En 1440, l'humaniste Laurent Valla entreprend un travail de critique textuelle du document. D'abord destiné au concile de Florence, son texte est imprimé en 1506. Il prouve la fausseté du document, dont il situe la rédaction au . Cependant, il ne remet pas en cause le contenu de la donation, ce qui incite la polémique protestante à l'attaquer violemment pendant la Réforme.