# Europeiska unionens L 206/2006

| | ISSN 1725-2628 |
| --- | --- |
| Europeiska unionens
  officiella tidning | L 206 |
| | |
| Svensk utgåva | Lagstiftning | 49 årgången27 juli 2006 |

ISSN 1725-2628

Europeiska unionens

officiella tidning

L 206

Svensk utgåva

Lagstiftning

49 årgången27 juli 2006

---

| Innehållsförteckning | | I   Rättsakter vilkas publicering är obligatorisk | Sida |
| --- | --- | --- | --- |
| | * | Kommissionens direktiv 2006/60/EG av den 7 juli 2006 om ändring av bilagorna till rådets direktiv 90/642/EEG när det gäller gränsvärden av trifloxystrobin, tiabendazol, abamectin, benomyl, karbendazim, tiofanatmetyl, myklobutanil, glyfosat, trimetylsulfonium, fenpropimorf och klormekvat (
  1
  ) | 1 |
| | * | Kommissionens direktiv 2006/61/EG av den 7 juli 2006 om ändring av bilagorna till rådets direktiv 86/362/EEG, 86/363/EEG och 90/642/EEG när det gäller gränsvärden för resthalter av atrazin, azinfosetyl, cyflutrin, etefon, fention, metamidofos, metomyl, parakvat och triazofos (
  1
  ) | 12 |
| | * | Kommissionens direktiv 2006/62/EG av den 12 juli 2006 om ändring av bilagorna till rådets direktiv 76/895/EEG, 86/362/EEG, 86/363/EEG och 90/642/EEG beträffande gränsvärden för resthalter av desmedifam, fenmedifam och klorfenvinfos (
  1
  ) | 27 |
| | * | Kommissionens direktiv 2006/63/EG av den 14 juli 2006 om ändring av bilagorna II–VII till rådets direktiv 98/57/EG om bekämpning av Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi m.fl. | 36 |
| | * | Kommissionens direktiv 2006/64/EG av den 18 juli 2006 om ändring av rådets direktiv 91/414/EEG för att införa klopyralid, cyprodinil, fosetyl och trinexapak som verksamma ämnen (
  1
  ) | 107 |

Innehållsförteckning

I   Rättsakter vilkas publicering är obligatorisk

Sida

*

Kommissionens direktiv 2006/60/EG av den 7 juli 2006 om ändring av bilagorna till rådets direktiv 90/642/EEG när det gäller gränsvärden av trifloxystrobin, tiabendazol, abamectin, benomyl, karbendazim, tiofanatmetyl, myklobutanil, glyfosat, trimetylsulfonium, fenpropimorf och klormekvat (
  1
  )

1

1

*

Kommissionens direktiv 2006/61/EG av den 7 juli 2006 om ändring av bilagorna till rådets direktiv 86/362/EEG, 86/363/EEG och 90/642/EEG när det gäller gränsvärden för resthalter av atrazin, azinfosetyl, cyflutrin, etefon, fention, metamidofos, metomyl, parakvat och triazofos (
  1
  )

1

12

*

Kommissionens direktiv 2006/62/EG av den 12 juli 2006 om ändring av bilagorna till rådets direktiv 76/895/EEG, 86/362/EEG, 86/363/EEG och 90/642/EEG beträffande gränsvärden för resthalter av desmedifam, fenmedifam och klorfenvinfos (
  1
  )

1

27

*

Kommissionens direktiv 2006/63/EG av den 14 juli 2006 om ändring av bilagorna II–VII till rådets direktiv 98/57/EG om bekämpning av Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi m.fl.

Ralstonia solanacearum

36

*

Kommissionens direktiv 2006/64/EG av den 18 juli 2006 om ändring av rådets direktiv 91/414/EEG för att införa klopyralid, cyprodinil, fosetyl och trinexapak som verksamma ämnen (
  1
  )

1

107

| | |
| --- | --- |
| | (1)   Text av betydelse för EES. |

---

(1)   Text av betydelse för EES.

1

| SV | De rättsakter vilkas titlar är tryckta med fin stil är sådana rättsakter som har avseende på den löpande handläggningen av jordbrukspolitiska frågor. De har normalt en begränsad giltighetstid.
  Beträffande alla övriga rättsakter gäller att titlarna är tryckta med fetstil och föregås av en asterisk. |
| --- | --- |

SV

De rättsakter vilkas titlar är tryckta med fin stil är sådana rättsakter som har avseende på den löpande handläggningen av jordbrukspolitiska frågor. De har normalt en begränsad giltighetstid.

Beträffande alla övriga rättsakter gäller att titlarna är tryckta med fetstil och föregås av en asterisk.

---

I Rättsakter vilkas publicering är obligatorisk

| 27.7.2006 | SV | Europeiska unionens officiella tidning | L 206/1 |
| --- | --- | --- | --- |

27.7.2006

SV

Europeiska unionens officiella tidning

L 206/1

---

KOMMISSIONENS DIREKTIV 2006/60/EG

av den 7 juli 2006

om ändring av bilagorna till rådets direktiv 90/642/EEG när det gäller gränsvärden av trifloxystrobin, tiabendazol, abamectin, benomyl, karbendazim, tiofanatmetyl, myklobutanil, glyfosat, trimetylsulfonium, fenpropimorf och klormekvat

(Text av betydelse för EES)

EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT DETTA DIREKTIV

med beaktande av fördraget om upprättandet av Europeiska gemenskapen,

med beaktande av rådets direktiv 90/642/EEG av den 27 november 1990 om fastställande av gränsvärden för bekämpningsmedelsrester i och på produkter av vegetabiliskt ursprung inklusive frukt och grönsaker (1), särskilt artikel 7,

med beaktande av rådets direktiv 91/414/EEG av den 15 juli 1991 om utsläppande av växtskyddsmedel på marknaden (2), särskilt artikel 4.1 f, och

av följande skäl:

| (1) | I enlighet med direktiv 91/414/EEG är godkännande av växtskyddsmedel för användning på speciella grödor medlemsstaternas ansvar. Sådana godkännanden måste grunda sig på en utvärdering av effekterna på människors och djurs hälsa och på miljön. De faktorer som skall tas med i bedömningen är bland annat vilken exponering som användaren och övriga vid användningen närvarande personer utsätts för samt påverkan på mark, vatten och luft, liksom den påverkan som människor och djur utsätts för vid konsumtion av behandlade grödor som innehåller resthalter av ämnena i fråga. |
| --- | --- |

(1)

I enlighet med direktiv 91/414/EEG är godkännande av växtskyddsmedel för användning på speciella grödor medlemsstaternas ansvar. Sådana godkännanden måste grunda sig på en utvärdering av effekterna på människors och djurs hälsa och på miljön. De faktorer som skall tas med i bedömningen är bland annat vilken exponering som användaren och övriga vid användningen närvarande personer utsätts för samt påverkan på mark, vatten och luft, liksom den påverkan som människor och djur utsätts för vid konsumtion av behandlade grödor som innehåller resthalter av ämnena i fråga.

| (2) | Gränsvärdena för resthalter avspeglar de minsta mängder bekämpningsmedel som krävs för effektivt växtskydd, när medlet används på ett sådant sätt att resthalterna blir så låga som är praktiskt möjligt och godtagbart ur toxikologisk synpunkt, särskilt vad gäller det uppskattade intaget via födan. |
| --- | --- |

(2)

Gränsvärdena för resthalter avspeglar de minsta mängder bekämpningsmedel som krävs för effektivt växtskydd, när medlet används på ett sådant sätt att resthalterna blir så låga som är praktiskt möjligt och godtagbart ur toxikologisk synpunkt, särskilt vad gäller det uppskattade intaget via födan.

| (3) | De gränsvärden för bekämpningsmedelsrester som omfattas av direktiv 90/642/EEG skall ses över regelbundet och kan ändras med hänsyn till nya eller ändrade användningsområden. Kommissionen har fått uppgifter om nya eller ändrade användningsområden som leder till ändrade resthalter av trifloxystrobin, tiabendazol, abamectin, benomylgruppen (benomyl, karbendazim och tiofanatmetyl), myklobutanil, glyfosat, trimetylsulfonium och fenpropimorf. |
| --- | --- |

(3)

De gränsvärden för bekämpningsmedelsrester som omfattas av direktiv 90/642/EEG skall ses över regelbundet och kan ändras med hänsyn till nya eller ändrade användningsområden. Kommissionen har fått uppgifter om nya eller ändrade användningsområden som leder till ändrade resthalter av trifloxystrobin, tiabendazol, abamectin, benomylgruppen (benomyl, karbendazim och tiofanatmetyl), myklobutanil, glyfosat, trimetylsulfonium och fenpropimorf.

| (4) | Kommissionen har fått uppgifter om klormekvat som motiverar att ett tillfälligt gränsvärde för resthalter på päron antas för tre år. |
| --- | --- |

(4)

Kommissionen har fått uppgifter om klormekvat som motiverar att ett tillfälligt gränsvärde för resthalter på päron antas för tre år.

| (5) | Konsumenternas livstidsexponering för dessa bekämpningsmedel genom de livsmedelsprodukter som kan innehålla rester av bekämpningsmedlen har bedömts och utvärderats enlighet med gemenskapens förfaranden och praxis, med beaktande av Världshälsoorganisationens riktlinjer (3). Vid denna utvärdering beaktades även det faktum att abamectin och tiabendazol används som veterinärmedicinska läkemedel för livsmedelsproducerande djur och att gränsvärden för resthalter av dessa två ämnen har fastställts i enlighet med bestämmelserna i rådets förordning (EEG) nr 2377/90 (4). Utifrån dessa bedömningar och utvärderingar bör gränsvärdena för resthalter av dessa bekämpningsmedel fastställas så att det säkerställs att det acceptabla dagliga intaget inte överskrids. |
| --- | --- |

(5)

Konsumenternas livstidsexponering för dessa bekämpningsmedel genom de livsmedelsprodukter som kan innehålla rester av bekämpningsmedlen har bedömts och utvärderats enlighet med gemenskapens förfaranden och praxis, med beaktande av Världshälsoorganisationens riktlinjer (3). Vid denna utvärdering beaktades även det faktum att abamectin och tiabendazol används som veterinärmedicinska läkemedel för livsmedelsproducerande djur och att gränsvärden för resthalter av dessa två ämnen har fastställts i enlighet med bestämmelserna i rådets förordning (EEG) nr 2377/90 (4). Utifrån dessa bedömningar och utvärderingar bör gränsvärdena för resthalter av dessa bekämpningsmedel fastställas så att det säkerställs att det acceptabla dagliga intaget inte överskrids.

| (6) | I fråga om benomyl, karbendazim, tiofanatmetyl, fenpropimorf och klormekvat, för vilka det finns en akut referensdos (ARfD), har konsumenternas akuta exponering för dessa bekämpningsmedel genom vart och ett av de livsmedelsprodukter som kan innehålla resthalter av bekämpningsmedlen bedömts och utvärderats i enlighet med gemenskapens förfaranden och praxis, med beaktande av Världshälsoorganisationens riktlinjer. Yttrandena från vetenskapliga kommittén för växter har beaktats, särskilt dess råd och rekommendationer om konsumentskyddet avseende livsmedelsprodukter som behandlats med bekämpningsmedel (5). Utifrån beräkningarna av intaget via födan bör gränsvärdena för resthalter av dessa bekämpningsmedel fastställas så att det säkerställs att den akuta referensdosen inte överskrids. I fråga om de andra ämnena har bedömningen av tillgängliga uppgifter visat att det inte behövs någon akut referensdos och därmed inte heller någon korttidsberäkning. |
| --- | --- |

(6)

I fråga om benomyl, karbendazim, tiofanatmetyl, fenpropimorf och klormekvat, för vilka det finns en akut referensdos (ARfD), har konsumenternas akuta exponering för dessa bekämpningsmedel genom vart och ett av de livsmedelsprodukter som kan innehålla resthalter av bekämpningsmedlen bedömts och utvärderats i enlighet med gemenskapens förfaranden och praxis, med beaktande av Världshälsoorganisationens riktlinjer. Yttrandena från vetenskapliga kommittén för växter har beaktats, särskilt dess råd och rekommendationer om konsumentskyddet avseende livsmedelsprodukter som behandlats med bekämpningsmedel (5). Utifrån beräkningarna av intaget via födan bör gränsvärdena för resthalter av dessa bekämpningsmedel fastställas så att det säkerställs att den akuta referensdosen inte överskrids. I fråga om de andra ämnena har bedömningen av tillgängliga uppgifter visat att det inte behövs någon akut referensdos och därmed inte heller någon korttidsberäkning.

| (7) | Gränsvärdena bör fastställas till den lägsta analytiska bestämningsgränsen i de fall där godkänd användning av växtskyddsmedel inte ger upphov till påvisbara halter av bekämpningsmedelsrester i eller på livsmedel, eller då det inte finns några godkända användningsområden, eller då medlemsstaternas beslut om godkännande för vissa användningsområden inte underbyggts med nödvändiga uppgifter, eller då användningsområden i tredjeländer som ger upphov till bekämpningsmedelsrester i eller på sådana livsmedel som får övergå till fri omsättning på gemenskapens marknad, inte har underbyggts med nödvändiga uppgifter. |
| --- | --- |

(7)

Gränsvärdena bör fastställas till den lägsta analytiska bestämningsgränsen i de fall där godkänd användning av växtskyddsmedel inte ger upphov till påvisbara halter av bekämpningsmedelsrester i eller på livsmedel, eller då det inte finns några godkända användningsområden, eller då medlemsstaternas beslut om godkännande för vissa användningsområden inte underbyggts med nödvändiga uppgifter, eller då användningsområden i tredjeländer som ger upphov till bekämpningsmedelsrester i eller på sådana livsmedel som får övergå till fri omsättning på gemenskapens marknad, inte har underbyggts med nödvändiga uppgifter.

| (8) | Nya gränsvärden för resthalter av dessa bekämpningsmedel bör därför fastställas. |
| --- | --- |

(8)

Nya gränsvärden för resthalter av dessa bekämpningsmedel bör därför fastställas.

| (9) | Att provisoriska gränsvärden fastställs eller ändras på gemenskapsnivå hindrar inte medlemsstaterna från att fastställa provisoriska gränsvärden för glyfosat, trimetylsulfonium och trifloxystrobin i enlighet med artikel 4.1 f i direktiv 91/414/EEG och bilaga VI till det direktivet. Fyra år anses vara en tillräckligt lång period för att godkänna ytterligare användningsområden för dessa ämnen. Gemenskapens provisoriska gränsvärden bör därefter bli permanenta. |
| --- | --- |

(9)

Att provisoriska gränsvärden fastställs eller ändras på gemenskapsnivå hindrar inte medlemsstaterna från att fastställa provisoriska gränsvärden för glyfosat, trimetylsulfonium och trifloxystrobin i enlighet med artikel 4.1 f i direktiv 91/414/EEG och bilaga VI till det direktivet. Fyra år anses vara en tillräckligt lång period för att godkänna ytterligare användningsområden för dessa ämnen. Gemenskapens provisoriska gränsvärden bör därefter bli permanenta.

| (10) | Lupiner konsumeras som livsmedel i flera medlemsstater. Användningen av glyfosat på lupiner har godkänts. Det är därför nödvändigt att ta med lupiner i förteckningen och fastställa gränsvärden för att skydda konsumenterna från stora mängder bekämpningsmedelsrester på lupiner. |
| --- | --- |

(10)

Lupiner konsumeras som livsmedel i flera medlemsstater. Användningen av glyfosat på lupiner har godkänts. Det är därför nödvändigt att ta med lupiner i förteckningen och fastställa gränsvärden för att skydda konsumenterna från stora mängder bekämpningsmedelsrester på lupiner.

| (11) | Direktiv 90/642/EEG bör därför ändras i enlighet med detta. |
| --- | --- |

(11)

Direktiv 90/642/EEG bör därför ändras i enlighet med detta.

| (12) | De åtgärder som föreskrivs i detta direktiv är förenliga med yttrandet från ständiga kommittén för livsmedelskedjan och djurhälsa. |
| --- | --- |

(12)

De åtgärder som föreskrivs i detta direktiv är förenliga med yttrandet från ständiga kommittén för livsmedelskedjan och djurhälsa.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE:

Artikel 1

Direktiv 90/642/EEG skall ändras på följande sätt:

| 1. | I bilaga I, i gruppen ”3. Baljväxter (torkade)” skall ”Lupiner” läggas till på så sätt att ”Hela produkten” i den sista spalten omfattar alla fyra produkterna. |
| --- | --- |

1.

I bilaga I, i gruppen ”3. Baljväxter (torkade)” skall ”Lupiner” läggas till på så sätt att ”Hela produkten” i den sista spalten omfattar alla fyra produkterna.

| 2. | Bilaga II skall ändras i enlighet med bilagan till det här direktivet. |
| --- | --- |

2.

Bilaga II skall ändras i enlighet med bilagan till det här direktivet.

Artikel 2

1.   Medlemsstaterna skall senast den 20 januari 2007 anta och offentliggöra de lagar och andra författningar som är nödvändiga för att följa detta direktiv, utom bestämmelserna för benomylgruppen och tiofanatmetyl som de skall anta och offentliggöra senast den 14 september 2006 och bestämmelserna för klormekvat som de skall anta och offentliggöra senast den 31 juli 2006. De skall genast överlämna texterna till dessa bestämmelser till kommissionen tillsammans med en jämförelsetabell för dessa bestämmelser och bestämmelserna i detta direktiv.

De skall tillämpa dessa bestämmelser från och med den 21 januari 2007, utom bestämmelserna för benomylgruppen och tiofanatmetyl som skall tillämpas senast den 15 september 2006 och bestämmelserna för klormekvat som skall tillämpas senast den 1 augusti 2006.

När en medlemsstat antar dessa bestämmelser skall de innehålla en hänvisning till detta direktiv eller åtföljas av sådan hänvisning när de offentliggörs. Närmare föreskrifter om hur hänvisningen skall göras skall varje medlemsstat själv utfärda.

2.   Medlemsstaterna skall till kommissionen överlämna texten till de centrala bestämmelser i nationell lagstiftning som de antar inom det område som omfattas av detta direktiv.

Artikel 3

Detta direktiv träder i kraft den tjugonde dagen efter det att det har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning.

Artikel 4

Detta direktiv riktar sig till medlemsstaterna.

Utfärdat i Bryssel den 7 juli 2006.

På kommissionens vägnar

Markos KYPRIANOU

Ledamot av kommissionen

---

(1)  EGT L 350, 14.12.1990, s. 71. Direktivet senast ändrat genom kommissionens direktiv 2006/53/EG (EUT L 154, 8.6.2006, s. 11).

1

(2)  EGT L 230, 19.8.1991, s. 1. Direktivet senast ändrat genom kommissionens direktiv 2006/45/EG (EUT L 130, 18.5.2006, s. 27).

2

(3)  Riktlinjer för beräkning av intaget av bekämpningsmedelsrester (reviderad utgåva), upprättade av GEMS/Livsmedelsprogrammet i samarbete med Codex Alimentarius-kommittén för bekämpningsmedelsrester och utgivna av Världshälsoorganisationen 1997 (WHO/FSF/FOS/97.7).

3

(4)  EGT L 224, 18.8.1990, s. 1. Förordningen senast ändrad genom kommissionens förordning (EG) nr 205/2006 (EUT L 34, 7.2.2006, s. 21).

4

(5)  Yttrande om frågor som gäller ändring av bilagorna till rådets direktiv 86/362/EEG, 86/363/EEG och 90/642/EEG (SCP:s yttrande av den 14 juli 1998); yttrande om varierande resthalter av bekämpningsmedel i frukt och grönsaker (SCP:s yttrande av den 14 juli 1998) http://europa.eu.int/comm/food/fs/sc/scp/outcome_ppp_en.html.

5

---

BILAGA

Bilaga II till direktiv 90/642/EEG skall ändras på följande sätt:

| 1. | Fotnot (t) till uppgifterna om klormekvat på päron skall ersättas med följande: ”Ett tillfälligt gränsvärde på 0,2 mg/kg skall tillämpas till och med den 31 juli 2009.” |
| --- | --- |

1.

Fotnot (t) till uppgifterna om klormekvat på päron skall ersättas med följande: ”Ett tillfälligt gränsvärde på 0,2 mg/kg skall tillämpas till och med den 31 juli 2009.”

| 2. | I del A skall kolumnerna för trifloxystrobin, tiabendazol, abamectin, benomyl, karbendazim, tiofanatmetyl, myklobutanil, glyfosat, trimetylsulfonium och fenpropimorf ersättas med följande: | Bekämpningsmedelsrester och gränsvärden (mg/kg) |
| --- | --- | --- |
| Grupper av och exempel på enskilda produkter för vilka gränsvärdena gäller | Trifloxy–strobin | Tiaben-dazol | Abamectin (summan av avermectin B1a, avermectin B1b och delta-8,9 isomer av avermectin B1a) | Summan av benomyl och karbendazim, uttryckt som karbendazim | Tiofanat–metyl | Myklobutanil | Glyfosat | Trimetylsulfo–nium–katjon, till följd av användning av glyfosat | Fenpropi–morf |
| ”1. | Frukt: färsk, torkad eller okokt, konserverad genom frysning utan tillsats av socker; nötter | | | | | | | | | |
| | i) | CITRUSFRUKTER | 0,3 (2) | 5 | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 3 | | | 0,05 (1) |
| | | Grapefrukt | | | | | | | | | |
| | | Citroner | | | | | | | | | |
| | | Lime | | | | | | | | | |
| | | Mandariner (inkl. klementiner och andra hybrider) | | | | | | | 0,5 (2) | 0,5 (2) | |
| | | Apelsiner | | | | | | | 0,5 (2) | 0,5 (2) | |
| | | Pomelo | | | | | | | | | |
| | | Övriga | | | | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| | ii) | TRÄDNÖTTER (skalade eller oskalade) | 0,02 (1)
   (2) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1) | 0,2 | 0,05 (1) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Mandlar | | | | | | | | | |
| | | Paranötter | | | | | | | | | |
| | | Cashewnötter | | | | | | | | | |
| | | Kastanjer | | | | | | | | | |
| | | Kokosnötter | | | | | | | | | |
| | | Hasselnötter | | | | | | | | | |
| | | Macadamianötter | | | | | | | | | |
| | | Pekannötter | | | | | | | | | |
| | | Pinjenötter | | | | | | | | | |
| | | Pistaschmandlar | | | | | | | | | |
| | | Valnötter | | | | | | | | | |
| | | Övriga | | | | | | | | | |
| | iii) | KÄRNFRUKTER | 0,5 (2) | | 0,01 (1) | 0,2 | 0,5 | 0,5 | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Äpplen | | 5 | | | | | | | |
| | | Päron | | 5 | | | | | | | |
| | | Kvitten | | | | | | | | | |
| | | Övriga | | 0,05 (1) | | | | | | | |
| | iv) | STENFRUKTER | | 0,05 (1) | 0,01 (1) | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Aprikoser | 1 (2) | | | 0,2 | 2 | 0,3 | | | |
| | | Körsbär | 1 (2) | | | 0,5 | 0,3 | 1 | | | |
| | | Persikor (inkl. nektariner och liknande hybrider) | 1 (2) | | | 0,2 | 2 | 0,5 | | | |
| | | Plommon | 0,2 (2) | | | 0,5 | 0,3 | 0,5 | | | |
| | | Övriga | 0,02 (1)
   (2) | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | |
| | v) | BÄR OCH SMÅ FRUKTER | | 0,05 (1) | | | | | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | a) | Bordsdruvor och druvor för vinframställning | 5 (2) | | 0,01 (1) | | | 1 | 0,5 (2) | | 0,05 (1) |
| | | | Bordsdruvor | | | | 0,3 | 0,1 (1) | | | | |
| | | | Druvor för vinframställning | | | | 0,5 | 3 | | | | |
| | | b) | Jordgubbar (odlade) | 0,5 (1)
   (2) | | 0,1 | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 1 | 0,1 (1)
   (2) | | 1 |
| | | c) | Rubusfrukter (odlade) | 0,02 (1)
   (2) | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | | 1 |
| | | | Björnbär | | | 0,1 | | | 1 | | | |
| | | | Blåhallon | | | | | | | | | |
| | | | Loganbär | | | | | | | | | |
| | | | Hallon | | | 0,1 | | | 1 | | | |
| | | | Övriga | | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | d) | Andra små frukter och bär (odlade) | | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | | 1 |
| | | | Blåbär | | | | | | | | | |
| | | | Tranbär | | | | | | | | | |
| | | | Vinbär (röda, svarta och vita) | 1 (2) | | | | | 1 | | | |
| | | | Krusbär | 1 (2) | | | | | 1 | | | |
| | | | Övriga | 0,02 (1)
   (2) | | | | | 0,02 (1) | | | |
| | | e) | Vilda bär och frukter | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1)
   (2) | | 0,05 (1) |
| | vi) | DIVERSE FRUKTER | | | 0,01 (1) | | | | | | |
| | | Avokado | | 15 | | | | | | | |
| | | Bananer | 0,05 (2) | 5 | | | | 2 | | | 2 |
| | | Dadlar | | | | | | | | | |
| | | Fikon | | | | | | | | | |
| | | Kiwifrukter | | | | | | | | | |
| | | Kumquat | | | | | | | | | |
| | | Litchiplommon | | | | | | | | | |
| | | Mango | | 5 | | | | | | | |
| | | Oliver (för förtäring) | | | | | | | | | |
| | | Oliver (för oljeutvinning) | | | | | | | 1 (2) | 1 (2) | |
| | | Papaya | | 10 | | 0,2 | 1 | | | | |
| | | Passionsfrukt | | | | | | | | | |
| | | Ananas | | | | | | | | | |
| | | Granatäpplen | | | | | | | | | |
| | | Övriga | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| 2. | Grönsaker, färska eller okokta, frysta eller torkade | | | | | | | | | |
| | i) | ROT- OCH KNÖLGRÖNSAKER | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Rödbetor | | | | | | | | | |
| | | Morötter | | | | | | 0,2 | | | |
| | | Kassava | | 15 | | | | | | | |
| | | Rotselleri | | | | | | | | | |
| | | Pepparrot | | | | | | 0,2 | | | |
| | | Jordärtskockor | | | | | | | | | |
| | | Palsternackor | | | | | | 0,2 | | | |
| | | Rotpersilja | | | | | | 0,2 | | | |
| | | Rädisor | | | | | | | | | |
| | | Haverrot | | | | | | | | | |
| | | Sötpotatis | | 15 | | | | | | | |
| | | Kålrötter | | | | | | | | | |
| | | Rovor | | | | | | | | | |
| | | Jamsrot | | 15 | | | | | | | |
| | | Övriga | | 0,05 (1) | | | | 0,02 (1) | | | |
| | ii) | LÖKGRÖNSAKER | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Vitlök | | | | | | | | | |
| | | Kepalök | | | | | | | | | |
| | | Schalottenlök | | | | | | | | | |
| | | Knipplök | | | | | | | | | |
| | | Övriga | | | | | | | | | |
| | iii) | FRUKTGRÖNSAKER | | 0,05 (1) | | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | a) | Solanacea | | | | | | | | | |
| | | | Tomater | 0,5 (2) | | 0,02 | 0,5 | 2 | 0,3 | | | |
| | | | Paprikor | | | 0,05 | | | 0,5 | | | |
| | | | Auberginer | | | 0,02 | 0,5 | 2 | 0,3 | | | |
| | | | Okra | | | | 2 | 1 | | | | |
| | | | Övriga | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | |
| | | b) | Gurkväxter – ätligt skal | 0,2 (2) | | 0,02 | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,1 | | | |
| | | | Slanggurkor | | | | | | | | | |
| | | | Druvgurkor | | | | | | | | | |
| | | | Zucchini (sommarsquash) | | | | | | | | | |
| | | | Övriga | | | | | | | | | |
| | | c) | Gurkväxter – oätligt skal | | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,3 | 0,2 | | | |
| | | | Meloner | 0,3 (2) | | | | | | | | |
| | | | Squash (vintersquash) | | | | | | | | | |
| | | | Vattenmeloner | | | | | | | | | |
| | | | Övriga | 0,02 (1)
   (2) | | | | | | | | |
| | | d) | Sockermajs | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | |
| | iv) | KÅLGRÖNSAKER | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | a) | Blommande kål | | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | | | 0,05 (1) |
| | | | Broccoli (även Calabrese) | | 5 | | | | | | | |
| | | | Blomkål | | | | | | | | | |
| | | | Övriga | | 0,05 (1) | | | | | | | |
| | | b) | Huvudbildande kål | | 0,05 (1) | | | | | | | |
| | | | Brysselkål | | | | 0,5 | 1 | | | | 0,5 |
| | | | Vitkål, rödkål | | | | | | | | | |
| | | | Övriga | | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | | | 0,05 (1) |
| | | c) | Bladbildande kål | | 0,05 (1) | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | | | 0,05 (1) |
| | | | Salladskål | | | | | | | | | |
| | | | Grönkål | | | | | | | | | |
| | | | Övriga | | | | | | | | | |
| | | d) | Kålrabbi | | 0,05 (1) | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | | | 0,05 (1) |
| | v) | BLADGRÖNSAKER OCH FÄRSKA ÖRTER | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | a) | Sallat och liknande | | | 0,1 | | | | | | |
| | | | Kryddkrasse | | | | | | | | | |
| | | | Vårklynne | | | | | | 5 | | | |
| | | | Sallat | | | | | | | | | |
| | | | Escarole | | | | | | | | | |
| | | | Ruccolasallad | | | | | | | | | |
| | | | Blad och stjälkar av kål | | | | | | | | | |
| | | | Övriga | | | | | | 0,02 (1) | | | |
| | | b) | Spenat och liknande | | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | | Spenat | | | | | | | | | |
| | | | Mangold | | | | | | | | | |
| | | | Övriga | | | | | | | | | |
| | | c) | Vattenkrasse | | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | d) | Endiviasallat | | 1 | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | e) | Örter | | | 0,01 (1) | | | 0,02 (1) | | | |
| | | | Körvel | | | | | | | | | |
| | | | Gräslök | | | | | | | | | |
| | | | Persilja | | | | | | | | | |
| | | | Snittselleri | | | | | | | | | |
| | | | Övriga | | | | | | | | | |
| | vi) | BALJVÄXTER (färska) | | 0,05 (1) | 0,01 (1) | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | | Bönor (med skida) | 0,5 (2) | | | 0,2 | 0,1 (1) | 0,3 | | | |
| | | Bönor (utan skida) | | | | | | | | | |
| | | Ärter (med skida) | | | | 0,2 | 0,1 (1) | | | | |
| | | Ärter (utan skida) | | | | | | | | | |
| | | Övriga | 0,02 (1)
   (2) | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | |
| | vii) | STJÄLKGRÖNSAKER (färska) | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Sparris | | | | | | | | | |
| | | Kardon | | | | | | | | | |
| | | Bladselleri | | | | | | | | | |
| | | Fänkål | | | | | | | | | |
| | | Kronärtskockor | | | | | | 0,5 | | | |
| | | Purjolök | | | | | | | | | 1 |
| | | Rabarber | | | | | | | | | |
| | | Övriga | | | | | | 0,02 (1) | | | 0,05 (1) |
| | viii) | SVAMP | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | | 0,05 (1) |
| | | a) | Odlad svamp | | 10 | | | | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | b) | Vild svamp | | 0,05 (1) | | | | | 50 (2) | 20 (2) | |
| 3. | Baljväxter (torkade) | 0,02 (1)
   (2) | 0,05 (1) | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | Bönor | | | | | | | 2 (2) | | |
| | Linser | | | | | | | | | |
| | Ärter | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Lupiner | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Övriga | | | | | | | 0,1 (1)
   (2) | | |
| 4. | Oljeväxtfröer | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) | 0,02 (1) | | | 0,05 (1) | | | 0,05 (1) |
| | Linfrö | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Jordnötter | | | | | | | | | |
| | Vallmofrö | | | | | | | | | |
| | Sesamfrö | | | | | | | | | |
| | Solrosfrö | | | | | | | 20 (2) | | |
| | Rapsfrö | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Sojabönor | | | | 0,2 | 0,3 | | 20 (2) | 10 (2) | |
| | Senapsfrö | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Bomullsfrö | | | | | | | 10 (2) | | |
| | Hampfrö | | | | | | | | | |
| | Övriga | | | | 0,1 (1) | 0,1 (1) | | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | |
| 5. | Potatis | 0,02 (1)
   (2) | | 0,01 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,5 (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| | Färskpotatis | | 0,05 (1) | | | | | | | |
| | Övrig matpotatis | | 15 | | | | | | | |
| 6. | Te (torkade blad och stjälkar, jästa eller ojästa, av Camellia sinensis) | 0,05 (1)
   (2) | 0,1 (1) | 0,02 (1) | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 0,05 (1) | 2 (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,1 (1) |
| 7. | Humle (torkad), inkl. pellets och icke-koncentrerat pulver | 30 (2) | 0,1 (1) | 0,05 | 0,1 (1) | 0,1 (1) | 2 | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 10 |

2.

I del A skall kolumnerna för trifloxystrobin, tiabendazol, abamectin, benomyl, karbendazim, tiofanatmetyl, myklobutanil, glyfosat, trimetylsulfonium och fenpropimorf ersättas med följande:

Bekämpningsmedelsrester och gränsvärden (mg/kg)

Grupper av och exempel på enskilda produkter för vilka gränsvärdena gäller

Trifloxy–strobin

Tiaben-dazol

Abamectin (summan av avermectin B1a, avermectin B1b och delta-8,9 isomer av avermectin B1a)

Summan av benomyl och karbendazim, uttryckt som karbendazim

Tiofanat–metyl

Myklobutanil

Glyfosat

Trimetylsulfo–nium–katjon, till följd av användning av glyfosat

Fenpropi–morf

”1.

Frukt: färsk, torkad eller okokt, konserverad genom frysning utan tillsats av socker; nötter

i)

CITRUSFRUKTER

0,3 (2)

5

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

3

0,05 (1)

Grapefrukt

Citroner

Lime

Mandariner (inkl. klementiner och andra hybrider)

0,5 (2)

0,5 (2)

Apelsiner

0,5 (2)

0,5 (2)

Pomelo

Övriga

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

ii)

TRÄDNÖTTER (skalade eller oskalade)

0,02 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)

0,2

0,05 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Mandlar

Paranötter

Cashewnötter

Kastanjer

Kokosnötter

Hasselnötter

Macadamianötter

Pekannötter

Pinjenötter

Pistaschmandlar

Valnötter

Övriga

iii)

KÄRNFRUKTER

0,5 (2)

0,01 (1)

0,2

0,5

0,5

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Äpplen

5

Päron

5

Kvitten

Övriga

0,05 (1)

iv)

STENFRUKTER

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Aprikoser

1 (2)

0,2

2

0,3

Körsbär

1 (2)

0,5

0,3

1

Persikor (inkl. nektariner och liknande hybrider)

1 (2)

0,2

2

0,5

Plommon

0,2 (2)

0,5

0,3

0,5

Övriga

0,02 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

v)

BÄR OCH SMÅ FRUKTER

0,05 (1)

0,05 (1)
   (2)

a)

Bordsdruvor och druvor för vinframställning

5 (2)

0,01 (1)

1

0,5 (2)

0,05 (1)

Bordsdruvor

0,3

0,1 (1)

Druvor för vinframställning

0,5

3

b)

Jordgubbar (odlade)

0,5 (1)
   (2)

0,1

0,1 (1)

0,1 (1)

1

0,1 (1)
   (2)

1

c)

Rubusfrukter (odlade)

0,02 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

1

Björnbär

0,1

1

Blåhallon

Loganbär

Hallon

0,1

1

Övriga

0,01 (1)

0,02 (1)

d)

Andra små frukter och bär (odlade)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

1

Blåbär

Tranbär

Vinbär (röda, svarta och vita)

1 (2)

1

Krusbär

1 (2)

1

Övriga

0,02 (1)
   (2)

0,02 (1)

e)

Vilda bär och frukter

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)

vi)

DIVERSE FRUKTER

0,01 (1)

Avokado

15

Bananer

0,05 (2)

5

2

2

Dadlar

Fikon

Kiwifrukter

Kumquat

Litchiplommon

Mango

5

Oliver (för förtäring)

Oliver (för oljeutvinning)

1 (2)

1 (2)

Papaya

10

0,2

1

Passionsfrukt

Ananas

Granatäpplen

Övriga

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

2.

Grönsaker, färska eller okokta, frysta eller torkade

i)

ROT- OCH KNÖLGRÖNSAKER

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Rödbetor

Morötter

0,2

Kassava

15

Rotselleri

Pepparrot

0,2

Jordärtskockor

Palsternackor

0,2

Rotpersilja

0,2

Rädisor

Haverrot

Sötpotatis

15

Kålrötter

Rovor

Jamsrot

15

Övriga

0,05 (1)

0,02 (1)

ii)

LÖKGRÖNSAKER

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Vitlök

Kepalök

Schalottenlök

Knipplök

Övriga

iii)

FRUKTGRÖNSAKER

0,05 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

a)

Solanacea

Tomater

0,5 (2)

0,02

0,5

2

0,3

Paprikor

0,05

0,5

Auberginer

0,02

0,5

2

0,3

Okra

2

1

Övriga

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

b)

Gurkväxter – ätligt skal

0,2 (2)

0,02

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1

Slanggurkor

Druvgurkor

Zucchini (sommarsquash)

Övriga

c)

Gurkväxter – oätligt skal

0,01 (1)

0,1 (1)

0,3

0,2

Meloner

0,3 (2)

Squash (vintersquash)

Vattenmeloner

Övriga

0,02 (1)
   (2)

d)

Sockermajs

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

iv)

KÅLGRÖNSAKER

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

a)

Blommande kål

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

Broccoli (även Calabrese)

5

Blomkål

Övriga

0,05 (1)

b)

Huvudbildande kål

0,05 (1)

Brysselkål

0,5

1

0,5

Vitkål, rödkål

Övriga

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

c)

Bladbildande kål

0,05 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

Salladskål

Grönkål

Övriga

d)

Kålrabbi

0,05 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

v)

BLADGRÖNSAKER OCH FÄRSKA ÖRTER

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

a)

Sallat och liknande

0,1

Kryddkrasse

Vårklynne

5

Sallat

Escarole

Ruccolasallad

Blad och stjälkar av kål

Övriga

0,02 (1)

b)

Spenat och liknande

0,01 (1)

0,02 (1)

Spenat

Mangold

Övriga

c)

Vattenkrasse

0,01 (1)

0,02 (1)

d)

Endiviasallat

1

0,01 (1)

0,02 (1)

e)

Örter

0,01 (1)

0,02 (1)

Körvel

Gräslök

Persilja

Snittselleri

Övriga

vi)

BALJVÄXTER (färska)

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Bönor (med skida)

0,5 (2)

0,2

0,1 (1)

0,3

Bönor (utan skida)

Ärter (med skida)

0,2

0,1 (1)

Ärter (utan skida)

Övriga

0,02 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

vii)

STJÄLKGRÖNSAKER (färska)

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

Sparris

Kardon

Bladselleri

Fänkål

Kronärtskockor

0,5

Purjolök

1

Rabarber

Övriga

0,02 (1)

0,05 (1)

viii)

SVAMP

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,05 (1)

a)

Odlad svamp

10

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

b)

Vild svamp

0,05 (1)

50 (2)

20 (2)

3.

Baljväxter (torkade)

0,02 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Bönor

2 (2)

Linser

Ärter

10 (2)

Lupiner

10 (2)

Övriga

0,1 (1)
   (2)

4.

Oljeväxtfröer

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

0,02 (1)

0,05 (1)

0,05 (1)

Linfrö

10 (2)

Jordnötter

Vallmofrö

Sesamfrö

Solrosfrö

20 (2)

Rapsfrö

10 (2)

Sojabönor

0,2

0,3

20 (2)

10 (2)

Senapsfrö

10 (2)

Bomullsfrö

10 (2)

Hampfrö

Övriga

0,1 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

5.

Potatis

0,02 (1)
   (2)

0,01 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,5 (2)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)

Färskpotatis

0,05 (1)

Övrig matpotatis

15

6.

Te (torkade blad och stjälkar, jästa eller ojästa, av Camellia sinensis)

0,05 (1)
   (2)

0,1 (1)

0,02 (1)

0,1 (1)

0,1 (1)

0,05 (1)

2 (2)

0,05 (1)
   (2)

0,1 (1)

7.

Humle (torkad), inkl. pellets och icke-koncentrerat pulver

30 (2)

0,1 (1)

0,05

0,1 (1)

0,1 (1)

2

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

10

---

(1)  Lägsta analytiska bestämningsgräns.

(2)  Provisoriskt gränsvärde har fastställts i enlighet med artikel 4.1 f i direktiv 91/414/EEG.”

---

| 27.7.2006 | SV | Europeiska unionens officiella tidning | L 206/12 |
| --- | --- | --- | --- |

27.7.2006

SV

Europeiska unionens officiella tidning

L 206/12

---

KOMMISSIONENS DIREKTIV 2006/61/EG

av den 7 juli 2006

om ändring av bilagorna till rådets direktiv 86/362/EEG, 86/363/EEG och 90/642/EEG när det gäller gränsvärden för resthalter av atrazin, azinfosetyl, cyflutrin, etefon, fention, metamidofos, metomyl, parakvat och triazofos

(Text av betydelse för EES)

EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT DETTA DIREKTIV

med beaktande av fördraget om upprättandet av Europeiska gemenskapen,

med beaktande av rådets direktiv 86/362/EEG av den 24 juli 1986 om fastställande av gränsvärden för bekämpningsmedelsrester i och på spannmål (1), särskilt artikel 10,

med beaktande av rådets direktiv 86/363/EEG av den 24 juli 1986 om fastställande av gränsvärden för bekämpningsmedelsrester i och på livsmedel av animaliskt ursprung (2), särskilt artikel 10,

med beaktande av rådets direktiv 90/642/EEG av den 27 november 1990 om fastställande av gränsvärden för bekämpningsmedelsrester i och på produkter av vegetabiliskt ursprung inklusive frukt och grönsaker (3), särskilt artikel 7,

med beaktande av rådets direktiv 91/414/EEG av den 15 juli 1991 om utsläppande av växtskyddsmedel på marknaden (4), särskilt artikel 4.1 f, och

av följande skäl:

| (1) | Gränsvärdena för resthalter i spannmål och produkter av vegetabiliskt ursprung, inklusive frukt och grönsaker, avspeglar de minsta mängder bekämpningsmedel som krävs för ett effektivt växtskydd, när medlen används på ett sådant sätt att resthalterna blir så låga som det är praktiskt möjligt och godtagbart ur toxikologisk synpunkt, särskilt med hänsyn till skyddet av miljön och konsumenternas beräknade intag via födan. Gränsvärdena för resthalter i livsmedel av animaliskt ursprung avspeglar djurens intag av spannmål och produkter av vegetabiliskt ursprung som behandlats med bekämpningsmedel och eventuellt direkta konsekvenser av användningen av olika veterinärmedicinska läkemedel. Gemenskapens gränsvärden för resthalter motsvarar den övre gränsen för de resthalter som kan förväntas finnas i produkterna om producenterna har tillämpat god lantbrukspraxis. |
| --- | --- |

(1)

Gränsvärdena för resthalter i spannmål och produkter av vegetabiliskt ursprung, inklusive frukt och grönsaker, avspeglar de minsta mängder bekämpningsmedel som krävs för ett effektivt växtskydd, när medlen används på ett sådant sätt att resthalterna blir så låga som det är praktiskt möjligt och godtagbart ur toxikologisk synpunkt, särskilt med hänsyn till skyddet av miljön och konsumenternas beräknade intag via födan. Gränsvärdena för resthalter i livsmedel av animaliskt ursprung avspeglar djurens intag av spannmål och produkter av vegetabiliskt ursprung som behandlats med bekämpningsmedel och eventuellt direkta konsekvenser av användningen av olika veterinärmedicinska läkemedel. Gemenskapens gränsvärden för resthalter motsvarar den övre gränsen för de resthalter som kan förväntas finnas i produkterna om producenterna har tillämpat god lantbrukspraxis.

| (2) | Gränsvärdena för bekämpningsmedelsrester ses regelbundet över och ändras med hänsyn till ny information och nya uppgifter. Gränsvärdena fastställs till den lägsta analytiska bestämningsgränsen i de fall där godkänd användning av växtskyddsmedel inte ger upphov till påvisbara halter av bekämpningsmedelsrester i eller på livsmedel, eller då det inte finns några godkända användningsområden, eller då medlemsstaternas beslut om godkännande för vissa användningsområden inte underbyggts med nödvändiga uppgifter, eller då användningsområden i tredjeländer som ger upphov till bekämpningsmedelsrester i eller på sådana livsmedel som får övergå till fri omsättning på gemenskapens marknad, inte har underbyggts med nödvändiga uppgifter. |
| --- | --- |

(2)

Gränsvärdena för bekämpningsmedelsrester ses regelbundet över och ändras med hänsyn till ny information och nya uppgifter. Gränsvärdena fastställs till den lägsta analytiska bestämningsgränsen i de fall där godkänd användning av växtskyddsmedel inte ger upphov till påvisbara halter av bekämpningsmedelsrester i eller på livsmedel, eller då det inte finns några godkända användningsområden, eller då medlemsstaternas beslut om godkännande för vissa användningsområden inte underbyggts med nödvändiga uppgifter, eller då användningsområden i tredjeländer som ger upphov till bekämpningsmedelsrester i eller på sådana livsmedel som får övergå till fri omsättning på gemenskapens marknad, inte har underbyggts med nödvändiga uppgifter.

| (3) | Kommissionen har informerats om att de gällande gränsvärdena för resthalter av ett flertal bekämpningsmedel kan behöva ses över på grund av ny information om toxikologin och konsumenternas intag. Kommissionen har bett respektive rapporterande medlemsstater lämna in förslag till översyn av gemenskapens gränsvärden. Sådana förslag har inkommit till kommissionen. |
| --- | --- |

(3)

Kommissionen har informerats om att de gällande gränsvärdena för resthalter av ett flertal bekämpningsmedel kan behöva ses över på grund av ny information om toxikologin och konsumenternas intag. Kommissionen har bett respektive rapporterande medlemsstater lämna in förslag till översyn av gemenskapens gränsvärden. Sådana förslag har inkommit till kommissionen.

| (4) | Konsumenternas livstids- och korttidsexponering för de bekämpningsmedel som behandlas i detta direktiv genom olika livsmedelsprodukter har bedömts på nytt och utvärderats i enlighet med de rutiner och den praxis som används inom gemenskapen, med beaktande av Världshälsoorganisationens riktlinjer (5). Det är därför lämpligt att fastställa nya gränsvärden för att förhindra att konsumenterna utsätts för oacceptabel exponering. |
| --- | --- |

(4)

Konsumenternas livstids- och korttidsexponering för de bekämpningsmedel som behandlas i detta direktiv genom olika livsmedelsprodukter har bedömts på nytt och utvärderats i enlighet med de rutiner och den praxis som används inom gemenskapen, med beaktande av Världshälsoorganisationens riktlinjer (5). Det är därför lämpligt att fastställa nya gränsvärden för att förhindra att konsumenterna utsätts för oacceptabel exponering.

| (5) | I relevanta fall har konsumenternas akuta exponering för dessa bekämpningsmedel genom var och en av de livsmedelsprodukter som kan innehålla resthalter bedömts och utvärderats i enlighet med de rutiner och den praxis som används inom gemenskapen, med beaktande av Världshälsoorganisationens riktlinjer. Förekomst av resthalter av bekämpningsmedel på samma nivå som eller under de nya gränsvärdena bedöms inte förorsaka några akuta toxiska effekter. |
| --- | --- |

(5)

I relevanta fall har konsumenternas akuta exponering för dessa bekämpningsmedel genom var och en av de livsmedelsprodukter som kan innehålla resthalter bedömts och utvärderats i enlighet med de rutiner och den praxis som används inom gemenskapen, med beaktande av Världshälsoorganisationens riktlinjer. Förekomst av resthalter av bekämpningsmedel på samma nivå som eller under de nya gränsvärdena bedöms inte förorsaka några akuta toxiska effekter.

| (6) | Gemenskapens handelspartner ombads via Världshandelsorganisationen att yttra sig om de nya gränsvärdena och deras synpunkter har beaktats. |
| --- | --- |

(6)

Gemenskapens handelspartner ombads via Världshandelsorganisationen att yttra sig om de nya gränsvärdena och deras synpunkter har beaktats.

| (7) | Bilagorna till direktiven 86/362/EEG, 86/363/EEG och 90/642/EEG bör därför ändras i enlighet med detta. |
| --- | --- |

(7)

Bilagorna till direktiven 86/362/EEG, 86/363/EEG och 90/642/EEG bör därför ändras i enlighet med detta.

| (8) | De åtgärder som föreskrivs i detta direktiv är förenliga med yttrandet från ständiga kommittén för livsmedelskedjan och djurhälsa. |
| --- | --- |

(8)

De åtgärder som föreskrivs i detta direktiv är förenliga med yttrandet från ständiga kommittén för livsmedelskedjan och djurhälsa.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

Artikel 1

Bilaga II till direktiv 86/362/EEG skall ändras enligt bilaga I till det här direktivet.

