เมื่อต้นเดือนตุลาคมพ.ศ. 212 หรือ เมื่อ 333 ปีก่อนคริสตกาล พระองค์ยกตราทัพสู่อาณาจักรเปอร์เซีย เพื่อท้ารบกับกษัตริย์ดาไรอุสที่ 3 แห่งเปอร์เซีย ที่เชื่อว่าเป็นผู้จ้างคนลอบสังหารพระเจ้าพีลิปโปสที่ 2 พระบิดาของพระองค์ ในศึกแห่งอิสซัส ทัพของทั้งคู่เผชิญหน้ากันที่กอกามีลา (ในตะวันออกกลาง หรือพื้นที่ส่วนมากของประเทศอิรักในปัจจุบัน) โดยที่กองทัพของอเล็กซานเดอร์มหาราชมีเพียง 20,000 เท่านั้น ขณะที่กองทัพเปอร์เซียมีนับแสน แต่ด้วยความกล้าหาญของทหารมาเกโดนีอาทุกคน กับการวางแผนการรบที่ชาญฉลาดอเล็กซานเดอร์มหาราช ทำให้พระองค์ได้รับชัยชนะแม้จะสูญเสียเป็นจำนวนมากก็ตาม ในการรบครั้งนี้นับเป็นการรบที่มีชื่อของอเล็กซานเดอร์มหาราชที่สุด เนื่องจากพระองค์ทรงควบบูซาเฟลัสบุกเดี่ยวฝ่ากองป้องกันของทหารเปอร์เซียขว้างหอกใส่กษัตริย์ดาไรอุส ทำให้กษัตริย์ดาไรอุสตกพระทัย และหลบหนีขึ้นเขาไปในที่สุด ผลจากการรบครั้งนี้ทำให้อเล็กซานเดอร์มหาราชได้เข้าสู่นครแพร์ซโพลิส (Persepolis) ศูนย์กลางอาณาจักรเปอร์เซีย และได้เป็นพระราชาแห่งเอเชีย