En lo tocante a la religión, se puede decir que Manuel I fue un hombre bastante religioso que invirtió una parte importante de la fortuna del país en la construcción de iglesias y monasterios, así como en el patrocinio de la construcción de misiones católicas y la evangelización de los nativos de las nuevas colonias. También intentó promover una nueva cruzada contra los turcos. En su contra está que, siguiendo el ejemplo de otros reinos europeos como los vecinos de Castilla y Aragón, entre 1496 y 1498 promovió acciones para acabar con la presencia en su reino de judíos y musulmanes, obligando a la conversión forzosa de aquellos miembros de ambas religiones que quisieran permanecer en Portugal. Aunque hay quien indica que esta política extremista pretendía satisfacer a los Reyes Católicos en una cláusula que fue acordada antes de su matrimonio con Isabel de Aragón. Por otra parte, sí que es cierto que no permitió la distinción jurídica entre católicos y judíos conversos, y que aquellos que decidieron ser bautizados fueron protegidos de cualquier abuso. Nada de lo cual evitó, sin embargo, la masacre de judíos del 19 de abril de 1506, en la que cerca de 4000 judíos fueron asesinados por las turbas.