Die fundierte Ausbildung, die er bei den beiden Fotografen genoss, veranlassten O’Sullivan nach Ausbruch des Sezessionskrieges mit ihnen als Fotograf ins Feld zu ziehen, um die Schlachten zu dokumentieren. Nach einer ersten Heimkehr von der Front gingen Gardner und O’Sullivan auf der einen und Brady auf der anderen Seite getrennte Wege. Letzterem wurde vorgeworfen, dass er seine Fotografen nicht würdigte, indem er als alleiniger Urheber aller Bilder angegeben wurde. Im weiteren Verlauf des Krieges schaffte es O’Sullivan erfolgreich, das komplizierte Kollodium-Verfahren auf das Schlachtfeld zu übertragen und so wurde er schließlich einer der herausragenden Kriegschronisten. Er dokumentierte viele historisch bedeutende Schlachten, wie beispielsweise 1862 die Zweite Schlacht am Bull Run oder 1865 die Schlacht von Appomattox. Berühmtheit erlangte nach dem Krieg vor allem das Bild "The Harvest of Death" (zu deutsch: "Die Ernte des Todes") aus dem Jahr 1863, für das O’Sullivan die Leichen auf dem Schlachtfeld von Gettysburg fotografiert hatte. Von den vierhundert der allein von der Unionsarmee offiziell angegebenen Kriegsfotografen konnten nach dem Krieg nur wenige herausstechen. Sowohl O’Sullivan als auch Gardner gelang dies. In dem von letzterem veröffentlichten Band "Photographic Sketchbook of the Civil War" (1866) waren 44 der 100 enthaltenen Bilder von O’Sullivan gemacht worden.