Persano wurde im Dritten Italienischen Unabhängigkeitskrieg 1866 erneut mit der Führung der Flotte betraut. In einem von Marineminister Agostino Depretis am 15. Juli 1866 in Ancona vorgelegten Kriegsplan wurde befohlen, die österreichische Flotte in der Adria anzugreifen. Der Plan sah auch einen Angriff auf den österreichischen Stützpunkt auf der Insel Lissa vor. Persano lief am 16. Juli von Ancona aus und beschoss vom 18. bis zum 20. Juli 1866 mit insgesamt 34 Kriegsschiffen (252 Kanonen) die österreichischen Festungs- und Hafenanlagen auf Lissa. Wegen unterschiedlicher Meinungen über den wenig wirkungsvollen Artillerieeinsatz bei Lissa überwarfen sich Persano und seine untergebenen Admirale Giovanni Vacca und Giovanni Battista Albini am 19. Juli. Dieser Streit sollte am nächsten Tag noch Folgen haben.