As boas atuações despertaram o interesse da Juventus, que em 1999 pagou 15 milhões de euros pelo jogador. Sofreu lesão em 2002 e, enquanto se recuperava, viu a lateral-direita ser dominada por Camoranesi. Deslocado para a lateral-esquerda, ajudou a Juventus a conquistar dois Campeonatos Italianos e chegar à final da Liga dos Campeões 2002–03, na qual foram derrotados pelo Milan na disputa por pênaltis após um empate sem gols. Na temporada seguinte, a Juventus vingou a derrota ao bater o Milan na Supercopa da Itália de 2003, nos pênaltis, e também chegou à final da Copa da Itália de 2004, embora não tenha conseguido ser campeã. Na temporada 2005–06, após a lesão de Jonathan Zebina e a chegada de Giorgio Chiellini, Zambrotta foi novamente deslocado para a lateral-direita. Desde então, alternou entre as posições com frequência ao longo da temporada. Em 2005, Zambrotta prolongou o seu contrato para 2010 mas, após o rebaixamento da Juventus à Serie B devido ao escândalo da Serie A 2006 ("calciopoli"), bem como a revogação dos títulos de 2004–05 e 2005–06, ele decidiu deixar o clube no verão de 2006. Durante seus sete anos na Juve, Zambrotta fez parte de uma das melhores equipes do mundo na época, bem como uma das defesas mais temidas. Atuou com grandes jogadores, como Mark Iuliano, Paolo Montero, Ciro Ferrara, Lilian Thuram, Jonathan Zebina, Nicola Legrottaglie, Alessandro Birindelli, Fabio Cannavaro e Giorgio Chiellini. No total, disputou 300 partidas pela Juventus, marcando dez gols.