Artikel 2

Bilaga II till direktiv 86/363/EEG skall ändras enligt bilaga II till det här direktivet.

Artikel 3

Bilaga II till direktiv 90/642/EEG skall ändras enligt bilaga III till det här direktivet.

Artikel 4

1.   Medlemsstaterna skall senast den 20 januari 2007 anta och offentliggöra de lagar och andra författningar som är nödvändiga för att följa detta direktiv. De skall genast överlämna texterna till dessa bestämmelser till kommissionen tillsammans med en jämförelsetabell för dessa bestämmelser och bestämmelserna i detta direktiv.

De skall tillämpa dessa bestämmelser från och med den 21 januari 2007.

När en medlemsstat antar dessa bestämmelser skall de innehålla en hänvisning till detta direktiv eller åtföljas av sådan hänvisning när de offentliggörs. Närmare föreskrifter om hur hänvisningen skall göras skall varje medlemsstat själv utfärda.

2.   Medlemsstaterna skall till kommissionen överlämna texten till de centrala bestämmelser i nationell lagstiftning som de antar inom det område som omfattas av detta direktiv.

Artikel 5

Detta direktiv träder i kraft den tjugonde dagen efter det att det har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning.

Artikel 6

Detta direktiv riktar sig till medlemsstaterna.

Utfärdat i Bryssel den 7 juli 2006.

På kommissionens vägnar

Markos KYPRIANOU

Ledamot av kommissionen

---

(1)  EGT L 221, 7.8.1986, s. 37. Direktivet senast ändrat genom kommissionens direktiv 2006/59/EG (EUT L 175, 29.6.2006, s. 61)

1

(2)  EGT L 221, 7.8.1986, s. 43. Direktivet senast ändrat genom kommissionens direktiv 2006/59/EG.

2

(3)  EGT L 350, 14.12.1990, s. 71. Direktivet senast ändrat genom kommissionens direktiv 2006/59/EG.

3

(4)  EGT L 230, 19.8.1991, s. 1. Direktivet senast ändrat genom kommissionens direktiv 2006/45/EG (EUT L 130, 18.5.2006, s. 27).

4

(5)  Riktlinjer för beräkning av intaget av bekämpningsmedelsrester (reviderad utgåva), upprättade av GEMS/Livsmedelsprogrammet i samarbete med Codex Alimentarius-kommittén för bekämpningsmedelsrester och utgivna av Världshälsoorganisationen 1997 (WHO/FSF/FOS/97.7).

5

---

BILAGA I

Del A i bilaga II till direktiv 86/362/EEG skall ändras på följande sätt:

| 1. | Följande rad för atrazin skall läggas till:






  Bekämpningsmedelsrester | Gränsvärde i mg/kg |
| --- | --- | --- |
| ”Atrazin | 0,05 (1)

  SPANNMÅL |

1.

Följande rad för atrazin skall läggas till:

Bekämpningsmedelsrester

Gränsvärde i mg/kg

”Atrazin

0,05 (1)

SPANNMÅL

| 2. | Raderna för azinfosetyl, etefon och triazofos skall ersättas med följande:






  Bekämpningsmedelsrester | Gränsvärde i mg/kg |
| --- | --- | --- |
| ”Azinfosetyl | 0,05 (2)

  SPANNMÅL |
| Etefon | 0,5 korn, råg
  0,2 rågvete, vete
  0,05 (2) övriga spannmål |
| Triazofos | 0,02 (2)

  SPANNMÅL |

2.

Raderna för azinfosetyl, etefon och triazofos skall ersättas med följande:

Bekämpningsmedelsrester

Gränsvärde i mg/kg

”Azinfosetyl

0,05 (2)

SPANNMÅL

Etefon

0,5 korn, råg

0,2 rågvete, vete

0,05 (2) övriga spannmål

Triazofos

0,02 (2)

SPANNMÅL

---

(1)  Lägsta analytiska bestämningsgräns.”

(2)  Lägsta analytiska bestämningsgräns.”

---

BILAGA II

Del A i bilaga II till direktiv 86/363/EEG skall ändras på följande sätt:

| 1. | I del A i bilaga II till direktiv 86/363/EEG skall raderna för azinfosetyl och triazofos ersättas med följande:








  Bekämpningsmedelsrester | Gränsvärde i mg/kg |
| --- | --- | --- |
| | För fett i kött, köttberedningar, slaktbiprodukter och djurfetter som förtecknas i bilaga I under KN-nummer ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 och 1602 (1) (4) | För komjölk och helmjölk från ko som förtecknas i bilaga I under KN-nummer 0401; för övriga livsmedel under KN-nummer 0401, 0402, 0405 00 och 0406 i enlighet med (2) (4) | För färska ägg utan skal, fågelägg och äggula som förtecknas i bilaga I under KN-nummer 0407 00 och 0408 (3) (4) |
| ”Azinfosetyl | 0,01 (1) | 0,01 (1) | 0,01 (1) |
| Triazofos | 0,01 (1) | 0,01 (1) | 0,01 (1) |

1.

I del A i bilaga II till direktiv 86/363/EEG skall raderna för azinfosetyl och triazofos ersättas med följande:

Bekämpningsmedelsrester

Gränsvärde i mg/kg

För fett i kött, köttberedningar, slaktbiprodukter och djurfetter som förtecknas i bilaga I under KN-nummer ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 och 1602 (1) (4)

För komjölk och helmjölk från ko som förtecknas i bilaga I under KN-nummer 0401; för övriga livsmedel under KN-nummer 0401, 0402, 0405 00 och 0406 i enlighet med (2) (4)

För färska ägg utan skal, fågelägg och äggula som förtecknas i bilaga I under KN-nummer 0407 00 och 0408 (3) (4)

”Azinfosetyl

0,01 (1)

0,01 (1)

0,01 (1)

Triazofos

0,01 (1)

0,01 (1)

0,01 (1)

| 2. | I del A i bilaga II till direktiv 86/363/EEG skall raden för fention ersättas med följande:








  Bekämpningsmedelsrester | Gränsvärde i mg/kg |
| --- | --- | --- |
| | För fett i kött, köttberedningar, slaktbiprodukter och djurfetter som förtecknas i bilaga I under KN-nummer ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 och 1602 (1) (4) | För komjölk och helmjölk från ko som förtecknas i bilaga I under KN-nummer 0401; för övriga livsmedel under KN-nummer 0401, 0402, 0405 00 och 0406 i enlighet med (2) (4) | För färska ägg utan skal, fågelägg och äggula som förtecknas i bilaga I under KN-nummer 0407 00 och 0408 (3) (4) |
| ”Fention och dess syreanalog, deras sulfoxider och sulfoner, uttryckt som fention | 0,05 (2) | 0,01 (2) | — |

2.

I del A i bilaga II till direktiv 86/363/EEG skall raden för fention ersättas med följande:

Bekämpningsmedelsrester

Gränsvärde i mg/kg

För fett i kött, köttberedningar, slaktbiprodukter och djurfetter som förtecknas i bilaga I under KN-nummer ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 och 1602 (1) (4)

För komjölk och helmjölk från ko som förtecknas i bilaga I under KN-nummer 0401; för övriga livsmedel under KN-nummer 0401, 0402, 0405 00 och 0406 i enlighet med (2) (4)

För färska ägg utan skal, fågelägg och äggula som förtecknas i bilaga I under KN-nummer 0407 00 och 0408 (3) (4)

”Fention och dess syreanalog, deras sulfoxider och sulfoner, uttryckt som fention

0,05 (2)

0,01 (2)

—

---

(1)  Lägsta analytiska bestämningsgräns.”

(2)  Lägsta analytiska bestämningsgräns.”

---

BILAGA III

Del A i bilaga II till direktiv 90/642/EEG skall ändras på följande sätt:

| 1. | Följande kolumn för fention skall läggas till:









  Grupper av och exempel på enskilda produkter för vilka gränsvärdena gäller | Fention och dess syreanalog, deras sulfoxider och sulfoner, uttryckt som fention |
| --- | --- | --- |
| ”1. | Frukt: färsk, torkad eller okokt, konserverad genom frysning utan tillsats av socker; nötter | |
| | i) | CITRUSFRUKTER | 3 |
| | | Grapefrukt | |
| | | Citroner | |
| | | Lime | |
| | | Mandariner (inkl. klementiner och andra hybrider) | |
| | | Apelsiner | |
| | | Pomelo | |
| | | Övriga | |
| | ii) | Trädnötter (skalade eller oskalade) | 0,01 (1) |
| | | Mandlar | |
| | | Paranötter | |
| | | Cashewnötter | |
| | | Kastanjer | |
| | | Kokosnötter | |
| | | Hasselnötter | |
| | | Macadamianötter | |
| | | Pekannötter | |
| | | Pinjenötter | |
| | | Pistaschmandlar | |
| | | Valnötter | |
| | | Övriga | |
| | iii) | KÄRNFRUKTER | 0,01 (1) |
| | | Äpplen | |
| | | Päron | |
| | | Kvitten | |
| | | Övriga | |
| | iv) | STENFRUKTER | |
| | | Aprikoser | |
| | | Körsbär | 2 |
| | | Persikor (inkl. nektariner och liknande hybrider) | |
| | | Plommon | |
| | | Övriga | 0,01 (1) |
| | v) | BÄR OCH SMÅ FRUKTER | 0,01 (1) |
| | | a) | Bordsdruvor och druvor för vinframställning | |
| | | | Bordsdruvor | |
| | | | Druvor för vinframställning | |
| | | b) | Jordgubbar (odlade) | |
| | | c) | Rubusfrukter (odlade) | |
| | | | Björnbär | |
| | | | Blåhallon | |
| | | | Loganbär | |
| | | | Hallon | |
| | | | Övriga | |
| | | d) | Andra små frukter och bär (odlade) | |
| | | | Blåbär | |
| | | | Tranbär | |
| | | | Vinbär (röda, svarta och vita) | |
| | | | Krusbär | |
| | | | Övriga | |
| | | e) | Vilda bär och frukter | |
| | vi) | DIVERSE FRUKTER | |
| | | Avokado | |
| | | Bananer | |
| | | Dadlar | |
| | | Fikon | |
| | | Kiwifrukter | |
| | | Kumquat | |
| | | Litchiplommon | |
| | | Mango | |
| | | Oliver (bordsoliver) | 1 |
| | | Oliver (för oljeproduktion) | 1 |
| | | Papaya | |
| | | Passionsfrukt | |
| | | Ananas | |
| | | Övriga | 0,01 (1) |
| 2. | Grönsaker, färska eller okokta, frysta eller torkade | 0,01 (1) |
| | i) | ROT- OCH KNÖLGRÖNSAKER | |
| | | Rödbetor | |
| | | Morötter | |
| | | Maniok | |
| | | Rotselleri | |
| | | Pepparrot | |
| | | Jordärtskockor | |
| | | Palsternackor | |
| | | Rotpersilja | |
| | | Rädisor | |
| | | Haverrot | |
| | | Sötpotatis | |
| | | Kålrötter | |
| | | Rovor | |
| | | Jamsrot | |
| | | Övriga | |
| | ii) | LÖKGRÖNSAKER | |
| | | Vitlök | |
| | | Kepalök | |
| | | Schalottenlök | |
| | | Knipplök | |
| | | Övriga | |
| | iii) | FRUKTGRÖNSAKER | |
| | | a) | Solanacea | |
| | | | Tomater | |
| | | | Paprikor | |
| | | | Auberginer | |
| | | | Okra | |
| | | | Övriga | |
| | | b) | Gurkväxter – ätligt skal | |
| | | | Slanggurkor | |
| | | | Druvgurkor | |
| | | | Zucchini (sommarsquash) | |
| | | | Övriga | |
| | | c) | Gurkväxter – oätligt skal | |
| | | | Meloner | |
| | | | Squash (vintersquash) | |
| | | | Vattenmeloner | |
| | | | Övriga | |
| | | d) | Sockermajs | |
| | iv) | KÅLGRÖNSAKER | |
| | | a) | Blommande kål | |
| | | | Broccoli | |
| | | | Blomkål | |
| | | | Övriga | |
| | | b) | Huvudbildande kål | |
| | | | Brysselkål | |
| | | | Vitkål, rödkål | |
| | | | Övriga | |
| | | c) | Bladbildande kål | |
| | | | Salladskål | |
| | | | Grönkål | |
| | | | Övriga | |
| | | d) | Kålrabbi | |
| | v) | BLADGRÖNSAKER OCH FÄRSKA ÖRTER | |
| | | a) | Sallat och liknande | |
| | | | Kryddkrasse | |
| | | | Vårklynne | |
| | | | Sallat | |
| | | | Escarole | |
| | | | Ruccolasallad | |
| | | | Blad och stjälkar av kål | |
| | | | Övriga | |
| | | b) | Spenat och liknande | |
| | | | Spenat | |
| | | | Mangold | |
| | | | Övriga | |
| | | c) | Vattenkrasse | |
| | | d) | Endivsallat | |
| | | e) | Örter | |
| | | | Körvel | |
| | | | Gräslök | |
| | | | Persilja | |
| | | | Snittselleri | |
| | | | Övriga | |
| | vi) | BALJVÄXTER (färska) | |
| | | Bönor (med skida) | |
| | | Bönor (utan skida) | |
| | | Ärter (med skida) | |
| | | Ärter (utan skida) | |
| | | Övriga | |
| | vii) | STJÄLKGRÖNSAKER (färska) | |
| | | Sparris | |
| | | Kardon | |
| | | Bladselleri | |
| | | Fänkål | |
| | | Kronärtskockor | |
| | | Purjolök | |
| | | Rabarber | |
| | | Övriga | |
| | viii) | SVAMP | |
| | | a) | Odlad svamp | |
| | | b) | Vild svamp | |
| 3. | Baljväxter (torkade) | 0,01 (1) |
| | Bönor | |
| | Linser | |
| | Ärter | |
| | Övriga | |
| 4. | Oljeväxtfröer | 0,02 (1) |
| | Linfrö | |
| | Jordnötter | |
| | Vallmofrö | |
| | Sesamfrö | |
| | Solrosfrö | |
| | Rapsfrö | |
| | Sojabönor | |
| | Senapsfrö | |
| | Bomullsfrö | |
| | Hampfrö | |
| | Övriga | |
| 5. | Potatis | 0,01 (1) |
| | Färskpotatis | |
| | Övrig matpotatis | |
| 6. | Te (torkade blad och stjälkar, jästa eller ojästa, av Camellia sinensis) | 0,1 (1) |
| 7. | Humle (torkad), inkl. pellets och icke-koncentrerat pulver | 0,1 (1) |

1.

Följande kolumn för fention skall läggas till:

Grupper av och exempel på enskilda produkter för vilka gränsvärdena gäller

Fention och dess syreanalog, deras sulfoxider och sulfoner, uttryckt som fention

”1.

Frukt: färsk, torkad eller okokt, konserverad genom frysning utan tillsats av socker; nötter

i)

CITRUSFRUKTER

3

Grapefrukt

Citroner

Lime

Mandariner (inkl. klementiner och andra hybrider)

Apelsiner

Pomelo

Övriga

ii)

Trädnötter (skalade eller oskalade)

0,01 (1)

Mandlar

Paranötter

Cashewnötter

Kastanjer

Kokosnötter

Hasselnötter

Macadamianötter

Pekannötter

Pinjenötter

Pistaschmandlar

Valnötter

Övriga

iii)

KÄRNFRUKTER

0,01 (1)

Äpplen

Päron

Kvitten

Övriga

iv)

STENFRUKTER

Aprikoser

Körsbär

2

Persikor (inkl. nektariner och liknande hybrider)

Plommon

Övriga

0,01 (1)

v)

BÄR OCH SMÅ FRUKTER

0,01 (1)

a)

Bordsdruvor och druvor för vinframställning

Bordsdruvor

Druvor för vinframställning

b)

Jordgubbar (odlade)

c)

Rubusfrukter (odlade)

Björnbär

Blåhallon

Loganbär

Hallon

Övriga

d)

Andra små frukter och bär (odlade)

Blåbär

Tranbär

Vinbär (röda, svarta och vita)

Krusbär

Övriga

e)

Vilda bär och frukter

vi)

DIVERSE FRUKTER

Avokado

Bananer

Dadlar

Fikon

Kiwifrukter

Kumquat

Litchiplommon

Mango

Oliver (bordsoliver)

1

Oliver (för oljeproduktion)

1

Papaya

Passionsfrukt

Ananas

Övriga

0,01 (1)

2.

Grönsaker, färska eller okokta, frysta eller torkade

0,01 (1)

i)

ROT- OCH KNÖLGRÖNSAKER

Rödbetor

Morötter

Maniok

Rotselleri

Pepparrot

Jordärtskockor

Palsternackor

Rotpersilja

Rädisor

Haverrot

Sötpotatis

Kålrötter

Rovor

Jamsrot

Övriga

ii)

LÖKGRÖNSAKER

Vitlök

Kepalök

Schalottenlök

Knipplök

Övriga

iii)

FRUKTGRÖNSAKER

a)

Solanacea

Tomater

Paprikor

Auberginer

Okra

Övriga

b)

Gurkväxter – ätligt skal

Slanggurkor

Druvgurkor

Zucchini (sommarsquash)

Övriga

c)

Gurkväxter – oätligt skal

Meloner

Squash (vintersquash)

Vattenmeloner

Övriga

d)

Sockermajs

iv)

KÅLGRÖNSAKER

a)

Blommande kål

Broccoli

Blomkål

Övriga

b)

Huvudbildande kål

Brysselkål

Vitkål, rödkål

Övriga

c)

Bladbildande kål

Salladskål

Grönkål

Övriga

d)

Kålrabbi

v)

BLADGRÖNSAKER OCH FÄRSKA ÖRTER

a)

Sallat och liknande

Kryddkrasse

Vårklynne

Sallat

Escarole

Ruccolasallad

Blad och stjälkar av kål

Övriga

b)

Spenat och liknande

Spenat

Mangold

Övriga

c)

Vattenkrasse

d)

Endivsallat

e)

Örter

Körvel

Gräslök

Persilja

Snittselleri

Övriga

vi)

BALJVÄXTER (färska)

Bönor (med skida)

Bönor (utan skida)

Ärter (med skida)

Ärter (utan skida)

Övriga

vii)

STJÄLKGRÖNSAKER (färska)

Sparris

Kardon

Bladselleri

Fänkål

Kronärtskockor

Purjolök

Rabarber

Övriga

viii)

SVAMP

a)

Odlad svamp

b)

Vild svamp

3.

Baljväxter (torkade)

0,01 (1)

Bönor

Linser

Ärter

Övriga

4.

Oljeväxtfröer

0,02 (1)

Linfrö

Jordnötter

Vallmofrö

Sesamfrö

Solrosfrö

Rapsfrö

Sojabönor

Senapsfrö

Bomullsfrö

Hampfrö

Övriga

5.

Potatis

0,01 (1)

Färskpotatis

Övrig matpotatis

6.

Te (torkade blad och stjälkar, jästa eller ojästa, av Camellia sinensis)

0,1 (1)

7.

Humle (torkad), inkl. pellets och icke-koncentrerat pulver

0,1 (1)

| 2. | Kolumnerna för atrazin, azinfosetyl, cyflutrin, etefon, metamidofos, metomyl, parakvat och triazofos skall ersättas med följande:
















  Grupper av och exempel på enskilda produkter för vilka gränsvärdena gäller | Atrazin | Azinfosetyl | Cyflutrin inklusive andra besläktade isomerblandningar (summan av isomerer) | Etefon | Metamidofos | Metomyl/Tiodikarb (summan uttryckt som metomyl) | Parakvat | Triazofos |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| ”1. | Frukt: färsk, torkad eller okokt, konserverad genom frysning utan tillsats av socker; nötter | 0,05 (2) | 0,02 (2) | | | | | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | i) | CITRUSFRUKTER | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | | | |
| | | Grapefrukt | | | | | | 0,5 | | |
| | | Citroner | | | | | | 1 | | |
| | | Lime | | | | | | 1 | | |
| | | Mandariner (inkl. klementiner och andra hybrider) | | | | | | 1 | | |
| | | Apelsiner | | | | | | 0,5 | | |
| | | Pomelo | | | | | | 0,5 | | |
| | | Övriga | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | ii) | Trädnötter (skalade eller oskalade) | | | 0,02 (2) | 0,1 | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | Mandlar | | | | | | | | |
| | | Paranötter | | | | | | | | |
| | | Cashewnötter | | | | | | | | |
| | | Kastanjer | | | | | | | | |
| | | Kokosnötter | | | | | | | | |
| | | Hasselnötter | | | | | | | | |
| | | Macadamianötter | | | | | | | | |
| | | Pekannötter | | | | | | | | |
| | | Pinjenötter | | | | | | | | |
| | | Pistaschmandlar | | | | | | | | |
| | | Valnötter | | | | | | | | |
| | | Övriga | | | | | | | | |
| | iii) | KÄRNFRUKTER | | | 0,2 | | 0,01 (2) | 0,2 | | |
| | | Äpplen | | | | 0,5 | | | | |
| | | Päron | | | | | | | | |
| | | Kvitten | | | | | | | | |
| | | Övriga | | | | 0,05 (2) | | | | |
| | iv) | STENFRUKTER | | | | | | | | |
| | | Aprikoser | | | 0,3 | | 0,1 | 0,2 | | |
| | | Körsbär | | | 0,2 | 3 | | 0,1 | | |
| | | Persikor (inkl. nektariner och liknande hybrider) | | | 0,3 | | 0,05 | 0,2 | | |
| | | Plommon | | | 0,2 | | | 0,5 | | |
| | | Övriga | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | v) | BÄR OCH SMÅ FRUKTER | | | | | 0,01 (2) | | | |
| | | a) | Bordsdruvor och druvor för vinframställning | | | 0,3 | 1 | | | | |
| | | | Bordsdruvor | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | | | Druvor för vinframställning | | | | | | 1 | | |
| | | b) | Jordgubbar (odlade) | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | c) | Rubusfrukter (odlade) | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | | Björnbär | | | | | | | | |
| | | | Blåhallon | | | | | | | | |
| | | | Loganbär | | | | | | | | |
| | | | Hallon | | | | | | | | |
| | | | Övriga | | | | | | | | |
| | | d) | Andra små frukter och bär (odlade) | | | 0,02 (2) | | | 0,05 (2) | | |
| | | | Blåbär | | | | | | | | |
| | | | Tranbär | | | | | | | | |
| | | | Vinbär (röda, svarta och vita) | | | | 5 | | | | |
| | | | Krusbär | | | | | | | | |
| | | | Övriga | | | | 0,05 (2) | | | | |
| | | e) | Vilda bär och frukter | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | vi) | DIVERSE FRUKTER | | | 0,02 (2) | | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | Avokado | | | | | | | | |
| | | Bananer | | | | | | | | |
| | | Dadlar | | | | | | | | |
| | | Fikon | | | | | | | | |
| | | Kiwifrukter | | | | | | | | |
| | | Kumquat | | | | | | | | |
| | | Litchiplommon | | | | | | | | |
| | | Mango | | | | | | | | |
| | | Oliver (bordsoliver) | | | | | | | | |
| | | Oliver (för oljeproduktion) | | | | | | | | |
| | | Papaya | | | | | | | | |
| | | Passionsfrukt | | | | | | | | |
| | | Ananas | | | | 2 | | | | |
| | | Övriga | | | | 0,05 (2) | | | | |
| 2. | Grönsaker, färska eller okokta, frysta eller torkade | | 0,02 (2) | | | | | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | i) | ROT- OCH KNÖLGRÖNSAKER | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | | | |
| | | Rödbetor | | | | | | | | |
| | | Morötter | | | | | | | | |
| | | Maniok | | | | | | | | |
| | | Rotselleri | | | | | | | | |
| | | Pepparrot | | | | | | | | |
| | | Jordärtskockor | | | | | | | | |
| | | Palsternackor | | | | | | | | |
| | | Rotpersilja | | | | | | | | |
| | | Rädisor | | | | | | 0,5 | | |
| | | Haverrot | | | | | | | | |
| | | Sötpotatis | | | | | | | | |
| | | Kålrötter | | | | | | | | |
| | | Rovor | | | | | | | | |
| | | Jamsrot | | | | | | | | |
| | | Övriga | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | ii) | LÖKGRÖNSAKER | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | Vitlök | | | | | | | | |
| | | Kepalök | | | | | | | | |
| | | Schalottenlök | | | | | | | | |
| | | Knipplök | | | | | | | | |
| | | Övriga | | | | | | | | |
| | iii) | FRUKTGRÖNSAKER | | | | | 0,01 (2) | | | |
| | | a) | Solanacea | 0,05 (2) | | | | | | | |
| | | | Tomater | | | 0,05 | 1 | | 0,2 | | |
| | | | Paprikor | | | 0,3 | 3 | | | | |
| | | | Auberginer | | | | | | 0,2 | | |
| | | | Okra | | | | | | | | |
| | | | Övriga | | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | b) | Gurkväxter – ätligt skal | 0,05 (2) | | | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | | Slanggurkor | | | 0,1 | | | | | |
| | | | Druvgurkor | | | | | | | | |
| | | | Zucchini (sommarsquash) | | | | | | | | |
| | | | Övriga | | | 0,02 (2) | | | | | |
| | | c) | Gurkväxter – oätligt skal | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | | Meloner | | | | | | | | |
| | | | Squash (vintersquash) | | | | | | | | |
| | | | Vattenmeloner | | | | | | | | |
| | | | Övriga | | | | | | | | |
| | | d) | Sockermajs | 0,1 | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | iv) | KÅLGRÖNSAKER | 0,05 (2) | | | 0,05 (2) | | | | |
| | | a) | Blommande kål | | | 0,05 | | 0,02 | | | |
| | | | Broccoli | | | | | | 0,2 | | |
| | | | Blomkål | | | | | | | | |
| | | | Övriga | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | | b) | Huvudbildande kål | | | 0,2 | | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | | Brysselkål | | | | | | | | |
| | | | Vitkål, rödkål | | | | | | | | |
| | | | Övriga | | | | | | | | |
| | | c) | Bladbildande kål | | | 0,3 | | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | | Salladskål | | | | | | | | |
| | | | Grönkål | | | | | | | | |
| | | | Övriga | | | | | | | | |
| | | d) | Kålrabbi | | | 0,02 (2) | | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | v) | BLADGRÖNSAKER OCH FÄRSKA ÖRTER | 0,05 (2) | | | 0,05 (2) | 0,01 (2) | | | |
| | | a) | Sallat och liknande | | | 0,5 | | | | | |
| | | | Kryddkrasse | | | | | | | | |
| | | | Vårklynne | | | | | | | | |
| | | | Sallat | | | | | | 0,3 | | |
| | | | Escarole | | | | | | | | |
| | | | Ruccolasallad | | | | | | | | |
| | | | Blad och stjälkar av kål | | | | | | | | |
| | | | Övriga | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | | b) | Spenat och liknande | | | 0,02 (2) | | | | | |
| | | | Spenat | | | | | | 0,05 | | |
| | | | Mangold | | | | | | | | |
| | | | Övriga | | | | | | 0,05 (2) | | |
| | | c) | Vattenkrasse | | | 0,02 (2) | | | 0,05 (2) | | |
| | | d) | Endivsallat | | | 0,02 (2) | | | 0,05 (2) | | |
| | | e) | Örter | | | 0,02 (2) | | | 0,3 | | |
| | | | Körvel | | | | | | | | |
| | | | Gräslök | | | | | | | | |
| | | | Persilja | | | | | | | | |
| | | | Snittselleri | | | | | | | | |
| | | | Övriga | | | | | | | | |
| | vi) | BALJVÄXTER (färska) | 0,05 (2) | | 0,05 | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | Bönor (med skida) | | | | | 0,5 | | | |
| | | Bönor (utan skida) | | | | | | | | |
| | | Ärter (med skida) | | | | | 0,5 | | | |
| | | Ärter (utan skida) | | | | | | | | |
| | | Övriga | | | | | 0,01 (2) | | | |
| | vii) | STJÄLKGRÖNSAKER (färska) | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | | 0,05 (2) | | |
| | | Sparris | | | | | | | | |
| | | Kardon | | | | | | | | |
| | | Bladselleri | | | | | | | | |
| | | Fänkål | | | | | | | | |
| | | Kronärtskockor | | | | | 0,1 | | | |
| | | Purjolök | | | | | | | | |
| | | Rabarber | | | | | | | | |
| | | Övriga | | | | | 0,01 (2) | | | |
| | viii) | SVAMP | 0,05 (2) | | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| | | a) | Odlad svamp | | | | | | | | |
| | | b) | Vild svamp | | | | | | | | |
| 3. | Baljväxter (torkade) | 0,05 (2) | 0,02 (2) | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | Bönor | | | | | | | | |
| | Linser | | | | | | | | |
| | Ärter | | | | | | | | |
| | Övriga | | | | | | | | |
| 4. | Oljeväxtfröer | 0,05 (2) | 0,02 (2) | | | | | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | Linfrö | | | | | | | | |
| | Jordnötter | | | | | | 0,1 | | |
| | Vallmofrö | | | | | | | | |
| | Sesamfrö | | | | | | | | |
| | Solrosfrö | | | | | | | | |
| | Rapsfrö | | | 0,05 | | | | | |
| | Sojabönor | | | | | 0,2 | 0,1 | | |
| | Senapsfrö | | | | | | | | |
| | Bomullsfrö | | | | 2 | 0,2 | 0,1 | | |
| | Hampfrö | | | | | | | | |
| | Övriga | | | 0,02 (2) | 0,1 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | | |
| 5. | Potatis | 0,05 (2) | 0,02 (2) | 0,02 (2) | 0,05 (2) | 0,01 (2) | 0,05 (2) | 0,02 (2) | 0,01 (2) |
| | Färskpotatis | | | | | | | | |
| | Övrig matpotatis | | | | | | | | |
| 6. | Te (torkade blad och stjälkar, jästa eller ojästa, av Camellia sinensis) | 0,1 (2) | 0,05 (2) | 0,1 (2) | 0,1 (2) | 0,02 (2) | 0,1 (2) | 0,05 (2) | 0,02 (2) |
| 7. | Humle (torkad), inkl. pellets och icke-koncentrerat pulver | 0,1 (2) | 0,05 (2) | 20 | 0,1 (2) | 0,02 (2) | 10 | 0,05 (2) | 0,02 (2) |

2.

Kolumnerna för atrazin, azinfosetyl, cyflutrin, etefon, metamidofos, metomyl, parakvat och triazofos skall ersättas med följande:

Grupper av och exempel på enskilda produkter för vilka gränsvärdena gäller

Atrazin

Azinfosetyl

Cyflutrin inklusive andra besläktade isomerblandningar (summan av isomerer)

Etefon

Metamidofos

Metomyl/Tiodikarb (summan uttryckt som metomyl)

Parakvat

Triazofos

”1.

Frukt: färsk, torkad eller okokt, konserverad genom frysning utan tillsats av socker; nötter

0,05 (2)

0,02 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

i)

CITRUSFRUKTER

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

Grapefrukt

0,5

Citroner

1

Lime

1

Mandariner (inkl. klementiner och andra hybrider)

1

Apelsiner

0,5

Pomelo

0,5

Övriga

0,05 (2)

ii)

Trädnötter (skalade eller oskalade)

0,02 (2)

0,1

0,01 (2)

0,05 (2)

Mandlar

Paranötter

Cashewnötter

Kastanjer

Kokosnötter

Hasselnötter

Macadamianötter

Pekannötter

Pinjenötter

Pistaschmandlar

Valnötter

Övriga

iii)

KÄRNFRUKTER

0,2

0,01 (2)

0,2

Äpplen

0,5

Päron

Kvitten

Övriga

0,05 (2)

iv)

STENFRUKTER

Aprikoser

0,3

0,1

0,2

Körsbär

0,2

3

0,1

Persikor (inkl. nektariner och liknande hybrider)

0,3

0,05

0,2

Plommon

0,2

0,5

Övriga

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

v)

BÄR OCH SMÅ FRUKTER

0,01 (2)

a)

Bordsdruvor och druvor för vinframställning

0,3

1

Bordsdruvor

0,05 (2)

Druvor för vinframställning

1

b)

Jordgubbar (odlade)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

c)

Rubusfrukter (odlade)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

Björnbär

Blåhallon

Loganbär

Hallon

Övriga

d)

Andra små frukter och bär (odlade)

0,02 (2)

0,05 (2)

Blåbär

Tranbär

Vinbär (röda, svarta och vita)

5

Krusbär

Övriga

0,05 (2)

e)

Vilda bär och frukter

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

vi)

DIVERSE FRUKTER

0,02 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

Avokado

Bananer

Dadlar

Fikon

Kiwifrukter

Kumquat

Litchiplommon

Mango

Oliver (bordsoliver)

Oliver (för oljeproduktion)

Papaya

Passionsfrukt

Ananas

2

Övriga

0,05 (2)

2.

Grönsaker, färska eller okokta, frysta eller torkade

0,02 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

i)

ROT- OCH KNÖLGRÖNSAKER

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

Rödbetor

Morötter

Maniok

Rotselleri

Pepparrot

Jordärtskockor

Palsternackor

Rotpersilja

Rädisor

0,5

Haverrot

Sötpotatis

Kålrötter

Rovor

Jamsrot

Övriga

0,05 (2)

ii)

LÖKGRÖNSAKER

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

Vitlök

Kepalök

Schalottenlök

Knipplök

Övriga

iii)

FRUKTGRÖNSAKER

0,01 (2)

a)

Solanacea

0,05 (2)

Tomater

0,05

1

0,2

Paprikor

0,3

3

Auberginer

0,2

Okra

Övriga

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

b)

Gurkväxter – ätligt skal

0,05 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

Slanggurkor

0,1

Druvgurkor

Zucchini (sommarsquash)

Övriga

0,02 (2)

c)

Gurkväxter – oätligt skal

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

Meloner

Squash (vintersquash)

Vattenmeloner

Övriga

d)

Sockermajs

0,1

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

iv)

KÅLGRÖNSAKER

0,05 (2)

0,05 (2)

a)

Blommande kål

0,05

0,02

Broccoli

0,2

Blomkål

Övriga

0,05 (2)

b)

Huvudbildande kål

0,2

0,01 (2)

0,05 (2)

Brysselkål

Vitkål, rödkål

Övriga

c)

Bladbildande kål

0,3

0,01 (2)

0,05 (2)

Salladskål

Grönkål

Övriga

d)

Kålrabbi

0,02 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

v)

BLADGRÖNSAKER OCH FÄRSKA ÖRTER

0,05 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

a)

Sallat och liknande

0,5

Kryddkrasse

Vårklynne

Sallat

0,3

Escarole

Ruccolasallad

Blad och stjälkar av kål

Övriga

0,05 (2)

b)

Spenat och liknande

0,02 (2)

Spenat

0,05

Mangold

Övriga

0,05 (2)

c)

Vattenkrasse

0,02 (2)

0,05 (2)

d)

Endivsallat

0,02 (2)

0,05 (2)

e)

Örter

0,02 (2)

0,3

Körvel

Gräslök

Persilja

Snittselleri

Övriga

vi)

BALJVÄXTER (färska)

0,05 (2)

0,05

0,05 (2)

0,05 (2)

Bönor (med skida)

0,5

Bönor (utan skida)

Ärter (med skida)

0,5

Ärter (utan skida)

Övriga

0,01 (2)

vii)

STJÄLKGRÖNSAKER (färska)

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,05 (2)

Sparris

Kardon

Bladselleri

Fänkål

Kronärtskockor

0,1

Purjolök

Rabarber

Övriga

0,01 (2)

viii)

SVAMP

0,05 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

a)

Odlad svamp

b)

Vild svamp

3.

Baljväxter (torkade)

0,05 (2)

0,02 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

Bönor

Linser

Ärter

Övriga

4.

Oljeväxtfröer

0,05 (2)

0,02 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

Linfrö

Jordnötter

0,1

Vallmofrö

Sesamfrö

Solrosfrö

Rapsfrö

0,05

Sojabönor

0,2

0,1

Senapsfrö

Bomullsfrö

2

0,2

0,1

Hampfrö

Övriga

0,02 (2)

0,1 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

5.

Potatis

0,05 (2)

0,02 (2)

0,02 (2)

0,05 (2)

0,01 (2)

0,05 (2)

0,02 (2)

0,01 (2)

Färskpotatis

Övrig matpotatis

6.

Te (torkade blad och stjälkar, jästa eller ojästa, av Camellia sinensis)

0,1 (2)

0,05 (2)

0,1 (2)

0,1 (2)

0,02 (2)

0,1 (2)

0,05 (2)

0,02 (2)

7.

Humle (torkad), inkl. pellets och icke-koncentrerat pulver

0,1 (2)

0,05 (2)

20

0,1 (2)

0,02 (2)

10

0,05 (2)

0,02 (2)

---

(1)  Lägsta analytiska bestämningsgräns.”

(2)  Lägsta analytiska bestämningsgräns.”

---

| 27.7.2006 | SV | Europeiska unionens officiella tidning | L 206/27 |
| --- | --- | --- | --- |

27.7.2006

SV

Europeiska unionens officiella tidning

L 206/27

---

KOMMISSIONENS DIREKTIV 2006/62/EG

av den 12 juli 2006

om ändring av bilagorna till rådets direktiv 76/895/EEG, 86/362/EEG, 86/363/EEG och 90/642/EEG beträffande gränsvärden för resthalter av desmedifam, fenmedifam och klorfenvinfos

(Text av betydelse för EES)

EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT DETTA DIREKTIV

med beaktande av fördraget om upprättandet av Europeiska gemenskapen,

med beaktande av rådets direktiv 76/895/EEG av den 23 november 1976 om fastställande av gränsvärden för bekämpningsmedelsrester i och på frukt och grönsaker (1), särskilt artikel 5,

med beaktande av rådets direktiv 86/362/EEG av den 24 juli 1986 om fastställande av gränsvärden för bekämpningsmedelsrester i och på spannmål (2), särskilt artikel 10,

med beaktande av rådets direktiv 86/363/EEG av den 24 juli 1986 om fastställande av gränsvärden för bekämpningsmedelsrester i och på livsmedel av animaliskt ursprung (3), särskilt artikel 10,

med beaktande av rådets direktiv 90/642/EEG av den 27 november 1990 om fastställande av gränsvärden för bekämpningsmedelsrester i och på produkter av vegetabiliskt ursprung inklusive frukt och grönsaker (4), särskilt artikel 7,

med beaktande av rådets direktiv 91/414/EEG av den 15 juli 1991 om utsläppande av växtskyddsmedel på marknaden (5), särskilt artikel 4.1 f, och

av följande skäl:

| (1) | De befintliga verksamma ämnena desmedifam och fenmedifam infördes i bilaga I till direktiv 91/414/EEG genom kommissionens direktiv 2004/58/EG (6). |
| --- | --- |

(1)

De befintliga verksamma ämnena desmedifam och fenmedifam infördes i bilaga I till direktiv 91/414/EEG genom kommissionens direktiv 2004/58/EG (6).

| (2) | Införandet av de berörda verksamma ämnena i bilaga I till direktiv 91/414/EEG grundades på en bedömning av den information som lämnats in om de föreslagna användningsområdena. Uppgifter om användningen har lämnats in av vissa medlemsstater i enlighet med artikel 4.1 f i direktiv 91/414/EEG. Tillgängliga uppgifter har gåtts igenom och har befunnits vara tillräckliga för att vissa gränsvärden för bekämpningsmedelsrester skall kunna fastställas. |
| --- | --- |

(2)

Införandet av de berörda verksamma ämnena i bilaga I till direktiv 91/414/EEG grundades på en bedömning av den information som lämnats in om de föreslagna användningsområdena. Uppgifter om användningen har lämnats in av vissa medlemsstater i enlighet med artikel 4.1 f i direktiv 91/414/EEG. Tillgängliga uppgifter har gåtts igenom och har befunnits vara tillräckliga för att vissa gränsvärden för bekämpningsmedelsrester skall kunna fastställas.

| (3) | Genom kommissionens förordning (EG) nr 2076/2002 (7) beslutades att inte införa klorfenvinfos i bilaga I till direktiv 91/414/EEG. Några medlemsstater har tillstånd att behålla vissa gällande godkännanden av användning av produkter innehållande klorfenvinfos till och med den 30 juni 2007. |
| --- | --- |

(3)

Genom kommissionens förordning (EG) nr 2076/2002 (7) beslutades att inte införa klorfenvinfos i bilaga I till direktiv 91/414/EEG. Några medlemsstater har tillstånd att behålla vissa gällande godkännanden av användning av produkter innehållande klorfenvinfos till och med den 30 juni 2007.

| (4) | Genom direktiv 76/895/EEG har det redan fastställts gränsvärden för klorfenvinfos på gemenskapsnivå. Dessa bör beaktas när gränsvärden för klorfenvinfos fastställs i direktiv 90/642/EEG. |
| --- | --- |

(4)

Genom direktiv 76/895/EEG har det redan fastställts gränsvärden för klorfenvinfos på gemenskapsnivå. Dessa bör beaktas när gränsvärden för klorfenvinfos fastställs i direktiv 90/642/EEG.

| (5) | I kommissionens granskningsrapporter, som utarbetades inför införandet av de berörda verksamma ämnena i bilaga I till direktiv 91/414/EEG, fastställdes acceptabelt dagligt intag (ADI) och vid behov akut referensdos (ARfD) för ämnena. Konsumenternas exponering genom livsmedelsprodukter som behandlats med de berörda verksamma ämnena har bedömts i enlighet med gemenskapens förfaranden. Det har också tagits hänsyn till Världshälsoorganisationens riktlinjer (8) och yttrandet från vetenskapliga kommittén för växter (9) om de metoder som använts. De föreslagna gränsvärdena bedöms inte leda till att de acceptabla dagliga intagen eller de akuta referensdoserna överskrids. |
| --- | --- |

(5)

I kommissionens granskningsrapporter, som utarbetades inför införandet av de berörda verksamma ämnena i bilaga I till direktiv 91/414/EEG, fastställdes acceptabelt dagligt intag (ADI) och vid behov akut referensdos (ARfD) för ämnena. Konsumenternas exponering genom livsmedelsprodukter som behandlats med de berörda verksamma ämnena har bedömts i enlighet med gemenskapens förfaranden. Det har också tagits hänsyn till Världshälsoorganisationens riktlinjer (8) och yttrandet från vetenskapliga kommittén för växter (9) om de metoder som använts. De föreslagna gränsvärdena bedöms inte leda till att de acceptabla dagliga intagen eller de akuta referensdoserna överskrids.

| (6) | För att konsumenterna skall få tillräckligt skydd mot exponering för bekämpningsmedelsrester till följd av otillåten användning av växtskyddsmedel, bör provisoriska gränsvärden fastställas till den lägsta analytiska bestämningsgränsen för de berörda kombinationerna av produkter/bekämpningsmedel. |
| --- | --- |

(6)

För att konsumenterna skall få tillräckligt skydd mot exponering för bekämpningsmedelsrester till följd av otillåten användning av växtskyddsmedel, bör provisoriska gränsvärden fastställas till den lägsta analytiska bestämningsgränsen för de berörda kombinationerna av produkter/bekämpningsmedel.

| (7) | Att sådana provisoriska gränsvärden fastställs på gemenskapsnivå hindrar inte medlemsstaterna från att fastställa provisoriska gränsvärden för de berörda ämnena i enlighet med artikel 4.1 f i direktiv 91/414/EEG och bilaga VI till det direktivet. Fyra år anses vara en tillräckligt lång period för att godkänna ytterligare användningsområden för de berörda verksamma ämnena. De provisoriska gränsvärdena bör därefter bli permanenta. |
| --- | --- |

(7)

Att sådana provisoriska gränsvärden fastställs på gemenskapsnivå hindrar inte medlemsstaterna från att fastställa provisoriska gränsvärden för de berörda ämnena i enlighet med artikel 4.1 f i direktiv 91/414/EEG och bilaga VI till det direktivet. Fyra år anses vara en tillräckligt lång period för att godkänna ytterligare användningsområden för de berörda verksamma ämnena. De provisoriska gränsvärdena bör därefter bli permanenta.

| (8) | Det är därför nödvändigt att förteckna samtliga de gränsvärden för bekämpningsmedelsrester som härrör från användningen av dessa växtskyddsmedel i bilagorna till direktiv 86/362/EEG, 86/363/EEG och 90/642/EEG för att möjliggöra ändamålsenlig övervakning och kontroll av användningsförbudet och för att skydda konsumenterna. Om gränsvärden hittills inte har fastställts bör de fastställas nu. |
| --- | --- |

(8)

Det är därför nödvändigt att förteckna samtliga de gränsvärden för bekämpningsmedelsrester som härrör från användningen av dessa växtskyddsmedel i bilagorna till direktiv 86/362/EEG, 86/363/EEG och 90/642/EEG för att möjliggöra ändamålsenlig övervakning och kontroll av användningsförbudet och för att skydda konsumenterna. Om gränsvärden hittills inte har fastställts bör de fastställas nu.

| (9) | De bestämmelser i direktiv 76/895/EEG som fastställer gränsvärden för klorfenvinfos bör följaktligen utgå. |
| --- | --- |

(9)

De bestämmelser i direktiv 76/895/EEG som fastställer gränsvärden för klorfenvinfos bör följaktligen utgå.

| (10) | Direktiven 76/895/EEG, 86/362/EEG, 86/363/EEG och 90/642/EEG bör därför ändras i enlighet med detta. |
| --- | --- |

(10)

Direktiven 76/895/EEG, 86/362/EEG, 86/363/EEG och 90/642/EEG bör därför ändras i enlighet med detta.

| (11) | De åtgärder som föreskrivs i detta direktiv är förenliga med yttrandet från ständiga kommittén för livsmedelskedjan och djurhälsa. |
| --- | --- |

(11)

De åtgärder som föreskrivs i detta direktiv är förenliga med yttrandet från ständiga kommittén för livsmedelskedjan och djurhälsa.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE:

Artikel 1

I bilaga II till direktiv 76/895/EEG skall de uppgifter som gäller klorfenvinfos utgå.

Artikel 2

Bilaga II till direktiv 86/362/EEG skall ändras i enlighet med bilaga I till det här direktivet.

Artikel 3

Bilaga II till direktiv 86/363/EEG skall ändras i enlighet med bilaga II till det här direktivet.

