16日、伊21は呉を出港。18日、ドーリットル空襲が起こったため米機動部隊の捜索を行うが、見つけることはできなかった。その後トラックに到着。27日、トラックを出港しヌーメアに向かった。5月2日、浮上航走中に米空母ヨークタウン("USS Yorktown, CV-5")から発進したドーントレスに発見される。ドーントレスはヨークタウンに戻って通信筒で報告。報告を受け、爆雷2発を搭載したTBD デバステーター3機が発進。その後、伊21は接近するデバステーターを発見して急速潜航した。1時間後、再度浮上したところ、後部甲板に多数の爆弾の破片があるのがわかった。5日、ヌーメア近海でドラム缶入りのガソリン2000トンを輸送中の米リバティ船ジョン・アダムス（John Adams、7,176トン）を発見。2時間の追跡の後、の地点で魚雷2本を発射。魚雷はジョン・アダムスに2本とも命中し、同船を撃沈した。ジョン・アダムスは太平洋戦争で撃沈された最初のリバティ船だった。7日0630、のヌーメア西方20浬地点付近でギリシャ貨物船クロエ（Chloe、4,641トン）の推進器音を聴取したため魚雷2本を発射したが、どちらも早爆した。その後浮上し、主砲弾70発を発射してクロエを撃沈した。撃沈後、救命艇に横付けして食糧を提供し、ヌーメアへ向かうよう指示した。8日、大型輸送船を発見して雷撃するも命中せず、浮上して砲撃を行ったが、その最中に哨戒機を発見して潜航退避した。哨戒機は爆雷6発を投下してきたが、伊21に損害はなかった。14日、哨戒区域を離れる。19日早朝、スバを飛行偵察し、グラスゴー級軽巡洋艦1、潜水艦7の在泊を報告。24日早朝、オークランドを飛行偵察したが、スコールにより失敗。このとき、オークランドの飛行場上空を搭載機が飛行中、味方機と思われたらしく飛行場の着陸灯が点灯したという。29日、特殊潜航艇によるシドニー港攻撃に参加。シドニー北東35浬地点付近に進出し、シドニーを航空偵察。この際、搭載機はサーチライトに捉えられたが、脱出に成功。0420、停泊中の米重巡シカゴ(USS Chicago, CA-29)を発見し、戦艦と判断した。また、蘭病院船を発見している。搭載機は当初米軍機と思われていた。その後オーストラリア空軍の戦闘機が迎撃に向かったが、見つかることはなかった。着水時、搭載機が転覆したため、伊21は搭乗員を救助した後搭載機を処分した。31日に攻撃が行われ、伊21は甲標的の帰還を6月3日まで待った。8日0215、ニューキャッスルの造船所へ向け砲撃を開始。13分後、反撃の砲弾4発を発射されるが、その後も3分間砲撃を行い、主砲弾34発を発射。その後、メルボルンへ向かう輸送船団を発見するも、攻撃に失敗。11日、レーダーを装備した駆逐艦の追跡を受けるが、振り切ることに成功。12日0114、シドニー沖40浬地点付近でニューキャッスルからワイアラへ向かう輸送船8隻からなる輸送船団を発見し、浮上したまま船団内の輸送船2隻へ向け魚雷4本を発射。4200トンのコークスを輸送中のパナマ貨物船グアテマラ（Guatemala、5,527トン）に命中し、グアテマラは1時間後に沈没した。25日、クェゼリンに到着。その後クェゼリンを出港し、7月12日に横須賀に到着して整備を受ける。