İlk fırsat Schleswig-Holstein sorunu ile geldi. 15 Kasım 1863'te XI. Christian Danimarka kralı, Schleswig ve Holstein dükü oldu. 18 Kasım 1863'te Danimarka Kasım Anayasası'nı imzaladı ve Schleswig Dükalığı'nın Danimarka'nın bir parçası olduğunu ilan etti. Alman Konfederasyonu bunu, Danimarka Krallığı'nın durumunun Schleswig ve Holstein dükalıklarından ayrı olduğunu vurgulayan 1852 Londra Protokolu'nun ihlali olarak gördü. Schleswig ve Holstein halkı da bağımsız durumlarını önemsiyordu: Holstein halkının çoğunluğu Alman asıllıydı ve Almanca konuşuyordu; Schleswig halkı ise biraz daha karışık durumdaydı. Kasım Anayasası'nı yürürlükten kaldırma çabaları sonuçsuz kaldı. 1 Şubat 1864'te Prusya ve Avusturya askerleri Schleswig sınırını geçince savaş başladı. Danimarkalılar, "Danevirke" adındaki eski toprak duvarlar ile ülkelerini savunmaya çalıştılar. Fakat, Danimarkalıların gücü birleşen Prusya ve Avusturya ordularıyla mücadele etmeye yetmedi ve protokolleri ihlal ettikleri için İskandinav devletlerindeki müttefiklerinden yardım isteyemediler. Burada kullanılan, ilk kurmalı silah (bolt action) tüfeklerden biri olan Needle Gun hem bu savaşta hem de iki yıl sonraki Avusturya-Prusya Savaşı'nda Prusyalılara avantaj sağladı. Bu silah yerde yatan bir Prusyalı askerin beş kez ateş edebilmesine imkân verirken, karşı taraftakiler bir atıştan sonra silahlarını ayakta doldurmak zorunda kalıyordu. İkinci Schleswig-Holstein Savaşı, Prusya ve Avusturya ordularının lehine sonuçlandı ve iki ülke 30 Ekim 1864'te imzalanan 1864 Viyana Antlaşması ile Schleswig ve Holstein'ın kontrolünü ele geçirdi.