# Euroopan unionin L 206/2006

| | ISSN 1725-261X |
| --- | --- |
| Euroopan unionin
  virallinen lehti | L 206 |
| | |
| Suomenkielinen laitos | Lainsäädäntö | 49. vuosikerta27. heinäkuu 2006 |

ISSN 1725-261X

Euroopan unionin

virallinen lehti

L 206

Suomenkielinen laitos

Lainsäädäntö

49. vuosikerta27. heinäkuu 2006

---

| Sisältö | | I   Säädökset, jotka on julkaistava | Sivu |
| --- | --- | --- | --- |
| | * | Komission direktiivi 2006/60/EY, annettu 7 päivänä heinäkuuta 2006, direktiivin 90/642/ETY liitteiden muuttamisesta trifloksistrobiinin, thiabendatsolin, abamektiinin, benomyylin, karbendatsiimin, thiofanaattimetyylin, myklobutanyylin, glyfosaatin, trimetyylisulfoniumin, fenpropimorfin ja klormekvatin jäämien enimmäismäärien osalta (
  1
  ) | 1 |
| | * | Komission direktiivi 2006/61/EY, annettu 7 päivänä heinäkuuta 2006, neuvoston direktiivien 86/362/ETY, 86/363/ETY ja 90/642/ETY liitteiden muuttamisesta atratsiinin, atsinfossietyylin, syflutriinin, etefonin, fentionin, metamidofossin, metomyylin, parakvaatin ja triatsofossin jäämien enimmäismäärien osalta (
  1
  ) | 12 |
| | * | Komission direktiivi 2006/62/EY, annettu 12 päivänä heinäkuuta 2006, neuvoston direktiivien 76/895/ETY, 86/362/ETY, 86/363/ETY ja 90/642/ETY liitteiden muuttamisesta desmedifaamin, fenmedifaamin ja klorfenvinfossin jäämien enimmäismäärien osalta (
  1
  ) | 27 |
| | * | Komission direktiivi 2006/63/EY, annettu 14 päivänä heinäkuuta 2006, Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. -kasvintuhoojan torjunnasta annetun neuvoston direktiivin 98/57/EY liitteiden II–VII muuttamisesta | 36 |
| | * | Komission direktiivi 2006/64/EY, annettu 18 päivänä heinäkuuta 2006, neuvoston direktiivin 91/414/ETY muuttamisesta klopyralidin, syprodiniilin, fosetyylin ja trineksapakin sisällyttämiseksi siihen tehoaineina (
  1
  ) | 107 |

Sisältö

I   Säädökset, jotka on julkaistava

Sivu

*

Komission direktiivi 2006/60/EY, annettu 7 päivänä heinäkuuta 2006, direktiivin 90/642/ETY liitteiden muuttamisesta trifloksistrobiinin, thiabendatsolin, abamektiinin, benomyylin, karbendatsiimin, thiofanaattimetyylin, myklobutanyylin, glyfosaatin, trimetyylisulfoniumin, fenpropimorfin ja klormekvatin jäämien enimmäismäärien osalta (
  1
  )

1

1

*

Komission direktiivi 2006/61/EY, annettu 7 päivänä heinäkuuta 2006, neuvoston direktiivien 86/362/ETY, 86/363/ETY ja 90/642/ETY liitteiden muuttamisesta atratsiinin, atsinfossietyylin, syflutriinin, etefonin, fentionin, metamidofossin, metomyylin, parakvaatin ja triatsofossin jäämien enimmäismäärien osalta (
  1
  )

1

12

*

Komission direktiivi 2006/62/EY, annettu 12 päivänä heinäkuuta 2006, neuvoston direktiivien 76/895/ETY, 86/362/ETY, 86/363/ETY ja 90/642/ETY liitteiden muuttamisesta desmedifaamin, fenmedifaamin ja klorfenvinfossin jäämien enimmäismäärien osalta (
  1
  )

1

27

*

Komission direktiivi 2006/63/EY, annettu 14 päivänä heinäkuuta 2006, Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. -kasvintuhoojan torjunnasta annetun neuvoston direktiivin 98/57/EY liitteiden II–VII muuttamisesta

Ralstonia solanacearum

et al.

36

*

Komission direktiivi 2006/64/EY, annettu 18 päivänä heinäkuuta 2006, neuvoston direktiivin 91/414/ETY muuttamisesta klopyralidin, syprodiniilin, fosetyylin ja trineksapakin sisällyttämiseksi siihen tehoaineina (
  1
  )

1

107

| | |
| --- | --- |
| | (1)   ETA:n kannalta merkityksellinen teksti. |

---

(1)   ETA:n kannalta merkityksellinen teksti.

1

| FI | Säädökset, joiden otsikot on painettu laihalla kirjasintyypillä, ovat maatalouspolitiikan alaan kuuluvia juoksevien asioiden hoitoon liityviä säädöksiä, joiden voimassaoloaika on yleensä rajoitettu.
  Kaikkien muiden säädösten otsikot on painettu lihavalla kirjasintyypillä ja merkitty tähdellä. |
| --- | --- |

FI

Säädökset, joiden otsikot on painettu laihalla kirjasintyypillä, ovat maatalouspolitiikan alaan kuuluvia juoksevien asioiden hoitoon liityviä säädöksiä, joiden voimassaoloaika on yleensä rajoitettu.

Kaikkien muiden säädösten otsikot on painettu lihavalla kirjasintyypillä ja merkitty tähdellä.

---

I Säädökset, jotka on julkaistava

| 27.7.2006 | FI | Euroopan unionin virallinen lehti | L 206/1 |
| --- | --- | --- | --- |

27.7.2006

FI

Euroopan unionin virallinen lehti

L 206/1

---

KOMISSION DIREKTIIVI 2006/60/EY,

annettu 7 päivänä heinäkuuta 2006,

direktiivin 90/642/ETY liitteiden muuttamisesta trifloksistrobiinin, thiabendatsolin, abamektiinin, benomyylin, karbendatsiimin, thiofanaattimetyylin, myklobutanyylin, glyfosaatin, trimetyylisulfoniumin, fenpropimorfin ja klormekvatin jäämien enimmäismäärien osalta

(ETA:n kannalta merkityksellinen teksti)

EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka

ottaa huomioon Euroopan yhteisön perustamissopimuksen,

ottaa huomioon torjunta-ainejäämien enimmäismäärien vahvistamisesta tietyille kasvikunnasta peräisin oleville tuotteille, mukaan lukien hedelmät ja vihannekset, 27 päivänä marraskuuta 1990 annetun neuvoston direktiivin 90/642/ETY (1) ja erityisesti sen 7 artiklan,

ottaa huomioon kasvinsuojeluaineiden markkinoille saattamisesta 15 päivänä heinäkuuta 1991 annetun neuvoston direktiivin 91/414/ETY (2) ja erityisesti sen 4 artiklan 1 kohdan f alakohdan,

sekä katsoo seuraavaa:

| (1) | Direktiivin 91/414/ETY mukaan tiettyihin viljelykasveihin käytettävien kasvinsuojeluaineiden salliminen kuuluu jäsenvaltioiden vastuulle. Sallimisen on perustuttava ihmisten ja eläinten terveydelle ja ympäristölle aiheutuvien vaikutusten arviointiin. Arvioinnissa huomioon otettaviin tekijöihin on sisällyttävä käyttäjien ja sivullisten altistuminen, maaperään, vesiin ja ilmaan kohdistuvat ympäristövaikutukset sekä ihmisten ja eläinten nauttimien käsiteltyjen viljelykasvien torjunta-ainejäämien vaikutukset ihmisiin ja eläimiin. |
| --- | --- |

(1)

Direktiivin 91/414/ETY mukaan tiettyihin viljelykasveihin käytettävien kasvinsuojeluaineiden salliminen kuuluu jäsenvaltioiden vastuulle. Sallimisen on perustuttava ihmisten ja eläinten terveydelle ja ympäristölle aiheutuvien vaikutusten arviointiin. Arvioinnissa huomioon otettaviin tekijöihin on sisällyttävä käyttäjien ja sivullisten altistuminen, maaperään, vesiin ja ilmaan kohdistuvat ympäristövaikutukset sekä ihmisten ja eläinten nauttimien käsiteltyjen viljelykasvien torjunta-ainejäämien vaikutukset ihmisiin ja eläimiin.

| (2) | Jäämien enimmäismäärät vahvistetaan sen mukaan, mikä on kasveille tehokkaan suojan antava pienin mahdollinen määrä torjunta-ainetta käytettäessä sitä niin, että jäämä on mahdollisimman pieni sekä toksikologisesti hyväksyttävä etenkin arvioitaessa saantia ravinnon mukana. |
| --- | --- |

(2)

Jäämien enimmäismäärät vahvistetaan sen mukaan, mikä on kasveille tehokkaan suojan antava pienin mahdollinen määrä torjunta-ainetta käytettäessä sitä niin, että jäämä on mahdollisimman pieni sekä toksikologisesti hyväksyttävä etenkin arvioitaessa saantia ravinnon mukana.

| (3) | Direktiivin 90/642/ETY soveltamisalaan kuuluvien torjunta-ainejäämien enimmäismääriä on jatkuvasti seurattava, ja niitä voidaan muuttaa uusien tai muuttuneiden käyttötapojen huomioon ottamiseksi. Tietoja uusista tai muuttuneista käyttötavoista on ilmoitettu komissiolle, ja ne tulevat aiheuttamaan muutoksia trifloksistrobiinin, thiabendatsolin, abamektiinin, benomyyliryhmän (benomyyli, karbendatsiimi ja thiofanaattimetyyli), myklobutanyylin, glyfosaatin, trimetyylisulfoniumin ja fenpropimorfin jäämien enimmäismäärissä. |
| --- | --- |

(3)

Direktiivin 90/642/ETY soveltamisalaan kuuluvien torjunta-ainejäämien enimmäismääriä on jatkuvasti seurattava, ja niitä voidaan muuttaa uusien tai muuttuneiden käyttötapojen huomioon ottamiseksi. Tietoja uusista tai muuttuneista käyttötavoista on ilmoitettu komissiolle, ja ne tulevat aiheuttamaan muutoksia trifloksistrobiinin, thiabendatsolin, abamektiinin, benomyyliryhmän (benomyyli, karbendatsiimi ja thiofanaattimetyyli), myklobutanyylin, glyfosaatin, trimetyylisulfoniumin ja fenpropimorfin jäämien enimmäismäärissä.

| (4) | Klormekvatin osalta komissiolle on toimitettu tietoa, jonka perusteella vahvistetaan kolmeksi vuodeksi väliaikainen jäämien enimmäismäärä päärynöillä. |
| --- | --- |

(4)

Klormekvatin osalta komissiolle on toimitettu tietoa, jonka perusteella vahvistetaan kolmeksi vuodeksi väliaikainen jäämien enimmäismäärä päärynöillä.

| (5) | Kuluttajien elinikäinen altistuminen näille torjunta-aineille niiden jäämiä mahdollisesti sisältävien elintarvikkeiden välityksellä on arvioitu ja mitattu yhteisössä käytettävien menettelyiden ja käytäntöjen mukaisesti ottaen huomioon Maailman terveysjärjestön julkaisemat ohjeet (3). Tässä arvioinnissa otettiin huomioon, että abamektiiniä ja thiabendatsolia käytetään myös eläinlääkkeinä tuotantoeläimillä ja että kyseisten kahden aineen jäämien enimmäismäärät on vahvistettu neuvoston asetuksen (ETY) N:o 2377/90 (4) säännösten mukaisesti. Eri arviointien perusteella kyseisten torjunta-aineiden jäämien enimmäismäärät olisi vahvistettava sellaisiksi, ettei hyväksyttävä päiväsaanti ylity. |
| --- | --- |

(5)

Kuluttajien elinikäinen altistuminen näille torjunta-aineille niiden jäämiä mahdollisesti sisältävien elintarvikkeiden välityksellä on arvioitu ja mitattu yhteisössä käytettävien menettelyiden ja käytäntöjen mukaisesti ottaen huomioon Maailman terveysjärjestön julkaisemat ohjeet (3). Tässä arvioinnissa otettiin huomioon, että abamektiiniä ja thiabendatsolia käytetään myös eläinlääkkeinä tuotantoeläimillä ja että kyseisten kahden aineen jäämien enimmäismäärät on vahvistettu neuvoston asetuksen (ETY) N:o 2377/90 (4) säännösten mukaisesti. Eri arviointien perusteella kyseisten torjunta-aineiden jäämien enimmäismäärät olisi vahvistettava sellaisiksi, ettei hyväksyttävä päiväsaanti ylity.

| (6) | Benomyylin, karbendatsiimin, thiofanaattimetyylin, fenpropimorfin ja klormekvatin osalta akuutin altistumisen viiteannos on vahvistettu ja kuluttajien akuutti altistuminen tämän torjunta-aineen jäämiä mahdollisesti sisältävän kunkin elintarvikkeen välityksellä on arvioitu yhteisössä käytössä olevien menettelyiden ja käytäntöjen mukaisesti ottaen huomioon Maailman terveysjärjestön julkaisemat ohjeet. Kasveja käsittelevän tiedekomitean lausunnot, etenkin kuluttajien suojelua torjunta-aineilla käsiteltyjen elintarvikkeiden osalta koskevat neuvot ja suositukset (5), on otettu huomioon. Saantia ravinnon mukana koskevan arvioinnin perusteella kyseisten torjunta-aineiden jäämien enimmäismäärät olisi vahvistettava sellaisiksi, ettei akuutin altistumisen viiteannos ylity. Muita aineita koskevien käytettävissä olevien tietojen arviointi on osoittanut, että akuutin altistumisen viiteannosta ei ole tarpeen vahvistaa, eikä lyhyen aikavälin arviointia tämän vuoksi tarvita. |
| --- | --- |

(6)

Benomyylin, karbendatsiimin, thiofanaattimetyylin, fenpropimorfin ja klormekvatin osalta akuutin altistumisen viiteannos on vahvistettu ja kuluttajien akuutti altistuminen tämän torjunta-aineen jäämiä mahdollisesti sisältävän kunkin elintarvikkeen välityksellä on arvioitu yhteisössä käytössä olevien menettelyiden ja käytäntöjen mukaisesti ottaen huomioon Maailman terveysjärjestön julkaisemat ohjeet. Kasveja käsittelevän tiedekomitean lausunnot, etenkin kuluttajien suojelua torjunta-aineilla käsiteltyjen elintarvikkeiden osalta koskevat neuvot ja suositukset (5), on otettu huomioon. Saantia ravinnon mukana koskevan arvioinnin perusteella kyseisten torjunta-aineiden jäämien enimmäismäärät olisi vahvistettava sellaisiksi, ettei akuutin altistumisen viiteannos ylity. Muita aineita koskevien käytettävissä olevien tietojen arviointi on osoittanut, että akuutin altistumisen viiteannosta ei ole tarpeen vahvistaa, eikä lyhyen aikavälin arviointia tämän vuoksi tarvita.

| (7) | Jäämien enimmäismääriksi vahvistetaan analyysiherkkyyden alaraja, kun kasvinsuojeluaineiden sallitusta käytöstä ei aiheudu elintarvikkeisiin tai niiden pinnalle havaittavissa olevia torjunta-aineiden jäämiä tai kun sallittua käyttöä ei ole tai kun jäsenvaltioiden salliman käytön tukena ei ole ollut tarvittavia tietoja tai kun kolmansissa maissa käytön tukena ei ole ollut tarvittavia tietoja ja käytöstä on aiheutunut torjunta-aineiden jäämiä yhteisön markkinoille mahdollisesti tuleviin elintarvikkeisiin tai niiden pinnalle. |
| --- | --- |

(7)

Jäämien enimmäismääriksi vahvistetaan analyysiherkkyyden alaraja, kun kasvinsuojeluaineiden sallitusta käytöstä ei aiheudu elintarvikkeisiin tai niiden pinnalle havaittavissa olevia torjunta-aineiden jäämiä tai kun sallittua käyttöä ei ole tai kun jäsenvaltioiden salliman käytön tukena ei ole ollut tarvittavia tietoja tai kun kolmansissa maissa käytön tukena ei ole ollut tarvittavia tietoja ja käytöstä on aiheutunut torjunta-aineiden jäämiä yhteisön markkinoille mahdollisesti tuleviin elintarvikkeisiin tai niiden pinnalle.

| (8) | Siksi kyseessä oleville torjunta-aineille on aiheellista vahvistaa uudet jäämien enimmäismäärät. |
| --- | --- |

(8)

Siksi kyseessä oleville torjunta-aineille on aiheellista vahvistaa uudet jäämien enimmäismäärät.

| (9) | Jäämien väliaikaisten enimmäismäärien vahvistaminen tai muuttaminen yhteisön tasolla ei estä jäsenvaltioita vahvistamasta glyfosaatille, trimetyylisulfoniumille ja trifloksistrobiinille väliaikaista jäämien enimmäismäärää direktiivin 91/414/ETY 4 artiklan 1 kohdan f alakohdan ja liitteen VI mukaisesti. Neljää vuotta pidetään riittävänä ajanjaksona, jonka kuluessa kyseisten aineiden tulevat käyttötarkoitukset voidaan vahvistaa. Tämän jälkeen yhteisössä vahvistetun jäämien väliaikaisen enimmäismäärän pitäisi muuttua lopulliseksi. |
| --- | --- |

(9)

Jäämien väliaikaisten enimmäismäärien vahvistaminen tai muuttaminen yhteisön tasolla ei estä jäsenvaltioita vahvistamasta glyfosaatille, trimetyylisulfoniumille ja trifloksistrobiinille väliaikaista jäämien enimmäismäärää direktiivin 91/414/ETY 4 artiklan 1 kohdan f alakohdan ja liitteen VI mukaisesti. Neljää vuotta pidetään riittävänä ajanjaksona, jonka kuluessa kyseisten aineiden tulevat käyttötarkoitukset voidaan vahvistaa. Tämän jälkeen yhteisössä vahvistetun jäämien väliaikaisen enimmäismäärän pitäisi muuttua lopulliseksi.

| (10) | Lupiineja käytetään elintarvikkeena useissa jäsenvaltioissa. Glyfosaatin käyttö lupiineilla on sallittu. Siksi on tarpeen lisätä rivi ”lupiinit” ja vahvistaa lupiineille jäämien enimmäismäärä kuluttajien suojelemiseksi lupiineilla käytettyjen torjunta-aineiden jäämiltä. |
| --- | --- |

(10)

Lupiineja käytetään elintarvikkeena useissa jäsenvaltioissa. Glyfosaatin käyttö lupiineilla on sallittu. Siksi on tarpeen lisätä rivi ”lupiinit” ja vahvistaa lupiineille jäämien enimmäismäärä kuluttajien suojelemiseksi lupiineilla käytettyjen torjunta-aineiden jäämiltä.

| (11) | Direktiivi 90/642/ETY olisi sen vuoksi muutettava vastaavasti. |
| --- | --- |

(11)

Direktiivi 90/642/ETY olisi sen vuoksi muutettava vastaavasti.

| (12) | Tässä direktiivissä säädetyt toimenpiteet ovat elintarvikeketjua ja eläinten terveyttä käsittelevän pysyvän komitean lausunnon mukaiset, |
| --- | --- |

(12)

Tässä direktiivissä säädetyt toimenpiteet ovat elintarvikeketjua ja eläinten terveyttä käsittelevän pysyvän komitean lausunnon mukaiset,

ON ANTANUT TÄMÄN DIREKTIIVIN:

1 artikla

Muutetaan direktiivi 90/642/ETY seuraavasti:

| 1. | Liitteeseen I lisätään ryhmään ”3. Kuivatut palkokasvit” rivi ”Lupiinit” siten, että viimeisessä sarakkeessa oleva määre ”Koko tuote” kattaa kaikki neljä riviä. |
| --- | --- |

1.

Liitteeseen I lisätään ryhmään ”3. Kuivatut palkokasvit” rivi ”Lupiinit” siten, että viimeisessä sarakkeessa oleva määre ”Koko tuote” kattaa kaikki neljä riviä.

| 2. | Muutetaan liite II tämän direktiivin liitteen mukaisesti. |
| --- | --- |

2.

Muutetaan liite II tämän direktiivin liitteen mukaisesti.

2 artikla

1.   Jäsenvaltioiden on annettava ja julkaistava tämän direktiivin noudattamisen edellyttämät lait, asetukset ja hallinnolliset määräykset viimeistään 20 päivänä tammikuuta 2007 lukuun ottamatta benomyyliryhmää ja thiofanaattimetyyliä, joiden osalta niiden on annettava ja julkaistava ne viimeistään 14 päivänä syyskuuta 2006, ja klormekvattia, jonka osalta ne on annettava ja julkaistava viimeistään 31 päivänä heinäkuuta 2006. Niiden on toimitettava komissiolle viipymättä kirjallisina nämä säännökset sekä kyseisiä säännöksiä ja tätä direktiiviä koskeva vastaavuustaulukko.

Niiden on sovellettava näitä säännöksiä 21 päivästä tammikuuta 2007 lukuun ottamatta benomyyliryhmää ja thiofanaattimetyyliä, joiden osalta niitä on sovellettava 15 päivästä syyskuuta 2006, ja klormekvattia, jonka osalta niitä on sovellettava 1 päivästä elokuuta 2006.

Näissä jäsenvaltioiden antamissa säännöksissä on viitattava tähän direktiiviin tai niihin on liitettävä tällainen viittaus, kun ne virallisesti julkaistaan. Jäsenvaltioiden on säädettävä siitä, miten viittaukset tehdään.

2.   Jäsenvaltioiden on toimitettava tässä direktiivissä tarkoitetuista kysymyksistä antamansa keskeiset kansalliset säännökset kirjallisina komissiolle.

3 artikla

Tämä direktiivi tulee voimaan kahdentenakymmenentenä päivänä sen jälkeen, kun se on julkaistu Euroopan unionin virallisessa lehdessä.

4 artikla

Tämä direktiivi on osoitettu kaikille jäsenvaltioille.

Tehty Brysselissä 7 päivänä heinäkuuta 2006.

Komission puolesta

Markos KYPRIANOU

Komission jäsen

---

(1)  EYVL L 350, 14.12.1990, s. 71. Direktiivi sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna komission direktiivillä 2006/53/EY (EUVL L 154, 8.6.2006, s. 11).

1

(2)  EYVL L 230, 19.8.1991, s. 1. Direktiivi sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna komission direktiivillä 2006/45/EY (EUVL L 130, 18.5.2006, s. 27).

2

(3)  Ohjeet ravinnon mukana saatavien torjunta-ainejäämien arvioimiseksi. GEMS/Food Programme -ohjelma yhdessä elintarvikkeiden torjunta-ainejäämiä käsittelevän Codex-komitean kanssa. Maailman terveysjärjestön julkaisu, 1997 (WHO/FSF/FOS/97.7).

3

(4)  EYVL L 224, 18.8.1990, s. 1. Asetus sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna komission asetuksella (EY) N:o 205/2006 (EUVL L 34, 7.2.2006, s. 21).

4

(5)  Lausunto neuvoston direktiivien 86/362/ETY, 86/363/ETY ja 90/642/ETY liitteiden muuttamiseen liittyvistä kysymyksistä (kasveja käsittelevän tiedekomitean lausunto 14 päivänä heinäkuuta 1998); lausunto vaihtelevista torjunta-ainejäämistä hedelmissä ja vihanneksissa (kasveja käsittelevän tiedekomitean lausunto 14 päivänä heinäkuuta 1998), http://europa.eu.int/comm/food/fs/sc/scp/outcome_ppp_en.html

5

---

LIITE

Muutetaan direktiivin 90/642/ETY liite II seuraavasti:

| 1. | Korvataan päärynöiden kohdalla klormekvattia koskeva alaviite (t) seuraavasti: ”Väliaikaista jäämien enimmäismäärää 0,2 mg/kg sovelletaan 31 päivään heinäkuuta 2009 saakka.” |
| --- | --- |

1.

Korvataan päärynöiden kohdalla klormekvattia koskeva alaviite (t) seuraavasti: ”Väliaikaista jäämien enimmäismäärää 0,2 mg/kg sovelletaan 31 päivään heinäkuuta 2009 saakka.”

| 2. | Korvataan A osassa trifloksistrobiinin, thiabendatsolin, abamektiinin, benomyylin, karbendatsiimin, thiofanaattimetyylin, myklobutanyylin, glyfosaatin, trimetyylisulfoniumin ja fenpropimorfiinin sarakkeet seuraavasti: | Torjunta-ainejäämä ja enimmäismäärä (mg/kg) |
| --- | --- | --- |
| Ryhmät ja esimerkkejä yksittäisistä tuotteista, joihin jäämien enimmäismääriä sovelletaan | Trifloksistrobiini | Thiabendatsoli | Abamektiini (avermektiini B1a:n, avermektiini B1b:n ja avermektiini B1a:n delta-8,9 isomeerin yhteismäärä) | Benomyylin ja karbendatsiimin yhteismäärä ilmaistuna karbendatsiimina | Thiofanaattimetyyli | Myklobutanyyli | Glyfosaatti | Trimetyylisulfoniumin kationi, glyfosaatin käytöstä aiheutuva | Fenpropimorfi |
| ”1. | Tuoreet, kuivatut tai keittämättömät, jäädyttämällä ilman sokerin lisäystä säilötyt hedelmät; pähkinät | | | | | | | | | |
| | (i) | SITRUSHEDELMÄT | 0,3 (2) | 5 | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 3 | | | 0,05 (1) |
| | | Greipit | | | | | | | | | |
| | | Sitruunat | | | | | | | | | |
| | | Limetit | | | | | | | | | |
| | | Mandariinit (klementiinit ja muut sitrushybridit mukaan luettuina) | | | | | | | 0,5 (2) | 0,5 (2) | |
| | | Appelsiinit | | | | | | | 0,5 (2) | 0,5 (2) | |
| | | Pomelot | | | | | | | | | |
| | | Muut | | | | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| | (ii) | PÄHKINÄT (kuoritut tai kuorimattomat) | 0,02 (1)
   (2) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1) | 0,2 | 0,05 (1) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Mantelit | | | | | | | | | |
| | | Parapähkinät | | | | | | | | | |
| | | Cashewpähkinät | | | | | | | | | |
| | | Kastanjat | | | | | | | | | |
| | | Kookospähkinät | | | | | | | | | |
| | | Hasselpähkinät | | | | | | | | | |
| | | Makadamiapähkinät | | | | | | | | | |
| | | Pekaanipähkinät | | | | | | | | | |
| | | Pinjansiemenet | | | | | | | | | |
| | | Pistaasimantelit | | | | | | | | | |
| | | Saksanpähkinät | | | | | | | | | |
| | | Muut | | | | | | | | | |
| | (iii) | SIEMENHEDELMÄT | 0,5 (2) | | 0,01 (1) | 0,2 | 0,5 | 0,5 | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Omenat | | 5 | | | | | | | |
| | | Päärynät | | 5 | | | | | | | |
| | | Kvittenit | | | | | | | | | |
| | | Muut | | 0,05 (1) | | | | | | | |
| | (iv) | KIVIHEDELMÄT | | 0,05 (1) | 0,01 (1) | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Aprikoosit | 1 (2) | | | 0,2 | 2 | 0,3 | | | |
| | | Kirsikat | 1 (2) | | | 0,5 | 0,3 | 1 | | | |
| | | Persikat (nektariinit ja niiden kaltaiset hybridit mukaan luettuina) | 1 (2) | | | 0,2 | 2 | 0,5 | | | |
| | | Luumut | 0,2 (2) | | | 0,5 | 0,3 | 0,5 | | | |
| | | Muut | 0,02 (1)
   (2) | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | |
| | (v) | MARJAT JA PIENET HEDELMÄT | | 0,05 (1) | | | | | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | (a) | Viinirypäleet | 5 (2) | | 0,01 (1) | | | 1 | 0,5 (2) | | 0,05 (1) |
| | | | Syötäväksi tarkoitetut viinirypäleet | | | | 0,3 | 0,1 (1) | | | | |
| | | | Viinin valmistukseen tarkoitetut viinirypäleet) | | | | 0,5 | 3 | | | | |
| | | (b) | Mansikat (muut kuin luonnonvaraiset) | 0,5 (1)
   (2) | | 0,1 | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 1 | 0,1 (1)
   (2) | | 1 |
| | | (c) | Pensasmarjat (muut kuin luonnonvaraiset) | 0,02 (1)
   (2) | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | | 1 |
| | | | Karhunvatukat | | | 0,1 | | | 1 | | | |
| | | | Sinivatukat | | | | | | | | | |
| | | | Jättivatukat (boysen- ja loganinmarjat) | | | | | | | | | |
| | | | Vadelmat | | | 0,1 | | | 1 | | | |
| | | | Muut | | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | (d) | Muut pienhedelmät ja marjat (muut kuin luonnonvaraiset) | | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | | 1 |
| | | | Mustikat | | | | | | | | | |
| | | | Karpalot | | | | | | | | | |
| | | | Herukat (punaiset, mustat ja valkoiset) | 1 (2) | | | | | 1 | | | |
| | | | Karviaismarjat | 1 (2) | | | | | 1 | | | |
| | | | Muut | 0,02 (1)
   (2) | | | | | 0,02 (1) | | | |
| | | (e) | Luonnonvaraiset marjat ja hedelmät | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1)
   (2) | | 0,05 (1) |
| | (vi) | SEKALAISET HEDELMÄT | | | 0,01 (1) | | | | | | |
| | | Avokadot | | 15 | | | | | | | |
| | | Banaanit | 0,05 (2) | 5 | | | | 2 | | | 2 |
| | | Taatelit | | | | | | | | | |
| | | Viikunat | | | | | | | | | |
| | | Kiivit | | | | | | | | | |
| | | Kumkvatit | | | | | | | | | |
| | | Litsit | | | | | | | | | |
| | | Mangot | | 5 | | | | | | | |
| | | Oliivit (syötäviksi tarkoitetut) | | | | | | | | | |
| | | Oliivit (öljyn valmistukseen tarkoitetut) | | | | | | | 1 (2) | 1 (2) | |
| | | Papaijat | | 10 | | 0,2 | 1 | | | | |
| | | Passionhedelmät | | | | | | | | | |
| | | Ananakset | | | | | | | | | |
| | | Granaattiomenat | | | | | | | | | |
| | | Muut | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| 2. | Vihannekset, tuoreet tai keittämättömät, jäädytetyt tai kuivatut | | | | | | | | | |
| | (i) | JUUREKSET JA JUURIMUKULAT | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Punajuuret | | | | | | | | | |
| | | Porkkanat | | | | | | 0,2 | | | |
| | | Kassavat | | 15 | | | | | | | |
| | | Mukulasellerit | | | | | | | | | |
| | | Piparjuuri | | | | | | 0,2 | | | |
| | | Maa-artisokat | | | | | | | | | |
| | | Palsternakat | | | | | | 0,2 | | | |
| | | Juuripersiljat | | | | | | 0,2 | | | |
| | | Retiisit ja retikat | | | | | | | | | |
| | | Kaurajuuret | | | | | | | | | |
| | | Bataatit | | 15 | | | | | | | |
| | | Lantut | | | | | | | | | |
| | | Nauriit | | | | | | | | | |
| | | Jamssit | | 15 | | | | | | | |
| | | Muut | | 0,05 (1) | | | | 0,02 (1) | | | |
| | (ii) | SIPULIKASVIT | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Valkosipulit | | | | | | | | | |
| | | Sipulit | | | | | | | | | |
| | | Salottisipulit | | | | | | | | | |
| | | Varhaissipulit | | | | | | | | | |
| | | Muut | | | | | | | | | |
| | (iii) | HEDELMÄVI-HANNEKSET | | 0,05 (1) | | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | (a) | Solanaceae-heimo | | | | | | | | | |
| | | | Tomaatit | 0,5 (2) | | 0,02 | 0,5 | 2 | 0,3 | | | |
| | | | Paprikat | | | 0,05 | | | 0,5 | | | |
| | | | Munakoisot | | | 0,02 | 0,5 | 2 | 0,3 | | | |
| | | | Okra | | | | 2 | 1 | | | | |
| | | | Muut | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | |
| | | (b) | Syötäväkuoriset, Cucurbitaceae-heimo | 0,2 (2) | | 0,02 | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,1 | | | |
| | | | Kurkut | | | | | | | | | |
| | | | Pikkukurkut | | | | | | | | | |
| | | | Kesäkurpitsat | | | | | | | | | |
| | | | Muut | | | | | | | | | |
| | | (c) | Paksukuoriset, Cucurbitaceae-heimo | | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,3 | 0,2 | | | |
| | | | Melonit | 0,3 (2) | | | | | | | | |
| | | | Kurpitsat | | | | | | | | | |
| | | | Vesimelonit | | | | | | | | | |
| | | | Muut | 0,02 (1)
   (2) | | | | | | | | |
| | | (d) | Sokerimaissi | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | |
| | (iv) | KAALIT | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | (a) | Kukinnon muodostavat kaalit | | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | | | 0,05 (1) |
| | | | Parsakaalit | | 5 | | | | | | | |
| | | | Kukkakaali | | | | | | | | | |
| | | | Muut | | 0,05 (1) | | | | | | | |
| | | (b) | Kerivät kaalit | | 0,05 (1) | | | | | | | |
| | | | Ruusukaalit | | | | 0,5 | 1 | | | | 0,5 |
| | | | Keräkaalit | | | | | | | | | |
| | | | Muut | | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | | | 0,05 (1) |
| | | (c) | Lehtikaalit | | 0,05 (1) | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | | | 0,05 (1) |
| | | | Kiinankaalit | | | | | | | | | |
| | | | Lehtikaali | | | | | | | | | |
| | | | Muut | | | | | | | | | |
| | | (d) | Kyssäkaali | | 0,05 (1) | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | | | 0,05 (1) |
| | (v) | LEHTIVIHANNEKSET JA TUOREET YRTIT | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | (a) | Lehtisalaatti ja sen kaltaiset | | | 0,1 | | | | | | |
| | | | Vihanneskrassi | | | | | | | | | |
| | | | Vuonankaali | | | | | | 5 | | | |
| | | | Salaatti | | | | | | | | | |
| | | | Siloendiivi | | | | | | | | | |
| | | | Rucola | | | | | | | | | |
| | | | Kaalin lehdet ja varret | | | | | | | | | |
| | | | Muut | | | | | | 0,02 (1) | | | |
| | | (b) | Pinaatti ja sen kaltaiset | | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | | Pinaatti | | | | | | | | | |
| | | | Mangoldi (eli lehtijuurikas) | | | | | | | | | |
| | | | Muut | | | | | | | | | |
| | | (c) | Vesikrassi | | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | (d) | Sikuri | | 1 | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | (e) | Yrtit | | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | | Kirveli | | | | | | | | | |
| | | | Ruohosipuli | | | | | | | | | |
| | | | Persilja | | | | | | | | | |
| | | | Yrttiselleri | | | | | | | | | |
| | | | Muut | | | | | | | | | |
| | (vi) | PALKOVIHANNEKSET (tuoreet) | | 0,05 (1) | 0,01 (1) | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Pavut (silpimättömät) | 0,5 (2) | | | 0,2 | 0,1 (1) | 0,3 | | | |
| | | Pavut (silvityt) | | | | | | | | | |
| | | Herneet (silpimättömät) | | | | 0,2 | 0,1 (1) | | | | |
| | | Herneet (silvityt) | | | | | | | | | |
| | | Muut | 0,02 (1)
   (2) | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | |
| | (vii) | VARSIVIHANNEKSET (tuoreet) | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Parsa | | | | | | | | | |
| | | Kardoni | | | | | | | | | |
| | | Lehtiselleri | | | | | | | | | |
| | | Fenkoli | | | | | | | | | |
| | | Latva-artisokka | | | | | | 0,5 | | | |
| | | Purjo | | | | | | | | | 1 |
| | | Raparperi | | | | | | | | | |
| | | Muut | | | | | | 0,02 (1) | | | 0,05 (1) |
| | (viii) | SIENET | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | 0,05 (1) |
| | | (a) | Viljellyt sienet | | 10 | | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | (b) | Luonnonvaraiset sienet | | 0,05 (1) | | | | | 50 (2) | 20 (2) | |
| 3. | Kuivatut palkokasvit | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | Pavut | | | | | | | 2 (2) | | |
| | Linssit | | | | | | | | | |
| | Herneet | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Lupiinit | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Muut | | | | | | | 0,1 (1)
   (2) | | |
| 4. | Öljykasvien siemenet | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) | 0,02 (1) | | | 0,05 (1) | | | 0,05 (1) |
| | Pellavansiemenet | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Maapähkinät | | | | | | | | | |
| | Unikonsiemenet | | | | | | | | | |
| | Seesaminsiemenet | | | | | | | | | |
| | Auringonkukansiemenet | | | | | | | 20 (2) | | |
| | Rapsinsiemenet | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Soijapavut | | | | 0,2 | 0,3 | | 20 (2) | 10 (2) | |
| | Sinapinsiemenet | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Puuvillansiemenet | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Hampunsiemenet | | | | | | | | | |
| | Muut | | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| 5. | Perunat | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,5 (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | Varhaisperunat | | 0,05 (1) | | | | | | | |
| | Varastoperunat | | 15 | | | | | | | |
| 6. | Tee (kuivatut lehdet ja lehtiruodit, fermentoitu ja muu, Camellia sinensis -laji) | 0,05 (1)
   (2) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,05 (1) | 2 (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,1 (1) |
| 7. | Humala (kuivattu), myös pelleteiksi valmistetut tai jauhetut humalantähkät | 30 (2) | 0,1 (1) | 0,05 | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 2 | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 10 |

2.

Korvataan A osassa trifloksistrobiinin, thiabendatsolin, abamektiinin, benomyylin, karbendatsiimin, thiofanaattimetyylin, myklobutanyylin, glyfosaatin, trimetyylisulfoniumin ja fenpropimorfiinin sarakkeet seuraavasti:

Torjunta-ainejäämä ja enimmäismäärä (mg/kg)

Ryhmät ja esimerkkejä yksittäisistä tuotteista, joihin jäämien enimmäismääriä sovelletaan

Trifloksistrobiini

Thiabendatsoli

Abamektiini (avermektiini B1a:n, avermektiini B1b:n ja avermektiini B1a:n delta-8,9 isomeerin yhteismäärä)

Benomyylin ja karbendatsiimin yhteismäärä ilmaistuna karbendatsiimina

Thiofanaattimetyyli

Myklobutanyyli

Glyfosaatti

Trimetyylisulfoniumin kationi, glyfosaatin käytöstä aiheutuva

Fenpropimorfi

”1.

Tuoreet, kuivatut tai keittämättömät, jäädyttämällä ilman sokerin lisäystä säilötyt hedelmät; pähkinät

(i)

SITRUSHEDELMÄT

0,3 (2)

5

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

3

0,05 (1)

Greipit

Sitruunat

Limetit

Mandariinit (klementiinit ja muut sitrushybridit mukaan luettuina)

0,5 (2)

0,5 (2)

Appelsiinit

0,5 (2)

0,5 (2)

Pomelot

Muut

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

(ii)

PÄHKINÄT (kuoritut tai kuorimattomat)

0,02 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)

0,2

0,05 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Mantelit

Parapähkinät

Cashewpähkinät

Kastanjat

Kookospähkinät

Hasselpähkinät

Makadamiapähkinät

Pekaanipähkinät

Pinjansiemenet

Pistaasimantelit

Saksanpähkinät

Muut

(iii)

SIEMENHEDELMÄT

0,5 (2)

0,01 (1)

0,2

0,5

0,5

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Omenat

5

Päärynät

5

Kvittenit

Muut

0,05 (1)

(iv)

KIVIHEDELMÄT

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Aprikoosit

1 (2)

0,2

2

0,3

Kirsikat

1 (2)

0,5

0,3

1

Persikat (nektariinit ja niiden kaltaiset hybridit mukaan luettuina)

1 (2)

0,2

2

0,5

Luumut

0,2 (2)

0,5

0,3

0,5

Muut

0,02 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

(v)

MARJAT JA PIENET HEDELMÄT

0,05 (1)

0,05 (1)
   (2)

(a)

Viinirypäleet

5 (2)

0,01 (1)

1

0,5 (2)

0,05 (1)

Syötäväksi tarkoitetut viinirypäleet

0,3

0,1 (1)

Viinin valmistukseen tarkoitetut viinirypäleet)

0,5

3

(b)

Mansikat (muut kuin luonnonvaraiset)

0,5 (1)
   (2)

0,1

0,1 (1)

0,1 (1)

1

0,1 (1)
   (2)

1

(c)

Pensasmarjat (muut kuin luonnonvaraiset)

0,02 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

1

Karhunvatukat

0,1

1

Sinivatukat

Jättivatukat (boysen- ja loganinmarjat)

Vadelmat

0,1

1

Muut

0,01 (1)

0,02 (1)

(d)

Muut pienhedelmät ja marjat (muut kuin luonnonvaraiset)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

1

Mustikat

Karpalot

Herukat (punaiset, mustat ja valkoiset)

1 (2)

1

Karviaismarjat

1 (2)

1

Muut

0,02 (1)
   (2)

0,02 (1)

(e)

Luonnonvaraiset marjat ja hedelmät

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)

(vi)

SEKALAISET HEDELMÄT

0,01 (1)

Avokadot

15

Banaanit

0,05 (2)

5

2

2

Taatelit

Viikunat

Kiivit

Kumkvatit

Litsit

Mangot

5

Oliivit (syötäviksi tarkoitetut)

Oliivit (öljyn valmistukseen tarkoitetut)

1 (2)

1 (2)

Papaijat

10

0,2

1

Passionhedelmät

Ananakset

Granaattiomenat

Muut

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

2.

Vihannekset, tuoreet tai keittämättömät, jäädytetyt tai kuivatut

(i)

JUUREKSET JA JUURIMUKULAT

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Punajuuret

Porkkanat

0,2

Kassavat

15

Mukulasellerit

Piparjuuri

0,2

Maa-artisokat

Palsternakat

0,2

Juuripersiljat

0,2

Retiisit ja retikat

Kaurajuuret

Bataatit

15

Lantut

Nauriit

Jamssit

15

Muut

0,05 (1)

0,02 (1)

(ii)

SIPULIKASVIT

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Valkosipulit

Sipulit

Salottisipulit

Varhaissipulit

Muut

(iii)

HEDELMÄVI-HANNEKSET

0,05 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

(a)

Solanaceae-heimo

Tomaatit

0,5 (2)

0,02

0,5

2

0,3

Paprikat

0,05

0,5

Munakoisot

0,02

0,5

2

0,3

Okra

2

1

Muut

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

(b)

Syötäväkuoriset, Cucurbitaceae-heimo

0,2 (2)

0,02

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1

Kurkut

Pikkukurkut

Kesäkurpitsat

Muut

(c)

Paksukuoriset, Cucurbitaceae-heimo

0,01 (1)

0,1 (1)

0,3

0,2

Melonit

0,3 (2)

Kurpitsat

Vesimelonit

Muut

0,02 (1)
   (2)

(d)

Sokerimaissi

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

(iv)

KAALIT

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

(a)

Kukinnon muodostavat kaalit

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

Parsakaalit

5

Kukkakaali

Muut

0,05 (1)

(b)

Kerivät kaalit

0,05 (1)

Ruusukaalit

0,5

1

0,5

Keräkaalit

Muut

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

(c)

Lehtikaalit

0,05 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

Kiinankaalit

Lehtikaali

Muut

(d)

Kyssäkaali

0,05 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

(v)

LEHTIVIHANNEKSET JA TUOREET YRTIT

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

(a)

Lehtisalaatti ja sen kaltaiset

0,1

Vihanneskrassi

Vuonankaali

5

Salaatti

Siloendiivi

Rucola

Kaalin lehdet ja varret

Muut

0,02 (1)

(b)

Pinaatti ja sen kaltaiset

0,01 (1)

0,02 (1)

Pinaatti

Mangoldi (eli lehtijuurikas)

Muut

(c)

Vesikrassi

0,01 (1)

0,02 (1)

(d)

Sikuri

1

0,01 (1)

0,02 (1)

(e)

Yrtit

0,01 (1)

0,02 (1)

Kirveli

Ruohosipuli

Persilja

Yrttiselleri

Muut

(vi)

PALKOVIHANNEKSET (tuoreet)

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Pavut (silpimättömät)

0,5 (2)

0,2

0,1 (1)

0,3

Pavut (silvityt)

Herneet (silpimättömät)

0,2

0,1 (1)

Herneet (silvityt)

Muut

0,02 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

(vii)

VARSIVIHANNEKSET (tuoreet)

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

Parsa

Kardoni

Lehtiselleri

Fenkoli

Latva-artisokka

0,5

Purjo

1

Raparperi

Muut

0,02 (1)

0,05 (1)

(viii)

SIENET

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,05 (1)

(a)

Viljellyt sienet

10

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

(b)

Luonnonvaraiset sienet

0,05 (1)

50 (2)

20 (2)

3.

Kuivatut palkokasvit

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Pavut

2 (2)

Linssit

Herneet

10 (2)

Lupiinit

10 (2)

Muut

0,1 (1)
   (2)

4.

Öljykasvien siemenet

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,02 (1)

0,05 (1)

0,05 (1)

Pellavansiemenet

10 (2)

Maapähkinät

Unikonsiemenet

Seesaminsiemenet

Auringonkukansiemenet

20 (2)

Rapsinsiemenet

10 (2)

Soijapavut

0,2

0,3

20 (2)

10 (2)

Sinapinsiemenet

10 (2)

Puuvillansiemenet

10 (2)

Hampunsiemenet

Muut

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

5.

Perunat

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,5 (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Varhaisperunat

0,05 (1)

Varastoperunat

15

6.

Tee (kuivatut lehdet ja lehtiruodit, fermentoitu ja muu, Camellia sinensis -laji)

0,05 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

2 (2)

0,05 (1)
   (2)

0,1 (1)

7.

Humala (kuivattu), myös pelleteiksi valmistetut tai jauhetut humalantähkät

30 (2)

0,1 (1)

0,05

0,1 (1)

0,1 (1)

2

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

10

---

(1)  Analyysiherkkyyden alaraja

(2)  Jäämien enimmäismäärä vahvistettu väliaikaisesti direktiivin 91/414/ETY 4 artiklan 1 kohdan f alakohdan mukaisesti.”

---

| 27.7.2006 | FI | Euroopan unionin virallinen lehti | L 206/12 |
| --- | --- | --- | --- |

27.7.2006

FI

Euroopan unionin virallinen lehti

L 206/12

---

KOMISSION DIREKTIIVI 2006/61/EY,

annettu 7 päivänä heinäkuuta 2006,

neuvoston direktiivien 86/362/ETY, 86/363/ETY ja 90/642/ETY liitteiden muuttamisesta atratsiinin, atsinfossietyylin, syflutriinin, etefonin, fentionin, metamidofossin, metomyylin, parakvaatin ja triatsofossin jäämien enimmäismäärien osalta

(ETA:n kannalta merkityksellinen teksti)

EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka

ottaa huomioon Euroopan yhteisön perustamissopimuksen,

ottaa huomioon viljojen torjunta-ainejäämien enimmäismääristä 24 päivänä heinäkuuta 1986 annetun neuvoston direktiivin 86/362/ETY (1) ja erityisesti sen 10 artiklan,

ottaa huomioon eläinkunnasta peräisin olevissa elintarvikkeissa ja niiden pinnassa olevien torjunta-ainejäämien enimmäismäärien vahvistamisesta 24 päivänä heinäkuuta 1986 annetun neuvoston direktiivin 86/363/ETY (2) ja erityisesti sen 10 artiklan,

ottaa huomioon torjunta-ainejäämien enimmäismäärien vahvistamisesta tietyille kasvikunnasta peräisin oleville tuotteille, mukaan lukien hedelmät ja vihannekset, 27 päivänä marraskuuta 1990 annetun neuvoston direktiivin 90/642/ETY (3) ja erityisesti sen 7 artiklan,

ottaa huomioon kasvinsuojeluaineiden markkinoille saattamisesta 15 päivänä heinäkuuta 1991 annetun neuvoston direktiivin 91/414/ETY (4) ja erityisesti sen 4 artiklan 1 kohdan f alakohdan,

sekä katsoo seuraavaa:

| (1) | Viljojen ja kasviperäisten tuotteiden, hedelmät ja vihannekset mukaan luettuina, jäämien enimmäismäärät kuvastavat sellaista käyttöä, joka on kasveille tehokkaan suojan antava pienin mahdollinen tarvittava määrä torjunta-ainetta käytettäessä sitä niin, että jäämä on mahdollisimman alhainen sekä toksikologisesti hyväksyttävä etenkin ympäristönsuojelun ja kuluttajien ravinnon välityksellä tapahtuvan arvioidun saannin kannalta. Eläinperäisten elintarvikkeiden osalta jäämien enimmäismäärät kuvastavat sitä, kuinka paljon eläimet kuluttavat torjunta-aineilla käsiteltyjä viljoja ja kasviperäisiä tuotteita, ottaen tarvittaessa huomioon eläinlääkkeiden välittömät vaikutukset. Yhteisössä sovellettavat jäämien enimmäismäärät edustavat tällaisten jäämien enimmäismääriä, joita hyödykkeissä voi olla silloin kun hyvää viljelykäytäntöä on noudatettu. |
| --- | --- |

(1)

Viljojen ja kasviperäisten tuotteiden, hedelmät ja vihannekset mukaan luettuina, jäämien enimmäismäärät kuvastavat sellaista käyttöä, joka on kasveille tehokkaan suojan antava pienin mahdollinen tarvittava määrä torjunta-ainetta käytettäessä sitä niin, että jäämä on mahdollisimman alhainen sekä toksikologisesti hyväksyttävä etenkin ympäristönsuojelun ja kuluttajien ravinnon välityksellä tapahtuvan arvioidun saannin kannalta. Eläinperäisten elintarvikkeiden osalta jäämien enimmäismäärät kuvastavat sitä, kuinka paljon eläimet kuluttavat torjunta-aineilla käsiteltyjä viljoja ja kasviperäisiä tuotteita, ottaen tarvittaessa huomioon eläinlääkkeiden välittömät vaikutukset. Yhteisössä sovellettavat jäämien enimmäismäärät edustavat tällaisten jäämien enimmäismääriä, joita hyödykkeissä voi olla silloin kun hyvää viljelykäytäntöä on noudatettu.

| (2) | Torjunta-aineiden jäämien enimmäismääriä arvioidaan jatkuvasti uudelleen, ja niitä muutetaan uuden tietämyksen ja tutkimustulosten huomioon ottamiseksi. Jäämien enimmäismääriksi vahvistetaan analyysiherkkyyden alaraja, kun kasvinsuojeluaineiden sallitusta käytöstä ei aiheudu elintarvikkeisiin tai niiden pinnalle havaittavissa olevia torjunta-aineiden jäämiä tai kun sallittua käyttöä ei ole tai kun jäsenvaltioiden salliman käytön tukena ei ole ollut tarvittavia tietoja tai kun kolmansissa maissa käytön tukena ei ole ollut tarvittavia tietoja ja käytöstä on aiheutunut torjunta-aineiden jäämiä yhteisön markkinoille mahdollisesti tuleviin elintarvikkeisiin tai niiden pinnalle. |
| --- | --- |

(2)

Torjunta-aineiden jäämien enimmäismääriä arvioidaan jatkuvasti uudelleen, ja niitä muutetaan uuden tietämyksen ja tutkimustulosten huomioon ottamiseksi. Jäämien enimmäismääriksi vahvistetaan analyysiherkkyyden alaraja, kun kasvinsuojeluaineiden sallitusta käytöstä ei aiheudu elintarvikkeisiin tai niiden pinnalle havaittavissa olevia torjunta-aineiden jäämiä tai kun sallittua käyttöä ei ole tai kun jäsenvaltioiden salliman käytön tukena ei ole ollut tarvittavia tietoja tai kun kolmansissa maissa käytön tukena ei ole ollut tarvittavia tietoja ja käytöstä on aiheutunut torjunta-aineiden jäämiä yhteisön markkinoille mahdollisesti tuleviin elintarvikkeisiin tai niiden pinnalle.

| (3) | Komissiolle on ilmoitettu, että useiden torjunta-aineiden nykyisiä enimmäismääriä on ehkä tarkistettava ottaen huomioon toksisuutta ja kuluttajien altistumista koskevat uudet tiedot. Komissio on pyytänyt esittelijöinä toimivia jäsenvaltioita tekemään ehdotuksia yhteisön enimmäismäärien tarkistamiseksi. Tällaisia ehdotuksia on toimitettu komissiolle. |
| --- | --- |

(3)

Komissiolle on ilmoitettu, että useiden torjunta-aineiden nykyisiä enimmäismääriä on ehkä tarkistettava ottaen huomioon toksisuutta ja kuluttajien altistumista koskevat uudet tiedot. Komissio on pyytänyt esittelijöinä toimivia jäsenvaltioita tekemään ehdotuksia yhteisön enimmäismäärien tarkistamiseksi. Tällaisia ehdotuksia on toimitettu komissiolle.

| (4) | Kuluttajien elinikäistä ja lyhytaikaista altistumista tämän direktiivin soveltamisalaan kuuluville torjunta-aineille elintarvikkeiden välityksellä on arvioitu yhteisössä käytettyjen menettelyjen ja käytänteiden mukaan ottaen huomioon Maailman terveysjärjestön julkaisemat ohjeet (5). Tältä pohjalta on aiheellista vahvistaa uudet jäämien enimmäismäärät, joilla taataan, että kuluttajien altistuminen ei ole liiallista. |
| --- | --- |

(4)

Kuluttajien elinikäistä ja lyhytaikaista altistumista tämän direktiivin soveltamisalaan kuuluville torjunta-aineille elintarvikkeiden välityksellä on arvioitu yhteisössä käytettyjen menettelyjen ja käytänteiden mukaan ottaen huomioon Maailman terveysjärjestön julkaisemat ohjeet (5). Tältä pohjalta on aiheellista vahvistaa uudet jäämien enimmäismäärät, joilla taataan, että kuluttajien altistuminen ei ole liiallista.

| (5) | Kuluttajien akuuttia altistumista näille torjunta-aineille kaikkien sellaisten elintarvikkeiden välityksellä, jotka saattavat sisältää jäämiä, on tarvittaessa arvioitu yhteisössä käytettyjen menettelyjen ja käytänteiden mukaan ottaen samalla huomioon Maailman terveysjärjestön julkaisemat ohjeet. Päätelmänä on, että uusia jäämien enimmäismääriä vastaavilla tai niitä alhaisemmilla torjunta-ainejäämillä ei ole akuutteja myrkytysvaikutuksia. |
| --- | --- |

(5)

Kuluttajien akuuttia altistumista näille torjunta-aineille kaikkien sellaisten elintarvikkeiden välityksellä, jotka saattavat sisältää jäämiä, on tarvittaessa arvioitu yhteisössä käytettyjen menettelyjen ja käytänteiden mukaan ottaen samalla huomioon Maailman terveysjärjestön julkaisemat ohjeet. Päätelmänä on, että uusia jäämien enimmäismääriä vastaavilla tai niitä alhaisemmilla torjunta-ainejäämillä ei ole akuutteja myrkytysvaikutuksia.

| (6) | Yhteisön kauppakumppaneita on kuultu uusista jäämien enimmäismääristä Maailman kauppajärjestön välityksellä ja niiden näitä tasoja koskevat huomautukset on otettu huomioon. |
| --- | --- |

(6)

Yhteisön kauppakumppaneita on kuultu uusista jäämien enimmäismääristä Maailman kauppajärjestön välityksellä ja niiden näitä tasoja koskevat huomautukset on otettu huomioon.

| (7) | Direktiivien 86/362/ETY, 86/363/ETY ja 90/642/ETY liitteet olisi tästä syystä muutettava vastaavasti. |
| --- | --- |

(7)

Direktiivien 86/362/ETY, 86/363/ETY ja 90/642/ETY liitteet olisi tästä syystä muutettava vastaavasti.

| (8) | Tässä direktiivissä säädetyt toimenpiteet ovat elintarvikeketjua ja eläinten terveyttä käsittelevän pysyvän komitean lausunnon mukaiset, |
| --- | --- |

(8)

Tässä direktiivissä säädetyt toimenpiteet ovat elintarvikeketjua ja eläinten terveyttä käsittelevän pysyvän komitean lausunnon mukaiset,

ON ANTANUT TÄMÄN DIREKTIIVIN:

1 artikla

Muutetaan direktiivin 86/362/ETY liite II tämän direktiivin liitteen I mukaisesti.

2 artikla

Muutetaan direktiivin 86/363/ETY liite II tämän direktiivin liitteen II mukaisesti.

3 artikla

Muutetaan direktiivin 90/642/ETY liite II tämän direktiivin liitteen III mukaisesti.

4 artikla

1.   Jäsenvaltioiden on annettava ja julkaistava tämän direktiivin noudattamisen edellyttämät lait, asetukset ja hallinnolliset määräykset viimeistään 20 päivänä tammikuuta 2007. Niiden on toimitettava komissiolle viipymättä kirjallisina nämä säännökset sekä kyseisiä säännöksiä ja tätä direktiiviä koskeva vastaavuustaulukko.

