Kort voor de bezetting van Tsjecho-Slowakije door nazi-Duitsland, werd Horáková gedwongen om ontslag te nemen bij de gemeenteraad van Praag. Ze sloot zich aan bij een verzetsgroep genaamd "Wij Blijven Trouw" (Tsjechisch: "My zůstáváme věrni") waarbij zij tijdens de bezetting onderdak regelde voor onderduikers en informatie doorspeelde aan spionnen. Op 2 juli 1940 werd zij samen met Bohuslav, haar echtgenoot, gearresteerd door de nazi's. Ze is naar verluidt op brute wijze verhoord door de nazi's maar heeft nooit informatie vrijgegeven. De daarop volgende twee jaren zat zij gevangen in Praag. Nadat Operation Anthropoid succesvol is gebleken, namelijk de aanslag op het leven van Reichsprotektor Reinhard Heydrich van het Protectoraat Bohemen en Moravië op 27 mei 1942, werd Horáková overgebracht naar concentratiekamp Theresienstadt. Aldaar had zij een kort weerzien met senatrice en goede vriendin Františka Plamínkova, zij werd op 30 juni 1942 gefusillieerd op de militaire schietbaan in de Praagse wijk Kobylisy. Ook Bohuslav, Horáková's echtgenoot, was naar Theresienstadt gedeporteerd echter een weerzien werd hen niet toegestaan. Vervolgens is ze in juni 1944 overgebracht naar gevangenissen in respectievelijk Leipzig en Dresden. In oktober 1944 werd Horáková aanvankelijk ter dood veroordeeld, maar de uitspraak werd omgezet in een gevangenisstraf van acht jaar. In de lente van 1945 werd Horáková bevrijd door Amerikaanse troepen toen zij gevangen zat in Aichach, in de Duitse deelstaat Beieren.