Ihre bisher wichtigste Rolle spielte Witherspoon 2005 in James Mangolds Drama "Walk the Line". In der Filmbiografie über den US-amerikanischen Country-Sänger Johnny Cash spielte sie dessen zweite Ehefrau June Carter Cash und sang für den Film vier Lieder selbst ein. Für ihre Darstellung wurde sie von der Kritik gelobt und mit zahlreichen Filmpreisen ausgezeichnet, darunter der Golden Globe als beste Hauptdarstellerin in einer Komödie/Musical sowie der Oscar als beste Hauptdarstellerin. In ihrem folgenden Film "Solange du da bist" brillierte Witherspoon erneut als Komödiendarstellerin, die mit Hilfe von Mark Ruffalo versucht, ihre wahre Identität herauszufinden.