Booker je hlavním protagonistou hry a první hlavní postavou série Bioshock s jasně vymezenou identitou a hlasovým projevem. Během událostí hry je mu 41 let. DeWitt se zúčastnil jako člen 7. kavalerie bitvy u Wounded Knee a pro svoje hrůzné činy byl ostatními spolubojovníky přezdíván "The White Injun". Masakr ho natolik poznamenal, že si nebyl schopen udržet místo u detektivní společnosti Pinkerton a pro svoje extrémní metody byl propuštěn. Když se odmítl dát na křesťanskou víru, stal se soukromým vyšetřovatelem, propadl alkoholu a sázkám. Dluhu, jež se mu nastřádal, se zbavil prodejem své dcery Anny Robertu Lutecovi a ve výčitkách žil dalších dvacet let, než byl sourozenci Lutecovými přenesen do Comstockovy dimenze skrze trhlinu. Tento přesun způsobil DeWittovi vytvoření umělých vzpomínek, které mu umožnily asimilovat se do této reality. DeWittovi bylo zadáno, aby z létajícího města Columbia přivedl do New Yorku tajemnou dívku Elizabeth a splatil další nahromaděné dluhy. Podle iniciálů „AD“, které si Booker vyryl do ruky jako vzpomínku na svoji dceru, je však ve městě rozpoznán a musí se k Elizabeth probojovat. Únik se jim sice nepodaří, ale vyvolají ve městě občanskou válku mezi Zakladateli a dělnickým hnutím Vox Populi a zničí Siphon, který ovládá Elizabethiny schopnosti. Na konci hry je Booker utopen několika verzemi Elizabeth z jiných dimenzí, aby nemohlo dojít ke křtu, jenž by z Bookera vytvořil věřícího Zacharyho Comstocka a Elizabeth tak byla jako dítě unesena. Samotný Booker DeWitt zůstává existovat pouze v jediné realitě se svojí dcerou Annou.