Im frühen 16. Jahrhundert wurde unter Bischof Veit Truchseß von Pommersfelden mit dem Bau der noch an vielen Stellen erhaltenen Wehranlage mit Wehrmauer und Stadttoren begonnen. Sein Amtswappen ziert noch heute das Erleinhofer und das Forchheimer Tor. Während des Deutschen Bauernkriegs 1525, des Zweiten Markgrafenkriegs 1552, des Dreißigjährigen Krieges (vor allem 1632) und der Napoleonischen Kriege ab 1798 musste Neunkirchen am Brand immer wieder schwere Zeiten durch Sachschäden, Bevölkerungsrückgänge, wirtschaftlichen und kulturellen Niedergang und Hungersnöte durchleiden. Die trostlose Finanzlage des Erzbistums Bamberg als Folge des Zweiten Markgrafenkriegs führte letztlich 1555 zur Schließung des Augustiner-Chorherrenstiftes Kloster Neunkirchen am Brand mit dem Tod des letzten Propstes Augustin. Ab 1691 wurden die Klostergüter zum Unterhalt des Priesterseminars Bamberg verwendet.