# Euroopan unionin L 193/2012

| | ISSN 1977-0812
  doi:10.3000/19770812.L_2012.193.fin |
| --- | --- |
| Euroopan unionin
  virallinen lehti | L 193 |
| | |
| Suomenkielinen laitos | Lainsäädäntö | 55. vuosikerta20. heinäkuu 2012 |

ISSN 1977-0812

doi:10.3000/19770812.L_2012.193.fin

Euroopan unionin

virallinen lehti

L 193

Suomenkielinen laitos

Lainsäädäntö

55. vuosikerta20. heinäkuu 2012

---

| Sisältö | | II   Muut kuin lainsäätämisjärjestyksessä hyväksyttävät säädökset | Sivu |
| --- | --- | --- | --- |
| | | ASETUKSET |
| | * | Komission asetus (EU) N:o 640/2012, annettu 6 päivänä heinäkuuta 2012, testimenetelmien vahvistamisesta kemikaalien rekisteröinnistä, arvioinnista, lupamenettelyistä ja rajoituksista (REACH) annetun Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksen (EY) N:o 1907/2006 nojalla annetun asetuksen (EY) N:o 440/2008 muuttamisesta sen mukauttamiseksi tekniikan kehitykseen (
  1
  ) | 1 |

Sisältö

II   Muut kuin lainsäätämisjärjestyksessä hyväksyttävät säädökset

Sivu

ASETUKSET

*

Komission asetus (EU) N:o 640/2012, annettu 6 päivänä heinäkuuta 2012, testimenetelmien vahvistamisesta kemikaalien rekisteröinnistä, arvioinnista, lupamenettelyistä ja rajoituksista (REACH) annetun Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksen (EY) N:o 1907/2006 nojalla annetun asetuksen (EY) N:o 440/2008 muuttamisesta sen mukauttamiseksi tekniikan kehitykseen (
  1
  )

1

1

| | |
| --- | --- |
| | (1)   ETA:n kannalta merkityksellinen teksti |

---

(1)   ETA:n kannalta merkityksellinen teksti

1

| FI | Säädökset, joiden otsikot on painettu laihalla kirjasintyypillä, ovat maatalouspolitiikan alaan kuuluvia juoksevien asioiden hoitoon liityviä säädöksiä, joiden voimassaoloaika on yleensä rajoitettu.
  Kaikkien muiden säädösten otsikot on painettu lihavalla kirjasintyypillä ja merkitty tähdellä. |
| --- | --- |

FI

Säädökset, joiden otsikot on painettu laihalla kirjasintyypillä, ovat maatalouspolitiikan alaan kuuluvia juoksevien asioiden hoitoon liityviä säädöksiä, joiden voimassaoloaika on yleensä rajoitettu.

Kaikkien muiden säädösten otsikot on painettu lihavalla kirjasintyypillä ja merkitty tähdellä.

---

II Muut kuin lainsäätämisjärjestyksessä hyväksyttävät säädökset

ASETUKSET

| 20.7.2012 | FI | Euroopan unionin virallinen lehti | L 193/1 |
| --- | --- | --- | --- |

20.7.2012

FI

Euroopan unionin virallinen lehti

L 193/1

---

KOMISSION ASETUS (EU) N:o 640/2012,

annettu 6 päivänä heinäkuuta 2012,

testimenetelmien vahvistamisesta kemikaalien rekisteröinnistä, arvioinnista, lupamenettelyistä ja rajoituksista (REACH) annetun Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksen (EY) N:o 1907/2006 nojalla annetun asetuksen (EY) N:o 440/2008 muuttamisesta sen mukauttamiseksi tekniikan kehitykseen

(ETA:n kannalta merkityksellinen teksti)

EUROOPAN KOMISSIO, joka

ottaa huomioon Euroopan unionin toiminnasta tehdyn sopimuksen,

ottaa huomioon kemikaalien rekisteröinnistä, arvioinnista, lupamenettelyistä ja rajoituksista (REACH), Euroopan kemikaaliviraston perustamisesta, direktiivin 1999/45/EY muuttamisesta sekä neuvoston asetuksen (ETY) N:o 793/93, komission asetuksen (EY) N:o 1488/94, neuvoston direktiivin 76/769/ETY ja komission direktiivien 91/155/ETY, 93/67/ETY, 93/105/EY ja 2000/21/EY kumoamisesta 18 päivänä joulukuuta 2006 annetun Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksen (EY) N:o 1907/2006 (1) ja erityisesti sen 13 artiklan 3 kohdan,

sekä katsoo seuraavaa:

| (1) | Komission asetuksessa (EY) N:o 440/2008 (2) vahvistetaan asetuksen (EY) N:o 1907/2006 soveltamiseksi käytettävät testimenetelmät, joilla määritellään aineiden fysikaaliskemialliset ominaisuudet, myrkyllisyys ja myrkyllisyys ympäristölle. |
| --- | --- |

(1)

Komission asetuksessa (EY) N:o 440/2008 (2) vahvistetaan asetuksen (EY) N:o 1907/2006 soveltamiseksi käytettävät testimenetelmät, joilla määritellään aineiden fysikaaliskemialliset ominaisuudet, myrkyllisyys ja myrkyllisyys ympäristölle.

| (2) | On tarpeen muuttaa asetusta (EY) N:o 440/2008 OECD:n hiljattain hyväksymien uusien ja ajan tasalle saatettujen vaihtoehtoisten testimenetelmien sisällyttämiseksi siihen ensisijaisen tärkeänä pidettynä asiana, jotta koetarkoituksiin käytettävien eläinten määrää voitaisiin vähentää tieteellisiin tarkoituksiin käytettävien eläinten suojelusta 22 päivänä syyskuuta 2010 annetun Euroopan parlamentin ja neuvoston direktiivin 2010/63/EU (3) ja kokeisiin ja muihin tieteellisiin tarkoituksiin käytettävien eläinten suojelua koskevien jäsenvaltioiden lakien, asetusten ja hallinnollisten määräysten lähentämisestä 24 päivänä marraskuuta 1986 annetun neuvoston direktiivin 86/609/ETY (4) mukaisesti. Sidosryhmiä on kuultu tästä säädösluonnoksesta. |
| --- | --- |

(2)

On tarpeen muuttaa asetusta (EY) N:o 440/2008 OECD:n hiljattain hyväksymien uusien ja ajan tasalle saatettujen vaihtoehtoisten testimenetelmien sisällyttämiseksi siihen ensisijaisen tärkeänä pidettynä asiana, jotta koetarkoituksiin käytettävien eläinten määrää voitaisiin vähentää tieteellisiin tarkoituksiin käytettävien eläinten suojelusta 22 päivänä syyskuuta 2010 annetun Euroopan parlamentin ja neuvoston direktiivin 2010/63/EU (3) ja kokeisiin ja muihin tieteellisiin tarkoituksiin käytettävien eläinten suojelua koskevien jäsenvaltioiden lakien, asetusten ja hallinnollisten määräysten lähentämisestä 24 päivänä marraskuuta 1986 annetun neuvoston direktiivin 86/609/ETY (4) mukaisesti. Sidosryhmiä on kuultu tästä säädösluonnoksesta.

| (3) | Sen vuoksi asetusta (EY) N:o 440/2008 olisi muutettava. |
| --- | --- |

(3)

Sen vuoksi asetusta (EY) N:o 440/2008 olisi muutettava.

| (4) | Tässä asetuksessa säädetyt toimenpiteet ovat asetuksen (EY) N:o 1907/2006 133 artiklalla perustetun komitean lausunnon mukaiset, |
| --- | --- |

(4)

Tässä asetuksessa säädetyt toimenpiteet ovat asetuksen (EY) N:o 1907/2006 133 artiklalla perustetun komitean lausunnon mukaiset,

ON HYVÄKSYNYT TÄMÄN ASETUKSEN:

1 artikla

Muutetaan asetuksen (EY) N:o 440/2008 liite tämän asetuksen liitteen mukaisesti.

2 artikla

Tämä asetus tulee voimaan kolmantena päivänä sen jälkeen, kun se on julkaistu Euroopan unionin virallisessa lehdessä.

Tämä asetus on kaikilta osiltaan velvoittava, ja sitä sovelletaan sellaisenaan kaikissa jäsenvaltioissa.

Tehty Brysselissä 6 päivänä heinäkuuta 2012.

Komission puolesta

Puheenjohtaja

José MANUEL BARROSO

---

(1)  EUVL L 396, 30.12.2006, s. 1.

1

(2)  EUVL L 142, 31.5.2008, s. 1.

2

(3)  EUVL L 276, 20.10.2010, s. 33.

3

(4)  EYVL L 358, 18.12.1986, s. 1.

4

---

LIITE

Muutetaan asetuksen (EY) N:o 440/2008 liite seuraavasti:

| 1. | Korvataan B.42 luku seuraavasti:

  ”B.42.   IHOHERKISTYS: PAIKALLINEN IMUSOLMUKEMÄÄRITYSMENETELMÄ

  JOHDANTO






  1. | Kemikaalien testausta koskevia OECD:n ohjeita ja niihin perustuvia EU:n testimenetelmiä tarkistetaan säännöllisesti tieteellisen kehityksen, muuttuvien sääntelytarpeiden ja eläinten hyvinvointiin liittyvien kysymysten perusteella. Hiirten ihoherkistyksen määrittämisessä käytettävä alkuperäinen testimenetelmä, paikallinen imusolmukemääritysmenetelmä (Local Lymph Node Assay, LLNA; OECD:n testiohje 429; tämän liitteen B.42 luku), on hyväksytty aiemmin (1). LLNA-menetelmän validointia koskevat yksityiskohtaiset tiedot ja siihen liittyvien tehtävien arviointi on julkaistu (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11). Ajan tasalle saatettu LLNA perustuu kokemusten ja tieteellisten tietojen arviointiin (12). Tämä on toinen menetelmä kemikaalien (aineiden ja seosten) ihoherkistyspotentiaalin arvioimiseksi eläimillä. Toisessa testimenetelmässä (OECD:n testiohje 406; tämän liitteen B.6 luku) käytetään marsutestejä, erityisesti marsuilla tehtävää maksimointitestiä ja Bühlerin testiä (13). LLNA-menetelmä on B.6 menetelmään ja OECD:n testiohjeeseen 406 (13) verrattuna edistyneempi eläinten hyvinvoinnin kannalta. Tässä ajan tasalle saatetussa LLNA-testimenetelmässä esitetään suoritusvaatimuksia (lisäys 1), joiden avulla LLNA-menetelmää toiminnallisesti ja mekaanisesti vastaavien uusien ja/tai mukautettujen testimenetelmien validoinnin tila voidaan arvioida OECD:n ohjeasiakirjan nro 34 (14) periaatteiden mukaisesti. |
| --- | --- | --- |

1.

Korvataan B.42 luku seuraavasti:

”B.42.   IHOHERKISTYS: PAIKALLINEN IMUSOLMUKEMÄÄRITYSMENETELMÄ

JOHDANTO

1.

Kemikaalien testausta koskevia OECD:n ohjeita ja niihin perustuvia EU:n testimenetelmiä tarkistetaan säännöllisesti tieteellisen kehityksen, muuttuvien sääntelytarpeiden ja eläinten hyvinvointiin liittyvien kysymysten perusteella. Hiirten ihoherkistyksen määrittämisessä käytettävä alkuperäinen testimenetelmä, paikallinen imusolmukemääritysmenetelmä (Local Lymph Node Assay, LLNA; OECD:n testiohje 429; tämän liitteen B.42 luku), on hyväksytty aiemmin (1). LLNA-menetelmän validointia koskevat yksityiskohtaiset tiedot ja siihen liittyvien tehtävien arviointi on julkaistu (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11). Ajan tasalle saatettu LLNA perustuu kokemusten ja tieteellisten tietojen arviointiin (12). Tämä on toinen menetelmä kemikaalien (aineiden ja seosten) ihoherkistyspotentiaalin arvioimiseksi eläimillä. Toisessa testimenetelmässä (OECD:n testiohje 406; tämän liitteen B.6 luku) käytetään marsutestejä, erityisesti marsuilla tehtävää maksimointitestiä ja Bühlerin testiä (13). LLNA-menetelmä on B.6 menetelmään ja OECD:n testiohjeeseen 406 (13) verrattuna edistyneempi eläinten hyvinvoinnin kannalta. Tässä ajan tasalle saatetussa LLNA-testimenetelmässä esitetään suoritusvaatimuksia (lisäys 1), joiden avulla LLNA-menetelmää toiminnallisesti ja mekaanisesti vastaavien uusien ja/tai mukautettujen testimenetelmien validoinnin tila voidaan arvioida OECD:n ohjeasiakirjan nro 34 (14) periaatteiden mukaisesti.

| 2. | LLNA-menetelmällä tutkitaan ihoherkistyksen induktiovaihetta ja tuotetaan annosvasteen arviointiin sopivia kvantitatiivisia tuloksia. On syytä huomata, että lievää tai keskimääräistä herkistystä aiheuttavia aineita, joita suositellaan positiivisiksi kontrollikemikaaleiksi marsutestimenetelmissä (B.6; OECD:n testiohje 406) (13), voidaan käyttää myös LLNA-menetelmässä (6) (8) (15). Myös koe-eläinten vähäisempään käyttöön perustuva LLNA-menetelmän muunnos (rLLNA-menetelmä), jossa eläimiä käytetään jopa 40 prosenttia vähemmän, kuvataan vaihtoehtona tässä testimenetelmässä (16) (17) (18). rLLNA-menetelmää voidaan käyttää, jos ihoherkistyspotentiaalin ennakoitu negatiivinen löydös on sääntelysyistä vahvistettava, edellyttäen että kaikkia muita tässä testimenetelmässä kuvattuja LLNA-menettelyn vaatimuksia noudatetaan. Negatiivisen löydöksen oletuksen on perustuttava kaikkiin 4 kohdassa tarkoitettuihin saatavilla oleviin tietoihin. Ennen rLLNA-menetelmän käyttöä on sille esitettävä selvät perustelut ja tieteelliset perusteet. Jos rLLNA-menetelmällä saadaan odotusten vastaisesti positiivinen tai epäselvä tulos, löydöksen tulkitsemiseksi tai selventämiseksi voidaan tarvita täydentäviä testejä. Tätä rLLNA-menetelmää ei saa käyttää ihoherkistystesteissä käytettävien aineiden vaarallisuuden määrittämiseksi siinä tapauksessa, että vaaditaan annos-vastetietoja, kuten aineiden ja seosten luokituksesta, merkinnöistä ja pakkaamisesta annetussa asetuksessa (EY) N:o 1272/2008 ja Yhdistyneiden kansakuntien (YK) GHS-järjestelmässä (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals) määritettyä alaluokitusta. |
| --- | --- |

2.

LLNA-menetelmällä tutkitaan ihoherkistyksen induktiovaihetta ja tuotetaan annosvasteen arviointiin sopivia kvantitatiivisia tuloksia. On syytä huomata, että lievää tai keskimääräistä herkistystä aiheuttavia aineita, joita suositellaan positiivisiksi kontrollikemikaaleiksi marsutestimenetelmissä (B.6; OECD:n testiohje 406) (13), voidaan käyttää myös LLNA-menetelmässä (6) (8) (15). Myös koe-eläinten vähäisempään käyttöön perustuva LLNA-menetelmän muunnos (rLLNA-menetelmä), jossa eläimiä käytetään jopa 40 prosenttia vähemmän, kuvataan vaihtoehtona tässä testimenetelmässä (16) (17) (18). rLLNA-menetelmää voidaan käyttää, jos ihoherkistyspotentiaalin ennakoitu negatiivinen löydös on sääntelysyistä vahvistettava, edellyttäen että kaikkia muita tässä testimenetelmässä kuvattuja LLNA-menettelyn vaatimuksia noudatetaan. Negatiivisen löydöksen oletuksen on perustuttava kaikkiin 4 kohdassa tarkoitettuihin saatavilla oleviin tietoihin. Ennen rLLNA-menetelmän käyttöä on sille esitettävä selvät perustelut ja tieteelliset perusteet. Jos rLLNA-menetelmällä saadaan odotusten vastaisesti positiivinen tai epäselvä tulos, löydöksen tulkitsemiseksi tai selventämiseksi voidaan tarvita täydentäviä testejä. Tätä rLLNA-menetelmää ei saa käyttää ihoherkistystesteissä käytettävien aineiden vaarallisuuden määrittämiseksi siinä tapauksessa, että vaaditaan annos-vastetietoja, kuten aineiden ja seosten luokituksesta, merkinnöistä ja pakkaamisesta annetussa asetuksessa (EY) N:o 1272/2008 ja Yhdistyneiden kansakuntien (YK) GHS-järjestelmässä (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals) määritettyä alaluokitusta.

MÄÄRITELMÄT

| 3. | Sovellettavat määritelmät esitetään lisäyksessä 2. |
| --- | --- |

3.

Sovellettavat määritelmät esitetään lisäyksessä 2.

JOHDANTO JA RAJOITUKSET

| 4. | LLNA on vaihtoehtoinen menetelmä ihoa herkistävien kemikaalien tunnistamiseksi. Tämä ei välttämättä merkitse sitä, että LLNA-menetelmää pitäisi käyttää kaikissa tapauksissa marsutestin asemesta (B.6; OECD:n testiohje 406) (13), vaan pikemminkin sitä, että menetelmä on yhtä hyvä ja sitä voidaan käyttää vaihtoehtona, jossa positiivisia ja negatiivisia tuloksia ei yleensä enää tarvitse varmistaa uudelleen. Testilaboratorion on otettava huomioon kaikki testiaineesta saatavilla olevat tiedot ennen tutkimuksen tekemistä. Tällaisia tietoja ovat muun muassa testiaineen tunnistetiedot ja kemiallinen rakenne, sen fysikaaliskemialliset ominaisuudet, muiden testiaineella tehtyjen in vitro- tai in vivo -myrkyllisyystestien tulokset sekä rakenteellisesti samankaltaisten kemikaalien toksikologiset tiedot. Tietojen perusteella on määritettävä, voidaanko LLNA-menetelmää käyttää kyseisen aineen testaamiseen (ottaen huomioon, että LLNA-menetelmä ei sovellu tiettyjen kemikaalityyppien testaamiseen – katso 1 kohta) ja mitä annosta on käytettävä. |
| --- | --- |

4.

LLNA on vaihtoehtoinen menetelmä ihoa herkistävien kemikaalien tunnistamiseksi. Tämä ei välttämättä merkitse sitä, että LLNA-menetelmää pitäisi käyttää kaikissa tapauksissa marsutestin asemesta (B.6; OECD:n testiohje 406) (13), vaan pikemminkin sitä, että menetelmä on yhtä hyvä ja sitä voidaan käyttää vaihtoehtona, jossa positiivisia ja negatiivisia tuloksia ei yleensä enää tarvitse varmistaa uudelleen. Testilaboratorion on otettava huomioon kaikki testiaineesta saatavilla olevat tiedot ennen tutkimuksen tekemistä. Tällaisia tietoja ovat muun muassa testiaineen tunnistetiedot ja kemiallinen rakenne, sen fysikaaliskemialliset ominaisuudet, muiden testiaineella tehtyjen in vitro- tai in vivo -myrkyllisyystestien tulokset sekä rakenteellisesti samankaltaisten kemikaalien toksikologiset tiedot. Tietojen perusteella on määritettävä, voidaanko LLNA-menetelmää käyttää kyseisen aineen testaamiseen (ottaen huomioon, että LLNA-menetelmä ei sovellu tiettyjen kemikaalityyppien testaamiseen – katso 1 kohta) ja mitä annosta on käytettävä.

| 5. | LLNA on in vivo -menetelmä, joten sitä käytettäessä ei lopeteta koe-eläinten käyttöä kosketusherkistyksen arvioinnissa. Sitä käytettäessä voidaan kuitenkin vähentää tähän tarkoitukseen tarvittavien eläinten määrää. LLNA-menetelmässä käytetty tapa testata kosketusherkistystä eläimillä on myös huomattavasti aikaisempia edistyneempi (vähemmän kipua ja kärsimystä). LLNA-menetelmän perustana on kemikaalien aiheuttamien immunologisten tapahtumien tarkastelu ihoherkistyksen induktiovaiheen aikana. Marsutesteistä (B.6; OECD:n testiohje 406) (13) poiketen LLNA-menetelmässä ei edellytetä tarkoituksellista ihon yliherkkyysreaktioiden tuottamista. LLNA-menetelmä ei myöskään edellytä adjuvantin käyttöä, toisin kuin marsuilla tehtävä maksimointitesti (13). Lena-menetelmään siis liittyy vähemmän eläinten kipua ja kärsimystä. Vaikka LLNA-menetelmä onkin B.6 menetelmään ja OECD:n testiohjeeseen 406 verrattuna edistyneempi, on syytä huomata, että siihen liittyy tiettyjä rajoituksia, joiden vuoksi voi olla tarpeen käyttää B.6 menetelmää tai OECD:n testiohjetta 406 (13) (väärät negatiiviset löydökset LLNA-menetelmällä joidenkin metallien osalta, väärät positiiviset löydökset joidenkin ihoa ärsyttävien aineiden, esimerkiksi pinta-aktiivisten kemikaalien, osalta (19) (20) tai testiaineen liukoisuus). Määritystä häiritseviä (21) funktionaalisia ryhmiä sisältävien kemikaaliluokkien tai aineiden yhteydessä voi olla tarpeen käyttää marsutestejä (B.6 menetelmä; OECD:n testiohje 406) (13). Pääasiassa torjunta-aineformulaatioita sisältävän suppean validointitietokannan perusteella LLNA-menetelmällä saadaan tämäntyyppisistä testiaineista (22) marsutestiä todennäköisemmin positiivinen tulos. Formulaatioita testattaessa on kuitenkin tarvittaessa otettava vertailuaineeksi tunnettuja tuloksia antavia aineita sen osoittamiseksi, että LLNA-menetelmä toimii asianmukaisesti (katso 16 kohta). Tällaisia tunnettuja rajoituksia lukuun ottamatta LLNA-menetelmällä olisi pystyttävä testaamaan mitä tahansa ainetta, elleivät kyseisten aineiden ominaisuudet vaikuta LLNA-menetelmän tarkkuuteen. |
| --- | --- |

5.

LLNA on in vivo -menetelmä, joten sitä käytettäessä ei lopeteta koe-eläinten käyttöä kosketusherkistyksen arvioinnissa. Sitä käytettäessä voidaan kuitenkin vähentää tähän tarkoitukseen tarvittavien eläinten määrää. LLNA-menetelmässä käytetty tapa testata kosketusherkistystä eläimillä on myös huomattavasti aikaisempia edistyneempi (vähemmän kipua ja kärsimystä). LLNA-menetelmän perustana on kemikaalien aiheuttamien immunologisten tapahtumien tarkastelu ihoherkistyksen induktiovaiheen aikana. Marsutesteistä (B.6; OECD:n testiohje 406) (13) poiketen LLNA-menetelmässä ei edellytetä tarkoituksellista ihon yliherkkyysreaktioiden tuottamista. LLNA-menetelmä ei myöskään edellytä adjuvantin käyttöä, toisin kuin marsuilla tehtävä maksimointitesti (13). Lena-menetelmään siis liittyy vähemmän eläinten kipua ja kärsimystä. Vaikka LLNA-menetelmä onkin B.6 menetelmään ja OECD:n testiohjeeseen 406 verrattuna edistyneempi, on syytä huomata, että siihen liittyy tiettyjä rajoituksia, joiden vuoksi voi olla tarpeen käyttää B.6 menetelmää tai OECD:n testiohjetta 406 (13) (väärät negatiiviset löydökset LLNA-menetelmällä joidenkin metallien osalta, väärät positiiviset löydökset joidenkin ihoa ärsyttävien aineiden, esimerkiksi pinta-aktiivisten kemikaalien, osalta (19) (20) tai testiaineen liukoisuus). Määritystä häiritseviä (21) funktionaalisia ryhmiä sisältävien kemikaaliluokkien tai aineiden yhteydessä voi olla tarpeen käyttää marsutestejä (B.6 menetelmä; OECD:n testiohje 406) (13). Pääasiassa torjunta-aineformulaatioita sisältävän suppean validointitietokannan perusteella LLNA-menetelmällä saadaan tämäntyyppisistä testiaineista (22) marsutestiä todennäköisemmin positiivinen tulos. Formulaatioita testattaessa on kuitenkin tarvittaessa otettava vertailuaineeksi tunnettuja tuloksia antavia aineita sen osoittamiseksi, että LLNA-menetelmä toimii asianmukaisesti (katso 16 kohta). Tällaisia tunnettuja rajoituksia lukuun ottamatta LLNA-menetelmällä olisi pystyttävä testaamaan mitä tahansa ainetta, elleivät kyseisten aineiden ominaisuudet vaikuta LLNA-menetelmän tarkkuuteen.

TESTIN PERIAATE

| 6. | LLNA-menetelmän perusperiaate on, että ihoa herkistävät aineet aiheuttavat lymfosyyttien proliferaatiota imusolmukkeissa, jotka dreneeraavat alueen, jonne testiaine on annosteltu. Tämä proliferaatio on suhteessa allergeenin annokseen ja potenssiin ja tarjoaa yksinkertaisen keinon ihoherkistyksen mittaamiseksi kvantitatiivisella tavalla. Proliferaatio mitataan vertaamalla kussakin testiryhmässä tapahtuvaa keskimääräistä proliferaatiota kantaja-aineella käsitellyssä kontrolliryhmässä tapahtuvaan keskimääräiseen proliferaatioon. Kunkin käsitellyn ryhmän keskimääräisen proliferaation ja sitä vastaavan kantaja-aineella käsitellyn ryhmän keskimääräisen proliferaation suhde (stimulaatioindeksi, SI) määritetään, ja sen on oltava vähintään 3, ennen kuin testiaine voidaan arvioida mahdollisesti ihoherkistystä aiheuttavaksi. Tässä kuvatut menetelmät perustuvat korvalehden dreneeraavien imusolmukkeiden solujen proliferaation mittaamiseen radioaktiivisen in vivo -merkkiaineen avulla. Solujen proliferaation arvioimiseksi voidaan kuitenkin käyttää myös muita päätepisteitä edellyttäen, että suoritusvaatimukset täytetään (lisäys 1). |
| --- | --- |

6.

LLNA-menetelmän perusperiaate on, että ihoa herkistävät aineet aiheuttavat lymfosyyttien proliferaatiota imusolmukkeissa, jotka dreneeraavat alueen, jonne testiaine on annosteltu. Tämä proliferaatio on suhteessa allergeenin annokseen ja potenssiin ja tarjoaa yksinkertaisen keinon ihoherkistyksen mittaamiseksi kvantitatiivisella tavalla. Proliferaatio mitataan vertaamalla kussakin testiryhmässä tapahtuvaa keskimääräistä proliferaatiota kantaja-aineella käsitellyssä kontrolliryhmässä tapahtuvaan keskimääräiseen proliferaatioon. Kunkin käsitellyn ryhmän keskimääräisen proliferaation ja sitä vastaavan kantaja-aineella käsitellyn ryhmän keskimääräisen proliferaation suhde (stimulaatioindeksi, SI) määritetään, ja sen on oltava vähintään 3, ennen kuin testiaine voidaan arvioida mahdollisesti ihoherkistystä aiheuttavaksi. Tässä kuvatut menetelmät perustuvat korvalehden dreneeraavien imusolmukkeiden solujen proliferaation mittaamiseen radioaktiivisen in vivo -merkkiaineen avulla. Solujen proliferaation arvioimiseksi voidaan kuitenkin käyttää myös muita päätepisteitä edellyttäen, että suoritusvaatimukset täytetään (lisäys 1).

MÄÄRITYSMENETELMÄN KUVAUS

Eläinlajin valinta

| 7. | Paras eläinlaji tähän testiin on hiiri. Testissä käytetään nuoria täysikasvuisia CBA/Ca- tai CBA/J-kannan naarashiiriä, jotka eivät ole synnyttäneet eivätkä ole raskaana. Testin alussa eläinten on oltava 8–12 viikon ikäisiä, ja eläinten painoerojen on oltava vähäisiä eli enintään 20 prosenttia keskipainosta. Muita kantoja tai uroseläimiä voidaan käyttää, jos tietoja tuotetaan riittävästi sen osoittamiseksi, että LLNA-vasteessa ei esiinny merkitseviä koe-eläinkantaan tai sukupuoleen liittyviä eroja. |
| --- | --- |

7.

Paras eläinlaji tähän testiin on hiiri. Testissä käytetään nuoria täysikasvuisia CBA/Ca- tai CBA/J-kannan naarashiiriä, jotka eivät ole synnyttäneet eivätkä ole raskaana. Testin alussa eläinten on oltava 8–12 viikon ikäisiä, ja eläinten painoerojen on oltava vähäisiä eli enintään 20 prosenttia keskipainosta. Muita kantoja tai uroseläimiä voidaan käyttää, jos tietoja tuotetaan riittävästi sen osoittamiseksi, että LLNA-vasteessa ei esiinny merkitseviä koe-eläinkantaan tai sukupuoleen liittyviä eroja.

Koe-eläintilat ja eläinten ruokinta

| 8. | Hiiret on pidettävä samoissa häkeissä (23), ellei hiirien pitämiselle erillisissä häkeissä esitetä riittäviä tieteellisiä perusteluja. Koe-eläintilan lämpötilan on oltava 22 ± 3 celsiusastetta. Vaikka riittää, että suhteellinen kosteus on vähintään 30 prosenttia eikä mielellään ylitä 70 prosenttia muulloin kuin huoneen puhdistuksen aikana, on kuitenkin pyrittävä 50–60 prosentin suhteelliseen kosteuteen. Huoneessa on käytettävä keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa, 12 tuntia pimeää). Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruokavaliota, eikä juomaveden määrää saa rajoittaa. |
| --- | --- |

8.

Hiiret on pidettävä samoissa häkeissä (23), ellei hiirien pitämiselle erillisissä häkeissä esitetä riittäviä tieteellisiä perusteluja. Koe-eläintilan lämpötilan on oltava 22 ± 3 celsiusastetta. Vaikka riittää, että suhteellinen kosteus on vähintään 30 prosenttia eikä mielellään ylitä 70 prosenttia muulloin kuin huoneen puhdistuksen aikana, on kuitenkin pyrittävä 50–60 prosentin suhteelliseen kosteuteen. Huoneessa on käytettävä keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa, 12 tuntia pimeää). Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruokavaliota, eikä juomaveden määrää saa rajoittaa.

Eläinten valmistelu

| 9. | Eläimet valitaan satunnaistetusti, merkitään niin, että yksilöt voidaan erottaa toisistaan (ei kuitenkaan korvamerkeillä), ja pidetään häkeissä vähintään viiden päivän ajan ennen testiaineen annostelun aloittamista, jotta ne tottuvat laboratorio-olosuhteisiin. Ennen käsittelyn alkua kaikki eläimet on tutkittava sen varmistamiseksi, ettei niillä ole havaittavia ihovaurioita. |
| --- | --- |

9.

Eläimet valitaan satunnaistetusti, merkitään niin, että yksilöt voidaan erottaa toisistaan (ei kuitenkaan korvamerkeillä), ja pidetään häkeissä vähintään viiden päivän ajan ennen testiaineen annostelun aloittamista, jotta ne tottuvat laboratorio-olosuhteisiin. Ennen käsittelyn alkua kaikki eläimet on tutkittava sen varmistamiseksi, ettei niillä ole havaittavia ihovaurioita.

Annosteluliuosten valmistelu

| 10. | Kiinteät kemikaalit on liuotettava tai sekoitettava liuottimiin tai kantaja-aineisiin ja tarvittaessa laimennettava ennen niiden annostelua hiiren korvaan. Nestemäiset kemikaalit voidaan annostella laimentamattomana tai ennen annostelua laimennettuina. Vaikealiukoisia kemikaaleja, kuten sellaisia, joita käytetään yleisesti lääkinnällisissä laitteissa, olisi uutettava erityisen voimakkaasti asianmukaisessa liuottimessa, jotta saataisiin testausta varten esiin kaikki uuttuvat ainesosat ennen annostelua hiirten korviin. Testiaineet on valmistettava päivittäin, paitsi jos säilyvyys on osoitettu stabiliteettitutkimuksilla. |
| --- | --- |

10.

Kiinteät kemikaalit on liuotettava tai sekoitettava liuottimiin tai kantaja-aineisiin ja tarvittaessa laimennettava ennen niiden annostelua hiiren korvaan. Nestemäiset kemikaalit voidaan annostella laimentamattomana tai ennen annostelua laimennettuina. Vaikealiukoisia kemikaaleja, kuten sellaisia, joita käytetään yleisesti lääkinnällisissä laitteissa, olisi uutettava erityisen voimakkaasti asianmukaisessa liuottimessa, jotta saataisiin testausta varten esiin kaikki uuttuvat ainesosat ennen annostelua hiirten korviin. Testiaineet on valmistettava päivittäin, paitsi jos säilyvyys on osoitettu stabiliteettitutkimuksilla.

Testin luotettavuuden tarkistus

| 11. | Määritysmenetelmän toimivuus osoitetaan positiivisten kontrollikemikaalien avulla. Niillä on testissä saatava aikaan riittävä ja toistettavissa oleva herkistyminen, ja vasteen voimakkuuden on oltava aineelle tyypillinen. Positiivisen kontrollikemikaalin käyttöä samanaikaisesti suositellaan, koska sillä osoitetaan, että laboratoriolla on riittävä pätevyys kunkin määritysmenetelmän toteuttamiseksi, ja sen avulla voidaan arvioida laboratorioiden sisäistä ja laboratorioiden välistä uusittavuutta ja vertailtavuutta. Myös tietyt sääntelyviranomaiset vaativat positiivisen kontrollikemikaalin käyttöä jokaisessa määrityksessä, ja käyttäjiä kehotetaankin ottamaan yhteyttä asiasta vastaaviin viranomaisiin ennen LLNA-menetelmän toteuttamista. Tämän takia suositellaan, että positiivista kontrollikemikaalia käytetään säännönmukaisesti kaikissa määrityksissä, jotta positiivisen kontrollikemikaalin satunnaisesta käytöstä mahdollisesti johtuvien vaatimusten täyttämiseksi ei tarvitsisi tehdä uusia eläinkokeita (katso 9 kohta). Positiivisen kontrollikemikaalin on tuotettava positiivinen LLNA-vaste altistustasolla, jonka odotetaan antavan stimulaatioindeksin (SI), joka on suurempi kuin 3, negatiiviseen kontrolliryhmään verrattuna. Positiivisen kontrollikemikaalin annostaso on valittava siten, että se ei aiheuta liian voimakasta ihoärsytystä tai koko elimistöön kohdistuvaa toksisuutta ja että induktio on toistettavissa mutta ei liian suuri (esimerkiksi SI > 20 on liian suuri). Suositeltavia positiivisia kontrollikemikaaleja ovat 25-prosenttinen heksyylikanelialdehydi (CAS-numero 101-86-0) asetonin ja oliiviöljyn seoksessa (4:1 v/v) ja 5-prosenttinen merkaptobentsotiatsoli (CAS-numero 149-30-4) N,N-dimetyyliformamidissä (katso lisäyksen 1 taulukko 1). Joissakin olosuhteissa voidaan riittävin perustein käyttää muita positiivisia kontrollikemikaaleja, jotka täyttävät edellä mainitut kriteerit. |
| --- | --- |

11.

Määritysmenetelmän toimivuus osoitetaan positiivisten kontrollikemikaalien avulla. Niillä on testissä saatava aikaan riittävä ja toistettavissa oleva herkistyminen, ja vasteen voimakkuuden on oltava aineelle tyypillinen. Positiivisen kontrollikemikaalin käyttöä samanaikaisesti suositellaan, koska sillä osoitetaan, että laboratoriolla on riittävä pätevyys kunkin määritysmenetelmän toteuttamiseksi, ja sen avulla voidaan arvioida laboratorioiden sisäistä ja laboratorioiden välistä uusittavuutta ja vertailtavuutta. Myös tietyt sääntelyviranomaiset vaativat positiivisen kontrollikemikaalin käyttöä jokaisessa määrityksessä, ja käyttäjiä kehotetaankin ottamaan yhteyttä asiasta vastaaviin viranomaisiin ennen LLNA-menetelmän toteuttamista. Tämän takia suositellaan, että positiivista kontrollikemikaalia käytetään säännönmukaisesti kaikissa määrityksissä, jotta positiivisen kontrollikemikaalin satunnaisesta käytöstä mahdollisesti johtuvien vaatimusten täyttämiseksi ei tarvitsisi tehdä uusia eläinkokeita (katso 9 kohta). Positiivisen kontrollikemikaalin on tuotettava positiivinen LLNA-vaste altistustasolla, jonka odotetaan antavan stimulaatioindeksin (SI), joka on suurempi kuin 3, negatiiviseen kontrolliryhmään verrattuna. Positiivisen kontrollikemikaalin annostaso on valittava siten, että se ei aiheuta liian voimakasta ihoärsytystä tai koko elimistöön kohdistuvaa toksisuutta ja että induktio on toistettavissa mutta ei liian suuri (esimerkiksi SI > 20 on liian suuri). Suositeltavia positiivisia kontrollikemikaaleja ovat 25-prosenttinen heksyylikanelialdehydi (CAS-numero 101-86-0) asetonin ja oliiviöljyn seoksessa (4:1 v/v) ja 5-prosenttinen merkaptobentsotiatsoli (CAS-numero 149-30-4) N,N-dimetyyliformamidissä (katso lisäyksen 1 taulukko 1). Joissakin olosuhteissa voidaan riittävin perustein käyttää muita positiivisia kontrollikemikaaleja, jotka täyttävät edellä mainitut kriteerit.

| 12. | Vaikka positiivisen kontrolliryhmän käyttöä suositellaan aina, joissakin tapauksissa positiivisen kontrollikemikaalin testaus vain ajoittain (enintään kuuden kuukauden välein) voi riittää LLNA-menetelmää säännöllisesti käyttävissä laboratorioissa (eli sellaisissa, jotka tekevät LLNA-määritystä vähintään kerran kuukaudessa) ja joilla on aiempia positiivisen kontrollikemikaalin määritystietoja, jotka osoittavat laboratorion valmiuden saada aikaan uusittavissa olevia ja täsmällisiä tuloksia positiivisilla kontrollikemikaaleilla. Riittävä LLNA-menetelmää koskeva pätevyys voidaan osoittaa tuottamalla positiivisella kontrollikemikaalilla toistuvasti samantasoisia positiivisia tuloksia vähintään kymmenessä riippumattomassa testissä kohtuullisen ajan kuluessa (alle yhden vuoden aikana). |
| --- | --- |

12.

Vaikka positiivisen kontrolliryhmän käyttöä suositellaan aina, joissakin tapauksissa positiivisen kontrollikemikaalin testaus vain ajoittain (enintään kuuden kuukauden välein) voi riittää LLNA-menetelmää säännöllisesti käyttävissä laboratorioissa (eli sellaisissa, jotka tekevät LLNA-määritystä vähintään kerran kuukaudessa) ja joilla on aiempia positiivisen kontrollikemikaalin määritystietoja, jotka osoittavat laboratorion valmiuden saada aikaan uusittavissa olevia ja täsmällisiä tuloksia positiivisilla kontrollikemikaaleilla. Riittävä LLNA-menetelmää koskeva pätevyys voidaan osoittaa tuottamalla positiivisella kontrollikemikaalilla toistuvasti samantasoisia positiivisia tuloksia vähintään kymmenessä riippumattomassa testissä kohtuullisen ajan kuluessa (alle yhden vuoden aikana).

| 13. | Samaan aikaan tehtyä positiivista kontrollikemikaalia on käytettävä aina, kun LLNA-menetelmää muutetaan (esimerkiksi kun koulutettu henkilökunta vaihtuu, testimenetelmän materiaalit ja/tai reagenssit vaihtuvat, testimenetelmässä käytettävät laitteet vaihtuvat tai koe-eläinten alkuperä vaihtuu), ja tällaiset muutokset on kirjattava laboratorioraportteihin. Muutosten vaikutusta aiempien määritystietojen asianmukaisuuteen on tarkasteltava päätettäessä, onko uusien määritystietojen kerääminen tarpeen positiivisen kontrollikemikaalin tulosten yhdenmukaisuuden osoittamiseksi. |
| --- | --- |

13.

Samaan aikaan tehtyä positiivista kontrollikemikaalia on käytettävä aina, kun LLNA-menetelmää muutetaan (esimerkiksi kun koulutettu henkilökunta vaihtuu, testimenetelmän materiaalit ja/tai reagenssit vaihtuvat, testimenetelmässä käytettävät laitteet vaihtuvat tai koe-eläinten alkuperä vaihtuu), ja tällaiset muutokset on kirjattava laboratorioraportteihin. Muutosten vaikutusta aiempien määritystietojen asianmukaisuuteen on tarkasteltava päätettäessä, onko uusien määritystietojen kerääminen tarpeen positiivisen kontrollikemikaalin tulosten yhdenmukaisuuden osoittamiseksi.

| 14. | Tutkijoiden on otettava huomioon, että jos positiivista kontrollikemikaalia ei määritetä joka kerralla vaan vain silloin tällöin, saattaa negatiivisten tutkimustulosten asianmukaisuus ja hyväksyttävyys vaarantua, kun ajoittain tehtyjen positiivisen kontrollikemikaalin määritysten välillä ei tehdä positiivisen kontrollikemikaalin määritystä samanaikaisesti. Jos esimerkiksi ajoittaisesta positiivisen kontrollikemikaalin määrityksestä saadaan väärä negatiivinen tulos, positiivisen kontrollikemikaalin viimeisen hyväksytyn ajoittaisen määrityksen ja positiivisen kontrollikemikaalin hylätyn ajoittaisen määrityksen tuloksen välisenä aikana saadut testiaineen negatiiviset tulokset voivat olla kyseenalaisia. Näiden tulosten seurauksia on tarkasteltava huolellisesti päätettäessä positiivisten kontrollikemikaalien käyttämisestä testiaineen rinnalla tai vain ajoittain. Lisäksi olisi harkittava, että testiaineen rinnalla käytettävää positiivista kontrolliryhmää varten käytettäisiin vähemmän eläimiä, jos se on tieteellisesti perusteltua ja jos laboratorio osoittaa laboratoriokohtaisten aiempien tietojen perusteella, että käytettävien hiirten määrää voidaan vähentää (12). |
| --- | --- |

14.

Tutkijoiden on otettava huomioon, että jos positiivista kontrollikemikaalia ei määritetä joka kerralla vaan vain silloin tällöin, saattaa negatiivisten tutkimustulosten asianmukaisuus ja hyväksyttävyys vaarantua, kun ajoittain tehtyjen positiivisen kontrollikemikaalin määritysten välillä ei tehdä positiivisen kontrollikemikaalin määritystä samanaikaisesti. Jos esimerkiksi ajoittaisesta positiivisen kontrollikemikaalin määrityksestä saadaan väärä negatiivinen tulos, positiivisen kontrollikemikaalin viimeisen hyväksytyn ajoittaisen määrityksen ja positiivisen kontrollikemikaalin hylätyn ajoittaisen määrityksen tuloksen välisenä aikana saadut testiaineen negatiiviset tulokset voivat olla kyseenalaisia. Näiden tulosten seurauksia on tarkasteltava huolellisesti päätettäessä positiivisten kontrollikemikaalien käyttämisestä testiaineen rinnalla tai vain ajoittain. Lisäksi olisi harkittava, että testiaineen rinnalla käytettävää positiivista kontrolliryhmää varten käytettäisiin vähemmän eläimiä, jos se on tieteellisesti perusteltua ja jos laboratorio osoittaa laboratoriokohtaisten aiempien tietojen perusteella, että käytettävien hiirten määrää voidaan vähentää (12).

| 15. | Vaikka positiiviset kontrollikemikaalit on testattava kantaja-aineessa, jonka tiedetään antavan aina samanlaisen vasteen (esimerkiksi asetoni:oliiviöljy, 4:1 v/v), joissakin tapauksissa testaus saattaa sääntelysyistä olla tarpeen myös muussa kuin standardikantaja-aineessa (kliinisesti/kemiallisesti relevantissa aineessa) (24). Jos samanaikaisesti määritettävää positiivista kontrollikemikaalia testataan eri kantaja-aineessa kuin testiainetta, on sitä varten käytettävä erillistä kantaja-aineella käsiteltyä positiivista kontrollia. |
| --- | --- |

15.

Vaikka positiiviset kontrollikemikaalit on testattava kantaja-aineessa, jonka tiedetään antavan aina samanlaisen vasteen (esimerkiksi asetoni:oliiviöljy, 4:1 v/v), joissakin tapauksissa testaus saattaa sääntelysyistä olla tarpeen myös muussa kuin standardikantaja-aineessa (kliinisesti/kemiallisesti relevantissa aineessa) (24). Jos samanaikaisesti määritettävää positiivista kontrollikemikaalia testataan eri kantaja-aineessa kuin testiainetta, on sitä varten käytettävä erillistä kantaja-aineella käsiteltyä positiivista kontrollia.

| 16. | Arvioitaessa tiettyyn kemikaaliluokkaan kuuluvia tai tietyn vastetason aikaansaavia testiaineita voidaan myös käyttää vertailuaineita sen osoittamiseksi, että testimenetelmällä voidaan asianmukaisesti havaita tämäntyyppisten testiaineiden ihoherkistyspotentiaali. Vertailuaineilla olisi oltava seuraavat ominaisuudet:






  — | rakenteellinen ja funktionaalinen vastaavuus testattavana olevaan testiaineluokkaan verrattuna |
| --- | --- | --- |

16.

Arvioitaessa tiettyyn kemikaaliluokkaan kuuluvia tai tietyn vastetason aikaansaavia testiaineita voidaan myös käyttää vertailuaineita sen osoittamiseksi, että testimenetelmällä voidaan asianmukaisesti havaita tämäntyyppisten testiaineiden ihoherkistyspotentiaali. Vertailuaineilla olisi oltava seuraavat ominaisuudet:

—

rakenteellinen ja funktionaalinen vastaavuus testattavana olevaan testiaineluokkaan verrattuna

| — | tunnetut fyysiset/kemialliset ominaisuudet |
| --- | --- |

—

tunnetut fyysiset/kemialliset ominaisuudet

| — | sopivuutta tukevia LLNA-menetelmästä saatuja tietoja |
| --- | --- |

—

sopivuutta tukevia LLNA-menetelmästä saatuja tietoja

| — | sopivuutta tukevia muista eläinmalleista ja/tai ihmisistä saatuja tietoja. |
| --- | --- |

—

sopivuutta tukevia muista eläinmalleista ja/tai ihmisistä saatuja tietoja.

TESTIMENETTELY

Koe-eläinten määrä ja annostasot

| 17. | Kussakin annostasoryhmässä on oltava vähintään neljä eläintä, ja testiaineesta on käytettävä vähintään kolmea konsentraatiota; lisäksi käytetään aina negatiivista kontrolliryhmää, joka käsitellään vain testiaineen kantaja-aineella, sekä positiivista kontrolliryhmää (jota käytetään aina tai jota on käytetty hiljattain, laboratorion toimintatavan mukaisesti, ottaen huomioon 11–14 kohdat). Positiivisesta kontrolliryhmästä on tarvittaessa testattava useita annoksia, etenkin jos positiivista kontrollikemikaalia testataan epäsäännöllisesti. Kontrolliryhmän eläimiä on kohdeltava samalla tavoin kuin testiryhmän eläimiä, paitsi että niitä ei käsitellä testiaineella. |
| --- | --- |

17.

Kussakin annostasoryhmässä on oltava vähintään neljä eläintä, ja testiaineesta on käytettävä vähintään kolmea konsentraatiota; lisäksi käytetään aina negatiivista kontrolliryhmää, joka käsitellään vain testiaineen kantaja-aineella, sekä positiivista kontrolliryhmää (jota käytetään aina tai jota on käytetty hiljattain, laboratorion toimintatavan mukaisesti, ottaen huomioon 11–14 kohdat). Positiivisesta kontrolliryhmästä on tarvittaessa testattava useita annoksia, etenkin jos positiivista kontrollikemikaalia testataan epäsäännöllisesti. Kontrolliryhmän eläimiä on kohdeltava samalla tavoin kuin testiryhmän eläimiä, paitsi että niitä ei käsitellä testiaineella.

| 18. | Annostason ja kantaja-aineen valinnan on perustuttava lähteissä (3) ja (5) esitettyihin suosituksiin. Yleensä valitaan sopivasta konsentraatiosarjasta, esimerkiksi sarjasta 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % jne. peräkkäisiä konsentraatioita. Käytettävälle konsentraatiosarjalle on esitettävä asianmukaiset tieteelliset perustelut. Kaikki käytettävissä olevat toksikologiset tiedot (esimerkiksi akuutti toksisuus ja ihoärsytys) ja rakenteelliset ja fysikaaliskemialliset tiedot kyseisestä testiaineesta (ja/tai rakenteellisesti vastaavista aineista) on tarvittaessa otettava huomioon kolmen peräkkäisen konsentraation valinnassa siten, että suurin konsentraatio edustaa maksimialtistusta, mutta kuitenkin niin, että vältetään koko elimistöön kohdistuva toksisuus ja/tai liian voimakas paikallinen ihoärsytys (3) (25). Jos tällaisia tietoja ei ole käytettävissä, voi olla tarpeen tehdä alustava kartoitustesti (katso 21–24 kohta). |
| --- | --- |

18.

Annostason ja kantaja-aineen valinnan on perustuttava lähteissä (3) ja (5) esitettyihin suosituksiin. Yleensä valitaan sopivasta konsentraatiosarjasta, esimerkiksi sarjasta 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % jne. peräkkäisiä konsentraatioita. Käytettävälle konsentraatiosarjalle on esitettävä asianmukaiset tieteelliset perustelut. Kaikki käytettävissä olevat toksikologiset tiedot (esimerkiksi akuutti toksisuus ja ihoärsytys) ja rakenteelliset ja fysikaaliskemialliset tiedot kyseisestä testiaineesta (ja/tai rakenteellisesti vastaavista aineista) on tarvittaessa otettava huomioon kolmen peräkkäisen konsentraation valinnassa siten, että suurin konsentraatio edustaa maksimialtistusta, mutta kuitenkin niin, että vältetään koko elimistöön kohdistuva toksisuus ja/tai liian voimakas paikallinen ihoärsytys (3) (25). Jos tällaisia tietoja ei ole käytettävissä, voi olla tarpeen tehdä alustava kartoitustesti (katso 21–24 kohta).

| 19. | Kantaja-aine ei saa vaikuttaa testituloksiin tai vääristää niitä, ja se on valittava siten, että testiaineen annosteluun sopivan liuoksen/suspension aikaan saannissa varmistetaan suurin mahdollinen liukoisuus ja konsentraatio. Suositeltavia kantaja-aineita ovat asetoni:oliiviöljy (4:1 v/v), N,N-dimetyyliformamidi, metyylietyyliketoni, propyleeniglykoli ja dimetyylisulfoksidi (19), mutta muitakin kantaja-aineita voidaan käyttää riittävin tieteellisin perustein. Joissakin tilanteissa voi olla tarpeen käyttää lisäkontrolliaineena kliinisesti perusteltua liuotinta tai sitä kaupallista valmistetta, jona testiainetta markkinoidaan. Erityisesti on varmistettava, että hydrofiiliset testiaineet sisällytetään sellaiseen kantaja-ainejärjestelmään, joka vettää ihon eikä valu heti pois, lisäämällä asianmukaisia liukenemista edistäviä aineita (esimerkiksi 1-prosenttinen Pluronic® L92). On siis syytä välttää kantaja-aineina pelkkiä vesiliuoksia. |
| --- | --- |

19.

Kantaja-aine ei saa vaikuttaa testituloksiin tai vääristää niitä, ja se on valittava siten, että testiaineen annosteluun sopivan liuoksen/suspension aikaan saannissa varmistetaan suurin mahdollinen liukoisuus ja konsentraatio. Suositeltavia kantaja-aineita ovat asetoni:oliiviöljy (4:1 v/v), N,N-dimetyyliformamidi, metyylietyyliketoni, propyleeniglykoli ja dimetyylisulfoksidi (19), mutta muitakin kantaja-aineita voidaan käyttää riittävin tieteellisin perustein. Joissakin tilanteissa voi olla tarpeen käyttää lisäkontrolliaineena kliinisesti perusteltua liuotinta tai sitä kaupallista valmistetta, jona testiainetta markkinoidaan. Erityisesti on varmistettava, että hydrofiiliset testiaineet sisällytetään sellaiseen kantaja-ainejärjestelmään, joka vettää ihon eikä valu heti pois, lisäämällä asianmukaisia liukenemista edistäviä aineita (esimerkiksi 1-prosenttinen Pluronic® L92). On siis syytä välttää kantaja-aineina pelkkiä vesiliuoksia.

| 20. | Yksittäisten hiirten imusolmukkeita prosessoimalla voidaan arvioida eläintenvälistä vaihtelua ja vertailla tilastollisesti testiaineella ja kantaja-aineella käsiteltyjen ryhmien tuloksia (katso 35 kohta). Myös positiivisen kontrolliryhmän hiirten määrän vähentämisen arviointi on mahdollista, kun tietoja kerätään yksittäisistä eläimistä (12). Tietyt sääntelyviranomaiset vaativat, että tietoja on kerättävä yksittäisistä eläimistä. Jotkut sääntelyviranomaiset kuitenkin hyväksyvät useista eläimistä yhdistettyjä tietoja, ja tällaisissa tilanteissa käyttäjät voivat kerätä tietoja joko yksittäisistä eläimistä tai eläinryhmistä. |
| --- | --- |

20.

Yksittäisten hiirten imusolmukkeita prosessoimalla voidaan arvioida eläintenvälistä vaihtelua ja vertailla tilastollisesti testiaineella ja kantaja-aineella käsiteltyjen ryhmien tuloksia (katso 35 kohta). Myös positiivisen kontrolliryhmän hiirten määrän vähentämisen arviointi on mahdollista, kun tietoja kerätään yksittäisistä eläimistä (12). Tietyt sääntelyviranomaiset vaativat, että tietoja on kerättävä yksittäisistä eläimistä. Jotkut sääntelyviranomaiset kuitenkin hyväksyvät useista eläimistä yhdistettyjä tietoja, ja tällaisissa tilanteissa käyttäjät voivat kerätä tietoja joko yksittäisistä eläimistä tai eläinryhmistä.

Varsinaista testiä edeltävä kartoitustesti

| 21. | Jos suurimman testattavan annoksen määrittämiseksi ei ole saatavilla tietoja (katso 18 kohta), on kartoitettava esitestillä, mikä olisi LLNA-menetelmän testeissä käytettävä asianmukainen annostaso. Kartoitustesti helpottaa enimmäisannoksen tason valinnassa varsinaista LLNA-tutkimusta varten, kun tietoja koko elimistöön kohdistuvan toksisuuden (katso 24 kohta) ja/tai liian voimakkaan paikallisen ihoärsytyksen (katso 23 kohta) aiheuttavasta konsentraatiosta ei ole saatavilla. Testattavan enimmäisannoksen tason on vastattava sataa prosenttia nestemäisen testiaineen osalta tai suurinta mahdollista konsentraatiota kiinteiden tai suspendoitujen aineiden osalta. |
| --- | --- |

21.

Jos suurimman testattavan annoksen määrittämiseksi ei ole saatavilla tietoja (katso 18 kohta), on kartoitettava esitestillä, mikä olisi LLNA-menetelmän testeissä käytettävä asianmukainen annostaso. Kartoitustesti helpottaa enimmäisannoksen tason valinnassa varsinaista LLNA-tutkimusta varten, kun tietoja koko elimistöön kohdistuvan toksisuuden (katso 24 kohta) ja/tai liian voimakkaan paikallisen ihoärsytyksen (katso 23 kohta) aiheuttavasta konsentraatiosta ei ole saatavilla. Testattavan enimmäisannoksen tason on vastattava sataa prosenttia nestemäisen testiaineen osalta tai suurinta mahdollista konsentraatiota kiinteiden tai suspendoitujen aineiden osalta.

| 22. | Kartoitustesti suoritetaan varsinaista LLNA-tutkimusta vastaavissa olosuhteissa, kuitenkin niin, että imusolmukkeiden proliferaatiota ei arvioida ja kussakin annosryhmässä voidaan käyttää vähemmän eläimiä. Kussakin annosryhmässä olisi hyvä käyttää yhtä tai kahta eläintä. Kaikkia hiiriä tarkkaillaan päivittäin koko elimistöön kohdistuvan toksisuuden tai applikaatiokohdassa esiintyvän paikallisen ärsytyksen kliinisten merkkien havaitsemiseksi. Eläinten paino kirjataan ennen testaamista ja ennen eläinten lopettamista (päivä 6). Kunkin hiiren molemmista korvista tutkitaan eryteeman merkit, ja ne pisteytetään taulukon 1 mukaisesti (25). Korvan paksuus mitataan paksuusmittarilla (esimerkiksi digitaalisella mikrometrillä tai Peacock Dial -paksuusmittarilla) päivänä 1 (ennen annosta), päivänä 3 (noin 48 tunnin kuluttua ensimmäisestä annoksesta) ja päivänä 6. Päivänä 6 korvan paksuus voidaan myös määrittää mittaamalla korvan lävistämiseen tarvittava massa sen jälkeen, kun eläimet on lopetettu humaanisti. Jos eryteema on erittäin voimakas ja/tai korvan paksuus on kasvanut vähintään 25 prosenttia minä tahansa mittauspäivänä, paikallinen ihoärsytys pisteytetään arvolla ≥ 3 (26) (27). Suurin varsinaiseen LLNA-tutkimukseen valittava annos on testiä edeltävän konsentraatiosarjan (katso 18 kohta) suurin annos, joka ei enää aiheuta koko elimistöön kohdistuvaa toksisuutta ja/tai liian voimakasta paikallista ihoärsytystä.

  Taulukko 1


  Eryteemapisteytys







  Havainto | Pisteet |
| --- | --- | --- |
| Ei eryteemaa | 0 |
| Hyvin lievä eryteema (tuskin havaittava) | 1 |
| Selkeästi erottuva eryteema | 2 |
| Keskivakava–vakava eryteema | 3 |
| Vakava eryteema (voimakas punoitus)–karsta, joka estää eryteeman pisteytyksen | 4 |

22.

Kartoitustesti suoritetaan varsinaista LLNA-tutkimusta vastaavissa olosuhteissa, kuitenkin niin, että imusolmukkeiden proliferaatiota ei arvioida ja kussakin annosryhmässä voidaan käyttää vähemmän eläimiä. Kussakin annosryhmässä olisi hyvä käyttää yhtä tai kahta eläintä. Kaikkia hiiriä tarkkaillaan päivittäin koko elimistöön kohdistuvan toksisuuden tai applikaatiokohdassa esiintyvän paikallisen ärsytyksen kliinisten merkkien havaitsemiseksi. Eläinten paino kirjataan ennen testaamista ja ennen eläinten lopettamista (päivä 6). Kunkin hiiren molemmista korvista tutkitaan eryteeman merkit, ja ne pisteytetään taulukon 1 mukaisesti (25). Korvan paksuus mitataan paksuusmittarilla (esimerkiksi digitaalisella mikrometrillä tai Peacock Dial -paksuusmittarilla) päivänä 1 (ennen annosta), päivänä 3 (noin 48 tunnin kuluttua ensimmäisestä annoksesta) ja päivänä 6. Päivänä 6 korvan paksuus voidaan myös määrittää mittaamalla korvan lävistämiseen tarvittava massa sen jälkeen, kun eläimet on lopetettu humaanisti. Jos eryteema on erittäin voimakas ja/tai korvan paksuus on kasvanut vähintään 25 prosenttia minä tahansa mittauspäivänä, paikallinen ihoärsytys pisteytetään arvolla ≥ 3 (26) (27). Suurin varsinaiseen LLNA-tutkimukseen valittava annos on testiä edeltävän konsentraatiosarjan (katso 18 kohta) suurin annos, joka ei enää aiheuta koko elimistöön kohdistuvaa toksisuutta ja/tai liian voimakasta paikallista ihoärsytystä.

Taulukko 1

Eryteemapisteytys

Havainto

Pisteet

Ei eryteemaa

0

Hyvin lievä eryteema (tuskin havaittava)

1

Selkeästi erottuva eryteema

2

Keskivakava–vakava eryteema

3

Vakava eryteema (voimakas punoitus)–karsta, joka estää eryteeman pisteytyksen

4

| 23. | Käsiteltyjen hiirten korvien paksuuden tilastollisesti merkittävää yli 25 prosentin kasvua (26) (27) kontrollihiiriin verrattuna on käytetty myös LLNA-menetelmän ärsyttävien aineiden määrittämisessä (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Vaikka tilastollisesti merkittävää paksuuden kasvua voi esiintyä silloinkin, kun korvan paksuus on alle 25 prosenttia, sen ei katsota liittyvän erityisesti erittäin voimakkaaseen ärsytykseen (30) (32) (33) (34). |
| --- | --- |

23.

Käsiteltyjen hiirten korvien paksuuden tilastollisesti merkittävää yli 25 prosentin kasvua (26) (27) kontrollihiiriin verrattuna on käytetty myös LLNA-menetelmän ärsyttävien aineiden määrittämisessä (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Vaikka tilastollisesti merkittävää paksuuden kasvua voi esiintyä silloinkin, kun korvan paksuus on alle 25 prosenttia, sen ei katsota liittyvän erityisesti erittäin voimakkaaseen ärsytykseen (30) (32) (33) (34).

| 24. | Seuraavat kliiniset havainnot voivat yhdennetyn arvioinnin osana olla osoituksena koko elimistöön kohdistuvasta toksisuudesta (35) (36) ja voivat näin ollen olla osoituksena suurimmasta annostasosta, jota varsinaisessa LLNA-menetelmässä voidaan käyttää: muutokset hermoston toiminnassa (esimerkiksi karvojen jäykistyminen, ataksia, vapina ja kouristukset); muutokset käyttäytymisessä (esimerkiksi aggressiivisuus, muutokset turkin hoidossa, aktiivisuustason huomattava muuttuminen); muutokset hengityksessä (hengityksen säännöllisyyden ja syvyyden muutokset, kuten hengenahdistus, hengen haukkominen ja rahina) sekä muutokset ravinnon ja veden kulutuksessa. Arvioinnissa on huomioitava myös letargian ja/tai passiivisuuden merkit, vähäistä tai hetkittäistä kipua suuremman kivun ja kärsimyksen mahdolliset kliiniset merkit tai eläimen painon yli viiden prosentin laskeminen päivästä 1 päivään 6 sekä kuolleisuus. Kuolevat eläimet, selvästi kärsivät eläimet tai eläimet, jotka osoittavat selviä merkkejä voimakkaasta ja jatkuvasta kärsimyksestä, on lopetettava humaanisti (37). |
| --- | --- |

24.

Seuraavat kliiniset havainnot voivat yhdennetyn arvioinnin osana olla osoituksena koko elimistöön kohdistuvasta toksisuudesta (35) (36) ja voivat näin ollen olla osoituksena suurimmasta annostasosta, jota varsinaisessa LLNA-menetelmässä voidaan käyttää: muutokset hermoston toiminnassa (esimerkiksi karvojen jäykistyminen, ataksia, vapina ja kouristukset); muutokset käyttäytymisessä (esimerkiksi aggressiivisuus, muutokset turkin hoidossa, aktiivisuustason huomattava muuttuminen); muutokset hengityksessä (hengityksen säännöllisyyden ja syvyyden muutokset, kuten hengenahdistus, hengen haukkominen ja rahina) sekä muutokset ravinnon ja veden kulutuksessa. Arvioinnissa on huomioitava myös letargian ja/tai passiivisuuden merkit, vähäistä tai hetkittäistä kipua suuremman kivun ja kärsimyksen mahdolliset kliiniset merkit tai eläimen painon yli viiden prosentin laskeminen päivästä 1 päivään 6 sekä kuolleisuus. Kuolevat eläimet, selvästi kärsivät eläimet tai eläimet, jotka osoittavat selviä merkkejä voimakkaasta ja jatkuvasta kärsimyksestä, on lopetettava humaanisti (37).

Varsinaisen tutkimuksen aikataulu

| 25. | Määrityksen aikataulu on seuraava:
  —   Päivä 1: Määritetään ja kirjataan kunkin koe-eläimen paino ja tehdään ja kirjataan mahdolliset kliiniset havainnot. Kunkin korvan takaosaan applikoidaan 25 μl testiaineen, kantaja-aineen tai positiivisen kontrollikemikaalin (jota käytetään aina tai jota on käytetty hiljattain, laboratorion toimintatavan mukaisesti, ottaen huomioon 11–15 kohdat) sopivaa laimennosta.
  —   Päivät 2 ja 3: Toistetaan päivänä 1 toteutettu applikointimenettely.
  —   Päivät 4 ja 5: Ei käsittelyä.
  —   Päivä 6: Kirjataan kunkin eläimen paino. Ruiskutetaan 250 μl steriiliä fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS), joka sisältää 20 μCi (7,4 × 105 Bq) tritiumilla merkittyä (3H)-metyylitymidiiniä, kaikkiin testi- ja kontrolliryhmän hiiriin häntävaltimon kautta. Vaihtoehtoisesti ruiskutetaan 250 μl steriiliä PBS:ää, joka sisältää 2 μCi (7,4 × 104 Bq) 125I-jodideoksiuridiinia ja 10-5-molaarista fluorideoksiuridiinia, kaikkiin hiiriin häntävaltimon kautta. Viiden tunnin (5 h) kuluttua eläimet lopetetaan humaanisti. Kummastakin korvasta leikataan irti dreneeraavat korvalehden imusolmukkeet, ja kunkin eläimen imusolmukkeet upotetaan PBS:ään (vain yhden yksilön näytteet); vaihtoehtoisesti kummankin korvan imusolmukkeet voidaan leikata ja koko koeryhmän imusolmukkeet voidaan upottaa PBS:ään (käsittelyryhmän näytteet yhdistetään). Imusolmukkeiden tunnistukseen ja leikkaamiseen liittyvät yksityiskohdat ja kaaviot esitetään lähteessä (12). Paikallista ihovastetta voidaan seurata varsinaisessa tutkimuksessa tarkemmin niin, että tutkimussuunnitelmaan sisällytetään täydentäviä parametreja, kuten korvan eryteeman pisteytys tai korvan paksuutta koskevat mittaustulokset (saadaan joko paksuusmittarilla tai ruumiinavauksen yhteydessä tehtävillä korvan lävistämiseen tarvittavan massan mittauksilla). |
| --- | --- |

25.

Määrityksen aikataulu on seuraava:

—   Päivä 1: Määritetään ja kirjataan kunkin koe-eläimen paino ja tehdään ja kirjataan mahdolliset kliiniset havainnot. Kunkin korvan takaosaan applikoidaan 25 μl testiaineen, kantaja-aineen tai positiivisen kontrollikemikaalin (jota käytetään aina tai jota on käytetty hiljattain, laboratorion toimintatavan mukaisesti, ottaen huomioon 11–15 kohdat) sopivaa laimennosta.

—   Päivät 2 ja 3: Toistetaan päivänä 1 toteutettu applikointimenettely.

—   Päivät 4 ja 5: Ei käsittelyä.

—   Päivä 6: Kirjataan kunkin eläimen paino. Ruiskutetaan 250 μl steriiliä fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS), joka sisältää 20 μCi (7,4 × 105 Bq) tritiumilla merkittyä (3H)-metyylitymidiiniä, kaikkiin testi- ja kontrolliryhmän hiiriin häntävaltimon kautta. Vaihtoehtoisesti ruiskutetaan 250 μl steriiliä PBS:ää, joka sisältää 2 μCi (7,4 × 104 Bq) 125I-jodideoksiuridiinia ja 10-5-molaarista fluorideoksiuridiinia, kaikkiin hiiriin häntävaltimon kautta. Viiden tunnin (5 h) kuluttua eläimet lopetetaan humaanisti. Kummastakin korvasta leikataan irti dreneeraavat korvalehden imusolmukkeet, ja kunkin eläimen imusolmukkeet upotetaan PBS:ään (vain yhden yksilön näytteet); vaihtoehtoisesti kummankin korvan imusolmukkeet voidaan leikata ja koko koeryhmän imusolmukkeet voidaan upottaa PBS:ään (käsittelyryhmän näytteet yhdistetään). Imusolmukkeiden tunnistukseen ja leikkaamiseen liittyvät yksityiskohdat ja kaaviot esitetään lähteessä (12). Paikallista ihovastetta voidaan seurata varsinaisessa tutkimuksessa tarkemmin niin, että tutkimussuunnitelmaan sisällytetään täydentäviä parametreja, kuten korvan eryteeman pisteytys tai korvan paksuutta koskevat mittaustulokset (saadaan joko paksuusmittarilla tai ruumiinavauksen yhteydessä tehtävillä korvan lävistämiseen tarvittavan massan mittauksilla).

Solususpensioiden valmistus

| 26. | Yksittäisten eläinten imusolmukeparien soluista tai testiryhmien yhdistetyistä imusolmukesoluista valmistetaan suspensio, jossa kaikki solut ovat irrallaan muista (yksisolususpensio), mekaanisesti hajottamalla solukertymät painamalla ne varovaisesti ruostumattoman terässeulan läpi (silmäkoko 200 μm) tai käyttämällä muuta yksisolususpension valmistamiseksi hyväksyttyä tekniikkaa. Imusolmukesolut pestään kahdesti runsaalla PBS:llä, ja DNA saostetaan 5-prosenttisessa trikloorietikkahapossa 4 °C:n lämpötilassa 18 tunnin ajan (3). Pelletit voidaan joko suspendoida uudelleen 1 ml:aan trikloorietikkahappoa ja siirtää tuikeputkiin, joissa on 10 ml tuikenestettä 3H-laskentaa varten, tai siirtää suoraan gammalaskentaputkiin 125I-laskentaa varten. |
| --- | --- |

26.

Yksittäisten eläinten imusolmukeparien soluista tai testiryhmien yhdistetyistä imusolmukesoluista valmistetaan suspensio, jossa kaikki solut ovat irrallaan muista (yksisolususpensio), mekaanisesti hajottamalla solukertymät painamalla ne varovaisesti ruostumattoman terässeulan läpi (silmäkoko 200 μm) tai käyttämällä muuta yksisolususpension valmistamiseksi hyväksyttyä tekniikkaa. Imusolmukesolut pestään kahdesti runsaalla PBS:llä, ja DNA saostetaan 5-prosenttisessa trikloorietikkahapossa 4 °C:n lämpötilassa 18 tunnin ajan (3). Pelletit voidaan joko suspendoida uudelleen 1 ml:aan trikloorietikkahappoa ja siirtää tuikeputkiin, joissa on 10 ml tuikenestettä 3H-laskentaa varten, tai siirtää suoraan gammalaskentaputkiin 125I-laskentaa varten.

Solujen proliferaation (inkorporoituneen radioaktiivisuuden) määritys

| 27. | 3H-metyylitymidiinin inkorporoituminen mitataan β-tuikelaskennalla hajoamisina minuutissa (DPM). 125I-jodideoksiuridiinin inkorporoituminen mitataan 125I-laskennalla ja ilmoitetaan niin ikään DPM-arvona. Inkorporoituminen ilmoitetaan DPM:nä joko eläintä kohti tai testiryhmää kohti. |
| --- | --- |

27.

3H-metyylitymidiinin inkorporoituminen mitataan β-tuikelaskennalla hajoamisina minuutissa (DPM). 125I-jodideoksiuridiinin inkorporoituminen mitataan 125I-laskennalla ja ilmoitetaan niin ikään DPM-arvona. Inkorporoituminen ilmoitetaan DPM:nä joko eläintä kohti tai testiryhmää kohti.

Vähemmän koe-eläimiä käyttävä LLNA-menetelmä

| 28. | Vaihtoehtoista, vähemmän koe-eläimiä käyttävää rLLNA-menetelmää (16) (17) (18) voidaan soveltaa tietyissä tapauksissa, joissa ihoherkistyspotentiaalin negatiivinen oletus on sääntelysyistä vahvistettava, edellyttäen että kaikkia muita tässä testimenetelmässä kuvattuja LLNA-menettelyn vaatimuksia noudatetaan. rLLNA-menettelyn käyttö on perusteltava selvästi ja tieteellisesti ennen menetelmän käyttöä. Jos tulos on positiivinen tai epäselvä, löydöksen tulkitsemiseksi tai selventämiseksi voidaan tarvita täydentäviä testejä. |
| --- | --- |

28.

Vaihtoehtoista, vähemmän koe-eläimiä käyttävää rLLNA-menetelmää (16) (17) (18) voidaan soveltaa tietyissä tapauksissa, joissa ihoherkistyspotentiaalin negatiivinen oletus on sääntelysyistä vahvistettava, edellyttäen että kaikkia muita tässä testimenetelmässä kuvattuja LLNA-menettelyn vaatimuksia noudatetaan. rLLNA-menettelyn käyttö on perusteltava selvästi ja tieteellisesti ennen menetelmän käyttöä. Jos tulos on positiivinen tai epäselvä, löydöksen tulkitsemiseksi tai selventämiseksi voidaan tarvita täydentäviä testejä.

| 29. | LLNA- ja rLLNA-testimenetelmien ainoana erona on erilainen annosryhmien määrä, minkä vuoksi rLLNA-menetelmä ei anna tietoja annosvasteesta. Näin ollen rLLNA-menettelyä ei pidä käyttää, jos annosvastetta koskevia tietoja tarvitaan. Kuten useisiin annoksiin perustuvassa LLNA-menettelyssä, myös rLLNA-menettelyssä arvioitavan testiaineen konsentraationa on käytettävä suurinta konsentraatiota, joka ei vielä aiheuta hiiressä koko elimistöön kohdistuvaa toksisuutta ja/tai liian voimakasta ihoärsytystä (katso 18 kohta). |
| --- | --- |

29.

LLNA- ja rLLNA-testimenetelmien ainoana erona on erilainen annosryhmien määrä, minkä vuoksi rLLNA-menetelmä ei anna tietoja annosvasteesta. Näin ollen rLLNA-menettelyä ei pidä käyttää, jos annosvastetta koskevia tietoja tarvitaan. Kuten useisiin annoksiin perustuvassa LLNA-menettelyssä, myös rLLNA-menettelyssä arvioitavan testiaineen konsentraationa on käytettävä suurinta konsentraatiota, joka ei vielä aiheuta hiiressä koko elimistöön kohdistuvaa toksisuutta ja/tai liian voimakasta ihoärsytystä (katso 18 kohta).

HAVAINNOT

Kliiniset havainnot

| 30. | Kustakin hiirestä on päivittäin havainnoitava huolellisesti mahdolliset kliiniset merkit joko annostelualueen paikallisesta ärsytyksestä tai koko elimistöön kohdistuvasta toksisuudesta. Kaikki havainnot kirjataan järjestelmällisesti erikseen kustakin hiirestä. Seurantasuunnitelmissa on esitettävä myös perusteet, joiden avulla voidaan nopeasti tunnistaa hiiret, joissa havaitaan merkkejä koko elimistöön kohdistuvasta toksisuudesta, erittäin voimakkaasta paikallisesta ihoärsytyksestä tai ihosyövyttävyydestä, jotta ne voitaisiin lopettaa (37). |
| --- | --- |

30.

Kustakin hiirestä on päivittäin havainnoitava huolellisesti mahdolliset kliiniset merkit joko annostelualueen paikallisesta ärsytyksestä tai koko elimistöön kohdistuvasta toksisuudesta. Kaikki havainnot kirjataan järjestelmällisesti erikseen kustakin hiirestä. Seurantasuunnitelmissa on esitettävä myös perusteet, joiden avulla voidaan nopeasti tunnistaa hiiret, joissa havaitaan merkkejä koko elimistöön kohdistuvasta toksisuudesta, erittäin voimakkaasta paikallisesta ihoärsytyksestä tai ihosyövyttävyydestä, jotta ne voitaisiin lopettaa (37).

Ruumiinpainot

| 31. | Kuten 25 kohdassa todetaan, kukin eläin on punnittava erikseen testin alussa ja aikataulun mukaisesti humaanin lopettamisen yhteydessä. |
| --- | --- |

31.

Kuten 25 kohdassa todetaan, kukin eläin on punnittava erikseen testin alussa ja aikataulun mukaisesti humaanin lopettamisen yhteydessä.

TULOSTEN LASKEMINEN

| 32. | Kunkin käsittelyryhmän tulokset ilmoitetaan stimulaatioindeksinä (SI). Yksilönäytteistä SI-arvo saadaan jakamalla kunkin testiaineryhmän ja positiivisen kontrolliryhmän hiirikohtaisista DPM-arvoista laskettu keskiarvo liuotin/kantaja-aineryhmän vastaavalla tuloksella. Kantaja-aineella käsiteltyjen kontrolliryhmien SI:n keskiarvo on 1. Ryhmänäytteistä SI-arvo saadaan jakamalla kunkin testiryhmän yhdistetty radioaktiivinen inkorporoituminen kantaja-aineryhmän yhdistetyllä inkorporoitumisella, jolloin saadaan SI:n keskiarvo. |
| --- | --- |

32.

