Во время Великой Отечественной войны собор был разрушен взрывом 3 ноября 1941 года. Согласно материалам советской Чрезвычайной государственной комиссии, фигурировавшим на Нюрнбергском процессе, взрыв совершили немецкие оккупационные войска. Перед разрушением храма под руководством рейхскомиссара Эриха Коха был осуществлён массовый вывоз ценностей храма, среди них литой серебряный престол из алтаря, серебряные царские врата, серебряные ризы, снятые с икон, серебряные гробницы, Евангелия в драгоценных окладах, собрание тканей и парчи, а также около 2 тысяч драгоценных предметов. В те же дни теряется след древней иконы Печерской Богоматери, давшей название всей Киево-Печерской лавре. Согласно данной версии, подрыв Успенского собора был произведён в целях сокрытия следов его разграбления.