เมื่อญี่ปุ่นเคลื่อนพลเข้าประเทศไทยในวันที่ 8 ธันวาคม 2484 ปรีดีกับดิเรก ชัยนาม รัฐมนตรีว่าการกระทรวงการต่างประเทศขณะนั้น เป็นผู้คัดค้านการยอมให้ทัพญี่ปุ่นเคลื่อนทัพผ่านประเทศของทูตญี่ปุ่น และคัดค้านการเข้าเป็นพันธมิตรกับญี่ปุ่น ปรีดีพ้นจากตำแหน่งรัฐมนตรีว่าการกระทรวงการคลังและรับตำแหน่งผู้สำเร็จราชการแทนพระบาทสมเด็จพระเจ้าอยู่หัวอานันทมหิดลในวันที่ 16 ธันวาคม 2484 ซึ่งเป็นตำแหน่งที่ถูกมองว่าไร้อำนาจ โดยมติของสภาผู้แทนราษฎร การแต่งตั้งนี้มีมูลเหตุมาจากความขัดแย้งส่วนตัวระหว่างปรีดีกับจอมพล ป. พิบูลสงคราม ตลอดจนอิทธิพลบีบบังคับของญี่ปุ่นเนื่องจากปรีดีในฐานะรัฐมนตรีว่าการกระทรวงการคลังขัดขวางมิให้ญี่ปุ่นนำเงินสกุลเยนมาแลกเงินบาทเพื่อใช้ซื้อเสบียงเลี้ยงกองทัพญี่ปุ่น และไม่ยอมให้กู้ยืมเงินบาท คล้อยหลังปรีดีพ้นจากตำแหน่งรัฐมนตรี รัฐบาลก็ได้ทำสัญญาเป็นพันธมิตรทางทหารกับญี่ปุ่นในวันที่ 21 ธันวาคม และเมื่อรัฐบาลประกาศสงครามต่อสหราชอาณาจักรและสหรัฐเมื่อวันที่ 25 มกราคม 2485 ปรีดีในฐานะหนึ่งในคณะผู้สำเร็จราชการแทนพระองค์หลีกเลี่ยงการร่วมลงนามในประกาศสงคราม อันจะทำให้ประกาศไม่มีผลสมบูรณ์ ระหว่างสงคราม ปรีดีถวายความปลอดภัยให้แก่พระบรมวงศานุวงศ์โดยจัดให้ไปพำนักอยู่ที่พระราชวังบางปะอิน