Kunkin käsittelyryhmän tulokset ilmoitetaan stimulaatioindeksinä (SI). Yksilönäytteistä SI-arvo saadaan jakamalla kunkin testiaineryhmän ja positiivisen kontrolliryhmän hiirikohtaisista DPM-arvoista laskettu keskiarvo liuotin/kantaja-aineryhmän vastaavalla tuloksella. Kantaja-aineella käsiteltyjen kontrolliryhmien SI:n keskiarvo on 1. Ryhmänäytteistä SI-arvo saadaan jakamalla kunkin testiryhmän yhdistetty radioaktiivinen inkorporoituminen kantaja-aineryhmän yhdistetyllä inkorporoitumisella, jolloin saadaan SI:n keskiarvo.

| 33. | Tulos katsotaan positiiviseksi, kun SI ≥ 3. Päätettäessä, katsotaanko rajatulos positiiviseksi, voidaan myös käyttää annosvasteen voimakkuutta, tilastollista merkitsevyyttä sekä liuottimen/kantaja-aineen ja positiivisen kontrollikemikaalin vasteiden yhdenmukaisuutta (4) (5) (6). |
| --- | --- |

33.

Tulos katsotaan positiiviseksi, kun SI ≥ 3. Päätettäessä, katsotaanko rajatulos positiiviseksi, voidaan myös käyttää annosvasteen voimakkuutta, tilastollista merkitsevyyttä sekä liuottimen/kantaja-aineen ja positiivisen kontrollikemikaalin vasteiden yhdenmukaisuutta (4) (5) (6).

| 34. | Jos saatuja tuloksia pitää selventää, huomioon on otettava testiaineen erilaiset ominaisuudet, mukaan luettuina mahdolliset rakenteelliset yhtäläisyydet tunnettuihin ihoherkistystä aiheuttaviin aineisiin, sen hiirelle mahdollisesti aiheuttama erittäin voimakas paikallinen ihoärsytys ja havaitun annosvasteen luonne. Näitä ja muita huomionarvoisia seikkoja käsitellään yksityiskohtaisesti lähteessä (7). |
| --- | --- |

34.

Jos saatuja tuloksia pitää selventää, huomioon on otettava testiaineen erilaiset ominaisuudet, mukaan luettuina mahdolliset rakenteelliset yhtäläisyydet tunnettuihin ihoherkistystä aiheuttaviin aineisiin, sen hiirelle mahdollisesti aiheuttama erittäin voimakas paikallinen ihoärsytys ja havaitun annosvasteen luonne. Näitä ja muita huomionarvoisia seikkoja käsitellään yksityiskohtaisesti lähteessä (7).

| 35. | Kun radioaktiivisuuden mittaustuloksia kerätään erikseen kustakin hiirestä, voidaan niiden perusteella analysoida tilastollisesti mahdollista annosvastetta ja sen tasoa. Tilastollisessa arvioinnissa voidaan myös arvioida annosvasteen voimakkuutta ja tehdä asianmukaisesti mukautettuja vertailuja testiryhmillä (esimerkiksi pareittain annoksen saaneen ryhmän vertailu kantaja-ainekontrolliryhmään, kun kontrolli on tehnyt samanaikaisesti). Tilastoanalyyseissä voidaan käyttää esimerkiksi lineaarista regressiota tai Williamin testiä, joilla arvioidaan annos-vastesuuntauksia, sekä Dunnettin testiä, jolla vertaillaan pareja. Tutkijan on otettava asianmukaisen tilastollisen analyysimenetelmän valinnassa huomioon varianssien mahdolliset erot ja muut vastaavat ongelmat, jotka saattavat edellyttää määritystulosten muuntamista tai non-parametrista tilastollista analyysia. Joka tapauksessa tutkija voi joutua tekemään SI-laskelmia ja tilastoanalyyseja siten, että mukana on tai ei ole tiettyjä määrityskohtia koskevia tietoja (ns. käyrän ulkopuolella olevat tulokset). |
| --- | --- |

35.

Kun radioaktiivisuuden mittaustuloksia kerätään erikseen kustakin hiirestä, voidaan niiden perusteella analysoida tilastollisesti mahdollista annosvastetta ja sen tasoa. Tilastollisessa arvioinnissa voidaan myös arvioida annosvasteen voimakkuutta ja tehdä asianmukaisesti mukautettuja vertailuja testiryhmillä (esimerkiksi pareittain annoksen saaneen ryhmän vertailu kantaja-ainekontrolliryhmään, kun kontrolli on tehnyt samanaikaisesti). Tilastoanalyyseissä voidaan käyttää esimerkiksi lineaarista regressiota tai Williamin testiä, joilla arvioidaan annos-vastesuuntauksia, sekä Dunnettin testiä, jolla vertaillaan pareja. Tutkijan on otettava asianmukaisen tilastollisen analyysimenetelmän valinnassa huomioon varianssien mahdolliset erot ja muut vastaavat ongelmat, jotka saattavat edellyttää määritystulosten muuntamista tai non-parametrista tilastollista analyysia. Joka tapauksessa tutkija voi joutua tekemään SI-laskelmia ja tilastoanalyyseja siten, että mukana on tai ei ole tiettyjä määrityskohtia koskevia tietoja (ns. käyrän ulkopuolella olevat tulokset).

MITTAUSTULOKSET JA TULOSTEN ILMOITTAMINEN

Mittaustulokset

| 36. | Mittaustulokset on esitettävä taulukkona. Yksilönäytteiden osalta esitetään eläinkohtaiset DPM-arvot, ryhmän eläinkohtaisen DPM-arvon keskiarvo, siihen liittyvä virhe (esimerkiksi keskihajonta tai keskiarvon keskivirhe) sekä kunkin annosryhmän keskimääräinen SI vastaavaan kantaja-ainekontrolliryhmään verrattuna. Ryhmänäytteiden osalta esitetään keskimääräinen DPM / DPM:n mediaani sekä kunkin annosryhmän keskimääräinen SI samanaikaisesti käsiteltyyn kantaja-ainekontrolliryhmään verrattuna. |
| --- | --- |

36.

Mittaustulokset on esitettävä taulukkona. Yksilönäytteiden osalta esitetään eläinkohtaiset DPM-arvot, ryhmän eläinkohtaisen DPM-arvon keskiarvo, siihen liittyvä virhe (esimerkiksi keskihajonta tai keskiarvon keskivirhe) sekä kunkin annosryhmän keskimääräinen SI vastaavaan kantaja-ainekontrolliryhmään verrattuna. Ryhmänäytteiden osalta esitetään keskimääräinen DPM / DPM:n mediaani sekä kunkin annosryhmän keskimääräinen SI samanaikaisesti käsiteltyyn kantaja-ainekontrolliryhmään verrattuna.

Testiraportti

| 37. | Testiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot: | Testi- ja kontrolliaineet






  — | tunnistetiedot (esimerkiksi CAS- ja EC-numerot, jos tiedossa; alkuperä, puhtaus, tunnetut epäpuhtaudet, eränumero), |
| --- | --- | --- | --- |

37.

Testiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot:

Testi- ja kontrolliaineet

—

tunnistetiedot (esimerkiksi CAS- ja EC-numerot, jos tiedossa; alkuperä, puhtaus, tunnetut epäpuhtaudet, eränumero),

| — | fysikaalinen olomuoto ja fysikaaliskemialliset ominaisuudet (esimerkiksi haihtuvuus, stabiilisuus, liukoisuus), |
| --- | --- |

—

fysikaalinen olomuoto ja fysikaaliskemialliset ominaisuudet (esimerkiksi haihtuvuus, stabiilisuus, liukoisuus),

| — | jos kyseessä on seos, sen koostumus ja ainesosien suhteelliset osuudet. |
| --- | --- |

—

jos kyseessä on seos, sen koostumus ja ainesosien suhteelliset osuudet.

| | Liuotin/kantaja-aine






  — | tunnistetiedot (puhtaus, tarvittaessa konsentraatio, käytetty tilavuus), |
| --- | --- | --- |

Liuotin/kantaja-aine

—

tunnistetiedot (puhtaus, tarvittaessa konsentraatio, käytetty tilavuus),

| — | perustelut kantaja-aineen valinnalle. |
| --- | --- |

—

perustelut kantaja-aineen valinnalle.

| | Koe-eläimet






  — | CBA-hiirten alkuperä, |
| --- | --- | --- |

Koe-eläimet

—

CBA-hiirten alkuperä,

| — | eläinten mikrobiologinen tila, jos se on tiedossa, |
| --- | --- |

—

eläinten mikrobiologinen tila, jos se on tiedossa,

| — | eläinten määrä ja ikä, |
| --- | --- |

—

eläinten määrä ja ikä,

| — | eläinten alkuperä, koe-eläintilat, ruokavalio ja niin edelleen. |
| --- | --- |

—

eläinten alkuperä, koe-eläintilat, ruokavalio ja niin edelleen.

| | Testiolosuhteet






  — | tiedot testiaineen valmistelusta ja annostelusta, |
| --- | --- | --- |

Testiolosuhteet

—

tiedot testiaineen valmistelusta ja annostelusta,

| — | perustelut annostasojen valinnalle (mukaan luettuina kartoitustestin tulokset, jos sellainen on tehty), |
| --- | --- |

—

perustelut annostasojen valinnalle (mukaan luettuina kartoitustestin tulokset, jos sellainen on tehty),

| — | käytetyt kantaja- ja testiaineiden konsentraatiot ja annostellun testiaineen kokonaismäärä, |
| --- | --- |

—

käytetyt kantaja- ja testiaineiden konsentraatiot ja annostellun testiaineen kokonaismäärä,

| — | tiedot ravinnon ja veden laadusta (mukaan luettuina ruokavalion tyyppi/alkuperä, veden alkuperä), |
| --- | --- |

—

tiedot ravinnon ja veden laadusta (mukaan luettuina ruokavalion tyyppi/alkuperä, veden alkuperä),

| — | tiedot käsittely- ja näytteenottoaikatauluista, |
| --- | --- |

—

tiedot käsittely- ja näytteenottoaikatauluista,

| — | toksisuuden mittausmenetelmät, |
| --- | --- |

—

toksisuuden mittausmenetelmät,

| — | tutkimusten positiivisuuden tai negatiivisuuden arviointiperusteet, |
| --- | --- |

—

tutkimusten positiivisuuden tai negatiivisuuden arviointiperusteet,

| — | tiedot menettelystä poikkeamisesta ja selvitys siitä, miten poikkeaminen vaikuttaa tutkimussuunnitelmaan ja tuloksiin. |
| --- | --- |

—

tiedot menettelystä poikkeamisesta ja selvitys siitä, miten poikkeaminen vaikuttaa tutkimussuunnitelmaan ja tuloksiin.

| | Luotettavuuden tarkistus






  — | yhteenveto viimeisimmän luotettavuustarkistuksen tuloksista, mukaan luettuina tiedot käytetystä testiaineesta, konsentraatiosta ja kantaja-aineesta, |
| --- | --- | --- |

Luotettavuuden tarkistus

—

yhteenveto viimeisimmän luotettavuustarkistuksen tuloksista, mukaan luettuina tiedot käytetystä testiaineesta, konsentraatiosta ja kantaja-aineesta,

| — | testauslaboratorion samanaikaisesti tehtyjen ja/tai aiemmin tehtyjen positiivisten ja samanaikaisesti tehtyjen negatiivisten kontrollien tulokset, |
| --- | --- |

—

testauslaboratorion samanaikaisesti tehtyjen ja/tai aiemmin tehtyjen positiivisten ja samanaikaisesti tehtyjen negatiivisten kontrollien tulokset,

| — | jos määrityksessä ei ollut samanaikaisesti tehtyä positiivista kontrollia, on annettava viimeisimmän positiivisen kontrollin päivämäärä ja laboratorioraportti sekä yksityiskohtainen selvitys laboratorion aiemmista positiivisista kontrollitiedoista, joiden perusteella positiivista kontrollia ei tehty. |
| --- | --- |

—

jos määrityksessä ei ollut samanaikaisesti tehtyä positiivista kontrollia, on annettava viimeisimmän positiivisen kontrollin päivämäärä ja laboratorioraportti sekä yksityiskohtainen selvitys laboratorion aiemmista positiivisista kontrollitiedoista, joiden perusteella positiivista kontrollia ei tehty.

| | Tulokset






  — | kunkin hiiren paino annostelun alussa ja aikataulun mukaisen lopettamisen yhteydessä sekä kunkin annosryhmän keskimääräinen virhetermi ja siihen liittyvä virhetermi (esimerkiksi keskihajonta tai keskiarvon keskivirhe), |
| --- | --- | --- |

Tulokset

—

kunkin hiiren paino annostelun alussa ja aikataulun mukaisen lopettamisen yhteydessä sekä kunkin annosryhmän keskimääräinen virhetermi ja siihen liittyvä virhetermi (esimerkiksi keskihajonta tai keskiarvon keskivirhe),

| — | toksisuuden ilmeneminen ajan funktiona ja toksisuuden merkit, mukaan luettuna annostelualueen ihoärsytys, jos sellaista esiintyy, erikseen kullekin eläinyksilölle, |
| --- | --- |

—

toksisuuden ilmeneminen ajan funktiona ja toksisuuden merkit, mukaan luettuna annostelualueen ihoärsytys, jos sellaista esiintyy, erikseen kullekin eläinyksilölle,

| — | taulukko kunkin hiiren (yksilönäytteet) tai kunkin käsittelyryhmän (ryhmänäytteet) keskimääräisistä DPM- ja SI-arvoista / DPM:n ja SI:n mediaaneista, |
| --- | --- |

—

taulukko kunkin hiiren (yksilönäytteet) tai kunkin käsittelyryhmän (ryhmänäytteet) keskimääräisistä DPM- ja SI-arvoista / DPM:n ja SI:n mediaaneista,

| — | kunkin käsittelyryhmän hiirikohtaisen DPM-arvon keskimääräinen virhetermi ja siihen liittyvä virhetermi (esimerkiksi keskihajonta ja keskiarvon keskivirhe) sekä käyrän ulkopuolella olevien vasteiden analyysin tulokset kullekin käsittelyryhmälle käytettäessä yksittäisiä eläimiä, |
| --- | --- |

—

kunkin käsittelyryhmän hiirikohtaisen DPM-arvon keskimääräinen virhetermi ja siihen liittyvä virhetermi (esimerkiksi keskihajonta ja keskiarvon keskivirhe) sekä käyrän ulkopuolella olevien vasteiden analyysin tulokset kullekin käsittelyryhmälle käytettäessä yksittäisiä eläimiä,

| — | testiaineella ja kontrolliaineella käsitellyille ryhmille yksilönäytteiden yhteydessä laskettu SI ja asianmukaisesti määritetty vaihteluväli, jossa otetaan huomioon eläinten välinen vaihtelu, |
| --- | --- |

—

testiaineella ja kontrolliaineella käsitellyille ryhmille yksilönäytteiden yhteydessä laskettu SI ja asianmukaisesti määritetty vaihteluväli, jossa otetaan huomioon eläinten välinen vaihtelu,

| — | annos-vastesuhde, |
| --- | --- |

—

annos-vastesuhde,

| — | tarvittaessa tilastolliset analyysit. |
| --- | --- |

—

tarvittaessa tilastolliset analyysit.

| | Tulosten pohdinta






  — | tulosten lyhyt kommentointi, annos-vasteanalyysi ja tarvittaessa tilastollinen analyysi sekä johtopäätös siitä, onko testiainetta pidettävä ihoherkistystä aiheuttavana. |
| --- | --- | --- |

Tulosten pohdinta

—

tulosten lyhyt kommentointi, annos-vasteanalyysi ja tarvittaessa tilastollinen analyysi sekä johtopäätös siitä, onko testiainetta pidettävä ihoherkistystä aiheuttavana.

LÄHDELUETTELO

| (1) | OECD (2002). Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay. OECD Guideline for the Testing of Chemicals No 429. Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines |
| --- | --- |

(1)

OECD (2002). Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay. OECD Guideline for the Testing of Chemicals No 429. Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines

| (2) | Kimber, I. ja Basketter, D. A. (1992). The murine local lymph node assay; collaborative studies and new directions: A commentary. Food Chem. Toxicol. 30, s. 165–169. |
| --- | --- |

(2)

Kimber, I. ja Basketter, D. A. (1992). The murine local lymph node assay; collaborative studies and new directions: A commentary. Food Chem. Toxicol. 30, s. 165–169.

| (3) | Kimber, I., Dearman, R. J., Scholes, E. W. ja Basketter, D. A. (1994). The local lymph node assay: developments and applications. Toxicol. 93, s. 13–31. |
| --- | --- |

(3)

Kimber, I., Dearman, R. J., Scholes, E. W. ja Basketter, D. A. (1994). The local lymph node assay: developments and applications. Toxicol. 93, s. 13–31.

| (4) | Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R. J., Gerberick, G. F., Ryan, C. A., Basketter, D. A., Lea, L., House, R. V., Ladies, G. S., Loveless, S. E. ja Hastings, K. L. (1998). Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ. Health 53, s. 563–79. |
| --- | --- |

(4)

Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R. J., Gerberick, G. F., Ryan, C. A., Basketter, D. A., Lea, L., House, R. V., Ladies, G. S., Loveless, S. E. ja Hastings, K. L. (1998). Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ. Health 53, s. 563–79.

| (5) | Chamberlain, M. ja Basketter, D. A. (1996). The local lymph node assay: status of validation. Food Chem. Toxicol. 34, s. 999–1002. |
| --- | --- |

(5)

Chamberlain, M. ja Basketter, D. A. (1996). The local lymph node assay: status of validation. Food Chem. Toxicol. 34, s. 999–1002.

| (6) | Basketter, D. A., Gerberick, G. F., Kimber, I. ja Loveless, S. E. (1996). The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem. Toxicol. 34, s. 985–997. |
| --- | --- |

(6)

Basketter, D. A., Gerberick, G. F., Kimber, I. ja Loveless, S. E. (1996). The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem. Toxicol. 34, s. 985–997.

| (7) | Basketter, D. A., Gerberick, G. F. ja Kimber, I. (1998). Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. Toxicol. 36, s. 327–33. |
| --- | --- |

(7)

Basketter, D. A., Gerberick, G. F. ja Kimber, I. (1998). Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. Toxicol. 36, s. 327–33.

| (8) | Van Och, F. M. M., Slob, W., De Jong, W. H., Vandebriel, R. J. ja Van Loveren, H. (2000). A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicol. 146, s. 49–59. |
| --- | --- |

(8)

Van Och, F. M. M., Slob, W., De Jong, W. H., Vandebriel, R. J. ja Van Loveren, H. (2000). A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicol. 146, s. 49–59.

| (9) | Dean, J. H., Twerdok, L. E., Tice, R. R., Sailstad, D. M., Hattan, D. G. ja Stokes, W. S. (2001). ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol 34, s. 258–273. |
| --- | --- |

(9)

Dean, J. H., Twerdok, L. E., Tice, R. R., Sailstad, D. M., Hattan, D. G. ja Stokes, W. S. (2001). ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol 34, s. 258–273.

| (10) | Haneke, K. E., Tice, R. R., Carson, B. L., Margolin, B. H. ja Stokes, W. S. (2001). ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol 34, s. 274–286. |
| --- | --- |

(10)

Haneke, K. E., Tice, R. R., Carson, B. L., Margolin, B. H. ja Stokes, W. S. (2001). ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol 34, s. 274–286.

| (11) | Sailstad, D. M., Hattan, D., Hill, R. N. ja Stokes, W. S. (2001). ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process. Reg. Toxicol. Pharmacol 34, s. 249–257. |
| --- | --- |

(11)

Sailstad, D. M., Hattan, D., Hill, R. N. ja Stokes, W. S. (2001). ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process. Reg. Toxicol. Pharmacol 34, s. 249–257.

| (12) | ICCVAM (2009). Recommended Performance Standards: Murine Local Lymph Node Assay. NIH-julkaisunumero 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf |
| --- | --- |

(12)

ICCVAM (2009). Recommended Performance Standards: Murine Local Lymph Node Assay. NIH-julkaisunumero 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf

| (13) | OECD (1992). Skin Sensitisation. OECD Guideline for Testing of Chemicals No 406. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines |
| --- | --- |

(13)

OECD (1992). Skin Sensitisation. OECD Guideline for Testing of Chemicals No 406. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines

| (14) | OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines |
| --- | --- |

(14)

OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines

| (15) | Dearman, R. J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D. A. ja Kimber, I. (1998). Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde. J. Appl. Toxicol. 18, s. 281–284. |
| --- | --- |

(15)

Dearman, R. J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D. A. ja Kimber, I. (1998). Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde. J. Appl. Toxicol. 18, s. 281–284.

| (16) | Kimber, I., Dearman, R. J., Betts, C. J., Gerberick, G. F., Ryan, C. A., Kern, P. S., Patlewicz, G. Y. ja Basketter, D. A. (2006). The local lymph node assay and skin sensitisation: a cut-down screen to reduce animal requirements? Contact Dermatitis 54, s. 181–185. |
| --- | --- |

(16)

Kimber, I., Dearman, R. J., Betts, C. J., Gerberick, G. F., Ryan, C. A., Kern, P. S., Patlewicz, G. Y. ja Basketter, D. A. (2006). The local lymph node assay and skin sensitisation: a cut-down screen to reduce animal requirements? Contact Dermatitis 54, s. 181–185.

| (17) | ESAC (2007). Statement on the Reduced Local Lymph Node Assay (rLLNA). Euroopan komission pääosasto – yhteinen tutkimuskeskus, kuluttajien terveyden ja kuluttajansuojan laitos, Euroopan vaihtoehtoisten menetelmien validointikeskus, huhtikuu 2007. Saatavilla osoitteessa http://ecvam.jrc.it/ft_doc/ESAC26_statement_rLLNA_20070525-1.pdf |
| --- | --- |

(17)

ESAC (2007). Statement on the Reduced Local Lymph Node Assay (rLLNA). Euroopan komission pääosasto – yhteinen tutkimuskeskus, kuluttajien terveyden ja kuluttajansuojan laitos, Euroopan vaihtoehtoisten menetelmien validointikeskus, huhtikuu 2007. Saatavilla osoitteessa http://ecvam.jrc.it/ft_doc/ESAC26_statement_rLLNA_20070525-1.pdf

| (18) | ICCVAM (2009). The Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) Test Method Evaluation Report. The Reduced Murine Local Lymph Node Assay: An Alternative Test Method Using Fewer Animals to Assess the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals and Products. NIH-julkaisunumero 09-6439. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/ |
| --- | --- |

(18)

ICCVAM (2009). The Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) Test Method Evaluation Report. The Reduced Murine Local Lymph Node Assay: An Alternative Test Method Using Fewer Animals to Assess the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals and Products. NIH-julkaisunumero 09-6439. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/

| (19) | ICCVAM (1999). The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Compounds, The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH-julkaisunumero 99-4494. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf |
| --- | --- |

(19)

ICCVAM (1999). The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Compounds, The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH-julkaisunumero 99-4494. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf

| (20) | Kreiling, R., Hollnagel, H. M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M. S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. ja Wendel, A. (2008). Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol. 46, s. 1896–1904. |
| --- | --- |

(20)

Kreiling, R., Hollnagel, H. M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M. S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. ja Wendel, A. (2008). Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol. 46, s. 1896–1904.

| (21) | Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J. C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. ja Mehling, A. (2009). Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. Pharmacol 55, s. 90–96. |
| --- | --- |

(21)

Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J. C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. ja Mehling, A. (2009). Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. Pharmacol 55, s. 90–96.

| (22) | ICCVAM (2009). ICCVAM Test Method Evaluation Report. Assessment of the Validity of the LLNA for Testing Pesticide Formulations and Other Products, Metals, and Substances in Aqueous Solutions. NIH-julkaisunumero 10-7512. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/ |
| --- | --- |

(22)

ICCVAM (2009). ICCVAM Test Method Evaluation Report. Assessment of the Validity of the LLNA for Testing Pesticide Formulations and Other Products, Metals, and Substances in Aqueous Solutions. NIH-julkaisunumero 10-7512. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/

| (23) | ILAR (1996). Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 7. painos. Washington, DC: National Academies Press. |
| --- | --- |

(23)

ILAR (1996). Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 7. painos. Washington, DC: National Academies Press.

| (24) | McGarry, H. F. (2007). The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH. Toxicol. 238, s. 71–89. |
| --- | --- |

(24)

McGarry, H. F. (2007). The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH. Toxicol. 238, s. 71–89.

| (25) | OECD (2002). Acute Dermal Irritation/Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 404. Pariisi, Ranska. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/document/40/0,3343,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html |
| --- | --- |

(25)

OECD (2002). Acute Dermal Irritation/Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 404. Pariisi, Ranska. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/document/40/0,3343,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html

| (26) | Reeder, M. K., Broomhead, Y. L., DiDonato, L. ja DeGeorge, G. L. (2007). Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances. Toxicologist 96, s. 235. |
| --- | --- |

(26)

Reeder, M. K., Broomhead, Y. L., DiDonato, L. ja DeGeorge, G. L. (2007). Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances. Toxicologist 96, s. 235.

| (27) | ICCVAM (2009). Non-radioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf |
| --- | --- |

(27)

ICCVAM (2009). Non-radioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf

| (28) | Hayes, B. B., Gerber, P. C., Griffey, S. S. ja Meade, B. J. (1998). Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice. Drug. Chem. Toxicol. 21, s. 195–206. |
| --- | --- |

(28)

Hayes, B. B., Gerber, P. C., Griffey, S. S. ja Meade, B. J. (1998). Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice. Drug. Chem. Toxicol. 21, s. 195–206.

| (29) | Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H. C., Ruzicka, T., Ahr, H. J., Lehmann, P. ja Vohr, V. W. (1998). An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxicol. Appl. Pharmacol. 153, s. 83–94. |
| --- | --- |

(29)

Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H. C., Ruzicka, T., Ahr, H. J., Lehmann, P. ja Vohr, V. W. (1998). An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxicol. Appl. Pharmacol. 153, s. 83–94.

| (30) | Woolhiser, M. R., Hayes, B. B. ja Meade, B. J. (1998). A combined murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals. Toxicol. Meth. 8, s. 245–256. |
| --- | --- |

(30)

Woolhiser, M. R., Hayes, B. B. ja Meade, B. J. (1998). A combined murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals. Toxicol. Meth. 8, s. 245–256.

| (31) | Hayes, B. B. ja Meade, B. J. (1999). Contact sensitivity to selected acrylate compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods. Drug. Chem. Toxicol. 22, s. 491–506. |
| --- | --- |

(31)

Hayes, B. B. ja Meade, B. J. (1999). Contact sensitivity to selected acrylate compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods. Drug. Chem. Toxicol. 22, s. 491–506.

| (32) | Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A. O., van Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. ja Vohr, H. W. (2005). A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol. 212, s. 60–68. |
| --- | --- |

(32)

Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A. O., van Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. ja Vohr, H. W. (2005). A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol. 212, s. 60–68.

| (33) | Vohr, H. W. ja Ahr, H. J. (2005). The local lymph node assay being too sensitive? Arch. Toxicol. 79, s. 721–728. |
| --- | --- |

(33)

Vohr, H. W. ja Ahr, H. J. (2005). The local lymph node assay being too sensitive? Arch. Toxicol. 79, s. 721–728.

| (34) | Patterson, R. M., Noga, E. ja Germolec, D. (2007). Lack of evidence for contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect. 115, s. 1023–1028. |
| --- | --- |

(34)

Patterson, R. M., Noga, E. ja Germolec, D. (2007). Lack of evidence for contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect. 115, s. 1023–1028.

| (35) | OECD (1987). Acute Dermal Toxicity, OECD Guideline for Testing of Chemicals No 402. Pariisi, Ranska. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines |
| --- | --- |

(35)

OECD (1987). Acute Dermal Toxicity, OECD Guideline for Testing of Chemicals No 402. Pariisi, Ranska. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines

| (36) | ICCVAM (2009). Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm |
| --- | --- |

(36)

ICCVAM (2009). Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm

| (37) | OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines |
| --- | --- |

(37)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines

Lisäys 1

Suoritusvaatimukset ehdotettujen samanlaisten tai mukautettujen ihoherkistyksen LLNA-testimenetelmien arviointia varten

JOHDANTO

| 1. | Suoritusvaatimusten tarkoituksena on antaa arviointiperusteet, joiden avulla voidaan määrittää, ovatko uudet testimenetelmät – niin yksinoikeudelliset (eli tekijänoikeudelliset, tavaramerkityt tai rekisteröidyt) kuin muut kuin yksinoikeudelliset – riittävän tarkkoja ja luotettavia tiettyjä testaustarkoituksia varten. Näitä validoituihin ja hyväksyttyihin testimenetelmiin perustuvia suoritusvaatimuksia voidaan käyttää muiden samanlaisten menetelmien (niin sanottujen me-too-testien) luotettavuuden ja täsmällisyyden arviointiin, kun kyseiset menetelmät perustuvat samanlaisiin tieteellisiin periaatteisiin ja niillä mitataan tai ennakoidaan samaa biologista tai toksista vaikutusta (14). |
| --- | --- |

1.

Suoritusvaatimusten tarkoituksena on antaa arviointiperusteet, joiden avulla voidaan määrittää, ovatko uudet testimenetelmät – niin yksinoikeudelliset (eli tekijänoikeudelliset, tavaramerkityt tai rekisteröidyt) kuin muut kuin yksinoikeudelliset – riittävän tarkkoja ja luotettavia tiettyjä testaustarkoituksia varten. Näitä validoituihin ja hyväksyttyihin testimenetelmiin perustuvia suoritusvaatimuksia voidaan käyttää muiden samanlaisten menetelmien (niin sanottujen me-too-testien) luotettavuuden ja täsmällisyyden arviointiin, kun kyseiset menetelmät perustuvat samanlaisiin tieteellisiin periaatteisiin ja niillä mitataan tai ennakoidaan samaa biologista tai toksista vaikutusta (14).

| 2. | Ennen menetelmien muuttamisen (eli hyväksytyn testimenetelmän ehdotetun mahdollisen parantamisen) hyväksymistä on arvioitava ehdotettujen muutosten vaikutus testin suorituskykyyn ja se, missä määrin kyseiset muutokset vaikuttavat validointimenettelyn muita osia varten saatavilla oleviin tietoihin. Ehdotettujen muutosten määrästä ja luonteesta, saaduista mittaustuloksista ja kyseisiä muutoksia tukevasta asiakirja-aineistosta riippuen menetelmän muutoksille on tehtävä uudelle testille kuvatun kaltainen validointimenettely tai tarvittaessa luotettavuuden ja merkityksellisyyden rajattu arviointi käyttämällä vakiintuneita suoritusvaatimuksia (14). |
| --- | --- |

2.

Ennen menetelmien muuttamisen (eli hyväksytyn testimenetelmän ehdotetun mahdollisen parantamisen) hyväksymistä on arvioitava ehdotettujen muutosten vaikutus testin suorituskykyyn ja se, missä määrin kyseiset muutokset vaikuttavat validointimenettelyn muita osia varten saatavilla oleviin tietoihin. Ehdotettujen muutosten määrästä ja luonteesta, saaduista mittaustuloksista ja kyseisiä muutoksia tukevasta asiakirja-aineistosta riippuen menetelmän muutoksille on tehtävä uudelle testille kuvatun kaltainen validointimenettely tai tarvittaessa luotettavuuden ja merkityksellisyyden rajattu arviointi käyttämällä vakiintuneita suoritusvaatimuksia (14).

| 3. | Tähän testaustarkoitukseen käytettäväksi ehdotettujen samanlaisten tai mukautettujen menetelmien luotettavuus ja tarkkuus olisi määritettävä käyttämällä kemikaaleja, jotka edustavat kattavasti kaikkia LLNA:n pisteytysarvoja. Eläinten tarpeettoman käytön välttämiseksi suositellaan painokkaasti, että mallien kehittäjät kuulevat asiasta vastaavia viranomaisia ennen validointitutkimusten käynnistämistä suoritusvaatimusten ja tässä testimenetelmässä esitettyjen ohjeiden mukaisesti. |
| --- | --- |

3.

Tähän testaustarkoitukseen käytettäväksi ehdotettujen samanlaisten tai mukautettujen menetelmien luotettavuus ja tarkkuus olisi määritettävä käyttämällä kemikaaleja, jotka edustavat kattavasti kaikkia LLNA:n pisteytysarvoja. Eläinten tarpeettoman käytön välttämiseksi suositellaan painokkaasti, että mallien kehittäjät kuulevat asiasta vastaavia viranomaisia ennen validointitutkimusten käynnistämistä suoritusvaatimusten ja tässä testimenetelmässä esitettyjen ohjeiden mukaisesti.

| 4. | Nämä suoritusvaatimukset perustuvat Yhdysvaltain US-ICCVAM:in, EU:n EC-ECVAM:in ja Japanin JaCVAM:in yhdenmukaistettuihin suoritusvaatimuksiin (12), joilla arvioidaan LLNA:n samanlaisten tai mukautettujen versioiden pätevyyttä. Suoritusvaatimukset koskevat testimenetelmän olennaisia osia, suositeltuja vertailukemikaaleja ja tarkkuus- ja luotettavuusvaatimuksia, jotka ehdotetun menetelmän olisi saavutettava tai ylitettävä. |
| --- | --- |

4.

Nämä suoritusvaatimukset perustuvat Yhdysvaltain US-ICCVAM:in, EU:n EC-ECVAM:in ja Japanin JaCVAM:in yhdenmukaistettuihin suoritusvaatimuksiin (12), joilla arvioidaan LLNA:n samanlaisten tai mukautettujen versioiden pätevyyttä. Suoritusvaatimukset koskevat testimenetelmän olennaisia osia, suositeltuja vertailukemikaaleja ja tarkkuus- ja luotettavuusvaatimuksia, jotka ehdotetun menetelmän olisi saavutettava tai ylitettävä.

I.   Olennaiset testimenetelmän osat

| 5. | Jotta samanlainen tai mukautettu LLNA-menetelmä vastaisi toiminnallisesti ja mekaanisesti LLNA:ta jotta varmistettaisiin, että sillä mitataan samaa biologista vaikutusta, testausprotokollassa on oltava seuraavat osat:






  — | Testiainetta on applikoitava paikallisesti hiiren molempiin korviin. |
| --- | --- | --- |

5.

Jotta samanlainen tai mukautettu LLNA-menetelmä vastaisi toiminnallisesti ja mekaanisesti LLNA:ta jotta varmistettaisiin, että sillä mitataan samaa biologista vaikutusta, testausprotokollassa on oltava seuraavat osat:

—

Testiainetta on applikoitava paikallisesti hiiren molempiin korviin.

| — | Lymfosyyttien proliferaatio on mitattava niissä imusolmukkeissa, jotka dreneeraavat alueelta, johon testiaine on annosteltu. |
| --- | --- |

—

Lymfosyyttien proliferaatio on mitattava niissä imusolmukkeissa, jotka dreneeraavat alueelta, johon testiaine on annosteltu.

| — | Lymfosyyttien proliferaatio on mitattava ihoherkistyksen induktiovaiheessa. |
| --- | --- |

—

Lymfosyyttien proliferaatio on mitattava ihoherkistyksen induktiovaiheessa.

| — | Testiaineiden suurimpana valittuna annoksena on käytettävä suurinta konsentraatiota, joka ei vielä aiheuta hiiressä koko elimistöön kohdistuvaa toksisuutta ja/tai liian voimakasta paikallista ihoärsytystä. Positiivisten vertailukemikaalien suurimpana annoksena on käytettävä annosta, joka vastaa vähintään vastaavien vertailukemikaalien LLNA EC3 -arvoja (katso taulukko 1) ilman, että se aiheuttaa hiiressä koko elimistöön kohdistuvaa toksisuutta ja/tai liian voimakasta paikallista ihoärsytystä. |
| --- | --- |

—

Testiaineiden suurimpana valittuna annoksena on käytettävä suurinta konsentraatiota, joka ei vielä aiheuta hiiressä koko elimistöön kohdistuvaa toksisuutta ja/tai liian voimakasta paikallista ihoärsytystä. Positiivisten vertailukemikaalien suurimpana annoksena on käytettävä annosta, joka vastaa vähintään vastaavien vertailukemikaalien LLNA EC3 -arvoja (katso taulukko 1) ilman, että se aiheuttaa hiiressä koko elimistöön kohdistuvaa toksisuutta ja/tai liian voimakasta paikallista ihoärsytystä.

| — | Jokaiseen tutkimukseen on sisällytettävä samaan aikaan määritetty kantaja-ainekontrolliryhmä ja tarvittaessa myös samaan aikaan määritetty positiivinen kontrollikemikaali. |
| --- | --- |

—

Jokaiseen tutkimukseen on sisällytettävä samaan aikaan määritetty kantaja-ainekontrolliryhmä ja tarvittaessa myös samaan aikaan määritetty positiivinen kontrollikemikaali.

| — | Kussakin annosryhmässä on oltava vähintään neljä eläintä. |
| --- | --- |

—

Kussakin annosryhmässä on oltava vähintään neljä eläintä.

| — | Tietoja voidaan kerätä joko eläinkohtaisesti tai ryhmäkohtaisesti. |
| --- | --- |

—

Tietoja voidaan kerätä joko eläinkohtaisesti tai ryhmäkohtaisesti.

Jos kaikkia vaatimuksia ei täytetä, suoritusvaatimuksilla ei voida validoida samanlaista tai mukautettua menetelmää.

II.   Vertailukemikaalien vähimmäisluettelo

| 6. | Yhdysvaltain US-ICCVAM:in, EU:n EC-ECVAM:in ja Japanin JaCVAM:in yhdenmukaistetuissa suoritusvaatimuksissa (12) on määritetty 18 pakollista vähimmäisvertailukemikaalia ja neljä valinnaista vertailukemikaalia (aineita, joilla saadaan LLNA-menetelmässä aikaan vääriä positiivisia tai vääriä negatiivisia tuloksia ihmis- ja marsutestien tuloksiin verrattuna (B.6 tai OECD:n testiohje 406) (13) ja joiden avulla voidaan näin ollen osoittaa LLNA-menetelmää vastaava tai parempi suorituskyky), jotka on sisällytetty LLNA-menetelmän suoritusvaatimuksiin. Näiden kemikaalien valinnassa on sovellettu seuraavia perusteita:






  — | Vertailukemikaalien luettelo edustaa niitä ainetyyppejä, joiden ihoärsytyspotentiaalia yleensä testataan, ja kaikkia niitä vasteita, joita LLNA-menetelmällä voidaan mitata tai ennustaa. |
| --- | --- | --- |

6.

Yhdysvaltain US-ICCVAM:in, EU:n EC-ECVAM:in ja Japanin JaCVAM:in yhdenmukaistetuissa suoritusvaatimuksissa (12) on määritetty 18 pakollista vähimmäisvertailukemikaalia ja neljä valinnaista vertailukemikaalia (aineita, joilla saadaan LLNA-menetelmässä aikaan vääriä positiivisia tai vääriä negatiivisia tuloksia ihmis- ja marsutestien tuloksiin verrattuna (B.6 tai OECD:n testiohje 406) (13) ja joiden avulla voidaan näin ollen osoittaa LLNA-menetelmää vastaava tai parempi suorituskyky), jotka on sisällytetty LLNA-menetelmän suoritusvaatimuksiin. Näiden kemikaalien valinnassa on sovellettu seuraavia perusteita:

—

Vertailukemikaalien luettelo edustaa niitä ainetyyppejä, joiden ihoärsytyspotentiaalia yleensä testataan, ja kaikkia niitä vasteita, joita LLNA-menetelmällä voidaan mitata tai ennustaa.

| — | Aineiden kemiallinen rakenne on määritetty täsmällisesti. |
| --- | --- |

—

Aineiden kemiallinen rakenne on määritetty täsmällisesti.

| — | LLNA-menetelmän tiedot marsutesteistä (B.6; OECD:n testiohje 406) (13) ja mahdolliset tiedot ihmiskokeista ovat saatavilla kunkin aineen osalta. |
| --- | --- |

—

LLNA-menetelmän tiedot marsutesteistä (B.6; OECD:n testiohje 406) (13) ja mahdolliset tiedot ihmiskokeista ovat saatavilla kunkin aineen osalta.

| — | Aineet ovat helposti saatavilla kaupallisista lähteistä. |
| --- | --- |

—

Aineet ovat helposti saatavilla kaupallisista lähteistä.

Suositellut vertailukemikaalit luetellaan taulukossa 1. Ehdotetuilla vertailukemikaaleilla tehtävät tutkimukset on arvioitava siinä kantaja-aineessa, joiden kanssa ne luetellaan taulukossa 1. Jos luettelossa mainittua ainetta ei ole saatavilla, muita edellä mainitut valintaperusteet täyttäviä aineita voidaan käyttää asianmukaisin perusteluin.

Taulukko 1

Suositellut vertailukemikaalit LLNA-menetelmän suoritusvaatimuksia varten

| Numero | Kemikaalit (3) | CAS-nro | Olomuoto | K-aine (4) | EC3 % (5) | N (6) | 0,5x – 2,0x EC3 | Todellinen EC3-vaihteluväli | LLNA vs. M | LLNA vs. ihminen |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| 1 | 5-Kloori-2-metyyli-4-isotiatsolin-3-oni (CMI) / 2-metyyli-4-isotiatsolin-3-oni (MI) (7) | 26172-55-4/2682-20-4 | Nest. | DMF | 0,009 | 1 | 0,0045–0,018 | EL | +/+ | +/+ |
| 2 | DNCB | 97-00-7 | Kiint. | AOO | 0,049 | 15 | 0,025–0,099 | 0,02–0,094 | +/+ | +/+ |
| 3 | 4-Fenyleenidiamiini | 106-50-3 | Kiint. | AOO | 0,11 | 6 | 0,055–0,22 | 0,07–0,16 | +/+ | +/+ |
| 4 | Kobolttikloridi | 7646-79-9 | Kiint. | DMSO | 0,6 | 2 | 0,3–1,2 | 0,4–0,8 | +/+ | +/+ |
| 5 | Isoeugenoli | 97-54-1 | Nest. | AOO | 1,5 | 47 | 0,77–3,1 | 0,5–3,3 | +/+ | +/+ |
| 6 | 2-Merkaptobentsotiatsoli | 149-30-4 | Kiint. | DMF | 1,7 | 1 | 0,85–3,4 | EL | +/+ | +/+ |
| 7 | Sitraali | 5392-40-5 | Nest. | AOO | 9,2 | 6 | 4,6–18,3 | 5,1–13 | +/+ | +/+ |
| 8 | HCA | 101-86-0 | Nest. | AOO | 9,7 | 21 | 4,8–19,5 | 4,4–14,7 | +/+ | +/+ |
| 9 | Eugenoli | 97-53-0 | Nest. | AOO | 10,1 | 11 | 5,05–20,2 | 4,9–15 | +/+ | +/+ |
| 10 | Fenyylibentsoaatti | 93-99-2 | Kiint. | AOO | 13,6 | 3 | 6,8–27,2 | 1,2–20 | +/+ | +/+ |
| 11 | Kanelialkoholi | 104-54-1 | Kiint. | AOO | 21 | 1 | 10,5–42 | EL | +/+ | +/+ |
| 12 | Imidatsolidinyyliurea | 39236-46-9 | Kiint. | DMF | 24 | 1 | 12–48 | EL | +/+ | +/+ |
| 13 | Metyylimetakrylaatti | 80-62-6 | Nest. | AOO | 90 | 1 | 45–100 | – | +/+ | +/+ |
| 14 | Klooribentseeni | 108-90-7 | Nest. | AOO | 25 | 1 | ES | ES | –/– | –/ (1) |
| 15 | Isopropanoli | 67-63-0 | Nest. | AOO | 50 | 1 | ES | ES | –/– | –/+ |
| 16 | Maitohappo | 50-21-5 | Nest. | DMSO | 25 | 1 | ES | ES | –/– | –/ (1) |
| 17 | Metyylisalisylaatti | 119-36-8 | Nest. | AOO | 20 | 9 | ES | ES | –/– | –/– |
| 18 | Salisyylihappo | 69-72-7 | Kiint. | AOO | 25 | 1 | ES | ES | –/– | –/– |
| Valinnaiset aineet, joilla osoitetaan suorituskyvyn paraneminen LLNA-menetelmään verrattuna |
| 19 | Natriumlauryylisulfaatti | 151-21-3 | Kiint. | DMF | 8,1 | 5 | 4,05–16,2 | 1,5–17,1 | +/– | +/– |
| 20 | Etyleeniglykolidimetakrylaatti | 97-90-5 | Nest. | MEK | 28 | 1 | 14–56 | EL | +/– | +/+ |
| 21 | Ksyleeni | 1330-20-7 | Nest. | AOO | 95,8 | 1 | 47,9–100 | EL | +/ (2) | +/– |
| 22 | Nikkelikloridi | 7718-54-9 | Kiint. | DMSO | 5 | 2 | ES | ES | –/+ | –/+ |
| Lyhenteet: AOO = asetoni:oliiviöljy (4:1 v/v); CAS-nro = Chemical Abstracts Service Number; DMF = N,N-dimetyyliformamidi; DMSO = dimetyylisulfoksidi; DNCB = 2,4-dinitroklooribentseeni; EC3 = arvioitu konsentraatio, jolla saadaan aikaan stimulaatioindeksi 3; M = marsutestin tulos (B.6 tai OECD:n testiohje 406) (12); HCA = heksyylikanelialdehydi; Nest. = neste; LLNA = hiirelle tehtävän paikallisen imusolmukemääritysmenetelmän tulos (B.42 tai OECD:n testiohje 429) (1); MEK = metyylietyyliketoni; ES = ei sovelleta, koska stimulaatioindeksi < 3; EL = ei laskettu, koska tiedot on saatu yhdestä tutkimuksesta; Kiint. = kiinteä; K-aine = testissä käytettävä kantaja-aine. |

Numero

Kemikaalit (3)

CAS-nro

Olomuoto

K-aine (4)

EC3 % (5)

N (6)

0,5x – 2,0x EC3

Todellinen EC3-vaihteluväli

LLNA vs. M

LLNA vs. ihminen

1

5-Kloori-2-metyyli-4-isotiatsolin-3-oni (CMI) / 2-metyyli-4-isotiatsolin-3-oni (MI) (7)

26172-55-4/2682-20-4

Nest.

DMF

0,009

1

0,0045–0,018

EL

+/+

+/+

2

DNCB

97-00-7

Kiint.

AOO

0,049

15

0,025–0,099

0,02–0,094

+/+

+/+

3

4-Fenyleenidiamiini

106-50-3

Kiint.

AOO

0,11

6

0,055–0,22

0,07–0,16

+/+

+/+

4

Kobolttikloridi

7646-79-9

Kiint.

DMSO

0,6

2

0,3–1,2

0,4–0,8

+/+

+/+

5

Isoeugenoli

97-54-1

Nest.

AOO

1,5

47

0,77–3,1

0,5–3,3

+/+

+/+

6

2-Merkaptobentsotiatsoli

149-30-4

Kiint.

DMF

1,7

1

0,85–3,4

EL

+/+

+/+

7

Sitraali

5392-40-5

Nest.

AOO

9,2

6

4,6–18,3

5,1–13

+/+

+/+

8

HCA

101-86-0

Nest.

AOO

9,7

21

4,8–19,5

4,4–14,7

+/+

+/+

9

Eugenoli

97-53-0

Nest.

AOO

10,1

11

5,05–20,2

4,9–15

+/+

+/+

10

Fenyylibentsoaatti

93-99-2

Kiint.

AOO

13,6

3

6,8–27,2

1,2–20

+/+

+/+

11

Kanelialkoholi

104-54-1

Kiint.

AOO

21

1

10,5–42

EL

+/+

+/+

12

Imidatsolidinyyliurea

39236-46-9

Kiint.

DMF

24

1

12–48

EL

+/+

+/+

13

Metyylimetakrylaatti

80-62-6

Nest.

AOO

90

1

45–100

–

+/+

+/+

14

Klooribentseeni

108-90-7

Nest.

AOO

25

1

ES

ES

–/–

–/ (1)

15

Isopropanoli

67-63-0

Nest.

AOO

50

1

ES

ES

–/–

–/+

16

Maitohappo

50-21-5

Nest.

DMSO

25

1

ES

ES

–/–

–/ (1)

17

Metyylisalisylaatti

119-36-8

Nest.

AOO

20

9

ES

ES

–/–

–/–

18

Salisyylihappo

69-72-7

Kiint.

AOO

25

1

ES

ES

–/–

–/–

Valinnaiset aineet, joilla osoitetaan suorituskyvyn paraneminen LLNA-menetelmään verrattuna

19

Natriumlauryylisulfaatti

151-21-3

Kiint.

DMF

8,1

5

4,05–16,2

1,5–17,1

+/–

+/–

20

Etyleeniglykolidimetakrylaatti

97-90-5

Nest.

MEK

28

1

14–56

EL

+/–

+/+

21

Ksyleeni

1330-20-7

Nest.

AOO

95,8

1

47,9–100

EL

+/ (2)

+/–

22

Nikkelikloridi

7718-54-9

Kiint.

DMSO

5

2

ES

ES

–/+

–/+

Lyhenteet: AOO = asetoni:oliiviöljy (4:1 v/v); CAS-nro = Chemical Abstracts Service Number; DMF = N,N-dimetyyliformamidi; DMSO = dimetyylisulfoksidi; DNCB = 2,4-dinitroklooribentseeni; EC3 = arvioitu konsentraatio, jolla saadaan aikaan stimulaatioindeksi 3; M = marsutestin tulos (B.6 tai OECD:n testiohje 406) (12); HCA = heksyylikanelialdehydi; Nest. = neste; LLNA = hiirelle tehtävän paikallisen imusolmukemääritysmenetelmän tulos (B.42 tai OECD:n testiohje 429) (1); MEK = metyylietyyliketoni; ES = ei sovelleta, koska stimulaatioindeksi < 3; EL = ei laskettu, koska tiedot on saatu yhdestä tutkimuksesta; Kiint. = kiinteä; K-aine = testissä käytettävä kantaja-aine.

III.   Määritellyt luotettavuus- ja tarkkuusvaatimukset

| 7. | Samanlaisen tai mukautetun LLNA-menetelmän tarkkuuden on oltava yhtä suuri tai suurempi kuin LLNA-suoritusvaatimuksissa määritelty tarkkuus, kun sitä arvioidaan käyttämällä 18:aa säädettyä vähimmäisvertailukemikaalia. Uudella tai mukautetulla menetelmällä on voitava suorittaa oikea luokittelu, joka perustuu kyllä/ei-päätökseen. Uudella tai mukautetulla menetelmällä ei kuitenkaan välttämättä voida luokitella asianmukaisesti kaikkia säädettyjä vähimmäisvertailukemikaaleja. Jos esimerkiksi yksi heikkoa herkistystä aiheuttavista aiheista luokitellaan väärin, vastaava suorituskyky voidaan osoittaa esittämällä virheellisen luokittelun perustelut ja muut tarvittavat tiedot (esimerkiksi testitulokset, joilla saadaan oikea sellaisten muiden aineiden luokittelu, joiden fyysiset, kemialliset ja herkistävät ominaisuudet vastaavat väärin luokitellun vertailukemikaalin ominaisuuksia). Tällaisessa tilanteessa uuden tai mukautetun LLNA-testimenetelmän validoinnin tila arvioidaan tapauskohtaisesti. |
| --- | --- |

7.

Samanlaisen tai mukautetun LLNA-menetelmän tarkkuuden on oltava yhtä suuri tai suurempi kuin LLNA-suoritusvaatimuksissa määritelty tarkkuus, kun sitä arvioidaan käyttämällä 18:aa säädettyä vähimmäisvertailukemikaalia. Uudella tai mukautetulla menetelmällä on voitava suorittaa oikea luokittelu, joka perustuu kyllä/ei-päätökseen. Uudella tai mukautetulla menetelmällä ei kuitenkaan välttämättä voida luokitella asianmukaisesti kaikkia säädettyjä vähimmäisvertailukemikaaleja. Jos esimerkiksi yksi heikkoa herkistystä aiheuttavista aiheista luokitellaan väärin, vastaava suorituskyky voidaan osoittaa esittämällä virheellisen luokittelun perustelut ja muut tarvittavat tiedot (esimerkiksi testitulokset, joilla saadaan oikea sellaisten muiden aineiden luokittelu, joiden fyysiset, kemialliset ja herkistävät ominaisuudet vastaavat väärin luokitellun vertailukemikaalin ominaisuuksia). Tällaisessa tilanteessa uuden tai mukautetun LLNA-testimenetelmän validoinnin tila arvioidaan tapauskohtaisesti.

Laboratorionsisäinen uusittavuus

| 8. | Laboratorionsisäisen uusittavuuden määrittämiseksi uutta tai mukautettua LLNA-menetelmää on arvioitava käyttämällä herkistävää ainetta, jonka ominaisuudet on LLNA-menetelmässä määritetty hyvin. Sen vuoksi LLNA-menetelmän suoritusvaatimukset perustuvat heksyylikanelialdehydillä (HCA) toistuvasti tehtyjen testien tulosten vaihteluun. Laboratorionsisäisen luotettavuuden arvioimiseksi HCA:n kynnyskonsentraatioarviot (ECt) on määritettävä neljässä eri testissä niin, että testit tehdään vähintään viikon välein. Laboratorionsisäinen uusittavuus hyväksytään, jos laboratorion kussakin HCA-testissä ECt:ksi saadaan 5–20 %, mikä vastaa LLNA-menetelmässä 0,5–2,0 kertaa HCA:lle määritettyä keskimääräistä EC3:a (10 %) (katso taulukko 1). |
| --- | --- |

8.

Laboratorionsisäisen uusittavuuden määrittämiseksi uutta tai mukautettua LLNA-menetelmää on arvioitava käyttämällä herkistävää ainetta, jonka ominaisuudet on LLNA-menetelmässä määritetty hyvin. Sen vuoksi LLNA-menetelmän suoritusvaatimukset perustuvat heksyylikanelialdehydillä (HCA) toistuvasti tehtyjen testien tulosten vaihteluun. Laboratorionsisäisen luotettavuuden arvioimiseksi HCA:n kynnyskonsentraatioarviot (ECt) on määritettävä neljässä eri testissä niin, että testit tehdään vähintään viikon välein. Laboratorionsisäinen uusittavuus hyväksytään, jos laboratorion kussakin HCA-testissä ECt:ksi saadaan 5–20 %, mikä vastaa LLNA-menetelmässä 0,5–2,0 kertaa HCA:lle määritettyä keskimääräistä EC3:a (10 %) (katso taulukko 1).

Laboratorioidenvälinen uusittavuus

| 9. | Uuden tai mukautetun LLNA-menetelmän laboratorioidenvälistä uusittavuutta on arvioitava käyttämällä kahta herkistävää ainetta, joiden ominaisuudet on LLNA-menetelmässä määritetty hyvin. LLNA-menetelmän suoritusvaatimukset perustuvat HCA:lla ja 2,4-dinitroklooribentseenillä (DNCB) eri laboratorioissa tehtyjen testien tulosten vaihteluun. ECt on määritettävä riippumattomasti yhden sellaisen tutkimuksen perusteella, joka tehdään vähintään kolmessa eri laboratoriossa. Laboratorioidenvälinen uusittavuus hyväksytään, jos kussakin laboratoriossa ECt:ksi saadaan HCA-testissä 5–20 % ja DNCB-testissä 0,025–0,1 %, mikä vastaa LLNA-menetelmässä 0,5–2,0 kertaa HCA:lle määritettyä keskimääräistä EC3:a (10 %) ja DNCB:lle määritettyä EC3:a (0,05 %) (katso taulukko 1). |
| --- | --- |

9.

Uuden tai mukautetun LLNA-menetelmän laboratorioidenvälistä uusittavuutta on arvioitava käyttämällä kahta herkistävää ainetta, joiden ominaisuudet on LLNA-menetelmässä määritetty hyvin. LLNA-menetelmän suoritusvaatimukset perustuvat HCA:lla ja 2,4-dinitroklooribentseenillä (DNCB) eri laboratorioissa tehtyjen testien tulosten vaihteluun. ECt on määritettävä riippumattomasti yhden sellaisen tutkimuksen perusteella, joka tehdään vähintään kolmessa eri laboratoriossa. Laboratorioidenvälinen uusittavuus hyväksytään, jos kussakin laboratoriossa ECt:ksi saadaan HCA-testissä 5–20 % ja DNCB-testissä 0,025–0,1 %, mikä vastaa LLNA-menetelmässä 0,5–2,0 kertaa HCA:lle määritettyä keskimääräistä EC3:a (10 %) ja DNCB:lle määritettyä EC3:a (0,05 %) (katso taulukko 1).

Lisäys 2

Määritelmät

Tarkkuus: Testimenetelmän tulosten ja hyväksyttyjen vertailuarvojen välinen ero. Tarkkuus mittaa testimenetelmän suorituskykyä, ja se on yksi merkityksellisyyden osatekijöistä. Tarkkuutta ja vastaavuutta (konkordanssi) käytetään usein toisiaan korvaavasti tarkoittamaan testimenetelmällä saatujen oikeiden tulosten osuutta (14).

Vertailuaine: Herkistävä tai muu kuin herkistävä aine, jota käytetään testiaineen vertailustandardina. Vertailuaineella olisi oltava seuraavat ominaisuudet: i) luotettava alkuperä, joka pysyy samana; ii) samanlainen rakenne ja toiminta kuin testattavana olevalla ainetyypillä; iii) tunnetut fysikaaliskemialliset ominaisuudet, iv) sopivuutta tukevia tietoja tunnetuista vaikutuksista ja v) tunnettu voimakkuus tavoitellun vasteen vaihteluvälillä.

Kynnyskonsentraatioarvio (ECt): Testiaineen arvioitu konsentraatio, jolla saadaan aikaan stimulaatioindeksi, joka osoittaa positiivisen vasteen.

Kynnyskonsentraatio-3 (EC3): Testiaineen arvioitu konsentraatio, jolla saadaan aikaan stimulaatioindeksi 3.

Väärä negatiivinen: Testiaine on testimenetelmässä määritetty väärin perustein negatiiviseksi tai inaktiiviseksi, vaikka se itse asiassa on positiivinen tai aktiivinen.

Väärä positiivinen: Testiaine on testimenetelmässä määritetty väärin perustein positiiviseksi tai aktiiviseksi, vaikka se itse asiassa on negatiivinen tai inaktiivinen.

Vaarallisuus: Mahdollisuus kielteiseen terveys- tai ympäristövaikutukseen. Kielteinen vaikutus edellyttää altistumista vähintään tietyllä tasolla.

Laboratorioidenvälinen uusittavuus: Se, missä määrin erilaiset valtuutetut laboratoriot voivat saada aikaan laadullisesti ja määrällisesti samanlaisia tuloksia käyttämällä samoja tutkimussuunnitelmia ja testaamalla samoja testiaineita. Laboratorioidenvälinen uusittavuus määritetään esivalidointi- ja validointimenettelyssä, ja sillä osoitetaan, missä määrin testi voidaan onnistuneesti toteuttaa eri laboratorioissa (14).

Laboratorionsisäinen uusittavuus: Se, missä määrin tietyn laboratorion pätevä henkilöstö voi saada onnistuneesti aikaan samat tulokset käyttämällä tiettyä tutkimussuunnitelmaa eri ajankohtina (14).

Me-too-testi: Puhekielinen nimitys testimenetelmälle, joka on rakenteellisesti ja funktionaalisesti samanlainen kuin validoitu ja hyväksytty vertailutestimenetelmää. Tällainen menetelmä voitaisiin myös validoida. Tarkoittaa samaa kuin ’samanlainen’ testimenetelmä (14).

Käyrän ulkopuolella oleva vaste: Käyrän ulkopuolella olevalla vasteella tarkoitetaan havaintoa, joka poikkeaa merkittävästi muista populaation satunnaistetuista arvoista.

Suoritusvaatimukset: Validoituun testimenetelmään perustuvat vaatimukset, joiden avulla arvioidaan ehdotetun toiminnallisesti ja mekanistisesti samanlaisen testimenetelmän vertailtavuutta. Suoritusvaatimuksiin sisältyvät i) testimenetelmän oleelliset osat; ii) vähimmäisluettelo vertailukemikaaleista, jotka on valittu niiden kemikaalien joukosta, joita on käytetty osoittamaan validoidun vertailumenetelmän hyväksyttävää suorituskykyä; ja iii) samanlaiset validoidusta testimenetelmästä saatuihin tuloksiin perustuvat tarkkuuden ja luotettavuuden tasot, jotka ehdotetun testimenetelmän olisi osoitettava, kun sitä arvioidaan vertailuaineiden vähimmäisluettelon avulla (14).

Yksinoikeudellinen testimenetelmä: Testimenetelmä, jonka valmistamista ja jakelua rajoitetaan patenteilla, tekijänoikeuksilla, tavaramerkeillä ynnä muilla.

Laadunvarmistus: Hallintomenettely, jossa testausta suorittavista henkilöistä riippumattomat henkilöt arvioivat laboratorion testausstandardien, vaatimusten ja kirjanpitomenettelyjen noudattamista ja tiedonsiirron tarkkuutta.

Vertailukemikaalit: Validointimenettelyyn valitut kemikaalit, joiden vasteet in vitro -vertailutestijärjestelmässä tai in vivo kyseisessä lajissa ovat tiedossa. Näiden kemikaalien on vastattava niitä kemikaaliluokkia, joiden yhteydessä kyseistä testimenetelmää todennäköisesti käytetään, ja niiden on edustettava kaikkia niitä vasteita, joita testimenetelmän kohteena olevilta kemikaaleilta voidaan odottaa (voimakkaista lieviin ja negatiivisiin). Validointimenettelyn eri vaiheita sekä eri testimenetelmiä ja testitarkoituksia varten voidaan vaatia erilaisia vertailukemikaaleja (14).

Merkityksellisyys: Kuvaus testin ja aineen vaikutuksen välisestä suhteesta ja siitä, onko testi tarkoituksenmukainen ja hyödyllinen tiettyä tarkoitusta varten. Merkityksellisyydellä tarkoitetaan sitä, missä määrin testillä voidaan tarkasti mitata tai ennustaa kyseisen aineen biologista vaikutusta. Merkityksellisyyden yhteydessä on huomioitava myös testimenetelmän tarkkuus (konkordanssi) (14).

Luotettavuus: Testimenetelmän uusittavuus samassa laboratoriossa tai eri laboratorioissa pitkällä aikavälillä käytettäessä samaa menettelyä. Se arvioidaan laskemalla laboratorionsisäinen ja laboratorioidenvälinen uusittavuus (14).

Ihoherkistys: Immunologinen prosessi, joka aiheutuu herkän yksilön paikallisesta altistamisesta kemialliselle allergeenille, joka aiheuttaa iholla immuunivasteen, joka voi johtaa kosketusherkistykseen.

Stimulaatioindeksi (SI): Testiaineen ihoärsytyspotentiaalin arvioimiseksi laskettu arvo, jolla esitetään käsiteltyjen ryhmien soluproliferaation ja samaan aikaan kantaja-aineella käsitellyn kontrolliryhmän soluproliferaation välinen suhde.

Testiaine (testikemikaali): Aine tai seos, jota testataan tällä testimenetelmällä.

Validoitu testimenetelmä: Testimenetelmä, jolle on tehty validointitutkimukset sen merkityksellisyyden (myös tarkkuuden) ja luotettavuuden määrittämiseksi tiettyä tarkoitusta varten. On syytä pitää mielessä, että validoidun testimenetelmän suorituskyky tarkkuuden ja luotettavuuden osalta ei välttämättä ole riittävä, jotta se voitaisiin hyväksyä ehdotettuun tarkoitukseen (14).

| 2. | Korvataan B.46 luku seuraavasti:

  ”B.46.   
  IN VITRO -IHOÄRSYTTÄVYYS: REKONSTRUOIDUN IHMISORVASKEDEN TESTIMENETELMÄ

  JOHDANTO






  1. | Ihoärsytyksellä tarkoitetaan korjautuvan ihovaurion syntymistä enintään neljä tuntia kestäneen testiaineen annostelun jälkeen (kuten on määritelty Yhdistyneiden kansakuntien (YK) GHS-järjestelmässä (Globally Harmonised System for the Classification and Labelling of Chemical Substances and Mixtures) ja aineiden ja seosten luokituksesta, merkinnöistä ja pakkaamisesta 16 päivänä joulukuuta 2008 annetussa Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksessa (EY) N:o 1272/2008 (CLP-asetus) (1) (3)). Tässä testimenetelmässä selostetaan in vitro -menettely, jolla voidaan määrittää ärsyttävien kemikaalien (aineiden ja seosten) vaarallisuus YK:n GHS-järjestelmän ja EU:n CLP-asetuksen luokan 2 mukaisesti (1) (2) (3). EU:ssa ja muilla alueilla, joilla ei ole hyväksytty YK:n GHS-järjestelmän valinnaista luokkaa 3 (lievästi ärsyttävät aineet), tätä testimenetelmää voidaan käyttää myös luokittelemattomien kemikaalien (YK:n GHS-järjestelmän ja EU:n CLP-asetuksen ’ei luokitusta’) määrittämiseen (1) (3). Tämän testimenetelmän avulla voidaan määrittää kemikaalien ihoärsytys yksittäisenä korvaavana testinä vaiheittaisen testausstrategian in vivo -ihoärsytystestauksen asemesta (4 ja tämän liitteen B.4 luku). |
| --- | --- | --- |

2.

Korvataan B.46 luku seuraavasti:

”B.46.   
  IN VITRO -IHOÄRSYTTÄVYYS: REKONSTRUOIDUN IHMISORVASKEDEN TESTIMENETELMÄ

”B.46.

IN VITRO

JOHDANTO

1.

Ihoärsytyksellä tarkoitetaan korjautuvan ihovaurion syntymistä enintään neljä tuntia kestäneen testiaineen annostelun jälkeen (kuten on määritelty Yhdistyneiden kansakuntien (YK) GHS-järjestelmässä (Globally Harmonised System for the Classification and Labelling of Chemical Substances and Mixtures) ja aineiden ja seosten luokituksesta, merkinnöistä ja pakkaamisesta 16 päivänä joulukuuta 2008 annetussa Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksessa (EY) N:o 1272/2008 (CLP-asetus) (1) (3)). Tässä testimenetelmässä selostetaan in vitro -menettely, jolla voidaan määrittää ärsyttävien kemikaalien (aineiden ja seosten) vaarallisuus YK:n GHS-järjestelmän ja EU:n CLP-asetuksen luokan 2 mukaisesti (1) (2) (3). EU:ssa ja muilla alueilla, joilla ei ole hyväksytty YK:n GHS-järjestelmän valinnaista luokkaa 3 (lievästi ärsyttävät aineet), tätä testimenetelmää voidaan käyttää myös luokittelemattomien kemikaalien (YK:n GHS-järjestelmän ja EU:n CLP-asetuksen ’ei luokitusta’) määrittämiseen (1) (3). Tämän testimenetelmän avulla voidaan määrittää kemikaalien ihoärsytys yksittäisenä korvaavana testinä vaiheittaisen testausstrategian in vivo -ihoärsytystestauksen asemesta (4 ja tämän liitteen B.4 luku).

in vitro

in vivo

| 2. | Ihoärsyttävyyden arviointi on tyypillisesti edellyttänyt koe-eläinten käyttöä (OECD:n testiohje 404; tämän liitteen B.4 luku) (4). Eläinten hyvinvointiin liittyvien näkökohtien osalta menetelmää B.4 tarkistettiin vuonna 2004 niin, että ihosyövyttävyys ja ihoärsyttävyys voidaan määrittää soveltamalla vaiheittaista testausstrategiaa käyttäen in vitro- tai ex vivo -testimenetelmiä, joiden avulla vältetään eläimille aiheutuva kipu ja kärsimys. Kolme validoitua in vitro -testimenetelmää on hyväksytty OECD:n testiohjeina 430, 431 ja 435 (5) (6) (7) ja kaksi tämän liitteen B.40 ja B.40a lukuna, ja niitä voidaan käyttää menetelmän B.4 ja OECD:n testiohjeen 404 vaiheittaisen testausstrategian syövyttävyysosiossa (4). |
| --- | --- |

2.

Ihoärsyttävyyden arviointi on tyypillisesti edellyttänyt koe-eläinten käyttöä (OECD:n testiohje 404; tämän liitteen B.4 luku) (4). Eläinten hyvinvointiin liittyvien näkökohtien osalta menetelmää B.4 tarkistettiin vuonna 2004 niin, että ihosyövyttävyys ja ihoärsyttävyys voidaan määrittää soveltamalla vaiheittaista testausstrategiaa käyttäen in vitro- tai ex vivo -testimenetelmiä, joiden avulla vältetään eläimille aiheutuva kipu ja kärsimys. Kolme validoitua in vitro -testimenetelmää on hyväksytty OECD:n testiohjeina 430, 431 ja 435 (5) (6) (7) ja kaksi tämän liitteen B.40 ja B.40a lukuna, ja niitä voidaan käyttää menetelmän B.4 ja OECD:n testiohjeen 404 vaiheittaisen testausstrategian syövyttävyysosiossa (4).

in vitro

ex vivo

in vitro

| 3. | Tässä testimenetelmässä tarkastellaan ihoärsytystä ihmisten terveyteen liittyvänä määrityskohteena. Tämä testimenetelmä perustuu ihmisen rekonstruoituun orvasketeen (Reconstructed human Epidermis, RhE), joka jäljittelee läheisesti ihmisihon ylemmän kerroksen eli epidermiksen biokemiallisia ja fysiologisia ominaisuuksia (solut ovat peräisin ihmisen orvaskeden keratinosyyteistä, ja testissä käytetään edustavaa kudos- ja soluarkkitehtuuria). Tähän testimenetelmään sisältyy myös sarja suoritusvaatimuksia (lisäys 2), joilla voidaan arvioida samanlaisia ja muunnettuja rekonstruoituun ihmisorvasketeen perustuvia menetelmiä. Suoritusvaatimukset on kehittänyt EC-ECVAM (8) OECD:n ohjeasiakirjan nro 34 (9) periaatteiden mukaisesti. |
| --- | --- |

3.

Tässä testimenetelmässä tarkastellaan ihoärsytystä ihmisten terveyteen liittyvänä määrityskohteena. Tämä testimenetelmä perustuu ihmisen rekonstruoituun orvasketeen (Reconstructed human Epidermis, RhE), joka jäljittelee läheisesti ihmisihon ylemmän kerroksen eli epidermiksen biokemiallisia ja fysiologisia ominaisuuksia (solut ovat peräisin ihmisen orvaskeden keratinosyyteistä, ja testissä käytetään edustavaa kudos- ja soluarkkitehtuuria). Tähän testimenetelmään sisältyy myös sarja suoritusvaatimuksia (lisäys 2), joilla voidaan arvioida samanlaisia ja muunnettuja rekonstruoituun ihmisorvasketeen perustuvia menetelmiä. Suoritusvaatimukset on kehittänyt EC-ECVAM (8) OECD:n ohjeasiakirjan nro 34 (9) periaatteiden mukaisesti.

| 4. | On olemassa kolme validoitua menetelmää, joissa noudatetaan tätä testimenetelmää. Validointia edeltävää vaihetta, optimointia ja validointia koskevat tutkimukset on saatettu päätökseen sen in vitro -menetelmän (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) osalta, jossa käytetään rekonstruoitua ihmisorvaskesimallia ja joka on kaupallisesti saatavilla nimellä EpiSkinTM (’validoitu vertailumenetelmä’, VVM). Kahdesta muusta kaupallisesti saatavilla olevasta ihoärsytyksen in vitro -menetelmästä, joissa käytetään RhE-menetelmää, on saatu samankaltaisia tuloksia kuin VVM:stä suoritusvaatimuksiin perustuvan validoinnin (21) perusteella. Nämä menetelmät ovat EpiDermTM-ihoärsytystesti (EPI-200) ja SkinEthicTM-RhE-menetelmät (22). |
| --- | --- |

4.

On olemassa kolme validoitua menetelmää, joissa noudatetaan tätä testimenetelmää. Validointia edeltävää vaihetta, optimointia ja validointia koskevat tutkimukset on saatettu päätökseen sen in vitro -menetelmän (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) osalta, jossa käytetään rekonstruoitua ihmisorvaskesimallia ja joka on kaupallisesti saatavilla nimellä EpiSkinTM (’validoitu vertailumenetelmä’, VVM). Kahdesta muusta kaupallisesti saatavilla olevasta ihoärsytyksen in vitro -menetelmästä, joissa käytetään RhE-menetelmää, on saatu samankaltaisia tuloksia kuin VVM:stä suoritusvaatimuksiin perustuvan validoinnin (21) perusteella. Nämä menetelmät ovat EpiDermTM-ihoärsytystesti (EPI-200) ja SkinEthicTM-RhE-menetelmät (22).

in vitro

TM

in vitro

TM

TM

| 5. | Ennen kuin ehdotettua samanlaista tai mukautettua in vitro -RhE-menetelmää, joka ei ole VVM, EpiDermTM-ihoärsytystesti (EPI-200) tai SkinEthicTM-RhE-menetelmä, voidaan käyttää lainsäädännössä määriteltyihin tarkoituksiin, sen luotettavuus, merkittävyys (tarkkuus) ja ehdotetun käytön rajoitukset on määritettävä, jotta voidaan varmistaa, että sitä voidaan verrata VVM:ään tässä testimenetelmässä (lisäys 2) vahvistetuissa suoritusvaatimuksissa asetettujen vaatimusten mukaisesti. Lisäksi suositellaan, että ennen samanlaisen tai mukautetun in vitro -RhE-menetelmän validointia ja toimittamista sääntelyviranomaisten hyväksyttäväksi on syytä tarkastella in vitro -ihoärsytystestausta koskevaa OECD:n perusteluasiakirjaa (23). |
| --- | --- |

5.

Ennen kuin ehdotettua samanlaista tai mukautettua in vitro -RhE-menetelmää, joka ei ole VVM, EpiDermTM-ihoärsytystesti (EPI-200) tai SkinEthicTM-RhE-menetelmä, voidaan käyttää lainsäädännössä määriteltyihin tarkoituksiin, sen luotettavuus, merkittävyys (tarkkuus) ja ehdotetun käytön rajoitukset on määritettävä, jotta voidaan varmistaa, että sitä voidaan verrata VVM:ään tässä testimenetelmässä (lisäys 2) vahvistetuissa suoritusvaatimuksissa asetettujen vaatimusten mukaisesti. Lisäksi suositellaan, että ennen samanlaisen tai mukautetun in vitro -RhE-menetelmän validointia ja toimittamista sääntelyviranomaisten hyväksyttäväksi on syytä tarkastella in vitro -ihoärsytystestausta koskevaa OECD:n perusteluasiakirjaa (23).

in vitro

TM

TM

in vitro

in vitro

MÄÄRITELMÄT

| 6. | Sovellettavat määritelmät esitetään lisäyksessä 1. |
| --- | --- |

6.

Sovellettavat määritelmät esitetään lisäyksessä 1.

ALUSTAVIA POHDINTOJA JA RAJOITUKSET

| 7. | Validointitutkimuksen (16) mukaisesti tämän testimenetelmän rajoituksena on, että kemikaalien luokittelu YK:n GHS-luokkaan 3 (lievästi ärsyttävät aineet) (1) ei ole mahdollista. Myöhemmin tehtävä in vivo -testaus voi olla tarpeen osittain korvaavana testinä ihoärsytyspotentiaalin ominaisuuksien täydellistä määrittämistä varten (4 ja tämän liitteen B.4 luku). On syytä muistaa, että ihmisihon käyttöön liittyy kansallisia ja kansainvälisiä eettisiä näkökohtia ja ehtoja. |
| --- | --- |

7.

Validointitutkimuksen (16) mukaisesti tämän testimenetelmän rajoituksena on, että kemikaalien luokittelu YK:n GHS-luokkaan 3 (lievästi ärsyttävät aineet) (1) ei ole mahdollista. Myöhemmin tehtävä in vivo -testaus voi olla tarpeen osittain korvaavana testinä ihoärsytyspotentiaalin ominaisuuksien täydellistä määrittämistä varten (4 ja tämän liitteen B.4 luku). On syytä muistaa, että ihmisihon käyttöön liittyy kansallisia ja kansainvälisiä eettisiä näkökohtia ja ehtoja.

in vivo

| 8. | Tässä testimenetelmässä tarkastellaan ihoärsyttävyyttä/-syövyttävyyttä koskevan B.4 menetelmän vaiheittaisen testausstrategian in vitro -ihoärsyttävyysosiota (OECD:n testiohje 404) (4). Vaikka tällä testimenetelmällä ei saada riittävästi tietoja ihosyövyttävyydestä, on syytä panna merkille, että ihosyövyttävyyttä koskeva B.40a menetelmä (OECD:n testiohje 431) perustuu samaan RhE-testijärjestelmään, mutta siinä käytetään muuta tutkimussuunnitelmaa (B.40a luku). Tässä selostettu menetelmä perustuu RhE-malleihin, joissa käytetään ihmisistä peräisin olevia keratinosyyttejä, jotka näin ollen edustavat tarkasteltavana olevan lajin kohde-elintä in vitro. Menetelmä kattaa suoraan myös aluksi esiintyvän tulehdusreaktion ja/tai reaktiomekanismin (soluvauriot ja paikalliseen vammaan johtavat kudosvauriot), joka tapahtuu in vivo -ärsytyksen aikana. Tämän testimenetelmän validoinnin yhteydessä on testattu useita erilaisia kemikaaleja, ja validointitutkimuksessa kerättyyn tietopankkiin käsittää yhteensä 58 kemikaalia (16) (18) (23). Menetelmää voidaan käyttää kiinteisiin aineisiin, nesteisiin, puolikiinteisiin aineisiin ja vahamaisiin aineisiin. Nesteet voivat olla vesiliuoksia tai orgaanisia liuoksia; kiinteät aineet voivat olla joko veteen liukenevia tai veteen liukenemattomia. Kiinteät aineet on mahdollisuuksien mukaan jauhettava hienoksi jauhoksi ennen applikointia; näytteen muuta esikäsittelyä ei vaadita. Kaasuja ja aerosoleja ei ole vielä arvioitu validointitutkimuksessa (24). Vaikka voidaan ajatella, että niitä voidaan testata RhE-tekniikalla, tällä testimenetelmällä kaasuja ja aerosoleja ei voida testata. On myös pantava merkille, että voimakkaanväriset kemikaalit voivat häiritä solujen elinkyvyn mittausta, joten on käytettävä mukautettuja kontrolleja (katso 24–26 kohta). |
| --- | --- |

8.

