Het eerste obstakel in het verenigen van Duitsland was de Sleeswijk-Holsteinse kwestie. Koning Christiaan IX van Denemarken werd op 15 november 1863 koning van Denemarken en hertog van het hertogdom Sleeswijk en het hertogdom Holstein. Drie dagen later verklaarde hij dat het hertogdom Sleeswijk bij Denemarken ingelijfd werd. Men zag dit als een schending van het Protocol van Londen van 1852 waarin bepaald werd dat de hertogdommen Sleeswijk en Holstein onafhankelijk waren van Denemarken. In beide hertogdommen werd voornamelijk Duits gesproken, al had Sleeswijk wel een aanzienlijke Deense minderheid. Diplomatieke pogingen om dit te herroepen mislukten en Bismarck besloot daarom samen met Oostenrijk Denemarken aan te vallen. Sleeswijk-Holstein werd ingelijfd bij Pruisen, met een Oostenrijks belang.