ביוני 1661 החל ללמוד בטריניטי קולג' של אוניברסיטת קיימברידג', בהנחייתו של בנג'מין פוליין, ובו התוודע ניוטון לפילוסופיה של אריסטו ולרעיונותיהם של פילוסופים מודרניים ובעיקר לדקארט, לאסטרונומים קופרניקוס, גלילאו ותומאס סטריט, שבאמצעות למידת כתביו נחשף לעבודתו החלוצית של קפלר. הוא כתב במחברתו רשימה של שאלות על פילוסופיה מכנית כפי שהבין אותה באותה עת. ב-1665, הוא גילה והכליל את משפט הבינום והחל לפתח את התורה המתמטית שלימים תיקרא חשבון דיפרנציאלי ואינטגרלי (חשבון אינפיניטסימלי). באוגוסט אותה שנה, זמן קצר לאחר שסיים את לימודיו, נסגרה אוניברסיטת קיימברידג' בעקבות התפרצות המגפה הגדולה של לונדון בשנים 1665 – 1666, את השנתיים הבאות בילה ניוטון בביתו בוולסת'רופ. מחקריו והגותו הפרטית של ניוטון בשנתיים אלה גיבשו את הבסיס לתאוריות שלו בענפים השונים: הוא החל לנסח את החשבון האינפיניטסימלי, לערוך את הניסויים הראשונים שלו באופטיקה ולהסיק מהם מסקנות מהפכניות, והחל להרהר על חוקי התנועה וכוח הכבידה. ב-1669 נתמנה ניוטון למשרת הפרופסור למתמטיקה על שם לוקאס בקיימברידג'. ניוטון ירש את מקומו של אייזיק בארו שביקש לפנות את זמנו לעיסוק בתאולוגיה.