En 1865, après des débats prolongés, l'Assemblée législative du Canada-Uni approuva la création d'une Confédération par 91 voix contre 33. Cependant, aucune colonie maritime n'approuva le plan. En 1866, Macdonald et ses collègues financèrent les candidats pro-Confédération lors de l'élection au Nouveau-Brunswick ; l'assemblée qui en résultait était favorable à la Confédération. Peu après l'élection, le premier ministre de Nouvelle-Écosse, Charles Tupper, présenta une proposition pro-Confédération à la législature. Une dernière conférence, organisée à Londres, était nécessaire avant que le parlement britannique ne confirme l'union. Les délégués des provinces maritimes se rendirent à Londres en juillet 1866 mais Macdonald qui buvait à nouveau beaucoup, ne s'y rendit pas avant novembre, ce qui ulcéra les délégués. En , Macdonald mena la Conférence de Londres, où il fut félicité pour sa conduite des débats et fit la cour à celle qui devint sa seconde épouse, Agnes Bernard. Agnes Bernard était la sœur d'Hewitt Bernard, le secrétaire privé de Macdonald ; le couple s'était rencontré pour la première fois à Québec en 1860 mais Macdonald l'admirait au moins depuis 1856. En , alors qu'il se trouvait toujours à Londres, il fut sérieusement brulé dans sa chambre d'hôtel lorsqu'une bougie mit le feu à la chaise sur laquelle il était assis ; il refusa néanmoins de manquer les réunions de la conférence. En février, il épousa Agnes à l'église de St George's Hanover Square. Le , l'Acte de l'Amérique du Nord britannique, qui sert de base à la Constitution canadienne fut adoptée par la Chambre des communes après avoir été validée par la Chambre des lords. La reine Victoria approuva la loi par une sanction royale le .