Ambrosini xuất hiện lần đầu ở đội tuyển năm 1999 trong trận Ý gặp Croatia, sau đó anh cùng đội tuyển Ý tham dự Olympics mùa hè 2000, và Euro 2000. Anh không tham dự được WC 2002, Euro 2004 và WC 2006 vì các chấn thương liên tiếp.