In 1566 viel de kerk ten prooi aan beeldenstormers. Van 1576 tot 1579 was de kerk in handen van Calvinisten, maar na het Beleg van Maastricht (1579) mochten de katholieken terugkeren. Na de verovering van de stad door Frederik Hendrik (1632) werd de kerk, samen met de Sint-Janskerk, definitief toegewezen aan de protestanten. De Sint-Matthiasparochie verhuisde naar de Sint-Catharinakapel, de veel kleinere kerspelkapel, aan de overkant van de Boschstraat gelegen. Afgezien van een korte onderbreking (1673-78) bleef de Matthiaskerk in protestantse handen tot de komst van de Fransen in 1794. In 1802 werd de kerk teruggegeven aan de katholieken.