Nel 1509, durante la Guerra della Lega di Cambrai, le forze veneziane in ritirata dopo la sconfitta nella battaglia di Agnadello, si asserragliarono al comando di Niccolò di Pitigliano nel castello di Mestre, che divenne l'estremo baluardo sulla terraferma e da dove partirono le spedizioni in soccorso di Treviso assediata, e alla riconquista di Padova, occupata dagli Imperiali. Nel 1513 Mestre dovette però affrontare nuovamente l'assalto di Spagnoli e Tedeschi, che conquistarono il castello, saccheggiando e incendiando il centro abitato. A onore dell'eroica resistenza, la città ricevette dalla Serenissima il titolo di "Mestre Fidelissima", che ne è ancora il motto.