Zatímco dosud byla Žitava pevnou oporou katolicismu, po Lutherově vystoupení se i zde začala situace měnit. Muž, který do města přinesl reformaci, byl magistr Laurentius Heidenreich, z něhož se stal slavný teolog, jenž působil až do své smrti jako žitavský "pastor primarius". V roce 1521 začal kázat v němčině, protestantismus ovšem převládl až po roce 1538. Tento rok byla zrušena komenda Řádu johanitů, františkánský klášter ji následoval v roce 1543. Neochota Žitavy a dalších měst spolku podpořit císaře Ferdinanda I. Habsburského v boji proti protestantům během šmalkaldské války vedla roku 1547 k hornolužickému "Pönfallu". Žitava utrpěla velké hospodářské ztráty, ale rychle se zotavila, např. již v roce 1574 získala Ojvín včetně hradu a kláštera. Také v 16. století zasáhla město morová nákaza, které roku 1555 podlehla značná část obyvatel. V roce 1559 a 1599 přišly další morové epidemie. Roku 1589 zničil velký požár 153 obytných domů, což tehdy byla asi čtvrtina města. Po velkém moru a kruté zimě roku 1606 si mnoho obětí vyžádal další velký požár v roce 1608 zapříčiněný žhářstvím. Tři čtvrtiny města byly zničeny. Tak začalo nové století, se kterým přišla katastrofa třicetileté války. Během ní byla Žitava v letech 1631–1645 opakovaně ostřelována, obléhána, pleněna a obsazována císařskými a švédskými vojsky. V důsledku porážky českých stavů po bitvě na Bílé hoře se po roce 1620 do města přistěhovalo mnoho českých evangelíků, kteří až do poloviny 19. století výrazně ovlivňovali charakter města. Poté, co císař Ferdinand II. Štýrský zastavil Horní Lužici saskému kurfiřtovi Janu Jiřímu I. Saskému (1620), dostala se Žitava po sjednání Pražského míru do správy Saského kurfiřtství.