Kaarlen perimä Aragonian valtakunta käsitti myös Napolin ja Sisilian kuningas­kunnat sekä Sardinian. Aragonia oli aikaisemmin hallinnut myös Milanon herttuakuntaa, mutta vuotta ennen Kaarlen nousua valta­istuimelle Ranska oli vallannut sen Marignanon taistelussa 1515. Vuonna 1522 Kaarle onnistui valloittamaan Milanon takaisin, kun hänen keisarilliset sota­joukkonsa voittivat ranskalais-sveitsiläisen armeijan Bicoccassa. Vuonna 1524 Ranskan Frans I sai jälleen aloitteen käsiinsä, tunkeutui Lombardiaan ja valloitti siellä jälleen Milanon ja monia muita kaupunkeja. Vain Pavia jäi valloittamatta, ja siellä Kaarlen keisarilliset sotajoukot vangitsivat Fransin 24. helmikuuta 1525, keisarin syntymä­päivänä, kukistivat hänen armeijansa ja ottivat jälleen hallintaansa Milanon ja Lombardian. Tämän jälkeen Espanja pystyi pitämään hallinnassaan kaikki italialaiset alueensa, vaikka niihin jatkuvasti hyökättiin monelta taholta. Habsburgien valta­kunnan käymää kauppaa Väli­merellä pyrki estämään myös Osmanien valtakunta. Vuonna 1538 Espanja ja kaikki italialaiset valtiot muodostivat Pyhän liiton karkottaakseen osmanit, mutta liittouma kärsi tappion Prevezan taistelussa 1538. Ratkaiseva voitto osmaneista saatiin merellä vasta Kaarlen kuoleman jälkeen Lepanton taistelussa vuonna 1571.