Niiden on sovellettava näitä säännöksiä 21 päivästä tammikuuta 2007.

Näissä jäsenvaltioiden antamissa säännöksissä on viitattava tähän direktiiviin tai niihin on liitettävä tällainen viittaus, kun ne virallisesti julkaistaan. Jäsenvaltioiden on säädettävä siitä, miten viittaukset tehdään.

2.   Jäsenvaltioiden on toimitettava tässä direktiivissä tarkoitetuista kysymyksistä antamansa keskeiset kansalliset säännökset kirjallisina komissiolle.

5 artikla

Tämä direktiivi tulee voimaan kahdentenakymmenentenä päivänä sen jälkeen, kun se on julkaistu Euroopan unionin virallisessa lehdessä.

6 artikla

Tämä direktiivi on osoitettu kaikille jäsenvaltioille.

Tehty Brysselissä 7 päivänä heinäkuuta 2006.

Komission puolesta

Markos KYPRIAN

Komission jäsen

---

(1)  EYVL L 221, 7.8.1986, s. 37. Direktiivi sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna komission direktiivillä 2006/59/EY (EUVL L 175, 29.6.2006, s. 61).

1

(2)  EYVL L 221, 7.8.1986, s. 43. Direktiivi sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna komission direktiivillä 2006/59/EY.

2

(3)  EYVL L 350, 14.12.1990, s. 71. Direktiivi sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna komission direktiivillä 2006/59/EY.

3

(4)  EYVL L 230, 19.8.1991, s. 1. Direktiivi sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna komission direktiivillä 2006/45/EY (EUVL L 130, 18.5.2006, s. 27).

4

(5)  Ohjeet ravinnon mukana saatavien torjunta-ainejäämien arvioimiseksi (tarkistettu). Laadittu GEMS/Food Programme -ohjelmassa yhdessä elintarvikkeiden torjunta-ainejäämiä käsittelevän Codex-komitean kanssa. Maailman terveysjärjestön julkaisu, 1997 (WHO/FSF/FOS/97.7).

5

---

LIITE I

Muutetaan direktiivin 86/362/EY liitteessä II oleva A osa seuraavasti:

| 1. | Lisätään atratsiinia koskeva kohta seuraavasti:






  Torjunta-ainejäämät | Enimmäismäärä mg/kg |
| --- | --- | --- |
| ”Atratsiini | 0,05 (1)

  VILJAT |

1.

Lisätään atratsiinia koskeva kohta seuraavasti:

Torjunta-ainejäämät

Enimmäismäärä mg/kg

”Atratsiini

0,05 (1)

VILJAT

| 2. | Korvataan atsinfossietyylia, etefonia ja triatsofossia koskevat kohdat seuraavasti:






  Torjunta-ainejäämät | Enimmäismäärä mg/kg |
| --- | --- | --- |
| ”Atsinfossietyyli | 0,05 (2)

  VILJAT |
| Etefoni | 0,5 ohra, ruis
  0,2 ruisvehnä, vehnä
  0,05 (2) muut viljat |
| Triatsofossi | 0,02 (2)

  VILJAT |

2.

Korvataan atsinfossietyylia, etefonia ja triatsofossia koskevat kohdat seuraavasti:

Torjunta-ainejäämät

Enimmäismäärä mg/kg

”Atsinfossietyyli

0,05 (2)

VILJAT

Etefoni

0,5 ohra, ruis

0,2 ruisvehnä, vehnä

0,05 (2) muut viljat

Triatsofossi

0,02 (2)

VILJAT

---

(1)  Analyysiherkkyyden alaraja.”

(2)  Analyysiherkkyyden alaraja.”

---

LIITE II

Muutetaan direktiivin 86/363/EY liitteessä II oleva A osa seuraavasti:

| 1. | Korvataan direktiivin 86/363/ETY liitteessä II olevassa A osassa atsinfossietyylia ja triatsofossia koskevat kohdat seuraavasti:








  Torjunta-ainejäämät | Enimmäismäärä mg/kg |
| --- | --- | --- |
| | rasva, jota on lihassa, lihavalmisteissa, muissa eläimenosissa ja eläinrasvoissa, jotka on lueteltu liitteessä I nimikkeissä ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 ja 1602 (1) (4) | lehmänmaito ja täysrasvainen lehmänmaito, jotka on lueteltu liitteessä I nimikkeessä 0401; muut elintarvikkeet nimikkeissä 0401, 0402, 0405 00 ja 0406 alaviitteiden (2) ja (4) mukaisesti | kuorelliset tuoreet munat, linnunmunat ja munankeltuaiset, jotka on lueteltu liitteessä I nimikkeissä 0407 00 ja 0408 (3) (4) |
| ”Atsinfossietyyli | 0,01 (1) | 0,01 (1) | 0,01 (1) |
| Triatsofossi | 0,01 (1) | 0,01 (1) | 0,01 (1) |

1.

Korvataan direktiivin 86/363/ETY liitteessä II olevassa A osassa atsinfossietyylia ja triatsofossia koskevat kohdat seuraavasti:

Torjunta-ainejäämät

Enimmäismäärä mg/kg

rasva, jota on lihassa, lihavalmisteissa, muissa eläimenosissa ja eläinrasvoissa, jotka on lueteltu liitteessä I nimikkeissä ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 ja 1602 (1) (4)

lehmänmaito ja täysrasvainen lehmänmaito, jotka on lueteltu liitteessä I nimikkeessä 0401; muut elintarvikkeet nimikkeissä 0401, 0402, 0405 00 ja 0406 alaviitteiden (2) ja (4) mukaisesti

kuorelliset tuoreet munat, linnunmunat ja munankeltuaiset, jotka on lueteltu liitteessä I nimikkeissä 0407 00 ja 0408 (3) (4)

”Atsinfossietyyli

0,01 (1)

0,01 (1)

0,01 (1)

Triatsofossi

0,01 (1)

0,01 (1)

0,01 (1)

| 2. | Lisätään direktiivin 86/363/ETY liitteessä II olevaan A osaan fentionia koskeva kohta seuraavasti:








  Torjunta-ainejäämät | Enimmäismäärä mg/kg |
| --- | --- | --- |
| | rasva, jota on lihassa, lihavalmisteissa, muissa eläimenosissa ja eläinrasvoissa, jotka on lueteltu liitteessä I nimikkeissä ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 ja 1602 (1) (4) | lehmänmaito ja täysrasvainen lehmänmaito, jotka on lueteltu liitteessä I nimikkeessä 0401; muut elintarvikkeet nimikkeissä 0401, 0402, 0405 00 ja 0406 alaviitteiden (2) ja (4) mukaisesti | kuorelliset tuoreet munat, linnunmunat ja munankeltuaiset, jotka on lueteltu liitteessä I nimikkeissä 0407 00 ja 0408 (3) (4) |
| ”fentioni ja sen happianalogi, näiden sulfoksidit ja sulfonit ilmoitettuina fentionina | 0,05 (2) | 0,01 (2) | — |

2.

Lisätään direktiivin 86/363/ETY liitteessä II olevaan A osaan fentionia koskeva kohta seuraavasti:

Torjunta-ainejäämät

Enimmäismäärä mg/kg

rasva, jota on lihassa, lihavalmisteissa, muissa eläimenosissa ja eläinrasvoissa, jotka on lueteltu liitteessä I nimikkeissä ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 ja 1602 (1) (4)

lehmänmaito ja täysrasvainen lehmänmaito, jotka on lueteltu liitteessä I nimikkeessä 0401; muut elintarvikkeet nimikkeissä 0401, 0402, 0405 00 ja 0406 alaviitteiden (2) ja (4) mukaisesti

kuorelliset tuoreet munat, linnunmunat ja munankeltuaiset, jotka on lueteltu liitteessä I nimikkeissä 0407 00 ja 0408 (3) (4)

”fentioni ja sen happianalogi, näiden sulfoksidit ja sulfonit ilmoitettuina fentionina

0,05 (2)

0,01 (2)

—

---

(1)  Analyysiherkkyyden alaraja.”

(2)  Analyysiherkkyyden alaraja.”

---

LIITE III

Muutetaan direktiivin 90/642/EY liitteessä II oleva A osa seuraavasti:

| 1. | Lisätään fentionia koskeva sarake seuraavasti:









  Ryhmät ja esimerkkejä yksittäisistä tuotteista, joihin jäämien enimmäismääriä sovelletaan | Fentioni ja sen happianalogi, näiden sulfoksidit ja sulfonit ilmoitettuina fentionina |
| --- | --- | --- |
| ”1. | Tuoreet, kuivatut tai keittämättömät, jäädyttämällä ilman sokerin lisäystä säilötyt hedelmät; pähkinät | |
| | i) | SITRUSHEDELMÄT | 3 |
| | | Greipit | |
| | | Sitruunat | |
| | | Limetit | |
| | | Mandariinit (klementiinit ja muut hybridit mukaan luettuina) | |
| | | Appelsiinit | |
| | | Pomelot | |
| | | Muut | |
| | ii) | PÄHKINÄT (kuoritut tai kuorimattomat) | 0,01 (1) |
| | | Mantelit | |
| | | Parapähkinät | |
| | | Cashewpähkinät | |
| | | Kastanjat | |
| | | Kookospähkinät | |
| | | Hasselpähkinät | |
| | | Macadamiapähkinät (Queenslandin pähkinät) | |
| | | Pekaanipähkinät | |
| | | Pinjansiemenet | |
| | | Pistaasimantelit | |
| | | Saksanpähkinät | |
| | | Muut | |
| | iii) | SIEMENHEDELMÄT | 0,01 (1) |
| | | Omenat | |
| | | Päärynät | |
| | | Kvittenit | |
| | | Muut | |
| | iv) | KIVIHEDELMÄT | |
| | | Aprikoosit | |
| | | Kirsikat | 2 |
| | | Persikat (nektariinit ja niiden kaltaiset hybridit mukaan luettuina) | |
| | | Luumut | |
| | | Muut | 0,01 (1) |
| | v) | MARJAT JA PIENET HEDELMÄT | 0,01 (1) |
| | | a) | Syötäväksi ja viinin valmistukseen tarkoitetut viinirypäleet | |
| | | | Syötäväksi tarkoitetut viinirypäleet | |
| | | | Viinin valmistukseen tarkoitetut viinirypäleet | |
| | | b) | Mansikat (muut kuin luonnonvaraiset) | |
| | | c) | Vadelmat ja vatukat (muut kuin luonnonvaraiset) | |
| | | | Karhunvatukat | |
| | | | Sinivatukat | |
| | | | Loganinmarjat (jättivatukat) | |
| | | | Vadelmat | |
| | | | Muut | |
| | | d) | Muut pienet hedelmät ja marjat (muut kuin luonnonvaraiset) | |
| | | | Mustikat | |
| | | | Karpalot | |
| | | | Herukat (puna-, musta- ja valkoherukat) | |
| | | | Karviaismarjat | |
| | | | Muut | |
| | | e) | Luonnonvaraiset marjat ja hedelmät | |
| | vi) | MUUT HEDELMÄT | |
| | | Avokadot | |
| | | Banaanit | |
| | | Taatelit | |
| | | Viikunat | |
| | | Kiivit | |
| | | Kumkvatit | |
| | | Litsit | |
| | | Mangot | |
| | | Oliivit (syötäviksi tarkoitetut) | 1 |
| | | Oliivit (öljyn valmistukseen tarkoitetut) | 1 |
| | | Papaijat | |
| | | Passionhedelmät | |
| | | Ananakset | |
| | | Muut | 0,01 (1) |
| 2. | Tuoreet tai keittämättömät, jäädytetyt tai kuivatut vihannekset | 0,01 (1) |
| | i) | JUUREKSET JA JUURIMUKULAT | |
| | | Punajuurikkaat | |
| | | Porkkanat | |
| | | Kassavat | |
| | | Mukulasellerit | |
| | | Piparjuuri | |
| | | Maa-artisokat | |
| | | Palsternakat | |
| | | Juuripersiljat | |
| | | Retiisit ja retikat | |
| | | Kaurajuuret | |
| | | Bataatit | |
| | | Lantut | |
| | | Nauriit | |
| | | Jamssit | |
| | | Muut | |
| | ii) | SIPULIKASVIT | |
| | | Valkosipuli | |
| | | Sipulit | |
| | | Salottisipulit | |
| | | Varhaissipulit | |
| | | Muut | |
| | iii) | HEDELMÄVIHANNEKSET | |
| | | a) | Solanaceae-heimo | |
| | | | Tomaatit | |
| | | | Paprikat | |
| | | | Munakoisot | |
| | | | Okra | |
| | | | Muut | |
| | | b) | Syötäväkuoriset Cucurbitaceae-heimon vihannekset | |
| | | | Kurkut | |
| | | | Pikkukurkut | |
| | | | Kesäkurpitsat | |
| | | | Muut | |
| | | c) | Paksukuoriset Cucurbitaceae-heimon vihannekset | |
| | | | Melonit | |
| | | | Kurpitsat | |
| | | | Vesimelonit | |
| | | | Muut | |
| | | d) | Sokerimaissi | |
| | iv) | KAALIKASVIT | |
| | | a) | Kukinnon muodostavat kaalit | |
| | | | Parsakaalit | |
| | | | Kukkakaali | |
| | | | Muut | |
| | | b) | Kerivät kaalit | |
| | | | Ruusukaali | |
| | | | Keräkaali | |
| | | | Muut | |
| | | c) | Lehtikaalit | |
| | | | Kiinankaalit | |
| | | | Lehtikaali | |
| | | | Muut | |
| | | d) | Kyssäkaali | |
| | v) | LEHTIVIHANNEKSET JA TUOREET YRTIT | |
| | | a) | Lehtisalaatti ja sen kaltaiset vihannekset | |
| | | | Vihanneskrassi | |
| | | | Vuonankaali | |
| | | | Lehtisalaatti | |
| | | | Siloendiivi | |
| | | | Sinappikaali (rucola) | |
| | | | Kaalikasvien lehdet ja lehtiruodit | |
| | | | Muut | |
| | | b) | Pinaatti ja sen kaltaiset | |
| | | | Pinaatti | |
| | | | Mangoldi (lehtijuurikas) | |
| | | | Muut | |
| | | c) | Vesikrassi | |
| | | d) | Sikuri | |
| | | e) | Yrtit | |
| | | | Kirveli | |
| | | | Ruohosipuli | |
| | | | Persilja | |
| | | | Yrttiselleri | |
| | | | Muut | |
| | vi) | PALKOVIHANNEKSET (tuoreet) | |
| | | Pavut (silpimättömät) | |
| | | Pavut (silvityt) | |
| | | Herneet (silpimättömät) | |
| | | Herneet (silvityt) | |
| | | Muut | |
| | vii) | VARSIVIHANNEKSET (tuoreet) | |
| | | Parsat | |
| | | Kardoni | |
| | | Lehtisellerit | |
| | | Fenkoli | |
| | | Latva-artisokka | |
| | | Purjo | |
| | | Raparperi | |
| | | Muut | |
| | viii) | SIENET | |
| | | a) | Viljellyt sienet | |
| | | b) | Luonnonvaraiset sienet | |
| 3. | Kuivatut palkokasvit | 0,01 (1) |
| | Pavut | |
| | Linssit | |
| | Herneet | |
| | Muut | |
| 4. | Öljysiemenet | 0,02 (1) |
| | Pellavansiemenet | |
| | Maapähkinät | |
| | Unikonsiemenet | |
| | Seesaminsiemenet | |
| | Auringonkukansiemenet | |
| | Rapsinsiemenet | |
| | Soijapavut | |
| | Sinapinsiemenet | |
| | Puuvillansiemenet | |
| | Hampunsiemenet | |
| | Muut | |
| 5. | Perunat | 0,01 (1) |
| | Varhaisperunat | |
| | Varastoperunat | |
| 6. | Tee (kuivatut lehdet ja lehtiruodit, fermentoitu ja muu, Camellia sinensis -laji) | 0,1 (1) |
| 7. | Humala (kuivattu), humalan siemenet ja tähkäjauhe mukaan luettuina | 0,1 (1) |

1.

Lisätään fentionia koskeva sarake seuraavasti:

Ryhmät ja esimerkkejä yksittäisistä tuotteista, joihin jäämien enimmäismääriä sovelletaan

Fentioni ja sen happianalogi, näiden sulfoksidit ja sulfonit ilmoitettuina fentionina

”1.

Tuoreet, kuivatut tai keittämättömät, jäädyttämällä ilman sokerin lisäystä säilötyt hedelmät; pähkinät

i)

SITRUSHEDELMÄT

3

Greipit

Sitruunat

Limetit

Mandariinit (klementiinit ja muut hybridit mukaan luettuina)

Appelsiinit

Pomelot

Muut

ii)

PÄHKINÄT (kuoritut tai kuorimattomat)

0,01 (1)

Mantelit

Parapähkinät

Cashewpähkinät

Kastanjat

Kookospähkinät

Hasselpähkinät

Macadamiapähkinät (Queenslandin pähkinät)

Pekaanipähkinät

Pinjansiemenet

Pistaasimantelit

Saksanpähkinät

Muut

iii)

SIEMENHEDELMÄT

0,01 (1)

Omenat

Päärynät

Kvittenit

Muut

iv)

KIVIHEDELMÄT

Aprikoosit

Kirsikat

2

Persikat (nektariinit ja niiden kaltaiset hybridit mukaan luettuina)

Luumut

Muut

0,01 (1)

v)

MARJAT JA PIENET HEDELMÄT

0,01 (1)

a)

Syötäväksi ja viinin valmistukseen tarkoitetut viinirypäleet

Syötäväksi tarkoitetut viinirypäleet

Viinin valmistukseen tarkoitetut viinirypäleet

b)

Mansikat (muut kuin luonnonvaraiset)

c)

Vadelmat ja vatukat (muut kuin luonnonvaraiset)

Karhunvatukat

Sinivatukat

Loganinmarjat (jättivatukat)

Vadelmat

Muut

d)

Muut pienet hedelmät ja marjat (muut kuin luonnonvaraiset)

Mustikat

Karpalot

Herukat (puna-, musta- ja valkoherukat)

Karviaismarjat

Muut

e)

Luonnonvaraiset marjat ja hedelmät

vi)

MUUT HEDELMÄT

Avokadot

Banaanit

Taatelit

Viikunat

Kiivit

Kumkvatit

Litsit

Mangot

Oliivit (syötäviksi tarkoitetut)

1

Oliivit (öljyn valmistukseen tarkoitetut)

1

Papaijat

Passionhedelmät

Ananakset

Muut

0,01 (1)

2.

Tuoreet tai keittämättömät, jäädytetyt tai kuivatut vihannekset

0,01 (1)

i)

JUUREKSET JA JUURIMUKULAT

Punajuurikkaat

Porkkanat

Kassavat

Mukulasellerit

Piparjuuri

Maa-artisokat

Palsternakat

Juuripersiljat

Retiisit ja retikat

Kaurajuuret

Bataatit

Lantut

Nauriit

Jamssit

Muut

ii)

SIPULIKASVIT

Valkosipuli

Sipulit

Salottisipulit

Varhaissipulit

Muut

iii)

HEDELMÄVIHANNEKSET

a)

Solanaceae-heimo

Tomaatit

Paprikat

Munakoisot

Okra

Muut

b)

Syötäväkuoriset Cucurbitaceae-heimon vihannekset

Kurkut

Pikkukurkut

Kesäkurpitsat

Muut

c)

Paksukuoriset Cucurbitaceae-heimon vihannekset

Melonit

Kurpitsat

Vesimelonit

Muut

d)

Sokerimaissi

iv)

KAALIKASVIT

a)

Kukinnon muodostavat kaalit

Parsakaalit

Kukkakaali

Muut

b)

Kerivät kaalit

Ruusukaali

Keräkaali

Muut

c)

Lehtikaalit

Kiinankaalit

Lehtikaali

Muut

d)

Kyssäkaali

v)

LEHTIVIHANNEKSET JA TUOREET YRTIT

a)

Lehtisalaatti ja sen kaltaiset vihannekset

Vihanneskrassi

Vuonankaali

Lehtisalaatti

Siloendiivi

Sinappikaali (rucola)

Kaalikasvien lehdet ja lehtiruodit

Muut

b)

Pinaatti ja sen kaltaiset

Pinaatti

Mangoldi (lehtijuurikas)

Muut

c)

Vesikrassi

d)

Sikuri

e)

Yrtit

Kirveli

Ruohosipuli

Persilja

Yrttiselleri

Muut

vi)

PALKOVIHANNEKSET (tuoreet)

Pavut (silpimättömät)

Pavut (silvityt)

Herneet (silpimättömät)

Herneet (silvityt)

Muut

vii)

VARSIVIHANNEKSET (tuoreet)

Parsat

Kardoni

Lehtisellerit

Fenkoli

Latva-artisokka

Purjo

Raparperi

Muut

viii)

SIENET

a)

Viljellyt sienet

b)

Luonnonvaraiset sienet

3.

Kuivatut palkokasvit

0,01 (1)

Pavut

Linssit

Herneet

Muut

4.

Öljysiemenet

0,02 (1)

Pellavansiemenet

Maapähkinät

Unikonsiemenet

Seesaminsiemenet

Auringonkukansiemenet

Rapsinsiemenet

Soijapavut

Sinapinsiemenet

Puuvillansiemenet

Hampunsiemenet

Muut

5.

Perunat

0,01 (1)

Varhaisperunat

Varastoperunat

6.

Tee (kuivatut lehdet ja lehtiruodit, fermentoitu ja muu, Camellia sinensis -laji)

0,1 (1)

7.

Humala (kuivattu), humalan siemenet ja tähkäjauhe mukaan luettuina

0,1 (1)

| 2. | Korvataan atratsiinia, atsinfossietyylia, syflutriinia, etefonia, metamidofossia, metomyylia, parakvaattia ja triatsofossia koskevat sarakkeet seuraavasti:
















  Ryhmät ja esimerkkejä yksittäisistä tuotteista, joihin jäämien enimmäismääriä sovelletaan | Atratsiini | Atsinfossietyyli | Syflutriini mukaan luettuina sen isomeerien muut seokset (isomeerien summa) | Etefoni | Metamidofossi | Metomyyli/tiodikarbi (summa ilmaistuna metomyylinä) | Parakvaatti | Triatsofossi |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| ”1. | Tuoreet, kuivatut tai keittämättömät, jäädyttämällä ilman sokerin lisäystä säilötyt hedelmät; pähkinät | 0,05 (2) | 0,02 (2) | | | | | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | i) | SITRUSHEDELMÄT | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | | | |
| | | Greipit | | | | | | 0,5 | | |
| | | Sitruunat | | | | | | 1 | | |
| | | Limetit | | | | | | 1 | | |
| | | Mandariinit (klementiinit ja muut hybridit mukaan luettuina) | | | | | | 1 | | |
| | | Appelsiinit | | | | | | 0,5 | | |
| | | Pomelot | | | | | | 0,5 | | |
| | | Muut | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | ii) | PÄHKINÄT (kuoritut tai kuorimattomat) | | | 0,02 (2) | 0,1 | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | Mantelit | | | | | | | | |
| | | Parapähkinät | | | | | | | | |
| | | Cashewpähkinät | | | | | | | | |
| | | Kastanjat | | | | | | | | |
| | | Kookospähkinät | | | | | | | | |
| | | Hasselpähkinät | | | | | | | | |
| | | Macadamiapähkinät (Queenslandin pähkinät) | | | | | | | | |
| | | Pekaanipähkinät | | | | | | | | |
| | | Pinjansiemenet | | | | | | | | |
| | | Pistaasimantelit | | | | | | | | |
| | | Saksanpähkinät | | | | | | | | |
| | | Muut | | | | | | | | |
| | iii) | SIEMENHEDELMÄT | | | 0,2 | | 0,01 (2) | 0,2 | | |
| | | Omenat | | | | 0,5 | | | | |
| | | Päärynät | | | | | | | | |
| | | Kvittenit | | | | | | | | |
| | | Muut | | | | 0,05 (2) | | | | |
| | iv) | KIVIHEDELMÄT | | | | | | | | |
| | | Aprikoosit | | | 0,3 | | 0,1 | 0,2 | | |
| | | Kirsikat | | | 0,2 | 3 | | 0,1 | | |
| | | Persikat (nektariinit ja niiden kaltaiset hybridit mukaan luettuina) | | | 0,3 | | 0,05 | 0,2 | | |
| | | Luumut | | | 0,2 | | | 0,5 | | |
| | | Muut | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | v) | MARJAT JA PIENET HEDELMÄT | | | | | 0,01 (2) | | | |
| | | a) | Syötäväksi ja viinin valmistukseen tarkoitetut viinirypäleet | | | 0,3 | 1 | | | | |
| | | | Syötäväksi tarkoitetut viinirypäleet | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | | | Viinin valmistukseen tarkoitetut viinirypäleet | | | | | | 1 | | |
| | | b) | Mansikat (muut kuin luonnonvaraiset) | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | c) | Vadelmat ja vatukat (muut kuin luonnonvaraiset) | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | | Karhunvatukat | | | | | | | | |
| | | | Sinivatukat | | | | | | | | |
| | | | Loganinmarjat (jättivatukat) | | | | | | | | |
| | | | Vadelmat | | | | | | | | |
| | | | Muut | | | | | | | | |
| | | d) | Muut pienet hedelmät ja marjat (muut kuin luonnonvaraiset) | | | 0,02 (2) | | | 0,05 (2) | | |
| | | | Mustikat | | | | | | | | |
| | | | Karpalot | | | | | | | | |
| | | | Herukat (puna-, musta- ja valkoherukat) | | | | 5 | | | | |
| | | | Karviaismarjat | | | | | | | | |
| | | | Muut | | | | 0,05 (2) | | | | |
| | | e) | Luonnonvaraiset marjat ja hedelmät | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | vi) | MUUT HEDELMÄT | | | 0,02 (2) | | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | Avokadot | | | | | | | | |
| | | Banaanit | | | | | | | | |
| | | Taatelit | | | | | | | | |
| | | Viikunat | | | | | | | | |
| | | Kiivit | | | | | | | | |
| | | Kumkvatit | | | | | | | | |
| | | Litsit | | | | | | | | |
| | | Mangot | | | | | | | | |
| | | Oliivit (syötäviksi tarkoitetut) | | | | | | | | |
| | | Oliivit (öljyn valmistukseen tarkoitetut) | | | | | | | | |
| | | Papaijat | | | | | | | | |
| | | Passionhedelmät | | | | | | | | |
| | | Ananakset | | | | 2 | | | | |
| | | Muut | | | | 0,05 (2) | | | | |
| 2. | Tuoreet tai keittämättömät, jäädytetyt tai kuivatut vihannekset | | 0,02 (2) | | | | | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | i) | JUUREKSET JA JUURIMUKULAT | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | | | |
| | | Punajuurikkaat | | | | | | | | |
| | | Porkkanat | | | | | | | | |
| | | Kassavat | | | | | | | | |
| | | Mukulasellerit | | | | | | | | |
| | | Piparjuuri | | | | | | | | |
| | | Maa-artisokat | | | | | | | | |
| | | Palsternakat | | | | | | | | |
| | | Juuripersiljat | | | | | | | | |
| | | Retiisit ja retikat | | | | | | 0,5 | | |
| | | Kaurajuuret | | | | | | | | |
| | | Bataatit | | | | | | | | |
| | | Lantut | | | | | | | | |
| | | Nauriit | | | | | | | | |
| | | Jamssit | | | | | | | | |
| | | Muut | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | ii) | SIPULIKASVIT | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | Valkosipuli | | | | | | | | |
| | | Sipulit | | | | | | | | |
| | | Salottisipulit | | | | | | | | |
| | | Varhaissipulit | | | | | | | | |
| | | Muut | | | | | | | | |
| | iii) | HEDELMÄVIHANNEKSET | | | | | 0,01 (2) | | | |
| | | a) | Solanaceae-heimo | 0,05 (2) | | | | | | | |
| | | | Tomaatit | | | 0,05 | 1 | | 0,2 | | |
| | | | Paprikat | | | 0,3 | 3 | | | | |
| | | | Munakoisot | | | | | | 0,2 | | |
| | | | Okra | | | | | | | | |
| | | | Muut | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | b) | Syötäväkuoriset Cucurbitaceae-heimon vihannekset | 0,05 (2) | | | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | | Kurkut | | | 0,1 | | | | | |
| | | | Pikkukurkut | | | | | | | | |
| | | | Kesäkurpitsat | | | | | | | | |
| | | | Muut | | | 0,02 (2) | | | | | |
| | | c) | Paksukuoriset Cucurbitaceae-heimon vihannekset | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | | Melonit | | | | | | | | |
| | | | Kurpitsat | | | | | | | | |
| | | | Vesimelonit | | | | | | | | |
| | | | Muut | | | | | | | | |
| | | d) | Sokerimaissi | 0,1 | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | iv) | KAALIKASVIT | 0,05 (2) | | | 0,05 (2) | | | | |
| | | a) | Kukinnon muodostavat kaalit | | | 0,05 | | 0,02 | | | |
| | | | Parsakaalit | | | | | | 0,2 | | |
| | | | Kukkakaali | | | | | | | | |
| | | | Muut | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | | b) | Kerivät kaalit | | | 0,2 | | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | | Ruusukaali | | | | | | | | |
| | | | Keräkaali | | | | | | | | |
| | | | Muut | | | | | | | | |
| | | c) | Lehtikaalit | | | 0,3 | | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | | Kiinankaalit | | | | | | | | |
| | | | Lehtikaali | | | | | | | | |
| | | | Muut | | | | | | | | |
| | | d) | Kyssäkaali | | | 0,02 (2) | | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | v) | LEHTIVIHANNEKSET JA TUOREET YRTIT | 0,05 (2) | | | 0,05 (2) | 0,01 (2) | | | |
| | | a) | Lehtisalaatti ja sen kaltaiset vihannekset | | | 0,5 | | | | | |
| | | | Vihanneskrassi | | | | | | | | |
| | | | Vuonankaali | | | | | | | | |
| | | | Lehtisalaatti | | | | | | 0,3 | | |
| | | | Siloendiivi | | | | | | | | |
| | | | Sinappikaali (rucola) | | | | | | | | |
| | | | Kaalikasvien lehdet ja lehtiruodit | | | | | | | | |
| | | | Muut | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | | b) | Pinaatti ja sen kaltaiset | | | 0,02 (2) | | | | | |
| | | | Pinaatti | | | | | | 0,05 | | |
| | | | Mangoldi (lehtijuurikas) | | | | | | | | |
| | | | Muut | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | | c) | Vesikrassi | | | 0,02 (2) | | | 0,05 (2) | | |
| | | d) | Sikuri | | | 0,02 (2) | | | 0,05 (2) | | |
| | | e) | Yrtit | | | 0,02 (2) | | | 0,3 | | |
| | | | Kirveli | | | | | | | | |
| | | | Ruohosipuli | | | | | | | | |
| | | | Persilja | | | | | | | | |
| | | | Yrttiselleri | | | | | | | | |
| | | | Muut | | | | | | | | |
| | vi) | PALKOVI-HANNEKSET (tuoreet) | 0,05 (2) | | 0,05 | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | Pavut (silpimättömät) | | | | | 0,5 | | | |
| | | Pavut (silvityt) | | | | | | | | |
| | | Herneet (silpimättömät) | | | | | 0,5 | | | |
| | | Herneet (silvityt) | | | | | | | | |
| | | Muut | | | | | 0,01 (2) | | | |
| | vii) | VARSIVIHANNEKSET (tuoreet) | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | Parsat | | | | | | | | |
| | | Kardoni | | | | | | | | |
| | | Lehtisellerit | | | | | | | | |
| | | Fenkoli | | | | | | | | |
| | | Latva-artisokka | | | | | 0,1 | | | |
| | | Purjo | | | | | | | | |
| | | Raparperi | | | | | | | | |
| | | Muut | | | | | 0,01 (2) | | | |
| | viii) | SIENET | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | a) | Viljellyt sienet | | | | | | | | |
| | | b) | Luonnonvaraiset sienet | | | | | | | | |
| 3. | Kuivatut palkokasvit | 0,05 (2) | 0,02 (2) | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | Pavut | | | | | | | | |
| | Linssit | | | | | | | | |
| | Herneet | | | | | | | | |
| | Muut | | | | | | | | |
| 4. | Öljysiemenet | 0,05 (2) | 0,02 (2) | | | | | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | Pellavansiemenet | | | | | | | | |
| | Maapähkinät | | | | | | 0,1 | | |
| | Unikonsiemenet | | | | | | | | |
| | Seesaminsiemenet | | | | | | | | |
| | Auringonkukansiemenet | | | | | | | | |
| | Rapsinsiemenet | | | 0,05 | | | | | |
| | Soijapavut | | | | | 0,2 | 0,1 | | |
| | Sinapinsiemenet | | | | | | | | |
| | Puuvillansiemenet | | | | 2 | 0,2 | 0,1 | | |
| | Hampunsiemenet | | | | | | | | |
| | Muut | | | 0,02 (2) | 0,1 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| 5. | Perunat | 0,05 (2) | 0,02 (2) | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | Varhaisperunat | | | | | | | | |
| | Varastoperunat | | | | | | | | |
| 6. | Tee (kuivatut lehdet ja lehtiruodit, fermentoitu ja muu, Camellia sinensis -laji) | 0,1 (2) | 0,05 (2) | 0,1 (2) | 0,1 (2) | 0,02 (2) | 0,1 (2) | 0,05 (2) | 0,02 (2) |
| 7. | Humala (kuivattu), humalan siemenet ja tähkäjauhe mukaan luettuina | 0,1 (2) | 0,05 (2) | 20 | 0,1 (2) | 0,02 (2) | 10 | 0,05 (2) | 0,02 (2) |

2.

Korvataan atratsiinia, atsinfossietyylia, syflutriinia, etefonia, metamidofossia, metomyylia, parakvaattia ja triatsofossia koskevat sarakkeet seuraavasti:

Ryhmät ja esimerkkejä yksittäisistä tuotteista, joihin jäämien enimmäismääriä sovelletaan

Atratsiini

Atsinfossietyyli

Syflutriini mukaan luettuina sen isomeerien muut seokset (isomeerien summa)

Etefoni

Metamidofossi

Metomyyli/tiodikarbi (summa ilmaistuna metomyylinä)

Parakvaatti

Triatsofossi

”1.

Tuoreet, kuivatut tai keittämättömät, jäädyttämällä ilman sokerin lisäystä säilötyt hedelmät; pähkinät

0,05 (2)

0,02 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

i)

SITRUSHEDELMÄT

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

Greipit

0,5

Sitruunat

1

Limetit

1

Mandariinit (klementiinit ja muut hybridit mukaan luettuina)

1

Appelsiinit

0,5

Pomelot

0,5

Muut

0,05 (2)

ii)

PÄHKINÄT (kuoritut tai kuorimattomat)

0,02 (2)

0,1

0,01 (2)

0,05 (2)

Mantelit

Parapähkinät

Cashewpähkinät

Kastanjat

Kookospähkinät

Hasselpähkinät

Macadamiapähkinät (Queenslandin pähkinät)

Pekaanipähkinät

Pinjansiemenet

Pistaasimantelit

Saksanpähkinät

Muut

iii)

SIEMENHEDELMÄT

0,2

0,01 (2)

0,2

Omenat

0,5

Päärynät

Kvittenit

Muut

0,05 (2)

iv)

KIVIHEDELMÄT

Aprikoosit

0,3

0,1

0,2

Kirsikat

0,2

3

0,1

Persikat (nektariinit ja niiden kaltaiset hybridit mukaan luettuina)

0,3

0,05

0,2

Luumut

0,2

0,5

Muut

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

v)

MARJAT JA PIENET HEDELMÄT

0,01 (2)

a)

Syötäväksi ja viinin valmistukseen tarkoitetut viinirypäleet

0,3

1

Syötäväksi tarkoitetut viinirypäleet

0,05 (2)

Viinin valmistukseen tarkoitetut viinirypäleet

1

b)

Mansikat (muut kuin luonnonvaraiset)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

c)

Vadelmat ja vatukat (muut kuin luonnonvaraiset)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

Karhunvatukat

Sinivatukat

Loganinmarjat (jättivatukat)

Vadelmat

Muut

d)

Muut pienet hedelmät ja marjat (muut kuin luonnonvaraiset)

0,02 (2)

0,05 (2)

Mustikat

Karpalot

Herukat (puna-, musta- ja valkoherukat)

5

Karviaismarjat

Muut

0,05 (2)

e)

Luonnonvaraiset marjat ja hedelmät

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

vi)

MUUT HEDELMÄT

0,02 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

Avokadot

Banaanit

Taatelit

Viikunat

Kiivit

Kumkvatit

Litsit

Mangot

Oliivit (syötäviksi tarkoitetut)

Oliivit (öljyn valmistukseen tarkoitetut)

Papaijat

Passionhedelmät

Ananakset

2

Muut

0,05 (2)

2.

Tuoreet tai keittämättömät, jäädytetyt tai kuivatut vihannekset

0,02 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

i)

JUUREKSET JA JUURIMUKULAT

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

Punajuurikkaat

Porkkanat

Kassavat

Mukulasellerit

Piparjuuri

Maa-artisokat

Palsternakat

Juuripersiljat

Retiisit ja retikat

0,5

Kaurajuuret

Bataatit

Lantut

Nauriit

Jamssit

Muut

0,05 (2)

ii)

SIPULIKASVIT

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

Valkosipuli

Sipulit

Salottisipulit

Varhaissipulit

Muut

iii)

HEDELMÄVIHANNEKSET

0,01 (2)

a)

Solanaceae-heimo

0,05 (2)

Tomaatit

0,05

1

0,2

Paprikat

0,3

3

Munakoisot

0,2

Okra

Muut

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

b)

Syötäväkuoriset Cucurbitaceae-heimon vihannekset

0,05 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

Kurkut

0,1

Pikkukurkut

Kesäkurpitsat

Muut

0,02 (2)

c)

Paksukuoriset Cucurbitaceae-heimon vihannekset

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

Melonit

Kurpitsat

Vesimelonit

Muut

d)

Sokerimaissi

0,1

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

iv)

KAALIKASVIT

0,05 (2)

0,05 (2)

a)

Kukinnon muodostavat kaalit

0,05

0,02

Parsakaalit

0,2

Kukkakaali

Muut

0,05 (2)

b)

Kerivät kaalit

0,2

0,01 (2)

0,05 (2)

Ruusukaali

Keräkaali

Muut

c)

Lehtikaalit

0,3

0,01 (2)

0,05 (2)

Kiinankaalit

Lehtikaali

Muut

d)

Kyssäkaali

0,02 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

v)

LEHTIVIHANNEKSET JA TUOREET YRTIT

0,05 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

a)

Lehtisalaatti ja sen kaltaiset vihannekset

0,5

Vihanneskrassi

Vuonankaali

Lehtisalaatti

0,3

Siloendiivi

Sinappikaali (rucola)

Kaalikasvien lehdet ja lehtiruodit

Muut

0,05 (2)

b)

Pinaatti ja sen kaltaiset

0,02 (2)

Pinaatti

0,05

Mangoldi (lehtijuurikas)

Muut

0,05 (2)

c)

Vesikrassi

0,02 (2)

0,05 (2)

d)

Sikuri

0,02 (2)

0,05 (2)

e)

Yrtit

0,02 (2)

0,3

Kirveli

Ruohosipuli

Persilja

Yrttiselleri

Muut

vi)

PALKOVI-HANNEKSET (tuoreet)

0,05 (2)

0,05

0,05 (2)

0,05 (2)

Pavut (silpimättömät)

0,5

Pavut (silvityt)

Herneet (silpimättömät)

0,5

Herneet (silvityt)

Muut

0,01 (2)

vii)

VARSIVIHANNEKSET (tuoreet)

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

Parsat

Kardoni

Lehtisellerit

Fenkoli

Latva-artisokka

0,1

Purjo

Raparperi

Muut

0,01 (2)

viii)

SIENET

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

a)

Viljellyt sienet

b)

Luonnonvaraiset sienet

3.

Kuivatut palkokasvit

0,05 (2)

0,02 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

Pavut

Linssit

Herneet

Muut

4.

Öljysiemenet

0,05 (2)

0,02 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

Pellavansiemenet

Maapähkinät

0,1

Unikonsiemenet

Seesaminsiemenet

Auringonkukansiemenet

Rapsinsiemenet

0,05

Soijapavut

0,2

0,1

Sinapinsiemenet

Puuvillansiemenet

2

0,2

0,1

Hampunsiemenet

Muut

0,02 (2)

0,1 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

5.

Perunat

0,05 (2)

0,02 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

Varhaisperunat

Varastoperunat

6.

Tee (kuivatut lehdet ja lehtiruodit, fermentoitu ja muu, Camellia sinensis -laji)

0,1 (2)

0,05 (2)

0,1 (2)

0,1 (2)

0,02 (2)

0,1 (2)

0,05 (2)

0,02 (2)

7.

Humala (kuivattu), humalan siemenet ja tähkäjauhe mukaan luettuina

0,1 (2)

0,05 (2)

20

0,1 (2)

0,02 (2)

10

0,05 (2)

0,02 (2)

---

(1)  Analyysiherkkyyden alaraja.”

(2)  Analyysiherkkyyden alaraja.”

---

| 27.7.2006 | FI | Euroopan unionin virallinen lehti | L 206/27 |
| --- | --- | --- | --- |

27.7.2006

FI

Euroopan unionin virallinen lehti

L 206/27

---

KOMISSION DIREKTIIVI 2006/62/EY,

annettu 12 päivänä heinäkuuta 2006,

neuvoston direktiivien 76/895/ETY, 86/362/ETY, 86/363/ETY ja 90/642/ETY liitteiden muuttamisesta desmedifaamin, fenmedifaamin ja klorfenvinfossin jäämien enimmäismäärien osalta

(ETA:n kannalta merkityksellinen teksti)

EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka

ottaa huomioon Euroopan yhteisön perustamissopimuksen,

ottaa huomioon hedelmien ja vihannesten torjunta-ainejäämien enimmäismäärien vahvistamisesta 23 päivänä marraskuuta 1976 annetun neuvoston direktiivin 76/895/ETY (1) ja erityisesti sen 5 artiklan,

ottaa huomioon viljojen torjunta-ainejäämien enimmäismääristä 24 päivänä heinäkuuta 1986 annetun neuvoston direktiivin 86/362/ETY (2) ja erityisesti sen 10 artiklan,

ottaa huomioon eläinkunnasta peräisin olevissa elintarvikkeissa ja niiden pinnassa olevien torjunta-ainejäämien enimmäismäärien vahvistamisesta 24 päivänä heinäkuuta 1986 annetun neuvoston direktiivin 86/363/ETY (3) ja erityisesti sen 10 artiklan,

ottaa huomioon torjunta-ainejäämien enimmäismäärien vahvistamisesta tietyille kasvikunnasta peräisin oleville tuotteille, mukaan lukien hedelmät ja vihannekset, 27 päivänä marraskuuta 1990 annetun neuvoston direktiivin 90/642/ETY (4) ja erityisesti sen 7 artiklan,

ottaa huomioon kasvinsuojeluaineiden markkinoille saattamisesta 15 päivänä heinäkuuta 1991 annetun neuvoston direktiivin 91/414/ETY (5) ja erityisesti sen 4 artiklan 1 kohdan f alakohdan,

sekä katsoo seuraavaa:

| (1) | Tehoaineet desmedifaami ja fenmedifaami sisällytettiin direktiivin 91/414/ETY liitteeseen I komission direktiivillä 2004/58/EY (6). |
| --- | --- |

(1)

Tehoaineet desmedifaami ja fenmedifaami sisällytettiin direktiivin 91/414/ETY liitteeseen I komission direktiivillä 2004/58/EY (6).

| (2) | Kyseisten tehoaineiden sisällyttäminen direktiivin 91/414/ETY liitteeseen I perustui ehdotettua käyttötarkoitusta koskevien toimitettujen tietojen arviointiin. Eräät jäsenvaltiot ovat toimittaneet tätä käyttötarkoitusta koskevia tietoja direktiivin 91/414/ETY 4 artiklan 1 kohdan f alakohdan mukaisesti. Käytettävissä olevat tiedot on käyty läpi, ja ne riittävät tiettyjen jäämien enimmäismäärien vahvistamiseen. |
| --- | --- |

(2)

Kyseisten tehoaineiden sisällyttäminen direktiivin 91/414/ETY liitteeseen I perustui ehdotettua käyttötarkoitusta koskevien toimitettujen tietojen arviointiin. Eräät jäsenvaltiot ovat toimittaneet tätä käyttötarkoitusta koskevia tietoja direktiivin 91/414/ETY 4 artiklan 1 kohdan f alakohdan mukaisesti. Käytettävissä olevat tiedot on käyty läpi, ja ne riittävät tiettyjen jäämien enimmäismäärien vahvistamiseen.

| (3) | Komission asetuksella (EY) N:o 2076/2002 (7) on päätetty olla lisäämättä klorfenvinfossia direktiivin 91/414/ETY liitteeseen I. Tiettyjen jäsenvaltioiden sallitaan pitää tietyt klorfenvinfossia sisältävien tuotteiden käyttöä koskevat luvat voimassa 30 päivään kesäkuuta 2007. |
| --- | --- |

(3)

Komission asetuksella (EY) N:o 2076/2002 (7) on päätetty olla lisäämättä klorfenvinfossia direktiivin 91/414/ETY liitteeseen I. Tiettyjen jäsenvaltioiden sallitaan pitää tietyt klorfenvinfossia sisältävien tuotteiden käyttöä koskevat luvat voimassa 30 päivään kesäkuuta 2007.

| (4) | Yhteisössä sovellettavat jäämien enimmäismäärät klorfenvinfossille sisältyvät jo direktiiviin 76/895/ETY. Ne olisi otettava huomioon, kun klorfenvinfossille asetetaan jäämien enimmäismääriä direktiivissä 90/642/ETY. |
| --- | --- |

(4)

Yhteisössä sovellettavat jäämien enimmäismäärät klorfenvinfossille sisältyvät jo direktiiviin 76/895/ETY. Ne olisi otettava huomioon, kun klorfenvinfossille asetetaan jäämien enimmäismääriä direktiivissä 90/642/ETY.

| (5) | Komission tarkastelukertomuksissa, jotka on laadittu kyseisten tehoaineiden sisällyttämiseksi direktiivin 91/414/ETY liitteeseen I, vahvistetaan kyseisten aineiden hyväksyttävä päiväsaanti (ADI-arvo) ja tarvittaessa akuutin altistumisen viiteannos (ARfD). Kyseisillä tehoaineilla käsiteltyjen elintarvikkeiden kuluttajien altistumista on arvioitu yhteisön menettelyjen mukaisesti. Lisäksi on otettu huomioon Maailman terveysjärjestön julkaisemat ohjeet (8) ja kasveja käsittelevän tiedekomitean lausunto (9) käytetyistä menetelmistä. Jäämien ehdotettujen enimmäismäärien ei katsota johtavan hyväksyttävien päiväsaantien tai akuutin altistumisen viiteannosten ylittymiseen. |
| --- | --- |

(5)

Komission tarkastelukertomuksissa, jotka on laadittu kyseisten tehoaineiden sisällyttämiseksi direktiivin 91/414/ETY liitteeseen I, vahvistetaan kyseisten aineiden hyväksyttävä päiväsaanti (ADI-arvo) ja tarvittaessa akuutin altistumisen viiteannos (ARfD). Kyseisillä tehoaineilla käsiteltyjen elintarvikkeiden kuluttajien altistumista on arvioitu yhteisön menettelyjen mukaisesti. Lisäksi on otettu huomioon Maailman terveysjärjestön julkaisemat ohjeet (8) ja kasveja käsittelevän tiedekomitean lausunto (9) käytetyistä menetelmistä. Jäämien ehdotettujen enimmäismäärien ei katsota johtavan hyväksyttävien päiväsaantien tai akuutin altistumisen viiteannosten ylittymiseen.

| (6) | Jotta taattaisiin, että kuluttajia suojellaan riittävästi altistumiselta jäämille, jotka ovat peräisin kasvinsuojeluaineiden luvattomasta käytöstä, olisi aiheellista vahvistaa, että jäämien väliaikainen enimmäismäärä asianomaisissa tuote/torjunta-aine-yhdistelmissä on sama kuin analyysiherkkyyden alaraja. |
| --- | --- |

(6)

Jotta taattaisiin, että kuluttajia suojellaan riittävästi altistumiselta jäämille, jotka ovat peräisin kasvinsuojeluaineiden luvattomasta käytöstä, olisi aiheellista vahvistaa, että jäämien väliaikainen enimmäismäärä asianomaisissa tuote/torjunta-aine-yhdistelmissä on sama kuin analyysiherkkyyden alaraja.

| (7) | Tällaiset yhteisön tasolla vahvistettavat jäämien väliaikaiset enimmäismäärät eivät estä jäsenvaltioita vahvistamasta kyseisille aineille väliaikaista jäämien enimmäismäärää direktiivin 91/414/ETY 4 artiklan 1 kohdan f alakohdan ja liitteen VI mukaisesti. Neljää vuotta on pidettävä riittävänä ajanjaksona, jonka kuluessa asianomaisen tehoaineen tulevat käyttötarkoitukset voidaan vahvistaa. Tämän ajanjakson jälkeen jäämien väliaikaisen enimmäismäärän pitäisi muuttua lopulliseksi. |
| --- | --- |

(7)

Tällaiset yhteisön tasolla vahvistettavat jäämien väliaikaiset enimmäismäärät eivät estä jäsenvaltioita vahvistamasta kyseisille aineille väliaikaista jäämien enimmäismäärää direktiivin 91/414/ETY 4 artiklan 1 kohdan f alakohdan ja liitteen VI mukaisesti. Neljää vuotta on pidettävä riittävänä ajanjaksona, jonka kuluessa asianomaisen tehoaineen tulevat käyttötarkoitukset voidaan vahvistaa. Tämän ajanjakson jälkeen jäämien väliaikaisen enimmäismäärän pitäisi muuttua lopulliseksi.

| (8) | Sen vuoksi kaikki näiden kasvinsuojeluaineiden käytöstä johtuvat jäämien enimmäismäärät on tarpeen lisätä direktiivien 86/362/ETY, 86/363/ETY ja 90/642/ETY liitteisiin niiden käyttökiellon asianmukaisen valvonnan mahdollistamiseksi ja kuluttajien suojelemiseksi. Jos jäämien enimmäismääriä ei ole vielä määritelty, ne on aiheellista vahvistaa ensimmäisen kerran. |
| --- | --- |

(8)

Sen vuoksi kaikki näiden kasvinsuojeluaineiden käytöstä johtuvat jäämien enimmäismäärät on tarpeen lisätä direktiivien 86/362/ETY, 86/363/ETY ja 90/642/ETY liitteisiin niiden käyttökiellon asianmukaisen valvonnan mahdollistamiseksi ja kuluttajien suojelemiseksi. Jos jäämien enimmäismääriä ei ole vielä määritelty, ne on aiheellista vahvistaa ensimmäisen kerran.

| (9) | Tämän seurauksena olisi poistettava direktiivin 76/895/ETY säännökset, joilla vahvistetaan jäämien enimmäismäärät klorfenvinfossille. |
| --- | --- |

(9)

Tämän seurauksena olisi poistettava direktiivin 76/895/ETY säännökset, joilla vahvistetaan jäämien enimmäismäärät klorfenvinfossille.

| (10) | Direktiivit 76/895/ETY, 86/362/ETY, 86/363/ETY sekä 90/642/ETY olisi tämän vuoksi muutettava vastaavasti. |
| --- | --- |

(10)

Direktiivit 76/895/ETY, 86/362/ETY, 86/363/ETY sekä 90/642/ETY olisi tämän vuoksi muutettava vastaavasti.

| (11) | Tässä direktiivissä säädetyt toimenpiteet ovat elintarvikeketjua ja eläinten terveyttä käsittelevän pysyvän komitean lausunnon mukaiset, |
| --- | --- |

(11)

Tässä direktiivissä säädetyt toimenpiteet ovat elintarvikeketjua ja eläinten terveyttä käsittelevän pysyvän komitean lausunnon mukaiset,

ON ANTANUT TÄMÄN DIREKTIIVIN:

1 artikla

Poistetaan direktiivin 76/895/ETY liitteessä II oleva klorfenvinfossia koskeva kohta.

2 artikla

Muutetaan direktiivin 86/362/ETY liite II tämän direktiivin liitteen I mukaisesti.

3 artikla

Muutetaan direktiivin 86/363/ETY liite II tämän direktiivin liitteen II mukaisesti.

4 artikla

Muutetaan direktiivin 90/642/ETY liite II tämän direktiivin liitteen III mukaisesti.

5 artikla

1.   Jäsenvaltioiden on annettava ja julkaistava tämän direktiivin noudattamisen edellyttämät lait, asetukset ja hallinnolliset määräykset viimeistään 20 päivänä tammikuuta 2008. Niiden on toimitettava komissiolle viipymättä kirjallisina nämä säännökset sekä kyseisiä säännöksiä ja tätä direktiiviä koskeva vastaavuustaulukko.

Niiden on sovellettava näitä säännöksiä 21 päivästä tammikuuta 2008.

Näissä jäsenvaltioiden antamissa säännöksissä on viitattava tähän direktiiviin tai niihin on liitettävä tällainen viittaus, kun ne virallisesti julkaistaan. Jäsenvaltioiden on säädettävä siitä, miten viittaukset tehdään.

2.   Jäsenvaltioiden on toimitettava tässä direktiivissä tarkoitetuista kysymyksistä antamansa keskeiset kansalliset säännökset kirjallisina komissiolle.

6 artikla

Tämä direktiivi tulee voimaan kahdentenakymmenentenä päivänä sen jälkeen, kun se on julkaistu Euroopan unionin virallisessa lehdessä.

7 artikla

Tämä direktiivi on osoitettu kaikille jäsenvaltioille.

Tehty Brysselissä 12. päivänä heinäkuuta 2006.

Komission puolesta

Markos KYPRIANOU

Komission jäsen

---

(1)  EYVL L 340, 9.12.1976, s. 26. Direktiivi sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna komission direktiivillä 2006/59/EY (EUVL L 175, 29.6.2006, s. 61).

1

(2)  EYVL L 221, 7.8.1986, s. 37. Direktiivi sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna komission direktiivillä 2006/59/EY).

2

(3)  EYVL L 221, 7.8.1986, s. 43. Direktiivi sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna komission direktiivillä 2006/59/EY.

3

(4)  EYVL L 350, 14.12.1990, s. 71. Direktiivi sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna komission direktiivillä 2006/59/EY..

4

(5)  EYVL L 230, 19.8.1991, s. 1. Direktiivi sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna komission direktiivillä 2006/45/EY (EUVL L 130, 18.5.2006, s. 27).

5

(6)  EUVL L 120, 24.4.2004, s. 26.

6

(7)  EUVL L 319, 23.11.2002, s. 3. Asetus sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna asetuksella (EY) N.o 1335/2005 (EUVL L 211, 211, 13.8.2005, s. 6).

7

(8)  Ohjeet ravinnon mukana saatavien torjunta-ainejäämien arvioimiseksi. GEMS/Food Programme -ohjelma yhdessä elintarvikkeiden torjunta-ainejäämiä käsittelevän Codex-komitean kanssa. Maailman terveysjärjestön julkaisu, 1997 (WHO/FSF/FOS/97.7).

8

(9)  Kasveja käsittelevän tiedekomitean lausunto neuvoston direktiivien 86/362/ETY, 86/363/ETY ja 90/642/ETY liitteiden muuttamiseen liittyvistä kysymyksistä (kasveja käsittelevän tiedekomitean lausunto, 14.7.1998) (http://europa.eu.int/comm/food/fs/sc/index_en.html).

9

---

LIITE I

Lisätään direktiivin 86/362/ETY liitteessä II olevaan A osaan seuraavat desmedifaamia, fenmedifamia ja klorfenvinfossia koskevat rivit:

| Torjunta-ainejäämä | Enimmäismäärä mg/kg |
| --- | --- |
| ”Desmedifaami | 0,05 (1)
   (2) viljat |
| Fenmedifaami | 0,05 (1)
   (2) viljat |
| Klorfenvinfossi (E- ja Z-isomeerien yhteismäärä) | 0,02 (1) viljat |

Torjunta-ainejäämä

Enimmäismäärä mg/kg

”Desmedifaami

0,05 (1)
   (2) viljat

Fenmedifaami

0,05 (1)
   (2) viljat

Klorfenvinfossi (E- ja Z-isomeerien yhteismäärä)

0,02 (1) viljat

---

(1)  Analyysiherkkyyden alaraja.

1

(2)  Jäämien enimmäismäärä vahvistettu väliaikaisesti direktiivin 91/414/ETY 4 artiklan 1 kohdan f alakohdan mukaisesti.”

