Calcagnini werd geboren op 17 september 1479 als zoon van protonotaris (kerkelijk hoogwaardigheidsbekleder) Calcagnini en Lucrezia Constantini, uit de adellijke familie Rovigo. Hij werd bij zijn vader thuis opgevoed, waar hij onder meer onderwijs in het Grieks kreeg. Vanaf de inval van Karel VIII in 1494, tot 1506 was hij in dienst van het leger van Ferrara, meestal in campagnes van keizer Maximiliaan I maar ook in die van paus Alexander VI. Van 1506 tot 1509 was hij secretaris van Alfonso I d'Este, hertog van Ferrara. Daarna werd hij benoemd in de leerstoel voor Griekse en Latijnse letterkunde aan de Universiteit van Ferrara. Deze positie bekleedde hij de rest van zijn leven.