Artikel 4

Bilaga II till direktiv 90/642/EEG skall ändras i enlighet med bilaga III till det här direktivet.

Artikel 5

1.   Medlemsstaterna skall senast den 20 januari 2008 anta och offentliggöra de lagar och andra författningar som är nödvändiga för att följa detta direktiv. De skall genast överlämna texterna till dessa bestämmelser till kommissionen tillsammans med en jämförelsetabell för dessa bestämmelser och bestämmelserna i detta direktiv.

De skall tillämpa dessa bestämmelser från och med den 21 januari 2008.

När en medlemsstat antar dessa bestämmelser skall de innehålla en hänvisning till detta direktiv eller åtföljas av sådan hänvisning när de offentliggörs. Närmare föreskrifter om hur hänvisningen skall göras skall varje medlemsstat själv utfärda.

2.   Medlemsstaterna skall till kommissionen överlämna texten till de centrala bestämmelser i nationell lagstiftning som de antar inom det område som omfattas av detta direktiv.

Artikel 6

Detta direktiv träder i kraft den tjugonde dagen efter det att det har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning.

Artikel 7

Detta direktiv riktar sig till medlemsstaterna.

Utfärdat i Bryssel den 12 juli 2006.

På kommissionens vägnar

Markos KYPRIANOU

Ledamot av kommissionen

---

(1)  EGT L 340, 9.12.1976, s. 26. Direktivet senast ändrat genom kommissionens direktiv 2006/59/EG (EUT L 175, 29.6.2006, s. 61).

1

(2)  EGT L 221, 7.8.1986, s. 37. Direktivet senast ändrat genom kommissionens direktiv 2006/59/EG.

2

(3)  EGT L 221, 7.8.1986, s. 43. Direktivet senast ändrat genom kommissionens direktiv 2006/59/EG.

3

(4)  EGT L 350, 14.12.1990, s. 71. Direktivet senast ändrat genom kommissionens direktiv 2006/59/EG.

4

(5)  EGT L 230, 19.8.1991, s. 1. Direktivet senast ändrat genom kommissionens direktiv 2006/45/EG (EUT L 130, 18.5.2006, s. 27).

5

(6)  EUT L 120, 24.4.2004, s. 26.

6

(7)  EGT L 319, 23.11.2002, s. 3. Förordningen senast ändrad genom förordning (EG) nr 1335/2005 (EUT L 211, 13.8.2005, s. 6).

7

(8)  Riktlinjer för beräkning av intaget av bekämpningsmedelsrester via födan (reviderad utgåva), upprättade av GEMS/Livsmedelsprogrammet i samarbete med Codex Alimentarius-kommittén för bekämpningsmedelsrester och utgivna av Världshälsoorganisationen 1997 (WHO/FSF/FOS/97.7).

8

(9)  Yttrande om frågor som gäller ändring av bilagorna till rådets direktiv 86/362/EEG, 86/363/EEG och 90/642/EEG (yttrande från vetenskapliga kommittén för växter av den 14 juli 1998) (http://europa.eu.int/comm/food/fs/sc/index_en.html).

9

---

BILAGA I

I del A i bilaga II till direktiv 86/362/EEG skall följande rader om desmedifam, fenmedifam och klorfenvinfos läggas till:

| Bekämpningsmedelsrester | Gränsvärde i mg/kg |
| --- | --- |
| ”Desmedifam | 0,05 (1)
   (2) spannmål |
| Fenmedifam | 0,05 (1)
   (2) spannmål |
| Klorfenvinfos (summan av E- och Z-isomerer) | 0,02 (1) spannmål |

Bekämpningsmedelsrester

Gränsvärde i mg/kg

”Desmedifam

0,05 (1)
   (2) spannmål

Fenmedifam

0,05 (1)
   (2) spannmål

Klorfenvinfos (summan av E- och Z-isomerer)

0,02 (1) spannmål

---

(1)  Lägsta analytiska bestämningsgräns.

1

(2)  Provisoriskt gränsvärde har fastställts i enlighet med artikel 4.1 f i direktiv 91/414/EEG.”

2

---

BILAGA II

Bilaga II till direktiv 86/363/EEG skall ändras på följande sätt:

| 1. | I del A skall följande uppgifter om klorfenvinfos läggas till:








  Bekämpningsmedelsrester | Gränsvärde i mg/kg |
| --- | --- | --- |
| | För fett i kött, köttberedningar, slaktbiprodukter och djurfetter som förtecknas i bilaga I under KN-nummer ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 och 1602 (1) (4) | För komjölk och helmjölk från ko som förtecknas i bilaga I under KN-nummer 0401; för övriga livsmedel under KN-nummer 0401, 0402, 0405 00 och 0406 i enlighet med (2) (4) | För färska ägg utan skal, fågelägg och äggula som förtecknas i bilaga I under KN-nummer 0407 00 och 0408 (3) (4) |
| ”Klorfenvinfos (summan av E- och Z-isomerer) | 0,01 (1) | 0,01 (1) | 0,01 (1) |

1.

I del A skall följande uppgifter om klorfenvinfos läggas till:

Bekämpningsmedelsrester

Gränsvärde i mg/kg

För fett i kött, köttberedningar, slaktbiprodukter och djurfetter som förtecknas i bilaga I under KN-nummer ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 och 1602 (1) (4)

För komjölk och helmjölk från ko som förtecknas i bilaga I under KN-nummer 0401; för övriga livsmedel under KN-nummer 0401, 0402, 0405 00 och 0406 i enlighet med (2) (4)

För färska ägg utan skal, fågelägg och äggula som förtecknas i bilaga I under KN-nummer 0407 00 och 0408 (3) (4)

”Klorfenvinfos (summan av E- och Z-isomerer)

0,01 (1)

0,01 (1)

0,01 (1)

| 2. | I del B skall följande uppgifter om fenmedifam läggas till:








  Bekämpningsmedelsrester | Gränsvärde i mg/kg |
| --- | --- | --- |
| | För kött, inklusive fett, köttberedningar, slaktbiprodukter och djurfetter som förtecknas i bilaga I under KN-nummer ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 och 1602 | För mjölk och mjölkprodukter som förtecknas i bilaga I under KN-nummer 0401, 0402, 0405 00 och 0406 | För färska ägg utan skal, fågelägg och äggula som förtecknas i bilaga I under KN-nummer 0407 00 och 0408 |
| ”Fenmedifam (metyl-N-(3-hydroxifenyl)karbamat (MHPC) uttryckt som fenmedifam) | 0,05 (2)
   (3) | 0,05 (2)
   (3) | 0,05 (2)
   (3) |

2.

I del B skall följande uppgifter om fenmedifam läggas till:

Bekämpningsmedelsrester

Gränsvärde i mg/kg

För kött, inklusive fett, köttberedningar, slaktbiprodukter och djurfetter som förtecknas i bilaga I under KN-nummer ex 0201, 0202, 0203, 0204, 0205 00 00, 0206, 0207, ex 0208, 0209 00, 0210, 1601 00 och 1602

För mjölk och mjölkprodukter som förtecknas i bilaga I under KN-nummer 0401, 0402, 0405 00 och 0406

För färska ägg utan skal, fågelägg och äggula som förtecknas i bilaga I under KN-nummer 0407 00 och 0408

”Fenmedifam (metyl-N-(3-hydroxifenyl)karbamat (MHPC) uttryckt som fenmedifam)

0,05 (2)
   (3)

0,05 (2)
   (3)

0,05 (2)
   (3)

---

(1)  Lägsta analytiska bestämningsgräns.”

(2)  Lägsta analytiska bestämningsgräns.

(3)  Provisoriskt gränsvärde som fastställts i enlighet med artikel 4.1 f i direktiv 91/414/EEG: Om det inte ändras blir gränsvärdet definitivt med verkan från och med den 9 augusti 2010.”

---

BILAGA III

I del A i bilaga II till direktiv 90/642/EEG skall följande kolumner för desmedifam, fenmedifam och klorfenvinfos läggas till:

| Bekämpningsmedelsrester och gränsvärden (mg/kg) |
| --- |
| Grupper av och exempel på individuella produkter för vilka gränsvärdena gäller | Desmedifam | Fenmedifam | Klorfenvinfos (summan av E- och Z-isomerer) |
| ”1. | Frukt: färsk, torkad eller okokt, konserverad genom frysning utan tillsats av socker; nötter | 0,05 (1)
   (2) | | 0,02 (1) |
| | i) | CITRUSFRUKTER | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Grapefrukt | | | |
| | | Citroner | | | |
| | | Lime | | | |
| | | Mandariner (inkl. klementiner och andra hybrider) | | | |
| | | Apelsiner | | | |
| | | Pomelo | | | |
| | | Övriga | | | |
| | ii) | TRÄDNÖTTER (skalade eller oskalade) | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Mandlar | | | |
| | | Paranötter | | | |
| | | Cashewnötter | | | |
| | | Kastanjer | | | |
| | | Kokosnötter | | | |
| | | Hasselnötter | | | |
| | | Macadamianötter | | | |
| | | Pekannötter | | | |
| | | Pinjenötter | | | |
| | | Pistaschmandlar | | | |
| | | Valnötter | | | |
| | | Övriga | | | |
| | iii) | KÄRNFRUKTER | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Äpplen | | | |
| | | Päron | | | |
| | | Kvitten | | | |
| | | Övriga | | | |
| | iv) | STENFRUKTER | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Aprikoser | | | |
| | | Körsbär | | | |
| | | Persikor (inkl. nektariner och liknande hybrider) | | | |
| | | Plommon | | | |
| | | Övriga | | | |
| | v) | BÄR OCH SMÅ FRUKTER | | | |
| | | a) | Bordsdruvor och druvor för vinframställning | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | Bordsdruvor | | | |
| | | | Druvor för vinframställning | | | |
| | | b) | Jordgubbar (odlade) | | 0,1 (1)
   (2) | |
| | | c) | Rubusfrukter (odlade) | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | Björnbär | | | |
| | | | Blåhallon | | | |
| | | | Loganbär | | | |
| | | | Hallon | | | |
| | | | Övriga | | | |
| | | d) | Andra små frukter och bär (odlade) | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | Blåbär | | | |
| | | | Tranbär | | | |
| | | | Vinbär (röda, svarta och vita) | | | |
| | | | Krusbär | | | |
| | | | Övriga | | | |
| | | e) | Vilda bär och frukter | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | vi) | DIVERSE FRUKTER | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Avokado | | | |
| | | Bananer | | | |
| | | Dadlar | | | |
| | | Fikon | | | |
| | | Kiwifrukter | | | |
| | | Kumquat | | | |
| | | Litchiplommon | | | |
| | | Mango | | | |
| | | Oliver (för förtäring) | | | |
| | | Oliver (för oljeutvinning) | | | |
| | | Papaya | | | |
| | | Passionsfrukt | | | |
| | | Ananas | | | |
| | | Granatäpplen | | | |
| | | Övriga | | | |
| 2. | Grönsaker, färska eller okokta, frysta eller torkade | 0,05 (1)
   (2) | | |
| | i) | ROT- OCH KNÖLGRÖNSAKER | | | |
| | | Rödbetor | | 0,1 (1)
   (2) | |
| | | Morötter | | | 0,5 |
| | | Cassava | | | |
| | | Rotselleri | | | |
| | | Pepparrot | | | |
| | | Jordärtskockor | | | |
| | | Palsternackor | | | 0,5 |
| | | Rotpersilja | | | |
| | | Rädisor | | | 0,5 |
| | | Haverrot | | | |
| | | Sötpotatis | | | |
| | | Kålrötter | | | 0,5 |
| | | Rovor | | | 0,5 |
| | | Jamsrot | | | |
| | | Övriga | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | ii) | LÖKGRÖNSAKER | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | Vitlök | | | 0,5 |
| | | Kepalök | | | |
| | | Schalottenlök | | | 0,5 |
| | | Knipplök | | | |
| | | Övriga | | | 0,02 (1) |
| | iii) | FRUKTGRÖNSAKER | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | a) | Solanacea | | | 0,02 (1) |
| | | | Tomater | | | |
| | | | Paprikor | | | |
| | | | Auberginer | | | |
| | | | Okra | | | |
| | | | Övriga | | | |
| | | b) | Gurkväxter – ätligt skal | | | |
| | | | Slanggurkor | | | |
| | | | Druvgurkor | | | |
| | | | Zucchini (sommarsquash) | | | 0,1 |
| | | | Övriga | | | 0,02 (1) |
| | | c) | Gurkväxter – oätligt skal | | | 0,02 (1) |
| | | | Meloner | | | |
| | | | Squash (vintersquash) | | | |
| | | | Vattenmeloner | | | |
| | | | Övriga | | | |
| | | d) | Sockermajs | | | 0,02 (1) |
| | iv) | KÅLGRÖNSAKER | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | a) | Blommande kål | | | 0,02 (1) |
| | | | Broccoli (även Calabrese) | | | |
| | | | Blomkål | | | |
| | | | Övriga | | | |
| | | b) | Huvudbildande kål | | | |
| | | | Brysselkål | | | 0,1 |
| | | | Vitkål, rödkål | | | 0,5 |
| | | | Övriga | | | 0,02 (1) |
| | | c) | Bladbildande kål | | | 0,02 (1) |
| | | | Salladskål | | | |
| | | | Grönkål | | | |
| | | | Övriga | | | |
| | | d) | Kålrabbi | | | 0,3 |
| | v) | BLADGRÖNSAKER OCH FÄRSKA ÖRTER | | | |
| | | a) | Sallat och liknande | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | Kryddkrasse | | | 0,1 |
| | | | Vårklynne | | | 0,1 |
| | | | Sallat | | | |
| | | | Escarole | | | |
| | | | Ruccolasallad | | | |
| | | | Blad och stjälkar av kål | | | |
| | | | Övriga | | | 0,02 (1) |
| | | b) | Spenat och liknande | | 0,5 (2) | |
| | | | Spenat | | | 0,1 |
| | | | Mangold | | | |
| | | | Övriga | | | 0,02 (1) |
| | | c) | Vattenkrasse | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | | d) | Endivsallat | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | | e) | Örter | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | | Körvel | | | |
| | | | Gräslök | | | |
| | | | Persilja | | | 0,5 |
| | | | Snittselleri | | | |
| | | | Övriga | | | 0,02 (1) |
| | vi) | BALJVÄXTER (färska) | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | | Bönor (med skida) | | | |
| | | Bönor (utan skida) | | | |
| | | Ärter (med skida) | | | |
| | | Ärter (utan skida) | | | |
| | | Övriga | | | |
| | vii) | STJÄLKGRÖNSAKER (färska) | | | |
| | | Sparris | | | 0,1 |
| | | Kardon | | | |
| | | Bladselleri | | | 0,5 |
| | | Fänkål | | | |
| | | Kronärtskockor | | 0,2 (2) | |
| | | Purjolök | | | 0,1 |
| | | Rabarber | | | |
| | | Övriga | | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | viii) | SVAMP | | 0,05 (1)
   (2) | |
| | | a) | Odlad svamp | | | 0,05 |
| | | b) | Vild svamp | | | 0,02 (1) |
| 3. | Baljväxter (torkade) | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | Bönor | | | |
| | Linser | | | |
| | Ärter | | | |
| | Övriga | | | |
| 4. | Oljeväxtfröer | 0,1 (1)
   (2) | 0,1 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | Linfrö | | | |
| | Jordnötter | | | |
| | Vallmofrö | | | |
| | Sesamfrö | | | |
| | Solrosfrö | | | |
| | Rapsfrö | | | |
| | Sojabönor | | | |
| | Senapsfrö | | | |
| | Bomullsfrö | | | |
| | Hampfrö | | | |
| | Övriga | | | |
| 5. | Potatis | 0,05 (1)
   (2) | 0,05 (1)
   (2) | 0,02 (1) |
| | Färskpotatis | | | |
| | Övrig matpotatis | | | |
| 6. | Te (torkade blad och stjälkar, jästa eller ojästa av Camellia sinensis) | 0,1 (1)
   (2) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1) |
| 7. | Humle (torkad), inkl. pellets och icke-koncentrerat pulver) | 0,1 (1)
   (2) | 0,1 (1)
   (2) | 0,05 (1) |

Bekämpningsmedelsrester och gränsvärden (mg/kg)

Grupper av och exempel på individuella produkter för vilka gränsvärdena gäller

Desmedifam

Fenmedifam

Klorfenvinfos (summan av E- och Z-isomerer)

”1.

Frukt: färsk, torkad eller okokt, konserverad genom frysning utan tillsats av socker; nötter

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

i)

CITRUSFRUKTER

0,05 (1)
   (2)

Grapefrukt

Citroner

Lime

Mandariner (inkl. klementiner och andra hybrider)

Apelsiner

Pomelo

Övriga

ii)

TRÄDNÖTTER (skalade eller oskalade)

0,05 (1)
   (2)

Mandlar

Paranötter

Cashewnötter

Kastanjer

Kokosnötter

Hasselnötter

Macadamianötter

Pekannötter

Pinjenötter

Pistaschmandlar

Valnötter

Övriga

iii)

KÄRNFRUKTER

0,05 (1)
   (2)

Äpplen

Päron

Kvitten

Övriga

iv)

STENFRUKTER

0,05 (1)
   (2)

Aprikoser

Körsbär

Persikor (inkl. nektariner och liknande hybrider)

Plommon

Övriga

v)

BÄR OCH SMÅ FRUKTER

a)

Bordsdruvor och druvor för vinframställning

0,05 (1)
   (2)

Bordsdruvor

Druvor för vinframställning

b)

Jordgubbar (odlade)

0,1 (1)
   (2)

c)

Rubusfrukter (odlade)

0,05 (1)
   (2)

Björnbär

Blåhallon

Loganbär

Hallon

Övriga

d)

Andra små frukter och bär (odlade)

0,05 (1)
   (2)

Blåbär

Tranbär

Vinbär (röda, svarta och vita)

Krusbär

Övriga

e)

Vilda bär och frukter

0,05 (1)
   (2)

vi)

DIVERSE FRUKTER

0,05 (1)
   (2)

Avokado

Bananer

Dadlar

Fikon

Kiwifrukter

Kumquat

Litchiplommon

Mango

Oliver (för förtäring)

Oliver (för oljeutvinning)

Papaya

Passionsfrukt

Ananas

Granatäpplen

Övriga

2.

Grönsaker, färska eller okokta, frysta eller torkade

0,05 (1)
   (2)

i)

ROT- OCH KNÖLGRÖNSAKER

Rödbetor

0,1 (1)
   (2)

Morötter

0,5

Cassava

Rotselleri

Pepparrot

Jordärtskockor

Palsternackor

0,5

Rotpersilja

Rädisor

0,5

Haverrot

Sötpotatis

Kålrötter

0,5

Rovor

0,5

Jamsrot

Övriga

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

ii)

LÖKGRÖNSAKER

0,05 (1)
   (2)

Vitlök

0,5

Kepalök

Schalottenlök

0,5

Knipplök

Övriga

0,02 (1)

iii)

FRUKTGRÖNSAKER

0,05 (1)
   (2)

a)

Solanacea

0,02 (1)

Tomater

Paprikor

Auberginer

Okra

Övriga

b)

Gurkväxter – ätligt skal

Slanggurkor

Druvgurkor

Zucchini (sommarsquash)

0,1

Övriga

0,02 (1)

c)

Gurkväxter – oätligt skal

0,02 (1)

Meloner

Squash (vintersquash)

Vattenmeloner

Övriga

d)

Sockermajs

0,02 (1)

iv)

KÅLGRÖNSAKER

0,05 (1)
   (2)

a)

Blommande kål

0,02 (1)

Broccoli (även Calabrese)

Blomkål

Övriga

b)

Huvudbildande kål

Brysselkål

0,1

Vitkål, rödkål

0,5

Övriga

0,02 (1)

c)

Bladbildande kål

0,02 (1)

Salladskål

Grönkål

Övriga

d)

Kålrabbi

0,3

v)

BLADGRÖNSAKER OCH FÄRSKA ÖRTER

a)

Sallat och liknande

0,05 (1)
   (2)

Kryddkrasse

0,1

Vårklynne

0,1

Sallat

Escarole

Ruccolasallad

Blad och stjälkar av kål

Övriga

0,02 (1)

b)

Spenat och liknande

0,5 (2)

Spenat

0,1

Mangold

Övriga

0,02 (1)

c)

Vattenkrasse

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

d)

Endivsallat

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

e)

Örter

0,05 (1)
   (2)

Körvel

Gräslök

Persilja

0,5

Snittselleri

Övriga

0,02 (1)

vi)

BALJVÄXTER (färska)

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

Bönor (med skida)

Bönor (utan skida)

Ärter (med skida)

Ärter (utan skida)

Övriga

vii)

STJÄLKGRÖNSAKER (färska)

Sparris

0,1

Kardon

Bladselleri

0,5

Fänkål

Kronärtskockor

0,2 (2)

Purjolök

0,1

Rabarber

Övriga

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

viii)

SVAMP

0,05 (1)
   (2)

a)

Odlad svamp

0,05

b)

Vild svamp

0,02 (1)

3.

Baljväxter (torkade)

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

Bönor

Linser

Ärter

Övriga

4.

Oljeväxtfröer

0,1 (1)
   (2)

0,1 (1)
   (2)

0,02 (1)

Linfrö

Jordnötter

Vallmofrö

Sesamfrö

Solrosfrö

Rapsfrö

Sojabönor

Senapsfrö

Bomullsfrö

Hampfrö

Övriga

5.

Potatis

0,05 (1)
   (2)

0,05 (1)
   (2)

0,02 (1)

Färskpotatis

Övrig matpotatis

6.

Te (torkade blad och stjälkar, jästa eller ojästa av Camellia sinensis)

0,1 (1)
   (2)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)

7.

Humle (torkad), inkl. pellets och icke-koncentrerat pulver)

0,1 (1)
   (2)

0,1 (1)
   (2)

0,05 (1)

---

(1)  Lägsta analytiska bestämningsgräns.

1

(2)  Provisoriskt gränsvärde som fastställts i enlighet med artikel 4.1 f i direktiv 91/414/EEG.”

2

---

| 27.7.2006 | SV | Europeiska unionens officiella tidning | L 206/36 |
| --- | --- | --- | --- |

27.7.2006

SV

Europeiska unionens officiella tidning

L 206/36

---

KOMMISSIONENS DIREKTIV 2006/63/EG

av den 14 juli 2006

om ändring av bilagorna II–VII till rådets direktiv 98/57/EG om bekämpning av Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi m.fl.

EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT DETTA DIREKTIV

med beaktande av fördraget om upprättandet av Europeiska gemenskapen,

med beaktande av rådets direktiv 98/57/EG av den 20 juli 1998 (1) om bekämpning av Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi m.fl., särskilt artikel 11, och

av följande skäl:

| (1) | En av de allvarligaste skadegörarna på potatis och tomater är Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi m.fl., den sjukdomsalstrande organism som orsakar mörk ringröta på potatis och bakteriologisk vissnesjuka hos potatis och tomater (nedan kallad ”skadegöraren”). |
| --- | --- |

(1)

En av de allvarligaste skadegörarna på potatis och tomater är Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi m.fl., den sjukdomsalstrande organism som orsakar mörk ringröta på potatis och bakteriologisk vissnesjuka hos potatis och tomater (nedan kallad ”skadegöraren”).

| (2) | Denna skadegörare förekommer fortfarande i vissa delar av gemenskapen. |
| --- | --- |

(2)

Denna skadegörare förekommer fortfarande i vissa delar av gemenskapen.

| (3) | I direktiv 98/57/EG fastställs detaljerade åtgärder som skall vidtas inom medlemsstaterna mot skadegöraren för att lokalisera den och kartlägga dess utbredning, förhindra dess förekomst och spridning, samt, om den konstateras, förhindra dess spridning och bekämpa den i syfte att utrota den. |
| --- | --- |

(3)

I direktiv 98/57/EG fastställs detaljerade åtgärder som skall vidtas inom medlemsstaterna mot skadegöraren för att lokalisera den och kartlägga dess utbredning, förhindra dess förekomst och spridning, samt, om den konstateras, förhindra dess spridning och bekämpa den i syfte att utrota den.

| (4) | Sedan dess har en betydande utveckling skett när det gäller förståelsen av skadegörarens biologi samt av förfarandena för att upptäcka och identifiera den. Erfarenheterna från bekämpning av skadegöraren i praktiken visar dessutom att det fordras en översyn av ett flertal tekniska bestämmelser knutna till bekämpningsåtgärderna. |
| --- | --- |

(4)

Sedan dess har en betydande utveckling skett när det gäller förståelsen av skadegörarens biologi samt av förfarandena för att upptäcka och identifiera den. Erfarenheterna från bekämpning av skadegöraren i praktiken visar dessutom att det fordras en översyn av ett flertal tekniska bestämmelser knutna till bekämpningsåtgärderna.

| (5) | Därför förefaller det nödvändigt att se över och uppdatera bestämmelserna i vissa av bilagorna till direktiv 98/57/EG. |
| --- | --- |

(5)

Därför förefaller det nödvändigt att se över och uppdatera bestämmelserna i vissa av bilagorna till direktiv 98/57/EG.

| (6) | När det gäller förfarandena för upptäckt och identifiering har FISH (fluorescent in-situ hybridization), en modern detektionsmetod, tagits med. Förbättringar av metoden polymeraskedjereaktion (PCR), liksom förbättringar av olika tekniska beståndsdelar i det nuvarande förfarandet för upptäckt och identifiering av skadegöraren i andra värdväxter än potatis och i vatten och jord, har också tagits med. |
| --- | --- |

(6)

När det gäller förfarandena för upptäckt och identifiering har FISH (fluorescent in-situ hybridization), en modern detektionsmetod, tagits med. Förbättringar av metoden polymeraskedjereaktion (PCR), liksom förbättringar av olika tekniska beståndsdelar i det nuvarande förfarandet för upptäckt och identifiering av skadegöraren i andra värdväxter än potatis och i vatten och jord, har också tagits med.

| (7) | När det gäller de tekniska komponenterna i bekämpningsåtgärderna har följande förbättrade bestämmelser fastställts: det sätt som proverna förvaras på för att möjliggöra spårning av skadegöraren, de beståndsdelar som behövs för att fastställa omfattningen hos den troliga nedsmittningen, närmare uppgifter om varje anmälan om bekräftad närvaro av skadegöraren och om det relevanta smittade området, åtgärder att vidta på produktionsplatser som har förklarats smittade inom de avgränsade områdena. Dessutom har vissa bestämmelser rörande tomater tagits med för att tomatplantans betydelse som värdväxt för skadegöraren i högre grad skall beaktas. |
| --- | --- |

(7)

När det gäller de tekniska komponenterna i bekämpningsåtgärderna har följande förbättrade bestämmelser fastställts: det sätt som proverna förvaras på för att möjliggöra spårning av skadegöraren, de beståndsdelar som behövs för att fastställa omfattningen hos den troliga nedsmittningen, närmare uppgifter om varje anmälan om bekräftad närvaro av skadegöraren och om det relevanta smittade området, åtgärder att vidta på produktionsplatser som har förklarats smittade inom de avgränsade områdena. Dessutom har vissa bestämmelser rörande tomater tagits med för att tomatplantans betydelse som värdväxt för skadegöraren i högre grad skall beaktas.

| (8) | De åtgärder som föreskrivs i detta direktiv är förenliga med yttrandet från ständiga kommittén för växtskydd. |
| --- | --- |

(8)

De åtgärder som föreskrivs i detta direktiv är förenliga med yttrandet från ständiga kommittén för växtskydd.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

Artikel 1

Bilagorna II–VII till direktiv 98/57/EG skall ersättas med motsvarande texter som utgör bilaga till det här direktivet.

Artikel 2

1.   Medlemsstaterna skall senast den 31 mars 2007 anta och offentliggöra de lagar och andra författningar som är nödvändiga för att följa detta direktiv. De skall genast överlämna texterna till dessa bestämmelser till kommissionen tillsammans med en jämförelsetabell för dessa bestämmelser och bestämmelserna i detta direktiv.

De skall tillämpa dessa bestämmelser från och med den 1 april 2007.

När en medlemsstat antar dessa bestämmelser skall de innehålla en hänvisning till detta direktiv eller åtföljas av en sådan hänvisning när de offentliggörs. Närmare föreskrifter om hur hänvisningen skall göras skall varje medlemsstat själv utfärda.

2.   Medlemsstaterna skall omgående till kommissionen överlämna texterna till de centrala bestämmelser i nationell lagstiftning som de antar inom det område som omfattas av detta direktiv.

Artikel 3

Detta direktiv träder i kraft den tredje dagen efter det att det har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning.

Artikel 4

Detta direktiv riktar sig till medlemsstaterna.

Utfärdat i Bryssel den 14 juli 2006.

På kommissionens vägnar

Markos KYPRIANOU

Ledamot av kommission

---

(1)  EGT L 235, 21.8.1998, s. 1.

1

---

BILAGA

BILAGA II

TESTPROGRAM FÖR ATT DIAGNOSTISERA, UPPTÄCKA OCH IDENTIFIERA RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI M. FL.

Testprogrammets omfatting

I det framtagna programmet beskrivs de olika förfarandena för att:

| i) | diagnostisera mörk ringröta i potatisknölar och bakteriologisk vissnesjuka på potatis- och tomatplantor och vissa andra värdväxter, |
| --- | --- |

i)

diagnostisera mörk ringröta i potatisknölar och bakteriologisk vissnesjuka på potatis- och tomatplantor och vissa andra värdväxter,

| ii) | upptäcka Ralstonia solanacearum i prover av potatisknölar, potatis- och tomatplantor och andra värdväxter, vatten och jord, |
| --- | --- |

ii)

upptäcka Ralstonia solanacearum i prover av potatisknölar, potatis- och tomatplantor och andra värdväxter, vatten och jord,

| iii) | identifiera Ralstonia solanacearum (R. solanacearum). |
| --- | --- |

iii)

identifiera Ralstonia solanacearum (R. solanacearum).

INNEHÅLL

| | | Sida |
| --- | --- | --- |
| | Allmänna principer | 40 |
| Avsnitt I: | Tillämpning av testprogrammet | 40 |
| | 1. | Program för diagnos på brun ringröta och bakteriologisk vissnesjuka (R. solanacearum) i potatisknölar och i potatisplantor, tomatplantor eller andra värdväxter med symtom på brun ringröta eller bakteriologisk vissnesjuka. | 40 |
| | 2. | Program för att upptäcka och identifiera R. solanacearum i prover av asymtomatiska potatisknölar | 43 |
| | 3. | Program för att upptäcka och identifiera R. solanacearum i prover av asymtomatiska potatisplantor, tomatplantor eller andra värdväxter. | 46 |
| Avsnitt II: | Detaljerade metoder för att upptäcka Ralstonia solanacearum i potatisknölar och i potatisplantor, tomatplantor eller andra värdväxter med symtom på brun ringröta eller bakteriologisk vissnesjuka | 48 |
| | 1. | Symtom | 48 |
| | 2. | Snabbscreeningtest | 48 |
| | 3. | Isoleringsförfarande | 49 |
| | 4. | Identifieringstest för R. solanacearum | 49 |
| Avsnitt III: | 1. | Detaljerade metoder för att upptäcka och identifiera R. solanacearum i prover av asymtomatiska potatisknölar | 49 |
| | | 1.1 | Preparering av prover | 49 |
| | | 1.2 | Testning | 51 |
| | 2. | Detaljerade metoder för att upptäcka och identifiera R. solanacearum i prover av asymtomatiska potatisplantor, tomatplantor eller andra värdväxter | 51 |
| | | 2.1 | Preparering av prover | 51 |
| | | 2.2 | Testning | 52 |
| Avsnitt IV: | 1. | Program för att upptäcka och identifiera R. solanacearum i vatten | 53 |
| | 2. | Metoder för att upptäcka och identifiera R. solanacearum i vatten | 55 |
| | | 2.1 | Preparering av prover | 55 |
| | | 2.2 | Testning | 55 |
| Avsnitt V: | 1. | Program för att upptäcka och identifiera R. solanacearum i jord | 56 |
| | 2. | Metoder för att upptäcka och identifiera R. solanacearum i jord | 58 |
| | | 2.1 | Preparering av prover | 58 |
| | | 2.2 | Testning | 58 |
| Avsnitt VI: | Optimerade protokoll för att upptäcka och identifiera R. solanacearum | 58 |
| | A. | Test för diagnos och upptäckt | 58 |
| | | 1. | Kärlströmningstest | 58 |
| | | 2. | Upptäckt av poly-β-hydroxibutyratkorn (PHB) | 58 |
| | | 3. | Serumagglutinationstest | 59 |
| | | 4. | Selektiv isolering | 60 |
| | | | 4.1 | Odling på selektivt medium | 60 |
| | | | 4.2 | Anrikningsförfarande | 60 |
| | | 5. | Immunofluorescenstest (IF-test) | 61 |
| | | 6. | Polymeraskedjereaktionstest (PCR-test) | 64 |
| | | | 6.1 | Metoder för rening av DNA | 65 |
| | | | | 6.1 a) | Metod enligt Pastrik (2000) | 65 |
| | | | | 6.1 b) | Andra metoder | 65 |
| | | | 6.2 | PCR | 66 |
| | | | 6.3 | Analys av PCR-produkten | 66 |
| | | 7. | Fluorescerande in situ-hybridisering (FISH-test) | 67 |
| | | 8. | Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA-test) | 69 |
| | | | 8 a) | Indirekt ELISA | 69 |
| | | | 8 b) | DASI (Double-Antibody Sandwich Indirect) ELISA | 70 |
| | | 9. | Biotest | 71 |
| | B. | Identifieringstest | 72 |
| | | 1. | Nutrient- och enzymatiskt identifieringstest | 72 |
| | | 2. | IF-test | 72 |
| | | 3. | ELISA-test | 73 |
| | | 4. | PCR-test | 73 |
| | | 5. | FISH-test | 73 |
| | | 6. | Fettsyraprofilering (FAP) | 73 |
| | | 7. | Metoder för stamkarakterisering | 73 |
| | | | 7.1 | Biovarbestämning | 73 |
| | | | 7.2 | Genomiskt fingeravtryck | 74 |
| | | | 7.3 | PCR-metoder | 74 |
| | C. | Verifieringstest | 74 |
| | | Tillägg 1 | Laboratorier som utför optimering och validering av protokoll | 76 |
| | | Tillägg 2 | Medier för isolering och odling av R. solanacearum | 77 |
| | | Tillägg 3 | A) | Standardiserade kontrollmaterial tillgängliga i handeln | 79 |
| | | | B) | Preparering av kontroller | 80 |
| | | Tillägg 4 | Buffertar för testförfaranden | 82 |
| | | Tillägg 5 | Bestämning av kontamineringsnivå i IF- och FISH-tester | 85 |
| | | Tillägg 6 | Validerade PCR-protokoll och PCR-reagens | 86 |
| | | Tillägg 7 | Validerade reagens för FISH-test | 91 |
| | | Tillägg 8 | Odlingsbetingelser för tomater och äggplantor | 93 |
| | | Referenser | | 94 |

Sida

Allmänna principer

40

Avsnitt I:

Tillämpning av testprogrammet

40

1.

Program för diagnos på brun ringröta och bakteriologisk vissnesjuka (R. solanacearum) i potatisknölar och i potatisplantor, tomatplantor eller andra värdväxter med symtom på brun ringröta eller bakteriologisk vissnesjuka.

40

2.

Program för att upptäcka och identifiera R. solanacearum i prover av asymtomatiska potatisknölar

43

3.

Program för att upptäcka och identifiera R. solanacearum i prover av asymtomatiska potatisplantor, tomatplantor eller andra värdväxter.

46

Avsnitt II:

Detaljerade metoder för att upptäcka Ralstonia solanacearum i potatisknölar och i potatisplantor, tomatplantor eller andra värdväxter med symtom på brun ringröta eller bakteriologisk vissnesjuka

48

1.

Symtom

48

2.

Snabbscreeningtest

48

3.

Isoleringsförfarande

49

4.

Identifieringstest för R. solanacearum

49

Avsnitt III:

1.

Detaljerade metoder för att upptäcka och identifiera R. solanacearum i prover av asymtomatiska potatisknölar

49

1.1

Preparering av prover

49

1.2

Testning

51

2.

Detaljerade metoder för att upptäcka och identifiera R. solanacearum i prover av asymtomatiska potatisplantor, tomatplantor eller andra värdväxter

51

2.1

Preparering av prover

51

2.2

Testning

52

Avsnitt IV:

1.

Program för att upptäcka och identifiera R. solanacearum i vatten

53

2.

Metoder för att upptäcka och identifiera R. solanacearum i vatten

55

2.1

Preparering av prover

55

2.2

Testning

55

Avsnitt V:

1.

Program för att upptäcka och identifiera R. solanacearum i jord

56

2.

Metoder för att upptäcka och identifiera R. solanacearum i jord

58

2.1

Preparering av prover

58

2.2

Testning

58

Avsnitt VI:

Optimerade protokoll för att upptäcka och identifiera R. solanacearum

58

A.

Test för diagnos och upptäckt

58

1.

Kärlströmningstest

58

2.

Upptäckt av poly-β-hydroxibutyratkorn (PHB)

58

3.

Serumagglutinationstest

59

4.

Selektiv isolering

60

4.1

Odling på selektivt medium

60

4.2

Anrikningsförfarande

60

5.

Immunofluorescenstest (IF-test)

61

6.

Polymeraskedjereaktionstest (PCR-test)

64

6.1

Metoder för rening av DNA

65

6.1 a)

Metod enligt Pastrik (2000)

65

6.1 b)

Andra metoder

65

6.2

PCR

66

6.3

Analys av PCR-produkten

66

7.

Fluorescerande in situ-hybridisering (FISH-test)

67

8.

Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA-test)

69

8 a)

Indirekt ELISA

69

8 b)

DASI (Double-Antibody Sandwich Indirect) ELISA

70

9.

Biotest

71

B.

Identifieringstest

72

1.

Nutrient- och enzymatiskt identifieringstest

72

2.

IF-test

72

3.

ELISA-test

73

4.

PCR-test

73

5.

FISH-test

73

6.

Fettsyraprofilering (FAP)

73

7.

Metoder för stamkarakterisering

73

7.1

Biovarbestämning

73

7.2

Genomiskt fingeravtryck

74

7.3

PCR-metoder

74

C.

Verifieringstest

74

Tillägg 1

Laboratorier som utför optimering och validering av protokoll

76

Tillägg 2

Medier för isolering och odling av R. solanacearum

77

Tillägg 3

A)

Standardiserade kontrollmaterial tillgängliga i handeln

79

B)

Preparering av kontroller

80

Tillägg 4

Buffertar för testförfaranden

82

Tillägg 5

Bestämning av kontamineringsnivå i IF- och FISH-tester

85

Tillägg 6

Validerade PCR-protokoll och PCR-reagens

86

Tillägg 7

Validerade reagens för FISH-test

91

Tillägg 8

Odlingsbetingelser för tomater och äggplantor

93

Referenser

94

ALLMÄNNA PRINCIPER

Optimerade protokoll för de olika metoderna, validerade reagenser och närmare uppgifter om beredningen av test- och kontrollmaterial finns i tilläggen. En förteckning över de laboratorier som togs med i optimeringen och valideringen av protokoll finns i tillägg 1.

Eftersom protokollen omfattar upptäckt av en karantänsorganism och användning av R. solanacearum som kontrollmaterial, är det nödvändigt att förfarandena tillämpas under lämpliga karantänförhållanden med lämpliga anordningar för avfallshantering och i enlighet med lämpliga licenser utfärdade av de officiella växtinspektionsmyndigheterna.

Testparametrarna skall utformas så att de säkerställer enhetliga och reproducerbara upptäckter av halter av R. solanacearum vid de fastställda tröskelvärdena för de valda metoderna.

En noggrann förberedning av de positiva kontrollerna är av största vikt.

Testning i enlighet med de föreskrivna tröskelvärdena fordrar även att utrustningen ställs in, underhålls och kalibreras på ett korrekt sätt, att reagenserna handhas och förvaras varsamt och att samtliga åtgärder för att förhindra nedsmittning mellan prover vidtas, t.ex. separering av positiva kontroller från prover. Standarder för kvalitetskontroll skall tillämpas för att undvika administrativa och andra fel, särskilt när det gäller märkning och dokumentering.

En misstänkt förekomst enligt artikel 4.2 i direktiv 98/57/EG innebär ett positivt resultat vid diagnostiska tester eller screeningtester som utförs på ett prov i enlighet med vad som anges i flödesdiagrammen. Om det första screeningtestet (IF-test, PCR/FISH, selektiv isolering) är positivt, skall detta bekräftas genom ett andra screeningtest, baserat på en annan biologisk princip.

Om det första screeningtestet är positivt, misstänks nedsmittning med R. solanacearum och ett andra screeningtest skall göras. Om det andra screeningtestet är positivt bekräftas misstanken (misstänkt förekomst) och testerna i enlighet med programmet skall fortsätta. Om det andra screeningtestet är negativt betraktas provet som icke nedsmittat med R. solanacearum.

Bekräftad närvaro enligt artikel 5.1 i direktiv 98/57/EG innebär isolering och identifiering av en renkultur av R. solanacearum med bekräftad patogenitet.

AVSNITT I

TILLÄMPNING AV TESTPROGRAMMET

1.   Program för diagnos på brun ringröta och bakteriologisk vissnesjuka (Ralstonia solanacearum) i potatisknölar och i potatisplantor, tomatplantor eller andra värdväxter med symtom på brun ringröta eller bakteriologisk vissnesjuka.

Testförfarandet är avsedd för potatisknölar och potatisplantor som uppvisar typiska eller misstänkta symtom på mörk ringröta eller vissnesjuka. Den omfattar ett snabbscreeningtest, isolering av den sjukdomsalstrande organismen från infekterad kärlvävnad på ett (selektivt) medium och, vid positivt utslag, identifiering av kulturen som Ralstonia solanacearum.

Image

Image

2.   Program för att upptäcka och identifiera Ralstonia solanacearum i prover av asymtomatiska potatisknölar

Princip:

Syftet med testförfarandet är att upptäcka latenta infektioner i potatisknölar. Minst två positiva screeningtest3 baserade på olika biologiska principer skall verifieras genom isolering av patogenet, vid isolering av typiska kolonier följt av identifiering av en renkultur som R. solanacearum. Endast ett positivt screeningtest är inte tillräckligt för att provet skall kunna betraktas som misstänkt.

Screening- och isoleringstesterna skall möjliggöra en upptäckt av 103–104 celler/ml återsuspenderade pellet, som är medtagna som positiva kontroller i varje testserie.

Image

Image

3.   Program för att upptäcka och identifiera Ralstonia solanacearum i prover av asymtomatiska potatisplantor, tomatplantor eller andra värdväxter

Image

Image

AVSNITT II

DETALJERADE METODER FÖR ATT UPPTÄCKA RALSTONIA SOLANACEARUM I POTATISKNÖLAR OCH I POTATISPLANTOR, TOMATPLANTOR ELLER ANDRA VÄRDVÄXTER MED SYMTOM PÅ BRUN RINGRÖTA ELLER BAKTERIOLOGISK VISSNESJUKA

1.   Symtom (se webbplats: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

1.1   Symtom på potatis

Potatisplantan. Det tidiga skedet av infektionen på fältet känns igen på att bladen vissnar mot toppen av plantan vid höga dagstemperaturer, men återhämtar sig under natten. På de tidiga stadierna av vissnande är bladen fortfarande gröna, men senare gulnar de för att så småningom bli brunt nekrokiska. Även epinasti uppträder. Vissningen hos skottet eller hela plantan blir snabbt bestående och leder till att plantan faller samman och dör. Kärlvävnaden i stjälkar skurna på tvären från vissnade plantor är vanligen bruna, och ett mjölkaktigt bakteriellt sekret avsöndras från den skurna ytan eller kan pressas ut. När en skuren stjälk ställs i vatten strömmar trådar av slem ut från kärlknippena.

Potatisknölen. Potatisknölarna måste skäras på tvären nära naveländan (stolonändan) eller på längden över stolonändan. I det tidiga skedet av infektionen syns en glasaktig gul till ljusbrun missfärgning av kärlringen, från vilken ett blekgult krämartat bakteriellt sekret spontant kommer fram efter några minuter. Senare blir kärlmissfärgningen tydligare brun, och nekrosen kan sprida sig till parenkymvävnaden. Vid långt framskridna skeden bryter infektionen fram från naveländan och ögonen, från vilka bakterieslem utsöndras så att jordpartiklar häftar vid. Rödbruna lätt insjunkna lesioner i skalet kan uppträda på skalet på grund av kollaps av kärlringvävnader inuti knölen. Sekundära utvecklingsstadier av svamp- och bakteriebetingad blötröta är vanligt förekommande i långt framskridna stadier av sjukdomen.

1.2   Symtom på tomater

Tomatplantan. Det första synliga symtomet är att de yngsta bladen blir sladdriga. Under gynnsamma miljöförhållanden för patogenet (jordtemperatur cirka 25 °C, mättad fuktighet) följer epinasti och vissning av ena sidan eller hela plantan inom några få dagar, vilket leder till att hela plantan faller samman. Under mindre gynnsamma förhållanden (jordtemperatur under 21 °C) inträffar vissning mindre ofta, men ett stort antal extra rottrådar kan utvecklas på stjälken. Vattendränkta strimmor som löper från stjälkens bas kan observeras, vilket är tecken på nekros i kärlsystemet. När stjälken genomskärs utsöndrar missfärgade bruna kärlvävnader vitt eller gulaktigt bakteriellt sekret.

1.3   Symtom på andra värdväxter

Solanum dulcamara och S. nigrum. Under naturliga förhållanden uppträder vissningsymtom sällan hos detta ogräs som är värdväxt, om inte jordtemperaturen överskrider 25 °C eller om inokulationen är omfattande (t.ex. i fallet S. nigrum, om den växer i anslutning till potatis- eller tomatplantor som dött). När vissnande sker uppträder samma symtom som för tomater. Icke-vissnande plantor av S. dulcamara som växer med stjälkarna och rötterna i vatten kan uppvisa inre ljusbrun missfärgning hos kärlvävnaderna i ett tvärsnitt av stjälkbasen eller av de stjälkdelar som befinner sig under vatten. Bakterieslem kan utsöndras från avskurna kärlvävnader eller bilda trådar av slem om den skurna stjälken ställs vertikalt i vatten, även i frånvaro av vissningssymtom.

2.   Snabbscreeningtest

Snabbscreeningtest underlättar presumtiv diagnos men är inte nödvändiga. Använd ett eller flera av följande validerade test:

2.1   Kärlströmningstest

(Se avsnitt VI.A.1.)

2.2   Upptäckt av poly-β-hydroxybutyratkorn (PHB)

Karakteristiska PHB-korn i celler av R. solanacearum kan göras synliga genom att färga värmefixerade utstrykningspreparat av bakteriellt sekret från infekterad vävnad på ett objektglas med Nilblått A eller Sudansvart B (se avsnitt VI.A.2.).

2.3   Serumagglutinationstest

(Se avsnitt VI.A.3.)

2.4   Andra test

Andra lämpliga snabbscreeningtest omfattar IF-test (se avsnitt VI.A.5.), FISH-test (se avsnitt VI.A.7.), ELISA-test (se avsnitt VI.A.8.) och PCR-test (se avsnitt VI.A.6).

