Kurz vor dem Beginn des Zweiten Weltkrieges am 26. August 1939 mobilisiert, war Pilecki in der an der Grenze zu Ostpreußen aufmarschierten Armia Prusy als Kommandant einer Kavallerie-Kolonne der 19. Infanterie-Division eingesetzt. Seine Einheit war an den Kämpfen gegen die deutsche Invasion beteiligt und wurde teilweise aufgerieben. Pileckis Kolonne zog sich in südöstlicher Richtung nach Lemberg zurück, wo sie mit der kurz zuvor aufgestellten 41. Infanterie-Division vereinigt wurde. Während des Krieges zerstörten Pilecki und seine Männer sieben deutsche Panzer und schossen zwei Flugzeuge ab. Nachdem ab 17. September 1939 infolge des Hitler-Stalin-Paktes die Rote Armee das östliche Polen besetzt hatte, wurde Pileckis Einheit aufgelöst, und er kehrte mit seinem Major Jan Włodarkiewicz ins deutsch besetzte Warschau zurück.