Nachdem der demokratische Senator Mark Dayton früh im Jahr 2005 angekündigt hatte, nicht erneut kandidieren zu wollen, galt Klobuchar als Favoritin für die Nachfolge. Am 29. September 2005 gab sie ihre Kandidatur bekannt und setzte sich in der parteiinternen Vorwahl durch. Bei der Senatswahl am 7. November 2006 erhielt Klobuchar 58 Prozent der Stimmen und setzte sich damit gegen den Republikaner Mark Kennedy durch. Sie wurde am 3. Januar 2007 als Senatorin im 110. Kongress der Vereinigten Staaten vereidigt – als erste gewählte Senatorin Minnesotas. Bei der Wahl 2012 wurde sie mit deutlicher Mehrheit wiedergewählt, bei der Wahl 2018 mit 60 zu 36 Prozent der Stimmen gegen den Republikaner Jim Neuberger.