2

---

LIITE II

Muutetaan direktiivin 86/363/ETY liite II seuraavasti:

| (1) | Lisätään A osaan seuraava klorfenvinfossia koskeva rivi:








  Torjunta-ainejäämä | Enimmäismäärä mg/kg |
| --- | --- | --- |
| | lihassa olevassa rasvassa, lihavalmisteissa, muissa eläimenosissa ja eläinrasvoissa, jotka kuuluvat liitteessä I oleviin nimikkeisiin ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 ja 1602 (1) (4) | raakamaidossa ja täysmaidossa, jotka kuuluvat liitteessä I olevaan nimikkeeseen 0401; muissa elintarvikkeissa, jotka kuuluvat nimikkeisiin 0401, 0402, 0405 00 ja 0406 alaviitteiden (2) ja (4) mukaisesti | tuoreissa kuorettomissa munissa, linnunmunissa ja munankeltuaisissa, jotka kuuluvat liitteessä I oleviin nimikkeisiin 0407 00 ja 0408 (3) (4) |
| ”Klorfenvinfossi (E- ja Z-isomeerien yhteismäärä) | 0,01 (1) | 0,01 (1) | 0,01 (1) |

(1)

Lisätään A osaan seuraava klorfenvinfossia koskeva rivi:

Torjunta-ainejäämä

Enimmäismäärä mg/kg

lihassa olevassa rasvassa, lihavalmisteissa, muissa eläimenosissa ja eläinrasvoissa, jotka kuuluvat liitteessä I oleviin nimikkeisiin ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 ja 1602 (1) (4)

raakamaidossa ja täysmaidossa, jotka kuuluvat liitteessä I olevaan nimikkeeseen 0401; muissa elintarvikkeissa, jotka kuuluvat nimikkeisiin 0401, 0402, 0405 00 ja 0406 alaviitteiden (2) ja (4) mukaisesti

tuoreissa kuorettomissa munissa, linnunmunissa ja munankeltuaisissa, jotka kuuluvat liitteessä I oleviin nimikkeisiin 0407 00 ja 0408 (3) (4)

”Klorfenvinfossi (E- ja Z-isomeerien yhteismäärä)

0,01 (1)

0,01 (1)

0,01 (1)

| (2) | Lisätään B osaan seuraava fenmedifaamia koskeva rivi:








  Torjunta-ainejäämä | Enimmäismäärä mg/kg |
| --- | --- | --- |
| | lihassa olevassa rasvassa, lihavalmisteissa, muissa eläimenosissa ja eläinrasvoissa, jotka kuuluvat liitteessä I oleviin nimikkeisiin ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 ja 1602 | raakamaidossa ja täysmaidossa, jotka kuuluvat liitteessä I oleviin nimikkeisiin 0401, 0402, 0405 00 ja 0406 | tuoreissa kuorettomissa munissa, linnunmunissa ja munankeltuaisissa, jotka kuuluvat liitteessä I oleviin nimikkeisiin 0407 00 ja 0408 |
| ”Fenmedifaami (metyyli-N-(3-hydroksifenyyli) karbamaatti (MHPC) fenmedifaamina ilmaistuna) | 0,05 (2)
   (3) | 0,05 (2)
   (3) | 0,05 (2)
   (3) |

(2)

Lisätään B osaan seuraava fenmedifaamia koskeva rivi:

Torjunta-ainejäämä

Enimmäismäärä mg/kg

lihassa olevassa rasvassa, lihavalmisteissa, muissa eläimenosissa ja eläinrasvoissa, jotka kuuluvat liitteessä I oleviin nimikkeisiin ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 ja 1602

raakamaidossa ja täysmaidossa, jotka kuuluvat liitteessä I oleviin nimikkeisiin 0401, 0402, 0405 00 ja 0406

tuoreissa kuorettomissa munissa, linnunmunissa ja munankeltuaisissa, jotka kuuluvat liitteessä I oleviin nimikkeisiin 0407 00 ja 0408

”Fenmedifaami (metyyli-N-(3-hydroksifenyyli) karbamaatti (MHPC) fenmedifaamina ilmaistuna)

0,05 (2)
   (3)

0,05 (2)
   (3)

0,05 (2)
   (3)

---

(1)  Analyysiherkkyyden alaraja.”

(2)  Analyysiherkkyyden alaraja.

(3)  Jäämien väliaikainen enimmäismäärä direktiivin 91/414/ETY 4 artiklan 1 kohdan f alakohdan mukaisesti. Jollei muutoksia tehdä, tämä enimmäismäärä katsotaan lopulliseksi 9 päivänä elokuuta 2010”

---

LIITE III

Lisätään direktiivin 90/642/ETY liitteessä II olevaan A osaan seuraavat desmedifaamia, fenmedifaamia ja klorfenvinfossia koskevat sarakkeet:

| Torjunta-ainejäämät ja niiden enimmäismäärät (mg/kg) |
| --- |
| Ryhmät ja esimerkkejä yksittäisistä tuotteista, joihin jäämien enimmäismääriä sovelletaan | Desmedifaami | Fenmedifaami | Klorfenvinfossi (E- ja Z-isomeerien yhteismäärä) |
| ”1. | Tuoreet, kuivatut tai keittämättömät, jäädyttämällä ilman sokerin lisäystä säilötyt hedelmät; pähkinät | 0,05 (1)
   (2) | | 0,02 (1) |
| | (i) | SITRUSHEDELMÄT | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Greipit | | | |
| | | Sitruunat | | | |
| | | Limetit | | | |
| | | Mandariinit (klementiinit ja muut hybridit mukaan luettuina) | | | |
| | | Appelsiinit | | | |
| | | Pomelot | | | |
| | | Muut | | | |
| | (ii) | PÄHKINÄT (kuoritut tai kuorimattomat) | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Mantelit | | | |
| | | Parapähkinät | | | |
| | | Cashewpähkinät | | | |
| | | Kastanjat | | | |
| | | Kookospähkinät | | | |
| | | Hasselpähkinät | | | |
| | | Makadamiapähkinät | | | |
| | | Pekaanipähkinät | | | |
| | | Pinjansiemenet | | | |
| | | Pistaasimantelit | | | |
| | | Saksanpähkinät | | | |
| | | Muut | | | |
| | (iii) | SIEMENHEDELMÄT | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Omenat | | | |
| | | Päärynät | | | |
| | | Kvittenit | | | |
| | | Muut | | | |
| | (iv) | KIVIHEDELMÄT | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Aprikoosit | | | |
| | | Kirsikat | | | |
| | | Persikat (nektariinit ja niiden kaltaiset hybridit mukaan luettuina) | | | |
| | | Luumut | | | |
| | | Muut | | | |
| | (v) | MARJAT JA PIENET HEDELMÄT | | | |
| | | (a) | Syötäväksi ja viinin valmistukseen tarkoitetut viinirypäleet | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | Syötäväksi tarkoitetut viinirypäleet | | | |
| | | | Viinin valmistukseen tarkoitetut viinirypäleet | | | |
| | | (b) | Mansikat (muut kuin luonnonvaraiset) | | 0,1 (1)
   (2) | |
| | | (c) | Vadelmat ja vatukat (muut kuin luonnonvaraiset) | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | Karhunvatukat | | | |
| | | | Sinivatukat | | | |
| | | | Jättivatukat (boysen- ja loganinmarjat) | | | |
| | | | Vadelmat | | | |
| | | | Muut | | | |
| | | (d) | Muut pienhedelmät ja marjat (muut kuin luonnonvaraiset) | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | Mustikat | | | |
| | | | Karpalot | | | |
| | | | Herukat (puna-, musta- ja valkoherukat) | | | |
| | | | Karviaiset | | | |
| | | | Muut | | | |
| | | (e) | Luonnonvaraiset marjat ja hedelmät | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | (vi) | MUUT HEDELMÄT | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Avokadot | | | |
| | | Banaanit | | | |
| | | Taatelit | | | |
| | | Viikunat | | | |
| | | Kiivihedelmät | | | |
| | | Kumkvatit | | | |
| | | Litsit | | | |
| | | Mangot | | | |
| | | Oliivit (syötäviksi tarkoitetut) | | | |
| | | Oliivit (öljyn valmistukseen tarkoitetut) | | | |
| | | Papaijat | | | |
| | | Passionhedelmät | | | |
| | | Ananakset | | | |
| | | Granaattiomenat | | | |
| | | Muut | | | |
| 2. | Tuoreet tai keittämättömät, jäädytetyt tai kuivatut vihannekset | 0,05 (1)
   (2) | | |
| | (i) | JUUREKSET JA JUURIMUKULAT | | | |
| | | Punajuurikkaat | | 0,1 (1)
   (2) | |
| | | Porkkanat | | | 0,5 |
| | | Kassavat | | | |
| | | Mukulasellerit | | | |
| | | Piparjuuret | | | |
| | | Maa-artisokat | | | |
| | | Palsternakat | | | 0,5 |
| | | Juuripersiljat | | | |
| | | Retiisit | | | 0,5 |
| | | Kaurajuuret | | | |
| | | Bataatit | | | |
| | | Lantut | | | 0,5 |
| | | Nauriit | | | 0,5 |
| | | Jamssit | | | |
| | | Muut | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | (ii) | SIPULIKASVIT | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Valkosipulit | | | 0,5 |
| | | Kepasipulit | | | |
| | | Salottisipulit | | | 0,5 |
| | | Varhaissipulit | | | |
| | | Muut | | | 0,02 (1) |
| | (iii) | HEDELMÄVI-HANNEKSET | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | (a) | Solanacea-heimo | | | 0,02 (1) |
| | | | Tomaatit | | | |
| | | | Paprikat | | | |
| | | | Munakoisot | | | |
| | | | Okra | | | |
| | | | Muut | | | |
| | | (b) | Syötäväkuoriset, Cucurbitaceae-heimo | | | |
| | | | Kurkut | | | |
| | | | Pikkukurkut | | | |
| | | | Kesäkurpitsat | | | 0,1 |
| | | | Muut | | | 0,02 (1) |
| | | (c) | Paksukuoriset, Cucurbitaceae-heimo | | | 0,02 (1) |
| | | | Melonit | | | |
| | | | Kurpitsat | | | |
| | | | Vesimelonit | | | |
| | | | Muut | | | |
| | | (d) | Sokerimaissi | | | 0,02 (1) |
| | (iv) | KAALIKASVIT | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | (a) | Kukinnon muodostavat kaalit | | | 0,02 (1) |
| | | | Parsakaalit (myös calabrese) | | | |
| | | | Kukkakaalit | | | |
| | | | Muut | | | |
| | | (b) | Kerivät kaalit | | | |
| | | | Ruusukaali | | | 0,1 |
| | | | Keräkaali | | | 0,5 |
| | | | Muut | | | 0,02 (1) |
| | | (c) | Lehtikaalit | | | 0,02 (1) |
| | | | Kiinankaalit | | | |
| | | | Lehtikaali | | | |
| | | | Muut | | | |
| | | (d) | Kyssäkaali | | | 0,3 |
| | (v) | LEHTIVIHANNEKSET JA TUOREET YRTIT | | | |
| | | (a) | Lehtisalaatti ja sen kaltaiset | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | Vihanneskrassi | | | 0,1 |
| | | | Vuonankaali | | | 0,1 |
| | | | Lehtisalaatti | | | |
| | | | Endiivi (leveälehtinen siloendiivi) | | | |
| | | | Rucola | | | |
| | | | Kaalin lehdet ja varret | | | |
| | | | Muut | | | 0,02 (1) |
| | | (b) | Pinaatti ja sen kaltaiset | | 0,5 (2) | |
| | | | Pinaatti | | | 0,1 |
| | | | Mangoldi (eli lehtijuurikas) | | | |
| | | | Muut | | | 0,02 (1) |
| | | (c) | Vesikrassi | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | | (d) | Sikuri (valkolehti) | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | | (e) | Yrtit | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | Kirveli | | | |
| | | | Ruohosipuli | | | |
| | | | Persilja | | | 0,5 |
| | | | Yrttiselleri | | | |
| | | | Muut | | | 0,02 (1) |
| | (vi) | PALKOVIHANNEKSET (tuoreet) | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | | Pavut (silpimättömät) | | | |
| | | Pavut (silvityt) | | | |
| | | Herneet (silpimättömät) | | | |
| | | Herneet (silvityt) | | | |
| | | Muut | | | |
| | (vii) | VARSIVIHANNEKSET (tuoreet) | | | |
| | | Parsat | | | 0,1 |
| | | Kardoni | | | |
| | | Lehtiselleri | | | 0,5 |
| | | Fenkoli | | | |
| | | Latva-artisokka | | 0,2 (2) | |
| | | Purjo | | | 0,1 |
| | | Raparperi | | | |
| | | Muut | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | (viii) | SIENET | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | (a) | Viljellyt sienet | | | 0,05 |
| | | (b) | Luonnonvaraiset sienet | | | 0,02 (1) |
| 3. | Kuivatut palkokasvit | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | Pavut | | | |
| | Linssit | | | |
| | Herneet | | | |
| | Muut | | | |
| 4. | Öljykasvin siemenet | 0,1 (1)
   (2) | 0,1 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | Pellavansiemenet | | | |
| | Maapähkinät | | | |
| | Unikonsiemenet | | | |
| | Seesaminsiemenet | | | |
| | Auringonkukansiemenet | | | |
| | Rapsinsiemenet | | | |
| | Soijapavut | | | |
| | Sinapinsiemenet | | | |
| | Puuvillansiemenet | | | |
| | Hampunsiemenet | | | |
| | Muut | | | |
| 5. | Perunat | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | Varhaisperunat | | | |
| | Varastoperunat | | | |
| 6. | Tee (kuivatut lehdet ja lehtiruodit, fermentoitu ja muu, Camellia sinensis -laji) | 0,1 (1)
   (2) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| 7. | Humala (kuivattu), myös pelleteiksi valmistetut tai jauhetut humalantähkät | 0,1 (1)
   (2) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1) |

Torjunta-ainejäämät ja niiden enimmäismäärät (mg/kg)

Ryhmät ja esimerkkejä yksittäisistä tuotteista, joihin jäämien enimmäismääriä sovelletaan

Desmedifaami

Fenmedifaami

Klorfenvinfossi (E- ja Z-isomeerien yhteismäärä)

”1.

Tuoreet, kuivatut tai keittämättömät, jäädyttämällä ilman sokerin lisäystä säilötyt hedelmät; pähkinät

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

(i)

SITRUSHEDELMÄT

0,05 (1)
   (2)

Greipit

Sitruunat

Limetit

Mandariinit (klementiinit ja muut hybridit mukaan luettuina)

Appelsiinit

Pomelot

Muut

(ii)

PÄHKINÄT (kuoritut tai kuorimattomat)

0,05 (1)
   (2)

Mantelit

Parapähkinät

Cashewpähkinät

Kastanjat

Kookospähkinät

Hasselpähkinät

Makadamiapähkinät

Pekaanipähkinät

Pinjansiemenet

Pistaasimantelit

Saksanpähkinät

Muut

(iii)

SIEMENHEDELMÄT

0,05 (1)
   (2)

Omenat

Päärynät

Kvittenit

Muut

(iv)

KIVIHEDELMÄT

0,05 (1)
   (2)

Aprikoosit

Kirsikat

Persikat (nektariinit ja niiden kaltaiset hybridit mukaan luettuina)

Luumut

Muut

(v)

MARJAT JA PIENET HEDELMÄT

(a)

Syötäväksi ja viinin valmistukseen tarkoitetut viinirypäleet

0,05 (1)
   (2)

Syötäväksi tarkoitetut viinirypäleet

Viinin valmistukseen tarkoitetut viinirypäleet

(b)

Mansikat (muut kuin luonnonvaraiset)

0,1 (1)
   (2)

(c)

Vadelmat ja vatukat (muut kuin luonnonvaraiset)

0,05 (1)
   (2)

Karhunvatukat

Sinivatukat

Jättivatukat (boysen- ja loganinmarjat)

Vadelmat

Muut

(d)

Muut pienhedelmät ja marjat (muut kuin luonnonvaraiset)

0,05 (1)
   (2)

Mustikat

Karpalot

Herukat (puna-, musta- ja valkoherukat)

Karviaiset

Muut

(e)

Luonnonvaraiset marjat ja hedelmät

0,05 (1)
   (2)

(vi)

MUUT HEDELMÄT

0,05 (1)
   (2)

Avokadot

Banaanit

Taatelit

Viikunat

Kiivihedelmät

Kumkvatit

Litsit

Mangot

Oliivit (syötäviksi tarkoitetut)

Oliivit (öljyn valmistukseen tarkoitetut)

Papaijat

Passionhedelmät

Ananakset

Granaattiomenat

Muut

2.

Tuoreet tai keittämättömät, jäädytetyt tai kuivatut vihannekset

0,05 (1)
   (2)

(i)

JUUREKSET JA JUURIMUKULAT

Punajuurikkaat

0,1 (1)
   (2)

Porkkanat

0,5

Kassavat

Mukulasellerit

Piparjuuret

Maa-artisokat

Palsternakat

0,5

Juuripersiljat

Retiisit

0,5

Kaurajuuret

Bataatit

Lantut

0,5

Nauriit

0,5

Jamssit

Muut

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

(ii)

SIPULIKASVIT

0,05 (1)
   (2)

Valkosipulit

0,5

Kepasipulit

Salottisipulit

0,5

Varhaissipulit

Muut

0,02 (1)

(iii)

HEDELMÄVI-HANNEKSET

0,05 (1)
   (2)

(a)

Solanacea-heimo

0,02 (1)

Tomaatit

Paprikat

Munakoisot

Okra

Muut

(b)

Syötäväkuoriset, Cucurbitaceae-heimo

Kurkut

Pikkukurkut

Kesäkurpitsat

0,1

Muut

0,02 (1)

(c)

Paksukuoriset, Cucurbitaceae-heimo

0,02 (1)

Melonit

Kurpitsat

Vesimelonit

Muut

(d)

Sokerimaissi

0,02 (1)

(iv)

KAALIKASVIT

0,05 (1)
   (2)

(a)

Kukinnon muodostavat kaalit

0,02 (1)

Parsakaalit (myös calabrese)

Kukkakaalit

Muut

(b)

Kerivät kaalit

Ruusukaali

0,1

Keräkaali

0,5

Muut

0,02 (1)

(c)

Lehtikaalit

0,02 (1)

Kiinankaalit

Lehtikaali

Muut

(d)

Kyssäkaali

0,3

(v)

LEHTIVIHANNEKSET JA TUOREET YRTIT

(a)

Lehtisalaatti ja sen kaltaiset

0,05 (1)
   (2)

Vihanneskrassi

0,1

Vuonankaali

0,1

Lehtisalaatti

Endiivi (leveälehtinen siloendiivi)

Rucola

Kaalin lehdet ja varret

Muut

0,02 (1)

(b)

Pinaatti ja sen kaltaiset

0,5 (2)

Pinaatti

0,1

Mangoldi (eli lehtijuurikas)

Muut

0,02 (1)

(c)

Vesikrassi

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

(d)

Sikuri (valkolehti)

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

(e)

Yrtit

0,05 (1)
   (2)

Kirveli

Ruohosipuli

Persilja

0,5

Yrttiselleri

Muut

0,02 (1)

(vi)

PALKOVIHANNEKSET (tuoreet)

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

Pavut (silpimättömät)

Pavut (silvityt)

Herneet (silpimättömät)

Herneet (silvityt)

Muut

(vii)

VARSIVIHANNEKSET (tuoreet)

Parsat

0,1

Kardoni

Lehtiselleri

0,5

Fenkoli

Latva-artisokka

0,2 (2)

Purjo

0,1

Raparperi

Muut

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

(viii)

SIENET

0,05 (1)
   (2)

(a)

Viljellyt sienet

0,05

(b)

Luonnonvaraiset sienet

0,02 (1)

3.

Kuivatut palkokasvit

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

Pavut

Linssit

Herneet

Muut

4.

Öljykasvin siemenet

0,1 (1)
   (2)

0,1 (1)
   (2)

0,02 (1)

Pellavansiemenet

Maapähkinät

Unikonsiemenet

Seesaminsiemenet

Auringonkukansiemenet

Rapsinsiemenet

Soijapavut

Sinapinsiemenet

Puuvillansiemenet

Hampunsiemenet

Muut

5.

Perunat

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

Varhaisperunat

Varastoperunat

6.

Tee (kuivatut lehdet ja lehtiruodit, fermentoitu ja muu, Camellia sinensis -laji)

0,1 (1)
   (2)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)

7.

Humala (kuivattu), myös pelleteiksi valmistetut tai jauhetut humalantähkät

0,1 (1)
   (2)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)

---

(1)  Analyysiherkkyyden alaraja.

1

(2)  Jäämien enimmäismäärä vahvistettu väliaikaisesti direktiivin 91/414/ETY 4 artiklan 1 kohdan f alakohdan mukaisesti.”

2

---

| 27.7.2006 | FI | Euroopan unionin virallinen lehti | L 206/36 |
| --- | --- | --- | --- |

27.7.2006

FI

Euroopan unionin virallinen lehti

L 206/36

---

KOMISSION DIREKTIIVI 2006/63/EY,

annettu 14 päivänä heinäkuuta 2006,

Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. -kasvintuhoojan torjunnasta annetun neuvoston direktiivin 98/57/EY liitteiden II–VII muuttamisesta

EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka

ottaa huomioon Euroopan yhteisön perustamissopimuksen,

ottaa huomioon Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. -kasvintuhoojan torjunnasta 20 päivänä heinäkuuta 1998 annetun neuvoston direktiivin 98/57/EY (1) ja erityisesti sen 11 artiklan,

sekä katsoo seuraavaa:

| (1) | Yksi merkittävistä perunalle ja tomaatille haitallisista organismeista on Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., perunan tumman rengasmädän sekä perunan ja tomaatin bakteerilakastumistaudin aiheuttaja (jäljempänä ”organismi”). |
| --- | --- |

(1)

Yksi merkittävistä perunalle ja tomaatille haitallisista organismeista on Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., perunan tumman rengasmädän sekä perunan ja tomaatin bakteerilakastumistaudin aiheuttaja (jäljempänä ”organismi”).

| (2) | Tätä organismia esiintyy edelleen joissakin yhteisön osissa. |
| --- | --- |

(2)

Tätä organismia esiintyy edelleen joissakin yhteisön osissa.

| (3) | Direktiivissä 98/57/EY vahvistetaan yksityiskohtaiset toimenpiteet, joita jäsenvaltioissa on toteutettava tämän kasvintuhoojan osalta sen paikallistamiseksi ja sen levinneisyyden määrittämiseksi, sen esiintymisen ja leviämisen estämiseksi, ja jos tuhoojaa löydetään, sen leviämisen estämiseksi ja torjumiseksi tarkoituksena hävittää se. |
| --- | --- |

(3)

Direktiivissä 98/57/EY vahvistetaan yksityiskohtaiset toimenpiteet, joita jäsenvaltioissa on toteutettava tämän kasvintuhoojan osalta sen paikallistamiseksi ja sen levinneisyyden määrittämiseksi, sen esiintymisen ja leviämisen estämiseksi, ja jos tuhoojaa löydetään, sen leviämisen estämiseksi ja torjumiseksi tarkoituksena hävittää se.

| (4) | Tämän kasvintuhoojan biologian ja toteamis- ja tunnistamismenettelyjen tuntemus on huomattavasti lisääntynyt direktiivin antamisen jälkeen. Lisäksi kasvintuhoojan torjunnasta saatu käytännön kokemus vaatii useiden torjuntatoimenpiteisiin liittyvien teknisten säännösten tarkistamista. |
| --- | --- |

(4)

Tämän kasvintuhoojan biologian ja toteamis- ja tunnistamismenettelyjen tuntemus on huomattavasti lisääntynyt direktiivin antamisen jälkeen. Lisäksi kasvintuhoojan torjunnasta saatu käytännön kokemus vaatii useiden torjuntatoimenpiteisiin liittyvien teknisten säännösten tarkistamista.

| (5) | Tällaisen kehityksen seurauksena näyttäisi olevan välttämätöntä tarkistaa ja päivittää direktiivin 98/57/EY tiettyihin liitteisiin sisältyvät toimenpiteet. |
| --- | --- |

(5)

Tällaisen kehityksen seurauksena näyttäisi olevan välttämätöntä tarkistaa ja päivittää direktiivin 98/57/EY tiettyihin liitteisiin sisältyvät toimenpiteet.

| (6) | Havaitsemis- ja tunnistamismenettelyjen osalta mukaan otetaan FISH-menetelmä (fluoresoiva in situ -hybridisaatio), joka on vastikään kehitetty toteamismenetelmä. Mukaan on otettu myös PCR-menetelmään (polymeraasiketjureaktio) sekä nykyisten toteamis- ja tunnistamismenettelyiden lukuisiin eri teknisiin elementteihin tehdyt parannukset samoin kuin menetelmät organismin havaitsemiseksi ja tunnistamiseksi muissa isäntäkasveissa kuin perunassa sekä vedessä ja maaperässä. |
| --- | --- |

(6)

Havaitsemis- ja tunnistamismenettelyjen osalta mukaan otetaan FISH-menetelmä (fluoresoiva in situ -hybridisaatio), joka on vastikään kehitetty toteamismenetelmä. Mukaan on otettu myös PCR-menetelmään (polymeraasiketjureaktio) sekä nykyisten toteamis- ja tunnistamismenettelyiden lukuisiin eri teknisiin elementteihin tehdyt parannukset samoin kuin menetelmät organismin havaitsemiseksi ja tunnistamiseksi muissa isäntäkasveissa kuin perunassa sekä vedessä ja maaperässä.

| (7) | Torjuntatoimenpiteiden teknisiä elementtejä on parannettu seuraavilta osin: testinäytteiden säilyttämistapa kasvintuhoojan jäljittämisen varmistamiseksi, todennäköisen saastumisen laajuuden määrittämiseksi tarvittavat elementit, kasvintuhoojan varmistetun esiintymisen ja saastuneiden alueiden ilmoittamista koskevat tiedot sekä saastuneiksi ilmoitetuilla tuotantopaikoilla ja rajoitetuilla alueilla toteutettavat toimenpiteet. Lisäksi mukaan on otettu joitakin tomaattia koskevia säännöksiä, jotta voitaisiin paremmin ottaa huomioon tämän kasvin merkitys kasvintuhoojan isäntänä. |
| --- | --- |

(7)

Torjuntatoimenpiteiden teknisiä elementtejä on parannettu seuraavilta osin: testinäytteiden säilyttämistapa kasvintuhoojan jäljittämisen varmistamiseksi, todennäköisen saastumisen laajuuden määrittämiseksi tarvittavat elementit, kasvintuhoojan varmistetun esiintymisen ja saastuneiden alueiden ilmoittamista koskevat tiedot sekä saastuneiksi ilmoitetuilla tuotantopaikoilla ja rajoitetuilla alueilla toteutettavat toimenpiteet. Lisäksi mukaan on otettu joitakin tomaattia koskevia säännöksiä, jotta voitaisiin paremmin ottaa huomioon tämän kasvin merkitys kasvintuhoojan isäntänä.

| (8) | Tässä päätöksessä säädetyt toimenpiteet ovat pysyvän kasvinsuojelukomitean lausunnon mukaiset, |
| --- | --- |

(8)

Tässä päätöksessä säädetyt toimenpiteet ovat pysyvän kasvinsuojelukomitean lausunnon mukaiset,

ON ANTANUT TÄMÄN DIREKTIIVIN:

1 artikla

Korvataan direktiivin 98/57/EY liitteet II–VII tämän direktiivin liitteessä olevilla vastaavilla teksteillä.

2 artikla

1.   Jäsenvaltioiden on annettava ja julkaistava tämän direktiivin noudattamisen edellyttämät lait, asetukset ja hallinnolliset määräykset viimeistään 31 päivänä maaliskuuta 2007. Niiden on toimitettava komissiolle kirjallisina nämä säännökset sekä kyseisiä säännöksiä ja tätä direktiiviä koskeva vastaavuustaulukko viipymättä.

Jäsenvaltioiden on sovellettava näitä säädöksiä 1 päivästä huhtikuuta 2007.

Näissä jäsenvaltioiden antamissa säännöksissä on viitattava tähän direktiiviin tai niihin on liitettävä tällainen viittaus, kun ne virallisesti julkaistaan. Jäsenvaltioiden on säädettävä siitä, miten viittaukset tehdään.

2.   Jäsenvaltioiden on toimitettava tässä direktiivissä tarkoitetuista kysymyksistä antamansa keskeiset kansalliset säännökset viipymättä kirjallisina komissiolle.

3 artikla

Tämä direktiivi tulee voimaan kolmantena päivänä sen jälkeen, kun se on julkaistu Euroopan unionin virallisessa lehdessä.

4 artikla

Tämä direktiivi on osoitettu kaikille jäsenvaltioille.

Tehty Brysselissä 14 päivänä heinäkuuta 2006.

Komission puolesta

Markos KYPRIANOU

Komission jäsen

---

(1)  EYVL L 235, 21.8.1998, s. 1.

1

---

LIITE

LIITE II

TUTKIMUSMENETELMÄ RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL. -KASVINTUHOOJAN MÄÄRITTÄMISEKSI, TOTEAMISEKSI JA TUNNISTAMISEKSI

TUTKIMUSMENETELMÄN SOVELTAMISALA

Esitetty menetelmä kuvaa eri menettelyjä, jotka koskevat

| i) | tumman rengasmädän määritystä perunan mukuloista ja bakteerilakastumistaudin määritystä perunasta ja tomaatista ja eräistä muista isäntäkasveista; |
| --- | --- |

i)

tumman rengasmädän määritystä perunan mukuloista ja bakteerilakastumistaudin määritystä perunasta ja tomaatista ja eräistä muista isäntäkasveista;

| ii) | Ralstonia solanacearum -kasvintuhoojan toteamista perunan mukuloista, perunoista, tomaateista ja muista isäntäkasveista, vedestä ja maaperästä otetuista näytteistä; |
| --- | --- |

ii)

Ralstonia solanacearum -kasvintuhoojan toteamista perunan mukuloista, perunoista, tomaateista ja muista isäntäkasveista, vedestä ja maaperästä otetuista näytteistä;

| iii) | Ralstonia solanacearum (R. solanacearum) -kasvintuhoojan tunnistamista. |
| --- | --- |

iii)

Ralstonia solanacearum (R. solanacearum) -kasvintuhoojan tunnistamista.

SISÄLTÖ

| | | Sivu |
| --- | --- | --- |
| | Yleiset periaatteet | 40 |
| I JAKSO: | Tutkimusmenetelmän soveltaminen | 40 |
| | 1. | Toteamismenetelmä tumman rengasmädän ja bakteerilakastumistaudin (R. solanacearum) määrittämiseksi perunan mukuloista ja perunasta, tomaatista tai muusta isäntäkasvista, jossa on tumman rengasmädän tai bakteerilakastumistaudin oireita | 40 |
| | 2. | Menetelmä R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista mukulanäytteistä | 43 |
| | 3. | Menetelmä R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista perunoista, tomaateista tai muista isäntäkasveista. | 46 |
| II JAKSO: | Yksityiskohtaiset menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi perunan mukuloista ja perunasta, tomaatista tai muusta isäntäkasvista, jossa on tumman rengasmädän tai bakteerilakastumistaudin oireita | 48 |
| | 1. | Oireet | 48 |
| | 2. | Pikaseulontatestit | 48 |
| | 3. | Eristämismenettely | 49 |
| | 4. | R. solanacearum -kasvintuhoojan tunnistustestit | 49 |
| III JAKSO: | 1. | Yksityiskohtaiset menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista mukulanäytteistä | 49 |
| | | 1.1 | Näytteiden valmistelu | 49 |
| | | 1.2 | Testaus | 51 |
| | 2. | Yksityiskohtaiset menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista perunoista, tomaateista tai muista kasveista. | 51 |
| | | 2.1 | Näytteiden valmistelu | 51 |
| | | 2.2 | Testaus | 52 |
| IV JAKSO: | 1. | Menetelmä R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi vedestä | 53 |
| | 2. | Menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi vedestä | 55 |
| | | 2.1 | Näytteiden valmistelu | 55 |
| | | 2.2 | Testaus | 55 |
| V JAKSO: | 1. | Menetelmä R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi maaperästä | 56 |
| | 2. | Menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi maaperästä | 58 |
| | | 2.1 | Näytteen valmistus | 58 |
| | | 2.2 | Testaus | 58 |
| VI JAKSO: | Optimoidut protokollat R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi | 58 |
| | A) | Määritys- ja toteamistestit | 58 |
| | | 1. | Valutuskoe | 58 |
| | | 2. | Poly-β-hydroksibutyraattirakeiden (PHB) toteaminen | 58 |
| | | 3. | Serologiset agglutinaatiokokeet | 59 |
| | | 4. | Eristäminen selektiivisellä alustalla | 60 |
| | | | 4.1 | Valikoiva maljaus | 60 |
| | | | 4.2 | Rikastusmenettely | 60 |
| | | 5. | Immunofluoresenssitesti (IF-testi) | 61 |
| | | 6. | Polymeraasiketjureaktiotesti (PCR-testi) | 64 |
| | | | 6.1 | DNA:n puhdistusmenetelmät | 65 |
| | | | | a) | Pastrikin menetelmä (2000) | 65 |
| | | | | b) | Muut menetelmät | 65 |
| | | | 6.2 | PCR-testi | 66 |
| | | | 6.3. | PCR-tuotteen määrittäminen | 66 |
| | | 7. | Fluoresoiva in situ -hybridisaatio (FISH-testi) | 67 |
| | | 8. | Entsyymi-immunologinen määritys (ELISA-testi) | 69 |
| | | | a) | Epäsuora ELISA-testi | 69 |
| | | | b) | DASI (Double-Antibody Sandwich Indirect) ELISA | 70 |
| | | 9. | Biologinen määritys | 71 |
| | B) | Tunnistustestit | 72 |
| | | 1. | Ravintokokeet ja entsymaattiset tunnistustestit | 72 |
| | | 2. | IF-testi | 72 |
| | | 3. | ELISA-testi | 73 |
| | | 4. | PCR-testi | 73 |
| | | 5. | FISH-testi | 73 |
| | | 6. | Rasvahappoprofilointi (FAP) | 73 |
| | | 7. | Kantojen määrittämismenetelmät | 73 |
| | | | 7.1 | Biovarin määrittäminen | 73 |
| | | | 7.2 | Genomien sormenjäljet | 74 |
| | | | 7.3 | PCR-menetelmät | 74 |
| | C) | Varmistustesti | 74 |
| | | Lisäys 1 | Optimointi- ja validointimenettelyissä mukana olevat laboratoriot | 76 |
| | | Lisäys 2 | Ravintoalusta R. solanacearum -kasvintuhoojan eristämistä ja viljelyä varten | 77 |
| | | Lisäys 3 | A) | Kaupallisesti saatavilla olevat standardoidut kontrollimateriaalit | 79 |
| | | | B) | Kontrollien valmistaminen | 80 |
| | | Lisäys 4 | Puskuriliuokset testimenettelyihin | 82 |
| | | Lisäys 5 | Kontaminaatioasteen määritys IF- ja FISH-testeillä | 85 |
| | | Lisäys 6 | Validoidut PCR-menettelyt ja reagenssit | 86 |
| | | Lisäys 7 | Validoidut reagenssit FISH-testiä varten | 91 |
| | | Lisäys 8 | Tomaatin ja munakoison viljelyolosuhteet | 93 |
| | | Viitteet | | 94 |

Sivu

Yleiset periaatteet

40

I JAKSO:

Tutkimusmenetelmän soveltaminen

40

1.

Toteamismenetelmä tumman rengasmädän ja bakteerilakastumistaudin (R. solanacearum) määrittämiseksi perunan mukuloista ja perunasta, tomaatista tai muusta isäntäkasvista, jossa on tumman rengasmädän tai bakteerilakastumistaudin oireita

40

2.

Menetelmä R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista mukulanäytteistä

43

3.

Menetelmä R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista perunoista, tomaateista tai muista isäntäkasveista.

46

II JAKSO:

Yksityiskohtaiset menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi perunan mukuloista ja perunasta, tomaatista tai muusta isäntäkasvista, jossa on tumman rengasmädän tai bakteerilakastumistaudin oireita

48

1.

Oireet

48

2.

Pikaseulontatestit

48

3.

Eristämismenettely

49

4.

R. solanacearum -kasvintuhoojan tunnistustestit

49

III JAKSO:

1.

Yksityiskohtaiset menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista mukulanäytteistä

49

1.1

Näytteiden valmistelu

49

1.2

Testaus

51

2.

Yksityiskohtaiset menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista perunoista, tomaateista tai muista kasveista.

51

2.1

Näytteiden valmistelu

51

2.2

Testaus

52

IV JAKSO:

1.

Menetelmä R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi vedestä

53

2.

Menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi vedestä

55

2.1

Näytteiden valmistelu

55

2.2

Testaus

55

V JAKSO:

1.

Menetelmä R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi maaperästä

56

2.

Menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi maaperästä

58

2.1

Näytteen valmistus

58

2.2

Testaus

58

VI JAKSO:

Optimoidut protokollat R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi

58

A)

Määritys- ja toteamistestit

58

1.

Valutuskoe

58

2.

Poly-β-hydroksibutyraattirakeiden (PHB) toteaminen

58

3.

Serologiset agglutinaatiokokeet

59

4.

Eristäminen selektiivisellä alustalla

60

4.1

Valikoiva maljaus

60

4.2

Rikastusmenettely

60

5.

Immunofluoresenssitesti (IF-testi)

61

6.

Polymeraasiketjureaktiotesti (PCR-testi)

64

6.1

DNA:n puhdistusmenetelmät

65

a)

Pastrikin menetelmä (2000)

65

b)

Muut menetelmät

65

6.2

PCR-testi

66

6.3.

PCR-tuotteen määrittäminen

66

7.

Fluoresoiva in situ -hybridisaatio (FISH-testi)

67

8.

Entsyymi-immunologinen määritys (ELISA-testi)

69

a)

Epäsuora ELISA-testi

69

b)

DASI (Double-Antibody Sandwich Indirect) ELISA

70

9.

Biologinen määritys

71

B)

Tunnistustestit

72

1.

Ravintokokeet ja entsymaattiset tunnistustestit

72

2.

IF-testi

72

3.

ELISA-testi

73

4.

PCR-testi

73

5.

FISH-testi

73

6.

Rasvahappoprofilointi (FAP)

73

7.

Kantojen määrittämismenetelmät

73

7.1

Biovarin määrittäminen

73

7.2

Genomien sormenjäljet

74

7.3

PCR-menetelmät

74

C)

Varmistustesti

74

Lisäys 1

Optimointi- ja validointimenettelyissä mukana olevat laboratoriot

76

Lisäys 2

Ravintoalusta R. solanacearum -kasvintuhoojan eristämistä ja viljelyä varten

77

Lisäys 3

A)

Kaupallisesti saatavilla olevat standardoidut kontrollimateriaalit

79

B)

Kontrollien valmistaminen

80

Lisäys 4

Puskuriliuokset testimenettelyihin

82

Lisäys 5

Kontaminaatioasteen määritys IF- ja FISH-testeillä

85

Lisäys 6

Validoidut PCR-menettelyt ja reagenssit

86

Lisäys 7

Validoidut reagenssit FISH-testiä varten

91

Lisäys 8

Tomaatin ja munakoison viljelyolosuhteet

93

Viitteet

94

YLEISET PERIAATTEET

Lisäyksissä esitetään optimaaliset testausprotokollat eri menetelmien ja validoitujen reagenssien osalta sekä testi- ja kontrollimateriaalien valmistusta koskevat tiedot. Lisäyksessä 1 on luettelo niistä laboratorioista, jotka olivat mukana testausprotokollien optimoinnissa ja validoinnissa.

Koska menettelyt liittyvät karanteenin alaisten organismien toteamiseen ja niissä käytetään R. solanacearum -kasvintuhoojan elinkykyisiä viljelmiä kontrollimateriaaleina, menettelyt on ehdottomasti toteutettava sopivissa karanteenioloissa siten, että käytössä on riittävät jätteenhävitysmahdollisuudet ja toiminta tapahtuu kasvikaranteenista vastaavien viranomaisten myöntämän luvan mukaisissa olosuhteissa.

Testausparametreilla on varmistettava R. solanacearum -kasvintuhoojan määrien johdonmukainen ja toistettavissa oleva toteaminen valituilla menetelmillä asetetuilla kynnysarvoilla.

Positiivisten kontrollinäytteiden huolellinen valmistaminen on ehdottoman tärkeää.

Vaadittujen kynnysarvojen mukainen testaus edellyttää myös laitteiden asianmukaisia asetuksia sekä niiden asianmukaista huoltoa ja vakaamista, reagenssien huolellista käsittelyä ja säilyttämistä sekä kaikkien sellaisten toimenpiteiden toteuttamista, joilla ehkäistään näytteiden välinen kontaminaatio, esim. positiivisten kontrollinäytteiden pitämistä erillään testinäytteistä. Laadunvalvontastandardeja on sovellettava hallinnollisten ja muiden virheiden välttämiseksi, erityisesti pakkausmerkintöjen ja dokumentaation osalta.

Direktiivin 98/57/EY 4 artiklan 2 kohdassa tarkoitettu epäilty esiintyminen tarkoittaa positiivista tulosta näytteelle jäljempänä olevissa vuokaavioissa esitetyissä määritys- tai seulontatesteissä. Jos ensimmäisen seulontatestin (IF- tai PCR/FISH-testi, selektiivinen eristäminen) tulos on positiivinen, se on vahvistettava toisella seulontatestillä, joka perustuu muihin biologisiin periaatteisiin.

Jos ensimmäisestä seulontatestistä saadaan positiivinen tulos, näytteen epäillään olevan bakteerin saastuttama ja sille on tehtävä toinen seulontatesti. Jos toisesta seulontatestistä saadaan positiivinen tulos, epäilys varmistuu (epäilty esiintyminen) ja tutkimusmenetelmän mukaista testausta on jatkettava. Jos toisesta seulontatestistä saadaan negatiivinen tulos, näytteen katsotaan olevan puhdas R. solanacearum -bakteerista.

Direktiivin 98/57/EY 5 artiklan 1 kohdassa tarkoitettu varmistettu esiintyminen tarkoittaa puhtaan R. solanacearum -viljelmän eristämistä ja tunnistamista siten, että sen patogeenisyys on varmistettu.

I JAKSO

TUTKIMUSMENETELMÄN SOVELTAMINEN

1.   Toteamismenetelmä tumman rengasmädän ja bakteerilakastumistaudin (Ralstonia solanacearum) määrittämiseksi perunan mukuloista ja perunasta, tomaatista tai muusta isäntäkasvista, jossa on tumman rengasmädän tai bakteerilakastumistaudin oireita

Testimenetelmä on tarkoitettu perunan mukuloille, joiden oireet ovat tyypillisiä tummalle rengasmädälle tai johtosolukon lakastumistaudille taikka antavat aihetta epäillä näitä tauteja. Siihen kuuluu pikaseulontatesti, taudinaiheuttajan eristäminen infektoituneesta johtosolukosta (selektiiviselle) alustalle ja, jos tulos on positiivinen, viljelmän tunnistaminen Ralstonia solanacearum -kasvintuhoojaksi.

Image

Image

2.   Menetelmä Ralstonia solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista mukulanäytteistä

Periaate

Menettely on tarkoitettu piilevien tartuntojen toteamiseen perunan mukuloissa. Jos erilaisiin biologisiin periaatteisiin perustuvista vähintään kahdesta seulontakokeesta saadaan positiivinen tutkimustulos, 3 sitä täydennetään eristämällä taudinaiheuttaja. Jos eristyskokeen tuloksena saadaan tyypillisiä pesäkkeitä, vuorossa on puhtaan viljelmän varmistaminen R. solanacearum -kasvintuhoojaksi. Positiivinen tulos ainoastaan yhdestä seulontatestistä ei riitä pitämään näytettä epäilyttävänä.

Seulonta- ja eristystesteillä on saatava toteamisrajaksi 103–104 solua perunauutteen yhtä millilitraa kohden; ne sisältyvät positiivisina kontrollivälineinä kuhunkin testisarjaan.

Image

Image

3.   Menetelmä Ralstonia solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista perunoista, tomaateista tai muista isäntäkasveista

Image

Image

II JAKSO

YKSITYISKOHTAISET MENETELMÄT RALSTONIA SOLANACEARUM -KASVINTUHOOJAN TOTEAMISEKSI PERUNAN MUKULOISTA JA PERUNASTA, TOMAATISTA TAI MUUSTA ISÄNTÄKASVISTA, JOSSA ON TUMMAN RENGASMÄDÄN TAI BAKTEERILAKASTUMISTAUDIN OIREITA

1.   Oireet (ks. www-sivusto osoitteessa: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

1.1   Oireet perunassa

Perunakasvi. Tartunnan varhaisvaihe pellolla voidaan tunnistaa lehdistä, jotka nuutuvat kasvin tyvestä alkaen päivällä lämpimällä säällä ja toipuvat yöllä. Nuutumisen alkuvaiheessa lehdet pysyvät vihreinä, mutta myöhemmin ne kellastuvat ja niihin kehittyy ruskea nekroosi. Myös epinastiaa esiintyy. Yhden verson tai koko kasvin nuutuminen jää nopeasti pysyväksi ja johtaa kasvin kollapsiin ja kuolemaan. Nuutuneiden kasvien varsien johtosolukko muuttuu poikkileikkauksesta tarkasteltuna tavallisesti ruskeaksi, ja maitomaista bakteerimätää valuu leikatulta pinnalta tai sitä voidaan pusertaa ulos. Kun leikattu varsi asetetaan veteen, johtosolukkokimpuista valuu limaa.

Perunan mukula. Perunan mukulat leikataan halki maavarren kiinnityskohdan läheltä tai poikkisuuntaan kiinnityskohdan yli. Tartunnan varhaisvaihe ilmenee lasimaisena, keltaisesta vaaleanruskeaan vaihtelevana värityksenä johtosolukkorenkaassa, josta muutaman minuutin kuluttua pursuaa itsestään vaaleankeltaista bakteerimätää. Myöhemmin johtojänteiden väritys muuttuu selvemmin ruskeaksi ja nekroosi voi laajeta tylppysolukkoon. Myöhemmässä vaiheessa tartunta leviää maavarren kiinnityskohdasta ja mukulan silmistä, ja näistä vuotaa bakteerimätää, johon kiinnittyy maahiukkasia. Kuoreen voi tulla punaruskeita hieman painuneita vioittumia, kun sisäiset johtosolukot painuvat kasaan. Taudin myöhemmissä vaiheissa esiintyy yleisesti sekundaarista sieni- ja bakteerimätää.

1.2   Oireet tomaatissa

Tomaattikasvi. Ensimmäinen näkyvä oire on nuorimpien lehtien velttous. Taudinaiheuttajalle suotuisissa ympäristöolosuhteissa (maaperän lämpötila noin 25 °C, kyllästyskosteus) on seurauksena muutaman päivän kuluessa epinastia ja kasvin yhden puolen tai koko kasvin nuutuminen, mikä johtaa koko kasvin kollapsiin. Vähemmän suotuisissa olosuhteissa (maaperän lämpötila alle 21 °C) nuutumista esiintyy vähemmän, mutta varteen saattaa kehittyä suuri määrä versojuuria. Varressa voidaan havaita varren alaosasta lähteviä vettyneitä juovia, jotka ovat osoitus johtojärjestelmän nekroosista. Jos varsi leikataan poikittaissuunnassa, varren värittyneistä ruskeista johtosolukoista tihkuu valkoista tai kellertävää bakteerimätää.

1.3   Oireet muissa isäntäkasveissa

Solanum dulcamara- ja S. nigrum -kasvit. Luonnonoloissa nuutumista esiintyy äärimmäisen harvoin näissä isäntinä toimivissa rikkakasveissa, ellei maaperän lämpötila ylitä 25 °C tai elleivät inokulaattitasot ole äärimmäisen korkeita (esim. S. nigrum, joka kasvaa saastuneiden peruna- tai tomaattikasvien vierellä). Jos nuutumista esiintyy, oireet vastaavat tomaatin yhteydessä kuvattuja oireita. Nuutumattomissa S. dulcamara -kasveissa, joiden varret ja juuret kasvavat vedessä, voi ilmetä johtosolukon sisäistä vaaleanruskeaa värinmuutosta varren alaosan tai varren vedenalaisen osan poikkileikkauksessa. Vaikka nuutumisoireita ei olisikaan, bakteereja voi tihkua johtosolukosta tai ne voivat muodostaa limanauhoja, jos leikattu varsi asetetaan pystysuoraan veteen.

2.   Pikaseulontatestit

Pikaseulontatestit helpottavat alustavaa taudinmääritystä, mutta ne eivät ole välttämättömiä. Käytetään yhtä tai useampaa seuraavista validoiduista testeistä:

2.1   Valutuskoe

(Ks. VI jakson A kohdan 1 alakohta)

2.2   Poly-β-hydroksibutyraattirakeiden (PHB) toteaminen

Tyypilliset PHB-rakeet R. solanacearum -bakteerin soluissa saadaan näkyviin värjäämällä saastuneesta solukosta otetusta bakteerimädästä lämpökäsittelyllä kiinnitetyt preparaatit niilinsinisellä A tai sudaninmustalla (ks. VI jakson A kohdan 2 alakohta).

2.3   Serologiset agglutinaatiokokeet

(Ks. VI jakson A kohdan 3 alakohta)

2.4   Muut testit

Muita soveltuvia pikaseulontatestejä ovat IF-testi (ks. VI jakson A kohdan 5 alakohta), FISH-testi (ks. VI jakson A kohdan 7 alakohta), ELISA-testit (ks. VI jakson A kohdan 8 alakohta) ja PCR-testit (ks. VI jakson A kohdan 6 alakohta).

3.   Eristämismenettely

| a) | Otetaan bakteerilimaa tai värittyneen solukon pala mukulan johtosolukkorenkaasta tai perunan tai tomaatin tai muun nuutuvan isäntäkasvin varren johtojänteistä. Suspendoidaan pieneen määrään steriiliä tislattua vettä tai 50 mM fosfaattipuskuriin (lisäys 4). Jätetään liuos 5–10 minuutiksi. |
| --- | --- |

a)

Otetaan bakteerilimaa tai värittyneen solukon pala mukulan johtosolukkorenkaasta tai perunan tai tomaatin tai muun nuutuvan isäntäkasvin varren johtojänteistä. Suspendoidaan pieneen määrään steriiliä tislattua vettä tai 50 mM fosfaattipuskuriin (lisäys 4). Jätetään liuos 5–10 minuutiksi.

| b) | Valmistetaan suspensiosta kymmenkertaisten laimennosten sarja. |
| --- | --- |

b)

Valmistetaan suspensiosta kymmenkertaisten laimennosten sarja.

| c) | Siirretään 50–100 μl suspensiota ja laimennoksia tavalliselle ravintoalustalle (NA, YPGA tai SPA; ks. lisäys 2) ja/tai Kelmanin tetratsoliumalustalle (lisäys 2) ja/tai validoidulle selektiiviselle alustalle (esim. SMSA; ks. lisäys 2). Levitetään tai sivellään maljalle tarkoituksenmukaista laimennussarjatekniikkaa käyttäen. Tarvittaessa valmistetaan erillisiä maljoja, joissa on laimennettua R. solanacearum biovaria 2 -solususpensioviljelmää positiivisena kontrollina. |
| --- | --- |

c)

Siirretään 50–100 μl suspensiota ja laimennoksia tavalliselle ravintoalustalle (NA, YPGA tai SPA; ks. lisäys 2) ja/tai Kelmanin tetratsoliumalustalle (lisäys 2) ja/tai validoidulle selektiiviselle alustalle (esim. SMSA; ks. lisäys 2). Levitetään tai sivellään maljalle tarkoituksenmukaista laimennussarjatekniikkaa käyttäen. Tarvittaessa valmistetaan erillisiä maljoja, joissa on laimennettua R. solanacearum biovaria 2 -solususpensioviljelmää positiivisena kontrollina.

| d) | Inkuboidaan maljoja 2–6 päivän ajan 28 °C:ssa.






  — | Tavallisella ravintoalustalla elinvoimaiset R. solanacearum -bakteerin isolaatit kehittyvät kermanvalkoisiksi, litteiksi, epäsäännöllisen muotoisiksi ja juokseviksi pesäkkeiksi, jotka ovat usein keskeltä tyypillisesti kierteisiä. Tautia aiheuttamattomat R. solanacearum -bakteerin muodot kehittävät pieniä, pyöreitä, voimaisia ja kokonaisuudessaan kermanvalkoisia pesäkkeitä, jotka eivät ole juoksevia. |
| --- | --- | --- |

d)

Inkuboidaan maljoja 2–6 päivän ajan 28 °C:ssa.

—

Tavallisella ravintoalustalla elinvoimaiset R. solanacearum -bakteerin isolaatit kehittyvät kermanvalkoisiksi, litteiksi, epäsäännöllisen muotoisiksi ja juokseviksi pesäkkeiksi, jotka ovat usein keskeltä tyypillisesti kierteisiä. Tautia aiheuttamattomat R. solanacearum -bakteerin muodot kehittävät pieniä, pyöreitä, voimaisia ja kokonaisuudessaan kermanvalkoisia pesäkkeitä, jotka eivät ole juoksevia.

| — | Kelmanin tetratsolium- ja SMSA-alustalla kierteet ovat väriltään verenpunaisia. Tautia aiheuttamattomat Ralstonia solanacearum -bakteerin muodot kehittävät pieniä, pyöreitä, voimaisia ja kokonaisuudessaan syvänpunaisia pesäkkeitä, jotka eivät juoksevia. |
| --- | --- |

—

Kelmanin tetratsolium- ja SMSA-alustalla kierteet ovat väriltään verenpunaisia. Tautia aiheuttamattomat Ralstonia solanacearum -bakteerin muodot kehittävät pieniä, pyöreitä, voimaisia ja kokonaisuudessaan syvänpunaisia pesäkkeitä, jotka eivät juoksevia.

4.   R. solanacearum -kasvintuhoojan tunnistustestit

Testit, joilla vahvistetaan oletettujen R. solanacearum -isolaattien tunnistus, esitetään VI jakson B kohdassa.

III JAKSO

1.   Yksityiskohtaiset menetelmät Ralstonia solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista mukulanäytteistä

1.1   Näytteiden valmistelu

Huomautus:

| — | Standardinäytekoko on 200 mukulaa testiä kohden. Laajempi näytteenotto edellyttää useampia testejä tämänkokoisille näytteille. Jos näytteessä on enemmän kuin 200 mukulaa, tulokset saattavat jäädä saamatta tai niitä on vaikea tulkita. Menettelyä voidaan kuitenkin hyvin käyttää alle 200 mukulan näytteisiin, jos 200:aa mukulaa ei ole käytettävissä. |
| --- | --- |

—

Standardinäytekoko on 200 mukulaa testiä kohden. Laajempi näytteenotto edellyttää useampia testejä tämänkokoisille näytteille. Jos näytteessä on enemmän kuin 200 mukulaa, tulokset saattavat jäädä saamatta tai niitä on vaikea tulkita. Menettelyä voidaan kuitenkin hyvin käyttää alle 200 mukulan näytteisiin, jos 200:aa mukulaa ei ole käytettävissä.

| — | Kaikkien jäljempänä kuvattujen toteamismenetelmien validointi perustuu 200 mukulan suuruisen näytteen testaamiseen. |
| --- | --- |

—

Kaikkien jäljempänä kuvattujen toteamismenetelmien validointi perustuu 200 mukulan suuruisen näytteen testaamiseen.

| — | Jäljempänä kuvattua perunauutetta voidaan käyttää myös perunan vaaleaa rengasmätää aiheuttavan Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus -bakteerin toteamiseen. |
| --- | --- |

—

Jäljempänä kuvattua perunauutetta voidaan käyttää myös perunan vaaleaa rengasmätää aiheuttavan Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus -bakteerin toteamiseen.

Näytteiden valmistamista edeltävät vapaavalintaiset esikäsittelyt:

| a) | Inkuboidaan näytteitä 25–30 °C:ssa enintään 2 viikon ajan ennen testausta mahdollisten R. solanacearum -populaatioiden lisääntymisen helpottamiseksi. |
| --- | --- |

a)

Inkuboidaan näytteitä 25–30 °C:ssa enintään 2 viikon ajan ennen testausta mahdollisten R. solanacearum -populaatioiden lisääntymisen helpottamiseksi.

| b) | Pestään mukulat. Kunkin näytteen jälkeen käytetään tarkoituksenmukaisia desinfiointiaineita (tehtäessä PCR-testi on käytettävä klooriyhdisteitä patogeenisen DNA:n poistamiseksi) ja puhdistusaineita. Ilmakuivataan mukulat. Pesumenettelystä on erityistä hyötyä (vaikkakaan sitä ei vaadita), jos näytteissä on paljon ylimääräistä multaa ja jos PCR-testi tai suora eristysmenettely toteutetaan. |
| --- | --- |

b)

Pestään mukulat. Kunkin näytteen jälkeen käytetään tarkoituksenmukaisia desinfiointiaineita (tehtäessä PCR-testi on käytettävä klooriyhdisteitä patogeenisen DNA:n poistamiseksi) ja puhdistusaineita. Ilmakuivataan mukulat. Pesumenettelystä on erityistä hyötyä (vaikkakaan sitä ei vaadita), jos näytteissä on paljon ylimääräistä multaa ja jos PCR-testi tai suora eristysmenettely toteutetaan.

