Pada awal musim 2000–01, Di Matteo mengalami cedera retak tulang pada tiga titik dikakinya di sebuah pertandingan melawan St. Gallen di ajang Piala UEFA. Cedera tersebut mengharuskannya beristirahat selama 18 bulan. Oleh karena waktu pemulihan cedera tersebut sangat panjang, ia menyerah dan memutuskan pensiun sebagai pemain sepak bola pada bulan Februari 2002 di usia 31 tahun. Sebagai ungkapan "rasa terima kasih atas kontribusi pemain gelandang tersebut dalam transformasi klub", manajer saat itu Claudio Ranieri memberikan kehormatan kepada Di Matteo untuk memimpin tim masuk ke lapangan pada laga final Piala FA tahun 2002, yang akhirnya dimenangkan rival sekota Arsenal dengan skor 2–0.