En agosto de 1805 zarpó la escuadra de Ferrol, uniéndose a la combinada de Gravina y Villeneuve. En el combate de Trafalgar, reñido el 21 de octubre de aquel año contra la escuadra de Nelson, ocupaba el "Neptuno" la cabeza de la línea de combate, formando parte de la división de vanguardia mandada por el contralmirante Dumanoir. Ya trabada la lucha, el "Neptuno", a pesar de la lentitud de decisión de Dumanoir, dio media vuelta y acudió en auxilio del "Bucentaure" y del "Santísima Trinidad".