1525年，查理五世在帕维亚之战中大敗法國，使很多義大利及德意志人感到意外，令人擔心他將會繼續擴張勢力。很快地，教宗克萊孟七世倒戈支持法國及義大利一些重要城邦，以上帝的名義宣布，弗朗索瓦一世與查理五世所簽訂的割地條約無效；克萊孟七世還主動參與針對哈布斯堡帝國的（1526-1529年）。查理五世因此勃然大怒，加上查理漸漸厭倦克萊孟七世教宗干預他認為與宗教毫無關係的事務，所以在1527年攻陷羅馬，使教宗蒙羞。結果，以後克萊孟七世與繼任的教宗在與世俗勢力交往時，都顯得加倍謹慎，不敢違背西班牙國王。1529年，教宗與查理簽署巴塞罗那和約，建立更和諧關係。西班牙正式成為天主教的保護者，而查理被教宗加冕為意大利國王（倫巴第）；因為教宗需要查理的西班牙出兵，以推翻趁機自立的佛羅倫薩共和國。1533年，教宗克萊孟七世拒絕讓英王亨利八世離婚，主要原因是他不希望觸怒亨利八世王后阿拉贡的凯瑟琳的外甥查理五世，令羅馬再度被洗劫。