1.1.1   Poistetaan puhtaalla ja desinfioidulla leikkausveitsellä tai vihannesveitsellä kuori mukulan napapäästä siten, että johtosolukot tulevat näkyviin. Leikataan varovasti pieni kartionmuotoinen kappale johtosolukosta kunkin mukulan napapäästä ja yritetään pitää muun solukon kuin johtosolukon osuus mahdollisimman pienenä (ks. www-sivusto osoitteessa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Huomautus: Laitetaan sivuun jokainen (pilaantunut) mukula, jossa on tummaksi rengasmädäksi epäiltyjä oireita, ja testataan yksittäin.

Jos napapään irrottamisen aikana havaitaan tummaksi rengasmädäksi epäiltyjä oireita, mukula olisi tutkittava silmämääräisesti ja lohkaistava läheltä napapäätä. Lohkaistuja mukuloita, joissa on epäilyttäviä oireita, olisi säilytettävä vähintään 2 vuorokautta huoneenlämmössä korkkiutumisen mahdollistamiseksi, minkä jälkeen mukula säilytetään jäähdytettynä (4–10 °C:ssa) asianmukaisissa karanteenioloissa. Kaikki mukulat (myös ne, joissa on epäilyttäviä oireita) olisi säilytettävä liitteen III mukaisesti.

1.1.2   Kerätään napapääkappaleet käyttämättömiin kertakäyttöisiin säilytysastioihin, jotka voidaan sulkea ja/tai sinetöidä (jos astioita käytetään uudelleen, ne olisi puhdistettava perusteellisesti ja desinfioitava klooriyhdisteillä). Kappaleet olisi mieluiten käsiteltävä viipymättä. Jos tämä ei ole mahdollista, niitä voidaan säilyttää astiassa – lisäämättä puskuriliuosta – jäähdytettyinä enintään 72 tunnin ajan tai huoneenlämmössä enintään 24 tunnin ajan.

Käsitellään napapääkappaleet yhtä seuraavista menettelyistä noudattaen: joko

| a) | peitetään kappaleet riittävällä määrällä (noin 40 ml) uuttopuskuria (lisäys 4) ja sekoitetaan tasoravistimella (50–100 rpm:n kierrosnopeudella) neljän tunnin ajan alle 24 °C:ssa tai 16–24 tunnin ajan jäähdytettyinä;
  tai |
| --- | --- |

a)

peitetään kappaleet riittävällä määrällä (noin 40 ml) uuttopuskuria (lisäys 4) ja sekoitetaan tasoravistimella (50–100 rpm:n kierrosnopeudella) neljän tunnin ajan alle 24 °C:ssa tai 16–24 tunnin ajan jäähdytettyinä;

tai

| b) | homogenoidaan kappaleet riittävällä määrällä (noin 40 ml) uuttopuskuria (lisäys 4) joko sekoittimella (esim. Waring tai Ultra Turrax) tai murskaamalla suljetussa kertakäyttöisessä liotepussissa (esim. luja Stomacher- tai Bioreba-polyeteenipussi, jonka mitat ovat 150 mm × 250 mm, säteilysteriili) käyttäen kumivasaraa tai sopivaa jauhamisvälinettä (esim. Homex). |
| --- | --- |

b)

homogenoidaan kappaleet riittävällä määrällä (noin 40 ml) uuttopuskuria (lisäys 4) joko sekoittimella (esim. Waring tai Ultra Turrax) tai murskaamalla suljetussa kertakäyttöisessä liotepussissa (esim. luja Stomacher- tai Bioreba-polyeteenipussi, jonka mitat ovat 150 mm × 250 mm, säteilysteriili) käyttäen kumivasaraa tai sopivaa jauhamisvälinettä (esim. Homex).

Huomautus: Näytteiden ristikontaminaation riski on suuri silloin, kun näytteet homogenoidaan sekoittimella. On ryhdyttävä varotoimiin roiskumisen tai läikkymisen välttämiseksi uuttamisprosessin aikana. On varmistettava, että jokaista näytettä varten käytetään vasta steriloituja sekoittimen lapoja ja astioita. Jos aiotaan tehdä PCR-testi, on vältettävä DNA:n siirtyminen astioihin tai jauhamislaitteisiin. Tehtäessä PCR-testi on suositeltavaa suorittaa murskaaminen kertakäyttöisissä pusseissa ja käyttää kertakäyttöisiä putkia.

1.1.3   Dekantoidaan supernatantti. Jos liuos on liian sameaa, sitä kirkastetaan joko hitaasti sentrifugoiden (enintään 180 g kymmenen minuutin ajan 4–10 °C:n lämpötilassa) tai suodatetaan liuos (40–100 μm:n huokoskoon vakuumisuodatusjärjestelmällä) ja pestään suodatin vielä uuttopuskurilla (10 ml).

1.1.4   Konsentroidaan bakteerifraktio sentrifugoimalla 7 000 g 15 minuutin ajan (tai 10 000 g 10 minuutin ajan) 4–10 °C:n lämpötilassa ja poistetaan supernatantti sakkaa sekoittamatta.

1.1.5   Suspendoidaan sakka uudelleen 1,5 ml:aan sakkapuskuria (lisäys 4). Käytetään 500 μl:aa R. solanacearum -bakteerin testaamiseksi, 500 μl:aa Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus -bakteerin testaamiseksi ja 500 μl:aa vertailutarkoituksiin. Lisätään 10–25 % (v/v) steriiliä glyserolia 500 μl:aan vertailuarvona olevaan määräosaan ja jäljellä olevaan testimääräosaan, sekoitetaan ja varastoidaan –16––24 °C:n lämpötilaan (viikoiksi) tai –68––86 °C:n lämpötilaan (kuukausiksi). Säilytetään testimääräosat 4–10 °C:ssa testauksen ajan.

Toistuva jäädytys ja sulatus ei ole suositeltavaa.

Jos uutetta joudutaan kuljettamaan, toimitus on tehtävä kylmälaukussa 24–48 tunnin kuluessa.

1.1.6   Saastunnan välttämiseksi on ehdottoman tärkeää käsitellä näytteet ja R. solanacearum -positiiviset vertailu-, kontrolli- ja valvontanäytteet toisistaan erillään. Tämä koskee sekä immunofluoresenssitestiä että kaikkia muitakin testejä.

1.2   Testaus

Ks. vuokaavio ja testien kuvaus sekä optimoidut protokollat niitä käsittelevissä lisäyksissä:

| | Eristäminen selektiivisellä alustalla (ks. VI jakson A kohdan 4 alakohta) |
| --- | --- |

Eristäminen selektiivisellä alustalla (ks. VI jakson A kohdan 4 alakohta)

| | IF-testi (VI jakson A kohdan 5 alakohta) |
| --- | --- |

IF-testi (VI jakson A kohdan 5 alakohta)

| | PCR-testi (VI jakson A kohdan 6 alakohta) |
| --- | --- |

PCR-testi (VI jakson A kohdan 6 alakohta)

| | FISH-testi (VI jakson A kohdan 7 alakohta) |
| --- | --- |

FISH-testi (VI jakson A kohdan 7 alakohta)

| | ELISA-testi (VI jakson A kohdan 8 alakohta) |
| --- | --- |

ELISA-testi (VI jakson A kohdan 8 alakohta)

| | Biologinen määritys (VI jakson A kohdan 9 alakohta). |
| --- | --- |

Biologinen määritys (VI jakson A kohdan 9 alakohta).

2.   Yksityiskohtaiset menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi oireettomista perunoista, tomaateista tai muista isäntäkasveista

2.1   Näytteiden valmistelu

Huomautus: Piilevien R. solanacearum -kantojen toteamiseksi on suositeltavaa käyttää kokoomanäytteitä. Menettelyä voidaan vaivatta käyttää jopa 200:n varresta otetun osan muodostamiin kokoomanäytteisiin. Jos tehdään tutkimuksia, niiden olisi perustuttava tilastollisesti edustavaan otokseen tutkittavana olevasta kasvipopulaatiosta.

2.1.1   Kerätään 1–2 cm:n kokoiset varren palaset suljettavaan steriiliin astiaan seuraavien näytteenottomenetelmien mukaisesti:

Tomaatin taimet taimitarhalla: Poistetaan desinfioiduilla leikkausveitsellä 1 cm:n palanen kunkin varren alaosasta juuri maanpinnan yläpuolelta.

Pellolla tai kasvihuoneessa kasvatetut tomaattikasvit: Puhtaalla ja desinfioidulla veitsellä poistetaan kustakin kasvista alin sivuverso leikkaamalla juuri verson ja kasvin päävarren liitoskohdan yläpuolelta. Poistetaan alin 1 cm:n osa kustakin sivuversosta.

Muut isäntäkasvit: Poistetaan desinfioiduilla leikkausveitsellä tai oksasaksilla 1 cm:n palanen kunkin varren alaosasta juuri maanpinnan yläpuolelta. Jos kyseessä on S. dulcamara tai muu vedessä kasvava isäntäkasvi, poistetaan 1–2 cm:n osia vedenalaisesta varresta tai rönsystä, jossa on vesijuuria.

Kun näytteitä otetaan jostakin tietystä paikasta, on suositeltavaa testata tilastollisesti edustava näyte, jossa on vähintään 10 potentiaalista isäntärikkakasvia kustakin näytteenottopaikasta. Taudinaiheuttaja voidaan luotettavimmin havaita loppukeväästä, kesällä ja syksyllä, vaikka luonnossa voidaankin havaita tartuntoja läpi vuoden vesistöissä kasvavissa monivuotisissa Solanum dulcamara -kasveissa. Tunnettuja isäntäkasveja ovat ylivuotiset perunakasvit, Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium ja muut Solanaceae-heimon jäsenet. Muita isäntäkasveja ovat Pelargonium spp. ja Portulaca oleracea. Muita eurooppalaisia rikkakasvilajikkeita, joiden juurissa ja/tai ritsosfäärissä (juurten ympäristössä) voidaan tietyissä ympäristöoloissa tavata R. solanacearum biovarin 2 rodun 3 populaatioita, ovat Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp., Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra ja Urtica dioica.

Huomautus: Kasveja voidaan tässä vaiheessa tarkastella silmämääräisesti sisäisten oireiden varalta (johtosolukon värjäytyminen tai bakteerimätä. Laitetaan sivuun kaikki varren osat, joissa on oireita, ja testataan erikseen (ks. II jakso).

2.1.2   Desinfioidaan varren osat pikaisesti 70-prosenttisella etanolilla ja kuivataan välittömästi paperipyyhkeeseen taputtamalla. Käsitellään tämän jälkeen varren palaset yhtä seuraavista menettelyistä noudattaen: joko

| a) | peitetään kappaleet riittävällä määrällä (noin 40 ml) uuttopuskuria (lisäys 4) ja sekoitetaan tasoravistimella (50–100 rpm:n kierrosnopeudella) neljän tunnin ajan alle 24 °C:ssa tai 16–24 tunnin ajan jäähdytettyinä; tai |
| --- | --- |

a)

peitetään kappaleet riittävällä määrällä (noin 40 ml) uuttopuskuria (lisäys 4) ja sekoitetaan tasoravistimella (50–100 rpm:n kierrosnopeudella) neljän tunnin ajan alle 24 °C:ssa tai 16–24 tunnin ajan jäähdytettyinä; tai

| b) | käsitellään välittömästi jauhamalla palaset lujassa pussissa (esim. Stomacher tai Bioreba) siten, että siinä on sopiva määrä uuttopuskuria (lisäys 4), käyttäen kumivasaraa tai sopivaa jauhamisvälinettä (esim. Homex). Jos tämä ei ole mahdollista, varastoidaan varren palaset jäähdytettyinä enintään 72 tunnin ajan tai huoneenlämmössä enintään 24 tunnin ajan. |
| --- | --- |

b)

käsitellään välittömästi jauhamalla palaset lujassa pussissa (esim. Stomacher tai Bioreba) siten, että siinä on sopiva määrä uuttopuskuria (lisäys 4), käyttäen kumivasaraa tai sopivaa jauhamisvälinettä (esim. Homex). Jos tämä ei ole mahdollista, varastoidaan varren palaset jäähdytettyinä enintään 72 tunnin ajan tai huoneenlämmössä enintään 24 tunnin ajan.

2.1.3   Dekantoidaan supernatantti, kun seos on saanut seistä 15 minuuttia.

2.1.4   Uutteen kirkastaminen lisää tai bakteerifraktion konsentrointi ei yleensä ole tarpeen mutta voidaan tehdä suodattamalla ja/tai sentrifugoimalla, kuten III jakson 1.1.3–1.1.5 kohdassa kuvataan.

2.1.5   Jaetaan laimentamaton tai konsentroitu näyteuute kahteen yhtä suureen osaan. Pidetään toista osaa 4–10 °C:n lämpötilassa testauksen ajan ja varastoidaan toinen puolisko 10–25 %:ssa (v/v) steriilissä glyserolissa –16––24 °C:n lämpötilaan (viikoiksi) tai –68––86 °C:n lämpötilaan (kuukaudeksi), mikäli lisätestaus on tarpeen.

2.2   Testaus

Ks. vuokaavio ja testien kuvaus sekä optimoidut protokollat niitä käsittelevissä lisäyksissä:

| | Eristäminen selektiivisellä alustalla (ks. VI jakson A kohdan 4 alakohta) |
| --- | --- |

Eristäminen selektiivisellä alustalla (ks. VI jakson A kohdan 4 alakohta)

| | IF-testi (VI jakson A kohdan 5 alakohta) |
| --- | --- |

IF-testi (VI jakson A kohdan 5 alakohta)

| | PCR-testi (VI jakson A kohdan 6 alakohta) |
| --- | --- |

PCR-testi (VI jakson A kohdan 6 alakohta)

| | FISH-testi (VI jakson A kohdan 7 alakohta) |
| --- | --- |

FISH-testi (VI jakson A kohdan 7 alakohta)

| | ELISA-testi (VI jakson A kohdan 8 alakohta) |
| --- | --- |

ELISA-testi (VI jakson A kohdan 8 alakohta)

| | Biologinen määritys (VI jakson A kohdan 9 alakohta). |
| --- | --- |

Biologinen määritys (VI jakson A kohdan 9 alakohta).

IV JAKSO

1.   Menetelmä R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi vedestä

Image

Image

2.   Menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi vedestä

Periaate

Tässä jaksossa kuvattavaa validoitua toteamismenettelyä sovelletaan taudinaiheuttajan havaitsemiseksi pintavesinäytteistä, ja sitä voidaan soveltaa myös perunanjalostuksessa syntyvien tai muiden jätevesien näytteiden testaamiseen. On kuitenkin huomattava, että odotettu havaitsemisherkkyys vaihtelee substraatin mukaisesti. Eristystestin herkkyyteen vaikuttavat kilpailevien saprofyyttisten bakteerien populaatiot, jotka ovat yleensä huomattavasti suurempia perunanjalostuksen jätevesissä ja muissa jätevesissä kuin pintavedessä. Vaikka jäljempänä kuvattavalla menettelyllä odotetaan havaittavan niinkin pieniä pitoisuuksia kuin 103 solua litraa kohden, havaitsemisherkkyys on todennäköisesti merkittävästi pienempi, kun kyseessä ovat perunanjalostuksen jätevedet tai muut jätevedet. Tämän vuoksi suositellaan, että jätevedet testataan mahdollisten puhdistuskäsittelyiden (esim. sedimentointi tai suodatus) jälkeen, jolloin saprofyyttisten bakteereiden populaatiot ovat pienempiä. Testimenettelyn herkkyyteen liittyvät rajoitukset on pidettävä mielessä, kun arvioidaan mahdollisesti saatujen negatiivisten tulosten luotettavuutta. Vaikka tätä menettelyä on onnistuneesti käytetty tutkimustyössä, jolla on pyritty määrittämään taudinaiheuttajan esiintyminen pintavedessä, menettelyn rajoitukset on tunnettava, jos sitä käytetään vastaaviin tutkimuksiin, jotka koskevat perunanjalostuksessa syntyviä jätevesiä tai muita jätevesiä.

2.1   Näytteiden valmistelu

Huomautus:

| — | R. solanacearum havaitaan pintavedestä luotettavimmin loppukeväästä, kesällä tai syksyllä, kun veden lämpötila on yli 15 °C. |
| --- | --- |

—

R. solanacearum havaitaan pintavedestä luotettavimmin loppukeväästä, kesällä tai syksyllä, kun veden lämpötila on yli 15 °C.

| — | Toistamalla näytteenotto määritetyistä näytteenottopaikoista eri aikoina edellä kuvatun kauden aikana voidaan vähentää ilmastollisten vaihteluiden vaikutuksia ja näin parantaa havaitsemisluotettavuutta. |
| --- | --- |

—

Toistamalla näytteenotto määritetyistä näytteenottopaikoista eri aikoina edellä kuvatun kauden aikana voidaan vähentää ilmastollisten vaihteluiden vaikutuksia ja näin parantaa havaitsemisluotettavuutta.

| — | Runsaiden sateiden ja vesistön maantieteellisen muodon vaikutus on otettava huomioon, jotta voidaan välttää laajan laimentumisen vaikutukset, jotka voisivat kätkeä taudinaiheuttajan esiintymisen. |
| --- | --- |

—

Runsaiden sateiden ja vesistön maantieteellisen muodon vaikutus on otettava huomioon, jotta voidaan välttää laajan laimentumisen vaikutukset, jotka voisivat kätkeä taudinaiheuttajan esiintymisen.

| — | Pintavesinäytteitä otetaan isäntäkasvien läheisyydestä, jos näitä kasveja esiintyy. |
| --- | --- |

—

Pintavesinäytteitä otetaan isäntäkasvien läheisyydestä, jos näitä kasveja esiintyy.

2.1.1   Vesinäytteet kerätään valikoiduista näytteenottopaikoista täyttämällä kertakäyttöiset steriilit putket tai pullot yli 30 cm syvyydessä ja enintään 2 m etäisyydellä rannasta, jos mahdollista. Jalostus- ja jätevesinäytteet kerätään jäteveden laskupaikalta. Suositeltava näytekoko on enintään 500 ml näytteenottopaikkaa kohden. Jos halutaan käyttää pienempiä näytteitä, on suositeltavaa ottaa näytteitä vähintään kolmesti kustakin näytteenottopaikasta ja siten, että kukin näyte koostuu kahdesta samanlaisesta vähintään 30 ml:n osanäytteestä. Intensiivistä tutkimustyötä varten valitaan vähintään 3 näytteenottopaikkaa 3 vesistökilometriä kohden ja varmistetaan, että myös vesistöön laskevista sivujoista ja -puroista otetaan näytteet.

2.1.2   Näytteet kuljetetaan pimeässä ja viileässä (4–10 °C) ja testataan 24 tunnin kuluessa.

2.1.3   Bakteerifraktio voidaan tarvittaessa konsentroida jollakin seuraavista menetelmistä:

| a) | Sentrifugoidaan 30–50 ml:n osanäytteitä 10 000 g:ssa 10 minuutin ajan (tai 7 000 g:ssa 15 minuutin ajan) mieluiten 4–10 °C:ssa, poistetaan supernatantti ja suspendoidaan pelletti uudelleen 1 ml:aan pellettipuskuria (lisäys 4). |
| --- | --- |

a)

Sentrifugoidaan 30–50 ml:n osanäytteitä 10 000 g:ssa 10 minuutin ajan (tai 7 000 g:ssa 15 minuutin ajan) mieluiten 4–10 °C:ssa, poistetaan supernatantti ja suspendoidaan pelletti uudelleen 1 ml:aan pellettipuskuria (lisäys 4).

| b) | Kalvosuodatus (vähimmäishuokoskoko 0,45 μm), minkä jälkeen pestään suodatin 5–10 ml:ssa pellettipuskuria ja säilytetään pesuliuos. Tämä menetelmä soveltuu suurille vesimäärille, jotka sisältävät vähäisiä määriä saprofyyttejä. |
| --- | --- |

b)

Kalvosuodatus (vähimmäishuokoskoko 0,45 μm), minkä jälkeen pestään suodatin 5–10 ml:ssa pellettipuskuria ja säilytetään pesuliuos. Tämä menetelmä soveltuu suurille vesimäärille, jotka sisältävät vähäisiä määriä saprofyyttejä.

Konsentrointia ei yleensä suositella perunan jalostuksessa syntyvän jäteveden tai muun jäteveden näytteille, koska kilpailevien saprofyyttisten bakteereiden populaatioiden kasvu estää Ralstonia solanacearum -bakteerien havaitsemisen.

2.2   Testaus

Ks. vuokaavio ja testien kuvaus niitä käsittelevissä lisäyksissä.

V JAKSO

1.   Menetelmä R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi maaperästä

Image

Image

2.   Menetelmät R. solanacearum -kasvintuhoojan toteamiseksi ja tunnistamiseksi maaperästä

Periaatteet

Tässä jaksossa kuvattavaa validoitua toteamismenettelyä sovelletaan taudinaiheuttajan havaitsemiseksi maaperänäytteissä, mutta sitä voidaan soveltaa myös perunan jalostuksessa syntyvän kiinteän jätteen tai viemärilietteen näytteiden testaamiseen. On kuitenkin huomattava, että nämä menetelmät eivät ole riittävän herkkiä sen takaamiseksi, että sillä havaittaisiin pienet ja/tai epätasaisesti jakautuneet Ralstonia solanacearum -populaatiot, joita voi esiintyä näistä substraateista saaduissa luonnollisesti saastuneissa näytteissä.

Tämän testimenettelyn herkkyyden asettamat rajoitukset olisi otettava huomioon, kun arvioidaan mahdollisesti saatujen negatiivisten tulosten luotettavuutta sekä silloin kun menettelyä käytetään tutkimuksissa, joilla pyritään määrittämään taudinaiheuttajan esiintyminen maaperässä tai lietteessä. Luotettavin testi taudinaiheuttajan toteamiseksi maaperästä on se, että istutetaan taudille altis kasvi ja seurataan, saako se tartunnan. Tälläkään menetelmällä ei tosin havaita alhaisia saastumistasoja.

2.1   Näytteiden valmistelu

2.1.1   Näytteenotto peltomaasta tehdään sukkulamatojen varalta tehtävässä näytteenotossa käytettävien yleisten periaatteiden mukaisesti. Kerätään 0,5–1 kg maata näytettä kohden 10–20 cm syvyydeltä siten, että näytteenottopaikkoja on 60 jokaista 0,3 ha kohden (tai ruudukosta, joka on 7 × 7 m). Jos taudinaiheuttajaa epäillään esiintyvän, keruupisteiden määrä nostetaan 120:een 0,3 ha kohden. Näytteet säilytettään 12–15 °C:ssa ennen testausta. Näytteet perunoiden jalostuksen jätelietteestä ja viemärilietteestä otetaan keräämällä yhteensä 1 kg paikoista, jotka edustavat tutkittavan lietteen kokonaismäärää. Näytteet sekoitetaan hyvin ennen testaamista.

2.1.2   Hajotetaan maaperästä tai lietteestä otetut 10–25 g:n osanäytteet tasoravistimella (250 rpm) 60–150 ml:aan uuttopuskuria (lisäys 4) enintään 2 tunnin ajan. Dispersiota voidaan tarvittaessa auttaa lisäämällä 0,02 % steriiliä Tween-20:tä ja 10–20 g steriiliä soraa.

2.1.3   Suspensio pidetään 4 °C:ssa testauksen aikana.

2.2   Testaus

Ks. vuokaavio ja testien kuvaus niitä käsittelevissä lisäyksissä.

VI JAKSO

OPTIMOIDUT PROTOKOLLAT R. SOLANACEARUM -KASVINTUHOOJAN TOTEAMISEKSI JA TUNNISTAMISEKSI

A)   Määritys- ja toteamistestit

1.   Valutuskoe

R. solanacearum -bakteerin esiintyminen nuutuvissa perunan, tomaatin tai muun isäntäkasvin varsissa voidaan osoittaa seuraavan yksinkertaisen ennakoivan testin avulla: Leikataan varsi aivan maanpinnan yläpuolelta. Suspendoidaan leikkuupinta putkelliseen puhdasta vettä. Seurataan, alkaako leikatuista johtosolukimpuista muutaman minuutin kuluttua spontaanisti valua bakteerilimarihmoja.

2.   Poly-β-hydroksibutyraattirakeiden (PHB) toteaminen

| 1. | Valmistetaan mikroskooppilevylle preparaatti saastuneesta solukosta saadusta bakteerimädästä tai 48 tunnin viljelmästä YPGA- tai SPA-alustalla (lisäys 2). |
| --- | --- |

1.

Valmistetaan mikroskooppilevylle preparaatti saastuneesta solukosta saadusta bakteerimädästä tai 48 tunnin viljelmästä YPGA- tai SPA-alustalla (lisäys 2).

| 2. | Valmistetaan positiiviset kontrollipreparaatit R. solanacearum -bakteerin biovarin 2 kannasta ja negatiivinen kontrollipreparaatti tunnetusti PHB-negatiivisesta lajista, jos tämä katsotaan hyödylliseksi. |
| --- | --- |

2.

Valmistetaan positiiviset kontrollipreparaatit R. solanacearum -bakteerin biovarin 2 kannasta ja negatiivinen kontrollipreparaatti tunnetusti PHB-negatiivisesta lajista, jos tämä katsotaan hyödylliseksi.

| 3. | Annetaan kuivua ja kuljetetaan kunkin levyn pohjaa nopeasti liekin yllä preparaattien kiinnittämiseksi. |
| --- | --- |

3.

Annetaan kuivua ja kuljetetaan kunkin levyn pohjaa nopeasti liekin yllä preparaattien kiinnittämiseksi.

| 4. | Värjätään preparaatti joko niilinsinisellä tai sudaninmustalla ja tutkitaan sitä mikroskoopilla seuraavasti: |
| --- | --- |

4.

Värjätään preparaatti joko niilinsinisellä tai sudaninmustalla ja tutkitaan sitä mikroskoopilla seuraavasti:

Niilinsinisellä tehtävä testi

| a) | Peitetään kukin preparaatti niilinsinisen A 1-prosenttisella vesiliuoksella. Inkuboidaan 10 minuuttia 55 °C:ssa. |
| --- | --- |

a)

Peitetään kukin preparaatti niilinsinisen A 1-prosenttisella vesiliuoksella. Inkuboidaan 10 minuuttia 55 °C:ssa.

| b) | Valutetaan värjäävä liuos pois. Pestään nopeasti vedellä hiljaa valuvan hanan alla. Poistetaan ylimääräinen vesi paperipyyhkeellä. |
| --- | --- |

b)

Valutetaan värjäävä liuos pois. Pestään nopeasti vedellä hiljaa valuvan hanan alla. Poistetaan ylimääräinen vesi paperipyyhkeellä.

| c) | Peitetään preparaatti 8-prosenttisella etikkahapon vesiliuoksella ja annetaan inkuboitua 1 minuutin ajan laboratoriolämpötilassa. |
| --- | --- |

c)

Peitetään preparaatti 8-prosenttisella etikkahapon vesiliuoksella ja annetaan inkuboitua 1 minuutin ajan laboratoriolämpötilassa.

| d) | Pestään nopeasti vedellä hiljaa valuvan hanan alla. Poistetaan ylimääräinen vesi paperipyyhkeellä. |
| --- | --- |

d)

Pestään nopeasti vedellä hiljaa valuvan hanan alla. Poistetaan ylimääräinen vesi paperipyyhkeellä.

| e) | Kostutetaan uudelleen pisaralla vettä. Asetetaan peitelasi. |
| --- | --- |

e)

Kostutetaan uudelleen pisaralla vettä. Asetetaan peitelasi.

| f) | Tutkitaan värjäytynyttä preparaattia mikroskoopilla, joka on varustettu epifluoresoivalla valonlähteellä, aallonpituudella 450 nm öljy- tai vesi-immersio-objektiivin 600–1 000-kertaisella suurennoksella. |
| --- | --- |

f)

Tutkitaan värjäytynyttä preparaattia mikroskoopilla, joka on varustettu epifluoresoivalla valonlähteellä, aallonpituudella 450 nm öljy- tai vesi-immersio-objektiivin 600–1 000-kertaisella suurennoksella.

| g) | Seurataan, esiintyykö PHB-rakeiden kirkkaan oranssia fluoresenssia. Tarkastellaan myös tavanomaisessa valaistuksessa sen varmistamiseksi, että rakeet ovat solunsisäisiä ja että solujen morfologia on tyypillinen R. solanacearum -bakteerille. |
| --- | --- |

g)

Seurataan, esiintyykö PHB-rakeiden kirkkaan oranssia fluoresenssia. Tarkastellaan myös tavanomaisessa valaistuksessa sen varmistamiseksi, että rakeet ovat solunsisäisiä ja että solujen morfologia on tyypillinen R. solanacearum -bakteerille.

Sudaninmustalla tehtävä testi

| a) | Peitetään kukin preparaatti sudaninmustan B 0,3-prosenttisella 70-prosenttisessa etanolissa olevalla liuoksella. Inkuboidaan 10 minuutin ajan laboratoriolämpötilassa. |
| --- | --- |

a)

Peitetään kukin preparaatti sudaninmustan B 0,3-prosenttisella 70-prosenttisessa etanolissa olevalla liuoksella. Inkuboidaan 10 minuutin ajan laboratoriolämpötilassa.

| b) | Valutetaan värjäävä liuos pois. Pestään nopeasti vedellä hanan alla. Poistetaan ylimääräinen vesi paperipyyhkeellä. |
| --- | --- |

b)

Valutetaan värjäävä liuos pois. Pestään nopeasti vedellä hanan alla. Poistetaan ylimääräinen vesi paperipyyhkeellä.

| c) | Kastetaan levyt pikaisesti ksyloliin. Taputellaan kuivaksi paperipyyhkeellä. Varoitus: Ksyloli on haitallinen aine. Tarvittaviin varotoimiin on ryhdyttävä. Työskennellään vetokaapissa. |
| --- | --- |

c)

Kastetaan levyt pikaisesti ksyloliin. Taputellaan kuivaksi paperipyyhkeellä. Varoitus: Ksyloli on haitallinen aine. Tarvittaviin varotoimiin on ryhdyttävä. Työskennellään vetokaapissa.

| d) | Peitetään levyt 0,5-prosenttisella (w/v) safraniinin vesiliuoksella ja jätetään 10 sekunniksi laboratoriolämpötilaan. Varoitus: Safraniini on haitallinen tuote. Tarvittaviin varotoimiin on ryhdyttävä. Työskennellään vetokaapissa. |
| --- | --- |

d)

Peitetään levyt 0,5-prosenttisella (w/v) safraniinin vesiliuoksella ja jätetään 10 sekunniksi laboratoriolämpötilaan. Varoitus: Safraniini on haitallinen tuote. Tarvittaviin varotoimiin on ryhdyttävä. Työskennellään vetokaapissa.

| e) | Pestään vedellä hiljaa valuvan hanan alla. Kuivataan paperipyyhkeellä ja asetetaan peitelasi. |
| --- | --- |

e)

Pestään vedellä hiljaa valuvan hanan alla. Kuivataan paperipyyhkeellä ja asetetaan peitelasi.

| f) | Tutkitaan värjäytynyttä preparaattia valomikroskoopilla öljyimmersio-objektiivin 1 000-kertaisella suurennoksella. |
| --- | --- |

f)

Tutkitaan värjäytynyttä preparaattia valomikroskoopilla öljyimmersio-objektiivin 1 000-kertaisella suurennoksella.

| g) | R. solanacearum -bakteerin solujen PHB-rakeet värjäytyvät sinimustiksi ja soluseinät vaaleanpunaisiksi. |
| --- | --- |

g)

R. solanacearum -bakteerin solujen PHB-rakeet värjäytyvät sinimustiksi ja soluseinät vaaleanpunaisiksi.

3.   Serologiset agglutinaatiokokeet

Bakteerimädässä tai oireilevassa kudoksessa olevien R. solanacearum -solujen agglutinaatio voidaan havaita parhaiten käyttämällä validoituja vasta-aineita (ks. lisäys 3), jotka on leimattu soveltuvilla värimarkkereilla, kuten punaisilla Staphylococcus aureus -soluilla tai värillisillä lateksihiukkasilla. Jos käytetään kaupallista testisarjaa (ks. lisäys 3), on noudatettava valmistajan ohjeita. Muussa tapauksessa toimitaan seuraavan menettelyn mukaisesti:

| a) | Sekoitetaan leimatun vasta-aineen suspensiota ja bakteerimätää pisaroina (noin 5 μl kumpaakin) monisyvennyslevyjen syvennyksissä. |
| --- | --- |

a)

Sekoitetaan leimatun vasta-aineen suspensiota ja bakteerimätää pisaroina (noin 5 μl kumpaakin) monisyvennyslevyjen syvennyksissä.

| b) | Valmistetaan positiivinen ja negatiivinen kontrolli käyttämällä R. solanacearum biovarin 2 suspensiota ja heterologista kantaa. |
| --- | --- |

b)

Valmistetaan positiivinen ja negatiivinen kontrolli käyttämällä R. solanacearum biovarin 2 suspensiota ja heterologista kantaa.

| c) | Positiivissa näytteissä voidaan havaita agglutinaatio, kun niitä on kevyesti sekoitettu 15 sekunnin ajan. |
| --- | --- |

c)

Positiivissa näytteissä voidaan havaita agglutinaatio, kun niitä on kevyesti sekoitettu 15 sekunnin ajan.

4.   Eristäminen selektiivisellä alustalla

4.1   Valikoiva maljaus

Huomautus: Ennen kuin tätä menetelmää käytetään ensimmäisen kerran, on suoritettava alustavia testejä, jolla varmistetaan, että aiemmin negatiivisiksi testattuihin näyteuutteisiin lisätyt R. solanacearum -bakteerin pesäkkeitä muodostavat yksiköt (103–104/ml) voidaan todeta. Testi on voitava toistaa.

Käytetään asiamukaisesti validoitua selektiivistä alustaa, esim. SMSA:ta (sellaisena kuin se muutettuna Elphinstone et al., 1996; ks. lisäys 2).

R. solanacearum -bakteerin erottaminen muista alustalla mahdollisesti kehittyvistä bakteereista edellyttää huolellisuutta. R. solanacearum -pesäkkeet voivat lisäksi olla morfologialtaan epätyypillisiä, jos alustalla on liian suuri populaatio tai jos myös antagonistisia bakteereita esiintyy. Jos epäillään kilpailua tai antagonismia, näyte olisi testattava uudestaan eri testiä käyttäen.

Tämän menetelmän tunnistamisherkkyys on suurin, kun käytetään vasta valmistettuja näyteuutteita. Menetelmää voidaan kuitenkin käyttää myös silloin, kun uutteita on säilytetty glyserolissa –68––86 °C:ssa.

Positiivisiksi kontrolleiksi valmistetaan kymmenkertaiset laimennokset suspensiosta, jossa on 106 PMY/ml R. solanacearum -bakteerin virulenttia biovari 2 -kantaa (esim. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Mahdollisen kontaminaation välttämiseksi positiiviset kontrollit on valmistettava täysin erillään testinäytteistä.

Ennen kuin vasta valmistettua selektiivisen alustan erää käytetään rutiininäytteiden testaamiseen, olisi testattava sen soveltuvuus taudinaiheuttajan kasvattamiseen.

Testataan kontrollimateriaali samalla tavoin kuin näyte (näytteet).

4.1.1   Käytetään tarkoituksenmukaista laimennussarjatekniikkaa, jolla pyritään varmistamaan, että mahdolliset taustalla olevat saprofyyttiset pesäkkeitä muodostavat populaatiot laimentuvat pois. Levitetään levyä kohden 50–100 μl näyteuutetta ja kutakin laimennosta.

4.1.2   Inkuboidaan levyjä 28 °C:n lämpötilassa. Tarkastellaan levyjä 48 tunnin kuluttua ja tämän jälkeen päivittäin kuuden päivän ajan. Tyypilliset R. solanacearum -pesäkkeet SMSA-alustalla ovat maidonvalkoisia, litteitä, epäsäännöllisiä ja juoksevia, ja kolmen päivän inkubaation jälkeen niiden keskustaan kehittyy vaaleanpunaisesta verenpunaiseen vaihtelevaa väritystä, johon liittyy sisäinen raidoitus tai kierteet. (ks. www-sivusto osoitteessa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Huomautus: Tällä alustalla muodostuu joskus epätyypillisiä R. solanacearum -pesäkkeitä. Nämä voivat olla pieniä, pyöreitä, täysin punaisia ja ei-juoksevia tai ainoastaan osittain juoksevia. Tämän vuoksi niitä on vaikeaa erottaa saprofyyttisista pesäkkeitä muodostavista bakteereista.

4.1.3   Puhdistetaan oletetut R. solanacearum -pesäkkeet sen jälkeen, kun ne on sivelty tai laimennettu tavanomaiselle ravintoalustalle eristettyjen pesäkkeiden saamiseksi (ks. lisäys 2).

4.1.4   Viljelmiä säilytetään lyhyen aikaa steriilissä vedessä (pH 6–8, klooriton) huoneenlämmössä ja pimeässä tai pidemmän aikaa soveltuvassa kylmäsuojaavassa alustassa –68––86 °C:ssa tai ne lyofilisoidaan.

4.1.5   Tunnistetaan oletetut viljelmät (ks. VI jakson B kohta) ja tehdään patogeenisyystesti (ks. VI jakson C kohta).

Laimennussarjatestin tulosten tulkinta

Laimennussarjatesti on negatiivinen, jos yhtään pesäkettä ei ole havaittu kuuden päivän jälkeen tai jos yhtään R. solanacearum -bakteerille tyypillistä pesäkettä ei löydetä edellyttäen, että ei epäillä muiden bakteerien kilpailevaa tai estävää vaikutusta ja että R. solanacearum -bakteerin tyypillisiä pesäkkeitä löytyy positiivisesta kontrollista.

Laimennussarjatesti on positiivinen, jos oletettuja R. solanacearum -bakteerin pesäkkeitä eristetään.

4.2   Rikastusmenettely

Käytetään validoitua rikastusalustaa kuten muutettua Wilbrinkin lientä (ks. lisäys 2).

Tällä menettelyllä voidaan valikoivasti kasvattaa R. solanacearum -populaatioita näyteuutteissa ja lisätä toteamisherkkyyttä. Menettely laimentaa myös tehokkaasti PCR-reaktion inhibiittoreita (1:100). On kuitenkin huomattava, että R. solanacearum -bakteerin rikastaminen voi epäonnistua saprofyyttisten organismien kilpailun tai estovaikutuksen vuoksi, sillä nämä rikastuvat usein samanaikaisesti. R. solanacearum -bakteerin eristäminen rikastetuista liemiviljelmistä voi tämän vuoksi olla vaikeaa. Koska serologisesti samankaltaisten saprofyyttien populaatiot voivat kasvaa, suositellaan spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden käyttämistä polyklonaalisten vasta-aineiden sijaan, kun käytetään ELISA-testiä.

4.2.1   Rikastus-PCR:ää varten siirretään 100 μl näyteuutetta 10 ml:aan rikastuslientä (lisäys 2), joka on aiemmin jaettu DNA-vapaisiin putkiin tai pulloihin. Rikastus-ELISAa varten näyteuutteen suhde liemeen voi olla suurempi (esim. 100 μl 1,0 ml:ssa rikastuslientä).

4.2.2   Inkuboidaan 72 tuntia 27–30 °C:ssa ravisteltavassa viljelmässä tai staattisessa viljelmässä siten, että korkit ovat löysällä ilmanvaihdon turvaamiseksi.

4.2.3   Sekoitetaan hyvin ennen ELISA- tai PCR-testeihin käyttämistä.

4.2.4   Rikastuslientä käytetään edellä mainituissa testeissä samoin kuin näytteitäkin.

Huomautus: Jos epäillään, että R. solanacearum -bakteerin rikastaminen voi estyä tiettyjen kilpailevien saprofyyttisten bakteerien suurten populaatioiden vuoksi, parempia tuloksia voidaan saada rikastamalla näyteuutteita ennen sentrifugointia tai muuta konsentrointivaihetta.

5.   Immunofluoresenssitesti (IF)

Periaate

IF-testin käyttö pääasiallisena seulontatestinä on suositeltavaa, koska se on todistetusti riittävän herkkä vaadittavien kynnysarvojen saavuttamiseksi.

Kun IF-testiä käytetään pääasiallisena seulontatestinä ja IF-testin tulos on positiivinen, toisena seulontatestinä on tehtävä eristämistesti, PCR- tai FISH-testi. Jos IF-testiä käytetään toisena seulontatestinä ja IF-testin tulos on positiivinen, vuokaavion mukainen lisätestaus on tarpeen analyysin suorittamiseksi.

Huomautus: Käytetään validoitua R. solanacearum -vasta-aineiden lähdettä (ks. www-sivusto osoitteessa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). On suositeltavaa määrittää titteri kullekin uudelle vasta-aine-erälle. Titteri määritellään korkeimmaksi laimennokseksi, jolla optimaalinen reaktio tapahtuu, kun testataan suspensiota, joka sisältää R. solanacearum -bakteerin homologisesta kannasta saatuja soluja, 105–106/ml, sopivalla fluoreseiini-isotiosyanaattikonjugaatilla (FITC) valmistajan suositusten mukaisesti. Validoidun polyklonaalisen antiseerumin IF-titterin olisi oltava vähintään 1:2 000. Testauksen aikana vasta-aineita olisi käytettävä lähellä titteriä olevassa tai titterin suuruisessa työskentelylaimennoksessa (tai -laimennoksissa).

Testi olisi tehtävä vasta valmistetuista näyteuutteista. Testi voidaan tarvittaessa tehdä uutteista, joita on säilytetty –68––86 °C:ssa glyserolissa. Glyseroli voidaan poistaa näytteestä lisäämällä 1 ml sakkapuskuria (lisäys 4), sentrifugoimalla uudelleen 15 minuutin ajan 7 000 g:ssä ja suspendoimalla uudelleen yhtä suureen määrään puskuriliuosta. Tämä ei ole useinkaan välttämätöntä erityisesti, jos näytteet kiinnitetään levyihin liekittämällä.

Valmistetaan erilliset positiiviset kontrollilevyt R. solanacearum -bakteerin homologisesta kannasta tai mistä tahansa muusta vertailukannasta, jotka on suspendoitu perunauutteeseen, kuten lisäyksen 3 B kohdassa täsmennetään, ja vaihtoehtoisesti puskuriliuokseen.

Luonnollisesti saastunutta solukkoa (joka on säilytetty lyofilisoimalla tai pakastamalla–16––24 °C:ssa) olisi mahdollisuuksien mukaan käytettävä vertailua varten samalla levyllä.

Negatiivisina kontrolleina käytetään sellaisia näyteuutteen määräosia, jotka on aiemmin testattu R. solanacearum -bakteerin osalta negatiivisiksi.

Tämän testin yhteydessä käytettäviksi on saatavilla standardoituja positiivisia ja negatiivisia kontrollimateriaaleja, jotka luetellaan lisäyksessä 3.

Käytetään mikroskoopin monisyvennyslevyjä, joissa on mieluiten 10 halkaisijaltaan vähintään 6 mm:n syvennystä.

Testataan kontrollimateriaali samalla tavoin kuin näyte (näytteet).

5.1   Käsitellään testilevyt yhdellä seuraavista menettelyistä:

| i) | Pelletit, joissa on suhteellisen vähän tärkkelystä:
  Pipetoidaan mitattu vakiomäärä (15 μl on sopiva halkaisijaltaan 6 mm:n syvennykseen – lisätään määrää samassa suhteessa suuremmille syvennyksille) suhteessa 1:100 laimennettua, uudelleen suspendoitua sakkaa ensimmäiseen syvennykseen. Pipetoidaan samanlainen määrä laimentamatonta sakkaa (1:1) rivin muihin syvennyksiin. Jäljellä olevaa riviä voidaan käyttää toisintona tai toiselle näytteelle kuten kuviossa 1 on esitetty. |
| --- | --- |

i)

Pelletit, joissa on suhteellisen vähän tärkkelystä:

Pipetoidaan mitattu vakiomäärä (15 μl on sopiva halkaisijaltaan 6 mm:n syvennykseen – lisätään määrää samassa suhteessa suuremmille syvennyksille) suhteessa 1:100 laimennettua, uudelleen suspendoitua sakkaa ensimmäiseen syvennykseen. Pipetoidaan samanlainen määrä laimentamatonta sakkaa (1:1) rivin muihin syvennyksiin. Jäljellä olevaa riviä voidaan käyttää toisintona tai toiselle näytteelle kuten kuviossa 1 on esitetty.

| ii) | Muut pelletit:
  Valmistetaan kymmenkertaisia laimennoksia (1:10, 1:100) uudelleen suspendoidusta sakasta sakkapuskuriin. Pipetoidaan mitattu vakiomäärä (15 μl on sopiva halkaisijaltaan 6 mm:n syvennykseen – lisätään määrää samassa suhteessa suuremmille syvennyksille) uudelleen suspendoitua sakkaa ja kutakin laimennosta riville syvennyksiä. Jäljellä olevaa riviä voidaan käyttää toisintona tai toiselle näytteelle kuten kuviossa 2 on esitetty. |
| --- | --- |

ii)

Muut pelletit:

Valmistetaan kymmenkertaisia laimennoksia (1:10, 1:100) uudelleen suspendoidusta sakasta sakkapuskuriin. Pipetoidaan mitattu vakiomäärä (15 μl on sopiva halkaisijaltaan 6 mm:n syvennykseen – lisätään määrää samassa suhteessa suuremmille syvennyksille) uudelleen suspendoitua sakkaa ja kutakin laimennosta riville syvennyksiä. Jäljellä olevaa riviä voidaan käyttää toisintona tai toiselle näytteelle kuten kuviossa 2 on esitetty.

5.2   Annetaan pisaroiden kuivua huoneenlämmössä tai lämmittämällä 40–45 °C:n lämpötilaan. Kiinnitetään bakteerisolut levylle joko kuumentamalla (15 minuuttia 60 °C:n lämpötilassa), liekittämällä tai 95 % etanolilla tai vasta-aineiden toimittajien nimenomaisten ohjeiden mukaisesti.

Kiinnitettyjä levyjä voidaan tarvittaessa säilyttää jäädytettyinä kuivatusainetta sisältävässä laatikossa mahdollisimman lyhyen aikaa (enintään 3 kuukautta) ennen lisätestejä.

5.3   IF-menettely

| i) | Testilevyn valmistaminen 5.1 alakohdan i alakohdan mukaisesti:
  Valmistetaan kaksinkertaisten laimennosten sarja. Ensimmäisen syvennyksen olisi oltava 1/2 titteriä (T/2), ja muiden 1/4 titteriä (T/4), 1/2 titteriä (T/2), titteri (T) ja titteri kaksinkertaisena (2T). |
| --- | --- |

i)

Testilevyn valmistaminen 5.1 alakohdan i alakohdan mukaisesti:

Valmistetaan kaksinkertaisten laimennosten sarja. Ensimmäisen syvennyksen olisi oltava 1/2 titteriä (T/2), ja muiden 1/4 titteriä (T/4), 1/2 titteriä (T/2), titteri (T) ja titteri kaksinkertaisena (2T).

| ii) | Testilevyn valmistaminen 5.1 alakohdan ii alakohdan mukaisesti:
  Valmistetaan työskentelylaimennos vasta-aineesta IF-puskuriin. Työskentelylaimennos vaikuttaa spesifisyyteen. |
| --- | --- |

ii)

Testilevyn valmistaminen 5.1 alakohdan ii alakohdan mukaisesti:

Valmistetaan työskentelylaimennos vasta-aineesta IF-puskuriin. Työskentelylaimennos vaikuttaa spesifisyyteen.

Kaavio 1.   Testilevyn valmistaminen 5.1 alakohdan i alakohdan ja 5.3 alakohdan i alakohdan mukaisesti

| | Laimennokset uudelleen suspendoidusta sakasta |
| --- | --- |
| 1/100 | 1/1 | 1/1 | 1/1 | 1/1 |  | Uudelleen suspendoidun sakan laimennos |
| (T = titteri) | T/2 | T/4 | T/2 | T | 2T |  | Antiseerumin/vasta-aineen kaksinkertaiset laimennokset |
| Näyte 1 | | | | | | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Näytteen 1 toisinto tai näyte 2 | | | | | |
| 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |

Laimennokset uudelleen suspendoidusta sakasta

1/100

1/1

1/1

1/1

1/1



Uudelleen suspendoidun sakan laimennos

(T = titteri)

T/2

T/4

T/2

T

2T



Antiseerumin/vasta-aineen kaksinkertaiset laimennokset

Näyte 1

Image

Image

Image

Image

Image

1

2

3

4

5

Näytteen 1 toisinto tai näyte 2

Image

Image

Image

Image

Image

6

7

8

9

10

Kaavio 2.   Testilevyn valmistaminen 5.1 alakohdan ii alakohdan ja 5.3 alakohdan ii alakohdan mukaisesti

| | Työskentelylaimennos antiseerumista/vasta-aineesta |
| --- | --- |
| 1/1 | 1/10 | 1/100 | Tyhjä | Tyhjä |  | Uudelleen suspendoidun sakan kymmenkertainen laimennos |
| Näyte 1 | | | | | | | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Näytteen 1 toisinto tai näyte 2 | | | | | |
| 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |

Työskentelylaimennos antiseerumista/vasta-aineesta

1/1

1/10

1/100

Tyhjä

Tyhjä



Uudelleen suspendoidun sakan kymmenkertainen laimennos

Näyte 1

Image

Image

Image

Image

Image

1

2

3

4

5

Näytteen 1 toisinto tai näyte 2

Image

Image

Image

Image

Image

6

7

8

9

10

5.3.1   Järjestetään levyt kostean paperipyyhkeen päälle. Täytetään testisyvennykset kokonaisuudessaan vasta-aineen laimennoksella tai laimennoksilla. Syvennyksiin lisättävän vasta-aineen tilavuuden on vastattava vähintään levitetyn uutteen tilavuutta.

Seuraava menettely olisi toteutettava, jos vasta-aineiden toimittajilta ei ole saatu nimenomaisia ohjeita:

5.3.2   Inkuboidaan levyjä kannen alla kostealla paperilla 30 minuutin ajan huoneenlämmössä (18–25 °C).

5.3.3   Ravistetaan pisarat pois kaikilta levyiltä ja huuhdellaan levyt varovasti IF-puskurilla. Pestään 5 minuutin ajan IF-puskuri-Tweenillä (lisäys 4) ja sen jälkeen IF-puskurissa. Vältetään roiskeita tai pisaroiden kulkeutumista, joista saattaa olla seurauksena ristikontaminaatio. Poistetaan varovasti ylimääräinen kosteus paperipyyhkeellä.

5.3.4   Järjestetään levyt kostean paperin päälle. Täytetään testisyvennykset FITC-konjugaatin laimennoksella, jota on käytetty titterin määrittämiseen. Syvennyksiin lisätyn konjugaatin määrän on vastattava lisätyn vasta-aineen määrää.

5.3.5   Inkuboidaan levyt kannen alla kostealla paperilla 30 minuutin ajan huoneenlämmössä (18–25 °C).

5.3.6   Ravistetaan konjugaattipisarat pois levyltä. Huuhdellaan ja pestään kuten edellä (5.3.3 alakohta).

Poistetaan varovasti ylimääräinen kosteus paperipyyhkeellä.

5.3.7   Pipetoidaan 5–10 μl 0,1 M fosfaattipuskuroitua glyserolia (lisäys 4) tai vastaavaa kaupallisesti saatavilla olevaa haalistumiselta suojaavaa peittausainetta kuhunkin syvennykseen ja asetetaan peitelasi.

5.4   IF-testin lukeminen

5.4.1   Tutkitaan testilevyjä mikroskoopilla, joka on varustettu epifluoresoivalla valonlähteellä, FITC:n eksitaatioon sopivilla suodattimilla öljy- tai vesi-immersio-objektiivin 500–1 000-kertaisella suurennoksella. Tarkastellaan objektikenttää laidasta laitaan pystysuoraan ja vaakasuoraan ja kiertämällä ulkoreunaa pitkin. Näytteistä, joissa ei näy yhtään tai vain hyvin vähän soluja, tarkastellaan vähintään 40 mikroskooppikenttää.

Tutkitaan ensin positiiviset kontrollilevyt. Solujen on oltava kirkkaasti fluoresoivia ja täydellisesti värjäytyneitä määritellyllä vasta-ainetitterillä tai työskentelylaimennoksella. IF-testi (VI jakson A kohdan 5 alakohta) on uusittava, jos värjäytyminen ei ole täydellistä.

5.4.2   Tarkastellaan testisyvennyksissä kirkkaasti fluoresoivia soluja, joiden morfologia on tyypillinen R. solanacearum -bakteerille (ks. www-sivusto osoitteessa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluoresenssin intensiteetin on vastattava positiivista kontrollikantaa samassa vasta-ainelaimennoksessa. Sellaisia soluja, joiden värjäytyminen on epätäydellistä tai joiden fluoresenssi on heikko, ei oteta huomioon.

Jos epäillään kontaminaatiota, testi on toistettava. Näin saattaa käydä, jos kaikilla erän levyillä on positiivisia soluja puskurin kontaminaation vuoksi tai jos positiivisia soluja löytyy (levyn syvennysten ulkopuolelta) levyn kalvolta.

5.4.3   Immunofluoresenssitestien spesifisyyteen liittyy useita ongelmia. Perunan napapäiden ja varren palasten sakassa esiintyy todennäköisesti morfologisesti epätyypillisiä fluoresoivien solujen ja R. solanacearum -bakteerin kanssa kooltaan ja morfologialtaan samanlaisten ristiin reagoivien saprofyyttisten bakteerien populaatioita.

5.4.4   Tarkastellaan ainoastaan fluoresoivia soluja, joilla on tyypillinen koko ja morfologia vasta-ainetitterissä tai -työskentelylaimennoksessa, kuten 5.3 alakohdassa kuvattiin.

5.4.5   IF-testin tulosten tulkinta:

| i) | Jos näytteestä löytyy kirkkaasti fluoresoivia soluja, joiden morfologia on tyypillinen, arvioidaan tyypillisten solujen keskimääräinen lukumäärä mikroskooppikenttää kohden ja lasketaan näiden solujen lukumäärä uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohden (lisäys 5).
  IF-testin tulos on positiivinen, jos näytteissä on vähintään 5 × 103 tyypillistä solua uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohden. Näytettä pidetään mahdollisesti saastuneena, ja lisätestaus on tarpeen. |
| --- | --- |

i)

Jos näytteestä löytyy kirkkaasti fluoresoivia soluja, joiden morfologia on tyypillinen, arvioidaan tyypillisten solujen keskimääräinen lukumäärä mikroskooppikenttää kohden ja lasketaan näiden solujen lukumäärä uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohden (lisäys 5).

IF-testin tulos on positiivinen, jos näytteissä on vähintään 5 × 103 tyypillistä solua uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohden. Näytettä pidetään mahdollisesti saastuneena, ja lisätestaus on tarpeen.

| ii) | IF-testin tulos on negatiivinen, jos näytteissä on vähemmän kuin 5 × 103 solua uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohden, ja näytettä pidetään negatiivisena. Lisätestausta ei vaadita. |
| --- | --- |

ii)

IF-testin tulos on negatiivinen, jos näytteissä on vähemmän kuin 5 × 103 solua uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohden, ja näytettä pidetään negatiivisena. Lisätestausta ei vaadita.

6.   PCR-testi

Periaatteet

Kun PCR-testiä käytetään pääasiallisena seulontatestinä ja siitä saadaan positiivinen tulos, toisena pakollisena seulontatestinä on tehtävä eristys- tai IF-testi. Kun PCR-testiä käytetään toisena seulontatestinä ja siitä saadaan positiivinen tulos, vuokaavion mukainen lisätestaus on tarpeen määrityksen tekemiseksi.

Tätä menetelmää on suositeltavaa käyttää pääasiallisena seulontatestinä ainoastaan, jos käytettävissä on sen tekemiseen vaadittavaa erityisasiantuntemusta.

Huomautus: Alustavan testauksen tällä menetelmällä pitäisi mahdollistaa se, että voidaan todeta aiemmin negatiivisiksi testattuihin näyteuutteisiin lisätyt R. solanacearum -bakteerin solut (103–104/ml). Testi on voitava toistaa. Optimointikokeet saattavat olla tarpeen herkkyyden ja spesifisyyden maksimoimiseksi kaikissa laboratorioissa.

