Après la mort prématurée du roi en , Catherine de Médicis, régente du Royaume, mène une politique de tolérance envers le culte réformé. Le duc de Guise et son parti, opposés à cette politique, sont écartés de la cour et du pouvoir. Le , sur les terres du duc en Champagne, des affrontements dont les responsabilités sont discutées par les historiens ont lieu entre ses troupes et des protestants qui célébraient leur culte (interdit) dans une grange. Plus de sont tués et 100 sont blessés. Cette affaire, qu'on appelle le massacre de Wassy, provoque une prise d’armes des protestants et déclenche la première des guerres de Religion. Commandant l'armée du roi, le duc est vainqueur des huguenots à Rouen, en , et à Dreux, en décembre de la même année ; puis il tente de reprendre Orléans. Pendant le siège d'Orléans, un gentilhomme protestant, Jean de Poltrot de Méré, lui tire un coup de pistolet le . Grièvement blessé, le duc de Guise meurt quelques jours plus tard. Après sa mort, dont les Guise accusent l'amiral de Coligny, Théodore de Bèze et , le calme revient pour quelque temps dans le royaume.