Як один з провідних та популярних акторів Бут був присутній на інавгурації Лінкольна, на багатьох виступах та зустрічах з президентом, однак спроб замаху на його життя не робив, оскільки сподівався викрасти Лінкольна та доставити його полоненим на південь. Однак у 1865 року стало ясно, що спроби викрасти президента були невдалими, до того ж Бут пересварився з іншими учасниками змови і замість викрадення вирішив вбити президента. 14 квітня 1865 року отримавши повідомлення про намір Авраама Лінкольна з дружиною відвідати його виставу почав розробку плану вбивства. Біля театру були підготовлені коні для втечі, у президентській ложі була зроблена щілина, через яку вбивця слідкував, коли президент прибув до театру. У той самий день, близько 10 години вечора, Бут прокрався до ложі і вистрелив президентові у потилицю. Поранивши також одного з присутніх ножем, Бут вискочив на сцену і прокричав "Sic semper tyrannis!" («Так завжди буде з тиранами»), після чого в сум'ятті йому вдалося втекти з театру і на заздалегідь приготовленому коні залишити Вашингтон.