С 1535 по 1547 год Штифель был протестантским пастором в Хольцдорфе. К этому периоду относятся его главные труды в области математики. Затем началась Шмалькальденская война, и Штифелю вновь пришлось бежать (в Кёнигсберг). В 1559 году он переехал в Йену, где стал первым профессором математики в университете города.