Nel frattempo le truppe imperiali del connestabile Carlo III di Borbone-Montpensier entravano a Roma; fra queste, i Lanzichenecchi comandati dal principe Ferrante I Gonzaga il 6 maggio 1527 misero a ferro e fuoco la città: è il famoso sacco di Roma. Durante il sacco Ascanio Colonna rientrò a Roma con 8.000 fanti ed ottenne a giugno la nomina a governatore di Velletri: in questa veste impose ai cittadini una taglia di 24.000 scudi a titolo di risarcimento per i danni arrecati dagli abitanti a Marino l'anno precedente nel corso degli scontri fra i suoi partigiani e le truppe papaline. Ne ottenne 7.000 subito e due ipoteche su terreni della città per i restanti, ma dopo due mesi fu sostituito dal marchese Giambattista Castaldo.