2016. június 12-én, körülbelül 02:00-kor, Mateen belépett a Pulse nevű szórakozóhelyre Orlandóban, és lövöldözni kezdett. 02:22-kor felhívta telefonon a rendőrséget (911), és elmondta, hogy hűségesküt tesz az Iszlám Államnak, és megemlítette a 2013-as bostoni robbantás két elkövetőjét Tamerlan és Dzhokhar Tsarnaev-et, és Moner Mohammad Abu Salha-t, egyik ismerősét, aki meghalt egy öngyilkos merényletben amit az Al-Nuszra Front szervezett 2014-ben Szíriában. Mateen túszokat ejtett, miután a rendőrség megérkezett többször tűzharcba keveredett velük. 05:00 körül a rendőrség agyonlőtte Mateen és ezzel véget vetett a támadásnak.