Walker foi voluntário na eclosão da Guerra Civil Americana como cirurgião - primeiro para o Exército, mas foi rejeitado por ser mulher (apesar de ter mantido um consultório particular por muitos anos). Foi-lhe oferecido o papel de enfermeira, mas recusou e escolheu ser voluntária como cirurgiã do Exército da União como civil. O Exército dos Estados Unidos não tinha cirurgiões do sexo feminino e, no início, ela só podia exercer a profissão de enfermeira. Durante este período, ela serviu na Primeira Batalha de Bull Run (Manassas), 21 de julho de 1861, e no Patent Office Hospital em Washington, DC. Ela trabalhou como cirurgiã de campo não remunerada perto das linhas de frente do União, incluindo no a Batalha de Fredericksburg e em Chattanooga após a Batalha de Chickamauga. Como sufragista, ela ficou feliz ao ver mulheres servindo como soldados, e alertou a imprensa sobre o caso de Frances Hook, na enfermaria 2 do hospital de Chattanooga, uma mulher que serviu nas forças da União disfarçada de homem. Walker foi a primeira mulher cirurgiã do exército da União. Ela usava roupas masculinas durante seu trabalho, alegando ser mais fácil para as altas demandas de seu trabalho.