Obwohl er sich immer für die Aussöhnung von Briten und Buren einsetzte, trat er beim Ausbruch des Zweiten Burenkriegs 1899 in die Armee ein. Er kämpfte bei der anfänglichen Invasion Natals und der Belagerung von Ladysmith und stieg schnell in den Rängen auf, bis er schließlich sogar als Vertreter des verletzten Piet Joubert den Befehl über die burischen Truppen am Tugela übernahm. Durch seine militärischen Erfolge, unter anderem in der Schlacht von Colenso, gewann er trotz seines noch jungen Alters ein solches Prestige, dass er nach dem Tode Jouberts im März 1900 zum Generalkommandanten der Armee des Transvaal ernannt wurde. Nach dem Fall von Pretoria im Juni 1900 führte Botha zusammen mit Koos de la Rey und Christiaan de Wet den Guerillakrieg gegen die Briten, denen durch sorgfältig vorbereitete Hinterhalte empfindliche Verluste beigebracht wurden. Anfang 1901 führte er in Middelburg erfolglose Friedensverhandlungen mit dem britischen Oberbefehlshaber Lord Kitchener. In den Friedensverhandlungen 1902 war Botha Mitglied der Verhandlungskommission und Unterzeichner des Friedens von Vereeniging. Anschließend reiste er zusammen mit De Wet und De la Rey nach Europa, um Geld für den Wiederaufbau zu sammeln.