Über Bessarions Herkunft liegen unterschiedliche Angaben vor, und über die Datierung seiner Geburt gehen in der Forschung die Meinungen auseinander. Unstrittig ist, dass er aus Trapezunt stammte, der Hauptstadt eines eigenständigen Kaiserreichs, das einer der Nachfolgestaaten des 1204 von den Kreuzrittern des vierten Kreuzzugs zerstörten Byzantinischen Reichs war. Nach der Darstellung des zeitgenössischen byzantinischen Schriftstellers Michael Apostoles, der den Kardinal gut kannte, lebten dessen Eltern in bescheidenen Verhältnissen und mussten ihren Lebensunterhalt mit ihren Händen verdienen. Einer anderen Überlieferung folgte der Historiker und Bischof von Alessio Benedetto Orsini, der seine Untersuchung über die Genealogie der Komnenen um 1635/36 abschloss. Orsini hatte noch Zugang zu heute verschollenen griechischen Quellen. Nach seinem Bericht war Bessarions Vater ein Adliger namens Konstantinos Milessios und seine Mutter Eudoxia Komnene, eine Tochter Kaiser Johannes’ III. von Trapezunt, der von 1342 bis 1344 regierte. Allerdings wird die Glaubwürdigkeit von Orsinis Angaben in der Forschung überwiegend skeptisch beurteilt. Einer zeitgenössischen Notiz zufolge hieß Bessarions Mutter Theodule. Er selbst nannte die Namen Theodoros und Theodora, die sich anscheinend auf seine Eltern beziehen. Vermutlich war entweder Theodora oder Theodule ein klösterlicher Name, den seine Mutter angenommen hatte, als sie als Witwe in ein Kloster eintrat.