3.   Isoleringsförfarande

| a) | Avlägsna sekret eller partier med missfärgad vävnad från knölens kärlring på potatis eller från stjälkens kärlsträngar på potatis, tomat eller andra vissnande värdväxter. Suspendera i en mindre volym av sterilt destillerat vatten eller 50 mM fosfatbuffert (tillägg 4) och låt stå i 5–10 minuter. |
| --- | --- |

a)

Avlägsna sekret eller partier med missfärgad vävnad från knölens kärlring på potatis eller från stjälkens kärlsträngar på potatis, tomat eller andra vissnande värdväxter. Suspendera i en mindre volym av sterilt destillerat vatten eller 50 mM fosfatbuffert (tillägg 4) och låt stå i 5–10 minuter.

| b) | Bered en serie av decimala utspädningar av suspensionen. |
| --- | --- |

b)

Bered en serie av decimala utspädningar av suspensionen.

| c) | För över 50–100 μl av suspensionen och utspädningarna till ett vanligt näringsmedium (NA, YPGA eller SPA; se tillägg 2) och/eller till Kelmans tetrazolium medium (tillägg 2) och/eller till ett validerat selektivt substrat (t.ex. SMSA; se tillägg 2). Utsprid eller utstryk med lämplig plattspridning från spädningsserie. Bered, om det anses lämpligt, separata plattor med en utspädd cellsuspension av R. solanacearum biovar 2 som positiv kontroll. |
| --- | --- |

c)

För över 50–100 μl av suspensionen och utspädningarna till ett vanligt näringsmedium (NA, YPGA eller SPA; se tillägg 2) och/eller till Kelmans tetrazolium medium (tillägg 2) och/eller till ett validerat selektivt substrat (t.ex. SMSA; se tillägg 2). Utsprid eller utstryk med lämplig plattspridning från spädningsserie. Bered, om det anses lämpligt, separata plattor med en utspädd cellsuspension av R. solanacearum biovar 2 som positiv kontroll.

| d) | Inkubera plattorna under 2–6 dagar vid 28 °C.






  — | På det allmänna näringsmediet utvecklar virulenta isolat av R. solanacearum pärl-/krämvita, platta, oregelbundna, flödiga kolonier med karakteristiska virvlar i mitten. Icke virulenta former av R. solanacearum utvecklar små runda icke-flödiga smörlika kolonier som är helt krämvita. |
| --- | --- | --- |

d)

Inkubera plattorna under 2–6 dagar vid 28 °C.

—

På det allmänna näringsmediet utvecklar virulenta isolat av R. solanacearum pärl-/krämvita, platta, oregelbundna, flödiga kolonier med karakteristiska virvlar i mitten. Icke virulenta former av R. solanacearum utvecklar små runda icke-flödiga smörlika kolonier som är helt krämvita.

| — | På Kelmans tetrazolium- och SMSA-medier har virvlarna blodröd färg. Icke virulenta former av R. solanacearum utvecklar små runda icke-flödiga smörlika kolonier som är fullständigt djupröda. |
| --- | --- |

—

På Kelmans tetrazolium- och SMSA-medier har virvlarna blodröd färg. Icke virulenta former av R. solanacearum utvecklar små runda icke-flödiga smörlika kolonier som är fullständigt djupröda.

4.   Identifieringstest för R. solanacearum

Test för att bekräfta identiteten hos förmodade isolat av R. solanacearum behandlas i avsnitt VI.B.

AVSNITT III

1.   Detaljerade metoder för att upptäcka och identifiera Ralstonia solanacearum i prover av asymtomatiska potatisknölar

1.1   Preparering av prover

Observera:

| — | Den standardiserade provmängden är 200 knölar per test. Vid intensivare provtagning krävs fler tester på prover av denna storlek. Ett större antal knölar i provet medför inhibering eller svårighet att tolka resultaten. Förfarandet kan emellertid användas för prover med färre än 200 knölar, om det endast finns färre knölar tillgängliga. |
| --- | --- |

—

Den standardiserade provmängden är 200 knölar per test. Vid intensivare provtagning krävs fler tester på prover av denna storlek. Ett större antal knölar i provet medför inhibering eller svårighet att tolka resultaten. Förfarandet kan emellertid användas för prover med färre än 200 knölar, om det endast finns färre knölar tillgängliga.

| — | Valideringen av samtliga nedan behandlade metoder för upptäckt har skett på grundval av test av stickprover på 200 knölar. |
| --- | --- |

—

Valideringen av samtliga nedan behandlade metoder för upptäckt har skett på grundval av test av stickprover på 200 knölar.

| — | Det nedan beskrivna potatisextraktet kan även användas för upptäckt av den bakterie som orsakar ljus ringröta hos potatis, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. |
| --- | --- |

—

Det nedan beskrivna potatisextraktet kan även användas för upptäckt av den bakterie som orsakar ljus ringröta hos potatis, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

Frivillig förbehandling före provpreparering:

| a) | Inkubation av prover vid 25–30 °C under upp till 2 veckor före testning för att främja förökning av alla populationer av R. solanacearum. |
| --- | --- |

a)

Inkubation av prover vid 25–30 °C under upp till 2 veckor före testning för att främja förökning av alla populationer av R. solanacearum.

| b) | Tvätta knölarna. Använd lämpliga desinfektionsmedel (vid PCR-test klorföreningar för att avlägsna patogent DNA) och tvättmedel mellan varje stickprov. Lufttorka knölarna. Detta rengöringsförfarande är användbart (men inte obligatoriskt) i synnerhet vid jordiga prover och om ett PCR-test eller ett direkt isoleringstest skall göras. |
| --- | --- |

b)

Tvätta knölarna. Använd lämpliga desinfektionsmedel (vid PCR-test klorföreningar för att avlägsna patogent DNA) och tvättmedel mellan varje stickprov. Lufttorka knölarna. Detta rengöringsförfarande är användbart (men inte obligatoriskt) i synnerhet vid jordiga prover och om ett PCR-test eller ett direkt isoleringstest skall göras.

1.1.1   Avlägsna med en ren, desinficerad skalpell eller grönsakskniv epidermis från varje knöls navelända (stolon) så att kärlringvävnaderna blir synliga. Skär försiktigt ur en liten kärna av kärlringvävnad i naveländan och minimera mängden icke-kärlringvävnad (se webbsida: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Anmärkning: Lägg undan alla (ruttnande) knölar med misstänkta symtom på brunröta och testa dem separat.

Om misstänkta symtom på mörk ringröta iakttas vid avlägsnandet av naveländan bör en okulärinspektion av denna knöl ske, och knölen bör skäras av nära naveländan. Alla skurna knölar med misstänkta symtom bör förvaras minst två dagar i rumstemperatur för att möjliggöra förkorkning och därefter lagras nedkylda (4–10 °C) under lämpliga karantänförhållanden. Alla knölar, inklusive dem med misstänkta symtom, bör förvaras i enlighet med bilaga III.

1.1.2   Samla naveländarna i oanvända avfallsbehållare som kan tillslutas och/eller förseglas (om behållare återanvänds bör de rengöras noggrant och desinficeras med klorföreningar). Naveländarna bör helst behandlas omedelbart. Om detta inte är möjligt bör de förvaras i behållaren, utan tillsats av buffert, nedkylda under högst 72 timmar eller i rumstemperatur under högst 24 timmar.

Behandla naveländarna enligt något av följande förfaranden:

| a) | Täck naveländarna genom att tillsätta en tillräcklig mängd (ungefär 40 ml.) extraktionsbuffert (tillägg 4) och skaka på en rotationsskak (50–100 r/min) under 4 timmar vid en temperatur lägre än 24 °C eller under 16–24 timmar nedkylt. |
| --- | --- |

a)

Täck naveländarna genom att tillsätta en tillräcklig mängd (ungefär 40 ml.) extraktionsbuffert (tillägg 4) och skaka på en rotationsskak (50–100 r/min) under 4 timmar vid en temperatur lägre än 24 °C eller under 16–24 timmar nedkylt.

| b) | Homogenisera naveländarna i en tillräcklig mängd (ungefär 40 ml) extraktionsbuffert (tillägg 4), antingen i en mixer (t.ex. Waring mixer eller Ultra Thurrax) eller genom att krossa dem i en förseglad engångspåse för finfördelning (t.ex. Stomacherpåse eller stark polyten från Bioreba, 150 × 250 mm, steriliserad genom strålning) med en gummihammare eller lämplig malapparat (t.ex. Homex). |
| --- | --- |

b)

Homogenisera naveländarna i en tillräcklig mängd (ungefär 40 ml) extraktionsbuffert (tillägg 4), antingen i en mixer (t.ex. Waring mixer eller Ultra Thurrax) eller genom att krossa dem i en förseglad engångspåse för finfördelning (t.ex. Stomacherpåse eller stark polyten från Bioreba, 150 × 250 mm, steriliserad genom strålning) med en gummihammare eller lämplig malapparat (t.ex. Homex).

Anmärkning: Risken för korskontaminering av proverna är hög när de homogeniseras med en mixer. Vidta försiktighetsåtgärder för att undvika att det alstras aerosoler eller uppkommer spill under extraheringen. Se till att nyligen steriliserade mixerblad och behållare används för varje prov. Om PCR-test skall användas, undvik överföring av DNA till behållare eller malapparat. Krossning i engångspåsar och användning av engångsrör rekommenderas vid PCR-test.

1.1.3   Dekantera supernatanten. Om den är mycket grumlig, separera genom långsam centrifugering (högst 180 g under 10 minuter. vid en temperatur av 4–10 °C) eller genom vakuumfiltrering (40–100 μm), varvid filtret tvättas med ytterligare (ca 10 ml) extraktionsbuffert.

1.1.4   Koncentrera bakteriedelen genom centrifugering vid 7 000 g under 15 minuter (eller 10 000 g under 10 minuter) vid en temperatur av 4-10 °C och kasta bort supernatanten utan att störa pelleten.

1.1.5   Återsuspendera pelleten i 1,5 ml pelletbuffert (tillägg 4). Använd 500 μl för att testa för R. solanacearum, 500 μl för Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus och 500 μl i referenssyfte. Tillsätt steril glycerol till en slutkoncentration av 10–25 % (v/v) till 500 μl av referensportionen och till den återstående testportionen. Skaka och förvara vid –16 till –24 °C (veckor) eller vid –68 till –86 °C (månader). Förvara testportionerna vid 4–10 °C under testningen.

Upprepade nedfrysningar och upptiningar är inte tillrådliga.

Om transport av extraktet krävs, se till att leveransen sker i en kall behållare inom 24 timmar.

1.1.6   Det är absolut nödvändigt att alla positiva kontroller och prover av R. solanacearum hanteras skilda från varandra för att nedsmittning skall undvikas. Detta gäller även för IF-glas och samtliga test.

1.2   Testning

Se flödesdiagram och beskrivningar av testerna och de optimerade protokollen i de berörda bilagorna enligt följande:

| | Selektiv isolering (se avsnitt VI.A.4). |
| --- | --- |

Selektiv isolering (se avsnitt VI.A.4).

| | IF-test (se avsnitt VI.A.5). |
| --- | --- |

IF-test (se avsnitt VI.A.5).

| | PCR-test (se avsnitt VI.A.6). |
| --- | --- |

PCR-test (se avsnitt VI.A.6).

| | FISH-test (se avsnitt VI.A.7). |
| --- | --- |

FISH-test (se avsnitt VI.A.7).

| | ELISA-test (se avsnitt VI.A.8). |
| --- | --- |

ELISA-test (se avsnitt VI.A.8).

| | Biotest (se avsnitt VI.A.9). |
| --- | --- |

Biotest (se avsnitt VI.A.9).

2.   Detaljerade metoder för att upptäcka och identifiera Ralstonia solanacearum i prover av asymtomatiska potatisplantor, tomatplantor eller andra värdväxter

2.1   Preparering av prover

Anmärkning: För upptäckt av latenta populationer R. solanacearum rekommenderas testning av blandprover. Förfarandet kan även lätt användas för blandprover bestående av upp till 200 stjälkdelar. Om undersökningar görs bör dessa grundas på ett statistiskt representativt prov av den plantpopulation som undersöks.

2.1.1   Samla 1–2 cm långa stjälksegment i en tillsluten steril behållare enligt följande provtagningsförfaranden:

Tomatplantor från plantskolor: Med en ren, desinficerad kniv eller sekatör avlägsnas ett 1 cm långt segment av basen på varje stjälk strax ovanför markytan.

Tomatplantor odlade på fält eller i växthus: Med en ren, desinficerad kniv avlägsnas det lägsta sidoskottet från varje planta genom att detta skärs av strax ovanför leden till huvudstjälken. Avlägsna ett 1 cm långt segment från den nedersta delen från varje sidoskott.

Andra värdväxter: Med en ren, desinficerad kniv eller sekatör avlägsnas ett 1 cm långt segment av basen på varje stjälk strax ovanför markytan. Från S. dulcamara eller andra värdväxter som växer i vatten avlägsnas 1–2 centimeter långa delar från undervattensstjälken eller revor (stolon) med vattenrötter.

Vid provtagning på en särskild plats rekommenderas ett statistiskt representativt prov av minst 10 plantor per provtagningsplats av varje ogräs som är potentiell värdväxt. Upptäckt av patogen är mest tillförlitligt under den sena vårsäsongen, samt sommar- och höstsäsongerna, även om naturliga infektioner kan upptäckas året runt hos den fleråriga Solanum dulcamara som växer i vattendrag. Kända värdväxter omfattar övervintrande potatisplantor (efterliggare), Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium och andra arter i familjen Solanaceae. Andra värdar är Pelargonium spp. och Portulaca oleracea. Vissa europeiska ogräsarter som potentiellt kan vara infekterade med biovar 2/Ras 3-populationer av R. solanacearum i rötterna och/eller rhizosfärer under särskilda miljöförhållanden omfattar Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp, Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra och Urtica dioica.

Anmärkning: Okulär besiktning för att påvisa inre symtom (färgning av vävnad eller bakteriellt sekret) kan göras på detta stadium. Lägg undan alla stjälksegment med symtom och testa dem separat (se avsnitt II).

2.1.2   Desinficera stjälksegmentet hastigt i 70-procentig etanol och torka omedelbart med mjukpapper. Behandla därefter stjälksegmenten enligt någon av följande metoder:

| a) | Täck segmenten genom att tillsätta en tillräcklig mängd (ungefär 40 ml) extraktionsbuffert (tillägg 4) och skaka på en rotationsskak (50–100 r/min) under 4 timmar vid en temperatur under 24 °C eller under 16-24 timmar nedkylda. |
| --- | --- |

a)

Täck segmenten genom att tillsätta en tillräcklig mängd (ungefär 40 ml) extraktionsbuffert (tillägg 4) och skaka på en rotationsskak (50–100 r/min) under 4 timmar vid en temperatur under 24 °C eller under 16-24 timmar nedkylda.

| b) | Behandla omedelbart segmenten genom att krossa dem i en kraftig påse för finfördelning (t.ex. Stomacherpåse eller Bioreba) i en lämplig mängd extraktionsbuffert (tillägg 4) med en gummihammare eller lämplig malapparat (t.ex. Homex). Om detta inte är möjligt, förvara stjälksegmenten under högst 72 timmar nedkylda eller under högst 24 timmar i rumstemperatur. |
| --- | --- |

b)

Behandla omedelbart segmenten genom att krossa dem i en kraftig påse för finfördelning (t.ex. Stomacherpåse eller Bioreba) i en lämplig mängd extraktionsbuffert (tillägg 4) med en gummihammare eller lämplig malapparat (t.ex. Homex). Om detta inte är möjligt, förvara stjälksegmenten under högst 72 timmar nedkylda eller under högst 24 timmar i rumstemperatur.

2.1.3   Dekantera supernatanten efter det att blandningen fått stå och sjunka under 15 minuter.

2.1.4   Ytterligare klarnande av extraheringen eller koncentrationen av bakteriedelen krävs vanligtvis inte men kan åstadkommas genom filtrering och/eller centrifugering enligt avsnitten III.1.1.3 till III.1.1.5.

2.1.5   Dela det outspädda eller koncentrerade provextraktet i två lika stora delar. Bibehåll ena hälften vid en temperatur av 4–10 °C under testet och lagra den andra hälften med 10- till 25-procentig (v/v) steril glycerol vid en temperatur av –16 till –24 °C (veckor) eller -68 till –86 °C (månader) för det fallet att ytterligare tester krävs.

2.2   Testning

Se flödesdiagram och beskrivningar av testerna och de optimerade protokollen i de berörda bilagorna enligt följande:

| | Selektiv isolering (se avsnitt VI.A.4). |
| --- | --- |

Selektiv isolering (se avsnitt VI.A.4).

| | IF-test (se avsnitt VI.A.5). |
| --- | --- |

IF-test (se avsnitt VI.A.5).

| | PCR-test (se avsnitt VI.A.6). |
| --- | --- |

PCR-test (se avsnitt VI.A.6).

| | FISH-test (se avsnitt VI.A.7). |
| --- | --- |

FISH-test (se avsnitt VI.A.7).

| | ELISA-test (se avsnitt VI.A.8). |
| --- | --- |

ELISA-test (se avsnitt VI.A.8).

| | Biotest (se avsnitt VI.A.9). |
| --- | --- |

Biotest (se avsnitt VI.A.9).

AVSNITT IV

1.   Program för att upptäcka och identifiera Ralstonia solanacearum i vatten

Image

Image

2.   Metoder för att upptäcka och identifiera Ralstonia solanacearum i vatten

Princip

Det validerade programmet för upptäckt som beskrivs i det här avsnittet är tillämpligt på upptäckt av patogen i prover av ytvatten och kan även tillämpas på testning av prover från process- eller avloppsvatten från verksamhet där potatis förädlas. Det är emellertid viktigt att påpeka att den förväntade detektionskänsligheten varierar beroende på substratet. Känsligheten hos isoleringstestet påverkas av populationerna av konkurrerande saprofytiska bakterier, som vanligtvis är mycket större i process- och avloppsvatten från verksamhet där potatis förädlas än i ytvatten. Programmet nedan är avsett att upptäcka ända ned till 103 celler per liter i ytvatten, men detektionskänsligheten vid process- eller avloppsvatten från anläggningar där potatis förädlas är troligen avsevärt lägre. Därför rekommenderas att testning av process- och avloppsvatten sker efter övrig rening (t.ex. sedimentering eller filtrering), då populationerna av saprofytiska bakterier minskar. Testprogrammets begränsningar i fråga om känslighet bör tas med i beräkningen vid bedömningen av tillförlitligheten hos alla eventuella negativa resultat. Det här programmet har med framgång använts i undersökningar för att påvisa närvaro eller frånvaro av patogenet i ytvatten, men dess begränsningar bör beaktas vid användning i liknande undersökningar av process- eller avloppsvatten från verksamhet där potatis förädlas.

2.1   Preparering av prover

Anmärkning:

| — | Upptäckt av of R. solanacearum i ytvatten är mest tillförlitlig under den sena vårsäsongen, samt sommar- och höstsäsongerna, när vattentemperaturerna överstiger 15 °C. |
| --- | --- |

—

Upptäckt av of R. solanacearum i ytvatten är mest tillförlitlig under den sena vårsäsongen, samt sommar- och höstsäsongerna, när vattentemperaturerna överstiger 15 °C.

| — | Upprepade provtagningar vid olika tidpunkter under ovannämnda period och på bestämda provtagningsplatser ökar tillförlitligheten hos upptäckten genom att reducera inverkan av klimatvariationen. |
| --- | --- |

—

Upprepade provtagningar vid olika tidpunkter under ovannämnda period och på bestämda provtagningsplatser ökar tillförlitligheten hos upptäckten genom att reducera inverkan av klimatvariationen.

| — | Beakta inverkan av kraftiga regnfall och vattendragens geografiska läge för att undvika alltför stora utspädningseffekter, som kan dölja närvaron av patogenet. |
| --- | --- |

—

Beakta inverkan av kraftiga regnfall och vattendragens geografiska läge för att undvika alltför stora utspädningseffekter, som kan dölja närvaron av patogenet.

| — | Ta ytvattenproverna i närheten av värdväxterna om dessa förekommer. |
| --- | --- |

—

Ta ytvattenproverna i närheten av värdväxterna om dessa förekommer.

2.1.1   På utvalda provtagningsplatser, samla vattenprover genom att fylla sterila engångsrör eller engångsflaskor om möjligt på ett djup av 30 cm och inom 2 m från strandkanten. Vid process- och avloppsvatten från verksamheter där potatis förädlas, samla in prover från den punkt där vätskorna släpps ut. Provstorlekar på upp till 500 ml per provtagningsplats rekommenderas. Om mindre prover föredras rekommenderas att proverna tas vid minst tre olika tillfällen per provtagningsplats och att varje prov består av två lika stora delprover av minst 30 ml. Vid intensiva undersökningar, välj minst tre provtagningsplatser per 3 km vattendrag och säkerställ att prover även tas på vattendragets tillflöden.

2.1.2   Transportera proverna svalt och mörkt (4–10 °C) och testa dem inom 24 timmar.

2.1.3   Bakteriedelen kan vid behov koncentreras genom en av följande metoder:

| a) | Centrifugera 30–50 ml delprover vid 10 000 g under 10 minuter (eller 7 000 g under 15 minuter), helst vid 4–10 °C. Kasta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml pelletbuffert (tillägg 4). |
| --- | --- |

a)

Centrifugera 30–50 ml delprover vid 10 000 g under 10 minuter (eller 7 000 g under 15 minuter), helst vid 4–10 °C. Kasta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml pelletbuffert (tillägg 4).

| b) | Membranfiltrering (lägsta porstorlek 0,45 μm) och därefter tvättning av filtret i 5–10 ml pelletbuffert och förvaring av tvättvätskan. Denna metod är lämplig vid större volymer vatten som innehåller små mängder av saprofyter. |
| --- | --- |

b)

Membranfiltrering (lägsta porstorlek 0,45 μm) och därefter tvättning av filtret i 5–10 ml pelletbuffert och förvaring av tvättvätskan. Denna metod är lämplig vid större volymer vatten som innehåller små mängder av saprofyter.

Koncentrering rekommenderas vanligtvis inte för prover av process- eller avloppsvatten från verksamhet där potatis förädlas, eftersom populationer av konkurrerande saprofytiska bakterier inhiberar upptäckten av R. solanacearum.

2.2   Testning

Se flödesdiagram och beskrivningar av testerna i de berörda bilagorna.

AVSNITT V

1.   Program för att upptäcka och identifiera R. solanacearum i jord

Image

Image

2.   Metoder för att upptäcka och identifiera R. solanacearum i jord

Principer

Det validerade program för upptäckt som beskrivs i detta avsnitt är tillämpligt på upptäckt av patogen i jordprover men kan även användas för testning av prover av fast avfall och avloppsslam från bearbetningen av potatis. Det bör emellertid noteras att dessa metoder inte är tillräckligt känsliga för att garantera upptäckt av små och/eller oregelbundet dispergerade populationer av R. solanacearum som kan förekomma i naturligt angripna prover av dessa substrat.

Detta testprograms begränsningar i fråga om känslighet bör beaktas vid bedömningen av tillförlitligheten hos alla eventuella negativa resultat och när det används i undersökningar för att påvisa närvaro eller frånvaro av patogenet i jord eller slam. Det mest tillförlitliga testet för att påvisa närvaro av patogenet i åkerjord är att plantera en mottaglig värdväxt och kontrollera om denna infekteras, men även med denna metod undgår små mängder av nedsmittning upptäckt.

2.1   Preparering av prover

2.1.1   Provtagningen av jordmån bör följa standardprinciperna för provtagning av nematoder. Samla in 0,5–1 kg jord per prov från 60 platser per 0,3 ha på ett djup av 10–20 cm (eller i ett rutnät av 7 x 7 m). Om förekomst av patogenet misstänks, öka mängden provtagningsplatser till 120 per 0,3 ha. Förvara proven vid 12–15 °C före testning. Ta prover på avfall och avloppsslam från bearbetning av potatis genom insamling av totalt 1 kg från platser som är representativa för den totala volym slam som skall testas. Blanda varje prov väl före testning.

2.1.2   Dispergera delprover av 10–25 g jord eller slam genom att skaka på en rotationsskak (250 rpm) i 60–150 ml extraktionsbuffert (tillägg 4) under upp till två timmar. Finfördelningen kan, om detta krävs, underlättas genom tillsats av 0,02 % steril Tween 20 och 10–20 g steriliserat grus.

2.1.3   Förvara suspensionen vid 4 °C under testningen.

2.2   Testning

Se flödesdiagram och beskrivningar av testerna i de berörda bilagorna.

AVSNITT VI

OPTIMERADE PROTOKOLL FÖR ATT UPPTÄCKA OCH IDENTIFIERA R. SOLANACEARUM

A.   TEST FÖR DIAGNOS OCH UPPTÄCKT

1.   Kärlströmningstest

Närvaro av R. solanacearum i stjälkar på vissnande potatis, tomat eller andra värdväxter kan påvisas genom följande enkla presumtiva test: Skär av stjälken strax ovan markytan. Suspendera den skurna ytan i ett rör med rent vatten. Sök efter karakteristiska spontana strömningar av trådar av bakterieslem som utsöndras från de avskurna kärlknippena efter några minuter.

2.   Upptäckt av poly-β-hydroxibutyratkorn

| 1. | Preparera ett utstryk av bakteriellt sekret från infekterad vävnad eller en 48-timmars kultur på YPGA- eller SPA-medium (tillägg 1) på ett objektglas. |
| --- | --- |

1.

Preparera ett utstryk av bakteriellt sekret från infekterad vävnad eller en 48-timmars kultur på YPGA- eller SPA-medium (tillägg 1) på ett objektglas.

| 2. | Bered som kontroll positiva utstryk av en biovar 2-stam av R. solanacearum och om det anses lämpligt ett negativt kontrollutstryk från en känd PHB-negativ art. |
| --- | --- |

2.

Bered som kontroll positiva utstryk av en biovar 2-stam av R. solanacearum och om det anses lämpligt ett negativt kontrollutstryk från en känd PHB-negativ art.

| 3. | Låt torka och för snabbt undersidan av glaset över lågan för att fixera utstryken. |
| --- | --- |

3.

Låt torka och för snabbt undersidan av glaset över lågan för att fixera utstryken.

| 4. | Preparera färgning med antingen Nilblått A eller Sudansvart B och observera i mikroskop enligt beskrivningen nedan: |
| --- | --- |

4.

Preparera färgning med antingen Nilblått A eller Sudansvart B och observera i mikroskop enligt beskrivningen nedan:

Nilblåttest:

| a) | Dränk in varje objektglas med 1 % vattenlösning av nilblått och inkubera under 10 minuter vid 55 °C. |
| --- | --- |

a)

Dränk in varje objektglas med 1 % vattenlösning av nilblått och inkubera under 10 minuter vid 55 °C.

| b) | Dränera av färglösningen. Tvätta snabbt i långsamt rinnande kranvatten. Avlägsna överskottsvatten med läskpapper. |
| --- | --- |

b)

Dränera av färglösningen. Tvätta snabbt i långsamt rinnande kranvatten. Avlägsna överskottsvatten med läskpapper.

| c) | Dränk in utstryket med 8 % lösning av ättiksyra i vatten, och inkubera i 1 minut vid rumstemperatur. |
| --- | --- |

c)

Dränk in utstryket med 8 % lösning av ättiksyra i vatten, och inkubera i 1 minut vid rumstemperatur.

| d) | Tvätta snabbt i långsamt rinnande kranvatten. Avlägsna överskottsvatten med läskpapper. |
| --- | --- |

d)

Tvätta snabbt i långsamt rinnande kranvatten. Avlägsna överskottsvatten med läskpapper.

| e) | Återfukta med en droppe vatten och lägg på ett täckglas. |
| --- | --- |

e)

Återfukta med en droppe vatten och lägg på ett täckglas.

| f) | Undersök det färgade utstryket i epifluorescensmikroskop vid 450 nm under oljeimmersion vid 600–1 000 gångers förstoring med ett olje- eller vattenimmersionsobjektiv. |
| --- | --- |

f)

Undersök det färgade utstryket i epifluorescensmikroskop vid 450 nm under oljeimmersion vid 600–1 000 gångers förstoring med ett olje- eller vattenimmersionsobjektiv.

| g) | Leta efter ljusorange fluorescens av PHB-korn. Undersök också provet i genomfallande vanligt ljus för att säkerställa att kornen är intracellulära och att cellmorfologin är typisk för R. solanacearum. |
| --- | --- |

g)

Leta efter ljusorange fluorescens av PHB-korn. Undersök också provet i genomfallande vanligt ljus för att säkerställa att kornen är intracellulära och att cellmorfologin är typisk för R. solanacearum.

Sudansvarttest:

| a) | Dränk in varje objektglas med 0,3 % Sudansvart B-lösning i 70 % etanol och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur. |
| --- | --- |

a)

Dränk in varje objektglas med 0,3 % Sudansvart B-lösning i 70 % etanol och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.

| b) | Dränera av färglösningen och tvätta snabbt i kranvatten, varvid överskottsvatten avlägsnas med läskpapper. |
| --- | --- |

b)

Dränera av färglösningen och tvätta snabbt i kranvatten, varvid överskottsvatten avlägsnas med läskpapper.

| c) | Doppa glasen hastigt i xylol och torka med mjukpapper. Varning: Xylol är skadligt. Vidta nödvändiga säkerhetsåtgärder och arbeta i ett dragskåp. |
| --- | --- |

c)

Doppa glasen hastigt i xylol och torka med mjukpapper. Varning: Xylol är skadligt. Vidta nödvändiga säkerhetsåtgärder och arbeta i ett dragskåp.

| d) | Dränk in glasen med 0,5 % (w/v) safranin i vatten och lämna i 10 sekunder vid rumstemperatur. Varning: Xylol är skadligt. Vidta nödvändiga säkerhetsåtgärder och arbeta i ett dragskåp. |
| --- | --- |

d)

Dränk in glasen med 0,5 % (w/v) safranin i vatten och lämna i 10 sekunder vid rumstemperatur. Varning: Xylol är skadligt. Vidta nödvändiga säkerhetsåtgärder och arbeta i ett dragskåp.

| e) | Tvätta försiktigt i rinnande kranvatten, torka med mjukpapper och lägg på ett täckglas. |
| --- | --- |

e)

Tvätta försiktigt i rinnande kranvatten, torka med mjukpapper och lägg på ett täckglas.

| f) | Undersök de färgade utstryken i ljusmikroskop (genomfallande ljus) under oljeimmersion vid 1 000 gångers förstoring med ett oljeimmersionsobjektiv. |
| --- | --- |

f)

Undersök de färgade utstryken i ljusmikroskop (genomfallande ljus) under oljeimmersion vid 1 000 gångers förstoring med ett oljeimmersionsobjektiv.

| g) | Sök efter blåsvart färgning av PHB-korn i celler av R. solanacearum rosafärgade cellväggar. |
| --- | --- |

g)

Sök efter blåsvart färgning av PHB-korn i celler av R. solanacearum rosafärgade cellväggar.

3.   Serumagglutinationstest

Agglutinering av R. solanacearum-celler i bakteriellt sekret eller symtomatisk vävnad observeras bäst genom användning av validerade antikroppar (se tillägg 3) försedda med lämpliga färgmärkningar, såsom röda Staphylococcus aureus-celler eller färgade latexpartiklar. Om en sats används som är tillgänglig i handeln (se tillägg 3), skall tillverkarens instruktioner följas. Om inte, skall följande förfarande tillämpas:

| a) | Blanda droppar av suspension av märkt antikropp och bakteriellt sekret (ungefär 5 μl var) på fönstren på multispot-objektglas. |
| --- | --- |

a)

Blanda droppar av suspension av märkt antikropp och bakteriellt sekret (ungefär 5 μl var) på fönstren på multispot-objektglas.

| b) | Preparera positiva och negativa kontroller, varvid suspensioner av R. solanacearum biovar 2 och en heterolog stam används. |
| --- | --- |

b)

Preparera positiva och negativa kontroller, varvid suspensioner av R. solanacearum biovar 2 och en heterolog stam används.

| c) | Sök efter agglutination i positiva prover efter försiktig blandning under 15 sekunder. |
| --- | --- |

c)

Sök efter agglutination i positiva prover efter försiktig blandning under 15 sekunder.

4.   Selektiv isolering

4.1   Odling på selektivt medium

Anmärkning: Innan denna metod används för första gången, gör preliminära tester för att möjliggöra reproducerbar upptäckt av 103–104 koloniformande enheter av R. solanacearum per ml som tillsätts till provextrakt som tidigare testats och gett negativt svar.

Använd ett lämpligt validerat selektivt medium, såsom SMSA (modifierat av Elphinstone et al., 1996. Se tillägg 2).

R. solanacearum måste noga skiljas från andra bakterier som kan utveckla kolonier på mediet. Kolonier av R. solanacearum kan även uppvisa atypisk morfologi om plattorna är överfulla eller om antagonistiska bakterier även är närvarande. Om inverkan av konkurrens eller antagonism misstänks, bör provet testas igen, varvid ett annat test används.

Denna metod har högsta känslighetsnivå när nyligen preparerade provextrakt testas. Metoden är emellertid även tillämplig på extrakt som har lagrats i glycerol vid –68 till –86 °C.

Som positiva kontroller preparera decimala utspädningar från en suspension av 106 kolonibildande enheter per ml av R. solanacearum (t.ex. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). För att undvika risk för smitta, preparera positiva kontroller som är fullständigt åtskilda från de prover som skall testas.

För varje nyligen preparerat parti av selektivt medium bör dess lämplighet för tillväxt av patogenet testas innan det används för att testa rutinprover.

Testa kontrollmaterialen exakt som provet (proven).

4.1.1   Gör en lämplig plattspridning från spädningsserie för att se till att alla saprofytiska kolonibildande bakgrundspopulationer späds ut. Utsprid 50–100 μl per platta av provextrakt och för varje utspädning.

4.1.2   Inkubera plattorna vid 28 °C. Avläs plattorna efter 48 timmar och därefter dagligen under högst sex dagar. Typiska kolonier av R. solanacearum på SMSA-medium är mjölkvita, platta, oregelbundna, flödiga kolonier och utvecklar efter tre dagars inkubation rosa till blodröda centra med inre strimmor eller virvlar (se webbplats http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Anmärkning: Atypiska kolonier av R. solanacearum bildas ibland på detta medium. De kan vara små, runda, helt rödfärgade och icke-flödiga eller partiellt flödiga och därför svåra att urskilja från saprofytiska kolonibildande bakterier.

4.1.3   Rena presumtiva kolonier av R. solanacearum efter utstryk eller plattspridning från spädningsserie på ett vanligt näringsmedium för att erhålla isolerade kolonier (se tillägg 2).

4.1.4   Lagra kolonierna under lång tid i sterilt vatten (pH 6–8, klorfritt) i rumstemperatur i mörker, eller under kort tid i lämpligt frysskyddmedel i –68 till –86 °C eller frystorkat.

4.1.5   Identifiera presumtiva kulturer (se avsnitt VI. B) och gör ett patogenitetstest (se avsnitt VI. C).

Tolkning av resultaten av odlingen på selektivt medium

Odlingen på selektivt medium är negativ om inga bakteriekolonier observeras efter sex dagar eller om inga förmodade kolonier typiska för R. solanacearum påvisas, förutsatt att ingen inhibition misstänks på grund av konkurrens eller antagonism från andra bakterier och att typiska kolonier av R. solanacearum påvisas i de positiva kontrollerna.

Odlingen på selektivt medium är positiv om presumtiva kolonier av R. solanacearum isoleras.

4.2   Anrikningsförfarande

Använd ett validerat anrikningsmedium, såsom modifierad Wilbrink-buljong (se tillägg 2).

Detta förfarande kan användas för att selektivt öka populationerna av R. solanacearum i provextrakten och för att öka känsligheten för upptäckt. Förfarandet späder dessutom effektivt ut inhibitorer av PCR-reaktion (1:100). Det bör emellertid noteras att anrikning av R. solanacearum kan misslyckas på grund av konkurrens eller antagonism från saprofytiska organismer, som ofta anrikas samtidigt. Därför kan isolering av R. solanacearum från anrikningsbuljonger vara svårt. Eftersom populationerna av serologiskt besläktade saprofyter kan förökas, rekommenderas dessutom att specifika monoklonala antikroppar används i stället för polyklonala antikroppar om ELISA-test används.

4.2.1   Vid anriknings-PCR tillsätt 100 μl provextrakt till 10 ml anrikningsbuljong (tillägg 2) som dessförinnan portionerats i DNA-fria rör eller flaskor. Vid anriknings-ELISA kan en proportionellt större andel provextrakt i förhållande till buljong användas (t.ex. 100 μl i 1,0 ml anrikningsbuljong).

4.2.2   Inkubera under 72 timmar vid 27–30 °C med eller utan skak med locket löst påsatt för luftning.

4.2.3   Blanda väl före användning i ELISA- eller PCR-test.

4.2.4   Behandla anrikningsbuljongen på exakt samma sätt som provet (proverna) i ovannämnda test.

Anmärkning: Om anrikningen av R. solanacearum förväntas inhiberas på grund av stora populationer av vissa konkurrerande saprofytiska bakterier, kan anrikning av provextrakten före centrifugering eller andra koncentrationssteg ge bättre resultat.

5.   IF-test

Princip

Det rekommenderas att IF-test används som huvudsakligt screeningtest på grund av dess dokumenterade förmåga att uppnå de föreskrivna tröskelvärdena.

Om IF-testet används som huvudsakligt screeningtest och resultatet är positivt, skall ett andra screeningtest med isolerings-, PCR- eller FISH-test göras. Om IF-testet används som ett andra screeningtest och resultatet är positivt, krävs ytterligare testning enligt flödesschemat för att analysen skall bli fullständig.

Anmärkning: Använd antikroppar mot R. solanacearum med validerat ursprung (se webbplats: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Det rekommenderas att titer bestäms för varje nytt parti antikroppar. Titern definieras som den högsta utspädning vid vilken en optimal reaktion sker när en suspension av 105–106 celler per ml av den homologa stammen av R. solanacearum testas och när en lämplig fluoresceinisothiocyanat (FITC) konjugat i överensstämmelse med tillverkarens rekommendationer används. Validerade polyklonala antiserum bör ha en IF-titer av minst 1:2 000. Vid testningen bör antikropparna användas vid en arbetsutspädning (arbetsutspädningar) nära eller vid titern.

Testet bör göras på nypreparerade provextrakt. Vid behov kan det göras på extrakt som lagrats i glycerol vid en temperatur på –68 till –86 °C. Glycerolen kan avlägsnas från provet genom tillsats av 1 ml pelletbuffert (tillägg 4), omcentrifugering under 15 minuter vid 7 000 g och återsuspension i en lika stor volym av pelletbuffert. Detta krävs vanligtvis inte, särskilt inte om glasproverna har fixerats på glasen med flambering.

Bered separata positiva kontrollglas av den homologa stammen eller någon annan referensstam av R. solanacearum, som suspenderats i potatisextrakt, alternativt i en buffert, såsom anges i tillägg 3 B.

Naturligt infekterad vävnad (som har bevarats genom frystorkning eller nedfrysning vid en temperatur av –16 till –24 °C) bör om möjligt användas som en liknande kontroll på samma glas.

Som negativa kontroller kan användas portioner av provextrakt som tidigare givit negativt svar beträffande R. solanacearum när de testats.

Standardiserade positiva och negativa kontrollmaterial som kan användas i detta test förtecknas i tillägg 3.

Använd multispot-objektglas med helst 10 fönster av minst 6 mm diameter.

Testa kontrollmaterialen exakt som provet (proven).

5.1   Preparera testglas enligt någon av följande metoder

| i) | För pelletar med relativt litet stärkelsesediment:
  Pipettera på det första glaset en uppmätt standardvolym (15 μl är lämpligt för 6 mm fönsterdiameter – öka volymen för större fönster) av en 1/100-utspädning av den återsuspenderade potatispelleten. Pipettera en motsvarande volym av koncentrerad pellet (1/1) på de återstående fönstren på raden. Den andra raden kan användas som duplikat eller för ett andra prov enligt figur 1. |
| --- | --- |

i)

För pelletar med relativt litet stärkelsesediment:

Pipettera på det första glaset en uppmätt standardvolym (15 μl är lämpligt för 6 mm fönsterdiameter – öka volymen för större fönster) av en 1/100-utspädning av den återsuspenderade potatispelleten. Pipettera en motsvarande volym av koncentrerad pellet (1/1) på de återstående fönstren på raden. Den andra raden kan användas som duplikat eller för ett andra prov enligt figur 1.

| ii) | För andra pelletar:
  Preparera decimala utspädningar (1/10, 1/100) av den återsuspenderade pelleten i pelletbuffert. Pipettera en uppmätt standardvolym (15 μl är lämpligt för 6 mm fönsterdiameter – öka volymen för större fönster) av den återsuspenderade pelleten och varje utspädning på en fönsterrad. Den andra raden kan användas som duplikat eller för ett andra prov enligt figur 2. |
| --- | --- |

ii)

För andra pelletar:

Preparera decimala utspädningar (1/10, 1/100) av den återsuspenderade pelleten i pelletbuffert. Pipettera en uppmätt standardvolym (15 μl är lämpligt för 6 mm fönsterdiameter – öka volymen för större fönster) av den återsuspenderade pelleten och varje utspädning på en fönsterrad. Den andra raden kan användas som duplikat eller för ett andra prov enligt figur 2.

5.2   Torka dropparna i omgivande temperatur eller genom uppvärmning till en temperatur av 40–45 °C. Fixera bakteriecellerna på glaset antingen genom upphettning (15 minuter vid 60 °C), flambering med 95-procentig etanol eller enligt särskilda instruktioner från leverantören av antikropparna.

Vid behov får fixerade glas lagras frysta i en torkad låda under så kort tid som möjligt (maximalt 3 månader) innan vidare testning sker.

5.3   IF-förfarande

| i) | Enligt testglaspreparering i 5,1 (i):
  Preparera en serie dubbla utspädningar. Den första brunnen bör ha 1/2 av titern (T/2), de övriga 1/4 av titern (T/4), 1/2 av titern (T/2), titern (T) och två gånger titern (2T). |
| --- | --- |

i)

Enligt testglaspreparering i 5,1 (i):

Preparera en serie dubbla utspädningar. Den första brunnen bör ha 1/2 av titern (T/2), de övriga 1/4 av titern (T/4), 1/2 av titern (T/2), titern (T) och två gånger titern (2T).

| ii) | Enligt testglaspreparering i 5,1 ii:
  Preparera arbetsutspädningen av antikropp i IF-buffert. Arbetsutspädningen påverkar specificiteten. |
| --- | --- |

ii)

Enligt testglaspreparering i 5,1 ii:

Preparera arbetsutspädningen av antikropp i IF-buffert. Arbetsutspädningen påverkar specificiteten.

Figur 1.   Preparering av testglaset enligt 5.1 i och 5.3 i.

| | Utspädningar av återsuspenderade pelletar |
| --- | --- |
| 1/100 | 1/1 | 1/1 | 1/1 | 1/1 |  | Utspädning av återsuspenderad pellet |
| (T = titer) | T/2 | T/4 | T/2 | T | 2T |  | Dubbla utspädningar av antiserum/antikropp |
| Prov 1 | | | | | | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Duplikat av prov 1 eller prov 2 | | | | | |
| 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |

Utspädningar av återsuspenderade pelletar

1/100

1/1

1/1

1/1

1/1



Utspädning av återsuspenderad pellet

(T = titer)

T/2

T/4

T/2

T

2T



Dubbla utspädningar av antiserum/antikropp

Prov 1

Image

Image

Image

Image

Image

1

2

3

4

5

Duplikat av prov 1 eller prov 2

Image

Image

Image

Image

Image

6

7

8

9

10

Figur 2.   Preparering av testglaset enligt 5,1 ii och 5,3 ii.

| | Arbetsutspädning av antiserum/antikropp |
| --- | --- |
| 1/1 | 1/10 | 1/100 | tom | tom |  | Decimal utspädning av återsuspenderad pellet |
| Prov 1 | | | | | | | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Duplikat av prov 1 eller prov 2 | | | | | |
| 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |

Arbetsutspädning av antiserum/antikropp

1/1

1/10

1/100

tom

tom



Decimal utspädning av återsuspenderad pellet

Prov 1

Image

Image

Image

Image

Image

1

2

3

4

5

Duplikat av prov 1 eller prov 2

Image

Image

Image

Image

Image

6

7

8

9

10

5.3.1   Ordna glasen på fuktigt mjukpapper. Täck varje testfönster fullständigt med antikropputspädning(ar). Den volym antikroppar som tillsätts varje fönster skall vara minst lika stor som volymen tillsatt extrakt.

Följande förfarande bör följas om det saknas särskilda instruktioner från leverantören av antikropparna:

5.3.2   Inkubera glasen på fuktigt papper övertäckta under 30 minuter vid omgivande temperatur (18–25 °C).

5.3.3   Skaka av dropparna från glaset och skölj glasen noga med IF-buffert. Tvätta genom att under 5 minuter sänka ned i IF-buffert-Tween (tillägg 4) och därefter i IF-buffert. Undvik uppkomst av aerosoler eller överföring av droppar som kan orsaka korskontaminering. Avlägsna noga överskottsfukt genom att försiktigt torka med läskpapper.

5.3.4   Ordna glasen på fuktigt mjukpapper. Täck testfönstren med den utspädning av FITC-konjugat som används för att bestämma titern. Den volym konjugat som tillsätts fönstren skall vara lika med volymen tillsatt antikropp.

5.3.5   Inkubera glasen på fuktigt papper övertäckta under 30 minuter vid omgivande temperatur (18–25 °C).

5.3.6   Skaka av konjugatdropparna från glaset. Skölj och tvätta som ovan (5.3.3).

Avlägsna noga överskottsfukt.

5.3.7   Pipettera 5–10 μl 0,1 M fosfatbuffrad glycerol (tillägg 4) eller en monteringslösning som motverkar blekning som finns tillgänglig i handeln på varje fönster och lägg på ett täckglas.

5.4   Avläsning av IF-testet

5.4.1   Undersök testglasen i ett epifluorescensmikroskop med filter lämpliga för FITC under olje- eller vattenimmersion vid 500–1 000 gångers förstoring. Scanna fönstren utefter två diametrar i rät vinkel och runt perimetern. På de prover som inte uppvisar några celler eller endast ett litet antal celler, observera minst 40 mikroskopfält.

Kontrollera glaset med positiv kontroll först. Cellerna skall vara klart fluorescerande och helt färgade vid den fastställda antikroppstitern eller arbetsutspädningen. IF-testet (avsnitt VI.A.5.) skall återupprepas om färgningen är avvikande.

5.4.2   Sök efter ljusa fluorescerande celler med morfologi som är karakteristisk för R. solanacearum i testfönstren på testglasen (se webbplats: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluorescensintensiteten måste motsvara det positiva kontrollisolatets vid samma antikropputspädning. Celler med ojämn eller ofullständig färgning eller med svag fluorescens beaktas inte.

Om smitta misstänks skall testet upprepas. Detta kan vara fallet om alla glas i ett parti uppvisar positiva celler på grund av nedsmittning av en buffert eller om positiva celler påträffas (utanför glasets fönster) på objektglasöverdraget.

5.4.3   Immunofluorescenstestets specificitet ger upphov till ett flertal problem. Bestånd av fluorescerande celler med atypisk morfologi och korsreagerande saprofytiska bakterier som har en liknande storlek och morfologi som R. solanacearum kan förekomma hos potatisar i naveländarna och i pelletar av stjälksegmentet.

5.4.4   Endast fluorescerande celler med typisk storlek och morfologi vid titern eller vid arbetsutspädningen av antikropparna skall beaktas, såsom i 5,3.

