С 520 года до н. э. Самос стал частью державы Ахеменидов. В 499 году до н. э. остров активно участвовал в Ионийском восстании против персов. В 494 году до н. э. Самос участвовал в морской битве при Ладе и выставил 60 кораблей. Большинство самосских командиров в решающий момент битвы посчитали, что в сражении будет слишком много потерь, и решили выйти из боя. 50 кораблей с Самоса покинули сражение и лишь 11 продолжили сражаться и были потоплены персами. Остров вновь был покорён персами. После победы греков при Саламине в 479 году до н. э. остров вошёл в состав Афинского морского союза. Остров первое время был довольно самостоятельным членом союза и пользовался автономией во внутренних делах. Власть на острове оказалась в руках олигархов.