Pour le Tournoi des Six Nations 2008, Jonny Wilkinson est le premier choix pour occuper le poste de demi d'ouverture et est titularisé lors des quatre premières rencontres. Pour la première, l'Angleterre reçoit les Gallois, désormais entraînés par Warren Gatland. Alors que le match est bien engagé pour les Anglais (16-6 à la pause), les Gallois profitent de la fébrilité de l'ouvreur anglais et d'Andy Gomarsall pour marquer et remporter le match. C'est la première victoire galloise à Twickenham depuis vingt ans. Lors de la deuxième journée, les hommes de Brian Ashton battent les Italiens sans panache au stade Flaminio (19-23) avec treize points inscrits par Wilkinson. Deux semaines plus tard, au Stade de France, le XV de la Rose sauve l'honneur en s'offrant la victoire face au XV de France sur le score de 13-24. À Murrayfield, dans un match sans essai, les Anglais sont dominés par les Écossais qui remportent à domicile leur seule victoire de l'édition 2008. Cette défaite remet en cause la présence du technicien Brian Ashton à la tête de l'équipe et celle de Wilkinson comme titulaire. Le joueur est écarté pour le match contre l'Irlande au profit de Danny Cipriani. C'est seulement la deuxième fois de sa carrière sous le maillot de la "Rose" qu'il est écarté et laissé sur le banc. Cependant, à la cinquante-troisième minute du match disputé le 15 mars contre l'Irlande, Jonny Wilkinson remplace Toby Flood, jouant aux côtés de Cipriani comme premier centre.