Elle passe beaucoup de temps en grossesses (avec un enfant tous les quatorze mois en moyenne). Lors des guerres d’Italie, la régence est attribuée à Anne de Beaujeu, qui a déjà tenu ce rôle de 1483 à 1491. Anne de Bretagne est encore jeune, et sa belle-sœur la suspecte. Elle n'a qu’un rôle réduit en France comme en Bretagne et doit parfois accepter d'être séparée de ses enfants en bas-âge. Anne vit essentiellement dans les châteaux royaux d'Amboise, de Loches et du Plessis ou dans les villes de Lyon, Grenoble ou Moulins (lorsque le roi est en Italie). À Amboise, fait faire des travaux, tandis qu'elle réside à côté, au Clos Lucé, où le roi lui fait construire une chapelle.