5.4.5   Tolkning av IF-testet:

| i) | För varje prov med ljusa fluorescerande celler med karakteristisk morfologi, bestäm medeltalet typiska celler per mikroskopfält och beräkna antal typiska celler per ml återsuspenderad pellet (tillägg 5).
  IF-testet är positivt om proven innehåller minst 5 × 103 typiska celler per ml återsuspenderad pellet. Provet betraktas som potentiellt smittat, och ytterligare tester krävs. |
| --- | --- |

i)

För varje prov med ljusa fluorescerande celler med karakteristisk morfologi, bestäm medeltalet typiska celler per mikroskopfält och beräkna antal typiska celler per ml återsuspenderad pellet (tillägg 5).

IF-testet är positivt om proven innehåller minst 5 × 103 typiska celler per ml återsuspenderad pellet. Provet betraktas som potentiellt smittat, och ytterligare tester krävs.

| ii) | IF-testet är negativt om proven innehåller färre än 5 × 103 celler per ml återsuspenderad pellet och provet betraktas som negativt. Inga ytterligare tester krävs. |
| --- | --- |

ii)

IF-testet är negativt om proven innehåller färre än 5 × 103 celler per ml återsuspenderad pellet och provet betraktas som negativt. Inga ytterligare tester krävs.

6.   PCR-test

Principer

Om ett PCR-test används som huvudsakligt screeningtest och resultatet är positivt, skall ett andra screeningtest i form av ett isoleringstest eller IF-test göras. Om PCR används som andra screeningtest och resultatet är positivt, krävs ytterligare testning enligt flödesschemat för att diagnosen skall bli fullständig.

Fullt utnyttjande av denna metod som huvudsakligt screeningtest rekommenderas endast när särskild fackkompetens har uppnåtts.

Anmärkning: Preliminär testning med denna metod bör möjliggöra reproducerbar upptäckt av 103–104 celler av R. solanacearum per ml som tillsätts till provextrakt som tidigare testats och gett negativt svar. Optimeringsexperiment kan krävas för att uppnå maximal sensitivitets- och specificitetsnivå i alla laboratorier.

Använd validerade PCR-reagens och PCR-protokoll (se avsnitt 6) Välj helst en metod med internkontroll.

Vidta lämpliga åtgärder för att undvika nedsmittning av prover med mål-DNA. PCR-testerna bör utföras av erfarna tekniker i specialiserade molekylärbiologiska laboratorier för att minimera risken för nedsmittning av mål-DNA.

Negativa kontroller (för DNA-extraktions- och PCR-förfaranden) bör alltid behandlas som slutligt prov i förfarandet för att tydligt kunna visa om överföring till mål-DNA har inträffat eller ej.

Följande negativa kontroller bör ingå i PCR-testet:

| — | Provextrakt som tidigare gett negativt svar när det testats med avseende på R. solanacearum. |
| --- | --- |

—

Provextrakt som tidigare gett negativt svar när det testats med avseende på R. solanacearum.

| — | Buffertkontroller som används för extrahering av bakterien och DNA från provet. |
| --- | --- |

—

Buffertkontroller som används för extrahering av bakterien och DNA från provet.

| — | PCR-reaktionsblandning. |
| --- | --- |

—

PCR-reaktionsblandning.

Följande positiva kontroller bör tas med:

| — | Portioner av återsuspenderad pellet till vilka R. solanacearum har tillsatts (information om preparering finns i tillägg 3 B). |
| --- | --- |

—

Portioner av återsuspenderad pellet till vilka R. solanacearum har tillsatts (information om preparering finns i tillägg 3 B).

| — | En suspension av 106 celler per ml av R. solanacearum i vatten från ett virulent isolat (t.ex. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; se tillägg 3 B). |
| --- | --- |

—

En suspension av 106 celler per ml av R. solanacearum i vatten från ett virulent isolat (t.ex. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; se tillägg 3 B).

| — | Om möjligt använd dessutom DNA från positiva kontrollprover från PCR-tester. |
| --- | --- |

—

Om möjligt använd dessutom DNA från positiva kontrollprover från PCR-tester.

För att undvika risk för nedsmittning, preparera positiva kontroller i en separat omgivning från de prover som skall testas.

Provextrakten bör vara så fria från jord som möjligt. Om PCR-protokoll skall användas kan det därför i vissa fall vara tillrådligt att preparera extraheringar från tvättade potatisar.

Standardiserade positiva och negativa kontrollmaterial som kan användas i detta test förtecknas i tillägg 3.

6.1   Metoder för rening av DNA

Använd positiva och negativa kontrollprover såsom beskrivs ovan (se tillägg 3).

Testa kontrollmaterialen exakt som provet (proven).

Det finns en rad olika metoder för att rena mål-DNA från komplexa provsubstrat och på så sätt avlägsna inhibitorer av PCR och andra enzymreaktioner och koncentrera mål-DNA i provextraktet. Följande metod har optimerats för att användas tillsammans med den validerade PCR-metod som visas i tillägg 6.

a)   Metod enligt Pastrik (2000)

| 1) | Pipettera 220 μl av lyseringsbuffert (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) i ett 1,5 ml Eppendorf-rör. |
| --- | --- |

1)

Pipettera 220 μl av lyseringsbuffert (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) i ett 1,5 ml Eppendorf-rör.

| 2) | Tillsätt 100 μl provextrakt och placera i värmeblock eller vattenbad vid 95 °C under 10 minuter. |
| --- | --- |

2)

Tillsätt 100 μl provextrakt och placera i värmeblock eller vattenbad vid 95 °C under 10 minuter.

| 3) | Ställ röret på kylning under 5 minuter. |
| --- | --- |

3)

Ställ röret på kylning under 5 minuter.

| 4) | Tillsätt 80 μl Lysozym stocklösning (50 mg lysozym per ml i 10 mM Tris HCl, pH 8,0) och inkubera vid 37 °C under 30 minuter. |
| --- | --- |

4)

Tillsätt 80 μl Lysozym stocklösning (50 mg lysozym per ml i 10 mM Tris HCl, pH 8,0) och inkubera vid 37 °C under 30 minuter.

| 5) | Tillsätt 220 μl Easy DNA® lösning A (Invitrogen), blanda väl genom skakning och inkubera vid 65 °C under 30 minuter. |
| --- | --- |

5)

Tillsätt 220 μl Easy DNA® lösning A (Invitrogen), blanda väl genom skakning och inkubera vid 65 °C under 30 minuter.

| 6) | Tillsätt 100 μl Easy DNA® lösning B (Invitrogen), skaka kraftigt till fällningen svävar fritt i röret och provet är jämnt trögflytande. |
| --- | --- |

6)

Tillsätt 100 μl Easy DNA® lösning B (Invitrogen), skaka kraftigt till fällningen svävar fritt i röret och provet är jämnt trögflytande.

| 7) | Tillsätt 500 μl chloroform och skaka till viskositeten ökar och blandningen är homogen. |
| --- | --- |

7)

Tillsätt 500 μl chloroform och skaka till viskositeten ökar och blandningen är homogen.

| 8) | Centrifugera vid 15 000 g under 20 minuter vid 4 °C för att separera faserna och bilda interfasen. |
| --- | --- |

8)

Centrifugera vid 15 000 g under 20 minuter vid 4 °C för att separera faserna och bilda interfasen.

| 9) | För över den övre fasen till ett rent Eppendorf-rör. |
| --- | --- |

9)

För över den övre fasen till ett rent Eppendorf-rör.

| 10) | Tillsätt 1 ml 100-procentig etanol (–20 °C), skaka snabbt och inkubera under nedkylning under 10 minuter. |
| --- | --- |

10)

Tillsätt 1 ml 100-procentig etanol (–20 °C), skaka snabbt och inkubera under nedkylning under 10 minuter.

| 11) | Centrifugera vid 15 000 g under 20 minuter vid 4 °C och avlägsna etanolen från pelleten. |
| --- | --- |

11)

Centrifugera vid 15 000 g under 20 minuter vid 4 °C och avlägsna etanolen från pelleten.

| 12) | Tillsätt 500 μl 80-procentig etanol (–20 °C) och blanda genom att vända upp och ned på röret. |
| --- | --- |

12)

Tillsätt 500 μl 80-procentig etanol (–20 °C) och blanda genom att vända upp och ned på röret.

| 13) | Centrifugera vid 15 000 g under 10 minuter vid 4 °C, spara pelleten och avlägsna etanolen. |
| --- | --- |

13)

Centrifugera vid 15 000 g under 10 minuter vid 4 °C, spara pelleten och avlägsna etanolen.

| 14) | Låt pelleten lufttorka eller torka i DNA speed vac. |
| --- | --- |

14)

Låt pelleten lufttorka eller torka i DNA speed vac.

| 15) | Återsuspendera pelleten i 100 μl sterilt ultrarent vatten och låt stå i rumstemperatur under minst 20 minuter. |
| --- | --- |

15)

Återsuspendera pelleten i 100 μl sterilt ultrarent vatten och låt stå i rumstemperatur under minst 20 minuter.

| 16) | Lagra vid –20 °C fram till användning för PCR. |
| --- | --- |

16)

Lagra vid –20 °C fram till användning för PCR.

| 17) | Blanda ned alla eventuella vita fällningar genom centrifugering och använd 5 μl av supernatanten innehållande DNA till PCR. |
| --- | --- |

17)

Blanda ned alla eventuella vita fällningar genom centrifugering och använd 5 μl av supernatanten innehållande DNA till PCR.

b)   Andra metoder

Andra metoder för extraktion av DNA, t.ex. Qiagen DNeasy Plant Kit, skulle kunna användas, förutsatt att det är belagt att de har lika stor inverkan när det gäller att rena DNA från kontrollprover innehållande 103–104 patogena celler per ml.

6.2   PCR

6.2.1   Preparera test- och kontrollmallar för PCR enligt de validerade protokollen (avsnitt VI.A.6.). Preparera en decimal utspädning av DNA-provextrakt (1:10 i ultrarent vatten).

6.2.2   Preparera lämplig PCR-reaktionsblandning i en omgivning fri från smitta enligt de offentliggjorda protokollen (tillägg 6). Användning av multiplexa PCR-protokoll som även omfattar en intern PCR-kontroll rekommenderas där så är möjligt.

6.2.3   Tillsätt 2–5 μl DNA-extrakt per 25 μl PCR-reaktion i sterila PCR-rör enligt PCR-protokollen (se tillägg 6).

6.2.4   Blanda i ett negativt kontrollprov innehållande PCR-reaktionsblandning och tillsätt ultrarent vatten av samma ursprung som det som användes i PCR-blandningen i stället för provet.

6.2.5   Placera rören i samma termocykelapparat som användes vid föregående testning och kör lämpligt optimerat PCR-program (tillägg 6).

6.3   Analys av PCR-produkten

6.3.1   Lös PCR-kopior med agarosgelelektrofores. Använd minst 12 μl av amplifierad DNA-reaktionsblandning från varje prov blandat med 3 μl laddningsbuffert (tillägg 6) i 2,0 % (w/v) agarosgel i tris-acetat-EDTA (TAE) buffert (tillägg 6) vid 5–8 V per cm. Använd en lämplig DNA-markör, t.ex. 100 bp storleksmarkör.

6.3.2   Påvisa DNA-band genom att färga i ethidiumbromid (0,5 mg/l) under 30–60 minuter, varvid lämpliga försiktighetsåtgärder bör vidtas vid hanteringen av denna mutagen.

6.3.3   Observera det färgade gelet i kortvågs-UV-genomlysning (λ = 302 nm) och sök efter amplifierade PCR-produkter av förväntad storlek (tillägg 6) och dokumentera.

6.3.4   För varje ny upptäckt/nytt fall verifiera autenticiteten hos PCR-kopian genom att utföra restriktionsenzymanalys på ett prov av det återstående amplifierade DNA genom inkubation vid optimal temperatur och under optimal tid med en lämplig enzym och buffert (se tillägg 6). Lös de uppdelade fragmenten genom agarosgelelektrofores, som ovan, och observera det karakteristiska restriktionsfragmentsmönstret vid UV-genomlysning efter färgning i etidiumbromid, och jämför med den ouppdelade och uppdelade positiva kontrollen.

Tolkning av PCR-resultaten:

PCR-testet är negativt om det R. solanacearum-specifika PCR-kopian av den förväntade storleken inte upptäcks i provet, men upptäcks i alla positiva kontrollprover (i fallet multiplex-PCR med plantspecifika interna kontrollprimrar måste en andra PCR-produkt av förväntad storlek amplifieras med provet i fråga).

PCR-testet är positivt om det R. solanacearum-specifika PCR-kopian av den förväntade storleken och det förväntade restriktionsmönstret (vid behov) upptäcks, förutsatt att det inte amplifierats från någon av de negativa kontrollproven. Tillförlitlig bekräftelse av ett positivt resultat kan även erhållas genom att testet upprepas med en andra uppsättning PCR-primrar (tillägg 6).

Anmärkning: Inhibering av PCR kan misstänkas om den förväntade kopian erhålls från det positiva kontrollprovet innehållande R. solanacearum i vatten men negativa resultat erhålls från positiva kontroller med R. solanacearum i potatisextrakt. I multiplexa PCR-protokoll med interna PCR-kontroller anges inhibering av reaktionen när inget av de båda kopiorna erhålls.

Nedsmittning kan misstänkas om den förväntade kopian erhålls från en eller flera av de negativa kontrollerna.

7.   FISH-test

Princip

Om FISH-testet används som första screeningtest och resultatet är positivt, skall ett andra screeningtest i form av isoleringstest eller IF-test göras. Om FISH-testet används som andra screeningtest och resultatet är positivt, krävs ytterligare testning enligt flödesschemat för att diagnosen skall bli fullständig.

Anmärkning: Använd validerade R. solanacearum-specifika oligo-prober (se tillägg 7). Preliminär testning med denna metod bör möjliggöra reproducerbar upptäckt av minst 103–104 celler av R. solanacearum per ml som tillsätts till provextrakt som tidigare testats och gett negativt svar.

Följande förfarande bör helst tillämpas på nypreparerade provextrakt men kan även tillämpas på provextrakt som lagrats i glycerol vid en temperatur av –16 till –24 °C eller –68 till –86 °C.

Som negativa kontroller använd portioner av provextrakt som tidigare givit negativt svar när de testats avseende R. solanacearum.

Som positiva kontroller preparera suspensioner innehållande 105–106 celler per ml av R. solanacearum biovar 2 (dvs. stam NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, se tillägg 3) i 0,01 M fosfatbuffert från en 3–5 dagar gammal kultur. Bered separata positiva kontrollglas av den homologa stammen eller någon annan referensstam av R. solanacearum, som suspenderats i potatisextrakt, såsom anges i tillägg 3 B.

Användningen av FITC-märkt eubakteriell oligo-prob fungerar som en kontroll av hybridiseringsprocessen, eftersom den färgar alla eubakterier som finns i provet.

Standardiserade positiva och negativa kontrollmaterial som kan användas i detta test förtecknas i tillägg 3 punkt A.

Testa kontrollmaterialen exakt som provet (proverna).

7.1   Fixering av potatisextrakt

Följande protokoll utgår ifrån Wullings et al. (1998):

7.1.1   Preparera fixeringslösningen (se tillägg 7).

7.1.2   Pipettera 100 μl av varje provextrakt i ett Eppendorf-rör och centrifugera under 7 minuteruter på 7 000 g.

7.1.3   Avlägsna supernatanten och lös pelleten i 200 μl fixeringsvätska som preparerats 24 timmar tidigare. Skaka och inkubera under 1 timme i kylskåp.

7.1.4   Centrifugera under 7 minuter på 7 000 g, avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 75 μl 0,01 M fosfatbuffert (se tillägg 7).

7.1.5   Droppa 16 μl av de fixerade suspensionerna på ett rent multitest-objektglas, såsom anges i fig. 7.1. Förse varje glas med två olika prover som är outspädda, och använd 10 μl för att göra en 1:100 utspädning (i 0,01 M fosfatbuffert). Den återstående provlösningen (49 μl) kan lagras vid –20 °C efter tillsats av 1 volym 96-procentig etanol. Om FISH-testet skall upprepas, avlägsna etanolen genom centrifugering, och tillsätt en lika stor volym 0,01 fosfatbuffert (omskakas).

Fig. 7.1:   FISH-glasets layout.

| Prov 1 | Blankprov | Blankprov | Blankprov | Prov 2 |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| | | | | |
| Fönster 1 | Fönster 2 | Fönster 3 | Fönster 4 | Fönster 5 |
| Prov 1 | Blankprov | Blankprov | Blankprov | Prov 2 |
| | | | | |
| Fönster 6 | Fönster 7 | Fönster 8 | Fönster 9 | Fönster 10 |
| Täckglas 1 | | Täckglas 2 |

Prov 1

Blankprov

Blankprov

Blankprov

Prov 2

Image

Image

Image

Image

Image

Fönster 1

Fönster 2

Fönster 3

Fönster 4

Fönster 5

Prov 1

Blankprov

Blankprov

Blankprov

Prov 2

Image

Image

Image

Image

Image

Fönster 6

Fönster 7

Fönster 8

Fönster 9

Fönster 10

Täckglas 1

Täckglas 2

7.1.6   Lufttorka glasen (eller torka på objektglastork vid 37 °C) och fixera dem genom flambering.

Förfarandet kan på detta stadium avbrytas, och hybridiseringen kan fortsätta följande dag. Glasen bör förvaras dammfritt och torrt i rumstemperatur.

7.2   Hybridisering

7.2.1   Torka cellerna i en serie av etanol om 50 %, 80 % och 96 % under 1 minut vardera. Lufttorka glasen i en hållare för objektglas.

7.2.2   Preparera en fuktkammare för inkubation genom att täcka botten av en lufttät behållare med mjuk- eller filterpapper doppat i 1 x hybmix (tillägg 7). Preinkubera behållaren i hybridiseringsugn vid 45 °C under minst 10 minuter.

7.2.3   Tillsätt 10 μl hybridiseringslösning (tillägg 7) till 8 fönster (fönstren 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 och 10; se figur 7.1) på varje glas och lämna de två mittfönstren (3 och 8) tomma.

7.2.4   Anbringa täckglass (24 × 24 mm) på det första och de 4 sista fönstren utan att låta någon luft komma emellan. Placera glasen i den redan uppvärmda fuktkammaren och hybridisera under 5 timmar i ugn i 45 °C i mörker.

7.2.5   Preparera 3 bägare innehållande 1 l Milli Q-vatten (av molekylärbiologisk kvalitet), 1 l av 1 x hybmix (334 ml 3 x hybmix och 666 ml Milli Q-vatten) och 1 l av 1/8 x hybmix (42 ml 3 x hybmix och 958 ml Milli Q-vatten). Preinkubera var och en i vattenbad vid 45 °C.

7.2.6   Avlägsna täckglasen från glasen och placera glasen i en hållare för objektglas.

7.2.7   Tvätta bort överskott av probe genom inkubation under 15 minuter i bägaren med 1 x hybmix vid 45 °C.

7.2.8   För över hållaren för objektglas till 1/8 hybmix tvättlösning och inkubera under ytterligare 15 minuter.

7.2.9   Doppa glasen hastigt i Milli Q-vatten och placera dem på filterpapper. Avlägsna överskottsfukt genom att försiktigt täcka ytan med filterpapper. Pipettera 5-10 μl av inbäddningslösning som motverkar blekning (t.ex. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA eller liknande) på varje fönster och lägg ett stort täckglas (24 × 60 mm) över hela glaset.

7.3   Avläsning av FISH-testet

7.3.1   Observera glasen omedelbart i ett mikroskop utrustat för epifluorescensmikroskopi vid 630 eller 1 000 × förstoring under oljeimmersion. Med ett filter lämpligt för fluoresceinisothiocyanat (FITC) färgas eubakteriecellerna (inklusive de flesta gramnegativa cellerna) i provet fluorescerande gröna. Med ett filter för tetrametylrodamin-5-isotiocyanat framträder Cy3-infärgade celler av R. solanacearum som fluroscerande röda. Jämför cellmorfologin med de positiva kontrollernas cellmorfologi. Cellerna skall vara klart fluorescerande och helt färgade. FISH-testet (avsnitt VI.A.7.) skall återupprepas om färgningen är avvikande. Scanna fönstren utefter två diametrar i rät vinkel och runt perimetern. På de prover som inte uppvisar några celler eller endast ett litet antal celler, observera minst 40 mikroskopfält.

7.3.2   Sök efter ljusa fluorescerande celler med morfologi som är karakteristisk för R. solanacearum i testfönstren på testglasen (se webbplats: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intensiteten hos fluorescensen skall vara likvärdig med eller större än fluorescensen hos den positiva kontrollstammen. Celler med ojämn eller ofullständig färgning eller med svag fluorescens beaktas inte.

7.3.3   Om nedsmittning misstänks skall testet upprepas. Detta kan vara fallet om alla glas i ett parti uppvisar positiva celler på grund av nedsmittning av en buffert eller om positiva celler påträffas (utanför glasets fönster) på objektglasöverdraget.

7.3.4   FISH-testets specificitet medför flera problem. Bestånd av fluorescerande celler med atypisk morfologi och korsreagerande saprofytiska bakterier som har en liknande storlek och morfologi som R. solanacearum kan förekomma hos potatisar, dels i naveländarna, dels i pelletar av stjälksegmentet, även om de är mycket mer lågfrekventa än i IF-test.

7.3.5   Endast fluorescerande celler med typisk storlek och morfologi tas i beaktande.

7.3.6   Tolkning av FISH-resultaten:

| i) | Giltiga resultat från FISH-test erhålls om klart fluorescerande gröna celler med storlek och morfologi som är typiskt för R. solanacearum observeras när ett FITC-filter används respektive klart fluorescerande röda celler när ett rodamin-filter används i alla positiva kontroller och inte i någon av de negativa kontrollerna. För varje prov med ljusa fluorescerande celler med karakteristisk morfologi: bestäm medeltalet typiska celler per mikroskopfält och beräkna antal typiska celler per ml återsuspenderad pellet (tillägg 4). Prover som innehåller minst 5 × 103 typiska celler per ml återsuspenderad pellet betraktas som potentiellt nedsmittade. Ytterligare provtagning krävs. Prover som innehåller färre än 5 x 103 typiska celler per ml återsuspenderad pellet betraktas som negativa. |
| --- | --- |

i)

Giltiga resultat från FISH-test erhålls om klart fluorescerande gröna celler med storlek och morfologi som är typiskt för R. solanacearum observeras när ett FITC-filter används respektive klart fluorescerande röda celler när ett rodamin-filter används i alla positiva kontroller och inte i någon av de negativa kontrollerna. För varje prov med ljusa fluorescerande celler med karakteristisk morfologi: bestäm medeltalet typiska celler per mikroskopfält och beräkna antal typiska celler per ml återsuspenderad pellet (tillägg 4). Prover som innehåller minst 5 × 103 typiska celler per ml återsuspenderad pellet betraktas som potentiellt nedsmittade. Ytterligare provtagning krävs. Prover som innehåller färre än 5 x 103 typiska celler per ml återsuspenderad pellet betraktas som negativa.

| ii) | FISH-testet är negativt om klart fluorescerande röda celler med storlek och morfologi som är typiskt för R. solanacearum inte observeras när rodamin-filtret används, förutsatt att typiska klart fluorescerande röda celler observeras i de positiva kontrollpreparaten när rodamin-filtret används. |
| --- | --- |

ii)

FISH-testet är negativt om klart fluorescerande röda celler med storlek och morfologi som är typiskt för R. solanacearum inte observeras när rodamin-filtret används, förutsatt att typiska klart fluorescerande röda celler observeras i de positiva kontrollpreparaten när rodamin-filtret används.

8.   ELISA-test

Princip

ELISA kan endast användas som ett frivilligt test som komplement till IF, PCR eller FISH på grund av den relativt sett låga känsligheten hos detta test. Om DAS ELISA används är anrikning och monoklonala antikroppar obligatoriskt (se webbplats: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Anrikning av proverna för ELISA kan vara användbart för att öka testets känslighet, men den kan misslyckas på grund av konkurrens från andra organismer i provet.

Anmärkning: Använd antikroppar mot R. solanacearum med validerat ursprung (se webbplats http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Det rekommenderas att titer bestäms för varje nytt parti antikroppar. Titern definieras som den högsta utspädning vid vilken en optimal reaktion sker när en suspension av 105 to 106 celler per ml av den homologa stammen av R. solanacearum testas och när lämpliga sekundära antikroppkonjugat i överensstämmelse med tillverkarens rekommendationer används. Vid testningen bör antikropparna användas vid en arbetsutspädning nära eller vid titern i den kommersiellt tillgängliga blandningen.

Bestäm titern av antikroppar i en suspension av 105 till 106 celler per ml av den homologa stammen av R. solanacearum.

Ta med ett provextrakt som tidigare gett negativt svar när det testats för R. solanacearum och en suspension av icke-korsreagerande bakterier i en fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som negativa kontroller.

Som positiv kontroll använd portioner av provextrakt som tidigare gett negativt svar när de testats, blandade med 103 till 104 celler per ml R. solanacearum biovar 2 (t.ex. stam NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, se tillägg 2 A och B). För jämförelse av resultaten på varje platta, använd en standardsuspension av celler per ml i PBS av solanacearum. Säkerställ att de positiva kontrollerna är väl åtskilda på mikrotiterplattan från provet (proven) under testet.

Standardiserade positiva och negativa kontrollmaterial som kan användas i detta test förtecknas i tillägg 3 A.

Testa kontrollmaterialen exakt som provet (proven).

Två ELISA-protokoll har validerats:

a)   Indirekt ELISA (Robinson-Smith m.fl., 1995)

| 1) | Använd 100–200 μl portioner av provextraktet. (Upphettning till 100 °C under 4 minuter i vattenbad eller värmeblock kan minska icke-specifika resultat i vissa fall.) |
| --- | --- |

1)

Använd 100–200 μl portioner av provextraktet. (Upphettning till 100 °C under 4 minuter i vattenbad eller värmeblock kan minska icke-specifika resultat i vissa fall.)

| 2) | Tillsätt en motsvarande volym coatingbuffert av dubbel styrka (tillägg 4) och skaka. |
| --- | --- |

2)

Tillsätt en motsvarande volym coatingbuffert av dubbel styrka (tillägg 4) och skaka.

| 3) | Tillsätt 100 μl portioner till var och en av de sista två brunnarna på en mikrotiterplatta (t.ex. Nunc-Polysorp eller motsvarande) och inkubera under 1 timme i 37 °C eller över natten i 4 °C. |
| --- | --- |

3)

Tillsätt 100 μl portioner till var och en av de sista två brunnarna på en mikrotiterplatta (t.ex. Nunc-Polysorp eller motsvarande) och inkubera under 1 timme i 37 °C eller över natten i 4 °C.

| 4) | Häll ut extrakten från brunnarna. Tvätta brunnarna tre gånger med PBS-Tween (tillägg 4), varvid den sista tvättlösningen får vara kvar i brunnarna minst 5 minuter. |
| --- | --- |

4)

Häll ut extrakten från brunnarna. Tvätta brunnarna tre gånger med PBS-Tween (tillägg 4), varvid den sista tvättlösningen får vara kvar i brunnarna minst 5 minuter.

| 5) | Bered den tillämpliga utspädningen av antikroppar mot R. solanacearum i blockeringsbuffert (tillägg 4). För validerade antikroppar som finns i handeln används de rekommenderade utspädningarna (vanligtvis dubbelt så hög koncentration som titern). |
| --- | --- |

5)

Bered den tillämpliga utspädningen av antikroppar mot R. solanacearum i blockeringsbuffert (tillägg 4). För validerade antikroppar som finns i handeln används de rekommenderade utspädningarna (vanligtvis dubbelt så hög koncentration som titern).

| 6. | Tillsätt 100 μl till varje brunn och inkubera under 1 timme i 37 °C. |
| --- | --- |

6.

Tillsätt 100 μl till varje brunn och inkubera under 1 timme i 37 °C.

| 7) | Häll ut antikroppslösningen från brunnarna och tvätta som ovan (4). |
| --- | --- |

7)

Häll ut antikroppslösningen från brunnarna och tvätta som ovan (4).

| 8) | Bered den tillämpliga utspädningen av sekundär antikropp-alkalin fosfatas konjugat i blockeringsbuffert. Tillsätt 100 μl till varje brunn och inkubera under 1 timme i 37 °C. |
| --- | --- |

8)

Bered den tillämpliga utspädningen av sekundär antikropp-alkalin fosfatas konjugat i blockeringsbuffert. Tillsätt 100 μl till varje brunn och inkubera under 1 timme i 37 °C.

| 9) | Häll ut antikroppskonjugatet från brunnarna och tvätta som ovan (4). |
| --- | --- |

9)

Häll ut antikroppskonjugatet från brunnarna och tvätta som ovan (4).

| 10) | Tillsätt 100 μl alkalisk fosfatassubstratlösning (tillägg 4) till varje brunn. Inkubera i mörker vid omgivande temperatur och läs av absorptionen vid 405 nm vid regelbundna intervaller inom 90 minuter. |
| --- | --- |

10)

Tillsätt 100 μl alkalisk fosfatassubstratlösning (tillägg 4) till varje brunn. Inkubera i mörker vid omgivande temperatur och läs av absorptionen vid 405 nm vid regelbundna intervaller inom 90 minuter.

b)   DASI ELISA

| 1) | Preparera lämplig utspädning av anti-R. solanacearum polyklonala immunoglobuliner i coatingbuffert pH 9,6 (tillägg 4). Tillsätt 200 μl till varje brunn. Inkubera vid 37 °C under 4–5 timmar eller vid 4 °C under 16 timmar. |
| --- | --- |

1)

Preparera lämplig utspädning av anti-R. solanacearum polyklonala immunoglobuliner i coatingbuffert pH 9,6 (tillägg 4). Tillsätt 200 μl till varje brunn. Inkubera vid 37 °C under 4–5 timmar eller vid 4 °C under 16 timmar.

| 2) | Tvätta brunnarna tre gånger med PBS-Tween (tillägg 4).
  Tillsätt 190 μl provextrakt till minst 2 brunnar. Tillsätt också positiva och negativa kontroller i två brunnar på varje platta. Inkubera under 16 timmar vid 4 °C. |
| --- | --- |

2)

Tvätta brunnarna tre gånger med PBS-Tween (tillägg 4).

Tillsätt 190 μl provextrakt till minst 2 brunnar. Tillsätt också positiva och negativa kontroller i två brunnar på varje platta. Inkubera under 16 timmar vid 4 °C.

| 3) | Tvätta brunnarna tre gånger med PBS-Tween (tillägg 4). |
| --- | --- |

3)

Tvätta brunnarna tre gånger med PBS-Tween (tillägg 4).

| 4) | Preparera en lämplig utspädning av R. solanacearum-specifika monoklonala antikroppar i PBS (tillägg 4) som även innehåller 0,5 % bovint serumalbumin (BSA) och tillsätt 190 μl till varje brunn. Inkubera vid 37 °C under 2 timmar. |
| --- | --- |

4)

Preparera en lämplig utspädning av R. solanacearum-specifika monoklonala antikroppar i PBS (tillägg 4) som även innehåller 0,5 % bovint serumalbumin (BSA) och tillsätt 190 μl till varje brunn. Inkubera vid 37 °C under 2 timmar.

| 5) | Tvätta brunnarna tre gånger med PBS-Tween (tillägg 4). |
| --- | --- |

5)

Tvätta brunnarna tre gånger med PBS-Tween (tillägg 4).

| 6) | Preparera en lämplig utspädning av antimus-antikroppar som konjugerats med alkaliskt fosfatas i PBS. Tillsätt 190 μl till varje brunn. Inkubera vid 37 °C under 2 timmar. |
| --- | --- |

6)

Preparera en lämplig utspädning av antimus-antikroppar som konjugerats med alkaliskt fosfatas i PBS. Tillsätt 190 μl till varje brunn. Inkubera vid 37 °C under 2 timmar.

| 7) | Tvätta brunnarna tre gånger med PBS-Tween (tillägg 4). |
| --- | --- |

7)

Tvätta brunnarna tre gånger med PBS-Tween (tillägg 4).

| 8) | Preparera en alkalisk fosfatassubstratlösning som innehåller 1 mg p-nitrofenylfosfat per ml substratbuffert (tillägg 4). Tillsätt 200 μl till varje brunn. Inkubera i mörker vid omgivande temperatur och läs av absorptionen vid 40 nm vid regelbundna intervaller inom 90 minuter. |
| --- | --- |

8)

Preparera en alkalisk fosfatassubstratlösning som innehåller 1 mg p-nitrofenylfosfat per ml substratbuffert (tillägg 4). Tillsätt 200 μl till varje brunn. Inkubera i mörker vid omgivande temperatur och läs av absorptionen vid 40 nm vid regelbundna intervaller inom 90 minuter.

Tolkning av resultaten av ELISA-testet:

ELISA-testet är negativt om den genomsnittliga optiska densiteten (OD) i duplicerade provbrunnar är < 2 x OD för den i kontrollbrunnen med det negativa provextraktet, förutsatt att OD för samtliga positiva kontroller är över 1,0 (efter 90 minuter inkubation med substratet) och är mer än dubbelt så hög som den OD som erhålls för de negativa provextrakten.

ELISA-testet är positivt om den genomsnittliga OD i duplicerade provbrunnar är > 2 x OD i brunnen med det negativa provextraktet, förutsatt att OD för samtliga negativa kontroller är < 2 x den i de positiva kontrollbrunnarna.

Negativa ELISA-resultat i positiva kontrollbrunnar antyder att testet inte har utförts korrekt eller har inhiberats. Positiva ELISA-resultat i negativa kontrollbrunnar antyder att korskontaminering eller icke-specifik antikroppsbindning har inträffat.

9.   Biotest

Anmärkning: Preliminär testning med denna metod bör möjliggöra reproducerbar upptäckt av 103–104 kolonibildande enheter av R. solanacearum per ml som tillsätts till provextrakt som tidigare testats och gett negativt svar (information om prepareringen finns i tillägg 3).

Högst känslighetsnivå för upptäckt kan förväntas då nyligen preparerade provextrakt används och optimala tillväxtförhållanden tillämpas. Metoden kan emellertid med framgång tillämpas på extrakt som har lagrats i glycerol vid –68 till –86 °C.

Nedanstående protokoll grundar sig på Janse (1988):

9.1   Använd 10 testplantor av mottagliga tomatsorter (t.ex. Moneymaker eller sorter med motsvarande mottaglighet enligt testlaboratoriet) Detaljerad information om odling finns i tillägg 8. Alternativt, använd äggplantor (t.ex. sorten Black Beauty eller sorter med motsvarande mottaglighet), och använd endast plantor på bladstadierna 2–3 upp till full utveckling av trebladsstadiet. Tidigare studier har visat att symtomen hos äggplantor är mindre påtagliga och utvecklas långsammare. Därför rekommenderas att tomatplantor används där så är möjligt.

Fördela 100 μl provextrakt mellan testplantorna.

9.2.1   Inympning med en spruta

Inokulera plantornas stjälkar just ovanför hjärtbladen med en spruta som är försedd med injektionsnål (minst 23 G). Fördela provet mellan testplantorna.

9.2.2   Inokulation genom skåra

Håll plantan mellan två fingrar, droppa med hjälp av en pipett en droppe (ca 5–10 μl) av det uppslammade koncentrerade extraktet på stjälken mellan hjärtbladen och det första bladet.

Gör med en steril skalpell en diagonal skåra ungefär 1,0 cm lång och ungefär lika djup som två tredjedelar av stjälkens diameter med början vid droppen med det koncentrerade extraktet.

Förslut skåran med sterilt vaselin från en spruta.

9.3   Inokulera med samma teknik, 5 småplantor med en vattensuspension av 105-106 celler per ml preparerad av en 48-timmarskultur av en virulent biovar 2-stam av R. solanacearum som positiv kontroll och med pelletbuffert (tillägg 4) som negativ kontroll. Separera de positiva och negativa kontrollplantorna från de andra plantorna för att undvika korskontaminering.

9.4   Odla testplantorna i karantänsanläggningar upp till 4 veckor vid 25–30 °C och med hög relativ luftfuktighet och med lämplig bevattning för att undvika vattenmättnad eller vissnande på grund av vattenbrist. För att undvika nedsmittning, inkubera positiva och negativa kontrollplantor på strikt separata bänkar i ett växthus eller odlingsrum eller, vid platsbrist, se till att hanteringen sker strikt separat. Om plantor från olika prover skall inkuberas tätt tillsammans, separera dem med lämpliga skärmar. Vid gödning, bevattning, inspektion och annan behandling, var noga med att undvika korskontaminering. Det är mycket viktigt att hålla växthus och odlingsrum fria från alla skadeinsekter eftersom de kan överföra bakterien från prov till prov.

Sök efter symtom på vissning, epinasti, kloros och/eller försvagad tillväxt.

9.5   Isolera från infekterade plantor (avsnitt II.3) och identifiera renkulturer av förmodad R. solanacearum (avsnitt VI. B).

9.6   Om inga symtom observeras efter 3 veckor, utför IF/PCR/isolering på ett blandprov av 1 cm stjälksegment från varje testplanta taget ovanför inokulationsstället. Om testet är positivt, utför plattspridning från spädningsserie (se avsnitt 4.1).

9.7   Identifiera och rena kulturerna av förmodad R. solanacearum (avsnitt VI. B).

Tolkning av resultaten av biotestet:

Giltiga resultat från biotest erhålls om plantor från den positiva kontrollen uppvisar typiska symtom, bakterier kan omisoleras från dessa plantor och inga symtom återfinns på de negativa kontrollerna.

Biotestet är negativt om testplantorna inte är infekterade av R. solanacearum och under förutsättning att R. solanacearum detekterats i de positiva kontrollerna.

Biotestet är positivt om testplantorna är infekterade av R. solanacearum.

B.   IDENTIFIERINGSTEST

Identifiera renkulturer av presumtiva R. solanacearum-isolat genom att utföra minst två av följande tester baserade på olika biologiska principer.

Ta med kända referensstammar när så är lämpligt vid varje test som utförs (se tillägg 3).

1.   Närings- och enzymtest

Fastställ följande fenotypiska egenskaper som alltid är närvarande eller frånvarande i R. solanacearum enligt metoderna Lelliott och Stead (1987), Klement m.fl. (1990), Schaad (2001).

| Test | Förväntat resultat |
| --- | --- |
| Produktion av fluorescerande pigment | – |
| poly-β-hydroxybutyrat-inklusioner | + |
| Oxidations-/fermenteringstest (O/F-test). | O+/F– |
| Katalasaktivitet | + |
| Kovacs oxidastest | + |
| Reduktion av nitrat | + |
| Användning av citrat | + |
| Tillväxt vid 40 °C | – |
| Tillväxt i 1 % NaCl | + |
| Tillväxt i 2 % NaCl | – |
| Arginindihydrolas-aktivitet | – |
| Smältning av gelatin | – |
| Hydrolys av stärkelse | – |
| Hydrolys av aesculin | – |
| Levanproduktion | – |

Test

Förväntat resultat

Produktion av fluorescerande pigment

–

poly-β-hydroxybutyrat-inklusioner

+

Oxidations-/fermenteringstest (O/F-test).

O+/F–

Katalasaktivitet

+

Kovacs oxidastest

+

Reduktion av nitrat

+

Användning av citrat

+

Tillväxt vid 40 °C

–

Tillväxt i 1 % NaCl

+

Tillväxt i 2 % NaCl

–

Arginindihydrolas-aktivitet

–

Smältning av gelatin

–

Hydrolys av stärkelse

–

Hydrolys av aesculin

–

Levanproduktion

–

2.   IF-test

2.1   Preparera en suspension av ungefär 106 celler per ml i IF-buffert (tillägg 4).

2.2   Preparera en serie dubbla utspädningar av ett lämpligt antiserum (se webbplats: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

2.3   Tillämpa IF-förfarandet (avsnitt VI.A.5.).

2.4   Ett positivt IF-test erhålls om kulturen har samma IF-titer som den positiva kontrollen.

3.   ELISA-test

Anmärkning: Om endast två identifieringstest görs, använd inget annat serologiskt test som komplement till den här metoden.

3.1   Preparera en suspension av ungefär 108 celler per ml i 1 x fosfatbuffrad koksaltlösning (tillägg 4).

3.2   Utför ett lämpligt ELISA-test med en specifik monoklonal antikropp till R. solanacearum.

3.3   ELISA-testet är positivt om ELISA-resultatet från kulturen är minst hälften så högt som det från den positiva kontrollen.

4.   PCR-test

4.1   Preparera en suspension av ungefär 106 celler per ml i sterilt vatten av molekylärbiologisk kvalitet.

4.2   Upphetta 100 μl av cellsuspensionen i tillslutna rör i värmeblock eller kokande vattenbad i 100 °C under 4 minuter. Proverna kan därefter lagras i –16 till –24 °C fram till användning.

4.3   Använd lämpliga PCR-förfaranden för att amplifiera R. solanacearum-specifika kopior (t.ex. Seal m.fl. [1993]; Pastrik and Maiss [2000]; Pastrik m.fl. [2002]; Boudazin m.fl. [1999]; Opina m.fl. [1997], Weller m.fl. [1999]).

4.4   En positiv identifiering av R. solanacearum erhålls om PCR-kopiorna har samma storlek och samma RFLP (restriction fragment length polymorphisms) som den positiva kontrollstammen.

5.   FISH-test

5.1   Preparera en suspension av ungefär 106 celler per ml i ultrarent vatten.

5.2   Tillämpa FISH-förfarandet (avsnitt VI.A.7.) med minst 2 R. solanacearum-specifika oligo-prober (tillägg 7).

5.3   Ett positivt FISH-test föreligger om samma reaktioner erhålls från kulturen och den positiva kontrollen.

6.   Fettsyraprofilering (FAP)

6.1   Odla kulturen på trypticase-soja-agar (Oxoid) under 48 timmar i 28 °C.

6.2   Tillämpa ett lämpligt FAP-förfarande (Janse, 1991; Stead, 1992).

6.3   Ett positivt FAP-test erhålls om den presumtiva kulturen har samma profil som den positiva kontrollen. Förekomsten av karakteristiska fettsyror är 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH och 18:1 2OH, och frånvaron av 16:0 3OH tyder i hög grad på Ralstonia sp.

7.   Metoder för stamkarakterisering

Stamkarakterisering är en av följande metoder som rekommenderas för varje nytt fall av isolering av R. solanacearum.

Ta med kända referensstammar när så är lämpligt vid varje test som utförs (se tillägg 3).

7.1   Biovarbestämning

R. solanacearum separeras i biovarer på grundval av förmågan att använda och/eller oxidera tre disackarider och tre hexosalkoholer (Hayward, 1964 och Hayward m.fl. 1990). Odlingsmedier för biovartest beskrivs i tillägg 2. Testet kan tillämpas genom att mediet stickinokuleras med renkulturer av R. solanacearum-isolat och inkuberas i 28 °C. Om mediet fördelas i sterila cellodlingsplattor med 96 brunnar (200 μl per brunn) kan färgändring från olivgrön till gul observeras inom 72 timmar, vilket indikerar ett positivt testresultat.

| | Biovar |
| --- | --- |
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Användning av: | |
| Maltos | - | + | + | - | + |
| Laktos | - | + | + | - | + |
| D (+) Cellobios | - | + | + | - | + |
| Mannitol | - | - | + | + | + |
| Sorbitol | - | - | + | + | - |
| Dulcitol | - | - | + | + | - |

Biovar

1

2

3

4

5

Användning av:

Maltos

-

+

+

-

+

Laktos

-

+

+

-

+

D (+) Cellobios

-

+

+

-

+

Mannitol

-

-

+

+

+

Sorbitol

-

-

+

+

-

Dulcitol

-

-

+

+

-

Ytterligare test differentierar biovar 2 subfenotyper.

| | Biovar 2A
  (världsvid spridning) | Biovar 2A
  (påträffas i Chile och Colombia) | Biovar 2T
  (påträffas i tropiska områden) |
| --- | --- | --- | --- |
| Användning av trehalos | - | + | + |
| Användning av meso-inositol | + | - | + |
| Användning av D-ribos | - | - | + |
| Pektolytisk aktivitet (1) | låg | låg | hög |

Biovar 2A

(världsvid spridning)

Biovar 2A

(påträffas i Chile och Colombia)

Biovar 2T

(påträffas i tropiska områden)

Användning av trehalos

-

+

+

Användning av meso-inositol

+

-

+

Användning av D-ribos

-

-

+

Pektolytisk aktivitet (1)

låg

låg

hög

7.2   Genomiskt fingeravtryck

Molekylär differentiering av stammar av R. solanacearum-komplexet kan åstadkommas genom att flera olika tekniker används, bland annat

7.2.1   RFLP-analys (restriction fragment length polymorphism) (Cook m.fl., 1989).

7.2.2   Repetitiv sekvens-PCR med användning av REP-, ERIC- och BOX-primrar (Louws m.fl., 1995; Smith m.fl., 1995).

7.2.3   AFLP-analys (amplified fragment length polymorphism) (Van der Wolf m.fl., 1998).

7.3   PCR-metoder

Specifika PCR primers (Pastrik m.fl., 2002; se tillägg 6) kan användas för att differentiera stammar tillhörande grupp 1 (biovar 3, 4 och 5) och grupp 2 (biovar 1, 2A och 2T) av R. solanacearum, ursprungligen definierade genom RFLP-analys (Cook m.fl., 1989) och 16S rDNA-sekvensbestämning (Taghavi m.fl., 1996).

C.   VERIFIERINGSTEST

Patogenitetstestet skall utföras som en slutlig bekräftelse på en diagnos av R. solanacearum och för att bedöma virulensen hos kulturer identifierade som R. solanacearum.

| 1) | Bered ett inokulat av ca 106 celler per ml av en 24–48-timmarskultur av det isolat som skall testas och en lämplig positiv kontrollstam av R. solanacearum (t.ex. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; se tillägg 3). |
| --- | --- |

1)

Bered ett inokulat av ca 106 celler per ml av en 24–48-timmarskultur av det isolat som skall testas och en lämplig positiv kontrollstam av R. solanacearum (t.ex. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; se tillägg 3).

| 2) | Inokulera 5–10 mottagliga små tomatplantor eller små äggplantor på trebladsstadiet (se avsnitt VI.A.9). |
| --- | --- |

2)

Inokulera 5–10 mottagliga små tomatplantor eller små äggplantor på trebladsstadiet (se avsnitt VI.A.9).

| 3) | Inkubera under 2 veckor i 25–28 °C med hög relativ luftfuktighet med lämplig bevattning för att undvika vattenmättnad eller stress till följd av torka. Med renodlingar bör typiskt vissnande uppnås inom 14 dagar. Om inga symtom märks efter denna period, kan det inte fastslås att kulturen är en patogen form av R. solanacearum. |
| --- | --- |

3)

Inkubera under 2 veckor i 25–28 °C med hög relativ luftfuktighet med lämplig bevattning för att undvika vattenmättnad eller stress till följd av torka. Med renodlingar bör typiskt vissnande uppnås inom 14 dagar. Om inga symtom märks efter denna period, kan det inte fastslås att kulturen är en patogen form av R. solanacearum.

| 4) | Sök efter symtom på vissning och/eller epinasti, kloros och försvagad tillväxt. |
| --- | --- |

4)

Sök efter symtom på vissning och/eller epinasti, kloros och försvagad tillväxt.

| 5) | Isolera från plantor med symtom genom att avlägsna ett segment från stjälken ca 2 cm ovanför inokuleringspunkten. Finfördela och suspendera i en liten volym sterilt destillerat vatten eller 50 mM fosfatbuffert (tillägg 4). Isolera från suspensionen genom utspridning eller utstryk från spädningsserie på ett lämpligt medium, företrädesvis ett selektivt substrat (tillägg 2), inkubera under 48–72 timmar i 28 °C och observera bildandet av kolonier typiska för R. solanacearum. |
| --- | --- |

5)

Isolera från plantor med symtom genom att avlägsna ett segment från stjälken ca 2 cm ovanför inokuleringspunkten. Finfördela och suspendera i en liten volym sterilt destillerat vatten eller 50 mM fosfatbuffert (tillägg 4). Isolera från suspensionen genom utspridning eller utstryk från spädningsserie på ett lämpligt medium, företrädesvis ett selektivt substrat (tillägg 2), inkubera under 48–72 timmar i 28 °C och observera bildandet av kolonier typiska för R. solanacearum.

