Contrariamente a las políticas de su padre, el rey Carlos fue un defensor de la formación de un estado nación alemán. Cuando después de la guerra de Prusia y Austria contra Dinamarca en 1864, el aumento de tensión entre los ex-aliados llevó al estallido de la guerra en 1866; Baviera, Wurtemberg y Baden se pusieron del lado de Austria. El ejército de Wurtemberg fue aplastado por las tropas prusianas el 24 de julio de 1866 en Tauberbischofsheim unos días antes del armisticio entre Prusia y Austria. Wurtemberg luego concluyó un armisticio con Prusia el 1 de agosto de 1866. La guerra terminó el 23 de agosto con la paz de Praga, en la cual el reino tuvo que reconocer la Confederación del Norte de Alemania que acababa de ser fundada por Prusia y tuvo que pagar una compensación de guerra a este último reino. Con esto se reconocía la disolución de la Confederación Germánica y se adhirió al igual que otras potencias medias alemanas en un "Schutz- und Trutzbündnis" a Prusia, tratados de protección y colaboración secretos con los estados del sur de Alemania, lo que se hizo público en 1867. Sin embargo, tanto la corte como el gobierno y el pueblo tenían oficialmente una actitud antiprusiana.