На 22 июня 1941 года полк в составе 21-й смешанной авиационной дивизии ВВС Одесского военного округа (с началом войны преобразованы в ВВС Южного фронта) вступил в боевые действия против фашистской Германии и её союзников на самолётах И-16. Полк имел на вооружении 70 самолётов И-16 (в том числе 20 неисправных), а также 5 самолётов МиГ-3, для полётов на которых лётчики ещё не были подготовлены. С 22 июня 1941 года по 26 июля 1941 года участвовал в приграничных сражениях в Молдавии.