בשלהי שנות ה-30 החלה ממלכת יוגוסלביה תחת הנסיך פאבלה להתקרב לגרמניה הנאצית, ותהליך זה לווה בחקיקה אנטישמית. בעקבות הפיכה צבאית אנטי-גרמנית בממלכה, פלשה גרמניה ליוגוסלביה בראשית אפריל 1941 והכניעה את צבאה. ביטולה ככל אזור מקדוניה הווארדארית הועברה לחזקת ממלכת בולגריה, בעלת בריתם של הגרמנים. בני הקהילה גורשו לאזור המערבי של העיר שהפך לגטו. ב-22 בפברואר 1943 חתמה ממשלת בולגריה הסכם עם גרמניה הנאצית על גירוש 20,000 יהודים המצויים בחזקת הבולגרים בתראקיה ומקדוניה ל"אזורים הגרמניים במזרח". ב-11 במרץ ביצעו הבולגרים אקציה בביטולה ועצרו 3,351 נפשות. העצורים גורשו ב-3 טרנספורטים למחנה ההשמדה טרבלינקה. 3,013 מיהודי ביטולה נרצחו בטרבלינקה. מקצת מיהודי העיר הצטרפו לכוחות הפרטיזנים של טיטו, ומהם ניתן לציין את אסתריה עובדיה, בנו רוסו וז'מילה קולונומוס.