Zum Jahresende 1532 brachte er auf zwei Schiffen hundert Mann von Nicaragua nach Puná, um Francisco Pizarro zu unterstützen, der Anfang des Jahres zur Conquista des Inkareichs aufgebrochen war und den er aus früheren Expeditionen gut kannte. Er wurde, zusammen mit Hernando Pizarro, einer von Francisco Pizarros Hauptleuten. De Soto kundschaftete das Land aus, entdeckte die Stadt Cajas in den Anden und den Weg nach Süden. Er war der erste Europäer, der mit dem Inkakönig Atahualpa sprach. Nachdem dieser bei der Schlacht von Cajamarca besiegt und inhaftiert worden war, besuchte er ihn öfters in der Haft, und es entwickelte sich eine Freundschaft. De Soto war verärgert, als ihm die Nachricht von Atahualpas Hinrichtung erreichte.