Po vyhlášení nezávislosti Slovenského státu (14. března 1939) byly letouny Š-328 dislokované na Slovensku zařazeny do výzbroje slovenského letectva. Jednalo se o 45 letadel, další stroje získali Slováci od Němců po dokončení výroby dalších 19 exemplářů, takže jich u Slovenských vzdušných zbrani bylo celkem 64 ks. 23. a 24. března 1939 byly Š-328 prvně bojově nasazeny proti maďarským jednotkám pronikajícím na východní Slovensko. Slovenské Š-328 se po boku Luftwaffe podílely na útoku proti Polsku na podzim roku 1939 a operační nasazení je čekalo i na východní frontě roku 1941. Slovenští letci se s třiceti svými letouny Letov Š-328, zařazenými u pozorovacích letek (1. zvědná Žilina, 2. zvědná Spišská Nová Ves, 3. zvědná Nitra), zúčastnili i německého vpádu do SSSR, avšak od konce července 1941 byli postupně odesíláni zpět do vlasti. V červnu 1942 byla na východní frontu odeslána pozorovací letka 1 se šesti Š-328, která tam působila až do roku 1943. Kromě pozorovacích a spojovacích letů se Š-328 účastnily i několika náletů proti partyzánům.