Cuando Francesco murió sin herederos en 1535, se abrió una pugna entre Francisco I de Francia y el rey Carlos I de España (emperador Carlos V del Sacro Imperio) y por su sucesión. Tras varias guerras el Emperador se anexionó el ducado, invistiendo con él a su hijo Felipe el 11 de octubre de 1540. Finalmente, el Tratado de Cateau-Cambrésis de 1559 reconoció la anexión del Milanesado por parte de España.