Die Siegmundische Linie teilte sich 1474 erneut in die ältere Dessauer Linie (Anhalt-Dessau) und die sogenannte ältere Köthener Linie (Anhalt-Köthen), hier als Bezeichnung verwendet im Sinne von Waldemarisch-Köthenscher Familienzweig, wobei diese Linie mit Wolfgang von Anhalt-Köthen 1566 erlosch und der Besitz bereits 1562 an die ältere Dessauer Linie ging. Die ältere Köthener Linie erwarb 1508 einen Teil der Zerbster Lande, der somit auch an die ältere Dessauer Linie überging. Um 1500 versuchte der Magdeburger Erzbischof das Fürstentum seinem eigenen Machtbereich unterzuordnen, was den Verlust der reichsunmittelbaren Stellung bedeutet hätte. Durch die Reichsreform wurden ab 1500 im Heiligen Römischen Reich Reichskreise geschaffen. Die Fürstentümer lagen im Obersächsischen Reichskreis. Wolfgang von Anhalt-Köthen führte 1525 die Reformation ein und war führend unter den protestantischen Landesfürsten. Er unterzeichnete 1530 das Augsburger Bekenntnis, war im Folgejahr Mitbegründer des Schmalkaldischen Bundes und nahm 1546 am Schmalkaldischen Krieg teil.