Käytetään validoituja PCR-reagensseja ja -testausprotokollia (ks. lisäys 6). Olisi mielellään valittava menetelmä, johon kuuluu sisäinen kontrolli.

On toteutettava tarkoituksenmukaisia varotoimia, jotta vältetään näytteen kontaminaatio kohde-DNA:lla. PCR-testi olisi annettava kokeneiden teknikoiden tehtäväksi erikoistuneissa molekyylibiologian laboratorioissa, jotta minimoidaan näytteen mahdollinen kontaminaatio kohde-DNA:lla.

Negatiivisia kontrolleja (DNA:n uuttamis- ja PCR-menettelyjen osalta) olisi aina käsiteltävä menettelyn viimeisenä näytteenä, jotta voitaisiin osoittaa selvästi, onko DNA:n siirtymistä tapahtunut.

PCR-testiin olisi sisällytettävä seuraavat negatiiviset kontrollit:

| — | näyteuute, joka on aiemmin testattu R. solanacearum -bakteerin suhteen negatiiviseksi, |
| --- | --- |

—

näyteuute, joka on aiemmin testattu R. solanacearum -bakteerin suhteen negatiiviseksi,

| — | puskurikontrollit, joita käytetään bakteerin ja DNA:n uuttamiseksi näytteestä, |
| --- | --- |

—

puskurikontrollit, joita käytetään bakteerin ja DNA:n uuttamiseksi näytteestä,

| — | PCR-reaktioseos. |
| --- | --- |

—

PCR-reaktioseos.

Testissä olisi käytettävä seuraavia positiivisia kontrolleja:

| — | uudelleen suspendoitujen sakkojen määräosat, joihin R. solanacearum -bakteeri on lisätty (valmistus ks. lisäyksen 3 B kohta), |
| --- | --- |

—

uudelleen suspendoitujen sakkojen määräosat, joihin R. solanacearum -bakteeri on lisätty (valmistus ks. lisäyksen 3 B kohta),

| — | vesisuspensio R. solanacearum -bakteerin virulentista isolaatista (esim. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; ks. lisäyksen 3 B kohta) saaduista soluista, 106 solua/ml, |
| --- | --- |

—

vesisuspensio R. solanacearum -bakteerin virulentista isolaatista (esim. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; ks. lisäyksen 3 B kohta) saaduista soluista, 106 solua/ml,

| — | jos mahdollista, PCR-testissä käytetään myös positiivisista kontrollinäytteistä saatua DNA:ta. |
| --- | --- |

—

jos mahdollista, PCR-testissä käytetään myös positiivisista kontrollinäytteistä saatua DNA:ta.

Mahdollisen kontaminaation välttämiseksi positiiviset kontrollit valmistetaan erillään testinäytteistä.

Näyteuutteiden olisi oltava mahdollisimman puhtaita mullasta. Joissakin tapauksissa saattaisi siksi olla suositeltavaa valmistaa uutteet pestyistä perunoista, mikäli aiotaan käyttää PCR-testausprotokollia.

Tämän testin yhteydessä käytettäviksi on saatavilla standardoituja positiivisia ja negatiivisia kontrollimateriaaleja, jotka luetellaan lisäyksessä 3.

6.1   DNA:n puhdistusmenetelmät

Käytetään edellä kuvattuja negatiivisia ja positiivisia kontrollinäytteitä (ks. lisäys 3).

Testataan kontrollimateriaali samalla tavoin kuin näyte (näytteet).

Kohde-DNA:n eristämiseksi kompleksisista näytealustoista on käytettävissä useita eri menetelmiä, joilla voidaan poistaa PCR:n ja muiden entsyymireaktioiden inhibiittorit ja konsentroida kohde-DNA näyteuutteessa. Seuraava menetelmä on optimoitu käytettäväksi lisäyksessä 6 kuvatuilla validoiduilla PCR-menetelmillä.

a)   Pastrikin menetelmä (2000)

| 1) | Pipetoidaan 220 μl lyysipuskuria (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) 1,5 ml:n eppendorfputkeen. |
| --- | --- |

1)

Pipetoidaan 220 μl lyysipuskuria (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) 1,5 ml:n eppendorfputkeen.

| 2) | Lisätään 100 μl näyteuutetta ja asetetaan kuumentimelle tai vesihauteeseen 95 °C:ssa 10 minuutin ajaksi. |
| --- | --- |

2)

Lisätään 100 μl näyteuutetta ja asetetaan kuumentimelle tai vesihauteeseen 95 °C:ssa 10 minuutin ajaksi.

| 3) | Siirretään putki jäihin 5 minuutiksi. |
| --- | --- |

3)

Siirretään putki jäihin 5 minuutiksi.

| 4) | Lisätään 80 μl lysotsyymikantaliuosta (50 mg lysotsyymia/ml 10 mM Tris HCl:ssa, pH 8,0) ja inkuboidaan 37 °C:ssa 30 minuutin ajan. |
| --- | --- |

4)

Lisätään 80 μl lysotsyymikantaliuosta (50 mg lysotsyymia/ml 10 mM Tris HCl:ssa, pH 8,0) ja inkuboidaan 37 °C:ssa 30 minuutin ajan.

| 5) | Lisätään 220 μl Easy DNA® -liuosta A (Invitrogen), sekoitetaan hyvin vorteksoimalla ja inkuboidaan 65 °C:ssa 30 minuutin ajan. |
| --- | --- |

5)

Lisätään 220 μl Easy DNA® -liuosta A (Invitrogen), sekoitetaan hyvin vorteksoimalla ja inkuboidaan 65 °C:ssa 30 minuutin ajan.

| 6) | Lisätään 100 μl Easy DNA® -liuosta B (Invitrogen), vorteksoidaan voimakkaasti, kunnes sakka valuu putkessa vapaasti ja näyte on kauttaaltaan yhtäläisen viskoosi. |
| --- | --- |

6)

Lisätään 100 μl Easy DNA® -liuosta B (Invitrogen), vorteksoidaan voimakkaasti, kunnes sakka valuu putkessa vapaasti ja näyte on kauttaaltaan yhtäläisen viskoosi.

| 7) | Lisätään 500 μl kloroformia ja vorteksoidaan, kunnes viskositeetti vähenee ja seos on homogeeninen. |
| --- | --- |

7)

Lisätään 500 μl kloroformia ja vorteksoidaan, kunnes viskositeetti vähenee ja seos on homogeeninen.

| 8) | Sentrifugoidaan 15 000 g 20 minuutin ajan 4 °C:ssa faasien erottamiseksi ja interfaasin muodostamiseksi. |
| --- | --- |

8)

Sentrifugoidaan 15 000 g 20 minuutin ajan 4 °C:ssa faasien erottamiseksi ja interfaasin muodostamiseksi.

| 9) | Siirretään yläfaasi puhtaaseen eppendorfputkeen. |
| --- | --- |

9)

Siirretään yläfaasi puhtaaseen eppendorfputkeen.

| 10) | Lisätään 1 ml 100 % etanolia (-20 °C), vorteksoidaan pikaisesti ja inkuboidaan jäissä 10 minuutin ajan. |
| --- | --- |

10)

Lisätään 1 ml 100 % etanolia (-20 °C), vorteksoidaan pikaisesti ja inkuboidaan jäissä 10 minuutin ajan.

| 11) | Sentrifugoidaan 15 000 g 20 minuutin ajan 4 °C:ssa ja poistetaan etanoli pelletistä. |
| --- | --- |

11)

Sentrifugoidaan 15 000 g 20 minuutin ajan 4 °C:ssa ja poistetaan etanoli pelletistä.

| 12) | Lisätään 500 μl 80 % etanolia (-20 °C) ja sekoitetaan kääntelemällä putkea. |
| --- | --- |

12)

Lisätään 500 μl 80 % etanolia (-20 °C) ja sekoitetaan kääntelemällä putkea.

| 13) | Sentrifugoidaan 15 000 g 10 minuutin ajan 4 °C:ssa, säästetään pelletti ja poistetaan etanoli. |
| --- | --- |

13)

Sentrifugoidaan 15 000 g 10 minuutin ajan 4 °C:ssa, säästetään pelletti ja poistetaan etanoli.

| 14) | Annetaan pelletin kuivua ilmassa tai DNA Speed Vac -laitteessa. |
| --- | --- |

14)

Annetaan pelletin kuivua ilmassa tai DNA Speed Vac -laitteessa.

| 15) | Suspendoidaan pelletti uudelleen 100 μl:aan steriiliä ultrapuhdasta vettä ja jätetään seisomaan huoneenlämpöön vähintään 20 minuutin ajaksi. |
| --- | --- |

15)

Suspendoidaan pelletti uudelleen 100 μl:aan steriiliä ultrapuhdasta vettä ja jätetään seisomaan huoneenlämpöön vähintään 20 minuutin ajaksi.

| 16) | Varastoidaan -20 °C:ssa, kunnes näytettä tarvitaan PCR-testissä. |
| --- | --- |

16)

Varastoidaan -20 °C:ssa, kunnes näytettä tarvitaan PCR-testissä.

| 17) | Erotetaan mahdollinen valkea sakka sentrifugoimalla, ja PCR-määritykseen käytetään 5 μl DNA:ta sisältävää liuosta. |
| --- | --- |

17)

Erotetaan mahdollinen valkea sakka sentrifugoimalla, ja PCR-määritykseen käytetään 5 μl DNA:ta sisältävää liuosta.

b)   Muut menetelmät

Muita DNA:n uuttamismenetelmiä (esim. Qiagen Dneasy Plant Kit) voidaan käyttää, jos niiden on osoitettu olevan yhtä tehokkaita DNA:n puhdistamisessa kontrollinäytteistä, jotka sisältävät 103–104 taudinaiheuttajasolua/ml.

6.2   PCR-testi

6.2.1   Valmistetaan PCR-testin testi- ja kontrollitemplaatit validoitujen testausprotokollien mukaisesti (VI jakson A kohdan 6 alakohta). Valmistetaan yksi kymmenkertainen laimennos DNA-näyteuutetta (1:10 ultrapuhtaaseen veteen).

6.2.2   Valmistetaan tarkoituksenmukainen PCR-reaktioseos julkaistujen testausprotokollien mukaisesti (lisäys 6) kontaminaatiolta vapaassa ympäristössä. Jos mahdollista, on suositeltavaa käyttää moninkertaisista PCR-protokollaa, johon sisältyy myös sisäinen PCR-kontrolli.

6.2.3   Lisätään 2–5 μl DNA-uutetta 25 μl:aan PCR-reaktioseosta steriileihin PCR-putkiin PCR-protokollien mukaisesti (ks. lisäys 6).

6.2.4   Otetaan ainoastaan PCR-reaktioseosta sisältävä negatiivinen kontrollinäyte ja lisätään näytteen sijasta ultrapuhdasta vettä samasta lähteestä, jota käytettiin PCR-seoksessa.

6.2.5   Asetetaan putket samaan lämpösyklilaitteeseen, jota käytettiin esitestauksessa, ja ajetaan asianmukaisesti optimoitu PCR-ohjelma (lisäys 6).

6.3   PCR-tuotteen määrittäminen

6.3.1   Erotetaan PCR-amplikonit agaroosigeelielektroforeesilla. Lisätään vähintään 12 μl monistettua DNA-reaktioseosta jokaisesta näytteestä ja sekoitetaan se 3 μl:aan latauspuskuria (lisäys 6) 2,0 % (w/v) agaroosigeelissä trisasetaattielektroforeesipuskurissa (TAE) (lisäys 6) ajaen geeliä 5–8 V/cm. Käytetään tarkoituksenmukaista DNA-markkeria, ’esim. 100 emäsparia.’

6.3.2   Saatetaan DNA-fragmentit näkyviin värjäämällä näyte etidiumbromidiliuoksessa (0,5 mg/l) 30–60 minuutin ajan huolehtien asianmukaisista varotoimista tämän mutageenin käsittelyssä.

6.3.3   Tarkastellaan värjäytynyttä geeliä UV-läpivalaisulla (λ = 302 nm) odotetunkokoisten monistettujen PCR-tuotteiden (lisäys 6) löytämiseksi ja dokumentoidaan tiedot.

6.3.4   Kaikkien uusien löydösten/tapausten osalta varmistetaan PCR-amplikonin autenttisuus tekemällä restriktioentsyymianalyysi jäljellä olevan monistetun DNA:n näytteelle inkuboimalla optimilämpötilassa ja -ajassa tarkoituksenmukaisella entsyymillä ja puskurilla (ks. lisäys 6). Määritetään pilkotut fragmentit agaroosigeelielektrofereesillä kuten edellä ja tarkkaillaan tyypillistä restriktiofragmenttikuviota UV-läpivalaisulla etidiumbromidivärjäyksen jälkeen ja verrataan pilkkoutumattomiin ja pilkottuihin positiivisiin kontrolleihin.

PCR-testin tulosten tulkinta

PCR-testin tulos on negatiivinen, jos odotetunkokoista R. solanacearum -spesifistä PCR-amplikonia ei todeta kyseisestä näytteestä, mutta se todetaan kaikista positiivisista kontrollinäytteistä (kun on kyse moninkertaisista PCR-tuotteista, joilla on kasveille spesifiset sisäiset kontrollialukkeet: toinen odotetunkokoinen PCR-tuote on monistettava kyseisellä näytteellä).

PCR-testin tulos on positiivinen, jos odotetunkokoinen R. solanacearum -spesifinen PCR-amplikoni ja odotettu restriktioreaktio (jos sellaista vaaditaan) todetaan edellyttäen, että sitä ei ole monistettu mistään negatiivisesta kontrollinäytteestä. Positiivisen tuloksen luotettava varmistus voidaan saada myös toistamalla testi toisilla PCR-alukkeilla (lisäys 6).

Huomautus: PCR:n inhibitiota voidaan epäillä, jos odotettu amplikoni saadaan positiivisesta kontrollinäytteestä, joka sisältää R. solanacearum -bakteeria vedessä, mutta negatiiviset tulokset saadaan positiivisista kontrolleista, jotka sisältävät R. solanacearum -bakteeria perunauutteessa. Moninkertaisten reaktioiden määritykseen perustuvissa PCR-testausprotokollissa, joissa on mukana sisäinen PCR-kontrolli, reaktion inhibitio näyttää olevan kyseessä silloin, jos ei saada kumpaakaan näistä kahdesta amplikonista.

Saastuntaa voidaan epäillä, jos odotettua amplikonia ei saada yhdestä tai useammasta negatiivisesta kontrollista.

7.   FISH-testi

Periaate

Kun FISH-testiä käytetään ensimmäisenä seulontatestinä ja siitä saadaan positiivinen tulos, toisena pakollisena seulontatestinä on tehtävä eristystesti tai IF-testi. Kun FISH-testiä käytetään toisena seulontatestinä ja siitä saadaan positiivinen tulos, vuokaavion mukainen lisätestaus on tarpeen määrityksen tekemiseksi.

Huomautus: Käytetään validoituja R. solanacearum -spesifisiä oligokoettimia (lisäys 7). Alustavan testauksen tällä menetelmällä pitäisi mahdollistaa se, että voidaan toistettavasti todeta aiemmin negatiivisiksi testattuihin näyteuutteisiin lisätyt R. solanacearum -bakteerin solut vähintään pitoisuudella 103–104/ml.

Menettely voidaan tarvittaessa kuitenkin tehdä näyteuutteille, joita on säilytetty glyserolissa –16––24 °C:ssa tai –68––86 °C:ssa.

Negatiivisina kontrolleina käytetään sellaisia näyteuutteen osia, jotka on aiemmin testattu R. solanacearum -bakteerin osalta negatiivisiksi.

Positiivisiksi kontrolleiksi valmistetaan suspensioita, jotka sisältävät 105–106 solua/ml R. solanacearum -bakteerin biovaria 2 (esim. kanta NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, ks. lisäys 3) 0,01 M fosfaattipuskurissa (PB) 3–5 vuorokauden viljelmästä. Valmistetaan erilliset positiiviset kontrollilevyt R. solanacearum -bakteerin homologisesta kannasta tai mistä tahansa muusta vertailukannasta, jotka on suspendoitu perunauutteeseen, kuten lisäyksen 3 B kohdassa täsmennetään.

FITC-leimatun eubakteriaalisen oligokoettimen käyttö toimii kontrollina hybridisaatioprosessissa, sillä se värjää kaikki näytteessä olevat eubakteerit.

Tämän testin yhteydessä käytettäviksi on saatavilla standardoituja positiivisia ja negatiivisia kontrollimateriaaleja, jotka luetellaan lisäyksen 3 A kohdassa.

Testataan kontrollimateriaali samalla tavoin kuin näyte (näytteet).

7.1   Perunauutteen fiksointi

Seuraava testausprotokolla on peräisin lähteestä Wullings et al., (1998):

7.1.1   Valmistetaan kiinniteliuos (ks. lisäys 7).

7.1.2   Pipetoidaan 100 μl kustakin näyteuutteesta eppendorfputkeen ja sentrifugoidaan 7 minuuttia 7 000 g:ssä.

7.1.3   Poistetaan supernatantti ja liuotetaan sakka 200 μl:aan kiinniteliuosta, joka on valmistettu < 24 tuntia aiemmin. Sekoitetaan vorteksilla ja inkuboidaan tunnin ajan jääkaapissa.

7.1.4   Sentrifugoidaan 7 minuutin ajan 7 000 g:ssä, poistetaan supernatantti ja suspensoidaan pelletti uudelleen 75 μl:aan 0,01 M fosfaattipuskuria (ks. lisäys 7).

7.1.5   Tiputetaan 16 μl kiinnitettyjä suspensioita kuvassa 7,1 esitetylle puhtaalle monitestilevylle. Laitetaan kullekin levylle 2 laimentamatonta eri näytettä ja käytetään 10 μl 1/100-laimennoksen (0,01 M:ssa fosfaattipuskuria) tekemiseksi. Jäljellä oleva näyteliuos (49 μl) voidaan varastoida -20 °C:ssa, kun siihen on lisätty 1 tilavuus 96-prosenttista etanolia. Jos FISH-testi on toistettava, poistetaan etanoli sentrifugoimalla ja lisätään sama määrä 0,01 M fosfaattipuskuria (sekoitetaan vorteksilla).

Kuvio 7.1   FISH-levy

| Näyte 1 | Nollakoe | Nollakoe | Nollakoe | Näyte 2 |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| | | | | |
| syvennys 1 | syvennys 2 | syvennys 3 | syvennys 4 | syvennys 5 |
| Näyte 1 | Nollakoe | Nollakoe | Nollakoe | Näyte 2 |
| | | | | |
| syvennys 6 | syvennys 7 | syvennys 8 | syvennys 9 | syvennys 10 |
| Peitelasi 1 | | Peitelasi 2 |

Näyte 1

Nollakoe

Nollakoe

Nollakoe

Näyte 2

Image

Image

Image

Image

Image

syvennys 1

syvennys 2

syvennys 3

syvennys 4

syvennys 5

Näyte 1

Nollakoe

Nollakoe

Nollakoe

Näyte 2

Image

Image

Image

Image

Image

syvennys 6

syvennys 7

syvennys 8

syvennys 9

syvennys 10

Peitelasi 1

Peitelasi 2

7.1.6   Ilmakuivataan levyt (tai kuivataan ne levynkuivaajalla 37 °C:ssa) ja kiinnitetään ne liekittämällä.

Tässä vaiheessa menettely voidaan keskeyttää, ja hydridisaatiota voidaan jatkaa seuraavana päivänä. Levyt olisi säilytettävä pölyltä suojassa ja kuivassa paikassa huoneenlämmössä.

7.2   Hybridisaatio

7.2.1   Poistetaan soluista vesi vaiheittain 50-, 80- ja 96-prosenttisessa etanolissa minuutin ajan kussakin. Ilmakuivataan levyt levynpidikkeessä.

7.2.2   Valmistellaan kostea inkubaatiokammio peittämällä ilmatiiviin laatikon pohja paperi- tai suodatinpaperilla, joka on kastettu 1X hybmixiin (lisäys 7). Esi-inkuboidaan laatikko hybridisaatiouunissa 45 °C:ssa vähintään 10 minuutin ajan.

7.2.3   Asetetaan 10 μl hybridisaatioliuosta (lisäys 7) kunkin levyn 8 syvennykseen (syvennykset 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 ja 10; ks. kuva 7.1) siten, että kaksi keskimmäistä syvennystä (3 ja 8) jäävät tyhjiksi.

7.2.4   Asetetaan peitelasit (24 × 24 mm) ensimmäiseen ja neljään viimeiseen syvennykseen siten, että väliin ei jää ilmaa. Laitetaan levyt esilämmitettyyn kosteaan kammioon ja hybridisoidaan 5 tuntia pimeässä uunissa 45 °C:ssä.

7.2.5   Valmistetaan 3 dekanterilasia, joiden koostumus on seuraava: 1 l Milli Q (molekyylisuodattimilla puhdistettua) -vettä, 1 l 1X hybmix (334 ml 3X hybmix ja 666 ml Milli Q -vettä) ja 1 l 1/8X hybmix (42 ml 3X hybmix ja 958 ml Milli Q -vettä). Esi-inkuboidaan kukin vesihauteessa 45 °C:ssa.

7.2.6   Poistetaan peitelasit levyiltä ja asetetaan levyt levytelineeseen.

7.2.7   Pestään ylimääräinen koetin inkuboimalla 15 minuutin ajan dekanterilasissa, jossa on 1X hybmix, 45 °C:ssa.

7.2.8   Siirretään levyteline 1/8X hybmix -pesuliuokseen ja inkuboidaan vielä 15 minuutin ajan.

7.2.9   Kastetaan levyt pikaisesti Milli Q -veteen ja asetetaan ne suodatinpaperille. Poistetaan liiallinen kosteus peittämällä pinta kevyesti suodatinpaperilla. Pipetoidaan 5–10 μl haalistumiselta suojaavaa peittausainetta (esim. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA, tai vastaavaa) jokaiseen syvennykseen ja asetetaan iso peitelasi (24 × 60 mm) koko levyn päälle.

7.3   FISH-testin lukeminen

7.3.1   Tutkitaan levyt välittömästi mikroskoopilla, joka on varustettu epifluoresoivalla valonlähteellä, öljyimmersio-objektiivin 630–1 000-kertaisella suurennoksella. FITC:iin sopivilla suodattimilla näytteen eubakteerisolut (mukaan luettuina useimmat gramnegatiiviset solut) fluoresoivat vihreinä. Kun käytetään tetrametyylirodamiini-5-isotiosyanaatille tarkoitettua suodatinta, Cy3-värjätyt R. solanacearum -bakteerin solut näkyvät fluoresoivan punaisina. Verrataan solujen morfologiaa positiivisten kontrollien morfologiaan. Solujen on oltava kirkkaasti fluoresoivia ja täydellisesti värjäytyneitä. FISH-testi (VI jakson A kohdan 7 alakohta) on toistettava, jos värjäytyminen on poikkeavaa. Tutkitaan syvennyksiä tarkasti kohtisuoraan kahden halkaisijan suuntaisesti ja pitkin aukon kehää. Näytteistä, joissa ei näy yhtään tai vain hyvin vähän soluja tarkastellaan vähintään 40 mikroskooppikenttää.

7.3.2   Tarkastellaan testisyvennyksissä kirkkaasti fluoresoivia soluja, joiden morfologia on tyypillinen R. solanacearum -bakteerille (ks. www-sivusto osoitteessa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluoresenssin intensiteetin on vastattava vähintään positiivisen kontrollikannan fluoresenssin intensiteettiä. Sellaisia soluja, joiden värjäytyminen on epätäydellistä tai joiden fluoresenssi on heikko, ei oteta huomioon.

7.3.3   Jos epäillään kontaminaatiota, testi on toistettava. Näin saattaa käydä, jos kaikilla erän levyillä on positiivisia soluja puskurin saastumisen vuoksi tai jos positiivisia soluja löytyy (levyn syvennysten ulkopuolelta) levyn kalvolta.

7.3.4   FISH-testin spesifisyyteen liittyy useita ongelmia. Perunan napapäiden ja varren palasten sakassa saattaa esiintyä morfologisesti epätyypillisiä fluoresoivien solujen ja R. solanacearum -bakteerin kanssa kooltaan ja morfologialtaan samanlaisten ristiin reagoivien saprofyyttisten bakteerien populaatioita, vaikkakin huomattavasti harvemmin kuin IF-testissä.

7.3.5   Ainoastaan ne fluoresoivat solut, jotka ovat kooltaan ja morfologialtaan tyypillisiä, on otettava huomioon.

7.3.6   FISH-testin tulosten tulkinta

| i) | FISH-testistä saadaan validit tulokset, jos FITC-suodatinta käyttäen havaitaan kirkkaan vihreitä fluoresoivia soluja, joiden koko ja morfologia on R. solanacearum -bakteerille tyypillinen, ja jos rodamiinisuodatinta käyttäen havaitaan kirkkaan punaisia fluoresoivia soluja kaikissa positiivissa kontrolleissa muttei yhdessäkään negatiivisessa kontrollissa. Jos näytteestä löytyy kirkkaasti fluoresoivia soluja, joiden morfologia on tyypillinen, arvioidaan tyypillisten solujen keskimääräinen lukumäärä mikroskooppikenttää kohden ja lasketaan näiden solujen lukumäärä uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohden (lisäys 4). Näytteitä, joissa on vähintään 5 × 103 tyypillistä solua uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohden, pidetään mahdollisesti saastuneina. Lisätestaus on tarpeen. Näytteitä, joissa on vähemmän kuin 5 × 103 tyypillistä solua uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohden, pidetään negatiivisina. |
| --- | --- |

i)

FISH-testistä saadaan validit tulokset, jos FITC-suodatinta käyttäen havaitaan kirkkaan vihreitä fluoresoivia soluja, joiden koko ja morfologia on R. solanacearum -bakteerille tyypillinen, ja jos rodamiinisuodatinta käyttäen havaitaan kirkkaan punaisia fluoresoivia soluja kaikissa positiivissa kontrolleissa muttei yhdessäkään negatiivisessa kontrollissa. Jos näytteestä löytyy kirkkaasti fluoresoivia soluja, joiden morfologia on tyypillinen, arvioidaan tyypillisten solujen keskimääräinen lukumäärä mikroskooppikenttää kohden ja lasketaan näiden solujen lukumäärä uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohden (lisäys 4). Näytteitä, joissa on vähintään 5 × 103 tyypillistä solua uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohden, pidetään mahdollisesti saastuneina. Lisätestaus on tarpeen. Näytteitä, joissa on vähemmän kuin 5 × 103 tyypillistä solua uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohden, pidetään negatiivisina.

| ii) | FISH-testin tulos on negatiivinen, jos rodamiinisuodatinta käyttäen ei havaita kirkkaan punaisia fluoresoivia soluja, joiden koko ja morfologia on R. solanacearum -bakteerille tyypillinen edellyttäen, että tyypillisiä kirkkaan punaisia fluoresoivia soluja havaitaan positiivisissa kontrollivalmisteissa silloin, kun käytetään rodamiinisuodatinta. |
| --- | --- |

ii)

FISH-testin tulos on negatiivinen, jos rodamiinisuodatinta käyttäen ei havaita kirkkaan punaisia fluoresoivia soluja, joiden koko ja morfologia on R. solanacearum -bakteerille tyypillinen edellyttäen, että tyypillisiä kirkkaan punaisia fluoresoivia soluja havaitaan positiivisissa kontrollivalmisteissa silloin, kun käytetään rodamiinisuodatinta.

8.   ELISA-testi

Periaate

ELISA-testiä voidaan käyttää ainoastaan valinnaisena testin IF-, PCR- tai FISH-testin lisäksi, koska testin herkkyys on verrattain alhainen. Kun käytetään DAS ELISA -testiä, rikastus ja monoklonaalisten vasta-aineiden käyttö ovat pakollisia (ks. www-sivusto http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Näytteiden rikastus ennen ELISA-testin käyttöä voi olla hyödyllistä testin herkkyyden parantamiseksi, mutta se voi epäonnistua näytteessä olevien muiden organismien kilpailun vuoksi.

Huomautus: Käytetään validoitua R. solanacearum -vasta-aineiden lähdettä (ks. www-sivusto http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). On suositeltavaa määrittää titteri kullekin uudelle vasta-aine-erälle. Titteri määritellään korkeimmaksi laimennokseksi, jolla optimaalinen reaktio tapahtuu, kun testataan suspensiota, joka sisältää millilitraa kohden 105–106
  R. solanacearum -bakteerin homologisesta kannasta saatua solua, ja kun käytetään sopivia sekundaareja vasta-ainekonjugaatteja valmistajan suositusten mukaisesti. Testauksen aikana vasta-aineita olisi käytettävä lähellä kaupallisesti saatavilla olevaa titteriä olevassa tai titterin suuruisessa työskentelylaimennoksessa.

Määritetään vasta-aineiden titteri suspensiossa, jossa on millilitraa kohden 105–106 solua R. solanacearum -bakteerin homologisesta kannasta.

Negatiiviksi kontrolleiksi otetaan näyteuute, joka on aiemmin testattu negatiiviseksi R. solanacearum -bakteerin osalta, sekä fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) oleva bakteeri, joka ei reagoi ristiin.

Positiivisena kontrollina käytetään sellaisia näyteuutteen osia, jotka on aiemmin testattu R. solanacearum -bakteerin osalta negatiivisiksi ja joihin on sekoitettu millilitraa kohden 103–104
  R. solanacearum -bakteerin biovarin 2 solua (esim. kanta NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, ks. lisäyksen 2 A ja B kohta). Tulosten vertailemiseksi kullakin levyllä käytetään standardiliuosta, jossa on millilitraa kohden 105–106 R. solanacearum -solua fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa. On varmistettava, että positiiviset kontrollit on tarkoin erotettu testattavista näytteistä mikrotitterilevyllä.

Tämän testin yhteydessä käytettäviksi on saatavilla standardoituja positiivisia ja negatiivisia kontrollimateriaaleja, jotka luetellaan lisäyksen 3 A kohdassa.

Testataan kontrollimateriaali samalla tavoin kuin näyte (näytteet).

Kaksi ELISA-protokollaa on validoitu.

a)   Epäsuora ELISA (Robinson Smith et al., 1995)

| 1) | Käytetään 100–200 μl näyteuutteen osia. (Kuumentaminen 100 °C:ssa 4 minuutin ajan vesihauteessa tai kuumentimella voi joissakin tapauksissa vähentää ei-spesifisiä tuloksia.) |
| --- | --- |

1)

Käytetään 100–200 μl näyteuutteen osia. (Kuumentaminen 100 °C:ssa 4 minuutin ajan vesihauteessa tai kuumentimella voi joissakin tapauksissa vähentää ei-spesifisiä tuloksia.)

| 2) | Lisätään sama tilavuusmäärä väkevyydeltään kaksinkertaista kiinnityspuskuria (lisäys 4) ja sekoitetaan vorteksilla. |
| --- | --- |

2)

Lisätään sama tilavuusmäärä väkevyydeltään kaksinkertaista kiinnityspuskuria (lisäys 4) ja sekoitetaan vorteksilla.

| 3) | Lisätään 100 μl:aa kuhunkin, vähintään kahteen, mikrotitterilevyn syvennykseen (esim. Nunc-Polysorp tai vastaava). Inkuboidaan tunnin ajan 37 °C:ssa tai yön yli 4 °C:ssa. |
| --- | --- |

3)

Lisätään 100 μl:aa kuhunkin, vähintään kahteen, mikrotitterilevyn syvennykseen (esim. Nunc-Polysorp tai vastaava). Inkuboidaan tunnin ajan 37 °C:ssa tai yön yli 4 °C:ssa.

| 4) | Kaadetaan uutteet pois syvennyksistä. Pestään syvennykset kolme kertaa PBS-Tweenillä (lisäys 4) siten, että viimeinen pesuliuos jätetään syvennyksiin vähintään 5 minuutiksi. |
| --- | --- |

4)

Kaadetaan uutteet pois syvennyksistä. Pestään syvennykset kolme kertaa PBS-Tweenillä (lisäys 4) siten, että viimeinen pesuliuos jätetään syvennyksiin vähintään 5 minuutiksi.

| 5) | Valmistetaan sopiva laimennos R. solanacearum -bakteerin vasta-aineista estopuskuriin (lisäys 4). Validoiduista kaupallisista vasta-aineista käytetään suositeltuja laimennoksia (yleensä kaksinkertainen konsentraatio titteriin verrattuna). |
| --- | --- |

5)

Valmistetaan sopiva laimennos R. solanacearum -bakteerin vasta-aineista estopuskuriin (lisäys 4). Validoiduista kaupallisista vasta-aineista käytetään suositeltuja laimennoksia (yleensä kaksinkertainen konsentraatio titteriin verrattuna).

| 6) | Lisätään 100 μl kuhunkin syvennykseen ja inkuboidaan tunnin ajan 37 °C:ssa. |
| --- | --- |

6)

Lisätään 100 μl kuhunkin syvennykseen ja inkuboidaan tunnin ajan 37 °C:ssa.

| 7) | Kaadetaan vasta-aineliuos syvennyksistä ja pestään kuten edellä (kohta 4). |
| --- | --- |

7)

Kaadetaan vasta-aineliuos syvennyksistä ja pestään kuten edellä (kohta 4).

| 8) | Valmistetaan sopiva laimennos sekundaarista vasta-aine-emäsfosfataasikonjugaattia estopuskuriin. Lisätään 100 μl kuhunkin syvennykseen ja inkuboidaan tunnin ajan 37 °C:ssa. |
| --- | --- |

8)

Valmistetaan sopiva laimennos sekundaarista vasta-aine-emäsfosfataasikonjugaattia estopuskuriin. Lisätään 100 μl kuhunkin syvennykseen ja inkuboidaan tunnin ajan 37 °C:ssa.

| 9) | Kaadetaan konjugaattivasta-aine syvennyksistä ja pestään kuten edellä (kohta 4). |
| --- | --- |

9)

Kaadetaan konjugaattivasta-aine syvennyksistä ja pestään kuten edellä (kohta 4).

| 10) | Lisätään 100 μl emäksistä fosfataasisubstraattiliuosta (lisäys 4) kuhunkin syvennykseen. Inkuboidaan pimeässä huoneenlämmössä ja mitataan absorbanssi 405 nm:ssä säännöllisesti 90 minuutin välein. |
| --- | --- |

10)

Lisätään 100 μl emäksistä fosfataasisubstraattiliuosta (lisäys 4) kuhunkin syvennykseen. Inkuboidaan pimeässä huoneenlämmössä ja mitataan absorbanssi 405 nm:ssä säännöllisesti 90 minuutin välein.

b)   DASI ELISA

| 1) | Valmistetaan sopiva laimennos R. solanacearum -bakteerin polyklonaalisista immunoglobuliinivasta-aineista kiinnityspuskuriin, pH 9,6 (lisäys 4). Lisätään 200 μl kuhunkin syvennykseen. Inkuboidaan 37 °C:ssa 4–5 tunnin ajan tai 4 °C:ssa 16 tunnin ajan. |
| --- | --- |

1)

Valmistetaan sopiva laimennos R. solanacearum -bakteerin polyklonaalisista immunoglobuliinivasta-aineista kiinnityspuskuriin, pH 9,6 (lisäys 4). Lisätään 200 μl kuhunkin syvennykseen. Inkuboidaan 37 °C:ssa 4–5 tunnin ajan tai 4 °C:ssa 16 tunnin ajan.

| 2) | Pestään syvennykset kolme kertaa PBS-Tweenillä (lisäys 4).
  Lisätään 190 μl näyteuutetta vähintään kahteen syvennykseen. Lisätään myös positiiviset ja negatiiviset kontrollit kahteen syvennykseen kullakin levyllä. Inkuboidaan 16 tunnin ajan 4 °C:ssa. |
| --- | --- |

2)

Pestään syvennykset kolme kertaa PBS-Tweenillä (lisäys 4).

Lisätään 190 μl näyteuutetta vähintään kahteen syvennykseen. Lisätään myös positiiviset ja negatiiviset kontrollit kahteen syvennykseen kullakin levyllä. Inkuboidaan 16 tunnin ajan 4 °C:ssa.

| 3) | Pestään syvennykset kolme kertaa PBS-Tweenillä (lisäys 4). |
| --- | --- |

3)

Pestään syvennykset kolme kertaa PBS-Tweenillä (lisäys 4).

| 4) | Valmistetaan sopiva laimennos R. solanacearum -bakteerille spesifisistä monoklonaalisista vasta-aineista fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS) (lisäys 4), joka sisältää myös 0,5 % naudan seerumin albumiinia (BSA), ja lisätään 190 μl kuhunkin syvennykseen. Inkuboidaan kahden tunnin ajan 37 °C:ssa. |
| --- | --- |

4)

Valmistetaan sopiva laimennos R. solanacearum -bakteerille spesifisistä monoklonaalisista vasta-aineista fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS) (lisäys 4), joka sisältää myös 0,5 % naudan seerumin albumiinia (BSA), ja lisätään 190 μl kuhunkin syvennykseen. Inkuboidaan kahden tunnin ajan 37 °C:ssa.

| 5) | Pestään syvennykset kolme kertaa PBS-Tweenillä (lisäys 4). |
| --- | --- |

5)

Pestään syvennykset kolme kertaa PBS-Tweenillä (lisäys 4).

| 6) | Valmistetaan sopiva laimennus hiiren vasta-aineimmunoglobuliineja konjugoituna emäksiseen fosfataasiin fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa. Lisätään 190 μl kuhunkin syvennykseen. Inkuboidaan kahden tunnin ajan 37 °C:ssa. |
| --- | --- |

6)

Valmistetaan sopiva laimennus hiiren vasta-aineimmunoglobuliineja konjugoituna emäksiseen fosfataasiin fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa. Lisätään 190 μl kuhunkin syvennykseen. Inkuboidaan kahden tunnin ajan 37 °C:ssa.

| 7) | Pestään syvennykset kolme kertaa PBS-Tweenillä (lisäys 4). |
| --- | --- |

7)

Pestään syvennykset kolme kertaa PBS-Tweenillä (lisäys 4).

| 8) | Valmistetaan emäksinen fosfataasisubstraattiliuos, jossa on 1 mg p-nitrofenyylifosfaattia substraattipuskurin millilitraa kohden (lisäys 4). Lisätään 200 μl kuhunkin syvennykseen. Inkuboidaan pimeässä huoneenlämmössä ja mitataan absorbanssi 405 nm:ssä säännöllisesti 90 minuutin välein. |
| --- | --- |

8)

Valmistetaan emäksinen fosfataasisubstraattiliuos, jossa on 1 mg p-nitrofenyylifosfaattia substraattipuskurin millilitraa kohden (lisäys 4). Lisätään 200 μl kuhunkin syvennykseen. Inkuboidaan pimeässä huoneenlämmössä ja mitataan absorbanssi 405 nm:ssä säännöllisesti 90 minuutin välein.

ELISA-testitulosten tulkinta

ELISA-testi on negatiivinen, jos kahden näytteen keskimääräinen optinen tiheys (OD) on < 2 × negatiivisen kontrollinäytesyvennyksen OD, sillä edellytyksellä, että kaikkien positiivisten kontrollien OD on suurempi kuin 1,0 (kun kontrolleja on inkuboitu 90 minuutin ajan substraatin kanssa) ja enemmän kuin kaksinkertainen negatiivista näyteuutteista saatuun OD:hen verrattuna.

ELISA-testi on positiivinen, jos kahden näytesyvennyksen keskimääräinen OD on > 2 × negatiivisen näyteuutteen syvennyksen OD, sillä edellytyksellä, että kaikkien negatiivisten kontrollisyvennysten OD on < 2 × positiivisten kontrollisyvennysten OD.

Negatiivinen ELISA-tulos positiivisissa kontrollisyvennyksissä osoittaa, että testiä ei ole tehty oikein tai se on inhiboitunut. Positiiviset ELISA-tulokset negatiivisissa kontrollisyvennyksissä ilmaiset, että testissä on tapahtunut ristikontaminaatiota tai epäspesifistä vasta-aineen sitoutumista.

9.   Biologinen määritys

Huomautus: Alustavan testauksen tällä menetelmällä pitäisi mahdollistaa se, että voidaan todeta aiemmin negatiivisiksi testattuihin näyteuutteisiin lisätyt R. solanacearum -bakteerin pesäkkeitä muodostavat yksiköt (103–104) (valmistus ks. lisäys 3). Testi on voitava toistaa.

Suurinta todentamisherkkyyttä voidaan odottaa, kun käytetään vasta valmistettua näyteuutetta optimaalisissa kasvuolosuhteissa. Menetelmää voidaan kuitenkin käyttää menestyksekkäästi myös sellaisiin uutteisiin, joita on varastoitu glyserolissa -68–-86 °C:ssa.

Seuraava testausprotokolla on peräisin lähteestä Janse (1988):

9.1   Testikasveina käytetään 10 kasvia, jotka ovat taudille altista kolmilehtiasteella olevaa tomaattilajiketta (esim. Moneymaker tai lajike, jonka alttiuden testilaboratorio on määrittänyt vastaavaksi). Viljelyn yksityiskohdista tarkemmin ks. lisäys 8. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää munakoisoja (esim. lajike Black Beauty tai lajikkeet, joiden alttius on vastaava). Käytetään ainoastaan kasveja, jotka ovat kaksi- tai kolmilehtilehtiasteella ja enintään todellisen kolmannen lehden täyteen puhkeamiseen asti. Munakoison oireiden on osoitettu olevan lievempiä ja kehittyvän hitaammin. Tämän vuoksi suositellaan mahdollisuuksien mukaan tomaatin taimien käyttöä.

Jaetaan 100 μl näyteuutetta testikasvien kesken.

9.2.1   Inokulointi injektoimalla

Inokulointi tehdään ruiskulla, joka on varustettu hypodermisellä neulalla (vähintään 23G), kasvin varsiin juuri sirkkalehtien yläpuolelle. Näyte jaetaan testikasvien kesken.

9.2.2   Inokulointi viiltämällä

Pidellään kasvia kahden sormen välissä ja tiputetaan pipetillä pisara (noin 5–10 μl) suspendoitua sakkaa varren päälle sirkkalehtien ja ensimmäisen kasvulehden väliin.

Tehdään steriilillä leikkausveitsellä sakan pisarasta lähtien vinosti poikittainen noin 1 cm:n viilto, jonka syvyys on noin kaksi kolmannesta varren paksuudesta.

Suljetaan viilto steriilillä vaseliinilla ruiskua käyttäen.

9.3   Inokuloidaan samalla tekniikalla viisi taimea positiivisena kontrollina vesisuspensiolla, jossa on 105–106 solua/ml virulenttia R. solanacearum -bakteerin biovarin 2 kantaa (positiivinen kontrolli) 48 tunnin viljelmästä, ja negatiivisena kontrollina sakkapuskurilla (lisäys 4). Kasvit, joita käytetään positiivisena ja negatiivisena kontrollina, pidetään erillään muista kasveista ristikontaminaation estämiseksi.

9.4   Kasvatetaan testikasveja karanteenioloissa enintään 4 viikon ajan 25–30 °C:ssa ja korkeassa suhteellisessa kosteudessa sopivasti kastellen siten, että vältetään sekä vettyminen että toisaalta kuihtuminen vedenpuutteen vuoksi. Saastunnan välttämiseksi inkuboidaan positiiviset ja negatiiviset kontrollikasvit selkeästi toisistaan erotettuihin penkkeihin kasvihuoneessa tai kasvatuskammioissa tai, jos tilaa on rajoitetusti, huolehditaan siitä, että käsittelyt tehdään tiukasti toisistaan erillään. Jos eri näytteisiin kuuluvat kasvit on inkuboitava lähellä toisiaan, ne on eroteltava asianmukaisilla suojilla. Lannoitettaessa, kasteltaessa tai tutkimuksia ja muita toimenpiteitä tehtäessä on huolellisesti vältettävä ristikontaminaatio. Kasvihuoneisiin ja kasvatuskammioihin ei ehdottomasti saa päästä mitään hyönteistuholaisia, sillä ne saattavat siirtää bakteeria näytteestä toiseen.

Tarkkaillaan nuutumisoireita, epinastiaa, kloroosia ja/tai hidastunutta kasvua.

9.5   Tartunnan saaneista kasveista eristetään (II jakson 3 kohta) ja tunnistetaan oletetun R. solanacearum -bakteerin puhtaat viljelmät (VI jakson B kohta).

9.6   Jos 3 viikon jälkeen ei havaita oireita, tehdään IF-, PCR- tai eristystesti kokoomanäytteelle, jossa on kustakin testikasvista 1 cm:n mittaisia varren palasia, jotka on otettu inokulointipaikan yläpuolelta. Jos testi on positiivinen, tehdään laimennussarja (alakohta 4.1).

9.7   Tunnistetaan mahdolliset oletetun R. solanacearum -bakteerin puhtaat viljelmät (VI jakson B kohta).

Biologisen määrityksen tulosten tulkinta

Biologisesta määrityksestä saadaan validit tulokset, jos positiivisen kontrollin kasveissa näkyy tyypillisiä oireita, bakteerit voidaan eristää uudelleen näistä kasveista ja negatiivisista kontrolleista ei löydy oireita.

Biologisen määrityksen tulos on negatiivinen, jos testikasveissa ei ole R. solanacearum -bakteerin aiheuttamaa tartuntaa ja R. solanacearum -bakteeri todetaan positiivisista kontrolleista.

Biologisen määrityksen tulos on positiivinen, jos testikasveissa on R. solanacearum -bakteerin aiheuttama tartunta.

B)   TUNNISTUSTESTIT

Tunnistetaan oletettujen R. solanacearum -isolaattien puhtaat viljelmät käyttäen ainakin kahta seuraavista eri biologisiin periaatteisiin perustuvista testeistä.

Sisällytetään tarvittaessa tunnetut vertailukannat kuhunkin testiin (ks. lisäys 3).

1.   Ravintokokeet ja entsymaattiset tunnistustestit

Määritetään seuraavat fenotyyppiset ominaisuudet, jotka yleisesti joko esiintyvät R. solanacearum -bakteerissa tai puuttuvat siitä. Käytetään seuraavissa lähteissä kuvattuja menetelmiä: Lelliott ja Stead (1987), Klement et al. (1990) ja Schaad (2001).

| Testi | Tavoiteltavat tulokset |
| --- | --- |
| Fluoresoivan pigmentin muodostus | – |
| Poly-β-hydroksibutyraatti-inkluusiot | + |
| Hapettumis-/käymistesti (O/F) | O+/F– |
| Katalaasi aktiivisuus | + |
| Kovacin oksidaasitesti | + |
| Nitraatin pelkistyminen | + |
| Sitraatin käyttö | + |
| Kasvu 40 °C:ssa | – |
| Kasvu 1-prosenttisessa NaCl:ssa | + |
| Kasvu 2-prosenttisessa NaCl:ssa | – |
| Arginiinidihydrolaasin aktiivisuus | – |
| Gelatiinin nesteytyminen | – |
| Tärkkelyksen hydrolyysi | – |
| Eskuliinin hydrolyysi | – |
| Levaanin tuotanto | – |

Testi

Tavoiteltavat tulokset

Fluoresoivan pigmentin muodostus

–

Poly-β-hydroksibutyraatti-inkluusiot

+

Hapettumis-/käymistesti (O/F)

O+/F–

Katalaasi aktiivisuus

+

Kovacin oksidaasitesti

+

Nitraatin pelkistyminen

+

Sitraatin käyttö

+

Kasvu 40 °C:ssa

–

Kasvu 1-prosenttisessa NaCl:ssa

+

Kasvu 2-prosenttisessa NaCl:ssa

–

Arginiinidihydrolaasin aktiivisuus

–

Gelatiinin nesteytyminen

–

Tärkkelyksen hydrolyysi

–

Eskuliinin hydrolyysi

–

Levaanin tuotanto

–

2.   IF-testi

2.1   Valmistetaan suspensio (noin 106 solua/ml) IF-puskuriin (lisäys 4).

2.2   Valmistetaan kaksinkertaisia laimennoksia tarkoituksenmukaisesta antiseerumista (ks. www-sivusto osoitteessa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

2.3   Sovelletaan IF-menettelyä (VI jakson A kohdan 5 alakohta).

2.4   IF-testistä saadaan positiivinen tulos, jos viljelmän IF-titteri vastaa positiivisen kontrollin titteriä.

3.   ELISA-testi

Huomautus: Jos tehdään ainoastaan kaksi tunnistustestiä, ei tämän menetelmän lisäksi käytetä muuta serologista testiä.

3.1   Valmistetaan suspensio (noin 108 solua/ml) 1X PBS -puskuriin (lisäys 4).

3.2   Toteutetaan soveltuva ELISA-menettely R. solanacearum -taudinaiheuttajalle spesifisellä monoklonaalisella vasta-aineella.

3.3   Positiivinen ELISA-testitulos saadaan, jos viljelmästä saatu ELISA-tulos on vähintään puolet positiivisen kontrollin tuloksesta.

4.   PCR-testi

4.1   Valmistetaan suspensio (noin 106 solua/ml) molekyylisuodattimilla puhdistettuun veteen.

4.2   Kuumennetaan 100 μl solususpensiota suljetuissa putkissa kuumentimessa tai kiehuvassa vesihauteessa 100 °C:ssa 4 minuutin ajan. Näytteet voidaan varastoida -16–-24 °C:ssa, kunnes niitä tarvitaan.

4.3   Sovelletaan tarkoituksenmukaisia PCR-menettelyjä R. solanacearum -spesifisten amplikonien monistamiseksi (esim. Seal et al. (1993); Pastrik and Maiss (2000); Pastrik et al. (2002); Boudazin et al. (1999); Opina et al. (1997), Weller et al. (1999)).

4.4   R. solanacearum -bakteerin positiivinen tunnistus toteutuu, jos PCR-amplikonit ovat samankokoisia kuin positiivisen kontrollikannan amplikonit ja niillä esiintyy samaa restriktiofragmenttien pituuspolymorfiaa.

5.   FISH-testi

5.1   Valmistetaan suspensio (noin 106 solua/ml) ultrapuhtaaseen veteen.

5.2   Käytetään FISH-menettelyä (VI jakson A kohdan 7 alakohta) vähintään kahdella R. solanacearum -spesifisellä oligokoettimella (lisäys 7).

5.3   FISH-testistä saadaan positiivinen tulos, jos viljelmästä ja positiivisesta kontrollista saadaan samat reaktiot.

6.   Rasvahappoprofilointi (FAP)

6.1   Kasvatetaan viljelmä tryptikaasi-soija-agarissa (Oxoid) 48 tunnin ajan 28 °C:ssa.

6.2   Tehdään tarkoituksenmukainen FAP-testi (Janse, 1991; Stead, 1992).

6.3   FAP-testistä saadaan positiivinen tulos, jos oletetun viljelmän profiili on identtinen positiivisen kontrollin profiilin kanssa. Tyypillisten rasvahappojen esiintyminen on seuraava: 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH ja 18:1 2OH, ja 16:0 3OH:n puuttuminen on erittäin vahva osoitus Ralstonia sp:stä.

7.   Kantojen määrittämismenetelmät

Kannan määritystä jollakin seuraavista menetelmistä suositellaan kaikissa uusissa R. solanacearum -bakteerin eristämistapauksissa.

Sisällytetään tarvittaessa tunnetut vertailukannat kuhunkin testiin (ks. lisäys 3).

7.1   Biovarin määrittäminen

R. solanacearum -bakteerin biovarit erotetaan kolmen disakkaridin ja kolmen heksoosialkoholin käyttö- ja/tai hapetuskyvyn perusteella (Hayward, 1964 ja Hayward et al., 1990). Biovaritestin kasvualustat kuvataan lisäyksessä 2. Testi voidaan tehdä inokuloimalla kasvualusta pistämällä siihen R. solanacearum -bakteerin isolaattien puhdasta viljelmää ja inkuboimalla 28 °C:ssa. Jos kasvualustat laitetaan steriileihin 96-syvennyksen soluviljelmälevyihin (200 μl/syvennys), 72 tunnin kuluessa voidaan havaita värinmuutos oliivinvihreästä keltaiseksi, mikä osoittaa positiivisen testituloksen.

| | Biovari |
| --- | --- |
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Käyttö: | |
| Maltoosi | – | + | + | – | + |
| Laktoosi | – | + | + | – | + |
| D (+) sellobioosi | – | + | + | – | + |
| Mannitoli | – | – | + | + | + |
| Sorbitoli | – | – | + | + | – |
| Dulsitoli | – | – | + | + | – |

Biovari

1

2

3

4

5

Käyttö:

Maltoosi

–

+

+

–

+

Laktoosi

–

+

+

–

+

D (+) sellobioosi

–

+

+

–

+

Mannitoli

–

–

+

+

+

Sorbitoli

–

–

+

+

–

Dulsitoli

–

–

+

+

–

Lisätesteillä biovari 2 jaetaan alafenotyyppeihin.

| | Biovari 2A
  (esiintyy maailmanlaajuisesti) | Biovari 2A
  (esiintyy Chilessä ja Kolumbiassa) | Biovari 2T
  (esiintyy tropiikissa) |
| --- | --- | --- | --- |
| Trehaloosin käyttö | – | + | + |
| Meso-inositolin käyttö | + | – | + |
| D-riboosin käyttö | – | – | + |
| Pektolyyttinen aktiivisuus (1) | vähäinen | vähäinen | suuri |

Biovari 2A

(esiintyy maailmanlaajuisesti)

Biovari 2A

(esiintyy Chilessä ja Kolumbiassa)

Biovari 2T

(esiintyy tropiikissa)

Trehaloosin käyttö

–

+

+

Meso-inositolin käyttö

+

–

+

D-riboosin käyttö

–

–

+

Pektolyyttinen aktiivisuus (1)

vähäinen

vähäinen

suuri

7.2   Genomien sormenjäljet

R. solanacearum -kompleksin kantojen molekulaarinen erottaminen voi tapahtua useilla menetelmillä. Näitä ovat

7.2.1   RFLP-analyysi (Restriction fragment length polymorphism analysis) (Cook et al., 1989).

7.2.2   Toistuvan järjestyksen PCR, jossa käytetään REP-, ERIC- ja BOX-alukkeita (primers) (Louws et al., 1995; Smith et al., 1995).

7.2.3   AFLP-analyysi (Amplified fragment length polymorphism) (Van der Wolf et al., 1998).

7.3   PCR-menetelmät

Spesifisiä PCR-alukkeita (primers) (Pastrik et al., 2002; ks. lisäys 6) voidaan käyttää alunperin RFLP-analyysilla (Cook et al., 1989) ja 16S rDNA -sekvensoinnilla (Taghavi et al., 1996) R. solanacearum -bakteerin luokkaan 1 (biovarit 3, 4 ja 5) sekä luokkaan 2 (biovarit 1, 2A ja 2T) kuuluvien kantojen erottamiseksi.

C)   VARMISTUSTESTI

Patogeenisyystesti on tehtävä R. solanacearum -bakteerin määrityksen lopulliseksi varmistamiseksi ja R. solanacearum -bakteeriksi tunnistettujen viljelmien virulenssin arvioimiseksi.

| 1) | Valmistetaan inokulaatti (noin 106 solua/ml) testattavan isolaatin 24–48 tunnin viljelmästä ja R. solanacearum -bakteerin asianmukaisesta positiivisesta kontrollikannasta (esim. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; ks. lisäys 3). |
| --- | --- |

1)

Valmistetaan inokulaatti (noin 106 solua/ml) testattavan isolaatin 24–48 tunnin viljelmästä ja R. solanacearum -bakteerin asianmukaisesta positiivisesta kontrollikannasta (esim. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; ks. lisäys 3).

| 2) | Inokuloidaan 5–10 taudille altista tomaatin tai munakoison taimea niiden kolmilehtiasteella (ks. VI jakson A kohdan 9 alakohta). |
| --- | --- |

2)

Inokuloidaan 5–10 taudille altista tomaatin tai munakoison taimea niiden kolmilehtiasteella (ks. VI jakson A kohdan 9 alakohta).

| 3) | Inkuboidaan enintään 2 viikon ajan 25–28 °C:ssa ja korkeassa suhteellisessa kosteudessa sopivasti kastellen siten, että vältetään sekä vettyminen että toisaalta kuivuusstressi. Puhtailla viljelmillä pitäisi 14 päivän kuluessa saavuttaa tyypillinen kasvin nuutuminen. Jos oireita ei ole tämän ajan kuluessa ilmaantunut, ei voida vakuuttua siitä, että olisi kyse R. solanacearum -bakteerin patogeenisen muodon kasvustosta. |
| --- | --- |

3)

Inkuboidaan enintään 2 viikon ajan 25–28 °C:ssa ja korkeassa suhteellisessa kosteudessa sopivasti kastellen siten, että vältetään sekä vettyminen että toisaalta kuivuusstressi. Puhtailla viljelmillä pitäisi 14 päivän kuluessa saavuttaa tyypillinen kasvin nuutuminen. Jos oireita ei ole tämän ajan kuluessa ilmaantunut, ei voida vakuuttua siitä, että olisi kyse R. solanacearum -bakteerin patogeenisen muodon kasvustosta.

| 4) | Tarkkaillaan nuutumisoireita, epinastiaa, kloroosia ja hidastunutta kasvua. |
| --- | --- |

4)

Tarkkaillaan nuutumisoireita, epinastiaa, kloroosia ja hidastunutta kasvua.

| 5) | Eristetään kasveista, joilla esiintyy oireita, poistamalla pätkä varresta noin 2 cm inokulaatiokohdan yläpuolelta. Pienennetään ja suspendoidaan pieneen määrään steriiliä tislattua vettä tai 50 mM fosfaattipuskuria (lisäys 4). Eristetään suspensiosta levittämällä laimennos tai sivelemällä soveltuvalle alustalle, mieluiten selektiiviselle alustalle (lisäys 2), inkuboidaan 48–72 tuntia 28 °C:ssa ja tutkitaan, muodostuuko R. solanacearum -bakteerille tyypillisiä pesäkkeitä. |
| --- | --- |

5)

Eristetään kasveista, joilla esiintyy oireita, poistamalla pätkä varresta noin 2 cm inokulaatiokohdan yläpuolelta. Pienennetään ja suspendoidaan pieneen määrään steriiliä tislattua vettä tai 50 mM fosfaattipuskuria (lisäys 4). Eristetään suspensiosta levittämällä laimennos tai sivelemällä soveltuvalle alustalle, mieluiten selektiiviselle alustalle (lisäys 2), inkuboidaan 48–72 tuntia 28 °C:ssa ja tutkitaan, muodostuuko R. solanacearum -bakteerille tyypillisiä pesäkkeitä.

