Die Reformation fand zur Zeit von Wilhelm von Hohnstein rasch Eingang in der Region. Insbesondere die Reichsstadt Straßburg wurde zu einem Zentrum der Reformation. Der Bauernkrieg von 1525 wurde auch im Hochstift blutig niedergeschlagen („Bauernschlachten bei Lupstein“). Erst Bischof Johann IV. von Manderscheid-Blankenheim ging gegen den Protestantismus auch im Domkapitel vor. Dies führte zum sogenannten Diebeskrieg. Nach seinem Tod beanspruchte ein katholischer und ein protestantischer Kandidat die Herrschaft für sich. Daraus entstand der Straßburger Kapitelstreit. Der Streit endete erst 1604 nach Verzicht des protestantischen Kandidaten. Die Kriegskosten zwangen das Stift das Renchtal an lutherische Württemberg zu verpfänden.