Vuonna 1521 Paavi Klemens VII lähetti Castiglionen Pyhän Istuimen lähettilääksi Madridiin. Castiglionen varsinainen tehtävä oli vakoilla kapinallismieliseksi epäiltyä keisari Kaarle V:tä. Tehtävä ei onnistunut, ja Castiglionea epäiltiin jopa Rooman ryöstön edesauttamisesta. Castiglionen laajat selityskirjeet saivat hänelle kuitenkin paavin anteeksiannon ja keisarin kunnianosoituksia.