Auch im Mittelmeer kam es zu Auseinandersetzungen mit wechselnden Erfolgen: 1535 gelang Kaiser Karl V. im Tunisfeldzug den kurz zuvor zum Oberbefehlshaber der osmanischen Flotte ernannten Korsaren Khair ad-Din Barbarossa aus Tunis zu vertreiben und Tunesien zum spanischen Vasallenstaat zu machen. 1537 wiederum griff die osmanische Flotte dieses Khair ad-Din Barbarossa die venezianischen Besitzungen in Griechenland an. Die vereinigten Seestreitkräfte der zur Verteidigung gebildeten Heiligen Liga konnten keinen effektiven Widerstand leisten. Im Jahre 1538 besiegte die Flotte Khair ad-Din Barbarossas die Flotte der Heiligen Liga unter Andrea Doria bei Preveza. Damit begann bis zur Seeschlacht von Lepanto 1571 eine über 30-jährige militärische Vormachtstellung der osmanischen Flotte im Mittelmeer. Venedig schloss 1540 mit den Osmanen einen Sonderfrieden, in dem Teile Dalmatiens, die verbliebenen Besitzungen Venedigs auf der Peloponnes und fast alle Inselbesitzungen Venedigs im Ägäischen Meer außer Tinos und Kreta an die Osmanen fielen. 1560 behaupteten die Osmanen in der Seeschlacht von Djerba ihre Vormachtstellung. 1565 schlug die Belagerung von Malta fehl: Die Ritter des Malteserordens konnten den Invasoren so lange standhalten, bis die durch Verluste und Krankheiten geschwächten osmanischen Streitkräfte sich angesichts der fortgeschrittenen Jahreszeit und der aus dem spanischen Sizilien eintreffenden Entsatztruppen zurückzogen.