Toisen maailmansodan aikana Jacksonvilleen rakennettiin Mayportin laivastotukikohta ja kaksi laivaston ilmavoimien tukikohtaa. Maailmansodan aikana kaupungin edustalla liikkui saksalaisten sukellusveneitä ja vuonna 1942 maihin tuotiin jopa saksalaisia sabotöörejä. Vuonna 1940 kaupungin asukasluku oli yli 173 000. Väkiluku laski kuitenkin 1950-luvulla kaupungin asukkaiden alkaessa muuttaa esikaupunkialueille. Kaupunki kasvoi huomattavasti, kun se liitettiin hallinnollisesti uusine alueineen Duvalin piirikunnan kanssa. Jacksonvillen merkitys sotilassataman korostui jälleen Persianlahden sodan aikana 1990–1991.