Il sacco di Roma danneggiò gravemente la chiesa di Santa Maria, motivo per cui papa Paolo III volle che venisse ricostruita; dell'antica struttura fu preservata soltanto la torre campanaria. Il progetto del nuovo edificio venne affidato ad Antonio da Sangallo il Giovane (il quale sarebbe subentrato a Baldassarre Peruzzi, morto nel 1536) e i lavori iniziarono nel 1538; dopo una interruzione, furono ripresi nel 1543 e terminarono nel 1545. La chiesa, che acquisì fin dall'inizio la nuova intitolazione allo Spirito Santo, venne dedicata il 17 maggio 1571 da Francesco Maria Piccolomini, vescovo di Montalcino e Pienza. Fu in vista della dedicazione che il commendatore dell'arcispedale Bernardino Cirillo volle che venisse decorata secondo le istanze del concilio di Trento su progetto di Ottaviano Mascherino; la facciata fu edificata tra il 1585 e il 1590. L'apparato decorativo dell'abside, invece, venne realizzato a partire dal 1593 da Jacopo Zucchi. Un nuovo altare maggiore venne dedicato nel 1668 da Francesco Maria Febei, commendatore dell'arcispedale e arcivescovo titolare di Tarso. Restauri vennero condotti sotto i pontificati di Benedetto XIV e Pio IX, e nuovamente nel 1950-1958.