Cambiasso estreou na Argentina em 2000. Ele participou da Copa das Confederações da FIFA de 2005 com sua equipe nacional, torneio no qual a Argentina chegou à final. Em 15 de maio de 2006, ele foi nomeado na seleção argentina para a Copa do Mundo de 2006. Em 16 de junho, ele completou uma partida argentina de 24 passes com um final para marcar o segundo gol na vitória por 6-0 sobre a Sérvia e Montenegro. Na partida das quartas de final contra a Alemanha, em 30 de junho de 2006, a partida entrou em pênaltis, onde Cambiasso teve seu pênalti salvo, resultando na Argentina perdendo por 4 a 2 e na Alemanha avançando para a semifinal. No ano seguinte, ele representou seu país na Copa América de 2007, onde a Argentina chegou à final, perdendo para o rival sul-americano Brasil.