | | | | | | | | |
| | | | Liście i pędy kapustnych | | | | | | | | | |
| | | | Pozostałe | | | | | | 0,02 (1) | | | |
| | | b) | Szpinak i podobne | | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | | Szpinak | | | | | | | | | |
| | | | Boćwina | | | | | | | | | |
| | | | Pozostałe | | | | | | | | | |
| | | c) | Rukiew wodna | | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | d) | Cykoria warzywna | | 1 | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | e) | Zioła | | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | | Trybulka | | | | | | | | | |
| | | | Szczypiorek | | | | | | | | | |
| | | | Pietruszka – nać | | | | | | | | | |
| | | | Liście selera | | | | | | | | | |
| | | | Pozostałe | | | | | | | | | |
| | vi) | WARZYWA STRĄCZKOWE (świeże) | | 0,05 (1) | 0,01 (1) | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Fasola (w strąkach) | 0,5 (2) | | | 0,2 | 0,1 (1) | 0,3 | | | |
| | | Fasola (bez strąków) | | | | | | | | | |
| | | Groch (w strąkach) | | | | 0,2 | 0,1 (1) | | | | |
| | | Groch (bez strąków) | | | | | | | | | |
| | | Pozostałe | 0,02 (1)
   (2) | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | |
| | vii) | WARZYWA ŁODYGOWE (świeże) | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Szparagi | | | | | | | | | |
| | | Karczochy | | | | | | | | | |
| | | Seler | | | | | | | | | |
| | | Koper włoski | | | | | | | | | |
| | | Karczochy kuliste | | | | | | 0,5 | | | |
| | | Por | | | | | | | | | 1 |
| | | Rabarbar | | | | | | | | | |
| | | Pozostałe | | | | | | 0,02 (1) | | | 0,05 (1) |
| | viii) | GRZYBY | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | 0,05 (1) |
| | | a) | Grzyby uprawne | | 10 | | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | b) | Grzyby dziko rosnące | | 0,05 (1) | | | | | 50 (2) | 20 (2) | |
| 3. | Jadalne nasiona roślin strączkowych | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | Fasola | | | | | | | 2 (2) | | |
| | Soczewica | | | | | | | | | |
| | Groch | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Łubin | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Pozostałe | | | | | | | 0,1 (1)
   (2) | | |
| 4. | Nasiona oleiste | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) | 0,02 (1) | | | 0,05 (1) | | | 0,05 (1) |
| | Siemię lnu | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Orzeszki ziemne | | | | | | | | | |
| | Mak | | | | | | | | | |
| | Ziarna sezamu | | | | | | | | | |
| | Ziarna słonecznika | | | | | | | 20 (2) | | |
| | Nasiona rzepaku | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Ziarna soi | | | | 0,2 | 0,3 | | 20 (2) | 10 (2) | |
| | Nasiona gorczycy | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Nasiona bawełny | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Nasiona konopi | | | | | | | | | |
| | Pozostałe | | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| 5. | Ziemniaki | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,5 (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | Ziemniaki wczesne | | 0,05 (1) | | | | | | | |
| | Ziemniaki przechowalnicze | | 15 | | | | | | | |
| 6. | Herbata (liście i łodygi suszone, fermentowane lub w inny sposób przetwarzane z Camellia sinensis) | 0,05 (1)
   (2) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,05 (1) | 2 (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,1 (1) |
| 7. | Chmiel (suszony), w tym szyszki chmielu i niezagęszczony proszek | 30 (2) | 0,1 (1) | 0,05 | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 2 | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 10 |

2)

w części A kolumny dotyczące trifloksystrobiny, tiabendazolu, abamektyny, benomylu, karbendazymu, tiofanatu metylowego, mychlobutanilu, glifosatu, trimetylosulfonium i fenpropimorfu otrzymują następujące brzmienie:

Pozostałości pestycydów i najwyższy dopuszczalny poziom (w mg/kg)

Grupy i przykłady poszczególnych produktów, do których stosuje się najwyższe dopuszczalne poziomy pozostałości

Trifloksystrobina

Tiabendazol

Abamektyna (suma awermektyny B1a, awermektyny B1b i izomeru delta-8,9 awermektyny B1a)

Suma benomylu i karbendazymu wyrażona jako karbendazym

Tiofanat metylowy

Mychlobutanil

Glifosat

Trimetylosulfonium, kation wynikającyc z zastosowania glifosatu

Fenpropimorf

„1.

Owoce, świeże, suszone lub niegotowane, zakonserwowane przez zamrażanie, niezawierające dodatku cukru; orzechy

i)

OWOCE CYTRUSOWE

0,3 (2)

5

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

3

0,05 (1)

Grejpfrut

Cytryny

Limonki

Mandarynki (łącznie z klementynkami i innymi mieszańcami)

0,5 (2)

0,5 (2)

Pomarańcze

0,5 (2)

0,5 (2)

Pomelo

Pozostałe

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

ii)

ORZECHY Z DRZEW ORZECHOWYCH (w łupinach lub bez)

0,02 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)

0,2

0,05 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Migdały

Orzechy brazylijskie

Orzechy nerkowca

Kasztany jadalne

Orzechy kokosowe

Orzechy laskowe

Orzechy makadamia

Orzeszki pekan

Orzeszki sosnowe

Pistacje

Orzechy włoskie

Pozostałe

iii)

OWOCE ZIARNKOWE

0,5 (2)

0,01 (1)

0,2

0,5

0,5

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Jabłka

5

Gruszki

5

Pigwy

Pozostałe

0,05 (1)

iv)

OWOCE PESTKOWE

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Morele

1 (2)

0,2

2

0,3

Wiśnie i czereśnie

1 (2)

0,5

0,3

1

Brzoskwinie (łącznie z nektarynami i podobnymi mieszańcami)

1 (2)

0,2

2

0,5

Śliwki

0,2 (2)

0,5

0,3

0,5

Pozostałe

0,02 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

v)

JAGODY I DROBNE OWOCE

0,05 (1)

0,05 (1)
   (2)

a)

Winogrona stołowe i do produkcji wina

5 (2)

0,01 (1)

1

0,5 (2)

0,05 (1)

Winogrona stołowe

0,3

0,1 (1)

Winogrona do produkcji wina

0,5

3

b)

Truskawki (inne niż dzikie)

0,5 (1)
   (2)

0,1

0,1 (1)

0,1 (1)

1

0,1 (1)
   (2)

1

c)

Owoce leśne (inne niż dzikie)

0,02 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

1

Jeżyny

0,1

1

Jeżyna popielica

Krzyżówka maliny z jeżyną

Maliny

0,1

1

Pozostałe

0,01 (1)

0,02 (1)

d)

Inne drobne owoce i jagody (inne niż dzikie)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

1

Borówki czarne

Żurawina

Porzeczka (czerwona, biała i czarna)

1 (2)

1

Agrest

1 (2)

1

Pozostałe

0,02 (1)
   (2)

0,02 (1)

e)

Dzikie jagody i dzikie owoce

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)

vi)

OWOCE RÓŻNE

0,01 (1)

Awokado

15

Banany

0,05 (2)

5

2

2

Daktyle

Figi

Kiwi

Kumkwat

Liczi

Mango

5

Oliwki (stołowe)

Oliwki (do produkcji oliwy)

1 (2)

1 (2)

Papaja

10

0,2

1

Owoce męczennicy

Ananasy

Granaty

Pozostałe

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

2.

Warzywa świeże lub niegotowane, mrożone lub suszone

i)

WARZYWA KORZENIOWE I BULWIASTE

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Buraki

Marchew

0,2

Maniok

15

Seler

Chrzan

0,2

Karczoch jerozolimski

Pasternak

0,2

Pietruszka - korzeń

0,2

Rzodkiewka

Salsefia

Słodki ziemniak

15

Brukiew

Rzepa

Pochrzyn

15

Pozostałe

0,05 (1)

0,02 (1)

ii)

WARZYWA CEBULOWE

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Czosnek

Cebula

Szalotka

Dymka

Pozostałe

iii)

WARZYWA OWOCOWE

0,05 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

a)

Rośliny psiankowate

Pomidory

0,5 (2)

0,02

0,5

2

0,3

Papryka

0,05

0,5

Bakłażan

0,02

0,5

2

0,3

Ketmia jadalna

2

1

Pozostałe

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

b)

Dyniowate – z jadalną skórką

0,2 (2)

0,02

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1

Ogórek

Korniszon

Cukinia

Pozostałe

c)

Dyniowate – z niejadalną skórką

0,01 (1)

0,1 (1)

0,3

0,2

Melony

0,3 (2)

Dynie

Arbuzy

Pozostałe

0,02 (1)
   (2)

d)

Kukurydza cukrowa

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

iv)

WARZYWA KAPUSTNE

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

a)

Kapustne kwitnące

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

Brokuły

5

Kalafior

Pozostałe

0,05 (1)

b)

Kapustne głowiaste

0,05 (1)

Brukselka

0,5

1

0,5

Kapusta głowiasta

Pozostałe

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

c)

Kapustne liściowe

0,05 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

Kapusta pekińska

Jarmuż

Pozostałe

d)

Kalarepa

0,05 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

v)

WARZYWA LIŚCIOWE I ŚWIEŻE ZIOŁA

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

a)

Sałata i podobne

0,1

Rzeżucha

Roszpunka jadalna

5

Sałata

Endywia (cykoria endywia)

Rokietta siewna (rukola)

Liście i pędy kapustnych

Pozostałe

0,02 (1)

b)

Szpinak i podobne

0,01 (1)

0,02 (1)

Szpinak

Boćwina

Pozostałe

c)

Rukiew wodna

0,01 (1)

0,02 (1)

d)

Cykoria warzywna

1

0,01 (1)

0,02 (1)

e)

Zioła

0,01 (1)

0,02 (1)

Trybulka

Szczypiorek

Pietruszka – nać

Liście selera

Pozostałe

vi)

WARZYWA STRĄCZKOWE (świeże)

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Fasola (w strąkach)

0,5 (2)

0,2

0,1 (1)

0,3

Fasola (bez strąków)

Groch (w strąkach)

0,2

0,1 (1)

Groch (bez strąków)

Pozostałe

0,02 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

vii)

WARZYWA ŁODYGOWE (świeże)

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

Szparagi

Karczochy

Seler

Koper włoski

Karczochy kuliste

0,5

Por

1

Rabarbar

Pozostałe

0,02 (1)

0,05 (1)

viii)

GRZYBY

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,05 (1)

a)

Grzyby uprawne

10

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

b)

Grzyby dziko rosnące

0,05 (1)

50 (2)

20 (2)

3.

Jadalne nasiona roślin strączkowych

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Fasola

2 (2)

Soczewica

Groch

10 (2)

Łubin

10 (2)

Pozostałe

0,1 (1)
   (2)

4.

Nasiona oleiste

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,02 (1)

0,05 (1)

0,05 (1)

Siemię lnu

10 (2)

Orzeszki ziemne

Mak

Ziarna sezamu

Ziarna słonecznika

20 (2)

Nasiona rzepaku

10 (2)

Ziarna soi

0,2

0,3

20 (2)

10 (2)

Nasiona gorczycy

10 (2)

Nasiona bawełny

10 (2)

Nasiona konopi

Pozostałe

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

5.

Ziemniaki

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,5 (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Ziemniaki wczesne

0,05 (1)

Ziemniaki przechowalnicze

15

6.

Herbata (liście i łodygi suszone, fermentowane lub w inny sposób przetwarzane z Camellia sinensis)

0,05 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

2 (2)

0,05 (1)
   (2)

0,1 (1)

7.

Chmiel (suszony), w tym szyszki chmielu i niezagęszczony proszek

30 (2)

0,1 (1)

0,05

0,1 (1)

0,1 (1)

2

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

10

---

(1)  Wskazuje granicę oznaczalności.

(2)  Oznacza, że najwyższy dopuszczalny poziom pozostałości został ustanowiony tymczasowo zgodnie z art. 4 ust. 1 lit. f) dyrektywy 91/414/EWG.”

---

| 27.7.2006 | PL | Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej | L 206/12 |
| --- | --- | --- | --- |

27.7.2006

PL

Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej

L 206/12

---

DYREKTYWA KOMISJI 2006/61/WE

z dnia 7 lipca 2006 r.

zmieniająca załączniki do dyrektyw Rady 86/362/EWG, 86/363/EWG i 90/642/EWG w odniesieniu do najwyższych dopuszczalnych poziomów pozostałości atrazyny, azynofosu etylowego, cyflutryny, etefonu, fentionu, metamidofosu, metomylu, parakwatu i triazofosu

(Tekst mający znaczenie dla EOG)

KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH,

uwzględniając Traktat ustanawiający Wspólnotę Europejską,

uwzględniając dyrektywę Rady 86/362/EWG z dnia 24 lipca 1986 r. w sprawie ustalania najwyższych dopuszczalnych poziomów pozostałości pestycydów w zbożach i na ich powierzchni (1), w szczególności jej art. 10,

uwzględniając dyrektywę Rady 86/363/EWG z dnia 24 lipca 1986 r. w sprawie ustalania najwyższych dopuszczalnych poziomów pozostałości pestycydów w środkach spożywczych pochodzenia zwierzęcego i na ich powierzchni (2), w szczególności jej art. 10,

uwzględniając dyrektywę Rady 90/642/EWG z dnia 27 listopada 1990 r. w sprawie ustalania najwyższych dopuszczalnych poziomów pozostałości pestycydów w niektórych produktach pochodzenia roślinnego, w tym owocach i warzywach oraz na ich powierzchni (3), w szczególności jej art. 7,

uwzględniając dyrektywę Rady 91/414/EWG z dnia 15 lipca 1991 r. dotyczącą wprowadzania do obrotu środków ochrony roślin (4), w szczególności jej art. 4 ust. 1 lit. f),

a także mając na uwadze, co następuje:

| (1) | W przypadku zbóż i produktów pochodzenia roślinnego, w tym owoców i warzyw, poziomy pozostałości odzwierciedlają użycie minimalnych ilości pestycydów niezbędnych do osiągnięcia skutecznej ochrony roślin, stosowanych w taki sposób, aby ilości pozostałości były jak najmniejsze z praktycznego i toksykologicznego punktu widzenia, uwzględniając w szczególności ochronę środowiska naturalnego i przewidywane spożycie przez konsumentów. W przypadku środków spożywczych pochodzenia zwierzęcego poziomy pozostałości odzwierciedlają spożycie przez zwierzęta zbóż i produktów pochodzenia roślinnego, wobec których stosowano pestycydy, oraz, gdy ma to znaczenie, bezpośrednie skutki stosowania leków weterynaryjnych. Wspólnotowe najwyższe dopuszczalne poziomy pozostałości (NDP) stanowią górne granice ilości takich pozostałości, które mogą znajdować się w produktach przy przestrzeganiu dobrych praktyk rolniczych. |
| --- | --- |

(1)

W przypadku zbóż i produktów pochodzenia roślinnego, w tym owoców i warzyw, poziomy pozostałości odzwierciedlają użycie minimalnych ilości pestycydów niezbędnych do osiągnięcia skutecznej ochrony roślin, stosowanych w taki sposób, aby ilości pozostałości były jak najmniejsze z praktycznego i toksykologicznego punktu widzenia, uwzględniając w szczególności ochronę środowiska naturalnego i przewidywane spożycie przez konsumentów. W przypadku środków spożywczych pochodzenia zwierzęcego poziomy pozostałości odzwierciedlają spożycie przez zwierzęta zbóż i produktów pochodzenia roślinnego, wobec których stosowano pestycydy, oraz, gdy ma to znaczenie, bezpośrednie skutki stosowania leków weterynaryjnych. Wspólnotowe najwyższe dopuszczalne poziomy pozostałości (NDP) stanowią górne granice ilości takich pozostałości, które mogą znajdować się w produktach przy przestrzeganiu dobrych praktyk rolniczych.

| (2) | NDP dla pestycydów są poddawane kontroli i zmieniane celem uwzględnienia nowych informacji i danych. NDP są ustalane na poziomie granicy oznaczalności, w przypadku gdy dozwolone stosowanie środków ochrony roślin nie powoduje powstania wykrywalnych poziomów pozostałości pestycydów w produktach spożywczych lub na ich powierzchni, lub gdy nie występują dozwolone przypadki stosowania, lub gdy stosowanie dozwolone przez państwa członkowskie nie zostało poparte niezbędnymi danymi, lub gdy stosowanie w państwach trzecich powodujące obecność pozostałości w produktach spożywczych lub na ich powierzchni, które mogą zostać wprowadzone do obrotu we Wspólnocie, nie zostało poparte niezbędnymi danymi. |
| --- | --- |

(2)

NDP dla pestycydów są poddawane kontroli i zmieniane celem uwzględnienia nowych informacji i danych. NDP są ustalane na poziomie granicy oznaczalności, w przypadku gdy dozwolone stosowanie środków ochrony roślin nie powoduje powstania wykrywalnych poziomów pozostałości pestycydów w produktach spożywczych lub na ich powierzchni, lub gdy nie występują dozwolone przypadki stosowania, lub gdy stosowanie dozwolone przez państwa członkowskie nie zostało poparte niezbędnymi danymi, lub gdy stosowanie w państwach trzecich powodujące obecność pozostałości w produktach spożywczych lub na ich powierzchni, które mogą zostać wprowadzone do obrotu we Wspólnocie, nie zostało poparte niezbędnymi danymi.

| (3) | Komisja była informowana, że w odniesieniu do wielu pestycydów obecny NDP może wymagać zmiany w świetle dostępnych nowych informacji w zakresie toksykologii i spożycia przez konsumentów. Komisja zwróciła się z prośbą do właściwego państwa członkowskiego pełniącego rolę sprawozdawcy o przygotowanie wniosków w sprawie zmian wspólnotowych NDP. Wnioski takie zostały przedłożone Komisji. |
| --- | --- |

(3)

Komisja była informowana, że w odniesieniu do wielu pestycydów obecny NDP może wymagać zmiany w świetle dostępnych nowych informacji w zakresie toksykologii i spożycia przez konsumentów. Komisja zwróciła się z prośbą do właściwego państwa członkowskiego pełniącego rolę sprawozdawcy o przygotowanie wniosków w sprawie zmian wspólnotowych NDP. Wnioski takie zostały przedłożone Komisji.

| (4) | Długotrwałe i krótkotrwałe narażenie konsumentów na działanie pestycydów wymienionych w niniejszej dyrektywie za pośrednictwem produktów spożywczych zostało ponownie zbadane i ocenione zgodnie ze wspólnotowymi procedurami i praktykami, z uwzględnieniem wytycznych opublikowanych przez Światową Organizację Zdrowia (5). Na tej podstawie należy ustalić nowe NDP gwarantujące, że nie występuje niedopuszczalne narażenie konsumentów. |
| --- | --- |

(4)

Długotrwałe i krótkotrwałe narażenie konsumentów na działanie pestycydów wymienionych w niniejszej dyrektywie za pośrednictwem produktów spożywczych zostało ponownie zbadane i ocenione zgodnie ze wspólnotowymi procedurami i praktykami, z uwzględnieniem wytycznych opublikowanych przez Światową Organizację Zdrowia (5). Na tej podstawie należy ustalić nowe NDP gwarantujące, że nie występuje niedopuszczalne narażenie konsumentów.

| (5) | Gdzie jest to właściwe, ostre narażenie konsumentów na działanie wymienionych pestycydów za pośrednictwem każdego z produktów spożywczych, które mogą zawierać ich pozostałości, zostało ocenione zgodnie ze wspólnotowymi procedurami i praktykami, z uwzględnieniem wytycznych opublikowanych przez Światową Organizację Zdrowia. Stwierdzono, że obecność pozostałości pestycydów na poziomie lub poniżej nowych NDP nie spowoduje ostrych skutków toksycznych. |
| --- | --- |

(5)

Gdzie jest to właściwe, ostre narażenie konsumentów na działanie wymienionych pestycydów za pośrednictwem każdego z produktów spożywczych, które mogą zawierać ich pozostałości, zostało ocenione zgodnie ze wspólnotowymi procedurami i praktykami, z uwzględnieniem wytycznych opublikowanych przez Światową Organizację Zdrowia. Stwierdzono, że obecność pozostałości pestycydów na poziomie lub poniżej nowych NDP nie spowoduje ostrych skutków toksycznych.

| (6) | Za pośrednictwem Światowej Organizacji Handlu zostały przeprowadzone konsultacje z partnerami handlowymi Wspólnoty na temat nowych NDP, a ich uwagi w tej sprawie zostały uwzględnione. |
| --- | --- |

(6)

Za pośrednictwem Światowej Organizacji Handlu zostały przeprowadzone konsultacje z partnerami handlowymi Wspólnoty na temat nowych NDP, a ich uwagi w tej sprawie zostały uwzględnione.

| (7) | Należy zatem odpowiednio zmienić załączniki do dyrektyw 86/362/EWG, 86/363/EWG i 90/642/EWG. |
| --- | --- |

(7)

Należy zatem odpowiednio zmienić załączniki do dyrektyw 86/362/EWG, 86/363/EWG i 90/642/EWG.

| (8) | Środki przewidziane w niniejszej dyrektywie są zgodne z opinią Stałego Komitetu ds. Łańcucha Żywnościowego i Zdrowia Zwierząt, |
| --- | --- |

(8)

Środki przewidziane w niniejszej dyrektywie są zgodne z opinią Stałego Komitetu ds. Łańcucha Żywnościowego i Zdrowia Zwierząt,

PRZYJMUJE NINIEJSZĄ DYREKTYWĘ:

Artykuł 1

W załączniku II do dyrektywy 86/362/EWG wprowadza się zmiany zgodnie z załącznikiem I do niniejszej dyrektywy.

Artykuł 2

W załączniku II do dyrektywy 86/363/EWG wprowadza się zmiany zgodnie z załącznikiem II do niniejszej dyrektywy.

Artykuł 3

W załączniku II do dyrektywy 90/642/EWG wprowadza się zmiany zgodnie z załącznikiem III do niniejszej dyrektywy.

Artykuł 4

1.   Państwa członkowskie przyjmą i opublikują najpóźniej do dnia 20 stycznia 2007 r. przepisy ustawowe, wykonawcze i administracyjne niezbędne dla przestrzegania niniejszej dyrektywy. Niezwłocznie przedstawiają one Komisji teksty tych przepisów oraz tabelę korelacji między tymi przepisami a niniejszą dyrektywą.

Państwa członkowskie stosują te przepisy od dnia 21 stycznia 2007 r..

Przepisy przyjęte przez państwa członkowskie zawierają odesłanie do niniejszej dyrektywy lub odesłanie takie towarzyszy ich urzędowej publikacji. Sposób dokonania takiego odesłania ustalany jest przez państwa członkowskie.

2.   Państwa członkowskie przedstawiają Komisji teksty głównych przepisów prawa krajowego, które przyjmują w obszarze objętym niniejszą dyrektywą.

Artykuł 5

Niniejsza dyrektywa wchodzi w życie dwudziestego dnia po jej opublikowaniu w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej.

Artykuł 6

Niniejsza dyrektywa skierowana jest do państw członkowskich.

Sporządzono w Brukseli, dnia 7 lipca 2006 r.

W imieniu Komisji

Markos KYPRIANOU

Członek Komisji

---

(1)  Dz.U. L 221 z 7.8.1986, str. 37. Dyrektywa ostatnio zmieniona dyrektywą Komisji 2006/59/WE (Dz.U. L 175 z 29.6.2006, str. 61).

1

(2)  Dz.U. L 221 z 7.8.1986, str. 43. Dyrektywa ostatnio zmieniona dyrektywą Komisji 2006/59/WE.

2

(3)  Dz.U. L 350 z 14.12.1990, str. 71. Dyrektywa ostatnio zmieniona dyrektywą Komisji 2006/59/WE.

3

(4)  Dz.U. L 230 z 19.8.1991, str. 1. Dyrektywa ostatnio zmieniona dyrektywą Komisji 2006/45/WE (Dz.U. L 130 z 18.5.2006, str. 27).

4

(5)  Wytyczne dotyczące przewidywania spożycia w żywności pozostałości pestycydów (poprawione) opracowane przez GEMS/Program Żywnościowy we współpracy z Komitetem Kodeksu ds. Pozostałości Pestycydów, opublikowane przez Światową Organizację Zdrowia w 1997 r. (WHO/FSO/FOS/97.7).

5

---

ZAŁĄCZNIK I

W części A załącznika II do dyrektywy 86/362/EWG wprowadza się następujące zmiany:

| 1) | dodaje się następujący wiersz odnoszący się do atrazyny:






  Pozostałości pestycydów | Najwyższy dopuszczalny poziom w mg/kg |
| --- | --- | --- |
| „Atrazyna | 0,05 (1)

  ZBOŻA |

1)

dodaje się następujący wiersz odnoszący się do atrazyny:

Pozostałości pestycydów

Najwyższy dopuszczalny poziom w mg/kg

„Atrazyna

0,05 (1)

ZBOŻA

| 2) | wiersze odnoszące się do azynofosu etylowego, etefonu i triazofosu otrzymują następujące brzmienie:






  Pozostałości pestycydów | Najwyższy dopuszczalny poziom w mg/kg |
| --- | --- | --- |
| „Azynofos etylowy | 0,05 (2)

  ZBOŻA |
| Etefon | 0,5 jęczmień, żyto
  0,2 pszenżyto, pszenica
  0,05 (2) pozostałe zboża |
| Triazofos | 0,02 (2)

  ZBOŻA |

2)

wiersze odnoszące się do azynofosu etylowego, etefonu i triazofosu otrzymują następujące brzmienie:

Pozostałości pestycydów

Najwyższy dopuszczalny poziom w mg/kg

„Azynofos etylowy

0,05 (2)

ZBOŻA

Etefon

0,5 jęczmień, żyto

0,2 pszenżyto, pszenica

0,05 (2) pozostałe zboża

Triazofos

0,02 (2)

ZBOŻA

---

(1)  Wskazuje granicę oznaczalności.”

(2)  Wskazuje granicę oznaczalności.”

---

ZAŁĄCZNIK II

W części A załącznika II do dyrektywy 86/363/EWG wprowadza się następujące zmiany:

| 1) | w części A załącznika II do dyrektywy 86/363/EWG, wiersze odnoszące się do azynofosu etylowego i triazofosu otrzymują następujące brzmienie:








  Pozostałości pestycydów | Najwyższy dopuszczalny poziom w mg/kg |
| --- | --- | --- |
| | dla tłuszczu zawartego w mięsie, wyrobach mięsnych, podrobach i tłuszczach zwierzęcych wymienionych w załączniku I objętych kodem CN nr ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 i 1602 (1) (4) | dla mleka krowiego i pełnotłustego mleka krowiego wymienionych w załączniku I objętych kodem CN nr 0401; dla pozostałych środków spożywczych objętych kodem CN nr 0401, 0402, 0405 00 i 0406 zgodnie z (2) (4) | dla świeżych jaj bez skorup, dla jaj ptasich i żółtek jaj wymienionych w załączniku I objętych kodem CN nr 0407 00 i 0408 (3) (4) |
| „Azynofos etylowy | 0,01 (1) | 0,01 (1) | 0,01 (1) |
| Triazofos | 0,01 (1) | 0,01 (1) | 0,01 (1) |

1)

w części A załącznika II do dyrektywy 86/363/EWG, wiersze odnoszące się do azynofosu etylowego i triazofosu otrzymują następujące brzmienie:

Pozostałości pestycydów

Najwyższy dopuszczalny poziom w mg/kg

dla tłuszczu zawartego w mięsie, wyrobach mięsnych, podrobach i tłuszczach zwierzęcych wymienionych w załączniku I objętych kodem CN nr ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 i 1602 (1) (4)

dla mleka krowiego i pełnotłustego mleka krowiego wymienionych w załączniku I objętych kodem CN nr 0401; dla pozostałych środków spożywczych objętych kodem CN nr 0401, 0402, 0405 00 i 0406 zgodnie z (2) (4)

dla świeżych jaj bez skorup, dla jaj ptasich i żółtek jaj wymienionych w załączniku I objętych kodem CN nr 0407 00 i 0408 (3) (4)

„Azynofos etylowy

0,01 (1)

0,01 (1)

0,01 (1)

Triazofos

0,01 (1)

0,01 (1)

0,01 (1)

| 2) | w części A załącznika II do dyrektywy 86/363/EWG, wiersz odnoszący się do fentionu otrzymuje następujące brzmienie:








  Pozostałości pestycydów | Najwyższe poziomy w mg/kg |
| --- | --- | --- |
| | dla tłuszczu zawartego w mięsie, wyrobach mięsnych, podrobach i tłuszczach zwierzęcych wymienionych w załączniku I objętych kodem CN nr ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 i 1602 (1) (4) | dla mleka krowiego i pełnotłustego mleka krowiego wymienionych w załączniku I objętych kodem CN nr 0401; dla pozostałych środków spożywczych objętych kodem CN nr 0401, 0402, 0405 00 i 0406 zgodnie z (2) (4) | dla świeżych jaj bez skorup, dla jaj ptasich i żółtek jaj wymienionych w załączniku I objętych kodem CN nr 0407 00 i 0408 (3) (4) |
| „Fention i jego lotny odpowiednik, ich sulfotlenki i sulfony wyrażone jako fention | 0,05 (2) | 0,01 (2) | — |

2)

w części A załącznika II do dyrektywy 86/363/EWG, wiersz odnoszący się do fentionu otrzymuje następujące brzmienie:

Pozostałości pestycydów

Najwyższe poziomy w mg/kg

dla tłuszczu zawartego w mięsie, wyrobach mięsnych, podrobach i tłuszczach zwierzęcych wymienionych w załączniku I objętych kodem CN nr ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 i 1602 (1) (4)

dla mleka krowiego i pełnotłustego mleka krowiego wymienionych w załączniku I objętych kodem CN nr 0401; dla pozostałych środków spożywczych objętych kodem CN nr 0401, 0402, 0405 00 i 0406 zgodnie z (2) (4)

dla świeżych jaj bez skorup, dla jaj ptasich i żółtek jaj wymienionych w załączniku I objętych kodem CN nr 0407 00 i 0408 (3) (4)

„Fention i jego lotny odpowiednik, ich sulfotlenki i sulfony wyrażone jako fention

0,05 (2)

0,01 (2)

—

---

(1)  Wskazuje granicę oznaczalności.”

(2)  Wskazuje granicę oznaczaloności.”

---

ZAŁĄCZNIK III

W części A załącznika II do dyrektywy 90/642/EWG wprowadza się następujące zmiany:

| 1) | dodaje się następującą kolumnę dla fentionu:









  Grupy i przykłady poszczególnych produktów, do których stosuje się NDP | Fention i jego lotny odpowiednik, ich sulfotlenki i sulfony wyrażone jako fention |
| --- | --- | --- |
| „1. | Owoce, świeże, suszone lub niegotowane, zakonserwowane przez zamrażanie, niezawierające dodatku cukru; orzechy | |
| | (i) | OWOCE CYTRUSOWE | 3 |
| | | Grejpfrut | |
| | | Cytryny | |
| | | Limonki | |
| | | Mandarynki (łącznie z klementynkami i innymi mieszańcami) | |
| | | Pomarańcze | |
| | | Pomelo | |
| | | Pozostałe | |
| | (ii) | ORZECHY Z DRZEW ORZECHOWYCH (w łupinach lub bez) | 0,01 (1) |
| | | Migdały | |
| | | Orzechy brazylijskie | |
| | | Orzechy nerkowca | |
| | | Kasztany jadalne | |
| | | Orzechy kokosowe | |
| | | Orzechy laskowe | |
| | | Orzechy makadamia | |
| | | Orzeszki pekan | |
| | | Orzeszki sosnowe | |
| | | Pistacje | |
| | | Orzechy włoskie | |
| | | Pozostałe | |
| | (iii) | OWOCE ZIARNKOWE | 0,01 (1) |
| | | Jabłka | |
| | | Gruszki | |
| | | Pigwy | |
| | | Pozostałe | |
| | (iv) | OWOCE PESTKOWE | |
| | | Morele | |
| | | Wiśnie i czereśnie | 2 |
| | | Brzoskwinie (łącznie z nektarynami i podobnymi mieszańcami) | |
| | | Śliwki | |
| | | Pozostałe | 0,01 (1) |
| | (v) | JAGODY I DROBNE OWOCE | 0,01 (1) |
| | | (a) | Winogrona stołowe i do produkcji wina | |
| | | | Winogrona stołowe | |
| | | | Winogrona do produkcji wina | |
| | | (b) | Truskawki (inne niż dzikie) | |
| | | (c) | Owoce leśne (inne niż dzikie) | |
| | | | Jeżyny | |
| | | | Jeżyna popielica | |
| | | | Krzyżówka maliny z jeżyną | |
| | | | Maliny | |
| | | | Pozostałe | |
| | | (d) | Inne drobne owoce i jagody (inne niż dzikie) | |
| | | | Borówki czarne | |
| | | | Żurawina | |
| | | | Porzeczka (czerwona, biała i czarna) | |
| | | | Agrest | |
| | | | Pozostałe | |
| | | (e) | Dzikie jagody i dzikie owoce | |
| | (vi) | OWOCE RÓŻNE | |
| | | Awokado | |
| | | Banany | |
| | | Daktyle | |
| | | Figi | |
| | | Kiwi | |
| | | Kumkwat | |
| | | Liczi | |
| | | Mango | |
| | | Oliwki (stołowe) | 1 |
| | | Oliwki (do produkcji oliwy) | 1 |
| | | Papaja | |
| | | Owoce męczennicy | |
| | | Ananasy | |
| | | Pozostałe | 0,01 (1) |
| 2. | Warzywa świeże lub niegotowane, mrożone lub suszone | 0,01 (1) |
| | (i) | WARZYWA KORZENIOWE I BULWIASTE | |
| | | Buraki | |
| | | Marchew | |
| | | Maniok | |
| | | Seler | |
| | | Chrzan | |
| | | Karczoch jerozolimski | |
| | | Pasternak | |
| | | Pietruszka – korzeń | |
| | | Rzodkiewka | |
| | | Salsefia | |
| | | Słodki ziemniak | |
| | | Brukiew | |
| | | Rzepa | |
| | | Pochrzyn | |
| | | Pozostałe | |
| | (ii) | WARZYWA CEBULOWE | |
| | | Czosnek | |
| | | Cebula | |
| | | Szalotka | |
| | | Dymka | |
| | | Pozostałe | |
| | (iii) | WARZYWA OWOCOWE | |
| | | (a) | Rośliny psiankowate | |
| | | | Pomidory | |
| | | | Papryka | |
| | | | Bakłażan | |
| | | | Ketmia jadalna (okra) | |
| | | | Pozostałe | |
| | | (b) | Dyniowate – z jadalną skórką | |
| | | | Ogórek | |
| | | | Korniszon | |
| | | | Cukinia | |
| | | | Pozostałe | |
| | | (c) | Dyniowate – z niejadalną skórką | |
| | | | Melony | |
| | | | Dynie | |
| | | | Arbuzy | |
| | | | Pozostałe | |
| | | (d) | Kukurydza cukrowa | |
| | (iv) | WARZYWA KAPUSTNE | |
| | | (a) | Kapustne kwitnące | |
| | | | Brokuły | |
| | | | Kalafior | |
| | | | Pozostałe | |
| | | (b) | Kapustne głowiaste | |
| | | | Brukselka | |
| | | | Kapusta głowiasta | |
| | | | Pozostałe | |
| | | (c) | Kapustne liściowe | |
| | | | Kapusta pekińska | |
| | | | Jarmuż | |
| | | | Pozostałe | |
| | | (d) | Kalarepa | |
| | (v) | WARZYWA LIŚCIOWE I ŚWIEŻE ZIOŁA | |
| | | (a) | Sałata i podobne | |
| | | | Rzeżucha | |
| | | | Roszpunka jadalna | |
| | | | Sałata | |
| | | | Endywia (cykoria endywia) | |
| | | | Rokietta siewna (rukola) | |
| | | | Liście i pędy kapustnych | |
| | | | Pozostałe | |
| | | (b) | Szpinak i podobne | |
| | | | Szpinak | |
| | | | Boćwina | |
| | | | Pozostałe | |
| | | (c) | Rukiew wodna | |
| | | (d) | Cykoria warzywna | |
| | | (e) | Zioła | |
| | | | Trybulka | |
| | | | Szczypiorek | |
| | | | Pietruszka – nać | |
| | | | Liście selera | |
| | | | Pozostałe | |
| | (vi) | WARZYWA STRĄCZKOWE (świeże) | |
| | | Fasola (w strąkach) | |
| | | Fasola (bez strąków) | |
| | | Groch (w strąkach) | |
| | | Groch (bez strąków) | |
| | | Pozostałe | |
| | (vii) | WARZYWA ŁODYGOWE (świeże) | |
| | | Szparagi | |
| | | Karczochy | |
| | | Seler | |
| | | Koper włoski | |
| | | Karczochy kuliste | |
| | | Por | |
| | | Rabarbar | |
| | | Pozostałe | |
| | (viii) | GRZYBY | |
| | | (a) | Grzyby uprawne | |
| | | (b) | Grzyby dziko rosnące | |
| 3. | Jadalne nasiona roślin strączkowych | 0,01 (1) |
| | Fasola | |
| | Soczewica | |
| | Groch | |
| | Pozostałe | |
| 4. | Nasiona oleiste | 0,02 (1) |
| | Siemię lnu | |
| | Orzeszki ziemne | |
| | Mak | |
| | Ziarna sezamu | |
| | Ziarna słonecznika | |
| | Nasiona rzepaku | |
| | Ziarna soi | |
| | Nasiona gorczycy | |
| | Nasiona bawełny | |
| | Nasiona konopi | |
| | Pozostałe | |
| 5. | Ziemniaki | 0,01 (1) |
| | Ziemniaki wczesne | |
| | Ziemniaki przechowalnicze | |
| 6. | Herbata (liście i łodygi suszone, fermentowane lub w inny sposób przetwarzane z Camellia sinensis) | 0,1 (1) |
| 7. | Chmiel (suszony), w tym szyszki chmielu i niezagęszzony proszek | 0,1 (1) |

1)

dodaje się następującą kolumnę dla fentionu:

Grupy i przykłady poszczególnych produktów, do których stosuje się NDP

Fention i jego lotny odpowiednik, ich sulfotlenki i sulfony wyrażone jako fention

„1.

Owoce, świeże, suszone lub niegotowane, zakonserwowane przez zamrażanie, niezawierające dodatku cukru; orzechy

(i)

OWOCE CYTRUSOWE

3

Grejpfrut

Cytryny

Limonki

Mandarynki (łącznie z klementynkami i innymi mieszańcami)

Pomarańcze

Pomelo

Pozostałe

(ii)

ORZECHY Z DRZEW ORZECHOWYCH (w łupinach lub bez)

0,01 (1)

Migdały

Orzechy brazylijskie

Orzechy nerkowca

Kasztany jadalne

Orzechy kokosowe

Orzechy laskowe

Orzechy makadamia

Orzeszki pekan

Orzeszki sosnowe

Pistacje

Orzechy włoskie

Pozostałe

(iii)

OWOCE ZIARNKOWE

0,01 (1)

Jabłka

Gruszki

Pigwy

Pozostałe

(iv)

OWOCE PESTKOWE

Morele

Wiśnie i czereśnie

2

Brzoskwinie (łącznie z nektarynami i podobnymi mieszańcami)

Śliwki

Pozostałe

0,01 (1)

(v)

JAGODY I DROBNE OWOCE

0,01 (1)

(a)

Winogrona stołowe i do produkcji wina

Winogrona stołowe

Winogrona do produkcji wina

(b)

Truskawki (inne niż dzikie)

(c)

Owoce leśne (inne niż dzikie)

Jeżyny

Jeżyna popielica

Krzyżówka maliny z jeżyną

Maliny

Pozostałe

(d)

Inne drobne owoce i jagody (inne niż dzikie)

Borówki czarne

Żurawina

Porzeczka (czerwona, biała i czarna)

Agrest

Pozostałe

(e)

Dzikie jagody i dzikie owoce

(vi)

OWOCE RÓŻNE

Awokado

Banany

Daktyle

Figi

Kiwi

Kumkwat

Liczi

Mango

Oliwki (stołowe)

1

Oliwki (do produkcji oliwy)

1

Papaja

Owoce męczennicy

Ananasy

Pozostałe

0,01 (1)

2.

Warzywa świeże lub niegotowane, mrożone lub suszone

0,01 (1)

(i)

WARZYWA KORZENIOWE I BULWIASTE

Buraki

Marchew

Maniok

Seler

Chrzan

Karczoch jerozolimski

Pasternak

Pietruszka – korzeń

Rzodkiewka

Salsefia

Słodki ziemniak

Brukiew

Rzepa

Pochrzyn

Pozostałe

(ii)

WARZYWA CEBULOWE

Czosnek

Cebula

Szalotka

Dymka

Pozostałe

(iii)

WARZYWA OWOCOWE

(a)

Rośliny psiankowate

Pomidory

Papryka

Bakłażan

Ketmia jadalna (okra)

Pozostałe

(b)

Dyniowate – z jadalną skórką

Ogórek

Korniszon

Cukinia

Pozostałe

(c)

Dyniowate – z niejadalną skórką

Melony

Dynie

Arbuzy

Pozostałe

(d)

Kukurydza cukrowa

(iv)

WARZYWA KAPUSTNE

(a)

Kapustne kwitnące

Brokuły

Kalafior

Pozostałe

(b)

Kapustne głowiaste

Brukselka

Kapusta głowiasta

Pozostałe

(c)

Kapustne liściowe

Kapusta pekińska

Jarmuż

Pozostałe

(d)

Kalarepa

(v)

WARZYWA LIŚCIOWE I ŚWIEŻE ZIOŁA

(a)

Sałata i podobne

Rzeżucha

Roszpunka jadalna

Sałata

Endywia (cykoria endywia)

Rokietta siewna (rukola)

Liście i pędy kapustnych

Pozostałe

(b)

Szpinak i podobne

Szpinak

Boćwina

Pozostałe

(c)

Rukiew wodna

(d)

Cykoria warzywna

(e)

Zioła

Trybulka

Szczypiorek

Pietruszka – nać

Liście selera

Pozostałe

(vi)

WARZYWA STRĄCZKOWE (świeże)

Fasola (w strąkach)

Fasola (bez strąków)

Groch (w strąkach)

Groch (bez strąków)

Pozostałe

(vii)

WARZYWA ŁODYGOWE (świeże)

Szparagi

Karczochy

Seler

Koper włoski

Karczochy kuliste

Por

Rabarbar

Pozostałe

(viii)

GRZYBY

(a)

Grzyby uprawne

(b)

Grzyby dziko rosnące

3.

Jadalne nasiona roślin strączkowych

0,01 (1)

Fasola

Soczewica

Groch

Pozostałe

4.

Nasiona oleiste

0,02 (1)

Siemię lnu

Orzeszki ziemne

Mak

Ziarna sezamu

Ziarna słonecznika

Nasiona rzepaku

Ziarna soi

Nasiona gorczycy

Nasiona bawełny

Nasiona konopi

Pozostałe

5.

Ziemniaki

0,01 (1)

Ziemniaki wczesne

Ziemniaki przechowalnicze

6.

Herbata (liście i łodygi suszone, fermentowane lub w inny sposób przetwarzane z Camellia sinensis)

0,1 (1)

7.

Chmiel (suszony), w tym szyszki chmielu i niezagęszzony proszek

0,1 (1)

| 2) | kolumny dotyczące atrazyny, azynofosu etylowego, cyflutryny, etefonu, metamidofosu, metomylu, parakwatu i triazofosu otrzymują następujące brzmienie:
















  Grupy i przykłady poszczególnych produktów, do których stosuje się NDP | Atrazyna | Azynofos etylowy | Cyflutryna, włączając inne mieszanki składników izomerycznych (suma izomerów) | Etefon | Metamidofos | Metomyl/tiodikarb (suma wyrażona jako metomyl) | Parakwat | Triazofos |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| „1. | Owoce, świeże, suszone lub niegotowane, zakonserwowane przez zamrażanie, niezawierające dodatku cukru; orzechy | 0,05 (2) | 0,02 (2) | | | | | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | (i) | OWOCE CYTRUSOWE | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | | | |
| | | Grejpfrut | | | | | | 0,5 | | |
| | | Cytryny | | | | | | 1 | | |
| | | Limonki | | | | | | 1 | | |
| | | Mandarynki (łącznie z klementynkami i innymi mieszańcami) | | | | | | 1 | | |
| | | Pomarańcze | | | | | | 0,5 | | |
| | | Pomelo | | | | | | 0,5 | | |
| | | Pozostałe | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | (ii) | ORZECHY Z DRZEW ORZECHOWYCH (w łupinach lub bez) | | | 0,02 (2) | 0,1 | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | Migdały | | | | | | | | |
| | | Orzechy brazylijskie | | | | | | | | |
| | | Orzechy nerkowca | | | | | | | | |
| | | Kasztany jadalne | | | | | | | | |
| | | Orzechy kokosowe | | | | | | | | |
| | | Orzechy laskowe | | | | | | | | |
| | | Orzechy makadamia | | | | | | | | |
| | | Orzeszki pekan | | | | | | | | |
| | | Orzeszki sosnowe | | | | | | | | |
| | | Pistacje | | | | | | | | |
| | | Orzechy włoskie | | | | | | | | |
| | | Pozostałe | | | | | | | | |
| | (iii) | OWOCE ZIARNKOWE | | | 0,2 | | 0,01 (2) | 0,2 | | |
| | | Jabłka | | | | 0,5 | | | | |
| | | Gruszki | | | | | | | | |
| | | Pigwy | | | | | | | | |
| | | Pozostałe | | | | 0,05 (2) | | | | |
| | (iv) | OWOCE PESTKOWE | | | | | | | | |
| | | Morele | | | 0,3 | | 0,1 | 0,2 | | |
| | | Wiśnie i czereśnie | | | 0,2 | 3 | | 0,1 | | |
| | | Brzoskwinie (łącznie z nektarynami i podobnymi mieszańcami) | | | 0,3 | | 0,05 | 0,2 | | |
| | | Śliwki | | | 0,2 | | | 0,5 | | |
| | | Pozostałe | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | (v) | JAGODY I DROBNE OWOCE | | | | | 0,01 (2) | | | |
| | | (a) | Winogrona stołowe i do produkcji wina | | | 0,3 | 1 | | | | |
| | | | Winogrona stołowe | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | | | Winogrona do produkcji wina | | | | | | 1 | | |
| | | (b) | Truskawki (inne niż dzikie) | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | (c) | Owoce leśne (inne niż dzikie) | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | | Jeżyny | | | | | | | | |
| | | | Jeżyna popielica | | | | | | | | |
| | | | Krzyżówka maliny z jeżyną | | | | | | | | |
| | | | Maliny | | | | | | | | |
| | | | Pozostałe | | | | | | | | |
| | | (d) | Inne drobne owoce i jagody (inne niż dzikie) | | | 0,02 (2) | | | 0,05 (2) | | |
| | | | Borówki czarne | | | | | | | | |
| | | | Żurawina | | | | | | | | |
| | | | Porzeczka (czerwona, biała i czarna) | | | | 5 | | | | |
| | | | Agrest | | | | | | | | |
| | | | Pozostałe | | | | 0,05 (2) | | | | |
| | | (e) | Dzikie jagody i dzikie owoce | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | (vi) | OWOCE RÓŻNE | | | 0,02 (2) | | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | Awokado | | | | | | | | |
| | | Banany | | | | | | | | |
| | | Daktyle | | | | | | | | |
| | | Figi | | | | | | | | |
| | | Kiwi | | | | | | | | |
| | | Kumkwat | | | | | | | | |
| | | Liczi | | | | | | | | |
| | | Mango | | | | | | | | |
| | | Oliwki (stołowe) | | | | | | | | |
| | | Oliwki (do produkcji oliwy) | | | | | | | | |
| | | Papaja | | | | | | | | |
| | | Owoce męczennicy | | | | | | | | |
| | | Ananasy | | | | 2 | | | | |
| | | Pozostałe | | | | 0,05 (2) | | | | |
| 2. | Warzywa świeże lub niegotowane, mrożone lub suszone | | 0,02 (2) | | | | | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | (i) | WARZYWA KORZENIOWE I BULWIASTE | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | | | |
| | | Buraki | | | | | | | | |
| | | Marchew | | | | | | | | |
| | | Maniok | | | | | | | | |
| | | Seler | | | | | | | | |
| | | Chrzan | | | | | | | | |
| | | Karczoch jerozolimski | | | | | | | | |
| | | Pasternak | | | | | | | | |
| | | Pietruszka korzeń | | | | | | | | |
| | | Rzodkiewka | | | | | | 0,5 | | |
| | | Salsefia | | | | | | | | |
| | | Słodki ziemniak | | | | | | | | |
| | | Brukiew | | | | | | | | |
| | | Rzepa | | | | | | | | |
| | | Pochrzyn | | | | | | | | |
| | | Pozostałe | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | (ii) | WARZYWA CEBULOWE | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | Czosnek | | | | | | | | |
| | | Cebula | | | | | | | | |
| | | Szalotka | | | | | | | | |
| | | Dymka | | | | | | | | |
| | | Pozostałe | | | | | | | | |
| | (iii) | WARZYWA OWOCOWE | | | | | 0,01 (2) | | | |
| | | (a) | Rośliny psiankowate | 0,05 (2) | | | | | | | |
| | | | Pomidory | | | 0,05 | 1 | | 0,2 | | |
| | | | Papryka | | | 0,3 | 3 | | | | |
| | | | Bakłażan | | | | | | 0,2 | | |
| | | | Ketmia jadalna (okra) | | | | | | | | |
| | | | Pozostałe | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | (b) | Dyniowate – z jadalną skórką | 0,05 (2) | | | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | | Ogórek | | | 0,1 | | | | | |
| | | | Korniszon | | | | | | | | |
| | | | Cukinia | | | | | | | | |
| | | | Pozostałe | | | 0,02 (2) | | | | | |
| | | (c) | Dyniowate – z niejadalną skórką | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | | Melony | | | | | | | | |
| | | | Dynie | | | | | | | | |
| | | | Arbuzy | | | | | | | | |
| | | | Pozostałe | | | | | | | | |
| | | (d) | Kukurydza cukrowa | 0,1 | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | (iv) | WARZYWA KAPUSTNE | 0,05 (2) | | | 0,05 (2) | | | | |
| | | (a) | Kapustne kwitnące | | | 0,05 | | 0,02 | | | |
| | | | Brokuły | | | | | | 0,2 | | |
| | | | Kalafior | | | | | | | | |
| | | | Pozostałe | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | | (b) | Kapustne głowiaste | | | 0,2 | | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | | Brukselka | | | | | | | | |
| | | | Kapusta głowiasta | | | | | | | | |
| | | | Pozostałe | | | | | | | | |
| | | (c) | Kapustne liściowe | | | 0,3 | | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | | Kapusta pekińska | | | | | | | | |
| | | | Jarmuż | | | | | | | | |
| | | | Pozostałe | | | | | | | | |
| | | (d) | Kalarepa | | | 0,02 (2) | | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | (v) | WARZYWA LIŚCIOWE I ŚWIEŻE ZIOŁA | 0,05 (2) | | | 0,05 (2) | 0,01 (2) | | | |
| | | (a) | Sałata i podobne | | | 0,5 | | | | | |
| | | | Rzeżucha | | | | | | | | |
| | | | Roszpunka jadalna | | | | | | | | |
| | | | Sałata | | | | | | 0,3 | | |
| | | | Endywia (cykoria endywia) | | | | | | | | |
| | | | Rokietta siewna (rukola) | | | | | | | | |
| | | | Liście i pędy kapustnych | | | | | | | | |
| | | | Pozostałe | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | | (b) | Szpinak i podobne | | | 0,02 (2) | | | | | |
| | | | Szpinak | | | | | | 0,05 | | |
| | | | Boćwina | | | | | | | | |
| | | | Pozostałe | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | | (c) | Rukiew wodna | | | 0,02 (2) | | | 0,05 (2) | | |
| | | (d) | Cykoria warzywna | | | 0,02 (2) | | | 0,05 (2) | | |
| | | (e) | Zioła | | | 0,02 (2) | | | 0,3 | | |
| | | | Trybulka | | | | | | | | |
| | | | Szczypiorek | | | | | | | | |
| | | | Pietruszka – nać | | | | | | | | |
| | | | Liście selera | | | | | | | | |
| | | | Pozostałe | | | | | | | | |
| | (vi) | WARZYWA STRĄCZKOWE (świeże) | 0,05 (2) | | 0,05 | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | Fasola (w strąkach) | | | | | 0,5 | | | |
| | | Fasola (bez strąków) | | | | | | | | |
| | | Groch (w strąkach) | | | | | 0,5 | | | |
| | | Groch (bez strąków) | | | | | | | | |
| | | Pozostałe | | | | | 0,01 (2) | | | |
| | (vii) | WARZYWA ŁODYGOWE (świeże) | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | Szparagi | | | | | | | | |
| | | Karczochy | | | | | | | | |
| | | Seler | | | | | | | | |
| | | Koper włoski | | | | | | | | |
| | | Karczochy kuliste | | | | | 0,1 | | | |
| | | Por | | | | | | | | |
| | | Rabarbar | | | | | | | | |
| | | Pozostałe | | | | | 0,01 (2) | | | |
| | (viii) | GRZYBY | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | (a) | Grzyby uprawne | | | | | | | | |
| | | (b) | Grzyby dziko rosnące | | | | | | | | |
| 3. | Jadalne nasiona roślin strączkowych | 0,05 (2) | 0,02 (2) | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | Fasola | | | | | | | | |
| | Soczewica | | | | | | | | |
| | Groch | | | | | | | | |
| | Pozostałe | | | | | | | | |
| 4. | Nasiona oleiste | 0,05 (2) | 0,02 (2) | | | | | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | Siemię lnu | | | | | | | | |
| | Orzeszki ziemne | | | | | | 0,1 | | |
| | Mak | | | | | | | | |
| | Ziarna sezamu | | | | | | | | |
| | Ziarna słonecznika | | | | | | | | |
| | Nasiona rzepaku | | | 0,05 | | | | | |
| | Ziarna soi | | | | | 0,2 | 0,1 | | |
| | Nasiona gorczycy | | | | | | | | |
| | Nasiona bawełny | | | | 2 | 0,2 | 0,1 | | |
| | Nasiona konopi | | | | | | | | |
| | Pozostałe | | | 0,02 (2) | 0,1 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| 5. | Ziemniaki | 0,05 (2) | 0,02 (2) | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | Ziemniaki wczesne | | | | | | | | |
| | Ziemniaki przechowalnicze | | | | | | | | |
| 6. | Herbata (liście i łodygi suszone, fermentowane lub w inny sposób przetwarzane z Camellia sinensis) | 0,1 (2) | 0,05 (2) | 0,1 (2) | 0,1 (2) | 0,02 (2) | 0,1 (2) | 0,05 (2) | 0,02 (2) |
| 7. | Chmiel (suszony), w tym szyszki chmielu i niezagęszczony proszek | 0,1 (2) | 0,05 (2) | 20 | 0,1 (2) | 0,02 (2) | 10 | 0,05 (2) | 0,02 (2) |

2)

kolumny dotyczące atrazyny, azynofosu etylowego, cyflutryny, etefonu, metamidofosu, metomylu, parakwatu i triazofosu otrzymują następujące brzmienie:

Grupy i przykłady poszczególnych produktów, do których stosuje się NDP

Atrazyna

Azynofos etylowy

Cyflutryna, włączając inne mieszanki składników izomerycznych (suma izomerów)

Etefon

Metamidofos

Metomyl/tiodikarb (suma wyrażona jako metomyl)

Parakwat

Triazofos

„1.

