Im Gegensatz zu seinen beiden Vorgängern gelang es Rudolf nicht, zwischen den Konfessionsparteien zu vermitteln. Der Kaiser neigte zwar insgesamt zu einer Bevorzugung der katholischen Position, spielte aber in den großen konfessionspolitischen Auseinandersetzungen nur eine eher untergeordnete Rolle, etwa im Straßburger Kapitelstreit, in dem sich die Katholiken durchsetzen konnten, oder im kölnischen Krieg: Der Übertritt des Kölner Kurfürsten Gebhard Truchsess zu Waldburg zum Protestantismus drohte die konfessionelle und machtpolitische Landkarte des Reiches zu verschieben, doch spielten in der Bekämpfung des Abtrünnigen die Wittelsbacher die entscheidende Rolle und sollten für die kommenden fast zwei Jahrhunderte den Kölner Kurfürsten stellen. Der oppositionellen Politik der calvinistischen Kurpfalz trat er nicht entgegen.