Lisäys 1

Optimointi- ja validointimenettelyissä mukana olevat laboratoriot

| Laboratorio (2) | Paikka | Maa |
| --- | --- | --- |
| Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit | Wien ja Linz | Itävalta |
| Departement Gewasbescherming | Merelbeke | Belgia |
| Plantedirektoratet | Lyngby | Tanska |
| Central Science Laboratory | York | Englanti |
| Scottish Agricultural Science Agency | Edinburgh | Skotlanti |
| Laboratoire national de la protection des végétaux, Unité de Bactériologie | Angers | Ranska |
| Laboratoire national de la protection des végétaux, Station de quarantaine de la pomme de terre | Le Rheu | Ranska |
| Biologische Bundesanstalt | Kleinmachnow | Saksa |
| Pflanzenschutzamt Hannover | Hannover | Saksa |
| State Laboratory | Dublin | Irlanti |
| Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali | Bologna | Italia |
| Regione Veneto Unità Periferica per i Servizi Fitosanitari | Verona | Italia |
| Nederlandse Algemene Keuringsdienst | Emmeloord | Alankomaat |
| Plantenziektenkundige Dienst | Wageningen | Alankomaat |
| Direcção-Geral de Protecção das Culturas | Lissabon | Portugali |
| Centro de Diagnostico de Aldearrubia | Salamanca | Espanja |
| Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias | Valencia | Espanja |
| Sveriges lantbruksuniversitet (Swedish University of Agricultural Sciences) | Upsala | Ruotsi |

Laboratorio (2)

Paikka

Maa

Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit

Wien ja Linz

Itävalta

Departement Gewasbescherming

Merelbeke

Belgia

Plantedirektoratet

Lyngby

Tanska

Central Science Laboratory

York

Englanti

Scottish Agricultural Science Agency

Edinburgh

Skotlanti

Laboratoire national de la protection des végétaux, Unité de Bactériologie

Angers

Ranska

Laboratoire national de la protection des végétaux, Station de quarantaine de la pomme de terre

Le Rheu

Ranska

Biologische Bundesanstalt

Kleinmachnow

Saksa

Pflanzenschutzamt Hannover

Hannover

Saksa

State Laboratory

Dublin

Irlanti

Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali

Bologna

Italia

Regione Veneto Unità Periferica per i Servizi Fitosanitari

Verona

Italia

Nederlandse Algemene Keuringsdienst

Emmeloord

Alankomaat

Plantenziektenkundige Dienst

Wageningen

Alankomaat

Direcção-Geral de Protecção das Culturas

Lissabon

Portugali

Centro de Diagnostico de Aldearrubia

Salamanca

Espanja

Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias

Valencia

Espanja

Sveriges lantbruksuniversitet (Swedish University of Agricultural Sciences)

Upsala

Ruotsi

Lisäys 2

Kasvatusalustat R. solanacearum -kasvintuhoojan eristämistä ja viljelyä varten

a)   Yleinen kasvatusalusta

Ravinneagar (NA)

| Ravinneagar (Difco) | 23,0 g |
| --- | --- |
| Tislattua vettä | 1,0 l |

Ravinneagar (Difco)

23,0 g

Tislattua vettä

1,0 l

Liuotetaan ainesosat ja steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan.

Hiiva-peptoni-glukoosiagar (YPGA)

| Hiivauute (Difco) | 5,0 g |
| --- | --- |
| Bacto-Peptoni (Difco) | 5,0 g |
| D(+)-glukoosi (monohydraatti) | 10,0 g |
| Bacto-Agar (Difco) | 15,0 g |
| Tislattua vettä | 1,0 l |

Hiivauute (Difco)

5,0 g

Bacto-Peptoni (Difco)

5,0 g

D(+)-glukoosi (monohydraatti)

10,0 g

Bacto-Agar (Difco)

15,0 g

Tislattua vettä

1,0 l

Liuotetaan ainesosat ja steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan.

Sakkaroosipeptoniagar (SPA)

| Sakkaroosi | 20,0 g |
| --- | --- |
| Bacto-Peptoni (Difco) | 5,0 g |
| K2HPO4 | 0,5 g |
| MgSO4.7H2O | 0,25 g |
| Bacto-Agar (Difco) | 15,0 g |
| Tislattua vettä | 1,0 l |
| pH 7,2–7,4 | |

Sakkaroosi

20,0 g

Bacto-Peptoni (Difco)

5,0 g

K2HPO4

0,5 g

MgSO4.7H2O

0,25 g

Bacto-Agar (Difco)

15,0 g

Tislattua vettä

1,0 l

pH 7,2–7,4

Liuotetaan ainesosat ja steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan.

Kelmanin tetratsolium-alusta

| Casaminohapot (Difco) | 1,0 g |
| --- | --- |
| Bacto-Peptoni (Difco) | 10,0 g |
| Dekstroosi | 5,0 g |
| Bacto-Agar (Difco) | 15,0 g |
| Tislattua vettä | 1,0 l |

Casaminohapot (Difco)

1,0 g

Bacto-Peptoni (Difco)

10,0 g

Dekstroosi

5,0 g

Bacto-Agar (Difco)

15,0 g

Tislattua vettä

1,0 l

Liuotetaan ainesosat ja steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan.

Jäähdytetään 50 °C:een ja lisätään suodatinsteriloitua 2,3,5-trifenyylitetratsoliumkloridin (Sigma) vesiliuosta, jotta loppupitoisuudeksi saadaan 50 mg/l.

b)   Validoitu selektiivinen kasvatusalusta

SMSA-alusta (Englebrecht, 1994, sellaisena kuin se on muutettuna julkaisulla Elphinstone et al., 1996)

| Kasvualusta | |
| --- | --- |
| Casaminohappoja (Difco) | 1,0 g |
| Bacto-Peptoni (Difco) | 10,0 g |
| Glyseroli | 5,0 ml |
| Bacto-Agar (Difco) (ks. Huomautus 2) | 15,0 g |
| Tislattua vettä | 1,0 L |

Kasvualusta

Casaminohappoja (Difco)

1,0 g

Bacto-Peptoni (Difco)

10,0 g

Glyseroli

5,0 ml

Bacto-Agar (Difco) (ks. Huomautus 2)

15,0 g

Tislattua vettä

1,0 L

Liuotetaan ainesosat ja steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan.

Jäähdytetään 50 °C:een ja lisätään seuraavien aineiden suodatinsteriloituja vesikantaliuoksia, jotta saadaan määrätyt loppupitoisuudet:

| Kristallivioletti (Sigma) | 5 mg/l |
| --- | --- |
| Polymyksiini-B-sulfaatti | (Sigma P-1004) 600 000 U(noin 100 mg) / l |
| Basitrasiini (Sigma B-0125) | 1 250 U (noin 25 mg)/l |
| Kloramfenikoli (Sigma C-3175) | 5 mg/l |
| Penisilliini G (Sigma P-3032) | 825 U (noin 0,5 mg)/l |
| 2,3,5-trifenyylitetratsoliumkloridi (Sigma) | 50 mg/l |

Kristallivioletti (Sigma)

5 mg/l

Polymyksiini-B-sulfaatti

(Sigma P-1004) 600 000 U(noin 100 mg) / l

Basitrasiini (Sigma B-0125)

1 250 U (noin 25 mg)/l

Kloramfenikoli (Sigma C-3175)

5 mg/l

Penisilliini G (Sigma P-3032)

825 U (noin 0,5 mg)/l

2,3,5-trifenyylitetratsoliumkloridi (Sigma)

50 mg/l

HUOMAUTUS:

| 1. | Muiden kuin edellä määritettyjen reagenssien käyttö voi vaikuttaa R. solanacearum -bakteerin kasvuun. |
| --- | --- |

1.

Muiden kuin edellä määritettyjen reagenssien käyttö voi vaikuttaa R. solanacearum -bakteerin kasvuun.

| 2. | Oxoid Agar #1:tä voidaan käyttää Bacto-Agarin (Difco) sijaan. Tällöin R. solanacearum -bakteerien kasvu on hitaampaa, mutta kilpailevien saprofyyttien kasvu voi myös vähentyä. Tyypillisten R. solanacearum -pesäkkeiden syntymiseen voi mennä 1–2 päivää kauemmin ja niiden punainen väritys voi olla vaaleampaa ja hajanaisempaa kuin Bacto-Agarissa. |
| --- | --- |

2.

Oxoid Agar #1:tä voidaan käyttää Bacto-Agarin (Difco) sijaan. Tällöin R. solanacearum -bakteerien kasvu on hitaampaa, mutta kilpailevien saprofyyttien kasvu voi myös vähentyä. Tyypillisten R. solanacearum -pesäkkeiden syntymiseen voi mennä 1–2 päivää kauemmin ja niiden punainen väritys voi olla vaaleampaa ja hajanaisempaa kuin Bacto-Agarissa.

| 3. | Basitrasiinipitoisuuden nostaminen arvoon 2 500 U/l voi pienentää kilpailevien bakteerien populaatiota vaikuttamatta Ralstonia solanacearum -bakteerin kasvuun. |
| --- | --- |

3.

Basitrasiinipitoisuuden nostaminen arvoon 2 500 U/l voi pienentää kilpailevien bakteerien populaatiota vaikuttamatta Ralstonia solanacearum -bakteerin kasvuun.

Kasvualustat ja antibioottien kantaliuokset on varastoitava 4 °C:ssa pimeässä ja käytettävä kuukauden kuluessa.

Levyillä ei saa olla tiivistynyttä kosteutta ennen niiden käyttöä.

Levyjen liiallista kuivumista on vältettävä.

Jokaisen uuden alustaerän valmistuksen jälkeen olisi toteutettava laadunvarmistustoimia maljaamalla R. solanacearum -bakteerin viiteviljelmän suspensio (ks. lisäys 3) ja tarkkailemalla tyypillisten pesäkkeiden muodostumista, kun levyä on inkuboitu 28 °C:ssa 2–5 päivän ajan.

c)   Validoitu rikastusalusta

SMSA-ravintoliuos (Elphinstone et al., 1996)

Valmistetaan kuten selektiivinen SMSA-agaralusta, mutta jätetään pois Bacto-Agar ja 2,3,5-tetratsoliumkloridi.

Muunnettu Wilbrinkin ravintoliuos (Caruso et al., 2002)

| Sakkaroosi | 10 g |
| --- | --- |
| Proteoosipeptoni | 5 g |
| K2HPO4 | 0,5 g |
| MgSO4 | 0,25 g |
| NaNO3 | 0,25 g |
| Tislattua vettä | 1 l |

Sakkaroosi

10 g

Proteoosipeptoni

5 g

K2HPO4

0,5 g

MgSO4

0,25 g

NaNO3

0,25 g

Tislattua vettä

1 l

Steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan ja jäähdytetään 50 °C:seen.

Lisätään antibioottien kantaliuokset kuten SMSA-ravintoliuoksessa.

Lisäys 3

A)   Kaupallisesti saatavilla olevat standardoidut kontrollimateriaalit

a)   Bakteeri-isolaatit

Seuraavia bakteerien isolaatteja suositellaan käytettäviksi standardoituina viitemateriaaleina joko positiivisina kontrolleina (taulukko 1) tai testien optimoinnin aikana ristireaktioiden välttämiseksi (taulukko 2). Kaikki kannat ovat kaupallisesti saatavilla seuraavista lähteistä:

| 1. | National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Central Science Laboratory, York, UK. |
| --- | --- |

1.

National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Central Science Laboratory, York, UK.

| 2. | Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen, the Netherlands. |
| --- | --- |

2.

Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen, the Netherlands.

| 3. | Collection Française de Bactéries Phytopathogènes (CFBP), INRA Station Phytobactériologie, Angers, France. |
| --- | --- |

3.

Collection Française de Bactéries Phytopathogènes (CFBP), INRA Station Phytobactériologie, Angers, France.

Taulukko 1   R. solanacearum -isolaattien SMT-viitepaneeli

| NCPPB-koodi | SMT-nro
  # | Muut koodit | Alkuperämaa | Biovari |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| NCPPB 4153 | 6 | CFBP 4582, Pr 3020, EURS11 | Egypti | 2 |
| NCPPB 4154 | 10 | CFBP 4585, 550, EURS21 | Turkki | 2 |
| NCPPB 3857 | 12 | CFBP 4587, Pr 1140, EURS26 | Englanti | 2 |
| NCPPB 1584 | 23 | CFBP 4598, EURS49 | Kypros | 2 |
| NCPPB 2505 | 24 | CFBP 4599, EURS50 | Ruotsi | 2 |
| NCPPB 4155 | 26 | CFBP 4601, 502, EURS55 | Belgia | 2 |
| NCPPB 4156 (3) | 71 (3) | PD 2762, CFBP 3857 | Alankomaat | 2 |
| NCPPB 4157 | 66 | LNPV 15.59 | Ranska | 2 |
| NCPPB 4158 | 39 | CFBP 4608, Port 448, EURS80, NCPPB 4066 | Portugali | 2 |
| NCPPB 4160 | 69 | IVIA-1632-2 | Espanja | 2 |
| NCPPB 4161 | 76 | B3B | Saksa | 2 |
| NCPPB 325 | 41 | CFBP 2047, KEL60-1, R842 | Yhdysvallat | 1 |
| NCPPB 3967 | 42 | CFBP 4610, R285, GONg7 | Costa Rica | 1 |
| NCPPB 4028 | 43 | CFBP 4611, R303/571, CIP310, SEQ205 | Kolumbia | 2 |
| NCPPB 3985 | 44 | CFBP 4612, R578, CIP312 | Peru | 2T |
| NCPPB 3989 | 45 | CFBP 4613, R568, CIP226 | Brasilia | 2T |
| NCPPB 3996 | 46 | CFBP 3928, R276/355, CIP72, SEQ225 | Peru | 3 |
| NCPPB 3997 | 47 | CFBP 4614, R280/363, CIP49, HAY0131a | Australia | 3 |
| NCPPB 4029 | 48 | CFBP 4615, R297/349, CIP121, CMIb2861 | Sri Lanka | 4 |
| NCPPB 4005 | 49 | CFBP 4616, R470 | Filippiinit | 4 |
| NCPPB 4011 | 50 | CFBP 4617, R288, HEmps2 | Kiina | 5 |

NCPPB-koodi

SMT-nro

#

Muut koodit

Alkuperämaa

Biovari

NCPPB 4153

6

CFBP 4582, Pr 3020, EURS11

Egypti

2

NCPPB 4154

10

CFBP 4585, 550, EURS21

Turkki

2

NCPPB 3857

12

CFBP 4587, Pr 1140, EURS26

Englanti

2

NCPPB 1584

23

CFBP 4598, EURS49

Kypros

2

NCPPB 2505

24

CFBP 4599, EURS50

Ruotsi

2

NCPPB 4155

26

CFBP 4601, 502, EURS55

Belgia

2

NCPPB 4156 (3)

71 (3)

PD 2762, CFBP 3857

Alankomaat

2

NCPPB 4157

66

LNPV 15.59

Ranska

2

NCPPB 4158

39

CFBP 4608, Port 448, EURS80, NCPPB 4066

Portugali

2

NCPPB 4160

69

IVIA-1632-2

Espanja

2

NCPPB 4161

76

B3B

Saksa

2

NCPPB 325

41

CFBP 2047, KEL60-1, R842

Yhdysvallat

1

NCPPB 3967

42

CFBP 4610, R285, GONg7

Costa Rica

1

NCPPB 4028

43

CFBP 4611, R303/571, CIP310, SEQ205

Kolumbia

2

NCPPB 3985

44

CFBP 4612, R578, CIP312

Peru

2T

NCPPB 3989

45

CFBP 4613, R568, CIP226

Brasilia

2T

NCPPB 3996

46

CFBP 3928, R276/355, CIP72, SEQ225

Peru

3

NCPPB 3997

47

CFBP 4614, R280/363, CIP49, HAY0131a

Australia

3

NCPPB 4029

48

CFBP 4615, R297/349, CIP121, CMIb2861

Sri Lanka

4

NCPPB 4005

49

CFBP 4616, R470

Filippiinit

4

NCPPB 4011

50

CFBP 4617, R288, HEmps2

Kiina

5

Huomautus: Edellä lueteltujen kantojen aitous voidaan taata ainoastaan, jos ne on saatu aidosta viljelmäkokoelmasta.

Taulukko 2   Serologisesti tai geneettisesti toisiaan muistuttavien bakteerien SMT-viitepaneeli käytettäväksi toteamistestien optimoinnissa.

| NCPPB-koodi | SMT-nro
  # | Muu koodi | Tunnistus |
| --- | --- | --- | --- |
| NCPPB 4162 | 51 | CFBP 1954 | Bacillus polymyxa
   (4) |
| NCPPB 4163 | 52 | CFBP 1538 | Pseudomonas marginalis pv. marginalis
   (4) |
| NCPPB 4164 | — | CFBP 2227 | Burkholderia cepacia
   (5) |
| NCPPB 4165 | — | CFBP 2459 | Ralstonia pickettii
   (5) |
| NCPPB 4166 | 58 | CFBP 3567
  CSL Pr1150 | Ralstonia pickettii
   (4) |
| NCPPB 4167 | 60 | CFBP 4618
  PD 2778 | Ralstonia sp. (4) |
| NCPPB 1127 | 53 | CFBP 3575 | Burkholderia andropogonis
   (4) |
| NCPPB 353 | 54 | CFBP 3572 | Burkholderia caryophylli
   (4) |
| NCPPB 945 | 55 | CFBP 3569 | Burkholderia cepacia
   (4) |
| NCPPB 3708 | 56 | CFBP 3574 | Burkholderia glumae
   (4) |
| NCPPB 3590 | 57 | CFBP 3573 | Burkholderia plantarii
   (4) |
| NCPPB 3726 | 59 | CFBP 3568 | Banana Blood Disease Bacterium
   (4)
   (5)
   (6) |
| NCPPB 4168 | 61 | CFBP 4619
  IPO S339 | Enterobacter sp. (4) |
| NCPPB 4169 | 62 | IPO 1695 | Enterobacter sp. (4) |
| NCPPB 4170 | 63 | CFBP 4621
  IPO S306 | Ochrobactrum anthropi
   (4)
   (5) |
| NCPPB 4171 | 64 | CFBP 4622
  IPO 1693 | Curtobacterium sp. (4)
   (5) |
| NCPPB 4172 | 65 | IPO 1696a | Pseudomonas sp. (4) |
| NCPPB 4173 | — | PD 2318 | Aureobacterium sp. (5) |
| NCPPB 4174 | 81 | IVIA 1844.06 | Flavobacterium sp. (4)
   (5) |

NCPPB-koodi

SMT-nro

#

Muu koodi

Tunnistus

NCPPB 4162

51

CFBP 1954

Bacillus polymyxa
   (4)

NCPPB 4163

52

CFBP 1538

Pseudomonas marginalis pv. marginalis
   (4)

NCPPB 4164

—

CFBP 2227

Burkholderia cepacia
   (5)

NCPPB 4165

—

CFBP 2459

Ralstonia pickettii
   (5)

NCPPB 4166

58

CFBP 3567

CSL Pr1150

Ralstonia pickettii
   (4)

NCPPB 4167

60

CFBP 4618

PD 2778

Ralstonia sp. (4)

NCPPB 1127

53

CFBP 3575

Burkholderia andropogonis
   (4)

NCPPB 353

54

CFBP 3572

Burkholderia caryophylli
   (4)

NCPPB 945

55

CFBP 3569

Burkholderia cepacia
   (4)

NCPPB 3708

56

CFBP 3574

Burkholderia glumae
   (4)

NCPPB 3590

57

CFBP 3573

Burkholderia plantarii
   (4)

NCPPB 3726

59

CFBP 3568

Banana Blood Disease Bacterium
   (4)
   (5)
   (6)

NCPPB 4168

61

CFBP 4619

IPO S339

Enterobacter sp. (4)

NCPPB 4169

62

IPO 1695

Enterobacter sp. (4)

NCPPB 4170

63

CFBP 4621

IPO S306

Ochrobactrum anthropi
   (4)
   (5)

NCPPB 4171

64

CFBP 4622

IPO 1693

Curtobacterium sp. (4)
   (5)

NCPPB 4172

65

IPO 1696a

Pseudomonas sp. (4)

NCPPB 4173

—

PD 2318

Aureobacterium sp. (5)

NCPPB 4174

81

IVIA 1844.06

Flavobacterium sp. (4)
   (5)

b)   Kaupallisesti saatavilla olevat standardoidut kontrollimateriaalit

Seuraavat standardoidut kontrollimateriaalit ovat saatavilla NCPPB-viljelmäkokoelmasta.

Pakastekuivattuja perunauutepellettejä 200:sta terveestä mukulasta kaikissa testeissä käytettäviksi negatiivisiksi kontrolleiksi.

200:sta terveestä mukulasta saatuja pakastekuivattuja perunauutepellettejä, jotka sisältävät 103–104 ja 104–106
  R. solanacearum -bakteerin biovarin 2 solua (kanta NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) positiivisiksi kontrolleiksi serologisiin ja PCR-testeihin. Koska pakastekuivaus vaikuttaa solujen elinkelpoisuuteen, ne eivät sovellu standardikontrolleiksi eristystesteihin tai biologiseen määritykseen.

Formaliinikiinnitetyt suspensiot (106 solua/ml) R. solanacearum -bakteerin biovarista 2 (kanta NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) positiivisiksi kontrolleiksi serologisiin testeihin.

B)   Positiivisten ja negatiivisten kontrollien valmistaminen napapäiden seulontatestejä PCR/IF ja FISH varten

Tuotetaan 48 tunnin viljelmä R. solanacearum -bakteerin rodun 3 / biovarin 2 virulentista kannasta (esim. kanta NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) SMSA-kasvualustalle ja suspendoidaan 10 mM fosfaattipuskuriin, jotta saataisiin solutiheydeksi noin 2 × 108 PMY/ml. Tämä saadaan tavallisesti hieman samealla suspensiolla, joka vastaa 0,15:n optista tiheyttä 600 nanometrissä.

Poistetaan 200 mukulan napapäästä kappaleet, jotka on otettu valkokuorisesta osasta, jonka tiedetään olevan R. solanacearum -bakteerista vapaa.

Käsitellään napapäät tavalliseen tapaan ja suspendoidaan sakka uudelleen 10 ml:aan.

Valmistetaan 10 steriiliä 1,5 ml:n mikroampullia, joissa on 900 μl uudelleen suspendoitua sakkaa.

Siirretään 100 μl R. solanacearum -bakteerin suspensiosta ensimmäiseen mikroampulliin. Sekoitetaan vorteksilla.

Saastumisaste määritetään laimennussarjan (seuraavat 5 ampullia) avulla.

Kuutta mikroampullia, jotka sisältävät bakteerinäytettä, käytetään positiivisina kontrolleina. Neljää mikroampullia, jotka eivät sisällä bakteerinäytettä, käytetään negatiivisina kontrolleina. Ampullit merkitään vastaavasti.

Valmistetaan 100 μl:an osanäytteitä steriileihin 1,5 ml:n mikroampulleihin, jolloin saadaan 9 toisintoa kustakin kontrollinäytteestä. Varastoidaan –16––24 °C:ssa käyttöön saakka.

R. solanacearum -bakteerin esiintyminen ja määrä kontrollinäytteissä olisi ensin varmistettava IF-testillä.

PCR-testiä varten DNA uutetaan positiivisista ja negatiivisista kontrollinäytteistä kullakin testinäytesarjalla.

IF- ja FISH-testejä varten tehdään määritykset positiivisista ja negatiivisista kontrollinäytteistä kullakin testinäytesarjalla.

IF-, FISH- ja PCR-määrityksissä R. solanacearum -bakteeri on on osoitettava ainakin niistä positiivisista kontrolleista, joissa on 106 ja 104 solua/ml, eikä sitä saa esiintyä yhdessäkään negatiivisessa kontrollissa.

Lisäys 4

Puskuriliuokset testimenettelyihin

YLEISTÄ: Avaamattomia steriloituja puskuriliuoksia voidaan säilyttää enintään vuoden ajan.

1.   Puskurit uuttamismenettelyä varten

1.1   Uuttopuskuri (50 mM fosfaattipuskuri, pH 7,0)

Tätä puskuriliuosta käytetään bakteerin uuttamiseen kasvisolukoista homogenoimalla tai ravistamalla.

| Na2HPO4 (vedetön) | 4,26 g |
| --- | --- |
| KH2PO4 | 2,72 g |
| Tislattua vettä | 1,00 l |

Na2HPO4 (vedetön)

4,26 g

KH2PO4

2,72 g

Tislattua vettä

1,00 l

Liuotetaan ainesosat, tarkastetaan pH ja steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan.

Muita aineksia voidaan lisätä seuraavasti:

| | Päämäärät | Määrä (litraa kohden) |
| --- | --- | --- |
| Lubrol-hiutaleita | Höytelöitymisenestoaine (7) | 0,5 g |
| DC-silikoni-vaahdonesto | Vaahdonestoaine (7) | 1,0 ml |
| Tetranatriumpyrofosfaatti | Hapettumisenestoaine | 1,0 g |
| Polyvinyylipyrrolidoni-40000 (PVP-40) | PCR:n inhibiittorien sidonta-aine | 50 g |

Päämäärät

Määrä (litraa kohden)

Lubrol-hiutaleita

Höytelöitymisenestoaine (7)

0,5 g

DC-silikoni-vaahdonesto

Vaahdonestoaine (7)

1,0 ml

Tetranatriumpyrofosfaatti

Hapettumisenestoaine

1,0 g

Polyvinyylipyrrolidoni-40000 (PVP-40)

PCR:n inhibiittorien sidonta-aine

50 g

1.2   Sakkapuskuri (10 mM fosfaattipuskuri, pH 7,2)

Tätä puskuria käytetään perunan mukulan napapääuutteiden uudelleen suspendointiin ja laimentamiseen, kun ne on ensin konsentroitu sakaksi sentrifugoimalla.

| Na2HPO4.12H2O | 2,7 g |
| --- | --- |
| NaH2PO4.2H2O | 0,4 g |
| Tislattua vettä | 1,0 l |

Na2HPO4.12H2O

2,7 g

NaH2PO4.2H2O

0,4 g

Tislattua vettä

1,0 l

Liuotetaan ainesosat, tarkastetaan pH ja steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan.

2.   Puskurit IF-testiä varten

2.1   IF-puskuri (10 mM fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS), pH 7,2)

Tätä puskuria käytetään vasta-aineiden laimentamiseen.

| Na2HPO4.12H2O | 2,7 g |
| --- | --- |
| NaH2PO4.2H2O | 0,4 g |
| NaCl | 8,0 g |
| Tislattua vettä | 1,0 l |

Na2HPO4.12H2O

2,7 g

NaH2PO4.2H2O

0,4 g

NaCl

8,0 g

Tislattua vettä

1,0 l

Liuotetaan ainesosat, tarkastetaan pH ja steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan.

2.2   IF-puskuri-Tween

Tätä puskuria käytetään levyjen pesuun.

Lisätään 0,1 % Tween 20:tä IF-puskuriin.

2.3   Fosfaattipuskuroitu glyseroli, pH 7,6

Tätä puskuria käytetään peittausliuoksena IF-levyjen syvennyksissä fluoresenssin tehostamiseksi.

| Na2HPO4.12H2O | 3,2 g |
| --- | --- |
| NaH2PO4.2H2O | 0,15 g |
| Glyseroli | 50 ml |
| Tislattua vettä | 100 ml |

Na2HPO4.12H2O

3,2 g

NaH2PO4.2H2O

0,15 g

Glyseroli

50 ml

Tislattua vettä

100 ml

Haalistumiselta suojaavia peittausaineita on saatavana kaupallisesti, esim. Vectashield® (Vector Laboratories) tai Citifluor® (Leica).

3.   Puskurit epäsuoraa ELISA-testiä varten

3.1   Väkevyydeltään kaksinkertainen kiinnityspuskuri, pH 9,6

| Na2CO3 | 6,36 g |
| --- | --- |
| NaHCO3 | 11,72 g |
| Tislattua vettä | 1,00 l |

Na2CO3

6,36 g

NaHCO3

11,72 g

Tislattua vettä

1,00 l

Liuotetaan ainesosat, tarkastetaan pH ja steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan.

Natriumsulfiittia (0,2 %) voidaan lisätä antioksidanttina, jos halutaan estää hapettuneiden aromaattisten molekyylien muodostuminen.

3.2   10X fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS), pH 7,4

| NaCl | 80,0 g |
| --- | --- |
| KH2PO4 | 2,0 g |
| Na2HPO4.12H2O | 29,0 g |
| KCl | 2,0 g |
| Tislattua vettä | 1,0 l |

NaCl

80,0 g

KH2PO4

2,0 g

Na2HPO4.12H2O

29,0 g

KCl

2,0 g

Tislattua vettä

1,0 l

3.3   PBS-Tween

| 10X PBS | 100 ml |
| --- | --- |
| 10 % Tween 20 | 5 ml |
| Tislattua vettä | 895 ml |

10X PBS

100 ml

10 % Tween 20

5 ml

Tislattua vettä

895 ml

3.4   Estopuskuri (valmistettava juuri ennen käyttöä)

| 10X PBS | 10,0 ml |
| --- | --- |
| Polyvinyylipyrrolidoni-44000 (PVP-44) | 2,0 g |
| 10 % Tween 20 | 0,5 ml |
| Maitojauhe | 0,5 g |
| Tislattua vettä | 100 ml:aan asti |

10X PBS

10,0 ml

Polyvinyylipyrrolidoni-44000 (PVP-44)

2,0 g

10 % Tween 20

0,5 ml

Maitojauhe

0,5 g

Tislattua vettä

100 ml:aan asti

3.5   Emäksinen fosfataasisubstraattiliuos, pH 9,8

| Dietanolamiini | 97 ml |
| --- | --- |
| Tislattua vettä | 800 ml |

Dietanolamiini

97 ml

Tislattua vettä

800 ml

Sekoitetaan ja säädetään pH:ksi 9,8 väkevällä HCI:llä.

Täytetään 1 l:ksi tislatulla vedellä.

Lisätään 0,2 g MgCl2:a.

Liuotetaan 2 × 5 mg fosfataasisubstraattitablettia (Sigma) 15 ml liuosta kohden.

4.   Puskurit DASI ELISA -testiä varten

4.1   Kiinnityspuskuri, pH 9,6

| Na2CO3 | 1,59 g |
| --- | --- |
| NaHCO3 | 2,93 g |
| Tislattua vettä | 1 000 ml |

Na2CO3

1,59 g

NaHCO3

2,93 g

Tislattua vettä

1 000 ml

Liuotetaan ainesosat ja tarkastetaan pH 9,6.

4.2   10X fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS), pH 7,2–7,4

| NaCl | 80,0 g |
| --- | --- |
| NaH2PO4.2 H2O | 4,0 g |
| Na2HPO4.12H2O | 27,0 g |
| Tislattua vettä | 1 000 ml |

NaCl

80,0 g

NaH2PO4.2 H2O

4,0 g

Na2HPO4.12H2O

27,0 g

Tislattua vettä

1 000 ml

4.3   PBS-Tween

| 10X PBS | 50 ml |
| --- | --- |
| 10 % Tween 20 | 5 ml |
| Tislattua vettä | 950 ml |

10X PBS

50 ml

10 % Tween 20

5 ml

Tislattua vettä

950 ml

4.4   Substraattipuskuri, pH 9,8

| Dietanolamiini | 100 ml |
| --- | --- |
| Tislattua vettä | 900 ml |

Dietanolamiini

100 ml

Tislattua vettä

900 ml

Sekoitetaan ja säädetään pH:ksi 9,8 väkevällä HCI:llä.

Lisäys 5

Bakteerien määrän arvioiminen IF- ja FISH-testeillä

| 1. | Lasketaan tyypillisten fluoresoivien solujen määrä kenttää kohden (c). |
| --- | --- |

1.

Lasketaan tyypillisten fluoresoivien solujen määrä kenttää kohden (c).

| 2. | Lasketaan tyypillisten fluoresoivien solujen määrä kuoppaa kohden (C).
  C = c × S/s








  jossa | S | = | monikuoppatestilevyn yhden kuopan pinta-ala |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| ja | s | = | objektiivikentän pinta-ala |

2.

Lasketaan tyypillisten fluoresoivien solujen määrä kuoppaa kohden (C).

C = c × S/s

jossa

S

=

monikuoppatestilevyn yhden kuopan pinta-ala

ja

s

=

objektiivikentän pinta-ala

| s = πi2/4G2K2 | jossa | i | = | kentän kerroin (8-24 okulaarin tyypin mukaan) |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| | | K | = | putken kerroin (1 tai 1,25) |
| | | G | = | objektiivin suurennos (100-kertainen, 40-kertainen jne.). |

s = πi2/4G2K2

jossa

i

=

kentän kerroin (8-24 okulaarin tyypin mukaan)

K

=

putken kerroin (1 tai 1,25)

G

=

objektiivin suurennos (100-kertainen, 40-kertainen jne.).

| 3. | Lasketaan tyypillisten fluoresoivien solujen määrä uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohti (N):
  N = C × 1 000/y × F








  jossa | y | = | uudelleen suspendoidun sakan tilavuus kuopassa |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| ja | F | = | uudelleen suspendoidun sakan laimennuskerroin. |

3.

Lasketaan tyypillisten fluoresoivien solujen määrä uudelleen suspendoidun sakan millilitraa kohti (N):

N = C × 1 000/y × F

jossa

y

=

uudelleen suspendoidun sakan tilavuus kuopassa

ja

F

=

uudelleen suspendoidun sakan laimennuskerroin.

Lisäys 6

Validoidut PCR-protokollat ja -reagenssit

Huomautus: Alustavan testauksen pitäisi mahdollistaa se, että voidaan todeta R. solanacearum -bakteerin solut, joiden pitoisuus on 103–104 näyteuutteen millilitraa kohden. Testi on voitava toistaa.

Alustavassa testauksessa ei myöskään pitäisi näkyä vääriä positiivisia tuloksia valikoiduilla bakteerikannoilla (ks. lisäys 3).

1.   PCR-protokolla: Seal et al. (1993)

1.1   Oligonukleotidialukkeet

| Koodaavan suunnan aluke OLI-1 | 5′-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3′ |
| --- | --- |
| Vastakkaisen suunnan aluke Y-2 | 5′-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3′ |

Koodaavan suunnan aluke OLI-1

5′-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3′

Vastakkaisen suunnan aluke Y-2

5′-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3′

R. solanacearum -bakteerin templaatti-DNA:sta odotettu amplikonikoko = 288 bp.

1.2   PCR-reaktioseos

| Reagenssi | Määrä reaktiota kohden | Lopullinen pitoisuus |
| --- | --- | --- |
| Steriiliä ultrapuhdasta vettä | 17,65 μl | |
| 10X PCR-puskuri (8) (15 mM MgCl2) | 2,5 μl | 1X (1,5 mM MgCl2) |
| dNTP-seos (20 mM) | 0,25 μl | 0,2 mM |
| Aluke OLI-1 (20 μM) | 1,25 μl | 1μM |
| Aluke Y-2 (20 μM) | 1,25 μl | 1μM |
| Taq-polymeraasi (5 U/μl) (8) | 0,1 μl | 0,5 U |
| Näytteen tilavuus: | 2,0 μl | |
| Kokonaistilavuus: | 25 μl | |

Reagenssi

Määrä reaktiota kohden

Lopullinen pitoisuus

Steriiliä ultrapuhdasta vettä

17,65 μl

10X PCR-puskuri (8) (15 mM MgCl2)

2,5 μl

1X (1,5 mM MgCl2)

dNTP-seos (20 mM)

0,25 μl

0,2 mM

Aluke OLI-1 (20 μM)

1,25 μl

1μM

Aluke Y-2 (20 μM)

1,25 μl

1μM

Taq-polymeraasi (5 U/μl) (8)

0,1 μl

0,5 U

Näytteen tilavuus:

2,0 μl

Kokonaistilavuus:

25 μl

1.3   PCR-reaktion olosuhteet

Ajetaan seuraava ohjelma:

| 1 sykli | i) | 2 minuuttia 96 °C:ssa (templaatti-DNA:n denaturointi) |
| --- | --- | --- |
| 35 sykliä | ii) | 20 sekuntia 94 °C:ssa (templaatti-DNA:n denaturointi) |
| | iii) | 20 sekuntia 68 °C:ssa (alukkeiden pariutuminen) |
| | iv) | 30 sekuntia 72 °C:ssa (kopioiden lisääminen) |
| 1 sykli | v) | 10 minuuttia 72 °C:ssa (lisääminen edelleen) |
| | vi) | pidetään 4 °C:ssa. |

1 sykli

i)

2 minuuttia 96 °C:ssa (templaatti-DNA:n denaturointi)

35 sykliä

ii)

20 sekuntia 94 °C:ssa (templaatti-DNA:n denaturointi)

iii)

20 sekuntia 68 °C:ssa (alukkeiden pariutuminen)

iv)

30 sekuntia 72 °C:ssa (kopioiden lisääminen)

1 sykli

v)

10 minuuttia 72 °C:ssa (lisääminen edelleen)

vi)

pidetään 4 °C:ssa.

Huomautus: Tämä ohjelma on optimoitu käytettäväksi Perkin Elmer 9600 -lämpösyklilaitteella. Muut mallit saattavat vaatia syklien ii, iii ja iv keston muuttamisen.

1.4   Amplikonin restriktio-entsyymianalyysi

R. solanacearum -bakteerin DNA:sta monistetut PCR-tuotteet tuottavat entsyymillä Ava II tyypillistä restriktiofragmenttien pituuspolymorfiaa, kun niitä on inkuboitu 37 °C:ssa.

2.   PCR-protokolla: Pastrik ja Maiss (2000)

2.1   Oligonukleotidialukkeet

| Koodaavan suunnan aluke Ps-1 | 5′-agt cga acg gca gcg ggg g-3′ |
| --- | --- |
| Vastakkaisen suunnan aluke Ps-2 | 5′-ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca-3′ |

Koodaavan suunnan aluke Ps-1

5′-agt cga acg gca gcg ggg g-3′

Vastakkaisen suunnan aluke Ps-2

5′-ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca-3′

R. solanacearum -bakteerin templaatti-DNA:sta odotettu amplikonikoko = 553 bp.

2.2   PCR-reaktioseos

| Reagenssi | Määrä reaktiota kohden | Lopullinen pitoisuus |
| --- | --- | --- |
| Steriiliä ultrapuhdasta vettä | 16,025 μl | |
| 10X PCR-puskuri (9) | 2,5 μl | 1X (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (fraktio V) (10 %) | 0,25 μl | 0,1 % |
| dNTP-seos (20 mM) | 0,125 μl | 0,1 mM |
| Aluke Ps-1 (10 μM) | 0,5 μl | 0,2 μM |
| Aluke Ps-2 (10 μM) | 0,5 μl | 0,2 μM |
| Taq-polymeraasi (5 U/μl) (9) | 0,1 μl | 0,5 U |
| Näytteen tilavuus | 5,0 μl | |
| Kokonaistilavuus: | 25,0 μl | |
| Huom: Alun perin optimoitu käytettäväksi MJ Research PTC 200 -lämpösyklilaitteella Gibcon Taq -polymerasilla.
  Myös Perkin Elmerin AmpliTaqia ja puskuria voidaan käyttää samoina pitoisuuksina. |

Reagenssi

Määrä reaktiota kohden

Lopullinen pitoisuus

Steriiliä ultrapuhdasta vettä

16,025 μl

10X PCR-puskuri (9)

2,5 μl

1X (1,5 mM MgCl2)

BSA (fraktio V) (10 %)

0,25 μl

0,1 %

dNTP-seos (20 mM)

0,125 μl

0,1 mM

Aluke Ps-1 (10 μM)

0,5 μl

0,2 μM

Aluke Ps-2 (10 μM)

0,5 μl

0,2 μM

Taq-polymeraasi (5 U/μl) (9)

0,1 μl

0,5 U

Näytteen tilavuus

5,0 μl

Kokonaistilavuus:

25,0 μl

Huom: Alun perin optimoitu käytettäväksi MJ Research PTC 200 -lämpösyklilaitteella Gibcon Taq -polymerasilla.

Myös Perkin Elmerin AmpliTaqia ja puskuria voidaan käyttää samoina pitoisuuksina.

2.3   PCR-reaktion olosuhteet

Ajetaan seuraava ohjelma:

| 1 sykli | i) | 5 minuuttia 95 °C:ssa (templaatti-DNA:n denaturointi) |
| --- | --- | --- |
| 35 sykliä | ii) | 30 sekuntia 95 °C:ssa (templaatti-DNA: |
| | iii) | 30 sekuntia 68 °C:ssa (alukkeiden pariutuminen) |
| | iv) | 45 sekuntia 72 °C:ssa (kopioiden lisääminen) |
| 1 sykli | v) | 5 minuuttia 72 °C:ssa (lisääminen edelleen) |
| | vi) | pidetään 4 °C:ssa. |

1 sykli

i)

5 minuuttia 95 °C:ssa (templaatti-DNA:n denaturointi)

35 sykliä

ii)

30 sekuntia 95 °C:ssa (templaatti-DNA:

iii)

30 sekuntia 68 °C:ssa (alukkeiden pariutuminen)

iv)

45 sekuntia 72 °C:ssa (kopioiden lisääminen)

1 sykli

v)

5 minuuttia 72 °C:ssa (lisääminen edelleen)

vi)

pidetään 4 °C:ssa.

Huomautus: Tämä ohjelma on optimoitu käytettäväksi MJ Research PTC 200 -lämpösyklilaitteella. Muut mallit saattavat vaatia syklien ii, iii ja iv keston muuttamisen.

2.4   Amplikonin restriktio-entsyymianalyysi

R. solanacearum -bakteerin DNA:sta monistetut PCR-tuotteet tuottavat entsyymillä Taq I tyypillistä restriktiofragmenttien pituuspolymorfiaa, kun niitä on inkuboitu 65 °C:ssa 30 minuutin ajan. R. solanacearum -spesifisestä fragmentista saadut restriktiofragmentit ovat kooltaan 457 ja 96 emäsparia.

3.   Moninkertaiseen reaktioon perustuva PCR-testausprotokolla, johon kuuluu sisäinen PCR-kontrolli (Pastrik et al., 2002)

3.1   Oligonukleotidialukkeet

| Koodaavan suunnan aluke Rs-1-F | 5′-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3′ |
| --- | --- |
| Vastakkaisen suunnan aluke Rs-1-R | 5′-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3′ |
| Koodaavan suunnan aluke Ns-5-F | 5′-AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G-3′ |
| Vastakkaisen suunnan aluke Ns-6-R | 5′-GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC-3′ |

Koodaavan suunnan aluke Rs-1-F

5′-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3′

Vastakkaisen suunnan aluke Rs-1-R

5′-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3′

Koodaavan suunnan aluke Ns-5-F

5′-AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G-3′

Vastakkaisen suunnan aluke Ns-6-R

5′-GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC-3′

R. solanacearum -bakteerin templaatti-DNA:sta odotettu amplikonikoko = 718 bp (Rs-alukesarja).

18S rRNA sisäisestä PCR-kontrollista odotettu amplikonikoko = 310 emäsparia (Ns-alukesarja).

3.2   PCR-reaktioseos

| Reagenssi | Määrä reaktiota kohden | Lopullinen pitoisuus |
| --- | --- | --- |
| Steriiliä ultrapuhdasta vettä | 12,625 μl | |
| 10X PCR-puskuri (10) (15 mM MgCl2) | 2,5 μl | 1X (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (fraktio V) (10 %) | 0,25 μl | 0,1 % |
| dNTP-seos (20 mM) | 0,125 μl | 0,1 mM |
| Aluke Rs-1-F (10 μM) | 2,0 μl | 0,8 μM |
| Aluke Rs-1-R (10 μM) | 2,0 μl | 0,8 μM |
| Aluke Ns-5-F (10μM) (11) | 0,15 μl | 0,06 μM |
| Aluke Ns-6-R (10μM) (11) | 0,15 μl | 0,06 μM |
| Taq-polymeraasi (5 U/μl) (10) | 0,2 μl | 1,0 U |
| Näytteen tilavuus | 5,0 μl | |
| Kokonaistilavuus: | 25,0 μl | |

Reagenssi

Määrä reaktiota kohden

Lopullinen pitoisuus

Steriiliä ultrapuhdasta vettä

12,625 μl

10X PCR-puskuri (10) (15 mM MgCl2)

2,5 μl

1X (1,5 mM MgCl2)

BSA (fraktio V) (10 %)

0,25 μl

0,1 %

dNTP-seos (20 mM)

0,125 μl

0,1 mM

Aluke Rs-1-F (10 μM)

2,0 μl

0,8 μM

Aluke Rs-1-R (10 μM)

2,0 μl

0,8 μM

Aluke Ns-5-F (10μM) (11)

0,15 μl

0,06 μM

Aluke Ns-6-R (10μM) (11)

0,15 μl

0,06 μM

Taq-polymeraasi (5 U/μl) (10)

0,2 μl

1,0 U

Näytteen tilavuus

5,0 μl

Kokonaistilavuus:

25,0 μl

3.3   PCR-reaktion olosuhteet

Ajetaan seuraava ohjelma:

| 1 sykli | i) | 5 minuuttia 95 °C:ssa (templaatti-DNA:n denaturointi) |
| --- | --- | --- |
| 35 sykliä | ii) | 30 sekuntia 95 °C:ssa (templaatti-DNA:n denaturointi) |
| | iii) | 30 sekuntia 58 °C:ssa (alukkeiden pariutuminen) |
| | iv) | 45 sekuntia 72 °C:ssa (kopioiden lisääminen) |
| 1 sykli | v) | 5 minuuttia 72 °C:ssa (lisääminen edelleen) |
| | vi) | pidetään 4 °C:ssa. |

1 sykli

i)

5 minuuttia 95 °C:ssa (templaatti-DNA:n denaturointi)

35 sykliä

ii)

30 sekuntia 95 °C:ssa (templaatti-DNA:n denaturointi)

iii)

30 sekuntia 58 °C:ssa (alukkeiden pariutuminen)

iv)

45 sekuntia 72 °C:ssa (kopioiden lisääminen)

1 sykli

v)

5 minuuttia 72 °C:ssa (lisääminen edelleen)

vi)

pidetään 4 °C:ssa.

Huomautus: Tämä ohjelma on optimoitu käytettäväksi MJ Research PTC 200 -lämpösyklilaitteella. Muut mallit saattavat vaatia syklien ii, iii ja iv keston muuttamisen.

3.4   Amplikonin restriktio-entsyymianalyysi

R. solanacearum -bakteerin DNA:sta monistetut PCR-tuotteet tuottavat entsyymillä Bsm I tyypillistä restriktiofragmenttien pituuspolymorfiaa tai isoskitsomeerin (esim. Mva 1269 I), kun niitä on inkuboitu 65 °C:ssa 30 minuutin ajan.

4.   R. solanacearum -bakteerin biovarispesifinen PCR-protokolla (Pastrik et al., 2001)

4.1   Oligonukleotidialukkeet

| Koodaavan suunnan aluke Rs-1-F | 5′-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3′ |
| --- | --- |
| Vastakkaisen suunnan aluke Rs-1-R | 5′-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3′ |
| Vastakkaisen suunnan aluke Rs-3-R | 5′-TTC ACG GCA AGA TCG CTC-3′ |

Koodaavan suunnan aluke Rs-1-F

5′-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3′

Vastakkaisen suunnan aluke Rs-1-R

5′-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3′

Vastakkaisen suunnan aluke Rs-3-R

5′-TTC ACG GCA AGA TCG CTC-3′

R. solanacearum -bakteerin templaatti-DNA:sta odotettu amplikonikoko:

Rs-1-F/Rs-1-R = 718 bp

Rs-1-F/Rs-3-R = 716 bp.

4.2   PCR-reaktioseos

| a) | Biovari 1/2 -spesifinen PCR







  Reagenssi | Määrä reaktiota kohden | Lopullinen pitoisuus |
| --- | --- | --- | --- |
| Steriiliä ultrapuhdasta vettä | 12,925 μl | |
| 10X PCR-puskuri (12) | 2,5 μl | 1X (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (fraktio V) (10 %) | 0,25 μl | 0,1 % |
| dNTP-seos (20mM) | 0,125 μl | 0,1 mM |
| Aluke Rs-1-F (10 μM) | 2 μl | 0,8 μM |
| Aluke Rs-1-R (10 μM) | 2 μl | 0,8 μM |
| Taq-polymeraasi (5 U/μl) (12) | 0,2 μl | 1 U |
| Näytteen tilavuus | 5,0 μl | |
| Kokonaistilavuus: | 25,0 μl | |

a)

Biovari 1/2 -spesifinen PCR

Reagenssi

Määrä reaktiota kohden

Lopullinen pitoisuus

Steriiliä ultrapuhdasta vettä

12,925 μl

10X PCR-puskuri (12)

2,5 μl

1X (1,5 mM MgCl2)

BSA (fraktio V) (10 %)

0,25 μl

0,1 %

dNTP-seos (20mM)

0,125 μl

0,1 mM

Aluke Rs-1-F (10 μM)

2 μl

0,8 μM

Aluke Rs-1-R (10 μM)

2 μl

0,8 μM

Taq-polymeraasi (5 U/μl) (12)

0,2 μl

1 U

Näytteen tilavuus

5,0 μl

Kokonaistilavuus:

25,0 μl

| b) | Biovari 3/4/5 -spesifinen PCR







  Reagenssi | Määrä reaktiota kohden | Lopullinen pitoisuus |
| --- | --- | --- | --- |
| Steriiliä ultrapuhdasta vettä | 14,925 μl | |
| 10X PCR-puskuri (13) | 2,5 μl | 1X (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (fraktio V) (10 %) | 0,25 μl | 0,1 % |
| dNTP-seos (20 mM) | 0,125 μl | 0,1 mM |
| Aluke Rs-1-F (10 μM) | 1 μl | 0,4 μM |
| Aluke Rs-3-R (10 μM) | 1 μl | 0,4 μM |
| Taq-polymeraasi (5 U/μl) (13) | 0,2 μl | 1 U |
| Näytteen tilavuus | 5,0 μl | |
| Kokonaistilavuus: | 25,0 μl | |

b)

Biovari 3/4/5 -spesifinen PCR

Reagenssi

Määrä reaktiota kohden

Lopullinen pitoisuus

Steriiliä ultrapuhdasta vettä

14,925 μl

10X PCR-puskuri (13)

2,5 μl

1X (1,5 mM MgCl2)

BSA (fraktio V) (10 %)

0,25 μl

0,1 %

dNTP-seos (20 mM)

0,125 μl

0,1 mM

Aluke Rs-1-F (10 μM)

1 μl

0,4 μM

Aluke Rs-3-R (10 μM)

1 μl

0,4 μM

Taq-polymeraasi (5 U/μl) (13)

0,2 μl

1 U

Näytteen tilavuus

5,0 μl

Kokonaistilavuus:

25,0 μl

4.3   PCR-reaktion olosuhteet

Ajetaan seuraava ohjelma sekä biovari 1/2- että biovari 3/4/5-spesifisiä reaktioita varten:

| 1 sykli | i) | 5 minuuttia 95 °C:ssa (templaatti-DNA:n denaturointi) |
| --- | --- | --- |
| 35 sykliä | ii) | 30 sekuntia 95 °C:ssa (templaatti-DNA:n denaturointi) |
| | iii) | 30 sekuntia 58 °C:ssa (alukkeiden pariutuminen) |
| | iv) | 45 sekuntia 72 °C:ssa (kopioiden lisääminen) |
| 1 sykli | v) | 5 minuuttia 72 °C:ssa (lisääminen edelleen) |
| | vi) | pidetään 4 °C:ssa. |

1 sykli

i)

5 minuuttia 95 °C:ssa (templaatti-DNA:n denaturointi)

35 sykliä

ii)

30 sekuntia 95 °C:ssa (templaatti-DNA:n denaturointi)

iii)

30 sekuntia 58 °C:ssa (alukkeiden pariutuminen)

iv)

45 sekuntia 72 °C:ssa (kopioiden lisääminen)

1 sykli

v)

5 minuuttia 72 °C:ssa (lisääminen edelleen)

vi)

pidetään 4 °C:ssa.

Huomautus: Tämä ohjelma optimoitiin käytettäväksi MJ Research PTC 200 -lämpösyklilaitteella. Muut mallit saattavat vaatia syklien ii, iii ja iv keston muuttamisen.

4.4   Amplikonin restriktio-entsyymianalyysi

R. solanacearum -bakteerin DNA:sta alukkeita Rs-1-F ja Rs-1-R käyttämällä monistetut PCR-tuotteet tuottavat entsyymillä Bsm I tyypillistä restriktiofragmenttien pituuspolymorfiaa tai isoskitsomeerin (esim. Mva 1269 I), kun niitä on inkuboitu 65 °C:ssa 30 minuutin ajan. R. solanacearum -bakteerin DNA:sta alukkeita Rs-1-F ja Rs-1-R käyttämällä monistetuilla PCR-tuotteilla ei ole restriktiokohtia.

5.   Latauspuskurin valmistaminen

5.1   Bromifenolisininen (10-prosenttinen kantaliuos)

| Bromifenolisininen | 5 g |
| --- | --- |
| Kahteen kertaan tislattua vettä | 50 ml |

Bromifenolisininen

5 g

Kahteen kertaan tislattua vettä

50 ml

5.2   Latauspuskuri

| Glyseroli (86 %) | 3,5 ml |
| --- | --- |
| Bromifenolisininen (5.1) | 300 μl |
| Kahteen kertaan tislattua vettä | 6,2 ml |

Glyseroli (86 %)

3,5 ml

Bromifenolisininen (5.1)

300 μl

Kahteen kertaan tislattua vettä

6,2 ml

6.   10X trisasetaatti-EDTA-puskuri (TAE), pH 8,0

| Tris-puskuri | 48,40 g |
| --- | --- |
| Jääetikka | 11,42 ml |
| EDTA (dinatriumsuola) | 3,72 g |
| Tislattua vettä | 1,00 l |

Tris-puskuri

48,40 g

Jääetikka

11,42 ml

EDTA (dinatriumsuola)

3,72 g

Tislattua vettä

1,00 l

Laimennetaan 1X:ään ennen käyttöä.

Saatavana myös kaupallisesti (esim. Invitrogen tai vastaava).

