В начале Великой Отечественной войны совместно с войсками Южного фронта отражала удары румынских войск в ходе Приграничных сражений в Молдавии. 24 июня и корабли флотилии успешно высадили самые первые в годы Великой Отечественной войны советские десанты на Дунае (см. Дунайский десант) и содействовали обороне захваченных на румынском берегу плацдармов почти месяц (до 19 июля). Флотилия активно поддерживала войска Южного фронта в оборонительной операции в Молдавии. В связи с отходом советских войск перебазировалась в Одессу, затем Николаев и Херсон, обеспечивала переправы через Южный Буг и Днепр. Корабли и личный состав флотилии участвовали в обороне Одессы.