Nach dem Kriegsausbruch 1939 kehrte er von einem Forschungsaufenthalt in Abessinien nach Polen zurück. Nach dem Einmarsch der Sowjettruppen im September 1939 setzte er die Tätigkeit des Instituts im nun sowjetisch besetzten Lemberg weiter fort. Das Gebäude des benachbarten Mädchengymnasiums wurde an das Institut angeschlossen. Die Produktion von Fleckfieberimpfstoffen wurde massiv gesteigert. Nach dem deutschen Einmarsch in der Stadt am 30. Juni 1941 ließen die neuen Besatzer insgesamt 25 Professoren der Universität erschießen, darunter den früheren polnischen Ministerpräsidenten und Mathematiker Kazimierz Bartel. Weigl erklärte sich angesichts der zunehmenden Gefahr für sein eigenes Leben bereit, unter den Deutschen weiter zu arbeiten, weigerte sich jedoch, die Deutsche Volksliste zu unterzeichnen.