ב-5 באוקטובר 1939 נאסר - כאחד ממ"ג אסירי ההגנה - והועמד לדין על החזקת נשק בלתי חוקית. דיין נדון לעשר שנות מאסר, שאותן החל לרצות בכלא עכו ובמחנה המעצר מזרעה. מלחמת העולם השנייה הביאה לכך שהצבא הבריטי היה זקוק לתמיכת היישוב, והחל שיתוף פעולה בין הצבא הבריטי ובין המחתרות היהודיות. החל גיוס של בני היישוב לצבא הבריטי, ובמסגרת זו הוסכם בין הנהגת היישוב ובין שלטונות המנדט הבריטי על שחרורם של המ"ג בפברואר 1941. כאשר שוחרר דיין מן הכלא היה המצב במזרח התיכון מסוכן. בעיראק החל מרד רשיד עאלי אל-כילאני הפרו נאצי נגד השלטון הבריטי, במדבר המערבי התקדמו צבאות הציר לעבר מצרים וארץ ישראל, ובסוריה ובלבנון, שהיו תחת מנדט צרפתי, שלט צבא צרפת של וישי אשר סר למרות משטר שיתוף הפעולה של המרשל פטן. בנסיבות אלו, החלו יצחק שדה ואחרים לארגן כוח (לימים נודע כהפלמ"ח) שיסייע לבריטים בפעולות סיור ולחימה זעירה. דיין מונה על ידי יצחק שדה למפקד פלוגה ב' של הכוח (על פלוגה א' פיקד יגאל אלון). ביוני 1941 במסגרת הפלישה לסוריה וללבנון, היה אמור לנוע על כביש החוף צפונית לראש הנקרה כוח של הדיוויזיה ה-7 האוסטרלית שמטרתו למנוע מהצרפתים לפוצץ את הגשרים שעל נהר הליטני וכך לאפשר תנועה חופשית של הכוחות הבריטיים על כביש החוף לביירות. דיין צורף אל הכוח האוסטרלי כמורה דרך, ובמהלך פעולה זו פגע צלף צרפתי במשקפת שאחז דיין, ורסיסי הזכוכית שנתזו ממנה פגעו בעינו השמאלית והוא איבד את ראייתו בה. מאז נהג דיין לכסות ברטייה את מקום הפגיעה, ומאז אותה פעולה היא הפכה להיות לו מעין "סמל מסחרי" המזוהה עם דמותו. לאחר שהחלים מפצעיו חזר דיין למשקו בנהלל, והמשיך בפעילות במסגרת "ההגנה". ב-1945 עבר לתל אביב, ובדצמבר 1946 נסע לבזל לשמש כציר בקונגרס הציוני. במשך השנים האלו (1939 - 1945) נולדו שלושת ילדיו של דיין - יעל הבכורה, אהוד (אודי) ואסף (אסי).