Al termine del campionato 1999-2000 fu ceduto al Benfica, venendo acquistato poi dal Valencia. Il difensore spagnolo firmò un quadriennale e fu coinvolto in uno scambio che mandò in Portogallo Zlatko Zahovič. Rimase al club per nove stagioni collezionando 230 apparizioni nella Liga e vincendo cinque trofei (la Liga nel 2002, la tripletta Liga-Coppa UEFA-Supercoppa UEFA nel 2004 e la Coppa del Re nel 2008). Le sue prestazioni con la maglia dei "rojiblancos" gli valsero la prima convocazione in Nazionale maggiore. Il 6 marzo 2007, al termine della gara di Champions League contro l'Inter (conclusasi con la vittoria del Valencia), si rese protagonista di una rissa con alcuni avversari; l'episodio gli costò una squalifica di 4 giornate nella competizione. Dopo Euro 2008, Marchena divenne il nuovo capitano del Valencia al posto di David Albelda.