1521 värvades Castiglione till påven och Kyrkostaten som diplomat. Leo X gav honom "tonsuren", varmed han påbörjade sin ecklesiastikala karriär. Clemens VIII sände honom som "nuncius apostolicus" (ambassadör för Heliga stolen) till Spanien 1524, och från Madrid följde han den tysk-romerska kejsaren Karl V till Toledo, Sevilla, och Granada. Under "Sacco di Roma" kritiserades han av påven för att ha underlåtit att informera om kejsarens intentioner. I ett brev till påven förklarade Castiglione att Kyrkostatens motsägelsefulla politik irriterat kejsaren och gjort hans eget arbete omöjligt. Mot alla odds fick han påvens förlåtelse och hedersbetygelser av kejsaren.