El tercer govern autènticament republicà s'inicià el 16 de maig de 1527 després de la crisi de relacions entre el papa Climent VII (membre de la família Mèdici) i l'emperador Carles V del Sacre Imperi Romanogermànic, i que finalitzà amb el Saqueig de Roma. En aquell moment el poble florentí veié en els Mèdici el principal mal per a la ciutat, caient en desgràcia, i expulsà del poder Alexandre de Mèdici. El papa, però, l'any 1529 s'alià amb l'emperador (abandonant la Santa Lliga), que per reinstaurar Alexandre al poder, va envair la Toscana la tardor de 1529 i va iniciar el setge de Florència.