W 1376 r. Grodno weszło ponownie w skład Wielkiego Księstwa Litewskiego. Na mocy unii w Krewie zawartej 10 lat później wraz z Wielkim Księstwem Litewskim formalnie włączone do Królestwa Polskiego. W tym czasie istniał w Grodnie drewniany gród z kamiennym stołpem, który atakowany był w czasie wojny Witolda z Jagiełłą w 1382, 1389 i 1390 r., a przez Zakon krzyżacki w latach 1284, 1295, 1306, 1311, 1312, 1328, 1363, 1373, 1375, 1377 i 1392. Krzyżacy pod dowództwem Konrada Wallenroda zdobyli go w końcu w 1393 r. W tym samym roku Grodno zostało siedzibą księcia Witolda, na którego rozkaz w 1398 r. wybudowano murowany gotycki zamek. Dwa lata później Grodno otrzymało niepełne prawo magdeburskie, zostając jednym z głównych miast księstwa. W grudniu 1400 roku Polacy i Litwini negocjowali w Grodnie warunki unii wileńsko-radomskiej. Kolejny najazd Krzyżaków na Grodno nastąpił w 1401 roku z powodu poparcia przez Witolda antykrzyżackiego powstania na Żmudzi.