Im Herbst 1587 gab jedoch der Sieg der Hugenotten bei Coutras dem Krieg eine neue Wendung. Herzog Heinrich von Guise versuchte, den geschwächten König durch ein Ultimatum in die Knie zu zwingen. Anstatt den Forderungen der Liga nachzugeben, reagierte dieser jedoch mit überraschender Festigkeit und ließ Truppen in Paris einrücken. Daraufhin löste eine „Liga der Sechzehn“ unter der Führung des Herzogs von Guise in der Stadt einen Volksaufstand aus („Tag der Barrikaden“ am 12. Mai 1588). Im Juli schien König Heinrich III. entmachtet: das Unionsedikt von Rouen erneuerte die Bestimmungen von Nemours und schloss jeden nichtkatholischen Fürsten von der Thronfolge aus.