Puis il prend part à la guerre de la Ligue de Cambrai (en Italie) dans l'armée de Ferdinand le Catholique. Il est nommé vice-roi de Sicile (vice-roi de Naples, 1507-1509) puis de Grand-amiral de Naples (1510-1522). En tant que chef de l'armée de la Sainte Ligue, il est d'abord battu par Gaston de Foix à la bataille de Ravenne (1512), mais par ses victoires à Novare et Vicence (1513), il rétablit les Médicis à Florence et chasse les Français du nord de l'Italie et de la Vénétie. En 1515, il ne put empêcher la jonction des Vénitiens avec les Français, et dut se replier sur Naples après Marignan.