סטאמבולוב נולד בווליקו טרנובו למשפחה לאומנית בולגרית וסיים את לימודי התיכון בעירו. בין 1870 ל-1872 למד בבית ספר טכנולוגי באודסה ובהמשך הצטרף לוועד המהפכני הבולגרי המרכזי, אשר פעל נגד השלטון העות'מאני בבולגריה. ב-18 בפברואר 1873 הוצא להורג וסיל לבסקי מנהיג הוועד המהפכני וסטאמבולוב נבחר להחליפו. ב-1874 נאלץ לגלות לבוקרשט, שם פגש את חריסטו בוטב וביחד הוציאו ספר שירים שנקרא "שירים ופואמות מאת בוטב וסטאמבולוב". ב-1876 הוביל את תנועתו במהלך מרד אפריל הבולגרי שהפך למלחמת אזרחים עם מניין נפגעים גבוה ובמהלך המלחמה העות'מאנית-רוסית (1877–1878) הועסק ככתב צבאי. לאחר הקמת נסיכות בולגריה מתוקף סיכומי קונגרס ברלין, היה סטאמבולוב ממייסדי המערכת הפרלמנטרית במדינה.