W czerwcu 1941 do Białegostoku wkroczyły wojska niemieckie. Od lipca 1941 do lipca 1944 był on ośrodkiem administracyjnym Okręgu Białostockiego. Pod koniec lipca 1941 roku w mieście utworzono getto, w którym w 1943 r. wybuchło powstanie. AK odmówiło pomocy żydowskiemu ruchowi oporu w getcie ze względu na obecność w nim komunistów. Ostatecznie białostoccy Żydzi zginęli w obozach zagłady w Treblince i na Majdanku. Po zajęciu miasta, w dawnych koszarach 10 Pułku Ułanów Litewskich hitlerowcy utworzyli obóz dla jeńców radzieckich. Pierwotnie przetrzymywano tam ok. 10–12 tys. jeńców, którzy na skutek ekstremalnych warunków bytowych, głodu i chorób masowo ginęli. Obóz zlikwidowano jesienią 1943 roku. W lipcu 1944 miały miejsce ciężkie walki o wyzwolenie Białegostoku spod okupacji hitlerowskiej (podczas operacji białostockiej zginęło 4643 żołnierzy Armii Czerwonej), w wyniku których miasto poważnie ucierpiało. Po II wojnie światowej odbudowane miasto na zawsze utraciło swój poprzedni charakter, będący dziedzictwem parowiekowej jego historii. Dzięki powojennym migracjom ludności wiejskiej Białystok powiększył się, kilkukrotnie przewyższając liczbę swoich mieszkańców sprzed 1939 r. W tym okresie powstały liczne uczelnie i nowe ośrodki przemysłowo-usługowe.