A területszerzéses katonai siker megerősítette Bismarckot. Elutasította az osztrákok újabb csatlakozási kérését a német vámunióhoz, és nem engedett a kizárólagos porosz uralomból a megszerzett hercegségek felett. Ennek ellenére a király Bismarck szabadsága alatt megkötötte a gastseini szerződést (1865. augusztus 14.), melyben Ausztriának engedte át Holsteint, megtartotta Schleswig tartományt és a Lauenburg hercegséget Az ekkor grófi címet kapott Bismarck azonban titokban megegyezett III. Napóleonnal, hogy nem áll Ausztria mellé, ha az olaszok harcba szállnak az osztrákok ellen Velence visszaszerzéséért. Az olaszok kötelezték magukat, hogy ők is megtámadják Ausztriát, ha a poroszok három hónapon belül háborút kezdenek. A háború két hétig tartott, 1866. július 3-án az osztrákok Königgrätz (Sadova) mellett megsemmisítő vereséget szenvedtek a poroszoktól. E csata tette híressé Bernhard von Moltke vezérkari főnököt. A csatatéren jelen volt I. Vilmos is, és az erre az alkalomra tartalékos főhadnagyból ideiglenesen vezérőrnaggyá előléptetett Bismarck. A német történelembe a csata a „königgrätzi mészárlás", ez a háború mint „belnémet- vagy testvérháború” néven került be.