La linea maschile dei Paleologi si estinse infine nel 1533, con la morte di Giovanni Giorgio Paleologo, e il marchesato passò a sua nipote Margherita, che governò insieme al marito Federico II Gonzaga, duca di Mantova. Nel 1555, durante l'ultima fase delle guerre d'Italia, Casale fu occupata dai francesi, che la tennero fino alla pace di Cateau-Cambrésis. Guglielmo Gonzaga, riottenuto il Monferrato, lo propose a Filippo II di Spagna, in cambio di Cremona, ma il re rifiutò, decisamente convinto che la discontinuità dei territori avrebbe garantito la fedeltà dei Gonzaga. Il marchese, dunque, decise di incrementare il suo controllo sul Monferrato, tramilte l'abolizione dei parlamenti cittadini, istituiti da Manfredo IV di Saluzzo e mantenuti dai Paleologi, ma i cittadini di Casale si sollevarono. Nel 1565, Guglielmo, supportato dalle truppe milanesi, mise in fuga i ribelli, che si rifugiarono presso Emanuele Filiberto di Savoia. Nel 1573, per limitare le ambizioni del duca di Savoia, Guglielmo chiese a Massimiliano II d'Asburgo di essere nominato granduca di Mantova e del Monferrato. L'imperatore, non volendo concedergli troppo potere, acconsentì solamente ad elevare il Monferrato in un ducato: nacque così il ducato del Monferrato.