אמברוזיני משחק במילאן מאז שנת 1995, עת הועבר אליה מקבוצת צ'זנה. הוא זכה עם הקבוצה בארבע אליפויות איטליה (1996, 1999, 2004 ו-2011), פעמיים בליגת האלופות (ב-2003 וב-2007) ופעם אחת באליפות העולם לקבוצות (2007). עם נבחרת איטליה הוא העפיל לגמר יורו 2000, שם הפסידה נבחרתו ל.