De TB-3 werd ingezet tijdens de Slag bij Halhin Gol tegen Japan en in de Winteroorlog met Finland. Hoewel het officieel uit dienst werd genomen in 1939 waren er aan het begin van de oorlog op 22 juni 1941 nog 551 TB-3’s in gebruik, waarvan 25 exemplaren bij de Sovjet-marine. Ze waren ver van het westfront gestationeerd waardoor weinigen werden vernietigd tijdens de eerste Duitse luchtaanvallen. Op 23 juni voerden de eerste TB-3's nachtvluchten uit. Door een tekort aan gevechtsklare vliegtuigen werden ze ook overdag ingezet, maar door het gebrek aan een escorte-jagers waren de verliezen als gevolg van vijandelijke jagers en grondvuur hoog. Tot 1943 nam het deel aan alle grote veldslagen, waaronder de eerste Slag om Smolensk, de Slag om Moskou, de Slag om Stalingrad, het Beleg van Leningrad en de Slag om Koersk. Op 1 juli 1945 had het luchtleger nog tien TB-3's in actieve dienst.