Karel zlepšil roku 1516 vztah s Františkem, ale když se stal pánem tak ohromných říší, cítil se František jeho mocí ohrožen a někdejší přátelství se proměnilo v opak. Z té a jiných příčin došlo mezi oběma roku 1521 k první a roku 1526 ke druhé italské válce. V první měl Karel za spojence Anglii, papeže a krom Benátek ostatní knížata italská. Na konci této války v roce 1525 dosáhla Karlova armáda velkého úspěchu u Pavie, a tak se papež Klement VII., obávaje se císařovy rostoucí moci v Itálii, spojil roku 1526 s Františkem.