Cuando el Estado de Misisipi se secesionó de la Unión justo antes del comienzo de la Guerra Civil, Barksdale dimitió de su puesto en el Congreso de los Estados Unidos para ocupar el cargo de general adjunto, y después de intendente general, de la milicia de Misisipi, con el rango de general de brigada. En mayo de 1861, Barksdale fue nombrado coronel del 13º Regimiento de Infantería de Misisipi del Ejército de los Estados Confederados, un regimiento que dirigió en la Primera batalla de Bull Run ese mismo verano. La primavera siguiente, llevó a regimiento a la Península de Virginia y luchó en la Campaña de la Península y en la batalla de los Siete Días. Cuando su comandante de brigada, el general Richard Griffin, fue mortalmente herido en la batalla de Savage's Station el 29 de junio de 1862, Barksdale asumió el mando de la brigada y la dirigió en una heroica, pero sangrienta y fútil, carga en la batalla de Malvern Hill. La brigada fue conocida a partir de entonces como «la brigada de Misisipi de Barksdale». Barksdale fue ascendido a general de brigada el 12 de agosto de 1862.