Der vorausschauende Kartograf Sebastian von Rotenhan hatte schon früh mit der Herstellung der Verteidigungsbereitschaft begonnen. Es ist überliefert, dass am 20. April 1525 der Bürgermeister und einige Ratsherren der Stadt Würzburg auf dem Marienberg vorstellig wurden, um sich über den Grund für diese Maßnahmen zu erkundigen. Sichtbares Element dieser Verteidigungsbereitschaft war vor allem die Abholzung der Hänge und eines heute nicht mehr vorhandenen Lustgartens im nordöstlichen Bereich des Geländes. Aus diesem Holz wurde ein Palisadenwall außerhalb des Scherenbergrings errichtet. Darüber hinaus wurden zusätzliche Schießscharten in Mauern und Türme gebrochen. Zu den nicht von außen sichtbaren Elementen dieser Verteidigungsbereitschaft zählte vor allem die Aufmunitionierung der Burg mit „Feuerwerk“ (Pech und Schwefel) und das Brechen von Verbindungsgängen innerhalb des Burggeländes, welches den Verteidigern zum späteren Zeitpunkt erlaubte, bei Alarm sehr viel schneller die zu verteidigenden Punkte der Burg zu erreichen bzw. mit zusätzlichen Kräften zu verstärken. (Vergleichbar mit modernen Fallschirmjägertaktiken bspw. bei der Belagerung von Bastogne im Dezember 1944.) Sebastian von Rotenhan ließ zu diesem Zweck auch in allen Himmelsrichtungen Alarmglocken anbringen. Weitere Maßnahmen waren die Umfunktionierungen der „Ratsstube“ (gen Norden) und des „Haferbodens“ (gen Osten) zu Geschützstellungen.