En 1535 commence sa carrière militaire; avec ses compatriotes Jean d'Andelot et Hugues Cousin, il prend part à la conquête de Tunis. Il participe ensuite aux neuvième et dixième guerres d'Italie. On le retrouve ainsi aux batailles de Landrecies et Muehlberg. Il se distingue tout particulièrement à la bataille d'Innsbruck le 19 mai 1552, où il permet à Charles Quint de s'échapper du champ de bataille et l'escorte en lieu sur. Jean de Poupet ressort auréolé d'un certain prestige. Cette même année, Gilbert Cousin dans sa "Description de la Franche-Comté" décrit Jean de Poupet comme "un brillant chevalier, fort en faveur auprès de l'empereur".