随着中国北伐战争的推进，1926年9月7日，北伐军攻占汉口。中华民国政府“以汉口为华洋互市之区，实全国商务中心”，遂于1926年10月7日，成立汉口市政府，刘文岛为汉口市第一任市长。1926年11月21日，中华民国国民政府迁都武汉，并决定将汉口、汉阳、武昌合并为一个城市，设为京兆区（首都），定名武汉，这也是武汉三镇首次在行政上统一于一个城市之内。1926年12月，中国国民党中央委员会国民政府委员临时联席会议第6次会议议决，推定孙科、宋子文计划武汉三镇设市政委员会。次年元旦外交、财政、交通、司法四部在汉开始办公，并举行了中国国民党二届三中全会。3月24日，中华民国武汉国民政府正式成立。同年，中国共产党中央机关也一起搬到武汉，随着中国主要几大政治势力全部云集到汉，武汉随即成为第一次国共合作的焦点所在，也成为了中国政治、军事中心。然而到了1927年7月15日，武汉国民政府头目汪精卫默许宁汉合流并发动发表宣言宣布制裁中国共产党后，“中国共产党第五次全国代表大会”在武汉召开，中国共产党内部第一次成立了“纪委”，8月7日共产党在汉口召开会议，提出枪杆子里面出政权，确立了武装暴动反抗国民党统治的方针，国共合作宣告失败，中国共产党的活动随即转入地下。11月起，桂系军阀建立了在武汉的统治，直到1929年被蒋介石军攻克。1932年5月，武汉成立了鄂豫皖剿匪总部。随着日本侵华的加剧，武汉抗日浪潮不断，1935年爆发了响应一二九运动的学生运动。