De kathedraal speelde eveneens een rol bij de tragische gebeurtenissen rond de Turkse bezetting van de stad in 1480. Na een mislukte aanval op Rhodos verlegde Mehmet II zijn aspiraties naar de verovering van de hoofdstad van het christendom. In 1480 doken voor de kust van Apulië de schepen van de Turkse vloot op. De zuidoostelijke stad Otranto was met 6000 inwoners destijds een belangrijke havenstad tussen Oost en West en vormde een bruggenhoofd naar Rome, het uiteindelijke doel van de veroveringstocht. Na 15 dagen belegering wisten de Turken een bres te slaan in de verdedigingsmuur. De admiraal Gedik Ahmed Pasja verordonneerde alle mannelijke bewoners boven 15 jaar om te brengen en de vrouwen en kinderen als slaaf in te schepen, maar een deel van de bevolking wist echter te ontkomen. Bijzonder wreed was de dood van de commandant van de verdedigingskrachten: hij werd van boven naar beneden doormidden gezaagd. De aartsbisschop Stefano Pendinelli liep de Turkse belagers vanuit de kathedraal tegemoet en smeekte de aanvallers om de mensen die zich verscholen in de kathedraal te sparen. Hem werd echter de keel doorgesneden en zijn hoofd werd als trofee in de stad rondgedragen. Gedik Ahmed Pasja eiste aan de christenen in de kathedraal zich tot de islam te bekeren, hiervoor kregen ze een nacht bedenktijd. Op 12 augustus lieten de christenen weten dat niemand van plan was zijn geloof in te ruilen voor de islam. Daarop gaf de Turkse krijgsheer het bevel allen te ketenen en de kathedraal in een stal te veranderen. Op 14 augustus gaf hij ten slotte opdracht alle gevangenen op een heuvel buiten de stad te onthoofden. Op de heuvel waar zij werden onthoofd, verrees later de kerk van de Heilige Maria van de Martelaren. In totaal werden er 17.000 mensen in de stad en omgeving afgeslacht.