La acumulación de tanto poder en un hombre y una dinastía preocupaba mucho al rey de Francia, Francisco I, que se encontró rodeado de territorios Habsburgo. En 1521, Francisco invadió las posesiones españolas en Italia e inauguró una segunda ronda del conflicto franco-español. Las Guerras Italianas fueron un desastre para Francia, que sufrió derrotas tanto en la llamada Guerra de los Cuatro Años (1521-1526) -Biccoca (1522) y Pavía (1525, en donde Francisco fue capturado)- como en la Guerra de la Liga de Cognac (1527-1530) -Landriano (1529)- antes de que Francisco cediera y abandonara Milán, en beneficio una vez más de España.