Tillägg 1

Laboratorier som utför optimering och validering av protokoll

| Laboratorium (2) | Plats | Land |
| --- | --- | --- |
| Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit | Wien och Linz | Österrike |
| Departement Gewasbescherming | Merelbeke | Belgien |
| Plantedirektoratet | Lyngby | Danmark |
| Central Science Laboratory | York | England |
| Scottish Agricultural Science Agency | Edinburgh | Skottland |
| Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Unité Bactériologie | Angers | Frankrike |
| Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme de Terre | Le Rheu | Frankrike |
| Biologische Bundesanstalt | Kleinmachnow | Tyskland |
| Pflanzenschutzamt Hannover | Hannover | Tyskland |
| State Laboratory | Dublin | Irland |
| Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali | Bologna | Italien |
| Regione Veneto Unità Periferica per i Servizi Fitosanitari | Verona | Italien |
| Nederlandse Algemene Keuringsdienst | Emmeloord | Nederländerna |
| Plantenziektenkundige Dienst | Wageningen | Nederländerna |
| Direcção-Geral de Protecção das Culturas | Lissabon | Portugal |
| Centro Diagnostico de Aldearrubia | Salamanca | Spanien |
| Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias | Valencia | Spanien |
| Sveriges lantbruksuniversitet | Uppsala | Sverige |

Laboratorium (2)

Plats

Land

Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit

Wien och Linz

Österrike

Departement Gewasbescherming

Merelbeke

Belgien

Plantedirektoratet

Lyngby

Danmark

Central Science Laboratory

York

England

Scottish Agricultural Science Agency

Edinburgh

Skottland

Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Unité Bactériologie

Angers

Frankrike

Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme de Terre

Le Rheu

Frankrike

Biologische Bundesanstalt

Kleinmachnow

Tyskland

Pflanzenschutzamt Hannover

Hannover

Tyskland

State Laboratory

Dublin

Irland

Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali

Bologna

Italien

Regione Veneto Unità Periferica per i Servizi Fitosanitari

Verona

Italien

Nederlandse Algemene Keuringsdienst

Emmeloord

Nederländerna

Plantenziektenkundige Dienst

Wageningen

Nederländerna

Direcção-Geral de Protecção das Culturas

Lissabon

Portugal

Centro Diagnostico de Aldearrubia

Salamanca

Spanien

Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias

Valencia

Spanien

Sveriges lantbruksuniversitet

Uppsala

Sverige

Tillägg 2

Medier för isolering och odling av R. solanacearum

a)   Allmänna odlingsmedier

Näringsagar (Nutrient Agar, NA)

| Näringsagar (Difco) | 23,0 g |
| --- | --- |
| Destillerat vatten | 1,0 l |

Näringsagar (Difco)

23,0 g

Destillerat vatten

1,0 l

Lös upp ingredienserna och sterilisera i autoklav i 121 °C under 15 minuter.

Jäst-pepton-glukosagar (YPGA)

| Jästextrakt (Difco) | 5,0 g |
| --- | --- |
| Bacto pepton (Difco) | 5,0 g |
| D(+)-glukos (monohydrat) | 10,0 g |
| Bacto agar (Difco) | 15,0 g |
| Destillerat vatten | 1,0 l |

Jästextrakt (Difco)

5,0 g

Bacto pepton (Difco)

5,0 g

D(+)-glukos (monohydrat)

10,0 g

Bacto agar (Difco)

15,0 g

Destillerat vatten

1,0 l

Lös upp ingredienserna och sterilisera i autoklav i 121 °C under 15 minuter.

Sukrospeptonagar (Sucrose Peptone Agar, SPA)

| Sackaros | 20,0 g |
| --- | --- |
| Bacto pepton (Difco) | 5,0 g |
| K2HPO4 | 0,5 g |
| MgSO4.7H2O | 0,25 g |
| Bacto agar (Difco) | 15,0 g |
| Destillerat vatten | 1,0 l |
| pH 7,2–7,4 | |

Sackaros

20,0 g

Bacto pepton (Difco)

5,0 g

K2HPO4

0,5 g

MgSO4.7H2O

0,25 g

Bacto agar (Difco)

15,0 g

Destillerat vatten

1,0 l

pH 7,2–7,4

Lös upp ingredienserna och sterilisera i autoklav i 121 °C under 15 minuter.

Kelmans tetrazolium medium

| Casaminosyror (Difco) | 1,0 g |
| --- | --- |
| Bacto pepton (Difco) | 10,0 g |
| Dextros | 5,0 g |
| Bacto agar (Difco) | 15,0 g |
| Destillerat vatten | 1,0 l |

Casaminosyror (Difco)

1,0 g

Bacto pepton (Difco)

10,0 g

Dextros

5,0 g

Bacto agar (Difco)

15,0 g

Destillerat vatten

1,0 l

Lös upp ingredienserna och sterilisera i autoklav i 121 °C under 15 minuter.

Kyl ned till 50 °C och tillsätt en filtersteriliserad lösning av 2,3,5-trifenyl-tetrazoliumklorid (Sigma) så att en slutkoncentration av 50 mg per l uppnås.

b)   Validerade selektiva odlingsmedier

SMSA-medium (Englebrecht, 1994, modifierat av Elphinstone m.fl., 1996)

| Basismedium | |
| --- | --- |
| Casaminosyror (Difco) | 1,0 g |
| Bacto pepton (Difco) | 10,0 g |
| Glycerol | 5,0 ml |
| Bacto agar (Difco) (se anmärkning 2) | 15,0 g |
| Destillerat vatten | 1,0 l |

Basismedium

Casaminosyror (Difco)

1,0 g

Bacto pepton (Difco)

10,0 g

Glycerol

5,0 ml

Bacto agar (Difco) (se anmärkning 2)

15,0 g

Destillerat vatten

1,0 l

Lös upp ingredienserna och sterilisera i autoklav i 121 °C under 15 minuter.

Kyl ned till 50 °C och tillsätt filtersteriliserade vattenstocklösningar bestående av följande ingredienser för att erhålla de angivna slutkoncentrationerna.

| Kristallviolett (Sigma) | 5 mg per l |
| --- | --- |
| Polymixin-B-Sulfat (Sigma P-1004) | 600 000 U (ca 100 mg) per l |
| Bacitracin (Sigma B-0125) | 1 250 U (ca 25 mg) per l |
| Kloramphenicol (Sigma C-3175) | 5 mg per l |
| Penicillin-G (Sigma P-3032) | 825 U (ca 0,5 mg) per l |
| 2,3,5-trifenyl-tetrazoliumklorid (Sigma) | 50 mg per l |

Kristallviolett (Sigma)

5 mg per l

Polymixin-B-Sulfat (Sigma P-1004)

600 000 U (ca 100 mg) per l

Bacitracin (Sigma B-0125)

1 250 U (ca 25 mg) per l

Kloramphenicol (Sigma C-3175)

5 mg per l

Penicillin-G (Sigma P-3032)

825 U (ca 0,5 mg) per l

2,3,5-trifenyl-tetrazoliumklorid (Sigma)

50 mg per l

Anmärkning:

| 1. | Användning av andra reagens än dem som anges ovan kan påverka tillväxten hos R. solanacearum. |
| --- | --- |

1.

Användning av andra reagens än dem som anges ovan kan påverka tillväxten hos R. solanacearum.

| 2. | Oxoid agar (nr 1) kan användas i stället för Bacto-agar (Difco). Tillväxten hos R. solanacearum kan då bli långsammare, men tillväxten hos konkurrerande saprofyter kan också reduceras. Typiska kolonier av R. solanacearum kan ta 1–2 dagar längre att bildas, och den röda färgen kan bli ljusare och mer diffus än på Bacto agar. |
| --- | --- |

2.

Oxoid agar (nr 1) kan användas i stället för Bacto-agar (Difco). Tillväxten hos R. solanacearum kan då bli långsammare, men tillväxten hos konkurrerande saprofyter kan också reduceras. Typiska kolonier av R. solanacearum kan ta 1–2 dagar längre att bildas, och den röda färgen kan bli ljusare och mer diffus än på Bacto agar.

| 3. | Om koncentrationen av bacitracin ökas till 2 500 U per l kan populationerna av konkurrerande bakterier minska utan att tillväxten hos R. solanacearum påverkas. |
| --- | --- |

3.

Om koncentrationen av bacitracin ökas till 2 500 U per l kan populationerna av konkurrerande bakterier minska utan att tillväxten hos R. solanacearum påverkas.

Lagra medierna och stocklösningarna av antibiotika i 4 °C i mörker och använd inom en månad.

Plattorna bör vara fria från ytkondensation före användning.

Undvik att plattorna torkar alltför mycket.

En kvalitetskontroll bör utföras efter prepareringen av varje nytt parti medier genom att plattodla en suspension av en referensodling av R. solanacearum (se tillägg 3) och observera bildandet av typiska kolonier efter inkubation vid 28 °C under 2–5 dagar.

c)   Validerade anrikningsmedier

SMSA-buljong (Elphinstone m.fl., 1996)

Preparera på samma sätt som SMSA selektivt agarmedium men uteslut Bacto-agar och 2,3,5-tetrazoliumklorid.

Modifierad Wilbrink-buljong (Caruso m.fl., 2002)

| Sackaros | 10 g |
| --- | --- |
| Proteos-pepton | 5 g |
| K2HPO4 | 0,5 g |
| MgSO4 | 0,25 g |
| NaNO3 | 0,25 g |
| Destillerat vatten | 1,0 l |

Sackaros

10 g

Proteos-pepton

5 g

K2HPO4

0,5 g

MgSO4

0,25 g

NaNO3

0,25 g

Destillerat vatten

1,0 l

Sterilisera i autoklav vid 121 °C under 15 minuter och kyl ned till 50 °C.

Tillsätt antibiotiska stocklösningar som för SMSA-buljong.

Tillägg 3

A.   Standardiserade kontrollmaterial tillgängliga i handeln

a)   Bakterieisolat

Följande bakterieisolat rekommenderas som standardreferensmaterial, antingen som positiva kontroller (tabell 1) eller under optimeringen av tester för att undvika korskontamineringar (tabell 2). Alla stammar finns tillgängliga i handeln på följande ställen:

| 1. | National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Central Science Laboratory, York, Storbritannien. |
| --- | --- |

1.

National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Central Science Laboratory, York, Storbritannien.

| 2. | Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen, Nederländerna. |
| --- | --- |

2.

Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen, Nederländerna.

| 3. | Collection Française de Bactéries Phytopathogènes (CFBP), INRA Station Phytobactériologie, Angers, Frankrike. |
| --- | --- |

3.

Collection Française de Bactéries Phytopathogènes (CFBP), INRA Station Phytobactériologie, Angers, Frankrike.

Tabell 1.   SMT-referenslista för isolat av R. solanacearum

| NCPPB-kod | SMT-nr
  # | Andra koder | Ursprungsland | Biovar |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| NCPPB 4153 | 6 | CFBP 4582, Pr 3020, EURS11 | Egypten | 2 |
| NCPPB 4154 | 10 | CFBP 4582, 550, EURS21 | Turkiet | 2 |
| NCPPB 857 | 12 | CFBP 4585, Pr 1140, EURS26 | England | 2 |
| NCPPB 1584 | 23 | CFBP 4598, EURS49 | Cypern | 2 |
| NCPPB 2505 | 24 | CFBP 4599, EURS50 | Sverige | 2 |
| NCPPB 4155 | 26 | CFBP 4601, 502, EURS55 | Belgien | 2 |
| NCPPB 4156 (3) | 71 (3) | PD 2762, CFBP 3857 | Nederländerna | 2 |
| NCPPB 4157 | 66 | LNPV 15.59 | Frankrike | 2 |
| NCPPB 4158 | 39 | CFBP 4608, Port 448, EURS80 | Portugal | 2 |
| NCPPB 4160 | 69 | IVIA-1632-2 | Spanien | 2 |
| NCPPB 4161 | 76 | B3B | Tyskland | 2 |
| NCPPB 325 | 41 | CFBP 2047, KEL60-1, R842 | USA | 1 |
| NCPPB 3967 | 42 | CFBP 4610, R285, GONg7 | Costa Rica | 1 |
| NCPPB 4028 | 43 | CFBP 4611, R303/571, CIP310, SEQ205 | Colombia | 2 |
| NCPPB 3985 | 44 | CFBP 4612, R578, CIP312 | Peru | 2T |
| NCPPB 3989 | 45 | CFBP 4613, R568, CIP226 | Brasilien | 2T |
| NCPPB 3996 | 46 | CFBP 3928, R276/355, CIP72, SEQ225 | Peru | 3 |
| NCPPB 3997 | 47 | CFBP 4614, R280/363, CIP49, HAY0131a | Australien | 3 |
| NCPPB 4029 | 48 | CFBP 4615, R297/349, CIP121, CMIb2861 | Sri Lanka | 4 |
| NCPPB 4005 | 49 | CFBP 4616, R470 | Filippinerna | 4 |
| NCPPB 4011 | 50 | CFBP 4617, R288, HEmps2 | Kina | 5 |

NCPPB-kod

SMT-nr

#

Andra koder

Ursprungsland

Biovar

NCPPB 4153

6

CFBP 4582, Pr 3020, EURS11

Egypten

2

NCPPB 4154

10

CFBP 4582, 550, EURS21

Turkiet

2

NCPPB 857

12

CFBP 4585, Pr 1140, EURS26

England

2

NCPPB 1584

23

CFBP 4598, EURS49

Cypern

2

NCPPB 2505

24

CFBP 4599, EURS50

Sverige

2

NCPPB 4155

26

CFBP 4601, 502, EURS55

Belgien

2

NCPPB 4156 (3)

71 (3)

PD 2762, CFBP 3857

Nederländerna

2

NCPPB 4157

66

LNPV 15.59

Frankrike

2

NCPPB 4158

39

CFBP 4608, Port 448, EURS80

Portugal

2

NCPPB 4160

69

IVIA-1632-2

Spanien

2

NCPPB 4161

76

B3B

Tyskland

2

NCPPB 325

41

CFBP 2047, KEL60-1, R842

USA

1

NCPPB 3967

42

CFBP 4610, R285, GONg7

Costa Rica

1

NCPPB 4028

43

CFBP 4611, R303/571, CIP310, SEQ205

Colombia

2

NCPPB 3985

44

CFBP 4612, R578, CIP312

Peru

2T

NCPPB 3989

45

CFBP 4613, R568, CIP226

Brasilien

2T

NCPPB 3996

46

CFBP 3928, R276/355, CIP72, SEQ225

Peru

3

NCPPB 3997

47

CFBP 4614, R280/363, CIP49, HAY0131a

Australien

3

NCPPB 4029

48

CFBP 4615, R297/349, CIP121, CMIb2861

Sri Lanka

4

NCPPB 4005

49

CFBP 4616, R470

Filippinerna

4

NCPPB 4011

50

CFBP 4617, R288, HEmps2

Kina

5

Anmärkning: Autenticiteten hos de ovan nämnda stammarna kan garanteras endast om de erhålls från en autentisk kultursamling.

Tabell 2.   SMT referenspanel av serologiskt eller genetiskt besläktade bakterier för användning vid optimering av detektionstester.

| NCPPB-kod | SMT-nr
  # | Annan kod | Identifiering |
| --- | --- | --- | --- |
| NCPPB 4162 | 51 | CFBP 1954 | Bacillus polymyxa
   (4) |
| NCPPB 4163 | 52 | CFBP 1538 | Pseudomonas marginalis pv. marginalis
   (4) |
| NCPPB 4164 | – | CFBP 2227 | Burkholderia cepacia
   (5) |
| NCPPB 4165 | – | CFBP 2459 | Ralstonia pickettii
   (5) |
| NCPPB 4166 | 58 | CFBP 3567
  CSL Pr1150 | Ralstonia pickettii
   (4) |
| NCPPB 4167 | 60 | CFBP 4618
  PD 2778 | Ralstonia sp. (4) |
| NCPPB 1127 | 53 | CFBP 3575 | Burkholderia andropogonis
   (4) |
| NCPPB 353 | 54 | CFBP 3572 | Burkholderia caryophylli
   (4) |
| NCPPB 945 | 55 | CFBP 3569 | Burkholderia cepacia
   (4) |
| NCPPB 3708 | 56 | CFBP 3574 | Burkholderia glumae
   (4) |
| NCPPB 3590 | 57 | CFBP 3573 | Burkholderia plantarii
   (4) |
| NCPPB 3726 | 59 | CFBP 3568 | Banana Blood Disease-bakterie
   (4)
   (5)
   (6) |
| NCPPB 4168 | 61 | CFBP 4619
  IPO S339 | Enterobacter sp. (4) |
| NCPPB 4169 | 62 | IPO 1695 | Enterobacter sp. (4) |
| NCPPB 4170 | 63 | CFBP 4621
  IPO S306 | Ochrobactrum anthropi
   (4)
   (5) |
| NCPPB 4171 | 64 | CFBP 4622
  IPO 1693 | Curtobacterium sp. (4)
   (5) |
| NCPPB 4172 | 65 | IPO 1696a | Pseudomonas sp. (4) |
| NCPPB 4173 | – | PD 2318 | Aureobacterium sp. (5) |
| NCPPB 4174 | 81 | IVIA 1 844,06 | Flavobacterium sp. (4)
   (5) |

NCPPB-kod

SMT-nr

#

Annan kod

Identifiering

NCPPB 4162

51

CFBP 1954

Bacillus polymyxa
   (4)

NCPPB 4163

52

CFBP 1538

Pseudomonas marginalis pv. marginalis
   (4)

NCPPB 4164

–

CFBP 2227

Burkholderia cepacia
   (5)

NCPPB 4165

–

CFBP 2459

Ralstonia pickettii
   (5)

NCPPB 4166

58

CFBP 3567

CSL Pr1150

Ralstonia pickettii
   (4)

NCPPB 4167

60

CFBP 4618

PD 2778

Ralstonia sp. (4)

NCPPB 1127

53

CFBP 3575

Burkholderia andropogonis
   (4)

NCPPB 353

54

CFBP 3572

Burkholderia caryophylli
   (4)

NCPPB 945

55

CFBP 3569

Burkholderia cepacia
   (4)

NCPPB 3708

56

CFBP 3574

Burkholderia glumae
   (4)

NCPPB 3590

57

CFBP 3573

Burkholderia plantarii
   (4)

NCPPB 3726

59

CFBP 3568

Banana Blood Disease-bakterie
   (4)
   (5)
   (6)

NCPPB 4168

61

CFBP 4619

IPO S339

Enterobacter sp. (4)

NCPPB 4169

62

IPO 1695

Enterobacter sp. (4)

NCPPB 4170

63

CFBP 4621

IPO S306

Ochrobactrum anthropi
   (4)
   (5)

NCPPB 4171

64

CFBP 4622

IPO 1693

Curtobacterium sp. (4)
   (5)

NCPPB 4172

65

IPO 1696a

Pseudomonas sp. (4)

NCPPB 4173

–

PD 2318

Aureobacterium sp. (5)

NCPPB 4174

81

IVIA 1 844,06

Flavobacterium sp. (4)
   (5)

b)   Standardiserade kontrollmaterial tillgängliga i handeln

Följande standardkontrollmaterial kan fås från NCPPB:s kultursamling.

Frystorkade pelletar av potatisextrakt från 200 friska potatisknölar som negativa kontroller för alla tester.

Frystorkade pelletar av potatisextrakt från 200 friska potatisknölar innehållande 103–104 och 104–106 celler R. solanacearum biovar 2 (t.ex. stam NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) som positiva kontroller för serologiska tester och PCR-tester. Eftersom cellernas livskraft påverkas under frystorkning, är dessa inte lämpliga som standardkontroller för isolerings- eller biotest.

Formalinfixerade suspensioner av R. solanacearum biovar 2 (stam NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) vid 106 celler per ml som positiva kontroller för serologiska test.

B.   Preparering av positiva och negativa kontroller för de huvudsakliga screeningtesterna PCR/IF och FISH

Framställ en 48-timmarskultur av en virulent stam av virulent ras 3, biovar 2-stam av R. solanacearum (t.ex. stam NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) på SMSA-basismedium och suspendera i 10 mM fosfatbuffert för att erhålla en celltäthet av omkring 2 x 108 kolonibildande enheter per ml. Detta erhålls vanligtvis genom en svagt grumlig suspension med en optisk densitet av 0,15 vid 600 nm.

Avlägsna naveländarna från 200 knölar tagna från en odling som är känd för att vara fri från R. solanacearum och där potatis med vitt skal odlas.

Behandla naveländarna på vanligt sätt och suspendera pelleten i 10 ml.

Preparera 10 sterila 1,5 ml mikrorör med 900 μl av den återsuspenderade pelleten.

Överför 100 μl av suspensionen av R. solanacearum till det första mikroröret. Skaka.

Fastställ decimala kontamineringsnivåer genom ytterligare spädning i de andra fem mikrorören.

De sex nedsmittade mikrorören används som positiva kontroller. De fyra icke-nedsmittade mikrorören används som negativa kontroller. Märk mikrorören i överensstämmelse härmed.

Preparera portioner på 100 μl i steril 1,5 ml mikrorör och erhåll på så sätt 9 repliker av varje kontrollprov. Lagra i –16 till –24 °C fram till användning.

Förekomsten och kvantifieringen av R. solanacearum i kontrollproverna bör först bekräftas via IF.

För PCR-testet, gör DNA-extraktion från de positiva och negativa kontrollproven för varje serie av testprover.

För IF- och FISH-testen, gör testerna på de positiva och negativa kontrollproven för varje serie av testprover.

För IF-, FISH- and PCR-testerna skall R. solanacearum påvisas i minst 106–104 celler/ml i de positiva kontrollerna och inte i någon i de negativa kontrollerna.

Tillägg 4

Buffertar för testförfaranden

ALLMÄN ANMÄRKNING: Oöppnade steriliserade buffertar kan förvaras i upp till ett år.

1.   Buffertar för extraktionsförfarande

1.1   Extraktionsbuffert (50 mM fosfatbuffert, pH 7,0)

Denna buffert används för extraktion av bakterien från plantvävnader genom homogenisering eller skakning.

| Na2HPO4 (vattenfri) | 4,26 g |
| --- | --- |
| KH2PO4 | 2,72 g |
| Destillerat vatten | 1,00 l |

Na2HPO4 (vattenfri)

4,26 g

KH2PO4

2,72 g

Destillerat vatten

1,00 l

Lös upp ingredienserna, kontrollera pH och sterilisera i autoklav i 121 °C under 15 minuter.

Ytterligare komponenter kan vara av nytta enligt följande:

| | Syfte | Kvantitet (per l) |
| --- | --- | --- |
| Flingor av lubrol | Deflockulering (7) | 0,5 g |
| DC-silikonskumdämpning | Skumdämpningsmedel (7) | 1,0 ml |
| Tetranatriumpyrofosfat | Antioxidant | 1,0 g |
| Polyvinylpyrrolidon-40000 (PVP-40) | Bindning av PCR-inhibitorer | 50 g |

Syfte

Kvantitet (per l)

Flingor av lubrol

Deflockulering (7)

0,5 g

DC-silikonskumdämpning

Skumdämpningsmedel (7)

1,0 ml

Tetranatriumpyrofosfat

Antioxidant

1,0 g

Polyvinylpyrrolidon-40000 (PVP-40)

Bindning av PCR-inhibitorer

50 g

1.2   Pelletbuffert (10 mM fosfatbuffert, pH 7,2)

Denna buffert används för återsuspension och utspädning av extrakt av naveländar från potatisknölar efter koncentration till en pellet följd av centrifugering.

| Na2HPO4.12H2O | 2,7 g |
| --- | --- |
| NaH2PO4.2H2O | 0,4 g |
| Destillerat vatten | 1,0 l |

Na2HPO4.12H2O

2,7 g

NaH2PO4.2H2O

0,4 g

Destillerat vatten

1,0 l

Lös upp ingredienserna, kontrollera pH och sterilisera i autoklav i 121 °C under 15 minuter.

2.   Buffertar för IF-test

2.1   IF-buffert (10 mM fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,2)

Denna buffert används för utspädning av antikroppar.

| Na2HPO4.12H2O | 2,7 g |
| --- | --- |
| NaH2PO4.2H2O | 0,4 g |
| NaCL | 8,0 g |
| Destillerat vatten | 1,0 l |

Na2HPO4.12H2O

2,7 g

NaH2PO4.2H2O

0,4 g

NaCL

8,0 g

Destillerat vatten

1,0 l

Lös upp ingredienserna, kontrollera pH och sterilisera i autoklav i 121 °C under 15 minuter.

2.2   IF-buffert – Tween

Denna buffert används för att tvätta objektglas.

Tillsätt 0,1 % Tween 20 till IF-bufferten.

2.3   Fosfatbuffrad glycerol, pH 7,6

Denna buffert används som monteringsvätska på fönstren av IF-glas för att förbättra fluorescensen.

| Na2HPO4.12H2O | 3,2 g |
| --- | --- |
| NaH2PO4.2H2O | 0,15 g |
| Glycerol | 50 ml |
| Destillerat vatten | 100 ml |

Na2HPO4.12H2O

3,2 g

NaH2PO4.2H2O

0,15 g

Glycerol

50 ml

Destillerat vatten

100 ml

Inbäddningslösning som motverkar blekning finns i handeln, t.ex. Vectashield® (Vector Laboratories) och Citifluor® (Leica).

3.   Buffertar för indirekt ELISA-test

3.1   Coatingbuffert av dubbel styrka, pH 9,6.

| Na2CO3 | 6,36 g |
| --- | --- |
| NaHCO3 | 11,72 g |
| Destillerat vatten | 1,00 l |

Na2CO3

6,36 g

NaHCO3

11,72 g

Destillerat vatten

1,00 l

Lös upp ingredienserna, kontrollera pH och sterilisera i autoklav i 121 °C under 15 minuter.

Natriumsulfit (0,2 %) kan vid behov tillsättas som antioxidationsmedel för att förhindra uppkomst av oxiderade aromatiska föreningar.

3.2   10 × fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,4

| NaCL | 80,0 g |
| --- | --- |
| KH2PO4 | 2,0 g |
| Na2HPO4.12H2O | 29,0 g |
| KCl | 2,0 g |
| Destillerat vatten | 1,0 l |

NaCL

80,0 g

KH2PO4

2,0 g

Na2HPO4.12H2O

29,0 g

KCl

2,0 g

Destillerat vatten

1,0 l

3.3   PBS-Tween

| 10X PBS | 100 ml |
| --- | --- |
| 10 % Tween 20 | 5 ml |
| Destillerat vatten | 895 ml |

10X PBS

100 ml

10 % Tween 20

5 ml

Destillerat vatten

895 ml

3.4   Blockerings- (antikropps-)buffert (måste vara nyberedd).

| 10X PBS | 10,0 ml |
| --- | --- |
| Polyvinylpyrrolidon-44000 (PVP-44) | 2,0 g |
| 10 % Tween 20 | 0,5 ml |
| Mjölkpulver | 0,5 g |
| Destillerat vatten | fyll upp till 100 ml |

10X PBS

10,0 ml

Polyvinylpyrrolidon-44000 (PVP-44)

2,0 g

10 % Tween 20

0,5 ml

Mjölkpulver

0,5 g

Destillerat vatten

fyll upp till 100 ml

3.5   Alkalisk fosfatas-substratlösning, pH 9,8

| Dietanolamin | 97 ml |
| --- | --- |
| Destillerat vatten | 800 ml |

Dietanolamin

97 ml

Destillerat vatten

800 ml

Blanda och justera till pH 9,8 med koncentrerad HCl.

Fyll upp till 1 liter med destillerat vatten.

Tillsätt 0,2 g Mg Cl2

Lös 2 tabletter à 5 mg av fosfatassubstrat (Sigma) per 15 ml lösning.

4.   Buffertar för DASI ELISA-test

4.1   Coatingbuffert, pH 9,6.

| Na2CO3 | 1,59 g |
| --- | --- |
| NaHCO3 | 2,93 g |
| Destillerat vatten | 1 000 ml |

Na2CO3

1,59 g

NaHCO3

2,93 g

Destillerat vatten

1 000 ml

Lös upp ingredienserna och kontrollera pH 9,6.

4.2   10X fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,2–7,4

| NaCl | 80,0 g |
| --- | --- |
| NaH2PO4.2H2O | 4,0 g |
| Na2HPO4.12H2O | 27,0 g |
| Destillerat vatten | 1 000 ml |

NaCl

80,0 g

NaH2PO4.2H2O

4,0 g

Na2HPO4.12H2O

27,0 g

Destillerat vatten

1 000 ml

4.3   PBS-Tween

| 10X PBS | 50 ml |
| --- | --- |
| 10 % Tween 20 | 5 ml |
| Destillerat vatten | 950 ml |

10X PBS

50 ml

10 % Tween 20

5 ml

Destillerat vatten

950 ml

4.4   Coatingbuffert, pH 9,8

| Dietanolamin | 100 ml |
| --- | --- |
| Destillerat vatten | 900 ml |

Dietanolamin

100 ml

Destillerat vatten

900 ml

Blanda och justera till pH 9,8 med koncentrerad HCl.

Tillägg 5

Bestämning av kontamineringsnivå i IF- och FISH-tester

| 1. | Räkna medeltalet typiska fluorescerande celler per synligt fält (c). |
| --- | --- |

1.

Räkna medeltalet typiska fluorescerande celler per synligt fält (c).

| 2. | Beräkna antalet typiska fluorescerande celler per objektglasfönster (C).
  C = c × S/s








  där | S | = | multispotglasets fönsteryta |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| och | s | = | objektivfältets yta |

2.

Beräkna antalet typiska fluorescerande celler per objektglasfönster (C).

C = c × S/s

där

S

=

multispotglasets fönsteryta

och

s

=

objektivfältets yta

| s = πi2/4G2K2 | där | i | = | synfältskoefficient (varierar från 8 till 24 beroende på typen av okular) |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| | | K | = | tubkoefficient (1 eller 1,25) |
| | | G | = | objektivets förstoring (100 ×, 40 × osv.) |

s = πi2/4G2K2

där

i

=

synfältskoefficient (varierar från 8 till 24 beroende på typen av okular)

K

=

tubkoefficient (1 eller 1,25)

G

=

objektivets förstoring (100 ×, 40 × osv.)

| 3. | Beräkna antalet typiska fluorescerande celler per ml återsuspenderad pellet (N)
  N = C × 1 000/y × F








  där | y | = | volym av återsuspenderad pellet på varje fönster |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| och | F | = | den återsuspenderade pelletens utspädningsfaktor |

3.

Beräkna antalet typiska fluorescerande celler per ml återsuspenderad pellet (N)

N = C × 1 000/y × F

där

y

=

volym av återsuspenderad pellet på varje fönster

och

F

=

den återsuspenderade pelletens utspädningsfaktor

Tillägg 6

Validerade PCR-protokoll och PCR-reagens

Anmärkning: Preliminär testning bör möjliggöra reproducerbar upptäckt av minst 103–104 celler av R. solanacearum per ml provextrakt.

Den preliminära testningen bör dessutom inte visa några falska positiva resultat med en grupp utvalda bakteriestammar (se tillägg 3).

1.   PCR-protokoll från Seal m.fl. (1993)

1.1   Oligonukleotidprimrar

| Forward primer OLI-1 | 5′-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3′ |
| --- | --- |
| Reverse primer Y-2 | 5′-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3′ |

Forward primer OLI-1

5′-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3′

Reverse primer Y-2

5′-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3′

Förväntad kopiestorlek från R. solanacearum templat-DNA = 288 bp

1.2   PCR-reaktionsblandningen

| Reagens | Kvantitet per reaktion | Slutlig koncentration |
| --- | --- | --- |
| Sterilt ultrarent vatten | 17,65 μl | |
| 10 x PCR-buffert (8) (15 mM MgCl2) | 2,5 μl | 1 x (1,5 mM MgCl2) |
| dNTP-blandning (20 mM) | 0,25 μl | 0,2 mM |
| Primer OLI-1 (20 μM) | 1,25 μl | 1 μM |
| Primer Y-2 (20 μM) | 1,25 μl | 1 μM |
| Taq polymeras (5 U/μl) (8) | 0,1 μl | 0,5 U |
| Provvolym | 2,0 μl | |
| Total volym: | 25 μl | |

Reagens

Kvantitet per reaktion

Slutlig koncentration

Sterilt ultrarent vatten

17,65 μl

10 x PCR-buffert (8) (15 mM MgCl2)

2,5 μl

1 x (1,5 mM MgCl2)

dNTP-blandning (20 mM)

0,25 μl

0,2 mM

Primer OLI-1 (20 μM)

1,25 μl

1 μM

Primer Y-2 (20 μM)

1,25 μl

1 μM

Taq polymeras (5 U/μl) (8)

0,1 μl

0,5 U

Provvolym

2,0 μl

Total volym:

25 μl

1.3   PCR-reaktionsbetingelser

Kör följande program:

| 1 cykel: | i) | 2 minuter vid 96 °C (denaturering av DNA-templat) |
| --- | --- | --- |
| 35 cykler: | ii) | 20 sekunder vid 94 °C (denaturering av DNA-templat) |
| | iii) | 20 sekunder vid 68 °C (påkoppling av primers) |
| | iv) | 30 sekunder vid 72 °C (förlängning av kopia) |
| 1 cykel: | v) | 10 minuter vid 72 °C (slutlig förlängning) |
| | vi) | håll temperaturen vid 4 °C. |

1 cykel:

i)

2 minuter vid 96 °C (denaturering av DNA-templat)

35 cykler:

ii)

20 sekunder vid 94 °C (denaturering av DNA-templat)

iii)

20 sekunder vid 68 °C (påkoppling av primers)

iv)

30 sekunder vid 72 °C (förlängning av kopia)

1 cykel:

v)

10 minuter vid 72 °C (slutlig förlängning)

vi)

håll temperaturen vid 4 °C.

Anmärkning: Detta program optimerades för användning med en Perkin Elmer 9600 termocykel. Vid användning av andra modeller kan det komma att krävas modifiering av cyklerna ii, iii och iv.

1.4   Restriktionsenzymanalys av kopian

PCR-produkter som amplifierats från R. solanacearum-DNA producerar distinkt RFLP (restriction fragment length polymorphism) med enzymet Ava II efter inkubation vid 37 °C.

2.   PCR-protokoll från Pastrik och Maiss (2000)

2.1   Oligonukleotidprimrar

| Forward primer Ps-1 | 5′- agt cga acg gca gcg ggg g -3′ |
| --- | --- |
| Reverse primer Ps-2 | 5′- ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca -3′ |

Forward primer Ps-1

5′- agt cga acg gca gcg ggg g -3′

Reverse primer Ps-2

5′- ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca -3′

Förväntad kopiestorlek från R. solanacearum templat-DNA = 553 bp.

2.2   PCR-reaktionsblandning

| Reagens | Kvantitet per reaktion | Slutlig koncentration |
| --- | --- | --- |
| Sterilt ultrarent vatten | 16,025 μl | |
| 10 x PCR-buffert (9) | 2,5 μl | 1 x (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (fraktion V) (10 %) | 0,25 μl | 0,1 % |
| d-nTP-blandning (20 mM) | 0,125 μl | 0,1 mM |
| Primer Ps-1 (10 μM) | 0,5 μl | 0,2 μM |
| Primer Ps-2 (10 μM) | 0,5 μl | 0,2 μM |
| Taq polymeras (5 U/μl) (9) | 0,1 μl | 0,5 U |
| Provvolym | 5,0 μl | |
| Total volym: | 25,0 μl | |
| Anmärkning: Ursprungligen optimerad för MJ Research PTC 200 termocykel med Gibco Taq Polymeras.
  Perkin Elmer AmpliTaq och buffert kan även användas i samma koncentrationer. |

Reagens

Kvantitet per reaktion

Slutlig koncentration

Sterilt ultrarent vatten

16,025 μl

10 x PCR-buffert (9)

2,5 μl

1 x (1,5 mM MgCl2)

BSA (fraktion V) (10 %)

0,25 μl

0,1 %

d-nTP-blandning (20 mM)

0,125 μl

0,1 mM

Primer Ps-1 (10 μM)

0,5 μl

0,2 μM

Primer Ps-2 (10 μM)

0,5 μl

0,2 μM

Taq polymeras (5 U/μl) (9)

0,1 μl

0,5 U

Provvolym

5,0 μl

Total volym:

25,0 μl

Anmärkning: Ursprungligen optimerad för MJ Research PTC 200 termocykel med Gibco Taq Polymeras.

Perkin Elmer AmpliTaq och buffert kan även användas i samma koncentrationer.

2.3   PCR-reaktionsbetingelser

Kör följande program:

| 1 cykel: | i) | 5 minuter vid 95 °C (denaturering av DNA-templat) |
| --- | --- | --- |
| 35 cykler: | ii) | 30 sekunder vid 95 °C (denaturering av DNA-templat) |
| | iii) | 30 sekunder vid 68 °C (påkoppling av primers) |
| | iv) | 45 sekunder vid 72 °C (förlängning av kopia) |
| 1 cykel: | v) | 5 minuter vid 72 °C (slutlig förlängning) |
| | vi) | håll temperaturen vid 4 °C. |

1 cykel:

i)

5 minuter vid 95 °C (denaturering av DNA-templat)

35 cykler:

ii)

30 sekunder vid 95 °C (denaturering av DNA-templat)

iii)

30 sekunder vid 68 °C (påkoppling av primers)

iv)

45 sekunder vid 72 °C (förlängning av kopia)

1 cykel:

v)

5 minuter vid 72 °C (slutlig förlängning)

vi)

håll temperaturen vid 4 °C.

Anmärkning: Detta program är optimerat för användning med en MJ Research PTC 200 termocykel. Vid användning av andra modeller kan det komma att krävas modifiering av cyklerna ii,iii och iv.

2.4   Restriktionsenzymanalys av kopian

PCR-produkter som amplifierats från R. solanacearum-DNA producerar distinkt RFLP (restriction fragment length polymorphism) med enzymet Taq I efter inkubation vid 65 °C under 30 minuter. De restriktionsfragment som erhållits från fragment specifika för R. solanacearum är 457 bp och 96 bp i storlek.

3.   Multiplexa PCR-protokoll med intern PCR-kontroll (Pastrik m.fl., 2002)

3.1   Oligonukleotidprimrar

| Forward primer RS-1-F | 5′- ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA -3′ |
| --- | --- |
| Reverse Primer RS-1-R | 5′- CCC AGT CAC GGC AGA GAC T -3′ |
| Forward primer NS-5-F | 5′- AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G -3′ |
| Reverse Primer NS-6-R | 5′- GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC -3′ |

Forward primer RS-1-F

5′- ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA -3′

Reverse Primer RS-1-R

5′- CCC AGT CAC GGC AGA GAC T -3′

Forward primer NS-5-F

5′- AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G -3′

Reverse Primer NS-6-R

5′- GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC -3′

Förväntad kopiestorlek från R. solanacearum templat-DNA = 718 bp (RS-primerset).

Förväntad kopiestorlek från 18S rRNA intern PCR-kontroll = 310 bp (NS-primerset).

3.2   PCR-reaktionsblandning

| Reagens | Kvantitet per reaktion | Slutlig koncentration |
| --- | --- | --- |
| Sterilt ultrarent vatten | 12,625 μl | |
| 10 x PCR-buffert (10) (15 mM MgCl2) | 2,5 μl | 1 x (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (fraktion V) (10 %) | 0,25 μl | 0,1 % |
| d-nTP-blandning (20 mM) | 0,125 μl | 0,1 mM |
| Primer RS-1-F (10 μM) | 2,0 μl | 0,8 μM |
| Primer RS-1-R (10 μM) | 2,0 μl | 0,8 μM |
| Primer NS-5-F (10 μM) (11) | 0,15 μl | 0,06 μM |
| Primer NS-6-R (10 μM) (11) | 0,15 μl | 0,06 μM |
| Taq polymeras (5 U/μl) (10) | 0,2 μl | 1,0 U |
| Provvolym | 5,0 μl | |
| Total volym: | 25,0 μl | |

Reagens

Kvantitet per reaktion

Slutlig koncentration

Sterilt ultrarent vatten

12,625 μl

10 x PCR-buffert (10) (15 mM MgCl2)

2,5 μl

1 x (1,5 mM MgCl2)

BSA (fraktion V) (10 %)

0,25 μl

0,1 %

d-nTP-blandning (20 mM)

0,125 μl

0,1 mM

Primer RS-1-F (10 μM)

2,0 μl

0,8 μM

Primer RS-1-R (10 μM)

2,0 μl

0,8 μM

Primer NS-5-F (10 μM) (11)

0,15 μl

0,06 μM

Primer NS-6-R (10 μM) (11)

0,15 μl

0,06 μM

Taq polymeras (5 U/μl) (10)

0,2 μl

1,0 U

Provvolym

5,0 μl

Total volym:

25,0 μl

3.3   PCR-reaktionsbetingelser

Kör följande program:

| 1 cykel: | i) | 5 minuter vid 95 °C (denaturering av DNA-templat) |
| --- | --- | --- |
| 35 cykler: | ii) | 30 sekunder vid 95 °C (denaturering av DNA-templat) |
| | iii) | 30 sekunder vid 58 °C (påkoppling av primers) |
| | iv) | 45 sekunder vid 72 °C (förlängning av kopia) |
| 1 cykel: | v) | 5 minuter vid 72 °C (slutlig förlängning) |
| | vi) | håll temperaturen vid 4 °C. |

1 cykel:

i)

5 minuter vid 95 °C (denaturering av DNA-templat)

35 cykler:

ii)

30 sekunder vid 95 °C (denaturering av DNA-templat)

iii)

30 sekunder vid 58 °C (påkoppling av primers)

iv)

45 sekunder vid 72 °C (förlängning av kopia)

1 cykel:

v)

5 minuter vid 72 °C (slutlig förlängning)

vi)

håll temperaturen vid 4 °C.

Anmärkning: Detta program är optimerat för användning med en MJ Research PTC 200 termocykel. Vid användning av andra modeller kan det komma att krävas modifiering av cyklerna ii, iii och iv.

3.4   Restriktionsenzymanalys av kopian

PCR-produkter som amplifierats från R. solanacearum-DNA producerar distinkt RFLP (restriction fragment length polymorphism) med enzymet Bsm I eller en Isoschizomer (t.ex. Mva 1269 I) efter inkubation vid 65 °C under 30 minuter.

4.   R. solanacearum biovar-specifika PCR-protokoll (Pastrik m.fl., 2001)

4.1   Oligonukleotidprimrar

| Forward primer Rs-1-F | 5′- ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA -3′ |
| --- | --- |
| Reverse Primer Rs-1-R | 5′- CCC AGT CAC GGC AGA GAC T -3′ |
| Reverse Primer Rs-3-R | 5′- TTC ACG GCA AGA TCG CTC -3′ |

Forward primer Rs-1-F

5′- ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA -3′

Reverse Primer Rs-1-R

5′- CCC AGT CAC GGC AGA GAC T -3′

Reverse Primer Rs-3-R

5′- TTC ACG GCA AGA TCG CTC -3′

Förväntad kopiestorlek från R. solanacearum templat-DNA:

med Rs-1-F/Rs-1-R = 718 bp

med Rs-1-F/Rs-3-R = 716 bp

4.2   PCR-reaktionsblandningen.

| a) | Biovar 1/2-specifik PCR







  Reagens | Kvantitet per reaktion | Slutlig koncentration |
| --- | --- | --- | --- |
| Sterilt ultrarent vatten | 12,925 μl | |
| 10 x PCR-buffert (12) | 2,5 μl | 1 x (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (fraktion V) (10 %) | 0,25 μl | 0,1 % |
| d-NTP-blandning (20 mM) | 0,125 μl | 0,1 mM |
| Primer Rs-1-F (10 μM) | 2 μl | 0,8 μM |
| Primer Rs-1-R (10 μM) | 2 μl | 0,8 μM |
| Taq polymeras (5 U/μl) (12) | 0,2 μl | 1 U |
| Provvolym | 5,0 μl | |
| Total volym: | 25,0 μl | |

a)

Biovar 1/2-specifik PCR

Reagens

Kvantitet per reaktion

Slutlig koncentration

Sterilt ultrarent vatten

12,925 μl

10 x PCR-buffert (12)

2,5 μl

1 x (1,5 mM MgCl2)

BSA (fraktion V) (10 %)

0,25 μl

0,1 %

d-NTP-blandning (20 mM)

0,125 μl

0,1 mM

Primer Rs-1-F (10 μM)

2 μl

0,8 μM

Primer Rs-1-R (10 μM)

2 μl

0,8 μM

Taq polymeras (5 U/μl) (12)

0,2 μl

1 U

Provvolym

5,0 μl

Total volym:

25,0 μl

| b) | Biovar 3/4/5-specifik PCR







  Reagens | Kvantitet per reaktion | Slutlig koncentration |
| --- | --- | --- | --- |
| Sterilt ultrarent vatten | 14,925 μl | |
| 10 x PCR-buffert (13) | 2,5 μl | 1 x (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (fraktion V) (10 %) | 0,25 μl | 0,1 % |
| dNTP-blandning (20 mM) | 0,125 μl | 0,1 mM |
| Primer Rs-1-F (10 μM) | 1 μl | 0,4 μM |
| Primer Rs-3-R (10 μM) | 1 μl | 0,4 μM |
| Taq polymeras (5 U/μl) (13) | 0,2 μl | 1 U |
| Provvolym | 5,0 μl | |
| Total volym: | 25,0 μl | |

b)

Biovar 3/4/5-specifik PCR

Reagens

Kvantitet per reaktion

Slutlig koncentration

Sterilt ultrarent vatten

14,925 μl

10 x PCR-buffert (13)

2,5 μl

1 x (1,5 mM MgCl2)

BSA (fraktion V) (10 %)

0,25 μl

0,1 %

dNTP-blandning (20 mM)

0,125 μl

0,1 mM

Primer Rs-1-F (10 μM)

1 μl

0,4 μM

Primer Rs-3-R (10 μM)

1 μl

0,4 μM

Taq polymeras (5 U/μl) (13)

0,2 μl

1 U

Provvolym

5,0 μl

Total volym:

25,0 μl

4.3   PCR-reaktionsbetingelser

Kör följande program för både biovar 1/2- och biovar 3/4/5-specifika reaktioner:

| 1 cykel: | i) | 5 minuter vid 95 °C (denaturering av DNA-templat) |
| --- | --- | --- |
| 35 cykler: | ii) | 30 sekunder vid 95 °C (denaturering av DNA-templat) |
| | iii) | 30 sekunder vid 58 °C (påkoppling av primers) |
| | iv) | 45 sekunder vid 72 °C (förlängning av kopia) |
| 1 cykel: | v) | 5 minuter vid 72 °C (slutlig förlängning) |
| | vi) | håll temperaturen vid 4 °C. |

1 cykel:

i)

5 minuter vid 95 °C (denaturering av DNA-templat)

35 cykler:

ii)

30 sekunder vid 95 °C (denaturering av DNA-templat)

iii)

30 sekunder vid 58 °C (påkoppling av primers)

iv)

45 sekunder vid 72 °C (förlängning av kopia)

1 cykel:

v)

5 minuter vid 72 °C (slutlig förlängning)

vi)

håll temperaturen vid 4 °C.

Anmärkning: Detta program optimerades för användning med en MJ Research PTC 200 termocykel. Vid användning av andra modeller kan det komma att krävas modifiering av cyklerna ii, iii och iv.

