En 1533, à la suite de la restauration des Médicis à Florence — effectué par l'empereur dans le but de se faire pardonner le terrible sac de Rome de 1527 — De Marchi entre au service du nouveau duc de Florence, Alexandre de Médicis, dit "le Maure". En 1536 celui-ci épouse Marguerite d'Autriche, fille naturelle de l'empereur Charles Quint, la laissant veuve après un an de mariage après son l'assassinat par son cousin Lorenzino de Médicis.