Донське козацтво сформувалося в другій половині 16 століття в нижній течії Дону, на незайманій території між Кримським ханством і Московією. Основу війська складали русини, московити, кримські і ногайські татари, що належали до різних соціальних верст. 1570 року козаки прийняли протекторат московського царя Івана Грозного і стали називатися Донським військом. Їхнім центром стала станиця Роздорська, а з 1644 року — місто Старочеркаськ. Залежність донців від Москви була формальною. З одного боку вони брали участь у ліквідації Сибірського ханства 1598 року, що було приєднано до Московії, і сприяли московській експансії в Азію. Проте під час московсько-польської війни 1605–1618 років козаки підтримували самозванців на московський престол і брали участь в антиурядовому повстанні Болотнікова 1606–1607 років. Разом із запорожцями донці ходили у самовільні походи на Крим, Московію, Персію, здійснювали грабіжницькі походи в акваторії Каспійського і Чорного морів. 1637 року козаки разом захопили османську фортецю Азов, яку утримували 5 років. У 1648–1657 роках частина донців підтримувала запорожців у боротьбі проти Речі Посполитої.