Im Zweiten Weltkrieg wurden die Urkunden und Akten des Archivs in 260 Kästen verpackt und zuerst im Waisenhaus des Klosters Günterstal untergebracht. Ab März 1940 lagerten die Bestände im ehemaligen Pergamentraum des Klosters St. Blasien. Die grenznahen Archive von Neuenburg, Burkheim, Ebringen, Endingen und Breisach hatten ihr Archivgut teilweise ebenfalls durch das Stadtarchiv sicherstellen lassen. Nach dem bombenbedingten Brand der Badischen Landesbibliothek in Karlsruhe im September 1942 wurde die Stadtbibliothek im Dezember 1942 ebenfalls ausquartiert. Sie kam im Hansjakobzimmer der Kartause Freiburg unter. Bei dem Luftangriff auf Freiburg am 27. November 1944 wurde das Archivgebäude in der Turmstraße zerstört und brannte am folgenden Tag aus. Der hintere Magazinbau wurde am selben Tag durch die Villinger Feuerwehr gerettet. Die Verluste beschränkten sich auf Teile der Kriegschronik aus dem Ersten Weltkrieg sowie auf einige Zeitungsjahrgänge seit 1900, die noch nicht ausgelagert gewesen waren.