Après la sécession de l'État du Mississippi juste avant le début de la guerre e Sécession, Barksdale démissionne du Congrès pour devenir adjudant général, et puis quartier-maître général, de la milice du Mississippi, au grade de brigadier général, avec une date de prise de rang au . Le , il est nommé colonel de l'armée des États confédérées du 13th Mississippi Infantry, le régiment qui commande lors de la première bataille de Bull Run à l'été, et à la bataille de Ball's Bluff en . Au printemps suivant, il conduit son régiment dans la péninsule de Virginie et combat lors de la campagne de la Péninsule et lors des batailles des sept jours. Lorsque son commandant de brigade, le brigadier général Richard Griffith, est mortellement blessé à la bataille de Savage's Station le , Barksdale assure le commandement de la brigade et la mène lors de la charge héroïque, mais sanglante et futile, lors de la bataille de Malvern Hlill. La bridage devient connue sous le nom de « Barksdale's Mississippi Brigade ». Il est promu brigadier général le .