Последний год обучения Николая Столетова в университете совпал с началом Крымской войны 1853—1856 годов, что решающим образом повлияло на всю его дальнейшую судьбу. Весной 1854 года, после окончания университета, преисполненный патриотических чувств, Николай Григорьевич добровольцем ушёл вольноопределяющимся в Русскую императорскую армию — был определён фейерверкером в лёгкую батарею № 10-й артиллерийской бригады. В составе этой батареи фейерверкер Столетов участвовал в Инкерманском сражении (24 октября/5 ноября 1854) и в обороне Севастополя. В гарнизоне крепости он находился с середины марта до конца апреля 1855 года, защищая 4-й бастион, батарею Забудского и редут Шварца. 23 мая 1855 года произведён в офицеры, получив чин прапорщика, назначен в лёгкую батарею 8-й артиллерийской бригады, в составе которой участвовал в сражении на Чёрной речке (4/16 августа 1855). За отличие в боевых действиях в Крыму Николай Столетов был награждён знаком отличия Военного ордена (№ 99730).