Auch nachdem in Straßburg die Reformation zur Aufhebung der Klöster führte und das Renchtal an die protestantischen Herzöge von Württemberg verpfändet wurde, blieb das klösterliche Leben ununterbrochen bestehen. 1592 konnte sich das durch den Straßburger Kapitelstreit konfessionell gespaltene Straßburger Domkapitel nicht auf einen neuen Bischof einigen. Der Kandidat der protestantischen Partei, Johann Georg von Brandenburg, regierte nach einem Kompromiss von 1593 die rechtsrheinischen Gebiete des Hochstifts. Er untersagte Allerheiligen die Aufnahme von Novizen und ließ die Klosterschule schließen. Die in Allerheiligen verbliebenen drei Chorherren wählten 1594 "Jakob Jehle" zum Propst, der jedoch von Johann Georg nicht bestätigt wurde. Stattdessen wurde Jehle von Soldaten des protestantischen Bischofs gefangen genommen, in der Festung Dachstein interniert und blieb ohne weiteres Lebenszeichen verschollen. Nur durch den Einsatz des Generalvikars Jan Lohelius, der auf Bitten der Äbte der schwäbischen Zirkarie bei Kaiser Rudolf II. intervenierte, konnte eine Auflösung des Stifts verhindert werden. Mit dem aus dem Kloster Strahov kommenden "Johannes Schüßler" wurde erst 1600, nachdem Rudolf II. die Besetzung des Bischofsamts zugunsten des katholischen Kandidaten Karl von Lothringen entschieden hatte, wieder ein neuer Propst bestimmt. Zu diesem Zeitpunkt lebte in Allerheiligen nur noch ein Kanoniker. Schüßler erreichte eine Einigung mit Johann Georg, woraufhin das Stift gegen Zahlung einer jährlichen Abgabe seine Güter und Rechte zurückerhielt. 1604 verzichtete Johann Georg im "Vertrag von Hagenau" auf seine Rechte am Bistum. Trotz großer Verwüstungen im Renchtal vor allem durch schwedische und weimarsche Truppen überstand das Stift den Dreißigjährigen Krieg unbeschadet.