Nel corso delle Guerre d'Italia la tradizione militare e cavalleresca del casato si espresse in molti condottieri e capitani di ventura. In particolare i cugini Prospero e Fabrizio, protagonista quest'ultimo del dialogo sull"'Arte della guerra" di Machiavelli, furono al servizio degli Asburgo e tra i principali artefici della vittoria spagnola contro la Francia nel conflitto, in continuità con la fedeltà al ghibellinismo già professato in epoca medievale. I cugini Colonna furono anche protagonisti della Disfida di Barletta, nella quale scelsero i componenti della squadra di 13 cavalieri italiani.