1524 traten zahlreiche Bürger zur Reformation über. 1529 wurde die Messe abgeschafft, ein reformierter Pfarrer bestellt und die Kirchengüter eingezogen. Die Stadt Diessenhofen unterstützte Zürich im Zweiten Kappelerkrieg 1531. Nach der Niederlage der Reformierten stellten die katholischen regierenden Orte 1532 die Messe wieder her. Das seither bestehende Simultanverhältnis endete erst mit dem Bau der katholischen Kirche 1966/67. Zwischen Diessenhofen und Schaffhausen liegen die im 13. Jahrhundert gegründeten Klosteranlagen St. Katharinental und Paradies, die bis zu ihrer Aufhebung im 19. Jahrhundert von Frauenkonventen besetzt waren.