L'allarme per la crescente potenza degli Asburgo portò alla costituzione della Lega di Cognac, promossa da papa Clemente VII de' Medici e siglata dal sovrano francese insieme alle repubbliche di Venezia e Firenze. Un'alleanza fragile che non fu in grado di evitare il terribile sacco di Roma del maggio 1527, episodio che suscitò orrore e costernazione in tutto il mondo cattolico: i Lanzichenecchi, soldati imperiali di origine prevalentemente tedesca e fede luterana, misero sotto assedio la Città Eterna, che fu espugnata e saccheggiata per giorni. Il papa, asserragliato in Castel Sant'Angelo, fu costretto alla pace con l'imperatore. Il papa Clemente VII, nell'intento di consolidare proprio potere indebolito dopo il sacco di Roma, ottenne però dall'imperatore la restaurazione della propria famiglia, i Medici, a Firenze, dove si era costituita una repubblica (1527-1530); riuscì poi a consolidare ulteriormente il proprio dominio impadronendosi di Perugia e di Ancona. Il 5 agosto 1529 venne stipulata la pace di Cambrai, con la quale la Francia rinunciava alle mire sull'Italia mentre Carlo V vedeva riconosciuto il possesso di Napoli e Milano.