Im Mai 1527 wurde Rom während des Krieges der Liga des Cognac von den Habsburgern belagert. Die Stadt wurde geplündert und zerstört. Als die Medici von der Niederlage des Kirchenstaates erfuhren, wurden sie in Florenz erneut von der Anti-Medici-Fraktion abgesetzt. Eine neue Welle des Puritanismus fegte über Florenz hinweg. Viele neue einschränkende fundamentalistische Gesetze wurden verabschiedet. Die Medici wurden von der Anti-Medici-Fraktion abgesetzt.