El reino de Francia, una vez más, vino a amenazar Nápoles y el dominio del emperador Carlos sobre el Mezzogiorno: los franceses, después de haber conquistado el Ducado de Milán al hijo de Ludovico el Moro, Maximiliano, fueron derrotados y expulsados de Lombardía por Carlos V tras las batallas de Bicoca y Pavía. El rey Francisco I de Francia en 1526 entró entonces en una liga, bendecida por el papa Clemente VII, llamada liga santa, con Venecia y Florencia, para expulsar a los españoles de Nápoles. Después de una primera derrota de la liga en Roma, los franceses respondieron con la intervención en Italia de Odet de Foix, que llegó a Nápoles asediando la ciudad, mientras la Serenísima República de Venecia ocupaba Otranto y Manfredonia. Cuando la flota genovesa, aliada de los franceses, se pasó al lado de Carlos V, el asedio de Nápoles se trasmutó en la enésima derrota de los enemigos de España, que llevó entonces al reconocimiento por parte de Clemente VII del título imperial del rey Carlos I de España. Venecia perdió definitivamente sus posesiones en Apulia (1528). Las hostilidades de Francia contra la dominación española en Italia sin embargo no cesaron: Enrique II de Francia, hijo de Francisco I de Francia, solicitado por Ferrante Sanseverino, príncipe de Salerno, se alió con el Imperio Otomano; en el verano de 1552 la flota turca al mando de Sinan Pascià sorprendió a la flota imperial, mandada por Andrea Doria y Juan de Mendoza, en el largo di Ponza, derrotándola.