# Eiropas Savienības L 193/2012

| | ISSN 1977-0715
  doi:10.3000/19770715.L_2012.193.lav |
| --- | --- |
| Eiropas Savienības
  Oficiālais Vēstnesis | L 193 |
| | |
| Izdevums latviešu valodā | Tiesību akti | 55. sējums2012. gada 20. jūlijs |

ISSN 1977-0715

doi:10.3000/19770715.L_2012.193.lav

Eiropas Savienības

Oficiālais Vēstnesis

L 193

Izdevums latviešu valodā

Tiesību akti

55. sējums2012. gada 20. jūlijs

---

| Saturs | | II   Neleģislatīvi akti | Lappuse |
| --- | --- | --- | --- |
| | | REGULAS |
| | * | Komisijas Regula (ES) Nr. 640/2012 (2012. gada 6. jūlijs), ar kuru, pielāgojot tehnikas attīstībai, groza Regulu (EK) Nr. 440/2008 par testēšanas metožu noteikšanu saskaņā ar Eiropas Parlamenta un Padomes Regulu (EK) Nr. 1907/2006, kas attiecas uz ķimikāliju reģistrēšanu, vērtēšanu, licencēšanu un ierobežošanu (REACH) (
  1
  ) | 1 |

Saturs

II   Neleģislatīvi akti

Lappuse

REGULAS

*

Komisijas Regula (ES) Nr. 640/2012 (2012. gada 6. jūlijs), ar kuru, pielāgojot tehnikas attīstībai, groza Regulu (EK) Nr. 440/2008 par testēšanas metožu noteikšanu saskaņā ar Eiropas Parlamenta un Padomes Regulu (EK) Nr. 1907/2006, kas attiecas uz ķimikāliju reģistrēšanu, vērtēšanu, licencēšanu un ierobežošanu (REACH) (
  1
  )

1

1

| | |
| --- | --- |
| | (1)   Dokuments attiecas uz EEZ |

---

(1)   Dokuments attiecas uz EEZ

1

| LV | Tiesību akti, kuru virsraksti ir gaišajā drukā, attiecas uz kārtējiem jautājumiem lauksaimniecības jomā un parasti ir spēkā tikai ierobežotu laika posmu.
  Visu citu tiesību aktu virsraksti ir tumšajā drukā, un pirms tiem ir zvaigznīte. |
| --- | --- |

LV

Tiesību akti, kuru virsraksti ir gaišajā drukā, attiecas uz kārtējiem jautājumiem lauksaimniecības jomā un parasti ir spēkā tikai ierobežotu laika posmu.

Visu citu tiesību aktu virsraksti ir tumšajā drukā, un pirms tiem ir zvaigznīte.

---

II Neleģislatīvi akti

REGULAS

| 20.7.2012 | LV | Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis | L 193/1 |
| --- | --- | --- | --- |

20.7.2012

LV

Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis

L 193/1

---

KOMISIJAS REGULA (ES) Nr. 640/2012

(2012. gada 6. jūlijs),

ar kuru, pielāgojot tehnikas attīstībai, groza Regulu (EK) Nr. 440/2008 par testēšanas metožu noteikšanu saskaņā ar Eiropas Parlamenta un Padomes Regulu (EK) Nr. 1907/2006, kas attiecas uz ķimikāliju reģistrēšanu, vērtēšanu, licencēšanu un ierobežošanu (REACH)

(Dokuments attiecas uz EEZ)

EIROPAS KOMISIJA,

ņemot vērā Līgumu par Eiropas Savienības darbību,

ņemot vērā Eiropas Parlamenta un Padomes 2006. gada 18. decembra Regulu (EK) Nr. 1907/2006, kas attiecas uz ķimikāliju reģistrēšanu, vērtēšanu, licencēšanu un ierobežošanu (REACH) un ar kuru izveido Eiropas Ķimikāliju aģentūru, groza Direktīvu 1999/45/EK un atceļ Padomes Regulu (EEK) Nr. 793/93 un Komisijas Regulu (EK) Nr. 1488/94, kā arī Padomes Direktīvu 76/769/EEK un Komisijas Direktīvu 91/155/EEK, 93/67/EEK, 93/105/EK un 2000/21/EK (1), un jo īpaši tās 13. panta 3. punktu,

tā kā:

| (1) | Komisijas Regulā (EK) Nr. 440/2008 (2) ir noteiktas Regulas (EK) Nr. 1907/2006 piemērošanai izmantojamās testēšanas metodes vielu fizikāli ķīmisko īpašību, toksicitātes un ekotoksicitātes noteikšanai. |
| --- | --- |

(1)

Komisijas Regulā (EK) Nr. 440/2008 (2) ir noteiktas Regulas (EK) Nr. 1907/2006 piemērošanai izmantojamās testēšanas metodes vielu fizikāli ķīmisko īpašību, toksicitātes un ekotoksicitātes noteikšanai.

| (2) | Jāatjaunina Regula (EK) Nr. 440/2008, tajā kā prioritāras iekļaujot jaunas un atjauninātas alternatīvas testēšanas metodes, kuras nesen pieņēmusi ESAO, lai panāktu izmēģinājumu dzīvnieku skaita samazināšanu, kā to paredz Eiropas Parlamenta un Padomes 2010. gada 22. septembra Direktīva 2010/63/ES par zinātniskiem mērķiem izmantojamo dzīvnieku aizsardzību (3) un Padomes 1986. gada 24. novembra Direktīva 86/609/EEK par dalībvalstu normatīvo un administratīvo aktu tuvināšanu attiecībā uz to dzīvnieku aizsardzību, kurus izmanto izmēģinājumos un citiem zinātniskiem mērķiem (4). Dokumenta projekts ir apspriests ar ieinteresētajām personām. |
| --- | --- |

(2)

Jāatjaunina Regula (EK) Nr. 440/2008, tajā kā prioritāras iekļaujot jaunas un atjauninātas alternatīvas testēšanas metodes, kuras nesen pieņēmusi ESAO, lai panāktu izmēģinājumu dzīvnieku skaita samazināšanu, kā to paredz Eiropas Parlamenta un Padomes 2010. gada 22. septembra Direktīva 2010/63/ES par zinātniskiem mērķiem izmantojamo dzīvnieku aizsardzību (3) un Padomes 1986. gada 24. novembra Direktīva 86/609/EEK par dalībvalstu normatīvo un administratīvo aktu tuvināšanu attiecībā uz to dzīvnieku aizsardzību, kurus izmanto izmēģinājumos un citiem zinātniskiem mērķiem (4). Dokumenta projekts ir apspriests ar ieinteresētajām personām.

| (3) | Tādēļ būtu attiecīgi jāgroza Regula (EK) Nr. 440/2008. |
| --- | --- |

(3)

Tādēļ būtu attiecīgi jāgroza Regula (EK) Nr. 440/2008.

| (4) | Šajā regulā noteiktie pasākumi ir saskaņā ar atzinumu, ko sniegusi komiteja, kas izveidota saskaņā ar Regulas (EK) Nr. 1907/2006 133. pantu, |
| --- | --- |

(4)

Šajā regulā noteiktie pasākumi ir saskaņā ar atzinumu, ko sniegusi komiteja, kas izveidota saskaņā ar Regulas (EK) Nr. 1907/2006 133. pantu,

IR PIEŅĒMUSI ŠO REGULU.

1. pants

Regulas (EK) Nr. 440/2008 pielikumu groza saskaņā ar šīs regulas pielikumu.

2. pants

Šī regula stājas spēkā trešajā dienā pēc tās publicēšanas Eiropas Savienības Oficiālajā Vēstnesī.

Šī regula uzliek saistības kopumā un ir tieši piemērojama visās dalībvalstīs.

Briselē, 2012. gada 6. jūlijā

Komisijas vārdā –

priekšsēdētājs

José MANUEL BARROSO

---

(1)  OV L 396, 30.12.2006., 1. lpp.

1

(2)  OV L 142, 31.5.2008., 1. lpp.

2

(3)  OV L 276, 20.10.2010., 33. lpp.

3

(4)  OV L 358, 18.12.1986., 1. lpp.

4

---

PIELIKUMS

Regulas (EK) Nr. 440/2008 pielikumu groza šādi:

| 1) | pielikuma B.42. nodaļu aizstāj ar šādu:
  “B.42.   ĀDAS SENSIBILIZĀCIJA: LOKĀLO LIMFMEZGLU NOTEIKŠANA (LLNA)

  IEVADS






  1. | ESAO ķīmisko vielu testēšanas vadlīnijas un uz tām pamatotās ES testēšanas metodes tiek regulāri pārskatītas, ņemot vērā tehnikas attīstību, regulatīvo prasību izmaiņas un dzīvnieku labturības apsvērumus. Sākotnējā, jau apstiprinātā testēšanas metode (TM) ādas sensibilizācijas noteikšanai pelēm ir lokālo limfmezglu noteikšanas metode (LLNA; ESAO 429. testēšanas vadlīnijas; šā pielikuma B.42. nodaļa) (1). Ir publicēti LLNA validācijas un ar to saistītā darba pārskati (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11). Atjauninātās LLNA pamatā ir praktiskās pieredzes un zinātnisko datu izvērtējums (12). Šī ir otrā no divām TM, kas izstrādājamas, lai novērtētu ķīmiskām vielām vai to maisījumiem piemītošo ādas sensibilizācijas potenciālu (dzīvniekiem). Pirmajā TM (ESAO 406. testēšanas vadlīnijas; šā pielikuma B.6. nodaļa) izmanto testēšanu ar jūrascūciņām, proti, maksimizācijas testu jūrascūciņām un Bīlera testu (13). Salīdzinot ar B.6 un EASO 406. testēšanas vadlīnijām (13), LLNA ir pārāka dzīvnieku labturības ziņā. Šī atjauninātā LLNA TM ietver veiktspējas standartus (PS) (1. papildinājums), kurus var izmantot, lai novērtētu tādu jaunu un/vai pārveidotu testēšanas metožu validācijas statusu, kuras ir funkcionalitātes vai noteikšanas mehānisma ziņā līdzīgas LLNA, saskaņā ar ESAO Vadlīniju dokumentā Nr. 34 izklāstītajiem principiem (14). |
| --- | --- | --- |

1)

pielikuma B.42. nodaļu aizstāj ar šādu:

“B.42.   ĀDAS SENSIBILIZĀCIJA: LOKĀLO LIMFMEZGLU NOTEIKŠANA (LLNA)

IEVADS

1.

ESAO ķīmisko vielu testēšanas vadlīnijas un uz tām pamatotās ES testēšanas metodes tiek regulāri pārskatītas, ņemot vērā tehnikas attīstību, regulatīvo prasību izmaiņas un dzīvnieku labturības apsvērumus. Sākotnējā, jau apstiprinātā testēšanas metode (TM) ādas sensibilizācijas noteikšanai pelēm ir lokālo limfmezglu noteikšanas metode (LLNA; ESAO 429. testēšanas vadlīnijas; šā pielikuma B.42. nodaļa) (1). Ir publicēti LLNA validācijas un ar to saistītā darba pārskati (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11). Atjauninātās LLNA pamatā ir praktiskās pieredzes un zinātnisko datu izvērtējums (12). Šī ir otrā no divām TM, kas izstrādājamas, lai novērtētu ķīmiskām vielām vai to maisījumiem piemītošo ādas sensibilizācijas potenciālu (dzīvniekiem). Pirmajā TM (ESAO 406. testēšanas vadlīnijas; šā pielikuma B.6. nodaļa) izmanto testēšanu ar jūrascūciņām, proti, maksimizācijas testu jūrascūciņām un Bīlera testu (13). Salīdzinot ar B.6 un EASO 406. testēšanas vadlīnijām (13), LLNA ir pārāka dzīvnieku labturības ziņā. Šī atjauninātā LLNA TM ietver veiktspējas standartus (PS) (1. papildinājums), kurus var izmantot, lai novērtētu tādu jaunu un/vai pārveidotu testēšanas metožu validācijas statusu, kuras ir funkcionalitātes vai noteikšanas mehānisma ziņā līdzīgas LLNA, saskaņā ar ESAO Vadlīniju dokumentā Nr. 34 izklāstītajiem principiem (14).

| 2. | LLNA pēta ādas sensibilizācijas indukcijas fāzi un sniedz kvantitatīvus datus, kas piemēroti atbildes reakcijas uz devu novērtēšanai. Turklāt jānorāda, ka vieglas/vidējas iedarbības sensibilizatori, kas ir ieteikti kā piemērotas pozitīvās kontroles vielas (PC) jūrascūciņu testa metodēm (B.6; EASO 406. testēšanas vadlīnijas) (13), ir piemēroti arī lietošanai ar LLNA (6) (8) (15). Kā viena no iespējamām pieejām šajā TM aprakstīta reducētā LLNA (rLLNA), kura ļauj maksimāli par 40 % samazināt izmantoto dzīvnieku skaitu (16) (17) (18). rLLNA var izmantot, ja ir regulatīva vajadzība apstiprināt negatīvu ādas sensibilizācijas potenciāla prognozi un ar nosacījumu, ka tiek ievērotas visas pārējās šajā TM aprakstītās LLNA protokola specifikācijas. Negatīvai ādas sensibilizācijas potenciāla prognozei būtu jābalstās uz visu pieejamo informāciju, kā aprakstīts 4. punktā. Lai varētu piemērot rLLNA pieeju, vajadzīgs skaidrs pamatojums un zinātniski argumenti. Ja pretēji gaidītajam ar rLLNA tiek iegūts pozitīvs vai neskaidrs rezultāts, var būt jāturpina testēšana, lai interpretētu vai precizētu minēto rezultātu. rLLNA nebūtu izmantojama ādu sensibilizējošu testējamo vielu bīstamības noteikšanai gadījumos, kad jānovērtē reakcija uz devu, piemēram, nosakot apakškategorijas atbilstīgi Regulai (EK) Nr. 1272/2008 par vielu un maisījumu klasificēšanu, marķēšanu un iepakošanu un ANO Globāli harmonizētajai ķīmisko vielu klasifikācijas un marķēšanas sistēmai. |
| --- | --- |

2.

LLNA pēta ādas sensibilizācijas indukcijas fāzi un sniedz kvantitatīvus datus, kas piemēroti atbildes reakcijas uz devu novērtēšanai. Turklāt jānorāda, ka vieglas/vidējas iedarbības sensibilizatori, kas ir ieteikti kā piemērotas pozitīvās kontroles vielas (PC) jūrascūciņu testa metodēm (B.6; EASO 406. testēšanas vadlīnijas) (13), ir piemēroti arī lietošanai ar LLNA (6) (8) (15). Kā viena no iespējamām pieejām šajā TM aprakstīta reducētā LLNA (rLLNA), kura ļauj maksimāli par 40 % samazināt izmantoto dzīvnieku skaitu (16) (17) (18). rLLNA var izmantot, ja ir regulatīva vajadzība apstiprināt negatīvu ādas sensibilizācijas potenciāla prognozi un ar nosacījumu, ka tiek ievērotas visas pārējās šajā TM aprakstītās LLNA protokola specifikācijas. Negatīvai ādas sensibilizācijas potenciāla prognozei būtu jābalstās uz visu pieejamo informāciju, kā aprakstīts 4. punktā. Lai varētu piemērot rLLNA pieeju, vajadzīgs skaidrs pamatojums un zinātniski argumenti. Ja pretēji gaidītajam ar rLLNA tiek iegūts pozitīvs vai neskaidrs rezultāts, var būt jāturpina testēšana, lai interpretētu vai precizētu minēto rezultātu. rLLNA nebūtu izmantojama ādu sensibilizējošu testējamo vielu bīstamības noteikšanai gadījumos, kad jānovērtē reakcija uz devu, piemēram, nosakot apakškategorijas atbilstīgi Regulai (EK) Nr. 1272/2008 par vielu un maisījumu klasificēšanu, marķēšanu un iepakošanu un ANO Globāli harmonizētajai ķīmisko vielu klasifikācijas un marķēšanas sistēmai.

DEFINĪCIJAS

| 3. | Definīcijas skatīt 2. papildinājumā. |
| --- | --- |

3.

Definīcijas skatīt 2. papildinājumā.

SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI UN IEROBEŽOJUMI

| 4. | LLNA ir viena no alternatīvām, kuras var izmantot ķīmisko vielu – potenciālu ādas sensibilizatoru noteikšanā. Tas nenozīmē, ka visos gadījumos LLNA būtu jālieto jūrascūciņu testa vietā (B.6; ESAO 406. testēšanas vadlīnijas) (13), bet gan to, ka šī noteikšana ir minētajam testam līdzvērtīga un to var izmantot kā alternatīvu, kuras pozitīvajam vai negatīvajam rezultātam vairs nav vajadzīgs papildu apstiprinājums. Pirms uzsākt pētījumus, testēšanas laboratorijai jāņem vērā visa par testējamo vielu pieejamā informācija. Pie šādas informācijas pieder tās identifikācija un ķīmiskā struktūra, fizikāli ķīmiskās īpašības, citu in vitro vai in vivo veikto toksicitātes testu rezultāti un toksikoloģiskie dati par struktūras ziņā saistītām vielām. Šī informācija jāizvērtē, lai noteiktu LLNA piemērotību konkrētajai vielai (ņemot vērā atsevišķu veidu vielu nesaderību ar LLNA; skatīt 5. punktu) un lai izraudzītos pareizu testējamās vielas devu. |
| --- | --- |

4.

LLNA ir viena no alternatīvām, kuras var izmantot ķīmisko vielu – potenciālu ādas sensibilizatoru noteikšanā. Tas nenozīmē, ka visos gadījumos LLNA būtu jālieto jūrascūciņu testa vietā (B.6; ESAO 406. testēšanas vadlīnijas) (13), bet gan to, ka šī noteikšana ir minētajam testam līdzvērtīga un to var izmantot kā alternatīvu, kuras pozitīvajam vai negatīvajam rezultātam vairs nav vajadzīgs papildu apstiprinājums. Pirms uzsākt pētījumus, testēšanas laboratorijai jāņem vērā visa par testējamo vielu pieejamā informācija. Pie šādas informācijas pieder tās identifikācija un ķīmiskā struktūra, fizikāli ķīmiskās īpašības, citu in vitro vai in vivo veikto toksicitātes testu rezultāti un toksikoloģiskie dati par struktūras ziņā saistītām vielām. Šī informācija jāizvērtē, lai noteiktu LLNA piemērotību konkrētajai vielai (ņemot vērā atsevišķu veidu vielu nesaderību ar LLNA; skatīt 5. punktu) un lai izraudzītos pareizu testējamās vielas devu.

| 5. | LLNA ir in vivo metode un kā tāda paredz dzīvnieku izmantošanu alerģiskās kontakta sensibilizējošās aktivitātes novērtējumā. Tomēr šim mērķim vajadzīgo dzīvnieku skaits var būt mazāks nekā parasti. Turklāt LLNA piedāvā būtiski uzlabot veidu, kādā dzīvnieki tiek izmantoti alerģiskās kontakta sensibilizācijas testēšanā (mazāk sāpju un ciešanu). LLNA pamatojas uz to imunoloģisko gadījumu izskatīšanu, kurus ķīmiskās vielas stimulē sensibilizācijas indukcijas fāzē. Atšķirībā no testiem ar jūrascūciņām (B.6; ESAO 406. testēšanas vadlīnijas) (13) ar LLNA nav jānoskaidro provocētās–inducētās ādas hipersensibilizācijas reakcijas. Turklāt LLNA nav jāizmanto palīgviela, kā tas ir jūrascūciņu maksimizācijas testā (13). Tādā veidā LLNA mazina dzīvnieku sāpes un ciešanas. Neraugoties uz LLNA priekšrocībām salīdzinājumā ar B.6 un ESAO 406. testēšanas vadlīnijām, ir jāatzīst, ka ir daži ierobežojumi, kas var radīt nepieciešamību izmantot B.6 un ESAO 406. testēšanas vadlīnijas (13) (piemēram, ar LLNA noteikti šķietami negatīvi dažiem metāliem, šķietami pozitīvi dažiem ādas kairinātājiem [tādiem kā atsevišķas surfaktantu tipa ķīmiskās vielas] (19) (20), vai testējamās vielas šķīdība). Turklāt vajadzība pēc jūrascūciņu testiem (B.6 un ESAO 406. testēšanas vadlīnijas) (21) var saglabāties attiecībā uz ķīmisko vielu klasēm vai vielām, kuru sastāvā ir funkcionālās grupas, par kurām ir pierādīts, ka tās darbojas kā potenciāli sajaucējfaktori (13). Bez tam, pamatojoties uz ierobežoto validācijas datubāzi, kas sastāvēja pārsvarā no pesticīdu preparātiem, attiecībā uz šāda tipa testējamām vielām (22) drīzāk LLNA, nevis jūrascūciņu tests dos pozitīvu rezultātu. Tomēr, testējot preparātus, varētu līdztekus testēt arī salīdzināšanas vielas (līdzīgas vielas, kuru reakcija ir zināma), lai pierādītu, ka LLNA darbojas pienācīgi (skatīt 16. punktu). Izņemot šādus minētos ierobežojumus, LLNA jāvar izmantot jebkuras vielas testēšanai, ja vien testējamai vielai nav tādu īpašību, kas varētu ietekmēt LLNA precizitāti. |
| --- | --- |

5.

LLNA ir in vivo metode un kā tāda paredz dzīvnieku izmantošanu alerģiskās kontakta sensibilizējošās aktivitātes novērtējumā. Tomēr šim mērķim vajadzīgo dzīvnieku skaits var būt mazāks nekā parasti. Turklāt LLNA piedāvā būtiski uzlabot veidu, kādā dzīvnieki tiek izmantoti alerģiskās kontakta sensibilizācijas testēšanā (mazāk sāpju un ciešanu). LLNA pamatojas uz to imunoloģisko gadījumu izskatīšanu, kurus ķīmiskās vielas stimulē sensibilizācijas indukcijas fāzē. Atšķirībā no testiem ar jūrascūciņām (B.6; ESAO 406. testēšanas vadlīnijas) (13) ar LLNA nav jānoskaidro provocētās–inducētās ādas hipersensibilizācijas reakcijas. Turklāt LLNA nav jāizmanto palīgviela, kā tas ir jūrascūciņu maksimizācijas testā (13). Tādā veidā LLNA mazina dzīvnieku sāpes un ciešanas. Neraugoties uz LLNA priekšrocībām salīdzinājumā ar B.6 un ESAO 406. testēšanas vadlīnijām, ir jāatzīst, ka ir daži ierobežojumi, kas var radīt nepieciešamību izmantot B.6 un ESAO 406. testēšanas vadlīnijas (13) (piemēram, ar LLNA noteikti šķietami negatīvi dažiem metāliem, šķietami pozitīvi dažiem ādas kairinātājiem [tādiem kā atsevišķas surfaktantu tipa ķīmiskās vielas] (19) (20), vai testējamās vielas šķīdība). Turklāt vajadzība pēc jūrascūciņu testiem (B.6 un ESAO 406. testēšanas vadlīnijas) (21) var saglabāties attiecībā uz ķīmisko vielu klasēm vai vielām, kuru sastāvā ir funkcionālās grupas, par kurām ir pierādīts, ka tās darbojas kā potenciāli sajaucējfaktori (13). Bez tam, pamatojoties uz ierobežoto validācijas datubāzi, kas sastāvēja pārsvarā no pesticīdu preparātiem, attiecībā uz šāda tipa testējamām vielām (22) drīzāk LLNA, nevis jūrascūciņu tests dos pozitīvu rezultātu. Tomēr, testējot preparātus, varētu līdztekus testēt arī salīdzināšanas vielas (līdzīgas vielas, kuru reakcija ir zināma), lai pierādītu, ka LLNA darbojas pienācīgi (skatīt 16. punktu). Izņemot šādus minētos ierobežojumus, LLNA jāvar izmantot jebkuras vielas testēšanai, ja vien testējamai vielai nav tādu īpašību, kas varētu ietekmēt LLNA precizitāti.

METODES PRINCIPS

| 6. | LLNA pamatprincips ir tāds, ka sensibilizatori inducē limfocītu savairošanos limfmezglos, kuri drenē testējamās vielas saņemšanas vietu. Šī savairošanās ir proporcionāla devai un alergēna iedarbīgumam un ir vienkāršs paņēmiens, lai iegūtu kvantitatīvu sensitivitātes mērījumu. Savairošanās pakāpi nosaka, vidējo savairošanos katrā testējamās vielas grupā salīdzinot ar vidējo savairošanos kontroles grupā, kas saņēmusi tikai nesēju (VC). Nosaka attiecību starp vidējo progresiju grupās, kas saņēmušas pētāmo vielu, un progresiju VC grupā; tas ir stimulācijas indekss (SI). Lai testējamo vielu pamatoti klasificētu kā potenciālu ādas sensibilizatoru, SI vērtībai jābūt ≥ 3. Šeit aprakstīto procedūru pamatā ir in vivo veikta radioaktīvā iezīmēšana šūnu savairošanās izmērīšanai aurikulārajos limfmezglos. Tomēr šūnu savairošanās vērtēšanai var izmantot citus beigu punktus ar nosacījumu, ka pilnībā tiek ievēroti PS (1. papildinājums). |
| --- | --- |

6.

LLNA pamatprincips ir tāds, ka sensibilizatori inducē limfocītu savairošanos limfmezglos, kuri drenē testējamās vielas saņemšanas vietu. Šī savairošanās ir proporcionāla devai un alergēna iedarbīgumam un ir vienkāršs paņēmiens, lai iegūtu kvantitatīvu sensitivitātes mērījumu. Savairošanās pakāpi nosaka, vidējo savairošanos katrā testējamās vielas grupā salīdzinot ar vidējo savairošanos kontroles grupā, kas saņēmusi tikai nesēju (VC). Nosaka attiecību starp vidējo progresiju grupās, kas saņēmušas pētāmo vielu, un progresiju VC grupā; tas ir stimulācijas indekss (SI). Lai testējamo vielu pamatoti klasificētu kā potenciālu ādas sensibilizatoru, SI vērtībai jābūt ≥ 3. Šeit aprakstīto procedūru pamatā ir in vivo veikta radioaktīvā iezīmēšana šūnu savairošanās izmērīšanai aurikulārajos limfmezglos. Tomēr šūnu savairošanās vērtēšanai var izmantot citus beigu punktus ar nosacījumu, ka pilnībā tiek ievēroti PS (1. papildinājums).

METODES APRAKSTS

Dzīvnieku sugas izvēle

| 7. | Šim testam izvēlētā suga ir peles. Izmanto jaunas, pieaugušas CBA/Ca vai CBA/J līnijas sievišķā dzimuma peles, kas nav dzemdējušas un nav grūsnas. Pētījuma sākumā dzīvniekiem jābūt 8–12 nedēļu veciem, dzīvnieku masas atšķirībām jābūt minimālām un ne lielākām par 20 % no vidējās masas. Citas līnijas un vīrišķā dzimuma dzīvniekus var izmantot, ja ir iegūts pietiekami daudz datu, lai parādītu, ka LLNA atbildes reakcijā nav nozīmīgu atšķirību, kas specifiskas līnijai un/vai dzimumam. |
| --- | --- |

7.

Šim testam izvēlētā suga ir peles. Izmanto jaunas, pieaugušas CBA/Ca vai CBA/J līnijas sievišķā dzimuma peles, kas nav dzemdējušas un nav grūsnas. Pētījuma sākumā dzīvniekiem jābūt 8–12 nedēļu veciem, dzīvnieku masas atšķirībām jābūt minimālām un ne lielākām par 20 % no vidējās masas. Citas līnijas un vīrišķā dzimuma dzīvniekus var izmantot, ja ir iegūts pietiekami daudz datu, lai parādītu, ka LLNA atbildes reakcijā nav nozīmīgu atšķirību, kas specifiskas līnijai un/vai dzimumam.

Turēšanas un barošanas apstākļi

| 8. | Ja nav zinātniska pamatojuma, kāpēc peles būtu turamas katra atsevišķi, peles izmitina grupā (23). Telpā, kurā tur izmēģinājumu dzīvniekus, jābūt 22 ± 3 °C temperatūrai. Lai gan, izņemot telpu uzkopšanas laiku, relatīvajam mitrumam jābūt vismaz 30 % un vēlams ne vairāk kā 70 %, tas jāuztur 50-60 % robežās. Apgaismojumam jābūt mākslīgam atbilstoši secībai 12 stundas gaišas, 12 stundas tumšas. Barošanai var izmantot parasto laboratorijas barību ar neierobežotu dzeramā ūdens daudzumu. |
| --- | --- |

8.

Ja nav zinātniska pamatojuma, kāpēc peles būtu turamas katra atsevišķi, peles izmitina grupā (23). Telpā, kurā tur izmēģinājumu dzīvniekus, jābūt 22 ± 3 °C temperatūrai. Lai gan, izņemot telpu uzkopšanas laiku, relatīvajam mitrumam jābūt vismaz 30 % un vēlams ne vairāk kā 70 %, tas jāuztur 50-60 % robežās. Apgaismojumam jābūt mākslīgam atbilstoši secībai 12 stundas gaišas, 12 stundas tumšas. Barošanai var izmantot parasto laboratorijas barību ar neierobežotu dzeramā ūdens daudzumu.

Dzīvnieku sagatavošana

| 9. | Dzīvniekus izvēlas pēc nejaušības principa, marķē individuālai identificēšanai (bet nekādā veidā nemarķē ausis) un tur būros vismaz piecas dienas pirms testa sākuma, lai tos aklimatizētu laboratorijas apstākļos. Pirms apstrādes uzsākšanas visus dzīvniekus apskata, lai pārliecinātos, ka tiem nav novērojami ādas bojājumi. |
| --- | --- |

9.

Dzīvniekus izvēlas pēc nejaušības principa, marķē individuālai identificēšanai (bet nekādā veidā nemarķē ausis) un tur būros vismaz piecas dienas pirms testa sākuma, lai tos aklimatizētu laboratorijas apstākļos. Pirms apstrādes uzsākšanas visus dzīvniekus apskata, lai pārliecinātos, ka tiem nav novērojami ādas bojājumi.

Testa šķīdumu sagatavošana

| 10. | Cietas ķīmiskās vielas pirms peļu ausu apstrādes izšķīdina vai suspendē, izmantojot šķīdinātājus vai nesējus, un vajadzības gadījumā atšķaida. Šķidras ķīmiskās vielas var izmantot gan atšķaidītas, gan neatšķaidītas. Nešķīstošas ķīmiskās vielas (kādas parasti izmanto medicīnas iekārtās) pirms peļu ausu apstrādes ekstrahē piemērotā šķīdinātājā, lai visas ekstrahējamās sastāvdaļas būtu pieejamas testēšanai. Ja dati par testējamo vielu stabilitāti liecina, ka tās uzglabāt nevar, katru dienu sagatavo svaigas testējamās vielas. |
| --- | --- |

10.

Cietas ķīmiskās vielas pirms peļu ausu apstrādes izšķīdina vai suspendē, izmantojot šķīdinātājus vai nesējus, un vajadzības gadījumā atšķaida. Šķidras ķīmiskās vielas var izmantot gan atšķaidītas, gan neatšķaidītas. Nešķīstošas ķīmiskās vielas (kādas parasti izmanto medicīnas iekārtās) pirms peļu ausu apstrādes ekstrahē piemērotā šķīdinātājā, lai visas ekstrahējamās sastāvdaļas būtu pieejamas testēšanai. Ja dati par testējamo vielu stabilitāti liecina, ka tās uzglabāt nevar, katru dienu sagatavo svaigas testējamās vielas.

Ticamības pārbaude

| 11. | Metodes veiktspējas pienācīgumu parāda ar pozitīvās kontroles vielu (PC) palīdzību, kas ar adekvātu un reproducējamu sensibilitāti reaģē kā sensibilizējošas testēšanas vielas, kuru reakcijas intensitāte ir sīki aprakstīta. Ieteicams paredzēt vienlaicīgu PC, jo tādā veidā var pierādīt laboratorijas spēju atkārtoti un sekmīgi īstenot noteikšanu, kā arī novērtēt iekšlaboratorijas un starplaboratoriju reproducējamību un rezultātu salīdzināmību. Pirms LLNA ieteicams lietotājiem konsultēties ar atbildīgajām iestādēm, jo dažas regulatīvās iestādes pieprasa PC izmantošanu katrā individuālā pētījumā. Attiecīgi labāk ir ikreiz izmantot vienlaicīgu PC, jo tas ļauj neveikt papildu testēšanu ar dzīvniekiem, lai izpildītu prasības, kuras var izrietēt no PC periodiskas izmantošanas (skatīt 12. punktu). PC jādod pozitīva LLNA atbildes reakcija tādā iedarbības līmenī, kurā ir sagaidāms stimulācijas indekss (SI) > 3, salīdzinot ar negatīvās kontroles vielu (NC) grupu. PC deva jāizvēlas tā, lai neizraisītu pārmērīgu ādas kairinājumu vai sistēmisku toksicitāti un lai indukcija būtu atkārtojama, taču ne pārmērīga (tā ir pārmērīga, piemēram, ja SI > 20). Ieteicamākās PC ir 25 % heksilkanēļskābes aldehīds (CAS Nr. 101-86-0) ar acetonu/olīveļļu (4:1 tilp./tilp.) un 5 % merkaptobenzotiazols (CAS No. 149-30-4) ar N,N-dimetilformamīdu (skatīt 1 papildinājuma 1. tabulu). Var būt apstākļi, kad ar pienācīgu pamatojumu var izmantot citas PC, kas atbilst iepriekš minētajiem kritērijiem. |
| --- | --- |

11.

Metodes veiktspējas pienācīgumu parāda ar pozitīvās kontroles vielu (PC) palīdzību, kas ar adekvātu un reproducējamu sensibilitāti reaģē kā sensibilizējošas testēšanas vielas, kuru reakcijas intensitāte ir sīki aprakstīta. Ieteicams paredzēt vienlaicīgu PC, jo tādā veidā var pierādīt laboratorijas spēju atkārtoti un sekmīgi īstenot noteikšanu, kā arī novērtēt iekšlaboratorijas un starplaboratoriju reproducējamību un rezultātu salīdzināmību. Pirms LLNA ieteicams lietotājiem konsultēties ar atbildīgajām iestādēm, jo dažas regulatīvās iestādes pieprasa PC izmantošanu katrā individuālā pētījumā. Attiecīgi labāk ir ikreiz izmantot vienlaicīgu PC, jo tas ļauj neveikt papildu testēšanu ar dzīvniekiem, lai izpildītu prasības, kuras var izrietēt no PC periodiskas izmantošanas (skatīt 12. punktu). PC jādod pozitīva LLNA atbildes reakcija tādā iedarbības līmenī, kurā ir sagaidāms stimulācijas indekss (SI) > 3, salīdzinot ar negatīvās kontroles vielu (NC) grupu. PC deva jāizvēlas tā, lai neizraisītu pārmērīgu ādas kairinājumu vai sistēmisku toksicitāti un lai indukcija būtu atkārtojama, taču ne pārmērīga (tā ir pārmērīga, piemēram, ja SI > 20). Ieteicamākās PC ir 25 % heksilkanēļskābes aldehīds (CAS Nr. 101-86-0) ar acetonu/olīveļļu (4:1 tilp./tilp.) un 5 % merkaptobenzotiazols (CAS No. 149-30-4) ar N,N-dimetilformamīdu (skatīt 1 papildinājuma 1. tabulu). Var būt apstākļi, kad ar pienācīgu pamatojumu var izmantot citas PC, kas atbilst iepriekš minētajiem kritērijiem.

| 12. | Lai gan vienlaicīgas PC grupas izmantošana ir ieteicama, var būt situācijas, kad laboratorijās, kurās LLNA veic regulāri (t. i., vismaz reizi mēnesī) un kurās tāpēc ir vēsturiska PC datubāze, kas pierāda laboratorijas spēju ar PC iegūt reproducējamus un pareizus rezultātus, adekvātāka var izrādīties periodiska PC izmantošana (t. i., vismaz reizi 6 mēnešos). LLNA metodes adekvātu pārzināšanu var sekmīgi pierādīt, ar PC iegūstot konsekventus pozitīvus rezultātus vismaz 10 neatkarīgās testēšanas reizēs, kuras veiktas samērīgā laika periodā (t. i., ne ilgāk kā gada laikā). |
| --- | --- |

12.

Lai gan vienlaicīgas PC grupas izmantošana ir ieteicama, var būt situācijas, kad laboratorijās, kurās LLNA veic regulāri (t. i., vismaz reizi mēnesī) un kurās tāpēc ir vēsturiska PC datubāze, kas pierāda laboratorijas spēju ar PC iegūt reproducējamus un pareizus rezultātus, adekvātāka var izrādīties periodiska PC izmantošana (t. i., vismaz reizi 6 mēnešos). LLNA metodes adekvātu pārzināšanu var sekmīgi pierādīt, ar PC iegūstot konsekventus pozitīvus rezultātus vismaz 10 neatkarīgās testēšanas reizēs, kuras veiktas samērīgā laika periodā (t. i., ne ilgāk kā gada laikā).

| 13. | Vienlaicīga PC grupa noteikti jāiekļauj, kad LLNA notiek procedurālas izmaiņas (piemēram, augsti kvalificēta personāla nomaiņa, testēšanas metodes materiālu un/vai reaģentu nomaiņa, cits izmēģinājumu dzīvnieku piegādātājs), un šādas izmaiņas pienācīgi jādokumentē laboratorijas pārskatos. Jānovērtē šādu izmaiņu ietekme uz iepriekš izveidotās vēsturiskās datubāzes adekvātumu un tas, vai vajag veidot jaunu vēsturisku datubāzi, lai dokumentētu ar PC iegūtu rezultātu konsekvenci. |
| --- | --- |

13.

Vienlaicīga PC grupa noteikti jāiekļauj, kad LLNA notiek procedurālas izmaiņas (piemēram, augsti kvalificēta personāla nomaiņa, testēšanas metodes materiālu un/vai reaģentu nomaiņa, cits izmēģinājumu dzīvnieku piegādātājs), un šādas izmaiņas pienācīgi jādokumentē laboratorijas pārskatos. Jānovērtē šādu izmaiņu ietekme uz iepriekš izveidotās vēsturiskās datubāzes adekvātumu un tas, vai vajag veidot jaunu vēsturisku datubāzi, lai dokumentētu ar PC iegūtu rezultātu konsekvenci.

| 14. | Pētniekiem jāapzinās, ka lēmums par periodisku, nevis vienlaicīgu PC izmantošanu ietekmēs to, kādā mērā par adekvātiem un pieņemamiem varēs uzskatīt negatīvos pētījumu rezultātus, kas bez vienlaicīgas PC iegūti periodiskās PC izmantošanas starplaikos. Piemēram, ja ar periodisko PC pētījumu iegūst šķietami negatīvu rezultātu, var apšaubīt negatīvu testējamās vielas rezultātu, kas iegūts iepriekšējā pieņemamā periodiskā PC pētījuma un nepieņemamā periodiskā PC pētījuma starplaikā. Tāpēc rūpīgi jāizvērtē, vai izmantot vienlaicīgu vai periodisku PC. Tāpat jāizvērtē, kādas ir iespējas vienlaicīgās PC grupā izmantot mazāk dzīvnieku, ja to var zinātniski pamatot un ja laboratorija ar saviem specifiskajiem vēsturiskajiem datiem var pierādīt, ka ir iespējams izmantot mazāk peļu (12). |
| --- | --- |

14.

Pētniekiem jāapzinās, ka lēmums par periodisku, nevis vienlaicīgu PC izmantošanu ietekmēs to, kādā mērā par adekvātiem un pieņemamiem varēs uzskatīt negatīvos pētījumu rezultātus, kas bez vienlaicīgas PC iegūti periodiskās PC izmantošanas starplaikos. Piemēram, ja ar periodisko PC pētījumu iegūst šķietami negatīvu rezultātu, var apšaubīt negatīvu testējamās vielas rezultātu, kas iegūts iepriekšējā pieņemamā periodiskā PC pētījuma un nepieņemamā periodiskā PC pētījuma starplaikā. Tāpēc rūpīgi jāizvērtē, vai izmantot vienlaicīgu vai periodisku PC. Tāpat jāizvērtē, kādas ir iespējas vienlaicīgās PC grupā izmantot mazāk dzīvnieku, ja to var zinātniski pamatot un ja laboratorija ar saviem specifiskajiem vēsturiskajiem datiem var pierādīt, ka ir iespējams izmantot mazāk peļu (12).

| 15. | Kaut arī PC jātestē nesējā, par kuru ir zināms, ka tas izrāda viendabīgu atbildes reakciju (piemēram, acetons/olīveļļa; 4:1 tilp./tilp.), var būt dažas reglamentējošas situācijas, kurās būs nepieciešama arī testēšana nestandarta nesējā (klīniski/ķīmiski piederīgs sastāvs) (24). Ja vienlaicīgo PC testē ar citu nesēju nekā testējamo vielu, vienlaicīgās PC vajadzībām jāparedz atsevišķs VC. |
| --- | --- |

15.

Kaut arī PC jātestē nesējā, par kuru ir zināms, ka tas izrāda viendabīgu atbildes reakciju (piemēram, acetons/olīveļļa; 4:1 tilp./tilp.), var būt dažas reglamentējošas situācijas, kurās būs nepieciešama arī testēšana nestandarta nesējā (klīniski/ķīmiski piederīgs sastāvs) (24). Ja vienlaicīgo PC testē ar citu nesēju nekā testējamo vielu, vienlaicīgās PC vajadzībām jāparedz atsevišķs VC.

| 16. | Ja vērtē testējamās vielas, kas pieder konkrētai ķīmisko vielu klasei vai kas dod noteikta diapazona reakciju, var izmantot salīdzināšanas vielas, kuras noder, lai parādītu, ka testēšanas metode darbojas un pienācīgi nosaka šā tipa testējamām vielām piemītošo ādas sensibilizācijas potenciālu. Pienācīgām salīdzināšanas vielām ir jāpiemīt šādām īpašībām:






  — | strukturāla un funkcionāla līdzība ar testējamās vielas klases vielām; |
| --- | --- | --- |

16.

Ja vērtē testējamās vielas, kas pieder konkrētai ķīmisko vielu klasei vai kas dod noteikta diapazona reakciju, var izmantot salīdzināšanas vielas, kuras noder, lai parādītu, ka testēšanas metode darbojas un pienācīgi nosaka šā tipa testējamām vielām piemītošo ādas sensibilizācijas potenciālu. Pienācīgām salīdzināšanas vielām ir jāpiemīt šādām īpašībām:

—

strukturāla un funkcionāla līdzība ar testējamās vielas klases vielām;

| — | labi zināmas fizikālās un ķīmiskās īpašības; |
| --- | --- |

—

labi zināmas fizikālās un ķīmiskās īpašības;

| — | papildinoši dati no LLNA; |
| --- | --- |

—

papildinoši dati no LLNA;

| — | papildinoši dati saistībā ar citiem dzīvniekiem un/vai cilvēku. |
| --- | --- |

—

papildinoši dati saistībā ar citiem dzīvniekiem un/vai cilvēku.

TESTA PROCEDŪRA

Dzīvnieku skaits un devu līmeņi

| 17. | Uz devas grupu ar vismaz trim testējamās vielas koncentrācijām izmanto vismaz četrus dzīvniekus un vienlaicīgas NC grupu, kas saņem tikai testējamās vielas nesēju, un PC grupu (vienlaicīgu vai nesenu atkarībā no laboratorijas prakses un saistībā ar 11.–15. punktu). Jāapsver iespēja testēt vairākas PC devas, īpaši tad, ja PC testēšana ir periodiska. Izņemot apstrādi ar testējamo vielu, ar kontroles grupu dzīvniekiem rīkojas tieši tāpat kā ar apstrādāto grupu dzīvniekiem. |
| --- | --- |

17.

Uz devas grupu ar vismaz trim testējamās vielas koncentrācijām izmanto vismaz četrus dzīvniekus un vienlaicīgas NC grupu, kas saņem tikai testējamās vielas nesēju, un PC grupu (vienlaicīgu vai nesenu atkarībā no laboratorijas prakses un saistībā ar 11.–15. punktu). Jāapsver iespēja testēt vairākas PC devas, īpaši tad, ja PC testēšana ir periodiska. Izņemot apstrādi ar testējamo vielu, ar kontroles grupu dzīvniekiem rīkojas tieši tāpat kā ar apstrādāto grupu dzīvniekiem.

| 18. | Devu un nesēja izvēlei jāpamatojas uz atsaucē (3) un (5) sniegtajiem ieteikumiem. Secīgas devas parasti izraugās no atbilstošas koncentrāciju rindas, kā 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 %, u. c. Koncentrāciju rindas izvēlei jābūt ar adekvātu zinātnisku pamatojumu. Jāizvērtē visa esošā toksikoloģiskā (piemēram, akūta toksicitāte un dermālais kairinājums) un struktūras un fizikālķīmiskā informācija par attiecīgo testējamo vielu (un/vai par struktūras ziņā saistītām vielām), ja tāda ir, un trīs secīgās koncentrācijas jāizraugās tā, lai augstākā no tām izraisītu stiprāko iedarbību, kura vēl nerada sistēmisku toksicitāti un/vai pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu (3) (25). Ja šādas informācijas nav, sākumā var būt jāveic priekšskrīninga tests (skatīt 21.–24. punktu). |
| --- | --- |

18.

Devu un nesēja izvēlei jāpamatojas uz atsaucē (3) un (5) sniegtajiem ieteikumiem. Secīgas devas parasti izraugās no atbilstošas koncentrāciju rindas, kā 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 %, u. c. Koncentrāciju rindas izvēlei jābūt ar adekvātu zinātnisku pamatojumu. Jāizvērtē visa esošā toksikoloģiskā (piemēram, akūta toksicitāte un dermālais kairinājums) un struktūras un fizikālķīmiskā informācija par attiecīgo testējamo vielu (un/vai par struktūras ziņā saistītām vielām), ja tāda ir, un trīs secīgās koncentrācijas jāizraugās tā, lai augstākā no tām izraisītu stiprāko iedarbību, kura vēl nerada sistēmisku toksicitāti un/vai pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu (3) (25). Ja šādas informācijas nav, sākumā var būt jāveic priekšskrīninga tests (skatīt 21.–24. punktu).

| 19. | Nesējs nedrīkst pārmainīt vai maskēt testēšanas rezultātus, un tas jāizraugās tāds, lai šķīdība būtu iespējami lielāka, tā ļaujot iegūt augstāko reāli sasniedzamo koncentrāciju un iegūstot šķīdumu/suspensiju, kas būtu derīga testējamās vielas pielietošanai. Ieteicamie nesēji ir acetons/olīveļļa (4:1 tilp./tilp.), N,N-dimetilformamīds, metiletilketons, propilēnglikols un dimetilsulfoksīds (19), bet var izmantot arī citus, ja tam ir pietiekams zinātniskais pamatojums. Dažos gadījumos papildu kontrolei jāizmanto klīniski atbilstošs šķīdinātājs vai tirdzniecības preparāts, kura sastāvā testējamo vielu tirgo. Īpaši jārūpējas, lai nodrošinātu to, ka hidrofīlas testējamās vielas ir iekļautas nesēja sistēmā, kas mitrina ādu un tūlīt nenotek, un jāizmanto pienācīgi šķīdinātāji (piemēram, 1 % Pluronic® L92). Tādēļ ir jāizvairās no nesējiem, kas satur vienīgi ūdeni. |
| --- | --- |

19.

Nesējs nedrīkst pārmainīt vai maskēt testēšanas rezultātus, un tas jāizraugās tāds, lai šķīdība būtu iespējami lielāka, tā ļaujot iegūt augstāko reāli sasniedzamo koncentrāciju un iegūstot šķīdumu/suspensiju, kas būtu derīga testējamās vielas pielietošanai. Ieteicamie nesēji ir acetons/olīveļļa (4:1 tilp./tilp.), N,N-dimetilformamīds, metiletilketons, propilēnglikols un dimetilsulfoksīds (19), bet var izmantot arī citus, ja tam ir pietiekams zinātniskais pamatojums. Dažos gadījumos papildu kontrolei jāizmanto klīniski atbilstošs šķīdinātājs vai tirdzniecības preparāts, kura sastāvā testējamo vielu tirgo. Īpaši jārūpējas, lai nodrošinātu to, ka hidrofīlas testējamās vielas ir iekļautas nesēja sistēmā, kas mitrina ādu un tūlīt nenotek, un jāizmanto pienācīgi šķīdinātāji (piemēram, 1 % Pluronic® L92). Tādēļ ir jāizvairās no nesējiem, kas satur vienīgi ūdeni.

| 20. | Izpētot no individuālām pelēm iegūtus limfmezglus, var novērtēt dzīvnieku savstarpējās atšķirības un iegūt testējamās vielas grupas un VC grupas mērījumu statistisku salīdzinājumu (skatīt 35. punktu). Turklāt PC grupas peļu skaita iespējamā samazinājuma izvērtējumam jēga ir tad, ja dati ir par individuāliem dzīvniekiem (12). Dažas regulatīvās iestādes prasa, lai dati būtu par individuāliem dzīvniekiem. Citas turpretim par pieņemamiem var uzskatīt arī datus par apstrādes dzīvnieku grupām, un šādā situācijā lietotājiem ir izvēle starp individuālu un grupas datu vākšanu. |
| --- | --- |

20.

Izpētot no individuālām pelēm iegūtus limfmezglus, var novērtēt dzīvnieku savstarpējās atšķirības un iegūt testējamās vielas grupas un VC grupas mērījumu statistisku salīdzinājumu (skatīt 35. punktu). Turklāt PC grupas peļu skaita iespējamā samazinājuma izvērtējumam jēga ir tad, ja dati ir par individuāliem dzīvniekiem (12). Dažas regulatīvās iestādes prasa, lai dati būtu par individuāliem dzīvniekiem. Citas turpretim par pieņemamiem var uzskatīt arī datus par apstrādes dzīvnieku grupām, un šādā situācijā lietotājiem ir izvēle starp individuālu un grupas datu vākšanu.

Priekšskrīninga tests

| 21. | Ja nav informācijas, lai noteiktu augstāko testējamo devu (skatīt 18. punktu), jāveic priekšskrīninga tests, lai definētu ar LLNA testējamo atbilstošo devas līmeni. Priekšskrīninga testa mērķis ir būt par orientieri ar LLNA testējamā maksimālā devas līmeņa izvēlē, ja nav informācijas par koncentrāciju, kādā testējamā viela izraisa sistēmisku toksicitāti (skatīt 24. punktu) un/vai pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu (skatīt 23. punktu). Maksimālajam testējamās vielas devas līmenim vajadzētu būt 100 % (šķidrumiem) un augstākajai iespējamajai koncentrācijai (cietām vielām un suspensijām). |
| --- | --- |

21.

Ja nav informācijas, lai noteiktu augstāko testējamo devu (skatīt 18. punktu), jāveic priekšskrīninga tests, lai definētu ar LLNA testējamo atbilstošo devas līmeni. Priekšskrīninga testa mērķis ir būt par orientieri ar LLNA testējamā maksimālā devas līmeņa izvēlē, ja nav informācijas par koncentrāciju, kādā testējamā viela izraisa sistēmisku toksicitāti (skatīt 24. punktu) un/vai pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu (skatīt 23. punktu). Maksimālajam testējamās vielas devas līmenim vajadzētu būt 100 % (šķidrumiem) un augstākajai iespējamajai koncentrācijai (cietām vielām un suspensijām).

| 22. | Priekšskrīninga testa apstākļi ir identiski pamata LLNA apstākļiem, izņemot to, ka nevērtē progresiju limfmezglos un ka devas grupā var izmantot mazāku skaitu dzīvnieku. Ieteicamais skaits ir viens vai divi dzīvnieki katrā devas grupā. Visām pelēm ik dienas pārbauda to, vai apstrādes vietā nav klīnisku pazīmju, kas liecinātu par sistēmisku toksicitāti vai lokālu kairinājumu. Pirms testa un tā beigās (6. diena) reģistrē dzīvnieku ķermeņa masu. Katrai peles apskata abas ausis, un iespējamo apsārtumu novērtē pēc 1. tabulas punktu skalas (25). Auss biezumu mēra ar piemērotu mērierīci (piemēram, digitālo mikrometru vai “Peacock” tipa biezuma mērierīci) 1. dienā (pirms devas), 3. dienā (aptuveni 48 stundas pēc pirmās devas) un 6. dienā. Turklāt 6. dienā auss biezumu var mērīt ar auss caursišanas paņēmienu pēc tam, kad dzīvnieki ir humāni nonāvēti. Lokālu ādas kairinājumu uzskata par pārmērīgu tad, ja jebkurā mērījumu dienā apsārtuma novērtējums pēc punktu skalas ir ≥ 3 un/vai auss biezums ir palielinājies par ≥ 25 % (26) (27). Lielākā deva, kas izmantojama LLNA pamata testā, ir otrā zemākā deva priekšskrīninga koncentrāciju rindā (skatīt 18. punktu), kas neizraisa sistēmisku toksicitāti un/vai pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu.

  1.   tabula


  Apsārtuma (eritēmas) skala







  Pazīmes | Punktu skaits |
| --- | --- | --- |
| Apsārtuma nav | 0 |
| Vāji izteikts (gandrīz nemanāms) apsārtums | 1 |
| Izteikts apsārtums | 2 |
| Vidēji stiprs un ļoti stiprs apsārtums | 3 |
| Ļoti stiprs apsārtums (biešu sarkans) un kreveles, kas apsārtuma novērtēšanu padara neiespējamu | 4 |

22.

Priekšskrīninga testa apstākļi ir identiski pamata LLNA apstākļiem, izņemot to, ka nevērtē progresiju limfmezglos un ka devas grupā var izmantot mazāku skaitu dzīvnieku. Ieteicamais skaits ir viens vai divi dzīvnieki katrā devas grupā. Visām pelēm ik dienas pārbauda to, vai apstrādes vietā nav klīnisku pazīmju, kas liecinātu par sistēmisku toksicitāti vai lokālu kairinājumu. Pirms testa un tā beigās (6. diena) reģistrē dzīvnieku ķermeņa masu. Katrai peles apskata abas ausis, un iespējamo apsārtumu novērtē pēc 1. tabulas punktu skalas (25). Auss biezumu mēra ar piemērotu mērierīci (piemēram, digitālo mikrometru vai “Peacock” tipa biezuma mērierīci) 1. dienā (pirms devas), 3. dienā (aptuveni 48 stundas pēc pirmās devas) un 6. dienā. Turklāt 6. dienā auss biezumu var mērīt ar auss caursišanas paņēmienu pēc tam, kad dzīvnieki ir humāni nonāvēti. Lokālu ādas kairinājumu uzskata par pārmērīgu tad, ja jebkurā mērījumu dienā apsārtuma novērtējums pēc punktu skalas ir ≥ 3 un/vai auss biezums ir palielinājies par ≥ 25 % (26) (27). Lielākā deva, kas izmantojama LLNA pamata testā, ir otrā zemākā deva priekšskrīninga koncentrāciju rindā (skatīt 18. punktu), kas neizraisa sistēmisku toksicitāti un/vai pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu.

1.   tabula

Apsārtuma (eritēmas) skala

Pazīmes

Punktu skaits

Apsārtuma nav

0

Vāji izteikts (gandrīz nemanāms) apsārtums

1

Izteikts apsārtums

2

Vidēji stiprs un ļoti stiprs apsārtums

3

Ļoti stiprs apsārtums (biešu sarkans) un kreveles, kas apsārtuma novērtēšanu padara neiespējamu

4

| 23. | Papildus auss biezuma 25 % pieaugumam (26) (27) kairinātāju identificēšanai LLNA izmanto arī statistiski nozīmīgus auss biezuma pieauguma rādītājus apstrādātajām pelēm salīdzinājumā ar kontroles grupas pelēm (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Tomēr, lai gan statistiski nozīmīgs pieaugums var arī nesasniegt 25 % robežu, šādu pieaugumu neuzskata par pārmērīga kairinājuma izpausmi (30) (32) (33) (34). |
| --- | --- |

23.

Papildus auss biezuma 25 % pieaugumam (26) (27) kairinātāju identificēšanai LLNA izmanto arī statistiski nozīmīgus auss biezuma pieauguma rādītājus apstrādātajām pelēm salīdzinājumā ar kontroles grupas pelēm (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Tomēr, lai gan statistiski nozīmīgs pieaugums var arī nesasniegt 25 % robežu, šādu pieaugumu neuzskata par pārmērīga kairinājuma izpausmi (30) (32) (33) (34).

| 24. | Turpmāk uzskaitītie klīniskie novērojumi, ja tie ir novērtējuma neatņemama daļa, var liecināt par sistēmisku toksicitāti (35) (36), un tāpēc var parādīt, kāds būs LLNA pamata testā izmantojamais maksimālais devas līmenis: nervu sistēmas darbības traucējumi (piemēram, piloarekcija, ataksija, drebuļi un krampji); uzvedības traucējumi (piemēram, agresivitāte, ar personīgo higiēnu saistītās uzvedības maiņa, jūtams aktivitātes samazinājums vai pieaugums); neraksturīga elpošana (piemēram, elpas vilcienu biežuma un intensitātes maiņa, kā apgrūtināta vai spazmatiska elpošana, trokšņi plaušās) un pārmaiņas barības un ūdens uzņemšanā. Turklāt novērtējumā jāņem vērā letarģijas pazīmes un/vai reakcijas samazināšanās un visas klīniskās pazīmes, kas liecina par vairāk nekā mirklīgām sāpēm un ciešanām, vai ķermeņa masas samazinājums par vairāk nekā 5 % laikā no 1. dienas līdz 6. dienai, kā arī mirstības rādītāji. Mirstoši dzīvnieki vai dzīvnieki, kuriem acīmredzami sāp vai kuri smagi un ilgstoši cieš, ir humāni jānonāvē (37). |
| --- | --- |

24.

Turpmāk uzskaitītie klīniskie novērojumi, ja tie ir novērtējuma neatņemama daļa, var liecināt par sistēmisku toksicitāti (35) (36), un tāpēc var parādīt, kāds būs LLNA pamata testā izmantojamais maksimālais devas līmenis: nervu sistēmas darbības traucējumi (piemēram, piloarekcija, ataksija, drebuļi un krampji); uzvedības traucējumi (piemēram, agresivitāte, ar personīgo higiēnu saistītās uzvedības maiņa, jūtams aktivitātes samazinājums vai pieaugums); neraksturīga elpošana (piemēram, elpas vilcienu biežuma un intensitātes maiņa, kā apgrūtināta vai spazmatiska elpošana, trokšņi plaušās) un pārmaiņas barības un ūdens uzņemšanā. Turklāt novērtējumā jāņem vērā letarģijas pazīmes un/vai reakcijas samazināšanās un visas klīniskās pazīmes, kas liecina par vairāk nekā mirklīgām sāpēm un ciešanām, vai ķermeņa masas samazinājums par vairāk nekā 5 % laikā no 1. dienas līdz 6. dienai, kā arī mirstības rādītāji. Mirstoši dzīvnieki vai dzīvnieki, kuriem acīmredzami sāp vai kuri smagi un ilgstoši cieš, ir humāni jānonāvē (37).

Eksperimenta grafiks pamata pētījuma laikā

| 25. | Eksperimenta grafiks ir šāds:
  —   1. diena: Individuāli nosaka un reģistrē katra dzīvnieka masu, izdara un reģistrē klīniskos novērojumus. Katras auss aizmugures virsmu apstrādā ar 25 μl atšķaidījuma, kurš satur attiecīgo testējamo vielu, tikai nesēju vai PC (vienlaicīgu vai nesenu atkarībā no laboratorijas prakses un saistībā ar 11.–15. punktu).
  —   2. un 3. diena: Atkārto 1. dienā veikto apstrādi.
  —   4. un 5. diena: Apstrāde nenotiek.
  —   6. diena: Reģistrē katra dzīvnieka masu. Visām testa un kontroles pelēm astes vēnā injicē 250 μl sterila fosfāta bufera fizioloģiskā šķīduma (PBS), kas satur 20 μCi (7,4 × 105 Bq) tritiāta (3H)-metiltimidīna. Alternatīvi visām pelēm astes vēnā injicē 250 μl sterila PBS, kas satur 2 μCi (7.4 × 104 Bq) 125I–joddeoksiuridīna un 10–5Μ fluordeoksiuridīna. Pēc piecām stundām (5 h) visus dzīvniekus humāni nonāvē. Pelēm izgriež aurikulāros limfmezglus un ievieto PBS katram dzīvniekam atsevišķi (individuālo dzīvnieku pieeja); alternatīvi izgriež visus aurikulāros limfmezglus un ievieto PBS katrai eksperimenta grupai kopā (apstrādes grupas pieeja). Sīkus datus un diagrammas par limfmezglu identificēšanu un izgriešanu skatīt atsaucēs (12). Eksperimenta protokolā var iekļaut papildu parametrus, kas raksturo turpmāku ādas lokālo reakciju pamata pētījuma laikā, piemēram, auss apsārtuma novērtējumu pēc punktu skalas vai auss biezuma mērījumus (nosaka ar mērierīci vai ar auss caursišanas paņēmienu autopsijā). |
| --- | --- |

25.

Eksperimenta grafiks ir šāds:

—   1. diena: Individuāli nosaka un reģistrē katra dzīvnieka masu, izdara un reģistrē klīniskos novērojumus. Katras auss aizmugures virsmu apstrādā ar 25 μl atšķaidījuma, kurš satur attiecīgo testējamo vielu, tikai nesēju vai PC (vienlaicīgu vai nesenu atkarībā no laboratorijas prakses un saistībā ar 11.–15. punktu).

—   2. un 3. diena: Atkārto 1. dienā veikto apstrādi.

—   4. un 5. diena: Apstrāde nenotiek.

—   6. diena: Reģistrē katra dzīvnieka masu. Visām testa un kontroles pelēm astes vēnā injicē 250 μl sterila fosfāta bufera fizioloģiskā šķīduma (PBS), kas satur 20 μCi (7,4 × 105 Bq) tritiāta (3H)-metiltimidīna. Alternatīvi visām pelēm astes vēnā injicē 250 μl sterila PBS, kas satur 2 μCi (7.4 × 104 Bq) 125I–joddeoksiuridīna un 10–5Μ fluordeoksiuridīna. Pēc piecām stundām (5 h) visus dzīvniekus humāni nonāvē. Pelēm izgriež aurikulāros limfmezglus un ievieto PBS katram dzīvniekam atsevišķi (individuālo dzīvnieku pieeja); alternatīvi izgriež visus aurikulāros limfmezglus un ievieto PBS katrai eksperimenta grupai kopā (apstrādes grupas pieeja). Sīkus datus un diagrammas par limfmezglu identificēšanu un izgriešanu skatīt atsaucēs (12). Eksperimenta protokolā var iekļaut papildu parametrus, kas raksturo turpmāku ādas lokālo reakciju pamata pētījuma laikā, piemēram, auss apsārtuma novērtējumu pēc punktu skalas vai auss biezuma mērījumus (nosaka ar mērierīci vai ar auss caursišanas paņēmienu autopsijā).

Šūnu suspensiju sagatavošana

| 26. | No abās pusēs izgrieztām limfmezglu šūnām (LNC) iegūtu atsevišķu šūnu suspensiju no atsevišķiem dzīvniekiem vai no apstrādes grupas pagatavo, šūnas saudzīgi mehāniski sadalot caur nerūsējošā tērauda sietu ar 200 μm acu izmēru vai izmantojot citu paņēmienu, kas ir derīgs atsevišķu šūnu suspensiju ieguvei. LNC divreiz mazgā lielā daudzumā PBS, un DNS izgulsnē ar 5 % trihloretiķskābi (TCA) 4 °C temperatūrā 18 stundu laikā (3). Plāksnītes vai nu vēlreiz suspendē 1 ml TCA un pārnes scintilācijas stobriņos, kas satur 10 ml 3H skaitīšanas scintilācijas šķidruma, vai tieši pārnes gamma skaitīšanas caurulītēs 125I skaitīšanai. |
| --- | --- |

26.

No abās pusēs izgrieztām limfmezglu šūnām (LNC) iegūtu atsevišķu šūnu suspensiju no atsevišķiem dzīvniekiem vai no apstrādes grupas pagatavo, šūnas saudzīgi mehāniski sadalot caur nerūsējošā tērauda sietu ar 200 μm acu izmēru vai izmantojot citu paņēmienu, kas ir derīgs atsevišķu šūnu suspensiju ieguvei. LNC divreiz mazgā lielā daudzumā PBS, un DNS izgulsnē ar 5 % trihloretiķskābi (TCA) 4 °C temperatūrā 18 stundu laikā (3). Plāksnītes vai nu vēlreiz suspendē 1 ml TCA un pārnes scintilācijas stobriņos, kas satur 10 ml 3H skaitīšanas scintilācijas šķidruma, vai tieši pārnes gamma skaitīšanas caurulītēs 125I skaitīšanai.

Šūnu savairošanās noteikšana (inkorporētā radioaktivitāte)

| 27. | 3H-metiltimidīna inkorporēšanos mēra ar β-scintilāciju skaitīšanu kā sadalīšanās skaitu minūtē (DPM). 125I-joddeoksiuridīna inkorporēšanos mēra ar 125I skaitīšanu un arī izsaka kā DPM. Atkarībā no izmantotās pieejas inkorporēšanos izsaka kā DPM katrai pelei (individuālā pieeja) vai DPM apstrādes grupai (apstrādes grupas pieeja). |
| --- | --- |

27.

3H-metiltimidīna inkorporēšanos mēra ar β-scintilāciju skaitīšanu kā sadalīšanās skaitu minūtē (DPM). 125I-joddeoksiuridīna inkorporēšanos mēra ar 125I skaitīšanu un arī izsaka kā DPM. Atkarībā no izmantotās pieejas inkorporēšanos izsaka kā DPM katrai pelei (individuālā pieeja) vai DPM apstrādes grupai (apstrādes grupas pieeja).

Reducētā LLNA

| 28. | Atsevišķos gadījumos, ja ir regulatīva vajadzība apstiprināt negatīvu ādas sensibilizācijas potenciāla prognozi un ar nosacījumu, ka tiek ievērotas visas pārējās šajā TM aprakstītās LLNA protokola specifikācijas, var izmantot fakultatīvu, rLLNA protokolu (16) (17) (18), kuram vajadzīgs mazāk izmēģinājuma dzīvnieku. Lai varētu piemērot rLLNA pieeju, vajadzīgs skaidrs pamatojums un zinātniski argumenti. Ja iegūtais rezultāts ir pozitīvs vai neskaidrs, var būt jāturpina testēšana, lai interpretētu vai precizētu minēto rezultātu. |
| --- | --- |

28.

Atsevišķos gadījumos, ja ir regulatīva vajadzība apstiprināt negatīvu ādas sensibilizācijas potenciāla prognozi un ar nosacījumu, ka tiek ievērotas visas pārējās šajā TM aprakstītās LLNA protokola specifikācijas, var izmantot fakultatīvu, rLLNA protokolu (16) (17) (18), kuram vajadzīgs mazāk izmēģinājuma dzīvnieku. Lai varētu piemērot rLLNA pieeju, vajadzīgs skaidrs pamatojums un zinātniski argumenti. Ja iegūtais rezultāts ir pozitīvs vai neskaidrs, var būt jāturpina testēšana, lai interpretētu vai precizētu minēto rezultātu.

| 29. | Devas grupu skaita samazinājums ir vienīgā atšķirība starp LLNA un rLLNA testēšanas metožu protokoliem, un tāpēc ar rLLNA neiegūst datus par devas un atbildes reakcijas mijiedarbību. Tātad rLLNA neizmanto gadījumos, kad minētā informācija ir vajadzīga. Tāpat kā daudzdevu LLNA gadījumā, testējamās vielas koncentrācijai, kuru vērtē ar rLLNA, jābūt augstākajai koncentrācijai, kura vēl nerada acīmredzamu sistēmisku toksicitāti un/vai pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu pelēm (skatīt 18. punktu). |
| --- | --- |

29.

Devas grupu skaita samazinājums ir vienīgā atšķirība starp LLNA un rLLNA testēšanas metožu protokoliem, un tāpēc ar rLLNA neiegūst datus par devas un atbildes reakcijas mijiedarbību. Tātad rLLNA neizmanto gadījumos, kad minētā informācija ir vajadzīga. Tāpat kā daudzdevu LLNA gadījumā, testējamās vielas koncentrācijai, kuru vērtē ar rLLNA, jābūt augstākajai koncentrācijai, kura vēl nerada acīmredzamu sistēmisku toksicitāti un/vai pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu pelēm (skatīt 18. punktu).

NOVĒROJUMI

Klīniskie novērojumi

| 30. | Ikviena pele vismaz reizi dienā ir rūpīgi jānovēro attiecībā uz vietēju kairinājumu apstrādes vietā vai sistēmiskas toksicitātes klīniskajām pazīmēm. Visus novērojumus sistemātiski reģistrē, par katru peli izdarot individuālu ierakstu. Novērošanas plānā jāiekļauj kritēriji, kas ļauj tūlīt identificēt peles, kurām ir sistēmiskas toksicitātes, pārmērīga lokāla ādas kairinājuma vai ādas korozijas pazīmes, lai tām veiktu eitanāziju (37). |
| --- | --- |

30.

Ikviena pele vismaz reizi dienā ir rūpīgi jānovēro attiecībā uz vietēju kairinājumu apstrādes vietā vai sistēmiskas toksicitātes klīniskajām pazīmēm. Visus novērojumus sistemātiski reģistrē, par katru peli izdarot individuālu ierakstu. Novērošanas plānā jāiekļauj kritēriji, kas ļauj tūlīt identificēt peles, kurām ir sistēmiskas toksicitātes, pārmērīga lokāla ādas kairinājuma vai ādas korozijas pazīmes, lai tām veiktu eitanāziju (37).

Ķermeņa masa

| 31. | Kā norādīts 25. punktā, individuālu dzīvnieku ķermeņa masa ir jānosaka testa sākumā un pirms plānotās humānās nonāvēšanas. |
| --- | --- |

31.

Kā norādīts 25. punktā, individuālu dzīvnieku ķermeņa masa ir jānosaka testa sākumā un pirms plānotās humānās nonāvēšanas.

REZULTĀTU APRĒĶINĀŠANA

| 32. | Katras apstrādes grupas rezultātu izsaka ar SI. Ja izmanto individuālo pieeju, SI iegūst, DPM vidējo lielumu katrai pelei katrā testējamās vielas grupā un PC grupā dalot ar DPM vidējo lielumu katrai pelei šķīdinātāja/VC grupā. Tā VC grupās vidējais SI ir 1. Ja izmanto apstrādes grupas pieeju, SI iegūst, dalot katras apstrādes grupas apvienoto radioaktīvo inkorporāciju ar apvienotās VC grupas inkorporāciju; rezultāts ir vidējais SI. |
| --- | --- |

32.

