Tijdens de wegwedstrijd van de Olympische Spelen in Rio de Janeiro in 2016 reed Van Vleuten alleen aan de leiding en was op koers voor het goud, maar viel ongeveer tien kilometer voor de finish in de laatste afdaling. De wedstrijd werd vervolgens gewonnen door landgenote Anna van der Breggen. Van Vleuten liep een hersenschudding en scheurtjes in haar wervelkolom op. Al 30 dagen later won ze de proloog van de Lotto Belgium Tour en na winst in de slotrit op de Muur van Geraardsbergen won ze tevens het eindklassement.