בתקופת המנדט חלה עלייה נוספת בתדירות נסיעת הרכבות במסילת העמק. בין חיפה לסמח' נסעו שתי רכבות בכל יום, כאשר לפחות אחת מהן המשיכה עד לדמשק. בקו עכו-תל חנן הופעלו שלוש רכבות יומיות ובקו חיפה שכם הופעלה רכבת שבועית שעברה דרך עפולה. בתקופת המאורעות (1936–1939) נסעו בקו רכבת העמק חמש רכבות ביום כאשר רכבת הבוקר המוקדמת החלה את מסעה מקרית חרושת והביאה פועלים לחיפה ואילו רכבת הערב החזירה את הפועלים לקריית חרושת. בתקופת מלחמת העולם השנייה הגיעה תנועת הרכבות בקוי העמק לשיא: שש רכבות יומיות בין חיפה לצמח וחזרה. בעת המערכה בסוריה ובלבנון היא פלישת הצבא הבריטי מארץ ישראל לסוריה ולבנון, על מנת לשחררן משלטון וישי, שנמשכה מ-8 ביוני עד 14 ביולי 1941, שימשה רכבת העמק אמצעי להובלת גייסות וכלי נשק ולפינוי פצועים.