En 1509 estalló el más grande de los conflictos terrestres que involucraron a Venecia: la Guerra de la Liga de Cambrai, durante la cual Venecia debió aguantar a las mayores potencias europeas (Francia, el Sacro Imperio y España). La falta de apoyo de Pitigliano en la retaguardia veneciana comandada por su primo Bartolomeo durante la batalla de Agnadello, en la fase inicial del conflicto, causó a Venecia una derrota de tal magnitud que causó la pérdida total de las posesiones del continente y la retirada a la laguna.