In februari 2016 viel Johnson op nadat Cameron had aangekondigd dat op 23 juni van dat jaar het referendum over het EU-lidmaatschap van het Verenigd Koninkrijk zou worden gehouden. In tegenstelling tot zijn partijgenoot sprak Johnson zich uit voor een uittreding van zijn land uit de Europese Unie, een zogeheten brexit. Johnson manifesteerde zich vervolgens als een van de voornaamste pleiters van een Brits vertrek uit de EU. Nadat het brexit-kamp het referendum won, tipte de Britse en buitenlandse pers Johnson als een van de belangrijkste kandidaten om Cameron op te volgen als partijleider en premier. Op 30 juni 2016 gaf Johnson echter te kennen dat hij daarvoor geen kandidaat was, nadat Michael Gove, met wie hij de brexit-campagne had gevoerd, had verklaard geen vertrouwen in zijn leiderschap te hebben. Vier dagen later gaf hij aan Andrea Leadsom, een van vijf kandidaten voor de opvolging van Cameron, te steunen. Volgens waarnemers leidde Johnsons steun ertoe dat Leadsom meer steunverklaringen van Lagerhuisleden verzamelde dan Gove, zodat zij en Theresa May overbleven als de twee kandidaten voor de verkiezing onder partijleden in september 2016. Die vond echter niet plaats omdat Leadsom zich terugtrok, zodat May op 13 juli 2016 een kabinet kon vormen. Johnson en Leadsom werden daarin minister.