Tässä testimenetelmässä tarkastellaan ihoärsyttävyyttä/-syövyttävyyttä koskevan B.4 menetelmän vaiheittaisen testausstrategian in vitro -ihoärsyttävyysosiota (OECD:n testiohje 404) (4). Vaikka tällä testimenetelmällä ei saada riittävästi tietoja ihosyövyttävyydestä, on syytä panna merkille, että ihosyövyttävyyttä koskeva B.40a menetelmä (OECD:n testiohje 431) perustuu samaan RhE-testijärjestelmään, mutta siinä käytetään muuta tutkimussuunnitelmaa (B.40a luku). Tässä selostettu menetelmä perustuu RhE-malleihin, joissa käytetään ihmisistä peräisin olevia keratinosyyttejä, jotka näin ollen edustavat tarkasteltavana olevan lajin kohde-elintä in vitro. Menetelmä kattaa suoraan myös aluksi esiintyvän tulehdusreaktion ja/tai reaktiomekanismin (soluvauriot ja paikalliseen vammaan johtavat kudosvauriot), joka tapahtuu in vivo -ärsytyksen aikana. Tämän testimenetelmän validoinnin yhteydessä on testattu useita erilaisia kemikaaleja, ja validointitutkimuksessa kerättyyn tietopankkiin käsittää yhteensä 58 kemikaalia (16) (18) (23). Menetelmää voidaan käyttää kiinteisiin aineisiin, nesteisiin, puolikiinteisiin aineisiin ja vahamaisiin aineisiin. Nesteet voivat olla vesiliuoksia tai orgaanisia liuoksia; kiinteät aineet voivat olla joko veteen liukenevia tai veteen liukenemattomia. Kiinteät aineet on mahdollisuuksien mukaan jauhettava hienoksi jauhoksi ennen applikointia; näytteen muuta esikäsittelyä ei vaadita. Kaasuja ja aerosoleja ei ole vielä arvioitu validointitutkimuksessa (24). Vaikka voidaan ajatella, että niitä voidaan testata RhE-tekniikalla, tällä testimenetelmällä kaasuja ja aerosoleja ei voida testata. On myös pantava merkille, että voimakkaanväriset kemikaalit voivat häiritä solujen elinkyvyn mittausta, joten on käytettävä mukautettuja kontrolleja (katso 24–26 kohta).

in vitro

in vitro

in vivo

| 9. | Kun testikemikaalin luokittelu on yksiselitteinen, se voidaan testata yhdessä kolme kudosnäytettä käsittävässä testiajossa. Jos luokittelu on vaikeaa, esimerkiksi jos rinnakkaisnäytteille saadut tulokset ovat erilaiset ja/tai jos keskimääräinen elinkyky on 50 ± 5 %, on harkittava toista testiajoa ja myös kolmatta, jos kahden ensimmäisen testin tulokset poikkeavat toisistaan. |
| --- | --- |

9.

Kun testikemikaalin luokittelu on yksiselitteinen, se voidaan testata yhdessä kolme kudosnäytettä käsittävässä testiajossa. Jos luokittelu on vaikeaa, esimerkiksi jos rinnakkaisnäytteille saadut tulokset ovat erilaiset ja/tai jos keskimääräinen elinkyky on 50 ± 5 %, on harkittava toista testiajoa ja myös kolmatta, jos kahden ensimmäisen testin tulokset poikkeavat toisistaan.

TESTIN PERIAATE

| 10. | Testikemikaalia applikoidaan paikallisesti kolmiulotteiseen rekonstruoituun ihmisorvaskesimalliin, joka koostuu ihmisestä saaduista muuntamattomista orvaskeden keratinosyyteistä, jotka on viljelty ihmisen orvaskeden monikerroksiseksi, täysin erilaistuneitten solujen malliksi. Se koostuu järjestyneistä ja selkeistä tyvisolu-, okasolu- ja jyväiskerroksista ja monikerroksisesta marraskedestä, joka sisältää solujenvälisiä lamellaarisia lipidikerroksia, jotka edustavat lipidiluokkia, joita havaitaan myös in vivo -kokeissa. |
| --- | --- |

10.

Testikemikaalia applikoidaan paikallisesti kolmiulotteiseen rekonstruoituun ihmisorvaskesimalliin, joka koostuu ihmisestä saaduista muuntamattomista orvaskeden keratinosyyteistä, jotka on viljelty ihmisen orvaskeden monikerroksiseksi, täysin erilaistuneitten solujen malliksi. Se koostuu järjestyneistä ja selkeistä tyvisolu-, okasolu- ja jyväiskerroksista ja monikerroksisesta marraskedestä, joka sisältää solujenvälisiä lamellaarisia lipidikerroksia, jotka edustavat lipidiluokkia, joita havaitaan myös in vivo -kokeissa.

in vivo

| 11. | Kemikaalien aiheuttama ihoärsytys, joka esiintyy eryteemana ja ödeemana, on seurauksena tapahtumasarjasta, joka käynnistyy, kun kemikaali läpäisee marraskeden, ja alla olevat keratinosyyttikerrokset vaurioituvat. Kuolevat keratinosyytit vapauttavat välittäjäaineita, jotka käynnistävät tulehdusreaktion, joka vaikuttaa verinahan soluihin, etenkin strooman ja endoteelin soluihin. Havaitut eryteema ja ödeema johtuvat endoteelin solujen laajentumisesta ja tavallista suuremmasta läpäisevyydestä (24). RhE-malliin perustuvilla menetelmillä mitataan tämän tapahtumasarjan käynnistäviä tapahtumia. |
| --- | --- |

11.

Kemikaalien aiheuttama ihoärsytys, joka esiintyy eryteemana ja ödeemana, on seurauksena tapahtumasarjasta, joka käynnistyy, kun kemikaali läpäisee marraskeden, ja alla olevat keratinosyyttikerrokset vaurioituvat. Kuolevat keratinosyytit vapauttavat välittäjäaineita, jotka käynnistävät tulehdusreaktion, joka vaikuttaa verinahan soluihin, etenkin strooman ja endoteelin soluihin. Havaitut eryteema ja ödeema johtuvat endoteelin solujen laajentumisesta ja tavallista suuremmasta läpäisevyydestä (24). RhE-malliin perustuvilla menetelmillä mitataan tämän tapahtumasarjan käynnistäviä tapahtumia.

| 12. | Solujen elinkyvyn mittaus perustuu siihen, että entsyymit muuntavat väriaine MTT:n (3-(4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2,5-difenyylitetratsoliumbromidi, tiatsolyylisininen; CAS-numero 298-93-1) siniseksi formatsaanisuolaksi, joka mitataan kvantitatiivisesti, kun se on uutettu kudoksista (25). Ärsytystä aiheuttavat aineet tunnistetaan niiden kyvystä alentaa solun elinkykyä määritettyjen kynnysarvojen alle (ts. ≤ 50 % YK:n GHS-järjestelmän / EU:n CLP-asetuksen luokan 2 osalta). Riippuen siitä sääntely-yhteydestä, jossa tämän testimenetelmän tuloksia käytetään, voidaan katsoa, että kemikaalit, jotka aiheuttavat määriteltyä kynnysarvoa korkeamman solujen elinkyvyn, eivät ole ärsyttäviä (ts. > 50 %, ei luokitusta). |
| --- | --- |

12.

Solujen elinkyvyn mittaus perustuu siihen, että entsyymit muuntavat väriaine MTT:n (3-(4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2,5-difenyylitetratsoliumbromidi, tiatsolyylisininen; CAS-numero 298-93-1) siniseksi formatsaanisuolaksi, joka mitataan kvantitatiivisesti, kun se on uutettu kudoksista (25). Ärsytystä aiheuttavat aineet tunnistetaan niiden kyvystä alentaa solun elinkykyä määritettyjen kynnysarvojen alle (ts. ≤ 50 % YK:n GHS-järjestelmän / EU:n CLP-asetuksen luokan 2 osalta). Riippuen siitä sääntely-yhteydestä, jossa tämän testimenetelmän tuloksia käytetään, voidaan katsoa, että kemikaalit, jotka aiheuttavat määriteltyä kynnysarvoa korkeamman solujen elinkyvyn, eivät ole ärsyttäviä (ts. > 50 %, ei luokitusta).

PÄTEVYYDEN OSOITUS

| 13. | Ennen kuin laboratoriot ryhtyvät käyttämään rutiininomaisesti jotakin tämän testimenetelmän mukaisista kolmesta validoidusta menetelmästä, laboratorioiden on osoitettava tekninen pätevyytensä taulukossa 1 lueteltujen kymmenen vertailukemikaalin avulla. Tämän testimenetelmän mukaisesti kehitettyjen samanlaisten menetelmien tai kolmen validoidun menetelmän mukautusten osalta tämän testimenetelmän lisäyksessä 2 vahvistetut suoritusvaatimukset on täytettävä, ennen kuin niitä käytetään lainsäädännössä edellytettyihin testeihin. |
| --- | --- |

13.

Ennen kuin laboratoriot ryhtyvät käyttämään rutiininomaisesti jotakin tämän testimenetelmän mukaisista kolmesta validoidusta menetelmästä, laboratorioiden on osoitettava tekninen pätevyytensä taulukossa 1 lueteltujen kymmenen vertailukemikaalin avulla. Tämän testimenetelmän mukaisesti kehitettyjen samanlaisten menetelmien tai kolmen validoidun menetelmän mukautusten osalta tämän testimenetelmän lisäyksessä 2 vahvistetut suoritusvaatimukset on täytettävä, ennen kuin niitä käytetään lainsäädännössä edellytettyihin testeihin.

| 14. | Osana pätevyyden osoittamista käyttäjän on kudosten vastaanoton jälkeen tarkastettava kudosten läpäisevyysominaisuudet RhE-mallin laatijan vaatimusten mukaisesti. Tämä on erityisen tärkeää, jos kudoksia kuljetetaan pitkiä välimatkoja tai pitkiä aikoja. Kun menetelmä on otettu onnistuneesti käyttöön ja laboratorion pätevyys on osoitettu, tällaista tarkastusta ei tarvitse tehdä säännöllisesti. Jos menetelmää käytetään säännöllisesti, on läpäisevyysominaisuudet kuitenkin jatkossakin syytä arvioida säännöllisin väliajoin.

  Taulukko 1


  Vertailukemikaalit (8)











  Kemikaali | CAS-nro | In vivo-tulos (9) | Fysikaalinen olomuoto | YK:n GHS-luokka / EU:n CLP-luokka |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| naftaleenietikkahappo | 86-87-3 | 0 | kiinteä | ei luokitusta |
| isopropanoli | 67-63-0 | 0,3 | neste | ei luokitusta |
| metyylistearaatti | 112-61-8 | 1 | kiinteä | ei luokitusta |
| heptyylibutyraatti | 5870-93-9 | 1,7 | neste | ei luokitusta
  (valinnainen luokka 3) (10)
   (11) |
| heksyylisalisylaatti | 6259-76-3 | 2 | neste | ei luokitusta
  (valinnainen luokka 3) (10)
   (11) |
| syklameenialdehydi | 103-95-7 | 2,3 | neste | luokka 2 |
| 1-bromiheksaani | 111-25-1 | 2,7 | neste | luokka 2 |
| kaliumhydroksidi (5 % liuos vedessä) | 1310-58-3 | 3 | neste | luokka 2 |
| 1-metyyli-3-fenyyli-1-piperatsiini | 5271-27-2 | 3,3 | kiinteä | luokka 2 |
| heptanaali | 111-71-7 | 3,4 | neste | luokka 2 |

14.

Osana pätevyyden osoittamista käyttäjän on kudosten vastaanoton jälkeen tarkastettava kudosten läpäisevyysominaisuudet RhE-mallin laatijan vaatimusten mukaisesti. Tämä on erityisen tärkeää, jos kudoksia kuljetetaan pitkiä välimatkoja tai pitkiä aikoja. Kun menetelmä on otettu onnistuneesti käyttöön ja laboratorion pätevyys on osoitettu, tällaista tarkastusta ei tarvitse tehdä säännöllisesti. Jos menetelmää käytetään säännöllisesti, on läpäisevyysominaisuudet kuitenkin jatkossakin syytä arvioida säännöllisin väliajoin.

Taulukko 1

Taulukko 1

Vertailukemikaalit (8)

Vertailukemikaalit (8

Kemikaali

CAS-nro

In vivo-tulos (9)

In vivo

9

Fysikaalinen olomuoto

YK:n GHS-luokka / EU:n CLP-luokka

naftaleenietikkahappo

86-87-3

0

kiinteä

ei luokitusta

isopropanoli

67-63-0

0,3

neste

ei luokitusta

metyylistearaatti

112-61-8

1

kiinteä

ei luokitusta

heptyylibutyraatti

5870-93-9

1,7

neste

ei luokitusta

(valinnainen luokka 3) (10)
   (11)

valinnainen luokka 3

10

11

heksyylisalisylaatti

6259-76-3

2

neste

ei luokitusta

(valinnainen luokka 3) (10)
   (11)

valinnainen luokka 3

10

11

syklameenialdehydi

103-95-7

2,3

neste

luokka 2

1-bromiheksaani

111-25-1

2,7

neste

luokka 2

kaliumhydroksidi (5 % liuos vedessä)

1310-58-3

3

neste

luokka 2

1-metyyli-3-fenyyli-1-piperatsiini

5271-27-2

3,3

kiinteä

luokka 2

heptanaali

111-71-7

3,4

neste

luokka 2

MENETTELY

| 15. | Seuraavassa esitellään RhE-menetelmää käyttävän ihoärsyttävyysarvioinnin osat ja menettelyt. RhE-malli on valmistettava, ja se voidaan valmistaa itse laboratoriossa tai hankkia kaupallisesti. EpiSkinTM-menetelmän, EpiDermTM-ihoärsytystestin (EPI-200) ja SkinEthicTM-RhE-menetelmän standardimenettelyt ovat saatavilla lähteissä (26) (27) (28). Testaus on toteutettava seuraavasti: |
| --- | --- |

15.

Seuraavassa esitellään RhE-menetelmää käyttävän ihoärsyttävyysarvioinnin osat ja menettelyt. RhE-malli on valmistettava, ja se voidaan valmistaa itse laboratoriossa tai hankkia kaupallisesti. EpiSkinTM-menetelmän, EpiDermTM-ihoärsytystestin (EPI-200) ja SkinEthicTM-RhE-menetelmän standardimenettelyt ovat saatavilla lähteissä (26) (27) (28). Testaus on toteutettava seuraavasti:

TM

TM

TM

RhE-TESTIMENETELMÄN osat

RhE-TESTIMENETELMÄN osat

Yleiset olosuhteet

Yleiset olosuhteet

| 16. | Epiteelin valmistamiseen on käytettävä muuntamattomia ihmisen keratinosyyttejä. Toimivan marraskeden alla on oltava useita kerroksia eläviä epiteelisoluja (tyvisolukerros, okasolukerros ja jyväiskerros). Marraskedessä on oltava useita kerroksia ja olennainen lipidikoostumus, jotta se voi toimia esteenä solumyrkyllisten merkkiaineiden, kuten natriumdodekyylisulfaatin (SDS) tai Triton X-100:n, nopealle kulkeutumiselle ihokerrosten läpi. Läpäisynestokyky on osoitettava, ja se voidaan arvioida joko määrittämällä pitoisuus, jossa merkkiaine vähentää kudosten elinkykyä 50 prosentilla (IC50) tietyn altistusajan jälkeen, tai määrittämällä altistusaika, joka tarvitaan solun elinkyvyn vähenemiseen 50 prosentilla (ET50) applikoitaessa merkkiainetta tietyssä, tunnetussa pitoisuudessa. Mallin on oltava sellainen, ettei materiaali pääse marraskeden ympäri elävään kudokseen, koska se heikentäisi mallin kykyä mallintaa ihoaltistusta. RhE-mallissa ei saa olla kontaminaatiota (bakteerit, virukset, mykoplasmat tai sieni-itiöt). |
| --- | --- |

16.

Epiteelin valmistamiseen on käytettävä muuntamattomia ihmisen keratinosyyttejä. Toimivan marraskeden alla on oltava useita kerroksia eläviä epiteelisoluja (tyvisolukerros, okasolukerros ja jyväiskerros). Marraskedessä on oltava useita kerroksia ja olennainen lipidikoostumus, jotta se voi toimia esteenä solumyrkyllisten merkkiaineiden, kuten natriumdodekyylisulfaatin (SDS) tai Triton X-100:n, nopealle kulkeutumiselle ihokerrosten läpi. Läpäisynestokyky on osoitettava, ja se voidaan arvioida joko määrittämällä pitoisuus, jossa merkkiaine vähentää kudosten elinkykyä 50 prosentilla (IC50) tietyn altistusajan jälkeen, tai määrittämällä altistusaika, joka tarvitaan solun elinkyvyn vähenemiseen 50 prosentilla (ET50) applikoitaessa merkkiainetta tietyssä, tunnetussa pitoisuudessa. Mallin on oltava sellainen, ettei materiaali pääse marraskeden ympäri elävään kudokseen, koska se heikentäisi mallin kykyä mallintaa ihoaltistusta. RhE-mallissa ei saa olla kontaminaatiota (bakteerit, virukset, mykoplasmat tai sieni-itiöt).

50

50

Toimintaolosuhteet

Toimintaolosuhteet

Solujen elinkyky

| 17. | Solujen elinkyky määritetään MTT-määritysmenetelmällä (25). RhE-mallien käyttäjien on varmistettava, että kukin RhE-mallin erä täyttää negatiiviselle kontrollille asetetut vaatimukset. Pelkän uuttoliuottimen optisen tiheyden (OD) on oltava riittävän pieni, ts. OD < 0,1. RhE-mallin kehittäjän/tuottajan on määritettävä negatiivisen kontrollin OD-arvojen hyväksyttävyyden vaihteluväli (ylempi ja alempi raja-arvo) (ihoärsytystestimenetelmän olosuhteissa). Kolmen validoidun menetelmän hyväksyttävyyden vaihteluvälit esitetään taulukossa 2. Negatiivisella kontrollikemikaalilla käsiteltyjen kudosten vakaus viljelmässä (niiden on annettava samanlaiset elinkykytulokset) testin altistusjakson ajan on dokumentoitava.

  Taulukko 2


  Negatiivisen kontrollin OD-arvojen hyväksyttävyyden vaihteluväli | Alempi hyväksyttävyysraja | Ylempi hyväksyttävyysraja |
| --- | --- | --- | --- |
| EpiSkinTM (ihomalli) | ≥ 0,6 | ≤ 1,5 |
| EpiDermTM-ihoärsytystesti (EPI-200) | ≥ 1,0 | ≤ 2,5 |
| SkinEthicTM-RhE-menetelmä | ≥ 1,2 | ≤ 2,5 |

17.

Solujen elinkyky määritetään MTT-määritysmenetelmällä (25). RhE-mallien käyttäjien on varmistettava, että kukin RhE-mallin erä täyttää negatiiviselle kontrollille asetetut vaatimukset. Pelkän uuttoliuottimen optisen tiheyden (OD) on oltava riittävän pieni, ts. OD < 0,1. RhE-mallin kehittäjän/tuottajan on määritettävä negatiivisen kontrollin OD-arvojen hyväksyttävyyden vaihteluväli (ylempi ja alempi raja-arvo) (ihoärsytystestimenetelmän olosuhteissa). Kolmen validoidun menetelmän hyväksyttävyyden vaihteluvälit esitetään taulukossa 2. Negatiivisella kontrollikemikaalilla käsiteltyjen kudosten vakaus viljelmässä (niiden on annettava samanlaiset elinkykytulokset) testin altistusjakson ajan on dokumentoitava.

Taulukko 2

Taulukko 2

Negatiivisen kontrollin OD-arvojen hyväksyttävyyden vaihteluväli

Negatiivisen kontrollin OD-arvojen hyväksyttävyyden vaihteluväli

Alempi hyväksyttävyysraja

Ylempi hyväksyttävyysraja

EpiSkinTM (ihomalli)

TM

≥ 0,6

≤ 1,5

EpiDermTM-ihoärsytystesti (EPI-200)

TM

≥ 1,0

≤ 2,5

SkinEthicTM-RhE-menetelmä

TM

≥ 1,2

≤ 2,5

Läpäisyn esto

| 18. | Marraskeden ja sen lipidikoostumuksen on oltava riittävä estämään solumyrkyllisten merkkiaineiden, esimerkiksi SDS:n tai Triton X-100:n, nopea läpäisy arvioituna IC50:llä tai ET50:llä (taulukko 3). |
| --- | --- |

18.

Marraskeden ja sen lipidikoostumuksen on oltava riittävä estämään solumyrkyllisten merkkiaineiden, esimerkiksi SDS:n tai Triton X-100:n, nopea läpäisy arvioituna IC50:llä tai ET50:llä (taulukko 3).

50

50

Morfologia

| 19. | RhE-malli on tutkittava histologisesti, ja on osoitettava, että rekonstruktiolla on ihmisen orvaskeden kaltainen rakenne (myös monikerroksinen marraskesi). |
| --- | --- |

19.

RhE-malli on tutkittava histologisesti, ja on osoitettava, että rekonstruktiolla on ihmisen orvaskeden kaltainen rakenne (myös monikerroksinen marraskesi).

Uusittavuus

| 20. | Testimenetelmän positiivisella kontrollikemikaalilla ja negatiivisilla kontrolleilla saatujen tulosten olisi osoitettava tulosten uusittavuus pidemmällä aikavälillä. |
| --- | --- |

20.

Testimenetelmän positiivisella kontrollikemikaalilla ja negatiivisilla kontrolleilla saatujen tulosten olisi osoitettava tulosten uusittavuus pidemmällä aikavälillä.

Laadunvalvonta

| 21. | RhE-mallin kehittäjän/tuottajan on varmistettava ja osoitettava, että kukin RhE-mallin erä täyttää määritellyt tuotantokriteerit, joiden joukosta elinkykyisyyttä (17 kohta), läpäisyn estoa (18 kohta) ja morfologiaa (19 kohta) koskevat perusteet ovat merkityksellisimmät. Tätä koskevat tiedot on annettava menetelmän käyttäjille, jotta he voivat ilmoittaa tiedot testiraportissa. RhE-mallin kehittäjän/tuottajan (tai laitoksen omaa mallia käytettäessä tutkijan) on annettava IC50:n tai ET50:n hyväksyttävyyden vaihteluväli (ylempi ja alempi raja-arvo). Ainoastaan hyväksytyillä kudoksilla saadut tulokset voidaan hyväksyä luotettavaksi ennusteeksi ärsytyksen luokittelua varten. Edellä käsiteltyjen kolmen validoidun menetelmän hyväksyttävyyden vaihteluvälit esitetään esimerkkeinä taulukossa 3.

  Taulukko 3


  Esimerkkejä laadunvalvonnan perusteista erän vapauttamiseksi tehtaalta myyntiin | Alempi hyväksyttävyysraja | Ylempi hyväksyttävyysraja |
| --- | --- | --- | --- |
| EpiSkinTM (ihomalli)
  (18 tunnin käsittely SDS:llä) (26) | IC50 = 1,0 mg/ml | IC50 = 3,0 mg/ml |
| EpiDermTM-ihoärsytystesti (EPI-200)
  (1 % Triton X-100) (27) | ET50 = 4,8 tuntia | ET50 = 8,7 tuntia |
| SkinEthicTM-RhE-menetelmä
  (1 % Triton X-100) (28) | ET50 = 4,0 tuntia | ET50 = 9,0 tuntia |

21.

RhE-mallin kehittäjän/tuottajan on varmistettava ja osoitettava, että kukin RhE-mallin erä täyttää määritellyt tuotantokriteerit, joiden joukosta elinkykyisyyttä (17 kohta), läpäisyn estoa (18 kohta) ja morfologiaa (19 kohta) koskevat perusteet ovat merkityksellisimmät. Tätä koskevat tiedot on annettava menetelmän käyttäjille, jotta he voivat ilmoittaa tiedot testiraportissa. RhE-mallin kehittäjän/tuottajan (tai laitoksen omaa mallia käytettäessä tutkijan) on annettava IC50:n tai ET50:n hyväksyttävyyden vaihteluväli (ylempi ja alempi raja-arvo). Ainoastaan hyväksytyillä kudoksilla saadut tulokset voidaan hyväksyä luotettavaksi ennusteeksi ärsytyksen luokittelua varten. Edellä käsiteltyjen kolmen validoidun menetelmän hyväksyttävyyden vaihteluvälit esitetään esimerkkeinä taulukossa 3.

elinkykyisyyttä

läpäisyn estoa

morfologiaa

50

50

Taulukko 3

Taulukko 3

Esimerkkejä laadunvalvonnan perusteista erän vapauttamiseksi tehtaalta myyntiin

Esimerkkejä laadunvalvonnan perusteista erän vapauttamiseksi tehtaalta myyntiin

Alempi hyväksyttävyysraja

Ylempi hyväksyttävyysraja

EpiSkinTM (ihomalli)

TM

(18 tunnin käsittely SDS:llä) (26)

IC50 = 1,0 mg/ml

50

IC50 = 3,0 mg/ml

50

EpiDermTM-ihoärsytystesti (EPI-200)

TM

(1 % Triton X-100) (27)

ET50 = 4,8 tuntia

50

ET50 = 8,7 tuntia

50

SkinEthicTM-RhE-menetelmä

TM

(1 % Triton X-100) (28)

ET50 = 4,0 tuntia

50

ET50 = 9,0 tuntia

50

Testi- ja kontrollikemikaalien annostelu

Testi- ja kontrollikemikaalien annostelu

| 22. | Kutakin testikemikaalia ja kunkin käsittelyn kontrollia kohti on käytettävä vähintään kolmea näytettä. Sekä nestemäisiä että kiinteitä aineita käytettäessä orvaskeden pinnalle on annosteltava testikemikaalia tasaisesti riittävä määrä kuitenkin niin, ettei käytetä hyvin suurta annosta. Kemikaalia olisi käytettävä vähintään 25 μl/cm2 tai 25 mg/cm2. Kiinteitä aineita käytettäessä orvaskeden pinta on kostutettava deionisoidulla tai tislatulla vedellä ennen aineen annostelua, jotta testikemikaalin ja orvaskeden pinnan välistä kosketus olisi parempi. Kiinteät aineet on mahdollisuuksien mukaan testattava hienona jauheena. Altistuksen jälkeen testikemikaali on huuhdeltava huolellisesti orvaskeden pinnalta sopivalla vesipitoisella puskuriliuoksella tai 0,9-prosenttisella NaCl:lla. Kolmesta validoidusta RhE-menetelmästä valitusta menetelmästä riippuen altistusaika voi olla 15–60 minuuttia ja inkubaatiolämpötila 20–37 °C. Nämä altistusajat ja lämpötilat on optimoitu erikseen kullekin RhE-menetelmälle, ja ne vastaavat menetelmien erilaisia ominaispiirteitä; lisätietoja on saatavilla menetelmien standardimenettelyistä (26) (27) (28). |
| --- | --- |

22.

Kutakin testikemikaalia ja kunkin käsittelyn kontrollia kohti on käytettävä vähintään kolmea näytettä. Sekä nestemäisiä että kiinteitä aineita käytettäessä orvaskeden pinnalle on annosteltava testikemikaalia tasaisesti riittävä määrä kuitenkin niin, ettei käytetä hyvin suurta annosta. Kemikaalia olisi käytettävä vähintään 25 μl/cm2 tai 25 mg/cm2. Kiinteitä aineita käytettäessä orvaskeden pinta on kostutettava deionisoidulla tai tislatulla vedellä ennen aineen annostelua, jotta testikemikaalin ja orvaskeden pinnan välistä kosketus olisi parempi. Kiinteät aineet on mahdollisuuksien mukaan testattava hienona jauheena. Altistuksen jälkeen testikemikaali on huuhdeltava huolellisesti orvaskeden pinnalta sopivalla vesipitoisella puskuriliuoksella tai 0,9-prosenttisella NaCl:lla. Kolmesta validoidusta RhE-menetelmästä valitusta menetelmästä riippuen altistusaika voi olla 15–60 minuuttia ja inkubaatiolämpötila 20–37 °C. Nämä altistusajat ja lämpötilat on optimoitu erikseen kullekin RhE-menetelmälle, ja ne vastaavat menetelmien erilaisia ominaispiirteitä; lisätietoja on saatavilla menetelmien standardimenettelyistä (26) (27) (28).

2

2

| 23. | Kussakin käsittelyssä on käytettävä samanaikaisesti negatiivisia ja positiivisia kontrolleja osoittamaan, että solujen elinkyky (negatiivisella kontrollilla), läpäisyn esto ja altistuksesta seuraava kudoksen herkistyminen (positiivisella kontrollilla) ovat pidemmän ajan kuluessa määritetyllä hyväksyttävyyden vaihteluvälillä. Positiivisena kontrolliaineena suositellaan käytettäväksi 5-prosenttista SDS:n vesiliuosta. Suositeltavat negatiiviset kontrollikemikaalit ovat vesi tai fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS). |
| --- | --- |

23.

Kussakin käsittelyssä on käytettävä samanaikaisesti negatiivisia ja positiivisia kontrolleja osoittamaan, että solujen elinkyky (negatiivisella kontrollilla), läpäisyn esto ja altistuksesta seuraava kudoksen herkistyminen (positiivisella kontrollilla) ovat pidemmän ajan kuluessa määritetyllä hyväksyttävyyden vaihteluvälillä. Positiivisena kontrolliaineena suositellaan käytettäväksi 5-prosenttista SDS:n vesiliuosta. Suositeltavat negatiiviset kontrollikemikaalit ovat vesi tai fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS).

Solujen elinkykymittaukset

Solujen elinkykymittaukset

| 24. | Tärkeintä testimenettelyssä on se, että elinkykymittauksia ei suoriteta heti testikemikaaleille altistumisen jälkeen, vaan vasta, kun kudokset on käsittelyn jälkeen huuhdeltu ja ne ovat olleet riittävän pitkän inkubaatioajan tuoreessa elatusaineessa. Inkubaatioaika mahdollistaa sekä palautumisen heikoista sytotoksisista vaikutuksista että selkeiden sytotoksisten vaikutusten esilletulon. Testin optimointivaiheessa (11) (12) (13) (14) (15) on käynyt ilmi, että 42 tuntia kestävä inkubaatioaika käsittelyn jälkeen on optimaalinen. |
| --- | --- |

24.

Tärkeintä testimenettelyssä on se, että elinkykymittauksia ei suoriteta heti testikemikaaleille altistumisen jälkeen, vaan vasta, kun kudokset on käsittelyn jälkeen huuhdeltu ja ne ovat olleet riittävän pitkän inkubaatioajan tuoreessa elatusaineessa. Inkubaatioaika mahdollistaa sekä palautumisen heikoista sytotoksisista vaikutuksista että selkeiden sytotoksisten vaikutusten esilletulon. Testin optimointivaiheessa (11) (12) (13) (14) (15) on käynyt ilmi, että 42 tuntia kestävä inkubaatioaika käsittelyn jälkeen on optimaalinen.

| 25. | MTT-määritysmenetelmä on validoitu kvantitatiivinen menetelmä, jota olisi käytettävä solujen elinkyvyn mittaamiseen tässä testimenetelmässä. MTT-menetelmä sopii käytettäväksi kolmiulotteisen kudosrakenteen kanssa. Kudosnäyte pannaan kolmeksi tunniksi sopivan vahvuiseen MTT-liuokseen (esimerkiksi 0,3–1 mg/ml). Saostunut sininen formatsaani uutetaan kudoksesta liuottimella (esimerkiksi isopropanoli tai hapan isopropanoli), ja formatsaanipitoisuus määritetään mittaamalla OD-arvo 570 ± 30 nm:ssä. |
| --- | --- |

25.

MTT-määritysmenetelmä on validoitu kvantitatiivinen menetelmä, jota olisi käytettävä solujen elinkyvyn mittaamiseen tässä testimenetelmässä. MTT-menetelmä sopii käytettäväksi kolmiulotteisen kudosrakenteen kanssa. Kudosnäyte pannaan kolmeksi tunniksi sopivan vahvuiseen MTT-liuokseen (esimerkiksi 0,3–1 mg/ml). Saostunut sininen formatsaani uutetaan kudoksesta liuottimella (esimerkiksi isopropanoli tai hapan isopropanoli), ja formatsaanipitoisuus määritetään mittaamalla OD-arvo 570 ± 30 nm:ssä.

| 26. | Testikemikaalin optiset ominaisuudet tai sen kemiallinen reaktio MTT:n kanssa voivat aiheuttaa sen, että määritysmenetelmällä saadaan väärä arvio elinkyvystä (koska testikemikaali voi estää värin muodostumisen tai vaihtoehtoisesti aiheuttaa sen). Näin voi tapahtua, jos tietty testikemikaali ei kokonaan poistu kudoksesta huuhtelemalla tai jos se imeytyy orvasketeen. Jos testikemikaali reagoi suoraan MTT:n kanssa (MTT-pelkistin), on luonnostaan värillinen tai värjäytyy kudoksen käsittelyn aikana, on käytettävä lisäkontrolleja, jotta testikemikaalin vaikutus solujen elinkyvyn mittaukseen voidaan osoittaa ja korjata. MTT:n suoran pelkistyksen ja väriaineiden aiheuttamien häiriöiden korjaamismenettelyt selostetaan yksityiskohtaisesti kyseisiä kolmea validoitua menetelmää koskevissa standardimenettelyissä (26) (27) (28). |
| --- | --- |

26.

Testikemikaalin optiset ominaisuudet tai sen kemiallinen reaktio MTT:n kanssa voivat aiheuttaa sen, että määritysmenetelmällä saadaan väärä arvio elinkyvystä (koska testikemikaali voi estää värin muodostumisen tai vaihtoehtoisesti aiheuttaa sen). Näin voi tapahtua, jos tietty testikemikaali ei kokonaan poistu kudoksesta huuhtelemalla tai jos se imeytyy orvasketeen. Jos testikemikaali reagoi suoraan MTT:n kanssa (MTT-pelkistin), on luonnostaan värillinen tai värjäytyy kudoksen käsittelyn aikana, on käytettävä lisäkontrolleja, jotta testikemikaalin vaikutus solujen elinkyvyn mittaukseen voidaan osoittaa ja korjata. MTT:n suoran pelkistyksen ja väriaineiden aiheuttamien häiriöiden korjaamismenettelyt selostetaan yksityiskohtaisesti kyseisiä kolmea validoitua menetelmää koskevissa standardimenettelyissä (26) (27) (28).

Hyväksyttävyysperusteet

Hyväksyttävyysperusteet

| 27. | Jokaisessa menetelmässä, jossa käytetään validoidun RhE-mallin eriä (katso 21 kohta), negatiivisella kontrollikemikaalilla käsiteltyjen kudosten OD:n vastattava sellaisten kudosten OD:tä, joille on suoritettu kaikki kuljetus- ja vastaanottovaiheet sekä kaikki tutkimussuunnitelman menettelyt. Kontrollien OD-arvot eivät saa olla alhaisemmat kuin pitkähkön aiemman ajanjakson alemmat rajat. Vastaavasti positiivisella kontrollilla eli 5-prosenttisella SDS:n vesiliuoksella käsiteltyjen kudosten on ilmennettävä kudosten kykyä reagoida ärsytystä aiheuttavaan kemikaaliin tässä testimenetelmässä (26) (27) (28). Rinnakkaisten kudosnäytteiden välisen vaihtelun asianmukaiset määrät on määriteltävä (esimerkiksi jos käytetään vakiopoikkeamia, niiden on oltava aiempien tietojen perusteella lasketun 1-puolisen 95 prosentin vaihteluvälin sisällä; validoiduille vertailumenetelmille vakiopoikkeama < 18 %). |
| --- | --- |

27.

Jokaisessa menetelmässä, jossa käytetään validoidun RhE-mallin eriä (katso 21 kohta), negatiivisella kontrollikemikaalilla käsiteltyjen kudosten OD:n vastattava sellaisten kudosten OD:tä, joille on suoritettu kaikki kuljetus- ja vastaanottovaiheet sekä kaikki tutkimussuunnitelman menettelyt. Kontrollien OD-arvot eivät saa olla alhaisemmat kuin pitkähkön aiemman ajanjakson alemmat rajat. Vastaavasti positiivisella kontrollilla eli 5-prosenttisella SDS:n vesiliuoksella käsiteltyjen kudosten on ilmennettävä kudosten kykyä reagoida ärsytystä aiheuttavaan kemikaaliin tässä testimenetelmässä (26) (27) (28). Rinnakkaisten kudosnäytteiden välisen vaihtelun asianmukaiset määrät on määriteltävä (esimerkiksi jos käytetään vakiopoikkeamia, niiden on oltava aiempien tietojen perusteella lasketun 1-puolisen 95 prosentin vaihteluvälin sisällä; validoiduille vertailumenetelmille vakiopoikkeama < 18 %).

Tulosten tulkinta ja ennustettavuusmalli

Tulosten tulkinta ja ennustettavuusmalli

| 28. | Negatiivisen kontrollin OD-arvon katsotaan testissä edustavan 100-prosenttista solujen elinkykyä. Kullakin testikemikaalilla saaduista OD-arvoista voidaan laskea solujen elinkyky prosentteina negatiivisesta kontrollista. Prosentuaalinen solujen elinkyvyn raja-arvo, jolla ärsyttävät testikemikaalit erotetaan luokittelemattomista testikemikaaleista, ja tulosten arviointiin ja ärsyttävien kemikaalien tunnistamiseen käytettävät tilastomenetelmät on määriteltävä selvästi ja dokumentoitava ja niiden sopivuus on osoitettava. Ärsytyksen ennusteen raja-arvot esitetään seuraavassa:






  — | Testikemikaalin katsotaan aiheuttavan ärsytystä iholla YK:n GHS-järjestelmän / EU:n CLP-asetuksen luokan 2 mukaisesti, jos kudoksen elinkyky altistuksen ja käsittelyn jälkeisen inkubaation jälkeen on alhaisempi tai yhtä suuri kuin (≤) 50 prosenttia. |
| --- | --- | --- |

28.

Negatiivisen kontrollin OD-arvon katsotaan testissä edustavan 100-prosenttista solujen elinkykyä. Kullakin testikemikaalilla saaduista OD-arvoista voidaan laskea solujen elinkyky prosentteina negatiivisesta kontrollista. Prosentuaalinen solujen elinkyvyn raja-arvo, jolla ärsyttävät testikemikaalit erotetaan luokittelemattomista testikemikaaleista, ja tulosten arviointiin ja ärsyttävien kemikaalien tunnistamiseen käytettävät tilastomenetelmät on määriteltävä selvästi ja dokumentoitava ja niiden sopivuus on osoitettava. Ärsytyksen ennusteen raja-arvot esitetään seuraavassa:

—

Testikemikaalin katsotaan aiheuttavan ärsytystä iholla YK:n GHS-järjestelmän / EU:n CLP-asetuksen luokan 2 mukaisesti, jos kudoksen elinkyky altistuksen ja käsittelyn jälkeisen inkubaation jälkeen on alhaisempi tai yhtä suuri kuin (≤) 50 prosenttia.

| — | Riippuen siitä, minkä säädöksen noudattaminen tulee kysymykseen tämän testimenetelmän yhteydessä, voidaan katsoa, että testikemikaali ei aiheuta ärsytystä iholla YK:n GHS-järjestelmän / EU:n CLP-asetuksen luokituksen ’ei luokitusta’ mukaisesti, jos kudoksen elinkyky altistuksen ja käsittelyn jälkeisen inkubaation jälkeen on suurempi kuin (>) 50 prosenttia. |
| --- | --- |

—

Riippuen siitä, minkä säädöksen noudattaminen tulee kysymykseen tämän testimenetelmän yhteydessä, voidaan katsoa, että testikemikaali ei aiheuta ärsytystä iholla YK:n GHS-järjestelmän / EU:n CLP-asetuksen luokituksen ’ei luokitusta’ mukaisesti, jos kudoksen elinkyky altistuksen ja käsittelyn jälkeisen inkubaation jälkeen on suurempi kuin (>) 50 prosenttia.

MITTAUSTULOKSET JA TULOSTEN ILMOITTAMINEN

Mittaustulokset

Mittaustulokset

| 29. | Kunkin testin osalta on esitettävä taulukkomuodossa yksittäisiä rinnakkaisia testinäytteitä koskevat mittaustulokset (esimerkiksi kunkin testikemikaalin OD-arvot ja solujen elinkyvyn prosentuaalista osuutta koskevat tiedot, mukaan luettuna luokittelu) ja tarvittaessa myös mittaustulokset toistetuista kokeista. Lisäksi on esitettävä kunkin käsittelyn keskiarvo ± keskihajonta. Kunkin testikemikaalin osalta on esitettävä havaittu vuorovaikutus MTT-reagenssin ja värillisten testikemikaalien kanssa. |
| --- | --- |

29.

Kunkin testin osalta on esitettävä taulukkomuodossa yksittäisiä rinnakkaisia testinäytteitä koskevat mittaustulokset (esimerkiksi kunkin testikemikaalin OD-arvot ja solujen elinkyvyn prosentuaalista osuutta koskevat tiedot, mukaan luettuna luokittelu) ja tarvittaessa myös mittaustulokset toistetuista kokeista. Lisäksi on esitettävä kunkin käsittelyn keskiarvo ± keskihajonta. Kunkin testikemikaalin osalta on esitettävä havaittu vuorovaikutus MTT-reagenssin ja värillisten testikemikaalien kanssa.

Testiraportti

Testiraportti

| 30. | Testiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot: | Testi- ja kontrollikemikaalit






  — | kemiallinen nimi/kemialliset nimet, kuten CAS-nimi ja -numero sekä EC-nimi ja -numero, jos ne tiedetään, |
| --- | --- | --- | --- |

30.

Testiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot:

Testi- ja kontrollikemikaalit

—

kemiallinen nimi/kemialliset nimet, kuten CAS-nimi ja -numero sekä EC-nimi ja -numero, jos ne tiedetään,

| — | kemikaalin puhtaus ja koostumus (painoprosentteina), |
| --- | --- |

—

kemikaalin puhtaus ja koostumus (painoprosentteina),

| — | tutkimuksen suorittamisen kannalta merkitykselliset fysikaaliskemialliset ominaisuudet (kuten fysikaalinen olomuoto, stabiilius ja haihtuvuus, pH ja vesiliukoisuus, jos se tiedetään), |
| --- | --- |

—

tutkimuksen suorittamisen kannalta merkitykselliset fysikaaliskemialliset ominaisuudet (kuten fysikaalinen olomuoto, stabiilius ja haihtuvuus, pH ja vesiliukoisuus, jos se tiedetään),

| — | tarvittaessa testi- tai kontrollikemikaalien käsittely ennen testiä (esimerkiksi lämmittäminen tai jauhaminen), |
| --- | --- |

—

tarvittaessa testi- tai kontrollikemikaalien käsittely ennen testiä (esimerkiksi lämmittäminen tai jauhaminen),

| — | varastointiolosuhteet. |
| --- | --- |

—

varastointiolosuhteet.

| | Käytetyn RhE-mallin ja testisuunnitelman perustelut |
| --- | --- |

Käytetyn RhE-mallin ja testisuunnitelman perustelut

| | Testiolosuhteet






  — | käytetty solujärjestelmä, |
| --- | --- | --- |

Testiolosuhteet

—

käytetty solujärjestelmä,

| — | täydelliset RhE-mallin käyttöä tukevat tiedot (mukaan luettuna mallin suoritusarvot). Näitä voivat olla, luettelon olematta tyhjentävä,






  i) | solujen elinkyky |
| --- | --- | --- |

—

täydelliset RhE-mallin käyttöä tukevat tiedot (mukaan luettuna mallin suoritusarvot). Näitä voivat olla, luettelon olematta tyhjentävä,

i)

solujen elinkyky

| ii) | läpäisyn esto |
| --- | --- |

ii)

läpäisyn esto

| iii) | morfologia |
| --- | --- |

iii)

morfologia

| iv) | uusittavuus ja ennustettavuus |
| --- | --- |

iv)

uusittavuus ja ennustettavuus

| v) | mallin laatukontrollit, |
| --- | --- |

v)

mallin laatukontrollit,

| — | tiedot käytetystä testimenettelystä, |
| --- | --- |

—

tiedot käytetystä testimenettelystä,

| — | testissä käytetyt annokset, altistuksen kesto ja käsittelyn jälkeinen inkubaatioaika, |
| --- | --- |

—

testissä käytetyt annokset, altistuksen kesto ja käsittelyn jälkeinen inkubaatioaika,

| — | kuvaus testimenettelyjen mahdollisista muutoksista, |
| --- | --- |

—

kuvaus testimenettelyjen mahdollisista muutoksista,

| — | viittaukset mallia koskeviin aiempiin tietoihin. Näitä voivat olla, luettelon olematta tyhjentävä,






  i) | laatukontrollitietojen hyväksyttävyys; viitattava aikaisempia eriä koskeviin tietoihin |
| --- | --- | --- |

—

viittaukset mallia koskeviin aiempiin tietoihin. Näitä voivat olla, luettelon olematta tyhjentävä,

i)

laatukontrollitietojen hyväksyttävyys; viitattava aikaisempia eriä koskeviin tietoihin

| ii) | positiivisten ja negatiivisten kontrollien hyväksyttävyys; viitattava positiivisten ja negatiivisten kontrollien keskiarvoihin ja vaihteluväleihin, |
| --- | --- |

ii)

positiivisten ja negatiivisten kontrollien hyväksyttävyys; viitattava positiivisten ja negatiivisten kontrollien keskiarvoihin ja vaihteluväleihin,

| — | käytettyjen arviointiperusteiden kuvaus, mukaan luettuina ennustettavuusmallin raja-arvojen valinnan perusteet, |
| --- | --- |

—

käytettyjen arviointiperusteiden kuvaus, mukaan luettuina ennustettavuusmallin raja-arvojen valinnan perusteet,

| — | viittaukset aiempiin kontrollitietoihin. |
| --- | --- |

—

viittaukset aiempiin kontrollitietoihin.

| | Tulokset






  — | yksittäisistä testikemikaaleista saadut tulokset kussakin testiajossa ja rinnakkaisista mittauksista taulukkomuodossa, |
| --- | --- | --- |

Tulokset

—

yksittäisistä testikemikaaleista saadut tulokset kussakin testiajossa ja rinnakkaisista mittauksista taulukkomuodossa,

| — | tiedot kontrolleista, joita on käytetty suorille MTT:n pelkistimille ja/tai värjääville testikemikaaleille, |
| --- | --- |

—

tiedot kontrolleista, joita on käytetty suorille MTT:n pelkistimille ja/tai värjääville testikemikaaleille,

| — | kuvaus muista havaituista vaikutuksista. |
| --- | --- |

—

kuvaus muista havaituista vaikutuksista.

| | Tulosten tarkastelu |
| --- | --- |

Tulosten tarkastelu

| | Päätelmät |
| --- | --- |

Päätelmät

LÄHDELUETTELO

| (1) | YK (2009). United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). 3. tarkistettu painos. YK, New York ja Geneve. Saatavilla osoitteessa http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev03/03files_e.html |
| --- | --- |

(1)

YK (2009). United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). 3. tarkistettu painos. YK, New York ja Geneve. Saatavilla osoitteessa http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev03/03files_e.html

| (2) | EC-ECVAM (2009). Statement on the ’Performance under UN GHS of three in vitro assays for skin irritation testing and the adaptation of the Reference Chemicals and Defined Accuracy Values of the ECVAM skin irritation Performance Standards’. ECVAM:in tieteellinen neuvoa-antava komitea (ESAC30), 9. huhtikuuta 2009. Saatavilla osoitteessa http://ecvam.jrc.ec.europa.eu |
| --- | --- |

(2)

EC-ECVAM (2009). Statement on the ’Performance under UN GHS of three in vitro assays for skin irritation testing and the adaptation of the Reference Chemicals and Defined Accuracy Values of the ECVAM skin irritation Performance Standards’. ECVAM:in tieteellinen neuvoa-antava komitea (ESAC30), 9. huhtikuuta 2009. Saatavilla osoitteessa http://ecvam.jrc.ec.europa.eu

in vitro

| (3) | Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus (EY) N:o 1272/2008, annettu 16 päivänä joulukuuta 2008, aineiden ja seosten luokituksesta, merkinnöistä ja pakkaamisesta sekä direktiivien 67/548/ETY ja 1999/45/EY muuttamisesta ja kumoamisesta ja asetuksen (EY) N:o 1907/2006 muuttamisesta. EUVL L 353, 31.12.2008, s. 1. |
| --- | --- |

(3)

Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus (EY) N:o 1272/2008, annettu 16 päivänä joulukuuta 2008, aineiden ja seosten luokituksesta, merkinnöistä ja pakkaamisesta sekä direktiivien 67/548/ETY ja 1999/45/EY muuttamisesta ja kumoamisesta ja asetuksen (EY) N:o 1907/2006 muuttamisesta. EUVL L 353, 31.12.2008, s. 1.

| (4) | OECD (2004). Acute Dermal Irritation/Corrosion, OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 404. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines |
| --- | --- |

(4)

OECD (2004). Acute Dermal Irritation/Corrosion, OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 404. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines

| (5) | OECD (2004). In Vitro Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical Resistance (TER), OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 430. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines |
| --- | --- |

(5)

OECD (2004). In Vitro Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical Resistance (TER), OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 430. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines

In Vitro

| (6) | OECD (2004). In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test, OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 431. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines |
| --- | --- |

(6)

OECD (2004). In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test, OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 431. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines

In Vitro

| (7) | OECD (2006). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion, OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 435. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines |
| --- | --- |

(7)

OECD (2006). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion, OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 435. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines

In Vitro

| (8) | EC-ECVAM (2009). Performance Standards for in vitro skin irritation test methods based on Reconstructed human Epidermis (RhE)? Saatavilla osoitteessa http://ecvam.jrc.ec.europa.eu |
| --- | --- |

(8)

EC-ECVAM (2009). Performance Standards for in vitro skin irritation test methods based on Reconstructed human Epidermis (RhE)? Saatavilla osoitteessa http://ecvam.jrc.ec.europa.eu

in vitro

| (9) | OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, OECD Series on Testing and Assessment No. 34. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines |
| --- | --- |

(9)

OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, OECD Series on Testing and Assessment No. 34. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines

| (10) | Fentem, J. H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G. R., Harbell, J. W., Heylings, J. R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J. J. M. ja Botham, P. (2001). A prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation, Results and evaluation by the Management Team. Toxicol. in Vitro 15, s. 57–93. |
| --- | --- |

(10)

Fentem, J. H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G. R., Harbell, J. W., Heylings, J. R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J. J. M. ja Botham, P. (2001). A prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation, Results and evaluation by the Management Team. Toxicol. in Vitro 15, s. 57–93.

in vitro

| (11) | Portes, P., Grandidier, M.-H., Cohen, C. ja Roguet, R. (2002). Refinement of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study. Toxicol. in Vitro 16, s. 765–770. |
| --- | --- |

(11)

Portes, P., Grandidier, M.-H., Cohen, C. ja Roguet, R. (2002). Refinement of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study. Toxicol. in Vitro 16, s. 765–770.

| (12) | Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, B. ja Spielmann, H. (2004). Optimisation of the EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests. ALTEX 21, s. 107–114. |
| --- | --- |

(12)

Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, B. ja Spielmann, H. (2004). Optimisation of the EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests. ALTEX 21, s. 107–114.

in vitro

| (13) | Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D. ja Spielmann, H. (2005). The EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests – An assessment of the performance of the optimised test. ATLA 33, s. 351–367. |
| --- | --- |

(13)

Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D. ja Spielmann, H. (2005). The EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests – An assessment of the performance of the optimised test. ATLA 33, s. 351–367.

in vitro

| (14) | Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. ja Rubinsteen, G. (2005). The in vitro acute skin irritation of chemicals: optimisation of the EPISKIN prediction model within the framework of the ECVAM validation process. ATLA 33, s. 329–349. |
| --- | --- |

(14)

Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. ja Rubinsteen, G. (2005). The in vitro acute skin irritation of chemicals: optimisation of the EPISKIN prediction model within the framework of the ECVAM validation process. ATLA 33, s. 329–349.

in vitro

| (15) | Zuang, V., Balls, M., Botham, P. A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R. D., Elliot, G. R., Fentem, J. H., Heylings, J. R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van De Sandt, J. J. M., Wiemann, C. ja Worth, A. (2002). Follow-up to the ECVAM prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation, The European Centre for the Validation of Alternative Methods Skin Irritation Task Force report 2. ATLA 30, s. 109–129. |
| --- | --- |

(15)

Zuang, V., Balls, M., Botham, P. A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R. D., Elliot, G. R., Fentem, J. H., Heylings, J. R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van De Sandt, J. J. M., Wiemann, C. ja Worth, A. (2002). Follow-up to the ECVAM prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation, The European Centre for the Validation of Alternative Methods Skin Irritation Task Force report 2. ATLA 30, s. 109–129.

in vitro

| (16) | Spielmann, H., mailto:Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovio, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., mailto:Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. ja Zuang, V. (2007). The ECVAM international validation study on in vitro tests for acute skin irritation: Report on the validity of the EPISKIN and EpiDerm assays and on the skin integrity function test. ATLA 35, s. 559–601. |
| --- | --- |

(16)

Spielmann, H., mailto:Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovio, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., mailto:Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. ja Zuang, V. (2007). The ECVAM international validation study on in vitro tests for acute skin irritation: Report on the validity of the EPISKIN and EpiDerm assays and on the skin integrity function test. ATLA 35, s. 559–601.

in vitro

| (17) | Hoffmann, S. (2006). ECVAM skin irritation validation study phase II: Analysis of the primary endpoint MTT and the secondary endpoint IL1-α. Saatavilla osoitteessa http://ecvam.jrc.ec.europa.eu |
| --- | --- |

(17)

Hoffmann, S. (2006). ECVAM skin irritation validation study phase II: Analysis of the primary endpoint MTT and the secondary endpoint IL1-α. Saatavilla osoitteessa http://ecvam.jrc.ec.europa.eu

| (18) | Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. ja Zuang, V. (2007). The ECVAM international validation study on in vitro tests for acute skin irritation: selection of test chemicals. ATLA 35, s. 603–619. |
| --- | --- |

(18)

Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. ja Zuang, V. (2007). The ECVAM international validation study on in vitro tests for acute skin irritation: selection of test chemicals. ATLA 35, s. 603–619.

in vitro

| (19) | Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Lelièvre, D., Roguet, R., Tinois-Tessonneaud, E. ja Leclaire, J. (2007). In vitro acute skin irritancy of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy – Results and performances with 184 cosmetic ingredients. AATEX 14, s. 351–358. |
| --- | --- |

(19)

Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Lelièvre, D., Roguet, R., Tinois-Tessonneaud, E. ja Leclaire, J. (2007). In vitro acute skin irritancy of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy – Results and performances with 184 cosmetic ingredients. AATEX 14, s. 351–358.

In vitro

| (20) | EC-ECVAM (2007). Statement on the validity of in vitro tests for skin irritation. ECVAM:in tieteellinen neuvoa-antava komitea (ESAC26), 27. huhtikuuta 2007. Saatavilla osoitteessa http://ecvam.jrc.ec.europa.eu |
| --- | --- |

(20)

EC-ECVAM (2007). Statement on the validity of in vitro tests for skin irritation. ECVAM:in tieteellinen neuvoa-antava komitea (ESAC26), 27. huhtikuuta 2007. Saatavilla osoitteessa http://ecvam.jrc.ec.europa.eu

in vitro

| (21) | EC-ECVAM (2007). Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation testing. Saatavilla osoitteessa http://ecvam.jrc.ec.europa.eu |
| --- | --- |

(21)

EC-ECVAM (2007). Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation testing. Saatavilla osoitteessa http://ecvam.jrc.ec.europa.eu

in vitro

| (22) | EC-ECVAM (2008). Statement on the scientific validity of in vitro tests for skin irritation testing. ECVAM:in tieteellinen neuvoa-antava komitea (ESAC29), 5. marraskuuta 2008. Saatavilla osoitteessa http://ecvam.jrc.ec.europa.eu |
| --- | --- |

(22)

EC-ECVAM (2008). Statement on the scientific validity of in vitro tests for skin irritation testing. ECVAM:in tieteellinen neuvoa-antava komitea (ESAC29), 5. marraskuuta 2008. Saatavilla osoitteessa http://ecvam.jrc.ec.europa.eu

in vitro

| (23) | OECD (2010). Explanatory background document to the OECD draft Test Guideline on in vitro skin irritation testing. OECD Series on Testing and Assessment, No. 137. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/document/24/0,3746,en_2649_34377_47858904_1_1_1_1,00.html |
| --- | --- |

(23)

OECD (2010). Explanatory background document to the OECD draft Test Guideline on in vitro skin irritation testing. OECD Series on Testing and Assessment, No. 137. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/document/24/0,3746,en_2649_34377_47858904_1_1_1_1,00.html

in vitro

| (24) | Welss, T., Basketter, D. A. ja Schröder, K. R. (2004). In vitro skin irritation: fact and future. State of the art review of mechanisms and models. Toxicol. in Vitro 18, s. 231–243. |
| --- | --- |

(24)

Welss, T., Basketter, D. A. ja Schröder, K. R. (2004). In vitro skin irritation: fact and future. State of the art review of mechanisms and models. Toxicol. in Vitro 18, s. 231–243.

In vitro

| (25) | Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods 65, s. 55–63. |
| --- | --- |

(25)

Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods 65, s. 55–63.

| (26) | EpiSkinTM SOP, Version 1.8 (helmikuu 2009). ECVAM Skin Irritation Validation Study: Validation of the EpiSkinTM test method 15 min – 42 hours for the prediction of acute skin irritation of chemicals. Saatavilla osoitteessa http://ecvam.jrc.ec.europa.eu |
| --- | --- |

(26)

EpiSkinTM SOP, Version 1.8 (helmikuu 2009). ECVAM Skin Irritation Validation Study: Validation of the EpiSkinTM test method 15 min – 42 hours for the prediction of acute skin irritation of chemicals. Saatavilla osoitteessa http://ecvam.jrc.ec.europa.eu

TM

TM

| (27) | EpiDermTM SOP, Version 7.0 (tarkistettu versio, maaliskuu 2009). Protocol for: In vitro EpiDermTM skin irritation test (EPI-200-SIT), For use with MatTek Corporation's reconstructed human epidermal model EpiDerm (EPI-200). Saatavilla osoitteessa http://ecvam.jrc.ec.europa.eu |
| --- | --- |

(27)

EpiDermTM SOP, Version 7.0 (tarkistettu versio, maaliskuu 2009). Protocol for: In vitro EpiDermTM skin irritation test (EPI-200-SIT), For use with MatTek Corporation's reconstructed human epidermal model EpiDerm (EPI-200). Saatavilla osoitteessa http://ecvam.jrc.ec.europa.eu

TM

In vitro

TM

| (28) | SkinEthicTM RHE SOP, Version 2.0 (helmikuu 2009). SkinEthic skin irritation test-42bis test method for the prediction of acute skin irritation of chemicals: 42 minutes application + 42 hours post-incubation. Saatavilla osoitteessa http://ecvam.jrc.ec.europa.eu |
| --- | --- |

(28)

SkinEthicTM RHE SOP, Version 2.0 (helmikuu 2009). SkinEthic skin irritation test-42bis test method for the prediction of acute skin irritation of chemicals: 42 minutes application + 42 hours post-incubation. Saatavilla osoitteessa http://ecvam.jrc.ec.europa.eu

TM

| (29) | Harvell, J. D., Lamminstausta, K. ja Maibach, H. I. (1995). Irritant contact dermatitis. Practical Contact Dermatitis, s. 7–18 (Toim. Guin J. D.). Mc Graw-Hill, New York. |
| --- | --- |

(29)

Harvell, J. D., Lamminstausta, K. ja Maibach, H. I. (1995). Irritant contact dermatitis. Practical Contact Dermatitis, s. 7–18 (Toim. Guin J. D.). Mc Graw-Hill, New York.

| (30) | Komission direktiivi 2001/59/EY, annettu 6 päivänä elokuuta 2001, vaarallisten aineiden luokitusta, pakkaamista ja merkintöjä koskevien lakien, asetusten ja hallinnollisten määräysten lähentämisestä annetun neuvoston direktiivin 67/548/ETY mukauttamisesta tekniikan kehitykseen kahdennenkymmenennenkahdeksannen kerran. EYVL L 225, 21.8.2001, s. 1. |
| --- | --- |

(30)

Komission direktiivi 2001/59/EY, annettu 6 päivänä elokuuta 2001, vaarallisten aineiden luokitusta, pakkaamista ja merkintöjä koskevien lakien, asetusten ja hallinnollisten määräysten lähentämisestä annetun neuvoston direktiivin 67/548/ETY mukauttamisesta tekniikan kehitykseen kahdennenkymmenennenkahdeksannen kerran. EYVL L 225, 21.8.2001, s. 1.

| (31) | Basketter, D. A., York, M., McFadden, J. P. ja Robinson, M. K. (2004). Determination of skin irritation potential in the human 4-h patch test. Contact Dermatitis 51, s. 1–4. |
| --- | --- |

(31)

Basketter, D. A., York, M., McFadden, J. P. ja Robinson, M. K. (2004). Determination of skin irritation potential in the human 4-h patch test. Contact Dermatitis 51, s. 1–4.

| (32) | Jirova, D., Liebsch, M., Basketter, D., Spiller, E., Kejlova, K., Bendova, H., Marriott, M. ja Kandarova, H. (2007). Comparison of human skin irritation and photo-irritation patch test data with cellular in vitro assays and animal in vivo data. ALTEX 14, s. 359–365. |
| --- | --- |

(32)

Jirova, D., Liebsch, M., Basketter, D., Spiller, E., Kejlova, K., Bendova, H., Marriott, M. ja Kandarova, H. (2007). Comparison of human skin irritation and photo-irritation patch test data with cellular in vitro assays and animal in vivo data. ALTEX 14, s. 359–365.

in vitro

in vivo

| (33) | Jírová, D., Basketter, D., Liebsch, M., Bendová, H., Kejlová, K., Marriott, M. ja Kandárová, H. (2010). Comparison of human skin irritation patch test data with in vitro skin irritation assays and animal data. Contact Dermatitis 62, s. 109–116. |
| --- | --- |

(33)

Jírová, D., Basketter, D., Liebsch, M., Bendová, H., Kejlová, K., Marriott, M. ja Kandárová, H. (2010). Comparison of human skin irritation patch test data with in vitro skin irritation assays and animal data. Contact Dermatitis 62, s. 109–116.

in vitro

Lisäys 1

Määritelmät

Tarkkuus: Testimenetelmän tulosten ja hyväksyttyjen vertailuarvojen välinen ero. Tarkkuus on testimenetelmän suorituskyvyn mitta ja yksi merkityksellisyyden osatekijöistä. Tarkkuutta ja vastaavuutta (konkordanssia) käytetään usein toisiaan korvaavasti tarkoittamaan testimenetelmällä saatujen oikeiden tulosten osuutta (9).

Solujen elinkyky: Muuttuja, jolla mitataan solupopulaation kokonaisaktiivisuutta, esimerkiksi solujen mitokondrioiden dehydrogenaasien kykyä pelkistää väriaine MTT (3-(4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2,5-difenyylitetratsoliumbromidi eli tiatsolyylisininen), joka mitatusta päätepisteestä ja testimenetelmästä riippuen korreloi solujen kokonaismäärään ja/tai elinkykyyn.

Vastaavuus: Testimenetelmän suorituskyvyn mitta sellaisille testimenetelmille, joiden tulokset ovat luokittelevia, ja yksi merkityksellisyyden osatekijöistä. Vastaavuutta ja tarkkuutta käytetään usein toisiaan korvaavasti, ja vastaavuus on määritelty kaikkien niiden testikemikaalien osuudeksi, jotka on luokiteltu oikein positiivisiksi tai negatiivisiksi (9).

ET50: Voidaan arvioida määrittämällä altistusaika, joka tarvitaan, jotta solujen elinkyky vähenee 50 prosenttia annosteltaessa merkkikemikaalia tietyssä, määrätyssä pitoisuudessa; katso myös IC50.

EU:n CLP-asetus (aineiden ja seosten luokituksesta, merkinnöistä ja pakkaamisesta 16 päivänä joulukuuta 2008 annettu Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus (EY) N:o 1272/2008): Kemikaalien (aineiden ja seosten) luokittelua ja merkintöjä koskeva YK:n GHS-järjestelmä saatetaan tällä asetuksella osaksi Euroopan unionin (EU) lainsäädäntöä (3).

GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals; Yhdistyneiden kansakuntien (YK) kemikaalien maailmanlaajuisesti yhdenmukaistettu luokitus- ja merkintäjärjestelmä): Tässä järjestelmässä kemikaalit (aineet ja seokset) luokitellaan vakioitujen fysikaalisten sekä terveys- ja ympäristövaarojen tyyppien ja -tasojen mukaisesti, ja niille osoitetaan vaaraviestinnän tunnukset, kuten kuvamerkit, huomiosanat, vaaralausekkeet, turvalausekkeet ja turvatiedotteet, jotta voidaan välittää tietoa kemikaalien haittavaikutuksista ihmisten ja ympäristön suojelemiseksi (esimerkiksi työnantajille, työntekijöille, kuljetushenkilökunnalle, kuluttajille ja pelastushenkilöstölle) (1).

IC50: Voidaan arvioida määrittämällä pitoisuus, jossa merkkikemikaali alentaa solujen elinkykyä 50 prosentilla (IC50) sovitun altistusajan jälkeen; katso myös ET50.

Rajoittamaton annos: Orvasketeen applikoidun testikemikaalin määrä, joka ylittää määrän, joka tarvitaan orvaskeden pinnan peittämiseksi kokonaisuudessaan ja tasaisesti.

Me-too-testi: Puhekielinen nimitys testimenetelmälle, joka on rakenteellisesti ja funktionaalisesti samanlainen kuin validoitu ja hyväksytty vertailutestimenetelmä. Tällainen menetelmä voitaisiin myös validoida. Tarkoittaa samaa kuin samanlainen testimenetelmä (9).

Suoritusvaatimukset: Validoituihin vertailumenetelmiin perustuvat standardit, jotka toimivat perustana arvioitaessa ehdotetun mekaanisesti ja toiminnallisesti samanlaisen testimenetelmän vertailtavuutta. Siihen sisältyvät i) testimenetelmän oleelliset osat; ii) vähimmäisluettelo vertailukemikaaleista, jotka on valittu niiden kemikaalien joukosta, joita on käytetty osoittamaan validoidun vertailumenetelmän hyväksyttävää suorituskykyä; ja iii) vertailukelpoiset validoidusta testimenetelmästä saatuihin tuloksiin perustuvat tarkkuuden ja luotettavuuden tasot, jotka ehdotetun testimenetelmän olisi osoitettava, kun sitä arvioidaan vertailukemikaalien vähimmäisluettelon avulla (9).

Vertailukemikaalit: Validointimenettelyyn valitut kemikaalit, joiden vasteet in vitro- tai in vivo -vertailutestijärjestelmässä tai kyseisessä lajissa ovat tiedossa. Näiden kemikaalien olisi edustettava niitä kemikaaliluokkia, joita testattaessa kyseistä testimenetelmää todennäköisesti käytetään, ja niiden on edustettava kaikkia niitä vasteita, joita tällä testimenetelmällä testattavilta kemikaaleilta voidaan odottaa (voimakkaista lieviin ja negatiivisiin). Validointimenettelyn eri vaiheita sekä eri testimenetelmiä ja testitarkoituksia varten voidaan vaatia erilaisia vertailukemikaaleja (9).

Merkityksellisyys: Kuvaus testin ja toivotun vaikutuksen välisestä suhteesta ja siitä, onko testi tarkoituksenmukainen ja hyödyllinen tiettyä tarkoitusta varten. Merkityksellisyydellä tarkoitetaan sitä, missä määrin testillä voidaan tarkasti mitata tai ennustaa haluttua biologista vaikutusta. Merkityksellisyyden yhteydessä on huomioitava myös testimenetelmän tarkkuus (vastaavuus) (9).

Luotettavuus: Laajuus, jolla testimenetelmä on uusittavissa samassa laboratoriossa tai eri laboratorioissa ajan myötä käytettäessä samaa menettelyä. Se arvioidaan laskemalla laboratorionsisäinen ja laboratorioidenvälinen uusittavuus (9).

Korvaava testi: Testi, jolla voidaan korvata testi, joka on säännöllisesti käytössä ja joka on hyväksytty vaarallisuuden määrittämiseen ja/tai riskien arviointiin, ja jonka on osoitettu antavan ihmisten tai eläinten terveyden tai tarvittaessa ympäristön kannalta vastaavan tai korkeamman suojelutason hyväksyttyyn testiin verrattuna kaikissa mahdollisissa testaustilanteissa ja kaikkien kemikaalien yhteydessä (9).

Herkkyys: Niiden positiivisten/aktiivisten testikemikaalien osuus, jotka on luokiteltu testissä oikein. Sillä mitataan luokittavia tuloksia tuottavan testimenetelmän tarkkuutta. Herkkyys on tärkeää ottaa huomioon arvioitaessa testimenetelmän merkityksellisyyttä (9).

Ihoärsyttävyys: Palautuvan ihovaurion ilmaantuminen enintään neljä tuntia kestäneen testikemikaalin annostelun jälkeen. Ihoärsytys on paikallisesti esiintyvä, ei-immunogeeninen reaktio, joka kehittyy pian stimulaation jälkeen (29). Sen tärkeimmät ominaispiirteet ovat sen palautuvuus, johon liittyy tulehdusreaktioita, ja useimmat tulehdusreaktioon liittyvät ärsyttävyyden kliiniset ominaispiirteet (eryteema, ödeema, kutina ja kipu).

Spesifisyys: Niiden negatiivisten/inaktiivisten testikemikaalien osuus, jotka on luokiteltu testissä oikein. Sillä mitataan luokittavia tuloksia tuottavan testimenetelmän tarkkuutta. On tärkeää ottaa spesifisyys huomioon arvioitaessa testimenetelmän merkityksellisyyttä (9).

Vaiheittainen testausstrategia: Testaus, jossa testimenetelmiä käytetään peräkkäin; testimenetelmät valitaan kullekin peräkkäiselle tasolle edellisen testaustason tulosten perusteella (9).

Testikemikaali (testiaine): Aine tai seos, jota testataan tällä testimenetelmällä.

Lisäys 2

Suoritusvaatimukset ehdotettujen samanlaisten tai mukautettujen rekonstruoituun ihmisorvasketeen (RhE) perustuvien ihoärsytyksen in vitro -menetelmien arviointia varten

JOHDANTO

| 1. | Suoritusvaatimuksien tarkoituksena on antaa perusta, jolla voidaan määrittää, ovatko yksinoikeudelliset (eli tekijänoikeudelliset, tavaramerkityt tai rekisteröidyt) ja muut kuin yksinoikeudelliset uudet menetelmät riittävän täsmällisiä ja luotettavia tiettyjä testaustarkoituksia varten. Näitä validoituihin ja hyväksyttyihin testimenetelmiin perustuvia suoritusvaatimuksia voidaan käyttää muiden samanlaisten menetelmien (niin sanottujen me-too-testien) luotettavuuden ja täsmällisyyden arviointiin, kun kyseiset menetelmät perustuvat vastaaviin tieteellisiin periaatteisiin ja niillä mitataan tai ennakoidaan samanlaista biologista tai toksista vaikutusta (9). |
| --- | --- |

1.

Suoritusvaatimuksien tarkoituksena on antaa perusta, jolla voidaan määrittää, ovatko yksinoikeudelliset (eli tekijänoikeudelliset, tavaramerkityt tai rekisteröidyt) ja muut kuin yksinoikeudelliset uudet menetelmät riittävän täsmällisiä ja luotettavia tiettyjä testaustarkoituksia varten. Näitä validoituihin ja hyväksyttyihin testimenetelmiin perustuvia suoritusvaatimuksia voidaan käyttää muiden samanlaisten menetelmien (niin sanottujen me-too-testien) luotettavuuden ja täsmällisyyden arviointiin, kun kyseiset menetelmät perustuvat vastaaviin tieteellisiin periaatteisiin ja niillä mitataan tai ennakoidaan samanlaista biologista tai toksista vaikutusta (9).

| 2. | Ennen mukautettujen menetelmien (eli hyväksytyn menetelmän mahdollisten parannusehdotusten) hyväksymistä on arvioitava ehdotettujen muutosten vaikutus testin suorittamiseen ja se, missä määrin kyseiset muutokset vaikuttavat validointimenettelyn muita osia varten saatavilla oleviin tietoihin. Ehdotettujen muutosten määrän ja luonteen, saatujen tietojen ja kyseisiä muutoksia tukevan aineiston mukaisesti ne on joko validoitava samalla tavalla kuin uusi testi tai, mikäli se on asianmukaista, niiden luotettavuus ja merkityksellisyys on arvioitava suppeammin käyttämällä vakiintuneita suoritusvaatimuksia (9). |
| --- | --- |

2.

Ennen mukautettujen menetelmien (eli hyväksytyn menetelmän mahdollisten parannusehdotusten) hyväksymistä on arvioitava ehdotettujen muutosten vaikutus testin suorittamiseen ja se, missä määrin kyseiset muutokset vaikuttavat validointimenettelyn muita osia varten saatavilla oleviin tietoihin. Ehdotettujen muutosten määrän ja luonteen, saatujen tietojen ja kyseisiä muutoksia tukevan aineiston mukaisesti ne on joko validoitava samalla tavalla kuin uusi testi tai, mikäli se on asianmukaista, niiden luotettavuus ja merkityksellisyys on arvioitava suppeammin käyttämällä vakiintuneita suoritusvaatimuksia (9).

| 3. | Tätä testiä varten käytettäväksi ehdotettujen kolmen validoidun menetelmän (EpiSkinTM (validoitu vertailumenetelmä – VVM), EpiDermTM-ihoärsytystesti (EPI-200) ja SkinEthicTM-RhE-menetelmä) samanlaisten (me-too-menetelmät) tai mukautettujen menetelmien luotettavuus ja täsmällisyys on määritettävä käyttämällä kemikaaleja, jotka edustavat koko Draizen ihoärsytyksen pisteytysasteikkoa. Kun ehdotettu menetelmä arvioidaan käyttämällä suoritusvaatimuksissa suositeltuja 20:tä vertailukemikaalia (taulukko 1), ehdotettujen samanlaisten tai mukautettujen menetelmien luotettavuus- ja tarkkuusarvojen on vastattava VVM:stä saatuja arvoja tai oltava niitä parempia (taulukko 2) (2) (16). Luotettavuus- ja tarkkuusarvot, jotka on saavutettava, esitetään tässä lisäyksessä olevissa 8–12 kohdassa. Vertailukemikaaleissa on mukana luokittelemattomia (YK:n GHS-järjestelmän / EU:n CLP-asetuksen ’ei luokitusta’) ja luokiteltuja (YK:n GHS-järjestelmän / EU:n CLP-asetuksen luokka 2) (1), erilaisia kemikaaliluokkia edustavia kemikaaleja, joten ehdotetun menetelmän luotettavuutta ja tarkkuutta (herkkyyttä, spesifisyyttä ja yleistä tarkkuutta) VVM:n luotettavuuteen ja tarkkuuteen voidaan verrata. Menetelmän luotettavuus sekä sen kyky tunnistaa oikein YK:n GHS-järjestelmän / EU:n CLP-asetuksen luokkaan 2 kuuluvat ärsytystä aiheuttavat kemikaalit sekä – riippuen siitä säännöstöstä, jota varten tietoja tuotetaan – myös sen kyky tunnistaa oikein YK:n GHS-järjestelmän / EU:n CLP-asetuksen luokkaan ’ei luokitusta’ kuuluvat kemikaalit olisi määritettävä, ennen kuin menetelmää käytetään uusien testikemikaalien testaamiseen. |
| --- | --- |

3.

