Du Plessis was die seun van ds. Lodewicus Johannes du Plessis en sy vrou, Martha Gerbrechta Smit, en 'n kleinseun van I.D. du Plessis en sy vrou, Hester Venter, stigters van die Gereformeerde kerk Colesberg op hul plaas Hamelfontein. Sy broer Dirk het ook 'n Gereformeerde predikant geword. Jacobus matrikuleer op Colesberg, waar sy vader predikant was van 1880 tot 1894, en studeer in die Literariese Departement van die Teologiese Skool van die Gereformeerde Kerk op Burgersdorp. In 1895 behaal hy die B.A.-graad van die Universiteit van die Kaap die Goeie Hoop en die jaar daarop word hy professor litterarum aan die Teologiese Skool en dien in dié hoedanigheid tot 1902 toe hy die kandidaateksamen aflê. Tydens die Tweede Anglo-Boereoorlog (1899–1902) was hy veldprediker en ambulansverpleger by die Boerekommando’s.