הרפורמציה הפרוטסטנטית גרמה לאי שקט במילהאוזן. מנהיג האיכרים, הנזיר היינריך פיפר (Heinrich Pfeiffer) ממנזר ריפנשטיין (Reifenstein), הטיף לראשונה בכנסיית מריה הקדושה בפברואר 1523 ואחריו החל לעשות זאת תומאס מינצר (Thomas Müntzer) באוגוסט 1524. ההטפות של שניהם לא הצטמצמו רק בתביעות דתיות (שניהם היו אנבפטיסטים), אלא העלו גם דרישות פוליטיות. דרישות אלה הועלו כנגד הפריווילגיות של שופטי העיר והאוליגרכים שלה. מועצת העיר הודחה והוחלפה במועצה נצחית (Ewiger Rat). במהלך מרד האיכרים של אלזס ב-1524–1525 נבזזו המנזרים של העיר ותופעת האיקונוקלאזם (Bildersturm) גרמה להרס הכנסיות. לאחר שצבא הקיסר דיכא את המרד, הוצאו להורג מינצר, פיפר ומנהיגים אחרים של המרד. הוצאתו להורג של מינצר ב-27 במאי 1525 התקיימה מחוץ למילהאוזן. בנוסף לכך אולצה העיר לשלם קנס של 40,000 גילדרים והיא איבדה את חלק מזכויותיה העצמאיות לאחר שנסיכי הסן ושני ענפי בית וטין מונו להיות שליטי העיר. בניגוד לשלושה שליטים אלה, נשארה מילהאוזן עיר קתולית ונעשתה לחברה סודית בברית נירנברג, ברית של שטחים קתולים שנותרו ברחבי האימפריה שנוסדה ב-1538. ב-1542 נכפתה הרפורמציה על מילהאוזן על ידי יוסטוס מנינג (Justus Menius). המלחמה השמלקלדית הסתיימה בתבוסתם של בית הסן והענף הארנסטיני של בית וטין על ידי הקיסר ב-1547 ובאופן חלקי הוחזרו למילהאוזן זכויותיה. את מדיניות החוץ שלה היה עליה לתאם עם הענף האלברטיני של בית וטין והיא נאלצה להעלות מס לקיסר. החל מ-1710 הייתה מילהאוזן תחת חסותה של נסיכות מבראונשווייג-לינבורג (Brunswick-Lüneburg).