Ahameniş İmparatorluğu'nu yeniden örgütlemeye girişen I. Darius döneminde kent, Kapadokya satraplığının hâkimiyet bölgesi içine alınmış ve tiran unvanı taşıyan askerî valiler tarafından yönetilmeye başlanmıştır. MÖ 331 yılında İskender'in Persleri Gaugamela Muharebesi'nde yenilgiye uğratıp Ahameniş İmparatorluğu'nu Makedonya topraklarına katmasıyla birlikte Samsun da Makedon hâkimiyetine girmiş, böylece kentte askerî temelli bir yönetim anlayışından tekrar demokratik yönetime dönülmüştür. İskender'in ölümüyle birlikte zayıflayan ve parçalanan Makedonya'dan bağımsızlığını ilân eden bölgelerden biri de I. Antiohos liderliğindeki Seleukos İmparatorluğu olmuş, Samsun MÖ 315'te bu devletin idaresi altına altına girmişse de kısa süre sonra Ariobarzanis ya da II. Mithridatis döneminde Pontus Krallığı toprakları içerisine sokulmuştur. VI. Mithridatis'in döneminde kraliyet ikâmetgâhı olarak kullanılan Samsun'da geniş bir imar hareketi başlatılarak şehir önemli bir gelişme kaydetmiştir.