DeWine est candidat à un troisième mandat lors élections de mi-mandat de 2006. Il remporte la primaire républicaine avec 71,71 % des voix, devant deux candidats qui lui reprochent ses positions en faveur d'une réforme de l'immigration. Dans un climat de défiance vis-à-vis de l'administration de George W. Bush et de scandales politiques, le sénateur sortant est donné distancé par le représentant démocrate Sherrod Brown. Au mois d'octobre, les républicains cessent d'apporter leur soutien financier à DeWine pour se concentrer sur d'autres élections jugées plus serrées. Il est finalement battu, ne rassemblant que 43,8 % des suffrages contre 56,2 % pour Brown.