Am 5. Mai 1866 erging der Mobilmachungsbefehl und das Regiment verlegte daraufhin am 24. Mai zunächst mit der Bahn nach Potsdam. Von dort trat es den Marsch nach Brieg an und überschritt am 26. Juni im Verbund mit der 1. Garde-Infanterie-Division die Grenze zu Böhmen. Bei Soor kam es am 28. Juni zu ersten Gefechten mit den Österreichern. Am Tag darauf gelang es dem I. und II. Bataillon bei Burkersdorf und Staudenz zwölf Offiziere und 394 Mann als Gefangene einzubringen. Die Füsiliere kamen im Gefecht bei Königinhof zum Einsatz, hatte aber keinen unmittelbaren Anteil am siegreichen Ausgang. In der Schlacht bei Königgrätz nahmen das I. und II. Bataillon am 3. Juli die strategisch wichtige Höhe bei Chlum ein und schaltete die dort positionierten feindlichen Artilleriebatterien aus. Während der Schlacht verlor das Regiment dreißig Mann und hatte vier Offiziere sowie 189 Mann an Verwundeten zu beklagen.