1954 wurde er Profi und belegte bei seinem ersten Start beim Giro d’Italia den 16. Platz, kam aber schon 1955 auf Platz 3 der Gesamtwertung. Bei der Straßen-Weltmeisterschaft in der Hitzeschlacht von Rom 1955 konnte er Vierter werden. Zwei Jahre später, 1957, hatte er den Giro d’Italia als überlegener Sieger beendet, wurde 1958 Fünfter und 1959 Zehnter. Sein bestes Jahr hatte er 1960, als er 2. beim Giro d’Italia 1960 und 1. im Gesamtklassement der Tour de France 1960 war. Er gewann bei der Tour de France vier und beim Giro d’Italia sieben Etappen. Der "Löwe von Mugello", wie Nencini genannt wurde, war ein sehr guter Kletterer. Nebenbei gilt er als einer der besten Abfahrer der Radsportgeschichte.