Mit dem erneuten Einfall der Franzosen unter Ludwig XII. flüchtete der neapolitanische König Friedrich IV. auf die Insel Ischia, während Fabrizio und Prospero Colonna die Verteidigung des Königreiches organisierten. Nach ihrer Niederlage wurden sie im Castel Nuovo bei Neapel eingeschlossen und gleichzeitig von Papst Alexander VI. exkommuniziert, der ihre Burgen in Latium beschlagnahmte. Nach ihrer Befreiung traten die beiden Cousins in den Dienst von Gonzalo Fernández de Córdoba, des spanischen Vizekönigs von Neapel, um die Franzosen aus Italien zu vertreiben. Prospero Colonna spielte eine bedeutende Rolle beim Sieg der Spanier in der Schlacht von Cerignola 1503, der den Spaniern endgültig den Zugriff auf Neapel sicherte. Nach dem Tode Alexanders VI. erhielt er auch seine Besitzungen in Latium zurück. In den folgenden italienischen Kriegen waren der Sieg bei Vicenza und der Einfall der Schweizer im Piemont sein Werk. 1515 von den Franzosen gefangen, löste er sich mit 350 Pfund Gold aus, befehligte dann das gesamte Heer der Verbündeten und entriss den Franzosen Italien. Das neue französische Heer unter Odet de Lautrec schlug er in der Schlacht bei Bicocca am 27. April 1522 und beendigte den Feldzug durch die Einnahme von Cremona und Genua. Colonna starb am 30. Dezember 1523. Italien ehrte ihn durch den Beinamen "Paganorum defensor et italicae gentis pater".