Po śmierci Hideyoshiego w 1600, Masayuki wziął udział w bitwie pod Sekigaharą po stronie Mitsunariego Ishidy. Masayuki wysłała starszego syna, Nobuyukiego, do sił wschodnich, sam wraz z młodszym Yukimurą dołączając do armii zachodniej. Według niektórych teorii, ten ruch miał zabezpieczyć przetrwanie klanu Sanada. Masayuki ufortyfikował zamek Ueda, gdzie z siłami 2000 ludzi walczył przeciwko armii Hidetady Tokugawy, liczącej 38000 żołnierzy. Była to druga bitwa o zamek Ueda i mimo że nie było to zdecydowane zwycięstwo, Masayuki zadał Hidetadzie poważne straty i opóźnił go dostatecznie, by ten nie dotarł na główne pole bitwy na czas.