Kurz nach Beginn des Zweiten Weltkriegs wurde die Stadt im Rahmen des Überfalls auf Polen Mitte September 1939 von deutschen Truppen eingenommen, nach der geheimen Absprache im deutsch-sowjetischen Nichtangriffspakt jedoch am 22. September 1939 den Truppen der Sowjetunion übergeben (amtlicher Name "Беласток"/"Belastok"). Im Zuge des am 22. Juni 1941 begonnenen deutschen Angriffs auf die Sowjetunion wurde Białystok erneut von der Wehrmacht besetzt; am 27. Juni 1941 brannte das deutsche Polizei-Bataillon 309 die Große Synagoge von Białystok nieder, in die sie zuvor Hunderte Juden getrieben hatten. Die neuen Machthaber errichteten hier den Bezirk Bialystok und das Ghetto Białystok. Die meisten der damals circa 43–60 Tausend jüdischen Einwohner wurden in die Vernichtungslager Treblinka und Auschwitz verbracht und dort ermordet. Białystok war Amtssitz des Chefs der Zivilverwaltung und des Befehlshabers der Sicherheitspolizei und des SD, der die unterstellten Kommandeure (KdS) und Einsatzgruppen der Sicherheitspolizei und des SD befehligte.