Owoce, świeże, suszone lub niegotowane, zakonserwowane przez zamrażanie, niezawierające dodatku cukru; orzechy

0,05 (2)

0,02 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

(i)

OWOCE CYTRUSOWE

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

Grejpfrut

0,5

Cytryny

1

Limonki

1

Mandarynki (łącznie z klementynkami i innymi mieszańcami)

1

Pomarańcze

0,5

Pomelo

0,5

Pozostałe

0,05 (2)

(ii)

ORZECHY Z DRZEW ORZECHOWYCH (w łupinach lub bez)

0,02 (2)

0,1

0,01 (2)

0,05 (2)

Migdały

Orzechy brazylijskie

Orzechy nerkowca

Kasztany jadalne

Orzechy kokosowe

Orzechy laskowe

Orzechy makadamia

Orzeszki pekan

Orzeszki sosnowe

Pistacje

Orzechy włoskie

Pozostałe

(iii)

OWOCE ZIARNKOWE

0,2

0,01 (2)

0,2

Jabłka

0,5

Gruszki

Pigwy

Pozostałe

0,05 (2)

(iv)

OWOCE PESTKOWE

Morele

0,3

0,1

0,2

Wiśnie i czereśnie

0,2

3

0,1

Brzoskwinie (łącznie z nektarynami i podobnymi mieszańcami)

0,3

0,05

0,2

Śliwki

0,2

0,5

Pozostałe

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

(v)

JAGODY I DROBNE OWOCE

0,01 (2)

(a)

Winogrona stołowe i do produkcji wina

0,3

1

Winogrona stołowe

0,05 (2)

Winogrona do produkcji wina

1

(b)

Truskawki (inne niż dzikie)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

(c)

Owoce leśne (inne niż dzikie)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

Jeżyny

Jeżyna popielica

Krzyżówka maliny z jeżyną

Maliny

Pozostałe

(d)

Inne drobne owoce i jagody (inne niż dzikie)

0,02 (2)

0,05 (2)

Borówki czarne

Żurawina

Porzeczka (czerwona, biała i czarna)

5

Agrest

Pozostałe

0,05 (2)

(e)

Dzikie jagody i dzikie owoce

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

(vi)

OWOCE RÓŻNE

0,02 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

Awokado

Banany

Daktyle

Figi

Kiwi

Kumkwat

Liczi

Mango

Oliwki (stołowe)

Oliwki (do produkcji oliwy)

Papaja

Owoce męczennicy

Ananasy

2

Pozostałe

0,05 (2)

2.

Warzywa świeże lub niegotowane, mrożone lub suszone

0,02 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

(i)

WARZYWA KORZENIOWE I BULWIASTE

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

Buraki

Marchew

Maniok

Seler

Chrzan

Karczoch jerozolimski

Pasternak

Pietruszka korzeń

Rzodkiewka

0,5

Salsefia

Słodki ziemniak

Brukiew

Rzepa

Pochrzyn

Pozostałe

0,05 (2)

(ii)

WARZYWA CEBULOWE

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

Czosnek

Cebula

Szalotka

Dymka

Pozostałe

(iii)

WARZYWA OWOCOWE

0,01 (2)

(a)

Rośliny psiankowate

0,05 (2)

Pomidory

0,05

1

0,2

Papryka

0,3

3

Bakłażan

0,2

Ketmia jadalna (okra)

Pozostałe

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

(b)

Dyniowate – z jadalną skórką

0,05 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

Ogórek

0,1

Korniszon

Cukinia

Pozostałe

0,02 (2)

(c)

Dyniowate – z niejadalną skórką

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

Melony

Dynie

Arbuzy

Pozostałe

(d)

Kukurydza cukrowa

0,1

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

(iv)

WARZYWA KAPUSTNE

0,05 (2)

0,05 (2)

(a)

Kapustne kwitnące

0,05

0,02

Brokuły

0,2

Kalafior

Pozostałe

0,05 (2)

(b)

Kapustne głowiaste

0,2

0,01 (2)

0,05 (2)

Brukselka

Kapusta głowiasta

Pozostałe

(c)

Kapustne liściowe

0,3

0,01 (2)

0,05 (2)

Kapusta pekińska

Jarmuż

Pozostałe

(d)

Kalarepa

0,02 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

(v)

WARZYWA LIŚCIOWE I ŚWIEŻE ZIOŁA

0,05 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

(a)

Sałata i podobne

0,5

Rzeżucha

Roszpunka jadalna

Sałata

0,3

Endywia (cykoria endywia)

Rokietta siewna (rukola)

Liście i pędy kapustnych

Pozostałe

0,05 (2)

(b)

Szpinak i podobne

0,02 (2)

Szpinak

0,05

Boćwina

Pozostałe

0,05 (2)

(c)

Rukiew wodna

0,02 (2)

0,05 (2)

(d)

Cykoria warzywna

0,02 (2)

0,05 (2)

(e)

Zioła

0,02 (2)

0,3

Trybulka

Szczypiorek

Pietruszka – nać

Liście selera

Pozostałe

(vi)

WARZYWA STRĄCZKOWE (świeże)

0,05 (2)

0,05

0,05 (2)

0,05 (2)

Fasola (w strąkach)

0,5

Fasola (bez strąków)

Groch (w strąkach)

0,5

Groch (bez strąków)

Pozostałe

0,01 (2)

(vii)

WARZYWA ŁODYGOWE (świeże)

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

Szparagi

Karczochy

Seler

Koper włoski

Karczochy kuliste

0,1

Por

Rabarbar

Pozostałe

0,01 (2)

(viii)

GRZYBY

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

(a)

Grzyby uprawne

(b)

Grzyby dziko rosnące

3.

Jadalne nasiona roślin strączkowych

0,05 (2)

0,02 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

Fasola

Soczewica

Groch

Pozostałe

4.

Nasiona oleiste

0,05 (2)

0,02 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

Siemię lnu

Orzeszki ziemne

0,1

Mak

Ziarna sezamu

Ziarna słonecznika

Nasiona rzepaku

0,05

Ziarna soi

0,2

0,1

Nasiona gorczycy

Nasiona bawełny

2

0,2

0,1

Nasiona konopi

Pozostałe

0,02 (2)

0,1 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

5.

Ziemniaki

0,05 (2)

0,02 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

Ziemniaki wczesne

Ziemniaki przechowalnicze

6.

Herbata (liście i łodygi suszone, fermentowane lub w inny sposób przetwarzane z Camellia sinensis)

0,1 (2)

0,05 (2)

0,1 (2)

0,1 (2)

0,02 (2)

0,1 (2)

0,05 (2)

0,02 (2)

7.

Chmiel (suszony), w tym szyszki chmielu i niezagęszczony proszek

0,1 (2)

0,05 (2)

20

0,1 (2)

0,02 (2)

10

0,05 (2)

0,02 (2)

---

(1)  Wskazuje granicę oznaczalności.”

(2)  Wskazuje granicę oznaczalności.”

---

| 27.7.2006 | PL | Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej | L 206/27 |
| --- | --- | --- | --- |

27.7.2006

PL

Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej

L 206/27

---

DYREKTYWA KOMISJI 2006/62/WE

z dnia 12 lipca 2006 r.

zmieniająca załączniki do dyrektyw Rady 76/895/EWG, 86/362/EWG, 86/363/EWG i 90/642/EWG w odniesieniu do najwyższych dopuszczalnych poziomów pozostałości desmedifamu, fenmedifamu i chlorfenwinfosu

(Tekst mający znaczenie dla EOG)

KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH,

uwzględniając Traktat ustanawiający Wspólnotę Europejską,

uwzględniając dyrektywę Rady 76/895/EWG z dnia 23 listopada 1976 r. odnoszącą się do ustalania najwyższych dopuszczalnych poziomów pozostałości pestycydów w owocach i warzywach oraz na ich powierzchni (1), w szczególności jej art. 5,

uwzględniając dyrektywę Rady 86/362/EWG z dnia 24 lipca 1986 r. w sprawie ustalania najwyższych dopuszczalnych poziomów pozostałości pestycydów w zbożach i na ich powierzchni (2), w szczególności jej art. 10,

uwzględniając dyrektywę Rady 86/363/EWG z dnia 24 lipca 1986 r. w sprawie ustalania najwyższych dopuszczalnych poziomów pozostałości pestycydów w środkach spożywczych pochodzenia zwierzęcego i na ich powierzchni (3), w szczególności jej art. 10,

uwzględniając dyrektywę Rady 90/642/EWG z dnia 27 listopada 1990 r. w sprawie ustalania najwyższych dopuszczalnych poziomów pozostałości pestycydów w niektórych produktach pochodzenia roślinnego, w tym owocach i warzywach, oraz na ich powierzchni (4), w szczególności jej art. 7,

uwzględniając dyrektywę Rady 91/414/EWG z dnia 15 lipca 1991 r. dotyczącą wprowadzania do obrotu środków ochrony roślin (5), w szczególności jej art. 4 ust. 1 lit. f),

a także mając na uwadze, co następuje:

| (1) | Istniejące substancje czynne desmedifam i fenmedifam zostały włączone do załącznika I do dyrektywy 91/414/EWG dyrektywą Komisji 2004/58/WE (6). |
| --- | --- |

(1)

Istniejące substancje czynne desmedifam i fenmedifam zostały włączone do załącznika I do dyrektywy 91/414/EWG dyrektywą Komisji 2004/58/WE (6).

| (2) | Włączenie do załącznika I do dyrektywy 91/414/EWG rozpatrywanych substancji czynnych opierało się na ocenie przedłożonych informacji dotyczących ich proponowanego zastosowania. Informacje dotyczące tego zastosowania zostały przedłożone przez niektóre państwa członkowskie zgodnie z art. 4 ust. 1 lit. f) dyrektywy 91/414/EWG. Dostępne informacje zostały poddane przeglądowi i są wystarczające, aby ustalić niektóre najwyższe dopuszczalne poziomy pozostałości (NDP). |
| --- | --- |

(2)

Włączenie do załącznika I do dyrektywy 91/414/EWG rozpatrywanych substancji czynnych opierało się na ocenie przedłożonych informacji dotyczących ich proponowanego zastosowania. Informacje dotyczące tego zastosowania zostały przedłożone przez niektóre państwa członkowskie zgodnie z art. 4 ust. 1 lit. f) dyrektywy 91/414/EWG. Dostępne informacje zostały poddane przeglądowi i są wystarczające, aby ustalić niektóre najwyższe dopuszczalne poziomy pozostałości (NDP).

| (3) | W przypadku chlorfenwinfosu w rozporządzeniu Komisji (WE) nr 2076/2002 (7) postanowiono nie włączać wspomnianej substancji do załącznika I do dyrektywy 91/414/EWG. Niektóre państwa członkowskie mogą utrzymać w mocy niektóre zezwolenia na wykorzystanie produktów zawierających chlorfenwinfos do dnia 30 czerwca 2007 r. |
| --- | --- |

(3)

W przypadku chlorfenwinfosu w rozporządzeniu Komisji (WE) nr 2076/2002 (7) postanowiono nie włączać wspomnianej substancji do załącznika I do dyrektywy 91/414/EWG. Niektóre państwa członkowskie mogą utrzymać w mocy niektóre zezwolenia na wykorzystanie produktów zawierających chlorfenwinfos do dnia 30 czerwca 2007 r.

| (4) | Wspólnotowe NDP dla chlorfenwinfosu już istnieją w dyrektywie 76/895/EWG. Należy je uwzględnić przy ustanawianiu NDP dla chlorfenwinfosu w dyrektywie 90/642/EWG. |
| --- | --- |

(4)

Wspólnotowe NDP dla chlorfenwinfosu już istnieją w dyrektywie 76/895/EWG. Należy je uwzględnić przy ustanawianiu NDP dla chlorfenwinfosu w dyrektywie 90/642/EWG.

| (5) | Sprawozdania kontrolne Komisji z przeglądu, które zostały przygotowane w związku z włączeniem rozpatrywanych substancji czynnych do załącznika I do dyrektywy 91/414/EWG, ustaliły akceptowalne dzienne pobranie (ADI) oraz, jeżeli to konieczne, ostrą dawkę referencyjną (ARfD) dla wspomnianych substancji. Narażenie konsumentów produktów spożywczych zawierających rozpatrywane substancje czynne zostało ocenione zgodnie z procedurami wspólnotowymi. Uwzględniono również wytyczne opublikowane przez Światową Organizację Zdrowia (8) oraz opinię Komitetu Naukowego ds. Roślin (9) w sprawie przyjętej metodologii. Wyciągnięto wniosek, że zaproponowane NDP nie doprowadzą do przekroczenia ADI i ARfD. |
| --- | --- |

(5)

Sprawozdania kontrolne Komisji z przeglądu, które zostały przygotowane w związku z włączeniem rozpatrywanych substancji czynnych do załącznika I do dyrektywy 91/414/EWG, ustaliły akceptowalne dzienne pobranie (ADI) oraz, jeżeli to konieczne, ostrą dawkę referencyjną (ARfD) dla wspomnianych substancji. Narażenie konsumentów produktów spożywczych zawierających rozpatrywane substancje czynne zostało ocenione zgodnie z procedurami wspólnotowymi. Uwzględniono również wytyczne opublikowane przez Światową Organizację Zdrowia (8) oraz opinię Komitetu Naukowego ds. Roślin (9) w sprawie przyjętej metodologii. Wyciągnięto wniosek, że zaproponowane NDP nie doprowadzą do przekroczenia ADI i ARfD.

| (6) | W celu zapewnienia odpowiedniej ochrony konsumenta przed wpływem pozostałości wynikających z niedozwolonych zastosowań środków ochrony roślin tymczasowe NDP powinny zostać określone na poziomie granicy oznaczalności w przypadku odpowiednich kombinacji produktów i pestycydów. |
| --- | --- |

(6)

W celu zapewnienia odpowiedniej ochrony konsumenta przed wpływem pozostałości wynikających z niedozwolonych zastosowań środków ochrony roślin tymczasowe NDP powinny zostać określone na poziomie granicy oznaczalności w przypadku odpowiednich kombinacji produktów i pestycydów.

| (7) | Ustanowienie na poziomie Wspólnoty tymczasowych NDP nie stanowi przeszkody dla ustanowienia przez państwa członkowskie NDP dla rozpatrywanych substancji, zgodnie z art. 4 ust. 1 lit. f) dyrektywy 91/414/EWG i załącznikiem VI do tej dyrektywy. Uważa się, że okres czterech lat jest wystarczający, by umożliwić dalsze stosowanie danej substancji czynnej. Po upływie tego okresu tymczasowy NDP stanie się ostateczny. |
| --- | --- |

(7)

Ustanowienie na poziomie Wspólnoty tymczasowych NDP nie stanowi przeszkody dla ustanowienia przez państwa członkowskie NDP dla rozpatrywanych substancji, zgodnie z art. 4 ust. 1 lit. f) dyrektywy 91/414/EWG i załącznikiem VI do tej dyrektywy. Uważa się, że okres czterech lat jest wystarczający, by umożliwić dalsze stosowanie danej substancji czynnej. Po upływie tego okresu tymczasowy NDP stanie się ostateczny.

| (8) | Wobec tego, aby umożliwić właściwy nadzór i kontrolę zakazu ich stosowania oraz ochronę konsumenta, należy do załączników do dyrektyw 86/362/EWG, 86/363/EWG i 90/642/EWG dodać wszystkie NDP pochodzące ze stosowania tych środków ochrony roślin. Jeżeli NDP nie zostały określone do tej pory, należy je ustalić po raz pierwszy. |
| --- | --- |

(8)

Wobec tego, aby umożliwić właściwy nadzór i kontrolę zakazu ich stosowania oraz ochronę konsumenta, należy do załączników do dyrektyw 86/362/EWG, 86/363/EWG i 90/642/EWG dodać wszystkie NDP pochodzące ze stosowania tych środków ochrony roślin. Jeżeli NDP nie zostały określone do tej pory, należy je ustalić po raz pierwszy.

| (9) | Dlatego też przepisy dyrektywy 76/895/EWG ustalające NDP dla chlorfenwinfosu powinny zostać skreślone. |
| --- | --- |

(9)

Dlatego też przepisy dyrektywy 76/895/EWG ustalające NDP dla chlorfenwinfosu powinny zostać skreślone.

| (10) | Należy zatem odpowiednio zmienić dyrektywy 76/895/EWG, 86/362/EWG, 86/363/EWG i 90/642/EWG. |
| --- | --- |

(10)

Należy zatem odpowiednio zmienić dyrektywy 76/895/EWG, 86/362/EWG, 86/363/EWG i 90/642/EWG.

| (11) | Środki przewidziane w niniejszej dyrektywie są zgodne z opinią Stałego Komitetu ds. Łańcucha Żywnościowego i Zdrowia Zwierząt, |
| --- | --- |

(11)

Środki przewidziane w niniejszej dyrektywie są zgodne z opinią Stałego Komitetu ds. Łańcucha Żywnościowego i Zdrowia Zwierząt,

PRZYJMUJE NINIEJSZĄ DYREKTYWĘ:

Artykuł 1

W załączniku II do dyrektywy 76/895/EWG skreśla się zapis dotyczący chlorfenwinfosu.

Artykuł 2

W załączniku II do dyrektywy 86/362/WE wprowadza się zmiany zgodnie z załącznikiem I do niniejszej dyrektywy.

Artykuł 3

W załączniku II do dyrektywy 86/363/WE wprowadza się zmiany zgodnie z załącznikiem II do niniejszej dyrektywy.

Artykuł 4

W załączniku II do dyrektywy 90/642/WE wprowadza się zmiany zgodnie z załącznikiem III do niniejszej dyrektywy.

Artykuł 5

1.   Państwa członkowskie przyjmą i opublikują najpóźniej do dnia 20 stycznia 2008 r. przepisy ustawowe, wykonawcze i administracyjne niezbędne dla przestrzegania niniejszej dyrektywy. Państwa członkowskie niezwłocznie przekażą Komisji tekst tych przepisów oraz tabelę korelacji między tymi przepisami a niniejszą dyrektywą.

Państwa członkowskie stosują wymienione przepisy od dnia 21 stycznia 2008 r.

Przepisy przyjęte przez państwa członkowskie zawierają odesłanie do niniejszej dyrektywy lub odesłanie takie towarzyszy ich urzędowej publikacji. Sposób dokonania takiego odesłania ustalany jest przez państwa członkowskie.

2.   Państwa członkowskie przekazują Komisji teksty podstawowych przepisów prawa krajowego przyjętych w dziedzinie objętej niniejszą dyrektywą.

Artykuł 6

Niniejsza dyrektywa wchodzi w życie dwudziestego dnia po jej opublikowaniu w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej.

Artykuł 7

Niniejsza dyrektywa skierowana jest do państw członkowskich.

Sporządzono w Brukseli, dnia 12 lipca 2006 r.

W imieniu Komisji

Markos KYPRIANOU

Członek Komisji

---

(1)  Dz.U. L 340 z 9.12.1976, str. 26. Dyrektywa ostatnio zmieniona dyrektywą Komisji 2006/59/WE (Dz.U. L 175 z 29.6.2006, str. 61).

1

(2)  Dz.U. L 221 z 7.8.1986, str. 37. Dyrektywa ostatnio zmieniona dyrektywą Komisji 2006/59/WE.

2

(3)  Dz.U. L 221 z 7.8.1986, str. 43. Dyrektywa ostatnio zmieniona dyrektywą Komisji 2006/59/WE.

3

(4)  Dz.U. L 350 z 14.12.1990, str. 71. Dyrektywa ostatnio zmieniona dyrektywą Komisji 2006/59/WE.

4

(5)  Dz.U. L 230 z 19.8.1991, str. 1. Dyrektywa ostatnio zmieniona dyrektywą Komisji 2006/45/WE (Dz.U. L 130 z 18.5.2006, str. 27).

5

(6)  Dz.U. L 120 z 24.4.2004, str. 26.

6

(7)  Dz.U. L 319 z 23.11.2002, str. 3. Rozporządzenie ostatnio zmienione rozporządzeniem (WE) nr 1335/2005 (Dz.U. L 211 z 13.8.2005, str. 6).

7

(8)  Wytyczne dotyczące przewidywania spożycia w żywności pozostałości pestycydów (poprawione) opracowane przez GEMS/Program Żywnościowy we współpracy z Komitetem Kodeksu ds. Pozostałości Pestycydów, opublikowane przez Światową Organizację Zdrowia w 1997 r. (WHO/FSO/FOS/97.7).

8

(9)  Opinia Komitetu Naukowego ds. Roślin dotycząca kwestii związanych ze zmianą załączników do dyrektyw Rady 86/362/EWG, 86/363/EWG i 90/642/EWG (Opinia wyrażona przez Komitet Naukowy ds. Roślin dnia 14 lipca 1998 r.) (http://europa.eu.int/comm/food/fs/sc/index_en.html).

9

---

ZAŁĄCZNIK I

W części A załącznika II do dyrektywy 86/362/EWG dodaje się następujące wiersze w odniesieniu do desmedifamu, fenmedifamu i chlorfenwinfosu:

| Pozostałości pestycydów | Najwyższy dopuszczalny poziom w mg/kg |
| --- | --- |
| „Desmedifam | 0,05 (1)
   (2): zboża |
| Fenmedifam | 0,05 (1)
   (2): zboża |
| Chlorfenwinfos (suma izomerów E- oraz Z-) | 0,02 (1): zboża |

Pozostałości pestycydów

Najwyższy dopuszczalny poziom w mg/kg

„Desmedifam

0,05 (1)
   (2): zboża

Fenmedifam

0,05 (1)
   (2): zboża

Chlorfenwinfos (suma izomerów E- oraz Z-)

0,02 (1): zboża

---

(1)  Wskazuje granicę oznaczalności.

1

(2)  Oznacza, że najwyższy dopuszczalny poziom pozostałości został ustanowiony tymczasowo zgodnie z art. 4 ust. 1 lit. f) dyrektywy 91/414/EWG.”

2

---

ZAŁĄCZNIK II

W załączniku II do dyrektywy 86/363/EWG wprowadza się następujące zmiany:

| 1) | w części A dodaje się następujący wiersz w odniesieniu do chlorfenwinfosu:








  Pozostałości pestycydów | Najwyższy dopuszczalny poziom w mg/kg |
| --- | --- | --- |
| | tłuszczu zawartego w mięsie, wyrobach mięsnych, odpadach poubojowych i tłuszczów zwierzęcych wymienionych w załączniku I w pozycjach nr ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 i 1602 (1) (4) | dla mleka krowiego i pełnotłustego mleka krowiego wymienionego w załączniku I w pozycji nr 0401; dla pozostałych środków spożywczych wymienionych w pozycji nr 0401, 0402, 0405 00 i 0406 zgodnie z (2) (4) | świeżych jaj w skorupach, dla jaj ptasich i żółtek jaj wymienionych w załączniku I w pozycjach nr 0407 00 i 0408 (3) (4) |
| „Chlorfenwinfos (suma izomerów E- oraz Z-) | 0,01 (1) | 0,01 (1) | 0,01 (1) |

1)

w części A dodaje się następujący wiersz w odniesieniu do chlorfenwinfosu:

Pozostałości pestycydów

Najwyższy dopuszczalny poziom w mg/kg

tłuszczu zawartego w mięsie, wyrobach mięsnych, odpadach poubojowych i tłuszczów zwierzęcych wymienionych w załączniku I w pozycjach nr ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 i 1602 (1) (4)

dla mleka krowiego i pełnotłustego mleka krowiego wymienionego w załączniku I w pozycji nr 0401; dla pozostałych środków spożywczych wymienionych w pozycji nr 0401, 0402, 0405 00 i 0406 zgodnie z (2) (4)

świeżych jaj w skorupach, dla jaj ptasich i żółtek jaj wymienionych w załączniku I w pozycjach nr 0407 00 i 0408 (3) (4)

„Chlorfenwinfos (suma izomerów E- oraz Z-)

0,01 (1)

0,01 (1)

0,01 (1)

| 2) | w części B dodaje się następujący wiersz w odniesieniu do fenmedifamu:








  Pozostałości pestycydów | Najwyższy dopuszczalny poziom w mg/kg |
| --- | --- | --- |
| | mięsa, w tym tłuszczu, wyrobów mięsnych, odpadów poubojowych i tłuszczów zwierzęcych wymienionych w załączniku I w pozycjach nr 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 i 1602 | dla mleka i przetworów mlecznych wymienionych w załączniku I w pozycjach nr 0401, 0402, 0405 00 i 0406 | świeżych jaj w skorupach, dla jaj ptasich i żółtek jaj wymienionych w załączniku I w pozycjach nr 0407 00 i 0408 |
| „Fenmedifam (N-(3-hydroksyfenylo)-karbaminian metylu (MHPC) wyrażony jako fenmedifam) | 0,05 (2)
   (3) | 0,05 (2)
   (3) | 0,05 (2)
   (3) |

2)

w części B dodaje się następujący wiersz w odniesieniu do fenmedifamu:

Pozostałości pestycydów

Najwyższy dopuszczalny poziom w mg/kg

mięsa, w tym tłuszczu, wyrobów mięsnych, odpadów poubojowych i tłuszczów zwierzęcych wymienionych w załączniku I w pozycjach nr 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 i 1602

dla mleka i przetworów mlecznych wymienionych w załączniku I w pozycjach nr 0401, 0402, 0405 00 i 0406

świeżych jaj w skorupach, dla jaj ptasich i żółtek jaj wymienionych w załączniku I w pozycjach nr 0407 00 i 0408

„Fenmedifam (N-(3-hydroksyfenylo)-karbaminian metylu (MHPC) wyrażony jako fenmedifam)

0,05 (2)
   (3)

0,05 (2)
   (3)

0,05 (2)
   (3)

---

(1)  Wskazuje granicę oznaczalności.”

(2)  Wskazuje granicę oznaczalności.

(3)  Wskazuje tymczasowy najwyższy dopuszczalny poziom pozostałości zgodnie z art. 4 ust. 1 lit. f) dyrektywy 91/414/EWG: poziom ten staje się ostateczny od dnia 9 sierpnia 2010 r., chyba że zostanie zmieniony.”

---

ZAŁĄCZNIK III

W części A załącznika II do dyrektywy 90/642/EWG dodaje się następujące kolumny w odniesieniu do desmedifamu, fenmedifamu i chlorfenwinfosu:

| Pozostałości pestycydów i najwyższe dopuszczalne poziomy pozostałości (mg/kg) |
| --- |
| Grupy i przykłady poszczególnych produktów, do których stosuje się najwyższe dopuszczalne poziomy pozostałości | Desmedifam | Fenmedifam | Chlorfenwinfos (suma izomerów E- oraz Z-) |
| „1. | Owoce, świeże, suszone lub niegotowane, zakonserwowane przez zamrażanie, niezawierające dodatku cukru; orzechy | 0,05 (1)
   (2) | | 0,02 (1) |
| | i) | OWOCE CYTRUSOWE | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Grejpfrut | | | |
| | | Cytryny | | | |
| | | Limonki | | | |
| | | Mandarynki (łącznie z klementynkami i innymi mieszańcami) | | | |
| | | Pomarańcze | | | |
| | | Pomelo | | | |
| | | Pozostałe | | | |
| | ii) | ORZECHY Z DRZEW ORZECHOWYCH (w łupinach lub bez) | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Migdały | | | |
| | | Orzechy brazylijskie | | | |
| | | Orzechy nerkowca | | | |
| | | Kasztany jadalne | | | |
| | | Orzechy kokosowe | | | |
| | | Orzechy laskowe | | | |
| | | Orzechy makadamia | | | |
| | | Orzeszki pekan | | | |
| | | Orzeszki sosnowe | | | |
| | | Pistacje | | | |
| | | Orzechy włoskie | | | |
| | | Pozostałe | | | |
| | iii) | OWOCE ZIARNKOWE | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Jabłka | | | |
| | | Gruszki | | | |
| | | Pigwy | | | |
| | | Pozostałe | | | |
| | iv) | OWOCE PESTKOWE | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Morele | | | |
| | | Wiśnie i czereśnie | | | |
| | | Brzoskwinie (łącznie z nektarynami i innymi mieszańcami) | | | |
| | | Śliwki | | | |
| | | Pozostałe | | | |
| | v) | JAGODY I DROBNE OWOCE | | | |
| | | a) | Winogrona deserowe i do produkcji wina | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | Winogrona deserowe | | | |
| | | | Winogrona do produkcji wina | | | |
| | | b) | Truskawki (inne niż dzikie) | | 0,1 (1)
   (2) | |
| | | c) | Owoce leśne (inne niż dzikie) | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | Jeżyny | | | |
| | | | Jeżyna popielica | | | |
| | | | Krzyżówka maliny z jeżyną | | | |
| | | | Maliny | | | |
| | | | Pozostałe | | | |
| | | d) | Inne drobne owoce i jagody (inne niż dzikie) | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | Borówki czarne | | | |
| | | | Żurawiny | | | |
| | | | Porzeczki (czerwona, biała i czarna) | | | |
| | | | Agrest | | | |
| | | | Pozostałe | | | |
| | | e) | Dzikie jagody i dzikie owoce | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | vi) | RÓŻNE | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Awokado | | | |
| | | Banany | | | |
| | | Daktyle | | | |
| | | Figi | | | |
| | | Kiwi | | | |
| | | Kumkwat | | | |
| | | Liczi | | | |
| | | Mango | | | |
| | | Oliwki (stołowe) | | | |
| | | Oliwki (do produkcji oliwy) | | | |
| | | Papaja | | | |
| | | Owoce męczennicy | | | |
| | | Ananasy | | | |
| | | Granaty | | | |
| | | Pozostałe | | | |
| 2. | Warzywa świeże lub niegotowane, mrożone lub suszone | 0,05 (1)
   (2) | | |
| | i) | WARZYWA KORZENIOWE I BULWIASTE | | | |
| | | Buraki | | 0,1 (1)
   (2) | |
| | | Marchew | | | 0,5 |
| | | Maniok | | | |
| | | Seler | | | |
| | | Chrzan | | | |
| | | Karczoch jerozolimski | | | |
| | | Pasternak | | | 0,5 |
| | | Pietruszka – korzeń | | | |
| | | Rzodkiewka | | | 0,5 |
| | | Salsefia | | | |
| | | Słodki ziemniak | | | |
| | | Brukiew | | | 0,5 |
| | | Rzepa | | | 0,5 |
| | | Pochrzyn | | | |
| | | Pozostałe | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | ii) | WARZYWA CEBULOWE | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Czosnek | | | 0,5 |
| | | Cebula | | | |
| | | Szalotka | | | 0,5 |
| | | Dymka | | | |
| | | Pozostałe | | | 0,02 (1) |
| | iii) | WARZYWA OWOCOWE | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | a) | Rośliny psiankowate | | | 0,02 (1) |
| | | | Pomidory | | | |
| | | | Papryka | | | |
| | | | Bakłażan | | | |
| | | | Ketmia jadalna | | | |
| | | | Pozostałe | | | |
| | | b) | Dyniowate – z jadalną skórką | | | |
| | | | Ogórek | | | |
| | | | Korniszon | | | |
| | | | Cukinia | | | 0,1 |
| | | | Pozostałe | | | 0,02 (1) |
| | | c) | Dyniowate – z niejadalną skórką | | | 0,02 (1) |
| | | | Melony | | | |
| | | | Dynie | | | |
| | | | Arbuzy | | | |
| | | | Pozostałe | | | |
| | | d) | Kukurydza cukrowa | | | 0,02 (1) |
| | iv) | WARZYWA KAPUSTNE | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | a) | Kapustne kwitnące | | | 0,02 (1) |
| | | | Brokuły (w tym odmiana kalabryjska) | | | |
| | | | Kalafior | | | |
| | | | Pozostałe | | | |
| | | b) | Kapustne głowiaste | | | |
| | | | Brukselka | | | 0,1 |
| | | | Kapusta głowiasta | | | 0,5 |
| | | | Pozostałe | | | 0,02 (1) |
| | | c) | Kapustne liściowe | | | 0,02 (1) |
| | | | Kapusta pekińska | | | |
| | | | Jarmuż | | | |
| | | | Pozostałe | | | |
| | | d) | Kalarepa | | | 0,3 |
| | v) | WARZYWA LIŚCIOWE I ŚWIEŻE ZIOŁA | | | |
| | | a) | Sałata i podobne | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | Rzeżucha | | | 0,1 |
| | | | Roszpunka jadalna | | | 0,1 |
| | | | Sałata | | | |
| | | | Endywia (cykoria endywia) | | | |
| | | | Rokietta siewna (rukola) | | | |
| | | | Liście i pędy kapustnych | | | |
| | | | Pozostałe | | | 0,02 (1) |
| | | b) | Szpinak i podobne | | 0,5 (2) | |
| | | | Szpinak | | | 0,1 |
| | | | Boćwina | | | |
| | | | Pozostałe | | | 0,02 (1) |
| | | c) | Rukiew wodna | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | | d) | Cykoria warzywna | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | | e) | Zioła | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | Trybulka | | | |
| | | | Szczypiorek | | | |
| | | | Pietruszka – nać | | | 0,5 |
| | | | Liście selera | | | |
| | | | Pozostałe | | | 0,02 (1) |
| | vi) | WARZYWA STRĄCZKOWE (świeże) | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | | Fasola (w strąkach) | | | |
| | | Fasola (bez strąków) | | | |
| | | Groch (w strąkach) | | | |
| | | Groch (bez strąków) | | | |
| | | Pozostałe | | | |
| | vii) | WARZYWA ŁODYGOWE (świeże) | | | |
| | | Szparagi | | | 0,1 |
| | | Karczochy | | | |
| | | Seler | | | 0,5 |
| | | Koper włoski | | | |
| | | Karczochy kuliste | | 0,2 (2) | |
| | | Por | | | 0,1 |
| | | Rabarbar | | | |
| | | Pozostałe | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | viii) | GRZYBY | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | a) | Grzyby uprawne | | | 0,05 |
| | | b) | Grzyby dziko rosnące | | | 0,02 (1) |
| 3. | Jadalne nasiona roślin strączkowych | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | Fasola | | | |
| | Soczewica | | | |
| | Groch | | | |
| | Pozostałe | | | |
| 4. | Nasiona oleiste | 0,1 (1)
   (2) | 0,1 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | Siemię lnu | | | |
| | Orzeszki ziemne | | | |
| | Mak | | | |
| | Ziarna sezamu | | | |
| | Ziarna słonecznika | | | |
| | Nasiona rzepaku | | | |
| | Ziarna soi | | | |
| | Nasiona gorczycy | | | |
| | Nasiona bawełny | | | |
| | Nasiona konopi | | | |
| | Pozostałe | | | |
| 5. | Ziemniaki | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | Ziemniaki wczesne | | | |
| | Ziemniaki przechowalnicze | | | |
| 6. | Herbata (liście i łodygi suszone, fermentowane lub w inny sposób przetwarzane Camellia sinensis) | 0,1 (1)
   (2) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| 7. | Chmiel (suszony), w tym szyszki chmielu i niezagęszczony proszek | 0,1 (1)
   (2) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1) |

Pozostałości pestycydów i najwyższe dopuszczalne poziomy pozostałości (mg/kg)

Grupy i przykłady poszczególnych produktów, do których stosuje się najwyższe dopuszczalne poziomy pozostałości

Desmedifam

Fenmedifam

Chlorfenwinfos (suma izomerów E- oraz Z-)

„1.

Owoce, świeże, suszone lub niegotowane, zakonserwowane przez zamrażanie, niezawierające dodatku cukru; orzechy

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

i)

OWOCE CYTRUSOWE

0,05 (1)
   (2)

Grejpfrut

Cytryny

Limonki

Mandarynki (łącznie z klementynkami i innymi mieszańcami)

Pomarańcze

Pomelo

Pozostałe

ii)

ORZECHY Z DRZEW ORZECHOWYCH (w łupinach lub bez)

0,05 (1)
   (2)

Migdały

Orzechy brazylijskie

Orzechy nerkowca

Kasztany jadalne

Orzechy kokosowe

Orzechy laskowe

Orzechy makadamia

Orzeszki pekan

Orzeszki sosnowe

Pistacje

Orzechy włoskie

Pozostałe

iii)

OWOCE ZIARNKOWE

0,05 (1)
   (2)

Jabłka

Gruszki

Pigwy

Pozostałe

iv)

OWOCE PESTKOWE

0,05 (1)
   (2)

Morele

Wiśnie i czereśnie

Brzoskwinie (łącznie z nektarynami i innymi mieszańcami)

Śliwki

Pozostałe

v)

JAGODY I DROBNE OWOCE

a)

Winogrona deserowe i do produkcji wina

0,05 (1)
   (2)

Winogrona deserowe

Winogrona do produkcji wina

b)

Truskawki (inne niż dzikie)

0,1 (1)
   (2)

c)

Owoce leśne (inne niż dzikie)

0,05 (1)
   (2)

Jeżyny

Jeżyna popielica

Krzyżówka maliny z jeżyną

Maliny

Pozostałe

d)

Inne drobne owoce i jagody (inne niż dzikie)

0,05 (1)
   (2)

Borówki czarne

Żurawiny

Porzeczki (czerwona, biała i czarna)

Agrest

Pozostałe

e)

Dzikie jagody i dzikie owoce

0,05 (1)
   (2)

vi)

RÓŻNE

0,05 (1)
   (2)

Awokado

Banany

Daktyle

Figi

Kiwi

Kumkwat

Liczi

Mango

Oliwki (stołowe)

Oliwki (do produkcji oliwy)

Papaja

Owoce męczennicy

Ananasy

Granaty

Pozostałe

2.

Warzywa świeże lub niegotowane, mrożone lub suszone

0,05 (1)
   (2)

i)

WARZYWA KORZENIOWE I BULWIASTE

Buraki

0,1 (1)
   (2)

Marchew

0,5

Maniok

Seler

Chrzan

Karczoch jerozolimski

Pasternak

0,5

Pietruszka – korzeń

Rzodkiewka

0,5

Salsefia

Słodki ziemniak

Brukiew

0,5

Rzepa

0,5

Pochrzyn

Pozostałe

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

ii)

WARZYWA CEBULOWE

0,05 (1)
   (2)

Czosnek

0,5

Cebula

Szalotka

0,5

Dymka

Pozostałe

0,02 (1)

iii)

WARZYWA OWOCOWE

0,05 (1)
   (2)

a)

Rośliny psiankowate

0,02 (1)

Pomidory

Papryka

Bakłażan

Ketmia jadalna

Pozostałe

b)

Dyniowate – z jadalną skórką

Ogórek

Korniszon

Cukinia

0,1

Pozostałe

0,02 (1)

c)

Dyniowate – z niejadalną skórką

0,02 (1)

Melony

Dynie

Arbuzy

Pozostałe

d)

Kukurydza cukrowa

0,02 (1)

iv)

WARZYWA KAPUSTNE

0,05 (1)
   (2)

a)

Kapustne kwitnące

0,02 (1)

Brokuły (w tym odmiana kalabryjska)

Kalafior

Pozostałe

b)

Kapustne głowiaste

Brukselka

0,1

Kapusta głowiasta

0,5

Pozostałe

0,02 (1)

c)

Kapustne liściowe

0,02 (1)

Kapusta pekińska

Jarmuż

Pozostałe

d)

Kalarepa

0,3

v)

WARZYWA LIŚCIOWE I ŚWIEŻE ZIOŁA

a)

Sałata i podobne

0,05 (1)
   (2)

Rzeżucha

0,1

Roszpunka jadalna

0,1

Sałata

Endywia (cykoria endywia)

Rokietta siewna (rukola)

Liście i pędy kapustnych

Pozostałe

0,02 (1)

b)

Szpinak i podobne

0,5 (2)

Szpinak

0,1

Boćwina

Pozostałe

0,02 (1)

c)

Rukiew wodna

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

d)

Cykoria warzywna

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

e)

Zioła

0,05 (1)
   (2)

Trybulka

Szczypiorek

Pietruszka – nać

0,5

Liście selera

Pozostałe

0,02 (1)

vi)

WARZYWA STRĄCZKOWE (świeże)

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

Fasola (w strąkach)

Fasola (bez strąków)

Groch (w strąkach)

Groch (bez strąków)

Pozostałe

vii)

WARZYWA ŁODYGOWE (świeże)

Szparagi

0,1

Karczochy

Seler

0,5

Koper włoski

Karczochy kuliste

0,2 (2)

Por

0,1

Rabarbar

Pozostałe

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

viii)

GRZYBY

0,05 (1)
   (2)

a)

Grzyby uprawne

0,05

b)

Grzyby dziko rosnące

0,02 (1)

3.

Jadalne nasiona roślin strączkowych

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

Fasola

Soczewica

Groch

Pozostałe

4.

Nasiona oleiste

0,1 (1)
   (2)

0,1 (1)
   (2)

0,02 (1)

Siemię lnu

Orzeszki ziemne

Mak

Ziarna sezamu

Ziarna słonecznika

Nasiona rzepaku

Ziarna soi

Nasiona gorczycy

Nasiona bawełny

Nasiona konopi

Pozostałe

5.

Ziemniaki

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

Ziemniaki wczesne

Ziemniaki przechowalnicze

6.

Herbata (liście i łodygi suszone, fermentowane lub w inny sposób przetwarzane Camellia sinensis)

0,1 (1)
   (2)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)

7.

Chmiel (suszony), w tym szyszki chmielu i niezagęszczony proszek

0,1 (1)
   (2)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)

---

(1)  Wskazuje granicę oznaczalności.

1

(2)  Oznacza, że najwyższy dopuszczalny poziom pozostałości został ustanowiony tymczasowo zgodnie z art. 4 ust. 1 lit. f) dyrektywy 91/414/EWG.”

