# Den Europæiske Unions L 193/2012

| | ISSN 1977-0634
  doi:10.3000/19770634.L_2012.193.dan |
| --- | --- |
| Den Europæiske Unions
  Tidende | L 193 |
| | |
| Dansk udgave | Retsforskrifter | 55. årgang20. juli 2012 |

ISSN 1977-0634

doi:10.3000/19770634.L_2012.193.dan

Den Europæiske Unions

Tidende

L 193

Dansk udgave

Retsforskrifter

55. årgang20. juli 2012

---

| Indhold | | II   Ikke-lovgivningsmæssige retsakter | Side |
| --- | --- | --- | --- |
| | | FORORDNINGER |
| | * | Kommissionens forordning (EU) nr. 640/2012 af 6. juli 2012 om tilpasning til den tekniske udvikling af forordning (EF) nr. 440/2008 om fastlæggelse af forsøgsmetoder i henhold til Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1907/2006 om registrering, vurdering og godkendelse af samt begrænsninger for kemikalier (REACH) (
  1
  ) | 1 |

Indhold

II   Ikke-lovgivningsmæssige retsakter

Side

FORORDNINGER

*

Kommissionens forordning (EU) nr. 640/2012 af 6. juli 2012 om tilpasning til den tekniske udvikling af forordning (EF) nr. 440/2008 om fastlæggelse af forsøgsmetoder i henhold til Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1907/2006 om registrering, vurdering og godkendelse af samt begrænsninger for kemikalier (REACH) (
  1
  )

1

1

| | |
| --- | --- |
| | (1)   EØS-relevant tekst |

---

(1)   EØS-relevant tekst

1

| DA | De akter, hvis titel er trykt med magre typer, er løbende retsakter inden for rammerne af landbrugspolitikken og har normalt en begrænset gyldighedsperiode.
  Titlen på alle øvrige akter er trykt med fede typer efter en asterisk. |
| --- | --- |

DA

De akter, hvis titel er trykt med magre typer, er løbende retsakter inden for rammerne af landbrugspolitikken og har normalt en begrænset gyldighedsperiode.

Titlen på alle øvrige akter er trykt med fede typer efter en asterisk.

---

II Ikke-lovgivningsmæssige retsakter

FORORDNINGER

| 20.7.2012 | DA | Den Europæiske Unions Tidende | L 193/1 |
| --- | --- | --- | --- |

20.7.2012

DA

Den Europæiske Unions Tidende

L 193/1

---

KOMMISSIONENS FORORDNING (EU) Nr. 640/2012

af 6. juli 2012

om tilpasning til den tekniske udvikling af forordning (EF) nr. 440/2008 om fastlæggelse af forsøgsmetoder i henhold til Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1907/2006 om registrering, vurdering og godkendelse af samt begrænsninger for kemikalier (REACH)

(EØS-relevant tekst)

EUROPA-KOMMISSIONEN HAR —

under henvisning til traktaten om Den Europæiske Unions funktionsmåde,

under henvisning til Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1907/2006 af 18. december 2006 om registrering, vurdering og godkendelse af samt begrænsninger for kemikalier (REACH), om oprettelse af et europæisk kemikalieagentur og om ændring af direktiv 1999/45/EF og ophævelse af Rådets forordning (EØF) nr. 793/93 og Kommissionens forordning (EF) nr. 1488/94 samt Rådets direktiv 76/769/EØF og Kommissionens direktiv 91/155/EØF, 93/67/EØF, 93/105/EF og 2000/21/EF (1), særlig artikel 13, stk. 3, og

ud fra følgende betragtninger:

| (1) | Kommissionens forordning (EF) nr. 440/2008 (2) indeholder de testmetoder, der skal anvendes til at bestemme stoffers fysisk-kemiske egenskaber, toksicitet og økotoksicitet i forbindelse med forordning (EF) nr. 1907/2006. |
| --- | --- |

(1)

Kommissionens forordning (EF) nr. 440/2008 (2) indeholder de testmetoder, der skal anvendes til at bestemme stoffers fysisk-kemiske egenskaber, toksicitet og økotoksicitet i forbindelse med forordning (EF) nr. 1907/2006.

| (2) | Der er behov for ajourføring af forordning (EF) nr. 440/2008 ved, at der med høj prioritet indsættes en række nye og ajourførte alternative testmetoder, som OECD har vedtaget for nyligt, således at antallet af dyr, der anvendes til dyreforsøg, begrænses til et minimum i overensstemmelse med Europa-Parlamentets og Rådets direktiv 2010/63/EU af 22. september 2010 om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål (3), og Rådets direktiv 86/609/EØF af 24. november 1986 om indbyrdes tilnærmelse af medlemsstaternes love og administrative bestemmelser om beskyttelse af dyr, der anvendes til forsøg og andre videnskabelige formål (4). De interesserede parter er blevet hørt om dette forslag. |
| --- | --- |

(2)

Der er behov for ajourføring af forordning (EF) nr. 440/2008 ved, at der med høj prioritet indsættes en række nye og ajourførte alternative testmetoder, som OECD har vedtaget for nyligt, således at antallet af dyr, der anvendes til dyreforsøg, begrænses til et minimum i overensstemmelse med Europa-Parlamentets og Rådets direktiv 2010/63/EU af 22. september 2010 om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål (3), og Rådets direktiv 86/609/EØF af 24. november 1986 om indbyrdes tilnærmelse af medlemsstaternes love og administrative bestemmelser om beskyttelse af dyr, der anvendes til forsøg og andre videnskabelige formål (4). De interesserede parter er blevet hørt om dette forslag.

| (3) | Forordning (EF) nr. 440/2008 bør derfor ændres i overensstemmelse hermed. |
| --- | --- |

(3)

Forordning (EF) nr. 440/2008 bør derfor ændres i overensstemmelse hermed.

| (4) | Foranstaltningerne i denne forordning er i overensstemmelse med udtalelse fra det udvalg, der er nedsat ved artikel 133 i forordning (EF) nr. 1907/2006 — |
| --- | --- |

(4)

Foranstaltningerne i denne forordning er i overensstemmelse med udtalelse fra det udvalg, der er nedsat ved artikel 133 i forordning (EF) nr. 1907/2006 —

VEDTAGET DENNE FORORDNING:

Artikel 1

Bilaget til forordning (EF) nr. 440/2008 ændres som angivet i bilaget til nærværende forordning.

Artikel 2

Denne forordning træder i kraft på tredjedagen efter offentliggørelsen i Den Europæiske Unions Tidende.

Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gælder umiddelbart i hver medlemsstat.

Udfærdiget i Bruxelles, 6. juli 2012

På Kommissionens vegne

José MANUEL BARROSO

Formand

---

(1)  EUT L 396 af 30.12.2006, s. 1.

1

(2)  EUT L 142 af 31.5.2008, s. 1.

2

(3)  EUT L 276 af 20.10.2010, s. 33.

3

(4)  EFT L 358 af 18.12.1986, s. 1.

4

---

BILAG

I bilaget til forordning (EF) nr. 440/2008 foretages følgende ændringer:

| 1) | Kapitel B.42 affattes således:
  »B.42.   HUDSENSIBILISERING: ASSAY PÅ LOKALE LYMFEKNUDER

  INDLEDNING






  1. | OECD's vejledning om testning af kemikalier og EU-testmetoder baseret på denne vejledning bliver med mellemrum gennemgået på baggrund af den videnskabelige udvikling, behovet for ny lovgivning og hensynet til dyrevelfærden. Den oprindelige testmetode (TM) til bestemmelse af hudsensibilisering i mus, assay på lokale lymfeknuder (LLNA, OECD Test Guideline 429, kapitel B.42 i dette bilag), er allerede blevet vedtaget (1). En validering af LLNA og en oversigt over det tilknyttede arbejde findes i litteraturen (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11). Den ajourførte LLNA er baseret på en evaluering af erfaringerne og videnskabelige data (12). Der er tale om endnu en TM til vurdering af kemikaliers (stoffer og blandinger) potentiale for hudsensibilisering i dyr. I den anden TM (dvs. OECD Test Guideline 406, kapitel B.6 i dette bilag) anvendes marsvin, navnlig maksimeringstesten på marsvin og Buehlertesten (13). LLNA har visse fordele frem for B.6 og OECD Test Guideline 406 (13), hvad angår dyrevelfærd. Denne ajourførte LLNA-TM rummer et sæt ydeevnestandarder (tillæg 1) til brug for vurdering af valideringsstatus for nye og/eller modificerede testmetoder, som funktionelt og mekanisk svarer til LLNA, i overensstemmelse med principperne i OECD Guidance Document No. 34 (14). |
| --- | --- | --- |

1)

Kapitel B.42 affattes således:

»B.42.   HUDSENSIBILISERING: ASSAY PÅ LOKALE LYMFEKNUDER

INDLEDNING

1.

OECD's vejledning om testning af kemikalier og EU-testmetoder baseret på denne vejledning bliver med mellemrum gennemgået på baggrund af den videnskabelige udvikling, behovet for ny lovgivning og hensynet til dyrevelfærden. Den oprindelige testmetode (TM) til bestemmelse af hudsensibilisering i mus, assay på lokale lymfeknuder (LLNA, OECD Test Guideline 429, kapitel B.42 i dette bilag), er allerede blevet vedtaget (1). En validering af LLNA og en oversigt over det tilknyttede arbejde findes i litteraturen (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11). Den ajourførte LLNA er baseret på en evaluering af erfaringerne og videnskabelige data (12). Der er tale om endnu en TM til vurdering af kemikaliers (stoffer og blandinger) potentiale for hudsensibilisering i dyr. I den anden TM (dvs. OECD Test Guideline 406, kapitel B.6 i dette bilag) anvendes marsvin, navnlig maksimeringstesten på marsvin og Buehlertesten (13). LLNA har visse fordele frem for B.6 og OECD Test Guideline 406 (13), hvad angår dyrevelfærd. Denne ajourførte LLNA-TM rummer et sæt ydeevnestandarder (tillæg 1) til brug for vurdering af valideringsstatus for nye og/eller modificerede testmetoder, som funktionelt og mekanisk svarer til LLNA, i overensstemmelse med principperne i OECD Guidance Document No. 34 (14).

| 2. | LLNA består i undersøgelse af induktionsfasen i hudsensibilisering og giver kvantitative data, som er velegnede til at vurdere dosis/responsforholdet. Det skal bemærkes, at de let til moderat sensibiliserende stoffer, der anbefales som velegnede positive kontrolstoffer (PC) ved marsvineforsøg (dvs. B.6, OECD Test Guideline 406) (13) også er egnede til brug i forbindelse med LLNA (6) (8) (15). En reduceret version af LLNA (rLLNA), hvor der anvendes op til 40 % færre dyr, er også beskrevet som en mulighed i denne TM (16) (17) (18). rLLNA kan anvendes, når det er lovgivningsmæssigt nødvendigt at bekræfte en negativ forudsigelse af et potentielt hudsensibiliserende stof, forudsat at alle andre LLNA-protokolspecifikationer overholdes som beskrevet i denne TM. En forudsigelse af et negativt resultat bør være baseret på alle foreliggende oplysninger som beskrevet i punkt 4. Inden anvendelsen af rLLNA-metoden skal der fremlægges klare begrundelser og et klart videnskabeligt rationale derfor. Hvis der imod forventning opnås et positivt eller tvetydigt resultat i rLLNA, kan det være nødvendigt at foretage yderligere forsøg for at fortolke eller uddybe resultatet. rLLNA bør ikke anvendes til fareidentifikation af hudsensibiliserende teststoffer, når der er brug for oplysninger om dosis-responsforholdet såsom underinddeling i henhold til forordning (EF) nr. 1272/2008 om klassificering, mærkning og emballering af stoffer og blandinger og FN's globale harmoniserede system for klassificering og mærkning af kemikalier. |
| --- | --- |

2.

LLNA består i undersøgelse af induktionsfasen i hudsensibilisering og giver kvantitative data, som er velegnede til at vurdere dosis/responsforholdet. Det skal bemærkes, at de let til moderat sensibiliserende stoffer, der anbefales som velegnede positive kontrolstoffer (PC) ved marsvineforsøg (dvs. B.6, OECD Test Guideline 406) (13) også er egnede til brug i forbindelse med LLNA (6) (8) (15). En reduceret version af LLNA (rLLNA), hvor der anvendes op til 40 % færre dyr, er også beskrevet som en mulighed i denne TM (16) (17) (18). rLLNA kan anvendes, når det er lovgivningsmæssigt nødvendigt at bekræfte en negativ forudsigelse af et potentielt hudsensibiliserende stof, forudsat at alle andre LLNA-protokolspecifikationer overholdes som beskrevet i denne TM. En forudsigelse af et negativt resultat bør være baseret på alle foreliggende oplysninger som beskrevet i punkt 4. Inden anvendelsen af rLLNA-metoden skal der fremlægges klare begrundelser og et klart videnskabeligt rationale derfor. Hvis der imod forventning opnås et positivt eller tvetydigt resultat i rLLNA, kan det være nødvendigt at foretage yderligere forsøg for at fortolke eller uddybe resultatet. rLLNA bør ikke anvendes til fareidentifikation af hudsensibiliserende teststoffer, når der er brug for oplysninger om dosis-responsforholdet såsom underinddeling i henhold til forordning (EF) nr. 1272/2008 om klassificering, mærkning og emballering af stoffer og blandinger og FN's globale harmoniserede system for klassificering og mærkning af kemikalier.

DEFINITIONER

| 3. | De anvendte definitioner er forklaret i tillæg 2. |
| --- | --- |

3.

De anvendte definitioner er forklaret i tillæg 2.

INDLEDENDE OVERVEJELSER OG BEGRÆNSNINGER

| 4. | LLNA er en alternativ metode til at udpege potentielle hudsensibiliserende kemikalier. Dette indebærer ikke, at LLNA i alle tilfælde bør benyttes i stedet for marsvinetesten (dvs. B.6, OECD Test Guideline 406) (13), men snarere, at dette assay er lige så nyttigt og kan anvendes som et alternativ, for hvilket det gælder, at positive og negative resultater sædvanligvis ikke længere kræver yderligere bekræftelse. Testlaboratoriet bør inden forsøgets udførelse gennemgå alle foreliggende oplysninger om teststoffet. Sådanne oplysninger omfatter stoffets identitet og kemiske struktur, dets fysisk-kemiske egenskaber, resultaterne af eventuelle andre in vivo- og in vitro-toksicitetsundersøgelser af teststoffet og toksikologiske data for strukturelt beslægtede kemikalier. Disse oplysninger bør tages i betragtning ved vurderingen af, om LLNA er egnet til brug for stoffet (i lyset af begrænsede typer kemikaliers inkompatibilitet med LLNA — se punkt 5) og som støtte ved valg af dosis. |
| --- | --- |

4.

LLNA er en alternativ metode til at udpege potentielle hudsensibiliserende kemikalier. Dette indebærer ikke, at LLNA i alle tilfælde bør benyttes i stedet for marsvinetesten (dvs. B.6, OECD Test Guideline 406) (13), men snarere, at dette assay er lige så nyttigt og kan anvendes som et alternativ, for hvilket det gælder, at positive og negative resultater sædvanligvis ikke længere kræver yderligere bekræftelse. Testlaboratoriet bør inden forsøgets udførelse gennemgå alle foreliggende oplysninger om teststoffet. Sådanne oplysninger omfatter stoffets identitet og kemiske struktur, dets fysisk-kemiske egenskaber, resultaterne af eventuelle andre in vivo- og in vitro-toksicitetsundersøgelser af teststoffet og toksikologiske data for strukturelt beslægtede kemikalier. Disse oplysninger bør tages i betragtning ved vurderingen af, om LLNA er egnet til brug for stoffet (i lyset af begrænsede typer kemikaliers inkompatibilitet med LLNA — se punkt 5) og som støtte ved valg af dosis.

| 5. | LLNA er en in vivo-metode og eliminerer således ikke brugen af dyr til vurdering af allergisk kontaktsensibiliserende aktivitet. Den giver imidlertid mulighed for at mindske det nødvendige antal dyr til dette formål. Desuden repræsenterer LLNA en væsentligt mere sofistikeret måde (mindre smerte og angst) at anvende dyr til allergisk kontaktsensibiliseringstest på. LLNA er baseret på immunologiske hændelser, som udløses af kemikalier i induktionsfasen af sensibiliseringen. I modsætning til marsvinetest, (dvs. B.6, OECD Test Guideline 406) (13) kræver LLNA ikke, at der fremkaldes challenge-inducerede dermale hypersensivitetsreaktioner. Desuden kræver LLNA ikke anvendelse af et adjuvans, således som det er tilfældet for maksimeringstesten på marsvin (13). LLNA mindsker således dyrenes lidelser. Trods LLNA's fordele frem for B.6 og OECD Test Guideline 406 må man have for øje, at metoden har visse begrænsninger, som kan gøre B.6 eller OECD Test Guideline 406 nødvendige (13) (f.eks. falsk negative resultater i LLNA for visse metaller, falsk positive resultater for visse hudirriterende stoffer [såsom visse overfladeaktive kemikalier] (19) (20) eller teststoffets opløselighed). Kemiske stofgrupper eller stoffer, der indeholder funktionelle grupper, som kan skabe uafklarede sammenhænge (confounders) (21), kan desuden gøre marsvinetest nødvendige (dvs. B.6, OECD Test Guideline 406) (13). I lyset af den begrænsede valideringsdatabase primært bestående af pesticidformuleringer er der endvidere større sandsynlighed for, at LLNA giver et positivt resultat i forbindelse med disse typer teststoffer (22) i forhold til marsvinetesten. I forbindelse med testning af formuleringer kan man imidlertid overveje at inkludere lignende stoffer med kendte resultater som referencestoffer for at påvise, at LLNA fungerer korrekt (se punkt 16). Bortset fra disse identificerede begrænsninger bør LLNA kunne anvendes til testning af alle stoffer, medmindre disse stoffer har egenskaber, som kan have indflydelse på LLNA-metodens nøjagtighed. |
| --- | --- |

5.

LLNA er en in vivo-metode og eliminerer således ikke brugen af dyr til vurdering af allergisk kontaktsensibiliserende aktivitet. Den giver imidlertid mulighed for at mindske det nødvendige antal dyr til dette formål. Desuden repræsenterer LLNA en væsentligt mere sofistikeret måde (mindre smerte og angst) at anvende dyr til allergisk kontaktsensibiliseringstest på. LLNA er baseret på immunologiske hændelser, som udløses af kemikalier i induktionsfasen af sensibiliseringen. I modsætning til marsvinetest, (dvs. B.6, OECD Test Guideline 406) (13) kræver LLNA ikke, at der fremkaldes challenge-inducerede dermale hypersensivitetsreaktioner. Desuden kræver LLNA ikke anvendelse af et adjuvans, således som det er tilfældet for maksimeringstesten på marsvin (13). LLNA mindsker således dyrenes lidelser. Trods LLNA's fordele frem for B.6 og OECD Test Guideline 406 må man have for øje, at metoden har visse begrænsninger, som kan gøre B.6 eller OECD Test Guideline 406 nødvendige (13) (f.eks. falsk negative resultater i LLNA for visse metaller, falsk positive resultater for visse hudirriterende stoffer [såsom visse overfladeaktive kemikalier] (19) (20) eller teststoffets opløselighed). Kemiske stofgrupper eller stoffer, der indeholder funktionelle grupper, som kan skabe uafklarede sammenhænge (confounders) (21), kan desuden gøre marsvinetest nødvendige (dvs. B.6, OECD Test Guideline 406) (13). I lyset af den begrænsede valideringsdatabase primært bestående af pesticidformuleringer er der endvidere større sandsynlighed for, at LLNA giver et positivt resultat i forbindelse med disse typer teststoffer (22) i forhold til marsvinetesten. I forbindelse med testning af formuleringer kan man imidlertid overveje at inkludere lignende stoffer med kendte resultater som referencestoffer for at påvise, at LLNA fungerer korrekt (se punkt 16). Bortset fra disse identificerede begrænsninger bør LLNA kunne anvendes til testning af alle stoffer, medmindre disse stoffer har egenskaber, som kan have indflydelse på LLNA-metodens nøjagtighed.

TESTPRINCIPPET

| 6. | Det tilgrundliggende princip for LLNA består i, at den sensibiliserende agens inducerer en lymfocytproliferation i de lymfeknuder, som dræner påføringsstedet for teststoffet. Denne proliferation er proportional med den påførte dosis og med allergenets styrke og gør det let at få et kvantitativt mål for sensibiliseringen. Proliferationen måles ved at sammenholde den gennemsnitlige proliferation i hver forsøgsgruppe med den gennemsnitlige proliferation i vehikelkontrolgruppen (VC-gruppen). Forholdet mellem den gennemsnitlige proliferation i den enkelte behandlingsgruppe og proliferationen i den sideløbende VC-gruppe kaldes stimulationsindekset (SI) og skal være mindst tre, før teststoffet kan klassificeres som en potentielt hudsensibiliserende agens. De her beskrevne metoder bygger på anvendelse af in vivo radioaktiv mærkning til måling af øget celleproliferation i de drænende aurikulære lymfeknuder. Andre endepunkter til bedømmelse af antallet af celler under formering kan imidlertid anvendes, forudsat af ydeevnestandarderne opfyldes fuldt ud (tillæg 1). |
| --- | --- |

6.

Det tilgrundliggende princip for LLNA består i, at den sensibiliserende agens inducerer en lymfocytproliferation i de lymfeknuder, som dræner påføringsstedet for teststoffet. Denne proliferation er proportional med den påførte dosis og med allergenets styrke og gør det let at få et kvantitativt mål for sensibiliseringen. Proliferationen måles ved at sammenholde den gennemsnitlige proliferation i hver forsøgsgruppe med den gennemsnitlige proliferation i vehikelkontrolgruppen (VC-gruppen). Forholdet mellem den gennemsnitlige proliferation i den enkelte behandlingsgruppe og proliferationen i den sideløbende VC-gruppe kaldes stimulationsindekset (SI) og skal være mindst tre, før teststoffet kan klassificeres som en potentielt hudsensibiliserende agens. De her beskrevne metoder bygger på anvendelse af in vivo radioaktiv mærkning til måling af øget celleproliferation i de drænende aurikulære lymfeknuder. Andre endepunkter til bedømmelse af antallet af celler under formering kan imidlertid anvendes, forudsat af ydeevnestandarderne opfyldes fuldt ud (tillæg 1).

BESKRIVELSE AF ASSAYET

Valg af dyreart

| 7. | Mus må foretrækkes til denne test. Der anvendes unge voksne hunmus af stamme CBA/Ca eller CBA/J, som ikke har født og ikke er drægtige. Ved forsøgets begyndelse skal dyrene være 8-12 uger gamle, og vægtvariationen mellem de anvendte dyr skal være mindst mulig og må ikke overstige 20 % af gennemsnitsvægten. Alternativt kan der anvendes andre stammer og handyr, når der er genereret tilstrækkelige data til at dokumentere, at der ikke er væsentlige stamme- og/eller kønsspecifikke forskelle i LLNA-respons. |
| --- | --- |

7.

Mus må foretrækkes til denne test. Der anvendes unge voksne hunmus af stamme CBA/Ca eller CBA/J, som ikke har født og ikke er drægtige. Ved forsøgets begyndelse skal dyrene være 8-12 uger gamle, og vægtvariationen mellem de anvendte dyr skal være mindst mulig og må ikke overstige 20 % af gennemsnitsvægten. Alternativt kan der anvendes andre stammer og handyr, når der er genereret tilstrækkelige data til at dokumentere, at der ikke er væsentlige stamme- og/eller kønsspecifikke forskelle i LLNA-respons.

Miljøbetingelser og fodring

| 8. | Mus bør anbringes i grupper (23), medmindre der fremlægges et fyldestgørende videnskabeligt rationale for at holde dem i hvert sit bur. Temperaturen i forsøgsdyrrummet skal være 22 ± 3 °C. Den relative luftfugtighed skal være mindst 30 % og helst ikke over 70 % bortset fra under rengøring af lokalet, men 50-60 % skal tilsigtes. Belysningen skal være kunstig og bestå af 12 timers lys og 12 timers mørke. Som foder kan anvendes sædvanligt laboratoriefoder med fri adgang til drikkevand. |
| --- | --- |

8.

Mus bør anbringes i grupper (23), medmindre der fremlægges et fyldestgørende videnskabeligt rationale for at holde dem i hvert sit bur. Temperaturen i forsøgsdyrrummet skal være 22 ± 3 °C. Den relative luftfugtighed skal være mindst 30 % og helst ikke over 70 % bortset fra under rengøring af lokalet, men 50-60 % skal tilsigtes. Belysningen skal være kunstig og bestå af 12 timers lys og 12 timers mørke. Som foder kan anvendes sædvanligt laboratoriefoder med fri adgang til drikkevand.

Forberedelse af dyrene

| 9. | Dyrene udtages på tilfældig måde, mærkes, så de enkelte dyr kan identificeres (men ikke med nogen form for øremærkning), og holdes i burene i mindst fem døgn forud for doseringen, så de kan akklimatisere sig til forsøgsbetingelserne. Før behandlingen påbegyndes, undersøges alle dyr for at sikre, at de er uden observerbare hudlæsioner. |
| --- | --- |

9.

Dyrene udtages på tilfældig måde, mærkes, så de enkelte dyr kan identificeres (men ikke med nogen form for øremærkning), og holdes i burene i mindst fem døgn forud for doseringen, så de kan akklimatisere sig til forsøgsbetingelserne. Før behandlingen påbegyndes, undersøges alle dyr for at sikre, at de er uden observerbare hudlæsioner.

Fremstilling af forsøgsopløsninger

| 10. | Faste stoffer opløses eller opslæmmes i opløsningsmidler/bærestoffer og fortyndes eventuelt inden påføring på musens øre. Flydende kemikalier kan enten gives ufortyndet eller fortyndes først. Uopløselige kemikalier såsom dem, der generelt anvendes i medicinsk udstyr, underkastes en stor ekstraktion med passende opløsningsmiddel for at afdække alle ekstraherbare bestanddele til testning inden påføring på musens øre. Teststofferne fremstilles dagligt, medmindre stabilitetsdata viser, at opbevaring er acceptabel. |
| --- | --- |

10.

Faste stoffer opløses eller opslæmmes i opløsningsmidler/bærestoffer og fortyndes eventuelt inden påføring på musens øre. Flydende kemikalier kan enten gives ufortyndet eller fortyndes først. Uopløselige kemikalier såsom dem, der generelt anvendes i medicinsk udstyr, underkastes en stor ekstraktion med passende opløsningsmiddel for at afdække alle ekstraherbare bestanddele til testning inden påføring på musens øre. Teststofferne fremstilles dagligt, medmindre stabilitetsdata viser, at opbevaring er acceptabel.

Pålidelighedskontrol

| 11. | Positive kontrolstoffer (PC) anvendes til at godtgøre, at assayets præstationer er tilstrækkelige ved at reagere med tilstrækkelig følsomhed og reproducerbarhed som et sensibiliserende teststof, hvor responsens størrelsesorden er velkarakteriseret. Det anbefales at anvende sideløbende positiv kontrol, fordi det godtgør, at laboratoriets kompetence er tilstrækkelig til, at assayet bliver vellykket, og gør det muligt at bedømme reproducerbarheden og sammenligneligheden inden for og mellem laboratorier. Nogle tilsynsmyndigheder stiller desuden krav om en positiv kontrol for den enkelte undersøgelse, og brugere opfordres derfor til at henvende sig til de relevante myndigheder inden udførelsen af LLNA. Det anbefales derfor at foretage sideløbende positiv kontrol regelmæssigt, således at der ikke bliver behov for yderligere dyreforsøg for at opfylde eventuelle krav ved regelmæssig brug af positiv kontrol (se punkt 12). Den positive kontrol skal fremkalde en positiv LLNA-respons ved det eksponeringsniveau, som forventes at give en stigning i SI, som er mere end 3 større end i den negative kontrolgruppe. PC-dosis vælges, således at den ikke forårsager for stærk hudirritation eller systemisk toksicitet, og således at induktionen er reproducerbar, men ikke for voldsom (dvs. et SI på > 20 er for højt). De foretrukne positive kontrolstoffer er 25 % hexylkanelaldehyd (Chemical Abstracts Service [CAS-] nr. 101-86-0) i acetone: olivenolie (4:1, v/v) og 5 % mercaptobenzothiazol (CAS nr. 149-30-4) i N,N-dimethylformamid (se tillæg 1, tabel 1). Under visse omstændigheder vil andre positive kontrolstoffer, der opfylder de ovennævnte kriterier, kunne anvendes, såfremt valget heraf kan begrundes. |
| --- | --- |

11.

Positive kontrolstoffer (PC) anvendes til at godtgøre, at assayets præstationer er tilstrækkelige ved at reagere med tilstrækkelig følsomhed og reproducerbarhed som et sensibiliserende teststof, hvor responsens størrelsesorden er velkarakteriseret. Det anbefales at anvende sideløbende positiv kontrol, fordi det godtgør, at laboratoriets kompetence er tilstrækkelig til, at assayet bliver vellykket, og gør det muligt at bedømme reproducerbarheden og sammenligneligheden inden for og mellem laboratorier. Nogle tilsynsmyndigheder stiller desuden krav om en positiv kontrol for den enkelte undersøgelse, og brugere opfordres derfor til at henvende sig til de relevante myndigheder inden udførelsen af LLNA. Det anbefales derfor at foretage sideløbende positiv kontrol regelmæssigt, således at der ikke bliver behov for yderligere dyreforsøg for at opfylde eventuelle krav ved regelmæssig brug af positiv kontrol (se punkt 12). Den positive kontrol skal fremkalde en positiv LLNA-respons ved det eksponeringsniveau, som forventes at give en stigning i SI, som er mere end 3 større end i den negative kontrolgruppe. PC-dosis vælges, således at den ikke forårsager for stærk hudirritation eller systemisk toksicitet, og således at induktionen er reproducerbar, men ikke for voldsom (dvs. et SI på > 20 er for højt). De foretrukne positive kontrolstoffer er 25 % hexylkanelaldehyd (Chemical Abstracts Service [CAS-] nr. 101-86-0) i acetone: olivenolie (4:1, v/v) og 5 % mercaptobenzothiazol (CAS nr. 149-30-4) i N,N-dimethylformamid (se tillæg 1, tabel 1). Under visse omstændigheder vil andre positive kontrolstoffer, der opfylder de ovennævnte kriterier, kunne anvendes, såfremt valget heraf kan begrundes.

| 12. | Selv om det anbefales at anvende en sideløbende PC-gruppe, kan der være situationer, hvor regelmæssig testning (dvs. med ≤ 6 måneders interval) af det positive kontrolstof kan være tilstrækkeligt for laboratorier, der jævnligt udfører LLNA (dvs. udfører LLNA mindst én gang om måneden) og har oprettet en historisk PC-database, der påviser laboratoriets evne til at skabe reproducerbare og nøjagtige resultater med positive kontroller. Laboratoriet kan påvise, at det har tilstrækkelig kompetence til at udføre LLNA ved at opnå sammenhængende og positive resultater med den positive kontrol i mindst 10 uafhængige forsøg udført inden for en rimelig periode (dvs. inden for et år). |
| --- | --- |

12.

Selv om det anbefales at anvende en sideløbende PC-gruppe, kan der være situationer, hvor regelmæssig testning (dvs. med ≤ 6 måneders interval) af det positive kontrolstof kan være tilstrækkeligt for laboratorier, der jævnligt udfører LLNA (dvs. udfører LLNA mindst én gang om måneden) og har oprettet en historisk PC-database, der påviser laboratoriets evne til at skabe reproducerbare og nøjagtige resultater med positive kontroller. Laboratoriet kan påvise, at det har tilstrækkelig kompetence til at udføre LLNA ved at opnå sammenhængende og positive resultater med den positive kontrol i mindst 10 uafhængige forsøg udført inden for en rimelig periode (dvs. inden for et år).

| 13. | Der skal altid anvendes en sideløbende PC-gruppe i tilfælde af en procedureændring af LLNA (f.eks. ændring af uddannet personale, ændring af testmaterialer og/eller reagenser, ændring af testudstyr, ændring af kildedyr), og disse ændringer skal dokumenteres i laboratorierapporter. Der skal tages hensyn til disse ændringers indvirkning på tilstrækkeligheden af den allerede oprettede historiske database, når det besluttes, om det er nødvendigt at oprette en ny historisk database for at dokumentere, at PC-resultaterne er sammenhængende. |
| --- | --- |

13.

Der skal altid anvendes en sideløbende PC-gruppe i tilfælde af en procedureændring af LLNA (f.eks. ændring af uddannet personale, ændring af testmaterialer og/eller reagenser, ændring af testudstyr, ændring af kildedyr), og disse ændringer skal dokumenteres i laboratorierapporter. Der skal tages hensyn til disse ændringers indvirkning på tilstrækkeligheden af den allerede oprettede historiske database, når det besluttes, om det er nødvendigt at oprette en ny historisk database for at dokumentere, at PC-resultaterne er sammenhængende.

| 14. | Forsøgslederen skal være opmærksom på, at afgørelsen om at udføre en PC-undersøgelse regelmæssigt i stedet for samtidigt har indflydelse på, om negative undersøgelsesresultater, der er opnået uden en sideløbende positiv kontrol i perioden mellem hver regelmæssige PC-undersøgelse, er tilstrækkelige og kan accepteres. Hvis der f.eks. opnås et falsk negativt resultat i den regelmæssige PC-undersøgelse, kan negative testresultater, der er opnået i perioden mellem den seneste godkendte PC-undersøgelse og den ikke godkendte regelmæssige PC-undersøgelse, drages i tvivl. Disse konsekvenser bør overvejes nøje, når det besluttes, om der skal udføres sideløbende positive kontroller, eller om der kun skal udføres regelmæssige positive kontroller. Det skal også overvejes at anvende færre dyr i den sideløbende PC-gruppe, når det er videnskabeligt begrundet, og hvis laboratoriet på grundlag af laboratoriespecifikke historiske data påviser, at der kan anvendes færre mus (12). |
| --- | --- |

14.

Forsøgslederen skal være opmærksom på, at afgørelsen om at udføre en PC-undersøgelse regelmæssigt i stedet for samtidigt har indflydelse på, om negative undersøgelsesresultater, der er opnået uden en sideløbende positiv kontrol i perioden mellem hver regelmæssige PC-undersøgelse, er tilstrækkelige og kan accepteres. Hvis der f.eks. opnås et falsk negativt resultat i den regelmæssige PC-undersøgelse, kan negative testresultater, der er opnået i perioden mellem den seneste godkendte PC-undersøgelse og den ikke godkendte regelmæssige PC-undersøgelse, drages i tvivl. Disse konsekvenser bør overvejes nøje, når det besluttes, om der skal udføres sideløbende positive kontroller, eller om der kun skal udføres regelmæssige positive kontroller. Det skal også overvejes at anvende færre dyr i den sideløbende PC-gruppe, når det er videnskabeligt begrundet, og hvis laboratoriet på grundlag af laboratoriespecifikke historiske data påviser, at der kan anvendes færre mus (12).

| 15. | Skønt det positive kontrolstof bør afprøves i et vehikel, som vides at fremkalde ensartet respons (f.eks. acetone: olivenolie, 4:1, v/v), kan det i visse godkendelsessituationer desuden være nødvendigt med testning i andre vehikler end standardvehiklet (med en klinisk-kemisk relevant formulering) (24). Hvis den sideløbende positive kontrol foretages i et andet vehikel end teststoffet, skal der foretages en særskilt vehikelkontrol for den sideløbende positive kontrol. |
| --- | --- |

15.

Skønt det positive kontrolstof bør afprøves i et vehikel, som vides at fremkalde ensartet respons (f.eks. acetone: olivenolie, 4:1, v/v), kan det i visse godkendelsessituationer desuden være nødvendigt med testning i andre vehikler end standardvehiklet (med en klinisk-kemisk relevant formulering) (24). Hvis den sideløbende positive kontrol foretages i et andet vehikel end teststoffet, skal der foretages en særskilt vehikelkontrol for den sideløbende positive kontrol.

| 16. | Ved vurdering af teststoffer af en specifik kemisk klasse eller responser kan referencestoffer også anvendes til at vise, at testmetoden kan anvendes til at påvise denne type teststoffers potentiale for hudsensibilisering korrekt. Egnede referencestoffer skal have følgende egenskaber:






  — | strukturel og funktionel lighed med den klasse, som det teststof, der testes, tilhører |
| --- | --- | --- |

16.

Ved vurdering af teststoffer af en specifik kemisk klasse eller responser kan referencestoffer også anvendes til at vise, at testmetoden kan anvendes til at påvise denne type teststoffers potentiale for hudsensibilisering korrekt. Egnede referencestoffer skal have følgende egenskaber:

—

strukturel og funktionel lighed med den klasse, som det teststof, der testes, tilhører

| — | kendte fysisk/kemiske egenskaber |
| --- | --- |

—

kendte fysisk/kemiske egenskaber

| — | støttedata fra LLNA |
| --- | --- |

—

støttedata fra LLNA

| — | støttedata fra andre dyremodeller og/eller fra mennesker. |
| --- | --- |

—

støttedata fra andre dyremodeller og/eller fra mennesker.

TESTPROCEDURE

Antal dyr og dosisniveauer

| 17. | Der anvendes mindst fire dyr i hver dosisgruppe, mindst tre forskellige koncentrationer af teststoffet, en sideløbende NC-gruppe, som udelukkende behandles med det til teststoffet anvendte vehikel, og en PC-gruppe (sideløbende eller nylig, afhængigt af laboratoriets politik, jf. punkt 11-14). Det bør overvejes at teste flere doser af det positive kontrolstof, navnlig ved periodisk testning af det positive kontrolstof. Bortset fra behandlingen med prøvestof behandles dyrene i kontrolgrupperne på samme måde som dyrene i behandlingsgrupperne. |
| --- | --- |

17.

Der anvendes mindst fire dyr i hver dosisgruppe, mindst tre forskellige koncentrationer af teststoffet, en sideløbende NC-gruppe, som udelukkende behandles med det til teststoffet anvendte vehikel, og en PC-gruppe (sideløbende eller nylig, afhængigt af laboratoriets politik, jf. punkt 11-14). Det bør overvejes at teste flere doser af det positive kontrolstof, navnlig ved periodisk testning af det positive kontrolstof. Bortset fra behandlingen med prøvestof behandles dyrene i kontrolgrupperne på samme måde som dyrene i behandlingsgrupperne.

| 18. | Dosering og valg af vehikel baseres på anbefalingerne i henvisning (3) og (5). Dosisniveauerne vælges normalt af koncentrationsserier på 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % osv. Der skal der fremlægges et fyldestgørende videnskabeligt rationale for valget af de anvendte koncentrationsserier. Alle foreliggende toksikologiske oplysninger (f.eks. vedrørende akut toksicitet og hudirritation) og strukturelle og fysisk-kemiske oplysninger om det pågældende teststof (og/eller strukturelt beslægtede stoffer) tages i betragtning, således at der vælges tre på hinanden følgende koncentrationer, hvoraf den højeste er den, der giver størst mulig eksponering uden systemisk toksicitet og/eller for stærk lokal hudirritation (3) (25). Såfremt disse oplysninger ikke foreligger, kan det være nødvendigt at foretage en prescreening (se punkt 21-24). |
| --- | --- |

18.

Dosering og valg af vehikel baseres på anbefalingerne i henvisning (3) og (5). Dosisniveauerne vælges normalt af koncentrationsserier på 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % osv. Der skal der fremlægges et fyldestgørende videnskabeligt rationale for valget af de anvendte koncentrationsserier. Alle foreliggende toksikologiske oplysninger (f.eks. vedrørende akut toksicitet og hudirritation) og strukturelle og fysisk-kemiske oplysninger om det pågældende teststof (og/eller strukturelt beslægtede stoffer) tages i betragtning, således at der vælges tre på hinanden følgende koncentrationer, hvoraf den højeste er den, der giver størst mulig eksponering uden systemisk toksicitet og/eller for stærk lokal hudirritation (3) (25). Såfremt disse oplysninger ikke foreligger, kan det være nødvendigt at foretage en prescreening (se punkt 21-24).

| 19. | Vehiklet må ikke indvirke på eller fordreje testresultatet og vælges, således at testkoncentrationer og opløselighed maksimeres, samtidig med at den fremstillede opløsning/suspension er egnet til påføring af tesstoffet. De anbefalede vehikler er acetone: olivenolie (4:1 v/v), N,N-dimethylformamid, methylethylketon, propylenglycol og dimethylsulphoxid (19), men andre kan anvendes, hvis der fremlægges et fyldestgørende videnskabeligt rationale derfor. I visse situationer kan det som yderligere kontrol være nødvendigt med et klinisk relevant opløsningsmiddel eller den formulering, hvori teststoffet markedsføres. Man må specielt være opmærksom på, at vehikelsystemet bør indeholde hydrofile teststoffer, som befugter huden og ikke straks løber af, ved at inkorporere egnede opløsningsmidler (f.eks. 1 % Pluronic® L92). Vehikler kun bestående af vand bør således undgås. |
| --- | --- |

19.

Vehiklet må ikke indvirke på eller fordreje testresultatet og vælges, således at testkoncentrationer og opløselighed maksimeres, samtidig med at den fremstillede opløsning/suspension er egnet til påføring af tesstoffet. De anbefalede vehikler er acetone: olivenolie (4:1 v/v), N,N-dimethylformamid, methylethylketon, propylenglycol og dimethylsulphoxid (19), men andre kan anvendes, hvis der fremlægges et fyldestgørende videnskabeligt rationale derfor. I visse situationer kan det som yderligere kontrol være nødvendigt med et klinisk relevant opløsningsmiddel eller den formulering, hvori teststoffet markedsføres. Man må specielt være opmærksom på, at vehikelsystemet bør indeholde hydrofile teststoffer, som befugter huden og ikke straks løber af, ved at inkorporere egnede opløsningsmidler (f.eks. 1 % Pluronic® L92). Vehikler kun bestående af vand bør således undgås.

| 20. | Behandling af lymfeknuder fra hver enkelt mus gør det muligt at vurdere variationen mellem dyr indbyrdes og at foretage en statistisk sammenligning af forskellen mellem teststoffet og målinger af VC-gruppen (se punkt 35). Det er desuden muligt at vurdere muligheden for at reducere antallet af mus i PC-gruppen, når der indsamles data for de enkelte dyr (12). Nogle tilsynsmyndigheder stilles desuden krav om indsamling af data for de enkelte dyr. Nogle tilsynsmyndigheder accepterer imidlertid poolede data, og i disse tilfælde kan brugerne vælge at indsamle data for de enkelte dyr eller poolede data. |
| --- | --- |

20.

Behandling af lymfeknuder fra hver enkelt mus gør det muligt at vurdere variationen mellem dyr indbyrdes og at foretage en statistisk sammenligning af forskellen mellem teststoffet og målinger af VC-gruppen (se punkt 35). Det er desuden muligt at vurdere muligheden for at reducere antallet af mus i PC-gruppen, når der indsamles data for de enkelte dyr (12). Nogle tilsynsmyndigheder stilles desuden krav om indsamling af data for de enkelte dyr. Nogle tilsynsmyndigheder accepterer imidlertid poolede data, og i disse tilfælde kan brugerne vælge at indsamle data for de enkelte dyr eller poolede data.

Prescreening

| 21. | Hvis der ikke foreligger tilstrækkelige oplysninger til at bestemme højeste dosis, der skal testes (se punkt 18), foretages en prescreening for at definere det passende dosisniveau, der skal testes i LLNA. Formålet med prescreeningen er at få hjælp til at vælge det maksimale dosisniveau, der skal anvendes i LLNA-hovedundersøgelsen, hvis der ikke foreligger oplysninger om den koncentration, der inducerer systemisk toksicitet (se punkt 24) og/eller for stærk lokal hudirritation (se punkt 23). Det maksimale dosisniveau, der testes, er 100 % af teststoffet for væsker eller den højest mulige koncentration for faste stoffer eller opslæmninger. |
| --- | --- |

21.

Hvis der ikke foreligger tilstrækkelige oplysninger til at bestemme højeste dosis, der skal testes (se punkt 18), foretages en prescreening for at definere det passende dosisniveau, der skal testes i LLNA. Formålet med prescreeningen er at få hjælp til at vælge det maksimale dosisniveau, der skal anvendes i LLNA-hovedundersøgelsen, hvis der ikke foreligger oplysninger om den koncentration, der inducerer systemisk toksicitet (se punkt 24) og/eller for stærk lokal hudirritation (se punkt 23). Det maksimale dosisniveau, der testes, er 100 % af teststoffet for væsker eller den højest mulige koncentration for faste stoffer eller opslæmninger.

| 22. | Prescreeningen foretages ved samme betingelser som for LLNA-hovedundersøgelsen, bortset fra at der ikke foretages en vurdering af lymfeknudeproliferationen, og der kan anvendes færre dyr til hver enkel dosisgruppe. Det foreslås at anvende et eller to dyr til hver enkel dosisgruppe. Alle mus observeres dagligt, og det registreres, om der optræder kliniske symptomer på systemisk toksicitet eller lokal irritation på påføringsstedet. Kropsvægten registreres inden forsøget og ved afslutning af forsøget (dag 6). Begge ører på de enkelte mus observeres for erytem, der registreres med en scoreværdi i tabel 1 (25). Der foretages målinger af øretykkelsen med en tykkelsesmåler (f.eks. et digitalt mikrometer eller en Peacock Dial-tykkelsesmåler) på dag 1 (inden administration af dosis), på dag 3 (ca. 48 timer efter den første dosis) og på dag 6. På dag 6 kan øretykkelsen desuden bestemmes ved hjælp af øremærkevægtbestemmelse, der foretages, efter at dyrene er blevet humant aflivet. For stærk lokal hudirritation angives med en erytemscore på ≥ 3 og/eller en forøgelse af øretykkelsen på ≥ 25 % på måledagen (26) (27). Den højeste dosis i LLNA-hovedundersøgelsen skal være den næsthøjeste dosis i prescreeningskoncentrationsserien (se punkt 18), som ikke inducerer systemisk toksicitet og/eller for stærk lokal hudirritation.

  Tabel 1


  Erytemscorer







  Observation | Score |
| --- | --- | --- |
| Intet erytem | 0 |
| Meget let erytem (knapt diagnosticerbart) | 1 |
| Veldefineret erytem | 2 |
| Moderat til svært erytem | 3 |
| Svært erytem (oksekødsfarvet) til escharadannelse, som umuliggør klassificering af erytemet | 4 |

22.

Prescreeningen foretages ved samme betingelser som for LLNA-hovedundersøgelsen, bortset fra at der ikke foretages en vurdering af lymfeknudeproliferationen, og der kan anvendes færre dyr til hver enkel dosisgruppe. Det foreslås at anvende et eller to dyr til hver enkel dosisgruppe. Alle mus observeres dagligt, og det registreres, om der optræder kliniske symptomer på systemisk toksicitet eller lokal irritation på påføringsstedet. Kropsvægten registreres inden forsøget og ved afslutning af forsøget (dag 6). Begge ører på de enkelte mus observeres for erytem, der registreres med en scoreværdi i tabel 1 (25). Der foretages målinger af øretykkelsen med en tykkelsesmåler (f.eks. et digitalt mikrometer eller en Peacock Dial-tykkelsesmåler) på dag 1 (inden administration af dosis), på dag 3 (ca. 48 timer efter den første dosis) og på dag 6. På dag 6 kan øretykkelsen desuden bestemmes ved hjælp af øremærkevægtbestemmelse, der foretages, efter at dyrene er blevet humant aflivet. For stærk lokal hudirritation angives med en erytemscore på ≥ 3 og/eller en forøgelse af øretykkelsen på ≥ 25 % på måledagen (26) (27). Den højeste dosis i LLNA-hovedundersøgelsen skal være den næsthøjeste dosis i prescreeningskoncentrationsserien (se punkt 18), som ikke inducerer systemisk toksicitet og/eller for stærk lokal hudirritation.

Tabel 1

Erytemscorer

Observation

Score

Intet erytem

0

Meget let erytem (knapt diagnosticerbart)

1

Veldefineret erytem

2

Moderat til svært erytem

3

Svært erytem (oksekødsfarvet) til escharadannelse, som umuliggør klassificering af erytemet

4

| 23. | Ud over en forøgelse af øretykkelsen på 25 % (26) (27) er en statistisk signifikant forøgelse af øretykkelsen hos de eksponerede mus sammenlignet med kontrolmusene også blevet anvendt til at identificere lokalirriterende stoffer i LLNA (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Selv om statistisk signifikante forøgelser kan forekomme, når øretykkelsen er under 25 %, er de ikke blevet specifikt forbundet med for stærk irritation (30) (32) (33) (34). |
| --- | --- |

23.

Ud over en forøgelse af øretykkelsen på 25 % (26) (27) er en statistisk signifikant forøgelse af øretykkelsen hos de eksponerede mus sammenlignet med kontrolmusene også blevet anvendt til at identificere lokalirriterende stoffer i LLNA (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Selv om statistisk signifikante forøgelser kan forekomme, når øretykkelsen er under 25 %, er de ikke blevet specifikt forbundet med for stærk irritation (30) (32) (33) (34).

| 24. | Følgende kliniske observationer kan indikere systemisk toksicitet (35) (36), hvis de anvendes som led i en integreret vurdering, og kan således indikere det maksimale dosisniveau, der kan anvendes i LLNA-hovedundersøgelsen: ændringer i nervesystemets funktion (f.eks. hårrejsning, ataxi, rystelser og kramper), adfærdsændringer (f.eks. aggressivitet, ændringer i soigneringsaktiviteten, markant ændring i aktivitetsniveauet), ændringer i respirationsmønstre (f.eks. ændringer i respirationshyppigheden og -intensiteten såsom åndenød, snappende respiration og rallelyd) samt ændringer i føde- og vandindtagelsen. Derudover skal tegn på apati og/eller mangel på respons og kliniske tegn på lidelse og smerte, der ikke er let eller kortvarig, en reduktion af kropsvægten på > 5 % fra dag 1 til dag 6 og dødelighed tages i betragtning ved vurderingen. Dyr, som er moribunde, har tydelige smerter eller viser tegn på svære og vedvarende lidelser, skal aflives humant (37). |
| --- | --- |

24.

Følgende kliniske observationer kan indikere systemisk toksicitet (35) (36), hvis de anvendes som led i en integreret vurdering, og kan således indikere det maksimale dosisniveau, der kan anvendes i LLNA-hovedundersøgelsen: ændringer i nervesystemets funktion (f.eks. hårrejsning, ataxi, rystelser og kramper), adfærdsændringer (f.eks. aggressivitet, ændringer i soigneringsaktiviteten, markant ændring i aktivitetsniveauet), ændringer i respirationsmønstre (f.eks. ændringer i respirationshyppigheden og -intensiteten såsom åndenød, snappende respiration og rallelyd) samt ændringer i føde- og vandindtagelsen. Derudover skal tegn på apati og/eller mangel på respons og kliniske tegn på lidelse og smerte, der ikke er let eller kortvarig, en reduktion af kropsvægten på > 5 % fra dag 1 til dag 6 og dødelighed tages i betragtning ved vurderingen. Dyr, som er moribunde, har tydelige smerter eller viser tegn på svære og vedvarende lidelser, skal aflives humant (37).

Forsøgsplanen for hovedundersøgelsen

| 25. | Forsøgsplanen for assayet er følgende:
  —   Dag 1: Hvert dyrs vægt bestemmes og registreres sammen med kliniske observationer. Dorsum af hvert øre påføres 25 μl af den pågældende teststofkoncentration, af vehiklet alene eller af det positive kontrolstof (sideløbende eller nylig, afhængigt af laboratoriets politik, jf. punkt 11-15)
  —   Dag 2 og 3: Påføringen fra dag 1 gentages.
  —   Dag 4 og 5: Ingen behandling.
  —   Dag 6: Hvert dyrs vægt registreres. 250 μl sterilt phosphatbufferet saltopløsning (PBS) indeholdende 20 μCi (7,4 × 105 Bq) tritieret (3H)-methylthymidin injiceres i alle testdyr og kontroldyr gennem halevenen. Alternativt injiceres 250 μL sterilt phosphatbufferet saltopløsning (PBS) indeholdende 2 μCi (7,4 × 104 Bq) 125I-iododeoxyuridin og 10–5M fluordeoxyuridin i alle dyr gennem halevenen. Fem timer (5 t) senere aflives dyrene. De drænende aurikulære lymfeknuder fra hvert museøre eksciseres og pooles i PBS for hvert dyr (enkeltdyrsmetode). Alternativt eksciseres og pooles lymfeknuderne fra hvert øre i PBS for hver behandlingsgruppe (metode med poolet behandlingsgruppe). Detaljer og diagrammer vedrørende identifikation og dissektion af lymfeknuder findes i henvisning (12). Der kan inkluderes yderligere parametre såsom bedømmelse af øreerythemscore eller målinger af øretykkelsen (foretages med en tykkelsesmåler eller ved hjælp af øremærkevægtbestemmelse ved obduktion) med henblik på yderligere kontrol af det lokale hudrespons i hovedundersøgelsen. |
| --- | --- |

25.

Forsøgsplanen for assayet er følgende:

—   Dag 1: Hvert dyrs vægt bestemmes og registreres sammen med kliniske observationer. Dorsum af hvert øre påføres 25 μl af den pågældende teststofkoncentration, af vehiklet alene eller af det positive kontrolstof (sideløbende eller nylig, afhængigt af laboratoriets politik, jf. punkt 11-15)

—   Dag 2 og 3: Påføringen fra dag 1 gentages.

—   Dag 4 og 5: Ingen behandling.

—   Dag 6: Hvert dyrs vægt registreres. 250 μl sterilt phosphatbufferet saltopløsning (PBS) indeholdende 20 μCi (7,4 × 105 Bq) tritieret (3H)-methylthymidin injiceres i alle testdyr og kontroldyr gennem halevenen. Alternativt injiceres 250 μL sterilt phosphatbufferet saltopløsning (PBS) indeholdende 2 μCi (7,4 × 104 Bq) 125I-iododeoxyuridin og 10–5M fluordeoxyuridin i alle dyr gennem halevenen. Fem timer (5 t) senere aflives dyrene. De drænende aurikulære lymfeknuder fra hvert museøre eksciseres og pooles i PBS for hvert dyr (enkeltdyrsmetode). Alternativt eksciseres og pooles lymfeknuderne fra hvert øre i PBS for hver behandlingsgruppe (metode med poolet behandlingsgruppe). Detaljer og diagrammer vedrørende identifikation og dissektion af lymfeknuder findes i henvisning (12). Der kan inkluderes yderligere parametre såsom bedømmelse af øreerythemscore eller målinger af øretykkelsen (foretages med en tykkelsesmåler eller ved hjælp af øremærkevægtbestemmelse ved obduktion) med henblik på yderligere kontrol af det lokale hudrespons i hovedundersøgelsen.

Fremstilling af cellesuspensioner

| 26. | En enkeltcellesuspension af lymfeknudeceller (LNC), eksciseret bilateralt ved hjælp af enkeltdyrsmetoden eller alternativt ved hjælp af metoden med poolet behandlingsgruppe, fremstilles ved forsigtig mekanisk disaggregering gennem 200 μm trådnet af rustfrit stål eller en anden acceptabel teknik til fremstilling af en enkeltcellesuspension. Lymfeknudecellerne vaskes to gange med overskud af saltvand med phosphatbuffer, og dna fældes med 5 % trichloreddikesyre (TCA) ved 4 °C i 18 timer (3). De dannede pellets genopslæmmes enten i 1 ml TCA og overføres til scintillationsglas indeholdende 10 ml scintillatorvæske til 3H-tælling, eller overføres direkte i gammatælleglas til tælling af 125I. |
| --- | --- |

26.

En enkeltcellesuspension af lymfeknudeceller (LNC), eksciseret bilateralt ved hjælp af enkeltdyrsmetoden eller alternativt ved hjælp af metoden med poolet behandlingsgruppe, fremstilles ved forsigtig mekanisk disaggregering gennem 200 μm trådnet af rustfrit stål eller en anden acceptabel teknik til fremstilling af en enkeltcellesuspension. Lymfeknudecellerne vaskes to gange med overskud af saltvand med phosphatbuffer, og dna fældes med 5 % trichloreddikesyre (TCA) ved 4 °C i 18 timer (3). De dannede pellets genopslæmmes enten i 1 ml TCA og overføres til scintillationsglas indeholdende 10 ml scintillatorvæske til 3H-tælling, eller overføres direkte i gammatælleglas til tælling af 125I.

Bestemmelse af celleproliferationen (optagen radioaktivitet)

| 27. | Optagelsen af 3H-methylthymidin måles ved β-scintillationstælling som antal disintegrationer pr. minut (DPM). Optagelsen af 125I-ioddeoxyuridin måles ved 125I-tælling og angives også som DPM. Afhængigt af den valgte metode angives optagelsen som DPM/dyr (individuel metode) eller DPM/behandlingsgruppe (poolet metode). |
| --- | --- |

27.

Optagelsen af 3H-methylthymidin måles ved β-scintillationstælling som antal disintegrationer pr. minut (DPM). Optagelsen af 125I-ioddeoxyuridin måles ved 125I-tælling og angives også som DPM. Afhængigt af den valgte metode angives optagelsen som DPM/dyr (individuel metode) eller DPM/behandlingsgruppe (poolet metode).

Reduceret LLNA

| 28. | I visse situationer, når det er lovgivningsmæssigt nødvendigt at bekræfte en negativ forudsigelse af et potentielt hudsensibiliserende stof, kan der anvendes en frivillig rLLNA-protokol (16) (17) (18), hvor der anvendes færre dyr, forudsat at alle andre LLNA-protokolspecifikationer overholdes som beskrevet i denne TM. Inden anvendelsen af rLLNA-metoden skal der fremlægges klare begrundelser og et klart videnskabeligt rationale derfor. Hvis der opnås et positivt eller tvetydigt resultat, kan det være nødvendigt at foretage yderligere forsøg for at fortolke eller uddybe resultatet. |
| --- | --- |

28.

I visse situationer, når det er lovgivningsmæssigt nødvendigt at bekræfte en negativ forudsigelse af et potentielt hudsensibiliserende stof, kan der anvendes en frivillig rLLNA-protokol (16) (17) (18), hvor der anvendes færre dyr, forudsat at alle andre LLNA-protokolspecifikationer overholdes som beskrevet i denne TM. Inden anvendelsen af rLLNA-metoden skal der fremlægges klare begrundelser og et klart videnskabeligt rationale derfor. Hvis der opnås et positivt eller tvetydigt resultat, kan det være nødvendigt at foretage yderligere forsøg for at fortolke eller uddybe resultatet.

| 29. | Det reducerede antal dosisgrupper er den eneste forskel mellem LLNA- og rLLNA-testprotokollerne, og rLLNA tilvejebringer derfor ikke oplysninger om dosis-responsforholdet. rLLNA bør derfor ikke anvendes, når der er behov for oplysninger om dosis-responsforholdet. Som ved flerdosis-LLNA skal den teststofkoncentration, der evalueres i rLLNA, være den maksimale koncentration, som ikke inducerer åbenbar systemisk toksicitet og/eller for stærk lokal hudirritation hos musen (se punkt 18). |
| --- | --- |

29.

Det reducerede antal dosisgrupper er den eneste forskel mellem LLNA- og rLLNA-testprotokollerne, og rLLNA tilvejebringer derfor ikke oplysninger om dosis-responsforholdet. rLLNA bør derfor ikke anvendes, når der er behov for oplysninger om dosis-responsforholdet. Som ved flerdosis-LLNA skal den teststofkoncentration, der evalueres i rLLNA, være den maksimale koncentration, som ikke inducerer åbenbar systemisk toksicitet og/eller for stærk lokal hudirritation hos musen (se punkt 18).

OBSERVATIONER

Kliniske observationer

| 30. | Hver enkelt mus observeres omhyggeligt mindst en gang dagligt for alle kliniske tegn på lokalirritation på påføringsstedet eller systemisk toksicitet. Alle observationer registreres systematisk i enkeltjournaler for hver mus. Kontrolplaner skal omfatte kriterier for omgående identificering af de mus, der udviser systemisk toksicitet, for stærk lokal hudirritation eller hudætsning, og som skal aflives (37). |
| --- | --- |

30.

Hver enkelt mus observeres omhyggeligt mindst en gang dagligt for alle kliniske tegn på lokalirritation på påføringsstedet eller systemisk toksicitet. Alle observationer registreres systematisk i enkeltjournaler for hver mus. Kontrolplaner skal omfatte kriterier for omgående identificering af de mus, der udviser systemisk toksicitet, for stærk lokal hudirritation eller hudætsning, og som skal aflives (37).

Kropsvægt

| 31. | Som angivet i punkt 25 måles kropsvægten af hvert dyr ved forsøgets begyndelse og ved den planmæssige humane aflivning. |
| --- | --- |

31.

Som angivet i punkt 25 måles kropsvægten af hvert dyr ved forsøgets begyndelse og ved den planmæssige humane aflivning.

BEREGNING AF RESULTATER

| 32. | Resultaterne for hver behandlingsgruppe angives som stimulationsindeks (SI). Ved enkeltdyrsmetoden fås SI-værdien ved at dividere den gennemsnitlige DPM/dyr fra hver stoftestgruppe og PC-gruppen med den gennemsnitlige DPM/mus fra opløsningsmiddel/vehikelkontrol-gruppen. Den gennemsnitlige SI-værdi for de vehikelbehandlede kontroldyr er således 1. Ved metoden med poolet behandlingsgruppe fås SI ved division af den poolede optagelse af radioaktivitet for hver behandlingsgruppe med den poolede optagelse for VC-gruppen. Resultatet er den gennemsnitlige SI-værdi. |
| --- | --- |

32.

