In 1939 is de in onbruik geraakte linie toch nog een keer in werking gesteld. In de plannen van de opperbevelhebber van het leger, generaal Reijnders, nam de linie de rol in van voorverdediging van de Vesting Holland. Op het laatste moment (februari 1940) besloot de nieuwe bevelhebber generaal Henri Winkelman de hoofdverdediging in de Grebbelinie te voeren. De inundaties werden in werking gesteld tussen de Grebbeberg en het IJsselmeer. Bij de Duitse invasie werd hier enkele dagen standgehouden door het Nederlandse leger. Op verschillende plaatsen, zoals bij Fort Engelaar moest de strijd opgegeven worden door gebrek aan munitie. De zwaarste strijd is gevoerd tijdens de Slag om de Grebbeberg.