2

---

| 27.7.2006 | PL | Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej | L 206/36 |
| --- | --- | --- | --- |

27.7.2006

PL

Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej

L 206/36

---

DYREKTYWA KOMISJI 2006/63/WE

z dnia 14 lipca 2006 r.

zmieniająca załączniki II–VII do dyrektywy Rady 98/57/WE w sprawie kontroli organizmu Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH,

uwzględniając Traktat ustanawiający Wspólnotę Europejską,

uwzględniając dyrektywę Rady 98/57/WE z dnia 20 lipca 1998 r. (1) w sprawie kontroli Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., w szczególności jej art. 11,

a także mając na uwadze, co następuje:

| (1) | Jednym z głównych organizmów szkodliwych dla ziemniaka i pomidora jest bakteria Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. (zwana dalej „organizmem”), powodująca chorobę zwaną śluzakiem. |
| --- | --- |

(1)

Jednym z głównych organizmów szkodliwych dla ziemniaka i pomidora jest bakteria Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. (zwana dalej „organizmem”), powodująca chorobę zwaną śluzakiem.

| (2) | Organizm wciąż występuje w niektórych częściach terytorium Wspólnoty. |
| --- | --- |

(2)

Organizm wciąż występuje w niektórych częściach terytorium Wspólnoty.

| (3) | Dyrektywa 98/57/WE ustanowiła szczegółowe środki do podjęcia przez państwa członkowskie przeciwko organizmowi dla jego zlokalizowania i określenia zasięgu jego występowania; niedopuszczenia do jej wystąpienia i rozprzestrzeniania się oraz – w przypadku stwierdzenia obecności tego organizmu – zabezpieczenia przed jego rozprzestrzenianiem się i jego zniszczenia przez usunięcie roślin z korzeniami. |
| --- | --- |

(3)

Dyrektywa 98/57/WE ustanowiła szczegółowe środki do podjęcia przez państwa członkowskie przeciwko organizmowi dla jego zlokalizowania i określenia zasięgu jego występowania; niedopuszczenia do jej wystąpienia i rozprzestrzeniania się oraz – w przypadku stwierdzenia obecności tego organizmu – zabezpieczenia przed jego rozprzestrzenianiem się i jego zniszczenia przez usunięcie roślin z korzeniami.

| (4) | Od tamtego czasu poczyniono znaczne postępy w rozumieniu biologii, procedurach wykrywania i identyfikacji organizmu; ponadto doświadczenie praktyczne uzyskane w trakcie kontroli organizmu wymaga rewizji kilku przepisów technicznych związanych ze środkami kontroli. |
| --- | --- |

(4)

Od tamtego czasu poczyniono znaczne postępy w rozumieniu biologii, procedurach wykrywania i identyfikacji organizmu; ponadto doświadczenie praktyczne uzyskane w trakcie kontroli organizmu wymaga rewizji kilku przepisów technicznych związanych ze środkami kontroli.

| (5) | W wyniku wspomnianych postępów wydaje się, że należy zrewidować i zaktualizować środki będące przedmiotem niektórych załączników do dyrektywy 98/57/WE. |
| --- | --- |

(5)

W wyniku wspomnianych postępów wydaje się, że należy zrewidować i zaktualizować środki będące przedmiotem niektórych załączników do dyrektywy 98/57/WE.

| (6) | W odniesieniu do procedur wykrywania i identyfikacji uwzględniono nowoczesną metodę wykrywania: test FISH, czyli fluorescencyjną hybrydyzację in situ. Uwzględniono również udoskonalony test PCR oraz ulepszone różne techniczne elementy aktualnej procedury wykrywania i identyfikacji, a także metody wykrywania i identyfikacji organizmu w roślinach żywicielskich innych niż ziemniaki oraz w wodzie i glebie. |
| --- | --- |

(6)

W odniesieniu do procedur wykrywania i identyfikacji uwzględniono nowoczesną metodę wykrywania: test FISH, czyli fluorescencyjną hybrydyzację in situ. Uwzględniono również udoskonalony test PCR oraz ulepszone różne techniczne elementy aktualnej procedury wykrywania i identyfikacji, a także metody wykrywania i identyfikacji organizmu w roślinach żywicielskich innych niż ziemniaki oraz w wodzie i glebie.

| (7) | Jeśli chodzi o techniczne elementy środków zwalczania choroby, zmieniono przepisy dotyczące: sposobu przechowywaia badanych prób, dla zapewnienia śledzenia porażenia, elementów potrzebnych do określenia zasięgu prawdopodobnego porażenia, szczegółów powiadamiania o wszelkich potwierdzonych przypadkach występowania organizmu oraz o strefach porażenia, środków, które należy wprowadzić w miejscach produkcji określonych jako porażone, a znajdujących się w obrębie wyznaczonych stref. Ponadto dołączono pewne postanowienia dotyczące pomidorów, tak aby w większym stopniu uwzględniać znaczenie tej rośliny jako żywiciela organizmu. |
| --- | --- |

(7)

Jeśli chodzi o techniczne elementy środków zwalczania choroby, zmieniono przepisy dotyczące: sposobu przechowywaia badanych prób, dla zapewnienia śledzenia porażenia, elementów potrzebnych do określenia zasięgu prawdopodobnego porażenia, szczegółów powiadamiania o wszelkich potwierdzonych przypadkach występowania organizmu oraz o strefach porażenia, środków, które należy wprowadzić w miejscach produkcji określonych jako porażone, a znajdujących się w obrębie wyznaczonych stref. Ponadto dołączono pewne postanowienia dotyczące pomidorów, tak aby w większym stopniu uwzględniać znaczenie tej rośliny jako żywiciela organizmu.

| (8) | Środki przewidziane w niniejszej dyrektywie są zgodne z opinią Stałego Komitetu ds. Zdrowia Roślin, |
| --- | --- |

(8)

Środki przewidziane w niniejszej dyrektywie są zgodne z opinią Stałego Komitetu ds. Zdrowia Roślin,

PRZYJMUJE NINIEJSZĄ DYREKTYWĘ:

Artykuł 1

Załączniki II–VII do dyrektywy 98/57/WE zastępuje się odpowiednimi tekstami znajdującymi się w Załączniku do niniejszej dyrektywy.

Artykuł 2

1.   Państwa członkowskie przyjmą i opublikują, najpóźniej do dnia 31 marca 2007 r., przepisy ustawowe, wykonawcze i administracyjne niezbędne do wykonania niniejszej dyrektywy. Państwa członkowskie niezwłocznie przekazują Komisji tekst tych przepisów oraz tabelę korelacji między tymi przepisami a niniejszą dyrektywą.

Państwa członkowskie stosują wymienione przepisy od dnia 1 kwietnia 2007 r.

Przepisy przyjęte przez państwa członkowskie zawierają odniesienie do niniejszej dyrektywy lub odniesienie takie towarzyszy ich urzędowej publikacji. Sposoby dokonywania takiego odniesienia określane są przez państwa członkowskie

2.   Państwa członkowskie niezwłocznie przekazują Komisji tekst podstawowych przepisów prawa krajowego przyjętych w dziedzinach objętych niniejszą dyrektywą.

Artykuł 3

Niniejsza dyrektywa wchodzi w życie trzeciego dnia po jej opublikowaniu w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej.

Artykuł 4

Niniejsza dyrektywa skierowana jest do państw członkowskich.

Sporządzono w Brukseli, dnia 14 lipca 2006 r.

W imieniu Komisji

Markos KYPRIANOU

Członek Komisji

---

(1)  Dz.U. L 235 z 21.8.1998, str. 1.

1

---

ZAŁĄCZNIK

ZAŁĄCZNIK II

SCHEMAT BADANIA DIAGNOSTYCZNEGO, WYKRYWANIA ORAZ IDENTYFIKACJI RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL.

ZAKRES BADANIA

Przedstawiony schemat opisuje różne procedury odnoszące się do:

| i) | diagnostyki śluzaka w bulwach ziemniaka oraz w roślinach ziemniaka i pomidora i niektórych innych roślinach żywicielskich; |
| --- | --- |

i)

diagnostyki śluzaka w bulwach ziemniaka oraz w roślinach ziemniaka i pomidora i niektórych innych roślinach żywicielskich;

| ii) | wykrywania Ralstonia solanacearum w próbach bulw ziemniaka, roślinach ziemniaka, pomidora i w innych roślinach żywicielskich, oraz w wodzie i glebie; |
| --- | --- |

ii)

wykrywania Ralstonia solanacearum w próbach bulw ziemniaka, roślinach ziemniaka, pomidora i w innych roślinach żywicielskich, oraz w wodzie i glebie;

| iii) | identyfikacji Ralstonia solanacearum (R. solanacearum). |
| --- | --- |

iii)

identyfikacji Ralstonia solanacearum (R. solanacearum).

SPIS TREŚCI

| | | Strona |
| --- | --- | --- |
| | Zasady ogólne | 40 |
| SEKCJA I: | Zastosowanie schematu badania | 40 |
| | 1. | Schemat diagnostyki śluzaka (R. solanacearum) w bulwach ziemniaka oraz w bulwach ziemniaka oraz roślinach ziemniaka, pomidora lub innych roślinach żywicielskich z objawami śluzaka lub więdnięcia bakteryjnego | 40 |
| | 2. | Schemat wykrywania oraz identyfikacji R. solanacearum w bezobjawowych próbach bulw ziemniaka | 43 |
| | 3. | Schemat wykrywania oraz identyfikacji R. solanacearum w bezobjawowych próbach bulw ziemniaka, pomidora lub innych roślin żywicielskich | 46 |
| SEKCJA II: | Szczegółowe metody wykrywania R. solanacearum w bulwach ziemniaka i roślinach ziemniaka, pomidora lub innych roślinach żywicielskich z objawami śluzaka lub więdnięcia bakteryjnego | 48 |
| | 1. | Objawy | 48 |
| | 2. | Szybkie testy przesiewowe | 48 |
| | 3. | Posiew na podłoża selektywne | 49 |
| | 4. | Testy identyfikacyjne dla R. solanacearum | 49 |
| SEKCJA III: | 1. | Szczegółowe metody wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w próbach bezobjawowych bulw ziemniaka | 49 |
| | | 1.1. | Przygotowanie próby | 49 |
| | | 1.2. | Badanie | 51 |
| | 2. | Szczegółowe metody wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w próbach bezobjawowych ziemniaka, pomidora lub innych roślin | 51 |
| | | 2.1. | Przygotowanie próby | 51 |
| | | 2.2. | Badanie | 52 |
| SEKCJA IV: | 1. | Schemat wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w wodzie | 53 |
| | 2. | Metody wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w wodzie | 55 |
| | | 2.1. | Przygotowanie próby | 55 |
| | | 2.2. | Badanie | 55 |
| SEKCJA V: | 1. | Schemat wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w glebie | 56 |
| | 2. | Metody wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w glebie | 58 |
| | | 2.1. | Przygotowanie próby | 58 |
| | | 2.2. | Badanie | 58 |
| SEKCJA VI: | Zoptymalizowane protokoły wykrywania i identyfikacji R. solanacearum | 58 |
| | A. | Testy diagnostyczne i wykrywanie | 58 |
| | | 1. | Badanie na obecność wycieków z wiązek przewodzących łodygi | 58 |
| | | 2. | Badanie na obecność granulek poly-β-hydroksymaślanu | 58 |
| | | 3. | Test aglutynacji serologicznej | 59 |
| | | 4. | Izolacja selektywna | 60 |
| | | | 4.1. | Izolacja na podłoże selektywne | 60 |
| | | | 4.2. | Procedura wzbogacenia | 60 |
| | | 5. | Test immunofluorescencyjny (test IF) | 61 |
| | | 6. | Reakcja łańcuchowa polimerazy (test PCR) | 64 |
| | | | 6.1. | Metody oczyszczania DNA | 65 |
| | | | | a) | Metoda zgodnie z Pastrik (2000) | 65 |
| | | | | b) | Inne metody | 65 |
| | | | 6.2. | PCR | 66 |
| | | | 6.3. | Analiza produktu PCR | 66 |
| | | 7. | Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ (test FISH) | 67 |
| | | 8. | Testy immunoenzymosorbcyjne (testy ELISA) | 69 |
| | | | a) | ELISA pośrednie | 69 |
| | | | b) | DASI ELISA (test ELISA sandwiczowy pośredni) | 70 |
| | | 9. | Test biologiczny | 71 |
| | B. | Testy identyfikacyjne | 72 |
| | | 1. | Testy fizjologiczne i biochemiczne | 72 |
| | | 2. | Test IF | 72 |
| | | 3. | Test ELISA | 73 |
| | | 4. | Test PCR | 73 |
| | | 5. | Test FISH | 73 |
| | | 6. | Analiza kwasów tłuszczowych (FAP) | 73 |
| | | 7. | Metoda oznaczania szczepu | 73 |
| | | | 7.1. | Określenie biowaru | 73 |
| | | | 7.2. | Genomowe fingerprinting | 74 |
| | | | 7.3. | Metody PCR | 74 |
| | C. | Testy potwierdzające | 74 |
| | | Dodatek 1 | Laboratoria zajmujące się optymalizacją i zatwierdzeniem protokołów | 76 |
| | | Dodatek 2 | Pożywki do izolacji i hodowli R. solanacearum | 77 |
| | | Dodatek 3 | A. | Dostępne w handlu znormalizowane materiały kontrolne | 79 |
| | | | B. | Przygotowanie kontroli | 80 |
| | | Dodatek 4 | Skład buforów i sposób ich przygotowania | 82 |
| | | Dodatek 5 | Określenie poziomu porażenia w testach IF i FISH | 85 |
| | | Dodatek 6 | Zatwierdzone protokoły PCR i odczynniki | 86 |
| | | Dodatek 7 | Zatwierdzone odczynniki do testu FISH | 91 |
| | | Dodatek 8 | Hodowla oberżyny i pomidora | 93 |
| | | Literatura | | 94 |

Strona

Zasady ogólne

40

SEKCJA I:

Zastosowanie schematu badania

40

1.

Schemat diagnostyki śluzaka (R. solanacearum) w bulwach ziemniaka oraz w bulwach ziemniaka oraz roślinach ziemniaka, pomidora lub innych roślinach żywicielskich z objawami śluzaka lub więdnięcia bakteryjnego

40

2.

Schemat wykrywania oraz identyfikacji R. solanacearum w bezobjawowych próbach bulw ziemniaka

43

3.

Schemat wykrywania oraz identyfikacji R. solanacearum w bezobjawowych próbach bulw ziemniaka, pomidora lub innych roślin żywicielskich

46

SEKCJA II:

Szczegółowe metody wykrywania R. solanacearum w bulwach ziemniaka i roślinach ziemniaka, pomidora lub innych roślinach żywicielskich z objawami śluzaka lub więdnięcia bakteryjnego

48

1.

Objawy

48

2.

Szybkie testy przesiewowe

48

3.

Posiew na podłoża selektywne

49

4.

Testy identyfikacyjne dla R. solanacearum

49

SEKCJA III:

1.

Szczegółowe metody wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w próbach bezobjawowych bulw ziemniaka

49

1.1.

Przygotowanie próby

49

1.2.

Badanie

51

2.

Szczegółowe metody wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w próbach bezobjawowych ziemniaka, pomidora lub innych roślin

51

2.1.

Przygotowanie próby

51

2.2.

Badanie

52

SEKCJA IV:

1.

Schemat wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w wodzie

53

2.

Metody wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w wodzie

55

2.1.

Przygotowanie próby

55

2.2.

Badanie

55

SEKCJA V:

1.

Schemat wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w glebie

56

2.

Metody wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w glebie

58

2.1.

Przygotowanie próby

58

2.2.

Badanie

58

SEKCJA VI:

Zoptymalizowane protokoły wykrywania i identyfikacji R. solanacearum

58

A.

Testy diagnostyczne i wykrywanie

58

1.

Badanie na obecność wycieków z wiązek przewodzących łodygi

58

2.

Badanie na obecność granulek poly-β-hydroksymaślanu

58

3.

Test aglutynacji serologicznej

59

4.

Izolacja selektywna

60

4.1.

Izolacja na podłoże selektywne

60

4.2.

Procedura wzbogacenia

60

5.

Test immunofluorescencyjny (test IF)

61

6.

Reakcja łańcuchowa polimerazy (test PCR)

64

6.1.

Metody oczyszczania DNA

65

a)

Metoda zgodnie z Pastrik (2000)

65

b)

Inne metody

65

6.2.

PCR

66

6.3.

Analiza produktu PCR

66

7.

Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ (test FISH)

67

8.

Testy immunoenzymosorbcyjne (testy ELISA)

69

a)

ELISA pośrednie

69

b)

DASI ELISA (test ELISA sandwiczowy pośredni)

70

9.

Test biologiczny

71

B.

Testy identyfikacyjne

72

1.

Testy fizjologiczne i biochemiczne

72

2.

Test IF

72

3.

Test ELISA

73

4.

Test PCR

73

5.

Test FISH

73

6.

Analiza kwasów tłuszczowych (FAP)

73

7.

Metoda oznaczania szczepu

73

7.1.

Określenie biowaru

73

7.2.

Genomowe fingerprinting

74

7.3.

Metody PCR

74

C.

Testy potwierdzające

74

Dodatek 1

Laboratoria zajmujące się optymalizacją i zatwierdzeniem protokołów

76

Dodatek 2

Pożywki do izolacji i hodowli R. solanacearum

77

Dodatek 3

A.

Dostępne w handlu znormalizowane materiały kontrolne

79

B.

Przygotowanie kontroli

80

Dodatek 4

Skład buforów i sposób ich przygotowania

82

Dodatek 5

Określenie poziomu porażenia w testach IF i FISH

85

Dodatek 6

Zatwierdzone protokoły PCR i odczynniki

86

Dodatek 7

Zatwierdzone odczynniki do testu FISH

91

Dodatek 8

Hodowla oberżyny i pomidora

93

Literatura

94

ZASADY OGÓLNE

Dodatki zawierają zoptymalizowane protokoły dla różnych metod, zatwierdzonych odczynników i danych szczegółowych dotyczących przygotowania badania i materiałów kontrolnych. Dodatek 1 zawiera spis laboratoriów uwzględnionych w optymalizacji i zatwierdzeniu protokołów.

W związku z tym, że protokoły obejmują wykrywanie organizmu poddanego kwarantannie i wykorzystanie kultur żywych R. solanacearum jako materiału kontrolnego, konieczne będzie wykonanie procedur w odpowiednich warunkach kwarantanny przy użyciu odpowiednich urządzeń do usuwania odpadów oraz będąc w posiadaniu odpowiednich pozwoleń wydanych przez władze urzędowe odpowiedzialne za kwarantannę roślin.

Parametry badania muszą zapewnić zgodne i dające się odtworzyć wykrycie różnych poziomów R. solanacearum przy użyciu określonych wartości progowych wybranych metod.

Niezbędne jest dokładne przygotowanie pozytywnych kontroli

Przeprowadzanie badań zgodnie z wymaganymi wartościami progowymi zakłada również właściwe ustawienia, utrzymanie oraz kalibrację urządzeń, ostrożne obchodzenie się i przechowywanie odczynników i wszystkie środki niezbędne dla zapobiegnięcia kontaminacji próbek, np. oddzielenie kontroli pozytywnych od prób badanych. Dla uniknięcia błędów administracyjnych i innych błędów należy przestrzegać norm kontroli jakości, zwłaszcza dotyczących etykietowania i dokumentacji.

Podejrzenie o wystąpienie opisane w art. 4 ust. 2 dyrektywy 98/57/WE oznacza pozytywny wynik badań diagnostycznych lub przesiewowych wykonanych na próbie zgodnie z tym, co określono na poniższych schematach blokowych. Pozytywne pierwsze badanie przesiewowe (badanie IF, PCR/FISH, izolacja selektywna) musi zostać potwierdzone drugim badaniem przesiewowym w oparciu o inną zasadę biologiczną.

Jeżeli pierwsze badanie przesiewowe da wynik pozytywny, wówczas istnieje podejrzenie porażenia R. solanacearum i należy wykonać drugie badanie przesiewowe. Jeżeli drugie badanie przesiewowe da wynik pozytywny, wówczas podejrzenie zostaje potwierdzone (podejrzenie występowania) i należy wykonywać badania zgodnie ze schematem. Jeśli drugie badanie przesiewowe da wynik negatywny, wówczas próbę uznaje się za nieporażoną R. solanacearum.

Potwierdzenie obecności porażenia, o której mowa w art. 5 ust. 1 dyrektywy 98/57/WE, oznacza wyizolowanie i zidentyfikowanie czystej kultury R. solanacearum z potwierdzeniem patogeniczności.

SEKCJA I

SCHEMAT BADANIA

1.   Schemat diagnozowania śluzaka w bulwach ziemniaka oraz R. solanacearum w bulwach ziemniaka oraz w roślinach ziemniaka, pomidora lub innych roślinach żywicielskich z objawami śluzaka lub więdnięcia bakteryjnego

Procedura badania jest przeznaczona dla bulw ziemniaka i roślin z objawami śluzaka lub więdnięcia bakteryjnego. Procedura ta obejmuje szybkie badanie przesiewowe, izolację patogenu z porażonej tkanki naczyniowej na pożywkę diagnostyczną (selektywną) oraz, w przypadku wyniku pozytywnego, identyfikację kultury jako Ralstonia solanacearum.

Image

Image

2.   Schemat wykrywania oraz identyfikacji Ralstonia solanacearum w bezobjawowych próbach bulw ziemniaka

Zasada:

Procedura badania przeznaczona jest do wykrywania utajonych infekcji bulw ziemniaka. W przypadku wyniku pozytywnego przynajmniej dwóch badań przesiewowych3, w oparciu o różne zasady biologiczne, procedura musi zostać uzupełniona izolacją patogenu, po której wykonane zostaje – w przypadku izolacji typowych kolonii – potwierdzenie czystej kultury jako R. solanacearum. Pozytywny wynik tylko jednego badania przesiewowego nie jest wystarczający dla stwierdzenia, że próba jest podejrzana.

Badania przesiewowe i badania izolacji muszą pozwolić na wykrycie od 103 do 104 komórek/ml zawieszonego osadu, w kontroli pozytywnej załączonej do każdej serii badań.

Image

Image

3.   Schemat wykrywania oraz identyfikacji Ralstonia solanacearum w bezobjawowych próbach roślin ziemniaka, pomidora lub innych roślin żywicielskich.

Image

Image

SEKCJA II

SZCZEGÓŁOWE METODY WYKRYWANIA RALSTONIA SOLANACEARUM W BULWACH ZIEMNIAKA I ROŚLINACH ZIEMNIAKA, POMIDORA LUB INNYCH ROŚLINACH ŻYWICIELSKICH Z OBJAWAMI ŚLUZAKA LUB WIĘDNIĘCIA BAKTERYJNEGO

1.   Objawy (patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

1.1.   Objawy na ziemniaku

Roślina ziemniaka. Wczesnym stadium infekcji w polu jest więdnięcie liści od podstawy w kierunku wierzchołka rośliny w wysokiej temperaturze panującej w ciągu dnia oraz poprawa ich stanu w ciągu nocy. We wczesnych stadiach więdnięcia liście pozostają zielone, lecz później żółkną i rozwijają się nekrozy. Występuje również epinastia. W szybkim czasie więdnięcie jednego pędu lub całej rośliny staje się nieodwracalne i prowadzi do śmierci całej rośliny. Tkanka naczyniowa w łodygach przeciętych w poprzek więdnącej rośliny zwykle brązowieje, a z przeciętej powierzchni wypływa mleczny śluz bakteryjny lub można go wycisnąć z rośliny. Gdy uciętą łodygę wstawi się pionowo do wody, z wiązek naczyniowych będzie wypływać śluz.

Bulwa ziemniaka. Bulwy ziemniaka należy przecinać poprzecznie w pobliżu części przystolonowej lub podłużnie poprzez stolon. Wczesne stadium infekcji objawia się odbarwieniem szklistożółtym do lekko brązowego pierścienia naczyniowego, na którym po kilku minutach samoistnie zacznie pojawiać się kremowy wyciek. Później przebarwienie wiązek naczyniowych staje się bardziej brązowe, a nekrozy mogą objąć tkankę parenchymatyczną. W zaawansowanych stadiach choroby infekcja rozprzestrzenia się i obejmuje nie tylko części przystolonowej oraz oczka, z których mogą wypływać bakterie, co powoduje przyleganie cząstek glebowych. Mogą pojawić się czerwonawo-brązowe, lekko zapadnięte zmiany na naskórku z powodu wewnętrznego zapadania się tkanek naczyniowych. W zaawansowanych stadiach choroby częste jest występowanie wtórnego rozwoju zgnilizny grzybowej i bakteryjnej.

1.2.   Objawy na pomidorze

Roślina pomidora. Pierwszym widocznym objawem jest zwiędły wygląd najmłodszych liści. W korzystnych dla patogenu warunkach środowiska (temperatura gleby około 25 °C, wysoka wilgotność powietrza) w ciągu kilku dni następuje epinastia oraz więdnięcie jednej strony lub całej rośliny, co prowadzi do pokładania się rośliny. W warunkach mniej korzystnych (temperatura gleby niższa od 21 °C) więdnięcie jest mniejsze, lecz na łodydze może rozwinąć się wiele nowych korzeni. Można zaobserwować tłustawy pasek dookoła łodygi, który świadczy o martwicy układu naczyniowego. Po przecięciu łodygi w poprzek odbarwione brązowe tkanki naczyniowe wydzielają krople białego lub żółtawego śluzu bakteryjnego.

1.3.   Objawy na innych roślinach żywicielskich

Rośliny Solanum dulcamara oraz S. nigrum. W warunkach naturalnych objawy więdnięcia u tych żywicieli obserwuje się rzadko, chyba że temperatura gleby przekracza 25 °C lub poziomy inokulum są bardzo wysokie (np. jak dla S. nigrum rosnącej w pobliżu chorej rośliny ziemniaka lub pomidora). Gdy nie występuje więdnięcie, objawy są takie jak w przypadku pomidora. Rośliny S. dulcamara, które nie więdną, rosnące z łodygami i korzeniami w wodzie, mogą wykazywać wewnętrzne lekkie brązowawe przebarwienie wiązek przewodzących na przekroju poprzecznym podstawy łodygi lub na częściach znajdujących się pod wodą. Z przeciętych wiązek przewodzących mogą wydostawać się bakterie lub smugi śluzu, jeśli przecięta łodyga zostanie ustawiona pionowo w wodzie, nawet przy braku objawów więdnięcia.

2.   Szybkie testy przesiewowe

Szybkie testy przesiewowe mogą ułatwić wstępną diagnozę, ale nie są niezbędne. Należy zastosować jeden lub kilka z poniższych zatwierdzonych testów:

2.1.   Badanie na obecność wycieków z wiązek przewodzących łodygi

(Patrz: sekcja VI.A.1)

2.2.   Wykrywanie granulek poli-β-hydroksymaślanu (PHB)

Charakterystyczne granulki PHB w komórkach R. solanacearum można zobaczyć, wybarwiając je na szkiełku przedmiotowym błękitem Nilu A lub czernią sudanową w utrwalonych termicznie rozmazach śluzu bakteryjnego z porażonej tkanki (patrz: sekcja VI.A.2).

2.3.   Test aglutynacji serologicznej

(Patrz: sekcja VI.A.3.)

2.4.   Inne testy

Dalsze odpowiednie badania przesiewowe to test IF (patrz: sekcja VI.A.5), Test FISH (patrz: sekcja VI.A.7), testy ELISA (patrz: sekcja VI.A.8) oraz test PCR (patrz: sekcja VI.A.6).

3.   Posiew na podłoża selektywne

| a) | Pobrać wyciek z tkanki lub fragmenty przebarwionej tkanki z pierścienia wiązek przewodzących bulwy ziemniaka albo z wiązek łodygi rośliny ziemniaka, pomidora lub innych więdnących roślin żywicielskich. Zawiesić je w niewielkiej ilości sterylnej wody destylowanej lub 50 mM buforu fosforanowego (dodatek 4) i pozostawić na 5–10 minut. |
| --- | --- |

a)

Pobrać wyciek z tkanki lub fragmenty przebarwionej tkanki z pierścienia wiązek przewodzących bulwy ziemniaka albo z wiązek łodygi rośliny ziemniaka, pomidora lub innych więdnących roślin żywicielskich. Zawiesić je w niewielkiej ilości sterylnej wody destylowanej lub 50 mM buforu fosforanowego (dodatek 4) i pozostawić na 5–10 minut.

| b) | Przygotować serię dziesięciokrotnych rozcieńczeń zawiesiny. |
| --- | --- |

b)

Przygotować serię dziesięciokrotnych rozcieńczeń zawiesiny.

| c) | Przenieść 50–100 μl zawiesiny i jej rozcieńczeń na pożywkę uniwersalną (NA, YPGA lub SPA; patrz: dodatek 2) i/lub na pożywkę tetrazolową Kelmana (dodatek 2) i/lub na zatwierdzoną selektywną pożywkę (np. SMSA; patrz: dodatek 2). Nanieść i rozprowadzić zawiesinę na płytce. W razie potrzeby przygotować oddzielne płytki z rozcieńczoną zawiesiną R. solanacearum biowaru 2 jako kontrolę pozytywną. |
| --- | --- |

c)

Przenieść 50–100 μl zawiesiny i jej rozcieńczeń na pożywkę uniwersalną (NA, YPGA lub SPA; patrz: dodatek 2) i/lub na pożywkę tetrazolową Kelmana (dodatek 2) i/lub na zatwierdzoną selektywną pożywkę (np. SMSA; patrz: dodatek 2). Nanieść i rozprowadzić zawiesinę na płytce. W razie potrzeby przygotować oddzielne płytki z rozcieńczoną zawiesiną R. solanacearum biowaru 2 jako kontrolę pozytywną.

| d) | Inkubować płytki przez 2–6 dni w temperaturze 28 °C.






  — | Na pożywkach uniwersalnych wirulentne szczepy R. solanacearum rosną w postaci kolonii perłowo-białych, płaskich, nieregularnych i ciekłych, często z charakterystycznymi spiralami w środku. Awirulentne postacie R. solanacearum rosną jako małe, okrągłe, nieciekłe kolonie całkowicie kremowo-białe. |
| --- | --- | --- |

d)

Inkubować płytki przez 2–6 dni w temperaturze 28 °C.

—

Na pożywkach uniwersalnych wirulentne szczepy R. solanacearum rosną w postaci kolonii perłowo-białych, płaskich, nieregularnych i ciekłych, często z charakterystycznymi spiralami w środku. Awirulentne postacie R. solanacearum rosną jako małe, okrągłe, nieciekłe kolonie całkowicie kremowo-białe.

| — | Na pożywce tetrazolowej Kelmana i SMSA spirale mają krwistoczerwony kolor. Awirulentne postacie R. solanacearum rosną jako małe, okrągłe, nieciekłe kolonie całe o głęboko czerwonej barwie oraz o maślanej konsystencji. |
| --- | --- |

—

Na pożywce tetrazolowej Kelmana i SMSA spirale mają krwistoczerwony kolor. Awirulentne postacie R. solanacearum rosną jako małe, okrągłe, nieciekłe kolonie całe o głęboko czerwonej barwie oraz o maślanej konsystencji.

4.   Testy identyfikacyjne dla R. solanacearum

Badania potwierdzające wstępną identyfikację szczepów R. solanacearum pokazano w sekcji VI.B.

SEKCJA III

1.   Szczegółowe metody wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w próbach bezobjawowych bulw ziemniaka

1.1.   Przygotowanie próby

Uwaga:

| — | Standardowa wielkość próby wynosi 200 bulw. Bardziej intensywne badania wymagają większej ilości testów na próbach tej wielkości. Większa liczba bulw w próbie będzie uniemożliwiać lub utrudniać interpretację wyników. Jednak gdy dostępna jest mniejsza niż 200 liczba bulw, procedurę tę można stosować z powodzeniem. |
| --- | --- |

—

Standardowa wielkość próby wynosi 200 bulw. Bardziej intensywne badania wymagają większej ilości testów na próbach tej wielkości. Większa liczba bulw w próbie będzie uniemożliwiać lub utrudniać interpretację wyników. Jednak gdy dostępna jest mniejsza niż 200 liczba bulw, procedurę tę można stosować z powodzeniem.

| — | Zatwierdzenie wszystkich opisanych niżej metod wykrywania oparte było na testowaniu prób złożonych z 200 bulw. |
| --- | --- |

—

Zatwierdzenie wszystkich opisanych niżej metod wykrywania oparte było na testowaniu prób złożonych z 200 bulw.

| — | Opisany poniżej ekstrakt z ziemniaków może być także wykorzystany do wykrywania bakterii bakteriozy pierścieniowej ziemniaka, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. |
| --- | --- |

—

Opisany poniżej ekstrakt z ziemniaków może być także wykorzystany do wykrywania bakterii bakteriozy pierścieniowej ziemniaka, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

Fakultatywne czynności wstępne przed przygotowaniem próby:

| a) | Inkubować próby w temperaturze 25–30 °C przez okres do dwu tygodni przed badaniem, aby pomóc w namnożeniu populacji R. solanacearum. |
| --- | --- |

a)

Inkubować próby w temperaturze 25–30 °C przez okres do dwu tygodni przed badaniem, aby pomóc w namnożeniu populacji R. solanacearum.

| b) | Umyć bulwy. Użyć właściwych środków odkażających (związki chloru, gdy zastosowane ma być badanie PCR dla usunięcia DNA patogenu) i detergentów pomiędzy każda próbą. Wysuszyć bulwy na powietrzu. Ta procedura mycia jest szczególnie przydatna (lecz niewymagana) przy próbach z nadmiarem ziemi i w przypadku wykonywania testu PCR lub procedury bezpośredniej izolacji. |
| --- | --- |

b)

Umyć bulwy. Użyć właściwych środków odkażających (związki chloru, gdy zastosowane ma być badanie PCR dla usunięcia DNA patogenu) i detergentów pomiędzy każda próbą. Wysuszyć bulwy na powietrzu. Ta procedura mycia jest szczególnie przydatna (lecz niewymagana) przy próbach z nadmiarem ziemi i w przypadku wykonywania testu PCR lub procedury bezpośredniej izolacji.

1.1.1.   Usunąć czystym i zdezynfekowanym skalpelem lub nożem do warzyw skórkę z części przystolonowej każdej bulwy, w taki sposób, by odsłonić tkanki przewodzące. Starannie wyciąć mały stożek z tkanki przewodzącej z części przystolonowej i ograniczyć ilość tkanki innej niż przewodząca do minimum. (Patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Uwaga: Odłożyć na bok wszystkie (gnijące) bulwy z objawami śluzaka przechowywać i badać oddzielnie.

Jeżeli w czasie pobierania tkanki przystolonowej obserwuje się objawy nasuwające podejrzenie śluzaka, należy przeprowadzić wzrokowe badanie bulwy i przeciąć bulwę w części przystolonowej. Wszystkie przekroje bulw z podejrzanymi objawami powinny być pozostawione co najmniej przez dwie doby w temperaturze pokojowej, aby umożliwić korkowacenie i przechowywane w lodówce (w temperaturze 4–10 °C) we właściwych warunkach kwarantanny. Wszystkie bulwy, włącznie z tymi przejawiającymi podejrzane objawy, należy przechowywać zgodnie z załącznikiem III.

1.1.2.   Fragmenty części przystolonowych umieścić w nieużywanych wcześniej pojemnikach jednorazowego użytku, które można szczelnie zamknąć (w przypadku powtórnego użycia pojemników należy je starannie oczyścić i zdezynfekować przy użyciu związków chloru). Pobrane fragmenty części przystolonowych najlepiej poddać obróbce niezwłocznie. Jeżeli jednak nie będzie to możliwe, przechować je w pojemniku bez dodatku roztworu buforowego w lodówce nie dłużej niż 72 godziny lub nie dłużej niż 24 godziny w temperaturze pokojowej.

Z pobranymi fragmentami części przystolonowych postępować według jednej z następujących procedur:

| a) | fragmenty tkanki przystolonowej pokryć dostateczną objętością (około 40 ml) buforu do ekstrakcji (dodatek 4) i mieszać na wytrząsarce obrotowej (50–100 obr./min) przez 4 godziny, utrzymując temperaturę poniżej 24 °C lub przez 16–24 godzin w lodówce;
  lub |
| --- | --- |

a)

fragmenty tkanki przystolonowej pokryć dostateczną objętością (około 40 ml) buforu do ekstrakcji (dodatek 4) i mieszać na wytrząsarce obrotowej (50–100 obr./min) przez 4 godziny, utrzymując temperaturę poniżej 24 °C lub przez 16–24 godzin w lodówce;

lub

| b) | fragmenty tkanki przystolonowej homogenizować z odpowiednią ilością (około 40 ml) buforu do ekstrakcji (dodatek 4) albo z użyciem miksera (np. Waring lub Ultra Thurax), albo przez rozdrabnianie w szczelnie zamkniętej jednorazowej torebce do maceracji (np. Stomacher lub Bioreba z polietylenu o dużej wytrzymałości, 150 x 250 mm; sterylizowane promieniowaniem), używając gumowego młotka lub odpowiedniego aparatu do rozdrabniania (np. Homex). |
| --- | --- |

b)

fragmenty tkanki przystolonowej homogenizować z odpowiednią ilością (około 40 ml) buforu do ekstrakcji (dodatek 4) albo z użyciem miksera (np. Waring lub Ultra Thurax), albo przez rozdrabnianie w szczelnie zamkniętej jednorazowej torebce do maceracji (np. Stomacher lub Bioreba z polietylenu o dużej wytrzymałości, 150 x 250 mm; sterylizowane promieniowaniem), używając gumowego młotka lub odpowiedniego aparatu do rozdrabniania (np. Homex).

Uwaga/ jeśli próby są homogenizowane przy użyciu miksera, ryzyko kontaminacji między próbami jest znaczne. Należy podjąć odpowiednie środki ostrożności, aby nie dopuścić do powstania aerozolu lub rozlania w czasie procesu ekstrakcji. Należy się upewnić, że do każdej próby używane są świeżo wysterylizowane ostrza i naczynia miksera. Jeśli ma być stosowany test PCR, unikać przeniesienia DNA na pojemniki lub aparaty do rozdrabniania. JeFśli ma być zastosowany test PCR, zleca się rozdrabnianie w torebkach i stosowanie jednorazowych probówek.

1.1.3.   Zdekantować supernatant. Jeśli jest zbyt mętny, sklarować – albo przez odwirowanie przy niskiej liczbie obrotów (przy nie więcej niż 180 g przez 10 minut w temperaturze 4–10 °C) lub przez filtrację w próżni (40–100 μm), myjąc filtr dodatkowym (10 ml) buforem do ekstrakcji.

1.1.4.   Zagęścić frakcję bakterii przez odwirowanie przy 7 000 g przez 15 minut (lub 10 000 g przez 10 minut) w temperaturze 4–10 °C i odrzucić supernatant bez naruszania osadu

1.1.5.   Zawiesić powtórnie osad w 1,5 ml buforu do zawieszania osadu (dodatek 4). Stosować 500 μl do badań na obecność R. solanacearum, 500 μl na obecność Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus i 500 μl do celów porównawczych. Dodać sterylną glicerynę aż do uzyskania ostatecznego stężenia 10–25 % (obj./obj.) i dodać do 500 μl zawiesiny porównawczej i do pozostałej zawiesiny testowej, zworteksować i przechowywać w temperaturze od –16 do –24 °C (tygodnie) lub od –68 do –86 °C (miesiące). W czasie wykonywania testu przechowywać zawiesiny testowe w temperaturze 4–10 °C.

Wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie nie jest wskazane.

Jeśli konieczny jest transport ekstraktu, zapewnić dostawę w przenośnej lodówce w ciągu 24 lub 48 godzin.

1.1.6.   Jest niezwykle ważne, aby w celu uniknięcia kontaminacji wszystkie kontrole pozytywne R. solanacearum i próby badać osobno. Odnosi się to zarówno do szkiełek IF, jak i do wszystkich testów.

1.2.   Badanie

Patrz: schemat blokowy i opis testów i protokołów zoptymalizowanych znajdujące się w odpowiednich dodatkach:

| | Posiew na podłoża selektywne (patrz: sekcja VI.A.4) |
| --- | --- |

Posiew na podłoża selektywne (patrz: sekcja VI.A.4)

| | Test IF (patrz: sekcja VI.A.5) |
| --- | --- |

Test IF (patrz: sekcja VI.A.5)

| | Test PCR (patrz: sekcja VI.A.6) |
| --- | --- |

Test PCR (patrz: sekcja VI.A.6)

| | Test FISH (patrz: sekcja VI.A.7) |
| --- | --- |

Test FISH (patrz: sekcja VI.A.7)

| | Testy ELISA (patrz: sekcja VI.A.8) |
| --- | --- |

Testy ELISA (patrz: sekcja VI.A.8)

| | Test biologiczny (patrz: sekcja VI.A.9) |
| --- | --- |

Test biologiczny (patrz: sekcja VI.A.9)

2.   Szczegółowe metody wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w próbach bezobjawowych roślin ziemniaka, pomidora lub innych roślin żywicielskich

2.1.   Przygotowanie próby

Uwaga: Przy wykrywaniu utajonych populacji R. solanacearum zaleca się przebadanie prób złożonych. Procedurę tę można łatwo zastosować do prób złożonych o wielkości do 200 części łodygi. Przy wykonywaniu badań powinny się one opierać o statystycznie reprezentatywną próbę badanej populacji rośliny.

2.1.1.   Pobrać fragmenty łodygi o wielkości 1–2 cm do zamkniętego sterylnego pojemnika zgodnie z poniższą procedurą próbobrania:

Sadzonki pomidora w szkółce: Przy pomocy czystego zdezynfekowanego noża pobrać 1 cm fragment u podstawy każdej łodygi, tuż nad glebą.

Rośliny pomidora hodowane na polu lub w szklarni: Przy pomocy czystego zdezynfekowanego noża pobrać najniższy pęd boczny z każdej rośliny, ucinając go tuż nad połączeniem z łodygą główną. Z każdego pędu bocznego odciąć najniższy 1 cm fragment.

Inni żywiciele: Przy pomocy czystego zdezynfekowanego noża lub sekatora pobrać 1 cm fragment u podstawy każdej łodygi, tuż nad glebą. W przypadku S. dulcamara lub innych roślin żywicielskich rosnących w wodzie, pobrać 1–2 cm fragmenty z łodygi znajdującej się pod wodą lub rozłogi z korzeniami wodnymi.

Podczas próbobrania w danym miejscu zaleca się przebadanie statystycznie reprezentatywnej próby składającej się z przynajmniej 10 roślin z miejsca próbobrania każdego potencjalnego żywiciela. Wykrycie patogenu będzie najbardziej wiarygodne późną wiosną, latem i jesienią, choć u wieloletnich Solanum dulcamara rosnących w ciekach wodnych porażenie naturalne można wykrywać przez cały rok. Znani żywiciele to samosiewy ziemniaka (groundkeeper), Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium i inni członkowie rodziny Solanaceae. Inni żywiciele to Pelargonium spp. oraz Portulaca oleracea. Niektóre gatunki chwastów europejskich, których korzenie lub ich rizosfera w pewnych szczególnych warunkach środowiskowych mogą potencjalnie stanowić rezerwuar populacji R. solanacearum biowar 2/rasa 3, to: Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp, Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra oraz Urtica dioica.

Uwaga: Na tym etapie można zastosować wizualne badanie na obecność wewnętrznych objawów (przebarwienie wiązek naczyniowych lub wyciek śluzu bakteryjnego). Odłożyć na bok wszystkie fragmenty łodygi wykazujące objawy i przebadać je oddzielnie (patrz: sekcja II).

2.1.2.   Zdezynfekować fragmenty łodygi krótko przy pomocy 70 % alkoholu etylowego i natychmiast wytrzeć je do sucha przy pomocy bibuły. Po czym poddać fragmenty łodyg jednej z następujących procedur:

| a) | fragmenty pokryć dostateczną objętością (około 40 ml) buforu do ekstrakcji (dodatek 4) i mieszać na wytrząsarce obrotowej (50–100 obr./min) przez 4 godziny, utrzymując temperaturę poniżej 24 °C lub przez 16–24 godzin w lodówce; lub |
| --- | --- |

a)

fragmenty pokryć dostateczną objętością (około 40 ml) buforu do ekstrakcji (dodatek 4) i mieszać na wytrząsarce obrotowej (50–100 obr./min) przez 4 godziny, utrzymując temperaturę poniżej 24 °C lub przez 16–24 godzin w lodówce; lub

| b) | rozpocząć procedurę bezzwłocznie, miażdżąc odcinki w mocnej torebce do maceracji (np. Stomacher lub Bioreba) z odpowiednią ilością buforu ekstrakcyjnego (dodatek 4), używając gumowego młotka lub odpowiedniego urządzenia do rozdrabniania (np. Homex). Jeśli nie jest to możliwe, przechowywać odcinki łodyg nie dłużej niż 72 godziny w lodówce lub nie dłużej niż 24 godziny w temperaturze pokojowej. |
| --- | --- |

b)

rozpocząć procedurę bezzwłocznie, miażdżąc odcinki w mocnej torebce do maceracji (np. Stomacher lub Bioreba) z odpowiednią ilością buforu ekstrakcyjnego (dodatek 4), używając gumowego młotka lub odpowiedniego urządzenia do rozdrabniania (np. Homex). Jeśli nie jest to możliwe, przechowywać odcinki łodyg nie dłużej niż 72 godziny w lodówce lub nie dłużej niż 24 godziny w temperaturze pokojowej.

2.1.3.   Zdekantować supernatant po ustaleniu się przez 15 minut.

2.1.4.   Dalsze klaryfikowanie ekstraktu lub zagęszczanie frakcji bakteryjnej zwykle nie jest wymagane, ale można je osiągnąć przez filtrację i/lub odwirowanie, jak opisano w częściach III.1.1.3–1.1.5.

2.1.5.   Podzielić czysty lub stężony ekstrakt z próby na dwie równe części. W czasie przeprowadzania testu jedną połowę trzymać w temperaturze 4–10 °C, a drugą połowę – z 10–25 % (obj./obj.) – sterylnego glicerolu przechowywać w temperaturze –16 do –24 °C (tygodnie) lub –68 do –86 °C (miesiące), jeśli wymagane są dalsze testy.

2.2.   Badanie

Patrz: schemat blokowy i opis testów i protokołów zoptymalizowanych znajdujące się w odpowiednich dodatkach:

| | Posiew na podłoża selektywne (patrz: sekcja VI.A.4) |
| --- | --- |

Posiew na podłoża selektywne (patrz: sekcja VI.A.4)

| | Test IF (patrz: sekcja VI.A.5) |
| --- | --- |

Test IF (patrz: sekcja VI.A.5)

| | Test PCR (patrz: sekcja VI.A.6) |
| --- | --- |

Test PCR (patrz: sekcja VI.A.6)

| | Test FISH (patrz: sekcja VI.A.7) |
| --- | --- |

Test FISH (patrz: sekcja VI.A.7)

| | Testy ELISA (patrz: sekcja VI.A.8) |
| --- | --- |

Testy ELISA (patrz: sekcja VI.A.8)

| | Test biologiczny (patrz: sekcja VI.A.9) |
| --- | --- |

Test biologiczny (patrz: sekcja VI.A.9)

SEKCJA IV

1.   Schemat wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w wodzie

Image

Image

2.   Metody wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w wodzie

Zasada

Zatwierdzony schemat wykrywania opisany w tej sekcji dotyczy wykrywania patogenu w próbach wód powierzchniowych i można go zastosować do badania prób ścieków z obróbki ziemniaków lub ścieków ciekłych. Ważne jest jednak, aby pamiętać, że oczekiwana czułość wykrywania zmienia się w zależności od substratu. Na czułość badania izolacji wpływ mają populacje konkurujących bakterii saprofitycznych, które są na ogół o wiele większe przy przetwarzaniu ziemniaków i w ściekach niż w wodzie powierzchniowej. Zakłada się, że poniższy schemat wykryje zaledwie 103 komórek na litr w wodzie powierzchniowej, natomiast czułość wykrywania przy przetwarzaniu ziemniaków lub w ściekach będzie prawdopodobnie znacznie niższa. Z tego powodu zaleca się badać ścieki po ich utylizacji (np. sedymentacji lub przefiltrowaniu), w czasie których to operacji zmniejszają się populacje saprofityczne. Ograniczenia czułości schematu badania powinno się wziąć pod uwagę przy ocenie wiarygodności wszelkich uzyskanych wyników negatywnych. Schemat ten był z powodzeniem stosowany w pracach badawczych dla ustalenia występowania lub braku patogenu w wodzie powierzchniowej, jednak należy pamiętać o jego ograniczeniach przy używaniu go do podobnych badań ścieków pochodzących z obróbki ziemniaków lub ścieków ciekłych.

2.1.   Przygotowanie próby

Uwaga:

| — | Wykrycie R. solanacearum w wodzie powierzchniowej jest najbardziej pewne późną wiosną, latem i jesienią, gdy temperatura wody przekracza 15 °C. |
| --- | --- |

—

Wykrycie R. solanacearum w wodzie powierzchniowej jest najbardziej pewne późną wiosną, latem i jesienią, gdy temperatura wody przekracza 15 °C.

| — | Wielokrotne próbobranie w różnych okresach w powyższym terminie w wyznaczonych punktach zwiększa prawdopodobieństwo wykrycia dzięki zmniejszeniu skutków zmian klimatycznych. |
| --- | --- |

—

Wielokrotne próbobranie w różnych okresach w powyższym terminie w wyznaczonych punktach zwiększa prawdopodobieństwo wykrycia dzięki zmniejszeniu skutków zmian klimatycznych.

| — | Pod uwagę należy wziąć skutki ulewnych deszczów i lokalizację cieków wodnych dla uniknięcia skutków nadmiernego rozwodnienia, co może wpływać na zamaskowanie obecności patogenu. |
| --- | --- |

—

Pod uwagę należy wziąć skutki ulewnych deszczów i lokalizację cieków wodnych dla uniknięcia skutków nadmiernego rozwodnienia, co może wpływać na zamaskowanie obecności patogenu.

| — | Próby wody należy pobrać w sąsiedztwie roślin żywicielskich, jeśli takie występują. |
| --- | --- |

—

Próby wody należy pobrać w sąsiedztwie roślin żywicielskich, jeśli takie występują.

2.1.1.   W wybranych punktach próbobrania pobrać próby wody, wypełniając nią jednorazowe sterylne probówki lub butelki na głębokości, o ile to możliwe, poniżej 30 cm i w promieniu 2 m od brzegu. W przypadku ścieków pochodzących z obróbki ziemniaków lub ścieków ciekłych, próby należy pobrać z punktu usuwania ścieków. Zaleca się stosowanie prób o wielkości do 500 ml na punkt próbobrania. Jeśli preferowane są próby mniejsze, zaleca się pobieranie prób przynajmniej 3 razy z każdego punktu próbobrania, z czego każda próba składa się z 2 podprób, każda o objętości minimum 30 ml. Przy intensywnych badaniach należy wybrać przynajmniej 3 punkty próbobrania na odcinku cieku wodnego o długości 3 km i zagwarantować, że zostaną pobrane próby również z dopływów.

2.1.2.   Próby transportować w niskiej temperaturze (4–10 °C), bez dostępu światła i przebadać w ciągu 24 godzin.

2.1.3.   W miarę potrzeby przy pomocy jednej z poniższych metod można zagęścić frakcję bakteryjną:

| a) | wirować 30–50 ml podpróby w 10 000 g przez 10 minut (lub 7 000 g przez 15 minut), najlepiej w temperaturze 4–10 °C, usunąć zawiesinę i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu do zawieszania osadu (dodatek 4); |
| --- | --- |

a)

wirować 30–50 ml podpróby w 10 000 g przez 10 minut (lub 7 000 g przez 15 minut), najlepiej w temperaturze 4–10 °C, usunąć zawiesinę i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu do zawieszania osadu (dodatek 4);

| b) | przeprowadzić filtrację membranową (minimalny rozmiar porów 0,45 μm), po której przemyć filtr 5–10 ml buforu do zwieszania osadu i zebrać popłuczyny. Metoda ta ma zastosowanie do większych objętości wody zawierającej małą ilość saprofitów. |
| --- | --- |

b)

przeprowadzić filtrację membranową (minimalny rozmiar porów 0,45 μm), po której przemyć filtr 5–10 ml buforu do zwieszania osadu i zebrać popłuczyny. Metoda ta ma zastosowanie do większych objętości wody zawierającej małą ilość saprofitów.

Zagęszczania nie poleca się zazwyczaj dla prób ścieków pochodzących z obróbki ziemniaków lub ścieków ciekłych, ponieważ zwiększona populacja konkurujących bakterii saprofitycznych hamuje wykrywanie Ralstonia solanacearum.

