Alexander der Große eroberte die Stadt nach dem Sieg bei Gaugamela und wurde als Befreier begrüßt. Alexander machte Babylon später zum Sitz seines Reiches, wo er dann auch am 10. Juni 323 v. Chr. verstarb. In der Zeit der Diadochen gehörte Babylon zum Seleukidenreich, verlor unter makedonischer Herrschaft jedoch an Macht, als die neue Hauptstadt Seleukia gebaut wurde und viele Bewohner Babylons dorthin umgesiedelt wurden. Umstritten ist, ob Babylon im Hellenismus eine Polis griechischen Typs gewesen ist. Fraglos verfügte Babylon spätestens seit Antiochos IV. über die typischen Bauwerke (Theater, Gymnasion, Agora), überdies werden "politai" ‚Bürger‘ erwähnt, doch andererseits fehlt bislang jeder Hinweis auf die typischen Institutionen einer Polis (Volksversammlung, Rat, Magistrate).