L'accumulo di tanto potere in un solo uomo e in una sola dinastia, preoccupava il re Francesco I di Francia, che si trovò accerchiato dai territori asburgici. Nel 1521 Francesco invase i territori asburgici in Italia e inaugurò una seconda fase delle guerre franco-spagnole. Le guerre in Italia furono disastrose per la Francia, la quale soffrì una serie di sconfitte, fra cui quella della Bicocca (1522), di Pavia (1525, nella quale Francesco venne catturato) e di Landriano (1529). Francesco I fu pertanto costretto ad abbandonare Milano alla Spagna.