Katras apstrādes grupas rezultātu izsaka ar SI. Ja izmanto individuālo pieeju, SI iegūst, DPM vidējo lielumu katrai pelei katrā testējamās vielas grupā un PC grupā dalot ar DPM vidējo lielumu katrai pelei šķīdinātāja/VC grupā. Tā VC grupās vidējais SI ir 1. Ja izmanto apstrādes grupas pieeju, SI iegūst, dalot katras apstrādes grupas apvienoto radioaktīvo inkorporāciju ar apvienotās VC grupas inkorporāciju; rezultāts ir vidējais SI.

| 33. | Lēmumu pieņemšanas procesā rezultātu uzskata par pozitīvu, ja SI ≥ 3. Tomēr, nosakot, vai neitrālam tuvu rezultātu varētu uzskatīt par pozitīvu, var ņemt vērā arī devas un atbildes reakcijas stiprumu un šķīdinātāja/nesēja un PC reakcijas statistisko nozīmīgumu un konsekvenci (4) (5) (6). |
| --- | --- |

33.

Lēmumu pieņemšanas procesā rezultātu uzskata par pozitīvu, ja SI ≥ 3. Tomēr, nosakot, vai neitrālam tuvu rezultātu varētu uzskatīt par pozitīvu, var ņemt vērā arī devas un atbildes reakcijas stiprumu un šķīdinātāja/nesēja un PC reakcijas statistisko nozīmīgumu un konsekvenci (4) (5) (6).

| 34. | Ja nepieciešams paskaidrot iegūtos rezultātus, jāņem vērā testējamās vielas dažādās īpašības, tostarp tas, vai tā strukturāli līdzinās jau zināmiem ādas sensibilizatoriem, vai tā izraisa pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu pelēm un kāda veida atbildes reakcija uz devu ir novērota. Šie un citi apsvērumi sīkāk iztirzāti citur (7). |
| --- | --- |

34.

Ja nepieciešams paskaidrot iegūtos rezultātus, jāņem vērā testējamās vielas dažādās īpašības, tostarp tas, vai tā strukturāli līdzinās jau zināmiem ādas sensibilizatoriem, vai tā izraisa pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu pelēm un kāda veida atbildes reakcija uz devu ir novērota. Šie un citi apsvērumi sīkāk iztirzāti citur (7).

| 35. | Radioaktivitātes datu vākšana par individuālām pelēm pavērs iespējas statistiskai analīzei par devas un atbildes reakcijas mijiedarbības esību un tās pakāpi šajos datos. Jebkurš statistisks novērtējums var ietvert devas un atbildes reakcijas mijiedarbības novērtējumu, kā arī pienācīgi koriģētus testējamo grupu salīdzinājumus (piemēram, devu pāri grupā un šīs grupas salīdzinājums ar vienlaicīgu VC grupu). Statistiskā analīze var ietvert, piemēram, lineāro regresiju jeb Viljama [William’s] testu, ar ko analizē devas un atbildes reakcijas mijiedarbību tendences, un Daneta [Dunnett] testu, lai salīdzinātu devu pārus. Izvēloties attiecīgu statistiskās analīzes metodi, pētniekam jāapzinās iespējamās mainīgo lielumu nevienādības un citas ar to saistītās problēmas, kuru dēļ var būt nepieciešama datu pārveidošana vai neparametriskā statistiskā analīze. Visādā ziņā iespējams, ka pētniekam SI būs jāaprēķina un statistiskā analīze jāveic gan ar, gan bez dažiem punktveida datiem (respektīvi, neņemot vērā galējības jeb rupjas kļūdas). |
| --- | --- |

35.

Radioaktivitātes datu vākšana par individuālām pelēm pavērs iespējas statistiskai analīzei par devas un atbildes reakcijas mijiedarbības esību un tās pakāpi šajos datos. Jebkurš statistisks novērtējums var ietvert devas un atbildes reakcijas mijiedarbības novērtējumu, kā arī pienācīgi koriģētus testējamo grupu salīdzinājumus (piemēram, devu pāri grupā un šīs grupas salīdzinājums ar vienlaicīgu VC grupu). Statistiskā analīze var ietvert, piemēram, lineāro regresiju jeb Viljama [William’s] testu, ar ko analizē devas un atbildes reakcijas mijiedarbību tendences, un Daneta [Dunnett] testu, lai salīdzinātu devu pārus. Izvēloties attiecīgu statistiskās analīzes metodi, pētniekam jāapzinās iespējamās mainīgo lielumu nevienādības un citas ar to saistītās problēmas, kuru dēļ var būt nepieciešama datu pārveidošana vai neparametriskā statistiskā analīze. Visādā ziņā iespējams, ka pētniekam SI būs jāaprēķina un statistiskā analīze jāveic gan ar, gan bez dažiem punktveida datiem (respektīvi, neņemot vērā galējības jeb rupjas kļūdas).

DATI UN TESTĒŠANAS PĀRSKATS

Dati

| 36. | Dati jāapkopo tabulā. Individuālu dzīvnieku apstrādes gadījumā jānorāda indivīdu DPM vērtības, grupas vidējā DPM vērtība uz dzīvnieku, attiecīgais kļūdas apzīmējums (piem., SD, SEM) un vidējais SI katrai devas grupai salīdzinājumā ar kontroles VC grupu. Dzīvnieku grupas apstrādes gadījumā jānorāda vidējais DPM un vidējais SI katrai devas grupai salīdzinājumā ar kontroles VC grupu. |
| --- | --- |

36.

Dati jāapkopo tabulā. Individuālu dzīvnieku apstrādes gadījumā jānorāda indivīdu DPM vērtības, grupas vidējā DPM vērtība uz dzīvnieku, attiecīgais kļūdas apzīmējums (piem., SD, SEM) un vidējais SI katrai devas grupai salīdzinājumā ar kontroles VC grupu. Dzīvnieku grupas apstrādes gadījumā jānorāda vidējais DPM un vidējais SI katrai devas grupai salīdzinājumā ar kontroles VC grupu.

Testēšanas pārskats

| 37. | Testēšanas pārskatā jābūt iekļautai šādai informācijai: | Testējamā viela un kontroles vielas:






  — | identifikācijas dati (piemēram, CAS un EK numurs (ja ir); avots; tīrība; zināmie piemaisījumi; partijas numurs), |
| --- | --- | --- | --- |

37.

Testēšanas pārskatā jābūt iekļautai šādai informācijai:

Testējamā viela un kontroles vielas:

—

identifikācijas dati (piemēram, CAS un EK numurs (ja ir); avots; tīrība; zināmie piemaisījumi; partijas numurs),

| — | fizikālās un fizikāli ķīmiskās īpašības (piemēram, gaistamība, stabilitāte, šķīdība), |
| --- | --- |

—

fizikālās un fizikāli ķīmiskās īpašības (piemēram, gaistamība, stabilitāte, šķīdība),

| — | maisījuma gadījumā: sastāvs un sastāvdaļu relatīvais procentuālais daudzums. |
| --- | --- |

—

maisījuma gadījumā: sastāvs un sastāvdaļu relatīvais procentuālais daudzums.

| | Šķīdinātājs/nesējs:






  — | identifikācijas dati (tīrība; koncentrācija (attiecīgā gadījumā); izmantotais tilpums), |
| --- | --- | --- |

Šķīdinātājs/nesējs:

—

identifikācijas dati (tīrība; koncentrācija (attiecīgā gadījumā); izmantotais tilpums),

| — | nesēja izvēles pamatojums. |
| --- | --- |

—

nesēja izvēles pamatojums.

| | Izmēģinājumu dzīvnieki:






  — | CBA peļu avots, |
| --- | --- | --- |

Izmēģinājumu dzīvnieki:

—

CBA peļu avots,

| — | dzīvnieku mikrobioloģiskais statuss, ja tas zināms, |
| --- | --- |

—

dzīvnieku mikrobioloģiskais statuss, ja tas zināms,

| — | dzīvnieku skaits un vecums, |
| --- | --- |

—

dzīvnieku skaits un vecums,

| — | dzīvnieku avots, turēšanas un barošanas apstākļi utt. |
| --- | --- |

—

dzīvnieku avots, turēšanas un barošanas apstākļi utt.

| | Testēšanas apstākļi:






  — | sīkas ziņas par testējamās vielas sagatavošanu un pielietošanu, |
| --- | --- | --- |

Testēšanas apstākļi:

—

sīkas ziņas par testējamās vielas sagatavošanu un pielietošanu,

| — | devu izvēles pamatojums, attiecīgā gadījumā iekļaujot priekšskrīninga testa rezultātus, |
| --- | --- |

—

devu izvēles pamatojums, attiecīgā gadījumā iekļaujot priekšskrīninga testa rezultātus,

| — | izmantotās nesēja un testējamās vielas koncentrācijas un pielietotās testējamās vielas kopējais daudzums, |
| --- | --- |

—

izmantotās nesēja un testējamās vielas koncentrācijas un pielietotās testējamās vielas kopējais daudzums,

| — | sīkas ziņas par barības un ūdens kvalitāti (iekļaujot barības veidu/izcelsmi, ūdens izcelsmi), |
| --- | --- |

—

sīkas ziņas par barības un ūdens kvalitāti (iekļaujot barības veidu/izcelsmi, ūdens izcelsmi),

| — | sīks apstrādes un paraugu ņemšanas shēmas apraksts, |
| --- | --- |

—

sīks apstrādes un paraugu ņemšanas shēmas apraksts,

| — | toksicitātes novērtēšanas metodes, |
| --- | --- |

—

toksicitātes novērtēšanas metodes,

| — | kritēriji, pēc kuriem testa rezultātu klasificē kā pozitīvu vai negatīvu, |
| --- | --- |

—

kritēriji, pēc kuriem testa rezultātu klasificē kā pozitīvu vai negatīvu,

| — | sīkas ziņas par novirzēm no protokola un paskaidrojums par to, kādā veidā šī novirze ietekmē pētījuma plānu un rezultātus. |
| --- | --- |

—

sīkas ziņas par novirzēm no protokola un paskaidrojums par to, kādā veidā šī novirze ietekmē pētījuma plānu un rezultātus.

| | Ticamības pārbaude:






  — | jaunākās ticamības pārbaudes rezultātu kopsavilkums, iekļaujot informāciju par testējamo vielu, tās koncentrāciju un nesēju, |
| --- | --- | --- |

Ticamības pārbaude:

—

jaunākās ticamības pārbaudes rezultātu kopsavilkums, iekļaujot informāciju par testējamo vielu, tās koncentrāciju un nesēju,

| — | vienlaicīgas un/vai vēsturiskas PC un vienlaicīgas NC dati no testēšanas laboratorijas, |
| --- | --- |

—

vienlaicīgas un/vai vēsturiskas PC un vienlaicīgas NC dati no testēšanas laboratorijas,

| — | ja vienlaicīga PC nav paredzēta: datums un laboratorijas pārskats par nesenāko kārtējo PC un pārskats par agrāko PC datiem konkrētajā laboratorijā, kuri pamato vienlaicīgas PC neveikšanu. |
| --- | --- |

—

ja vienlaicīga PC nav paredzēta: datums un laboratorijas pārskats par nesenāko kārtējo PC un pārskats par agrāko PC datiem konkrētajā laboratorijā, kuri pamato vienlaicīgas PC neveikšanu.

| | Rezultāti:






  — | individuālu peļu masa dozēšanas sākumā un veicot plānoto nonāvēšanu; vidējās vērtības un attiecīgais kļūdas apzīmējums (piem., SD, SEM) katrai apstrādes grupai, |
| --- | --- | --- |

Rezultāti:

—

individuālu peļu masa dozēšanas sākumā un veicot plānoto nonāvēšanu; vidējās vērtības un attiecīgais kļūdas apzīmējums (piem., SD, SEM) katrai apstrādes grupai,

| — | toksicitātes parādīšanās gaita un pazīmes, iekļaujot ādas kairinājumu ievadīšanas vietā, ja tāds ir, katram dzīvniekam, |
| --- | --- |

—

toksicitātes parādīšanās gaita un pazīmes, iekļaujot ādas kairinājumu ievadīšanas vietā, ja tāds ir, katram dzīvniekam,

| — | tabulā apkopoti dati par individuālu peļu (individuālu dzīvnieku pieeja) vai vidējām (apstrādes grupu pieeja) DPM vērtībām un SI vērtībām katrai apstrādes grupai, |
| --- | --- |

—

tabulā apkopoti dati par individuālu peļu (individuālu dzīvnieku pieeja) vai vidējām (apstrādes grupu pieeja) DPM vērtībām un SI vērtībām katrai apstrādes grupai,

| — | vidējās vērtības un attiecīgais kļūdas apzīmējums (piem., SD, SEM) par DPM katrai pelei katrā apstrādes grupā un galējību jeb rupju kļūdu analīze katrā apstrādes grupā, ja izmanto individuālu dzīvnieku pieeju, |
| --- | --- |

—

vidējās vērtības un attiecīgais kļūdas apzīmējums (piem., SD, SEM) par DPM katrai pelei katrā apstrādes grupā un galējību jeb rupju kļūdu analīze katrā apstrādes grupā, ja izmanto individuālu dzīvnieku pieeju,

| — | aprēķinātais SI un attiecīgs mainības mērs, kas ņem vērā to, ka ne testējamās vielas grupā, ne kontroles grupā dzīvnieki nav identiski (ja izmanto individuālu dzīvnieku pieeju), |
| --- | --- |

—

aprēķinātais SI un attiecīgs mainības mērs, kas ņem vērā to, ka ne testējamās vielas grupā, ne kontroles grupā dzīvnieki nav identiski (ja izmanto individuālu dzīvnieku pieeju),

| — | devas un atbildes reakcijas sakarības, |
| --- | --- |

—

devas un atbildes reakcijas sakarības,

| — | attiecīgā gadījumā, statistiskā analīze. |
| --- | --- |

—

attiecīgā gadījumā, statistiskā analīze.

| | Rezultātu izvērtējums:






  — | īss komentārs par rezultātiem, atbildes reakcijas uz devu analīzi un, attiecīgā gadījumā, statistisko analīzi ar secinājumu, vai testējamā viela jāuzskata par ādas sensibilizatoru. |
| --- | --- | --- |

Rezultātu izvērtējums:

—

īss komentārs par rezultātiem, atbildes reakcijas uz devu analīzi un, attiecīgā gadījumā, statistisko analīzi ar secinājumu, vai testējamā viela jāuzskata par ādas sensibilizatoru.

IZMANTOTĀ LITERATŪRA

| 1) | OECD (2002), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay. OECD Guideline for the Testing of Chemicals No 429, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

1)

OECD (2002), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay. OECD Guideline for the Testing of Chemicals No 429, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

| 2) | Kimber, I. and Basketter, D.A. (1992), The murine local lymph node assay; collaborative studies and new directions: A commentary, Food Chem. Toxicol., 30, 165-169. |
| --- | --- |

2)

Kimber, I. and Basketter, D.A. (1992), The murine local lymph node assay; collaborative studies and new directions: A commentary, Food Chem. Toxicol., 30, 165-169.

| 3) | Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes, E.W. and Basketter, D.A. (1994), The local lymph node assay: developments and applications, Toxicol., 93, 13-31. |
| --- | --- |

3)

Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes, E.W. and Basketter, D.A. (1994), The local lymph node assay: developments and applications, Toxicol., 93, 13-31.

| 4) | Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise, J. Toxicol. Environ. Health, 53, 563-79. |
| --- | --- |

4)

Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise, J. Toxicol. Environ. Health, 53, 563-79.

| 5) | Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: status of validation, Food Chem. Toxicol., 34, 999-1002. |
| --- | --- |

5)

Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: status of validation, Food Chem. Toxicol., 34, 999-1002.

| 6) | Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests, Food Chem. Toxicol., 34, 985-997. |
| --- | --- |

6)

Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests, Food Chem. Toxicol., 34, 985-997.

| 7) | Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests, Food Chem. Toxicol., 36, 327-33. |
| --- | --- |

7)

Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests, Food Chem. Toxicol., 36, 327-33.

| 8) | Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins, Toxicol., 146, 49-59. |
| --- | --- |

8)

Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins, Toxicol., 146, 49-59.

| 9) | Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34: 258-273. |
| --- | --- |

9)

Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34: 258-273.

| 10) | Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34, 274-286. |
| --- | --- |

10)

Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34, 274-286.

| 11) | Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34: 249-257. |
| --- | --- |

11)

Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34: 249-257.

| 12) | ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf] |
| --- | --- |

12)

ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf]

| 13) | OECD (1992), Skin Sensitisation. OECD Guideline for Testing of Chemicals No 406, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

13)

OECD (1992), Skin Sensitisation. OECD Guideline for Testing of Chemicals No 406, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

| 14) | OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

14)

OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

| 15) | Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and Kimber, I. (1998), Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde, J. Appl. Toxicol., 18, 281-284. |
| --- | --- |

15)

Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and Kimber, I. (1998), Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde, J. Appl. Toxicol., 18, 281-284.

| 16) | Kimber, I., Dearman, R.J., Betts, C.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Kern, P.S., Patlewicz, G.Y. and Basketter, D.A. (2006), The local lymph node assay and skin sensitisation: a cut-down screen to reduce animal requirements? Contact Dermatitis, 54, 181-185. |
| --- | --- |

16)

Kimber, I., Dearman, R.J., Betts, C.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Kern, P.S., Patlewicz, G.Y. and Basketter, D.A. (2006), The local lymph node assay and skin sensitisation: a cut-down screen to reduce animal requirements? Contact Dermatitis, 54, 181-185.

| 17) | ESAC (2007), Statement on the Reduced Local Lymph Node Assay (rLLNA), European Commission Directorate General, Joint Research Centre, Institute for Health and Consumer Protection, European Centre for the Validation of Alternative Methods, April 2007. Available at: [http://ecvam.jrc.it/ft_doc/ESAC26_statement_rLLNA_20070525-1.pdf] |
| --- | --- |

17)

ESAC (2007), Statement on the Reduced Local Lymph Node Assay (rLLNA), European Commission Directorate General, Joint Research Centre, Institute for Health and Consumer Protection, European Centre for the Validation of Alternative Methods, April 2007. Available at: [http://ecvam.jrc.it/ft_doc/ESAC26_statement_rLLNA_20070525-1.pdf]

| 18) | ICCVAM (2009), The Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) Test Method Evaluation Report. The Reduced Murine Local Lymph Node Assay: An Alternative Test Method Using Fewer Animals to Assess the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals and Products, NIH Publication Number 09-6439, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/] |
| --- | --- |

18)

ICCVAM (2009), The Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) Test Method Evaluation Report. The Reduced Murine Local Lymph Node Assay: An Alternative Test Method Using Fewer Animals to Assess the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals and Products, NIH Publication Number 09-6439, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/]

| 19) | ICCVAM (1999), The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Compounds, The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM), NIH Publication No. 99-4494, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf] |
| --- | --- |

19)

ICCVAM (1999), The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Compounds, The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM), NIH Publication No. 99-4494, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]

| 20) | Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT), Food Chem. Toxicol., 46, 1896-1904. |
| --- | --- |

20)

Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT), Food Chem. Toxicol., 46, 1896-1904.

| 21) | Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH, Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 90-96. |
| --- | --- |

21)

Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH, Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 90-96.

| 22) | ICCVAM (2009), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Assessment of the Validity of the LLNA for Testing Pesticide Formulations and Other Products, Metals, and Substances in Aqueous Solutions, NIH Publication Number 10-7512, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences, Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/] |
| --- | --- |

22)

ICCVAM (2009), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Assessment of the Validity of the LLNA for Testing Pesticide Formulations and Other Products, Metals, and Substances in Aqueous Solutions, NIH Publication Number 10-7512, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences, Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/]

| 23) | ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 7th ed. Washington, DC: National Academies Press. |
| --- | --- |

23)

ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 7th ed. Washington, DC: National Academies Press.

| 24) | McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH, Toxicol., 238, 71-89. |
| --- | --- |

24)

McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH, Toxicol., 238, 71-89.

| 25) | OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 404, Paris, France. Available at: http://www.oecd.org/document/40/0,3343,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html] |
| --- | --- |

25)

OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 404, Paris, France. Available at: http://www.oecd.org/document/40/0,3343,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html]

| 26) | Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances, Toxicologist, 96, 235. |
| --- | --- |

26)

Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances, Toxicologist, 96, 235.

| 27) | ICCVAM (2009), Non-radioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf] |
| --- | --- |

27)

ICCVAM (2009), Non-radioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf]

| 28) | Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice, Drug. Chem. Toxicol., 21, 195-206. |
| --- | --- |

28)

Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice, Drug. Chem. Toxicol., 21, 195-206.

| 29) | Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions, Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, 83-94. |
| --- | --- |

29)

Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions, Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, 83-94.

| 30) | Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals, Toxicol. Meth., 8, 245-256. |
| --- | --- |

30)

Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals, Toxicol. Meth., 8, 245-256.

| 31) | Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods, Drug. Chem. Toxicol., 22, 491-506. |
| --- | --- |

31)

Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods, Drug. Chem. Toxicol., 22, 491-506.

| 32) | Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, 60-68. |
| --- | --- |

32)

Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, 60-68.

| 33) | Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721-728. |
| --- | --- |

33)

Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721-728.

| 34) | Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for contact sensitisation by Pfiesteria extract, Environ. Health Perspect., 115, 1023-1028. |
| --- | --- |

34)

Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for contact sensitisation by Pfiesteria extract, Environ. Health Perspect., 115, 1023-1028.

| 35) | OECD (1987), Acute Dermal Toxicity, OECD Guideline for Testing of Chemicals No 402, Paris, France. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

35)

OECD (1987), Acute Dermal Toxicity, OECD Guideline for Testing of Chemicals No 402, Paris, France. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

| 36) | ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences, Available at: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm] |
| --- | --- |

36)

ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences, Available at: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm]

| 37) | OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

37)

OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

1. papildinājums

Veiktspējas standarti, pēc kuriem vērtējamas ierosinātās līdzīgās vai modificētās metodes ādas sensibilizācijas testēšanai ar LLNA

IEVADS

| 1. | Veiktspējas standartu (PS) izstrādes mērķis ir izveidot pamatu, kuram pielīdzināt jaunas testēšanas metodes – gan aizsargātas (t. i., ar autortiesībām, tirdzniecības zīmēm, reģistrāciju), gan neaizsargātas –, lai noteiktu, vai konkrētajām testēšanas vajadzībām tās ir pietiekami pareizas un ticamas. Šos PS, kuru pamatā ir validētas un pieņemtas testēšanas metodes, var izmantot, lai izvērtētu, cik ticamas un pareizas ir citas, līdzīgas metodes (ikdienā dēvētas par me-too jeb atdarinājuma testiem), kuru pamatā ir līdzīgi zinātniski principi un ar kurām mēra vai prognozē tā paša veida bioloģisko vai toksisko iedarbību (14). |
| --- | --- |

1.

Veiktspējas standartu (PS) izstrādes mērķis ir izveidot pamatu, kuram pielīdzināt jaunas testēšanas metodes – gan aizsargātas (t. i., ar autortiesībām, tirdzniecības zīmēm, reģistrāciju), gan neaizsargātas –, lai noteiktu, vai konkrētajām testēšanas vajadzībām tās ir pietiekami pareizas un ticamas. Šos PS, kuru pamatā ir validētas un pieņemtas testēšanas metodes, var izmantot, lai izvērtētu, cik ticamas un pareizas ir citas, līdzīgas metodes (ikdienā dēvētas par me-too jeb atdarinājuma testiem), kuru pamatā ir līdzīgi zinātniski principi un ar kurām mēra vai prognozē tā paša veida bioloģisko vai toksisko iedarbību (14).

| 2. | Pirms pieņemt modificētas metodes (t. i., ierosinātos potenciālos uzlabojumus jau apstiprinātā testēšanas metodē), jāveic novērtējums, kurā jānosaka ierosināto izmaiņu ietekme uz testa veiktspēju un pakāpe, kādā šīs izmaiņas ietekmē informāciju, kas pieejama par citiem validēšanas procesa komponentiem. Atkarībā no ierosināto izmaiņu daudzuma un rakstura, datiem, ko tās ģenerē, un papildu dokumentācijas šīs metodes vai nu jāvalidē tādā procesā, kāds paredzēts jaunām testēšanas metodēm, vai (ja tas ir pamatoti) ierobežotā apjomā, izmantojot esošos PS, jānovērtē to ticamība un piemērotība (14). |
| --- | --- |

2.

Pirms pieņemt modificētas metodes (t. i., ierosinātos potenciālos uzlabojumus jau apstiprinātā testēšanas metodē), jāveic novērtējums, kurā jānosaka ierosināto izmaiņu ietekme uz testa veiktspēju un pakāpe, kādā šīs izmaiņas ietekmē informāciju, kas pieejama par citiem validēšanas procesa komponentiem. Atkarībā no ierosināto izmaiņu daudzuma un rakstura, datiem, ko tās ģenerē, un papildu dokumentācijas šīs metodes vai nu jāvalidē tādā procesā, kāds paredzēts jaunām testēšanas metodēm, vai (ja tas ir pamatoti) ierobežotā apjomā, izmantojot esošos PS, jānovērtē to ticamība un piemērotība (14).

| 3. | Izmantojot ķīmiskās vielas, kas aptver visu ādas reakcijas klasifikācijas LLNA skalu, jānosaka ticamība un precizitāte visām līdzīgajām vai modificētajām metodēm, kuras izmanto saskaņā ar šo TM. Lai novērstu dzīvnieku neattaisnotu izmantošanu, modeļu izstrādātājiem, pirms uzsākt validācijas pētījumus saskaņā ar šajā TM sniegtajiem PS un testēšanas vadlīnijām, stingri ieteicams konsultēties ar attiecīgajām iestādēm. |
| --- | --- |

3.

Izmantojot ķīmiskās vielas, kas aptver visu ādas reakcijas klasifikācijas LLNA skalu, jānosaka ticamība un precizitāte visām līdzīgajām vai modificētajām metodēm, kuras izmanto saskaņā ar šo TM. Lai novērstu dzīvnieku neattaisnotu izmantošanu, modeļu izstrādātājiem, pirms uzsākt validācijas pētījumus saskaņā ar šajā TM sniegtajiem PS un testēšanas vadlīnijām, stingri ieteicams konsultēties ar attiecīgajām iestādēm.

| 4. | Attiecībā uz līdzīgu vai modificētu LLNA versiju validitātes novērtēšanu šo PS pamatā ir ASV US-ICCVAM, Eiropas EC-ECVAM un Japānas JaCVAM harmonizētie PS (12). PS veidojošie elementi ir būtiskie testēšanas metodes komponenti, ieteicamās references vielas un pareizības un ticamības standarti, kas ierosinātajai metodei jāsasniedz vai jāpārsniedz. |
| --- | --- |

4.

Attiecībā uz līdzīgu vai modificētu LLNA versiju validitātes novērtēšanu šo PS pamatā ir ASV US-ICCVAM, Eiropas EC-ECVAM un Japānas JaCVAM harmonizētie PS (12). PS veidojošie elementi ir būtiskie testēšanas metodes komponenti, ieteicamās references vielas un pareizības un ticamības standarti, kas ierosinātajai metodei jāsasniedz vai jāpārsniedz.

I.   Testēšanas metodes būtiskie komponenti

| 5. | Lai nodrošinātu to, ka LLNA līdzīgā vai modificētā metode funkcionalitātes ziņā vai pēc noteikšanas mehānisma ir analoga LLNA un mēra to pašu bioloģisko iedarbību, testēšanas metodes protokolā jāiekļauj šādi komponenti:






  — | testējamā ķīmiskā viela topikāli jāaplicē uz abām peles ausīm, |
| --- | --- | --- |

5.

Lai nodrošinātu to, ka LLNA līdzīgā vai modificētā metode funkcionalitātes ziņā vai pēc noteikšanas mehānisma ir analoga LLNA un mēra to pašu bioloģisko iedarbību, testēšanas metodes protokolā jāiekļauj šādi komponenti:

—

testējamā ķīmiskā viela topikāli jāaplicē uz abām peles ausīm,

| — | limfocītu savairošanās jāmēra limfmezglos, kuri drenē testējamās ķīmiskās vielas aplicēšanas vietu, |
| --- | --- |

—

limfocītu savairošanās jāmēra limfmezglos, kuri drenē testējamās ķīmiskās vielas aplicēšanas vietu,

| — | limfocītu savairošanās jāmēra ādas sensibilizācijas indukcijas fāzē, |
| --- | --- |

—

limfocītu savairošanās jāmēra ādas sensibilizācijas indukcijas fāzē,

| — | testējamām vielām: lielākajai izraudzītajai devai jāatbilst augstākajai koncentrācijai, kura vēl nerada acīmredzamu sistēmisku toksicitāti un/vai pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu pelēm; pozitīvām references vielām: lielākajai devai jābūt vismaz tikpat lielai kā LLNA EC3 vērtībām atbilstošajām references vielām (skatīt 1. tabulu), vēl neradot sistēmisku toksicitāti un/vai pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu pelēm, |
| --- | --- |

—

testējamām vielām: lielākajai izraudzītajai devai jāatbilst augstākajai koncentrācijai, kura vēl nerada acīmredzamu sistēmisku toksicitāti un/vai pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu pelēm; pozitīvām references vielām: lielākajai devai jābūt vismaz tikpat lielai kā LLNA EC3 vērtībām atbilstošajām references vielām (skatīt 1. tabulu), vēl neradot sistēmisku toksicitāti un/vai pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu pelēm,

| — | katrā pētījumā jāparedz kontroles VC grupa un, attiecīgā gadījumā, arī vienlaicīga PC grupa, |
| --- | --- |

—

katrā pētījumā jāparedz kontroles VC grupa un, attiecīgā gadījumā, arī vienlaicīga PC grupa,

| — | jāizmanto vismaz četri dzīvnieki katrā devas grupā, |
| --- | --- |

—

jāizmanto vismaz četri dzīvnieki katrā devas grupā,

| — | drīkst vākt datus tiklab par individuāliem dzīvniekiem kā par dzīvnieku grupām. |
| --- | --- |

—

drīkst vākt datus tiklab par individuāliem dzīvniekiem kā par dzīvnieku grupām.

Ja minētie kritēriji nav pilnībā izpildīti, šos PS nevar izmantot līdzīgas vai modificētas metodes validēšanai.

II.   References vielu obligātais minimums

| 6. | ASV US-ICCVAM, Eiropas EC-ECVAM un Japānas JaCVAM harmonizētajos PS (12) identificētas 18 obligāti izmantojamas references vielas un 4 fakultatīvas references vielas (t. i., vielas, kas LLNA uzrāda šķietami pozitīvu vai šķietami negatīvu rezultātu salīdzinājumā ar cilvēka un jūrascūciņu materiāla testēšanas rezultātiem (B.6; ESAO 406. testēšanas vadlīnijas) (13) un tāpēc dod iespēju demonstrēt LLNA līdzvērtīgu vai par to labāku veiktspēju), un tās visas ir iekļautas LLNA PS. Minēto ķīmisko vielu identificēšanai izmantotie atlases kritēriji ir šādi:






  — | sarakstā iekļautās references vielas pārstāv tādu veidu vielas, kurām parasti testē ādas sensibilizācijas potenciālu, un reakciju diapazonu, ko ir iespējams izmērīt vai prognozēt ar LLNA, |
| --- | --- | --- |

6.

ASV US-ICCVAM, Eiropas EC-ECVAM un Japānas JaCVAM harmonizētajos PS (12) identificētas 18 obligāti izmantojamas references vielas un 4 fakultatīvas references vielas (t. i., vielas, kas LLNA uzrāda šķietami pozitīvu vai šķietami negatīvu rezultātu salīdzinājumā ar cilvēka un jūrascūciņu materiāla testēšanas rezultātiem (B.6; ESAO 406. testēšanas vadlīnijas) (13) un tāpēc dod iespēju demonstrēt LLNA līdzvērtīgu vai par to labāku veiktspēju), un tās visas ir iekļautas LLNA PS. Minēto ķīmisko vielu identificēšanai izmantotie atlases kritēriji ir šādi:

—

sarakstā iekļautās references vielas pārstāv tādu veidu vielas, kurām parasti testē ādas sensibilizācijas potenciālu, un reakciju diapazonu, ko ir iespējams izmērīt vai prognozēt ar LLNA,

| — | tās ir ar precīzi noteiktu ķīmisko struktūru, |
| --- | --- |

—

tās ir ar precīzi noteiktu ķīmisko struktūru,

| — | par katru no šīm vielām ir pieejami LLNA dati no jūrascūciņu testa (B.6; ESAO 406. testēšanas vadlīnijas) (13) un, attiecīgā gadījumā, cilvēka materiāla testēšanas rezultāti, |
| --- | --- |

—

par katru no šīm vielām ir pieejami LLNA dati no jūrascūciņu testa (B.6; ESAO 406. testēšanas vadlīnijas) (13) un, attiecīgā gadījumā, cilvēka materiāla testēšanas rezultāti,

| — | vielas ir brīvi pieejamas no komerciāliem avotiem. |
| --- | --- |

—

vielas ir brīvi pieejamas no komerciāliem avotiem.

Ieteicamās references vielas uzskaitītas 1. tabulā. Pētījumi, kuros izmantotas ieteiktās references vielas, jāvērtē, izmantojot tām atbilstošo 1. tabulā norādīto nesēju. Ja tabulā norādīta viela nav pieejama, ar pienācīgu pamatojumu drīkst izmantot citas vielas, kas atbilst iepriekš minētajiem atlases kritērijiem.

1.   tabula

LLNA PS ieteicamās references vielas

| Nr. | Ķīmiskā viela (3) | CAS Nr. | Veids | Veh (4) | EC3 % (5) | N (6) | 0,5x – 2,0x EC3 | Faktiskais EC3 diapazons | LLNA vs. jūrasc. | LLNA vs. cilv. |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| 1 | 5-hlor-2-metil-4-izotiazolīn-3-ons (CMI)/2-metil-4-izotiazolīn-3-ons (MI) (7) | 26172-55-4/2682-20-4 | Liq | DMF | 0,009 | 1 | 0,0045-0,018 | NC | +/+ | +/+ |
| 2 | DNCB | 97-00-7 | Sol | AOO | 0,049 | 15 | 0,025-0,099 | 0,02-0,094 | +/+ | +/+ |
| 3 | 4-fenilēndiamīns | 106-50-3 | Sol | AOO | 0,11 | 6 | 0,055-0,22 | 0,07-0,16 | +/+ | +/+ |
| 4 | Kobalta hlorīds | 7646-79-9 | Sol | DMSO | 0,6 | 2 | 0,3-1,2 | 0,4-0,8 | +/+ | +/+ |
| 5 | Izoeigenols | 97-54-1 | Liq | AOO | 1,5 | 47 | 0,77-3,1 | 0,5-3,3 | +/+ | +/+ |
| 6 | 2-merkaptobenztiazols | 149-30-4 | Sol | DMF | 1,7 | 1 | 0,85-3,4 | NC | +/+ | +/+ |
| 7 | Citrāls | 5392-40-5 | Liq | AOO | 9,2 | 6 | 4,6-18,3 | 5,1-13 | +/+ | +/+ |
| 8 | HCA | 101-86-0 | Liq | AOO | 9,7 | 21 | 4,8-19,5 | 4,4-14,7 | +/+ | +/+ |
| 9 | Eigenols | 97-53-0 | Liq | AOO | 10,1 | 11 | 5,05-20,2 | 4,9-15 | +/+ | +/+ |
| 10 | Fenilbenzoāts | 93-99-2 | Sol | AOO | 13,6 | 3 | 6,8-27,2 | 1,2-20 | +/+ | +/+ |
| 11 | Kanēļskābes spirts | 104-54-1 | Sol | AOO | 21 | 1 | 10,5-42 | NC | +/+ | +/+ |
| 12 | Urīnvielas imidazolidinils | 39236-46-9 | Sol | DMF | 24 | 1 | 12-48 | NC | +/+ | +/+ |
| 13 | Metilmetakrilāts | 80-62-6 | Liq | AOO | 90 | 1 | 45-100 | NC | +/+ | +/+ |
| 14 | Hlorbenzols | 108-90-7 | Liq | AOO | 25 | 1 | NA | NA | –/– | –/ (1) |
| 15 | Izopropanols | 67-63-0 | Liq | AOO | 50 | 1 | NA | NA | –/– | –/+ |
| 16 | Pienskābe | 50-21-5 | Liq | DMSO | 25 | 1 | NA | NA | –/– | –/ (1) |
| 17 | Metilsalicilāts | 119-36-8 | Liq | AOO | 20 | 9 | NA | NA | –/– | –/– |
| 18 | Salicilskābe | 69-72-7 | Sol | AOO | 25 | 1 | NA | NA | –/– | –/– |
| Vielas, kuru lietojums par LLNA labākas veiktspējas demonstrēšanai ir fakultatīvs |
| 19 | Nātrija laurilsulfāts | 151-21-3 | Sol | DMF | 8,1 | 5 | 4,05-16,2 | 1,5-17,1 | +/– | +/– |
| 20 | Etilēnglikola dimetakrilāts | 97-90-5 | Liq | MEK | 28 | 1 | 14-56 | NC | +/– | +/+ |
| 21 | Ksilols | 1330-20-7 | Liq | AOO | 95,8 | 1 | 47,9-100 | NC | +/ (2) | +/– |
| 22 | Niķeļa hlorīds | 7718-54-9 | Sol | DMSO | 5 | 2 | NA | NA | –/+ | –/+ |
| Saīsinājumi: AOO = acetons/olīveļļa (4:1, tilp./tilp.); CAS Nr. = Ķīmiskā informatīvā dienesta [Chemical Abstracts Service] numurs; DMF = N,N-dimetilformamīds; DMSO = dimetilsulfoksīds; DNCB = 2,4-dinitrohlorbenzols; EC3 = koncentrācija, kurā stimulācijas indeksa vērtība ir 3; GP = jūrascūciņu testa rezultāts (B.6; ESAO 406. testēšanas vadlīnijas) (13); HCA = heksilkanēļskābes aldehīds; Liq = šķidrums; LLNA = peļu lokālo limfmezglu noteikšanas rezultāts (B.42; ESAO 429. testēšanas vadlīnijas) (1); MEK = metiletilketons; NA = nepiemēro, jo stimulācijas indekss < 3; NC = nav aprēķināts, jo dati pieejami tikai no viena pētījuma; Sol = cieta viela; Veh = nesējs. |

Nr.

Ķīmiskā viela (3)

CAS Nr.

Veids

Veh (4)

EC3 % (5)

N (6)

0,5x – 2,0x EC3

Faktiskais EC3 diapazons

LLNA vs. jūrasc.

LLNA vs. cilv.

1

5-hlor-2-metil-4-izotiazolīn-3-ons (CMI)/2-metil-4-izotiazolīn-3-ons (MI) (7)

26172-55-4/2682-20-4

Liq

DMF

0,009

1

0,0045-0,018

NC

+/+

+/+

2

DNCB

97-00-7

Sol

AOO

0,049

15

0,025-0,099

0,02-0,094

+/+

+/+

3

4-fenilēndiamīns

106-50-3

Sol

AOO

0,11

6

0,055-0,22

0,07-0,16

+/+

+/+

4

Kobalta hlorīds

7646-79-9

Sol

DMSO

0,6

2

0,3-1,2

0,4-0,8

+/+

+/+

5

Izoeigenols

97-54-1

Liq

AOO

1,5

47

0,77-3,1

0,5-3,3

+/+

+/+

6

2-merkaptobenztiazols

149-30-4

Sol

DMF

1,7

1

0,85-3,4

NC

+/+

+/+

7

Citrāls

5392-40-5

Liq

AOO

9,2

6

4,6-18,3

5,1-13

+/+

+/+

8

HCA

101-86-0

Liq

AOO

9,7

21

4,8-19,5

4,4-14,7

+/+

+/+

9

Eigenols

97-53-0

Liq

AOO

10,1

11

5,05-20,2

4,9-15

+/+

+/+

10

Fenilbenzoāts

93-99-2

Sol

AOO

13,6

3

6,8-27,2

1,2-20

+/+

+/+

11

Kanēļskābes spirts

104-54-1

Sol

AOO

21

1

10,5-42

NC

+/+

+/+

12

Urīnvielas imidazolidinils

39236-46-9

Sol

DMF

24

1

12-48

NC

+/+

+/+

13

Metilmetakrilāts

80-62-6

Liq

AOO

90

1

45-100

NC

+/+

+/+

14

Hlorbenzols

108-90-7

Liq

AOO

25

1

NA

NA

–/–

–/ (1)

15

Izopropanols

67-63-0

Liq

AOO

50

1

NA

NA

–/–

–/+

16

Pienskābe

50-21-5

Liq

DMSO

25

1

NA

NA

–/–

–/ (1)

17

Metilsalicilāts

119-36-8

Liq

AOO

20

9

NA

NA

–/–

–/–

18

Salicilskābe

69-72-7

Sol

AOO

25

1

NA

NA

–/–

–/–

Vielas, kuru lietojums par LLNA labākas veiktspējas demonstrēšanai ir fakultatīvs

19

Nātrija laurilsulfāts

151-21-3

Sol

DMF

8,1

5

4,05-16,2

1,5-17,1

+/–

+/–

20

Etilēnglikola dimetakrilāts

97-90-5

Liq

MEK

28

1

14-56

NC

+/–

+/+

21

Ksilols

1330-20-7

Liq

AOO

95,8

1

47,9-100

NC

+/ (2)

+/–

22

Niķeļa hlorīds

7718-54-9

Sol

DMSO

5

2

NA

NA

–/+

–/+

Saīsinājumi: AOO = acetons/olīveļļa (4:1, tilp./tilp.); CAS Nr. = Ķīmiskā informatīvā dienesta [Chemical Abstracts Service] numurs; DMF = N,N-dimetilformamīds; DMSO = dimetilsulfoksīds; DNCB = 2,4-dinitrohlorbenzols; EC3 = koncentrācija, kurā stimulācijas indeksa vērtība ir 3; GP = jūrascūciņu testa rezultāts (B.6; ESAO 406. testēšanas vadlīnijas) (13); HCA = heksilkanēļskābes aldehīds; Liq = šķidrums; LLNA = peļu lokālo limfmezglu noteikšanas rezultāts (B.42; ESAO 429. testēšanas vadlīnijas) (1); MEK = metiletilketons; NA = nepiemēro, jo stimulācijas indekss < 3; NC = nav aprēķināts, jo dati pieejami tikai no viena pētījuma; Sol = cieta viela; Veh = nesējs.

III.   Definētie ticamības un pareizības standarti

| 7. | Vērtējot ar 18 obligāti izmantojamajām references vielām, līdzīgas vai modificētas LLNA metodes pareizībai jābūt tādai pašai, kā paredz LLNA PS, vai lielākai. Jaunajai vai modificētajai metodei jānodrošina pareiza klasifikācija “jā/nē” līmenī. Tomēr ar jauno vai modificēto metodi var neizdoties pareizi klasificēt visas obligāti izmantojamās references vielas. Ja, piemēram, nepareizi klasificēts kāds no vājajiem sensibilizatoriem, bet tiek sniegts nepareizās klasifikācijas izskaidrojums un attiecīgi papildu dati (piemēram, testēšanas rezultāti, kuros pareizi klasificētas citas vielas, kam piemītošās fizikālās, ķīmiskās un sensibilizējošās īpašības ir līdzīgas nepareizi klasificētās references vielas īpašībām), to var uzskatīt par līdzvērtīgas veiktspējas pierādījumu. Šādos apstākļos jaunās vai modificētās LLNA testēšanas metodes validācijas statusu novērtē katrā gadījumā atsevišķi. |
| --- | --- |

7.

Vērtējot ar 18 obligāti izmantojamajām references vielām, līdzīgas vai modificētas LLNA metodes pareizībai jābūt tādai pašai, kā paredz LLNA PS, vai lielākai. Jaunajai vai modificētajai metodei jānodrošina pareiza klasifikācija “jā/nē” līmenī. Tomēr ar jauno vai modificēto metodi var neizdoties pareizi klasificēt visas obligāti izmantojamās references vielas. Ja, piemēram, nepareizi klasificēts kāds no vājajiem sensibilizatoriem, bet tiek sniegts nepareizās klasifikācijas izskaidrojums un attiecīgi papildu dati (piemēram, testēšanas rezultāti, kuros pareizi klasificētas citas vielas, kam piemītošās fizikālās, ķīmiskās un sensibilizējošās īpašības ir līdzīgas nepareizi klasificētās references vielas īpašībām), to var uzskatīt par līdzvērtīgas veiktspējas pierādījumu. Šādos apstākļos jaunās vai modificētās LLNA testēšanas metodes validācijas statusu novērtē katrā gadījumā atsevišķi.

Iekšlaboratorijas reproducējamība

| 8. | Lai noteiktu iekšlaboratorijas reproducējamības pakāpi, jaunā vai modificētā LLNA metode jāvērtē, izmantojot sensibilizējošu vielu, kura ar LLNA jau ir labi izpētīta. Tāpēc LLNA PS pamatā ir rezultātu variācija atkārtotos testos ar heksilkanēļskābes aldehīdu (HCA). Lai novērtētu iekšlaboratorijas reproducējamību, novērtētā koncentrācijas sliekšņa (ECt) vērtības ar HCA jāiegūst četrās atsevišķās testēšanas reizēs, testējot ar vismaz nedēļu ilgiem starplaikiem. Iekšlaboratorijas reproducējamības pakāpe ir pieņemama tad, ja laboratorija katrā HCA testēšanā iegūst ECt vērtības robežās no 5 % līdz 20 %, kas atbilst diapazonā 0,5–2,0 esoša skaitļa reizinājumam ar vidējo EC3 vērtību, kas attiecībā uz HCA (10 %) norādīta LLNA (skatīt 1. tabulu). |
| --- | --- |

8.

Lai noteiktu iekšlaboratorijas reproducējamības pakāpi, jaunā vai modificētā LLNA metode jāvērtē, izmantojot sensibilizējošu vielu, kura ar LLNA jau ir labi izpētīta. Tāpēc LLNA PS pamatā ir rezultātu variācija atkārtotos testos ar heksilkanēļskābes aldehīdu (HCA). Lai novērtētu iekšlaboratorijas reproducējamību, novērtētā koncentrācijas sliekšņa (ECt) vērtības ar HCA jāiegūst četrās atsevišķās testēšanas reizēs, testējot ar vismaz nedēļu ilgiem starplaikiem. Iekšlaboratorijas reproducējamības pakāpe ir pieņemama tad, ja laboratorija katrā HCA testēšanā iegūst ECt vērtības robežās no 5 % līdz 20 %, kas atbilst diapazonā 0,5–2,0 esoša skaitļa reizinājumam ar vidējo EC3 vērtību, kas attiecībā uz HCA (10 %) norādīta LLNA (skatīt 1. tabulu).

Starplaboratoriju reproducējamība

| 9. | Starplaboratoriju reproducējamības pakāpi jaunai vai modificētai LLNA metodei jāvērtē, izmantojot divas sensibilizējošas vielas, kuras ar LLNA jau ir labi izpētītas. LLNA PS pamatā ir rezultātu variācija testos ar HCA un 2,4-dinitrohlorbenzolu (DNCB) dažādās laboratorijās. ECt vērtības jāiegūst neatkarīgā veidā un no viena pētījuma, kas veikts vismaz trijās atsevišķās laboratorijās. Starplaboratoriju reproducējamības pakāpe ir pieņemama tad, ja katras laboratorijas iegūtās ECt vērtības ir no 5 % līdz 20 % HCA gadījumā un 0,025 % līdz 0,1 % DNCB gadījumā, kas atbilst diapazonā 0,5–2,0 esoša skaitļa reizinājumam ar vidējo EC3 vērtību, kas attiecībā uz HCA (10 %) un DNCB (0,05 %) norādīta LLNA (skatīt 1. tabulu). |
| --- | --- |

9.

Starplaboratoriju reproducējamības pakāpi jaunai vai modificētai LLNA metodei jāvērtē, izmantojot divas sensibilizējošas vielas, kuras ar LLNA jau ir labi izpētītas. LLNA PS pamatā ir rezultātu variācija testos ar HCA un 2,4-dinitrohlorbenzolu (DNCB) dažādās laboratorijās. ECt vērtības jāiegūst neatkarīgā veidā un no viena pētījuma, kas veikts vismaz trijās atsevišķās laboratorijās. Starplaboratoriju reproducējamības pakāpe ir pieņemama tad, ja katras laboratorijas iegūtās ECt vērtības ir no 5 % līdz 20 % HCA gadījumā un 0,025 % līdz 0,1 % DNCB gadījumā, kas atbilst diapazonā 0,5–2,0 esoša skaitļa reizinājumam ar vidējo EC3 vērtību, kas attiecībā uz HCA (10 %) un DNCB (0,05 %) norādīta LLNA (skatīt 1. tabulu).

2. papildinājums

Definīcijas

Pareizība: pēc testēšanas metodes iegūto mērījumu rezultātu sakritības pakāpe ar pieņemtajām references vērtībām. Tas ir testēšanas metodes veiktspējas raksturlielums un viens no tās piemērotības aspektiem. Šo terminu bieži izmanto “atbilstības” vietā, ar to apzīmējot pēc testēšanas metodes iegūto pareizo rezultātu daļu (14).

Salīdzināšanas viela: sensibilizējoša vai nesensibilizējoša viela, ko izmanto par standartu salīdzināšanai ar testējamo vielu. Salīdzināšanas vielai ir jābūt: (i) pastāvīgam un drošam ieguves avotam; (ii) struktūras un funkciju līdzībai ar testējamo vielu klases vielām; (iii) zināmām fizikāli ķīmiskajām īpašībām; (iv) papildu datiem par zināmajiem iedarbības veidiem; (v) vielas zināmajam iedarbības stiprumam jāatbilst vēlamās reakcijas intensitātes diapazonam.

Novērtētais koncentrācijas slieksnis (ECt): novērtētā zemākā testējamās vielas koncentrācija, kurā stimulācijas indekss liecina par pozitīvu reakciju.

Novērtētā koncentrācija-3 (EC3): novērtētā testējamās vielas koncentrācija, kurā stimulācijas indekss ir 3.

Šķietams negatīvs: testējamā viela, kurai ar testēšanas metodi kļūdaini identificēta negatīva vai neaktīva reakcija, lai gan faktiski tā ir pozitīva vai aktīva.

Šķietams pozitīvs: testējamā viela, kurai ar testēšanas metodi kļūdaini identificēta pozitīva vai aktīva reakcija, lai gan faktiski tā ir negatīva vai neaktīva.

Bīstamība: potenciālā spēja kaitēt veselībai vai videi. Kaitīgā iedarbība kļūst nosakāma tikai tad, ja iedarbības intensitāte ir pietiekami liela.

Starplaboratoriju reproducējamība: lielums, kas raksturo, kādā mērā vairākas kvalificētas laboratorijas spēj iegūt kvalitatīvi un kvantitatīvi līdzīgus rezultātus, ja tās izmanto vienu un to pašu protokolu un vienas un tās pašas testējamās vielas. Starplaboratoriju reproducējamību (saukta arī par interlaboratoriju reproducējamību) nosaka prevalidēšanas un validēšanas procesā, un šis lielums rāda, cik lielā mērā testēšanu vienlīdz sekmīgi iespējams veikt dažādās laboratorijās (14).

Iekšlaboratorijas reproducējamība: lielums, kas raksturo, kādā mērā vienā laboratorijā strādājoši kvalificēti darbinieki spēj sekmīgi atkārtot iepriekš iegūtus rezultātus, ja to pašu protokolu izmanto citā laikā. Saukts arī par intralaboratoriju reproducējamību (14).

Atdarinājuma (me-too) tests: sadzīvisks apzīmējums testēšanas metodei, kura ir noteikšanas mehānisma vai funkcionalitātes ziņā līdzīga validētai un pieņemtai testēšanas references metodei. Šāda testēšanas metode varētu kandidēt uz vēlāku validēšanu. Brīvi aizstājama ar tai līdzīgu testēšanas metodi (14).

Galējība jeb rupja kļūda: novērojums, kuru raksturo izteikta novirze no pārējām vērtībām populācijas paraugā, kurš atlasīts pēc nejaušības principa.

Veiktspējas standarti (PS): saskaņā ar validētu testēšanas metodi noteikti standarti, pēc kuriem novērtē funkcionalitātes ziņā vai pēc noteikšanas mehānisma līdzīgu testēšanas metožu salīdzināmību. Šeit iekļauti: i) testēšanas metodes būtiskie komponenti; ii) obligāti izmantojamās references vielas, kas izraudzītas no tām ķīmiskajām vielām, kuras izmantotas, lai pierādītu attiecīgās validētās testēšanas metodes veiktspējas pieņemamību; iii) līdzīgie pareizības un ticamības līmeņi, kuru pamatā ir attiecīgajai validētajai testēšanas metodei noteiktie konkrētie līmeņi un kuru nodrošināšanu ar novērtējamo testēšanas metodi var pierādīt ar obligāti izmantojamajām references vielām (14).

Aizsargāta testēšanas metode: testēšanas metode, ar kuru saistīto ražošanu un izplatīšanu ierobežo patentu tiesības, autortiesības, tirdzniecības zīmes u. c.

Kvalitātes nodrošināšana: pārvaldības process, kurā laboratorijas testēšanas standartu, prasību un pierakstu uzturēšanas procedūru ievērošanu un datu pārneses pareizību novērtē no testēšanas veicējiem neatkarīgas personas.

References vielas: ķīmiskas vielas, kas izraudzītas izmantošanai validēšanas procesā un kuru reakcija in vitro vai in vivo testēšanas standartsistēmā vai pētāmajās sugās ir jau zināma. Šīm ķīmiskajām vielām jābūt reprezentatīvām attiecībā uz to ķīmisko vielu klasi, kuras testē ar attiecīgo metodi, un jāaptver testējamo ķīmisko vielu iespējamo reakciju diapazons (izteikta reakcija, vāja reakcija, nav reakcijas). Dažādos validēšanas procesa posmos var būt vajadzīgas dažādas references vielas; tas pats attiecas uz testēšanas metodēm un to lietojumiem (14).

Piemērotība: testa raksturojums no tā lietderīguma viedokļa; vai tas ir piemērots un izmantojams kādam konkrētam mērķim. Pakāpe, kādā ar minēto testu iespējams pareizi izmērīt vai prognozēt pētāmo bioloģisko ietekmi. Piemērotība ietver arī testēšanas metodes pareizības (atbilstības) aspektu (14).

Ticamība: parametrs, ar kuru mēra pakāpi, kādā tajā pašā vai citā laboratorijā ilgākā laikā, izmantojot to pašu protokolu, var iegūt reproducējamus rezultātus. To novērtē, aprēķinot iekšlaboratorijas un starplaboratoriju reproducējamību (14).

Ādas sensibilizācija: imunoloģisks process, kurš norisinās, ja uz uzņemtspējīgu organismu ārēji iedarbojas stimulējošs ķīmisks alergēns, kas izraisa ādas imūnreakciju, kuras rezultāts var būt kontaktsensibilizācija.

Stimulācijas indekss (SI): vērtība, ko aprēķina, lai novērtētu testējamai vielai piemītošo ādas sensibilizācijas potenciālu; to izsaka kā attiecību starp progresiju grupās, kas saņēmušas pētāmo vielu, un progresiju kontroles grupā, kas saņēmusi tikai nesēju.

Testējamā viela (arī testējamā ķīmiskā viela): viela vai vielu maisījums, kuru testē ar šo TM.

Validēta testēšanas metode: testēšanas metode, par kuru ir pabeigti validācijas pētījumi, lai noteiktu metodes piemērotību noteiktam nolūkam (tostarp pareizību) un ticamību. Jāievēro, ka validētas testēšanas metodes veiktspēja pareizības un ticamības ziņā var nebūt pietiekama, lai to izmantotu paredzētajam nolūkam (14).

| 2) | pielikuma B.46. nodaļu aizstāj ar šādu:
  “B.46.   ĀDAS KAIRINĀJUMA NOTEIKŠANA AR CILVĒKA EPIDERMAS REKONSTRUKCIJAS MODEĻA IN VITRO TESTU

  IEVADS






  1. | Ādas kairinājums ir atgriezeniska audu bojājuma veidošanās ādā ne ilgāk kā 4 stundas pēc testējamās vielas aplicēšanas [saskaņā ar Apvienoto Nāciju Organizācijas (ANO) vielu klasificēšanas un marķēšanas globāli harmonizēto sistēmu (GHS) un Eiropas Parlamenta un Padomes 2008. gada 16. decembra Regulu (EK) Nr. 1272/2008 par vielu un maisījumu klasificēšanu, marķēšanu un iepakošanu (1) (3)]. Šajā testēšanas metodē (TM) aprakstīta in vitro noteikšanas procedūra, kuru var izmantot kairinošu ķīmisku vielu (substanču un maisījumu) bīstamības identificēšanai saskaņā ar 2. kategoriju ANO GHS un ES CLP regulā (1) (2) (3). ES un citos reģionos, kas nav pieņēmuši fakultatīvo ANO GHS 3. kategoriju (vājš kairinātājs), šo TM var izmantot arī neklasificētu ķīmisko vielu identificēšanai, t. i., ANO GHS un ES CLP“neklasificētām” vielām (1) (3). Šo TM var izmantot kā atsevišķu aizstājējtestu, lai noteiktu ādas kairināmību ar ķīmiskām vielām in vivo ādas kairināmības testēšanā ar pakāpeniskas testēšanas stratēģiju (4; šā pielikuma B.4. nodaļa). |
| --- | --- | --- |

2)

pielikuma B.46. nodaļu aizstāj ar šādu:

“B.46.   ĀDAS KAIRINĀJUMA NOTEIKŠANA AR CILVĒKA EPIDERMAS REKONSTRUKCIJAS MODEĻA IN VITRO TESTU

B.46.

ĀDAS KAIRINĀJUMA NOTEIKŠANA AR CILVĒKA EPIDERMAS REKONSTRUKCIJAS MODEĻA IN VITRO

IEVADS

1.

Ādas kairinājums ir atgriezeniska audu bojājuma veidošanās ādā ne ilgāk kā 4 stundas pēc testējamās vielas aplicēšanas [saskaņā ar Apvienoto Nāciju Organizācijas (ANO) vielu klasificēšanas un marķēšanas globāli harmonizēto sistēmu (GHS) un Eiropas Parlamenta un Padomes 2008. gada 16. decembra Regulu (EK) Nr. 1272/2008 par vielu un maisījumu klasificēšanu, marķēšanu un iepakošanu (1) (3)]. Šajā testēšanas metodē (TM) aprakstīta in vitro noteikšanas procedūra, kuru var izmantot kairinošu ķīmisku vielu (substanču un maisījumu) bīstamības identificēšanai saskaņā ar 2. kategoriju ANO GHS un ES CLP regulā (1) (2) (3). ES un citos reģionos, kas nav pieņēmuši fakultatīvo ANO GHS 3. kategoriju (vājš kairinātājs), šo TM var izmantot arī neklasificētu ķīmisko vielu identificēšanai, t. i., ANO GHS un ES CLP“neklasificētām” vielām (1) (3). Šo TM var izmantot kā atsevišķu aizstājējtestu, lai noteiktu ādas kairināmību ar ķīmiskām vielām in vivo ādas kairināmības testēšanā ar pakāpeniskas testēšanas stratēģiju (4; šā pielikuma B.4. nodaļa).

in vitro

CLP

CLP

in vivo

| 2. | Ādas kairinājuma novērtēšanai parasti veic laboratorijas izmēģinājumus ar dzīvniekiem [ESAO 404. testēšanas vadlīnijas; šā pielikuma B.4. nodaļa] (4). Ņemot vērā dzīvnieku labturības apsvērumus, 2004. gadā pārskatīja B.4. metodi, ar ko nosaka ādas kairinājumu/kodīgu jeb korozīvu iedarbību uz ādu pēc pakāpeniskas testēšanas stratēģijas, izmantojot validētas in vitro vai ex vivo metodes un tādā veidā neradot dzīvniekiem sāpes un ciešanas. Trīs validētas in vitro testēšanas metodes ir pieņemtas kā ESAO 430., 431. un 435. testēšanas vadlīnijas (5) (6) (7) un divas no tām kā šā pielikuma B.40. un B.40.a nodaļas, kas izmantojamas korozīvās iedarbības noteikšanai ar pakāpeniskas testēšanas stratēģiju, kā paredz B.4 un ESAO 404. testēšanas vadlīnijas (4). |
| --- | --- |

2.

Ādas kairinājuma novērtēšanai parasti veic laboratorijas izmēģinājumus ar dzīvniekiem [ESAO 404. testēšanas vadlīnijas; šā pielikuma B.4. nodaļa] (4). Ņemot vērā dzīvnieku labturības apsvērumus, 2004. gadā pārskatīja B.4. metodi, ar ko nosaka ādas kairinājumu/kodīgu jeb korozīvu iedarbību uz ādu pēc pakāpeniskas testēšanas stratēģijas, izmantojot validētas in vitro vai ex vivo metodes un tādā veidā neradot dzīvniekiem sāpes un ciešanas. Trīs validētas in vitro testēšanas metodes ir pieņemtas kā ESAO 430., 431. un 435. testēšanas vadlīnijas (5) (6) (7) un divas no tām kā šā pielikuma B.40. un B.40.a nodaļas, kas izmantojamas korozīvās iedarbības noteikšanai ar pakāpeniskas testēšanas stratēģiju, kā paredz B.4 un ESAO 404. testēšanas vadlīnijas (4).

in vitro

ex vivo

in vitro

| 3. | Šī TM ir par cilvēka veselības beigu punktam atbilstošo ādas kairinājumu. Šajā TM izmanto cilvēka epidermas rekonstrukcijas modeļus (RhE) (kuriem par šūnu avotu izmanto nepārveidotus cilvēka epidermas keratinocītus, ādai reprezentatīvu audu un citoloģisko arhitektūru), kuru bioķīmiskās un fizioloģiskās īpašības kopumā ir ļoti līdzīgas cilvēka ādas virsējās daļas, t. i., epidermas, īpašībām. Šajā TM ietverti arī veiktspējas standarti (PS) (2. papildinājums), kas ļauj novērtēt līdzīgas un modificētas RhE tipa metodes, kuras izstrādājusi EC-ECVAM (8) saskaņā ar ESAO vadlīniju dokumentu Nr. 34 (9). |
| --- | --- |

3.

Šī TM ir par cilvēka veselības beigu punktam atbilstošo ādas kairinājumu. Šajā TM izmanto cilvēka epidermas rekonstrukcijas modeļus (RhE) (kuriem par šūnu avotu izmanto nepārveidotus cilvēka epidermas keratinocītus, ādai reprezentatīvu audu un citoloģisko arhitektūru), kuru bioķīmiskās un fizioloģiskās īpašības kopumā ir ļoti līdzīgas cilvēka ādas virsējās daļas, t. i., epidermas, īpašībām. Šajā TM ietverti arī veiktspējas standarti (PS) (2. papildinājums), kas ļauj novērtēt līdzīgas un modificētas RhE tipa metodes, kuras izstrādājusi EC-ECVAM (8) saskaņā ar ESAO vadlīniju dokumentu Nr. 34 (9).

PS

EC-ECVAM

| 4. | Eksistē trīs validētas metodes, kuras līdzinās šai TM. Prevalidēšanas, optimizēšanas un validēšanas pētījumi jau pabeigti in vitro metodei (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20), kurā izmanto RhE modeli; komerciāli tā pieejama ar nosaukumu EpiSkinTM (validēta references metode – VRM). Divas pārējās komerciāli pieejamās in vitro ādas kairinājuma RhE metodes, validējot ar PS (21), uzrāda VRM līdzīgus rezultātus; tās ir EpiDermTM SIT (EPI-200) un SkinEthicTM RhE metode (22). |
| --- | --- |

4.

Eksistē trīs validētas metodes, kuras līdzinās šai TM. Prevalidēšanas, optimizēšanas un validēšanas pētījumi jau pabeigti in vitro metodei (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20), kurā izmanto RhE modeli; komerciāli tā pieejama ar nosaukumu EpiSkinTM (validēta references metode – VRM). Divas pārējās komerciāli pieejamās in vitro ādas kairinājuma RhE metodes, validējot ar PS (21), uzrāda VRM līdzīgus rezultātus; tās ir EpiDermTM SIT (EPI-200) un SkinEthicTM RhE metode (22).

in vitro

TM

in vitro

PS

TM

TM

| 5. | Pirms tādu ierosinātu līdzīgu vai modificētu in vitro RhE metožu, kas nav VRM, EpiDermTM SIT (EPI-200) vai SkinEthicTM RhE metode, izmantošanas regulatīviem mērķiem ir jānosaka šādu metožu ticamība, piemērotība (pareizība) un ierosinātā izmantojuma limiti, tādējādi nodrošinot, ka attiecīgo metodi var uzskatīt par līdzīgu VRM atbilstīgi PS prasībām, kas noteiktas šajā TM (2. papildinājums). Pirms līdzīgas vai modificētas in vitro RhE metodes izstrādes un validēšanas un iesniegšanas regulatīvai apstiprināšanai (23) turklāt ieteicams iepazīties ar ESAO paskaidrojošo pamatdokumentu par in vitro ādas kairinājuma testēšanu. |
| --- | --- |

5.

Pirms tādu ierosinātu līdzīgu vai modificētu in vitro RhE metožu, kas nav VRM, EpiDermTM SIT (EPI-200) vai SkinEthicTM RhE metode, izmantošanas regulatīviem mērķiem ir jānosaka šādu metožu ticamība, piemērotība (pareizība) un ierosinātā izmantojuma limiti, tādējādi nodrošinot, ka attiecīgo metodi var uzskatīt par līdzīgu VRM atbilstīgi PS prasībām, kas noteiktas šajā TM (2. papildinājums). Pirms līdzīgas vai modificētas in vitro RhE metodes izstrādes un validēšanas un iesniegšanas regulatīvai apstiprināšanai (23) turklāt ieteicams iepazīties ar ESAO paskaidrojošo pamatdokumentu par in vitro ādas kairinājuma testēšanu.

in vitro

TM

TM

PS

in vitro

in vitro

DEFINĪCIJAS

| 6. | Definīcijas skatīt 1. papildinājumā. |
| --- | --- |

6.

Definīcijas skatīt 1. papildinājumā.

SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI UN IEROBEŽOJUMI

| 7. | Saskaņā ar validācijas pētījumu (16) šīs TM iespējas ir ierobežotas tādā ziņā, ka ar šo metodi nevar ķīmiskās vielas klasificēt kā fakultatīvās ANO GHS 3. kategorijas vielas (vāji kairinātāji) (1). Ja metodi izmanto kā daļēju aizstājējtestu, var būt jāveic turpmāka in vivo testēšana, lai pilnībā aprakstītu vielas spēju izraisīt ādas kairinājumu (4; šā pielikuma B.4. nodaļa). Ir atzīts, ka cilvēka ādas izmantošanai jāatbilst nacionālām un starptautiskām ētiskajām normām un nosacījumiem. |
| --- | --- |

7.

Saskaņā ar validācijas pētījumu (16) šīs TM iespējas ir ierobežotas tādā ziņā, ka ar šo metodi nevar ķīmiskās vielas klasificēt kā fakultatīvās ANO GHS 3. kategorijas vielas (vāji kairinātāji) (1). Ja metodi izmanto kā daļēju aizstājējtestu, var būt jāveic turpmāka in vivo testēšana, lai pilnībā aprakstītu vielas spēju izraisīt ādas kairinājumu (4; šā pielikuma B.4. nodaļa). Ir atzīts, ka cilvēka ādas izmantošanai jāatbilst nacionālām un starptautiskām ētiskajām normām un nosacījumiem.

in vivo

| 8. | Ar šo TM in vitro tiek analizēts ādas kairinātāja komponents pakāpeniskās testēšanas stratēģijā B.4 (ESAO 404. testēšanas vadlīnijas) par ādas koroziju/kairinājumu (4). Lai arī ar šo TM nevar iegūt adekvātus datus par ādas koroziju, jāatzīmē, ka B.40.a (ESAO 431. testēšanas vadlīnijas) par ādas koroziju pamatojas uz tādu pašu RhE testēšanas sistēmu, bet izmanto citu protokolu (B.40.a nodaļa). Šīs metodes pamatā ir RhE modeļi, kuros izmanto cilvēka keratinocītus un kuri tādējādi in vitro pārstāv attiecīgās sugas mērķorgānu. Tā turklāt tiešā veidā aptver iekaisuma kaskādes/mehānisma sākotnējo posmu norisēs (šūnu bojājumi un audu bojājumi, kuru rezultāts ir lokalizēta trauma), kuras notiek, kairinājumam rodoties in vivo. Ar šo TM saistītajā validēšanas procesā ir testēts plašs ķīmisko vielu spektrs, un validācijas pētījuma empīriskā datubāze aptver kopumā 58 ķīmiskas vielas (16)(18)(23). Metode ir derīga cietām vielām, šķidrumiem, puscietām vielām un vaskiem. Šķidrumi var būt ūdens vai neūdens šķīdumu veidā; cietas vielas var būt gan ūdenī šķīstošas, gan nešķīstošas. Ja nepieciešams, cietās vielas pirms aplicēšanas jāsamaļ pulverī; nekāda cita iepriekšēja apstrāde paraugam nav vajadzīga. Validācijas pētījumā vēl nav novērtētas gāzes un aerosoli (24). Kaut arī jādomā, ka vispār ir iespējams tos testēt ar RhE tehnoloģiju, ar pašreizējo TM gāzes un aerosolus testēt nevar. Jāatzīmē arī tas, ka ķīmiskās vielas, kurām ir spilgta krāsa, var ietekmēt šūnu dzīvotspējas mērījumus, un tas jālabo ar pielāgotu kontroli (skatīt 24.–26. punktu). |
| --- | --- |

8.

