En 2016, Biles devient championne olympique aux Jeux de Rio au concours général par équipes. Elle obtient ensuite sa deuxième médaille d'or en remportant le concours général individuel en devançant sa compatriote Alexandra Raisman de plus de 2 points (!) et la Russe Aliya Mustafina, puis remporte un troisième titre au saut de cheval. Elle échoue ensuite dans sa quête d'une quatrième médaille d'or consécutive en terminant la finale de la poutre sur la troisième marche du podium. Mais elle remporte finalement un quatrième titre lors sa dernière épreuve, avec l'exercice au sol, et égale ainsi le record de sacres dans une même édition des Jeux, aux côtés de la Soviétique Larissa Latynina (en 1956), de la Tchécoslovaque Věra Čáslavská (en 1968) et de la Roumaine Ecaterina Szabó (en 1984). Biles devient la première gymnaste américaine à recevoir l'honneur d'être choisie comme porte-drapeau lors de clôture des Jeux. Elle est l'athlète de l'année 2016 pour l'Associated Press.