L'acumulació de tant poder en un home i una dinastia preocupava molt al rei de França, Francesc I, que es va trobar envoltat de territoris Habsburg. L'any 1521, Francesc va envaïr les possessions espanyoles a Itàlia i va inaugurar una segona ronda del conflicte franc-espanyol. Les Guerres d'Itàlia van ser un desastre per a França, que va patir derrotes tant a l'anomenada Guerra dels Quatre Anys (1521 - 1526), la Batalla de Bicocca (1522) i la Batalla de Pavia (1525, on Francesc va ser fet presoner), com a la Guerra de la Lliga de Cognac (1527 - 1530) i la Batalla de Landriano (1529), abans que Francesc cedís i abandonés Milà, un cop més, en benefici d'Espanya.