Assegnato alla United States Pacific Fleet, il sommergibile si rivelò troppo grosso e poco maneggevole per poter operare con successo in ruoli di attacco, ma ciò nondimeno vide un intenso impiego operativo nel corso degli scontri del teatro del Pacifico della seconda guerra mondiale contro i giapponesi. Dopo aver partecipato alla battaglia delle Midway nel giugno 1942 e al raid di Makin nell'agosto seguente, il "Nautilus" operò contro il traffico mercantile nemico al largo del Giappone stesso e nella zona delle isole Salomone, oltre che come battello da trasporto durante la campagna delle isole Aleutine. Nel novembre 1943 il sommergibile partecipò alla campagna delle isole Gilbert per poi essere impiegato, tra il 1944 e l'inizio del 1945, in missioni di trasporto di rifornimenti a favore della Resistenza filippina.