W 1500 roku ponownie zaatakował Wielkie Księstwo Litewskie za powód podając niewybudowanie przez Aleksandra Jagiellończyka obiecanej cerkwi na dziedzińcu zamku wileńskiego (Wojna litewsko-moskiewska (1500–1503)). W 1500 roku Iwan III pokonał hetmana litewskiego Konstantego Iwanowicza Ostrogskiego w bitwie nad Wiedroszą i wziął go do niewoli. Kontrakcja Aleksandra Jagiellończyka spowodowała uwolnienie oblężonego Smoleńska oraz najazd na ziemie moskiewskie chana Szeich-Achmata, który nadal uważał się za zwierzchnika Iwana III, oraz atak mistrza krajowego zakonu inflanckiego Woltera von Plettenberg, który pokonał Moskali w bitwie pod Izborskiem, jednak Moskwa rozpoczęła kolejne działania wojenne, które zakończyły się sukcesem Iwana III. Na mocy rozejmu Wielkie Księstwo Litewskie straciło 1/3 swojego terytorium. Do państwa moskiewskiego włączono wszystkie Księstwa Wierchowskie, Księstwo czernihowskie i Siewierszczyznę, część Kijowszczyzny, część Księstwa Mścisławskiego, Mglin, część Smoleńszczyzny i część Ziemi połockiej. W wyniku wojny osłabiona i zagrożona Litwa, zmuszona została do zacieśnienia związków z Polską podpisując w 1501 unię mielnicką.