Ar šo TM in vitro tiek analizēts ādas kairinātāja komponents pakāpeniskās testēšanas stratēģijā B.4 (ESAO 404. testēšanas vadlīnijas) par ādas koroziju/kairinājumu (4). Lai arī ar šo TM nevar iegūt adekvātus datus par ādas koroziju, jāatzīmē, ka B.40.a (ESAO 431. testēšanas vadlīnijas) par ādas koroziju pamatojas uz tādu pašu RhE testēšanas sistēmu, bet izmanto citu protokolu (B.40.a nodaļa). Šīs metodes pamatā ir RhE modeļi, kuros izmanto cilvēka keratinocītus un kuri tādējādi in vitro pārstāv attiecīgās sugas mērķorgānu. Tā turklāt tiešā veidā aptver iekaisuma kaskādes/mehānisma sākotnējo posmu norisēs (šūnu bojājumi un audu bojājumi, kuru rezultāts ir lokalizēta trauma), kuras notiek, kairinājumam rodoties in vivo. Ar šo TM saistītajā validēšanas procesā ir testēts plašs ķīmisko vielu spektrs, un validācijas pētījuma empīriskā datubāze aptver kopumā 58 ķīmiskas vielas (16)(18)(23). Metode ir derīga cietām vielām, šķidrumiem, puscietām vielām un vaskiem. Šķidrumi var būt ūdens vai neūdens šķīdumu veidā; cietas vielas var būt gan ūdenī šķīstošas, gan nešķīstošas. Ja nepieciešams, cietās vielas pirms aplicēšanas jāsamaļ pulverī; nekāda cita iepriekšēja apstrāde paraugam nav vajadzīga. Validācijas pētījumā vēl nav novērtētas gāzes un aerosoli (24). Kaut arī jādomā, ka vispār ir iespējams tos testēt ar RhE tehnoloģiju, ar pašreizējo TM gāzes un aerosolus testēt nevar. Jāatzīmē arī tas, ka ķīmiskās vielas, kurām ir spilgta krāsa, var ietekmēt šūnu dzīvotspējas mērījumus, un tas jālabo ar pielāgotu kontroli (skatīt 24.–26. punktu).

in vitro

in vitro

in vivo

| 9. | Vienai atsevišķai testēšanas reizei ar trim audu atkārtojumiem jābūt pietiekamai gadījumos, kad testējamās ķīmiskās vielas klasifikācija ir nepārprotama. Tomēr neskaidros gadījumos, kā nesakritīgi mērījumu rezultāti atkārtojumos un/vai vidējā procentuālā dzīvotspēja 50 ± 5 %, jāapsver vajadzība pēc otrās vai pat pēc trešās testēšanas reizes, ja nesakrīt abu pirmo divu testēšanas reižu rezultāti. |
| --- | --- |

9.

Vienai atsevišķai testēšanas reizei ar trim audu atkārtojumiem jābūt pietiekamai gadījumos, kad testējamās ķīmiskās vielas klasifikācija ir nepārprotama. Tomēr neskaidros gadījumos, kā nesakritīgi mērījumu rezultāti atkārtojumos un/vai vidējā procentuālā dzīvotspēja 50 ± 5 %, jāapsver vajadzība pēc otrās vai pat pēc trešās testēšanas reizes, ja nesakrīt abu pirmo divu testēšanas reižu rezultāti.

METODES PRINCIPS

| 10. | Testējamo ķīmisko vielu topikāli aplicē uz trīsdimensiju RhE modeļa, kuru veido nepārveidoti cilvēka epidermas keratinocīti, kultivēti tā, lai veidotos labi diferencētas daudzslāņu cilvēka epidermas modelis. Tam ir bazālais, spinālais un granulārais slānis, daudzslāņu stratum corneum ar lamelāriem lipīdu starpšūnu slāņiem, kuru uzbūve ir reprezentatīva galvenajām lipīdu klasēm in vivo. |
| --- | --- |

10.

Testējamo ķīmisko vielu topikāli aplicē uz trīsdimensiju RhE modeļa, kuru veido nepārveidoti cilvēka epidermas keratinocīti, kultivēti tā, lai veidotos labi diferencētas daudzslāņu cilvēka epidermas modelis. Tam ir bazālais, spinālais un granulārais slānis, daudzslāņu stratum corneum ar lamelāriem lipīdu starpšūnu slāņiem, kuru uzbūve ir reprezentatīva galvenajām lipīdu klasēm in vivo.

stratum corneum

in vivo

| 11. | Ķīmisku vielu izraisīts ādas kairinājums, kas izpaužas kā apsārtums un pietūkums, ir notikumu kaskādes rezultāts, kuras sākums ir iespiešanās stratum corneum un bojājumi zem tā esošajos keratinocītu slāņos. Mirstošās keratinocītu šūnas izdala mediatorus, kas sāk iekaisuma kaskādes norises, kuras ietekmē dermis esošās šūnas, jo sevišķi stromālās un endoteliālās šūnas. Novēroto apsārtumu un pietūkumu izraisa endoteliālo šūnu dilatācija un pieaugošā caurlaidība (24). RhE izmantojošās metodes mēra notikumu kaskādes sākuma norises. |
| --- | --- |

11.

Ķīmisku vielu izraisīts ādas kairinājums, kas izpaužas kā apsārtums un pietūkums, ir notikumu kaskādes rezultāts, kuras sākums ir iespiešanās stratum corneum un bojājumi zem tā esošajos keratinocītu slāņos. Mirstošās keratinocītu šūnas izdala mediatorus, kas sāk iekaisuma kaskādes norises, kuras ietekmē dermis esošās šūnas, jo sevišķi stromālās un endoteliālās šūnas. Novēroto apsārtumu un pietūkumu izraisa endoteliālo šūnu dilatācija un pieaugošā caurlaidība (24). RhE izmantojošās metodes mēra notikumu kaskādes sākuma norises.

stratum corneum

dermis

| 12. | Šūnu dzīvotspēju RhE modeļos mēra pēc vitālās krāsvielas MTT [3 (4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijbromīds, tiazolilzilais; CAS Nr. 298-93-1)] konversijas ar enzīmu par zilas krāsas formazāna sāli, kura daudzumu audu ekstraktā nosaka kvantitatīvi (25). Kairinošas ķīmiskās vielas tiek klasificētas pēc šūnu dzīvotspējas samazināšanās zemāk par kādu noteiktu iepriekš pieņemtu robežvērtību (t. i., ≤ 50 %, ANO GHS/ES CLP 2. kat. kairinošās vielas). Atkarībā no regulatīvās sistēmas, kurā izmanto šīs TM rezultātus, ķīmiskās vielas, ar kurām šūnu dzīvotspēja ir augstāka par noteikto robežvērtību, var uzskatīt par kairinājumu neizraisošām (t. i., > 50 %, neklasificētas vielas). |
| --- | --- |

12.

Šūnu dzīvotspēju RhE modeļos mēra pēc vitālās krāsvielas MTT [3 (4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijbromīds, tiazolilzilais; CAS Nr. 298-93-1)] konversijas ar enzīmu par zilas krāsas formazāna sāli, kura daudzumu audu ekstraktā nosaka kvantitatīvi (25). Kairinošas ķīmiskās vielas tiek klasificētas pēc šūnu dzīvotspējas samazināšanās zemāk par kādu noteiktu iepriekš pieņemtu robežvērtību (t. i., ≤ 50 %, ANO GHS/ES CLP 2. kat. kairinošās vielas). Atkarībā no regulatīvās sistēmas, kurā izmanto šīs TM rezultātus, ķīmiskās vielas, ar kurām šūnu dzīvotspēja ir augstāka par noteikto robežvērtību, var uzskatīt par kairinājumu neizraisošām (t. i., > 50 %, neklasificētas vielas).

CAS

CLP

PRASMES DEMONSTRĒŠANA

| 13. | Pirms sākt plaši izmantot kādu no trijām ar šo TM saistītajām validētajām testēšanas metodēm, tehniskās prasmes uzskatāmai parādīšanai laboratorijām jāizmanto desmit references vielas, kas norādītas 1. tabulā. Attiecībā uz līdzīgām metodēm, kas izstrādātas saskaņā ar šo TM, vai uz kādas no triju validēto metožu modifikācijām, pirms sākt attiecīgās metodes izmantošanu regulatīvās testēšanas vajadzībām, jābūt izpildītām šai TM noteikto veiktspējas standartu (PS) prasībām, kas aprakstītas 2. papildinājumā. |
| --- | --- |

13.

Pirms sākt plaši izmantot kādu no trijām ar šo TM saistītajām validētajām testēšanas metodēm, tehniskās prasmes uzskatāmai parādīšanai laboratorijām jāizmanto desmit references vielas, kas norādītas 1. tabulā. Attiecībā uz līdzīgām metodēm, kas izstrādātas saskaņā ar šo TM, vai uz kādas no triju validēto metožu modifikācijām, pirms sākt attiecīgās metodes izmantošanu regulatīvās testēšanas vajadzībām, jābūt izpildītām šai TM noteikto veiktspējas standartu (PS) prasībām, kas aprakstītas 2. papildinājumā.

PS

| 14. | Ieteicams, lai prasmes demonstrēšanas ietvaros lietotājs pēc audu saņemšanas verificētu šo audu barjeras funkcijas, kā precizējis RhE modeļa ražotājs. Īpaši svarīgi tas ir tad, ja audu sūtījums veicis tālu ceļu vai aizņēmis ilgu laiku. Kad metode ir sekmīgi apgūta un tās izmantošanas prasme uzskatāmi parādīta, šādu verifikāciju vairs nav nepieciešams veikt katru reizi. Tomēr, ja metodi izmanto parastajā praksē, ir ieteicams turpināt regulāri novērtēt šīs barjeras funkcijas.

  1.   tabula


  References vielas
   (8)










  Ķīmiskā viela | CAS Nr. | In vivo punkti (9) | Fizikālais stāvoklis | ANO GHS/ES CLP kategorija |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Naftalīnetiķskābe | 86-87-3 | 0 | Cietas vielas | Neklas. |
| Izopropanols | 67-63-0 | 0,3 | Šķidrums | Neklas. |
| Metilstearāts | 112-61-8 | 1 | Cietas vielas | Neklas. |
| Heptilbutirāts | 5870-93-9 | 1,7 | Šķidrums | Neklas.
  (Fakult. 3. kat.) (10)
   (11) |
| Heksilsalicilāts | 6259-76-3 | 2 | Šķidrums | Neklas.
  (Fakult. 3. kat.) (10)
   (11) |
| Ciklamenaldehīds | 103-95-7 | 2,3 | Šķidrums | 2. kat. |
| 1-bromheksāns | 111-25-1 | 2,7 | Šķidrums | 2. kat. |
| Kālija hidroksīds (5 % ūd.) | 1310-58-3 | 3 | Šķidrums | 2. kat. |
| 1-metil-3-fenil-1-piperazīns | 5271-27-2 | 3,3 | Cietas vielas | 2. kat. |
| Heptanāls | 111-71-7 | 3,4 | Šķidrums | 2. kat. |

14.

Ieteicams, lai prasmes demonstrēšanas ietvaros lietotājs pēc audu saņemšanas verificētu šo audu barjeras funkcijas, kā precizējis RhE modeļa ražotājs. Īpaši svarīgi tas ir tad, ja audu sūtījums veicis tālu ceļu vai aizņēmis ilgu laiku. Kad metode ir sekmīgi apgūta un tās izmantošanas prasme uzskatāmi parādīta, šādu verifikāciju vairs nav nepieciešams veikt katru reizi. Tomēr, ja metodi izmanto parastajā praksē, ir ieteicams turpināt regulāri novērtēt šīs barjeras funkcijas.

1.   tabula

1.

tabula

References vielas
   (8)

References vielas

8

Ķīmiskā viela

CAS Nr.

In vivo punkti (9)

In vivo

9

Fizikālais stāvoklis

ANO GHS/ES CLP kategorija

CLP

Naftalīnetiķskābe

86-87-3

0

Cietas vielas

Neklas.

Izopropanols

67-63-0

0,3

Šķidrums

Neklas.

Metilstearāts

112-61-8

1

Cietas vielas

Neklas.

Heptilbutirāts

5870-93-9

1,7

Šķidrums

Neklas.

(Fakult. 3. kat.) (10)
   (11)

Fakult. 3. kat.

10

11

Heksilsalicilāts

6259-76-3

2

Šķidrums

Neklas.

(Fakult. 3. kat.) (10)
   (11)

Fakult. 3. kat.

10

11

Ciklamenaldehīds

103-95-7

2,3

Šķidrums

2. kat.

1-bromheksāns

111-25-1

2,7

Šķidrums

2. kat.

Kālija hidroksīds (5 % ūd.)

1310-58-3

3

Šķidrums

2. kat.

1-metil-3-fenil-1-piperazīns

5271-27-2

3,3

Cietas vielas

2. kat.

Heptanāls

111-71-7

3,4

Šķidrums

2. kat.

PROCEDŪRA

| 15. | Turpmāk aprakstīti ādas kairinājuma noteikšanai izmantojamās RhE metodes komponenti un procedūras. Jārekonstruē RhE modelis, kuru sagatavo laboratorijā vai iegūst no komerciāliem avotiem. Par EpiSkinTM, EpiDermTM SIT (EPI-200) un SkinEthicTM RhE ir pieejamas standartoperāciju procedūras (SOP) (26)(27)(28). Testēšana jāveic, ievērojot turpmāk aprakstītos noteikumus. |
| --- | --- |

15.

Turpmāk aprakstīti ādas kairinājuma noteikšanai izmantojamās RhE metodes komponenti un procedūras. Jārekonstruē RhE modelis, kuru sagatavo laboratorijā vai iegūst no komerciāliem avotiem. Par EpiSkinTM, EpiDermTM SIT (EPI-200) un SkinEthicTM RhE ir pieejamas standartoperāciju procedūras (SOP) (26)(27)(28). Testēšana jāveic, ievērojot turpmāk aprakstītos noteikumus.

TM

TM

TM

RhE Testēšanas Metodes Komponenti

RhE Testēšanas Metodes Komponenti

Vispārīgi nosacījumi

Vispārīgi nosacījumi

| 16. | Epitēlija rekonstruēšanai jāizmanto nepārveidoti cilvēka keratinocīti. Zem funkcionāla stratum corneum jābūt vairākiem dzīvotspējīgu epitēlija šūnu slāņiem (bazālajam slānim, stratum spinosum, stratum granulosum). Stratum corneum jābūt daudzslāņu, ar raksturīgo lipīdu profilu, kas izveido funkcionālo barjeru, kura novērš citotoksisko marķieru, piemēram, nātrija dodecilsulfāta (SDS) vai Triton X-100, ātru penetrāciju. Barjeras funkcija jānovērtē, nosakot koncentrāciju, pie kuras ķīmiskais marķieris pēc noteikta ekspozīcijas laika samazina audu dzīvotspēju par 50 % (IC50), vai nosakot ekspozīcijas laiku, pēc kura noteiktas fiksētas koncentrācijas ķīmiskā marķiera iedarbībā audu dzīvotspēja samazinās par 50 % (ET50). RhE modeļa aizturēšanas īpašībām jānovērš ap stratum corneum esošā materiāla pāreja dzīvotspējīgos audos, kuras dēļ var tikt nepareizi modelēta faktiskā iedarbība uz ādu. RhE modelis nedrīkst būt kontaminēts ar baktērijām, vīrusiem, mikoplazmu un sēnītēm. |
| --- | --- |

16.

Epitēlija rekonstruēšanai jāizmanto nepārveidoti cilvēka keratinocīti. Zem funkcionāla stratum corneum jābūt vairākiem dzīvotspējīgu epitēlija šūnu slāņiem (bazālajam slānim, stratum spinosum, stratum granulosum). Stratum corneum jābūt daudzslāņu, ar raksturīgo lipīdu profilu, kas izveido funkcionālo barjeru, kura novērš citotoksisko marķieru, piemēram, nātrija dodecilsulfāta (SDS) vai Triton X-100, ātru penetrāciju. Barjeras funkcija jānovērtē, nosakot koncentrāciju, pie kuras ķīmiskais marķieris pēc noteikta ekspozīcijas laika samazina audu dzīvotspēju par 50 % (IC50), vai nosakot ekspozīcijas laiku, pēc kura noteiktas fiksētas koncentrācijas ķīmiskā marķiera iedarbībā audu dzīvotspēja samazinās par 50 % (ET50). RhE modeļa aizturēšanas īpašībām jānovērš ap stratum corneum esošā materiāla pāreja dzīvotspējīgos audos, kuras dēļ var tikt nepareizi modelēta faktiskā iedarbība uz ādu. RhE modelis nedrīkst būt kontaminēts ar baktērijām, vīrusiem, mikoplazmu un sēnītēm.

stratum corneum

stratum spinosum

stratum granulosum

Stratum corneum

50

50

stratum corneum

Funkcionāli nosacījumi

Funkcionāli nosacījumi

Dzīvotspēja

| 17. | Metode dzīvotspējas noteikšanai ir MTT metode (25). RhE modeļa lietotājiem jānodrošina, ka visas izmantotās RhE modeļa partijas atbilst negatīvās kontroles (NC) vajadzībām definētajiem kritērijiem. Ekstrakcijas šķīduma optiskajam blīvumam (OD) jābūt pietiekami zemam, t. i., OD< 0,1. Pieņemamības diapazonu (augšējā un apakšējā robeža) negatīvās kontroles OD vērtībām (resp., ādas kairinājuma testēšanas metodes apstākļus) nosaka RhE modeļa izstrādātājs/piegādātājs; pieņemamības diapazons trijām validētajām metodēm ir norādīts 2. tabulā. Jādokumentē ar NC apstrādāto audu stabilitāte kultūrā (jābūt ar salīdzināmiem dzīvotspējas rādītājiem) visas testa ekspozīcijas laikā.

  2.   tabula


  Pieņemamības diapazons negatīvās kontroles OD vērtībām | Apakšējā pieņemamības robežvērtība | Augšējā pieņemamības robežvērtība |
| --- | --- | --- | --- |
| EpiSkinTM (SM) | ≥ 0,6 | ≤ 1,5 |
| EpiDermTM SIT (EPI-200) | ≥ 1,0 | ≤ 2,5 |
| SkinEthicTM RhE | ≥ 1,2 | ≤ 2,5 |

17.

Metode dzīvotspējas noteikšanai ir MTT metode (25). RhE modeļa lietotājiem jānodrošina, ka visas izmantotās RhE modeļa partijas atbilst negatīvās kontroles (NC) vajadzībām definētajiem kritērijiem. Ekstrakcijas šķīduma optiskajam blīvumam (OD) jābūt pietiekami zemam, t. i., OD< 0,1. Pieņemamības diapazonu (augšējā un apakšējā robeža) negatīvās kontroles OD vērtībām (resp., ādas kairinājuma testēšanas metodes apstākļus) nosaka RhE modeļa izstrādātājs/piegādātājs; pieņemamības diapazons trijām validētajām metodēm ir norādīts 2. tabulā. Jādokumentē ar NC apstrādāto audu stabilitāte kultūrā (jābūt ar salīdzināmiem dzīvotspējas rādītājiem) visas testa ekspozīcijas laikā.

2.   tabula

2.

tabula

Pieņemamības diapazons negatīvās kontroles OD vērtībām

Pieņemamības diapazons negatīvās kontroles OD vērtībām

Apakšējā pieņemamības robežvērtība

Augšējā pieņemamības robežvērtība

EpiSkinTM (SM)

TM

≥ 0,6

≤ 1,5

EpiDermTM SIT (EPI-200)

TM

≥ 1,0

≤ 2,5

SkinEthicTM RhE

TM

≥ 1,2

≤ 2,5

Barjeras funkcija

| 18. | Stratum corneum un tā lipīdu sastāvam jābūt tādam, lai aizturētu citotoksisku ķīmisko marķieru, piemēram, SDS vai Triton X-100, ātru penetrāciju, ko nosaka pēc IC50 vai ET50 (3. tabula). |
| --- | --- |

18.

Stratum corneum un tā lipīdu sastāvam jābūt tādam, lai aizturētu citotoksisku ķīmisko marķieru, piemēram, SDS vai Triton X-100, ātru penetrāciju, ko nosaka pēc IC50 vai ET50 (3. tabula).

Stratum corneum

50

50

Morfoloģija

| 19. | Jāveic RhE modeļa histoloģiski izmeklējumi, lai demonstrētu modeļa līdzību cilvēka epidermas struktūrai (ieskaitot daudzslāņu stratum corneum). |
| --- | --- |

19.

Jāveic RhE modeļa histoloģiski izmeklējumi, lai demonstrētu modeļa līdzību cilvēka epidermas struktūrai (ieskaitot daudzslāņu stratum corneum).

stratum corneum

Reproducējamība

| 20. | Ar pozitīvās kontroles (PC) ķīmisko vielu un negatīvo kontroli (NC) iegūtajiem testēšanas metodes rezultātiem uzskatāmi jāparāda to reproducējamība laikā. |
| --- | --- |

20.

Ar pozitīvās kontroles (PC) ķīmisko vielu un negatīvo kontroli (NC) iegūtajiem testēšanas metodes rezultātiem uzskatāmi jāparāda to reproducējamība laikā.

Kvalitātes kontrole (QC)

| 21. | RhE modeļa izstrādātājam/piegādātājam jānodrošina un uzskatāmi jāparāda, ka visas izmantotās RhE modeļa partijas atbilst definētajiem produkcijas pieņemamības kritērijiem, kuru vidū piemērotākie ir dzīvotspēja (17. punkts), barjeras funkcija (18. punkts) un morfoloģija (19. punkts). Šie dati jādara pieejami metodes lietotājiem, lai tie šo informāciju iekļautu testēšanas pārskatā. RhE modeļa izstrādātājam/piegādātājam (vai pašiem testētājiem gadījumos, kad izmanto pašizgatavotus modeļus) jānosaka IC50 vai ET50 vērtību pieņemamības intervāls (augšējā un apakšējā robeža). Kairinātāja klasifikācijas prognozēšanai ir derīgi tikai ar prasībām atbilstošiem audu modeļiem noteiktie rezultāti. Kā piemērs 3. tabulā norādīti trijām validētajām metodēm noteiktie pieņemamības intervāli.

  3.   tabula


  Partiju QC pieņemamības intervāli | Apakšējā pieņemamības robežvērtība | Augšējā pieņemamības robežvērtība |
| --- | --- | --- | --- |
| EpiSkinTM (SM)
  (18 stundu apstrāde ar SDS)(26) | IC50 = 1,0 mg/ml | IC50 = 3,0 mg/ml |
| EpiDermTM SIT (EPI-200)
  (1 % Triton X-100)(27) | ET50 = 4,8 h | ET50 = 8,7 h |
| SkinEthicTM RhE
  (1 % Triton X-100)(28) | ET50 = 4,0 h | ET50 = 9,0 h |

21.

RhE modeļa izstrādātājam/piegādātājam jānodrošina un uzskatāmi jāparāda, ka visas izmantotās RhE modeļa partijas atbilst definētajiem produkcijas pieņemamības kritērijiem, kuru vidū piemērotākie ir dzīvotspēja (17. punkts), barjeras funkcija (18. punkts) un morfoloģija (19. punkts). Šie dati jādara pieejami metodes lietotājiem, lai tie šo informāciju iekļautu testēšanas pārskatā. RhE modeļa izstrādātājam/piegādātājam (vai pašiem testētājiem gadījumos, kad izmanto pašizgatavotus modeļus) jānosaka IC50 vai ET50 vērtību pieņemamības intervāls (augšējā un apakšējā robeža). Kairinātāja klasifikācijas prognozēšanai ir derīgi tikai ar prasībām atbilstošiem audu modeļiem noteiktie rezultāti. Kā piemērs 3. tabulā norādīti trijām validētajām metodēm noteiktie pieņemamības intervāli.

dzīvotspēja

barjeras funkcija

morfoloģija

50

50

3.   tabula

3.

tabula

Partiju QC pieņemamības intervāli

Partiju QC pieņemamības intervāli

Apakšējā pieņemamības robežvērtība

Augšējā pieņemamības robežvērtība

EpiSkinTM (SM)

TM

(18 stundu apstrāde ar SDS)(26)

IC50 = 1,0 mg/ml

50

IC50 = 3,0 mg/ml

50

EpiDermTM SIT (EPI-200)

TM

(1 % Triton X-100)(27)

ET50 = 4,8 h

50

ET50 = 8,7 h

50

SkinEthicTM RhE

TM

(1 % Triton X-100)(28)

ET50 = 4,0 h

50

ET50 = 9,0 h

50

Testējamās vielas un kontrolvielas aplicēšana

Testējamās vielas un kontrolvielas aplicēšana

| 22. | Katrai testējamai ķīmiskajai vielai un kontroles vielai katrā testēšanas reizē vajadzīgi vismaz trīs atkārtojumi. Testējamās ķīmiskās vielas, kas ir šķidras vai cietas vielas, uz epidermas virsmas vienmērīgā slānī jāaplicē pietiekamā daudzumā, t. i., minimāli 25 μl/cm2 vai 25 mg/cm2, raugoties, lai netiktu testēta nefiksēta deva. Testējot cietas vielas, lai nodrošinātu iespējami labāku testējamās vielas un epidermas virsmas kontaktu, pirms to aplicēšanas epidermas virsma jāsamitrina ar dejonizētu vai destilētu ūdeni. Ja iespējams, cietas vielas jātestē smalka pulvera veidā. Ekspozīcijas perioda beigās testējamā ķīmiskā viela no epidermas virsmas rūpīgi jānoskalo ar piemērotu buferšķīdumu vai 0,9 % NaCl. Atkarībā no lietotā RhE modeļa (validēti ir trīs modeļi) ekspozīcijas laiks var būt no 15 līdz 60 minūtēm, bet inkubēšanas temperatūra no 20 līdz 37 °C. Ekspozīcijas periodus un temperatūras optimizē katrai RhE metodei atsevišķi, un tie kļūst par konkrētajai metodei raksturīgajām iezīmēm; metodes sīkāk skatīt standartoperāciju procedūrās (SOP) (26) (27) (28). |
| --- | --- |

22.

Katrai testējamai ķīmiskajai vielai un kontroles vielai katrā testēšanas reizē vajadzīgi vismaz trīs atkārtojumi. Testējamās ķīmiskās vielas, kas ir šķidras vai cietas vielas, uz epidermas virsmas vienmērīgā slānī jāaplicē pietiekamā daudzumā, t. i., minimāli 25 μl/cm2 vai 25 mg/cm2, raugoties, lai netiktu testēta nefiksēta deva. Testējot cietas vielas, lai nodrošinātu iespējami labāku testējamās vielas un epidermas virsmas kontaktu, pirms to aplicēšanas epidermas virsma jāsamitrina ar dejonizētu vai destilētu ūdeni. Ja iespējams, cietas vielas jātestē smalka pulvera veidā. Ekspozīcijas perioda beigās testējamā ķīmiskā viela no epidermas virsmas rūpīgi jānoskalo ar piemērotu buferšķīdumu vai 0,9 % NaCl. Atkarībā no lietotā RhE modeļa (validēti ir trīs modeļi) ekspozīcijas laiks var būt no 15 līdz 60 minūtēm, bet inkubēšanas temperatūra no 20 līdz 37 °C. Ekspozīcijas periodus un temperatūras optimizē katrai RhE metodei atsevišķi, un tie kļūst par konkrētajai metodei raksturīgajām iezīmēm; metodes sīkāk skatīt standartoperāciju procedūrās (SOP) (26) (27) (28).

2

2

SOP

| 23. | Katrā testēšanas reizē jāizmanto paralēlas NC un PC, lai uzskatāmi parādītu, ka šūnu dzīvotspēja (ar NC), barjeras funkcija un audu jutība (ar PC) ir iepriekš noteiktajā vērtību pieņemamības intervālā. Ieteicamā PC ir nātrija dodecilsulfāta 5 % šķīdums ūdenī. Ieteicamās NC ķīmiskās vielas ir ūdens vai fizioloģiskais šķīdums ar fosfātbuferi (PBS). |
| --- | --- |

23.

Katrā testēšanas reizē jāizmanto paralēlas NC un PC, lai uzskatāmi parādītu, ka šūnu dzīvotspēja (ar NC), barjeras funkcija un audu jutība (ar PC) ir iepriekš noteiktajā vērtību pieņemamības intervālā. Ieteicamā PC ir nātrija dodecilsulfāta 5 % šķīdums ūdenī. Ieteicamās NC ķīmiskās vielas ir ūdens vai fizioloģiskais šķīdums ar fosfātbuferi (PBS).

Šūnu dzīvotspējas noteikšana

Šūnu dzīvotspējas noteikšana

| 24. | Testēšanas procedūras svarīgākais elements ir ievērot, ka dzīvotspējas mērījumus nedrīkst veikt tūlīt pēc testējamo vielu ekspozīcijas un ka noskalotajiem audiem jaunā barotnē ir vajadzīgs pietiekami ilgs pēcekspozīcijas inkubēšanas laiks. Šajā laikā izzūd vājas citotoksiskas iedarbības pazīmes un parādās nepārprotamas citotoksiskas iedarbības izpausmes. Testa optimizācijas posms (11) (12) (13) (14) (15) parādīja, ka optimāls ir 42 stundu ilgs pēcekspozīcijas inkubēšanas laiks. |
| --- | --- |

24.

Testēšanas procedūras svarīgākais elements ir ievērot, ka dzīvotspējas mērījumus nedrīkst veikt tūlīt pēc testējamo vielu ekspozīcijas un ka noskalotajiem audiem jaunā barotnē ir vajadzīgs pietiekami ilgs pēcekspozīcijas inkubēšanas laiks. Šajā laikā izzūd vājas citotoksiskas iedarbības pazīmes un parādās nepārprotamas citotoksiskas iedarbības izpausmes. Testa optimizācijas posms (11) (12) (13) (14) (15) parādīja, ka optimāls ir 42 stundu ilgs pēcekspozīcijas inkubēšanas laiks.

| 25. | Šūnu dzīvotspējas mērīšanai ar šo TM izmantojamā validētā kvantitatīvā metode ir MTT noteikšana. Tā ir audu trīsdimensiju modelim piemērota metode. Audu paraugu uz 3 stundām pārnes atbilstošas koncentrācijas (piemēram, 0,3-1 mg/ml) MTT šķīdumā. Pēc tam veic nogulsnētā zilas krāsas formazāna produkta ekstrakciju ar šķīdinātāju (piemēram, izopropanolu vai paskābinātu izopropanolu) un nosaka formazāna koncentrāciju, mērot optisko blīvumu pie viļņa garuma 570 nm ± 30 nm. |
| --- | --- |

25.

Šūnu dzīvotspējas mērīšanai ar šo TM izmantojamā validētā kvantitatīvā metode ir MTT noteikšana. Tā ir audu trīsdimensiju modelim piemērota metode. Audu paraugu uz 3 stundām pārnes atbilstošas koncentrācijas (piemēram, 0,3-1 mg/ml) MTT šķīdumā. Pēc tam veic nogulsnētā zilas krāsas formazāna produkta ekstrakciju ar šķīdinātāju (piemēram, izopropanolu vai paskābinātu izopropanolu) un nosaka formazāna koncentrāciju, mērot optisko blīvumu pie viļņa garuma 570 nm ± 30 nm.

| 26. | Testējamās ķīmiskās vielas optiskās īpašības vai ķīmiskās reakcijas ar MTT var traucēt noteikšanu, un tāpēc dzīvotspēja var būt noteikta nepareizi (jo testējamā ķīmiskā viela var gan kavēt, gan veicināt krāsas veidošanos vai atkrāsošanos). Tas var notikt gadījumos, kad testējamo ķīmisko vielu pilnībā nenoskalo no audiem vai tad, ja tā iespiežas epidermā. Ja testējamā ķīmiskā viela tieši iedarbojas uz vitālo krāsvielu MTT (MTT reducētājs), tai ir krāsa vai krāsa izveidojas ekspozīcijas laikā, testējamo ķīmisko vielu radīto dzīvotspējas mērījumu traucējumu noteikšanai un korekcijām jāizmanto papildu kontroles. SOP par trijām validētajām metodēm ir pieejams sīks apraksts par to, kā koriģēt tiešo MTT redukciju un traucējumus, ko rada vielas, kam ir krāsa (26) (27) (28). |
| --- | --- |

26.

Testējamās ķīmiskās vielas optiskās īpašības vai ķīmiskās reakcijas ar MTT var traucēt noteikšanu, un tāpēc dzīvotspēja var būt noteikta nepareizi (jo testējamā ķīmiskā viela var gan kavēt, gan veicināt krāsas veidošanos vai atkrāsošanos). Tas var notikt gadījumos, kad testējamo ķīmisko vielu pilnībā nenoskalo no audiem vai tad, ja tā iespiežas epidermā. Ja testējamā ķīmiskā viela tieši iedarbojas uz vitālo krāsvielu MTT (MTT reducētājs), tai ir krāsa vai krāsa izveidojas ekspozīcijas laikā, testējamo ķīmisko vielu radīto dzīvotspējas mērījumu traucējumu noteikšanai un korekcijām jāizmanto papildu kontroles. SOP par trijām validētajām metodēm ir pieejams sīks apraksts par to, kā koriģēt tiešo MTT redukciju un traucējumus, ko rada vielas, kam ir krāsa (26) (27) (28).

SOP

Pieņemamības kritēriji

Pieņemamības kritēriji

| 27. | Katrai metodei, kurā izmanto testēšanai derīgas RhE modeļu partijas (sk. 21. punktu) ar NC vielu apstrādātajiem audiem noteiktajām optiskā blīvuma vērtībām jāraksturo šo audu kvalitāte visos nosūtīšanas un saņemšanas cikla posmos un visos protokola procesos. Optiskā blīvuma kontrolvērtības nedrīkst būt zemākas par vēsturiski noteiktajām robežvērtībām. Arī datiem par audiem, kas apstrādāti ar PC vielu, t. i., nātrija dodecilsulfāta (SDS) 5 % šķīdumu ūdenī, jāraksturo audiem saglabājusies spēja reaģēt uz ķīmisko kairināju TM apstākļos (26) (27) (28). Jānosaka attiecīgi kritēriji par audu testēšanas atkārtojumos noteikto rezultātu pieļaujamo mainību (piemēram, ja par šādu kritēriju izmanto standartnovirzi (SD), tai jāiekļaujas vienpusējā 95 % pielaides intervālā, kas aprēķināts pēc vēsturiskiem datiem; VRM SD < 18 %). |
| --- | --- |

27.

Katrai metodei, kurā izmanto testēšanai derīgas RhE modeļu partijas (sk. 21. punktu) ar NC vielu apstrādātajiem audiem noteiktajām optiskā blīvuma vērtībām jāraksturo šo audu kvalitāte visos nosūtīšanas un saņemšanas cikla posmos un visos protokola procesos. Optiskā blīvuma kontrolvērtības nedrīkst būt zemākas par vēsturiski noteiktajām robežvērtībām. Arī datiem par audiem, kas apstrādāti ar PC vielu, t. i., nātrija dodecilsulfāta (SDS) 5 % šķīdumu ūdenī, jāraksturo audiem saglabājusies spēja reaģēt uz ķīmisko kairināju TM apstākļos (26) (27) (28). Jānosaka attiecīgi kritēriji par audu testēšanas atkārtojumos noteikto rezultātu pieļaujamo mainību (piemēram, ja par šādu kritēriju izmanto standartnovirzi (SD), tai jāiekļaujas vienpusējā 95 % pielaides intervālā, kas aprēķināts pēc vēsturiskiem datiem; VRM SD < 18 %).

Rezultātu interpretēšana un prognozes modelis

Rezultātu interpretēšana un prognozes modelis

| 28. | Katrai testējamajai ķīmiskajai vielai iegūtās optiskā blīvuma vērtības var izmantot dzīvotspējīgo šūnu daļas aprēķināšanai salīdzinājumā ar NC, kuru pieņem par 100 %. Precīzi jānosaka un jādokumentē šūnu dzīvotspējas robežvērtība, pēc kuras identificē un atšķir testējamās kairinošās ķīmiskās vielas no šādi neklasificētajām ķīmiskajām vielām, kā arī testēšanas rezultātu izvērtēšanai izmantotās statistiskās procedūras, un uzskatāmi jāparāda to piemērotība. Kairināmības prognozēšanas robežvērtības ir šādas:






  — | ja audu šūnu dzīvotspēja pēc ekspozīcijas un pēcapstrādes inkubēšanas laika ir mazāka vai vienāda ar (≤) 50 %, uzskata, ka testējamā ķīmiskā viela izraisa tādu ādas kairinājumu, ka tā jāklasificē ANO GHS/ES CLP 2. kategorijā, |
| --- | --- | --- |

28.

Katrai testējamajai ķīmiskajai vielai iegūtās optiskā blīvuma vērtības var izmantot dzīvotspējīgo šūnu daļas aprēķināšanai salīdzinājumā ar NC, kuru pieņem par 100 %. Precīzi jānosaka un jādokumentē šūnu dzīvotspējas robežvērtība, pēc kuras identificē un atšķir testējamās kairinošās ķīmiskās vielas no šādi neklasificētajām ķīmiskajām vielām, kā arī testēšanas rezultātu izvērtēšanai izmantotās statistiskās procedūras, un uzskatāmi jāparāda to piemērotība. Kairināmības prognozēšanas robežvērtības ir šādas:

—

ja audu šūnu dzīvotspēja pēc ekspozīcijas un pēcapstrādes inkubēšanas laika ir mazāka vai vienāda ar (≤) 50 %, uzskata, ka testējamā ķīmiskā viela izraisa tādu ādas kairinājumu, ka tā jāklasificē ANO GHS/ES CLP 2. kategorijā,

CLP

| — | ja audu šūnu dzīvotspēja pēc ekspozīcijas un pēcapstrādes inkubēšanas laika ir lielāka par (>) 50 %, atkarībā no regulatīvās sistēmas, kurā izmanto šīs TM rezultātus, var uzskatīt, ka testējamā ķīmiskā viela neizraisa ādas kairinājumu un ANO GHS/ES CLP sistēmā ir neklasificēta viela. |
| --- | --- |

—

ja audu šūnu dzīvotspēja pēc ekspozīcijas un pēcapstrādes inkubēšanas laika ir lielāka par (>) 50 %, atkarībā no regulatīvās sistēmas, kurā izmanto šīs TM rezultātus, var uzskatīt, ka testējamā ķīmiskā viela neizraisa ādas kairinājumu un ANO GHS/ES CLP sistēmā ir neklasificēta viela.

CLP

DATI UN TESTĒŠANAS PĀRSKATS

Dati

Dati

| 29. | Par katru noteikšanas reizi, arī par atkārtotiem eksperimentiem, ja tos veic, tabulas veidā apkopo visus datus par visiem testējamo audu atkārtojumiem (piemēram, optiskā blīvuma vērtības, datus par testējamās vielas ietekmi uz šūnu dzīvotspēju un tās klasifikācijas datus). Par katru noteikšanas reizi jānorāda rezultāta vidējā vērtība ± standartnovirze. Par katru testējamo vielu jādokumentē novērotā iedarbība ar MTT reaģentu un testējamo ķīmisko vielu, kurai ir krāsa. |
| --- | --- |

29.

Par katru noteikšanas reizi, arī par atkārtotiem eksperimentiem, ja tos veic, tabulas veidā apkopo visus datus par visiem testējamo audu atkārtojumiem (piemēram, optiskā blīvuma vērtības, datus par testējamās vielas ietekmi uz šūnu dzīvotspēju un tās klasifikācijas datus). Par katru noteikšanas reizi jānorāda rezultāta vidējā vērtība ± standartnovirze. Par katru testējamo vielu jādokumentē novērotā iedarbība ar MTT reaģentu un testējamo ķīmisko vielu, kurai ir krāsa.

Testēšanas pārskats

Testēšanas pārskats

| 30. | Testēšanas pārskatā jābūt iekļautai šādai informācijai: | Testējamā un kontroles viela:






  — | ķīmiskais nosaukums, piemēram, CAS nosaukums un numurs, EK nosaukums un numurs, ja zināms, |
| --- | --- | --- | --- |

30.

Testēšanas pārskatā jābūt iekļautai šādai informācijai:

Testējamā un kontroles viela:

—

ķīmiskais nosaukums, piemēram, CAS nosaukums un numurs, EK nosaukums un numurs, ja zināms,

CAS

| — | ķīmiskās vielas tīrība un sastāvs (masas procentos), |
| --- | --- |

—

ķīmiskās vielas tīrība un sastāvs (masas procentos),

| — | fizikāli ķīmiskās īpašības, kas attiecas uz testēšanu (piemēram, fizikālais stāvoklis, stabilitāte un iztvaikošanas spēja, pH, šķīdība ūdenī, ja tās ir zināmas), |
| --- | --- |

—

fizikāli ķīmiskās īpašības, kas attiecas uz testēšanu (piemēram, fizikālais stāvoklis, stabilitāte un iztvaikošanas spēja, pH, šķīdība ūdenī, ja tās ir zināmas),

| — | testējamo/kontroles ķīmisko vielu sagatavošana pirms testēšanas, ja tā ir veikta (piem., uzsildīšana, malšana), |
| --- | --- |

—

testējamo/kontroles ķīmisko vielu sagatavošana pirms testēšanas, ja tā ir veikta (piem., uzsildīšana, malšana),

| — | uzglabāšanas nosacījumi. |
| --- | --- |

—

uzglabāšanas nosacījumi.

| | RhE modeļa un testēšanas protokola izmantošanas pamatojums |
| --- | --- |

RhE modeļa un testēšanas protokola izmantošanas pamatojums

| | Testēšanas apstākļi:






  — | izmantotā šūnu sistēma, |
| --- | --- | --- |

Testēšanas apstākļi:

—

izmantotā šūnu sistēma,

| — | pietiekama papildinformācija par izmantoto RhE modeli un tā veiktspējas raksturlielumiem. No tiem jānorāda vismaz:






  i) | šūnu dzīvotspēja; |
| --- | --- | --- |

—

pietiekama papildinformācija par izmantoto RhE modeli un tā veiktspējas raksturlielumiem. No tiem jānorāda vismaz:

i)

šūnu dzīvotspēja;

| ii) | barjeras funkcija; |
| --- | --- |

ii)

barjeras funkcija;

| iii) | morfoloģija; |
| --- | --- |

iii)

morfoloģija;

| iv) | rezultātu reproducējamība un ticamības raksturlielumi; |
| --- | --- |

iv)

rezultātu reproducējamība un ticamības raksturlielumi;

| v) | modeļa kvalitātes kontrole (QC), |
| --- | --- |

v)

modeļa kvalitātes kontrole (QC),

| — | informācija par izmantoto testēšanas procedūru; |
| --- | --- |

—

informācija par izmantoto testēšanas procedūru;

| — | testēšanai lietotās devas, ekspozīcijas laiks un pēcekspozīcijas inkubēšanas laiks, |
| --- | --- |

—

testēšanai lietotās devas, ekspozīcijas laiks un pēcekspozīcijas inkubēšanas laiks,

| — | testēšanas procedūras iespējamo modifikāciju apraksts, |
| --- | --- |

—

testēšanas procedūras iespējamo modifikāciju apraksts,

| — | vēsturiskie dati par modeli. No tiem jānorāda vismaz:






  i) | kvalitātes kontroles datu pieņemamība saskaņā ar vēsturiskajiem datiem par partiju kontroles rezultātiem; |
| --- | --- | --- |

—

vēsturiskie dati par modeli. No tiem jānorāda vismaz:

i)

kvalitātes kontroles datu pieņemamība saskaņā ar vēsturiskajiem datiem par partiju kontroles rezultātiem;

| ii) | pozitīvās un negatīvās kontroles datu pieņemamība, ņemot vērā pozitīvās un negatīvās kontroles vidējās vērtības un vērtību intervālus, |
| --- | --- |

ii)

pozitīvās un negatīvās kontroles datu pieņemamība, ņemot vērā pozitīvās un negatīvās kontroles vidējās vērtības un vērtību intervālus,

| — | izmantotie novērtēšanas kritēriji un iedarbības prognozes modelim izraudzīto robežvērtību pamatojums, |
| --- | --- |

—

izmantotie novērtēšanas kritēriji un iedarbības prognozes modelim izraudzīto robežvērtību pamatojums,

| — | vēsturiskie kontroles dati. |
| --- | --- |

—

vēsturiskie kontroles dati.

| | Rezultāti:






  — | tabulā apkopoti dati par katru testējamo ķīmisko vielu visās noteikšanas reizēs un visos atkārtojumos, |
| --- | --- | --- |

Rezultāti:

—

tabulā apkopoti dati par katru testējamo ķīmisko vielu visās noteikšanas reizēs un visos atkārtojumos,

| — | kontrole, kas izmantota tiešajiem MTT reducētājiem un/vai testējamām ķīmiskām vielām, kurām ir krāsa, |
| --- | --- |

—

kontrole, kas izmantota tiešajiem MTT reducētājiem un/vai testējamām ķīmiskām vielām, kurām ir krāsa,

| — | citi novērojumi. |
| --- | --- |

—

citi novērojumi.

| | Rezultātu apspriešana |
| --- | --- |

Rezultātu apspriešana

| | Secinājumi |
| --- | --- |

Secinājumi

IZMANTOTĀ LITERATŪRA

| 1) | UN (2009), United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Third revised edition, UN New York and Geneva. Available at: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev03/03files_e.html] |
| --- | --- |

1)

UN (2009), United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Third revised edition, UN New York and Geneva. Available at: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev03/03files_e.html]

| 2) | EC-ECVAM (2009), Statement on the “Performance under UN GHS of three in vitro assays for skin irritation testing and the adaptation of the Reference Chemicals and Defined Accuracy Values of the ECVAM skin irritation Performance Standards”, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC30), 9 April 2009. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] |
| --- | --- |

2)

EC-ECVAM (2009), Statement on the “Performance under UN GHS of three in vitro assays for skin irritation testing and the adaptation of the Reference Chemicals and Defined Accuracy Values of the ECVAM skin irritation Performance Standards”, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC30), 9 April 2009. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

in vitro

| 3) | Regulation (EC) No 1272/2008 of the European Parliament and of the Council of 16 December 2008 on classification, labelling and packaging of substances and mixtures, amending and repealing Directives 67/548/EEC and 1999/45/EC, and amending Regulation (EC) No 1907/2006. OV L 353, 31.12.2008., 1. lpp. |
| --- | --- |

3)

Regulation (EC) No 1272/2008 of the European Parliament and of the Council of 16 December 2008 on classification, labelling and packaging of substances and mixtures, amending and repealing Directives 67/548/EEC and 1999/45/EC, and amending Regulation (EC) No 1907/2006. OV L 353, 31.12.2008., 1. lpp.

| 4) | OECD (2004), Acute Dermal Irritation/Corrosion, OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 404, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

4)

OECD (2004), Acute Dermal Irritation/Corrosion, OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 404, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

| 5) | OECD (2004), In Vitro Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical Resistance (TER), OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 430, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

5)

OECD (2004), In Vitro Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical Resistance (TER), OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 430, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

In Vitro

| 6) | OECD (2004), In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test, OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 431, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

6)

OECD (2004), In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test, OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 431, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

In Vitro

| 7) | OECD (2006), In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion, OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

7)

OECD (2006), In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion, OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

In Vitro

| 8) | EC-ECVAM (2009), Performance Standards for in vitro skin irritation test methods based on Reconstructed human Epidermis (RhE)? Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] |
| --- | --- |

8)

EC-ECVAM (2009), Performance Standards for in vitro skin irritation test methods based on Reconstructed human Epidermis (RhE)? Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

in vitro

| 9) | OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, OECD Series on Testing and Assessment No. 34, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

9)

OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, OECD Series on Testing and Assessment No. 34, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

| 10) | Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J. M. and Botham, P. (2001), A prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation, Results and evaluation by the Management Team, Toxicol. in Vitro 15, 57-93. |
| --- | --- |

10)

Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J. M. and Botham, P. (2001), A prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation, Results and evaluation by the Management Team, Toxicol. in Vitro 15, 57-93.

in vitro

| 11) | Portes, P., Grandidier, M.-H., Cohen, C. and Roguet, R. (2002), Refinement of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study, Toxicol. in Vitro 16, 765–770. |
| --- | --- |

11)

Portes, P., Grandidier, M.-H., Cohen, C. and Roguet, R. (2002), Refinement of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study, Toxicol. in Vitro 16, 765–770.

| 12) | Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, B. and Spielmann, H. (2004), Optimisation of the EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests, ALTEX 21, 107–114. |
| --- | --- |

12)

Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, B. and Spielmann, H. (2004), Optimisation of the EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests, ALTEX 21, 107–114.

in vitro

| 13) | Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D. and Spielmann, H. (2005), The EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests – An assessment of the performance of the optimised test, ATLA 33, 351-367. |
| --- | --- |

13)

Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D. and Spielmann, H. (2005), The EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests – An assessment of the performance of the optimised test, ATLA 33, 351-367.

in vitro

| 14) | Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. and Rubinsteen, G. (2005), The in vitro acute skin irritation of chemicals: optimisation of the EPISKIN prediction model within the framework of the ECVAM validation process, ATLA 33, 329-349. |
| --- | --- |

14)

Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. and Rubinsteen, G. (2005), The in vitro acute skin irritation of chemicals: optimisation of the EPISKIN prediction model within the framework of the ECVAM validation process, ATLA 33, 329-349.

in vitro

| 15) | Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. and Worth, A. (2002), Follow-up to the ECVAM prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation, The European Centre for the Validation of Alternative Methods Skin Irritation Task Force report 2, ATLA 30, 109-129. |
| --- | --- |

15)

Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. and Worth, A. (2002), Follow-up to the ECVAM prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation, The European Centre for the Validation of Alternative Methods Skin Irritation Task Force report 2, ATLA 30, 109-129.

in vitro

| 16) | Spielmann, H., mailto:Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovio, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., mailto:Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on in vitro tests for acute skin irritation: Report on the validity of the EPISKIN and EpiDerm assays and on the skin integrity function test, ATLA 35, 559-601. |
| --- | --- |

16)

Spielmann, H., mailto:Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovio, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., mailto:Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on in vitro tests for acute skin irritation: Report on the validity of the EPISKIN and EpiDerm assays and on the skin integrity function test, ATLA 35, 559-601.

in vitro

| 17) | Hoffmann, S. (2006), ECVAM skin irritation validation study phase II: Analysis of the primary endpoint MTT and the secondary endpoint IL1-α. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] |
| --- | --- |

17)

Hoffmann, S. (2006), ECVAM skin irritation validation study phase II: Analysis of the primary endpoint MTT and the secondary endpoint IL1-α. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

| 18) | Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on in vitro tests for acute skin irritation: selection of test chemicals, ATLA 35, 603-619. |
| --- | --- |

18)

Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on in vitro tests for acute skin irritation: selection of test chemicals, ATLA 35, 603-619.

in vitro

| 19) | Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Lelièvre, D., Roguet, R., Tinois-Tessonneaud, E. and Leclaire, J. (2007), In vitro acute skin irritancy of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy - Results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, 14, 351-358. |
| --- | --- |

19)

Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Lelièvre, D., Roguet, R., Tinois-Tessonneaud, E. and Leclaire, J. (2007), In vitro acute skin irritancy of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy - Results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, 14, 351-358.

In vitro

| 20) | EC-ECVAM (2007), Statement on the validity of in vitro tests for skin irritation, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC26), 27 April 2007. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] |
| --- | --- |

20)

EC-ECVAM (2007), Statement on the validity of in vitro tests for skin irritation, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC26), 27 April 2007. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

in vitro

| 21) | EC-ECVAM (2007), Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation testing. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] |
| --- | --- |

21)

EC-ECVAM (2007), Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation testing. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

in vitro

| 22) | EC-ECVAM (2008), Statement on the scientific validity of in vitro tests for skin irritation testing, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC29), 5 November 2008. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] |
| --- | --- |

22)

EC-ECVAM (2008), Statement on the scientific validity of in vitro tests for skin irritation testing, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC29), 5 November 2008. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

in vitro

| 23) | OECD (2010), Explanatory background document to the OECD draft Test Guideline on in vitro skin irritation testing. OECD Series on Testing and Assessment, No. 137, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/document/24/0,3746,en_2649_34377_47858904_1_1_1_1,00.html] |
| --- | --- |

23)

OECD (2010), Explanatory background document to the OECD draft Test Guideline on in vitro skin irritation testing. OECD Series on Testing and Assessment, No. 137, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/document/24/0,3746,en_2649_34377_47858904_1_1_1_1,00.html]

in vitro

| 24) | Welss, T., Basketter, D.A. and Schröder, K.R. (2004), In vitro skin irritation: fact and future. State of the art review of mechanisms and models, Toxicol. in Vitro 18, 231-243. |
| --- | --- |

24)

Welss, T., Basketter, D.A. and Schröder, K.R. (2004), In vitro skin irritation: fact and future. State of the art review of mechanisms and models, Toxicol. in Vitro 18, 231-243.

In vitro

| 25) | Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Methods 65, 55-63. |
| --- | --- |

25)

Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Methods 65, 55-63.

| 26) | EpiSkinTM SOP, Version 1.8 (February 2009), ECVAM Skin Irritation Validation Study: Validation of the EpiSkinTM test method 15 min - 42 hours for the prediction of acute skin irritation of chemicals. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] |
| --- | --- |

26)

EpiSkinTM SOP, Version 1.8 (February 2009), ECVAM Skin Irritation Validation Study: Validation of the EpiSkinTM test method 15 min - 42 hours for the prediction of acute skin irritation of chemicals. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

TM

TM

| 27) | EpiDermTM SOP, Version 7.0 (Revised March 2009), Protocol for: In vitro EpiDermTM skin irritation test (EPI-200-SIT), For use with MatTek Corporation’s reconstructed human epidermal model EpiDerm (EPI-200). Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] |
| --- | --- |

27)

EpiDermTM SOP, Version 7.0 (Revised March 2009), Protocol for: In vitro EpiDermTM skin irritation test (EPI-200-SIT), For use with MatTek Corporation’s reconstructed human epidermal model EpiDerm (EPI-200). Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

TM

In vitro

TM

| 28) | SkinEthicTM RHE SOP, Version 2.0 (February 2009), SkinEthic skin irritation test-42bis test method for the prediction of acute skin irritation of chemicals: 42 minutes application + 42 hours post-incubation. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] |
| --- | --- |

28)

SkinEthicTM RHE SOP, Version 2.0 (February 2009), SkinEthic skin irritation test-42bis test method for the prediction of acute skin irritation of chemicals: 42 minutes application + 42 hours post-incubation. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

TM

| 29) | Harvell, J.D., Lamminstausta, K., and Maibach, H.I. (1995), Irritant contact dermatitis, In: Practical Contact Dermatitis, pp 7-18, (Ed. Guin J. D.). Mc Graw-Hill, New York. |
| --- | --- |

29)

Harvell, J.D., Lamminstausta, K., and Maibach, H.I. (1995), Irritant contact dermatitis, In: Practical Contact Dermatitis, pp 7-18, (Ed. Guin J. D.). Mc Graw-Hill, New York.

| 30) | Commission Directive 2001/59/EC of 6 August 2001 adapting to technical progress for the 28th time Council Directive 67/548/EEC on the approximation of laws, regulations and administrative provisions relating to the classification, packaging and labelling of dangerous substances, OV L 225, 21.8.2001., 1. lpp. |
| --- | --- |

30)

Commission Directive 2001/59/EC of 6 August 2001 adapting to technical progress for the 28th time Council Directive 67/548/EEC on the approximation of laws, regulations and administrative provisions relating to the classification, packaging and labelling of dangerous substances, OV L 225, 21.8.2001., 1. lpp.

| 31) | Basketter, D.A., York, M., McFadden, J.P. and Robinson, M.K. (2004), Determination of skin irritation potential in the human 4-h patch test. Contact Dermatitis 51, 1-4. |
| --- | --- |

31)

Basketter, D.A., York, M., McFadden, J.P. and Robinson, M.K. (2004), Determination of skin irritation potential in the human 4-h patch test. Contact Dermatitis 51, 1-4.

| 32) | Jirova, D., Liebsch, M., Basketter, D., Spiller, E., Kejlova, K., Bendova, H., Marriott, M. and Kandarova, H. (2007), Comparison of human skin irritation and photo-irritation patch test data with cellular in vitro assays and animal in vivo data, ALTEX, 14, 359-365. |
| --- | --- |

32)

Jirova, D., Liebsch, M., Basketter, D., Spiller, E., Kejlova, K., Bendova, H., Marriott, M. and Kandarova, H. (2007), Comparison of human skin irritation and photo-irritation patch test data with cellular in vitro assays and animal in vivo data, ALTEX, 14, 359-365.

in vitro

in vivo

| 33) | Jírová, D., Basketter, D., Liebsch, M., Bendová, H., Kejlová, K., Marriott, M. and Kandárová, H. (2010), Comparison of human skin irritation patch test data with in vitro skin irritation assays and animal data, Contact Dermatitis, 62, 109-116. |
| --- | --- |

33)

Jírová, D., Basketter, D., Liebsch, M., Bendová, H., Kejlová, K., Marriott, M. and Kandárová, H. (2010), Comparison of human skin irritation patch test data with in vitro skin irritation assays and animal data, Contact Dermatitis, 62, 109-116.

in vitro

1. papildinājums

Definīcijas

Pareizība: pēc testēšanas metodes iegūto mērījumu rezultātu sakritības pakāpe ar pieņemtajām references vērtībām. Tas ir testēšanas metodes veiktspējas raksturlielums un viens no tās piemērotības aspektiem. Šo terminu bieži izmanto “atbilstības” vietā, ar to apzīmējot pēc testēšanas metodes iegūto pareizo rezultātu daļu (9).

Šūnu dzīvotspēja: parametrs, ar kuru mēra šūnu populācijas kopējo aktivitāti, piemēram, šūnu mitohondriju dehidrogenāžu spēju reducēt vitālo krāsvielu MTT (3–(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijbromīds, tiazolilzilais), kas atkarībā no nosakāmā testēšanas beigu punkta un izmantotā testēšanas plāna korelē ar dzīvo šūnu kopējo skaitu un/vai dzīvotspēju.

Sakritība: parametrs, ar kuru mēra to testēšanas metožu veiktspēju, ar kurām iegūst nepārprotami skaidrus rezultātus, un viens no piemērotības aspektiem. Šo terminu var lietot arī pareizības nozīmē, un to definē kā visu to testēto ķīmisko vielu proporcionālo daļu, kuras pareizi klasificētas kā tādas, kurām ir pozitīva vai negatīva reakcija (9).

ET50: parametrs, ko var aprēķināt pēc ekspozīcijas laika, kas pēc noteiktas koncentrācijas ķīmiskā marķiera aplicēšanas nepieciešams šūnu dzīvotspējas samazināšanai par 50 % (sk. arī IC50).

ES CLP regula (Eiropas Parlamenta un Padomes 2008. gada 16. decembra Regula (EK) Nr. 1272/2008 par vielu un maisījumu klasificēšanu, marķēšanu un iepakošanu): Eiropas Savienībā (ES) īsteno ANO GHS sistēmu ķīmisko vielu (substanču un to maisījumu) klasificēšanai un marķēšanai (3).

GHS (ANO Ķīmisko vielu klasificēšanas un marķēšanas Globāli harmonizētā sistēma): sistēma, saskaņā ar kuru ķīmiskās vielas (kā substances un maisījumos) klasificē pēc standartizētiem kaitīgās iedarbības veidiem un to intensitātes uz cilvēka veselību un vidi, kā arī paredz atbilstošu saziņas elementu izmantošanu, piemēram, piktogrammas, signālvārdus, bīstamības apzīmējumus, piesardzības apzīmējumus un drošības datu lapas, kuru mērķis ir sniegt informāciju, kas nepieciešama cilvēku (tostarp darba devēju, strādājošo, transporta darbinieku, patērētāju un avārijas dienestu darbinieku) un vides aizsardzībai pret to kaitīgo iedarbību (1).

IC50: parametrs, ko var aprēķināt pēc ķīmiskā marķiera koncentrācijas, kurā audu dzīvotspēja pēc noteikta ekspozīcijas laika samazinās par 50 % (IC50) (sk. arī ET50).

Nefiksēta deva: uz ādas epidermas aplicētais testējamās ķīmiskās vielas daudzums, kas ir lielāks par ādas epidermas pilnīgai un vienmērīgai pārklāšanai nepieciešamo daudzumu.

Atdarinājuma (me-too) tests: sadzīvisks apzīmējums testēšanas metodei, kura ir noteikšanas mehānisma vai funkcionalitātes ziņā līdzīga validētai un pieņemtai testēšanas references metodei. Šāda testēšanas metode varētu pretendēt uz vēlāku validēšanu. Brīvi aizstājama ar tai līdzīgu testēšanas metodi (9).

Veiktspējas standarti (PS): saskaņā ar validētu testēšanas metodi noteikti standarti, pēc kuriem novērtē noteikšanas mehānisma vai funkcionalitātes ziņā līdzīgu testēšanas metožu salīdzināmību. Šeit iekļauti: i) testēšanas metodes būtiskie komponenti; ii) obligāti izmantojamās references vielas, kas izraudzītas no tām ķīmiskajām vielām, kuras izmantotas, lai pierādītu attiecīgās validētās testēšanas metodes veiktspējas pieņemamību; iii) salīdzināmie pareizības un ticamības līmeņi, kuru pamatā ir attiecīgajai validētajai testēšanas metodei noteiktie konkrētie līmeņi un kuru nodrošināšanu ar novērtējamo testēšanas metodi var pierādīt ar obligāti izmantojamajām references vielām (9).

References vielas: ķīmiskas vielas, kas izraudzītas izmantošanai validēšanas procesā un kuru reakcija in vitro vai in vivo testēšanas standartsistēmā vai pētāmajās sugās ir jau zināma. Šīm ķīmiskajām vielām jābūt reprezentatīvām attiecībā uz to ķīmisko vielu klasi, kuras testē ar attiecīgo metodi, un jāaptver testējamo ķīmisko vielu iespējamo reakciju diapazons (izteikta reakcija, vāja reakcija, nav reakcijas). Dažādos validēšanas procesa posmos var būt vajadzīgas dažādas references vielas; tas pats attiecas uz testēšanas metodēm un to lietojumiem (9).

Piemērotība: testa raksturojums no tā lietderīguma viedokļa; vai tas ir piemērots un izmantojams kādam konkrētam mērķim. Pakāpe, kādā ar minēto testu iespējams pareizi izmērīt vai prognozēt pētāmo bioloģisko ietekmi. Piemērotība ietver arī testēšanas metodes pareizības (atbilstības) aspektu (9).

Ticamība: parametrs, ar kuru mēra pakāpi, kādā tajā pašā vai citā laboratorijā ilgākā laikā, izmantojot to pašu protokolu, var iegūt reproducējamus rezultātus. To novērtē, aprēķinot iekšlaboratorijas un starplaboratoriju reproducējamību (9).

Aizstājējtests: ikdienā lietota testa aizstāšanai paredzēts tests, kuru pieņemts izmantot bīstamības identificēšanai un/vai riska novērtēšanai, ar pierādītu spēju ekvivalentā vai labākā veidā, salīdzinot ar pieņemto testu, nodrošināt (pēc vajadzības) cilvēka un dzīvnieku veselības vai vides aizsardzību; attiecas uz visām iespējamām testēšanas situācijām un ķīmiskajām vielām (9).

Jutība: ar konkrēto testēšanas metodi pareizi klasificēto pozitīvo/aktīvo testējamo ķīmisko vielu daļa, kurām ir attiecīgā veida iedarbība. Jutība ir testēšanas metodes precizitātes mērs, kādā iegūst nepārprotami skaidrus rezultātus, un tā ir svarīgs faktors, kas jāņem vērā, novērtējot testēšanas metodes piemērotību (9).

Ādas kairinājums: atgriezeniska audu bojājuma veidošanās ādā ne ilgāk kā 4 stundas pēc testējamās ķīmiskās vielas aplicēšanas. Ādas kairinājums ir vietēja ar imūnsistēmu nesaistīta reakcija, kas parādās neilgi pēc kairinātāja iedarbības (29). Tās svarīgākā iezīme ir atgriezeniskums, kas saistīts ar iekaisuma reakcijām un ar iekaisuma procesu saistītā kairinājuma raksturīgo klīnisko pazīmju (ādas apsarkums, pietūkums, niezēšana un sāpes) lielāko daļu.

Specifiskums: ar konkrēto testēšanas metodi pareizi klasificēto negatīvo/neaktīvo testējamo ķīmisko vielu daļa. Specifiskums ir testēšanas metodes precizitātes mērs, kādā iegūst nepārprotami skaidrus rezultātus, un tā ir svarīgs faktors, kas jāņem vērā, novērtējot testēšanas metodes piemērotību (9).

Pakāpeniskas testēšanas stratēģija: testēšana, kurā secīgi izmanto vairākas metodes; nākamajā testēšanas posmā izmantojamo metodi izraugās atkarībā no iepriekšējā testēšanas posma rezultātiem (9).

Testējamā ķīmiskā viela (arī testējamā viela): viela vai vielu maisījums, kuru testē ar šo TM.

2. papildinājums

Veiktspējas standarti, pēc kuriem vērtējamas ierosinātās līdzīgās vai modificētās in vitro metodes ādas kairinājuma testēšanai ar cilvēka epidermas rekonstrukcijas modeļiem (RhE)

IEVADS

| 1. | Veiktspējas standartu (PS) izstrādes mērķis ir izveidot pamatu, kuram pielīdzināt jaunas metodes – gan aizsargātas (t. i., ar autortiesībām, tirdzniecības zīmēm, reģistrāciju), gan neaizsargātas –, lai noteiktu, vai konkrētajām testēšanas vajadzībām tās ir pietiekami pareizas un ticamas. Šos PS, kuru pamatā ir validētas un pieņemtas metodes, var izmantot, lai izvērtētu, cik ticamas un pareizas ir citas, analogas metodes (ikdienā dēvētas par me-too jeb atdarinājuma testiem), kuru pamatā ir līdzīgi zinātniski principi un ar kurām mēra vai prognozē tā paša veida bioloģisko vai toksisko iedarbību (9). |
| --- | --- |

1.

Veiktspējas standartu (PS) izstrādes mērķis ir izveidot pamatu, kuram pielīdzināt jaunas metodes – gan aizsargātas (t. i., ar autortiesībām, tirdzniecības zīmēm, reģistrāciju), gan neaizsargātas –, lai noteiktu, vai konkrētajām testēšanas vajadzībām tās ir pietiekami pareizas un ticamas. Šos PS, kuru pamatā ir validētas un pieņemtas metodes, var izmantot, lai izvērtētu, cik ticamas un pareizas ir citas, analogas metodes (ikdienā dēvētas par me-too jeb atdarinājuma testiem), kuru pamatā ir līdzīgi zinātniski principi un ar kurām mēra vai prognozē tā paša veida bioloģisko vai toksisko iedarbību (9).

| 2. | Pirms pieņemt modificētas metodes (t. i., ierosinātos potenciālos uzlabojumus jau apstiprinātā metodē), jāveic novērtējums, kurā jānosaka ierosināto izmaiņu ietekme uz testa veiktspēju un pakāpe, kādā šīs izmaiņas ietekmē informāciju, kas pieejama par citiem validēšanas procesa komponentiem. Atkarībā no ierosināto izmaiņu daudzuma un rakstura, datiem, ko tās ģenerē, un papildu dokumentācijas šīs metodes vai nu jāvalidē tādā procesā, kāds paredzēts jaunām testēšanas metodēm, vai (ja tas ir pamatoti) ierobežotā apjomā, izmantojot esošos PS, jānovērtē to ticamība un piemērotība (9). |
| --- | --- |

2.

Pirms pieņemt modificētas metodes (t. i., ierosinātos potenciālos uzlabojumus jau apstiprinātā metodē), jāveic novērtējums, kurā jānosaka ierosināto izmaiņu ietekme uz testa veiktspēju un pakāpe, kādā šīs izmaiņas ietekmē informāciju, kas pieejama par citiem validēšanas procesa komponentiem. Atkarībā no ierosināto izmaiņu daudzuma un rakstura, datiem, ko tās ģenerē, un papildu dokumentācijas šīs metodes vai nu jāvalidē tādā procesā, kāds paredzēts jaunām testēšanas metodēm, vai (ja tas ir pamatoti) ierobežotā apjomā, izmantojot esošos PS, jānovērtē to ticamība un piemērotība (9).

| 3. | Līdzīgas (atdarinājuma jeb me-too) vai modificētas metodes, kas radniecīgas kādai no trijām validētajām metodēm [EpiSkinTM (validētā references metode – VRM), EpiDermTM SIT (EPI-200) un SkinEthicTM RHE] un kas ierosinātas izmantošanai šajā TM, jānovērtē, lai noteiktu to ticamību un pareizību, un šajā procesā jāizmanto tādas ķīmiskās vielas, kas ir reprezentatīvas visam Dreiza [Draize] ādas kairinājuma reakcijas intervālam. Novērtētām pēc PS ar 20 ieteicamajām references vielām (1. tabula), ierosinātajām līdzīgajām vai modificētajām metodēm jābūt ar tādiem ticamības un pareizības rādītājiem, kas ir salīdzināmi ar VRM noteiktajiem vai labāki par tiem (2. tabula) (2) (16). Ticamības un pareizības vērtības, kuras jāsasniedz, norādītas šā papildinājuma 8. līdz 12. punktā. Jāiekļauj neklasificētas (ANO GHS/ES CLP“Neklas.”) un klasificētas (ANO GHS/ES CLP 2. kat.) (1) ķīmiskās vielas, kas pārstāv dažādas ķīmisko vielu klases, lai ierosinātās metodes ticamību un pareizību (jutība, specifiskums un kopējā precizitāte) varētu salīdzināt ar attiecīgajiem VRM rādītājiem. Pirms metodi izmantot jaunu testējamo ķīmisko vielu testēšanai, jānosaka metodes ticamība un tās spēja pareizi identificēt ANO GHS/ES CLP 2. kategorijas kairinošās ķīmiskās vielas un (atkarībā no regulatīvās sistēmas, kurai dati sagatavoti) arī spēja pareizi identificēt ANO GHS/ES CLP neklasificētās ķīmiskās vielas. |
| --- | --- |

3.

