Reformationen började 1523 med den radikala teologen Martin Reinhardt som fördrevs efter Martin Luthers ingripande 1524. År 1525 förstörde bönder och delar av stadens befolkning karmeliterklostret och dominikanerklostret ödelades. Nederlaget i Schmalkaldiska kriget 1546-1547 förlorades ernestinerna kurfurstevärdigheten. Jena kom att tillhöra Hertigdömet Sachsen. En följd av detta blev att man grundande en högre skola i dominikanerklostret som ersättning för universitet i Wittenberg som var en föregångare till dagens universitet Friedrich-Schiller-Universität Jena som grundades 1558.