La rivalità più forte e sentita dalla tifoseria viola è quella contro la Juventus, pure se oggi è andata scemando rispetto al culmine raggiunto dai primi anni ottanta sino all'inizio del terzo millennio; questa ha origine negli anni cinquanta e sessanta del Novecento, quando la Fiorentina si trovava stabilmente nelle zone di vertice del calcio italiano. Si è acquisita ulteriormente durante i decenni, coi contestati episodi nell'epilogo del campionato 1981-82, con la finale di Coppa UEFA 1989-1990, l'ulteriore cessione di Roberto Baggio dalla squadra viola a quella bianconera e l'astio sorto un periodo tra le famiglie dei Della Valle e degli Agnelli, che vantavano rispettivamente la maggioranza azionaria dei due club.