Līdzīgas (atdarinājuma jeb me-too) vai modificētas metodes, kas radniecīgas kādai no trijām validētajām metodēm [EpiSkinTM (validētā references metode – VRM), EpiDermTM SIT (EPI-200) un SkinEthicTM RHE] un kas ierosinātas izmantošanai šajā TM, jānovērtē, lai noteiktu to ticamību un pareizību, un šajā procesā jāizmanto tādas ķīmiskās vielas, kas ir reprezentatīvas visam Dreiza [Draize] ādas kairinājuma reakcijas intervālam. Novērtētām pēc PS ar 20 ieteicamajām references vielām (1. tabula), ierosinātajām līdzīgajām vai modificētajām metodēm jābūt ar tādiem ticamības un pareizības rādītājiem, kas ir salīdzināmi ar VRM noteiktajiem vai labāki par tiem (2. tabula) (2) (16). Ticamības un pareizības vērtības, kuras jāsasniedz, norādītas šā papildinājuma 8. līdz 12. punktā. Jāiekļauj neklasificētas (ANO GHS/ES CLP“Neklas.”) un klasificētas (ANO GHS/ES CLP 2. kat.) (1) ķīmiskās vielas, kas pārstāv dažādas ķīmisko vielu klases, lai ierosinātās metodes ticamību un pareizību (jutība, specifiskums un kopējā precizitāte) varētu salīdzināt ar attiecīgajiem VRM rādītājiem. Pirms metodi izmantot jaunu testējamo ķīmisko vielu testēšanai, jānosaka metodes ticamība un tās spēja pareizi identificēt ANO GHS/ES CLP 2. kategorijas kairinošās ķīmiskās vielas un (atkarībā no regulatīvās sistēmas, kurai dati sagatavoti) arī spēja pareizi identificēt ANO GHS/ES CLP neklasificētās ķīmiskās vielas.

| 4. | Šo PS pamatā ir EC-ECVAM PS (8), kas atjaunināti saskaņā ar ANO GHS un ES CLP sistēmu par klasifikāciju un marķēšanu (1) (3). Sākotnējos PS definēja pēc validācijas pētījuma (21) pabeigšanas, un to pamatā bija ES klasifikācijas sistēma, kas noteikta ar Komisijas 2001. gada 6. augusta Direktīvu 2001/59/EEK, ar ko divdesmit astoto reizi tehnikas attīstībai pielāgo Padomes Direktīvu 67/548/EEK par normatīvo un administratīvo aktu tuvināšanu attiecībā uz bīstamu vielu klasifikāciju, iepakošanu un marķēšanu (12). Laika posmā pēc validācijas pētījuma beigām un pirms šīs TM izstrādes pabeigšanas ANO GHS sistēma par klasifikāciju un marķēšanu tika pieņemta izmantošanai ES (ES CLP) (3), un tāpēc PS tika atjaunināti (8). Atjauninājumi attiecas pārsvarā uz: (i) PS references vielu kopumu; (ii) definētajām ticamības un pareizības vērtībām (2) (23). |
| --- | --- |

4.

Šo PS pamatā ir EC-ECVAM PS (8), kas atjaunināti saskaņā ar ANO GHS un ES CLP sistēmu par klasifikāciju un marķēšanu (1) (3). Sākotnējos PS definēja pēc validācijas pētījuma (21) pabeigšanas, un to pamatā bija ES klasifikācijas sistēma, kas noteikta ar Komisijas 2001. gada 6. augusta Direktīvu 2001/59/EEK, ar ko divdesmit astoto reizi tehnikas attīstībai pielāgo Padomes Direktīvu 67/548/EEK par normatīvo un administratīvo aktu tuvināšanu attiecībā uz bīstamu vielu klasifikāciju, iepakošanu un marķēšanu (12). Laika posmā pēc validācijas pētījuma beigām un pirms šīs TM izstrādes pabeigšanas ANO GHS sistēma par klasifikāciju un marķēšanu tika pieņemta izmantošanai ES (ES CLP) (3), un tāpēc PS tika atjaunināti (8). Atjauninājumi attiecas pārsvarā uz: (i) PS references vielu kopumu; (ii) definētajām ticamības un pareizības vērtībām (2) (23).

VEIKTSPĒJAS STANDARTI IN VITRO RhE TESTĒŠANAS METODĒM ĀDAS KAIRINĀJUMA NOTEIKŠANAI

| 5. | PS ir šādi trīs elementi (9):






  I) | Testēšanas metodes būtiskie komponenti |
| --- | --- | --- |

5.

PS ir šādi trīs elementi (9):

I)

Testēšanas metodes būtiskie komponenti

| II) | References vielu obligātais minimums |
| --- | --- |

II)

References vielu obligātais minimums

| III) | Definētās ticamības un pareizības vērtības |
| --- | --- |

III)

Definētās ticamības un pareizības vērtības

I.   Testēšanas metodes būtiskie komponenti

| 6. | Tie ir būtiski svarīgi validētas metodes struktūras, funkcionalitātes un procedūras elementi, kuri jāiekļauj ierosinātas, pēc noteikšanas mehānisma vai funkcionalitātes ziņā līdzīgas vai modificētas metodes protokolā. Šie komponenti ietver metodes unikālos raksturlielumus, kritiski svarīgas procedurālas iezīmes un kvalitātes kontroles pasākumus. Būtiski svarīgo testēšanas metodes komponentu ievērošana palīdzēs nodrošināt to, ka līdzīgas vai modificētas ierosinātās metodes koncepcija būs tāda pati kā atbilstošajai VRM (9). Būtiskie testēšanas metodes komponenti sīki aprakstīti TM 16. līdz 21. punktā, un testēšana jāveic saskaņā ar turpmāk minētajiem punktiem:






  — | Vispārīgi nosacījumi (16. punkts) |
| --- | --- | --- |

6.

Tie ir būtiski svarīgi validētas metodes struktūras, funkcionalitātes un procedūras elementi, kuri jāiekļauj ierosinātas, pēc noteikšanas mehānisma vai funkcionalitātes ziņā līdzīgas vai modificētas metodes protokolā. Šie komponenti ietver metodes unikālos raksturlielumus, kritiski svarīgas procedurālas iezīmes un kvalitātes kontroles pasākumus. Būtiski svarīgo testēšanas metodes komponentu ievērošana palīdzēs nodrošināt to, ka līdzīgas vai modificētas ierosinātās metodes koncepcija būs tāda pati kā atbilstošajai VRM (9). Būtiskie testēšanas metodes komponenti sīki aprakstīti TM 16. līdz 21. punktā, un testēšana jāveic saskaņā ar turpmāk minētajiem punktiem:

—

Vispārīgi nosacījumi (16. punkts)

| — | Funkcionālie nosacījumi, tostarp:






  — | šūnu dzīvotspēja (17. punkts), |
| --- | --- | --- |

—

Funkcionālie nosacījumi, tostarp:

—

šūnu dzīvotspēja (17. punkts),

| — | barjeras funkcija (18. punkts), |
| --- | --- |

—

barjeras funkcija (18. punkts),

| — | morfoloģija (19. punkts), |
| --- | --- |

—

morfoloģija (19. punkts),

| — | reproducējamība (20. punkts), |
| --- | --- |

—

reproducējamība (20. punkts),

| — | kvalitātes kontrole (21. punkts). |
| --- | --- |

—

kvalitātes kontrole (21. punkts).

II.   References vielu obligātais minimums

| 7. | References vielas izmanto, lai noteiktu, vai ierosināta vai modificēta metode, kura, kā pierādīts, strukturāli un funkcionāli ir pietiekami līdzīga VRM vai kura būtībā ir viena no trijām validētajām metodēm, tikai nedaudz modificētā veidā, ticamības un pareizības ziņā ir salīdzināma ar VRM vai ir labāka par to (2) (8) (16) (23). Ieteicamās 20 references vielas, kas uzskaitītas 1. tabulā, aptver dažādas ķīmisko vielu klases (t. i., ķīmisko vielu kategorijas atkarībā no to funkcionālajām grupām) un tās ir visam Dreiza [Draize] ādas kairinājuma reakcijas intervālam reprezentatīvas (no nekairinošām līdz stipri kairinošām). Minētajā sarakstā ir 10 ANO GHS/ES CLP 2. kategorijas ķīmiskās vielas un 10 neklasificētas ķīmiskās vielas, no kurām 3 ir fakultatīvās ANO GHS 3. kategorijas ķīmiskās vielas. Pēc šīs testēšanas metodes atsevišķi neklasificē vielas, ko var klasificēt ANO GHS 3. kategorijā. 1. tabulā uzskaitītās ķīmiskās vielas ir atlasītas no vielām, kuras izmantotas prevalidēšanai sekojošajā optimizācijas fāzē un VRM validēšanas pētījumā, ievērojot šo vielu funkcionālās īpašības un fizikālo stāvokli (14) (18). Šīs references vielas ir minimālais ķīmisko vielu daudzums, kas izmantojams, lai novērtētu ierosinātas līdzīgas vai modificētas metodes pareizību un ticamību, taču tās nav jāizmanto jaunu metožu izstrādē. Gadījumos, kad kāda no norādītajām ķīmiskajām vielām nav pieejama, var izmantot citas ķīmiskās vielas, par kurām ir pieejami atbilstoši references dati, kas iegūti in vivo izmēģinājumos, priekšroku dodot vielām, kuras izmantotas prevalidēšanai sekojošajā optimizācijas fāzē vai VRM validēšanas pētījumā. Ja nepieciešams, ierosinātās metodes pareizības tālākai novērtēšanai papildus obligātajam references vielu kopumam var izmantot citām ķīmisko vielu klasēm piederošas vielas, par kurām ir pieejami atbilstoši references dati, kas iegūti in vivo izmēģinājumos.

  1.   tabula


  Obligātās references vielas pareizības un ticamības vērtību noteikšanai līdzīgām vai modificētām RhE ādas kairinājuma noteikšanas metodēm
   (13)











  Ķīmiskā viela | CAS Nr. | Fizikālais stāvoklis | In vivo reakcija | VRM in vitro kat. | ANO GHS/ES CLP in vivo kat. |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| 1-brom-4-hlorbutāns | 6940-78-9 | Šķidr. | 0 | 2. kat. | Neklas. |
| dietilftalāts | 84-66-2 | Šķidr. | 0 | Neklas. | Neklas. |
| naftalīnetiķskābe | 86-87-3 | Cietv. | 0 | Neklas. | Neklas. |
| alilfenoksiacetāts | 7493-74-5 | Šķidr. | 0,3 | Neklas. | Neklas. |
| izopropanols | 67-63-0 | Šķidr. | 0,3 | Neklas. | Neklas. |
| 4-metiltiobenzaldehīds | 3446-89-7 | Šķidr. | 1 | 2. kat. | Neklas. |
| metilstearāts | 112-61-8 | Cietv. | 1 | Neklas. | Neklas. |
| heptilbutirāts | 5870-93-9 | Šķidr. | 1,7 | Neklas. | Neklas. |
| heksilsalicilāts | 6259-76-3 | Šķidr. | 2 | Neklas. | Neklas. |
| kanēļskābes aldehīds | 104-55-2 | Šķidr. | 2 | 2. kat. | Neklas.
  (Fakult. 3. kat.) (15) |
| 1-dekanols
   (14) | 112-30-1 | Šķidr. | 2,3 | 2. kat. | 2. kat. |
| ciklamenaldehīds | 103-95-7 | Šķidr. | 2,3 | 2. kat. | 2. kat. |
| 1-bromheksāns | 111-25-1 | Šķidr. | 2,7 | 2. kat. | 2. kat. |
| 2-hlormetil-3,5-dimetil-4-metoksipiridīna hidrohlorīds | 86604-75-3 | Cietv. | 2,7 | 2. kat. | 2. kat. |
| di-n-propildisulfīds
   (14) | 629-19-6 | Šķidr. | 3 | Neklas. | 2. kat. |
| kālija hidroksīds (5 % ūd.) | 1310-58-3 | Šķidr. | 3 | 2. kat. | 2. kat. |
| 5-(1,1-dimetiletil)-2-metilbenzotiols | 7340-90-1 | Šķidr. | 3,3 | 2. kat. | 2. kat. |
| 1-metil-3-fenil-1-piperazīns | 5271-27-2 | Cietv. | 3,3 | 2. kat. | 2. kat. |
| heptanāls | 111-71-7 | Šķidr. | 3,4 | 2. kat. | 2. kat. |
| tetrahloretilēns | 127-18-4 | Šķidr. | 4 | 2. kat. | 2. kat. |

7.

References vielas izmanto, lai noteiktu, vai ierosināta vai modificēta metode, kura, kā pierādīts, strukturāli un funkcionāli ir pietiekami līdzīga VRM vai kura būtībā ir viena no trijām validētajām metodēm, tikai nedaudz modificētā veidā, ticamības un pareizības ziņā ir salīdzināma ar VRM vai ir labāka par to (2) (8) (16) (23). Ieteicamās 20 references vielas, kas uzskaitītas 1. tabulā, aptver dažādas ķīmisko vielu klases (t. i., ķīmisko vielu kategorijas atkarībā no to funkcionālajām grupām) un tās ir visam Dreiza [Draize] ādas kairinājuma reakcijas intervālam reprezentatīvas (no nekairinošām līdz stipri kairinošām). Minētajā sarakstā ir 10 ANO GHS/ES CLP 2. kategorijas ķīmiskās vielas un 10 neklasificētas ķīmiskās vielas, no kurām 3 ir fakultatīvās ANO GHS 3. kategorijas ķīmiskās vielas. Pēc šīs testēšanas metodes atsevišķi neklasificē vielas, ko var klasificēt ANO GHS 3. kategorijā. 1. tabulā uzskaitītās ķīmiskās vielas ir atlasītas no vielām, kuras izmantotas prevalidēšanai sekojošajā optimizācijas fāzē un VRM validēšanas pētījumā, ievērojot šo vielu funkcionālās īpašības un fizikālo stāvokli (14) (18). Šīs references vielas ir minimālais ķīmisko vielu daudzums, kas izmantojams, lai novērtētu ierosinātas līdzīgas vai modificētas metodes pareizību un ticamību, taču tās nav jāizmanto jaunu metožu izstrādē. Gadījumos, kad kāda no norādītajām ķīmiskajām vielām nav pieejama, var izmantot citas ķīmiskās vielas, par kurām ir pieejami atbilstoši references dati, kas iegūti in vivo izmēģinājumos, priekšroku dodot vielām, kuras izmantotas prevalidēšanai sekojošajā optimizācijas fāzē vai VRM validēšanas pētījumā. Ja nepieciešams, ierosinātās metodes pareizības tālākai novērtēšanai papildus obligātajam references vielu kopumam var izmantot citām ķīmisko vielu klasēm piederošas vielas, par kurām ir pieejami atbilstoši references dati, kas iegūti in vivo izmēģinājumos.

1.   tabula

Obligātās references vielas pareizības un ticamības vērtību noteikšanai līdzīgām vai modificētām RhE ādas kairinājuma noteikšanas metodēm
   (13)

Ķīmiskā viela

CAS Nr.

Fizikālais stāvoklis

In vivo reakcija

VRM in vitro kat.

ANO GHS/ES CLP in vivo kat.

1-brom-4-hlorbutāns

6940-78-9

Šķidr.

0

2. kat.

Neklas.

dietilftalāts

84-66-2

Šķidr.

0

Neklas.

Neklas.

naftalīnetiķskābe

86-87-3

Cietv.

0

Neklas.

Neklas.

alilfenoksiacetāts

7493-74-5

Šķidr.

0,3

Neklas.

Neklas.

izopropanols

67-63-0

Šķidr.

0,3

Neklas.

Neklas.

4-metiltiobenzaldehīds

3446-89-7

Šķidr.

1

2. kat.

Neklas.

metilstearāts

112-61-8

Cietv.

1

Neklas.

Neklas.

heptilbutirāts

5870-93-9

Šķidr.

1,7

Neklas.

Neklas.

heksilsalicilāts

6259-76-3

Šķidr.

2

Neklas.

Neklas.

kanēļskābes aldehīds

104-55-2

Šķidr.

2

2. kat.

Neklas.

(Fakult. 3. kat.) (15)

1-dekanols
   (14)

112-30-1

Šķidr.

2,3

2. kat.

2. kat.

ciklamenaldehīds

103-95-7

Šķidr.

2,3

2. kat.

2. kat.

1-bromheksāns

111-25-1

Šķidr.

2,7

2. kat.

2. kat.

2-hlormetil-3,5-dimetil-4-metoksipiridīna hidrohlorīds

86604-75-3

Cietv.

2,7

2. kat.

2. kat.

di-n-propildisulfīds
   (14)

629-19-6

Šķidr.

3

Neklas.

2. kat.

kālija hidroksīds (5 % ūd.)

1310-58-3

Šķidr.

3

2. kat.

2. kat.

5-(1,1-dimetiletil)-2-metilbenzotiols

7340-90-1

Šķidr.

3,3

2. kat.

2. kat.

1-metil-3-fenil-1-piperazīns

5271-27-2

Cietv.

3,3

2. kat.

2. kat.

heptanāls

111-71-7

Šķidr.

3,4

2. kat.

2. kat.

tetrahloretilēns

127-18-4

Šķidr.

4

2. kat.

2. kat.

III.   Definētās ticamības un pareizības vērtības

| 8. | Lai noteiktu ierosināto līdzīgo vai modificēto metožu ticamību un piemērotību starplaboratoriskai izmantošanai, vismaz trijās laboratorijās jānotestē visas 20 references vielas, kas uzskaitītas 1. tabulā. Tomēr, ja ierosināto metodi izmantos tikai vienā laboratorijā, testēšana daudzās laboratorijās šīs metodes validēšanai nav nepieciešama. Būtiski svarīgi tomēr ir tas, lai šādus validācijas pētījumus saskaņā ar starptautiskām vadlīnijām izvērtētu neatkarīgas, starptautiski atzītas validācijas struktūras (9). Katrā laboratorijā visas 20 references vielas jātestē trijās neatkarīgās testēšanas sērijās, kuras veic ar atšķirīgu partiju audiem un ar pietiekami ilgstošiem starplaikiem. Katrā sērijā vienlaikus jātestē vismaz trīs audu paraugu atkārtojumi katrai testējamai vielai, NC un PC. |
| --- | --- |

8.

Lai noteiktu ierosināto līdzīgo vai modificēto metožu ticamību un piemērotību starplaboratoriskai izmantošanai, vismaz trijās laboratorijās jānotestē visas 20 references vielas, kas uzskaitītas 1. tabulā. Tomēr, ja ierosināto metodi izmantos tikai vienā laboratorijā, testēšana daudzās laboratorijās šīs metodes validēšanai nav nepieciešama. Būtiski svarīgi tomēr ir tas, lai šādus validācijas pētījumus saskaņā ar starptautiskām vadlīnijām izvērtētu neatkarīgas, starptautiski atzītas validācijas struktūras (9). Katrā laboratorijā visas 20 references vielas jātestē trijās neatkarīgās testēšanas sērijās, kuras veic ar atšķirīgu partiju audiem un ar pietiekami ilgstošiem starplaikiem. Katrā sērijā vienlaikus jātestē vismaz trīs audu paraugu atkārtojumi katrai testējamai vielai, NC un PC.

| 9. | Lai nodrošinātu to, ka ticamības un piemērotības vērtības tiek aprēķinātas iepriekš noteiktā un konsekventā veidā, ierosinātās metodes ticamību un pareizumu aprēķina, ņemot vērā visus četrus turpmāk minētos kritērijus kopā:






  1. | Iekšlaboratorijas un starplaboratoriju variāciju un prognozēšanas spējas (pareizības) aprēķināšanai izmantojami tikai dati no pilnīgām testēšanas sērijām. |
| --- | --- | --- |

9.

Lai nodrošinātu to, ka ticamības un piemērotības vērtības tiek aprēķinātas iepriekš noteiktā un konsekventā veidā, ierosinātās metodes ticamību un pareizumu aprēķina, ņemot vērā visus četrus turpmāk minētos kritērijus kopā:

1.

Iekšlaboratorijas un starplaboratoriju variāciju un prognozēšanas spējas (pareizības) aprēķināšanai izmantojami tikai dati no pilnīgām testēšanas sērijām.

| 2. | Katras references vielas galīgo klasifikāciju katrā attiecīgajā laboratorijā nosaka pēc šūnu dzīvotspējas vidējās vērtības, kas noteikta vairākām testējamo paraugu sērijām pilnīgā testēšanas sērijā. |
| --- | --- |

2.

Katras references vielas galīgo klasifikāciju katrā attiecīgajā laboratorijā nosaka pēc šūnu dzīvotspējas vidējās vērtības, kas noteikta vairākām testējamo paraugu sērijām pilnīgā testēšanas sērijā.

| 3. | Lai aprēķinātu metodes starplaboratoriju variāciju, izmantojami tikai dati par vielām, kurām visās attiecīgajās laboratorijās veiktas pilnīgas testēšanas sērijas. |
| --- | --- |

3.

Lai aprēķinātu metodes starplaboratoriju variāciju, izmantojami tikai dati par vielām, kurām visās attiecīgajās laboratorijās veiktas pilnīgas testēšanas sērijas.

| 4. | Pareizības vērtības aprēķina, pamatojoties uz individuālu laboratoriju prognozi par visām 20 references vielām, kura izveidota dažādās attiecīgajās laboratorijās. |
| --- | --- |

4.

Pareizības vērtības aprēķina, pamatojoties uz individuālu laboratoriju prognozi par visām 20 references vielām, kura izveidota dažādās attiecīgajās laboratorijās.

Šajā kontekstā testēšanas sērija ir trīs neatkarīgas testēšanas reizes, ko vienā laboratorijā veic vienai testējamai ķīmiskai vielai. Pilnīga testēšanas sērija ir testēšanas sērija, kuru vienā laboratorijā veic vienai testējamai ķīmiskai vielai un kurā visās trijās testēšanas reizēs iegūts derīgs rezultāts. Tas nozīmē, ka viena testēšanas reize, kurā iegūts nederīgs rezultāts, padara nederīgu visu testēšanas sēriju, kas sastāv no trijām testēšanas reizēm.

Iekšlaboratorijas reproducējamība

| 10. | Iekšlaboratorijas reproducējamībai jābūt tādai, ka pēc vienā laboratorijā dažādās neatkarīgās 20 references vielu testēšanas sērijās iegūtajiem rezultātiem noteiktās vielu klasifikācijas (ANO GHS/ES CLP 2. kat./neklas.) sakritība ir vienāda vai lielāka (≥) par 90 %. |
| --- | --- |

10.

Iekšlaboratorijas reproducējamībai jābūt tādai, ka pēc vienā laboratorijā dažādās neatkarīgās 20 references vielu testēšanas sērijās iegūtajiem rezultātiem noteiktās vielu klasifikācijas (ANO GHS/ES CLP 2. kat./neklas.) sakritība ir vienāda vai lielāka (≥) par 90 %.

Starplaboratoriju reproducējamība

| 11. | Starplaboratoriju reproducējamībai nav būtiskas nozīmes gadījumos, kad attiecīgo metodi paredzēts izmantot tikai vienā laboratorijā. Metodēm, kuras paredzēts izmantot vairākās laboratorijās, starplaboratoriju reproducējamībai ir jābūt tādai, ka pēc vismaz trijās laboratorijās dažādās neatkarīgās 20 references vielu testēšanas sērijās iegūtajiem rezultātiem noteiktās vielu klasifikācijas (ANO GHS/ES CLP 2. kat./neklas.) sakritība ir vienāda vai lielāka (≥) par 80 %. |
| --- | --- |

11.

Starplaboratoriju reproducējamībai nav būtiskas nozīmes gadījumos, kad attiecīgo metodi paredzēts izmantot tikai vienā laboratorijā. Metodēm, kuras paredzēts izmantot vairākās laboratorijās, starplaboratoriju reproducējamībai ir jābūt tādai, ka pēc vismaz trijās laboratorijās dažādās neatkarīgās 20 references vielu testēšanas sērijās iegūtajiem rezultātiem noteiktās vielu klasifikācijas (ANO GHS/ES CLP 2. kat./neklas.) sakritība ir vienāda vai lielāka (≥) par 80 %.

Prognozēšanas spēja (pareizība)

| 12. | Ierosinātās līdzīgās vai modificētās metodes precizitātei (jutība, specifiskums un kopējā pareizība) jābūt tādai pašai vai labākai nekā VRM, ņemot vērā papildu informāciju par metodes piemērotību pētāmajai sugai (2. tabula). Jutībai jābūt vienādai vai lielākai (≥) par 80 % (2) (8) (23). Tomēr pastāv vēl viens konkrēts ierobežojums attiecībā uz ierosinātās in vitro metodes jutību, proti, tikai divas in vivo 2. kategorijas ķīmiskās vielas, 1-dekanols un di-n-propildisulfīds, drīkst tikt kļūdaini identificētas kā neklasificētas vielas vairāk nekā vienā attiecīgajā laboratorijā. Specifiskumam jābūt vienādam vai lielākam (≥) par 70 % (2) (8) (23). Citu ierobežojumu attiecībā uz ierosinātās in vitro metodes specifiskumu nav, t. i., attiecīgā laboratorija drīkst kļūdaini identificēt in vivo neklasificētu ķīmisku vielu, kamēr vien testēšanas metodes specifiskuma galīgā vērtība paliek pieņemamajā diapazonā. Kopējai pareizībai jābūt vienādai vai lielākai (≥) par 75 % (2) (8) (23). Kaut arī VRM jutība, kas aprēķināta 20 references vielām, kuras uzskaitītas 1. tabulā, ir 90 %, definētā minimālās jutības vērtība, lai līdzīgu vai modificētu metodi uzskatītu par derīgu, ir 80 %, jo ir zināms, ka gan 1-dekanols (robežai tuvs rezultāts), gan di-n-propildisulfīds (šķietams negatīvs VRM) cilvēkam nav kairinoši (31) (32) (33), toties testēšanā ar trušiem tie identificēti kā kairinošas vielas. Tā kā RhE modeļos izmanto cilvēka izcelsmes šūnas, ar tiem var prognozēt šo ķīmisko vielu nekairinošo iedabu (ANO GHS/ES CLP neklas.).

  2.   tabula


  Prasītās jutības, specifiskuma un kopējās pareizības prognozētspējas vērtības, lai līdzīgu vai modificētu metodi uzskatītu par derīgu








  Jutība | Specifiskums | Kopējā pareizība |
| --- | --- | --- | --- |
| ≥ 80 % | ≥ 70 % | ≥ 75 % |

12.

Ierosinātās līdzīgās vai modificētās metodes precizitātei (jutība, specifiskums un kopējā pareizība) jābūt tādai pašai vai labākai nekā VRM, ņemot vērā papildu informāciju par metodes piemērotību pētāmajai sugai (2. tabula). Jutībai jābūt vienādai vai lielākai (≥) par 80 % (2) (8) (23). Tomēr pastāv vēl viens konkrēts ierobežojums attiecībā uz ierosinātās in vitro metodes jutību, proti, tikai divas in vivo 2. kategorijas ķīmiskās vielas, 1-dekanols un di-n-propildisulfīds, drīkst tikt kļūdaini identificētas kā neklasificētas vielas vairāk nekā vienā attiecīgajā laboratorijā. Specifiskumam jābūt vienādam vai lielākam (≥) par 70 % (2) (8) (23). Citu ierobežojumu attiecībā uz ierosinātās in vitro metodes specifiskumu nav, t. i., attiecīgā laboratorija drīkst kļūdaini identificēt in vivo neklasificētu ķīmisku vielu, kamēr vien testēšanas metodes specifiskuma galīgā vērtība paliek pieņemamajā diapazonā. Kopējai pareizībai jābūt vienādai vai lielākai (≥) par 75 % (2) (8) (23). Kaut arī VRM jutība, kas aprēķināta 20 references vielām, kuras uzskaitītas 1. tabulā, ir 90 %, definētā minimālās jutības vērtība, lai līdzīgu vai modificētu metodi uzskatītu par derīgu, ir 80 %, jo ir zināms, ka gan 1-dekanols (robežai tuvs rezultāts), gan di-n-propildisulfīds (šķietams negatīvs VRM) cilvēkam nav kairinoši (31) (32) (33), toties testēšanā ar trušiem tie identificēti kā kairinošas vielas. Tā kā RhE modeļos izmanto cilvēka izcelsmes šūnas, ar tiem var prognozēt šo ķīmisko vielu nekairinošo iedabu (ANO GHS/ES CLP neklas.).

2.   tabula

Prasītās jutības, specifiskuma un kopējās pareizības prognozētspējas vērtības, lai līdzīgu vai modificētu metodi uzskatītu par derīgu

Jutība

Specifiskums

Kopējā pareizība

≥ 80 %

≥ 70 %

≥ 75 %

Pētījuma rezultātu pieņemamības kritēriji

| 13. | Iespējams, ka vienā vai vairākos testos ar vienu vai vairākām testējamām vielām tiek/netiek izpildīti testēšanas pieņemamības kritēriji testējamām un kontroles vielām vai ka šie testi ir/nav pieņemami citu iemeslu dēļ. Lai iegūtu trūkstošos datus, pieļaujams katru testējamo vielu testēt ne vairāk kā vēl divas reizes (“atkārtota testēšana”). Precīzāk, tā kā atkārtotas testēšanas gadījumā vienlaikus jātestē arī PC un NC, katrai testējamai vielai maksimāli pieļaujamas divas papildu testēšanas sērijas. |
| --- | --- |

13.

Iespējams, ka vienā vai vairākos testos ar vienu vai vairākām testējamām vielām tiek/netiek izpildīti testēšanas pieņemamības kritēriji testējamām un kontroles vielām vai ka šie testi ir/nav pieņemami citu iemeslu dēļ. Lai iegūtu trūkstošos datus, pieļaujams katru testējamo vielu testēt ne vairāk kā vēl divas reizes (“atkārtota testēšana”). Precīzāk, tā kā atkārtotas testēšanas gadījumā vienlaikus jātestē arī PC un NC, katrai testējamai vielai maksimāli pieļaujamas divas papildu testēšanas sērijas.

| 14. | Jādomā, ka pat pēc atkārtotas testēšanas var būt tā, ka nevar katrai testējamai vielai nodrošināt prasītās trīs derīgās testēšanas sērijas ar katru references vielu katrā attiecīgajā laboratorijā, un rezultāts ir nepilnīga datu matrica. Šādos gadījumos datu kopas uzskata par pieņemamām tad, ja ir izpildīti visi trīs turpmāk minētie kritēriji.






  1. | Par katru no 20 references vielām jābūt vismaz vienai pilnīgai testēšanas sērijai. |
| --- | --- | --- |

14.

Jādomā, ka pat pēc atkārtotas testēšanas var būt tā, ka nevar katrai testējamai vielai nodrošināt prasītās trīs derīgās testēšanas sērijas ar katru references vielu katrā attiecīgajā laboratorijā, un rezultāts ir nepilnīga datu matrica. Šādos gadījumos datu kopas uzskata par pieņemamām tad, ja ir izpildīti visi trīs turpmāk minētie kritēriji.

1.

Par katru no 20 references vielām jābūt vismaz vienai pilnīgai testēšanas sērijai.

| 2. | Katrā no vismaz trim attiecīgajām laboratorijām jānodrošina, ka vismaz 85 % testēšanas sēriju ir pilnīgas (20 ķīmiskām vielām, t. i., vienā laboratorijā nederīgas drīkst būt trīs testēšanas sērijas). |
| --- | --- |

2.

Katrā no vismaz trim attiecīgajām laboratorijām jānodrošina, ka vismaz 85 % testēšanas sēriju ir pilnīgas (20 ķīmiskām vielām, t. i., vienā laboratorijā nederīgas drīkst būt trīs testēšanas sērijas).

| 3. | Vismaz 90 % visu iespējamo testēšanas sēriju no vismaz trim laboratorijām jābūt pilnīgām (20 ķīmiskām vielām, kas testētas trijās laboratorijās, t. i., nederīgas drīkst būt kopumā sešas testēšanas sērijas).; |
| --- | --- |

3.

Vismaz 90 % visu iespējamo testēšanas sēriju no vismaz trim laboratorijām jābūt pilnīgām (20 ķīmiskām vielām, kas testētas trijās laboratorijās, t. i., nederīgas drīkst būt kopumā sešas testēšanas sērijas).;

| 3) | Pievieno šādas nodaļas:
  “B.49.   
  IN VITRO ZĪDĪTĀJU ŠŪNU MIKROKODOLU TESTS

  IEVADS






  1. | In vitro mikrokodolu (MNvit) noteikšana ir genotoksicitātes tests mikrokodolu (MN) noteikšanai starpfāzu šūnu citoplazmā. Mikrokodoli var būt no acentriskiem hromosomu fragmentiem (t. i., tādiem, kuriem nav centromēra) vai no veselām hromosomām, kuras šūnu dalīšanās anafāzē nespēj atvirzīties uz šūnas poliem. Noteikšanā reģistrē klastogēno un aneigēno ķīmisko vielu (substanču un maisījumu) (1) (2) aktivitāti šūnās, kurās testējamās vielas iedarbības laikā vai pēc tās ir notikusi šūnu dalīšanās. Šī testēšanas metode (TM) ļauj izmantot testēšanas protokolu ar aktīna polimerizācijas inhibitoru citotalazīnu B (cytoB) vai bez tā. CytoB pievienošana pirms mērķmitozes ļauj identificēt un selektīvi analizēt mikrokodolu sastopamību šūnās, kurās noslēdzies viens mitozes cikls (jo šādās šūnās ir divi kodoli) (3) (4). Turklāt, ja ir pierādījumi tam, ka analizējamā šūnu populācijā ir notikusi mitoze, šī TM ļauj izmantot testēšanas protokolus, kuri neparedz citokinēzes bloķēšanu. |
| --- | --- | --- |

3)

Pievieno šādas nodaļas:

“B.49.   
  IN VITRO ZĪDĪTĀJU ŠŪNU MIKROKODOLU TESTS

B.49.

IN VITRO

IEVADS

1.

In vitro mikrokodolu (MNvit) noteikšana ir genotoksicitātes tests mikrokodolu (MN) noteikšanai starpfāzu šūnu citoplazmā. Mikrokodoli var būt no acentriskiem hromosomu fragmentiem (t. i., tādiem, kuriem nav centromēra) vai no veselām hromosomām, kuras šūnu dalīšanās anafāzē nespēj atvirzīties uz šūnas poliem. Noteikšanā reģistrē klastogēno un aneigēno ķīmisko vielu (substanču un maisījumu) (1) (2) aktivitāti šūnās, kurās testējamās vielas iedarbības laikā vai pēc tās ir notikusi šūnu dalīšanās. Šī testēšanas metode (TM) ļauj izmantot testēšanas protokolu ar aktīna polimerizācijas inhibitoru citotalazīnu B (cytoB) vai bez tā. CytoB pievienošana pirms mērķmitozes ļauj identificēt un selektīvi analizēt mikrokodolu sastopamību šūnās, kurās noslēdzies viens mitozes cikls (jo šādās šūnās ir divi kodoli) (3) (4). Turklāt, ja ir pierādījumi tam, ka analizējamā šūnu populācijā ir notikusi mitoze, šī TM ļauj izmantot testēšanas protokolus, kuri neparedz citokinēzes bloķēšanu.

In vitro

MNvit

cytoB

CytoB

| 2. | Papildus MNvit noteikšanas izmantojumam mikrokodolus inducējošu ķīmisku vielu (substanču un maisījumu) identificēšanai ir vēl citi noderīgi paņēmieni, kā iegūt informāciju par hromosomu bojājumu mehānismiem un mikrokodolu veidošanos, piemēram, citokinēzes bloķēšana, kinetohoru imūnķīmiskā iezīmēšana vai hibridizēšana ar centromēru/telomēru zondēm (fluorescenta in situ hibridizēšana, FISH) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). Iezīmēšanas un hibridizēšanas procedūras var izmantot, ja pastiprinās mikrokodolu veidošanās un pētnieks vēlas noskaidrot, vai šā pastiprinājuma izraisītāja iedaba ir klastogēna un/vai aneigēna. |
| --- | --- |

2.

Papildus MNvit noteikšanas izmantojumam mikrokodolus inducējošu ķīmisku vielu (substanču un maisījumu) identificēšanai ir vēl citi noderīgi paņēmieni, kā iegūt informāciju par hromosomu bojājumu mehānismiem un mikrokodolu veidošanos, piemēram, citokinēzes bloķēšana, kinetohoru imūnķīmiskā iezīmēšana vai hibridizēšana ar centromēru/telomēru zondēm (fluorescenta in situ hibridizēšana, FISH) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). Iezīmēšanas un hibridizēšanas procedūras var izmantot, ja pastiprinās mikrokodolu veidošanās un pētnieks vēlas noskaidrot, vai šā pastiprinājuma izraisītāja iedaba ir klastogēna un/vai aneigēna.

MNvit

in situ

FISH

| 3. | Mikrokodoli reprezentē meitasšūnām nodotos bojājumus, bet metafāzes šūnās uzskaitītās hromosomu aberācijas tālāk nodotas netiek. Tā kā mikrokodolu novērtējums interfāzes šūnās var būt relatīvi objektīvs, laboratorijas personāla vienīgais uzdevums ir noteikt, vai šūnās ir notikusi dalīšanās un cik daudz ir šūnu, kas satur mikrokodolu. Rezultātā uzskaiti preparātos iespējams paveikt relatīvi ātri, un analīzi var automatizēt. Tāpēc ir praktiski iespējams vienā apstrādes reizē uzskaitīt tūkstošiem, nevis simtiem šūnu un tādā veidā palielināt noteikšanas nozīmību. Visbeidzot, tā kā mikrokodoli var izveidoties no salīpošām hromosomām, ar šo metodi potenciāli var detektēt aneiploīdiju ierosinošos aģentus, kurus ir sarežģīti pētīt ar parastajiem hromosomu aberācijas testiem (piemēram, ESAO 473. testēšanas vadlīnijas; šā pielikuma B.10. nodaļa) (17). Tomēr ar MNvit noteikšanu, ja neizmanto tādus īpašus paņēmienus kā 2. punktā aprakstītais FISH, nav iespējams diferencēt poliploīdiju un klastogenitāti inducējošas ķīmiskas vielas. |
| --- | --- |

3.

Mikrokodoli reprezentē meitasšūnām nodotos bojājumus, bet metafāzes šūnās uzskaitītās hromosomu aberācijas tālāk nodotas netiek. Tā kā mikrokodolu novērtējums interfāzes šūnās var būt relatīvi objektīvs, laboratorijas personāla vienīgais uzdevums ir noteikt, vai šūnās ir notikusi dalīšanās un cik daudz ir šūnu, kas satur mikrokodolu. Rezultātā uzskaiti preparātos iespējams paveikt relatīvi ātri, un analīzi var automatizēt. Tāpēc ir praktiski iespējams vienā apstrādes reizē uzskaitīt tūkstošiem, nevis simtiem šūnu un tādā veidā palielināt noteikšanas nozīmību. Visbeidzot, tā kā mikrokodoli var izveidoties no salīpošām hromosomām, ar šo metodi potenciāli var detektēt aneiploīdiju ierosinošos aģentus, kurus ir sarežģīti pētīt ar parastajiem hromosomu aberācijas testiem (piemēram, ESAO 473. testēšanas vadlīnijas; šā pielikuma B.10. nodaļa) (17). Tomēr ar MNvit noteikšanu, ja neizmanto tādus īpašus paņēmienus kā 2. punktā aprakstītais FISH, nav iespējams diferencēt poliploīdiju un klastogenitāti inducējošas ķīmiskas vielas.

MNvit

FISH

| 4. | MNvit noteikšana ir in vitro metode, kurā parasti izmanto cilvēka vai grauzēju šūnu kultūras. Tā dod visaptverošu pamatu hromosomu bojājumu potenciāla izpētei in vitro, jo ļauj detektēt gan aneigēnus, gan klastogēnus. |
| --- | --- |

4.

MNvit noteikšana ir in vitro metode, kurā parasti izmanto cilvēka vai grauzēju šūnu kultūras. Tā dod visaptverošu pamatu hromosomu bojājumu potenciāla izpētei in vitro, jo ļauj detektēt gan aneigēnus, gan klastogēnus.

MNvit

in vitro

in vitro

| 5. | MNvit noteikšana ir noturīga un efektīva dažādu tipu šūnās, ar cytoB vai bez tā. Bagātīgs datu klāsts apstiprina MNvit noteikšanas derīgumu dažādās grauzēju šūnu līnijās (CHO, V79, CHL/IU un L5178Y) un cilvēka limfocītos (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31). Īpaši jāatzīmē starptautiskie validācijas pētījumi, kuru norisi koordinējusi Francijas Genotoksikoloģijas biedrība [Société Française de Toxicologie Génétique] (SFTG) (18) (19) (20) (21) (22), un Starptautiskā Genotoksikoloģijas darbsemināra materiāli (4) (16). Veicot retrospektīvu validācijas pētījumu, pieejamos datus turklāt pēc zinātnisko pierādījumu nozīmīguma principa atkārtoti izvērtējis Eiropas Komisijas izveidotais Eiropas Alternatīvo metožu validēšanas centrs (ECVAM), un ECVAM zinātniskā padomdevēja komiteja (ESAC) šo testēšanas metodi ir akceptējusi kā zinātniski derīgu (32) (33) (34). Aprakstīta arī cilvēka TK6 limfoblastoīdo šūnu līnijas (35) HepG2 šūnu (36) (37) un Sīrijas kāmja embrija primāro šūnu (38) izmantošana, taču par tām nav bijis validācijas pētījumu. |
| --- | --- |

5.

MNvit noteikšana ir noturīga un efektīva dažādu tipu šūnās, ar cytoB vai bez tā. Bagātīgs datu klāsts apstiprina MNvit noteikšanas derīgumu dažādās grauzēju šūnu līnijās (CHO, V79, CHL/IU un L5178Y) un cilvēka limfocītos (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31). Īpaši jāatzīmē starptautiskie validācijas pētījumi, kuru norisi koordinējusi Francijas Genotoksikoloģijas biedrība [Société Française de Toxicologie Génétique] (SFTG) (18) (19) (20) (21) (22), un Starptautiskā Genotoksikoloģijas darbsemināra materiāli (4) (16). Veicot retrospektīvu validācijas pētījumu, pieejamos datus turklāt pēc zinātnisko pierādījumu nozīmīguma principa atkārtoti izvērtējis Eiropas Komisijas izveidotais Eiropas Alternatīvo metožu validēšanas centrs (ECVAM), un ECVAM zinātniskā padomdevēja komiteja (ESAC) šo testēšanas metodi ir akceptējusi kā zinātniski derīgu (32) (33) (34). Aprakstīta arī cilvēka TK6 limfoblastoīdo šūnu līnijas (35) HepG2 šūnu (36) (37) un Sīrijas kāmja embrija primāro šūnu (38) izmantošana, taču par tām nav bijis validācijas pētījumu.

MNvit

cytoB

MNvit

Société Française de Toxicologie Génétique

SFTG

ECVAM

ECVAM

ESAC

DEFINĪCIJAS

| 6. | Definīcijas skatīt 1. papildinājumā. |
| --- | --- |

6.

Definīcijas skatīt 1. papildinājumā.

SĀKOTNĒJI APSVĒRUMI

| 7. | In vitro testos parasti jāizmanto metaboliskajai aktivācijai eksogēns avots, izņemot ja šūnas attiecībā uz testējamām vielām ir metaboliski kompetentas. Eksogēnā metaboliskās aktivācijas sistēma nav pilnībā identiska in vivo apstākļiem. Jāpievērš uzmanība tam, lai novērstu apstākļus, kuros iegūst šķietami pozitīvus rezultātus, kas neliecina par testējamai vielai piemītošu mutagenitāti, bet kuru cēlonis ir vērā ņemamas izmaiņas pH vai osmozē vai paaugstināta citotoksicitāte (39) (40) (41). Ja testējamā viela tās pievienošanas laikā izmaina barotnes pH, tas jākoriģē, ieteicams, ar buferšķīdumu, ko pievieno izejas standartšķīdumam, lai pH visos tilpumos, koncentrācijās un barotnēs būtu vienāds. |
| --- | --- |

7.

In vitro testos parasti jāizmanto metaboliskajai aktivācijai eksogēns avots, izņemot ja šūnas attiecībā uz testējamām vielām ir metaboliski kompetentas. Eksogēnā metaboliskās aktivācijas sistēma nav pilnībā identiska in vivo apstākļiem. Jāpievērš uzmanība tam, lai novērstu apstākļus, kuros iegūst šķietami pozitīvus rezultātus, kas neliecina par testējamai vielai piemītošu mutagenitāti, bet kuru cēlonis ir vērā ņemamas izmaiņas pH vai osmozē vai paaugstināta citotoksicitāte (39) (40) (41). Ja testējamā viela tās pievienošanas laikā izmaina barotnes pH, tas jākoriģē, ieteicams, ar buferšķīdumu, ko pievieno izejas standartšķīdumam, lai pH visos tilpumos, koncentrācijās un barotnēs būtu vienāds.

In vitro

in vivo

| 8. | Mikrokodolu indukcijas analīzē izšķiroša nozīme ir tam, lai apstrādātajās un neapstrādātajās kultūrās būtu notikusi mitoze. Mikrokodolu uzskaitei labākais laiks ir tad, kad testējamās vielas pievienošanas laikā vai pēc tam šūnās ir noslēgusies viena mitoze. |
| --- | --- |

8.

Mikrokodolu indukcijas analīzē izšķiroša nozīme ir tam, lai apstrādātajās un neapstrādātajās kultūrās būtu notikusi mitoze. Mikrokodolu uzskaitei labākais laiks ir tad, kad testējamās vielas pievienošanas laikā vai pēc tam šūnās ir noslēgusies viena mitoze.

METODES PRINCIPS

| 9. | Uz cilvēka vai zīdītāju izcelsmes šūnu kultūrām iedarbojas ar testējamo vielu, izmantojot eksogēnu metaboliskās aktivācijas avotu un arī bez tā, izņemot ja lieto šūnas ar adekvātu metabolisko kapacitāti. Visos testos izmanto vienlaicīgas šķīdinātāja/nesēja kontroles (VC) un pozitīvās kontroles (PC) ķīmiskās vielas. |
| --- | --- |

9.

Uz cilvēka vai zīdītāju izcelsmes šūnu kultūrām iedarbojas ar testējamo vielu, izmantojot eksogēnu metaboliskās aktivācijas avotu un arī bez tā, izņemot ja lieto šūnas ar adekvātu metabolisko kapacitāti. Visos testos izmanto vienlaicīgas šķīdinātāja/nesēja kontroles (VC) un pozitīvās kontroles (PC) ķīmiskās vielas.

| 10. | Uz šūnām iedarbojas ar testējamo vielu, un iedarbības laikā vai pēc tās šūnas kultivē pietiekami ilgu laiku, lai hromosomu vai vārpstiņas bojājumi izraisītu mikrokodolu veidošanos starpfāzu šūnās. Lai inducētu aneiploīdiju, parasti mitozei jānotiek testējamās vielas klātbūtnē. Savāktās un iekrāsotās starpfāzu šūnas analizē, lai tajās noteiktu mikrokodolu esību. Ideālā gadījumā mikrokodoli jāuzskaita tikai tajās šūnās, kurās mitoze noslēgusies testējamās vielas iedarbības laikā vai pēciedarbības periodā, ja tāds ir. Ar citokinēzes bloķētāju apstrādātās kultūrās uzskaita tikai divkodolu šūnas. Ja citokinēzes bloķētājs nav lietots, ir svarīgi parādīt, ka analizētajās šūnās, visticamāk, ir notikusi šūnu dalīšanās testējamās vielas iedarbības laikā vai pēc tās. Attiecībā uz visiem protokoliem ir svarīgi parādīt, ka šūnu savairošanās ir notikusi gan kontroles, gan apstrādātajā kultūrā; kultūrās, kurās uzskaita mikrokodolus (vai paralēlajās kultūrās), jānovērtē testējamās vielas inducētās citotoksicitātes vai citostāzes pakāpe. |
| --- | --- |

10.

Uz šūnām iedarbojas ar testējamo vielu, un iedarbības laikā vai pēc tās šūnas kultivē pietiekami ilgu laiku, lai hromosomu vai vārpstiņas bojājumi izraisītu mikrokodolu veidošanos starpfāzu šūnās. Lai inducētu aneiploīdiju, parasti mitozei jānotiek testējamās vielas klātbūtnē. Savāktās un iekrāsotās starpfāzu šūnas analizē, lai tajās noteiktu mikrokodolu esību. Ideālā gadījumā mikrokodoli jāuzskaita tikai tajās šūnās, kurās mitoze noslēgusies testējamās vielas iedarbības laikā vai pēciedarbības periodā, ja tāds ir. Ar citokinēzes bloķētāju apstrādātās kultūrās uzskaita tikai divkodolu šūnas. Ja citokinēzes bloķētājs nav lietots, ir svarīgi parādīt, ka analizētajās šūnās, visticamāk, ir notikusi šūnu dalīšanās testējamās vielas iedarbības laikā vai pēc tās. Attiecībā uz visiem protokoliem ir svarīgi parādīt, ka šūnu savairošanās ir notikusi gan kontroles, gan apstrādātajā kultūrā; kultūrās, kurās uzskaita mikrokodolus (vai paralēlajās kultūrās), jānovērtē testējamās vielas inducētās citotoksicitātes vai citostāzes pakāpe.

METODES APRAKSTS

Preparāti

Preparāti

| 11. | Var izmantot kultivētus primāros cilvēka perifēro asinsvadu limfocītus (5) (19) (42) (43) un vairākas grauzēju šūnu līnijas, piemēram, CHO, V79, CHL/IU, un L5178Y šūnas (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). Ja izmanto citas šūnu līnijas un tipus, tas jāpamato ar uzskatāmi parādītu veiktspēju, kā aprakstīts iedaļā par pieņemamības kritērijiem. Mikrokodolu sastopamības biežums ietekmēs testa jutību, un tāpēc ieteicams izmantot šūnu tipus ar zemiem, stabiliem mikrokodolu veidošanās biežuma rādītājiem. |
| --- | --- |

11.

Var izmantot kultivētus primāros cilvēka perifēro asinsvadu limfocītus (5) (19) (42) (43) un vairākas grauzēju šūnu līnijas, piemēram, CHO, V79, CHL/IU, un L5178Y šūnas (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). Ja izmanto citas šūnu līnijas un tipus, tas jāpamato ar uzskatāmi parādītu veiktspēju, kā aprakstīts iedaļā par pieņemamības kritērijiem. Mikrokodolu sastopamības biežums ietekmēs testa jutību, un tāpēc ieteicams izmantot šūnu tipus ar zemiem, stabiliem mikrokodolu veidošanās biežuma rādītājiem.

| 12. | Cilvēka perifēro asinsvadu limfocīti jāiegūst no jauniem cilvēkiem (aptuveni 18–35 gadus veciem), kas ir veselīgi, nesmēķētāji un nav nesen bijuši saskarē ar genotoksisku ķīmisku vielu vai starojumu. Ja izmanto šūnas no vairāk nekā viena donora, jānorāda donoru skaits. Mikrokodolu sastopamības biežums palielinās līdz ar vecumu, un šī tendence ir izteiktāka sievietēm nekā vīriešiem (44); tas jāņem vērā, izvēloties grupējamās donoru šūnas. |
| --- | --- |

12.

Cilvēka perifēro asinsvadu limfocīti jāiegūst no jauniem cilvēkiem (aptuveni 18–35 gadus veciem), kas ir veselīgi, nesmēķētāji un nav nesen bijuši saskarē ar genotoksisku ķīmisku vielu vai starojumu. Ja izmanto šūnas no vairāk nekā viena donora, jānorāda donoru skaits. Mikrokodolu sastopamības biežums palielinās līdz ar vecumu, un šī tendence ir izteiktāka sievietēm nekā vīriešiem (44); tas jāņem vērā, izvēloties grupējamās donoru šūnas.

Barotne un kultivēšanas apstākļi

| 13. | Kultūru uzturēšanai lieto piemērotas barotnes un ievēro atbilstošus kultivēšanas apstākļus (trauki kultūrām, CO2 koncentrācija, temperatūra un mitrums). Stabilām šūnu līnijām un celmiem regulāri jāpārbauda modālo hromosomu skaita stabilitāte un mikoplazmas neesība, un tos nedrīkst izmantot, ja konstatē mikoplazmu vai ja modālo hromosomu skaits ir mainījies. Jāzina, kāds ir normālais šūnas cikla laiks kultivēšanas apstākļos, ko izmanto testēšanas laboratorijā. Ja izmanto citokinēzes bloķēšanas paņēmienu, citokinēzes inhibitora koncentrācija jāoptimizē konkrētajam šūnu tipam un jāizraugās tāda, par kuru zināms, ka uzskaites vajadzībām tā dod labu divkodolu šūnu iznākumu. |
| --- | --- |

13.

Kultūru uzturēšanai lieto piemērotas barotnes un ievēro atbilstošus kultivēšanas apstākļus (trauki kultūrām, CO2 koncentrācija, temperatūra un mitrums). Stabilām šūnu līnijām un celmiem regulāri jāpārbauda modālo hromosomu skaita stabilitāte un mikoplazmas neesība, un tos nedrīkst izmantot, ja konstatē mikoplazmu vai ja modālo hromosomu skaits ir mainījies. Jāzina, kāds ir normālais šūnas cikla laiks kultivēšanas apstākļos, ko izmanto testēšanas laboratorijā. Ja izmanto citokinēzes bloķēšanas paņēmienu, citokinēzes inhibitora koncentrācija jāoptimizē konkrētajam šūnu tipam un jāizraugās tāda, par kuru zināms, ka uzskaites vajadzībām tā dod labu divkodolu šūnu iznākumu.

2

Šūnu kultūru sagatavošana

| 14. | Stabilas šūnu līnijas un celmi: šūnas pavairo no pamatkultūrām, izsēj barotnē tādā blīvumā, lai kultūras nesaplūstu monoslānī un lai suspensiju kultūras nesasniegtu pārmērīgu blīvumu pirms šūnu savākšanas, un inkubē 37 °C temperatūrā. |
| --- | --- |

14.

Stabilas šūnu līnijas un celmi: šūnas pavairo no pamatkultūrām, izsēj barotnē tādā blīvumā, lai kultūras nesaplūstu monoslānī un lai suspensiju kultūras nesasniegtu pārmērīgu blīvumu pirms šūnu savākšanas, un inkubē 37 °C temperatūrā.

| 15. | Limfocīti: pilnu asins sastāvu, kas apstrādāts ar antikoagulantu (piemēram, heparīnu), vai tikai limfocītus kultivē, klātesot mitogēnam, piemēram, fitohemaglutinīnam (PHA), un tad uz to iedarbojas ar testējamo vielu un ar cytoB. |
| --- | --- |

15.

Limfocīti: pilnu asins sastāvu, kas apstrādāts ar antikoagulantu (piemēram, heparīnu), vai tikai limfocītus kultivē, klātesot mitogēnam, piemēram, fitohemaglutinīnam (PHA), un tad uz to iedarbojas ar testējamo vielu un ar cytoB.

cytoB

Metaboliskā aktivācija

| 16. | Ja izmanto šūnas ar nepietiekamu endogēno metabolisko kapacitāti, jālieto eksogēnas metabolizējošās sistēmas. Plašāk izmantojamā aktivācijas sistēma ir ar kofaktoru papildināta pēcmitohondriskā frakcija (S9), ko pagatavo no grauzēju aknām, kas apstrādātas ar enzīmstimulējošām vielām, piemēram, Aroclor 1254 (45) (46) vai fenobarbitona un β-naftoflavona maisījumu (46) (47) (48) (49). Pēdējā minētā kombinācija nav pretrunā ar Stokholmas Konvenciju par noturīgiem organiskajiem piesārņotājiem (50) un Regulu (EK) Nr. 850/2004 par noturīgiem organiskajiem piesārņotājiem (66) un jauktas funkcijas oksidāžu inducēšanā izrādījusies tikpat efektīva kā Aroclor 1254 (46) (47) (48) (49). S9 frakciju parasti izmanto koncentrācijā 1–10 % (tilp./tilp.) galīgajā testa barotnē. Metaboliskās aktivācijas sistēmas stāvoklis var būt atkarīgs no testējamo ķīmisko vielu klases, un dažos gadījumos var būt lietderīgi izmantot vairāk nekā vienu S9 koncentrāciju. |
| --- | --- |

16.

Ja izmanto šūnas ar nepietiekamu endogēno metabolisko kapacitāti, jālieto eksogēnas metabolizējošās sistēmas. Plašāk izmantojamā aktivācijas sistēma ir ar kofaktoru papildināta pēcmitohondriskā frakcija (S9), ko pagatavo no grauzēju aknām, kas apstrādātas ar enzīmstimulējošām vielām, piemēram, Aroclor 1254 (45) (46) vai fenobarbitona un β-naftoflavona maisījumu (46) (47) (48) (49). Pēdējā minētā kombinācija nav pretrunā ar Stokholmas Konvenciju par noturīgiem organiskajiem piesārņotājiem (50) un Regulu (EK) Nr. 850/2004 par noturīgiem organiskajiem piesārņotājiem (66) un jauktas funkcijas oksidāžu inducēšanā izrādījusies tikpat efektīva kā Aroclor 1254 (46) (47) (48) (49). S9 frakciju parasti izmanto koncentrācijā 1–10 % (tilp./tilp.) galīgajā testa barotnē. Metaboliskās aktivācijas sistēmas stāvoklis var būt atkarīgs no testējamo ķīmisko vielu klases, un dažos gadījumos var būt lietderīgi izmantot vairāk nekā vienu S9 koncentrāciju.

Aroclor 1254

Aroclor 1254

| 17. | Ar gēnu inženierijas metodēm iegūtas šūnu līnijas, kas izteic specifiskos cilvēka vai grauzēju enzīmus, var atbrīvot no vajadzības pēc eksogēnas metaboliskās aktivācijas sistēmas, un tās var izmantot kā testa šūnas. Šādos gadījumos izmantojamo šūnu līniju izvēlei jābūt zinātniski pamatotai, piemēram, ar jauktas funkcijas oksidāžu atbilstību testējamās vielas metabolismam (51) un ar to reaģētspēju uz zināmiem klastogēniem un aneigēniem (skatīt daļu par pieņemamības kritērijiem). Jāatzīst, ka testējamo vielu nedrīkst metabolizēt ar izteiktām jauktas funkcijas oksidāzēm; šajā gadījumā negatīvs rezultāts neliecina, ka testējamā viela nespēj inducēt mikrokodolus. |
| --- | --- |

17.

Ar gēnu inženierijas metodēm iegūtas šūnu līnijas, kas izteic specifiskos cilvēka vai grauzēju enzīmus, var atbrīvot no vajadzības pēc eksogēnas metaboliskās aktivācijas sistēmas, un tās var izmantot kā testa šūnas. Šādos gadījumos izmantojamo šūnu līniju izvēlei jābūt zinātniski pamatotai, piemēram, ar jauktas funkcijas oksidāžu atbilstību testējamās vielas metabolismam (51) un ar to reaģētspēju uz zināmiem klastogēniem un aneigēniem (skatīt daļu par pieņemamības kritērijiem). Jāatzīst, ka testējamo vielu nedrīkst metabolizēt ar izteiktām jauktas funkcijas oksidāzēm; šajā gadījumā negatīvs rezultāts neliecina, ka testējamā viela nespēj inducēt mikrokodolus.

Testējamās vielas sagatavošana

| 18. | Cietas ķīmiskās vielas jāizšķīdina atbilstošos šķīdinātājos vai nesējos un, ja vajadzīgs, pirms šūnu apstrādes jāatšķaida. Šķidras ķīmiskās vielas var tieši pievienot testēšanas sistēmā un/vai pirms šūnu apstrādes atšķaidīt. Gāzes vai gaistošas vielas jātestē ar attiecīgām standarta protokolu modifikācijām, piemēram, apstrādi veicot hermētiski noslēgtā traukā (52) (53). Ja dati par testējamo vielu preparātu stabilitāti liecina, ka tos uzglabāt nevar, izmanto svaigi pagatavotus preparātus. |
| --- | --- |

18.

Cietas ķīmiskās vielas jāizšķīdina atbilstošos šķīdinātājos vai nesējos un, ja vajadzīgs, pirms šūnu apstrādes jāatšķaida. Šķidras ķīmiskās vielas var tieši pievienot testēšanas sistēmā un/vai pirms šūnu apstrādes atšķaidīt. Gāzes vai gaistošas vielas jātestē ar attiecīgām standarta protokolu modifikācijām, piemēram, apstrādi veicot hermētiski noslēgtā traukā (52) (53). Ja dati par testējamo vielu preparātu stabilitāti liecina, ka tos uzglabāt nevar, izmanto svaigi pagatavotus preparātus.

Testēšanas apstākļi

Testēšanas apstākļi

Šķīdinātāji/nesēji

| 19. | Šķīdinātājs vai nesējs nedrīkst reaģēt ar testējamo vielu vai nebūt saderīgs ar šūnu dzīvotspēju vai ar S9 aktivitātes uzturēšanu izmantotajās koncentrācijās. Ja nelieto labi zināmu šķīdinātāju/nesēju (piemēram, ūdeni, šūnu kultūras barotni, dimetilsulfoksīdu), lietojums jāpamato ar datiem par tā saderību ar testējamo vielu un to, ka izmantotais šķīdinātājs/nesējs nav genotoksisks. Vienmēr, kad tas iespējams, vispirms ieteicams izmantot ūdeni saturošus šķīdinātājus vai nesējus. |
| --- | --- |

19.

Šķīdinātājs vai nesējs nedrīkst reaģēt ar testējamo vielu vai nebūt saderīgs ar šūnu dzīvotspēju vai ar S9 aktivitātes uzturēšanu izmantotajās koncentrācijās. Ja nelieto labi zināmu šķīdinātāju/nesēju (piemēram, ūdeni, šūnu kultūras barotni, dimetilsulfoksīdu), lietojums jāpamato ar datiem par tā saderību ar testējamo vielu un to, ka izmantotais šķīdinātājs/nesējs nav genotoksisks. Vienmēr, kad tas iespējams, vispirms ieteicams izmantot ūdeni saturošus šķīdinātājus vai nesējus.

CytoB kā citokinēzes bloķētājs

| 20. | Viens no svarīgākajiem apsvērumiem MNvit metodes veiktspējas nodrošināšanā ir tāds, ka uzskaitītajām šūnām apstrādes laikā vai pēcapstrādes inkubēšanas laikā (ja tāds ir) ir jābūt pabeigušām mitozi. CytoB ir aģents, ko ļoti plaši izmanto kā citokinēzes bloķētāju, jo tas inhibē aktīna veidošanos un tādējādi neļauj meitasšūnām atdalīties pēc mitozes; rezultātā rodas divkodolu šūnas (5) (54), (55). Mikrokodolu uzskaiti tāpēc var veikt tikai tajās šūnās, kurās apstrādes laikā vai pēc tās ir beigusies mitoze. Vienlaikus var izmērīt testējamās vielas ietekmi uz šūnu savairošanās kinētiku. CytoB ieteicams izmantot kā citokinēzes bloķētāju cilvēka limfocītos, jo šūnu cikla ilgumi dažādās kultūrās un dažādiem donoriem atšķirsies un ne visi limfocīti reaģē uz PHA. Šūnu līniju testēšanā, lai noteiktu, vai uzskaites šūnas ir sadalījušās, izmanto citas metodes; tās ir apskatītas turpmāk (skatīt 26. punktu). |
| --- | --- |

20.

Viens no svarīgākajiem apsvērumiem MNvit metodes veiktspējas nodrošināšanā ir tāds, ka uzskaitītajām šūnām apstrādes laikā vai pēcapstrādes inkubēšanas laikā (ja tāds ir) ir jābūt pabeigušām mitozi. CytoB ir aģents, ko ļoti plaši izmanto kā citokinēzes bloķētāju, jo tas inhibē aktīna veidošanos un tādējādi neļauj meitasšūnām atdalīties pēc mitozes; rezultātā rodas divkodolu šūnas (5) (54), (55). Mikrokodolu uzskaiti tāpēc var veikt tikai tajās šūnās, kurās apstrādes laikā vai pēc tās ir beigusies mitoze. Vienlaikus var izmērīt testējamās vielas ietekmi uz šūnu savairošanās kinētiku. CytoB ieteicams izmantot kā citokinēzes bloķētāju cilvēka limfocītos, jo šūnu cikla ilgumi dažādās kultūrās un dažādiem donoriem atšķirsies un ne visi limfocīti reaģē uz PHA. Šūnu līniju testēšanā, lai noteiktu, vai uzskaites šūnas ir sadalījušās, izmanto citas metodes; tās ir apskatītas turpmāk (skatīt 26. punktu).

MNvit

CytoB

CytoB

| 21. | Laboratorijai jānosaka atbilstoša cytoB koncentrācija katram šūnu tipam, lai sasniegtu optimālu divkodolu šūnu sastopamību šķīdinātāja/nesēja kontroles kultūrās. Atbilstošas koncentrācijas cytoB parasti ir starp 3 un 6 μg/ml. |
| --- | --- |

21.

Laboratorijai jānosaka atbilstoša cytoB koncentrācija katram šūnu tipam, lai sasniegtu optimālu divkodolu šūnu sastopamību šķīdinātāja/nesēja kontroles kultūrās. Atbilstošas koncentrācijas cytoB parasti ir starp 3 un 6 μg/ml.

cytoB

cytoB

Šūnu savairošanās un citotoksicitātes mērīšana un iedarbības koncentrācijas izvēle

| 22. | Nosakot augstāko testējamās vielas koncentrāciju, kas jātestē, neizvēlas koncentrācijas, kas spēj radīt šķietami pozitīvas atbildes reakcijas, piemēram, tādas koncentrācijas, kas izraisa pārmērīgu citotoksicitāti, nogulsnes barotnē vai manāmi izmaina pH vai osmozi (39) (40) (41). |
| --- | --- |

22.

Nosakot augstāko testējamās vielas koncentrāciju, kas jātestē, neizvēlas koncentrācijas, kas spēj radīt šķietami pozitīvas atbildes reakcijas, piemēram, tādas koncentrācijas, kas izraisa pārmērīgu citotoksicitāti, nogulsnes barotnē vai manāmi izmaina pH vai osmozi (39) (40) (41).

| 23. | Mēra šūnu savairošanos, lai nodrošinātu, ka apstrādātajās šūnās testēšanas laikā ir beigusies mitoze un ka apstrāde tiek veikta attiecīgā citotoksicitātes līmenī (skatīt 29. punktu). Citotoksicitāti ar metabolisma aktivāciju un bez tās nosaka šūnās, kam vajadzīga metaboliskā aktivācija, izmantojot šūnu skaita relatīvo pieaugumu (RICC) vai populācijas relatīvo divkāršošanos (RPD) (formulas skatīt 2. papildinājumā), ja vien neizmanto cytoB. Ja izmanto cytoB, citotoksicitāti var noteikt, izmantojot replicēšanās indeksu (RI) (formulas skatīt 2. papildinājumā). |
| --- | --- |

23.

Mēra šūnu savairošanos, lai nodrošinātu, ka apstrādātajās šūnās testēšanas laikā ir beigusies mitoze un ka apstrāde tiek veikta attiecīgā citotoksicitātes līmenī (skatīt 29. punktu). Citotoksicitāti ar metabolisma aktivāciju un bez tās nosaka šūnās, kam vajadzīga metaboliskā aktivācija, izmantojot šūnu skaita relatīvo pieaugumu (RICC) vai populācijas relatīvo divkāršošanos (RPD) (formulas skatīt 2. papildinājumā), ja vien neizmanto cytoB. Ja izmanto cytoB, citotoksicitāti var noteikt, izmantojot replicēšanās indeksu (RI) (formulas skatīt 2. papildinājumā).

cytoB

cytoB

| 24. | Kultūru apstrāde ar cytoB un vienkodola, divkodolu un daudzkodolu šūnu relatīvā sastopamības biežuma noteikšana kultūrā ir laba metode, kā kvantitatīvi izteikt ietekmi uz šūnu savairošanos un apstrādes citotoksisko vai citostatisko darbību (5), un nodrošina, ka uzskaitītas tiek tikai šūnas, kas apstrādes laikā vai pēc tās ir dalījušās. |
| --- | --- |

24.

Kultūru apstrāde ar cytoB un vienkodola, divkodolu un daudzkodolu šūnu relatīvā sastopamības biežuma noteikšana kultūrā ir laba metode, kā kvantitatīvi izteikt ietekmi uz šūnu savairošanos un apstrādes citotoksisko vai citostatisko darbību (5), un nodrošina, ka uzskaitītas tiek tikai šūnas, kas apstrādes laikā vai pēc tās ir dalījušās.

cytoB

| 25. | Pētījumos ar cytoB citostāzi/citotoksicitāti var kvantitatīvi izteikt ar savairošanās indeksu pēc citokinēzes blokādes (CBPI) (5) (26) (56) vai tās var iegūt no RI, kas raksturo vismaz 500 šūnas vienā kultūrā (formulas skatīt 2. papildinājumā). Ja cytoB izmanto, lai novērtētu šūnu savairošanās pakāpi, CBPI vai RI jānosaka vismaz 500 šūnām vienā kultūrā. Šos mērījumus, cita starpā, var izmantot, lai noteiktu citotoksicitāti, salīdzinot vērtības apstrādātajās un kontroles kultūrās. Noderīgu informāciju var dot citu citotoksicitātes marķieru (piemēram, šūnu saplūšanas, šūnu skaita, apoptozes, nekrozes, metafāzes uzskaites) novērtēšana. |
| --- | --- |

25.

Pētījumos ar cytoB citostāzi/citotoksicitāti var kvantitatīvi izteikt ar savairošanās indeksu pēc citokinēzes blokādes (CBPI) (5) (26) (56) vai tās var iegūt no RI, kas raksturo vismaz 500 šūnas vienā kultūrā (formulas skatīt 2. papildinājumā). Ja cytoB izmanto, lai novērtētu šūnu savairošanās pakāpi, CBPI vai RI jānosaka vismaz 500 šūnām vienā kultūrā. Šos mērījumus, cita starpā, var izmantot, lai noteiktu citotoksicitāti, salīdzinot vērtības apstrādātajās un kontroles kultūrās. Noderīgu informāciju var dot citu citotoksicitātes marķieru (piemēram, šūnu saplūšanas, šūnu skaita, apoptozes, nekrozes, metafāzes uzskaites) novērtēšana.

cytoB

cytoB

| 26. | Pētījumos bez cytoB ir uzskatāmi jāparāda, ka kultūrā uzskaitītās šūnas ir beigušas dalīties apstrādes laikā vai pēc apstrādes ar testējamo vielu, citādi var iegūt šķietami negatīvu rezultātu. Metodes, kas izmantotas, lai nodrošinātu, ka uzskaitītas tiek dalīšanos beigušās šūnas, paredz iekļaut un pēc tam detektēt bromdeoksiuridīnu (BRDU), lai identificētu replicējušās šūnas (57), klonu veidošanos, kad šūnas no pastāvīgās šūnu līnijas apstrādā un uzskaita in situ uz mikroskopa priekšmetstikliņa (savairošanās indekss (PI)) (25) (26) (27) (28), vai arī populācijas relatīvās divkāršošanās (RPD) vai šūnu skaita relatīvā pieauguma (RICC) noteikšanu vai citas pārbaudītas metodes (16) (56) (58) (59) (formulas skatīt 2. papildinājumā). Noderīgu informāciju var dot citu citotoksicitātes vai citostāzes marķieru (piemēram, šūnu saplūšanas, šūnu skaita, apoptozes, nekrozes, metafāzes uzskaites) novērtēšana. |
| --- | --- |

26.

