С началом войны полк под командованием полковника Пушкарёва вел боевые действия на Юго-Западном фронте. Участвовал в приграничном сражении и Киевской оборонительной операции. Летчики полка уничтожали танки и мотомеханизированные части противника в районах Сокаль, Крыстынополь, Берестечко, Дубно, Ровно, Шепетовка, Бердичев. С переходом на ночную работу полк уничтожал самолеты противника на аэродромах Житомир, Скоморохи, Бердичев, Белая Церковь, Узин, Городище, Кировоград; наносил бомбовые удары по скоплениям вражеских войск в районах Канев, Кременчуг, Черкассы, Окуниново.