De Serie B 1999/00 was de 68ste editie van de strijd op het tweede niveau van het Italiaanse profvoetbal. Er namen in totaal twintig teams deel aan de competitie, waarvan vier gepromoveerde uit de Serie C (Alzano Virescit, Pistoiese, Fermana en Savoia) en vier gedegradeerde uit de Serie A (Salernitana, Sampdoria, Vicenza en Empoli). De competitie begon op 29 augustus 1999 en eindigde op 11 juni 2000. In de 380 gespeelde competitiewedstrijden werd in totaal 952 keer gescoord, goed voor een gemiddelde van 2,51 doelpunt per wedstrijd.