Le , c'est également à bord cet avion que John Kennedy se rendit à Dallas où il allait être assassiné. Après son décès, le vice-président Lyndon B. Johnson, qui était présent dans le cortège, deux voitures derrière celle de Kennedy, prêta serment comme nouveau président à bord d'Air Force One à l'aéroport de Love Field de Dallas avant que l'avion ne décolle. La dépouille du président Kennedy fut rapatriée dans l'avion. Les pilotes refusèrent que le cercueil soit mis dans la soute et exigèrent qu'il soit placé en cabine par respect pour le président assassiné (depuis pour leurs obsèques nationales à Washington, les cercueils des anciens présidents, Johnson, Nixon, Ford et Reagan, ont tous été transportés en cabine à bord d'un des avions de la flotte présidentielle).