Il ritorno dei Medici (1512) vede al governo della città il cardinale Giulio, figlio naturale di Giuliano di Piero di Cosimo, che nel 1523 sarà eletto papa con il nome di Clemente VII. Nel 1527, tuttavia, dopo il Sacco di Roma da parte delle truppe di Carlo V, i fiorentini insorgono proclamando nuovamente la repubblica: solo l'accordo tra il papa Medici e l'imperatore consentirà la sconfitta definitiva dell'ultimo regime repubblicano, dopo un lungo assedio. Nel 1531 Alessandro de' Medici prende possesso del governo della città; l'anno dopo riceve il titolo ducale, dà vita al Senato dei Quarantotto e al Consiglio dei Dugento, riformando le antiche istituzioni repubblicane e comunali. Morirà nel 1537 per mano di Lorenzo di Pier Francesco de' Medici, meglio noto come Lorenzino o Lorenzaccio. Il governo viene dunque assunto da Cosimo, figlio di Giovanni delle Bande Nere, discendente del ramo cadetto, e di Maria Salviati, nipote di Lorenzo il Magnifico.