Ainsi, lors du Euro 2000, Nesta, qui joue alors toujours à la Lazio, fait partie de l'effectif qui perd en finale face à la France. Il participe à toutes les rencontres de son pays et fait partie, avec Fabio Cannavaro et Mark Iuliano, d'une impressionnante défense centrale à trois concoctée par le sélectionneur Dino Zoff. L'Italie atteint la finale en n'ayant encaissé que deux buts, battant même au passage les hôtes belges et hollandais. En finale, les Italiens ouvrent le score à la par Marco Delvecchio. Ils se créent même plusieurs occasions additionnelles... avant de s'effondrer dans les arrêts de jeu puis en prolongations, quand Sylvain Wiltord et David Trezeguet viennent donner la victoire aux Bleus.