В кінці XV століття в Київській митрополії засновано Дерманський і Супрасльський монастирі. 1500 року Іван III розпочав другу війну з ВКЛ, внаслідок якої московські війська зайняли близько третини земель Київської митрополії. Брянську та Чернігівську єпископії було ліквідовано, а їхні єпархії підпорядковано ієрархам Московської митрополії. В підпорядкування московському митрополиту було переведено і християн Торопецького повіту. Жителі Смоленська, натхненні смоленським єпископом Йосифом (Солтаном), витримали облогу московськими військами і 1507 року православні литвини обрали Йосипа митрополитом Київським і всієї Русі. 1509 року Йосип провів у Вільні собор православних християн Київської митрополії та 20 вересня 1509 року підписав грамоту, якою дозволялося проводити православні богослужіння у польських і німецьких землях на рухомому антиміні, отриманому від патріарха представниками віленського братства парафіян Пречистенського собору. 1510 року Василь III захопив Псков. 1511 року митрополит Йосип отримав від короля Сигізмунда I підтвердження своєї влади над усіма церквами грецького закону в Литві і Польщі. 1514 року московські війська захопили Смоленськ і рушили вглиб Литви, але 8 вересня московське військо було розгромлене біля Орші військом під командуванням Костянтина Івановича Острозького. На честь оршанської перемоги у Вільні було збудовано тріумфальну арку, яку народ назвав Острозькою брамою (пізніше звана Острою брамою), відому як місцеперебування Остробрамської ікони Божої Матері. На гроші Костянтина Івановича Острозького у Вільні перебудовано катедральний Пречистенський собор, Троїцька і Микільська церкви. 1517 року полочанин Франциск Скорина почав друкування церковно-православних книг у Празі, а 1520 року заснував друкарню у Вільно.