Ahameniş İmparatorluğu'nu yeniden örgütlemeye girişen I. Darius döneminde kent, Kapadokya satraplığının hâkimiyet bölgesi içine alınmış ve tiran unvanı taşıyan askerî valiler tarafından yönetilmeye başlanmıştır. MÖ 331 yılında İskender'in Persleri Gaugamela Muharebesi'nde yenilgiye uğratıp Ahameniş İmparatorluğunu Makedonya topraklarına katmasıyla birlikte Samsun da Makedon hâkimiyetine girmiş, böylece kentte askerî temelli bir yönetim anlayışından tekrar demokratik yönetime dönülmüştür. Bu dönemden itibaren şehir o döneme kadar Anadolu'nun kuzeyindeki en önemli liman şehri olan Sinopi'nin bu üstünlüğünü eline geçirmeye başlamış ve Orta Asya'dan uzanan önemli bir ticaret yolu buraya bağlanır hâle gelmiştir. Orta Asya'dan Fırat'a kadar gelen mallar Mazaka-Sebastea-Komana Pontiki-Laodikea hattını takip ederek şehre ulaşmakta ve buradan denizyoluyla batıya aktarılmaktaydı.