Am 8. Juni 1861 löste sich Tennessee nach einer im zweiten Anlauf erfolgreichen Volksabstimmung als letzter der Südstaaten aus der Union und trat am 2. Juli den Konföderierten Staaten von Amerika bei. Es gab in bestimmten Gegenden eine klare Mehrheit von Sezessionsgegnern, die nach dem Referendum auf einer Versammlung in Greeneville den Verbleib Osttennessees in den Vereinigten Staaten beschlossen, ohne sich gegen Nashville durchsetzen zu können. Während des Krieges fanden mehrere Schlachten auf dem Boden Tennessees statt, so zum Beispiel die Schlacht von Chattanooga, die Schlacht von Nashville und die Schlacht von Franklin. Nach dem Amerikanischen Bürgerkrieg gab sich der Staat am 22. Februar 1865 eine neue Verfassung, durch die die Sklaverei abgeschafft wurde, und ratifizierte am 18. Juli 1866 den 14. Zusatzartikel zur US-amerikanischen Verfassung. Tennessee war damit der erste der abtrünnigen Staaten, der den Vereinigten Staaten wieder beitrat (am 24. Juli 1866).