Sau khi hoàng đế Pháp Napoléon I đánh tan liên quân Nga-Áo trong trận Austerlitz năm 1805, Phổ đã từ bỏ thái độ trung lập của mình và tham gia cuộc Chiến tranh Liên minh thứ ba chống Pháp (1806). Cùng với Scharnhorst, cũng là nhà cải cách quan trọng của quân đội Phổ về sau này, Gneisenau đã dự đoán bi quan và kết quả của cuộc chiến năm 1806. Trên cương vị là sĩ quan tham mưu của Vương tước Hohenlohe-Ingelfingen Friedrich Ludwig, người chỉ huy cánh quân của quân đội Phổ, ông bị thương ở chân trong trận Saafeld. Sau đó, ông tiếp tục tham chiến trong trận Jena-Auerstedt vào ngày 14 tháng 10 năm 1806, nơi quân Phổ bị thảm bại. Trong cuộc rút chạy, Gneisenau và Knesebeck được giao nhiệm vụ sửa soạn lương thảo cho binh lính trên con đường tới Stettin, và từ Stettin ông phi ngựa đến đại bản doanh của Đức vua ở Graudenz, điểm tập kết của các lực lượng Phổ bại trận, rồi đến Königsberg. Tại Königsberg, Gneisenau kết bạn với Công chúa Louise và kể cho bà nghe về cái chết của anh bà, Thân vương Ludwig Ferdinand, trong trận Saalfeld, điều mà ông chứng kiến tận mắt.