Устоличењем Карлоса I 1516. и његовим избором за суверена Светог римског царства 1519. године, Франсоа I се нашао окружен територијама под влашћу Хабзбурговаца. Његовим нападом на шпанске поседе у Италији 1521. започео је други рат у француско-шпанском сукобу. Рат се завршио погубно по Француску, поражена је у биткама код Бикоке (1522) и Павије (1525) у којој је Франсоа I заробљен и одведен у Мадрид, и код Ландријана (1529) након које је Франсоа попустио и одрекао се претензија ка Италији.