Das Augsburger Interim zwang den Rat, dem 1524 verdrängten Bischof wieder einige Kirchen zu übergeben, und drängte Bucer zur Emigration nach England. Obwohl der Besuch der Messe von der Bevölkerung verweigert wurde, wurde sie erst 1559 wieder abgeschafft. Unter dem Einfluss von Johannes Pappus erlangte die lutherische Lehre (in Abgrenzung von der reformierten) alleinige Geltung. Im Jahr 1584 ersuchte Straßburg um den Beitritt zur Eidgenossenschaft. Deren Tagsatzung verschleppte jedoch das Gesuch, weil es das konfessionelle Gleichgewicht zuungunsten der Katholiken verändert hätte. 1598 verpflichtete sich Straßburg in einer neuen Kirchenordnung auch auf die "Konkordienformel". Im Straßburger Kapitelstreit 1583 bis 1604 konnte sich jedoch die katholische Partei durchsetzen, und das Gebiet des Fürstbistums Straßburg, d. h. ein großer Teil des Straßburger Umlands, blieb katholisch.