اما در همین هنگام با یورش عثمانیها مواجه شد. سلطان عثمانی به نام سلطان سلیم یکم که شیعیان را کافر می‌دانست، به قصد اشغال کامل ایران با لشکری عظیم به این کشور لشکرکشی کرد. شاه اسماعیل به قصد دفع حمله عثمانیان که پس از فتح دیاربکر مستقیم راه تبریز را در پیش گرفته بودند با جمع‌آوری حدود ۵۰ هزار سرباز در مقابل ۲۰۰ هزار سپاه عثمانی به غرب لشکر کشید و به رغم کمبود نیرو و استفاده سپاه مهاجم از توپخانه در نبرد چالدران در سال ۸۹۳ خورشیدی آنچنان دلیرانه فرماندهی کرد و خود در میدان نبرد جنگید که به‌رغم شکست خوردن، نبرد او در زمره نبردهای بزرگ تاریخ و از افتخارات ایرانیان محسوب می‌شود.