Després de perdre el domini de l'illa de Rodes, novament l'orde va haver de cercar un lloc on establir-se. El gran mestre hospitaler es va dirigir a l'emperador Carles V per sol·licitar-li que els cedís una terra on fixar-hi la residència. L'emperador els va oferir l'illa de Malta, se'n signà la cessió el 1530 i l'orde va prendre possessió de les illes de Malta, Gozo i Trípoli. L'orde de Sant Joan de Jerusalem, que ja començava a denominar-se orde de Malta, va armar galeres i no va cessar en la seva lluita contra les naus turques. Va ser una època d'incessants combats navals. Anys després, l'orde de Malta va participar en la Batalla de Lepant (1571).