16日、伊16は横須賀を出港し、呉に移動。4月16日、第1潜水隊の僚艦、伊10、伊30と共に甲先遣隊を編成し、呉を出港。18日、ドーリットル空襲を受け、小笠原諸島北方沖にいる米機動部隊の迎撃のために北東へ向かったが、空振りに終わった。27日、ペナンに到着し、水上機母艦日進により運ばれてきた甲標的を搭載。30日、伊30を除いた部隊は特設巡洋艦報国丸（大阪商船、10,438トン）、愛国丸（大阪商船、10,437トン）と共にペナンを出港。5月5日、10日、15日に報国丸、愛国丸から給油を受けた後、2隻と別れた。17日、波浪により左舷機関室に浸水。20日、伊10の搭載機がダーバンを飛行偵察。30日、伊10の搭載機がマダガスカル島ディエゴ・スアレスを飛行偵察し、戦艦1他多数の艦船の在泊を報告してきた。31日1740、ディエゴ・スアレス港の攻撃を行うべく、伊16はディエゴ・スアレス沖10浬の地点で岩瀬勝輔少尉、高田高三二等兵曹が乗り込んだ甲標的を発進。搭載艇は発進後消息不明となった。6月6日、の地点でユーゴスラビア貨物船スザック（Susak、3,889トン）を発見し、砲雷撃により撃沈。8日、の地点でギリシャ貨物船アギオス・ゲオリギオスⅣ（Aghios Georgios Ⅳ、4,847トン）を発見し、砲撃により撃沈。12日、の地点でユーゴスラビア貨物船スペタル（Supetar、3,748トン）を発見し、雷撃により撃沈。17日、報国丸、愛国丸との会合点に到着し、燃料と食糧の補給を受けた。7月1日、の地点でスウェーデン貨物船エクナレン（Eknaren、5,248トン）を発見し、雷撃により撃沈。26日、ディエゴガルシア島を偵察。8月10日、ペナンに寄港し、26日に横須賀に到着して整備を受ける。