Nach demagogischen Predigten des Dionysius Melander wurden bei einem regelrechten Bildersturm Altartafeln und Reliquien der Kirche zerstört. Am 23. April 1533 wurden alle katholischen Gottesdienste in der Stadt verboten, auch im Chor des Doms, bisher letzte Zufluchtsstätte des alten Glaubens. Zum Schutz gegen kaiserliche Strafmaßnahmen schlossen sich die lutherischen Länder 1531 zum Schmalkaldischen Bund zusammen, dem Frankfurt 1536 beitrat. Zehn Jahre später kam es zum Krieg zwischen den verfeindeten Parteien. Die Stadt nutzte die günstige Gelegenheit und beschlagnahmte große Teile des Stiftsvermögens. Nach der Niederlage in der Schlacht bei Mühlberg1547 gerieten die protestantischen Reichsstände in die Defensive. 1548 nahm die Stadt das Augsburger Interim gegen den Widerstand der lutherischen Geistlichkeit und großer Teile des Bürgertums an und gab die Bartholomäuskirche sowie vier andere Stifts- und Ordenskirchen an die katholische Kirche zurück. Am 14. Oktober 1548 wurde der Dom vom Mainzer Erzbischof Sebastian von Heusenstamm vorsorglich noch einmal geweiht.