En même temps, le droit de Magdebourg est introduit à Vilnius. La ville connaît une période de grande prospérité économique au . À la suite de l'union polono-lituanienne (1385-1569), la ville se trouve de plus en plus sous influence polonaise, et la population de la ville devient majoritairement polonaise. D'où les tentatives de Contre-Réforme. Le collège des Jésuites fondé en 1570 dans ce dessein devient en 1579 une université ("Alma academia et universitas Vilnensis societatis JESU"), avec privilège du roi de Pologne Étienne Bathory et bénédiction du pape Grégoire XII. Avec celles de Prague, Cracovie et Bar, l'université de Vilnius fut longtemps l'une des rares en Europe centrale et de l'Est. En même temps, l'union polono-lituanienne fait venir des populations juives qui participent à la prospérité de Vilnius qui devient une ville importante pour la culture ashkénaze en Europe du Nord. Elle est surnommée la « "Jérusalem de Lituanie" » en raison de son importance spirituelle pour le judaïsme, avec, par exemple, le Gaon de Vilna (« génie de Vilna »). Sur le plan économique, le cependant voit s'amorcer un lent déclin. Le est marqué par des conflits (de 1655 à 1661, la ville est occupée par des troupes russes dans le cadre de la guerre russo-polonaise) et des épreuves comme les incendies et la peste.