Resultaterne for hver behandlingsgruppe angives som stimulationsindeks (SI). Ved enkeltdyrsmetoden fås SI-værdien ved at dividere den gennemsnitlige DPM/dyr fra hver stoftestgruppe og PC-gruppen med den gennemsnitlige DPM/mus fra opløsningsmiddel/vehikelkontrol-gruppen. Den gennemsnitlige SI-værdi for de vehikelbehandlede kontroldyr er således 1. Ved metoden med poolet behandlingsgruppe fås SI ved division af den poolede optagelse af radioaktivitet for hver behandlingsgruppe med den poolede optagelse for VC-gruppen. Resultatet er den gennemsnitlige SI-værdi.

| 33. | I beslutningsprocessen anses et resultat for at være positivt, når SI er mindst 3. Dosis/responsforholdets styrke, den statistiske signifikans og opløsningsmidlets/vehiklets og PC-responsets sammenhæng kan imidlertid også indgå i bedømmelsen af, om et tvetydigt resultat anses for at være positivt (4) (5) (6). |
| --- | --- |

33.

I beslutningsprocessen anses et resultat for at være positivt, når SI er mindst 3. Dosis/responsforholdets styrke, den statistiske signifikans og opløsningsmidlets/vehiklets og PC-responsets sammenhæng kan imidlertid også indgå i bedømmelsen af, om et tvetydigt resultat anses for at være positivt (4) (5) (6).

| 34. | Hvis det er nødvendigt at uddybe de opnåede resultater, bør teststoffets forskellige egenskaber tages i betragtning, herunder om det er strukturelt beslægtet med kendte hudsensibiliserende stoffer, om det medfører for stærk lokal hudirritation hos musen, og arten af det iagttagne dosis-responsforhold. Disse og andre overvejelser er der redegjort mere indgående for andetsteds (7). |
| --- | --- |

34.

Hvis det er nødvendigt at uddybe de opnåede resultater, bør teststoffets forskellige egenskaber tages i betragtning, herunder om det er strukturelt beslægtet med kendte hudsensibiliserende stoffer, om det medfører for stærk lokal hudirritation hos musen, og arten af det iagttagne dosis-responsforhold. Disse og andre overvejelser er der redegjort mere indgående for andetsteds (7).

| 35. | Indsamling af data om radioaktivitet for den enkelte mus gør det muligt at foretage en statistisk analyse af tilstedeværelsen og omfanget af dosis-responsforholdet i dataene. Statistiske vurderinger kan omfatte en evaluering af dosis-responsforholdet samt behørigt tilpassede sammenligninger af testgrupper (f.eks. parvis sammenligning af dosisgruppe og sideløbende VC-gruppe). Statistiske analyser kan omfatte f.eks. lineær regression eller Williams test til vurdering af dosis-responsudviklingen og Dunnetts test til parvis sammenligning. Ved valg af passende statistisk analysemetode bør undersøgeren være opmærksom på mulige forskelle i varians eller andre tilknyttede problemer, som kan kræve transformation af data eller anvendelse af ikkeparametrisk statistisk analyse. Undersøgeren kan under alle omstændigheder være nødsaget til at udføre SI-beregninger og statistiske analyser med og uden visse datapunkter (til tider kaldet »outliers«). |
| --- | --- |

35.

Indsamling af data om radioaktivitet for den enkelte mus gør det muligt at foretage en statistisk analyse af tilstedeværelsen og omfanget af dosis-responsforholdet i dataene. Statistiske vurderinger kan omfatte en evaluering af dosis-responsforholdet samt behørigt tilpassede sammenligninger af testgrupper (f.eks. parvis sammenligning af dosisgruppe og sideløbende VC-gruppe). Statistiske analyser kan omfatte f.eks. lineær regression eller Williams test til vurdering af dosis-responsudviklingen og Dunnetts test til parvis sammenligning. Ved valg af passende statistisk analysemetode bør undersøgeren være opmærksom på mulige forskelle i varians eller andre tilknyttede problemer, som kan kræve transformation af data eller anvendelse af ikkeparametrisk statistisk analyse. Undersøgeren kan under alle omstændigheder være nødsaget til at udføre SI-beregninger og statistiske analyser med og uden visse datapunkter (til tider kaldet »outliers«).

DATA OG RAPPORTERING

Data

| 36. | Data opstilles i tabelform. Ved enkeltdyrsmetoden angives de individuelle DPM-værdier, gruppens gennemsnitlige DPM/dyr, det tilknyttede fejlled (f.eks. SD, SEM), og det gennemsnitlige SI for hver dosisgruppe sammenholdt med den sideløbende VC-gruppe. Ved metoden med poolet behandlingsgruppe vises den gennemsnitlige/mediane DPM og det gennemsnitlige SI for hver dosisgruppe sammenholdt med den sideløbende VC-gruppe. |
| --- | --- |

36.

Data opstilles i tabelform. Ved enkeltdyrsmetoden angives de individuelle DPM-værdier, gruppens gennemsnitlige DPM/dyr, det tilknyttede fejlled (f.eks. SD, SEM), og det gennemsnitlige SI for hver dosisgruppe sammenholdt med den sideløbende VC-gruppe. Ved metoden med poolet behandlingsgruppe vises den gennemsnitlige/mediane DPM og det gennemsnitlige SI for hver dosisgruppe sammenholdt med den sideløbende VC-gruppe.

Testrapport

| 37. | Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger: | Test- og kontrolstoffer:






  — | identifikationsoplysninger (f.eks. CAS- og EF-numre, hvis de findes, oprindelse, renhed, kendte urenheder, batchnummer) |
| --- | --- | --- | --- |

37.

Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:

Test- og kontrolstoffer:

—

identifikationsoplysninger (f.eks. CAS- og EF-numre, hvis de findes, oprindelse, renhed, kendte urenheder, batchnummer)

| — | fysisk tilstand og fysisk-kemiske egenskaber (f.eks. flygtighed, stabilitet, opløselighed) |
| --- | --- |

—

fysisk tilstand og fysisk-kemiske egenskaber (f.eks. flygtighed, stabilitet, opløselighed)

| — | for blandinger: sammensætning og relativt indhold af bestanddelene. |
| --- | --- |

—

for blandinger: sammensætning og relativt indhold af bestanddelene.

| | Opløsningsmiddel/bærestof:






  — | identifikationsoplysninger (renhed, koncentration (i givet fald), anvendt volumen) |
| --- | --- | --- |

Opløsningsmiddel/bærestof:

—

identifikationsoplysninger (renhed, koncentration (i givet fald), anvendt volumen)

| — | begrundelse for valg af vehikel. |
| --- | --- |

—

begrundelse for valg af vehikel.

| | For forsøgsdyrene:






  — | den anvendte CBA-musestamme |
| --- | --- | --- |

For forsøgsdyrene:

—

den anvendte CBA-musestamme

| — | dyrenes mikrobiologiske status, hvis den kendes |
| --- | --- |

—

dyrenes mikrobiologiske status, hvis den kendes

| — | antal dyr og deres alder |
| --- | --- |

—

antal dyr og deres alder

| — | dyrenes oprindelse, miljøbetingelser, kost osv. |
| --- | --- |

—

dyrenes oprindelse, miljøbetingelser, kost osv.

| | Testbetingelser:






  — | nærmere oplysninger om præparation og påføring af teststoffet |
| --- | --- | --- |

Testbetingelser:

—

nærmere oplysninger om præparation og påføring af teststoffet

| — | begrundelse af den valgte dosis (herunder resultaterne af prescreeningen, hvis en sådan er udført) |
| --- | --- |

—

begrundelse af den valgte dosis (herunder resultaterne af prescreeningen, hvis en sådan er udført)

| — | anvendte koncentrationer af vehikel og teststof og samlet mængde påført teststof |
| --- | --- |

—

anvendte koncentrationer af vehikel og teststof og samlet mængde påført teststof

| — | nærmere oplysninger om foderets og vandets kvalitet (herunder fødens art/oprindelse, vandets oprindelse). |
| --- | --- |

—

nærmere oplysninger om foderets og vandets kvalitet (herunder fødens art/oprindelse, vandets oprindelse).

| — | detaljeret beskrivelse af behandlings- og prøveudtagningsplan |
| --- | --- |

—

detaljeret beskrivelse af behandlings- og prøveudtagningsplan

| — | metoder til måling af toksicitet |
| --- | --- |

—

metoder til måling af toksicitet

| — | kriterier for bedømmelse af undersøgelsen som positiv eller negativ |
| --- | --- |

—

kriterier for bedømmelse af undersøgelsen som positiv eller negativ

| — | nærmere oplysninger om afvigelser fra protokollen og en redegørelse for, hvordan afvigelsen indvirker på undersøgelsens udformning og resultater. |
| --- | --- |

—

nærmere oplysninger om afvigelser fra protokollen og en redegørelse for, hvordan afvigelsen indvirker på undersøgelsens udformning og resultater.

| | Pålidelighedskontrol:






  — | sammenfatning af resultaterne af den seneste pålidelighedskontrol, herunder oplysninger om teststoffet og anvendt koncentration og vehikel |
| --- | --- | --- |

Pålidelighedskontrol:

—

sammenfatning af resultaterne af den seneste pålidelighedskontrol, herunder oplysninger om teststoffet og anvendt koncentration og vehikel

| — | data for sideløbende og/eller tidligere positive og sideløbende negative kontrolprøver fra prøvelaboratoriet |
| --- | --- |

—

data for sideløbende og/eller tidligere positive og sideløbende negative kontrolprøver fra prøvelaboratoriet

| — | hvis der ikke blev foretaget en sideløbende positiv kontrol, datoen for og laboratorierapport om den seneste regelmæssige positive kontrol og en rapport med nærmere historiske data for den positive kontrol fra laboratoriet, hvori det begrundes, hvorfor der ikke er blevet foretaget en sideløbende positiv kontrol. |
| --- | --- |

—

hvis der ikke blev foretaget en sideløbende positiv kontrol, datoen for og laboratorierapport om den seneste regelmæssige positive kontrol og en rapport med nærmere historiske data for den positive kontrol fra laboratoriet, hvori det begrundes, hvorfor der ikke er blevet foretaget en sideløbende positiv kontrol.

| | Resultater:






  — | de enkelte mus' vægt ved doseringens begyndelse og ved den planmæssige aflivning samt det gennemsnitlige og tilknyttede fejlled (f.eks. SD, SEM) for hver behandlingsgruppe |
| --- | --- | --- |

Resultater:

—

de enkelte mus' vægt ved doseringens begyndelse og ved den planmæssige aflivning samt det gennemsnitlige og tilknyttede fejlled (f.eks. SD, SEM) for hver behandlingsgruppe

| — | tidspunkt for indtræden af og tegnene på toksicitet, herunder eventuel hudirritation på administrationsstedet for hvert dyr |
| --- | --- |

—

tidspunkt for indtræden af og tegnene på toksicitet, herunder eventuel hudirritation på administrationsstedet for hvert dyr

| — | en tabel med individuelle (enkeltdyrsmetode) eller gennemsnitlige/mediane (metode med poolet behandlingsgruppe) DPM-værdier og SI-værdier for hver behandlingsgruppe |
| --- | --- |

—

en tabel med individuelle (enkeltdyrsmetode) eller gennemsnitlige/mediane (metode med poolet behandlingsgruppe) DPM-værdier og SI-værdier for hver behandlingsgruppe

| — | det gennemsnitlige og tilknyttede fejlled (f.eks. SD, SEM) for DPM/mus for hver behandlingsgruppe og resultaterne af en outlieranalyse for hver behandlingsgruppe ved enkeltdyrsmetoden |
| --- | --- |

—

det gennemsnitlige og tilknyttede fejlled (f.eks. SD, SEM) for DPM/mus for hver behandlingsgruppe og resultaterne af en outlieranalyse for hver behandlingsgruppe ved enkeltdyrsmetoden

| — | beregnet SI og et passende mål for variationen, hvor der tages hensyn til variationen mellem dyr i både teststoffet og kontrolgrupperne ved enkeltdyrsmetoden |
| --- | --- |

—

beregnet SI og et passende mål for variationen, hvor der tages hensyn til variationen mellem dyr i både teststoffet og kontrolgrupperne ved enkeltdyrsmetoden

| — | dosis-responsforholdet |
| --- | --- |

—

dosis-responsforholdet

| — | statistiske analyser, når det er hensigtsmæssigt. |
| --- | --- |

—

statistiske analyser, når det er hensigtsmæssigt.

| | Behandling af resultater:






  — | Kortfattet kommentar til resultaterne, dosis-responsanalyse og i givet fald statistisk analyse med en konklusion med hensyn til, om det undersøgte stof må anses for hudirriterende. |
| --- | --- | --- |

Behandling af resultater:

—

Kortfattet kommentar til resultaterne, dosis-responsanalyse og i givet fald statistisk analyse med en konklusion med hensyn til, om det undersøgte stof må anses for hudirriterende.

LITTERATUR

| (1) | OECD (2002), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay. OECD Guideline for the Testing of Chemicals No 429, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

(1)

OECD (2002), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay. OECD Guideline for the Testing of Chemicals No 429, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

| (2) | Kimber, I. and Basketter, D.A. (1992), The murine local lymph node assay; collaborative studies and new directions: A commentary, Food Chem. Toxicol., 30, 165-169. |
| --- | --- |

(2)

Kimber, I. and Basketter, D.A. (1992), The murine local lymph node assay; collaborative studies and new directions: A commentary, Food Chem. Toxicol., 30, 165-169.

| (3) | Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes, E.W. and Basketter, D.A. (1994), The local lymph node assay: developments and applications, Toxicol., 93, 13-31. |
| --- | --- |

(3)

Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes, E.W. and Basketter, D.A. (1994), The local lymph node assay: developments and applications, Toxicol., 93, 13-31.

| (4) | Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise, J. Toxicol. Environ. Health, 53, 563-79. |
| --- | --- |

(4)

Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise, J. Toxicol. Environ. Health, 53, 563-79.

| (5) | Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: status of validation, Food Chem. Toxicol., 34, 999-1002. |
| --- | --- |

(5)

Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: status of validation, Food Chem. Toxicol., 34, 999-1002.

| (6) | Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests, Food Chem. Toxicol., 34, 985-997. |
| --- | --- |

(6)

Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests, Food Chem. Toxicol., 34, 985-997.

| (7) | Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests, Food Chem. Toxicol., 36, 327-33. |
| --- | --- |

(7)

Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests, Food Chem. Toxicol., 36, 327-33.

| (8) | Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins, Toxicol., 146, 49-59. |
| --- | --- |

(8)

Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins, Toxicol., 146, 49-59.

| (9) | Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34: 258-273. |
| --- | --- |

(9)

Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34: 258-273.

| (10) | Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34, 274-286. |
| --- | --- |

(10)

Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34, 274-286.

| (11) | Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34: 249-257. |
| --- | --- |

(11)

Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34: 249-257.

| (12) | ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf] |
| --- | --- |

(12)

ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf]

| (13) | OECD (1992), Skin Sensitisation. OECD Guideline for Testing of Chemicals No 406, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

(13)

OECD (1992), Skin Sensitisation. OECD Guideline for Testing of Chemicals No 406, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

| (14) | OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

(14)

OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

| (15) | Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and Kimber, I. (1998), Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde, J. Appl. Toxicol., 18, 281-284. |
| --- | --- |

(15)

Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and Kimber, I. (1998), Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde, J. Appl. Toxicol., 18, 281-284.

| (16) | Kimber, I., Dearman, R.J., Betts, C.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Kern, P.S., Patlewicz, G.Y. and Basketter, D.A. (2006), The local lymph node assay and skin sensitisation: a cut-down screen to reduce animal requirements? Contact Dermatitis, 54, 181-185. |
| --- | --- |

(16)

Kimber, I., Dearman, R.J., Betts, C.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Kern, P.S., Patlewicz, G.Y. and Basketter, D.A. (2006), The local lymph node assay and skin sensitisation: a cut-down screen to reduce animal requirements? Contact Dermatitis, 54, 181-185.

| (17) | ESAC (2007), Statement on the Reduced Local Lymph Node Assay (rLLNA), European Commission Directorate General, Joint Research Centre, Institute for Health and Consumer Protection, European Centre for the Validation of Alternative Methods, April 2007. Available at: [http://ecvam.jrc.it/ft_doc/ESAC26_statement_rLLNA_20070525-1.pdf] |
| --- | --- |

(17)

ESAC (2007), Statement on the Reduced Local Lymph Node Assay (rLLNA), European Commission Directorate General, Joint Research Centre, Institute for Health and Consumer Protection, European Centre for the Validation of Alternative Methods, April 2007. Available at: [http://ecvam.jrc.it/ft_doc/ESAC26_statement_rLLNA_20070525-1.pdf]

| (18) | ICCVAM (2009), The Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) Test Method Evaluation Report. The Reduced Murine Local Lymph Node Assay: An Alternative Test Method Using Fewer Animals to Assess the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals and Products, NIH Publication Number 09-6439, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/] |
| --- | --- |

(18)

ICCVAM (2009), The Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) Test Method Evaluation Report. The Reduced Murine Local Lymph Node Assay: An Alternative Test Method Using Fewer Animals to Assess the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals and Products, NIH Publication Number 09-6439, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/]

| (19) | ICCVAM (1999), The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Compounds, The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM), NIH Publication No. 99-4494, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf] |
| --- | --- |

(19)

ICCVAM (1999), The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Compounds, The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM), NIH Publication No. 99-4494, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]

| (20) | Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT), Food Chem. Toxicol., 46, 1896-1904. |
| --- | --- |

(20)

Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT), Food Chem. Toxicol., 46, 1896-1904.

| (21) | Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH, Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 90-96. |
| --- | --- |

(21)

Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH, Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 90-96.

| (22) | ICCVAM (2009), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Assessment of the Validity of the LLNA for Testing Pesticide Formulations and Other Products, Metals, and Substances in Aqueous Solutions, NIH Publication Number 10-7512, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences, Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/] |
| --- | --- |

(22)

ICCVAM (2009), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Assessment of the Validity of the LLNA for Testing Pesticide Formulations and Other Products, Metals, and Substances in Aqueous Solutions, NIH Publication Number 10-7512, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences, Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/]

| (23) | ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 7th ed. Washington, DC: National Academies Press. |
| --- | --- |

(23)

ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 7th ed. Washington, DC: National Academies Press.

| (24) | McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH, Toxicol., 238, 71-89. |
| --- | --- |

(24)

McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH, Toxicol., 238, 71-89.

| (25) | OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 404, Paris, France. Available at: http://www.oecd.org/document/40/0,3343,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html] |
| --- | --- |

(25)

OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 404, Paris, France. Available at: http://www.oecd.org/document/40/0,3343,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html]

| (26) | Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances, Toxicologist, 96, 235. |
| --- | --- |

(26)

Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances, Toxicologist, 96, 235.

| (27) | ICCVAM (2009), Non-radioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf] |
| --- | --- |

(27)

ICCVAM (2009), Non-radioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf]

| (28) | Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice, Drug. Chem. Toxicol., 21, 195-206. |
| --- | --- |

(28)

Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice, Drug. Chem. Toxicol., 21, 195-206.

| (29) | Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions, Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, 83-94. |
| --- | --- |

(29)

Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions, Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, 83-94.

| (30) | Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals, Toxicol. Meth., 8, 245-256. |
| --- | --- |

(30)

Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals, Toxicol. Meth., 8, 245-256.

| (31) | Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods, Drug. Chem. Toxicol., 22, 491-506. |
| --- | --- |

(31)

Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods, Drug. Chem. Toxicol., 22, 491-506.

| (32) | Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, 60-68. |
| --- | --- |

(32)

Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, 60-68.

| (33) | Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721-728. |
| --- | --- |

(33)

Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721-728.

| (34) | Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for contact sensitisation by Pfiesteria extract, Environ. Health Perspect., 115, 1023-1028. |
| --- | --- |

(34)

Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for contact sensitisation by Pfiesteria extract, Environ. Health Perspect., 115, 1023-1028.

| (35) | OECD (1987), Acute Dermal Toxicity, OECD Guideline for Testing of Chemicals No 402, Paris, France. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

(35)

OECD (1987), Acute Dermal Toxicity, OECD Guideline for Testing of Chemicals No 402, Paris, France. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

| (36) | ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences, Available at: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm] |
| --- | --- |

(36)

ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences, Available at: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm]

| (37) | OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

(37)

OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

Tillæg 1

Ydeevnestandarder til brug for vurdering af foreslåede lignende eller modificerede LLNA-testmetoder til bedømmelse af hudsensibilisering

INDLEDNING

| 1. | Formålet med ydeevnestandarder er at fastslå grundlaget for bedømmelsen af nye testmetoder, både beskyttede (dvs. ophavsretsbeskyttede, varemærkebeskyttede og registrerede) og ikkebeskyttede, som værende tilstrækkelig nøjagtige og pålidelige til bestemte testformål. Disse ydeevnestandarder for validerede og anerkendte testmetoder kan anvendes til at evaluere pålideligheden og nøjagtigheden af andre lignende metoder (i daglig tale »me-too«-test), som er baseret på lignende videnskabelige principper, og til at måle eller forudsige den samme biologiske eller toksiske effekt (14). |
| --- | --- |

1.

Formålet med ydeevnestandarder er at fastslå grundlaget for bedømmelsen af nye testmetoder, både beskyttede (dvs. ophavsretsbeskyttede, varemærkebeskyttede og registrerede) og ikkebeskyttede, som værende tilstrækkelig nøjagtige og pålidelige til bestemte testformål. Disse ydeevnestandarder for validerede og anerkendte testmetoder kan anvendes til at evaluere pålideligheden og nøjagtigheden af andre lignende metoder (i daglig tale »me-too«-test), som er baseret på lignende videnskabelige principper, og til at måle eller forudsige den samme biologiske eller toksiske effekt (14).

| 2. | Inden indførelsen af modificerede metoder (dvs. foreslåede potentielle forbedringer af en godkendt testmetode) skal der foretages en bedømmelse af de foreslåede ændringers effekt på testresultatet og af, i hvilket omfang disse ændringer berører de oplysninger, der er tilgængelige for de øvrige dele i valideringsprocessen. Afhængigt af antallet og arten af de foreslåede ændringer, de genererede data og støttedokumentation for disse ændringer, skal de enten underkastes den samme valideringsproces som beskrevet for en ny test eller, hvis det er hensigtsmæssigt, en begrænset vurdering af pålideligheden og relevansen på grundlag af anerkendte ydeevnestandarder (14). |
| --- | --- |

2.

Inden indførelsen af modificerede metoder (dvs. foreslåede potentielle forbedringer af en godkendt testmetode) skal der foretages en bedømmelse af de foreslåede ændringers effekt på testresultatet og af, i hvilket omfang disse ændringer berører de oplysninger, der er tilgængelige for de øvrige dele i valideringsprocessen. Afhængigt af antallet og arten af de foreslåede ændringer, de genererede data og støttedokumentation for disse ændringer, skal de enten underkastes den samme valideringsproces som beskrevet for en ny test eller, hvis det er hensigtsmæssigt, en begrænset vurdering af pålideligheden og relevansen på grundlag af anerkendte ydeevnestandarder (14).

| 3. | Lignende eller modificerede metoder, der foreslås anvendt i forbindelse med denne TM, skal vurderes med hensyn til pålidelighed og nøjagtighed ved hjælp af kemikalier, der repræsenterer hele LLNA-pointskalaen. For at undgå unødvendig brug af dyr opfordres metodeudviklere på det kraftigste til at rådføre sig med de kompetente myndigheder inden iværksættelsen af valideringsundersøgelser i overensstemmelse med ydeevnestandarderne og vejledningen i denne TM. |
| --- | --- |

3.

Lignende eller modificerede metoder, der foreslås anvendt i forbindelse med denne TM, skal vurderes med hensyn til pålidelighed og nøjagtighed ved hjælp af kemikalier, der repræsenterer hele LLNA-pointskalaen. For at undgå unødvendig brug af dyr opfordres metodeudviklere på det kraftigste til at rådføre sig med de kompetente myndigheder inden iværksættelsen af valideringsundersøgelser i overensstemmelse med ydeevnestandarderne og vejledningen i denne TM.

| 4. | Disse harmoniserede ydeevnestandarder er baseret på de harmoniserede ydeevnestandarder US-ICCVAM, EU-ECVAM og japanske JaCVAM (12) for vurdering af validiteten af lignende eller modificerede versioner af LLNA. Ydeevnestandarderne indeholder de centrale dele af testmetoden, anbefalede referencekemikalier og standarder for nøjagtighed og pålidelighed, som den foreslåede metode som minimum skal opfylde. |
| --- | --- |

4.

Disse harmoniserede ydeevnestandarder er baseret på de harmoniserede ydeevnestandarder US-ICCVAM, EU-ECVAM og japanske JaCVAM (12) for vurdering af validiteten af lignende eller modificerede versioner af LLNA. Ydeevnestandarderne indeholder de centrale dele af testmetoden, anbefalede referencekemikalier og standarder for nøjagtighed og pålidelighed, som den foreslåede metode som minimum skal opfylde.

I.   Centrale dele af testmetoden

| 5. | For at sikre, at en lignende eller modificeret LLNA-metode funktionelt og mekanisk svarer til LLNA og måler den samme biologiske effekt, skal følgende dele inkluderes i testprotokollen:






  — | Teststoffet skal påføres begge musens ører. |
| --- | --- | --- |

5.

For at sikre, at en lignende eller modificeret LLNA-metode funktionelt og mekanisk svarer til LLNA og måler den samme biologiske effekt, skal følgende dele inkluderes i testprotokollen:

—

Teststoffet skal påføres begge musens ører.

| — | Lymfocytproliferationen måles i de lymfeknuder, som dræner påføringsstedet for teststoffet. |
| --- | --- |

—

Lymfocytproliferationen måles i de lymfeknuder, som dræner påføringsstedet for teststoffet.

| — | Lymfocytproliferationen måles i induktionsfasen i hudsensibilisering. |
| --- | --- |

—

Lymfocytproliferationen måles i induktionsfasen i hudsensibilisering.

| — | For teststoffer skal den højeste dosis være den maksimale koncentration, som ikke inducerer systemisk toksicitet og/eller for stærk lokal hudirritation hos musen. For positive referencekemikalier skal den højeste dosis være mindst lige så høj som de tilsvarende referencekemikaliers EC3-værdier i LLNA (se tabel 1) uden at inducere systemisk toksicitet og/eller for stærk lokal hudirritation hos musen. |
| --- | --- |

—

For teststoffer skal den højeste dosis være den maksimale koncentration, som ikke inducerer systemisk toksicitet og/eller for stærk lokal hudirritation hos musen. For positive referencekemikalier skal den højeste dosis være mindst lige så høj som de tilsvarende referencekemikaliers EC3-værdier i LLNA (se tabel 1) uden at inducere systemisk toksicitet og/eller for stærk lokal hudirritation hos musen.

| — | Alle undersøgelser skal omfatte en sideløbende vehikelkontrol, og når det er relevant, foretages der også en sideløbende positiv kontrol. |
| --- | --- |

—

Alle undersøgelser skal omfatte en sideløbende vehikelkontrol, og når det er relevant, foretages der også en sideløbende positiv kontrol.

| — | Der anvendes mindst fire dyr i hver dosisgruppe. |
| --- | --- |

—

Der anvendes mindst fire dyr i hver dosisgruppe.

| — | Der indsamles data for de enkelte dyr eller poolede data. |
| --- | --- |

—

Der indsamles data for de enkelte dyr eller poolede data.

Hvis nogle af disse kriterier ikke opfyldes, kan disse ydeevnestandarder ikke anvendes til validering af den lignende eller modificerede metode.

II.   Minimumsliste over referencekemikalier

| 6. | I de harmoniserede ydeevnestandarder US-ICCVAM, EU-ECVAM og japanske JaCVAM (12) er der blevet identificeret 18 referencekemikalier, der som minimum skal anvendes, og fire valgfrie referencekemikalier (dvs. stoffer, der gav enten falsk positive eller falsk negative resultater i LLNA sammenholdt med resultaterne af forsøg med mennesker og marsvin (B.6 eller OECD Test Guideline 406) (13), og således gør det muligt at påvise en tilsvarende eller bedre ydeevne end LLNA), som er inkluderet i LLNA-ydeevnestandarderne. Kriterierne for udvælgelse af disse kemikalier var:






  — | Listen over referencekemikalier indeholdt den type stoffer, der typisk testes for potentiale for hudsensibilisering, og det responsområde, som kan måles eller forudsiges i LLNA. |
| --- | --- | --- |

6.

I de harmoniserede ydeevnestandarder US-ICCVAM, EU-ECVAM og japanske JaCVAM (12) er der blevet identificeret 18 referencekemikalier, der som minimum skal anvendes, og fire valgfrie referencekemikalier (dvs. stoffer, der gav enten falsk positive eller falsk negative resultater i LLNA sammenholdt med resultaterne af forsøg med mennesker og marsvin (B.6 eller OECD Test Guideline 406) (13), og således gør det muligt at påvise en tilsvarende eller bedre ydeevne end LLNA), som er inkluderet i LLNA-ydeevnestandarderne. Kriterierne for udvælgelse af disse kemikalier var:

—

Listen over referencekemikalier indeholdt den type stoffer, der typisk testes for potentiale for hudsensibilisering, og det responsområde, som kan måles eller forudsiges i LLNA.

| — | Stofferne havde veldefinerede kemiske strukturer. |
| --- | --- |

—

Stofferne havde veldefinerede kemiske strukturer.

| — | LLNA-data fra marsvinetest, (dvs. B.6, OECD Test Guideline 406) (13) og (hvis muligt) data for mennesker var tilgængelige for hvert stof. |
| --- | --- |

—

LLNA-data fra marsvinetest, (dvs. B.6, OECD Test Guideline 406) (13) og (hvis muligt) data for mennesker var tilgængelige for hvert stof.

| — | Stofferne var gængse. |
| --- | --- |

—

Stofferne var gængse.

De anbefalede referencekemikalier er angivet i tabel 1. Studier baseret på de anbefalede referencekemikalier evalueres i det vehikel, som er angivet i tabel 1. Hvis et stof på listen ikke kan fås, kan der benyttes andre stoffer, som opfylder de nævnte udvælgelseskriterier, hvis der gives tilstrækkelig begrundelse.

Tabel 1

Anbefalede referencekemikalier for LLNA-ydeevnestandarderne

| Antal | Kemikalier (3) | CAS-nr. | Form | Veh (4) | EC3 % (5) | N (6) | 0,5x – 2,0x EC3 | EC3-interval | LLNA vs. marsvin | LLNA vs. human |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| 1 | 5-chlor-2-methyl-4-isothiazolin-3-on (CMI)/2-methyl-4-isothiazolin-3-on (MI) (7) | 26172-55-4/2682-20-4 | Fly. | DMF | 0,009 | 1 | 0,0045-0,018 | IB | +/+ | +/+ |
| 2 | DNCB | 97-00-7 | Fast | AOO | 0,049 | 15 | 0,025-0,099 | 0,02-0,094 | +/+ | +/+ |
| 3 | 4-phenylendiamin | 106-50-3 | Fast | AOO | 0,11 | 6 | 0,055-0,22 | 0,07-0,16 | +/+ | +/+ |
| 4 | Cobaltchlorid | 7646-79-9 | Fast | DMSO | 0,6 | 2 | 0,3-1,2 | 0,4-0,8 | +/+ | +/+ |
| 5 | Isoeugenol | 97-54-1 | Fly. | AOO | 1,5 | 47 | 0,77-3,1 | 0,5-3,3 | +/+ | +/+ |
| 6 | 2-mercaptobenzothiazol | 149-30-4 | Fast | DMF | 1,7 | 1 | 0,85-3,4 | IB | +/+ | +/+ |
| 7 | Citral | 5392-40-5 | Fly. | AOO | 9,2 | 6 | 4,6-18,3 | 5,1-13 | +/+ | +/+ |
| 8 | Hexachloraceton | 101-86-0 | Fly. | AOO | 9,7 | 21 | 4,8-19,5 | 4,4-14,7 | +/+ | +/+ |
| 9 | Eugenol | 97-53-0 | Fly. | AOO | 10,1 | 11 | 5,05-20,2 | 4,9-15 | +/+ | +/+ |
| 10 | Phenylbenzoat | 93-99-2 | Fast | AOO | 13,6 | 3 | 6,8-27,2 | 1,2-20 | +/+ | +/+ |
| 11 | Kanelalkohol | 104-54-1 | Fast | AOO | 21 | 1 | 10,5-42 | IB | +/+ | +/+ |
| 12 | Imidazolidinyl urea | 39236-46-9 | Fast | DMF | 24 | 1 | 12-48 | IB | +/+ | +/+ |
| 13 | Methylmethacrylat | 80-62-6 | Fly. | AOO | 90 | 1 | 45-100 | IB | +/+ | +/+ |
| 14 | Chlorbenzen | 108-90-7 | Fly. | AOO | 25 | 1 | Ikke relevant | Ikke relevant | –/– | –/ (1) |
| 15 | Isopropanol | 67-63-0 | Fly. | AOO | 50 | 1 | Ikke relevant | Ikke relevant | –/– | –/+ |
| 16 | Mælkesyre | 50-21-5 | Fly. | DMSO | 25 | 1 | Ikke relevant | Ikke relevant | –/– | –/ (1) |
| 17 | Methylsalicylat | 119-36-8 | Fly. | AOO | 20 | 9 | Ikke relevant | Ikke relevant | –/– | –/– |
| 18 | Salicylsyre | 69-72-7 | Fast | AOO | 25 | 1 | Ikke relevant | Ikke relevant | –/– | –/– |
| Frivillige stoffer til påvisning af forbedret ydeevne i forhold til LLNA |
| 19 | Natriumlaurylsulfat | 151-21-3 | Fast | DMF | 8,1 | 5 | 4,05-16,2 | 1,5-17,1 | +/– | +/– |
| 20 | Ethylenglycoldimethacrylat | 97-90-5 | Fly | MEK | 28 | 1 | 14-56 | IB | +/– | +/+ |
| 21 | Xylen | 1330-20-7 | Fly | AOO | 95,8 | 1 | 47,9-100 | IB | +/ (2) | +/– |
| 22 | Nikkelchlorid | 7718-54-9 | Fast | DMSO | 5 | 2 | Ikke relevant | Ikke relevant | –/+ | –/+ |
| Forkortelser: AOO = acetone: olivenolie (4:1, v/v); CAS-nr. = Chemical Abstracts Service Number; DMF = N,N-dimethylformamid; DMSO = dimethylsulfoxid; DNCB = 2,4-dinitrochlorobenzen; EC3 = den estimerede koncentration, der skal til for at fremkalde en tre gange stigning i stimulationsindekset; Marsvin = marsvinetestresultat (dvs. B.6 eller OECD Test Guideline 406) (13); HCA = hexylkanelaldehyd; Fly = flydende; LLNA = resultat af assay på lokale lymfeknuder i mus (dvs. B.42 eller OECD Test Guideline 429) (1); MEK = methylethylketon; NA = ikke relevant, da stimulationsindekset er < 3; IB = ikke beregnet, da data hidrører fra en enkelt undersøgelse; Fast = faste; Veh = testvehikel. |

Antal

Kemikalier (3)

CAS-nr.

Form

Veh (4)

EC3 % (5)

N (6)

0,5x – 2,0x EC3

EC3-interval

LLNA vs. marsvin

LLNA vs. human

1

5-chlor-2-methyl-4-isothiazolin-3-on (CMI)/2-methyl-4-isothiazolin-3-on (MI) (7)

26172-55-4/2682-20-4

Fly.

DMF

0,009

1

0,0045-0,018

IB

+/+

+/+

2

DNCB

97-00-7

Fast

AOO

0,049

15

0,025-0,099

0,02-0,094

+/+

+/+

3

4-phenylendiamin

106-50-3

Fast

AOO

0,11

6

0,055-0,22

0,07-0,16

+/+

+/+

4

Cobaltchlorid

7646-79-9

Fast

DMSO

0,6

2

0,3-1,2

0,4-0,8

+/+

+/+

5

Isoeugenol

97-54-1

Fly.

AOO

1,5

47

0,77-3,1

0,5-3,3

+/+

+/+

6

2-mercaptobenzothiazol

149-30-4

Fast

DMF

1,7

1

0,85-3,4

IB

+/+

+/+

7

Citral

5392-40-5

Fly.

AOO

9,2

6

4,6-18,3

5,1-13

+/+

+/+

8

Hexachloraceton

101-86-0

Fly.

AOO

9,7

21

4,8-19,5

4,4-14,7

+/+

+/+

9

Eugenol

97-53-0

Fly.

AOO

10,1

11

5,05-20,2

4,9-15

+/+

+/+

10

Phenylbenzoat

93-99-2

Fast

AOO

13,6

3

6,8-27,2

1,2-20

+/+

+/+

11

Kanelalkohol

104-54-1

Fast

AOO

21

1

10,5-42

IB

+/+

+/+

12

Imidazolidinyl urea

39236-46-9

Fast

DMF

24

1

12-48

IB

+/+

+/+

13

Methylmethacrylat

80-62-6

Fly.

AOO

90

1

45-100

IB

+/+

+/+

14

Chlorbenzen

108-90-7

Fly.

AOO

25

1

Ikke relevant

Ikke relevant

–/–

–/ (1)

15

Isopropanol

67-63-0

Fly.

AOO

50

1

Ikke relevant

Ikke relevant

–/–

–/+

16

Mælkesyre

50-21-5

Fly.

DMSO

25

1

Ikke relevant

Ikke relevant

–/–

–/ (1)

17

Methylsalicylat

119-36-8

Fly.

AOO

20

9

Ikke relevant

Ikke relevant

–/–

–/–

18

Salicylsyre

69-72-7

Fast

AOO

25

1

Ikke relevant

Ikke relevant

–/–

–/–

Frivillige stoffer til påvisning af forbedret ydeevne i forhold til LLNA

19

Natriumlaurylsulfat

151-21-3

Fast

DMF

8,1

5

4,05-16,2

1,5-17,1

+/–

+/–

20

Ethylenglycoldimethacrylat

97-90-5

Fly

MEK

28

1

14-56

IB

+/–

+/+

21

Xylen

1330-20-7

Fly

AOO

95,8

1

47,9-100

IB

+/ (2)

+/–

22

Nikkelchlorid

7718-54-9

Fast

DMSO

5

2

Ikke relevant

Ikke relevant

–/+

–/+

Forkortelser: AOO = acetone: olivenolie (4:1, v/v); CAS-nr. = Chemical Abstracts Service Number; DMF = N,N-dimethylformamid; DMSO = dimethylsulfoxid; DNCB = 2,4-dinitrochlorobenzen; EC3 = den estimerede koncentration, der skal til for at fremkalde en tre gange stigning i stimulationsindekset; Marsvin = marsvinetestresultat (dvs. B.6 eller OECD Test Guideline 406) (13); HCA = hexylkanelaldehyd; Fly = flydende; LLNA = resultat af assay på lokale lymfeknuder i mus (dvs. B.42 eller OECD Test Guideline 429) (1); MEK = methylethylketon; NA = ikke relevant, da stimulationsindekset er < 3; IB = ikke beregnet, da data hidrører fra en enkelt undersøgelse; Fast = faste; Veh = testvehikel.

III.   Fastlagte standarder for nøjagtighed og pålidelighed

| 7. | Nøjagtigheden af en lignende eller modificeret LLNA-metode skal som minimum være den samme som for LLNA-ydeevnestandarderne, når den vurderes på grundlag af de 18 referencekemikalier, der som minimum skal anvendes. Den nye eller modificerede metode skal resultere i en korrekt klassificering baseret på en »ja/nej«-afgørelse. Alle de referencekemikalier, der som minimum skal anvendes, klassificeres ikke altid korrekt ved den nye eller modificerede metode. Hvis et af de milde sensibiliserende stoffer f.eks. blev klassificeret forkert, kan en begrundelse for fejlklassificeringen og relevante supplerende data (f.eks. testresultater med korrekte klassificeringer af andre stoffer med samme fysiske, kemiske og sensibiliserende egenskaber som det fejlklassificerede referencekemikalie) anses som dokumentation for samme ydeevne. I så fald vurderes valideringsstatus for den nye eller modificerede LLNA-testmetode fra sag til sag. |
| --- | --- |

7.

Nøjagtigheden af en lignende eller modificeret LLNA-metode skal som minimum være den samme som for LLNA-ydeevnestandarderne, når den vurderes på grundlag af de 18 referencekemikalier, der som minimum skal anvendes. Den nye eller modificerede metode skal resultere i en korrekt klassificering baseret på en »ja/nej«-afgørelse. Alle de referencekemikalier, der som minimum skal anvendes, klassificeres ikke altid korrekt ved den nye eller modificerede metode. Hvis et af de milde sensibiliserende stoffer f.eks. blev klassificeret forkert, kan en begrundelse for fejlklassificeringen og relevante supplerende data (f.eks. testresultater med korrekte klassificeringer af andre stoffer med samme fysiske, kemiske og sensibiliserende egenskaber som det fejlklassificerede referencekemikalie) anses som dokumentation for samme ydeevne. I så fald vurderes valideringsstatus for den nye eller modificerede LLNA-testmetode fra sag til sag.

Reproducerbarhed inden for laboratorier

| 8. | Ved bestemmelse af reproducerbarheden inden for laboratorier skal en ny eller modificeret LLNA-metode vurderes ved hjælp af et sensibiliserende stof, som er velkarakteriseret i LLNA. LLNA-ydeevnestandarderne er således baseret på de variable resultater af gentagne test af hexylkanelaldehyd (HCA). Ved vurdering af pålideligheden inden for laboratorier skal de beregnede koncentrationstærskelværdier (ECt-værdier) for HCA udledes fire gange med mindst en uges mellemrum mellem forsøgene. Reproducerbarheden inden for laboratorier er acceptabel, hvis laboratoriet i hver HCA-test kan opnå ECt-værdier på mellem 5 % og 20 %, hvilket udgør 0,5-2 gange den EC3-middelværdi, der er specificeret for HCA (10 %) i LLNA (se tabel 1). |
| --- | --- |

8.

Ved bestemmelse af reproducerbarheden inden for laboratorier skal en ny eller modificeret LLNA-metode vurderes ved hjælp af et sensibiliserende stof, som er velkarakteriseret i LLNA. LLNA-ydeevnestandarderne er således baseret på de variable resultater af gentagne test af hexylkanelaldehyd (HCA). Ved vurdering af pålideligheden inden for laboratorier skal de beregnede koncentrationstærskelværdier (ECt-værdier) for HCA udledes fire gange med mindst en uges mellemrum mellem forsøgene. Reproducerbarheden inden for laboratorier er acceptabel, hvis laboratoriet i hver HCA-test kan opnå ECt-værdier på mellem 5 % og 20 %, hvilket udgør 0,5-2 gange den EC3-middelværdi, der er specificeret for HCA (10 %) i LLNA (se tabel 1).

Reproducerbarhed mellem laboratorier

| 9. | Ved bedømmelsen af reproducerbarheden mellem laboratorier skal en ny eller modificeret LLNA-metode vurderes ved hjælp af to sensibiliserende stoffer, som er velkarakteriserede i LLNA. LLNA-ydeevnestandarderne er baseret på de variable resultater af HCA- og 2,4-dinitrochlorobenzen (DNCB)-test i forskellige laboratorier. ECt-værdierne afledes uafhængigt af en enkelt undersøgelse udført i mindst tre forskellige laboratorier. For at påvise, at reproducerbarheden mellem laboratorier er acceptabel, skal det enkelte laboratorium opnå ECt-værdier på 5 %-20 % og 0,025 %-0,1 % for DNCB, hvilket udgør 0,5-2 gange den EC3-middelværdi, der er specificeret for henholdsvis HCA (10 %) og DNCB (0,05 %) i LLNA (se tabel 1). |
| --- | --- |

9.

Ved bedømmelsen af reproducerbarheden mellem laboratorier skal en ny eller modificeret LLNA-metode vurderes ved hjælp af to sensibiliserende stoffer, som er velkarakteriserede i LLNA. LLNA-ydeevnestandarderne er baseret på de variable resultater af HCA- og 2,4-dinitrochlorobenzen (DNCB)-test i forskellige laboratorier. ECt-værdierne afledes uafhængigt af en enkelt undersøgelse udført i mindst tre forskellige laboratorier. For at påvise, at reproducerbarheden mellem laboratorier er acceptabel, skal det enkelte laboratorium opnå ECt-værdier på 5 %-20 % og 0,025 %-0,1 % for DNCB, hvilket udgør 0,5-2 gange den EC3-middelværdi, der er specificeret for henholdsvis HCA (10 %) og DNCB (0,05 %) i LLNA (se tabel 1).

Tillæg 2

Definitioner

Nøjagtighed: Overensstemmelsen mellem testmetodens resultater og accepterede referenceværdier. Den er et mål for testmetodens ydeevne og et af aspekterne af relevans. Udtrykket benyttes ofte som synonym for »konkordans«, forstået som den andel korrekte udfald, testmetoden fører til (14).

Referencestof: Et sensibiliserende eller ikkesensibiliserende stof, der anvendes som standard til sammenligning med et teststof. Et referencestof skal have følgende egenskaber: i) en eller flere ensartede og pålidelige kilder; ii) strukturel og funktionel lighed med den stofgruppe, der testes; iii) kendte fysisk/kemiske egenskaber; iv) støttedata om kendte virkninger og v) kendt styrke i det ønskede responsområde.

Beregnet koncentrationstærskel (ECt): Beregnet koncentration af det teststof, der er påkrævet for at fremkalde et stimulationsindeks, der er indikativt for en positiv respons.

Beregnet koncentration tre (EC3): Beregnet koncentration af det teststof, der er påkrævet for at fremkalde et stimulationsindeks på tre.

Falsk negativ: Et teststof, som ved en testmetode fejlagtigt identificeres som negativt eller ikkeaktivt, selv om det rent faktisk er positivt eller aktivt.

Falsk positiv: Et teststof, som ved en testmetode fejlagtigt identificeres som positivt eller aktivt, selv om det rent faktisk er negativt eller ikkeaktivt.

Fare: Potentielle skadelige virkninger for menneskers sundhed og miljøet. De skadelige virkninger fremkaldes kun, hvis eksponeringen er tilstrækkelig.

Reproducerbarhed mellem laboratorier: Mål for, i hvilken grad forskellige kvalificerede laboratorier kan opnå de samme resultater kvalitativt og kvantitativt, når de anvender samme protokol og tester de samme teststoffer. Reproducerbarheden mellem laboratorier bestemmes forud for og under valideringsprocessen og angiver, i hvilken grad en test kan overføres mellem laboratorier med et vellykket resultat. Kaldes også ekstern reproducerbarhed (14).

Reproducerbarhed inden for laboratorier: Bestemmelse af, i hvilken grad kvalificeret personale på det samme laboratorium kan reproducere resultater ved anvendelse af en specifik protokol på forskellige tidspunkter. Kaldes også intern reproducerbarhed (14).

Me-too-test: Gængs udtryk for en testmetode, som strukturelt og funktionelt ligner en valideret og anerkendt referencetestmetode. En sådan testmetode underkastes ofte en catch-up-validering. Benyttes som synonym for tilsvarende testmetode (14).

Outlier: En outlier er en observation, der er markant anderledes end andre værdier i en tilfældig stikprøve af en population.

Ydeevnestandarder (PS): Standarder, som med udgangspunkt i en valideret testmetode giver mulighed for at vurdere, om en foreslået testmetode, som er mekanistisk og funktionelt tilsvarende, er sammenlignelig. De indeholder bl.a.: i) de centrale dele af testmetoden, ii) en minimumsliste med referencekemikalier, som er udvalgt blandt de kemikalier, der er benyttet til at påvise, at den validerede testmetodes ydeevne er acceptabel, iii) de sammenlignelige niveauer af nøjagtighed og pålidelighed, som er fastsat efter, hvad der er opnået med den validerede testmetode, og som det skal påvises, at den foreslåede testmetode kan yde, ved vurdering ud fra minimumslisten med referencekemikalier (14).

Beskyttet testmetode: En testmetode, hvor fremstilling og distribution er beskyttet af patenter, ophavsrettigheder, varemærker osv.

Kvalitetssikring: En forvaltningsproces, hvor overholdelsen af laboratoriets teststandarder, krav og registreringsprocedurer og nøjagtigheden af dataoverførsler vurderes af personer, der er uafhængige af de personer, der udfører forsøget.

Referencekemikalier: Kemikalier, der anvendes i valideringsprocessen, hvor respons i in vitro eller in vivo-referencetestsystemet eller de pågældende arter allerede er kendt. Disse kemikalier skal være repræsentative for de kemiske stofgrupper, som testmetoden forventes at blive anvendt på, og skal repræsentere hele det forventede responsområde for de kemikalier, som den anvendes til, fra kraftig til svag eller negativ respons. Det kan være nødvendigt at anvende forskellige referencekemikalier i de forskellige faser i valideringsprocessen og til forskellige testmetoder og testformål (14).

Relevans: Beskrivelse af sammenhængen mellem testen og den pågældende virkning og dens meningsfuldhed og brugbarhed til et bestemt formål. Det angives, i hvilket omfang testen måler eller forudsiger den pågældende biologiske virkning korrekt. Testmetodens nøjagtighed (konkordans) indgår i vurderingen af dens relevans (14).

Pålidelighed: Mål for, i hvilken grad en testmetode kan udføres reproducerbart i og mellem laboratorier over en længere periode, når den udføres efter samme protokol. Den bedømmes ved beregning af reproducerbarhed inden for og mellem laboratorier (14).

Hudsensibilisering: En immunologisk proces, der udløses, når en disponeret person eksponeres for en inducerende kemisk allergen, som fremkalder en kutan immunrespons, der kan føre til udviklingen af kontaktsensibilisering.

Stimulationsindeks (SI): En værdi, der beregnes for at vurdere et teststofs potentiale for hudsensibilisering, og som er forholdet mellem proliferation i behandlingsgrupperne og proliferationen i den sideløbende vehikelkontrolgruppe.

Teststof (eller testkemikalie): Alle stoffer eller blandinger, der testes ved hjælp af denne TM.

Valideret testmetode: En testmetode, for hvilken der er gennemført valideringsundersøgelser for at fastslå relevansen (herunder nøjagtigheden) og pålideligheden til et bestemt formål. Det er vigtigt at være opmærksom på, at en valideret testmetode måske ikke har tilstrækkelig ydeevne med hensyn til nøjagtighed og pålidelighed til at være acceptabel til det planlagte formål (14).

| 2) | Kapitel B.46 affattes således:
  »B.46.   IN VITRO-HUDIRRITATION: TESTMETODE MED REKONSTRUERET HUMAN EPIDERMIS

  INDLEDNING






  1. | Hudirritation defineres som fremkomsten af reversible hudskader efter påføring af testkemikalie i op til 4 timer [som defineret i FN's globale harmoniserede system for klassificering og mærkning af kemikalier (GHS) og Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1272/2008 af 16. december 2008 om klassificering, mærkning og emballering af stoffer og blandinger (1) (3)]. Denne testmetode (TM) omfatter en in vitro-procedure, som kan anvendes til fareidentifikation af lokalirriterende stoffer (stoffer og blandinger) i kategori 2 ifølge FN GHS og EU CPL (1) (2) (3). I EU og andre regioner, der ikke har indført den valgfrie kategori 3 ifølge FN GHS (milde lokalirriterende stoffer), kan denne TM også anvendes til at identificere ikkeklassificerede stoffer, dvs. stoffer i FN GHS og EU CLP »Ingen kategori« (1) (3). Denne TM kan anvendes til at bestemme stoffers hudirritation og udgøre en selvstændig erstatningstest for in vivo-testning for hudirritation i en trindelt testningsstrategi (4) og kapitel B.4 i dette bilag). |
| --- | --- | --- |

2)

Kapitel B.46 affattes således:

»B.46.   IN VITRO-HUDIRRITATION: TESTMETODE MED REKONSTRUERET HUMAN EPIDERMIS

B.46.

IN VITRO-HUDIRRITATION: TESTMETODE MED REKONSTRUERET HUMAN EPIDERMIS

INDLEDNING

1.

Hudirritation defineres som fremkomsten af reversible hudskader efter påføring af testkemikalie i op til 4 timer [som defineret i FN's globale harmoniserede system for klassificering og mærkning af kemikalier (GHS) og Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1272/2008 af 16. december 2008 om klassificering, mærkning og emballering af stoffer og blandinger (1) (3)]. Denne testmetode (TM) omfatter en in vitro-procedure, som kan anvendes til fareidentifikation af lokalirriterende stoffer (stoffer og blandinger) i kategori 2 ifølge FN GHS og EU CPL (1) (2) (3). I EU og andre regioner, der ikke har indført den valgfrie kategori 3 ifølge FN GHS (milde lokalirriterende stoffer), kan denne TM også anvendes til at identificere ikkeklassificerede stoffer, dvs. stoffer i FN GHS og EU CLP »Ingen kategori« (1) (3). Denne TM kan anvendes til at bestemme stoffers hudirritation og udgøre en selvstændig erstatningstest for in vivo-testning for hudirritation i en trindelt testningsstrategi (4) og kapitel B.4 i dette bilag).

| 2. | Vurderingen af hudirritation har typisk omfattet brug af forsøgsdyr [OECD Test Guideline 404, kapitel B.4 i dette bilag] (4). Af hensyn til dyrevelfærden blev B.4 revideret i 2004 og giver nu mulighed for at bestemme hudætsning/hudirritation ved hjælp af en trindelt teststrategi, der består af validerede in vitro- eller ex vivo-metoder, hvorved det undgås, at dyr udsættes for smerter og lidelser. Der er blevet vedtaget tre in vitro-testmetoder — OECD Test Guidelines 430, 431 og 435 (5) (6) (7) — hvoraf to er indføjet som kapitel B.40 og B.40a i dette bilag, som er relevante for ætsningsdelen af den trindelte teststrategi beskrevet i B.4 eller OECD Test Guideline 404 (4). |
| --- | --- |

2.

Vurderingen af hudirritation har typisk omfattet brug af forsøgsdyr [OECD Test Guideline 404, kapitel B.4 i dette bilag] (4). Af hensyn til dyrevelfærden blev B.4 revideret i 2004 og giver nu mulighed for at bestemme hudætsning/hudirritation ved hjælp af en trindelt teststrategi, der består af validerede in vitro- eller ex vivo-metoder, hvorved det undgås, at dyr udsættes for smerter og lidelser. Der er blevet vedtaget tre in vitro-testmetoder — OECD Test Guidelines 430, 431 og 435 (5) (6) (7) — hvoraf to er indføjet som kapitel B.40 og B.40a i dette bilag, som er relevante for ætsningsdelen af den trindelte teststrategi beskrevet i B.4 eller OECD Test Guideline 404 (4).

| 3. | Denne TM's endepunkt for menneskers sundhed er hudirritation. Den bygger på rekonstrueret human epidermis (RhE), som på grund af dets overordnede udformning (brug af humant afledte ikketransformerede epidermiskeratinocytter som cellekilde og brug af repræsentativt væv og cellearkitektur) ret nøje efterligner de biokemiske og fysiologiske egenskaber i de øvre dele af menneskers hud, dvs. epidermis. Denne TM rummer også et sæt ydeevnestandarder (tillæg 2) til brug for vurdering af lignende og modificerede RhE-baserede metoder udviklet af Europæiske Center for Validering af Alternative Metoder (ECVAM) (8) i overensstemmelse med principperne i OECD Guidance Document No. 34 (9). |
| --- | --- |

3.

Denne TM's endepunkt for menneskers sundhed er hudirritation. Den bygger på rekonstrueret human epidermis (RhE), som på grund af dets overordnede udformning (brug af humant afledte ikketransformerede epidermiskeratinocytter som cellekilde og brug af repræsentativt væv og cellearkitektur) ret nøje efterligner de biokemiske og fysiologiske egenskaber i de øvre dele af menneskers hud, dvs. epidermis. Denne TM rummer også et sæt ydeevnestandarder (tillæg 2) til brug for vurdering af lignende og modificerede RhE-baserede metoder udviklet af Europæiske Center for Validering af Alternative Metoder (ECVAM) (8) i overensstemmelse med principperne i OECD Guidance Document No. 34 (9).

| 4. | Der er tre validerede metoder, der følger denne TM. En in vitro-testmetode, hvor der benyttes en RhE-model, som forhandles under betegnelsen EpiSkinTM (den validerede referencemetode — VRM), har været underkastet prævaliderings-, optimerings- og valideringsundersøgelser (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20). To andre in vitro-RhE-metoder til testning af hudirritation, som fås i handelen, har vist samme resultater som VRM-metoden i en validering baseret på ydeevnestandarder (21), nemlig EpiDermTM SIT (EPI-200)- og SkinEthicTM RHE-metoderne (22). |
| --- | --- |

4.

Der er tre validerede metoder, der følger denne TM. En in vitro-testmetode, hvor der benyttes en RhE-model, som forhandles under betegnelsen EpiSkinTM (den validerede referencemetode — VRM), har været underkastet prævaliderings-, optimerings- og valideringsundersøgelser (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20). To andre in vitro-RhE-metoder til testning af hudirritation, som fås i handelen, har vist samme resultater som VRM-metoden i en validering baseret på ydeevnestandarder (21), nemlig EpiDermTM SIT (EPI-200)- og SkinEthicTM RHE-metoderne (22).

TM

TM

TM

| 5. | Inden en foreslået lignende eller modificeret in vitro-RhE-metode ud over VRM-, EpiDermTM SIT (EPI-200)- eller SkinEthicTM RHE-metoderne kan benyttes i forbindelse med lovgivningen, skal dens pålidelighed og relevans (nøjagtighed) og grænserne for dens påtænkte anvendelse bestemmes, så det er sikkert, at den på de punkter er sammenlignelig med VRM-metoden, og det skal ske i overensstemmelse med ydeevnestandarderne i denne TM (tillæg 2). Det anbefales desuden at konsultere OECD's baggrundsdokument om in vitro-testning for hudirritation inden udvikling og validering af en lignende eller modificeret in vitro-RhE-metode og fremlæggelse af lovforslag til vedtagelse (23). |
| --- | --- |

5.

Inden en foreslået lignende eller modificeret in vitro-RhE-metode ud over VRM-, EpiDermTM SIT (EPI-200)- eller SkinEthicTM RHE-metoderne kan benyttes i forbindelse med lovgivningen, skal dens pålidelighed og relevans (nøjagtighed) og grænserne for dens påtænkte anvendelse bestemmes, så det er sikkert, at den på de punkter er sammenlignelig med VRM-metoden, og det skal ske i overensstemmelse med ydeevnestandarderne i denne TM (tillæg 2). Det anbefales desuden at konsultere OECD's baggrundsdokument om in vitro-testning for hudirritation inden udvikling og validering af en lignende eller modificeret in vitro-RhE-metode og fremlæggelse af lovforslag til vedtagelse (23).

TM

TM

DEFINITIONER

| 6. | De anvendte definitioner er forklaret i tillæg 1. |
| --- | --- |

6.

De anvendte definitioner er forklaret i tillæg 1.

INDLEDENDE OVERVEJELSER OG BEGRÆNSNINGER

| 7. | Der er en begrænsning for TM'en, som påvist i valideringsundersøgelsen (16), nemlig at den ikke giver mulighed for klassificering af kemikalier i den valgfrie kategori 3 ifølge FN GHS (milde lokalirriterende stoffer) (1). Når den benyttes som en delvis erstatningstest, kan det være nødvendigt at udføre en opfølgende in vivo-test for at bedømme det fulde potentiale for hudirritation (4 og kapitel B.4 i dette bilag). Det anerkendes, at brugen af human hud er underlagt nationale og internationale etiske hensyn og betingelser. |
| --- | --- |

7.

Der er en begrænsning for TM'en, som påvist i valideringsundersøgelsen (16), nemlig at den ikke giver mulighed for klassificering af kemikalier i den valgfrie kategori 3 ifølge FN GHS (milde lokalirriterende stoffer) (1). Når den benyttes som en delvis erstatningstest, kan det være nødvendigt at udføre en opfølgende in vivo-test for at bedømme det fulde potentiale for hudirritation (4 og kapitel B.4 i dette bilag). Det anerkendes, at brugen af human hud er underlagt nationale og internationale etiske hensyn og betingelser.

| 8. | Denne TM er relevant for in vitro-hudirritationsdelen af den trindelte teststrategi beskrevet i B.4 (OECD Test Guideline 404) om hudirritation/ætsning (4). Selv om denne TM ikke giver fyldestgørende oplysninger om hudætsning, skal det bemærkes, at B.40a (OECD Test Guideline 431) om hudætsning er baseret på det samme RhE-testsystem, skønt der anvendes en anden protokol (kapitel B.40a). Denne metode er baseret på RhE-modeller, hvor der anvendes humane keratinocytter, som derfor in vitro repræsenterer de pågældende arters målorgan. Den omfatter endvidere direkte det indledende trin i den inflammatoriske kaskade/aktionsmekanisme (cellebeskadigelse og vævsbeskadigelse, der forårsager lokalt traume), som forekommer i forbindelse med in vivo-irritation. Der er blevet testet en lang række forskellige kemikalier i forbindelse med valideringen af denne TM, og den empiriske database for valideringsundersøgelsen omfattede 58 kemikalier i alt (16) (18) (23). Den kan benyttes til test af faste stoffer, væsker, halvfaste stoffer og vokser. Væsker kan være vandige eller ikkevandige, og faste stoffer kan være opløselige eller uopløselige i vand. Faste stoffer skal males til et fint pulver, før de påføres, når det overhovedet er muligt. Der kræves ingen anden forbehandling af teststoffet. Gasser og aerosoler er endnu ikke vurderet ved en valideringsundersøgelse (24). Selv om det er tænkeligt, at disse stoffer kan undersøges ved hjælp af RhE-teknologi, muliggør den nuværende TM ikke undersøgelse af gasser og aerosoler. Det skal bemærkes, at kraftigt farvede kemikalier kan interferere med målingen af cellelevedygtighed og behovet for at anvende tilpassede kontrolprøver til korrektioner (se punkt 24-26). |
| --- | --- |

8.

