Nachdem 1663 der Lucasische Lehrstuhl für Mathematik eingerichtet wurde, wechselte Barrow 1664 auf diesen und gab seine Regius-Professur für Griechisch auf. Im selben Jahr gab er seine Ordination auf (aus unbekannten Gründen) – der Lucasian-Professor war künftig von der eigentlich obligatorischen Ordination für Professoren befreit aufgrund einer speziellen Deklaration, die Barrow erwirkte. Seine ersten Mathematikvorlesungen gab er im Frühjahr 1664 und er setzte diese bis 1667 fort, unterbrochen von längeren Zeitabschnitten, in denen die Universität wegen der Pest geschlossen war. Sein berühmtester Schüler war dabei wahrscheinlich Isaac Newton. 1668/69 gab Barrow noch Optik-Vorlesungen (überwiegend geometrische Optik), die Newton ebenfalls wahrscheinlich hörte.