En sus primeros años, la Orden participó con éxito en la escalada de hostilidades entre los imperios español y otomano por el control del Mediterráneo, así estuvieron presentes en el sitio de Malta (1565), la Batalla de Lepanto (1571) y la captura en 1607 por el entonces almirante Jacopo Inghirami de la ciudad de Annaba en Argelia, que quedó incendiada y donde mataron a 470 personas y tomaron 1.500 prisioneros. Después de esta etapa inicial más agresiva, la Orden se concentró en la defensa de las costas mediterráneas contra piratas turcos y africanos. En particular, los Caballeros hicieron algunas incursiones en las Islas del Egeo controladas por los turcos, y tomaron parte en las campañas en Dalmacia, Negroponte y Corfú.