Andre verdenskrig ble den vanskeligste perioden i universitetets historie. Den 6. november 1939, ble universitetets professorer og assistenter invitert av de tyske okkupantene under påskudd av en forelesning og så arrestert og sendt til konsentrasjonsleirer. Flere overlevde, men i årene 1939–1945 ble 34 professorer drept i tyske konsentrasjonsleirer og i Katyn-massakren. Under krigen var universitetet stengt, og dets utstyr ble systematisk ødelagt. Til tross for dette klarte man å organisere undervisning ved et undergrunnsuniversitet – den såkalte "Tajny Uniwersytet Jagielloński" (Det hemmelige jagellonske universitet), hvor over 900 studenter og 140 vitenskapsmenn deltok.