Tätä testiä varten käytettäväksi ehdotettujen kolmen validoidun menetelmän (EpiSkinTM (validoitu vertailumenetelmä – VVM), EpiDermTM-ihoärsytystesti (EPI-200) ja SkinEthicTM-RhE-menetelmä) samanlaisten (me-too-menetelmät) tai mukautettujen menetelmien luotettavuus ja täsmällisyys on määritettävä käyttämällä kemikaaleja, jotka edustavat koko Draizen ihoärsytyksen pisteytysasteikkoa. Kun ehdotettu menetelmä arvioidaan käyttämällä suoritusvaatimuksissa suositeltuja 20:tä vertailukemikaalia (taulukko 1), ehdotettujen samanlaisten tai mukautettujen menetelmien luotettavuus- ja tarkkuusarvojen on vastattava VVM:stä saatuja arvoja tai oltava niitä parempia (taulukko 2) (2) (16). Luotettavuus- ja tarkkuusarvot, jotka on saavutettava, esitetään tässä lisäyksessä olevissa 8–12 kohdassa. Vertailukemikaaleissa on mukana luokittelemattomia (YK:n GHS-järjestelmän / EU:n CLP-asetuksen ’ei luokitusta’) ja luokiteltuja (YK:n GHS-järjestelmän / EU:n CLP-asetuksen luokka 2) (1), erilaisia kemikaaliluokkia edustavia kemikaaleja, joten ehdotetun menetelmän luotettavuutta ja tarkkuutta (herkkyyttä, spesifisyyttä ja yleistä tarkkuutta) VVM:n luotettavuuteen ja tarkkuuteen voidaan verrata. Menetelmän luotettavuus sekä sen kyky tunnistaa oikein YK:n GHS-järjestelmän / EU:n CLP-asetuksen luokkaan 2 kuuluvat ärsytystä aiheuttavat kemikaalit sekä – riippuen siitä säännöstöstä, jota varten tietoja tuotetaan – myös sen kyky tunnistaa oikein YK:n GHS-järjestelmän / EU:n CLP-asetuksen luokkaan ’ei luokitusta’ kuuluvat kemikaalit olisi määritettävä, ennen kuin menetelmää käytetään uusien testikemikaalien testaamiseen.

| 4. | Nämä suoritusvaatimukset perustuvat EC-ECVAM:in suoritusvaatimuksiin (8), jotka on saatettu ajan tasalle luokitusta ja merkintöjä koskevien YK:n GHS-järjestelmän ja EU:n CLP-asetuksen mukaisesti (1) (3). Alkuperäiset suoritusvaatimukset määriteltiin validointitutkimuksen (21) suorittamisen jälkeen, ja ne perustuivat EU:n luokittelujärjestelmään, josta säädetään vaarallisten aineiden luokitusta, pakkaamista ja merkintöjä koskevien lakien, asetusten ja hallinnollisten määräysten lähentämisestä annetun neuvoston direktiivin 67/548/ETY mukauttamisesta tekniikan kehitykseen kahdennenkymmenennenkahdeksannen kerran 6 päivänä elokuuta 2001 annetulla komission direktiivillä 2001/59/EY (12). Koska YK:n GHS-järjestelmä hyväksyttiin EU:n luokitus- ja merkintäjärjestelmäksi (EU:n CLP-asetus) (3) validointitutkimuksen päätökseen saattamisen ja tämän testimenetelmän lopullisen version laatimisen välisenä aikana, suoritusvaatimuksia on saatettu ajan tasalle (8). Nämä ajan tasalle saattamiseksi tehtävät tarkistukset koskevat pääasiassa muutoksia i) suoritusvaatimuksissa mainituissa vertailukemikaaleissa ja ii) määriteltyjä luotettavuus- ja tarkkuusarvoja (2) (23). |
| --- | --- |

4.

Nämä suoritusvaatimukset perustuvat EC-ECVAM:in suoritusvaatimuksiin (8), jotka on saatettu ajan tasalle luokitusta ja merkintöjä koskevien YK:n GHS-järjestelmän ja EU:n CLP-asetuksen mukaisesti (1) (3). Alkuperäiset suoritusvaatimukset määriteltiin validointitutkimuksen (21) suorittamisen jälkeen, ja ne perustuivat EU:n luokittelujärjestelmään, josta säädetään vaarallisten aineiden luokitusta, pakkaamista ja merkintöjä koskevien lakien, asetusten ja hallinnollisten määräysten lähentämisestä annetun neuvoston direktiivin 67/548/ETY mukauttamisesta tekniikan kehitykseen kahdennenkymmenennenkahdeksannen kerran 6 päivänä elokuuta 2001 annetulla komission direktiivillä 2001/59/EY (12). Koska YK:n GHS-järjestelmä hyväksyttiin EU:n luokitus- ja merkintäjärjestelmäksi (EU:n CLP-asetus) (3) validointitutkimuksen päätökseen saattamisen ja tämän testimenetelmän lopullisen version laatimisen välisenä aikana, suoritusvaatimuksia on saatettu ajan tasalle (8). Nämä ajan tasalle saattamiseksi tehtävät tarkistukset koskevat pääasiassa muutoksia i) suoritusvaatimuksissa mainituissa vertailukemikaaleissa ja ii) määriteltyjä luotettavuus- ja tarkkuusarvoja (2) (23).

SUORITUSVAATIMUKSET REKONSTRUOITUUN IHMISORVASKETEEN (RhE) PERUSTUVIA IHOÄRSYTYKSEN IN VITRO -TESTIMENETELMIÄ VARTEN

| 5. | Suoritusvaatimukset koostuvat seuraavista kolmesta osasta (9):






  I) | testimenetelmän oleelliset osat |
| --- | --- | --- |

5.

Suoritusvaatimukset koostuvat seuraavista kolmesta osasta (9):

I)

testimenetelmän oleelliset osat

| II) | vertailukemikaalien vähimmäisluettelo |
| --- | --- |

II)

vertailukemikaalien vähimmäisluettelo

| III) | määritellyt luotettavuus- ja tarkkuusarvot |
| --- | --- |

III)

määritellyt luotettavuus- ja tarkkuusarvot

I)   Testimenetelmän oleelliset osat

| 6. | Nämä koostuvat validoidun menetelmän oleellisista rakenteellisista, toiminnallisista ja menettelyihin liittyvistä osista, jotka on sisällytettävä ehdotetun mekaanisesti tai toiminnallisesti samanlaisen tai mukautetun menetelmän testisuunnitelmaan. Näitä osia ovat vain kyseisellä menetelmällä olevat ominaisuudet, menettelyihin liittyvät ratkaisevan tärkeät yksityiskohdat sekä laadunvalvontamenettelyt. Testimenetelmän oleellisia osia koskevia vaatimuksia noudattamalla varmistetaan, että ehdotettu samanlainen tai mukautettu menetelmä perustuu samoihin tekijöihin kuin vastaava VVM (9). Testimenetelmän oleelliset osat kuvataan yksityiskohtaisesti testimenetelmän 16–21 kohdassa, ja testaus olisi tehtävä seuraavien kohtien mukaisesti:






  — | yleiset ehdot (16 kohta) |
| --- | --- | --- |

6.

Nämä koostuvat validoidun menetelmän oleellisista rakenteellisista, toiminnallisista ja menettelyihin liittyvistä osista, jotka on sisällytettävä ehdotetun mekaanisesti tai toiminnallisesti samanlaisen tai mukautetun menetelmän testisuunnitelmaan. Näitä osia ovat vain kyseisellä menetelmällä olevat ominaisuudet, menettelyihin liittyvät ratkaisevan tärkeät yksityiskohdat sekä laadunvalvontamenettelyt. Testimenetelmän oleellisia osia koskevia vaatimuksia noudattamalla varmistetaan, että ehdotettu samanlainen tai mukautettu menetelmä perustuu samoihin tekijöihin kuin vastaava VVM (9). Testimenetelmän oleelliset osat kuvataan yksityiskohtaisesti testimenetelmän 16–21 kohdassa, ja testaus olisi tehtävä seuraavien kohtien mukaisesti:

—

yleiset ehdot (16 kohta)

| — | funktionaaliset ehdot, joihin kuuluvat






  — | solujen elinkyky (17 kohta), |
| --- | --- | --- |

—

funktionaaliset ehdot, joihin kuuluvat

—

solujen elinkyky (17 kohta),

| — | läpäisyn esto (18 kohta), |
| --- | --- |

—

läpäisyn esto (18 kohta),

| — | morfologia (19 kohta), |
| --- | --- |

—

morfologia (19 kohta),

| — | uusittavuus (20 kohta) ja |
| --- | --- |

—

uusittavuus (20 kohta) ja

| — | laadunvalvonta (21 kohta). |
| --- | --- |

—

laadunvalvonta (21 kohta).

II)   Vertailukemikaalien vähimmäisluettelo

| 7. | Vertailukemikaalien avulla määritetään, onko ehdotettu samanlainen tai mukautettu menetelmä, joka on osoitettu rakenteellisesti ja toiminnallisesti riittävän samanlaiseksi VVM:ään verrattuna, tai joka on jonkin edellä mainituista kolmesta validoidusta menetelmästä vähäinen mukautus, yhtä luotettava ja tarkka tai luotettavampi tai tarkempi kuin VVM (2) (8) (16) (23). Taulukossa 1 lueteltuihin 20 suositeltuun vertailukemikaaliin on sisällytetty kemikaaleja erilaisista kemiallisista luokista (eli funktionaalisiin ryhmiin perustuvista kemikaaliluokista), ja ne edustavat koko Draizen ihoärsytyksen pisteytysasteikkoa (ärsyttämättömästä erittäin ärsyttävään). Luetteloon on sisällytetty kymmenen YK:n GHS-järjestelmän / EU:n CLP-asetuksen luokan 2 kemikaalia ja kymmenen luokittelematonta kemikaalia, joista kolme on YK:n GHS-järjestelmän valinnaisen luokan 3 kemikaaleja. Tässä testimenetelmässä valinnainen luokka 3 katsotaan luokaksi ’ei luokitusta’. Taulukossa 1 luetellut kemikaalit on valittu esivalidointia seuraavassa optimointivaiheessa ja VVM:n validointitutkimuksessa käytetyistä kemikaaleista niin, että huomioon on otettu kemiallinen funktionaalisuus ja fysikaalinen olomuoto (14) (18). Nämä vertailukemikaalit edustavat niiden kemikaalien vähimmäismäärää, joita on käytettävä ehdotetun samanlaisen tai mukautetun menetelmän tarkkuuden ja luotettavuuden arvioimiseksi. Niitä ei kuitenkaan pidä käyttää uusien menetelmien kehittämiseksi. Jos lueteltu kemikaali ei ole saatavilla, myös muita kemikaaleja voidaan käyttää, jos niistä on saatavilla asianmukaiset in vivo -vertailutiedot. Tällaiset kemikaalit on valittava ensisijaisesti niistä kemikaaleista, joita on käytetty esivalidointia seuraavassa optimointivaiheessa tai VVM:n validointitutkimuksessa. Vertailukemikaalien vähimmäisluetteloon voidaan tarvittaessa lisätä muita kemikaaliluokkia edustavia kemikaaleja, joista on saatavilla asianmukaiset in vivo -vertailutiedot, jotta ehdotetun menetelmän tarkkuutta voidaan arvioida yksityiskohtaisemmin.

  Taulukko 1


  Samanlaisten tai mukautettujen RhE-ihoärsytysmenetelmien tarkkuus- ja luotettavuusarvojen määrittämisessä käytettävien vertailukemikaalien vähimmäisluettelo
   (13)











  Kemikaali | CAS-nro | Fysikaalinen olomuoto | In vivo-tulos | VRM in vitro-luokka | YK GHS / EU CLP in vivo-luokka |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| 1-bromi-4-klooributaani | 6940-78-9 | neste | 0 | luokka 2 | ei luokitusta |
| dietyyliftalaatti | 84-66-2 | neste | 0 | ei luokitusta | ei luokitusta |
| naftaleenietikkahappo | 86-87-3 | kiinteä | 0 | ei luokitusta | ei luokitusta |
| allyylifenoksiasetaatti | 7493-74-5 | neste | 0,3 | ei luokitusta | ei luokitusta |
| isopropanoli | 67-63-0 | neste | 0,3 | ei luokitusta | ei luokitusta |
| 4-(metyylitio)-bentsaldedydi | 3446-89-7 | neste | 1 | luokka 2 | ei luokitusta |
| metyylistearaatti | 112-61-8 | kiinteä | 1 | ei luokitusta | ei luokitusta |
| heptyylibutyraatti | 5870-93-9 | neste | 1,7 | ei luokitusta | ei luokitusta |
| heksyylisalisylaatti | 6259-76-3 | neste | 2 | ei luokitusta | ei luokitusta |
| kanelialdehydi | 104-55-2 | neste | 2 | luokka 2 | ei luokitusta
  (valinnainen luokka 3) (15) |
| 1-dekanoli
   (14) | 112-30-1 | neste | 2,3 | luokka 2 | luokka 2 |
| syklameenialdehydi | 103-95-7 | neste | 2,3 | luokka 2 | luokka 2 |
| 1-bromiheksaani | 111-25-1 | neste | 2,7 | luokka 2 | luokka 2 |
| 2-kloorimetyyli-3,5-dimetyyli-4-metoksipyridiinihydrokloridi | 86604-75-3 | kiinteä | 2,7 | luokka 2 | luokka 2 |
| di-n-propyylidisulfidi
   (14) | 629-19-6 | neste | 3 | ei luokitusta | luokka 2 |
| kaliumhydroksidi (5 % liuos vedessä) | 1310-58-3 | neste | 3 | luokka 2 | luokka 2 |
| bentseenitioli, 5-(1,1-dimetyylietyyli)-2-metyyli- | 7340-90-1 | neste | 3,3 | luokka 2 | luokka 2 |
| 1-metyyli-3-fenyyli-1-piperatsiini | 5271-27-2 | kiinteä | 3,3 | luokka 2 | luokka 2 |
| heptanaali | 111-71-7 | neste | 3,4 | luokka 2 | luokka 2 |
| tetrakloorietyleeni | 127-18-4 | neste | 4 | luokka 2 | luokka 2 |

7.

Vertailukemikaalien avulla määritetään, onko ehdotettu samanlainen tai mukautettu menetelmä, joka on osoitettu rakenteellisesti ja toiminnallisesti riittävän samanlaiseksi VVM:ään verrattuna, tai joka on jonkin edellä mainituista kolmesta validoidusta menetelmästä vähäinen mukautus, yhtä luotettava ja tarkka tai luotettavampi tai tarkempi kuin VVM (2) (8) (16) (23). Taulukossa 1 lueteltuihin 20 suositeltuun vertailukemikaaliin on sisällytetty kemikaaleja erilaisista kemiallisista luokista (eli funktionaalisiin ryhmiin perustuvista kemikaaliluokista), ja ne edustavat koko Draizen ihoärsytyksen pisteytysasteikkoa (ärsyttämättömästä erittäin ärsyttävään). Luetteloon on sisällytetty kymmenen YK:n GHS-järjestelmän / EU:n CLP-asetuksen luokan 2 kemikaalia ja kymmenen luokittelematonta kemikaalia, joista kolme on YK:n GHS-järjestelmän valinnaisen luokan 3 kemikaaleja. Tässä testimenetelmässä valinnainen luokka 3 katsotaan luokaksi ’ei luokitusta’. Taulukossa 1 luetellut kemikaalit on valittu esivalidointia seuraavassa optimointivaiheessa ja VVM:n validointitutkimuksessa käytetyistä kemikaaleista niin, että huomioon on otettu kemiallinen funktionaalisuus ja fysikaalinen olomuoto (14) (18). Nämä vertailukemikaalit edustavat niiden kemikaalien vähimmäismäärää, joita on käytettävä ehdotetun samanlaisen tai mukautetun menetelmän tarkkuuden ja luotettavuuden arvioimiseksi. Niitä ei kuitenkaan pidä käyttää uusien menetelmien kehittämiseksi. Jos lueteltu kemikaali ei ole saatavilla, myös muita kemikaaleja voidaan käyttää, jos niistä on saatavilla asianmukaiset in vivo -vertailutiedot. Tällaiset kemikaalit on valittava ensisijaisesti niistä kemikaaleista, joita on käytetty esivalidointia seuraavassa optimointivaiheessa tai VVM:n validointitutkimuksessa. Vertailukemikaalien vähimmäisluetteloon voidaan tarvittaessa lisätä muita kemikaaliluokkia edustavia kemikaaleja, joista on saatavilla asianmukaiset in vivo -vertailutiedot, jotta ehdotetun menetelmän tarkkuutta voidaan arvioida yksityiskohtaisemmin.

Taulukko 1

Samanlaisten tai mukautettujen RhE-ihoärsytysmenetelmien tarkkuus- ja luotettavuusarvojen määrittämisessä käytettävien vertailukemikaalien vähimmäisluettelo
   (13)

Kemikaali

CAS-nro

Fysikaalinen olomuoto

In vivo-tulos

VRM in vitro-luokka

YK GHS / EU CLP in vivo-luokka

1-bromi-4-klooributaani

6940-78-9

neste

0

luokka 2

ei luokitusta

dietyyliftalaatti

84-66-2

neste

0

ei luokitusta

ei luokitusta

naftaleenietikkahappo

86-87-3

kiinteä

0

ei luokitusta

ei luokitusta

allyylifenoksiasetaatti

7493-74-5

neste

0,3

ei luokitusta

ei luokitusta

isopropanoli

67-63-0

neste

0,3

ei luokitusta

ei luokitusta

4-(metyylitio)-bentsaldedydi

3446-89-7

neste

1

luokka 2

ei luokitusta

metyylistearaatti

112-61-8

kiinteä

1

ei luokitusta

ei luokitusta

heptyylibutyraatti

5870-93-9

neste

1,7

ei luokitusta

ei luokitusta

heksyylisalisylaatti

6259-76-3

neste

2

ei luokitusta

ei luokitusta

kanelialdehydi

104-55-2

neste

2

luokka 2

ei luokitusta

(valinnainen luokka 3) (15)

1-dekanoli
   (14)

112-30-1

neste

2,3

luokka 2

luokka 2

syklameenialdehydi

103-95-7

neste

2,3

luokka 2

luokka 2

1-bromiheksaani

111-25-1

neste

2,7

luokka 2

luokka 2

2-kloorimetyyli-3,5-dimetyyli-4-metoksipyridiinihydrokloridi

86604-75-3

kiinteä

2,7

luokka 2

luokka 2

di-n-propyylidisulfidi
   (14)

629-19-6

neste

3

ei luokitusta

luokka 2

kaliumhydroksidi (5 % liuos vedessä)

1310-58-3

neste

3

luokka 2

luokka 2

bentseenitioli, 5-(1,1-dimetyylietyyli)-2-metyyli-

7340-90-1

neste

3,3

luokka 2

luokka 2

1-metyyli-3-fenyyli-1-piperatsiini

5271-27-2

kiinteä

3,3

luokka 2

luokka 2

heptanaali

111-71-7

neste

3,4

luokka 2

luokka 2

tetrakloorietyleeni

127-18-4

neste

4

luokka 2

luokka 2

III)   Määritellyt luotettavuus- ja tarkkuusarvot

| 8. | Kun ehdotettuja samanlaisia tai mukautettuja menetelmiä on tarkoitus käyttää monissa laboratorioissa, on luotettavuuden ja merkityksellisyyden määrittämiseksi kaikki taulukossa 1 esitetyt 20 vertailukemikaalia testattava vähintään kolmessa laboratoriossa. Jos ehdotettua menetelmää aiotaan käyttää vain yhdessä laboratoriossa, ei validointiin vaadita useissa laboratorioissa tehtävää testausta. On kuitenkin tärkeää, että kansainvälisesti tunnustetut validointielimet arvioivat kyseisiä validointitutkimuksia riippumattomasti kansainvälisten ohjeiden mukaisesti (9). Kaikki 20 vertailukemikaalia on testattava kussakin laboratoriossa kolmella erillisellä testiajolla, jotka suoritetaan eri kudosnäytteillä ja riittävän pitkän ajan kuluttua toisistaan. Kussakin testiajossa on testattava samanaikaisesti vähintään kolme rinnakkaista kudosnäytettä jokaista testattavaa testikemikaalia sekä negatiivista kontrollikemikaalia ja positiivista kontrollikemikaalia kohti. |
| --- | --- |

8.

Kun ehdotettuja samanlaisia tai mukautettuja menetelmiä on tarkoitus käyttää monissa laboratorioissa, on luotettavuuden ja merkityksellisyyden määrittämiseksi kaikki taulukossa 1 esitetyt 20 vertailukemikaalia testattava vähintään kolmessa laboratoriossa. Jos ehdotettua menetelmää aiotaan käyttää vain yhdessä laboratoriossa, ei validointiin vaadita useissa laboratorioissa tehtävää testausta. On kuitenkin tärkeää, että kansainvälisesti tunnustetut validointielimet arvioivat kyseisiä validointitutkimuksia riippumattomasti kansainvälisten ohjeiden mukaisesti (9). Kaikki 20 vertailukemikaalia on testattava kussakin laboratoriossa kolmella erillisellä testiajolla, jotka suoritetaan eri kudosnäytteillä ja riittävän pitkän ajan kuluttua toisistaan. Kussakin testiajossa on testattava samanaikaisesti vähintään kolme rinnakkaista kudosnäytettä jokaista testattavaa testikemikaalia sekä negatiivista kontrollikemikaalia ja positiivista kontrollikemikaalia kohti.

| 9. | Ehdotetun menetelmän luotettavuus- ja tarkkuusarvot on laskettava niin, että huomioon otetaan seuraavat neljä perustetta, ja on varmistettava, että luotettavuus- ja tarkkuusarvot lasketaan ennalta määritetyllä ja johdonmukaisella tavalla:






  1. | Vain täydellisistä testeistä saatuja tietoja voidaan käyttää menetelmän laboratorionsisäisen ja laboratorioidenvälisen vaihtelun ja ennustettavuuden (tarkkuuden) laskemiseksi. |
| --- | --- | --- |

9.

Ehdotetun menetelmän luotettavuus- ja tarkkuusarvot on laskettava niin, että huomioon otetaan seuraavat neljä perustetta, ja on varmistettava, että luotettavuus- ja tarkkuusarvot lasketaan ennalta määritetyllä ja johdonmukaisella tavalla:

1.

Vain täydellisistä testeistä saatuja tietoja voidaan käyttää menetelmän laboratorionsisäisen ja laboratorioidenvälisen vaihtelun ja ennustettavuuden (tarkkuuden) laskemiseksi.

| 2. | Kunkin osallistuvan laboratorion kunkin vertailukemikaalin lopullinen luokittelu on tehtävä käyttämällä täydellisen testin eri testikerroilla saatujen solujen elinkyvyn arvojen keskiarvoa. |
| --- | --- |

2.

Kunkin osallistuvan laboratorion kunkin vertailukemikaalin lopullinen luokittelu on tehtävä käyttämällä täydellisen testin eri testikerroilla saatujen solujen elinkyvyn arvojen keskiarvoa.

| 3. | Vain sellaisista kemikaaleista saadut tiedot, joille on tehty täydelliset testit kaikissa osallistuvissa laboratorioissa, voidaan ottaa huomioon laskettaessa menetelmän laboratorioidenvälistä vaihtelua. |
| --- | --- |

3.

Vain sellaisista kemikaaleista saadut tiedot, joille on tehty täydelliset testit kaikissa osallistuvissa laboratorioissa, voidaan ottaa huomioon laskettaessa menetelmän laboratorioidenvälistä vaihtelua.

| 4. | Tarkkuusarvot on laskettava osallistuvissa laboratorioissa 20 vertailukemikaalille tuotettujen yksittäisten laboratorioennusteiden perusteella. |
| --- | --- |

4.

Tarkkuusarvot on laskettava osallistuvissa laboratorioissa 20 vertailukemikaalille tuotettujen yksittäisten laboratorioennusteiden perusteella.

Tässä yhteydessä testikerta (testiajo) koostuu tietyn laboratorion tietylle testikemikaalille tekemästä kolmesta riippumattomasta testauksesta. Täydellisellä testiajolla tarkoitetaan tietyssä laboratoriossa tietylle testikemikaalille tehtyä testiä, jonka kaikki kolme ajoa ovat valideja. Tämä tarkoittaa, että yksikin hylätty ajo/testikerta johtaa koko kolmesta testiajosta koostuvan täydellisen testiajon hylkäämiseen.

Laboratorionsisäinen uusittavuus

| 10. | Laboratorion sisäisen uusittavuuden arvioinnilla on osoitettava, että tietyssä laboratoriossa 20 vertailukemikaalilla suoritetut yksittäisillä, erillisillä testikerroilla saadut luokittelut vastaavat vähintään 90-prosenttisesti YK:n GHS-järjestelmän tai EU:n CLP-asetuksen luokitusta (luokka 2 tai ei luokitusta). |
| --- | --- |

10.

Laboratorion sisäisen uusittavuuden arvioinnilla on osoitettava, että tietyssä laboratoriossa 20 vertailukemikaalilla suoritetut yksittäisillä, erillisillä testikerroilla saadut luokittelut vastaavat vähintään 90-prosenttisesti YK:n GHS-järjestelmän tai EU:n CLP-asetuksen luokitusta (luokka 2 tai ei luokitusta).

Laboratorioidenvälinen uusittavuus

| 11. | Laboratorioidenvälisen uusittavuuden arviointi ei ole tarpeen, jos ehdotettua menetelmää aiotaan käyttää vain yhdessä laboratoriossa. Jotta menetelmiä voitaisiin käyttää useissa laboratorioissa, mieluiten kolmessa eri laboratoriossa 20 vertailukemikaalilla suoritetuilla yksittäisillä, erillisillä testikerroilla saatujen luokitusten olisi vastattava vähintään 80-prosenttisesti YK:n GHS-järjestelmän tai EU:n CLP-asetuksen luokitusta (luokka 2 tai ei luokitusta). |
| --- | --- |

11.

Laboratorioidenvälisen uusittavuuden arviointi ei ole tarpeen, jos ehdotettua menetelmää aiotaan käyttää vain yhdessä laboratoriossa. Jotta menetelmiä voitaisiin käyttää useissa laboratorioissa, mieluiten kolmessa eri laboratoriossa 20 vertailukemikaalilla suoritetuilla yksittäisillä, erillisillä testikerroilla saatujen luokitusten olisi vastattava vähintään 80-prosenttisesti YK:n GHS-järjestelmän tai EU:n CLP-asetuksen luokitusta (luokka 2 tai ei luokitusta).

Ennustettavuusi (tarkkuus)

| 12. | Ehdotetun samanlaisen tai mukautetun menetelmän tarkkuuden (herkkyyden, spesifisyyden ja yleisen tarkkuuden) on oltava yhtä suuri tai suurempi kuin VVM:n, kun kohdelajin osalta otetaan huomioon täydentävät merkityksellisyyttä koskevat tiedot (taulukko 2). Herkkyyden on oltava yhtä suuri tai suurempi kuin (≥) 80 prosenttia (2) (8) (23). Ehdotetun in vitro -menetelmän herkkyyteen sovelletaan kuitenkin erityistä rajoitusta: vain kaksi luokkaan 2 kuuluvaa in vivo -kemikaalia, 1-dekanoli ja di-n-propyylidisulfidi, saadaan luokitella väärin useammassa kuin yhdessä osallistuvassa laboratoriossa. Spesifisyyden on oltava yhtä suuri tai suurempi kuin (≥) 70 prosenttia (2) (8) (23). Ehdotetun in vitro -menetelmän spesifisyyteen ei sovelleta muita rajoituksia. Toisin sanoen mikä tahansa osallistuva laboratorio saa luokitella ei luokitusta -luokkaan kuuluvan in vivo -kemikaalin väärin edellyttäen, että testimenetelmän lopullinen spesifisyys on hyväksyttävällä vaihteluvälillä. Yleisen tarkkuuden on oltava yhtä suuri tai suurempi kuin (≥) 75 prosenttia (2) (8) (23). Vaikka taulukossa 1 lueteltujen vertailukemikaalien perusteella lasketun VVM:n herkkyys on yhtä suuri kuin 90 prosenttia, samanlaisen tai mukautetun menetelmän hyväksymiseen vaadittu herkkyyden vähimmäisarvo on määritetty 80 prosentiksi, koska tiedetään, että 1-dekanoli (kemikaalina rajatapaus) ja di-n-propyylidisulfidi (VVM:n väärä negatiivinen) eivät aiheuta ärsytystä ihmisille (31) (32) (33), vaikka niiden on määritetty aiheuttavan ärsytystä kanitestissä. Koska RhE-mallit perustuvat ihmisestä saatuihin soluihin, niissä voidaan ennustaa, että kyseiset kemikaalit eivät ärsytä (YK:n GHS-järjestelmän / EU:n CLP-asetuksen ’ei luokitusta’).

  Taulukko 2


  Samanlaisen tai mukautetun menetelmän validoimiseksi vaaditut herkkyyden, spesifisyyden ja yleisen tarkkuuden ennustearvot








  Herkkyys | Spesifisyys | Yleinen tarkkuus |
| --- | --- | --- | --- |
| ≥ 80 % | ≥ 70 % | ≥ 75 % |

12.

Ehdotetun samanlaisen tai mukautetun menetelmän tarkkuuden (herkkyyden, spesifisyyden ja yleisen tarkkuuden) on oltava yhtä suuri tai suurempi kuin VVM:n, kun kohdelajin osalta otetaan huomioon täydentävät merkityksellisyyttä koskevat tiedot (taulukko 2). Herkkyyden on oltava yhtä suuri tai suurempi kuin (≥) 80 prosenttia (2) (8) (23). Ehdotetun in vitro -menetelmän herkkyyteen sovelletaan kuitenkin erityistä rajoitusta: vain kaksi luokkaan 2 kuuluvaa in vivo -kemikaalia, 1-dekanoli ja di-n-propyylidisulfidi, saadaan luokitella väärin useammassa kuin yhdessä osallistuvassa laboratoriossa. Spesifisyyden on oltava yhtä suuri tai suurempi kuin (≥) 70 prosenttia (2) (8) (23). Ehdotetun in vitro -menetelmän spesifisyyteen ei sovelleta muita rajoituksia. Toisin sanoen mikä tahansa osallistuva laboratorio saa luokitella ei luokitusta -luokkaan kuuluvan in vivo -kemikaalin väärin edellyttäen, että testimenetelmän lopullinen spesifisyys on hyväksyttävällä vaihteluvälillä. Yleisen tarkkuuden on oltava yhtä suuri tai suurempi kuin (≥) 75 prosenttia (2) (8) (23). Vaikka taulukossa 1 lueteltujen vertailukemikaalien perusteella lasketun VVM:n herkkyys on yhtä suuri kuin 90 prosenttia, samanlaisen tai mukautetun menetelmän hyväksymiseen vaadittu herkkyyden vähimmäisarvo on määritetty 80 prosentiksi, koska tiedetään, että 1-dekanoli (kemikaalina rajatapaus) ja di-n-propyylidisulfidi (VVM:n väärä negatiivinen) eivät aiheuta ärsytystä ihmisille (31) (32) (33), vaikka niiden on määritetty aiheuttavan ärsytystä kanitestissä. Koska RhE-mallit perustuvat ihmisestä saatuihin soluihin, niissä voidaan ennustaa, että kyseiset kemikaalit eivät ärsytä (YK:n GHS-järjestelmän / EU:n CLP-asetuksen ’ei luokitusta’).

Taulukko 2

Samanlaisen tai mukautetun menetelmän validoimiseksi vaaditut herkkyyden, spesifisyyden ja yleisen tarkkuuden ennustearvot

Herkkyys

Spesifisyys

Yleinen tarkkuus

≥ 80 %

≥ 70 %

≥ 75 %

Tutkimuksen hyväksymisperusteet

| 13. | On mahdollista, että yhteen tai useampaan testikemikaaliin liittyvässä yhdessä tai useammassa testissä ei täytetä testi- ja vertailukemikaaleihin sovellettavia testien hyväksymisperusteita tai että sitä/niitä ei voida hyväksyä muista syistä. Kullekin testikemikaalille voidaan puuttuvien tietojen täydentämiseksi tehdä enintään kaksi täydentävää testiä (’uudelleentestaus’). Tarkemmin sanottuna kullakin testikemikaalilla voidaan tehdä enintään kaksi täydentävää testiajoa, koska uudelleentestauksen yhteydessä myös positiiviset ja negatiiviset vertailukemikaalit on testattava samanaikaisesti. |
| --- | --- |

13.

On mahdollista, että yhteen tai useampaan testikemikaaliin liittyvässä yhdessä tai useammassa testissä ei täytetä testi- ja vertailukemikaaleihin sovellettavia testien hyväksymisperusteita tai että sitä/niitä ei voida hyväksyä muista syistä. Kullekin testikemikaalille voidaan puuttuvien tietojen täydentämiseksi tehdä enintään kaksi täydentävää testiä (’uudelleentestaus’). Tarkemmin sanottuna kullakin testikemikaalilla voidaan tehdä enintään kaksi täydentävää testiajoa, koska uudelleentestauksen yhteydessä myös positiiviset ja negatiiviset vertailukemikaalit on testattava samanaikaisesti.

| 14. | Mahdollisesti vielä uudelleentestauksen jälkeenkin kaikilla vertailukemikaaleilla ei saada aikaan kunkin testattavan kemikaalin osalta vaadittuja vähintään kolmea hyväksyttyä ajoa kaikissa osallistuvissa laboratorioissa. Näin ollen tietomatriisi ei ole täydellinen. Tällaisessa tapauksessa kaikki seuraavat kolme vaatimusta olisi täytettävä, jotta tiedot katsotaan hyväksyttäviksi:






  1. | Kaikille 20 vertailukemikaalille on tehty vähintään yksi täydellinen testiajo. |
| --- | --- | --- |

14.

Mahdollisesti vielä uudelleentestauksen jälkeenkin kaikilla vertailukemikaaleilla ei saada aikaan kunkin testattavan kemikaalin osalta vaadittuja vähintään kolmea hyväksyttyä ajoa kaikissa osallistuvissa laboratorioissa. Näin ollen tietomatriisi ei ole täydellinen. Tällaisessa tapauksessa kaikki seuraavat kolme vaatimusta olisi täytettävä, jotta tiedot katsotaan hyväksyttäviksi:

1.

Kaikille 20 vertailukemikaalille on tehty vähintään yksi täydellinen testiajo.

| 2. | Kussakin (vähintään kolme) osallistuvassa laboratoriossa vähintään 85 prosenttia testiajoista ovat täydellisiä (20 kemikaalia; yhdessä laboratoriossa sallitaan kolme hylättyä testiä). |
| --- | --- |

2.

Kussakin (vähintään kolme) osallistuvassa laboratoriossa vähintään 85 prosenttia testiajoista ovat täydellisiä (20 kemikaalia; yhdessä laboratoriossa sallitaan kolme hylättyä testiä).

| 3. | Vähintään 90 prosenttia kaikista mahdollisista vähintään kolmen laboratorion testiajoista ovat täydellisiä (20 kemikaalia, testattu kolmessa laboratoriossa; yhteensä kuusi hylättyä testiajoa sallitaan). |
| --- | --- |

3.

Vähintään 90 prosenttia kaikista mahdollisista vähintään kolmen laboratorion testiajoista ovat täydellisiä (20 kemikaalia, testattu kolmessa laboratoriossa; yhteensä kuusi hylättyä testiajoa sallitaan).

| 3. | Lisätään seuraavat luvut:

  ”B.49.   
  IN VITRO -MIKROTUMATESTI NISÄKÄSSOLUILLA

  JOHDANTO






  1. | In vitro -mikrotumamääritysmenetelmä (MNvit) on genotoksisuustesti, jolla määritetään interfaasisolujen sytoplasman mikrotumat. Mikrotumat voivat olla peräisin asentrisista kromosomin osista (joista puuttuu sentromeeri) tai kokonaisista kromosomeista, jotka eivät pysty vetäytymään kohti napoja solunjakautumisen anafaasivaiheessa. Määritysmenetelmässä osoitetaan klastogeenisten ja aneugeenisten kemikaalien (aineiden ja seosten) (1) (2) aktiivisuus soluissa, joissa on tapahtunut solun jakautuminen testiaineelle altistumisen aikana tai sen jälkeen. Testi voidaan suorittaa niin, että aktiinin polymerisaation inhibiittoria sytokalasiini B:tä (sytoB) käytetään tai ei käytetä. Kun sytoB:tä lisätään ennen tavoiteltua mitoosia, mikrotumafrekvenssi voidaan määrittää ja analysoida valikoivasti soluissa, joissa on tapahtunut yksi mitoosi, koska tällaiset solut ovat kaksitumaisia (3) (4). Tässä testimenetelmässä testisuunnitelmia voidaan soveltaa myös ilman sytokineesin inhibitointia edellyttäen, että analysoitavassa solupopulaatiossa on todistetusti tapahtunut mitoosi. |
| --- | --- | --- |

3.

Lisätään seuraavat luvut:

”B.49.   
  IN VITRO -MIKROTUMATESTI NISÄKÄSSOLUILLA

”B.49.

IN VITRO

JOHDANTO

1.

In vitro -mikrotumamääritysmenetelmä (MNvit) on genotoksisuustesti, jolla määritetään interfaasisolujen sytoplasman mikrotumat. Mikrotumat voivat olla peräisin asentrisista kromosomin osista (joista puuttuu sentromeeri) tai kokonaisista kromosomeista, jotka eivät pysty vetäytymään kohti napoja solunjakautumisen anafaasivaiheessa. Määritysmenetelmässä osoitetaan klastogeenisten ja aneugeenisten kemikaalien (aineiden ja seosten) (1) (2) aktiivisuus soluissa, joissa on tapahtunut solun jakautuminen testiaineelle altistumisen aikana tai sen jälkeen. Testi voidaan suorittaa niin, että aktiinin polymerisaation inhibiittoria sytokalasiini B:tä (sytoB) käytetään tai ei käytetä. Kun sytoB:tä lisätään ennen tavoiteltua mitoosia, mikrotumafrekvenssi voidaan määrittää ja analysoida valikoivasti soluissa, joissa on tapahtunut yksi mitoosi, koska tällaiset solut ovat kaksitumaisia (3) (4). Tässä testimenetelmässä testisuunnitelmia voidaan soveltaa myös ilman sytokineesin inhibitointia edellyttäen, että analysoitavassa solupopulaatiossa on todistetusti tapahtunut mitoosi.

In vitro

| 2. | Mikrotumien muodostumista aiheuttavien kemikaalien (aineiden ja seosten) tunnistamiseksi toteutettavan MNvit-määritysmenetelmän lisäksi kromosomivaurioiden ja mikrotuman muodostumisen mekanismeista voidaan saada tietoa myös käyttämällä sytokineesin inhibiittoria, kinetokorien immunokemiallista merkkausta tai sentromeeri-/telomeerikoettimilla suoritettavaa hybridisaatiota (fluoresenssi- in situ -hybridisaatio (FISH)) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). Merkkaus- ja hybridisaatiomenetelmiä voidaan käyttää, kun mikrotumien muodostuminen on kiihtynyt ja tutkija haluaa määrittää, johtuuko kiihtyminen klastogeenisista ja/tai aneugeenisista tapahtumista. |
| --- | --- |

2.

Mikrotumien muodostumista aiheuttavien kemikaalien (aineiden ja seosten) tunnistamiseksi toteutettavan MNvit-määritysmenetelmän lisäksi kromosomivaurioiden ja mikrotuman muodostumisen mekanismeista voidaan saada tietoa myös käyttämällä sytokineesin inhibiittoria, kinetokorien immunokemiallista merkkausta tai sentromeeri-/telomeerikoettimilla suoritettavaa hybridisaatiota (fluoresenssi- in situ -hybridisaatio (FISH)) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). Merkkaus- ja hybridisaatiomenetelmiä voidaan käyttää, kun mikrotumien muodostuminen on kiihtynyt ja tutkija haluaa määrittää, johtuuko kiihtyminen klastogeenisista ja/tai aneugeenisista tapahtumista.

in situ

| 3. | Mikrotumat edustavat vauriota, jotka ovat välittyneet tytärsoluihin. Sen sijaan metafaasivaiheen soluissa esiintyvät kromosomipoikkeavuudet eivät ehkä välity seuraaviin vaiheisiin. Koska interfaasisolujen mikrotumat voidaan havaita suhteellisen objektiivisesti, laboratorion henkilökunnan on vain määritettävä, ovatko solut jakautuneet ja kuinka monessa solussa on mikrotuma. Näin ollen preparaatit voidaan laskea suhteellisen nopeasti ja analysointi voidaan automatisoida. Tämän takia kussakin käsittelyssä voidaan laskea satojen solujen sijaan tuhansia soluja, mikä lisää määritysmenetelmän tehokkuutta. Koska mikrotumia voi syntyä hitaasti liikkuvista (’lagging’) kromosomeista, menetelmällä voidaan havaita aneuploidisia tekijöitä, joita on vaikea tutkia perinteisillä kromosomipoikkeavuustesteillä, kuten OECD:n testiohjeella 473 (tämän liitteen B.10 luku) (17). MNvit-määritysmenetelmällä ei kuitenkaan voida eritellä polyploidisia kemikaaleja ja klastogeenisia kemikaaleja ilman erityistekniikoita, kuten 2 kohdassa tarkoitettua FISH-tekniikkaa. |
| --- | --- |

3.

Mikrotumat edustavat vauriota, jotka ovat välittyneet tytärsoluihin. Sen sijaan metafaasivaiheen soluissa esiintyvät kromosomipoikkeavuudet eivät ehkä välity seuraaviin vaiheisiin. Koska interfaasisolujen mikrotumat voidaan havaita suhteellisen objektiivisesti, laboratorion henkilökunnan on vain määritettävä, ovatko solut jakautuneet ja kuinka monessa solussa on mikrotuma. Näin ollen preparaatit voidaan laskea suhteellisen nopeasti ja analysointi voidaan automatisoida. Tämän takia kussakin käsittelyssä voidaan laskea satojen solujen sijaan tuhansia soluja, mikä lisää määritysmenetelmän tehokkuutta. Koska mikrotumia voi syntyä hitaasti liikkuvista (’lagging’) kromosomeista, menetelmällä voidaan havaita aneuploidisia tekijöitä, joita on vaikea tutkia perinteisillä kromosomipoikkeavuustesteillä, kuten OECD:n testiohjeella 473 (tämän liitteen B.10 luku) (17). MNvit-määritysmenetelmällä ei kuitenkaan voida eritellä polyploidisia kemikaaleja ja klastogeenisia kemikaaleja ilman erityistekniikoita, kuten 2 kohdassa tarkoitettua FISH-tekniikkaa.

| 4. | MNvit-määritysmenetelmä on in vitro -menetelmä, jossa tavallisesti käytetään viljeltyjä ihmis- tai jyrsijäsoluja. Sillä voidaan kattavasti tutkia in vitro kromosomivaurioiden mahdollisuutta, koska sillä voidaan havaita sekä aneugeenit että klastogeenit. |
| --- | --- |

4.

MNvit-määritysmenetelmä on in vitro -menetelmä, jossa tavallisesti käytetään viljeltyjä ihmis- tai jyrsijäsoluja. Sillä voidaan kattavasti tutkia in vitro kromosomivaurioiden mahdollisuutta, koska sillä voidaan havaita sekä aneugeenit että klastogeenit.

in vitro

in vitro

| 5. | MNvit-määritysmenetelmässä voidaan käyttää luotettavasti ja tehokkaasti useita eri solutyyppejä joko sytoB:n kanssa tai ilman sitä. Erilaisten jyrsijäsolulinjojen (CHO, V79, CHL/IU ja L5178Y) ja ihmisestä saatujen lymfosyyttien käytön soveltuvuudesta MNvit-määritysmenetelmään on saatu kattavia todisteita (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31). Näitä ovat etenkin Société Française de Toxicologie Génétique -järjestön (SFTG) koordinoimat kansainväliset validointitutkimukset (18) (19) (20) (21) (22) sekä genotoksisuuden testausta käsittelevän kansainvälisen työryhmän (International Workshop on Genotoxicity Testing) selvitykset (4) (16). Saatavilla olevat tiedot on myös arvioitu uudelleen Euroopan komission alaisen Euroopan vaihtoehtoisten menetelmien validointikeskuksen (ECVAM) tekemässä todistusnäytön jälkivalidointitutkimuksessa, ja ECVAM:in tieteellinen neuvoa-antava komitea (ESAC) on vahvistanut testimenetelmän tieteellisesti päteväksi (32) (33) (34). Menetelmässä kuvataan ihmisen lymfoblasti-TK6-solulinjan (35), HepG2-solujen (36) (37) ja syyrianhamsterialkion primaarisolujen (38) käyttöä, vaikka niitä ei ole käytetty validointitutkimuksissa. |
| --- | --- |

5.

MNvit-määritysmenetelmässä voidaan käyttää luotettavasti ja tehokkaasti useita eri solutyyppejä joko sytoB:n kanssa tai ilman sitä. Erilaisten jyrsijäsolulinjojen (CHO, V79, CHL/IU ja L5178Y) ja ihmisestä saatujen lymfosyyttien käytön soveltuvuudesta MNvit-määritysmenetelmään on saatu kattavia todisteita (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31). Näitä ovat etenkin Société Française de Toxicologie Génétique -järjestön (SFTG) koordinoimat kansainväliset validointitutkimukset (18) (19) (20) (21) (22) sekä genotoksisuuden testausta käsittelevän kansainvälisen työryhmän (International Workshop on Genotoxicity Testing) selvitykset (4) (16). Saatavilla olevat tiedot on myös arvioitu uudelleen Euroopan komission alaisen Euroopan vaihtoehtoisten menetelmien validointikeskuksen (ECVAM) tekemässä todistusnäytön jälkivalidointitutkimuksessa, ja ECVAM:in tieteellinen neuvoa-antava komitea (ESAC) on vahvistanut testimenetelmän tieteellisesti päteväksi (32) (33) (34). Menetelmässä kuvataan ihmisen lymfoblasti-TK6-solulinjan (35), HepG2-solujen (36) (37) ja syyrianhamsterialkion primaarisolujen (38) käyttöä, vaikka niitä ei ole käytetty validointitutkimuksissa.

MÄÄRITELMÄT

| 6. | Sovellettavat määritelmät esitetään lisäyksessä 1. |
| --- | --- |

6.

Sovellettavat määritelmät esitetään lisäyksessä 1.

JOHDANTO

| 7. | In vitro -testit edellyttävät yleensä eksogeenista metabolista aktivaatiojärjestelmää, ellei solujen metabolia sovellu kyseisten aineiden testaamiseen. Eksogeeninen metabolinen aktivaatiojärjestelmä ei täysin jäljittele in vivo -olosuhteita. On myös vältettävä olosuhteita, joissa väärät positiiviset tulokset eivät heijasta luontaista mutageenisuutta, vaan voivat johtua esimerkiksi pH-arvon tai osmolaliteetin huomattavasta muutoksesta tai sytotoksisuuden korkeasta tasosta (39) (40) (41). Jos testikemikaali aiheuttaa viljelyaineen pH-arvon muuttumisen lisäämishetkellä, pH-arvoa on mukautettava mielellään siten, että kantaliuosta puskuroidaan niin, että kaikkien testinäytteiden, myös kaikkien kontrollinäytteiden, tilavuus pysyy muuttumattomana. |
| --- | --- |

7.

In vitro -testit edellyttävät yleensä eksogeenista metabolista aktivaatiojärjestelmää, ellei solujen metabolia sovellu kyseisten aineiden testaamiseen. Eksogeeninen metabolinen aktivaatiojärjestelmä ei täysin jäljittele in vivo -olosuhteita. On myös vältettävä olosuhteita, joissa väärät positiiviset tulokset eivät heijasta luontaista mutageenisuutta, vaan voivat johtua esimerkiksi pH-arvon tai osmolaliteetin huomattavasta muutoksesta tai sytotoksisuuden korkeasta tasosta (39) (40) (41). Jos testikemikaali aiheuttaa viljelyaineen pH-arvon muuttumisen lisäämishetkellä, pH-arvoa on mukautettava mielellään siten, että kantaliuosta puskuroidaan niin, että kaikkien testinäytteiden, myös kaikkien kontrollinäytteiden, tilavuus pysyy muuttumattomana.

In vitro

in vivo

| 8. | Mikrotumien muodostumisen analysoimiseksi on tärkeää, että sekä käsitellyissä että käsittelemättömissä viljelmissä on tapahtunut mitoosi. Eniten tietoja mikrotumien laskemiseksi saadaan soluista, joissa on tapahtunut yksi mitoosi testiaineella käsittelyn aikana tai sen jälkeen. |
| --- | --- |

8.

Mikrotumien muodostumisen analysoimiseksi on tärkeää, että sekä käsitellyissä että käsittelemättömissä viljelmissä on tapahtunut mitoosi. Eniten tietoja mikrotumien laskemiseksi saadaan soluista, joissa on tapahtunut yksi mitoosi testiaineella käsittelyn aikana tai sen jälkeen.

TESTIN PERIAATE

| 9. | Ihmis- tai nisäkäsperäiset soluviljelmät altistetaan testiaineelle sekä eksogeenisen metabolisen aktivaatiojärjestelmän kanssa että ilman sitä, paitsi jos testissä käytetään soluja, joiden metabolointikyky on riittävä. Kaikissa testeissä käytetään samanaikaisesti myös liuotinta/kantaja-ainekontrollia ja positiivisia kontrollikemikaaleja. |
| --- | --- |

9.

Ihmis- tai nisäkäsperäiset soluviljelmät altistetaan testiaineelle sekä eksogeenisen metabolisen aktivaatiojärjestelmän kanssa että ilman sitä, paitsi jos testissä käytetään soluja, joiden metabolointikyky on riittävä. Kaikissa testeissä käytetään samanaikaisesti myös liuotinta/kantaja-ainekontrollia ja positiivisia kontrollikemikaaleja.

| 10. | Testiaineelle altistamisen aikana tai sen jälkeen soluja kasvatetaan riittävän kauan, jotta kromosomi- tai sukkulavauriot voivat johtaa mikrotuman muodostumiseen inferfaasisoluissa. Jotta aneuploidia muodostuisi, testiaineen olisi yleensä oltava läsnä mitoosin aikana. Kerätyt ja värjätyt interfaasisolut analysoidaan mikrotumien havaitsemiseksi. Mikrotumat on laskettava pääasiassa vain niissä soluissa, joissa mitoosi on päättynyt testiaineelle altistamisen aikana tai altistamisen jälkeisessä vaiheessa, jos testissä käytetään sitä. Sytokineesin inhibiittorilla käsitellyistä viljelmistä lasketaan vain kaksitumaiset solut. Jos sytokineesin inhibiittoria ei ole käytetty, on tärkeä osoittaa, että analysoiduissa soluissa on todennäköisesti tapahtunut solunjakautuminen testiaineelle altistumisen aikana tai sen jälkeen. Kaikkien menetelmissä on tärkeä osoittaa, että solut ovat lisääntyneet sekä kontrolliviljelmässä että käsitellyissä viljelmissä, ja testiaineen aiheuttamaa sytotoksisuutta tai sytostaasia on arvioitava niissä viljelmissä (tai rinnakkaisviljelmissä), joiden mikrotumat lasketaan. |
| --- | --- |

10.

Testiaineelle altistamisen aikana tai sen jälkeen soluja kasvatetaan riittävän kauan, jotta kromosomi- tai sukkulavauriot voivat johtaa mikrotuman muodostumiseen inferfaasisoluissa. Jotta aneuploidia muodostuisi, testiaineen olisi yleensä oltava läsnä mitoosin aikana. Kerätyt ja värjätyt interfaasisolut analysoidaan mikrotumien havaitsemiseksi. Mikrotumat on laskettava pääasiassa vain niissä soluissa, joissa mitoosi on päättynyt testiaineelle altistamisen aikana tai altistamisen jälkeisessä vaiheessa, jos testissä käytetään sitä. Sytokineesin inhibiittorilla käsitellyistä viljelmistä lasketaan vain kaksitumaiset solut. Jos sytokineesin inhibiittoria ei ole käytetty, on tärkeä osoittaa, että analysoiduissa soluissa on todennäköisesti tapahtunut solunjakautuminen testiaineelle altistumisen aikana tai sen jälkeen. Kaikkien menetelmissä on tärkeä osoittaa, että solut ovat lisääntyneet sekä kontrolliviljelmässä että käsitellyissä viljelmissä, ja testiaineen aiheuttamaa sytotoksisuutta tai sytostaasia on arvioitava niissä viljelmissä (tai rinnakkaisviljelmissä), joiden mikrotumat lasketaan.

MÄÄRITYSMENETELMÄN KUVAUS

Testin valmistelu

Testin valmistelu

| 11. | Testeissä voidaan käyttää viljeltyjä ihmisen perifeerisen veren primaarisia lymfosyyttejä (5) (19) (42) (43) ja erilaisten jyrsijäsolulinjojen (esimerkiksi CHO, V79, CHL/IU ja L5178Y) soluja (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). Muiden solulinjojen ja -tyyppien käyttö on perusteltava esittäen tiedot niiden todistetusta suorituskyvystä määritysmenetelmässä Hyväksyttävyysperusteet -kohdan mukaisesti. Koska mikrotumien esiintymistaajuus vaikuttaa taustana määritysmenetelmän herkkyyteen, menetelmässä olisi käytettävä solutyyppejä, joissa mikrotumien muodostumisen taustataajuus on alhainen ja tasainen. |
| --- | --- |

11.

Testeissä voidaan käyttää viljeltyjä ihmisen perifeerisen veren primaarisia lymfosyyttejä (5) (19) (42) (43) ja erilaisten jyrsijäsolulinjojen (esimerkiksi CHO, V79, CHL/IU ja L5178Y) soluja (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). Muiden solulinjojen ja -tyyppien käyttö on perusteltava esittäen tiedot niiden todistetusta suorituskyvystä määritysmenetelmässä Hyväksyttävyysperusteet -kohdan mukaisesti. Koska mikrotumien esiintymistaajuus vaikuttaa taustana määritysmenetelmän herkkyyteen, menetelmässä olisi käytettävä solutyyppejä, joissa mikrotumien muodostumisen taustataajuus on alhainen ja tasainen.

| 12. | Ihmisen perifeerisen veren lymfosyytit on kerättävä nuorilta (noin 18–35-vuotiaat), terveiltä, tupakoimattomilta henkilöiltä, joiden ei tiedetä altistuneen äskettäin genotoksisille kemikaaleille tai säteilylle. Jos soluja kerätään useammalta kuin yhdeltä luovuttajalta, luovuttajien määrä on ilmoitettava. Mikrotumataajuus kasvaa iän myötä, ja ilmiö on yleisempi naisilla kuin miehillä (44). Tämä on otettava huomioon valittaessa luovuttajien soluja, jos ne on tarkoitus yhdistää. |
| --- | --- |

12.

Ihmisen perifeerisen veren lymfosyytit on kerättävä nuorilta (noin 18–35-vuotiaat), terveiltä, tupakoimattomilta henkilöiltä, joiden ei tiedetä altistuneen äskettäin genotoksisille kemikaaleille tai säteilylle. Jos soluja kerätään useammalta kuin yhdeltä luovuttajalta, luovuttajien määrä on ilmoitettava. Mikrotumataajuus kasvaa iän myötä, ja ilmiö on yleisempi naisilla kuin miehillä (44). Tämä on otettava huomioon valittaessa luovuttajien soluja, jos ne on tarkoitus yhdistää.

Elatusaineet ja viljelyolosuhteet

| 13. | Soluviljelmiä on viljeltävä sopivissa elatusaineissa ja inkubaatio-olosuhteissa (kasvatusastiat, CO2-pitoisuus, lämpötila ja kosteus). Pysyvistä solulinjoista ja kannoista on tarkistettava ajoittain modaalisen kromosomimäärän pysyvyys ja varmistettava, ettei ole mykoplasmakontaminaatiota. Viljelmiä ei pidä käyttää, jos ne ovat kontaminoituneet tai jos modaalinen kromosomimäärä on muuttunut. Normaali solusyklin kesto testauslaboratoriossa käytetyissä viljelyolosuhteissa on tunnettava. Jos menetelmänä käytetään sytokineesin estämistä, sytokineesin inhibiittorin pitoisuus on optimoitava tiettyä solutyyppiä varten, ja on osoitettava, että sillä saadaan aikaan riittävä määrä kaksitumaisia soluja pisteytystä varten. |
| --- | --- |

13.

Soluviljelmiä on viljeltävä sopivissa elatusaineissa ja inkubaatio-olosuhteissa (kasvatusastiat, CO2-pitoisuus, lämpötila ja kosteus). Pysyvistä solulinjoista ja kannoista on tarkistettava ajoittain modaalisen kromosomimäärän pysyvyys ja varmistettava, ettei ole mykoplasmakontaminaatiota. Viljelmiä ei pidä käyttää, jos ne ovat kontaminoituneet tai jos modaalinen kromosomimäärä on muuttunut. Normaali solusyklin kesto testauslaboratoriossa käytetyissä viljelyolosuhteissa on tunnettava. Jos menetelmänä käytetään sytokineesin estämistä, sytokineesin inhibiittorin pitoisuus on optimoitava tiettyä solutyyppiä varten, ja on osoitettava, että sillä saadaan aikaan riittävä määrä kaksitumaisia soluja pisteytystä varten.

2

Soluviljelmien valmistelu

| 14. | Pysyvät solulinjat ja solukannat: solut kasvatetaan kantaviljelmistä, kylvetään elatusaineeseen sellaiseen tiheyteen, että soluviljelmät eivät saavuta konfluenttisuutta yhden solun vahvuisessa kerroksessa eivätkä kasvatusviljelmät ole liian tiheitä ennen solujen keräämisajankohtaa, ja inkuboidaan 37 °C:ssa. |
| --- | --- |

14.

Pysyvät solulinjat ja solukannat: solut kasvatetaan kantaviljelmistä, kylvetään elatusaineeseen sellaiseen tiheyteen, että soluviljelmät eivät saavuta konfluenttisuutta yhden solun vahvuisessa kerroksessa eivätkä kasvatusviljelmät ole liian tiheitä ennen solujen keräämisajankohtaa, ja inkuboidaan 37 °C:ssa.

| 15. | Lymfosyytit: antikoagulantilla (esimerkiksi hepariinilla) käsiteltyä kokoverta tai erotettuja lymfosyyttejä viljellään mitogeenin (esimerkiksi fytohemagglutiniini, PHA) kanssa ennen testiaineelle ja sytoB:lle altistamista. |
| --- | --- |

15.

Lymfosyytit: antikoagulantilla (esimerkiksi hepariinilla) käsiteltyä kokoverta tai erotettuja lymfosyyttejä viljellään mitogeenin (esimerkiksi fytohemagglutiniini, PHA) kanssa ennen testiaineelle ja sytoB:lle altistamista.

Metabolinen aktivaatio

| 16. | Jos solujen endogeeninen metabolointikyky ei ole riittävä, on käytettävä eksogeenisia metabolisia järjestelmiä. Yleisimmin käytetty aktivaatiojärjestelmä on entsyymejä indusoivilla aineilla, kuten Aroclor 1254:llä (45) (46) tai fenobarbitonin ja β-naftoflavonin yhdistelmällä (46) (47) (48) (49) käsiteltyjen jyrsijöiden maksasta eristetty postmitokondriaalinen jae (S9), johon on lisätty kofaktoria. Jälkimmäisenä mainittu yhdistelmä ei ole ristiriidassa pysyviä orgaanisia yhdisteitä koskevan Tukholman yleissopimuksen (50) ja pysyvistä orgaanisista yhdisteistä annetun asetuksen (EY) N:o 850/2004 (66) säännösten kanssa, ja sen on osoitettu indusoivan sekaoksidaasia yhtä tehokkaasti kuin Aroclor 1254:n (46) (47) (48) (49). S9-jakeen yleisesti käytetty pitoisuusalue lopullisessa testiväliaineessa on 1–10 % (v/v). Metabolisen aktivaatiojärjestelmän kunto voi riippua testattavan kemikaalin luokasta, ja joissakin tapauksissa saattaa olla perusteltua käyttää useampaa kuin yhtä S9-jakeen pitoisuutta. |
| --- | --- |

16.

Jos solujen endogeeninen metabolointikyky ei ole riittävä, on käytettävä eksogeenisia metabolisia järjestelmiä. Yleisimmin käytetty aktivaatiojärjestelmä on entsyymejä indusoivilla aineilla, kuten Aroclor 1254:llä (45) (46) tai fenobarbitonin ja β-naftoflavonin yhdistelmällä (46) (47) (48) (49) käsiteltyjen jyrsijöiden maksasta eristetty postmitokondriaalinen jae (S9), johon on lisätty kofaktoria. Jälkimmäisenä mainittu yhdistelmä ei ole ristiriidassa pysyviä orgaanisia yhdisteitä koskevan Tukholman yleissopimuksen (50) ja pysyvistä orgaanisista yhdisteistä annetun asetuksen (EY) N:o 850/2004 (66) säännösten kanssa, ja sen on osoitettu indusoivan sekaoksidaasia yhtä tehokkaasti kuin Aroclor 1254:n (46) (47) (48) (49). S9-jakeen yleisesti käytetty pitoisuusalue lopullisessa testiväliaineessa on 1–10 % (v/v). Metabolisen aktivaatiojärjestelmän kunto voi riippua testattavan kemikaalin luokasta, ja joissakin tapauksissa saattaa olla perusteltua käyttää useampaa kuin yhtä S9-jakeen pitoisuutta.

| 17. | Jos käytössä on spesifisiä ihmisen tai jyrsijöiden aktivoivia entsyymejä ilmentäviä geenitekniikalla tuotettuja solulinjoja, ei eksogeenista metabolista aktivaatiojärjestelmää välttämättä tarvita, ja näitä soluja voidaan myös käyttää testisoluina. Tällaisissa tapauksissa käytettyjen solulinjojen valinta on perusteltava tieteellisesti, esimerkiksi ilmoittamalla sekaoksidaasin merkitys testiaineen (51) metabolialle ja niiden reagoivuus tunnettuihin klastogeeneihin ja aneugeeneihin (katso erillinen Hyväksyttävyysperusteet-kohta). On mahdollista, että ilmentyvä(t) sekaoksidaasi(t) ei(vät) pysty metaboloimaan testiainetta; tässä tapauksessa negatiiviset tulokset eivät osoita, että testiaineella ei voida indusoida mikrotumia. |
| --- | --- |

17.

Jos käytössä on spesifisiä ihmisen tai jyrsijöiden aktivoivia entsyymejä ilmentäviä geenitekniikalla tuotettuja solulinjoja, ei eksogeenista metabolista aktivaatiojärjestelmää välttämättä tarvita, ja näitä soluja voidaan myös käyttää testisoluina. Tällaisissa tapauksissa käytettyjen solulinjojen valinta on perusteltava tieteellisesti, esimerkiksi ilmoittamalla sekaoksidaasin merkitys testiaineen (51) metabolialle ja niiden reagoivuus tunnettuihin klastogeeneihin ja aneugeeneihin (katso erillinen Hyväksyttävyysperusteet-kohta). On mahdollista, että ilmentyvä(t) sekaoksidaasi(t) ei(vät) pysty metaboloimaan testiainetta; tässä tapauksessa negatiiviset tulokset eivät osoita, että testiaineella ei voida indusoida mikrotumia.

Testiaineen valmistelu

| 18. | Kiinteät kemikaalit on liuotettava tai sekoitettava sopiviin liuottimiin tai kantaja-aineisiin ja tarvittaessa laimennettava ennen solujen käsittelyä. Nestemäiset kemikaalit voidaan lisätä suoraan koejärjestelmiin ja/tai laimentaa ennen solujen käsittelyä. Kaasujen tai haituvien kemikaalien testauksessa standardimenettelyihin on tehtävä asianmukaisia mukautuksia. Kyseiset kaasut tai kemikaalit on esimerkiksi käsiteltävä suljetuissa astioissa (52) (53). Testiaine on valmisteltava juuri ennen altistusta, paitsi jos säilyvyys on osoitettu stabiliteettitutkimuksilla. |
| --- | --- |

18.

Kiinteät kemikaalit on liuotettava tai sekoitettava sopiviin liuottimiin tai kantaja-aineisiin ja tarvittaessa laimennettava ennen solujen käsittelyä. Nestemäiset kemikaalit voidaan lisätä suoraan koejärjestelmiin ja/tai laimentaa ennen solujen käsittelyä. Kaasujen tai haituvien kemikaalien testauksessa standardimenettelyihin on tehtävä asianmukaisia mukautuksia. Kyseiset kaasut tai kemikaalit on esimerkiksi käsiteltävä suljetuissa astioissa (52) (53). Testiaine on valmisteltava juuri ennen altistusta, paitsi jos säilyvyys on osoitettu stabiliteettitutkimuksilla.

Testiolosuhteet

Testiolosuhteet

Liuottimet/kantaja-aineet

| 19. | Liuotin/kantaja-aine ei saisi reagoida testiaineen kanssa tai vaikuttaa solujen elinkykyyn tai S9:n aktiivisuuteen käytetyssä pitoisuudessa. Jos testissä käytetään muita kuin hyvin tunnettuja liuottimia/kantaja-aineita (esimerkiksi vettä, soluviljelmän elatusainetta tai dimetyylisulfoksidia), niiden käyttö on perusteltava tiedoilla, joilla osoitetaan, että ne ja testiaine sopivat yhteen ja että ne eivät ole genotoksisia. Vesipitoisen liuottimen/kantaja-aineen käyttöä on harkittava ensisijaisesti aina, kun se on mahdollista. |
| --- | --- |

19.

Liuotin/kantaja-aine ei saisi reagoida testiaineen kanssa tai vaikuttaa solujen elinkykyyn tai S9:n aktiivisuuteen käytetyssä pitoisuudessa. Jos testissä käytetään muita kuin hyvin tunnettuja liuottimia/kantaja-aineita (esimerkiksi vettä, soluviljelmän elatusainetta tai dimetyylisulfoksidia), niiden käyttö on perusteltava tiedoilla, joilla osoitetaan, että ne ja testiaine sopivat yhteen ja että ne eivät ole genotoksisia. Vesipitoisen liuottimen/kantaja-aineen käyttöä on harkittava ensisijaisesti aina, kun se on mahdollista.

SytoB:n käyttö sytokineesin inhibiittorina

| 20. | Yhtenä MNvit-määritysmenetelmän tärkeimpänä näkökohtana on varmistaa, että lasketuissa soluissa on tapahtunut mitoosi käsittelyn aikana tai käsittelyä seuraavalla inkubaatiojaksolla, jos sitä on käytetty. Sytokineesin inhibiittorina käytetään yleisimmin sytoB:tä, koska se estää aktiinin muodostumisen ja näin ollen estää tytärsolujen erkaantumisen mitoosin jälkeen, mikä johtaa kaksitumaisten solujen muodostumiseen (5) (54) (55). Tämän ansiosta mikrotumien laskeminen voidaan rajoittaa soluihin, joissa on tapahtunut mitoosi käsittelyn aikana tai sen jälkeen. Testiaineen vaikutus solujen proliferaation kinetiikkaan voidaan mitata samanaikaisesti. Ihmisen lymfosyyttejä käytettäessä sytokineesin inhibiittorina on käytettävä sytoB:tä, koska solusyklin kesto vaihtelee eri viljelmien ja luovuttajien välillä ja koska kaikki lymfosyytit eivät reagoi PHA:han. Solulinjojen testauksessa on käytetty myös muita menetelmiä sen määrittämiseksi, ovatko laskettavat solut jakautuneet; näitä menetelmiä tarkastellaan jäljempänä (katso 26 kohta). |
| --- | --- |

20.

Yhtenä MNvit-määritysmenetelmän tärkeimpänä näkökohtana on varmistaa, että lasketuissa soluissa on tapahtunut mitoosi käsittelyn aikana tai käsittelyä seuraavalla inkubaatiojaksolla, jos sitä on käytetty. Sytokineesin inhibiittorina käytetään yleisimmin sytoB:tä, koska se estää aktiinin muodostumisen ja näin ollen estää tytärsolujen erkaantumisen mitoosin jälkeen, mikä johtaa kaksitumaisten solujen muodostumiseen (5) (54) (55). Tämän ansiosta mikrotumien laskeminen voidaan rajoittaa soluihin, joissa on tapahtunut mitoosi käsittelyn aikana tai sen jälkeen. Testiaineen vaikutus solujen proliferaation kinetiikkaan voidaan mitata samanaikaisesti. Ihmisen lymfosyyttejä käytettäessä sytokineesin inhibiittorina on käytettävä sytoB:tä, koska solusyklin kesto vaihtelee eri viljelmien ja luovuttajien välillä ja koska kaikki lymfosyytit eivät reagoi PHA:han. Solulinjojen testauksessa on käytetty myös muita menetelmiä sen määrittämiseksi, ovatko laskettavat solut jakautuneet; näitä menetelmiä tarkastellaan jäljempänä (katso 26 kohta).

| 21. | Laboratorion on määritettävä sopiva sytoB:n pitoisuus erikseen kullekin solutyypille, jotta liuottimella/kantaja-aineella käsiteltyjen kontrolliviljelmien kaksitumaisten solujen määrä voidaan optimoida. Yleensä sytoB:n sopiva pitoisuus on 3–6 μg/ml. |
| --- | --- |

21.

Laboratorion on määritettävä sopiva sytoB:n pitoisuus erikseen kullekin solutyypille, jotta liuottimella/kantaja-aineella käsiteltyjen kontrolliviljelmien kaksitumaisten solujen määrä voidaan optimoida. Yleensä sytoB:n sopiva pitoisuus on 3–6 μg/ml.

Solujen proliferaation ja sytotoksisuuden mittaaminen ja altistuspitoisuuksien valitseminen

| 22. | Päätettäessä suurimmasta testattavasta pitoisuudesta on vältettävä pitoisuuksia, jotka voivat aiheuttaa vääriä positiivisia vasteita, kuten liian voimakasta sytotoksisuutta, saostumista väliaineeseen tai pH-arvon tai osmolaliteetin merkittävää muuttumista (39) (40) (41). |
| --- | --- |

22.

Päätettäessä suurimmasta testattavasta pitoisuudesta on vältettävä pitoisuuksia, jotka voivat aiheuttaa vääriä positiivisia vasteita, kuten liian voimakasta sytotoksisuutta, saostumista väliaineeseen tai pH-arvon tai osmolaliteetin merkittävää muuttumista (39) (40) (41).

| 23. | Solujen proliferaation mittauksella varmistetaan, että käsitellyissä soluissa on tapahtunut mitoosi määritysmenettelyn aikana ja että käsittelyissä on käytetty asianmukaisia sytotoksisuustasoja (katso 29 kohta). Sytotoksisuus on määritettävä metabolisen aktivaation avulla ja ilman sitä soluissa, joissa metabolinen aktivaatio on tarpeen, tarkastelemalla solumäärän suhteellista lisääntymistä tai populaation suhteellista kaksinkertaistumista (katso kaavat lisäyksessä 2), paitsi jos käytetään sytoB:tä. Jos sytoB:tä käytetään, sytotoksisuus voidaan määrittää käyttämällä replikaatioindeksiä (RI) (katso kaava lisäyksessä 2). |
| --- | --- |

23.

Solujen proliferaation mittauksella varmistetaan, että käsitellyissä soluissa on tapahtunut mitoosi määritysmenettelyn aikana ja että käsittelyissä on käytetty asianmukaisia sytotoksisuustasoja (katso 29 kohta). Sytotoksisuus on määritettävä metabolisen aktivaation avulla ja ilman sitä soluissa, joissa metabolinen aktivaatio on tarpeen, tarkastelemalla solumäärän suhteellista lisääntymistä tai populaation suhteellista kaksinkertaistumista (katso kaavat lisäyksessä 2), paitsi jos käytetään sytoB:tä. Jos sytoB:tä käytetään, sytotoksisuus voidaan määrittää käyttämällä replikaatioindeksiä (RI) (katso kaava lisäyksessä 2).

| 24. | Kun viljelmät käsitellään sytoB:llä ja viljelmän yksitumaisten, kaksitumaisten ja monitumaisten solujen suhteellinen osuus määritetään, käsittelyn täsmällinen vaikutus solujen proliferaatioon ja solun sytotoksiseen tai sytostaattiseen toimintaan voidaan määrittää kvantitatiivisesti (5). Lisäksi varmistetaan, että laskennassa huomioon otetaan vain solut, jotka ovat jakautuneet käsittelyn aikana tai sen jälkeen. |
| --- | --- |

24.

Kun viljelmät käsitellään sytoB:llä ja viljelmän yksitumaisten, kaksitumaisten ja monitumaisten solujen suhteellinen osuus määritetään, käsittelyn täsmällinen vaikutus solujen proliferaatioon ja solun sytotoksiseen tai sytostaattiseen toimintaan voidaan määrittää kvantitatiivisesti (5). Lisäksi varmistetaan, että laskennassa huomioon otetaan vain solut, jotka ovat jakautuneet käsittelyn aikana tai sen jälkeen.

| 25. | SytoB:llä tehtävissä tutkimuksissa sytostaasi/sytotoksisuus voidaan kvantifioida sytokineesin eston jälkeisestä proliferaatioindeksistä (5) (26) (56) tai se voidaan johtaa RI:stä, joka on määritetty vähintään 500 solulle viljelmää kohti (katso kaavat lisäyksessä 2). Kun solujen proliferaatiota arvioidaan sytoB:n avulla, sytokineesin eston proliferaatioindeksi tai RI on määritettävä tarkastelemalla vähintään 500:aa solua viljelmää kohti. Sytotoksisuus voidaan arvioida muun muassa näiden tulosten avulla vertailemalla käsiteltyjen viljelmien ja kontrolliviljelmien arvoja. Myös muiden sytotoksisuuden merkkien (esimerkiksi konfluenttisuuden, solujen määrän, apoptoosin, nekroosin ja metafaasien määrän) arvioinnilla voidaan saada hyödyllistä tietoa. |
| --- | --- |

25.

SytoB:llä tehtävissä tutkimuksissa sytostaasi/sytotoksisuus voidaan kvantifioida sytokineesin eston jälkeisestä proliferaatioindeksistä (5) (26) (56) tai se voidaan johtaa RI:stä, joka on määritetty vähintään 500 solulle viljelmää kohti (katso kaavat lisäyksessä 2). Kun solujen proliferaatiota arvioidaan sytoB:n avulla, sytokineesin eston proliferaatioindeksi tai RI on määritettävä tarkastelemalla vähintään 500:aa solua viljelmää kohti. Sytotoksisuus voidaan arvioida muun muassa näiden tulosten avulla vertailemalla käsiteltyjen viljelmien ja kontrolliviljelmien arvoja. Myös muiden sytotoksisuuden merkkien (esimerkiksi konfluenttisuuden, solujen määrän, apoptoosin, nekroosin ja metafaasien määrän) arvioinnilla voidaan saada hyödyllistä tietoa.

| 26. | Ilman sytoB:tä tehtävissä tutkimuksissa on osoitettava, että viljelmässä lasketut solut ovat jakautuneet testiaineella käsittelyn aikana tai sen jälkeen. Muussa tapauksessa tutkimuksesta voidaan saada vääriä negatiivisia tuloksia. Menetelmiä, joilla varmistetaan, että jakautuneet solut tulevat lasketuiksi, ovat muun muassa bromodeoksiuridiinin (BrdU) inkorporoituminen ja sen osoittaminen myöhemmin jakautuneiden solujen tunnistamiseksi (57), kloonien muodostuminen, kun pysyvien solulinjojen soluja käsitellään ja lasketaan in situ mikroskooppilevyllä (proliferaatioindeksi (PI)) (25) (26) (27) (28), tai populaation suhteellisen kaksinkertaistumisen tai solumäärän suhteellisen lisääntymisen määrittäminen tai muu soveltuvaksi osoitettu menetelmä (16) (56) (58) (59) (katso kaavat lisäyksessä 2). Myös muiden sytotoksisuuden tai sytostaasin merkkien (esimerkiksi konfluenttisuuden, solujen määrän, apoptoosin, nekroosin ja metafaasien määrän) arvioinnilla voidaan saada hyödyllistä tietoa. |
| --- | --- |

26.

Ilman sytoB:tä tehtävissä tutkimuksissa on osoitettava, että viljelmässä lasketut solut ovat jakautuneet testiaineella käsittelyn aikana tai sen jälkeen. Muussa tapauksessa tutkimuksesta voidaan saada vääriä negatiivisia tuloksia. Menetelmiä, joilla varmistetaan, että jakautuneet solut tulevat lasketuiksi, ovat muun muassa bromodeoksiuridiinin (BrdU) inkorporoituminen ja sen osoittaminen myöhemmin jakautuneiden solujen tunnistamiseksi (57), kloonien muodostuminen, kun pysyvien solulinjojen soluja käsitellään ja lasketaan in situ mikroskooppilevyllä (proliferaatioindeksi (PI)) (25) (26) (27) (28), tai populaation suhteellisen kaksinkertaistumisen tai solumäärän suhteellisen lisääntymisen määrittäminen tai muu soveltuvaksi osoitettu menetelmä (16) (56) (58) (59) (katso kaavat lisäyksessä 2). Myös muiden sytotoksisuuden tai sytostaasin merkkien (esimerkiksi konfluenttisuuden, solujen määrän, apoptoosin, nekroosin ja metafaasien määrän) arvioinnilla voidaan saada hyödyllistä tietoa.

in situ

| 27. | Vähintään kolmea analysoitavissa olevaa testipitoisuutta on arvioitava. Jotta tämä olisi mahdollista, kokeessa voidaan käyttää useampia, toisistaan vain hieman poikkeavia pitoisuuksia. Mikrotumien muodostuminen voidaan arvioida niissä pitoisuuksissa, joiden sytotoksisuus on asianmukaisella vaihteluvälillä. Vaihtoehtoisesti voidaan suorittaa alustava sytotoksisuustesti, jolla rajataan lopullisen testin vaihteluväliä. |
| --- | --- |

27.

