Au début des hostilités, Mosby, alors simple soldat, rejoint la compagnie de la milice "Washington Mounted Guard" composée d’autres Virginiens qui se préparent à la lutte dans la vallée de la Shenandoah. La "Washington Mounted Guard" a été affectée à la "1st Virginia Cavalry" en tant que Company D sous les ordres du capitaine William E. « Grumble » Jones. James Ewell Brown Stuart reçut le commandement général du régiment. Le "1st Virginia Cavalry" a pris part à la première bataille de Manassas en juillet 1861 et a passé le reste de l’année aux avant-postes le long des lignes confédérées dans le nord de la Virginie.