La culminación de su carrera militar se produjo cuando Fernando el Católico, bajo un ejército comandado por el II duque de Alba, consigue conquistar el Reino de Navarra durante el verano de 1512. Diego Fernández de Córdoba intervino, junto con otros nobles castellanos, en ayuda al duque de Alba cuando los reyes navarros Juan III y Catalina I intentaron recuperar su reino en diciembre del mismo año. Este logro hizo que el 27 de diciembre de 1512 el rey Fernando lo nombrara primer virrey de Navarra y, además, elevara su señorío de Comares a marquesado, convirtiéndose en el primer marqués de Comares. Su virreinato se caracterizó por una situación difícil, donde los navarros no sentían aprecio por sus nuevos soberanos, por lo que Diego respetó escrupulosamente las leyes y fueros propios del reino, así como convocó a las Cortes navarras anualmente para evitar grandes revueltas.