Lisäys 7

Validoidut reagenssit FISH-testiä varten

1.   Oligokoettimet

R. solanacearum -spesifinen koetin OLI-1-CY3 5′- ggc agg tag caa gct acc ccc-3′

Ei-spesifinen eubakteriaalinen koetin EUB-338-FITC 5′- gct gcc tcc cgt agg agt -3′

2.   Kiinniteliuos

[VAROITUS! KIINNITE SISÄLTÄÄ PARAFORMALDEHYDIÄ, JOKA ON TOKSISTA. SITÄ EI SAA HENGITTÄÄ, JA ON KÄYTETTÄVÄ KÄSINEITÄ. ON SUOSITELTAVAA TYÖSKENNELLÄ VETOKAAPISSA.]

| i) | Kuumennetaan 9 ml molekyylisuodattimilla puhdistettua vettä (esim. ultrapuhdasta vettä – UPW) noin 60 °C:een ja lisätään 0,4 g paraformaldehydiä. Paraformaldehydi liukenee, kun on lisätty 5 tippaa 1N NaOH:ta ja sekoitettu magneettisekoittimella. |
| --- | --- |

i)

Kuumennetaan 9 ml molekyylisuodattimilla puhdistettua vettä (esim. ultrapuhdasta vettä – UPW) noin 60 °C:een ja lisätään 0,4 g paraformaldehydiä. Paraformaldehydi liukenee, kun on lisätty 5 tippaa 1N NaOH:ta ja sekoitettu magneettisekoittimella.

| ii) | Säädetään pH arvoon 7,0 lisäämällä 1 ml 0,1 M fosfaattipuskuria (PB; pH 7,0) ja 5 tippaa 1N HCl:ää. Tarkistetaan pH indikaattoriliuskoilla ja säädetään tarvittaessa HCl:llä tai NaOH:lla. [VAROITUS! PARAFORMALDEHYDILIUOKSISSA EI SAA KÄYTTÄÄ PH-MITTARIA.] |
| --- | --- |

ii)

Säädetään pH arvoon 7,0 lisäämällä 1 ml 0,1 M fosfaattipuskuria (PB; pH 7,0) ja 5 tippaa 1N HCl:ää. Tarkistetaan pH indikaattoriliuskoilla ja säädetään tarvittaessa HCl:llä tai NaOH:lla. [VAROITUS! PARAFORMALDEHYDILIUOKSISSA EI SAA KÄYTTÄÄ PH-MITTARIA.]

| iii) | Suodatetaan liuos 0,22 μm:n kalvosuodattimen läpi ja pidetään pölyltä suojassa 4 °C:ssa, kunnes sitä tarvitaan. |
| --- | --- |

iii)

Suodatetaan liuos 0,22 μm:n kalvosuodattimen läpi ja pidetään pölyltä suojassa 4 °C:ssa, kunnes sitä tarvitaan.

3.   3X Hybmix

| NaCl | 2,7 M |
| --- | --- |
| Tris-HCl | 60 mM (pH 7,4) |
| EDTA (suodatinsteriloitu ja autoklavoitu) | 15 mM |

NaCl

2,7 M

Tris-HCl

60 mM (pH 7,4)

EDTA (suodatinsteriloitu ja autoklavoitu)

15 mM

Laimennetaan 1X:ään tarpeen mukaan.

4.   Hybridisaatioliuos

| 1X Hybmix | |
| --- | --- |
| Natriumdodekyylisulfaatti (SDS) | 0,01 % |
| Formamidi | 30 %, |
| koetin EUB 338 | 5 ng/μl |
| koetin OLI-1 tai OLI-2 | 5 ng/μl |

1X Hybmix

Natriumdodekyylisulfaatti (SDS)

0,01 %

Formamidi

30 %,

koetin EUB 338

5 ng/μl

koetin OLI-1 tai OLI-2

5 ng/μl

Valmistetaan taulukossa esitettyjen laskelmien mukaisia määriä hybridisaatioliuosta. Kutakin levyä (jotka sisältävät 2 eri näytettä kahteen kertaan) varten tarvitaan 90 μl hybridisaatioliuosta. TÄRKEÄÄ: FORMAMIDI ON ERITTÄIN TOKSISTA, JOTEN KÄSINEITÄ ON KÄYTETTÄVÄ JA TARVITTAVIIN VAROTOIMIIN ON RYHDYTTÄVÄ!

Taulukko   Hybridisaatioseoksen valmistamiseen ehdotetut määrät

| Levyjen lukumäärä: | 1 | 4 | 6 | 8 | 10 |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Steriiliä ultrapuhdasta vettä | 23,1 | 92,4 | 138,6 | 184,8 | 231,0 |
| 3X hybmix | 30,0 | 120,0 | 180,0 | 240,0 | 300,0 |
| 1 % SDS | 0,9 | 3,6 | 5,4 | 7,2 | 9,0 |
| Formamidi | 27,0 | 108,0 | 162,0 | 216,0 | 270,0 |
| Koetin EUB 338 (100 ng/μl) | 4,5 | 18,0 | 27,0 | 36,0 | 45,0 |
| Koetin OLI-1 tai OLI-2 (100 ng/μl) | 4,5 | 18,0 | 27,0 | 36,0 | 45,0 |
| Kokonaismäärä (μl) | 90,0 | 360,0 | 540,0 | 720,0 | 900,0 |
| Huom. Varastoidaan kaikki valolle herkkiä oligokoettimia sisältävät liuokset pimeässä –20 °C:ssa.
  Suojataan käytön aikana suoralta auringonvalolta tai sähkövalolta. |

Levyjen lukumäärä:

1

4

6

8

10

Steriiliä ultrapuhdasta vettä

23,1

92,4

138,6

184,8

231,0

3X hybmix

30,0

120,0

180,0

240,0

300,0

1 % SDS

0,9

3,6

5,4

7,2

9,0

Formamidi

27,0

108,0

162,0

216,0

270,0

Koetin EUB 338 (100 ng/μl)

4,5

18,0

27,0

36,0

45,0

Koetin OLI-1 tai OLI-2 (100 ng/μl)

4,5

18,0

27,0

36,0

45,0

Kokonaismäärä (μl)

90,0

360,0

540,0

720,0

900,0

Huom. Varastoidaan kaikki valolle herkkiä oligokoettimia sisältävät liuokset pimeässä –20 °C:ssa.

Suojataan käytön aikana suoralta auringonvalolta tai sähkövalolta.

5.   0,1M fosfaattipuskuri, pH 7,0

| Na2HPO4 | 8,52 g |
| --- | --- |
| KH2PO4 | 5,44 g |
| Tislattua vettä | 1,00 l |

Na2HPO4

8,52 g

KH2PO4

5,44 g

Tislattua vettä

1,00 l

Liuotetaan ainesosat, tarkastetaan pH ja steriloidaan autoklavoimalla 121 °C:ssa 15 minuutin ajan.

Lisäys 8

Munakoiso- ja tomaattiviljelmä

Kylvetään tomaatin (Lycopersicon esculentum) tai munakoison (Solanum melongena) siemeniä pastöroidulle kylvöalustalle. Istutetaan kylvötaimet uudelleen pastöroituun istutusalustaan, kun sirkkalehdet ovat täysin kehittyneet (10–14 päivää).

Munakoisot tai tomaatit on ennen inokulointia viljeltävä kasvihuoneessa seuraavissa olosuhteissa:

| Päivän pituus | 14 tuntia tai luonnollinen päivän pituus, jos se on tätä pidempi |
| --- | --- |
| Lämpötila | päivä 21–24 °C
  yö 14–18 °C |
| Sopiva tomaattilajike | ’Moneymaker’ |
| Sopiva munakoisolajike | ’Black Beauty’ |
| Tomaattien tai munakoisojen toimittajat | ks. www-sivusto osoitteessa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main. |

Päivän pituus

14 tuntia tai luonnollinen päivän pituus, jos se on tätä pidempi

Lämpötila

päivä 21–24 °C

yö 14–18 °C

Sopiva tomaattilajike

’Moneymaker’

Sopiva munakoisolajike

’Black Beauty’

Tomaattien tai munakoisojen toimittajat

ks. www-sivusto osoitteessa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

VIITTEET

| 1. | Amann, R.I., L. Krumholz and D.A. Stahl. 1990. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology. J. Bacteriol. 172: 762-770. |
| --- | --- |

1.

Amann, R.I., L. Krumholz and D.A. Stahl. 1990. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology. J. Bacteriol. 172: 762-770.

| 2. | Anon. 1998. Council Directive 98/57/EC of 20 July 1998 on the control of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Official Journal of the European Communities L235, 1-39. |
| --- | --- |

2.

Anon. 1998. Council Directive 98/57/EC of 20 July 1998 on the control of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Official Journal of the European Communities L235, 1-39.

| 3. | Boudazin, G., A.C. Le Roux, K. Josi, P. Labarre and B. Jouan. 1999. Design of division specific primers of Ralstonia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology 105; 373-380. |
| --- | --- |

3.

Boudazin, G., A.C. Le Roux, K. Josi, P. Labarre and B. Jouan. 1999. Design of division specific primers of Ralstonia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology 105; 373-380.

| 4. | Caruso, P., Gorris, M.T., Cambra, M., Palomo, J.L., Collar, J and Lopez, M.M. 2002. Enrichment Double-Antibody Sandwich Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal Antibody for sensitive Detection of Ralstonia solanacearum in Asymptomatic Potato Tubers. Applied and Environmental Microbiology, 68, 3634-3638. |
| --- | --- |

4.

Caruso, P., Gorris, M.T., Cambra, M., Palomo, J.L., Collar, J and Lopez, M.M. 2002. Enrichment Double-Antibody Sandwich Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal Antibody for sensitive Detection of Ralstonia solanacearum in Asymptomatic Potato Tubers. Applied and Environmental Microbiology, 68, 3634-3638.

| 5. | Cook, D., Barlow, E. and Sequeira, L. 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphisms with DNA probes that specify virulence and the hypersensitive response. Molecular Plant-Microbe Interactions 1:113-121. |
| --- | --- |

5.

Cook, D., Barlow, E. and Sequeira, L. 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphisms with DNA probes that specify virulence and the hypersensitive response. Molecular Plant-Microbe Interactions 1:113-121.

| 6. | Elphinstone, J.G., Hennessy, J., Wilson, J.K. and Stead, D.E. 1996. Sensitivity of detection of Ralstonia solanacearum in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26; 663-678. |
| --- | --- |

6.

Elphinstone, J.G., Hennessy, J., Wilson, J.K. and Stead, D.E. 1996. Sensitivity of detection of Ralstonia solanacearum in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26; 663-678.

| 7. | Englebrecht, M.C. (1994) Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. In: A.C. Hayward (ed.) Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Australian Centre for International Agricultural Research, Canberra, Australia. |
| --- | --- |

7.

Englebrecht, M.C. (1994) Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. In: A.C. Hayward (ed.) Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Australian Centre for International Agricultural Research, Canberra, Australia.

| 8. | Hayward, A.C. 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27; 265-277. |
| --- | --- |

8.

Hayward, A.C. 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27; 265-277.

| 9. | Hayward, A.C., El-Nashaar, H.M., Nydegger, U. and De Lindo, L. 1990. Variation in nitrate metabolism in biovars of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 69; 269-280. |
| --- | --- |

9.

Hayward, A.C., El-Nashaar, H.M., Nydegger, U. and De Lindo, L. 1990. Variation in nitrate metabolism in biovars of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 69; 269-280.

| 10. | Ito, S., Y. Ushijima, T. Fujii, S. Tanaka, M. Kameya-Iwaki, S. Yoshiwara and F. Kishi. 1998. Detection of viable cells of Ralstonia solanacearum in soil using a semi-selective medium and a PCR technique. J. Phytopathology 146; 379-384. |
| --- | --- |

10.

Ito, S., Y. Ushijima, T. Fujii, S. Tanaka, M. Kameya-Iwaki, S. Yoshiwara and F. Kishi. 1998. Detection of viable cells of Ralstonia solanacearum in soil using a semi-selective medium and a PCR technique. J. Phytopathology 146; 379-384.

| 11. | Janse, J.D. (1988) A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 18, 343-351. |
| --- | --- |

11.

Janse, J.D. (1988) A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 18, 343-351.

| 12. | Janse, J.D. 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacaerum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335-345. |
| --- | --- |

12.

Janse, J.D. 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacaerum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335-345.

| 13. | Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity of Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 44; 693-695. |
| --- | --- |

13.

Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity of Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 44; 693-695.

| 14. | Klement Z.; Rudolph, K and D.C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp. |
| --- | --- |

14.

Klement Z.; Rudolph, K and D.C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp.

| 15. | Lelliott, R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd., Oxford. 216 pp. |
| --- | --- |

15.

Lelliott, R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd., Oxford. 216 pp.

| 16. | Lopez, M.M., Gorris, M.T., Llop, P., Cubero, J., Vicedo, B., Cambra, M., 1997. Selective enrichment improves selective isolation, serological and molecular detection of plant pathogenic bacteria. In: H.W. Dehne et al., (eds). Klewer Academic Publishers. pp. 117-121. |
| --- | --- |

16.

Lopez, M.M., Gorris, M.T., Llop, P., Cubero, J., Vicedo, B., Cambra, M., 1997. Selective enrichment improves selective isolation, serological and molecular detection of plant pathogenic bacteria. In: H.W. Dehne et al., (eds). Klewer Academic Publishers. pp. 117-121.

| 17. | Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1994. Specific genomic fingerprints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR. Applied and Environmental Microbiology, 60, 2286-2295. |
| --- | --- |

17.

Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1994. Specific genomic fingerprints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR. Applied and Environmental Microbiology, 60, 2286-2295.

| 18. | Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J. 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85; 528-536. |
| --- | --- |

18.

Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J. 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85; 528-536.

| 19. | Opina, N., F. Tavner, G. Holloway, J.-F Wang, T.-H Li, R. Maghirang, M. Fegan, A.C. Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W. Holloway, J.N. Timmis. 1997. A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 5; 19-33. |
| --- | --- |

19.

Opina, N., F. Tavner, G. Holloway, J.-F Wang, T.-H Li, R. Maghirang, M. Fegan, A.C. Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W. Holloway, J.N. Timmis. 1997. A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 5; 19-33.

| 20. | Pastrik, K.H. and Maiss, E. 2000. Detection of R. solanacearum in potato tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148; 619-626. |
| --- | --- |

20.

Pastrik, K.H. and Maiss, E. 2000. Detection of R. solanacearum in potato tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148; 619-626.

| 21. | Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831-842. |
| --- | --- |

21.

Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831-842.

| 22. | Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D. (1995) Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79. |
| --- | --- |

22.

Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D. (1995) Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79.

| 23. | Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. - 3. ed.; St. Paul, Minnesota: 373 pp. |
| --- | --- |

23.

Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. - 3. ed.; St. Paul, Minnesota: 373 pp.

| 24. | Seal, S.E., L.A. Jackson, J.P.W. Young, and M.J. Daniels. 1993. Detection of Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii and Blood Disease Bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. J. Gen. Microbiol. 139: 1587-1594. |
| --- | --- |

24.

Seal, S.E., L.A. Jackson, J.P.W. Young, and M.J. Daniels. 1993. Detection of Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii and Blood Disease Bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. J. Gen. Microbiol. 139: 1587-1594.

| 25. | Smith, J.J., Offord, L.C., Holderness, M. and Saddler, G.S. 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61; 4262-4268. |
| --- | --- |

25.

Smith, J.J., Offord, L.C., Holderness, M. and Saddler, G.S. 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61; 4262-4268.

| 26. | Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281-295. |
| --- | --- |

26.

Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281-295.

| 27. | Taghavi, M., Hayward, A.C., Sly, L.I., Fegan, M. 1996. Analysiss of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46; 10-15. |
| --- | --- |

27.

Taghavi, M., Hayward, A.C., Sly, L.I., Fegan, M. 1996. Analysiss of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46; 10-15.

| 28. | Van Der Wolf, J.M., Bonants, P.J.M., Smith, J.J., Hagenaar, M., Nijhuis, E., Van Beckhoven, J.R.C., Saddler, G.S., Trigalet, A., Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 in Western Europe as determined by AFLP, RC-PFGE and rep-PCR. In: Prior, P., Allen, C. and Elphinstone, J. (eds.) Bacterial wilt disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 44-49. |
| --- | --- |

28.

Van Der Wolf, J.M., Bonants, P.J.M., Smith, J.J., Hagenaar, M., Nijhuis, E., Van Beckhoven, J.R.C., Saddler, G.S., Trigalet, A., Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 in Western Europe as determined by AFLP, RC-PFGE and rep-PCR. In: Prior, P., Allen, C. and Elphinstone, J. (eds.) Bacterial wilt disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 44-49.

| 29. | Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., Stead, D.E. and Boonham, N. 1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an automated and quantitative flourogenic 5’ nuclease TaqMan assay. Applied and Environmental Microbiology 66; 2853-2858. |
| --- | --- |

29.

Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., Stead, D.E. and Boonham, N. 1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an automated and quantitative flourogenic 5’ nuclease TaqMan assay. Applied and Environmental Microbiology 66; 2853-2858.

| 30. | Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A.D.L. Akkermans. 1998. Detection of R. solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4546-4554. |
| --- | --- |

30.

Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A.D.L. Akkermans. 1998. Detection of R. solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4546-4554.

LIITE III

| 1. | Kaikissa epäillyissä esiintymistapauksissa, joiden seulontakokeista on luettelossa olevan kasviaineiston osalta sekä kaikkien muiden tapausten osalta saatu positiivinen tulos käyttäen liitteessä II esitettyä asianmukaista menetelmää ja joille odotetaan vahvistusta tai kumoamista kyseisen menetelmän päätyttyä, olisi säilytettävä ja varastoitava asianmukaisissa olosuhteissa kyseisen menetelmän loppuun saattamiseen asti






  — | kaikki mukulat, joista on otettu näyte, ja jos se on mahdollista, kaikki kasvit, joista on otettu näyte, |
| --- | --- | --- |

1.

Kaikissa epäillyissä esiintymistapauksissa, joiden seulontakokeista on luettelossa olevan kasviaineiston osalta sekä kaikkien muiden tapausten osalta saatu positiivinen tulos käyttäen liitteessä II esitettyä asianmukaista menetelmää ja joille odotetaan vahvistusta tai kumoamista kyseisen menetelmän päätyttyä, olisi säilytettävä ja varastoitava asianmukaisissa olosuhteissa kyseisen menetelmän loppuun saattamiseen asti

—

kaikki mukulat, joista on otettu näyte, ja jos se on mahdollista, kaikki kasvit, joista on otettu näyte,

| — | jäljellä oleva uute ja seulontatestejä varten valmistettu lisämateriaali, esim. immunofluoresenssilevyt,
  ja |
| --- | --- |

—

jäljellä oleva uute ja seulontatestejä varten valmistettu lisämateriaali, esim. immunofluoresenssilevyt,

ja

| — | kaikki asian kannalta merkityksellinen dokumentaatio kyseisten menetelmien loppuun saattamiseen asti. |
| --- | --- |

—

kaikki asian kannalta merkityksellinen dokumentaatio kyseisten menetelmien loppuun saattamiseen asti.

Mukuloiden säilyttämisen ansiosta voidaan tarvittaessa tehdä lajiketestaus.

| 2. | Niissä tapauksissa, joissa organismin esiintyminen on varmistunut, olisi säilytettävä ja varastoitava asianmukaisissa olosuhteissa vähintään yhden kuukauden ajan 5 artiklan 2 kohdassa säädetyn ilmoitusmenettelyn jälkeen






  — | 1 kohdassa tarkoitettu aineisto,
  ja |
| --- | --- | --- |

2.

Niissä tapauksissa, joissa organismin esiintyminen on varmistunut, olisi säilytettävä ja varastoitava asianmukaisissa olosuhteissa vähintään yhden kuukauden ajan 5 artiklan 2 kohdassa säädetyn ilmoitusmenettelyn jälkeen

—

1 kohdassa tarkoitettu aineisto,

ja

| — | tomaatti- tai munakoisonäyte, joka on saastutettu inokuloimalla mukula- tai kasviuutteella,
  ja |
| --- | --- |

—

tomaatti- tai munakoisonäyte, joka on saastutettu inokuloimalla mukula- tai kasviuutteella,

ja

| — | organismin eristetty viljelmä. |
| --- | --- |

—

organismin eristetty viljelmä.

LIITE IV

Edellä 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan i alakohdassa tarkoitetussa tutkimuksessa olisi tarvittaessa otettava huomioon seuraavat tekijät:

| i) | tuotantopaikat,






  — | joilla viljellään tai on viljelty perunoita, jotka polveutuvat samasta kloonista kuin organismin saastuttamat perunat, |
| --- | --- | --- |

i)

tuotantopaikat,

—

joilla viljellään tai on viljelty perunoita, jotka polveutuvat samasta kloonista kuin organismin saastuttamat perunat,

| — | joilla viljellään tai on viljelty tomaatteja, joiden alkuperä on sama kuin organismin saastuttamien tomaattien, |
| --- | --- |

—

joilla viljellään tai on viljelty tomaatteja, joiden alkuperä on sama kuin organismin saastuttamien tomaattien,

| — | joilla viljellään tai on viljelty perunoita tai tomaatteja, jotka ovat virallisen valvonnan alaisina organismin epäillyn esiintymisen vuoksi, |
| --- | --- |

—

joilla viljellään tai on viljelty perunoita tai tomaatteja, jotka ovat virallisen valvonnan alaisina organismin epäillyn esiintymisen vuoksi,

| — | joilla viljellään tai on viljelty perunoita, jotka polveutuvat samasta kloonista kuin perunat, joiden on todettu kasvaneen organismin saastuttamissa tuotantopaikoissa, |
| --- | --- |

—

joilla viljellään tai on viljelty perunoita, jotka polveutuvat samasta kloonista kuin perunat, joiden on todettu kasvaneen organismin saastuttamissa tuotantopaikoissa,

| — | joilla viljellään perunoita tai tomaatteja, jotka sijaitsevat saastuneiden tuotantopaikkojen läheisyydessä mukaan lukien tuotantopaikat, jotka joutuvat tekemisiin samojen välineiden tai tuotantotilojen kanssa välittömästi tai yhteisen yrittäjän välityksellä, |
| --- | --- |

—

joilla viljellään perunoita tai tomaatteja, jotka sijaitsevat saastuneiden tuotantopaikkojen läheisyydessä mukaan lukien tuotantopaikat, jotka joutuvat tekemisiin samojen välineiden tai tuotantotilojen kanssa välittömästi tai yhteisen yrittäjän välityksellä,

| — | joilla käytetään pintavettä kasteluun tai sumutukseen lähteestä, joka on vahvistettu tai jota epäillään organismin saastuttamaksi, |
| --- | --- |

—

joilla käytetään pintavettä kasteluun tai sumutukseen lähteestä, joka on vahvistettu tai jota epäillään organismin saastuttamaksi,

| — | joilla käytetään pintavettä kasteluun tai sumutukseen lähteestä, jota käytetään myös organismin saastuttamiksi vahvistetuilla tai epäillyillä tuotantopaikoilla, |
| --- | --- |

—

joilla käytetään pintavettä kasteluun tai sumutukseen lähteestä, jota käytetään myös organismin saastuttamiksi vahvistetuilla tai epäillyillä tuotantopaikoilla,

| — | joilla organismin saastuttamaksi vahvistettu tai epäilty pintavesi tulvii tai on tulvinut; |
| --- | --- |

—

joilla organismin saastuttamaksi vahvistettu tai epäilty pintavesi tulvii tai on tulvinut;

ja

| ii) | pintavesi, jota käytetään kasteluun tai sumutukseen tai joka on tulvinut pellolla (pelloilla) tai tuotantopaikalla (-paikoilla), jonka on vahvistettu olevan organismin saastuttamia. |
| --- | --- |

ii)

pintavesi, jota käytetään kasteluun tai sumutukseen tai joka on tulvinut pellolla (pelloilla) tai tuotantopaikalla (-paikoilla), jonka on vahvistettu olevan organismin saastuttamia.

LIITE V

| 1. | Edellä 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan iii alakohdassa ja 5 artiklan 1 kohdan c alakohdan iii alakohdassa tarkoitetun todennäköisen saastunnan laajuuden määrittämiseen olisi otettava huomioon seuraavat tekijät:






  — | luettelossa oleva kasviaineisto, jota on viljelty 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoitetulla tuotantopaikalla, |
| --- | --- | --- |

1.

Edellä 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan iii alakohdassa ja 5 artiklan 1 kohdan c alakohdan iii alakohdassa tarkoitetun todennäköisen saastunnan laajuuden määrittämiseen olisi otettava huomioon seuraavat tekijät:

—

luettelossa oleva kasviaineisto, jota on viljelty 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoitetulla tuotantopaikalla,

| — | tuotantopaikat, jotka ovat tuotantojärjestelmässä jossakin yhteydessä 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoitettuun luettelossa olevaan kasviaineistoon, mukaan lukien ne, jotka joutuvat tekemisiin samojen välineiden tai tuotantotilojen kanssa välittömästi tai yhteisen yrittäjän välityksellä, |
| --- | --- |

—

tuotantopaikat, jotka ovat tuotantojärjestelmässä jossakin yhteydessä 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoitettuun luettelossa olevaan kasviaineistoon, mukaan lukien ne, jotka joutuvat tekemisiin samojen välineiden tai tuotantotilojen kanssa välittömästi tai yhteisen yrittäjän välityksellä,

| — | luettelossa oleva kasviaineisto, joka on tuotettu edellisessä luetelmakohdassa tarkoitetulla tuotantopaikalla (-paikoilla) tai joka on mainitulla paikalla (mainituilla paikoilla) aikana, jolloin 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoitettu luettelossa oleva kasviaineisto oli ensimmäisessä luetelmakohdassa tarkoitetuissa tuotantopaikoissa, |
| --- | --- |

—

luettelossa oleva kasviaineisto, joka on tuotettu edellisessä luetelmakohdassa tarkoitetulla tuotantopaikalla (-paikoilla) tai joka on mainitulla paikalla (mainituilla paikoilla) aikana, jolloin 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoitettu luettelossa oleva kasviaineisto oli ensimmäisessä luetelmakohdassa tarkoitetuissa tuotantopaikoissa,

| — | tilat, joissa on käsitelty edellä mainituissa luetelmakohdissa tarkoitetuilta tuotantopaikoilta peräisin olevaa luettelossa olevaa kasviaineistoa, |
| --- | --- |

—

tilat, joissa on käsitelty edellä mainituissa luetelmakohdissa tarkoitetuilta tuotantopaikoilta peräisin olevaa luettelossa olevaa kasviaineistoa,

| — | kaikki koneet, ajoneuvot, säiliöt, varastot tai näiden osat sekä kaikki muut esineet, mukaan lukien pakkaukset, jotka ovat voineet olla kosketuksissa 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoitetun luettelossa olevan kasviaineiston kanssa, |
| --- | --- |

—

kaikki koneet, ajoneuvot, säiliöt, varastot tai näiden osat sekä kaikki muut esineet, mukaan lukien pakkaukset, jotka ovat voineet olla kosketuksissa 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoitetun luettelossa olevan kasviaineiston kanssa,

| — | luettelossa oleva kasviaineisto, joka on varastoitu johonkin edellisessä luetelmakohdassa tarkoitettuun rakenteeseen tai esineeseen tai joka on ollut kosketuksissa niiden kanssa ennen kyseisten rakenteiden ja esineiden puhdistamista ja desinfiointia, |
| --- | --- |

—

luettelossa oleva kasviaineisto, joka on varastoitu johonkin edellisessä luetelmakohdassa tarkoitettuun rakenteeseen tai esineeseen tai joka on ollut kosketuksissa niiden kanssa ennen kyseisten rakenteiden ja esineiden puhdistamista ja desinfiointia,

| — | perunan osalta 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan i alakohdassa tarkoitettujen tutkimusten ja testien jälkeen ne mukulat tai kasvit, jotka ovat samaa sisarus- tai vanhemmaiskloonialkuperää, ja tomaatin osalta kasvit, jotka ovat samasta lähteestä kuin 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoitettu luettelossa oleva kasviaineisto ja joiden saastunta näyttäisi todennäköiseltä samasta kloonista polveutumisen kautta, vaikka niiden testitulokset ovat negatiiviset organismin osalta. Saastuneiden ja samasta kloonista polveutuvien mukuloiden tai kasvien tunnistamisen varmistamiseksi voidaan tehdä lajiketestaus, |
| --- | --- |

—

perunan osalta 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan i alakohdassa tarkoitettujen tutkimusten ja testien jälkeen ne mukulat tai kasvit, jotka ovat samaa sisarus- tai vanhemmaiskloonialkuperää, ja tomaatin osalta kasvit, jotka ovat samasta lähteestä kuin 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoitettu luettelossa oleva kasviaineisto ja joiden saastunta näyttäisi todennäköiseltä samasta kloonista polveutumisen kautta, vaikka niiden testitulokset ovat negatiiviset organismin osalta. Saastuneiden ja samasta kloonista polveutuvien mukuloiden tai kasvien tunnistamisen varmistamiseksi voidaan tehdä lajiketestaus,

| — | edellisessä luetelmakohdassa tarkoitetun luettelossa olevan kasviaineiston tuotantopaikka (-paikat), |
| --- | --- |

—

edellisessä luetelmakohdassa tarkoitetun luettelossa olevan kasviaineiston tuotantopaikka (-paikat),

| — | luettelossa olevan kasviaineiston tuotantopaikka (-paikat), jossa (joissa) käytetään 5 artiklan 1 kohdan c alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoitettua pintavettä kasteluun tai sumutukseen, |
| --- | --- |

—

luettelossa olevan kasviaineiston tuotantopaikka (-paikat), jossa (joissa) käytetään 5 artiklan 1 kohdan c alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoitettua pintavettä kasteluun tai sumutukseen,

| — | pelloilla, joilla on tulvinut organismin saastuttamaksi vahvistettu pintavesi, tuotettu luettelossa oleva kasviaineisto. |
| --- | --- |

—

pelloilla, joilla on tulvinut organismin saastuttamaksi vahvistettu pintavesi, tuotettu luettelossa oleva kasviaineisto.

| 2. | Edellä 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan iv alakohdassa ja 5 artiklan 1 kohdan c alakohdan iii alakohdassa tarkoitetun mahdollisen leviämisen määrittämisessä on otettava huomioon seuraavat tekijät:






  i) | 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan iv alakohdan mukaisissa tapauksissa






  — | muiden sellaisten tuotantopaikkojen läheisyys, joilla viljellään luettelossa olevaa kasviaineistoa, |
| --- | --- | --- | --- |

2.

Edellä 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan iv alakohdassa ja 5 artiklan 1 kohdan c alakohdan iii alakohdassa tarkoitetun mahdollisen leviämisen määrittämisessä on otettava huomioon seuraavat tekijät:

i)

5 artiklan 1 kohdan a alakohdan iv alakohdan mukaisissa tapauksissa

—

muiden sellaisten tuotantopaikkojen läheisyys, joilla viljellään luettelossa olevaa kasviaineistoa,

| — | siemenperunoiden yhteistuotanto ja -käyttö, |
| --- | --- |

—

siemenperunoiden yhteistuotanto ja -käyttö,

| — | tuotantopaikat, joilla käytetään pintavettä luettelossa olevan kasviaineiston kasteluun tai sumutukseen, jos kyseessä olevissa tapauksissa 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoitetulta tuotantopaikalta (-paikoilta) on tai on ollut vaarana valua pintavettä tai jos siellä on tai on ollut tulvimisvaara; |
| --- | --- |

—

tuotantopaikat, joilla käytetään pintavettä luettelossa olevan kasviaineiston kasteluun tai sumutukseen, jos kyseessä olevissa tapauksissa 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoitetulta tuotantopaikalta (-paikoilta) on tai on ollut vaarana valua pintavettä tai jos siellä on tai on ollut tulvimisvaara;

| ii) | tapauksissa, joissa pintavesi on edellä 5 artiklan 1 kohdan c alakohdan ii alakohdan mukaisesti ilmoitettu saastuneeksi






  — | tuotantopaikka (-paikat), jossa tuotetaan luettelossa olevaa kasviaineistoa ja joka sijaitsee saastuneeksi ilmoitetun pintaveden läheisyydessä tai jossa esiintyy sen tulvimisen uhka, |
| --- | --- | --- |

ii)

tapauksissa, joissa pintavesi on edellä 5 artiklan 1 kohdan c alakohdan ii alakohdan mukaisesti ilmoitettu saastuneeksi

—

tuotantopaikka (-paikat), jossa tuotetaan luettelossa olevaa kasviaineistoa ja joka sijaitsee saastuneeksi ilmoitetun pintaveden läheisyydessä tai jossa esiintyy sen tulvimisen uhka,

| — | kaikki erilliset kastelualtaat, jotka ovat yhteydessä saastuneeksi ilmoitettuun pintaveteen, |
| --- | --- |

—

kaikki erilliset kastelualtaat, jotka ovat yhteydessä saastuneeksi ilmoitettuun pintaveteen,

| — | kaikki vedet, jotka ovat yhteydessä saastuneeksi ilmoitettuun pintaveteen, ottaen huomioon






  — | saastuneeksi ilmoitetun veden virtaussuunta ja -nopeus, |
| --- | --- | --- |

—

kaikki vedet, jotka ovat yhteydessä saastuneeksi ilmoitettuun pintaveteen, ottaen huomioon

—

saastuneeksi ilmoitetun veden virtaussuunta ja -nopeus,

| — | luonnonvaraisten isäntäkasvina toimivien koisokasvien esiintyminen. |
| --- | --- |

—

luonnonvaraisten isäntäkasvina toimivien koisokasvien esiintyminen.

| 3. | Edellä 5 artiklan 2 kohdan ensimmäisessä alakohdassa tarkoitettu ilmoittaminen on hoidettava seuraavien sääntöjen mukaisesti:






  — | välittömästi sen jälkeen, kun kasvintuhoojan esiintyminen on varmistettu laboratoriotestauksella käyttäen liitteessä II esitettyjä menetelmiä, on ilmoitettava ainakin






  — | perunoiden osalta






  a) | perunaerän lajikenimi; |
| --- | --- | --- | --- | --- |

3.

Edellä 5 artiklan 2 kohdan ensimmäisessä alakohdassa tarkoitettu ilmoittaminen on hoidettava seuraavien sääntöjen mukaisesti:

—

välittömästi sen jälkeen, kun kasvintuhoojan esiintyminen on varmistettu laboratoriotestauksella käyttäen liitteessä II esitettyjä menetelmiä, on ilmoitettava ainakin

—

perunoiden osalta

a)

perunaerän lajikenimi;

| b) | tyyppi (ruoka-, siemenperuna jne.) ja tarvittaessa siemenluokka, |
| --- | --- |

b)

tyyppi (ruoka-, siemenperuna jne.) ja tarvittaessa siemenluokka,

| — | tomaattikasvien osalta erän lajikenimi ja tarvittaessa luokka, |
| --- | --- |

—

tomaattikasvien osalta erän lajikenimi ja tarvittaessa luokka,

| — | jos on olemassa toisesta jäsenvaltiosta tai toiseen jäsenvaltioon siirrettävään luettelossa olevaan kasviaineistoon liittyvä saastuntariski, sen jäsenvaltion, jossa taudinaiheuttajan esiintyminen on vahvistettu, on ilmoitettava viipymättä kyseiselle toiselle jäsenvaltiolle (-valtioille) 5 artiklan 3 kohdan noudattamisen edellyttämät tiedot, sanotun kuitenkaan rajoittamatta 4 artiklan 3 kohdassa säädettyjä velvoitteita ilmoittaa epäillystä esiintymistapauksesta; näitä tietoja ovat esimerkiksi






  a) | peruna- tai tomaattierän lajikenimi; |
| --- | --- | --- |

—

jos on olemassa toisesta jäsenvaltiosta tai toiseen jäsenvaltioon siirrettävään luettelossa olevaan kasviaineistoon liittyvä saastuntariski, sen jäsenvaltion, jossa taudinaiheuttajan esiintyminen on vahvistettu, on ilmoitettava viipymättä kyseiselle toiselle jäsenvaltiolle (-valtioille) 5 artiklan 3 kohdan noudattamisen edellyttämät tiedot, sanotun kuitenkaan rajoittamatta 4 artiklan 3 kohdassa säädettyjä velvoitteita ilmoittaa epäillystä esiintymistapauksesta; näitä tietoja ovat esimerkiksi

a)

peruna- tai tomaattierän lajikenimi;

| b) | lähettäjän ja vastaanottajan nimi ja osoite; |
| --- | --- |

b)

lähettäjän ja vastaanottajan nimi ja osoite;

| c) | peruna- tai tomaattierän toimituspäivämäärä; |
| --- | --- |

c)

peruna- tai tomaattierän toimituspäivämäärä;

| d) | toimitetun peruna- tai tomaattierän koko; |
| --- | --- |

d)

toimitetun peruna- tai tomaattierän koko;

| e) | jäljennös kasvipassista tai tarvittaessa ainakin kasvipassin numero, tai tarvittaessa viljelijän tai kauppiaan rekisteröintinumero ja jäljennös toimitusilmoituksesta. |
| --- | --- |

e)

jäljennös kasvipassista tai tarvittaessa ainakin kasvipassin numero, tai tarvittaessa viljelijän tai kauppiaan rekisteröintinumero ja jäljennös toimitusilmoituksesta.

Komissiolle on viipymättä ilmoitettava tällaisten tietojen toimittamisesta.

| 4. | Edellä 5 artiklan 2 kohdan toisessa alakohdassa tarkoitettu ilmoittaminen on hoidettava seuraavien sääntöjen mukaisesti:
  kun kaikki tutkimukset on tehty, on aina ilmoitettava






  a) | päivämäärä, jona saastunta varmistui; |
| --- | --- | --- |

4.

Edellä 5 artiklan 2 kohdan toisessa alakohdassa tarkoitettu ilmoittaminen on hoidettava seuraavien sääntöjen mukaisesti:

kun kaikki tutkimukset on tehty, on aina ilmoitettava

a)

päivämäärä, jona saastunta varmistui;

| b) | lyhyt kuvaus tutkimuksista, jotka tehtiin saastunnan lähteen ja mahdollisen leviämisen tunnistamiseksi, toteutetun näytteenoton laajuus mukaan luettuna; |
| --- | --- |

b)

lyhyt kuvaus tutkimuksista, jotka tehtiin saastunnan lähteen ja mahdollisen leviämisen tunnistamiseksi, toteutetun näytteenoton laajuus mukaan luettuna;

| c) | tiedot saastunnan tunnistetusta tai oletetusta lähteestä (tai lähteistä); |
| --- | --- |

c)

tiedot saastunnan tunnistetusta tai oletetusta lähteestä (tai lähteistä);

| d) | ilmoitetun saastunnan laajuutta koskevat tiedot, mukaan luettuina tuotantopaikkojen lukumäärä ja perunoiden osalta erien lukumäärä ja lajike sekä siemenperunoiden yhteydessä myös luokka; |
| --- | --- |

d)

ilmoitetun saastunnan laajuutta koskevat tiedot, mukaan luettuina tuotantopaikkojen lukumäärä ja perunoiden osalta erien lukumäärä ja lajike sekä siemenperunoiden yhteydessä myös luokka;

| e) | alueen rajoittamista koskevat tiedot, mukaan luettuina sellaisten tuotantopaikkojen lukumäärä, joita ei ole ilmoitettu saastuneiksi mutta jotka on sisällytetty alueeseen; |
| --- | --- |

e)

alueen rajoittamista koskevat tiedot, mukaan luettuina sellaisten tuotantopaikkojen lukumäärä, joita ei ole ilmoitettu saastuneiksi mutta jotka on sisällytetty alueeseen;

| f) | tiedot vedestä, myös veden nimi ja sijainti sekä saastuneeksi toteamisen/kastelukiellon laajuus; |
| --- | --- |

f)

tiedot vedestä, myös veden nimi ja sijainti sekä saastuneeksi toteamisen/kastelukiellon laajuus;

| g) | kaikkien saastuneiksi ilmoitettujen tomaattilähetysten tai -erien osalta direktiivin 2000/29/EY 13 artiklan 1 kohdan ii alakohdassa säädetyt todistukset ja passin numero direktiivin 2000/29/EY liitteessä V olevan A kohdan I jakson 2.2 kohdan luettelon mukaisesti; |
| --- | --- |

g)

kaikkien saastuneiksi ilmoitettujen tomaattilähetysten tai -erien osalta direktiivin 2000/29/EY 13 artiklan 1 kohdan ii alakohdassa säädetyt todistukset ja passin numero direktiivin 2000/29/EY liitteessä V olevan A kohdan I jakson 2.2 kohdan luettelon mukaisesti;

| h) | vahvistettua esiintymistä (tai esiintymisiä) koskevat muut tiedot, joita komissio voi vaatia. |
| --- | --- |

h)

vahvistettua esiintymistä (tai esiintymisiä) koskevat muut tiedot, joita komissio voi vaatia.

LIITE VI

| 1. | Edellä 6 artiklan 1 kohdassa tarkoitetut säännökset ovat seuraavat:






  — | käyttäminen eläinten rehuksi sellaisen lämpökäsittelyn jälkeen, jolla varmistetaan ettei organismi jää henkiin,
  tai |
| --- | --- | --- |

1.

Edellä 6 artiklan 1 kohdassa tarkoitetut säännökset ovat seuraavat:

—

käyttäminen eläinten rehuksi sellaisen lämpökäsittelyn jälkeen, jolla varmistetaan ettei organismi jää henkiin,

tai

| — | hävittäminen virallisesti hyväksytyllä tarkoitukseen varatulla jätteidenhävittämispaikalla, jossa ei ole tunnistettavaa riskiä organismin pääsystä ympäristöön, esimerkiksi siten, että se valuisi maatalousmaahan tai joutuisi kosketuksiin sellaisten vedensaantilähteiden kanssa, joita voitaisiin käyttää maatalousmaan kasteluun,
  tai |
| --- | --- |

—

hävittäminen virallisesti hyväksytyllä tarkoitukseen varatulla jätteidenhävittämispaikalla, jossa ei ole tunnistettavaa riskiä organismin pääsystä ympäristöön, esimerkiksi siten, että se valuisi maatalousmaahan tai joutuisi kosketuksiin sellaisten vedensaantilähteiden kanssa, joita voitaisiin käyttää maatalousmaan kasteluun,

tai

| — | tuhkaksi polttaminen,
  tai |
| --- | --- |

—

tuhkaksi polttaminen,

tai

| — | teollinen käsittely toimittamalla suoraan ja välittömästi sellaiselle käsittelylaitokselle, jolla on käytettävissään virallisesti hyväksytyt jätteidenhävitystilat ja -laitteet, joista on todettu, että minkäänlaista tunnistettavaa kasvintuhoojan leviämisvaaraa ei ole, sekä järjestelmä, jolla ainakin laitoksesta lähtevät ajoneuvot voidaan puhdistaa ja desinfioida,
  tai |
| --- | --- |

—

teollinen käsittely toimittamalla suoraan ja välittömästi sellaiselle käsittelylaitokselle, jolla on käytettävissään virallisesti hyväksytyt jätteidenhävitystilat ja -laitteet, joista on todettu, että minkäänlaista tunnistettavaa kasvintuhoojan leviämisvaaraa ei ole, sekä järjestelmä, jolla ainakin laitoksesta lähtevät ajoneuvot voidaan puhdistaa ja desinfioida,

tai

| — | muut toimenpiteet, jos on todettu, että minkäänlaista tunnistettavaa kasvintuhoojan leviämisvaaraa ei ole; nämä toimenpiteet ja niiden perustelut on ilmoitettava komissiolle ja muille jäsenvaltioille. |
| --- | --- |

—

muut toimenpiteet, jos on todettu, että minkäänlaista tunnistettavaa kasvintuhoojan leviämisvaaraa ei ole; nämä toimenpiteet ja niiden perustelut on ilmoitettava komissiolle ja muille jäsenvaltioille.

Edellä mainittuihin vaihtoehtoihin liittyvä tai niistä syntyvä mahdollinen jäljelle jäävä jäte hävitetään virallisesti hyväksytyillä menetelmillä tämän direktiivin liitteen VII mukaisesti.

| 2. | Kyseisen jäsenvaltion (-valtioiden) vastuullisten toimivaltaisten viranomaisten valvonnan alaista 6 artiklan 2 kohdassa tarkoitetun luettelossa olevan kasviaineiston asianmukaista käyttöä tai hävittämistä on, edellyttäen, että toimivaltaisten viranomaisten välillä toimii asianmukainen tiedonvaihto jatkuvan valvonnan varmistamiseksi ja että jäsenvaltion vastuullinen toimivaltainen viranomainen on hyväksynyt ensimmäisessä ja toisessa luetelmakohdassa tarkoitetut jätteidenhävitystilat ja -laitteet paikoissa, joissa perunat on tarkoitus pakata tai jalostaa, seuraava:






  i) | perunan mukuloiden osalta






  — | niiden käyttö kulutukseen tarkoitettuina ruokaperunoina, suoraan toimitukseen ja käyttöön valmiissa pakkauksissa, jotka eivät edellytä minkäänlaista uudelleen pakkaamista, paikassa, jossa on asianmukaiset jätteidenhävitystilat ja -laitteet. Kylvämiseen tarkoitettuja perunoita saa käsitellä samassa paikassa ainoastaan, jos tämä tapahtuu erikseen tai puhdistuksen ja desinfioinnin jälkeen,
  tai |
| --- | --- | --- | --- |

2.

Kyseisen jäsenvaltion (-valtioiden) vastuullisten toimivaltaisten viranomaisten valvonnan alaista 6 artiklan 2 kohdassa tarkoitetun luettelossa olevan kasviaineiston asianmukaista käyttöä tai hävittämistä on, edellyttäen, että toimivaltaisten viranomaisten välillä toimii asianmukainen tiedonvaihto jatkuvan valvonnan varmistamiseksi ja että jäsenvaltion vastuullinen toimivaltainen viranomainen on hyväksynyt ensimmäisessä ja toisessa luetelmakohdassa tarkoitetut jätteidenhävitystilat ja -laitteet paikoissa, joissa perunat on tarkoitus pakata tai jalostaa, seuraava:

i)

perunan mukuloiden osalta

—

niiden käyttö kulutukseen tarkoitettuina ruokaperunoina, suoraan toimitukseen ja käyttöön valmiissa pakkauksissa, jotka eivät edellytä minkäänlaista uudelleen pakkaamista, paikassa, jossa on asianmukaiset jätteidenhävitystilat ja -laitteet. Kylvämiseen tarkoitettuja perunoita saa käsitellä samassa paikassa ainoastaan, jos tämä tapahtuu erikseen tai puhdistuksen ja desinfioinnin jälkeen,

tai

| — | niiden käyttö teolliseen käsittelyyn tarkoitettuina perunoina, jotka toimitetaan suoraan ja välittömästi sellaiselle käsittelylaitokselle, jolla on käytettävissään asianmukaiset jätteidenhävitystilat ja -laitteet sekä järjestelmä, jolla ainakin laitoksesta lähtevät ajoneuvot voidaan puhdistaa ja desinfioida,
  tai |
| --- | --- |

—

niiden käyttö teolliseen käsittelyyn tarkoitettuina perunoina, jotka toimitetaan suoraan ja välittömästi sellaiselle käsittelylaitokselle, jolla on käytettävissään asianmukaiset jätteidenhävitystilat ja -laitteet sekä järjestelmä, jolla ainakin laitoksesta lähtevät ajoneuvot voidaan puhdistaa ja desinfioida,

tai

| — | mikä tahansa muu käyttö tai hävittäminen, jos on todettu, että se ei aiheuta tunnistettavaa kasvintuhoojan leviämisvaaraa ja jos se on saanut mainittujen vastuussa olevien viranomaisten hyväksynnän; |
| --- | --- |

—

mikä tahansa muu käyttö tai hävittäminen, jos on todettu, että se ei aiheuta tunnistettavaa kasvintuhoojan leviämisvaaraa ja jos se on saanut mainittujen vastuussa olevien viranomaisten hyväksynnän;

| ii) | muiden kasvin osien osalta, varsien ja lehtien jätteet mukaan luettuina,






  — | hävittäminen,
  tai |
| --- | --- | --- |

ii)

muiden kasvin osien osalta, varsien ja lehtien jätteet mukaan luettuina,

—

hävittäminen,

tai

| — | mikä tahansa muu käyttö tai hävittäminen, jos on todettu, että se ei aiheuta tunnistettavaa organismin leviämisvaaraa, ja jos se on saanut mainittujen vastuullisten toimivaltaisten viranomaisten hyväksynnän. |
| --- | --- |

—

mikä tahansa muu käyttö tai hävittäminen, jos on todettu, että se ei aiheuta tunnistettavaa organismin leviämisvaaraa, ja jos se on saanut mainittujen vastuullisten toimivaltaisten viranomaisten hyväksynnän.

| 3. | Asianmukaiset 6 artiklan 3 kohdassa tarkoitettujen esineiden puhdistamismenetelmät ovat pesu ja tarvittaessa desinfioiminen siten, että ne eivät aiheuta tunnistettavaa organismin leviämisvaaraa; niitä on käytettävä jäsenvaltioiden vastuullisten viranomaisten valvonnassa. |
| --- | --- |

3.

Asianmukaiset 6 artiklan 3 kohdassa tarkoitettujen esineiden puhdistamismenetelmät ovat pesu ja tarvittaessa desinfioiminen siten, että ne eivät aiheuta tunnistettavaa organismin leviämisvaaraa; niitä on käytettävä jäsenvaltioiden vastuullisten viranomaisten valvonnassa.

| 4. | Toimenpiteisiin, jotka jäsenvaltioiden on toteutettava 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan iv alakohdan ja 5 artiklan 1 kohdan c alakohdan iii alakohdan mukaisesti vahvistetuilla ja 6 artiklan 4 kohdassa tarkoitetuilla alueilla on kuuluttava seuraavat toimenpiteet: |
| --- | --- |

4.

