Accompagnant le lieutenant-général, il reçoit le baptême du feu en 1537 à la bataille du Pas de Suse (huitième guerre d'Italie). Il y pratique la première désarticulation du coude et découvre que la poudre des arquebuses n'empoisonne pas les blessures comme on le croyait. Il voit des scènes atroces et tente avec succès d'adoucir les méthodes de guérison trop brutales qui consistent par exemple à cautériser les plaies à l'huile bouillante. À la mort de Montjean, Ambroise Paré est de retour à Paris. Il se marie le avec Jeanne Mazelin à Saint-André-des-Arts (elle décédera, et sera inhumée à église Saint-André-des-Arts, le en lui laissant la garde de leur fille âgée de treize ans, Catherine, et celle de leur nièce de dix-neuf ans, Jeanne Paré). Il entre alors une première fois au service de René de Rohan.