2.2.   Badanie

Patrz: schemat blokowy i opis badań we właściwych protokołach.

SEKCJA V

1.   Schemat wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w glebie

Image

Image

2.   Metody wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w glebie

Zasada

Zatwierdzony schemat wykrywania opisany w tej sekcji dotyczy wykrywania patogenu w próbach gleby, lecz można go również wykorzystać do badania prób stałego lub ciekłego odpadu z obróbki ziemniaka. Ważne jest jednak, aby pamiętać, że metody te nie są wystarczająco czułe do zagwarantowania wykrywania nisko i/lub nieregularnie rozproszonych populacji Ralstonia solanacearum, które mogą występować w naturalnie porażonych próbach tych substratów.

Przy ocenie wiarygodności wszelkich uzyskanych wyników negatywnych, jak również przy badaniu w celu określenia obecności lub nieobecności patogenu w glebie i odpadach powinno się wziąć pod uwagę ograniczenia czułości schematu badania. Najbardziej wiarygodnym badaniem obecności patogenu w glebie jest posadzenie żywiciela podatnego na chorobę i kontrolowanie go pod względem porażenia, lecz nawet przy tej metodzie niskie poziomy porażenia nie zostaną wykryte.

2.1.   Przygotowanie próby

2.1.1.   Próbobranie gleby z pola powinno być wykonane zgodnie ze standardowymi zasadami stosowanymi dla prób nicieniowych. Należy pobrać 0,5–1 kg ziemi dla każdej próby z 60 miejsc na każde 0,3 ha z głębokości 10–20 cm (lub w siatce 7 x 7 metrów). Jeśli istnieje podejrzenie występowania patogenu, należy zwiększyć liczbę punktów poboru do 120 na 0,3 ha. Przed badaniem próby trzymać w temperaturze 12–15 °C. Próby osadów z obróbki ziemniaków i ścieków należy sporządzić, pobierając łącznie 1 kg z punktów próbobrania, tak aby były reprezentatywne dla całkowitej wielkości badanego osadu. Przed badaniem dobrze wymieszać każdą próbę.

2.1.2.   Podpróby 10–25 g ziemi lub osadu zawiesić w 60–150 ml buforu ekstrakcyjnego (dodatek 4) i wytrząsać na wstrząsarce obrotowej (250 obr./min) przez okres do 2 godzin. W razie potrzeby w rozdrobnieniu może pomóc dodanie 0,02 % sterylnego Tween-20 i 10–20 g sterylnego żwiru.

2.1.3.   W czasie badania utrzymywać zawiesinę w temperaturze 4 °C.

2.2.   Badanie

Patrz: schemat blokowy i opis badań we właściwych protokołach.

SEKCJA VI

ZOPTYMALIZOWANE PROTOKOŁY WYKRYWANIA I IDENTYFIKACJI R. SOLANACEARUM

A.   TESTY DIAGNOSTYCZNE I WYKRYWANIE

1.   Badanie na obecność wycieków z wiązek przewodzących łodygi

Obecność R. solanacearum w więdnących łodygach ziemniaka lub pomidora lub innych roślin żywicielskich można stwierdzić, wykonując poniższe proste badanie wstępne: uciąć łodygę tuż nad poziomem gleby. Umieścić odciętą powierzchnię łodygi w probówce napełnionej czystą wodą. Po kilku minutach można zaobserwować charakterystyczny samoczynny wypływ śluzu bakteryjnego z przeciętych wiązek przewodzących.

2.   Badanie na obecność granulek poly-β-hydroksymaślanu

| 1. | Przygotować rozmaz śluzu bakteryjnego z porażonej tkanki albo rozmaz z 48-godzinnej hodowli na pożywce YPGA lub SPA (dodatek 2) na szkiełku mikroskopowym. |
| --- | --- |

1.

Przygotować rozmaz śluzu bakteryjnego z porażonej tkanki albo rozmaz z 48-godzinnej hodowli na pożywce YPGA lub SPA (dodatek 2) na szkiełku mikroskopowym.

| 2. | Przygotować rozmazy kontroli pozytywnej ze szczepu biowar 2 R. solanacearum, oraz jeśli konieczne, przygotować rozmaz kontroli negatywnej PHB sp. |
| --- | --- |

2.

Przygotować rozmazy kontroli pozytywnej ze szczepu biowar 2 R. solanacearum, oraz jeśli konieczne, przygotować rozmaz kontroli negatywnej PHB sp.

| 3. | Pozostawić rozmazy do wyschnięcia i przesunąć dolną część szkiełka kilkakrotnie w płomieniu palnika, w celu utrwalenia rozmazu. |
| --- | --- |

3.

Pozostawić rozmazy do wyschnięcia i przesunąć dolną część szkiełka kilkakrotnie w płomieniu palnika, w celu utrwalenia rozmazu.

| 4. | Preparat wybarwić błękitem nilu lub czernią sudanowa i obserwować pod mikroskopem zgodnie z poniższym opisem. |
| --- | --- |

4.

Preparat wybarwić błękitem nilu lub czernią sudanowa i obserwować pod mikroskopem zgodnie z poniższym opisem.

Badanie z błękitem Nilu:

| a) | Zanurzyć utrwalony rozmaz w 1 % wodnym roztworze błękitu nilu A i inkubować przez 10 minut w temperaturze 55 °C. |
| --- | --- |

a)

Zanurzyć utrwalony rozmaz w 1 % wodnym roztworze błękitu nilu A i inkubować przez 10 minut w temperaturze 55 °C.

| b) | Zlać roztwór barwiący. Opłukać krótko pod kranem z bieżącą wodą. Usunąć nadmiar wody bibułą. |
| --- | --- |

b)

Zlać roztwór barwiący. Opłukać krótko pod kranem z bieżącą wodą. Usunąć nadmiar wody bibułą.

| c) | Zanurzyć rozmaz w 8 % wodnym roztworze kwasu octowego i inkubować przez 1 minutę w temperaturze otoczenia. |
| --- | --- |

c)

Zanurzyć rozmaz w 8 % wodnym roztworze kwasu octowego i inkubować przez 1 minutę w temperaturze otoczenia.

| d) | Opłukać krótko pod kranem z bieżącą wodą. Usunąć nadmiar wody bibułą. |
| --- | --- |

d)

Opłukać krótko pod kranem z bieżącą wodą. Usunąć nadmiar wody bibułą.

| e) | Ponownie zwilżyć rozmaz kroplą wody i nałożyć szkiełko przykrywkowe. |
| --- | --- |

e)

Ponownie zwilżyć rozmaz kroplą wody i nałożyć szkiełko przykrywkowe.

| f) | Oglądać rozmaz pod mikroskopem epifluorescencyjnym w świetle 450 nm, pod warstwą oleju immersyjnego, przy powiększeniu 600–1 000 razy, używając do tego celu obiektywu olejowego lub wodnego. |
| --- | --- |

f)

Oglądać rozmaz pod mikroskopem epifluorescencyjnym w świetle 450 nm, pod warstwą oleju immersyjnego, przy powiększeniu 600–1 000 razy, używając do tego celu obiektywu olejowego lub wodnego.

| g) | Sprawdzić, czy pojawi się jasna, pomarańczowa fluorescencja granulek PHB. Sprawdzić także w świetle normalnym, czy wewnątrz komórek znajdują się granulki i czy morfologia komórek ma cechy typowe dla R. solanacearum. |
| --- | --- |

g)

Sprawdzić, czy pojawi się jasna, pomarańczowa fluorescencja granulek PHB. Sprawdzić także w świetle normalnym, czy wewnątrz komórek znajdują się granulki i czy morfologia komórek ma cechy typowe dla R. solanacearum.

Badanie z czernią sudanową:

| a) | Zanurzyć utrwalony rozmaz w 0,3 % roztworze czerni sudanowej B w 70 % alkoholu etylowym i inkubować przez 10 minut w temperaturze otoczenia. |
| --- | --- |

a)

Zanurzyć utrwalony rozmaz w 0,3 % roztworze czerni sudanowej B w 70 % alkoholu etylowym i inkubować przez 10 minut w temperaturze otoczenia.

| b) | Zlać roztwór barwiący i krótko płukać pod bieżącą wodą z kranu, usuwając nadmiar wody bibułą. |
| --- | --- |

b)

Zlać roztwór barwiący i krótko płukać pod bieżącą wodą z kranu, usuwając nadmiar wody bibułą.

| c) | Zanurzyć szkiełka na chwilę w ksylenie i osuszyć na bibule. Uwaga: Ksylen jest substancją szkodliwą dla zdrowia, dlatego należy przedsięwziąć odpowiednie środki bezpieczeństwa i pracować w dygestorium. |
| --- | --- |

c)

Zanurzyć szkiełka na chwilę w ksylenie i osuszyć na bibule. Uwaga: Ksylen jest substancją szkodliwą dla zdrowia, dlatego należy przedsięwziąć odpowiednie środki bezpieczeństwa i pracować w dygestorium.

| d) | Zanurzyć szkiełka w 0,5 % (w/v) wodnym roztworze safraniny i pozostawić na 10 sekund w temperaturze otoczenia. Uwaga: Safranina jest substancją szkodliwą dla zdrowia, dlatego należy przedsięwziąć odpowiednie środki bezpieczeństwa i pracować w dygestorium. |
| --- | --- |

d)

Zanurzyć szkiełka w 0,5 % (w/v) wodnym roztworze safraniny i pozostawić na 10 sekund w temperaturze otoczenia. Uwaga: Safranina jest substancją szkodliwą dla zdrowia, dlatego należy przedsięwziąć odpowiednie środki bezpieczeństwa i pracować w dygestorium.

| e) | Wypłukać delikatnie wodą z kranu, osuszyć na bibule i nałożyć szkiełko przykrywkowe. |
| --- | --- |

e)

Wypłukać delikatnie wodą z kranu, osuszyć na bibule i nałożyć szkiełko przykrywkowe.

| f) | Oglądać wybarwiony rozmaz pod mikroskopem, stosując światło przechodzące, pod warstwą olejku immersyjnego, przy powiększeniu 1 000 razy z użyciem obiektywu olejowego. |
| --- | --- |

f)

Oglądać wybarwiony rozmaz pod mikroskopem, stosując światło przechodzące, pod warstwą olejku immersyjnego, przy powiększeniu 1 000 razy z użyciem obiektywu olejowego.

| g) | Granulki PHB w komórkach R. solanacearum wybarwiają się na kolor czarno-niebieski, a ściany komórkowe na różowo. |
| --- | --- |

g)

Granulki PHB w komórkach R. solanacearum wybarwiają się na kolor czarno-niebieski, a ściany komórkowe na różowo.

3.   Test aglutynacji serologicznej

Aglutynacja komórek R. solanacearum w śluzie bakteryjnym lub ekstrakcie z tkanek symptomatycznych jest najlepiej widoczna przy użyciu zatwierdzonych przeciwciał (patrz: dodatek 3) oznaczonych odpowiednio zabarwionymi markerami, takimi jak czerwone komórki Staphylococcus aureus lub zabarwione elementy lateksowe. Używając zestawu dostępnego w obrocie handlowym (patrz: dodatek 3), należy postępować zgodnie ze wskazówkami producenta. W przeciwnym razie należy wykonać następującą procedurę:

| a) | Wymieszać krople zawiesiny przeciwciał i śluzu bakteryjnego (ok. 5 μl każdej) na okienkach szkiełek z wieloma zagłębieniami. |
| --- | --- |

a)

Wymieszać krople zawiesiny przeciwciał i śluzu bakteryjnego (ok. 5 μl każdej) na okienkach szkiełek z wieloma zagłębieniami.

| b) | Przygotować kontrolę pozytywną i negatywną przy użyciu zawiesin R. solanacearum biowar 2 i szczepu heterogenicznego. |
| --- | --- |

b)

Przygotować kontrolę pozytywną i negatywną przy użyciu zawiesin R. solanacearum biowar 2 i szczepu heterogenicznego.

| c) | Mieszając delikatnie przez 15 sekund, można zaobserwować aglutynację w próbach pozytywnych. |
| --- | --- |

c)

Mieszając delikatnie przez 15 sekund, można zaobserwować aglutynację w próbach pozytywnych.

4.   Izolacja selektywna

4.1.   Izolacja na podłoże selektywne

Uwaga: Przed użyciem tej metody po raz pierwszy, należy wykonać wstępne badania mające zagwarantować odtwarzalność wykrywania rzędu 103 do 104 jednostek R. solanacearum tworzących kolonie na ml dodany do ekstraktu prób, które uprzednio zostały przetestowane jako negatywne.

Należy użyć właściwie zatwierdzonej pożywki selektywnej, takiej jak SMSA (zmodyfikowanej przez Elphinstone et al., 1996; patrz: dodatek 2).

Należy uważać, aby odróżnić R. solanacearum od innych bakterii będących w stanie rozwinąć kolonie na pożywce. Poza tym, kolonie R. solanacearum mogą wykazywać morfologię nietypową, jeśli płytki są przepełnione lub obecne są również bakterie antagonistyczne. Jeśli podejrzewa się występowanie skutków konkurencji lub antagonizmu, próby należy ponownie przebadać z użyciem innego testu.

Najwyższej czułości wykrywania przy użyciu tej metody można oczekiwać przy użyciu świeżo przygotowanych ekstraktów. Jednak metoda ta jest używana również w odniesieniu do ekstraktów przechowywanych w glicerynie w temperaturze –68 do –86 °C.

Jako kontrole pozytywne należy przygotować dziesięciokrotne rozcieńczenia zawiesiny 106 cfu na ml wirulentnego szczepu biowar 2 R. solanacearum (np. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Dla uniknięcia ewentualnej kontaminacji kontrole pozytywne należy przygotować w ścisłej separacji od badanych prób.

W przypadku każdej nowo przygotowanej partii pożywki selektywnej przed użyciem jej do przebadania rutynowych prób należy sprawdzić jej przydatność do wzrostu patogenu.

Kontrole pozytywne traktować w sposób identyczny, jak próbę(-y).

4.1.1.   Zastosować odpowiednią technikę rozcieńczeń płytkowych w celu zapewnienia, że wszelkie saprofityczne populacje tworzące kolonie zostają rozcieńczone. Nanieść 50–100 μl na płytkę ekstraktu i każdego rozcieńczenia.

4.1.2.   Inkubować płytki w temperaturze 28 °C. Oglądanie płytek rozpocząć po 48 godzinach, a potem kontynuować codziennie do 6 dni. Typowe kolonie R. solanacearum na pożywce SMSA są mlecznobiałe, płaskie, nieregularne oraz ciekłe, a po 3 dniach inkubacji ich środek staje się od różowego do krwistoczerwonego z wewnętrznymi smugami lub spiralami. (Patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Uwaga: Na tej pożywce tworzą się czasami nietypowe kolonie R. solanacearum. Mogą być małe, okrągłe, całkiem czerwone i nieciekłe lub tylko częściowo ciekłe i w związku z tym mogą występować problemy z odróżnieniem ich od bakterii saprofitycznych tworzących kolonie.

4.1.3.   W celu uzyskania pojedynczych kolonii oczyścić kolonie wstępne przez pasażowanie lub metodą rozcieńczeń płytkowych R. solanacearum na pożywce odżywczej (patrz: dodatek 2).

4.1.4.   W celu krótkotrwałego przechowywania trzymać kultury w sterylnej wodzie (pH 6–8, bez chloru) w temperaturze pokojowej w ciemności lub w celu długotrwałego przechowywania w odpowiedniej pożywce krioochronnej lub w temperaturze –68 do –86 °C lub w postaci liofilizowanej.

4.1.5.   Zidentyfikować czyste kultury (patrz: sekcja VI.B.) i wykonać test patogeniczności (patrz: sekcja VI. C).

Interpretacja wyników posiewu na podłoże selektywne

Wynik posiewu na podłoże selektywne jest negatywny w przypadku, gdy po 6 dniach nie obserwuje się żadnych kolonii bakteryjnych, albo jeżeli nie odnaleziono żadnych kolonii o morfologii charakterystycznej dla R. solanacearum, pod warunkiem że nie podejrzewa się inhibicji kolonii wskutek konkurencji lub antagonizmu przez inne bakterie i że na płytkach z kontrolą pozytywną potwierdzono obecność kolonii charakterystycznych dla R. solanacearum.

Wynik posiewu na podłoże selektywne jest pozytywny, jeżeli wyizolowano kolonie o morfologii charakterystycznej dla R. solanacearum.

4.2.   Procedura wzbogacenia

Należy użyć zatwierdzonej pożywki wzbogacającej, takiej jak zmodyfikowana pożywka Wilbrink (patrz: dodatek 2).

Procedurę tę można wykorzystywać do selektywnego zwiększania populacji R. solanacearum w ekstraktach i zwiększenia czułości wykrywania. Procedura ta również skutecznie rozcieńcza inhibitory reakcji PCR (1:100). Należy jednak pamiętać, że wzbogacenie R. solanacearum może się nie udać wskutek konkurencji lub antagonizmu ze strony organizmów saprofitycznych, które często są równocześnie wzbogacane. Z tego powodu izolacja R. solanacearum ze wzbogaconych kultur pożywki może okazać się trudna. Poza tym, jako że można zwiększyć populację serologicznie zbliżonych saprofitów, zaleca się stosowanie konkretnych przeciwciał monoklinalnych raczej niż przeciwciał poliklonalnych, gdy stosowany ma być test ELISA.

4.2.1.   Przy wzbogacaniu do testu PCR przenieść 100 μl ekstraktu do 10 ml pożywki wzbogaconej (dodatek 2) uprzednio umieszczonej w zlewkach lub kolbach pozbawionych DNA. Przy wzbogacaniu do testu ELISA można użyć większych proporcji ekstraktu do pożywki (np. 100 μl w 1,0 ml pożywki wzbogaconej).

4.2.2.   Inkubować przez 72 godziny w temperaturze od 27 do 30 °C w hodowli wstrząsanej lub statycznej, a przykrywka powinna luźno przylegać do probówki, tak by umożliwić dostęp do powietrza.

4.2.3.   Dobrze wymieszać przed użyciem w teście ELISA lub teście PCR.

4.2.4.   Ze wzbogaconą pożywką postępować w taki sam sposób, jak z próbą w powyższych testach.

Uwaga: Jeśli przewiduje się zahamowanie procesu wzbogacenia R. solanacearum z powodu wysokich populacji niektórych konkurujących bakterii saprofitycznych, lepsze wyniki może dać wzbogacenie ekstraktów przed odwirowaniem lub innymi sposobami zagęszczania patogenu.

5.   Test IF

Zasada

Stosowanie testu IF jako głównego testu przesiewowego jest zalecane z uwagi na wykazaną zdolność osiągania wymaganych progów wykrywalności.

Kiedy test IF jest stosowany jako główny test przesiewowy, a wynik IF jest dodatni, konieczne jest zastosowanie izolacji, testu PCR lub FISH jako drugiego testu przesiewowego. Kiedy test IF jest stosowany jako drugi test przesiewowy, a odczyt IF jest dodatni, do zakończenia analizy wymagane jest przeprowadzanie dalszych testów, zgodnie ze schematem blokowym.

Uwaga: Należy używać zatwierdzonego źródła przeciwciał przeciw r. solanacearum (patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Zaleca się, aby dla każdej nowej partii przeciwciał określać miano. Miano jest określane jako największe rozcieńczenie, przy którym zachodzi optymalna reakcja w czasie testowania zawiesiny od 105do 106 komórek na ml homologicznego szczepu R. solanacearum i przy użyciu odpowiedniego koniugatu izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC), zgodnie z zaleceniami producenta. Stężone przeciwciała poliklonalne powinny mieć miano IF przynajmniej 1:2 000. W czasie przeprowadzania testu przeciwciała powinny być stosowane przy stężeniu roboczym (WD) bliskim lub równym mianu.

Test powinien być przeprowadzany na świeżo przygotowanych ekstraktach z prób. Jeśli to konieczne, może być z powodzeniem przeprowadzany na ekstraktach przechowywanych w temperaturze od –68 do –86 °C w glicerolu. Glicerol może być usunięty z próby przez dodanie 1 ml buforu do zawieszania osadu (dodatek 4), powtórne odwirowanie przez 15 minut przy 7 000 g i powtórne zawieszenie w równej objętości buforu do zawieszania osadu. Często nie jest to konieczne, zwłaszcza jeśli preparaty z prób były utrwalane na szkiełkach przy pomocy opalania.

Przygotować oddzielne szkiełka kontroli pozytywnej szczepu homologicznego lub innego szczepu odniesienia R. solanacearum zawieszonego w ekstrakcie z ziemniaka, jak szczegółowo opisano w dodatku 3B, oraz ewentualnie w buforze.

W miarę możliwości na to samo szkiełko należy nanieść jako podobną kontrolę naturalnie zainfekowane tkanki (zachowane w formie liofilizowanej lub zamrożone w temperaturze od –16 do –24 °C).

Jako kontrolę negatywną na R. solanacearum stosować ekstrakty prób, które wcześniej dały w teście wynik ujemny.

Standaryzowane pozytywne i negatywne materiały kontrolne do wykorzystania w teście są wymienione w dodatku 3.

Używać wielopunktowych szkiełek mikroskopowych, najlepiej z 10 okienkami, o średnicy co najmniej 6 mm.

Kontrole pozytywne traktować w sposób identyczny, jak próbę(-y).

5.1.   Przygotować szkiełka do badań, stosując jedną z poniższych procedur:

| i) | dla prób zawierających stosunkowo niewiele skrobi:
  Odmierzyć pipetą standardową objętość (15 l odpowiada 6 mm średnicy okienka – dla większych okienek odmierzyć odpowiednio większą objętość) w rozcieńczeniu 1/100 zawieszonego osadu ziemniaka na pierwsze okienko. Następnie odmierzyć pipetą podobną objętość nierozcieńczonego osadu (1/1) na pozostałe okienka w szeregu. Drugi szereg można wykorzystać do powtórzenia badania lub można go przeznaczyć do analizy drugiej próby, patrz: rysunek 1; |
| --- | --- |

i)

dla prób zawierających stosunkowo niewiele skrobi:

Odmierzyć pipetą standardową objętość (15 l odpowiada 6 mm średnicy okienka – dla większych okienek odmierzyć odpowiednio większą objętość) w rozcieńczeniu 1/100 zawieszonego osadu ziemniaka na pierwsze okienko. Następnie odmierzyć pipetą podobną objętość nierozcieńczonego osadu (1/1) na pozostałe okienka w szeregu. Drugi szereg można wykorzystać do powtórzenia badania lub można go przeznaczyć do analizy drugiej próby, patrz: rysunek 1;

| ii) | dla innych osadów:
  Przygotować dziesięciokrotne rozcieńczenia (1/10, 1/100) zawieszonego osadu w buforze do zawieszania osadu. Odmierzyć standardową objętość (15 l odpowiada 6 mm średnicy okienka – dla większych okienek odmierzyć proporcjonalnie większą objętość) zawiesiny na szereg okienek. Drugi szereg można wykorzystać do powtórzenia badania lub można go przeznaczyć do analizy drugiej próby, patrz: rysunek 2. |
| --- | --- |

ii)

dla innych osadów:

Przygotować dziesięciokrotne rozcieńczenia (1/10, 1/100) zawieszonego osadu w buforze do zawieszania osadu. Odmierzyć standardową objętość (15 l odpowiada 6 mm średnicy okienka – dla większych okienek odmierzyć proporcjonalnie większą objętość) zawiesiny na szereg okienek. Drugi szereg można wykorzystać do powtórzenia badania lub można go przeznaczyć do analizy drugiej próby, patrz: rysunek 2.

5.2.   Wysuszyć krople w temperaturze otoczenia lub ogrzewając je w temperaturze od 40 do 45 °C. Utrwalić komórki bakteryjne na szkiełku przez ogrzanie (15 minut w temp. 60 °C), albo umieszczenie w płomieniu, lub też za pomocą 95 % alkoholu etylowego zgodnie ze szczegółowymi instrukcjami dostawcy przeciwciał.

W miarę potrzeby utrwalone szkiełka można przechowywać zamrożone w suchym pojemniku przez jak najkrótszy okres (maksymalnie przez 3 miesiące) przed dalszym badaniem.

5.3.   Procedura IF

| i) | Przygotować szkiełka tak jak opisano w ust. 5.1 ppkt i): Przygotować zestaw dwukrotnych rozcieńczeń.
  Pierwsze okienko powinno mieć 1/2 miana (T/2), pozostałe 1/4 miana (T/4), 1/2 miana (T/2), miano (T) i dwukrotność miana (2T). |
| --- | --- |

i)

Przygotować szkiełka tak jak opisano w ust. 5.1 ppkt i): Przygotować zestaw dwukrotnych rozcieńczeń.

Pierwsze okienko powinno mieć 1/2 miana (T/2), pozostałe 1/4 miana (T/4), 1/2 miana (T/2), miano (T) i dwukrotność miana (2T).

| ii) | Przygotować szkiełka do badania, jak opisano w ust. 5.1 ppkt ii):
  Przygotować rozcieńczenie robocze (WD) przeciwciał w buforze IF. Rozcieńczenie robocze ma wpływ na specyficzność. |
| --- | --- |

ii)

Przygotować szkiełka do badania, jak opisano w ust. 5.1 ppkt ii):

Przygotować rozcieńczenie robocze (WD) przeciwciał w buforze IF. Rozcieńczenie robocze ma wpływ na specyficzność.

Rysunek 1   Przygotowanie szkiełka roboczego według 5.1 i) i 5.3 i)

| | Rozcieńczenia próby ponownie zawieszonego osadu w buforze |
| --- | --- |
| 1/100 | 1/1 | 1/1 | 1/1 | 1/1 |  | Rozcieńczenie ponownie zawieszonego osadu |
| (T = miano) | T/2 | T/4 | T/2 | T | 2T |  | Dwukrotne rozcieńczenia surowicy/przeciwciała |
| Próba 1 | | | | | | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Powtórzenie próby 1 lub próba 2 | | | | | |
| 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |

Rozcieńczenia próby ponownie zawieszonego osadu w buforze

1/100

1/1

1/1

1/1

1/1



Rozcieńczenie ponownie zawieszonego osadu

(T = miano)

T/2

T/4

T/2

T

2T



Dwukrotne rozcieńczenia surowicy/przeciwciała

Próba 1

Image

Image

Image

Image

Image

1

2

3

4

5

Powtórzenie próby 1 lub próba 2

Image

Image

Image

Image

Image

6

7

8

9

10

Rysunek 2   Przygotowanie szkiełka roboczego według ust. 5.1 ppkt ii) i 5.3 ppkt ii)

| | Rozcieńczenie robocze surowicy/przeciwciała |
| --- | --- |
| 1/1 | 1/10 | 1/100 | puste | puste |  | Dziesięciokrotne rozcieńczenia ponownie zawieszonego osadu |
| Próba 1 | | | | | | | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Powtórzenie próby 1 lub próba 2 | | | | | |
| 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |

Rozcieńczenie robocze surowicy/przeciwciała

1/1

1/10

1/100

puste

puste



Dziesięciokrotne rozcieńczenia ponownie zawieszonego osadu

Próba 1

Image

Image

Image

Image

Image

1

2

3

4

5

Powtórzenie próby 1 lub próba 2

Image

Image

Image

Image

Image

6

7

8

9

10

5.3.1.   Ułożyć szkiełka na wilgotnej bibule. Pokryć całkowicie każde okienko rozcieńczonymi przeciwciałami. Objętość nakładanej surowicy musi być równa objętości nakładanego ekstraktu.

W przypadku braku szczegółowych instrukcji od dostawcy przeciwciał należy zastosować następującą procedurę:

5.3.2.   Inkubować szkiełka na wilgotnym papierze pod przykryciem przez 30 minut w temperaturze otoczenia (18–25 °C).

5.3.3.   Strząsnąć krople surowicy ze szkiełek i przepłukać szkiełka starannie buforem IF. Zanurzyć je na 5 minut w buforze IF – Tween (dodatek 4), a następnie w buforze IF. Unikać powstawania aerozoli i przenoszenia kropelek, co mogłoby doprowadzić do kontaminacji miedzy próbami. Ostrożnie usunąć nadmiar wilgoci przez delikatne osuszanie bibułą.

5.3.4.   Ułożyć szkiełka na wilgotnym papierze. Pokryć okienka do badań oraz okienko FTIC rozcieńczonym koniugatem FTIC, stosowanym do oznaczania miana. Objętość koniugatu nałożonego na okienka musi być identyczna z objętością zastosowanych przeciwciał.

5.3.5.   Inkubować szkiełka na wilgotnym papierze pod przykryciem przez 30 minut w temperaturze otoczenia (18–25 °C).

5.3.6.   Strząsnąć krople surowicy ze szkiełek. Obmyć i przepłukać tak jak poprzednio (5.3.3).

Ostrożnie usunąć nadmiar wilgoci.

5.3.7.   Na każde okienko nanieść po 5–10 l 0,1 M buforu fosforanowego-glicerynowego (dodatek 4) albo podobną ilością dostępnego w obrocie utrwalacza i przykryć je szkiełkiem nakrywkowym.

5.4.   Odczytywanie testu IF

5.4.1.   Sprawdzić szkiełka pod mikroskopem epifluorescencyjnym z filtrem właściwym dla wzbudzenia FITC, pod olejkiem imersyjnym lub wodą, przy powiększeniu 500–1 000 razy. Okienka przeglądać wzdłuż dwóch średnic pod kątem prostym oraz dookoła obwodu. Sprawdzić przynajmniej 40 pól mikroskopowych w okienkach niezawierających komórek lub zawierających ich małą ilość.

Sprawdzić najpierw okienko z kontrolą pozytywną. Komórki muszą fluoryzować jasno i być zupełnie wybarwione przy określonym mianie przeciwciał lub rozcieńczeniu roboczym. Badanie IF (sekcja VI.A.5) należy powtórzyć, jeżeli wybarwienie nie jest właściwe.

5.4.2.   Poszukiwać w okienkach szkiełek testowych jaskrawo fluoryzujących komórek, o charakterystycznej dla R. solanacearum morfologii (patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intensywność fluorescencji musi być równoważna intensywności wykazywanej przez pozytywny szczep kontrolny przy tym samym rozcieńczeniu surowicy. Komórki niecałkowicie wybarwione lub komórki o słabej fluorescencji należy odrzucić.

W przypadku podejrzenia kontaminacji badanie należy powtórzyć. Tak może być w przypadku gdy wszystkie szkiełka w partii wykazują komórki pozytywne z powodu kontaminacji buforu lub jeśli komórki pozytywne zostają odnalezione (poza okienkami szkiełek) na powierzchni szkiełka.

5.4.3.   Ze specyficznością testu immunofluorescencyjnego wiąże się nieodłącznie kilka problemów. W osadzie z części przystolonowych bulw ziemniaka i odcinka łodygi prawdopodobne jest występowanie w tle populacji fluoryzujących komórek o nietypowej morfologii oraz bakterii saprofitycznych o wielkości i morfologii podobnej do R. solanacearum i dających reakcje krzyżowe.

5.4.4.   Uwzględniać wyłącznie fluoryzujące komórki o typowych wymiarach i morfologii przy mianie lub rozcieńczeniu roboczym, takim jak w 5.3.

5.4.5.   Interpretacja wyników testu IF:

| i) | Jeżeli stwierdzono obecność fluoryzujących komórek o charakterystycznej morfologii, trzeba oszacować średnią liczbę typowych komórek w polu widzenia mikroskopu oraz obliczyć liczbę komórek typowych przypadająca na ml ponownie zawieszonego osadu (dodatek 5).
  Wynik IF jest dodatni dla prób z przynajmniej 5 x 103 komórek na ml zawieszonego osadu. Próba uznawana jest za potencjalnie porażoną i wymagane są dalsze testy. |
| --- | --- |

i)

Jeżeli stwierdzono obecność fluoryzujących komórek o charakterystycznej morfologii, trzeba oszacować średnią liczbę typowych komórek w polu widzenia mikroskopu oraz obliczyć liczbę komórek typowych przypadająca na ml ponownie zawieszonego osadu (dodatek 5).

Wynik IF jest dodatni dla prób z przynajmniej 5 x 103 komórek na ml zawieszonego osadu. Próba uznawana jest za potencjalnie porażoną i wymagane są dalsze testy.

| ii) | Odczyt IF jest negatywny dla prób o liczbie komórek mniejszej niż 5 x 103 na ml zawieszonego osadu, a próba uznawana jest za negatywną. Kolejne testy nie są wymagane. |
| --- | --- |

ii)

Odczyt IF jest negatywny dla prób o liczbie komórek mniejszej niż 5 x 103 na ml zawieszonego osadu, a próba uznawana jest za negatywną. Kolejne testy nie są wymagane.

6.   Test PCR

Zasada

Przy wykorzystaniu testu PCR jako podstawowego badania przesiewowego i uzyskaniu w nim pozytywnego wyniku jako drugie badanie przesiewowe należy wykonać izolację lub test IF. Gdy test PCR jest stosowany jako drugie badanie przesiewowe, a odczyt jest pozytywny, dla zakończenia diagnozy wymagane jest dalsze badanie zgodne ze schematem blokowym.

Pełne wykorzystanie tej metody jako głównego badania przesiewowego zaleca się tylko wtedy, jeśli posiada się specjalistyczną, fachową wiedzę na ten temat.

Uwaga: Wstępne badanie przy użyciu tej metody powinno pozwolić na uzyskanie odtwarzalnego wykrywania rzędu od 103 do 104 komórek R. solanacearum przypadających na ml dodanych do ekstraktów prób, które w poprzednim badaniu wypadły negatywnie. Dla uzyskania maksymalnych poziomów czułości i specyficzności we wszystkich laboratoriach wymagane może być przeprowadzenie eksperymentów optymalizujących.

Należy używać zatwierdzonych odczynników PCR i protokołów (patrz: dodatek 6). Zaleca się wybór metody z kontrolą wewnętrzną.

Należy zastosować odpowiednie środki bezpieczeństwa w celu uniknięcia kontaminacji próbki docelowym DNA. Test PCR powinni wykonywać doświadczeni technicy w wyspecjalizowanych laboratoriach biologii molekularnej, tak aby zminimalizować możliwość kontaminacji docelowym DNA.

Kontrola negatywna (dla ekstrakcji DNA i procedur PCR) powinna być zawsze wykonywana jako ostatnia próba w procedurze tak, aby jasno stwierdzić, czy pojawiło się jakiekolwiek przeniesienie DNA.

W badaniu PCR należy zawrzeć następujące kontrolę negatywne:

| — | ekstrakt próby, który poprzednio został uznany za negatywny dla R. solanacearum, |
| --- | --- |

—

ekstrakt próby, który poprzednio został uznany za negatywny dla R. solanacearum,

| — | próby kontrolne buforu używanego do ekstrakcji bakterii i DNA z próby, |
| --- | --- |

—

próby kontrolne buforu używanego do ekstrakcji bakterii i DNA z próby,

| — | mieszaninę do reakcji PCR. |
| --- | --- |

—

mieszaninę do reakcji PCR.

Należy zawrzeć następujące kontrole pozytywne::

| — | zawiesiny osadu, do którego dodano R. solanacearum (przygotowanie patrz: dodatek 3 B), |
| --- | --- |

—

zawiesiny osadu, do którego dodano R. solanacearum (przygotowanie patrz: dodatek 3 B),

| — | zawiesinę 106 komórek przypadających na ml wirulentnego izolatu R. solanacearum zawieszonego w wodzie (np. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; patrz: dodatek 3 B), |
| --- | --- |

—

zawiesinę 106 komórek przypadających na ml wirulentnego izolatu R. solanacearum zawieszonego w wodzie (np. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; patrz: dodatek 3 B),

| — | w miarę możliwości korzystać również z ekstraktów DNA z kontroli pozytywnych DNA otrzymanych z testu PCR. |
| --- | --- |

—

w miarę możliwości korzystać również z ekstraktów DNA z kontroli pozytywnych DNA otrzymanych z testu PCR.

Dla uniknięcia potencjalnej kontaminacji, kontrole pozytywne przygotować w miejscu oddzielonym od prób, które mają być badane.

Ekstrakty stanowiące próby powinny być w jak największym stopniu pozbawione ziemi. W pewnych warunkach radzi się więc, aby ekstrakty przygotować z mytych ziemniaków, jeśli mają zostać zastosowane protokoły PCR.

Standaryzowane pozytywne i negatywne materiały kontrolne do wykorzystania w teście są wymienione w dodatku 3.

6.1.   Metody oczyszczania DNA

Użyć opisanych powyżej kontroli pozytywnych i negatywnych (patrz: dodatek 3).

Kontrole pozytywne traktować w sposób identyczny, jak próbę(-y).

Dostępnych jest wiele metod oczyszczania docelowego DNA, ze złożonych substratów próby, które usuwają inhibitory PCR i inne reakcje enzymatyczne i koncentrują docelowe DNA w ekstrakcie próby. Metoda przedstawiona poniżej została zoptymalizowana do użytku z zatwierdzoną metodą PCR przedstawioną w dodatku 6.

a)   Metoda zgodnie z Pastrik (2000)

| 1. | Odmierzyć pipetą 220 μl buforu do lizy (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) do 1,5 ml probówki Eppendorfa. |
| --- | --- |

1.

Odmierzyć pipetą 220 μl buforu do lizy (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) do 1,5 ml probówki Eppendorfa.

| 2. | Dodać 100 μl ekstraktu i umieścić w jednostce grzewczej lub łaźni wodnej w temp. 95 °C na 10 min. |
| --- | --- |

2.

Dodać 100 μl ekstraktu i umieścić w jednostce grzewczej lub łaźni wodnej w temp. 95 °C na 10 min.

| 3. | Trzymać probówkę w lodzie przez 5 min. |
| --- | --- |

3.

Trzymać probówkę w lodzie przez 5 min.

| 4. | Dodać 80 μl roztworu lizozymowego (50 mg lizozymu przypadających na ml w 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) i inkubować w temp. 37 °C przez 30 min. |
| --- | --- |

4.

Dodać 80 μl roztworu lizozymowego (50 mg lizozymu przypadających na ml w 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) i inkubować w temp. 37 °C przez 30 min.

| 5. | Dodać 220 μl roztworu Easy DNA® A (Invitrogen), dobrze wymieszać przez worteksowanie i inkubować w temp. 65 °C przez 30 min. |
| --- | --- |

5.

Dodać 220 μl roztworu Easy DNA® A (Invitrogen), dobrze wymieszać przez worteksowanie i inkubować w temp. 65 °C przez 30 min.

| 6. | Dodać 100 μl roztworu Easy DNA® B (Invitrogen), energicznie wymieszać przez worteksowanie, aż w probówce uwolni się osad i próbka będzie równomiernie lepka. |
| --- | --- |

6.

Dodać 100 μl roztworu Easy DNA® B (Invitrogen), energicznie wymieszać przez worteksowanie, aż w probówce uwolni się osad i próbka będzie równomiernie lepka.

| 7. | Dodać 500 μl chloroformu i wymieszać przez worteksowanie, aż lepkość spadnie i mieszanina będzie jednorodna. |
| --- | --- |

7.

Dodać 500 μl chloroformu i wymieszać przez worteksowanie, aż lepkość spadnie i mieszanina będzie jednorodna.

| 8. | Odwirować przy 15 000 g przez 20 min w temp. 4 °C, aby wytrącić fazy i utworzyć międzyfazę. |
| --- | --- |

8.

Odwirować przy 15 000 g przez 20 min w temp. 4 °C, aby wytrącić fazy i utworzyć międzyfazę.

| 9. | Przenieść górną fazę do świeżej probówki typu Eppendorf. |
| --- | --- |

9.

Przenieść górną fazę do świeżej probówki typu Eppendorf.

| 10. | Dodać 1 ml 100 % alkoholu etylowego (–20 °C), krótko wymieszać przez worteksowanie i inkubować na lodzie przez 10 min. |
| --- | --- |

10.

Dodać 1 ml 100 % alkoholu etylowego (–20 °C), krótko wymieszać przez worteksowanie i inkubować na lodzie przez 10 min.

| 11. | Wirować przy 15 000 g przez 20 min w temp. 4 °C i usunąć alkohol etylowy z osadu. |
| --- | --- |

11.

Wirować przy 15 000 g przez 20 min w temp. 4 °C i usunąć alkohol etylowy z osadu.

| 12. | Dodać 500 μl 80 % alkoholu etylowego (–20 °C) i wymieszać przez odwracanie probówki. |
| --- | --- |

12.

Dodać 500 μl 80 % alkoholu etylowego (–20 °C) i wymieszać przez odwracanie probówki.

| 13. | Wirować przy 15 000 g przez 10 min w temp. 4 °C, zostawić osad i usunąć etanol. |
| --- | --- |

13.

Wirować przy 15 000 g przez 10 min w temp. 4 °C, zostawić osad i usunąć etanol.

| 14. | Zostawić osad do wysuszenia powietrzem lub w wirówce do suszenia DNA. |
| --- | --- |

14.

Zostawić osad do wysuszenia powietrzem lub w wirówce do suszenia DNA.

| 15. | Zawiesić ponownie osad w 100 μl sterylnej UPW i zostawić w temperaturze pokojowej przez przynajmniej 20 minut. |
| --- | --- |

15.

Zawiesić ponownie osad w 100 μl sterylnej UPW i zostawić w temperaturze pokojowej przez przynajmniej 20 minut.

| 16. | Przechowywać w temp. –20 °C, aż będzie potrzebny do badania PCR. |
| --- | --- |

16.

Przechowywać w temp. –20 °C, aż będzie potrzebny do badania PCR.

| 17. | Oddzielić wszelki biały osad, wirując i użyć 5 μl zawiesiny zawierającej DNA do testu PCR. |
| --- | --- |

17.

Oddzielić wszelki biały osad, wirując i użyć 5 μl zawiesiny zawierającej DNA do testu PCR.

b)   Inne metody

Można zastosować inne metody ekstrakcji DNA, np. Qiagen DNeasy Plant Kit, pod warunkiem że dowiedzione zostało, że są równie skuteczne w oczyszczaniu DNA pochodzącego z prób kontrolnych zawierających od 103 do 104 komórek patogenu przypadających na ml.

6.2.   PCR

6.2.1.   Przygotować matryce testowe i kontrolne dla PCR według zatwierdzonych protokołów (sekcja VI.A.6). Przygotować jedno dziesięciokrotne rozcieńczenie DNA z ekstraktu próby (1:10 w UPW).

6.2.2.   Przygotować odpowiednią mieszaninę reakcyjną PCR i wymieszać w nieskażonym środowisku zgodnie z opublikowanymi protokołami (dodatek 6). W miarę możliwości radzi się użyć multipleksowego protokołu PCR zawierającego również wewnętrzną kontrolę PCR.

6.2.3.   Dodać 2–5 μl ekstraktu DNA przypadającego na 25 μl objętości reakcji PCR w sterylnych probówkach do PCR według protokołów PCR (patrz: dodatek 6).

6.2.4.   Dodać negatywną kontrolę zawierającą tylko mieszaninę reakcyjną PCR. Wymieszać i w miejsce próby dodać to samo źródło UPW, które było używane w mieszaninie PCR.

6.2.5.   Umieścić probówki w tym samym termocyklerze, który używany był do badań wstępnych i uruchomić właściwie zoptymalizowany program PCR (dodatek 6).

6.3.   Analiza produktu PCR

6.3.1.   Rozdzielić produkty PCR metodą elektroforezy na żelu agarozowym. Użyć przynajmniej 12 μl zwielokrotnionej mieszaniny reakcyjnej DNA z każdej próby zmieszanej z 3 μl buforu obciążającego (dodatek 6) w 2,0 % (w/v) żelu agarozowym w buforze trisacetate-EDTA (TAE) (dodatek 6) przy 5–8 V przypadających na cm. Użyć odpowiedniego markera DNA, np. 100 bp ladder.

6.3.2.   Uwidocznić paski DNA odbarwiając żel w bromku etydyny (0,5 mg/l) przez 30–60 min, stosując właściwe środki ostrożności przy obchodzeniu się z tym mutagenem.

6.3.3.   Oglądać wybarwiony żel w transiluminatorze UV (λ = 302 nm), szukając zamplifikowanych produktów PCR o oczekiwanym rozmiarze (dodatek 6) i udokumentować wyniki.

6.3.4.   Dla wszystkich nowych wyników/przypadków weryfikować autentyczność amplikonu PCR, przeprowadzając analizę z użyciem enzymów restrykcyjnych na próbce pozostałego zamplifikowanego DNA przez inkubację w optymalnej temperaturze i przez odpowiedni czas z właściwym enzymem i buforem (patrz: dodatek 6). Rozdzielić strawione fragmenty za pomocą elektroforezy na żelu agarozowym jak wcześniej i oglądać charakterystyczny układ fragmentów strawionych przez enzymy restrykcyjne w transiluminatorze UV po uprzednim barwieniu bromkiem etydyny. Porównać z niestrawioną i strawioną kontrolą pozytywną

Interpretacja wyników testu PCR:

Wynik testu PCR jest negatywny, jeśli nie wykryto specyficznego dla R. solanacearum fragmentu amplikonu PCR o oczekiwanym rozmiarze w danej próbie, a taki fragment znaleziono we wszystkich kontrolach pozytywnych (w przypadku multipleksowego PCR ze specyficznymi dla rośliny starterami kontroli wewnętrznej: drugi produkt PCR o oczekiwanym rozmiarze musi zostać zamplifikowany w danej próbie).

Wynik testu PCR jest pozytywny, jeżeli wykryto specyficzny amplikon dla R. solanacearum o oczekiwanym rozmiarze i wzorze restrykcyjnym (jeśli taki jest wymagany), pod warunkiem, że nie jest on namnożony z jakiejkolwiek negatywnej próby kontrolnej. Wiarygodne potwierdzenie pozytywnego wyniku można również uzyskać, powtarzając badanie przy pomocy drugiego zestawu primerów PCR (dodatek 6).

Uwaga: Może istnieć podejrzenie inhibicji PCR, jeśli oczekiwany amplikon zostanie uzyskany z kontroli pozytywnej zawierającej R. solanacearum w wodzie, lecz z pozytywnych prób kontrolnych z R. solanacearum w ekstrakcie z ziemniaka uzyskano wyniki negatywne. W multipleksowych protokołach PCR z wewnętrznymi kontrolami PCR, na inhibicję reakcji wskazuje fakt, że nie został uzyskany żaden z dwóch amplikonów.

Jeśli z jednej lub większej ilości kontroli negatywnych uzyskano oczekiwany amplikon, wówczas można podejrzewać kontaminację.

7.   Test FISH

Zasada

Jeżeli test FISH używany jest jako pierwsze badanie przesiewowe, a wynik jego jest pozytywny, należy wykonać izolację lub badanie IF jako drugie, obowiązkowe badanie przesiewowe. Gdy test FISH jest stosowany jako drugie badanie przesiewowe, a odczyt jest pozytywny, dla zakończenia diagnozy wymagane jest dalsze badanie zgodne ze schematem blokowym.

Uwaga: Użyć zatwierdzonych, specyficznych dla R. solanacearum sond oligonukleotydowych (patrz: dodatek 7). Badanie wstępne przy użyciu tej metody powinno pozwolić na odtwarzalne wykrywanie przynajmniej 103–104 komórek R. solanacearum przypadających na ml dodanych do ekstraktów prób, w stosunku do których uprzednio uzyskano wynik negatywny.

Następującą procedurę najlepiej jest stosować w przypadku świeżo przygotowanego ekstraktu z próby, lecz można ją stosować również w odniesieniu do ekstraktu przechowywanego w glicerynie w temperaturze od –16 do –24 °C lub od –68 do –86 °C.

Jako kontroli negatywnej użyć ekstraktu próby, w stosunku do której uprzednio uzyskano wynik negatywny dla R. solanacearum.

Jako kontrole pozytywne przygotować zawiesiny zawierające 105 do 106 komórek przypadających na ml R. solanacearum biowar 2 (np. szczep NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, patrz: dodatek 3) w buforze fosforanowym 0,01M (PB) z 3–5-dniowej hodowli). Przygotować oddzielne szkiełka kontroli pozytywnej z homogenicznego szczepu lub innego szczepu referencyjnego R. solanacearum, zawieszonego w ekstrakcie z ziemniaka, zgodnie z opisem w dodatku 3 B.

Stosowanie znakowanej FITC eubakteryjnej sondy oligonukleotydowej daje możliwość kontrolowania procesu hybrydyzacji, ponieważ barwione będą wszystkie eubakterie obecne w próbie.

Znormalizowane pozytywne i negatywne materiały kontrolne dostępne do użycia przy tym badaniu wymieniono w dodatku 3 A).

Kontrole pozytywne traktować w sposób identyczny, jak próbę(-y).

7.1.   Utrwalanie ekstraktu z ziemniaka

Poniższa procedura oparta jest na pracy Wullings et al., (1998):

7.1.1.   Przygotować roztwór utrwalający (patrz: dodatek 7).

7.1.2.   Odmierzyć pipetą 100 μl ekstraktu z każdej próby do probówki Eppendorfa i odwirować przez 7 min przy 7 000 g.

7.1.3.   Usunąć supernatant i rozpuścić osad w 200 μl utrwalacza przygotowanego < 24 godzin wcześniej. Odwirować i inkubować przez 1 godzinę w lodówce.

7.1.4.   Odwirować przez 7 min przy 7 000 g, usunąć supernatant i zawiesić ponownie osad w 75 μl 0,01M PB (patrz: dodatek 7).

7.1.5.   Nanieść po 16 μl utrwalonych zawiesin na czyste szkiełko wielopunktowe tak, jak pokazano na rys. 7.1. Na szkiełko nakładać dwie różne próby, nierozcieńczone i w rozcieńczeniu 1:100, używając 10 μl ekstraktu, aby uzyskać rozcieńczenie 1:100 (w 0,01M PB). Pozostały roztwór próby (49 μl) może być przechowywany w –20 °C po dodaniu 1 objętości 96 % etanolu. W przypadku jeśli test FISH wymaga powtórzenia, usunąć etanol przez wirowanie i dodać tę samą ilość 0,01M PB (zworteksować).