Denne TM er relevant for in vitro-hudirritationsdelen af den trindelte teststrategi beskrevet i B.4 (OECD Test Guideline 404) om hudirritation/ætsning (4). Selv om denne TM ikke giver fyldestgørende oplysninger om hudætsning, skal det bemærkes, at B.40a (OECD Test Guideline 431) om hudætsning er baseret på det samme RhE-testsystem, skønt der anvendes en anden protokol (kapitel B.40a). Denne metode er baseret på RhE-modeller, hvor der anvendes humane keratinocytter, som derfor in vitro repræsenterer de pågældende arters målorgan. Den omfatter endvidere direkte det indledende trin i den inflammatoriske kaskade/aktionsmekanisme (cellebeskadigelse og vævsbeskadigelse, der forårsager lokalt traume), som forekommer i forbindelse med in vivo-irritation. Der er blevet testet en lang række forskellige kemikalier i forbindelse med valideringen af denne TM, og den empiriske database for valideringsundersøgelsen omfattede 58 kemikalier i alt (16) (18) (23). Den kan benyttes til test af faste stoffer, væsker, halvfaste stoffer og vokser. Væsker kan være vandige eller ikkevandige, og faste stoffer kan være opløselige eller uopløselige i vand. Faste stoffer skal males til et fint pulver, før de påføres, når det overhovedet er muligt. Der kræves ingen anden forbehandling af teststoffet. Gasser og aerosoler er endnu ikke vurderet ved en valideringsundersøgelse (24). Selv om det er tænkeligt, at disse stoffer kan undersøges ved hjælp af RhE-teknologi, muliggør den nuværende TM ikke undersøgelse af gasser og aerosoler. Det skal bemærkes, at kraftigt farvede kemikalier kan interferere med målingen af cellelevedygtighed og behovet for at anvende tilpassede kontrolprøver til korrektioner (se punkt 24-26).

| 9. | En analyseserie bestående af tre vævsgentagelser bør være tilstrækkelig for et teststof, når klassificeringen er entydig. I tilfælde af tvetydige resultater såsom diskordante gentagne målinger, og/eller hvis den gennemsnitlige levedygtighed er 50 ± 5 %, skal det overvejes at lave en anden analyseserie samt en tredje, hvis resultaterne af de første to analyseserier er diskordante. |
| --- | --- |

9.

En analyseserie bestående af tre vævsgentagelser bør være tilstrækkelig for et teststof, når klassificeringen er entydig. I tilfælde af tvetydige resultater såsom diskordante gentagne målinger, og/eller hvis den gennemsnitlige levedygtighed er 50 ± 5 %, skal det overvejes at lave en anden analyseserie samt en tredje, hvis resultaterne af de første to analyseserier er diskordante.

TESTPRINCIPPET

| 10. | Teststoffet påføres på en tredimensional RhE-model, som består af ikketransformerede humant afledte epidermiskeratinocytter, som ved dyrkning har dannet en stærkt differentieret flerlagsmodel af den humane epidermis. Den består af velordnede basallag, stratum spinosum og stratum granulosum og et flerlaget stratum corneum med intercellulære lamellære lipidlag fra samme lipidklasser, som dem man finder in vivo. |
| --- | --- |

10.

Teststoffet påføres på en tredimensional RhE-model, som består af ikketransformerede humant afledte epidermiskeratinocytter, som ved dyrkning har dannet en stærkt differentieret flerlagsmodel af den humane epidermis. Den består af velordnede basallag, stratum spinosum og stratum granulosum og et flerlaget stratum corneum med intercellulære lamellære lipidlag fra samme lipidklasser, som dem man finder in vivo.

| 11. | Kemikalieinduceret hudirritation i form af erytem og ødem er resultatet af en kaskade af begivenheder, der indledes med gennemtrængning af stratum corneum og beskadigelse af de underliggende keratinocytlag. De døende keratinocytter frigiver mediatorer, der starter den inflammatoriske kaskade, der påvirker cellerne i dermis, navnlig de stromale og endotele celler. Det er dilatationen og den øgede permeabilitet i de endotele celler, som producerer den observerede erytem og ødem (24). Ved de RhE-baserede metoder måles de udløsende begivenheder i kaskade. |
| --- | --- |

11.

Kemikalieinduceret hudirritation i form af erytem og ødem er resultatet af en kaskade af begivenheder, der indledes med gennemtrængning af stratum corneum og beskadigelse af de underliggende keratinocytlag. De døende keratinocytter frigiver mediatorer, der starter den inflammatoriske kaskade, der påvirker cellerne i dermis, navnlig de stromale og endotele celler. Det er dilatationen og den øgede permeabilitet i de endotele celler, som producerer den observerede erytem og ødem (24). Ved de RhE-baserede metoder måles de udløsende begivenheder i kaskade.

| 12. | Cellernes levedygtighed i RhE-modeller måles ved, at enzym omdanner vitalfarvestoffet MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid, thiazolylblåt; CAS-nr. 298-93-1)] til et blåt formazansalt, der måles kvantitativt efter ekstraktion fra vævene (25). Lokalirriterende stoffer identificeres ved deres evne til at nedsætte cellernes levedygtighed til en bestemt tærskelværdi eller derunder (f.eks. ≤ 50 % for lokalirriterende stoffer i kategori 2 ifølge FN GHS/EU CLP). Afhængigt af de lovgivningsrammer, inden for hvilke resultaterne af denne TM anvendes, kan kemikalier, der fører til en levedygtighed for cellerne, der ligger over den fastlagte tærskel, betragtes som ikkeirriterende stoffer (dvs. > 50 % »Ingen kategori«). |
| --- | --- |

12.

Cellernes levedygtighed i RhE-modeller måles ved, at enzym omdanner vitalfarvestoffet MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid, thiazolylblåt; CAS-nr. 298-93-1)] til et blåt formazansalt, der måles kvantitativt efter ekstraktion fra vævene (25). Lokalirriterende stoffer identificeres ved deres evne til at nedsætte cellernes levedygtighed til en bestemt tærskelværdi eller derunder (f.eks. ≤ 50 % for lokalirriterende stoffer i kategori 2 ifølge FN GHS/EU CLP). Afhængigt af de lovgivningsrammer, inden for hvilke resultaterne af denne TM anvendes, kan kemikalier, der fører til en levedygtighed for cellerne, der ligger over den fastlagte tærskel, betragtes som ikkeirriterende stoffer (dvs. > 50 % »Ingen kategori«).

GODTGØRELSE AF KOMPETENCE

| 13. | Inden et laboratorium påbegynder rutinemæssig brug af en valideret metode, der følger denne TM, bør de godtgøre deres tekniske kompetence ved hjælp af de 10 anbefalede referencekemikalier i tabel 1. For lignende testmetoder, der udvikles under denne TM, eller modificeringer af en af de tre validerede metoder skal ydeevnestandarderne i tillæg 2 til denne TM opfyldes inden anvendelse af metoden i lovgivningsøjemed. |
| --- | --- |

13.

Inden et laboratorium påbegynder rutinemæssig brug af en valideret metode, der følger denne TM, bør de godtgøre deres tekniske kompetence ved hjælp af de 10 anbefalede referencekemikalier i tabel 1. For lignende testmetoder, der udvikles under denne TM, eller modificeringer af en af de tre validerede metoder skal ydeevnestandarderne i tillæg 2 til denne TM opfyldes inden anvendelse af metoden i lovgivningsøjemed.

| 14. | Som led i godtgørelsen af kompetence anbefales det, at brugeren kontrollerer vævenes barriereegenskaber efter modtagelse som beskrevet i RhE-modellen. Det er navnlig vigtigt, hvis vævene sendes over lang afstand/lange perioder. Når en metode er blevet helt fastlagt, og kompetencen er blevet godtgjort, er det ikke nødvendigt at kontrollere disse egenskaber rutinemæssigt. Ved rutinemæssig brug af en metode anbefales det imidlertid at kontrollere barriereegenskaberne med jævne mellemrum.

  Tabel 1


  Referencekemikalier
   (8)










  Kemisk stof | CAS-nr. | In vivo-score (9) | Fysisk form | UN GHS-/EU CLP-kategori |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| naphthaleneddikesyre | 86-87-3 | 0 | Fast | Ingen kat. |
| isopropanol | 67-63-0 | 0,3 | Flydende | Ingen kat. |
| methylstearat | 112-61-8 | 1 | Fast | Ingen kat. |
| heptylbutyrat | 5870-93-9 | 1,7 | Flydende | Ingen kat.
  (Valgfri kat. 3) (10)
   (11) |
| hexylsalicylat | 6259-76-3 | 2 | Flydende | Ingen kat.
  (Valgfri kat. 3) (10)
   (11) |
| cyclamenaldehyd | 103-95-7 | 2,3 | Flydende | Kat. 2 |
| 1-bromhexan | 111-25-1 | 2,7 | Flydende | Kat. 2 |
| kaliumhydroxid (5 % aq.) | 1310-58-3 | 3 | Flydende | Kat. 2 |
| 1-methyl-3-phenyl-1-piperazin | 5271-27-2 | 3,3 | Fast | Kat. 2 |
| heptanal | 111-71-7 | 3,4 | Flydende | Kat. 2 |

14.

Som led i godtgørelsen af kompetence anbefales det, at brugeren kontrollerer vævenes barriereegenskaber efter modtagelse som beskrevet i RhE-modellen. Det er navnlig vigtigt, hvis vævene sendes over lang afstand/lange perioder. Når en metode er blevet helt fastlagt, og kompetencen er blevet godtgjort, er det ikke nødvendigt at kontrollere disse egenskaber rutinemæssigt. Ved rutinemæssig brug af en metode anbefales det imidlertid at kontrollere barriereegenskaberne med jævne mellemrum.

Tabel 1

Tabel 1

Referencekemikalier
   (8)

Referencekemikalier

8

Kemisk stof

CAS-nr.

In vivo-score (9)

9

Fysisk form

UN GHS-/EU CLP-kategori

naphthaleneddikesyre

86-87-3

0

Fast

Ingen kat.

isopropanol

67-63-0

0,3

Flydende

Ingen kat.

methylstearat

112-61-8

1

Fast

Ingen kat.

heptylbutyrat

5870-93-9

1,7

Flydende

Ingen kat.

(Valgfri kat. 3) (10)
   (11)

Valgfri kat. 3

10

11

hexylsalicylat

6259-76-3

2

Flydende

Ingen kat.

(Valgfri kat. 3) (10)
   (11)

Valgfri kat. 3

10

11

cyclamenaldehyd

103-95-7

2,3

Flydende

Kat. 2

1-bromhexan

111-25-1

2,7

Flydende

Kat. 2

kaliumhydroxid (5 % aq.)

1310-58-3

3

Flydende

Kat. 2

1-methyl-3-phenyl-1-piperazin

5271-27-2

3,3

Fast

Kat. 2

heptanal

111-71-7

3,4

Flydende

Kat. 2

TESTPROCEDURE

| 15. | Nedenfor følger en beskrivelse af komponenter og procedurer i en RhE-metode til vurdering af hudirritation. En RhE-model kan konstrueres, fremstilles internt eller købes i handelen. Standardprocedurer (SOP) for EpiSkinTM, EpiDermTM SIT (EPI-200) og SkinEthicTM RHE er tilgængelige (26) (27) (28). Test bør udføres på følgende måde: |
| --- | --- |

15.

Nedenfor følger en beskrivelse af komponenter og procedurer i en RhE-metode til vurdering af hudirritation. En RhE-model kan konstrueres, fremstilles internt eller købes i handelen. Standardprocedurer (SOP) for EpiSkinTM, EpiDermTM SIT (EPI-200) og SkinEthicTM RHE er tilgængelige (26) (27) (28). Test bør udføres på følgende måde:

TM

TM

TM

Komponenterne i rhe-testmetoden

Komponenterne i rhe-testmetoden

Almindelige betingelser

Almindelige betingelser

| 16. | Der skal anvendes ikketransformerede humane keratinocytter til at konstruere epithelet. Der skal være flere lag af levedygtige epithelceller (basallag, stratum spinosum, stratum granulosum) til stede under et fungerende stratum corneum. Stratum corneum skal være flerlaget og indeholde den fedtprofil, der gør den til en effektiv barriere, der kan modstå hurtig gennemtrængning af cytotoksiske markørstoffer, f.eks. SDS eller Triton X-100. Barrierefunktionen kan bedømmes enten ved at bestemme den koncentration, hvor et markørstof nedsætter vævets levedygtighed med 50 % (IC50) efter en fast eksponeringstid, eller ved at bestemme den eksponeringstid, der er nødvendig for at nedsætte levedygtigheden med 50 % (ET50), når markørstoffet påføres i en nærmere angivet fast koncentration. RhE-modellens fysiske udformning skal forhindre, at stof passerer uden om stratum corneum til det levedygtige væv, hvilket ville forringe modelleringen af hudens eksponering. RhE-modellen skal være fri for kontamination med bakterier, virus, mykoplasma og svampe. |
| --- | --- |

16.

Der skal anvendes ikketransformerede humane keratinocytter til at konstruere epithelet. Der skal være flere lag af levedygtige epithelceller (basallag, stratum spinosum, stratum granulosum) til stede under et fungerende stratum corneum. Stratum corneum skal være flerlaget og indeholde den fedtprofil, der gør den til en effektiv barriere, der kan modstå hurtig gennemtrængning af cytotoksiske markørstoffer, f.eks. SDS eller Triton X-100. Barrierefunktionen kan bedømmes enten ved at bestemme den koncentration, hvor et markørstof nedsætter vævets levedygtighed med 50 % (IC50) efter en fast eksponeringstid, eller ved at bestemme den eksponeringstid, der er nødvendig for at nedsætte levedygtigheden med 50 % (ET50), når markørstoffet påføres i en nærmere angivet fast koncentration. RhE-modellens fysiske udformning skal forhindre, at stof passerer uden om stratum corneum til det levedygtige væv, hvilket ville forringe modelleringen af hudens eksponering. RhE-modellen skal være fri for kontamination med bakterier, virus, mykoplasma og svampe.

50

50

Funktionsmæssige betingelser

Funktionsmæssige betingelser

Levedygtighed

| 17. | MTT-assayet foretrækkes til kvantificering af levedygtigheden (25). Brugerne af RhE-modellen skal sikre, at hver batch af den anvendte RhE-model overholder de fastlagte kriterier for den negative kontrol (NC). Absorbansen (optisk densitet — OD) af det rene ekstraktionsmiddel skal være tilstrækkelig lav, dvs. OD < 0,1. Udvikleren/leverandøren af RhE-modellen skal fastsætte et interval (øvre og nedre grænse) for acceptable OD-værdier for negativ kontrol (i metodebetingelserne for hudirritationstesten), og acceptintervallerne for de tre validerede metoder er angivet i tabel 2. Det skal godtgøres, at vævet fra behandling med negativ kontrol er en stabil kultur (leverer enslydende levedygtighedsmålinger) i hele testeksponeringsperioden.

  Tabel 2


  Intervaller for acceptable OD-værdier for negativ kontrol | Nedre acceptgrænse | Øvre acceptgrænse |
| --- | --- | --- | --- |
| EpiSkinTM (SM) | ≥ 0,6 | ≤ 1,5 |
| EpiDermTM SIT (EPI-200) | ≥ 1,0 | ≤ 2,5 |
| SkinEthicTM RHE | ≥ 1,2 | ≤ 2,5 |

17.

MTT-assayet foretrækkes til kvantificering af levedygtigheden (25). Brugerne af RhE-modellen skal sikre, at hver batch af den anvendte RhE-model overholder de fastlagte kriterier for den negative kontrol (NC). Absorbansen (optisk densitet — OD) af det rene ekstraktionsmiddel skal være tilstrækkelig lav, dvs. OD < 0,1. Udvikleren/leverandøren af RhE-modellen skal fastsætte et interval (øvre og nedre grænse) for acceptable OD-værdier for negativ kontrol (i metodebetingelserne for hudirritationstesten), og acceptintervallerne for de tre validerede metoder er angivet i tabel 2. Det skal godtgøres, at vævet fra behandling med negativ kontrol er en stabil kultur (leverer enslydende levedygtighedsmålinger) i hele testeksponeringsperioden.

Tabel 2

Tabel 2

Intervaller for acceptable OD-værdier for negativ kontrol

Intervaller for acceptable OD-værdier for negativ kontrol

Nedre acceptgrænse

Øvre acceptgrænse

EpiSkinTM (SM)

TM

≥ 0,6

≤ 1,5

EpiDermTM SIT (EPI-200)

TM

≥ 1,0

≤ 2,5

SkinEthicTM RHE

TM

≥ 1,2

≤ 2,5

Barrierefunktion

| 18. | Stratum corneum og dets lipidsammensætning skal være tilstrækkelig til at modstå hurtig gennemtrængning af cytotoksiske markørstoffer, f.eks. SDS eller Triton X-100, bestemt ved IC50 eller ET50 (tabel 3). |
| --- | --- |

18.

Stratum corneum og dets lipidsammensætning skal være tilstrækkelig til at modstå hurtig gennemtrængning af cytotoksiske markørstoffer, f.eks. SDS eller Triton X-100, bestemt ved IC50 eller ET50 (tabel 3).

50

50

Morfologi

| 19. | Der skal udføres en histologisk undersøgelse af RhE-modellen for human epidermis-lignende struktur (herunder flerlaget stratum corneum). |
| --- | --- |

19.

Der skal udføres en histologisk undersøgelse af RhE-modellen for human epidermis-lignende struktur (herunder flerlaget stratum corneum).

Reproducerbarhed

| 20. | Resultaterne af testmetoden med positive (PC) og negative (NC) kontrolprøver skal udvise tidsmæssig reproducerbarhed. |
| --- | --- |

20.

Resultaterne af testmetoden med positive (PC) og negative (NC) kontrolprøver skal udvise tidsmæssig reproducerbarhed.

Kvalitetskontrol

| 21. | Udvikleren/leverandøren af RhE-modellen skal sikre og påvise, at hver batch af den anvendte RhE-model overholder veldefinerede produktionsgodkendelseskriterier, hvoraf levedygtighed (punkt 17), barrierefunktion (punkt 18) og morfologi (punkt 19) er de vigtigste. Brugerne af metoden skal have adgang til disse data, således at de kan medtage disse oplysninger i testrapporten. Udvikleren/leverandøren af RhE-modellen (eller forsøgslederen, hvis modellen er internt fremstillet) skal fastsætte et interval for acceptable værdier af IC50 eller ET50 (øvre og nedre grænse). Kun resultater, der er fremkommet med kvalificerede væv, kan accepteres til at give en pålidelig vurdering af lokalirriterende klassificering. Nedenfor er acceptintervallerne for de tre validerede metoder angivet som eksempler i tabel 3.

  Tabel 3


  Eksempler på batchgodkendelseskriterier til kvalitetskontrol | Nedre acceptgrænse | Øvre acceptgrænse |
| --- | --- | --- | --- |
| EpiSkinTM (SM)
  (behandling i 18 timer med SDS) (26) | IC50 = 1,0 mg/ml | IC50 = 3,0 mg/ml |
| EpiDermTM SIT (EPI-200)
  (1 % Triton X-100) (27) | ET50 = 4,8 t | ET50 = 8,7 t |
| SkinEthicTM RHE
  (1 % Triton X-100) (28) | ET50 = 4,0 t | ET50 = 9,0 t |

21.

Udvikleren/leverandøren af RhE-modellen skal sikre og påvise, at hver batch af den anvendte RhE-model overholder veldefinerede produktionsgodkendelseskriterier, hvoraf levedygtighed (punkt 17), barrierefunktion (punkt 18) og morfologi (punkt 19) er de vigtigste. Brugerne af metoden skal have adgang til disse data, således at de kan medtage disse oplysninger i testrapporten. Udvikleren/leverandøren af RhE-modellen (eller forsøgslederen, hvis modellen er internt fremstillet) skal fastsætte et interval for acceptable værdier af IC50 eller ET50 (øvre og nedre grænse). Kun resultater, der er fremkommet med kvalificerede væv, kan accepteres til at give en pålidelig vurdering af lokalirriterende klassificering. Nedenfor er acceptintervallerne for de tre validerede metoder angivet som eksempler i tabel 3.

levedygtighed

barrierefunktion

morfologi

50

50

Tabel 3

Tabel 3

Eksempler på batchgodkendelseskriterier til kvalitetskontrol

Eksempler på batchgodkendelseskriterier til kvalitetskontrol

Nedre acceptgrænse

Øvre acceptgrænse

EpiSkinTM (SM)

TM

(behandling i 18 timer med SDS) (26)

IC50 = 1,0 mg/ml

50

IC50 = 3,0 mg/ml

50

EpiDermTM SIT (EPI-200)

TM

(1 % Triton X-100) (27)

ET50 = 4,8 t

50

ET50 = 8,7 t

50

SkinEthicTM RHE

TM

(1 % Triton X-100) (28)

ET50 = 4,0 t

50

ET50 = 9,0 t

50

Påføring af test- og kontrolstoffer

Påføring af test- og kontrolstoffer

| 22. | Der anvendes mindst tre vævsgentagelser for hvert testkemikalie og til kontroller pr. analyseserie. For både flydende og faste stoffer gælder det, at der skal påføres tilstrækkelig meget testkemikalie til, at epidermisoverfladen dækkes med et jævnt lag, samtidig med at uendelig dosis undgås, dvs. mindst 25 μL/cm2 eller 25 mg/cm2. I tilfælde af faste stoffer fugtes epidermisoverfladen med deioniseret eller destilleret vand inden påføringen, så kontakten mellem det kemiske teststof og epidermisoverfladen forbedres. Faste stoffer bør testes som fint pulver, når det overhovedet er muligt. Efter eksponeringsperioden vaskes teststoffet omhyggeligt af epidermisoverfladen med vandig buffer eller 0,9 % NaCl. Afhængigt af, hvilke af de tre validerede RhE-metoder der anvendes, kan eksponeringsperioden variere mellem 15 og 60 minutter og inkubationstemperaturen mellem 20 og 37 °C. Disse eksponeringsperioder og temperaturer optimeres for hver RhE-metode og repræsenterer metodernes forskellige iboende egenskaber. Der er nærmere oplysninger i de tre metoders standardprocedurer (SOP) (26) (27) (28). |
| --- | --- |

22.

Der anvendes mindst tre vævsgentagelser for hvert testkemikalie og til kontroller pr. analyseserie. For både flydende og faste stoffer gælder det, at der skal påføres tilstrækkelig meget testkemikalie til, at epidermisoverfladen dækkes med et jævnt lag, samtidig med at uendelig dosis undgås, dvs. mindst 25 μL/cm2 eller 25 mg/cm2. I tilfælde af faste stoffer fugtes epidermisoverfladen med deioniseret eller destilleret vand inden påføringen, så kontakten mellem det kemiske teststof og epidermisoverfladen forbedres. Faste stoffer bør testes som fint pulver, når det overhovedet er muligt. Efter eksponeringsperioden vaskes teststoffet omhyggeligt af epidermisoverfladen med vandig buffer eller 0,9 % NaCl. Afhængigt af, hvilke af de tre validerede RhE-metoder der anvendes, kan eksponeringsperioden variere mellem 15 og 60 minutter og inkubationstemperaturen mellem 20 og 37 °C. Disse eksponeringsperioder og temperaturer optimeres for hver RhE-metode og repræsenterer metodernes forskellige iboende egenskaber. Der er nærmere oplysninger i de tre metoders standardprocedurer (SOP) (26) (27) (28).

2

2

| 23. | Der skal i hver analyseserie anvendes sideløbende negative og positive kontroller (PC), så det godtgøres, at levedygtigheden (NC), barrierefunktionen og vævets deraf følgende følsomhed (med kontrolstoffet) ligger inden for et forud fastsat acceptinterval. Som positivt kontrolstof foreslås 5 % vandig SDS. Som negativt kontrolstof foreslås vand eller phosphatbufferet saltopløsning (PBS). |
| --- | --- |

23.

Der skal i hver analyseserie anvendes sideløbende negative og positive kontroller (PC), så det godtgøres, at levedygtigheden (NC), barrierefunktionen og vævets deraf følgende følsomhed (med kontrolstoffet) ligger inden for et forud fastsat acceptinterval. Som positivt kontrolstof foreslås 5 % vandig SDS. Som negativt kontrolstof foreslås vand eller phosphatbufferet saltopløsning (PBS).

Måling af cellelevedygtighed

Måling af cellelevedygtighed

| 24. | Det vigtigste i testproceduren er, at levedygtigheden ikke måles umiddelbart efter eksponeringen med testkemikalierne, men først efter en tilstrækkelig lang inkubationsperiode i frisk substrat af de renskyllede væv fra behandlingen. En sådan periode betyder, dels at huden kan kommer sig over svagt cytotoksiske virkninger, dels at eventuelle cytotoksiske virkninger træder tydeligt frem. En inkubationsperiode efter behandlingen på 42 timer viste sig i testoptimeringsfasen (11) (12) (13) (14) (15) at være optimal. |
| --- | --- |

24.

Det vigtigste i testproceduren er, at levedygtigheden ikke måles umiddelbart efter eksponeringen med testkemikalierne, men først efter en tilstrækkelig lang inkubationsperiode i frisk substrat af de renskyllede væv fra behandlingen. En sådan periode betyder, dels at huden kan kommer sig over svagt cytotoksiske virkninger, dels at eventuelle cytotoksiske virkninger træder tydeligt frem. En inkubationsperiode efter behandlingen på 42 timer viste sig i testoptimeringsfasen (11) (12) (13) (14) (15) at være optimal.

| 25. | MTT-assayet er en valideret kvantitativ metode, som skal benyttes til måling af cellelevedygtigheden i forbindelse med denne TM. Den er forenelig med brug i et tredimensionalt væv. Vævsprøven anbringes i en MTT-opløsning af passende koncentration (f.eks. 0,3-1 mg/ml) i tre timer. Det udfældede blå formazan ekstraheres fra vævet med et opløsningsmiddel (f.eks. isopropanol eller sur isopropanol), og formazankoncentrationen beregnes ud fra måling af absorbansen i et højst ± 30 nm bredt filterbånd ved 570 nm. |
| --- | --- |

25.

MTT-assayet er en valideret kvantitativ metode, som skal benyttes til måling af cellelevedygtigheden i forbindelse med denne TM. Den er forenelig med brug i et tredimensionalt væv. Vævsprøven anbringes i en MTT-opløsning af passende koncentration (f.eks. 0,3-1 mg/ml) i tre timer. Det udfældede blå formazan ekstraheres fra vævet med et opløsningsmiddel (f.eks. isopropanol eller sur isopropanol), og formazankoncentrationen beregnes ud fra måling af absorbansen i et højst ± 30 nm bredt filterbånd ved 570 nm.

| 26. | Teststoffets optiske egenskaber eller dets kemiske reaktion med MTT kan interferere med målingen og føre til et forkert skøn over levedygtigheden (da teststoffet kan standse, mindske eller forårsage farvedannelsen). Det kan forekomme, hvis et specifikt testkemikalie ikke bliver fjernet fuldstændigt fra vævet ved skylning, eller hvis det er trængt ned i epidermis. Hvis teststoffet reagerer direkte med MTT (MTT-opløsning), hvis det selv er farvet, eller hvis det bliver farvet under behandlingen af vævet, skal der anvendes yderligere kontroller til at spore og korrigere for teststoffernes interferens med levedygtighedsmålingen. Det er nærmere beskrevet, hvordan der korrigeres for MTT-reduktion og farvestoffernes interferens, i SOP'erne for de tre validerede metoder (26) (27) (28). |
| --- | --- |

26.

Teststoffets optiske egenskaber eller dets kemiske reaktion med MTT kan interferere med målingen og føre til et forkert skøn over levedygtigheden (da teststoffet kan standse, mindske eller forårsage farvedannelsen). Det kan forekomme, hvis et specifikt testkemikalie ikke bliver fjernet fuldstændigt fra vævet ved skylning, eller hvis det er trængt ned i epidermis. Hvis teststoffet reagerer direkte med MTT (MTT-opløsning), hvis det selv er farvet, eller hvis det bliver farvet under behandlingen af vævet, skal der anvendes yderligere kontroller til at spore og korrigere for teststoffernes interferens med levedygtighedsmålingen. Det er nærmere beskrevet, hvordan der korrigeres for MTT-reduktion og farvestoffernes interferens, i SOP'erne for de tre validerede metoder (26) (27) (28).

Acceptkriterier

Acceptkriterier

| 27. | For hver metode med gyldige RhE-modelbatcher (se punkt 21) skal væv, der er behandlet med negativ kontrol, give absorbansresultater, der afspejler kvaliteten af de væv, der har været underkastet alle forsendelses- og modtagelsestrin og alle protokolprocesser. Absorbansværdierne af kontrollerne må ikke ligge lavere end forud fastsatte nedre grænser. På tilsvarende måde skal væv, der er behandlet med positiv kontrol, dvs. 5 % vandig SDS, afspejle vævenes evne til at reagere på et lokalirriterende stof under aktuelle forsøgsvilkår (26) (27) (28). Der skal defineres passende mål for den tilknyttede variation mellem multiple bestemmelser på samme væv (f.eks. skal en eventuel standardafvigelse ligge inden for det ensidige toleranceinterval på 95 % beregnet på grundlag af historiske data, der for VRM-standardafvigelser er ≤ 18 %). |
| --- | --- |

27.

For hver metode med gyldige RhE-modelbatcher (se punkt 21) skal væv, der er behandlet med negativ kontrol, give absorbansresultater, der afspejler kvaliteten af de væv, der har været underkastet alle forsendelses- og modtagelsestrin og alle protokolprocesser. Absorbansværdierne af kontrollerne må ikke ligge lavere end forud fastsatte nedre grænser. På tilsvarende måde skal væv, der er behandlet med positiv kontrol, dvs. 5 % vandig SDS, afspejle vævenes evne til at reagere på et lokalirriterende stof under aktuelle forsøgsvilkår (26) (27) (28). Der skal defineres passende mål for den tilknyttede variation mellem multiple bestemmelser på samme væv (f.eks. skal en eventuel standardafvigelse ligge inden for det ensidige toleranceinterval på 95 % beregnet på grundlag af historiske data, der for VRM-standardafvigelser er ≤ 18 %).

Fortolkning af resultater og prædiktionsmodel

Fortolkning af resultater og prædiktionsmodel

| 28. | De absorbansværdier, som måles ved hver undersøgelse, anvendes til beregning af den procentuelle levedygtighed i forhold til den negative kontrol, som vilkårligt sættes til 100 %. Den tærskelværdi for cellelevedygtighedsprocent, som adskiller lokalirriterende stoffer fra ikkeklassificerede stoffer, og de statistiske metoder, der benyttes til at vurdere resultaterne og udpege lokalirriterende stoffer, skal klart defineres, dokumenteres og bevises at være hensigtsmæssige. Tærskelværdierne for vurdering som lokalirriterende er som følger:






  — | Teststoffet betragtes som værende hudirriterende i kategori 2 ifølge FN GHS/EU CLP, hvis vævslevedygtigheden efter eksponering og inkubation efter behandling er mindre end eller lig med (≤) 50 % |
| --- | --- | --- |

28.

De absorbansværdier, som måles ved hver undersøgelse, anvendes til beregning af den procentuelle levedygtighed i forhold til den negative kontrol, som vilkårligt sættes til 100 %. Den tærskelværdi for cellelevedygtighedsprocent, som adskiller lokalirriterende stoffer fra ikkeklassificerede stoffer, og de statistiske metoder, der benyttes til at vurdere resultaterne og udpege lokalirriterende stoffer, skal klart defineres, dokumenteres og bevises at være hensigtsmæssige. Tærskelværdierne for vurdering som lokalirriterende er som følger:

—

Teststoffet betragtes som værende hudirriterende i kategori 2 ifølge FN GHS/EU CLP, hvis vævslevedygtigheden efter eksponering og inkubation efter behandling er mindre end eller lig med (≤) 50 %

| — | Afhængigt af de lovgivningsrammer, inden for hvilke resultaterne af denne TM anvendes, betragtes teststoffet som værende ikkehudirriterende ifølge FN GHS/EU CLP »Ingen kategori«, hvis vævslevedygtigheden efter eksponering og inkubation efter behandling er større end (>) 50 %. |
| --- | --- |

—

Afhængigt af de lovgivningsrammer, inden for hvilke resultaterne af denne TM anvendes, betragtes teststoffet som værende ikkehudirriterende ifølge FN GHS/EU CLP »Ingen kategori«, hvis vævslevedygtigheden efter eksponering og inkubation efter behandling er større end (>) 50 %.

DATA OG RAPPORTERING

Data

Data

| 29. | For hver analyseserie skal data fra de enkelte multipelbestemmelser (f.eks. absorbansværdier og beregnet cellelevedygtighedsprocent for hvert testkemikalie samt klassificeringen) fremlægges i tabelform, herunder data fra eventuelle gentagelser af forsøget. Desuden skal gennemsnit og standardafvigelse angives for hver analyseserie. For hvert testkemikalie oplyses der om eventuelt iagttagne vekselvirkninger med MTT-reagenset og farvede teststoffer. |
| --- | --- |

29.

For hver analyseserie skal data fra de enkelte multipelbestemmelser (f.eks. absorbansværdier og beregnet cellelevedygtighedsprocent for hvert testkemikalie samt klassificeringen) fremlægges i tabelform, herunder data fra eventuelle gentagelser af forsøget. Desuden skal gennemsnit og standardafvigelse angives for hver analyseserie. For hvert testkemikalie oplyses der om eventuelt iagttagne vekselvirkninger med MTT-reagenset og farvede teststoffer.

Testrapport

Testrapport

| 30. | Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger: | Test- og kontrolstoffer:






  — | kemiske navne, f.eks. CAS-navn og -nummer, hvis de kendes |
| --- | --- | --- | --- |

30.

Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:

Test- og kontrolstoffer:

—

kemiske navne, f.eks. CAS-navn og -nummer, hvis de kendes

| — | stoffets renhed og sammensætning (i vægtprocent) |
| --- | --- |

—

stoffets renhed og sammensætning (i vægtprocent)

| — | fysisk-kemiske egenskaber, som er relevante for undersøgelsen (f.eks. fysisk tilstand, stabilitet og flygtighed, pH og opløselighed i vand, hvis kendt) |
| --- | --- |

—

fysisk-kemiske egenskaber, som er relevante for undersøgelsen (f.eks. fysisk tilstand, stabilitet og flygtighed, pH og opløselighed i vand, hvis kendt)

| — | eventuel behandling af test-/kontrolstoffet inden testen (f.eks. opvarmning, formaling) |
| --- | --- |

—

eventuel behandling af test-/kontrolstoffet inden testen (f.eks. opvarmning, formaling)

| — | opbevaringsforhold. |
| --- | --- |

—

opbevaringsforhold.

| | Begrundelse for valg af RhE-model og forsøgsprotokol. |
| --- | --- |

Begrundelse for valg af RhE-model og forsøgsprotokol.

| | Testbetingelser:






  — | anvendt cellesystem |
| --- | --- | --- |

Testbetingelser:

—

anvendt cellesystem

| — | komplet dokumentation for den anvendte RhE-model, herunder om dens ydeevne. Der skal bl.a. gives oplysning om:






  i) | levedygtighed |
| --- | --- | --- |

—

komplet dokumentation for den anvendte RhE-model, herunder om dens ydeevne. Der skal bl.a. gives oplysning om:

i)

levedygtighed

| ii) | barrierefunktion |
| --- | --- |

ii)

barrierefunktion

| iii) | morfologi |
| --- | --- |

iii)

morfologi

| iv) | reproducerbarhed og prædiktionsevne |
| --- | --- |

iv)

reproducerbarhed og prædiktionsevne

| v) | kvalitetskontroller (QC) i modellen |
| --- | --- |

v)

kvalitetskontroller (QC) i modellen

| — | detaljer om den anvendte testprocedure |
| --- | --- |

—

detaljer om den anvendte testprocedure

| — | anvendte testdoser, eksponeringens varighed og længden af inkubationsperioden efter behandlingen |
| --- | --- |

—

anvendte testdoser, eksponeringens varighed og længden af inkubationsperioden efter behandlingen

| — | beskrivelse af eventuelle ændringer i testproceduren |
| --- | --- |

—

beskrivelse af eventuelle ændringer i testproceduren

| — | reference til historiske data for modellen. Der skal bl.a. gives oplysning om:






  i) | om QC-dataene kan accepteres, sammenlignet med data om tidligere batcher |
| --- | --- | --- |

—

reference til historiske data for modellen. Der skal bl.a. gives oplysning om:

i)

om QC-dataene kan accepteres, sammenlignet med data om tidligere batcher

| ii) | om positive og negative kontrolværdier kan accepteres, sammenlignet med gennemsnit og intervaller for positive og negative kontroller |
| --- | --- |

ii)

om positive og negative kontrolværdier kan accepteres, sammenlignet med gennemsnit og intervaller for positive og negative kontroller

| — | beskrivelse af de anvendte evalueringskriterier, herunder begrundelse for valg af prædiktionsmodellens afskæringspunkt(er) |
| --- | --- |

—

beskrivelse af de anvendte evalueringskriterier, herunder begrundelse for valg af prædiktionsmodellens afskæringspunkt(er)

| — | reference til historiske kontroldata. |
| --- | --- |

—

reference til historiske kontroldata.

| | Resultater:






  — | angivelse i tabelform af data fra hvert enkelt testkemikalie for hver analyseserie og fra hver flergangsbestemmelse |
| --- | --- | --- |

Resultater:

—

angivelse i tabelform af data fra hvert enkelt testkemikalie for hver analyseserie og fra hver flergangsbestemmelse

| — | angivelse af kontrolprøver anvendt til direkte MTT-opløsninger og/eller farvede teststoffer |
| --- | --- |

—

angivelse af kontrolprøver anvendt til direkte MTT-opløsninger og/eller farvede teststoffer

| — | beskrivelse af andre observerede virkninger. |
| --- | --- |

—

beskrivelse af andre observerede virkninger.

| | Behandling af resultater |
| --- | --- |

Behandling af resultater

| | Konklusioner |
| --- | --- |

Konklusioner

LITTERATUR

| (1) | UN (2009), United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Third revised edition, UN New York and Geneva. Available at: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev03/03files_e.html] |
| --- | --- |

(1)

UN (2009), United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Third revised edition, UN New York and Geneva. Available at: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev03/03files_e.html]

| (2) | EC-ECVAM (2009), Statement on the »Performance under UN GHS of three in vitro assays for skin irritation testing and the adaptation of the Reference Chemicals and Defined Accuracy Values of the ECVAM skin irritation Performance Standards«, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC30), 9 April 2009. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] |
| --- | --- |

(2)

EC-ECVAM (2009), Statement on the »Performance under UN GHS of three in vitro assays for skin irritation testing and the adaptation of the Reference Chemicals and Defined Accuracy Values of the ECVAM skin irritation Performance Standards«, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC30), 9 April 2009. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

in vitro

| (3) | Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1272/2008 af 16. december 2008 om klassificering, mærkning og emballering af stoffer og blandinger og om ændring og ophævelse af direktiv 67/548/EØF og 1999/45/EF og om ændring af forordning (EF) nr. 1907/2006. EUT L 353 af 31.12.2008, s. 1. |
| --- | --- |

(3)

Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1272/2008 af 16. december 2008 om klassificering, mærkning og emballering af stoffer og blandinger og om ændring og ophævelse af direktiv 67/548/EØF og 1999/45/EF og om ændring af forordning (EF) nr. 1907/2006. EUT L 353 af 31.12.2008, s. 1.

| (4) | OECD (2004), Acute Dermal Irritation/Corrosion, OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 404, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

(4)

OECD (2004), Acute Dermal Irritation/Corrosion, OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 404, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

| (5) | OECD (2004), In Vitro Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical Resistance (TER), OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 430, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

(5)

OECD (2004), In Vitro Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical Resistance (TER), OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 430, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

In Vitro

| (6) | OECD (2004), In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test, OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 431, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

(6)

OECD (2004), In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test, OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 431, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

In Vitro

| (7) | OECD (2006), In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion, OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

(7)

OECD (2006), In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion, OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

In Vitro

| (8) | EC-ECVAM (2009), Performance Standards for in vitro skin irritation test methods based on Reconstructed human Epidermis (RhE)? Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] |
| --- | --- |

(8)

EC-ECVAM (2009), Performance Standards for in vitro skin irritation test methods based on Reconstructed human Epidermis (RhE)? Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

in vitro

| (9) | OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, OECD Series on Testing and Assessment No. 34, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

(9)

OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, OECD Series on Testing and Assessment No. 34, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

| (10) | Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J. M. and Botham, P. (2001), A prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation, Results and evaluation by the Management Team, Toxicol. in Vitro 15, 57-93. |
| --- | --- |

(10)

Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J. M. and Botham, P. (2001), A prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation, Results and evaluation by the Management Team, Toxicol. in Vitro 15, 57-93.

in vitro

| (11) | Portes, P., Grandidier, M.-H., Cohen, C. and Roguet, R. (2002), Refinement of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study, Toxicol. in Vitro 16, 765–770. |
| --- | --- |

(11)

Portes, P., Grandidier, M.-H., Cohen, C. and Roguet, R. (2002), Refinement of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study, Toxicol. in Vitro 16, 765–770.

| (12) | Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, B. and Spielmann, H. (2004), Optimisation of the EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests, ALTEX 21, 107–114. |
| --- | --- |

(12)

Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, B. and Spielmann, H. (2004), Optimisation of the EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests, ALTEX 21, 107–114.

in vitro

| (13) | Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D. and Spielmann, H. (2005), The EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests — An assessment of the performance of the optimised test, ATLA 33, 351-367. |
| --- | --- |

(13)

Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D. and Spielmann, H. (2005), The EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests — An assessment of the performance of the optimised test, ATLA 33, 351-367.

in vitro

| (14) | Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. and Rubinsteen, G. (2005), The in vitro acute skin irritation of chemicals: optimisation of the EPISKIN prediction model within the framework of the ECVAM validation process, ATLA 33, 329-349. |
| --- | --- |

(14)

Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. and Rubinsteen, G. (2005), The in vitro acute skin irritation of chemicals: optimisation of the EPISKIN prediction model within the framework of the ECVAM validation process, ATLA 33, 329-349.

in vitro

| (15) | Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. and Worth, A. (2002), Follow-up to the ECVAM prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation, The European Centre for the Validation of Alternative Methods Skin Irritation Task Force report 2, ATLA 30, 109-129. |
| --- | --- |

(15)

Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. and Worth, A. (2002), Follow-up to the ECVAM prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation, The European Centre for the Validation of Alternative Methods Skin Irritation Task Force report 2, ATLA 30, 109-129.

in vitro

| (16) | Spielmann, H., mailto:Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovio, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., mailto:Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on in vitro tests for acute skin irritation: Report on the validity of the EPISKIN and EpiDerm assays and on the skin integrity function test, ATLA 35, 559-601. |
| --- | --- |

(16)

Spielmann, H., mailto:Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovio, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., mailto:Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on in vitro tests for acute skin irritation: Report on the validity of the EPISKIN and EpiDerm assays and on the skin integrity function test, ATLA 35, 559-601.

in vitro

| (17) | Hoffmann, S. (2006), ECVAM skin irritation validation study phase II: Analysis of the primary endpoint MTT and the secondary endpoint IL1-α. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] |
| --- | --- |

(17)

Hoffmann, S. (2006), ECVAM skin irritation validation study phase II: Analysis of the primary endpoint MTT and the secondary endpoint IL1-α. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

| (18) | Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on in vitro tests for acute skin irritation: selection of test chemicals, ATLA 35, 603-619. |
| --- | --- |

(18)

Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on in vitro tests for acute skin irritation: selection of test chemicals, ATLA 35, 603-619.

in vitro

| (19) | Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Lelièvre, D., Roguet, R., Tinois-Tessonneaud, E. and Leclaire, J. (2007), In vitro acute skin irritancy of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy — Results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, 14, 351-358. |
| --- | --- |

(19)

Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Lelièvre, D., Roguet, R., Tinois-Tessonneaud, E. and Leclaire, J. (2007), In vitro acute skin irritancy of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy — Results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, 14, 351-358.

In vitro

| (20) | EC-ECVAM (2007), Statement on the validity of in vitro tests for skin irritation, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC26), 27 April 2007. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] |
| --- | --- |

(20)

EC-ECVAM (2007), Statement on the validity of in vitro tests for skin irritation, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC26), 27 April 2007. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

in vitro

| (21) | EC-ECVAM (2007), Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation testing. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] |
| --- | --- |

(21)

EC-ECVAM (2007), Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation testing. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

in vitro

| (22) | EC-ECVAM (2008), Statement on the scientific validity of in vitro tests for skin irritation testing, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC29), 5 November 2008. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] |
| --- | --- |

(22)

EC-ECVAM (2008), Statement on the scientific validity of in vitro tests for skin irritation testing, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC29), 5 November 2008. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

in vitro

| (23) | OECD (2010), Explanatory background document to the OECD draft Test Guideline on in vitro skin irritation testing. OECD Series on Testing and Assessment, No. 137, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/document/24/0,3746,en_2649_34377_47858904_1_1_1_1,00.html] |
| --- | --- |

(23)

OECD (2010), Explanatory background document to the OECD draft Test Guideline on in vitro skin irritation testing. OECD Series on Testing and Assessment, No. 137, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/document/24/0,3746,en_2649_34377_47858904_1_1_1_1,00.html]

in vitro

| (24) | Welss, T., Basketter, D.A. and Schröder, K.R. (2004), In vitro skin irritation: fact and future. State of the art review of mechanisms and models, Toxicol. in Vitro 18, 231-243. |
| --- | --- |

(24)

Welss, T., Basketter, D.A. and Schröder, K.R. (2004), In vitro skin irritation: fact and future. State of the art review of mechanisms and models, Toxicol. in Vitro 18, 231-243.

In vitro

| (25) | Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Methods 65, 55-63. |
| --- | --- |

(25)

Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Methods 65, 55-63.

| (26) | EpiSkinTM SOP, Version 1.8 (February 2009), ECVAM Skin Irritation Validation Study: Validation of the EpiSkinTM test method 15 min – 42 hours for the prediction of acute skin irritation of chemicals. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] |
| --- | --- |

(26)

EpiSkinTM SOP, Version 1.8 (February 2009), ECVAM Skin Irritation Validation Study: Validation of the EpiSkinTM test method 15 min – 42 hours for the prediction of acute skin irritation of chemicals. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

TM

TM

| (27) | EpiDermTM SOP, Version 7.0 (Revised March 2009), Protocol for: In vitro EpiDermTM skin irritation test (EPI-200-SIT), For use with MatTek Corporation's reconstructed human epidermal model EpiDerm (EPI-200). Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] |
| --- | --- |

(27)

EpiDermTM SOP, Version 7.0 (Revised March 2009), Protocol for: In vitro EpiDermTM skin irritation test (EPI-200-SIT), For use with MatTek Corporation's reconstructed human epidermal model EpiDerm (EPI-200). Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

TM

In vitro

TM

| (28) | SkinEthicTM RHE SOP, Version 2.0 (February 2009), SkinEthic skin irritation test-42bis test method for the prediction of acute skin irritation of chemicals: 42 minutes application + 42 hours post-incubation. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] |
| --- | --- |

(28)

SkinEthicTM RHE SOP, Version 2.0 (February 2009), SkinEthic skin irritation test-42bis test method for the prediction of acute skin irritation of chemicals: 42 minutes application + 42 hours post-incubation. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

TM

| (29) | Harvell, J.D., Lamminstausta, K., and Maibach, H.I. (1995), Irritant contact dermatitis, In: Practical Contact Dermatitis, pp 7-18, (Ed. Guin J. D.). Mc Graw-Hill, New York. |
| --- | --- |

(29)

Harvell, J.D., Lamminstausta, K., and Maibach, H.I. (1995), Irritant contact dermatitis, In: Practical Contact Dermatitis, pp 7-18, (Ed. Guin J. D.). Mc Graw-Hill, New York.

| (30) | Commission Directive 2001/59/EC of 6 August 2001 adapting to technical progress for the 28th time Council Directive 67/548/EEC on the approximation of laws, regulations and administrative provisions relating to the classification, packaging and labelling of dangerous substances, OJ L 225, 21.8.2001, p.1. |
| --- | --- |

(30)

Commission Directive 2001/59/EC of 6 August 2001 adapting to technical progress for the 28th time Council Directive 67/548/EEC on the approximation of laws, regulations and administrative provisions relating to the classification, packaging and labelling of dangerous substances, OJ L 225, 21.8.2001, p.1.

| (31) | Basketter, D.A., York, M., McFadden, J.P. and Robinson, M.K. (2004), Determination of skin irritation potential in the human 4-h patch test. Contact Dermatitis 51, 1-4. |
| --- | --- |

(31)

Basketter, D.A., York, M., McFadden, J.P. and Robinson, M.K. (2004), Determination of skin irritation potential in the human 4-h patch test. Contact Dermatitis 51, 1-4.

| (32) | Jirova, D., Liebsch, M., Basketter, D., Spiller, E., Kejlova, K., Bendova, H., Marriott, M. and Kandarova, H. (2007), Comparison of human skin irritation and photo-irritation patch test data with cellular in vitro assays and animal in vivo data, ALTEX, 14, 359-365. |
| --- | --- |

(32)

Jirova, D., Liebsch, M., Basketter, D., Spiller, E., Kejlova, K., Bendova, H., Marriott, M. and Kandarova, H. (2007), Comparison of human skin irritation and photo-irritation patch test data with cellular in vitro assays and animal in vivo data, ALTEX, 14, 359-365.

in vitro

in vivo

| (33) | Jírová, D., Basketter, D., Liebsch, M., Bendová, H., Kejlová, K., Marriott, M. and Kandárová, H. (2010), Comparison of human skin irritation patch test data with in vitro skin irritation assays and animal data, Contact Dermatitis, 62, 109-116. |
| --- | --- |

(33)

Jírová, D., Basketter, D., Liebsch, M., Bendová, H., Kejlová, K., Marriott, M. and Kandárová, H. (2010), Comparison of human skin irritation patch test data with in vitro skin irritation assays and animal data, Contact Dermatitis, 62, 109-116.

in vitro

Tillæg 1

Definitioner

Nøjagtighed: Overensstemmelsen mellem testmetodens resultater og accepterede referenceværdier. Den er et mål for testmetodens ydeevne og et af aspekterne af relevans. Udtrykket benyttes ofte som synonym for »konkordans«, forstået som den andel korrekte udfald, testmetoden fører til (9).

Cellelevedygtighed: En parameter, der måler den samlede aktivitet i en cellepopulation, f.eks. udtrykt ved de cellulære mitokondriedehydrogenasers evne til at reducere vitalfarvestoffet MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid, thiazolylblåt], og som, afhængigt af det valgte endepunkt og testens udformning, korrelerer med det totale antal levende celler og/eller deres levedygtighed.

Konkordans: Den er et mål for ydeevnen af en testmetode, der fører til kategoriske resultater, og er et af aspekterne af relevans. Udtrykket benyttes som synonym for »nøjagtighed« og defineres som andelen af alle kemikalier, der klassificeres korrekt som positive eller negative. (9).

ET50: Kan bedømmes ved at bestemme den eksponeringstid, der er nødvendig for at nedsætte cellernes levedygtighed med 50 % ved påføring af et markørstof i en nærmere angivet fast koncentration; se også IC50.

EU CLP (Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 1272/2008 af 16. december 2008 om klassificering, mærkning og emballering af stoffer og blandinger): Gennemfører FN's globale harmoniserede system for klassificering og mærkning af kemikalier (stoffer og blandinger) (GHS) i Den Europæiske Union (EU) (3).

De Forenede Nationers (FN) GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals [det globale harmoniserede system for klassificering og mærkning af kemikalier]): Et system til klassificering af kemikalier (stoffer og blandinger) efter standardiserede typer og niveauer af fysisk fare, sundhedsfare og miljøfare med tilhørende kommunikationselementer såsom piktogrammer, signalord, risikosætninger, sikkerhedssætninger og sikkerhedsdatablade, således at oplysninger om kemikaliernes skadelige virkninger kan videreformidles med henblik på at beskytte mennesker (f.eks. arbejdsgivere, arbejdstagere, transportører, forbrugere og redningspersonel) og miljø (1).

IC50: Kan bedømmes ved at bestemme den koncentration, hvor et markørstof nedsætter vævets levedygtighed med 50 % (IC50) efter en fast eksponeringstid; se også ET50.

Uendelig dosis: Den mængde testkemikalie, som er påført på epidermis ud over den mængde, der er nødvendig for helt at dække epidermisoverfladen på ensartet måde.

Me-too-test: Gængs udtryk for en testmetode, som strukturelt og funktionelt ligner en valideret og anerkendt referencetestmetode. En sådan testmetode underkastes ofte en catch-up-validering. Benyttes som synonym for tilsvarende testmetode (9).

Ydeevnestandarder (PS): Standarder, som med udgangspunkt i en valideret testmetode giver mulighed for at vurdere, om en foreslået testmetode, som er mekanistisk og funktionelt tilsvarende, er sammenlignelig. De indeholder bl.a.: i) de centrale dele af testmetoden, ii) en minimumsliste med referencekemikalier, som er udvalgt blandt de kemikalier, der er benyttet til at påvise, at den validerede testmetodes ydeevne er acceptabel, iii) de sammenlignelige niveauer af nøjagtighed og pålidelighed, som er fastsat efter, hvad der er opnået med den validerede testmetode, og som det skal påvises, at den foreslåede testmetode kan yde, ved vurdering ud fra minimumslisten med referencekemikalier (9).

Referencekemikalier: Kemikalier, der anvendes i valideringsprocessen, hvor respons i in vitro- eller in vivo -referencetestsystemet eller de pågældende arter allerede er kendt. Disse kemikalier skal være repræsentative for de kemiske stofgrupper, som testmetoden forventes at blive anvendt på, og skal repræsentere hele det forventede responsområde for de kemikalier, som den anvendes til, fra kraftig til svag eller negativ respons. Det kan være nødvendigt at anvende forskellige referencekemikalier i de forskellige faser i valideringsprocessen og til forskellige testmetoder og testformål (9).

Relevans: Beskrivelse af sammenhængen mellem testen og den pågældende virkning og dens meningsfuldhed og brugbarhed til et bestemt formål. Det angives, i hvilket omfang testen måler eller forudsiger den pågældende biologiske virkning korrekt. Testmetodens nøjagtighed (konkordans) indgår i vurderingen af dens relevans (9).

Pålidelighed: Mål for, i hvilken grad en testmetode kan udføres reproducerbart i og mellem laboratorier over en længere periode, når den udføres efter samme protokol. Den bedømmes ved beregning af reproducerbarhed inden for og mellem laboratorier (9).

Erstatningstest: En test, der erstatter en test, der bruges rutinemæssigt og er godkendt til fareidentifikation og/eller risikovurdering, og som vurderes at sikre en tilsvarende eller bedre beskyttelse af menneskers og dyrs sundhed eller miljøet alt afhængigt af situationen i forhold til den godkendte test, til alle testsituationer og alle kemikalier (9).

Følsomhed: Andelen af alle positive/aktive testkemikalier, der klassificeres korrekt ved testen. Den er et mål for nøjagtigheden af en testmetode, der fører til kategoriske resultater, og har stor betydning for vurdering af en testmetodes relevans (9).

Hudirritation: Fremkaldelse af reversibel skade på huden ved påføring af teststoffet i indtil 4 timer. Hudirritation er en lokalt fremkaldt ikkeimmunogen reaktion, som indtræder kort tid efter stimuleringen (29). Den karakteriseres især ved, at den reversible proces indebærer inflammatoriske reaktioner og de fleste af de karakteristiske kliniske tegn på irritation (rødme, ødem, kløe og smerte), der er knyttet til en inflammatorisk proces.

Specificitet: Andelen af alle negative/inaktive testkemikalier, der klassificeres korrekt ved testen. Den er et mål for nøjagtigheden af en testmetode, der fører til kategoriske resultater, og har stor betydning for vurdering af en testmetodes relevans (9).

Trindelt testningsstrategi: Testning, hvor der anvendes sekventielle testmetoder. Testmetoderne på de enkelte trin udvælges på grundlag af resultaterne på det tidligere testtrin (9).

Testkemikalie (eller teststof): Alle stoffer eller blandinger, der testes ved hjælp af denne TM.

Tillæg 2

Ydeevnestandarder til brug for vurdering af foreslåede lignende eller modificerede in vitro-(rhe)-metoder med rekonstrueret human epidermis for hudirritation

INDLEDNING

| 1. | Formålet med ydeevnestandarder er at fastslå grundlaget for bedømmelsen af nye metoder, både beskyttede (dvs. ophavsretsbeskyttede, varemærkebeskyttede og registrerede) og ikkebeskyttede, som værende tilstrækkelig nøjagtige og pålidelige til bestemte testformål. Disse ydeevnestandarder for validerede og anerkendte testmetoder kan anvendes til at evaluere pålideligheden og nøjagtigheden af andre analoge metoder (i daglig tale »me-too«-test), som er baseret på lignende videnskabelige principper, og til at måle eller forudsige den samme biologiske eller toksiske effekt (9). |
| --- | --- |

1.

Formålet med ydeevnestandarder er at fastslå grundlaget for bedømmelsen af nye metoder, både beskyttede (dvs. ophavsretsbeskyttede, varemærkebeskyttede og registrerede) og ikkebeskyttede, som værende tilstrækkelig nøjagtige og pålidelige til bestemte testformål. Disse ydeevnestandarder for validerede og anerkendte testmetoder kan anvendes til at evaluere pålideligheden og nøjagtigheden af andre analoge metoder (i daglig tale »me-too«-test), som er baseret på lignende videnskabelige principper, og til at måle eller forudsige den samme biologiske eller toksiske effekt (9).

| 2. | Inden indførelsen af modificerede metoder, dvs. foreslåede potentielle forbedringer af en godkendt metode, skal der foretages en bedømmelse af de foreslåede ændringers effekt på testresultatet og af, i hvilket omfang disse ændringer berører de oplysninger, der er tilgængelige for de øvrige dele i valideringsprocessen. Afhængigt af antallet og arten af de foreslåede ændringer, de genererede data og støttedokumentation for disse ændringer, skal de enten underkastes den samme valideringsproces som beskrevet for en ny test eller, hvis det er hensigtsmæssigt, en begrænset vurdering af pålideligheden og relevansen på grundlag af anerkendte ydeevnestandarder (9). |
| --- | --- |

2.

Inden indførelsen af modificerede metoder, dvs. foreslåede potentielle forbedringer af en godkendt metode, skal der foretages en bedømmelse af de foreslåede ændringers effekt på testresultatet og af, i hvilket omfang disse ændringer berører de oplysninger, der er tilgængelige for de øvrige dele i valideringsprocessen. Afhængigt af antallet og arten af de foreslåede ændringer, de genererede data og støttedokumentation for disse ændringer, skal de enten underkastes den samme valideringsproces som beskrevet for en ny test eller, hvis det er hensigtsmæssigt, en begrænset vurdering af pålideligheden og relevansen på grundlag af anerkendte ydeevnestandarder (9).

| 3. | Lignende (me-too-) eller modificerede metoder af de tre validerede metoder [EpiSkinTM (den validerede referencemetode — VRM), EpiDermTM SIT (EPI-200) og SkinEthicTM RHE], der foreslås anvendt i forbindelse med denne TM, skal vurderes med hensyn til pålidelighed og nøjagtighed ved hjælp af kemikalier, der repræsenterer hele Draize-pointskalaen for irritation. Når foreslåede testmetoder bedømmes ved hjælp af de 20 anbefalede referencekemikalier, der opfylder ydeevnestandarderne (tabel 1), skal de foreslåede lignende eller modificerede metoder have samme niveau af pålidelighed og nøjagtighed som VRM eller et højere niveau (tabel 2) (2) (16). De nøjagtigheds- og pålidelighedsværdier, der skal opnås, er angivet i punkt 8-12 i dette tillæg. Der indgår ikkeklassificerede og klassificerede (FN GHS/EU CLP »Ingen kategori«) og klassificerede (kategori 2 ifølge FN GHS/EU CLP) (1) kemikalier, således at pålideligheden og nøjagtigheden med hensyn til følsomhed, specificitet og generel nøjagtighed af den foreslåede testmetode kan sammenlignes med VRM. Inden metoden tages i brug til test af nye kemikalier, skal det fastslås, om den er pålidelig og — afhængigt af lovgivningsrammerne, inden for hvilke dataene genereres — om den kan identificere hudirriterende kemikalier i kategori 2 ifølge FN GHS/EU CLP »Ingen kategori« korrekt. |
| --- | --- |

3.

