En 1863, estalló el conflicto de nuevo cuando el rey Federico VII de Dinamarca murió sin descendencia legítima. Según el orden de sucesión de Dinamarca y Schleswig, las coronas tanto de Dinamarca como de Schleswig pasarían al duque Cristián de Glücksburg, quien se convertiría en Cristián IX; la transmisión del ducado de Holstein a la cabeza de la rama (orientada hacia Alemania) de la familia real danesa, la Casa de Augustenborg era más controvertido. La separación de los dos ducados fue desafiado por el heredero Augustenborg, que pretendió, como en 1848, ser el legítimo heredero tanto de Schleswig como de Holstein. En 1864, Prusia y Austria intervienen diplomáticamente en el conflicto. La promulgación de una constitución común para Dinamarca y Schleswig en noviembre de 1863 hizo que Otto von Bismarck interviniese y Prusia y Austria declararon la guerra a Dinamarca. Esta fue la segunda guerra de Schleswig, que terminó con derrota danesa. Los intentos británicos de mediar en la Conferencia de Londres de 1864 fracasaron, y Dinamarca perdió Schleswig (Schleswig septentrional y meridional), Holstein, y Lauenburgo a favor de Prusia y Austria. En 1866, tras la Guerra de los Ducados Schleswig-Holstein pasa a control prusiano.