Rysunek 7.1.   Rozkład na szkiełku FISH

| Próba 1 | Puste | Puste | Puste | Próba 2 |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| | | | | |
| okienko 1 | okienko 2 | okienko 3 | okienko 4 | okienko 5 |
| Próba 1 | Puste | Puste | Puste | Próba 2 |
| | | | | |
| okienko 6 | okienko 7 | okienko 8 | okienko 9 | okienko 10 |
| Szkiełko nakrywkowe 1 | | Szkiełko nakrywkowe 2 |

Próba 1

Puste

Puste

Puste

Próba 2

Image

Image

Image

Image

Image

okienko 1

okienko 2

okienko 3

okienko 4

okienko 5

Próba 1

Puste

Puste

Puste

Próba 2

Image

Image

Image

Image

Image

okienko 6

okienko 7

okienko 8

okienko 9

okienko 10

Szkiełko nakrywkowe 1

Szkiełko nakrywkowe 2

7.1.6.   Wysuszyć szkiełka na powietrzu (lub na płycie do suszenia szkiełek w temperaturze 37 °C) i utrwalić w płomieniu.

W tym momencie procedurę można przerwać i kontynuować hybrydyzację w dniu następnym. Szkiełka powinny być przechowywane w suchym miejscu pozbawionym kurzu. w temperaturze pokojowej.

7.2.   Hybrydyzacja

7.2.1.   Odwodnić komórki w serii rozcieńczeń alkoholu etylowego o stężeniach 50 %, 80 % i 96 % przez 1 minutę w każdym. Wysuszyć szkiełka na powietrzu w statywie na szkiełka.

7.2.2.   Przygotować wilgotną komorę do inkubacji wykładając dno hermetycznego pojemnika bibułą lub papierem filtracyjnym nasączonym w 1x mieszaninie hybrydyzacyjnej (hybmix) (dodatek 7). Wstępnie inkubować pojemnik w cieplarce do hybrydyzacji w temperaturze 45 °C przez przynajmniej 10 minut.

7.2.3.   Nanieść po 10 μl roztworu do hybrydyzacji (dodatek 7) na 8 okienek (okienka 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 oraz 10; patrz: rys. 7.1) z każdego szkiełka, pozostawiając dwa okienka środkowe (3 i 8) puste.

7.2.4.   Przykryć szkiełkami nakrywkowymi (24 x 24 mm) pierwsze i ostatnie 4 okienka, tak aby nie uwięzić przy tym powietrza. Umieścić szkiełka we wstępnie ogrzanej wilgotnej komorze i hybrydyzować przez 5 godzin w cieplarce w 45 °C w ciemności.

7.2.5.   Przygotować 3 zlewki zawierające 1 l Milli Q (stopień molekularny) wody, 1 l 1x mieszaniny hybrydyzacyjnej (334 ml 3x hybmix i 666 ml Milli Q wody) oraz 1 l 1/8x hybmix (42 ml 3x hybmix oraz 958 ml Milli Q wody). Inkubować wstępnie każdą z nich w łaźni wodnej w 45 °C.

7.2.6.   Usunąć szkiełka nakrywkowe ze szkiełek i umieścić szkiełka w statywie.

7.2.7.   Usunąć nadmiar sondy, inkubując przez 15 min w zlewce z 1x mieszaniny hybrydyzacyjnej w temperaturze 45 °C.

7.2.8.   Przenieść statyw do szkiełek do 1/8 hybmix roztworu wymywającego i inkubować przez następne 15 min.

7.2.9.   Zanurzyć szkiełka na krótko w Milli Q wodzie i umieścić na bibule filtracyjnej. Usunąć nadmiar wilgoci pokrywając powierzchnie delikatnie bibułą filtracyjną. Odmierzyć pipetą 5–10 μl roztworu utrwalającego zapobiegającego odbarwieniu (np. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA lub równoważny) na każde okienko i nałożyć duże szkiełko nakrywkowe (24 x 60 mm) na powierzchnię całego szkiełka.

7.3.   Odczyt testu FISH

7.3.1.   Oglądać szkiełka natychmiast, używając mikroskopu dostosowanego do mikroskopii epifluoroscencyjnej pod powiększeniem 630 lub 1 000 x, pod olejkiem imersyjnym. Przy filtrze odpowiednim dla izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC), komórki eubakteryjne (w tym większość komórek Gram ujemnych) są zabarwione na kolor fluorescencyjno zielony. Przy stosowaniu filtra do 5-izotiocyjanianu tetrametylorodaminy barwione komórki Cy3 R. solanacearum są fluoryzująco czerwone. Porównać morfologię komórek z tą w kontroli pozytywnej. W przypadku niewłaściwego zabarwienia test FISH (sekcja VI.A.7) należy powtórzyć. Okienka przeglądać wzdłuż dwóch średnic pod kątem prostym oraz dookoła obwodu. Sprawdzić przynajmniej 40 pól mikroskopowych w okienkach niezawierających komórek lub zawierających ich małą ilość.

7.3.2.   Poszukiwać w okienkach szkiełek testowych jaskrawo fluoryzujących komórek, o charakterystycznej dla R. solanacearum morfologii (patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intensywność fluorescencji musi być taka sama lub większa niż szczepu użytego jako kontrola pozytywna. Komórki niecałkowicie wybarwione lub komórki o słabej fluorescencji należy odrzucić.

7.3.3.   W przypadku podejrzenia kontaminacji badanie należy powtórzyć. Tak może być w przypadku gdy wszystkie szkiełka w partii pokazują komórki pozytywne z powodu kontaminacji buforu lub jeśli odnalezione zostaną komórki pozytywne (poza okienkami szkiełek) na powierzchni szkiełka.

7.3.4.   Ze specyficznością testu FISH wiąże się nieodłącznie kilka problemów. W osadzie z części przystolonowych bulw ziemniaka i fragmentów łodygi prawdopodobne jest występowanie w tle populacji fluoryzujących komórek o nietypowej morfologii oraz dających reakcje krzyżowe bakterii saprofitycznych o wielkości i budowie podobnej do R. solanacearum choć znacznie rzadziej niż w przypadku testu IF.

7.3.5.   Pod uwagę brać należy jedynie fluoryzujące komórki o typowym rozmiarze i morfologii.

7.3.6.   Interpretacja wyników testu FISH:

| i) | Prawidłowe wyniki testu FISH uzyskuje się, jeśli przy użyciu filtra FITC zaobserwuje się jasne zielone komórki fluorescencyjne o rozmiarze i morfologii typowej dla R. solanacearum i jeśli zaobserwuje się jasne fluorescencyjne czerwone komórki przy użyciu filtra rodaminowego we wszystkich kontrolach pozytywnych, a nie zaobserwuje się ich w żadnej kontroli negatywnej. Jeżeli stwierdzono obecność fluoryzujących komórek o charakterystycznej morfologii, trzeba oszacować średnią liczbę typowych komórek w polu widzenia mikroskopu oraz obliczyć liczbę komórek typowych przypadająca na ml ponownie zawieszonego osadu (dodatek 4). Próbki o odczycie 5 x 103 typowych komórek przypadających na ml ponownie zawieszonego osadu uznaje się za potencjalnie porażone. Konieczne wykonanie jest dalszych badań. Odczyt jest negatywny przy mniej niż 5 x 103 komórek typowych przypadających na ml zawieszonego osadu. |
| --- | --- |

i)

Prawidłowe wyniki testu FISH uzyskuje się, jeśli przy użyciu filtra FITC zaobserwuje się jasne zielone komórki fluorescencyjne o rozmiarze i morfologii typowej dla R. solanacearum i jeśli zaobserwuje się jasne fluorescencyjne czerwone komórki przy użyciu filtra rodaminowego we wszystkich kontrolach pozytywnych, a nie zaobserwuje się ich w żadnej kontroli negatywnej. Jeżeli stwierdzono obecność fluoryzujących komórek o charakterystycznej morfologii, trzeba oszacować średnią liczbę typowych komórek w polu widzenia mikroskopu oraz obliczyć liczbę komórek typowych przypadająca na ml ponownie zawieszonego osadu (dodatek 4). Próbki o odczycie 5 x 103 typowych komórek przypadających na ml ponownie zawieszonego osadu uznaje się za potencjalnie porażone. Konieczne wykonanie jest dalszych badań. Odczyt jest negatywny przy mniej niż 5 x 103 komórek typowych przypadających na ml zawieszonego osadu.

| ii) | Test FISH jest negatywny, jeśli fluoryzujące czerwone komórki o rozmiarze i morfologii typowej dla R. solanacearum nie zostaną wykryte przy użyciu filtra rodaminy, pod warunkiem zaobserwowania typowych fluoryzujących na czerwono komórek w preparatach kontroli pozytywnych przy użyciu filtra rodaminowego. |
| --- | --- |

ii)

Test FISH jest negatywny, jeśli fluoryzujące czerwone komórki o rozmiarze i morfologii typowej dla R. solanacearum nie zostaną wykryte przy użyciu filtra rodaminy, pod warunkiem zaobserwowania typowych fluoryzujących na czerwono komórek w preparatach kontroli pozytywnych przy użyciu filtra rodaminowego.

8.   Testy ELISA

Zasada

Test ELISA możne być używany wyłącznie jako badanie fakultatywne wraz z badaniem IF, PCR lub FISH ponieważ ma ono niską czułość. Przy użyciu testu DAS ELISA, konieczne jest zastosowanie wzbogacenia i przeciwciał monoklonalnych (patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Wzbogacenie prób przed użyciem w teście ELISA może okazać się pomocne dla zwiększenia czułości tego badania, lecz może się nie powieść z powodu konkurencji ze strony innych organizmów obecnych w próbie.

Uwaga: Należy używać zatwierdzonego źródła przeciwciał przeciw R. solanacearum (patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Zaleca się, aby dla każdej nowej partii przeciwciał określać miano. Miano określa się jako największe rozcieńczenie, przy którym pojawia się optymalna reakcja w trakcie badania zawiesiny zawierającej 105 do 106 komórek przypadających na ml szczepu homogenicznego R. solanacearum i przy użyciu właściwych koniugatów przeciwciał zgodnie z zaleceniami producenta. Podczas badań rutynowych używa się dostępnych w handlu przeciwciał w rozcieńczeniu roboczym zbliżonym do wartości miana.

Określić miano przeciwciał na zawiesinie 105 do 106 komórek przypadających na ml homogenicznego szczepu R. solanacearum.

Dołączyć ekstrakt z próby, w przypadku którego uprzednie badanie wykazało negatywne wyniki na R. solanacearum i zawiesinę niereagujących krzyżowo bakterii w buforze fosforanowym (PBS) jako kontrolę negatywną.

Jako kontroli pozytywnej użyć ekstraktu próby, w przypadku którego uprzednie badanie dało negatywne wyniki, wymieszanego z 103 do 104 komórek przypadających na ml R. solanacearum biowar 2 (np. szczep NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, patrz: dodatek 2 A i B). Dla porównania wyników na każdej płytce wykorzystać standardową zawiesinę zawierającą 105 do 106 komórek przypadających na ml w PBS R. solanacearum. Należy upewnić się, że na płytce titracyjnej kontrole pozytywne są właściwie oddzielone od prób badanych.

Znormalizowane pozytywne i negatywne materiały kontrolne dostępne do użycia przy tym badaniu wymieniono w dodatku 3 A.

Kontrole pozytywne traktować w sposób identyczny jak próbę(-y).

Zatwierdzone zostały dwa protokoły testu ELISA:

a)   Pośredni test ELISA (Elphinstone i wsp., 1995)

| 1. | Użyć 100-200 μl ekstraktu próby. (Ogrzewanie przez 4 minuty w temperaturze 100 °C w łaźni wodnej lub bloku grzewczym może w pewnych wypadkach zredukować niespecyficzne wyniki). |
| --- | --- |

1.

Użyć 100-200 μl ekstraktu próby. (Ogrzewanie przez 4 minuty w temperaturze 100 °C w łaźni wodnej lub bloku grzewczym może w pewnych wypadkach zredukować niespecyficzne wyniki).

| 2. | Dodać tę samą objętość podwójnie stężonego buforu powlekającego (dodatek 4) i zworteksować. |
| --- | --- |

2.

Dodać tę samą objętość podwójnie stężonego buforu powlekającego (dodatek 4) i zworteksować.

| 3. | Nałożyć po 100 l do każdej z co najmniej dwóch studzienek na płytce (np. Nunc-Polysorp lub równoważny). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C lub przez noc w temperaturze 4 °C. |
| --- | --- |

3.

Nałożyć po 100 l do każdej z co najmniej dwóch studzienek na płytce (np. Nunc-Polysorp lub równoważny). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C lub przez noc w temperaturze 4 °C.

| 4. | Usunąć ekstrakty ze studzienek. Przepłukać studzienki trzykrotnie buforem PBS-Tween (dodatek 4), pozostawiając w studzience ostatni roztwór używany do płukania na przynajmniej 5 minut. |
| --- | --- |

4.

Usunąć ekstrakty ze studzienek. Przepłukać studzienki trzykrotnie buforem PBS-Tween (dodatek 4), pozostawiając w studzience ostatni roztwór używany do płukania na przynajmniej 5 minut.

| 5. | Przygotować stosowne rozcieńczenia przeciwciał przeciw R. solanacearum w buforze blokującym (dodatek 4). W przypadku zatwierdzonych komercyjnych przeciwciał, użyć zalecanych rozcieńczeń (zazwyczaj o stężeniu dwukrotnie większym niż miano). |
| --- | --- |

5.

Przygotować stosowne rozcieńczenia przeciwciał przeciw R. solanacearum w buforze blokującym (dodatek 4). W przypadku zatwierdzonych komercyjnych przeciwciał, użyć zalecanych rozcieńczeń (zazwyczaj o stężeniu dwukrotnie większym niż miano).

| 6. | Nałożyć po 100 l do każdej studzienki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. |
| --- | --- |

6.

Nałożyć po 100 l do każdej studzienki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.

| 7. | Usunąć roztwór przeciwciał ze studzienek i wypłukać jak poprzednio (pkt 4). |
| --- | --- |

7.

Usunąć roztwór przeciwciał ze studzienek i wypłukać jak poprzednio (pkt 4).

| 8. | Przygotować właściwe rozcieńczenia drugich przeciwciał koniugatu alkalicznej fosfatazy w buforze blokującym. Nałożyć po 100 l do każdej studzienki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. |
| --- | --- |

8.

Przygotować właściwe rozcieńczenia drugich przeciwciał koniugatu alkalicznej fosfatazy w buforze blokującym. Nałożyć po 100 l do każdej studzienki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.

| 9. | Usunąć koniugaty przeciwciał ze studzienek i wypłukać jak poprzednio (pkt 4). |
| --- | --- |

9.

Usunąć koniugaty przeciwciał ze studzienek i wypłukać jak poprzednio (pkt 4).

| 10. | Dodać 100 μl roztworu substratu fosfatazy alkalicznej (dodatek 4) do każdej studzienki. Inkubować w ciemności w temperaturze otoczenia i odczytać absorbancję przy 405 nm w regularnych odstępach, w ciągu 90 minut. |
| --- | --- |

10.

Dodać 100 μl roztworu substratu fosfatazy alkalicznej (dodatek 4) do każdej studzienki. Inkubować w ciemności w temperaturze otoczenia i odczytać absorbancję przy 405 nm w regularnych odstępach, w ciągu 90 minut.

b)   DASI ELISA

| 1. | Przygotować stosowne rozcieńczenia przeciwciał poliklonalnych przeciw R. solanacearum w buforze powlekającym pH 9,6 (dodatek 4). Dodać 200 μl do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 4–5 godz. lub przy 4 °C przez 16 godz. |
| --- | --- |

1.

Przygotować stosowne rozcieńczenia przeciwciał poliklonalnych przeciw R. solanacearum w buforze powlekającym pH 9,6 (dodatek 4). Dodać 200 μl do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 4–5 godz. lub przy 4 °C przez 16 godz.

| 2. | Wypłukać studzienki trzykrotnie przy użyciu buforu PBS-Tween (dodatek 4).
  Dodać 190 μl ekstraktu próby do co najmniej 2 studzienek. Dodać także kontrolę pozytywną i negatywną do dwóch studzienek przypadających na płytkę. Inkubować przez 16 godz. w temperaturze 4 °C. |
| --- | --- |

2.

Wypłukać studzienki trzykrotnie przy użyciu buforu PBS-Tween (dodatek 4).

Dodać 190 μl ekstraktu próby do co najmniej 2 studzienek. Dodać także kontrolę pozytywną i negatywną do dwóch studzienek przypadających na płytkę. Inkubować przez 16 godz. w temperaturze 4 °C.

| 3. | Wypłukać studzienki trzykrotnie przy użyciu buforu PBS-Tween (dodatek 4). |
| --- | --- |

3.

Wypłukać studzienki trzykrotnie przy użyciu buforu PBS-Tween (dodatek 4).

| 4. | Przygotować stosowne rozcieńczenia specyficznych dla R. solanacearum przeciwciał monoklonalnych w PBS (dodatek 4) zawierających również 0,5 % albuminy z surowicy bydlęcej (BSA) oraz dodać 190 μl do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godz. |
| --- | --- |

4.

Przygotować stosowne rozcieńczenia specyficznych dla R. solanacearum przeciwciał monoklonalnych w PBS (dodatek 4) zawierających również 0,5 % albuminy z surowicy bydlęcej (BSA) oraz dodać 190 μl do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godz.

| 5. | Wypłukać studzienki trzykrotnie przy użyciu buforu PBS-Tween (dodatek 4). |
| --- | --- |

5.

Wypłukać studzienki trzykrotnie przy użyciu buforu PBS-Tween (dodatek 4).

| 6. | Przygotować stosowne rozcieńczenie koniugatu anty-mysich immunoglobin z fosfatazą alkaliczną w PBS. Dodać 190 μl do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godz. |
| --- | --- |

6.

Przygotować stosowne rozcieńczenie koniugatu anty-mysich immunoglobin z fosfatazą alkaliczną w PBS. Dodać 190 μl do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godz.

| 7. | Wypłukać studzienki trzykrotnie przy użyciu buforu PBS-Tween (dodatek 4). |
| --- | --- |

7.

Wypłukać studzienki trzykrotnie przy użyciu buforu PBS-Tween (dodatek 4).

| 8. | Przygotować roztwór substratu alkalicznej fosfatazy zawierający 1 mg fosfatazy p-nitrofenylu przypadającego na ml buforu substratowego (dodatek 4). Dodać 200 μl do każdej studzienki. Inkubować w ciemności w temperaturze otoczenia i odczytać absorbancję przy 405 nm w regularnych odstępach, w ciągu 90 minut. |
| --- | --- |

8.

Przygotować roztwór substratu alkalicznej fosfatazy zawierający 1 mg fosfatazy p-nitrofenylu przypadającego na ml buforu substratowego (dodatek 4). Dodać 200 μl do każdej studzienki. Inkubować w ciemności w temperaturze otoczenia i odczytać absorbancję przy 405 nm w regularnych odstępach, w ciągu 90 minut.

Interpretacja wyników testu ELISA

Wynik testu ELISA jest negatywny, gdy średnia gęstość optyczna (OD) odczytywana w dwóch powtórzeniach ze studzienek próby wynosi < 2x OD dla studzienki kontroli negatywnej, pod warunkiem że OD dla kontroli pozytywnych studzienek kontrolnych wynosi powyżej 1,0 (po 90 minutach inkubacji z substratem) i więcej niż podwójna OD uzyskana dla negatywnych ekstraktów prób.

Wynik testu ELISA jest pozytywny, gdy odczyty średniej gęstości optycznej OD próby w dwóch powtórzeniach wynoszą > 2x OD w negatywnym ekstrakcie próby pod warunkiem, że odczyt OD dla wszystkich kontroli pozytywnych wynosi < 2x tych w studzienkach kontroli pozytywnych.

Negatywne odczyty testu ELISA w studzienkach kontroli pozytywnych wskazują, że badanie nie zostało wykonane poprawnie lub że zostało zahamowane. Pozytywne odczyty testu ELISA w studzienkach kontroli negatywnych wskazują na kontaminację lub pojawienie się niespecyficznego wiązania przeciwciał.

9.   Test biologiczny

Uwaga: Wstępne testy przy użyciu tej metody powinny pozwolić na powtarzalne wykrywanie od 103 do 104 jednostek tworzących kolonie R. solanacearum. na ml dodanych do ekstraktów prób, które we wcześniejszych testach dały wyniki ujemne (sposób przygotowania opisano w dodatku 3).

Najwyższej czułości wykrywania można oczekiwać, kiedy stosuje się świeżo przygotowane ekstrakty i zapewnia się optymalne warunki wzrostu. Metodę tę można jednak z powodzeniem stosować do ekstraktów, które były przechowywane pod glicerolem w temp. od –68 do –86 °C.

Protokół ten oparty jest o publikację Janse (1988):

9.1.   Dla każdej próby użyć 10 roślin testowych wrażliwej odmiany pomidora (np. »Moneymaker« lub odmiany o podobnej podatności określonej w badaniu laboratoryjnym) w stadium trzeciego właściwego liścia. Szczegóły hodowli zamieszczono w dodatku 8. Alternatywnie można użyć roślin oberżyny (np. odmiany »Black Beauty« lub odmian o podobnej podatności), używać wyłącznie roślin w stadium 2–3 liści do pełnego rozwoju trzeciego liścia właściwego. Wykazano, że w przypadku użycia oberżyny obserwowane symptomy były słabsze i rozwijały się wolniej. W miarę możliwości zaleca się używanie sadzonek pomidora.

Rozdzielić po 100 μl ekstraktu próby pomiędzy rośliny testowe.

9.2.1.   Inokulacja za pomocą strzykawki

Inokulować łodygi roślin powyżej liścieni za pomocą strzykawki z igłą do iniekcji podskórnej (nie mniejszej niż 23 G). Próbę rozdzielić między rośliny testowe.

9.2.2.   Inokulacja przez nacięcie

Trzymając roślinę między dwoma palcami, nanieść na łodygę kroplę (średnio 5–10 μl) zawieszonego osadu w miejscu między liścieniami i pierwszym liściem.

Za pomocą sterylnego skalpela wykonać ukośne nacięcie, o długości 1,0 cm i na głębokość średnio 2/3 grubości łodygi, rozpoczynając od miejsca naniesienia kropli osadu.

Ranę zamknąć sterylną wazeliną ze strzykawki.

9.3.   Stosując tę samą technikę, zainokulować 5 sadzonek zawiesiną wodną 105 do 106 komórek przypadających na ml, przygotowaną z 48 godz. kultury wirulentnego biowar 2 szczepu R. solanacearum jako kontrolę pozytywną oraz buforem do zawieszania osadu (dodatek 4) jako kontrolę negatywną. W celu uniknięcia kontaminacji oddzielić kontrolę pozytywną i negatywną od pozostałych roślin testowych.

9.4.   Utrzymywać rośliny testowe w warunkach kwarantanny przez okres do 4 tygodni, w temperaturze 25–30 °C w wilgotności względnej z właściwym podlewaniem, aby zapobiec podtopieniu lub więdnięciu z powodu braku wody. Dla uniknięcia kontaminacji inkubować rośliny zainokulowanej kontroli pozytywnej i negatywnej na wyraźnie oddzielonych stołach w szklarni lub komorze wzrostu lub, w przypadku ograniczonej przestrzeni, zapewnić restrykcyjne oddzielenie pomiędzy procesami. Jeśli rośliny należące do różnych prób muszą być inkubowane w pobliżu, oddzielić je odpowiednimi ekranami. Przy nawożeniu, podlewaniu, kontrolowaniu i innych procedurach, należy bardzo uważać, aby unikać kontaminacji. Bardzo ważne jest, aby w szklarni lub komorze hodowlanej nie było żadnych owadów, ponieważ mogą one z próby na próbę przenosić bakterie.

Obserwować objawy więdnięcia, epinastii, chlorozy i/lub zahamowania rozwoju.

9.5.   Wyizolować z porażonych roślin (sekcja II.3) i zidentyfikować oczyszczone kultury typowe dla R. solanacearum (sekcja VI. B).

9.6.   Jeśli w okresie 3 tygodni nie zaobserwuje się żadnych objawów, wykonać IF/PCR/izolację na próbie zbiorczej złożonej z 1 cm fragmentów łodyg każdej badanej rośliny wziętej z odcinka powyżej miejsca inokulacji. Jeśli wynik testu jest pozytywny, wykonać posiew metodą rozcieńczeń płytkowych (sekcja 4.1).

9.7.   Zidentyfikować wszelkie oczyszczone kultury typowe dla R. solanacearum (sekcja VI. B).

Interpretacja wyników testu biologicznego:

Prawidłowe wyniki testu biologicznego są uzyskiwane, kiedy rośliny stanowiące kontrolę pozytywną wykazują typowe objawy, bakterie z tych roślin mogą być reizolowane, a na roślinach będących kontrolą negatywną nie występują objawy.

Test biologiczny daje wynik negatywny, jeżeli rośliny nie zostały porażone przez R. solanacearum, pod warunkiem że obecność kultury R. solanacearum wykryto w kontrolach pozytywnych.

Test biologiczny daje wynik pozytywny, gdy rośliny testowe są porażone przez R. solanacearum.

B.   TESTY IDENTYFIKACYJNE

Zidentyfikować czyste kultury typowe dla R. solanacearum przy użyciu co najmniej dwóch z poniższych testów opartych na różnych zasadach biologicznych.

Dołączyć znane szczepy referencyjne, tam gdzie to stosowne, dla każdego wykonywanego badania (patrz: dodatek 3).

1.   Testy fizjologiczne i biochemiczne

Określić następujące właściwości fenotypu, które standardowo występują lub nie w R. solanacearum, zgodnie z metodami Lelliotta i Steada (1987), Klementa et al. (1990), Schaad (2001).

| Test | Oczekiwany wynik |
| --- | --- |
| Produkcja barwnika fluorescencyjnego | – |
| Obecność poli-β -hydroksymaślanu | + |
| Test oksydacyjno/fermentacyjny (O/F) | O+/F— |
| Katalaza | + |
| Aktywność oksydazy | + |
| Redukcja azotanu | + |
| Wykorzystywanie cytrynianu | + |
| Wzrost przy 40 °C | – |
| Wzrost w 1 % NaCl | + |
| Wzrost w 2 % NaCl | – |
| Aktywność hydrolazy argininy | – |
| Upłynnianie żelatyny | – |
| Hydroliza skrobi | – |
| Hydroliza esuliny | – |
| Produkcja lewanu | – |

Test

Oczekiwany wynik

Produkcja barwnika fluorescencyjnego

–

Obecność poli-β -hydroksymaślanu

+

Test oksydacyjno/fermentacyjny (O/F)

O+/F—

Katalaza

+

Aktywność oksydazy

+

Redukcja azotanu

+

Wykorzystywanie cytrynianu

+

Wzrost przy 40 °C

–

Wzrost w 1 % NaCl

+

Wzrost w 2 % NaCl

–

Aktywność hydrolazy argininy

–

Upłynnianie żelatyny

–

Hydroliza skrobi

–

Hydroliza esuliny

–

Produkcja lewanu

–

2.   Test IF

2.1.   Przygotować zawiesinę około 106 komórek przypadających na ml w buforze IF (dodatek 4).

2.2.   Przygotować serię dwukrotnych rozcieńczeń odpowiedniej surowicy (patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

2.3.   Zastosować procedurę IF (sekcja VI.A.5).

2.4.   Wynik testu IF jest dodatni, jeśli miano IF badanej kultury jest równoważne mianu z kontroli pozytywnej.

3.   Test ELISA

Uwaga: Jeżeli wykonywane są tylko 2 testy identyfikacyjne, poza tą metodą, nie należy używać kolejnego badania serologicznego.

3.1.   Przygotować zawiesinę około 108 komórek przypadających na ml 1X PBS (dodatek 4).

3.2.   Zastosować odpowiednią procedurę testu ELISA ze specyficznymi przeciwciałami monoklonalnymi przeciw R. solanacearum.

3.3.   Wynik testu ELISA jest dodatni, jeśli odczyt ELISA uzyskany z badanej kultury wynosi przynajmniej połowę tego uzyskanego dla kontroli pozytywnej.

4.   Test PCR

4.1.   Przygotować zawiesinę około 106 komórek przypadających na ml w sterylnej wodzie o stopniu molekularnym.

4.2.   Podgrzać 100 μl zawiesiny komórek w zamkniętych probówkach w bloku grzejnym lub wrzącej łaźni wodnej w temperaturze 100 °C przez 4 minuty. Próbki mogą być następnie przechowywane do momentu, kiedy będą potrzebne w temp. od –16 do –24 °C.

4.3.   Użyć właściwych procedur PCR dla namnożenia specyficznych dla R. solanacearum amplikonów (np. Seal et al. (1993); Pastrik i Maiss (2000); Pastrik et al. (2002); Boudazin et al. (1999); Opina et al. (1997), Weller et al. (1999).

4.4.   Pozytywna identyfikacja R. solanacearum następuje, jeśli amplikony PCR są tego samego rozmiaru i posiadają te same polimorfizmy restrykcyjne długości fragmentu, co dla szczepu kontroli pozytywnej.

5.   Test FISH

5.1.   Przygotować zawiesinę około 106 komórek przypadających na ml w UPW.

5.2.   Zastosować procedurę FISH (sekcja VI.A.7) przynajmniej z dwoma pozytywnymi specyficznymi dla R. solanacearum sondami oligonukleotydowymi (dodatek 7).

5.3.   Wynik testu FISH jest dodatni, jeśli takie same reakcje uzyskuje się z kultury badanej oraz kontroli pozytywnej.

6.   Analiza kwasów tłuszczowych (FAP)

6.1.   Hodować kulturę na trypticase soy agar (Oxoid) przez 48 godzin w temperaturze 28 °C.

6.2.   Zastosować odpowiednią metodę FAP (Janse, 1991; Stead, 1992).

6.3.   Badanie FAP daje wynik pozytywny, gdy profil kultury badanej jest identyczny z profilem dla kontroli pozytywnej. Obecność charakterystycznych kwasów tłuszczowych takich jak 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH oraz 18:1 2OH, a brak 16:0 3OH w dużym w stopniu wskazuje na występowanie Ralstonia sp.

7.   Metoda oznaczania szczepu

Wykonanie oznaczenia szczepu przy użyciu z jednej z następujących metod zaleca się dla każdego nowego przypadku izolacji R. solanacearum.

Dołączyć znane szczepy referencyjne, tam gdzie to stosowne, dla każdego wykonywanego badania (patrz: dodatek 3).

7.1.   Określenie biowaru

R. solanacearum dzieli się na biowary ze względu na ich zdolność do wytwarzania i/lub utleniania trzech cukrów i trzech alkoholi heksozowych (Hayward, 1964 i Hayward et al., 1990). Podłoże wzrostowe do badania browarów opisano w dodatku 2. Badanie można z powodzeniem wykonać szczepiąc podłoże czystymi kulturami R. solanacearum i inkubując w temperaturze 28 °C. Jeśli podłoże rozdzieli się do sterylnych 96 studzienek płytki (200 μl na studzienkę), w ciągu 72 godzin można zaobserwować zmianę barwy z oliwkowo zielonej na żółtą, co wskazuje na pozytywny wynik badania.

| | Biowar |
| --- | --- |
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Wykorzystanie: | |
| Maltozy | – | + | + | – | + |
| Laktozy | – | + | + | – | + |
| D (+) celobiozy | – | + | + | – | + |
| Mannitolu | – | – | + | + | + |
| Sorbitolu | – | – | + | + | – |
| Dulcytolu | – | – | + | + | – |

Biowar

1

2

3

4

5

Wykorzystanie:

Maltozy

–

+

+

–

+

Laktozy

–

+

+

–

+

D (+) celobiozy

–

+

+

–

+

Mannitolu

–

–

+

+

+

Sorbitolu

–

–

+

+

–

Dulcytolu

–

–

+

+

–

Dodatkowe badania różnicujące biowar 2 na podfenotypy

| | Biovar 2A
  (Na całym świecie) | Biovar 2A
  (W Chile i Kolumbii) | Biovar 2T
  (W obszarach tropikalnych) |
| --- | --- | --- | --- |
| Wykorzystanie trehalozy | – | + | + |
| Wykorzystanie mezoinozytolu | + | – | + |
| Wykorzystanie D-rybozy | – | – | + |
| Aktywność pektolityczna (1) | niska | niska | wysoka |

Biovar 2A

(Na całym świecie)

Biovar 2A

(W Chile i Kolumbii)

Biovar 2T

(W obszarach tropikalnych)

Wykorzystanie trehalozy

–

+

+

Wykorzystanie mezoinozytolu

+

–

+

Wykorzystanie D-rybozy

–

–

+

Aktywność pektolityczna (1)

niska

niska

wysoka

7.2.   Genomowe fingerprinting

Różnicowanie molekularne szczepów kompleksu R. solanacearum można zrealizować na drodze kilku technik, w tym:

7.2.1.   Analizą restrykcyjnego polimorfizmu długości fragmentu (RFLP) (Cook et al., 1989).

7.2.2.   Powtarzanego sekwencjonowania PCR przy użyciu REP, BOX i starterów ERIC (Louws et al., 1995; Smith et al. (1995).

7.2.3.   Analizą mnożonego polimorfizmu długości fragmentu (AFLP) (Van der Wolf et al., 1998).

7.3.   Metody PCR

Specyficzne startery PCR (Pastrik et al., 2002; patrz: dodatek 6) można użyć do rozróżnienia szczepów należących do działu 1 (biowary 3, 4 i 5) i działu 2 (biowary 1, 2A i 2T) R. solanacearum, zgodnie z pierwotną definicją analizy RFLP (Cook et al., 1989) oraz 16S sekwencjonowania rDNA (Taghavi et al., 1996).

C.   TESTY POTWIERDZAJĄCE

Test patogeniczności musi być wykonany jako końcowe potwierdzenie diagnozy występowania R. solanacearum oraz do określania wirulencji kultur zidentyfikowanych jako R. solanacearum.

| 1. | Przygotować inokulum 106 komórek na 1 ml z badanej kultury hodowanej przez 24–48 godzin i szczep kontroli pozytywnej R. solanacearum (np. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; patrz: dodatek 3). |
| --- | --- |

1.

Przygotować inokulum 106 komórek na 1 ml z badanej kultury hodowanej przez 24–48 godzin i szczep kontroli pozytywnej R. solanacearum (np. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; patrz: dodatek 3).

| 2. | Zainokulować 5–10 wrażliwych sadzonek pomidora lub oberżyny w stadium trzeciego właściwego liścia (Patrz: sekcja VI.A.9). |
| --- | --- |

2.

Zainokulować 5–10 wrażliwych sadzonek pomidora lub oberżyny w stadium trzeciego właściwego liścia (Patrz: sekcja VI.A.9).

| 3. | Inkubować przez okres do 2 tygodni w temperaturze 25–28 °C w wysokiej wilgotności względnej z właściwym podlewaniem, aby zapobiec powstaniu stresu z powodu podtopienia lub zbytniego wysuszenia. Przy czystych kulturach, typowe więdnięcie powinno się uzyskać w ciągu 15 dni. Jeśli po tym okresie nie ma objawów, nie można potwierdzić, że kultura jest patogeniczną formą R. solanacearum. |
| --- | --- |

3.

Inkubować przez okres do 2 tygodni w temperaturze 25–28 °C w wysokiej wilgotności względnej z właściwym podlewaniem, aby zapobiec powstaniu stresu z powodu podtopienia lub zbytniego wysuszenia. Przy czystych kulturach, typowe więdnięcie powinno się uzyskać w ciągu 15 dni. Jeśli po tym okresie nie ma objawów, nie można potwierdzić, że kultura jest patogeniczną formą R. solanacearum.

| 4. | Izolacji dokonywać z roślin wykazujących objawy porażenia w następujący sposób. |
| --- | --- |

4.

Izolacji dokonywać z roślin wykazujących objawy porażenia w następujący sposób.

| 5. | Pobrać wycinek tkanki z łodygi, 2 cm powyżej punktu inokulacji. Rozdrobnić ją i zawiesić w małej objętości sterylnej wody destylowanej lub 50 mM buforu fosforanowego (dodatek 4). Izolować z zawiesiny poprzez naniesienie rozcieńczenia na odpowiednią pożywkę, najlepiej na pożywkę selektywną (dodatek 2), inkubować przez 48–72 godzin w temperaturze 28 °C i sprawdzić, czy pojawiły się typowe kolonie R. solanacearum. |
| --- | --- |

5.

Pobrać wycinek tkanki z łodygi, 2 cm powyżej punktu inokulacji. Rozdrobnić ją i zawiesić w małej objętości sterylnej wody destylowanej lub 50 mM buforu fosforanowego (dodatek 4). Izolować z zawiesiny poprzez naniesienie rozcieńczenia na odpowiednią pożywkę, najlepiej na pożywkę selektywną (dodatek 2), inkubować przez 48–72 godzin w temperaturze 28 °C i sprawdzić, czy pojawiły się typowe kolonie R. solanacearum.

Dodatek 1

Laboratoria zajmujące się optymalizacją i zatwierdzeniem protokołów

| Laboratorium (2) | Miasto | Państwo |
| --- | --- | --- |
| Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit | Wiedeń i Linz | Austria |
| Departement Gewasbescherming | Merelbeke | Belgia |
| Plantedirektoratet | Lyngby | Dania |
| Central Science Laboratory | York | Anglia |
| Scottish Agricultural Science Agency | Edynburg | Szkocja |
| Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Unité de Bactériologie | Angers | Francja |
| Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme de Terre | Le Rheu | Francja |
| Biologische Bundesanstalt | Kleinmachnow | Niemcy |
| Pflanzenschutzamt Hannover | Hannover | Niemcy |
| State Laboratory | Dublin | Irlandia |
| Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali | Bolonia | Włochy |
| Regione Veneto Unità Periferica per i Servizi Fitosanitari | Werona | Włochy |
| Nederlandse Algemene Keuringsdienst | Emmeloord | Holandia |
| Plantenziektenkundige Dienst | Wageningen | Holandia |
| Direcção-Geral de Protecção das Culturas | Lizbona | Portugalia |
| Centro Diagnostico de Aldearrubia | Salamanca | Hiszpania |
| Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias | Walencja | Hiszpania |
| Swedish University of Agricultural Sciences | Uppsala | Szwecja |

Laboratorium (2)

Miasto

Państwo

Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit

Wiedeń i Linz

Austria

Departement Gewasbescherming

Merelbeke

Belgia

Plantedirektoratet

Lyngby

Dania

Central Science Laboratory

York

Anglia

Scottish Agricultural Science Agency

Edynburg

Szkocja

Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Unité de Bactériologie

Angers

Francja

Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme de Terre

Le Rheu

Francja

Biologische Bundesanstalt

Kleinmachnow

Niemcy

Pflanzenschutzamt Hannover

Hannover

Niemcy

State Laboratory

Dublin

Irlandia

Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali

Bolonia

Włochy

Regione Veneto Unità Periferica per i Servizi Fitosanitari

Werona

Włochy

Nederlandse Algemene Keuringsdienst

Emmeloord

Holandia

Plantenziektenkundige Dienst

Wageningen

Holandia

Direcção-Geral de Protecção das Culturas

Lizbona

Portugalia

Centro Diagnostico de Aldearrubia

Salamanca

Hiszpania

Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias

Walencja

Hiszpania

Swedish University of Agricultural Sciences

Uppsala

Szwecja

Dodatek 2

Pożywki do izolacji i hodowli R. solanacearum

a)   Ogólne pożywki do hodowli

Pożywka agarowa (NA)

| Nutrient Agar (Difco) | 23,0 g |
| --- | --- |
| Woda destylowana | 1,0 l |

Nutrient Agar (Difco)

23,0 g

Woda destylowana

1,0 l

Rozpuścić składniki i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 min

Agar drożdżowo-peptonowo-glukozowy (YPGA)

| Yeast extract (Difco) | 5,0 g |
| --- | --- |
| Bacto-Peptone (Difco) | 5,0 g |
| Monohydrat D(+) glukozy | 10,0 g |
| Bacto-Agar (Difco) | 15,0 g |
| Woda destylowana | 1,0 l |

Yeast extract (Difco)

5,0 g

Bacto-Peptone (Difco)

5,0 g

Monohydrat D(+) glukozy

10,0 g

Bacto-Agar (Difco)

15,0 g

Woda destylowana

1,0 l

Rozpuścić składniki i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut.

Agar sacharozowo-peptonowy (SPA)

| Sacharoza | 20,0 g |
| --- | --- |
| Bacto-Peptone (Difco) | 5,0 g |
| K2HPO4 | 0,5 g |
| MgSO4.7H2O | 0,25 g |
| Bacto-Agar (Difco) | 15,0 g |
| Woda destylowana | 1,0 l |
| pH 7,2–7,4 | |

Sacharoza

20,0 g

Bacto-Peptone (Difco)

5,0 g

K2HPO4

0,5 g

MgSO4.7H2O

0,25 g

Bacto-Agar (Difco)

15,0 g

Woda destylowana

1,0 l

pH 7,2–7,4

Rozpuścić składniki i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut.

Pożywka tetrazolowa Kelmana

| Casamino acids (Difco) | 1,0 g |
| --- | --- |
| Bacto-Peptone (Difco) | 10,0 g |
| Dekstroza | 5,0 g |
| Bacto-Agar (Difco) | 15,0 g |
| Woda destylowana | 1,0 l |

Casamino acids (Difco)

1,0 g

Bacto-Peptone (Difco)

10,0 g

Dekstroza

5,0 g

Bacto-Agar (Difco)

15,0 g

Woda destylowana

1,0 l

Rozpuścić składniki i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut.

Oziębić do 50oC i dodać sterylizowany przez filtr roztwór wodny 2,3,5 chlorku trifenylo-tetrazolowego (Sigma), tak by otrzymać stężenie końcowe 50 mg/l.

b)   Zatwierdzone pożywki selektywne do hodowli

Pożywka SMSA (Englebrecht, 1994 zmodyfikowane przez Elphinstone et al., 1996)

| Pożywka podstawowa | |
| --- | --- |
| Casamino acids (Difco) | 1,0 g |
| Bacto-Peptone (Difco) | 10,0 g |
| Gliceryna | 5,0 ml |
| Bacto-Agar (Difco) (patrz: Uwaga 2) | 15,0 g |
| Woda destylowana | 1,0 l |

Pożywka podstawowa

Casamino acids (Difco)

1,0 g

Bacto-Peptone (Difco)

10,0 g

Gliceryna

5,0 ml

Bacto-Agar (Difco) (patrz: Uwaga 2)

15,0 g

Woda destylowana

1,0 l

Rozpuścić składniki i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut

Oziębić do 50 °C i dodać sterylizowany przez filtr roztwór wodny następujących składników w celu uzyskania określonych stężeń końcowych:

| Fiolet krystaliczny (Sigma) | 5 mg na l |
| --- | --- |
| Siarczan polimyksyny B | (Sigma P-1004) 600 000 U (około 100 mg) na l |
| Bacytracyna (Sigma B-0125) | 1 250 U (około 25 mg) na l |
| Chloroamfenikol (Sigma C-3175) | 5 mg na l |
| Penicylina-G (Sigma P-3032) | 825 U (około 0,5 mg) na l |
| 2,3,5 chlorek trifenylo-tetrazolowy (Sigma) | 50 mg na l |

Fiolet krystaliczny (Sigma)

5 mg na l

Siarczan polimyksyny B

(Sigma P-1004) 600 000 U (około 100 mg) na l

Bacytracyna (Sigma B-0125)

1 250 U (około 25 mg) na l

Chloroamfenikol (Sigma C-3175)

5 mg na l

Penicylina-G (Sigma P-3032)

825 U (około 0,5 mg) na l

2,3,5 chlorek trifenylo-tetrazolowy (Sigma)

50 mg na l

Uwaga:

| 1. | Używanie odczynników innych niż wskazane powyżej może mieć wpływ na hodowlę R. solanacearum. |
| --- | --- |

1.

Używanie odczynników innych niż wskazane powyżej może mieć wpływ na hodowlę R. solanacearum.

| 2. | Oxoid Agar #1 można użyć zamiast Bacto-agar (Difco). W tym wypadku, wzrost R. solanacearum będzie wolniejszy, choć można zmniejszyć też wzrost konkurujących saprofitów. Typowe dla R. solanacearum kolonie mogą formować się 1–2 dni dłużej, a czerwony kolor może być jaśniejszy i bardziej rozproszony niż na Bacto-Agar. |
| --- | --- |

2.

Oxoid Agar #1 można użyć zamiast Bacto-agar (Difco). W tym wypadku, wzrost R. solanacearum będzie wolniejszy, choć można zmniejszyć też wzrost konkurujących saprofitów. Typowe dla R. solanacearum kolonie mogą formować się 1–2 dni dłużej, a czerwony kolor może być jaśniejszy i bardziej rozproszony niż na Bacto-Agar.

| 3. | Zwiększenie stężenia bacytracyny do 2 500 U/l może zredukować populacje konkurujących bakterii bez wpływu na wzrost R. solanacearum. |
| --- | --- |

3.

Zwiększenie stężenia bacytracyny do 2 500 U/l może zredukować populacje konkurujących bakterii bez wpływu na wzrost R. solanacearum.

Pożywki i roztwory antybiotyków przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemnym miejscu i wykorzystać w ciągu miesiąca.

Przed użyciem z płytek należy usunąć skropliny, jakie wytwarzają się na powierzchni.

Należy unikać nadmiernego wysuszenia płytek.

Kontrolę jakości powinno się wykonać po przygotowaniu każdej nowej partii pożywki poprzez nałożenie na płytki zawiesiny kultury referencyjnej R. solanacearum (patrz: dodatek 3) i obserwowanie formowania się typowych kolonii po inkubacji w temperaturze 28 °C przez 2–5 dni.

c)   Zatwierdzona pożywka do wzbogacenia

Pożywka SMSA (Elphinstone et al., 1996)

Przygotować tak jak pożywkę agarową selektywną SMSA, lecz pominąć Bacto-Agar i 2,3,5 chlorek trójfenylo-tetrazolowy.

Zmodyfikowana pożywka Wilbrink (Caruso et al., 2002)

| Sacharoza | 10 g |
| --- | --- |
| Proteose peptone | 5 g |
| K2HPO4 | 0,5 g |
| MgSO4 | 0,25 g |
| NaNO3 | 0,25 g |
| Woda destylowana | 1 l |

Sacharoza

10 g

Proteose peptone

5 g

K2HPO4

0,5 g

MgSO4

0,25 g

NaNO3

0,25 g

Woda destylowana

1 l

Sterylizować pożywkę w autoklawie, w temp. 121 °C, przez 15 minut i ochłodzić do 50 °C

Dodać roztwory antybiotyków jak dla pożywki SMSA.

Dodatek 3

A.   Dostępne w handlu znormalizowane materiały kontrolne

a)   Szczepy bakterii

Do użycia jako standardowy materiał referencyjny zaleca się następujący szczep bakteryjny do przygotowania kontroli pozytywnych (tabela 1) lub w trakcie optymalizacji badań dla uniknięcia reakcji krzyżowych (tabela 2). Wszystkie szczepy są ogólno dostępne w handlu w następujących podmiotach:

| 1. | National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Central Science Laboratory, York, UK. |
| --- | --- |

1.

National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Central Science Laboratory, York, UK.

| 2. | Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen, Niderlandy. |
| --- | --- |

2.

Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen, Niderlandy.

| 3. | Collection Française de Bactéries Phytopathogènes (CFBP), INRA Station Phytobactériologie, Angers, Francja. |
| --- | --- |

3.

Collection Française de Bactéries Phytopathogènes (CFBP), INRA Station Phytobactériologie, Angers, Francja.

Tabela 1   Panel referencyjny SMT szczepów R. solanacearum

| Kod NCPPB | SMT
  # | Pozostałe kody | Kraj pochodzenia | Biowar |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| NCPPB 4153 | 6 | CFBP 4582, Pr 3020, EURS11 | Egipt | 2 |
| NCPPB 4154 | 10 | CFBP 4585, 550, EURS21 | Turcja | 2 |
| NCPPB 3857 | 12 | CFBP 4587, Pr 1140, EURS26 | Anglia | 2 |
| NCPPB 1584 | 23 | CFBP 4598, EURS49 | Cypr | 2 |
| NCPPB 2505 | 24 | CFBP 4599, EURS50 | Szwecja | 2 |
| NCPPB 4155 | 26 | CFBP 4601, 502, EURS55 | Belgia | 2 |
| NCPPB 4156 (3) | 71 (3) | PD 2762, CFBP 3857 | Holandia | 2 |
| NCPPB 4157 | 66 | LNPV 15.59 | Francja | 2 |
| NCPPB 4158 | 39 | CFBP 4608, Port 448, EURS80 | Portugalia | 2 |
| NCPPB 4160 | 69 | IVIA-1632-2 | Hiszpania | 2 |
| NCPPB 4161 | 76 | B3B | Niemcy | 2 |
| NCPPB 325 | 41 | CFBP 2047, KEL60-1, R842 | USA | 1 |
| NCPPB 3967 | 42 | CFBP 4610, R285, GONg7 | Kostaryka | 1 |
| NCPPB 4028 | 43 | CFBP 4611, R303/571, CIP310, SEQ205 | Kolumbia | 2 |
| NCPPB 3985 | 44 | CFBP 4612, R578, CIP312 | Peru | 2T |
| NCPPB 3989 | 45 | CFBP 4613, R568, CIP226 | Brazylia | 2T |
| NCPPB 3996 | 46 | CFBP 3928, R276/355, CIP72, SEQ225 | Peru | 3 |
| NCPPB 3997 | 47 | CFBP 4614, R280/363, CIP49, HAY0131a | Australia | 3 |
| NCPPB 4029 | 48 | CFBP 4615, R297/349, CIP121, CMIb2861 | Sri Lanka | 4 |
| NCPPB 4005 | 49 | CFBP 4616, R470 | Filipiny | 4 |
| NCPPB 4011 | 50 | CFBP 4617, R288, HEmps2 | Chiny | 5 |

Kod NCPPB

SMT

#

Pozostałe kody

Kraj pochodzenia

Biowar

NCPPB 4153

6

CFBP 4582, Pr 3020, EURS11

Egipt

2

NCPPB 4154

10

CFBP 4585, 550, EURS21

Turcja

2

NCPPB 3857

12

CFBP 4587, Pr 1140, EURS26

Anglia

2

NCPPB 1584

23

CFBP 4598, EURS49

Cypr

2

NCPPB 2505

24

CFBP 4599, EURS50

Szwecja

2

NCPPB 4155

26

CFBP 4601, 502, EURS55

Belgia

2

NCPPB 4156 (3)

71 (3)

PD 2762, CFBP 3857

Holandia

2

NCPPB 4157

66

LNPV 15.59

Francja

2

NCPPB 4158

39

CFBP 4608, Port 448, EURS80

Portugalia

2

NCPPB 4160

69

IVIA-1632-2

Hiszpania

2

NCPPB 4161

76

B3B

Niemcy

2

NCPPB 325

41

CFBP 2047, KEL60-1, R842

USA

1

NCPPB 3967

42

CFBP 4610, R285, GONg7

Kostaryka

1

NCPPB 4028

43

CFBP 4611, R303/571, CIP310, SEQ205

Kolumbia

2

NCPPB 3985

44

CFBP 4612, R578, CIP312

Peru

2T

NCPPB 3989

45

CFBP 4613, R568, CIP226

Brazylia

2T

NCPPB 3996

46

CFBP 3928, R276/355, CIP72, SEQ225

Peru

3

NCPPB 3997

47

CFBP 4614, R280/363, CIP49, HAY0131a

Australia

3

NCPPB 4029

48

CFBP 4615, R297/349, CIP121, CMIb2861

Sri Lanka

4

NCPPB 4005

49

CFBP 4616, R470

Filipiny

4

NCPPB 4011

50

CFBP 4617, R288, HEmps2

Chiny

5

Uwaga: Autentyczność powyższych szczepów może być zagwarantowana tylko wówczas, gdy zostały one pozyskane z autentycznego zbioru hodowli.

