Nach einem wechselhaften Start in die Saison 2016, konnte Muguruza erst auf Sandplatz wieder an die Leistungen der vergangenen Saison anknüpfen. So gelang ihr in Rom der erstmalige Sprung ins Halbfinale, in dem sie Madison Keys verlor, bevor sie bei den French Open nach einem Zweisatzsieg im Finale gegen Serena Williams ihren ersten Grand-Slam-Titel erringen konnte. Im gesamten Turnierverlauf gab sie dabei nur einen Satz in ihrer Auftaktpartie ab. Anschließend tat sich Muguruza schwer, die gezeigten Leistungen zu wiederholen. Nach einem frühen Ausscheiden in der zweiten Runde von Wimbledon, erreichte sie bei den Olympischen Spielen 2016 in Rio de Janeiro im Einzel an Nummer Drei gesetzt durch Siege über Andreea Mitu und Nao Hibino die dritte Runde, in der sie der späteren Goldmedaillengewinnerin Mónica Puig unterlag. Im Doppel ging sie mit Carla Suárez Navarro zusammen an den Start. An Position Vier gesetzt, scheiterten die Beiden jedoch im Viertelfinale an Jekaterina Makarowa und Jelena Wesnina. Bis zum Jahresabschluss erzielte sie nur noch ein weiteres Halbfinale in Cincinnati, in dem sie Karolína Plíšková unterlag. Als Weltranglistensiebte qualifizierte sie sich das zweite Jahr in Folge für die WTA Championships, doch schied sie nach nur einem Sieg über Swetlana Kusnezowa sowie zwei Niederlagen gegen Plíšková und Agnieszka Radwańska diesmal in der Vorrunde aus.