Pētījumos bez cytoB ir uzskatāmi jāparāda, ka kultūrā uzskaitītās šūnas ir beigušas dalīties apstrādes laikā vai pēc apstrādes ar testējamo vielu, citādi var iegūt šķietami negatīvu rezultātu. Metodes, kas izmantotas, lai nodrošinātu, ka uzskaitītas tiek dalīšanos beigušās šūnas, paredz iekļaut un pēc tam detektēt bromdeoksiuridīnu (BRDU), lai identificētu replicējušās šūnas (57), klonu veidošanos, kad šūnas no pastāvīgās šūnu līnijas apstrādā un uzskaita in situ uz mikroskopa priekšmetstikliņa (savairošanās indekss (PI)) (25) (26) (27) (28), vai arī populācijas relatīvās divkāršošanās (RPD) vai šūnu skaita relatīvā pieauguma (RICC) noteikšanu vai citas pārbaudītas metodes (16) (56) (58) (59) (formulas skatīt 2. papildinājumā). Noderīgu informāciju var dot citu citotoksicitātes vai citostāzes marķieru (piemēram, šūnu saplūšanas, šūnu skaita, apoptozes, nekrozes, metafāzes uzskaites) novērtēšana.

cytoB

in situ

| 27. | Jāizvērtē vismaz trīs analizējamas testējamās koncentrācijas. Lai to panāktu, var būt nepieciešams veikt eksperimentu, izmantojot lielāku skaitu savstarpēji tuvu esošu koncentrāciju un analizēt mikrokodolu veidošanos tādās koncentrācijās, kas nodrošina piemērotu citotoksicitāšu diapazonu. Alternatīva stratēģija ir veikt iepriekšēju citotoksicitātes testēšanu, lai galīgajā testā vajadzētu pētīt mazāku skaitu koncentrāciju. |
| --- | --- |

27.

Jāizvērtē vismaz trīs analizējamas testējamās koncentrācijas. Lai to panāktu, var būt nepieciešams veikt eksperimentu, izmantojot lielāku skaitu savstarpēji tuvu esošu koncentrāciju un analizēt mikrokodolu veidošanos tādās koncentrācijās, kas nodrošina piemērotu citotoksicitāšu diapazonu. Alternatīva stratēģija ir veikt iepriekšēju citotoksicitātes testēšanu, lai galīgajā testā vajadzētu pētīt mazāku skaitu koncentrāciju.

| 28. | Augstākajai koncentrācijai jārada 55 ± 5 % citotoksicitāte. Augstākās koncentrācijās kā sekundāra citotoksicitātes ietekme var rasties hromosomu bojājumi (60). Ja konstatē citotoksicitāti, izraudzītajām testējamām koncentrācijām jābūt diapazonā no koncentrācijas, kas rada 55 ± 5 % citotoksicitāti, līdz koncentrācijai, kas rada nelielu citotoksicitāti vai to nerada nemaz. |
| --- | --- |

28.

Augstākajai koncentrācijai jārada 55 ± 5 % citotoksicitāte. Augstākās koncentrācijās kā sekundāra citotoksicitātes ietekme var rasties hromosomu bojājumi (60). Ja konstatē citotoksicitāti, izraudzītajām testējamām koncentrācijām jābūt diapazonā no koncentrācijas, kas rada 55 ± 5 % citotoksicitāti, līdz koncentrācijai, kas rada nelielu citotoksicitāti vai to nerada nemaz.

| 29. | Ja citotoksiskums vai nogulsnes nav novērotas, augstākajai testējamai koncentrācijai jāatbilst 0,01 M, 5 mg/ml vai 5 μl/ml atkarībā no tā, kura ir mazākā. Analīzei atlasītajām koncentrācijām parasti jāatšķiras par ne vairāk kā 10 vienībām. Testējamām vielām, kam koncentrācijas–atbildes reakcijas līknes ir stāvas, var būt jātestē savstarpēji mazāk atšķirīgas koncentrācijas, lai uzskaiti varētu veikt arī kultūrās ar vidēju un zemu toksicitātes diapazonu. |
| --- | --- |

29.

Ja citotoksiskums vai nogulsnes nav novērotas, augstākajai testējamai koncentrācijai jāatbilst 0,01 M, 5 mg/ml vai 5 μl/ml atkarībā no tā, kura ir mazākā. Analīzei atlasītajām koncentrācijām parasti jāatšķiras par ne vairāk kā 10 vienībām. Testējamām vielām, kam koncentrācijas–atbildes reakcijas līknes ir stāvas, var būt jātestē savstarpēji mazāk atšķirīgas koncentrācijas, lai uzskaiti varētu veikt arī kultūrās ar vidēju un zemu toksicitātes diapazonu.

| 30. | Ja ierobežojošais faktors ir šķīdība, maksimālā koncentrācija (ja to neierobežo citotoksicitāte) ir zemākā koncentrācija, kurā kultūrās ir saredzamas minimālas nogulsnes, ar nosacījumu, ka tas netraucē uzskaitei. Nogulsnes jāvērtē ar tādām metodēm kā gaismas mikroskopija un kultivēšanas gaitā neizzūdošu vai (līdz apstrādes beigām) parādošos nogulšņu konstatēšana. |
| --- | --- |

30.

Ja ierobežojošais faktors ir šķīdība, maksimālā koncentrācija (ja to neierobežo citotoksicitāte) ir zemākā koncentrācija, kurā kultūrās ir saredzamas minimālas nogulsnes, ar nosacījumu, ka tas netraucē uzskaitei. Nogulsnes jāvērtē ar tādām metodēm kā gaismas mikroskopija un kultivēšanas gaitā neizzūdošu vai (līdz apstrādes beigām) parādošos nogulšņu konstatēšana.

Kontroles

| 31. | Katrā eksperimentā jāiekļauj vienlaicīgas pozitīvās un šķīdinātāja/nesēja kontroles, ar metabolisma aktivāciju vai bez tās. |
| --- | --- |

31.

Katrā eksperimentā jāiekļauj vienlaicīgas pozitīvās un šķīdinātāja/nesēja kontroles, ar metabolisma aktivāciju vai bez tās.

| 32. | PC ir vajadzīga, lai pierādītu izmantoto šūnu spēju un testa protokola derīgumu klastogēnu un aneigēnu identificēšanai un apliecinātu S9 preparāta metabolisko kapacitāti. Ar PC būtu jāizmanto zināmi mikrokodolu veidošanās inducētāji tādās koncentrācijās, kurās sagaidāms neliels, bet reproducējams palielinājums salīdzinājumā ar fona līmeni, un tiek uzskatāmi parādīta testēšanas sistēmas jutība. PC vielu koncentrācijas izvēlas tā, lai to iedarbība būtu skaidri redzama, tomēr lai kodēto priekšmetstikliņu identitāti to nolasītājs nevarētu konstatēt uzreiz. |
| --- | --- |

32.

PC ir vajadzīga, lai pierādītu izmantoto šūnu spēju un testa protokola derīgumu klastogēnu un aneigēnu identificēšanai un apliecinātu S9 preparāta metabolisko kapacitāti. Ar PC būtu jāizmanto zināmi mikrokodolu veidošanās inducētāji tādās koncentrācijās, kurās sagaidāms neliels, bet reproducējams palielinājums salīdzinājumā ar fona līmeni, un tiek uzskatāmi parādīta testēšanas sistēmas jutība. PC vielu koncentrācijas izvēlas tā, lai to iedarbība būtu skaidri redzama, tomēr lai kodēto priekšmetstikliņu identitāti to nolasītājs nevarētu konstatēt uzreiz.

| 33. | Lai uzskatāmi parādītu testēšanas sistēmas metabolisko kompetenci un spēju detektēt klastogēnus, jāizmanto klastogēns, kuram vajadzīga metabolisma aktivācija (piemēram, ciklofosfamīds vai benz[a]pirēns). Ja tas ir pamatoti, var lietot citas PC. Dažas PC, kam vajadzīga metabolisma aktivācija, noteiktos apstrādes apstākļos vai noteiktās šūnu līnijās var būt aktīvas bez eksogēnas metabolisma aktivācijas, un tāpēc izraudzītajā šūnu līnijā un izraudzītajās koncentrācijās jātestē vajadzība pēc metaboliskās aktivācijas un S9 preparāta aktivitāte. |
| --- | --- |

33.

Lai uzskatāmi parādītu testēšanas sistēmas metabolisko kompetenci un spēju detektēt klastogēnus, jāizmanto klastogēns, kuram vajadzīga metabolisma aktivācija (piemēram, ciklofosfamīds vai benz[a]pirēns). Ja tas ir pamatoti, var lietot citas PC. Dažas PC, kam vajadzīga metabolisma aktivācija, noteiktos apstrādes apstākļos vai noteiktās šūnu līnijās var būt aktīvas bez eksogēnas metabolisma aktivācijas, un tāpēc izraudzītajā šūnu līnijā un izraudzītajās koncentrācijās jātestē vajadzība pēc metaboliskās aktivācijas un S9 preparāta aktivitāte.

| 34. | Patlaban nav zināms neviens aneigēns, kam vajadzīga metaboliska aktivācija, lai tas kļūtu genotoksiski aktīvs (16). Aneigēnās aktivitātes jomā patlaban pieņemtās PC ir, piemēram, kolhicīns un vinblastīns. Var izmantot citas ķīmiskas vielas, ja tās inducē mikrokodolu veidošanos vienīgi vai galvenokārt aneigēnas aktivitātes rezultātā. Lai novērstu vajadzību pēc divām PC (klastogenicitātei un aneigenicitātei) bez metaboliskās aktivācijas, aneigenicitātes kontroli var izmantot par PC bez S9 un klastogenicitātes kontroli var lietot, lai testētu izmantotās metabolisma aktivācijas sistēmas piemērotību. Klastogenicitātes un aneigenicitātes PC jāizmanto šūnās, kurām nav vajadzīga S9. Ieteicamās PC norādītas 3. papildinājumā. |
| --- | --- |

34.

Patlaban nav zināms neviens aneigēns, kam vajadzīga metaboliska aktivācija, lai tas kļūtu genotoksiski aktīvs (16). Aneigēnās aktivitātes jomā patlaban pieņemtās PC ir, piemēram, kolhicīns un vinblastīns. Var izmantot citas ķīmiskas vielas, ja tās inducē mikrokodolu veidošanos vienīgi vai galvenokārt aneigēnas aktivitātes rezultātā. Lai novērstu vajadzību pēc divām PC (klastogenicitātei un aneigenicitātei) bez metaboliskās aktivācijas, aneigenicitātes kontroli var izmantot par PC bez S9 un klastogenicitātes kontroli var lietot, lai testētu izmantotās metabolisma aktivācijas sistēmas piemērotību. Klastogenicitātes un aneigenicitātes PC jāizmanto šūnās, kurām nav vajadzīga S9. Ieteicamās PC norādītas 3. papildinājumā.

| 35. | Ja ir pieejamas piemērotas ķīmiskās vielas, var apsvērt ar ķīmiskās vielas klasi saistītas PC izmantošanu. Visām izmantotajām PC jābūt piemērotām attiecīgajam šūnu tipam un aktivācijas apstākļiem. |
| --- | --- |

35.

Ja ir pieejamas piemērotas ķīmiskās vielas, var apsvērt ar ķīmiskās vielas klasi saistītas PC izmantošanu. Visām izmantotajām PC jābūt piemērotām attiecīgajam šūnu tipam un aktivācijas apstākļiem.

| 36. | Visās šūnu savākšanas reizēs jāparedz šķīdinātāja/nesēja kontroles izmantošana. Turklāt jāizmanto arī neapstrādāta NC (bez šķīdinātāja/nesēja), ja vien nav publicētu vai laboratorijā pieejamu vēsturisko kontroles datu, kas uzskatāmi parāda, ka izraudzītajam šķīdinātājam šādā koncentrācijā nav genotoksiskas vai citas kaitīgas iedarbības. |
| --- | --- |

36.

Visās šūnu savākšanas reizēs jāparedz šķīdinātāja/nesēja kontroles izmantošana. Turklāt jāizmanto arī neapstrādāta NC (bez šķīdinātāja/nesēja), ja vien nav publicētu vai laboratorijā pieejamu vēsturisko kontroles datu, kas uzskatāmi parāda, ka izraudzītajam šķīdinātājam šādā koncentrācijā nav genotoksiskas vai citas kaitīgas iedarbības.

TESTA PROCEDŪRA

Apstrādes kārtība

Apstrādes kārtība

| 37. | Lai palielinātu varbūtību, ka aneigēns vai klastogēns tiek detektēts brīdī, kad tas ir aktīvs kādā konkrētā šūnas cikla posmā, ir svarīgi ar testējamo vielu apstrādāt pietiekamu skaitu šūnu visos to šūnas cikla posmos. Tādēļ šūnu līniju un primāro šūnu kultūru apstrādes kārtība var nedaudz atšķirties no limfocītu apstrādes, kam vajadzīga mitogēnā stimulācija, lai sāktos šūnas cikls; tas apskatīts 41.–43. punktā (16). |
| --- | --- |

37.

Lai palielinātu varbūtību, ka aneigēns vai klastogēns tiek detektēts brīdī, kad tas ir aktīvs kādā konkrētā šūnas cikla posmā, ir svarīgi ar testējamo vielu apstrādāt pietiekamu skaitu šūnu visos to šūnas cikla posmos. Tādēļ šūnu līniju un primāro šūnu kultūru apstrādes kārtība var nedaudz atšķirties no limfocītu apstrādes, kam vajadzīga mitogēnā stimulācija, lai sāktos šūnas cikls; tas apskatīts 41.–43. punktā (16).

| 38. | Teorētiski apsvērumi, kā arī publicētie dati (18), rāda, ka lielākā daļa aneigēnu un klastogēnu tiks detektēti īsā 3–6 stundu apstrādes periodā ar S9 vai bez tā, un turpinājumā sekos testējamās vielas noņemšana un augšanas periods 1,5–2,0 šūnas ciklu garumā (6). Šūnu paraugus ņem pēc laika perioda, kas atbilst aptuveni 1,5–2,0 parastajiem (t. i., neapstrādātu šūnu) šūnas cikliem, apstrādes sākumā vai beigās (skatīt 1. tabulu). Paraugu ņemšanas vai atveseļošanās laiku var pagarināt, ja ir zināms vai domājams, ka testējamā viela ietekmē šūnas cikla ilgumu (piemēram, ja testē nukleozīdu analogus). |
| --- | --- |

38.

Teorētiski apsvērumi, kā arī publicētie dati (18), rāda, ka lielākā daļa aneigēnu un klastogēnu tiks detektēti īsā 3–6 stundu apstrādes periodā ar S9 vai bez tā, un turpinājumā sekos testējamās vielas noņemšana un augšanas periods 1,5–2,0 šūnas ciklu garumā (6). Šūnu paraugus ņem pēc laika perioda, kas atbilst aptuveni 1,5–2,0 parastajiem (t. i., neapstrādātu šūnu) šūnas cikliem, apstrādes sākumā vai beigās (skatīt 1. tabulu). Paraugu ņemšanas vai atveseļošanās laiku var pagarināt, ja ir zināms vai domājams, ka testējamā viela ietekmē šūnas cikla ilgumu (piemēram, ja testē nukleozīdu analogus).

| 39. | Ņemot vērā S9 preparātu potenciālo citotoksicitāti kultivētās zīdītāju šūnās, apstrādi ar paildzinātu iedarbību 1,5–2,0 normālos šūnas ciklos veic tikai bez S9. Paildzinātā apstrādē ir iespējas šūnu apstrādi ar testējamo vielu veikt cytoB klātbūtnē vai bez tās. Šīs iespējas attiecas uz situācijām, kurās var būt bažas par iespējamo mijiedarbību starp testējamo vielu un cytoB. |
| --- | --- |

39.

Ņemot vērā S9 preparātu potenciālo citotoksicitāti kultivētās zīdītāju šūnās, apstrādi ar paildzinātu iedarbību 1,5–2,0 normālos šūnas ciklos veic tikai bez S9. Paildzinātā apstrādē ir iespējas šūnu apstrādi ar testējamo vielu veikt cytoB klātbūtnē vai bez tās. Šīs iespējas attiecas uz situācijām, kurās var būt bažas par iespējamo mijiedarbību starp testējamo vielu un cytoB.

cytoB

cytoB

| 40. | Ierosinātā šūnu apstrādes kārtība ir parādīta 1. tabulā. Šo vispārīgo apstrādes kārtību var modificēt atkarībā no testējamās vielas stabilitātes vai reaģētspējas vai no konkrētām izmantoto šūnu augšanas īpatnībām. Visos variantos apstrādei jāsākas un jābeidzas, kad šūnu augšana ir eksponenciāla. Apstrādes kārtība sīkāk izklāstīta 41.–47. punktā.

  1.   tabula


  Šūnu apstrādes un savākšanas laiks MNvit noteikšanā








  Limfocīti, primārās šūnas un šūnu līnijas ar cytoB | + S9 | 3–6 stundas apstrādā S9 klātbūtnē;
  aizvāc S9 un apstrādes barotni;
  pievieno jaunu barotni un cytoB;
  šūnas savāc pēc 1,5–2,0 normāliem šūnas cikliem. |
| --- | --- | --- | --- |
| – S9
  Īslaicīga iedarbība | Apstrādā 3–6 stundas;
  aizvāc apstrādes barotni;
  pievieno jaunu barotni un cytoB;
  šūnas savāc pēc 1,5–2,0 normāliem šūnas cikliem. |
| – S9
  Ilgstoša iedarbība | A variants. 1,5–2 normālu šūnas ciklu laikā apstrādā cytoB klātbūtnē;
  savāc iedarbības laika beigās.

  B variants. apstrādā 1,5–2 normālu šūnas ciklu laikā;
  aizvāc testējamo vielu;
  pievieno jaunu barotni un cytoB;
  šūnas savāc pēc 1,5–2,0 normāliem šūnas cikliem. |
| Šūnu līnijas bez cytoB

  (Apstrāde identiska iepriekš aprakstītajai, taču bez cytoB pievienošanas.) |

40.

Ierosinātā šūnu apstrādes kārtība ir parādīta 1. tabulā. Šo vispārīgo apstrādes kārtību var modificēt atkarībā no testējamās vielas stabilitātes vai reaģētspējas vai no konkrētām izmantoto šūnu augšanas īpatnībām. Visos variantos apstrādei jāsākas un jābeidzas, kad šūnu augšana ir eksponenciāla. Apstrādes kārtība sīkāk izklāstīta 41.–47. punktā.

1.   tabula

1.

tabula

Šūnu apstrādes un savākšanas laiks MNvit noteikšanā

Šūnu apstrādes un savākšanas laiks MNvit

Limfocīti, primārās šūnas un šūnu līnijas ar cytoB

cytoB

- S9

3–6 stundas apstrādā S9 klātbūtnē;

aizvāc S9 un apstrādes barotni;

pievieno jaunu barotni un cytoB;

cytoB

šūnas savāc pēc 1,5–2,0 normāliem šūnas cikliem.

– S9

Īslaicīga iedarbība

Apstrādā 3–6 stundas;

aizvāc apstrādes barotni;

pievieno jaunu barotni un cytoB;

cytoB

šūnas savāc pēc 1,5–2,0 normāliem šūnas cikliem.

– S9

Ilgstoša iedarbība

A variants. 1,5–2 normālu šūnas ciklu laikā apstrādā cytoB klātbūtnē;

A variants.

cytoB

savāc iedarbības laika beigās.

B variants. apstrādā 1,5–2 normālu šūnas ciklu laikā;

B variants.

aizvāc testējamo vielu;

pievieno jaunu barotni un cytoB;

cytoB

šūnas savāc pēc 1,5–2,0 normāliem šūnas cikliem.

Šūnu līnijas bez cytoB

cytoB

(Apstrāde identiska iepriekš aprakstītajai, taču bez cytoB pievienošanas.)

cytoB

Limfocīti, primārās šūnas un šūnu līnijas ar cytoB

Limfocīti, primārās šūnas un šūnu līnijas ar cytoB

| 41. | Limfocītiem visefektīvākā pieeja ir sākt testējamās vielas iedarbību 44–48 stundas pēc stimulēšanas ar PHA, kad cikla sinhronizācija būs zudusi (5). Sākotnējā noteikšanā šūnas 3–6 stundas apstrādā ar testējamo vielu S9 klātbūtnē vai bez tās. Apstrādes barotni aizvāc un aizstāj ar svaigu barotni, kas satur cytoB, un pēc 1,5–2,0 normāliem šūnas cikliem šūnas savāc. |
| --- | --- |

41.

Limfocītiem visefektīvākā pieeja ir sākt testējamās vielas iedarbību 44–48 stundas pēc stimulēšanas ar PHA, kad cikla sinhronizācija būs zudusi (5). Sākotnējā noteikšanā šūnas 3–6 stundas apstrādā ar testējamo vielu S9 klātbūtnē vai bez tās. Apstrādes barotni aizvāc un aizstāj ar svaigu barotni, kas satur cytoB, un pēc 1,5–2,0 normāliem šūnas cikliem šūnas savāc.

cytoB

| 42. | Ja abās sākotnējās noteikšanās ar īslaicīgu (3–6 stundu) apstrādi rezultāts ir negatīvs vai neskaidrs, nākamo apstrādi veic ar ilgstošāku iedarbību bez S9. Pieejami divi vienlīdz pieņemami apstrādes varianti. Tomēr iespējams, A variants ir labāks stimulētiem limfocītiem, jo eksponenciālā augšana 96 stundas pēc stimulēšanas sākuma var mazināties. Turklāt B variantā līdz galīgajam paraugu ņemšanas laikam šūnu kultūras nebūtu saplūdušas.






  — | A variants. Šūnas apstrādā ar testējamo vielu 1,5–2,0 normālu šūnas ciklu laikā un apstrādes laika beigās šūnas savāc. |
| --- | --- | --- |

42.

Ja abās sākotnējās noteikšanās ar īslaicīgu (3–6 stundu) apstrādi rezultāts ir negatīvs vai neskaidrs, nākamo apstrādi veic ar ilgstošāku iedarbību bez S9. Pieejami divi vienlīdz pieņemami apstrādes varianti. Tomēr iespējams, A variants ir labāks stimulētiem limfocītiem, jo eksponenciālā augšana 96 stundas pēc stimulēšanas sākuma var mazināties. Turklāt B variantā līdz galīgajam paraugu ņemšanas laikam šūnu kultūras nebūtu saplūdušas.

—

A variants. Šūnas apstrādā ar testējamo vielu 1,5–2,0 normālu šūnas ciklu laikā un apstrādes laika beigās šūnas savāc.

| — | B variants. Šūnas apstrādā ar testējamo vielu 1,5–2,0 normālu šūnas ciklu laikā. Apstrādes barotni aizvāc un aizstāj ar svaigu barotni, un šūnas savāc pēc tam, kad beigušies vēl 1,5–2,0 normāli šūnas cikli. |
| --- | --- |

—

B variants. Šūnas apstrādā ar testējamo vielu 1,5–2,0 normālu šūnas ciklu laikā. Apstrādes barotni aizvāc un aizstāj ar svaigu barotni, un šūnas savāc pēc tam, kad beigušies vēl 1,5–2,0 normāli šūnas cikli.

| 43. | Primārās šūnas un šūnu līnijas jāapstrādā līdzīgi kā limfocītus, izņemot to, ka nav nepieciešams tos 44–48 stundas stimulēt ar PHA. Uz šūnām, kas nav limfocīti, iedarbojas tā, ka pētījuma beigās šūnas joprojām atrodas logaritmiskajā augšanas posmā. |
| --- | --- |

43.

Primārās šūnas un šūnu līnijas jāapstrādā līdzīgi kā limfocītus, izņemot to, ka nav nepieciešams tos 44–48 stundas stimulēt ar PHA. Uz šūnām, kas nav limfocīti, iedarbojas tā, ka pētījuma beigās šūnas joprojām atrodas logaritmiskajā augšanas posmā.

Šūnu līnijas bez cytoB

Šūnu līnijas bez cytoB

| 44. | Šūnas 3–6 stundas apstrādā S9 klātbūtnē vai bez tās. Apstrādes barotni aizvāc un aizstāj ar svaigu barotni, un pēc 1,5–2,0 normāliem šūnas cikliem šūnas savāc. |
| --- | --- |

44.

Šūnas 3–6 stundas apstrādā S9 klātbūtnē vai bez tās. Apstrādes barotni aizvāc un aizstāj ar svaigu barotni, un pēc 1,5–2,0 normāliem šūnas cikliem šūnas savāc.

| 45. | Ja abās sākotnējās noteikšanās ar īslaicīgu (3–6 stundu) apstrādi rezultāts ir negatīvs vai neskaidrs, nākamo apstrādi veic ar ilgstošāku iedarbību. Pieejami divi vienlīdz pieņemami apstrādes varianti.






  — | A variants. Šūnas apstrādā ar testējamo vielu 1,5–2,0 normālu šūnas ciklu laikā un apstrādes laika beigās šūnas savāc. |
| --- | --- | --- |

45.

Ja abās sākotnējās noteikšanās ar īslaicīgu (3–6 stundu) apstrādi rezultāts ir negatīvs vai neskaidrs, nākamo apstrādi veic ar ilgstošāku iedarbību. Pieejami divi vienlīdz pieņemami apstrādes varianti.

—

A variants. Šūnas apstrādā ar testējamo vielu 1,5–2,0 normālu šūnas ciklu laikā un apstrādes laika beigās šūnas savāc.

| — | B variants. Šūnas apstrādā ar testējamo vielu 1,5–2,0 normālu šūnas ciklu laikā. Apstrādes barotni aizvāc un aizstāj ar svaigu barotni, un šūnas savāc pēc tam, kad beigušies vēl 1,5–2,0 normāli šūnas cikli. |
| --- | --- |

—

B variants. Šūnas apstrādā ar testējamo vielu 1,5–2,0 normālu šūnas ciklu laikā. Apstrādes barotni aizvāc un aizstāj ar svaigu barotni, un šūnas savāc pēc tam, kad beigušies vēl 1,5–2,0 normāli šūnas cikli.

| 46. | Monoslāņa kultūrās 3–6 stundu apstrādes beigās vēl var būt mitotiskās šūnas (identificējamas kā apaļas un tādas, kas atdalās no virsmas). Tā kā mitotiskās šūnas viegli atdalās, tās var tikt aizvāktas kopā ar testējamo vielu saturošo barotni. Šīs šūnas jāsavāc, kad kultūras mazgā, un jāievieto atpakaļ kultūrā, lai šūnu savākšanas laikā nebūtu mitotiski dalošos šūnu un mikrokodolu zuduma. |
| --- | --- |

46.

Monoslāņa kultūrās 3–6 stundu apstrādes beigās vēl var būt mitotiskās šūnas (identificējamas kā apaļas un tādas, kas atdalās no virsmas). Tā kā mitotiskās šūnas viegli atdalās, tās var tikt aizvāktas kopā ar testējamo vielu saturošo barotni. Šīs šūnas jāsavāc, kad kultūras mazgā, un jāievieto atpakaļ kultūrā, lai šūnu savākšanas laikā nebūtu mitotiski dalošos šūnu un mikrokodolu zuduma.

Šūnu kultūru skaits

Šūnu kultūru skaits

| 47. | Dublikātu kultūras jāizmanto katrai testējamās vielas koncentrācijai un nesēja/šķīdinātāja un NC kultūrām. Ja dublikātu kultūru variācija ir minimāla, ko pierāda ar vēsturiskiem laboratorijas datiem, ir pieņemami izmantot tikai vienu kultūru. Ja izmanto tikai vienu kultūru, ieteicams analizēt lielāku koncentrāciju skaitu. |
| --- | --- |

47.

Dublikātu kultūras jāizmanto katrai testējamās vielas koncentrācijai un nesēja/šķīdinātāja un NC kultūrām. Ja dublikātu kultūru variācija ir minimāla, ko pierāda ar vēsturiskiem laboratorijas datiem, ir pieņemami izmantot tikai vienu kultūru. Ja izmanto tikai vienu kultūru, ieteicams analizēt lielāku koncentrāciju skaitu.

Šūnu savākšana un priekšmetstikliņu sagatavošana

Šūnu savākšana un priekšmetstikliņu sagatavošana

| 48. | Šūnas no katras kultūras savāc un apstrādā atsevišķi. Šūnu preparātu sagatavošana var ietvert hipotonisku apstrādi, bet tā nav nepieciešama, ja atbilstošu šūnu izklājumu panāk citā veidā. Var izmantot dažādus priekšmetstikliņu sagatavošanas paņēmienus, ja vien uzskaites vajadzībām tiek iegūti augstas kvalitātes šūnu preparāti. Šūnu citoplazma jāsaglabā, lai detektētu mikrokodolus un (ar citokinēzes bloķēšanas metodi) ticami identificētu divkodolu šūnas. |
| --- | --- |

48.

Šūnas no katras kultūras savāc un apstrādā atsevišķi. Šūnu preparātu sagatavošana var ietvert hipotonisku apstrādi, bet tā nav nepieciešama, ja atbilstošu šūnu izklājumu panāk citā veidā. Var izmantot dažādus priekšmetstikliņu sagatavošanas paņēmienus, ja vien uzskaites vajadzībām tiek iegūti augstas kvalitātes šūnu preparāti. Šūnu citoplazma jāsaglabā, lai detektētu mikrokodolus un (ar citokinēzes bloķēšanas metodi) ticami identificētu divkodolu šūnas.

| 49. | Priekšmetstikliņus iekrāsot var ar dažādām metodēm, piemēram, Giemsa vai luminiscences DNS specifiskām krāsvielām (59). Lietojot DNS specifisku krāsvielu (piemēram, akridīnoranžo (61) vai Hoechst 33258 ar pironīnu-Y (62)), iespējams izvairīties no daļas artefaktu, kas saistīti ar DNS nespecifisku krāsvielu izmantošanu. Antikinetohoru antivielas, FISH ar pancentromēriskām DNS zondēm vai in situ iezīmēšanu ar pancentromēriem specifiskām gruntskrāsām, kā arī atbilstošu DNS iekrāsošanu, var izmantot, lai identificētu mikrokodolu saturu (hromosomas/hromosomu fragmentus), ja vajadzīga informācija par to veidošanās mehāniku (15) (16). Citas metodes un diferenciāciju starp klastogēniem un aneigēniem var izmantot tad, ja pagātnē tā ir izrādījusies efektīva. |
| --- | --- |

49.

Priekšmetstikliņus iekrāsot var ar dažādām metodēm, piemēram, Giemsa vai luminiscences DNS specifiskām krāsvielām (59). Lietojot DNS specifisku krāsvielu (piemēram, akridīnoranžo (61) vai Hoechst 33258 ar pironīnu-Y (62)), iespējams izvairīties no daļas artefaktu, kas saistīti ar DNS nespecifisku krāsvielu izmantošanu. Antikinetohoru antivielas, FISH ar pancentromēriskām DNS zondēm vai in situ iezīmēšanu ar pancentromēriem specifiskām gruntskrāsām, kā arī atbilstošu DNS iekrāsošanu, var izmantot, lai identificētu mikrokodolu saturu (hromosomas/hromosomu fragmentus), ja vajadzīga informācija par to veidošanās mehāniku (15) (16). Citas metodes un diferenciāciju starp klastogēniem un aneigēniem var izmantot tad, ja pagātnē tā ir izrādījusies efektīva.

Hoechst 33258

FISH

in situ

Analīze

Analīze

| 50. | Visus priekšmetstikliņus, tostarp šķīdinātāja/nesēja un kontroles priekšmetstikliņus, pirms mikroskopiskās analīzes kodē. Alternatīvi, kodētus paraugus var analizēt, izmantojot validētas, automatizētas plūsmas citometriskā vai attēlu analīzes sistēmā. |
| --- | --- |

50.

Visus priekšmetstikliņus, tostarp šķīdinātāja/nesēja un kontroles priekšmetstikliņus, pirms mikroskopiskās analīzes kodē. Alternatīvi, kodētus paraugus var analizēt, izmantojot validētas, automatizētas plūsmas citometriskā vai attēlu analīzes sistēmā.

| 51. | Ar cytoB apstrādātās kultūrās mikrokodolu sastopamība jāanalizē vismaz 2 000 divkodolu šūnām vienā koncentrācijā (vismaz 1 000 divkodolu šūnās vienā kultūrā; divas kultūras vienā koncentrācijā). Ja izmanto tikai vienu kultūru, tajā jāuzskaita vismaz 2 000 divkodolu šūnu no katras koncentrācijas. Ja katrā koncentrācijā uzskaitei ir pieejamas ievērojami mazāk nekā 1 000 divkodolu šūnu katrā kultūrā vai 2 000 divkodolu šūnu, ja izmanto tikai vienu kultūru, un ja nav detektējams ievērojams mikrokodolu skaita pieaugums, testēšana jāatkārto ar lielāku daudzumu šūnu vai ar mazāk toksiskām koncentrācijām atkarībā no tā, kas ir piemērotāk. Jāraugās, lai neuzskaitītu divkodolu šūnas ar neregulāru formu vai tādas, kuru abi kodoli ir ļoti nevienādi; tāpat nevajag sajaukt divkodolu šūnas un nevienmērīgā izklājumā esošas daudzkodolu šūnas. Šūnās, kas satur vairāk nekā divus galvenos kodolus, mikrokodoli nav jāanalizē, jo šajās šūnās mikrokodolu vidējā izplatība var būt augstāka (63), (64). Vienkodola šūnu uzskaite ir pieņemama tad, ja ir pierādīts, ka testējamā vielas maina cytoB aktivitāti. |
| --- | --- |

51.

Ar cytoB apstrādātās kultūrās mikrokodolu sastopamība jāanalizē vismaz 2 000 divkodolu šūnām vienā koncentrācijā (vismaz 1 000 divkodolu šūnās vienā kultūrā; divas kultūras vienā koncentrācijā). Ja izmanto tikai vienu kultūru, tajā jāuzskaita vismaz 2 000 divkodolu šūnu no katras koncentrācijas. Ja katrā koncentrācijā uzskaitei ir pieejamas ievērojami mazāk nekā 1 000 divkodolu šūnu katrā kultūrā vai 2 000 divkodolu šūnu, ja izmanto tikai vienu kultūru, un ja nav detektējams ievērojams mikrokodolu skaita pieaugums, testēšana jāatkārto ar lielāku daudzumu šūnu vai ar mazāk toksiskām koncentrācijām atkarībā no tā, kas ir piemērotāk. Jāraugās, lai neuzskaitītu divkodolu šūnas ar neregulāru formu vai tādas, kuru abi kodoli ir ļoti nevienādi; tāpat nevajag sajaukt divkodolu šūnas un nevienmērīgā izklājumā esošas daudzkodolu šūnas. Šūnās, kas satur vairāk nekā divus galvenos kodolus, mikrokodoli nav jāanalizē, jo šajās šūnās mikrokodolu vidējā izplatība var būt augstāka (63), (64). Vienkodola šūnu uzskaite ir pieņemama tad, ja ir pierādīts, ka testējamā vielas maina cytoB aktivitāti.

cytoB

cytoB

| 52. | Ar cytoB neapstrādātās šūnu līnijās mikrokodoli jāuzskaita vismaz 2 000 šūnām vienā koncentrācijā (vismaz 1 000 šūnu vienā kultūrā; divas kultūras vienā koncentrācijā). Ja izmanto tikai vienu kultūru katrai koncentrācijai, no šīs kultūras jāuzskaita vismaz 2 000 šūnu. |
| --- | --- |

52.

Ar cytoB neapstrādātās šūnu līnijās mikrokodoli jāuzskaita vismaz 2 000 šūnām vienā koncentrācijā (vismaz 1 000 šūnu vienā kultūrā; divas kultūras vienā koncentrācijā). Ja izmanto tikai vienu kultūru katrai koncentrācijai, no šīs kultūras jāuzskaita vismaz 2 000 šūnu.

cytoB

| 53. | Ja lieto cytoB, jānosaka CBPI vai RI, lai novērtētu šūnu savairošanos (skatīt 2. papildinājumu), izmantojot vismaz 500 šūnas katrā kultūrā. Ja apstrādi veic bez cytoB, ir būtiski sniegt uzskaitīto šūnu savairošanās pierādījumus, kā aprakstīts 24.–27. punktā. |
| --- | --- |

53.

Ja lieto cytoB, jānosaka CBPI vai RI, lai novērtētu šūnu savairošanos (skatīt 2. papildinājumu), izmantojot vismaz 500 šūnas katrā kultūrā. Ja apstrādi veic bez cytoB, ir būtiski sniegt uzskaitīto šūnu savairošanās pierādījumus, kā aprakstīts 24.–27. punktā.

cytoB

cytoB

Pieņemamības kritēriji

Pieņemamības kritēriji

| 54. | Laboratorijai, kas ierosina izmantot MNvit noteikšanu, kas aprakstīta šajā TM, jāpierāda tās spēja ticami un pareizi detektēt ķīmiskās vielas ar zināmu aneigēnu un klastogēnu aktivitāti, ar metabolisko aktivāciju un bez tās, kā arī detektēt zināmas, negatīvi reaģējošas ķīmiskās vielas, izmantojot references vielas, kas uzskaitītas 3. papildinājumā. Kā pierādījumu savai spējai pareizi veikt šo TM laboratorijai jāsniedz pierādījumi par to, ka šūnās, kurās uzskaita mikrokodolu veidošanos, ir beigusies viena kodolu dalīšanās, ja testēšanu veic bez cytoB. |
| --- | --- |

54.

Laboratorijai, kas ierosina izmantot MNvit noteikšanu, kas aprakstīta šajā TM, jāpierāda tās spēja ticami un pareizi detektēt ķīmiskās vielas ar zināmu aneigēnu un klastogēnu aktivitāti, ar metabolisko aktivāciju un bez tās, kā arī detektēt zināmas, negatīvi reaģējošas ķīmiskās vielas, izmantojot references vielas, kas uzskaitītas 3. papildinājumā. Kā pierādījumu savai spējai pareizi veikt šo TM laboratorijai jāsniedz pierādījumi par to, ka šūnās, kurās uzskaita mikrokodolu veidošanos, ir beigusies viena kodolu dalīšanās, ja testēšanu veic bez cytoB.

MNvit

cytoB

| 55. | Ieteicamās references vielas ir ķīmiskās vielas, kas uzskaitītas 3. papildinājumā. Šo sarakstu var papildināt un tajā iekļautās ķīmiskās vielas aizstāt ar citām, ja šo ķīmisko vielu aktivitāte ir zināma un ja mikrokodolus tās inducē ar vienādiem darbības mehānismiem, un ja ir pierādīts, ka tās ir piemērotas ķīmiskajām vielām, kuras tiks testētas, izmantojot MNvit procedūru. Pamatojums var būt validācijas pētījums, kurš aptver daudzas un dažādas vai arī tikai dažas vielas, kas izvēlētas, ņemot vērā testējamās vielas ķīmisko klasi vai bojājumu rašanās mehānismu, kuru pēta. |
| --- | --- |

55.

Ieteicamās references vielas ir ķīmiskās vielas, kas uzskaitītas 3. papildinājumā. Šo sarakstu var papildināt un tajā iekļautās ķīmiskās vielas aizstāt ar citām, ja šo ķīmisko vielu aktivitāte ir zināma un ja mikrokodolus tās inducē ar vienādiem darbības mehānismiem, un ja ir pierādīts, ka tās ir piemērotas ķīmiskajām vielām, kuras tiks testētas, izmantojot MNvit procedūru. Pamatojums var būt validācijas pētījums, kurš aptver daudzas un dažādas vai arī tikai dažas vielas, kas izvēlētas, ņemot vērā testējamās vielas ķīmisko klasi vai bojājumu rašanās mehānismu, kuru pēta.

MNvit

| 56. | Šķīdinātāja/nesēja kontrolei un neapstrādātām kultūrām būtu jāuzrāda reproducējami zema un stabila mikrokodolu sastopamība (parasti 5–25 mikrokodoli uz 1 000 šūnām visiem šūnu tipiem, kas minēti 11. punktā). Citiem šūnu tipiem var būt dažādi reakciju diapazoni, kas jānosaka, kad tos validē izmantošanai MNvit noteikšanā. Vēsturiskos kontroles diapazonus veido no datiem par negatīvo kontroli, šķīdinātāju un PC. Šīs vērtības jāizmanto, lemjot par to, vai eksperimentā izmantot vienlaicīgu NC/PC. |
| --- | --- |

56.

Šķīdinātāja/nesēja kontrolei un neapstrādātām kultūrām būtu jāuzrāda reproducējami zema un stabila mikrokodolu sastopamība (parasti 5–25 mikrokodoli uz 1 000 šūnām visiem šūnu tipiem, kas minēti 11. punktā). Citiem šūnu tipiem var būt dažādi reakciju diapazoni, kas jānosaka, kad tos validē izmantošanai MNvit noteikšanā. Vēsturiskos kontroles diapazonus veido no datiem par negatīvo kontroli, šķīdinātāju un PC. Šīs vērtības jāizmanto, lemjot par to, vai eksperimentā izmantot vienlaicīgu NC/PC.

MNvit

| 57. | Ja noteikšanas vajadzībām ierosinātas sīkas izmaiņas testēšanas protokolā (piemēram, automatizēta, nevis manuāla uzskaite; jauns šūnu tips), šo izmaiņu efektivitāte jāpierāda, pirms modificēto protokolu var uzskatīt par pieņemamu izmantošanai. Efektivitātes pierādīšana ietver demonstrēšanu, ka ir iespējams detektēt hromosomu pārrāvumu un papildinājumu vai zaudējumu galvenos mehānismus un ka var iegūt atbilstošu pozitīvu un negatīvu rezultātu attiecībā uz atsevišķās vielas klasi vai daudzām dažādām vielām, kuras paredzēts testēt. |
| --- | --- |

57.

Ja noteikšanas vajadzībām ierosinātas sīkas izmaiņas testēšanas protokolā (piemēram, automatizēta, nevis manuāla uzskaite; jauns šūnu tips), šo izmaiņu efektivitāte jāpierāda, pirms modificēto protokolu var uzskatīt par pieņemamu izmantošanai. Efektivitātes pierādīšana ietver demonstrēšanu, ka ir iespējams detektēt hromosomu pārrāvumu un papildinājumu vai zaudējumu galvenos mehānismus un ka var iegūt atbilstošu pozitīvu un negatīvu rezultātu attiecībā uz atsevišķās vielas klasi vai daudzām dažādām vielām, kuras paredzēts testēt.

DATI UN TESTĒŠANAS PĀRSKATS

Rezultātu apstrāde

Rezultātu apstrāde

| 58. | Ja izmanto citokinēzes bloķēšanas paņēmienu, mikrokodolu indukcijas novērtēšanai izmanto tikai divkodolu šūnas ar mikrokodoliem (neatkarīgi no mikrokodolu skaita šūnā). Atsevišķi uzskaitot šūnas ar vienu, diviem vai vairākiem mikrokodoliem, var iegūt noderīgu informāciju, bet tā nav obligāta. |
| --- | --- |

58.

Ja izmanto citokinēzes bloķēšanas paņēmienu, mikrokodolu indukcijas novērtēšanai izmanto tikai divkodolu šūnas ar mikrokodoliem (neatkarīgi no mikrokodolu skaita šūnā). Atsevišķi uzskaitot šūnas ar vienu, diviem vai vairākiem mikrokodoliem, var iegūt noderīgu informāciju, bet tā nav obligāta.

| 59. | Jānosaka vienlaicīgie citotoksiskuma un/vai citostāzes pasākumi visām apstrādātajām kultūrām un šķīdinātāja/nesēja kontroles kultūrām (58). Jāaprēķina CBPI vai RI visām apstrādātajām un kontroles kultūrām, to izsakot kā šūnas cikla kavēšanās mērījumus gadījumā, ja izmanto citokinēzes bloķēšanas paņēmienu. Ja nav cytoB, izmanto RPD vai RICC, vai PI (skatīt 2. papildinājumu). |
| --- | --- |

59.

Jānosaka vienlaicīgie citotoksiskuma un/vai citostāzes pasākumi visām apstrādātajām kultūrām un šķīdinātāja/nesēja kontroles kultūrām (58). Jāaprēķina CBPI vai RI visām apstrādātajām un kontroles kultūrām, to izsakot kā šūnas cikla kavēšanās mērījumus gadījumā, ja izmanto citokinēzes bloķēšanas paņēmienu. Ja nav cytoB, izmanto RPD vai RICC, vai PI (skatīt 2. papildinājumu).

cytoB

| 60. | Norāda datus par atsevišķām kultūrām. Turklāt visus datus apkopo tabulas veidā. |
| --- | --- |

60.

Norāda datus par atsevišķām kultūrām. Turklāt visus datus apkopo tabulas veidā.

| 61. | Ķīmiskās vielas var inducēt mikrokodolu veidošanos MNvit tāpēc, ka tās inducē hromosomu pārrāvumu, hromosomu zaudējumu vai abus kopā. Var veikt papildu analīzi ar antikinetohoru antivielām vai centromēriem specifiskām in situ zondēm vai izmantot citas metodes, lai noteiktu, vai mikrokodolu inducēšanas mehānisms ir saistīts ar klastogēnu un/vai ar aneigēnu aktivitāti. |
| --- | --- |

61.

Ķīmiskās vielas var inducēt mikrokodolu veidošanos MNvit tāpēc, ka tās inducē hromosomu pārrāvumu, hromosomu zaudējumu vai abus kopā. Var veikt papildu analīzi ar antikinetohoru antivielām vai centromēriem specifiskām in situ zondēm vai izmantot citas metodes, lai noteiktu, vai mikrokodolu inducēšanas mehānisms ir saistīts ar klastogēnu un/vai ar aneigēnu aktivitāti.

MNvit

in situ

Rezultātu izvērtējums un interpretācija

Rezultātu izvērtējums un interpretācija

| 62. | Nav prasības veikt verifikāciju, papildus testējot izteikti pozitīvu vai negatīvu reakciju. Neskaidri rezultāti jāprecizē, analizējot vēl 1 000 šūnu no visām kultūrām, lai saglabātu aklā nolasījuma principu. Ja šī pieeja nedod rezultātu, testēšanu turpina. Turpmākajā testēšanā jāapsver pētījuma parametru modifikācija pēc vajadzības plašākā vai šaurākā diapazonā. Pētījuma parametri, kurus varētu modificēt, ir testējamo koncentrāciju atšķirības, apstrādes un šūnu savākšanas laiks un/vai metabolisma aktivācijas apstākļi. |
| --- | --- |

62.

Nav prasības veikt verifikāciju, papildus testējot izteikti pozitīvu vai negatīvu reakciju. Neskaidri rezultāti jāprecizē, analizējot vēl 1 000 šūnu no visām kultūrām, lai saglabātu aklā nolasījuma principu. Ja šī pieeja nedod rezultātu, testēšanu turpina. Turpmākajā testēšanā jāapsver pētījuma parametru modifikācija pēc vajadzības plašākā vai šaurākā diapazonā. Pētījuma parametri, kurus varētu modificēt, ir testējamo koncentrāciju atšķirības, apstrādes un šūnu savākšanas laiks un/vai metabolisma aktivācijas apstākļi.

| 63. | Ir vairāki pozitīva rezultāta kritēriji, kā, piemēram, mikrokodolus saturošo šūnu skaita pieaugums atkarībā no koncentrācijas vai statistiski nozīmīgs pieaugums. Vispirms rezultātus izvērtē no bioloģiskā skatpunkta. Apsverot, vai novērotās vērtības ir vēsturiskā kontroles diapazona robežās vai ārpus tām, var iegūt pieturas punktus, lai novērtētu reakcijas bioloģisko nozīmīgumu. Kā palīglīdzekli izmēģinājumu rezultātu novērtēšanai var izmantot piemērotas statistikas metodes (65). Tomēr statistiskās testēšanas rezultāti jānovērtē attiecībā uz devas un reakcijas mijiedarbību. Jāņem vērā arī reproducējamība un vēsturiskie dati. |
| --- | --- |

63.

Ir vairāki pozitīva rezultāta kritēriji, kā, piemēram, mikrokodolus saturošo šūnu skaita pieaugums atkarībā no koncentrācijas vai statistiski nozīmīgs pieaugums. Vispirms rezultātus izvērtē no bioloģiskā skatpunkta. Apsverot, vai novērotās vērtības ir vēsturiskā kontroles diapazona robežās vai ārpus tām, var iegūt pieturas punktus, lai novērtētu reakcijas bioloģisko nozīmīgumu. Kā palīglīdzekli izmēģinājumu rezultātu novērtēšanai var izmantot piemērotas statistikas metodes (65). Tomēr statistiskās testēšanas rezultāti jānovērtē attiecībā uz devas un reakcijas mijiedarbību. Jāņem vērā arī reproducējamība un vēsturiskie dati.

| 64. | Lai gan lielākajā daļā eksperimentu iegūst nepārprotami pozitīvus vai negatīvus rezultātus, tomēr dažkārt pēc iegūtajiem datiem nevar skaidri spriest par testējamās vielas aktivitāti. Šīs neviennozīmīgās vai apšaubāmās reakcijas var rasties neatkarīgi no tā, cik reizes eksperimentu atkārto. |
| --- | --- |

64.

Lai gan lielākajā daļā eksperimentu iegūst nepārprotami pozitīvus vai negatīvus rezultātus, tomēr dažkārt pēc iegūtajiem datiem nevar skaidri spriest par testējamās vielas aktivitāti. Šīs neviennozīmīgās vai apšaubāmās reakcijas var rasties neatkarīgi no tā, cik reizes eksperimentu atkārto.

| 65. | Pozitīvs MNvit noteikšanas rezultāts liecina, ka testējamās vielas inducē hromosomu pārrāvumu vai hromosomu zaudējumu kultivētās zīdītāju šūnās. Negatīvs rezultāts liecina, ka konkrētajos testēšanas apstākļos testējamā viela nerada hromosomu pārrāvumu un/vai papildinājumu vai zaudējumu kultivētās zīdītāju šūnās. |
| --- | --- |

65.

Pozitīvs MNvit noteikšanas rezultāts liecina, ka testējamās vielas inducē hromosomu pārrāvumu vai hromosomu zaudējumu kultivētās zīdītāju šūnās. Negatīvs rezultāts liecina, ka konkrētajos testēšanas apstākļos testējamā viela nerada hromosomu pārrāvumu un/vai papildinājumu vai zaudējumu kultivētās zīdītāju šūnās.

MNvit

Testēšanas pārskats

Testēšanas pārskats

| 66. | Testēšanas pārskatā jāiekļauj vismaz šāda informācija, ja tā attiecas uz konkrēto noteikšanu. | Testējamā ķīmiskā viela:







  — | identifikācijas dati, CAS numurs un EK numurs, |
| --- | --- | --- | --- |

66.

Testēšanas pārskatā jāiekļauj vismaz šāda informācija, ja tā attiecas uz konkrēto noteikšanu.

Testējamā ķīmiskā viela:

Testējamā ķīmiskā viela:

—

identifikācijas dati, CAS numurs un EK numurs,

CAS

| — | fizikālās īpašības un tīrības pakāpe, |
| --- | --- |

—

fizikālās īpašības un tīrības pakāpe,

| — | fizikāli ķīmiskās īpašības, kas attiecas uz testa veikšanu, |
| --- | --- |

—

fizikāli ķīmiskās īpašības, kas attiecas uz testa veikšanu,

| — | testējamās ķīmiskās vielas reaģētspēja ar šķīdinātāju/nesēju vai šūnu kultūras barotni. |
| --- | --- |

—

testējamās ķīmiskās vielas reaģētspēja ar šķīdinātāju/nesēju vai šūnu kultūras barotni.

| | Šķīdinātājs/nesējs:







  — | šķīdinātāja/nesēja izvēles pamatojums, |
| --- | --- | --- |

Šķīdinātājs/nesējs:

Šķīdinātājs/nesējs:

—

šķīdinātāja/nesēja izvēles pamatojums,

| — | testējamās vielas šķīdība un stabilitāte šķīdinātājā/nesējā. |
| --- | --- |

—

testējamās vielas šķīdība un stabilitāte šķīdinātājā/nesējā.

| | Šūnas:







  — | izmantoto šūnu tips un avots, |
| --- | --- | --- |

Šūnas:

Šūnas:

—

izmantoto šūnu tips un avots,

| — | izmantotā šūnu tipa piemērotība, |
| --- | --- |

—

izmantotā šūnu tipa piemērotība,

| — | mikoplazmas neesība (attiecīgā gadījumā), |
| --- | --- |

—

mikoplazmas neesība (attiecīgā gadījumā),

| — | informācija par šūnu cikla ilgumu, šūnu skaita divkāršošanās laiks vai savairošanās indekss, |
| --- | --- |

—

informācija par šūnu cikla ilgumu, šūnu skaita divkāršošanās laiks vai savairošanās indekss,

| — | ja izmanto limfocītus: asins donoru dzimums, vecums un skaits (attiecīgā gadījumā), |
| --- | --- |

—

ja izmanto limfocītus: asins donoru dzimums, vecums un skaits (attiecīgā gadījumā),

| — | ja izmanto limfocītus: vai iedarbojas uz pilnu asins sastāvu vai tikai uz atsevišķi izdalītiem limfocītiem, |
| --- | --- |

—

ja izmanto limfocītus: vai iedarbojas uz pilnu asins sastāvu vai tikai uz atsevišķi izdalītiem limfocītiem,

| — | pārneses reižu skaits (attiecīgā gadījumā), |
| --- | --- |

—

pārneses reižu skaits (attiecīgā gadījumā),

| — | šūnu kultūru uzturēšanas metodes (attiecīgā gadījumā), |
| --- | --- |

—

šūnu kultūru uzturēšanas metodes (attiecīgā gadījumā),

| — | hromosomu modālais skaits, |
| --- | --- |

—

hromosomu modālais skaits,

| — | normālais šūnas cikla ilgums (negatīvā kontrole). |
| --- | --- |

—

normālais šūnas cikla ilgums (negatīvā kontrole).

| | Testēšanas apstākļi:







  — | ja izmanto citokinēzes bloķētāju (piemēram, cytoB): vielas identitāte, koncentrācija un laika periods, kurā notiek iedarbība uz šūnām, |
| --- | --- | --- |

Testēšanas apstākļi:

Testēšanas apstākļi:

—

ja izmanto citokinēzes bloķētāju (piemēram, cytoB): vielas identitāte, koncentrācija un laika periods, kurā notiek iedarbība uz šūnām,

cytoB

| — | vielas koncentrāciju un šūnu kultūru skaita izvēles pamatojums, piemēram, dati par citotoksiskajām īpašībām un šķīdības robežām, ja tie ir pieejami, |
| --- | --- |

—

vielas koncentrāciju un šūnu kultūru skaita izvēles pamatojums, piemēram, dati par citotoksiskajām īpašībām un šķīdības robežām, ja tie ir pieejami,

| — | barotnes sastāvs, CO2 koncentrācija (attiecīgā gadījumā), |
| --- | --- |

—

barotnes sastāvs, CO2 koncentrācija (attiecīgā gadījumā),

2

| — | testējamās vielas koncentrācijas, |
| --- | --- |

—

testējamās vielas koncentrācijas,

| — | pievienotā nesēja un testējamās vielas koncentrācija (un/vai tilpums), |
| --- | --- |

—

pievienotā nesēja un testējamās vielas koncentrācija (un/vai tilpums),

| — | inkubācijas temperatūra un ilgums, |
| --- | --- |

—

inkubācijas temperatūra un ilgums,

| — | apstrādes ar testējamo vielu ilgums, |
| --- | --- |

—

apstrādes ar testējamo vielu ilgums,

| — | šūnu savākšanas ilgums pēc apstrādes, |
| --- | --- |

—

šūnu savākšanas ilgums pēc apstrādes,

| — | šūnu blīvums to izsējas laikā (attiecīgā gadījumā), |
| --- | --- |

—

šūnu blīvums to izsējas laikā (attiecīgā gadījumā),

| — | metabolisma aktivācijas sistēmas veids un sastāvs, norādot pieņemamības kritērijus, |
| --- | --- |

—

metabolisma aktivācijas sistēmas veids un sastāvs, norādot pieņemamības kritērijus,

| — | pozitīvās kontroles ķīmiskā viela un negatīvā kontrole, |
| --- | --- |

—

pozitīvās kontroles ķīmiskā viela un negatīvā kontrole,

| — | priekšmetstikliņu sagatavošanas metodes un izmantotais šūnu iekrāsošanas paņēmiens, |
| --- | --- |

—

priekšmetstikliņu sagatavošanas metodes un izmantotais šūnu iekrāsošanas paņēmiens,

| — | mikrokodolu identifikācijas kritēriji, |
| --- | --- |

—

mikrokodolu identifikācijas kritēriji,

| — | analizēto šūnu skaits, |
| --- | --- |

—

analizēto šūnu skaits,

| — | citotoksicitātes mērīšanas metodes, |
| --- | --- |

—

citotoksicitātes mērīšanas metodes,

| — | ar citotoksicitāti saistīta papildu informācija, |
| --- | --- |

—

ar citotoksicitāti saistīta papildu informācija,

| — | kritēriji, pēc kuriem novērtē, vai testēšanas rezultāts ir pozitīvs, negatīvs vai neskaidrs, |
| --- | --- |

—

kritēriji, pēc kuriem novērtē, vai testēšanas rezultāts ir pozitīvs, negatīvs vai neskaidrs,

| — | izmantotā statistiskās analīzes metode vai metodes, |
| --- | --- |

—

izmantotā statistiskās analīzes metode vai metodes,

| — | metodes (piemēram, tādas kā kinetohoru antivielas izmantošana), lai noskaidrotu, vai mikrokodoli satur veselas vai fragmentētas hromosomas (attiecīgā gadījumā). |
| --- | --- |

—

metodes (piemēram, tādas kā kinetohoru antivielas izmantošana), lai noskaidrotu, vai mikrokodoli satur veselas vai fragmentētas hromosomas (attiecīgā gadījumā).

| | Rezultāti:







  — | citotoksicitātes mērīšanas veids, piemēram, CBPI vai RI, ja izmanto citokinēzes bloķēšanas paņēmienu; RICC, RPD vai PI, ja citokinēzes bloķēšanas paņēmienu neizmanto; citi novērojumi (attiecīgā gadījumā), piemēram, šūnu saplūšana, apoptoze, nekroze, metafāzu skaits, divkodolu šūnu sastopamības biežums, |
| --- | --- | --- |

Rezultāti:

Rezultāti:

—

citotoksicitātes mērīšanas veids, piemēram, CBPI vai RI, ja izmanto citokinēzes bloķēšanas paņēmienu; RICC, RPD vai PI, ja citokinēzes bloķēšanas paņēmienu neizmanto; citi novērojumi (attiecīgā gadījumā), piemēram, šūnu saplūšana, apoptoze, nekroze, metafāzu skaits, divkodolu šūnu sastopamības biežums,

| — | izgulsnēšanās pazīmes, |
| --- | --- |

—

izgulsnēšanās pazīmes,

| — | dati par apstrādes barotnes pH un osmozi, ja tie noteikti, |
| --- | --- |

—

dati par apstrādes barotnes pH un osmozi, ja tie noteikti,

| — | analīzei pieņemamu šūnu definīcija, |
| --- | --- |

—

analīzei pieņemamu šūnu definīcija,

| — | vienkodola, divkodolu un daudzkodolu šūnu sastopamība, ja izmanto citokinēzes bloķēšanas metodi, |
| --- | --- |

—

vienkodola, divkodolu un daudzkodolu šūnu sastopamība, ja izmanto citokinēzes bloķēšanas metodi,

| — | katrai apstrādātajai un kontroles kultūrai atsevišķi norādīts to šūnu skaits, kurām ir mikrokodoli, un norādīts, vai mikrokodoli ir no divkodolu vai no vienkodola šūnām (attiecīgā gadījumā), |
| --- | --- |

—

katrai apstrādātajai un kontroles kultūrai atsevišķi norādīts to šūnu skaits, kurām ir mikrokodoli, un norādīts, vai mikrokodoli ir no divkodolu vai no vienkodola šūnām (attiecīgā gadījumā),

| — | ja iespējams, reakcijas uz koncentrāciju novērtējums, |
| --- | --- |

—

ja iespējams, reakcijas uz koncentrāciju novērtējums,

| — | vienlaicīgas negatīvās (šķīdinātāja/nesēja) un pozitīvās kontroles ķīmiskie dati (koncentrācijas un šķīdinātāji), |
| --- | --- |

—

vienlaicīgas negatīvās (šķīdinātāja/nesēja) un pozitīvās kontroles ķīmiskie dati (koncentrācijas un šķīdinātāji),

| — | vēsturiskie negatīvās (šķīdinātāja/nesēja) un pozitīvās kontroles ķīmiskie dati, norādot diapazonus, vidējās vērtības un standartnovirzes un ticamības intervālu (piemēram, 95 %), |
| --- | --- |

—

vēsturiskie negatīvās (šķīdinātāja/nesēja) un pozitīvās kontroles ķīmiskie dati, norādot diapazonus, vidējās vērtības un standartnovirzes un ticamības intervālu (piemēram, 95 %),

| — | statistiskā analīze; p-vērtības (attiecīgā gadījumā). |
| --- | --- |

—

statistiskā analīze; p-vērtības (attiecīgā gadījumā).

| | Rezultātu apspriešana |
| --- | --- |

Rezultātu apspriešana

Rezultātu apspriešana

| | Secinājumi |
| --- | --- |

Secinājumi

Secinājumi

IZMANTOTĀ LITERATŪRA

| 1) | Kirsch-Volders, M. (1997), Towards a validation of the micronucleus test. Mutation Res., 392, 1-4. |
| --- | --- |

1)

Kirsch-Volders, M. (1997), Towards a validation of the micronucleus test. Mutation Res., 392, 1-4.

Mutation Res.,

| 2) | Parry, J.M. and Sors, A. (1993), The detection and assessment of the aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community aneuploidy project, Mutation Res., 287, 3-15. |
| --- | --- |

2)

Parry, J.M. and Sors, A. (1993), The detection and assessment of the aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community aneuploidy project, Mutation Res., 287, 3-15.

Mutation Res.

| 3) | Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Solutions to the kinetic problem in the micronucleus assay, Cytobios., 43, 233-246. |
| --- | --- |

3)

Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Solutions to the kinetic problem in the micronucleus assay, Cytobios., 43, 233-246.

Cytobios.,

| 4) | Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2000), Report from the In Vitro Micronucleus Assay Working Group, Environ. Mol. Mutagen., 35, 167-172. |
| --- | --- |

4)

Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2000), Report from the In Vitro Micronucleus Assay Working Group, Environ. Mol. Mutagen., 35, 167-172.

In Vitro

Environ. Mol. Mutagen

| 5) | Fenech, M. (2007), Cytokinesis-block micronucleus cytome assay, Nature Protocols, 2(5), 1084-1104. |
| --- | --- |

5)

Fenech, M. (2007), Cytokinesis-block micronucleus cytome assay, Nature Protocols, 2(5), 1084-1104.

Nature Protocols, 2

| 6) | Fenech, M. and Morley, A.A. (1986), Cytokinesis-block micronucleus method in human lymphocytes: effect of in-vivo ageing and low dose X-irradiation, Mutation Res., 161, 193-198. |
| --- | --- |

6)

Fenech, M. and Morley, A.A. (1986), Cytokinesis-block micronucleus method in human lymphocytes: effect of in-vivo ageing and low dose X-irradiation, Mutation Res., 161, 193-198.

in-vivo

Mutation Res.,

| 7) | Eastmond, D.A. and Tucker, J.D. (1989), Identification of aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody, Environ. Mol. Mutagen., 13, 34-43. |
| --- | --- |

7)

Eastmond, D.A. and Tucker, J.D. (1989), Identification of aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody, Environ. Mol. Mutagen., 13, 34-43.

Environ. Mol. Mutagen.,

| 8) | Eastmond, D.A. and Pinkel, D. (1990), Detection of aneuploidy and aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence in-situ hybridisation with chromosome-specific DNA probes, Mutation Res., 234, 9-20. |
| --- | --- |

8)

Eastmond, D.A. and Pinkel, D. (1990), Detection of aneuploidy and aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence in-situ hybridisation with chromosome-specific DNA probes, Mutation Res., 234, 9-20.

in-situ

Mutation Res.,

| 9) | Miller, B.M., Zitzelsberger, H.F., Weier, H.U. and Adler, I.D. (1991), Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA, Mutagenesis, 6, 297-302. |
| --- | --- |

9)

Miller, B.M., Zitzelsberger, H.F., Weier, H.U. and Adler, I.D. (1991), Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA, Mutagenesis, 6, 297-302.

in situ

Mutagenesis,

| 10) | Farooqi, Z., Darroudi, F. and Natarajan, A.T. (1993), The use of fluorescence in-situ hybridisation for the detection of aneugens in cytokinesis-blocked mouse splenocytes, Mutagenesis, 8, 329-334. |
| --- | --- |

10)

Farooqi, Z., Darroudi, F. and Natarajan, A.T. (1993), The use of fluorescence in-situ hybridisation for the detection of aneugens in cytokinesis-blocked mouse splenocytes, Mutagenesis, 8, 329-334.

in-situ

Mutagenesis,

| 11) | Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. and Lo Jacono, F. (1993), Cytogenetic damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds and micronucleus analysis by fluorescence in situ hybridization with a centromeric probe, Mutation Res., 319, 205-213. |
| --- | --- |

11)

Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. and Lo Jacono, F. (1993), Cytogenetic damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds and micronucleus analysis by fluorescence in situ hybridization with a centromeric probe, Mutation Res., 319, 205-213.

in situ

Mutation Res.,

| 12) | Norppa, H., Renzi, L. and Lindholm, C. (1993), Detection of whole chromosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by antikinetochore staining and in situ hybridization, Mutagenesis, 8, 519-525. |
| --- | --- |

12)

Norppa, H., Renzi, L. and Lindholm, C. (1993), Detection of whole chromosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by antikinetochore staining and in situ hybridization, Mutagenesis, 8, 519-525.

in situ

Mutagenesis,

| 13) | Eastmond, D.A, Rupa, D.S. and Hasegawa, L.S. (1994), Detection of hyperdiploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes following exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor fluorescence in situ hybridization with DNA probes, Mutation Res., 322, 9-20. |
| --- | --- |

13)

Eastmond, D.A, Rupa, D.S. and Hasegawa, L.S. (1994), Detection of hyperdiploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes following exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor fluorescence in situ hybridization with DNA probes, Mutation Res., 322, 9-20.

in situ

Mutation Res.,

| 14) | Marshall, R.R., Murphy, M., Kirkland, D.J. and Bentley, K.S. (1996), Fluorescence in situ hybridisation (FISH) with chromosome-specific centromeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy, Mutation Res., 372, 233-245. |
| --- | --- |

14)

Marshall, R.R., Murphy, M., Kirkland, D.J. and Bentley, K.S. (1996), Fluorescence in situ hybridisation (FISH) with chromosome-specific centromeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy, Mutation Res., 372, 233-245.

in situ

Mutation Res.,

| 15) | Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. and Crebelli, R. (1996), Analysis of chromosome segregation by means of fluorescence in situ hybridization: application to cytokinesis-blocked human lymphocytes, Mutation Res., 372, 211-219. |
| --- | --- |

15)

Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. and Crebelli, R. (1996), Analysis of chromosome segregation by means of fluorescence in situ hybridization: application to cytokinesis-blocked human lymphocytes, Mutation Res., 372, 211-219.

in situ

Mutation Res.,

| 16) | Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2003), Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Res., 540, 153-163. |
| --- | --- |

16)

Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2003), Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Res., 540, 153-163.

in vitro

Mutation Res.,

| 17) | OECD (1997), In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test, Test Guideline No. 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

17)

OECD (1997), In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test, Test Guideline No. 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [www.oecd.org/env/testguidelines]

In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test,

| 18) | Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M.J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G. and Marzin, D. (2006), SFTG International collaborative Study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study, Mutation Res., 607, 13-36. |
| --- | --- |

18)

Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M.J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G. and Marzin, D. (2006), SFTG International collaborative Study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study, Mutation Res., 607, 13-36.

in vitro

Mutation Res.,

| 19) | Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L.C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes, Mutation Res., 607, 37-60. |
| --- | --- |

19)

Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L.C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes, Mutation Res., 607, 37-60.

in vitro

Mutation Res.,

| 20) | Aardema, M.J., Snyder, R.D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R.J., Gibson, D.P., Soelter, S., Curry, P.T., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, III. Using CHO cells, Mutation Res., 607, 61-87. |
| --- | --- |

20)

Aardema, M.J., Snyder, R.D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R.J., Gibson, D.P., Soelter, S., Curry, P.T., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, III. Using CHO cells, Mutation Res., 607, 61-87.

in vitro

Mutation Res.,

| 21) | Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., Kobayashi, K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells, Mutation Res., 607, 88-124. |
| --- | --- |

21)

Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., Kobayashi, K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells, Mutation Res., 607, 88-124.

in vitro

Mutation Res.,

| 22) | Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, V. Using L5178Y cells, Mutation Res., 607, 125-152. |
| --- | --- |

22)

Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, V. Using L5178Y cells, Mutation Res., 607, 125-152.

in vitro

Mutation Res.,

| 23) | Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A.A. and Locher, F. (1997), Detailed data on in vitro MNT and in vitro CA: industrial experience, Mutation Res., 392, 187-208. |
| --- | --- |

23)

Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A.A. and Locher, F. (1997), Detailed data on in vitro MNT and in vitro CA: industrial experience, Mutation Res., 392, 187-208.

in vitro

in vitro

Mutation Res.,

| 24) | Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. and Lorge, E. (1997), Comparative evaluation of the in vitro micronucleus test and the in vitro chromosome aberration test: industrial experience, Mutation Res., 392, 45-59. |
| --- | --- |

24)

Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. and Lorge, E. (1997), Comparative evaluation of the in vitro micronucleus test and the in vitro chromosome aberration test: industrial experience, Mutation Res., 392, 45-59.

in vitro

in vitro

Mutation Res.,

| 25) | Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. and Madle, S. (1998), Evaluation of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosomal aberration assay: position of the GUM Working Group on the in vitro micronucleus test. Gesellschaft fur Umwelt-Mutations-forschung, Mutation Res., 410, 81-116. |
| --- | --- |

25)

Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. and Madle, S. (1998), Evaluation of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosomal aberration assay: position of the GUM Working Group on the in vitro micronucleus test. Gesellschaft fur Umwelt-Mutations-forschung, Mutation Res., 410, 81-116.

in vitro

in vitro

in vitro

Mutation Res.,

| 26) | Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. and Madle, S. (1999), Chemically induced micronucleus formation in V79 cells – comparison of three different test approaches, Mutation Res. 439, 183-190. |
| --- | --- |

26)

Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. and Madle, S. (1999), Chemically induced micronucleus formation in V79 cells – comparison of three different test approaches, Mutation Res. 439, 183-190.

Mutation Res.

| 27) | Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S.Y., Kasper, P. and Müller, L. (1999), The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 cells to detect drug-induced photogenotoxicity, Mutation Res. 445, 55-71. |
| --- | --- |

27)

Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S.Y., Kasper, P. and Müller, L. (1999), The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 cells to detect drug-induced photogenotoxicity, Mutation Res. 445, 55-71.

