Mafian ja Yhdysvaltain keskustiedustelupalvelu CIA:n epäilty osuus salamurhassa on usein kytketty yhteen lähinnä näiden Kuuban suhteen tekemän yhteistyön takia. CIA hyödynsi Fidel Castron syrjäyttämisyrityksissään muun muassa Kuubassa ennen vallankumousta toimineen mafiapomon Santos Trafficanten yhteyksiä. CIA:n järjestämän Sikojenlahden maihinnousun epäonnistumisen osasyynä on pidetty Kennedyn päätöstä olla antamatta aseellista tukea kuubalaisista pakolaisista kootulle maihinnousujoukolle. Teoreetikot ovat katsoneet tämän motiiviksi CIA:n mahdolliselle sekaantumiselle Kennedyn murhaan.