בעקבות האינתיפאדה וגל פיגועי ההתאבדות, החלה ישראל באמצע 2002 בהקמת גדר ההפרדה. האגודה התריעה כי תוואי הגדר גורם לפגיעה קשה ורחבה בזכויות האדם של התושבים הפלסטינים, ומנתקת רבים מהם מאדמתם, ממקומות עבודתם ומשירותים חיוניים. בעקבות עתירות ופעילות האגודה שונה תוואי הגדר באופן משמעותי בגזרות שונות. בשנת 2002, לאחר אירועי הפיגוע במלון פארק בנתניה ומבצע חומת מגן פרץ עימות פנימי באגודה סביב מה שנתפס בעיני יו"ר ההנהלה, נעמה כרמי, כהצדקה של חלק מהעובדים - רובם ערבים - לפיגועי טרור נגד יהודים, ובעיניהם - כהזדהות של האגודה עם הנראטיב של צה"ל ומדינת ישראל. בד בבד עם פעילותה זו, התקבלה באגודה החלטה לפיה הפגיעות בזכויות אדם של האוכלוסייה הפלסטינית, הנובעות מההתנחלויות, הן פרי המשטר בשטחים המקיים להשקפתה שתי מערכות נורמטיביות שונות, הנותנות עדיפות למתיישבים היהודים בשטח על פני התושבים המקומיים הפלסטינים. מצב זה, לדעת האגודה, מנוגד מעצם טיבו לזכויות אדם. עם זאת האגודה אינה נוקטת בעמדה ישירה באשר להחלטות מדיניות, כדוגמת הסדרים ביחס לסיום הסכסוך, אלא רק באשר להשלכותיהם על זכויות אדם ואזרח.