I 1999 blev Zambrotta udtaget til landsholdstroppen af træneren Dino Zoff. Han debuterte i en målløs træningskamp mod Norge den 10. februar 1999. Under EM 2000 startet han inde for Italien i semifinalen mod Holland, men allerede efter en halv times spil blev han udvist. Zambrotta har også spillet for landsholdet under fire slutrunder (VM i '02 og '06 samt EM i '04 og '08.