Tabela 2   Panel referencyjny SMT i związanych serologicznie lub genetycznie bakterii do stosowania przy optymalizacji badań wykrywania.

| Kod NCPPB | SMT
  # | Pozostałe kody | Identyfikacja |
| --- | --- | --- | --- |
| NCPPB 4162 | 51 | CFBP 1954 | Bacillus polymyxa
   (4) |
| NCPPB 4163 | 52 | CFBP 1538 | Pseudomonas marginalis pv. marginalis
   (4) |
| NCPPB 4164 | — | CFBP 2227 | Burkholderia cepacia
   (5) |
| NCPPB 4165 | — | CFBP 2459 | Ralstonia pickettii
   (5) |
| NCPPB 4166 | 58 | CFBP 3567
  CSL Pr1150 | Ralstonia pickettii
   (4) |
| NCPPB 4167 | 60 | CFBP 4618
  PD 2778 | Ralstonia sp.
   (4) |
| NCPPB 1127 | 53 | CFBP 3575 | Burkholderia andropogonis
   (4) |
| NCPPB 353 | 54 | CFBP 3572 | Burkholderia caryophylli
   (4) |
| NCPPB 945 | 55 | CFBP 3569 | Burkholderia cepacia
   (4) |
| NCPPB 3708 | 56 | CFBP 3574 | Burkholderia glumae
   (4) |
| NCPPB 3590 | 57 | CFBP 3573 | Burkholderia plantarii
   (4) |
| NCPPB 3726 | 59 | CFBP 3568 | Banana Blood Disease Bacterium
   (4)
   (5)
   (6) |
| NCPPB 4168 | 61 | CFBP 4619
  IPO S339 | Enterobacter sp. (4) |
| NCPPB 4169 | 62 | IPO 1695 | Enterobacter sp. (4) |
| NCPPB 4170 | 63 | CFBP 4621
  IPO S306 | Ochrobactrum anthropi
   (4)
   (5) |
| NCPPB 4171 | 64 | CFBP 4622
  IPO 1693 | Curtobacterium sp. (4)
   (5) |
| NCPPB 4172 | 65 | IPO 1696a | Pseudomonas sp. (4) |
| NCPPB 4173 | — | PD 2318 | Aureobacterium sp. (5) |
| NCPPB 4174 | 81 | IVIA 1 844,06 | Flavobacterium sp. (4)
   (5) |

Kod NCPPB

SMT

#

Pozostałe kody

Identyfikacja

NCPPB 4162

51

CFBP 1954

Bacillus polymyxa
   (4)

NCPPB 4163

52

CFBP 1538

Pseudomonas marginalis pv. marginalis
   (4)

NCPPB 4164

—

CFBP 2227

Burkholderia cepacia
   (5)

NCPPB 4165

—

CFBP 2459

Ralstonia pickettii
   (5)

NCPPB 4166

58

CFBP 3567

CSL Pr1150

Ralstonia pickettii
   (4)

NCPPB 4167

60

CFBP 4618

PD 2778

Ralstonia sp.
   (4)

NCPPB 1127

53

CFBP 3575

Burkholderia andropogonis
   (4)

NCPPB 353

54

CFBP 3572

Burkholderia caryophylli
   (4)

NCPPB 945

55

CFBP 3569

Burkholderia cepacia
   (4)

NCPPB 3708

56

CFBP 3574

Burkholderia glumae
   (4)

NCPPB 3590

57

CFBP 3573

Burkholderia plantarii
   (4)

NCPPB 3726

59

CFBP 3568

Banana Blood Disease Bacterium
   (4)
   (5)
   (6)

NCPPB 4168

61

CFBP 4619

IPO S339

Enterobacter sp. (4)

NCPPB 4169

62

IPO 1695

Enterobacter sp. (4)

NCPPB 4170

63

CFBP 4621

IPO S306

Ochrobactrum anthropi
   (4)
   (5)

NCPPB 4171

64

CFBP 4622

IPO 1693

Curtobacterium sp. (4)
   (5)

NCPPB 4172

65

IPO 1696a

Pseudomonas sp. (4)

NCPPB 4173

—

PD 2318

Aureobacterium sp. (5)

NCPPB 4174

81

IVIA 1 844,06

Flavobacterium sp. (4)
   (5)

b)   Dostępne w handlu znormalizowane materiały kontrolne

Następujące standardowe materiały kontrolne są dostępne ze zbiorów hodowlanych NCPPB.

Zamrozić wysuszony osad ekstraktu ziemniaka z 200 zdrowych bulw jako kontrolę negatywną dla wszystkich testów.

Zamrozić wysuszony osad ekstrakt ziemniaka z 200 zdrowych bulw zawierających od 103 do 104 i 104 do 106 komórek R. solanacearum biowar 2 (szczep NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) jako pozytywne kontrole dla testu serologicznego i testu PCR. Jako że żywotność komórek jest w trakcie zamrażania i suszenia obniżana, nie nadają się one jako standardowe próby kontrolne do badań izolacji lub testów biologicznych.

Zawiesiny utrwalane w formalinie R. solanacearum biowar 2 (szczep NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) przy 106 komórek przypadających na ml jako pozytywne kontrole do testów serologicznych.

B.   Przygotowanie kontroli pozytywnych i negatywnych testów przesiewowych PCR/IF i FISH

Wytworzyć kulturę 48-godzinną wirulentnego szczepu R. solanacearum rasa3/biowar2 (np. szczep NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) na uniwersalnej pożywce SMSA i zawiesić w 10 mM buforze fosforanowym dla uzyskania gęstości około 2 × 108 cfu przypadających na ml. Uzyskuje się zwykle lekko mętną zawiesinę odpowiadającą gęstości optycznej 0,15 przy 600 nm.

Pobrać części przystolonowe z 200 bulw ziemniaków odmiany o białej skórce, o których wiadomo, że są wolne od R. solanacearum.

Z pobranymi częściami przystolonowymi postępować jak zwykle i zawiesić osad w 10 ml.

Przygotować 10 sterylnych mikrofiolek 1,5 ml z 900 μl zawieszonego osadu.

Przenieść 100 μl zawiesiny R. solanacearum do pierwszej mikrofiolki. Zworteksować.

Ustalić dziesiętne poziomy porażenia przez dalsze rozcieńczanie w następnych pięciu mikrofiolkach.

Sześć porażonych mikrofiolek należy wykorzystać jako kontrolę pozytywną. Cztery nieporażone mikrofiolki należy wykorzystać jako kontrolę negatywną. Należy zaopatrzyć mikrofiolki w odpowiednie etykiety.

Rozdzielić uzyskane zawiesiny po 100 μl do sterylnych 1,5 ml mikrofiolek otrzymując 9 powtórzeń każdego rozcieńczenia. Przechowywać w temp. –16 do –24 °C do chwili użycia.

Obecność i liczebność R. solanacearum w próbach kontrolnych należy najpierw potwierdzić przez test IF.

W przypadku testu PCR dla każdej serii prób testowych dokonać ekstrakcji DNA z prób kontroli pozytywnej i negatywnej.

W przypadku testów IF i FISH dla każdej serii prób testowych przeprowadzić badania na próbach kontroli pozytywnej i negatywnej.

W przypadku testów IF, FISH i PCR R. solanacearum musi zostać wykryty w przynajmniej 106 i 104 komórek/ml kontroli pozytywnej i nie wykryty w żadnej kontroli negatywnej.

Dodatek 4

Skład buforów i sposób ich przygotowania

UWAGI OGÓLNE: Zamknięte sterylne bufory można przechowywać do jednego roku

1.   Bufory do ekstrakcji

1.1.   Bufor ekstrakcyjny (50 mM bufor fosforanowy, pH 7,0)

Ten bufor jest używany do ekstrakcji bakterii z tkanek rośliny poprzez homogenizację lub wstrząsanie.

| Na2HPO4 (bezwodny) | 4,26 g |
| --- | --- |
| KH2PO4 | 2,72 g |
| Woda destylowana | 1,00 l |

Na2HPO4 (bezwodny)

4,26 g

KH2PO4

2,72 g

Woda destylowana

1,00 l

Rozpuścić składniki, sprawdzić wartość pH i wysterylizować przy użyciu autoklawu w temperaturze 121 °C przez 15 min.

Przydatne mogą być następujące dodatkowe składniki:

| | Cel | Ilość (na l) |
| --- | --- | --- |
| Lubrol w płatkach | Czynnik deflokulacyjny (7) | 0,5 g |
| Czynnik antypieniący (Silicone DC) | Czynnik antypieniący (7) | 1,0 ml |
| Pirofosforan czterosodowy | Antyutleniacz | 1,0 g |
| Poliwinylopirolidon-40000 (PVP-40) | Wiązane inhibitorów PCR | 50 g |

Cel

Ilość (na l)

Lubrol w płatkach

Czynnik deflokulacyjny (7)

0,5 g

Czynnik antypieniący (Silicone DC)

Czynnik antypieniący (7)

1,0 ml

Pirofosforan czterosodowy

Antyutleniacz

1,0 g

Poliwinylopirolidon-40000 (PVP-40)

Wiązane inhibitorów PCR

50 g

1.2.   Bufor do zawieszania osadu (10 mM bufor fosforanowy, pH 7,2)

Bufor jest używany do zawieszania i rozcieńczania ekstraktów z bulw ziemniaka po zagęszczeniu przez wirowanie.

| Na2HPO4.12H2O | 2,7 g |
| --- | --- |
| NaH2PO4.2H2O | 0,4 g |
| Woda destylowana | 1,0 l |

Na2HPO4.12H2O

2,7 g

NaH2PO4.2H2O

0,4 g

Woda destylowana

1,0 l

Rozpuścić składniki, sprawdzić wartość pH i wysterylizować przy użyciu autoklawu w temperaturze 121 °C przez 15 min.

2.   Bufory do testu IF

2.1.   Bufor IF (10 mM bufor fosforanowy (PBS), pH 7,2)

Bufor jest używany do rozpuszczania przeciwciał

| Na2HPO4.12H2O | 2,7 g |
| --- | --- |
| NaH2PO4.2H2O | 0,4 g |
| NaCL | 8,0 g |
| Woda destylowana | 1,0 l |

Na2HPO4.12H2O

2,7 g

NaH2PO4.2H2O

0,4 g

NaCL

8,0 g

Woda destylowana

1,0 l

Rozpuścić składniki, sprawdzić wartość pH i wysterylizować przy użyciu autoklawu w temperaturze 121 °C przez 15 min.

2.2.   Bufor IF-Tween

Bufor ten stosowany jest do płukania szkiełek.

Dodać 0,1 % Tween 20 do buforu IF.

2.3.   Bufor glicerynowo-fosforanowy, pH 7,6

Bufor ten jest dodawany na okienka szkiełek IF, w celu zwiększenia fluorescencji.

| Na2HPO4.12H2O | 3,2 g |
| --- | --- |
| NaH2PO4.2H2O | 0,15 g |
| Gliceryna | 50 ml |
| Woda destylowana | 100 ml |

Na2HPO4.12H2O

3,2 g

NaH2PO4.2H2O

0,15 g

Gliceryna

50 ml

Woda destylowana

100 ml

Roztwory utrwalające o działaniu przeciwodbarwiającym są dostępne np. w Vectashield® (Vector Laboratories) lub Citifluor® (Leica).

3.   Bufory do pośredniego testu ELISA

3.1.   Podwójnie stężony bufor powlekający, pH 9,6

| Na2CO3 | 6,36 g |
| --- | --- |
| NaHCO3 | 11,72 g |
| Woda destylowana | 1,00 l |

Na2CO3

6,36 g

NaHCO3

11,72 g

Woda destylowana

1,00 l

Rozpuścić składniki, sprawdzić wartość pH i wysterylizować przy użyciu autoklawu w temperaturze 121 °C przez 15 min.

Można dodać siarczek sodu jako antyutleniacz dla wyeliminowania nagromadzenia się utlenionych związków substancji aromatycznych.

3.2.   10 X bufor fosforanowy (PBS), pH 7,4

| NaCl | 80,0 g |
| --- | --- |
| KH2PO4 | 2,0 g |
| Na2HPO4.12H2O | 29,0 g |
| KCl | 2,0 g |
| Woda destylowana | 1,0 l |

NaCl

80,0 g

KH2PO4

2,0 g

Na2HPO4.12H2O

29,0 g

KCl

2,0 g

Woda destylowana

1,0 l

3.3.   PBS-Tween

| 10X PBS | 100 ml |
| --- | --- |
| 10 % Tween 20 | 5 ml |
| Woda destylowana | 895 ml |

10X PBS

100 ml

10 % Tween 20

5 ml

Woda destylowana

895 ml

3.4.   Bufor blokujący (przeciwciała) (należy go przygotowywać na krótko przed wykorzystaniem)

| 10X PBS | 10,0 ml |
| --- | --- |
| Poliwinylopirolidon-44000 (PVP-44) | 2,0 g |
| 10 % Tween 20 | 0,5 ml |
| Mleko w proszku | 0,5 g |
| Woda destylowana | uzupełnić do 100 ml |

10X PBS

10,0 ml

Poliwinylopirolidon-44000 (PVP-44)

2,0 g

10 % Tween 20

0,5 ml

Mleko w proszku

0,5 g

Woda destylowana

uzupełnić do 100 ml

3.5.   Roztwór substratu alkalicznej fosfatazy buforze fosforanowym, pH 9,8

| Dietanoloamina | 97 ml |
| --- | --- |
| Woda destylowana | 800 ml |

Dietanoloamina

97 ml

Woda destylowana

800 ml

Mieszać i ustawić pH na 9,8 za pomocą stężonego roztworu HCl

Uzupełnić wodą destylowaną do 1 l.

Dodać 0,2 g MgCl2.

Rozpuścić po dwie tabletki substratu fosfatazy po 5 mg (Sigma) w 15 ml roztworu.

4.   Bufory do testu DASI ELISA

4.1.   Bufor powlekający, pH 9,6

| Na2CO3 | 1,59 g |
| --- | --- |
| NaHCO3 | 2,93 g |
| Woda destylowana | 1 000 ml |

Na2CO3

1,59 g

NaHCO3

2,93 g

Woda destylowana

1 000 ml

Rozpuścić składniki i sprawdzić pH.

4.2.   10 X bufor fosforanowy (PBS), pH 7,2–7,4

| NaCl | 80,0 g |
| --- | --- |
| NaH2PO4.2 H2O | 4,0 g |
| Na2HPO4.12H2O | 27,0 g |
| Woda destylowana | 1 000 ml |

NaCl

80,0 g

NaH2PO4.2 H2O

4,0 g

Na2HPO4.12H2O

27,0 g

Woda destylowana

1 000 ml

4.3.   PBS-Tween

| 10X PBS | 50 ml |
| --- | --- |
| 10 % Tween 20 | 5 ml |
| Woda destylowana | 950 ml |

10X PBS

50 ml

10 % Tween 20

5 ml

Woda destylowana

950 ml

4.4.   Bufor substratowy, pH 9,8

| Dietanoloamina | 100 ml |
| --- | --- |
| Woda destylowana | 900 ml |

Dietanoloamina

100 ml

Woda destylowana

900 ml

Mieszać i ustawić pH na 9,8 za pomocą stężonego roztworu HCl.

Dodatek 5

Określenie poziomu porażenia w testach IF i FISH

| 1. | Policzyć średnią liczbę typowych komórek fluorescencyjnych przypadających na pole widzenia (c). |
| --- | --- |

1.

Policzyć średnią liczbę typowych komórek fluorescencyjnych przypadających na pole widzenia (c).

| 2. | Obliczyć liczbę typowych komórek fluorescencyjnych przypadających na okienko szkiełka mikroskopu (C).
  C = c × S/s








  gdzie | S | = | pole powierzchni okienka szkiełka wielopunktowego; |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| oraz | s | = | pole powierzchni obiektywu; |

2.

Obliczyć liczbę typowych komórek fluorescencyjnych przypadających na okienko szkiełka mikroskopu (C).

C = c × S/s

gdzie

S

=

pole powierzchni okienka szkiełka wielopunktowego;

oraz

s

=

pole powierzchni obiektywu;

| s = πi2/4G2K2 | gdzie | i | = | współczynnik pola (zależy od rodzaju okularu i zmienia się od 8 do 24); |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| | | K | = | współczynnik tubusa (1 lub 1,25); |
| | | G | = | powiększenie obiektywu (100x, 40x itd.). |

s = πi2/4G2K2

gdzie

i

=

współczynnik pola (zależy od rodzaju okularu i zmienia się od 8 do 24);

K

=

współczynnik tubusa (1 lub 1,25);

G

=

powiększenie obiektywu (100x, 40x itd.).

| 3. | Obliczyć liczbę typowych komórek fluorescencyjnych przypadających na ml zawieszonego osadu (N).
  N = C × 1 000/y × F








  gdzie | y | = | objętość ponownie zawieszonego osadu w każdym okienku; |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| oraz | F | = | współczynnik rozcieńczenia zawieszonego osadu. |

3.

Obliczyć liczbę typowych komórek fluorescencyjnych przypadających na ml zawieszonego osadu (N).

N = C × 1 000/y × F

gdzie

y

=

objętość ponownie zawieszonego osadu w każdym okienku;

oraz

F

=

współczynnik rozcieńczenia zawieszonego osadu.

Dodatek 6

Zatwierdzone protokoły PCR i odczynniki

Uwaga: Wstępne badanie powinno pozwolić na odtwarzalne wykrywanie od 103 do 104 komórek R. solanacearum przypadających na ml ekstraktu.

Wstępne badanie powinno wykazać również brak fałszywie pozytywnych wyników przy panelu wybranych szczepów bakteryjnych (patrz: dodatek 3).

1.   Protokół PCR Seal et al. (1993)

1.1.   Primery oligonukleotydowe

| Primer przedni OLI-1 | 5′-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3′ |
| --- | --- |
| Primer tylny Y-2 | 5′-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3′ |

Primer przedni OLI-1

5′-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3′

Primer tylny Y-2

5′-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3′

Oczekiwany rozmiar amplikonu z R. solanacearum matrycy DNA = 288 bp

1.2.   Mieszanina reakcji PCR

| Odczynnik | Ilość przypadająca na reakcję | Stężenie końcowe |
| --- | --- | --- |
| Sterylna woda ultra czysta (UPW) | 17,65 μl | |
| 10X PCR bufor (8) (15 mM MgCl2) | 2,5 μl | 1X (1,5 mM MgCl2) |
| Mieszania dNTP (20mM) | 0,25 μl | 0,2 mM |
| Starter OLI-1 (20μM) | 1,25 μl | 1 μM |
| Starter Y-2 (20μM) | 1,25 μl | 1 μM |
| Polimeraza Taq (5U/μl) (8) | 0,1 μl | 0,5 U |
| Objętość próby | 2,0 μl | |
| Objętość całkowita | 25 μl | |

Odczynnik

Ilość przypadająca na reakcję

Stężenie końcowe

Sterylna woda ultra czysta (UPW)

17,65 μl

10X PCR bufor (8) (15 mM MgCl2)

2,5 μl

1X (1,5 mM MgCl2)

Mieszania dNTP (20mM)

0,25 μl

0,2 mM

Starter OLI-1 (20μM)

1,25 μl

1 μM

Starter Y-2 (20μM)

1,25 μl

1 μM

Polimeraza Taq (5U/μl) (8)

0,1 μl

0,5 U

Objętość próby

2,0 μl

Objętość całkowita

25 μl

1.3.   Warunki reakcji PCR

Przeprowadzić następujący program:

| 1 cykl: | i) | 2 minuty w temperaturze 96 °C: (denaturacja matrycy DNA) |
| --- | --- | --- |
| 35 cykli: | ii) | 20 sekund w temperaturze 94 °C(denaturacja matrycy DNA) |
| | iii) | 20 sekund w temperaturze 68 °C (dołączanie primerów) |
| | iv) | 30 sekund w temperaturze 72 °C (wydłużanie kopii) |
| 1 cykl: | v) | 10 minut w temperaturze 72 °C (końcowe wydłużanie) |
| | vi) | trzymać w temperaturze 4 °C. |

1 cykl:

i)

2 minuty w temperaturze 96 °C: (denaturacja matrycy DNA)

35 cykli:

ii)

20 sekund w temperaturze 94 °C(denaturacja matrycy DNA)

iii)

20 sekund w temperaturze 68 °C (dołączanie primerów)

iv)

30 sekund w temperaturze 72 °C (wydłużanie kopii)

1 cykl:

v)

10 minut w temperaturze 72 °C (końcowe wydłużanie)

vi)

trzymać w temperaturze 4 °C.

Uwaga: Program ten został zoptymalizowany do stosowania z termocyklerem Perkin Elmer 9600. Przy używaniu z innymi modelami konieczna może okazać się zmiana czasu trwania etapów cykli ii), iii) oraz iv).

1.4.   Analiza amplikonu przy użyciu enzymów restrykcyjnych

Produkty PCR namnożone z DNA R. solanacearum wytwarzają odmienny polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych z enzymem Ava II po inkubacji w temperaturze 37 °C.

2.   Protokół PCR wg Pastrik i Maiss (2000)

2.1.   Primery oligonukleotydowe

| Primer przedni Ps-1 | 5′-agt cga acg gca gcg ggg g-3′ |
| --- | --- |
| Primer tylny Ps-2 | 5′-ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca-3′ |

Primer przedni Ps-1

5′-agt cga acg gca gcg ggg g-3′

Primer tylny Ps-2

5′-ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca-3′

Oczekiwany rozmiar amplikonu z R. solanacearum matrycy DNA = 553 bp.

2.2.   Mieszanina reakcji PCR

| Odczynnik | Ilość przypadająca na reakcję | Stężenie końcowe |
| --- | --- | --- |
| Sterylna woda ultra czysta (UPW) | 16,025 μl | |
| 10X PCR bufor (9) | 2,5 μl | 1X (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (frakcja V) (10 %) | 0,25 μl | 0,1 % |
| Mieszania d-nTP (20mM) | 0,125 μl | 0,1 mM |
| Starter Ps-1 (10μM) | 0,5 μl | 0,2 μM |
| Starter Ps-2 (10μM) | 0,5 μl | 0,2 μM |
| Polimeraza Taq (5U/μl) (9) | 0,1 μl | 0,5 U |
| Objętość próby | 5,0 μl | |
| Objętość całkowita: | 25,0 μl | |
| Uwaga: Pierwotnie zoptymalizowano dla termocyklera MJ Research PTC 200 z Gibco Taq Polymerase.
  Perkin Elmer AmpliTaq i bufor można również wykorzystać w tych samych stężeniach. |

Odczynnik

Ilość przypadająca na reakcję

Stężenie końcowe

Sterylna woda ultra czysta (UPW)

16,025 μl

10X PCR bufor (9)

2,5 μl

1X (1,5 mM MgCl2)

BSA (frakcja V) (10 %)

0,25 μl

0,1 %

Mieszania d-nTP (20mM)

0,125 μl

0,1 mM

Starter Ps-1 (10μM)

0,5 μl

0,2 μM

Starter Ps-2 (10μM)

0,5 μl

0,2 μM

Polimeraza Taq (5U/μl) (9)

0,1 μl

0,5 U

Objętość próby

5,0 μl

Objętość całkowita:

25,0 μl

Uwaga: Pierwotnie zoptymalizowano dla termocyklera MJ Research PTC 200 z Gibco Taq Polymerase.

Perkin Elmer AmpliTaq i bufor można również wykorzystać w tych samych stężeniach.

2.3.   Warunki reakcji PCR

Przeprowadzić następujący program:

| 1 cykl: | i) | 5 minuty w temperaturze 95 °C: (denaturacja matrycy DNA) |
| --- | --- | --- |
| 35 cykli: | ii) | 30 sekund w temperaturze 95 °C (denaturacja matrycy DNA) |
| | iii) | 30 sekund w temperaturze 68 °C (dołączanie primerów) |
| | iv) | 45 sekund w temperaturze 72 °C (wydłużanie kopii) |
| 1 cykl: | v) | 5 minut w temperaturze 72 °C (końcowe wydłużanie) |
| | vi) | trzymać w temperaturze 4 °C. |

1 cykl:

i)

5 minuty w temperaturze 95 °C: (denaturacja matrycy DNA)

35 cykli:

ii)

30 sekund w temperaturze 95 °C (denaturacja matrycy DNA)

iii)

30 sekund w temperaturze 68 °C (dołączanie primerów)

iv)

45 sekund w temperaturze 72 °C (wydłużanie kopii)

1 cykl:

v)

5 minut w temperaturze 72 °C (końcowe wydłużanie)

vi)

trzymać w temperaturze 4 °C.

Uwaga: Program ten został zoptymalizowany do stosowania z termocyklerem MJ Research PTC 200. Przy używaniu z innymi modelami konieczna może okazać się zmiana czasu trwania etapów cykli ii), iii) oraz iv).

2.4.   Analiza amplikonu przy użyciu enzymów restrykcyjnych

Produkty PCR namnożone z DNA R. solanacearum wytwarzają odmienny polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych uzyskanych za pomocą enzymu Taq I po inkubacji w temperaturze 65 °C przez 30 minut. Fragmenty restrykcyjne uzyskane z R. solanacearum mają wielkość 457 bp oraz 96 bp.

3.   Protokół testu multipleks PCR z kontrolą wewnętrzną PCR (Pastrik et al., 2002)

3.1.   Primery oligonukleotydowe

| Starter forward RS-1-F | 5′-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3′ |
| --- | --- |
| Starter reverse RS-1-R | 5′-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3′ |
| Starter forward NS-5-F | 5′-AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G-3′ |
| Starter reverse NS-6-R | 5′-GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC-3′ |

Starter forward RS-1-F

5′-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3′

Starter reverse RS-1-R

5′-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3′

Starter forward NS-5-F

5′-AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G-3′

Starter reverse NS-6-R

5′-GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC-3′

Oczekiwany rozmiar amplikonu z R. solanacearum matrycy DNA = 718 bp (zestaw RS primer).

Oczekiwany rozmiar amplikonu z 18S rRNA z wewnętrzną kontrolą PCR = 310 bp (zestaw NS primer).

3.2.   Mieszanina reakcji PCR

| Odczynnik | Ilość przypadająca na reakcję | Stężenie końcowe |
| --- | --- | --- |
| Sterylna woda ultra czysta (UPW) | 12,625 μl | |
| 10X PCR bufor (10) (15 mM MgCl2) | 2,5 μl | 1X (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (frakcja V) (10 %) | 0,25 μl | 0,1 % |
| Mieszania d-nTP (20mM) | 0,125 μl | 0,1 mM |
| Starter RS-1-F(10μM) | 2,0 μl | 0,8 μM |
| Starter RS-1-R(10μM) | 2,0 μl | 0,8 μM |
| Starter NS-5-F (10μM) (11) | 0,15 μl | 0,06 μM |
| Starter NS-6-R (10μM) (11) | 0,15 μl | 0,06 μM |
| Polimeraza Taq (5U/μl) (10) | 0,2 μl | 1,0 U |
| Objętość próby | 5,0 μl | |
| Objętość całkowita | 25,0 μl | |

Odczynnik

Ilość przypadająca na reakcję

Stężenie końcowe

Sterylna woda ultra czysta (UPW)

12,625 μl

10X PCR bufor (10) (15 mM MgCl2)

2,5 μl

1X (1,5 mM MgCl2)

BSA (frakcja V) (10 %)

0,25 μl

0,1 %

Mieszania d-nTP (20mM)

0,125 μl

0,1 mM

Starter RS-1-F(10μM)

2,0 μl

0,8 μM

Starter RS-1-R(10μM)

2,0 μl

0,8 μM

Starter NS-5-F (10μM) (11)

0,15 μl

0,06 μM

Starter NS-6-R (10μM) (11)

0,15 μl

0,06 μM

Polimeraza Taq (5U/μl) (10)

0,2 μl

1,0 U

Objętość próby

5,0 μl

Objętość całkowita

25,0 μl

3.3.   Warunki reakcji PCR

Przeprowadzić następujący program:

| 1 cykl: | i) | 5 minuty w temperaturze 95 °C: (denaturacja matrycy DNA) |
| --- | --- | --- |
| 35 cykli: | ii) | 30 sekund w temperaturze 95 °C (denaturacja matrycy DNA) |
| | iii) | 30 sekund w temperaturze 58 °C (dołączanie primerów) |
| | iv) | 45 sekund w temperaturze 72 °C (wydłużanie kopii) |
| 1 cykl: | v) | 5 minut w temperaturze 72 °C (końcowe wydłużanie) |
| | vi) | trzymać w temperaturze 4 °C. |

1 cykl:

i)

5 minuty w temperaturze 95 °C: (denaturacja matrycy DNA)

35 cykli:

ii)

30 sekund w temperaturze 95 °C (denaturacja matrycy DNA)

iii)

30 sekund w temperaturze 58 °C (dołączanie primerów)

iv)

45 sekund w temperaturze 72 °C (wydłużanie kopii)

1 cykl:

v)

5 minut w temperaturze 72 °C (końcowe wydłużanie)

vi)

trzymać w temperaturze 4 °C.

Uwaga: Program ten został zoptymalizowany do stosowania z termocyklerem MJ Research PTC 200. Przy używaniu z innymi modelami, konieczna może okazać się zmiana czasu trwania etapów cykli ii), iii) oraz iv).

3.4.   Analiza amplikonu przy użyciu enzymów restrykcyjnych

Produkty PCR namnożone z DNA R. solanacearum wytwarzają odmienny polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych z enzymem Bsm I lub Isoschizomere (np. Mva 1269 I) po inkubacji w temperaturze 65 °C przez 30 minut.

4.   Protokół testu PCR specyficzny dla biowaru R. solanacearum (Pastrik et al., 2001)

4.1.   Primery oligonukleotydowe

| Starter forward Rs-1-F | 5′-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3′ |
| --- | --- |
| Starter reverse Rs-1-R | 5′-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3′ |
| Starter reverse Rs-3-R | 5′-TTC ACG GCA AGA TCG CTC-3′ |

Starter forward Rs-1-F

5′-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3′

Starter reverse Rs-1-R

5′-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3′

Starter reverse Rs-3-R

5′-TTC ACG GCA AGA TCG CTC-3′

Oczekiwany rozmiar amplikonu z R. solanacearum matrycy DNA:

z Rs-1-F/Rs-1-R = 718 bp

z Rs-1-F/Rs-3-R = 716 bp.

4.2.   Mieszanina reakcji PCR

| a) | Biowar 1/2 specyficzny dla PCR







  Odczynnik | Ilość przypadająca na reakcję | Stężenie końcowe |
| --- | --- | --- | --- |
| Sterylna woda ultra czysta (UPW) | 12,925 μl | |
| 10X PCR bufor (12) | 2,5 μl | 1X (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (frakcja V) (10 %) | 0,25 μl | 0,1 % |
| Mieszania d-NTP (20mM) | 0,125 μl | 0,1 mM |
| Starter Rs-1-F (10μM) | 2 μl | 0,8 μM |
| Starter Rs-1-R (10μM) | 2 μl | 0,8 μM |
| Polimeraza Taq (5U/μl) (12) | 0,2 μl | 1 U |
| Objętość próby | 5,0 μl | |
| Objętość całkowita: | 25,0 μl | |

a)

Biowar 1/2 specyficzny dla PCR

Odczynnik

Ilość przypadająca na reakcję

Stężenie końcowe

Sterylna woda ultra czysta (UPW)

12,925 μl

10X PCR bufor (12)

2,5 μl

1X (1,5 mM MgCl2)

BSA (frakcja V) (10 %)

0,25 μl

0,1 %

Mieszania d-NTP (20mM)

0,125 μl

0,1 mM

Starter Rs-1-F (10μM)

2 μl

0,8 μM

Starter Rs-1-R (10μM)

2 μl

0,8 μM

Polimeraza Taq (5U/μl) (12)

0,2 μl

1 U

Objętość próby

5,0 μl

Objętość całkowita:

25,0 μl

| b) | PCR specyficzny dla biowaru 3/4/5







  Odczynnik | Ilość przypadająca na reakcję | Stężenie końcowe |
| --- | --- | --- | --- |
| Sterylna woda ultra czysta (UPW) | 14,925 μl | |
| 10X PCR bufor (13) | 2,5 μl | 1X (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (frakcja V) (10 %) | 0,25 μl | 0,1 % |
| Mieszania dNTP (20mM) | 0,125 μl | 0,1 mM |
| Starter Rs-1-F (10μM) | 1 μl | 0,4 μM |
| Starter Rs-3-R (10μM) | 1 μl | 0,4 μM |
| Polimeraza Taq (5U/μl) (13) | 0,2 μl | 1 U |
| Objętość próby | 5,0 μl | |
| Objętość całkowita | 25,0 μl | |

b)

PCR specyficzny dla biowaru 3/4/5

Odczynnik

Ilość przypadająca na reakcję

Stężenie końcowe

Sterylna woda ultra czysta (UPW)

14,925 μl

10X PCR bufor (13)

2,5 μl

1X (1,5 mM MgCl2)

BSA (frakcja V) (10 %)

0,25 μl

0,1 %

Mieszania dNTP (20mM)

0,125 μl

0,1 mM

Starter Rs-1-F (10μM)

1 μl

0,4 μM

Starter Rs-3-R (10μM)

1 μl

0,4 μM

Polimeraza Taq (5U/μl) (13)

0,2 μl

1 U

Objętość próby

5,0 μl

Objętość całkowita

25,0 μl

4.3.   Warunki reakcji PCR

Przeprowadzić następujący program dla reakcji specyficznej dla biowaru 1/2 i biowaru 3/4/5:

| 1 cykl: | i) | 5 minut w temperaturze 95 °C: (denaturacja matrycy DNA) |
| --- | --- | --- |
| 35 cykli: | ii) | 30 sekund w temperaturze 95 °C(denaturacja matrycy DNA) |
| | iii) | 30 sekund w temperaturze 58 °C (dołączanie primerów) |
| | iv) | 45 sekund w temperaturze 72 °C (wydłużanie kopii) |
| 1 cykl: | v) | 5 minut w temperaturze 72 °C (końcowe wydłużanie) |
| | vi) | trzymać w temperaturze 4 °C. |

1 cykl:

i)

5 minut w temperaturze 95 °C: (denaturacja matrycy DNA)

35 cykli:

ii)

30 sekund w temperaturze 95 °C(denaturacja matrycy DNA)

iii)

30 sekund w temperaturze 58 °C (dołączanie primerów)

iv)

45 sekund w temperaturze 72 °C (wydłużanie kopii)

1 cykl:

v)

5 minut w temperaturze 72 °C (końcowe wydłużanie)

vi)

trzymać w temperaturze 4 °C.

Uwaga: Program ten został zoptymalizowany do stosowania z termocyklerem MJ Research PTC 200. Przy używaniu z innymi modelami, konieczna może okazać się zmiana czasu trwania etapów cykli ii), iii) oraz iv).

4.4.   Analiza amplikonu przy użyciu enzymów restrykcyjnych

Produkty PCR namnożone z DNA R. solanacearum przy użyciu primerów Rs-1-F oraz Rs-1-R wytwarzają odmienny polimorfizm długości fragmentu z enzymem Bsm I lub Isoschizomere (np. Mva 1269 I) po inkubacji w temperaturze 65 °C przez 30 minut. Produkty PCR namnożone z DNA R. solanacearum przy pomocy primerów Rs-1-F oraz Rs-3-R nie posiadają miejsc restrykcji.

5.   Przygotowanie buforu obciążającego

5.1.   Błękit bromofenolowy (roztwór 10 %)

| Błękit bromofenolowy | 5 g |
| --- | --- |
| Woda destylowana (bidest) | 50 ml |

Błękit bromofenolowy

5 g

Woda destylowana (bidest)

50 ml

5.2.   Bufor obciążający

| Gliceryna (86 %) | 3,5 ml |
| --- | --- |
| Błękit bromofenolowy (5,1) | 300 μl |
| Woda destylowana (bidest) | 6,2 ml |

Gliceryna (86 %)

3,5 ml

Błękit bromofenolowy (5,1)

300 μl

Woda destylowana (bidest)

6,2 ml

6.   Bufor 10X Tris Acetate EDTA (TAE), pH 8.0

| Bufor Tris | 48,40 g |
| --- | --- |
| Kwas octowy lodowaty | 11,42 ml |
| EDTA (sól dwusodowa) | 3,72 g |
| Woda destylowana | 1,00 l |

Bufor Tris

48,40 g

Kwas octowy lodowaty

11,42 ml

EDTA (sól dwusodowa)

3,72 g

Woda destylowana

1,00 l

Przed użyciem rozcieńczyć 1X.

Wszystkie dostępne w handlu (np. Invitrogen lub równoważne).

Dodatek 7

Zatwierdzone odczynniki do testu FISH

1.   Sondy oligonukleotydowe

Sonda specyficzna dla R. solanacearum OLI-1-CY3: 5′-ggc agg tag caa gct acc ccc-3′

Sonda niespecyficzna eubakteryjna EUB-338-FITC: 5′-gct gcc tcc cgt agg agt-3′

2.   Roztwór utrwalający

[UWAGA! UTRWALACZ ZAWIERA TOKSYCZNY PARAFORMALDEHYD. NALEŻY NOSIĆ RĘKAWICE I NIE WDYCHAĆ. ZALECA SIĘ PRACĘ W DYGESTORIUM]

| i) | Ogrzać 9 ml wody o stopniu molekularnym (np. Ultra czysta woda (UPW)) do około 60 °C i dodać 0,4 g paraformaldehydu. Paraformaldehyd rozpuszcza się po dodaniu 5 kropli 1N NaOH i wymieszaniu na mieszadle magnetycznym. |
| --- | --- |

i)

Ogrzać 9 ml wody o stopniu molekularnym (np. Ultra czysta woda (UPW)) do około 60 °C i dodać 0,4 g paraformaldehydu. Paraformaldehyd rozpuszcza się po dodaniu 5 kropli 1N NaOH i wymieszaniu na mieszadle magnetycznym.

| ii) | Ustawić pH na 7,0 dodając 1 ml 0,1M buforu fosforanowego (PB; pH 7,0) i 5 kropli 1N HCl. Sprawdzić pH papierkiem lakmusowym i dostosować jeśli zachodzi taka potrzeba przy pomocy HCl lub NaOH. [UWAGA! NIE UŻYWAĆ PH-METRU W ROZTWORACH Z PARAFORMALEDHYDEM] |
| --- | --- |

ii)

Ustawić pH na 7,0 dodając 1 ml 0,1M buforu fosforanowego (PB; pH 7,0) i 5 kropli 1N HCl. Sprawdzić pH papierkiem lakmusowym i dostosować jeśli zachodzi taka potrzeba przy pomocy HCl lub NaOH. [UWAGA! NIE UŻYWAĆ PH-METRU W ROZTWORACH Z PARAFORMALEDHYDEM]

| iii) | Przefiltrować roztwór przez filtr membranowy 0,22 μm i przechowywać do czasu użycia w temperaturze 4 °C, zabezpieczywszy przed kurzem. |
| --- | --- |

iii)

Przefiltrować roztwór przez filtr membranowy 0,22 μm i przechowywać do czasu użycia w temperaturze 4 °C, zabezpieczywszy przed kurzem.

3.   3X Hybmix

| NaCl | 2,7 M |
| --- | --- |
| Tris-HCl | 60 mM (pH 7,4) |
| EDTA (sterylizowany na filtrze i autoklawowany) | 15 mM |

NaCl

2,7 M

Tris-HCl

60 mM (pH 7,4)

EDTA (sterylizowany na filtrze i autoklawowany)

15 mM

W miarę potrzeby rozcieńczyć do 1X.

4.   Roztwór do hybrydyzacji

| 1X Hybmix | |
| --- | --- |
| Siarczan dodecylu sodu (SDS) | 0,01 % |
| Formamid | 30 % |
| Sonda EUB 338 | 5 ng/μl |
| Sonda OLI-1 lub OLI-2 | 5 ng/μl |

1X Hybmix

Siarczan dodecylu sodu (SDS)

0,01 %

Formamid

30 %

Sonda EUB 338

5 ng/μl

Sonda OLI-1 lub OLI-2

5 ng/μl

Przygotować ilości roztworu do hybrydyzacji według obliczeń w tabeli 1. Dla każdego szkiełka (zawierającego 2 różne próby w powtórzeniu) wymagane jest 90 μl roztworu do hybrydyzacji. UWAGA: FORMAMID JEST BARDZO TOKSYCZNY, DLATEGO NALEŻY NOSIĆ RĘKAWICE I ZASTOSOWAĆ WŁAŚCIWE ŚRODKI BEZPIECZEŃSTWA!

Tabela 1   Sugerowane ilości przygotowania mieszaniny do hybrydyzacji

| Liczba szkiełek | 1 | 4 | 6 | 8 | 10 |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Sterylna woda ultra czysta (UPW) | 23,1 | 92,4 | 138,6 | 184,8 | 231,0 |
| 3x Hybmix | 30,0 | 120,0 | 180,0 | 240,0 | 300,0 |
| 1 % SDS | 0,9 | 3,6 | 5,4 | 7,2 | 9,0 |
| Formamid | 27,0 | 108,0 | 162,0 | 216,0 | 270,0 |
| Sonda EUB 338 (100 ng/μl) | 4,5 | 18,0 | 27,0 | 36,0 | 45,0 |
| Sonda OLI-1 lub OLI-2 (100 ng/μl) | 4,5 | 18,0 | 27,0 | 36,0 | 45,0 |
| Całkowita objętość (μl) | 90,0 | 360,0 | 540,0 | 720,0 | 900,0 |
| Uwaga: Przechowywać wszystkie roztwory zawierające wrażliwe na światło sondy oligonukleotydowe w ciemności, w temperaturze –20 °C.
  Chronić przed bezpośrednim padaniem promieni słonecznych lub światła elektrycznego. |

Liczba szkiełek

1

4

6

8

10

Sterylna woda ultra czysta (UPW)

23,1

92,4

138,6

184,8

231,0

3x Hybmix

30,0

120,0

180,0

240,0

300,0

1 % SDS

0,9

3,6

5,4

7,2

9,0

Formamid

27,0

108,0

162,0

216,0

270,0

Sonda EUB 338 (100 ng/μl)

4,5

18,0

27,0

36,0

45,0

Sonda OLI-1 lub OLI-2 (100 ng/μl)

4,5

18,0

27,0

36,0

45,0

Całkowita objętość (μl)

90,0

360,0

540,0

720,0

900,0

Uwaga: Przechowywać wszystkie roztwory zawierające wrażliwe na światło sondy oligonukleotydowe w ciemności, w temperaturze –20 °C.

Chronić przed bezpośrednim padaniem promieni słonecznych lub światła elektrycznego.

5.   0,1M bufor fosforanowy, pH 7,0

| Na2HPO4 | 8,52 g |
| --- | --- |
| KH2PO4 | 5,44 g |
| Woda destylowana | 1,00 l |

Na2HPO4

8,52 g

KH2PO4

5,44 g

Woda destylowana

1,00 l

Rozpuścić składniki, sprawdzić wartość pH i wysterylizować przy użyciu autoklawu w temperaturze 121 °C przez 15 min.

Dodatek 8

Hodowla roślin oberżyny i pomidora

Wysiać nasiona pomidora (Lycopersicon esculentum) lub oberżyny (Solanum melongena) do pasteryzowanego kompostu stosowanego do nasion. Siewki z pełni rozwiniętymi liścieniami (od 10 do 14 dni) przesadzić do pasteryzowanego kompostu doniczkowego.

Przed inokulacją, rośliny oberżyny lub pomidorów powinno hodować się w szklarni w następujących warunkach środowiskowych:

| Długość dnia: | 14 godzin lub naturalna długość dnia, w przypadku dnia dłuższego |
| --- | --- |
| Temperatura: | dzień: 21 do 24 °C,
  noc: 14 do 18 °C. |
| Wrażliwa odmiana pomidora: | »Moneymaker« |
| Wrażliwa odmiana oberżyny: | »Black Beauty« |
| Dostawcy: | patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main |

Długość dnia:

14 godzin lub naturalna długość dnia, w przypadku dnia dłuższego

Temperatura:

dzień: 21 do 24 °C,

noc: 14 do 18 °C.

Wrażliwa odmiana pomidora:

»Moneymaker«

Wrażliwa odmiana oberżyny:

»Black Beauty«

Dostawcy:

patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

LITERATURA

| 1. | Amann, R.I., L. Krumholz and D.A. Stahl. 1990. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology. J. Bacteriol. 172: 762-770. |
| --- | --- |

1.

Amann, R.I., L. Krumholz and D.A. Stahl. 1990. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology. J. Bacteriol. 172: 762-770.

| 2. | Anon. 1998. Council Directive 98/57/EC of 20 July 1998 on the control of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Official Journal of the European Communities L235, 1-39. |
| --- | --- |

2.

Anon. 1998. Council Directive 98/57/EC of 20 July 1998 on the control of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Official Journal of the European Communities L235, 1-39.

| 3. | Boudazin, G., A.C. Le Roux, K. Josi, P. Labarre and B. Jouan. 1999. Design of division specific primers of Ralstonia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology 105; 373-380. |
| --- | --- |

3.

Boudazin, G., A.C. Le Roux, K. Josi, P. Labarre and B. Jouan. 1999. Design of division specific primers of Ralstonia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology 105; 373-380.

| 4. | Caruso, P., Gorris, M.T., Cambra, M., Palomo, J.L., Collar, J and Lopez, M.M. 2002. Enrichment Double-Antibody Sandwich Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal Antibody for sensitive Detection of Ralstonia solanacearum in Asymptomatic Potato Tubers. Applied and Environmental Microbiology, 68, 3634-3638. |
| --- | --- |

4.

Caruso, P., Gorris, M.T., Cambra, M., Palomo, J.L., Collar, J and Lopez, M.M. 2002. Enrichment Double-Antibody Sandwich Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal Antibody for sensitive Detection of Ralstonia solanacearum in Asymptomatic Potato Tubers. Applied and Environmental Microbiology, 68, 3634-3638.

| 5. | Cook, D., Barlow, E. and Sequeira, L. 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphisms with DNA probes that specify virulence and the hypersensitive response. Molecular Plant-Microbe Interactions 1:113-121. |
| --- | --- |

5.

Cook, D., Barlow, E. and Sequeira, L. 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphisms with DNA probes that specify virulence and the hypersensitive response. Molecular Plant-Microbe Interactions 1:113-121.

| 6. | Elphinstone, J.G., Hennessy, J., Wilson, J.K. and Stead, D.E. 1996. Sensitivity of detection of Ralstonia solanacearum in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26; 663-678. |
| --- | --- |

6.

Elphinstone, J.G., Hennessy, J., Wilson, J.K. and Stead, D.E. 1996. Sensitivity of detection of Ralstonia solanacearum in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26; 663-678.

| 7. | Englebrecht, M.C. (1994) Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. In: A.C. Hayward (ed.) Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Australian Centre for International Agricultural Research, Canberra, Australia. |
| --- | --- |

7.

Englebrecht, M.C. (1994) Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. In: A.C. Hayward (ed.) Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Australian Centre for International Agricultural Research, Canberra, Australia.

| 8. | Hayward, A.C. 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27; 265-277. |
| --- | --- |

8.

Hayward, A.C. 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27; 265-277.

| 9. | Hayward, A.C., El-Nashaar, H.M., Nydegger, U. and De Lindo, L. 1990. Variation in nitrate metabolism in biovars of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 69; 269-280. |
| --- | --- |

9.

Hayward, A.C., El-Nashaar, H.M., Nydegger, U. and De Lindo, L. 1990. Variation in nitrate metabolism in biovars of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 69; 269-280.

| 10. | Ito, S., Y. Ushijima, T. Fujii, S. Tanaka, M. Kameya-Iwaki, S. Yoshiwara and F. Kishi. 1998. Detection of viable cells of Ralstonia solanacearum in soil using a semi-selective medium and a PCR technique. J. Phytopathology 146; 379-384. |
| --- | --- |

10.

