Menggantikan ayahnya, Aleksander mengambil alih perang Persia sendiri. Selama satu dekade berkampanye, Aleksander menaklukkan seluruh Kekaisaran Persia, menggulingkan raja Persia Darius III. Negeri-negeri yang ditaklukkan termasuk Asia Kecil, Asyur, Levant, Mesir, Mesopotamia, Media, Persia, dan bagian-bagian Afghanistan modern, Pakistan, dan stepa Asia Tengah. Kampanye militer yang dilakukannya terus-menerus telah membuahkan hasil, namun Aleksander meninggal pada tahun 323 SM. Setelah kematiannya, wilayah-wilayah besar yang ditaklukkan Aleksander menjadi sasaran pengaruh Yunani yang kuat (Helenisasi) selama dua atau tiga abad berikutnya, sampai kebangkitan Roma di barat, dan Partia di timur. Ketika budaya Yunani dan Levant berbaur, pengembangan budaya Helenistik campuran dimulai, dan bertahan bahkan ketika diisolasi dari pusat-pusat utama budaya Yunani (misalnya, di kerajaan Yunani-Baktria). Dapat dikatakan bahwa beberapa perubahan di Kekaisaran Makedonia setelah penaklukan Aleksander dan selama pemerintahan Diadokhoi bisa terjadi tanpa pengaruh pemerintahan Yunani. Seperti yang disebutkan oleh Peter Green, banyak faktor penaklukan telah digabungkan pada istilah Periode Helenistik. Daerah-daerah tertentu yang ditaklukkan oleh pasukan penyerang Aleksander, termasuk Mesir dan wilayah-wilayah Asia Kecil dan Mesopotamia "jatuh" dengan sukarela untuk ditaklukan dan memandang Aleksander lebih sebagai pembebas daripada penakluk.