Im Februar 1563 fiel François de Lorraine einem Attentat zum Opfer. Während der Mörder sofort ergriffen und hingerichtet worden war, setzte Anna d’Este alles daran, den in ihren Augen als Auftraggeber verantwortlichen Anführer der französischen Hugenotten, Gaspard de Coligny, juristisch zu verfolgen. Drei Jahre lang bedrängte die Witwe den König und seine Gerichte mit ihren Forderungen, doch im Januar 1566 erklärte der königliche Rat Coligny für unschuldig und gebot ewiges Schweigen in dieser Angelegenheit. Hinter dem Schuss, der am Vormittag des 22. August 1572 die Brust Colignys nur zufällig verfehlte und der Auslöser für die Morde der Bartholomäusnacht werden sollte, wurde folglich von den Zeitgenossen als Auftraggeberin die Witwe des Herzogs von Guise gesehen. Die Frage, welche Rolle Anna d’Este in der Bartholomäusnacht tatsächlich spielte, ist anhand der Quellen jedoch nicht zu beantworten.