Sau khi Tây Ban Nha chinh phục Đế quốc Aztec cũng như sau khi Hernán Cortés thám hiểm vùng Honduras ngày nay trở về, đội quân viễn chinh quyết định xây dựng một nhà thờ tại địa điểm của Templo Mayor trong thành phố Tenochtitlan của người Aztec để củng cố quyền lực của Tây Ban Nha trên lãnh thổ mới chiếm được. Có bằng chứng về sự hiện diện của đền thờ thần Quetzalcoatl rất lớn, một đền thờ dành riêng cho thần Huītzilōpōchtli (thần chiến tranh và vị thần chính của người Aztec) và các công trình phụ khác. Kiến trúc sư Martín de Sepúlveda là giám đốc đầu tiên của dự án từ năm 1524 đến 1532, còn Juan de Zumárraga là giám mục đầu tiên của Tòa giám mục ở Tân Thế giới. Nhà thờ Zumárraga nằm ở phía đông bắc nhà thờ chính tòa hiện nay. Nó có ba gian giữa ngăn cách nhau bằng hàng cột Tuscan, trần được chạm khắc tinh xảo do Juan Salcedo Espinosa thực hiện và được Francisco de Zumaya và Andrés de la Concha mạ vàng. Cửa chính có lẽ theo phong cách Phục hưng. Khu ca đoàn có 48 chiếc ghế bằng gỗ thông trắng do Adrián Suster và Juan Montaño chế tác thủ công. Đá từ đền thờ Huītzilōpōchtli được dùng để xây dựng nhà thờ. Dầu vậy, nhà thờ này sớm bị coi là không xứng với tầm quan trọng gia tăng của thủ đô Tân Tây Ban Nha. Nhà thờ đầu tiên này được Hoàng đế La Mã Thần thánh Karl V và Giáo hoàng Clêmentê VII nâng lên thành "Catedral (nhà thờ lớn)" vào ngày 9 tháng 9 năm 1534 và sau đó được Giáo hoàng Phaolô III thêm chữ "Metropolitana (chính tòa)" vào năm 1547.