Nella stagione 2006-2007, dopo un infortunio iniziale, Ambrosini ha riconquistato il suo posto nel Milan, formando con Gennaro Gattuso e Andrea Pirlo il centrocampo titolare. La squadra è schierata infatti da Ancelotti con due incontristi e con Kaká più avanzato e vicino all'unica punta, soluzione che ha permesso ai rossoneri di vincere la Champions League 2006-2007 contro il Liverpool nella finale giocata ad Atene, durante la quale dà inizio all'azione che porterà al gol del 2-0. Ambrosini ha realizzato anche due gol in campionato, entrambi decisivi per il risultato finale di 1-0: contro la Sampdoria e contro l'Atalanta, in entrambi i casi a San Siro. Durante la festa su un autobus scoperto, per celebrare l'affermazione europea, il centrocampista si è reso autore di un gesto controverso esponendo uno striscione con scritte volgari nei confronti dell'Inter: tale fatto ha poi comportato il suo deferimento, nonché un'ammenda pecuniaria. In risposta, dopo la vittoria del campionato 2008-09, i calciatori nerazzurri esposero uno striscione simile.