A pesar de su fuerte oposición al protestantismo en Francia, se horrorizó cuando recibió noticias de la masacre del día de San Bartolomé, que comenzó el 24 de agosto de 1572, y que continuó durante varios días después, cuando miles de protestantes franceses fueron asesinados en París. Según Pierre de Brantôme, a la mañana siguiente, sorprendida al enterarse de lo ocurrido por un miembro de su séquito, preguntó si su esposo lo sabía. Cuando le dijeron que no solo lo sabía sino que fue su iniciador, exclamó: "¡Dios mío! ¿Qué es esto? ¿Quiénes son estos consejeros que le dieron tal consejo? Dios mío, te pido que lo perdones". Luego pidió su libro de horas y comenzó a rezar. Durante esos días, Isabel recibió peticiones para interceder por los inocentes y obtuvo la promesa de salvar la vida de los protestantes extranjeros (especialmente numerosos alemanes). Muy avanzada en el embarazo en ese momento (tenía siete meses), no se regocijó públicamente por tantas muertes, como hicieron otros católicos prominentes.