1535 gründete Pizarro an der Pazifikküste die Stadt Lima, die verkehrstechnisch viel günstiger lag und das Verwaltungszentrum der Kolonie werden sollte. Im gleichen Jahr floh der von Pizarro eingesetzte Marionettenherrscher Manco Cápac II. aus Cusco und organisierte einen groß angelegten Aufstand. Mit über 100.000 Mann marschierte er gegen Cusco und belagerte die Stadt mehrere Monate lang. Nur mit knapper Not und dank der Rückeroberung der Festung Sacsayhuamán konnten die Spanier dem Untergang entgehen. Cusco wurde bei der Belagerung vor allem durch Brandgeschosse zerstört und in den darauf folgenden Jahren im kolonialen Stil wieder aufgebaut, wobei die aus der Inkazeit stammenden Grundmauern und die alte Straßenführung weitgehend erhalten blieben. 1536 wurde Cusco Sitz eines Bistums, des zweiten (nach Cartagena) auf dem südamerikanischen Kontinent.