Am 5. Mai 1842, dem ersten Tag des dreitägigen Großen Brands, fiel St. Nikolai als die erste der Hamburger Kirchen und Großgebäude dem Feuer zum Opfer. Der Hauptgottesdienst am Morgen hatte noch abgehalten werden können, der Mittagsgottesdienst wurde nach einer Fürbitte für den Erhalt der Kirche abgebrochen. Um etwa vier Uhr nachmittags ergriff das Feuer den Turm. Es gelang wegen der unzulänglichen Löschtechnik nicht, Wasser in ausreichender Menge hinauf zu befördern. Schließlich stürzte er ein und übertrug die Flammen auf das Kirchenschiff, das vollständig niederbrannte. Nur wenige Kunstwerke waren zuvor aus dem Gebäude gerettet worden.