L'ascesa di Carlo di Spagna al trono imperiale, una posizione alla quale anche Francesco I mirava, portò al collasso le relazioni tra la Francia e gli Asburgo. Nel 1519, un'invasione spagnola nella Navarra, nominalmente feudo francese, diede il pretesto a Francesco di iniziare la guerra; così armate francesi strariparono in Italia ed iniziarono una campagna per scacciare Carlo da Napoli. I francesi, tuttavia, vennero opposti efficacemente dalle tattiche dei tercio spagnoli e subirono una serie di rovinose sconfitte alla Bicocca e sulla Sesia contro le truppe spagnole sotto il comando di Fernando d'Avalos. Con Milano minacciata, Francesco portò un'armata in Lombardia nel 1525, solo per venire battuto e catturato nella Battaglia di Pavia; imprigionato a Madrid, Francesco fu obbligato ad accettare molte concessioni sui suoi territori italiani nel "Trattato di Madrid" (1526).