W kwestii stosunków z Polską Karol V kontynuował linię polityczną swojego dziadka Maksymiliana. Podczas elekcji zabiegał wprawdzie o poparcie dla swojej kandydatury u króla Zygmunta Starego (który był prawnym opiekunem elektora Ludwika Jagiellończyka), ale po wyborze kontynuował działania swojego dziadka, zmierzające do sojuszu Cesarstwa z państwem moskiewskim. Już w 1519 r. wysłał do Moskwy posła, który jednak został zatrzymany w Polsce, a potem odesłany z powrotem do Karola. Podczas wojny polsko-krzyżackiej 1519-1521 z wielkim mistrzem zakonu krzyżackiego Albrechtem Hohenzollernem Karol opowiedział się w 1520 r. po stronie Zakonu. 15 lutego 1522 r. zlecił, po naleganiach Albrechta, pośrednictwo w rokowaniach między wielkim mistrzem a królem Zygmuntem swojemu bratu Ferdynandowi i Sejmowi Rzeszy.