Wimbledonissa 2010 Isner ja Nicolas Mahut pelasivat ammattilaistenniksen pisimmän tennisottelun. Yksitoista tuntia ja viisi minuuttia kestänyt ottelu päättyi lopulta Isnerin voittoon luvuin 6–4, 3–6, 6–7(3), 7–6(7), 70–68. Isner syötti ottelun aikana 112 läpisyöttöä tehden uuden ennätyksen läpisyöttöjen määrässä. Seuraavana päivänä turnauksen toisella kierroksella hän hävisi suoraan kolmessa erässä Thiemo de Bakkerille luvuin 6–0, 6–3, 6–2.