במקביל למאבקה על הלבוש הנשי, פעלה ווקר גם לביטל העבדות בארצות הברית, ועם פרוץ מלחמת האזרחים האמריקנית בשנת 1861 התנדבה לשרת בצבא האיחוד. היא רצתה לשרת כמנתחת, אולם הצבא לא הסכים לקבל נשים, והיא שרתה כאחות ללא תשלום. היא השתתפה בקרב בול ראן הראשון, קרב פרדריקסברג, וקרב צ'יקמוגה. היא הייתה זו שחשפה לעיתונות את סיפורה של פרנסס הוק (Frances Hook), אשה שהתחזתה לגבר ולחמה בצבא האיחוד. הוק נפלה בשבי הקונפדרציה, וקיבלה הצעה אישית מג'פרסון דייוויס לשרת בצבא הקונפדרציה בדרגת לוטננט. הוק סרבה ואמרה שהיא מעדיפה להיות טוראית בצבא האיחוד ולא לוטננט בצבא הקונפדרציה. היא הוסיפה שהיא בוחרת להיתלות ולא להילחם כנגד הברית. לאחר שהוק שוחררה במסגרת חילופי שבויים, הגיע סיפורה אל ווקר אשר העבירה אותו לעיתונות, וקראה להעניק להוק דרגת לוטננט בצבא האיחוד. קריאותיה לא נשמעו. בספטמבר 1862 הגישה ווקר בקשה למשרד המלחמה וביקשה תעסוקה כמרגלת, בקשותיה נדחו, אולם שנה לאחר מכן היא מונתה כמנתחת בצוות הרפואי של ארמיית קמברלנד, ובכך הייתה למנתחת הראשונה בהיסטוריה של צבא ארצות הברית. לעיתים קרובות היא לא טיפלה רק בחיילים פצועים, אלא גם באזרחים משני צידי המתרס.