Mazzini valittiin protestihengessä vuonna 1865 Messinan kaupungin edustajana Italian parlamenttiin, mutta koska hänelle langetettu kuolemantuomio oli edelleen voimassa, Italian viranomaiset mitätöivät vaalin. Seuraavana vuonna annettu yleinen armahdus olisi poistanut esteen, mutta Mazzini kieltäytyi vastaanottamasta paikkaansa parlamentissa. Koska Italian yhdistymistä ei ollut saatettu loppuun, Mazzinin suurin mielenkiinnon kohde 1860-luvulla oli Itävallalle jääneen Venetsian alueen sekä Kirkkovaltion hallitseman Rooman vapauttaminen. Molemmat päämäärät toteutuivat lopulta ilman hänen panostaan. Erityisesti Rooman saaminen yhdistyneen Italian pääkaupungiksi oli Mazzinille tärkeää, sillä hän oli uskoi historiallisia valtakuntia seuraavaan ”kolmanteen Roomaan”, joka toisi mukanaan uuden loiston. Vuonna 1870 Mazzini oli menossa Sisiliaan johtamaan tasavaltalaista kansannousua, mutta jäi kiinni matkalla Kirkkovaltion alueella ja joutui lyhyeksi aikaa vangituksi Gaetaan. Italian joukkojen vallattua Rooman samana vuonna hänet armahdettiin.