Während des vom Markgrafen Albrecht Alcibiades von Kulmbach provozierten Zweiten Markgrafenkriegs (1552–1555), auch Bundesständischer Krieg genannt, wurden 1554 die Burgen auf dem Rauhen und dem Kleinen Kulm etwa ein Jahr lang von Truppen der Reichsstadt Nürnberg, Bambergern, Würzburgern und Bayern unter Führung des churfürstlichen Landrichters Hans Umseher von Waldeck belagert, die Bewohner ausgehungert und die Gebäude völlig zerstört. Der Festungskommandant von Heydenab übergab die Festung am Rauhen Kulm am 28. Juni 1554. Anschließend wurde sie mit Schrauben gesprengt, die dreifachen Mauern wurden geschleift und zerstört. In diesem Krieg wurden auch die Städte Kulmbach und Bayreuth niedergebrannt. Anschließend verwalteten die Amtsleute der Markgrafen von der Kulmstadt aus das umliegende Land. Um die Stadtmauern zu verstärken, wurden teilweise Steine der mittelalterlichen Wälle beider Burganlagen in die Stadt geschafft. Neustadt am Kulm blieb nach der Reformation bis in die Gegenwart evangelisch, während das Umland, beispielsweise die Städte Eschenbach, Grafenwöhr, Kemnath und die Gemeinde Speichersdorf um das Jahr 1620 und später mehrmals das Bekenntnis wechselten. Die konsequente Ausrichtung der Stadt am evangelisch-lutherischen Bekenntnis zeigt sich auch daran, dass Willibald Caspari, der von 1560 bis 1589 Pfarrer in Neustadt am Kulm war, Mitunterzeichner der Formula Concordiae war. Zusammen mit Filchendorf und dem Weiler Scheckenhof gehörte die Stadt zwischen den Kulmen fortan zum Markgraftum Brandenburg-Ansbach-Bayreuth, auch Fürstentum Ansbach genannt.