W czasie kampanii wrześniowej 9 i 12 września 1939 niemieckie samoloty zbombardowały Zamość. Zginęło ponad 250 osób, wiele było rannych, przede wszystkim cywilów. 13 września wojska niemieckie wkroczyły do Zamościa. Dotrzymując Paktu Ribbentrop-Mołotow, 25 września Niemcy opuścili Zamość a ich miejsce zajęła Armia Czerwona. Na mocy Traktatu o granicach i przyjaźni III Rzesza – ZSRR wojska sowieckie opuściły Zamość 6 października. Od 8 października 1939 do lipca 1944 miasto znalazło się w rękach Niemiec hitlerowskich. Podczas II wojny światowej na Rotundzie utworzono obóz zagłady, gdzie zginęło ponad 8 tysięcy ludzi, oraz obozy jeńców radzieckich i obóz tymczasowy dla wysiedlonych mieszkańców Zamojszczyzny (w tym dla licznych dzieci Zamojszczyzny). W czasie okupacji niemieckiej na Zamojszczyźnie miała miejsce masowa akcja wysiedleńcza i pacyfikacyjna Aktion Zamość prowadzona przez Niemców, dążących do stworzenia tu niemieckiego osadnictwa jako przyczółka do germanizacji Wschodu, dlatego okolice Zamościa były terenem wielu walk partyzantów AK, BCh, GL/AL (powstanie zamojskie). Zamość został zdobyty przez wojska radzieckie i przez współdziałających z nimi żołnierzy Armii Krajowej w lipcu 1944 r.