En el contexto de la guerra de los cuatro años, participó en la defensa del Reino de Nápoles contra las tropas del duque de Albany, y en los preparativos de la guerra que los Colonna estaban armando contra el papa Clemente VII, que había cambiado su actitud imparcial por una alianza con la Francia de Francisco I. El conflicto se verificó en 1526 con la toma de Anagni y con el posterior asalto a Roma, dirigido por Vespasiano junto con sus parientes Ascanio y Pompeo, y se agudizó con el saqueo de la ciudad del año siguiente.