1527年羅馬之劫時，大學被迫關閉，部分教師和學生被查理五世野蛮的神圣罗马帝国軍隊殺死。直至1534年，才由教宗保祿三世復校。16世纪初，著名的文艺复兴家族佛罗伦萨的美迪奇家族的支持推动了罗马大学的发展，洛伦佐·德·梅迪奇的儿子，教皇利奥十世（洛伦佐·德·梅迪奇之子）、教皇克莱门特八世大力推动了罗马大学的发展，全面赞助了大学在人文、艺术和科学领域的发展，召集了欧洲各地的著名学者到罗马大学讲学。文艺复兴时期，罗马大学成为欧洲文化和科学的重要中心，如1587年，伽利略带着关于固体重心计算法的论文到访罗马大学，与著名数学家和历法家C.克拉维乌斯教授交流，人体解剖学先驱巴托罗梅奥·埃乌斯塔基奥也任教于罗马大学，1592年生理学家安德烈亚·切萨尔皮诺在罗马大学发现了血液循环的证据。