A coroa de Aragão herdada por Carlos incluía o Reino de Nápoles, o Reino da Sicília e o Reino da Sardenha. Como Sacro Imperador Romano, Carlos era soberano em vários estados do norte da Itália e reivindicou a Coroa de Ferro (obtida em 1530). O Ducado de Milão, no entanto, estava sob controle francês. A França tirou Milão da Casa de Sforza após a vitória contra a Suíça na Batalha de Marignano, em 1515. As tropas imperial-papais conseguiram reinstalar o Sforza em Milão em 1521, no contexto de uma aliança entre Carlos V e o papa Leão X. Um exército franco-suíço foi finalmente expulso da Lombardia em Bicocca um ano depois. No entanto, em 1524, Francisco I da França retomou a iniciativa, cruzando a Lombardia, onde Milão, juntamente com várias outras cidades, caiu novamente em seu ataque. Pavia resistiu sozinha e, em 24 de fevereiro de 1525 (no vigésimo quinto aniversário de Carlos), as forças do Imperador lideradas por Carlos de Lannoy capturaram Francisco e esmagaram seu exército na Batalha de Pavia. Em 1535, Francesco II Sforza morreu sem herdeiros e Carlos V anexou o território como um estado imperial vago. Carlos manteve com sucesso todos os seus territórios italianos, embora eles tenham sido invadidos novamente em várias ocasiões durante as Guerras Italianas.