Reformace přinesly v Mühlhausenu mnoho změn. Nesouhlasili s nimi například Heinrich Pfeiffer nebo Thomas Müntzer. Oba se rozhodli svůj nesouhlas vyjádřit kázáním v opatství Reifenstein v Durynsku. Během německé selské války byli vyměněni členové městské rady a vypleněny kláštery i kostely. Když pak císařova armáda potlačila povstání, byl Thomas Müntzer z Mühlhausenu popraven, Město navíc muselo zaplatit 40 000 zlatých říši a částečně ztratilo nezávislost. Do čela města byly dosazeni Wettinové, kvůli kterým ve 14. století vznikla zmíněná aliance, a hesenská lankrabata. Oba rody byly především protestantské, nicméně, Mühlhausen zůstal pod vlivem katolicismu a tajně vstoupil do Norimberské ligy. Šmalkaldská válka a prohra Wettinů i hesenských v ní ale přinesla městu opět nezávislost. Během následujících let pak město přežilo sedmiletou i třicetiletou válku a několikrát se měnil i nadřazený celek, od Vestfálského království (součástí 1807 až 1815) až po Saskou provincii.