Witherspoon New Orleansban, Louisiana államban született. Apja John Witherspoon, georgiai születésű altábornagy az amerikai hadsereg tartalékos állományában, később otolaringológus ( fül-orr-gégész ). Anyja Betty Witherspoon, gyermekgyógyászati ápolónő a Tennessee állambeli Harrimanből, később professzorasszony a Vanderbilt Universityn. Witherspoon elmondása szerint egyenes ági leszármazottja a skóciai születésű John Witherspoonnak, aki egyik aláírója volt az Egyesült Államok függetlenségi nyilatkozatának és hatodik elnöke a Princetoni Egyetemnek. A színésznő az episzkopális (az episzkopális egyház protestáns egyház, melyben a római katolikus püspökséghez hasonló hierarchia van ) vallásban nevelkedett. Kiskorában négy évet élt Wiesbadenben, Németországban, ahol édesapja az amerikai hadsereg tagjaként dolgozott. Miután visszatért az Egyesült Államokba, Witherspoon Nashville-ben, Tennesse-ben töltötte gyermekkorát, ahol – ahogy egy, az "Interview" magazinnak adott interjújában meséli – „olyan környezetben nőttem fel, amiben a nők rengeteget vittek véghez. És ha erre nem voltak képesek, az csak a társadalmi korlátok miatt volt. Nagymamám – édesapám anyja – mellett nőttem fel, aki hihetetlenül értelmes volt, de a társadalom és az illendőség határokat szabott neki… Nem tudott betelni az olvasással, s engem is bátorított rá, mikor gyerek voltam…” A nagymama képességei és azok érvényesülésének hiánya folytonosan motiválja Witherspoont az életben. Nashville-ben végezte el a Harpeth Hall School magániskolát, ahová csak lányok jártak, és ahol Witherspoon pompomlány is volt. Ezt követően a kaliforniai Stanford Egyetem hallgatója volt, angol irodalom szakon. Egy év elvégzése után otthagyta az egyetemet, hogy megvalósítsa színészi karrierjét.