В результаті Реформації, що почалася в 1517 р., імперія виявилася розколеною на лютеранську північ і католицький південь. Протестантизм у першій половині XVI століття прийняли багато великих князівств (Саксонія, Бранденбург, Курпфальц, Брауншвейг-Люнебург, Гессен, Вюртемберг), а також найважливіші імперські міста — Страсбург, Франкфурт-на-Майні, Нюрнберг, Гамбург, Любек. Католицькими залишилися церковні курфюрства Рейна, Брауншвейг-Вольфенбюттель, Баварія, Австрія, Лотарингія, Аугсбург, Зальцбург і деякі інші держави. Конфесійний розкол імперії в умовах відродження претензій на гегемонію в Європі імператора Карла V (Італійські війни), а також політики централізації імперських інститутів, що проводилася ним, призвів до загострення внутрішнього положення Німеччини і зростання конфлікту між країнами імперії і імператором. Невирішеність церковного питання і провал спроб імператора досягти компромісу з теологічних питань на Аугсбурзькому рейхстазі 1530 р. викликали оформлення двох політичних союзів в Німеччині — протестантського Шмалькальденського і католицького Нюрнбергського союзу. Їх протистояння вилилося в Шмалькальденську війну 1546–1547 рр., що потрясла конституційні основи імперії. Хоча Карл V отримав перемогу у війні, незабаром проти нього об'єдналися всі основні політичні сили імперії, невдоволені універсалізмом політики Карла, що бажає створити «всесвітню імперію» на основі своїх німецьких, австрійських і іспанських володінь, і непослідовністю у вирішенні церковних питань. У 1555 р. на рейхстазі в Аугсбурзі був укладений Аугсбурзький мир, який визнав лютеранство як легітимну релігію і гарантував свободу віросповідання для імперських класів, за принципом «"кого країна, того і віра"» (). Карл V відмовився підписати цю угоду і незабаром склав з себе повноваження імператора.