A 16. század első felében Krakkó erőteljesen ellenállt a reformációval terjedő tanoknak, a városban az „eretnekséggel” szembeni erős cenzúra érvényesült. Az egyetem ennek kapcsán vesztett vonzerejéből, és külföldi diákjainak száma is jelentősen megcsappant. A magyar és német diákoknak fenntartott kollégiumok bezártak. Amint a lengyel nemesség lehetőséget kapott arra, hogy egyetemi képzettség nélkül is betölthessen hivatalokat, a lengyel hallgatók száma is csökkent. 1586-ban az egyetem létrehozta a ma is létező Nowodworski középiskolát, amely Lengyelország egyik legrégibb középfokú oktatási intézménye. A középiskola a 17. században része lett annak az iskolák közötti szövetségnek, amelyet az egyetem igyekezett megszervezni. III. Zsigmond lengyel király uralkodása alatt a támogatását élvező jezsuiták továbbra is erős befolyást igyekeztek gyakorolni az egyetemreb, amely tovább vesztett nemzetközi tekintélyéből. 1655-ben a lengyel–svéd háború idején, a Krakkót megszálló svéd csapatok az egyetemet is feldúlták.