『糸車の聖母』の主題に関する最初期の記録は、マントヴァ侯妃イザベラ・デステへ宛てた、フィレンツェのカルメル会修道院長フラ・ピエトロ・ダ・ノヴェラーラの1501年4月14日付の書簡である。1499年の第二次イタリア戦争でフランス軍がイタリアに侵攻したため、ミラノで活動していたレオナルドは、ヴェネツィアを経て1500年に故郷のフィレンツェへと避難した。レオナルドはマントヴァのイザベラの宮廷にも出入りし、イザベラからの肖像画制作依頼を受けて習作となるドローイング（ルーヴル美術館所蔵）を描いたが、肖像画を手がけることなくヴェネツィアへと居を移してしまった。イザベラはフィレンツェのフラ・ピエトロに連絡を取り、肖像画の完成を望んでいることをレオナルドに伝えさせた。この件の進捗をイザベラに報告するフラ・ピエトロの書簡が二通現存している。二通目の書簡はフラ・ピエトロがレオナルドに面会した後に書かれたもので、当時のレオナルドが数学の研究に気をとられているうえに、フロリモン・ロベルタから依頼された小さな絵画作品の制作で忙しいと記されている。さらにレオナルドが手掛けている絵画について、