Als der Amerikanische Bürgerkrieg begann, kündigte Barton ihren Posten in Washington. Sie meldete sich wie viele andere Frauen freiwillig zur Pflege verwundeter Soldaten. Schnell erkannte sie, dass die Armee in medizinischen Belangen schlecht vorbereitet war. Nach der ersten Schlacht am Bull Run im Juli 1861 gelang es ihr, eine Gesellschaft für die Beschaffung und Verteilung von medizinischen Hilfsgütern an verwundete Soldaten aufzubauen. Barton musste über ein Jahr gegen bürokratische Hemmnisse kämpfen, um eigene Hilfsgüter auf die Schlachtfelder bringen zu dürfen. Ihre Erfahrungen aus Washington waren ihr dabei sicherlich eine Hilfe. Im Juli 1862 erhielt sie endlich die gewünschte Erlaubnis, mit der es ihr möglich war, auf einigen der schrecklichsten Schlachtfelder des Bürgerkrieges Hilfe zu leisten, wie bei der Belagerung von Petersburg und Richmond. Die Herkunft der verwundeten Soldaten spielte für sie keine Rolle, sie half sowohl verwundeten Nord- wie Südstaatenkämpfern. Ohne Wissen von den Erlebnissen Henry Dunants bei der Schlacht von Solferino in Italien im Jahr 1859 war ihr Handeln somit von den gleichen Grundsätzen geleitet, die 1863 auf Initiative von Henry Dunant zur Gründung des Internationales Komitee der Hilfsgesellschaften für die Verwundetenpflege führte, das sich 1876 umbenannte in „Internationales Komitee vom Roten Kreuz“ (IKRK). 1864 wurde sie offiziell von General Benjamin Franklin Butler zur Leiterin seiner Frontspitäler ernannt. Für ihren insgesamt dreijährigen Einsatz an der Front erhielt sie die anerkennenden Beinamen „Engel des Schlachtfeldes“ und „amerikanische Florence Nightingale“.