Reformacja przyszła do miasta w 1523 r. wraz z radykalnym teologiem Martinem Reinhardtem, którego wypędzono rok później po interwencji Marcina Lutra. W 1525 r. chłopi i część mieszkańców miasta zniszczyli klasztor karmelitów oraz zdewastowali klasztor dominikanów. W wyniku porażki w wojnie szmalkaldzkiej w latach 1546-47 ród Ernestynów stracił godność elektorów. Od tego czasu Jena należała do Księstwa Saksonii. W roku 1548 utworzono Szkołę Wyższą przy klasztorze dominikanów, z której po dziesięciu latach powstał uniwersytet.