L'année suivante, il établit deux nouveaux records du monde lors des sélections américaines pour les Championnats du monde 1986 disputés à Madrid : il réalise 22 s 33 lors du 50 mètres nage libre et 48 s 74 sur le 100 mètres nage libre. En Espagne, il est devancé par son compatriote Tom Jager et le Suisse Dano Halsall sur le 50 mètres. Il obtient son premier titre mondial en remportant le 100 mètres en devançant Stéphan Caron et Jager. Il remporte la médaille d'argent du 100 mètres papillon, battu par l'Américain Pablo Morales et il termine à la troisième place du 200 mètres nage libre. Biondi fait partie des trois relais américains, la sélection américaine remportant l'or sur 4 × 100 m nage libre et 4 × 100 m quatre nages mais devant s'incliner face aux relais allemands sur le 4 × 200 m, l'Allemagne de l'Est remportant le titre devant l'Allemagne de l'Ouest. Il devient le premier nageur à remporter sept médailles lors d'un championnat du monde.