Po předčasné smrti bezdětného Františka vládla v letech 1560–1572 za svého dalšího, nezletilého a neduživého syna Karla IX. Ve Francii ovlivněné podobně jako velká část Evropy reformací vypukly náboženské nepokoje mezi katolíky a hugenoty – tzv. hugenotské války. V čele katolické strany stála rodina de Guisů, v čele protestantů Jindřich Navarrský. Znesvářené strany měl smířit sňatek mezi Kateřininou dcerou Markétou a Jindřichem Navarrským. Namísto usmíření však několik dní po svatbě, 24. srpna 1572 začalo v Paříži a posléze v celé Francii krvavé vraždění hugenotů, označované jako Bartolomějská noc. Kateřina měla být údajně hlavní iniciátorkou celé akce.