Setelah pembentukan Federasi Malaysia pada 1963, Johor Bahru masih menjadi ibu kota negara bagian Johor, dan pembangunan pun terus digalakkan, termasuk dengan memperluas kota dan mendirikan kawasan-kawasan industri yang baru. Konfrontasi dengan Indonesia tidak berdampak secara langsung terhadap Johor Bahru karena tempat pendaratan utama pasukan Indonesia di Johor adalah di Labis dan Tenang. Hanya terdapat satu organisasi mata-mata Indonesia yang aktif di kota tersebut pada masa ini, yang dikenal dengan nama "Gerakan Ekonomi Melayu Indonesia" (GEMI). Organisasi tersebut sering meminta orang-orang Indonesia yang tinggal di Johor Bahru untuk memberikan informasi hingga terjadinya pengeboman MacDonald House di Singapura pada 1965. Pada awal era 1990-an, Johor Bahru mengalami perkembangan pesat, dan secara resmi memperoleh status kota pada 1 Januari 1994. Alun-alun utama di Johor Bahru, yaitu Alun-Alun Kota Johor Bahru, dibangun untuk merayakan peristiwa ini. Distrik bisnis pusat kemudian dibangun di sekitaran Jalan Wong Ah Fook di pusat kota Johor Bahru dari pertengahan era 1990-an. Pemerintah negara bagian dan federal sendiri terus menggelontorkan dana yang besar untuk membangun kota ini - terutama setelah 2006, ketika kawasan ekonomi Iskandar Malaysia dibentuk.