Toimenpiteisiin, jotka jäsenvaltioiden on toteutettava 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan iv alakohdan ja 5 artiklan 1 kohdan c alakohdan iii alakohdan mukaisesti vahvistetuilla ja 6 artiklan 4 kohdassa tarkoitetuilla alueilla on kuuluttava seuraavat toimenpiteet:

| 4.1 | Edellä 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneiksi ilmoitettujen tuotantopaikkojen tapauksissa






  a) | edellä 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoitetulla pellolla tai katteen alla kasvatettujen satokasvien tuotantoyksikössä joko






  i) | ilmoitettua saastuntaa seuraavien vähintään neljän kasvuvuoden aikana






  — | toteutetaan toimenpiteitä ylivuotisten perunan ja tomaatin kasvien sekä muiden organismin isäntäkasvien, koisokasvien rikkakasvit mukaan luettuina, hävittämiseksi,
  ja |
| --- | --- | --- | --- | --- |

4.1

Edellä 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneiksi ilmoitettujen tuotantopaikkojen tapauksissa

a)

edellä 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoitetulla pellolla tai katteen alla kasvatettujen satokasvien tuotantoyksikössä joko

i)

ilmoitettua saastuntaa seuraavien vähintään neljän kasvuvuoden aikana

—

toteutetaan toimenpiteitä ylivuotisten perunan ja tomaatin kasvien sekä muiden organismin isäntäkasvien, koisokasvien rikkakasvit mukaan luettuina, hävittämiseksi,

ja

| — | ei istuteta eikä kylvetä






  — | perunan mukuloita, kasveja tai siemeniä, |
| --- | --- | --- |

—

ei istuteta eikä kylvetä

—

perunan mukuloita, kasveja tai siemeniä,

| — | tomaatin kasveja tai siemeniä, |
| --- | --- |

—

tomaatin kasveja tai siemeniä,

| — | organismin biologia huomioon ottaen |
| --- | --- |

—

organismin biologia huomioon ottaen

| — | muita isäntäkasveja, |
| --- | --- |

—

muita isäntäkasveja,

| — | Brassica-sukuisia kaaleja, joiden osalta on olemassa tunnistettava vaara, että organismi säilyy hengissä, |
| --- | --- |

—

Brassica-sukuisia kaaleja, joiden osalta on olemassa tunnistettava vaara, että organismi säilyy hengissä,

| — | satokasveja, joiden osalta on tunnistettu organismin leviämisvaara, |
| --- | --- |

—

satokasveja, joiden osalta on tunnistettu organismin leviämisvaara,

| — | edellisessä luetelmakohdassa tarkoitettua ajanjaksoa seuraavan ensimmäisen perunoiden tai tomaattien korjuukauden aikana ja edellyttäen, että pelto on virallisen tarkastuksen yhteydessä todettu vähintään kahden perättäisen kasvuvuoden aikana ennen istuttamista vapaaksi ylivuotisista perunan tai tomaatin kasveista tai muista isäntäkasveista, koisokasvien rikkakasvit mukaan luettuina,






  — | perunoiden osalta sallitaan ainoastaan ruokaperunan tuotanto, |
| --- | --- | --- |

—

edellisessä luetelmakohdassa tarkoitettua ajanjaksoa seuraavan ensimmäisen perunoiden tai tomaattien korjuukauden aikana ja edellyttäen, että pelto on virallisen tarkastuksen yhteydessä todettu vähintään kahden perättäisen kasvuvuoden aikana ennen istuttamista vapaaksi ylivuotisista perunan tai tomaatin kasveista tai muista isäntäkasveista, koisokasvien rikkakasvit mukaan luettuina,

—

perunoiden osalta sallitaan ainoastaan ruokaperunan tuotanto,

| — | perunoiden ja tomaattien osalta korjatut mukulat tai tomaattikasvit on tutkittava liitteessä II kuvatun menettelyn mukaisesti, |
| --- | --- |

—

perunoiden ja tomaattien osalta korjatut mukulat tai tomaattikasvit on tutkittava liitteessä II kuvatun menettelyn mukaisesti,

| — | edeltävässä luetelmakohdassa tarkoitettua kautta seuraavan perunoiden tai tomaattien korjuukauden aikana ja sopivan viljelykierron jälkeen – jonka pituus on vähintään kaksi vuotta, jos on kasvatettava siemenperunoita – perunoiden ja tomaattien osalta suoritetaan virallisia tutkimuksia 2 artiklan 1 kohdan mukaisesti; |
| --- | --- |

—

edeltävässä luetelmakohdassa tarkoitettua kautta seuraavan perunoiden tai tomaattien korjuukauden aikana ja sopivan viljelykierron jälkeen – jonka pituus on vähintään kaksi vuotta, jos on kasvatettava siemenperunoita – perunoiden ja tomaattien osalta suoritetaan virallisia tutkimuksia 2 artiklan 1 kohdan mukaisesti;

tai

| ii) | ilmoitettua saastuntaa seuraavien viiden kasvuvuoden aikana






  — | toteutetaan toimenpiteitä ylivuotisten peruna- ja tomaattikasvien ja muiden luonnossa esiintyvien organismin isäntäkasvien, koisokasvien rikkakasvit mukaan luettuina, hävittämiseksi,
  ja |
| --- | --- | --- |

ii)

ilmoitettua saastuntaa seuraavien viiden kasvuvuoden aikana

—

toteutetaan toimenpiteitä ylivuotisten peruna- ja tomaattikasvien ja muiden luonnossa esiintyvien organismin isäntäkasvien, koisokasvien rikkakasvit mukaan luettuina, hävittämiseksi,

ja

| — | pelto jätetään avokesannoksi ja sitä pidetään ensimmäisten kolmen vuoden ajan joko avokesantona tai viljalla tunnistetusta vaarasta riippuen tai se jätetään pysyvästi laitumeksi, jolloin sitä joko niitetään usein ja lyhyeksi tai laidunnetaan tehokkaasti, tai se pidetään nurmella siementuotantoa varten, minkä jälkeen seuraavien kahden vuoden ajan siinä viljellään muita kuin organismin isäntäkasveja, joista ei aiheudu tunnistettavaa organismin säilymis- tai leviämisvaaraa, |
| --- | --- |

—

pelto jätetään avokesannoksi ja sitä pidetään ensimmäisten kolmen vuoden ajan joko avokesantona tai viljalla tunnistetusta vaarasta riippuen tai se jätetään pysyvästi laitumeksi, jolloin sitä joko niitetään usein ja lyhyeksi tai laidunnetaan tehokkaasti, tai se pidetään nurmella siementuotantoa varten, minkä jälkeen seuraavien kahden vuoden ajan siinä viljellään muita kuin organismin isäntäkasveja, joista ei aiheudu tunnistettavaa organismin säilymis- tai leviämisvaaraa,

| — | edellisessä luetelmakohdassa tarkoitettua ajanjaksoa seuraavan ensimmäisen perunoiden tai tomaattien korjuukauden aikana ja edellyttäen, että pelto on virallisen tarkastuksen yhteydessä todettu vähintään kahden perättäisen kasvuvuoden aikana ennen istuttamista vapaaksi ylivuotisista perunan tai tomaatin kasveista tai muista isäntäkasveista, koisokasvien rikkakasvit mukaan luettuina,






  — | perunoiden osalta sallitaan ainoastaan siemen- tai ruokaperunan tuotanto, |
| --- | --- | --- |

—

edellisessä luetelmakohdassa tarkoitettua ajanjaksoa seuraavan ensimmäisen perunoiden tai tomaattien korjuukauden aikana ja edellyttäen, että pelto on virallisen tarkastuksen yhteydessä todettu vähintään kahden perättäisen kasvuvuoden aikana ennen istuttamista vapaaksi ylivuotisista perunan tai tomaatin kasveista tai muista isäntäkasveista, koisokasvien rikkakasvit mukaan luettuina,

—

perunoiden osalta sallitaan ainoastaan siemen- tai ruokaperunan tuotanto,

| — | korjatut mukulat tai tomaattikasvit on tutkittava liitteessä II kuvatun menettelyn mukaisesti; |
| --- | --- |

—

korjatut mukulat tai tomaattikasvit on tutkittava liitteessä II kuvatun menettelyn mukaisesti;

| b) | kaikilla muilla saastuneen tuotantopaikan pelloilla, jos vastuussa olevilla viranomaisilla on varmuus siitä, että ylivuotiset peruna- ja tomaattikasvit ja muut luonnostaan esiintyvät kasvintuhoojan isäntäkasvit, koisokasvien rikkakasvit mukaan luettuina, on hävitetty






  — | ilmoitettua saastuntaa seuraavan kasvuvuoden aikana






  — | ei istuteta tai kylvetä yhtään perunan mukulaa, kasvia tai siementä tai muuta kasvintuhoojan isäntäkasvia,
  tai |
| --- | --- | --- | --- |

b)

kaikilla muilla saastuneen tuotantopaikan pelloilla, jos vastuussa olevilla viranomaisilla on varmuus siitä, että ylivuotiset peruna- ja tomaattikasvit ja muut luonnostaan esiintyvät kasvintuhoojan isäntäkasvit, koisokasvien rikkakasvit mukaan luettuina, on hävitetty

—

ilmoitettua saastuntaa seuraavan kasvuvuoden aikana

—

ei istuteta tai kylvetä yhtään perunan mukulaa, kasvia tai siementä tai muuta kasvintuhoojan isäntäkasvia,

tai

| — | perunan mukuloiden osalta istutetaan sertifioitua siemenperunaa ainoastaan ruokaperunan tuottamiseksi, |
| --- | --- |

—

perunan mukuloiden osalta istutetaan sertifioitua siemenperunaa ainoastaan ruokaperunan tuottamiseksi,

| — | tomaattien osalta istutetaan tomaattikasveja, jotka on kasvatettu direktiivin 2000/29/EY vaatimukset täyttävästä siemenestä, ainoastaan hedelmien tuottamiseksi, |
| --- | --- |

—

tomaattien osalta istutetaan tomaattikasveja, jotka on kasvatettu direktiivin 2000/29/EY vaatimukset täyttävästä siemenestä, ainoastaan hedelmien tuottamiseksi,

| — | ilmoitettua saastuntaa seuraavan toisen kasvuvuoden aikana






  — | istutetaan tai kylvetään siemen- tai ruokaperunan tuottamiseksi ainoastaan varmennettuja siemenperunoita tai siemenperunoita, jotka on virallisissa testeissä todettu perunan tummasta rengasmädästä vapaiksi ja jotka on kasvatettu virallisessa valvonnassa muissa kuin 4.1 kohdassa tarkoitetuissa tuotantopaikoissa, |
| --- | --- | --- |

—

ilmoitettua saastuntaa seuraavan toisen kasvuvuoden aikana

—

istutetaan tai kylvetään siemen- tai ruokaperunan tuottamiseksi ainoastaan varmennettuja siemenperunoita tai siemenperunoita, jotka on virallisissa testeissä todettu perunan tummasta rengasmädästä vapaiksi ja jotka on kasvatettu virallisessa valvonnassa muissa kuin 4.1 kohdassa tarkoitetuissa tuotantopaikoissa,

| — | istutetaan tai kylvetään kasvien tai hedelmien tuottamiseksi ainoastaan sellaisia tomaattikasveja, jotka on kasvatettu direktiivin 2000/29/EY vaatimukset täyttävästä siemenestä, tai jos ne on lisätty kasvullisesti, tomaattikasveista, jotka on tuotettu sellaisesta siemenestä ja kasvatettu virallisessa valvonnassa muissa kuin 4.1 kohdassa tarkoitetuissa tuotantopaikoissa, |
| --- | --- |

—

istutetaan tai kylvetään kasvien tai hedelmien tuottamiseksi ainoastaan sellaisia tomaattikasveja, jotka on kasvatettu direktiivin 2000/29/EY vaatimukset täyttävästä siemenestä, tai jos ne on lisätty kasvullisesti, tomaattikasveista, jotka on tuotettu sellaisesta siemenestä ja kasvatettu virallisessa valvonnassa muissa kuin 4.1 kohdassa tarkoitetuissa tuotantopaikoissa,

| — | vähintäänkin kolmannen ilmoitettua saastuntaa seuraavan kasvuvuoden aikana






  — | perunoiden osalta istutetaan ainoastaan sertifioituja siemenperunoita tai sertifioiduista siemenperunoista virallisen valvonnan alaisina kasvatettuja siemenperunoita joko siemenen tai ruokaperunan tuottamiseksi, |
| --- | --- | --- |

—

vähintäänkin kolmannen ilmoitettua saastuntaa seuraavan kasvuvuoden aikana

—

perunoiden osalta istutetaan ainoastaan sertifioituja siemenperunoita tai sertifioiduista siemenperunoista virallisen valvonnan alaisina kasvatettuja siemenperunoita joko siemenen tai ruokaperunan tuottamiseksi,

| — | tomaattien osalta istutetaan ainoastaan sellaisia tomaattikasveja, jotka on kasvatettu direktiivin 2000/29/EY vaatimukset täyttävästä siemenestä, tai virallisessa valvonnassa tällaisista kasveista kasvatettuja tomaattikasveja, joko kasvien tai hedelmien tuottamiseksi, |
| --- | --- |

—

tomaattien osalta istutetaan ainoastaan sellaisia tomaattikasveja, jotka on kasvatettu direktiivin 2000/29/EY vaatimukset täyttävästä siemenestä, tai virallisessa valvonnassa tällaisista kasveista kasvatettuja tomaattikasveja, joko kasvien tai hedelmien tuottamiseksi,

| — | edellisissä alakohdissa tarkoitettujen kasvuvuosien aikana toteutetaan toimenpiteitä ylivuotisten peruna- ja tomaattikasvien ja muiden luonnostaan esiintyvien kasvintuhoojan isäntäkasvien hävittämiseksi, jos niitä esiintyy, ja tehdään korjattavalle sadolle sopivina ajankohtina virallinen tarkastus ja tehdään kullakin perunapellolla virallisia testejä korjatuille perunoille liitteessä II kuvatun menettelyn mukaisesti; |
| --- | --- |

—

edellisissä alakohdissa tarkoitettujen kasvuvuosien aikana toteutetaan toimenpiteitä ylivuotisten peruna- ja tomaattikasvien ja muiden luonnostaan esiintyvien kasvintuhoojan isäntäkasvien hävittämiseksi, jos niitä esiintyy, ja tehdään korjattavalle sadolle sopivina ajankohtina virallinen tarkastus ja tehdään kullakin perunapellolla virallisia testejä korjatuille perunoille liitteessä II kuvatun menettelyn mukaisesti;

| c) | välittömästi 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisen saastunnan toteamisen jälkeen ja ensimmäisenä tätä seuraavana kasvuvuotena






  — | kaikki tuotantopaikan koneet ja varastotilat, joita käytetään perunan ja tomaatin tuotantoon, on puhdistettava ja tarvittaessa desinfioitava sopivin menetelmin 3 kohdan mukaisesti, |
| --- | --- | --- |

c)

välittömästi 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisen saastunnan toteamisen jälkeen ja ensimmäisenä tätä seuraavana kasvuvuotena

—

kaikki tuotantopaikan koneet ja varastotilat, joita käytetään perunan ja tomaatin tuotantoon, on puhdistettava ja tarvittaessa desinfioitava sopivin menetelmin 3 kohdan mukaisesti,

| — | kastelu- ja sumutusohjelmia sekä niiden kieltoa koskevia virallisia tarkastuksia on tarvittaessa toteutettava organismin leviämisen estämiseksi; |
| --- | --- |

—

kastelu- ja sumutusohjelmia sekä niiden kieltoa koskevia virallisia tarkastuksia on tarvittaessa toteutettava organismin leviämisen estämiseksi;

| d) | edellä 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoitetussa, katteen alla kasvatettujen satokasvien yksikössä, jossa kasvualustan korvaaminen kokonaan on mahdollista






  — | mukuloita, kasveja tai siemeniä tai muita organismin isäntäkasveja, tomaattikasvit ja tomaatin siemenet mukaan luettuina, saa istuttaa tai kylvää ainoastaan, jos tuotantoyksikköön sovelletaan virallisessa valvonnassa toimenpiteitä, joiden tarkoituksena on organismin ja kaikkien isäntäkasviaineistoon kuuluvien kasvien hävittäminen, mukaan lukien vähintään kasvualustan vaihtaminen kokonaan sekä kyseisen yksikön ja kaikkien välineiden puhdistus ja tarvittaessa desinfiointi, ja jos vastuulliset viranomaiset ovat tämän seurauksena hyväksyneet sen perunan tai tomaatin tuotantoon,
  ja |
| --- | --- | --- |

d)

edellä 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoitetussa, katteen alla kasvatettujen satokasvien yksikössä, jossa kasvualustan korvaaminen kokonaan on mahdollista

—

mukuloita, kasveja tai siemeniä tai muita organismin isäntäkasveja, tomaattikasvit ja tomaatin siemenet mukaan luettuina, saa istuttaa tai kylvää ainoastaan, jos tuotantoyksikköön sovelletaan virallisessa valvonnassa toimenpiteitä, joiden tarkoituksena on organismin ja kaikkien isäntäkasviaineistoon kuuluvien kasvien hävittäminen, mukaan lukien vähintään kasvualustan vaihtaminen kokonaan sekä kyseisen yksikön ja kaikkien välineiden puhdistus ja tarvittaessa desinfiointi, ja jos vastuulliset viranomaiset ovat tämän seurauksena hyväksyneet sen perunan tai tomaatin tuotantoon,

ja

| — | perunantuotannossa perunoita tuotetaan sertifioiduista siemenperunoista tai testatuista lähteistä olevista minimukuloista tai mikrokasveista, |
| --- | --- |

—

perunantuotannossa perunoita tuotetaan sertifioiduista siemenperunoista tai testatuista lähteistä olevista minimukuloista tai mikrokasveista,

| — | tomaatintuotannossa tomaatteja tuotetaan direktiivin 2000/29/EY vaatimukset täyttävästä siemenestä, tai jos ne on lisätty kasvullisesti, tomaattikasveista, jotka on tuotettu sellaisesta siemenestä ja kasvatettu virallisessa valvonnassa, |
| --- | --- |

—

tomaatintuotannossa tomaatteja tuotetaan direktiivin 2000/29/EY vaatimukset täyttävästä siemenestä, tai jos ne on lisätty kasvullisesti, tomaattikasveista, jotka on tuotettu sellaisesta siemenestä ja kasvatettu virallisessa valvonnassa,

| — | kastelu- ja sumutusohjelmia sekä niiden kieltoa koskevia virallisia tarkastuksia on tarvittaessa toteutettava organismin leviämisen estämiseksi. |
| --- | --- |

—

kastelu- ja sumutusohjelmia sekä niiden kieltoa koskevia virallisia tarkastuksia on tarvittaessa toteutettava organismin leviämisen estämiseksi.

| 4.2 | Rajoittamatta 4.1 kohdassa lueteltujen toimenpiteiden soveltamista, jäsenvaltioiden on rajoitusalueen sisällä






  a) | huolehdittava siitä, että välittömästi ilmoitetun saastunnan jälkeen kaikki tuotantopaikan laitteistot ja varastotilat, jotka ovat yhteydessä perunan tai tomaatin tuotantoon, puhdistetaan ja desinfioidaan tarvittaessa 3 kohdassa tarkoitetuilla sopivilla menetelmillä; |
| --- | --- | --- |

4.2

Rajoittamatta 4.1 kohdassa lueteltujen toimenpiteiden soveltamista, jäsenvaltioiden on rajoitusalueen sisällä

a)

huolehdittava siitä, että välittömästi ilmoitetun saastunnan jälkeen kaikki tuotantopaikan laitteistot ja varastotilat, jotka ovat yhteydessä perunan tai tomaatin tuotantoon, puhdistetaan ja desinfioidaan tarvittaessa 3 kohdassa tarkoitetuilla sopivilla menetelmillä;

| b) | välittömästi todetun saastunnan jälkeen ja sen jälkeen vähintään kolmen kasvuvuoden ajan






  ba) | edellä 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan iv alakohdan mukaisesti määritetyn alueen osalta






  — | määrättävä vastuulliset viranomaiset valvomaan tiloja, joissa harjoitetaan perunan mukuloiden tai tomaattien viljelyä varastointia tai käsittelyä, sekä niiden yritysten tiloja, jotka käyttävät perunan- tai tomaatintuotannossa koneita sopimuksen perusteella, |
| --- | --- | --- | --- |

b)

välittömästi todetun saastunnan jälkeen ja sen jälkeen vähintään kolmen kasvuvuoden ajan

ba)

edellä 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan iv alakohdan mukaisesti määritetyn alueen osalta

—

määrättävä vastuulliset viranomaiset valvomaan tiloja, joissa harjoitetaan perunan mukuloiden tai tomaattien viljelyä varastointia tai käsittelyä, sekä niiden yritysten tiloja, jotka käyttävät perunan- tai tomaatintuotannossa koneita sopimuksen perusteella,

| — | vaadittava, että kyseisen alueen kaikki perunasadot istutetaan ainoastaan sertifioitua siementä käyttäen tai virallisen valvonnan alaisena kasvatettua siementä ja että korjuun jälkeen testataan 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan iii alakohdan mukaisesti mahdollisesti saastuneiksi määritellyillä tuotantopaikoilla kasvaneet siemenperunat, |
| --- | --- |

—

vaadittava, että kyseisen alueen kaikki perunasadot istutetaan ainoastaan sertifioitua siementä käyttäen tai virallisen valvonnan alaisena kasvatettua siementä ja että korjuun jälkeen testataan 5 artiklan 1 kohdan a alakohdan iii alakohdan mukaisesti mahdollisesti saastuneiksi määritellyillä tuotantopaikoilla kasvaneet siemenperunat,

| — | vaadittava, että kaikissa alueen yrityksissä siemenperuna ja ruokaperuna käsitellään erillään tai että siemen- ja ruokaperunoiden käsittelyn välillä huolehditaan tarvittaessa puhdistamisesta ja desinfioinnista, |
| --- | --- |

—

vaadittava, että kaikissa alueen yrityksissä siemenperuna ja ruokaperuna käsitellään erillään tai että siemen- ja ruokaperunoiden käsittelyn välillä huolehditaan tarvittaessa puhdistamisesta ja desinfioinnista,

| — | vaadittava, että kaiken alueella kasvatettavan tomaattisadon istutukseen käytetään ainoastaan tomaattikasveja, jotka on kasvatettu direktiivin 2000/29/EY vaatimukset täyttävästä siemenestä, tai jos ne on lisätty kasvullisesti, tomaattikasveja, jotka on tuotettu sellaisesta siemenestä ja kasvatettu virallisessa valvonnassa, |
| --- | --- |

—

vaadittava, että kaiken alueella kasvatettavan tomaattisadon istutukseen käytetään ainoastaan tomaattikasveja, jotka on kasvatettu direktiivin 2000/29/EY vaatimukset täyttävästä siemenestä, tai jos ne on lisätty kasvullisesti, tomaattikasveja, jotka on tuotettu sellaisesta siemenestä ja kasvatettu virallisessa valvonnassa,

| — | toteutettava viralliset tutkimukset 2 artiklan 1 kohdan mukaisesti; |
| --- | --- |

—

toteutettava viralliset tutkimukset 2 artiklan 1 kohdan mukaisesti;

| bb) | edellä 5 artiklan 1 kohdan c alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoitetun tai liitteessä V olevan 2 kohdan mukaisesti organismin mahdollisen leviämisen määrittämisessä huomioon otettaviin tekijöihin kuuluvan pintaveden osalta






  — | toteutettava luettelossa olevan kasviaineiston osalta soveltuvina ajankohtina vuosittainen tutkimus, joka käsittää näytteenoton pintavedestä sekä asiaankuuluvista isäntäkoisokasveista soveltuviin vedensaantilähteisiin liittyen sekä testauksen liitteessä II vahvistetuin soveltuvin menetelmin ja muiden tapausten osalta, |
| --- | --- | --- |

bb)

edellä 5 artiklan 1 kohdan c alakohdan ii alakohdan mukaisesti saastuneeksi ilmoitetun tai liitteessä V olevan 2 kohdan mukaisesti organismin mahdollisen leviämisen määrittämisessä huomioon otettaviin tekijöihin kuuluvan pintaveden osalta

—

toteutettava luettelossa olevan kasviaineiston osalta soveltuvina ajankohtina vuosittainen tutkimus, joka käsittää näytteenoton pintavedestä sekä asiaankuuluvista isäntäkoisokasveista soveltuviin vedensaantilähteisiin liittyen sekä testauksen liitteessä II vahvistetuin soveltuvin menetelmin ja muiden tapausten osalta,

| — | toteutettava virallisia tarkastuksia, jotka koskevat kastelu- ja sumutusohjelmia sekä saastuneeksi ilmoitetun veden luettelossa olevan kasviaineiston kasteluun ja sumutukseen tarkoitettua käyttöä koskevaa kieltoa ja tarvittaessa muita isäntäkasveja organismin leviämisen estämiseksi. Kieltoa voidaan tarkistaa mainitussa vuosittaisessa tutkimuksessa saatujen tulosten perusteella ja saastuneeksi toteaminen voidaan peruuttaa, jos vastuullinen toimivaltainen viranomainen katsoo, että pintavesi ei enää ole saastunutta. Kiellon kohteena olevan veden käyttö isäntäkasvien kasteluun ja sumutukseen voidaan sallia virallisessa valvonnassa, jos käytetään virallisesti hyväksyttyjä menetelmiä, joilla taudinaiheuttaja hävitetään ja sen leviäminen estetään, |
| --- | --- |

—

toteutettava virallisia tarkastuksia, jotka koskevat kastelu- ja sumutusohjelmia sekä saastuneeksi ilmoitetun veden luettelossa olevan kasviaineiston kasteluun ja sumutukseen tarkoitettua käyttöä koskevaa kieltoa ja tarvittaessa muita isäntäkasveja organismin leviämisen estämiseksi. Kieltoa voidaan tarkistaa mainitussa vuosittaisessa tutkimuksessa saatujen tulosten perusteella ja saastuneeksi toteaminen voidaan peruuttaa, jos vastuullinen toimivaltainen viranomainen katsoo, että pintavesi ei enää ole saastunutta. Kiellon kohteena olevan veden käyttö isäntäkasvien kasteluun ja sumutukseen voidaan sallia virallisessa valvonnassa, jos käytetään virallisesti hyväksyttyjä menetelmiä, joilla taudinaiheuttaja hävitetään ja sen leviäminen estetään,

| — | saastuneiden nestemäisten jätepäästöjen osalta toteutettava virallisia tarkastuksia, jotka koskevat luettelossa olevaa kasviaineistoa käsittelevien teollisten jalostus- ja pakkauslaitosten kiinteiden jätteiden tai nestemäisten jätepäästöjen hävittämistä; |
| --- | --- |

—

saastuneiden nestemäisten jätepäästöjen osalta toteutettava virallisia tarkastuksia, jotka koskevat luettelossa olevaa kasviaineistoa käsittelevien teollisten jalostus- ja pakkauslaitosten kiinteiden jätteiden tai nestemäisten jätepäästöjen hävittämistä;

| c) | laadittava tarvittaessa ohjelma kaikkien siemenperunavarastojen korvaamiseksi sopivan ajanjakson kuluessa. |
| --- | --- |

c)

laadittava tarvittaessa ohjelma kaikkien siemenperunavarastojen korvaamiseksi sopivan ajanjakson kuluessa.

LIITE VII

Liitteessä VI olevassa 1 kohdassa tarkoitettujen virallisesti hyväksyttyjen jätteidenhävitysmenetelmien on vastattava seuraavia säännöksiä siten, että vältetään mahdollinen tunnistettava kasvintuhoojan leviämisvaara:

| i) | peruna- ja tomaattijäte (hylätyt perunat ja kuoret ja tomaatit mukaan luettuina) ja mahdollinen muu perunoihin ja tomaatteihin liittyvä kiinteä jäte (maaperä, kivet ja muu jäte mukaan luettuina) hävitetään joko






  — | hävittämällä virallisesti hyväksytyllä tarkoitukseen varatulla jätteidenhävittämispaikalla, jossa ei ole tunnistettavaa riskiä kasvintuhoojan pääsystä ympäristöön, esimerkiksi siten, että se imeytyisi maatalousmaahan tai joutuisi kosketuksiin sellaisten vedensaantilähteiden kanssa, joita saatetaan käyttää maatalousmaan kasteluun; jäte on kuljetettava suoraan hävittämispaikalle pakkaamalla se siten, ettei ole vaaraa jätteen häviämisestä,
  tai |
| --- | --- | --- |

i)

peruna- ja tomaattijäte (hylätyt perunat ja kuoret ja tomaatit mukaan luettuina) ja mahdollinen muu perunoihin ja tomaatteihin liittyvä kiinteä jäte (maaperä, kivet ja muu jäte mukaan luettuina) hävitetään joko

—

hävittämällä virallisesti hyväksytyllä tarkoitukseen varatulla jätteidenhävittämispaikalla, jossa ei ole tunnistettavaa riskiä kasvintuhoojan pääsystä ympäristöön, esimerkiksi siten, että se imeytyisi maatalousmaahan tai joutuisi kosketuksiin sellaisten vedensaantilähteiden kanssa, joita saatetaan käyttää maatalousmaan kasteluun; jäte on kuljetettava suoraan hävittämispaikalle pakkaamalla se siten, ettei ole vaaraa jätteen häviämisestä,

tai

| — | tuhkaksi polttamalla,
  tai |
| --- | --- |

—

tuhkaksi polttamalla,

tai

| — | muilla toimenpiteillä, jos on todettu, että minkäänlaista tunnistettavaa kasvintuhoojan leviämisvaaraa ei ole; nämä toimenpiteet on ilmoitettava komissiolle ja muille jäsenvaltioille; |
| --- | --- |

—

muilla toimenpiteillä, jos on todettu, että minkäänlaista tunnistettavaa kasvintuhoojan leviämisvaaraa ei ole; nämä toimenpiteet on ilmoitettava komissiolle ja muille jäsenvaltioille;

| ii) | nestemäinen jäte: nestemäinen jäte, joka sisältää suspendoituneita kiinteitä aineita, suodatetaan ennen hävittämistä tai kiintoaineet poistetaan laskeuttamalla. Nämä kiintoaineet hävitetään i alakohdassa esitetyllä tavalla.
  Tämän jälkeen nestemäinen jäte joko






  — | kuumennetaan kauttaaltaan vähintään 60 °C:seen 30 minuutin ajaksi ennen hävittämistä,
  tai |
| --- | --- | --- |

ii)

nestemäinen jäte: nestemäinen jäte, joka sisältää suspendoituneita kiinteitä aineita, suodatetaan ennen hävittämistä tai kiintoaineet poistetaan laskeuttamalla. Nämä kiintoaineet hävitetään i alakohdassa esitetyllä tavalla.

Tämän jälkeen nestemäinen jäte joko

—

kuumennetaan kauttaaltaan vähintään 60 °C:seen 30 minuutin ajaksi ennen hävittämistä,

tai

| — | hävitetään muulla virallisesti hyväksytyllä tavalla virallisessa valvonnassa siten, ettei ole olemassa tunnistettavaa riskiä jätteen pääsystä kosketuksiin maatalousmaan tai sellaisten vedensaantilähteiden kanssa, joita saatetaan käyttää maatalousmaan kasteluun. Asiaan liittyvät yksityiskohdat on ilmoitettava muille jäsenvaltioille ja komissiolle. |
| --- | --- |

—

hävitetään muulla virallisesti hyväksytyllä tavalla virallisessa valvonnassa siten, ettei ole olemassa tunnistettavaa riskiä jätteen pääsystä kosketuksiin maatalousmaan tai sellaisten vedensaantilähteiden kanssa, joita saatetaan käyttää maatalousmaan kasteluun. Asiaan liittyvät yksityiskohdat on ilmoitettava muille jäsenvaltioille ja komissiolle.

Tässä liitteessä kuvatut vaihtoehdot koskevat myös saastuneiden erien käsittelyyn, hävittämiseen ja prosessointiin liittyvää jätettä.

---

(1)  Ks. Lelliott and Stead (1987).

1

(2)  Yhteyshenkilöt: ks. www-sivusto http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

2

http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

(3)  Käytetään R. solanacearum -bakteerin biovarin 2 (rotu 3) standardoituna viitekantana.

3

R. solanacearum

(4)  Serologisissa testeissä (IF ja/tai ELISA), joissa käytetään polyklonaalisia antiseerumeita, potentiaalisesti ristiin reagoiva kanta.

4

(5)  Kanta, josta joissakin laboratorioissa voidaan monistaa PCR-tuote, joka on vastaavan kokoinen kuin spesifisiä OLI-1- ja Y-2-alukkeita käytettäessä odotettava tulos (ks. lisäys 6).

5

(6)  Aiheuttaa todennäköisesti ristireaktion useimmissa testeissä mutta esiintyy tunnetusti ainoastaan banaanissa Indonesiassa.

6

(7)  Käytetään homogenoimalla tapahtuvassa uuttamismenettelyssä.

7

(8)  Menetelmä validoitiin käyttäen Perkin Elmerin Taq-polymeraasia (AmpliTaq) ja Gibco BRL:tä.

8

Taq

(9)  Menetelmät validoitiin käyttäen Perkin Elmerin Taq-polymeraasia (AmpliTaq) ja Gibco BRL:tä.

9

Taq

Huom: Alun perin optimoitu käytettäväksi MJ Research PTC 200 -lämpösyklilaitteella Gibcon Taq -polymerasilla.

Huom:

Myös Perkin Elmerin AmpliTaqia ja puskuria voidaan käyttää samoina pitoisuuksina.

(10)  Menetelmät validoitiin käyttäen Perkin Elmerin Taq-polymeraasia (AmpliTaq) ja Gibco BRL:tä.

10

Taq

(11)  Alukkeiden Ns-5-F ja Ns-6-R konsentraatio optimoitiin perunan napapääuutteelle käyttäen homogenointimenettelyä ja DNA:n puhdistusta Pastrikin mukaan (2000) (ks. VI jakson A kohdan 6.1.a alakohta). Reagenssien konsentraatiot on optimoitava uudelleen, jos käytetään ravistamalla tapahtuvaa uuttamismenetelmää tai muuta DNA:n eristämismenetelmää.

11

(12)  Menetelmät on validoitu käyttäen Perkin Elmerin Taq-polymeraasia (AmpliTaq) ja Gibco BRL:tä.

12

Taq

(13)  Menetelmät on validoitu käyttäen Perkin Elmerin Taq-polymeraasia (AmpliTaq) ja Gibco BRL:tä.

13

---

| 27.7.2006 | FI | Euroopan unionin virallinen lehti | L 206/107 |
| --- | --- | --- | --- |

27.7.2006

FI

Euroopan unionin virallinen lehti

L 206/107

---

KOMISSION DIREKTIIVI 2006/64/EY,

annettu 18 päivänä heinäkuuta 2006,

neuvoston direktiivin 91/414/ETY muuttamisesta klopyralidin, syprodiniilin, fosetyylin ja trineksapakin sisällyttämiseksi siihen tehoaineina

(ETA:n kannalta merkityksellinen teksti)

EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka

ottaa huomioon Euroopan yhteisön perustamissopimuksen,

ottaa huomioon kasvinsuojeluaineiden markkinoille saattamisesta 15 päivänä heinäkuuta 1991 annetun neuvoston direktiivin 91/414/ETY (1) ja erityisesti sen 6 artiklan 1 kohdan,

sekä katsoo seuraavaa:

| (1) | Komission asetuksissa (EY) N:o 451/2000 (2) ja (EY) N:o 703/2001 (3) vahvistetaan direktiivin 91/414/ETY 8 artiklan 2 kohdassa tarkoitetun työohjelman toisen vaiheen täytäntöönpanoa koskevat yksityiskohtaiset säännöt sekä luettelo tehoaineista niiden arviointia ja mahdollista direktiivin 91/414/ETY liitteeseen I sisällyttämistä varten. Kyseiseen luetteloon sisältyvät klopyralidi, syprodiniili, fosetyyli ja trineksapakki. |
| --- | --- |

(1)

Komission asetuksissa (EY) N:o 451/2000 (2) ja (EY) N:o 703/2001 (3) vahvistetaan direktiivin 91/414/ETY 8 artiklan 2 kohdassa tarkoitetun työohjelman toisen vaiheen täytäntöönpanoa koskevat yksityiskohtaiset säännöt sekä luettelo tehoaineista niiden arviointia ja mahdollista direktiivin 91/414/ETY liitteeseen I sisällyttämistä varten. Kyseiseen luetteloon sisältyvät klopyralidi, syprodiniili, fosetyyli ja trineksapakki.

| (2) | Kyseisten tehoaineiden vaikutukset ihmisten terveyteen ja ympäristöön on arvioitu asetusten (EY) N:o 451/2000 ja (EY) N:o 703/2001 säännösten mukaisesti ilmoittajan ehdottamien käyttötarkoitusten osalta. Lisäksi kyseisissä asetuksissa nimetään esittelijöinä toimivat jäsenvaltiot, joiden on toimitettava asiaa koskevat arviointikertomukset ja suositukset Euroopan elintarviketurvallisuusviranomaiselle asetuksen (EY) N:o 451/2000 8 artiklan 1 kohdan mukaisesti. Klopyralidin osalta esittelevä jäsenvaltio oli Suomi, ja kaikki asiaa koskevat tiedot toimitettiin 2 päivänä joulukuuta 2003. Syprodiniilin ja fosetyylin osalta esittelevä jäsenvaltio oli Ranska, ja kaikki asiaa koskevat tiedot toimitettiin 16 päivänä tammikuuta 2004 ja 20 päivänä lokakuuta 2003. Trineksapakin osalta esittelevä jäsenvaltio oli Alankomaat, ja kaikki asiaa koskevat tiedot toimitettiin 7 päivänä marraskuuta 2003. |
| --- | --- |

(2)

Kyseisten tehoaineiden vaikutukset ihmisten terveyteen ja ympäristöön on arvioitu asetusten (EY) N:o 451/2000 ja (EY) N:o 703/2001 säännösten mukaisesti ilmoittajan ehdottamien käyttötarkoitusten osalta. Lisäksi kyseisissä asetuksissa nimetään esittelijöinä toimivat jäsenvaltiot, joiden on toimitettava asiaa koskevat arviointikertomukset ja suositukset Euroopan elintarviketurvallisuusviranomaiselle asetuksen (EY) N:o 451/2000 8 artiklan 1 kohdan mukaisesti. Klopyralidin osalta esittelevä jäsenvaltio oli Suomi, ja kaikki asiaa koskevat tiedot toimitettiin 2 päivänä joulukuuta 2003. Syprodiniilin ja fosetyylin osalta esittelevä jäsenvaltio oli Ranska, ja kaikki asiaa koskevat tiedot toimitettiin 16 päivänä tammikuuta 2004 ja 20 päivänä lokakuuta 2003. Trineksapakin osalta esittelevä jäsenvaltio oli Alankomaat, ja kaikki asiaa koskevat tiedot toimitettiin 7 päivänä marraskuuta 2003.

| (3) | Arviointikertomuksia ovat tarkastelleet jäsenvaltiot vertaistarkasteluna ja Euroopan elintarviketurvallisuusviranomainen, ja ne on esitetty komissiolle 14 päivänä joulukuuta 2005 klopyralidia, syprodiniilia, fosetyylia ja trineksapakkia koskevien Euroopan elintarviketurvallisuusviranomaisen tieteellisten kertomusten muodossa (4). Jäsenvaltiot ja komissio ovat tarkastelleet kyseisiä kertomuksia elintarvikeketjua ja eläinten terveyttä käsittelevässä pysyvässä komiteassa, ja 4 päivänä huhtikuuta 2006 valmistuivat klopyralidia, syprodiniilia, fosetyylia ja trineksapakkia koskevat komission tarkastelukertomukset. |
| --- | --- |

(3)

Arviointikertomuksia ovat tarkastelleet jäsenvaltiot vertaistarkasteluna ja Euroopan elintarviketurvallisuusviranomainen, ja ne on esitetty komissiolle 14 päivänä joulukuuta 2005 klopyralidia, syprodiniilia, fosetyylia ja trineksapakkia koskevien Euroopan elintarviketurvallisuusviranomaisen tieteellisten kertomusten muodossa (4). Jäsenvaltiot ja komissio ovat tarkastelleet kyseisiä kertomuksia elintarvikeketjua ja eläinten terveyttä käsittelevässä pysyvässä komiteassa, ja 4 päivänä huhtikuuta 2006 valmistuivat klopyralidia, syprodiniilia, fosetyylia ja trineksapakkia koskevat komission tarkastelukertomukset.

| (4) | Eri tutkimuksista on käynyt ilmi, että klopyralidia, syprodiniilia, fosetyylia ja trineksapakkia sisältävien kasvinsuojeluaineiden voidaan yleisesti olettaa täyttävän direktiivin 91/414/ETY 5 artiklan 1 kohdan a ja b alakohdassa säädetyt edellytykset erityisesti tutkittujen ja komission tarkastelukertomuksessa lueteltujen käyttötarkoitusten osalta. Näin ollen on aiheellista sisällyttää kyseiset tehoaineet liitteeseen I sen varmistamiseksi, että kyseisiä tehoaineita sisältäviä kasvinsuojeluaineita koskevien lupien myöntäminen voidaan järjestää kaikissa jäsenvaltioissa mainitussa direktiivissä säädetyllä tavalla. |
| --- | --- |

(4)

Eri tutkimuksista on käynyt ilmi, että klopyralidia, syprodiniilia, fosetyylia ja trineksapakkia sisältävien kasvinsuojeluaineiden voidaan yleisesti olettaa täyttävän direktiivin 91/414/ETY 5 artiklan 1 kohdan a ja b alakohdassa säädetyt edellytykset erityisesti tutkittujen ja komission tarkastelukertomuksessa lueteltujen käyttötarkoitusten osalta. Näin ollen on aiheellista sisällyttää kyseiset tehoaineet liitteeseen I sen varmistamiseksi, että kyseisiä tehoaineita sisältäviä kasvinsuojeluaineita koskevien lupien myöntäminen voidaan järjestää kaikissa jäsenvaltioissa mainitussa direktiivissä säädetyllä tavalla.

| (5) | Rajoittamatta edellä esitetyn päätelmän soveltamista on kuitenkin asianmukaista hankkia lisätietoja klopyralidia, syprodiniilia ja fosetyylia koskevista tietyistä seikoista. Direktiivin 91/414/ETY 6 artiklan 1 kohdassa säädetään, että tehoaineen sisällyttämiselle liitteeseen I voidaan asettaa ehtoja. Sen vuoksi on asianmukaista vaatia, että klopyralidille, syprodiniilille ja fosetyylille tehtäisiin lisätestejä riskinarvioinnin vahvistamiseksi tiettyjen seikkojen osalta ja että ilmoittajat esittelisivät tällaiset tutkimukset. |
| --- | --- |

(5)

Rajoittamatta edellä esitetyn päätelmän soveltamista on kuitenkin asianmukaista hankkia lisätietoja klopyralidia, syprodiniilia ja fosetyylia koskevista tietyistä seikoista. Direktiivin 91/414/ETY 6 artiklan 1 kohdassa säädetään, että tehoaineen sisällyttämiselle liitteeseen I voidaan asettaa ehtoja. Sen vuoksi on asianmukaista vaatia, että klopyralidille, syprodiniilille ja fosetyylille tehtäisiin lisätestejä riskinarvioinnin vahvistamiseksi tiettyjen seikkojen osalta ja että ilmoittajat esittelisivät tällaiset tutkimukset.

| (6) | Kohtuullinen määräaika on tarpeen ennen tehoaineen sisällyttämistä liitteeseen I, jotta jäsenvaltiot ja asianomaiset osapuolet voivat valmistautua sisällyttämisestä seuraaviin uusiin vaatimuksiin. |
| --- | --- |

(6)

Kohtuullinen määräaika on tarpeen ennen tehoaineen sisällyttämistä liitteeseen I, jotta jäsenvaltiot ja asianomaiset osapuolet voivat valmistautua sisällyttämisestä seuraaviin uusiin vaatimuksiin.

| (7) | Ilman, että tehoaineen sisällyttämisellä liitteeseen I rajoitettaisiin direktiivin 91/414/ETY velvoitteiden soveltamista, jäsenvaltioilla olisi sisällyttämisen jälkeen oltava kuusi kuukautta aikaa tarkistaa nykyiset klopyralidia, syprodiniilia, fosetyylia ja trineksapakkia sisältävien kasvinsuojeluaineiden luvat sen varmistamiseksi, että direktiivissä 91/414/ETY ja erityisesti sen 13 artiklassa säädetyt vaatimukset ja liitteessä I vahvistetut ehdot täyttyvät. Jäsenvaltioiden olisi direktiivin 91/414/ETY säännösten mukaisesti tapauksen mukaan muutettava, korvattava tai peruutettava nykyiset luvat. Edellä esitetystä määräajasta poiketen olisi säädettävä pidemmästä määräajasta kutakin kasvinsuojeluainetta ja kutakin aiottua käyttötarkoitusta koskevan täydellisen, liitteen III mukaisen asiakirja-aineiston jättämistä ja arviointia varten direktiivissä 91/414/ETY säädettyjen yhtenäisten periaatteiden mukaisesti. |
| --- | --- |

(7)

Ilman, että tehoaineen sisällyttämisellä liitteeseen I rajoitettaisiin direktiivin 91/414/ETY velvoitteiden soveltamista, jäsenvaltioilla olisi sisällyttämisen jälkeen oltava kuusi kuukautta aikaa tarkistaa nykyiset klopyralidia, syprodiniilia, fosetyylia ja trineksapakkia sisältävien kasvinsuojeluaineiden luvat sen varmistamiseksi, että direktiivissä 91/414/ETY ja erityisesti sen 13 artiklassa säädetyt vaatimukset ja liitteessä I vahvistetut ehdot täyttyvät. Jäsenvaltioiden olisi direktiivin 91/414/ETY säännösten mukaisesti tapauksen mukaan muutettava, korvattava tai peruutettava nykyiset luvat. Edellä esitetystä määräajasta poiketen olisi säädettävä pidemmästä määräajasta kutakin kasvinsuojeluainetta ja kutakin aiottua käyttötarkoitusta koskevan täydellisen, liitteen III mukaisen asiakirja-aineiston jättämistä ja arviointia varten direktiivissä 91/414/ETY säädettyjen yhtenäisten periaatteiden mukaisesti.

| (8) | Komission asetuksen (ETY) N:o 3600/92 (5) puitteissa arvioitujen tehoaineiden sisällyttämisestä direktiivin 91/414/ETY liitteeseen I saatu aiempi kokemus on osoittanut, että voimassa olevien lupien haltijoiden velvollisuuksien tulkinnassa saattaa syntyä vaikeuksia tietojen saatavuuden osalta. Lisävaikeuksien ehkäisemiseksi näyttää tämän vuoksi olevan tarpeen selkeyttää jäsenvaltioiden velvollisuuksia ja erityisesti velvollisuutta tarkistaa, että luvanhaltija osoittaa kyseisen direktiivin liitteen II vaatimukset täyttävän asiakirja-aineiston saatavuuden. Tällä selvennyksellä ei kuitenkaan aiheuteta jäsenvaltioille tai luvanhaltijoille uusia velvoitteita verrattuna direktiiveihin, joita on tähän mennessä annettu liitteen I muuttamiseksi. |
| --- | --- |

(8)

Komission asetuksen (ETY) N:o 3600/92 (5) puitteissa arvioitujen tehoaineiden sisällyttämisestä direktiivin 91/414/ETY liitteeseen I saatu aiempi kokemus on osoittanut, että voimassa olevien lupien haltijoiden velvollisuuksien tulkinnassa saattaa syntyä vaikeuksia tietojen saatavuuden osalta. Lisävaikeuksien ehkäisemiseksi näyttää tämän vuoksi olevan tarpeen selkeyttää jäsenvaltioiden velvollisuuksia ja erityisesti velvollisuutta tarkistaa, että luvanhaltija osoittaa kyseisen direktiivin liitteen II vaatimukset täyttävän asiakirja-aineiston saatavuuden. Tällä selvennyksellä ei kuitenkaan aiheuteta jäsenvaltioille tai luvanhaltijoille uusia velvoitteita verrattuna direktiiveihin, joita on tähän mennessä annettu liitteen I muuttamiseksi.

| (9) | Sen vuoksi direktiivi 91/414/ETY olisi muutettava vastaavasti. |
| --- | --- |

(9)

Sen vuoksi direktiivi 91/414/ETY olisi muutettava vastaavasti.

| (10) | Tässä päätöksessä säädetyt toimenpiteet ovat elintarvikeketjua ja eläinten terveyttä käsittelevän pysyvän komitean lausunnon mukaiset, |
| --- | --- |

(10)

Tässä päätöksessä säädetyt toimenpiteet ovat elintarvikeketjua ja eläinten terveyttä käsittelevän pysyvän komitean lausunnon mukaiset,

ON ANTANUT TÄMÄN DIREKTIIVIN:

1 artikla

Muutetaan direktiivin 91/414/ETY liite I tämän direktiivin liitteen mukaisesti.

2 artikla

Jäsenvaltioiden on saatettava tämän direktiivin noudattamisen edellyttämät lait, asetukset ja hallinnolliset määräykset voimaan ja julkaistava ne viimeistään 31 päivänä lokakuuta 2007. Niiden on toimitettava kirjallisina komissiolle nämä säännökset sekä kyseisiä säännöksiä ja tätä direktiiviä koskeva vastaavuustaulukko viipymättä.

Niiden on sovellettava näitä säännöksiä 1 päivästä marraskuuta 2007.

Näissä jäsenvaltioiden antamissa säännöksissä on viitattava tähän direktiiviin tai niihin on liitettävä tällainen viittaus, kun ne virallisesti julkaistaan. Jäsenvaltioiden on säädettävä siitä, miten viittaukset tehdään.

3 artikla

1.   Jäsenvaltioiden on direktiivin 91/414/ETY mukaisesti tarvittaessa muutettava tai peruutettava klopyralidia, syprodiniilia, fosetyylia ja trineksapakkia tehoaineenaan sisältäviä kasvinsuojeluaineita koskevat voimassa olevat luvat 31 päivään lokakuuta 2007 mennessä.

Jäsenvaltioiden on tähän päivämäärään mennessä erityisesti tarkistettava, että klopyralidia, syprodiniilia, fosetyylia ja trineksapakkia koskevat mainitun direktiivin liitteen I edellytykset täyttyvät, kyseistä tehoainetta koskevan tekstin B osassa mainittuja edellytyksiä lukuun ottamatta, ja että luvanhaltijalla tai luvanhaltijan saatavilla on mainitun direktiivin liitteen II vaatimukset täyttävä asiakirja-aineisto mainitun direktiivin 13 artiklan vaatimusten mukaisesti.

2.   Poiketen siitä, mitä 1 kohdassa säädetään, jäsenvaltioiden on arvioitava tuote uudelleen direktiivin 91/414/ETY liitteessä VI säädettyjen yhtenäisten periaatteiden mukaisesti mainitun direktiivin liitteessä III vahvistetut vaatimukset täyttävän asiakirja-aineiston perusteella kaikkien sellaisten sallittujen kasvinsuojeluaineiden osalta, jotka sisältävät klopyralidia, syprodiniilia, fosetyylia tai trineksapakkia joko ainoana tehoaineenaan tai yhtenä monista tehoaineistaan, jotka kaikki on 30 päivään huhtikuuta 2007 mennessä sisällytetty direktiivin 91/414/ETY liitteeseen I, ja ottaen huomioon klopyralidia, syprodiniilia, fosetyylia ja trineksapakkia koskevien, mainitun direktiivin liitteessä I olevien tekstien B osa. Jäsenvaltioiden on kyseisen arvioinnin perusteella määriteltävä, täyttääkö tuote direktiivin 91/414/ETY 4 artiklan 1 kohdan b, c, d ja e alakohdassa vahvistetut edellytykset.

Määrittämisen jälkeen jäsenvaltioiden on

| a) | klopyralidia, syprodiniilia, fosetyylia tai trineksapakkia ainoana tehoaineenaan sisältävien tuotteiden osalta tarvittaessa muutettava tai peruutettava lupa viimeistään 30 päivänä huhtikuuta 2011;
  tai |
| --- | --- |

a)

klopyralidia, syprodiniilia, fosetyylia tai trineksapakkia ainoana tehoaineenaan sisältävien tuotteiden osalta tarvittaessa muutettava tai peruutettava lupa viimeistään 30 päivänä huhtikuuta 2011;

tai

| b) | klopyralidia, syprodiniilia, fosetyylia tai trineksapakkia yhtenä monista tehoaineistaan sisältävien tuotteiden osalta tarvittaessa muutettava tai peruutettava lupa viimeistään 30 päivänä huhtikuuta 2011 taikka siinä direktiivissä tai niissä direktiiveissä, joilla kyseinen aine tai aineet lisätään direktiivin 91/414/ETY liitteeseen I, tällaista muuttamista tai peruuttamista varten vahvistettuna ajankohtana sen mukaan, kumpi ajankohta on myöhäisempi. |
| --- | --- |

b)

klopyralidia, syprodiniilia, fosetyylia tai trineksapakkia yhtenä monista tehoaineistaan sisältävien tuotteiden osalta tarvittaessa muutettava tai peruutettava lupa viimeistään 30 päivänä huhtikuuta 2011 taikka siinä direktiivissä tai niissä direktiiveissä, joilla kyseinen aine tai aineet lisätään direktiivin 91/414/ETY liitteeseen I, tällaista muuttamista tai peruuttamista varten vahvistettuna ajankohtana sen mukaan, kumpi ajankohta on myöhäisempi.

4 artikla

Tämä direktiivi tulee voimaan 1 päivänä toukokuuta 2007.

5 artikla

Tämä direktiivi on osoitettu kaikille jäsenvaltioille.

Tehty Brysselissä 18 päivänä heinäkuuta 2006.

Komission puolesta

Markos KYPRIANOU

Komission jäsen

---

(1)  EYVL L 230, 19.8.1991, s. 1. Direktiivi sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna komission direktiivillä 2006/45/EY (EUVL L 130, 18.5.2006, s. 27).

1

(2)  EYVL L 55, 29.2.2000, s. 25. Asetus sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna asetuksella (EY) N:o 1044/2003 (EUVL L 151, 19.6.2003, s. 32).

2

(3)  EYVL L 98, 7.4.2001, s. 6.

3

(4)  EFSA Scientific Report (2005) 50, 1–65, Conclusion regarding the Peer review of the pesticide risk assessment of the active substance clopyralid (lopullinen versio: 14.12.2005).

4

EFSA Scientific Report (2005) 51, 1–78, Conclusion regarding the Peer review of the pesticide risk assessment of the active substance cyprodinil (lopullinen versio: 14.12.2005).

EFSA Scientific Report (2005) 54, 1–79, Conclusion regarding the Peer review of the pesticide risk assessment of the active substance fosethyl (lopullinen versio: 14.12.2005).

EFSA Scientific Report (2005) 57, 1–70, Conclusion regarding the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance trinexapac (lopullinen versio: 14.12.2005).

(5)  EYVL L 366, 15.12.1992, s. 10. Asetus sellaisena kuin se on viimeksi muutettuna asetuksella (EY) N:o 2266/2000 (EYVL L 259, 13.10.2000, s. 27).

5

---

LIITE

Lisätään direktiivin 91/414/ETY liitteessä I olevan taulukon loppuun seuraavat tiedot:

| Nro | Yleisnimi, tunnistenumerot | IUPAC-nimi | Puhtaus (1) | Voimaantulo | Sisällyttämisen päättymispäivä | Erityisiä säännöksiä |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| ”131 | Klopyralidi
  CAS-numero: 1702-17-6
  CIPAC-numero: 455 | 3,6-diklooripyridiini-2-karboksyylihappo | ≥ 950 g/kg | 1.5.2007 | 30.4.2017 | A OSA
  Lupa voidaan myöntää ainoastaan käyttöön rikkakasvien torjunta-aineena.
  OSA B
  Arvioidessaan hakemuksia, jotka koskevat klopyralidia sisältävien kasvinsuojeluaineiden käytön sallimista muihin käyttötarkoituksiin kuin keväällä tapahtuvaan käsittelyyn, jäsenvaltioiden on kiinnitettävä erityistä huomiota 4 artiklan 1 kohdan b alakohdan perusteisiin ja varmistettava, että tarvittavat tiedot toimitetaan ennen luvan myöntämistä.
  Liitteessä VI vahvistettujen yhtenäisten periaatteiden täytäntöönpanemiseksi on otettava huomioon elintarvikeketjua ja eläinten terveyttä käsittelevässä pysyvässä komiteassa 4 päivänä huhtikuuta 2006 valmiiksi saadun klopyralidia koskevan tarkastelukertomuksen päätelmät ja erityisesti sen lisäykset I ja II.
  Kokonaisarvioinnissa jäsenvaltioiden on kiinnitettävä erityistä huomiota






  — | muiden kuin kohdekasvien ja pohjaveden suojeluun herkillä alueilla. Tarvittaessa lupaedellytyksiin on sisällyttävä riskinhallintatoimenpiteitä ja pohjavesien mahdollisen saastumisen varmentamiseksi on käynnistettävä seurantaohjelmia pilaantumiselle alttiilla alueilla. |

Nro

Yleisnimi, tunnistenumerot

IUPAC-nimi

Puhtaus (1)

Voimaantulo

Sisällyttämisen päättymispäivä

Erityisiä säännöksiä

”131

Klopyralidi

CAS-numero: 1702-17-6

CIPAC-numero: 455

3,6-diklooripyridiini-2-karboksyylihappo

≥ 950 g/kg

1.5.2007

30.4.2017

A OSA

Lupa voidaan myöntää ainoastaan käyttöön rikkakasvien torjunta-aineena.

OSA B

Arvioidessaan hakemuksia, jotka koskevat klopyralidia sisältävien kasvinsuojeluaineiden käytön sallimista muihin käyttötarkoituksiin kuin keväällä tapahtuvaan käsittelyyn, jäsenvaltioiden on kiinnitettävä erityistä huomiota 4 artiklan 1 kohdan b alakohdan perusteisiin ja varmistettava, että tarvittavat tiedot toimitetaan ennen luvan myöntämistä.

Liitteessä VI vahvistettujen yhtenäisten periaatteiden täytäntöönpanemiseksi on otettava huomioon elintarvikeketjua ja eläinten terveyttä käsittelevässä pysyvässä komiteassa 4 päivänä huhtikuuta 2006 valmiiksi saadun klopyralidia koskevan tarkastelukertomuksen päätelmät ja erityisesti sen lisäykset I ja II.

Kokonaisarvioinnissa jäsenvaltioiden on kiinnitettävä erityistä huomiota

—

muiden kuin kohdekasvien ja pohjaveden suojeluun herkillä alueilla. Tarvittaessa lupaedellytyksiin on sisällyttävä riskinhallintatoimenpiteitä ja pohjavesien mahdollisen saastumisen varmentamiseksi on käynnistettävä seurantaohjelmia pilaantumiselle alttiilla alueilla.

Asianomaisten jäsenvaltioiden on pyydettävä toimittamaan lisätutkimuksia, jotka vahvistavat eläinten metabolismia koskevat tulokset. Niiden on varmistettava, että ilmoittajat, joiden pyynnöstä klopyralidi on sisällytetty tähän liitteeseen, toimittavat tällaiset tutkimukset komissiolle kahden vuoden kuluessa tämän direktiivin voimaantulosta.

132

Syprodiniili

CAS-numero: 121522-61-2

CIPAC-numero: 511

(4-syklopropyyli-6-metyyli-pyrimidiini-2-yyli)-fenyyliamiini

≥ 980 g/kg

1.5.2007

30.4.2017

A OSA

Lupa voidaan myöntää ainoastaan sienitautien torjunta-aineena käyttöä varten.

OSA B

Liitteessä VI vahvistettujen yhtenäisten periaatteiden täytäntöönpanemiseksi on otettava huomioon elintarvikeketjua ja eläinten terveyttä käsittelevässä pysyvässä komiteassa 4 päivänä huhtikuuta 2006 valmiiksi saadun syprodiniilia koskevan tarkastelukertomuksen päätelmät ja erityisesti sen lisäykset I ja II.

Tässä yleisarvioinnissa jäsenvaltioiden on

| — | kiinnitettävä erityistä huomiota käyttäjien turvallisuuteen ja varmistettava, että käyttöohjeissa määrätään asianmukaisten henkilönsuojainten käyttämisestä, |
| --- | --- |

—

kiinnitettävä erityistä huomiota käyttäjien turvallisuuteen ja varmistettava, että käyttöohjeissa määrätään asianmukaisten henkilönsuojainten käyttämisestä,

| — | kiinnitettävä erityistä huomiota lintujen, nisäkkäiden ja vesieliöiden suojeluun. Lupaedellytyksiin on tarvittaessa sisällyttävä riskinhallintatoimenpiteitä, kuten puskurivyöhykkeitä. |
| --- | --- |

—

kiinnitettävä erityistä huomiota lintujen, nisäkkäiden ja vesieliöiden suojeluun. Lupaedellytyksiin on tarvittaessa sisällyttävä riskinhallintatoimenpiteitä, kuten puskurivyöhykkeitä.

Asianomaisten jäsenvaltioiden on pyydettävä toimittamaan uusia tutkimuksia, jotka vahvistavat riskinarvioinnin lintujen ja nisäkkäiden osalta ja metaboliitti CGA 304075:n jäämien mahdollisen esiintymisen osalta eläinperäisissä elintarvikkeissa. Niiden on varmistettava, että ilmoittajat, joiden pyynnöstä syprodiniili on sisällytetty tähän liitteeseen, toimittavat tällaiset tutkimukset komissiolle kahden vuoden kuluessa tämän direktiivin voimaantulosta.

133

Fosetyyli

CAS-numero: 15845-66-6

CIPAC-numero: 384

Etyylivetyfosfonaatti

≥ 960 g/kg (ilmoitettuna fosetyyli-Al:na)

1.5.2007

30.4.2017

A OSA

Lupa voidaan myöntää ainoastaan sienitautien torjunta-aineena käyttöä varten.

OSA B

Liitteessä VI vahvistettujen yhtenäisten periaatteiden täytäntöönpanemiseksi on otettava huomioon elintarvikeketjua ja eläinten terveyttä käsittelevässä pysyvässä komiteassa 4 päivänä huhtikuuta 2006 valmiiksi saadun fosetyylia koskevan tarkastelukertomuksen päätelmät ja erityisesti sen lisäykset I ja II.

Tässä yleisarvioinnissa jäsenvaltioiden on

| — | kiinnitettävä erityistä huomioita lintujen, nisäkkäiden, vesieliöiden ja muiden kuin kohdelajina olevien niveljalkaisten suojeluun. |
| --- | --- |

—

kiinnitettävä erityistä huomioita lintujen, nisäkkäiden, vesieliöiden ja muiden kuin kohdelajina olevien niveljalkaisten suojeluun.

Lupaedellytyksiin on tarvittaessa sisällyttävä riskinhallintatoimenpiteitä, kuten puskurivyöhykkeitä.

Asianomaisten jäsenvaltioiden on pyydettävä toimittamaan uusia tutkimuksia, jotka vahvistavat riskinarvioinnin muiden kuin kohdelajina olevien niveljalkaisten osalta, erityisesti käsiteltyjen alueiden palautumisen suhteen, ja kasvissyöjänisäkkäiden osalta. Niiden on varmistettava, että ilmoittaja, jonka pyynnöstä fosetyyli on sisällytetty tähän liitteeseen, toimittaa tällaiset tutkimukset komissiolle kahden vuoden kuluessa tämän direktiivin voimaantulosta.

134

Trineksapakki

CAS-numero: 104273-73-6

CIPAC-numero: 732

4-(syklopropyyli-hydroksimetyleeni)-3,5-diokso-sykloheksaanikarboksyylihappo

≥ 940 g/kg (ilmoitettuna trineksapakkietyylinä)

1.5.2007

30.4.2017

A OSA

Lupa voidaan myöntää ainoastaan kasvien kasvunsäätelyaineena käyttöä varten.

OSA B

Liitteessä VI vahvistettujen yhtenäisten periaatteiden täytäntöönpanemiseksi on otettava huomioon elintarvikeketjua ja eläinten terveyttä käsittelevässä pysyvässä komiteassa 4 päivänä huhtikuuta 2006 valmiiksi saadun trineksapakkia koskevan tarkastelukertomuksen päätelmät ja erityisesti sen lisäykset I ja II.

Tässä yleisarvioinnissa jäsenvaltioiden on

| — | kiinnitettävä erityistä huomiota lintujen ja nisäkkäiden suojeluun. |
| --- | --- |

—

kiinnitettävä erityistä huomiota lintujen ja nisäkkäiden suojeluun.

Lupaedellytyksiin on tarvittaessa sisällyttävä riskinhallintatoimenpiteitä.

---

(1)  Lisätietoja tehoaineen tunnistuksesta ja määritelmästä annetaan sitä koskevassa tarkastelukertomuksessa.”

1

---