Universitetet grundades av den polska kungen Stefan Batory som "Alma Academia et Universitas Vilnensis Societatis Iesu". 1803 förnyade tsar Alexander I universitetet, som blev en polskspråkig institution. Under 1800-talet växte både den polska och litauiska nationalismen sig stark bland studenter på universitetet. Den ryska statsmakten såg universitetet i Vilnius som centrum för nationalistiska strömningar och efter det misslyckade polska Novemberupproret 1830–31 stängdes lärosätet 1832. Universitetet var stängt fram till slutet av första världskriget och öppnades igen 1919.