Am 10. Oktober 1806 nahm Gneisenau unter dem Befehl des Prinzen Louis Ferdinand von Preußen im Gefecht bei Saalfeld erstmals an Kampfhandlungen gegen die Truppen Napoleons teil und wurde verwundet. Trotzdem kämpfte er in der Doppelschlacht bei Jena und Auerstedt am 14. Oktober 1806 im Gefolge des preußischen Generals Ernst von Rüchel. Nach der Niederlage der preußischen Truppen entkam Gneisenau zum Sammelpunkt der geschlagenen preußischen Armee nach Graudenz. Er wurde am 17. Dezember 1806 zum Major befördert und mit seinem Bataillon an die russische Grenze in (Preußisch-)Litauen verlegt. In Denkschriften analysierte Gneisenau die Fehler der Preußen in den Schlachten bei Jena und Auerstedt und forderte eine Reform der Taktik. Vom König Friedrich Wilhelm III. von Preußen wurde Gneisenau auf Empfehlung des Generals Ernst von Rüchel, inzwischen Generalgouverneur der Provinz Preußen, als neuer Kommandant in die belagerte pommersche Festung Kolberg entsandt, wo er am 29. April 1807 auf dem Seeweg über die Ostsee eintraf. Gneisenau organisierte die erfolgreiche Verteidigung der Festung auch durch die Einbeziehung patriotischer Bürger um den Bürgerrepräsentanten Joachim Nettelbeck. Der Waffenstillstand zwischen Preußen und Frankreich beendete den Kampf um Kolberg am 2. Juli 1807. Gneisenau war bereits am 13. Juni 1807 zum Oberstleutnant befördert worden und wurde auf Wunsch von Scharnhorst in die Militär-Reorganisationskommission berufen.