Vähintään kolmea analysoitavissa olevaa testipitoisuutta on arvioitava. Jotta tämä olisi mahdollista, kokeessa voidaan käyttää useampia, toisistaan vain hieman poikkeavia pitoisuuksia. Mikrotumien muodostuminen voidaan arvioida niissä pitoisuuksissa, joiden sytotoksisuus on asianmukaisella vaihteluvälillä. Vaihtoehtoisesti voidaan suorittaa alustava sytotoksisuustesti, jolla rajataan lopullisen testin vaihteluväliä.

| 28. | Suurimmassa pitoisuudessa sytotoksisuuden on oltava 55 ± 5 %. Sitä korkeammilla tasoilla kromosomit voivat vaurioitua sytotoksisuuden sekundaarivaikutuksena (60). Jos sytotoksisuutta esiintyy, valittujen testipitoisuuksien on katettava vaihteluväli 55 ± 5 prosentin sytotoksisuudesta vähäiseen sytotoksisuuteen tai tasoon, jolla sytotoksisuutta ei esiinny lainkaan. |
| --- | --- |

28.

Suurimmassa pitoisuudessa sytotoksisuuden on oltava 55 ± 5 %. Sitä korkeammilla tasoilla kromosomit voivat vaurioitua sytotoksisuuden sekundaarivaikutuksena (60). Jos sytotoksisuutta esiintyy, valittujen testipitoisuuksien on katettava vaihteluväli 55 ± 5 prosentin sytotoksisuudesta vähäiseen sytotoksisuuteen tai tasoon, jolla sytotoksisuutta ei esiinny lainkaan.

| 29. | Jos sytotoksisuutta tai saostumista ei esiinny, suurimman testipitoisuuden on vastattava tasoa 0,01 M, 5 mg/ml tai 5 μl/ml sen mukaan, mikä pitoisuuksista on pienin. Analysoitavaksi valittujen pitoisuuksien on pääsääntöisesti erottava toisistaan enintään 10-kertaisesti. Jos testiaineen pitoisuus-vastekäyrä on jyrkkä, testiaineiden pitoisuudet voivat tarvittaessa olla lähempänä toisiaan, jotta myös keskitason ja vähäisen toksisuustason viljelmät pisteytetään. |
| --- | --- |

29.

Jos sytotoksisuutta tai saostumista ei esiinny, suurimman testipitoisuuden on vastattava tasoa 0,01 M, 5 mg/ml tai 5 μl/ml sen mukaan, mikä pitoisuuksista on pienin. Analysoitavaksi valittujen pitoisuuksien on pääsääntöisesti erottava toisistaan enintään 10-kertaisesti. Jos testiaineen pitoisuus-vastekäyrä on jyrkkä, testiaineiden pitoisuudet voivat tarvittaessa olla lähempänä toisiaan, jotta myös keskitason ja vähäisen toksisuustason viljelmät pisteytetään.

| 30. | Jos liukoisuus on rajoittava tekijä, suurimman pitoisuuden – jos sitä ei ole rajoitettu sytotoksisuuden takia – on oltava se pienin pitoisuus, jossa viljelmissä esiintyy mahdollisimman vähäistä saostumista; saostuminen ei kuitenkaan saa vaikuttaa laskemiseen. Saostumisen arvioinnissa on käytettävä esimerkiksi valomikroskooppia, jotta voidaan havaita viljelyn aikana esiintyvä tai (käsittelyn loppuun mennessä) muodostuva saostuma. |
| --- | --- |

30.

Jos liukoisuus on rajoittava tekijä, suurimman pitoisuuden – jos sitä ei ole rajoitettu sytotoksisuuden takia – on oltava se pienin pitoisuus, jossa viljelmissä esiintyy mahdollisimman vähäistä saostumista; saostuminen ei kuitenkaan saa vaikuttaa laskemiseen. Saostumisen arvioinnissa on käytettävä esimerkiksi valomikroskooppia, jotta voidaan havaita viljelyn aikana esiintyvä tai (käsittelyn loppuun mennessä) muodostuva saostuma.

Kontrollit

| 31. | Jokaisessa kokeessa on käytettävä samanaikaisia positiivisia kontrolleja ja liuotin-/kantaja-ainekontrolleja metabolisen aktivaation läsnä ollessa ja ilman sitä. |
| --- | --- |

31.

Jokaisessa kokeessa on käytettävä samanaikaisia positiivisia kontrolleja ja liuotin-/kantaja-ainekontrolleja metabolisen aktivaation läsnä ollessa ja ilman sitä.

| 32. | Positiivisia kontrolliaineita tarvitaan, jotta voidaan osoittaa käytettyjen solujen – ja testisuunnitelman – kyky tunnistaa klastogeenejä ja aneugeenejä sekä vahvistaa S9-preparaatin metabolointikyky. Positiivisina kontrollikemikaaleina on käytettävä tunnettuja mikrotumien indusoijia pitoisuuksina, joiden voidaan odottaa aiheuttavan vähäisen mutta toistettavissa olevan lisääntymisen taustaan verrattuna ja osoittaa koejärjestelmän herkkyyden. Positiivisen kontrollikemikaalin pitoisuudet on valittava siten, että vaikutukset ovat selvät mutta eivät paljasta heti lukijalle koodattujen objektilasien identiteettiä. |
| --- | --- |

32.

Positiivisia kontrolliaineita tarvitaan, jotta voidaan osoittaa käytettyjen solujen – ja testisuunnitelman – kyky tunnistaa klastogeenejä ja aneugeenejä sekä vahvistaa S9-preparaatin metabolointikyky. Positiivisina kontrollikemikaaleina on käytettävä tunnettuja mikrotumien indusoijia pitoisuuksina, joiden voidaan odottaa aiheuttavan vähäisen mutta toistettavissa olevan lisääntymisen taustaan verrattuna ja osoittaa koejärjestelmän herkkyyden. Positiivisen kontrollikemikaalin pitoisuudet on valittava siten, että vaikutukset ovat selvät mutta eivät paljasta heti lukijalle koodattujen objektilasien identiteettiä.

| 33. | Soluviljelmän metabolointikyky ja klastogeenien osoituskyky on osoitettava käyttämällä metabolista aktivaatiota edellyttävää klastogeenia (esimerkiksi syklofosfamidi tai bentso[a]pyreeni). Muita positiivisia kontrollikemikaaleja voidaan käyttää, jos käyttö perustellaan. Koska tietyt metabolista aktivaatiota edellyttävät positiiviset kontrollikemikaalit voivat tietyissä käsittelyolosuhteissa tai tietyissä solulinjoissa aktivoitua ilman eksogeenista metabolista aktivaatiota, metabolisen aktivaation tarve ja S9-preparaatin toiminta on testattava valitussa solulinjassa ja valituissa pitoisuuksissa. |
| --- | --- |

33.

Soluviljelmän metabolointikyky ja klastogeenien osoituskyky on osoitettava käyttämällä metabolista aktivaatiota edellyttävää klastogeenia (esimerkiksi syklofosfamidi tai bentso[a]pyreeni). Muita positiivisia kontrollikemikaaleja voidaan käyttää, jos käyttö perustellaan. Koska tietyt metabolista aktivaatiota edellyttävät positiiviset kontrollikemikaalit voivat tietyissä käsittelyolosuhteissa tai tietyissä solulinjoissa aktivoitua ilman eksogeenista metabolista aktivaatiota, metabolisen aktivaation tarve ja S9-preparaatin toiminta on testattava valitussa solulinjassa ja valituissa pitoisuuksissa.

| 34. | Tähän mennessä ei ole havaittu, että yhdenkään aneugeenin genotoksinen toiminta edellyttäisi metabolista aktivaatiota (16). Nykyisin aneugeenisen toiminnan hyväksyttyjä positiivisia kontrollikemikaaleja ovat esimerkiksi kolkisiini ja vinblastiini. Myös muiden kemikaalien käyttö on sallittu, jos ne indusoivat mikrotumia yksinomaan tai pääasiassa aneugeenisen toiminnan välityksellä. Jotta ei tarvittaisi kahta positiivista kontrollikemikaalia erikseen klastogeenisuutta ja aneugeenisuutta varten (ilman metabolista aktivaatiota), aneugeenisuuden kontrollikemikaalia voidaan käyttää positiivisena kontrollikemikaalina ilman S9-jaetta ja käytetyn metabolisen aktivaatiojärjestelmän riittävyys voidaan testata klastogeenisuuden kontrollikemikaalilla. Sekä klastogeenisuuden että aneugeenisuuden positiivista kontrollikemikaalia on käytettävä soluissa, joissa ei tarvita S9-jaetta. Ehdotetut positiiviset kontrollikemikaalit esitetään lisäyksessä 3. |
| --- | --- |

34.

Tähän mennessä ei ole havaittu, että yhdenkään aneugeenin genotoksinen toiminta edellyttäisi metabolista aktivaatiota (16). Nykyisin aneugeenisen toiminnan hyväksyttyjä positiivisia kontrollikemikaaleja ovat esimerkiksi kolkisiini ja vinblastiini. Myös muiden kemikaalien käyttö on sallittu, jos ne indusoivat mikrotumia yksinomaan tai pääasiassa aneugeenisen toiminnan välityksellä. Jotta ei tarvittaisi kahta positiivista kontrollikemikaalia erikseen klastogeenisuutta ja aneugeenisuutta varten (ilman metabolista aktivaatiota), aneugeenisuuden kontrollikemikaalia voidaan käyttää positiivisena kontrollikemikaalina ilman S9-jaetta ja käytetyn metabolisen aktivaatiojärjestelmän riittävyys voidaan testata klastogeenisuuden kontrollikemikaalilla. Sekä klastogeenisuuden että aneugeenisuuden positiivista kontrollikemikaalia on käytettävä soluissa, joissa ei tarvita S9-jaetta. Ehdotetut positiiviset kontrollikemikaalit esitetään lisäyksessä 3.

| 35. | Samaan kemiallisten aineiden ryhmään kuuluvan positiivisen kontrollikemikaalin käyttöä voidaan harkita, mikäli sopivia kemikaaleja on saatavilla. Positiivisia kontrollikemikaaleja on käytettävä vain, jos ne soveltuvat kyseiselle solutyypille ja kyseisiin aktivaatio-olosuhteisiin. |
| --- | --- |

35.

Samaan kemiallisten aineiden ryhmään kuuluvan positiivisen kontrollikemikaalin käyttöä voidaan harkita, mikäli sopivia kemikaaleja on saatavilla. Positiivisia kontrollikemikaaleja on käytettävä vain, jos ne soveltuvat kyseiselle solutyypille ja kyseisiin aktivaatio-olosuhteisiin.

| 36. | Solujen jokaisena keräämisajankohtana on otettava näytteet myös liuottimella/kantaja-aineella käsitellyistä kontrolleista. Lisäksi on käytettävä myös käsittelemättömiä negatiivisia kontrolleja (ei liuotinta/kantaja-ainetta), paitsi jos julkaistut tai laboratorion aikaisemmat tiedot kontrollista osoittavat, ettei valitulla liuottimella ole käytetyissä pitoisuuksissa genotoksisia tai muita haitallisia vaikutuksia. |
| --- | --- |

36.

Solujen jokaisena keräämisajankohtana on otettava näytteet myös liuottimella/kantaja-aineella käsitellyistä kontrolleista. Lisäksi on käytettävä myös käsittelemättömiä negatiivisia kontrolleja (ei liuotinta/kantaja-ainetta), paitsi jos julkaistut tai laboratorion aikaisemmat tiedot kontrollista osoittavat, ettei valitulla liuottimella ole käytetyissä pitoisuuksissa genotoksisia tai muita haitallisia vaikutuksia.

TESTIMENETTELY

Käsittelyaikataulu

Käsittelyaikataulu

| 37. | Jotta aneugeenin tai klastogeenin toiminta tietyssä solusyklin vaiheessa voidaan mahdollisimman todennäköisesti osoittaa, on tärkeää, että testiaineella käsitellään riittävä määrä soluja niiden kaikissa solusyklin vaiheissa. Solulinjojen ja primääristen soluviljelmien käsittelyaikataulu voi näin ollen poiketa jonkin verran lymfosyyttien käsittelyaikataulusta, sillä niiden solusyklin käynnistyminen edellyttää mitogeenista stimulaatiota. Niitä tarkastellaan 41–43 kohdassa (16). |
| --- | --- |

37.

Jotta aneugeenin tai klastogeenin toiminta tietyssä solusyklin vaiheessa voidaan mahdollisimman todennäköisesti osoittaa, on tärkeää, että testiaineella käsitellään riittävä määrä soluja niiden kaikissa solusyklin vaiheissa. Solulinjojen ja primääristen soluviljelmien käsittelyaikataulu voi näin ollen poiketa jonkin verran lymfosyyttien käsittelyaikataulusta, sillä niiden solusyklin käynnistyminen edellyttää mitogeenista stimulaatiota. Niitä tarkastellaan 41–43 kohdassa (16).

| 38. | Teorian ja julkaistujen tietojen perusteella (18) useimmat aneugeenit ja klastogeenit voidaan osoittaa S9-jakeen kanssa ja ilman S9-jaetta toteutettavalla 3–6 tuntia kestävällä lyhyellä käsittelyjaksolla, jonka jälkeen testiaine poistetaan ja viljelmän annetaan kasvaa 1,5–2,0 solusyklin ajan (6). Solut kerätään noin 1,5–2,0 normaalin (eli käsittelemättömän) solusyklin kuluttua joko käsittelyn aloittamisen jälkeen tai sen lopussa (katso taulukko 1). Näytteenotto- tai palautumisaikoja voidaan pidentää, jos tiedetään tai oletetaan, että testiaine vaikuttaa solusyklin kestoon (esimerkiksi kun testataan nukleosidianalogeja). |
| --- | --- |

38.

Teorian ja julkaistujen tietojen perusteella (18) useimmat aneugeenit ja klastogeenit voidaan osoittaa S9-jakeen kanssa ja ilman S9-jaetta toteutettavalla 3–6 tuntia kestävällä lyhyellä käsittelyjaksolla, jonka jälkeen testiaine poistetaan ja viljelmän annetaan kasvaa 1,5–2,0 solusyklin ajan (6). Solut kerätään noin 1,5–2,0 normaalin (eli käsittelemättömän) solusyklin kuluttua joko käsittelyn aloittamisen jälkeen tai sen lopussa (katso taulukko 1). Näytteenotto- tai palautumisaikoja voidaan pidentää, jos tiedetään tai oletetaan, että testiaine vaikuttaa solusyklin kestoon (esimerkiksi kun testataan nukleosidianalogeja).

| 39. | Koska S9-preparaatiot voivat olla toksisia viljellyille nisäkässoluille, pidennettyä 1,5–2,0 normaalin solusyklin altistusta käytetään vain ilman S9-jaetta. Pidennetyssä käsittelyssä soluja voidaan käsitellä testikemikaalilla joko sytoB:n kanssa tai ilman sitä. Näin voidaan ottaa huomioon testiaineen ja sytoB:n mahdollinen vuorovaikutus. |
| --- | --- |

39.

Koska S9-preparaatiot voivat olla toksisia viljellyille nisäkässoluille, pidennettyä 1,5–2,0 normaalin solusyklin altistusta käytetään vain ilman S9-jaetta. Pidennetyssä käsittelyssä soluja voidaan käsitellä testikemikaalilla joko sytoB:n kanssa tai ilman sitä. Näin voidaan ottaa huomioon testiaineen ja sytoB:n mahdollinen vuorovaikutus.

| 40. | Solujen ehdotetut käsittelyaikataulut esitetään taulukossa 1. Näitä yleisiä käsittelyaikatauluja voidaan mukauttaa testiaineen stabiiliuden tai reaktiivisuuden tai käytettävien solujen erityisten kasvuominaisuuksien mukaisesti. Kaikki käsittelyt on käynnistettävä ja saatava päätökseen, kun solut kasvavat eksponentiaalisesti. Aikataulut esitellään yksityiskohtaisemmin jäljempänä olevissa 41–47 kohdassa.

  Taulukko 1


  Solujen käsittely- ja keräämisajankohdat MNvit-määritysmenetelmässä








  Lymfosyytit, primaarisolut ja solulinjat, jotka on käsitelty sytoB:llä | + S9 | Käsitellään 3–6 tuntia S9:n kanssa;
  poistetaan S9 ja käsittelyväliaine;
  lisätään uusi väliaine ja sytoB;
  kerätään 1,5–2,0 normaalia solusykliä myöhemmin. |
| --- | --- | --- | --- |
| – S9
  Lyhyt altistus | Käsitellään 3–6 tuntia;
  poistetaan käsittelyväliaine;
  lisätään uusi väliaine ja sytoB;
  kerätään 1,5–2,0 normaalia solusykliä myöhemmin. |
| – S9
  Pidennetty altistus | Vaihtoehto A: Käsitellään 1,5–2 normaalin solusyklin ajan sytoB:n kanssa;
  kerätään altistusjakson päättyessä.

  Vaihtoehto B: Käsitellään 1,5–2,0 normaalin solusyklin ajan;
  poistetaan testiaine;
  lisätään uusi väliaine ja sytoB;
  kerätään 1,5–2,0 normaalia solusykliä myöhemmin. |
| Solulinjat, joita ei ole käsitelty sytoB:n kanssa
  (Samat käsittelyaikataulut, mutta sytoB:tä ei lisätä) |

40.

Solujen ehdotetut käsittelyaikataulut esitetään taulukossa 1. Näitä yleisiä käsittelyaikatauluja voidaan mukauttaa testiaineen stabiiliuden tai reaktiivisuuden tai käytettävien solujen erityisten kasvuominaisuuksien mukaisesti. Kaikki käsittelyt on käynnistettävä ja saatava päätökseen, kun solut kasvavat eksponentiaalisesti. Aikataulut esitellään yksityiskohtaisemmin jäljempänä olevissa 41–47 kohdassa.

Taulukko 1

Taulukko 1

Solujen käsittely- ja keräämisajankohdat MNvit-määritysmenetelmässä

Solujen käsittely- ja keräämisajankohdat MNvit-määritysmenetelmässä

Lymfosyytit, primaarisolut ja solulinjat, jotka on käsitelty sytoB:llä

- S9

Käsitellään 3–6 tuntia S9:n kanssa;

poistetaan S9 ja käsittelyväliaine;

lisätään uusi väliaine ja sytoB;

kerätään 1,5–2,0 normaalia solusykliä myöhemmin.

– S9

Lyhyt altistus

Käsitellään 3–6 tuntia;

poistetaan käsittelyväliaine;

lisätään uusi väliaine ja sytoB;

kerätään 1,5–2,0 normaalia solusykliä myöhemmin.

– S9

Pidennetty altistus

Vaihtoehto A: Käsitellään 1,5–2 normaalin solusyklin ajan sytoB:n kanssa;

Vaihtoehto A:

kerätään altistusjakson päättyessä.

Vaihtoehto B: Käsitellään 1,5–2,0 normaalin solusyklin ajan;

Vaihtoehto B:

poistetaan testiaine;

lisätään uusi väliaine ja sytoB;

kerätään 1,5–2,0 normaalia solusykliä myöhemmin.

Solulinjat, joita ei ole käsitelty sytoB:n kanssa

(Samat käsittelyaikataulut, mutta sytoB:tä ei lisätä)

Lymfosyytit, primaarisolut ja solulinjat sytoB:n kanssa

Lymfosyytit, primaarisolut ja solulinjat sytoB:n kanssa

| 41. | Tehokkain menetelmä lymfosyyteille on aloittaa testiaineelle altistaminen 44–48 tunnin kuluttua PHA-stimulaatiosta, kun syklin synkronoitumista ei enää havaita (5). Solut käsitellään ensin testiaineella 3–6 tunnin ajan sekä S9:n läsnä ollessa että ilman sitä. Käsittelyväliaine poistetaan ja lisätään uutta väliainetta, joka sisältää sytoB:tä, ja solut kerätään 1,5–2,0 normaalia solusykliä myöhemmin. |
| --- | --- |

41.

Tehokkain menetelmä lymfosyyteille on aloittaa testiaineelle altistaminen 44–48 tunnin kuluttua PHA-stimulaatiosta, kun syklin synkronoitumista ei enää havaita (5). Solut käsitellään ensin testiaineella 3–6 tunnin ajan sekä S9:n läsnä ollessa että ilman sitä. Käsittelyväliaine poistetaan ja lisätään uutta väliainetta, joka sisältää sytoB:tä, ja solut kerätään 1,5–2,0 normaalia solusykliä myöhemmin.

| 42. | Jos näistä lyhyistä (3–6 tunnin) käsittelyistä saadaan negatiiviset tai epäselvät tulokset, soluja altistetaan uudelleen kauemmin kestävälle käsittelylle ilman S9:ää. On olemassa kaksi yhtä hyvää käsittelyvaihtoehtoa. Stimuloiduille lymfosyyteille voi kuitenkin olla parempi käyttää vaihtoehtoa A, joilla eksponentiaalinen kasvu voi hidastua 96 tunnin kuluttua stimulaatiosta. Soluviljelmät eivät myöskään saa olla konfluentteja vaihtoehdon B viimeiseen näytteenottoajankohtaan mennessä.






  — | Vaihtoehto A: Soluja käsitellään testiaineella 1,5–2,0 normaalin solusyklin ajan, ja ne kerätään käsittelyjakson päättyessä. |
| --- | --- | --- |

42.

Jos näistä lyhyistä (3–6 tunnin) käsittelyistä saadaan negatiiviset tai epäselvät tulokset, soluja altistetaan uudelleen kauemmin kestävälle käsittelylle ilman S9:ää. On olemassa kaksi yhtä hyvää käsittelyvaihtoehtoa. Stimuloiduille lymfosyyteille voi kuitenkin olla parempi käyttää vaihtoehtoa A, joilla eksponentiaalinen kasvu voi hidastua 96 tunnin kuluttua stimulaatiosta. Soluviljelmät eivät myöskään saa olla konfluentteja vaihtoehdon B viimeiseen näytteenottoajankohtaan mennessä.

—

Vaihtoehto A: Soluja käsitellään testiaineella 1,5–2,0 normaalin solusyklin ajan, ja ne kerätään käsittelyjakson päättyessä.

| — | Vaihtoehto B: Soluja käsitellään testiaineella 1,5–2,0 normaalin solusyklin ajan. Käsittelyväliaine poistetaan ja korvataan uudella väliaineella, ja solut kerätään seuraavan 1,5–2,0 normaalin solusyklin jälkeen. |
| --- | --- |

—

Vaihtoehto B: Soluja käsitellään testiaineella 1,5–2,0 normaalin solusyklin ajan. Käsittelyväliaine poistetaan ja korvataan uudella väliaineella, ja solut kerätään seuraavan 1,5–2,0 normaalin solusyklin jälkeen.

| 43. | Primaarisoluja ja solulinjoja on käsiteltävä samalla tavalla kuin lymfosyyttejä, mutta niitä ei tarvitse stimuloida PHA:lla 44–48 tunnin ajan. Kun kyseessä ovat muut solut kuin lymfosyytit, niitä on altistettava niin, että tutkimuksen päättymisajankohtana solut ovat edelleen kasvun logaritmisessa vaiheessa. |
| --- | --- |

43.

Primaarisoluja ja solulinjoja on käsiteltävä samalla tavalla kuin lymfosyyttejä, mutta niitä ei tarvitse stimuloida PHA:lla 44–48 tunnin ajan. Kun kyseessä ovat muut solut kuin lymfosyytit, niitä on altistettava niin, että tutkimuksen päättymisajankohtana solut ovat edelleen kasvun logaritmisessa vaiheessa.

Solulinjat ilman sytoB:tä

Solulinjat ilman sytoB:tä

| 44. | Soluja on käsiteltävä 3–6 tunnin ajan S9:n läsnä ollessa ja ilman sitä. Käsittelyväliaine poistetaan ja korvataan uudella väliaineella, ja solut kerätään 1,5–2,0 normaalia solusykliä myöhemmin. |
| --- | --- |

44.

Soluja on käsiteltävä 3–6 tunnin ajan S9:n läsnä ollessa ja ilman sitä. Käsittelyväliaine poistetaan ja korvataan uudella väliaineella, ja solut kerätään 1,5–2,0 normaalia solusykliä myöhemmin.

| 45. | Jos molemmista lyhyistä (3–6 tunnin) käsittelyistä saadaan negatiiviset tai epäselvät tulokset, soluja altistetaan uudelleen pidennetylle käsittelylle (ilman S9:ää). Käytettävissä on kaksi yhtä hyvää käsittelyvaihtoehtoa:






  — | Vaihtoehto A: Soluja käsitellään testiaineella 1,5–2,0 normaalin solusyklin ajan, ja ne kerätään käsittelyjakson päättyessä. |
| --- | --- | --- |

45.

Jos molemmista lyhyistä (3–6 tunnin) käsittelyistä saadaan negatiiviset tai epäselvät tulokset, soluja altistetaan uudelleen pidennetylle käsittelylle (ilman S9:ää). Käytettävissä on kaksi yhtä hyvää käsittelyvaihtoehtoa:

—

Vaihtoehto A: Soluja käsitellään testiaineella 1,5–2,0 normaalin solusyklin ajan, ja ne kerätään käsittelyjakson päättyessä.

| — | Vaihtoehto B: Soluja käsitellään testiaineella 1,5–2,0 normaalin solusyklin ajan. Käsittelyväliaine poistetaan ja korvataan uudella väliaineella, ja solut kerätään seuraavan 1,5–2,0 normaalin solusyklin jälkeen. |
| --- | --- |

—

Vaihtoehto B: Soluja käsitellään testiaineella 1,5–2,0 normaalin solusyklin ajan. Käsittelyväliaine poistetaan ja korvataan uudella väliaineella, ja solut kerätään seuraavan 1,5–2,0 normaalin solusyklin jälkeen.

| 46. | Yhden solun vahvuisissa kerroksissa voi esiintyä mitoosissa olevia soluja (pyöreitä, irtoavat pinnasta) 3–6 tuntia kestävän käsittelyn päättyessä. Koska mitoosissa olevat solut irtoavat helposti, ne voivat hävitä väliaineen mukana, kun se kaadetaan pois. Nämä solut on kerättävä huolellisesti viljelmien huuhtelun yhteydessä ja palautettava viljelmiin, jotta mitoosivaiheessa olevia soluja, joissa mikrotumia voi muodostua, ei menetetä keruuvaiheessa. |
| --- | --- |

46.

Yhden solun vahvuisissa kerroksissa voi esiintyä mitoosissa olevia soluja (pyöreitä, irtoavat pinnasta) 3–6 tuntia kestävän käsittelyn päättyessä. Koska mitoosissa olevat solut irtoavat helposti, ne voivat hävitä väliaineen mukana, kun se kaadetaan pois. Nämä solut on kerättävä huolellisesti viljelmien huuhtelun yhteydessä ja palautettava viljelmiin, jotta mitoosivaiheessa olevia soluja, joissa mikrotumia voi muodostua, ei menetetä keruuvaiheessa.

Viljelmien määrä

Viljelmien määrä

| 47. | Testiaineen jokaista pitoisuutta sekä kantaja-aine-/liuotinkontrollia ja negatiivista kontrollia varten on käytettävä kaksi rinnakkaisviljelmää. Mikäli laboratorion aikaisemmat tutkimustulokset osoittavat, että rinnakkaisviljelmien välillä on vain hyvin vähäisiä eroja, yhden viljelmän käyttö voi olla hyväksyttävää. Yhtä viljelmää käytettäessä suositellaan, että pitoisuuksia analysoidaan tavallista suurempi määrä. |
| --- | --- |

47.

Testiaineen jokaista pitoisuutta sekä kantaja-aine-/liuotinkontrollia ja negatiivista kontrollia varten on käytettävä kaksi rinnakkaisviljelmää. Mikäli laboratorion aikaisemmat tutkimustulokset osoittavat, että rinnakkaisviljelmien välillä on vain hyvin vähäisiä eroja, yhden viljelmän käyttö voi olla hyväksyttävää. Yhtä viljelmää käytettäessä suositellaan, että pitoisuuksia analysoidaan tavallista suurempi määrä.

Solujen kerääminen ja objektilasien preparointi

Solujen kerääminen ja objektilasien preparointi

| 48. | Jokainen viljelmä kerätään ja käsitellään erikseen. Solujen preparointiin voidaan käyttää hypotonista käsittelyä, mutta tämä vaihe ei ole tarpeen, jos solut levittäytyvät lasille riittävästi. Objektilasien preparoinnissa voidaan käyttää erilaisia tekniikoita edellyttäen, että pisteytystä varten saadaan korkealaatuisia solupreparaatteja. Solulima on säilytettävä mikrotumien osoittamista ja (sytokineesin estämiseen perustuvassa menetelmässä) kaksitumaisten solujen luotettavaa tunnistamista varten. |
| --- | --- |

48.

Jokainen viljelmä kerätään ja käsitellään erikseen. Solujen preparointiin voidaan käyttää hypotonista käsittelyä, mutta tämä vaihe ei ole tarpeen, jos solut levittäytyvät lasille riittävästi. Objektilasien preparoinnissa voidaan käyttää erilaisia tekniikoita edellyttäen, että pisteytystä varten saadaan korkealaatuisia solupreparaatteja. Solulima on säilytettävä mikrotumien osoittamista ja (sytokineesin estämiseen perustuvassa menetelmässä) kaksitumaisten solujen luotettavaa tunnistamista varten.

| 49. | Objektilasit voidaan värjätä erilaisilla menetelmillä, kuten Giemsa-menetelmällä tai fluorisoivilla DNA-spesifisillä väriaineilla (59). DNA-spesifisen väriaineen (esimerkiksi akridiinioranssin (61) tai Hoechst 33258:n plus pyroniini-Y:n (62)) käytöllä voidaan eliminoida joitakin ei-DNA-spesifisen väriaineen käyttöön liittyviä artefakteja. Mikrotumien sisällön (kromosomin/kromosomifragmentin) selvittämisessä voidaan käyttää anti-kinetokorivasta-aineita, FISH-tekniikkaa yhdessä pansentromeeri-DNA-koettimien kanssa tai in situ -merkkausta pansentromeerispesifisillä alukkeilla yhdessä sopivan DNA:n vastavärjäyksen kanssa, jos mikrotumien muodostumisesta halutaan saada mekanistista tietoa (15) (16). Muita klastogeenien ja aneugeenien erottelumenetelmiä voidaan käyttää, jos menetelmät on osoitettu tehokkaiksi. |
| --- | --- |

49.

Objektilasit voidaan värjätä erilaisilla menetelmillä, kuten Giemsa-menetelmällä tai fluorisoivilla DNA-spesifisillä väriaineilla (59). DNA-spesifisen väriaineen (esimerkiksi akridiinioranssin (61) tai Hoechst 33258:n plus pyroniini-Y:n (62)) käytöllä voidaan eliminoida joitakin ei-DNA-spesifisen väriaineen käyttöön liittyviä artefakteja. Mikrotumien sisällön (kromosomin/kromosomifragmentin) selvittämisessä voidaan käyttää anti-kinetokorivasta-aineita, FISH-tekniikkaa yhdessä pansentromeeri-DNA-koettimien kanssa tai in situ -merkkausta pansentromeerispesifisillä alukkeilla yhdessä sopivan DNA:n vastavärjäyksen kanssa, jos mikrotumien muodostumisesta halutaan saada mekanistista tietoa (15) (16). Muita klastogeenien ja aneugeenien erottelumenetelmiä voidaan käyttää, jos menetelmät on osoitettu tehokkaiksi.

in situ

Analyysi

Analyysi

| 50. | Kaikki objektilasit, myös positiivisia ja negatiivisia kontrolleja sisältävät, on koodattava ennen mikroskooppitutkimusta. Koodattuja näytteitä voidaan analysoida myös validoidulla, automaattisella virtaussytometria- tai kuva-analyysijärjestelmällä. |
| --- | --- |

50.

Kaikki objektilasit, myös positiivisia ja negatiivisia kontrolleja sisältävät, on koodattava ennen mikroskooppitutkimusta. Koodattuja näytteitä voidaan analysoida myös validoidulla, automaattisella virtaussytometria- tai kuva-analyysijärjestelmällä.

| 51. | SytoB-käsiteltyjen viljelmien mikrotumien määrä on analysoitava vähintään 2 000 kaksitumaisessa solussa kutakin pitoisuutta kohti (vähintään 1 000 kaksitumaista solua viljelmää kohti; kaksi viljelmää pitoisuutta kohti). Jos käytetään yhtä erillistä viljelmää, viljelmästä on laskettava vähintään 2 000 kaksitumaista solua pitoisuutta kohti. Jos kussakin pitoisuudessa laskettavissa on huomattavasti vähemmän kuin 1 000 kaksitumaista solua viljelmää kohti (tai 2 000 solua, jos käytetään yhtä viljelmää) ja jos mikrotumien määrä ei havaintojen mukaan ole kasvanut merkittävästi, testi on toistettava useammilla soluilla tai vähätoksisemmilla pitoisuuksilla sen mukaisesti, kumpi vaihtoehto soveltuu tarkoitukseen paremmin. On varmistettava, että muodoltaan epäsäännöllisiä kaksitumaisia soluja tai soluja, joiden kaksi tumaa poikkeaa kooltaan huomattavasti toisistaan, ei lasketa; kaksitumaisia soluja ei myöskään saa sekoittaa huonosti levittyneisiin monitumaisiin soluihin. Useampia kuin kaksi päätumaa sisältävistä soluista ei pitäisi analysoida mikrotumia, koska mikrotumien määrä voi olla tällaisissa soluissa suurempi (63) (64). Yksitumaisten solujen laskeminen hyväksytään, jos testiaineen on osoitettu häiritsevän sytoB:n aktiivisuutta. |
| --- | --- |

51.

SytoB-käsiteltyjen viljelmien mikrotumien määrä on analysoitava vähintään 2 000 kaksitumaisessa solussa kutakin pitoisuutta kohti (vähintään 1 000 kaksitumaista solua viljelmää kohti; kaksi viljelmää pitoisuutta kohti). Jos käytetään yhtä erillistä viljelmää, viljelmästä on laskettava vähintään 2 000 kaksitumaista solua pitoisuutta kohti. Jos kussakin pitoisuudessa laskettavissa on huomattavasti vähemmän kuin 1 000 kaksitumaista solua viljelmää kohti (tai 2 000 solua, jos käytetään yhtä viljelmää) ja jos mikrotumien määrä ei havaintojen mukaan ole kasvanut merkittävästi, testi on toistettava useammilla soluilla tai vähätoksisemmilla pitoisuuksilla sen mukaisesti, kumpi vaihtoehto soveltuu tarkoitukseen paremmin. On varmistettava, että muodoltaan epäsäännöllisiä kaksitumaisia soluja tai soluja, joiden kaksi tumaa poikkeaa kooltaan huomattavasti toisistaan, ei lasketa; kaksitumaisia soluja ei myöskään saa sekoittaa huonosti levittyneisiin monitumaisiin soluihin. Useampia kuin kaksi päätumaa sisältävistä soluista ei pitäisi analysoida mikrotumia, koska mikrotumien määrä voi olla tällaisissa soluissa suurempi (63) (64). Yksitumaisten solujen laskeminen hyväksytään, jos testiaineen on osoitettu häiritsevän sytoB:n aktiivisuutta.

| 52. | Solulinjoissa, joilla tehdään määritys ilman sytoB-käsittelyä, mikrotumat olisi pisteytettävä vähintään 2 000 solussa pitoisuutta kohti (vähintään 1 000 solua viljelmää kohti; kaksi viljelmää pitoisuutta kohti). Jos yhtä pitoisuutta kohti käytetään vain yhtä viljelmää, kyseisestä viljelmästä on laskettava vähintään 2 000 solua. |
| --- | --- |

52.

Solulinjoissa, joilla tehdään määritys ilman sytoB-käsittelyä, mikrotumat olisi pisteytettävä vähintään 2 000 solussa pitoisuutta kohti (vähintään 1 000 solua viljelmää kohti; kaksi viljelmää pitoisuutta kohti). Jos yhtä pitoisuutta kohti käytetään vain yhtä viljelmää, kyseisestä viljelmästä on laskettava vähintään 2 000 solua.

| 53. | Kun sytoB:tä käytetään, sytokineesin eston proliferaatioindeksi tai RI on määritettävä solujen proliferaation arvioimiseksi (katso lisäys 2) käyttämällä vähintään 500:aa solua viljelmää kohti. Kun käsittely tehdään ilman sytoB:tä, on tärkeää esittää todisteet siitä, että laskettavat solut ovat proliferoituneet (ks. 24–27 kohta). |
| --- | --- |

53.

Kun sytoB:tä käytetään, sytokineesin eston proliferaatioindeksi tai RI on määritettävä solujen proliferaation arvioimiseksi (katso lisäys 2) käyttämällä vähintään 500:aa solua viljelmää kohti. Kun käsittely tehdään ilman sytoB:tä, on tärkeää esittää todisteet siitä, että laskettavat solut ovat proliferoituneet (ks. 24–27 kohta).

Hyväksyttävyysperusteet

Hyväksyttävyysperusteet

| 54. | Tässä kuvatun MNvit-määritysmenetelmän käyttöä ehdottavan laboratorion on osoitettava valmiutensa osoittaa luotettavasti ja täsmällisesti kemikaalit, jotka tunnetusti toimivat aneugeenisesti ja klastogeenisesti metabolisen aktivaation läsnä ollessa ja ilman sitä, sekä tunnetut negatiiviset kemikaalit. Tässä on käytettävä lisäyksessä 3 lueteltuja vertailukemikaaleja. Laboratorio voi osoittaa valmiutensa käyttää tätä testimenetelmää asianmukaisesti esittämällä todisteet siitä, että mikrotumien muodostumisen pisteytykseen käytetyissä soluissa on tapahtunut yksi tuman jakautuminen, jos testi tehdään ilman sytoB:tä. |
| --- | --- |

54.

Tässä kuvatun MNvit-määritysmenetelmän käyttöä ehdottavan laboratorion on osoitettava valmiutensa osoittaa luotettavasti ja täsmällisesti kemikaalit, jotka tunnetusti toimivat aneugeenisesti ja klastogeenisesti metabolisen aktivaation läsnä ollessa ja ilman sitä, sekä tunnetut negatiiviset kemikaalit. Tässä on käytettävä lisäyksessä 3 lueteltuja vertailukemikaaleja. Laboratorio voi osoittaa valmiutensa käyttää tätä testimenetelmää asianmukaisesti esittämällä todisteet siitä, että mikrotumien muodostumisen pisteytykseen käytetyissä soluissa on tapahtunut yksi tuman jakautuminen, jos testi tehdään ilman sytoB:tä.

| 55. | Vertailukemikaaleina käytettäväksi suositellaan lisäyksessä 3 lueteltuja kemikaaleja. Korvaavia tai täydentäviä kemikaaleja voidaan käyttää, jos niiden vaikutus tunnetaan, jos ne indusoivat mikrotumia samoilla toimintamekanismeilla ja jos ne on osoitettu merkityksellisiksi MNvit-menetelmällä testattavien kemikaalien suhteen. Perusteluna voidaan esittää muun muassa validointitutkimusta, jossa testiaineen kemikaaliluokan tai tutkittavan vauriomekanismin perusteella on käytetty useita eri aineita tai vähäisempää ainemäärää. |
| --- | --- |

55.

Vertailukemikaaleina käytettäväksi suositellaan lisäyksessä 3 lueteltuja kemikaaleja. Korvaavia tai täydentäviä kemikaaleja voidaan käyttää, jos niiden vaikutus tunnetaan, jos ne indusoivat mikrotumia samoilla toimintamekanismeilla ja jos ne on osoitettu merkityksellisiksi MNvit-menetelmällä testattavien kemikaalien suhteen. Perusteluna voidaan esittää muun muassa validointitutkimusta, jossa testiaineen kemikaaliluokan tai tutkittavan vauriomekanismin perusteella on käytetty useita eri aineita tai vähäisempää ainemäärää.

| 56. | Liuotin-/kantaja-ainekontrollien ja käsittelemättömien viljelmien olisi annettava tulokseksi toistettavasti vähäinen ja yhdenmukainen mikrotumien määrä (yleensä 5–25 mikrotumaa tuhatta solua kohti 11 kohdassa mainittujen solutyyppien osalta). Muiden solutyyppien tuotosten vaihteluvälit voivat olla erilaisia, ja ne on määritettävä, kun solutyyppejä validoidaan MNvit-määritysmenetelmässä käyttämistä varten. Kontrollien vaihteluvälit on määritettävä pitkältä ajalta negatiivisista kontrolleista, liuotinkontrolleista ja positiivisista kontrolleista saatujen tietojen perusteella. Näitä arvoja olisi käytettävä arvioitaessa, ovatko samanaikaiset negatiiviset tai positiiviset kontrollit asianmukaisia. |
| --- | --- |

56.

Liuotin-/kantaja-ainekontrollien ja käsittelemättömien viljelmien olisi annettava tulokseksi toistettavasti vähäinen ja yhdenmukainen mikrotumien määrä (yleensä 5–25 mikrotumaa tuhatta solua kohti 11 kohdassa mainittujen solutyyppien osalta). Muiden solutyyppien tuotosten vaihteluvälit voivat olla erilaisia, ja ne on määritettävä, kun solutyyppejä validoidaan MNvit-määritysmenetelmässä käyttämistä varten. Kontrollien vaihteluvälit on määritettävä pitkältä ajalta negatiivisista kontrolleista, liuotinkontrolleista ja positiivisista kontrolleista saatujen tietojen perusteella. Näitä arvoja olisi käytettävä arvioitaessa, ovatko samanaikaiset negatiiviset tai positiiviset kontrollit asianmukaisia.

| 57. | Jos määritysmenetelmän tutkimussuunnitelmaan ehdotetaan pieniä muutoksia (esimerkiksi automaattisten pisteytystekniikoiden käyttämistä manuaalisten laskentatekniikoiden asemesta tai uuden solutyypin käyttämistä), muutoksen vaikutus on osoitettava, ennen kuin tutkimussuunnitelman muutos voidaan hyväksyä. Vaikutuksen osoittamisella tarkoitetaan, että on muun muassa osoitettava, että kromosomin katkeamisen, liittymän tai häviämän tärkeimmät mekanismit voidaan osoittaa ja että testattavan yksittäisen aineen luokalle tai monille erilaisille aineille voidaan saada asianmukaiset positiiviset ja negatiiviset tulokset. |
| --- | --- |

57.

Jos määritysmenetelmän tutkimussuunnitelmaan ehdotetaan pieniä muutoksia (esimerkiksi automaattisten pisteytystekniikoiden käyttämistä manuaalisten laskentatekniikoiden asemesta tai uuden solutyypin käyttämistä), muutoksen vaikutus on osoitettava, ennen kuin tutkimussuunnitelman muutos voidaan hyväksyä. Vaikutuksen osoittamisella tarkoitetaan, että on muun muassa osoitettava, että kromosomin katkeamisen, liittymän tai häviämän tärkeimmät mekanismit voidaan osoittaa ja että testattavan yksittäisen aineen luokalle tai monille erilaisille aineille voidaan saada asianmukaiset positiiviset ja negatiiviset tulokset.

MITTAUSTULOKSET JA TULOSTEN ILMOITTAMINEN

Tulosten käsittely

Tulosten käsittely

| 58. | Jos käytetään sytokineesin inhibiittoritekniikkaa, mikrotumien indusoitumisen arvioinnissa käytetään vain sellaisia kaksitumaisia soluja, joissa esiintyy mikrotumia (riippumatta mikrotumien määrästä solua kohti). Yksi, kaksi tai monta mikrotumaa omaavien solujen määrän laskemisella voidaan saada hyödyllistä tietoa, mutta se ei ole pakollista. |
| --- | --- |

58.

Jos käytetään sytokineesin inhibiittoritekniikkaa, mikrotumien indusoitumisen arvioinnissa käytetään vain sellaisia kaksitumaisia soluja, joissa esiintyy mikrotumia (riippumatta mikrotumien määrästä solua kohti). Yksi, kaksi tai monta mikrotumaa omaavien solujen määrän laskemisella voidaan saada hyödyllistä tietoa, mutta se ei ole pakollista.

| 59. | Kaikille käsitellyille viljelmille ja liuotin-/kantajakontrolleille olisi tehtävä samanaikaisesti sytotoksisuus- ja/tai sytostaasimääritykset (58). Sytokineesin eston proliferaatioindeksi tai RI on laskettava kaikille käsitellyille viljelmille ja kontrolliviljelmille määrittämällä solusyklin viivästyminen, kun käytetään sytokineesin estomenetelmää. Jos sytoB:tä ei käytetä, on määritettävä populaation suhteellinen kaksinkertaistuminen, solumäärän suhteellisen lisääntyminen tai PI (katso lisäys 2). |
| --- | --- |

59.

Kaikille käsitellyille viljelmille ja liuotin-/kantajakontrolleille olisi tehtävä samanaikaisesti sytotoksisuus- ja/tai sytostaasimääritykset (58). Sytokineesin eston proliferaatioindeksi tai RI on laskettava kaikille käsitellyille viljelmille ja kontrolliviljelmille määrittämällä solusyklin viivästyminen, kun käytetään sytokineesin estomenetelmää. Jos sytoB:tä ei käytetä, on määritettävä populaation suhteellinen kaksinkertaistuminen, solumäärän suhteellisen lisääntyminen tai PI (katso lisäys 2).

| 60. | Kustakin viljelmästä on esitettävä tiedot erikseen. Kaikista tiedoista on lisäksi esitettävä yhteenveto taulukkomuodossa. |
| --- | --- |

60.

Kustakin viljelmästä on esitettävä tiedot erikseen. Kaikista tiedoista on lisäksi esitettävä yhteenveto taulukkomuodossa.

| 61. | MNvit-määritysmenetelmässä kemikaalit voivat aiheuttaa mikrotumien muodostumista indusoimalla kromosomien katkeamista, niiden häviämistä tai molempia. Antikinetokorivasta-aineilla, sentromeerispesifisillä in situ -koettimilla tai muilla menetelmillä voidaan yrittää määrittää, johtuuko mikrotumien indusoitumismekanismi klastogeenisesta ja/tai aneugeenisesta vaikutuksesta. |
| --- | --- |

61.

MNvit-määritysmenetelmässä kemikaalit voivat aiheuttaa mikrotumien muodostumista indusoimalla kromosomien katkeamista, niiden häviämistä tai molempia. Antikinetokorivasta-aineilla, sentromeerispesifisillä in situ -koettimilla tai muilla menetelmillä voidaan yrittää määrittää, johtuuko mikrotumien indusoitumismekanismi klastogeenisesta ja/tai aneugeenisesta vaikutuksesta.

in situ

Tulosten arviointi ja tulkinta

Tulosten arviointi ja tulkinta

| 62. | Selviä positiivisia tai negatiivisia tuloksia ei tarvitse vahvistaa täydentävillä testeillä. Epäselviä tuloksia voidaan selventää analysoimalla vielä tuhat solua kaikista viljelmistä, jotta vältetään satunnaisuuden vääristyminen. Jos tulosta ei saada selville tällä tavalla, viljelmille on tehtävä uusia testejä. Niissä olisi harkittava tutkimusparametrien muuttamista tapauksesta riippuen laajemmin tai suppeammin. Tutkimusparametreja, joita voitaisiin muuttaa, ovat muun muassa testipitoisuuksien erot, viljelmien käsittelyajankohta ja solujen keräämisajankohta ja/tai metabolisen aktivaation olosuhteet. |
| --- | --- |

62.

Selviä positiivisia tai negatiivisia tuloksia ei tarvitse vahvistaa täydentävillä testeillä. Epäselviä tuloksia voidaan selventää analysoimalla vielä tuhat solua kaikista viljelmistä, jotta vältetään satunnaisuuden vääristyminen. Jos tulosta ei saada selville tällä tavalla, viljelmille on tehtävä uusia testejä. Niissä olisi harkittava tutkimusparametrien muuttamista tapauksesta riippuen laajemmin tai suppeammin. Tutkimusparametreja, joita voitaisiin muuttaa, ovat muun muassa testipitoisuuksien erot, viljelmien käsittelyajankohta ja solujen keräämisajankohta ja/tai metabolisen aktivaation olosuhteet.

| 63. | Positiivinen tulos voidaan päätellä useiden perusteiden avulla. Näitä ovat esimerkiksi mikrotumallisten solujen määrän pitoisuuteen sidottu kasvu tai tilastollisesti merkittävä kasvu. Aluksi on tarkasteltava tulosten biologista merkityksellisyyttä. Sen arvioimiseksi voidaan tarkastella sitä, ovatko havaitut arvot aiemman kontrollivaihteluvälin sisällä vai sen ulkopuolella. Testitulosten arvioinnissa voidaan käyttää asianmukaisia tilastollisia menetelmiä (65). Tilastollisen testauksen tuloksia on kuitenkin arvioitava suhteessa annos-vastesuhteeseen. Myös uusittavuus ja aiemmat tulokset on otettava huomioon. |
| --- | --- |

63.

Positiivinen tulos voidaan päätellä useiden perusteiden avulla. Näitä ovat esimerkiksi mikrotumallisten solujen määrän pitoisuuteen sidottu kasvu tai tilastollisesti merkittävä kasvu. Aluksi on tarkasteltava tulosten biologista merkityksellisyyttä. Sen arvioimiseksi voidaan tarkastella sitä, ovatko havaitut arvot aiemman kontrollivaihteluvälin sisällä vai sen ulkopuolella. Testitulosten arvioinnissa voidaan käyttää asianmukaisia tilastollisia menetelmiä (65). Tilastollisen testauksen tuloksia on kuitenkin arvioitava suhteessa annos-vastesuhteeseen. Myös uusittavuus ja aiemmat tulokset on otettava huomioon.

| 64. | Useimmissa testeissä saadaan selvästi positiivisia tai negatiivisia tuloksia, mutta joissakin tapauksissa mittaustulosten pohjalta ei voida tehdä varmoja päätelmiä testiaineen aktiivisuudesta. Tulokset saattavat jäädä epäselviksi tai kyseenalaisiksi kokeen toistokertojen määrästä riippumatta. |
| --- | --- |

64.

Useimmissa testeissä saadaan selvästi positiivisia tai negatiivisia tuloksia, mutta joissakin tapauksissa mittaustulosten pohjalta ei voida tehdä varmoja päätelmiä testiaineen aktiivisuudesta. Tulokset saattavat jäädä epäselviksi tai kyseenalaisiksi kokeen toistokertojen määrästä riippumatta.

| 65. | MNvit-määritysmenetelmässä saadut positiiviset tulokset osoittavat, että testiaine indusoi kromosomien katkeamista tai häviämää viljellyissä nisäkässoluissa. Negatiiviset tulokset osoittavat, että testiaine ei käytetyissä testiolosuhteissa indusoi kromosomien katkeamista ja/tai liittymää tai häviämää viljellyissä nisäkässoluissa. |
| --- | --- |

65.

MNvit-määritysmenetelmässä saadut positiiviset tulokset osoittavat, että testiaine indusoi kromosomien katkeamista tai häviämää viljellyissä nisäkässoluissa. Negatiiviset tulokset osoittavat, että testiaine ei käytetyissä testiolosuhteissa indusoi kromosomien katkeamista ja/tai liittymää tai häviämää viljellyissä nisäkässoluissa.

Testiraportti

Testiraportti

| 66. | Testiraportissa on annettava vähintään seuraavat tiedot, jos ne ovat merkityksellisiä tutkimuksen suorituksen kannalta: | Testikemikaali







  — | tunnistetiedot sekä CAS-numero ja EC-numero |
| --- | --- | --- | --- |

66.

Testiraportissa on annettava vähintään seuraavat tiedot, jos ne ovat merkityksellisiä tutkimuksen suorituksen kannalta:

Testikemikaali

Testikemikaali

—

tunnistetiedot sekä CAS-numero ja EC-numero

| — | fysikaalinen olomuoto ja puhtaus |
| --- | --- |

—

fysikaalinen olomuoto ja puhtaus

| — | tutkimuksen tekemisen kannalta merkitykselliset fysikaaliskemialliset ominaisuudet |
| --- | --- |

—

tutkimuksen tekemisen kannalta merkitykselliset fysikaaliskemialliset ominaisuudet

| — | testikemikaalin reagointi liuottimen/kantaja-aineen tai solujen kasvatusväliaineen kanssa |
| --- | --- |

—

testikemikaalin reagointi liuottimen/kantaja-aineen tai solujen kasvatusväliaineen kanssa

| | Liuotin/kantaja-aine







  — | liuottimen/kantaja-aineen valintaperusteet |
| --- | --- | --- |

Liuotin/kantaja-aine

Liuotin/kantaja-aine

—

liuottimen/kantaja-aineen valintaperusteet

| — | testiaineen liukoisuus ja stabiliteetti liuottimessa/kantaja-aineessa |
| --- | --- |

—

testiaineen liukoisuus ja stabiliteetti liuottimessa/kantaja-aineessa

| | Solut







  — | käytettyjen solujen tyyppi ja alkuperä |
| --- | --- | --- |

Solut

Solut

—

käytettyjen solujen tyyppi ja alkuperä

| — | käytetyn solutyypin soveltuvuus |
| --- | --- |

—

käytetyn solutyypin soveltuvuus

| — | mahdollinen mykoplasmakontaminaatio |
| --- | --- |

—

mahdollinen mykoplasmakontaminaatio

| — | tiedot solusyklin kestosta, jakautumisaika tai proliferaatioindeksi |
| --- | --- |

—

tiedot solusyklin kestosta, jakautumisaika tai proliferaatioindeksi

| — | lymfosyyttien osalta verenluovuttajien sukupuoli, ikä ja tarvittaessa määrä |
| --- | --- |

—

lymfosyyttien osalta verenluovuttajien sukupuoli, ikä ja tarvittaessa määrä

| — | lymfosyyttien osalta tieto siitä, onko testissä altistettu kokoverta vai eristettyjä lymfosyyttejä |
| --- | --- |

—

lymfosyyttien osalta tieto siitä, onko testissä altistettu kokoverta vai eristettyjä lymfosyyttejä

| — | tarvittaessa siirrostusten lukumäärä |
| --- | --- |

—

tarvittaessa siirrostusten lukumäärä

| — | tarvittaessa soluviljelymenetelmät |
| --- | --- |

—

tarvittaessa soluviljelymenetelmät

| — | kromosomien modaalinen lukumäärä |
| --- | --- |

—

kromosomien modaalinen lukumäärä

| — | tavallinen (negatiivisen kontrollin) solusyklin kesto |
| --- | --- |

—

tavallinen (negatiivisen kontrollin) solusyklin kesto

| | Testiolosuhteet







  — | mahdollinen sytokineesin inhibiittori (esimerkiksi sytoB), sen pitoisuus ja solujen altistuksen kesto |
| --- | --- | --- |

Testiolosuhteet

Testiolosuhteet

—

mahdollinen sytokineesin inhibiittori (esimerkiksi sytoB), sen pitoisuus ja solujen altistuksen kesto

| — | pitoisuuksien ja soluviljelmien lukumäärän valintaperusteet, joihin sisältyvät esimerkiksi sytotoksisuustiedot ja liukoisuusrajoitukset, mikäli tiedot ovat käytettävissä |
| --- | --- |

—

pitoisuuksien ja soluviljelmien lukumäärän valintaperusteet, joihin sisältyvät esimerkiksi sytotoksisuustiedot ja liukoisuusrajoitukset, mikäli tiedot ovat käytettävissä

| — | väliaineen koostumus ja tarvittaessa CO2-pitoisuus |
| --- | --- |

—

väliaineen koostumus ja tarvittaessa CO2-pitoisuus

2

| — | testiaineen pitoisuudet |
| --- | --- |

—

testiaineen pitoisuudet

| — | lisätyn kantaja-aineen ja testiaineen pitoisuus (ja/tai tilavuus) |
| --- | --- |

—

lisätyn kantaja-aineen ja testiaineen pitoisuus (ja/tai tilavuus)

| — | inkubaatiolämpötila ja -aika |
| --- | --- |

—

inkubaatiolämpötila ja -aika

| — | käsittelyn kesto |
| --- | --- |

—

käsittelyn kesto

| — | käsittelyn jälkeinen keräämisajankohta |
| --- | --- |

—

käsittelyn jälkeinen keräämisajankohta

| — | tarvittaessa solutiheys inokuloitaessa |
| --- | --- |

—

tarvittaessa solutiheys inokuloitaessa

| — | metabolisen aktivaatiojärjestelmän tyyppi ja koostumus, myös sen hyväksyttävyysperusteet |
| --- | --- |

—

metabolisen aktivaatiojärjestelmän tyyppi ja koostumus, myös sen hyväksyttävyysperusteet

| — | positiiviset kontrollikemikaalit ja negatiiviset kontrollit |
| --- | --- |

—

positiiviset kontrollikemikaalit ja negatiiviset kontrollit

| — | objektilasien preparointimenetelmät ja käytetyt värjäystekniikat |
| --- | --- |

—

objektilasien preparointimenetelmät ja käytetyt värjäystekniikat

| — | mikrotumien tunnistusperusteet |
| --- | --- |

—

mikrotumien tunnistusperusteet

| — | analysoitujen solujen määrät |
| --- | --- |

—

analysoitujen solujen määrät

| — | sytotoksisuuden mittausmenetelmät |
| --- | --- |

—

sytotoksisuuden mittausmenetelmät

| — | muut sytotoksisuuteen liittyvät tiedot |
| --- | --- |

—

muut sytotoksisuuteen liittyvät tiedot

| — | tutkimusten positiivisuuden, negatiivisuuden tai epäselvyyden arviointiperusteet |
| --- | --- |

—

tutkimusten positiivisuuden, negatiivisuuden tai epäselvyyden arviointiperusteet

| — | käytetyt tilastoanalyysimenetelmät |
| --- | --- |

—

käytetyt tilastoanalyysimenetelmät

| — | tarvittaessa menetelmät sen määrittämiseksi, sisältävätkö mikrotumat kokonaisia kromosomeja vai kromosomifragmentteja, esimerkiksi kinetokorivasta-aineen käyttö |
| --- | --- |

—

tarvittaessa menetelmät sen määrittämiseksi, sisältävätkö mikrotumat kokonaisia kromosomeja vai kromosomifragmentteja, esimerkiksi kinetokorivasta-aineen käyttö

| | Tulokset







  — | käytetyt sytotoksisuuden määritysmenetelmät, esimerkiksi sytokineesin eston proliferaatioindeksi tai RI (sytokineesin estoon perustuva menetelmä); solumäärän suhteellinen lisääntyminen, populaation suhteellinen kaksinkertaistuminen tai PI (muu kuin sytokineesin estoon perustuva menetelmä); tarvittaessa muut havainnot, esimerkiksi solujen konfluenssi, apoptoosi, nekroosi, metafaasien määrä ja kaksitumaisten solujen määrä |
| --- | --- | --- |

Tulokset

Tulokset

—

käytetyt sytotoksisuuden määritysmenetelmät, esimerkiksi sytokineesin eston proliferaatioindeksi tai RI (sytokineesin estoon perustuva menetelmä); solumäärän suhteellinen lisääntyminen, populaation suhteellinen kaksinkertaistuminen tai PI (muu kuin sytokineesin estoon perustuva menetelmä); tarvittaessa muut havainnot, esimerkiksi solujen konfluenssi, apoptoosi, nekroosi, metafaasien määrä ja kaksitumaisten solujen määrä

| — | saostumisen merkit |
| --- | --- |

—

saostumisen merkit

| — | tiedot käsittelyväliaineen pH:sta ja osmolaliteetista, jos määritetty |
| --- | --- |

—

tiedot käsittelyväliaineen pH:sta ja osmolaliteetista, jos määritetty

| — | analysoitavaksi hyväksyttävien solujen määritelmä |
| --- | --- |

—

analysoitavaksi hyväksyttävien solujen määritelmä

| — | yksi-, kaksi- ja monitumaisten solujen osuudet, jos sytokineesin estoon perustuvaa menetelmää on käytetty |
| --- | --- |

—

yksi-, kaksi- ja monitumaisten solujen osuudet, jos sytokineesin estoon perustuvaa menetelmää on käytetty

| — | mikrotumallisten solujen määrä kussakin käsitellyssä viljelmässä ja kontrolliviljelmässä ja tiedot solujen mahdollisesta kaksitumaisuudesta tai monitumaisuudesta |
| --- | --- |

—

mikrotumallisten solujen määrä kussakin käsitellyssä viljelmässä ja kontrolliviljelmässä ja tiedot solujen mahdollisesta kaksitumaisuudesta tai monitumaisuudesta

| — | pitoisuus-vastesuhde, jos mahdollista |
| --- | --- |

—

pitoisuus-vastesuhde, jos mahdollista

| — | samanaikaisten negatiivisten (liuotin/kantaja-aine) ja positiivisten kontrollikemikaalien tiedot (pitoisuudet ja liuottimet) |
| --- | --- |

—

samanaikaisten negatiivisten (liuotin/kantaja-aine) ja positiivisten kontrollikemikaalien tiedot (pitoisuudet ja liuottimet)

| — | aikaisemmat tiedot negatiivisista (liuotin/kantaja-aine) ja positiivisista kontrollikemikaaleista, myös vaihteluvälit, keskiarvot ja keskihajonnat sekä luottamusväli (esimerkiksi 95 prosenttia) |
| --- | --- |

—

aikaisemmat tiedot negatiivisista (liuotin/kantaja-aine) ja positiivisista kontrollikemikaaleista, myös vaihteluvälit, keskiarvot ja keskihajonnat sekä luottamusväli (esimerkiksi 95 prosenttia)

| — | tilastoanalyysi; mahdolliset p-arvot |
| --- | --- |

—

tilastoanalyysi; mahdolliset p-arvot

| | Tulosten tarkastelu |
| --- | --- |

Tulosten tarkastelu

Tulosten tarkastelu

| | Päätelmät |
| --- | --- |

Päätelmät

Päätelmät

LÄHDELUETTELO

| (1) | Kirsch-Volders, M. (1997). Towards a validation of the micronucleus test. Mutation Res. 392, s. 1–4. |
| --- | --- |

(1)

Kirsch-Volders, M. (1997). Towards a validation of the micronucleus test. Mutation Res. 392, s. 1–4.

Mutation Res.

| (2) | Parry, J. M. ja Sors, A. (1993). The detection and assessment of the aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community aneuploidy project. Mutation Res. 287, s. 3–15. |
| --- | --- |

(2)

Parry, J. M. ja Sors, A. (1993). The detection and assessment of the aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community aneuploidy project. Mutation Res. 287, s. 3–15.

Mutation Res.

| (3) | Fenech, M. ja Morley, A. A. (1985). Solutions to the kinetic problem in the micronucleus assay. Cytobios. 43, s. 233–246. |
| --- | --- |

(3)

Fenech, M. ja Morley, A. A. (1985). Solutions to the kinetic problem in the micronucleus assay. Cytobios. 43, s. 233–246.

Cytobios.

| (4) | Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. ja Wakata, A. (2000). Report from the In Vitro Micronucleus Assay Working Group. Environ. Mol. Mutagen. 35, s. 167–172. |
| --- | --- |

(4)

Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. ja Wakata, A. (2000). Report from the In Vitro Micronucleus Assay Working Group. Environ. Mol. Mutagen. 35, s. 167–172.

In Vitro

Environ. Mol. Mutagen

| (5) | Fenech, M. (2007). Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols 2(5), s. 1084–1104. |
| --- | --- |

(5)

Fenech, M. (2007). Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols 2(5), s. 1084–1104.

Nature Protocols 2

| (6) | Fenech, M. ja Morley, A. A. (1986). Cytokinesis-block micronucleus method in human lymphocytes: effect of in-vivo ageing and low dose X-irradiation. Mutation Res. 161, s. 193–198. |
| --- | --- |

(6)

Fenech, M. ja Morley, A. A. (1986). Cytokinesis-block micronucleus method in human lymphocytes: effect of in-vivo ageing and low dose X-irradiation. Mutation Res. 161, s. 193–198.

in-vivo

Mutation Res.

| (7) | Eastmond, D. A. ja Tucker, J. D. (1989). Identification of aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody. Environ. Mol. Mutagen. 13, s. 34–43. |
| --- | --- |

(7)

Eastmond, D. A. ja Tucker, J. D. (1989). Identification of aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody. Environ. Mol. Mutagen. 13, s. 34–43.

Environ. Mol. Mutagen.

| (8) | Eastmond, D. A. ja Pinkel, D. (1990). Detection of aneuploidy and aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence in-situ hybridisation with chromosome-specific DNA probes. Mutation Res. 234, s. 9–20. |
| --- | --- |

(8)

Eastmond, D. A. ja Pinkel, D. (1990). Detection of aneuploidy and aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence in-situ hybridisation with chromosome-specific DNA probes. Mutation Res. 234, s. 9–20.

in-situ

Mutation Res.

| (9) | Miller, B. M., Zitzelsberger, H. F., Weier, H. U. ja Adler, I. D. (1991). Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA. Mutagenesis 6, s. 297–302. |
| --- | --- |

(9)

Miller, B. M., Zitzelsberger, H. F., Weier, H. U. ja Adler, I. D. (1991). Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA. Mutagenesis 6, s. 297–302.

in situ

Mutagenesis

| (10) | Farooqi, Z., Darroudi, F. ja Natarajan, A. T. (1993). The use of fluorescence in-situ hybridisation for the detection of aneugens in cytokinesis-blocked mouse splenocytes. Mutagenesis 8, s. 329–334. |
| --- | --- |

(10)

Farooqi, Z., Darroudi, F. ja Natarajan, A. T. (1993). The use of fluorescence in-situ hybridisation for the detection of aneugens in cytokinesis-blocked mouse splenocytes. Mutagenesis 8, s. 329–334.

in-situ

Mutagenesis

| (11) | Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. ja Lo Jacono, F. (1993). Cytogenetic damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds and micronucleus analysis by fluorescence in situ hybridization with a centromeric probe. Mutation Res. 319, s. 205–213. |
| --- | --- |

(11)

Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. ja Lo Jacono, F. (1993). Cytogenetic damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds and micronucleus analysis by fluorescence in situ hybridization with a centromeric probe. Mutation Res. 319, s. 205–213.

in situ

Mutation Res.

| (12) | Norppa, H., Renzi, L. ja Lindholm, C. (1993). Detection of whole chromosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by antikinetochore staining and in situ hybridization. Mutagenesis 8, s. 519–525. |
| --- | --- |

(12)

Norppa, H., Renzi, L. ja Lindholm, C. (1993). Detection of whole chromosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by antikinetochore staining and in situ hybridization. Mutagenesis 8, s. 519–525.

in situ

Mutagenesis

| (13) | Eastmond, D. A, Rupa, D. S. ja Hasegawa, L. S. (1994). Detection of hyperdiploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes following exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor fluorescence in situ hybridization with DNA probes. Mutation Res. 322, s. 9–20. |
| --- | --- |

(13)

Eastmond, D. A, Rupa, D. S. ja Hasegawa, L. S. (1994). Detection of hyperdiploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes following exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor fluorescence in situ hybridization with DNA probes. Mutation Res. 322, s. 9–20.

in situ

Mutation Res.

| (14) | Marshall, R. R., Murphy, M., Kirkland, D. J. ja Bentley, K. S. (1996). Fluorescence in situ hybridisation (FISH) with chromosome-specific centromeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy. Mutation Res. 372, s. 233–245. |
| --- | --- |

(14)

Marshall, R. R., Murphy, M., Kirkland, D. J. ja Bentley, K. S. (1996). Fluorescence in situ hybridisation (FISH) with chromosome-specific centromeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy. Mutation Res. 372, s. 233–245.

in situ

Mutation Res.

| (15) | Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. ja Crebelli, R. (1996). Analysis of chromosome segregation by means of fluorescence in situ hybridization: application to cytokinesis-blocked human lymphocytes. Mutation Res. 372, s. 211–219. |
| --- | --- |

(15)

Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. ja Crebelli, R. (1996). Analysis of chromosome segregation by means of fluorescence in situ hybridization: application to cytokinesis-blocked human lymphocytes. Mutation Res. 372, s. 211–219.

in situ

Mutation Res.

| (16) | Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der Hude, W. ja Wakata, A. (2003). Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Res. 540, s. 153–163. |
| --- | --- |

(16)

Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der Hude, W. ja Wakata, A. (2003). Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Res. 540, s. 153–163.

in vitro

Mutation Res.

| (17) | OECD (1997). In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test, Test Guideline No. 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa www.oecd.org/env/testguidelines |
| --- | --- |

(17)

OECD (1997). In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test, Test Guideline No. 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa www.oecd.org/env/testguidelines

In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test

| (18) | Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M. J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G. ja Marzin, D. (2006). SFTG International collaborative Study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study. Mutation Res. 607, s. 13–36. |
| --- | --- |

(18)

Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M. J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G. ja Marzin, D. (2006). SFTG International collaborative Study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study. Mutation Res. 607, s. 13–36.

in vitro

Mutation Res.

| (19) | Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L. C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. ja Lorge, E. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes. Mutation Res. 607, s. 37–60. |
| --- | --- |

(19)

Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L. C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. ja Lorge, E. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes. Mutation Res. 607, s. 37–60.

in vitro

Mutation Res.

| (20) | Aardema, M. J., Snyder, R. D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R. J., Gibson, D. P., Soelter, S., Curry, P. T., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. ja Lorge, E. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, III. Using CHO cells. Mutation Res. 607, s. 61–87. |
| --- | --- |

(20)

Aardema, M. J., Snyder, R. D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R. J., Gibson, D. P., Soelter, S., Curry, P. T., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. ja Lorge, E. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, III. Using CHO cells. Mutation Res. 607, s. 61–87.

in vitro

Mutation Res.

| (21) | Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., Kobayashi, K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. ja Lorge, E. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells. Mutation Res. 607, s. 88–124. |
| --- | --- |

(21)

Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., Kobayashi, K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. ja Lorge, E. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells. Mutation Res. 607, s. 88–124.

in vitro

Mutation Res.

| (22) | Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. ja Lorge, E. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, V. Using L5178Y cells. Mutation Res. 607, s. 125–152. |
| --- | --- |

(22)

Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. ja Lorge, E. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, V. Using L5178Y cells. Mutation Res. 607, s. 125–152.

in vitro

Mutation Res.

| (23) | Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A. A. ja Locher, F. (1997). Detailed data on in vitro MNT and in vitro CA: industrial experience. Mutation Res. 392, s. 187–208. |
| --- | --- |

(23)

Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A. A. ja Locher, F. (1997). Detailed data on in vitro MNT and in vitro CA: industrial experience. Mutation Res. 392, s. 187–208.

in vitro

in vitro

Mutation Res.

| (24) | Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. ja Lorge, E. (1997). Comparative evaluation of the in vitro micronucleus test and the in vitro chromosome aberration test: industrial experience. Mutation Res. 392, s. 45–59. |
| --- | --- |

(24)

Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. ja Lorge, E. (1997). Comparative evaluation of the in vitro micronucleus test and the in vitro chromosome aberration test: industrial experience. Mutation Res. 392, s. 45–59.

in vitro

in vitro

Mutation Res.

| (25) | Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. ja Madle, S. (1998). Evaluation of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosomal aberration assay: position of the GUM Working Group on the in vitro micronucleus test. Gesellschaft fur Umwelt-Mutations-forschung. Mutation Res. 410, s. 81–116. |
| --- | --- |

(25)

Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. ja Madle, S. (1998). Evaluation of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosomal aberration assay: position of the GUM Working Group on the in vitro micronucleus test. Gesellschaft fur Umwelt-Mutations-forschung. Mutation Res. 410, s. 81–116.

in vitro

in vitro

in vitro

Mutation Res.

| (26) | Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. ja Madle, S. (1999). Chemically induced micronucleus formation in V79 cells – comparison of three different test approaches. Mutation Res. 439, s. 183–190. |
| --- | --- |

(26)

Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. ja Madle, S. (1999). Chemically induced micronucleus formation in V79 cells – comparison of three different test approaches. Mutation Res. 439, s. 183–190.

Mutation Res.

| (27) | Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S. Y., Kasper, P. ja Müller, L. (1999). The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 cells to detect drug-induced photogenotoxicity. Mutation Res. 445, s. 55–71. |
| --- | --- |

(27)

Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S. Y., Kasper, P. ja Müller, L. (1999). The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 cells to detect drug-induced photogenotoxicity. Mutation Res. 445, s. 55–71.

Mutation Res.

| (28) | von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., Slacik-Erben, R., Miltenburger, H. G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. ja Madle, S. (2000). In vitro micronucleus assay with Chinese hamster V79 cells – results of a collaborative study with in situ exposure to 26 chemical substances. Mutation Res. 468, s. 137–163. |
| --- | --- |

(28)

von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., Slacik-Erben, R., Miltenburger, H. G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. ja Madle, S. (2000). In vitro micronucleus assay with Chinese hamster V79 cells – results of a collaborative study with in situ exposure to 26 chemical substances. Mutation Res. 468, s. 137–163.

In vitro

in situ

Mutation Res

| (29) | Garriott, M. L., Phelps, J. B. ja Hoffman, W. P. (2002). A protocol for the in vitro micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity. Mutation Res. 517, s. 123–134. |
| --- | --- |

(29)

Garriott, M. L., Phelps, J. B. ja Hoffman, W. P. (2002). A protocol for the in vitro micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity. Mutation Res. 517, s. 123–134.

in vitro

Mutation Res.

| (30) | Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. ja Sofuni, T. (1999). Validation study of the in vitro micronucleus test in a Chinese hamster lung cell line (CHL/IU). Mutagenesis 14, s. 569–580. |
| --- | --- |

(30)

Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. ja Sofuni, T. (1999). Validation study of the in vitro micronucleus test in a Chinese hamster lung cell line (CHL/IU). Mutagenesis 14, s. 569–580.

in vitro

Mutagenesis

| (31) | Elhajouji, A. ja Lorge, E. (2006). Special Issue: SFTG International collaborative study on in vitro micronucleus test. Mutation Res. 607, s. 1–152. |
| --- | --- |

(31)

Elhajouji, A. ja Lorge, E. (2006). Special Issue: SFTG International collaborative study on in vitro micronucleus test. Mutation Res. 607, s. 1–152.

in vitro

Mutation Res.

| (32) | ECVAM (2006). Statement by the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on the scientific validity of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosome aberration assay for genotoxicity testing. ESAC:in 25. kokous, 16.–17. marraskuuta 2006. Saatavilla osoitteessa http://ecvam.jrc.it/index.htm |
| --- | --- |

(32)

ECVAM (2006). Statement by the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on the scientific validity of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosome aberration assay for genotoxicity testing. ESAC:in 25. kokous, 16.–17. marraskuuta 2006. Saatavilla osoitteessa http://ecvam.jrc.it/index.htm

in vitro

in vitro

| (33) | ESAC (2006). ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer Review, Retrospective Validation of the In Vitro Micronucleus Test, Summary and Conclusions of the Peer Review Panel. Saatavilla osoitteessa http://ecvam.jrc.it/index.htm |
| --- | --- |

(33)

ESAC (2006). ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer Review, Retrospective Validation of the In Vitro Micronucleus Test, Summary and Conclusions of the Peer Review Panel. Saatavilla osoitteessa http://ecvam.jrc.it/index.htm

In Vitro

| (34) | Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, van Benthem, J. ja Vanparys P. (2008). ECVAM Retrospective Validation of in vitro Micronucleus Test (MNT). Mutagenesis 23, s. 271–283. |
| --- | --- |

(34)

Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, van Benthem, J. ja Vanparys P. (2008). ECVAM Retrospective Validation of in vitro Micronucleus Test (MNT). Mutagenesis 23, s. 271–283.

in vitro

Mutagenesis

| (35) | Zhang, L. S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. ja Sofuni, T. (1995). A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the in vitro micronucleus test. Mutation Res. 347, s. 105–115. |
| --- | --- |

(35)

Zhang, L. S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. ja Sofuni, T. (1995). A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the in vitro micronucleus test. Mutation Res. 347, s. 105–115.

in vitro

Mutation Res.

| (36) | Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. ja Knasmeuller, S. (2002). Fumonisin B1 is genotoxic in human derived hepatoma (HepG2) cells. Mutagenesis 17, s. 257–260. |
| --- | --- |

(36)

Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. ja Knasmeuller, S. (2002). Fumonisin B1 is genotoxic in human derived hepatoma (HepG2) cells. Mutagenesis 17, s. 257–260.

1

Mutagenesis

| (37) | Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., Huber, W. W., Hoelzl, C., Bichler, J. ja Majer, B. J. (2004). Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge. Toxicol. 198, s. 315–328. |
| --- | --- |

(37)

Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., Huber, W. W., Hoelzl, C., Bichler, J. ja Majer, B. J. (2004). Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge. Toxicol. 198, s. 315–328.

Toxicol.

| (38) | Gibson, D. P., Brauninger, R., Shaffi, H. S., Kerckaert, G. A., LeBoeuf, R. A., Isfort, R. J. ja Aardema, M. J. (1997). Induction of micronuclei in Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation assay for National Toxicology Program test chemicals. Mutation Res. 392, s. 61–70. |
| --- | --- |

(38)

Gibson, D. P., Brauninger, R., Shaffi, H. S., Kerckaert, G. A., LeBoeuf, R. A., Isfort, R. J. ja Aardema, M. J. (1997). Induction of micronuclei in Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation assay for National Toxicology Program test chemicals. Mutation Res. 392, s. 61–70.

Mutation Res.

| (39) | Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. ja Myhr, B. C. (1991). International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res. 257, s. 147–205. |
| --- | --- |

(39)

Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. ja Myhr, B. C. (1991). International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res. 257, s. 147–205.

