Während des Dreißigjährigen Kriegs kam es zum Niedergang der Stadt. So wurde Zerbst, nachdem es vom Kriegsgeschehen zunächst verschont worden war, 1626 von den unter dänischem Befehl stehenden Truppen Ernst von Mansfelds gestürmt, verheert und besetzt. Die während des Angriffs in die Stadtmauer geschlagene Bresche am Franziskanerkloster (dem heutigen Francisceum) ist noch heute mit einer Inschrift gekennzeichnet. Nach der Niederlage Mansfelds in der Schlacht bei Dessau besetzten kaiserliche Truppen unter Wallenstein die Stadt. Wie Mansfeld wohnte auch Wallenstein für kurze Zeit im „Neuen Haus“ (zerstört 1945) am Zerbster Markt und erlegte der Stadt zur Strafe für die „Unterstützung“ der protestantischen Truppen hohe Kontributionen auf. In den folgenden Jahren bis zum Ende des Kriegs wurde Zerbst wiederholt von verschiedenen Heeren besetzt, wodurch sie letztendlich wirtschaftlich ruiniert wurde und verarmte. Weiterhin wüteten mehrere durch die Besatzungstruppen in die Stadt getragene Pestepidemien in der Stadt, denen wahrscheinlich mehr als jeder dritte Einwohner zum Opfer fiel.