Франсуа I был вероломно убит во время осады Орлеана 18 февраля 1563 года. Его убийца вскоре был схвачен и казнён. Анна обвинила в организации убийства мужа одного из лидеров гугенотов — Гаспара II, графа де Колиньи. Монарший дом желал мира в государстве, Анна же требовала возмездия. Король Карл IX отложил рассмотрение этого дела на три года. За это время королева-мать пыталась отговорить вдовствующую герцогиню от планов мести. Она даже предложила Анне устроить её брак с другим лидером гугенотов Людовиком I, принцем Конде, который сразу после покушения на её мужа написал ей письмо, что не имеет к этому отношения. В январе 1566 года Совет короля признал графа де Колиньи невиновным в организации убийства Франсуа де Гиза. Граф поклялся вдовствующей герцогине, что не повинен в смерти её мужа, но Анна не поверила. В августе 1572 года, по тайной просьбе королевы-матери, она устроила на него покушение, которое оказалось неудачным. Наёмный убийца только ранил жертву. Неизвестно, принимала ли Анна участие в организации нападения и последующего убийства Гаспара II в ночь святого Варфоломея в Париже. Известно, что во время резни она спасла жизнь нескольким гугенотам. Тем не менее месть вдовствующей герцогини была удовлетворена.