Mutation Res.

| (40) | Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. ja Okumura, K. (1992). Clastogenicity of low pH to various cultured mammalian cells. Mutation Res. 268, s. 297–305. |
| --- | --- |

(40)

Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. ja Okumura, K. (1992). Clastogenicity of low pH to various cultured mammalian cells. Mutation Res. 268, s. 297–305.

Mutation Res.

| (41) | Brusick, D. (1986). Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations. Environ. Mutagen. 8, s. 789–886. |
| --- | --- |

(41)

Brusick, D. (1986). Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations. Environ. Mutagen. 8, s. 789–886.

Environ. Mutagen

| (42) | Fenech, M. ja Morley, A. A. (1985). Measurement of micronuclei in lymphocytes. Mutation Res. 147, s. 29–36. |
| --- | --- |

(42)

Fenech, M. ja Morley, A. A. (1985). Measurement of micronuclei in lymphocytes. Mutation Res. 147, s. 29–36.

Mutation Res.

| (43) | Fenech, M. (1997). The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood micronucleus method. Mutation Res. 392, s. 11–18. |
| --- | --- |

(43)

Fenech, M. (1997). The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood micronucleus method. Mutation Res. 392, s. 11–18.

Mutation Res.

| (44) | Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y. P., Ceppi, M., Chang, W. P., Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M. P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L. R., Fucic, A., Lima, O. G., Hrelia, P., Krishnaja, A. P., Lee, T. K., Migliore, L., Mikhalevich, L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W. U., Odagiri, Y., Scarffi, M. R., Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. ja Zijno, A. (2001). HUman MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of micronuclei. Environ. Mol. Mutagen. 37, s. 31–45. |
| --- | --- |

(44)

Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y. P., Ceppi, M., Chang, W. P., Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M. P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L. R., Fucic, A., Lima, O. G., Hrelia, P., Krishnaja, A. P., Lee, T. K., Migliore, L., Mikhalevich, L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W. U., Odagiri, Y., Scarffi, M. R., Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. ja Zijno, A. (2001). HUman MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of micronuclei. Environ. Mol. Mutagen. 37, s. 31–45.

Environ. Mol. Mutagen.

| (45) | Maron, D. M. ja Ames, B. N. (1983). Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutation Res. 113, s. 173–215. |
| --- | --- |

(45)

Maron, D. M. ja Ames, B. N. (1983). Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutation Res. 113, s. 173–215.

Mutation Res.

| (46) | Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C. R. ja Zeiger, E. (1980). Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver. J. Environ. Pathol. Toxicol. 4, s. 55–65. |
| --- | --- |

(46)

Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C. R. ja Zeiger, E. (1980). Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver. J. Environ. Pathol. Toxicol. 4, s. 55–65.

J. Environ. Pathol. Toxicol.

| (47) | Elliott, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. ja Wolf, R. C. (1992). Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in-vitro genotoxicity assays. Mutagenesis 7, s. 175–177. |
| --- | --- |

(47)

Elliott, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. ja Wolf, R. C. (1992). Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in-vitro genotoxicity assays. Mutagenesis 7, s. 175–177.

in-vitro

Mutagenesis

| (48) | Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. ja Sugimura, T. (1976). A safe substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, teoksessa: de Serres, F. J., Fouts, J. R., Bend, J. R. ja Philpot, R. M. (ed.), In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, s. 85–88. |
| --- | --- |

(48)

Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. ja Sugimura, T. (1976). A safe substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, teoksessa: de Serres, F. J., Fouts, J. R., Bend, J. R. ja Philpot, R. M. (ed.), In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, s. 85–88.

teoksessa:

In Vitro

| (49) | Johnson, T. E., Umbenhauer, D. R. ja Galloway, S. M. (1996). Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9. Environ. Mol. Mutagen. 28, s. 51–59. |
| --- | --- |

(49)

Johnson, T. E., Umbenhauer, D. R. ja Galloway, S. M. (1996). Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9. Environ. Mol. Mutagen. 28, s. 51–59.

Environ. Mol. Mutagen.

| (50) | UNEP (2001). Pysyviä orgaanisia yhdisteitä koskeva Tukholman yleissopimus. Yhdistyneiden kansakuntien ympäristöohjelma (UNEP). Saatavilla osoitteessa http://www.pops.int/ |
| --- | --- |

(50)

UNEP (2001). Pysyviä orgaanisia yhdisteitä koskeva Tukholman yleissopimus. Yhdistyneiden kansakuntien ympäristöohjelma (UNEP). Saatavilla osoitteessa http://www.pops.int/

| (51) | Doherty, A. T., Ellard, S., Parry, E. M. ja Parry, J. M. (1996). An investigation into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to genotoxins in metabolically competent human cells. Mutagenesis 11, s. 247–274. |
| --- | --- |

(51)

Doherty, A. T., Ellard, S., Parry, E. M. ja Parry, J. M. (1996). An investigation into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to genotoxins in metabolically competent human cells. Mutagenesis 11, s. 247–274.

Mutagenesis

| (52) | Krahn, D. F., Barsky, F. C. ja McCooey, K. T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, teoksessa: Tice, R. R., Costa, D. L. ja Schaich, K. M. (ed.), Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, s. 91–103. |
| --- | --- |

(52)

Krahn, D. F., Barsky, F. C. ja McCooey, K. T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, teoksessa: Tice, R. R., Costa, D. L. ja Schaich, K. M. (ed.), Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, s. 91–103.

teoksessa:

| (53) | Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. ja Brooks, A. L. (1983). Evaluation of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay. Environ. Mutagenesis 5, s. 795–801. |
| --- | --- |

(53)

Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. ja Brooks, A. L. (1983). Evaluation of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay. Environ. Mutagenesis 5, s. 795–801.

Environ. Mutagenesis

| (54) | Fenech, M. (1993). The cytokinesis-block micronucleus technique: a detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations. Mutation Res. 285, s. 35–44. |
| --- | --- |

(54)

Fenech, M. (1993). The cytokinesis-block micronucleus technique: a detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations. Mutation Res. 285, s. 35–44.

Mutation Res.

| (55) | Phelps, J. B., Garriott, M. L. ja Hoffman, W. P. (2002). A protocol for the in vitro micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity. Mutation Res. 521, s. 103–112. |
| --- | --- |

(55)

Phelps, J. B., Garriott, M. L. ja Hoffman, W. P. (2002). A protocol for the in vitro micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity. Mutation Res. 521, s. 103–112.

in vitro

Mutation Res.

| (56) | Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., Surralles, J., Vanhauwaert, A. ja Wakata, A. (2004). Corrigendum to ’Report from the in vitro micronucleus assay working group’. Mutation Res. 564, s. 97–100. |
| --- | --- |

(56)

Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., Surralles, J., Vanhauwaert, A. ja Wakata, A. (2004). Corrigendum to ’Report from the in vitro micronucleus assay working group’. Mutation Res. 564, s. 97–100.

in vitro

Mutation Res.

| (57) | Pincu, M., Bass, D. ja Norman, A. (1984). An improved micronuclear assay in lymphocytes. Mutation Res. 139, s. 61–65. |
| --- | --- |

(57)

Pincu, M., Bass, D. ja Norman, A. (1984). An improved micronuclear assay in lymphocytes. Mutation Res. 139, s. 61–65.

Mutation Res.

| (58) | Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. ja Kirkland, D. (2008). Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects. Mutation Res. 655, s. 1–3. |
| --- | --- |

(58)

Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. ja Kirkland, D. (2008). Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects. Mutation Res. 655, s. 1–3.

in vitro

Mutation Res.

| (59) | Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. ja Marcos, R. (1995). Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures. Mutation Res. 341, s. 169–184. |
| --- | --- |

(59)

Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. ja Marcos, R. (1995). Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures. Mutation Res. 341, s. 169–184.

Mutation Res.

| (60) | Galloway, S. (2000). Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay. Environ. Molec. Mutagenesis 35, s. 191–201. |
| --- | --- |

(60)

Galloway, S. (2000). Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay. Environ. Molec. Mutagenesis 35, s. 191–201.

in vitro

Mutagenesis

| (61) | Hayashi, M., Sofuni, T. ja Ishidate, M. Jr. (1983). An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test. Mutation Res. 120, s. 241–247. |
| --- | --- |

(61)

Hayashi, M., Sofuni, T. ja Ishidate, M. Jr. (1983). An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test. Mutation Res. 120, s. 241–247.

Mutation Res.

| (62) | MacGregor, J. T., Wehr, C. M. ja Langlois, R. G. (1983). A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Res. 120, s. 269–275. |
| --- | --- |

(62)

MacGregor, J. T., Wehr, C. M. ja Langlois, R. G. (1983). A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Res. 120, s. 269–275.

Mutation Res.

| (63) | Hayashi, M., Sofuni, T. ja Ishidate, M. Jr. (1983). An application of acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test. Mutation Res. 120, s. 241–247. |
| --- | --- |

(63)

Hayashi, M., Sofuni, T. ja Ishidate, M. Jr. (1983). An application of acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test. Mutation Res. 120, s. 241–247.

Mutation Res.

| (64) | Fenech, M., Chang, W. P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. ja Zeiger, E. (2003). HUMN project: detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures. Mutation Res. 534, s. 65–75. |
| --- | --- |

(64)

Fenech, M., Chang, W. P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. ja Zeiger, E. (2003). HUMN project: detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures. Mutation Res. 534, s. 65–75.

Mutation Res.

| (65) | Hoffman, W. P., Garriott, M. L. ja Lee, C. (2003). In vitro micronucleus test, teoksessa: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, 2. painos. S. Chow (toim.), Marcel Dekker, Inc. New York, NY, s. 463–467. |
| --- | --- |

(65)

Hoffman, W. P., Garriott, M. L. ja Lee, C. (2003). In vitro micronucleus test, teoksessa: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, 2. painos. S. Chow (toim.), Marcel Dekker, Inc. New York, NY, s. 463–467.

In vitro

teoksessa:

| (66) | Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus (EY) N:o 850/2004, annettu 29 päivänä huhtikuuta 2004, pysyvistä orgaanisista yhdisteistä sekä direktiivin 79/117/ETY muuttamisesta. EUVL L 229, 30.4.2004, s. 5. |
| --- | --- |

(66)

Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus (EY) N:o 850/2004, annettu 29 päivänä huhtikuuta 2004, pysyvistä orgaanisista yhdisteistä sekä direktiivin 79/117/ETY muuttamisesta. EUVL L 229, 30.4.2004, s. 5.

Lisäys 1

Määritelmät

Aneugeeni: aine tai prosessi, joka vuorovaikutuksessa solun mitoottisen ja meioottisen jakautumissyklin vaiheiden kanssa johtaa solujen tai organismien aneuploidiaan.

Aneuploidia: yksittäisen tai useamman kuin yhden kromosomin mutta ei kuitenkaan koko kromosomiston (polyploidia) poikkeaminen kromosomien tavallisesta diploidisesta (tai haploidisesta) määrästä.

Apoptoosi: ohjelmoitunut solukuolema, jossa tietyt vaiheet johtavat solujen hajoamiseen solukalvon ympäröimiksi rakkuloiksi, jotka myöhemmin häviävät fagosytoosin tai puhkeamisen seurauksena.

Solujen proliferaatio: solujen määrän kasvaminen solujen mitoottisen jakautumisen seurauksena.

Sentromeeri: kromosomin DNA:n alue, jossa kromatidit liittyvät yhteen ja johon molemmat kinetokorit kiinnittyvät rinnakkain.

Klastogeeni: aine tai prosessi, joka aiheuttaa rakenteellisia kromosomipoikkeavuuksia solu- tai organismipopulaatioissa.

Sytokineesi: solun jakautuminen välittömästi mitoosin jälkeen, jolloin muodostuu kaksi yksitumaista tytärsolua.

Sytokineesin eston proliferaatioindeksi: toisen jakautumisvaiheen solujen osuus käsitellyssä populaatiossa käsittelemättömään kontrollipopulaatioon verrattuna (katso kaava lisäyksessä 2).

Sytostaasi: solujen kasvun estäminen (katso kaava lisäyksessä 2).

Sytotoksisuus: solurakenteeseen kohdistuvat haitalliset vaikutukset tai toiminta, joka johtaa solukuolemaan.

Genotoksinen: yleinen nimitys kaikentyyppisille DNA- tai kromosomivaurioille, muun muassa katkeamiselle, adduktien uudelleenjärjestäytymiselle, mutaatioille, kromosomipoikkeavuuksille ja aneuploidialle. Kaikki genotoksiset vaikutukset eivät johda mutaatioihin tai pysyviin kromosomivaurioihin.

Interfaasisolut: solut, jotka eivät ole mitoosivaiheessa.

Kinetokori: proteiinia sisältävä rakenne, joka rakentuu kromosomin sentromeerin kohdalle, johon tumasukkulat kiinnittyvät solun jakautumisen aikana ja jonka ansiosta tytärkromosomit voivat liikkua kohti tytärsolujen napoja.

Mikrotumat: pienet tumat, jotka eivät ole solujen varsinaisia tumia vaan esiintyvät niiden lisäksi ja jotka muodostuvat hitaasti liikkuvista kromosomifragmenteista tai kokonaisista kromosomeista mitoosin tai meioosin telofaasin aikana.

Mitoosi: solutuman jakautuminen, joka jaotellaan yleensä profaasiin, prometafaasiin, metafaasiin, anafaasiin ja telofaasiin.

Mitoosi-indeksi: suhdeluku, joka saadaan jakamalla metafaasissa olevien solujen määrä solupopulaatiossa todettujen solujen kokonaismäärällä; ilmoittaa solujen proliferaatioasteen kyseisessä solupopulaatiossa.

Mutageeninen: aiheuttaa periytyvän muutoksen geenien DNA:n emäsparirakenteessa tai kromosomirakenteessa (kromosomipoikkeavuudet).

Nondisjunktio: häiriö, jossa kromatidiparit eivät erkaannu toisistaan ja jakaudu oikein kehittyviin tytärsoluihin, minkä takia tytärsolujen kromosomimäärä poikkeaa tavallisesta.

Polyploidia: solujen tai organismien kromosomien lukumäärää koskeva poikkeavuus, joka koskee yksittäisen kromosomin tai kromosomien (aneuploidia) sijaan koko kromosomistoa.

Proliferaatioindeksi (PI): sytotoksisuuden mittausmenetelmä, kun sytoB:tä ei käytetä (katso kaava lisäyksessä 2).

Solumäärän suhteellinen lisääntyminen: sytotoksisuuden mittausmenetelmä, kun sytoB:tä ei käytetä (katso kaava lisäyksessä 2).

Populaation suhteellinen kaksinkertaistuminen: sytotoksisuuden mittausmenetelmä, kun sytoB:tä ei käytetä (katso kaava lisäyksessä 2).

Replikaatioindeksi (RI): altistus- ja palautumisjakson aikana päättyneiden solunjakautumissyklien osuus käsitellyssä viljelmässä verrattuna käsittelemättömään kontrolliviljelmään (katso kaava lisäyksessä 2).

Testikemikaali (testiaine): aine tai seos, jota testataan tällä testimenetelmällä.

Lisäys 2

Kaavat sytotoksisuuden määritystä varten

| 1. | Kun sytoB:tä käytetään, sytotoksisuuden arvioinnin on perustuttava sytokineesin eston proliferaatioindeksiin (SEPI) tai replikaatioindeksiin (RI) (16) (58). Sytokineesin eston proliferaatioindeksi ilmaisee solusyklien keskimääräistä määrää solua kohti sytoB:lle altistamisen aikana, ja sitä voidaan käyttää solujen proliferaation laskemiseen. RI ilmaisee tumien suhteellista määrää käsitellyissä viljelmissä verrattuna kontrolliviljelmiin, ja sitä voidaan käyttää sytostaasiasteen (sytostaasi-%) laskemiseen seuraavasti:
  sytostaasi-% = 100 – 100{(SEPIT – 1) ÷ (SEPIC – 1)}
  ja:







  T | = | testikemikaalilla käsitelty viljelmä |
| --- | --- | --- | --- |
| C | = | kantaja-ainekontrolliviljelmä |

1.

Kun sytoB:tä käytetään, sytotoksisuuden arvioinnin on perustuttava sytokineesin eston proliferaatioindeksiin (SEPI) tai replikaatioindeksiin (RI) (16) (58). Sytokineesin eston proliferaatioindeksi ilmaisee solusyklien keskimääräistä määrää solua kohti sytoB:lle altistamisen aikana, ja sitä voidaan käyttää solujen proliferaation laskemiseen. RI ilmaisee tumien suhteellista määrää käsitellyissä viljelmissä verrattuna kontrolliviljelmiin, ja sitä voidaan käyttää sytostaasiasteen (sytostaasi-%) laskemiseen seuraavasti:

sytostaasi-% = 100 – 100{(SEPIT – 1) ÷ (SEPIC – 1)}

ja:

T

=

testikemikaalilla käsitelty viljelmä

C

=

kantaja-ainekontrolliviljelmä

jossa:

Formula

Näin ollen, jos SEPI = 1 (kaikki solut ovat yksitumaisia), sytostaasi on 100 %.

Sytostaasi = 100 – RI

Formula

| T | = | käsitellyt viljelmät |
| --- | --- | --- |
| C | = | kontrolliviljelmät |

T

=

käsitellyt viljelmät

C

=

kontrolliviljelmät

| 2. | Näin ollen, jos RI = 53 %, kontrolliviljelmässä kaksitumaisiksi ja monitumaisiksi soluiksi jakaantuneiden solujen määrään verrattuna vain 53 % soluista jakaantui käsitellyssä viljelmässä, eli sytostaasi on 47 %. |
| --- | --- |

2.

Näin ollen, jos RI = 53 %, kontrolliviljelmässä kaksitumaisiksi ja monitumaisiksi soluiksi jakaantuneiden solujen määrään verrattuna vain 53 % soluista jakaantui käsitellyssä viljelmässä, eli sytostaasi on 47 %.

| 3. | Kun sytoB:tä ei käytetä, sytotoksisuus on arvioitava solumäärän suhteellisen lisääntymisen (SMSL) tai populaation suhteellisen kaksinkertaistumisen (PSK) perusteella (58), koska molemmissa otetaan huomioon jakaantuneen solupopulaation osuus.






  jossa:
  populaation kaksinkertaistuminen = [log (solumäärä käsittelyn jälkeen ÷ alkuperäinen solumäärä)] ÷ log 2 |
| --- | --- |

3.

Kun sytoB:tä ei käytetä, sytotoksisuus on arvioitava solumäärän suhteellisen lisääntymisen (SMSL) tai populaation suhteellisen kaksinkertaistumisen (PSK) perusteella (58), koska molemmissa otetaan huomioon jakaantuneen solupopulaation osuus.

Formula

Formula

jossa:

populaation kaksinkertaistuminen = [log (solumäärä käsittelyn jälkeen ÷ alkuperäinen solumäärä)] ÷ log 2

| 4. | Näin ollen, jos SMSL tai PSK = 53 %, sytotoksisuus/sytostaasi = 47 %. |
| --- | --- |

4.

Näin ollen, jos SMSL tai PSK = 53 %, sytotoksisuus/sytostaasi = 47 %.

| 5. | Sytotoksisuutta voidaan arvioida proliferaatioindeksin (PI) avulla laskemalla 1 solusta (kl1), 2 solusta (kl2), 3 tai 4 solusta (kl4) ja 5–8 solusta (kl8) muodostuneiden kloonien määrä seuraavasti |
| --- | --- |

5.

Sytotoksisuutta voidaan arvioida proliferaatioindeksin (PI) avulla laskemalla 1 solusta (kl1), 2 solusta (kl2), 3 tai 4 solusta (kl4) ja 5–8 solusta (kl8) muodostuneiden kloonien määrä seuraavasti

Formula

| 6. | Proliferaatioindeksiä on käytetty sytotoksisuuden tärkeänä ja luotettavana parametrina myös ilman sytoB:tä in situ viljellyille solulinjoille (25) (26) (27) (28). |
| --- | --- |

6.

Proliferaatioindeksiä on käytetty sytotoksisuuden tärkeänä ja luotettavana parametrina myös ilman sytoB:tä in situ viljellyille solulinjoille (25) (26) (27) (28).

Lisäys 3

Suorituskyvyn arviointiin suositeltavat vertailukemikaalit
   (16)

| Luokka | Kemikaali | CAS-numero | EC-numero |
| --- | --- | --- | --- |
| 1.   Klastogeenit, jotka ovat aktiivisia ilman metabolista aktivaatiota |
| | Sytosiiniarabinosidi | 147-94-4 | 205-705-9 |
| | Mitomysiini C | 50-07-7 | 200-008-6 |
| 2.   Klastogeenit, jotka edellyttävät metabolista aktivaatiota |
| | Bentso(a)pyreeni | 50-32-8 | 200-028-5 |
| | Syklofosfamidi | 50-18-0 | 200-015-4 |
| 3.   Aneugeenit |
| | Kolkisiini | 64-86-8 | 200-598-5 |
| | Vinblastiini | 143-67-9 | 205-606-0 |
| 4.   Negatiiviset aineet |
| | Di(2-etyyliheksyyli)ftalaatti | 117-81-7 | 204-211-0 |
| | Nalidiksiinihappo | 389-08-2 | 206-864-7 |
| | Pyreeni | 129-00-0 | 204-927-3 |
| | Natriumkloridi | 7647-14-5 | 231-598-3 |

Luokka

Kemikaali

CAS-numero

EC-numero

Klastogeenit, jotka ovat aktiivisia ilman metabolista aktivaatiota

Sytosiiniarabinosidi

147-94-4

205-705-9

Mitomysiini C

50-07-7

200-008-6

Klastogeenit, jotka edellyttävät metabolista aktivaatiota

Bentso(a)pyreeni

50-32-8

200-028-5

Syklofosfamidi

50-18-0

200-015-4

Aneugeenit

Kolkisiini

64-86-8

200-598-5

Vinblastiini

143-67-9

205-606-0

Negatiiviset aineet

Di(2-etyyliheksyyli)ftalaatti

117-81-7

204-211-0

Nalidiksiinihappo

389-08-2

206-864-7

Pyreeni

129-00-0

204-927-3

Natriumkloridi

7647-14-5

231-598-3

B.50.   IHOHERKISTYS: PAIKALLINEN IMUSOLMUKEMÄÄRITYSMENETELMÄ: DA

B.50.

IHOHERKISTYS: PAIKALLINEN IMUSOLMUKEMÄÄRITYSMENETELMÄ: DA

JOHDANTO

| 1. | Kemikaalien testausta koskevia OECD:n suuntaviivoja ja EU:n testimenetelmiä tarkistetaan säännöllisesti tieteellisen kehityksen, muuttuvien sääntelytarpeiden ja eläinten hyvinvointiin liittyvien kysymysten perusteella. Ensimmäinen, hiiren ihoherkistyksen määrittämisessä käytettävä testimenetelmä (B.42) eli paikallinen imusolmukemääritysmenetelmä (Local Lymph Node Assay, LLNA; OECD:n testiohje 429) on tarkistettu (1). LLNA-menetelmän validointia koskevat yksityiskohtaiset tiedot ja siihen liittyvän työn arviointi on julkaistu (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) LLNA-menetelmässä lymfosyyttien proliferaatio määritetään radioisotoopilla leimatun tymidiinin tai jodin avulla. Siksi määritysmenetelmän käyttö on rajattua paikoissa, joissa radioaktiivisten aineiden hankkiminen, käyttö tai hävittäminen on ongelmallista. LLNA: DA -menetelmä (jonka on kehittänyt Daicel Chemical Industries, Ltd) on LLNA-menetelmän mukautus, jossa ei käytetä radioaktiivisia merkkiaineita, vaan jossa lymfosyyttien proliferaatio määritetään bioluminesenssin avulla määritettävän adenosiinitrifosfaattipitoisuuden (ATP-pitoisuuden) avulla. Kansainvälinen vertaisarviointityöryhmä on arvioinut LLNA: DA -testimenetelmän, validoinut sen ja katsonut, että sillä voidaan määrittää ihoa herkistäviä ja muunlaisia kemikaaleja tietyin rajoituksin (10) (11) (12) (13). Tässä selostettu testimenetelmä on suunniteltu kemikaalien (aineiden ja seosten) ihoherkistyspotentiaalin arvioimiseen eläimillä. Tämän liitteen B.6 luvussa ja OECD:n testiohjeessa 406 käytetään marsutestejä, erityisesti marsuilla tehtävää maksimointitestiä ja Bühlerin testiä (14). Käytettäessä LLNA-menetelmää (tämän liitteen B.42 luku; OECD:n testiohje 429) ja sen kahta muuhun kuin radioaktiivisuuteen perustuvaa muunnosta eli LLNA: DA -menetelmää (tämän liitteen B.50 luku; OECD:n testiohje 442 A) ja LLNA: BrdU-ELISA -menetelmää (tämän liitteen B.51 luku; OECD:n testiohje 442 B) voidaan testeihin käytettävien eläinten määrää vähentää. Näin ollen ne ovat eläinten käytön osalta edistyneempiä B.6 luvussa ja OECD:n testiohjeessa 406 (14) tarkoitettuihin marsutesteihin verrattuna. |
| --- | --- |

1.

Kemikaalien testausta koskevia OECD:n suuntaviivoja ja EU:n testimenetelmiä tarkistetaan säännöllisesti tieteellisen kehityksen, muuttuvien sääntelytarpeiden ja eläinten hyvinvointiin liittyvien kysymysten perusteella. Ensimmäinen, hiiren ihoherkistyksen määrittämisessä käytettävä testimenetelmä (B.42) eli paikallinen imusolmukemääritysmenetelmä (Local Lymph Node Assay, LLNA; OECD:n testiohje 429) on tarkistettu (1). LLNA-menetelmän validointia koskevat yksityiskohtaiset tiedot ja siihen liittyvän työn arviointi on julkaistu (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) LLNA-menetelmässä lymfosyyttien proliferaatio määritetään radioisotoopilla leimatun tymidiinin tai jodin avulla. Siksi määritysmenetelmän käyttö on rajattua paikoissa, joissa radioaktiivisten aineiden hankkiminen, käyttö tai hävittäminen on ongelmallista. LLNA: DA -menetelmä (jonka on kehittänyt Daicel Chemical Industries, Ltd) on LLNA-menetelmän mukautus, jossa ei käytetä radioaktiivisia merkkiaineita, vaan jossa lymfosyyttien proliferaatio määritetään bioluminesenssin avulla määritettävän adenosiinitrifosfaattipitoisuuden (ATP-pitoisuuden) avulla. Kansainvälinen vertaisarviointityöryhmä on arvioinut LLNA: DA -testimenetelmän, validoinut sen ja katsonut, että sillä voidaan määrittää ihoa herkistäviä ja muunlaisia kemikaaleja tietyin rajoituksin (10) (11) (12) (13). Tässä selostettu testimenetelmä on suunniteltu kemikaalien (aineiden ja seosten) ihoherkistyspotentiaalin arvioimiseen eläimillä. Tämän liitteen B.6 luvussa ja OECD:n testiohjeessa 406 käytetään marsutestejä, erityisesti marsuilla tehtävää maksimointitestiä ja Bühlerin testiä (14). Käytettäessä LLNA-menetelmää (tämän liitteen B.42 luku; OECD:n testiohje 429) ja sen kahta muuhun kuin radioaktiivisuuteen perustuvaa muunnosta eli LLNA: DA -menetelmää (tämän liitteen B.50 luku; OECD:n testiohje 442 A) ja LLNA: BrdU-ELISA -menetelmää (tämän liitteen B.51 luku; OECD:n testiohje 442 B) voidaan testeihin käytettävien eläinten määrää vähentää. Näin ollen ne ovat eläinten käytön osalta edistyneempiä B.6 luvussa ja OECD:n testiohjeessa 406 (14) tarkoitettuihin marsutesteihin verrattuna.

| 2. | Kuten LLNA-menetelmässä, myös LLNA: DA -menetelmässä tutkitaan ihoherkistyksen induktiovaihetta ja tuotetaan annosvasteen arviointiin sopivia kvantitatiivisia tuloksia. Koska ihoa herkistäviä aineita voidaan tunnistaa ilman radioaktiivista DNA-merkkiainetta, työssä ei altistuta radioaktiivisuudelle, eikä jätteiden hävittäminen aiheuta ongelmia. Tämä voi johtaa hiirten entistä yleisempään käyttöön ihoa herkistävien aineiden tunnistamisessa, millä puolestaan vähennetään entisestään marsujen käyttämistä ihoherkistyspotentiaalin testauksessa (B.6 menetelmä; OECD:n testiohje 406) 0. |
| --- | --- |

2.

Kuten LLNA-menetelmässä, myös LLNA: DA -menetelmässä tutkitaan ihoherkistyksen induktiovaihetta ja tuotetaan annosvasteen arviointiin sopivia kvantitatiivisia tuloksia. Koska ihoa herkistäviä aineita voidaan tunnistaa ilman radioaktiivista DNA-merkkiainetta, työssä ei altistuta radioaktiivisuudelle, eikä jätteiden hävittäminen aiheuta ongelmia. Tämä voi johtaa hiirten entistä yleisempään käyttöön ihoa herkistävien aineiden tunnistamisessa, millä puolestaan vähennetään entisestään marsujen käyttämistä ihoherkistyspotentiaalin testauksessa (B.6 menetelmä; OECD:n testiohje 406) 0.

MÄÄRITELMÄT

| 3. | Sovellettavat määritelmät esitetään lisäyksessä 1. |
| --- | --- |

3.

Sovellettavat määritelmät esitetään lisäyksessä 1.

JOHDANTO JA RAJOITUKSET

| 4. | LLNA: DA -menetelmä on LLNA-menetelmän muunnos, jolla voidaan tunnistaa mahdollisia ihoa herkistäviä kemikaaleja tietyin rajoituksin. Tämä ei välttämättä merkitse sitä, että LLNA: DA -menetelmää pitäisi käyttää kaikissa tapauksissa LLNA-menetelmän tai marsutestin asemesta (B.6 menetelmä; OECD:n testiohje 406) (14), vaan pikemminkin sitä, että määritysmenetelmä on yhtä hyvä ja sitä voidaan käyttää vaihtoehtona, jossa positiivisia ja negatiivisia tuloksia ei yleensä enää tarvitse varmistaa uudelleen (10) (11). Testilaboratorion on otettava huomioon kaikki testiaineesta saatavilla olevat tiedot ennen tutkimuksen tekemistä. Tällaisia tietoja ovat muun muassa testiaineen tunnistetiedot ja kemiallinen rakenne, sen fysikaaliskemialliset ominaisuudet, muiden testiaineella tehtyjen in vitro- tai in vivo -myrkyllisyystestien tulokset sekä rakenteellisesti samankaltaisia kemikaaleja koskevat toksikologiset tiedot. Tietojen perusteella on määritettävä, voidaanko LLNA: DA -menetelmää käyttää kyseisen aineen testaamiseen (ottaen huomioon, että LLNA: DA -menetelmä ei sovellu tiettyjen kemikaalityyppien testaamiseen (katso 5 kohta)) ja mitä annosta on käytettävä. |
| --- | --- |

4.

LLNA: DA -menetelmä on LLNA-menetelmän muunnos, jolla voidaan tunnistaa mahdollisia ihoa herkistäviä kemikaaleja tietyin rajoituksin. Tämä ei välttämättä merkitse sitä, että LLNA: DA -menetelmää pitäisi käyttää kaikissa tapauksissa LLNA-menetelmän tai marsutestin asemesta (B.6 menetelmä; OECD:n testiohje 406) (14), vaan pikemminkin sitä, että määritysmenetelmä on yhtä hyvä ja sitä voidaan käyttää vaihtoehtona, jossa positiivisia ja negatiivisia tuloksia ei yleensä enää tarvitse varmistaa uudelleen (10) (11). Testilaboratorion on otettava huomioon kaikki testiaineesta saatavilla olevat tiedot ennen tutkimuksen tekemistä. Tällaisia tietoja ovat muun muassa testiaineen tunnistetiedot ja kemiallinen rakenne, sen fysikaaliskemialliset ominaisuudet, muiden testiaineella tehtyjen in vitro- tai in vivo -myrkyllisyystestien tulokset sekä rakenteellisesti samankaltaisia kemikaaleja koskevat toksikologiset tiedot. Tietojen perusteella on määritettävä, voidaanko LLNA: DA -menetelmää käyttää kyseisen aineen testaamiseen (ottaen huomioon, että LLNA: DA -menetelmä ei sovellu tiettyjen kemikaalityyppien testaamiseen (katso 5 kohta)) ja mitä annosta on käytettävä.

in vitro

in vivo

| 5. | LLNA: DA on in vivo -menetelmä, joten sillä ei lopeteta koe-eläinten käyttöä kosketusherkistyksen arvioinnissa. Sillä voidaan kuitenkin vähentää tähän tarkoitukseen käytettävien eläinten määrää marsutesteihin verrattuna (B.6 menetelmä; OECD:n testiohje 406) (14). LLNA: DA -menetelmässä käytetty tapa testata kosketusherkistystä eläimillä on myös huomattavasti edistyneempi (vähemmän kipua ja kärsimystä), koska toisin kuin B.6 menetelmässä ja OECD:n testiohjeessa 406, LLNA: DA -menetelmässä ei edellytetä tarkoituksellista ihon yliherkkyysreaktioiden tuottamista. Vaikka LLNA: DA -menetelmä onkin tietyllä tasolla edistyneempi kuin B.6 menetelmä tai OECD:n testiohje 406 (14), siihen liittyy tiettyjä rajoituksia, joiden vuoksi voi olla tarpeen käyttää B.6 menetelmää tai OECD:n testiohjetta 406 (esimerkiksi tiettyjen metallien testaus, väärät positiiviset löydökset joidenkin ihoa ärsyttävien aineiden, esimerkiksi pinta-aktiivisten aineiden osalta (6) (1 ja tämän liitteen B.42 luku) tai testiaineen liukoisuus). Määritystä häiritseviä (16) funktionaalisia ryhmiä sisältävien kemikaaliluokkien tai aineiden yhteydessä voi olla tarpeen käyttää marsutestejä (B.6 menetelmä; OECD:n testiohje 406 (14)). Suositellaan, että LLNA-menetelmälle asetettuja rajoituksia (1 ja tämän liitteen B.42 luku) sovelletaan myös LLNA: DA -menetelmään (10). LLNA: DA -menetelmä ei välttämättä sovellu ATP-pitoisuuksiin vaikuttavien, esimerkiksi ATP-inhibiittoreina toimivien aineiden tai sellaisten aineiden testaukseen, jotka vaikuttavat solun sisäisen ATP:n täsmälliseen määrittämiseen (esimerkiksi ATP:tä hajottavat entsyymit, solun ulkopuolinen ATP imusolmukkeessa). Tällaisia tunnettuja rajoituksia lukuun ottamatta aineet on testattava LLNA: DA -menetelmällä, elleivät kyseisten aineiden ominaisuudet vaikuta LLNA: DA -menetelmän tarkkuuteen. Myös positiivisten rajatulosten mahdollisuus on otettava huomioon, kun saadaan stimulaatioindeksiksi (SI) välillä 1,8–2,5 (katso 31–32 kohta). Tämä perustuu 44 aineen validointitietokantaan, jossa aineiden SI ≥ 1,8 (katso 6 kohta) ja jossa LLNA: DA -menetelmällä on tunnistettu oikein kaikki 32 herkistystä aiheuttavaa LLNA-ainetta mutta tunnistettu väärin kolme niistä 12 muusta kuin herkistystä aiheuttavasta LLNA-aineesta, joiden SI-arvo on 1,8–2,5 (positiivinen rajatulos) (10). Koska samaa tulosjoukkoa on käytetty SI-arvojen määrittämiseen ja testin ennakoivien ominaisuuksien laskemiseen, esitetyissä tuloksissa voidaan yliarvioida todellisia ennakoivia ominaisuuksia. |
| --- | --- |

5.

LLNA: DA on in vivo -menetelmä, joten sillä ei lopeteta koe-eläinten käyttöä kosketusherkistyksen arvioinnissa. Sillä voidaan kuitenkin vähentää tähän tarkoitukseen käytettävien eläinten määrää marsutesteihin verrattuna (B.6 menetelmä; OECD:n testiohje 406) (14). LLNA: DA -menetelmässä käytetty tapa testata kosketusherkistystä eläimillä on myös huomattavasti edistyneempi (vähemmän kipua ja kärsimystä), koska toisin kuin B.6 menetelmässä ja OECD:n testiohjeessa 406, LLNA: DA -menetelmässä ei edellytetä tarkoituksellista ihon yliherkkyysreaktioiden tuottamista. Vaikka LLNA: DA -menetelmä onkin tietyllä tasolla edistyneempi kuin B.6 menetelmä tai OECD:n testiohje 406 (14), siihen liittyy tiettyjä rajoituksia, joiden vuoksi voi olla tarpeen käyttää B.6 menetelmää tai OECD:n testiohjetta 406 (esimerkiksi tiettyjen metallien testaus, väärät positiiviset löydökset joidenkin ihoa ärsyttävien aineiden, esimerkiksi pinta-aktiivisten aineiden osalta (6) (1 ja tämän liitteen B.42 luku) tai testiaineen liukoisuus). Määritystä häiritseviä (16) funktionaalisia ryhmiä sisältävien kemikaaliluokkien tai aineiden yhteydessä voi olla tarpeen käyttää marsutestejä (B.6 menetelmä; OECD:n testiohje 406 (14)). Suositellaan, että LLNA-menetelmälle asetettuja rajoituksia (1 ja tämän liitteen B.42 luku) sovelletaan myös LLNA: DA -menetelmään (10). LLNA: DA -menetelmä ei välttämättä sovellu ATP-pitoisuuksiin vaikuttavien, esimerkiksi ATP-inhibiittoreina toimivien aineiden tai sellaisten aineiden testaukseen, jotka vaikuttavat solun sisäisen ATP:n täsmälliseen määrittämiseen (esimerkiksi ATP:tä hajottavat entsyymit, solun ulkopuolinen ATP imusolmukkeessa). Tällaisia tunnettuja rajoituksia lukuun ottamatta aineet on testattava LLNA: DA -menetelmällä, elleivät kyseisten aineiden ominaisuudet vaikuta LLNA: DA -menetelmän tarkkuuteen. Myös positiivisten rajatulosten mahdollisuus on otettava huomioon, kun saadaan stimulaatioindeksiksi (SI) välillä 1,8–2,5 (katso 31–32 kohta). Tämä perustuu 44 aineen validointitietokantaan, jossa aineiden SI ≥ 1,8 (katso 6 kohta) ja jossa LLNA: DA -menetelmällä on tunnistettu oikein kaikki 32 herkistystä aiheuttavaa LLNA-ainetta mutta tunnistettu väärin kolme niistä 12 muusta kuin herkistystä aiheuttavasta LLNA-aineesta, joiden SI-arvo on 1,8–2,5 (positiivinen rajatulos) (10). Koska samaa tulosjoukkoa on käytetty SI-arvojen määrittämiseen ja testin ennakoivien ominaisuuksien laskemiseen, esitetyissä tuloksissa voidaan yliarvioida todellisia ennakoivia ominaisuuksia.

in vivo

TESTIMENETELMÄN PERIAATE

| 6. | LLNA: DA -menetelmän perusperiaate on, että ihoa herkistävät aineet aiheuttavat lymfosyyttien proliferaatiota imusolmukkeissa, jotka dreneeraavat testiaineen annostelualueen. Tämä proliferaatio on suhteessa käytettyyn annokseen ja allergeenin voimakkuuteen ja tarjoaa yksinkertaisen keinon ihoherkistyksen mittaamiseksi kvantitatiivisella tavalla. Proliferaatio mitataan vertaamalla kussakin testiryhmässä tapahtuvaa keskimääräistä proliferaatiota pelkästään kantaja-aineella käsitellyssä kontrolliryhmässä tapahtuvaan keskimääräiseen proliferaatioon. Kunkin testiryhmän keskimääräisen proliferaation ja sitä vastaavan kontrolliryhmän keskimääräisen proliferaation suhde (SI) määritetään, ja sen on oltava yhtä suuri tai suurempi kuin 1,8, jotta testiaine olisi syytä arvioida tarkemmin mahdollisesti ihoherkistystä aiheuttavaksi. Tässä määritysmenetelmässä kuvatut menettelyt perustuvat ATP-pitoisuuden mittaamiseen bioluminesenssin avulla (sen tiedetään korreloivan elävien solujen määrää) (17), millä määritetään solujen proliferaation lisääntyminen dreneeraavissa korvalehden imusolmukkeissa (18) (19). Bioluminesenssimenetelmässä lusiferaasientsyymi katalysoi valon muodostusta (luminesenssia) ATP:sta ja lusiferiinista. Reaktio tapahtuu seuraavan kaavan mukaisesti:

  ATP + Lusiferiini + O
  2

  Oksilusiferiini + AMP + PPi
  - CO
  2 + Valo







  ATP | ATP |
| --- | --- | --- |
| Luciferin | lusiferiini |
| O2 | O2 |
| Luciferase | lusiferaasi |
| Oxyluciferin | oksilusiferiini |
| AMP | AMP |
| PPi | PPi |
| CO2 | CO2 |
| Light | valo |

6.

LLNA: DA -menetelmän perusperiaate on, että ihoa herkistävät aineet aiheuttavat lymfosyyttien proliferaatiota imusolmukkeissa, jotka dreneeraavat testiaineen annostelualueen. Tämä proliferaatio on suhteessa käytettyyn annokseen ja allergeenin voimakkuuteen ja tarjoaa yksinkertaisen keinon ihoherkistyksen mittaamiseksi kvantitatiivisella tavalla. Proliferaatio mitataan vertaamalla kussakin testiryhmässä tapahtuvaa keskimääräistä proliferaatiota pelkästään kantaja-aineella käsitellyssä kontrolliryhmässä tapahtuvaan keskimääräiseen proliferaatioon. Kunkin testiryhmän keskimääräisen proliferaation ja sitä vastaavan kontrolliryhmän keskimääräisen proliferaation suhde (SI) määritetään, ja sen on oltava yhtä suuri tai suurempi kuin 1,8, jotta testiaine olisi syytä arvioida tarkemmin mahdollisesti ihoherkistystä aiheuttavaksi. Tässä määritysmenetelmässä kuvatut menettelyt perustuvat ATP-pitoisuuden mittaamiseen bioluminesenssin avulla (sen tiedetään korreloivan elävien solujen määrää) (17), millä määritetään solujen proliferaation lisääntyminen dreneeraavissa korvalehden imusolmukkeissa (18) (19). Bioluminesenssimenetelmässä lusiferaasientsyymi katalysoi valon muodostusta (luminesenssia) ATP:sta ja lusiferiinista. Reaktio tapahtuu seuraavan kaavan mukaisesti:

ATP + Lusiferiini + O
  2
  Image
  Oksilusiferiini + AMP + PPi
  - CO
  2 + Valo

ATP

Lusiferiini

O

2

Oksilusiferiini

AMP

PPi

CO

2

Valo

ATP

ATP

Luciferin

lusiferiini

O2

2

O2

2

Luciferase

lusiferaasi

Oxyluciferin

oksilusiferiini

AMP

AMP

PPi

i

PPi

i

CO2

2

CO2

2

Light

valo

Emittoituneen valon valovoima on suoraan verrannollinen ATP-pitoisuuteen, ja se mitataan luminometrillä. Lusiferiini-lusiferaasi-määritysmenetelmä on herkkä ATP-pitoisuuden määritysmenetelmä, jota käytetään erilaisissa käyttökohteissa (20).

MÄÄRITYSMENETELMÄN KUVAUS

Eläinlajin valinta

Eläinlajin valinta

| 7. | Tähän testiin paras eläinlaji on hiiri. LLNA: DA -määritysmenetelmän validointitutkimukset on tehty yksinomaan CBA/J-kannalla, joten sen käyttöä suositellaan (12) (13). Määritysmenetelmässä käytetään nuoria täysikasvuisia naarashiiriä, jotka eivät ole poikineet eivätkä ole tiineenä. Testin alussa eläinten on oltava 8–12 viikon ikäisiä, ja eläinten painoerojen on oltava vähäisiä eli enintään 20 prosenttia keskipainosta. Muita kantoja tai uroseläimiä voidaan käyttää, jos tietoja tuotetaan riittävästi sen osoittamiseksi, että LLNA: DA -vasteessa ei esiinny merkitseviä koe-eläinkantaan tai sukupuoleen liittyviä eroja. |
| --- | --- |

7.

Tähän testiin paras eläinlaji on hiiri. LLNA: DA -määritysmenetelmän validointitutkimukset on tehty yksinomaan CBA/J-kannalla, joten sen käyttöä suositellaan (12) (13). Määritysmenetelmässä käytetään nuoria täysikasvuisia naarashiiriä, jotka eivät ole poikineet eivätkä ole tiineenä. Testin alussa eläinten on oltava 8–12 viikon ikäisiä, ja eläinten painoerojen on oltava vähäisiä eli enintään 20 prosenttia keskipainosta. Muita kantoja tai uroseläimiä voidaan käyttää, jos tietoja tuotetaan riittävästi sen osoittamiseksi, että LLNA: DA -vasteessa ei esiinny merkitseviä koe-eläinkantaan tai sukupuoleen liittyviä eroja.

Koe-eläintilat ja eläinten ruokinta

Koe-eläintilat ja eläinten ruokinta

| 8. | Hiiret on pidettävä yhteishäkeissä (21), ellei hiirien pitämiselle erillisissä häkeissä esitetä riittäviä tieteellisiä perusteluja. Koe-eläintilan lämpötilan on oltava 22 ± 3 celsiusastetta. Vaikka riittää, että suhteellinen kosteus on vähintään 30 prosenttia eikä mielellään ylitä 70:tä prosenttia muulloin kuin huoneen puhdistuksen aikana, pitäisi kuitenkin pyrkiä 50–60 prosentin suhteelliseen kosteuteen. Huoneessa on käytettävä keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa, 12 tuntia pimeää). Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruokavaliota, eikä juomaveden määrää saa rajoittaa. |
| --- | --- |

8.

Hiiret on pidettävä yhteishäkeissä (21), ellei hiirien pitämiselle erillisissä häkeissä esitetä riittäviä tieteellisiä perusteluja. Koe-eläintilan lämpötilan on oltava 22 ± 3 celsiusastetta. Vaikka riittää, että suhteellinen kosteus on vähintään 30 prosenttia eikä mielellään ylitä 70:tä prosenttia muulloin kuin huoneen puhdistuksen aikana, pitäisi kuitenkin pyrkiä 50–60 prosentin suhteelliseen kosteuteen. Huoneessa on käytettävä keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa, 12 tuntia pimeää). Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruokavaliota, eikä juomaveden määrää saa rajoittaa.

Eläinten valmistelu

Eläinten valmistelu

| 9. | Eläimet valitaan satunnaistetusti, merkitään niin, että yksilöt voidaan erottaa toisistaan (ei kuitenkaan korvamerkeillä), ja pidetään häkeissä vähintään viiden päivän ajan ennen testiaineen annostelun aloittamista, jotta ne tottuvat laboratorio-olosuhteisiin. Ennen käsittelyn alkua kaikki eläimet on tutkittava sen varmistamiseksi, ettei niillä ole havaittavia ihovaurioita. |
| --- | --- |

9.

Eläimet valitaan satunnaistetusti, merkitään niin, että yksilöt voidaan erottaa toisistaan (ei kuitenkaan korvamerkeillä), ja pidetään häkeissä vähintään viiden päivän ajan ennen testiaineen annostelun aloittamista, jotta ne tottuvat laboratorio-olosuhteisiin. Ennen käsittelyn alkua kaikki eläimet on tutkittava sen varmistamiseksi, ettei niillä ole havaittavia ihovaurioita.

Annosteluliuosten valmistelu

Annosteluliuosten valmistelu

| 10. | Kiinteät kemikaalit on liuotettava tai sekoitettava liuottimiin tai kantaja-aineisiin ja tarvittaessa laimennettava ennen niiden annostelua hiiren korvaan. Nestemäiset kemikaalit voidaan annostella laimentamattomana, tai ne voidaan laimentaa ennen annostelua. Liukenemattomat kemikaalit, kuten lääkinnällisissä laitteissa yleisesti käytetyt kemikaalit, on uutettava erittäin voimakkaasti asianmukaiseen liuottimeen, jotta saataisiin testausta varten esiin kaikki uuttuvat ainesosat ennen annostelua hiirten korviin. Testiaineet on valmistettava päivittäin, paitsi jos säilyvyys on osoitettu stabiliteettitutkimuksilla. |
| --- | --- |

10.

Kiinteät kemikaalit on liuotettava tai sekoitettava liuottimiin tai kantaja-aineisiin ja tarvittaessa laimennettava ennen niiden annostelua hiiren korvaan. Nestemäiset kemikaalit voidaan annostella laimentamattomana, tai ne voidaan laimentaa ennen annostelua. Liukenemattomat kemikaalit, kuten lääkinnällisissä laitteissa yleisesti käytetyt kemikaalit, on uutettava erittäin voimakkaasti asianmukaiseen liuottimeen, jotta saataisiin testausta varten esiin kaikki uuttuvat ainesosat ennen annostelua hiirten korviin. Testiaineet on valmistettava päivittäin, paitsi jos säilyvyys on osoitettu stabiliteettitutkimuksilla.

Luotettavuuden tarkistus

Luotettavuuden tarkistus

| 11. | Määritysmenetelmän toimivuus osoitetaan positiivisten kontrollikemikaalien avulla. Herkistystesteissä käytettävän aineen vasteena on saatava aikaan riittävä ja toistettavissa oleva herkistyminen. Vasteen on oltava aineelle tyypillinen. Samanaikaisesti on käytettävä positiivista kontrollikemikaalia, koska sillä osoitetaan, että laboratoriolla on riittävä pätevyys kunkin määritysmenetelmän käyttöön. Sen avulla voidaan myös arvioida laboratorioidenvälistä ja laboratorionsisäistä uusittavuutta ja vertailtavuutta. Jotkut sääntelyviranomaiset vaativat positiivisten kontrollikemikaalien käyttämistä kaikissa tutkimuksissa. Käyttäjien olisikin otettava yhteyttä asiasta vastaaviin viranomaisiin ennen LLNA: DA -määritysmenetelmän käyttöönottoa. Tämän takia suositellaan, että positiivista kontrollikemikaalia käytetään aina näytteiden kanssa samanaikaisesti, jotta ei tarvitsisi tehdä uusia eläinkokeita sellaisten vaatimusten täyttämiseksi, jotka aiheutuvat positiivisten kontrollikemikaalien käyttämisestä vain silloin tällöin (katso 12 kohta). Positiivisen kontrollikemikaalin on tuotettava positiivinen LLNA: DA -vaste altistustasolla, jonka odotetaan antavan negatiiviseen kontrolliryhmään verrattuna stimulaatioindeksin, joka on yhtä suuri tai suurempi kuin 1,8. Positiivisen kontrollikemikaalin annospitoisuus on valittava siten, että se ei aiheuta liian voimakasta ihoärsytystä tai koko elimistöön kohdistuvaa toksisuutta ja että induktio on toistettavissa mutta ei liian suuri (esimerkiksi SI > 10 on liian suuri). Suositeltavia positiivisia kontrollikemikaaleja ovat 25-prosenttinen heksyylikanelialdehydi (CAS-numero 101-86-0) ja 25-prosenttinen eugenoli (CAS-numero 97-53-0) asetonin ja oliiviöljyn seoksessa (4:1 v/v). Joissakin olosuhteissa voidaan riittävin perustein käyttää muita positiivisia kontrollikemikaaleja, jotka täyttävät edellä mainitut kriteerit. |
| --- | --- |

11.

Määritysmenetelmän toimivuus osoitetaan positiivisten kontrollikemikaalien avulla. Herkistystesteissä käytettävän aineen vasteena on saatava aikaan riittävä ja toistettavissa oleva herkistyminen. Vasteen on oltava aineelle tyypillinen. Samanaikaisesti on käytettävä positiivista kontrollikemikaalia, koska sillä osoitetaan, että laboratoriolla on riittävä pätevyys kunkin määritysmenetelmän käyttöön. Sen avulla voidaan myös arvioida laboratorioidenvälistä ja laboratorionsisäistä uusittavuutta ja vertailtavuutta. Jotkut sääntelyviranomaiset vaativat positiivisten kontrollikemikaalien käyttämistä kaikissa tutkimuksissa. Käyttäjien olisikin otettava yhteyttä asiasta vastaaviin viranomaisiin ennen LLNA: DA -määritysmenetelmän käyttöönottoa. Tämän takia suositellaan, että positiivista kontrollikemikaalia käytetään aina näytteiden kanssa samanaikaisesti, jotta ei tarvitsisi tehdä uusia eläinkokeita sellaisten vaatimusten täyttämiseksi, jotka aiheutuvat positiivisten kontrollikemikaalien käyttämisestä vain silloin tällöin (katso 12 kohta). Positiivisen kontrollikemikaalin on tuotettava positiivinen LLNA: DA -vaste altistustasolla, jonka odotetaan antavan negatiiviseen kontrolliryhmään verrattuna stimulaatioindeksin, joka on yhtä suuri tai suurempi kuin 1,8. Positiivisen kontrollikemikaalin annospitoisuus on valittava siten, että se ei aiheuta liian voimakasta ihoärsytystä tai koko elimistöön kohdistuvaa toksisuutta ja että induktio on toistettavissa mutta ei liian suuri (esimerkiksi SI > 10 on liian suuri). Suositeltavia positiivisia kontrollikemikaaleja ovat 25-prosenttinen heksyylikanelialdehydi (CAS-numero 101-86-0) ja 25-prosenttinen eugenoli (CAS-numero 97-53-0) asetonin ja oliiviöljyn seoksessa (4:1 v/v). Joissakin olosuhteissa voidaan riittävin perustein käyttää muita positiivisia kontrollikemikaaleja, jotka täyttävät edellä mainitut kriteerit.

| 12. | Vaikka positiivisen kontrolliryhmän samanaikaista käyttöä suositellaan, joissakin tapauksissa positiivisen kontrollikemikaalin testaus ajoittain (enintään kuuden kuukauden välein) voi riittää LLNA: DA -menetelmää säännöllisesti käyttävissä laboratorioissa (eli sellaisissa, jotka käyttävät LLNA: DA -menetelmää vähintään kerran kuukaudessa), joilla on aiempia positiivisen kontrollikemikaalin määritystietoja, jotka osoittavat laboratorion valmiuden saada aikaan uusittavissa olevia ja täsmällisiä tuloksia positiivisilla kontrollikemikaaleilla. Riittävä LLNA DA -menetelmää koskeva pätevyys voidaan osoittaa tuottamalla positiivisella kontrollikemikaalilla toistuvasti samantasoisia positiivisia tuloksia vähintään kymmenessä riippumattomassa testissä, jotka suoritetaan kohtuullisen ajanjakson (alle yhden vuoden) aikana. |
| --- | --- |

12.

Vaikka positiivisen kontrolliryhmän samanaikaista käyttöä suositellaan, joissakin tapauksissa positiivisen kontrollikemikaalin testaus ajoittain (enintään kuuden kuukauden välein) voi riittää LLNA: DA -menetelmää säännöllisesti käyttävissä laboratorioissa (eli sellaisissa, jotka käyttävät LLNA: DA -menetelmää vähintään kerran kuukaudessa), joilla on aiempia positiivisen kontrollikemikaalin määritystietoja, jotka osoittavat laboratorion valmiuden saada aikaan uusittavissa olevia ja täsmällisiä tuloksia positiivisilla kontrollikemikaaleilla. Riittävä LLNA DA -menetelmää koskeva pätevyys voidaan osoittaa tuottamalla positiivisella kontrollikemikaalilla toistuvasti samantasoisia positiivisia tuloksia vähintään kymmenessä riippumattomassa testissä, jotka suoritetaan kohtuullisen ajanjakson (alle yhden vuoden) aikana.

| 13. | Samanaikaista positiivista kontrolliryhmää olisi käytettävä aina, kun LLNA: DA -menettelyjä muutetaan (esimerkiksi kun koulutettu henkilökunta vaihtuu, testimenetelmän materiaalit ja/tai reagenssit vaihtuvat, testimenetelmässä käytettävät laitteet vaihtuvat tai koe-eläinten alkuperä vaihtuu). Tällaiset muutokset on kirjattava laboratorioraportteihin. Muutosten vaikutusta aiempien määritystietojen asianmukaisuuteen on tarkasteltava, jotta voidaan päättää, onko kerättävä uusi määritystietoja positiivisen kontrollikemikaalin tulosten yhdenmukaisuuden osoittamiseksi. |
| --- | --- |

13.

Samanaikaista positiivista kontrolliryhmää olisi käytettävä aina, kun LLNA: DA -menettelyjä muutetaan (esimerkiksi kun koulutettu henkilökunta vaihtuu, testimenetelmän materiaalit ja/tai reagenssit vaihtuvat, testimenetelmässä käytettävät laitteet vaihtuvat tai koe-eläinten alkuperä vaihtuu). Tällaiset muutokset on kirjattava laboratorioraportteihin. Muutosten vaikutusta aiempien määritystietojen asianmukaisuuteen on tarkasteltava, jotta voidaan päättää, onko kerättävä uusi määritystietoja positiivisen kontrollikemikaalin tulosten yhdenmukaisuuden osoittamiseksi.

| 14. | Tutkijoiden on otettava huomioon, että jos positiivisen kontrollikemikaalin tutkimusta ei suoriteta samanaikaisesti vaan vain ajoittain, negatiivisten tutkimustulosten asianmukaisuus ja hyväksyttävyys voivat vaarantua, jos samanaikaista positiivista kontrollia ei testata ajoittain tehtyjen positiivisten kontrollitestien välillä. Jos esimerkiksi saadaan väärä negatiivinen tulos, kun positiivinen kontrolli ei ole ollut aina samanaikaisesti mukana, positiivisen kontrollikemikaalin viimeisen hyväksytyn yksittäisen tutkimuksen ja positiivisen kontrollikemikaalin hylätyn yksittäisen tutkimuksen tuloksen välisenä aikana saadut testiaineen negatiiviset tulokset voivat olla kyseenalaisia. Näiden tulosten seurauksia on tarkasteltava huolellisesti päätettäessä positiivisten kontrollikemikaalien käyttämisestä testiaineen kanssa samanaikaisesti tai vain ajoittain. Olisi myös harkittava pienemmän eläinmäärän käyttämistä testiaineen kanssa samanaikaisesti tehtävää positiivista kontrolliryhmää varten, jos se on tieteellisesti perusteltua ja jos laboratorio osoittaa laboratoriokohtaisten aiempien tietojen perusteella, että hiiriä voidaan käyttää vähemmän (22). |
| --- | --- |

14.

Tutkijoiden on otettava huomioon, että jos positiivisen kontrollikemikaalin tutkimusta ei suoriteta samanaikaisesti vaan vain ajoittain, negatiivisten tutkimustulosten asianmukaisuus ja hyväksyttävyys voivat vaarantua, jos samanaikaista positiivista kontrollia ei testata ajoittain tehtyjen positiivisten kontrollitestien välillä. Jos esimerkiksi saadaan väärä negatiivinen tulos, kun positiivinen kontrolli ei ole ollut aina samanaikaisesti mukana, positiivisen kontrollikemikaalin viimeisen hyväksytyn yksittäisen tutkimuksen ja positiivisen kontrollikemikaalin hylätyn yksittäisen tutkimuksen tuloksen välisenä aikana saadut testiaineen negatiiviset tulokset voivat olla kyseenalaisia. Näiden tulosten seurauksia on tarkasteltava huolellisesti päätettäessä positiivisten kontrollikemikaalien käyttämisestä testiaineen kanssa samanaikaisesti tai vain ajoittain. Olisi myös harkittava pienemmän eläinmäärän käyttämistä testiaineen kanssa samanaikaisesti tehtävää positiivista kontrolliryhmää varten, jos se on tieteellisesti perusteltua ja jos laboratorio osoittaa laboratoriokohtaisten aiempien tietojen perusteella, että hiiriä voidaan käyttää vähemmän (22).

| 15. | Vaikka positiiviset kontrollikemikaalit olisi mieluiten testattava kantaja-aineessa, jonka tiedetään antavan aina samanlaisen vasteen (esimerkiksi asetoni:oliiviöljy, 4:1 v/v), voi joidenkin säännösten mukaan olla tarpeen testata aine myös muussa kuin vakiokantaja-aineessa (kliinisesti/kemiallisesti relevantissa aineessa (23)). Jos positiivista kontrollikemikaalia testataan samanaikaisesti eri kantaja-aineessa kuin testiainetta, on samanaikaista positiivista kontrollikemikaalia varten käytettävä erillistä kantaja-ainekontrollia. |
| --- | --- |

15.

Vaikka positiiviset kontrollikemikaalit olisi mieluiten testattava kantaja-aineessa, jonka tiedetään antavan aina samanlaisen vasteen (esimerkiksi asetoni:oliiviöljy, 4:1 v/v), voi joidenkin säännösten mukaan olla tarpeen testata aine myös muussa kuin vakiokantaja-aineessa (kliinisesti/kemiallisesti relevantissa aineessa (23)). Jos positiivista kontrollikemikaalia testataan samanaikaisesti eri kantaja-aineessa kuin testiainetta, on samanaikaista positiivista kontrollikemikaalia varten käytettävä erillistä kantaja-ainekontrollia.

| 16. | Arvioitaessa tiettyyn kemikaaliluokkaan kuuluvia tai tietyn vastetason aikaansaavia aineita voidaan myös vertailuaineita käyttää osoittamaan, että testimenetelmällä voidaan osoittaa asianmukaisesti tämäntyyppisten aineiden ihoherkistyspotentiaali. Vertailuaineilla olisi oltava seuraavat ominaisuudet:






  — | samanlainen rakenne ja toiminta kuin testattavalla aineryhmällä |
| --- | --- | --- |

16.

Arvioitaessa tiettyyn kemikaaliluokkaan kuuluvia tai tietyn vastetason aikaansaavia aineita voidaan myös vertailuaineita käyttää osoittamaan, että testimenetelmällä voidaan osoittaa asianmukaisesti tämäntyyppisten aineiden ihoherkistyspotentiaali. Vertailuaineilla olisi oltava seuraavat ominaisuudet:

—

samanlainen rakenne ja toiminta kuin testattavalla aineryhmällä

| — | tunnetut fysikaalis-kemialliset ominaisuudet |
| --- | --- |

—

tunnetut fysikaalis-kemialliset ominaisuudet

| — | sopivuutta tukevia tietoja LLNA: DA -menetelmästä |
| --- | --- |

—

sopivuutta tukevia tietoja LLNA: DA -menetelmästä

| — | sopivuutta tukevia tietoja muista eläinmalleista ja/tai ihmisistä. |
| --- | --- |

—

sopivuutta tukevia tietoja muista eläinmalleista ja/tai ihmisistä.

TESTIMENETTELY

Koe-eläinten määrä ja annostasot

Koe-eläinten määrä ja annostasot

| 17. | Kussakin annostasoryhmässä on oltava vähintään neljä eläintä, ja testiaineesta on käytettävä vähintään kolmea konsentraatiota; lisäksi käytetään samanaikaisesti määritettävää negatiivista kontrolliryhmää, joka käsitellään vain testiaineen kantaja-aineella, sekä positiivista kontrolliryhmää (joka määritetään samanaikaisesti tai joka on määritetty hiljattain, laboratorion toimintatavan mukaisesti, ottaen huomioon 11–15 kohdat). Positiivisesta kontrolliryhmästä on tarvittaessa testattava useita annoksia, etenkin jos positiivista kontrollikemikaalia testataan epäsäännöllisesti. Kontrolliryhmän eläimiä on kohdeltava samalla tavoin kuin testiryhmän eläimiä, paitsi että niitä ei käsitellä testiaineella. |
| --- | --- |

17.

Kussakin annostasoryhmässä on oltava vähintään neljä eläintä, ja testiaineesta on käytettävä vähintään kolmea konsentraatiota; lisäksi käytetään samanaikaisesti määritettävää negatiivista kontrolliryhmää, joka käsitellään vain testiaineen kantaja-aineella, sekä positiivista kontrolliryhmää (joka määritetään samanaikaisesti tai joka on määritetty hiljattain, laboratorion toimintatavan mukaisesti, ottaen huomioon 11–15 kohdat). Positiivisesta kontrolliryhmästä on tarvittaessa testattava useita annoksia, etenkin jos positiivista kontrollikemikaalia testataan epäsäännöllisesti. Kontrolliryhmän eläimiä on kohdeltava samalla tavoin kuin testiryhmän eläimiä, paitsi että niitä ei käsitellä testiaineella.

| 18. | Annostaso ja kantaja-aine on valittava lähteissä (2) ja (24) esitettyjen suositusten perusteella. Annostasot valitaan yleensä sopivasta konsentraatiosarjasta, esimerkiksi sarjasta 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % ja niin edelleen. Käytettävälle konsentraatiosarjalle on esitettävä asianmukaiset tieteelliset perustelut. Kaikki käytettävissä olevat toksikologiset tiedot (esimerkiksi akuutti toksisuus ja ihoärsytys) sekä rakennetta ja fysikaaliskemiallisia ominaisuuksia koskevat tiedot kyseisestä testiaineesta (ja/tai rakenteellisesti vastaavista aineista) on tarvittaessa otettava huomioon kolmen peräkkäisen konsentraation valinnassa niin, että suurin konsentraatio edustaa maksimialtistusta, mutta koko elimistöön kohdistuva toksisuus ja/tai liian voimakas paikallinen ihoärsytys kuitenkin vältetään (24) (25). Jos tällaisia tietoja ei ole käytettävissä, voi olla tarpeen tehdä esitesti (katso 21–24 kohta). |
| --- | --- |

18.

Annostaso ja kantaja-aine on valittava lähteissä (2) ja (24) esitettyjen suositusten perusteella. Annostasot valitaan yleensä sopivasta konsentraatiosarjasta, esimerkiksi sarjasta 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % ja niin edelleen. Käytettävälle konsentraatiosarjalle on esitettävä asianmukaiset tieteelliset perustelut. Kaikki käytettävissä olevat toksikologiset tiedot (esimerkiksi akuutti toksisuus ja ihoärsytys) sekä rakennetta ja fysikaaliskemiallisia ominaisuuksia koskevat tiedot kyseisestä testiaineesta (ja/tai rakenteellisesti vastaavista aineista) on tarvittaessa otettava huomioon kolmen peräkkäisen konsentraation valinnassa niin, että suurin konsentraatio edustaa maksimialtistusta, mutta koko elimistöön kohdistuva toksisuus ja/tai liian voimakas paikallinen ihoärsytys kuitenkin vältetään (24) (25). Jos tällaisia tietoja ei ole käytettävissä, voi olla tarpeen tehdä esitesti (katso 21–24 kohta).

| 19. | Kantaja-aine ei saa vaikuttaa testituloksiin tai vääristää niitä. Se on valittava siten, että testiaine liukenee siihen mahdollisimman helposti ja aineen konsentraatio annosteluun sopivassa liuoksessa tai suspensiossa on mahdollisimman suuri. Suositeltavat kantaja-aineet ovat asetoni:oliiviöljy (4:1 v/v), N,N-dimetyyliformamidi, metyylietyyliketoni, propyleeniglykoli ja dimetyylisulfoksidi (6), mutta muitakin kantaja-aineita voidaan käyttää riittävin tieteellisin perustein. Joissakin tilanteissa voi olla tarpeen käyttää lisäkontrolliaineena kliinisesti perusteltua liuotinta tai kaupallista valmistetta, jona testiainetta markkinoidaan. Erityisesti on varmistettava, että hydrofiiliset testiaineet sisällytetään sellaiseen kantaja-ainejärjestelmään, joka vettää ihon eikä valu heti pois, lisäämällä asianmukaisia liukenemista edistäviä aineita (esimerkiksi 1-prosenttinen Pluronic® L92). Pelkkiä vesiliuoksia on siis syytä välttää. |
| --- | --- |

19.

Kantaja-aine ei saa vaikuttaa testituloksiin tai vääristää niitä. Se on valittava siten, että testiaine liukenee siihen mahdollisimman helposti ja aineen konsentraatio annosteluun sopivassa liuoksessa tai suspensiossa on mahdollisimman suuri. Suositeltavat kantaja-aineet ovat asetoni:oliiviöljy (4:1 v/v), N,N-dimetyyliformamidi, metyylietyyliketoni, propyleeniglykoli ja dimetyylisulfoksidi (6), mutta muitakin kantaja-aineita voidaan käyttää riittävin tieteellisin perustein. Joissakin tilanteissa voi olla tarpeen käyttää lisäkontrolliaineena kliinisesti perusteltua liuotinta tai kaupallista valmistetta, jona testiainetta markkinoidaan. Erityisesti on varmistettava, että hydrofiiliset testiaineet sisällytetään sellaiseen kantaja-ainejärjestelmään, joka vettää ihon eikä valu heti pois, lisäämällä asianmukaisia liukenemista edistäviä aineita (esimerkiksi 1-prosenttinen Pluronic® L92). Pelkkiä vesiliuoksia on siis syytä välttää.

| 20. | Yksittäisiä hiirten imusolmukkeita prosessoimalla voidaan arvioida eläintenvälistä vaihtelua ja verrata tilastollisesti testiaineella ja kantaja-aineella käsiteltyjen ryhmien tuloksia (katso 33 kohta). Positiivisen kontrolliryhmän hiirten määrän vähentäminen voi olla mahdollista, mutta vain siinä tapauksessa, että tietoja kerätään yksittäisistä eläimistä (22). Tietyt sääntelyviranomaiset vaativat, että tietoja on kerättävä yksittäisistä eläimistä. Yksittäisiä eläimiä koskevien tietojen säännöllisellä keräämisellä edistetään eläinten hyvinvointia, koska siten vältetään päällekkäiset testaukset, jotka ovat tarpeen, jos sääntelyviranomaisten on tarkasteltava tietyllä tavalla (esimerkiksi eläimistä saatuja mittaustietoja yhdistämällä) saatuja testiainetuloksia myöhemmin muiden vaatimusten (esimerkiksi yksittäisiä eläimiä koskevat tiedot) perusteella. |
| --- | --- |

20.

Yksittäisiä hiirten imusolmukkeita prosessoimalla voidaan arvioida eläintenvälistä vaihtelua ja verrata tilastollisesti testiaineella ja kantaja-aineella käsiteltyjen ryhmien tuloksia (katso 33 kohta). Positiivisen kontrolliryhmän hiirten määrän vähentäminen voi olla mahdollista, mutta vain siinä tapauksessa, että tietoja kerätään yksittäisistä eläimistä (22). Tietyt sääntelyviranomaiset vaativat, että tietoja on kerättävä yksittäisistä eläimistä. Yksittäisiä eläimiä koskevien tietojen säännöllisellä keräämisellä edistetään eläinten hyvinvointia, koska siten vältetään päällekkäiset testaukset, jotka ovat tarpeen, jos sääntelyviranomaisten on tarkasteltava tietyllä tavalla (esimerkiksi eläimistä saatuja mittaustietoja yhdistämällä) saatuja testiainetuloksia myöhemmin muiden vaatimusten (esimerkiksi yksittäisiä eläimiä koskevat tiedot) perusteella.

Testiä edeltävä kartoitus

Testiä edeltävä kartoitus

| 21. | Jos ei ole tietoja, joiden perusteella päätetään suurin testattava annos (katso 18 kohta), on LLNA: DA -menetelmän testeissä käytettävä asianmukainen annostaso selvitettävä ennen päätestiä. Siten saadaan apua enimmäisannoksen valintaan varsinaista LLNA: DA -tutkimusta varten, kun tietoja koko elimistöön kohdistuvan toksisuuden (katso 24 kohta) ja/tai liian voimakkaan paikallisen ihoärsytyksen (katso 23 kohta) aiheuttavasta konsentraatiosta ei ole saatavilla. Testattavan enimmäisannoksen on vastattava sataa prosenttia nestemäisen testiaineen osalta tai suurinta mahdollista konsentraatiota kiinteiden tai suspendoitujen aineiden osalta. |
| --- | --- |

21.

Jos ei ole tietoja, joiden perusteella päätetään suurin testattava annos (katso 18 kohta), on LLNA: DA -menetelmän testeissä käytettävä asianmukainen annostaso selvitettävä ennen päätestiä. Siten saadaan apua enimmäisannoksen valintaan varsinaista LLNA: DA -tutkimusta varten, kun tietoja koko elimistöön kohdistuvan toksisuuden (katso 24 kohta) ja/tai liian voimakkaan paikallisen ihoärsytyksen (katso 23 kohta) aiheuttavasta konsentraatiosta ei ole saatavilla. Testattavan enimmäisannoksen on vastattava sataa prosenttia nestemäisen testiaineen osalta tai suurinta mahdollista konsentraatiota kiinteiden tai suspendoitujen aineiden osalta.

| 22. | Kartoitustesti suoritetaan varsinaista LLNA: DA -tutkimusta vastaavissa olosuhteissa, kuitenkin niin, että imusolmukkeiden proliferaatiota ei arvioida ja kussakin annosryhmässä voidaan käyttää vähemmän eläimiä. Kussakin annosryhmässä olisi hyvä käyttää yhtä tai kahta eläintä. Kaikkia hiiriä tarkkaillaan päivittäin koko elimistöön kohdistuvan toksisuuden tai annostelukohdassa esiintyvän paikallisen ärsytyksen kliinisten merkkien havaitsemiseksi. Eläinten paino kirjataan ennen testaamista ja ennen eläinten lopettamista (päivä 8). Kunkin hiiren molemmista korvista tutkitaan eryteeman merkit, ja ne pisteytetään taulukon 1 mukaisesti (25). Korvan paksuus mitataan paksuusmittarilla (esimerkiksi digitaalisella mikrometrillä tai Peacock Dial -paksuusmittarilla) päivänä 1 (ennen annosta), päivänä 3 (noin 48 tunnin kuluttua ensimmäisestä annoksesta), päivänä 7 (24 tuntia ennen lopettamista) ja päivänä 8. Päivänä 8 korvan paksuus voidaan määrittää myös mittaamalla korvan lävistämiseen tarvittava massa sen jälkeen, kun eläimet on lopetettu humaanisti. Paikallinen ärsytys on erittäin voimakas, jos eryteemapisteytyksen arvo ≥ 3 ja/tai korvan paksuuntuminen ≥ 25 prosenttia minä tahansa mittauspäivänä (26) (27). Suurin varsinaiseen LLNA: DA -tutkimukseen valittava annos on kartoitusta varten määritetyn konsentraatiosarjan (katso 18 kohta) suurin annos, joka ei enää aiheuta koko elimistöön kohdistuvaa toksisuutta ja/tai liian voimakasta paikallista ihoärsytystä.

  Taulukko 1


  Eryteemapisteytys







  Havainto | Pisteet |
| --- | --- | --- |
| Ei eryteemaa | 0 |
| Hyvin lievä eryteema (tuskin havaittava) | 1 |
| Selkeästi erottuva eryteema | 2 |
| Keskivakava–vakava eryteema | 3 |
| Vakava eryteema (voimakas punoitus)–karsta, joka estää eryteeman pisteytyksen | 4 |

22.

Kartoitustesti suoritetaan varsinaista LLNA: DA -tutkimusta vastaavissa olosuhteissa, kuitenkin niin, että imusolmukkeiden proliferaatiota ei arvioida ja kussakin annosryhmässä voidaan käyttää vähemmän eläimiä. Kussakin annosryhmässä olisi hyvä käyttää yhtä tai kahta eläintä. Kaikkia hiiriä tarkkaillaan päivittäin koko elimistöön kohdistuvan toksisuuden tai annostelukohdassa esiintyvän paikallisen ärsytyksen kliinisten merkkien havaitsemiseksi. Eläinten paino kirjataan ennen testaamista ja ennen eläinten lopettamista (päivä 8). Kunkin hiiren molemmista korvista tutkitaan eryteeman merkit, ja ne pisteytetään taulukon 1 mukaisesti (25). Korvan paksuus mitataan paksuusmittarilla (esimerkiksi digitaalisella mikrometrillä tai Peacock Dial -paksuusmittarilla) päivänä 1 (ennen annosta), päivänä 3 (noin 48 tunnin kuluttua ensimmäisestä annoksesta), päivänä 7 (24 tuntia ennen lopettamista) ja päivänä 8. Päivänä 8 korvan paksuus voidaan määrittää myös mittaamalla korvan lävistämiseen tarvittava massa sen jälkeen, kun eläimet on lopetettu humaanisti. Paikallinen ärsytys on erittäin voimakas, jos eryteemapisteytyksen arvo ≥ 3 ja/tai korvan paksuuntuminen ≥ 25 prosenttia minä tahansa mittauspäivänä (26) (27). Suurin varsinaiseen LLNA: DA -tutkimukseen valittava annos on kartoitusta varten määritetyn konsentraatiosarjan (katso 18 kohta) suurin annos, joka ei enää aiheuta koko elimistöön kohdistuvaa toksisuutta ja/tai liian voimakasta paikallista ihoärsytystä.