Ito, S., Y. Ushijima, T. Fujii, S. Tanaka, M. Kameya-Iwaki, S. Yoshiwara and F. Kishi. 1998. Detection of viable cells of Ralstonia solanacearum in soil using a semi-selective medium and a PCR technique. J. Phytopathology 146; 379-384.

| 11. | Janse, J.D. (1988) A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 18, 343-351. |
| --- | --- |

11.

Janse, J.D. (1988) A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 18, 343-351.

| 12. | Janse, J.D. 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacaerum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335-345. |
| --- | --- |

12.

Janse, J.D. 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacaerum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335-345.

| 13. | Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity of Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 44; 693-695. |
| --- | --- |

13.

Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity of Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 44; 693-695.

| 14. | Klement Z.; Rudolph, K and D.C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp. |
| --- | --- |

14.

Klement Z.; Rudolph, K and D.C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp.

| 15. | Lelliott, R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd., Oxford. 216 pp. |
| --- | --- |

15.

Lelliott, R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd., Oxford. 216 pp.

| 16. | Lopez, M.M., Gorris, M.T., Llop, P., Cubero, J., Vicedo, B., Cambra, M., 1997. Selective enrichment improves selective isolation, serological and molecular detection of plant pathogenic bacteria. In: H.W. Dehne et al., (eds). Klewer Academic Publishers. pp. 117-121. |
| --- | --- |

16.

Lopez, M.M., Gorris, M.T., Llop, P., Cubero, J., Vicedo, B., Cambra, M., 1997. Selective enrichment improves selective isolation, serological and molecular detection of plant pathogenic bacteria. In: H.W. Dehne et al., (eds). Klewer Academic Publishers. pp. 117-121.

| 17. | Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1994. Specific genomic fingerprints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR. Applied and Environmental Microbiology, 60, 2286-2295. |
| --- | --- |

17.

Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1994. Specific genomic fingerprints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR. Applied and Environmental Microbiology, 60, 2286-2295.

| 18. | Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J. 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85; 528-536. |
| --- | --- |

18.

Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J. 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85; 528-536.

| 19. | Opina, N., F. Tavner, G. Holloway, J.-F Wang, T.-H Li, R. Maghirang, M. Fegan, A.C. Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W. Holloway, J.N. Timmis. 1997. A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 5; 19-33. |
| --- | --- |

19.

Opina, N., F. Tavner, G. Holloway, J.-F Wang, T.-H Li, R. Maghirang, M. Fegan, A.C. Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W. Holloway, J.N. Timmis. 1997. A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 5; 19-33.

| 20. | Pastrik, K.H. and Maiss, E. 2000. Detection of R. solanacearum in potato tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148; 619-626. |
| --- | --- |

20.

Pastrik, K.H. and Maiss, E. 2000. Detection of R. solanacearum in potato tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148; 619-626.

| 21. | Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831-842. |
| --- | --- |

21.

Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831-842.

| 22. | Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D. (1995) Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79. |
| --- | --- |

22.

Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D. (1995) Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79.

| 23. | Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. - 3. ed.; St. Paul, Minnesota: 373 pp. |
| --- | --- |

23.

Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. - 3. ed.; St. Paul, Minnesota: 373 pp.

| 24. | Seal, S.E., L.A. Jackson, J.P.W. Young, and M.J. Daniels. 1993. Detection of Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii and Blood Disease Bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. J. Gen. Microbiol. 139: 1587-1594. |
| --- | --- |

24.

Seal, S.E., L.A. Jackson, J.P.W. Young, and M.J. Daniels. 1993. Detection of Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii and Blood Disease Bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. J. Gen. Microbiol. 139: 1587-1594.

| 25. | Smith, J.J., Offord, L.C., Holderness, M. and Saddler, G.S. 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61; 4262-4268. |
| --- | --- |

25.

Smith, J.J., Offord, L.C., Holderness, M. and Saddler, G.S. 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61; 4262-4268.

| 26. | Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281-295. |
| --- | --- |

26.

Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281-295.

| 27. | Taghavi, M., Hayward, A.C., Sly, L.I., Fegan, M. 1996. Analysiss of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46; 10-15. |
| --- | --- |

27.

Taghavi, M., Hayward, A.C., Sly, L.I., Fegan, M. 1996. Analysiss of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46; 10-15.

| 28. | Van Der Wolf, J.M., Bonants, P.J.M., Smith, J.J., Hagenaar, M., Nijhuis, E., Van Beckhoven, J.R.C., Saddler, G.S., Trigalet, A., Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 in Western Europe as determined by AFLP, RC-PFGE and rep-PCR. In: Prior, P., Allen, C. and Elphinstone, J. (eds.) Bacterial wilt disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 44-49. |
| --- | --- |

28.

Van Der Wolf, J.M., Bonants, P.J.M., Smith, J.J., Hagenaar, M., Nijhuis, E., Van Beckhoven, J.R.C., Saddler, G.S., Trigalet, A., Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 in Western Europe as determined by AFLP, RC-PFGE and rep-PCR. In: Prior, P., Allen, C. and Elphinstone, J. (eds.) Bacterial wilt disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 44-49.

| 29. | Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., Stead, D.E. and Boonham, N. 1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an automated and quantitative flourogenic 5’ nuclease TaqMan assay. Applied and Environmental Microbiology 66; 2853-2858. |
| --- | --- |

29.

Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., Stead, D.E. and Boonham, N. 1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an automated and quantitative flourogenic 5’ nuclease TaqMan assay. Applied and Environmental Microbiology 66; 2853-2858.

| 30. | Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A.D.L. Akkermans. 1998. Detection of R. solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4546-4554. |
| --- | --- |

30.

Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A.D.L. Akkermans. 1998. Detection of R. solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4546-4554.

ZAŁĄCZNIK III

| 1. | We wszystkich przypadkach podejrzenia wystąpienia organizmu, gdy uzyskano pozytywny wynik badania przesiewowego dla wyszczególnionego materiału roślinnego i dla innych przypadków, stosując właściwą metodę określoną w załączniku II, gdy oczekuje się na potwierdzenie lub wykluczenie wyniku po zakończeniu stosowanych badań, należy we właściwy sposób zachować i zabezpieczyć:






  — | wszystkie próby bulw oraz, gdy tylko jest to możliwe, wszystkie próby roślin, |
| --- | --- | --- |

1.

We wszystkich przypadkach podejrzenia wystąpienia organizmu, gdy uzyskano pozytywny wynik badania przesiewowego dla wyszczególnionego materiału roślinnego i dla innych przypadków, stosując właściwą metodę określoną w załączniku II, gdy oczekuje się na potwierdzenie lub wykluczenie wyniku po zakończeniu stosowanych badań, należy we właściwy sposób zachować i zabezpieczyć:

—

wszystkie próby bulw oraz, gdy tylko jest to możliwe, wszystkie próby roślin,

| — | wszelkie pozostałe ekstrakty oraz przygotowany do badań przesiewowych materiał, np. szkiełka do immunofluorescencji, oraz
  wszelkie stosowne dokumenty |
| --- | --- |

—

wszelkie pozostałe ekstrakty oraz przygotowany do badań przesiewowych materiał, np. szkiełka do immunofluorescencji, oraz

wszelkie stosowne dokumenty

| — | aż do zakończenia opisywanych badań. |
| --- | --- |

—

aż do zakończenia opisywanych badań.

Zatrzymanie bulw umożliwi wykonanie różnorodnych badań, w razie wystąpienia takiej potrzeby.

| 2. | W przypadku potwierdzenia wystąpienia organizmu należy zachować i we właściwy sposób zabezpieczyć:






  — | materiał wyszczególniony w pkt. 1,
  oraz |
| --- | --- | --- |

2.

W przypadku potwierdzenia wystąpienia organizmu należy zachować i we właściwy sposób zabezpieczyć:

—

materiał wyszczególniony w pkt. 1,

oraz

| — | próbę zainfekowanego materiału z pomidora lub oberżyny zainokulowanej ekstraktem z bulwy lub rośliny, tam gdzie stosowne, a także
  kulturę wyizolowanego organizmu. |
| --- | --- |

—

próbę zainfekowanego materiału z pomidora lub oberżyny zainokulowanej ekstraktem z bulwy lub rośliny, tam gdzie stosowne, a także

kulturę wyizolowanego organizmu.

| — | przez co najmniej jeden miesiąc po procedurze powiadomienia, zgodnie z art. 5 ust. 2. |
| --- | --- |

—

przez co najmniej jeden miesiąc po procedurze powiadomienia, zgodnie z art. 5 ust. 2.

ZAŁĄCZNIK IV

Elementy składające się na postępowanie, do których odnosi się art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt i) obejmują odpowiednio:

| i) | miejsca produkcji:






  — | gdzie są lub były uprawiane rośliny ziemniaka, które są klonalnie spokrewnione z roślinami ziemniaka porażonymi przez organizm, |
| --- | --- | --- |

i)

miejsca produkcji:

—

gdzie są lub były uprawiane rośliny ziemniaka, które są klonalnie spokrewnione z roślinami ziemniaka porażonymi przez organizm,

| — | gdzie są lub były uprawiane rośliny pomidora, które pochodzą z tego samego źródła, co rośliny pomidora porażone przez organizm, |
| --- | --- |

—

gdzie są lub były uprawiane rośliny pomidora, które pochodzą z tego samego źródła, co rośliny pomidora porażone przez organizm,

| — | gdzie są lub były uprawiane rośliny ziemniaka lub pomidora, które zostały objęte urzędową kontrolą w związku z podejrzeniem wystąpienia organizmu, |
| --- | --- |

—

gdzie są lub były uprawiane rośliny ziemniaka lub pomidora, które zostały objęte urzędową kontrolą w związku z podejrzeniem wystąpienia organizmu,

| — | gdzie są lub były uprawiane rośliny ziemniaka, które są klonalnie spokrewnione z roślinami ziemniaka rosnącymi w miejscach produkcji porażonych organizmem, |
| --- | --- |

—

gdzie są lub były uprawiane rośliny ziemniaka, które są klonalnie spokrewnione z roślinami ziemniaka rosnącymi w miejscach produkcji porażonych organizmem,

| — | gdzie są uprawiane rośliny ziemniaka lub pomidora, zlokalizowane w pobliżu porażonych miejsc produkcji, łącznie z takimi miejscami produkcji, w których wspólnie był lub jest, bezpośrednio lub pośrednio, użytkowany sprzęt lub urządzenia, |
| --- | --- |

—

gdzie są uprawiane rośliny ziemniaka lub pomidora, zlokalizowane w pobliżu porażonych miejsc produkcji, łącznie z takimi miejscami produkcji, w których wspólnie był lub jest, bezpośrednio lub pośrednio, użytkowany sprzęt lub urządzenia,

| — | w których stosuje się do nawadniania lub opryskiwania wody powierzchniowe ze źródła, o którym wiadomo lub podejrzewa się, że zostało skażone organizmem, |
| --- | --- |

—

w których stosuje się do nawadniania lub opryskiwania wody powierzchniowe ze źródła, o którym wiadomo lub podejrzewa się, że zostało skażone organizmem,

| — | w których wykorzystuje się te same wody powierzchniowe do nawadniania lub opryskiwania, co w porażonych lub podejrzanych o porażenie organizmem miejscach produkcji, |
| --- | --- |

—

w których wykorzystuje się te same wody powierzchniowe do nawadniania lub opryskiwania, co w porażonych lub podejrzanych o porażenie organizmem miejscach produkcji,

| — | które są lub były zalewane wodami powierzchniowymi, o których wiadomo, lub podejrzewa się, że zostały skażone organizmem; |
| --- | --- |

—

które są lub były zalewane wodami powierzchniowymi, o których wiadomo, lub podejrzewa się, że zostały skażone organizmem;

oraz

| ii) | wody powierzchniowe, stosowane do nawadniania lub opryskiwania, lub takie wody, które zalewają pole(-a) lub miejsce(-a) produkcji, o których wiadomo, że zostały porażone organizmem. |
| --- | --- |

ii)

wody powierzchniowe, stosowane do nawadniania lub opryskiwania, lub takie wody, które zalewają pole(-a) lub miejsce(-a) produkcji, o których wiadomo, że zostały porażone organizmem.

ZAŁĄCZNIK V

| 1. | Elementy brane pod uwagę w celu określenia zasięgu prawdopodobnego porażenia, na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt iii) oraz 5 ust. 1 lit. c) ppkt iii), obejmują:






  — | wyszczególniony materiał roślinny rosnący w miejscu produkcji, uznanym za porażone na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt ii), |
| --- | --- | --- |

1.

Elementy brane pod uwagę w celu określenia zasięgu prawdopodobnego porażenia, na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt iii) oraz 5 ust. 1 lit. c) ppkt iii), obejmują:

—

wyszczególniony materiał roślinny rosnący w miejscu produkcji, uznanym za porażone na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt ii),

| — | miejsce(-a) produkcji związane w jakikolwiek sposób z produkcją wyszczególnionego materiału roślinnego, uznanego za porażony, na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt ii), łącznie z tymi miejscami, w których wspólnie był lub jest, bezpośrednio lub pośrednio, użytkowany sprzęt lub urządzenia, |
| --- | --- |

—

miejsce(-a) produkcji związane w jakikolwiek sposób z produkcją wyszczególnionego materiału roślinnego, uznanego za porażony, na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt ii), łącznie z tymi miejscami, w których wspólnie był lub jest, bezpośrednio lub pośrednio, użytkowany sprzęt lub urządzenia,

| — | wyszczególniony materiał roślinny, wytworzony w miejscu(-ach) produkcji, do których odnosi się poprzednie tiret, lub obecny w takim miejscu(ach) produkcji, w okresie, gdy wyszczególniony materiał roślinny, uznany za porażony na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt ii), był obecny w miejscu produkcji, do którego odnosi się tiret pierwsze, |
| --- | --- |

—

wyszczególniony materiał roślinny, wytworzony w miejscu(-ach) produkcji, do których odnosi się poprzednie tiret, lub obecny w takim miejscu(ach) produkcji, w okresie, gdy wyszczególniony materiał roślinny, uznany za porażony na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt ii), był obecny w miejscu produkcji, do którego odnosi się tiret pierwsze,

| — | miejsca, w których znajdował się wyszczególniony materiał roślinny, pochodzący z miejsc produkcji omawianych w powyższych tiret, |
| --- | --- |

—

miejsca, w których znajdował się wyszczególniony materiał roślinny, pochodzący z miejsc produkcji omawianych w powyższych tiret,

| — | wszelkie maszyny, urządzenia, sprzęt, pojazdy, pojemniki, magazyny, lub ich części, a także wszelkie inne przedmioty, łącznie z materiałami używanymi do pakowania, które mogły mieć kontakt z wyszczególnionym materiałem roślinnym uznanym za porażony, na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt ii), |
| --- | --- |

—

wszelkie maszyny, urządzenia, sprzęt, pojazdy, pojemniki, magazyny, lub ich części, a także wszelkie inne przedmioty, łącznie z materiałami używanymi do pakowania, które mogły mieć kontakt z wyszczególnionym materiałem roślinnym uznanym za porażony, na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt ii),

| — | cały wyszczególniony materiał roślinny, przechowywany, lub będący w kontakcie, z wszelkimi obiektami lub przedmiotami, wyszczególnionymi w poprzednim tiret, przed ich oczyszczeniem i zdezynfekowaniem, |
| --- | --- |

—

cały wyszczególniony materiał roślinny, przechowywany, lub będący w kontakcie, z wszelkimi obiektami lub przedmiotami, wyszczególnionymi w poprzednim tiret, przed ich oczyszczeniem i zdezynfekowaniem,

| — | w wyniku postępowania i badań, na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt i), w przypadku ziemniaka, bulwy lub rośliny pochodzące z tego samego rozmnożenia klonalnego (powiązane siostrzanie lub matecznie), a w przypadku pomidora, rośliny pochodzące z tego samego źródła, co wyszczególniony materiał roślinny, uznany za porażony na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt ii), i w przypadku którego istnieje prawdopodobieństwo porażenia ze względu na pokrewieństwo klonalne, pomimo uzyskania negatywnych wyników badań. Celem identyfikacji porażonych i klonalnie spokrewnionych bulw lub roślin, można zastosować testowanie odmian, |
| --- | --- |

—

w wyniku postępowania i badań, na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt i), w przypadku ziemniaka, bulwy lub rośliny pochodzące z tego samego rozmnożenia klonalnego (powiązane siostrzanie lub matecznie), a w przypadku pomidora, rośliny pochodzące z tego samego źródła, co wyszczególniony materiał roślinny, uznany za porażony na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt ii), i w przypadku którego istnieje prawdopodobieństwo porażenia ze względu na pokrewieństwo klonalne, pomimo uzyskania negatywnych wyników badań. Celem identyfikacji porażonych i klonalnie spokrewnionych bulw lub roślin, można zastosować testowanie odmian,

| — | miejsce(-a) produkcji wyszczególnionego materiału roślinnego, przedstawione w poprzednim tiret, |
| --- | --- |

—

miejsce(-a) produkcji wyszczególnionego materiału roślinnego, przedstawione w poprzednim tiret,

| — | miejsce(-a) produkcji wyszczególnionego materiału roślinnego, w którym stosuje się do nawadniania lub opryskiwania wodę, która została uznana za skażoną, na mocy art. 5 ust. 1 lit. c) ppkt ii), |
| --- | --- |

—

miejsce(-a) produkcji wyszczególnionego materiału roślinnego, w którym stosuje się do nawadniania lub opryskiwania wodę, która została uznana za skażoną, na mocy art. 5 ust. 1 lit. c) ppkt ii),

| — | wyszczególniony materiał roślinny, produkowany na polach zalewanych wodami powierzchniowymi, uznanymi za skażone. |
| --- | --- |

—

wyszczególniony materiał roślinny, produkowany na polach zalewanych wodami powierzchniowymi, uznanymi za skażone.

| 2. | Elementy brane pod uwagę w celu ustalenia zasięgu możliwego rozprzestrzeniania się organizmu, na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt iv) oraz art. 5 ust. 1 lit. c) ppkt iii) obejmują:






  i) | w przypadkach objętych art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt iv):






  — | bliskość innych miejsc produkcji wyszczególnionego materiału roślinnego, |
| --- | --- | --- | --- |

2.

Elementy brane pod uwagę w celu ustalenia zasięgu możliwego rozprzestrzeniania się organizmu, na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt iv) oraz art. 5 ust. 1 lit. c) ppkt iii) obejmują:

i)

w przypadkach objętych art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt iv):

—

bliskość innych miejsc produkcji wyszczególnionego materiału roślinnego,

| — | wspólną produkcję i używanie tego samego materiału wyjściowego sadzeniaka ziemniaka, |
| --- | --- |

—

wspólną produkcję i używanie tego samego materiału wyjściowego sadzeniaka ziemniaka,

| — | miejsca produkcji, w których wykorzystuje się wody powierzchniowe do nawadniania lub opryskiwania wyszczególnionego materiału roślinnego, w przypadkach, gdy istnieje ryzyko, że wody te spłynęły, lub zalewały miejsca(-ch) produkcji, uznane za porażone na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) punkt ii). |
| --- | --- |

—

miejsca produkcji, w których wykorzystuje się wody powierzchniowe do nawadniania lub opryskiwania wyszczególnionego materiału roślinnego, w przypadkach, gdy istnieje ryzyko, że wody te spłynęły, lub zalewały miejsca(-ch) produkcji, uznane za porażone na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) punkt ii).

| ii) | w przypadkach gdy wody powierzchniowe zostały uznane za skażone, na mocy art. 5 ust. 1 lit. c) ppkt ii):






  — | miejsce(-a) produkcji wyszczególnionego materiału roślinnego, sąsiadujące lub narażone na ryzyko zalania przez wody powierzchniowe uznane za skażone, |
| --- | --- | --- |

ii)

w przypadkach gdy wody powierzchniowe zostały uznane za skażone, na mocy art. 5 ust. 1 lit. c) ppkt ii):

—

miejsce(-a) produkcji wyszczególnionego materiału roślinnego, sąsiadujące lub narażone na ryzyko zalania przez wody powierzchniowe uznane za skażone,

| — | dowolne, oddzielnie umiejscowione zbiorniki nawadniające, łączące się z wodą uznaną za skażoną, |
| --- | --- |

—

dowolne, oddzielnie umiejscowione zbiorniki nawadniające, łączące się z wodą uznaną za skażoną,

| — | jakikolwiek odosobniony zbiornik irygacyjny połączony z wodami powierzchniowymi uznanymi za skażone, z uwzględnieniem:






  — | kierunku i natężenia przepływu wody uznanej za skażoną, |
| --- | --- | --- |

—

jakikolwiek odosobniony zbiornik irygacyjny połączony z wodami powierzchniowymi uznanymi za skażone, z uwzględnieniem:

—

kierunku i natężenia przepływu wody uznanej za skażoną,

| — | obecności dzikich żywicielskich roślin z rodziny psiankowatych. |
| --- | --- |

—

obecności dzikich żywicielskich roślin z rodziny psiankowatych.

| 3. | Informacje zawarte w powiadomieniu, wskazanym w art. 5 ust. 2, obejmują:






  — | natychmiast po potwierdzeniu obecności organizmu na podstawie badania laboratoryjnego, przy wykorzystaniu metod określonych w załączniku II, przynajmniej:






  — | dla ziemniaków:






  a) | nazwę odmiany dla każdej partii; |
| --- | --- | --- | --- | --- |

3.

Informacje zawarte w powiadomieniu, wskazanym w art. 5 ust. 2, obejmują:

—

natychmiast po potwierdzeniu obecności organizmu na podstawie badania laboratoryjnego, przy wykorzystaniu metod określonych w załączniku II, przynajmniej:

—

dla ziemniaków:

a)

nazwę odmiany dla każdej partii;

| b) | typ (sadzeniaki, ziemniaki inne niż sadzeniaki, itp.) oraz, tam, gdzie właściwe, kategorię dla sadzeniaków ziemniaka, |
| --- | --- |

b)

typ (sadzeniaki, ziemniaki inne niż sadzeniaki, itp.) oraz, tam, gdzie właściwe, kategorię dla sadzeniaków ziemniaka,

| — | dla roślin pomidorów – nazwę odmiany dla każdej partii oraz, tam gdzie właściwe, kategorię, |
| --- | --- |

—

dla roślin pomidorów – nazwę odmiany dla każdej partii oraz, tam gdzie właściwe, kategorię,

| — | bez uszczerbku dla wymogów odnośnie powiadamiania o podejrzewanym wystąpieniu w art. 4 ust. 3, państwo członkowskie, w którym potwierdzono występowanie, w sytuacji, w której istnieje ryzyko porażenia objętego wykazem materiału roślinnego z innego lub w innym państwie członkowskim, natychmiast przekaże zainteresowanemu państwu członkowskiemu informacje konieczne dla zapewnienia zgodności z art. 5 ust. 3, takie jak:






  a) | nazwa odmiany partii ziemniaka lub pomidora; |
| --- | --- | --- |

—

bez uszczerbku dla wymogów odnośnie powiadamiania o podejrzewanym wystąpieniu w art. 4 ust. 3, państwo członkowskie, w którym potwierdzono występowanie, w sytuacji, w której istnieje ryzyko porażenia objętego wykazem materiału roślinnego z innego lub w innym państwie członkowskim, natychmiast przekaże zainteresowanemu państwu członkowskiemu informacje konieczne dla zapewnienia zgodności z art. 5 ust. 3, takie jak:

a)

nazwa odmiany partii ziemniaka lub pomidora;

| b) | nazwa i adres wysyłającego i odbiorcy; |
| --- | --- |

b)

nazwa i adres wysyłającego i odbiorcy;

| c) | data dostawy partii ziemniaków lub pomidorów; |
| --- | --- |

c)

data dostawy partii ziemniaków lub pomidorów;

| d) | wielkość dostarczonej partii ziemniaków lub pomidorów; |
| --- | --- |

d)

wielkość dostarczonej partii ziemniaków lub pomidorów;

| e) | kopia paszportu roślin lub przynajmniej jego numer, tam gdzie ma to zastosowanie, lub, tam gdzie ma to zastosowanie, numer rejestracyjny producenta lub handlowca i kopia dokumentu dostawczego. |
| --- | --- |

e)

kopia paszportu roślin lub przynajmniej jego numer, tam gdzie ma to zastosowanie, lub, tam gdzie ma to zastosowanie, numer rejestracyjny producenta lub handlowca i kopia dokumentu dostawczego.

Komisja zostanie natychmiast powiadomiona o dostarczeniu takich informacji.

| 4. | Szczegółowe informacje zawarte w dodatkowym powiadomieniu, przedstawionym w art. 5 ust. 2 akapit drugi, obejmują:
  po zakończeniu postępowania, dla każdego przypadku:






  a) | datę potwierdzenia porażenia; |
| --- | --- | --- |

4.

Szczegółowe informacje zawarte w dodatkowym powiadomieniu, przedstawionym w art. 5 ust. 2 akapit drugi, obejmują:

po zakończeniu postępowania, dla każdego przypadku:

a)

datę potwierdzenia porażenia;

| b) | krótki opis postępowania prowadzonego w celu określenia źródła i zasięgu możliwego rozprzestrzenienia się porażenia, łącznie z informacją o poziomie próbobrania; |
| --- | --- |

b)

krótki opis postępowania prowadzonego w celu określenia źródła i zasięgu możliwego rozprzestrzenienia się porażenia, łącznie z informacją o poziomie próbobrania;

| c) | informacje na temat rozpoznanych lub podejrzewanych źródeł(-a) porażenia; |
| --- | --- |

c)

informacje na temat rozpoznanych lub podejrzewanych źródeł(-a) porażenia;

| d) | szczegółowe informacje na temat określonego zasięgu porażenia, wraz z liczbą miejsc produkcji, a w przypadku ziemniaków liczbą partii ze wskazaniem odmiany oraz, w przypadku sadzeniaków, kategorii; |
| --- | --- |

d)

szczegółowe informacje na temat określonego zasięgu porażenia, wraz z liczbą miejsc produkcji, a w przypadku ziemniaków liczbą partii ze wskazaniem odmiany oraz, w przypadku sadzeniaków, kategorii;

| e) | szczegółowe informacje na temat wyznaczonej strefy, wraz z liczbą miejsc produkcji, nieoznaczonych jako porażone, lecz znajdujących się w tej strefie; |
| --- | --- |

e)

szczegółowe informacje na temat wyznaczonej strefy, wraz z liczbą miejsc produkcji, nieoznaczonych jako porażone, lecz znajdujących się w tej strefie;

| f) | szczegółowe informacje na temat wyznaczonych wód, wraz z nazwą i lokalizacją zbiornika wodnego i wyznaczonym zasięgiem/zakazem nawadniania; |
| --- | --- |

f)

szczegółowe informacje na temat wyznaczonych wód, wraz z nazwą i lokalizacją zbiornika wodnego i wyznaczonym zasięgiem/zakazem nawadniania;

| g) | w przypadku wszelkich przesyłek lub partii roślin pomidora uznanych za porażone – świadectwa zalecane w art. 13 ust. 1 ppkt ii) dyrektywy 2000/29/WE oraz numer paszportu, zgodnie z wykazem przedstawionym w załączniku V, część A sekcja I.2.2 do dyrektywy 2000/29/WE; |
| --- | --- |

g)

w przypadku wszelkich przesyłek lub partii roślin pomidora uznanych za porażone – świadectwa zalecane w art. 13 ust. 1 ppkt ii) dyrektywy 2000/29/WE oraz numer paszportu, zgodnie z wykazem przedstawionym w załączniku V, część A sekcja I.2.2 do dyrektywy 2000/29/WE;

| h) | inne informacje dotyczące potwierdzonego przypadku wystąpienia, jakich może zażądać Komisja. |
| --- | --- |

h)

inne informacje dotyczące potwierdzonego przypadku wystąpienia, jakich może zażądać Komisja.

ZAŁĄCZNIK VI

| 1. | Przepisy, o których mowa w art. 6 ust. 1, obejmują:






  — | zastosowanie jako pasza dla zwierząt po uprzedniej obróbce cieplnej, która zabezpieczy przed ryzykiem przeżycia organizmu,
  lub |
| --- | --- | --- |

1.

Przepisy, o których mowa w art. 6 ust. 1, obejmują:

—

zastosowanie jako pasza dla zwierząt po uprzedniej obróbce cieplnej, która zabezpieczy przed ryzykiem przeżycia organizmu,

lub

| — | złożenie na urzędowo zatwierdzonym specjalnym składowisku odpadów, gdzie nie istnieje możliwe do zidentyfikowania ryzyko przedostania się organizmu do środowiska np. poprzez przesączanie na użytki rolne lub kontakt ze źródłami wody, która mogłaby być wykorzystywana do nawadniania użytków rolnych,
  lub |
| --- | --- |

—

złożenie na urzędowo zatwierdzonym specjalnym składowisku odpadów, gdzie nie istnieje możliwe do zidentyfikowania ryzyko przedostania się organizmu do środowiska np. poprzez przesączanie na użytki rolne lub kontakt ze źródłami wody, która mogłaby być wykorzystywana do nawadniania użytków rolnych,

lub

| — | spalenie,
  lub |
| --- | --- |

—

spalenie,

lub

| — | przetwórstwo przemysłowe, poprzez bezpośrednie i natychmiastowe przesłanie do zakładu przetwórczego posiadającego urzędowo zaakceptowane urządzenia do utylizacji odpadów, dla których ustalono, że nie występuje możliwe do zidentyfikowania ryzyko rozprzestrzeniania się organizmu wraz z systemem oczyszczania i dezynfekcji przynajmniej pojazdów wyjeżdżających,
  lub |
| --- | --- |

—

przetwórstwo przemysłowe, poprzez bezpośrednie i natychmiastowe przesłanie do zakładu przetwórczego posiadającego urzędowo zaakceptowane urządzenia do utylizacji odpadów, dla których ustalono, że nie występuje możliwe do zidentyfikowania ryzyko rozprzestrzeniania się organizmu wraz z systemem oczyszczania i dezynfekcji przynajmniej pojazdów wyjeżdżających,

lub

| — | podjęcie innych środków, pod warunkiem, że nie niosą one ze sobą możliwego do zidentyfikowania ryzyka rozprzestrzeniania się organizmu; o tych środkach wraz z ich uzasadnieniem należy powiadamiać Komisję i pozostałe państwa członkowskie. |
| --- | --- |

—

podjęcie innych środków, pod warunkiem, że nie niosą one ze sobą możliwego do zidentyfikowania ryzyka rozprzestrzeniania się organizmu; o tych środkach wraz z ich uzasadnieniem należy powiadamiać Komisję i pozostałe państwa członkowskie.

Jakiekolwiek pozostałe odpady powstałe w wyniku wyżej opisanych procedur należy usuwać za pomocą urzędowo zatwierdzonych metod zgodnie z załącznikiem VII do niniejszej dyrektywy.

| 2. | Właściwe wykorzystanie lub składowanie wyszczególnionego materiału roślinnego, o którym mowa w art. 6 ust. 2, pod kontrolą właściwych organów urzędowych danego(-ych) państwa(-w) członkowskiego(-ich), przy zapewnieniu właściwej komunikacji pomiędzy tymi organami w celu utrzymania stałego poziomu kontroli oraz przy akceptacji właściwych organów państwa członkowskiego, w którym ziemniaki są pakowane lub przetwarzane, w związku z wymienionymi w pierwszym i drugim tiret urządzeniami do usuwania odpadów, obejmuje:






  i) | w stosunku do bulw ziemniaka:






  — | wykorzystanie ich jako ziemniaki inne niż sadzeniaki przeznaczone do konsumpcji, pakowane jako gotowe do bezpośredniej dostawy i zastosowania bez przepakowywania w miejscach, w których są urządzenia przeznaczone do usuwania odpadów. Ziemniaki przeznaczone do sadzenia można przetwarzać lub przechowywać w tym samym miejscu tylko wówczas, jeśli odbywa się to w oddzieleniu lub po oczyszczeniu i dezynfekcji,
  lub |
| --- | --- | --- | --- |

2.

Właściwe wykorzystanie lub składowanie wyszczególnionego materiału roślinnego, o którym mowa w art. 6 ust. 2, pod kontrolą właściwych organów urzędowych danego(-ych) państwa(-w) członkowskiego(-ich), przy zapewnieniu właściwej komunikacji pomiędzy tymi organami w celu utrzymania stałego poziomu kontroli oraz przy akceptacji właściwych organów państwa członkowskiego, w którym ziemniaki są pakowane lub przetwarzane, w związku z wymienionymi w pierwszym i drugim tiret urządzeniami do usuwania odpadów, obejmuje:

i)

w stosunku do bulw ziemniaka:

—

wykorzystanie ich jako ziemniaki inne niż sadzeniaki przeznaczone do konsumpcji, pakowane jako gotowe do bezpośredniej dostawy i zastosowania bez przepakowywania w miejscach, w których są urządzenia przeznaczone do usuwania odpadów. Ziemniaki przeznaczone do sadzenia można przetwarzać lub przechowywać w tym samym miejscu tylko wówczas, jeśli odbywa się to w oddzieleniu lub po oczyszczeniu i dezynfekcji,

lub

| — | wykorzystanie ich jako ziemniaki inne niż sadzeniaki, przeznaczone do przetwórstwa przemysłowego oraz przeznaczone do bezpośredniej i natychmiastowej dostawy do zakładu przetwórczego, wyposażonego w odpowiednie urządzenia do usuwania odpadów oraz system oczyszczania i dezynfekcji przynajmniej pojazdów wyjeżdżających,
  lub |
| --- | --- |

—

wykorzystanie ich jako ziemniaki inne niż sadzeniaki, przeznaczone do przetwórstwa przemysłowego oraz przeznaczone do bezpośredniej i natychmiastowej dostawy do zakładu przetwórczego, wyposażonego w odpowiednie urządzenia do usuwania odpadów oraz system oczyszczania i dezynfekcji przynajmniej pojazdów wyjeżdżających,

lub

| — | inne sposoby wykorzystania lub usunięcia, pod warunkiem że ustalono, iż nie istnieje możliwe do zidentyfikowania ryzyko rozprzestrzeniania się organizmu i po uzyskaniu akceptacji właściwych organów urzędowych; |
| --- | --- |

—

inne sposoby wykorzystania lub usunięcia, pod warunkiem że ustalono, iż nie istnieje możliwe do zidentyfikowania ryzyko rozprzestrzeniania się organizmu i po uzyskaniu akceptacji właściwych organów urzędowych;

| ii) | w odniesieniu do innych części roślin, łącznie z łodygą oraz resztkami liści:






  — | zniszczenie,
  lub |
| --- | --- | --- |

ii)

w odniesieniu do innych części roślin, łącznie z łodygą oraz resztkami liści:

—

zniszczenie,

lub

| — | inny sposób wykorzystania lub usunięcia, pod warunkiem że nie niesie on ze sobą możliwego do zidentyfikowania ryzyka rozprzestrzeniania się organizmu; oraz po uzyskaniu akceptacji wyżej wymienionych właściwych organów urzędowych. |
| --- | --- |

—

inny sposób wykorzystania lub usunięcia, pod warunkiem że nie niesie on ze sobą możliwego do zidentyfikowania ryzyka rozprzestrzeniania się organizmu; oraz po uzyskaniu akceptacji wyżej wymienionych właściwych organów urzędowych.

| 3. | Właściwymi metodami odkażania przedmiotów lub obiektów, określonych w art. 6 ust. 3, jest oczyszczanie oraz – w przypadkach uzasadnionych – dezynfekcja, tak aby nie powstało możliwe do zidentyfikowania ryzyko rozprzestrzeniania się organizmu. Metody te należy stosować pod nadzorem właściwych organów urzędowych państw członkowskich. |
| --- | --- |

3.

Właściwymi metodami odkażania przedmiotów lub obiektów, określonych w art. 6 ust. 3, jest oczyszczanie oraz – w przypadkach uzasadnionych – dezynfekcja, tak aby nie powstało możliwe do zidentyfikowania ryzyko rozprzestrzeniania się organizmu. Metody te należy stosować pod nadzorem właściwych organów urzędowych państw członkowskich.

| 4. | Szereg środków, które państwa członkowskie wprowadzą w wyznaczonej strefie(-ach), na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt iv) oraz art. 5 ust. 1 lit. c) ppkt iii), określonych w art. 6 ust. 4, obejmuje: |
| --- | --- |

4.

Szereg środków, które państwa członkowskie wprowadzą w wyznaczonej strefie(-ach), na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt iv) oraz art. 5 ust. 1 lit. c) ppkt iii), określonych w art. 6 ust. 4, obejmuje:

| 4.1. | W miejscach produkcji uznanych za porażone, na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt ii):






  a) | na polu lub w miejscu uprawy pod osłonami, które na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt ii) zostało oznaczone jako porażone, albo:






  i) | w ciągu co najmniej czterech lat uprawy, następujących po stwierdzeniu porażenia,






  — | podjęte zostaną środki, prowadzące do wyeliminowania samosiewów ziemniaka oraz pomidora, a także innych roślin żywicielskich dla organizmu, łącznie z chwastami z rodziny psiankowatych,
  oraz |
| --- | --- | --- | --- | --- |

4.1.

W miejscach produkcji uznanych za porażone, na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt ii):

a)

na polu lub w miejscu uprawy pod osłonami, które na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt ii) zostało oznaczone jako porażone, albo:

i)

w ciągu co najmniej czterech lat uprawy, następujących po stwierdzeniu porażenia,

—

podjęte zostaną środki, prowadzące do wyeliminowania samosiewów ziemniaka oraz pomidora, a także innych roślin żywicielskich dla organizmu, łącznie z chwastami z rodziny psiankowatych,

oraz

| — | zakazuje się sadzenia:






  — | bulw, roślin i nasion ziemniaka, |
| --- | --- | --- |

—

zakazuje się sadzenia:

—

bulw, roślin i nasion ziemniaka,

| — | roślin i nasion pomidora, |
| --- | --- |

—

roślin i nasion pomidora,

| — | uwzględniając biologię organizmu, |
| --- | --- |

—

uwzględniając biologię organizmu,

| — | innych roślin żywicielskich, |
| --- | --- |

—

innych roślin żywicielskich,

| — | roślin z rodzaju Brassica, w stosunku do których istnieje zidentyfikowane ryzyko przetrwania tego organizmu. |
| --- | --- |

—

roślin z rodzaju Brassica, w stosunku do których istnieje zidentyfikowane ryzyko przetrwania tego organizmu.

| — | innych roślin, dla których istnieje możliwe do zidentyfikowania ryzyko rozprzestrzeniania się organizmu, |
| --- | --- |

—

innych roślin, dla których istnieje możliwe do zidentyfikowania ryzyko rozprzestrzeniania się organizmu,

| — | w pierwszym sezonie uprawy ziemniaka lub pomidora, następującym po okresie opisanym w poprzednim tiret, jeżeli sprawdzono w czasie urzędowych kontroli, że na polu nie ma ani samosiewów ziemniaka lub pomidora, ani innych roślin żywicielskich organizmu, łącznie z chwastami z rodziny psiankowatych, przez dwa kolejne lata uprawy przed sadzeniem,






  — | w przypadku ziemniaka zezwala się na produkcję jedynie ziemniaków innych niż sadzeniaki, |
| --- | --- | --- |

—

w pierwszym sezonie uprawy ziemniaka lub pomidora, następującym po okresie opisanym w poprzednim tiret, jeżeli sprawdzono w czasie urzędowych kontroli, że na polu nie ma ani samosiewów ziemniaka lub pomidora, ani innych roślin żywicielskich organizmu, łącznie z chwastami z rodziny psiankowatych, przez dwa kolejne lata uprawy przed sadzeniem,

—

w przypadku ziemniaka zezwala się na produkcję jedynie ziemniaków innych niż sadzeniaki,

| — | w przypadku ziemniaka i pomidora, zebrane bulwy ziemniaka lub rośliny pomidora, w odpowiednich przypadkach są badane zgodnie z procedurą opisaną w załączniku II; |
| --- | --- |

—

w przypadku ziemniaka i pomidora, zebrane bulwy ziemniaka lub rośliny pomidora, w odpowiednich przypadkach są badane zgodnie z procedurą opisaną w załączniku II;

| — | w sezonie uprawy ziemniaka lub pomidora, następującym bezpośrednio po sezonie, o którym mowa w poprzednim tiret, oraz po zastosowaniu właściwego zmianowania, które obejmuje co najmniej dwa lata, jeśli mają być uprawiane sadzeniaki ziemniaka, przeprowadza się urzędową kontrolę zgodnie z art. 2 ust. 1; |
| --- | --- |

—

w sezonie uprawy ziemniaka lub pomidora, następującym bezpośrednio po sezonie, o którym mowa w poprzednim tiret, oraz po zastosowaniu właściwego zmianowania, które obejmuje co najmniej dwa lata, jeśli mają być uprawiane sadzeniaki ziemniaka, przeprowadza się urzędową kontrolę zgodnie z art. 2 ust. 1;

albo

| ii) | podczas pięciu lat uprawy następujących po stwierdzeniu porażenia:






  — | powinny być podejmowane działania, zmierzające do eliminacji samosiewów ziemniaka oraz pomidora i innych naturalnie występujących roślin żywicielskich organizmu, łącznie z chwastami z rodziny psiankowatych,
  oraz |
| --- | --- | --- |

ii)

podczas pięciu lat uprawy następujących po stwierdzeniu porażenia:

—

powinny być podejmowane działania, zmierzające do eliminacji samosiewów ziemniaka oraz pomidora i innych naturalnie występujących roślin żywicielskich organizmu, łącznie z chwastami z rodziny psiankowatych,

oraz

| — | pole w ciągu pierwszych trzech lat należy: albo pozostawić odłogiem, albo uprawiać na nim zboża w zależności od ocenionego stopnia ryzyka, albo przeznaczyć na stałe pastwisko stosując częste niskie koszenie lub intensywny wypas, albo przeznaczyć na produkcję nasienną traw, po czym przez kolejne dwa lata uprawiać tam rośliny niebędące żywicielami organizmu i niestwarzające możliwego do zidentyfikowania ryzyka przetrwania lub rozprzestrzeniania się tego organizmu, |
| --- | --- |

—

pole w ciągu pierwszych trzech lat należy: albo pozostawić odłogiem, albo uprawiać na nim zboża w zależności od ocenionego stopnia ryzyka, albo przeznaczyć na stałe pastwisko stosując częste niskie koszenie lub intensywny wypas, albo przeznaczyć na produkcję nasienną traw, po czym przez kolejne dwa lata uprawiać tam rośliny niebędące żywicielami organizmu i niestwarzające możliwego do zidentyfikowania ryzyka przetrwania lub rozprzestrzeniania się tego organizmu,

| — | w pierwszym sezonie uprawy ziemniaka lub pomidora, następującym po okresie opisanym w poprzednim tiret, jeżeli sprawdzono w czasie urzędowych kontroli, że na polu nie ma ani samosiewów ziemniaka lub pomidora, ani innych roślin żywicielskich organizmu, łącznie z chwastami z rodziny psiankowatych, przez dwa kolejne lata uprawy przed sadzeniem:






  — | w przypadku ziemniaków dopuszcza się uprawę sadzeniaków ziemniaka lub innych ziemniaków, |
| --- | --- | --- |

—

w pierwszym sezonie uprawy ziemniaka lub pomidora, następującym po okresie opisanym w poprzednim tiret, jeżeli sprawdzono w czasie urzędowych kontroli, że na polu nie ma ani samosiewów ziemniaka lub pomidora, ani innych roślin żywicielskich organizmu, łącznie z chwastami z rodziny psiankowatych, przez dwa kolejne lata uprawy przed sadzeniem:

—

w przypadku ziemniaków dopuszcza się uprawę sadzeniaków ziemniaka lub innych ziemniaków,

| — | zbierane bulwy ziemniaka lub rośliny pomidora są badane zgodnie z procedurą opisaną w załączniku II; |
| --- | --- |

—

zbierane bulwy ziemniaka lub rośliny pomidora są badane zgodnie z procedurą opisaną w załączniku II;

| b) | na wszystkich pozostałych polach porażonego miejsca produkcji, pod warunkiem że właściwe organy urzędowe mają pewność, że wyeliminowane zostało ryzyko występowania samosiewów ziemniaków lub pomidorów i innych naturalnie występujących roślin żywicielskich organizmu łącznie z chwastami z rodziny psiankowatych:






  — | w roku uprawy następującym bezpośrednio po roku, w którym stwierdzono porażenie:






  — | nie uprawia się bulw, roślin ani nasion ziemniaka lub innych roślin żywicielskich organizmu,
  lub |
| --- | --- | --- | --- |

b)

na wszystkich pozostałych polach porażonego miejsca produkcji, pod warunkiem że właściwe organy urzędowe mają pewność, że wyeliminowane zostało ryzyko występowania samosiewów ziemniaków lub pomidorów i innych naturalnie występujących roślin żywicielskich organizmu łącznie z chwastami z rodziny psiankowatych:

—

w roku uprawy następującym bezpośrednio po roku, w którym stwierdzono porażenie:

—

nie uprawia się bulw, roślin ani nasion ziemniaka lub innych roślin żywicielskich organizmu,

lub

| — | w odniesieniu do bulw ziemniaka, sadzi się wyłącznie urzędowo kwalifikowane sadzeniaki ziemniaka, przeznaczone na ziemniaki inne niż sadzeniaki, |
| --- | --- |

—

w odniesieniu do bulw ziemniaka, sadzi się wyłącznie urzędowo kwalifikowane sadzeniaki ziemniaka, przeznaczone na ziemniaki inne niż sadzeniaki,

| — | w przypadku roślin pomidora mogą być uprawiane tylko rośliny pomidora uzyskane z nasion, które spełniają wymogi dyrektywy 2000/29/WE, z przeznaczeniem na produkcję owoców, |
| --- | --- |

—

w przypadku roślin pomidora mogą być uprawiane tylko rośliny pomidora uzyskane z nasion, które spełniają wymogi dyrektywy 2000/29/WE, z przeznaczeniem na produkcję owoców,

| — | w drugim roku uprawy następującym po roku, w którym stwierdzono porażenie:






  — | w odniesieniu do ziemniaków, można sadzić wyłącznie urzędowo kwalifikowane sadzeniaki ziemniaka lub ziemniaki urzędowo przebadane pod katem występowania organizmu, które były uprawiane pod kontrolą urzędową w miejscach produkcji inne niż te, o których mowa w pkt 4.1, z przeznaczeniem na sadzeniaki lub ziemniaki inne niż sadzeniaki, |
| --- | --- | --- |

—

w drugim roku uprawy następującym po roku, w którym stwierdzono porażenie:

—

w odniesieniu do ziemniaków, można sadzić wyłącznie urzędowo kwalifikowane sadzeniaki ziemniaka lub ziemniaki urzędowo przebadane pod katem występowania organizmu, które były uprawiane pod kontrolą urzędową w miejscach produkcji inne niż te, o których mowa w pkt 4.1, z przeznaczeniem na sadzeniaki lub ziemniaki inne niż sadzeniaki,

| — | w przypadku pomidorów można sadzić wyłącznie rośliny uzyskane z nasion, które spełniają wymogi dyrektywy 2000/29/WE lub w przypadku roślin rozmnażanych wegetatywnie, z roślin uzyskanych z takich nasion i rosnących pod urzędową kontrolą w miejscach produkcji innych niż te, o których mowa w pkt 4.1, z przeznaczeniem na produkcję roślin lub owoców, |
| --- | --- |

—

w przypadku pomidorów można sadzić wyłącznie rośliny uzyskane z nasion, które spełniają wymogi dyrektywy 2000/29/WE lub w przypadku roślin rozmnażanych wegetatywnie, z roślin uzyskanych z takich nasion i rosnących pod urzędową kontrolą w miejscach produkcji innych niż te, o których mowa w pkt 4.1, z przeznaczeniem na produkcję roślin lub owoców,

| — | przynajmniej przez trzeci rok uprawy następujący po roku w którym stwierdzono porażenie:






  — | w przypadku ziemniaków, można sadzić wyłącznie urzędowo kwalifikowane sadzeniaki ziemniaka lub ziemniaki, które były uprawiane pod urzędową kontrolą z urzędowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka, z przeznaczeniem na sadzeniaki lub ziemniaki inne niż sadzeniaki, |
| --- | --- | --- |

—

przynajmniej przez trzeci rok uprawy następujący po roku w którym stwierdzono porażenie:

—

w przypadku ziemniaków, można sadzić wyłącznie urzędowo kwalifikowane sadzeniaki ziemniaka lub ziemniaki, które były uprawiane pod urzędową kontrolą z urzędowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka, z przeznaczeniem na sadzeniaki lub ziemniaki inne niż sadzeniaki,

| — | w przypadku pomidorów, można sadzić wyłącznie rośliny uzyskane z nasion spełniających wymogi dyrektywy 2000/29/WE lub rośliny uzyskane pod urzędową kontrolą z takich roślin, z przeznaczeniem na produkcję roślin lub owoców, |
| --- | --- |

—

w przypadku pomidorów, można sadzić wyłącznie rośliny uzyskane z nasion spełniających wymogi dyrektywy 2000/29/WE lub rośliny uzyskane pod urzędową kontrolą z takich roślin, z przeznaczeniem na produkcję roślin lub owoców,

| — | w każdym roku uprawy, o którym mowa w poprzednich tiret, podejmuje się środki w celu wyeliminowania samosiewnych roślin ziemniaka i innych naturalnie występujących roślin żywicielskich organizmu jeśli zostanie stwierdzona ich obecność, oraz przeprowadza się urzędową kontrolę uprawy w odpowiednim czasie, a w przypadku każdego pola ziemniaków zebrane bulwy są badane zgodnie z procedurą opisaną w załączniku II; |
| --- | --- |

—

w każdym roku uprawy, o którym mowa w poprzednich tiret, podejmuje się środki w celu wyeliminowania samosiewnych roślin ziemniaka i innych naturalnie występujących roślin żywicielskich organizmu jeśli zostanie stwierdzona ich obecność, oraz przeprowadza się urzędową kontrolę uprawy w odpowiednim czasie, a w przypadku każdego pola ziemniaków zebrane bulwy są badane zgodnie z procedurą opisaną w załączniku II;

| c) | niezwłocznie po stwierdzeniu porażenia, na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt ii), a także po pierwszym kolejnym roku uprawy:






  — | wszelkie maszyny, urządzenia, sprzęt i miejsca przechowywania znajdujące się w miejscu produkcji oraz wykorzystywane do produkcji ziemniaka lub pomidora, są oczyszczone i w razie potrzeby, są poddawane dezynfekcji, przy użyciu właściwych metod, wyszczególnionych w ust. 3, |
| --- | --- | --- |

c)

niezwłocznie po stwierdzeniu porażenia, na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt ii), a także po pierwszym kolejnym roku uprawy:

—

wszelkie maszyny, urządzenia, sprzęt i miejsca przechowywania znajdujące się w miejscu produkcji oraz wykorzystywane do produkcji ziemniaka lub pomidora, są oczyszczone i w razie potrzeby, są poddawane dezynfekcji, przy użyciu właściwych metod, wyszczególnionych w ust. 3,

| — | urzędowe kontrole programów nawadniania i opryskiwania, łącznie z zakazem tych czynności, zostaną wprowadzone jako zabezpieczenie przed rozprzestrzenianiem się organizmu; |
| --- | --- |

—

urzędowe kontrole programów nawadniania i opryskiwania, łącznie z zakazem tych czynności, zostaną wprowadzone jako zabezpieczenie przed rozprzestrzenianiem się organizmu;

| d) | w miejscach uprawy pod osłonami uznanych za porażone na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt ii), w przypadkach, w których możliwa jest całkowita wymiana podłoża uprawowego:






  — | nie sadzi się bulw, roślin ani nasion ziemniaka, ani też nie uprawia się innych roślin żywicielskich organizmu, łącznie z roślinami i nasionami pomidora, dopóki dane miejsce nie zostanie poddane urzędowo uznanym środkom, prowadzącym do wyeliminowania organizmu i usunięcia pozostałości roślin żywicielskich, łącznie co najmniej z całkowitą wymianą podłoża uprawowego i oczyszczeniem, a w razie potrzeby, dezynfekcją tego miejsca oraz wszelkiego sprzętu, w wyniku czego właściwe organy urzędowe wyrażają zgodę na produkcję roślin ziemniaka lub pomidora,
  oraz |
| --- | --- | --- |

d)

w miejscach uprawy pod osłonami uznanych za porażone na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt ii), w przypadkach, w których możliwa jest całkowita wymiana podłoża uprawowego:

—

nie sadzi się bulw, roślin ani nasion ziemniaka, ani też nie uprawia się innych roślin żywicielskich organizmu, łącznie z roślinami i nasionami pomidora, dopóki dane miejsce nie zostanie poddane urzędowo uznanym środkom, prowadzącym do wyeliminowania organizmu i usunięcia pozostałości roślin żywicielskich, łącznie co najmniej z całkowitą wymianą podłoża uprawowego i oczyszczeniem, a w razie potrzeby, dezynfekcją tego miejsca oraz wszelkiego sprzętu, w wyniku czego właściwe organy urzędowe wyrażają zgodę na produkcję roślin ziemniaka lub pomidora,

oraz

| — | w przypadku produkcji ziemniaka odbywa się ona z wykorzystaniem urzędowo kwalifikowanego sadzeniaka ziemniaka, albo minibulw lub mikroroślin, pochodzących z przebadanych źródeł, |
| --- | --- |

—

w przypadku produkcji ziemniaka odbywa się ona z wykorzystaniem urzędowo kwalifikowanego sadzeniaka ziemniaka, albo minibulw lub mikroroślin, pochodzących z przebadanych źródeł,

| — | w przypadku produkcji pomidorów odbywa się ona z wykorzystaniem roślin uzyskanych z nasion, które spełniają wymogi dyrektywy 2000/29/WE, lub w wypadku roślin rozmnażanych wegetatywnie z roślin pomidora uzyskanych z takich nasion i rosnących pod urzędową kontrolą, |
| --- | --- |

—

w przypadku produkcji pomidorów odbywa się ona z wykorzystaniem roślin uzyskanych z nasion, które spełniają wymogi dyrektywy 2000/29/WE, lub w wypadku roślin rozmnażanych wegetatywnie z roślin pomidora uzyskanych z takich nasion i rosnących pod urzędową kontrolą,

| — | wprowadza się urzędowe kontrole programów nawadniania i opryskiwania, oraz – w razie potrzeby – ich zakaz, w celu zapobieżenia rozprzestrzenianiu się danego organizmu. |
| --- | --- |

—

wprowadza się urzędowe kontrole programów nawadniania i opryskiwania, oraz – w razie potrzeby – ich zakaz, w celu zapobieżenia rozprzestrzenianiu się danego organizmu.

| 4.2. | W obrębie wyznaczonej strefy, bez uszczerbku dla środków podjętych zgodnie z pkt 4.1, państwa członkowskie:






  a) | niezwłocznie po stwierdzeniu porażenia zapewniają oczyszczenie i dezynfekcję wszystkich maszyn, urządzeń, sprzętu i miejsc przechowywania związanych z produkcją ziemniaków lub pomidorów na takim terenie w odpowiedni sposób i przy użyciu właściwych metod zgodnie z pkt 3; |
| --- | --- | --- |

4.2.

