A notícia do saque de Roma, que havia posto de joelhos a figura agora predominante dos Médici, o Papa Clemente VII (Giulio de Médici) levou à última caçada da principal família da cidade e a um novo saque do palácio (1527). Seguiu-se a recuperação da cidade com o famoso Cerco de Florença de 1530, no final do qual os últimos descendentes do ramo principal da família regressaram ao palácio. No entanto, o assassínio cruzado do duque Alexandre de Médici e do primo Lorenzino (também chamado de Lorenzaccio) levou ao poder um ramo até então secundário da família, o dos chamados "populares", com a ascensão ao título ducal de Cosme I, o qual se transferiu com a mulher, Leonor de Toledo, para o Palazzo Vecchio (1540), abandonando o Palazzo Medici da Via Larga aos descendentes dos ramos caídos da família. O palácio ficou, então, privado de qualquer função de representação.