Taulukko 1

Taulukko 1

Eryteemapisteytys

Eryteemapisteytys

Havainto

Pisteet

Ei eryteemaa

0

Hyvin lievä eryteema (tuskin havaittava)

1

Selkeästi erottuva eryteema

2

Keskivakava–vakava eryteema

3

Vakava eryteema (voimakas punoitus)–karsta, joka estää eryteeman pisteytyksen

4

| 23. | Paitsi korvien paksuuden tilastollisesti merkittävää yli 25 prosentin kasvua (26) (27), myös tilastollisesti merkittävää käsiteltyjen hiirten korvien paksuuden lisääntymistä kontrollihiiriin verrattuna on käytetty ärsyttävien aineiden tunnistamiseksi LLNA-menetelmässä (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Tilastollisesti merkittävää paksuuntumista voi esiintyä silloinkin, kun korvan paksuuntuminen on alle 25 prosenttia, mutta sen ei katsota liittyvän spesifisesti erittäin voimakkaaseen ärsytykseen (30) (31) (32) (33) (34). |
| --- | --- |

23.

Paitsi korvien paksuuden tilastollisesti merkittävää yli 25 prosentin kasvua (26) (27), myös tilastollisesti merkittävää käsiteltyjen hiirten korvien paksuuden lisääntymistä kontrollihiiriin verrattuna on käytetty ärsyttävien aineiden tunnistamiseksi LLNA-menetelmässä (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Tilastollisesti merkittävää paksuuntumista voi esiintyä silloinkin, kun korvan paksuuntuminen on alle 25 prosenttia, mutta sen ei katsota liittyvän spesifisesti erittäin voimakkaaseen ärsytykseen (30) (31) (32) (33) (34).

| 24. | Seuraavat kliiniset havainnot voivat kokonaisvaltaisessa arvioinnissa olla osoituksena koko elimistöön kohdistuvasta toksisuudesta (35) ja voivat näin ollen olla osoituksena suurimmasta annostasosta, jota varsinaisessa LLNA. DA -menetelmässä voidaan käyttää: muutokset hermoston toiminnassa (esimerkiksi karvojen jäykistyminen, ataksia, vapina ja kouristukset); muutokset käyttäytymisessä (esimerkiksi aggressiivisuus, muutokset turkin hoidossa, aktiivisuustason huomattava muuttuminen); muutokset hengityksessä (hengityksen säännöllisyyden ja syvyyden muutokset, kuten hengenahdistus, hengen haukkominen ja rahina) sekä muutokset ravinnon ja veden kulutuksessa. Arvioinnissa on huomioitava myös letargian ja/tai passiivisuuden merkit, vähäistä tai hetkittäistä kipua suuremman kivun ja kärsimyksen mahdolliset kliiniset merkit tai eläimen painon yli viiden prosentin laskeminen päivästä 1 päivään 8 sekä kuolleisuus. Kuolevat eläimet tai eläimet, jotka osoittavat selviä merkkejä voimakkaasta kivusta ja kärsimyksestä, on lopetettava humaanisti (36). |
| --- | --- |

24.

Seuraavat kliiniset havainnot voivat kokonaisvaltaisessa arvioinnissa olla osoituksena koko elimistöön kohdistuvasta toksisuudesta (35) ja voivat näin ollen olla osoituksena suurimmasta annostasosta, jota varsinaisessa LLNA. DA -menetelmässä voidaan käyttää: muutokset hermoston toiminnassa (esimerkiksi karvojen jäykistyminen, ataksia, vapina ja kouristukset); muutokset käyttäytymisessä (esimerkiksi aggressiivisuus, muutokset turkin hoidossa, aktiivisuustason huomattava muuttuminen); muutokset hengityksessä (hengityksen säännöllisyyden ja syvyyden muutokset, kuten hengenahdistus, hengen haukkominen ja rahina) sekä muutokset ravinnon ja veden kulutuksessa. Arvioinnissa on huomioitava myös letargian ja/tai passiivisuuden merkit, vähäistä tai hetkittäistä kipua suuremman kivun ja kärsimyksen mahdolliset kliiniset merkit tai eläimen painon yli viiden prosentin laskeminen päivästä 1 päivään 8 sekä kuolleisuus. Kuolevat eläimet tai eläimet, jotka osoittavat selviä merkkejä voimakkaasta kivusta ja kärsimyksestä, on lopetettava humaanisti (36).

Varsinaisen tutkimuksen aikataulu

Varsinaisen tutkimuksen aikataulu

| 25. | Määritysmenetelmän aikataulu on seuraava:
  —   Päivä 1: Määritetään ja kirjataan kunkin koe-eläimen paino ja tehdään mahdollisia kliinisiä havaintoja. Kunkin korvan takaosaan annostellaan 1-prosenttista natriumlauryylisulfaattivesiliuosta (NLS) NLS-liuokseen upotetulla siveltimellä niin että kunkin korvan takaosa peittyy neljällä tai viidellä sivellyksellä. Yhden tunnin kuluttua NLS-käsittelystä kunkin korvan takaosaan annostellaan 25 μl testiaineen, kantaja-aineen tai positiivisen kontrollikemikaalin (samanaikaisen tai hiljattain tehdyn, laboratorion toimintatavan mukaisesti, ottaen huomioon 11–15 kohdat) sopivaa laimennosta.
  —   Päivät 2, 3 ja 7: Toistetaan päivänä 1 suoritettu 1-prosenttisella NLS-vesiliuoksella tehty alustava käsittely ja testiaineen annostelu.
  —   Päivät 4, 5 ja 6: Ei käsittelyä.
  —   Päivä 8: Kirjataan kunkin koe-eläimen paino ja tehdään mahdollisia kliinisiä havaintoja. Noin 24–30 tunnin kuluttua päivänä 7 tehdyn annostelun aloittamisesta eläimet lopetetaan humaanisti. Hiiren kummastakin korvasta leikataan irti dreneeraavat korvalehden imusolmukkeet, ja kunkin eläimen imusolmukkeet upotetaan fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS). Imusolmukkeiden tunnistukseen ja poistamiseen liittyvät tiedot ja kaaviot esitetään lähteessä (22). Paikallista ihovastetta voidaan seurata varsinaisessa tutkimuksessa edelleen sisällyttämällä tutkimussuunnitelmaan täydentäviä parametreja, kuten korvan eryteeman pisteytys tai korvan paksuutta koskevat mittaustulokset (saadaan joko paksuusmittarilla tai ruumiinavauksen yhteydessä tehtävillä korvan lävistämiseen tarvittavan massan mittauksilla). |
| --- | --- |

25.

Määritysmenetelmän aikataulu on seuraava:

—   Päivä 1: Määritetään ja kirjataan kunkin koe-eläimen paino ja tehdään mahdollisia kliinisiä havaintoja. Kunkin korvan takaosaan annostellaan 1-prosenttista natriumlauryylisulfaattivesiliuosta (NLS) NLS-liuokseen upotetulla siveltimellä niin että kunkin korvan takaosa peittyy neljällä tai viidellä sivellyksellä. Yhden tunnin kuluttua NLS-käsittelystä kunkin korvan takaosaan annostellaan 25 μl testiaineen, kantaja-aineen tai positiivisen kontrollikemikaalin (samanaikaisen tai hiljattain tehdyn, laboratorion toimintatavan mukaisesti, ottaen huomioon 11–15 kohdat) sopivaa laimennosta.

—   Päivät 2, 3 ja 7: Toistetaan päivänä 1 suoritettu 1-prosenttisella NLS-vesiliuoksella tehty alustava käsittely ja testiaineen annostelu.

—   Päivät 4, 5 ja 6: Ei käsittelyä.

—   Päivä 8: Kirjataan kunkin koe-eläimen paino ja tehdään mahdollisia kliinisiä havaintoja. Noin 24–30 tunnin kuluttua päivänä 7 tehdyn annostelun aloittamisesta eläimet lopetetaan humaanisti. Hiiren kummastakin korvasta leikataan irti dreneeraavat korvalehden imusolmukkeet, ja kunkin eläimen imusolmukkeet upotetaan fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS). Imusolmukkeiden tunnistukseen ja poistamiseen liittyvät tiedot ja kaaviot esitetään lähteessä (22). Paikallista ihovastetta voidaan seurata varsinaisessa tutkimuksessa edelleen sisällyttämällä tutkimussuunnitelmaan täydentäviä parametreja, kuten korvan eryteeman pisteytys tai korvan paksuutta koskevat mittaustulokset (saadaan joko paksuusmittarilla tai ruumiinavauksen yhteydessä tehtävillä korvan lävistämiseen tarvittavan massan mittauksilla).

Solususpensioiden valmistus

Solususpensioiden valmistus

| 26. | Kunkin hiiren imusolmukeparien soluista valmistetaan yksisolususpensio asettamalla imusolmukkeet kahden objektilasin väliin ja painamalla niitä kevyesti imusolmukkeiden murskaamiseksi. Tämän jälkeen varmistetaan, että kudos on levinnyt objektilaseille ohuesti, ja objektilasit irrotetaan toisistaan varovasti. Molemmilla objektilaseilla oleva kudos suspendoidaan PBS-liuokseen niin, että kumpaakin objektilasia pidetään kallistettuna petrimaljan yläpuolella ja huuhdellaan PBS-liuoksella samalla, kun kudosta raaputetaan objektilasista soluraaputtimella. Negatiivisen kontrolliryhmän eläinten imusolmukkeet ovat pieniä, joten vaihe on suoritettava huolellisesti SI-arvoihin mahdollisesti vaikuttavien artefaktojen välttämiseksi. Molemmat objektilasit on huuhdeltava yhteensä 1 ml:lla PBS-liuosta. Imusolmukeparien soluista petrimaljaan valmistettu suspensio homogenoidaan kevyesti soluraaputtimella. Tämän jälkeen imusolmukeparien soluista valmistetusta suspensiosta otetaan 20 μl:n mittausnäyte mikropipetillä niin, ettei näytteeseen tule mukaan silmämääräisesti havaittavaa kalvoa. Suspensio sekoitetaan 1,98 ml:aan PBS-liuosta, jolloin saadaan 2 ml:n näyte. Tämän jälkeen valmistetaan toinen 2 ml:n näyte samalla menettelyllä niin, että kustakin eläimestä saadaan kaksi näytettä. |
| --- | --- |

26.

Kunkin hiiren imusolmukeparien soluista valmistetaan yksisolususpensio asettamalla imusolmukkeet kahden objektilasin väliin ja painamalla niitä kevyesti imusolmukkeiden murskaamiseksi. Tämän jälkeen varmistetaan, että kudos on levinnyt objektilaseille ohuesti, ja objektilasit irrotetaan toisistaan varovasti. Molemmilla objektilaseilla oleva kudos suspendoidaan PBS-liuokseen niin, että kumpaakin objektilasia pidetään kallistettuna petrimaljan yläpuolella ja huuhdellaan PBS-liuoksella samalla, kun kudosta raaputetaan objektilasista soluraaputtimella. Negatiivisen kontrolliryhmän eläinten imusolmukkeet ovat pieniä, joten vaihe on suoritettava huolellisesti SI-arvoihin mahdollisesti vaikuttavien artefaktojen välttämiseksi. Molemmat objektilasit on huuhdeltava yhteensä 1 ml:lla PBS-liuosta. Imusolmukeparien soluista petrimaljaan valmistettu suspensio homogenoidaan kevyesti soluraaputtimella. Tämän jälkeen imusolmukeparien soluista valmistetusta suspensiosta otetaan 20 μl:n mittausnäyte mikropipetillä niin, ettei näytteeseen tule mukaan silmämääräisesti havaittavaa kalvoa. Suspensio sekoitetaan 1,98 ml:aan PBS-liuosta, jolloin saadaan 2 ml:n näyte. Tämän jälkeen valmistetaan toinen 2 ml:n näyte samalla menettelyllä niin, että kustakin eläimestä saadaan kaksi näytettä.

Solujen proliferaation määritys (lymfosyyttien ATP-pitoisuuden mittaaminen)

Solujen proliferaation määritys (lymfosyyttien ATP-pitoisuuden mittaaminen)

| 27. | Imusolmukkeiden ATP-pitoisuuden kasvua mitataan lusiferiini/lusiferaasi-menetelmällä käyttämällä ATP-määrityskittiä, jolla mitataan bioluminesenssia suhteellisina valoyksikköinä (Relative Luminescence Unit, RLU). Määritys tehdään aikana, joka ulottuu imusolmukkeiden eläimestä irrottamisesta ATP-pitoisuuden mittaamiseen. Sen on oltava kunkin eläimen osalta sama noin 30 minuutin tarkkuudella, sillä ATP-pitoisuuden katsotaan laskevan vähitellen sen jälkeen, kun eläin on kuollut (12). Näin ollen menettely, joka käynnistyy korvalehden imusolmukkeiden irrottamisesta ja päättyy ATP-mittaukseen, olisi saatava päätökseen 20 minuutin sisällä etukäteen määritettyyn määräaikaan mennessä, joka on sama kaikille eläimille. ATP:n luminesenssi on mitattava kustakin 2 ml:n näytteestä. Kullakin eläimellä tehdään siis yhteensä kaksi ATP-mittausta. Tämän jälkeen määritetään ATP:n keskimääräinen luminesenssi, jota käytetään myöhemmin tehtävissä laskelmissa (katso 30 kohta). |
| --- | --- |

27.

Imusolmukkeiden ATP-pitoisuuden kasvua mitataan lusiferiini/lusiferaasi-menetelmällä käyttämällä ATP-määrityskittiä, jolla mitataan bioluminesenssia suhteellisina valoyksikköinä (Relative Luminescence Unit, RLU). Määritys tehdään aikana, joka ulottuu imusolmukkeiden eläimestä irrottamisesta ATP-pitoisuuden mittaamiseen. Sen on oltava kunkin eläimen osalta sama noin 30 minuutin tarkkuudella, sillä ATP-pitoisuuden katsotaan laskevan vähitellen sen jälkeen, kun eläin on kuollut (12). Näin ollen menettely, joka käynnistyy korvalehden imusolmukkeiden irrottamisesta ja päättyy ATP-mittaukseen, olisi saatava päätökseen 20 minuutin sisällä etukäteen määritettyyn määräaikaan mennessä, joka on sama kaikille eläimille. ATP:n luminesenssi on mitattava kustakin 2 ml:n näytteestä. Kullakin eläimellä tehdään siis yhteensä kaksi ATP-mittausta. Tämän jälkeen määritetään ATP:n keskimääräinen luminesenssi, jota käytetään myöhemmin tehtävissä laskelmissa (katso 30 kohta).

HAVAINNOT

Kliiniset havainnot

Kliiniset havainnot

| 28. | Kustakin hiirestä on päivittäin havainnoitava huolellisesti mahdolliset kliiniset merkit joko annostelualueen paikallisesta ärsytyksestä tai koko elimistöön kohdistuvasta toksisuudesta. Kaikki havainnot kirjataan järjestelmällisesti erikseen kustakin hiirestä. Seurantasuunnitelmissa on esitettävä myös perusteet, joiden avulla voidaan nopeasti tunnistaa hiiret, joissa havaitaan merkkejä koko elimistöön kohdistuvasta toksisuudesta, liian voimakkaasta paikallisesta ihoärsytyksestä tai ihosyövyttävyydestä ja jotka on lopetettava (36). |
| --- | --- |

28.

Kustakin hiirestä on päivittäin havainnoitava huolellisesti mahdolliset kliiniset merkit joko annostelualueen paikallisesta ärsytyksestä tai koko elimistöön kohdistuvasta toksisuudesta. Kaikki havainnot kirjataan järjestelmällisesti erikseen kustakin hiirestä. Seurantasuunnitelmissa on esitettävä myös perusteet, joiden avulla voidaan nopeasti tunnistaa hiiret, joissa havaitaan merkkejä koko elimistöön kohdistuvasta toksisuudesta, liian voimakkaasta paikallisesta ihoärsytyksestä tai ihosyövyttävyydestä ja jotka on lopetettava (36).

Ruumiinpainot

Ruumiinpainot

| 29. | Kuten 25 kohdassa todetaan, kukin eläin on punnittava erikseen testin alussa ja aikataulun mukaisesti humaanin lopettamisen yhteydessä. |
| --- | --- |

29.

Kuten 25 kohdassa todetaan, kukin eläin on punnittava erikseen testin alussa ja aikataulun mukaisesti humaanin lopettamisen yhteydessä.

TULOSTEN LASKEMINEN

| 30. | Kunkin käsittelyryhmän tulokset ilmoitetaan keskimääräisenä SI:nä. Sl-arvo saadaan jakamalla testiaineryhmän ja positiivisen kontrolliryhmän hiirikohtaisista RLU-arvoista laskettu keskiarvo liuotin/kantaja-ainekontrollin vastaavalla tuloksella. Kantaja-ainekontrolliryhmien SI:n keskiarvo on 1. |
| --- | --- |

30.

Kunkin käsittelyryhmän tulokset ilmoitetaan keskimääräisenä SI:nä. Sl-arvo saadaan jakamalla testiaineryhmän ja positiivisen kontrolliryhmän hiirikohtaisista RLU-arvoista laskettu keskiarvo liuotin/kantaja-ainekontrollin vastaavalla tuloksella. Kantaja-ainekontrolliryhmien SI:n keskiarvo on 1.

| 31. | Tulos katsotaan positiiviseksi, kun SI ≥ 1,8 (10). Rajatuloksen (SI-arvo 1,8–2,5) positiivisuuden määrittämiseksi voidaan kuitenkin tarkastella myös annos-vastesuhteen voimakkuutta, tilastollista merkitsevyyttä sekä liuottimen/kantaja-aineen ja positiivisen kontrollikemikaalin vasteiden yhdenmukaisuutta (2) (3) (37). |
| --- | --- |

31.

Tulos katsotaan positiiviseksi, kun SI ≥ 1,8 (10). Rajatuloksen (SI-arvo 1,8–2,5) positiivisuuden määrittämiseksi voidaan kuitenkin tarkastella myös annos-vastesuhteen voimakkuutta, tilastollista merkitsevyyttä sekä liuottimen/kantaja-aineen ja positiivisen kontrollikemikaalin vasteiden yhdenmukaisuutta (2) (3) (37).

| 32. | Jos positiivisen rajavasteen SI on 1,8–2,5, käyttäjät voivat tulosten positiivisuuden vahvistamiseksi tarkastella SI-arvojen lisäksi myös muita tietoja, kuten annos-vastesuhdetta, merkkejä koko elimistöön kohdistuvasta toksisuudesta tai liian voimakkaasta ärsytyksestä ja tarvittaessa tilastollista merkittävyyttä (10). Lisäksi on syytä ottaa huomioon testiaineen ominaisuudet, mukaan luettuina mahdolliset rakenteelliset yhtäläisyydet tunnettuihin ihoherkistystä aiheuttaviin aineisiin, sen hiirelle mahdollisesti aiheuttama erittäin voimakas ihoärsytys ja havaitun annosvasteen luonne. Näitä ja muita huomionarvoisia seikkoja käsitellään yksityiskohtaisesti lähteessä (4). |
| --- | --- |

32.

Jos positiivisen rajavasteen SI on 1,8–2,5, käyttäjät voivat tulosten positiivisuuden vahvistamiseksi tarkastella SI-arvojen lisäksi myös muita tietoja, kuten annos-vastesuhdetta, merkkejä koko elimistöön kohdistuvasta toksisuudesta tai liian voimakkaasta ärsytyksestä ja tarvittaessa tilastollista merkittävyyttä (10). Lisäksi on syytä ottaa huomioon testiaineen ominaisuudet, mukaan luettuina mahdolliset rakenteelliset yhtäläisyydet tunnettuihin ihoherkistystä aiheuttaviin aineisiin, sen hiirelle mahdollisesti aiheuttama erittäin voimakas ihoärsytys ja havaitun annosvasteen luonne. Näitä ja muita huomionarvoisia seikkoja käsitellään yksityiskohtaisesti lähteessä (4).

| 33. | Kun tietoja kerätään erikseen kustakin hiirestä, tietojen perusteella voidaan analysoida tilastollisesti mahdollista annosvasteen olemassaoloa ja sen voimakkuutta. Tilastoanalyysissä voidaan muun muassa arvioida annos-vastesuhdetta ja tehdä asianmukaisesti mukautettuja vertailuja testiryhmillä (esimerkiksi pareittain annoksen saaneen ryhmän vertailu samaan aikaan tehtyyn liuotin-/kantaja-ainekontrolliryhmään). Tilastollisina analyyseina voidaan käyttää esimerkiksi lineaarista regressiota tai Williamsin testiä, joilla arvioidaan annos-vasteen suuntauksia, sekä Dunnettin testiä, jolla pareja vertaillaan toisiinsa. Tutkijan on otettava asianmukaisen tilastoanalyysimenetelmän valinnassa huomioon varianssien mahdolliset erot ja muut vastaavat ongelmat, jotka saattavat edellyttää määritystulosten muuntamista tai non-parametrista tilastoanalyysia. Joka tapauksessa tutkijan on mahdollisesti tehtävä SI-laskelmia ja tilastoanalyyseja sekä käyttäen tiettyjä määrityspisteitä koskevia tietoja (niin sanotut käyrän ulkopuolella olevat vasteet) että ilman niitä. |
| --- | --- |

33.

Kun tietoja kerätään erikseen kustakin hiirestä, tietojen perusteella voidaan analysoida tilastollisesti mahdollista annosvasteen olemassaoloa ja sen voimakkuutta. Tilastoanalyysissä voidaan muun muassa arvioida annos-vastesuhdetta ja tehdä asianmukaisesti mukautettuja vertailuja testiryhmillä (esimerkiksi pareittain annoksen saaneen ryhmän vertailu samaan aikaan tehtyyn liuotin-/kantaja-ainekontrolliryhmään). Tilastollisina analyyseina voidaan käyttää esimerkiksi lineaarista regressiota tai Williamsin testiä, joilla arvioidaan annos-vasteen suuntauksia, sekä Dunnettin testiä, jolla pareja vertaillaan toisiinsa. Tutkijan on otettava asianmukaisen tilastoanalyysimenetelmän valinnassa huomioon varianssien mahdolliset erot ja muut vastaavat ongelmat, jotka saattavat edellyttää määritystulosten muuntamista tai non-parametrista tilastoanalyysia. Joka tapauksessa tutkijan on mahdollisesti tehtävä SI-laskelmia ja tilastoanalyyseja sekä käyttäen tiettyjä määrityspisteitä koskevia tietoja (niin sanotut käyrän ulkopuolella olevat vasteet) että ilman niitä.

MITTAUSTULOKSET JA TULOSTEN ILMOITTAMINEN

Mittaustulokset

Mittaustulokset

| 34. | Mittaustulokset on esitettävä taulukkona, josta käyvät ilmi eläinkohtaiset RLU-arvot, ryhmän eläinkohtaisten RLU-arvojen keskiarvo, siihen liittyvä virhetermi (esimerkiksi keskihajonta tai keskiarvon keskivirhe) sekä kunkin annosryhmän keskimääräinen SI samanaikaiseen liuotin-/kantaja-ainekontrolliryhmään verrattuna. |
| --- | --- |

34.

Mittaustulokset on esitettävä taulukkona, josta käyvät ilmi eläinkohtaiset RLU-arvot, ryhmän eläinkohtaisten RLU-arvojen keskiarvo, siihen liittyvä virhetermi (esimerkiksi keskihajonta tai keskiarvon keskivirhe) sekä kunkin annosryhmän keskimääräinen SI samanaikaiseen liuotin-/kantaja-ainekontrolliryhmään verrattuna.

Testiraportti

Testiraportti

| 35. | Testiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot: | Testi- ja kontrollikemikaalit






  — | tunnistetiedot (esimerkiksi CAS- ja EC-numerot, jos tiedossa; alkuperä, puhtaus, tunnetut epäpuhtaudet, eränumero), |
| --- | --- | --- | --- |

35.

Testiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot:

Testi- ja kontrollikemikaalit

—

tunnistetiedot (esimerkiksi CAS- ja EC-numerot, jos tiedossa; alkuperä, puhtaus, tunnetut epäpuhtaudet, eränumero),

| — | fysikaalinen olomuoto ja fysikaaliskemialliset ominaisuudet (esimerkiksi haihtuvuus, stabiilisuus, liukoisuus), |
| --- | --- |

—

fysikaalinen olomuoto ja fysikaaliskemialliset ominaisuudet (esimerkiksi haihtuvuus, stabiilisuus, liukoisuus),

| — | jos kyseessä on seos, sen koostumus ja ainesosien suhteelliset osuudet. |
| --- | --- |

—

jos kyseessä on seos, sen koostumus ja ainesosien suhteelliset osuudet.

| | Liuotin/kantaja-aine






  — | tunnistetiedot (puhtaus, tarvittaessa konsentraatio, käytetty tilavuus), |
| --- | --- | --- |

Liuotin/kantaja-aine

—

tunnistetiedot (puhtaus, tarvittaessa konsentraatio, käytetty tilavuus),

| — | perustelut kantaja-aineen valinnalle. |
| --- | --- |

—

perustelut kantaja-aineen valinnalle.

| | Koe-eläimet






  — | CBA-hiirten alkuperä, |
| --- | --- | --- |

Koe-eläimet

—

CBA-hiirten alkuperä,

| — | eläinten mikrobiologinen tila, jos se on tiedossa, |
| --- | --- |

—

eläinten mikrobiologinen tila, jos se on tiedossa,

| — | eläinten määrä ja ikä, |
| --- | --- |

—

eläinten määrä ja ikä,

| — | eläinten alkuperä, koe-eläintilat, ruokavalio ja niin edelleen. |
| --- | --- |

—

eläinten alkuperä, koe-eläintilat, ruokavalio ja niin edelleen.

| | Testiolosuhteet






  — | ATP-määrityskitin alkuperä, eränumero ja valmistajan laadunvarmistus-/laadunvalvontatiedot, |
| --- | --- | --- |

Testiolosuhteet

—

ATP-määrityskitin alkuperä, eränumero ja valmistajan laadunvarmistus-/laadunvalvontatiedot,

| — | tiedot testiaineen valmistelusta ja annostelusta, |
| --- | --- |

—

tiedot testiaineen valmistelusta ja annostelusta,

| — | perustelut annostasojen valinnalle (mukaan luettuina kartoitustestin tulokset, jos sellainen on tehty), |
| --- | --- |

—

perustelut annostasojen valinnalle (mukaan luettuina kartoitustestin tulokset, jos sellainen on tehty),

| — | käytetyt kantaja- ja testiaineiden konsentraatiot ja annostellun testiaineen kokonaismäärä, |
| --- | --- |

—

käytetyt kantaja- ja testiaineiden konsentraatiot ja annostellun testiaineen kokonaismäärä,

| — | tiedot ravinnon ja veden laadusta (mukaan luettuina ruokavalion tyyppi/alkuperä, veden alkuperä), |
| --- | --- |

—

tiedot ravinnon ja veden laadusta (mukaan luettuina ruokavalion tyyppi/alkuperä, veden alkuperä),

| — | tiedot käsittely- ja näytteenottoaikatauluista, |
| --- | --- |

—

tiedot käsittely- ja näytteenottoaikatauluista,

| — | toksisuuden määritysmenetelmät, |
| --- | --- |

—

toksisuuden määritysmenetelmät,

| — | tulosten positiivisuuden tai negatiivisuuden arviointiperusteet, |
| --- | --- |

—

tulosten positiivisuuden tai negatiivisuuden arviointiperusteet,

| — | tiedot tutkimussuunnitelmasta poikkeamisesta ja selvitys siitä, miten poikkeaminen vaikuttaa tutkimuksen suunnitteluun ja tuloksiin. |
| --- | --- |

—

tiedot tutkimussuunnitelmasta poikkeamisesta ja selvitys siitä, miten poikkeaminen vaikuttaa tutkimuksen suunnitteluun ja tuloksiin.

| | Luotettavuuden tarkistus






  — | yhteenveto viimeisimmän luotettavuustarkistuksen tuloksista, mukaan luettuina tiedot käytetystä testiaineesta, konsentraatiosta ja kantaja-aineesta, |
| --- | --- | --- |

Luotettavuuden tarkistus

—

yhteenveto viimeisimmän luotettavuustarkistuksen tuloksista, mukaan luettuina tiedot käytetystä testiaineesta, konsentraatiosta ja kantaja-aineesta,

| — | testauslaboratorion samanaikaisesti ja/tai aiemmin tehtyjen positiivisten ja samanaikaisesti tehtyjen negatiivisten (liuotin/kantaja-aine) kontrollien tulokset, |
| --- | --- |

—

testauslaboratorion samanaikaisesti ja/tai aiemmin tehtyjen positiivisten ja samanaikaisesti tehtyjen negatiivisten (liuotin/kantaja-aine) kontrollien tulokset,

| — | jos mukana ei ollut samanaikaista positiivista kontrollia, viimeisimmän yksittäisen positiivisen kontrollin päivämäärä ja laboratorioraportti sekä yksityiskohtainen selvitys laboratorion aiemmista positiivista kontrollia koskevista tiedoista, joiden perusteella positiivista kontrollia ei tarvitse tehdä joka kerta. |
| --- | --- |

—

jos mukana ei ollut samanaikaista positiivista kontrollia, viimeisimmän yksittäisen positiivisen kontrollin päivämäärä ja laboratorioraportti sekä yksityiskohtainen selvitys laboratorion aiemmista positiivista kontrollia koskevista tiedoista, joiden perusteella positiivista kontrollia ei tarvitse tehdä joka kerta.

| | Tulokset






  — | kunkin hiiren paino annostelun alussa ja aikataulun mukaisen lopettamisen yhteydessä sekä kunkin annosryhmän keskimääräinen ja asiaan liittyviin muuttujiin liittyvä virhetermi (esimerkiksi keskihajonta tai keskiarvon keskivirhe), |
| --- | --- | --- |

Tulokset

—

kunkin hiiren paino annostelun alussa ja aikataulun mukaisen lopettamisen yhteydessä sekä kunkin annosryhmän keskimääräinen ja asiaan liittyviin muuttujiin liittyvä virhetermi (esimerkiksi keskihajonta tai keskiarvon keskivirhe),

| — | toksisuuden ilmeneminen ajan funktiona ja toksisuuden merkit, mukaan luettuna annostelualueen ihoärsytys, jos sellaista esiintyy, erikseen kullekin eläinyksilölle, |
| --- | --- |

—

toksisuuden ilmeneminen ajan funktiona ja toksisuuden merkit, mukaan luettuna annostelualueen ihoärsytys, jos sellaista esiintyy, erikseen kullekin eläinyksilölle,

| — | eläinten lopettamisen ja ATP-mittauksen ajankohta kunkin eläimen osalta, |
| --- | --- |

—

eläinten lopettamisen ja ATP-mittauksen ajankohta kunkin eläimen osalta,

| — | taulukko yksittäisten hiirten RLU-arvoista ja SI-arvoista kunkin käsitellyn annosryhmän osalta, |
| --- | --- |

—

taulukko yksittäisten hiirten RLU-arvoista ja SI-arvoista kunkin käsitellyn annosryhmän osalta,

| — | kunkin käsittelyryhmän hiirikohtaisen RLU-arvon keskimääräinen virhetermi ja asiaan liittyviin muuttujiin liittyvä virhetermi (esimerkiksi keskihajonta ja keskiarvon keskivirhe) sekä käyrän ulkopuolella olevien vasteiden analyysin tulokset kullekin käsittelyryhmälle, |
| --- | --- |

—

kunkin käsittelyryhmän hiirikohtaisen RLU-arvon keskimääräinen virhetermi ja asiaan liittyviin muuttujiin liittyvä virhetermi (esimerkiksi keskihajonta ja keskiarvon keskivirhe) sekä käyrän ulkopuolella olevien vasteiden analyysin tulokset kullekin käsittelyryhmälle,

| — | laskettu SI ja asianmukaisesti määritetty vaihteluväli, jossa otetaan huomioon eläintenvälinen vaihtelu sekä testiaineella että kontrolliaineella käsitellyissä ryhmissä, |
| --- | --- |

—

laskettu SI ja asianmukaisesti määritetty vaihteluväli, jossa otetaan huomioon eläintenvälinen vaihtelu sekä testiaineella että kontrolliaineella käsitellyissä ryhmissä,

| — | annos-vastesuhde, |
| --- | --- |

—

annos-vastesuhde,

| — | tarvittaessa tilastoanalyysit. |
| --- | --- |

—

tarvittaessa tilastoanalyysit.

| | Tulosten pohdinta






  — | tulosten lyhyt kommentointi, annos-vasteanalyysi ja tarvittaessa tilastoanalyysit sekä johtopäätös siitä, voidaanko testiainetta pitää ihoherkistystä aiheuttavana. |
| --- | --- | --- |

Tulosten pohdinta

—

tulosten lyhyt kommentointi, annos-vasteanalyysi ja tarvittaessa tilastoanalyysit sekä johtopäätös siitä, voidaanko testiainetta pitää ihoherkistystä aiheuttavana.

LÄHDELUETTELO

| (1) | OECD (2010). Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guideline No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines |
| --- | --- |

(1)

OECD (2010). Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guideline No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines

Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay

| (2) | Chamberlain, M. ja Basketter, D. A. (1996). The local lymph node assay: status of validation. Food Chem. Toxicol. 34, s. 999–1002. |
| --- | --- |

(2)

Chamberlain, M. ja Basketter, D. A. (1996). The local lymph node assay: status of validation. Food Chem. Toxicol. 34, s. 999–1002.

Food Chem. Toxicol

| (3) | Basketter, D. A., Gerberick, G. F., Kimber, I. ja Loveless, S. E. (1996). The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem. Toxicol. 34, s. 985–997. |
| --- | --- |

(3)

Basketter, D. A., Gerberick, G. F., Kimber, I. ja Loveless, S. E. (1996). The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem. Toxicol. 34, s. 985–997.

Food Chem. Toxicol

| (4) | Basketter, D. A., Gerberick, G. F. ja Kimber, I. (1998). Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. Toxicol. 36, s. 327–333. |
| --- | --- |

(4)

Basketter, D. A., Gerberick, G. F. ja Kimber, I. (1998). Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. Toxicol. 36, s. 327–333.

Food Chem. Toxicol.

| (5) | Van Och, F. M. M., Slob, W., De Jong, W. H., Vandebriel, R. J. ja Van Loveren, H. (2000). A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicol. 146, s. 49–59. |
| --- | --- |

(5)

Van Och, F. M. M., Slob, W., De Jong, W. H., Vandebriel, R. J. ja Van Loveren, H. (2000). A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicol. 146, s. 49–59.

Toxicol

| (6) | ICCVAM (1999). The murine local lymph node Assay: A test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH-julkaisunumero 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf |
| --- | --- |

(6)

ICCVAM (1999). The murine local lymph node Assay: A test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH-julkaisunumero 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf

| (7) | Dean, J. H., Twerdok, L. E., Tice, R. R., Sailstad, D. M., Hattan, D. G., Stokes, W. S. (2001). ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol 34, s. 258–273. |
| --- | --- |

(7)

Dean, J. H., Twerdok, L. E., Tice, R. R., Sailstad, D. M., Hattan, D. G., Stokes, W. S. (2001). ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol 34, s. 258–273.

Reg. Toxicol. Pharmacol

| (8) | Haneke, K. E., Tice, R. R., Carson, B. L., Margolin, B. H. ja Stokes, W. S. (2001). ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol 34, a. 274–286. |
| --- | --- |

(8)

Haneke, K. E., Tice, R. R., Carson, B. L., Margolin, B. H. ja Stokes, W. S. (2001). ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol 34, a. 274–286.

Reg. Toxicol. Pharmacol

| (9) | Sailstad, D. M., Hattan, D., Hill, R. N. ja Stokes, W. S. (2001). ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process. Reg. Toxicol. Pharmacol 34, s. 249–257. |
| --- | --- |

(9)

Sailstad, D. M., Hattan, D., Hill, R. N. ja Stokes, W. S. (2001). ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process. Reg. Toxicol. Pharmacol 34, s. 249–257.

Reg. Toxicol. Pharmacol

| (10) | ICCVAM (2010). ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioactive local lymph node assay: modified by Daicel Chemical Industries, Ltd, based on ATP content test method protocol (LLNA: DA). NIH-julkaisunumero 10-7551A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-DA/TMER.htm |
| --- | --- |

(10)

ICCVAM (2010). ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioactive local lymph node assay: modified by Daicel Chemical Industries, Ltd, based on ATP content test method protocol (LLNA: DA). NIH-julkaisunumero 10-7551A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-DA/TMER.htm

| (11) | ICCVAM (2009). Independent Scientific Peer Review Panel Report: Updated validation status of new versions and applications of the murine local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf. |
| --- | --- |

(11)

ICCVAM (2009). Independent Scientific Peer Review Panel Report: Updated validation status of new versions and applications of the murine local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf.

| (12) | Idehara, K., Yamagishi, G., Yamashita, K. ja Ito, M. (2008). Characterization and evaluation of a modified local lymph node assay using ATP content as a non-radio isotopic endpoint. J. Pharmacol. Toxicol. Meth. 58, s. 1–10. |
| --- | --- |

(12)

Idehara, K., Yamagishi, G., Yamashita, K. ja Ito, M. (2008). Characterization and evaluation of a modified local lymph node assay using ATP content as a non-radio isotopic endpoint. J. Pharmacol. Toxicol. Meth. 58, s. 1–10.

J. Pharmacol. Toxicol. Meth.

| (13) | Omori, T., Idehara, K., Kojima, H., Sozu, T., Arima, K., Goto, H., Hanada, T., Ikarashi, Y., Inoda, T., Kanazawa, Y., Kosaka, T., Maki, E., Morimoto, T., Shinoda, S., Shinoda, N., Takeyoshi, M., Tanaka, M., Uratani, M., Usami, M., Yamanaka, A., Yoneda, T., Yoshimura, I. ja Yuasa, A. (2008). Interlaboratory validation of the modified murine local lymph node assay based on adenosine triphosphate measurement. J. Pharmacol. Toxicol. Meth. 58, s. 11–26. |
| --- | --- |

(13)

Omori, T., Idehara, K., Kojima, H., Sozu, T., Arima, K., Goto, H., Hanada, T., Ikarashi, Y., Inoda, T., Kanazawa, Y., Kosaka, T., Maki, E., Morimoto, T., Shinoda, S., Shinoda, N., Takeyoshi, M., Tanaka, M., Uratani, M., Usami, M., Yamanaka, A., Yoneda, T., Yoshimura, I. ja Yuasa, A. (2008). Interlaboratory validation of the modified murine local lymph node assay based on adenosine triphosphate measurement. J. Pharmacol. Toxicol. Meth. 58, s. 11–26.

J. Pharmacol. Toxicol. Meth.

| (14) | OECD (1992). Skin Sensitisation, Test Guideline No. 406, Guidelines for Testing of Chemicals. OECD, Pariisi. Saatavilla osoittessa http://www.oecd.org/env/testguidelines |
| --- | --- |

(14)

OECD (1992). Skin Sensitisation, Test Guideline No. 406, Guidelines for Testing of Chemicals. OECD, Pariisi. Saatavilla osoittessa http://www.oecd.org/env/testguidelines

Skin Sensitisation

| (15) | Kreiling, R., Hollnagel, H. M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M. S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. ja Wendel, A. (2008). Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol. 46, s. 1896–1904. |
| --- | --- |

(15)

Kreiling, R., Hollnagel, H. M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M. S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. ja Wendel, A. (2008). Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol. 46, s. 1896–1904.

Food Chem. Toxicol

| (16) | Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrillo, J. C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. ja Mehling, A. (2009). Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. Pharmacol 55, s. 90–96. |
| --- | --- |

(16)

Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrillo, J. C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. ja Mehling, A. (2009). Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. Pharmacol 55, s. 90–96.

Reg. Toxicol. Pharmacol

| (17) | Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J. ja Fletcher J. (1993). The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J. Immunol. Meth. 160, s. 81–88. |
| --- | --- |

(17)

Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J. ja Fletcher J. (1993). The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J. Immunol. Meth. 160, s. 81–88.

J. Immunol. Meth

| (18) | Ishizaka, A., Tono-oka, T. ja Matsumoto, S. (1984). Evaluation of the proliferative response of lymphocytes by measurement of intracellular ATP. J. Immunol. Meth. 72, s. 127–132. |
| --- | --- |

(18)

Ishizaka, A., Tono-oka, T. ja Matsumoto, S. (1984). Evaluation of the proliferative response of lymphocytes by measurement of intracellular ATP. J. Immunol. Meth. 72, s. 127–132.

J. Immunol. Meth

| (19) | Dexter, S. J., Cámara, M., Davies, M. ja Shakesheff, K. M. (2003). Development of a bioluminescent ATP assay to quantify mammalian and bacterial cell number from a mixed population. Biomat. 24, s. 27–34. |
| --- | --- |

(19)

Dexter, S. J., Cámara, M., Davies, M. ja Shakesheff, K. M. (2003). Development of a bioluminescent ATP assay to quantify mammalian and bacterial cell number from a mixed population. Biomat. 24, s. 27–34.

Biomat.

| (20) | Lundin A. (2000). Use of firefly luciferase in ATP-related assays of biomass, enzymes, and metabolites. Meth. Enzymol. 305, s. 346–370. |
| --- | --- |

(20)

Lundin A. (2000). Use of firefly luciferase in ATP-related assays of biomass, enzymes, and metabolites. Meth. Enzymol. 305, s. 346–370.

Meth. Enzymol

| (21) | ILAR (1996). Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 7. painos. Washington, DC: National Academies Press. |
| --- | --- |

(21)

ILAR (1996). Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 7. painos. Washington, DC: National Academies Press.

| (22) | ICCVAM (2009). Recommended Performance Standards: Murine Local Lymph Node Assay. NIH-julkaisunumero 09-7357. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Science. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf |
| --- | --- |

(22)

ICCVAM (2009). Recommended Performance Standards: Murine Local Lymph Node Assay. NIH-julkaisunumero 09-7357. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Science. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf

| (23) | McGarry, H. F. (2007). The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH. Toxicol. 238, s. 71–89. |
| --- | --- |

(23)

McGarry, H. F. (2007). The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH. Toxicol. 238, s. 71–89.

Toxicol

| (24) | Kimber, I., Dearman, R. J., Scholes, E. W. ja Basketter, D. A. (1994). The local lymph node assay: developments and applications. Toxicol. 93, s. 13–31. |
| --- | --- |

(24)

Kimber, I., Dearman, R. J., Scholes, E. W. ja Basketter, D. A. (1994). The local lymph node assay: developments and applications. Toxicol. 93, s. 13–31.

Toxicol

| (25) | OECD (2002). Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No. 404, Guidelines for Testing of Chemicals. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines |
| --- | --- |

(25)

OECD (2002). Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No. 404, Guidelines for Testing of Chemicals. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines

Acute Dermal Irritation/Corrosion

| (26) | Reeder, M. K., Broomhead, Y. L., DiDonato, L. ja DeGeorge, G. L. (2007). Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances. Toxicologist 96, s. 235. |
| --- | --- |

(26)

Reeder, M. K., Broomhead, Y. L., DiDonato, L. ja DeGeorge, G. L. (2007). Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances. Toxicologist 96, s. 235.

Toxicologist

| (27) | ICCVAM (2009). Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf. |
| --- | --- |

(27)

ICCVAM (2009). Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf.

| (28) | Hayes, B. B., Gerber, P. C., Griffey, S. S. ja Meade, B. J. (1998). Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice. Drug. Chem. Toxicol. 21, s. 195–206. |
| --- | --- |

(28)

Hayes, B. B., Gerber, P. C., Griffey, S. S. ja Meade, B. J. (1998). Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice. Drug. Chem. Toxicol. 21, s. 195–206.

Drug. Chem. Toxicol.

| (29) | Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H. C., Ruzicka, T., Ahr, H. J., Lehmann, P. ja Vohr, V. W. (1998). An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxicol. Appl. Pharmacol. 153, s. 83–94. |
| --- | --- |

(29)

Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H. C., Ruzicka, T., Ahr, H. J., Lehmann, P. ja Vohr, V. W. (1998). An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxicol. Appl. Pharmacol. 153, s. 83–94.

Toxicol. Appl. Pharmacol

| (30) | Woolhiser, M. R., Hayes, B. B. ja Meade, B. J. (1998). A combined murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals. Toxicol. Meth. 8, s. 245–256. |
| --- | --- |

(30)

Woolhiser, M. R., Hayes, B. B. ja Meade, B. J. (1998). A combined murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals. Toxicol. Meth. 8, s. 245–256.

Toxicol. Meth.

| (31) | Hayes, B. B. ja Meade, B. J. (1999). Contact sensitivity to selected acrylate compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods. Drug. Chem. Toxicol. 22, s. 491–506. |
| --- | --- |

(31)

Hayes, B. B. ja Meade, B. J. (1999). Contact sensitivity to selected acrylate compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods. Drug. Chem. Toxicol. 22, s. 491–506.

Drug. Chem. Toxicol

| (32) | Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A. O., van Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. ja Vohr, H. W. (2005). A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol. 212, s. 60–68. |
| --- | --- |

(32)

Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A. O., van Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. ja Vohr, H. W. (2005). A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol. 212, s. 60–68.

Toxicol

| (33) | Vohr, H. W. ja Ahr, H. J. (2005). The local lymph node assay being too sensitive? Arch. Toxicol. 79, s. 721–728. |
| --- | --- |

(33)

Vohr, H. W. ja Ahr, H. J. (2005). The local lymph node assay being too sensitive? Arch. Toxicol. 79, s. 721–728.

Arch. Toxicol.

| (34) | Patterson, R. M., Noga, E. ja Germolec, D. (2007). Lack of evidence for contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect. 115, s. 1023–1028. |
| --- | --- |

(34)

Patterson, R. M., Noga, E. ja Germolec, D. (2007). Lack of evidence for contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect. 115, s. 1023–1028.

Environ. Health Perspect

| (35) | ICCVAM (2009). Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm |
| --- | --- |

(35)

ICCVAM (2009). Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm

In Vitro

| (36) | OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines |
| --- | --- |

(36)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines

Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation

| (37) | Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R. J., Gerberick, G. F., Ryan, C. A., Basketter, D. A., Lea, L., House, R. V., Ladies, G. S., Loveless, S. E. ja Hastings, K. L. (1998). Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ. Health 53, s. 563–79. |
| --- | --- |

(37)

Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R. J., Gerberick, G. F., Ryan, C. A., Basketter, D. A., Lea, L., House, R. V., Ladies, G. S., Loveless, S. E. ja Hastings, K. L. (1998). Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ. Health 53, s. 563–79.

J. Toxicol. Environ. Health

| (38) | OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines |
| --- | --- |

(38)

OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines

Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment

Lisäys 1

MÄÄRITELMÄT

Tarkkuus: Testimenetelmän tulosten ja hyväksyttyjen vertailuarvojen välinen ero. Tarkkuus on testimenetelmän suorituskyvyn mitta ja yksi merkityksellisyyden osatekijöistä. Tarkkuutta ja vastaavuutta (konkordanssia) käytetään usein toisiaan korvaavasti tarkoittamaan testimenetelmällä saatujen oikeiden tulosten osuutta (38).

Vertailuaine: Herkistävä tai muu kuin herkistävä aine, jota käytetään testiaineen vertailustandardina. Vertailuaineella on oltava seuraavat ominaisuudet: i) luotettava alkuperä, joka pysyy samana, ii) samanlainen rakenne ja toiminta kuin testiaineryhmällä, iii) tunnetut fysikaaliskemialliset ominaisuudet, iv) todisteet tunnetuista vaikutuksista ja v) tunnettu voimakkuus tavoitellulla vasteen vaihteluvälillä.

Väärä negatiivinen: Aine on testimenetelmässä määritetty väärin perustein negatiiviseksi tai inaktiiviseksi, vaikka se itse asiassa on positiivinen tai aktiivinen.

Väärä positiivinen: Aine on testimenetelmässä määritetty väärin perustein positiiviseksi tai aktiiviseksi, vaikka se itse asiassa on negatiivinen tai inaktiivinen.

Vaarallisuus: Mahdollisuus kielteiseen terveys- tai ympäristövaikutukseen. Kielteinen vaikutus edellyttää altistumista vähintään tietyllä tasolla.

Laboratorioidenvälinen uusittavuus: Se, missä määrin eri (pätevät) laboratoriot voivat saada aikaan laadullisesti ja määrällisesti samanlaisia tuloksia käyttämällä samoja tutkimussuunnitelmia ja testaamalla samoja testiaineita. Laboratorioidenvälinen uusittavuus määritetään esivalidointi- ja validointimenettelyissä, ja se osoittaa, missä määrin testi voidaan onnistuneesti toteuttaa eri laboratorioissa (38).

Laboratorionsisäinen uusittavuus: Se, missä määrin pätevä laboratoriohenkilöstö voi (kyseisessä laboratoriossa) saada onnistuneesti aikaan samat tulokset käyttämällä tiettyä tutkimussuunnitelmaa eri ajankohtina (38).

Käyrän ulkopuolella oleva vaste: Käyrän ulkopuolella olevalla vasteella tarkoitetaan havaintoa, joka poikkeaa merkittävästi muista populaation sattumanvaraisten näytteiden arvoista.

Laadunvarmistus: Hallintomenettely, jossa testausta suorittavista henkilöistä riippumattomat henkilöt arvioivat laboratorion testausstandardien, vaatimusten ja kirjanpitomenettelyjen noudattamista ja tiedonsiirron tarkkuutta.

Luotettavuus: Laajuus, jolla testimenetelmä on uusittavissa samassa laboratoriossa tai eri laboratorioissa pidemmällä aikavälillä käytettäessä samaa tutkimussuunnitelmaa. Luotettavuus arvioidaan laskemalla laboratorionsisäinen ja laboratorioidenvälinen uusittavuus (38).

Ihoherkistys: Immunologinen prosessi, joka aiheutuu herkän yksilön paikallisesta altistamisesta tietylle kemialliselle allergeenille, joka aiheuttaa iholla immuunivasteen, joka voi johtaa kosketusherkistykseen.

Stimulaatioindeksi (SI): Testiaineen ihoärsytyspotentiaalin arvioimiseksi laskettu arvo, jolla esitetään käsiteltyjen ryhmien soluproliferaation ja samanaikaisesti kantaja-aineella käsitellyn kontrolliryhmän soluproliferaation välinen suhde.

Testiaine (testikemikaali): Aine tai seos, jota testataan tällä testimenetelmällä.

B.51.   IHOHERKISTYS: PAIKALLINEN IMUSOLMUKEMÄÄRITYSMENETELMÄ: BRDU-ELISA

B.51.

IHOHERKISTYS: PAIKALLINEN IMUSOLMUKEMÄÄRITYSMENETELMÄ: BRDU-ELISA

JOHDANTO

| 1. | Kemikaalien testausta koskevia OECD:n suuntaviivoja ja EU:n testimenetelmiä tarkistetaan säännöllisesti tieteellisen kehityksen, muuttuvien sääntelytarpeiden ja eläinten hyvinvointiin liittyvien kysymysten perusteella. Ensimmäinen, hiirten ihoherkistyksen määrittämisessä käytettävä testimenetelmä (B.42) eli paikallinen imusolmukemääritysmenetelmä (Local Lymph Node Assay, LLNA; OECD:n testiohje 429) on tarkistettu (1 ja tämän liitteen B.42 luku). LLNA-menetelmän validointia koskevat yksityiskohtaiset tiedot ja yleiskatsaus siihen liittyneestä työstä on julkaistu (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). LLNA-menetelmässä lymfosyyttien proliferaatio määritetään radioisotoopilla leimatun tymidiinin tai jodin avulla. Siksi määritysmenetelmän käyttö on rajattua paikoissa, joissa radioaktiivisten aineiden hankkiminen, käyttö tai hävittäminen on ongelmallista. LLNA: BrdU-ELISA (entsyymivälitteinen immunosorbenttimääritysmenetelmä) on LLNA-testimenetelmän muunnos, jossa ei käytetä radioisotooppeja ja jossa lymfosyyttien proliferaatio määritetään ELISA-testijärjestelmässä käyttämällä ei-radioaktiivisesti merkattua 5-bromi-2-deoksiuridiinia (BrdU) (CAS-numero 59-14-3). Kansainvälinen riippumaton tieteellinen vertaisarviointityöryhmä on arvioinut LLNA: BrdU-ELISA -testimenetelmä, validoinut sen ja katsonut, että sillä voidaan määrittää ihoa herkistäviä ja muita kuin herkistäviä kemikaaleja tietyin rajoituksin (10) (11) (12). Tämä testimenetelmä on suunniteltu kemikaalien (aineiden ja seosten) ihoherkistyspotentiaalin arvioimiseen eläimillä. Tämän liitteen B.6 luvussa ja OECD:n testiohjeessa 406 käytetään marsutestejä, erityisesti marsuilla tehtävää maksimointitestiä ja Bühlerin testiä (13). LLNA-menetelmällä (tämän liitteen B.42 luku; OECD:n testiohje 429) ja sen kahdella muuhun kuin radioaktiivisuuteen perustuvalla mukautuksella eli LLNA: BrdU-ELISA -menetelmällä (tämän liitteen B.51 luku; OECD:n testiohje 442 B) ja LLNA: DA -menetelmällä (tämän liitteen B.50 luku; OECD:n testiohje 442 A) voidaan kaikilla vähentää testeihin käytettävien eläinten määrää. Näin ollen ne ovat eläinten käytön osalta edistyneempiä kuin B.6 luvussa ja OECD:n testiohjeessa 406 (13) tarkoitetut marsutestit. |
| --- | --- |

1.

Kemikaalien testausta koskevia OECD:n suuntaviivoja ja EU:n testimenetelmiä tarkistetaan säännöllisesti tieteellisen kehityksen, muuttuvien sääntelytarpeiden ja eläinten hyvinvointiin liittyvien kysymysten perusteella. Ensimmäinen, hiirten ihoherkistyksen määrittämisessä käytettävä testimenetelmä (B.42) eli paikallinen imusolmukemääritysmenetelmä (Local Lymph Node Assay, LLNA; OECD:n testiohje 429) on tarkistettu (1 ja tämän liitteen B.42 luku). LLNA-menetelmän validointia koskevat yksityiskohtaiset tiedot ja yleiskatsaus siihen liittyneestä työstä on julkaistu (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). LLNA-menetelmässä lymfosyyttien proliferaatio määritetään radioisotoopilla leimatun tymidiinin tai jodin avulla. Siksi määritysmenetelmän käyttö on rajattua paikoissa, joissa radioaktiivisten aineiden hankkiminen, käyttö tai hävittäminen on ongelmallista. LLNA: BrdU-ELISA (entsyymivälitteinen immunosorbenttimääritysmenetelmä) on LLNA-testimenetelmän muunnos, jossa ei käytetä radioisotooppeja ja jossa lymfosyyttien proliferaatio määritetään ELISA-testijärjestelmässä käyttämällä ei-radioaktiivisesti merkattua 5-bromi-2-deoksiuridiinia (BrdU) (CAS-numero 59-14-3). Kansainvälinen riippumaton tieteellinen vertaisarviointityöryhmä on arvioinut LLNA: BrdU-ELISA -testimenetelmä, validoinut sen ja katsonut, että sillä voidaan määrittää ihoa herkistäviä ja muita kuin herkistäviä kemikaaleja tietyin rajoituksin (10) (11) (12). Tämä testimenetelmä on suunniteltu kemikaalien (aineiden ja seosten) ihoherkistyspotentiaalin arvioimiseen eläimillä. Tämän liitteen B.6 luvussa ja OECD:n testiohjeessa 406 käytetään marsutestejä, erityisesti marsuilla tehtävää maksimointitestiä ja Bühlerin testiä (13). LLNA-menetelmällä (tämän liitteen B.42 luku; OECD:n testiohje 429) ja sen kahdella muuhun kuin radioaktiivisuuteen perustuvalla mukautuksella eli LLNA: BrdU-ELISA -menetelmällä (tämän liitteen B.51 luku; OECD:n testiohje 442 B) ja LLNA: DA -menetelmällä (tämän liitteen B.50 luku; OECD:n testiohje 442 A) voidaan kaikilla vähentää testeihin käytettävien eläinten määrää. Näin ollen ne ovat eläinten käytön osalta edistyneempiä kuin B.6 luvussa ja OECD:n testiohjeessa 406 (13) tarkoitetut marsutestit.

| 2. | Kuten LLNA-menetelmässä, myös LLNA: BrdU-ELISA -menetelmässä tutkitaan ihoherkistyksen induktiovaihetta ja tuotetaan annosvasteen arviointiin sopivia kvantitatiivisia tuloksia. Koska ihoa herkistäviä aineita voidaan tunnistaa ilman radioaktiivista DNA-merkkiainetta, työssä ei altistuta radioaktiivisuudelle, eikä jätteiden hävittäminen aiheuta ongelmia. Tämä voi johtaa hiirten entistä yleisempään käyttöön ihoa herkistävien aineiden tunnistamisessa, millä puolestaan vähennetään entisestään marsujen käyttämistä ihoherkistyspotentiaalin testauksessa (B.6 menetelmä; OECD:n testiohje 406) (13). |
| --- | --- |

2.

Kuten LLNA-menetelmässä, myös LLNA: BrdU-ELISA -menetelmässä tutkitaan ihoherkistyksen induktiovaihetta ja tuotetaan annosvasteen arviointiin sopivia kvantitatiivisia tuloksia. Koska ihoa herkistäviä aineita voidaan tunnistaa ilman radioaktiivista DNA-merkkiainetta, työssä ei altistuta radioaktiivisuudelle, eikä jätteiden hävittäminen aiheuta ongelmia. Tämä voi johtaa hiirten entistä yleisempään käyttöön ihoa herkistävien aineiden tunnistamisessa, millä puolestaan vähennetään entisestään marsujen käyttämistä ihoherkistyspotentiaalin testauksessa (B.6 menetelmä; OECD:n testiohje 406) (13).

MÄÄRITELMÄT

| 3. | Sovellettavat määritelmät esitetään lisäyksessä 1. |
| --- | --- |

3.

Sovellettavat määritelmät esitetään lisäyksessä 1.

JOHDANTO JA RAJOITUKSET

| 4. | LLNA: BrdU-ELISA -menetelmä on mukautettu LLNA-menetelmä mahdollisten ihoa herkistävien kemikaalien tunnistamiseksi tietyin rajoituksin. Tämä ei välttämättä merkitse sitä, että LLNA: BrdU-ELISA -menetelmää pitäisi käyttää kaikissa tapauksissa LLNA-menetelmän tai marsutestin asemesta (B.6 menetelmä; OECD:n testiohje 406) (13), vaan pikemminkin sitä, että määritysmenetelmä on yhtä hyvä ja sitä voidaan käyttää vaihtoehtona, jossa positiivisia ja negatiivisia tuloksia ei yleensä enää tarvitse varmistaa uudelleen (10) (11). Testilaboratorion on otettava huomioon kaikki testiaineesta saatavilla olevat tiedot ennen tutkimuksen tekemistä. Tällaisia tietoja ovat muun muassa testiaineen tunnistetiedot ja kemiallinen rakenne, sen fysikaaliskemialliset ominaisuudet, muiden aineella tehtyjen in vitro- tai in vivo -myrkyllisyystestien tulokset sekä rakenteellisesti samankaltaisten kemikaalien toksikologiset tiedot. Tietojen perusteella on määritettävä, voidaanko LLNA: BrdU-ELISA -menetelmää käyttää kyseisen aineen testaamiseen (ottaen huomioon, että LLNA: BrdU-ELISA -menetelmä ei sovellu tiettyjen kemikaalityyppien testaamiseen (katso 5 kohta)) ja mitä annosta on käytettävä. |
| --- | --- |

4.

LLNA: BrdU-ELISA -menetelmä on mukautettu LLNA-menetelmä mahdollisten ihoa herkistävien kemikaalien tunnistamiseksi tietyin rajoituksin. Tämä ei välttämättä merkitse sitä, että LLNA: BrdU-ELISA -menetelmää pitäisi käyttää kaikissa tapauksissa LLNA-menetelmän tai marsutestin asemesta (B.6 menetelmä; OECD:n testiohje 406) (13), vaan pikemminkin sitä, että määritysmenetelmä on yhtä hyvä ja sitä voidaan käyttää vaihtoehtona, jossa positiivisia ja negatiivisia tuloksia ei yleensä enää tarvitse varmistaa uudelleen (10) (11). Testilaboratorion on otettava huomioon kaikki testiaineesta saatavilla olevat tiedot ennen tutkimuksen tekemistä. Tällaisia tietoja ovat muun muassa testiaineen tunnistetiedot ja kemiallinen rakenne, sen fysikaaliskemialliset ominaisuudet, muiden aineella tehtyjen in vitro- tai in vivo -myrkyllisyystestien tulokset sekä rakenteellisesti samankaltaisten kemikaalien toksikologiset tiedot. Tietojen perusteella on määritettävä, voidaanko LLNA: BrdU-ELISA -menetelmää käyttää kyseisen aineen testaamiseen (ottaen huomioon, että LLNA: BrdU-ELISA -menetelmä ei sovellu tiettyjen kemikaalityyppien testaamiseen (katso 5 kohta)) ja mitä annosta on käytettävä.

in vitro

in vivo

| 5. | LLNA: BrdU-ELISA on in vivo -menetelmä, joten sen käyttö ei merkitse koe-eläinten käytön loppumista kosketusherkistyksen arvioinnissa. Sillä voidaan kuitenkin vähentää tähän tarkoitukseen käytettävien eläinten määrää marsutesteihin verrattuna (B.6 menetelmä; OECD:n testiohje 406) (13). LLNA: BrdU-ELISA -menetelmässä käytetty tapa testata kosketusherkistystä eläimillä on myös huomattavasti edistyneempi, koska toisin kuin B.6 menetelmässä ja OECD:n testiohjeessa 406, LLNA: BrdU-ELISA -menetelmässä ei edellytetä tarkoituksellista ihon yliherkkyysreaktioiden tuottamista. LLNA: BrdU-ELISA -menetelmä ei myöskään edellytä adjuvantin käyttöä, toisin kuin marsuilla tehtävä maksimointitesti (tämän liitteen B.6 luku, 13). Näin ollen LLNA: BrdU-ELISA -menetelmällä vähennetään eläinten kärsimystä. Vaikka LLNA: BrdU-ELISA -menetelmä onkin tietyllä tasolla edistyneempi kuin B.6 menetelmä tai OECD:n testiohje 406 (13), siihen liittyy tiettyjä rajoituksia, joiden vuoksi voi olla tarpeen käyttää B.6 menetelmää tai OECD:n testiohjetta 406 (esimerkiksi tiettyjen metallien testaus, väärät positiiviset löydökset joidenkin ihoa ärsyttävien aineiden, esimerkiksi pinta-aktiivisten aineiden osalta (6) (1 ja tämän liitteen B.42 luku) tai testiaineen liukoisuus). Häiritseviä (15) funktionaalisia ryhmiä sisältävien kemikaaliluokkien tai aineiden yhteydessä voi olla tarpeen käyttää marsutestejä (B.6 menetelmä; OECD:n testiohje 406 (13)). LLNA-menetelmälle asetettuja rajoituksia (1 ja tämän liitteen B.42 luku) on sovellettava myös LLNA: BrdU-ELISA -menetelmään (10). Tällaisia tunnistettuja rajoituksia lukuun ottamatta mitä tahansa kemikaaleja pitäisi voida testata LLNA: BrdU-ELISA -menetelmällä, elleivät kyseisten kemikaalien ominaisuudet vaikuta LLNA: BrdU-ELISA -menetelmän tarkkuuteen. Myös positiivisten rajatulosten mahdollisuus on otettava huomioon, kun saadaan stimulaatioindeksiksi (SI) 1,6–1,9 (katso 31–32 kohta). Tämä perustuu 43 aineen validointitietokantaan, jossa aineiden SI ≥ 1,6 (katso 6 kohta) ja jossa LLNA: BrdU-ELISA -menetelmällä on tunnistettu oikein kaikki 32 herkistystä aiheuttavaa LLNA-ainetta mutta tunnistettu väärin kaksi niistä 11 muusta kuin herkistystä aiheuttavasta LLNA-aineesta, joiden SI-arvo on 1,6–1,9 (positiivinen rajatulos) (10). Koska samaa tulosjoukkoa on käytetty SI-arvojen määrittämiseen ja testin ennakoivien ominaisuuksien laskemiseen, esitetyissä tuloksissa voidaan yliarvioida todellisia ennakoivia ominaisuuksia. |
| --- | --- |

5.

LLNA: BrdU-ELISA on in vivo -menetelmä, joten sen käyttö ei merkitse koe-eläinten käytön loppumista kosketusherkistyksen arvioinnissa. Sillä voidaan kuitenkin vähentää tähän tarkoitukseen käytettävien eläinten määrää marsutesteihin verrattuna (B.6 menetelmä; OECD:n testiohje 406) (13). LLNA: BrdU-ELISA -menetelmässä käytetty tapa testata kosketusherkistystä eläimillä on myös huomattavasti edistyneempi, koska toisin kuin B.6 menetelmässä ja OECD:n testiohjeessa 406, LLNA: BrdU-ELISA -menetelmässä ei edellytetä tarkoituksellista ihon yliherkkyysreaktioiden tuottamista. LLNA: BrdU-ELISA -menetelmä ei myöskään edellytä adjuvantin käyttöä, toisin kuin marsuilla tehtävä maksimointitesti (tämän liitteen B.6 luku, 13). Näin ollen LLNA: BrdU-ELISA -menetelmällä vähennetään eläinten kärsimystä. Vaikka LLNA: BrdU-ELISA -menetelmä onkin tietyllä tasolla edistyneempi kuin B.6 menetelmä tai OECD:n testiohje 406 (13), siihen liittyy tiettyjä rajoituksia, joiden vuoksi voi olla tarpeen käyttää B.6 menetelmää tai OECD:n testiohjetta 406 (esimerkiksi tiettyjen metallien testaus, väärät positiiviset löydökset joidenkin ihoa ärsyttävien aineiden, esimerkiksi pinta-aktiivisten aineiden osalta (6) (1 ja tämän liitteen B.42 luku) tai testiaineen liukoisuus). Häiritseviä (15) funktionaalisia ryhmiä sisältävien kemikaaliluokkien tai aineiden yhteydessä voi olla tarpeen käyttää marsutestejä (B.6 menetelmä; OECD:n testiohje 406 (13)). LLNA-menetelmälle asetettuja rajoituksia (1 ja tämän liitteen B.42 luku) on sovellettava myös LLNA: BrdU-ELISA -menetelmään (10). Tällaisia tunnistettuja rajoituksia lukuun ottamatta mitä tahansa kemikaaleja pitäisi voida testata LLNA: BrdU-ELISA -menetelmällä, elleivät kyseisten kemikaalien ominaisuudet vaikuta LLNA: BrdU-ELISA -menetelmän tarkkuuteen. Myös positiivisten rajatulosten mahdollisuus on otettava huomioon, kun saadaan stimulaatioindeksiksi (SI) 1,6–1,9 (katso 31–32 kohta). Tämä perustuu 43 aineen validointitietokantaan, jossa aineiden SI ≥ 1,6 (katso 6 kohta) ja jossa LLNA: BrdU-ELISA -menetelmällä on tunnistettu oikein kaikki 32 herkistystä aiheuttavaa LLNA-ainetta mutta tunnistettu väärin kaksi niistä 11 muusta kuin herkistystä aiheuttavasta LLNA-aineesta, joiden SI-arvo on 1,6–1,9 (positiivinen rajatulos) (10). Koska samaa tulosjoukkoa on käytetty SI-arvojen määrittämiseen ja testin ennakoivien ominaisuuksien laskemiseen, esitetyissä tuloksissa voidaan yliarvioida todellisia ennakoivia ominaisuuksia.

in vivo

TESTIMENETELMÄN PERIAATE

| 6. | LLNA: BrdU-ELISA -menetelmän perusperiaate on, että ihoa herkistävät aineet aiheuttavat lymfosyyttien proliferaatiota imusolmukkeissa, jotka dreneeraavat testiaineen annostelualueen. Tämä proliferaatio on suhteessa käytettyyn annokseen ja allergeenin voimakkuuteen ja tarjoaa yksinkertaisen keinon ihoherkistyksen mittaamiseksi kvantitatiivisella tavalla. Proliferaatio mitataan vertaamalla kussakin testiryhmässä tapahtuvaa keskimääräistä soluproliferaatiota kantaja-aineella käsitellyssä kontrolliryhmässä tapahtuvaan keskimääräiseen soluproliferaatioon. Kunkin testiryhmän keskimääräisen soluproliferaation ja sitä vastaavan kontrolliryhmän keskimääräisen soluproliferaation suhde (SI) määritetään, ja sen on oltava yhtä suuri tai suurempi kuin 1,6, jotta testiaineen mahdollista ihoherkistyspotentiaalia olisi syytä arvioida tarkemmin. Tässä kuvatut menetelmät perustuvat korvalehden dreneeraavien imusolmukkeiden solujen lisääntymisen määrittämiseen BrdU-pitoisuuden mittaamisen avulla. BrdU on tymidiinin analogi ja inkorporoituu lisääntyvien solujen DNA:han samalla tavalla. BrdU:n inkorporoitumista mitataan ELISA-menetelmällä, jossa käytetään BrdU-spesifistä vasta-ainetta, joka leimataan myös peroksidaasilla. Kun lisätään peroksidaasi-entsyymin substraatti, peroksidaasi reagoi substraatin kanssa ja muodostaa värillisen tuotteen, jonka määrä määritetään mittaamalla absorbanssi tietyllä aallonpituudella käyttämällä kuoppalevyjen lukulaitetta. |
| --- | --- |

6.

LLNA: BrdU-ELISA -menetelmän perusperiaate on, että ihoa herkistävät aineet aiheuttavat lymfosyyttien proliferaatiota imusolmukkeissa, jotka dreneeraavat testiaineen annostelualueen. Tämä proliferaatio on suhteessa käytettyyn annokseen ja allergeenin voimakkuuteen ja tarjoaa yksinkertaisen keinon ihoherkistyksen mittaamiseksi kvantitatiivisella tavalla. Proliferaatio mitataan vertaamalla kussakin testiryhmässä tapahtuvaa keskimääräistä soluproliferaatiota kantaja-aineella käsitellyssä kontrolliryhmässä tapahtuvaan keskimääräiseen soluproliferaatioon. Kunkin testiryhmän keskimääräisen soluproliferaation ja sitä vastaavan kontrolliryhmän keskimääräisen soluproliferaation suhde (SI) määritetään, ja sen on oltava yhtä suuri tai suurempi kuin 1,6, jotta testiaineen mahdollista ihoherkistyspotentiaalia olisi syytä arvioida tarkemmin. Tässä kuvatut menetelmät perustuvat korvalehden dreneeraavien imusolmukkeiden solujen lisääntymisen määrittämiseen BrdU-pitoisuuden mittaamisen avulla. BrdU on tymidiinin analogi ja inkorporoituu lisääntyvien solujen DNA:han samalla tavalla. BrdU:n inkorporoitumista mitataan ELISA-menetelmällä, jossa käytetään BrdU-spesifistä vasta-ainetta, joka leimataan myös peroksidaasilla. Kun lisätään peroksidaasi-entsyymin substraatti, peroksidaasi reagoi substraatin kanssa ja muodostaa värillisen tuotteen, jonka määrä määritetään mittaamalla absorbanssi tietyllä aallonpituudella käyttämällä kuoppalevyjen lukulaitetta.

MÄÄRITYSMENETELMÄN KUVAUS

Eläinlajin valinta

Eläinlajin valinta

| 7. | Tähän testiin paras eläinlaji on hiiri. LLNA: BrdU-ELISA -määritysmenetelmän validointitutkimukset on tehty yksinomaan CBA/JN-kannalla, joten sen käyttöä suositellaan (10) (12). Määritysmenetelmässä käytetään nuoria täysikasvuisia naarashiiriä, jotka eivät ole poikineet eivätkä ole tiineenä. Testin alussa eläinten on oltava 8–12 viikon ikäisiä, ja eläinten painoerojen on oltava vähäisiä eli enintään 20 prosenttia keskipainosta. Muita kantoja tai uroseläimiä voidaan käyttää, jos tietoja tuotetaan riittävästi sen osoittamiseksi, että LLNA: BrdU-ELISA -vasteessa ei esiinny merkitseviä koe-eläinkantaan tai sukupuoleen liittyviä eroja. |
| --- | --- |

7.

Tähän testiin paras eläinlaji on hiiri. LLNA: BrdU-ELISA -määritysmenetelmän validointitutkimukset on tehty yksinomaan CBA/JN-kannalla, joten sen käyttöä suositellaan (10) (12). Määritysmenetelmässä käytetään nuoria täysikasvuisia naarashiiriä, jotka eivät ole poikineet eivätkä ole tiineenä. Testin alussa eläinten on oltava 8–12 viikon ikäisiä, ja eläinten painoerojen on oltava vähäisiä eli enintään 20 prosenttia keskipainosta. Muita kantoja tai uroseläimiä voidaan käyttää, jos tietoja tuotetaan riittävästi sen osoittamiseksi, että LLNA: BrdU-ELISA -vasteessa ei esiinny merkitseviä koe-eläinkantaan tai sukupuoleen liittyviä eroja.

Koe-eläintilat ja eläinten ruokinta

Koe-eläintilat ja eläinten ruokinta

| 8. | Hiiret on pidettävä yhteishäkeissä (16), ellei hiirien pitämiselle erillisissä häkeissä esitetä riittäviä tieteellisiä perusteluja. Koe-eläintilan lämpötilan on oltava 22 ± 3 celsiusastetta. Vaikka riittää, että suhteellinen kosteus on vähintään 30 prosenttia eikä mielellään ylitä 70 prosenttia muulloin kuin huoneen puhdistuksen aikana, on kuitenkin pyrittävä 50–60 prosentin suhteelliseen kosteuteen. Huoneessa on käytettävä keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa, 12 tuntia pimeää). Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruokavaliota, eikä juomaveden määrää saa rajoittaa. |
| --- | --- |

8.

Hiiret on pidettävä yhteishäkeissä (16), ellei hiirien pitämiselle erillisissä häkeissä esitetä riittäviä tieteellisiä perusteluja. Koe-eläintilan lämpötilan on oltava 22 ± 3 celsiusastetta. Vaikka riittää, että suhteellinen kosteus on vähintään 30 prosenttia eikä mielellään ylitä 70 prosenttia muulloin kuin huoneen puhdistuksen aikana, on kuitenkin pyrittävä 50–60 prosentin suhteelliseen kosteuteen. Huoneessa on käytettävä keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa, 12 tuntia pimeää). Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruokavaliota, eikä juomaveden määrää saa rajoittaa.

Eläinten valmistelu

Eläinten valmistelu

| 9. | Eläimet valitaan satunnaistetusti, merkitään niin, että yksilöt voidaan erottaa toisistaan (ei kuitenkaan korvamerkeillä), ja pidetään häkeissä vähintään viiden päivän ajan ennen testiaineen annostelun aloittamista, jotta ne tottuvat laboratorio-olosuhteisiin. Ennen käsittelyn alkua kaikki eläimet on tutkittava sen varmistamiseksi, ettei niillä ole havaittavia ihovaurioita. |
| --- | --- |

9.

Eläimet valitaan satunnaistetusti, merkitään niin, että yksilöt voidaan erottaa toisistaan (ei kuitenkaan korvamerkeillä), ja pidetään häkeissä vähintään viiden päivän ajan ennen testiaineen annostelun aloittamista, jotta ne tottuvat laboratorio-olosuhteisiin. Ennen käsittelyn alkua kaikki eläimet on tutkittava sen varmistamiseksi, ettei niillä ole havaittavia ihovaurioita.

Annosteluliuosten valmistelu

Annosteluliuosten valmistelu

| 10. | Kiinteät kemikaalit on liuotettava tai sekoitettava liuottimiin tai kantaja-aineisiin ja tarvittaessa laimennettava ennen niiden annostelua hiiren korvaan. Nestemäiset kemikaalit voidaan annostella laimentamattomana tai ennen annostelua laimennettuina. Liukenemattomia kemikaaleja, kuten lääkinnällisissä laitteissa yleisesti käytettyjä kemikaaleja, on pyrittävä uuttamaan erittäin voimakkaasti asianmukaiseen liuottimeen, jotta kaikki uuttuvat ainesosat tulisivat esiin ennen annostelua hiirten korviin. Testiaineet on valmistettava päivittäin, paitsi jos säilyvyys on osoitettu stabiliteettitutkimuksilla. |
| --- | --- |

10.

Kiinteät kemikaalit on liuotettava tai sekoitettava liuottimiin tai kantaja-aineisiin ja tarvittaessa laimennettava ennen niiden annostelua hiiren korvaan. Nestemäiset kemikaalit voidaan annostella laimentamattomana tai ennen annostelua laimennettuina. Liukenemattomia kemikaaleja, kuten lääkinnällisissä laitteissa yleisesti käytettyjä kemikaaleja, on pyrittävä uuttamaan erittäin voimakkaasti asianmukaiseen liuottimeen, jotta kaikki uuttuvat ainesosat tulisivat esiin ennen annostelua hiirten korviin. Testiaineet on valmistettava päivittäin, paitsi jos säilyvyys on osoitettu stabiliteettitutkimuksilla.

