Eusebio Di Francesco commence sa carrière avec les équipes d'Empoli et de Lucchese-Libertas. En 1995, il rejoint Piacenza, où il a l'occasion de jouer régulièrement dans l'élite. En 1997, il signe à l'AS Rome, remportant un titre de champion d'Italie en 2001 avec les Giallorossi. Il dispute également les quarts de finale de la Coupe de l'UEFA en 1999 avec la Roma.