Lignende (me-too-) eller modificerede metoder af de tre validerede metoder [EpiSkinTM (den validerede referencemetode — VRM), EpiDermTM SIT (EPI-200) og SkinEthicTM RHE], der foreslås anvendt i forbindelse med denne TM, skal vurderes med hensyn til pålidelighed og nøjagtighed ved hjælp af kemikalier, der repræsenterer hele Draize-pointskalaen for irritation. Når foreslåede testmetoder bedømmes ved hjælp af de 20 anbefalede referencekemikalier, der opfylder ydeevnestandarderne (tabel 1), skal de foreslåede lignende eller modificerede metoder have samme niveau af pålidelighed og nøjagtighed som VRM eller et højere niveau (tabel 2) (2) (16). De nøjagtigheds- og pålidelighedsværdier, der skal opnås, er angivet i punkt 8-12 i dette tillæg. Der indgår ikkeklassificerede og klassificerede (FN GHS/EU CLP »Ingen kategori«) og klassificerede (kategori 2 ifølge FN GHS/EU CLP) (1) kemikalier, således at pålideligheden og nøjagtigheden med hensyn til følsomhed, specificitet og generel nøjagtighed af den foreslåede testmetode kan sammenlignes med VRM. Inden metoden tages i brug til test af nye kemikalier, skal det fastslås, om den er pålidelig og — afhængigt af lovgivningsrammerne, inden for hvilke dataene genereres — om den kan identificere hudirriterende kemikalier i kategori 2 ifølge FN GHS/EU CLP »Ingen kategori« korrekt.

| 4. | Disse ydeevnestandarder er baseret på EU-ECVAM (8), der er opdateret i overensstemmelse med FN's GHS- og EU's CLP-system for klassificering og mærkning (1) (3). De oprindelige ydeevnestandarder blev fastlagt efter afslutning af valideringsundersøgelsen (21) og var baseret på EU's klassificeringssystem som fastlagt i Kommissionens direktiv 2001/59/EF af 6. august 2001 om 28. tilpasning til den tekniske udvikling af Rådets direktiv 67/548/EØF om tilnærmelse af lovgivning om klassificering, emballering og etikettering af farlige stoffer (12). Som følge af vedtagelsen af FN's GHS-system for klassificering og mærkning i EU ((EU CLP) (3), der skete i perioden mellem afslutningen af valideringsundersøgelsen og færdiggørelsen af denne TM, er ydeevnestandarderne blevet opdateret (8). Denne opdatering vedrører navnlig ændringer af i) PS-referencekemikalierne og ii) de fastlagte nøjagtigheds- og pålidelighedsværdier (2) (23). |
| --- | --- |

4.

Disse ydeevnestandarder er baseret på EU-ECVAM (8), der er opdateret i overensstemmelse med FN's GHS- og EU's CLP-system for klassificering og mærkning (1) (3). De oprindelige ydeevnestandarder blev fastlagt efter afslutning af valideringsundersøgelsen (21) og var baseret på EU's klassificeringssystem som fastlagt i Kommissionens direktiv 2001/59/EF af 6. august 2001 om 28. tilpasning til den tekniske udvikling af Rådets direktiv 67/548/EØF om tilnærmelse af lovgivning om klassificering, emballering og etikettering af farlige stoffer (12). Som følge af vedtagelsen af FN's GHS-system for klassificering og mærkning i EU ((EU CLP) (3), der skete i perioden mellem afslutningen af valideringsundersøgelsen og færdiggørelsen af denne TM, er ydeevnestandarderne blevet opdateret (8). Denne opdatering vedrører navnlig ændringer af i) PS-referencekemikalierne og ii) de fastlagte nøjagtigheds- og pålidelighedsværdier (2) (23).

YDEEVNESTANDARDER TIL BRUG FOR IN VITRO-RhE-TESTMETODER FOR HUDIRRITATION

| 5. | Ydeevnestandarderne omfatter følge tre elementer (9):






  I) | De centrale dele af testmetoden |
| --- | --- | --- |

5.

Ydeevnestandarderne omfatter følge tre elementer (9):

I)

De centrale dele af testmetoden

| II) | Minimumsliste over referencekemikalier |
| --- | --- |

II)

Minimumsliste over referencekemikalier

| III) | Definerede nøjagtigheds- og pålidelighedsværdier |
| --- | --- |

III)

Definerede nøjagtigheds- og pålidelighedsværdier

I)   De centrale dele af testmetoden

| 6. | Disse indeholder central strukturelle, funktionelle og metodemæssige dele af en valideret metode, der skal inkluderes i protokollen for en foreslået lignende eller modificeret metode, der er mekanistisk og funktionelt tilsvarende. Disse dele omfatter unikke karakteristika ved metoden, kritiske metodemæssige detaljer og kvalitetskontrolforanstaltninger. Inkluderingen af de centrale dele af testmetoden vil medvirke til at sikre, at en lignende eller modificeret foreslået metode er baseret på samme begreber som den tilsvarende VRM (9). De centrale dele af testmetoden beskrives nærmere i punkt 16-21 i TM'en, og test bør udføres på følgende måde:






  — | Almindelige modelbetingelser (punkt 16). |
| --- | --- | --- |

6.

Disse indeholder central strukturelle, funktionelle og metodemæssige dele af en valideret metode, der skal inkluderes i protokollen for en foreslået lignende eller modificeret metode, der er mekanistisk og funktionelt tilsvarende. Disse dele omfatter unikke karakteristika ved metoden, kritiske metodemæssige detaljer og kvalitetskontrolforanstaltninger. Inkluderingen af de centrale dele af testmetoden vil medvirke til at sikre, at en lignende eller modificeret foreslået metode er baseret på samme begreber som den tilsvarende VRM (9). De centrale dele af testmetoden beskrives nærmere i punkt 16-21 i TM'en, og test bør udføres på følgende måde:

—

Almindelige modelbetingelser (punkt 16).

| — | Funktionsmæssige betingelser, der omfatter:






  — | levedygtighed (punkt 17) |
| --- | --- | --- |

—

Funktionsmæssige betingelser, der omfatter:

—

levedygtighed (punkt 17)

| — | barrierefunktion (punkt 18) |
| --- | --- |

—

barrierefunktion (punkt 18)

| — | morfologi (punkt 19) |
| --- | --- |

—

morfologi (punkt 19)

| — | reproducerbarhed (punkt 20) |
| --- | --- |

—

reproducerbarhed (punkt 20)

| — | kvalitetskontrol (punkt 21) |
| --- | --- |

—

kvalitetskontrol (punkt 21)

II)   Minimumsliste over referencekemikalier

| 7. | Referencekemikalier benyttes til at fastslå, om en foreslået lignende eller modificeret metode, som er bevist at have tilstrækkelig strukturel og funktionel lighed med VRM, eller som består i en mindre modifikation af en af de tre validerede metoder, har samme niveau af pålidelighed og nøjagtighed som VRM (2) (8) (16) (23). De 20 anbefalede referencekemikalier i tabel 1 omfatter kemikalier fra forskellige kemiske stofgrupper (dvs. kemiske kategorier baseret på funktionelle grupper) og repræsenterer hele Draize-pointskalaen (fra ikkeirriterende til stærkt irriterende). På listen er der 10 kemikalier i kategori 2 ifølge FN GHS/EU CLP og 10 ikkeklassificerede kemikalier, heraf tre kemikalier i den valgfrie kategori 3 ifølge FN GHS. I denne testmetode betragtes stoffer i den valgfrie kategori 3 som ikkeklassificerede (»Ingen kategori«). Kemikalierne i tabel 1 udvælges blandt de kemikalier, der anvendes i optimeringsfasen efter prævalideringen og i VRM-valideringsundersøgelsen, på grundlag af kemisk funktion og fysisk form (14) (18). Disse referencekemikalier er det mindste antal kemikalier, der skal indgå i vurderingen af nøjagtighed og pålidelighed af en foreslået lignende eller modificeret metode, men bør ikke anvendes til udvikling af nye metoder. Hvis et stof på listen ikke kan fås, kan der benyttes andre kemikalier, som der foreligger tilstrækkelige in vivo-referencedata om, primært de kemikalier, der anvendes i optimeringsfasen efter prævalideringen eller i VRM-valideringsundersøgelsen. Hvis det ønskes for at udbygge vurderingen af den foreslåede metodes nøjagtighed, kan der tilføjes flere kemikalier, som repræsenterer andre kemiske stofgrupper, og som der foreligger tilstrækkelige in vivo-referencedata om, til minimumslisten over referencekemikalier.

  Tabel 1


  Minimumslisten over referencestoffer til bestemmelse af nøjagtigheds- og pålidelighedsværdier for lignende eller modificerede RhE-metoder til testning af hudirritation
   (13)











  Kemikalie | CAS-nummer | Fysisk form | In vivo-vurdering | VRM in vitro-kategori | FN GHS/EU CLP in vivo-kategori |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| 1-brom-4-chlorbutan | 6940-78-9 | Flydende | 0 | Kat. 2 | Ingen kat. |
| diethylphthalat | 84-66-2 | Flydende | 0 | Ingen kat. | Ingen kat. |
| naphthaleneddikesyre | 86-87-3 | Fast | 0 | Ingen kat. | Ingen kat. |
| allylphenoxyacetat | 7493-74-5 | Flydende | 0,3 | Ingen kat. | Ingen kat. |
| isopropanol | 67-63-0 | Flydende | 0,3 | Ingen kat. | Ingen kat. |
| 4-(methylthio)-benzaldehyd | 3446-89-7 | Flydende | 1 | Kat. 2 | Ingen kat. |
| methylstearat | 112-61-8 | Fast | 1 | Ingen kat. | Ingen kat. |
| heptylbutyrat | 5870-93-9 | Flydende | 1,7 | Ingen kat. | Ingen kat. |
| hexylsalicylat | 6259-76-3 | Flydende | 2 | Ingen kat. | Ingen kat. |
| cinnamaldehyd | 104-55-2 | Flydende | 2 | Kat. 2 | Ingen kat.
  (Valgfri kat. 3) (15) |
| 1-decanol
   (14) | 112-30-1 | Flydende | 2,3 | Kat. 2 | Kat. 2 |
| cyclamenaldehyd | 103-95-7 | Flydende | 2,3 | Kat. 2 | Kat. 2 |
| 1-bromhexan | 111-25-1 | Flydende | 2,7 | Kat. 2 | Kat. 2 |
| 2-chlormethyl-3,5-dimethyl-4-methoxypyridin HC1 | 86604-75-3 | Fast | 2,7 | Kat. 2 | Kat. 2 |
| di-n-propyldisulfid
   (14) | 629-19-6 | Flydende | 3 | Ingen kat. | Kat. 2 |
| kaliumhydroxid (5 % aq.) | 1310-58-3 | Flydende | 3 | Kat. 2 | Kat. 2 |
| benzenthiol, 5-(1,1-dimethylethyl)-2-methyl | 7340-90-1 | Flydende | 3,3 | Kat. 2 | Kat. 2 |
| 1-methyl-3-phenyl-1-piperazin | 5271-27-2 | Fast | 3,3 | Kat. 2 | Kat. 2 |
| heptanal | 111-71-7 | Flydende | 3,4 | Kat. 2 | Kat. 2 |
| tetrachlorethylen | 127-18-4 | Flydende | 4 | Kat. 2 | Kat. 2 |

7.

Referencekemikalier benyttes til at fastslå, om en foreslået lignende eller modificeret metode, som er bevist at have tilstrækkelig strukturel og funktionel lighed med VRM, eller som består i en mindre modifikation af en af de tre validerede metoder, har samme niveau af pålidelighed og nøjagtighed som VRM (2) (8) (16) (23). De 20 anbefalede referencekemikalier i tabel 1 omfatter kemikalier fra forskellige kemiske stofgrupper (dvs. kemiske kategorier baseret på funktionelle grupper) og repræsenterer hele Draize-pointskalaen (fra ikkeirriterende til stærkt irriterende). På listen er der 10 kemikalier i kategori 2 ifølge FN GHS/EU CLP og 10 ikkeklassificerede kemikalier, heraf tre kemikalier i den valgfrie kategori 3 ifølge FN GHS. I denne testmetode betragtes stoffer i den valgfrie kategori 3 som ikkeklassificerede (»Ingen kategori«). Kemikalierne i tabel 1 udvælges blandt de kemikalier, der anvendes i optimeringsfasen efter prævalideringen og i VRM-valideringsundersøgelsen, på grundlag af kemisk funktion og fysisk form (14) (18). Disse referencekemikalier er det mindste antal kemikalier, der skal indgå i vurderingen af nøjagtighed og pålidelighed af en foreslået lignende eller modificeret metode, men bør ikke anvendes til udvikling af nye metoder. Hvis et stof på listen ikke kan fås, kan der benyttes andre kemikalier, som der foreligger tilstrækkelige in vivo-referencedata om, primært de kemikalier, der anvendes i optimeringsfasen efter prævalideringen eller i VRM-valideringsundersøgelsen. Hvis det ønskes for at udbygge vurderingen af den foreslåede metodes nøjagtighed, kan der tilføjes flere kemikalier, som repræsenterer andre kemiske stofgrupper, og som der foreligger tilstrækkelige in vivo-referencedata om, til minimumslisten over referencekemikalier.

Tabel 1

Minimumslisten over referencestoffer til bestemmelse af nøjagtigheds- og pålidelighedsværdier for lignende eller modificerede RhE-metoder til testning af hudirritation
   (13)

Kemikalie

CAS-nummer

Fysisk form

In vivo-vurdering

VRM in vitro-kategori

FN GHS/EU CLP in vivo-kategori

1-brom-4-chlorbutan

6940-78-9

Flydende

0

Kat. 2

Ingen kat.

diethylphthalat

84-66-2

Flydende

0

Ingen kat.

Ingen kat.

naphthaleneddikesyre

86-87-3

Fast

0

Ingen kat.

Ingen kat.

allylphenoxyacetat

7493-74-5

Flydende

0,3

Ingen kat.

Ingen kat.

isopropanol

67-63-0

Flydende

0,3

Ingen kat.

Ingen kat.

4-(methylthio)-benzaldehyd

3446-89-7

Flydende

1

Kat. 2

Ingen kat.

methylstearat

112-61-8

Fast

1

Ingen kat.

Ingen kat.

heptylbutyrat

5870-93-9

Flydende

1,7

Ingen kat.

Ingen kat.

hexylsalicylat

6259-76-3

Flydende

2

Ingen kat.

Ingen kat.

cinnamaldehyd

104-55-2

Flydende

2

Kat. 2

Ingen kat.

(Valgfri kat. 3) (15)

1-decanol
   (14)

112-30-1

Flydende

2,3

Kat. 2

Kat. 2

cyclamenaldehyd

103-95-7

Flydende

2,3

Kat. 2

Kat. 2

1-bromhexan

111-25-1

Flydende

2,7

Kat. 2

Kat. 2

2-chlormethyl-3,5-dimethyl-4-methoxypyridin HC1

86604-75-3

Fast

2,7

Kat. 2

Kat. 2

di-n-propyldisulfid
   (14)

629-19-6

Flydende

3

Ingen kat.

Kat. 2

kaliumhydroxid (5 % aq.)

1310-58-3

Flydende

3

Kat. 2

Kat. 2

benzenthiol, 5-(1,1-dimethylethyl)-2-methyl

7340-90-1

Flydende

3,3

Kat. 2

Kat. 2

1-methyl-3-phenyl-1-piperazin

5271-27-2

Fast

3,3

Kat. 2

Kat. 2

heptanal

111-71-7

Flydende

3,4

Kat. 2

Kat. 2

tetrachlorethylen

127-18-4

Flydende

4

Kat. 2

Kat. 2

III)   Definerede nøjagtigheds- og pålidelighedsværdier

| 8. | Med henblik på at fastslå pålideligheden og relevansen af foreslåede lignende eller modificerede metoder, der ønsker overført mellem laboratorier, skal alle 20 referencekemikalier i tabel 1 testes i mindst tre laboratorier. Hvis den foreslåede metode kun skal anvendes i et laboratorium, er der imidlertid ikke noget krav om testning i flere laboratorier i forbindelse med valideringen. Det er imidlertid af afgørende betydning, at sådanne valideringsundersøgelser vurderes af internationalt anerkendte uafhængige valideringsorganer i overensstemmelse med internationale retningslinjer (9). I hvert laboratorium skal alle 20 referencekemikalier testes ved uafhængige analyseserier, der foretages med forskellige vævsbatcher og på tilstrækkeligt adskilte tidspunkter. Hver analyseserie skal bestå af minimum tre parallelt testede vævsgentagelser for hvert inkluderet testkemikalie og negative og positive kontrolprøve. |
| --- | --- |

8.

Med henblik på at fastslå pålideligheden og relevansen af foreslåede lignende eller modificerede metoder, der ønsker overført mellem laboratorier, skal alle 20 referencekemikalier i tabel 1 testes i mindst tre laboratorier. Hvis den foreslåede metode kun skal anvendes i et laboratorium, er der imidlertid ikke noget krav om testning i flere laboratorier i forbindelse med valideringen. Det er imidlertid af afgørende betydning, at sådanne valideringsundersøgelser vurderes af internationalt anerkendte uafhængige valideringsorganer i overensstemmelse med internationale retningslinjer (9). I hvert laboratorium skal alle 20 referencekemikalier testes ved uafhængige analyseserier, der foretages med forskellige vævsbatcher og på tilstrækkeligt adskilte tidspunkter. Hver analyseserie skal bestå af minimum tre parallelt testede vævsgentagelser for hvert inkluderet testkemikalie og negative og positive kontrolprøve.

| 9. | Beregningen af den foreslåede testmetodes nøjagtigheds- og pålidelighedsværdier skal foretages under hensyntagen til alle fire nedennævnte kriterier under ét, således at det sikres, at alle værdierne for nøjagtighed og pålidelighed beregnes på en forud fastlagt og konsekvent måde.






  1. | Kun data fra analyseserier i komplette analysesekvenser kan anvendes som grundlag for beregningen af metodevariationen og prædiktionsevnen (nøjagtigheden) inden for laboratoriet og mellem laboratorier. |
| --- | --- | --- |

9.

Beregningen af den foreslåede testmetodes nøjagtigheds- og pålidelighedsværdier skal foretages under hensyntagen til alle fire nedennævnte kriterier under ét, således at det sikres, at alle værdierne for nøjagtighed og pålidelighed beregnes på en forud fastlagt og konsekvent måde.

1.

Kun data fra analyseserier i komplette analysesekvenser kan anvendes som grundlag for beregningen af metodevariationen og prædiktionsevnen (nøjagtigheden) inden for laboratoriet og mellem laboratorier.

| 2. | Hvert deltagende laboratorium skal fastsætte den endelige klassificering af de enkelte referencekemikalier ud fra gennemsnittet af levedygtigheden over de forskellige analyseserier i en komplet analysesekvens. |
| --- | --- |

2.

Hvert deltagende laboratorium skal fastsætte den endelige klassificering af de enkelte referencekemikalier ud fra gennemsnittet af levedygtigheden over de forskellige analyseserier i en komplet analysesekvens.

| 3. | Kun data fra kemikalier, som har komplette analysesekvenser i alle deltagende laboratorier, kan anvendes som grundlag for beregningen af metodevariationen mellem laboratorier. |
| --- | --- |

3.

Kun data fra kemikalier, som har komplette analysesekvenser i alle deltagende laboratorier, kan anvendes som grundlag for beregningen af metodevariationen mellem laboratorier.

| 4. | Beregningen af nøjagtighedsværdierne skal foretages på grundlag af de forskellige deltagende laboratorier egne forudsigelser for de 20 referencekemikalier. |
| --- | --- |

4.

Beregningen af nøjagtighedsværdierne skal foretages på grundlag af de forskellige deltagende laboratorier egne forudsigelser for de 20 referencekemikalier.

I denne forbindelse består en analysesekvens af tre uafhængige analyseserier fra et laboratorium for et testkemikalie. En komplet analysesekvens er en analysesekvens fra et laboratorium for et testkemikalie, hvor alle tre serier er gyldige. Dette indebærer, at en enkelt ugyldig analyseserie ugyldiggør hele analyseserien af de tre analyseserier.

Reproducerbarhed inden for laboratoriet

| 10. | En vurdering af reproducerbarheden inden for laboratoriet skal vise, at klassificeringerne (kategori 2 ifølge FN GHS/EU CLP og »Ingen kategori«) ved forskellige uafhængige analyseserier med de 20 referencekemikalier i ét enkelt laboratorium er overensstemmende i 90 % af tilfældene eller derover. |
| --- | --- |

10.

En vurdering af reproducerbarheden inden for laboratoriet skal vise, at klassificeringerne (kategori 2 ifølge FN GHS/EU CLP og »Ingen kategori«) ved forskellige uafhængige analyseserier med de 20 referencekemikalier i ét enkelt laboratorium er overensstemmende i 90 % af tilfældene eller derover.

Reproducerbarhed mellem laboratorier

| 11. | En vurdering af reproducerbarheden mellem laboratorier er ikke afgørende, hvis de foreslåede metoder kun skal benyttes i ét laboratorium. For metoder, der ønskes overført mellem laboratorier, skal klassificeringerne (kategori 2 ifølge FN GHS/EU CLP og »Ingen kategori«) ved forskellige uafhængige analyseserier med de 20 referencekemikalier, der foretages i helst mindst tre laboratorier, være overensstemmende i 80 % af tilfældene eller derover. |
| --- | --- |

11.

En vurdering af reproducerbarheden mellem laboratorier er ikke afgørende, hvis de foreslåede metoder kun skal benyttes i ét laboratorium. For metoder, der ønskes overført mellem laboratorier, skal klassificeringerne (kategori 2 ifølge FN GHS/EU CLP og »Ingen kategori«) ved forskellige uafhængige analyseserier med de 20 referencekemikalier, der foretages i helst mindst tre laboratorier, være overensstemmende i 80 % af tilfældene eller derover.

Prædiktionsevne (nøjagtighed)

| 12. | Nøjagtigheden med hensyn til følsomhed, specificitet og generel nøjagtighed af en foreslået lignende eller modificeret metode skal være sammenlignelig eller bedre end nøjagtigheden af en VRM under hensyntagen til yderligere oplysninger om relevansen i de pågældende arter (tabel 2). Følsomheden skal være 80 % eller derover (2) (8) (23). Der er imidlertid en yderligere særlig begrænsning for følsomheden af den foreslåede in vitro-metode, da kun to in vivo-kemikalier i kategori 2, 1-decanol og di-n-propyldisulfid, må fejlklassificeres som ikkeklassificerede (»Ingen kategori«) af mere end et deltagende laboratorium. Specificiteten skal være 70 % eller derover (2) (8) (23). Der er ingen yderligere begrænsning med hensyn til specificiteten af den foreslåede in vitro-metode, dvs. at de deltagende laboratorier kan fejlklassificere ethvert ikkeklassificeret in vivo-kemikalie, så længe testmetodens endelige specificitet ligger inden for det acceptable interval. Den generelle nøjagtighed skal være 75 % eller derover (2) (8) (23). Selv om den beregnede følsomhed af VRM for de 20 referencekemikalier i tabel 1 er 90 %, skal den definerede minimumsfølsomhedsværdi for en lignende eller modificeret metode være 80 % for at kunne blive betragtet som gyldig, da både 1-decanol (et borderline-kemikalie) og di-n-propyl propyldisulfid (et falsk negativ af VRM) vides at være ikkeirriterende for mennesker (31) (32) (33), selv om de er identificeret som lokalirriterende stoffer i kanintesten. Eftersom RhE-modeller er baseret på celler af menneskelig oprindelse, kan de anvendes til at identificere disse kemikalier som ikkeirriterende (FN GHS/EU CLP »Ingen kategori«).

  Tabel 2


  Krævet prædiktionsevne for nøjagtighed med hensyn til følsomhed, specificitet og generel nøjagtighed, for at en lignende eller modificeret metode skal kunne betragtes som gyldig








  Følsomhed | Specificitet | Generel nøjagtighed |
| --- | --- | --- | --- |
| ≥ 80 % | ≥ 70 % | ≥ 75 % |

12.

Nøjagtigheden med hensyn til følsomhed, specificitet og generel nøjagtighed af en foreslået lignende eller modificeret metode skal være sammenlignelig eller bedre end nøjagtigheden af en VRM under hensyntagen til yderligere oplysninger om relevansen i de pågældende arter (tabel 2). Følsomheden skal være 80 % eller derover (2) (8) (23). Der er imidlertid en yderligere særlig begrænsning for følsomheden af den foreslåede in vitro-metode, da kun to in vivo-kemikalier i kategori 2, 1-decanol og di-n-propyldisulfid, må fejlklassificeres som ikkeklassificerede (»Ingen kategori«) af mere end et deltagende laboratorium. Specificiteten skal være 70 % eller derover (2) (8) (23). Der er ingen yderligere begrænsning med hensyn til specificiteten af den foreslåede in vitro-metode, dvs. at de deltagende laboratorier kan fejlklassificere ethvert ikkeklassificeret in vivo-kemikalie, så længe testmetodens endelige specificitet ligger inden for det acceptable interval. Den generelle nøjagtighed skal være 75 % eller derover (2) (8) (23). Selv om den beregnede følsomhed af VRM for de 20 referencekemikalier i tabel 1 er 90 %, skal den definerede minimumsfølsomhedsværdi for en lignende eller modificeret metode være 80 % for at kunne blive betragtet som gyldig, da både 1-decanol (et borderline-kemikalie) og di-n-propyl propyldisulfid (et falsk negativ af VRM) vides at være ikkeirriterende for mennesker (31) (32) (33), selv om de er identificeret som lokalirriterende stoffer i kanintesten. Eftersom RhE-modeller er baseret på celler af menneskelig oprindelse, kan de anvendes til at identificere disse kemikalier som ikkeirriterende (FN GHS/EU CLP »Ingen kategori«).

Tabel 2

Krævet prædiktionsevne for nøjagtighed med hensyn til følsomhed, specificitet og generel nøjagtighed, for at en lignende eller modificeret metode skal kunne betragtes som gyldig

Følsomhed

Specificitet

Generel nøjagtighed

≥ 80 %

≥ 70 %

≥ 75 %

Undersøgelsesacceptkriterier

| 13. | Det er muligt, at et eller flere forsøg vedrørende et eller flere kemikalier opfylder/ikke opfylder acceptkriterierne for test- og kontrolstofferne eller ikke kan accepteres af andre årsager. Der kan foretages højst to yderligere forsøg (»gentagelse af forsøg«) for hvert testkemikalie for at supplere manglende data. Da der ved gentagelse af forsøg skal anvendes sideløbende negative og positive kontroller, må der mere præcist udføres højst to yderligere analyseserier for hvert testkemikalie. |
| --- | --- |

13.

Det er muligt, at et eller flere forsøg vedrørende et eller flere kemikalier opfylder/ikke opfylder acceptkriterierne for test- og kontrolstofferne eller ikke kan accepteres af andre årsager. Der kan foretages højst to yderligere forsøg (»gentagelse af forsøg«) for hvert testkemikalie for at supplere manglende data. Da der ved gentagelse af forsøg skal anvendes sideløbende negative og positive kontroller, må der mere præcist udføres højst to yderligere analyseserier for hvert testkemikalie.

| 14. | Selv efter gentagelse af forsøg er det tænkeligt, at kravet om mindst tre gyldige analyseserier for hvert testkemikalie ikke opfyldes for hvert enkelt referencekemikalie i alle deltagende laboratorier, hvilket resulterer i en ufuldstændig datamatrix. I disse tilfælde skal følgende tre kriterier alle opfyldes, for at datasættene skal kunne betragtes som acceptable:






  1. | Alle 20 referencekemikalier skal have mindst en komplet analysesekvens. |
| --- | --- | --- |

14.

Selv efter gentagelse af forsøg er det tænkeligt, at kravet om mindst tre gyldige analyseserier for hvert testkemikalie ikke opfyldes for hvert enkelt referencekemikalie i alle deltagende laboratorier, hvilket resulterer i en ufuldstændig datamatrix. I disse tilfælde skal følgende tre kriterier alle opfyldes, for at datasættene skal kunne betragtes som acceptable:

1.

Alle 20 referencekemikalier skal have mindst en komplet analysesekvens.

| 2. | I mindst tre deltagende laboratorier skal mindst 85 % af analysesekvenserne være komplette (for 20 kemikalier, dvs. at tre ugyldige analysesekvenser i et laboratorium tillades). |
| --- | --- |

2.

I mindst tre deltagende laboratorier skal mindst 85 % af analysesekvenserne være komplette (for 20 kemikalier, dvs. at tre ugyldige analysesekvenser i et laboratorium tillades).

| 3. | Mindst 90 % af alle mulige analysesekvenser fra mindst tre laboratorier skal være komplette (for 20 kemikalier testet i tre laboratorier, dvs. at i alt seks ugyldige analysesekvenser tillades). |
| --- | --- |

3.

Mindst 90 % af alle mulige analysesekvenser fra mindst tre laboratorier skal være komplette (for 20 kemikalier testet i tre laboratorier, dvs. at i alt seks ugyldige analysesekvenser tillades).

| 3) | Følgende kapitler indsættes
  »B.49.   IN VITRO-MIKROKERNETEST I PATTEDYRCELLER

  INDLEDNING






  1. | En in vitro-mikrokernetest (MNvit-test) er en genotoksicitetstest til påvisning af mikrokerner (MN) i cytoplasma i interfaseceller. Mikrokerner kan dannes ud fra acentriske kromosomfragmenter (dvs. uden en centromer), eller hele kromosomer, som ikke kan migrere til polerne under celledelingens anafase. Assayet påviser klastogene og aneugene kemikaliers (stoffer og blandinger) virkninger (1) (2) i celler, der er blevet delt under eller efter eksponering for teststoffet. I denne testmetode (TM) kan der anvendes protokoller med og uden aktinpolymeriseringsinhibitoren cytochalasin B (cytoB). Tilsætningen af cytoB inden mitosen muliggør identifikation og selektiv analyse af mikrokerneforekomsten i celler, der har afsluttet mitosen, da sådanne celler er binukleære (3) (4). I denne TM kan der desuden anvendes protokoller uden cytokineseblokerende stof, hvis det kan dokumenteres, at analyserede cellepopulation har undergået mitose. |
| --- | --- | --- |

3)

Følgende kapitler indsættes

»B.49.   IN VITRO-MIKROKERNETEST I PATTEDYRCELLER

B.49.

IN VITRO-MIKROKERNETEST I PATTEDYRCELLER

INDLEDNING

1.

En in vitro-mikrokernetest (MNvit-test) er en genotoksicitetstest til påvisning af mikrokerner (MN) i cytoplasma i interfaseceller. Mikrokerner kan dannes ud fra acentriske kromosomfragmenter (dvs. uden en centromer), eller hele kromosomer, som ikke kan migrere til polerne under celledelingens anafase. Assayet påviser klastogene og aneugene kemikaliers (stoffer og blandinger) virkninger (1) (2) i celler, der er blevet delt under eller efter eksponering for teststoffet. I denne testmetode (TM) kan der anvendes protokoller med og uden aktinpolymeriseringsinhibitoren cytochalasin B (cytoB). Tilsætningen af cytoB inden mitosen muliggør identifikation og selektiv analyse af mikrokerneforekomsten i celler, der har afsluttet mitosen, da sådanne celler er binukleære (3) (4). I denne TM kan der desuden anvendes protokoller uden cytokineseblokerende stof, hvis det kan dokumenteres, at analyserede cellepopulation har undergået mitose.

| 2. | Ud over anvendelse af MNvit-assayet til identifikation af kemikalier (stoffer og blandinger), der inducerer mikrokerner, kan anvendelsen af et cytokineseblokerende stof, immunkemisk mærkning af kinetokorer eller hybridisering med centromeriske/telomeriske prober (fluorescerende in situ-hybridisering (FISH)) også tilvejebringe oplysninger om mekanismerne for kromosomskade og mikrokernedannelse (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). Mærknings- og hybridiseringsprocedurerne kan anvendes i tilfælde af øget mikrokernedannelse, hvis forsøgslederen ønsker at bestemme, om forøgelsen skyldtes klastogene og/eller aneugene begivenheder. |
| --- | --- |

2.

Ud over anvendelse af MNvit-assayet til identifikation af kemikalier (stoffer og blandinger), der inducerer mikrokerner, kan anvendelsen af et cytokineseblokerende stof, immunkemisk mærkning af kinetokorer eller hybridisering med centromeriske/telomeriske prober (fluorescerende in situ-hybridisering (FISH)) også tilvejebringe oplysninger om mekanismerne for kromosomskade og mikrokernedannelse (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). Mærknings- og hybridiseringsprocedurerne kan anvendes i tilfælde af øget mikrokernedannelse, hvis forsøgslederen ønsker at bestemme, om forøgelsen skyldtes klastogene og/eller aneugene begivenheder.

| 3. | Mikrokerner er skader, der er blevet overført til datterceller, hvorimod kromosomaberrationer i metafaseceller ikke nødvendigvis er overført. Da mikrokerner i interfaseceller kan vurderes relativt objektivt, behøver laboratoriepersonalet kun at bestemme, om cellerne har delt sig eller ej, og hvor mange celler der indeholder en mikrokerne. Præparaterne kan derfor bedømmes relativt hurtigt, og analysen kan automatiseres. Det gør det praktisk at bedømme tusindvis i stedet for hundredvis af celler pr. behandling, hvilket øger assayets ydeevne. Da mikrokerner kan dannes ud fra tiloversblevne kromosomer, er det endeligt muligt at påvise aneuploidiinducerende stoffer, som er vanskelige at undersøge i konventionelle test for kromosomaberrationer, f.eks. OECD Test Guideline 473 (kapitel B.10 i dette bilag) (17). MNvit-assayet kan dog ikke anvendes til at differentiere polyploidiinducerende kemikalier fra klastogenicitetinducerende kemikalier uden særlige teknikker såsom FISH, der er beskrevet i punkt 2. |
| --- | --- |

3.

Mikrokerner er skader, der er blevet overført til datterceller, hvorimod kromosomaberrationer i metafaseceller ikke nødvendigvis er overført. Da mikrokerner i interfaseceller kan vurderes relativt objektivt, behøver laboratoriepersonalet kun at bestemme, om cellerne har delt sig eller ej, og hvor mange celler der indeholder en mikrokerne. Præparaterne kan derfor bedømmes relativt hurtigt, og analysen kan automatiseres. Det gør det praktisk at bedømme tusindvis i stedet for hundredvis af celler pr. behandling, hvilket øger assayets ydeevne. Da mikrokerner kan dannes ud fra tiloversblevne kromosomer, er det endeligt muligt at påvise aneuploidiinducerende stoffer, som er vanskelige at undersøge i konventionelle test for kromosomaberrationer, f.eks. OECD Test Guideline 473 (kapitel B.10 i dette bilag) (17). MNvit-assayet kan dog ikke anvendes til at differentiere polyploidiinducerende kemikalier fra klastogenicitetinducerende kemikalier uden særlige teknikker såsom FISH, der er beskrevet i punkt 2.

| 4. | MNvit-assayet er en in vitro-metode, der typisk anvender dyrkede celler fra mennesker eller gnavere. Den danner et solidt grundlag for in vitro-undersøgelse af potentialet for kromosomskade, da både aneugener og klastogener kan påvises. |
| --- | --- |

4.

MNvit-assayet er en in vitro-metode, der typisk anvender dyrkede celler fra mennesker eller gnavere. Den danner et solidt grundlag for in vitro-undersøgelse af potentialet for kromosomskade, da både aneugener og klastogener kan påvises.

| 5. | MNvit-assayet er solid og effektiv til en lang række celletyper og til påvisning af forekomsten eller fraværet af cytoB. Der findes omfattende data, der påviser gyldigheden af MNvit-assayet, hvor der anvendes forskellige cellelinjer fra gnavere (CHO, V79, CHL/IU ogL5178Y) og humane lymfocytter (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31), herunder navnlig de internationale valideringsundersøgelser koordineret af Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (18) (19) (20) (21) (22) og rapporterne fra den internationale workshop vedrørende testning for genotoksicitet (4) (16). De tilgængelige data er desuden blevet revurderet i forbindelse med en retrospektiv weight-of-evidence-undersøgelse gennemført af Det Europæiske Center for Validering af Alternative Metoder (ECVAM) under Europa-Kommissionen, og ECVAM's videnskabelige rådgivende udvalg (ESAC) har godkendt testmetoden som videnskabeligt underbygget (32) (33) (34). Anvendelsen af den humane lymfoblastcellelinje TK6 (35), HepG2-celler (36) (37) og primære embryoceller fra syrisk hamster (38) er blevet beskrevet, selv om de ikke er blevet anvendt i valideringsundersøgelser. |
| --- | --- |

5.

MNvit-assayet er solid og effektiv til en lang række celletyper og til påvisning af forekomsten eller fraværet af cytoB. Der findes omfattende data, der påviser gyldigheden af MNvit-assayet, hvor der anvendes forskellige cellelinjer fra gnavere (CHO, V79, CHL/IU ogL5178Y) og humane lymfocytter (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31), herunder navnlig de internationale valideringsundersøgelser koordineret af Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (18) (19) (20) (21) (22) og rapporterne fra den internationale workshop vedrørende testning for genotoksicitet (4) (16). De tilgængelige data er desuden blevet revurderet i forbindelse med en retrospektiv weight-of-evidence-undersøgelse gennemført af Det Europæiske Center for Validering af Alternative Metoder (ECVAM) under Europa-Kommissionen, og ECVAM's videnskabelige rådgivende udvalg (ESAC) har godkendt testmetoden som videnskabeligt underbygget (32) (33) (34). Anvendelsen af den humane lymfoblastcellelinje TK6 (35), HepG2-celler (36) (37) og primære embryoceller fra syrisk hamster (38) er blevet beskrevet, selv om de ikke er blevet anvendt i valideringsundersøgelser.

DEFINITIONER

| 6. | De anvendte definitioner er forklaret i tillæg 1. |
| --- | --- |

6.

De anvendte definitioner er forklaret i tillæg 1.

INDLEDENDE OVERVEJELSER

| 7. | Normalt kræver en in vitro-test, at der benyttes en eksogen metabolisk aktivering, medmindre cellerne er metabolisk kompetente i forhold til teststoffet. Metabolismeaktiveringssystemet efterligner ikke fuldstændigt in vivo-forholdene. Man må desuden omhyggeligt undgå betingelser, som fører til et artefakt positivt resultat, der ikke skyldes selve mutageniciteten, men kan være forårsaget af faktorer som væsentlige ændringer i pH eller osmolalitet eller af høj cytotoksicitet (39) (40) (41). Hvis et testkemikalie forårsager en pH-ændring af mediet på tilsætningstidspunktet, skal pH justeres, helst ved buffering af stamopløsningen, således at alle voluminer ved alle testkoncentrationer og for alle kontrolprøver forbliver de samme. |
| --- | --- |

7.

Normalt kræver en in vitro-test, at der benyttes en eksogen metabolisk aktivering, medmindre cellerne er metabolisk kompetente i forhold til teststoffet. Metabolismeaktiveringssystemet efterligner ikke fuldstændigt in vivo-forholdene. Man må desuden omhyggeligt undgå betingelser, som fører til et artefakt positivt resultat, der ikke skyldes selve mutageniciteten, men kan være forårsaget af faktorer som væsentlige ændringer i pH eller osmolalitet eller af høj cytotoksicitet (39) (40) (41). Hvis et testkemikalie forårsager en pH-ændring af mediet på tilsætningstidspunktet, skal pH justeres, helst ved buffering af stamopløsningen, således at alle voluminer ved alle testkoncentrationer og for alle kontrolprøver forbliver de samme.

| 8. | Ved analyse af induktion af mikrokerner er det afgørende, at både behandlede og ubehandlede kulturer har undergået mitose. Den mest informative fase for bedømmelse af mikrokerner er i celler, som har afsluttet mitosen under eller efter behandling med teststoffet. |
| --- | --- |

8.

Ved analyse af induktion af mikrokerner er det afgørende, at både behandlede og ubehandlede kulturer har undergået mitose. Den mest informative fase for bedømmelse af mikrokerner er i celler, som har afsluttet mitosen under eller efter behandling med teststoffet.

TESTPRINCIPPET

| 9. | Cellekulturer fra mennesker eller pattedyr eksponeres for teststoffet både med og uden en eksogen metabolisk aktivering, medmindre der anvendes celler med en tilstrækkelig metaboliseringsevne. I alle forsøg medtages sideløbende positive kontrolprøver (PC) og kontrolprøver med opløsningsmiddel/bærestof (VC). |
| --- | --- |

9.

Cellekulturer fra mennesker eller pattedyr eksponeres for teststoffet både med og uden en eksogen metabolisk aktivering, medmindre der anvendes celler med en tilstrækkelig metaboliseringsevne. I alle forsøg medtages sideløbende positive kontrolprøver (PC) og kontrolprøver med opløsningsmiddel/bærestof (VC).

| 10. | Under eller efter eksponering for teststoffet dyrkes cellerne i tilstrækkelig lang tid til, at kromosom- eller tentrådsskade medfører dannelse af mikrokerner i interfaseceller. Ved induktion af aneuploidi skal teststoffet normalt være til stede under mitosen. Høstede og farvede interfaseceller analyseres for tilstedeværelse af mikrokerner. Ideelt set bør mikrokerner kun bedømmes i celler, som har afsluttet mitosen under eksponering for teststoffet eller i påkommende tilfælde i perioden efter eksponering. I kulturer, som er blevet behandlet med et cytokineseblokerende stof, gøres dette ved kun at bedømme binukleære celler. Såfremt der ikke anvendes et cytokineseblokerende stof, er det vigtigt at påvise, at det er sandsynligt, at de analyserede celler er blevet delt under eller efter eksponering for teststoffet. For alle protokoller er det vigtigt at påvise, at der er sket celleproliferation i både kontrolkulturerne og de behandlede kulturer, og omfanget af den teststofinducerede cytotoksicitet eller cytostase skal vurderes i kulturerne (eller i parallelle kulturer), som bedømmes for forekomst af mikrokerner. |
| --- | --- |

10.

Under eller efter eksponering for teststoffet dyrkes cellerne i tilstrækkelig lang tid til, at kromosom- eller tentrådsskade medfører dannelse af mikrokerner i interfaseceller. Ved induktion af aneuploidi skal teststoffet normalt være til stede under mitosen. Høstede og farvede interfaseceller analyseres for tilstedeværelse af mikrokerner. Ideelt set bør mikrokerner kun bedømmes i celler, som har afsluttet mitosen under eksponering for teststoffet eller i påkommende tilfælde i perioden efter eksponering. I kulturer, som er blevet behandlet med et cytokineseblokerende stof, gøres dette ved kun at bedømme binukleære celler. Såfremt der ikke anvendes et cytokineseblokerende stof, er det vigtigt at påvise, at det er sandsynligt, at de analyserede celler er blevet delt under eller efter eksponering for teststoffet. For alle protokoller er det vigtigt at påvise, at der er sket celleproliferation i både kontrolkulturerne og de behandlede kulturer, og omfanget af den teststofinducerede cytotoksicitet eller cytostase skal vurderes i kulturerne (eller i parallelle kulturer), som bedømmes for forekomst af mikrokerner.

BESKRIVELSE AF ASSAYET

Præparater

Præparater

| 11. | Der kan anvendes dyrkede primære perifere blodlymfocytter fra det perifere blod hos mennesker (5) (19) (42) (43) og en række cellelinjer fra gnavere såsom CHO, V79, CHL/IU, og L5178Y-celler (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). Anvendelsen af andre cellelinjer og -typer skal være baseret på dokumenteret ydeevne i assayet som beskrevet i afsnittet om acceptkriterier. Da baggrundsforekomsten af mikrokerner vil påvirke assayets følsomhed, anbefales det, at der anvendes celletyper med en lav, stabil baggrundsforekomst af mikrokernedannelse. |
| --- | --- |

11.

Der kan anvendes dyrkede primære perifere blodlymfocytter fra det perifere blod hos mennesker (5) (19) (42) (43) og en række cellelinjer fra gnavere såsom CHO, V79, CHL/IU, og L5178Y-celler (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). Anvendelsen af andre cellelinjer og -typer skal være baseret på dokumenteret ydeevne i assayet som beskrevet i afsnittet om acceptkriterier. Da baggrundsforekomsten af mikrokerner vil påvirke assayets følsomhed, anbefales det, at der anvendes celletyper med en lav, stabil baggrundsforekomst af mikrokernedannelse.

| 12. | Perifere humane blodlymfocytter skal udtages fra unge (ca. 18-35 år), sunde, ikkerygende personer uden nylige kendte eksponeringer for genotoksiske kemikalier eller bestråling. Hvis celler fra mere end en doner pooles, skal antallet af donorer angives. Mikrokerneforekomsten forøges med alderen, og denne udvikling er mere markant hos kvinder end hos mænd (44), og der skal tages i betragtning ved udvælgelsen af donorceller til pooling. |
| --- | --- |

12.

Perifere humane blodlymfocytter skal udtages fra unge (ca. 18-35 år), sunde, ikkerygende personer uden nylige kendte eksponeringer for genotoksiske kemikalier eller bestråling. Hvis celler fra mere end en doner pooles, skal antallet af donorer angives. Mikrokerneforekomsten forøges med alderen, og denne udvikling er mere markant hos kvinder end hos mænd (44), og der skal tages i betragtning ved udvælgelsen af donorceller til pooling.

Medier og dyrkningsbetingelser

| 13. | Til vedligeholdelse af kulturerne benyttes der egnede dyrkningssubstrater og inkuberingsbetingelser (dyrkningsflasker, CO2-koncentration, temperatur og fugtighed). Etablerede cellelinjer og -stammer kontrolleres regelmæssigt for stabilt normalt kromosomtal og mykoplasmakontaminering, og i tilfælde af kontaminering, eller hvis det normale kromosomtal har ændret sig, anvendes kulturen ikke. Cellernes normale cykluslængde og dyrkningsbetingelserne i laboratoriet skal være kendt. Ved anvendelse af cytokineseblokeringsmetoden skal koncentrationen af cytokineseinhibitoren optimeres for den særlige celletype og påvise et godt udbytte af binukleære celler til bedømmelse. |
| --- | --- |

13.

Til vedligeholdelse af kulturerne benyttes der egnede dyrkningssubstrater og inkuberingsbetingelser (dyrkningsflasker, CO2-koncentration, temperatur og fugtighed). Etablerede cellelinjer og -stammer kontrolleres regelmæssigt for stabilt normalt kromosomtal og mykoplasmakontaminering, og i tilfælde af kontaminering, eller hvis det normale kromosomtal har ændret sig, anvendes kulturen ikke. Cellernes normale cykluslængde og dyrkningsbetingelserne i laboratoriet skal være kendt. Ved anvendelse af cytokineseblokeringsmetoden skal koncentrationen af cytokineseinhibitoren optimeres for den særlige celletype og påvise et godt udbytte af binukleære celler til bedømmelse.

2

Fremstilling af kulturer

| 14. | Etablerede cellelinjer og -stammer: Celler udtages fra stamkulturer og udsås i dyrkningssubstrat med en sådan tæthed, at kulturerne ikke flyder sammen inden høst, og inkuberes ved 37 °C. |
| --- | --- |

14.

Etablerede cellelinjer og -stammer: Celler udtages fra stamkulturer og udsås i dyrkningssubstrat med en sådan tæthed, at kulturerne ikke flyder sammen inden høst, og inkuberes ved 37 °C.

| 15. | Lymfocytter: Fuldblod, der er behandlet med antikoaguleringsmiddel (f.eks. heparin), eller fraseparerede lymfocytter dyrkes i substratet, der indeholder et mitogen, f.eks. phytohæmagglutinin (PHA), inden eksponering for teststoffet og cytoB. |
| --- | --- |

15.

Lymfocytter: Fuldblod, der er behandlet med antikoaguleringsmiddel (f.eks. heparin), eller fraseparerede lymfocytter dyrkes i substratet, der indeholder et mitogen, f.eks. phytohæmagglutinin (PHA), inden eksponering for teststoffet og cytoB.

Metabolisk aktivering

| 16. | Eksogene metaboliserende systemer skal anvendes, når der gøres brug af celler med utilstrækkelige endogene metaboliske egenskaber. Det mest almindeligt anvendte system er en cofaktorsuppleret postmitokondriefraktion (S9), der fremstilles af levere fra rotter, der har været behandlet med enzyminducerende stoffer såsom Aroclor 1254 (45) (46) eller en blanding af phenobarbiton og β-naphthoflavon (46) (47) (48) (49). Den sidstnævnte blanding er ikke i strid med Stockholmkonventionen om persistente organiske miljøgifte (50) og forordning (EF) nr. 850/2004 om persistente organiske miljøgifte (66) og har vist sig at være lige så effektiv som Aroclor 1254 til induktion af oxidaser med blandet funktion (46) (47) (48) (49). S9-fraktionen anvendes normalt i en koncentration på 1-10 % (v/v) i det færdige testsubstrat. Et metabolismeaktiveringssystems beskaffenhed kan afhænge af, hvilken kemisk klasse teststoffet tilhører, og i nogle tilfælde vil det være hensigtsmæssigt at benytte mere end én S9-koncentration. |
| --- | --- |

16.

Eksogene metaboliserende systemer skal anvendes, når der gøres brug af celler med utilstrækkelige endogene metaboliske egenskaber. Det mest almindeligt anvendte system er en cofaktorsuppleret postmitokondriefraktion (S9), der fremstilles af levere fra rotter, der har været behandlet med enzyminducerende stoffer såsom Aroclor 1254 (45) (46) eller en blanding af phenobarbiton og β-naphthoflavon (46) (47) (48) (49). Den sidstnævnte blanding er ikke i strid med Stockholmkonventionen om persistente organiske miljøgifte (50) og forordning (EF) nr. 850/2004 om persistente organiske miljøgifte (66) og har vist sig at være lige så effektiv som Aroclor 1254 til induktion af oxidaser med blandet funktion (46) (47) (48) (49). S9-fraktionen anvendes normalt i en koncentration på 1-10 % (v/v) i det færdige testsubstrat. Et metabolismeaktiveringssystems beskaffenhed kan afhænge af, hvilken kemisk klasse teststoffet tilhører, og i nogle tilfælde vil det være hensigtsmæssigt at benytte mere end én S9-koncentration.

| 17. | Genetisk konstruerede cellelinjer, der udtrykker specifikke aktiverende enzymer fra mennesker eller gnavere, kan fjerne behovet for et eksogen metabolisk aktiveringssystem og kan anvendes som testceller. I disse tilfælde skal valget af en bestemt cellelinje begrundes sagligt f.eks. ved, at oxidaserne med blandet funktion er relevante for teststoffets metabolisme (51), og at de er følsomme over for kendte klastogener og aneugener (se særskilt afsnit om acceptkriterier). Man skal være opmærksom på, at teststoffet ikke altid metaboliseres af de(n) udtrykte oxidase(r) med blandet funktion. I dette tilfælde indebærer negative testresultater ikke, at teststoffet ikke kan fremkalde mikrokerner. |
| --- | --- |

17.

Genetisk konstruerede cellelinjer, der udtrykker specifikke aktiverende enzymer fra mennesker eller gnavere, kan fjerne behovet for et eksogen metabolisk aktiveringssystem og kan anvendes som testceller. I disse tilfælde skal valget af en bestemt cellelinje begrundes sagligt f.eks. ved, at oxidaserne med blandet funktion er relevante for teststoffets metabolisme (51), og at de er følsomme over for kendte klastogener og aneugener (se særskilt afsnit om acceptkriterier). Man skal være opmærksom på, at teststoffet ikke altid metaboliseres af de(n) udtrykte oxidase(r) med blandet funktion. I dette tilfælde indebærer negative testresultater ikke, at teststoffet ikke kan fremkalde mikrokerner.

Fremstilling af teststof

| 18. | Testkemikalier i fast form opløses eller opslæmmes i passende opløsningsmidler eller bærestoffer og fortyndes eventuelt inden behandling af cellerne. Testkemikalier i væskeform kan enten tilsættes direkte til testsystemet og/eller fortyndes inden behandlingen. Gasser og flygtige stoffer skal testes ved passende modifikation af standardprotokollerne, f.eks. i forseglede dyrkningsflasker (52) (53). Der benyttes frisk fremstillede teststofpræparater, medmindre stabilitetsdata viser, at opbevaring er acceptabel. |
| --- | --- |

18.

Testkemikalier i fast form opløses eller opslæmmes i passende opløsningsmidler eller bærestoffer og fortyndes eventuelt inden behandling af cellerne. Testkemikalier i væskeform kan enten tilsættes direkte til testsystemet og/eller fortyndes inden behandlingen. Gasser og flygtige stoffer skal testes ved passende modifikation af standardprotokollerne, f.eks. i forseglede dyrkningsflasker (52) (53). Der benyttes frisk fremstillede teststofpræparater, medmindre stabilitetsdata viser, at opbevaring er acceptabel.

Testbetingelser

Testbetingelser

Opløsningsmidler/bærestoffer

| 19. | Opløsningsmidlet/bærestoffet må ikke reagere med teststoffet eller hæmme cellernes overlevelse eller S9-aktiviteten ved den anvendte koncentration. Benyttes der andre opløsningsmidler/bærestoffer end de velkendte (f.eks. vand, dyrkningssubstrat, dimethylsulfoxid), skal brugen af dem underbygges med data, der viser deres kompatibilitet med teststoffet og fraværet af genetisk toksicitet. Det anbefales i videst muligt omfang først at forsøge at benytte et vandigt opløsningsmiddel/bærestofsystem. |
| --- | --- |

19.

Opløsningsmidlet/bærestoffet må ikke reagere med teststoffet eller hæmme cellernes overlevelse eller S9-aktiviteten ved den anvendte koncentration. Benyttes der andre opløsningsmidler/bærestoffer end de velkendte (f.eks. vand, dyrkningssubstrat, dimethylsulfoxid), skal brugen af dem underbygges med data, der viser deres kompatibilitet med teststoffet og fraværet af genetisk toksicitet. Det anbefales i videst muligt omfang først at forsøge at benytte et vandigt opløsningsmiddel/bærestofsystem.

Anvendelse af cytoB som cytokineseblokerende stof

| 20. | Et af de vigtigste aspekter i forbindelse med MNvit-assayet er at sikre, at de bedømte celler har afsluttet mitosen under behandlingen eller i påkommende tilfælde i inkubationsperioden efter behandlingen. CytoB har været det mest anvendte stof til at hæmme cytokinese, da det hæmmer samlingen af aktin og således forhindrer deling af datterceller efter mitose, hvilket resulterer i dannelsen af binukleære celler (5) (54) (55). Bedømmelsen af mikrokerne kan således begrænses til celler, der har undergået mitose under eller efter behandling. Teststoffets indvirkning på celleproliferationens kinetik kan måles samtidigt. CytoB bør anvendes som cytokineseblokerende stof, når der gøres brug af humane lymfocytter, da cellecykluslængder varierer inden for kulturer og mellem donorer, og da det ikke er alle lymfocytter, der reagerer på PHA. Der har været anvendt andre metoder ved test af cellelinjer for at bestemme, om de bedømte celler har delt sig (se punkt 26). |
| --- | --- |

20.

Et af de vigtigste aspekter i forbindelse med MNvit-assayet er at sikre, at de bedømte celler har afsluttet mitosen under behandlingen eller i påkommende tilfælde i inkubationsperioden efter behandlingen. CytoB har været det mest anvendte stof til at hæmme cytokinese, da det hæmmer samlingen af aktin og således forhindrer deling af datterceller efter mitose, hvilket resulterer i dannelsen af binukleære celler (5) (54) (55). Bedømmelsen af mikrokerne kan således begrænses til celler, der har undergået mitose under eller efter behandling. Teststoffets indvirkning på celleproliferationens kinetik kan måles samtidigt. CytoB bør anvendes som cytokineseblokerende stof, når der gøres brug af humane lymfocytter, da cellecykluslængder varierer inden for kulturer og mellem donorer, og da det ikke er alle lymfocytter, der reagerer på PHA. Der har været anvendt andre metoder ved test af cellelinjer for at bestemme, om de bedømte celler har delt sig (se punkt 26).

| 21. | Laboratoriet skal vælge den passende koncentration af cytoB for hver celletype for at opnå den optimale forekomst af binukleære celler i kontrolkulturerne med opløsningsmiddel/bærestof. Den passende koncentration af cytoB ligger normalt mellem 3 og 6 μg/ml. |
| --- | --- |

21.

Laboratoriet skal vælge den passende koncentration af cytoB for hver celletype for at opnå den optimale forekomst af binukleære celler i kontrolkulturerne med opløsningsmiddel/bærestof. Den passende koncentration af cytoB ligger normalt mellem 3 og 6 μg/ml.

Måling af celleproliferation og cytotoksicitet og valg af eksponeringskoncentrationer

| 22. | Ved valg af højeste koncentration af teststoffet, der skal testes, bør man undgå koncentrationer, der kan frembringe artefakt positiv respons, f.eks. koncentrationer, der frembringer for høj cytotoksicitet, udfældning i et dyrkningssubstrat og væsentlige ændringer i pH eller osmolalitet (39) (40) (41). |
| --- | --- |

22.

Ved valg af højeste koncentration af teststoffet, der skal testes, bør man undgå koncentrationer, der kan frembringe artefakt positiv respons, f.eks. koncentrationer, der frembringer for høj cytotoksicitet, udfældning i et dyrkningssubstrat og væsentlige ændringer i pH eller osmolalitet (39) (40) (41).

| 23. | Målinger af celleproliferation foretages for at sikre, at de behandlede celler har undergået mitose under assayet, og at behandlingerne udføres med passende cytotoksicitet (se punkt 29). Cytotoksiciteten bestemmes med og uden metabolisk aktivering i celler, der kræver metabolisk aktivering, ved hjælp af relativ forøgelse af celletal (RICC) eller relativ populationsfordobling (RPD) (se formlerne i tillæg 2), medmindre cytoB anvendes. Ved anvendelse af cytoB kan cytotoksiciteten bestemmes ved hjælp af replikationsindekset (RI) (se formlen i tillæg 2). |
| --- | --- |

23.

Målinger af celleproliferation foretages for at sikre, at de behandlede celler har undergået mitose under assayet, og at behandlingerne udføres med passende cytotoksicitet (se punkt 29). Cytotoksiciteten bestemmes med og uden metabolisk aktivering i celler, der kræver metabolisk aktivering, ved hjælp af relativ forøgelse af celletal (RICC) eller relativ populationsfordobling (RPD) (se formlerne i tillæg 2), medmindre cytoB anvendes. Ved anvendelse af cytoB kan cytotoksiciteten bestemmes ved hjælp af replikationsindekset (RI) (se formlen i tillæg 2).

| 24. | Behandling af kulturer med cytoB og måling af de relative forekomster af mononukleære, binukleære og multinukleære celler i kulturen er en nøjagtig metode til kvantificering af indvirkningen på celleproliferationen og en behandlings cytotoksiske eller cytostatiske virkning (5) og sikrer, at der udelukkende bedømmes celler, som delte sig under eller efter behandling. |
| --- | --- |

24.

Behandling af kulturer med cytoB og måling af de relative forekomster af mononukleære, binukleære og multinukleære celler i kulturen er en nøjagtig metode til kvantificering af indvirkningen på celleproliferationen og en behandlings cytotoksiske eller cytostatiske virkning (5) og sikrer, at der udelukkende bedømmes celler, som delte sig under eller efter behandling.

| 25. | I undersøgelser med cytoB kan cytostase/cytotoksicitet kvantificeres ved hjælp af proliferationsindekset for cytokineseblokerende stof (CBPI) (5) (26) (56) eller udledes af RI fra mindst 500 celler pr. kultur (se formlerne i tillæg 2). Når cytoB anvendes til vurdering af celleproliferationen, bestemmes CBPI eller RI ud fra mindst 500 celler pr. kultur. Disse målinger kan indgå i vurderingen af cytotoksiciteten ved at sammenligne værdier i de behandlede kulturer og kontrolkulturerne. Vurdering af andre cytotoksicitetsmarkører (f.eks. konfluens, celleantal, apoptose, nekrose, antal metafaser) kan give nyttige oplysninger. |
| --- | --- |

25.

I undersøgelser med cytoB kan cytostase/cytotoksicitet kvantificeres ved hjælp af proliferationsindekset for cytokineseblokerende stof (CBPI) (5) (26) (56) eller udledes af RI fra mindst 500 celler pr. kultur (se formlerne i tillæg 2). Når cytoB anvendes til vurdering af celleproliferationen, bestemmes CBPI eller RI ud fra mindst 500 celler pr. kultur. Disse målinger kan indgå i vurderingen af cytotoksiciteten ved at sammenligne værdier i de behandlede kulturer og kontrolkulturerne. Vurdering af andre cytotoksicitetsmarkører (f.eks. konfluens, celleantal, apoptose, nekrose, antal metafaser) kan give nyttige oplysninger.

| 26. | I undersøgelser uden cytoB er det nødvendigt at påvise, at de bedømte celler i kulturen er blevet delt under eller efter behandling med teststoffet, idet der i modsat fald kan fremkaldes et falsk negativt respons. De metoder, der er blevet anvendt til at sikre, at de celler, som bedømmes, har delt sig, omfatter inkorporering og efterfølgende påvisning af bromdeoxyuridin (BrdU) til identifikation af celler, der har replikeret sig (57), dannelse af kloner, når celler fra etablerede cellelinjer behandles og bedømmes in situ på et mikroskopobjektglas (proliferationsindeks (PI)) (25) (26) (27) (28), eller måling af relativ populationsfordobling (RPD) eller relativ forøgelse af celletal (RICC) eller andre påviste metoder (16) (56) (58) (59) (se formlerne i tillæg 2). Vurdering af andre cytotoksicitets- eller cytostasemarkører (f.eks. konfluens, celleantal, apoptose, nekrose, antal metafaser) kan give nyttige oplysninger. |
| --- | --- |

26.

