南北戦争中、工廠は再びワシントン防衛の重要地点となった。工廠長であったフランクリン・ブキャナンは、ジョン・ダールグレン () 中佐に後を委ねて工廠を去り、南軍に身を投じた。エイブラハム・リンカーン大統領は、ダールグレンに絶大な信頼をおいており、しばしば工廠を訪れていた。有名な装甲艦モニターは、南軍の装甲艦バージニアとのハンプトン・ローズ海戦の後、ワシントン海軍工廠で修理された。リンカーン大統領暗殺事件の共謀者達は逮捕の後、工廠へと連行された。実行犯のジョン・ウィルクス・ブースの遺体は工廠に係留されていたモニター艦モントーク () 上で検死され、本人確認がなされた。