האוניברסיטה המשיכה את פעילותה על אף פלישת גרמניה הנאצית לפולין בשנת 1939. לאחר שמזרח פולין נכבשה על ידי הסובייטים, שבה וילנה לשליטתה של ברית המועצות וליטא באוקטובר 1939, לאחר 18 שנות כיבוש פולני. האוניברסיטה נסגרה לאחר מספר שבועות; הסגל והסטודנטים פוזרו, ונדרשו לעזוב את תחומי המגורים. ליטא הנחילה מדיניות תרבותית חדשה במדינה, שבעקבותה הקימה את האוניברסיטה מחדש, בעזרת סגל מאוניברסיטת קובנה. תוכניות הלימוד הפולניות הוחלפו באלה של הליטאים, והשפה הרשמית באוניברסיטה הפכה לליטאית. מספר פרופסורים פולניים אשר לימדו באוניברסיטה (בהם הרקטור לשעבר יקוביצקי) נעצרו על ידי השלטונות הסובייטים, ואף תשעה מהם נרצחו בטבח יער קאטין.