I undersøgelser uden cytoB er det nødvendigt at påvise, at de bedømte celler i kulturen er blevet delt under eller efter behandling med teststoffet, idet der i modsat fald kan fremkaldes et falsk negativt respons. De metoder, der er blevet anvendt til at sikre, at de celler, som bedømmes, har delt sig, omfatter inkorporering og efterfølgende påvisning af bromdeoxyuridin (BrdU) til identifikation af celler, der har replikeret sig (57), dannelse af kloner, når celler fra etablerede cellelinjer behandles og bedømmes in situ på et mikroskopobjektglas (proliferationsindeks (PI)) (25) (26) (27) (28), eller måling af relativ populationsfordobling (RPD) eller relativ forøgelse af celletal (RICC) eller andre påviste metoder (16) (56) (58) (59) (se formlerne i tillæg 2). Vurdering af andre cytotoksicitets- eller cytostasemarkører (f.eks. konfluens, celleantal, apoptose, nekrose, antal metafaser) kan give nyttige oplysninger.

| 27. | Der benyttes mindst tre analyserbare testkoncentrationer. For at opnå dette kan det være nødvendigt at udføre forsøget med et større antal koncentrationer med tætte intervaller og analysere mikrokernedannelsen i disse koncentrationer med passende cytotoksicitet. En alternativ strategi er at udføre en indledende cytotoksicitetstest for at indsnævre koncentrationsområdet for den endelige test. |
| --- | --- |

27.

Der benyttes mindst tre analyserbare testkoncentrationer. For at opnå dette kan det være nødvendigt at udføre forsøget med et større antal koncentrationer med tætte intervaller og analysere mikrokernedannelsen i disse koncentrationer med passende cytotoksicitet. En alternativ strategi er at udføre en indledende cytotoksicitetstest for at indsnævre koncentrationsområdet for den endelige test.

| 28. | Den højeste koncentration bør frembringe en cytotoksicitet på 55 ± 5 %. Højere niveauer kan inducere kromosomskade som en bivirkning af cytotoksicitet (60). Hvis der er tale om cytotoksicitet, skal de valgte koncentrationer dække et interval fra det, der frembringer en cytotoksicitet på 55 ± 5 %, til ringe eller ingen cytotoksicitet. |
| --- | --- |

28.

Den højeste koncentration bør frembringe en cytotoksicitet på 55 ± 5 %. Højere niveauer kan inducere kromosomskade som en bivirkning af cytotoksicitet (60). Hvis der er tale om cytotoksicitet, skal de valgte koncentrationer dække et interval fra det, der frembringer en cytotoksicitet på 55 ± 5 %, til ringe eller ingen cytotoksicitet.

| 29. | Hvis der ikke observeres cytotoksicitet eller bundfald, må testkoncentrationen højst være 0,01 M, 5 mg/ml eller 5 μl/ml (den laveste af de tre). De valgte koncentrationer til analyse skal generelt adskilles med en spredning på højst 10. I forbindelse med teststoffer med en stejl koncentrations-responskurv kan det være nødvendigt at mindske spredningen af teststofkoncentrationerne, således at kulturer med moderat og lav toksicitet også bedømmes. |
| --- | --- |

29.

Hvis der ikke observeres cytotoksicitet eller bundfald, må testkoncentrationen højst være 0,01 M, 5 mg/ml eller 5 μl/ml (den laveste af de tre). De valgte koncentrationer til analyse skal generelt adskilles med en spredning på højst 10. I forbindelse med teststoffer med en stejl koncentrations-responskurv kan det være nødvendigt at mindske spredningen af teststofkoncentrationerne, således at kulturer med moderat og lav toksicitet også bedømmes.

| 30. | Når opløselighed er en begrænsende faktor, skal den højeste koncentration, hvis den ikke er begrænset af cytotoksicitet, være den laveste koncentration med synlig udfældning i kulturer, forudsat at bundfaldet ikke har indflydelse på bedømmelsen. Evalueringen af udfældningen foretages ved hjælp af metoder som lysmikroskopi, og vedvarende bundfald eller bundfald, der fremkommer under dyrkningen (efter behandlingens afslutning), noteres. |
| --- | --- |

30.

Når opløselighed er en begrænsende faktor, skal den højeste koncentration, hvis den ikke er begrænset af cytotoksicitet, være den laveste koncentration med synlig udfældning i kulturer, forudsat at bundfaldet ikke har indflydelse på bedømmelsen. Evalueringen af udfældningen foretages ved hjælp af metoder som lysmikroskopi, og vedvarende bundfald eller bundfald, der fremkommer under dyrkningen (efter behandlingens afslutning), noteres.

Kontrolprøver

| 31. | Der foretages sideløbende positive kontrolprøver og kontrolprøver med opløsningsmiddel/bærestof med og uden metabolisk aktivering i hvert forsøg. |
| --- | --- |

31.

Der foretages sideløbende positive kontrolprøver og kontrolprøver med opløsningsmiddel/bærestof med og uden metabolisk aktivering i hvert forsøg.

| 32. | Positive kontrolprøver anvendes til at påvise de anvendte cellers og testprotokollens evne til at identificere klastogener og aneugener og til at bekræfte S9-blandingens metaboliske egenskaber. I positive kontrolprøver benyttes kendte induktorer af mikrokernedannelse i koncentrationer, der forventes at give små, men reproducerbare forøgelser i forhold til baggrundsværdierne, hvorved testsystemets følsomhed godtgøres. Der vælges sådanne koncentrationer i de positive kontrolprøver, at virkningerne er tydelige, uden dog at de kodede objektglas' identitet umiddelbart afsløres for den, der aflæser dem. |
| --- | --- |

32.

Positive kontrolprøver anvendes til at påvise de anvendte cellers og testprotokollens evne til at identificere klastogener og aneugener og til at bekræfte S9-blandingens metaboliske egenskaber. I positive kontrolprøver benyttes kendte induktorer af mikrokernedannelse i koncentrationer, der forventes at give små, men reproducerbare forøgelser i forhold til baggrundsværdierne, hvorved testsystemets følsomhed godtgøres. Der vælges sådanne koncentrationer i de positive kontrolprøver, at virkningerne er tydelige, uden dog at de kodede objektglas' identitet umiddelbart afsløres for den, der aflæser dem.

| 33. | Et klastogen, der kræver metabolisk aktivering (f.eks. cyclofosfamid, enzo[a]pyren), anvendes til påvisning af den metaboliske evne og testsystemets evne til at påvise klastogener. Andre positive kontrolprøver kan anvendes, hvis der er grund til det. Da nogle positive kontrolprøver, som kræver metabolisk aktivering, kan være aktive uden eksogen metabolisk aktivering i visse behandlingssituationer eller i visse cellelinjer, skal behovet for metabolisk aktivering og S9-blandingens aktivitet testes i de valgte cellelinjer og ved de valgte koncentrationer. |
| --- | --- |

33.

Et klastogen, der kræver metabolisk aktivering (f.eks. cyclofosfamid, enzo[a]pyren), anvendes til påvisning af den metaboliske evne og testsystemets evne til at påvise klastogener. Andre positive kontrolprøver kan anvendes, hvis der er grund til det. Da nogle positive kontrolprøver, som kræver metabolisk aktivering, kan være aktive uden eksogen metabolisk aktivering i visse behandlingssituationer eller i visse cellelinjer, skal behovet for metabolisk aktivering og S9-blandingens aktivitet testes i de valgte cellelinjer og ved de valgte koncentrationer.

| 34. | For indeværende er der ingen kendte aneugener, som kræver metabolisk aktivering for at bedømme deres gentoksiske virkninger (16). Positive kontrolprøver til påvisning af aneugen aktivitet, der accepteres i dag, er f.eks. colchicin og vinblastin. Der kan anvendes andre kemikalier, hvis de udelukkende eller primært inducerer mikrokerner gennem aneugen aktivitet. For at undgå behovet for to positive kontrolprøver (for klastogenicitet og aneugenicitet) uden metabolisk aktivering kan aneugenicitetskontrollen fungere som positiv kontrolprøve uden S9, og klastogenicitetskontrollen kan anvendes til at teste tilstrækkeligheden af det anvendte metaboliske aktiveringssystem. Positive kontrolprøver for både klastogenicitet og aneugenicitet skal anvendes i celler, som ikke kræver S9. Anbefalede positive kontrolprøver er angivet i tillæg 3. |
| --- | --- |

34.

For indeværende er der ingen kendte aneugener, som kræver metabolisk aktivering for at bedømme deres gentoksiske virkninger (16). Positive kontrolprøver til påvisning af aneugen aktivitet, der accepteres i dag, er f.eks. colchicin og vinblastin. Der kan anvendes andre kemikalier, hvis de udelukkende eller primært inducerer mikrokerner gennem aneugen aktivitet. For at undgå behovet for to positive kontrolprøver (for klastogenicitet og aneugenicitet) uden metabolisk aktivering kan aneugenicitetskontrollen fungere som positiv kontrolprøve uden S9, og klastogenicitetskontrollen kan anvendes til at teste tilstrækkeligheden af det anvendte metaboliske aktiveringssystem. Positive kontrolprøver for både klastogenicitet og aneugenicitet skal anvendes i celler, som ikke kræver S9. Anbefalede positive kontrolprøver er angivet i tillæg 3.

| 35. | Hvis der er mulighed for det, bør der anvendes kemisk beslægtede positive kontrolstoffer. Alle anvendte positive kontrolstoffer skal være egnet for celletypen og aktiveringsforholdene. |
| --- | --- |

35.

Hvis der er mulighed for det, bør der anvendes kemisk beslægtede positive kontrolstoffer. Alle anvendte positive kontrolstoffer skal være egnet for celletypen og aktiveringsforholdene.

| 36. | Der skal i hver høst indgå negative (opløsningsmiddel eller bærestof) kontrolprøver. Desuden skal der anvendes ubehandlede negative kontrolprøver (uden opløsningsmiddel/bærestof), medmindre der foreligger offentliggjorte eller historiske kontroldata fra laboratorieforsøg, der viser, at det valgte opløsningsmiddel ved de anvendte koncentrationer ikke har nogen genotoksiske eller andre skadelige virkninger. |
| --- | --- |

36.

Der skal i hver høst indgå negative (opløsningsmiddel eller bærestof) kontrolprøver. Desuden skal der anvendes ubehandlede negative kontrolprøver (uden opløsningsmiddel/bærestof), medmindre der foreligger offentliggjorte eller historiske kontroldata fra laboratorieforsøg, der viser, at det valgte opløsningsmiddel ved de anvendte koncentrationer ikke har nogen genotoksiske eller andre skadelige virkninger.

TESTPROCEDURE

Behandlingsplan

Behandlingsplan

| 37. | For at maksimere sandsynligheden for at påvise aneugeners eller klastogeners aktivitet i en bestemt fase i cellecyklussen er det vigtigt, at et tilstrækkeligt antal celler behandles med teststoffet i alle cellecyklussens faser. Behandlingsplanen for cellelinjer og primære cellekulturer kan derfor være forskellig fra behandlingsplanen for lymfocytter, der kræver stimulering med mitogen for at sætte cellecyklussen i gang, og disse behandles i punkt 41-43 (16). |
| --- | --- |

37.

For at maksimere sandsynligheden for at påvise aneugeners eller klastogeners aktivitet i en bestemt fase i cellecyklussen er det vigtigt, at et tilstrækkeligt antal celler behandles med teststoffet i alle cellecyklussens faser. Behandlingsplanen for cellelinjer og primære cellekulturer kan derfor være forskellig fra behandlingsplanen for lymfocytter, der kræver stimulering med mitogen for at sætte cellecyklussen i gang, og disse behandles i punkt 41-43 (16).

| 38. | Teoretiske overvejelser og offentliggjorte data (18) viser, at de fleste aneugener og klastogener vil blive påvist efter en kortvarig behandlingsperiode på 3-6 timer med eller uden tilsætning af S9, efterfølgende fjernelse af teststoffet og en vækstperiode på 1,5-2 gange en normal cellecyklus (6). Cellerne udtages efter et tidsrum, der svarer til ca. 1,5-2 gange den normale (dvs. ubehandlede) cellecykluslængde, regnet fra behandlingens start eller afslutning (se tabel 1). Prøveudtagnings- og restitutionsperioden kan udvides, hvis man ved eller har mistanke om, at teststoffet påvirker cellecykluslængden (f.eks. ved test af nucleosidanaloger). |
| --- | --- |

38.

Teoretiske overvejelser og offentliggjorte data (18) viser, at de fleste aneugener og klastogener vil blive påvist efter en kortvarig behandlingsperiode på 3-6 timer med eller uden tilsætning af S9, efterfølgende fjernelse af teststoffet og en vækstperiode på 1,5-2 gange en normal cellecyklus (6). Cellerne udtages efter et tidsrum, der svarer til ca. 1,5-2 gange den normale (dvs. ubehandlede) cellecykluslængde, regnet fra behandlingens start eller afslutning (se tabel 1). Prøveudtagnings- og restitutionsperioden kan udvides, hvis man ved eller har mistanke om, at teststoffet påvirker cellecykluslængden (f.eks. ved test af nucleosidanaloger).

| 39. | På grund af den potentielle cytotoksiske virkning af S9-blandinger til dyrkede pattedyrceller udvides eksponeringsperioden til at dække 1,5-2 gange en normal cellecyklus uden tilsætning af S9. Udvides eksponeringsperioden er der flere muligheder for behandling af cellerne med testkemikaliet uden og med tilsætning af cytoB. Med disse valgmuligheder tages der højde for situationer, der kan give anledning til bekymring over risikoen for interaktion mellem teststoffet og cytoB. |
| --- | --- |

39.

På grund af den potentielle cytotoksiske virkning af S9-blandinger til dyrkede pattedyrceller udvides eksponeringsperioden til at dække 1,5-2 gange en normal cellecyklus uden tilsætning af S9. Udvides eksponeringsperioden er der flere muligheder for behandling af cellerne med testkemikaliet uden og med tilsætning af cytoB. Med disse valgmuligheder tages der højde for situationer, der kan give anledning til bekymring over risikoen for interaktion mellem teststoffet og cytoB.

| 40. | De anbefalede behandlingsplaner fremgår af tabel 1. Disse generelle behandlingsplaner kan ændres afhængigt af teststoffets stabilitet eller reaktivitet eller de anvendte cellers særlige vækstegenskaber. Alle behandlinger skal indledes og afsluttes, medens cellevæksten stadig er eksponentiel. Der redegøres nærmere for denne tidsplan i punkt 41-47 nedenfor.

  Tabel 1


  Tidsplan for cellebehandling og høst for MNvit-assayet








  Lymfocytter, primærceller og cellelinjer behandlet med cytoB | + S9 | Behandles i 3-6 timer med tilsætning af S9
  S9 og behandlingsmediet fjernes
  Friskt medium og cytoB tilsættes
  Høstes efter 1,5-2 gange en normal cellecyklus. |
| --- | --- | --- | --- |
| – S9
  Kortvarig eksponering | Behandles i 3-6 timer
  Behandlingsmediet fjernes
  Friskt medium og cytoB tilsættes
  Høstes efter 1,5-2 gange en normal cellecyklus. |
| – S9
  Udvidet eksponering | Valgmulighed A: Behandles i 1,5-2 gange en normal cellecyklus med tilsætning af cytoB
  Høstes ved afslutningen af eksponeringsperioden.

  Valgmulighed B: Behandles i 1,5-2 gange en normal cellecyklus
  Teststoffet fjernes
  Friskt medium og cytoB tilsættes
  Høstes efter 1,5-2 gange en normal cellecyklus. |
| Cellelinjer behandlet uden cytoB
  (Samme behandlingsplan som anført ovenfor, bortset fra at der ikke tilsættes cytoB) |

40.

De anbefalede behandlingsplaner fremgår af tabel 1. Disse generelle behandlingsplaner kan ændres afhængigt af teststoffets stabilitet eller reaktivitet eller de anvendte cellers særlige vækstegenskaber. Alle behandlinger skal indledes og afsluttes, medens cellevæksten stadig er eksponentiel. Der redegøres nærmere for denne tidsplan i punkt 41-47 nedenfor.

Tabel 1

Tabel 1

Tidsplan for cellebehandling og høst for MNvit-assayet

Tidsplan for cellebehandling og høst for MNvit-assayet

Lymfocytter, primærceller og cellelinjer behandlet med cytoB

- S9

Behandles i 3-6 timer med tilsætning af S9

S9 og behandlingsmediet fjernes

Friskt medium og cytoB tilsættes

Høstes efter 1,5-2 gange en normal cellecyklus.

– S9

Kortvarig eksponering

Behandles i 3-6 timer

Behandlingsmediet fjernes

Friskt medium og cytoB tilsættes

Høstes efter 1,5-2 gange en normal cellecyklus.

– S9

Udvidet eksponering

Valgmulighed A: Behandles i 1,5-2 gange en normal cellecyklus med tilsætning af cytoB

Valgmulighed A:

Høstes ved afslutningen af eksponeringsperioden.

Valgmulighed B: Behandles i 1,5-2 gange en normal cellecyklus

Valgmulighed B:

Teststoffet fjernes

Friskt medium og cytoB tilsættes

Høstes efter 1,5-2 gange en normal cellecyklus.

Cellelinjer behandlet uden cytoB

(Samme behandlingsplan som anført ovenfor, bortset fra at der ikke tilsættes cytoB)

Lymfocytter, primærceller og cellelinjer behandlet med cytoB

Lymfocytter, primærceller og cellelinjer behandlet med cytoB

| 41. | For lymfocytter er den mest effektive tilgang at indlede eksponeringen for teststoffet 44-48 timer efter PHA-stimuleringen, når synkroniseringen af cyklussen er afsluttet (5). I det første assay behandles cellerne i 3-6 timer med teststoffet uden og med tilsætning af S9. Behandlingsmediet fjernes og erstattes af et friskt medium med cytoB, og cellerne høstes efter 1,5-2 gange en normal cellecyklus. |
| --- | --- |

41.

For lymfocytter er den mest effektive tilgang at indlede eksponeringen for teststoffet 44-48 timer efter PHA-stimuleringen, når synkroniseringen af cyklussen er afsluttet (5). I det første assay behandles cellerne i 3-6 timer med teststoffet uden og med tilsætning af S9. Behandlingsmediet fjernes og erstattes af et friskt medium med cytoB, og cellerne høstes efter 1,5-2 gange en normal cellecyklus.

| 42. | Hvis de to første test med kortvarig (3-6 timer) behandling er negative eller tvetydige, udvides eksponeringsperioden uden tilsætning af S9. Der findes to behandlingsmuligheder, som er lige brugbare. Det kan imidlertid være mere hensigtsmæssigt at vælge valgmulighed A i forbindelse med stimulerede lymfocytter, hvor den eksponentielle vækst kan være faldende 96 timer efter stimulering. Desuden vil cellekulturerne ikke have konflueret på tidspunktet for den endelige prøveudtagning ved anvendelse af valgmulighed B.






  — | Valgmulighed A: Cellerne behandles med teststoffet i et tidsrum, der svarer til 1,5-2 gange en normal cellecyklus, og høstes ved afslutningen af eksponeringsperioden. |
| --- | --- | --- |

42.

Hvis de to første test med kortvarig (3-6 timer) behandling er negative eller tvetydige, udvides eksponeringsperioden uden tilsætning af S9. Der findes to behandlingsmuligheder, som er lige brugbare. Det kan imidlertid være mere hensigtsmæssigt at vælge valgmulighed A i forbindelse med stimulerede lymfocytter, hvor den eksponentielle vækst kan være faldende 96 timer efter stimulering. Desuden vil cellekulturerne ikke have konflueret på tidspunktet for den endelige prøveudtagning ved anvendelse af valgmulighed B.

—

Valgmulighed A: Cellerne behandles med teststoffet i et tidsrum, der svarer til 1,5-2 gange en normal cellecyklus, og høstes ved afslutningen af eksponeringsperioden.

| — | Valgmulighed B: Cellerne behandles med teststoffet i 1,5-2 gange en normal cellecyklus. Behandlingsmediet fjernes og erstattes af et friskt medium, og cellerne høstes efter yderligere 1,5-2 gange en normal cellecyklus. |
| --- | --- |

—

Valgmulighed B: Cellerne behandles med teststoffet i 1,5-2 gange en normal cellecyklus. Behandlingsmediet fjernes og erstattes af et friskt medium, og cellerne høstes efter yderligere 1,5-2 gange en normal cellecyklus.

| 43. | Primærceller og cellelinjer behandles på samme måde som lymfocytter, bortset fra at det ikke er nødvendigt at stimulere dem med PHA i 44-48 timer. Andre celler end lymfocytter skal eksponeres på en sådan måde, at cellerne ved afslutningen af eksponeringsperioden fortsat er i den logaritmiske vækstfase. |
| --- | --- |

43.

Primærceller og cellelinjer behandles på samme måde som lymfocytter, bortset fra at det ikke er nødvendigt at stimulere dem med PHA i 44-48 timer. Andre celler end lymfocytter skal eksponeres på en sådan måde, at cellerne ved afslutningen af eksponeringsperioden fortsat er i den logaritmiske vækstfase.

Cellelinjer uden cytoB

Cellelinjer uden cytoB

| 44. | Celler behandles i 3-6 timer med og uden tilsætning af S9. Behandlingsmediet fjernes og erstattes af et friskt medium, og cellerne høstes efter 1,5-2 gange en normal cellecyklus. |
| --- | --- |

44.

Celler behandles i 3-6 timer med og uden tilsætning af S9. Behandlingsmediet fjernes og erstattes af et friskt medium, og cellerne høstes efter 1,5-2 gange en normal cellecyklus.

| 45. | Hvis de to første test med kortvarig (3-6 timer) behandling er negative eller tvetydige, udvides eksponeringsperioden (uden tilsætning af S9). Der findes to behandlingsmuligheder, som er lige brugbare.






  — | Valgmulighed A: Cellerne behandles med teststoffet i 1,5-2 gange en normal cellecyklus og høstes ved afslutningen af eksponeringsperioden. |
| --- | --- | --- |

45.

Hvis de to første test med kortvarig (3-6 timer) behandling er negative eller tvetydige, udvides eksponeringsperioden (uden tilsætning af S9). Der findes to behandlingsmuligheder, som er lige brugbare.

—

Valgmulighed A: Cellerne behandles med teststoffet i 1,5-2 gange en normal cellecyklus og høstes ved afslutningen af eksponeringsperioden.

| — | Valgmulighed B: Cellerne behandles med teststoffet i 1,5-2 gange en normal cellecyklus. Behandlingsmediet fjernes og erstattes af et friskt medium, og cellerne høstes efter yderligere 1,5-2 gange en normal cellecyklus. |
| --- | --- |

—

Valgmulighed B: Cellerne behandles med teststoffet i 1,5-2 gange en normal cellecyklus. Behandlingsmediet fjernes og erstattes af et friskt medium, og cellerne høstes efter yderligere 1,5-2 gange en normal cellecyklus.

| 46. | I encellede lag kan der være mitotiske celler (runde celler, der er løsrevet fra overfladen) til stede efter eksponeringen på 3-6 timer. Da disse mitotiske celler løsrives nemt, kan de gå tabt, når mediet med teststoffet fjernes. Det er vigtigt at indsamle disse celler, når kulturerne vaskes, og at føre dem tilbage til kulturerne for ikke at miste celler, der er i mitose, og hvor der er risiko for dannelse af mikrokerner på høsttidspunktet. |
| --- | --- |

46.

I encellede lag kan der være mitotiske celler (runde celler, der er løsrevet fra overfladen) til stede efter eksponeringen på 3-6 timer. Da disse mitotiske celler løsrives nemt, kan de gå tabt, når mediet med teststoffet fjernes. Det er vigtigt at indsamle disse celler, når kulturerne vaskes, og at føre dem tilbage til kulturerne for ikke at miste celler, der er i mitose, og hvor der er risiko for dannelse af mikrokerner på høsttidspunktet.

Antal kulturer

Antal kulturer

| 47. | Der benyttes dobbeltbestemmelse ved hver koncentration af teststof og for negative kontrolkulturer med opløsningsmiddel/bærestof. Hvis det på grundlag af data fra tidligere laboratorieforsøg kan godtgøres, at forskellen mellem dobbeltbestemmelser er minimal, kan enkeltbestemmelse accepteres. Benyttes der kun én kultur, anbefales det at øge antallet af koncentrationer til analyse. |
| --- | --- |

47.

Der benyttes dobbeltbestemmelse ved hver koncentration af teststof og for negative kontrolkulturer med opløsningsmiddel/bærestof. Hvis det på grundlag af data fra tidligere laboratorieforsøg kan godtgøres, at forskellen mellem dobbeltbestemmelser er minimal, kan enkeltbestemmelse accepteres. Benyttes der kun én kultur, anbefales det at øge antallet af koncentrationer til analyse.

Cellehøst og præparering af objektglas

Cellehøst og præparering af objektglas

| 48. | Høst og præparering foregår særskilt for hver enkelt kultur. Præpareringen af celler kan bestå i hypotonisk behandling, men dette er ikke nødvendigt, hvis der opnås en tilstrækkelig spredning af cellerne på anden vis. Der kan anvendes forskellige teknikker til præparering af objektglas, forudsat at der fremstilles cellepræparater af høj kvalitet til bedømmelse. Cellens cytoplasma anvendes til påvisning af mikrokerner og (ved cytokineseblokeringsmetoden) pålidelig identifikation af binukleære celler. |
| --- | --- |

48.

Høst og præparering foregår særskilt for hver enkelt kultur. Præpareringen af celler kan bestå i hypotonisk behandling, men dette er ikke nødvendigt, hvis der opnås en tilstrækkelig spredning af cellerne på anden vis. Der kan anvendes forskellige teknikker til præparering af objektglas, forudsat at der fremstilles cellepræparater af høj kvalitet til bedømmelse. Cellens cytoplasma anvendes til påvisning af mikrokerner og (ved cytokineseblokeringsmetoden) pålidelig identifikation af binukleære celler.

| 49. | Objektglassene kan farves ved hjælp af forskellige metoder, f.eks. med Giemsa- eller fluorescerende dna-specifikke farvestoffer (59). Ved at bruge en dna-specifik farvning (f.eks. acridinorange (61) eller Hoechst 33258 plus pyronin-Y (62)) kan man undgå nogle af de artifakter, der optræder ved ikke-dna-specifik farvning. Anti-kinetokor-antistoffer, FISH med pancentromeriske dna-prober eller primet in situ-mærkning med pancentromerspecifikke primere og egnet dna-kontrastfarvning kan anvendes til identifikation af mikrokerners indhold (kromosom/kromosomfragment), hvis der er brug for mekanistisk information og dannelsen heraf (15) (16). Andre metoder til differentiering mellem klastogener og aneugener kan anvendes, hvis de har vist sig at være effektive. |
| --- | --- |

49.

Objektglassene kan farves ved hjælp af forskellige metoder, f.eks. med Giemsa- eller fluorescerende dna-specifikke farvestoffer (59). Ved at bruge en dna-specifik farvning (f.eks. acridinorange (61) eller Hoechst 33258 plus pyronin-Y (62)) kan man undgå nogle af de artifakter, der optræder ved ikke-dna-specifik farvning. Anti-kinetokor-antistoffer, FISH med pancentromeriske dna-prober eller primet in situ-mærkning med pancentromerspecifikke primere og egnet dna-kontrastfarvning kan anvendes til identifikation af mikrokerners indhold (kromosom/kromosomfragment), hvis der er brug for mekanistisk information og dannelsen heraf (15) (16). Andre metoder til differentiering mellem klastogener og aneugener kan anvendes, hvis de har vist sig at være effektive.

Analyse

Analyse

| 50. | Alle objektglas, herunder kontrolprøver med opløsningsmiddel/bærestof, kodes uafhængigt inden mikroskoperingen. Alternativt analyseres kodede prøver ved hjælp af et valideret system til automatisk flow-cytometri- eller billedanalyse. |
| --- | --- |

50.

Alle objektglas, herunder kontrolprøver med opløsningsmiddel/bærestof, kodes uafhængigt inden mikroskoperingen. Alternativt analyseres kodede prøver ved hjælp af et valideret system til automatisk flow-cytometri- eller billedanalyse.

| 51. | I cytoB-behandlede kulturer analyseres mikrokerneforekomsten i mindst 2 000 binukleære celler pr. koncentration (mindst 1 000 binukleære celler pr. kultur, to kulturer pr. koncentration). Benyttes der kun én kultur, bedømmes mindst 2 000 binukleære celler pr. koncentration fra den pågældende kultur. Hvis der er væsentligt færre end 1 000 binukleære celler pr. kultur, eller færre end 2 000, hvis der kun benyttes én kultur, til bedømmelse i hver koncentration, og hvis der ikke påvises en væsentlig forøgelse af antallet af mikrokerner, gentages testen med flere celler eller i mindre toksiske koncentrationer afhængigt af forholdene. Det er vigtigt at undlade at bedømme binukleære celler med uregelmæssige former, eller hvor de to kerner har en meget forskellig størrelse, og binukleære celler må heller ikke forveksles med ujævnt udstrøgne multinukleære celler. Celler med mere end to hovedkerner analyseres ikke for forekomsten af mikrokerner, da mikrokerneforekomsten i forvejen kan være højere i disse celler (63) (64). Det er acceptabelt at bedømme mononukleære celler, hvis det påvises, at teststoffet griber ind i cytoB-aktiviteten. |
| --- | --- |

51.

I cytoB-behandlede kulturer analyseres mikrokerneforekomsten i mindst 2 000 binukleære celler pr. koncentration (mindst 1 000 binukleære celler pr. kultur, to kulturer pr. koncentration). Benyttes der kun én kultur, bedømmes mindst 2 000 binukleære celler pr. koncentration fra den pågældende kultur. Hvis der er væsentligt færre end 1 000 binukleære celler pr. kultur, eller færre end 2 000, hvis der kun benyttes én kultur, til bedømmelse i hver koncentration, og hvis der ikke påvises en væsentlig forøgelse af antallet af mikrokerner, gentages testen med flere celler eller i mindre toksiske koncentrationer afhængigt af forholdene. Det er vigtigt at undlade at bedømme binukleære celler med uregelmæssige former, eller hvor de to kerner har en meget forskellig størrelse, og binukleære celler må heller ikke forveksles med ujævnt udstrøgne multinukleære celler. Celler med mere end to hovedkerner analyseres ikke for forekomsten af mikrokerner, da mikrokerneforekomsten i forvejen kan være højere i disse celler (63) (64). Det er acceptabelt at bedømme mononukleære celler, hvis det påvises, at teststoffet griber ind i cytoB-aktiviteten.

| 52. | I cellelinjer, der ikke behandles med cytoB, bedømmes mikrokerneforekomsten i mindst 2 000 celler pr. koncentration (mindst 1 000 celler pr. kultur, to kulturer pr. koncentration). Benyttes der kun én kultur pr. koncentration, bedømmes mindst 2 000 celler fra den pågældende kultur. |
| --- | --- |

52.

I cellelinjer, der ikke behandles med cytoB, bedømmes mikrokerneforekomsten i mindst 2 000 celler pr. koncentration (mindst 1 000 celler pr. kultur, to kulturer pr. koncentration). Benyttes der kun én kultur pr. koncentration, bedømmes mindst 2 000 celler fra den pågældende kultur.

| 53. | Når cytoB anvendes, bestemmes CBPI eller RI til vurdering af celleproliferationen (se tillæg 2) ud fra mindst 500 celler pr. kultur. Ved behandling uden tilsætning af cytoB er det afgørende at dokumentere, at de celler, der bedømmes, har formeret sig, jf. punkt 24-27. |
| --- | --- |

53.

Når cytoB anvendes, bestemmes CBPI eller RI til vurdering af celleproliferationen (se tillæg 2) ud fra mindst 500 celler pr. kultur. Ved behandling uden tilsætning af cytoB er det afgørende at dokumentere, at de celler, der bedømmes, har formeret sig, jf. punkt 24-27.

Acceptkriterier

Acceptkriterier

| 54. | Et laboratorium, der ønsker at udføre det MNvit-assay, der er beskrevet i denne TM, skal påvise, at det har kompetence til på pålidelig og nøjagtig vis at identificere kemikalier med kendt aneugen og klastogen aktivitet og med eller uden metabolisk aktivering såvel som kendte negative kemikalier på grundlag af referencekemikalierne i tillæg 3. Som dokumentation for dets kompetence til at udføre denne TM korrekt skal laboratoriet dokumentere, at kernedelingen af de celler, der bedømmes for mikrokernedannelse, er afsluttet, hvis testen udføres uden tilsætning af cytoB. |
| --- | --- |

54.

Et laboratorium, der ønsker at udføre det MNvit-assay, der er beskrevet i denne TM, skal påvise, at det har kompetence til på pålidelig og nøjagtig vis at identificere kemikalier med kendt aneugen og klastogen aktivitet og med eller uden metabolisk aktivering såvel som kendte negative kemikalier på grundlag af referencekemikalierne i tillæg 3. Som dokumentation for dets kompetence til at udføre denne TM korrekt skal laboratoriet dokumentere, at kernedelingen af de celler, der bedømmes for mikrokernedannelse, er afsluttet, hvis testen udføres uden tilsætning af cytoB.

| 55. | Det anbefales at anvende kemikalierne i tillæg 3 som referencekemikalier. Det er muligt at tilføje eller erstatte kemikalier, hvis deres aktivitet er kendt, og hvis de inducerer mikrokerner ved hjælp af de samme mekanismer, og hvis det påvises, at de er egnede for de kemikalier, som skal testes ved hjælp af MNvit-assayet. Begrundelsen kan omfatte en valideringsundersøgelse af en bred vifte af stoffer eller en undersøgelse med fokus på et snævrere spektrum baseret på teststoffets kemiske gruppe eller de undersøgte skadevirkninger. |
| --- | --- |

55.

Det anbefales at anvende kemikalierne i tillæg 3 som referencekemikalier. Det er muligt at tilføje eller erstatte kemikalier, hvis deres aktivitet er kendt, og hvis de inducerer mikrokerner ved hjælp af de samme mekanismer, og hvis det påvises, at de er egnede for de kemikalier, som skal testes ved hjælp af MNvit-assayet. Begrundelsen kan omfatte en valideringsundersøgelse af en bred vifte af stoffer eller en undersøgelse med fokus på et snævrere spektrum baseret på teststoffets kemiske gruppe eller de undersøgte skadevirkninger.

| 56. | Kontrolkulturer med opløsningsmiddel/bærestof og ubehandlede kulturer bør resultere i reproducerbart lave og konsistente mikrokerneforekomster (typisk 5-25 mikrokerner/1 000 celler for de celletyper, der er identificeret i punkt 11). Andre celletyper kan have andre responsintervaller, der skal fastslås ved valideringen af deres anvendelse i MNvit-assayet. Data fra negative kontrolprøver med opløsningsmiddel og positive kontrolprøver anvendes til at fastslå historiske kontrolintervaller. Disse værdier indgår i vurderingen af, om de sideløbende negative/positive kontrolprøver opfylder kravene til forsøg. |
| --- | --- |

56.

Kontrolkulturer med opløsningsmiddel/bærestof og ubehandlede kulturer bør resultere i reproducerbart lave og konsistente mikrokerneforekomster (typisk 5-25 mikrokerner/1 000 celler for de celletyper, der er identificeret i punkt 11). Andre celletyper kan have andre responsintervaller, der skal fastslås ved valideringen af deres anvendelse i MNvit-assayet. Data fra negative kontrolprøver med opløsningsmiddel og positive kontrolprøver anvendes til at fastslå historiske kontrolintervaller. Disse værdier indgår i vurderingen af, om de sideløbende negative/positive kontrolprøver opfylder kravene til forsøg.

| 57. | Hvis der foreslås mindre ændringer til protokollen (f.eks. anvendelse af automatiserede i stedet for manuelle bedømmelsesteknikker, anvendelse af en ny celletype), skal ændringens effektivitet påvises, inden den modificerede protokol kan accepteres. Det skal i denne forbindelse påvises, at det er muligt at identificere de vigtigste mekanismer for kromosomskade og gevinst eller tab, og at der kan opnås korrekte positive og negative resultater for den enkelte stofgruppe eller det brede spektrum af stoffer, der skal testes. |
| --- | --- |

57.

Hvis der foreslås mindre ændringer til protokollen (f.eks. anvendelse af automatiserede i stedet for manuelle bedømmelsesteknikker, anvendelse af en ny celletype), skal ændringens effektivitet påvises, inden den modificerede protokol kan accepteres. Det skal i denne forbindelse påvises, at det er muligt at identificere de vigtigste mekanismer for kromosomskade og gevinst eller tab, og at der kan opnås korrekte positive og negative resultater for den enkelte stofgruppe eller det brede spektrum af stoffer, der skal testes.

DATA OG RAPPORTERING

Behandling af resultater

Behandling af resultater

| 58. | Ved cytokineseblokeringsmetoden tages der kun højde for forekomsten af binukleære celler med mikrokerner (uafhængigt af antallet af mikrokerner pr. celle) ved vurdering af induktionen af mikrokerner. Det er ikke obligatorisk at bedømme antallet af celler med en, to eller flere mikrokerner, men det kan give nyttige oplysninger. |
| --- | --- |

58.

Ved cytokineseblokeringsmetoden tages der kun højde for forekomsten af binukleære celler med mikrokerner (uafhængigt af antallet af mikrokerner pr. celle) ved vurdering af induktionen af mikrokerner. Det er ikke obligatorisk at bedømme antallet af celler med en, to eller flere mikrokerner, men det kan give nyttige oplysninger.

| 59. | Der foretages sideløbende målinger af cytotoksicitet og/eller cytostase for alle behandlede kulturer samt kontrolkulturer med opløsningsmiddel/bærestof (58). Ved cytokineseblokeringsmetoden udregnes CBPI eller RI for alle behandlede kulturer og kontrolkulturer som målinger af cellecyklusforsinkelse. Hvis cytoB ikke anvendes, anvendes RPD-, RICC- eller PI-metoden (se tillæg 2). |
| --- | --- |

59.

Der foretages sideløbende målinger af cytotoksicitet og/eller cytostase for alle behandlede kulturer samt kontrolkulturer med opløsningsmiddel/bærestof (58). Ved cytokineseblokeringsmetoden udregnes CBPI eller RI for alle behandlede kulturer og kontrolkulturer som målinger af cellecyklusforsinkelse. Hvis cytoB ikke anvendes, anvendes RPD-, RICC- eller PI-metoden (se tillæg 2).

| 60. | Der anføres data for hver enkelt kultur. Desuden sammenfattes alle data i tabelform. |
| --- | --- |

60.

Der anføres data for hver enkelt kultur. Desuden sammenfattes alle data i tabelform.

| 61. | Når kemikalier inducerer mikrokerne i MNvit-assayet, kan det skyldes, at de fremkalder kromosombrud, kromosomtab eller en kombination heraf. Yderligere analyse med anvendelse af anti-kinetokor-antistof, centromeriske in situ-prober eller andre metoder kan anvendes til at bestemme, om induktionen af mikrokerner skyldes klastogen og/eller aneugen aktivitet. |
| --- | --- |

61.

Når kemikalier inducerer mikrokerne i MNvit-assayet, kan det skyldes, at de fremkalder kromosombrud, kromosomtab eller en kombination heraf. Yderligere analyse med anvendelse af anti-kinetokor-antistof, centromeriske in situ-prober eller andre metoder kan anvendes til at bestemme, om induktionen af mikrokerner skyldes klastogen og/eller aneugen aktivitet.

Evaluering og fortolkning af resultater

Evaluering og fortolkning af resultater

| 62. | Der er ingen krav om verifikation af et klart positivt eller negativt resultat ved hjælp af yderligere forsøg. Tvetydige resultater kan afklares ved analyse af yderligere 1 000 celler fra alle kulturerne for at undgå tab af blinding. Hvis denne tilgang ikke afklarer resultatet, udføres der yderligere test. Ved opfølgende forsøg bør det overvejes at ændre undersøgelsesparametrene og udvide eller indskrænke forsøgsbetingelserne i relevant omfang. Blandt de undersøgelsesparametre, der kan ændres på, er testkoncentrationernes spredning, tidsplanen for behandling og cellehøst og/eller metabolismeaktiveringen. |
| --- | --- |

62.

Der er ingen krav om verifikation af et klart positivt eller negativt resultat ved hjælp af yderligere forsøg. Tvetydige resultater kan afklares ved analyse af yderligere 1 000 celler fra alle kulturerne for at undgå tab af blinding. Hvis denne tilgang ikke afklarer resultatet, udføres der yderligere test. Ved opfølgende forsøg bør det overvejes at ændre undersøgelsesparametrene og udvide eller indskrænke forsøgsbetingelserne i relevant omfang. Blandt de undersøgelsesparametre, der kan ændres på, er testkoncentrationernes spredning, tidsplanen for behandling og cellehøst og/eller metabolismeaktiveringen.

| 63. | Der findes en række kriterier for opnåelse af et positivt resultat, f.eks. en koncentrationsafhængig forøgelse eller en statistisk signifikant forøgelse af antallet af celler med mikrokerner. Der bør i første række ses på resultaternes biologiske relevans. Det kan være nyttigt at undersøge, om de observerede værdier ligger inden eller uden for det historiske kontrolinterval, ved vurderingen af responsets biologiske signifikans. Egnede statistiske metoder kan benyttes som hjælpemiddel ved evalueringen af testresultaterne (65). Dosis-responsforholdet skal imidlertid også indgå i bedømmelsen af de statistiske testresultater. Reproducerbarhed og historiske data skal også tages i betragtning. |
| --- | --- |

63.

Der findes en række kriterier for opnåelse af et positivt resultat, f.eks. en koncentrationsafhængig forøgelse eller en statistisk signifikant forøgelse af antallet af celler med mikrokerner. Der bør i første række ses på resultaternes biologiske relevans. Det kan være nyttigt at undersøge, om de observerede værdier ligger inden eller uden for det historiske kontrolinterval, ved vurderingen af responsets biologiske signifikans. Egnede statistiske metoder kan benyttes som hjælpemiddel ved evalueringen af testresultaterne (65). Dosis-responsforholdet skal imidlertid også indgå i bedømmelsen af de statistiske testresultater. Reproducerbarhed og historiske data skal også tages i betragtning.

| 64. | De fleste forsøg giver klart positivt eller negativt resultat, men i nogle tilfælde giver dataene ikke mulighed for en endegyldig bedømmelse af teststoffets aktivitet. Resultatet kan stadig være tvetydigt eller tvivlsomt, uanset hvor mange gange forsøget gentages. |
| --- | --- |

64.

De fleste forsøg giver klart positivt eller negativt resultat, men i nogle tilfælde giver dataene ikke mulighed for en endegyldig bedømmelse af teststoffets aktivitet. Resultatet kan stadig være tvetydigt eller tvivlsomt, uanset hvor mange gange forsøget gentages.

| 65. | Et positivt resultat af MNvit-assayet viser, at teststoffet fremkalder kromosombrud eller kromosomtab i dyrkede celler fra pattedyr. Et negativt resultat viser, at teststoffet under testbetingelserne ikke fremkalder kromosombrud og/eller gevinst eller tab af kromosomer i dyrkede celler fra pattedyr. |
| --- | --- |

65.

Et positivt resultat af MNvit-assayet viser, at teststoffet fremkalder kromosombrud eller kromosomtab i dyrkede celler fra pattedyr. Et negativt resultat viser, at teststoffet under testbetingelserne ikke fremkalder kromosombrud og/eller gevinst eller tab af kromosomer i dyrkede celler fra pattedyr.

Testrapport

Testrapport

| 66. | Testrapporten skal som minimum omfatte følgende oplysninger, hvis de er relevante for undersøgelsens gennemførelse: | Testkemikalie







  — | identifikationsoplysninger, CAS-nr. (Chemical Abstract Services Registry Number) og EF-nr. |
| --- | --- | --- | --- |

66.

Testrapporten skal som minimum omfatte følgende oplysninger, hvis de er relevante for undersøgelsens gennemførelse:

Testkemikalie

Testkemikalie

—

identifikationsoplysninger, CAS-nr. (Chemical Abstract Services Registry Number) og EF-nr.

| — | fysiske egenskaber og renhedsgrad |
| --- | --- |

—

fysiske egenskaber og renhedsgrad

| — | fysisk-kemiske egenskaber, som er relevante for undersøgelsen |
| --- | --- |

—

fysisk-kemiske egenskaber, som er relevante for undersøgelsen

| — | testkemikaliets reaktivitet med opløsningsmiddel/bærestof eller celledyrkningsmedium |
| --- | --- |

—

testkemikaliets reaktivitet med opløsningsmiddel/bærestof eller celledyrkningsmedium

| | Opløsningsmiddel/bærestof







  — | begrundelse for valg af opløsningsmiddel/bærestof |
| --- | --- | --- |

Opløsningsmiddel/bærestof

Opløsningsmiddel/bærestof

—

begrundelse for valg af opløsningsmiddel/bærestof

| — | teststoffets opløselighed og stabilitet i opløsningsmiddel/bærestof |
| --- | --- |

—

teststoffets opløselighed og stabilitet i opløsningsmiddel/bærestof

| | Celler







  — | den valgte celletype og oprindelse |
| --- | --- | --- |

Celler

Celler

—

den valgte celletype og oprindelse

| — | den valgte celletypes egnethed |
| --- | --- |

—

den valgte celletypes egnethed

| — | eventuelt fravær af mykoplasma |
| --- | --- |

—

eventuelt fravær af mykoplasma

| — | oplysninger om cellecyklussens længde, fordoblingstid eller proliferationsindeks |
| --- | --- |

—

oplysninger om cellecyklussens længde, fordoblingstid eller proliferationsindeks

| — | ved anvendelse af humane lymfocytter, bloddonorers køn, alder og antal, hvis det er relevant |
| --- | --- |

—

ved anvendelse af humane lymfocytter, bloddonorers køn, alder og antal, hvis det er relevant

| — | ved anvendelse af humane lymfocytter, om fuldblod eller fraseparerede lymfocytter eksponeres |
| --- | --- |

—

ved anvendelse af humane lymfocytter, om fuldblod eller fraseparerede lymfocytter eksponeres

| — | eventuelt antal passager |
| --- | --- |

—

eventuelt antal passager

| — | eventuelle metoder til opretholdelse af cellekulturer |
| --- | --- |

—

eventuelle metoder til opretholdelse af cellekulturer

| — | normalt kromosomtal |
| --- | --- |

—

normalt kromosomtal

| — | cellecyklussens normale længde (negativ kontrol) |
| --- | --- |

—

cellecyklussens normale længde (negativ kontrol)

| | Testbetingelser







  — | det cytokineseblokerende stofs (f.eks. cytoB) betegnelse og koncentration og længden af cellernes udsættelse for stoffet |
| --- | --- | --- |

Testbetingelser

Testbetingelser

—

det cytokineseblokerende stofs (f.eks. cytoB) betegnelse og koncentration og længden af cellernes udsættelse for stoffet

| — | begrundelse for valg af koncentrationer og antal kulturer, herunder eventuelle cytotoksicitetsdata og opløselighedsbegrænsninger |
| --- | --- |

—

begrundelse for valg af koncentrationer og antal kulturer, herunder eventuelle cytotoksicitetsdata og opløselighedsbegrænsninger

| — | substratsammensætning og eventuel CO2-koncentration |
| --- | --- |

—

substratsammensætning og eventuel CO2-koncentration

2

| — | teststofkoncentrationer |
| --- | --- |

—

teststofkoncentrationer

| — | koncentration (og/eller volumen) af tilsat bærestof og teststof |
| --- | --- |

—

koncentration (og/eller volumen) af tilsat bærestof og teststof

| — | inkubationstemperatur og -periode |
| --- | --- |

—

inkubationstemperatur og -periode

| — | behandlingens varighed |
| --- | --- |

—

behandlingens varighed

| — | høsttidspunkt efter behandling |
| --- | --- |

—

høsttidspunkt efter behandling

| — | celletæthed ved udsåning, hvis det er relevant |
| --- | --- |

—

celletæthed ved udsåning, hvis det er relevant

| — | metabolismeaktiveringssystemets type og sammensætning, herunder acceptkriterier |
| --- | --- |

—

metabolismeaktiveringssystemets type og sammensætning, herunder acceptkriterier

| — | positive og negative kontrolprøver |
| --- | --- |

—

positive og negative kontrolprøver

| — | anvendte metoder til præparering af objektglas og farvningsteknik |
| --- | --- |

—

anvendte metoder til præparering af objektglas og farvningsteknik

| — | kriterier for identifikation af mikrokerner |
| --- | --- |

—

kriterier for identifikation af mikrokerner

| — | antal analyserede celler |
| --- | --- |

—

antal analyserede celler

| — | metoder til måling af cytotoksicitet |
| --- | --- |

—

metoder til måling af cytotoksicitet

| — | eventuelle supplerende oplysninger vedrørende cytotoksicitet |
| --- | --- |

—

eventuelle supplerende oplysninger vedrørende cytotoksicitet

| — | kriterier for bedømmelse af undersøgelsen som positiv, negativ eller tvetydig |
| --- | --- |

—

kriterier for bedømmelse af undersøgelsen som positiv, negativ eller tvetydig

| — | anvendte statistiske analysemetoder |
| --- | --- |

—

anvendte statistiske analysemetoder

| — | metoder som f.eks. anvendelse af kinetokor-antistof til bestemmelse af, om mikrokerner indeholder hele kromosomer eller kromosomfragmenter. |
| --- | --- |

—

metoder som f.eks. anvendelse af kinetokor-antistof til bestemmelse af, om mikrokerner indeholder hele kromosomer eller kromosomfragmenter.

| | Resultater







  — | anvendt måling af cytotoksicitet, f.eks. CBPI eller RI ved anvendelse af cytokineseblokeringsmetoden, RICC, RPD eller PI, når cytokineseblokeringsmetoden ikke anvendes, andre relevante observationer, f.eks. cellekonfluens, apoptose, nekrose, antal metafaser, forekomst af binukleære celler |
| --- | --- | --- |

Resultater

Resultater

—

anvendt måling af cytotoksicitet, f.eks. CBPI eller RI ved anvendelse af cytokineseblokeringsmetoden, RICC, RPD eller PI, når cytokineseblokeringsmetoden ikke anvendes, andre relevante observationer, f.eks. cellekonfluens, apoptose, nekrose, antal metafaser, forekomst af binukleære celler

| — | tegn på udfældning |
| --- | --- |

—

tegn på udfældning

| — | data om pH og osmolalitet i behandlingsmediet, hvis disse værdier er målt |
| --- | --- |

—

data om pH og osmolalitet i behandlingsmediet, hvis disse værdier er målt

| — | definition af acceptable celler til analyse |
| --- | --- |

—

definition af acceptable celler til analyse

| — | fordeling af mono-, bi- og multinukleære celler ved anvendelse af en cytokineseblokeringsmetode |
| --- | --- |

—

fordeling af mono-, bi- og multinukleære celler ved anvendelse af en cytokineseblokeringsmetode

| — | antal celler med mikrokerner, anført særskilt for hver behandlet kultur og kontrolkultur, og bestemmelse af, om de er indsamlet fra binukleære eller mononukleære celler, hvis det er relevant |
| --- | --- |

—

antal celler med mikrokerner, anført særskilt for hver behandlet kultur og kontrolkultur, og bestemmelse af, om de er indsamlet fra binukleære eller mononukleære celler, hvis det er relevant

| — | koncentrations-responssammenhængen, når det er muligt |
| --- | --- |

—

koncentrations-responssammenhængen, når det er muligt

| — | kemiske data (koncentrationer og opløsningsmidler) for sideløbende negative (opløsningsmiddel/bærestof) og positive kontrolprøver |
| --- | --- |

—

kemiske data (koncentrationer og opløsningsmidler) for sideløbende negative (opløsningsmiddel/bærestof) og positive kontrolprøver

| — | kemiske data for tidligere negative (opløsningsmiddel/bærestof) og positive kontrolprøver med angivelse af intervaller, gennemsnit, standardafvigelser og konfidensinterval (f.eks. 95 %) |
| --- | --- |

—

kemiske data for tidligere negative (opløsningsmiddel/bærestof) og positive kontrolprøver med angivelse af intervaller, gennemsnit, standardafvigelser og konfidensinterval (f.eks. 95 %)

| — | statistisk analyse og eventuelle P-værdier. |
| --- | --- |

—

statistisk analyse og eventuelle P-værdier.

| | Behandling af resultater |
| --- | --- |

Behandling af resultater

Behandling af resultater

| | Konklusioner |
| --- | --- |

Konklusioner

Konklusioner

LITTERATUR

| (1) | Kirsch-Volders, M. (1997), Towards a validation of the micronucleus test. Mutation Res., 392, 1-4. |
| --- | --- |

(1)

Kirsch-Volders, M. (1997), Towards a validation of the micronucleus test. Mutation Res., 392, 1-4.

Mutation Res.

| (2) | Parry, J.M. and Sors, A. (1993), The detection and assessment of the aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community aneuploidy project, Mutation Res., 287, 3-15. |
| --- | --- |

(2)

Parry, J.M. and Sors, A. (1993), The detection and assessment of the aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community aneuploidy project, Mutation Res., 287, 3-15.

Mutation Res.

| (3) | Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Solutions to the kinetic problem in the micronucleus assay, Cytobios., 43, 233-246. |
| --- | --- |

(3)

Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Solutions to the kinetic problem in the micronucleus assay, Cytobios., 43, 233-246.

Cytobios.

| (4) | Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2000), Report from the In Vitro Micronucleus Assay Working Group, Environ. Mol. Mutagen., 35, 167-172. |
| --- | --- |

(4)

Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2000), Report from the In Vitro Micronucleus Assay Working Group, Environ. Mol. Mutagen., 35, 167-172.

In Vitro

Environ. Mol. Mutagen

| (5) | Fenech, M. (2007), Cytokinesis-block micronucleus cytome assay, Nature Protocols, 2(5), 1084-1104. |
| --- | --- |

(5)

Fenech, M. (2007), Cytokinesis-block micronucleus cytome assay, Nature Protocols, 2(5), 1084-1104.

Nature Protocols, 2

| (6) | Fenech, M. and Morley, A.A. (1986), Cytokinesis-block micronucleus method in human lymphocytes: effect of in-vivo ageing and low dose X-irradiation, Mutation Res., 161, 193-198. |
| --- | --- |

(6)

Fenech, M. and Morley, A.A. (1986), Cytokinesis-block micronucleus method in human lymphocytes: effect of in-vivo ageing and low dose X-irradiation, Mutation Res., 161, 193-198.

in-vivo

Mutation Res.

| (7) | Eastmond, D.A. and Tucker, J.D. (1989), Identification of aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody, Environ. Mol. Mutagen., 13, 34-43. |
| --- | --- |

(7)

Eastmond, D.A. and Tucker, J.D. (1989), Identification of aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody, Environ. Mol. Mutagen., 13, 34-43.

Environ. Mol. Mutagen.

| (8) | Eastmond, D.A. and Pinkel, D. (1990), Detection of aneuploidy and aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence in-situ hybridisation with chromosome-specific DNA probes, Mutation Res., 234, 9-20. |
| --- | --- |

(8)

Eastmond, D.A. and Pinkel, D. (1990), Detection of aneuploidy and aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence in-situ hybridisation with chromosome-specific DNA probes, Mutation Res., 234, 9-20.

in-situ

Mutation Res.

| (9) | Miller, B.M., Zitzelsberger, H.F., Weier, H.U. and Adler, I.D. (1991), Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA, Mutagenesis, 6, 297-302. |
| --- | --- |

(9)

Miller, B.M., Zitzelsberger, H.F., Weier, H.U. and Adler, I.D. (1991), Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA, Mutagenesis, 6, 297-302.

in situ

Mutagenesis

| (10) | Farooqi, Z., Darroudi, F. and Natarajan, A.T. (1993), The use of fluorescence in-situ hybridisation for the detection of aneugens in cytokinesis-blocked mouse splenocytes, Mutagenesis, 8, 329-334. |
| --- | --- |

(10)

Farooqi, Z., Darroudi, F. and Natarajan, A.T. (1993), The use of fluorescence in-situ hybridisation for the detection of aneugens in cytokinesis-blocked mouse splenocytes, Mutagenesis, 8, 329-334.

in-situ

Mutagenesis

| (11) | Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. and Lo Jacono, F. (1993), Cytogenetic damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds and micronucleus analysis by fluorescence in situ hybridization with a centromeric probe, Mutation Res., 319, 205-213. |
| --- | --- |

(11)

Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. and Lo Jacono, F. (1993), Cytogenetic damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds and micronucleus analysis by fluorescence in situ hybridization with a centromeric probe, Mutation Res., 319, 205-213.

in situ

Mutation Res.

| (12) | Norppa, H., Renzi, L. and Lindholm, C. (1993), Detection of whole chromosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by antikinetochore staining and in situ hybridization, Mutagenesis, 8, 519-525. |
| --- | --- |

(12)

Norppa, H., Renzi, L. and Lindholm, C. (1993), Detection of whole chromosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by antikinetochore staining and in situ hybridization, Mutagenesis, 8, 519-525.

in situ

Mutagenesis

| (13) | Eastmond, D.A, Rupa, D.S. and Hasegawa, L.S. (1994), Detection of hyperdiploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes following exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor fluorescence in situ hybridization with DNA probes, Mutation Res., 322, 9-20. |
| --- | --- |

(13)

Eastmond, D.A, Rupa, D.S. and Hasegawa, L.S. (1994), Detection of hyperdiploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes following exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor fluorescence in situ hybridization with DNA probes, Mutation Res., 322, 9-20.

in situ

Mutation Res.

| (14) | Marshall, R.R., Murphy, M., Kirkland, D.J. and Bentley, K.S. (1996), Fluorescence in situ hybridisation (FISH) with chromosome-specific centromeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy, Mutation Res., 372, 233-245. |
| --- | --- |

(14)

Marshall, R.R., Murphy, M., Kirkland, D.J. and Bentley, K.S. (1996), Fluorescence in situ hybridisation (FISH) with chromosome-specific centromeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy, Mutation Res., 372, 233-245.

in situ

Mutation Res.

| (15) | Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. and Crebelli, R. (1996), Analysis of chromosome segregation by means of fluorescence in situ hybridization: application to cytokinesis-blocked human lymphocytes, Mutation Res., 372, 211-219. |
| --- | --- |

(15)

Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. and Crebelli, R. (1996), Analysis of chromosome segregation by means of fluorescence in situ hybridization: application to cytokinesis-blocked human lymphocytes, Mutation Res., 372, 211-219.

in situ

Mutation Res.

| (16) | Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2003), Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Res., 540, 153-163. |
| --- | --- |

(16)

Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2003), Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Res., 540, 153-163.

in vitro

Mutation Res.

| (17) | OECD (1997), In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test, Test Guideline No. 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

(17)

OECD (1997), In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test, Test Guideline No. 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [www.oecd.org/env/testguidelines]

In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test

| (18) | Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M.J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G. and Marzin, D. (2006), SFTG International collaborative Study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study, Mutation Res., 607, 13-36. |
| --- | --- |

(18)

Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M.J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G. and Marzin, D. (2006), SFTG International collaborative Study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study, Mutation Res., 607, 13-36.

in vitro

Mutation Res.

| (19) | Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L.C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes, Mutation Res., 607, 37-60. |
| --- | --- |

(19)

Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L.C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes, Mutation Res., 607, 37-60.

in vitro

Mutation Res.

| (20) | Aardema, M.J., Snyder, R.D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R.J., Gibson, D.P., Soelter, S., Curry, P.T., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, III. Using CHO cells, Mutation Res., 607, 61-87. |
| --- | --- |

(20)

Aardema, M.J., Snyder, R.D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R.J., Gibson, D.P., Soelter, S., Curry, P.T., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, III. Using CHO cells, Mutation Res., 607, 61-87.

in vitro

Mutation Res.

| (21) | Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., Kobayashi, K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells, Mutation Res., 607, 88-124. |
| --- | --- |

(21)

Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., Kobayashi, K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells, Mutation Res., 607, 88-124.

in vitro

Mutation Res.

| (22) | Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, V. Using L5178Y cells, Mutation Res., 607, 125-152. |
| --- | --- |

(22)

Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, V. Using L5178Y cells, Mutation Res., 607, 125-152.

in vitro

Mutation Res.

| (23) | Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A.A. and Locher, F. (1997), Detailed data on in vitro MNT and in vitro CA: industrial experience, Mutation Res., 392, 187-208. |
| --- | --- |

(23)

Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A.A. and Locher, F. (1997), Detailed data on in vitro MNT and in vitro CA: industrial experience, Mutation Res., 392, 187-208.

in vitro

in vitro

Mutation Res.

| (24) | Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. and Lorge, E. (1997), Comparative evaluation of the in vitro micronucleus test and the in vitro chromosome aberration test: industrial experience, Mutation Res., 392, 45-59. |
| --- | --- |

(24)

Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. and Lorge, E. (1997), Comparative evaluation of the in vitro micronucleus test and the in vitro chromosome aberration test: industrial experience, Mutation Res., 392, 45-59.

in vitro

in vitro

Mutation Res.

| (25) | Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. and Madle, S. (1998), Evaluation of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosomal aberration assay: position of the GUM Working Group on the in vitro micronucleus test. Gesellschaft fur Umwelt-Mutations-forschung, Mutation Res., 410, 81-116. |
| --- | --- |

(25)

Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. and Madle, S. (1998), Evaluation of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosomal aberration assay: position of the GUM Working Group on the in vitro micronucleus test. Gesellschaft fur Umwelt-Mutations-forschung, Mutation Res., 410, 81-116.

in vitro

in vitro

in vitro

Mutation Res.

| (26) | Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. and Madle, S. (1999), Chemically induced micronucleus formation in V79 cells — comparison of three different test approaches, Mutation Res. 439, 183-190. |
| --- | --- |

(26)

Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. and Madle, S. (1999), Chemically induced micronucleus formation in V79 cells — comparison of three different test approaches, Mutation Res. 439, 183-190.

