Catherine miệt mài nỗ lực bảo vệ ngai vàng, nhưng ba người con yếu đuối của bà gánh chịu nhiều thất bại khi họ trị vì nước Pháp trong một giai đoạn nhiễu nhương, đánh dấu bởi những cuộc nội chiến và Chiến tranh tôn giáo Pháp nối tiếp nhau bùng nổ. Lúc đầu, Catherine muốn thỏa hiệp với phong trào Huguenot bằng cách nhượng bộ họ có giới hạn; nhưng bà lại không chịu chấp nhận những nguyên tắc thần học căn cốt đối với người Huguenot, trong đó có quyền tự do thờ phụng dành cho mọi người. Trong tâm trạng hoang mang và giận dữ, Catherine từ bỏ lập trường hòa giải và phục hồi các biện pháp cứng rắn đối với những người bất đồng về niềm tin tôn giáo. Do đó, Catherine bị xem là người chịu trách nhiệm về những hành động tàn bạo của vương quyền, đặc biệt là vụ Thảm sát Ngày lễ Thánh Barthélemy năm 1572 khi hàng ngàn người Huguenot bị tàn sát ở Paris và trên khắp nước Pháp.