Gedurende de Burgeroorlog werd Barton een verpleegkundige in het ziekenhuis in Washington D.C. Na het overlijden van haar vader ging zij mee het veld in, waar zij begon als distributeur van voorraden voor het Noordelijke leger. Omdat zij zich in deze functie van onvoldoende waarde achtte, werd zij een onafhankelijke verpleegster en verkreeg ook toestemming om aan het front te mogen gaan werken. Zij hielp tijdens de Eerste Slag bij Bull Run en later ook bij de slag bij Antietam gewonde soldaten, zocht er naar vermisten en distribueerde voorraden. In december dat jaar vond bij Fredericksburg in Virginia de bekende slag bij Fredericksburg plaats, ook daar was Barton bij. Gedurende de oorlog hielp zij zowel soldaten van het Noordelijke, als van het Zuidelijke leger. Barton hielp de gewonde soldaten en krijgsgevangenen met voorraden van het Noordelijke leger, maar ook met hulpmiddelen die zij zelf heeft aangeschaft. Na de oorlog kreeg zij door het Congres haar onkosten vergoed. Op de slagvelden verkreeg zij al snel de bijnaam "The Angel of the Battlefield". In 1864 werd zij aangewezen als toezichthouder van het Army of the James. Nadat haar diensten niet meer nodig waren als oorlogverpleegster, ging zij voor het Ministerie van Oorlog werken. Aldaar probeerde zij soldaten met hun familie te herenigen en uit te zoeken waar vermiste soldaten zich bevonden. Ook gaf zij lessen over de Burgeroorlog. In maart 1865 wees president Abraham Lincoln Barton aan om vermiste soldaten op te gaan speuren. Het was haar taak om verontruste familieleden en vrienden te vertellen waar zij hun vermiste persoon konden vinden. Barton moest hiervoor in Annapolis in Maryland lijsten van gevangenen en omgekomen soldaten doorlezen. Nadat zij deze taak op zich heeft gekregen, richtte zij het Bureau voor Documentatie en Vermiste Manschappen van de Legers van de Verenigde Staten op. Dit bureau publiceerde ook de lijsten van vermisten.