Mutation Res.

| (27) | Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S.Y., Kasper, P. and Müller, L. (1999), The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 cells to detect drug-induced photogenotoxicity, Mutation Res. 445, 55-71. |
| --- | --- |

(27)

Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S.Y., Kasper, P. and Müller, L. (1999), The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 cells to detect drug-induced photogenotoxicity, Mutation Res. 445, 55-71.

Mutation Res.

| (28) | von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., Slacik-Erben, R., Miltenburger, H.G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. and Madle, S. (2000), In vitro micronucleus assay with Chinese hamster V79 cells — results of a collaborative study with in situ exposure to 26 chemical substances, Mutation Res., 468, 137-163. |
| --- | --- |

(28)

von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., Slacik-Erben, R., Miltenburger, H.G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. and Madle, S. (2000), In vitro micronucleus assay with Chinese hamster V79 cells — results of a collaborative study with in situ exposure to 26 chemical substances, Mutation Res., 468, 137-163.

In vitro

in situ

Mutation Res

| (29) | Garriott, M.L., Phelps, J.B. and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the in vitro micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity, Mutation Res., 517, 123-134. |
| --- | --- |

(29)

Garriott, M.L., Phelps, J.B. and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the in vitro micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity, Mutation Res., 517, 123-134.

in vitro

Mutation Res.

| (30) | Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. and Sofuni, T. (1999), Validation study of the in vitro micronucleus test in a Chinese hamster lung cell line (CHL/IU), Mutagenesis, 14, 569-580. |
| --- | --- |

(30)

Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. and Sofuni, T. (1999), Validation study of the in vitro micronucleus test in a Chinese hamster lung cell line (CHL/IU), Mutagenesis, 14, 569-580.

in vitro

Mutagenesis

| (31) | Elhajouji, A., and Lorge, E. (2006), Special Issue: SFTG International collaborative study on in vitro micronucleus test, Mutation Res., 607, 1-152. |
| --- | --- |

(31)

Elhajouji, A., and Lorge, E. (2006), Special Issue: SFTG International collaborative study on in vitro micronucleus test, Mutation Res., 607, 1-152.

in vitro

Mutation Res.

| (32) | ECVAM (2006), Statement by the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on the scientific validity of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosome aberration assay for genotoxicity testing. ESAC 25th meeting, 16-17 November, 2006, Available at: [http://ecvam.jrc.it/index.htm] |
| --- | --- |

(32)

ECVAM (2006), Statement by the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on the scientific validity of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosome aberration assay for genotoxicity testing. ESAC 25th meeting, 16-17 November, 2006, Available at: [http://ecvam.jrc.it/index.htm]

in vitro

in vitro

th

| (33) | ESAC (2006), ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer Review, Retrospective Validation of the In Vitro Micronucleus Test, Summary and Conclusions of the Peer Review Panel, Available at: [http://ecvam.jrc.it/index.htm] |
| --- | --- |

(33)

ESAC (2006), ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer Review, Retrospective Validation of the In Vitro Micronucleus Test, Summary and Conclusions of the Peer Review Panel, Available at: [http://ecvam.jrc.it/index.htm]

In Vitro

| (34) | Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, van Benthem, J., Vanparys P. (2008), ECVAM Retrospective Validation of in vitro Micronucleus Test (MNT), Mutagenesis, 23, 271-283. |
| --- | --- |

(34)

Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, van Benthem, J., Vanparys P. (2008), ECVAM Retrospective Validation of in vitro Micronucleus Test (MNT), Mutagenesis, 23, 271-283.

in vitro

Mutagenesis

| (35) | Zhang, L.S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. and Sofuni, T. (1995), A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the in vitro micronucleus test, Mutation Res., 347, 105-115. |
| --- | --- |

(35)

Zhang, L.S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. and Sofuni, T. (1995), A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the in vitro micronucleus test, Mutation Res., 347, 105-115.

in vitro

Mutation Res.

| (36) | Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. and Knasmeuller, S. (2002), Fumonisin B1 is genotoxic in human derived hepatoma (HepG2) cells, Mutagenesis, 17, 257-260. |
| --- | --- |

(36)

Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. and Knasmeuller, S. (2002), Fumonisin B1 is genotoxic in human derived hepatoma (HepG2) cells, Mutagenesis, 17, 257-260.

1

Mutagenesis

| (37) | Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., Huber, W.W., Hoelzl, C., Bichler, J. and Majer, B.J. (2004), Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge, Toxicol., 198, 315-328. |
| --- | --- |

(37)

Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., Huber, W.W., Hoelzl, C., Bichler, J. and Majer, B.J. (2004), Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge, Toxicol., 198, 315-328.

Toxicol.

| (38) | Gibson, D.P., Brauninger, R., Shaffi, H.S., Kerckaert, G.A., LeBoeuf, R.A., Isfort, R.J. and Aardema, M.J. (1997), Induction of micronuclei in Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation assay for National Toxicology Program test chemicals, Mutation Res., 392, 61-70. |
| --- | --- |

(38)

Gibson, D.P., Brauninger, R., Shaffi, H.S., Kerckaert, G.A., LeBoeuf, R.A., Isfort, R.J. and Aardema, M.J. (1997), Induction of micronuclei in Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation assay for National Toxicology Program test chemicals, Mutation Res., 392, 61-70.

Mutation Res.

| (39) | Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, 147-205. |
| --- | --- |

(39)

Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, 147-205.

Mutation Res.

| (40) | Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992), Clastogenicity of low pH to various cultured mammalian cells, Mutation Res., 268, 297-305. |
| --- | --- |

(40)

Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992), Clastogenicity of low pH to various cultured mammalian cells, Mutation Res., 268, 297-305.

Mutation Res.

| (41) | Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations, Environ. Mutagen., 8, 789-886. |
| --- | --- |

(41)

Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations, Environ. Mutagen., 8, 789-886.

Environ. Mutagen

| (42) | Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Measurement of micronuclei in lymphocytes, Mutation Res., 147, 29-36. |
| --- | --- |

(42)

Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Measurement of micronuclei in lymphocytes, Mutation Res., 147, 29-36.

Mutation Res.

| (43) | Fenech, M. (1997), The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood micronucleus method, Mutation Res., 392, 11-18. |
| --- | --- |

(43)

Fenech, M. (1997), The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood micronucleus method, Mutation Res., 392, 11-18.

Mutation Res.

| (44) | Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y.P., Ceppi, M., Chang, W.P., Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M.P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L.R., Fucic, A., Lima, O.G., Hrelia, P., Krishnaja, A.P., Lee, T.K., Migliore, L., Mikhalevich, L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W.U., Odagiri, Y., Scarffi, M.R., Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. and Zijno, A. (2001), HUman MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of micronuclei, Environ. Mol. Mutagen. 37, 31-45. |
| --- | --- |

(44)

Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y.P., Ceppi, M., Chang, W.P., Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M.P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L.R., Fucic, A., Lima, O.G., Hrelia, P., Krishnaja, A.P., Lee, T.K., Migliore, L., Mikhalevich, L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W.U., Odagiri, Y., Scarffi, M.R., Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. and Zijno, A. (2001), HUman MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of micronuclei, Environ. Mol. Mutagen. 37, 31-45.

Environ. Mol. Mutagen.

| (45) | Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983), Revised methods for the Salmonella mutagenicity test, Mutation Res., 113, 173-215. |
| --- | --- |

(45)

Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983), Revised methods for the Salmonella mutagenicity test, Mutation Res., 113, 173-215.

Mutation Res.

| (46) | Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C.R. and Zeiger, E. (1980), Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4, 55-65. |
| --- | --- |

(46)

Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C.R. and Zeiger, E. (1980), Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4, 55-65.

J. Environ. Pathol. Toxicol.

| (47) | Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in-vitro genotoxicity assays. Mutagenesis, 7, 175-177. |
| --- | --- |

(47)

Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in-vitro genotoxicity assays. Mutagenesis, 7, 175-177.

in-vitro

Mutagenesis

| (48) | Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A safe substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, In: de Serres, F.J., Fouts, J. R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds), In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, pp. 85-88. |
| --- | --- |

(48)

Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A safe substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, In: de Serres, F.J., Fouts, J. R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds), In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.

In:

In Vitro

| (49) | Johnson, T.E., Umbenhauer, D.R. and Galloway, S.M. (1996), Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28, 51-59. |
| --- | --- |

(49)

Johnson, T.E., Umbenhauer, D.R. and Galloway, S.M. (1996), Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28, 51-59.

Environ. Mol. Mutagen.

| (50) | UNEP (2001), Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP). Available at: [http://www.pops.int/] |
| --- | --- |

(50)

UNEP (2001), Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP). Available at: [http://www.pops.int/]

| (51) | Doherty, A.T., Ellard, S., Parry, E.M. and Parry, J.M. (1996), An investigation into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to genotoxins in metabolically competent human cells, Mutagenesis, 11, 247-274. |
| --- | --- |

(51)

Doherty, A.T., Ellard, S., Parry, E.M. and Parry, J.M. (1996), An investigation into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to genotoxins in metabolically competent human cells, Mutagenesis, 11, 247-274.

Mutagenesis

| (52) | Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, In: Tice, R.R., Costa, D.L. and Schaich, K.M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, pp. 91-103. |
| --- | --- |

(52)

Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, In: Tice, R.R., Costa, D.L. and Schaich, K.M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, pp. 91-103.

In:

| (53) | Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983), Evaluation of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay, Environ. Mutagenesis 5, 795-801. |
| --- | --- |

(53)

Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983), Evaluation of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay, Environ. Mutagenesis 5, 795-801.

Environ. Mutagenesis

| (54) | Fenech, M. (1993), The cytokinesis-block micronucleus technique: a detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations, Mutation Res., 285, 35-44. |
| --- | --- |

(54)

Fenech, M. (1993), The cytokinesis-block micronucleus technique: a detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations, Mutation Res., 285, 35-44.

Mutation Res.

| (55) | Phelps, J.B., Garriott, M.L., and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the in vitro micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity, Mutation Res., 521, 103-112. |
| --- | --- |

(55)

Phelps, J.B., Garriott, M.L., and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the in vitro micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity, Mutation Res., 521, 103-112.

in vitro

Mutation Res.

| (56) | Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., Surralles, J., Vanhauwaert, A. and Wakata, A. (2004), Corrigendum to »Report from the in vitro micronucleus assay working group«, Mutation Res., 564, 97-100. |
| --- | --- |

(56)

Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., Surralles, J., Vanhauwaert, A. and Wakata, A. (2004), Corrigendum to »Report from the in vitro micronucleus assay working group«, Mutation Res., 564, 97-100.

in vitro

Mutation Res.

| (57) | Pincu, M., Bass, D. and Norman, A. (1984), An improved micronuclear assay in lymphocytes, Mutation Res., 139, 61-65. |
| --- | --- |

(57)

Pincu, M., Bass, D. and Norman, A. (1984), An improved micronuclear assay in lymphocytes, Mutation Res., 139, 61-65.

Mutation Res.

| (58) | Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. and Kirkland, D. (2008), Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects, Mutation Res., 655, 1-3. |
| --- | --- |

(58)

Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. and Kirkland, D. (2008), Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects, Mutation Res., 655, 1-3.

in vitro

Mutation Res.

| (59) | Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. and Marcos, R. (1995), Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures, Mutation Res., 341, 169-184. |
| --- | --- |

(59)

Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. and Marcos, R. (1995), Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures, Mutation Res., 341, 169-184.

Mutation Res.

| (60) | Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay, Environ. Molec. Mutagenesis 35, 191-201. |
| --- | --- |

(60)

Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay, Environ. Molec. Mutagenesis 35, 191-201.

in vitro

Mutagenesis

| (61) | Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, 241-247. |
| --- | --- |

(61)

Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, 241-247.

Mutation Res.

| (62) | MacGregor, J. T., Wehr, C. M., and Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y, Mutation Res., 120, 269-275. |
| --- | --- |

(62)

MacGregor, J. T., Wehr, C. M., and Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y, Mutation Res., 120, 269-275.

Mutation Res.

| (63) | Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An application of acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test, Mutation Res., 120, 241-247. |
| --- | --- |

(63)

Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An application of acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test, Mutation Res., 120, 241-247.

Mutation Res.

| (64) | Fenech, M., Chang, W.P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. and Zeiger, E. (2003), HUMN project: detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures, Mutation Res., 534, 65-75. |
| --- | --- |

(64)

Fenech, M., Chang, W.P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. and Zeiger, E. (2003), HUMN project: detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures, Mutation Res., 534, 65-75.

Mutation Res.

| (65) | Hoffman, W.P., Garriott, M.L. and Lee, C. (2003), In vitro micronucleus test, In: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, Second edition. S. Chow (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, NY, pp. 463-467. |
| --- | --- |

(65)

Hoffman, W.P., Garriott, M.L. and Lee, C. (2003), In vitro micronucleus test, In: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, Second edition. S. Chow (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, NY, pp. 463-467.

In vitro

In:

| (66) | Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 850/2004 af 29. april 2004 om persistente organiske miljøgifte og om ændring af direktiv 79/117/EØF, EUT L 158 af 30.4.2004, s. 7. |
| --- | --- |

(66)

Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EF) nr. 850/2004 af 29. april 2004 om persistente organiske miljøgifte og om ændring af direktiv 79/117/EØF, EUT L 158 af 30.4.2004, s. 7.

Tillæg 1

Definitioner

Aneugen: Alle stoffer eller processer, der ved interaktion med komponenterne i den mitotiske og meiotiske celledelingscyklus forårsager aneuploidi i celler eller organismer.

Aneuploidi: Enhver afvigelse fra det normale diploide (eller haploide) kromosomtal af et eller flere kromosomer, men ikke af et eller flere komplette kromosomsæt (polyploidi)

Apoptose: Programmeret celledød karakteriseret ved en række trin, der forårsager opløsning af celler i membranbundne partikler, som herefter elimineres ved fagocytose eller afstødning.

Celleproliferation: Forøgelse af celleantal som følge af mitotisk celledeling

Centromer: Dna-region af et kromosom, hvor begge kromatider holdes sammen, og hvorpå begge kinetokorer er bundet side om side.

Klastogen: Alle stoffer eller processer, der forårsager strukturelle kromosomaberrationer i populationer af celler eller organismer.

Cytokinese: Celledeling umiddelbart efter mitose, hvorved der dannes to datterceller, som hver indeholder en enkelt kerne.

Proliferationsindeks for cytokineseblokerende stof (CBPI): Andelen af celler efter anden deling i den behandlede population i forhold til den ubehandlede kontrol (se formlen i tillæg 2).

Cytostase: Hæmning af cellevækst (se formlen i tillæg 2)

Cytotoksicitet: Skadelige virkninger i cellestruktur eller -funktion, der i sidste ende forårsager celledød.

Genotoksisk: Et generelt udtryk, der omfatter alle former for dna- eller kromosombeskadigelse, herunder brud, omlejring af addukter, mutationer, kromosomaberrationer og aneuploidi. Det er ikke alle former for gentoksiske virkninger, der forårsager mutationer eller stabil kromosomskade.

Interfaseceller: Celler, der ikke er i mitosefase.

Kinetokor: En proteinstruktur, der er samlet ved et kromosoms centromer, hvortil tentrådene er påhæftet under celledeling, således at datterkromosomerne kan ordnes i forhold til dattercellernes poler.

Mikrokerner: Små ekstrakerner, der er adskilt fra cellens hovedkerne, og som dannes under mitosens eller meiosens telofase ud fra efterladte kromosomfragmenter eller hele kromosomer.

Mitose: Deling af cellekernen, der normalt inddeles i profase, prometafase, metafase, anafase og telofase.

Mitoseindeks: Forholdet mellem antallet af celler i metafase og det samlede antal celler i en population; det viser populationens celleformeringsgrad.

Mutagen: Forårsager arvelige ændringer af dna-baseparsekvens(er) i gener eller i kromosomstrukturen (kromosomaberrationer).

Non-disjunction: Forbundne kromatiders manglende evne til at dele sig og spalte sig korrekt til dattercellerne under udvikling, hvorved der dannes datterceller med anormale kromosomtal.

Polyploidi: Numeriske kromosomaberrationer i celler eller organismer, der involverer et eller flere komplette kromosomsæt, men ikke et enkelt kromosom eller kromosomer (aneuploidi).

Proliferationsindeks (PI): Metode til måling af cytotoksicitet, hvis der ikke anvendes cytoB (se formlen i tillæg 2)

Relativ forøgelse af celletal (RICC): Metode til måling af cytotoksicitet, hvis der ikke anvendes cytoB (se formlen i tillæg 2).

Relativ populationsfordobling (RPD): Metode til måling af cytotoksicitet, hvis der ikke anvendes cytoB (se formlen i tillæg 2).

Replikationsindeks (RI): Andelen af afsluttede celledelingscyklusser i den behandlede kultur i forhold til den ubehandlede kontrol i eksponerings- og restitutionsfasen (se formlen i tillæg 2).

Testkemikalie (eller teststof): Alle stoffer eller blandinger, der testes ved hjælp af denne TM.

Tillæg 2

Formler for vurdering af cytotoksicitet

| 1. | Hvis cytoB anvendes, baseres evalueringen af cytotoksicitet på proliferationsindekset for cytokineseblokerende stof (CBPI) eller replikationsindekset (RI) (16) (58). CBPI angiver det gennemsnitlige antal cellecyklusser pr. celle under eksponeringen for cytoB og kan anvendes til at beregne celleproliferationen. RI angiver det relative antal kerner i behandlede kulturer sammenholdt med kontrolkulturerne og kan anvendes til at beregne cytostase i procent.
  % cytostase = 100 – 100{(CBPIT – 1) ÷ (CBPIC – 1)}
  og:







  T | = | kultur til behandling af testkemikalier |
| --- | --- | --- | --- |
| C | = | kultur til vehikelkontrol |

1.

Hvis cytoB anvendes, baseres evalueringen af cytotoksicitet på proliferationsindekset for cytokineseblokerende stof (CBPI) eller replikationsindekset (RI) (16) (58). CBPI angiver det gennemsnitlige antal cellecyklusser pr. celle under eksponeringen for cytoB og kan anvendes til at beregne celleproliferationen. RI angiver det relative antal kerner i behandlede kulturer sammenholdt med kontrolkulturerne og kan anvendes til at beregne cytostase i procent.

% cytostase = 100 – 100{(CBPIT – 1) ÷ (CBPIC – 1)}

og:

T

=

kultur til behandling af testkemikalier

C

=

kultur til vehikelkontrol

hvor:

Formula

Et CBPI på 1 (alle celler er mononukleære) svarer til en cytostase på 100 %.

Cytostase = 100 – RI

Formula

| T | = | behandlede kulturer |
| --- | --- | --- |
| C | = | kontrolkulturer |

T

=

behandlede kulturer

C

=

kontrolkulturer

| 2. | Et RI på 53 % angiver således, at i forhold til antallet af celler, der delte sig til binukleære og multinukleære celler i kontrolkulturen, var der kun 53 % af disse celler, der delte sig i den behandlede kultur, dvs. 47 % cytostase. |
| --- | --- |

2.

Et RI på 53 % angiver således, at i forhold til antallet af celler, der delte sig til binukleære og multinukleære celler i kontrolkulturen, var der kun 53 % af disse celler, der delte sig i den behandlede kultur, dvs. 47 % cytostase.

| 3. | Hvis cytoB ikke anvendes, anbefales evaluering af cytotoksicitet baseret på relativ forøgelse af celletal (RICC) eller relativ populationsfordobling (RPD) (58), da der ved begge metoder tages højde for den andel af cellepopulationen, som har delt sig.






  hvor:
  Populationsfordobling = [log (celleantal efter behandling ÷ oprindeligt celleantal)] ÷ log 2 |
| --- | --- |

3.

Hvis cytoB ikke anvendes, anbefales evaluering af cytotoksicitet baseret på relativ forøgelse af celletal (RICC) eller relativ populationsfordobling (RPD) (58), da der ved begge metoder tages højde for den andel af cellepopulationen, som har delt sig.

Formula

Formula

hvor:

Populationsfordobling = [log (celleantal efter behandling ÷ oprindeligt celleantal)] ÷ log 2

| 4. | Et RICC eller RPD på 53 % angiver således 47 % cytotoksicitet/cytostase. |
| --- | --- |

4.

Et RICC eller RPD på 53 % angiver således 47 % cytotoksicitet/cytostase.

| 5. | Ved anvendelse af et proliferationsindeks (PI) kan cytotoksiciteten vurderes ved optælling af antallet af kloner med 1 celle (cl1), 2 celler (cl2), 3-4 celler (cl4) og 5-8 celler (cl8). |
| --- | --- |

5.

Ved anvendelse af et proliferationsindeks (PI) kan cytotoksiciteten vurderes ved optælling af antallet af kloner med 1 celle (cl1), 2 celler (cl2), 3-4 celler (cl4) og 5-8 celler (cl8).

Formula

| 6. | PI er også blevet anvendt som et værdifuldt og pålideligt cytotoksicitetsparameter for cellelinjer dyrket in situ uden cytoB (25) (26) (27) (28). |
| --- | --- |

6.

PI er også blevet anvendt som et værdifuldt og pålideligt cytotoksicitetsparameter for cellelinjer dyrket in situ uden cytoB (25) (26) (27) (28).

Tillæg 3

Anbefalede referencekemikalier til vurdring af ydeevne
   (16)

| Kategori | Kemikalie | CAS-nr. | EF-nr. |
| --- | --- | --- | --- |
| 1.   Aktive klastogener uden metabolisk aktivering |
| | Cytosinarabinosid | 147-94-4 | 205-705-9 |
| | Mitomycin C | 50-07-7 | 200-008-6 |
| 2.   Klastogener, som kræver metabolisk aktivering |
| | Benzo(a)pyren | 50-32-8 | 200-028-5 |
| | Cyclofosfamid | 50-18-0 | 200-015-4 |
| 3.   Aneugener |
| | Colchicin | 64-86-8 | 200-598-5 |
| | Vinblastin | 143-67-9 | 205-606-0 |
| 4.   Negative stoffer |
| | Di-(2-ethylhexyl)phthalat | 117-81-7 | 204-211-0 |
| | Nalidixinsyre | 389-08-2 | 206-864-7 |
| | Pyren | 129-00-0 | 204-927-3 |
| | Natriumchlorid | 7647-14-5 | 231-598-3 |

Kategori

Kemikalie

CAS-nr.

EF-nr.

Aktive klastogener uden metabolisk aktivering

Cytosinarabinosid

147-94-4

205-705-9

Mitomycin C

50-07-7

200-008-6

Klastogener, som kræver metabolisk aktivering

Benzo(a)pyren

50-32-8

200-028-5

Cyclofosfamid

50-18-0

200-015-4

Aneugener

Colchicin

64-86-8

200-598-5

Vinblastin

143-67-9

205-606-0

Negative stoffer

Di-(2-ethylhexyl)phthalat

117-81-7

204-211-0

Nalidixinsyre

389-08-2

206-864-7

Pyren

129-00-0

204-927-3

Natriumchlorid

7647-14-5

231-598-3

B.50.   HUDSENSIBILISERING: ASSAY PÅ LOKALE LYMFEKNUDER: DA

B.50.

HUDSENSIBILISERING: ASSAY PÅ LOKALE LYMFEKNUDER: DA

INDLEDNING

| 1. | OECD's vejledning om testning af kemikalier og EU-testmetoder bliver med mellemrum gennemgået på baggrund af den videnskabelige udvikling, behovet for ny lovgivning og hensynet til dyrevelfærden. Den oprindelige testmetode (TM) (B.42) til bestemmelse af hudsensibilisering i mus, assay på lokale lymfeknuder (LLNA, OECD Test Guideline 429), er blevet revideret (1). En validering af LLNA og en oversigt over det tilknyttede arbejde findes i litteraturen (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). I LLNA anvendes radioisotopisk thymidin eller jod til måling af lymfocytproliferation, og assayet har derfor begrænset anvendelse, når fremstilling, anvendelse eller bortskaffelse af radioaktivitet er problematisk. LLNA: DA (udviklet af Daicel Chemical Industries, Ltd.) er en ikkeradioaktiv modificering af LLNA, der kvantificerer adenosintrifosat (ATP)-indholdet ved hjælp af bioluminescens som indikator for lymfocytproliferation. LLNA: DA-testmetoden er blevet valideret og gennemgået og anbefales af et internationalt peer review-panel, der vurderer, at metoden med visse begrænsninger kan anvendes til at udpege hudsensibiliserende og ikkehudsensibiliserende kemikalier (10) (11) (12) (13). TM'en anvendes til vurdering af kemikaliers (stoffer og blandinger) potentiale for hudsensibilisering i dyr. I kapitel B.6 i dette bilag og i OECD Test Guideline 406 anvendes marsvin, navnlig maksimeringstesten på marsvin og Buehlertesten (14). LLNA (kapitel B.42 i dette bilag, OECD Test Guideline 429) og de to ikkeradioaktive modificeringer, LLNA: DA (kapitel B.50 i dette bilag, OECD Test Guideline 442 A) og LLNA: BrdU-ELISA (kapitel B.51 i dette bilag, OECD Test Guideline 442 B), har alle en fordel frem for marsvinetestene i B.6 og OECD Test Guideline 406 (14) med hensyn til begrænsning og forfinelse af anvendelsen af dyr. |
| --- | --- |

1.

OECD's vejledning om testning af kemikalier og EU-testmetoder bliver med mellemrum gennemgået på baggrund af den videnskabelige udvikling, behovet for ny lovgivning og hensynet til dyrevelfærden. Den oprindelige testmetode (TM) (B.42) til bestemmelse af hudsensibilisering i mus, assay på lokale lymfeknuder (LLNA, OECD Test Guideline 429), er blevet revideret (1). En validering af LLNA og en oversigt over det tilknyttede arbejde findes i litteraturen (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). I LLNA anvendes radioisotopisk thymidin eller jod til måling af lymfocytproliferation, og assayet har derfor begrænset anvendelse, når fremstilling, anvendelse eller bortskaffelse af radioaktivitet er problematisk. LLNA: DA (udviklet af Daicel Chemical Industries, Ltd.) er en ikkeradioaktiv modificering af LLNA, der kvantificerer adenosintrifosat (ATP)-indholdet ved hjælp af bioluminescens som indikator for lymfocytproliferation. LLNA: DA-testmetoden er blevet valideret og gennemgået og anbefales af et internationalt peer review-panel, der vurderer, at metoden med visse begrænsninger kan anvendes til at udpege hudsensibiliserende og ikkehudsensibiliserende kemikalier (10) (11) (12) (13). TM'en anvendes til vurdering af kemikaliers (stoffer og blandinger) potentiale for hudsensibilisering i dyr. I kapitel B.6 i dette bilag og i OECD Test Guideline 406 anvendes marsvin, navnlig maksimeringstesten på marsvin og Buehlertesten (14). LLNA (kapitel B.42 i dette bilag, OECD Test Guideline 429) og de to ikkeradioaktive modificeringer, LLNA: DA (kapitel B.50 i dette bilag, OECD Test Guideline 442 A) og LLNA: BrdU-ELISA (kapitel B.51 i dette bilag, OECD Test Guideline 442 B), har alle en fordel frem for marsvinetestene i B.6 og OECD Test Guideline 406 (14) med hensyn til begrænsning og forfinelse af anvendelsen af dyr.

| 2. | I lighed med LLNA består LLNA: DA i undersøgelse af induktionsfasen i hudsensibilisering og giver kvantitative data, som er velegnede til at vurdere dosis/responsforholdet. Evnen til at påvise hudsensibiliserende stoffer uden at det er nødvendigt at anvende dna-radioaktivt mærkede stoffer, fjerner risikoen for erhvervsmæssig eksponering for radioaktivitet og imødegår problemer med bortskaffelse af affald. Det kan skabe grundlag for øget anvendelse af mus til påvisning af hudsensibiliserende stoffer, hvilket vil mindske anvendelsen af marsvin til test for potentiale for hudsensibilisering (dvs. B.6, OECD Test Guideline 406) (14). |
| --- | --- |

2.

I lighed med LLNA består LLNA: DA i undersøgelse af induktionsfasen i hudsensibilisering og giver kvantitative data, som er velegnede til at vurdere dosis/responsforholdet. Evnen til at påvise hudsensibiliserende stoffer uden at det er nødvendigt at anvende dna-radioaktivt mærkede stoffer, fjerner risikoen for erhvervsmæssig eksponering for radioaktivitet og imødegår problemer med bortskaffelse af affald. Det kan skabe grundlag for øget anvendelse af mus til påvisning af hudsensibiliserende stoffer, hvilket vil mindske anvendelsen af marsvin til test for potentiale for hudsensibilisering (dvs. B.6, OECD Test Guideline 406) (14).

DEFINITIONER

| 3. | De anvendte definitioner er forklaret i tillæg 1. |
| --- | --- |

3.

De anvendte definitioner er forklaret i tillæg 1.

INDLEDENDE OVERVEJELSER OG BEGRÆNSNINGER

| 4. | LLNA: DA er en modificeret LLNA-metode til at udpege potentielle hudsensibiliserende kemikalier med bestemte begrænsninger. Det indebærer ikke nødvendigvis, at LLNA: DA altid skal anvendes i stedet for LLNA eller marsvinetest (dvs. B.6, OECD Test Guideline 406) (14), men snarere, at dette assay er lige så nyttigt og kan anvendes som et alternativ, for hvilket det gælder, at positive og negative resultater sædvanligvis ikke længere kræver yderligere bekræftelse (10) (11). Testlaboratoriet bør inden forsøgets udførelse gennemgå alle foreliggende oplysninger om teststoffet. Sådanne oplysninger omfatter stoffets identitet og kemiske struktur, dets fysisk-kemiske egenskaber, resultaterne af eventuelle andre in vivo- og in vitro-toksicitetsundersøgelser af teststoffet og toksikologiske data for strukturelt beslægtede kemikalier. Disse oplysninger bør tages i betragtning ved vurderingen af, om LLNA: DA er egnet til brug for stoffet (i lyset af begrænsede typer kemikaliers inkompatibilitet med LLNA: DA [se punkt 5]) og som støtte ved valg af dosis. |
| --- | --- |

4.

LLNA: DA er en modificeret LLNA-metode til at udpege potentielle hudsensibiliserende kemikalier med bestemte begrænsninger. Det indebærer ikke nødvendigvis, at LLNA: DA altid skal anvendes i stedet for LLNA eller marsvinetest (dvs. B.6, OECD Test Guideline 406) (14), men snarere, at dette assay er lige så nyttigt og kan anvendes som et alternativ, for hvilket det gælder, at positive og negative resultater sædvanligvis ikke længere kræver yderligere bekræftelse (10) (11). Testlaboratoriet bør inden forsøgets udførelse gennemgå alle foreliggende oplysninger om teststoffet. Sådanne oplysninger omfatter stoffets identitet og kemiske struktur, dets fysisk-kemiske egenskaber, resultaterne af eventuelle andre in vivo- og in vitro-toksicitetsundersøgelser af teststoffet og toksikologiske data for strukturelt beslægtede kemikalier. Disse oplysninger bør tages i betragtning ved vurderingen af, om LLNA: DA er egnet til brug for stoffet (i lyset af begrænsede typer kemikaliers inkompatibilitet med LLNA: DA [se punkt 5]) og som støtte ved valg af dosis.

| 5. | LLNA: DA er en in vivo-metode og eliminerer således ikke brugen af dyr til vurdering af allergisk kontaktsensibiliserende aktivitet. Den giver imidlertid mulighed for at mindske antallet af dyr til dette formål i forhold til marsvinetest (B.6, OECD Test Guideline 406) (14). LLNA: repræsenterer desuden en væsentligt mere sofistikeret måde (mindre smerte og angst) at anvende dyr til allergisk kontaktsensibiliseringstest på, idet LLNA: DA i modsætning til B.6 og OECD Test Guideline 406 ikke kræver, at der fremkaldes challenge-inducerede dermale hypersensivitetsreaktioner. På trods af LLNA: DA-metodens fordele frem for B.6 og OECD Test Guideline 406 (14) er der visse begrænsninger, som kan gøre B.6 eller OECD Test Guideline 406 nødvendige, f.eks. test af visse metaller, falsk positive resultater for visse hudirriterende stoffer [såsom visse overfladeaktive kemikalier] (6) (1 og kapitel B.42 i dette bilag) eller teststoffets opløselighed). Kemiske stofgrupper eller stoffer, der indeholder funktionelle grupper, som kan skabe uafklarede sammenhænge (confounders) (16), kan desuden gøre marsvinetest nødvendige (dvs. B.6, OECD Test Guideline 406 (14). Det anbefales, at de begrænsninger, der er blevet identificeret for LLNA (1 og kapitel B.42 i dette bilag), ligeledes finder anvendelse for LLNA: DA (10). Derudover er det muligvis ikke hensigtsmæssig at anvende LLNA: DA til test af stoffer, der påvirker ATP-niveauet (f.eks. stoffer, der fungerer som ATP-inhibitorer), eller stoffer der påvirker den nøjagtige måling af intracellulær ATP (f.eks. forekomst af ATP-nedbrydende enzymer, forekomst af ekstracellulær ATP i lymfeknuden). Bortset fra disse identificerede begrænsninger bør LLNA: DA kunne anvendes til testning af alle stoffer, medmindre disse stoffer har egenskaber, som kan have indflydelse på LLNA: DA-metodens nøjagtighed. Der skal desuden tages hensyn til muligheden for tvetydige positive resultater ved stimulationsindeks (SI)-værdier på mellem 1,8 og 2,5 (se punkt 31-32). Dette er baseret på valideringsdatabasen over 44 stoffer med et SI på 1,8 eller derover (se punkt 6), for hvilke LLNA: DA identificerede alle 32 LLNA-sensibiliserende stoffer korrekt, men identificerede tre ud af 12 LLNA-ikkesensibiliserende stoffer med SI-værdier på mellem 1,8 og 2,5 (dvs. tvetydige positive resultater) forkert (10). Da det samme datasæt blev anvendt til fastsættelse af SI-værdierne og beregning af testens prædiktionsevne, kan de anførte resultater imidlertid være en overvurdering af den reelle prædiktionsevne. |
| --- | --- |

5.

LLNA: DA er en in vivo-metode og eliminerer således ikke brugen af dyr til vurdering af allergisk kontaktsensibiliserende aktivitet. Den giver imidlertid mulighed for at mindske antallet af dyr til dette formål i forhold til marsvinetest (B.6, OECD Test Guideline 406) (14). LLNA: repræsenterer desuden en væsentligt mere sofistikeret måde (mindre smerte og angst) at anvende dyr til allergisk kontaktsensibiliseringstest på, idet LLNA: DA i modsætning til B.6 og OECD Test Guideline 406 ikke kræver, at der fremkaldes challenge-inducerede dermale hypersensivitetsreaktioner. På trods af LLNA: DA-metodens fordele frem for B.6 og OECD Test Guideline 406 (14) er der visse begrænsninger, som kan gøre B.6 eller OECD Test Guideline 406 nødvendige, f.eks. test af visse metaller, falsk positive resultater for visse hudirriterende stoffer [såsom visse overfladeaktive kemikalier] (6) (1 og kapitel B.42 i dette bilag) eller teststoffets opløselighed). Kemiske stofgrupper eller stoffer, der indeholder funktionelle grupper, som kan skabe uafklarede sammenhænge (confounders) (16), kan desuden gøre marsvinetest nødvendige (dvs. B.6, OECD Test Guideline 406 (14). Det anbefales, at de begrænsninger, der er blevet identificeret for LLNA (1 og kapitel B.42 i dette bilag), ligeledes finder anvendelse for LLNA: DA (10). Derudover er det muligvis ikke hensigtsmæssig at anvende LLNA: DA til test af stoffer, der påvirker ATP-niveauet (f.eks. stoffer, der fungerer som ATP-inhibitorer), eller stoffer der påvirker den nøjagtige måling af intracellulær ATP (f.eks. forekomst af ATP-nedbrydende enzymer, forekomst af ekstracellulær ATP i lymfeknuden). Bortset fra disse identificerede begrænsninger bør LLNA: DA kunne anvendes til testning af alle stoffer, medmindre disse stoffer har egenskaber, som kan have indflydelse på LLNA: DA-metodens nøjagtighed. Der skal desuden tages hensyn til muligheden for tvetydige positive resultater ved stimulationsindeks (SI)-værdier på mellem 1,8 og 2,5 (se punkt 31-32). Dette er baseret på valideringsdatabasen over 44 stoffer med et SI på 1,8 eller derover (se punkt 6), for hvilke LLNA: DA identificerede alle 32 LLNA-sensibiliserende stoffer korrekt, men identificerede tre ud af 12 LLNA-ikkesensibiliserende stoffer med SI-værdier på mellem 1,8 og 2,5 (dvs. tvetydige positive resultater) forkert (10). Da det samme datasæt blev anvendt til fastsættelse af SI-værdierne og beregning af testens prædiktionsevne, kan de anførte resultater imidlertid være en overvurdering af den reelle prædiktionsevne.

TESTMETODENS PRINCIP

| 6. | Det tilgrundliggende princip for LLNA: DA består i, at den sensibiliserende agens inducerer en lymfocytproliferation i de lymfeknuder, som dræner påføringsstedet for teststoffet. Denne proliferation er proportional med den påførte dosis og med allergenets styrke og gør det let at få et kvantitativt mål for sensibiliseringen. Proliferationen måles ved at sammenholde den gennemsnitlige proliferation i hver forsøgsgruppe med den gennemsnitlige proliferation i vehikelkontrolgruppen (VC-gruppen). Forholdet mellem den gennemsnitlige proliferation i den enkelte behandlingsgruppe og proliferationen i den sideløbende VC-gruppe kaldes stimulationsindekset (SI) og skal være mindst 1,8, før teststoffet kan vurderes nærmere som en potentielt hudsensibiliserende agens. De her beskrevne metoder bygger på anvendelse af måling af ATP-indhold ved hjælp af bioluminescens (vides at korrelere med antal levende celler) (17) til måling af øget celleproliferation i de drænende aurikulære lymfeknuder (18) (19). Ved bioluminescensmetoden anvendes luciferaseenzymet til at katalysere dannelsen af lys fra ATP og luciferin på grundlag af følgende reaktion:

  ATP + luciferin + O
  2

  Oxyluciferin + AMP + PPi
  - CO
  2 + lys

  Den udsendte lysintensitet er lineært forbundet til ATP-koncentrationen og måles ved hjælp af et luminometer. Luciferin-luciferaseassayet er en følsom metode til kvantificering af ATP, der benyttes til en lang række formål (20). |
| --- | --- |

6.

Det tilgrundliggende princip for LLNA: DA består i, at den sensibiliserende agens inducerer en lymfocytproliferation i de lymfeknuder, som dræner påføringsstedet for teststoffet. Denne proliferation er proportional med den påførte dosis og med allergenets styrke og gør det let at få et kvantitativt mål for sensibiliseringen. Proliferationen måles ved at sammenholde den gennemsnitlige proliferation i hver forsøgsgruppe med den gennemsnitlige proliferation i vehikelkontrolgruppen (VC-gruppen). Forholdet mellem den gennemsnitlige proliferation i den enkelte behandlingsgruppe og proliferationen i den sideløbende VC-gruppe kaldes stimulationsindekset (SI) og skal være mindst 1,8, før teststoffet kan vurderes nærmere som en potentielt hudsensibiliserende agens. De her beskrevne metoder bygger på anvendelse af måling af ATP-indhold ved hjælp af bioluminescens (vides at korrelere med antal levende celler) (17) til måling af øget celleproliferation i de drænende aurikulære lymfeknuder (18) (19). Ved bioluminescensmetoden anvendes luciferaseenzymet til at katalysere dannelsen af lys fra ATP og luciferin på grundlag af følgende reaktion:

ATP + luciferin + O
  2
  Image
  Oxyluciferin + AMP + PPi
  - CO
  2 + lys

ATP

luciferin

O

2

Oxyluciferin

AMP

PPi

CO

2

lys

Den udsendte lysintensitet er lineært forbundet til ATP-koncentrationen og måles ved hjælp af et luminometer. Luciferin-luciferaseassayet er en følsom metode til kvantificering af ATP, der benyttes til en lang række formål (20).

BESKRIVELSE AF ASSAYET

Valg af dyreart

Valg af dyreart

| 7. | Mus må foretrækkes til denne test. Valideringsundersøgelser for LLNA: DA blev udelukkende udført med CBA/J-stammen, som derfor betragtes som den foretrukne stamme (12) (13). Der anvendes unge voksne hunmus, som ikke har født og ikke er drægtige. Ved forsøgets begyndelse skal dyrene være 8-12 uger gamle, og vægtvariationen mellem de anvendte dyr skal være mindst mulig og må ikke overstige 20 % af gennemsnitsvægten. Alternativt kan der anvendes andre stammer og handyr, når der er genereret tilstrækkelige data til at dokumentere, at der ikke er væsentlige stamme- og/eller kønsspecifikke forskelle i LLNA: DA-respons. |
| --- | --- |

7.

Mus må foretrækkes til denne test. Valideringsundersøgelser for LLNA: DA blev udelukkende udført med CBA/J-stammen, som derfor betragtes som den foretrukne stamme (12) (13). Der anvendes unge voksne hunmus, som ikke har født og ikke er drægtige. Ved forsøgets begyndelse skal dyrene være 8-12 uger gamle, og vægtvariationen mellem de anvendte dyr skal være mindst mulig og må ikke overstige 20 % af gennemsnitsvægten. Alternativt kan der anvendes andre stammer og handyr, når der er genereret tilstrækkelige data til at dokumentere, at der ikke er væsentlige stamme- og/eller kønsspecifikke forskelle i LLNA: DA-respons.

Miljøbetingelser og fodring

Miljøbetingelser og fodring

| 8. | Mus bør anbringes i grupper (21), medmindre der fremlægges et fyldestgørende videnskabeligt rationale for at holde dem i hvert sit bur. Temperaturen i forsøgsdyrrummet skal være 22 ± 3 °C. Den relative luftfugtighed skal være mindst 30 % og helst ikke over 70 % bortset fra under rengøring af lokalet, men 50-60 % skal tilsigtes. Belysningen skal være kunstig og bestå af 12 timers lys og 12 timers mørke. Som foder kan anvendes sædvanligt laboratoriefoder med fri adgang til drikkevand. |
| --- | --- |

8.

Mus bør anbringes i grupper (21), medmindre der fremlægges et fyldestgørende videnskabeligt rationale for at holde dem i hvert sit bur. Temperaturen i forsøgsdyrrummet skal være 22 ± 3 °C. Den relative luftfugtighed skal være mindst 30 % og helst ikke over 70 % bortset fra under rengøring af lokalet, men 50-60 % skal tilsigtes. Belysningen skal være kunstig og bestå af 12 timers lys og 12 timers mørke. Som foder kan anvendes sædvanligt laboratoriefoder med fri adgang til drikkevand.

Forberedelse af dyrene

Forberedelse af dyrene

| 9. | Dyrene udtages på tilfældig måde, mærkes, så de enkelte dyr kan identificeres (men ikke med nogen form for øremærkning), og holdes i burene i mindst fem døgn forud for doseringen, så de kan akklimatisere sig til forsøgsbetingelserne. Før behandlingen påbegyndes, undersøges alle dyr for at sikre, at de er uden observerbare hudlæsioner. |
| --- | --- |

9.

Dyrene udtages på tilfældig måde, mærkes, så de enkelte dyr kan identificeres (men ikke med nogen form for øremærkning), og holdes i burene i mindst fem døgn forud for doseringen, så de kan akklimatisere sig til forsøgsbetingelserne. Før behandlingen påbegyndes, undersøges alle dyr for at sikre, at de er uden observerbare hudlæsioner.

Fremstilling af forsøgsopløsninger

Fremstilling af forsøgsopløsninger

| 10. | Faste stoffer opløses eller opslæmmes i opløsningsmidler/bærestoffer og fortyndes eventuelt inden påføring på musens øre. Flydende kemikalier kan enten gives ufortyndet eller fortyndes først. Uopløselige kemikalier såsom dem, der generelt anvendes i medicinsk udstyr, underkastes en stor ekstraktion med passende opløsningsmiddel for at afdække alle ekstraherbare bestanddele til testning inden påføring på musens øre. Teststofferne fremstilles dagligt, medmindre stabilitetsdata viser, at opbevaring er acceptabel. |
| --- | --- |

10.

Faste stoffer opløses eller opslæmmes i opløsningsmidler/bærestoffer og fortyndes eventuelt inden påføring på musens øre. Flydende kemikalier kan enten gives ufortyndet eller fortyndes først. Uopløselige kemikalier såsom dem, der generelt anvendes i medicinsk udstyr, underkastes en stor ekstraktion med passende opløsningsmiddel for at afdække alle ekstraherbare bestanddele til testning inden påføring på musens øre. Teststofferne fremstilles dagligt, medmindre stabilitetsdata viser, at opbevaring er acceptabel.

Pålidelighedskontrol

Pålidelighedskontrol

| 11. | Positive kontrolstoffer (PC) anvendes til at godtgøre, at assayets præstationer er tilstrækkelige ved at reagere med tilstrækkelig følsomhed og reproducerbarhed på et sensibiliserende teststof, hvor responsens størrelsesorden er velkarakteriseret. Det anbefales at anvende sideløbende positiv kontrol, fordi det godtgør, at laboratoriets kompetence er tilstrækkelig til, at assayet bliver vellykket, og gør det muligt at bedømme reproducerbarheden og sammenligneligheden inden for og mellem laboratorier. Nogle tilsynsmyndigheder stiller desuden krav om en positiv kontrol for den enkelte undersøgelse, og brugere opfordres derfor til at henvende sig til de relevante myndigheder inden udførelsen af LLNA. DA. Det anbefales derfor at foretage sideløbende positiv kontrol regelmæssigt, således at der ikke bliver behov for yderligere dyreforsøg for at opfylde eventuelle krav ved regelmæssig brug af positiv kontrol (se punkt 12). Den positive kontrol skal fremkalde en positiv LLNA: DA-respons ved det eksponeringsniveau, som forventes at give en stigning i SI, som er mere end 1,8 større end i den negative kontrolgruppe. PC-dosis vælges, således at den ikke forårsager for stærk hudirritation eller systemisk toksicitet, og således at induktionen er reproducerbar, men ikke for voldsom (dvs. et SI på > 10 er for højt). De foretrukne positive kontrolstoffer er 25 % hexylkanelaldehyd (Chemical Abstracts Service [CAS-] nr. 101-86-0) og 25 % eugenol (CAS-nr. 97-53-0) i acetone: olivenolie (4:1, v/v). Under visse omstændigheder vil andre positive kontrolstoffer, der opfylder de ovennævnte kriterier, kunne anvendes, såfremt valget heraf kan begrundes. |
| --- | --- |

11.

Positive kontrolstoffer (PC) anvendes til at godtgøre, at assayets præstationer er tilstrækkelige ved at reagere med tilstrækkelig følsomhed og reproducerbarhed på et sensibiliserende teststof, hvor responsens størrelsesorden er velkarakteriseret. Det anbefales at anvende sideløbende positiv kontrol, fordi det godtgør, at laboratoriets kompetence er tilstrækkelig til, at assayet bliver vellykket, og gør det muligt at bedømme reproducerbarheden og sammenligneligheden inden for og mellem laboratorier. Nogle tilsynsmyndigheder stiller desuden krav om en positiv kontrol for den enkelte undersøgelse, og brugere opfordres derfor til at henvende sig til de relevante myndigheder inden udførelsen af LLNA. DA. Det anbefales derfor at foretage sideløbende positiv kontrol regelmæssigt, således at der ikke bliver behov for yderligere dyreforsøg for at opfylde eventuelle krav ved regelmæssig brug af positiv kontrol (se punkt 12). Den positive kontrol skal fremkalde en positiv LLNA: DA-respons ved det eksponeringsniveau, som forventes at give en stigning i SI, som er mere end 1,8 større end i den negative kontrolgruppe. PC-dosis vælges, således at den ikke forårsager for stærk hudirritation eller systemisk toksicitet, og således at induktionen er reproducerbar, men ikke for voldsom (dvs. et SI på > 10 er for højt). De foretrukne positive kontrolstoffer er 25 % hexylkanelaldehyd (Chemical Abstracts Service [CAS-] nr. 101-86-0) og 25 % eugenol (CAS-nr. 97-53-0) i acetone: olivenolie (4:1, v/v). Under visse omstændigheder vil andre positive kontrolstoffer, der opfylder de ovennævnte kriterier, kunne anvendes, såfremt valget heraf kan begrundes.

| 12. | Selv om det anbefales at anvende en sideløbende PC-gruppe, kan der være situationer, hvor regelmæssig testning (dvs. med ≤ 6 måneders interval) af det positive kontrolstof kan være tilstrækkeligt for laboratorier, der jævnligt udfører LLNA: DA (dvs. udfører LLNA: DA mindst én gang om måneden) og har oprettet en historisk PC-database, der påviser laboratoriets evne til at skabe reproducerbare og nøjagtige resultater med positive kontroller. Laboratoriet kan påvise, at det har tilstrækkelig kompetence til at udføre LLNA: DA ved at opnå sammenhængende og positive resultater med den positive kontrol i mindst 10 uafhængige forsøg udført inden for en rimelig periode (dvs. inden for et år). |
| --- | --- |

12.

Selv om det anbefales at anvende en sideløbende PC-gruppe, kan der være situationer, hvor regelmæssig testning (dvs. med ≤ 6 måneders interval) af det positive kontrolstof kan være tilstrækkeligt for laboratorier, der jævnligt udfører LLNA: DA (dvs. udfører LLNA: DA mindst én gang om måneden) og har oprettet en historisk PC-database, der påviser laboratoriets evne til at skabe reproducerbare og nøjagtige resultater med positive kontroller. Laboratoriet kan påvise, at det har tilstrækkelig kompetence til at udføre LLNA: DA ved at opnå sammenhængende og positive resultater med den positive kontrol i mindst 10 uafhængige forsøg udført inden for en rimelig periode (dvs. inden for et år).

| 13. | Der skal altid anvendes en sideløbende PC-gruppe i tilfælde af en ændring af LLNA: DA (f.eks. ændring af uddannet personale, ændring af testmaterialer og/eller reagenser, ændring af testudstyr, ændring af kildedyr), og disse ændringer skal dokumenteres i laboratorierapporter. Der skal tages hensyn til disse ændringers indvirkning på tilstrækkeligheden af den allerede oprettede historiske database, når det besluttes, om det er nødvendigt at oprette en ny historisk database for at dokumentere, at PC-resultaterne er sammenhængende. |
| --- | --- |

13.

Der skal altid anvendes en sideløbende PC-gruppe i tilfælde af en ændring af LLNA: DA (f.eks. ændring af uddannet personale, ændring af testmaterialer og/eller reagenser, ændring af testudstyr, ændring af kildedyr), og disse ændringer skal dokumenteres i laboratorierapporter. Der skal tages hensyn til disse ændringers indvirkning på tilstrækkeligheden af den allerede oprettede historiske database, når det besluttes, om det er nødvendigt at oprette en ny historisk database for at dokumentere, at PC-resultaterne er sammenhængende.

| 14. | Forsøgslederen skal være opmærksom på, at afgørelsen om at udføre en PC-undersøgelse regelmæssigt i stedet for samtidigt har indflydelse på, om negative undersøgelsesresultater, der er opnået uden en sideløbende positiv kontrol i perioden mellem hver regelmæssige PC-undersøgelse, er tilstrækkelige og kan accepteres. Hvis der f.eks. opnås et falsk negativt resultat i den regelmæssige PC-undersøgelse, kan negative testresultater, der er opnået i perioden mellem den seneste godkendte PC-undersøgelse og den ikke godkendte regelmæssige PC-undersøgelse, drages i tvivl. Disse konsekvenser bør overvejes nøje, når det besluttes, om der skal udføres sideløbende positive kontroller, eller om der kun skal udføres regelmæssige positive kontroller. Det skal også overvejes at anvende færre dyr i den sideløbende PC-gruppe, når det er videnskabeligt begrundet, og hvis laboratoriet på grundlag af laboratoriespecifikke historiske data påviser, at der kan anvendes færre mus (22). |
| --- | --- |

14.

Forsøgslederen skal være opmærksom på, at afgørelsen om at udføre en PC-undersøgelse regelmæssigt i stedet for samtidigt har indflydelse på, om negative undersøgelsesresultater, der er opnået uden en sideløbende positiv kontrol i perioden mellem hver regelmæssige PC-undersøgelse, er tilstrækkelige og kan accepteres. Hvis der f.eks. opnås et falsk negativt resultat i den regelmæssige PC-undersøgelse, kan negative testresultater, der er opnået i perioden mellem den seneste godkendte PC-undersøgelse og den ikke godkendte regelmæssige PC-undersøgelse, drages i tvivl. Disse konsekvenser bør overvejes nøje, når det besluttes, om der skal udføres sideløbende positive kontroller, eller om der kun skal udføres regelmæssige positive kontroller. Det skal også overvejes at anvende færre dyr i den sideløbende PC-gruppe, når det er videnskabeligt begrundet, og hvis laboratoriet på grundlag af laboratoriespecifikke historiske data påviser, at der kan anvendes færre mus (22).

| 15. | Skønt det positive kontrolstof bør afprøves i et vehikel, som vides at fremkalde ensartet respons (f.eks. acetone: olivenolie, 4:1, v/v), kan det i visse godkendelsessituationer desuden være nødvendigt med testning i andre vehikler end standardvehiklet (med en klinisk-kemisk relevant formulering) (23). Hvis den sideløbende positive kontrol foretages i et andet vehikel end teststoffet, skal der foretages en særskilt vehikelkontrol for den sideløbende positive kontrol. |
| --- | --- |

15.

Skønt det positive kontrolstof bør afprøves i et vehikel, som vides at fremkalde ensartet respons (f.eks. acetone: olivenolie, 4:1, v/v), kan det i visse godkendelsessituationer desuden være nødvendigt med testning i andre vehikler end standardvehiklet (med en klinisk-kemisk relevant formulering) (23). Hvis den sideløbende positive kontrol foretages i et andet vehikel end teststoffet, skal der foretages en særskilt vehikelkontrol for den sideløbende positive kontrol.

| 16. | Ved vurdering af teststoffer af en specifik kemisk klasse eller responser kan referencestoffer også anvendes til at vise, at testmetoden kan anvendes til at påvise denne type stoffers potentiale for hudsensibilisering. Egnede referencestoffer skal have følgende egenskaber:






  — | strukturel og funktionel lighed med den klasse, som det teststof, der testes, tilhører |
| --- | --- | --- |

16.

Ved vurdering af teststoffer af en specifik kemisk klasse eller responser kan referencestoffer også anvendes til at vise, at testmetoden kan anvendes til at påvise denne type stoffers potentiale for hudsensibilisering. Egnede referencestoffer skal have følgende egenskaber:

—

strukturel og funktionel lighed med den klasse, som det teststof, der testes, tilhører

| — | kendte fysisk/kemiske egenskaber |
| --- | --- |

—

kendte fysisk/kemiske egenskaber

| — | støttedata fra LLNA: DA |
| --- | --- |

—

støttedata fra LLNA: DA

| — | støttedata fra andre dyremodeller og/eller fra mennesker. |
| --- | --- |

—

støttedata fra andre dyremodeller og/eller fra mennesker.

TESTPROCEDURE

Antal dyr og dosisniveauer

Antal dyr og dosisniveauer

| 17. | Der anvendes mindst fire dyr i hver dosisgruppe, mindst tre forskellige koncentrationer af teststoffet, en sideløbende NC-gruppe, som udelukkende behandles med det til teststoffet anvendte vehikel, og en PC-gruppe (sideløbende eller nylig, afhængigt af laboratoriets politik, jf. punkt 11-15). Det bør overvejes at teste flere doser af det positive kontrolstof, navnlig ved periodisk testning af det positive kontrolstof. Bortset fra behandlingen med prøvestof behandles dyrene i kontrolgrupperne på samme måde som dyrene i behandlingsgrupperne. |
| --- | --- |

17.

Der anvendes mindst fire dyr i hver dosisgruppe, mindst tre forskellige koncentrationer af teststoffet, en sideløbende NC-gruppe, som udelukkende behandles med det til teststoffet anvendte vehikel, og en PC-gruppe (sideløbende eller nylig, afhængigt af laboratoriets politik, jf. punkt 11-15). Det bør overvejes at teste flere doser af det positive kontrolstof, navnlig ved periodisk testning af det positive kontrolstof. Bortset fra behandlingen med prøvestof behandles dyrene i kontrolgrupperne på samme måde som dyrene i behandlingsgrupperne.

| 18. | Dosering og valg af vehikel baseres på anbefalingerne i henvisning (2) og (24). Dosisniveauerne vælges normalt af koncentrationsserier på 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % osv. Der skal der fremlægges et fyldestgørende videnskabeligt rationale for valget af de anvendte koncentrationsserier. Alle foreliggende toksikologiske oplysninger (f.eks. vedrørende akut toksicitet og hudirritation) og strukturelle og fysisk-kemiske oplysninger om det pågældende teststof (og/eller strukturelt beslægtede stoffer) tages i betragtning, således at der vælges tre på hinanden følgende koncentrationer, hvoraf den højeste er den, der giver størst mulig eksponering uden systemisk toksicitet og/eller for stærk lokal hudirritation (24) (25). Såfremt disse oplysninger ikke foreligger, kan det være nødvendigt at foretage en prescreening (se punkt 21-24). |
| --- | --- |

18.

Dosering og valg af vehikel baseres på anbefalingerne i henvisning (2) og (24). Dosisniveauerne vælges normalt af koncentrationsserier på 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % osv. Der skal der fremlægges et fyldestgørende videnskabeligt rationale for valget af de anvendte koncentrationsserier. Alle foreliggende toksikologiske oplysninger (f.eks. vedrørende akut toksicitet og hudirritation) og strukturelle og fysisk-kemiske oplysninger om det pågældende teststof (og/eller strukturelt beslægtede stoffer) tages i betragtning, således at der vælges tre på hinanden følgende koncentrationer, hvoraf den højeste er den, der giver størst mulig eksponering uden systemisk toksicitet og/eller for stærk lokal hudirritation (24) (25). Såfremt disse oplysninger ikke foreligger, kan det være nødvendigt at foretage en prescreening (se punkt 21-24).

| 19. | Vehiklet må ikke indvirke på eller fordreje testresultatet og vælges, således at testkoncentrationer og opløselighed maksimeres, samtidig med at den fremstillede opløsning/suspension er egnet til påføring af tesstoffet. De anbefalede vehikler er acetone: olivenolie (4:1 v/v), N,N-dimethylformamid, methylethylketon, propylenglycol og dimethylsulphoxid (6), men andre kan anvendes, hvis der fremlægges et fyldestgørende videnskabeligt rationale derfor. I visse situationer kan det som yderligere kontrol være nødvendigt med et klinisk relevant opløsningsmiddel eller den formulering, hvori teststoffet markedsføres. Man må specielt være opmærksom på, at vehikelsystemet bør indeholde hydrofile teststoffer, som befugter huden og ikke straks løber af, ved at inkorporere egnede opløsningsmidler (f.eks. 1 % Pluronic® L92). Vehikler kun bestående af vand bør således undgås. |
| --- | --- |

19.

Vehiklet må ikke indvirke på eller fordreje testresultatet og vælges, således at testkoncentrationer og opløselighed maksimeres, samtidig med at den fremstillede opløsning/suspension er egnet til påføring af tesstoffet. De anbefalede vehikler er acetone: olivenolie (4:1 v/v), N,N-dimethylformamid, methylethylketon, propylenglycol og dimethylsulphoxid (6), men andre kan anvendes, hvis der fremlægges et fyldestgørende videnskabeligt rationale derfor. I visse situationer kan det som yderligere kontrol være nødvendigt med et klinisk relevant opløsningsmiddel eller den formulering, hvori teststoffet markedsføres. Man må specielt være opmærksom på, at vehikelsystemet bør indeholde hydrofile teststoffer, som befugter huden og ikke straks løber af, ved at inkorporere egnede opløsningsmidler (f.eks. 1 % Pluronic® L92). Vehikler kun bestående af vand bør således undgås.

| 20. | Behandling af lymfeknuder fra hver enkelt mus gør det muligt at vurdere variationen mellem dyr indbyrdes og at foretage en statistisk sammenligning af forskellen mellem teststoffet og målinger af VC-gruppen (se punkt 33). Det er desuden muligt at vurdere muligheden for at reducere antallet af mus i PC-gruppen, når der indsamles data for de enkelte dyr (22). Nogle tilsynsmyndigheder stilles desuden krav om indsamling af data for de enkelte dyr. Regelmæssig indsamling af data for de enkelte dyr øger dyrevelfærden, idet man undgår gentagelse af forsøg, som ville være nødvendige, hvis tilsynsmyndigheder på et senere tidspunkt stiller andre krav til de teststofresultater, der oprindeligt blev indsamlet på én måde (f.eks. på grundlag af poolede data for dyr), (f.eks. krav om data for de enkelte dyr). |
| --- | --- |

20.

Behandling af lymfeknuder fra hver enkelt mus gør det muligt at vurdere variationen mellem dyr indbyrdes og at foretage en statistisk sammenligning af forskellen mellem teststoffet og målinger af VC-gruppen (se punkt 33). Det er desuden muligt at vurdere muligheden for at reducere antallet af mus i PC-gruppen, når der indsamles data for de enkelte dyr (22). Nogle tilsynsmyndigheder stilles desuden krav om indsamling af data for de enkelte dyr. Regelmæssig indsamling af data for de enkelte dyr øger dyrevelfærden, idet man undgår gentagelse af forsøg, som ville være nødvendige, hvis tilsynsmyndigheder på et senere tidspunkt stiller andre krav til de teststofresultater, der oprindeligt blev indsamlet på én måde (f.eks. på grundlag af poolede data for dyr), (f.eks. krav om data for de enkelte dyr).

