Anche sotto la guida di Carlo Ancelotti, Ambrosini si è rivelato un giocatore importante per la squadra che ha conquistato la Champions League 2002-2003, la Coppa Italia e lo scudetto 2003-2004. Decisivo è un suo assist di testa nell'azione del gol vittoria nella partita di ritorno dei quarti di finale contro l'Ajax nel 2003. Durante la vittoriosa finale di Manchester contro la Juventus, entra in campo sul finire dei tempi regolamentari, disputando quelli supplementari. Nell'edizione della UEFA Champions League 2004-2005, durante la semifinale di ritorno contro il PSV Eindhoven è autore del gol decisivo che permette al Milan di accedere alla sfortunata finale di Istanbul persa contro il Liverpool.