I 1990 deltok han i grunnleggelsen av Det serbiske demokratiske parti (SDS). I 1992 ble han valgt til president i den serbiske utbryterstaten Republika Srpska. Med støtte fra Serbia ledet Karadžić bosnisk-serbiske styrker i kampen mot bosnjaker og kroater i Bosnia-krigen fra 1992 til 1995. De bosnisk-serbiske styrkene beleiret Sarajevo og fordrev bosnjaker og kroater fra sine hjem i det som er beskrevet som etnisk rensning. I juli 1995 ble over 8000 bosnjaker drept i Srebrenica-massakren. Som president var Karadžić øverstkommanderende for Republika Srpskas væpnede styrker.