Ambrosini ha esordito in Nazionale maggiore il 28 aprile 1999 a Zagabria contro la Croazia, sotto la direzione di Dino Zoff. Integratosi perfettamente nel centrocampo italiano, nell'estate del 2000 viene scelto da Zoff per il Campionato europeo in Belgio e Paesi Bassi. Fa il suo esordio nella seconda gara della fase a gironi contro il Belgio, entrando all'82 al posto di Stefano Fiore. Gioca titolare solo contro la Svezia, ultima gara della fase a gironi, e poi subentra al 66º minuto nella finalissima contro la Francia, persa al golden gol, durante la quale confeziona un assist smarcante per Del Piero, il quale non finalizza calciando sul portiere.