Chamberlain wurde am 8. August 1862 zum stellvertretenden Kommandeur des neu aufgestellten 20. Maine Infanterieregiment ernannt, das von Oberst Adelbert Ames geführt wurde. Das neue Regiment wurde im Camp Mason in Portland ausgebildet. Auch Chamberlains Bruder, Thomas Davee, war als Sergeant Angehöriger des Regiments. Das Regiment wurde nach der Ausbildung der 3. Brigade der 1. Division des V. Korps der Potomac-Armee in Virginia unterstellt. An der Schlacht am Antietam nahm es nicht aktiv teil, in der Verfolgung der ausweichenden Nord-Virginia-Armee nahm es an einigen Gefechten teil. Das 20. Maine wurde mit Chamberlain während der Schlacht von Fredericksburg in den heftigsten Kampfhandlungen beim Angriff auf die Marye’s Heights eingesetzt und erlitt schwere Verluste.