Mutation Res.

| 28) | von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., Slacik-Erben, R., Miltenburger, H.G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. and Madle, S. (2000), In vitro micronucleus assay with Chinese hamster V79 cells - results of a collaborative study with in situ exposure to 26 chemical substances, Mutation Res., 468, 137-163. |
| --- | --- |

28)

von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., Slacik-Erben, R., Miltenburger, H.G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. and Madle, S. (2000), In vitro micronucleus assay with Chinese hamster V79 cells - results of a collaborative study with in situ exposure to 26 chemical substances, Mutation Res., 468, 137-163.

In vitro

in situ

Mutation Res

| 29) | Garriott, M.L., Phelps, J.B. and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the in vitro micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity, Mutation Res., 517, 123-134. |
| --- | --- |

29)

Garriott, M.L., Phelps, J.B. and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the in vitro micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity, Mutation Res., 517, 123-134.

in vitro

Mutation Res.,

| 30) | Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. and Sofuni, T. (1999), Validation study of the in vitro micronucleus test in a Chinese hamster lung cell line (CHL/IU), Mutagenesis, 14, 569-580. |
| --- | --- |

30)

Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. and Sofuni, T. (1999), Validation study of the in vitro micronucleus test in a Chinese hamster lung cell line (CHL/IU), Mutagenesis, 14, 569-580.

in vitro

Mutagenesis,

| 31) | Elhajouji, A., and Lorge, E. (2006), Special Issue: SFTG International collaborative study on in vitro micronucleus test, Mutation Res., 607, 1-152. |
| --- | --- |

31)

Elhajouji, A., and Lorge, E. (2006), Special Issue: SFTG International collaborative study on in vitro micronucleus test, Mutation Res., 607, 1-152.

in vitro

Mutation Res.,

| 32) | ECVAM (2006), Statement by the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on the scientific validity of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosome aberration assay for genotoxicity testing. ESAC 25th meeting, 16-17 November, 2006, Available at: [http://ecvam.jrc.it/index.htm] |
| --- | --- |

32)

ECVAM (2006), Statement by the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on the scientific validity of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosome aberration assay for genotoxicity testing. ESAC 25th meeting, 16-17 November, 2006, Available at: [http://ecvam.jrc.it/index.htm]

in vitro

in vitro

th

| 33) | ESAC (2006), ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer Review, Retrospective Validation of the In Vitro Micronucleus Test, Summary and Conclusions of the Peer Review Panel, Available at: [http://ecvam.jrc.it/index.htm] |
| --- | --- |

33)

ESAC (2006), ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer Review, Retrospective Validation of the In Vitro Micronucleus Test, Summary and Conclusions of the Peer Review Panel, Available at: [http://ecvam.jrc.it/index.htm]

In Vitro

| 34) | Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, van Benthem, J., Vanparys P. (2008), ECVAM Retrospective Validation of in vitro Micronucleus Test (MNT), Mutagenesis, 23, 271-283. |
| --- | --- |

34)

Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, van Benthem, J., Vanparys P. (2008), ECVAM Retrospective Validation of in vitro Micronucleus Test (MNT), Mutagenesis, 23, 271-283.

in vitro

Mutagenesis,

| 35) | Zhang, L.S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. and Sofuni, T. (1995), A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the in vitro micronucleus test, Mutation Res., 347, 105-115. |
| --- | --- |

35)

Zhang, L.S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. and Sofuni, T. (1995), A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the in vitro micronucleus test, Mutation Res., 347, 105-115.

in vitro

Mutation Res.,

| 36) | Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. and Knasmeuller, S. (2002), Fumonisin B1 is genotoxic in human derived hepatoma (HepG2) cells, Mutagenesis, 17, 257-260. |
| --- | --- |

36)

Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. and Knasmeuller, S. (2002), Fumonisin B1 is genotoxic in human derived hepatoma (HepG2) cells, Mutagenesis, 17, 257-260.

1

Mutagenesis,

| 37) | Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., Huber, W.W., Hoelzl, C., Bichler, J. and Majer, B.J. (2004), Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge, Toxicol., 198, 315-328. |
| --- | --- |

37)

Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., Huber, W.W., Hoelzl, C., Bichler, J. and Majer, B.J. (2004), Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge, Toxicol., 198, 315-328.

Toxicol.,

| 38) | Gibson, D.P., Brauninger, R., Shaffi, H.S., Kerckaert, G.A., LeBoeuf, R.A., Isfort, R.J. and Aardema, M.J. (1997), Induction of micronuclei in Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation assay for National Toxicology Program test chemicals, Mutation Res., 392, 61-70. |
| --- | --- |

38)

Gibson, D.P., Brauninger, R., Shaffi, H.S., Kerckaert, G.A., LeBoeuf, R.A., Isfort, R.J. and Aardema, M.J. (1997), Induction of micronuclei in Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation assay for National Toxicology Program test chemicals, Mutation Res., 392, 61-70.

Mutation Res.,

| 39) | Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, 147-205. |
| --- | --- |

39)

Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, 147-205.

Mutation Res.,

| 40) | Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992), Clastogenicity of low pH to various cultured mammalian cells, Mutation Res., 268, 297-305. |
| --- | --- |

40)

Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992), Clastogenicity of low pH to various cultured mammalian cells, Mutation Res., 268, 297-305.

Mutation Res.,

| 41) | Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations, Environ. Mutagen., 8, 789-886. |
| --- | --- |

41)

Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations, Environ. Mutagen., 8, 789-886.

Environ. Mutagen

| 42) | Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Measurement of micronuclei in lymphocytes, Mutation Res., 147, 29-36. |
| --- | --- |

42)

Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Measurement of micronuclei in lymphocytes, Mutation Res., 147, 29-36.

Mutation Res.,

| 43) | Fenech, M. (1997), The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood micronucleus method, Mutation Res., 392, 11-18. |
| --- | --- |

43)

Fenech, M. (1997), The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood micronucleus method, Mutation Res., 392, 11-18.

Mutation Res.,

| 44) | Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y.P., Ceppi, M., Chang, W.P., Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M.P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L.R., Fucic, A., Lima, O.G., Hrelia, P., Krishnaja, A.P., Lee, T.K., Migliore, L., Mikhalevich, L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W.U., Odagiri, Y., Scarffi, M.R., Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. and Zijno, A. (2001), HUman MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of micronuclei, Environ. Mol. Mutagen.
  37, 31-45. |
| --- | --- |

44)

Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y.P., Ceppi, M., Chang, W.P., Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M.P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L.R., Fucic, A., Lima, O.G., Hrelia, P., Krishnaja, A.P., Lee, T.K., Migliore, L., Mikhalevich, L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W.U., Odagiri, Y., Scarffi, M.R., Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. and Zijno, A. (2001), HUman MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of micronuclei, Environ. Mol. Mutagen.
  37, 31-45.

Environ. Mol. Mutagen.

37

| 45) | Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983), Revised methods for the Salmonella mutagenicity test, Mutation Res., 113, 173-215. |
| --- | --- |

45)

Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983), Revised methods for the Salmonella mutagenicity test, Mutation Res., 113, 173-215.

Mutation Res.,

| 46) | Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C.R. and Zeiger, E. (1980), Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4, 55-65. |
| --- | --- |

46)

Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C.R. and Zeiger, E. (1980), Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4, 55-65.

J. Environ. Pathol. Toxicol.,

| 47) | Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in-vitro genotoxicity assays. Mutagenesis, 7, 175-177. |
| --- | --- |

47)

Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in-vitro genotoxicity assays. Mutagenesis, 7, 175-177.

in-vitro

Mutagenesis,

| 48) | Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A safe substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, In: de Serres, F.J., Fouts, J. R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds), In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, 85. – 88. lpp. |
| --- | --- |

48)

Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A safe substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, In: de Serres, F.J., Fouts, J. R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds), In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, 85. – 88. lpp.

In:

In Vitro

| 49) | Johnson, T.E., Umbenhauer, D.R. and Galloway, S.M. (1996), Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28, 51-59. |
| --- | --- |

49)

Johnson, T.E., Umbenhauer, D.R. and Galloway, S.M. (1996), Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28, 51-59.

Environ. Mol. Mutagen.,

| 50) | UNEP (2001), Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP). Available at: [http://www.pops.int/] |
| --- | --- |

50)

UNEP (2001), Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP). Available at: [http://www.pops.int/]

| 51) | Doherty, A.T., Ellard, S., Parry, E.M. and Parry, J.M. (1996), An investigation into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to genotoxins in metabolically competent human cells, Mutagenesis, 11, 247-274. |
| --- | --- |

51)

Doherty, A.T., Ellard, S., Parry, E.M. and Parry, J.M. (1996), An investigation into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to genotoxins in metabolically competent human cells, Mutagenesis, 11, 247-274.

Mutagenesis,

| 52) | Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, In: Tice, R.R., Costa, D.L. and Schaich, K.M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, 91. – 103. lpp. |
| --- | --- |

52)

Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, In: Tice, R.R., Costa, D.L. and Schaich, K.M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, 91. – 103. lpp.

In:

| 53) | Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983), Evaluation of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay, Environ. Mutagenesis 5, 795-801. |
| --- | --- |

53)

Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983), Evaluation of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay, Environ. Mutagenesis 5, 795-801.

Environ. Mutagenesis

| 54) | Fenech, M. (1993), The cytokinesis-block micronucleus technique: a detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations, Mutation Res., 285, 35-44. |
| --- | --- |

54)

Fenech, M. (1993), The cytokinesis-block micronucleus technique: a detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations, Mutation Res., 285, 35-44.

Mutation Res.,

| 55) | Phelps, J.B., Garriott, M.L., and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the in vitro micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity, Mutation Res., 521, 103-112. |
| --- | --- |

55)

Phelps, J.B., Garriott, M.L., and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the in vitro micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity, Mutation Res., 521, 103-112.

in vitro

Mutation Res.,

| 56) | Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., Surralles, J., Vanhauwaert, A. and Wakata, A. (2004), Corrigendum to “Report from the in vitro micronucleus assay working group”, Mutation Res., 564, 97-100. |
| --- | --- |

56)

Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., Surralles, J., Vanhauwaert, A. and Wakata, A. (2004), Corrigendum to “Report from the in vitro micronucleus assay working group”, Mutation Res., 564, 97-100.

in vitro

Mutation Res.,

| 57) | Pincu, M., Bass, D. and Norman, A. (1984), An improved micronuclear assay in lymphocytes, Mutation Res., 139, 61-65. |
| --- | --- |

57)

Pincu, M., Bass, D. and Norman, A. (1984), An improved micronuclear assay in lymphocytes, Mutation Res., 139, 61-65.

Mutation Res.,

| 58) | Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. and Kirkland, D. (2008), Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects, Mutation Res., 655, 1-3. |
| --- | --- |

58)

Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. and Kirkland, D. (2008), Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects, Mutation Res., 655, 1-3.

in vitro

Mutation Res.,

| 59) | Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. and Marcos, R. (1995), Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures, Mutation Res., 341, 169-184. |
| --- | --- |

59)

Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. and Marcos, R. (1995), Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures, Mutation Res., 341, 169-184.

Mutation Res.,

| 60) | Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay, Environ. Molec. Mutagenesis 35, 191-201. |
| --- | --- |

60)

Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay, Environ. Molec. Mutagenesis 35, 191-201.

in vitro

Mutagenesis

| 61) | Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, 241-247. |
| --- | --- |

61)

Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, 241-247.

Mutation Res.,

| 62) | MacGregor, J. T., Wehr, C. M., and Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y, Mutation Res., 120, 269-275. |
| --- | --- |

62)

MacGregor, J. T., Wehr, C. M., and Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y, Mutation Res., 120, 269-275.

Mutation Res.,

| 63) | Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An application of acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test, Mutation Res., 120, 241-247. |
| --- | --- |

63)

Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An application of acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test, Mutation Res., 120, 241-247.

Mutation Res.,

| 64) | Fenech, M., Chang, W.P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. and Zeiger, E. (2003), HUMN project: detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures, Mutation Res., 534, 65-75. |
| --- | --- |

64)

Fenech, M., Chang, W.P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. and Zeiger, E. (2003), HUMN project: detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures, Mutation Res., 534, 65-75.

Mutation Res.,

| 65) | Hoffman, W.P., Garriott, M.L. and Lee, C. (2003), In vitro micronucleus test, In: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, Second edition. S. Chow (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, NY, 463.–467. lpp. |
| --- | --- |

65)

Hoffman, W.P., Garriott, M.L. and Lee, C. (2003), In vitro micronucleus test, In: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, Second edition. S. Chow (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, NY, 463.–467. lpp.

In vitro

In:

| 66) | Regulation (EC) No 850/2004 of the European Parliament and of the Council of 29 April 2004 on persistent organic pollutants and amending Directive 79/117/EEC, OV L 229, 30.4.2004., 5. lpp. |
| --- | --- |

66)

Regulation (EC) No 850/2004 of the European Parliament and of the Council of 29 April 2004 on persistent organic pollutants and amending Directive 79/117/EEC, OV L 229, 30.4.2004., 5. lpp.

1. papildinājums

Definīcijas

Aneigēns: viela vai process, kas mijiedarbībā ar mitotiskā un mejotiskā šūnu dalīšanās cikla komponentiem izraisa šūnu vai organismu aneiploīdiju.

Aneiploīdija: novirze no normālā diploīdā (vai haploīdā) hromosomu skaita par vienu vai vairākām atsevišķām hromosomām, bet ne par hromosomu pāri vai pāriem (poliploīdija).

Apoptoze: programmēta šūnu nāve, ko raksturo virkne posmu, kuru rezultātā šūnas sabrūk, bet saglabā membrānu integritāti, un veidojas apoptotiskie ķermenīši, kurus iznīcina fagocīti vai kuri tiek fiziski izvadīti.

Šūnu savairošanās: šūnu skaita pieaugums šūnu mitotiskās dalīšanās rezultātā.

Centromērs: hromosomas DNS reģions, kurā abas hromatīdas ir saistītas un uz kura sānu pie sāna piestiprinājušās abas kinetohoras.

Klastogēns: viela vai process, kas izraisa strukturālu hromosomālu aberāciju (novirzīšanos no normāltipa) šūnu vai organismu populācijās.

Citokinēze: šūnas dalīšanās process, kas notiek tūlīt pēc mitozes un kura rezultātā izveidojas divas meitšūnas, katra ar savu kodolu.

Savairošanās indekss pēc citokinēzes blokādes (CBPI): otrā dalīšanās viļņa šūnu proporcionālā daļa populācijās, kas saņēmušas pētāmo vielu, salīdzinājumā ar pētāmo vielu nesaņēmušo kontroles populāciju (formulu skatīt 2. papildinājumā).

Citostāze: šūnu augšanas kavēšana (formulu skatīt 2. papildinājumā).

Citotoksicitāte: šūnas nāvi izraisoša kaitīga ietekme uz šūnas struktūru vai funkcionalitāti.

Genotoksisks: vispārīgs termins, kas aptver visu veidu bojājumus DNS vai hromosomās, tostarp sekvences pārtraukumus, pārkārtojumus, mutācijas, hromosomu aberācijas un aneiploīdiju. Ne visas genotoksiskās ietekmes rada mutācijas vai pastāvīgus hromosomu bojājumus.

Starpfāzu šūnas: šūnas, kas neatrodas mitotiskajā stadijā.

Kinetohora: proteīnus saturoša struktūra, kas sagrupējas pie centromēra hromosomā, ar kuru šūnas dalīšanās laikā saistās vārpstiņas šķiedras, nodrošinot secīgu meitashromosomu pārvietošanos uz meitasšūnu poliem.

Mikrokodoli: mazi kodoli, kas papildus šūnu galvenajiem kodoliem mitozes vai mejozes telofāzē atsevišķi izveidojas, salīpot hromosomu fragmentiem vai veselām hromosomām.

Mitoze: šūnas kodola dalīšanās process, kuru parasti sīkāk iedala šādās stadijās: profāze, prometafāze, metafāze, anafāze un telofāze.

Mitotiskais indekss: metafāzē esošu šūnu skaita attiecība pret šūnu kopējo skaitu populācijā; raksturo šūnu savairošanās pakāpi šajā populācijā.

Mutagēns: faktors, kas izraisa pārmantojamas DNS bāzu pāru sekvences vai sekvenču izmaiņas gēnos vai hromosomu struktūrā (hromosomu aberācijas).

Neatdalīšanās: māshromatīdu neatdalīšanās, kas meitšūnu veidošanās procesā neļauj māshromatīdām pienācīgi atvirzīties vienai no otras un kuras rezultātā hromosomu skaits meitšūnās nav normāls.

Poliploīdija: vienu vai vairākus hromosomu komplektus ietverošas skaitliskas hromosomu aberācijas šūnās vai organismos (pretstatā aneiploīdijai, kas skar vienu vai vairākas atsevišķas hromosomas).

Savairošanās indekss (PI): citotoksicitātes mērīšanas paņēmiens, ja neizmanto cytoB (formulu skatīt 2. papildinājumā).

Šūnu skaita relatīvais pieaugums (RICC): citotoksicitātes mērīšanas paņēmiens, ja neizmanto cytoB (formulu skatīt 2. papildinājumā).

Populācijas relatīvā divkāršošanās (RPD): citotoksicitātes mērīšanas paņēmiens, ja neizmanto cytoB (formulu skatīt 2. papildinājumā).

Replicēšanās indekss (RI): pabeigtu [šūnu dalīšanās] ciklu proporcionālā daļa kultūrā, kas saņēmusi pētāmo vielu, ekspozīcijas un atveseļošanās laikā salīdzinājumā ar pētāmo vielu nesaņēmušo kontroles kultūru (formulu skatīt 2. papildinājumā).

Testējamā ķīmiskā viela (arī testējama viela): viela vai vielu maisījums, kuru testē ar šo TM.

2. papildinājums

Citotoksicitātes novērtējuma formulas

| 1. | Ja izmanto cytoB, citotoksicitātes novērtējuma pamatā ir savairošanās indekss pēc citokinēzes blokādes (CBPI) vai replicēšanās indekss (RI) (16) (58). CBPI rāda šūnas ciklu vidējo skaitu vienai šūnai laikā, kamēr uz to iedarbojas cytoB, un šo indeksu var izmantot, lai aprēķinātu šūnu savairošanos. RI rāda kodolu relatīvo skaitu apstrādātajās kultūrās salīdzinājumā ar kontroles kultūrām, un ar to var procentos (%) izteikt citostāzi:
  % citostāze = 100 – 100{(CBPIT – 1) ÷ (CBPIC – 1)}
  un:







  T | = | ar testējamo ķīmisko vielu apstrādātā kultūra |
| --- | --- | --- | --- |
| C | = | nesēju saņēmusī kontroles kultūra |

1.

Ja izmanto cytoB, citotoksicitātes novērtējuma pamatā ir savairošanās indekss pēc citokinēzes blokādes (CBPI) vai replicēšanās indekss (RI) (16) (58). CBPI rāda šūnas ciklu vidējo skaitu vienai šūnai laikā, kamēr uz to iedarbojas cytoB, un šo indeksu var izmantot, lai aprēķinātu šūnu savairošanos. RI rāda kodolu relatīvo skaitu apstrādātajās kultūrās salīdzinājumā ar kontroles kultūrām, un ar to var procentos (%) izteikt citostāzi:

% citostāze = 100 – 100{(CBPIT – 1) ÷ (CBPIC – 1)}

un:

T

=

ar testējamo ķīmisko vielu apstrādātā kultūra

C

=

nesēju saņēmusī kontroles kultūra

kur:

Formula

Tādā veidā CBPI ar vērtību 1 (visas šūnas ir vienkodola šūnas) ir līdzvērtīgs 100 % citostāzei.

Citostāze = 100 – RI

Formula

| T | = | apstrādātās kultūras |
| --- | --- | --- |
| C | = | kontroles kultūras |

T

=

apstrādātās kultūras

C

=

kontroles kultūras

| 2. | Tādā veidā, ja RI ir 53 %, tas nozīmē, ka, salīdzinot ar kontroles kultūras šūnu skaitu, kuras dalījušās, izveidojot divkodolu un daudzkodolu šūnas, apstrādātajā kultūrā šādi dalījušies tikai 53 % no tāda paša šūnu skaita, t. i., ir 47 % citostāze. |
| --- | --- |

2.

Tādā veidā, ja RI ir 53 %, tas nozīmē, ka, salīdzinot ar kontroles kultūras šūnu skaitu, kuras dalījušās, izveidojot divkodolu un daudzkodolu šūnas, apstrādātajā kultūrā šādi dalījušies tikai 53 % no tāda paša šūnu skaita, t. i., ir 47 % citostāze.

| 3. | Ja cytoBneizmanto, citotoksicitātes novērtējuma pamatā ieteicams likt šūnu skaita relatīvā pieauguma (RICC) vai populācijas relatīvās divkāršošanās (RPD) rādītājus (58), jo tie abi ņem vērā to šūnu populācijas daļu, kura ir dalījusies.






  kur:
  Populācijas divkāršošanās = [log (šūnu skaits pēc apstrādes ÷ šūnu skaits sākumā)] ÷ log 2 |
| --- | --- |

3.

Ja cytoBneizmanto, citotoksicitātes novērtējuma pamatā ieteicams likt šūnu skaita relatīvā pieauguma (RICC) vai populācijas relatīvās divkāršošanās (RPD) rādītājus (58), jo tie abi ņem vērā to šūnu populācijas daļu, kura ir dalījusies.

Formula

Formula

kur:

Populācijas divkāršošanās = [log (šūnu skaits pēc apstrādes ÷ šūnu skaits sākumā)] ÷ log 2

| 4. | Tādā veidā, ja RICC vai RPD ir 53 %, tas uzrāda 47 % citotoksicitāti/citostāzi. |
| --- | --- |

4.

Tādā veidā, ja RICC vai RPD ir 53 %, tas uzrāda 47 % citotoksicitāti/citostāzi.

| 5. | Ar savairošanās indeksu (PI) citotoksicitāti var novērtēt, saskaitot klonus, ko veido 1 šūna (cl1), 2 šūnas (cl2), 3 līdz 4 šūnas (cl4) un 5 līdz 8 šūnas (cl8). |
| --- | --- |

5.

Ar savairošanās indeksu (PI) citotoksicitāti var novērtēt, saskaitot klonus, ko veido 1 šūna (cl1), 2 šūnas (cl2), 3 līdz 4 šūnas (cl4) un 5 līdz 8 šūnas (cl8).

Formula

| 6. | PI ir ticis izmantots kā noderīgs un ticams citotoksicitātes parametrs arī bez cytoB iedarbības in situ kultivētām šūnu līnijām (25) (26) (27) (28). |
| --- | --- |

6.

PI ir ticis izmantots kā noderīgs un ticams citotoksicitātes parametrs arī bez cytoB iedarbības in situ kultivētām šūnu līnijām (25) (26) (27) (28).

3. papildinājums

Veiktspējas novērtēšanai ieteicamās references vielas
   (16)

| Kategorija | Ķīmiskā viela | CAS Nr. | EK Nr. |
| --- | --- | --- | --- |
| 1.   Klastogēni, kuriem metabolisma aktivācija nav vajadzīga |
| | Citozīnarabinozīds | 147-94-4 | 205-705-9 |
| | Mitomicīns C | 50-07-7 | 200-008-6 |
| 2.   Klastogēni, kam ir vajadzīga metabolisma aktivācija |
| | Benz(a)pirēns | 50-32-8 | 200-028-5 |
| | Ciklofosfamīds | 50-18-0 | 200-015-4 |
| 3.   Aneigēni |
| | Kolhicīns | 64-86-8 | 200-598-5 |
| | Vinblastīns | 143-67-9 | 205-606-0 |
| 4.   Negatīvās vielas |
| | Di-(2-etilheksil)ftalāts | 117-81-7 | 204-211-0 |
| | Nalidiksskābe | 389-08-2 | 206-864-7 |
| | Pirēns | 129-00-0 | 204-927-3 |
| | Nātrija hlorīds | 7647-14-5 | 231-598-3 |

Kategorija

Ķīmiskā viela

CAS Nr.

EK Nr.

Klastogēni, kuriem metabolisma aktivācija nav vajadzīga

Citozīnarabinozīds

147-94-4

205-705-9

Mitomicīns C

50-07-7

200-008-6

Klastogēni, kam ir vajadzīga metabolisma aktivācija

Benz(a)pirēns

50-32-8

200-028-5

Ciklofosfamīds

50-18-0

200-015-4

Aneigēni

Kolhicīns

64-86-8

200-598-5

Vinblastīns

143-67-9

205-606-0

Negatīvās vielas

Di-(2-etilheksil)ftalāts

117-81-7

204-211-0

Nalidiksskābe

389-08-2

206-864-7

Pirēns

129-00-0

204-927-3

Nātrija hlorīds

7647-14-5

231-598-3

B.50.   ĀDAS SENSIBILIZĀCIJA: LOKĀLO LIMFMEZGLU NOTEIKŠANA (LLNA:DA)

B.50.

ĀDAS SENSIBILIZĀCIJA: LOKĀLO LIMFMEZGLU NOTEIKŠANA (LLNA:DA)

IEVADS

| 1. | ESAO ķīmisko vielu testēšanas vadlīnijas un ES testēšanas metodes tiek regulāri pārskatītas, ņemot vērā tehnikas attīstību, regulatīvo prasību izmaiņas un dzīvnieku labturības apsvērumus. Ir pārskatīta B.42 – pirmā no testēšanas metodēm (TM) ādas sensibilizācijas noteikšanai pelēm jeb lokālo limfmezglu noteikšanas metode (LLNA; ESAO 429. testēšanas vadlīnijas) (1). Ir publicēti LLNA validācijas un ar to saistītā darba pārskati (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). Lai mērītu limfocītu savairošanos, LLNA izmanto radioizotopisko timidīnu vai jodīnu, un tāpēc šīs metodes pielietošana ir ierobežota gadījumos, kad radioaktīvo komponentu iegāde, izmantošana vai apglabāšana ir problemātiska. LLNA:DA (izstrādātājs: Daicel Chemical Industies Ltd.) ir modificēta LLNA, kurā nav radioaktīvo komponentu un ar kuru kvantitatīvi nosaka adenozīntrifosfāta (ATP) saturu, par limfocītu savairošanās indikatoru izmantojot bioluminiscenci. LLNA:DA testēšanas metode ir validēta, to ir pārskatījusi starptautiska salīdzinošās izvērtēšanas komisija un ir rekomendējusi šo metodi kā tādu, kas ar dažiem ierobežojumiem uzskatāma par noderīgu ādu sensibilizējošu un nesensibilizējošu ķīmisku vielu identificēšanai (10) (11) (12) (13). Šī TM ir izstrādāta, lai novērtētu ķīmiskām vielām vai to maisījumiem piemītošo ādas sensibilizācijas potenciālu (dzīvniekiem). Šā pielikuma B.6. nodaļā un ESAO 406. testēšanas vadlīnijās aprakstītā metode izmanto testēšanu ar jūrascūciņām, proti, maksimizācijas testu jūrascūciņām un Bīlera testu (14). LLNA (šā pielikuma B.42. nodaļa; ESAO 429. testēšanas vadlīnijas) un abas šīs metodes modifikācijas, kurās nav radioaktīvo komponentu, proti, LLNA:DA (šā pielikuma B.50. nodaļa; ESAO 442.a testēšanas vadlīnijas) un LLNA:BrdU-ELISA (šā pielikuma B.51. nodaļa; ESAO 442.b testēšanas vadlīnijas), visas ir pārākas par testēšanas metodēm ar jūrascūciņām, kas aprakstītas B.6 un ESAO 406. testēšanas vadlīnijās (14), dzīvnieku skaita samazinājuma un labāka izmantojuma ziņā. |
| --- | --- |

1.

ESAO ķīmisko vielu testēšanas vadlīnijas un ES testēšanas metodes tiek regulāri pārskatītas, ņemot vērā tehnikas attīstību, regulatīvo prasību izmaiņas un dzīvnieku labturības apsvērumus. Ir pārskatīta B.42 – pirmā no testēšanas metodēm (TM) ādas sensibilizācijas noteikšanai pelēm jeb lokālo limfmezglu noteikšanas metode (LLNA; ESAO 429. testēšanas vadlīnijas) (1). Ir publicēti LLNA validācijas un ar to saistītā darba pārskati (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). Lai mērītu limfocītu savairošanos, LLNA izmanto radioizotopisko timidīnu vai jodīnu, un tāpēc šīs metodes pielietošana ir ierobežota gadījumos, kad radioaktīvo komponentu iegāde, izmantošana vai apglabāšana ir problemātiska. LLNA:DA (izstrādātājs: Daicel Chemical Industies Ltd.) ir modificēta LLNA, kurā nav radioaktīvo komponentu un ar kuru kvantitatīvi nosaka adenozīntrifosfāta (ATP) saturu, par limfocītu savairošanās indikatoru izmantojot bioluminiscenci. LLNA:DA testēšanas metode ir validēta, to ir pārskatījusi starptautiska salīdzinošās izvērtēšanas komisija un ir rekomendējusi šo metodi kā tādu, kas ar dažiem ierobežojumiem uzskatāma par noderīgu ādu sensibilizējošu un nesensibilizējošu ķīmisku vielu identificēšanai (10) (11) (12) (13). Šī TM ir izstrādāta, lai novērtētu ķīmiskām vielām vai to maisījumiem piemītošo ādas sensibilizācijas potenciālu (dzīvniekiem). Šā pielikuma B.6. nodaļā un ESAO 406. testēšanas vadlīnijās aprakstītā metode izmanto testēšanu ar jūrascūciņām, proti, maksimizācijas testu jūrascūciņām un Bīlera testu (14). LLNA (šā pielikuma B.42. nodaļa; ESAO 429. testēšanas vadlīnijas) un abas šīs metodes modifikācijas, kurās nav radioaktīvo komponentu, proti, LLNA:DA (šā pielikuma B.50. nodaļa; ESAO 442.a testēšanas vadlīnijas) un LLNA:BrdU-ELISA (šā pielikuma B.51. nodaļa; ESAO 442.b testēšanas vadlīnijas), visas ir pārākas par testēšanas metodēm ar jūrascūciņām, kas aprakstītas B.6 un ESAO 406. testēšanas vadlīnijās (14), dzīvnieku skaita samazinājuma un labāka izmantojuma ziņā.

LLNA

LLNA

LLNA

LLNA:DA

Daicel Chemical Industies Ltd.

LLNA

LLNA:DA

LLNA

LLNA:DA

LLNA:BrdU-ELISA

| 2. | Līdzīgi kā LLNA, ar LLNA:DA pēta ādas sensibilizācijas indukcijas fāzi un sniedz kvantitatīvus datus, kas piemēroti atbildes reakcijas uz devu novērtēšanai. Turklāt iespēja noteikt ādas sensibilizatorus, neizmantojot radioaktīvus DNS marķierus, atbrīvo no vajadzības risināt arodapstarošanas un radioaktīvo atkritumu apglabāšanas jautājumus. Tas savukārt ļauj ādas sensibilizatoru noteikšanai biežāk izmantot peles un turpināt samazināt jūrascūciņu izmantošanu ādas sensibilizācijas potenciāla testēšanā (t. i., B.6; ESAO 406. testēšanas vadlīnijas) (14). |
| --- | --- |

2.

Līdzīgi kā LLNA, ar LLNA:DA pēta ādas sensibilizācijas indukcijas fāzi un sniedz kvantitatīvus datus, kas piemēroti atbildes reakcijas uz devu novērtēšanai. Turklāt iespēja noteikt ādas sensibilizatorus, neizmantojot radioaktīvus DNS marķierus, atbrīvo no vajadzības risināt arodapstarošanas un radioaktīvo atkritumu apglabāšanas jautājumus. Tas savukārt ļauj ādas sensibilizatoru noteikšanai biežāk izmantot peles un turpināt samazināt jūrascūciņu izmantošanu ādas sensibilizācijas potenciāla testēšanā (t. i., B.6; ESAO 406. testēšanas vadlīnijas) (14).

LLNA

LLNA:DA

DEFINĪCIJAS

| 3. | Definīcijas skatīt 1. papildinājumā. |
| --- | --- |

3.

Definīcijas skatīt 1. papildinājumā.

SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI UN IEROBEŽOJUMI

| 4. | LLNA:DA metode ir modificēta LLNA, kura paredzēta ķīmisko vielu – potenciālu ādas sensibilizatoru identificēšanai un kurai ir zināmi ierobežojumi. Tas nenozīmē, ka visos gadījumos LLNA:DA būtu jālieto LLNA vai jūrascūciņu testa vietā (B.6; ESAO 406. testēšanas vadlīnijas) (14), bet gan to, ka šī noteikšana ir minētajam testam līdzvērtīga un to var izmantot kā alternatīvu, kuras pozitīvajam vai negatīvajam rezultātam vairs nav vajadzīgs papildu apstiprinājums (10) (11). Pirms uzsākt pētījumus, testēšanas laboratorijai jāņem vērā visa par testējamo vielu pieejamā informācija. Pie šādas informācijas pieder testējamās vielas identifikācija un ķīmiskā struktūra, fizikāli ķīmiskās īpašības, citu in vitro vai in vivo veikto toksicitātes testu rezultāti un toksikoloģiskie dati par struktūras ziņā saistītām vielām. Šī informācija jāizvērtē, lai noteiktu LLNA:DA piemērotību konkrētajai testējamai vielai (ņemot vērā atsevišķu veidu vielu nesaderību ar LLNA:DA; skatīt 5. punktu) un lai izraudzītos pareizu testējamās vielas devu. |
| --- | --- |

4.

LLNA:DA metode ir modificēta LLNA, kura paredzēta ķīmisko vielu – potenciālu ādas sensibilizatoru identificēšanai un kurai ir zināmi ierobežojumi. Tas nenozīmē, ka visos gadījumos LLNA:DA būtu jālieto LLNA vai jūrascūciņu testa vietā (B.6; ESAO 406. testēšanas vadlīnijas) (14), bet gan to, ka šī noteikšana ir minētajam testam līdzvērtīga un to var izmantot kā alternatīvu, kuras pozitīvajam vai negatīvajam rezultātam vairs nav vajadzīgs papildu apstiprinājums (10) (11). Pirms uzsākt pētījumus, testēšanas laboratorijai jāņem vērā visa par testējamo vielu pieejamā informācija. Pie šādas informācijas pieder testējamās vielas identifikācija un ķīmiskā struktūra, fizikāli ķīmiskās īpašības, citu in vitro vai in vivo veikto toksicitātes testu rezultāti un toksikoloģiskie dati par struktūras ziņā saistītām vielām. Šī informācija jāizvērtē, lai noteiktu LLNA:DA piemērotību konkrētajai testējamai vielai (ņemot vērā atsevišķu veidu vielu nesaderību ar LLNA:DA; skatīt 5. punktu) un lai izraudzītos pareizu testējamās vielas devu.

LLNA:DA

LLNA

LLNA:DA

LLNA

in vitro

in vivo

LLNA:DA

LLNA:DA

| 5. | LLNA:DA ir in vivo metode un kā tāda paredz dzīvnieku izmantošanu alerģiskās kontakta sensibilizējošās aktivitātes novērtējumā. Tomēr salīdzinājumā ar testēšanas metodēm, kurās izmanto jūrascūciņas (B.6; ESAO 406. testēšanas metode), tajā iespējams izmantot mazāku skaitu dzīvnieku (14). LLNA:DA turklāt piedāvā būtisku uzlabojumu (mazāk sāpju un ciešanu) dzīvnieku izmantojumā alerģiskās kontakta sensibilizējošās testēšanas vajadzībām, jo (atšķirībā no B.6 un ESAO 406. testēšanas vadlīnijām) LLNA:DA nav jānoskaidro provocētās–inducētās ādas hipersensibilizācijas reakcijas. Neraugoties uz LLNA:DA priekšrocībām salīdzinājumā ar B.6 un ESAO 406. testēšanas vadlīnijām (14), šai metodei ir daži ierobežojumi, kuru dēļ tomēr jāizmanto B.6 vai ESAO 406. testēšanas vadlīniju metode (piemēram, dažu metālu testēšanā, šķietami pozitīva rezultāta konstatēšanas gadījumā dažiem ādas sensibilizatoriem [kā, piemēram, atsevišķām surfaktantu tipa vielām] (6) (1; šā pielikuma B.42. nodaļa) vai testējamās vielas šķīdības labad). Turklāt vajadzība pēc jūrascūciņu testiem (B.6 un ESAO 406. testēšanas vadlīnijas (14)) var saglabāties attiecībā uz ķīmisko vielu klasēm vai vielām, kuru sastāvā ir funkcionālās grupas, par kurām ir pierādīts, ka tās darbojas kā potenciāli sajaucējfaktori (16). Ierobežojumus, kuri konstatēti LLNA gadījumā (1; šā pielikuma B.42. nodaļa) ieteicams attiecināt arī uz LLNA:DA (10). Turklāt LLNA:DA var nebūt piemērotākā metode tādu vielu testēšanai, kas ietekmē ATP koncentrācijas (piemēram, vielas, kam ir ATP inhibējoša iedarbība) vai kas ietekmē starpšūnu ATP mērījumu precizitāti (piemēram, ATP degradējošu enzīmu klātbūtne, ārpusšūnu ATP klātbūtne limfmezglā). Izņemot šādus minētos ierobežojumus, LLNA:DA jāvar izmantot jebkuras vielas testēšanai, ja vien testējamai vielai nav tādu īpašību, kas varētu ietekmēt LLNA:DA precizitāti. Ja stimulācijas indeksa (SI) vērtība ir robežās no 1,8 līdz 2,5, jāapsver neitrālam tuva pozitīva rezultāta iespējamība (skatīt 31.–32. punktu). Šā apgalvojuma pamatā ir validēšanas datubāze, kuru veido 44 vielas ar SI ≥ 1,8 (skatīt 6. punktu); LLNA:DA pareizi identificēja visus 32 LLNA sensibilizatorus, bet kļūdaini identificēja trīs no 12 LLNA nesensibilizējošajām vielām, kuru SI vērtības bija robežās no 1,8 līdz 2,5 (t. i., pozitīvs neitrālam tuvs rezultāts) (10). Tomēr, tā kā SI vērtību noteikšanai un testēšanas metodes prognozēšanas spējas aprēķināšanai tika izmantota viena un tā pati datu kopa, minētie rezultāti var būt pārāk augsts reālās prognozēšanas spējas novērtējums. |
| --- | --- |

5.

LLNA:DA ir in vivo metode un kā tāda paredz dzīvnieku izmantošanu alerģiskās kontakta sensibilizējošās aktivitātes novērtējumā. Tomēr salīdzinājumā ar testēšanas metodēm, kurās izmanto jūrascūciņas (B.6; ESAO 406. testēšanas metode), tajā iespējams izmantot mazāku skaitu dzīvnieku (14). LLNA:DA turklāt piedāvā būtisku uzlabojumu (mazāk sāpju un ciešanu) dzīvnieku izmantojumā alerģiskās kontakta sensibilizējošās testēšanas vajadzībām, jo (atšķirībā no B.6 un ESAO 406. testēšanas vadlīnijām) LLNA:DA nav jānoskaidro provocētās–inducētās ādas hipersensibilizācijas reakcijas. Neraugoties uz LLNA:DA priekšrocībām salīdzinājumā ar B.6 un ESAO 406. testēšanas vadlīnijām (14), šai metodei ir daži ierobežojumi, kuru dēļ tomēr jāizmanto B.6 vai ESAO 406. testēšanas vadlīniju metode (piemēram, dažu metālu testēšanā, šķietami pozitīva rezultāta konstatēšanas gadījumā dažiem ādas sensibilizatoriem [kā, piemēram, atsevišķām surfaktantu tipa vielām] (6) (1; šā pielikuma B.42. nodaļa) vai testējamās vielas šķīdības labad). Turklāt vajadzība pēc jūrascūciņu testiem (B.6 un ESAO 406. testēšanas vadlīnijas (14)) var saglabāties attiecībā uz ķīmisko vielu klasēm vai vielām, kuru sastāvā ir funkcionālās grupas, par kurām ir pierādīts, ka tās darbojas kā potenciāli sajaucējfaktori (16). Ierobežojumus, kuri konstatēti LLNA gadījumā (1; šā pielikuma B.42. nodaļa) ieteicams attiecināt arī uz LLNA:DA (10). Turklāt LLNA:DA var nebūt piemērotākā metode tādu vielu testēšanai, kas ietekmē ATP koncentrācijas (piemēram, vielas, kam ir ATP inhibējoša iedarbība) vai kas ietekmē starpšūnu ATP mērījumu precizitāti (piemēram, ATP degradējošu enzīmu klātbūtne, ārpusšūnu ATP klātbūtne limfmezglā). Izņemot šādus minētos ierobežojumus, LLNA:DA jāvar izmantot jebkuras vielas testēšanai, ja vien testējamai vielai nav tādu īpašību, kas varētu ietekmēt LLNA:DA precizitāti. Ja stimulācijas indeksa (SI) vērtība ir robežās no 1,8 līdz 2,5, jāapsver neitrālam tuva pozitīva rezultāta iespējamība (skatīt 31.–32. punktu). Šā apgalvojuma pamatā ir validēšanas datubāze, kuru veido 44 vielas ar SI ≥ 1,8 (skatīt 6. punktu); LLNA:DA pareizi identificēja visus 32 LLNA sensibilizatorus, bet kļūdaini identificēja trīs no 12 LLNA nesensibilizējošajām vielām, kuru SI vērtības bija robežās no 1,8 līdz 2,5 (t. i., pozitīvs neitrālam tuvs rezultāts) (10). Tomēr, tā kā SI vērtību noteikšanai un testēšanas metodes prognozēšanas spējas aprēķināšanai tika izmantota viena un tā pati datu kopa, minētie rezultāti var būt pārāk augsts reālās prognozēšanas spējas novērtējums.

LLNA:DA

in vivo

LLNA:DA

LLNA:DA

LLNA:DA

LLNA

LLNA:DA

LLNA:DA

LLNA:DA

LLNA:DA

LLNA:DA

LLNA

LLNA

TESTĒŠANAS METODES PRINCIPS

| 6. | LLNA:DA pamatprincips ir tāds, ka sensibilizatori inducē limfocītu savairošanos limfmezglos, kuri drenē testējamās vielas saņemšanas vietu. Šī savairošanās ir proporcionāla devai un alergēna iedarbīgumam un ir vienkāršs paņēmiens, lai iegūtu kvantitatīvu sensitivitātes mērījumu. Savairošanās pakāpi nosaka, vidējo savairošanos katrā testējamās vielas grupā salīdzinot ar vidējo savairošanos kontroles grupā, kas saņēmusi tikai nesēju (VC). Nosaka attiecību starp vidējo progresiju grupās, kas saņēmušas pētāmo vielu, un progresiju VC grupā; tas ir stimulācijas indekss (SI). Lai testējamo vielu pamatoti turpinātu vērtēt kā potenciālu ādas sensibilizatoru, SI vērtībai jābūt ≥ 1,8. Šeit aprakstītās procedūras pamatā ir adenozīntrifosfāta (ATP) satura mērīšana ar bioluminiscenci (zināms, ka tas korelē ar dzīvo šūnu skaitu) (17), lai indicētu vairojošos šūnu skaita pieaugumu aurikulārajos limfmezglos (18) (19). Biolumuniscences metodē izmanto luciferāzi (enzīms), lai katalizētu gaismas rašanos no ATP un luciferīna šādā reakcijā:

  ATP + Luciferīns + O
  2

  Oksiluciferīns + AMP + PPi
  - CO
  2 + Gaisma

  Emitētās gaismas intensitāte ir lineārā sakarībā ar ATP koncentrāciju, un to mēra ar luminometru. Luciferīna–luciferāzes noteikšana ir jutīga metode ATP kvantitatīvai noteikšanai, kam ir plašs lietojumu spektrs (20). |
| --- | --- |

6.

LLNA:DA pamatprincips ir tāds, ka sensibilizatori inducē limfocītu savairošanos limfmezglos, kuri drenē testējamās vielas saņemšanas vietu. Šī savairošanās ir proporcionāla devai un alergēna iedarbīgumam un ir vienkāršs paņēmiens, lai iegūtu kvantitatīvu sensitivitātes mērījumu. Savairošanās pakāpi nosaka, vidējo savairošanos katrā testējamās vielas grupā salīdzinot ar vidējo savairošanos kontroles grupā, kas saņēmusi tikai nesēju (VC). Nosaka attiecību starp vidējo progresiju grupās, kas saņēmušas pētāmo vielu, un progresiju VC grupā; tas ir stimulācijas indekss (SI). Lai testējamo vielu pamatoti turpinātu vērtēt kā potenciālu ādas sensibilizatoru, SI vērtībai jābūt ≥ 1,8. Šeit aprakstītās procedūras pamatā ir adenozīntrifosfāta (ATP) satura mērīšana ar bioluminiscenci (zināms, ka tas korelē ar dzīvo šūnu skaitu) (17), lai indicētu vairojošos šūnu skaita pieaugumu aurikulārajos limfmezglos (18) (19). Biolumuniscences metodē izmanto luciferāzi (enzīms), lai katalizētu gaismas rašanos no ATP un luciferīna šādā reakcijā:

LLNA:DA

ATP + Luciferīns + O
  2
  Image
  Oksiluciferīns + AMP + PPi
  - CO
  2 + Gaisma

ATP

Luciferīns

O

2

Oksiluciferīns

AMP

PPi

CO

2

Gaisma

Emitētās gaismas intensitāte ir lineārā sakarībā ar ATP koncentrāciju, un to mēra ar luminometru. Luciferīna–luciferāzes noteikšana ir jutīga metode ATP kvantitatīvai noteikšanai, kam ir plašs lietojumu spektrs (20).

METODES APRAKSTS

Dzīvnieku sugas izvēle

Dzīvnieku sugas izvēle

| 7. | Šim testam izvēlētā suga ir peles. LLNA:DA validēšanas pētījumi ir veikti vienīgi ar CBA/J līnijas dzīvniekiem, un tāpēc to uzskata par ieteicamo līniju (12) (13). Izmanto jaunas, pieaugušas sievišķā dzimuma peles, kas nav dzemdējušas un nav grūsnas. Pētījuma sākumā dzīvniekiem jābūt 8–12 nedēļu veciem, dzīvnieku masas atšķirībām jābūt minimālām un ne lielākām par 20 % no vidējās masas. Citas līnijas un vīrišķā dzimuma dzīvniekus var izmantot, ja ir iegūts pietiekami daudz datu, lai parādītu, ka LLNA:DA atbildes reakcijā nav nozīmīgu atšķirību, kas specifiskas līnijai un/vai dzimumam. |
| --- | --- |

7.

Šim testam izvēlētā suga ir peles. LLNA:DA validēšanas pētījumi ir veikti vienīgi ar CBA/J līnijas dzīvniekiem, un tāpēc to uzskata par ieteicamo līniju (12) (13). Izmanto jaunas, pieaugušas sievišķā dzimuma peles, kas nav dzemdējušas un nav grūsnas. Pētījuma sākumā dzīvniekiem jābūt 8–12 nedēļu veciem, dzīvnieku masas atšķirībām jābūt minimālām un ne lielākām par 20 % no vidējās masas. Citas līnijas un vīrišķā dzimuma dzīvniekus var izmantot, ja ir iegūts pietiekami daudz datu, lai parādītu, ka LLNA:DA atbildes reakcijā nav nozīmīgu atšķirību, kas specifiskas līnijai un/vai dzimumam.

LLNA:DA

LLNA:DA

Turēšanas un barošanas apstākļi

Turēšanas un barošanas apstākļi

| 8. | Ja nav zinātniska pamatojuma, kāpēc peles būtu turamas katra atsevišķi, peles izmitina grupā (21). Telpā, kurā tur izmēģinājumu dzīvniekus, jābūt 22 ± 3 °C temperatūrai. Lai gan, izņemot telpu uzkopšanas laiku, relatīvajam mitrumam jābūt vismaz 30 % un vēlams ne vairāk kā 70 %, tas jāuztur 50–60 % robežās. Apgaismojumam jābūt mākslīgam atbilstoši secībai 12 stundas gaišas, 12 stundas tumšas. Barošanai var izmantot parasto laboratorijas barību ar neierobežotu dzeramā ūdens daudzumu. |
| --- | --- |

8.

Ja nav zinātniska pamatojuma, kāpēc peles būtu turamas katra atsevišķi, peles izmitina grupā (21). Telpā, kurā tur izmēģinājumu dzīvniekus, jābūt 22 ± 3 °C temperatūrai. Lai gan, izņemot telpu uzkopšanas laiku, relatīvajam mitrumam jābūt vismaz 30 % un vēlams ne vairāk kā 70 %, tas jāuztur 50–60 % robežās. Apgaismojumam jābūt mākslīgam atbilstoši secībai 12 stundas gaišas, 12 stundas tumšas. Barošanai var izmantot parasto laboratorijas barību ar neierobežotu dzeramā ūdens daudzumu.

Dzīvnieku sagatavošana

Dzīvnieku sagatavošana

| 9. | Dzīvniekus izvēlas pēc nejaušības principa, marķē individuālai identificēšanai (bet nekādā veidā nemarķē ausis) un tur būros vismaz piecas dienas pirms testa sākuma, lai tos aklimatizētu laboratorijas apstākļos. Pirms apstrādes uzsākšanas visus dzīvniekus apskata, lai pārliecinātos, ka tiem nav novērojami ādas bojājumi. |
| --- | --- |

9.

Dzīvniekus izvēlas pēc nejaušības principa, marķē individuālai identificēšanai (bet nekādā veidā nemarķē ausis) un tur būros vismaz piecas dienas pirms testa sākuma, lai tos aklimatizētu laboratorijas apstākļos. Pirms apstrādes uzsākšanas visus dzīvniekus apskata, lai pārliecinātos, ka tiem nav novērojami ādas bojājumi.

Testa šķīdumu sagatavošana

Testa šķīdumu sagatavošana

| 10. | Cietas ķīmiskās vielas pirms peļu ausu apstrādes izšķīdina vai suspendē, izmantojot šķīdinātājus vai nesējus, un vajadzības gadījumā atšķaida. Šķidras ķīmiskās vielas var izmantot gan atšķaidītas, gan neatšķaidītas. Nešķīstošas ķīmiskās vielas (kādas parasti izmanto medicīnas iekārtās) pirms peļu ausu apstrādes ekstrahē piemērotā šķīdinātājā, lai visas ekstrahējamās sastāvdaļas būtu pieejamas testēšanai. Ja dati par testējamo vielu stabilitāti liecina, ka tās uzglabāt nevar, katru dienu sagatavo svaigas testējamās vielas. |
| --- | --- |

10.

Cietas ķīmiskās vielas pirms peļu ausu apstrādes izšķīdina vai suspendē, izmantojot šķīdinātājus vai nesējus, un vajadzības gadījumā atšķaida. Šķidras ķīmiskās vielas var izmantot gan atšķaidītas, gan neatšķaidītas. Nešķīstošas ķīmiskās vielas (kādas parasti izmanto medicīnas iekārtās) pirms peļu ausu apstrādes ekstrahē piemērotā šķīdinātājā, lai visas ekstrahējamās sastāvdaļas būtu pieejamas testēšanai. Ja dati par testējamo vielu stabilitāti liecina, ka tās uzglabāt nevar, katru dienu sagatavo svaigas testējamās vielas.

Ticamības pārbaude

Ticamības pārbaude

| 11. | Metodes veiktspējas pienācīgumu parāda ar pozitīvās kontroles vielu (PC) palīdzību, kuras ar adekvātu un reproducējamu sensibilitāti reaģē uz sensibilizējošām testēšanas vielām un kuru reakcijas intensitāte ir sīki aprakstīta. Ieteicams paredzēt vienlaicīgu PC, jo tādā veidā var pierādīt laboratorijas spēju atkārtoti un sekmīgi īstenot noteikšanu, kā arī novērtēt iekšlaboratorijas un starplaboratoriju reproducējamību un rezultātu salīdzināmību. Pirms LLNA:DA ieteicams lietotājiem konsultēties ar atbildīgajām iestādēm, jo dažas regulatīvās iestādes pieprasa PC izmantošanu katrā individuālā pētījumā. Attiecīgi labāk ir ikreiz izmantot vienlaicīgu PC, jo tas ļauj neveikt papildu testēšanu ar dzīvniekiem, lai izpildītu prasības, kuras var izrietēt no PC neregulāras izmantošanas (skatīt 12. punktu). PC jādod pozitīva LLNA:DA atbildes reakcija tādā iedarbības līmenī, kurā ir sagaidāms stimulācijas indekss (SI) ≥ 1,8, salīdzinot ar negatīvās kontroles vielu (NC) grupu. PC deva jāizvēlas tā, lai neizraisītu pārmērīgu ādas kairinājumu vai sistēmisku toksicitāti un lai indukcija būtu atkārtojama, taču ne pārmērīga (piemēram, SI > 10 uzskata par pārmērīgu). Ieteicamākās PC ir 25 % heksilkanēļskābes aldehīds (Chemical Abstracts Service [CAS] Nr. 101-86-0) un 25 % eigenols (CAS Nr. 97-53-0) ar acetonu/olīveļļu (4:1 tilp./tilp.). Var būt apstākļi, kad ar pienācīgu pamatojumu var izmantot citas PC, kas atbilst iepriekš minētajiem kritērijiem. |
| --- | --- |

11.

Metodes veiktspējas pienācīgumu parāda ar pozitīvās kontroles vielu (PC) palīdzību, kuras ar adekvātu un reproducējamu sensibilitāti reaģē uz sensibilizējošām testēšanas vielām un kuru reakcijas intensitāte ir sīki aprakstīta. Ieteicams paredzēt vienlaicīgu PC, jo tādā veidā var pierādīt laboratorijas spēju atkārtoti un sekmīgi īstenot noteikšanu, kā arī novērtēt iekšlaboratorijas un starplaboratoriju reproducējamību un rezultātu salīdzināmību. Pirms LLNA:DA ieteicams lietotājiem konsultēties ar atbildīgajām iestādēm, jo dažas regulatīvās iestādes pieprasa PC izmantošanu katrā individuālā pētījumā. Attiecīgi labāk ir ikreiz izmantot vienlaicīgu PC, jo tas ļauj neveikt papildu testēšanu ar dzīvniekiem, lai izpildītu prasības, kuras var izrietēt no PC neregulāras izmantošanas (skatīt 12. punktu). PC jādod pozitīva LLNA:DA atbildes reakcija tādā iedarbības līmenī, kurā ir sagaidāms stimulācijas indekss (SI) ≥ 1,8, salīdzinot ar negatīvās kontroles vielu (NC) grupu. PC deva jāizvēlas tā, lai neizraisītu pārmērīgu ādas kairinājumu vai sistēmisku toksicitāti un lai indukcija būtu atkārtojama, taču ne pārmērīga (piemēram, SI > 10 uzskata par pārmērīgu). Ieteicamākās PC ir 25 % heksilkanēļskābes aldehīds (Chemical Abstracts Service [CAS] Nr. 101-86-0) un 25 % eigenols (CAS Nr. 97-53-0) ar acetonu/olīveļļu (4:1 tilp./tilp.). Var būt apstākļi, kad ar pienācīgu pamatojumu var izmantot citas PC, kas atbilst iepriekš minētajiem kritērijiem.

LLNA:DA

LLNA:DA

Chemical Abstracts Service

CAS

CAS

| 12. | Lai gan vienlaicīgas PC grupas izmantošana ir ieteicama, var būt situācijas, kad laboratorijās, kurās LLNA:DA veic regulāri (t. i., vismaz reizi mēnesī) un kurās tāpēc ir vēsturiska PC datubāze, kas pierāda laboratorijas spēju ar PC iegūt reproducējamus un pareizus rezultātus, piemērotāka var izrādīties periodiska PC izmantošana (t. i., vismaz reizi 6 mēnešos). LLNA:DA metodes adekvātu pārzināšanu var sekmīgi pierādīt, ar PC iegūstot konsekventus pozitīvus rezultātus vismaz 10 neatkarīgās testēšanas reizēs, kuras veiktas samērīgā laika periodā (t. i., ne ilgāk kā gada laikā). |
| --- | --- |

12.

Lai gan vienlaicīgas PC grupas izmantošana ir ieteicama, var būt situācijas, kad laboratorijās, kurās LLNA:DA veic regulāri (t. i., vismaz reizi mēnesī) un kurās tāpēc ir vēsturiska PC datubāze, kas pierāda laboratorijas spēju ar PC iegūt reproducējamus un pareizus rezultātus, piemērotāka var izrādīties periodiska PC izmantošana (t. i., vismaz reizi 6 mēnešos). LLNA:DA metodes adekvātu pārzināšanu var sekmīgi pierādīt, ar PC iegūstot konsekventus pozitīvus rezultātus vismaz 10 neatkarīgās testēšanas reizēs, kuras veiktas samērīgā laika periodā (t. i., ne ilgāk kā gada laikā).

LLNA:DA

LLNA:DA

| 13. | Vienlaicīga PC grupa noteikti jāiekļauj, kad LLNA:DA notiek procedurālas izmaiņas (piemēram, augsti kvalificēta personāla nomaiņa, testēšanas metodes materiālu un/vai reaģentu nomaiņa, cits izmēģinājumu dzīvnieku piegādātājs), un šādas izmaiņas pienācīgi jādokumentē laboratorijas pārskatos. Jānovērtē šādu izmaiņu ietekme uz iepriekš izveidotās vēsturiskās datubāzes adekvātumu un tas, vai vajag veidot jaunu vēsturisku datubāzi, lai dokumentētu ar PC iegūtu rezultātu konsekvenci. |
| --- | --- |

13.

Vienlaicīga PC grupa noteikti jāiekļauj, kad LLNA:DA notiek procedurālas izmaiņas (piemēram, augsti kvalificēta personāla nomaiņa, testēšanas metodes materiālu un/vai reaģentu nomaiņa, cits izmēģinājumu dzīvnieku piegādātājs), un šādas izmaiņas pienācīgi jādokumentē laboratorijas pārskatos. Jānovērtē šādu izmaiņu ietekme uz iepriekš izveidotās vēsturiskās datubāzes adekvātumu un tas, vai vajag veidot jaunu vēsturisku datubāzi, lai dokumentētu ar PC iegūtu rezultātu konsekvenci.

LLNA:DA

| 14. | Pētniekiem jāapzinās, ka lēmums par periodisku, nevis vienlaicīgu PC izmantošanu ietekmēs to, kādā mērā par adekvātiem un pieņemamiem varēs uzskatīt negatīvos pētījumu rezultātus, kas bez vienlaicīgas PC iegūti periodiskās PC izmantošanas starplaikos. Piemēram, ja ar periodisko PC pētījumu iegūst šķietami negatīvu rezultātu, var apšaubīt negatīvu testējamās vielas rezultātu, kas iegūts iepriekšējā pieņemamā periodiskā PC pētījuma un nepieņemamā periodiskā PC pētījuma starplaikā. Tāpēc rūpīgi jāizvērtē, vai izmantot vienlaicīgu vai periodisku PC. Tāpat jāizvērtē, kādas ir iespējas vienlaicīgās PC grupā izmantot mazāk dzīvnieku, ja to var zinātniski pamatot un ja laboratorija ar saviem specifiskajiem vēsturiskajiem datiem var pierādīt, ka ir iespējams izmantot mazāk peļu (22). |
| --- | --- |

14.

Pētniekiem jāapzinās, ka lēmums par periodisku, nevis vienlaicīgu PC izmantošanu ietekmēs to, kādā mērā par adekvātiem un pieņemamiem varēs uzskatīt negatīvos pētījumu rezultātus, kas bez vienlaicīgas PC iegūti periodiskās PC izmantošanas starplaikos. Piemēram, ja ar periodisko PC pētījumu iegūst šķietami negatīvu rezultātu, var apšaubīt negatīvu testējamās vielas rezultātu, kas iegūts iepriekšējā pieņemamā periodiskā PC pētījuma un nepieņemamā periodiskā PC pētījuma starplaikā. Tāpēc rūpīgi jāizvērtē, vai izmantot vienlaicīgu vai periodisku PC. Tāpat jāizvērtē, kādas ir iespējas vienlaicīgās PC grupā izmantot mazāk dzīvnieku, ja to var zinātniski pamatot un ja laboratorija ar saviem specifiskajiem vēsturiskajiem datiem var pierādīt, ka ir iespējams izmantot mazāk peļu (22).

| 15. | Kaut arī PC jātestē nesējā, par kuru ir zināms, ka tas izrāda viendabīgu atbildes reakciju (piemēram, acetons/olīveļļa; 4:1 tilp./tilp.), var būt dažas reglamentējošas situācijas, kurās būs nepieciešama arī testēšana nestandarta nesējā (klīniski/ķīmiski piederīgs sastāvs) (23). Ja vienlaicīgo PC testē ar citu nesēju nekā testējamo vielu, vienlaicīgās PC vajadzībām jāparedz atsevišķs VC. |
| --- | --- |

15.

Kaut arī PC jātestē nesējā, par kuru ir zināms, ka tas izrāda viendabīgu atbildes reakciju (piemēram, acetons/olīveļļa; 4:1 tilp./tilp.), var būt dažas reglamentējošas situācijas, kurās būs nepieciešama arī testēšana nestandarta nesējā (klīniski/ķīmiski piederīgs sastāvs) (23). Ja vienlaicīgo PC testē ar citu nesēju nekā testējamo vielu, vienlaicīgās PC vajadzībām jāparedz atsevišķs VC.

| 16. | Ja vērtē vielas, kas pieder konkrētai ķīmisko vielu klasei vai kas dod noteikta diapazona reakciju, var izmantot salīdzināšanas vielas, kuras noder, lai parādītu, ka testēšanas metode darbojas un pienācīgi nosaka šā tipa vielām piemītošo ādas sensibilizācijas potenciālu. Pienācīgām salīdzināšanas vielām ir jāpiemīt šādām īpašībām:






  — | strukturāla un funkcionāla līdzība ar testējamās vielas klases vielām, |
| --- | --- | --- |

16.

Ja vērtē vielas, kas pieder konkrētai ķīmisko vielu klasei vai kas dod noteikta diapazona reakciju, var izmantot salīdzināšanas vielas, kuras noder, lai parādītu, ka testēšanas metode darbojas un pienācīgi nosaka šā tipa vielām piemītošo ādas sensibilizācijas potenciālu. Pienācīgām salīdzināšanas vielām ir jāpiemīt šādām īpašībām:

—

strukturāla un funkcionāla līdzība ar testējamās vielas klases vielām,

| — | labi zināmas fizikālās un ķīmiskās īpašības, |
| --- | --- |

—

labi zināmas fizikālās un ķīmiskās īpašības,

| — | papildinoši dati no LLNA:DA, |
| --- | --- |

—

papildinoši dati no LLNA:DA,

LLNA:DA

| — | papildinoši dati saistībā ar citiem dzīvniekiem un/vai cilvēku. |
| --- | --- |

—

papildinoši dati saistībā ar citiem dzīvniekiem un/vai cilvēku.

TESTA PROCEDŪRA

Dzīvnieku skaits un devu līmeņi

Dzīvnieku skaits un devu līmeņi

| 17. | Uz devas grupu ar vismaz trim testējamās vielas koncentrācijām izmanto vismaz četrus dzīvniekus un vienlaicīgas NC grupu, kas saņem tikai testējamās vielas nesēju, un PC grupu (vienlaicīgu vai nesenu atkarībā no laboratorijas prakses un saistībā ar 11.–15. punktu). Jāapsver iespēja testēt vairākas PC devas, īpaši tad, ja PC testēšana ir periodiska. Izņemot apstrādi ar testējamo vielu, ar kontroles grupu dzīvniekiem rīkojas tieši tāpat kā ar apstrādāto grupu dzīvniekiem. |
| --- | --- |

17.

Uz devas grupu ar vismaz trim testējamās vielas koncentrācijām izmanto vismaz četrus dzīvniekus un vienlaicīgas NC grupu, kas saņem tikai testējamās vielas nesēju, un PC grupu (vienlaicīgu vai nesenu atkarībā no laboratorijas prakses un saistībā ar 11.–15. punktu). Jāapsver iespēja testēt vairākas PC devas, īpaši tad, ja PC testēšana ir periodiska. Izņemot apstrādi ar testējamo vielu, ar kontroles grupu dzīvniekiem rīkojas tieši tāpat kā ar apstrādāto grupu dzīvniekiem.

| 18. | Devu un nesēja izvēlei jāpamatojas uz atsaucē (2) un (24) sniegtajiem ieteikumiem. Secīgas devas parasti izraugās no atbilstošas koncentrāciju rindas, kā 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 %, u. c. Koncentrāciju rindas izvēlei jābūt ar adekvātu zinātnisku pamatojumu. Jāizvērtē visa esošā toksikoloģiskā (piemēram, akūta toksicitāte un dermālais kairinājums) un struktūras un fizikālķīmiskā informācija par attiecīgo testējamo vielu (un/vai par struktūras ziņā saistītām vielām), ja tāda ir, un trīs secīgās koncentrācijas jāizraugās tā, lai augstākā no tām izraisītu stiprāko iedarbību, kura vēl nerada sistēmisku toksicitāti un/vai pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu (24) (25). Ja šādas informācijas nav, sākumā var būt jāveic priekšskrīninga tests (skatīt 21.–24. punktu). |
| --- | --- |

18.

Devu un nesēja izvēlei jāpamatojas uz atsaucē (2) un (24) sniegtajiem ieteikumiem. Secīgas devas parasti izraugās no atbilstošas koncentrāciju rindas, kā 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 %, u. c. Koncentrāciju rindas izvēlei jābūt ar adekvātu zinātnisku pamatojumu. Jāizvērtē visa esošā toksikoloģiskā (piemēram, akūta toksicitāte un dermālais kairinājums) un struktūras un fizikālķīmiskā informācija par attiecīgo testējamo vielu (un/vai par struktūras ziņā saistītām vielām), ja tāda ir, un trīs secīgās koncentrācijas jāizraugās tā, lai augstākā no tām izraisītu stiprāko iedarbību, kura vēl nerada sistēmisku toksicitāti un/vai pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu (24) (25). Ja šādas informācijas nav, sākumā var būt jāveic priekšskrīninga tests (skatīt 21.–24. punktu).

| 19. | Nesējs nedrīkst pārmainīt vai maskēt testēšanas rezultātus, un tas jāizraugās tāds, lai šķīdība būtu iespējami lielāka, tā ļaujot iegūt augstāko reāli sasniedzamo koncentrāciju un iegūstot šķīdumu/suspensiju, kas būtu derīga testējamās vielas pielietošanai. Ieteicamie nesēji ir acetons/olīveļļa (4:1 tilp./tilp.), N,N-dimetilformamīds, metiletilketons, propilēnglikols un dimetilsulfoksīds (6), bet var izmantot arī citus, ja tam ir pietiekams zinātniskais pamatojums. Dažos gadījumos papildu kontrolei jāizmanto klīniski atbilstošs šķīdinātājs vai tirdzniecības preparāts, kura sastāvā testējamo vielu tirgo. Īpaši jārūpējas, lai nodrošinātu to, ka hidrofīlas vielas ir iekļautas nesēja sistēmā, kas mitrina ādu un tūlīt nenotek, un jāizmanto pienācīgi šķīdinātāji (piemēram, 1 % Pluronic® L92). Tādēļ ir jāizvairās no nesējiem, kas satur vienīgi ūdeni. |
| --- | --- |

19.

Nesējs nedrīkst pārmainīt vai maskēt testēšanas rezultātus, un tas jāizraugās tāds, lai šķīdība būtu iespējami lielāka, tā ļaujot iegūt augstāko reāli sasniedzamo koncentrāciju un iegūstot šķīdumu/suspensiju, kas būtu derīga testējamās vielas pielietošanai. Ieteicamie nesēji ir acetons/olīveļļa (4:1 tilp./tilp.), N,N-dimetilformamīds, metiletilketons, propilēnglikols un dimetilsulfoksīds (6), bet var izmantot arī citus, ja tam ir pietiekams zinātniskais pamatojums. Dažos gadījumos papildu kontrolei jāizmanto klīniski atbilstošs šķīdinātājs vai tirdzniecības preparāts, kura sastāvā testējamo vielu tirgo. Īpaši jārūpējas, lai nodrošinātu to, ka hidrofīlas vielas ir iekļautas nesēja sistēmā, kas mitrina ādu un tūlīt nenotek, un jāizmanto pienācīgi šķīdinātāji (piemēram, 1 % Pluronic® L92). Tādēļ ir jāizvairās no nesējiem, kas satur vienīgi ūdeni.

N,N

| 20. | Izpētot no individuālām pelēm iegūtus limfmezglus, var novērtēt dzīvnieku savstarpējās atšķirības un iegūt testējamās vielas grupas un VC grupas mērījumu statistisku salīdzinājumu (skatīt 33. punktu). Turklāt PC grupas peļu skaita iespējamā samazinājuma izvērtējumam jēga ir vienīgi tad, ja dati ir par individuāliem dzīvniekiem (22). Dažas regulatīvās iestādes prasa, lai dati būtu par individuāliem dzīvniekiem. Regulāra datu vākšana par individuāliem dzīvniekiem dod priekšrocības dzīvnieku labturības ziņā, jo ļauj izvairīties no atkārtotas testēšanas gadījumā, ja vielas testēšanas rezultātus sākotnēji apkopo vienā veidā (piemēram, par apstrādes grupu), bet regulatīvās iestādes vēlāk izvirza citas prasības (piemēram, pieprasa datus par individuāliem dzīvniekiem). |
| --- | --- |

20.

Izpētot no individuālām pelēm iegūtus limfmezglus, var novērtēt dzīvnieku savstarpējās atšķirības un iegūt testējamās vielas grupas un VC grupas mērījumu statistisku salīdzinājumu (skatīt 33. punktu). Turklāt PC grupas peļu skaita iespējamā samazinājuma izvērtējumam jēga ir vienīgi tad, ja dati ir par individuāliem dzīvniekiem (22). Dažas regulatīvās iestādes prasa, lai dati būtu par individuāliem dzīvniekiem. Regulāra datu vākšana par individuāliem dzīvniekiem dod priekšrocības dzīvnieku labturības ziņā, jo ļauj izvairīties no atkārtotas testēšanas gadījumā, ja vielas testēšanas rezultātus sākotnēji apkopo vienā veidā (piemēram, par apstrādes grupu), bet regulatīvās iestādes vēlāk izvirza citas prasības (piemēram, pieprasa datus par individuāliem dzīvniekiem).

Priekšskrīninga tests

Priekšskrīninga tests

| 21. | Ja nav informācijas, lai noteiktu augstāko testējamo devu (skatīt 18. punktu), jāveic priekšskrīninga tests, lai definētu ar LLNA:DA testējamo atbilstošo devas līmeni. Priekšskrīninga testa mērķis ir būt par orientieri ar LLNA:DA testējamā maksimālā devas līmeņa izvēlē, ja nav informācijas par koncentrāciju, kādā testējamā viela izraisa sistēmisku toksicitāti (skatīt 24. punktu) un/vai pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu (skatīt 23. punktu). Maksimālajam testējamās vielas devas līmenim vajadzētu būt 100 % (šķidrumiem) un augstākajai iespējamajai koncentrācijai (cietām vielām un suspensijām). |
| --- | --- |

21.

