El paso del tiempo trajo el relevo generacional y Francisco I se convirtió en rey de Francia y Carlos I en rey de España. Ambos, se enfrentaron por el título de emperador, desembocando en la Guerra Italiana de 1521-1526. Francisco I invadió Italia para sufrir derrotas como Bicoca y sobre todo, Pavía. En esta batalla de 1525, donde Francisco I fue capturado, se marcó el punto de inflexión a favor de España. Francisco tuvo que abandonar muchas de sus pretensiones sobre Italia y Borgoña. Aunque tras su liberación se negó a cumplir los términos del acuerdo, España se había convertido en la mayor potencia del momento.