Con la Lazio cosechó su etapa más exitosa la temporada 1999-2000. El equipo dirigido por Sven-Göran Eriksson se adjudicó la Serie A tras disputarle el campeonato a la Juventus hasta la última jornada, en la cual la derrota de los "bianconeros" en Perugia y la victoria de la Lazio les otorgaba a los romanos su segundo "scudetto" en la historia (26 años después del primero). Además aquella campaña el equipo también se proclamó campeón de la Copa de Italia, de la Supercopa de Italia y de la Supercopa de Europa. En aquella Lazio, además del propio Simeone, destacaban jugadores como Nedved, Boksic, Salas, Verón, Stankovic, Mihajlovic o Nesta, entre otros. A finales de 2001, en un partido frente al PSV en Eindhoven, sufrió una importante lesión de menisco y ligamento cruzado, lo que hizo peligrar su presencia en el mundial de Japón, sin embargo, se recuperó a tiempo para disputar el torneo, donde el equipo argentino no pasó de la primera fase.