Sus padres la amaban a pesar de su inevitable decepción de que ella no era el heredero masculino que esperaban. Fue criada bajo la supervisión de su institutriz, Isabelle de Crissé. Cuando su madre aún estaba embarazada de 7 meses, el 24 de agosto de 1572, dio inicio la masacre del día de San Bartolomé. En el momento de su nacimiento, la salud de su padre se estaba deteriorando rápidamente. Cuando tenía menos de dos años, su padre, el rey Carlos IX, murió, y su tío se convirtió en Enrique III de Francia. Apenas un año después, su madre regresó a Viena después de que Maximiliano II le devolviera su dote, mientras que María Isabel, se quedó en Francia. Madre e hija se despidieron en el castillo de Amboise, el 28 de agosto de 1575 para no volver a verse.