Căsătoria dintre prințesa Margareta de Valois și Henric de Navara ar trebui să fie garanția unei reconcilieri durabile între cele două facțiuni religioase, dar la câteva zile după nuntă, 22 august 1572, are loc atentatul împotriva lui Gaspard al II-lea de Coligny, căpetenia hughenoților. Temându-se de o revoltă, la sfatul Caterinei de Medici, Carol decide exterminarea căpeteniilor protestante cu câteva excepții, printre care prințul de sânge Henric de Navara și prințul de Condé. Această decizie declanșează masacrul din Noaptea Sfântului Bartolomeu (24 august 1572), care a făcut mii de victime la Paris și în majoritatea orașelor Franței. Determinat să mențină ordinea, regele ordonă încetarea masacrului în dimineața de 24 august, dar multiplele apeluri la calm au fost încălcate și continuă câteva săptămâni în toată Franța. Acest masacru marchează o cotitură în domnia lui Carol al IX-lea. Anularea edictului de la Saint-Germain și excesele anturajului regal, îi fac pe protestanți să-și piardă încrederea definitiv. După evenimente, monarhia decide să modereze în mod radical politica de conciliere în privința protestanților. Printre numeroasele măsuri luate, se numără interzicerea practicării cultului lor. Războaiele religioase reîncep cu asediul orașului La Rochelle.