Babilónia continuou a ser uma cidade importante no Império Aqueménida, apesar de não ser a capital, e a região babilónica era um território crucial, onde a nobreza persa dispunha de vastos domínios. Em , Babilónia abriu as suas portas ao rei macedónio Alexandre, o Grande depois da sua vitória em Gaugamela e os invasores são manifestamente bem acolhidos pela população. Alexandre patrocinou a restauração de canais e do Esagila; depois da sua expedição à Índia, instalou-se na cidade durante alguns meses, antes de morrer em junho de