La prima missione venne effettuata il 17 gennaio 1991 con l'ausilio di sette B-52G decollati il giorno prima dalla base aerea di Barksdale Air Force Base in Louisiana, i quali attaccarono 35 postazioni nemiche. Il compito principale dei B-52 durante l'operazione Desert Storm fu quello di indebolire le difese irachene, affinché le forze della coalizione potessero avanzare trovando la minore resistenza possibile. In tale occasione i velivoli operarono scortati da caccia F-15 ed F-16. Ciò nonostante i B-52 non riuscirono ad essere efficaci quanto il comando statunitense sperava. Molti bombardamenti a tappeto ebbero scarsa efficacia dal momento che non impiegavano bombe di precisione, disperdendo la propria potenza di fuoco in vaste aree desertiche. Inoltre gli equipaggi dei B-52 erano stati addestrati per missioni con armi nucleari a bassa quota dove non era richiesta una precisione eccessiva. Complessivamente i B-52 effettuarono 1 620 missioni durante la prima guerra del Golfo, portando a termine il 3% delle missioni ma sganciando il 30% delle bombe impiegate durante l'intero conflitto.