Karel V palmde het Hertogdom Milaan in na de dood van de laatste hertog Francesco II Sforza, goed voor een nieuwe oorlog, de Italiaanse Oorlog (1535-1538). Deze keer kreeg Frans I steun van het Ottomaanse Rijk, vooral de inbreng van admiraal Barbarossa was doorslaggevend. Karel V was verplicht de Vrede van Nice te ondertekenen. Karel behield Milaan en Frans kon een groot deel van Piëmont inlijven.