Setelah menaklukkan Melaka pada 1511, Portugis di bawah Francisco Serrão mencari Kepulauan Maluku. Serrão yang pada awalnya berlabuh di Ambon berakhir di Ternate sebagai sekutunya pada 1512. Sejak itu, Portugis berhasil menanamkan kekuasaannya di Maluku. Portugis membangun beberapa loji dan benteng di Ambon serta Banda di mana terjadi penginjilan dan perkawinan campur di permukiman yang tumbuh di sekitarnya. Banda berperan sebagai pusat perdagangan, sementara Ambon menjadi bandar. Kedudukan Portugis sempat terguncang oleh Spanyol yang tiba pada 1521. Kehadiran Spanyol yang bersekutu dengan Tidore menimbulkan pertikaian dengan Portugis, meski dapat diakhiri dengan penandatanganan Perjanjian Saragosa pada 1529 yang memaksa Spanyol untuk meninggalkan Maluku. Selama berkuasa di Maluku, Portugis mengenalkan teknologi pembangunan Eropa dan tanaman-tanaman asing seperti ketela serta merintis pendidikan barat di Maluku. Dua Sultan Ternate yang kala itu menguasai sebagian besar Maluku tercatat secara resmi menyerahkan Maluku kepada Raja Portugal, pada 1545 oleh Tabariji dan setahun setelahnya oleh Khairun. Namun demikian, pusat kedudukan Portugis berpindah dari Ternate ke Ambon sejak Portugis diusir oleh Baabullah pada 1575. Spanyol sempat kembali lagi ke Maluku pascapembentukan Uni Iberia di bawah Mahkota Spanyol pada 1580 juga dengan bersekutu bersama Tidore.