Prescreening

Prescreening

| 21. | Hvis der ikke foreligger tilstrækkelige oplysninger til at bestemme højeste dosis, der skal testes (se punkt 18), foretages en prescreening for at definere det passende dosisniveau, der skal testes i LLNA: DA. Formålet med prescreeningen er at få hjælp til at vælge det maksimale dosisniveau, der skal anvendes i LLNA: DA-hovedundersøgelsen, hvis der ikke foreligger oplysninger om den koncentration, der inducerer systemisk toksicitet (se punkt 24) og/eller for stærk lokal hudirritation (se punkt 23). Det maksimale dosisniveau, der testes, er 100 % af teststoffet for væsker eller den højest mulige koncentration for faste stoffer eller opslæmninger. |
| --- | --- |

21.

Hvis der ikke foreligger tilstrækkelige oplysninger til at bestemme højeste dosis, der skal testes (se punkt 18), foretages en prescreening for at definere det passende dosisniveau, der skal testes i LLNA: DA. Formålet med prescreeningen er at få hjælp til at vælge det maksimale dosisniveau, der skal anvendes i LLNA: DA-hovedundersøgelsen, hvis der ikke foreligger oplysninger om den koncentration, der inducerer systemisk toksicitet (se punkt 24) og/eller for stærk lokal hudirritation (se punkt 23). Det maksimale dosisniveau, der testes, er 100 % af teststoffet for væsker eller den højest mulige koncentration for faste stoffer eller opslæmninger.

| 22. | Prescreeningen foretages ved samme betingelser som for LLNA: DA-hovedundersøgelsen, bortset fra at der ikke foretages en vurdering af lymfeknudeproliferationen, og der kan anvendes færre dyr til hver enkel dosisgruppe. Det foreslås at anvende et eller to dyr til hver enkel dosisgruppe. Alle mus observeres dagligt, og det registreres, om der optræder kliniske symptomer på systemisk toksicitet eller lokal irritation på påføringsstedet. Kropsvægten registreres inden forsøget og ved afslutning af forsøget (dag 8). Begge ører på de enkelte mus observeres for erytem, der registreres med en scoreværdi i tabel 1 (25). Der foretages målinger af øretykkelsen med en tykkelsesmåler (f.eks. et digitalt mikrometer eller en Peacock Dial-tykkelsesmåler) på dag 1 (inden administration af dosis), på dag 3 (ca. 48 timer efter den første dosis), på dag 7 (24 timer før afslutning) og på dag 8. På dag 8 kan øretykkelsen desuden bestemmes ved hjælp af øremærkevægtbestemmelse, der foretages, efter at dyrene er blevet humant aflivet. For stærk lokal hudirritation angives med en erytemscore på ≥ 3 og/eller en forøgelse af øretykkelsen på ≥ 25 % på måledagen (26) (27). Den højeste dosis i LLNA: DA-hovedundersøgelsen skal være den næsthøjeste dosis i prescreeningskoncentrationsserien (se punkt 18), som ikke inducerer systemisk toksicitet og/eller for stærk lokal hudirritation.

  Tabel 1


  Erytemscorer







  Observation | Score |
| --- | --- | --- |
| Intet erytem | 0 |
| Meget let erytem (knapt diagnosticerbart) | 1 |
| Veldefineret erytem | 2 |
| Moderat til svært erytem | 3 |
| Svært erytem (oksekødsfarvet) til escharadannelse, som umuliggør klassificering af erytemet | 4 |

22.

Prescreeningen foretages ved samme betingelser som for LLNA: DA-hovedundersøgelsen, bortset fra at der ikke foretages en vurdering af lymfeknudeproliferationen, og der kan anvendes færre dyr til hver enkel dosisgruppe. Det foreslås at anvende et eller to dyr til hver enkel dosisgruppe. Alle mus observeres dagligt, og det registreres, om der optræder kliniske symptomer på systemisk toksicitet eller lokal irritation på påføringsstedet. Kropsvægten registreres inden forsøget og ved afslutning af forsøget (dag 8). Begge ører på de enkelte mus observeres for erytem, der registreres med en scoreværdi i tabel 1 (25). Der foretages målinger af øretykkelsen med en tykkelsesmåler (f.eks. et digitalt mikrometer eller en Peacock Dial-tykkelsesmåler) på dag 1 (inden administration af dosis), på dag 3 (ca. 48 timer efter den første dosis), på dag 7 (24 timer før afslutning) og på dag 8. På dag 8 kan øretykkelsen desuden bestemmes ved hjælp af øremærkevægtbestemmelse, der foretages, efter at dyrene er blevet humant aflivet. For stærk lokal hudirritation angives med en erytemscore på ≥ 3 og/eller en forøgelse af øretykkelsen på ≥ 25 % på måledagen (26) (27). Den højeste dosis i LLNA: DA-hovedundersøgelsen skal være den næsthøjeste dosis i prescreeningskoncentrationsserien (se punkt 18), som ikke inducerer systemisk toksicitet og/eller for stærk lokal hudirritation.

Tabel 1

Tabel 1

Erytemscorer

Erytemscorer

Observation

Score

Intet erytem

0

Meget let erytem (knapt diagnosticerbart)

1

Veldefineret erytem

2

Moderat til svært erytem

3

Svært erytem (oksekødsfarvet) til escharadannelse, som umuliggør klassificering af erytemet

4

| 23. | Ud over en forøgelse af øretykkelsen på 25 % (26) (27) er en statistisk signifikant forøgelse af øretykkelsen hos de eksponerede mus sammenlignet med kontrolmusene også blevet anvendt til at identificere lokalirriterende stoffer i LLNA (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Selv om statistisk signifikante forøgelser kan forekomme, når øretykkelsen er under 25 %, er de ikke blevet specifikt forbundet med for stærk irritation (30) (31) (32) (33) (34). |
| --- | --- |

23.

Ud over en forøgelse af øretykkelsen på 25 % (26) (27) er en statistisk signifikant forøgelse af øretykkelsen hos de eksponerede mus sammenlignet med kontrolmusene også blevet anvendt til at identificere lokalirriterende stoffer i LLNA (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Selv om statistisk signifikante forøgelser kan forekomme, når øretykkelsen er under 25 %, er de ikke blevet specifikt forbundet med for stærk irritation (30) (31) (32) (33) (34).

| 24. | Følgende kliniske observationer kan indikere systemisk toksicitet (35), hvis de anvendes som led i en integreret vurdering, og kan således indikere det maksimale dosisniveau, der kan anvendes i LLNA: DA-hovedundersøgelsen: ændringer i nervesystemets funktion (f.eks. hårrejsning, ataxi, rystelser og kramper), adfærdsændringer (f.eks. aggressivitet, ændringer i soigneringsaktiviteten, markant ændring i aktivitetsniveauet), ændringer i respirationsmønstre (f.eks. ændringer i respirationshyppigheden og -intensiteten såsom åndenød, snappende respiration og rallelyd) samt ændringer i føde- og vandindtagelsen. Derudover skal tegn på apati og/eller mangel på respons og kliniske tegn på lidelse og smerte, der ikke er let eller kortvarig, en reduktion af kropsvægten på > 5 % fra dag 1 til dag 8 og dødelighed tages i betragtning ved vurderingen. Dyr, som er moribunde, har tydelige smerter eller viser tegn på svære og vedvarende lidelser, skal aflives humant (36). |
| --- | --- |

24.

Følgende kliniske observationer kan indikere systemisk toksicitet (35), hvis de anvendes som led i en integreret vurdering, og kan således indikere det maksimale dosisniveau, der kan anvendes i LLNA: DA-hovedundersøgelsen: ændringer i nervesystemets funktion (f.eks. hårrejsning, ataxi, rystelser og kramper), adfærdsændringer (f.eks. aggressivitet, ændringer i soigneringsaktiviteten, markant ændring i aktivitetsniveauet), ændringer i respirationsmønstre (f.eks. ændringer i respirationshyppigheden og -intensiteten såsom åndenød, snappende respiration og rallelyd) samt ændringer i føde- og vandindtagelsen. Derudover skal tegn på apati og/eller mangel på respons og kliniske tegn på lidelse og smerte, der ikke er let eller kortvarig, en reduktion af kropsvægten på > 5 % fra dag 1 til dag 8 og dødelighed tages i betragtning ved vurderingen. Dyr, som er moribunde, har tydelige smerter eller viser tegn på svære og vedvarende lidelser, skal aflives humant (36).

Forsøgsplanen for hovedundersøgelsen

Forsøgsplanen for hovedundersøgelsen

| 25. | Forsøgsplanen for assayet er følgende:
  —   Dag 1: Hvert dyrs vægt bestemmes og registreres sammen med kliniske observationer. Dorsum af hvert øre påføres 1 % natriumlaurylsulfat (SLS) i form af en vandig opløsning ved hjælp af en børste dyppet i SLS-opløsningen, således at hele dorsum af hvert øre dækkes med fire til fem strøg. En time efter SLS-behandlingen påføres dorsum af hvert øre 25 μl af den pågældende teststofkoncentration, af vehiklet alene eller af det positive kontrolstof (sideløbende eller nylig, afhængigt af laboratoriets politik, jf. punkt 11-15)
  —   Dag 2, 3 og 7: Proceduren fra dag 1 for forbehandling med 1 % SLS-vandopløsningen og påføring af teststoffet gentages.
  —   Dag 4, 5 og 6: Ingen behandling.
  —   Dag 8: Hvert dyrs vægt bestemmes og registreres sammen med kliniske observationer. Ca. 24-30 timer efter påføringen på dag 7 aflives dyrene humant. De drænende aurikulære lymfeknuder fra hvert museøre eksciseres og behandles særskilt i en phosphatbufferet saltopløsning (PBS) for hvert dyr. Detaljer og diagrammer vedrørende identifikation og dissektion af lymfeknuder findes i henvisning (22). Der kan inkluderes yderligere parametre såsom bedømmelse af øreerythemscore eller målinger af øretykkelsen (foretages med en tykkelsesmåler eller ved hjælp af øremærkevægtbestemmelse ved obduktion) med henblik på yderligere kontrol af det lokale hudrespons i hovedundersøgelsen. |
| --- | --- |

25.

Forsøgsplanen for assayet er følgende:

—   Dag 1: Hvert dyrs vægt bestemmes og registreres sammen med kliniske observationer. Dorsum af hvert øre påføres 1 % natriumlaurylsulfat (SLS) i form af en vandig opløsning ved hjælp af en børste dyppet i SLS-opløsningen, således at hele dorsum af hvert øre dækkes med fire til fem strøg. En time efter SLS-behandlingen påføres dorsum af hvert øre 25 μl af den pågældende teststofkoncentration, af vehiklet alene eller af det positive kontrolstof (sideløbende eller nylig, afhængigt af laboratoriets politik, jf. punkt 11-15)

—   Dag 2, 3 og 7: Proceduren fra dag 1 for forbehandling med 1 % SLS-vandopløsningen og påføring af teststoffet gentages.

—   Dag 4, 5 og 6: Ingen behandling.

—   Dag 8: Hvert dyrs vægt bestemmes og registreres sammen med kliniske observationer. Ca. 24-30 timer efter påføringen på dag 7 aflives dyrene humant. De drænende aurikulære lymfeknuder fra hvert museøre eksciseres og behandles særskilt i en phosphatbufferet saltopløsning (PBS) for hvert dyr. Detaljer og diagrammer vedrørende identifikation og dissektion af lymfeknuder findes i henvisning (22). Der kan inkluderes yderligere parametre såsom bedømmelse af øreerythemscore eller målinger af øretykkelsen (foretages med en tykkelsesmåler eller ved hjælp af øremærkevægtbestemmelse ved obduktion) med henblik på yderligere kontrol af det lokale hudrespons i hovedundersøgelsen.

Fremstilling af cellesuspensioner

Fremstilling af cellesuspensioner

| 26. | Fra hver mus fremstilles en bilateralt eksciseret enkeltcellesuspension af lymfeknudeceller (LNC) ved at anbringe lymfeknuderne mellem to objektglas og påføre et let tryk for at knuse knuderne. Når det er konstateres, at vævet er blevet spredt ud i et tyndt lag, adskilles de to objektglas. Vævet på begge objektglas opslæmmes i PBS ved at holde hvert objektglas i vinkel over petriskålen og rense det med PBS, samtidigt med at vævet skrabes af objektglasset med en celleskraber. Lymfeknuder i negative kontroldyr er desuden små, så det er vigtigt, at de håndteres forsigtigt for at undgå en kunstig indvirkning på SI-værdier. Der anvendes en samlet volumen på 1 ml PBS til rensning af begge objektglas. LNC-suspensionen i petriskålen homogeniseres let med celleskraberen. Der udtages en 20 μL-prøve af LNC-suspensionen med en mikropipette, idet det sikres, at den synlige membran ikke udtages, og prøven blandes herefter med 1,98 ml PBS til fremstilling af en 2 ml-prøve. Der fremstilles herefter en ny 2 ml-prøve efter samme metode, således at der fremstilles to prøver for hvert dyr. |
| --- | --- |

26.

Fra hver mus fremstilles en bilateralt eksciseret enkeltcellesuspension af lymfeknudeceller (LNC) ved at anbringe lymfeknuderne mellem to objektglas og påføre et let tryk for at knuse knuderne. Når det er konstateres, at vævet er blevet spredt ud i et tyndt lag, adskilles de to objektglas. Vævet på begge objektglas opslæmmes i PBS ved at holde hvert objektglas i vinkel over petriskålen og rense det med PBS, samtidigt med at vævet skrabes af objektglasset med en celleskraber. Lymfeknuder i negative kontroldyr er desuden små, så det er vigtigt, at de håndteres forsigtigt for at undgå en kunstig indvirkning på SI-værdier. Der anvendes en samlet volumen på 1 ml PBS til rensning af begge objektglas. LNC-suspensionen i petriskålen homogeniseres let med celleskraberen. Der udtages en 20 μL-prøve af LNC-suspensionen med en mikropipette, idet det sikres, at den synlige membran ikke udtages, og prøven blandes herefter med 1,98 ml PBS til fremstilling af en 2 ml-prøve. Der fremstilles herefter en ny 2 ml-prøve efter samme metode, således at der fremstilles to prøver for hvert dyr.

Bestemmelse af celleproliferationen (måling af ATP-indholdet i lymfocytter)

Bestemmelse af celleproliferationen (måling af ATP-indholdet i lymfocytter)

| 27. | Forøgelser af ATP-indholdet i lymfeknuder måles ved hjælp af luciferin/luciferasemetoden med et ATP-målekit, der måler bioluminescens i relative lysenheder (RLU). Testperioden fra tidspunktet for aflivning af dyret til måling af ATP-indholdet for hvert enkelt dyr skal være ens og ligge inden for ca. 30 minutter, da det vurderes, at ATP-indholdet reduceres gradvist efter aflivning af dyret (12). Procedurerne fra ekscision af aurikulære lymfeknuder til måling af ATP skal således afsluttes inden for 20 minutter på grundlag af en forud fastlagt tidsplan, der gælder for alle dyr. ATP-luminescensen måles i hver 2 ml-prøve, således at der indsamles i alt to ATP-målinger for hvert dyr. Den gennemsnitlige ATP-luminescens måles herefter og anvendes i efterfølgende beregninger (se punkt (30). |
| --- | --- |

27.

Forøgelser af ATP-indholdet i lymfeknuder måles ved hjælp af luciferin/luciferasemetoden med et ATP-målekit, der måler bioluminescens i relative lysenheder (RLU). Testperioden fra tidspunktet for aflivning af dyret til måling af ATP-indholdet for hvert enkelt dyr skal være ens og ligge inden for ca. 30 minutter, da det vurderes, at ATP-indholdet reduceres gradvist efter aflivning af dyret (12). Procedurerne fra ekscision af aurikulære lymfeknuder til måling af ATP skal således afsluttes inden for 20 minutter på grundlag af en forud fastlagt tidsplan, der gælder for alle dyr. ATP-luminescensen måles i hver 2 ml-prøve, således at der indsamles i alt to ATP-målinger for hvert dyr. Den gennemsnitlige ATP-luminescens måles herefter og anvendes i efterfølgende beregninger (se punkt (30).

OBSERVATIONER

Kliniske observationer

Kliniske observationer

| 28. | Hver enkelt mus observeres omhyggeligt mindst en gang dagligt for alle kliniske tegn på lokalirritation på påføringsstedet eller systemisk toksicitet. Alle observationer registreres systematisk i enkeltjournaler for hver mus. Kontrolplaner skal omfatte kriterier for omgående identificering af de mus, der udviser systemisk toksicitet, for stærk lokal hudirritation eller hudætsning, og som skal aflives (36). |
| --- | --- |

28.

Hver enkelt mus observeres omhyggeligt mindst en gang dagligt for alle kliniske tegn på lokalirritation på påføringsstedet eller systemisk toksicitet. Alle observationer registreres systematisk i enkeltjournaler for hver mus. Kontrolplaner skal omfatte kriterier for omgående identificering af de mus, der udviser systemisk toksicitet, for stærk lokal hudirritation eller hudætsning, og som skal aflives (36).

Kropsvægt

Kropsvægt

| 29. | Som angivet i punkt 25 måles kropsvægten af hvert dyr ved forsøgets begyndelse og ved den planmæssige humane aflivning. |
| --- | --- |

29.

Som angivet i punkt 25 måles kropsvægten af hvert dyr ved forsøgets begyndelse og ved den planmæssige humane aflivning.

BEREGNING AF RESULTATER

| 30. | Resultaterne for hver behandlingsgruppe angives som den gennemsnitlige SI-værdi. SI-værdien fås ved at dividere den gennemsnitlige RLU/mus i hver stoftestgruppe og PC-gruppen med den gennemsnitlige RLU/mus for opløsningsmiddel/vehikelkontrol-gruppen. Den gennemsnitlige SI-værdi for de vehikelbehandlede kontroldyr er således 1. |
| --- | --- |

30.

Resultaterne for hver behandlingsgruppe angives som den gennemsnitlige SI-værdi. SI-værdien fås ved at dividere den gennemsnitlige RLU/mus i hver stoftestgruppe og PC-gruppen med den gennemsnitlige RLU/mus for opløsningsmiddel/vehikelkontrol-gruppen. Den gennemsnitlige SI-værdi for de vehikelbehandlede kontroldyr er således 1.

| 31. | I beslutningsprocessen anses et resultat for at være positivt, når SI er mindst 1,8 (10) Dosis/responsforholdets styrke, den statistiske signifikans og opløsningsmidlets/vehiklets og PC-responsets sammenhæng kan imidlertid også indgå i bedømmelsen af, om et tvetydigt resultat (dvs. en SI-værdi på mellem 1,8 og 2,5) anses for at være positivt (2) (3) (37). |
| --- | --- |

31.

I beslutningsprocessen anses et resultat for at være positivt, når SI er mindst 1,8 (10) Dosis/responsforholdets styrke, den statistiske signifikans og opløsningsmidlets/vehiklets og PC-responsets sammenhæng kan imidlertid også indgå i bedømmelsen af, om et tvetydigt resultat (dvs. en SI-værdi på mellem 1,8 og 2,5) anses for at være positivt (2) (3) (37).

| 32. | I tilfælde af tvetydige resultater med en SI på mellem 1,8 og 2,5 vil det være hensigtsmæssigt at tage højde for yderligere oplysninger som f.eks. dosis-responsforholdet, dokumentation for systemisk toksicitet eller for stærk irritation og i påkommende tilfælde statistisk signifikans sammen med SI-værdierne for at få bekræftet, at disse resultater er positive (10). Teststoffets forskellige egenskaber bør ligeledes tages i betragtning, herunder om det er strukturelt beslægtet med kendte hudsensibiliserende stoffer, om det medfører for stærk lokal hudirritation hos musen, og arten af det iagttagne dosis-responsforhold. Disse og andre overvejelser er der redegjort mere indgående for andetsteds (4). |
| --- | --- |

32.

I tilfælde af tvetydige resultater med en SI på mellem 1,8 og 2,5 vil det være hensigtsmæssigt at tage højde for yderligere oplysninger som f.eks. dosis-responsforholdet, dokumentation for systemisk toksicitet eller for stærk irritation og i påkommende tilfælde statistisk signifikans sammen med SI-værdierne for at få bekræftet, at disse resultater er positive (10). Teststoffets forskellige egenskaber bør ligeledes tages i betragtning, herunder om det er strukturelt beslægtet med kendte hudsensibiliserende stoffer, om det medfører for stærk lokal hudirritation hos musen, og arten af det iagttagne dosis-responsforhold. Disse og andre overvejelser er der redegjort mere indgående for andetsteds (4).

| 33. | Indsamling af data for den enkelte mus gør det muligt at foretage en statistisk analyse af tilstedeværelsen og omfanget af dosis-responsforholdet i dataene. Statistiske vurderinger kan omfatte en evaluering af dosis-responsforholdet samt behørigt tilpassede sammenligninger af testgrupper (f.eks. parvis sammenligning af dosisgruppe og sideløbende (opløsningsmiddel/bærestof) kontrolgrupper). Statistiske analyser kan omfatte f.eks. lineær regression eller Williams test til vurdering af dosis-responsudviklingen og Dunnetts test til parvis sammenligning. Ved valg af passende statistisk analysemetode bør undersøgeren være opmærksom på mulige forskelle i varians eller andre tilknyttede problemer, som kan kræve transformation af data eller anvendelse af ikkeparametrisk statistisk analyse. Undersøgeren kan under alle omstændigheder være nødsaget til at udføre SI-beregninger og statistiske analyser med og uden visse datapunkter (til tider kaldet »outliers«). |
| --- | --- |

33.

Indsamling af data for den enkelte mus gør det muligt at foretage en statistisk analyse af tilstedeværelsen og omfanget af dosis-responsforholdet i dataene. Statistiske vurderinger kan omfatte en evaluering af dosis-responsforholdet samt behørigt tilpassede sammenligninger af testgrupper (f.eks. parvis sammenligning af dosisgruppe og sideløbende (opløsningsmiddel/bærestof) kontrolgrupper). Statistiske analyser kan omfatte f.eks. lineær regression eller Williams test til vurdering af dosis-responsudviklingen og Dunnetts test til parvis sammenligning. Ved valg af passende statistisk analysemetode bør undersøgeren være opmærksom på mulige forskelle i varians eller andre tilknyttede problemer, som kan kræve transformation af data eller anvendelse af ikkeparametrisk statistisk analyse. Undersøgeren kan under alle omstændigheder være nødsaget til at udføre SI-beregninger og statistiske analyser med og uden visse datapunkter (til tider kaldet »outliers«).

DATA OG RAPPORTERING

Data

Data

| 34. | Data opstilles i tabelform med angivelse af det enkelte dyrs RLU-værdier, gruppens gennemsnitlige RLU/dyr, det tilknyttede fejlled (f.eks. SD, SEM), og det gennemsnitlige SI for hver dosisgruppe sammenholdt med den sideløbende opløsningsmiddel/vehikelkontrol-gruppe. |
| --- | --- |

34.

Data opstilles i tabelform med angivelse af det enkelte dyrs RLU-værdier, gruppens gennemsnitlige RLU/dyr, det tilknyttede fejlled (f.eks. SD, SEM), og det gennemsnitlige SI for hver dosisgruppe sammenholdt med den sideløbende opløsningsmiddel/vehikelkontrol-gruppe.

Testrapport

Testrapport

| 35. | Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger: | Test- og kontrolstoffer:






  — | identifikationsoplysninger (f.eks. CAS- og EF-numre, hvis de findes, oprindelse, renhed, kendte urenheder, batchnummer) |
| --- | --- | --- | --- |

35.

Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:

Test- og kontrolstoffer:

—

identifikationsoplysninger (f.eks. CAS- og EF-numre, hvis de findes, oprindelse, renhed, kendte urenheder, batchnummer)

| — | fysisk tilstand og fysisk-kemiske egenskaber (f.eks. flygtighed, stabilitet, opløselighed) |
| --- | --- |

—

fysisk tilstand og fysisk-kemiske egenskaber (f.eks. flygtighed, stabilitet, opløselighed)

| — | for blandinger: sammensætning og relativt indhold af bestanddelene. |
| --- | --- |

—

for blandinger: sammensætning og relativt indhold af bestanddelene.

| | Opløsningsmiddel/bærestof:






  — | identifikationsoplysninger (renhed, koncentration (i givet fald), anvendt volumen) |
| --- | --- | --- |

Opløsningsmiddel/bærestof:

—

identifikationsoplysninger (renhed, koncentration (i givet fald), anvendt volumen)

| — | begrundelse for valg af vehikel |
| --- | --- |

—

begrundelse for valg af vehikel

| | For forsøgsdyrene:






  — | den anvendte CBA-musestamme |
| --- | --- | --- |

For forsøgsdyrene:

—

den anvendte CBA-musestamme

| — | dyrenes mikrobiologiske status, hvis den kendes |
| --- | --- |

—

dyrenes mikrobiologiske status, hvis den kendes

| — | antal dyr og deres alder |
| --- | --- |

—

antal dyr og deres alder

| — | dyrenes oprindelse, miljøbetingelser, kost osv. |
| --- | --- |

—

dyrenes oprindelse, miljøbetingelser, kost osv.

| | Testbetingelser:






  — | oprindelse, batchnummer og producentens oplysninger om kvalitetssikring/kvalitetskontrol for ATP-kittet |
| --- | --- | --- |

Testbetingelser:

—

oprindelse, batchnummer og producentens oplysninger om kvalitetssikring/kvalitetskontrol for ATP-kittet

| — | nærmere oplysninger om præparation og påføring af teststoffet |
| --- | --- |

—

nærmere oplysninger om præparation og påføring af teststoffet

| — | begrundelse af den valgte dosis (herunder resultaterne af prescreeningen, hvis en sådan er udført) |
| --- | --- |

—

begrundelse af den valgte dosis (herunder resultaterne af prescreeningen, hvis en sådan er udført)

| — | anvendte koncentrationer af vehikel og teststof og samlet mængde påført teststof |
| --- | --- |

—

anvendte koncentrationer af vehikel og teststof og samlet mængde påført teststof

| — | nærmere oplysninger om foderets og vandets kvalitet (herunder fødens art/oprindelse, vandets oprindelse) |
| --- | --- |

—

nærmere oplysninger om foderets og vandets kvalitet (herunder fødens art/oprindelse, vandets oprindelse)

| — | detaljeret beskrivelse af behandlings- og prøveudtagningsplan |
| --- | --- |

—

detaljeret beskrivelse af behandlings- og prøveudtagningsplan

| — | metoder til måling af toksicitet |
| --- | --- |

—

metoder til måling af toksicitet

| — | kriterier for bedømmelse af undersøgelsen som positiv eller negativ |
| --- | --- |

—

kriterier for bedømmelse af undersøgelsen som positiv eller negativ

| — | nærmere oplysninger om afvigelser fra protokollen og en redegørelse for, hvordan afvigelsen indvirker på undersøgelsens udformning og resultater. |
| --- | --- |

—

nærmere oplysninger om afvigelser fra protokollen og en redegørelse for, hvordan afvigelsen indvirker på undersøgelsens udformning og resultater.

| | Pålidelighedskontrol:






  — | sammenfatning af resultaterne af den seneste pålidelighedskontrol, herunder oplysninger om teststoffet og anvendt koncentration og vehikel |
| --- | --- | --- |

Pålidelighedskontrol:

—

sammenfatning af resultaterne af den seneste pålidelighedskontrol, herunder oplysninger om teststoffet og anvendt koncentration og vehikel

| — | data for sideløbende og/eller tidligere positive og sideløbende negative (opløsningsmiddel/bærestof) kontrolprøver fra prøvelaboratoriet |
| --- | --- |

—

data for sideløbende og/eller tidligere positive og sideløbende negative (opløsningsmiddel/bærestof) kontrolprøver fra prøvelaboratoriet

| — | hvis der ikke blev foretaget en sideløbende positiv kontrol, datoen for og laboratorierapport om den seneste regelmæssige positive kontrol og en rapport med nærmere historiske data for den positive kontrol fra laboratoriet, hvori det begrundes, hvorfor der ikke er blevet foretaget en sideløbende positiv kontrol. |
| --- | --- |

—

hvis der ikke blev foretaget en sideløbende positiv kontrol, datoen for og laboratorierapport om den seneste regelmæssige positive kontrol og en rapport med nærmere historiske data for den positive kontrol fra laboratoriet, hvori det begrundes, hvorfor der ikke er blevet foretaget en sideløbende positiv kontrol.

| | Resultater:






  — | de enkelte mus' vægt ved doseringens begyndelse og ved den planmæssige aflivning samt det gennemsnitlige og tilknyttede fejlled (f.eks. SD, SEM) for hver behandlingsgruppe |
| --- | --- | --- |

Resultater:

—

de enkelte mus' vægt ved doseringens begyndelse og ved den planmæssige aflivning samt det gennemsnitlige og tilknyttede fejlled (f.eks. SD, SEM) for hver behandlingsgruppe

| — | tidspunkt for indtræden af og tegnene på toksicitet, herunder eventuel hudirritation på administrationsstedet for hvert dyr |
| --- | --- |

—

tidspunkt for indtræden af og tegnene på toksicitet, herunder eventuel hudirritation på administrationsstedet for hvert dyr

| — | tidspunktet for aflivning af dyr og tidspunktet for måling af ATP for hvert dyr |
| --- | --- |

—

tidspunktet for aflivning af dyr og tidspunktet for måling af ATP for hvert dyr

| — | en tabel med RLU-værdier for de enkelte mus og SI-værdier for hver behandlingsgruppe |
| --- | --- |

—

en tabel med RLU-værdier for de enkelte mus og SI-værdier for hver behandlingsgruppe

| — | det gennemsnitlige og tilknyttede fejlled (f.eks. SD, SEM) for RLU/mus for hver behandlingsgruppe og resultaterne af en outlieranalyse for hver behandlingsgruppe |
| --- | --- |

—

det gennemsnitlige og tilknyttede fejlled (f.eks. SD, SEM) for RLU/mus for hver behandlingsgruppe og resultaterne af en outlieranalyse for hver behandlingsgruppe

| — | beregnet SI og et passende mål for variationen, hvor der tages hensyn til variationen mellem dyr i både teststoffet og kontrolgrupperne |
| --- | --- |

—

beregnet SI og et passende mål for variationen, hvor der tages hensyn til variationen mellem dyr i både teststoffet og kontrolgrupperne

| — | dosis-responsforholdet |
| --- | --- |

—

dosis-responsforholdet

| — | statistiske analyser, når det er hensigtsmæssigt. |
| --- | --- |

—

statistiske analyser, når det er hensigtsmæssigt.

| | Behandling af resultater:






  — | Kortfattet kommentar til resultaterne, dosis-responsanalyse og i givet fald statistisk analyse med en konklusion med hensyn til, om det undersøgte stof må anses for hudirriterende. |
| --- | --- | --- |

Behandling af resultater:

—

Kortfattet kommentar til resultaterne, dosis-responsanalyse og i givet fald statistisk analyse med en konklusion med hensyn til, om det undersøgte stof må anses for hudirriterende.

LITTERATUR

| (1) | OECD (2010), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guideline No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

(1)

OECD (2010), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guideline No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay

| (2) | Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: status of validation. Food Chem, Toxicol., 34, 999-1002. |
| --- | --- |

(2)

Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: status of validation. Food Chem, Toxicol., 34, 999-1002.

Food Chem, Toxicol

| (3) | Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem, Toxicol., 34, 985-997. |
| --- | --- |

(3)

Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem, Toxicol., 34, 985-997.

Food Chem, Toxicol

| (4) | Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 36, 327-333. |
| --- | --- |

(4)

Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 36, 327-333.

Food Chem. Toxicol.

| (5) | Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicol., 146, 49-59. |
| --- | --- |

(5)

Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicol., 146, 49-59.

Toxicol

| (6) | ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf] |
| --- | --- |

(6)

ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]

| (7) | Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, 258-273. |
| --- | --- |

(7)

Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, 258-273.

Reg. Toxicol. Pharmacol.

| (8) | Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, 274-286. |
| --- | --- |

(8)

Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, 274-286.

Reg. Toxicol. Pharmacol. 34

| (9) | Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process.Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, 249-257. |
| --- | --- |

(9)

Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process.Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, 249-257.

Reg. Toxicol. Pharmacol.

| (10) | ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioactive local lymph node assay: modified by Daicel Chemical Industries, Ltd., based on ATP content test method protocol (LLNA: DA). NIH Publication No. 10-7551A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-DA/TMER.htm] |
| --- | --- |

(10)

ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioactive local lymph node assay: modified by Daicel Chemical Industries, Ltd., based on ATP content test method protocol (LLNA: DA). NIH Publication No. 10-7551A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-DA/TMER.htm]

| (11) | ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: Updated validation status of new versions and applications of the murine local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf]. |
| --- | --- |

(11)

ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: Updated validation status of new versions and applications of the murine local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf].

| (12) | Idehara, K., Yamagishi, G., Yamashita, K. and Ito, M. (2008), Characterization and evaluation of a modified local lymph node assay using ATP content as a non-radio isotopic endpoint.J. Pharmacol. Toxicol. Meth., 58, 1-10. |
| --- | --- |

(12)

Idehara, K., Yamagishi, G., Yamashita, K. and Ito, M. (2008), Characterization and evaluation of a modified local lymph node assay using ATP content as a non-radio isotopic endpoint.J. Pharmacol. Toxicol. Meth., 58, 1-10.

J. Pharmacol. Toxicol. Meth.

| (13) | Omori, T., Idehara, K., Kojima, H., Sozu, T., Arima, K., Goto, H., Hanada, T., Ikarashi, Y., Inoda, T., Kanazawa, Y., Kosaka, T., Maki, E., Morimoto, T., Shinoda, S., Shinoda, N., Takeyoshi, M., Tanaka, M., Uratani, M., Usami, M., Yamanaka, A., Yoneda, T., Yoshimura, I. and Yuasa, A. (2008), Interlaboratory validation of the modified murine local lymph node assay based on adenosine triphosphate measurement. J. Pharmacol. Toxicol. Meth., 58, 11-26. |
| --- | --- |

(13)

Omori, T., Idehara, K., Kojima, H., Sozu, T., Arima, K., Goto, H., Hanada, T., Ikarashi, Y., Inoda, T., Kanazawa, Y., Kosaka, T., Maki, E., Morimoto, T., Shinoda, S., Shinoda, N., Takeyoshi, M., Tanaka, M., Uratani, M., Usami, M., Yamanaka, A., Yoneda, T., Yoshimura, I. and Yuasa, A. (2008), Interlaboratory validation of the modified murine local lymph node assay based on adenosine triphosphate measurement. J. Pharmacol. Toxicol. Meth., 58, 11-26.

J. Pharmacol. Toxicol. Meth.

| (14) | OECD (1992), Skin Sensitisation, Test Guideline No. 406, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

(14)

OECD (1992), Skin Sensitisation, Test Guideline No. 406, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

Skin Sensitisation

| (15) | Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol., 46, 1896-1904. |
| --- | --- |

(15)

Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol., 46, 1896-1904.

Food Chem. Toxicol

| (16) | Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrillo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 90-96. |
| --- | --- |

(16)

Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrillo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 90-96.

Reg. Toxicol. Pharmacol

| (17) | Crouch, S.P., Kozlowski, R., Slater, K.J. and Fletcher J. (1993), The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J. Immunol. Meth., 160, 81-88. |
| --- | --- |

(17)

Crouch, S.P., Kozlowski, R., Slater, K.J. and Fletcher J. (1993), The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J. Immunol. Meth., 160, 81-88.

J. Immunol. Meth

| (18) | Ishizaka, A., Tono-oka, T. and Matsumoto, S. (1984), Evaluation of the proliferative response of lymphocytes by measurement of intracellular ATP. J. Immunol. Meth., 72, 127-132. |
| --- | --- |

(18)

Ishizaka, A., Tono-oka, T. and Matsumoto, S. (1984), Evaluation of the proliferative response of lymphocytes by measurement of intracellular ATP. J. Immunol. Meth., 72, 127-132.

J. Immunol. Meth

| (19) | Dexter, S.J., Cámara, M., Davies, M. and Shakesheff, K.M. (2003), Development of a bioluminescent ATP assay to quantify mammalian and bacterial cell number from a mixed population. Biomat., 24, 27-34. |
| --- | --- |

(19)

Dexter, S.J., Cámara, M., Davies, M. and Shakesheff, K.M. (2003), Development of a bioluminescent ATP assay to quantify mammalian and bacterial cell number from a mixed population. Biomat., 24, 27-34.

Biomat.

| (20) | Lundin A. (2000), Use of firefly luciferase in ATP-related assays of biomass, enzymes, and metabolites. Meth. Enzymol., 305, 346-370. |
| --- | --- |

(20)

Lundin A. (2000), Use of firefly luciferase in ATP-related assays of biomass, enzymes, and metabolites. Meth. Enzymol., 305, 346-370.

Meth. Enzymol

| (21) | ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National Academies Press. |
| --- | --- |

(21)

ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National Academies Press.

| (22) | ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Science. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf] |
| --- | --- |

(22)

ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Science. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf]

| (23) | McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH. Toxicol., 238, 71-89. |
| --- | --- |

(23)

McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH. Toxicol., 238, 71-89.

Toxicol

| (24) | Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The local lymph node assay: developments and applications. Toxicol., 93, 13-31. |
| --- | --- |

(24)

Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The local lymph node assay: developments and applications. Toxicol., 93, 13-31.

Toxicol

| (25) | OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No. 404, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

(25)

OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No. 404, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

Acute Dermal Irritation/Corrosion

| (26) | Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances. Toxicologist, 96, 235. |
| --- | --- |

(26)

Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances. Toxicologist, 96, 235.

Toxicologist

| (27) | ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf]. |
| --- | --- |

(27)

ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf].

| (28) | Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice. Drug. Chem. Toxicol., 21, 195-206. |
| --- | --- |

(28)

Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice. Drug. Chem. Toxicol., 21, 195-206.

Drug. Chem. Toxicol

| (29) | Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, 83-94. |
| --- | --- |

(29)

Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, 83-94.

Toxicol. Appl. Pharmacol.

| (30) | Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals. Toxicol. Meth., 8, 245-256. |
| --- | --- |

(30)

Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals. Toxicol. Meth., 8, 245-256.

Toxicol. Meth.

| (31) | Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods. Drug Chem. Toxicol., 22, 491-506. |
| --- | --- |

(31)

Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods. Drug Chem. Toxicol., 22, 491-506.

Drug Chem. Toxicol

| (32) | Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, 60-68. |
| --- | --- |

(32)

Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, 60-68.

Toxicol

| (33) | Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721-728. |
| --- | --- |

(33)

Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721-728.

Arch. Toxicol

| (34) | Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect., 115, 1023-1028. |
| --- | --- |

(34)

Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect., 115, 1023-1028.

Environ. Health Perspect

| (35) | ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm] |
| --- | --- |

(35)

ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm]

In Vitro

| (36) | OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

(36)

OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation

| (37) | Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ. Health, 53 563-79. |
| --- | --- |

(37)

Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ. Health, 53 563-79.

J. Toxicol. Environ. Health

| (38) | OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

(38)

OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment

Tillæg 1

DEFINITIONER

Nøjagtighed: Overensstemmelsen mellem testmetodens resultater og accepterede referenceværdier. Den er et mål for testmetodens ydeevne og et af aspekterne af relevans. Udtrykket benyttes ofte som synonym for »konkordans«, forstået som den andel korrekte udfald, testmetoden fører til (38).

Referencestof: Et sensibiliserende eller ikkesensibiliserende stof, der anvendes som standard til sammenligning med et teststof. Et referencestof skal have følgende egenskaber: i) en eller flere ensartede og pålidelige kilder; ii) strukturel og funktionel lighed med den stofgruppe, der testes; iii) kendte fysisk/kemiske egenskaber; iv) støttedata om kendte virkninger og v) kendt styrke i det ønskede responsområde.

Falsk negativ: Et teststof, som ved en testmetode fejlagtigt identificeres som negativt eller ikkeaktivt, selv om det rent faktisk er positivt eller aktivt.

Falsk positiv: Et stof, som ved en test fejlagtigt identificeres som positivt eller aktivt, selv om det rent faktisk er negativt eller ikkeaktivt.

Fare: Potentielle skadelige virkninger for menneskers sundhed og miljøet. De skadelige virkninger fremkaldes kun, hvis eksponeringen er tilstrækkelig.

Reproducerbarhed mellem laboratorier: Mål for, i hvilken grad forskellige kvalificerede laboratorier kan opnå de samme resultater kvalitativt og kvantitativt, når de anvender samme protokol og tester de samme teststoffer. Reproducerbarheden mellem laboratorier bestemmes forud for og under valideringsprocessen og angiver, i hvilken grad en test kan overføres mellem laboratorier med et vellykket resultat. Kaldes også ekstern reproducerbarhed (38).

Reproducerbarhed inden for laboratorier: Bestemmelse af, i hvilken grad kvalificeret personale på det samme laboratorium kan reproducere resultater ved anvendelse af en specifik protokol på forskellige tidspunkter. Kaldes også intern reproducerbarhed (38).

Outlier: En outlier er en observation, der er markant anderledes end andre værdier i en tilfældig stikprøve af en population.

Kvalitetssikring: En forvaltningsproces, hvor overholdelsen af laboratoriets teststandarder, krav og registreringsprocedurer og nøjagtigheden af dataoverførsler vurderes af personer, der er uafhængige af de personer, der udfører forsøget.

Pålidelighed: Mål for, i hvilken grad en testmetode kan udføres reproducerbart i og mellem laboratorier over en længere periode, når den udføres efter samme protokol. Den bedømmes ved beregning af reproducerbarhed inden for og mellem laboratorier (38).

Hudsensibilisering: En immunologisk proces, der udløses, når en disponeret person eksponeres for en inducerende kemisk allergen, som fremkalder en kutan immunrespons, der kan føre til udviklingen af kontaktsensibilisering.

Stimulationsindeks (SI): En værdi, der beregnes for at vurdere et teststofs potentiale for hudsensibilisering, og som er forholdet mellem proliferation i behandlingsgrupperne og proliferationen i den sideløbende vehikelkontrolgruppe.

Teststof (eller testkemikalie): Alle stoffer eller blandinger, der testes ved hjælp af denne TM.

B.51.   HUDSENSIBILISERING: ASSAY PÅ LOKALE LYMFEKNUDER: BrdU-ELISA

B.51.

HUDSENSIBILISERING: ASSAY PÅ LOKALE LYMFEKNUDER: BrdU-ELISA

INDLEDNING

| 1. | OECD's vejledning om testning af kemikalier og EU-testmetoder bliver med mellemrum gennemgået på baggrund af den videnskabelige udvikling, behovet for ny lovgivning og hensynet til dyrevelfærden. Den oprindelige testmetode (TM) (B.42) til bestemmelse af hudsensibilisering i mus, assay på lokale lymfeknuder (LLNA, OECD Test Guideline 429), er blevet revideret (1 og kapitel B.42 i dette bilag). En validering af LLNA og en oversigt over det tilknyttede arbejde findes i litteraturen (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). I LLNA anvendes radioisotopisk thymidin eller jod til måling af lymfocytproliferation, og assayet har derfor begrænset anvendelse, når fremstilling, anvendelse eller bortskaffelse af radioaktivitet er problematisk. LLNA: BrdU-ELISA [Enzyme-Linked Immunosorbent Assay] er en ikke radioaktiv modificering af LLNA-TM, der anvender ikkeradioaktivt mærket 5-brom-2-deoxyuridin (BrdU) (Chemical Abstracts Service [CAS-] nr. 59-14-3) i et ELISA-baseret testsystem til måling af lymfocytproliferation. LLNA: BrdU-ELISA er blevet valideret og gennemgået og anbefales af et internationalt uafhængigt peer review-panel, der vurderer, at metoden med visse begrænsninger kan anvendes til at udpege hudsensibiliserende og ikkehudsensibiliserende kemikalier (10) (11) (12). TM'en anvendes til vurdering af kemikaliers (stoffer og blandinger) potentiale for hudsensibilisering i dyr. I kapitel B.6 i dette bilag og i OECD Test Guideline 406 anvendes marsvin, navnlig maksimeringstesten på marsvin og Buehlertesten (13). LLNA (kapitel B.42 i dette bilag, OECD Test Guideline 429) og de to ikkeradioaktive modificeringer, LLNA: BrdU-ELISA (kapitel B.51 i dette bilag, OECD Test Guideline 442 B) og LLNA: DA (kapitel B.50 i dette bilag, OECD Test Guideline 442 A), har alle en fordel frem for marsvinetestene i B.6 og OECD Test Guideline 406 (13) med hensyn til begrænsning og forfinelse af anvendelsen af dyr. |
| --- | --- |

1.

OECD's vejledning om testning af kemikalier og EU-testmetoder bliver med mellemrum gennemgået på baggrund af den videnskabelige udvikling, behovet for ny lovgivning og hensynet til dyrevelfærden. Den oprindelige testmetode (TM) (B.42) til bestemmelse af hudsensibilisering i mus, assay på lokale lymfeknuder (LLNA, OECD Test Guideline 429), er blevet revideret (1 og kapitel B.42 i dette bilag). En validering af LLNA og en oversigt over det tilknyttede arbejde findes i litteraturen (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). I LLNA anvendes radioisotopisk thymidin eller jod til måling af lymfocytproliferation, og assayet har derfor begrænset anvendelse, når fremstilling, anvendelse eller bortskaffelse af radioaktivitet er problematisk. LLNA: BrdU-ELISA [Enzyme-Linked Immunosorbent Assay] er en ikke radioaktiv modificering af LLNA-TM, der anvender ikkeradioaktivt mærket 5-brom-2-deoxyuridin (BrdU) (Chemical Abstracts Service [CAS-] nr. 59-14-3) i et ELISA-baseret testsystem til måling af lymfocytproliferation. LLNA: BrdU-ELISA er blevet valideret og gennemgået og anbefales af et internationalt uafhængigt peer review-panel, der vurderer, at metoden med visse begrænsninger kan anvendes til at udpege hudsensibiliserende og ikkehudsensibiliserende kemikalier (10) (11) (12). TM'en anvendes til vurdering af kemikaliers (stoffer og blandinger) potentiale for hudsensibilisering i dyr. I kapitel B.6 i dette bilag og i OECD Test Guideline 406 anvendes marsvin, navnlig maksimeringstesten på marsvin og Buehlertesten (13). LLNA (kapitel B.42 i dette bilag, OECD Test Guideline 429) og de to ikkeradioaktive modificeringer, LLNA: BrdU-ELISA (kapitel B.51 i dette bilag, OECD Test Guideline 442 B) og LLNA: DA (kapitel B.50 i dette bilag, OECD Test Guideline 442 A), har alle en fordel frem for marsvinetestene i B.6 og OECD Test Guideline 406 (13) med hensyn til begrænsning og forfinelse af anvendelsen af dyr.

| 2. | I lighed med LLNA består LLNA: BrdU-ELISA i undersøgelse af induktionsfasen i hudsensibilisering og giver kvantitative data, som er velegnede til at vurdere dosis/responsforholdet. Evnen til at påvise hudsensibiliserende stoffer uden at det er nødvendigt at anvende dna-radioaktivt mærkede stoffer, fjerner risikoen for erhvervsmæssig eksponering for radioaktivitet og imødegår problemer med bortskaffelse af affald. Det kan skabe grundlag for øget anvendelse af mus til påvisning af hudsensibiliserende stoffer, hvilket kan mindske anvendelsen af marsvin til test for potentiale for hudsensibilisering (dvs. B.6, OECD Test Guideline 406) (13). |
| --- | --- |

2.

I lighed med LLNA består LLNA: BrdU-ELISA i undersøgelse af induktionsfasen i hudsensibilisering og giver kvantitative data, som er velegnede til at vurdere dosis/responsforholdet. Evnen til at påvise hudsensibiliserende stoffer uden at det er nødvendigt at anvende dna-radioaktivt mærkede stoffer, fjerner risikoen for erhvervsmæssig eksponering for radioaktivitet og imødegår problemer med bortskaffelse af affald. Det kan skabe grundlag for øget anvendelse af mus til påvisning af hudsensibiliserende stoffer, hvilket kan mindske anvendelsen af marsvin til test for potentiale for hudsensibilisering (dvs. B.6, OECD Test Guideline 406) (13).

DEFINITIONER

| 3. | De anvendte definitioner er forklaret i tillæg 1. |
| --- | --- |

3.

De anvendte definitioner er forklaret i tillæg 1.

INDLEDENDE OVERVEJELSER OG BEGRÆNSNINGER

| 4. | LLNA: BrdU-ELISA er en modificeret LLNA-metode til at udpege potentielle hudsensibiliserende kemikalier med bestemte begrænsninger. Det indebærer ikke nødvendigvis, at LLNA: BrdU-ELISA altid skal anvendes i stedet for LLNA eller marsvinetest (dvs. B.6, OECD Test Guideline 406) (13), men snarere, at dette assay er lige så nyttigt og kan anvendes som et alternativ, for hvilket det gælder, at positive og negative resultater sædvanligvis ikke længere kræver yderligere bekræftelse (10) (11). Testlaboratoriet bør inden forsøgets udførelse gennemgå alle foreliggende oplysninger om teststoffet. Sådanne oplysninger omfatter stoffets identitet og kemiske struktur, dets fysisk-kemiske egenskaber, resultaterne af eventuelle andre in vivo- og in vitro-toksicitetsundersøgelser af teststoffet og toksikologiske data for strukturelt beslægtede kemikalier. Disse oplysninger bør tages i betragtning ved vurderingen af, om LLNA: BrdU-ELISA er egnet til brug for stoffet (i lyset af begrænsede typer kemikaliers inkompatibilitet med LLNA: BrdU-ELISA [se punkt 5]) og som støtte ved valg af dosis. |
| --- | --- |

4.

LLNA: BrdU-ELISA er en modificeret LLNA-metode til at udpege potentielle hudsensibiliserende kemikalier med bestemte begrænsninger. Det indebærer ikke nødvendigvis, at LLNA: BrdU-ELISA altid skal anvendes i stedet for LLNA eller marsvinetest (dvs. B.6, OECD Test Guideline 406) (13), men snarere, at dette assay er lige så nyttigt og kan anvendes som et alternativ, for hvilket det gælder, at positive og negative resultater sædvanligvis ikke længere kræver yderligere bekræftelse (10) (11). Testlaboratoriet bør inden forsøgets udførelse gennemgå alle foreliggende oplysninger om teststoffet. Sådanne oplysninger omfatter stoffets identitet og kemiske struktur, dets fysisk-kemiske egenskaber, resultaterne af eventuelle andre in vivo- og in vitro-toksicitetsundersøgelser af teststoffet og toksikologiske data for strukturelt beslægtede kemikalier. Disse oplysninger bør tages i betragtning ved vurderingen af, om LLNA: BrdU-ELISA er egnet til brug for stoffet (i lyset af begrænsede typer kemikaliers inkompatibilitet med LLNA: BrdU-ELISA [se punkt 5]) og som støtte ved valg af dosis.

| 5. | LLNA: BrdU-ELISA er en in vivo-metode og eliminerer således ikke brugen af dyr til vurdering af allergisk kontaktsensibiliserende aktivitet. Den giver imidlertid mulighed for at mindske antallet af dyr til dette formål i forhold til marsvinetest (B.6, OECD Test Guideline 406) (13). LLNA: BrdU-ELISA repræsenterer desuden en væsentligt mere sofistikeret måde (mindre smerte og angst) at anvende dyr til allergisk kontaktsensibiliseringstest på, idet LLNA: BrdU-ELISA i modsætning til B.6 og OECD Test Guideline 406 ikke kræver, at der fremkaldes challenge-inducerede dermale hypersensivitetsreaktioner. Desuden kræver LLNA: BrdU-ELISA ikke anvendelse af et adjuvans, således som det er tilfældet for maksimeringstesten på marsvin (kapitel B.6 i dette bilag, 13). LLNA: BrdU-ELISA mindsker således dyrenes lidelser. På trods af LLNA: BrdU-ELISA-metodens fordele frem for B.6 og OECD Test Guideline 406 (13) er der visse begrænsninger, som kan gøre B.6 eller OECD Test Guideline 406 nødvendige, f.eks. test af visse metaller, falsk positive resultater for visse hudirriterende stoffer [såsom visse overfladeaktive kemikalier] (6) (1) og kapitel B.42 i dette bilag) eller teststoffets opløselighed). Kemiske stofgrupper eller stoffer, der indeholder funktionelle grupper, som kan skabe uafklarede sammenhænge (confounders) (15), kan desuden gøre marsvinetest nødvendige (dvs. B.6, OECD Test Guideline 406 (13)). Det anbefales, at de begrænsninger, der er blevet identificeret for LLNA (1 og kapitel B.42 i dette bilag), ligeledes finder anvendelse for LLNA: BrdU-ELISA (10). Bortset fra disse identificerede begrænsninger bør LLNA: BrdU-ELISA kunne anvendes til testning af alle kemikalier, medmindre disse kemikalier har egenskaber, som kan have indflydelse på LLNA: BrdU-ELISA-metodens nøjagtighed. Der skal desuden tages hensyn til muligheden for tvetydige positive resultater ved stimulationsindeks (SI)-værdier på mellem 1,6 og 1,9 (se punkt 31-32). Dette er baseret på valideringsdatabasen over 43 stoffer med et SI på 1,6 eller derover (se punkt 6), for hvilke LLNA: BrdU-ELISA identificerede alle 32 LLNA-sensibiliserende stoffer korrekt, men identificere tre ud af 11 LLNA-ikkesensibiliserende stoffer med SI-værdier på mellem 1,6 og 1,9 (dvs. tvetydige positive resultater) (10) forkert. Da det samme datasæt blev anvendt til fastsættelse af SI-værdierne og beregning af testens prædiktionsevne, kan de anførte resultater imidlertid være en overvurdering af den reelle prædiktionsevne. |
| --- | --- |

5.

LLNA: BrdU-ELISA er en in vivo-metode og eliminerer således ikke brugen af dyr til vurdering af allergisk kontaktsensibiliserende aktivitet. Den giver imidlertid mulighed for at mindske antallet af dyr til dette formål i forhold til marsvinetest (B.6, OECD Test Guideline 406) (13). LLNA: BrdU-ELISA repræsenterer desuden en væsentligt mere sofistikeret måde (mindre smerte og angst) at anvende dyr til allergisk kontaktsensibiliseringstest på, idet LLNA: BrdU-ELISA i modsætning til B.6 og OECD Test Guideline 406 ikke kræver, at der fremkaldes challenge-inducerede dermale hypersensivitetsreaktioner. Desuden kræver LLNA: BrdU-ELISA ikke anvendelse af et adjuvans, således som det er tilfældet for maksimeringstesten på marsvin (kapitel B.6 i dette bilag, 13). LLNA: BrdU-ELISA mindsker således dyrenes lidelser. På trods af LLNA: BrdU-ELISA-metodens fordele frem for B.6 og OECD Test Guideline 406 (13) er der visse begrænsninger, som kan gøre B.6 eller OECD Test Guideline 406 nødvendige, f.eks. test af visse metaller, falsk positive resultater for visse hudirriterende stoffer [såsom visse overfladeaktive kemikalier] (6) (1) og kapitel B.42 i dette bilag) eller teststoffets opløselighed). Kemiske stofgrupper eller stoffer, der indeholder funktionelle grupper, som kan skabe uafklarede sammenhænge (confounders) (15), kan desuden gøre marsvinetest nødvendige (dvs. B.6, OECD Test Guideline 406 (13)). Det anbefales, at de begrænsninger, der er blevet identificeret for LLNA (1 og kapitel B.42 i dette bilag), ligeledes finder anvendelse for LLNA: BrdU-ELISA (10). Bortset fra disse identificerede begrænsninger bør LLNA: BrdU-ELISA kunne anvendes til testning af alle kemikalier, medmindre disse kemikalier har egenskaber, som kan have indflydelse på LLNA: BrdU-ELISA-metodens nøjagtighed. Der skal desuden tages hensyn til muligheden for tvetydige positive resultater ved stimulationsindeks (SI)-værdier på mellem 1,6 og 1,9 (se punkt 31-32). Dette er baseret på valideringsdatabasen over 43 stoffer med et SI på 1,6 eller derover (se punkt 6), for hvilke LLNA: BrdU-ELISA identificerede alle 32 LLNA-sensibiliserende stoffer korrekt, men identificere tre ud af 11 LLNA-ikkesensibiliserende stoffer med SI-værdier på mellem 1,6 og 1,9 (dvs. tvetydige positive resultater) (10) forkert. Da det samme datasæt blev anvendt til fastsættelse af SI-værdierne og beregning af testens prædiktionsevne, kan de anførte resultater imidlertid være en overvurdering af den reelle prædiktionsevne.

TESTMETODENS PRINCIP

| 6. | Det tilgrundliggende princip for LLNA: BrdU-ELISA består i, at den sensibiliserende agens inducerer en lymfocytproliferation i de lymfeknuder, som dræner påføringsstedet for teststoffet. Denne proliferation er proportional med den påførte dosis og med allergenets styrke og gør det let at få et kvantitativt mål for sensibiliseringen. Proliferationen måles ved at sammenholde den gennemsnitlige proliferation i hver forsøgsgruppe med den gennemsnitlige proliferation i vehikelkontrolgruppen (VC-gruppen). Forholdet mellem den gennemsnitlige proliferation i den enkelte behandlingsgruppe og proliferationen i den sideløbende VC-gruppe kaldes stimulationsindekset (SI) og skal være mindst 1,6, før teststoffet kan vurderes nærmere som en potentielt hudsensibiliserende agens. De her beskrevne metoder bygger på anvendelse af måling af BrdU-indholdet til måling af øget celleproliferation i de drænende aurikulære lymfeknuder. BrdU er beslægtet med thymidin og er ligeledes inkorporeret i dna-cellerne under formering. Inkorporeringen af BrdU måles ved hjælp af ELISA, der anvender et BrdU-specifikt antistof, som også mærkes med peroxydase. Når substratet tilsættes, reagerer peroxydasen med substratet og der frembringes et farvet produkt, som kvantificeres ved en bestemt absorbans ved hjælp af en mikrotiterpladeaflæser. |
| --- | --- |

6.

Det tilgrundliggende princip for LLNA: BrdU-ELISA består i, at den sensibiliserende agens inducerer en lymfocytproliferation i de lymfeknuder, som dræner påføringsstedet for teststoffet. Denne proliferation er proportional med den påførte dosis og med allergenets styrke og gør det let at få et kvantitativt mål for sensibiliseringen. Proliferationen måles ved at sammenholde den gennemsnitlige proliferation i hver forsøgsgruppe med den gennemsnitlige proliferation i vehikelkontrolgruppen (VC-gruppen). Forholdet mellem den gennemsnitlige proliferation i den enkelte behandlingsgruppe og proliferationen i den sideløbende VC-gruppe kaldes stimulationsindekset (SI) og skal være mindst 1,6, før teststoffet kan vurderes nærmere som en potentielt hudsensibiliserende agens. De her beskrevne metoder bygger på anvendelse af måling af BrdU-indholdet til måling af øget celleproliferation i de drænende aurikulære lymfeknuder. BrdU er beslægtet med thymidin og er ligeledes inkorporeret i dna-cellerne under formering. Inkorporeringen af BrdU måles ved hjælp af ELISA, der anvender et BrdU-specifikt antistof, som også mærkes med peroxydase. Når substratet tilsættes, reagerer peroxydasen med substratet og der frembringes et farvet produkt, som kvantificeres ved en bestemt absorbans ved hjælp af en mikrotiterpladeaflæser.

BESKRIVELSE AF ASSAYET

Valg af dyreart

Valg af dyreart

| 7. | Mus må foretrækkes til denne test. Valideringsundersøgelser for LLNA: BrdU-ELISA blev udelukkende udført med CBA/JN-stammen, som derfor betragtes som den foretrukne stamme (10) (12). Der anvendes unge voksne hunmus, som ikke har født og ikke er drægtige. Ved forsøgets begyndelse skal dyrene være 8-12 uger gamle, og vægtvariationen mellem de anvendte dyr skal være mindst mulig og må ikke overstige 20 % af gennemsnitsvægten. Alternativt kan der anvendes andre stammer og handyr, når der er genereret tilstrækkelige data til at dokumentere, at der ikke er væsentlige stamme- og/eller kønsspecifikke forskelle i BrdU-ELISA-respons. |
| --- | --- |

7.

Mus må foretrækkes til denne test. Valideringsundersøgelser for LLNA: BrdU-ELISA blev udelukkende udført med CBA/JN-stammen, som derfor betragtes som den foretrukne stamme (10) (12). Der anvendes unge voksne hunmus, som ikke har født og ikke er drægtige. Ved forsøgets begyndelse skal dyrene være 8-12 uger gamle, og vægtvariationen mellem de anvendte dyr skal være mindst mulig og må ikke overstige 20 % af gennemsnitsvægten. Alternativt kan der anvendes andre stammer og handyr, når der er genereret tilstrækkelige data til at dokumentere, at der ikke er væsentlige stamme- og/eller kønsspecifikke forskelle i BrdU-ELISA-respons.

Miljøbetingelser og fodring

Miljøbetingelser og fodring

| 8. | Mus bør anbringes i grupper (16), medmindre der fremlægges et fyldestgørende videnskabeligt rationale for at holde dem i hvert sit bur. Temperaturen i forsøgsdyrrummet skal være 22 ± 3 °C. Den relative luftfugtighed skal være mindst 30 % og helst ikke over 70 % bortset fra under rengøring af lokalet, men 50-60 % skal tilsigtes. Belysningen skal være kunstig og bestå af 12 timers lys og 12 timers mørke. Som foder kan anvendes sædvanligt laboratoriefoder med fri adgang til drikkevand. |
| --- | --- |

8.

