L'any 1569 es va constituir el Gran Ducat de Toscana, sent-ne escollit el primer Gran Duc. Va ser un generós mecenes d'artistes i va desenvolupar l'armada florentina, que participaria en la Batalla de Lepant, i que va confiar a la seua nova creació, l'Orde Militar dels Cavallers de Sant Esteve Papa i Màrtir. També va ser un actiu promotor d'infraestructures militars en un intent de protegir el seu Estat del freqüent pas d'exèrcits estrangers (en són exemples les noves fortaleses de Siena, Arezzo i Sansepolcro; les noves muralles de Pisa i Fivizzano; i els fortins de Portoferraio, a l'illa d'Elba, i Terra del Sole). A canvi de l'ajuda financera que va prestar a Carles V va aconseguir la retirada de la Toscana de les guarnicions imperials espanyoles, fet que va ajudar a disminuir l'àmplia influència espanyola a Itàlia.