Επειδή όμως μεγάλες δυσχέρειες παρουσιάστηκαν στο Βυζάντιο για την επικύρωση της Ένωσης από τη ρωμαλέα αντίσταση ανθενωτικών όπως ο Μάρκος Ευγενικός κι ο Γεννάδιος Σχολάριος, το 1451 ο νέος αυτοκράτορας Κωνσταντίνος ΙΑ' Παλαιολόγος ζήτησε βοήθεια από τον νέο Πάπα Νικόλαο Ε' . Αυτος δε μπορούσε να βρει καλυτερο από τον Ισίδωρο, που βεβαια μιλούσε ελληνικά κι ηταν φημισμένος για την πολυμάθεια και την ευγλωττία του. Μαζί με τον άλλο Έλληνα καθολικό Λεονάρδο το Χίο, έπλευσαν από τη Ρώμη με 200 στρατιώτες, με σταθμό στη Χίο κι έφτασαν στην Κωνσταντινούπολη το Νοέμβρη 1452 για να πείσουν τον κλήρο να παραδεχτεί τη σύνοδο και τις αποφάσεις της. Φτάνοντας ο Ισίδωρος έγινε δεκτός από τον αυτοκράτορα Κωνσταντίνο ΙΑ' Παλαιολόγο, και μαζί τέλεσαν θεία λειτουργία στην Αγιά Σοφιά στις 12 Δεκεμβρίου, στην οποία αρνήθηκε να παραστεί ο Πατριάρχης και πολλοί κληρικοί. Κάποιοι ωστόσο πήγαν από σεβασμό και φόβο στον αυτοκράτορα. Κατά τη θεία Λειτουργία ο Ισίδωρος μνημόνευσε τον Πάπα και στο Πιστεύω προσέθεσε τη φράση "και εκ του Υιού εκπορευόμενον", προκαλώντας βίαιες αντιδράσεις εντός κι εκτός της εκκλησίας. Πολλοί δεν πήραν αντίδωρο, θεωρώντας το μιαρό, όπως γράφει ο ιστορικός Δούκας. Ο Ισίδωρος δεν πτοήθηκε, διέμεινε στην Πόλη και λίγους μήνες μετά, τη μέρα της Αλώσεως 29 Μαΐου 1453 πολέμησε στα τείχη τους εισβολείς. Στην προσπάθειά του να ξεφύγει, βρήκε ένα πτώμα, άλλαξε τα ρούχα καρδιναλίου του με τα σκισμένα ενός αγνώστου και μεταμφιεσμένος αγνώριστος ζητιάνος χάθηκε στο πλήθος που έτρεχε. Οι Τούρκοι όταν βρήκαν το πτώμα με ρούχα καρδιναλίου, νομίζοντας ότι πράγματι ήταν καρδινάλιος του έκοψαν το κεφάλι και το περιέφεραν πάνω σε κοντάρι θριαμβευτικά μέσα στην Πόλη. Τη μαρτυρία για το επεισόδιο αυτό καταγράφει ο ιστορικός Σάθας από τον Αινεία Σίλβιο, προφανώς εννοώντας τον πάπα Πίο Β, αργότερα εκκλησιαστικό προϊστάμενο του Ισιδώρου που του την είχε εκμυστηρευτεί.