Larry Daley, nouveau gardien du musée d'histoire naturelle de New York, découvre que tous les squelettes, animaux empaillés et statues de cire s'animent durant la nuit : Attila, Sacagawea, Theodore Roosevelt, Christophe Colomb, Lewis et Clark, les cow-boys, les soldats romains (dont le général Caius Octavius), les soldats de la guerre de Sécession, les Mayas, les hommes de Néandertal, un tyrannosaure, des singes capucins et une statue de l'île de Pâques. Il y a aussi le pharaon imaginaire Ahkmenrah, dont la tablette fait s'animer les personnages la nuit.