A causa di difficoltà economiche si trasferisce a Lucignano, in provincia di Arezzo dove dirige l'ospedale cittadino; è all'interno dello stesso che Ruffini allestisce un laboratorio dove, nelle poche ore di tempo libero, prosegue le sue ricerche. Nel 1901 approda all'Istituto Anatomico di Siena e diviene professore di Embriologia. L'undici novembre 1908 è iniziato in Massoneria nella Loggia "Venti settembre" di Roma, e il 29 aprile 1912 diviene Maestro massone. Nel 1910 la Regia Accademia Dei Lincei (di cui in seguito diventerà socio) gli conferisce due premi e la medaglia d'oro (detta dei Quaranta). Nel 1912 approda alla cattedra di Istologia e Fisiologia Generale della Regia Università di Bologna, dove viene nominato Benedettino della Accademia Delle Scienze dello studio bolognese e si aggiudica il premio Sacchetti, conferitogli dal Comune di Bologna.