През 1527 г. войниците на император Карл V разграбват град Рим ("Sacco di Roma"), и флорентинците се възползват от неспокойствията в Италия, за да изгонят Медичите и да отново да направят Република. Алесандро, Иполито Медичи и голяма част от техните привърженици бягат от града, между тях представителят на папата, Силвио Пасерини. Микеланджело, който по това време строи голяма гробна капела за Медичите, се грижи за засилването на стената на Флоренция трябва също да избяга по-късно за известно време. Климент VII сключва мир с императора, републиката е свалена след дълга обсада и Медичите се връщат обратно като владетели през лятото 1530 г. Климент предава града на вече 19-годишния Алесандро, който е номиниран на херцог. Той идва в града на 5 юли 1531 г., за да поеме управлението. След девет месеца императорът го номинира на наследствен херцог на Флоренция.