Nach der Machtübertragung an die NSDAP am 30. Januar 1933 begann eines der dunkelsten Kapitel der Stadt, die organisierte Diskriminierung von Juden und anderen „Nichtariern“. Die NSDAP wurde bei den Reichstagswahlen vom 5. März 1933 mit 45,8 % der abgegebenen Stimmen (Reich: 43,9 %; Baden: 45,4 %) die stärkste Partei in der Stadt. Im April 1933 wurden alle „nichtarischen“ Beamten zwangsbeurlaubt, bis 1939 verlor die Heidelberger Universität mehr als ein Drittel ihres Lehrkörpers aus rassistischen oder politischen Gründen (1930 waren 9 % des Lehrkörpers jüdischer Konfession). Während der Reichspogromnacht am 9. November 1938 brannten Heidelberger Nationalsozialisten die Synagogen in der Altstadt und in Rohrbach nieder. Zeitgleich zerstörten sie den Betsaal in der Plöck 35 und verwüsteten bzw. plünderten zahlreiche Geschäfte und Wohnungen jüdischer Bürger vor den Augen der Bevölkerung und der Polizei. Am nächsten Tag wurden 150 Heidelberger Juden in das Konzentrationslager Dachau zur vorgeblichen Schutzhaft verschleppt, um sie zur Emigration zu nötigen und ihr Vermögen zu arisieren. Am 22. Oktober 1940 wurden in der „Wagner-Bürckel-Aktion“ über 6000 badische Juden, darunter 280 aus Heidelberg, in das Internierungslager Camp de Gurs nach Südwestfrankreich deportiert. Nur wenige überlebten.