Saksa hyökkäsi Neuvostoliittoon kesäkuussa 1941, jolloin 24-vuotias Pavlytšenko asui Odessassa. Saksalais-romanialaiset joukot etenivät pian alueelle ja Odessan taistelu alkoi. Pavlytšenko halusi värväytyä armeijaan, mutta naisia ei vielä tuolloin hyväksytty rintamatehtäviin. Häntä yritettiin ohjata sairaanhoitajaksi, mutta hän kieltäytyi. Hän teki kaikkensa päästäkseen armeijaan ja esitteli Vorošilovin tarkka-ampujan merkkiään värvääville upseereille. Elokuussa 1941 hänelle tarjoutui tilaisuus näyttää ampumataitonsa, kun puna-armeija järjesti improvisoidun pääsykokeen eräällä mäellä lähellä Biljajivkaa, jota se puolusti. Pavlytšenkolle annettiin kivääri ja osoitettiin kaksi romanialaista sotilasta. Hän ampui molemmat ja hänet hyväksyttiin armeijaan. Hän kertoi myöhemmin, että näitä romanialaisia ei laskettu hänen tappolukuunsa, sillä ”ne olivat koelaukauksia”. Hänet sijoitettiin puna-armeijan 25. ”Tšapajevin” kivääridivisioonaan, joka oli nimetty Venäjän sisällissodan aikaisen komentajan Vasili Tšapajevin mukaan.