Mus bør anbringes i grupper (16), medmindre der fremlægges et fyldestgørende videnskabeligt rationale for at holde dem i hvert sit bur. Temperaturen i forsøgsdyrrummet skal være 22 ± 3 °C. Den relative luftfugtighed skal være mindst 30 % og helst ikke over 70 % bortset fra under rengøring af lokalet, men 50-60 % skal tilsigtes. Belysningen skal være kunstig og bestå af 12 timers lys og 12 timers mørke. Som foder kan anvendes sædvanligt laboratoriefoder med fri adgang til drikkevand.

Forberedelse af dyrene

Forberedelse af dyrene

| 9. | Dyrene udtages på tilfældig måde, mærkes, så de enkelte dyr kan identificeres (men ikke med nogen form for øremærkning), og holdes i burene i mindst fem døgn forud for doseringen, så de kan akklimatisere sig til forsøgsbetingelserne. Før behandlingen påbegyndes, undersøges alle dyr for at sikre, at de er uden observerbare hudlæsioner. |
| --- | --- |

9.

Dyrene udtages på tilfældig måde, mærkes, så de enkelte dyr kan identificeres (men ikke med nogen form for øremærkning), og holdes i burene i mindst fem døgn forud for doseringen, så de kan akklimatisere sig til forsøgsbetingelserne. Før behandlingen påbegyndes, undersøges alle dyr for at sikre, at de er uden observerbare hudlæsioner.

Fremstilling af forsøgsopløsninger

Fremstilling af forsøgsopløsninger

| 10. | Faste stoffer opløses eller opslæmmes i opløsningsmidler/bærestoffer og fortyndes eventuelt inden påføring på musens øre. Flydende kemikalier kan enten gives ufortyndet eller fortyndes først. Uopløselige kemikalier såsom dem, der generelt anvendes i medicinsk udstyr, underkastes en stor ekstraktion med passende opløsningsmiddel for at afdække alle ekstraherbare bestanddele til testning inden påføring på musens øre. Teststofferne fremstilles dagligt, medmindre stabilitetsdata viser, at opbevaring er acceptabel. |
| --- | --- |

10.

Faste stoffer opløses eller opslæmmes i opløsningsmidler/bærestoffer og fortyndes eventuelt inden påføring på musens øre. Flydende kemikalier kan enten gives ufortyndet eller fortyndes først. Uopløselige kemikalier såsom dem, der generelt anvendes i medicinsk udstyr, underkastes en stor ekstraktion med passende opløsningsmiddel for at afdække alle ekstraherbare bestanddele til testning inden påføring på musens øre. Teststofferne fremstilles dagligt, medmindre stabilitetsdata viser, at opbevaring er acceptabel.

Pålidelighedskontrol

Pålidelighedskontrol

| 11. | Positive kontrolstoffer (PC) anvendes til at godtgøre, at assayets præstationer er tilstrækkelige ved at reagere med tilstrækkelig følsomhed og reproducerbarhed som et sensibiliserende teststof, hvor responsens størrelsesorden er velkarakteriseret. Det anbefales at anvende sideløbende positiv kontrol, fordi det godtgør, at laboratoriets kompetence er tilstrækkelig til, at assayet bliver vellykket, og gør det muligt at bedømme reproducerbarheden og sammenligneligheden inden for og mellem laboratorier. Nogle tilsynsmyndigheder stiller desuden krav om en positiv kontrol for den enkelte undersøgelse, og brugere opfordres derfor til at henvende sig til de relevante myndigheder inden udførelsen af LLNA. BrdU-ELISA. Det anbefales derfor at foretage sideløbende positiv kontrol regelmæssigt, således at der ikke bliver behov for yderligere dyreforsøg for at opfylde eventuelle krav ved regelmæssig brug af positiv kontrol (se punkt 12). Den positive kontrol skal fremkalde en positiv LLNA: BrdU-ELISA-respons ved det eksponeringsniveau, som forventes at give en stigning i SI, som er mere end 1,6 større end i den negative kontrolgruppe). PC-dosis vælges, således at den ikke forårsager for stærk hudirritation eller systemisk toksicitet, og således at induktionen er reproducerbar, men ikke for voldsom (dvs. et SI på > 14 er for højt). De foretrukne positive kontrolstoffer er 25 % hexylkanelaldehyd (CAS-nr. 101-86-0) og 25 % eugenol (CAS-nr. 97-53-0) i acetone: olivenolie (4:1, v/v). Under visse omstændigheder vil andre positive kontrolstoffer, der opfylder de ovennævnte kriterier, kunne anvendes, såfremt valget heraf kan begrundes. |
| --- | --- |

11.

Positive kontrolstoffer (PC) anvendes til at godtgøre, at assayets præstationer er tilstrækkelige ved at reagere med tilstrækkelig følsomhed og reproducerbarhed som et sensibiliserende teststof, hvor responsens størrelsesorden er velkarakteriseret. Det anbefales at anvende sideløbende positiv kontrol, fordi det godtgør, at laboratoriets kompetence er tilstrækkelig til, at assayet bliver vellykket, og gør det muligt at bedømme reproducerbarheden og sammenligneligheden inden for og mellem laboratorier. Nogle tilsynsmyndigheder stiller desuden krav om en positiv kontrol for den enkelte undersøgelse, og brugere opfordres derfor til at henvende sig til de relevante myndigheder inden udførelsen af LLNA. BrdU-ELISA. Det anbefales derfor at foretage sideløbende positiv kontrol regelmæssigt, således at der ikke bliver behov for yderligere dyreforsøg for at opfylde eventuelle krav ved regelmæssig brug af positiv kontrol (se punkt 12). Den positive kontrol skal fremkalde en positiv LLNA: BrdU-ELISA-respons ved det eksponeringsniveau, som forventes at give en stigning i SI, som er mere end 1,6 større end i den negative kontrolgruppe). PC-dosis vælges, således at den ikke forårsager for stærk hudirritation eller systemisk toksicitet, og således at induktionen er reproducerbar, men ikke for voldsom (dvs. et SI på > 14 er for højt). De foretrukne positive kontrolstoffer er 25 % hexylkanelaldehyd (CAS-nr. 101-86-0) og 25 % eugenol (CAS-nr. 97-53-0) i acetone: olivenolie (4:1, v/v). Under visse omstændigheder vil andre positive kontrolstoffer, der opfylder de ovennævnte kriterier, kunne anvendes, såfremt valget heraf kan begrundes.

| 12. | Selv om det anbefales at anvende en sideløbende PC-gruppe, kan der være situationer, hvor regelmæssig testning (dvs. med ≤ 6 måneders interval) af det positive kontrolstof kan være tilstrækkeligt for laboratorier, der jævnligt udfører LLNA: BrdU-ELISA (dvs. udfører LLNA: BrdU-ELISA mindst én gang om måneden) og har oprettet en historisk PC-database, der påviser laboratoriets evne til at skabe reproducerbare og nøjagtige resultater med positive kontroller. Laboratoriet kan påvise, at det har tilstrækkelig kompetence til at udføre LLNA: BrdU-ELISA ved at opnå sammenhængende og positive resultater med den positive kontrol i mindst 10 uafhængige forsøg udført inden for en rimelig periode (dvs. inden for et år). |
| --- | --- |

12.

Selv om det anbefales at anvende en sideløbende PC-gruppe, kan der være situationer, hvor regelmæssig testning (dvs. med ≤ 6 måneders interval) af det positive kontrolstof kan være tilstrækkeligt for laboratorier, der jævnligt udfører LLNA: BrdU-ELISA (dvs. udfører LLNA: BrdU-ELISA mindst én gang om måneden) og har oprettet en historisk PC-database, der påviser laboratoriets evne til at skabe reproducerbare og nøjagtige resultater med positive kontroller. Laboratoriet kan påvise, at det har tilstrækkelig kompetence til at udføre LLNA: BrdU-ELISA ved at opnå sammenhængende og positive resultater med den positive kontrol i mindst 10 uafhængige forsøg udført inden for en rimelig periode (dvs. inden for et år).

| 13. | Der skal altid anvendes en sideløbende PC-gruppe i tilfælde af en procedureændring af LLNA: BrdU-ELISA (f.eks. ændring af uddannet personale, ændring af testmaterialer og/eller reagenser, ændring af testudstyr, ændring af kildedyr), og disse ændringer skal dokumenteres i laboratorierapporter. Der skal tages hensyn til disse ændringers indvirkning på tilstrækkeligheden af den allerede oprettede historiske database, når det besluttes, om det er nødvendigt at oprette en ny historisk database for at dokumentere, at PC-resultaterne er sammenhængende. |
| --- | --- |

13.

Der skal altid anvendes en sideløbende PC-gruppe i tilfælde af en procedureændring af LLNA: BrdU-ELISA (f.eks. ændring af uddannet personale, ændring af testmaterialer og/eller reagenser, ændring af testudstyr, ændring af kildedyr), og disse ændringer skal dokumenteres i laboratorierapporter. Der skal tages hensyn til disse ændringers indvirkning på tilstrækkeligheden af den allerede oprettede historiske database, når det besluttes, om det er nødvendigt at oprette en ny historisk database for at dokumentere, at PC-resultaterne er sammenhængende.

| 14. | Forsøgslederen skal være opmærksom på, at afgørelsen om at udføre en PC-undersøgelse regelmæssigt i stedet for samtidigt har indflydelse på, om negative undersøgelsesresultater, der er opnået uden en sideløbende positiv kontrol i perioden mellem hver regelmæssige PC-undersøgelse, er tilstrækkelige og kan accepteres. Hvis der f.eks. opnås et falsk negativt resultat i den regelmæssige PC-undersøgelse, kan negative testresultater, der er opnået i perioden mellem den seneste godkendte PC-undersøgelse og den ikke godkendte regelmæssige PC-undersøgelse, drages i tvivl. Disse konsekvenser bør overvejes nøje, når det besluttes, om der skal udføres sideløbende positive kontroller, eller om der kun skal udføres regelmæssige positive kontroller. Det skal også overvejes at anvende færre dyr i den sideløbende PC-gruppe, når det er videnskabeligt begrundet, og hvis laboratoriet på grundlag af laboratoriespecifikke historiske data påviser, at der kan anvendes færre mus (17). |
| --- | --- |

14.

Forsøgslederen skal være opmærksom på, at afgørelsen om at udføre en PC-undersøgelse regelmæssigt i stedet for samtidigt har indflydelse på, om negative undersøgelsesresultater, der er opnået uden en sideløbende positiv kontrol i perioden mellem hver regelmæssige PC-undersøgelse, er tilstrækkelige og kan accepteres. Hvis der f.eks. opnås et falsk negativt resultat i den regelmæssige PC-undersøgelse, kan negative testresultater, der er opnået i perioden mellem den seneste godkendte PC-undersøgelse og den ikke godkendte regelmæssige PC-undersøgelse, drages i tvivl. Disse konsekvenser bør overvejes nøje, når det besluttes, om der skal udføres sideløbende positive kontroller, eller om der kun skal udføres regelmæssige positive kontroller. Det skal også overvejes at anvende færre dyr i den sideløbende PC-gruppe, når det er videnskabeligt begrundet, og hvis laboratoriet på grundlag af laboratoriespecifikke historiske data påviser, at der kan anvendes færre mus (17).

| 15. | Skønt det positive kontrolstof bør afprøves i et vehikel, som vides at fremkalde ensartet respons (f.eks. acetone: olivenolie, 4:1, v/v), kan det i visse godkendelsessituationer desuden være nødvendigt med testning i andre vehikler end standardvehiklet (med en klinisk-kemisk relevant formulering) (18). Hvis den sideløbende positive kontrol foretages i et andet vehikel end teststoffet, skal der foretages en særskilt vehikelkontrol for den sideløbende positive kontrol. |
| --- | --- |

15.

Skønt det positive kontrolstof bør afprøves i et vehikel, som vides at fremkalde ensartet respons (f.eks. acetone: olivenolie, 4:1, v/v), kan det i visse godkendelsessituationer desuden være nødvendigt med testning i andre vehikler end standardvehiklet (med en klinisk-kemisk relevant formulering) (18). Hvis den sideløbende positive kontrol foretages i et andet vehikel end teststoffet, skal der foretages en særskilt vehikelkontrol for den sideløbende positive kontrol.

| 16. | Ved vurdering af teststoffer af en specifik kemisk klasse eller responser kan referencestoffer også anvendes til at vise, at testmetoden kan anvendes til at påvise denne type teststoffers potentiale for hudsensibilisering korrekt. Egnede referencestoffer skal have følgende egenskaber:






  — | strukturel og funktionel lighed med den klasse, som det teststof, der testes, tilhører |
| --- | --- | --- |

16.

Ved vurdering af teststoffer af en specifik kemisk klasse eller responser kan referencestoffer også anvendes til at vise, at testmetoden kan anvendes til at påvise denne type teststoffers potentiale for hudsensibilisering korrekt. Egnede referencestoffer skal have følgende egenskaber:

—

strukturel og funktionel lighed med den klasse, som det teststof, der testes, tilhører

| — | kendte fysisk/kemiske egenskaber |
| --- | --- |

—

kendte fysisk/kemiske egenskaber

| — | støttedata fra LLNA: BrdU-ELISA |
| --- | --- |

—

støttedata fra LLNA: BrdU-ELISA

| — | støttedata fra andre dyremodeller og/eller fra mennesker. |
| --- | --- |

—

støttedata fra andre dyremodeller og/eller fra mennesker.

TESTPROCEDURE

Antal dyr og dosisniveauer

Antal dyr og dosisniveauer

| 17. | Der anvendes mindst fire dyr i hver dosisgruppe, mindst tre forskellige koncentrationer af teststoffet, en sideløbende NC-gruppe, som udelukkende behandles med det til teststoffet anvendte vehikel, og en PC-gruppe (sideløbende eller nylig, afhængigt af laboratoriets politik, jf. punkt 11-15). Det bør overvejes at teste flere doser af det positive kontrolstof, navnlig ved periodisk testning af det positive kontrolstof. Bortset fra behandlingen med prøvestof behandles dyrene i kontrolgrupperne på samme måde som dyrene i behandlingsgrupperne. |
| --- | --- |

17.

Der anvendes mindst fire dyr i hver dosisgruppe, mindst tre forskellige koncentrationer af teststoffet, en sideløbende NC-gruppe, som udelukkende behandles med det til teststoffet anvendte vehikel, og en PC-gruppe (sideløbende eller nylig, afhængigt af laboratoriets politik, jf. punkt 11-15). Det bør overvejes at teste flere doser af det positive kontrolstof, navnlig ved periodisk testning af det positive kontrolstof. Bortset fra behandlingen med prøvestof behandles dyrene i kontrolgrupperne på samme måde som dyrene i behandlingsgrupperne.

| 18. | Dosering og valg af vehikel baseres på anbefalingerne i henvisning 2 og 19. Dosisniveauerne vælges normalt af koncentrationsserier på 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % osv. Der skal der fremlægges et fyldestgørende videnskabeligt rationale for valget af de anvendte koncentrationsserier. Alle foreliggende toksikologiske oplysninger (f.eks. vedrørende akut toksicitet og hudirritation) og strukturelle og fysisk-kemiske oplysninger om det pågældende teststof (og/eller strukturelt beslægtede stoffer) tages i betragtning, således at der vælges tre på hinanden følgende koncentrationer, hvoraf den højeste er den, der giver størst mulig eksponering uden systemisk toksicitet og/eller for stærk lokal hudirritation (19) (20 og kapitel B.4 i dette bilag). Såfremt disse oplysninger ikke foreligger, kan det være nødvendigt at foretage en prescreening (se punkt 21-24). |
| --- | --- |

18.

Dosering og valg af vehikel baseres på anbefalingerne i henvisning 2 og 19. Dosisniveauerne vælges normalt af koncentrationsserier på 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % osv. Der skal der fremlægges et fyldestgørende videnskabeligt rationale for valget af de anvendte koncentrationsserier. Alle foreliggende toksikologiske oplysninger (f.eks. vedrørende akut toksicitet og hudirritation) og strukturelle og fysisk-kemiske oplysninger om det pågældende teststof (og/eller strukturelt beslægtede stoffer) tages i betragtning, således at der vælges tre på hinanden følgende koncentrationer, hvoraf den højeste er den, der giver størst mulig eksponering uden systemisk toksicitet og/eller for stærk lokal hudirritation (19) (20 og kapitel B.4 i dette bilag). Såfremt disse oplysninger ikke foreligger, kan det være nødvendigt at foretage en prescreening (se punkt 21-24).

| 19. | Vehiklet må ikke indvirke på eller fordreje testresultatet og vælges, således at testkoncentrationer og opløselighed maksimeres, samtidig med at den fremstillede opløsning/suspension er egnet til påføring af tesstoffet. De anbefalede vehikler er acetone: olivenolie (4:1 v/v), N,N-dimethylformamid, methylethylketon, propylenglycol og dimethylsulphoxid (6), men andre kan anvendes, hvis der fremlægges et fyldestgørende videnskabeligt rationale derfor. I visse situationer kan det som yderligere kontrol være nødvendigt med et klinisk relevant opløsningsmiddel eller den formulering, hvori teststoffet markedsføres. Man må specielt være opmærksom på, at vehikelsystemet bør indeholde hydrofile teststoffer, som befugter huden og ikke straks løber af, ved at inkorporere egnede opløsningsmidler (f.eks. 1 % Pluronic® L92). Vehikler kun bestående af vand bør således undgås. |
| --- | --- |

19.

Vehiklet må ikke indvirke på eller fordreje testresultatet og vælges, således at testkoncentrationer og opløselighed maksimeres, samtidig med at den fremstillede opløsning/suspension er egnet til påføring af tesstoffet. De anbefalede vehikler er acetone: olivenolie (4:1 v/v), N,N-dimethylformamid, methylethylketon, propylenglycol og dimethylsulphoxid (6), men andre kan anvendes, hvis der fremlægges et fyldestgørende videnskabeligt rationale derfor. I visse situationer kan det som yderligere kontrol være nødvendigt med et klinisk relevant opløsningsmiddel eller den formulering, hvori teststoffet markedsføres. Man må specielt være opmærksom på, at vehikelsystemet bør indeholde hydrofile teststoffer, som befugter huden og ikke straks løber af, ved at inkorporere egnede opløsningsmidler (f.eks. 1 % Pluronic® L92). Vehikler kun bestående af vand bør således undgås.

N,N

| 20. | Behandling af lymfeknuder fra hver enkelt mus gør det muligt at vurdere variationen mellem dyr indbyrdes og at foretage en statistisk sammenligning af forskellen mellem teststoffet og målinger af VC-gruppen (se punkt 33). Det er desuden muligt at vurdere muligheden for at reducere antallet af mus i PC-gruppe, når der indsamles data for de enkelte dyr (17). Nogle tilsynsmyndigheder stilles desuden krav om indsamling af data for de enkelte dyr. Regelmæssig indsamling af data for de enkelte dyr øger dyrevelfærden, idet man undgår gentagelse af forsøg, som ville være nødvendige, hvis tilsynsmyndigheder på et senere tidspunkt stiller andre krav til de teststofresultater, der oprindeligt blev indsamlet på én måde (f.eks. på grundlag af poolede data for dyr), (f.eks. krav om data for de enkelte dyr). |
| --- | --- |

20.

Behandling af lymfeknuder fra hver enkelt mus gør det muligt at vurdere variationen mellem dyr indbyrdes og at foretage en statistisk sammenligning af forskellen mellem teststoffet og målinger af VC-gruppen (se punkt 33). Det er desuden muligt at vurdere muligheden for at reducere antallet af mus i PC-gruppe, når der indsamles data for de enkelte dyr (17). Nogle tilsynsmyndigheder stilles desuden krav om indsamling af data for de enkelte dyr. Regelmæssig indsamling af data for de enkelte dyr øger dyrevelfærden, idet man undgår gentagelse af forsøg, som ville være nødvendige, hvis tilsynsmyndigheder på et senere tidspunkt stiller andre krav til de teststofresultater, der oprindeligt blev indsamlet på én måde (f.eks. på grundlag af poolede data for dyr), (f.eks. krav om data for de enkelte dyr).

Prescreening

Prescreening

| 21. | Hvis der ikke foreligger tilstrækkelige oplysninger til at bestemme højeste dosis, der skal testes (se punkt 18), foretages en prescreening for at definere det passende dosisniveau, der skal testes i LLNA: BrdU-ELISA. Formålet med prescreeningen er at få hjælp til at vælge det maksimale dosisniveau, der skal anvendes i LLNA: BrdU-ELISA-hovedundersøgelsen, hvis der ikke foreligger oplysninger om den koncentration, der inducerer systemisk toksicitet (se punkt 24) og/eller for stærk lokal hudirritation (se punkt 23). Det maksimale dosisniveau, der testes, er 100 % af teststoffet for væsker eller den højest mulige koncentration for faste stoffer eller opslæmninger. |
| --- | --- |

21.

Hvis der ikke foreligger tilstrækkelige oplysninger til at bestemme højeste dosis, der skal testes (se punkt 18), foretages en prescreening for at definere det passende dosisniveau, der skal testes i LLNA: BrdU-ELISA. Formålet med prescreeningen er at få hjælp til at vælge det maksimale dosisniveau, der skal anvendes i LLNA: BrdU-ELISA-hovedundersøgelsen, hvis der ikke foreligger oplysninger om den koncentration, der inducerer systemisk toksicitet (se punkt 24) og/eller for stærk lokal hudirritation (se punkt 23). Det maksimale dosisniveau, der testes, er 100 % af teststoffet for væsker eller den højest mulige koncentration for faste stoffer eller opslæmninger.

| 22. | Prescreeningen foretages ved samme betingelser som for LLNA: BrdU-ELISA-hovedundersøgelsen, bortset fra at der ikke foretages en vurdering af lymfeknudeproliferationen, og der kan anvendes færre dyr til hver enkel dosisgruppe. Det foreslås at anvende et eller to dyr til hver enkel dosisgruppe. Alle mus observeres dagligt, og det registreres, om der optræder kliniske symptomer på systemisk toksicitet eller lokal irritation på påføringsstedet. Kropsvægten registreres inden forsøget og ved afslutning af forsøget (dag 6). Begge ører på de enkelte mus observeres for erytem, der registreres med en scoreværdi i tabel 1 (20 og kapitel B.4 i dette bilag). Der foretages målinger af øretykkelsen med en tykkelsesmåler (f.eks. et digitalt mikrometer eller en Peacock Dial-tykkelsesmåler) på dag 1 (inden administration af dosis), på dag 3 (ca. 48 timer efter den første dosis) og på dag 6. På dag 6 kan øretykkelsen desuden bestemmes ved hjælp af øremærkevægtbestemmelse, der foretages, efter at dyrene er blevet humant aflivet. For stærk lokal hudirritation angives med en erytemscore på ≥ 3 og/eller en forøgelse af øretykkelsen på ≥ 25 % på måledagen (21) (22). Den højeste dosis i LLNA: BrdU-ELISA-hovedundersøgelsen skal være den næsthøjeste dosis i prescreeningskoncentrationsserien (se punkt 18), som ikke inducerer systemisk toksicitet og/eller for stærk lokal hudirritation.

  Tabel 1


  Erytemscorer







  Observation | Score |
| --- | --- | --- |
| Intet erytem | 0 |
| Meget let erytem (knapt diagnosticerbart) | 1 |
| Veldefineret erytem | 2 |
| Moderat til svært erytem | 3 |
| Svært erytem (oksekødsfarvet) til escharadannelse, som umuliggør klassificering af erytemet | 4 |

22.

Prescreeningen foretages ved samme betingelser som for LLNA: BrdU-ELISA-hovedundersøgelsen, bortset fra at der ikke foretages en vurdering af lymfeknudeproliferationen, og der kan anvendes færre dyr til hver enkel dosisgruppe. Det foreslås at anvende et eller to dyr til hver enkel dosisgruppe. Alle mus observeres dagligt, og det registreres, om der optræder kliniske symptomer på systemisk toksicitet eller lokal irritation på påføringsstedet. Kropsvægten registreres inden forsøget og ved afslutning af forsøget (dag 6). Begge ører på de enkelte mus observeres for erytem, der registreres med en scoreværdi i tabel 1 (20 og kapitel B.4 i dette bilag). Der foretages målinger af øretykkelsen med en tykkelsesmåler (f.eks. et digitalt mikrometer eller en Peacock Dial-tykkelsesmåler) på dag 1 (inden administration af dosis), på dag 3 (ca. 48 timer efter den første dosis) og på dag 6. På dag 6 kan øretykkelsen desuden bestemmes ved hjælp af øremærkevægtbestemmelse, der foretages, efter at dyrene er blevet humant aflivet. For stærk lokal hudirritation angives med en erytemscore på ≥ 3 og/eller en forøgelse af øretykkelsen på ≥ 25 % på måledagen (21) (22). Den højeste dosis i LLNA: BrdU-ELISA-hovedundersøgelsen skal være den næsthøjeste dosis i prescreeningskoncentrationsserien (se punkt 18), som ikke inducerer systemisk toksicitet og/eller for stærk lokal hudirritation.

Tabel 1

Tabel 1

Erytemscorer

Erytemscorer

Observation

Score

Intet erytem

0

Meget let erytem (knapt diagnosticerbart)

1

Veldefineret erytem

2

Moderat til svært erytem

3

Svært erytem (oksekødsfarvet) til escharadannelse, som umuliggør klassificering af erytemet

4

| 23. | Ud over en forøgelse af øretykkelsen på 25 % (21) (22) er en statistisk signifikant forøgelse af øretykkelsen hos de eksponerede mus sammenlignet med kontrolmusene også blevet anvendt til at identificere lokalirriterende stoffer i LLNA (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28). Selv om statistisk signifikante forøgelser kan forekomme, når øretykkelsen er under 25 %, er de ikke blevet specifikt forbundet med for stærk irritation (25) (26) (27) (28) (29). |
| --- | --- |

23.

Ud over en forøgelse af øretykkelsen på 25 % (21) (22) er en statistisk signifikant forøgelse af øretykkelsen hos de eksponerede mus sammenlignet med kontrolmusene også blevet anvendt til at identificere lokalirriterende stoffer i LLNA (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28). Selv om statistisk signifikante forøgelser kan forekomme, når øretykkelsen er under 25 %, er de ikke blevet specifikt forbundet med for stærk irritation (25) (26) (27) (28) (29).

| 24. | Følgende kliniske observationer kan indikere systemisk toksicitet (30), hvis de anvendes som led i en integreret vurdering, og kan således indikere det maksimale dosisniveau, der kan anvendes i LLNA: BrdU-ELISA: ændringer i nervesystemets funktion (f.eks. hårrejsning, ataxi, rystelser og kramper), adfærdsændringer (f.eks. aggressivitet, ændringer i soigneringsaktiviteten, markant ændring i aktivitetsniveauet), ændringer i respirationsmønstre (f.eks. ændringer i respirationshyppigheden og -intensiteten såsom åndenød, snappende respiration og rallelyd) samt ændringer i føde- og vandindtagelsen. Derudover skal tegn på apati og/eller mangel på respons og kliniske tegn på lidelse og smerte, der ikke er let eller kortvarig, en reduktion af kropsvægten på > 5 % fra dag 1 til dag 6 og dødelighed tages i betragtning ved vurderingen. Dyr, som er moribunde, har tydelige smerter eller viser tegn på svære og vedvarende lidelser, skal aflives humant (31). |
| --- | --- |

24.

Følgende kliniske observationer kan indikere systemisk toksicitet (30), hvis de anvendes som led i en integreret vurdering, og kan således indikere det maksimale dosisniveau, der kan anvendes i LLNA: BrdU-ELISA: ændringer i nervesystemets funktion (f.eks. hårrejsning, ataxi, rystelser og kramper), adfærdsændringer (f.eks. aggressivitet, ændringer i soigneringsaktiviteten, markant ændring i aktivitetsniveauet), ændringer i respirationsmønstre (f.eks. ændringer i respirationshyppigheden og -intensiteten såsom åndenød, snappende respiration og rallelyd) samt ændringer i føde- og vandindtagelsen. Derudover skal tegn på apati og/eller mangel på respons og kliniske tegn på lidelse og smerte, der ikke er let eller kortvarig, en reduktion af kropsvægten på > 5 % fra dag 1 til dag 6 og dødelighed tages i betragtning ved vurderingen. Dyr, som er moribunde, har tydelige smerter eller viser tegn på svære og vedvarende lidelser, skal aflives humant (31).

Forsøgsplanen for hovedundersøgelsen

Forsøgsplanen for hovedundersøgelsen

| 25. | Forsøgsplanen for assayet er følgende:
  —   Dag 1: Hvert dyrs vægt bestemmes og registreres sammen med kliniske observationer. Dorsum af hvert øre påføres 25 μl af den pågældende teststofkoncentration, af vehiklet alene eller af det positive kontrolstof (sideløbende eller nylig, afhængigt af laboratoriets politik, jf. punkt 11-15).
  —   Dag 2 og 3: Påføringen fra dag 1 gentages.
  —   Dag 4: Ingen behandling.
  —   Dag 5: En opløsning på 0,5 ml (5 mg/mus) af BrdU (10 mg/ml) injiceres intraperitonealt.
  —   Dag 6: Hvert dyrs vægt bestemmes og registreres sammen med kliniske observationer. Ca. 24 timer (24 t) efter BrdU-injektionen aflives dyrene humant. De drænende aurikulære lymfeknuder fra hvert museøre eksciseres og behandles særskilt i en phosphatbufferet saltopløsning (PBS) for hvert dyr. Detaljer og diagrammer vedrørende identifikation og dissektion af lymfeknuder findes i henvisning (17). Der kan inkluderes yderligere parametre såsom bedømmelse af øreerythemscore eller målinger af øretykkelsen (foretages med en tykkelsesmåler eller ved hjælp af øremærkevægtbestemmelse ved obduktion) med henblik på yderligere kontrol af det lokale hudrespons i hovedundersøgelsen. |
| --- | --- |

25.

Forsøgsplanen for assayet er følgende:

—   Dag 1: Hvert dyrs vægt bestemmes og registreres sammen med kliniske observationer. Dorsum af hvert øre påføres 25 μl af den pågældende teststofkoncentration, af vehiklet alene eller af det positive kontrolstof (sideløbende eller nylig, afhængigt af laboratoriets politik, jf. punkt 11-15).

—   Dag 2 og 3: Påføringen fra dag 1 gentages.

—   Dag 4: Ingen behandling.

—   Dag 5: En opløsning på 0,5 ml (5 mg/mus) af BrdU (10 mg/ml) injiceres intraperitonealt.

—   Dag 6: Hvert dyrs vægt bestemmes og registreres sammen med kliniske observationer. Ca. 24 timer (24 t) efter BrdU-injektionen aflives dyrene humant. De drænende aurikulære lymfeknuder fra hvert museøre eksciseres og behandles særskilt i en phosphatbufferet saltopløsning (PBS) for hvert dyr. Detaljer og diagrammer vedrørende identifikation og dissektion af lymfeknuder findes i henvisning (17). Der kan inkluderes yderligere parametre såsom bedømmelse af øreerythemscore eller målinger af øretykkelsen (foretages med en tykkelsesmåler eller ved hjælp af øremærkevægtbestemmelse ved obduktion) med henblik på yderligere kontrol af det lokale hudrespons i hovedundersøgelsen.

Fremstilling af cellesuspensioner

Fremstilling af cellesuspensioner

| 26. | Fra hver mus fremstilles en bilateralt eksciseret enkeltcellesuspension af lymfeknudeceller (LNC) ved forsigtig mekanisk disaggregering gennem 200 μm trådnet af rustfrit stål eller en anden acceptabel teknik til fremstilling af en enkeltcellesuspension (f.eks. anvendelse af en pistil i plast til engangsbrug til knusning af lymfeknuderne, der herefter ledes gennem en #70 nylonmaske). Proceduren for fremstilling af LNC-suspensionen er meget vigtig i dette assay, og alle operatører skal derfor sætte sig ind i denne procedure på forhånd. Lymfeknuder i negative kontroldyr er desuden små, så det er vigtigt at de håndteres forsigtigt for at undgå en kunstig indvirkning på SI-værdier. LNC-suspensionens målvolumen skal i hvert enkelt tilfælde justeres til en bestemt optimal volumen (ca. 15 ml). Den optimale volumen er baseret på opnåelsen af en gennemsnitlig absorbans for NC-gruppen, der ligger inden for intervallet 0,1- 0,2. |
| --- | --- |

26.

Fra hver mus fremstilles en bilateralt eksciseret enkeltcellesuspension af lymfeknudeceller (LNC) ved forsigtig mekanisk disaggregering gennem 200 μm trådnet af rustfrit stål eller en anden acceptabel teknik til fremstilling af en enkeltcellesuspension (f.eks. anvendelse af en pistil i plast til engangsbrug til knusning af lymfeknuderne, der herefter ledes gennem en #70 nylonmaske). Proceduren for fremstilling af LNC-suspensionen er meget vigtig i dette assay, og alle operatører skal derfor sætte sig ind i denne procedure på forhånd. Lymfeknuder i negative kontroldyr er desuden små, så det er vigtigt at de håndteres forsigtigt for at undgå en kunstig indvirkning på SI-værdier. LNC-suspensionens målvolumen skal i hvert enkelt tilfælde justeres til en bestemt optimal volumen (ca. 15 ml). Den optimale volumen er baseret på opnåelsen af en gennemsnitlig absorbans for NC-gruppen, der ligger inden for intervallet 0,1- 0,2.

Bestemmelse af celleproliferationen (måling af BrdU-indholdet i dna af lymfocytter)

Bestemmelse af celleproliferationen (måling af BrdU-indholdet i dna af lymfocytter)

| 27. | BrdU måles ved hjælp af ELISA med kommercielt kit (f.eks. Roche Applied Science, Mannheim, Germany, Catalogue Number 11 647 229 001). Kort beskrevet tilsættes 100 μl af LNC-suspensionen til hullerne i en fladbundet tredobbelt mikroplade. Efter fiksering og denaturering af LNC tilsættes anti-BrdU-antistof til hvert hul og henstår til reaktion. Anti-BrdU-antistoffet vaskes efterfølgende af, hvorefter substratopløsningen tilsættes og henstår til fremstilling af kromogen. Herefter måles absorbans ved 370 nm med en referencebølgelængde på 492 nm. Testbetingelserne skal altid optimeres (se punkt 26). |
| --- | --- |

27.

BrdU måles ved hjælp af ELISA med kommercielt kit (f.eks. Roche Applied Science, Mannheim, Germany, Catalogue Number 11 647 229 001). Kort beskrevet tilsættes 100 μl af LNC-suspensionen til hullerne i en fladbundet tredobbelt mikroplade. Efter fiksering og denaturering af LNC tilsættes anti-BrdU-antistof til hvert hul og henstår til reaktion. Anti-BrdU-antistoffet vaskes efterfølgende af, hvorefter substratopløsningen tilsættes og henstår til fremstilling af kromogen. Herefter måles absorbans ved 370 nm med en referencebølgelængde på 492 nm. Testbetingelserne skal altid optimeres (se punkt 26).

OBSERVATIONER

Kliniske observationer

Kliniske observationer

| 28. | Hver enkelt mus observeres omhyggeligt mindst en gang dagligt for alle kliniske tegn på lokalirritation på påføringsstedet eller systemisk toksicitet. Alle observationer registreres systematisk i enkeltjournaler for hver mus. Kontrolplaner skal omfatte kriterier for omgående identificering af de mus, der udviser systemisk toksicitet, for stærk lokal hudirritation eller hudætsning, og som skal aflives (31). |
| --- | --- |

28.

Hver enkelt mus observeres omhyggeligt mindst en gang dagligt for alle kliniske tegn på lokalirritation på påføringsstedet eller systemisk toksicitet. Alle observationer registreres systematisk i enkeltjournaler for hver mus. Kontrolplaner skal omfatte kriterier for omgående identificering af de mus, der udviser systemisk toksicitet, for stærk lokal hudirritation eller hudætsning, og som skal aflives (31).

Kropsvægt

Kropsvægt

| 29. | Som angivet i punkt 25 måles kropsvægten af hvert dyr ved forsøgets begyndelse og ved den planmæssige humane aflivning. |
| --- | --- |

29.

Som angivet i punkt 25 måles kropsvægten af hvert dyr ved forsøgets begyndelse og ved den planmæssige humane aflivning.

BEREGNING AF RESULTATER

| 30. | Resultaterne for hver behandlingsgruppe angives som den gennemsnitlige SI-værdi. SI-værdien fås ved at dividere det gennemsnitlige BrdU-mærkningsindeks/mus i hver stoftestgruppe og PC-gruppen med det gennemsnitlige BrdU-mærkningsindeks/mus for opløsningsmiddel/vehikelkontrol-gruppen. Den gennemsnitlige SI-værdi for de vehikelbehandlede kontroldyr er således 1.
  BrdU-mærkningsindekset defineres som:
  BrdU-mærkningsindeks = (ABSem — ABS blankem) – (ABSref — ABS blankref)
  Hvor: em = emissionsbølgelængde og ref = referencebølgelængde. |
| --- | --- |

30.

Resultaterne for hver behandlingsgruppe angives som den gennemsnitlige SI-værdi. SI-værdien fås ved at dividere det gennemsnitlige BrdU-mærkningsindeks/mus i hver stoftestgruppe og PC-gruppen med det gennemsnitlige BrdU-mærkningsindeks/mus for opløsningsmiddel/vehikelkontrol-gruppen. Den gennemsnitlige SI-værdi for de vehikelbehandlede kontroldyr er således 1.

BrdU-mærkningsindekset defineres som:

BrdU-mærkningsindeks = (ABSem — ABS blankem) – (ABSref — ABS blankref)

em

em

ref

ref

Hvor: em = emissionsbølgelængde og ref = referencebølgelængde.

| 31. | I beslutningsprocessen anses et resultat for at være positivt, når SI er mindst 1,6 (10). Dosis/responsforholdets styrke, den statistiske signifikans og opløsningsmidlets/vehiklets og PC-responsets sammenhæng kan imidlertid også indgå i bedømmelsen af, om et tvetydigt resultat (dvs. en SI-værdi på mellem 1,6 og 1,9) anses for at være positivt (3) (6) (32). |
| --- | --- |

31.

I beslutningsprocessen anses et resultat for at være positivt, når SI er mindst 1,6 (10). Dosis/responsforholdets styrke, den statistiske signifikans og opløsningsmidlets/vehiklets og PC-responsets sammenhæng kan imidlertid også indgå i bedømmelsen af, om et tvetydigt resultat (dvs. en SI-værdi på mellem 1,6 og 1,9) anses for at være positivt (3) (6) (32).

| 32. | I tilfælde af tvetydige resultater med en SI på mellem 1,6 og 1,9 vil det være hensigtsmæssigt at tage højde for yderligere oplysninger som f.eks. dosis-responsforholdet, dokumentation for systemisk toksicitet eller for stærk irritation og i påkommende tilfælde statistisk signifikans sammen med SI-værdierne for at få bekræftet, at disse resultater er positive (10). Teststoffets forskellige egenskaber bør ligeledes tages i betragtning, herunder om det er strukturelt beslægtet med kendte hudsensibiliserende stoffer, om det medfører for stærk lokal hudirritation hos musen, og arten af det iagttagne dosis-responsforhold. Disse og andre overvejelser er der redegjort mere indgående for andetsteds (4). |
| --- | --- |

32.

I tilfælde af tvetydige resultater med en SI på mellem 1,6 og 1,9 vil det være hensigtsmæssigt at tage højde for yderligere oplysninger som f.eks. dosis-responsforholdet, dokumentation for systemisk toksicitet eller for stærk irritation og i påkommende tilfælde statistisk signifikans sammen med SI-værdierne for at få bekræftet, at disse resultater er positive (10). Teststoffets forskellige egenskaber bør ligeledes tages i betragtning, herunder om det er strukturelt beslægtet med kendte hudsensibiliserende stoffer, om det medfører for stærk lokal hudirritation hos musen, og arten af det iagttagne dosis-responsforhold. Disse og andre overvejelser er der redegjort mere indgående for andetsteds (4).

| 33. | Indsamling af data om radioaktivitet for den enkelte mus gør det muligt at foretage en statistisk analyse af tilstedeværelsen og omfanget af dosis-responsforholdet i dataene. Statistiske vurderinger kan omfatte en evaluering af dosis-responsforholdet samt behørigt tilpassede sammenligninger af testgrupper (f.eks. parvis sammenligning af dosisgruppe og sideløbende (opløsningsmiddel/bærestof) kontrolgrupper). Statistiske analyser kan omfatte f.eks. lineær regression eller Williams test til vurdering af dosis-responsudviklingen og Dunnetts test til parvis sammenligning. Ved valg af passende statistisk analysemetode bør undersøgeren være opmærksom på mulige forskelle i varians eller andre tilknyttede problemer, som kan kræve transformation af data eller anvendelse af ikkeparametrisk statistisk analyse. Undersøgeren kan under alle omstændigheder være nødsaget til at udføre SI-beregninger og statistiske analyser med og uden visse datapunkter (til tider kaldet »outliers«). |
| --- | --- |

33.

Indsamling af data om radioaktivitet for den enkelte mus gør det muligt at foretage en statistisk analyse af tilstedeværelsen og omfanget af dosis-responsforholdet i dataene. Statistiske vurderinger kan omfatte en evaluering af dosis-responsforholdet samt behørigt tilpassede sammenligninger af testgrupper (f.eks. parvis sammenligning af dosisgruppe og sideløbende (opløsningsmiddel/bærestof) kontrolgrupper). Statistiske analyser kan omfatte f.eks. lineær regression eller Williams test til vurdering af dosis-responsudviklingen og Dunnetts test til parvis sammenligning. Ved valg af passende statistisk analysemetode bør undersøgeren være opmærksom på mulige forskelle i varians eller andre tilknyttede problemer, som kan kræve transformation af data eller anvendelse af ikkeparametrisk statistisk analyse. Undersøgeren kan under alle omstændigheder være nødsaget til at udføre SI-beregninger og statistiske analyser med og uden visse datapunkter (til tider kaldet »outliers«).

DATA OG RAPPORTERING

Data

Data

| 34. | Data opstilles i tabelform med angivelse af de enkelte dyrs BrdU-mærkningsindeksværdier, gruppens gennemsnitlige BrdU-mærkningsindeks/dyr, det tilknyttede fejlled (f.eks. SD, SEM), og det gennemsnitlige SI for hver dosisgruppe sammenholdt med den sideløbende opløsningsmiddel/vehikelkontrol-gruppe. |
| --- | --- |

34.

Data opstilles i tabelform med angivelse af de enkelte dyrs BrdU-mærkningsindeksværdier, gruppens gennemsnitlige BrdU-mærkningsindeks/dyr, det tilknyttede fejlled (f.eks. SD, SEM), og det gennemsnitlige SI for hver dosisgruppe sammenholdt med den sideløbende opløsningsmiddel/vehikelkontrol-gruppe.

Testrapport

Testrapport

| 35. | Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger: | Test- og kontrolstoffer:






  — | identifikationsoplysninger (f.eks. CAS- og EF-numre, hvis de findes, oprindelse, renhed, kendte urenheder, batchnummer) |
| --- | --- | --- | --- |

35.

Testrapporten skal indeholde følgende oplysninger:

Test- og kontrolstoffer:

—

identifikationsoplysninger (f.eks. CAS- og EF-numre, hvis de findes, oprindelse, renhed, kendte urenheder, batchnummer)

| — | fysisk tilstand og fysisk-kemiske egenskaber (f.eks. flygtighed, stabilitet, opløselighed) |
| --- | --- |

—

fysisk tilstand og fysisk-kemiske egenskaber (f.eks. flygtighed, stabilitet, opløselighed)

| — | for blandinger: sammensætning og relativt indhold af bestanddelene. |
| --- | --- |

—

for blandinger: sammensætning og relativt indhold af bestanddelene.

| | Opløsningsmiddel/bærestof:






  — | identifikationsoplysninger (renhed, koncentration (i givet fald), anvendt volumen) |
| --- | --- | --- |

Opløsningsmiddel/bærestof:

—

identifikationsoplysninger (renhed, koncentration (i givet fald), anvendt volumen)

| — | begrundelse for valg af vehikel |
| --- | --- |

—

begrundelse for valg af vehikel

| | For forsøgsdyrene:






  — | den anvendte CBA-musestamme |
| --- | --- | --- |

For forsøgsdyrene:

—

den anvendte CBA-musestamme

| — | dyrenes mikrobiologiske status, hvis den kendes |
| --- | --- |

—

dyrenes mikrobiologiske status, hvis den kendes

| — | antal dyr og deres alder |
| --- | --- |

—

antal dyr og deres alder

| — | dyrenes oprindelse, miljøbetingelser, kost osv. |
| --- | --- |

—

dyrenes oprindelse, miljøbetingelser, kost osv.

| | Testbetingelser:






  — | oprindelse, batchnummer og producentens oplysninger om kvalitetssikring/kvalitetskontrol (antistoffets følsomhed og specificitet og påvisningsgrænsen) for ELISA-kittet |
| --- | --- | --- |

Testbetingelser:

—

oprindelse, batchnummer og producentens oplysninger om kvalitetssikring/kvalitetskontrol (antistoffets følsomhed og specificitet og påvisningsgrænsen) for ELISA-kittet

| — | nærmere oplysninger om præparation og påføring af teststoffet |
| --- | --- |

—

nærmere oplysninger om præparation og påføring af teststoffet

| — | begrundelse af den valgte dosis (herunder resultaterne af prescreeningen, hvis en sådan er udført) |
| --- | --- |

—

begrundelse af den valgte dosis (herunder resultaterne af prescreeningen, hvis en sådan er udført)

| — | anvendte koncentrationer af vehikel og teststof og samlet mængde påført teststof |
| --- | --- |

—

anvendte koncentrationer af vehikel og teststof og samlet mængde påført teststof

| — | nærmere oplysninger om foderets og vandets kvalitet (herunder fødens art/oprindelse, vandets oprindelse). |
| --- | --- |

—

nærmere oplysninger om foderets og vandets kvalitet (herunder fødens art/oprindelse, vandets oprindelse).

| — | detaljeret beskrivelse af behandlings- og prøveudtagningsplan |
| --- | --- |

—

detaljeret beskrivelse af behandlings- og prøveudtagningsplan

| — | metoder til måling af toksicitet |
| --- | --- |

—

metoder til måling af toksicitet

| — | kriterier for bedømmelse af undersøgelsen som positiv eller negativ |
| --- | --- |

—

kriterier for bedømmelse af undersøgelsen som positiv eller negativ

| — | nærmere oplysninger om afvigelser fra protokollen og en redegørelse for, hvordan afvigelsen indvirker på undersøgelsens udformning og resultater. |
| --- | --- |

—

nærmere oplysninger om afvigelser fra protokollen og en redegørelse for, hvordan afvigelsen indvirker på undersøgelsens udformning og resultater.

| | Pålidelighedskontrol:






  — | sammenfatning af resultaterne af den seneste pålidelighedskontrol, herunder oplysninger om teststoffet og anvendt koncentration og vehikel |
| --- | --- | --- |

Pålidelighedskontrol:

—

sammenfatning af resultaterne af den seneste pålidelighedskontrol, herunder oplysninger om teststoffet og anvendt koncentration og vehikel

| — | data for sideløbende og/eller tidligere positive og sideløbende negative (opløsningsmiddel/bærestof) kontrolprøver fra prøvelaboratoriet |
| --- | --- |

—

data for sideløbende og/eller tidligere positive og sideløbende negative (opløsningsmiddel/bærestof) kontrolprøver fra prøvelaboratoriet

| — | hvis der ikke blev foretaget en sideløbende positiv kontrol, datoen for og laboratorierapport om den seneste regelmæssige positive kontrol og en rapport med nærmere historiske data for den positive kontrol fra laboratoriet, hvori det begrundes, hvorfor der ikke er blevet foretaget en sideløbende positiv kontrol. |
| --- | --- |

—

hvis der ikke blev foretaget en sideløbende positiv kontrol, datoen for og laboratorierapport om den seneste regelmæssige positive kontrol og en rapport med nærmere historiske data for den positive kontrol fra laboratoriet, hvori det begrundes, hvorfor der ikke er blevet foretaget en sideløbende positiv kontrol.

| | Resultater:






  — | de enkelte mus' vægt ved doseringens begyndelse og ved den planmæssige humane aflivning samt det gennemsnitlige og tilknyttede fejlled (f.eks. SD, SEM) for hver behandlingsgruppe |
| --- | --- | --- |

Resultater:

—

de enkelte mus' vægt ved doseringens begyndelse og ved den planmæssige humane aflivning samt det gennemsnitlige og tilknyttede fejlled (f.eks. SD, SEM) for hver behandlingsgruppe

| — | tidspunkt for indtræden af og tegnene på toksicitet, herunder eventuel hudirritation på administrationsstedet for hvert dyr |
| --- | --- |

—

tidspunkt for indtræden af og tegnene på toksicitet, herunder eventuel hudirritation på administrationsstedet for hvert dyr

| — | en tabel med mærkningsindekser for de enkelte mus og SI-værdier for hver behandlingsgruppe |
| --- | --- |

—

en tabel med mærkningsindekser for de enkelte mus og SI-værdier for hver behandlingsgruppe

| — | det gennemsnitlige og tilknyttede fejlled (f.eks. SD, SEM) for mærkningsindeks/mus for hver behandlingsgruppe og resultaterne af en outlieranalyse for hver behandlingsgruppe |
| --- | --- |

—

det gennemsnitlige og tilknyttede fejlled (f.eks. SD, SEM) for mærkningsindeks/mus for hver behandlingsgruppe og resultaterne af en outlieranalyse for hver behandlingsgruppe

| — | beregnet SI og et passende mål for variationen, hvor der tages hensyn til variationen mellem dyr i både teststoffet og kontrolgrupperne |
| --- | --- |

—

beregnet SI og et passende mål for variationen, hvor der tages hensyn til variationen mellem dyr i både teststoffet og kontrolgrupperne

| — | dosis-responsforholdet |
| --- | --- |

—

dosis-responsforholdet

| — | statistiske analyser, når det er hensigtsmæssigt. |
| --- | --- |

—

statistiske analyser, når det er hensigtsmæssigt.

| | Behandling af resultater:






  — | Kortfattet kommentar til resultaterne, dosis-responsanalyse og i givet fald statistisk analyse med en konklusion med hensyn til, om det undersøgte stof må anses for hudirriterende. |
| --- | --- | --- |

Behandling af resultater:

—

Kortfattet kommentar til resultaterne, dosis-responsanalyse og i givet fald statistisk analyse med en konklusion med hensyn til, om det undersøgte stof må anses for hudirriterende.

LITTERATUR

| (1) | OECD (2010), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guideline No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

(1)

OECD (2010), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guideline No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

| (2) | Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: status of validation. Food Chem. Toxicol., 34, 999-1002. |
| --- | --- |

(2)

Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: status of validation. Food Chem. Toxicol., 34, 999-1002.

| (3) | Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 34, 985-997. |
| --- | --- |

(3)

Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 34, 985-997.

| (4) | Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 36, 327-33. |
| --- | --- |

(4)

Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 36, 327-33.

| (5) | Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicol., 146, 49-59. |
| --- | --- |

(5)

Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicol., 146, 49-59.

| (6) | ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf] |
| --- | --- |

(6)

ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]

| (7) | Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 258-273. |
| --- | --- |

(7)

Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 258-273.

| (8) | Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 274-286. |
| --- | --- |

(8)

Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 274-286.

| (9) | Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 249-257. |
| --- | --- |

(9)

Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 249-257.

| (10) | ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioactive local lymph node assay: BrdU-ELISA Test Method Protocol (LLNA: BrdU-ELISA). NIH Publication No. 10-7552A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-ELISA/TMER.htm] |
| --- | --- |

(10)

ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioactive local lymph node assay: BrdU-ELISA Test Method Protocol (LLNA: BrdU-ELISA). NIH Publication No. 10-7552A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-ELISA/TMER.htm]

| (11) | ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: Updated validation status of new versions and applications of the murine local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf] |
| --- | --- |

(11)

ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: Updated validation status of new versions and applications of the murine local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf]

| (12) | Takeyoshi, M., Iida, K., Shiraishi, K. and Hoshuyama, S. (2005), Novel approach for classifying chemicals according to skin sensitising potency by non-radioisotopic modification of the local lymph node assay. J. Appl. Toxicol., 25, 129-134. |
| --- | --- |

(12)

Takeyoshi, M., Iida, K., Shiraishi, K. and Hoshuyama, S. (2005), Novel approach for classifying chemicals according to skin sensitising potency by non-radioisotopic modification of the local lymph node assay. J. Appl. Toxicol., 25, 129-134.

| (13) | OECD (1992), Skin Sensitisation, Test Guideline No. 406, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

(13)

OECD (1992), Skin Sensitisation, Test Guideline No. 406, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

| (14) | Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol., 46, 1896-1904. |
| --- | --- |

(14)

Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol., 46, 1896-1904.

| (15) | Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 90-96. |
| --- | --- |

(15)

Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 90-96.

| (16) | ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National Academies Press. |
| --- | --- |

(16)

ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National Academies Press.

| (17) | ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local Lymph Node Assay. NIH Publication Number 09-7357. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf] |
| --- | --- |

(17)

ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local Lymph Node Assay. NIH Publication Number 09-7357. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf]

| (18) | McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH. Toxicol., 238, 71-89. |
| --- | --- |

(18)

McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH. Toxicol., 238, 71-89.

| (19) | Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The local lymph node assay: developments and applications. Toxicol., 93, 13-31. |
| --- | --- |

(19)

Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The local lymph node assay: developments and applications. Toxicol., 93, 13-31.

| (20) | OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No. 404, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

(20)

OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No. 404, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

| (21) | Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances. Toxicologist, 96, 235. |
| --- | --- |

(21)

Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances. Toxicologist, 96, 235.

| (22) | ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf]. |
| --- | --- |

(22)

ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf].

| (23) | Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice. Drug Chem. Toxicol., 21, 195-206. |
| --- | --- |

(23)

Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice. Drug Chem. Toxicol., 21, 195-206.

| (24) | Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, 83-94. |
| --- | --- |

(24)

Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, 83-94.

| (25) | Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals. Toxicol. Meth., 8, 245-256. |
| --- | --- |

(25)

Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals. Toxicol. Meth., 8, 245-256.

| (26) | Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods. Drug. Chem. Toxicol., 22, 491-506. |
| --- | --- |

(26)

Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods. Drug. Chem. Toxicol., 22, 491-506.

| (27) | Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter- laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, 60-68. |
| --- | --- |

(27)

Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter- laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, 60-68.

| (28) | Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721-728. |
| --- | --- |

(28)

Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721-728.

| (29) | Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec D. (2007), Lack of evidence for contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect., 115, 1023-1028. |
| --- | --- |

(29)

Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec D. (2007), Lack of evidence for contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect., 115, 1023-1028.

| (30) | ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm]. |
| --- | --- |

(30)

ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm].

In Vitro

| (31) | OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

(31)

OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

| (32) | Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ.l Health, 53, 563-79. |
| --- | --- |

(32)

Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ.l Health, 53, 563-79.

| (33) | OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

(33)

OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

Tillæg 1

DEFINITIONER

Nøjagtighed: Overensstemmelsen mellem testmetodens resultater og accepterede referenceværdier. Den er et mål for testmetodens ydeevne og et af aspekterne af relevans. Udtrykket benyttes ofte som synonym for »konkordans«, forstået som den andel korrekte udfald, testmetoden fører til (33).

Referencestof: Et sensibiliserende eller ikkesensibiliserende stof, der anvendes som standard til sammenligning med et teststof. Et referencestof skal have følgende egenskaber: i) en eller flere ensartede og pålidelige kilder; ii) strukturel og funktionel lighed med den stofgruppe, der testes; iii) kendte fysisk/kemiske egenskaber; iv) støttedata om kendte virkninger og v) kendt styrke i det ønskede responsområde.

Falsk negativ: Et teststof, som ved en testmetode fejlagtigt identificeres som negativt eller ikkeaktivt, selv om det rent faktisk er positivt eller aktivt (33).

Falsk positiv: Et teststof, som ved en testmetode fejlagtigt identificeres som positivt eller aktivt, selv om det rent faktisk er negativt eller ikkeaktivt (33).

Fare: Potentielle skadelige virkninger for menneskers sundhed og miljøet. De skadelige virkninger fremkaldes kun, hvis eksponeringen er tilstrækkelig.

Reproducerbarhed mellem laboratorier: Mål for, i hvilken grad forskellige kvalificerede laboratorier kan opnå de samme resultater kvalitativt og kvantitativt, når de anvender samme protokol og tester de samme teststoffer. Reproducerbarheden mellem laboratorier bestemmes forud for og under valideringsprocessen og angiver, i hvilken grad en test kan overføres mellem laboratorier med et vellykket resultat. Kaldes også ekstern reproducerbarhed (33).

Reproducerbarhed inden for laboratorier: Bestemmelse af, i hvilken grad kvalificeret personale på det samme laboratorium kan reproducere resultater ved anvendelse af en specifik protokol på forskellige tidspunkter. Kaldes også intern reproducerbarhed (33).

Outlier: En outlier er en observation, der er markant anderledes end andre værdier i en tilfældig stikprøve af en population.

Kvalitetssikring: En forvaltningsproces, hvor overholdelsen af laboratoriets teststandarder, krav og registreringsprocedurer og nøjagtigheden af dataoverførsler vurderes af personer, der er uafhængige af de personer, der udfører forsøget.

Pålidelighed: Mål for, i hvilken grad en testmetode kan udføres reproducerbart i og mellem laboratorier over en længere periode, når den udføres efter samme protokol. Den bedømmes ved beregning af reproducerbarhed inden for og mellem laboratorier (33).

Hudsensibilisering: En immunologisk proces, der udløses, når en disponeret person eksponeres for en inducerende kemisk allergen, som fremkalder en kutan immunrespons, der kan føre til udviklingen af kontaktsensibilisering.

Stimulationsindeks (SI): En værdi, der beregnes for at vurdere et teststofs potentiale for hudsensibilisering, og som er forholdet mellem proliferation i behandlingsgrupperne og proliferationen i den sideløbende vehikelkontrolgruppe.

Teststof (eller testkemikalie): Alle stoffer eller blandinger, der testes ved hjælp af denne TM.

---

(1)  Antages ikke at være et sensibiliserende stof for mennesker, da der ikke blev fundet nogen kliniske lappetestresultater, det er ikke inkluderet som et lappetestkit til påvisning af allergi, og der blev ikke fundet nogen caserapporter om human sensibilisering.

1

(2)  Der foreligger ingen data fra marsvinetest.

2

(3)  Kemikalier fremstilles dagligt, medmindre stabilitetsdata viser, at opbevaring er acceptabel.

3

(4)  Som følge af den potentielle indvirkning af forskellige vehikler på LLNA's ydeevne bør det anbefalede vehikel for hvert referencekemikalie anvendes (24) (32).

4

(5)  Middelværdi, hvor der var mere end en EC3-værdi. For negative stoffer (dvs. med stimulationsindeks < 3) angives den højeste testede koncentration.

5

(6)  Antal LLNA-undersøgelser, som dataene hidrører fra.

6

(7)  Forhandles under betegnelsen Kathon CG (CAS-nr. 55965-84-9), der er en blanding af CMI og MI i forholdet 1:3. De relative koncentrationer af hver komponent ligger i intervallet 1,1 % til 1,25 % (CMI) og 0,3 % til 0,45 % (MI). De inaktive komponenter er magnesiumsalte (21,5 % til 24 %) og kobbernitrat (0,15 % til 0,17 %), og resten af formuleringen er 74 % til 77 % vand. Kathon CG forhandles allerede gennem Sigma-Aldrich and Rohm and Haas (nu Dow Chemical Corporation).

7

(8)  Disse referencekemikalier udgør en delmængde af de referencekemikalier, der anvendes i valideringsundersøgelsen.

8

(9)  In vivo-score i overensstemmelse med B.4 og OECD Test Guideline 404 (4).

9

(10)  I denne testmetode betragtes stoffer i den valgfrie kategori 3 (milde lokalirriterende stoffer) i FN GHS som ikkeklassificerede (»Ingen kategori«).

10

(11)  Kategori 3 i FN GHS anvendes ikke i henhold til EU CLP.

11

(12)  EFT L 225 af 21.8.2001, s. 1.

12

(13)  Kemikalierne er udvalgt på grundlag af følgende kriterier: i) kemikalierne fås i handelen, ii) de repræsenterer hele Draize-pointskalaen (fra ikkeirriterende til stærkt irriterende), iii) de har en veldefineret kemisk struktur, iv) de er repræsentative for de typer kemisk funktion, der indgår i valideringsprocessen, og de har ikke nogen ekstremt toksisk profil (f.eks. kræftfremkaldende eller reproduktionstoksiske) og indebærer heller ikke urimeligt høje bortskaffelsesomkostninger.

13

(14)  Kemikalier, der er irriterende for kaniner, men hvor der foreligger pålidelig dokumentation for, at de er ikkeirriterende for mennesker (31) (32) (33).

14

(15)  I henhold til FN GHS, ikke i henhold til EU CLP.

15

(16)  Referencekemikalierne er de anbefalede kemikalier. Det er muligt at tilføje eller erstatte kemikalier på listen over referencekemikalier, hvis deres aktivitet er kendt, og hvis de inducerer mikrokerner ved hjælp af de samme mekanismer, og hvis det påvises, at de er egnede for de kemikalier, som skal testes ved hjælp af MNvit-assayet. Afhængigt af formålet kan begrundelsen også omfatte en valideringsundersøgelse af en bred vifte af stoffer eller en undersøgelse med fokus på et snævrere spektrum baseret på teststoffets kemiske gruppe eller de undersøgte skadevirkninger.

16

---