4.4   Restriktionsenzymanalys av kopian

PCR-produkter som amplifierats från R. solanacearum-DNA med användning av primrarna Rs-1-F och Rs-1-R producerar distinkt RFLP (restriction fragment length polymorphism) med enzymet Bsm I eller en Isoschizomer (t.ex. Mva 1269 I) efter inkubation vid 65 °C under 30 minuter. PCR-kopior som amplifierats från R. solanacearum-DNA med användning av primrarna Rs-1-F och Rs-3-R har inga sekvenser som känns igen av restriktionsenzymer.

5.   Preparering av laddningsbuffert

5.1   Bromtymolblått (10-procentig stocklösning)

| Bromtymolblått | 5 g |
| --- | --- |
| Destillerat vatten (dubbeldestillerat) | 50 ml |

Bromtymolblått

5 g

Destillerat vatten (dubbeldestillerat)

50 ml

5.2   Laddningsbuffert

| Glycerol (86 %) | 3,5 ml |
| --- | --- |
| Bromtymolblått (5,1) | 300 μl |
| Destillerat vatten (dubbeldestillerat) | 6,2 ml |

Glycerol (86 %)

3,5 ml

Bromtymolblått (5,1)

300 μl

Destillerat vatten (dubbeldestillerat)

6,2 ml

6.   10 x Tris-Acetat-EDTA (TAE) buffert, pH 8,0

| Tris-buffert | 48,40 g |
| --- | --- |
| Iskall ättiksyra | 11,42 ml |
| EDTA (dinatriumsalt) | 3,72 g |
| Destillerat vatten | 1,00 l |

Tris-buffert

48,40 g

Iskall ättiksyra

11,42 ml

EDTA (dinatriumsalt)

3,72 g

Destillerat vatten

1,00 l

Späd till 1 x före användning.

Finns även att köpa i handeln (t.ex. Invitrogen eller motsvarande).

Tillägg 7

Validerade reagens för FISH-test

1.   Oligo-prober

R. solanacearum-specifik prob OLI-1-CY3 5′- GGC AGG TAG CAA GCT ACC CCC-3′

Icke-specifik eubakteriell prob EUB-338-FITC 5′- GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3′

2.   Fixeringslösning

(VARNING! FIXERINGSVÄTSKAN INNEHÅLLER PARAFORMALDEHYD, SOM ÄR GIFTIGT. BÄR HANDSKAR OCH ANDAS INTE IN GASEN. DET ÄR TILLRÅDLIGT ATT ARBETA I ETT DRAGSKÅP.]

| i) | Upphetta 9 ml vatten av molekylärbiologisk kvalitet (t.ex. ultrarent vatten) till ca 60 °C och tillsätt 0,4 g paraformaldehyd. Paraformaldehyden löses efter tillsats av 5 droppar 1N NaOH och omrörning med magnetomrörare. |
| --- | --- |

i)

Upphetta 9 ml vatten av molekylärbiologisk kvalitet (t.ex. ultrarent vatten) till ca 60 °C och tillsätt 0,4 g paraformaldehyd. Paraformaldehyden löses efter tillsats av 5 droppar 1N NaOH och omrörning med magnetomrörare.

| ii) | Justera pH till 7,0 genom tillsats av 1 ml 0,1 M fosfatbuffert (pH 7,0) och 5 droppar 1N HCl. Kontrollera pH med indikatorpapper och justera vid behov med HCl eller NaOH. (VARNING! ANVÄND INTE EN PH-MÄTARE I VÄTSKOR MED PARAFORMALDEHYD.] |
| --- | --- |

ii)

Justera pH till 7,0 genom tillsats av 1 ml 0,1 M fosfatbuffert (pH 7,0) och 5 droppar 1N HCl. Kontrollera pH med indikatorpapper och justera vid behov med HCl eller NaOH. (VARNING! ANVÄND INTE EN PH-MÄTARE I VÄTSKOR MED PARAFORMALDEHYD.]

| iii) | Filtrera lösningen genom ett 0,22 μm membranfilter och förvara dammfritt i 4 °C fram till användning. |
| --- | --- |

iii)

Filtrera lösningen genom ett 0,22 μm membranfilter och förvara dammfritt i 4 °C fram till användning.

3.   3 x Hybmix

| NaCl | 2,7 M |
| --- | --- |
| Tris-HCl | 60 mM (pH 7,4) |
| EDTA (filter steriliserat och autoklaverat) | 15 mM |

NaCl

2,7 M

Tris-HCl

60 mM (pH 7,4)

EDTA (filter steriliserat och autoklaverat)

15 mM

Späd till 1 x i enlighet med kraven.

4.   Hybridiseringslösning

| 1 x Hybmix | |
| --- | --- |
| Natriumdodecylsulfat (SDS) | 0,01 % |
| Formamid | 30 % |
| prob EUB 338 | 5 ng/μl |
| prob OLI-1 eller OLI-2 | 5 ng/μl |

1 x Hybmix

Natriumdodecylsulfat (SDS)

0,01 %

Formamid

30 %

prob EUB 338

5 ng/μl

prob OLI-1 eller OLI-2

5 ng/μl

Preparera de kvantiteter av hybridiseringslösning som anges i beräkningarna i tabellen. För varje glas (innehållande 2 olika prover i duplikat) krävs 90 μl hybridiseringslösning. OBS! FORMAMID ÄR MYCKET GIFTIGT! ANVÄND HANDSKAR OCH VIDTA NÖDVÄNDIGA FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER!

Tabell 1:   Föreslagna kvantiteter för preparering av hybridiseringslösning.

| Antal glas: | 1 | 4 | 6 | 8 | 10 |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Sterilt ultrarent vatten | 23,1 | 92,4 | 138,6 | 184,8 | 231,0 |
| 3 x hybmix | 30,0 | 120,0 | 180,0 | 240,0 | 300,0 |
| 1 % SDS | 0,9 | 3,6 | 5,4 | 7,2 | 9,0 |
| Formamid | 27,0 | 108,0 | 162,0 | 216,0 | 270,0 |
| Probe EUB 338 (100 ng/μl) | 4,5 | 18,0 | 27,0 | 36,0 | 45,0 |
| Probe OLI -1 eller OLI-2 (100 ng/μl) | 4,5 | 18,0 | 27,0 | 36,0 | 45,0 |
| Total volym (μl) | 90,0 | 360,0 | 540,0 | 720,0 | 900,0 |
| Anmärkning: Lagra alla lösningar innehållande ljuskänsliga oligo-prober mörkt i –20 °C.
  Skydda mot direkt solljus eller elektriskt ljus vid användning. |

Antal glas:

1

4

6

8

10

Sterilt ultrarent vatten

23,1

92,4

138,6

184,8

231,0

3 x hybmix

30,0

120,0

180,0

240,0

300,0

1 % SDS

0,9

3,6

5,4

7,2

9,0

Formamid

27,0

108,0

162,0

216,0

270,0

Probe EUB 338 (100 ng/μl)

4,5

18,0

27,0

36,0

45,0

Probe OLI -1 eller OLI-2 (100 ng/μl)

4,5

18,0

27,0

36,0

45,0

Total volym (μl)

90,0

360,0

540,0

720,0

900,0

Anmärkning: Lagra alla lösningar innehållande ljuskänsliga oligo-prober mörkt i –20 °C.

Skydda mot direkt solljus eller elektriskt ljus vid användning.

5.   0,1 M fosfatbuffert, pH 7,0

| Na2HPO4 | 8,52 g |
| --- | --- |
| KH2PO4 | 5,44 g |
| Destillerat vatten | 1,00 l |

Na2HPO4

8,52 g

KH2PO4

5,44 g

Destillerat vatten

1,00 l

Lös upp ingredienserna, kontrollera pH och sterilisera i autoklav i 121 °C under 15 minuter.

Tillägg 8

Äggplant- och tomatkulturer

Så fröer av tomat (Lycopersicon esculentum) eller äggplanta (Solanum melongena) i steril såjord. Fröplantorna utplanteras i steril planteringsjord då hjärtbladen är helt utvecklade (10 till 14 dagar).

Äggplantor eller tomater bör odlas i växthus under följande miljöförhållanden före inympning:

| Dagslängd | 14 timmar eller naturlig dagslängd om längre |
| --- | --- |
| Temperatur: | dag 21–24 °C
  natt 14–18 °C. |
| Mottaglig tomatsort: | ’Moneymaker’ |
| Mottaglig äggplantssort: | ’Black Beauty’ |
| För leverantörer, | se webbplats (http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main) |

Dagslängd

14 timmar eller naturlig dagslängd om längre

Temperatur:

dag 21–24 °C

natt 14–18 °C.

Mottaglig tomatsort:

’Moneymaker’

Mottaglig äggplantssort:

’Black Beauty’

För leverantörer,

se webbplats (http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

REFERENSER

| 1. | Amann, R.I., L. Krumholz and D.A. Stahl. 1990. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology. J. Bacteriol. 172: 762-770. |
| --- | --- |

1.

Amann, R.I., L. Krumholz and D.A. Stahl. 1990. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology. J. Bacteriol. 172: 762-770.

| 2. | Anon. 1998. Council Directive 98/57/EC of 20 July 1998 on the control of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Official Journal of the European Communities L235, 1-39. |
| --- | --- |

2.

Anon. 1998. Council Directive 98/57/EC of 20 July 1998 on the control of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Official Journal of the European Communities L235, 1-39.

| 3. | Boudazin, G., A.C. Le Roux, K. Josi, P. Labarre and B. Jouan. 1999. Design of division specific primers of Ralstonia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology 105; 373-380. |
| --- | --- |

3.

Boudazin, G., A.C. Le Roux, K. Josi, P. Labarre and B. Jouan. 1999. Design of division specific primers of Ralstonia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology 105; 373-380.

| 4. | Caruso, P., Gorris, M.T., Cambra, M., Palomo, J.L., Collar, J and Lopez, M.M. 2002. Enrichment Double-Antibody Sandwich Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal Antibody for sensitive Detection of Ralstonia solanacearum in Asymptomatic Potato Tubers. Applied and Environmental Microbiology, 68, 3634-3638. |
| --- | --- |

4.

Caruso, P., Gorris, M.T., Cambra, M., Palomo, J.L., Collar, J and Lopez, M.M. 2002. Enrichment Double-Antibody Sandwich Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal Antibody for sensitive Detection of Ralstonia solanacearum in Asymptomatic Potato Tubers. Applied and Environmental Microbiology, 68, 3634-3638.

| 5. | Cook, D., Barlow, E. and Sequeira, L. 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphisms with DNA probes that specify virulence and the hypersensitive response. Molecular Plant-Microbe Interactions 1:113-121. |
| --- | --- |

5.

Cook, D., Barlow, E. and Sequeira, L. 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphisms with DNA probes that specify virulence and the hypersensitive response. Molecular Plant-Microbe Interactions 1:113-121.

| 6. | Elphinstone, J.G., Hennessy, J., Wilson, J.K. and Stead, D.E. 1996. Sensitivity of detection of Ralstonia solanacearum in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26; 663-678. |
| --- | --- |

6.

Elphinstone, J.G., Hennessy, J., Wilson, J.K. and Stead, D.E. 1996. Sensitivity of detection of Ralstonia solanacearum in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26; 663-678.

| 7. | Englebrecht, M.C. (1994) Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. In: A.C. Hayward (ed.) Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Australian Centre for International Agricultural Research, Canberra, Australia. |
| --- | --- |

7.

Englebrecht, M.C. (1994) Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. In: A.C. Hayward (ed.) Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Australian Centre for International Agricultural Research, Canberra, Australia.

| 8. | Hayward, A.C. 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27; 265-277. |
| --- | --- |

8.

Hayward, A.C. 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27; 265-277.

| 9. | Hayward, A.C., El-Nashaar, H.M., Nydegger, U. and De Lindo, L. 1990. Variation in nitrate metabolism in biovars of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 69; 269-280. |
| --- | --- |

9.

Hayward, A.C., El-Nashaar, H.M., Nydegger, U. and De Lindo, L. 1990. Variation in nitrate metabolism in biovars of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 69; 269-280.

| 10. | Ito, S., Y. Ushijima, T. Fujii, S. Tanaka, M. Kameya-Iwaki, S. Yoshiwara and F. Kishi. 1998. Detection of viable cells of Ralstonia solanacearum in soil using a semi-selective medium and a PCR technique. J. Phytopathology 146; 379-384. |
| --- | --- |

10.

Ito, S., Y. Ushijima, T. Fujii, S. Tanaka, M. Kameya-Iwaki, S. Yoshiwara and F. Kishi. 1998. Detection of viable cells of Ralstonia solanacearum in soil using a semi-selective medium and a PCR technique. J. Phytopathology 146; 379-384.

| 11. | Janse, J.D. (1988) A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 18, 343-351. |
| --- | --- |

11.

Janse, J.D. (1988) A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 18, 343-351.

| 12. | Janse, J.D. 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacaerum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335-345. |
| --- | --- |

12.

Janse, J.D. 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacaerum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335-345.

| 13. | Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity of Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 44; 693-695. |
| --- | --- |

13.

Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity of Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 44; 693-695.

| 14. | Klement Z.; Rudolph, K and D.C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp. |
| --- | --- |

14.

Klement Z.; Rudolph, K and D.C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp.

| 15. | Lelliott, R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd., Oxford. 216 pp. |
| --- | --- |

15.

Lelliott, R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd., Oxford. 216 pp.

| 16. | Lopez, M.M., Gorris, M.T., Llop, P., Cubero, J., Vicedo, B., Cambra, M., 1997. Selective enrichment improves selective isolation, serological and molecular detection of plant pathogenic bacteria. In: H.W. Dehne et al., (eds). Klewer Academic Publishers. pp. 117-121. |
| --- | --- |

16.

Lopez, M.M., Gorris, M.T., Llop, P., Cubero, J., Vicedo, B., Cambra, M., 1997. Selective enrichment improves selective isolation, serological and molecular detection of plant pathogenic bacteria. In: H.W. Dehne et al., (eds). Klewer Academic Publishers. pp. 117-121.

| 17. | Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1994. Specific genomic fingerprints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR. Applied and Environmental Microbiology, 60, 2286-2295. |
| --- | --- |

17.

Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1994. Specific genomic fingerprints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR. Applied and Environmental Microbiology, 60, 2286-2295.

| 18. | Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J. 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85; 528-536. |
| --- | --- |

18.

Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J. 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85; 528-536.

| 19. | Opina, N., F. Tavner, G. Holloway, J.-F Wang, T.-H Li, R. Maghirang, M. Fegan, A.C. Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W. Holloway, J.N. Timmis. 1997. A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 5; 19-33. |
| --- | --- |

19.

Opina, N., F. Tavner, G. Holloway, J.-F Wang, T.-H Li, R. Maghirang, M. Fegan, A.C. Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W. Holloway, J.N. Timmis. 1997. A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 5; 19-33.

| 20. | Pastrik, K.H. and Maiss, E. 2000. Detection of R. solanacearum in potato tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148; 619-626. |
| --- | --- |

20.

Pastrik, K.H. and Maiss, E. 2000. Detection of R. solanacearum in potato tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148; 619-626.

| 21. | Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831-842. |
| --- | --- |

21.

Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831-842.

| 22. | Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D. (1995) Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79. |
| --- | --- |

22.

Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D. (1995) Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79.

| 23. | Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. - 3. ed.; St. Paul, Minnesota: 373 pp. |
| --- | --- |

23.

Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. - 3. ed.; St. Paul, Minnesota: 373 pp.

| 24. | Seal, S.E., L.A. Jackson, J.P.W. Young, and M.J. Daniels. 1993. Detection of Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii and Blood Disease Bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. J. Gen. Microbiol. 139: 1587-1594. |
| --- | --- |

24.

Seal, S.E., L.A. Jackson, J.P.W. Young, and M.J. Daniels. 1993. Detection of Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii and Blood Disease Bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. J. Gen. Microbiol. 139: 1587-1594.

| 25. | Smith, J.J., Offord, L.C., Holderness, M. and Saddler, G.S. 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61; 4262-4268. |
| --- | --- |

25.

Smith, J.J., Offord, L.C., Holderness, M. and Saddler, G.S. 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61; 4262-4268.

| 26. | Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281-295. |
| --- | --- |

26.

Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281-295.

| 27. | Taghavi, M., Hayward, A.C., Sly, L.I., Fegan, M. 1996. Analysiss of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46; 10-15. |
| --- | --- |

27.

Taghavi, M., Hayward, A.C., Sly, L.I., Fegan, M. 1996. Analysiss of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46; 10-15.

| 28. | Van Der Wolf, J.M., Bonants, P.J.M., Smith, J.J., Hagenaar, M., Nijhuis, E., Van Beckhoven, J.R.C., Saddler, G.S., Trigalet, A., Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 in Western Europe as determined by AFLP, RC-PFGE and rep-PCR. In: Prior, P., Allen, C. and Elphinstone, J. (eds.) Bacterial wilt disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 44-49. |
| --- | --- |

28.

Van Der Wolf, J.M., Bonants, P.J.M., Smith, J.J., Hagenaar, M., Nijhuis, E., Van Beckhoven, J.R.C., Saddler, G.S., Trigalet, A., Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 in Western Europe as determined by AFLP, RC-PFGE and rep-PCR. In: Prior, P., Allen, C. and Elphinstone, J. (eds.) Bacterial wilt disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 44-49.

| 29. | Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., Stead, D.E. and Boonham, N. 1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an automated and quantitative flourogenic 5’ nuclease TaqMan assay. Applied and Environmental Microbiology 66; 2853-2858. |
| --- | --- |

29.

Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., Stead, D.E. and Boonham, N. 1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an automated and quantitative flourogenic 5’ nuclease TaqMan assay. Applied and Environmental Microbiology 66; 2853-2858.

| 30. | Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A.D.L. Akkermans. 1998. Detection of R. solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4546-4554. |
| --- | --- |

30.

Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A.D.L. Akkermans. 1998. Detection of R. solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4546-4554.

BILAGA III

| 1. | Varje gång det föreligger misstanke om att skadegöraren förekommer och ett eller flera positiva screeningtest har genomförts för det förtecknade växtmaterialet eller i alla andra fall enligt den metod som anges i bilaga II, bör, i avvaktan på bekräftelse eller vederläggning genom slutförande av den nämnda metoden, bevaras och förvaras på lämpligt sätt tills metoden har slutförts






  — | alla de knölar, och om möjligt plantor, från vilka prover har tagits, |
| --- | --- | --- |

1.

Varje gång det föreligger misstanke om att skadegöraren förekommer och ett eller flera positiva screeningtest har genomförts för det förtecknade växtmaterialet eller i alla andra fall enligt den metod som anges i bilaga II, bör, i avvaktan på bekräftelse eller vederläggning genom slutförande av den nämnda metoden, bevaras och förvaras på lämpligt sätt tills metoden har slutförts

—

alla de knölar, och om möjligt plantor, från vilka prover har tagits,

| — | allt kvarvarande extrakt och ytterligare förberett material för screeningtest(er), t.ex. immunofluorescensglas, |
| --- | --- |

—

allt kvarvarande extrakt och ytterligare förberett material för screeningtest(er), t.ex. immunofluorescensglas,

| — | all relevant dokumentation, |
| --- | --- |

—

all relevant dokumentation,

fram till slutförandet av de nämnda metoderna.

Genom bevaring av knölarna kan vid behov sorttester göras.

| 2. | Om förekomst av skadegöraren bekräftas, bör bevaras och förvaras på lämpligt sätt






  — | det material som specificeras i punkt 1,
  och |
| --- | --- | --- |

2.

Om förekomst av skadegöraren bekräftas, bör bevaras och förvaras på lämpligt sätt

—

det material som specificeras i punkt 1,

och

| — | ett prov av det infekterade tomat- eller äggplantematerialet inokulerat med knöl- eller plantextrakt, i förekommande fall,
  och |
| --- | --- |

—

ett prov av det infekterade tomat- eller äggplantematerialet inokulerat med knöl- eller plantextrakt, i förekommande fall,

och

| — | den isolerade kulturen av skadegöraren, |
| --- | --- |

—

den isolerade kulturen av skadegöraren,

fram till minst en månad efter anmälan enligt förfarandet i artikel 5.2.

BILAGA IV

Följande skall, när så är lämpligt, ingå i den utredning som anges i artikel 5.1 a i:

| i) | Produktionsplatser






  — | där potatis odlas eller har odlats ur kloner som är närbesläktade med potatis som har visat sig vara smittad av skadegöraren, |
| --- | --- | --- |

i)

Produktionsplatser

—

där potatis odlas eller har odlats ur kloner som är närbesläktade med potatis som har visat sig vara smittad av skadegöraren,

| — | där tomater odlas eller har odlats, vilka har samma härstamning som tomater som har visat sig vara smittade av skadegöraren, |
| --- | --- |

—

där tomater odlas eller har odlats, vilka har samma härstamning som tomater som har visat sig vara smittade av skadegöraren,

| — | där potatis eller tomater odlas eller har odlats vilka har satts under officiell kontroll därför att det misstänks att skadegöraren förekommer, |
| --- | --- |

—

där potatis eller tomater odlas eller har odlats vilka har satts under officiell kontroll därför att det misstänks att skadegöraren förekommer,

| — | där potatis odlas eller har odlats ur kloner som är närbesläktade med potatis som har växt på produktionsplatser som befunnits vara infekterad av skadegöraren, |
| --- | --- |

—

där potatis odlas eller har odlats ur kloner som är närbesläktade med potatis som har växt på produktionsplatser som befunnits vara infekterad av skadegöraren,

| — | där potatis eller tomater odlas i närheten av infekterade produktionsplatser, inklusive anknytning via produktionsutrustning och produktionsanordningar som delas direkt eller genom en gemensam entreprenör, |
| --- | --- |

—

där potatis eller tomater odlas i närheten av infekterade produktionsplatser, inklusive anknytning via produktionsutrustning och produktionsanordningar som delas direkt eller genom en gemensam entreprenör,

| — | där det för bevattning eller besprutning används ytvatten från någon källa som har bekräftats vara eller som misstänks vara infekterad av skadegöraren, |
| --- | --- |

—

där det för bevattning eller besprutning används ytvatten från någon källa som har bekräftats vara eller som misstänks vara infekterad av skadegöraren,

| — | där det för bevattning eller besprutning används ytvatten från en källa som även används på produktionsplatser som har bekräftats vara eller som misstänks vara infekterad av skadegöraren, |
| --- | --- |

—

där det för bevattning eller besprutning används ytvatten från en källa som även används på produktionsplatser som har bekräftats vara eller som misstänks vara infekterad av skadegöraren,

| — | som är översvämmade eller har översvämmats av ytvatten som bekräftats eller misstänks vara infekterad av skadegöraren. |
| --- | --- |

—

som är översvämmade eller har översvämmats av ytvatten som bekräftats eller misstänks vara infekterad av skadegöraren.

| ii) | Ytvatten som används för bevattning eller besprutning av, eller som har översvämmat det eller de fält eller den eller de produktionsplatser som har bekräftats vara smittade av skadegöraren. |
| --- | --- |

ii)

Ytvatten som används för bevattning eller besprutning av, eller som har översvämmat det eller de fält eller den eller de produktionsplatser som har bekräftats vara smittade av skadegöraren.

BILAGA V

| 1. | Följande skall beaktas vid bestämningen av hur omfattande den troliga smitta som avses i artikel 5.1 a iii och 5.1 c iii är:






  — | Det förtecknade växtmaterial som har odlats på en produktionsplats som förklaras smittad enligt artikel 5.1 a ii. |
| --- | --- | --- |

1.

Följande skall beaktas vid bestämningen av hur omfattande den troliga smitta som avses i artikel 5.1 a iii och 5.1 c iii är:

—

Det förtecknade växtmaterial som har odlats på en produktionsplats som förklaras smittad enligt artikel 5.1 a ii.

| — | Den eller de produktionsplatser med anknytning till produktionen av det förtecknade växtmaterial som har förklarats smittat i enlighet med artikel 5.1 a ii, inklusive anknytning via produktionsutrustning och anordningar som delas direkt eller genom en gemensam entreprenör. |
| --- | --- |

—

Den eller de produktionsplatser med anknytning till produktionen av det förtecknade växtmaterial som har förklarats smittat i enlighet med artikel 5.1 a ii, inklusive anknytning via produktionsutrustning och anordningar som delas direkt eller genom en gemensam entreprenör.

| — | Det förtecknade växtmaterial som har producerats på en eller flera sådana produktionsplatser som avses i föregående strecksats, eller som har förvarats på en eller flera sådana produktionsplatser under den tid då det förtecknade växtmaterial som har förklarats smittat i enlighet med artikel 5.1 a ii befann sig på de produktionsplatser som avses i första strecksatsen. |
| --- | --- |

—

Det förtecknade växtmaterial som har producerats på en eller flera sådana produktionsplatser som avses i föregående strecksats, eller som har förvarats på en eller flera sådana produktionsplatser under den tid då det förtecknade växtmaterial som har förklarats smittat i enlighet med artikel 5.1 a ii befann sig på de produktionsplatser som avses i första strecksatsen.

| — | Anläggningar som hanterar det förtecknade växtmaterialet från de produktionsplatser som avses i ovannämnda strecksatser. |
| --- | --- |

—

Anläggningar som hanterar det förtecknade växtmaterialet från de produktionsplatser som avses i ovannämnda strecksatser.

| — | Alla maskiner, fordon, fartyg, lager, eller delar av dessa, och alla andra föremål, inklusive förpackningsmaterial, som kan ha kommit i kontakt med det förtecknade växtmaterial som har förklarats smittat i enlighet med artikel 5.1 a ii. |
| --- | --- |

—

Alla maskiner, fordon, fartyg, lager, eller delar av dessa, och alla andra föremål, inklusive förpackningsmaterial, som kan ha kommit i kontakt med det förtecknade växtmaterial som har förklarats smittat i enlighet med artikel 5.1 a ii.

| — | All växtmaterial som har lagrats i, eller kommit i kontakt med, något av de föremål som anges i föregående strecksats innan dessa föremål hade rengjorts och sanerats. |
| --- | --- |

—

All växtmaterial som har lagrats i, eller kommit i kontakt med, något av de föremål som anges i föregående strecksats innan dessa föremål hade rengjorts och sanerats.

| — | Till följd av den undersökning och de test som avses i artikel 5.1 a i, i fråga om potatis, de knölar eller plantor som har ett syster- eller moderförhållande genom kloning och i fråga om tomater de plantor med samma källa som det förtecknade växtmaterial som har förklarats smittat i enlighet med artikel 5.1 a ii och som trots att det kan ha givit negativt svar när det testats för skadegöraren, sannolikt är smittat via ett kloningssamband. Sorttester kan göras för att styrka identiteten hos de knölar eller plantor som är smittade och som kommer ur kloner som är närbesläktade. |
| --- | --- |

—

Till följd av den undersökning och de test som avses i artikel 5.1 a i, i fråga om potatis, de knölar eller plantor som har ett syster- eller moderförhållande genom kloning och i fråga om tomater de plantor med samma källa som det förtecknade växtmaterial som har förklarats smittat i enlighet med artikel 5.1 a ii och som trots att det kan ha givit negativt svar när det testats för skadegöraren, sannolikt är smittat via ett kloningssamband. Sorttester kan göras för att styrka identiteten hos de knölar eller plantor som är smittade och som kommer ur kloner som är närbesläktade.

| — | Den eller de produktionsplatser för det förtecknade växtmaterial som avses i föregående strecksats. |
| --- | --- |

—

Den eller de produktionsplatser för det förtecknade växtmaterial som avses i föregående strecksats.

| — | Den eller de produktionsplatser för det förtecknade växtmaterialet där det för bevattning eller besprutning används sådant vatten som har förklarats smittat i enlighet med artikel 5.1 c ii. |
| --- | --- |

—

Den eller de produktionsplatser för det förtecknade växtmaterialet där det för bevattning eller besprutning används sådant vatten som har förklarats smittat i enlighet med artikel 5.1 c ii.

| — | Det företecknade växtmaterial som produceras på fält som översvämmats av ytvatten som bekräftats vara smittat. |
| --- | --- |

—

Det företecknade växtmaterial som produceras på fält som översvämmats av ytvatten som bekräftats vara smittat.

| 2. | Följande skall beaktas vid fastställandet av den möjliga spridning som avses i artikel 5.1 a iv och 5.1 c iii:






  i) | För fall som behandlas i artikel 5.1 a iv:






  — | Närheten till andra produktionsplatser där det förtecknade växtmaterialet odlas. |
| --- | --- | --- | --- |

2.

Följande skall beaktas vid fastställandet av den möjliga spridning som avses i artikel 5.1 a iv och 5.1 c iii:

i)

För fall som behandlas i artikel 5.1 a iv:

—

Närheten till andra produktionsplatser där det förtecknade växtmaterialet odlas.

| — | Den gemensamma produktionen och användningen av partierna av utsädespotatis. |
| --- | --- |

—

Den gemensamma produktionen och användningen av partierna av utsädespotatis.

| — | Produktionsplatser som använder ytvatten för bevattning eller besprutning av förtecknat växtmaterial i fall då det finns eller har funnits en risk för ytvattenströmningar från eller översvämning av den eller de produktionsplatser som har förklarats smittade i enlighet med artikel 5.1 a ii. |
| --- | --- |

—

Produktionsplatser som använder ytvatten för bevattning eller besprutning av förtecknat växtmaterial i fall då det finns eller har funnits en risk för ytvattenströmningar från eller översvämning av den eller de produktionsplatser som har förklarats smittade i enlighet med artikel 5.1 a ii.

| ii) | För fall då ytvattnet har förklarats smittat i enlighet med artikel 5.1 c ii skall följande beaktas:






  — | Produktionsplatser där det produceras förtecknat växtmaterial och som gränsar till eller riskerar att bli översvämmade av ytvatten som har förklarats smittat. |
| --- | --- | --- |

ii)

För fall då ytvattnet har förklarats smittat i enlighet med artikel 5.1 c ii skall följande beaktas:

—

Produktionsplatser där det produceras förtecknat växtmaterial och som gränsar till eller riskerar att bli översvämmade av ytvatten som har förklarats smittat.

| — | Alla åtskilda bevattningsdammar som är förbundna med det ytvatten som har förklarats smittat. |
| --- | --- |

—

Alla åtskilda bevattningsdammar som är förbundna med det ytvatten som har förklarats smittat.

| — | Vatten i anslutning till sådant ytvatten som har förklarats smittat, varvid hänsyn skall tas till följande:






  — | Flödet och flödesriktningen hos det vatten som förklarats smittat. |
| --- | --- | --- |

—

Vatten i anslutning till sådant ytvatten som har förklarats smittat, varvid hänsyn skall tas till följande:

—

Flödet och flödesriktningen hos det vatten som förklarats smittat.

| — | Förekomsten av vilda värdväxter av familjen solanaceae. |
| --- | --- |

—

Förekomsten av vilda värdväxter av familjen solanaceae.

| 3. | Den anmälan som avses i artikel 5.2 första stycket skall göras enligt följande:






  — | Den skall avges omedelbart efter det att förekomst av skadegöraren har bekräftats av laboratorietester, vilka utförts med tillämpning av de metoder som anges i bilaga II, och omfatta minst följande:






  — | För potatis






  a) | partiets sortnamn, |
| --- | --- | --- | --- | --- |

3.

Den anmälan som avses i artikel 5.2 första stycket skall göras enligt följande:

—

Den skall avges omedelbart efter det att förekomst av skadegöraren har bekräftats av laboratorietester, vilka utförts med tillämpning av de metoder som anges i bilaga II, och omfatta minst följande:

—

För potatis

a)

partiets sortnamn,

| b) | partiets typ (matpotatis, utsädespotatis m.m.) och i förekommande fall utsädeskategori. |
| --- | --- |

b)

partiets typ (matpotatis, utsädespotatis m.m.) och i förekommande fall utsädeskategori.

| — | För tomatplantor, partiets sortnamn och, i tillämpliga fall, kategori. |
| --- | --- |

—

För tomatplantor, partiets sortnamn och, i tillämpliga fall, kategori.

| — | Utan att detta påverkar tillämpningen av kraven på anmälning av misstänkt förekomst enligt artikel 4.3, skall de medlemsstater där förekomst bekräftats, när det föreligger risk för smitta av förtecknat växtmaterial från eller i en annan medlemsstat eller andra medlemsstater, genast meddela den berörda medlemsstaten eller de berörda medlemsstaterna vilken information som behövs för att iaktta artikel 5.3, såsom






  a) | potatis- eller tomatpartiets sortnamn, |
| --- | --- | --- |

—

Utan att detta påverkar tillämpningen av kraven på anmälning av misstänkt förekomst enligt artikel 4.3, skall de medlemsstater där förekomst bekräftats, när det föreligger risk för smitta av förtecknat växtmaterial från eller i en annan medlemsstat eller andra medlemsstater, genast meddela den berörda medlemsstaten eller de berörda medlemsstaterna vilken information som behövs för att iaktta artikel 5.3, såsom

a)

potatis- eller tomatpartiets sortnamn,

| b) | exportörens respektive mottagarens namn och adress, |
| --- | --- |

b)

exportörens respektive mottagarens namn och adress,

| c) | potatis- eller tomatpartiets leveransdatum, |
| --- | --- |

c)

potatis- eller tomatpartiets leveransdatum,

| d) | storleken på det potatis- eller tomatparti som levereras, |
| --- | --- |

d)

storleken på det potatis- eller tomatparti som levereras,

| e) | om så är lämpligt kopia av växtpasset eller åtminstone växtpassnumret, och om så är lämpligt odlarens eller handlarens registreringsnummer och en kopia av leveransbeskedet. |
| --- | --- |

e)

om så är lämpligt kopia av växtpasset eller åtminstone växtpassnumret, och om så är lämpligt odlarens eller handlarens registreringsnummer och en kopia av leveransbeskedet.

När denna information har tillhandahållits skall kommissionen genast underrättas om detta.

| 4. | Innehållet i den tilläggsanmälan som avses i artikel 5.2 andra stycket skall uppfylla följande:
  Anmälan skall avges efter det att alla undersökningar har avslutats, och varje undersökning skall innehålla






  a) | det datum då smittan bekräftades, |
| --- | --- | --- |

4.

Innehållet i den tilläggsanmälan som avses i artikel 5.2 andra stycket skall uppfylla följande:

Anmälan skall avges efter det att alla undersökningar har avslutats, och varje undersökning skall innehålla

a)

det datum då smittan bekräftades,

| b) | en kort beskrivning av den undersökning som gjorts för att identifiera källa och möjlig spridning av smittan, samt på vilken nivå provtagningen har skett, |
| --- | --- |

b)

en kort beskrivning av den undersökning som gjorts för att identifiera källa och möjlig spridning av smittan, samt på vilken nivå provtagningen har skett,

| c) | information om smittans identifierade eller misstänkta källor, |
| --- | --- |

c)

information om smittans identifierade eller misstänkta källor,

| d) | detaljerade uppgifter om den angivna smittans omfattning, inklusive antalet produktionsställen och, för potatis, antalet partier med uppgifter om sort och, i fall av utsädespotatis, kategori, |
| --- | --- |

d)

detaljerade uppgifter om den angivna smittans omfattning, inklusive antalet produktionsställen och, för potatis, antalet partier med uppgifter om sort och, i fall av utsädespotatis, kategori,

| e) | detaljerade uppgifter om det område som har avgränsats, inklusive det antal produktionsplatser som inte har förklarats smittade men inkluderats i området, |
| --- | --- |

e)

detaljerade uppgifter om det område som har avgränsats, inklusive det antal produktionsplatser som inte har förklarats smittade men inkluderats i området,

| f) | detaljerade uppgifter om de vatten som förklarats smittade, inklusive namn, placering och omfattningen hos dessa samt omfattningen av bevattningsförbudet, |
| --- | --- |

f)

detaljerade uppgifter om de vatten som förklarats smittade, inklusive namn, placering och omfattningen hos dessa samt omfattningen av bevattningsförbudet,

| g) | för alla sändningar med eller partier av tomatplantor som har förklarats smittade, de certifikat som föreskrivs i artikel 13.1 ii i direktiv 2000/29/EG och växtpassnummer i enlighet med förteckningen i del A avsnitt I.2.2 i bilaga V till direktiv 2000/29/EG, |
| --- | --- |

g)

för alla sändningar med eller partier av tomatplantor som har förklarats smittade, de certifikat som föreskrivs i artikel 13.1 ii i direktiv 2000/29/EG och växtpassnummer i enlighet med förteckningen i del A avsnitt I.2.2 i bilaga V till direktiv 2000/29/EG,

| h) | annan information som bekräftar förekomsten (förekomsterna) av smitta och som kommissionen kan kräva. |
| --- | --- |

h)

annan information som bekräftar förekomsten (förekomsterna) av smitta och som kommissionen kan kräva.

BILAGA VI

| 1. | De bestämmelser som det hänvisas till i artikel 6.1 skall vara följande:






  — | Användning som djurfoder efter värmebehandling av en typ som innebär att det inte finns någon risk för att skadegöraren har överlevt. |
| --- | --- | --- |

1.

De bestämmelser som det hänvisas till i artikel 6.1 skall vara följande:

—

Användning som djurfoder efter värmebehandling av en typ som innebär att det inte finns någon risk för att skadegöraren har överlevt.

| — | Bortskaffande på en officiellt godkänd för ändamålet avsedd upplagsplats för avfall där det inte finns någon identifierbar risk för att organismen sprids till omgivningen, t.ex. genom läckage till jordbruksmark eller kontakt med vattenkällor som skulle kunna användas vid bevattning av jordbruksmark. |
| --- | --- |

—

Bortskaffande på en officiellt godkänd för ändamålet avsedd upplagsplats för avfall där det inte finns någon identifierbar risk för att organismen sprids till omgivningen, t.ex. genom läckage till jordbruksmark eller kontakt med vattenkällor som skulle kunna användas vid bevattning av jordbruksmark.

| — | Förbränning. |
| --- | --- |

—

Förbränning.

| — | Användning för industriell bearbetning genom direkt och omedelbar leverans till en bearbetningsanläggning med officiellt godkända anordningar för avfallshantering för vilken det har säkerställts att det inte finns någon identifierbar risk för att skadegöraren skall spridas, och med ett system för rengöring och desinfektion av åtminstone avgående fordon. |
| --- | --- |

—

Användning för industriell bearbetning genom direkt och omedelbar leverans till en bearbetningsanläggning med officiellt godkända anordningar för avfallshantering för vilken det har säkerställts att det inte finns någon identifierbar risk för att skadegöraren skall spridas, och med ett system för rengöring och desinfektion av åtminstone avgående fordon.

| — | Andra åtgärder, förutsatt att det har säkerställts att det inte finns någon identifierbar risk för att skadegöraren skall spridas. Dessa åtgärder skall anmälas till kommissionen och till de andra medlemsstaterna. |
| --- | --- |

—

Andra åtgärder, förutsatt att det har säkerställts att det inte finns någon identifierbar risk för att skadegöraren skall spridas. Dessa åtgärder skall anmälas till kommissionen och till de andra medlemsstaterna.

Allt kvarvarande avfall som berörs av eller har uppkommit på grund av ovannämnda någon av ovanstående åtgärder skall bortskaffas genom officiellt godkända metoder i överensstämmelse med bilaga VII till detta direktiv.

| 2. | För att under tillsyn av de berörda medlemsstaternas ansvariga officiella organ använda eller bortförskaffa det förtecknade växtmaterial som avses i artikel 6.2, med lämplig kommunikation mellan ansvariga officiella organ för att alltid säkerställa sådan tillsyn och godkännande av ansvarigt officiellt organ i den medlemsstat där potatisen skall förpackas eller bearbetas med hänsyn till de anordningar för avfallshantering som avses i första och andra strecksatsen, är något av följande sätt lämpliga:






  i) | När det gäller potatisknölar:






  — | Användning som matpotatis avsedd för konsumtion och packad på platser med lämpliga anordningar för avfallshantering, klar för direkt leverans och användning utan ompaketering. Potatisar avsedda för sättning får behandlas på samma plats endast om detta sker separat eller efter rengöring och desinfektion. |
| --- | --- | --- | --- |

2.

För att under tillsyn av de berörda medlemsstaternas ansvariga officiella organ använda eller bortförskaffa det förtecknade växtmaterial som avses i artikel 6.2, med lämplig kommunikation mellan ansvariga officiella organ för att alltid säkerställa sådan tillsyn och godkännande av ansvarigt officiellt organ i den medlemsstat där potatisen skall förpackas eller bearbetas med hänsyn till de anordningar för avfallshantering som avses i första och andra strecksatsen, är något av följande sätt lämpliga:

i)

När det gäller potatisknölar:

—

Användning som matpotatis avsedd för konsumtion och packad på platser med lämpliga anordningar för avfallshantering, klar för direkt leverans och användning utan ompaketering. Potatisar avsedda för sättning får behandlas på samma plats endast om detta sker separat eller efter rengöring och desinfektion.

| — | Användning som industripotatis, och avsedd för direkt och omedelbar leverans till en bearbetningsanläggning som har lämpliga anordningar för avfallshantering och ett system för rengöring och desinfektion av åtminstone avgående fordon. |
| --- | --- |

—

Användning som industripotatis, och avsedd för direkt och omedelbar leverans till en bearbetningsanläggning som har lämpliga anordningar för avfallshantering och ett system för rengöring och desinfektion av åtminstone avgående fordon.

| — | Annan användning eller annat bortförskaffande, förutsatt att det har säkerställts att det inte finns någon identifierbar risk för att skadegöraren sprids och under förutsättning att nämnda ansvariga officiella organ lämnat sitt tillstånd. |
| --- | --- |

—

Annan användning eller annat bortförskaffande, förutsatt att det har säkerställts att det inte finns någon identifierbar risk för att skadegöraren sprids och under förutsättning att nämnda ansvariga officiella organ lämnat sitt tillstånd.

| ii) | När det gäller andra växtdelar, inklusive avfall från skaft och blad:






  — | Destruktion. |
| --- | --- | --- |

ii)

När det gäller andra växtdelar, inklusive avfall från skaft och blad:

—

Destruktion.

| — | Annan användning eller annat bortförskaffande, förutsatt att det har säkerställts att det inte finns någon identifierbar risk för att skadegöraren sprids och under förutsättning att nämnda ansvariga officiella organ lämnat sitt tillstånd. |
| --- | --- |

—

Annan användning eller annat bortförskaffande, förutsatt att det har säkerställts att det inte finns någon identifierbar risk för att skadegöraren sprids och under förutsättning att nämnda ansvariga officiella organ lämnat sitt tillstånd.

| 3. | Lämpliga metoder för att sanera de föremål som avses i artikel 6.3 skall vara rengöring och när så är lämpligt desinfektion, så att det inte finns någon identifierbar risk för att skadegöraren sprids. Metoderna skall tillämpas under övervakning av medlemsstaternas ansvariga officiella organ. |
| --- | --- |

3.

Lämpliga metoder för att sanera de föremål som avses i artikel 6.3 skall vara rengöring och när så är lämpligt desinfektion, så att det inte finns någon identifierbar risk för att skadegöraren sprids. Metoderna skall tillämpas under övervakning av medlemsstaternas ansvariga officiella organ.

| 4. | Den serie åtgärder som medlemsstaterna skall vidta inom det eller de avgränsade områden som upprättas i enlighet med artikel 5.1 a iv och 5.1 c iii och som avses i artikel 6.4 skall inkludera följande: |
| --- | --- |

4.

Den serie åtgärder som medlemsstaterna skall vidta inom det eller de avgränsade områden som upprättas i enlighet med artikel 5.1 a iv och 5.1 c iii och som avses i artikel 6.4 skall inkludera följande:

| 4.1. | På produktionsplatser som har förklarats smittade i enlighet med artikel 5.1 a ii:






  a) | På fält eller enheter med skyddad växtproduktion som har förklarats smittade i enlighet med artikel 5.1 a ii, gäller antingen följande:






  i) | Under åtminstone de fyra odlingsår som följer på det år då fältet förklarades smittat






  — | skall åtgärder vidtas för att utrota övervintrade potatis- och tomatplantor och andra värdväxter för skadegöraren inklusive ogräs av familjen solanaceae,
  och |
| --- | --- | --- | --- | --- |

4.1.

