Bei dem EU-Mitgliedschaftsreferendum 2016 votierten Schottland und Nordirland, anders als England und Wales, für den Verbleib in der EU; Schottland war der einzige Landesteil, in dem alle Wahlkreise ausnahmslos mit "Remain" (Verbleib in der EU) stimmten. Sturgeon erklärte, es sei demokratisch inakzeptabel, dass Schottland gegen seinen erklärten Willen aus der EU herausgenommen werde. Ein zweites Unabhängigkeitsreferendum sei „auf dem Tisch“. Sie berief ein Expertengremium ein, um über die Folgen des Brexit für Schottland zu beraten. Am 29. Juni traf sie in Brüssel mit Jean-Claude Juncker und Martin Schulz zusammen, der Präsident des Europäischen Rats, Donald Tusk, lehnte ein Treffen mit ihr jedoch ab. Am 15. Juli 2016 traf sie mit der neuen britischen Premierministerin Theresa May zusammen, die das von Sturgeon ins Gespräch gebrachte neue Referendum über die schottische Unabhängigkeit klar ablehnte.