Luotettavuuden tarkistus

Luotettavuuden tarkistus

| 11. | Positiivisia kontrollikemikaaleja käytetään, jotta voidaan osoittaa määritysmenetelmän toimivuus. Herkistystesteissä käytettävän aineen vasteena on menetelmässä saatava aikaan riittävä ja toistettavissa oleva herkistyminen, jonka vastetaso on aineelle tyypillinen. Positiivisen kontrollikemikaalin käyttöä testissä samanaikaisesti testikemikaalin kanssa suositellaan, koska sillä osoitetaan, että laboratoriolla on riittävä pätevyys kuhunkin määritysmenetelmään, ja sen avulla voidaan arvioida laboratorionsisäistä ja laboratorioidenvälistä uusittavuutta ja vertailtavuutta. Myös tietyt sääntelyviranomaiset vaativat positiivisten kontrollikemikaalien käyttämistä kaikissa tutkimuksissa. Käyttäjien olisikin otettava yhteyttä asiasta vastaaviin viranomaisiin ennen LLNA: BrdU-ELISA -määritysmenetelmän käyttöönottoa. Tämän takia suositellaan positiivisen kontrollikemikaalin käyttöä samanaikaisesti rutiininomaisesti, jotta ei tarvitsisi uusia eläinkokeita sellaisten vaatimusten täyttämiseksi, jotka johtuvat siitä, että positiivista kontrollikemikaalia käytetään vain ajoittain (katso 12 kohta). Positiivisen kontrollikemikaalin on tuotettava positiivinen LLNA: BrdU-ELISA -vaste altistustasolla, jonka odotetaan antavan stimulaatioindeksin, joka on yhtä suuri tai suurempi kuin 1,6 verrattuna negatiiviseen kontrolliryhmään. Positiivisen kontrollikemikaalin annostaso on valittava siten, että se ei aiheuta liian voimakasta ihoärsytystä tai koko elimistöön kohdistuvaa toksisuutta ja että induktio on toistettavissa mutta ei liian suuri (esimerkiksi SI > 14 on liian suuri). Suositeltavia positiivisia kontrollikemikaaleja ovat 25-prosenttinen heksyylikanelialdehydi (CAS-numero 101-86-0) ja 25-prosenttinen eugenoli (CAS-numero 97-53-0) asetonin ja oliiviöljyn seoksessa (4:1 v/v). Joissakin olosuhteissa voidaan riittävin perustein käyttää muita positiivisia kontrollikemikaaleja, jotka täyttävät edellä mainitut kriteerit. |
| --- | --- |

11.

Positiivisia kontrollikemikaaleja käytetään, jotta voidaan osoittaa määritysmenetelmän toimivuus. Herkistystesteissä käytettävän aineen vasteena on menetelmässä saatava aikaan riittävä ja toistettavissa oleva herkistyminen, jonka vastetaso on aineelle tyypillinen. Positiivisen kontrollikemikaalin käyttöä testissä samanaikaisesti testikemikaalin kanssa suositellaan, koska sillä osoitetaan, että laboratoriolla on riittävä pätevyys kuhunkin määritysmenetelmään, ja sen avulla voidaan arvioida laboratorionsisäistä ja laboratorioidenvälistä uusittavuutta ja vertailtavuutta. Myös tietyt sääntelyviranomaiset vaativat positiivisten kontrollikemikaalien käyttämistä kaikissa tutkimuksissa. Käyttäjien olisikin otettava yhteyttä asiasta vastaaviin viranomaisiin ennen LLNA: BrdU-ELISA -määritysmenetelmän käyttöönottoa. Tämän takia suositellaan positiivisen kontrollikemikaalin käyttöä samanaikaisesti rutiininomaisesti, jotta ei tarvitsisi uusia eläinkokeita sellaisten vaatimusten täyttämiseksi, jotka johtuvat siitä, että positiivista kontrollikemikaalia käytetään vain ajoittain (katso 12 kohta). Positiivisen kontrollikemikaalin on tuotettava positiivinen LLNA: BrdU-ELISA -vaste altistustasolla, jonka odotetaan antavan stimulaatioindeksin, joka on yhtä suuri tai suurempi kuin 1,6 verrattuna negatiiviseen kontrolliryhmään. Positiivisen kontrollikemikaalin annostaso on valittava siten, että se ei aiheuta liian voimakasta ihoärsytystä tai koko elimistöön kohdistuvaa toksisuutta ja että induktio on toistettavissa mutta ei liian suuri (esimerkiksi SI > 14 on liian suuri). Suositeltavia positiivisia kontrollikemikaaleja ovat 25-prosenttinen heksyylikanelialdehydi (CAS-numero 101-86-0) ja 25-prosenttinen eugenoli (CAS-numero 97-53-0) asetonin ja oliiviöljyn seoksessa (4:1 v/v). Joissakin olosuhteissa voidaan riittävin perustein käyttää muita positiivisia kontrollikemikaaleja, jotka täyttävät edellä mainitut kriteerit.

| 12. | Vaikka samanaikaisen positiivisen kontrolliryhmän käyttöä suositellaan, joissakin tapauksissa positiivisen kontrollikemikaalin ajoittainen testaus (enintään kuuden kuukauden välein) voi riittää LLNA: BrdU-ELISA -menetelmää säännöllisesti käyttävissä laboratorioissa (eli sellaisissa, jotka käyttävät LLNA: BrdU-ELISA -menetelmää vähintään kerran kuukaudessa) ja joilla on aiempia positiivisen kontrollikemikaalin määritystietoja, jotka osoittavat laboratorion valmiuden saada aikaan uusittavissa olevia ja täsmällisiä tuloksia positiivisilla kontrollikemikaaleilla. Riittävä LLNA: BrdU-ELISA -menetelmää koskeva pätevyys voidaan osoittaa tuottamalla positiivisella kontrollikemikaalilla toistuvasti samantasoisia positiivisia tuloksia vähintään kymmenessä riippumattomassa testissä, jotka suoritetaan kohtuullisen ajanjakson kuluessa (alle yhden vuoden aikana). |
| --- | --- |

12.

Vaikka samanaikaisen positiivisen kontrolliryhmän käyttöä suositellaan, joissakin tapauksissa positiivisen kontrollikemikaalin ajoittainen testaus (enintään kuuden kuukauden välein) voi riittää LLNA: BrdU-ELISA -menetelmää säännöllisesti käyttävissä laboratorioissa (eli sellaisissa, jotka käyttävät LLNA: BrdU-ELISA -menetelmää vähintään kerran kuukaudessa) ja joilla on aiempia positiivisen kontrollikemikaalin määritystietoja, jotka osoittavat laboratorion valmiuden saada aikaan uusittavissa olevia ja täsmällisiä tuloksia positiivisilla kontrollikemikaaleilla. Riittävä LLNA: BrdU-ELISA -menetelmää koskeva pätevyys voidaan osoittaa tuottamalla positiivisella kontrollikemikaalilla toistuvasti samantasoisia positiivisia tuloksia vähintään kymmenessä riippumattomassa testissä, jotka suoritetaan kohtuullisen ajanjakson kuluessa (alle yhden vuoden aikana).

| 13. | Samanaikaista positiivista kontrollikemikaalia on käytettävä aina, kun LLNA: BrdU-ELISA -menettelyä muutetaan (esimerkiksi kun koulutettu henkilökunta vaihtuu, testimenetelmän materiaalit ja/tai reagenssit vaihtuvat, testimenetelmässä käytettävät laitteet vaihtuvat tai koe-eläinten alkuperä vaihtuu), ja tällaiset muutokset on kirjattava laboratorioraportteihin. Muutosten vaikutusta aiemmin saatujen aiempien määritystietojen asianmukaisuuteen on tarkasteltava, jotta voidaan päättää, onko kerättävä uusi määritystietokanta positiivisen kontrollikemikaalin tulosten yhdenmukaisuuden osoittamiseksi. |
| --- | --- |

13.

Samanaikaista positiivista kontrollikemikaalia on käytettävä aina, kun LLNA: BrdU-ELISA -menettelyä muutetaan (esimerkiksi kun koulutettu henkilökunta vaihtuu, testimenetelmän materiaalit ja/tai reagenssit vaihtuvat, testimenetelmässä käytettävät laitteet vaihtuvat tai koe-eläinten alkuperä vaihtuu), ja tällaiset muutokset on kirjattava laboratorioraportteihin. Muutosten vaikutusta aiemmin saatujen aiempien määritystietojen asianmukaisuuteen on tarkasteltava, jotta voidaan päättää, onko kerättävä uusi määritystietokanta positiivisen kontrollikemikaalin tulosten yhdenmukaisuuden osoittamiseksi.

| 14. | Tutkijoiden on otettava huomioon, että jos positiivisen kontrollikemikaalin tutkimusta ei suoriteta samanaikaisesti vaan vain ajoittain, positiivisen kontrollikemikaalin kunkin säännöllisen tutkimuksen välillä ilman vastaavaa positiivista kontrollikemikaalia aikaan saatujen negatiivisten tutkimustulosten asianmukaisuus ja hyväksyttävyys voivat vaarantua. Jos esimerkiksi saadaan väärä negatiivinen tulos, kun positiivinen kontrolli ei ole ollut aina samanaikaisesti mukana, positiivisen kontrollikemikaalin viimeisen hyväksytyn yksittäisen tutkimuksen ja positiivisen kontrollikemikaalin hylätyn yksittäisen tutkimuksen tuloksen välisenä aikana saadut testiaineen negatiiviset tulokset voivat olla kyseenalaisia. Näiden tulosten seurauksia on tarkasteltava huolellisesti päätettäessä positiivisten kontrollikemikaalien käyttämisestä aina testiaineen rinnalla tai vain ajoittain Lisäksi on huomioitava, että testiaineen rinnalla käytettävää positiivista kontrolliryhmää varten olisi käytettävä vähemmän eläimiä, jos se on tieteellisesti perusteltua ja jos laboratorio osoittaa laboratoriokohtaisten aiempien tietojen perusteella, että hiiriä voidaan käyttää vähemmän (17). |
| --- | --- |

14.

Tutkijoiden on otettava huomioon, että jos positiivisen kontrollikemikaalin tutkimusta ei suoriteta samanaikaisesti vaan vain ajoittain, positiivisen kontrollikemikaalin kunkin säännöllisen tutkimuksen välillä ilman vastaavaa positiivista kontrollikemikaalia aikaan saatujen negatiivisten tutkimustulosten asianmukaisuus ja hyväksyttävyys voivat vaarantua. Jos esimerkiksi saadaan väärä negatiivinen tulos, kun positiivinen kontrolli ei ole ollut aina samanaikaisesti mukana, positiivisen kontrollikemikaalin viimeisen hyväksytyn yksittäisen tutkimuksen ja positiivisen kontrollikemikaalin hylätyn yksittäisen tutkimuksen tuloksen välisenä aikana saadut testiaineen negatiiviset tulokset voivat olla kyseenalaisia. Näiden tulosten seurauksia on tarkasteltava huolellisesti päätettäessä positiivisten kontrollikemikaalien käyttämisestä aina testiaineen rinnalla tai vain ajoittain Lisäksi on huomioitava, että testiaineen rinnalla käytettävää positiivista kontrolliryhmää varten olisi käytettävä vähemmän eläimiä, jos se on tieteellisesti perusteltua ja jos laboratorio osoittaa laboratoriokohtaisten aiempien tietojen perusteella, että hiiriä voidaan käyttää vähemmän (17).

| 15. | Vaikka positiiviset kontrollikemikaalit on testattava kantaja-aineessa, jonka tiedetään antavan aina samanlaisen vasteen (esimerkiksi asetoni:oliiviöljy, 4:1 v/v), joidenkin säännösten mukaan testaus muussa kuin standardikantaja-aineessa (kliinisesti/kemiallisesti relevantissa aineessa) saattaa myös olla tarpeen (18). Jos samanaikaista positiivista kontrollikemikaalia testataan eri kantaja-aineessa kuin testiainetta, sitä varten on käytettävä erillistä kantaja-aineella käsiteltyä kontrollia. |
| --- | --- |

15.

Vaikka positiiviset kontrollikemikaalit on testattava kantaja-aineessa, jonka tiedetään antavan aina samanlaisen vasteen (esimerkiksi asetoni:oliiviöljy, 4:1 v/v), joidenkin säännösten mukaan testaus muussa kuin standardikantaja-aineessa (kliinisesti/kemiallisesti relevantissa aineessa) saattaa myös olla tarpeen (18). Jos samanaikaista positiivista kontrollikemikaalia testataan eri kantaja-aineessa kuin testiainetta, sitä varten on käytettävä erillistä kantaja-aineella käsiteltyä kontrollia.

| 16. | Arvioitaessa tiettyyn kemikaaliluokkaan kuuluvia tai tietyn vastetason aikaansaavia testiaineita vertailuaineilla voidaan myös osoittaa, että testimenetelmä toimii asianmukaisesti, kun halutaan osoittaa tämäntyyppisten testiaineiden ihoherkistyspotentiaali. Vertailuaineilla olisi silloin oltava seuraavat ominaisuudet:






  — | samanlainen rakenne ja toiminta kuin testattavalla aineryhmällä |
| --- | --- | --- |

16.

Arvioitaessa tiettyyn kemikaaliluokkaan kuuluvia tai tietyn vastetason aikaansaavia testiaineita vertailuaineilla voidaan myös osoittaa, että testimenetelmä toimii asianmukaisesti, kun halutaan osoittaa tämäntyyppisten testiaineiden ihoherkistyspotentiaali. Vertailuaineilla olisi silloin oltava seuraavat ominaisuudet:

—

samanlainen rakenne ja toiminta kuin testattavalla aineryhmällä

| — | tunnetut fysikaalis-kemialliset ominaisuudet |
| --- | --- |

—

tunnetut fysikaalis-kemialliset ominaisuudet

| — | sopivuutta tukevia tietoja LLNA: DA -menetelmästä |
| --- | --- |

—

sopivuutta tukevia tietoja LLNA: DA -menetelmästä

| — | sopivuutta tukevia tietoja muista eläinmalleista ja/tai ihmisistä. |
| --- | --- |

—

sopivuutta tukevia tietoja muista eläinmalleista ja/tai ihmisistä.

TESTIMENETTELY

Koe-eläinten määrä ja annostasot

Koe-eläinten määrä ja annostasot

| 17. | Kussakin annostasoryhmässä on oltava vähintään neljä eläintä, ja testiaineesta on käytettävä vähintään kolmea konsentraatiota. Lisäksi käytetään negatiivista kontrolliryhmää, joka käsitellään vain testiaineen kantaja-aineella, sekä positiivista kontrolliryhmää (joka määritetään samanaikaisesti tai joka on määritetty hiljattain, laboratorion toimintatavan mukaisesti, ottaen huomioon 11–15 kohdat). Positiivisesta kontrolliryhmästä on tarvittaessa testattava useita annoksia, etenkin jos positiivista kontrollikemikaalia testataan epäsäännöllisesti. Kontrolliryhmän eläimiä on kohdeltava samalla tavoin kuin testiryhmän eläimiä, paitsi että niitä ei käsitellä testiaineella. |
| --- | --- |

17.

Kussakin annostasoryhmässä on oltava vähintään neljä eläintä, ja testiaineesta on käytettävä vähintään kolmea konsentraatiota. Lisäksi käytetään negatiivista kontrolliryhmää, joka käsitellään vain testiaineen kantaja-aineella, sekä positiivista kontrolliryhmää (joka määritetään samanaikaisesti tai joka on määritetty hiljattain, laboratorion toimintatavan mukaisesti, ottaen huomioon 11–15 kohdat). Positiivisesta kontrolliryhmästä on tarvittaessa testattava useita annoksia, etenkin jos positiivista kontrollikemikaalia testataan epäsäännöllisesti. Kontrolliryhmän eläimiä on kohdeltava samalla tavoin kuin testiryhmän eläimiä, paitsi että niitä ei käsitellä testiaineella.

| 18. | Annostason ja kantaja-aineen valinnan on perustuttava lähteissä 2 ja 19 esitettyihin suosituksiin. Peräkkäiset annostasot valitaan yleensä sopivasta konsentraatiosarjasta, esimerkiksi sarjasta 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % ja niin edelleen. Käytettävälle konsentraatiosarjalle on esitettävä asianmukaiset tieteelliset perustelut. Kaikki käytettävissä olevat toksikologiset tiedot (esimerkiksi akuutti toksisuus ja ihoärsytys) ja rakenteelliset ja fysikaaliskemialliset tiedot kyseisestä testiaineesta (ja/tai rakenteellisesti vastaavista aineista) on tarvittaessa otettava huomioon kolmen peräkkäisen konsentraation valinnassa niin, että suurin konsentraatio edustaa maksimialtistusta, mutta koko elimistöön kohdistuva toksisuus ja/tai liian voimakas paikallinen ihoärsytys kuitenkin vältetään (19) (20 ja tämän liitteen B.4 luku). Jos tällaisia tietoja ei ole käytettävissä, testiä edeltävä kartoitus voi olla tarpeen (katso 21–24 kohta). |
| --- | --- |

18.

Annostason ja kantaja-aineen valinnan on perustuttava lähteissä 2 ja 19 esitettyihin suosituksiin. Peräkkäiset annostasot valitaan yleensä sopivasta konsentraatiosarjasta, esimerkiksi sarjasta 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % ja niin edelleen. Käytettävälle konsentraatiosarjalle on esitettävä asianmukaiset tieteelliset perustelut. Kaikki käytettävissä olevat toksikologiset tiedot (esimerkiksi akuutti toksisuus ja ihoärsytys) ja rakenteelliset ja fysikaaliskemialliset tiedot kyseisestä testiaineesta (ja/tai rakenteellisesti vastaavista aineista) on tarvittaessa otettava huomioon kolmen peräkkäisen konsentraation valinnassa niin, että suurin konsentraatio edustaa maksimialtistusta, mutta koko elimistöön kohdistuva toksisuus ja/tai liian voimakas paikallinen ihoärsytys kuitenkin vältetään (19) (20 ja tämän liitteen B.4 luku). Jos tällaisia tietoja ei ole käytettävissä, testiä edeltävä kartoitus voi olla tarpeen (katso 21–24 kohta).

| 19. | Kantaja-aine ei saa vaikuttaa testituloksiin tai vääristää niitä. Se on valittava siten, että testiaine liukenee siihen mahdollisimman helposti ja aineen konsentraatio annosteluun sopivassa liuoksessa tai suspensiossa on mahdollisimman suuri. Suositeltavat kantaja-aineet ovat asetoni:oliiviöljy (4:1 v/v), N,N-dimetyyliformamidi, metyylietyyliketoni, propyleeniglykoli ja dimetyylisulfoksidi (6), mutta muitakin kantaja-aineita voidaan käyttää riittävin tieteellisin perustein. Joissakin tilanteissa voi olla tarpeen käyttää lisäkontrolliaineena kliinisesti perusteltua liuotinta taikka kaupallista valmistetta, jona testiainetta markkinoidaan. Erityisesti on varmistettava, että hydrofiiliset testiaineet sisällytetään sellaiseen kantaja-ainejärjestelmään, joka vettää ihon eikä valu heti pois, lisäämällä asianmukaisia liukenemista edistäviä aineita (esimerkiksi 1-prosenttinen Pluronic® L92). Pelkkiä vesiliuoksia on siis syytä välttää. |
| --- | --- |

19.

Kantaja-aine ei saa vaikuttaa testituloksiin tai vääristää niitä. Se on valittava siten, että testiaine liukenee siihen mahdollisimman helposti ja aineen konsentraatio annosteluun sopivassa liuoksessa tai suspensiossa on mahdollisimman suuri. Suositeltavat kantaja-aineet ovat asetoni:oliiviöljy (4:1 v/v), N,N-dimetyyliformamidi, metyylietyyliketoni, propyleeniglykoli ja dimetyylisulfoksidi (6), mutta muitakin kantaja-aineita voidaan käyttää riittävin tieteellisin perustein. Joissakin tilanteissa voi olla tarpeen käyttää lisäkontrolliaineena kliinisesti perusteltua liuotinta taikka kaupallista valmistetta, jona testiainetta markkinoidaan. Erityisesti on varmistettava, että hydrofiiliset testiaineet sisällytetään sellaiseen kantaja-ainejärjestelmään, joka vettää ihon eikä valu heti pois, lisäämällä asianmukaisia liukenemista edistäviä aineita (esimerkiksi 1-prosenttinen Pluronic® L92). Pelkkiä vesiliuoksia on siis syytä välttää.

N,N

| 20. | Prosessoimalla yksittäisten hiirten imusolmukkeita voidaan arvioida eläintenvälistä vaihtelua ja vertailla tilastollisesti testiaineen ja kantaja-aineella käsitellyn ryhmän tuloksia (katso 33 kohta). Positiivisen kontrolliryhmän hiirten määrän vähentäminen voi olla mahdollista, mutta vain siinä tapauksessa, että tietoja kerätään yksittäisistä eläimistä (17). Tietyt sääntelyviranomaiset vaativat, että tietoja on kerättävä yksittäisistä eläimistä. Yksittäisiä eläimiä koskevien tietojen keräämisellä edistetään eläinten hyvinvointia, koska siten vältetään päällekkäiset testaukset, jotka ovat tarpeen, jos sääntelyviranomaisten on tarkasteltava tietyllä tavalla (esimerkiksi eläimistä saatuja mittaustietoja yhdistämällä) saatuja testiainetuloksia myöhemmin muiden vaatimusten (esimerkiksi yksittäisiä eläimiä koskevat tiedot) perusteella. |
| --- | --- |

20.

Prosessoimalla yksittäisten hiirten imusolmukkeita voidaan arvioida eläintenvälistä vaihtelua ja vertailla tilastollisesti testiaineen ja kantaja-aineella käsitellyn ryhmän tuloksia (katso 33 kohta). Positiivisen kontrolliryhmän hiirten määrän vähentäminen voi olla mahdollista, mutta vain siinä tapauksessa, että tietoja kerätään yksittäisistä eläimistä (17). Tietyt sääntelyviranomaiset vaativat, että tietoja on kerättävä yksittäisistä eläimistä. Yksittäisiä eläimiä koskevien tietojen keräämisellä edistetään eläinten hyvinvointia, koska siten vältetään päällekkäiset testaukset, jotka ovat tarpeen, jos sääntelyviranomaisten on tarkasteltava tietyllä tavalla (esimerkiksi eläimistä saatuja mittaustietoja yhdistämällä) saatuja testiainetuloksia myöhemmin muiden vaatimusten (esimerkiksi yksittäisiä eläimiä koskevat tiedot) perusteella.

Testiä edeltävä kartoitus

Testiä edeltävä kartoitus

| 21. | Jos suurimman testattavan annoksen määrittämiseksi ei ole saatavilla tietoja (katso 18 kohta), on testiä ennen kartoitettava LLNA: BrdU-ELISA -menetelmän testeissä käytettävä asianmukainen annostaso. Siten autetaan enimmäisannoksen valinnassa varsinaista LLNA: BrdU-ELISA -tutkimusta varten, kun tietoja koko elimistöön kohdistuvan toksisuuden (katso 24 kohta) ja/tai liian voimakkaan paikallisen ihoärsytyksen (katso 23 kohta) aiheuttavasta konsentraatiosta ei ole saatavilla. Testattavan enimmäisannoksen tason on vastattava sadan prosentin pitoisuutta nestemäisen testiaineen osalta tai suurinta mahdollista konsentraatiota kiinteiden tai suspendoitujen aineiden osalta. |
| --- | --- |

21.

Jos suurimman testattavan annoksen määrittämiseksi ei ole saatavilla tietoja (katso 18 kohta), on testiä ennen kartoitettava LLNA: BrdU-ELISA -menetelmän testeissä käytettävä asianmukainen annostaso. Siten autetaan enimmäisannoksen valinnassa varsinaista LLNA: BrdU-ELISA -tutkimusta varten, kun tietoja koko elimistöön kohdistuvan toksisuuden (katso 24 kohta) ja/tai liian voimakkaan paikallisen ihoärsytyksen (katso 23 kohta) aiheuttavasta konsentraatiosta ei ole saatavilla. Testattavan enimmäisannoksen tason on vastattava sadan prosentin pitoisuutta nestemäisen testiaineen osalta tai suurinta mahdollista konsentraatiota kiinteiden tai suspendoitujen aineiden osalta.

| 22. | Testiä edeltävä kartoitus suoritetaan varsinaista LLNA: BrdU-ELISA -tutkimusta vastaavissa olosuhteissa, kuitenkin niin, että imusolmukkeiden soluproliferaatiota ei arvioida, ja kussakin annosryhmässä voidaan käyttää vähemmän eläimiä. Kussakin annosryhmässä olisi hyvä käyttää yhtä tai kahta eläintä. Kaikkia hiiriä tarkkaillaan päivittäin koko elimistöön kohdistuvan toksisuuden tai annostelukohdassa esiintyvän paikallisen ärsytyksen kliinisten merkkien havaitsemiseksi. Eläinten paino kirjataan ennen testaamista ja ennen eläinten lopettamista (päivä 6). Kunkin hiiren molemmista korvista tutkitaan eryteeman merkit, ja ne pisteytetään taulukon 1 mukaisesti (20 ja tämän liitteen B.4 luku). Korvan paksuus mitataan paksuusmittarilla (esimerkiksi digitaalisella mikrometrillä tai Peacock Dial -paksuusmittarilla) päivänä 1 (ennen annosta), päivänä 3 (noin 48 tunnin kuluttua ensimmäisestä annoksesta) ja päivänä 6. Päivänä 6 korvan paksuus voidaan myös määrittää mittaamalla korvan lävistämiseen tarvittava massa sen jälkeen, kun eläimet on lopetettu humaanisti. Paikallinen ärsytys on erittäin voimakas, jos eryteemapisteytyksen arvo ≥ 3 ja/tai korvan paksuuntuminen ≥ 25 prosenttia minä tahansa mittauspäivänä (21) (22). Suurin varsinaiseen LLNA: BrdU-ELISA -tutkimukseen valittava annos on kartoitusta varten määritetyn konsentraatiosarjan (katso 18 kohta) suurin annos, joka ei enää aiheuta koko elimistöön kohdistuvaa toksisuutta ja/tai liian voimakasta paikallista ihoärsytystä.

  Taulukko 1


  Eryteemapisteytys







  Havainto | Pisteet |
| --- | --- | --- |
| Ei eryteemaa | 0 |
| Hyvin lievä eryteema (tuskin havaittava) | 1 |
| Selkeästi erottuva eryteema | 2 |
| Keskivakava–vakava eryteema | 3 |
| Vakava eryteema (voimakas punoitus)–karsta, joka estää eryteeman pisteytyksen | 4 |

22.

Testiä edeltävä kartoitus suoritetaan varsinaista LLNA: BrdU-ELISA -tutkimusta vastaavissa olosuhteissa, kuitenkin niin, että imusolmukkeiden soluproliferaatiota ei arvioida, ja kussakin annosryhmässä voidaan käyttää vähemmän eläimiä. Kussakin annosryhmässä olisi hyvä käyttää yhtä tai kahta eläintä. Kaikkia hiiriä tarkkaillaan päivittäin koko elimistöön kohdistuvan toksisuuden tai annostelukohdassa esiintyvän paikallisen ärsytyksen kliinisten merkkien havaitsemiseksi. Eläinten paino kirjataan ennen testaamista ja ennen eläinten lopettamista (päivä 6). Kunkin hiiren molemmista korvista tutkitaan eryteeman merkit, ja ne pisteytetään taulukon 1 mukaisesti (20 ja tämän liitteen B.4 luku). Korvan paksuus mitataan paksuusmittarilla (esimerkiksi digitaalisella mikrometrillä tai Peacock Dial -paksuusmittarilla) päivänä 1 (ennen annosta), päivänä 3 (noin 48 tunnin kuluttua ensimmäisestä annoksesta) ja päivänä 6. Päivänä 6 korvan paksuus voidaan myös määrittää mittaamalla korvan lävistämiseen tarvittava massa sen jälkeen, kun eläimet on lopetettu humaanisti. Paikallinen ärsytys on erittäin voimakas, jos eryteemapisteytyksen arvo ≥ 3 ja/tai korvan paksuuntuminen ≥ 25 prosenttia minä tahansa mittauspäivänä (21) (22). Suurin varsinaiseen LLNA: BrdU-ELISA -tutkimukseen valittava annos on kartoitusta varten määritetyn konsentraatiosarjan (katso 18 kohta) suurin annos, joka ei enää aiheuta koko elimistöön kohdistuvaa toksisuutta ja/tai liian voimakasta paikallista ihoärsytystä.

Taulukko 1

Taulukko 1

Eryteemapisteytys

Eryteemapisteytys

Havainto

Pisteet

Ei eryteemaa

0

Hyvin lievä eryteema (tuskin havaittava)

1

Selkeästi erottuva eryteema

2

Keskivakava–vakava eryteema

3

Vakava eryteema (voimakas punoitus)–karsta, joka estää eryteeman pisteytyksen

4

| 23. | Sen lisäksi, että käytetään korvien paksuuden lisääntymistä yli 25 prosenttia (21) (22), myös tilastollisesti merkittävää käsiteltyjen hiirten korvan paksuuden kasvua kontrollihiiriin verrattuna on käytetty ärsyttävien aineiden määrittämiseksi LLNA-menetelmässä (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28). Vaikka tilastollisesti merkittävää kasvua voi esiintyä silloinkin, kun korva paksuuntuu alle 25 prosenttia, sen ei katsota liittyvän erityisesti hyvin voimakkaaseen ärsytykseen (25) (26) (27) (28) (29). |
| --- | --- |

23.

Sen lisäksi, että käytetään korvien paksuuden lisääntymistä yli 25 prosenttia (21) (22), myös tilastollisesti merkittävää käsiteltyjen hiirten korvan paksuuden kasvua kontrollihiiriin verrattuna on käytetty ärsyttävien aineiden määrittämiseksi LLNA-menetelmässä (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28). Vaikka tilastollisesti merkittävää kasvua voi esiintyä silloinkin, kun korva paksuuntuu alle 25 prosenttia, sen ei katsota liittyvän erityisesti hyvin voimakkaaseen ärsytykseen (25) (26) (27) (28) (29).

| 24. | Seuraavat kliiniset havainnot voivat yhdennetyn arvioinnin osana olla osoituksena koko elimistöön kohdistuvasta toksisuudesta (30) ja voivat näin ollen olla osoituksena suurimmasta annostasosta, jota varsinaisessa LLNA: BrdU-ELISA -menetelmässä voidaan käyttää: muutokset hermoston toiminnassa (esimerkiksi karvojen jäykistyminen, ataksia, vapina ja kouristukset); muutokset käyttäytymisessä (esimerkiksi aggressiivisuus, muutokset turkin hoidossa, aktiivisuustason huomattava muuttuminen); muutokset hengityksessä (hengityksen säännöllisyyden ja syvyyden muutokset, kuten hengenahdistus, hengen haukkominen ja rahina) sekä muutokset ravinnon ja veden kulutuksessa. Arvioinnissa on huomioitava myös letargian ja/tai passiivisuuden merkit, vähäistä tai hetkittäistä kipua suuremman kivun ja kärsimyksen mahdolliset kliiniset merkit tai eläimen painon yli viiden prosentin laskeminen päivästä 1 päivään 6 sekä kuolleisuus. Kuolevat eläimet tai eläimet, jotka osoittavat selviä merkkejä voimakkaasta kivusta ja kärsimyksestä, on lopetettava humaanisti (31). |
| --- | --- |

24.

Seuraavat kliiniset havainnot voivat yhdennetyn arvioinnin osana olla osoituksena koko elimistöön kohdistuvasta toksisuudesta (30) ja voivat näin ollen olla osoituksena suurimmasta annostasosta, jota varsinaisessa LLNA: BrdU-ELISA -menetelmässä voidaan käyttää: muutokset hermoston toiminnassa (esimerkiksi karvojen jäykistyminen, ataksia, vapina ja kouristukset); muutokset käyttäytymisessä (esimerkiksi aggressiivisuus, muutokset turkin hoidossa, aktiivisuustason huomattava muuttuminen); muutokset hengityksessä (hengityksen säännöllisyyden ja syvyyden muutokset, kuten hengenahdistus, hengen haukkominen ja rahina) sekä muutokset ravinnon ja veden kulutuksessa. Arvioinnissa on huomioitava myös letargian ja/tai passiivisuuden merkit, vähäistä tai hetkittäistä kipua suuremman kivun ja kärsimyksen mahdolliset kliiniset merkit tai eläimen painon yli viiden prosentin laskeminen päivästä 1 päivään 6 sekä kuolleisuus. Kuolevat eläimet tai eläimet, jotka osoittavat selviä merkkejä voimakkaasta kivusta ja kärsimyksestä, on lopetettava humaanisti (31).

Varsinaisen tutkimuksen testiaikataulu

Varsinaisen tutkimuksen testiaikataulu

| 25. | Määritysmenetelmän aikataulu on seuraava:
  —   Päivä 1: Määritetään ja kirjataan kunkin koe-eläimen paino ja tehdään mahdollisia kliinisiä havaintoja. Kunkin korvan takaosaan annostellaan 25 μl testiaineen, kantaja-aineen tai positiivisen kontrollikemikaalin (rinnakkaisen tai hiljattain tehdyn, laboratorion toimintatavan mukaisesti, ottaen huomioon 11–15 kohdat) sopivaa laimennosta.
  —   Päivät 2 ja 3: Toistetaan päivänä 1 toteutettu annostelu.
  —   Päivä 4: Ei käsittelyä.
  —   Päivä 5: Ruiskutetaan 0,5 ml (5 mg/hiiri) BrdU-liuosta (10 mg/ml) intraperitoneaalisesti.
  —   Päivä 6: Kirjataan kunkin koe-eläimen paino ja tehdään mahdollisia kliinisiä havaintoja. Noin 24 tunnin (24 h) kuluttua BrdU-injektiosta eläimet lopetetaan humaanisti. Hiiren kummastakin korvasta leikataan irti dreneeraavat korvalehden imusolmukkeet, ja kunkin eläimen imusolmukkeet prosessoidaan erikseen fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS). Imusolmukkeiden tunnistukseen ja irrotukseen liittyvät tiedot ja kaaviot esitetään lähteessä (17). Paikallista ihovastetta voidaan seurata varsinaisessa tutkimuksessa tarkemmin niin, että tutkimussuunnitelmaan sisällytetään täydentäviä parametreja, kuten korvan eryteeman pisteytys tai korvan paksuutta koskevat mittaustulokset (saadaan joko paksuusmittarilla tai ruumiinavauksen yhteydessä tehtävillä korvan lävistämiseen tarvittavan massan mittauksilla). |
| --- | --- |

25.

Määritysmenetelmän aikataulu on seuraava:

—   Päivä 1: Määritetään ja kirjataan kunkin koe-eläimen paino ja tehdään mahdollisia kliinisiä havaintoja. Kunkin korvan takaosaan annostellaan 25 μl testiaineen, kantaja-aineen tai positiivisen kontrollikemikaalin (rinnakkaisen tai hiljattain tehdyn, laboratorion toimintatavan mukaisesti, ottaen huomioon 11–15 kohdat) sopivaa laimennosta.

—   Päivät 2 ja 3: Toistetaan päivänä 1 toteutettu annostelu.

—   Päivä 4: Ei käsittelyä.

—   Päivä 5: Ruiskutetaan 0,5 ml (5 mg/hiiri) BrdU-liuosta (10 mg/ml) intraperitoneaalisesti.

—   Päivä 6: Kirjataan kunkin koe-eläimen paino ja tehdään mahdollisia kliinisiä havaintoja. Noin 24 tunnin (24 h) kuluttua BrdU-injektiosta eläimet lopetetaan humaanisti. Hiiren kummastakin korvasta leikataan irti dreneeraavat korvalehden imusolmukkeet, ja kunkin eläimen imusolmukkeet prosessoidaan erikseen fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS). Imusolmukkeiden tunnistukseen ja irrotukseen liittyvät tiedot ja kaaviot esitetään lähteessä (17). Paikallista ihovastetta voidaan seurata varsinaisessa tutkimuksessa tarkemmin niin, että tutkimussuunnitelmaan sisällytetään täydentäviä parametreja, kuten korvan eryteeman pisteytys tai korvan paksuutta koskevat mittaustulokset (saadaan joko paksuusmittarilla tai ruumiinavauksen yhteydessä tehtävillä korvan lävistämiseen tarvittavan massan mittauksilla).

Solususpensioiden valmistus

Solususpensioiden valmistus

| 26. | Kunkin hiiren imusolmukeparien soluista valmistetaan suspensio, jossa kaikki solut ovat irrallaan muista (yksisolususpensio), hajottamalla kudos mekaanisesti painamalla se varovaisesti ruostumattoman terässeulan läpi (silmäkoko 200 μm) tai käyttämällä muuta yksisolususpension valmistamiseksi hyväksyttyä tekniikkaa (esimerkiksi käyttämällä kertakäyttöistä muovista survinta imusolmukkeiden murskaamiseen ja painamalla ne sitten nylonseulan läpi (silmäkoko 70)). Yksisolususpension valmistustapa on tässä määritysmenetelmässä erittäin tärkeä, ja menettely on opeteltava etukäteen. Negatiivisen kontrolliryhmän eläinten imusolmukkeet ovat pieniä, joten vaihe on suoritettava huolellisesti SI-arvoihin mahdollisesti vaikuttavien artefaktojen välttämiseksi. Kussakin menettelyssä yksisolususpension tilavuus on saatettava määritetyn optimoidun tilavuuden mukaiseksi (noin 15 ml). Optimoitu tilavuus perustuu negatiivisen kontrolliryhmän keskimääräiseen absorbanssiin välillä 0,1–0,2. |
| --- | --- |

26.

Kunkin hiiren imusolmukeparien soluista valmistetaan suspensio, jossa kaikki solut ovat irrallaan muista (yksisolususpensio), hajottamalla kudos mekaanisesti painamalla se varovaisesti ruostumattoman terässeulan läpi (silmäkoko 200 μm) tai käyttämällä muuta yksisolususpension valmistamiseksi hyväksyttyä tekniikkaa (esimerkiksi käyttämällä kertakäyttöistä muovista survinta imusolmukkeiden murskaamiseen ja painamalla ne sitten nylonseulan läpi (silmäkoko 70)). Yksisolususpension valmistustapa on tässä määritysmenetelmässä erittäin tärkeä, ja menettely on opeteltava etukäteen. Negatiivisen kontrolliryhmän eläinten imusolmukkeet ovat pieniä, joten vaihe on suoritettava huolellisesti SI-arvoihin mahdollisesti vaikuttavien artefaktojen välttämiseksi. Kussakin menettelyssä yksisolususpension tilavuus on saatettava määritetyn optimoidun tilavuuden mukaiseksi (noin 15 ml). Optimoitu tilavuus perustuu negatiivisen kontrolliryhmän keskimääräiseen absorbanssiin välillä 0,1–0,2.

Solujen proliferaation määritys (lymfosyyttien DNA:n BrdU-pitoisuuden mittaaminen)

Solujen proliferaation määritys (lymfosyyttien DNA:n BrdU-pitoisuuden mittaaminen)

| 27. | BrdU mitataan ELISA-menetelmällä käyttämällä kaupallisesti saatavilla olevaa välineistöä (esimerkiksi Roche Applied Science, Mannheim, Saksa, kataloginumero 11 647 229 001). Tasapohjaisen kuoppalevyn kuoppiin lisätään 100 μl imusolmukesolususpensiota kolmoismäärityksinä. Solususpension fiksaation ja denaturaation jälkeen jokaiseen kuoppaan lisätään anti-BrdU-vasta-aine ja sen annetaan reagoida. Tämän jälkeen anti-BrdU-vasta-aine poistetaan huuhtelemalla ja lisätään reaktion substraatti. Vapautuvan kromogeenin absorbanssi mitataan 370 nm:ssä ja 492 nm:n vertailuaallonpituudella. Määritysmenetelmän testiolosuhteet on kaikissa yhteyksissä optimoitava (katso 26 kohta). |
| --- | --- |

27.

BrdU mitataan ELISA-menetelmällä käyttämällä kaupallisesti saatavilla olevaa välineistöä (esimerkiksi Roche Applied Science, Mannheim, Saksa, kataloginumero 11 647 229 001). Tasapohjaisen kuoppalevyn kuoppiin lisätään 100 μl imusolmukesolususpensiota kolmoismäärityksinä. Solususpension fiksaation ja denaturaation jälkeen jokaiseen kuoppaan lisätään anti-BrdU-vasta-aine ja sen annetaan reagoida. Tämän jälkeen anti-BrdU-vasta-aine poistetaan huuhtelemalla ja lisätään reaktion substraatti. Vapautuvan kromogeenin absorbanssi mitataan 370 nm:ssä ja 492 nm:n vertailuaallonpituudella. Määritysmenetelmän testiolosuhteet on kaikissa yhteyksissä optimoitava (katso 26 kohta).

HAVAINNOT

Kliiniset havainnot

Kliiniset havainnot

| 28. | Kustakin hiirestä on päivittäin havainnoitava huolellisesti mahdolliset kliiniset merkit joko annostelualueen paikallisesta ärsytyksestä tai koko elimistöön kohdistuvasta toksisuudesta. Kaikki havainnot kirjataan järjestelmällisesti erikseen kustakin hiirestä. Seurantasuunnitelmissa on esitettävä myös perusteet, joiden avulla voidaan nopeasti tunnistaa hiiret, joissa havaitaan merkkejä koko elimistöön kohdistuvasta toksisuudesta, liian voimakkaasta paikallisesta ihoärsytyksestä tai ihosyövyttävyydestä ja jotka on lopetettava (31). |
| --- | --- |

28.

Kustakin hiirestä on päivittäin havainnoitava huolellisesti mahdolliset kliiniset merkit joko annostelualueen paikallisesta ärsytyksestä tai koko elimistöön kohdistuvasta toksisuudesta. Kaikki havainnot kirjataan järjestelmällisesti erikseen kustakin hiirestä. Seurantasuunnitelmissa on esitettävä myös perusteet, joiden avulla voidaan nopeasti tunnistaa hiiret, joissa havaitaan merkkejä koko elimistöön kohdistuvasta toksisuudesta, liian voimakkaasta paikallisesta ihoärsytyksestä tai ihosyövyttävyydestä ja jotka on lopetettava (31).

Ruumiinpainot

Ruumiinpainot

| 29. | Kuten 25 kohdassa todetaan, kukin eläin on punnittava erikseen testin alussa ja aikataulun mukaisesti humaanin lopettamisen yhteydessä. |
| --- | --- |

29.

Kuten 25 kohdassa todetaan, kukin eläin on punnittava erikseen testin alussa ja aikataulun mukaisesti humaanin lopettamisen yhteydessä.

TULOSTEN LASKEMINEN

| 30. | Kunkin käsittelyryhmän tulokset ilmoitetaan keskimääräisenä SI:nä. Sl-arvo saadaan jakamalla testiaineryhmän ja positiivisen kontrolliryhmän hiirikohtaisista BrdU-merkki-indekseistä laskettu keskiarvo liuottimen/kantaja-aineen kontrolliryhmän vastaavalla tuloksella. Kantaja-ainekontrollien SI:n keskiarvo on 1.
  BrdU-merkki-indeksi määritellään seuraavasti:
  BrdU-merkki-indeksi = (ABSem – ABS blankem) – (ABSref – ABS blankref)
  jossa: em = emissioaallonpituus; ja ref = referenssiaallonpituus. |
| --- | --- |

30.

Kunkin käsittelyryhmän tulokset ilmoitetaan keskimääräisenä SI:nä. Sl-arvo saadaan jakamalla testiaineryhmän ja positiivisen kontrolliryhmän hiirikohtaisista BrdU-merkki-indekseistä laskettu keskiarvo liuottimen/kantaja-aineen kontrolliryhmän vastaavalla tuloksella. Kantaja-ainekontrollien SI:n keskiarvo on 1.

BrdU-merkki-indeksi määritellään seuraavasti:

BrdU-merkki-indeksi = (ABSem – ABS blankem) – (ABSref – ABS blankref)

em

em

ref

ref

jossa: em = emissioaallonpituus; ja ref = referenssiaallonpituus.

| 31. | Tulos katsotaan positiiviseksi, kun SI ≥ 1,6 (10). Rajatuloksen (SI-arvo 1,6–1,9) positiivisuuden määrittämiseksi voidaan kuitenkin tarkastella myös annosvasteen voimakkuutta, tilastollista merkitsevyyttä sekä liuottimen/kantaja-aineen ja positiivisen kontrollikemikaalin vasteiden yhdenmukaisuutta (3) (6) (32). |
| --- | --- |

31.

Tulos katsotaan positiiviseksi, kun SI ≥ 1,6 (10). Rajatuloksen (SI-arvo 1,6–1,9) positiivisuuden määrittämiseksi voidaan kuitenkin tarkastella myös annosvasteen voimakkuutta, tilastollista merkitsevyyttä sekä liuottimen/kantaja-aineen ja positiivisen kontrollikemikaalin vasteiden yhdenmukaisuutta (3) (6) (32).

| 32. | Jos positiivisen rajavasteen SI on 1,6–1,9, käyttäjät voivat tulosten positiivisuuden vahvistamiseksi tarkastella SI-arvojen lisäksi myös muita tietoja, kuten annosvasteen voimakkuutta, merkkejä koko elimistöön kohdistuvasta toksisuudesta tai erittäin voimakkaasta ärsytyksestä ja tarvittaessa tilastollista merkittävyyttä (10). Lisäksi on syytä ottaa huomioon testiaineen erilaiset ominaisuudet, mukaan luettuina mahdolliset rakenteelliset yhtäläisyydet tunnettuihin ihoherkistystä aiheuttaviin aineisiin, sen hiirelle mahdollisesti aiheuttama erittäin voimakas ihoärsytys ja havaitun annosvasteen luonne. Näitä ja muita näkökohtia käsitellään yksityiskohtaisesti lähteessä (4). |
| --- | --- |

32.

Jos positiivisen rajavasteen SI on 1,6–1,9, käyttäjät voivat tulosten positiivisuuden vahvistamiseksi tarkastella SI-arvojen lisäksi myös muita tietoja, kuten annosvasteen voimakkuutta, merkkejä koko elimistöön kohdistuvasta toksisuudesta tai erittäin voimakkaasta ärsytyksestä ja tarvittaessa tilastollista merkittävyyttä (10). Lisäksi on syytä ottaa huomioon testiaineen erilaiset ominaisuudet, mukaan luettuina mahdolliset rakenteelliset yhtäläisyydet tunnettuihin ihoherkistystä aiheuttaviin aineisiin, sen hiirelle mahdollisesti aiheuttama erittäin voimakas ihoärsytys ja havaitun annosvasteen luonne. Näitä ja muita näkökohtia käsitellään yksityiskohtaisesti lähteessä (4).

| 33. | Kun tiedot kerätään erikseen kustakin hiirestä, voidaan niiden perusteella analysoida tilastollisesti mahdollista annosvasteen voimakkuutta ja sen tasoa. Tilastoarvioinnissa voidaan myös arvioida annosvasteen voimakkuutta ja tehdä asianmukaisesti mukautettuja vertailuja testiryhmillä (esimerkiksi pareittain annoksen saaneen ryhmän vertailu samanaikaisesti tehtyyn liuotin-/kantaja-ainekontrolliryhmään). Tilastollisina analyyseina voidaan käyttää esimerkiksi lineaarista regressiota tai Williamin testiä, joilla arvioidaan annos-vastekehitystä, sekä Dunnettin testiä, jolla pareja vertaillaan toisiinsa. Tutkijan on otettava asianmukaisen tilastoanalyysimenetelmän valinnassa huomioon varianssien mahdolliset erot ja muut vastaavat ongelmat, jotka saattavat edellyttää määritystulosten muuntamista tai non-parametrista tilastoanalyysia. Tutkijan on kuitenkin mahdollisesti tehtävä SI-laskelmia ja tilastoanalyyseja sekä käyttäen tiettyjä määrityspisteitä koskevia tietoja (niin sanotut käyrän ulkopuolella olevat vasteet) että ilman niitä. |
| --- | --- |

33.

Kun tiedot kerätään erikseen kustakin hiirestä, voidaan niiden perusteella analysoida tilastollisesti mahdollista annosvasteen voimakkuutta ja sen tasoa. Tilastoarvioinnissa voidaan myös arvioida annosvasteen voimakkuutta ja tehdä asianmukaisesti mukautettuja vertailuja testiryhmillä (esimerkiksi pareittain annoksen saaneen ryhmän vertailu samanaikaisesti tehtyyn liuotin-/kantaja-ainekontrolliryhmään). Tilastollisina analyyseina voidaan käyttää esimerkiksi lineaarista regressiota tai Williamin testiä, joilla arvioidaan annos-vastekehitystä, sekä Dunnettin testiä, jolla pareja vertaillaan toisiinsa. Tutkijan on otettava asianmukaisen tilastoanalyysimenetelmän valinnassa huomioon varianssien mahdolliset erot ja muut vastaavat ongelmat, jotka saattavat edellyttää määritystulosten muuntamista tai non-parametrista tilastoanalyysia. Tutkijan on kuitenkin mahdollisesti tehtävä SI-laskelmia ja tilastoanalyyseja sekä käyttäen tiettyjä määrityspisteitä koskevia tietoja (niin sanotut käyrän ulkopuolella olevat vasteet) että ilman niitä.

MITTAUSTULOKSET JA TULOSTEN ILMOITTAMINEN

Mittaustulokset

Mittaustulokset

| 34. | Tulokset on esitettävä taulukkona, josta käyvät ilmi eläinkohtaiset BrdU-merkki-indeksin arvot, ryhmän eläinkohtaisten BrdU-merkki-indeksien keskiarvo, siihen liittyvä virhetermi (esimerkiksi keskihajonta tai keskiarvon keskivirhe) sekä kunkin annosryhmän keskimääräinen SI samanaikaiseen liuotin-/kantaja-ainekontrolliryhmään verrattuna. |
| --- | --- |

34.

Tulokset on esitettävä taulukkona, josta käyvät ilmi eläinkohtaiset BrdU-merkki-indeksin arvot, ryhmän eläinkohtaisten BrdU-merkki-indeksien keskiarvo, siihen liittyvä virhetermi (esimerkiksi keskihajonta tai keskiarvon keskivirhe) sekä kunkin annosryhmän keskimääräinen SI samanaikaiseen liuotin-/kantaja-ainekontrolliryhmään verrattuna.

Loppuraportti

Loppuraportti

| 35. | Loppuraportissa on esitettävä seuraavat tiedot: | Testi- ja kontrollikemikaalit






  — | tunnistetiedot (esimerkiksi CAS- ja EC-numerot, jos tiedossa; alkuperä, puhtaus, tunnetut epäpuhtaudet, eränumero), |
| --- | --- | --- | --- |

35.

Loppuraportissa on esitettävä seuraavat tiedot:

Testi- ja kontrollikemikaalit

—

tunnistetiedot (esimerkiksi CAS- ja EC-numerot, jos tiedossa; alkuperä, puhtaus, tunnetut epäpuhtaudet, eränumero),

| — | fysikaalinen olomuoto ja fysikaaliskemialliset ominaisuudet (esimerkiksi haihtuvuus, stabiilisuus, liukoisuus), |
| --- | --- |

—

fysikaalinen olomuoto ja fysikaaliskemialliset ominaisuudet (esimerkiksi haihtuvuus, stabiilisuus, liukoisuus),

| — | jos kyseessä on seos, sen koostumus ja ainesosien suhteelliset osuudet. |
| --- | --- |

—

jos kyseessä on seos, sen koostumus ja ainesosien suhteelliset osuudet.

| | Liuotin/kantaja-aine






  — | tunnistetiedot (puhtaus, tarvittaessa konsentraatio, käytetty tilavuus), |
| --- | --- | --- |

Liuotin/kantaja-aine

—

tunnistetiedot (puhtaus, tarvittaessa konsentraatio, käytetty tilavuus),

| — | perustelut kantaja-aineen valinnalle. |
| --- | --- |

—

perustelut kantaja-aineen valinnalle.

| | Koe-eläimet






  — | CBA-hiirten alkuperä, |
| --- | --- | --- |

Koe-eläimet

—

CBA-hiirten alkuperä,

| — | eläinten mikrobiologinen tila, jos se on tiedossa, |
| --- | --- |

—

eläinten mikrobiologinen tila, jos se on tiedossa,

| — | eläinten määrä ja ikä, |
| --- | --- |

—

eläinten määrä ja ikä,

| — | eläinten alkuperä, koe-eläintilat, ruokavalio ja niin edelleen. |
| --- | --- |

—

eläinten alkuperä, koe-eläintilat, ruokavalio ja niin edelleen.

| | Testiolosuhteet






  — | ELISA-välineistön alkuperä, erän numero ja valmistajan laadunvarmistus-/laadunvalvontatiedot (vasta-aineen herkkyys ja spesifisyys sekä osoitusraja), |
| --- | --- | --- |

Testiolosuhteet

—

ELISA-välineistön alkuperä, erän numero ja valmistajan laadunvarmistus-/laadunvalvontatiedot (vasta-aineen herkkyys ja spesifisyys sekä osoitusraja),

| — | tiedot testiaineen valmistelusta ja annostelusta, |
| --- | --- |

—

tiedot testiaineen valmistelusta ja annostelusta,

| — | perustelut annostasojen valinnalle (mukaan luettuina ennen testiä mahdollisesti suoritetun kartoituksen tulokset), |
| --- | --- |

—

perustelut annostasojen valinnalle (mukaan luettuina ennen testiä mahdollisesti suoritetun kartoituksen tulokset),

| — | käytetyt kantaja- ja testiaineiden konsentraatiot ja annostellun testiaineen kokonaismäärä, |
| --- | --- |

—

käytetyt kantaja- ja testiaineiden konsentraatiot ja annostellun testiaineen kokonaismäärä,

| — | tiedot ravinnon ja veden laadusta (mukaan luettuina ruokavalion tyyppi/alkuperä, veden alkuperä), |
| --- | --- |

—

tiedot ravinnon ja veden laadusta (mukaan luettuina ruokavalion tyyppi/alkuperä, veden alkuperä),

| — | tiedot käsittely- ja näytteenottoaikatauluista, |
| --- | --- |

—

tiedot käsittely- ja näytteenottoaikatauluista,

| — | toksisuuden mittausmenetelmät, |
| --- | --- |

—

toksisuuden mittausmenetelmät,

| — | tutkimusten positiivisuuden tai negatiivisuuden arviointiperusteet, |
| --- | --- |

—

tutkimusten positiivisuuden tai negatiivisuuden arviointiperusteet,

| — | tiedot menettelystä poikkeamisesta ja selvitys siitä, miten poikkeaminen vaikuttaa tutkimussuunnitelmaan ja tuloksiin. |
| --- | --- |

—

tiedot menettelystä poikkeamisesta ja selvitys siitä, miten poikkeaminen vaikuttaa tutkimussuunnitelmaan ja tuloksiin.

| | Luotettavuuden tarkistus






  — | yhteenveto viimeisimmän luotettavuustarkistuksen tuloksista, mukaan luettuina tiedot käytetystä testiaineesta, konsentraatiosta ja kantaja-aineesta, |
| --- | --- | --- |

Luotettavuuden tarkistus

—

yhteenveto viimeisimmän luotettavuustarkistuksen tuloksista, mukaan luettuina tiedot käytetystä testiaineesta, konsentraatiosta ja kantaja-aineesta,

| — | testauslaboratorion samaan aikaan ja/tai aiemmin tehtyjen positiivisten ja samanaikaisten negatiivisten (liuotin/kantaja-aine) kontrollien tulokset, |
| --- | --- |

—

testauslaboratorion samaan aikaan ja/tai aiemmin tehtyjen positiivisten ja samanaikaisten negatiivisten (liuotin/kantaja-aine) kontrollien tulokset,

| — | jos testissä ei ollut samanaikaista positiivista kontrollia, viimeisimmän positiivisen kontrollin päivämäärä ja laboratorioraportti sekä yksityiskohtainen selvitys laboratorion aiemmista positiivista kontrollia koskevista tiedoista, joiden perusteella samanaikaista positiivista kontrollia ei tarvitsisi käyttää. |
| --- | --- |

—

jos testissä ei ollut samanaikaista positiivista kontrollia, viimeisimmän positiivisen kontrollin päivämäärä ja laboratorioraportti sekä yksityiskohtainen selvitys laboratorion aiemmista positiivista kontrollia koskevista tiedoista, joiden perusteella samanaikaista positiivista kontrollia ei tarvitsisi käyttää.

| | Tulokset






  — | kunkin hiiren paino annostelun alussa ja aikataulun mukaisen humaanin lopettamisen yhteydessä sekä kunkin annosryhmän keskimääräinen virhetermi ja asiaan liittyviin muuttujiin liittyvä virhetermi (esimerkiksi keskihajonta tai keskiarvon keskivirhe), |
| --- | --- | --- |

Tulokset

—

kunkin hiiren paino annostelun alussa ja aikataulun mukaisen humaanin lopettamisen yhteydessä sekä kunkin annosryhmän keskimääräinen virhetermi ja asiaan liittyviin muuttujiin liittyvä virhetermi (esimerkiksi keskihajonta tai keskiarvon keskivirhe),

| — | toksisuuden ilmeneminen ajan funktiona ja toksisuuden merkit, mukaan luettuna mahdollinen annostelualueen ihoärsytys, erikseen kullekin eläinyksilölle, |
| --- | --- |

—

toksisuuden ilmeneminen ajan funktiona ja toksisuuden merkit, mukaan luettuna mahdollinen annostelualueen ihoärsytys, erikseen kullekin eläinyksilölle,

| — | taulukko yksittäisten hiirten BrdU-merkki-indekseistä ja kunkin käsittelyryhmän SI-arvoista, |
| --- | --- |

—

taulukko yksittäisten hiirten BrdU-merkki-indekseistä ja kunkin käsittelyryhmän SI-arvoista,

| — | kunkin käsittelyryhmän hiirikohtaisten BrdU-merkki-indeksien keskimääräinen virhetermi ja siihen liittyviin muuttujiin liittyvä virhetermi (esimerkiksi keskihajonta ja keskiarvon keskivirhe) sekä käyrän ulkopuolella olevien vasteiden analyysin tulokset kullekin käsittelyryhmälle, |
| --- | --- |

—

kunkin käsittelyryhmän hiirikohtaisten BrdU-merkki-indeksien keskimääräinen virhetermi ja siihen liittyviin muuttujiin liittyvä virhetermi (esimerkiksi keskihajonta ja keskiarvon keskivirhe) sekä käyrän ulkopuolella olevien vasteiden analyysin tulokset kullekin käsittelyryhmälle,

| — | laskettu SI ja asianmukaisesti määritetty vaihteluväli, jossa otetaan huomioon eläintenvälinen vaihtelu, testiaineella ja kontrolliaineella käsitellyissä ryhmissä, |
| --- | --- |

—

laskettu SI ja asianmukaisesti määritetty vaihteluväli, jossa otetaan huomioon eläintenvälinen vaihtelu, testiaineella ja kontrolliaineella käsitellyissä ryhmissä,

| — | annosvasteen voimakkuus, |
| --- | --- |

—

annosvasteen voimakkuus,

| — | tarvittaessa tilastoanalyysit. |
| --- | --- |

—

tarvittaessa tilastoanalyysit.

| | Tulosten pohdinta






  — | tulosten lyhyt kommentointi, annos-vasteanalyysi ja tarvittaessa tilastoanalyysi sekä johtopäätös siitä, onko testiainetta pidettävä ihoherkistystä aiheuttavana. |
| --- | --- | --- |

Tulosten pohdinta

—

tulosten lyhyt kommentointi, annos-vasteanalyysi ja tarvittaessa tilastoanalyysi sekä johtopäätös siitä, onko testiainetta pidettävä ihoherkistystä aiheuttavana.

LÄHDELUETTELO

| (1) | OECD (2010). Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guideline No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines |
| --- | --- |

(1)

OECD (2010). Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guideline No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines

| (2) | Chamberlain, M. ja Basketter, D. A. (1996). The local lymph node assay: status of validation. Food Chem. Toxicol. 34, s. 999–1002. |
| --- | --- |

(2)

Chamberlain, M. ja Basketter, D. A. (1996). The local lymph node assay: status of validation. Food Chem. Toxicol. 34, s. 999–1002.

Food Chem. Toxicol.

| (3) | Basketter, D. A., Gerberick, G. F., Kimber, I. ja Loveless, S. E. (1996). The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem. Toxicol. 34, s. 985–997. |
| --- | --- |

(3)

Basketter, D. A., Gerberick, G. F., Kimber, I. ja Loveless, S. E. (1996). The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem. Toxicol. 34, s. 985–997.

Food Chem. Toxicol.

| (4) | Basketter, D. A., Gerberick, G. F. ja Kimber, I. (1998). Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. Toxicol. 36, s. 327–33. |
| --- | --- |

(4)

Basketter, D. A., Gerberick, G. F. ja Kimber, I. (1998). Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. Toxicol. 36, s. 327–33.

Food Chem. Toxicol.

| (5) | Van Och, F. M. M., Slob, W., De Jong, W. H., Vandebriel, R. J. ja Van Loveren, H. (2000). A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicol. 146, s. 49–59. |
| --- | --- |

(5)

Van Och, F. M. M., Slob, W., De Jong, W. H., Vandebriel, R. J. ja Van Loveren, H. (2000). A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicol. 146, s. 49–59.

Toxicol.

| (6) | ICCVAM (1999). The murine local lymph node Assay: A test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH-julkaisunumero 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf |
| --- | --- |

(6)

ICCVAM (1999). The murine local lymph node Assay: A test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH-julkaisunumero 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf

| (7) | Dean, J. H., Twerdok, L. E., Tice, R. R., Sailstad, D. M., Hattan, D. G., Stokes, W. S. (2001). ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol 34(3), s. 258–273. |
| --- | --- |

(7)

Dean, J. H., Twerdok, L. E., Tice, R. R., Sailstad, D. M., Hattan, D. G., Stokes, W. S. (2001). ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol 34(3), s. 258–273.

Reg. Toxicol. Pharmacol

| (8) | Haneke, K. E., Tice, R. R., Carson, B. L., Margolin, B. H., Stokes, W. S. (2001). ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol 34(3), s. 274–286. |
| --- | --- |

(8)

Haneke, K. E., Tice, R. R., Carson, B. L., Margolin, B. H., Stokes, W. S. (2001). ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol 34(3), s. 274–286.

Reg. Toxicol. Pharmacol

| (9) | Sailstad, D. M., Hattan, D., Hill, R. N., Stokes, W. S. (2001). ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process. Reg. Toxicol. Pharmacol 34(3), s. 249–257. |
| --- | --- |

(9)

Sailstad, D. M., Hattan, D., Hill, R. N., Stokes, W. S. (2001). ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process. Reg. Toxicol. Pharmacol 34(3), s. 249–257.

Reg. Toxicol. Pharmacol

| (10) | ICCVAM (2010). ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioactive local lymph node assay: BrdU-ELISA Test Method Protocol (LLNA: BrdU-ELISA). NIH-julkaisunumero 10-7552A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-ELISA/TMER.htm |
| --- | --- |

(10)

ICCVAM (2010). ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioactive local lymph node assay: BrdU-ELISA Test Method Protocol (LLNA: BrdU-ELISA). NIH-julkaisunumero 10-7552A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-ELISA/TMER.htm

| (11) | ICCVAM (2009). Independent Scientific Peer Review Panel Report: Updated validation status of new versions and applications of the murine local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf |
| --- | --- |

(11)

ICCVAM (2009). Independent Scientific Peer Review Panel Report: Updated validation status of new versions and applications of the murine local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf

| (12) | Takeyoshi, M., Iida, K., Shiraishi, K. ja Hoshuyama, S. (2005). Novel approach for classifying chemicals according to skin sensitising potency by non-radioisotopic modification of the local lymph node assay. J. Appl. Toxicol. 25, s. 129–134. |
| --- | --- |

(12)

Takeyoshi, M., Iida, K., Shiraishi, K. ja Hoshuyama, S. (2005). Novel approach for classifying chemicals according to skin sensitising potency by non-radioisotopic modification of the local lymph node assay. J. Appl. Toxicol. 25, s. 129–134.

J. Appl. Toxicol.

| (13) | OECD (1992). Skin Sensitisation, Test Guideline No. 406, Guidelines for Testing of Chemicals. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines |
| --- | --- |

(13)

OECD (1992). Skin Sensitisation, Test Guideline No. 406, Guidelines for Testing of Chemicals. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines

| (14) | Kreiling, R., Hollnagel, H. M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M. S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. ja Wendel, A. (2008). Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol. 46, s. 1896–1904. |
| --- | --- |

(14)

Kreiling, R., Hollnagel, H. M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M. S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. ja Wendel, A. (2008). Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol. 46, s. 1896–1904.

Food Chem. Toxicol.

| (15) | Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J. C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. ja Mehling, A. (2009). Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. Pharmacol 55, s. 90–96. |
| --- | --- |

(15)

Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J. C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. ja Mehling, A. (2009). Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. Pharmacol 55, s. 90–96.

Reg. Toxicol. Pharmacol

| (16) | ILAR (1996). Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 7. painos. Washington, DC: National Academies Press. |
| --- | --- |

(16)

ILAR (1996). Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 7. painos. Washington, DC: National Academies Press.

| (17) | ICCVAM (2009). Recommended Performance Standards: Murine Local Lymph Node Assay. NIH-julkaisunumero 09-7357. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa
  http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf |
| --- | --- |

(17)

ICCVAM (2009). Recommended Performance Standards: Murine Local Lymph Node Assay. NIH-julkaisunumero 09-7357. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa

http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf

| (18) | McGarry, H. F. (2007). The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH. Toxicol. 238, s. 71–89. |
| --- | --- |

(18)

McGarry, H. F. (2007). The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH. Toxicol. 238, s. 71–89.

Toxicol.

| (19) | Kimber, I., Dearman, R. J., Scholes E. W. ja Basketter, D. A. (1994). The local lymph node assay: developments and applications. Toxicol. 93, s. 13–31. |
| --- | --- |

(19)

Kimber, I., Dearman, R. J., Scholes E. W. ja Basketter, D. A. (1994). The local lymph node assay: developments and applications. Toxicol. 93, s. 13–31.

Toxicol.

| (20) | OECD (2002). Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No. 404, Guidelines for Testing of Chemicals. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines |
| --- | --- |

(20)

OECD (2002). Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No. 404, Guidelines for Testing of Chemicals. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines

| (21) | Reeder, M. K., Broomhead, Y. L., DiDonato, L. ja DeGeorge, G. L. (2007). Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances. Toxicologist 96, s. 235. |
| --- | --- |

(21)

Reeder, M. K., Broomhead, Y. L., DiDonato, L. ja DeGeorge, G. L. (2007). Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances. Toxicologist 96, s. 235.

Toxicologist

| (22) | ICCVAM (2009). Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf. |
| --- | --- |

(22)

ICCVAM (2009). Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf.

| (23) | Hayes, B. B., Gerber, P. C., Griffey, S. S. ja Meade, B. J. (1998). Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice. Drug Chem. Toxicol. 21, s. 195–206. |
| --- | --- |

(23)

Hayes, B. B., Gerber, P. C., Griffey, S. S. ja Meade, B. J. (1998). Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice. Drug Chem. Toxicol. 21, s. 195–206.

Drug Chem. Toxicol.

| (24) | Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H. C., Ruzicka, T., Ahr, H. J., Lehmann, P. ja Vohr, V. W. (1998). An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxicol. Appl. Pharmacol. 153, s. 83–94. |
| --- | --- |

(24)

Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H. C., Ruzicka, T., Ahr, H. J., Lehmann, P. ja Vohr, V. W. (1998). An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxicol. Appl. Pharmacol. 153, s. 83–94.

Toxicol. Appl. Pharmacol.

| (25) | Woolhiser, M. R., Hayes, B. B. ja Meade, B. J. (1998). A combined murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals. Toxicol. Meth. 8, s. 245–256. |
| --- | --- |

(25)

Woolhiser, M. R., Hayes, B. B. ja Meade, B. J. (1998). A combined murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals. Toxicol. Meth. 8, s. 245–256.

Toxicol. Meth.

| (26) | Hayes, B. B. ja Meade, B. J. (1999). Contact sensitivity to selected acrylate compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods. Drug. Chem. Toxicol. 22, s. 491–506. |
| --- | --- |

(26)

Hayes, B. B. ja Meade, B. J. (1999). Contact sensitivity to selected acrylate compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods. Drug. Chem. Toxicol. 22, s. 491–506.

Drug. Chem. Toxicol.

| (27) | Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A. O., van Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. ja Vohr, H. W. (2005). A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol. 212, s. 60–68. |
| --- | --- |

(27)

Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A. O., van Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. ja Vohr, H. W. (2005). A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol. 212, s. 60–68.

Toxicol.

| (28) | Vohr, H. W. ja Ahr, H. J. (2005). The local lymph node assay being too sensitive? Arch. Toxicol. 79, s. 721–728. |
| --- | --- |

(28)

Vohr, H. W. ja Ahr, H. J. (2005). The local lymph node assay being too sensitive? Arch. Toxicol. 79, s. 721–728.

Arch. Toxicol.

| (29) | Patterson, R. M., Noga, E. ja Germolec D. (2007). Lack of evidence for contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect. 115, s. 1023–1028. |
| --- | --- |

(29)

Patterson, R. M., Noga, E. ja Germolec D. (2007). Lack of evidence for contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect. 115, s. 1023–1028.

| (30) | ICCVAM (2009). Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm. |
| --- | --- |

(30)

ICCVAM (2009). Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm.

In Vitro

| (31) | OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines |
| --- | --- |

(31)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines

| (32) | Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R. J., Gerberick, G. F., Ryan, C. A., Basketter, D. A., Lea, L., House, R. V., Ladies, G. S., Loveless, S. E. ja Hastings, K. L. (1998). Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ.l Health 53, s. 563–79. |
| --- | --- |

(32)

Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R. J., Gerberick, G. F., Ryan, C. A., Basketter, D. A., Lea, L., House, R. V., Ladies, G. S., Loveless, S. E. ja Hastings, K. L. (1998). Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ.l Health 53, s. 563–79.

J. Toxicol. Environ.l Health

| (33) | OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines |
| --- | --- |

(33)

OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14. OECD, Pariisi. Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/env/testguidelines

Lisäys 1

MÄÄRITELMÄT

Tarkkuus: Testimenetelmän tulosten ja hyväksyttyjen vertailuarvojen välinen ero. Tarkkuus on testimenetelmän suorituskyvyn mitta ja yksi merkityksellisyyden osa-tekijöistä. Tarkkuutta ja vastaavuutta (konkordanssia) käytetään usein toisiaan korvaavasti tarkoittamaan testimenetelmällä saatujen oikeiden tulosten osuutta (33).

Vertailuaine: Herkistävä tai muu kuin herkistävä aine, jota käytetään testiaineen vertailustandardina. Vertailuaineella on oltava seuraavat ominaisuudet: i) luotettava alkuperä, joka pysyy samana, ii) samanlainen rakenne ja toiminta kuin testiaineryhmällä, iii) tunnetut fysikaaliskemialliset ominaisuudet, iv) todisteet tunnetuista vaikutuksista ja v) tunnettu voimakkuus tavoitellulla vasteen vaihteluvälillä.

Väärä negatiivinen: Testiaine on testimenetelmässä määritetty väärin perustein negatiiviseksi tai inaktiiviseksi, vaikka se itse asiassa on positiivinen tai aktiivinen (33).

Väärä positiivinen: Testiaine on testimenetelmässä määritetty väärin perustein positiiviseksi tai aktiiviseksi, vaikka se itse asiassa on negatiivinen tai inaktiivinen (33).

Vaarallisuus: Mahdollisuus kielteiseen terveys- tai ympäristövaikutukseen. Kielteinen vaikutus edellyttää altistumista vähintään tietyllä tasolla.

Laboratorioidenvälinen uusittavuus: Se, missä määrin eri (pätevät) laboratoriot voivat saada aikaan laadullisesti ja määrällisesti samanlaisia tuloksia käyttämällä samoja tutkimussuunnitelmia ja testaamalla samaa testiainetta. Laboratorioidenvälinen uusittavuus määritetään esivalidointi- ja validointimenettelyissä, ja sillä osoitetaan, missä määrin testi voidaan onnistuneesti toteuttaa eri laboratorioissa (33).

Laboratorionsisäinen uusittavuus: Se, missä määrin tietyn laboratorion pätevä henkilöstö voi saada onnistuneesti aikaan samat tulokset käyttämällä tiettyä tutkimussuunnitelmaa eri ajankohtina (33).

Käyrän ulkopuolella oleva vaste: Käyrän ulkopuolella olevalla vasteella tarkoitetaan havaintoa, joka poikkeaa merkittävästi muista populaation sattumanvaraisten näytteiden arvoista.

Laadunvarmistus: Hallintomenettely, jossa testausta suorittavista henkilöistä riippumattomat henkilöt arvioivat laboratorion testausstandardien, vaatimusten ja kirjanpitomenettelyjen noudattamista ja tiedonsiirron tarkkuutta.

Luotettavuus: Laajuus, jolla testimenetelmä on toistettavissa samassa laboratoriossa tai eri laboratorioissa pidemmällä aikavälillä käytettäessä samaa menettelyä. Se arvioidaan laskemalla uusittavuus samassa laboratoriossa ja eri laboratorioissa (33).

Ihoherkistys: Immunologinen prosessi, joka aiheutuu herkän yksilön paikallisesta altistamisesta tietylle kemialliselle allergeenille, joka aiheuttaa iholla immuunivasteen, joka voi johtaa kosketusherkistykseen.

Stimulaatioindeksi (SI): Testiaineen ihoärsytyspotentiaalin arvioimiseksi laskettu arvo, jolla esitetään käsiteltyjen ryhmien soluproliferaation ja samanaikaisen kantaja-aineella käsitellyn kontrolliryhmän soluproliferaation välinen suhde.

Testiaine (testikemikaali): Aine tai seos, jota testataan tällä testimenetelmällä.

---

(1)  Oletetaan, että ei aiheuta ihoherkistystä ihmisillä, koska kliinisten lapputestien tuloksia ei ole saatavilla, sitä ei ole sisällytetty lapputestipaketin allergeeniksi eikä ihmisten herkistymisestä ole saatavilla tapausselvityksiä.

1

(2)  Marsutestien tietoja ei ole saatavilla.

2

(3)  Kemikaalit on valmistettava päivittäin, paitsi jos säilyvyys on osoitettu stabiliteettitutkimuksilla.

3

(4)  Koska erilaiset kantaja-aineet voivat vaikuttaa LLNA-menetelmän suorituskykyyn, kullekin vertailukemikaalille suositeltua kantaja-ainetta on käytettävä (24) (32).

4

(5)  Keskiarvo, jos saatavilla on useampi kuin yksi EC3-arvo. Negatiivisten aineiden (stimulaatioindeksi < 3) osalta esitetään suurin testattu konsentraatio.

5

(6)  Niiden LLNA-tutkimusten määrä, joista tiedot on saatu.

6

(7)  Kaupallisesti saatavilla Kathon CG:nä (CAS-nro 55965-84-9), joka on CMI:n ja MI:n seos (3:1). Kunkin osan suhteelliset konsentraatiot vaihtelevat välillä 1,1–1,25 % (CMI) ja 0,3–0,45 % (MI). Inaktiivisina osina ovat magnesiumsuolat (21,5–24 %) ja kuparinitraatti (0,15–0,17 %), ja muu osa valmisteesta (74–77 %) on vettä. Kathon CG on helposti saatavilla Sigma-Aldrich-yrityksen ja Rohm and Haas -yrityksen (nykyisin Dow Chemical Corporation) välityksellä.

7

(8)  Nämä vertailukemikaalit muodostavat osan validointitutkimuksessa käytettävistä vertailukemikaaleista.

8

(9)  In vivo -pisteytystulos B.4-menetelmän ja OECD:n testiohjeen 404 (4) mukaisesti.

9

In vivo

(10)  Tässä testimenetelmässä katsotaan, että YK:n GHS-järjestelmän valinnainen luokka 3 (lievästi ärsyttävät aineet) (1) vastaa luokitusta ’ei luokitusta’.

10

(11)  YK:n GHS-järjestelmän valinnaista luokkaa 3 ei sovelleta EU:n CLP-asetuksessa.

11

(12)  EYVL L 225, 21.8.2001, s. 1.

12

(13)  Kemikaalit valitaan seuraavin perustein: i) kemikaalit ovat kaupallisesti saatavilla; ii) ne edustavat koko Draizen ärsyttävyyspisteytysasteikkoa (ärsyttämättömästä erittäin ärsyttävään); iii) niiden kemiallinen rakenne on tarkkaan määritetty; iv) niiden kemiallinen funktio on sama kuin validointiprosessissa käytettyjen kemikaalien; ja v) niillä ei ole erittäin toksisia ominaisuuksia (esimerkiksi karsinogeenisia tai lisääntymisjärjestelmälle myrkyllisiä ominaisuuksia), eivätkä niiden loppusijoituskustannukset saa olla niin suuret, että ne estäisivät menetelmän käytön.

13

(14)  Kemikaalit, jotka aiheuttavat ärsytystä kanille mutta jotka luotettavien todisteiden mukaan eivät aiheuta ärsytystä ihmisille (31) (32) (33).

14

(15)  YK:n GHS-järjestelmässä, ei EU:n CLP-asetuksessa

15

(16)  Vertailukemikaalien käyttöä suositellaan. Korvaavia tai täydentäviä kemikaaleja voidaan lisätä vertailukemikaalien luetteloon, jos niiden vaikutus on tiedossa ja ne indusoivat mikrotumia samoilla toimintamekanismeilla ja jos niiden osoitetaan olevan merkityksellisiä MNvit-menetelmällä testattavien kemikaalien osalta. Käyttötarkoituksesta riippuen perusteluna voidaan esittää myös muun muassa validointitutkimus, jossa on käytetty useita eri aineita tai jossa keskitytään kapeampaan kirjoon testiaineen kemikaaliluokan tai tutkittavan vauriomekanismin perusteella.

16

---