Henrik efterfulgte i 1563 sin far som Hertug af Guise. Han kæmpede mod tyrkerne i Ungarn i 1565, og ved sin hjemkomst blev han en af lederne for katolikkerne i i Den Franske Religionskrig. Han deltog i slaget ved Saint-Denis i 1567 og ved slaget i Jarnac og slaget ved Moncontour. Han faldt i unåde og fornærmede kongen, Karl den 9. i 1570 ved at fri til dennes søster, Marguerite af Valois. Det lykkedes ham dog at genoprette sin status ved hoffet, da han samme år giftede sig med grevinden af Eu, Catherine af Clèves (1548-1633). Den 24. august 1572 myrdede han huguenotlederen, Admiral Coligny (1519-72), og indledte dermed massakren på huguenotterne under Bartholomæusnatten. Han anså Coligny for at være arkitekten bag mordet på faderen, Frans af Guise, under indtagelsen af Orléans i 1563.