V prvních letech rytíři bojovali spolu se Španěly proti Turkům a byli u obležení Malty roku 1565, a u bitvy u Lepanta roku 1571. Po roce 1640 se rytíři soustředili hlavně na obranu pobřeží a podporu Benátek v bojích proti Osmanům. Poslední vojenská operace řádu proběhla roku 1719 a poté velkovévoda Petr Leopold řád reorganizoval na vzdělávací instituci toskánské šlechty. Leopold poté, co se stal císařem, abdikoval z hodnosti toskánského velkovévody ve prospěch svého mladšího syna Ferdinanda III., zakladatele současné linie velkovévodů a velmistrů řádu. Roku 1799 Ferdinand III. kapituloval před silami Francouzské republiky a vzdal se velmistrovství řádu. Řád přežíval v krátkodobém Etruském království. Roku 1814 bylo obnoveno velkovévodství pod Ferdinandem III. a roku 1815 byl i obnoven řád dekretem "Ripristinazione dell'Ordine dei Cavalieri di S. Stefano". Roku 1859 bylo Toskánsko dobyto Sardinským královstvím a řád byl rozpuštěn. Vzhledem k tomu, že se jedná o církevní a dynastický řád, toto rozpuštění není platné a řád dodnes existuje.