Пополнениями Галереи были заняты: Козимо II (1590—1621), ценитель эмилианца Гверчино и его сына; эрудированный кардинал Леопольдо (1617—1675), основатель Академии дель Чименто, где впервые были размещены автопортреты и рисунки; Козимо III (1642—1723), купивший картины иностранцев, главным образом фламандцев, например, два холста Рубенса, поврежденные взрывом 1993 года и теперь реставрированные. И, наконец, Великий принц Фердинандо (1663—1713), пригласивший во Флоренцию художников Джузеппе Мария Креспи, Маньяско и обоих Риччи. Последняя из угасающей династии Медичи, Анна Мария Луиза (1667—1743), назвав Галерею «всегда открытой публике», тем самым определила, что Уффици выживет и в дальнейшем, с вступлением во власть Лотарингов. Просвещённому Пьетро Леопольдо (Великий герцог Тосканский в 1765—1790 гг.) Галерея обязана большой входной лестницей, вестибюлем и Залом Ниобеи. Вновь возникший интерес к «примитивистам» вызывает и новые приобретения — древние картины поступают сюда из ликвидированных монастырей. К этому времени составляется ядро французской живописи и издаются первые «научные» путеводители (Бенчивенни Пелли, 1779; Луиджи Ланци, 1782).