Po svém návratu do velkovévodství v roce 1641 znovu upevnil svou vládu v Sieně. Nezůstal doma dlouho, protože vypukla válka o italské město Castro. Ferdinand II. Medicejský svěřil Mattiasovi nejvyšší velení nad spojenými armádami velkovévodství, a tak velel lize Benátské republiky, Toskánského velkovévodství, Parmy a Vévodství Modena a Reggio proti armádě papeže Urbana VIII. z rodiny Barberiniů. Vládou v Sieně po dobu své nepřítomnosti pověřil svého bratra kardinála Leopolda de Medici.