Zambrotta joue son premier match pour le Milan lors de la première journée de la saison 2008-2009 contre le Bologne FC, le 31 août 2008. Le Milan AC s'incline à domicile par deux buts à un ce jour-là. Il inscrit son premier but dès la troisième journée de championnat, le 21 septembre 2008 face à la Lazio Rome. Alors que le score est de un partout avec des buts de Clarence Seedorf pour le Milan et de Mauro Zárate pour la Lazio, Zambrotta redonne l'avantage à son équipe d'une frappe de loin de 31 mètres. Le Milan AC remportent ce match par quatre buts à un.