I Slaget ved Antietam, i kommando af 1. brigade i 1. Division i II Korps var Barlow i centrum af kampen på den notorisk kendte hulvej "Bloody Lane" og tog 300 fanger. Han blev såret af en artillerigranat i ansigtet og skrå i skridtet. Brigadegeneral John C. Caldwell skrev om Barlow i sin officielle rapport: