Humayun syntyi vuonna 1508 Kabulissa nykyisessä Afganistanissa ja oli isänsä Baburin toiseksi vanhin poika. Vuonna 1526 hän osallistui isänsä mukana Panipatin taisteluun, josta alkoi Intian valloitus. Sittemmin Humayun toimi isänsä alaisuudessa Kabulin kuvernöörinä palaten Intiaan hieman Baburin kuoleman jälkeen. Humayunista tuli Babutrin perustaman Suurmogulien valtakunnan hallitsija vuonna 1530, mutta hänen valtansa jäi nimelliseksi. Humayun nimitti neljä veljeään eri maakuntien kuvernööreiksi ja kaksi heistä, Kamran ja Askari, liittoutuivat keskenään halliten Punjabia itsenäisesti. Afgaanien vastarintaa moguleja vastaan johtanut Šer Šah Suri hallitsi puolestaan Biharin aluetta. Humayun kärsi myös pahenevasta oopiumiriippuvuudesta. Vuonna 1537 Šer Šah valtasi Bengalin ja kukisti häntä vastaan marssineen Humayunin Chausan taistelussa Gangesin varrella vuonna 1539 ja Kannaujin taistelussa vuoden 1540 puolella. Humayun joutui pakenemaan maastaan eläen kodittomana Sindissä ja Rajasthanissa.