Au début du XVIe siècle, au cours des guerres d’Italie qui opposèrent la France à l’Espagne, la ville fut le théâtre de faits historiques, dont celui du célèbre défi de Barletta. La confrontation entre les chevaliers italiens et français, survenue à la suite de provocations côté français, s’est tenue le 13 février 1503 dans la plaine entre Andria et Corato, sur le territoire de la ville de Trani, et s’est conclue par la victoire des Italiens menés par le capitaine Ettore Fieramosca. La ville devint un bastion des Espagnols qui en ont renforcé les fortifications et le château. En 1528, déjà tiraillée par des divisions internes, Barletta fut dévastée par les Français qui perpétrèrent des pillages et des incendies tels que cela a abouti à la destruction d’églises et d’édifices conventuels. Le déclin de la ville commença à partir de ce moment-là, favorisé par la mauvaise gouvernance espagnole et par les catastrophes naturelles successives tout au cours du XVIIe siècle. En 1656, la peste frappa la ville et le nombre de ses habitants passa d’environ 20.000 à près de 8.000 en mars 1657. En 1689, et 1743, des tremblements de terre mirent à genoux la population.