B-17 gjorde primært tjeneste ved United States Army Air Forces (USAAF) og blev benyttet til dagangreb under 2.verdenskrigs strategiske bombekampagner imod tyske industrielle og militære mål. USAs Eighth Air Force, baseret på mange forskellige flyvepladser i det sydlige og mellemste England, og Fifteenth Air Force, baseret i Italien, komplementerede RAF Bomber Commands natlige fladebombning under arbejdet med at sikre luftoverlegenhed over byerne, fabrikkerne og krigszonerne i Vesteuropa, unde forberedelserne til invasionen af Frankrig i 1944. B-17 deltog også i noget mindre grad i Stillehavskrigen tidligt under 2. verdenskrig, hvor flyet udførte angreb på japansk skibstrafik og mod japanske flyvepladser.