Johnston polgárháborús katonai tevékenységét szüntelenül akadályozta Jefferson Davis elnökkel való konfrontációja, aki gyakran kritizálta agresszivitáshiányáért; így a győzelem legtöbb hadjáratában kicsúszott a kezei közül. Az 1861-es, Manassas mellett kivívott nagy konföderációs győzelemnél ő volt a hadsereg parancsnoka, de a helyzetfelismerést és a vezetési kiválóságot általában beosztottjának, P. G. T. Beauregardnak szokták tulajdonítani. 1862-ben felismerve, hogy a konföderációs fővárost, Richmondot a York-félsziget felől támadás érheti, visszavonta csapatait Manassas alól és a James-félszigeti hadjáratban a George B. McClellan vezérőrnagy vezette uniós túlerőt sikeresen akadályozva újracsoportosította erőit Richmond alatt. A Seven Pines-i ütközetben megpróbált ellentámadásba lendülni, de súlyos sebesülést szenvedett és át kellett adnia a parancsnokságot. Utóda egykori West Point-i kadéttársa, Robert E. Lee tábornagy lett. 1863-ban a Nyugati adminisztratív körzet parancsnokaként kritikák kereszttüzébe került Vicksburg elvesztése miatt. 1864-ben William Tecumseh Sherman vezérőrnagy csapatai ellen küzdött az Atlanta hadjáratban, de Georgia állam északnyugati részébe, Atlanta külvárosáig való visszavonulása miatt Davis leváltotta beosztásából. A háború végén Karolinák hadjárata idején újra parancsnokságot kapott egy kisebb erő fölött, melynek élén Bennett Place-nél 1865. április 26-án letette a fegyvert Sherman előtt. Két nagy ellenfele, Ulysses S. Grant és Sherman igen magasra értékelte háborús teljesítményét, mely által elnyerte barátságukat.