Mastroeni arribó a Estados Unidos desde Argentina a los 4 años de edad. Comenzó jugando en el equipo universitario de la Universidad Estatal de Carolina del Norte y fue contratado por el club Miami Fusion con el que jugaría cuatro temporadas. En 2001 fue elegido como uno de los mejores defensores de la MLS (Major League Soccer), y debutaría en la selección de Estados Unidos el 7 de junio de ese mismo año contra Ecuador. En 2002 es transferido al club Colorado Rapids donde permanece desde entonces. Cuando el jugador Chris Armas sufrió una lesión a semanas de comenzar el Mundial Corea-Japón 2002, Pablo fue convocado como titular en la defensa para el debut contra Portugal, debido a su buen desempeño comenzó a liderar el chart de los mejores defensores de la MLS.En 2006 vuelve a ser convocado para la Selección de fútbol de los Estados Unidos y debuta en la Copa Mundial de Fútbol de 2006 el 17 de junio ante Italia, Mastroeni es expulsado por una falta agresiva y fue multado con 7500 CHF por la FIFA, además de recibir una suspensión por tres partidos, pese a esto formará parte de la selección estadounidense para jugar la Copa de Oro de la CONCACAF 2007.