Wchodząc do służby, nowe samoloty, wzięły udział w incydencie granicznym z Japonią w lecie 1939 roku znanym jako bitwa nad Chałchin-Goł. Dwanaście samolotów I-153 tworzyło eskadrę w 70 Pułku Myśliwskim. 25 lipca tego samego roku dziewięć radzieckich samolotów zestrzeliło cztery japońskie maszyny Nakajima Ki-27. Pierwsze doświadczenia bojowe wykazały bardzo dobrą zwrotność I-153 ale mniejszą prędkość w porównaniu z japońskimi samolotami. W sierpniu 1940 roku 93 I-153 zostały przekazane do Chin, jednak nie odegrały już znaczącej roli. Samoloty te odegrały poważną rolę w radziecko-fińskiej wojnie zimowej 1939-1940 podczas której radziły sobie z fińskimi Gladiatorami i Fokkerami D.XXI, a także w czasie pierwszego etapu niemieckiej inwazji na ZSRR z czerwca 1941 roku. Ocalałe myśliwce I-153 od 1943 roku były przenoszone do jednostek szkolnych. Mimo to na Dalekiej Północy i Dalekim Wschodzie, samoloty te dotrwały w pierwszej linii do 1945 roku. Po raz ostatni zostały użyte bojowo, razem z samolotami I-15bis, w czasie walk z Japończykami w Mandżurii. Fińskie zdobyczne myśliwce, również wykorzystywano jako samoloty pierwszoliniowe do roku 1945. W rękach doświadczonego pilota samolot ten był dość skuteczną bronią, lecz niedoświadczonym mógł sprawiać kłopoty. Jeden ze zdobytych przez Niemców podczas wojny egzemplarzy I-153 został przez nich wyremontowany. Odnaleziony po wojnie we Francji jest eksponowany w Muzeum Lotnictwa i Astronautyki Le Bourget.