En 2005, Prandelli firmó un contrato como nuevo técnico de la Fiorentina, en sustitución de Dino Zoff. Tras dos temporadas de mejoría, llevó al equipo a disputar las semifinales de la Copa de la UEFA en la temporada 2007-08, donde fue eliminado por el Glasgow Rangers en la tanda de penaltis. Ese año clasificó al conjunto "viola" para disputar la Liga de Campeones al terminar cuarto en la Serie A. Debido a estos logros, Prandelli obtuvo el premio Entrenador del Año en la Serie A. En la temporada 2008-09 repitió la 4ª posición, alcanzando los octavos de final de la Champions al año siguiente, pero decayó al 11º puesto de la tabla en la Serie A 2009-10.