TB-3被使用在對日本的1938年8月6日哈桑湖战斗，43架轰炸了反复争夺的几个高地；1939年諾門罕戰役，出动了500架次以上用于夜间轰炸，还大量用于军事空运。對芬蘭的冬季戰爭中。雖然它在1939年被正式退役。然而，1941年6月22日，德蘇戰爭開始時，蘇聯空軍依舊擁有516架可運作的TB-3，另有25架屬於蘇聯海軍航空兵。由於駐紮地遠離蘇聯西部邊界，TB-3從首波德國空襲中避免了災難性的損失，在這之後TB-3在該年6月23日起編入第三重型轟炸機團（TBAP）擔任夜間轟炸。但由於前线对地支援飞机与戰鬥機大量损失，TB-3必須在沒有護航的情況下在昼間執行轟炸任務，缓慢的航速导致易于被地方高射炮击中；虽然有环形防御火力，但在现代戰鬥機面前等于无。1941年8月時，TB-3佔了蘇聯轟炸機部隊的25%。但TB-3很适合作为夜间轰炸机，低航速使得命中精度高；机队中积累了大批精英空勤人員，一夜可執行三趟出击任務。TB-3幾乎參加了一直到1943年蘇聯所有主要的戰鬥，包括第一次斯摩稜斯克戰役、莫斯科戰役、史達林格勒戰役、列寧格勒圍城戰和庫爾斯克會戰。1941年，苏联各种原因损失了超过40架TB-3。1945年1月，第18航空軍仍然擁有十架可運作的TB-3。TB-3廣泛被使用在貨物和傘兵運輸，最多可攜帶35士兵。在戰爭前五個月，TB-3累計運送了2,797噸的物資和2,300名人員。TB-3也被用在幾個特殊的項目，例如:Zveno計畫的戰鬥機母艦和空運或空降輕型、T-37或坦克。1941年8月1日，兩架屬於Zveno計畫戰鬥團的TB-3，各攜帶了兩架各攜帶了一對炸彈的伊-16，以自身無損失的狀況下，摧毀了羅馬尼亞康斯坦察港口中的油庫。1941年8月11日和13日，Zveno計畫戰鬥團成功地破壞了在羅馬尼亞境內多瑙河上的。Zveno計畫在1942年因為母艦過於脆弱而結束。