V roce 1806 se zavázal Rusku, že neposkytne Napoleonovi vojáky pro jeho plánovaný vpád do této země. Později vydal Francii ultimátum, ve kterém stanovil požadavek na stažení všech francouzských vojsk z jižního Německa. Toto ultimátum přišlo v době po porážce Rakušanů a Rusů v bitvě u Slavkova a francouzského triumfu, proto ho Napoleon ignoroval a místo toho vyhlásil dne 9. října 1806 Prusku válku. V bitvě u Saalfeldu z 10. října téhož roku padl u dvora velmi vlivný princ Ludvík Ferdinand, synovec Fridricha II. V následující bitvě u Jeny byla pruská armáda zničena a Fridrich Vilém musel uprchnout do Memelu ve Východním Prusku. Dne 9. července 1807 byl nucen podepsat tzv. Tylžský mír, ve kterém ztratilo Prusko všechna území západně od řeky Labe a také velkou část území, získaného během dělení Polska.