Der deutsch-dänische Konflikt war jedoch nicht beigelegt und flammte 1863 wieder auf, als die dänische Regierung eine gemeinsame Verfassung für das Königreich und Schleswig anstrebte. Darin erkannte der Deutsche Bund unter preußischer Führung einen Verstoß gegen das Londoner Protokoll. Zum einen argumentierte man, das zum Deutschen Bund gehörende Holstein könne nicht ohne Verfassung (diese war von der holsteinischen Ständeversammlung 1858 ausgesetzt worden) bleiben; zum anderen war im Londoner Protokoll festgelegt worden, dass das dänische Lehen Schleswig nicht enger an Dänemark gebunden werden durfte. Der Deutsch-Dänische Krieg endete 1864 mit einer dänischen Niederlage, worauf die Herzogtümer abgetreten werden mussten.