Stefanos inaugura la stagione 2021, prendendo parte all'ATP Cup in qualità di rappresentante della Grecia. Nonostante le due vittorie in singolo contro Alex De Minaur e Roberto Bautista Agut, la sconfitta in doppio insieme a Michail Pervolarakis contro la coppia John Peers/Luke Saville risulta fatale, costringendo la compagine ellenica all'eliminazione nella fase a gironi; in questa specialità si aggiudicherà il match contro Marcel Granollers/Pablo Carreño Busta per ritiro degli spagnoli nel secondo game del primo parziale. Vola a Melbourne per il primo Slam della stagione e si aggiudica con facilità il primo turno contro Gilles Simon, lasciando al francese appena quattro games; nel turno seguente fatica contro Thanasi Kokkinakis, riuscendo ad avere la meglio solo dopo quattro ore e mezza di battaglia, con lo score di 6(5)–7, 6–4, 6–1, 6(5)–7, 6–4. Successivamente, elimina senza perdere alcun set Mikael Ymer, per poi usufruire del ritiro di Matteo Berrettini, il quale non scende in campo per un infortunio addominale. I quarti di finale lo vedono opposto a Rafael Nadal; il greco si impone in rimonta per 3–6 2–6 7–64 6–4 7–5, così da divenire il terzo giocatore nella storia a riuscire a battere Nadal avendo perso i primi due set. Prima di lui ci erano riusciti soltanto Roger Federer e Fabio Fognini. L'impresa proietta Tsitsipas in semifinale, dove tuttavia dovrà arrendersi al russo Daniil Medvedev che lo sconfigge 2–6 4–6 5–7.