Hooker lernte nach Abschluss der Südpolexpedition Charles Darwin kennen und übernahm die Klassifikation der von Darwin auf den Galápagos-Inseln gesammelten Pflanzen. Die beiden Wissenschaftler wurden enge Freunde und Hooker stand Darwin seitdem mit Rat und Tat zur Seite. Zusammen mit Thomas Huxley verteidigte er am 30. Juni 1860 an der University of Oxford während der „Huxley-Wilberforce-Debatte“ Darwins Schrift "Die Entstehung der Arten" ("On the Origin of Species"). Kurz vor seinem Tod im Jahr 1882 betraute Darwin Hooker mit der Gesamtverantwortung für die Erstellung des Index Kewensis, einem Index aller zwischen 1753 und 1885 publizierten Namen von Blütenpflanzen. Als Autor und Bearbeiter beauftragte Hooker den Sekretär der Linnean Society of London, Benjamin Daydon Jackson.