Nel febbraio del 1563 Francesco di Lorena fu ucciso. Mentre l'assassino fu preso e giustiziato immediatamente, Anna d'Este tentò di tutto per far arrestare Gaspard de Coligny, capo dei Calvinisti francesi, da lei ritenuto il mandante dell'omicidio. Nei tre anni successivi la vedova fece pressioni sul re e i suoi tribunali al fine di assicurare alla giustizia Coligny, che tuttavia fu dichiarato innocente nel gennaio del 1566 dal consiglio del re. In conseguenza di ciò molti la ritennero responsabile di un agguato a fuoco subito proprio da Coligny la mattina del 22 agosto 1572, il quale rimase illeso come per miracolo. È comunque difficile appurare quale fu il vero ruolo d'Anna d'Este in questo attentato e nella conseguente strage della Notte di san Bartolomeo.