W obrębie wyznaczonej strefy, bez uszczerbku dla środków podjętych zgodnie z pkt 4.1, państwa członkowskie:

a)

niezwłocznie po stwierdzeniu porażenia zapewniają oczyszczenie i dezynfekcję wszystkich maszyn, urządzeń, sprzętu i miejsc przechowywania związanych z produkcją ziemniaków lub pomidorów na takim terenie w odpowiedni sposób i przy użyciu właściwych metod zgodnie z pkt 3;

| b) | niezwłocznie i przez co najmniej trzy lata uprawy po stwierdzeniu porażenia:






  ba) | w przypadkach wyznaczenia strefy na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt iv):






  — | zapewniają nadzór, sprawowany przez właściwe organy urzędowe, miejsc produkcji, magazynowania, przeładunku lub innych miejsc związanych z bulwami ziemniaka lub pomidorami, łącznie z miejscami w których wspólnie użytkowane są maszyny, urządzenia, sprzęt do produkcji ziemniaka lub pomidora, |
| --- | --- | --- | --- |

b)

niezwłocznie i przez co najmniej trzy lata uprawy po stwierdzeniu porażenia:

ba)

w przypadkach wyznaczenia strefy na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt iv):

—

zapewniają nadzór, sprawowany przez właściwe organy urzędowe, miejsc produkcji, magazynowania, przeładunku lub innych miejsc związanych z bulwami ziemniaka lub pomidorami, łącznie z miejscami w których wspólnie użytkowane są maszyny, urządzenia, sprzęt do produkcji ziemniaka lub pomidora,

| — | wymagają sadzenia jedynie urzędowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka lub ziemniaków, uprawianych pod urzędową kontrolą w stosunku do wszystkich ziemniaków uprawianych w tej strefie, a także badania po zbiorze sadzeniaków uprawianych w miejscach produkcji określonych zgodnie z art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt iii) jako prawdopodobnie porażone, |
| --- | --- |

—

wymagają sadzenia jedynie urzędowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka lub ziemniaków, uprawianych pod urzędową kontrolą w stosunku do wszystkich ziemniaków uprawianych w tej strefie, a także badania po zbiorze sadzeniaków uprawianych w miejscach produkcji określonych zgodnie z art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt iii) jako prawdopodobnie porażone,

| — | wymagają separowania czynności w jakikolwiek sposób związanych ze zbiorem, przechowywaniem, przemieszczaniem, pakowaniem zebranych sadzeniaków ziemniaka, od takich czynności wykonywanych przy ziemniakach innych niż sadzeniaki, na terenie wszystkich miejsc w obrębie strefy lub zapewnienia systemu oczyszczania i, gdzie to stosowne, dezynfekcji, pomiędzy sadzeniakami i ziemniakami innymi niż sadzeniaki, |
| --- | --- |

—

wymagają separowania czynności w jakikolwiek sposób związanych ze zbiorem, przechowywaniem, przemieszczaniem, pakowaniem zebranych sadzeniaków ziemniaka, od takich czynności wykonywanych przy ziemniakach innych niż sadzeniaki, na terenie wszystkich miejsc w obrębie strefy lub zapewnienia systemu oczyszczania i, gdzie to stosowne, dezynfekcji, pomiędzy sadzeniakami i ziemniakami innymi niż sadzeniaki,

| — | wymagają, aby uprawiane były jedynie rośliny pomidora uzyskane z nasion, które spełniają wymogi dyrektywy 2000/29/WE, lub w przypadku roślin rozmnażanych wegetatywnie z roślin uzyskanych z takich nasion i rosnących pod urzędową kontrolą, we wszystkich uprawach pomidorów w strefie, |
| --- | --- |

—

wymagają, aby uprawiane były jedynie rośliny pomidora uzyskane z nasion, które spełniają wymogi dyrektywy 2000/29/WE, lub w przypadku roślin rozmnażanych wegetatywnie z roślin uzyskanych z takich nasion i rosnących pod urzędową kontrolą, we wszystkich uprawach pomidorów w strefie,

| — | przeprowadzają urzędowe kontrole, jak szczegółowo określono w art. 2 ust. 1; |
| --- | --- |

—

przeprowadzają urzędowe kontrole, jak szczegółowo określono w art. 2 ust. 1;

| bb) | w przypadkach uznania wód powierzchniowych za skażone na mocy art. 5 ust. 1 lit. c) ppkt ii) lub za drogę możliwego rozprzestrzeniania się organizmu, zgodnie z załącznikiem V pkt 2:






  — | prowadzą coroczną kontrolę we właściwym czasie, łącznie z pobraniem prób wód powierzchniowych oraz w odpowiednich przypadkach roślin żywicielskich z rodziny psiankowatych, rosnących w sąsiedztwie tych wód, oraz wykonują badania zgodnie z właściwymi metodami wymienionymi w załączniku II dla wyszczególnionego materiału roślinnego i w innych przypadkach, |
| --- | --- | --- |

bb)

w przypadkach uznania wód powierzchniowych za skażone na mocy art. 5 ust. 1 lit. c) ppkt ii) lub za drogę możliwego rozprzestrzeniania się organizmu, zgodnie z załącznikiem V pkt 2:

—

prowadzą coroczną kontrolę we właściwym czasie, łącznie z pobraniem prób wód powierzchniowych oraz w odpowiednich przypadkach roślin żywicielskich z rodziny psiankowatych, rosnących w sąsiedztwie tych wód, oraz wykonują badania zgodnie z właściwymi metodami wymienionymi w załączniku II dla wyszczególnionego materiału roślinnego i w innych przypadkach,

| — | przeprowadzają urzędowe kontrole programów nawadniania i opryskiwania, łącznie z zakazem stosowania wody uznanej za skażoną do nawadniania lub opryskiwania wyszczególnionego materiału roślinnego, oraz w miarę potrzeb, innych roślin żywicielskich, dla zapobieżenia rozprzestrzeniania się organizmu. Zakaz można zweryfikować na podstawie wyników wspominanych wyżej corocznych kontroli, a uznanie skażenia może zostać zniesione, jeśli właściwe organy urzędowe uznają, że wody powierzchniowe nie są skażone. Użycie wody podlegającej zakazowi może być dozwolone, pod urzędowym nadzorem, dla nawadniania i opryskiwania roślin żywicielskich, przy wykorzystaniu urzędowo zatwierdzonych technik eliminowania organizmu i zapobiegania jego rozprzestrzenianiu, |
| --- | --- |

—

przeprowadzają urzędowe kontrole programów nawadniania i opryskiwania, łącznie z zakazem stosowania wody uznanej za skażoną do nawadniania lub opryskiwania wyszczególnionego materiału roślinnego, oraz w miarę potrzeb, innych roślin żywicielskich, dla zapobieżenia rozprzestrzeniania się organizmu. Zakaz można zweryfikować na podstawie wyników wspominanych wyżej corocznych kontroli, a uznanie skażenia może zostać zniesione, jeśli właściwe organy urzędowe uznają, że wody powierzchniowe nie są skażone. Użycie wody podlegającej zakazowi może być dozwolone, pod urzędowym nadzorem, dla nawadniania i opryskiwania roślin żywicielskich, przy wykorzystaniu urzędowo zatwierdzonych technik eliminowania organizmu i zapobiegania jego rozprzestrzenianiu,

| — | w przypadkach stwierdzenia skażenia odpadów płynnych należy wprowadzić kontrole urzędowe usuwania odpadów stałych lub płynnych powstałych podczas przetwórstwa przemysłowego lub z miejsc pakowania, związanych z wyszczególnionym materiałem roślinnym, |
| --- | --- |

—

w przypadkach stwierdzenia skażenia odpadów płynnych należy wprowadzić kontrole urzędowe usuwania odpadów stałych lub płynnych powstałych podczas przetwórstwa przemysłowego lub z miejsc pakowania, związanych z wyszczególnionym materiałem roślinnym,

| c) | w miarę potrzeb ustanawiają program wymiany sadzeniaków ziemniaka w określonym czasie. |
| --- | --- |

c)

w miarę potrzeb ustanawiają program wymiany sadzeniaków ziemniaka w określonym czasie.

ZAŁĄCZNIK VII

Urzędowo zatwierdzone metody usuwania odpadów, określone w ust. 1 załącznika VI, są zgodne z następującymi przepisami, wykluczającymi możliwe do zidentyfikowania ryzyko rozprzestrzeniania się danego organizmu:

| i) | stałe odpady z przetwórstwa przemysłowego ziemniaka oraz pomidora (łącznie z odrzuconymi ziemniakami i pomidorami oraz z obierzynami ziemniaków) oraz wszelkie inne stałe odpady związane z ziemniakami lub pomidorami (w tym gleba, kamienie i inne resztki), powinny być utylizowane następująco:






  — | składowane na urzędowo zatwierdzonym specjalnym składowisku odpadów, gdzie nie istnieje możliwe do zidentyfikowania ryzyko przedostania się organizmu do środowiska, np. poprzez przesączanie na użytki rolne lub kontakt ze źródłami wody, która mogłaby być używana do ich nawadniania. Odpady należy przewieźć bezpośrednio na składowisko w warunkach wykluczających ryzyko ich rozniesienia się,
  lub |
| --- | --- | --- |

i)

stałe odpady z przetwórstwa przemysłowego ziemniaka oraz pomidora (łącznie z odrzuconymi ziemniakami i pomidorami oraz z obierzynami ziemniaków) oraz wszelkie inne stałe odpady związane z ziemniakami lub pomidorami (w tym gleba, kamienie i inne resztki), powinny być utylizowane następująco:

—

składowane na urzędowo zatwierdzonym specjalnym składowisku odpadów, gdzie nie istnieje możliwe do zidentyfikowania ryzyko przedostania się organizmu do środowiska, np. poprzez przesączanie na użytki rolne lub kontakt ze źródłami wody, która mogłaby być używana do ich nawadniania. Odpady należy przewieźć bezpośrednio na składowisko w warunkach wykluczających ryzyko ich rozniesienia się,

lub

| — | spalone,
  lub |
| --- | --- |

—

spalone,

lub

| — | usunięte za pomocą innych środków, pod warunkiem, że nie niosą one ze sobą możliwego do zidentyfikowania ryzyka rozprzestrzeniania się organizmu; Komisja i inne państwa członkowskie muszą być powiadomione o takich środkach; |
| --- | --- |

—

usunięte za pomocą innych środków, pod warunkiem, że nie niosą one ze sobą możliwego do zidentyfikowania ryzyka rozprzestrzeniania się organizmu; Komisja i inne państwa członkowskie muszą być powiadomione o takich środkach;

| ii) | w odniesieniu do odpadów płynnych: przed ich utylizacją, odpady płynne zawierające zawieszone cząstki stałe należy poddać filtrowaniu lub procesowi osiadania w celu usunięcia tych cząstek. Cząstki te należy usuwać jak określono w ppkt i).
  Następnie odpady płynne należy:






  — | podgrzewać w całej objętości do temperatury co najmniej 60 °C przez przynajmniej 30 minut przed ich usunięciem,
  lub |
| --- | --- | --- |

ii)

w odniesieniu do odpadów płynnych: przed ich utylizacją, odpady płynne zawierające zawieszone cząstki stałe należy poddać filtrowaniu lub procesowi osiadania w celu usunięcia tych cząstek. Cząstki te należy usuwać jak określono w ppkt i).

Następnie odpady płynne należy:

—

podgrzewać w całej objętości do temperatury co najmniej 60 °C przez przynajmniej 30 minut przed ich usunięciem,

lub

| — | za zgodą odpowiednich władz i pod urzędową kontrolą usunąć w taki sposób, by nie zaistniało możliwe do zidentyfikowania ryzyko, że odpady te wejdą w kontakt z glebą użytków rolnych lub ze źródłami wody, która mogłaby być użyta do ich nawadniania. Komisja i pozostałe państwa członkowskie są powiadamiane szczegółowo o przeprowadzonych działaniach. |
| --- | --- |

—

za zgodą odpowiednich władz i pod urzędową kontrolą usunąć w taki sposób, by nie zaistniało możliwe do zidentyfikowania ryzyko, że odpady te wejdą w kontakt z glebą użytków rolnych lub ze źródłami wody, która mogłaby być użyta do ich nawadniania. Komisja i pozostałe państwa członkowskie są powiadamiane szczegółowo o przeprowadzonych działaniach.

Opcje opisane w niniejszym załączniku stosuje się również w odniesieniu do odpadów powstałych podczas przetwarzania, przewożenia lub usuwania porażonych partii.

---

(1)  Patrz: Lelliott and Stead (1987)

1

(2)  Naukowcy będący osobami kontaktowymi: patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

2

(3)  Stosować jako standardowe szczepy referencyjne R. solanacearum biowar 2 (rasa 3).

3

R. solanacearum

(4)  Potencjalny szczep reagujący krzyżowo w badaniach serologicznych (IF i/lub ELISA) z antysurowicą poliklonalną.

4

(5)  Szczep, z którego można rozmnożyć produkt PCR w pewnych laboratoriach o podobnym rozmiarze do tego, jakiego się oczekuje przy użyciu specyficznych primerów OLI-1 oraz Y-2 (patrz: dodatek 6).

5

(6)  Prawdopodobna reakcja krzyżowa w większości badań, lecz znany z występowania tylko na bananach w Indonezji.

6

(7)  Do stosowania w przypadku metody ekstrakcji przez homogenizacji.

7

(8)  Metoda została zatwierdzona przy użyciu polimerazy Taq od Perkin Elmer (AmpliTaq) i Gibco BRL.

8

(9)  Metoda została zatwierdzona przy użyciu polimerazy Taq od Perkin Elmer (AmpliTaq) i Gibco BRL.

9

Uwaga: Pierwotnie zoptymalizowano dla termocyklera MJ Research PTC 200 z Gibco Taq Polymerase.

Uwaga:

Perkin Elmer AmpliTaq i bufor można również wykorzystać w tych samych stężeniach.

(10)  Metoda została zatwierdzona przy użyciu polimerazy Taq od Perkin Elmer (AmpliTaq) i Gibco BRL.

10

(11)  Stężenie primerów NS-5-F oraz NS-6-R zoptymalizowano do ekstrakcji części przystolonowych przy pomocy metody homogenizacji i oczyszczania DNA według Pastrik (2000) (Patrz: sekcja VI.A.6,1.a). Ponowna optymalizacja stężeń odczynnika będzie wymagana, jeśli zostanie użyta metoda ekstrakcji przez wstrząsanie lub inna metoda izolacji DNA.

11

(12)  Metoda została zatwierdzona przy użyciu polimerazy Taq z Perkin Elmer (AmpliTaq) i Gibco BRL.

12

(13)  Metoda została zatwierdzona przy użyciu polimerazy Taq z Perkin Elmer (AmpliTaq) i Gibco BRL.

13

---

| 27.7.2006 | PL | Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej | L 206/107 |
| --- | --- | --- | --- |

27.7.2006

PL

Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej

L 206/107

---

DYREKTYWA KOMISJI 2006/64/WE

z dnia 18 lipca 2006 r.

zmieniająca dyrektywę Rady 91/414/EWG w celu włączenia klopyralidu, cyprodynilu, fosetylu i trineksapaku jako substancji czynnych

(Tekst mający znaczenie dla EOG)

KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH,

uwzględniając Traktat ustanawiający Wspólnotę Europejską,

uwzględniając dyrektywę Rady 91/414/EWG z dnia 15 lipca 1991 r. dotyczącą wprowadzania do obrotu środków ochrony roślin (1), w szczególności jej art. 6 ust. 1,

a także mając na uwadze, co następuje:

| (1) | Rozporządzenia Komisji (WE) nr 451/2000 (2) i (WE) nr 703/2001 (3) określają szczegółowe zasady realizacji drugiego etapu programu pracy, o którym mowa w art. 8 ust. 2 dyrektywy 91/414/EWG, i ustanawiają wykaz substancji czynnych, które mają zostać poddane ocenie w celu ich ewentualnego włączenia do załącznika I do dyrektywy 91/414/EWG. Wykaz ten obejmuje klopyralid, cyprodynil, fosetyl i trineksapak. |
| --- | --- |

(1)

Rozporządzenia Komisji (WE) nr 451/2000 (2) i (WE) nr 703/2001 (3) określają szczegółowe zasady realizacji drugiego etapu programu pracy, o którym mowa w art. 8 ust. 2 dyrektywy 91/414/EWG, i ustanawiają wykaz substancji czynnych, które mają zostać poddane ocenie w celu ich ewentualnego włączenia do załącznika I do dyrektywy 91/414/EWG. Wykaz ten obejmuje klopyralid, cyprodynil, fosetyl i trineksapak.

| (2) | Wpływ tych substancji czynnych na zdrowie ludzi i środowisko naturalne został poddany ocenie zgodnie z przepisami ustanowionymi w rozporządzeniach (WE) nr 451/2000 i (WE) nr 703/2001 w odniesieniu do zakresów zastosowań proponowanych przez powiadamiającego. Ponadto w rozporządzeniach tych wyznaczono państwa członkowskie pełniące rolę sprawozdawców, które muszą przedłożyć odpowiednie sprawozdania z oceny i zalecenia Europejskiemu Urzędowi ds. Bezpieczeństwa Żywności (EFSA) zgodnie z art. 8 ust. 1 rozporządzenia (WE) nr 451/2000. W przypadku klopyralidu państwem członkowskim pełniącym rolę sprawozdawcy była Finlandia, a wszystkie istotne informacje przekazano dnia 2 grudnia 2003 r. W przypadku cyprodynilu i fosetylu państwem członkowskim pełniącym rolę sprawozdawcy była Francja, a wszystkie istotne informacje przekazano odpowiednio dnia 20 października 2003 r. W przypadku trineksapaku państwem członkowskim pełniącym rolę sprawozdawcy było Królestwo Niderlandów, a wszystkie istotne informacje przekazano dnia 7 listopada 2003 r. |
| --- | --- |

(2)

Wpływ tych substancji czynnych na zdrowie ludzi i środowisko naturalne został poddany ocenie zgodnie z przepisami ustanowionymi w rozporządzeniach (WE) nr 451/2000 i (WE) nr 703/2001 w odniesieniu do zakresów zastosowań proponowanych przez powiadamiającego. Ponadto w rozporządzeniach tych wyznaczono państwa członkowskie pełniące rolę sprawozdawców, które muszą przedłożyć odpowiednie sprawozdania z oceny i zalecenia Europejskiemu Urzędowi ds. Bezpieczeństwa Żywności (EFSA) zgodnie z art. 8 ust. 1 rozporządzenia (WE) nr 451/2000. W przypadku klopyralidu państwem członkowskim pełniącym rolę sprawozdawcy była Finlandia, a wszystkie istotne informacje przekazano dnia 2 grudnia 2003 r. W przypadku cyprodynilu i fosetylu państwem członkowskim pełniącym rolę sprawozdawcy była Francja, a wszystkie istotne informacje przekazano odpowiednio dnia 20 października 2003 r. W przypadku trineksapaku państwem członkowskim pełniącym rolę sprawozdawcy było Królestwo Niderlandów, a wszystkie istotne informacje przekazano dnia 7 listopada 2003 r.

| (3) | Sprawozdania z oceny zostały poddane wzajemnej weryfikacji przez państwa członkowskie i EFSA oraz przedstawione Komisji w dniu 14 grudnia 2005 r. w formie sprawozdań naukowych EFSA dotyczących klopyralidu, cyprodynilu, fosetylu i trineksapaku (4). Sprawozdania te zostały poddane przeglądowi przez państwa członkowskie i Komisję w ramach Stałego Komitetu ds. Łańcucha Żywnościowego i Zdrowia Zwierząt, a następnie przyjęte dnia 4 kwietnia 2006 r. w formie sprawozdania Komisji z przeglądu dotyczącego fosetylu i trineksapaku. |
| --- | --- |

(3)

Sprawozdania z oceny zostały poddane wzajemnej weryfikacji przez państwa członkowskie i EFSA oraz przedstawione Komisji w dniu 14 grudnia 2005 r. w formie sprawozdań naukowych EFSA dotyczących klopyralidu, cyprodynilu, fosetylu i trineksapaku (4). Sprawozdania te zostały poddane przeglądowi przez państwa członkowskie i Komisję w ramach Stałego Komitetu ds. Łańcucha Żywnościowego i Zdrowia Zwierząt, a następnie przyjęte dnia 4 kwietnia 2006 r. w formie sprawozdania Komisji z przeglądu dotyczącego fosetylu i trineksapaku.

| (4) | Na podstawie różnych przeprowadzonych badań okazało się, że można oczekiwać, iż środki ochrony roślin zawierające klopyralid, cyprodynil, fosetyl i trineksapak zasadniczo spełniają wymogi ustanowione w art. 5 ust. 1 lit. a) i b) dyrektywy 91/414/EWG, w szczególności w odniesieniu do zastosowań, które zostały zbadane przez Komisję i wyszczególnione w jej sprawozdaniach z przeglądu. Należy zatem włączyć te substancje czynne do załącznika I w celu zapewnienia we wszystkich państwach członkowskich możliwości udzielania zezwoleń w odniesieniu do środków ochrony roślin zawierających dane substancje czynne zgodnie z przepisami wymienionej dyrektywy. |
| --- | --- |

(4)

Na podstawie różnych przeprowadzonych badań okazało się, że można oczekiwać, iż środki ochrony roślin zawierające klopyralid, cyprodynil, fosetyl i trineksapak zasadniczo spełniają wymogi ustanowione w art. 5 ust. 1 lit. a) i b) dyrektywy 91/414/EWG, w szczególności w odniesieniu do zastosowań, które zostały zbadane przez Komisję i wyszczególnione w jej sprawozdaniach z przeglądu. Należy zatem włączyć te substancje czynne do załącznika I w celu zapewnienia we wszystkich państwach członkowskich możliwości udzielania zezwoleń w odniesieniu do środków ochrony roślin zawierających dane substancje czynne zgodnie z przepisami wymienionej dyrektywy.

| (5) | Bez uszczerbku dla tego ustalenia należy uzyskać dalsze informacje na temat pewnych szczegółowych kwestii dotyczących klopyralidu, cyprodynilu i fosetylu. Artykuł 6 ust. 1 dyrektywy 91/414//EWG stanowi, że włączenie substancji do załącznika I może podlegać pewnym warunkom. W związku z powyższym właściwe jest, aby klopyralid, cyprodynil i fosetyl zostały poddane dalszym badaniom w celu potwierdzenia niektórych aspektów oceny zagrożenia oraz aby powiadamiający przedstawili odnośne badania. |
| --- | --- |

(5)

Bez uszczerbku dla tego ustalenia należy uzyskać dalsze informacje na temat pewnych szczegółowych kwestii dotyczących klopyralidu, cyprodynilu i fosetylu. Artykuł 6 ust. 1 dyrektywy 91/414//EWG stanowi, że włączenie substancji do załącznika I może podlegać pewnym warunkom. W związku z powyższym właściwe jest, aby klopyralid, cyprodynil i fosetyl zostały poddane dalszym badaniom w celu potwierdzenia niektórych aspektów oceny zagrożenia oraz aby powiadamiający przedstawili odnośne badania.

| (6) | Należy przewidzieć rozsądny termin, jaki powinien upłynąć zanim substancja czynna zostanie włączona do załącznika I, żeby umożliwić państwom członkowskim i zainteresowanym stronom przygotowanie się do spełnienia nowych wymogów wynikających z włączenia. |
| --- | --- |

(6)

Należy przewidzieć rozsądny termin, jaki powinien upłynąć zanim substancja czynna zostanie włączona do załącznika I, żeby umożliwić państwom członkowskim i zainteresowanym stronom przygotowanie się do spełnienia nowych wymogów wynikających z włączenia.

| (7) | Nie naruszając określonych w dyrektywie 91/414/EWG obowiązków wynikających z włączenia substancji czynnej do załącznika I, państwa członkowskie powinny mieć sześć miesięcy od daty włączenia na dokonanie przeglądu istniejących zezwoleń dotyczących środków ochrony roślin zawierających klopyralid, cyprodynil, fosetyl i trineksapak w celu spełnienia wymogów ustanowionych w dyrektywie 91/414/EWG, w szczególności jej art. 13, oraz stosownych warunków określonych w załączniku I. Państwa członkowskie powinny odpowiednio zmienić, zastąpić lub cofnąć istniejące zezwolenia zgodnie z przepisami dyrektywy 91/414/EWG. W drodze odstępstwa od powyższego terminu należy przyznać więcej czasu na przedłożenie i ocenę pełnej dokumentacji wyszczególnionej w załączniku III dla każdego środka ochrony roślin i każdego zamierzonego zastosowania, zgodnie z jednolitymi zasadami ustanowionymi w dyrektywie 91/414/EWG. |
| --- | --- |

(7)

Nie naruszając określonych w dyrektywie 91/414/EWG obowiązków wynikających z włączenia substancji czynnej do załącznika I, państwa członkowskie powinny mieć sześć miesięcy od daty włączenia na dokonanie przeglądu istniejących zezwoleń dotyczących środków ochrony roślin zawierających klopyralid, cyprodynil, fosetyl i trineksapak w celu spełnienia wymogów ustanowionych w dyrektywie 91/414/EWG, w szczególności jej art. 13, oraz stosownych warunków określonych w załączniku I. Państwa członkowskie powinny odpowiednio zmienić, zastąpić lub cofnąć istniejące zezwolenia zgodnie z przepisami dyrektywy 91/414/EWG. W drodze odstępstwa od powyższego terminu należy przyznać więcej czasu na przedłożenie i ocenę pełnej dokumentacji wyszczególnionej w załączniku III dla każdego środka ochrony roślin i każdego zamierzonego zastosowania, zgodnie z jednolitymi zasadami ustanowionymi w dyrektywie 91/414/EWG.

| (8) | Doświadczenie zdobyte w wyniku wcześniejszych włączeń substancji czynnych ocenionych w ramach rozporządzenia Komisji (EWG) nr 3600/92 (5) do załącznika I do dyrektywy 91/414/EWG pokazuje, że mogą pojawić się trudności przy interpretacji obowiązków posiadaczy istniejących zezwoleń w odniesieniu do dostępu do danych. W celu uniknięcia dalszych trudności wydaje się zatem konieczne wyjaśnienie obowiązków państw członkowskich, a w szczególności obowiązku sprawdzenia, czy posiadacz zezwolenia ma dostęp do dokumentacji zgodnej z wymogami określonymi w załączniku II do wymienionej dyrektywy. Wyjaśnienie to nie nakłada jednak na państwa członkowskie ani na posiadaczy zezwoleń żadnych nowych obowiązków w porównaniu z dyrektywami przyjętymi do dnia dzisiejszego i zmieniającymi załącznik I. |
| --- | --- |

(8)

Doświadczenie zdobyte w wyniku wcześniejszych włączeń substancji czynnych ocenionych w ramach rozporządzenia Komisji (EWG) nr 3600/92 (5) do załącznika I do dyrektywy 91/414/EWG pokazuje, że mogą pojawić się trudności przy interpretacji obowiązków posiadaczy istniejących zezwoleń w odniesieniu do dostępu do danych. W celu uniknięcia dalszych trudności wydaje się zatem konieczne wyjaśnienie obowiązków państw członkowskich, a w szczególności obowiązku sprawdzenia, czy posiadacz zezwolenia ma dostęp do dokumentacji zgodnej z wymogami określonymi w załączniku II do wymienionej dyrektywy. Wyjaśnienie to nie nakłada jednak na państwa członkowskie ani na posiadaczy zezwoleń żadnych nowych obowiązków w porównaniu z dyrektywami przyjętymi do dnia dzisiejszego i zmieniającymi załącznik I.

| (9) | Należy zatem odpowiednio zmienić dyrektywę 91/414/EWG. |
| --- | --- |

(9)

Należy zatem odpowiednio zmienić dyrektywę 91/414/EWG.

| (10) | Środki przewidziane w niniejszej dyrektywie są zgodne z opinią Stałego Komitetu ds. Łańcucha Żywnościowego i Zdrowia Zwierząt, |
| --- | --- |

(10)

Środki przewidziane w niniejszej dyrektywie są zgodne z opinią Stałego Komitetu ds. Łańcucha Żywnościowego i Zdrowia Zwierząt,

PRZYJMUJE NINIEJSZĄ DYREKTYWĘ:

Artykuł 1

W załączniku I do dyrektywy 91/414/EWG wprowadza się zmiany zgodnie z załącznikiem do niniejszej dyrektywy.

Artykuł 2

Państwa członkowskie przyjmują i publikują przepisy ustawowe, wykonawcze i administracyjne niezbędne do wykonania niniejszej dyrektywy najpóźniej do dnia 31 października 2007 r. Państwa członkowskie niezwłocznie przekazują Komisji tekst tych przepisów oraz tabelę korelacji między tymi przepisami a niniejszą dyrektywą.

Państwa członkowskie stosują wspomniane przepisy od dnia 1 listopada 2007 r.

Przepisy przyjęte przez państwa członkowskie zawierają odesłanie do niniejszej dyrektywy lub odesłanie to towarzyszy ich urzędowej publikacji. Sposób dokonania takiego odesłania ustalany jest przez państwa członkowskie.

Artykuł 3

1.   Zgodnie z dyrektywą 91/414/EWG państwa członkowskie w miarę potrzeby odpowiednio zmieniają lub cofają istniejące zezwolenia dla środków ochrony roślin zawierających klopyralid, cyprodynil, fosetyl i trineksapak jako substancje czynne do dnia 31 października 2007 r.

Przed upływem tego terminu państwa członkowskie w szczególności zweryfikują, czy spełnione są warunki wymienione w załączniku I do wspomnianej dyrektywy dotyczące klopyralidu, cyprodynilu, fosetylu i trineksapaku, z wyjątkiem warunków określonych w części B pozycji odnoszącej się do tych substancji czynnych, oraz czy posiadacz zezwolenia zgodnie z warunkami ustanowionymi w art. 13 tej dyrektywy posiada dokumentację spełniającą wymogi załącznika II do wspomnianej dyrektywy lub dostęp do takiej dokumentacji.

2.   W drodze odstępstwa od ust. 1, państwa członkowskie dokonują ponownej oceny każdego dopuszczonego do obrotu środka ochrony roślin zawierającego klopyralid, cyprodynil, fosetyl lub trineksapak jako jedyną substancję czynną lub jako jedną z kilku substancji czynnych wyszczególnionych w załączniku I do dyrektywy 91/414/EWG najpóźniej do dnia 30 kwietnia 2007r. zgodnie z jednolitymi zasadami określonymi w załączniku VI do dyrektywy 91/414/EWG, na podstawie dokumentacji zgodnej z wymogami określonymi w załączniku III do wymienionej dyrektywy i z uwzględnieniem części B zapisów dotyczących klopyralidu, cyprodynilu, fosetylu i trineksapaku w załączniku I do wymienionej dyrektywy. Na podstawie powyższej oceny państwa członkowskie określają, czy środek spełnia warunki ustanowione w art. 4 ust. 1 lit. b), c), d) i e) dyrektywy 91/414/EWG.

Po dokonaniu tych ustaleń państwa członkowskie:

| a) | w przypadku środka zawierającego klopyralid, cyprodynil, fosetyl lub trineksapak jako jedyną substancję czynną, w razie potrzeby, zmieniają lub wycofują zezwolenie najpóźniej do dnia 30 kwietnia 2011 r.;
  lub |
| --- | --- |

a)

w przypadku środka zawierającego klopyralid, cyprodynil, fosetyl lub trineksapak jako jedyną substancję czynną, w razie potrzeby, zmieniają lub wycofują zezwolenie najpóźniej do dnia 30 kwietnia 2011 r.;

lub

| b) | w przypadku środka zawierającego klopyralid, cyprodynil, fosetyl lub trineksapak jako jedną z kilku substancji czynnych, w razie potrzeby, zmieniają lub wycofują zezwolenie do dnia 30 kwietnia 2011 r. lub w terminie określonym dla takiej zmiany lub wycofania we właściwej dyrektywie lub dyrektywach włączających odpowiednią substancję lub substancje do załącznika I do dyrektywy 91/414/EWG. Obowiązuje data późniejsza. |
| --- | --- |

b)

w przypadku środka zawierającego klopyralid, cyprodynil, fosetyl lub trineksapak jako jedną z kilku substancji czynnych, w razie potrzeby, zmieniają lub wycofują zezwolenie do dnia 30 kwietnia 2011 r. lub w terminie określonym dla takiej zmiany lub wycofania we właściwej dyrektywie lub dyrektywach włączających odpowiednią substancję lub substancje do załącznika I do dyrektywy 91/414/EWG. Obowiązuje data późniejsza.

Artykuł 4

Niniejsza dyrektywa wchodzi w życie z dniem 1 maja 2007 r.

Artykuł 5

Niniejsza dyrektywa skierowana jest do państw członkowskich.

Sporządzono w Brukseli, dnia 18 lipca 2006 r.

W imieniu Komisji

Markos KYPRIANOU

Członek Komisji

---

(1)  Dz.U. L 230 z 19.8.1991, str. 1. Dyrektywa ostatnio zmieniona dyrektywą Komisji 2006/45/WE (Dz.U. L 130 z 18.5.2006, str. 27).

1

(2)  Dz.U. L 55 z 29.2.2000, str. 25. Rozporządzenie ostatnio zmienione rozporządzeniem (WE) nr 1044/2003 (Dz.U. L 151 z 19.6.2003, str. 32).

2

(3)  Dz.U. L 98 z 7.4.2001, str. 6.

3

(4)  EFSA Scientific Report (2005) 50, 1–65, Conclusion regarding the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance clopyralid (Sprawozdanie naukowe EFSA (2005) 50, 1-65, Wnioski z przeglądu w ramach oceny zagrożeń stwarzanych przez pestycydy, dotyczącej substancji czynnej klopyralidu) (sfinalizowano: dnia 14 grudnia 2005 r.).

4

EFSA Scientific Report (2005) 51, 1–78, Conclusion regarding the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance cyprodinil (Sprawozdanie naukowe EFSA (2005) 51, 1-78, Wnioski z przeglądu w ramach oceny zagrożeń stwarzanych przez pestycydy, dotyczącej substancji czynnej cyprodynilu) (sfinalizowano: dnia 14 grudnia 2005 r.).

EFSA Scientific Report (2005) 54, 1–79, Conclusion regarding the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance fosethyl (Sprawozdanie naukowe EFSA (2005) 54, 1-79, Wnioski z przeglądu w ramach oceny zagrożeń stwarzanych przez pestycydy, dotyczącej substancji czynnej fosetylu) (sfinalizowano: dnia 14 grudnia 2005 r.).

EFSA Scientific Report (2005) 57, 1–70, Conclusion regarding the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance trinexapac (Sprawozdanie naukowe EFSA (2005) 57, 1-70, Wnioski z przeglądu w ramach oceny zagrożeń stwarzanych przez pestycydy, dotyczącej substancji czynnej trineksapaku) (sfinalizowano: dnia 14 grudnia 2005 r.).

(5)  Dz.U. L 366 z 15.12.1992, str. 10. Rozporządzenie ostatnio zmienione rozporządzeniem (WE) nr 2266/2000 (Dz.U. L 259 z 13.10.2000, str. 27).

5

---

ZAŁĄCZNIK

Na końcu tabeli w załączniku I do dyrektywy 91/414/WE dodaje się następującą pozycję:

| Nr | Nazwa zwyczajowa, numery identyfikacyjne | Nazwa IUPAC | Czystość (1) | Data wejścia w życie | Data wygaśnięcia włączenia | Przepisy szczegółowe |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| „131 | Klopyralid
  Nr CAS 1702-17-6
  Nr CIPAC 455 | kwas 3,6-dichloropirydyno-2-karboksylowy | ≥ 950 g/kg | 1 maja 2007 r. | 30 kwietnia 2017 r. | CZĘŚĆ A
  Zezwala się wyłącznie na stosowanie w charakterze środka chwastobójczego.
  CZĘŚĆ B
  Podczas oceniania wniosków dotyczących zezwolenia dla środków ochrony roślin zawierających klopyralid, w przypadku zastosowań innych niż zastosowanie w okresie wiosennym, państwa członkowskie zwrócą szczególną uwagę na kryteria zawarte w art. 4 ust. 1 lit. b) i sprawią, by wszelkie potrzebne dane i informacje zostały dostarczone przed udzieleniem takiego zezwolenia.
  W celu wprowadzenia w życie jednolitych zasad zawartych w załączniku VI należy uwzględnić wnioski ze sprawozdania z przeglądu dotyczącego klopyralidu, w szczególności jego dodatki I i II, w wersji sfinalizowanej przez Stały Komitet ds. Łańcucha Żywnościowego i Zdrowia Zwierząt w dniu 4 kwietnia 2006 r.
  W ramach ogólnej oceny państwa członkowskie muszą zwrócić szczególną uwagę na:






  — | ochronę roślin niebędących przedmiotem zwalczania i wód gruntowych w sytuacjach, w których są one podatne na zagrożenia. Warunki zezwolenia powinny obejmować środki służące zmniejszeniu ryzyka oraz w miarę potrzeby należy wprowadzić programy do sprawdzania możliwości skażenia wód gruntowych w strefach podatnych na zagrożenia. |

Nr

Nazwa zwyczajowa, numery identyfikacyjne

Nazwa IUPAC

Czystość (1)

Data wejścia w życie

Data wygaśnięcia włączenia

Przepisy szczegółowe

„131

Klopyralid

Nr CAS 1702-17-6

Nr CIPAC 455

kwas 3,6-dichloropirydyno-2-karboksylowy

≥ 950 g/kg

1 maja 2007 r.

30 kwietnia 2017 r.

CZĘŚĆ A

Zezwala się wyłącznie na stosowanie w charakterze środka chwastobójczego.

CZĘŚĆ B

Podczas oceniania wniosków dotyczących zezwolenia dla środków ochrony roślin zawierających klopyralid, w przypadku zastosowań innych niż zastosowanie w okresie wiosennym, państwa członkowskie zwrócą szczególną uwagę na kryteria zawarte w art. 4 ust. 1 lit. b) i sprawią, by wszelkie potrzebne dane i informacje zostały dostarczone przed udzieleniem takiego zezwolenia.

W celu wprowadzenia w życie jednolitych zasad zawartych w załączniku VI należy uwzględnić wnioski ze sprawozdania z przeglądu dotyczącego klopyralidu, w szczególności jego dodatki I i II, w wersji sfinalizowanej przez Stały Komitet ds. Łańcucha Żywnościowego i Zdrowia Zwierząt w dniu 4 kwietnia 2006 r.

W ramach ogólnej oceny państwa członkowskie muszą zwrócić szczególną uwagę na:

—

ochronę roślin niebędących przedmiotem zwalczania i wód gruntowych w sytuacjach, w których są one podatne na zagrożenia. Warunki zezwolenia powinny obejmować środki służące zmniejszeniu ryzyka oraz w miarę potrzeby należy wprowadzić programy do sprawdzania możliwości skażenia wód gruntowych w strefach podatnych na zagrożenia.

Państwa członkowskie powinny wystąpić o przedłożenie dalszych badań w celu potwierdzenia wyników na temat metabolizmu u zwierząt. Państwa członkowskie powinny sprawić, by powiadamiający, na wniosek których klopyralid został włączony do niniejszego załącznika, dostarczyli Komisji odnośne badania w ciągu dwóch lat od wejścia w życie niniejszej dyrektywy.

132

Cyprodynil

Nr CAS 121522-61-2

Nr CIPAC 511

fenyloamina 4-cyklopropylo-6-metylopirymidyno-2-ylu

≥ 980 g/kg

1 maja 2007 r.

30 kwietnia 2017 r.

CZĘŚĆ A

Zezwala się wyłącznie na stosowanie w charakterze środka grzybobójczego.

CZĘŚĆ B

W celu wprowadzenia w życie jednolitych zasad zawartych w załączniku VI należy uwzględnić wnioski ze sprawozdania z przeglądu dotyczącego cyprodynilu, w szczególności jego dodatki I i II, w wersji sfinalizowanej przez Stały Komitet ds. Łańcucha Żywnościowego i Zdrowia Zwierząt w dniu 4 kwietnia 2006 r.

W ramach ogólnej oceny państwa członkowskie:

| — | muszą zwrócić szczególną uwagę na bezpieczeństwo operatorów sprzętu i zapewnić umieszczanie w warunkach użytkowania zaleceń dotyczących stosowania odpowiedniego wyposażenia ochrony osobistej, |
| --- | --- |

—

muszą zwrócić szczególną uwagę na bezpieczeństwo operatorów sprzętu i zapewnić umieszczanie w warunkach użytkowania zaleceń dotyczących stosowania odpowiedniego wyposażenia ochrony osobistej,

| — | muszą zwrócić szczególną uwagę na ochronę ptaków, ssaków i organizmów wodnych. Warunki zezwolenia powinny, w miarę potrzeby, zawierać środki ograniczające zagrożenia, takie jak strefy buforowe. |
| --- | --- |

—

muszą zwrócić szczególną uwagę na ochronę ptaków, ssaków i organizmów wodnych. Warunki zezwolenia powinny, w miarę potrzeby, zawierać środki ograniczające zagrożenia, takie jak strefy buforowe.

Państwa członkowskie, których to dotyczy, powinny wystąpić o przedłożenie dalszych badań w celu potwierdzenia oceny zagrożenia dla ptaków i ssaków lub możliwej obecności pozostałości metabolitu CGA 304075 w żywności pochodzenia zwierzęcego. Państwa członkowskie powinny sprawić, by powiadamiający, na wniosek których cyprodynil został włączony do niniejszego załącznika, dostarczyli Komisji odnośne badania w ciągu dwóch lat od wejścia w życie niniejszej dyrektywy.

133

Fosetyl

Nr CAS 15845-66-6

Nr CIPAC 384

wodorofosfonian etylu

≥ 960 g/kg (wyrażona jako fosetyl Al)

1 maja 2007 r.

30 kwietnia 2017 r.

CZĘŚĆ A

Zezwala się wyłącznie na stosowanie w charakterze środka grzybobójczego.

CZĘŚĆ B

W celu wprowadzenia w życie jednolitych zasad zawartych w załączniku VI należy uwzględnić wnioski ze sprawozdania z przeglądu dotyczącego fosetylu, w szczególności jego dodatki I i II, w wersji sfinalizowanej przez Stały Komitet ds. Łańcucha Żywnościowego i Zdrowia Zwierząt w dniu 4 kwietnia 2006 r.

W ramach ogólnej oceny państwa członkowskie:

| — | muszą zwrócić szczególną uwagę na ochronę ptaków, ssaków, organizmów wodnych oraz stawonogów niebędących przedmiotem zwalczania. |
| --- | --- |

—

muszą zwrócić szczególną uwagę na ochronę ptaków, ssaków, organizmów wodnych oraz stawonogów niebędących przedmiotem zwalczania.

Warunki zezwolenia powinny w miarę potrzeby zawierać środki ograniczające zagrożenia, takie jak strefy buforowe.

Państwa członkowskie, których to dotyczy, powinny wystąpić o przedłożenie dalszych badań w celu potwierdzenia oceny zagrożenia dla stawonogów niebędących przedmiotem zwalczania, w szczególności w odniesieniu do odtwarzania populacji, oraz ssaków roślinożernych. Państwa członkowskie powinny sprawić, by powiadamiający, na wniosek którego fosetyl został włączony do niniejszego załącznika, dostarczył Komisji odnośne badania w ciągu dwóch lat od wejścia w życie niniejszej dyrektywy.

134

Trineksapak

Nr CAS 104273-73-6

Nr CIPAC 732

kwas 3,5-dioksocykloheksanowęglan 4-cyklopropylo-hydroksymetylenu (4-cyclopropyl-hydroxymethylene-3,5-dioxo-cyclohexanecarboxylic acid)

≥ 940g/kg (wyrażone jako trineksapak etylu)

1 maja 2007 r.

30 kwietnia 2017 r.

CZĘŚĆ A

Zezwala się wyłącznie na stosowanie w charakterze regulatora wzrostu roślin.

CZĘŚĆ B

W celu wprowadzenia w życie jednolitych zasad zawartych w załączniku VI należy uwzględnić wnioski ze sprawozdania z przeglądu dotyczącego trineksapaku, w szczególności jego dodatki I i II, w wersji sfinalizowanej przez Stały Komitet ds. Łańcucha Żywnościowego i Zdrowia Zwierząt w dniu 4 kwietnia 2006 r.

W ramach ogólnej oceny państwa członkowskie:

| — | muszą zwrócić szczególną uwagę na ochronę ptaków i ssaków. |
| --- | --- |

—

muszą zwrócić szczególną uwagę na ochronę ptaków i ssaków.

Warunki zezwolenia powinny w miarę potrzeby obejmować środki służące zmniejszeniu ryzyka.

---

(1)  Dodatkowe dane na temat identyfikacji i specyfikacji substancji czynnej znajdują się w sprawozdaniu z przeglądu.”

1

---