La audiencia estuvo compuesta al principio de cuatro oidores letrados, seguidamente fue trasladada en 1544 a Gracias a Dios, actual ciudad de Gracias (Lempira), en Honduras, punto fronterizo de las provincias de Guatemala, Honduras y Nicaragua. La jurisdicción de la real audiencia y de la capitanía general guatemalteca originalmente comprendía los actuales territorios de Yucatán, Tabasco, Cozumel, Chiapas, Soconusco, Guatemala, El Salvador, Honduras, Nicaragua y Costa Rica. Su función era conocer todas las causas criminales nuevas y pendientes y sus sentencias no podían apelarse. Posteriormente fue trasladada en 1549 a Santiago de los Caballeros de Guatemala y, luego de los Terremotos de Santa Marta que destruyeron dicha ciudad en 1773, fue trasladada a la Nueva Guatemala de la Asunción.