Het seizoen 2016 was het afscheidsjaar van Cancellara, zoals hij in november 2015 al had aangekondigd. Hij won voor de derde keer in zijn carrière de Strade Bianche en eindigde als tweede in de Ronde van Vlaanderen. In Parijs-Roubaix kon hij, mede door een valpartij, geen hoge notering behalen. In de tijdritten presteerde Cancellara weer uitstekend: hij won de tijdritten in de Ronde van de Algarve, Tirreno-Adiatico en Ronde van Zwitserland en werd nationaal kampioen tijdrijden. Op 10 augustus bekroonde hij zijn loopbaan door met overmacht olympisch goud te winnen op de tijdrit in Rio de Janeiro. Die prestatie leverde hem aan het einde van het jaar (2016) de uitverkiezing op tot Zwitsers Sportpersoon van het Jaar. Cancellara sloot zijn laatste seizoen af met enkele kleine ritten zoals een gewonnen criterium in Bavikhove op 4 september en als laatste reguliere race een criterium in het Japanse Utsunomiya (22 oktober), op 12 november gevolgd door een afscheidsfeest met ruim 6000 toeschouwers in 't Kuipke in Gent.