През 1940 година полкът е формиран отново, под името "силистренски" и се установява на постоянен гарнизон в Силистра. През 1941 и 1944 е на Прикриващия фронт в района на Александрово, Зорница, Маломирово, Голям Дервент и Лалково. Участва в двете фази на заключителния етап на Втората световна война в състава 12-а пехотна дивизия от Първа Българска Армия. Полкът си спечелва името „железният“ по време на боевете при Драва, Мур и с. Ястребци. Участва в боевете при Липовица, Горно Кърино, Прищина и Чекел. Загубите, дадени от полка през Втората световна война, са 1333 души убити, ранени и безследно изчезнали при обща численост от 2300 войници, сержанти и офицери. Краят на войната заварва 31 Силистренски полк в Австрия.