Nominato "Difensor Ecclesiae" da papa Leone X, Carlo promosse la Dieta di Worms (1521) che mise al bando Martin Lutero, il quale fu però tratto in salvo dai principi protestanti. Lo stesso anno scoppiò il conflitto militare con Francesco I di Francia, che terminò con la cattura di quest'ultimo nella battaglia di Pavia del 1525. L'accantonata questione luterana esplose di nuovo nel 1527, quando truppe di mercenari germanici di fede protestante e di stanza in Italia disertarono, discesero sullo Stato della Chiesa e saccheggiarono Roma. Sia perché aveva liberato la Lombardia dai Francesi, sia perché aveva fatto ritirare le truppe imperiali dallo stato pontificio, Carlo V ottenne la corona ferrea d'Italia da Papa Clemente VII al Congresso di Bologna del 1530.