Après le massacre de Wassy le , il prend les armes. En avril, il publie un manifeste où il proclame sa volonté de délivrer la régente et le roi des Guise. Il obtient des promesses d’aide d’Allemagne, et s’empare de plusieurs villes de la vallée de la Loire avec une poignée de cavaliers. Les protestants prennent le contrôle de la vallée du Rhône, du Dauphiné, du Languedoc, de Lyon, dont il confie la garde à Soubise. Mais aucun renfort ne peut lui parvenir, ni de ces régions ni de Guyenne. Il perd la bataille de Dreux et y est fait prisonnier (1562). Il est libéré par la paix d'Amboise de 1563, qui octroie aux huguenots une certaine tolérance religieuse.