Ja nav informācijas, lai noteiktu augstāko testējamo devu (skatīt 18. punktu), jāveic priekšskrīninga tests, lai definētu ar LLNA:DA testējamo atbilstošo devas līmeni. Priekšskrīninga testa mērķis ir būt par orientieri ar LLNA:DA testējamā maksimālā devas līmeņa izvēlē, ja nav informācijas par koncentrāciju, kādā testējamā viela izraisa sistēmisku toksicitāti (skatīt 24. punktu) un/vai pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu (skatīt 23. punktu). Maksimālajam testējamās vielas devas līmenim vajadzētu būt 100 % (šķidrumiem) un augstākajai iespējamajai koncentrācijai (cietām vielām un suspensijām).

LLNA:DA

LLNA:DA

| 22. | Priekšskrīninga testa apstākļi ir identiski pamata LLNA:DA apstākļiem, izņemot to, ka nevērtē progresiju limfmezglos un ka devas grupā var izmantot mazāku skaitu dzīvnieku. Ieteicamais skaits ir viens vai divi dzīvnieki katrā devas grupā. Visām pelēm ik dienas pārbauda to, vai apstrādes vietā nav klīnisku pazīmju, kas liecinātu par sistēmisku toksicitāti vai lokālu kairinājumu. Pirms testa un tā beigās (8. diena) reģistrē dzīvnieku ķermeņa masu. Katrai peles apskata abas ausis, un iespējamo apsārtumu novērtē pēc 1. tabulas punktu skalas (25). Auss biezumu mēra ar piemērotu mērierīci (piemēram, digitālo mikrometru vai “Peacock” tipa biezuma mērierīci) 1. dienā (pirms devas), 3. dienā (aptuveni 48 stundas pēc pirmās devas), 7. dienā (24 stundas pirms testēšanas beigām) un 8. dienā. Turklāt 8. dienā auss biezumu var mērīt ar auss caursišanas paņēmienu pēc tam, kad dzīvnieki ir humāni nonāvēti. Lokālu kairinājumu uzskata par pārmērīgu tad, ja jebkurā mērījumu dienā apsārtuma novērtējums pēc punktu skalas ir ≥ 3 un/vai auss biezums ≥ 25 % (26) (27). Lielākā deva, kas izmantojama LLNA:DA pamata testā, ir otrā zemākā deva priekšskrīninga koncentrāciju rindā (skatīt 18. punktu), kas neizraisa sistēmisku toksicitāti un/vai pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu.

  1.   tabula


  Apsārtuma (eritēmas) skala







  Pazīmes | Punktu skaits |
| --- | --- | --- |
| Apsārtuma nav | 0 |
| Vāji izteikts (gandrīz nemanāms) apsārtums | 1 |
| Izteikts apsārtums | 2 |
| Vidēji stiprs un ļoti stiprs apsārtums | 3 |
| Ļoti stiprs apsārtums (biešu sarkans) un kreveles, kas apsārtuma novērtēšanu padara neiespējamu | 4 |

22.

Priekšskrīninga testa apstākļi ir identiski pamata LLNA:DA apstākļiem, izņemot to, ka nevērtē progresiju limfmezglos un ka devas grupā var izmantot mazāku skaitu dzīvnieku. Ieteicamais skaits ir viens vai divi dzīvnieki katrā devas grupā. Visām pelēm ik dienas pārbauda to, vai apstrādes vietā nav klīnisku pazīmju, kas liecinātu par sistēmisku toksicitāti vai lokālu kairinājumu. Pirms testa un tā beigās (8. diena) reģistrē dzīvnieku ķermeņa masu. Katrai peles apskata abas ausis, un iespējamo apsārtumu novērtē pēc 1. tabulas punktu skalas (25). Auss biezumu mēra ar piemērotu mērierīci (piemēram, digitālo mikrometru vai “Peacock” tipa biezuma mērierīci) 1. dienā (pirms devas), 3. dienā (aptuveni 48 stundas pēc pirmās devas), 7. dienā (24 stundas pirms testēšanas beigām) un 8. dienā. Turklāt 8. dienā auss biezumu var mērīt ar auss caursišanas paņēmienu pēc tam, kad dzīvnieki ir humāni nonāvēti. Lokālu kairinājumu uzskata par pārmērīgu tad, ja jebkurā mērījumu dienā apsārtuma novērtējums pēc punktu skalas ir ≥ 3 un/vai auss biezums ≥ 25 % (26) (27). Lielākā deva, kas izmantojama LLNA:DA pamata testā, ir otrā zemākā deva priekšskrīninga koncentrāciju rindā (skatīt 18. punktu), kas neizraisa sistēmisku toksicitāti un/vai pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu.

LLNA:DA

LLNA:DA

1.   tabula

1.

tabula

Apsārtuma (eritēmas) skala

Apsārtuma (eritēmas) skala

Pazīmes

Punktu skaits

Apsārtuma nav

0

Vāji izteikts (gandrīz nemanāms) apsārtums

1

Izteikts apsārtums

2

Vidēji stiprs un ļoti stiprs apsārtums

3

Ļoti stiprs apsārtums (biešu sarkans) un kreveles, kas apsārtuma novērtēšanu padara neiespējamu

4

| 23. | Papildus auss biezuma 25 % pieaugumam (26) (27) kairinātāju identificēšanai LLNA izmanto arī statistiski nozīmīgus auss biezuma pieauguma rādītājus apstrādātajām pelēm salīdzinājumā ar kontroles grupas pelēm (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Tomēr, lai gan statistiski nozīmīgs pieaugums var arī nesasniegt 25 % robežu, šādu pieaugumu neuzskata par pārmērīga kairinājuma izpausmi (30) (31) (32) (33) (34). |
| --- | --- |

23.

Papildus auss biezuma 25 % pieaugumam (26) (27) kairinātāju identificēšanai LLNA izmanto arī statistiski nozīmīgus auss biezuma pieauguma rādītājus apstrādātajām pelēm salīdzinājumā ar kontroles grupas pelēm (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Tomēr, lai gan statistiski nozīmīgs pieaugums var arī nesasniegt 25 % robežu, šādu pieaugumu neuzskata par pārmērīga kairinājuma izpausmi (30) (31) (32) (33) (34).

LLNA

| 24. | Turpmāk uzskaitītie klīniskie novērojumi, ja tie ir novērtējuma neatņemama daļa, var liecināt par sistēmisku toksicitāti (35), un tāpēc var parādīt, kāds būs LLNA:DA pamata testā izmantojamais maksimālais devas līmenis: nervu sistēmas darbības traucējumi (piemēram, piloarekcija, ataksija, drebuļi un krampji); uzvedības traucējumi (piemēram, agresivitāte, ar personīgo higiēnu saistītās uzvedības maiņa, jūtams aktivitātes samazinājums vai pieaugums); neraksturīga elpošana (piemēram, elpas vilcienu biežuma un intensitātes maiņa, kā apgrūtināta vai spazmatiska elpošana, trokšņi plaušās) un pārmaiņas barības un ūdens uzņemšanā. Turklāt novērtējumā jāņem vērā letarģijas pazīmes un/vai reakcijas samazināšanās un visas klīniskās pazīmes, kas liecina par vairāk nekā mirklīgām sāpēm un ciešanām, vai ķermeņa masas samazinājums par vairāk nekā 5 % laikā no 1. dienas līdz 8. dienai, kā arī mirstības rādītāji. Mirstoši dzīvnieki vai dzīvnieki, kuri uzrāda stipru sāpju un ciešanu pazīmes, ir humāni jānonāvē (36). |
| --- | --- |

24.

Turpmāk uzskaitītie klīniskie novērojumi, ja tie ir novērtējuma neatņemama daļa, var liecināt par sistēmisku toksicitāti (35), un tāpēc var parādīt, kāds būs LLNA:DA pamata testā izmantojamais maksimālais devas līmenis: nervu sistēmas darbības traucējumi (piemēram, piloarekcija, ataksija, drebuļi un krampji); uzvedības traucējumi (piemēram, agresivitāte, ar personīgo higiēnu saistītās uzvedības maiņa, jūtams aktivitātes samazinājums vai pieaugums); neraksturīga elpošana (piemēram, elpas vilcienu biežuma un intensitātes maiņa, kā apgrūtināta vai spazmatiska elpošana, trokšņi plaušās) un pārmaiņas barības un ūdens uzņemšanā. Turklāt novērtējumā jāņem vērā letarģijas pazīmes un/vai reakcijas samazināšanās un visas klīniskās pazīmes, kas liecina par vairāk nekā mirklīgām sāpēm un ciešanām, vai ķermeņa masas samazinājums par vairāk nekā 5 % laikā no 1. dienas līdz 8. dienai, kā arī mirstības rādītāji. Mirstoši dzīvnieki vai dzīvnieki, kuri uzrāda stipru sāpju un ciešanu pazīmes, ir humāni jānonāvē (36).

LLNA:DA

Eksperimenta grafiks pamata pētījuma laikā

Eksperimenta grafiks pamata pētījuma laikā

| 25. | Eksperimenta grafiks ir šāds:
  —   1. diena: individuāli nosaka un reģistrē katra dzīvnieka masu, reģistrē klīniskos novērojumus. Izmantojot SLS šķīdumā iemērktu otiņu un katras auss aizmugures virsmu noklājot četros līdz piecos triepienos, uzliek 1 % nātrija laurilsulfāta (SLS) šķīdumu ūdenī. Stundu pēc apstrādes ar SLS katras auss aizmugures virsmu apstrādā ar 25 μl atšķaidījuma, kurš satur attiecīgo testējamo vielu, tikai nesēju vai PC (vienlaicīgu vai nesenu atkarībā no laboratorijas prakses un saistībā ar 11.–15. punktu).
  —   2., 3. un 7. diena: atkārto priekšapstrādi ar 1 % SLS šķīdumu ūdenī un testējamās vielas uzlikšanu kā 1. dienā.
  —   4., 5. un 6. diena: apstrāde nenotiek.
  —   8. diena: reģistrē katra dzīvnieka masu un klīniskos novērojumus. Aptuveni 24 līdz 30 stundas pēc tam, kad 7. dienā sākta vielas uzlikšana, dzīvniekus humāni nonāvē. No katras auss izgriež aurikulāros limfmezglus, kurus katrai pelei atsevišķi apstrādā fizioloģiskajā šķīdumā ar fosfātbuferi (PBS). Sīkus datus un diagrammas par limfmezglu identificēšanu un izgriešanu skatīt atsaucēs (22). Eksperimenta protokolā var iekļaut papildu parametrus, kas raksturo turpmāku ādas lokālo reakciju pamata pētījuma laikā, piemēram, auss apsārtuma novērtējumu pēc punktu skalas vai auss biezuma mērījumus (nosaka ar mērierīci vai ar auss caursišanas paņēmienu autopsijā). |
| --- | --- |

25.

Eksperimenta grafiks ir šāds:

—   1. diena: individuāli nosaka un reģistrē katra dzīvnieka masu, reģistrē klīniskos novērojumus. Izmantojot SLS šķīdumā iemērktu otiņu un katras auss aizmugures virsmu noklājot četros līdz piecos triepienos, uzliek 1 % nātrija laurilsulfāta (SLS) šķīdumu ūdenī. Stundu pēc apstrādes ar SLS katras auss aizmugures virsmu apstrādā ar 25 μl atšķaidījuma, kurš satur attiecīgo testējamo vielu, tikai nesēju vai PC (vienlaicīgu vai nesenu atkarībā no laboratorijas prakses un saistībā ar 11.–15. punktu).

—   2., 3. un 7. diena: atkārto priekšapstrādi ar 1 % SLS šķīdumu ūdenī un testējamās vielas uzlikšanu kā 1. dienā.

—   4., 5. un 6. diena: apstrāde nenotiek.

—   8. diena: reģistrē katra dzīvnieka masu un klīniskos novērojumus. Aptuveni 24 līdz 30 stundas pēc tam, kad 7. dienā sākta vielas uzlikšana, dzīvniekus humāni nonāvē. No katras auss izgriež aurikulāros limfmezglus, kurus katrai pelei atsevišķi apstrādā fizioloģiskajā šķīdumā ar fosfātbuferi (PBS). Sīkus datus un diagrammas par limfmezglu identificēšanu un izgriešanu skatīt atsaucēs (22). Eksperimenta protokolā var iekļaut papildu parametrus, kas raksturo turpmāku ādas lokālo reakciju pamata pētījuma laikā, piemēram, auss apsārtuma novērtējumu pēc punktu skalas vai auss biezuma mērījumus (nosaka ar mērierīci vai ar auss caursišanas paņēmienu autopsijā).

Šūnu suspensiju sagatavošana

Šūnu suspensiju sagatavošana

| 26. | No katrai pelei abās pusēs izgrieztām limfmezglu šūnām (LNC) sagatavo atsevišķu šūnu suspensiju; to dara, limfmezglus novietojot starp diviem priekšmetstikliņiem un viegli uzspiežot, lai tie pārplīstu. Kad audi vienmērīgi un plānā kārtā izlīdzinājušies, priekšmetstikliņus atdala vienu no otra. Uz abiem priekšmetstikliņiem esošos audus suspendē ar PBS, priekšmetstikliņu slīpā leņķī turot virs Petri trauciņa un skalojot ar PBS, un vienlaikus ar šūnu skrāpi tīrot priekšmetstikliņu no audiem. Tā kā NC dzīvnieku limfmezgli ir mazi, tie jāapstrādā ar sevišķu rūpību, lai novērstu SI vērtību izkropļojumus. Abu priekšmetstikliņu noskalošanai jāizmanto kopā 1 mL PBS. Petri trauciņā atrodošos LNC suspensiju homogenizē, nedaudz apmaisot ar šūnu skrāpi. Ar mikropipeti savāc 20 μL LNC suspensijas alikvotas, neskarot ar aci saredzamo membrānu, un pagatavo tās maisījumu ar 1,98 mL PBS, rezultātā iegūstot 2 mL paraugu. Pēc šīs pašas procedūras sagatavo otru 2 mL paraugu; tādā veidā no katra dzīvnieka iegūst divus paraugus. |
| --- | --- |

26.

No katrai pelei abās pusēs izgrieztām limfmezglu šūnām (LNC) sagatavo atsevišķu šūnu suspensiju; to dara, limfmezglus novietojot starp diviem priekšmetstikliņiem un viegli uzspiežot, lai tie pārplīstu. Kad audi vienmērīgi un plānā kārtā izlīdzinājušies, priekšmetstikliņus atdala vienu no otra. Uz abiem priekšmetstikliņiem esošos audus suspendē ar PBS, priekšmetstikliņu slīpā leņķī turot virs Petri trauciņa un skalojot ar PBS, un vienlaikus ar šūnu skrāpi tīrot priekšmetstikliņu no audiem. Tā kā NC dzīvnieku limfmezgli ir mazi, tie jāapstrādā ar sevišķu rūpību, lai novērstu SI vērtību izkropļojumus. Abu priekšmetstikliņu noskalošanai jāizmanto kopā 1 mL PBS. Petri trauciņā atrodošos LNC suspensiju homogenizē, nedaudz apmaisot ar šūnu skrāpi. Ar mikropipeti savāc 20 μL LNC suspensijas alikvotas, neskarot ar aci saredzamo membrānu, un pagatavo tās maisījumu ar 1,98 mL PBS, rezultātā iegūstot 2 mL paraugu. Pēc šīs pašas procedūras sagatavo otru 2 mL paraugu; tādā veidā no katra dzīvnieka iegūst divus paraugus.

LNC

LNC

LNC

Šūnu savairošanās noteikšana (limfocītu ATP satura mērīšana)

Šūnu savairošanās noteikšana (limfocītu ATP satura mērīšana)

| 27. | ATP satura pieaugumu limfmezglos mēra ar luciferīna/luciferāzes metodi, izmantojot ATP mērīšanas komplektu, kas mēra bioluminiscenci, to izsakot relatīvās luminiscences vienībās (RLU). Noteikšanas laikam, kas aizrit no dzīvnieka nonāvēšanas brīža līdz ATP satura izmērīšanai, katra individuāla dzīvnieka gadījumā jābūt iespējami vienādākam un jāiekļaujas apmēram 30 minūtēs, jo uzskata, ka ATP saturs pēc dzīvnieka nonāvēšanas pakāpeniski samazinās (12). Tāpēc procedūru virkne, no aurikulāro limfmezglu izgriešanas līdz ATP izmērīšanai, jāpabeidz 20 minūtēs, ievērojot iepriekš noteiktu grafiku, kas visiem dzīvniekiem ir vienāds. ATP luminiscence jāmēra katrā 2 mL paraugā, tādā veidā no katra dzīvnieka iegūstot divus ATP mērījumu rezultātus. Turpmāko aprēķinu vajadzībām nosaka un izmanto vidējo ATP luminiscences rādītāju (skatīt 30. punktu). |
| --- | --- |

27.

ATP satura pieaugumu limfmezglos mēra ar luciferīna/luciferāzes metodi, izmantojot ATP mērīšanas komplektu, kas mēra bioluminiscenci, to izsakot relatīvās luminiscences vienībās (RLU). Noteikšanas laikam, kas aizrit no dzīvnieka nonāvēšanas brīža līdz ATP satura izmērīšanai, katra individuāla dzīvnieka gadījumā jābūt iespējami vienādākam un jāiekļaujas apmēram 30 minūtēs, jo uzskata, ka ATP saturs pēc dzīvnieka nonāvēšanas pakāpeniski samazinās (12). Tāpēc procedūru virkne, no aurikulāro limfmezglu izgriešanas līdz ATP izmērīšanai, jāpabeidz 20 minūtēs, ievērojot iepriekš noteiktu grafiku, kas visiem dzīvniekiem ir vienāds. ATP luminiscence jāmēra katrā 2 mL paraugā, tādā veidā no katra dzīvnieka iegūstot divus ATP mērījumu rezultātus. Turpmāko aprēķinu vajadzībām nosaka un izmanto vidējo ATP luminiscences rādītāju (skatīt 30. punktu).

NOVĒROJUMI

Klīniskie novērojumi

Klīniskie novērojumi

| 28. | Ikviena pele vismaz reizi dienā ir rūpīgi jānovēro attiecībā uz vietēju kairinājumu apstrādes vietā vai sistēmiskas toksicitātes klīniskajām pazīmēm. Visus novērojumus sistemātiski reģistrē, par katru peli izdarot individuālu ierakstu. Novērošanas plānā jāiekļauj kritēriji, kas ļauj tūlīt identificēt peles, kurām ir sistēmiskas toksicitātes, pārmērīga lokāla ādas kairinājuma vai ādas korozijas pazīmes, lai tām veiktu eitanāziju (36). |
| --- | --- |

28.

Ikviena pele vismaz reizi dienā ir rūpīgi jānovēro attiecībā uz vietēju kairinājumu apstrādes vietā vai sistēmiskas toksicitātes klīniskajām pazīmēm. Visus novērojumus sistemātiski reģistrē, par katru peli izdarot individuālu ierakstu. Novērošanas plānā jāiekļauj kritēriji, kas ļauj tūlīt identificēt peles, kurām ir sistēmiskas toksicitātes, pārmērīga lokāla ādas kairinājuma vai ādas korozijas pazīmes, lai tām veiktu eitanāziju (36).

Ķermeņa masa

Ķermeņa masa

| 29. | Kā norādīts 25. punktā, individuālu dzīvnieku ķermeņa masa ir jānosaka testa sākumā un pirms plānotās humānās nonāvēšanas. |
| --- | --- |

29.

Kā norādīts 25. punktā, individuālu dzīvnieku ķermeņa masa ir jānosaka testa sākumā un pirms plānotās humānās nonāvēšanas.

REZULTĀTU APRĒĶINĀŠANA

| 30. | Katras apstrādes grupas rezultātu izsaka ar vidējo SI. SI iegūst, vidējo RLU vērtību katrai pelei katrā testējamās vielas grupā un PC grupā dalot ar vidējo RLU vērtību katrai pelei šķīdinātāja/VC grupā. Tā VC grupās vidējais SI ir 1. |
| --- | --- |

30.

Katras apstrādes grupas rezultātu izsaka ar vidējo SI. SI iegūst, vidējo RLU vērtību katrai pelei katrā testējamās vielas grupā un PC grupā dalot ar vidējo RLU vērtību katrai pelei šķīdinātāja/VC grupā. Tā VC grupās vidējais SI ir 1.

| 31. | Lēmumu pieņemšanas procesā rezultātu uzskata par pozitīvu, ja SI ≥ 1,8 (10). Tomēr, nosakot, vai neitrālam tuvu rezultātu (t. i., ar SI vērtību robežās no 1,8 līdz 2,5) varētu uzskatīt par pozitīvu, var ņemt vērā arī devas un atbildes reakcijas stiprumu un šķīdinātāja/nesēja un PC reakcijas statistisko nozīmīgumu un konsekvenci (2) (3) (37). |
| --- | --- |

31.

Lēmumu pieņemšanas procesā rezultātu uzskata par pozitīvu, ja SI ≥ 1,8 (10). Tomēr, nosakot, vai neitrālam tuvu rezultātu (t. i., ar SI vērtību robežās no 1,8 līdz 2,5) varētu uzskatīt par pozitīvu, var ņemt vērā arī devas un atbildes reakcijas stiprumu un šķīdinātāja/nesēja un PC reakcijas statistisko nozīmīgumu un konsekvenci (2) (3) (37).

| 32. | Attiecībā uz neitrālam tuvu pozitīvu rezultātu ar SI vērtību robežās no 1,8 līdz 2,5, pirms apstiprināt, ka šis rezultāts ir pozitīvs, lietotāji var izvērtēt tādu papildu informāciju kā devas un atbildes reakcijas mijiedarbība, sistēmiskas toksicitātes vai pārmērīga kairinājuma pazīmes un, attiecīgā gadījumā, statistiskais nozīmīgums apvienojumā ar SI vērtībām (10). Jāņem vērā arī testējamās vielas dažādās īpašības, tostarp tas, vai tā strukturāli līdzinās jau zināmiem ādas sensibilizatoriem, vai tā izraisa pārmērīgu ādas kairinājumu pelēm un kāda veida atbildes reakcija uz devu ir novērota. Šie un citi apsvērumi sīkāk iztirzāti citur (4). |
| --- | --- |

32.

Attiecībā uz neitrālam tuvu pozitīvu rezultātu ar SI vērtību robežās no 1,8 līdz 2,5, pirms apstiprināt, ka šis rezultāts ir pozitīvs, lietotāji var izvērtēt tādu papildu informāciju kā devas un atbildes reakcijas mijiedarbība, sistēmiskas toksicitātes vai pārmērīga kairinājuma pazīmes un, attiecīgā gadījumā, statistiskais nozīmīgums apvienojumā ar SI vērtībām (10). Jāņem vērā arī testējamās vielas dažādās īpašības, tostarp tas, vai tā strukturāli līdzinās jau zināmiem ādas sensibilizatoriem, vai tā izraisa pārmērīgu ādas kairinājumu pelēm un kāda veida atbildes reakcija uz devu ir novērota. Šie un citi apsvērumi sīkāk iztirzāti citur (4).

| 33. | Datu vākšana par individuālām pelēm pavērs iespējas statistiskai analīzei par devas un atbildes reakcijas mijiedarbības esību un tās pakāpi šajos datos. Jebkurš statistisks novērtējums var ietvert devas un atbildes reakcijas mijiedarbības novērtējumu, kā arī pienācīgi koriģētus testējamo grupu salīdzinājumus (piemēram, devu pāri grupā un šīs grupas salīdzinājums ar vienlaicīgu šķīdinātāja/kontroles grupu). Statistiskā analīze var ietvert, piemēram, lineāro regresiju jeb Viljamsa [William’s] testu, ar ko analizē devas un atbildes reakcijas mijiedarbību tendences, un Daneta [Dunnett] testu, lai salīdzinātu devu pārus. Izvēloties attiecīgu statistiskās analīzes metodi, pētniekam jāapzinās iespējamās mainīgo lielumu nevienādības un citas ar to saistītās problēmas, kuru dēļ var būt nepieciešama datu pārveidošana vai neparametriskā statistiskā analīze. Visādā ziņā iespējams, ka pētniekam SI būs jāaprēķina un statistiskā analīze jāveic gan ar, gan bez dažiem punktveida datiem (respektīvi, neņemot vērā galējības jeb rupjas kļūdas). |
| --- | --- |

33.

Datu vākšana par individuālām pelēm pavērs iespējas statistiskai analīzei par devas un atbildes reakcijas mijiedarbības esību un tās pakāpi šajos datos. Jebkurš statistisks novērtējums var ietvert devas un atbildes reakcijas mijiedarbības novērtējumu, kā arī pienācīgi koriģētus testējamo grupu salīdzinājumus (piemēram, devu pāri grupā un šīs grupas salīdzinājums ar vienlaicīgu šķīdinātāja/kontroles grupu). Statistiskā analīze var ietvert, piemēram, lineāro regresiju jeb Viljamsa [William’s] testu, ar ko analizē devas un atbildes reakcijas mijiedarbību tendences, un Daneta [Dunnett] testu, lai salīdzinātu devu pārus. Izvēloties attiecīgu statistiskās analīzes metodi, pētniekam jāapzinās iespējamās mainīgo lielumu nevienādības un citas ar to saistītās problēmas, kuru dēļ var būt nepieciešama datu pārveidošana vai neparametriskā statistiskā analīze. Visādā ziņā iespējams, ka pētniekam SI būs jāaprēķina un statistiskā analīze jāveic gan ar, gan bez dažiem punktveida datiem (respektīvi, neņemot vērā galējības jeb rupjas kļūdas).

William’s

Dunnett

DATI UN TESTĒŠANAS PĀRSKATS

Dati

Dati

| 34. | Dati jāapkopo tabulā, uzrādot indivīdu RLU vērtības, grupas vidējo RLU vērtību uz dzīvnieku, attiecīgo kļūdas apzīmējumu (piem., SD, SEM) un vidējo SI katrai devas grupai salīdzinājumā ar vienlaicīgo šķīdinātāja/kontroles grupu. |
| --- | --- |

34.

Dati jāapkopo tabulā, uzrādot indivīdu RLU vērtības, grupas vidējo RLU vērtību uz dzīvnieku, attiecīgo kļūdas apzīmējumu (piem., SD, SEM) un vidējo SI katrai devas grupai salīdzinājumā ar vienlaicīgo šķīdinātāja/kontroles grupu.

Testēšanas pārskats

Testēšanas pārskats

| 35. | Testēšanas pārskatā jābūt iekļautai šādai informācijai: | Testējamā un kontroles viela:






  — | identifikācijas dati (piemēram, CAS un EK numurs (ja ir); avots; tīrība; zināmie piemaisījumi; partijas numurs), |
| --- | --- | --- | --- |

35.

Testēšanas pārskatā jābūt iekļautai šādai informācijai:

Testējamā un kontroles viela:

—

identifikācijas dati (piemēram, CAS un EK numurs (ja ir); avots; tīrība; zināmie piemaisījumi; partijas numurs),

CAS

| — | fizikālās un fizikāli ķīmiskās īpašības (piemēram, gaistamība, stabilitāte, šķīdība), |
| --- | --- |

—

fizikālās un fizikāli ķīmiskās īpašības (piemēram, gaistamība, stabilitāte, šķīdība),

| — | maisījuma gadījumā: sastāvs un sastāvdaļu relatīvais procentuālais daudzums. |
| --- | --- |

—

maisījuma gadījumā: sastāvs un sastāvdaļu relatīvais procentuālais daudzums.

| | Šķīdinātājs/nesējs:






  — | identifikācijas dati (tīrība; koncentrācija (attiecīgā gadījumā); izmantotais tilpums), |
| --- | --- | --- |

Šķīdinātājs/nesējs:

—

identifikācijas dati (tīrība; koncentrācija (attiecīgā gadījumā); izmantotais tilpums),

| — | nesēja izvēles pamatojums. |
| --- | --- |

—

nesēja izvēles pamatojums.

| | Izmēģinājumu dzīvnieki:






  — | CBA peļu avots, |
| --- | --- | --- |

Izmēģinājumu dzīvnieki:

—

CBA peļu avots,

| — | dzīvnieku mikrobioloģiskais statuss, ja tas zināms, |
| --- | --- |

—

dzīvnieku mikrobioloģiskais statuss, ja tas zināms,

| — | dzīvnieku skaits un vecums, |
| --- | --- |

—

dzīvnieku skaits un vecums,

| — | dzīvnieku avots, turēšanas un barošanas apstākļi utt. |
| --- | --- |

—

dzīvnieku avots, turēšanas un barošanas apstākļi utt.

| | Testēšanas apstākļi:






  — | ATP komplekta avots, partijas numurs un ražotāja kvalitātes nodrošinājuma/kvalitātes kontroles dati, |
| --- | --- | --- |

Testēšanas apstākļi:

—

ATP komplekta avots, partijas numurs un ražotāja kvalitātes nodrošinājuma/kvalitātes kontroles dati,

| — | sīkas ziņas par testējamās vielas sagatavošanu un pielietošanu, |
| --- | --- |

—

sīkas ziņas par testējamās vielas sagatavošanu un pielietošanu,

| — | devu izvēles pamatojums, attiecīgā gadījumā iekļaujot priekšskrīninga testa rezultātus, |
| --- | --- |

—

devu izvēles pamatojums, attiecīgā gadījumā iekļaujot priekšskrīninga testa rezultātus,

| — | izmantotās nesēja un testējamās vielas koncentrācijas un pielietotās testējamās vielas kopējais daudzums, |
| --- | --- |

—

izmantotās nesēja un testējamās vielas koncentrācijas un pielietotās testējamās vielas kopējais daudzums,

| — | sīkas ziņas par barības un ūdens kvalitāti (iekļaujot barības veidu/izcelsmi, ūdens izcelsmi), |
| --- | --- |

—

sīkas ziņas par barības un ūdens kvalitāti (iekļaujot barības veidu/izcelsmi, ūdens izcelsmi),

| — | sīks apstrādes un paraugu ņemšanas shēmas apraksts, |
| --- | --- |

—

sīks apstrādes un paraugu ņemšanas shēmas apraksts,

| — | toksicitātes novērtēšanas metodes, |
| --- | --- |

—

toksicitātes novērtēšanas metodes,

| — | kritēriji, pēc kuriem testa rezultātu klasificē kā pozitīvu vai negatīvu, |
| --- | --- |

—

kritēriji, pēc kuriem testa rezultātu klasificē kā pozitīvu vai negatīvu,

| — | sīkas ziņas par novirzēm no protokola un paskaidrojums par to, kādā veidā šī novirze ietekmē pētījuma plānu un rezultātus. |
| --- | --- |

—

sīkas ziņas par novirzēm no protokola un paskaidrojums par to, kādā veidā šī novirze ietekmē pētījuma plānu un rezultātus.

| | Ticamības pārbaude:






  — | jaunākās ticamības pārbaudes rezultātu kopsavilkums, iekļaujot informāciju par testējamo vielu, tās koncentrāciju un nesēju, |
| --- | --- | --- |

Ticamības pārbaude:

—

jaunākās ticamības pārbaudes rezultātu kopsavilkums, iekļaujot informāciju par testējamo vielu, tās koncentrāciju un nesēju,

| — | vienlaicīgi un/vai vēsturiski PC un vienlaicīgi negatīvās (šķīdinātājs/nesējs) kontroles dati no testēšanas laboratorijas, |
| --- | --- |

—

vienlaicīgi un/vai vēsturiski PC un vienlaicīgi negatīvās (šķīdinātājs/nesējs) kontroles dati no testēšanas laboratorijas,

| — | ja vienlaicīga PC nav paredzēta: datums un laboratorijas pārskats par nesenāko kārtējo PC un pārskats par agrāko PC datiem konkrētajā laboratorijā, kuri pamato vienlaicīgas PC neveikšanu. |
| --- | --- |

—

ja vienlaicīga PC nav paredzēta: datums un laboratorijas pārskats par nesenāko kārtējo PC un pārskats par agrāko PC datiem konkrētajā laboratorijā, kuri pamato vienlaicīgas PC neveikšanu.

| | Rezultāti:






  — | individuālu peļu masa dozēšanas sākumā un veicot plānoto nonāvēšanu; vidējās vērtības un attiecīgais kļūdas apzīmējums (piem., SD, SEM) katrai apstrādes grupai, |
| --- | --- | --- |

Rezultāti:

—

individuālu peļu masa dozēšanas sākumā un veicot plānoto nonāvēšanu; vidējās vērtības un attiecīgais kļūdas apzīmējums (piem., SD, SEM) katrai apstrādes grupai,

| — | toksicitātes parādīšanās gaita un pazīmes, iekļaujot ādas kairinājumu ievadīšanas vietā, ja tāds ir, katram dzīvniekam, |
| --- | --- |

—

toksicitātes parādīšanās gaita un pazīmes, iekļaujot ādas kairinājumu ievadīšanas vietā, ja tāds ir, katram dzīvniekam,

| — | dzīvnieka nonāvēšanas laiks un ATP mērījuma laiks katram dzīvniekam, |
| --- | --- |

—

dzīvnieka nonāvēšanas laiks un ATP mērījuma laiks katram dzīvniekam,

| — | tabula ar individuālu peļu RLU vērtībām un SI vērtībām visām devām katrā apstrādes grupā, |
| --- | --- |

—

tabula ar individuālu peļu RLU vērtībām un SI vērtībām visām devām katrā apstrādes grupā,

| — | vidējās vērtības un attiecīgais kļūdas apzīmējums (piem., SD, SEM) par RLU katrai pelei katrā apstrādes grupā un galējību jeb rupju kļūdu analīze katrā apstrādes grupā, |
| --- | --- |

—

vidējās vērtības un attiecīgais kļūdas apzīmējums (piem., SD, SEM) par RLU katrai pelei katrā apstrādes grupā un galējību jeb rupju kļūdu analīze katrā apstrādes grupā,

| — | aprēķinātais SI un attiecīgs mainības mērs, kas ņem vērā to, ka ne testējamās vielas grupā, ne kontroles grupā dzīvnieki nav identiski, |
| --- | --- |

—

aprēķinātais SI un attiecīgs mainības mērs, kas ņem vērā to, ka ne testējamās vielas grupā, ne kontroles grupā dzīvnieki nav identiski,

| — | devas un atbildes reakcijas sakarības, |
| --- | --- |

—

devas un atbildes reakcijas sakarības,

| — | attiecīgā gadījumā, statistiskā analīze. |
| --- | --- |

—

attiecīgā gadījumā, statistiskā analīze.

| | Rezultātu izvērtējums:






  — | īss komentārs par rezultātiem, atbildes reakcijas uz devu analīzi un, attiecīgā gadījumā, statistisko analīzi ar secinājumu, vai testējamā viela jāuzskata par ādas sensibilizatoru. |
| --- | --- | --- |

Rezultātu izvērtējums:

—

īss komentārs par rezultātiem, atbildes reakcijas uz devu analīzi un, attiecīgā gadījumā, statistisko analīzi ar secinājumu, vai testējamā viela jāuzskata par ādas sensibilizatoru.

IZMANTOTĀ LITERATŪRA

| 1) | OECD (2010), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guideline No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

1)

OECD (2010), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guideline No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay

| 2) | Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: status of validation. Food Chem, Toxicol., 34, 999-1002. |
| --- | --- |

2)

Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: status of validation. Food Chem, Toxicol., 34, 999-1002.

Food Chem, Toxicol

| 3) | Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem, Toxicol., 34, 985-997. |
| --- | --- |

3)

Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem, Toxicol., 34, 985-997.

Food Chem, Toxicol

| 4) | Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 36, 327-333. |
| --- | --- |

4)

Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 36, 327-333.

Food Chem. Toxicol.,

| 5) | Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicol., 146, 49-59. |
| --- | --- |

5)

Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicol., 146, 49-59.

Toxicol

| 6) | ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf] |
| --- | --- |

6)

ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]

| 7) | Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, 258-273. |
| --- | --- |

7)

Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, 258-273.

Reg. Toxicol. Pharmacol.

| 8) | Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, 274-286. |
| --- | --- |

8)

Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, 274-286.

Reg. Toxicol. Pharmacol. 34

| 9) | Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process.Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, 249-257. |
| --- | --- |

9)

Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process.Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, 249-257.

Reg. Toxicol. Pharmacol.

| 10) | ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioactive local lymph node assay: modified by Daicel Chemical Industries, Ltd., based on ATP content test method protocol (LLNA: DA). NIH Publication No. 10-7551A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-DA/TMER.htm] |
| --- | --- |

10)

ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioactive local lymph node assay: modified by Daicel Chemical Industries, Ltd., based on ATP content test method protocol (LLNA: DA). NIH Publication No. 10-7551A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-DA/TMER.htm]

| 11) | ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: Updated validation status of new versions and applications of the murine local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf]. |
| --- | --- |

11)

ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: Updated validation status of new versions and applications of the murine local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf].

| 12) | Idehara, K., Yamagishi, G., Yamashita, K. and Ito, M. (2008), Characterization and evaluation of a modified local lymph node assay using ATP content as a non-radio isotopic endpoint.J. Pharmacol. Toxicol. Meth., 58, 1-10. |
| --- | --- |

12)

Idehara, K., Yamagishi, G., Yamashita, K. and Ito, M. (2008), Characterization and evaluation of a modified local lymph node assay using ATP content as a non-radio isotopic endpoint.J. Pharmacol. Toxicol. Meth., 58, 1-10.

J. Pharmacol. Toxicol. Meth.,

| 13) | Omori, T., Idehara, K., Kojima, H., Sozu, T., Arima, K., Goto, H., Hanada, T., Ikarashi, Y., Inoda, T., Kanazawa, Y., Kosaka, T., Maki, E., Morimoto, T., Shinoda, S., Shinoda, N., Takeyoshi, M., Tanaka, M., Uratani, M., Usami, M., Yamanaka, A., Yoneda, T., Yoshimura, I. and Yuasa, A. (2008), Interlaboratory validation of the modified murine local lymph node assay based on adenosine triphosphate measurement. J. Pharmacol. Toxicol. Meth., 58, 11-26. |
| --- | --- |

13)

Omori, T., Idehara, K., Kojima, H., Sozu, T., Arima, K., Goto, H., Hanada, T., Ikarashi, Y., Inoda, T., Kanazawa, Y., Kosaka, T., Maki, E., Morimoto, T., Shinoda, S., Shinoda, N., Takeyoshi, M., Tanaka, M., Uratani, M., Usami, M., Yamanaka, A., Yoneda, T., Yoshimura, I. and Yuasa, A. (2008), Interlaboratory validation of the modified murine local lymph node assay based on adenosine triphosphate measurement. J. Pharmacol. Toxicol. Meth., 58, 11-26.

J. Pharmacol. Toxicol. Meth.,

| 14) | OECD (1992), Skin Sensitisation, Test Guideline No. 406, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

14)

OECD (1992), Skin Sensitisation, Test Guideline No. 406, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

Skin Sensitisation

| 15) | Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol., 46, 1896-1904. |
| --- | --- |

15)

Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol., 46, 1896-1904.

Food Chem. Toxicol

| 16) | Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrillo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 90-96. |
| --- | --- |

16)

Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrillo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 90-96.

Reg. Toxicol. Pharmacol

| 17) | Crouch, S.P., Kozlowski, R., Slater, K.J. and Fletcher J. (1993), The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J. Immunol. Meth., 160, 81-88. |
| --- | --- |

17)

Crouch, S.P., Kozlowski, R., Slater, K.J. and Fletcher J. (1993), The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J. Immunol. Meth., 160, 81-88.

J. Immunol. Meth

| 18) | Ishizaka, A., Tono-oka, T. and Matsumoto, S. (1984), Evaluation of the proliferative response of lymphocytes by measurement of intracellular ATP. J. Immunol. Meth., 72, 127-132. |
| --- | --- |

18)

Ishizaka, A., Tono-oka, T. and Matsumoto, S. (1984), Evaluation of the proliferative response of lymphocytes by measurement of intracellular ATP. J. Immunol. Meth., 72, 127-132.

J. Immunol. Meth

| 19) | Dexter, S.J., Cámara, M., Davies, M. and Shakesheff, K.M. (2003), Development of a bioluminescent ATP assay to quantify mammalian and bacterial cell number from a mixed population. Biomat., 24, 27-34. |
| --- | --- |

19)

Dexter, S.J., Cámara, M., Davies, M. and Shakesheff, K.M. (2003), Development of a bioluminescent ATP assay to quantify mammalian and bacterial cell number from a mixed population. Biomat., 24, 27-34.

Biomat.,

| 20) | Lundin A. (2000), Use of firefly luciferase in ATP-related assays of biomass, enzymes, and metabolites. Meth. Enzymol., 305, 346-370. |
| --- | --- |

20)

Lundin A. (2000), Use of firefly luciferase in ATP-related assays of biomass, enzymes, and metabolites. Meth. Enzymol., 305, 346-370.

Meth. Enzymol

| 21) | ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National Academies Press. |
| --- | --- |

21)

ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National Academies Press.

| 22) | ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Science. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf] |
| --- | --- |

22)

ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Science. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf]

| 23) | McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH. Toxicol., 238, 71-89. |
| --- | --- |

23)

McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH. Toxicol., 238, 71-89.

Toxicol

| 24) | Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The local lymph node assay: developments and applications. Toxicol., 93, 13-31. |
| --- | --- |

24)

Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The local lymph node assay: developments and applications. Toxicol., 93, 13-31.

Toxicol

| 25) | OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No. 404, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

25)

OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No. 404, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

Acute Dermal Irritation/Corrosion

| 26) | Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances. Toxicologist, 96, 235. |
| --- | --- |

26)

Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances. Toxicologist, 96, 235.

Toxicologist

| 27) | ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf]. |
| --- | --- |

27)

ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf].

| 28) | Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice. Drug. Chem. Toxicol., 21, 195-206. |
| --- | --- |

28)

Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice. Drug. Chem. Toxicol., 21, 195-206.

Drug. Chem. Toxicol

| 29) | Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, 83-94. |
| --- | --- |

29)

Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, 83-94.

Toxicol. Appl. Pharmacol.,

| 30) | Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals. Toxicol. Meth., 8, 245-256. |
| --- | --- |

30)

Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals. Toxicol. Meth., 8, 245-256.

Toxicol. Meth.,

| 31) | Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods. Drug Chem. Toxicol., 22, 491-506. |
| --- | --- |

31)

Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods. Drug Chem. Toxicol., 22, 491-506.

Drug Chem. Toxicol

| 32) | Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, 60-68. |
| --- | --- |

32)

Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, 60-68.

Toxicol

| 33) | Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721-728. |
| --- | --- |

33)

Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721-728.

Arch. Toxicol

| 34) | Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect., 115, 1023-1028. |
| --- | --- |

34)

Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect., 115, 1023-1028.

Environ. Health Perspect

| 35) | ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm] |
| --- | --- |

35)

ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm]

In Vitro

| 36) | OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

36)

OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation

| 37) | Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ. Health, 53 563-79. |
| --- | --- |

37)

Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ. Health, 53 563-79.

J. Toxicol. Environ. Health,

| 38) | OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

38)

OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment,

1. papildinājums

DEFINĪCIJAS

Pareizība: pēc testēšanas metodes iegūto mērījumu rezultātu sakritības pakāpe ar pieņemtajām references vērtībām. Tas ir testēšanas metodes veiktspējas raksturlielums un viens no tās piemērotības aspektiem. Šo terminu bieži izmanto “atbilstības” vietā, ar to apzīmējot pēc testēšanas metodes iegūto pareizo rezultātu daļu (38).

Salīdzināšanas viela: sensibilizējoša vai nesensibilizējoša viela, ko izmanto par standartu salīdzināšanai ar testējamo vielu. Salīdzināšanas vielai ir jābūt: (i) pastāvīgs un uzticams ieguves avots; (ii) struktūras un funkciju līdzība ar testējamo vielu klases vielām; (iii) zināmas fizikāli ķīmiskās īpašības; (iv) papildu datiem par zināmajiem iedarbības veidiem; (v) vielas zināmajam iedarbības stiprumam jāatbilst vēlamās reakcijas intensitātes diapazonam.

Šķietams negatīvs: viela, kurai ar testēšanas metodi kļūdaini noteikta negatīva vai neaktīva reakcija, lai gan faktiski tā ir pozitīva vai aktīva.

Šķietams pozitīvs: viela, kurai ar testēšanas metodi kļūdaini noteikta pozitīva vai aktīva reakcija, lai gan faktiski tā ir negatīva vai neaktīva.

Bīstamība: potenciālā spēja kaitēt veselībai vai videi. Kaitīgā iedarbība kļūst nosakāma tikai tad, ja iedarbības intensitāte ir pietiekami liela.

Starplaboratoriju reproducējamība: lielums, kas raksturo, kādā mērā vairākas kvalificētas laboratorijas spēj iegūt kvalitatīvi un kvantitatīvi līdzīgus rezultātus, ja tās izmanto vienu un to pašu protokolu un vienas un tās pašas testējamās vielas. Starplaboratoriju reproducējamību (saukta arī par interlaboratoriju reproducējamību) nosaka prevalidēšanas un validēšanas procesā, un šis lielums rāda, cik lielā mērā testēšanu vienlīdz sekmīgi iespējams veikt dažādās laboratorijās (38).

Iekšlaboratorijas reproducējamība: lielums, kas raksturo, kādā mērā vienā laboratorijā strādājoši kvalificēti darbinieki spēj sekmīgi atkārtot iepriekš iegūtus rezultātus, ja to pašu protokolu izmanto citā laikā. Saukts arī par intralaboratoriju reproducējamību (38).

Galējība jeb rupja kļūda: novērojums, kuru raksturo izteikta novirze no pārējām vērtībām populācijas paraugā, kurš atlasīts pēc nejaušības principa.

Kvalitātes nodrošināšana: pārvaldības process, kurā laboratorijas testēšanas standartu, prasību un pierakstu uzturēšanas procedūru ievērošanu un datu pārneses pareizību novērtē no testēšanas veicējiem neatkarīgas personas.

Ticamība: parametrs, ar kuru mēra pakāpi, kādā tajā pašā vai citā laboratorijā ilgākā laikā, izmantojot to pašu protokolu, var iegūt reproducējamus rezultātus. To novērtē, aprēķinot iekšlaboratorijas un starplaboratoriju reproducējamību (38).

Ādas sensibilizācija: imunoloģisks process, kurš norisinās, ja uz uzņemtspējīgu organismu ārēji iedarbojas stimulējošs ķīmisks alergēns, kas izraisa ādas imūnreakciju, kuras rezultāts var būt kontaktsensibilizācija.

Stimulācijas indekss (SI): vērtība, ko aprēķina, lai novērtētu testējamai vielai piemītošo ādas sensibilizācijas potenciālu; to izsaka kā attiecību starp progresiju grupās, kas saņēmušas pētāmo vielu, un progresiju kontroles grupā, kas saņēmusi tikai nesēju.

Testējamā viela (arī testējamā ķīmiskā viela): viela vai vielu maisījums, kuru testē ar šo TM.

B.51.   ĀDAS SENSIBILIZĀCIJA: LOKĀLO LIMFMEZGLU NOTEIKŠANA (LLNA:BrdU-ELISA)

B.51.

ĀDAS SENSIBILIZĀCIJA: LOKĀLO LIMFMEZGLU NOTEIKŠANA (LLNA:BrdU-ELISA)

IEVADS

| 1. | ESAO ķīmisko vielu testēšanas vadlīnijas un ES testēšanas metodes tiek regulāri pārskatītas, ņemot vērā tehnikas attīstību, regulatīvo prasību izmaiņas un dzīvnieku labturības apsvērumus. Ir pārskatīta B.42 – pirmā no testēšanas metodēm (TM) ādas sensibilizācijas noteikšanai pelēm jeb lokālo limfmezglu noteikšanas metode (LLNA; ESAO 429. testēšanas vadlīnijas) (1; šā pielikuma B.42. nodaļa). Ir publicēti sīki dati par LLNA validāciju un pārskats par saistītajiem darbiem (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). Lai mērītu limfocītu savairošanos, LLNA izmanto radioizotopisko timidīnu vai jodīnu, un tāpēc šīs metodes pielietošana ir ierobežota gadījumos, kad radioaktīvo komponentu iegāde, izmantošana vai apglabāšana ir problemātiska. LLNA:BrdU-ELISA [Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, konkurējošā imūnfermentācijas analīze] ir modificēta LLNA, kurā nav radioaktīvo komponentu un kurā izmanto ar radioaktīvajiem izotopiem neiezīmētu 5-brom-2-deoksiuridīnu (BrdU) (Chemical Abstracts Service [CAS] Nr. 59-14-3), lai ar testēšanas sistēmu, kuras pamatā ir ELISA metode, mērītu limfocītu savairošanos. LLNA:BrdU-ELISA testēšanas metode ir validēta, to ir pārskatījusi starptautiska neatkarīga salīdzinošās zinātniskās izvērtēšanas komisija un ir rekomendējusi šo metodi kā tādu, kas ar dažiem ierobežojumiem uzskatāma par noderīgu ādu sensibilizējošu un nesensibilizējošu ķīmisku vielu identificēšanai (10) (11) (12). Šī TM ir izstrādāta, lai novērtētu ķīmiskām vielām vai to maisījumiem piemītošo ādas sensibilizācijas potenciālu (dzīvniekiem). Šā pielikuma B.6. nodaļā un ESAO 406. testēšanas vadlīnijās aprakstītā metode izmanto testēšanu ar jūrascūciņām, proti, maksimizācijas testu jūrascūciņām un Bīlera testu (13). LLNA (šā pielikuma B.42. nodaļa; ESAO 429. testēšanas vadlīnijas) un abas šīs metodes modifikācijas, kurās nav radioaktīvo komponentu, proti, LLNA:BrdU-ELISA (šā pielikuma B.51. nodaļa; ESAO 442.b testēšanas vadlīnijas) un LLNA:DA (šā pielikuma B.50. nodaļa; ESAO 442.a testēšanas vadlīnijas), visas ir pārākas par testēšanas metodēm ar jūrascūciņām, kas aprakstītas B.6 un ESAO 406. testēšanas vadlīnijās (13), dzīvnieku skaita samazinājuma un labāka izmantojuma ziņā. |
| --- | --- |

1.

ESAO ķīmisko vielu testēšanas vadlīnijas un ES testēšanas metodes tiek regulāri pārskatītas, ņemot vērā tehnikas attīstību, regulatīvo prasību izmaiņas un dzīvnieku labturības apsvērumus. Ir pārskatīta B.42 – pirmā no testēšanas metodēm (TM) ādas sensibilizācijas noteikšanai pelēm jeb lokālo limfmezglu noteikšanas metode (LLNA; ESAO 429. testēšanas vadlīnijas) (1; šā pielikuma B.42. nodaļa). Ir publicēti sīki dati par LLNA validāciju un pārskats par saistītajiem darbiem (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). Lai mērītu limfocītu savairošanos, LLNA izmanto radioizotopisko timidīnu vai jodīnu, un tāpēc šīs metodes pielietošana ir ierobežota gadījumos, kad radioaktīvo komponentu iegāde, izmantošana vai apglabāšana ir problemātiska. LLNA:BrdU-ELISA [Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, konkurējošā imūnfermentācijas analīze] ir modificēta LLNA, kurā nav radioaktīvo komponentu un kurā izmanto ar radioaktīvajiem izotopiem neiezīmētu 5-brom-2-deoksiuridīnu (BrdU) (Chemical Abstracts Service [CAS] Nr. 59-14-3), lai ar testēšanas sistēmu, kuras pamatā ir ELISA metode, mērītu limfocītu savairošanos. LLNA:BrdU-ELISA testēšanas metode ir validēta, to ir pārskatījusi starptautiska neatkarīga salīdzinošās zinātniskās izvērtēšanas komisija un ir rekomendējusi šo metodi kā tādu, kas ar dažiem ierobežojumiem uzskatāma par noderīgu ādu sensibilizējošu un nesensibilizējošu ķīmisku vielu identificēšanai (10) (11) (12). Šī TM ir izstrādāta, lai novērtētu ķīmiskām vielām vai to maisījumiem piemītošo ādas sensibilizācijas potenciālu (dzīvniekiem). Šā pielikuma B.6. nodaļā un ESAO 406. testēšanas vadlīnijās aprakstītā metode izmanto testēšanu ar jūrascūciņām, proti, maksimizācijas testu jūrascūciņām un Bīlera testu (13). LLNA (šā pielikuma B.42. nodaļa; ESAO 429. testēšanas vadlīnijas) un abas šīs metodes modifikācijas, kurās nav radioaktīvo komponentu, proti, LLNA:BrdU-ELISA (šā pielikuma B.51. nodaļa; ESAO 442.b testēšanas vadlīnijas) un LLNA:DA (šā pielikuma B.50. nodaļa; ESAO 442.a testēšanas vadlīnijas), visas ir pārākas par testēšanas metodēm ar jūrascūciņām, kas aprakstītas B.6 un ESAO 406. testēšanas vadlīnijās (13), dzīvnieku skaita samazinājuma un labāka izmantojuma ziņā.

LLNA

LLNA

LLNA

LLNA:BrdU-ELISA

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

LLNA

Chemical Abstracts Service

CAS

ELISA

LLNA:BrdU-ELISA

LLNA

LLNA:BrdU-ELISA

LLNA:DA

| 2. | Līdzīgi kā LLNA, ar LLNA:BrdU-ELISA pēta ādas sensibilizācijas indukcijas fāzi un sniedz kvantitatīvus datus, kas piemēroti atbildes reakcijas uz devu novērtēšanai. Turklāt iespēja noteikt ādas sensibilizatorus, neizmantojot radioaktīvus DNS marķierus, atbrīvo no vajadzības risināt arodapstarošanas un radioaktīvo atkritumu apglabāšanas jautājumus. Tas savukārt ļauj ādas sensibilizatoru noteikšanai biežāk izmantot peles un turpināt samazināt jūrascūciņu izmantošanu ādas sensibilizācijas potenciāla testēšanā (t. i., B.6; ESAO 406. testēšanas vadlīnijas) (13). |
| --- | --- |

2.

Līdzīgi kā LLNA, ar LLNA:BrdU-ELISA pēta ādas sensibilizācijas indukcijas fāzi un sniedz kvantitatīvus datus, kas piemēroti atbildes reakcijas uz devu novērtēšanai. Turklāt iespēja noteikt ādas sensibilizatorus, neizmantojot radioaktīvus DNS marķierus, atbrīvo no vajadzības risināt arodapstarošanas un radioaktīvo atkritumu apglabāšanas jautājumus. Tas savukārt ļauj ādas sensibilizatoru noteikšanai biežāk izmantot peles un turpināt samazināt jūrascūciņu izmantošanu ādas sensibilizācijas potenciāla testēšanā (t. i., B.6; ESAO 406. testēšanas vadlīnijas) (13).

LLNA

LLNA:BrdU-ELISA

DEFINĪCIJAS

| 3. | Definīcijas skatīt 1. papildinājumā. |
| --- | --- |

3.

Definīcijas skatīt 1. papildinājumā.

SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI UN IEROBEŽOJUMI

| 4. | LLNA:BrdU-ELISA metode ir modificēta LLNA, kura paredzēta ķīmisko vielu – potenciālu ādas sensibilizatoru identificēšanai un kurai ir zināmi ierobežojumi. Tas nenozīmē, ka visos gadījumos LLNA:BrdU-ELISA būtu jālieto LLNA vai jūrascūciņu testa vietā (B.6; ESAO 406. testēšanas vadlīnijas) (13), bet gan to, ka šī noteikšana ir minētajam testam līdzvērtīga un to var izmantot kā alternatīvu, kuras pozitīvajam vai negatīvajam rezultātam vairs nav vajadzīgs papildu apstiprinājums (10) (11). Pirms uzsākt pētījumus, testēšanas laboratorijai jāņem vērā visa par testējamo vielu pieejamā informācija. Pie šādas informācijas pieder tās identifikācija un ķīmiskā struktūra, fizikāli ķīmiskās īpašības, citu in vitro vai in vivo veikto toksicitātes testu rezultāti un toksikoloģiskie dati par struktūras ziņā saistītām vielām. Šī informācija jāizvērtē, lai noteiktu LLNA:BrdU-ELISA piemērotību konkrētajai testējamai vielai (ņemot vērā atsevišķu veidu vielu nesaderību ar LLNA:BrdU-ELISA; skatīt 5. punktu) un lai izraudzītos pareizu testējamās vielas devu. |
| --- | --- |

4.

LLNA:BrdU-ELISA metode ir modificēta LLNA, kura paredzēta ķīmisko vielu – potenciālu ādas sensibilizatoru identificēšanai un kurai ir zināmi ierobežojumi. Tas nenozīmē, ka visos gadījumos LLNA:BrdU-ELISA būtu jālieto LLNA vai jūrascūciņu testa vietā (B.6; ESAO 406. testēšanas vadlīnijas) (13), bet gan to, ka šī noteikšana ir minētajam testam līdzvērtīga un to var izmantot kā alternatīvu, kuras pozitīvajam vai negatīvajam rezultātam vairs nav vajadzīgs papildu apstiprinājums (10) (11). Pirms uzsākt pētījumus, testēšanas laboratorijai jāņem vērā visa par testējamo vielu pieejamā informācija. Pie šādas informācijas pieder tās identifikācija un ķīmiskā struktūra, fizikāli ķīmiskās īpašības, citu in vitro vai in vivo veikto toksicitātes testu rezultāti un toksikoloģiskie dati par struktūras ziņā saistītām vielām. Šī informācija jāizvērtē, lai noteiktu LLNA:BrdU-ELISA piemērotību konkrētajai testējamai vielai (ņemot vērā atsevišķu veidu vielu nesaderību ar LLNA:BrdU-ELISA; skatīt 5. punktu) un lai izraudzītos pareizu testējamās vielas devu.

LLNA:BrdU-ELISA

LLNA

LLNA:BrdU-ELISA

LLNA

in vitro

in vivo

LLNA:BrdU-ELISA

LLNA:BrdU-ELISA

| 5. | LLNA:BrdU-ELISA ir in vivo metode un kā tāda paredz dzīvnieku izmantošanu alerģiskās kontakta sensibilizējošās aktivitātes novērtējumā. Tomēr salīdzinājumā ar testēšanas metodēm, kurās izmanto jūrascūciņas (B.6; ESAO 406. testēšanas metode), tajā iespējams izmantot mazāku skaitu dzīvnieku (13). LLNA:BrdU-ELISA turklāt piedāvā būtisku uzlabojumu dzīvnieku izmantojumā alerģiskās kontakta sensibilizējošās testēšanas vajadzībām, jo (atšķirībā no B.6 un ESAO 406. testēšanas vadlīnijām) LLNA:BrdU-ELISA nav jānoskaidro provocētās–inducētās ādas hipersensibilizācijas reakcijas. Turklāt LLNA:BrdU-ELISA nav jāizmanto palīgviela, kā tas ir jūrascūciņu maksimizācijas testā (šā pielikuma B.6. nodaļa; 13). Tādā veidā LLNA:BrdU-ELISA samazina dzīvnieku ciešanas. Neraugoties uz LLNA:BrdU-ELISA priekšrocībām salīdzinājumā ar B.6 un ESAO 406. testēšanas vadlīnijām (13), šai metodei ir daži ierobežojumi, kuru dēļ tomēr jāizmanto B.6 vai ESAO 406. testēšanas vadlīniju metode (piemēram, dažu metālu testēšanā, šķietami pozitīva rezultāta konstatēšanas gadījumā dažiem ādas sensibilizatoriem [kā, piemēram, atsevišķām surfaktantu tipa vielām] (6) (1; šā pielikuma B.42. nodaļa) vai testējamās vielas šķīdības labad). Turklāt vajadzība pēc jūrascūciņu testiem (B.6 un ESAO 406. testēšanas vadlīnijas) (13) var saglabāties attiecībā uz ķīmisko vielu klasēm vai vielām, kuru sastāvā ir funkcionālās grupas, par kurām ir pierādīts, ka tās darbojas kā potenciāli sajaucējfaktori (15). Ierobežojumus, kuri konstatēti LLNA gadījumā (1; šā pielikuma B.42. nodaļa) ieteicams attiecināt arī uz LLNA:BrdU-ELISA (10). Izņemot šādus minētos ierobežojumus, LLNA:BrdU-ELISA jāvar izmantot jebkuras ķīmiskas vielas testēšanai, ja vien testējamai ķīmiskajai vielai nav tādu īpašību, kas varētu ietekmēt LLNA:BrdU-ELISA precizitāti. Ja stimulācijas indeksa (SI) vērtība ir robežās no 1,6 līdz 1,9, jāapsver neitrālam tuva pozitīva rezultāta iespējamība (skatīt 31.–32. punktu). Šā apgalvojuma pamatā ir validēšanas datubāze, kuru veido 43 vielas ar SI ≥ 1,6 (skatīt 6. punktu); LLNA:BrdU-ELISA pareizi identificēja visus 32 LLNA sensibilizatorus, bet kļūdaini identificēja divus no 11 LLNA nesensibilizējošajām vielām, kuru SI vērtības bija robežās no 1,6 līdz 1,9 (t. i., pozitīvs neitrālam tuvs rezultāts) (10). Tomēr, tā kā SI vērtību noteikšanai un testēšanas metodes prognozēšanas spējas aprēķināšanai tika izmantota viena un tā pati datu kopa, minētie rezultāti var būt pārāk augsts reālās prognozēšanas spējas novērtējums. |
| --- | --- |

5.

LLNA:BrdU-ELISA ir in vivo metode un kā tāda paredz dzīvnieku izmantošanu alerģiskās kontakta sensibilizējošās aktivitātes novērtējumā. Tomēr salīdzinājumā ar testēšanas metodēm, kurās izmanto jūrascūciņas (B.6; ESAO 406. testēšanas metode), tajā iespējams izmantot mazāku skaitu dzīvnieku (13). LLNA:BrdU-ELISA turklāt piedāvā būtisku uzlabojumu dzīvnieku izmantojumā alerģiskās kontakta sensibilizējošās testēšanas vajadzībām, jo (atšķirībā no B.6 un ESAO 406. testēšanas vadlīnijām) LLNA:BrdU-ELISA nav jānoskaidro provocētās–inducētās ādas hipersensibilizācijas reakcijas. Turklāt LLNA:BrdU-ELISA nav jāizmanto palīgviela, kā tas ir jūrascūciņu maksimizācijas testā (šā pielikuma B.6. nodaļa; 13). Tādā veidā LLNA:BrdU-ELISA samazina dzīvnieku ciešanas. Neraugoties uz LLNA:BrdU-ELISA priekšrocībām salīdzinājumā ar B.6 un ESAO 406. testēšanas vadlīnijām (13), šai metodei ir daži ierobežojumi, kuru dēļ tomēr jāizmanto B.6 vai ESAO 406. testēšanas vadlīniju metode (piemēram, dažu metālu testēšanā, šķietami pozitīva rezultāta konstatēšanas gadījumā dažiem ādas sensibilizatoriem [kā, piemēram, atsevišķām surfaktantu tipa vielām] (6) (1; šā pielikuma B.42. nodaļa) vai testējamās vielas šķīdības labad). Turklāt vajadzība pēc jūrascūciņu testiem (B.6 un ESAO 406. testēšanas vadlīnijas) (13) var saglabāties attiecībā uz ķīmisko vielu klasēm vai vielām, kuru sastāvā ir funkcionālās grupas, par kurām ir pierādīts, ka tās darbojas kā potenciāli sajaucējfaktori (15). Ierobežojumus, kuri konstatēti LLNA gadījumā (1; šā pielikuma B.42. nodaļa) ieteicams attiecināt arī uz LLNA:BrdU-ELISA (10). Izņemot šādus minētos ierobežojumus, LLNA:BrdU-ELISA jāvar izmantot jebkuras ķīmiskas vielas testēšanai, ja vien testējamai ķīmiskajai vielai nav tādu īpašību, kas varētu ietekmēt LLNA:BrdU-ELISA precizitāti. Ja stimulācijas indeksa (SI) vērtība ir robežās no 1,6 līdz 1,9, jāapsver neitrālam tuva pozitīva rezultāta iespējamība (skatīt 31.–32. punktu). Šā apgalvojuma pamatā ir validēšanas datubāze, kuru veido 43 vielas ar SI ≥ 1,6 (skatīt 6. punktu); LLNA:BrdU-ELISA pareizi identificēja visus 32 LLNA sensibilizatorus, bet kļūdaini identificēja divus no 11 LLNA nesensibilizējošajām vielām, kuru SI vērtības bija robežās no 1,6 līdz 1,9 (t. i., pozitīvs neitrālam tuvs rezultāts) (10). Tomēr, tā kā SI vērtību noteikšanai un testēšanas metodes prognozēšanas spējas aprēķināšanai tika izmantota viena un tā pati datu kopa, minētie rezultāti var būt pārāk augsts reālās prognozēšanas spējas novērtējums.

LLNA:BrdU-ELISA

in vivo

LLNA:BrdU-ELISA

LLNA:BrdU-ELISA

LLNA:BrdU-ELISA

LLNA:BrdU-ELISA

LLNA:BrdU-ELISA

LLNA

LLNA:BrdU-ELISA

LLNA:BrdU-ELISA

LLNA:BrdU-ELISA

LLNA:BrdU-ELISA

LLNA

LLNA

TESTĒŠANAS METODES PRINCIPS

| 6. | LLNA:BrdU-ELISA pamatprincips ir tāds, ka sensibilizatori inducē limfocītu savairošanos limfmezglos, kuri drenē testējamās vielas saņemšanas vietu. Šī savairošanās ir proporcionāla devai un alergēna iedarbīgumam un ir vienkāršs paņēmiens, lai iegūtu kvantitatīvu sensitivitātes mērījumu. Savairošanās pakāpi nosaka, vidējo savairošanos katrā testējamās vielas grupā salīdzinot ar vidējo savairošanos kontroles grupā, kas saņēmusi tikai nesēju (VC). Nosaka attiecību starp vidējo progresiju grupās, kas saņēmušas pētāmo vielu, un progresiju VC grupā; tas ir stimulācijas indekss (SI). Lai testējamo vielu pamatoti turpinātu vērtēt kā potenciālu ādas sensibilizatoru, SI vērtībai jābūt ≥ 1,6. Šeit aprakstīto procedūru pamatā ir BrdU satura noteikšana šūnu savairošanās izmērīšanai aurikulārajos limfmezglos. BrdU ir timidīna analogs un vairojošos šūnu DNS sastāvā iekļaujas līdzīgā veidā. BrdU iekļaušanās pakāpi mēra ar ELISA metodi, kurā lieto BrdU specifisku antivielu, kas turklāt iezīmēta ar peroksidāzi. Kad pievieno substrātu, peroksidāze ar to reaģē, un reakcijas produktam ir krāsa; reakcijas produkta daudzumu mēra noteiktā absorbcijas režīmā, izmantojot mikrotitrēšanas plati. |
| --- | --- |

6.

LLNA:BrdU-ELISA pamatprincips ir tāds, ka sensibilizatori inducē limfocītu savairošanos limfmezglos, kuri drenē testējamās vielas saņemšanas vietu. Šī savairošanās ir proporcionāla devai un alergēna iedarbīgumam un ir vienkāršs paņēmiens, lai iegūtu kvantitatīvu sensitivitātes mērījumu. Savairošanās pakāpi nosaka, vidējo savairošanos katrā testējamās vielas grupā salīdzinot ar vidējo savairošanos kontroles grupā, kas saņēmusi tikai nesēju (VC). Nosaka attiecību starp vidējo progresiju grupās, kas saņēmušas pētāmo vielu, un progresiju VC grupā; tas ir stimulācijas indekss (SI). Lai testējamo vielu pamatoti turpinātu vērtēt kā potenciālu ādas sensibilizatoru, SI vērtībai jābūt ≥ 1,6. Šeit aprakstīto procedūru pamatā ir BrdU satura noteikšana šūnu savairošanās izmērīšanai aurikulārajos limfmezglos. BrdU ir timidīna analogs un vairojošos šūnu DNS sastāvā iekļaujas līdzīgā veidā. BrdU iekļaušanās pakāpi mēra ar ELISA metodi, kurā lieto BrdU specifisku antivielu, kas turklāt iezīmēta ar peroksidāzi. Kad pievieno substrātu, peroksidāze ar to reaģē, un reakcijas produktam ir krāsa; reakcijas produkta daudzumu mēra noteiktā absorbcijas režīmā, izmantojot mikrotitrēšanas plati.

LLNA:BrdU-ELISA

ELISA

METODES APRAKSTS

Dzīvnieku sugas izvēle

Dzīvnieku sugas izvēle

| 7. | Šim testam izvēlētā suga ir peles. LLNA:BrdU-ELISA validēšanas pētījumi ir veikti vienīgi ar CBA/JN līnijas dzīvniekiem, un tāpēc to uzskata par ieteicamo līniju (10) (12). Izmanto jaunas, pieaugušas sievišķā dzimuma peles, kas nav dzemdējušas un nav grūsnas. Pētījuma sākumā dzīvniekiem jābūt 8–12 nedēļu veciem, dzīvnieku masas atšķirībām jābūt minimālām un ne lielākām par 20 % no vidējās masas. Citas līnijas un vīrišķā dzimuma dzīvniekus var izmantot, ja ir iegūts pietiekami daudz datu, lai parādītu, ka LLNA:BrdU-ELISA atbildes reakcijā nav nozīmīgu atšķirību, kas specifiskas līnijai un/vai dzimumam. |
| --- | --- |

7.

Šim testam izvēlētā suga ir peles. LLNA:BrdU-ELISA validēšanas pētījumi ir veikti vienīgi ar CBA/JN līnijas dzīvniekiem, un tāpēc to uzskata par ieteicamo līniju (10) (12). Izmanto jaunas, pieaugušas sievišķā dzimuma peles, kas nav dzemdējušas un nav grūsnas. Pētījuma sākumā dzīvniekiem jābūt 8–12 nedēļu veciem, dzīvnieku masas atšķirībām jābūt minimālām un ne lielākām par 20 % no vidējās masas. Citas līnijas un vīrišķā dzimuma dzīvniekus var izmantot, ja ir iegūts pietiekami daudz datu, lai parādītu, ka LLNA:BrdU-ELISA atbildes reakcijā nav nozīmīgu atšķirību, kas specifiskas līnijai un/vai dzimumam.

