За єпископа Афанасія (Пузини) (1623-1650) становище православної Волинської єпархії покращилося. Православна шляхта заснувала нові монастирі, школи, друкарні для видання церковно-полемічної літератури, а сам єпископ активно захищав Православ'я і вів боротьбу з уніатством. Великим захисником Православної церкви на Волині був також князь Костянтин Острозький. Утиски та насилля з боку уніатів призвели до низки козацьких війн, які завершилися загальним повстанням під проводом Богдана Хмельницького в 1648-1654 роках. Православні волиняни брали активну участь у цій визвольній війні. У 1651 році в околицях міста Берестечка відбулася Берестейська битва, де полягли тисячі православних козаків.