במשך שני דורות התנהלו הדברים על מי מנוחות והפרסים לא התערבו בענייני הפנים של היוונים, אך לבסוף פרץ בשנת 500 לפנה"ס מרד גדול, הידוע בשם המרד האיוני, כנגד הפרסים. הרודוטוס הוא המקור המשמעותי היחיד למהלכי המרד. על פי הרודוטוס אריסטגורס (Aristagoras Αρισταγόρας), החתן של היסטיאיוס (Histiaeus Ἱστιαῖος), מושל מילטוס היה יוזם המרד כי לא יכול היה לשלם את חובו על איסוף צבא לכיבוש נקסוס. עם זאת, נראה שהיו סיבות עמוקות יותר למרד זה.