Эфес продолжал процветать, но после повышения налогов при Камбисе II и Дарии I жители города приняли участие в Ионийском восстании против персидского владычества. В 498 году до н. э. состоялась битва при Эфесе, в которой греки потерпели поражение. В 479 году до н. э. ионийцы при поддержке Афин смогли вытеснить персов с берегов Малой Азии. В 478 году до н. э. ионийские города создали вместе с Афинами Первый афинский морской союз против персов. Эфес не предоставлял союзу корабли, но оказывал финансовую поддержку. На заключительном этапе Пелопонесской войны Эфес вышел из союза и воевал против Афин на стороне Спарты. После Коринфской войны, когда спартанские войска покинули Малую Азию, Эфес снова оказался под контролем Персии. В 334 году до н. э. после битвы при Гранике город был освобождён от персов Александром Македонским. Позже в 283 году до н. э. Эфес захватил один из преемников Александра Лисимах.