LLNA:BrdU-ELISA

LLNA:BrdU-ELISA

Turēšanas un barošanas apstākļi

Turēšanas un barošanas apstākļi

| 8. | Ja nav zinātniska pamatojuma, kāpēc peles būtu turamas katra atsevišķi, peles izmitina grupā (16). Telpā, kurā tur izmēģinājumu dzīvniekus, jābūt 22 ± 3 °C temperatūrai. Lai gan, izņemot telpu uzkopšanas laiku, relatīvajam mitrumam jābūt vismaz 30 % un vēlams ne vairāk kā 70 %, tas jāuztur 50-60 % robežās. Apgaismojumam jābūt mākslīgam atbilstoši secībai 12 stundas gaišas, 12 stundas tumšas. Barošanai var izmantot parasto laboratorijas barību ar neierobežotu dzeramā ūdens daudzumu. |
| --- | --- |

8.

Ja nav zinātniska pamatojuma, kāpēc peles būtu turamas katra atsevišķi, peles izmitina grupā (16). Telpā, kurā tur izmēģinājumu dzīvniekus, jābūt 22 ± 3 °C temperatūrai. Lai gan, izņemot telpu uzkopšanas laiku, relatīvajam mitrumam jābūt vismaz 30 % un vēlams ne vairāk kā 70 %, tas jāuztur 50-60 % robežās. Apgaismojumam jābūt mākslīgam atbilstoši secībai 12 stundas gaišas, 12 stundas tumšas. Barošanai var izmantot parasto laboratorijas barību ar neierobežotu dzeramā ūdens daudzumu.

Dzīvnieku sagatavošana

Dzīvnieku sagatavošana

| 9. | Dzīvniekus izvēlas pēc nejaušības principa, marķē individuālai identificēšanai (bet nekādā veidā nemarķē ausis) un tur būros vismaz piecas dienas pirms testa sākuma, lai tos aklimatizētu laboratorijas apstākļos. Pirms apstrādes uzsākšanas visus dzīvniekus apskata, lai pārliecinātos, ka tiem nav novērojami ādas bojājumi. |
| --- | --- |

9.

Dzīvniekus izvēlas pēc nejaušības principa, marķē individuālai identificēšanai (bet nekādā veidā nemarķē ausis) un tur būros vismaz piecas dienas pirms testa sākuma, lai tos aklimatizētu laboratorijas apstākļos. Pirms apstrādes uzsākšanas visus dzīvniekus apskata, lai pārliecinātos, ka tiem nav novērojami ādas bojājumi.

Testa šķīdumu sagatavošana

Testa šķīdumu sagatavošana

| 10. | Cietas ķīmiskās vielas pirms peļu ausu apstrādes izšķīdina vai suspendē, izmantojot šķīdinātājus vai nesējus, un vajadzības gadījumā atšķaida. Šķidras ķīmiskās vielas var izmantot gan atšķaidītas, gan neatšķaidītas. Nešķīstošas ķīmiskās vielas (kādas parasti izmanto medicīnas iekārtās) pirms peļu ausu apstrādes ekstrahē piemērotā šķīdinātājā, lai visas ekstrahējamās sastāvdaļas būtu pieejamas testēšanai. Ja dati par testējamo vielu stabilitāti liecina, ka tās uzglabāt nevar, katru dienu sagatavo svaigas testējamās vielas. |
| --- | --- |

10.

Cietas ķīmiskās vielas pirms peļu ausu apstrādes izšķīdina vai suspendē, izmantojot šķīdinātājus vai nesējus, un vajadzības gadījumā atšķaida. Šķidras ķīmiskās vielas var izmantot gan atšķaidītas, gan neatšķaidītas. Nešķīstošas ķīmiskās vielas (kādas parasti izmanto medicīnas iekārtās) pirms peļu ausu apstrādes ekstrahē piemērotā šķīdinātājā, lai visas ekstrahējamās sastāvdaļas būtu pieejamas testēšanai. Ja dati par testējamo vielu stabilitāti liecina, ka tās uzglabāt nevar, katru dienu sagatavo svaigas testējamās vielas.

Ticamības pārbaude

Ticamības pārbaude

| 11. | Metodes veiktspējas pienācīgumu parāda ar pozitīvās kontroles vielu (PC) palīdzību, kas ar adekvātu un reproducējamu sensibilitāti reaģē kā sensibilizējošas testēšanas vielas, kuru reakcijas intensitāte ir sīki aprakstīta. Ieteicams paredzēt vienlaicīgu PC, jo tādā veidā var pierādīt laboratorijas spēju atkārtoti un sekmīgi īstenot noteikšanu, kā arī novērtēt iekšlaboratorijas un starplaboratoriju reproducējamību un rezultātu salīdzināmību. Pirms LLNA:BrdU-ELISA ieteicams lietotājiem konsultēties ar atbildīgajām iestādēm, jo dažas regulatīvās iestādes pieprasa PC izmantošanu katrā individuālā pētījumā. Attiecīgi labāk ir ikreiz izmantot vienlaicīgu PC, jo tas ļauj neveikt papildu testēšanu ar dzīvniekiem, lai izpildītu prasības, kuras var izrietēt no PC neregulāras izmantošanas (skatīt 12. punktu). PC jādod pozitīva LLNA:BrdU-ELISA atbildes reakcija tādā iedarbības līmenī, kurā ir sagaidāms stimulācijas indekss (SI) ≥ 1,6, salīdzinot ar negatīvās kontroles vielu (NC) grupu. PC deva jāizvēlas tā, lai neizraisītu pārmērīgu ādas kairinājumu vai sistēmisku toksicitāti un lai indukcija būtu atkārtojama, taču ne pārmērīga (piemēram, SI > 14 uzskata par pārmērīgu). Ieteicamākās PC ir 25 % heksilkanēļskābes aldehīds (CAS Nr. 101-86-0) un 25 % eigenols (CAS Nr. 97-53-0) ar acetonu/olīveļļu (4:1 tilp./tilp.). Var būt apstākļi, kad ar pienācīgu pamatojumu var izmantot citas PC, kas atbilst iepriekš minētajiem kritērijiem. |
| --- | --- |

11.

Metodes veiktspējas pienācīgumu parāda ar pozitīvās kontroles vielu (PC) palīdzību, kas ar adekvātu un reproducējamu sensibilitāti reaģē kā sensibilizējošas testēšanas vielas, kuru reakcijas intensitāte ir sīki aprakstīta. Ieteicams paredzēt vienlaicīgu PC, jo tādā veidā var pierādīt laboratorijas spēju atkārtoti un sekmīgi īstenot noteikšanu, kā arī novērtēt iekšlaboratorijas un starplaboratoriju reproducējamību un rezultātu salīdzināmību. Pirms LLNA:BrdU-ELISA ieteicams lietotājiem konsultēties ar atbildīgajām iestādēm, jo dažas regulatīvās iestādes pieprasa PC izmantošanu katrā individuālā pētījumā. Attiecīgi labāk ir ikreiz izmantot vienlaicīgu PC, jo tas ļauj neveikt papildu testēšanu ar dzīvniekiem, lai izpildītu prasības, kuras var izrietēt no PC neregulāras izmantošanas (skatīt 12. punktu). PC jādod pozitīva LLNA:BrdU-ELISA atbildes reakcija tādā iedarbības līmenī, kurā ir sagaidāms stimulācijas indekss (SI) ≥ 1,6, salīdzinot ar negatīvās kontroles vielu (NC) grupu. PC deva jāizvēlas tā, lai neizraisītu pārmērīgu ādas kairinājumu vai sistēmisku toksicitāti un lai indukcija būtu atkārtojama, taču ne pārmērīga (piemēram, SI > 14 uzskata par pārmērīgu). Ieteicamākās PC ir 25 % heksilkanēļskābes aldehīds (CAS Nr. 101-86-0) un 25 % eigenols (CAS Nr. 97-53-0) ar acetonu/olīveļļu (4:1 tilp./tilp.). Var būt apstākļi, kad ar pienācīgu pamatojumu var izmantot citas PC, kas atbilst iepriekš minētajiem kritērijiem.

LLNA:BrdU-ELISA

LLNA:BrdU-ELISA

CAS

CAS

| 12. | Lai gan vienlaicīgas PC grupas izmantošana ir ieteicama, var būt situācijas, kad laboratorijās, kurās LLNA:BrdU-ELISA veic regulāri (t. i., vismaz reizi mēnesī) un kurās tāpēc ir vēsturiska PC datubāze, kas pierāda laboratorijas spēju ar PC iegūt reproducējamus un pareizus rezultātus, piemērotāka var izrādīties periodiska PC izmantošana (t. i., vismaz reizi 6 mēnešos). LLNA:BrdU-ELISA metodes adekvātu pārzināšanu var sekmīgi pierādīt, ar PC iegūstot konsekventus pozitīvus rezultātus vismaz 10 neatkarīgās testēšanas reizēs, kuras veiktas samērīgā laika periodā (t. i., ne ilgāk kā gada laikā). |
| --- | --- |

12.

Lai gan vienlaicīgas PC grupas izmantošana ir ieteicama, var būt situācijas, kad laboratorijās, kurās LLNA:BrdU-ELISA veic regulāri (t. i., vismaz reizi mēnesī) un kurās tāpēc ir vēsturiska PC datubāze, kas pierāda laboratorijas spēju ar PC iegūt reproducējamus un pareizus rezultātus, piemērotāka var izrādīties periodiska PC izmantošana (t. i., vismaz reizi 6 mēnešos). LLNA:BrdU-ELISA metodes adekvātu pārzināšanu var sekmīgi pierādīt, ar PC iegūstot konsekventus pozitīvus rezultātus vismaz 10 neatkarīgās testēšanas reizēs, kuras veiktas samērīgā laika periodā (t. i., ne ilgāk kā gada laikā).

LLNA:BrdU-ELISA

LLNA:BrdU-ELISA

| 13. | Vienlaicīga PC grupa noteikti jāiekļauj, kad LLNA:BrdU-ELISA notiek procedurālas izmaiņas (piemēram, augsti kvalificēta personāla nomaiņa, testēšanas metodes materiālu un/vai reaģentu nomaiņa, cits izmēģinājumu dzīvnieku piegādātājs), un šādas izmaiņas pienācīgi jādokumentē laboratorijas pārskatos. Jānovērtē šādu izmaiņu ietekme uz iepriekš izveidotās vēsturiskās datubāzes adekvātumu un tas, vai vajag veidot jaunu vēsturisku datubāzi, lai dokumentētu ar PC iegūtu rezultātu konsekvenci. |
| --- | --- |

13.

Vienlaicīga PC grupa noteikti jāiekļauj, kad LLNA:BrdU-ELISA notiek procedurālas izmaiņas (piemēram, augsti kvalificēta personāla nomaiņa, testēšanas metodes materiālu un/vai reaģentu nomaiņa, cits izmēģinājumu dzīvnieku piegādātājs), un šādas izmaiņas pienācīgi jādokumentē laboratorijas pārskatos. Jānovērtē šādu izmaiņu ietekme uz iepriekš izveidotās vēsturiskās datubāzes adekvātumu un tas, vai vajag veidot jaunu vēsturisku datubāzi, lai dokumentētu ar PC iegūtu rezultātu konsekvenci.

LLNA:BrdU-ELISA

| 14. | Pētniekiem jāapzinās, ka lēmums par periodisku, nevis vienlaicīgu PC izmantošanu ietekmēs to, kādā mērā par adekvātiem un pieņemamiem varēs uzskatīt negatīvos pētījumu rezultātus, kas bez vienlaicīgas PC iegūti periodiskās PC izmantošanas starplaikos. Piemēram, ja ar periodisko PC pētījumu iegūst šķietami negatīvu rezultātu, var apšaubīt negatīvu testējamās vielas rezultātu, kas iegūts iepriekšējā pieņemamā periodiskā PC pētījuma un nepieņemamā periodiskā PC pētījuma starplaikā. Tāpēc rūpīgi jāizvērtē, vai izmantot vienlaicīgu vai periodisku PC. Tāpat jāizvērtē, kādas ir iespējas vienlaicīgās PC grupā izmantot mazāk dzīvnieku, ja to var zinātniski pamatot un ja laboratorija ar saviem specifiskajiem vēsturiskajiem datiem var pierādīt, ka ir iespējams izmantot mazāk peļu (17). |
| --- | --- |

14.

Pētniekiem jāapzinās, ka lēmums par periodisku, nevis vienlaicīgu PC izmantošanu ietekmēs to, kādā mērā par adekvātiem un pieņemamiem varēs uzskatīt negatīvos pētījumu rezultātus, kas bez vienlaicīgas PC iegūti periodiskās PC izmantošanas starplaikos. Piemēram, ja ar periodisko PC pētījumu iegūst šķietami negatīvu rezultātu, var apšaubīt negatīvu testējamās vielas rezultātu, kas iegūts iepriekšējā pieņemamā periodiskā PC pētījuma un nepieņemamā periodiskā PC pētījuma starplaikā. Tāpēc rūpīgi jāizvērtē, vai izmantot vienlaicīgu vai periodisku PC. Tāpat jāizvērtē, kādas ir iespējas vienlaicīgās PC grupā izmantot mazāk dzīvnieku, ja to var zinātniski pamatot un ja laboratorija ar saviem specifiskajiem vēsturiskajiem datiem var pierādīt, ka ir iespējams izmantot mazāk peļu (17).

| 15. | Kaut arī PC jātestē nesējā, par kuru ir zināms, ka tas izrāda viendabīgu atbildes reakciju (piemēram, acetons/olīveļļa; 4:1 tilp./tilp.), var būt dažas reglamentējošas situācijas, kurās būs nepieciešama arī testēšana nestandarta nesējā (klīniski/ķīmiski piederīgs sastāvs) (18). Ja vienlaicīgo PC testē ar citu nesēju nekā testējamo vielu, vienlaicīgās PC vajadzībām jāparedz atsevišķs VC. |
| --- | --- |

15.

Kaut arī PC jātestē nesējā, par kuru ir zināms, ka tas izrāda viendabīgu atbildes reakciju (piemēram, acetons/olīveļļa; 4:1 tilp./tilp.), var būt dažas reglamentējošas situācijas, kurās būs nepieciešama arī testēšana nestandarta nesējā (klīniski/ķīmiski piederīgs sastāvs) (18). Ja vienlaicīgo PC testē ar citu nesēju nekā testējamo vielu, vienlaicīgās PC vajadzībām jāparedz atsevišķs VC.

| 16. | Ja vērtē testējamās vielas, kas pieder konkrētai ķīmisko vielu klasei vai kas dod noteikta diapazona reakciju, var izmantot salīdzināšanas vielas, kuras noder, lai parādītu, ka testēšanas metode darbojas un pienācīgi nosaka šā tipa testējamām vielām piemītošo ādas sensibilizācijas potenciālu. Pienācīgām salīdzināšanas vielām ir jāpiemīt šādām īpašībām:






  — | strukturāla un funkcionāla līdzība ar testējamās vielas klases vielām, |
| --- | --- | --- |

16.

Ja vērtē testējamās vielas, kas pieder konkrētai ķīmisko vielu klasei vai kas dod noteikta diapazona reakciju, var izmantot salīdzināšanas vielas, kuras noder, lai parādītu, ka testēšanas metode darbojas un pienācīgi nosaka šā tipa testējamām vielām piemītošo ādas sensibilizācijas potenciālu. Pienācīgām salīdzināšanas vielām ir jāpiemīt šādām īpašībām:

—

strukturāla un funkcionāla līdzība ar testējamās vielas klases vielām,

| — | labi zināmas fizikālās un ķīmiskās īpašības, |
| --- | --- |

—

labi zināmas fizikālās un ķīmiskās īpašības,

| — | papildinoši dati no LLNA:BrdU-ELISA, |
| --- | --- |

—

papildinoši dati no LLNA:BrdU-ELISA,

LLNA:BrdU-ELISA

| — | papildinoši dati saistībā ar citiem dzīvniekiem un/vai cilvēku. |
| --- | --- |

—

papildinoši dati saistībā ar citiem dzīvniekiem un/vai cilvēku.

TESTA PROCEDŪRA

Dzīvnieku skaits un devu līmeņi

Dzīvnieku skaits un devu līmeņi

| 17. | Uz devas grupu ar vismaz trim testējamās vielas koncentrācijām izmanto vismaz četrus dzīvniekus un vienlaicīgas NC grupu, kas saņem tikai testējamās vielas nesēju, un PC grupu (vienlaicīgu vai nesenu atkarībā no laboratorijas prakses un saistībā ar 11.–15. punktu). Jāapsver iespēja testēt vairākas PC devas, īpaši tad, ja PC testēšana ir periodiska. Izņemot apstrādi ar testējamo vielu, ar kontroles grupu dzīvniekiem rīkojas tieši tāpat kā ar apstrādāto grupu dzīvniekiem. |
| --- | --- |

17.

Uz devas grupu ar vismaz trim testējamās vielas koncentrācijām izmanto vismaz četrus dzīvniekus un vienlaicīgas NC grupu, kas saņem tikai testējamās vielas nesēju, un PC grupu (vienlaicīgu vai nesenu atkarībā no laboratorijas prakses un saistībā ar 11.–15. punktu). Jāapsver iespēja testēt vairākas PC devas, īpaši tad, ja PC testēšana ir periodiska. Izņemot apstrādi ar testējamo vielu, ar kontroles grupu dzīvniekiem rīkojas tieši tāpat kā ar apstrādāto grupu dzīvniekiem.

| 18. | Devu un nesēja izvēlei jāpamatojas uz atsaucē (2) un (19) sniegtajiem ieteikumiem. Secīgas devas parasti izraugās no atbilstošas koncentrāciju rindas, kā 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 %, u. c. Koncentrāciju rindas izvēlei jābūt ar adekvātu zinātnisku pamatojumu. Jāizvērtē visa esošā toksikoloģiskā (piemēram, akūta toksicitāte un dermālais kairinājums) un struktūras un fizikālķīmiskā informācija par attiecīgo testējamo vielu (un/vai par struktūras ziņā saistītām vielām), ja tāda ir, un trīs secīgās koncentrācijas jāizraugās tā, lai augstākā no tām izraisītu stiprāko iedarbību, kura vēl nerada sistēmisku toksicitāti un/vai pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu (19) (20 un šā pielikuma B.4. nodaļa). Ja šādas informācijas nav, sākumā var būt jāveic priekšskrīninga tests (skatīt 21.–24. punktu). |
| --- | --- |

18.

Devu un nesēja izvēlei jāpamatojas uz atsaucē (2) un (19) sniegtajiem ieteikumiem. Secīgas devas parasti izraugās no atbilstošas koncentrāciju rindas, kā 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 %, u. c. Koncentrāciju rindas izvēlei jābūt ar adekvātu zinātnisku pamatojumu. Jāizvērtē visa esošā toksikoloģiskā (piemēram, akūta toksicitāte un dermālais kairinājums) un struktūras un fizikālķīmiskā informācija par attiecīgo testējamo vielu (un/vai par struktūras ziņā saistītām vielām), ja tāda ir, un trīs secīgās koncentrācijas jāizraugās tā, lai augstākā no tām izraisītu stiprāko iedarbību, kura vēl nerada sistēmisku toksicitāti un/vai pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu (19) (20 un šā pielikuma B.4. nodaļa). Ja šādas informācijas nav, sākumā var būt jāveic priekšskrīninga tests (skatīt 21.–24. punktu).

| 19. | Nesējs nedrīkst pārmainīt vai maskēt testēšanas rezultātus, un tas jāizraugās tāds, lai šķīdība būtu iespējami lielāka, tā ļaujot iegūt augstāko reāli sasniedzamo koncentrāciju un iegūstot šķīdumu/suspensiju, kas būtu derīga testējamās vielas pielietošanai. Ieteicamie nesēji ir acetons/olīveļļa (4:1 tilp./tilp.), N,N-dimetilformamīds, metiletilketons, propilēnglikols un dimetilsulfoksīds (6), bet var izmantot arī citus, ja tam ir pietiekams zinātniskais pamatojums. Dažos gadījumos papildu kontrolei jāizmanto klīniski atbilstošs šķīdinātājs vai tirdzniecības preparāts, kura sastāvā testējamo vielu tirgo. Īpaši jārūpējas, lai nodrošinātu to, ka hidrofīlas testējamās vielas ir iekļautas nesēja sistēmā, kas mitrina ādu un tūlīt nenotek, un jāizmanto pienācīgi šķīdinātāji (piemēram, 1 % Pluronic® L92). Tādēļ ir jāizvairās no nesējiem, kas satur vienīgi ūdeni. |
| --- | --- |

19.

Nesējs nedrīkst pārmainīt vai maskēt testēšanas rezultātus, un tas jāizraugās tāds, lai šķīdība būtu iespējami lielāka, tā ļaujot iegūt augstāko reāli sasniedzamo koncentrāciju un iegūstot šķīdumu/suspensiju, kas būtu derīga testējamās vielas pielietošanai. Ieteicamie nesēji ir acetons/olīveļļa (4:1 tilp./tilp.), N,N-dimetilformamīds, metiletilketons, propilēnglikols un dimetilsulfoksīds (6), bet var izmantot arī citus, ja tam ir pietiekams zinātniskais pamatojums. Dažos gadījumos papildu kontrolei jāizmanto klīniski atbilstošs šķīdinātājs vai tirdzniecības preparāts, kura sastāvā testējamo vielu tirgo. Īpaši jārūpējas, lai nodrošinātu to, ka hidrofīlas testējamās vielas ir iekļautas nesēja sistēmā, kas mitrina ādu un tūlīt nenotek, un jāizmanto pienācīgi šķīdinātāji (piemēram, 1 % Pluronic® L92). Tādēļ ir jāizvairās no nesējiem, kas satur vienīgi ūdeni.

N,N

| 20. | Izpētot no individuālām pelēm iegūtus limfmezglus, var novērtēt dzīvnieku savstarpējās atšķirības un iegūt testējamās vielas grupas un VC grupas mērījumu statistisku salīdzinājumu (skatīt 33. punktu). Turklāt PC grupas peļu skaita iespējamā samazinājuma izvērtējumam jēga ir vienīgi tad, ja dati ir par individuāliem dzīvniekiem (17). Dažas regulatīvās iestādes prasa, lai dati būtu par individuāliem dzīvniekiem. Regulāra datu vākšana par individuāliem dzīvniekiem dod priekšrocības dzīvnieku labturības ziņā, jo ļauj izvairīties no atkārtotas testēšanas gadījumā, ja vielas testēšanas rezultātus sākotnēji apkopo vienā veidā (piemēram, par apstrādes grupu), bet regulatīvās iestādes vēlāk izvirza citas prasības (piemēram, pieprasa datus par individuāliem dzīvniekiem). |
| --- | --- |

20.

Izpētot no individuālām pelēm iegūtus limfmezglus, var novērtēt dzīvnieku savstarpējās atšķirības un iegūt testējamās vielas grupas un VC grupas mērījumu statistisku salīdzinājumu (skatīt 33. punktu). Turklāt PC grupas peļu skaita iespējamā samazinājuma izvērtējumam jēga ir vienīgi tad, ja dati ir par individuāliem dzīvniekiem (17). Dažas regulatīvās iestādes prasa, lai dati būtu par individuāliem dzīvniekiem. Regulāra datu vākšana par individuāliem dzīvniekiem dod priekšrocības dzīvnieku labturības ziņā, jo ļauj izvairīties no atkārtotas testēšanas gadījumā, ja vielas testēšanas rezultātus sākotnēji apkopo vienā veidā (piemēram, par apstrādes grupu), bet regulatīvās iestādes vēlāk izvirza citas prasības (piemēram, pieprasa datus par individuāliem dzīvniekiem).

Priekšskrīninga tests

Priekšskrīninga tests

| 21. | Ja nav informācijas, lai noteiktu augstāko testējamo devu (skatīt 18. punktu), jāveic priekšskrīninga tests, lai definētu ar LLNA:BrdU-ELISA testējamo atbilstošo devas līmeni. Priekšskrīninga testa mērķis ir būt par orientieri ar LLNA:BrdU-ELISA testējamā maksimālā devas līmeņa izvēlē, ja nav informācijas par koncentrāciju, kādā testējamā viela izraisa sistēmisku toksicitāti (skatīt 24. punktu) un/vai pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu (skatīt 23. punktu). Maksimālajai testējamās vielas devas koncentrācijai vajadzētu būt 100 % (šķidrumiem) un augstākajai iespējamajai koncentrācijai (cietām vielām un suspensijām). |
| --- | --- |

21.

Ja nav informācijas, lai noteiktu augstāko testējamo devu (skatīt 18. punktu), jāveic priekšskrīninga tests, lai definētu ar LLNA:BrdU-ELISA testējamo atbilstošo devas līmeni. Priekšskrīninga testa mērķis ir būt par orientieri ar LLNA:BrdU-ELISA testējamā maksimālā devas līmeņa izvēlē, ja nav informācijas par koncentrāciju, kādā testējamā viela izraisa sistēmisku toksicitāti (skatīt 24. punktu) un/vai pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu (skatīt 23. punktu). Maksimālajai testējamās vielas devas koncentrācijai vajadzētu būt 100 % (šķidrumiem) un augstākajai iespējamajai koncentrācijai (cietām vielām un suspensijām).

LLNA:BrdU-ELISA

LLNA:BrdU-ELISA

| 22. | Priekšskrīninga testa apstākļi ir identiski pamata LLNA:BrdU-ELISA apstākļiem, izņemot to, ka nevērtē progresiju limfmezglos un ka devas grupā var izmantot mazāku skaitu dzīvnieku. Ieteicamais skaits ir viens vai divi dzīvnieki katrā devas grupā. Visām pelēm ik dienas pārbauda to, vai apstrādes vietā nav klīnisku pazīmju, kas liecinātu par sistēmisku toksicitāti vai lokālu kairinājumu. Pirms testa un tā beigās (6. diena) reģistrē dzīvnieku ķermeņa masu. Katrai peles apskata abas ausis, un iespējamo apsārtumu novērtē pēc 1. tabulas punktu skalas (20; šā pielikuma B.4. nodaļa). Auss biezumu mēra ar piemērotu mērierīci (piemēram, digitālo mikrometru vai “Peacock” tipa biezuma mērierīci) 1. dienā (pirms devas), 3. dienā (aptuveni 48 stundas pēc pirmās devas) un 6. dienā. Turklāt 6. dienā auss biezumu var mērīt ar auss caursišanas paņēmienu pēc tam, kad dzīvnieki ir humāni nonāvēti. Lokālu kairinājumu uzskata par pārmērīgu tad, ja jebkurā mērījumu dienā apsārtuma novērtējums pēc punktu skalas ir ≥ 3 un/vai auss biezums ≥ 25 % (21) (22). Lielākā deva, kas izmantojama LLNA:BrdU-ELISA pamata testā, ir otrā zemākā deva priekšskrīninga koncentrāciju rindā (skatīt 18. punktu), kas neizraisa sistēmisku toksicitāti un/vai pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu.

  1.   tabula


  Apsārtuma (eritēmas) skala







  Pazīmes | Punktu skaits |
| --- | --- | --- |
| Apsārtuma nav | 0 |
| Vāji izteikts (gandrīz nemanāms) apsārtums | 1 |
| Izteikts apsārtums | 2 |
| Vidēji stiprs un ļoti stiprs apsārtums | 3 |
| Ļoti stiprs apsārtums (biešu sarkans) un kreveles, kas apsārtuma novērtēšanu padara neiespējamu | 4 |

22.

Priekšskrīninga testa apstākļi ir identiski pamata LLNA:BrdU-ELISA apstākļiem, izņemot to, ka nevērtē progresiju limfmezglos un ka devas grupā var izmantot mazāku skaitu dzīvnieku. Ieteicamais skaits ir viens vai divi dzīvnieki katrā devas grupā. Visām pelēm ik dienas pārbauda to, vai apstrādes vietā nav klīnisku pazīmju, kas liecinātu par sistēmisku toksicitāti vai lokālu kairinājumu. Pirms testa un tā beigās (6. diena) reģistrē dzīvnieku ķermeņa masu. Katrai peles apskata abas ausis, un iespējamo apsārtumu novērtē pēc 1. tabulas punktu skalas (20; šā pielikuma B.4. nodaļa). Auss biezumu mēra ar piemērotu mērierīci (piemēram, digitālo mikrometru vai “Peacock” tipa biezuma mērierīci) 1. dienā (pirms devas), 3. dienā (aptuveni 48 stundas pēc pirmās devas) un 6. dienā. Turklāt 6. dienā auss biezumu var mērīt ar auss caursišanas paņēmienu pēc tam, kad dzīvnieki ir humāni nonāvēti. Lokālu kairinājumu uzskata par pārmērīgu tad, ja jebkurā mērījumu dienā apsārtuma novērtējums pēc punktu skalas ir ≥ 3 un/vai auss biezums ≥ 25 % (21) (22). Lielākā deva, kas izmantojama LLNA:BrdU-ELISA pamata testā, ir otrā zemākā deva priekšskrīninga koncentrāciju rindā (skatīt 18. punktu), kas neizraisa sistēmisku toksicitāti un/vai pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu.

LLNA:BrdU-ELISA

LLNA:BrdU-ELISA

1.   tabula

1.

tabula

Apsārtuma (eritēmas) skala

Apsārtuma (eritēmas) skala

Pazīmes

Punktu skaits

Apsārtuma nav

0

Vāji izteikts (gandrīz nemanāms) apsārtums

1

Izteikts apsārtums

2

Vidēji stiprs un ļoti stiprs apsārtums

3

Ļoti stiprs apsārtums (biešu sarkans) un kreveles, kas apsārtuma novērtēšanu padara neiespējamu

4

| 23. | Papildus auss biezuma 25 % pieaugumam (21) (22) kairinātāju identificēšanai LLNA izmanto arī statistiski nozīmīgus auss biezuma pieauguma rādītājus apstrādātajām pelēm salīdzinājumā ar kontroles grupas pelēm (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28). Tomēr, lai gan statistiski nozīmīgs pieaugums var arī nesasniegt 25 % robežu, šādu pieaugumu neuzskata par pārmērīga kairinājuma izpausmi (25) (26) (27) (28) (29). |
| --- | --- |

23.

Papildus auss biezuma 25 % pieaugumam (21) (22) kairinātāju identificēšanai LLNA izmanto arī statistiski nozīmīgus auss biezuma pieauguma rādītājus apstrādātajām pelēm salīdzinājumā ar kontroles grupas pelēm (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28). Tomēr, lai gan statistiski nozīmīgs pieaugums var arī nesasniegt 25 % robežu, šādu pieaugumu neuzskata par pārmērīga kairinājuma izpausmi (25) (26) (27) (28) (29).

LLNA

| 24. | Turpmāk uzskaitītie klīniskie novērojumi, ja tie ir novērtējuma neatņemama daļa, var liecināt par sistēmisku toksicitāti (30), un tāpēc var parādīt, kāds būs LLNA:BrdU-ELISA pamata testā izmantojamais maksimālais devas līmenis: nervu sistēmas darbības traucējumi (piemēram, piloarekcija, ataksija, drebuļi un krampji); uzvedības traucējumi (piemēram, agresivitāte, ar personīgo higiēnu saistītās uzvedības maiņa, jūtams aktivitātes samazinājums vai pieaugums); neraksturīga elpošana (piemēram, elpas vilcienu biežuma un intensitātes maiņa, kā apgrūtināta vai spazmatiska elpošana, trokšņi plaušās) un pārmaiņas barības un ūdens uzņemšanā. Turklāt novērtējumā jāņem vērā letarģijas pazīmes un/vai reakcijas samazināšanās un visas klīniskās pazīmes, kas liecina par vairāk nekā mirklīgām sāpēm un ciešanām, vai ķermeņa masas samazinājums par vairāk nekā 5 % laikā no 1. dienas līdz 6. dienai, kā arī mirstības rādītāji. Mirstoši dzīvnieki vai dzīvnieki, kuri uzrāda stipru sāpju un ciešanu pazīmes, ir humāni jānonāvē (31). |
| --- | --- |

24.

Turpmāk uzskaitītie klīniskie novērojumi, ja tie ir novērtējuma neatņemama daļa, var liecināt par sistēmisku toksicitāti (30), un tāpēc var parādīt, kāds būs LLNA:BrdU-ELISA pamata testā izmantojamais maksimālais devas līmenis: nervu sistēmas darbības traucējumi (piemēram, piloarekcija, ataksija, drebuļi un krampji); uzvedības traucējumi (piemēram, agresivitāte, ar personīgo higiēnu saistītās uzvedības maiņa, jūtams aktivitātes samazinājums vai pieaugums); neraksturīga elpošana (piemēram, elpas vilcienu biežuma un intensitātes maiņa, kā apgrūtināta vai spazmatiska elpošana, trokšņi plaušās) un pārmaiņas barības un ūdens uzņemšanā. Turklāt novērtējumā jāņem vērā letarģijas pazīmes un/vai reakcijas samazināšanās un visas klīniskās pazīmes, kas liecina par vairāk nekā mirklīgām sāpēm un ciešanām, vai ķermeņa masas samazinājums par vairāk nekā 5 % laikā no 1. dienas līdz 6. dienai, kā arī mirstības rādītāji. Mirstoši dzīvnieki vai dzīvnieki, kuri uzrāda stipru sāpju un ciešanu pazīmes, ir humāni jānonāvē (31).

LLNA:BrdU-ELISA

Eksperimenta grafiks pamata pētījuma laikā

Eksperimenta grafiks pamata pētījuma laikā

| 25. | Eksperimenta grafiks ir šāds:
  —   1. diena: individuāli nosaka un reģistrē katra dzīvnieka masu, reģistrē klīniskos novērojumus. Katras auss aizmugures virsmu apstrādā ar 25 μl atšķaidījuma, kurš satur attiecīgo testējamo vielu, tikai nesēju vai PC (vienlaicīgu vai nesenu atkarībā no laboratorijas prakses un saistībā ar 11.–15. punktu).
  —   2. un 3. diena: atkārto 1. dienā veikto apstrādi.
  —   4. diena: apstrāde nenotiek.
  —   5. diena: intraperitoneāli injicē 0,5 mL (5 mg uz peli) BrdU (10 mg/mL) šķīduma.
  —   6. diena: reģistrē katra dzīvnieka masu un klīniskos novērojumus. Aptuveni 24 stundas (24 h) pēc BrdU injicēšanas dzīvniekus humāni nonāvē. No katras auss izgriež aurikulāros limfmezglus, kurus katrai pelei atsevišķi apstrādā fizioloģiskajā šķīdumā ar fosfātbuferi (PBS). Sīkus datus un diagrammas par limfmezglu identificēšanu un izgriešanu skatīt atsaucēs (17). Eksperimenta protokolā var iekļaut papildu parametrus, kas raksturo turpmāku ādas lokālo reakciju pamata pētījuma laikā, piemēram, auss apsārtuma novērtējumu pēc punktu skalas vai auss biezuma mērījumus (nosaka ar mērierīci vai ar auss caursišanas paņēmienu autopsijā). |
| --- | --- |

25.

Eksperimenta grafiks ir šāds:

—   1. diena: individuāli nosaka un reģistrē katra dzīvnieka masu, reģistrē klīniskos novērojumus. Katras auss aizmugures virsmu apstrādā ar 25 μl atšķaidījuma, kurš satur attiecīgo testējamo vielu, tikai nesēju vai PC (vienlaicīgu vai nesenu atkarībā no laboratorijas prakses un saistībā ar 11.–15. punktu).

—   2. un 3. diena: atkārto 1. dienā veikto apstrādi.

—   4. diena: apstrāde nenotiek.

—   5. diena: intraperitoneāli injicē 0,5 mL (5 mg uz peli) BrdU (10 mg/mL) šķīduma.

—   6. diena: reģistrē katra dzīvnieka masu un klīniskos novērojumus. Aptuveni 24 stundas (24 h) pēc BrdU injicēšanas dzīvniekus humāni nonāvē. No katras auss izgriež aurikulāros limfmezglus, kurus katrai pelei atsevišķi apstrādā fizioloģiskajā šķīdumā ar fosfātbuferi (PBS). Sīkus datus un diagrammas par limfmezglu identificēšanu un izgriešanu skatīt atsaucēs (17). Eksperimenta protokolā var iekļaut papildu parametrus, kas raksturo turpmāku ādas lokālo reakciju pamata pētījuma laikā, piemēram, auss apsārtuma novērtējumu pēc punktu skalas vai auss biezuma mērījumus (nosaka ar mērierīci vai ar auss caursišanas paņēmienu autopsijā).

Šūnu suspensiju sagatavošana

Šūnu suspensiju sagatavošana

| 26. | No katrai pelei abās pusēs izgrieztām limfmezglu šūnām (LNC) sagatavo atsevišķu šūnu suspensiju, šūnas saudzīgi mehāniski sadalot caur nerūsējošā tērauda sietu ar 200 μm acu izmēru vai izmantojot citu paņēmienu, kas ir derīgs atsevišķu šūnu suspensiju ieguvei (piemēram, vienreizlietojamā plastmasas piestā saberžot limfmezglus un pēc tam tos filtrējot caur #70 neilona filtru). Šajā testā LNC suspensijas pareizai sagatavošanai ir izšķiroša nozīme, un tāpēc tās gatavotājam jābūt pieredzējušam un prasmīgam. Tā kā NC dzīvnieku limfmezgli ir mazi, tie jāapstrādā ar sevišķu rūpību, lai novērstu SI vērtību izkropļojumus. Visos gadījumos LNC suspensijas mērķtilpums jākoriģē līdz noteiktam optimizētam tilpumam (aptuveni 15 mL). Optimizētā tilpuma vērtību izraugās tā, lai NC grupas vidējās absorbcijas vērtība būtu 0,1–0,2 robežās. |
| --- | --- |

26.

No katrai pelei abās pusēs izgrieztām limfmezglu šūnām (LNC) sagatavo atsevišķu šūnu suspensiju, šūnas saudzīgi mehāniski sadalot caur nerūsējošā tērauda sietu ar 200 μm acu izmēru vai izmantojot citu paņēmienu, kas ir derīgs atsevišķu šūnu suspensiju ieguvei (piemēram, vienreizlietojamā plastmasas piestā saberžot limfmezglus un pēc tam tos filtrējot caur #70 neilona filtru). Šajā testā LNC suspensijas pareizai sagatavošanai ir izšķiroša nozīme, un tāpēc tās gatavotājam jābūt pieredzējušam un prasmīgam. Tā kā NC dzīvnieku limfmezgli ir mazi, tie jāapstrādā ar sevišķu rūpību, lai novērstu SI vērtību izkropļojumus. Visos gadījumos LNC suspensijas mērķtilpums jākoriģē līdz noteiktam optimizētam tilpumam (aptuveni 15 mL). Optimizētā tilpuma vērtību izraugās tā, lai NC grupas vidējās absorbcijas vērtība būtu 0,1–0,2 robežās.

LNC

LNC

LNC

Šūnu savairošanās noteikšana (BrdU satura mērīšana limfocītu DNS)

Šūnu savairošanās noteikšana (BrdU satura mērīšana limfocītu DNS)

| 27. | BrdU mēra ar ELISA metodi, izmantojot komerciāli pieejamu testēšanas komplektu (piemēram, Roche Applied Science, Manheima, Vācija, kataloga nr. 11 647 229 001). Īsumā, 100 μL LNC suspensijas trīskāršā atkārtojumā pārnes plakandibena mikroplates bedrītēs. Pēc LNC fiksācijas un denaturācijas katrā bedrītē pievieno anti-BrdU antivielu un ļauj, lai notiek reakcija. Pēc tam mazgājot atdala anti-BrdU antivielu, pievieno substrāta šķīdumu un ļauj, lai rodas hromogēns. Pēc tam mēra absorbciju pie 370 nm, par references viļņa garumu izmantojot 492 nm. Visos gadījumos testēšanas apstākļi jāoptimizē (skatīt 26. punktu). |
| --- | --- |

27.

BrdU mēra ar ELISA metodi, izmantojot komerciāli pieejamu testēšanas komplektu (piemēram, Roche Applied Science, Manheima, Vācija, kataloga nr. 11 647 229 001). Īsumā, 100 μL LNC suspensijas trīskāršā atkārtojumā pārnes plakandibena mikroplates bedrītēs. Pēc LNC fiksācijas un denaturācijas katrā bedrītē pievieno anti-BrdU antivielu un ļauj, lai notiek reakcija. Pēc tam mazgājot atdala anti-BrdU antivielu, pievieno substrāta šķīdumu un ļauj, lai rodas hromogēns. Pēc tam mēra absorbciju pie 370 nm, par references viļņa garumu izmantojot 492 nm. Visos gadījumos testēšanas apstākļi jāoptimizē (skatīt 26. punktu).

ELISA

Roche Applied Science

LNC

NOVĒROJUMI

Klīniskie novērojumi

Klīniskie novērojumi

| 28. | Ikviena pele vismaz reizi dienā ir rūpīgi jānovēro attiecībā uz vietēju kairinājumu apstrādes vietā vai sistēmiskas toksicitātes klīniskajām pazīmēm. Visus novērojumus sistemātiski reģistrē, par katru peli izdarot individuālu ierakstu. Novērošanas plānā jāiekļauj kritēriji, kas ļauj tūlīt identificēt peles, kurām ir sistēmiskas toksicitātes, pārmērīga lokāla ādas kairinājuma vai ādas korozijas pazīmes, lai tām veiktu eitanāziju (31). |
| --- | --- |

28.

Ikviena pele vismaz reizi dienā ir rūpīgi jānovēro attiecībā uz vietēju kairinājumu apstrādes vietā vai sistēmiskas toksicitātes klīniskajām pazīmēm. Visus novērojumus sistemātiski reģistrē, par katru peli izdarot individuālu ierakstu. Novērošanas plānā jāiekļauj kritēriji, kas ļauj tūlīt identificēt peles, kurām ir sistēmiskas toksicitātes, pārmērīga lokāla ādas kairinājuma vai ādas korozijas pazīmes, lai tām veiktu eitanāziju (31).

Ķermeņa masa

Ķermeņa masa

| 29. | Kā norādīts 25. punktā, individuālu dzīvnieku ķermeņa masa ir jānosaka testa sākumā un pirms plānotās humānās nonāvēšanas. |
| --- | --- |

29.

Kā norādīts 25. punktā, individuālu dzīvnieku ķermeņa masa ir jānosaka testa sākumā un pirms plānotās humānās nonāvēšanas.

REZULTĀTU APRĒĶINĀŠANA

| 30. | Katras apstrādes grupas rezultātu izsaka ar vidējo SI. SI iegūst, vidējo BrdU iezīmēšanas indeksa vērtību katrai pelei katrā testējamās vielas grupā un PC grupā dalot ar vidējo BrdU iezīmēšanas indeksa vērtību šķīdinātāja/VC grupā. Tā VC grupās vidējais SI ir 1.
  BrdU iezīmēšanas indeksu definē šādi:
  BrdU iezīmēšanas indekss = (ABSem – ABS tukšaisem) – (ABSref – ABS tukšaisref)
  kur: “em” ir emisijas viļņa garums un “ref” ir references viļņa garums. |
| --- | --- |

30.

Katras apstrādes grupas rezultātu izsaka ar vidējo SI. SI iegūst, vidējo BrdU iezīmēšanas indeksa vērtību katrai pelei katrā testējamās vielas grupā un PC grupā dalot ar vidējo BrdU iezīmēšanas indeksa vērtību šķīdinātāja/VC grupā. Tā VC grupās vidējais SI ir 1.

BrdU iezīmēšanas indeksu definē šādi:

BrdU iezīmēšanas indekss = (ABSem – ABS tukšaisem) – (ABSref – ABS tukšaisref)

em

em

ref

ref

kur: “em” ir emisijas viļņa garums un “ref” ir references viļņa garums.

| 31. | Lēmumu pieņemšanas procesā rezultātu uzskata par pozitīvu, ja SI ≥ 1,6 (10). Tomēr, nosakot, vai neitrālam tuvu rezultātu (t. i., ar SI vērtību robežās no 1,6 līdz 1,9) varētu uzskatīt par pozitīvu, var ņemt vērā arī devas un atbildes reakcijas stiprumu un šķīdinātāja/nesēja un PC reakcijas statistisko nozīmīgumu un konsekvenci (3) (6) (32). |
| --- | --- |

31.

Lēmumu pieņemšanas procesā rezultātu uzskata par pozitīvu, ja SI ≥ 1,6 (10). Tomēr, nosakot, vai neitrālam tuvu rezultātu (t. i., ar SI vērtību robežās no 1,6 līdz 1,9) varētu uzskatīt par pozitīvu, var ņemt vērā arī devas un atbildes reakcijas stiprumu un šķīdinātāja/nesēja un PC reakcijas statistisko nozīmīgumu un konsekvenci (3) (6) (32).

| 32. | Attiecībā uz neitrālam tuvu pozitīvu rezultātu ar SI vērtību robežās no 1,6 līdz 1,9, pirms apstiprināt, ka šis rezultāts ir pozitīvs, lietotāji var izvērtēt tādu papildu informāciju kā devas un atbildes reakcijas mijiedarbība, sistēmiskas toksicitātes vai pārmērīga kairinājuma pazīmes un, attiecīgā gadījumā, statistiskais nozīmīgums apvienojumā ar SI vērtībām (10). Jāņem vērā arī testējamās vielas dažādās īpašības, tostarp tas, vai tā strukturāli līdzinās jau zināmiem ādas sensibilizatoriem, vai tā izraisa pārmērīgu ādas kairinājumu pelēm un kāda veida atbildes reakcija uz devu ir novērota. Šie un citi apsvērumi turpmāk iztirzāti sīkāk (4). |
| --- | --- |

32.

Attiecībā uz neitrālam tuvu pozitīvu rezultātu ar SI vērtību robežās no 1,6 līdz 1,9, pirms apstiprināt, ka šis rezultāts ir pozitīvs, lietotāji var izvērtēt tādu papildu informāciju kā devas un atbildes reakcijas mijiedarbība, sistēmiskas toksicitātes vai pārmērīga kairinājuma pazīmes un, attiecīgā gadījumā, statistiskais nozīmīgums apvienojumā ar SI vērtībām (10). Jāņem vērā arī testējamās vielas dažādās īpašības, tostarp tas, vai tā strukturāli līdzinās jau zināmiem ādas sensibilizatoriem, vai tā izraisa pārmērīgu ādas kairinājumu pelēm un kāda veida atbildes reakcija uz devu ir novērota. Šie un citi apsvērumi turpmāk iztirzāti sīkāk (4).

| 33. | Datu vākšana par individuālām pelēm pavērs iespējas statistiskai analīzei par devas un atbildes reakcijas mijiedarbības esību un tās pakāpi šajos datos. Jebkurš statistisks novērtējums var ietvert devas un atbildes reakcijas mijiedarbības novērtējumu, kā arī pienācīgi koriģētus testējamo grupu salīdzinājumus (piemēram, devu pāri grupā un šīs grupas salīdzinājums ar vienlaicīgu šķīdinātāja/kontroles grupu). Statistiskā analīze var ietvert, piemēram, lineāro regresiju jeb Viljamsa [William’s] testu, ar ko analizē devas un atbildes reakcijas mijiedarbību tendences, un Daneta [Dunnett] testu, lai salīdzinātu devu pārus. Izvēloties attiecīgu statistiskās analīzes metodi, pētniekam jāapzinās iespējamās mainīgo lielumu nevienādības un citas ar to saistītās problēmas, kuru dēļ var būt nepieciešama datu pārveidošana vai neparametriskā statistiskā analīze. Visādā ziņā iespējams, ka pētniekam SI būs jāaprēķina un statistiskā analīze jāveic gan ar, gan bez dažiem punktveida datiem (respektīvi, neņemot vērā galējības jeb rupjas kļūdas). |
| --- | --- |

33.

Datu vākšana par individuālām pelēm pavērs iespējas statistiskai analīzei par devas un atbildes reakcijas mijiedarbības esību un tās pakāpi šajos datos. Jebkurš statistisks novērtējums var ietvert devas un atbildes reakcijas mijiedarbības novērtējumu, kā arī pienācīgi koriģētus testējamo grupu salīdzinājumus (piemēram, devu pāri grupā un šīs grupas salīdzinājums ar vienlaicīgu šķīdinātāja/kontroles grupu). Statistiskā analīze var ietvert, piemēram, lineāro regresiju jeb Viljamsa [William’s] testu, ar ko analizē devas un atbildes reakcijas mijiedarbību tendences, un Daneta [Dunnett] testu, lai salīdzinātu devu pārus. Izvēloties attiecīgu statistiskās analīzes metodi, pētniekam jāapzinās iespējamās mainīgo lielumu nevienādības un citas ar to saistītās problēmas, kuru dēļ var būt nepieciešama datu pārveidošana vai neparametriskā statistiskā analīze. Visādā ziņā iespējams, ka pētniekam SI būs jāaprēķina un statistiskā analīze jāveic gan ar, gan bez dažiem punktveida datiem (respektīvi, neņemot vērā galējības jeb rupjas kļūdas).

William’s

Dunnett

DATI UN TESTĒŠANAS PĀRSKATS

Dati

Dati

| 34. | Dati jāapkopo tabulā, uzrādot indivīdu BrdU iezīmēšanas indeksa vērtības, grupas vidējo BrdU iezīmēšanas indeksa vērtību uz dzīvnieku, attiecīgo kļūdas apzīmējumu (piem., SD, SEM) un vidējo SI katrai devas grupai salīdzinājumā ar vienlaicīgo šķīdinātāja/kontroles grupu. |
| --- | --- |

34.

Dati jāapkopo tabulā, uzrādot indivīdu BrdU iezīmēšanas indeksa vērtības, grupas vidējo BrdU iezīmēšanas indeksa vērtību uz dzīvnieku, attiecīgo kļūdas apzīmējumu (piem., SD, SEM) un vidējo SI katrai devas grupai salīdzinājumā ar vienlaicīgo šķīdinātāja/kontroles grupu.

Testēšanas pārskats

Testēšanas pārskats

| 35. | Testēšanas pārskatā jābūt iekļautai šādai informācijai: | Testējamā un kontroles viela:






  — | identifikācijas dati (piemēram, CAS un EK numurs (ja ir); avots; tīrība; zināmie piemaisījumi; partijas numurs), |
| --- | --- | --- | --- |

35.

Testēšanas pārskatā jābūt iekļautai šādai informācijai:

Testējamā un kontroles viela:

—

identifikācijas dati (piemēram, CAS un EK numurs (ja ir); avots; tīrība; zināmie piemaisījumi; partijas numurs),

CAS

| — | fizikālās un fizikāli ķīmiskās īpašības (piemēram, gaistamība, stabilitāte, šķīdība), |
| --- | --- |

—

fizikālās un fizikāli ķīmiskās īpašības (piemēram, gaistamība, stabilitāte, šķīdība),

| — | maisījuma gadījumā: sastāvs un sastāvdaļu relatīvais procentuālais daudzums. |
| --- | --- |

—

maisījuma gadījumā: sastāvs un sastāvdaļu relatīvais procentuālais daudzums.

| | Šķīdinātājs/nesējs:






  — | identifikācijas dati (tīrība; koncentrācija (attiecīgā gadījumā); izmantotais tilpums), |
| --- | --- | --- |

Šķīdinātājs/nesējs:

—

identifikācijas dati (tīrība; koncentrācija (attiecīgā gadījumā); izmantotais tilpums),

| — | nesēja izvēles pamatojums. |
| --- | --- |

—

nesēja izvēles pamatojums.

| | Izmēģinājumu dzīvnieki:






  — | CBA peļu avots, |
| --- | --- | --- |

Izmēģinājumu dzīvnieki:

—

CBA peļu avots,

| — | dzīvnieku mikrobioloģiskais statuss, ja tas zināms, |
| --- | --- |

—

dzīvnieku mikrobioloģiskais statuss, ja tas zināms,

| — | dzīvnieku skaits un vecums, |
| --- | --- |

—

dzīvnieku skaits un vecums,

| — | dzīvnieku avots, turēšanas un barošanas apstākļi utt. |
| --- | --- |

—

dzīvnieku avots, turēšanas un barošanas apstākļi utt.

| | Testēšanas apstākļi:






  — | ELISA komplekta avots, partijas numurs un ražotāja kvalitātes nodrošinājuma/kvalitātes kontroles dati (jutība pret antivielām, specifiskums un detekcijas limits), |
| --- | --- | --- |

Testēšanas apstākļi:

—

ELISA komplekta avots, partijas numurs un ražotāja kvalitātes nodrošinājuma/kvalitātes kontroles dati (jutība pret antivielām, specifiskums un detekcijas limits),

ELISA

| — | sīkas ziņas par testējamās vielas sagatavošanu un pielietošanu, |
| --- | --- |

—

sīkas ziņas par testējamās vielas sagatavošanu un pielietošanu,

| — | devu izvēles pamatojums, attiecīgā gadījumā iekļaujot priekšskrīninga testa rezultātus, |
| --- | --- |

—

devu izvēles pamatojums, attiecīgā gadījumā iekļaujot priekšskrīninga testa rezultātus,

| — | izmantotās nesēja un testējamās vielas koncentrācijas un pielietotās testējamās vielas kopējais daudzums, |
| --- | --- |

—

izmantotās nesēja un testējamās vielas koncentrācijas un pielietotās testējamās vielas kopējais daudzums,

| — | sīkas ziņas par barības un ūdens kvalitāti (iekļaujot barības veidu/izcelsmi, ūdens izcelsmi), |
| --- | --- |

—

sīkas ziņas par barības un ūdens kvalitāti (iekļaujot barības veidu/izcelsmi, ūdens izcelsmi),

| — | sīks apstrādes un paraugu ņemšanas shēmas apraksts, |
| --- | --- |

—

sīks apstrādes un paraugu ņemšanas shēmas apraksts,

| — | toksicitātes novērtēšanas metodes, |
| --- | --- |

—

toksicitātes novērtēšanas metodes,

| — | kritēriji, pēc kuriem testa rezultātu klasificē kā pozitīvu vai negatīvu, |
| --- | --- |

—

kritēriji, pēc kuriem testa rezultātu klasificē kā pozitīvu vai negatīvu,

| — | sīkas ziņas par novirzēm no protokola un paskaidrojums par to, kādā veidā šī novirze ietekmē pētījuma plānu un rezultātus. |
| --- | --- |

—

sīkas ziņas par novirzēm no protokola un paskaidrojums par to, kādā veidā šī novirze ietekmē pētījuma plānu un rezultātus.

| | Ticamības pārbaude:






  — | jaunākās ticamības pārbaudes rezultātu kopsavilkums, iekļaujot informāciju par testējamo vielu, tās koncentrāciju un nesēju, |
| --- | --- | --- |

Ticamības pārbaude:

—

jaunākās ticamības pārbaudes rezultātu kopsavilkums, iekļaujot informāciju par testējamo vielu, tās koncentrāciju un nesēju,

| — | vienlaicīgi un/vai vēsturiski PC un vienlaicīgi negatīvās (šķīdinātājs/nesējs) kontroles dati no testēšanas laboratorijas, |
| --- | --- |

—

vienlaicīgi un/vai vēsturiski PC un vienlaicīgi negatīvās (šķīdinātājs/nesējs) kontroles dati no testēšanas laboratorijas,

| — | ja vienlaicīga PC nav paredzēta: datums un laboratorijas pārskats par nesenāko kārtējo PC un pārskats par agrāko PC datiem konkrētajā laboratorijā, kuri pamato vienlaicīgas PC neveikšanu. |
| --- | --- |

—

ja vienlaicīga PC nav paredzēta: datums un laboratorijas pārskats par nesenāko kārtējo PC un pārskats par agrāko PC datiem konkrētajā laboratorijā, kuri pamato vienlaicīgas PC neveikšanu.

| | Rezultāti:






  — | individuālu peļu masa dozēšanas sākumā un veicot plānoto humāno nonāvēšanu; vidējās vērtības un attiecīgais kļūdas apzīmējums (piem., SD, SEM) katrai apstrādes grupai, |
| --- | --- | --- |

Rezultāti:

—

individuālu peļu masa dozēšanas sākumā un veicot plānoto humāno nonāvēšanu; vidējās vērtības un attiecīgais kļūdas apzīmējums (piem., SD, SEM) katrai apstrādes grupai,

| — | toksicitātes parādīšanās gaita un pazīmes, iekļaujot ādas kairinājumu ievadīšanas vietā, ja tāds ir, katram dzīvniekam, |
| --- | --- |

—

toksicitātes parādīšanās gaita un pazīmes, iekļaujot ādas kairinājumu ievadīšanas vietā, ja tāds ir, katram dzīvniekam,

| — | tabula ar individuālu peļu BrdU iezīmēšanas indeksa un SI vērtībām katrā apstrādes grupā, |
| --- | --- |

—

tabula ar individuālu peļu BrdU iezīmēšanas indeksa un SI vērtībām katrā apstrādes grupā,

| — | vidējās vērtības un attiecīgais kļūdas apzīmējums (piem., SD, SEM) par BrdU iezīmēšanas indeksu katrai pelei katrā apstrādes grupā un galējību jeb rupju kļūdu analīze katrā apstrādes grupā, |
| --- | --- |

—

vidējās vērtības un attiecīgais kļūdas apzīmējums (piem., SD, SEM) par BrdU iezīmēšanas indeksu katrai pelei katrā apstrādes grupā un galējību jeb rupju kļūdu analīze katrā apstrādes grupā,

| — | aprēķinātais SI un attiecīgs mainības mērs, kas ņem vērā to, ka ne testējamās vielas grupā, ne kontroles grupā dzīvnieki nav identiski, |
| --- | --- |

—

aprēķinātais SI un attiecīgs mainības mērs, kas ņem vērā to, ka ne testējamās vielas grupā, ne kontroles grupā dzīvnieki nav identiski,

| — | devas un atbildes reakcijas sakarības, |
| --- | --- |

—

devas un atbildes reakcijas sakarības,

| — | attiecīgā gadījumā, statistiskā analīze. |
| --- | --- |

—

attiecīgā gadījumā, statistiskā analīze.

| | Rezultātu izvērtējums:






  — | īss komentārs par rezultātiem, atbildes reakcijas uz devu analīzi un, attiecīgā gadījumā, statistisko analīzi ar secinājumu, vai testējamā viela jāuzskata par ādas sensibilizatoru. |
| --- | --- | --- |

Rezultātu izvērtējums:

—

īss komentārs par rezultātiem, atbildes reakcijas uz devu analīzi un, attiecīgā gadījumā, statistisko analīzi ar secinājumu, vai testējamā viela jāuzskata par ādas sensibilizatoru.

IZMANTOTĀ LITERATŪRA

| 1) | OECD (2010), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guideline No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

1)

OECD (2010), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guideline No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

| 2) | Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: status of validation. Food Chem. Toxicol., 34, 999-1002. |
| --- | --- |

2)

Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: status of validation. Food Chem. Toxicol., 34, 999-1002.

| 3) | Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 34, 985-997. |
| --- | --- |

3)

Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 34, 985-997.

| 4) | Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 36, 327-33. |
| --- | --- |

4)

Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 36, 327-33.

| 5) | Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicol., 146, 49-59. |
| --- | --- |

5)

Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicol., 146, 49-59.

| 6) | ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf] |
| --- | --- |

6)

ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]

| 7) | Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 258-273. |
| --- | --- |

7)

Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 258-273.

| 8) | Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 274-286. |
| --- | --- |

8)

Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 274-286.

| 9) | Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 249-257. |
| --- | --- |

9)

Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 249-257.

| 10) | ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioactive local lymph node assay: BrdU-ELISA Test Method Protocol (LLNA: BrdU-ELISA). NIH Publication No. 10-7552A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-ELISA/TMER.htm] |
| --- | --- |

10)

ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioactive local lymph node assay: BrdU-ELISA Test Method Protocol (LLNA: BrdU-ELISA). NIH Publication No. 10-7552A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-ELISA/TMER.htm]

| 11) | ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: Updated validation status of new versions and applications of the murine local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf] |
| --- | --- |

11)

ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: Updated validation status of new versions and applications of the murine local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf]

| 12) | Takeyoshi, M., Iida, K., Shiraishi, K. and Hoshuyama, S. (2005), Novel approach for classifying chemicals according to skin sensitising potency by non-radioisotopic modification of the local lymph node assay. J. Appl. Toxicol., 25, 129-134. |
| --- | --- |

12)

Takeyoshi, M., Iida, K., Shiraishi, K. and Hoshuyama, S. (2005), Novel approach for classifying chemicals according to skin sensitising potency by non-radioisotopic modification of the local lymph node assay. J. Appl. Toxicol., 25, 129-134.

| 13) | OECD (1992), Skin Sensitisation, Test Guideline No. 406, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

13)

OECD (1992), Skin Sensitisation, Test Guideline No. 406, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

| 14) | Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol., 46, 1896-1904. |
| --- | --- |

14)

Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol., 46, 1896-1904.

| 15) | Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 90-96. |
| --- | --- |

15)

Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 90-96.

| 16) | ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National Academies Press. |
| --- | --- |

16)

ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National Academies Press.

| 17) | ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local Lymph Node Assay. NIH Publication Number 09-7357. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf] |
| --- | --- |

17)

ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local Lymph Node Assay. NIH Publication Number 09-7357. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf]

| 18) | McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH. Toxicol., 238, 71-89. |
| --- | --- |

18)

McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH. Toxicol., 238, 71-89.

| 19) | Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The local lymph node assay: developments and applications. Toxicol., 93, 13-31. |
| --- | --- |

19)

Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The local lymph node assay: developments and applications. Toxicol., 93, 13-31.

| 20) | OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No. 404, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

20)

OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No. 404, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

| 21) | Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances. Toxicologist, 96, 235. |
| --- | --- |

21)

Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances. Toxicologist, 96, 235.

| 22) | ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf]. |
| --- | --- |

22)

ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf].

| 23) | Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice. Drug Chem. Toxicol., 21, 195-206. |
| --- | --- |

23)

Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice. Drug Chem. Toxicol., 21, 195-206.

| 24) | Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, 83-94. |
| --- | --- |

24)

Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, 83-94.

| 25) | Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals. Toxicol. Meth., 8, 245-256. |
| --- | --- |

25)

Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals. Toxicol. Meth., 8, 245-256.

| 26) | Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods. Drug. Chem. Toxicol., 22, 491-506. |
| --- | --- |

26)

Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods. Drug. Chem. Toxicol., 22, 491-506.

| 27) | Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter- laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, 60-68. |
| --- | --- |

27)

Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter- laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, 60-68.

| 28) | Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721-728. |
| --- | --- |

28)

Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721-728.

| 29) | Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec D. (2007), Lack of evidence for contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect., 115, 1023-1028. |
| --- | --- |

29)

Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec D. (2007), Lack of evidence for contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect., 115, 1023-1028.

| 30) | ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm]. |
| --- | --- |

30)

ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm].

In Vitro

| 31) | OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

31)

OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

| 32) | Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ.l Health, 53, 563-79. |
| --- | --- |

32)

Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ.l Health, 53, 563-79.

| 33) | OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] |
| --- | --- |

33)

OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

1. papildinājums

DEFINĪCIJAS

Pareizība: pēc testēšanas metodes iegūto mērījumu rezultātu sakritības pakāpe ar pieņemtajām references vērtībām. Tas ir testēšanas metodes veiktspējas raksturlielums un viens no tās piemērotības aspektiem. Šo terminu bieži izmanto “atbilstības” vietā, ar to apzīmējot pēc testēšanas metodes iegūto pareizo rezultātu daļu (33).

Salīdzināšanas viela: sensibilizējoša vai nesensibilizējoša viela, ko izmanto par standartu salīdzināšanai ar testējamo vielu. Salīdzināšanas vielai ir jāpiemīt šādām īpašībām: (i) pastāvīgs un uzticams ieguves avots, (ii) struktūras un funkciju līdzība ar testējamo vielu klases vielām, (iii) zināmas fizikālās/ķīmiskās īpašības; (iv) papildu dati par zināmajiem iedarbības veidiem; (v) vielas zināmais iedarbības stiprums atbilst vēlamās reakcijas intensitātes diapazonam.

Šķietams negatīvs: testējamā viela, kurai ar testēšanas metodi kļūdaini noteikta negatīva vai neaktīva reakcija, lai gan faktiski tā ir pozitīva vai aktīva (33).

Šķietams pozitīvs: testējamā viela, kurai ar testēšanas metodi kļūdaini noteikta pozitīva vai aktīva reakcija, lai gan faktiski tā ir negatīva vai neaktīva (33).

Bīstamība: potenciālā spēja kaitēt veselībai vai videi. Kaitīgā iedarbība kļūst nosakāma tikai tad, ja iedarbības intensitāte ir pietiekami liela.

Starplaboratoriju reproducējamība: lielums, kas raksturo, kādā mērā vairākas kvalificētas laboratorijas spēj iegūt kvalitatīvi un kvantitatīvi līdzīgus rezultātus, ja tās izmanto vienu un to pašu protokolu un vienas un tās pašas testējamās vielas. Starplaboratoriju reproducējamību (saukta arī par interlaboratoriju reproducējamību) nosaka prevalidēšanas un validēšanas procesā, un šis lielums rāda, cik lielā mērā testēšanu vienlīdz sekmīgi iespējams veikt dažādās laboratorijās (33).

Iekšlaboratorijas reproducējamība: lielums, kas raksturo, kādā mērā vienā laboratorijā strādājoši kvalificēti darbinieki spēj sekmīgi atkārtot iepriekš iegūtus rezultātus, ja to pašu protokolu izmanto citā laikā. Saukts arī par intralaboratoriju reproducējamību (33).

Galējība jeb rupja kļūda: novērojums, kuru raksturo izteikta novirze no pārējām vērtībām populācijas paraugā, kurš atlasīts pēc nejaušības principa.

Kvalitātes nodrošināšana: pārvaldības process, kurā laboratorijas testēšanas standartu, prasību un pierakstu uzturēšanas procedūru ievērošanu un datu pārneses pareizību novērtē no testēšanas veicējiem neatkarīgas personas.

Ticamība: parametrs, ar kuru mēra pakāpi, kādā tajā pašā vai citā laboratorijā ilgākā laikā, izmantojot to pašu protokolu, var iegūt reproducējamus rezultātus. To novērtē, aprēķinot iekšlaboratorijas un starplaboratoriju reproducējamību (33).

Ādas sensibilizācija: imunoloģisks process, kurš norisinās, ja uz uzņemtspējīgu organismu ārēji iedarbojas stimulējošs ķīmisks alergēns, kas izraisa ādas imūnreakciju, kuras rezultāts var būt kontaktsensibilizācija.

Stimulācijas indekss (SI): vērtība, ko aprēķina, lai novērtētu testējamai vielai piemītošo ādas sensibilizācijas potenciālu; to izsaka kā attiecību starp progresiju grupās, kas saņēmušas pētāmo vielu, un progresiju kontroles grupā, kas saņēmusi tikai nesēju.

Testējamā viela (arī testējamā ķīmiskā viela): viela vai vielu maisījums, kuru testē ar šo TM.

---

(1)  Tiek uzskatīta par cilvēka ādu nesensibilizējošu vielu, jo: nav zināmi klīniski ādas strēmelīšu testa rezultāti; viela nav ādas strēmelīšu testa komplektā iekļauts alergēns; nav zināmi cilvēka ādas sensibilizācijas gadījumi.

1

(2)  GP dati nav pieejami.

2

(3)  Ja dati par testējamo vielu stabilitāti liecina, ka tās uzglabāt nevar, katru dienu sagatavo svaigas testējamās ķīmiskās vielas.

3

(4)  Dažādi nesēji var dažādi ietekmēt LLNA veiktspēju, tāpēc ar katru references vielu jālieto tai ieteicamais nesējs (24)(32).

4

LLNA

(5)  Ja pieejama vairāk nekā viena EC3 vērtība, norādīta vidējā vērtība. Vielām ar negatīvu reakciju (t. i., stimulācijas indekss < 3) norādīta augstākā testētā koncentrācija.

5

(6)  LLNA pētījumu skaits, no kuriem iegūti dati.

6

LLNA

(7)  Komerciāli pieejams ar nosaukumu katons CG (CAS Nr. 55965-84-9); CMI un MI maisījums attiecībā 3:1. Katra komponenta relatīvā koncentrācija ir no 1,1 % līdz 1,25 % (CMI) un no 0,3 % līdz 0,45 % (MI). Neaktīvie komponenti ir magnija sāļi (21,5 % līdz 24 %) un vara nitrāts (0,15 % līdz 0,17 %), atlikusī preparāta daļa ir 74 % līdz 77 % ūdens. Katons CG ir brīvi pieejams no tādiem komerciāliem avotiem kā Sigma-Aldrich un Rohm and Haas (tagad Dow Chemical Corporation).

7

CAS

Sigma-Aldrich

Rohm and Haas

Dow Chemical Corporation

(8)  Šīs references vielas ir daļa no validācijas pētījumā izmantotā references vielu kopuma.

8

(9)  In vivo punkti saskaņā ar B.4 un ESAO 404. testēšanas vadlīnijām (4).

9

In vivo

(10)  Pēc šīs testēšanas metodes atsevišķi neklasificē vielas, ko var klasificēt ANO GHS 3. kategorijā (vāji kairinātāji).

10

(11)  ANO GHS fakultatīvo 3. kategoriju ES CLP regulā nepiemēro.

11

CLP

(12)  OV L 225, 21.8.2001., 1. lpp.

12

(13)  Ķīmisko vielu izvēles pamatā ir šādi kritēriji: (i) vielas ir nopērkamas, (ii) tās ir visam Dreiza [Draize] ādas kairinājuma reakcijas intervālam reprezentatīvas (no nekairinošām līdz stipri kairinošām), (iii) tās ir ar precīzi noteiktu ķīmisko struktūru, (iv) vielas ir reprezentatīvas validācijas procesā izmantotajām ķīmiskajām funkcijām, (v) tās nav ekstrēmi toksiskas (piemēram, kancerogēnas vai reproduktīvajai sistēmai toksiskas), un to lietošana nav saistīta ar pārlieku augstām atkritumu apsaimniekošanas izmaksām.

13

Draize

(14)  Ādu kairinoša iedarbība uz trušiem, bet ir ticami pierādījumi, ka iedarbība uz cilvēku nav kairinoša (31) (32) (33).

14

(15)  Saskaņā ar ANO GHS, bet ne ar ES CLP.

15

CLP

(16)  References vielas ir lietošanai ieteicamās ķīmiskās vielas. References vielu sarakstu var papildināt un tajās iekļautās ķīmiskās vielas aizstāt ar citām, ja šo ķīmisko vielu aktivitāte ir zināma un ja mikrokodolus tās inducē ar vienādiem darbības mehānismiem, un ja ir pierādīts, ka tās ir piemērotas ķīmiskajām vielām, kuras tiks testētas, izmantojot MNvit procedūru. Atkarībā no testēšanas mērķa pamatojums var būt arī validācijas pētījums, kurš aptver daudzas un dažādas vai arī tikai dažas vielas, kas izvēlētas, ņemot vērā testējamās vielas ķīmisko klasi vai bojājumu rašanās mehānismu, kuru pēta.

16

MNvit

---