Разом з тим домігся союзу зі Священною Римською імперією та Іспанією. 1538 року орден увійшов до Священної ліги, спрямованої проти Османської імперії. Мальтійські флот брав участь у складі коаліційної флотилії у битві при Превезі, де османський флот здобув перемогу. 1541 року госпітальєри долучилися до походу Карла V з метою здобуття Алжиру, що завершився цілковитою невдачею. 1543 року госпітальєри брали участь в обороні Ніцци від франко-османського флоту, що завершилося падінням міста.