De Serie B 2000/01 was de 69ste editie van de strijd op het tweede niveau van het Italiaanse profvoetbal. Er namen in totaal twintig teams deel aan de competitie, waarvan vier gepromoveerde uit de Serie C en vier gedegradeerde uit de Serie A (Torino, Venezia, Cagliari en Piacenza). De competitie begon op 3 september 2000 en eindigde op 3 juni 2001. In de 380 gespeelde competitiewedstrijden werd in totaal 937 keer gescoord, goed voor een gemiddelde van 2,47 doelpunt per wedstrijd.