С восхождением на трон Карла I в 1516 году и его избранием императором Священной Римской империи в 1519, Франциск I, который оказался со всех сторон окружён территориями Габсбургов, вторгся в испанские владения в Италии в 1521 году, и начал второй этап франко-испанского конфликта. Война завершилась катастрофой для Франции, которая потерпела поражения при Бикокке (1522), Павии (1525, где Франциск попал в плен) и Ландриано (1529), после чего Франциск вернул Милан Испании.