Ter ere van het honderdjarig bestaan organiseerde de CONMEBOL in 2016 de Copa América Centenario. Messi deed tijdens de eerste groepswedstrijd tegen Chili niet mee vanwege een rugblessure. In de tweede wedstrijd kwam hij na 61 minuten in het veld tegen Panama, dat inmiddels met tien man op het veld stond. Argentinië stond op dat moment met 1-0 voor. 26 minuten later was het 4-0 door een hattrick van Messi en uiteindelijk zou het nog 5-0 worden. Het was de eerste keer in de 110-jarige geschiedenis van het Argentijns voetbalelftal dat een speler die inviel een hattrick scoorde. In de met 4-1 gewonnen kwartfinale tegen Venezuela gaf Messi de assist voor de 1-0 en scoorde hij zelf de 3-0. Tijdens de met 0-4 gewonnen halve finale tegen de Verenigde Staten gaf Messi de assists voor de 0-1 en de 0-4. Zelf scoorde hij de 0-2 vanuit een vrije trap. De finale tegen Chili bleef tot en met de verlengingen 0-0. Tijdens een beslissende strafschoppenreeks miste Messi de eerste penalty voor Argentinië, dat de serie met 4-2 verloor. Messi verloor zo voor het derde jaar op rij een finale met de nationale ploeg en ook voor de derde keer een finale van de Copa América, na die in 2007 en 2015. Direct na de wedstrijd kondigde Messi aan te stoppen als international, maar hier kwam hij zeven weken later op terug.