בשנת 490 לפנה"ס נכבשה דלוס על ידי הפרסים במרד האיוני, כחלק ממלחמת יוון-פרס. הפרסים שמרו על קדושתו של האי ולא פגעו במקדש אפולו. דלוס השתחררה מעול הפרסים עם ניצחונם של היוונים בשנת 479 לפנה"ס, ושנה לאחר מכן נקבעה כמקום מושבה של הליגה האטית-דלית אשר החליפה את האמפיקטיונה. האי שימש כמשכנה של קופת הליגה המשותפת, עד שבשנת 454 לפנה"ס הועבר האוצר מדלוס לאתונה, ובשל כך הפך האי הקטן לתלוי במעצמה היוונית הגדולה. בשנת 426 לפנה"ס טוהר האי בשנית וקברים ששכנו בו רוקנו ותכולתם הועברה לאי הסמוך. שנתיים לאחר מכן גורשו מרבית תושביו לגלות שנמשכה למעלה ממאה שנים. האתונאים ייסדו את הפסטיבל הדלי שנערך אחת לארבע שנים בחודש מאי עד שנת 316 לפנה"ס, וזה נחשב לאחד האירועים החשובים ביוון העתיקה. דלוס השתחררה משלטון אתונה לאחר המלחמה הפלופונסית, אך שבה לחסותה בשנת 378 לפנה"ס. אנטיגונוס מונופתלמוס, אחד הדיאדוכים שהתחרו על השלטון במוקדון לאחר מותו של אלכסנדר מוקדון, שחרר את האי משליטתה של אתונה באופן סופי, ובשנת 314 לפנה"ס איפשר לצאצאי התושבים הגולים לשוב אל האי.