DB-3 weszły na uzbrojenie pułków bombowców dalekiego zasięgu i w pułków minowo-torpedowych lotnictwa floty. Wiosną 1937 roku rozpoczęto próby wojskowe pierwszych samolotów w 90. Eskadrze Lotniczej w Monino. W ciągu tego roku zaczęły one wchodzić po kilka sztuk na wyposażenie eskadr bojowych, a pod koniec roku jeden samolot otrzymało także lotnictwo morskie Floty Bałtyckiej. Do końca 1937 roku oddano lotnictwu 45 samolotów. W 1938 roku liczba DB-3 na uzbrojeniu wojska wzrastała i pierwszy raz zaprezentowano je publicznie na defiladzie pierwszomajowej w Moskwie. Na początku służby samoloty borykały się z licznymi usterkami, a silniki M-85 szybko zużywały się; później konstrukcja była dopracowywana. Samoloty były uważane ogólnie za nowoczesne i udane, ale skomplikowane w czynnościach obsługowych. Część samolotów dyslokowano w 1938 roku na Dalekim Wschodzie i postawiono w gotowość bojową, lecz z uwagi na nieopanowanie nowego sprzętu w wystarczającym stopniu, nie wzięły aktywnego udziału w konflikcie z Japonią wokół jeziora Chasan jesienią tego roku. Nie zostały też ostatecznie użyte bojowo w walkach nad Chałchin-Goł w maju 1939 roku ani inwazji na Polskę 17 września.