После военного переворота 20 марта 1926 года Чан Кайши распорядился об увольнении из офицерского корпуса Национально-революционной армии всех коммунистов. После сдачи дел Чжоу Эньлай стал начальником Специальных курсов политической подготовки; большинство окончивших эти курсы Чжоу Эньлай отправил в отдельный полк под командованием Е Тина. В декабре 1926 года Чжоу Эньлай по распоряжению КПК был откомандирован в Шанхай и приступил к работе в качестве заведующего Орготделом ЦК КПК и члена Военного комитета ЦК КПК. 21 марта 1927 года восставшему пролетариату удалось захватить власть в Шанхае и в течение трёх недель удерживать в своих руках город до подхода частей Национально-революционной армии. Однако Чан Кайши, введя войска в город 12 апреля, по сговору с империалистическими державами и местной контрреволюцией, учинил расправу над восставшими. Чжоу Эньлаю удалось спастись, за его голову была объявлена огромная награда.