En 1999, la Lazio, sous la direction de Sven-Göran Eriksson, achète Simeone qui rejoint un effectif à forte saveur argentine comprenant aussi Roberto Sensini, Matías Almeyda, Hernán Crespo et Juan Sebastián Verón. L'équipe était passée proche du "Scudetto" juste avant l'arrivée Simeone et il aide son nouveau club à décrocher le championnat après une saison éprouvante, qui voit la Juventus, en tête du classement par deux points d'avance avant la dernière journée, perdre sous la pluie à Pérouse tandis que la Lazio s'impose sur la Reggina au Stadio Olimpico, assurant à Simeone son premier titre de Serie A. Simeone réalise le second doublé coupe-championnat de sa carrière en battant l'Inter en finale de la "Coppa Italia". Il joue ensuite trois autres saisons chez les "Biancocelesti" et marque un but contre son ancien club de l'Inter lors de la dernière journée de la saison 2001-2002 qui ruine les rêves de titre de son ancien employeur.