Amphipolis erlangte während des Peloponnesischen Kriegs Bedeutung, unter anderem wegen der Beschaffung von Holz für den Schiffbau, Einnahmen aus den Bergwerken der Umgebung, Zöllen sowie der strategischen Position. Die Stadt ergab sich 424 v. Chr. kampflos dem Spartaner Brasidas, wobei der athenische Strategos Thukydides, der spätere Historiker, zu spät eintraf, um die Stadt noch für Athen zu retten; er musste daraufhin ins Exil gehen. Im Jahr 422 v. Chr. griff der athenische General Kleon Brasidas bei Amphipolis an. In der Schlacht, in der Sparta Sieger blieb, kamen beide Generäle ums Leben. Kurz darauf wurde der Nikiasfrieden geschlossen. Die Einwohner bestatteten den Spartaner innerhalb der Mauern. Sie betrachteten ihn als den zweiten Gründer ihrer Stadt und verehrten ihn mit Spielen und kultischen Feiern als Heros.