På produktionsplatser som har förklarats smittade i enlighet med artikel 5.1 a ii:

a)

På fält eller enheter med skyddad växtproduktion som har förklarats smittade i enlighet med artikel 5.1 a ii, gäller antingen följande:

i)

Under åtminstone de fyra odlingsår som följer på det år då fältet förklarades smittat

—

skall åtgärder vidtas för att utrota övervintrade potatis- och tomatplantor och andra värdväxter för skadegöraren inklusive ogräs av familjen solanaceae,

och

| — | får det inte planteras






  — | knölar, plantor eller frön av potatis, |
| --- | --- | --- |

—

får det inte planteras

—

knölar, plantor eller frön av potatis,

| — | tomatplantor och tomatfrön, |
| --- | --- |

—

tomatplantor och tomatfrön,

| — | med hänsyn till skadegörarens biologiska egenskaper, |
| --- | --- |

—

med hänsyn till skadegörarens biologiska egenskaper,

| — | andra värdväxter, |
| --- | --- |

—

andra värdväxter,

| — | växter av arten Brassica, på vilka det finns en identifierad risk att skadegöraren överlever, |
| --- | --- |

—

växter av arten Brassica, på vilka det finns en identifierad risk att skadegöraren överlever,

| — | grödor som medför en identifierad risk för att skadegöraren kommer att spridas, |
| --- | --- |

—

grödor som medför en identifierad risk för att skadegöraren kommer att spridas,

| — | under den första växtsäsongen för potatis eller tomater efter den period som fastställs i föregående strecksats, och på villkor att fältet har förklarats vara fritt från övervintrade potatis- och tomatplantor och andra värdväxter, inklusive ogräs av familjen solanaceae vid officiella inspektioner under minst två på varandra följande odlingsår före plantering,






  — | får, när det gäller potatis, endast produktion av annan potatis än utsädespotatis tillåtas, |
| --- | --- | --- |

—

under den första växtsäsongen för potatis eller tomater efter den period som fastställs i föregående strecksats, och på villkor att fältet har förklarats vara fritt från övervintrade potatis- och tomatplantor och andra värdväxter, inklusive ogräs av familjen solanaceae vid officiella inspektioner under minst två på varandra följande odlingsår före plantering,

—

får, när det gäller potatis, endast produktion av annan potatis än utsädespotatis tillåtas,

| — | skall, när det gäller potatis och tomater, de skördade potatisknölarna eller tomatplantorna testas enligt de förfaranden som anges i bilaga II, |
| --- | --- |

—

skall, när det gäller potatis och tomater, de skördade potatisknölarna eller tomatplantorna testas enligt de förfaranden som anges i bilaga II,

| — | skall, under den potatis- eller tomatväxtsäsong som följer på den som avses i föregående strecksats och efter en lämplig växtföljdscykel som skall omfatta minst två år om det gäller odling av utsädespotatis, en officiell undersökning göras i enlighet med artikel 2.1, |
| --- | --- |

—

skall, under den potatis- eller tomatväxtsäsong som följer på den som avses i föregående strecksats och efter en lämplig växtföljdscykel som skall omfatta minst två år om det gäller odling av utsädespotatis, en officiell undersökning göras i enlighet med artikel 2.1,

eller följande:

| ii) | Under de fem odlingsåren som följer på det år då fältet förklarades smittat






  — | skall åtgärder vidtas för att utrota övervintrade potatis- och tomatplantor, liksom andra naturligt förekommande värdväxter för skadegöraren inklusive ogräs av familjen solanaceae,
  och |
| --- | --- | --- |

ii)

Under de fem odlingsåren som följer på det år då fältet förklarades smittat

—

skall åtgärder vidtas för att utrota övervintrade potatis- och tomatplantor, liksom andra naturligt förekommande värdväxter för skadegöraren inklusive ogräs av familjen solanaceae,

och

| — | skall fältet under de första tre åren läggas och bibehållas antingen i helträda eller med spannmål i enlighet med den identifierade risken eller med permanent betesmark som slås ofta respektive betas intensivt eller som gräs för utsädesproduktion, följt under de följande två åren av plantering av växter som inte är värdväxter för skadegöraren och som därmed inte utgör någon identifierad risk för att skadegöraren överlever eller sprids, |
| --- | --- |

—

skall fältet under de första tre åren läggas och bibehållas antingen i helträda eller med spannmål i enlighet med den identifierade risken eller med permanent betesmark som slås ofta respektive betas intensivt eller som gräs för utsädesproduktion, följt under de följande två åren av plantering av växter som inte är värdväxter för skadegöraren och som därmed inte utgör någon identifierad risk för att skadegöraren överlever eller sprids,

| — | under den första växtsäsongen för potatis eller tomater efter den period som fastställs i föregående strecksats, och på villkor att fältet har förklarats vara fritt från övervintrade potatis- och tomatplantor och andra värdväxter, inklusive ogräs av familjen solanaceae vid officiella inspektioner under minst två på varandra följande odlingsår före plantering






  — | skall, när det gäller potatis, produktion av utsädespotatis och annan potatis tillåtas, |
| --- | --- | --- |

—

under den första växtsäsongen för potatis eller tomater efter den period som fastställs i föregående strecksats, och på villkor att fältet har förklarats vara fritt från övervintrade potatis- och tomatplantor och andra värdväxter, inklusive ogräs av familjen solanaceae vid officiella inspektioner under minst två på varandra följande odlingsår före plantering

—

skall, när det gäller potatis, produktion av utsädespotatis och annan potatis tillåtas,

| — | skall de skördade potatisknölarna eller tomatplantorna testas enligt de förfaranden som anges i bilaga II. |
| --- | --- |

—

skall de skördade potatisknölarna eller tomatplantorna testas enligt de förfaranden som anges i bilaga II.

| b) | På alla andra fält tillhörande den smittade produktionsplatsen och på villkor att de ansvariga officiella organen har förvissat sig om att risken för plantor från övervintrande potatis och tomat och andra naturligt förekommande värdväxter för skadegöraren, inklusive ogräs av familjen Solanaceae i tillämpliga fall, har undanröjts gäller följande:






  — | Under det odlingsår som följer på det år då fältet förklarades för smittat






  — | skall antingen inga knölar, plantor eller frön av potatis, och inte heller andra värdväxter för skadegöraren planteras,
  eller |
| --- | --- | --- | --- |

b)

På alla andra fält tillhörande den smittade produktionsplatsen och på villkor att de ansvariga officiella organen har förvissat sig om att risken för plantor från övervintrande potatis och tomat och andra naturligt förekommande värdväxter för skadegöraren, inklusive ogräs av familjen Solanaceae i tillämpliga fall, har undanröjts gäller följande:

—

Under det odlingsår som följer på det år då fältet förklarades för smittat

—

skall antingen inga knölar, plantor eller frön av potatis, och inte heller andra värdväxter för skadegöraren planteras,

eller

| — | får, när det gäller potatisknölar, certifierad utsädespotatis endast planteras för produktion av annan potatis än utsädespotatis, |
| --- | --- |

—

får, när det gäller potatisknölar, certifierad utsädespotatis endast planteras för produktion av annan potatis än utsädespotatis,

| — | får, när det gäller tomatplantor, endast tomatplantor som odlats av frön som uppfyller kraven i direktiv 2000/29/EG planteras, och endast för fruktproduktion. |
| --- | --- |

—

får, när det gäller tomatplantor, endast tomatplantor som odlats av frön som uppfyller kraven i direktiv 2000/29/EG planteras, och endast för fruktproduktion.

| — | Under det andra odlingsår som följer på det år då fältet förklarades för smittat






  — | får, när det gäller potatis, endast certifierad utsädespotatis eller utsädespotatis som genomgått officiella tester avseende mörk ringröta och som odlats under officiell kontroll på andra produktionsställen än dem som anges i punkt 4.1 planteras för produktion av utsädespotatis eller annan potatis, |
| --- | --- | --- |

—

Under det andra odlingsår som följer på det år då fältet förklarades för smittat

—

får, när det gäller potatis, endast certifierad utsädespotatis eller utsädespotatis som genomgått officiella tester avseende mörk ringröta och som odlats under officiell kontroll på andra produktionsställen än dem som anges i punkt 4.1 planteras för produktion av utsädespotatis eller annan potatis,

| — | får, när det gäller tomater, endast tomatplantor som odlats av frön som uppfyller kraven i direktiv 2000/29/EG eller, om de har förökats på vegetativ väg, som kommer från tomatplantor framställda från sådana frön och odlade under officiell kontroll på andra produktionsplatser än de som anges i punkt 4.1, planteras för antingen plant- eller fruktproduktion. |
| --- | --- |

—

får, när det gäller tomater, endast tomatplantor som odlats av frön som uppfyller kraven i direktiv 2000/29/EG eller, om de har förökats på vegetativ väg, som kommer från tomatplantor framställda från sådana frön och odlade under officiell kontroll på andra produktionsplatser än de som anges i punkt 4.1, planteras för antingen plant- eller fruktproduktion.

| — | Under åtminstone de tre odlingsår som följer på det år då fältet förklarades smittat






  — | får, när det gäller potatis, endast certifierad utsädespotatis eller utsädespotatis som odlats under officiell kontroll och kommer från certifierad utsädespotatis planteras för produktion av utsädespotatis eller annan potatis, |
| --- | --- | --- |

—

Under åtminstone de tre odlingsår som följer på det år då fältet förklarades smittat

—

får, när det gäller potatis, endast certifierad utsädespotatis eller utsädespotatis som odlats under officiell kontroll och kommer från certifierad utsädespotatis planteras för produktion av utsädespotatis eller annan potatis,

| — | får, när det gäller tomater, endast certifierade tomatplantor som odlats av frön som uppfyller kraven i direktiv 2000/29/EG eller som odlats under officiell kontroll från sådana plantor planteras för antingen plant- eller fruktproduktion, |
| --- | --- |

—

får, när det gäller tomater, endast certifierade tomatplantor som odlats av frön som uppfyller kraven i direktiv 2000/29/EG eller som odlats under officiell kontroll från sådana plantor planteras för antingen plant- eller fruktproduktion,

| — | skall, för vart och ett av de odlingsår som anges i föregående strecksats, åtgärder vidtas för att utrota plantor från övervintrande knölar och andra naturligt förekommande värdväxter för skadegöraren, en officiell inspektion av den växande grödan utföras, och en officiell testning göras av de skördade potatisarna på varje potatisfält enligt det förfarande som anges i bilaga II. |
| --- | --- |

—

skall, för vart och ett av de odlingsår som anges i föregående strecksats, åtgärder vidtas för att utrota plantor från övervintrande knölar och andra naturligt förekommande värdväxter för skadegöraren, en officiell inspektion av den växande grödan utföras, och en officiell testning göras av de skördade potatisarna på varje potatisfält enligt det förfarande som anges i bilaga II.

| c) | Omedelbart efter förklaringen om smitta enligt artikel 5.1 a ii och efter det första därpå följande odlingsåret






  — | skall alla maskiner och lageranläggningar på produktionsplatsen som har använts vid potatis- eller tomatproduktionen rengöras och, när så är lämpligt, desinfekteras med lämpliga metoder enligt punkt 3, |
| --- | --- | --- |

c)

Omedelbart efter förklaringen om smitta enligt artikel 5.1 a ii och efter det första därpå följande odlingsåret

—

skall alla maskiner och lageranläggningar på produktionsplatsen som har använts vid potatis- eller tomatproduktionen rengöras och, när så är lämpligt, desinfekteras med lämpliga metoder enligt punkt 3,

| — | skall officiella kontroller av program för bevattning och duschning, inklusive ett förbud mot detta, införas enligt vad som är lämpligt, för att hindra att skadegöraren sprids. |
| --- | --- |

—

skall officiella kontroller av program för bevattning och duschning, inklusive ett förbud mot detta, införas enligt vad som är lämpligt, för att hindra att skadegöraren sprids.

| d) | I en enhet med skyddad växtproduktion som har förklarats smittad i enlighet med artikel 5.1 a ii, där det är möjligt att fullständigt byta ut odlingsmediet






  — | får knölar, plantor eller frön av potatis eller andra värdväxter för skadegöraren inklusive tomatplantor och utsäde planteras endast om produktionsenheten har underkastats officiellt övervakade åtgärder för att utrota skadegöraren och avlägsna allt material från värdväxter, inklusive åtminstone ett totalt byte av odlingsmedium och rengöring och, där så är lämpligt, desinfektion av den angivna enheten och all utrustning, och därefter av de ansvariga officiella organen har godkänts för potatis- eller tomatproduktion, |
| --- | --- | --- |

d)

I en enhet med skyddad växtproduktion som har förklarats smittad i enlighet med artikel 5.1 a ii, där det är möjligt att fullständigt byta ut odlingsmediet

—

får knölar, plantor eller frön av potatis eller andra värdväxter för skadegöraren inklusive tomatplantor och utsäde planteras endast om produktionsenheten har underkastats officiellt övervakade åtgärder för att utrota skadegöraren och avlägsna allt material från värdväxter, inklusive åtminstone ett totalt byte av odlingsmedium och rengöring och, där så är lämpligt, desinfektion av den angivna enheten och all utrustning, och därefter av de ansvariga officiella organen har godkänts för potatis- eller tomatproduktion,

| — | skall, när det gäller potatisproduktion, denna produktion komma från officiellt certifierad utsädespotatis, eller från miniknölar eller mikroplantor som härstammar från undersökta källor, |
| --- | --- |

—

skall, när det gäller potatisproduktion, denna produktion komma från officiellt certifierad utsädespotatis, eller från miniknölar eller mikroplantor som härstammar från undersökta källor,

| — | skall, för tomatproduktion, produktionen komma från frön som uppfyller kraven i direktiv 2000/29/EG eller, om de har förökats på vegetativ väg, som kommer från tomatplantor framställda från sådana frön och odlade under officiell kontroll, |
| --- | --- |

—

skall, för tomatproduktion, produktionen komma från frön som uppfyller kraven i direktiv 2000/29/EG eller, om de har förökats på vegetativ väg, som kommer från tomatplantor framställda från sådana frön och odlade under officiell kontroll,

| — | skall officiella kontroller av program för bevattning och duschning, inklusive ett förbud mot detta, införas enligt vad som är lämpligt, för att hindra att skadegöraren sprids. |
| --- | --- |

—

skall officiella kontroller av program för bevattning och duschning, inklusive ett förbud mot detta, införas enligt vad som är lämpligt, för att hindra att skadegöraren sprids.

| 4.2. | Utan att det påverkar tillämpningen av åtgärderna i 4.1 skall medlemsstaterna inom det avgränsade området






  a) | omedelbart efter det att fältet förklarades smittat se till att alla maskiner och lageranläggningar på produktionsplatsen som har använts vid potatis- eller tomatproduktionen rengörs och desinfekteras på lämpligt sätt och med lämpliga metoder enligt punkt 3, |
| --- | --- | --- |

4.2.

Utan att det påverkar tillämpningen av åtgärderna i 4.1 skall medlemsstaterna inom det avgränsade området

a)

omedelbart efter det att fältet förklarades smittat se till att alla maskiner och lageranläggningar på produktionsplatsen som har använts vid potatis- eller tomatproduktionen rengörs och desinfekteras på lämpligt sätt och med lämpliga metoder enligt punkt 3,

| b) | omedelbart, och under åtminstone tre vegetationsperioder efter det att området har förklarats smittat,






  ba) | när det avgränsade området har fastställts enligt artikel 5.1 a iv






  — | säkerställa övervakning genom sina ansvariga officiella organ av anläggningar där potatisknölar eller tomater odlas, lagras eller hanteras, och av anläggningar som bedriver entreprenadverksamhet med maskiner för potatis- och tomatproduktion, |
| --- | --- | --- | --- |

b)

omedelbart, och under åtminstone tre vegetationsperioder efter det att området har förklarats smittat,

ba)

när det avgränsade området har fastställts enligt artikel 5.1 a iv

—

säkerställa övervakning genom sina ansvariga officiella organ av anläggningar där potatisknölar eller tomater odlas, lagras eller hanteras, och av anläggningar som bedriver entreprenadverksamhet med maskiner för potatis- och tomatproduktion,

| — | kräva att endast certifierat utsäde eller utsäde som odlats under officiell kontroll för alla potatisgrödor inom det området planteras, samt att utsädespotatis som har odlats på produktionsplatser som har fastställts som troligen smittade enligt artikel 5.1 a iii, testas efter skörden, |
| --- | --- |

—

kräva att endast certifierat utsäde eller utsäde som odlats under officiell kontroll för alla potatisgrödor inom det området planteras, samt att utsädespotatis som har odlats på produktionsplatser som har fastställts som troligen smittade enligt artikel 5.1 a iii, testas efter skörden,

| — | kräva att skördade partier av utsädespotatis från alla produktionsplatser inom det avgränsade området hanteras skilt från potatis avsedd för annat ändamål, eller ett system för rengöring och, när så är lämpligt, desinfektion mellan hanteringen av partier av utsädespotatis och partier av annan potatis, |
| --- | --- |

—

kräva att skördade partier av utsädespotatis från alla produktionsplatser inom det avgränsade området hanteras skilt från potatis avsedd för annat ändamål, eller ett system för rengöring och, när så är lämpligt, desinfektion mellan hanteringen av partier av utsädespotatis och partier av annan potatis,

| — | kräva att plantering sker endast av tomatplantor från frön som uppfyller kraven i direktiv 2000/29/EG eller, om de har förökats på vegetativ väg, som kommer från tomatplantor framställda från sådana frön och odlade under officiell kontroll, |
| --- | --- |

—

kräva att plantering sker endast av tomatplantor från frön som uppfyller kraven i direktiv 2000/29/EG eller, om de har förökats på vegetativ väg, som kommer från tomatplantor framställda från sådana frön och odlade under officiell kontroll,

| — | genomföra en officiell undersökning enligt artikel 2.1, |
| --- | --- |

—

genomföra en officiell undersökning enligt artikel 2.1,

| bb) | när ytvattnet har förklarats smittat enligt artikel 5.1 c ii eller kan finnas med bland de faktorer som kan sprida skadegöraren i enlighet med punkt 2 i bilaga V






  — | genomföra en årlig undersökning vid lämplig tidpunkt som omfattar provtagning av ytvatten och, i förekommande fall, värdväxter av familjen solanaceae i de relevanta vattnen och testning enligt de lämpliga metoder som anges i bilaga II för det förtecknade växtmaterialet och för övriga fall, |
| --- | --- | --- |

bb)

när ytvattnet har förklarats smittat enligt artikel 5.1 c ii eller kan finnas med bland de faktorer som kan sprida skadegöraren i enlighet med punkt 2 i bilaga V

—

genomföra en årlig undersökning vid lämplig tidpunkt som omfattar provtagning av ytvatten och, i förekommande fall, värdväxter av familjen solanaceae i de relevanta vattnen och testning enligt de lämpliga metoder som anges i bilaga II för det förtecknade växtmaterialet och för övriga fall,

| — | införa officiella kontroller av programmen för bevattning och duschning, inklusive ett förbud mot att vatten som förklarats smittat används för bevattning och duschning av förtecknat växtmaterial, och, när så är lämpligt, av andra värdväxter för att hindra att skadegöraren sprids. Detta förbud kan tas upp till granskning igen mot bakgrund av resultaten från den nämnda årliga undersökningen, och förklaringar om smitta kan upphävas om de ansvariga officiella organen har förvissat sig om att ytvattnet inte längre är smittat. Användning av vatten som belagts med förbud får tillåtas för bevattning och duschning av värdväxter, om detta sker under officiell kontroll och om officiellt godkänd teknik som utrotar skadegöraren och förhindrar dess spridning används, |
| --- | --- |

—

införa officiella kontroller av programmen för bevattning och duschning, inklusive ett förbud mot att vatten som förklarats smittat används för bevattning och duschning av förtecknat växtmaterial, och, när så är lämpligt, av andra värdväxter för att hindra att skadegöraren sprids. Detta förbud kan tas upp till granskning igen mot bakgrund av resultaten från den nämnda årliga undersökningen, och förklaringar om smitta kan upphävas om de ansvariga officiella organen har förvissat sig om att ytvattnet inte längre är smittat. Användning av vatten som belagts med förbud får tillåtas för bevattning och duschning av värdväxter, om detta sker under officiell kontroll och om officiellt godkänd teknik som utrotar skadegöraren och förhindrar dess spridning används,

| — | när spillvattnets utlopp är smittade, införa officiella kontroller av bortskaffandet av utsläpp av fast och flytande avfall från anläggningar för industriell bearbetning eller förpackning av förtecknat växtmaterial, |
| --- | --- |

—

när spillvattnets utlopp är smittade, införa officiella kontroller av bortskaffandet av utsläpp av fast och flytande avfall från anläggningar för industriell bearbetning eller förpackning av förtecknat växtmaterial,

| c) | upprätta ett program, när så är lämpligt, för att ersätta alla partier utsädespotatis under en lämplig tidsperiod. |
| --- | --- |

c)

upprätta ett program, när så är lämpligt, för att ersätta alla partier utsädespotatis under en lämplig tidsperiod.

BILAGA VII

De officiellt godkända metoder för avfallshantering som anges i första stycket i bilaga VI skall uppfylla kraven i följande bestämmelser så att varje identifierbar risk för spridning av skadegöraren undanröjs:

| i) | Potatis- och tomatavfall (även kasserad potatis, skal och tomater) och allt annat fast avfall som kommit i kontakt med potatisen och tomaterna (även jord, stenar och annat skräp) skall bortskaffas på något av följande sätt:






  — | Bortskaffande på officiellt godkänd för ändamålet avsedd upplagsplats för avfall där det inte finns någon identifierbar risk för att patogenen sprids till omgivningen, t.ex. genom läckage till jordbruksmark eller kontakt med jordbruksmark eller vattenkällor som kan komma att användas för bevattning av jordbruksmark. Avfallet skall föras direkt till platsen under så säkra omständigheter att det inte finns någon risk för att någon del av avfallet förloras. |
| --- | --- | --- |

i)

Potatis- och tomatavfall (även kasserad potatis, skal och tomater) och allt annat fast avfall som kommit i kontakt med potatisen och tomaterna (även jord, stenar och annat skräp) skall bortskaffas på något av följande sätt:

—

Bortskaffande på officiellt godkänd för ändamålet avsedd upplagsplats för avfall där det inte finns någon identifierbar risk för att patogenen sprids till omgivningen, t.ex. genom läckage till jordbruksmark eller kontakt med jordbruksmark eller vattenkällor som kan komma att användas för bevattning av jordbruksmark. Avfallet skall föras direkt till platsen under så säkra omständigheter att det inte finns någon risk för att någon del av avfallet förloras.

| — | Förbränning. |
| --- | --- |

—

Förbränning.

| — | Andra åtgärder, förutsatt att det har säkerställts att det inte finns någon identifierbar risk för att skadegöraren skall spridas. Dessa åtgärder skall anmälas till kommissionen och till de andra medlemsstaterna. |
| --- | --- |

—

Andra åtgärder, förutsatt att det har säkerställts att det inte finns någon identifierbar risk för att skadegöraren skall spridas. Dessa åtgärder skall anmälas till kommissionen och till de andra medlemsstaterna.

| ii) | Flytande avfall: Innan det bortskaffas skall flytande avfall som innehåller uppslammade fasta ämnen genomgå filtrering eller sedimentering så att dessa fasta ämnen tas bort. Dessa ämnen skall bortförskaffas på det sätt som föreskrivs i punkt i.
  Därefter skall det flytande avfallet bortskaffas på något av följande sätt:






  — | Upphettning av hela volymen till minst 60 °C under minst 30 minuter. Därefter bortskaffande. |
| --- | --- | --- |

ii)

Flytande avfall: Innan det bortskaffas skall flytande avfall som innehåller uppslammade fasta ämnen genomgå filtrering eller sedimentering så att dessa fasta ämnen tas bort. Dessa ämnen skall bortförskaffas på det sätt som föreskrivs i punkt i.

Därefter skall det flytande avfallet bortskaffas på något av följande sätt:

—

Upphettning av hela volymen till minst 60 °C under minst 30 minuter. Därefter bortskaffande.

| — | Bortskaffande på annat sätt, förutsatt att det sker efter officiellt godkännande och under officiell kontroll så att det inte finns någon identifierbar risk för att avfallet kan komma i kontakt med jordbruksmark eller vattenkällor som kan komma att användas för bevattning av jordbruksmark. Uppgifterna om detta skall meddelas de andra medlemsstaterna och kommissionen. |
| --- | --- |

—

Bortskaffande på annat sätt, förutsatt att det sker efter officiellt godkännande och under officiell kontroll så att det inte finns någon identifierbar risk för att avfallet kan komma i kontakt med jordbruksmark eller vattenkällor som kan komma att användas för bevattning av jordbruksmark. Uppgifterna om detta skall meddelas de andra medlemsstaterna och kommissionen.

De alternativ som anges i denna bilaga gäller även avfall med anknytning till hantering, bortskaffande och bearbetning av smittade partier.

---

(1)  Se Lelliott och Stead (1987).

1

(2)  För kontaktuppgifter för personal, se webbplats: (http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

2

http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

(3)  Använd en standardreferensstam av R. solanacearum biovar 2 (ras 3).

3

R. solanacearum

(4)  Potentiell korsreagerande stam i serologiska tester (IF och/eller ELISA) med polyklonala antiserum.

4

(5)  Stam från vilken PCR-kopia kan amplifieras i vissa laboratorier av storlek liknande den som förväntas vid användning av de specifika primrarna OLI-1 och Y-2 (se tillägg 6).

5

(6)  Kan korsreagera i de flesta test, något som dock endast har observerats på bananplanta i Indonesien.

6

(7)  Används med homogeniseringsextraktionsmetod.

7

(8)  Metoden validerades med Taq polymeras från Perkin Elmer (AmpliTaq) och Gibco BRL.

8

Taq

(9)  Metoderna validerades med Taq polymeras från Perkin Elmer (AmpliTaq) och Gibco BRL.

9

Taq

Anmärkning: Ursprungligen optimerad för MJ Research PTC 200 termocykel med Gibco Taq Polymeras.

Anmärkning:

Perkin Elmer AmpliTaq och buffert kan även användas i samma koncentrationer.

(10)  Metoderna validerades med Taq polymeras från Perkin Elmer (AmpliTaq) och Gibco BRL.

10

Taq

(11)  Koncentrationen av primrarna NS-5-F och NS-6-R optimerades för extraktion av potatisars naveländar med användning av homogeniseringsmetoden och DNA-rening enligt Pastrik (2000) (se avsnitt VI.A.6.1.a.). Reoptimering av reagenskoncentrationerna krävs om extraktion genom skakning eller andra metoder för isolering av DNA används.

11

(12)  Metoderna validerades med Taq polymeras från Perkin Elmer (AmpliTaq) och Gibco BRL.

12

Taq

(13)  Metoderna validerades med Taq polymeras från Perkin Elmer (AmpliTaq) och Gibco BRL.

13

Taq

---

| 27.7.2006 | SV | Europeiska unionens officiella tidning | L 206/107 |
| --- | --- | --- | --- |

27.7.2006

SV

Europeiska unionens officiella tidning

L 206/107

---

KOMMISSIONENS DIREKTIV 2006/64/EG

av den 18 juli 2006

om ändring av rådets direktiv 91/414/EEG för att införa klopyralid, cyprodinil, fosetyl och trinexapak som verksamma ämnen

(Text av betydelse för EES)

EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT DETTA DIREKTIV

med beaktande av fördraget om upprättandet av Europeiska gemenskapen,

med beaktande av rådets direktiv 91/414/EEG av den 15 juli 1991 om utsläppande av växtskyddsmedel på marknaden (1), särskilt artikel 6.1, och

av följande skäl:

| (1) | I kommissionens förordningar (EG) nr 451/2000 (2) och (EG) nr 703/2001 (3) fastställs närmare bestämmelser för genomförandet av den andra etappen i det arbetsprogram som avses i artikel 8.2 i direktiv 91/414/EEG tillsammans med en förteckning över de verksamma ämnen som skall utvärderas för att eventuellt införas i bilaga I till direktiv 91/414/EEG. I denna förteckning ingår klopyralid, cyprodinil, fosetyl och trinexapak. |
| --- | --- |

(1)

I kommissionens förordningar (EG) nr 451/2000 (2) och (EG) nr 703/2001 (3) fastställs närmare bestämmelser för genomförandet av den andra etappen i det arbetsprogram som avses i artikel 8.2 i direktiv 91/414/EEG tillsammans med en förteckning över de verksamma ämnen som skall utvärderas för att eventuellt införas i bilaga I till direktiv 91/414/EEG. I denna förteckning ingår klopyralid, cyprodinil, fosetyl och trinexapak.

| (2) | Effekterna av dessa verksamma ämnen på människors hälsa och på miljön har utvärderats i enlighet med bestämmelserna i förordningarna (EG) nr 451/2000 och (EG) nr 703/2001 för ett antal av de användningsområden som har föreslagits av det anmälande företaget. I dessa förordningar utses dessutom de rapporterande medlemsstater som i enlighet med artikel 8.1 i förordning (EG) nr 451/2000 skall lämna relevanta utvärderingsrapporter och rekommendationer till Europeiska myndigheten för livsmedelssäkerhet. Finland var den rapporterande medlemsstaten för klopyralid och alla relevanta upplysningar lämnades den 2 december 2003. Frankrike var den rapporterande medlemsstaten för cyprodinil och fosetyl och alla relevanta upplysningar lämnades den 16 januari 2004 respektive den 20 oktober 2003. Nederländerna var den rapporterande medlemsstaten för trinexapak och alla relevanta upplysningar lämnades den 7 november 2003. |
| --- | --- |

(2)

Effekterna av dessa verksamma ämnen på människors hälsa och på miljön har utvärderats i enlighet med bestämmelserna i förordningarna (EG) nr 451/2000 och (EG) nr 703/2001 för ett antal av de användningsområden som har föreslagits av det anmälande företaget. I dessa förordningar utses dessutom de rapporterande medlemsstater som i enlighet med artikel 8.1 i förordning (EG) nr 451/2000 skall lämna relevanta utvärderingsrapporter och rekommendationer till Europeiska myndigheten för livsmedelssäkerhet. Finland var den rapporterande medlemsstaten för klopyralid och alla relevanta upplysningar lämnades den 2 december 2003. Frankrike var den rapporterande medlemsstaten för cyprodinil och fosetyl och alla relevanta upplysningar lämnades den 16 januari 2004 respektive den 20 oktober 2003. Nederländerna var den rapporterande medlemsstaten för trinexapak och alla relevanta upplysningar lämnades den 7 november 2003.

| (3) | Utvärderingsrapporterna har varit föremål för inbördes granskning av medlemsstaterna och Europeiska myndigheten för livsmedelssäkerhet och de lades fram för kommissionen den 14 december 2005 i form av myndighetens vetenskapliga rapporter om klopyralid, cyprodinil, fosetyl och trinexapak (4). Medlemsstaterna och kommissionen har granskat rapporterna i ständiga kommittén för livsmedelskedjan och djurhälsa, och de godkändes slutgiltigt den 4 april 2006 som kommissionens granskningsrapporter om klopyralid, cyprodinil, fosetyl och trinexapak. |
| --- | --- |

(3)

Utvärderingsrapporterna har varit föremål för inbördes granskning av medlemsstaterna och Europeiska myndigheten för livsmedelssäkerhet och de lades fram för kommissionen den 14 december 2005 i form av myndighetens vetenskapliga rapporter om klopyralid, cyprodinil, fosetyl och trinexapak (4). Medlemsstaterna och kommissionen har granskat rapporterna i ständiga kommittén för livsmedelskedjan och djurhälsa, och de godkändes slutgiltigt den 4 april 2006 som kommissionens granskningsrapporter om klopyralid, cyprodinil, fosetyl och trinexapak.

| (4) | De olika undersökningar som gjorts har visat att växtskyddsmedel som innehåller klopyralid, cyprodinil, fosetyl och trinexapak i allmänhet kan antas uppfylla kraven i artikel 5.1 a och 5.1 b i direktiv 91/414/EEG, särskilt när det gäller de användningsområden som undersökts och som beskrivs i kommissionens granskningsrapporter. Dessa verksamma ämnen bör därför införas i bilaga I så att godkännanden av de växtskyddsmedel som innehåller dessa verksamma ämnen kan meddelas i alla medlemsstater i enlighet med det direktivet. |
| --- | --- |

(4)

De olika undersökningar som gjorts har visat att växtskyddsmedel som innehåller klopyralid, cyprodinil, fosetyl och trinexapak i allmänhet kan antas uppfylla kraven i artikel 5.1 a och 5.1 b i direktiv 91/414/EEG, särskilt när det gäller de användningsområden som undersökts och som beskrivs i kommissionens granskningsrapporter. Dessa verksamma ämnen bör därför införas i bilaga I så att godkännanden av de växtskyddsmedel som innehåller dessa verksamma ämnen kan meddelas i alla medlemsstater i enlighet med det direktivet.

| (5) | Oberoende av det som anges ovan bör ytterligare uppgifter inhämtas om vissa specifika aspekter avseende klopyralid, cyprodinil and fosetyl. Enligt artikel 6.1 i direktiv 91/414/EEG kan det ställas villkor för införandet av ett ämne i bilaga I. Det är därför skäligt att kräva att klopyralid, cyprodinil och fosetyl skall genomgå ytterligare test som kan bekräfta riskbedömningen i fråga om vissa aspekter och att de anmälande företagen skall inkomma med sådana studier. |
| --- | --- |

(5)

Oberoende av det som anges ovan bör ytterligare uppgifter inhämtas om vissa specifika aspekter avseende klopyralid, cyprodinil and fosetyl. Enligt artikel 6.1 i direktiv 91/414/EEG kan det ställas villkor för införandet av ett ämne i bilaga I. Det är därför skäligt att kräva att klopyralid, cyprodinil och fosetyl skall genomgå ytterligare test som kan bekräfta riskbedömningen i fråga om vissa aspekter och att de anmälande företagen skall inkomma med sådana studier.

| (6) | Innan ett verksamt ämne förs in i bilaga I bör medlemsstaterna och berörda parter medges en rimlig tidsfrist för att anpassa sig till de nya krav som kommer att följa av införandet. |
| --- | --- |

(6)

Innan ett verksamt ämne förs in i bilaga I bör medlemsstaterna och berörda parter medges en rimlig tidsfrist för att anpassa sig till de nya krav som kommer att följa av införandet.

| (7) | Utan att det påverkar de förpliktelser som enligt direktiv 91/414/EEG följer av införandet av ett verksamt ämne i bilaga I, bör medlemsstaterna medges en tidsfrist om sex månader efter införandet för att på nytt granska befintliga godkännanden av växtskyddsmedel som innehåller klopyralid, cyprodinil, fosetyl och trinexapak i syfte att se till att kraven i direktiv 91/414/EEG är uppfyllda, särskilt kraven i artikel 13 och de relevanta villkoren i bilaga I. Medlemsstaterna bör, beroende vad som är relevant, ändra, ersätta eller återkalla befintliga godkännanden enligt bestämmelserna i direktiv 91/414/EEG. Med avvikelse från ovanstående tidsfrist bör en längre period medges för inlämnande och bedömning av den fullständiga dokumentationen i enlighet med bilaga III för varje växtskyddsmedel och för varje avsett användningsområde i överensstämmelse med de enhetliga principer som anges i direktiv 91/414/EEG. |
| --- | --- |

(7)

Utan att det påverkar de förpliktelser som enligt direktiv 91/414/EEG följer av införandet av ett verksamt ämne i bilaga I, bör medlemsstaterna medges en tidsfrist om sex månader efter införandet för att på nytt granska befintliga godkännanden av växtskyddsmedel som innehåller klopyralid, cyprodinil, fosetyl och trinexapak i syfte att se till att kraven i direktiv 91/414/EEG är uppfyllda, särskilt kraven i artikel 13 och de relevanta villkoren i bilaga I. Medlemsstaterna bör, beroende vad som är relevant, ändra, ersätta eller återkalla befintliga godkännanden enligt bestämmelserna i direktiv 91/414/EEG. Med avvikelse från ovanstående tidsfrist bör en längre period medges för inlämnande och bedömning av den fullständiga dokumentationen i enlighet med bilaga III för varje växtskyddsmedel och för varje avsett användningsområde i överensstämmelse med de enhetliga principer som anges i direktiv 91/414/EEG.

| (8) | När verksamma ämnen som utvärderats enligt kommissionens förordning (EEG) nr 3600/92 (5) tidigare har införts i bilaga I till direktiv 91/414/EEG har det visat sig att svårigheter kan uppstå vid tolkningen av de skyldigheter som innehavarna av befintliga godkännanden har när det gäller tillgången till uppgifter. För att undvika ytterligare svårigheter framstår det därför som nödvändigt att klargöra medlemsstaternas skyldigheter, särskilt den att kontrollera att innehavaren av ett godkännande kan visa att han har tillgång till dokumentation som uppfyller kraven i bilaga II till det direktivet. Detta klargörande innebär dock inte att några nya krav ställs på medlemsstaterna eller på innehavarna av godkännanden i förhållande till de direktiv som hittills har antagits om ändring av bilaga I. |
| --- | --- |

(8)

När verksamma ämnen som utvärderats enligt kommissionens förordning (EEG) nr 3600/92 (5) tidigare har införts i bilaga I till direktiv 91/414/EEG har det visat sig att svårigheter kan uppstå vid tolkningen av de skyldigheter som innehavarna av befintliga godkännanden har när det gäller tillgången till uppgifter. För att undvika ytterligare svårigheter framstår det därför som nödvändigt att klargöra medlemsstaternas skyldigheter, särskilt den att kontrollera att innehavaren av ett godkännande kan visa att han har tillgång till dokumentation som uppfyller kraven i bilaga II till det direktivet. Detta klargörande innebär dock inte att några nya krav ställs på medlemsstaterna eller på innehavarna av godkännanden i förhållande till de direktiv som hittills har antagits om ändring av bilaga I.

| (9) | Direktiv 91/414/EEG bör därför ändras i enlighet med detta. |
| --- | --- |

(9)

Direktiv 91/414/EEG bör därför ändras i enlighet med detta.

| (10) | De åtgärder som föreskrivs i detta direktiv är förenliga med yttrandet från ständiga kommittén för livsmedelskedjan och djurhälsa. |
| --- | --- |

(10)

De åtgärder som föreskrivs i detta direktiv är förenliga med yttrandet från ständiga kommittén för livsmedelskedjan och djurhälsa.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

Artikel 1

Bilaga I till direktiv 91/414/EEG skall ändras på det sätt som anges bilagan till detta direktiv.

Artikel 2

Medlemsstaterna skall senast den 31 oktober 2007 anta och offentliggöra de lagar och andra författningar som är nödvändiga för att följa detta direktiv. De skall genast överlämna texterna till dessa bestämmelser till kommissionen tillsammans med en jämförelsetabell för dessa bestämmelser och bestämmelserna i detta direktiv.

De skall tillämpa dessa bestämmelser från och med den 1 november 2007.

När en medlemsstat antar dessa bestämmelser skall de innehålla en hänvisning till detta direktiv eller åtföljas av en sådan hänvisning när de offentliggörs. Närmare föreskrifter om hur hänvisningen skall göras skall varje medlemsstat själv utfärda.

Artikel 3

1.   Om så krävs skall medlemsstaterna i enlighet med direktiv 91/414/EEG ändra eller återkalla befintliga godkännanden av växtskyddsmedel som innehåller klopyralid, cyprodinil, fosetyl och trinexapak som verksamt ämne senast den 31 oktober 2007.

Senast detta datum skall medlemsstaterna särskilt kontrollera att villkoren som rör klopyralid, cyprodinil, fosetyl och trinexapak i bilaga I till det direktivet har uppfyllts, med undantag av de krav i del B som rör detta verksamma ämne, samt att innehavaren av godkännandet har eller har tillgång till dokumentation som uppfyller kraven i bilaga II till det direktivet i enlighet med villkoren i artikel 13 i samma direktiv.

2.   Med avvikelse från vad som sägs i punkt 1 skall medlemsstaterna för varje godkänt växtskyddsmedel som innehåller klopyralid, cyprodinil, fosetyl och trinexapak antingen som enda verksamma ämne eller som ett av flera verksamma ämnen, som alla senast den 30 april 2007 förtecknats i bilaga I till direktiv 91/414/EEG, ta upp medlet till ny prövning i enlighet med de enhetliga principer som föreskrivs i bilaga VI till direktiv 91/414/EEG, på grundval av dokumentation som uppfyller kraven i bilaga III till det direktivet och med beaktande av del B i den post i samma direktivs bilaga I som rör klopyralid, cyprodinil, fosetyl respektive trinexapak. På grundval av denna prövning skall medlemsstaterna fastställa om medlet uppfyller de villkor som anges i artikel 4.1 b, c, d och e i direktiv 91/414/EEG.

Därefter skall medlemsstaterna

| a) | om en produkt innehåller klopyralid, cyprodinil, fosetyl eller trinexapak som enda verksamma ämne, om så krävs, senast den 30 april 2011 ändra eller återkalla godkännandet,
  eller |
| --- | --- |

a)

om en produkt innehåller klopyralid, cyprodinil, fosetyl eller trinexapak som enda verksamma ämne, om så krävs, senast den 30 april 2011 ändra eller återkalla godkännandet,

eller

| b) | om en produkt innehåller klopyralid, cyprodinil, fosetyl eller trinexapak som ett av flera verksamma ämnen, om så krävs, ändra eller återkalla godkännandet senast den 30 april 2011 eller senast det datum som fastställts för en sådan ändring eller ett sådant återkallande i det eller de direktiv där ämnet eller ämnena i fråga infördes i bilaga I till direktiv 91/414/EEG, beroende på vilket datum som är det senaste. |
| --- | --- |

b)

om en produkt innehåller klopyralid, cyprodinil, fosetyl eller trinexapak som ett av flera verksamma ämnen, om så krävs, ändra eller återkalla godkännandet senast den 30 april 2011 eller senast det datum som fastställts för en sådan ändring eller ett sådant återkallande i det eller de direktiv där ämnet eller ämnena i fråga infördes i bilaga I till direktiv 91/414/EEG, beroende på vilket datum som är det senaste.

Artikel 4

Detta direktiv träder i kraft den 1 maj 2007.

Artikel 5

Detta direktiv riktar sig till medlemsstaterna.

Utfärdat i Bryssel den 18 juli 2006.

På kommissionens vägnar

Markos KYPRIANOU

Ledamot av kommissionen

---

(1)  EGT L 230, 19.8.1991, s. 1. Direktivet senast ändrat genom kommissionens direktiv 2006/45/EG (EUT L 130, 18.5.2006, s. 27).

1

(2)  EGT L 55, 29.2.2000, s. 25. Förordningen senast ändrad genom förordning (EG) nr 1044/2003 (EUT L 151, 19.6.2003, s. 32).

2

(3)  EGT L 98, 7.4.2001, s. 6.

3

(4)  EFSA Scientific Report (2005) 50, 1-65, Conclusion regarding the Peer review of the pesticide risk assessment of the active substance clopyralid (färdigställd den 14 december 2005).

4

EFSA Scientific Report (2005) 51, 1-78, Conclusion regarding the Peer review of the pesticide risk assessment of the active substance cyprodinil (färdigställd den 14 december 2005).

EFSA Scientific Report (2005) 54, 1-79, Conclusion regarding the Peer review of the pesticide risk assessment of the active substance fosethyl (färdigställd den 14 december 2005).

EFSA Scientific Report (2005) 57, 1-70, Conclusion regarding the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance trinexapac (färdigställd den 14 december 2005).

(5)  EGT L 366, 15.12.1992, s. 10. Förordningen senast ändrad genom förordning (EG) nr 2266/2000 (EGT L 259, 13.10.2000, s. 27).

5

---

BILAGA

Följande post skall läggas till i slutet av tabellen i bilaga I till direktiv 91/414/EG:

| Nummer | Trivialnamn, identifika tionsnummer | Namn enligt IUPAC | Renhetsgrad (1) | Ikraftträdande | Införande till och med | Särskilda bestämmelser |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| ”131 | Klopyralid
  CAS-nr 1702-17-6
  CIPAC-nr 455 | 3,6-dikloropyridin-2-karboxylsyra | ≥ 950 g/kg | 1 maj 2007 | 30 april 2017 | DEL A
  Får endast godkännas för användning som herbicid.
  DEL B
  När medlemsstaterna bedömer ansökningar om godkännande av växtskyddsmedel som innehåller klopyralid för andra användningsområden än besprutning under våren, skall de särskilt beakta villkoren i artikel 4.1 b samt se till att alla nödvändiga uppgifter lämnats innan ett sådant godkännande meddelas.
  Vid tillämpningen av de enhetliga principerna i bilaga VI skall slutsatserna i granskningsrapporten om klopyralid beaktas, särskilt tilläggen I och II, i den form den slutgiltigt godkändes av ständiga kommittén för livsmedelskedjan och djurhälsa den 4 april 2006.
  Vid den samlade bedömningen skall medlemsstaterna särskilt beakta






  — | skyddet för växter som inte är målarter och grundvattnet under känsliga förhållanden. Villkoren för godkännande bör inbegripa riskreducerande åtgärder, och program för övervakning bör införas för att kontrollera eventuell grundvattenförorening i utsatta områden, där detta är tillämpligt. |

Nummer

Trivialnamn, identifika tionsnummer

Namn enligt IUPAC

Renhetsgrad (1)

Ikraftträdande

Införande till och med

Särskilda bestämmelser

”131

Klopyralid

CAS-nr 1702-17-6

CIPAC-nr 455

3,6-dikloropyridin-2-karboxylsyra

≥ 950 g/kg

1 maj 2007

30 april 2017

DEL A

Får endast godkännas för användning som herbicid.

DEL B

När medlemsstaterna bedömer ansökningar om godkännande av växtskyddsmedel som innehåller klopyralid för andra användningsområden än besprutning under våren, skall de särskilt beakta villkoren i artikel 4.1 b samt se till att alla nödvändiga uppgifter lämnats innan ett sådant godkännande meddelas.

Vid tillämpningen av de enhetliga principerna i bilaga VI skall slutsatserna i granskningsrapporten om klopyralid beaktas, särskilt tilläggen I och II, i den form den slutgiltigt godkändes av ständiga kommittén för livsmedelskedjan och djurhälsa den 4 april 2006.

Vid den samlade bedömningen skall medlemsstaterna särskilt beakta

—

skyddet för växter som inte är målarter och grundvattnet under känsliga förhållanden. Villkoren för godkännande bör inbegripa riskreducerande åtgärder, och program för övervakning bör införas för att kontrollera eventuell grundvattenförorening i utsatta områden, där detta är tillämpligt.

Berörda medlemsstater skall begära in ytterligare studier för att bekräfta resultaten avseende djurs ämnesomsättning. De skall se till att de anmälande företag på vars förfrågan klopyralid införts i den här bilagan inkommer med sådana studier till kommissionen senast två år efter det att det här direktivet har trätt i kraft.

132

Cyprodinil

CAS-nr 121522-61-2

CIPAC-nr 511

(4-cyklopropyl-6-metyl-pyrimidin-2-yl)-fenyl-amin

≥ 980 g/kg

1 maj 2007

30 april 2017

DEL A

Får godkännas endast för användning som fungicid.

DEL B

Vid tillämpningen av de enhetliga principerna i bilaga VI skall slutsatserna i granskningsrapporten om cyprodinil beaktas, särskilt tilläggen I och II, i den form den slutgiltigt godkändes av ständiga kommittén för livsmedelskedjan och djurhälsa den 4 april 2006.

Vid den allmänna bedömningen skall medlemsstaterna

| — | särskilt beakta användarsäkerheten och se till att det i villkoren för användning ingår föreskrifter om tillräcklig personlig skyddsutrustning, |
| --- | --- |

—

särskilt beakta användarsäkerheten och se till att det i villkoren för användning ingår föreskrifter om tillräcklig personlig skyddsutrustning,

| — | särskilt beakta skyddet för fåglar, däggdjur och vattenlevande organismer. Villkoren för godkännande skall inbegripa riskreducerande åtgärder, t.ex. buffertzoner. |
| --- | --- |

—

särskilt beakta skyddet för fåglar, däggdjur och vattenlevande organismer. Villkoren för godkännande skall inbegripa riskreducerande åtgärder, t.ex. buffertzoner.

Berörda medlemsstater skall begära in ytterligare studier för att bekräfta bedömningen av risken för fåglar och däggdjur och för eventuell förekomst av resthalter av metaboliten CGA 304075 i livsmedel av animaliskt ursprung. De skall se till att de anmälande företag på vars förfrågan cyprodinil införts i den här bilagan inkommer med sådana studier till kommissionen senast två år efter det att det här direktivet har trätt i kraft.

133

Fosetyl

CAS-nr 15845-66-6

CIPAC-nr 384

Etylvätefosfonat

≥ 960 g/kg (uttryckt som fosetylaluminium)

1 maj 2007

30 april 2017

DEL A

Får godkännas endast för användning som fungicid.

DEL B

Vid tillämpningen av de enhetliga principerna i bilaga VI skall slutsatserna i granskningsrapporten om fosetyl beaktas, särskilt tilläggen I och II, i den form den slutgiltigt godkändes av ständiga kommittén för livsmedelskedjan och djurhälsa den 4 april 2006.

Vid den allmänna bedömningen skall medlemsstaterna

| — | särskilt beakta skyddet för fåglar, däggdjur, vattenlevande organismer och leddjur som inte är målarter. |
| --- | --- |

—

särskilt beakta skyddet för fåglar, däggdjur, vattenlevande organismer och leddjur som inte är målarter.

Villkoren för godkännande skall inbegripa riskreducerande åtgärder, där detta är lämpligt, t.ex. buffertzoner.

Berörda medlemsstater skall begära in ytterligare studier som bekräftar riskbedömningen för leddjur som inte är målarter, särskilt när det gäller återhämtningen av bestånden i de besprutade områdena, och för gräsätande däggdjur. De skall se till att den sökande på vars förfrågan fosetyl införts i den här bilagan inkommer med sådana studier till kommissionen senast två år efter det att det här direktivet har trätt i kraft.

134

Trinexapak

CAS-nr 104273-73-6

CIPAC-nr 732

4-(cyklopropyl-hydroximetylen)-3,5-dioxo-cyklohexankarboxylsyra

≥ 940 g/kg (uttryckt som trinexapaketyl)

1 maj 2007

30 april 2017

DEL A

Får endast godkännas för användning som tillväxtreglerande ämne.

DEL B

Vid tillämpningen av de enhetliga principerna i bilaga VI skall slutsatserna i granskningsrapporten om trinexapak beaktas, särskilt tilläggen I och II, i den form den slutgiltigt godkändes av ständiga kommittén för livsmedelskedjan och djurhälsa den 4 april 2006.

Vid den allmänna bedömningen skall medlemsstaterna

| — | särskilt beakta skyddet för fåglar och däggdjur. |
| --- | --- |

—

särskilt beakta skyddet för fåglar och däggdjur.

Villkoren för godkännande skall vid behov inbegripa riskreducerande åtgärder.

---

(1)  En detaljerad beskrivning av varje verksamt ämne återfinns i granskningsrapporten för ämnet i fråga.”

1

---