Robert Pfleger wurde als Sohn des Kaufmanns Otto Pfleger und der Eusebia geb. Rüger in der elterlichen Wohnung in der Markgrafenstraße 15 in der Friedrichstadt geboren. Der Vater war Protestant, die Mutter Katholikin. Nach dem Abitur am Gymnasium Steglitz, begann er 1924 sein Chemiestudium an der Berliner Friedrich-Wilhelms-Universität. Gemeinsam mit seinem lebenslangen Freund Ernst Boris Chain war er dort Schüler von Max Bodenstein, Herbert Freundlich, Fritz Haber, Walther Nernst, Robert Pschorr, Wilhelm Schlenk, Otto Warburg und Fritz Micheel. 1929 schloss Pfleger sein Studium mit der Promotion ab und arbeitete bis 1931 als Wissenschaftlicher Assistent am Kaiser-Wilhelm-Institut für Chemie.