Poco después, estalló la Guerra italiana de 1536-1538, la tercera guerra de Francisco I de Francia contra Carlos V, y la expedición contra Francia de 1536 a través de Provenza fue la última experiencia militar de Garcilaso. El poeta fue nombrado maestre de campo de un tercio de infantería, embarcándose en Málaga a cargo de los 3000 infantes que lo componían. Durante el temerario asalto a una fortaleza a finales de septiembre de 1536, acudiendo al combate sin armas defensivas a excepción de una rodela, en Le Muy, cerca de Fréjus, fue el primer hombre en trepar por la escala, y alcanzado por una piedra arrojada por los defensores cayó al foso gravemente herido. El Emperador, preso de la ira por su futura y segura muerte mandó ahorcar a la guarnición una vez tomada la fortificación. Trasladado a Niza, murió en esta ciudad a los pocos días, el 14 de octubre, asistido por su amigo Francisco de Borja, duque de Gandía y más tarde canonizado por la Iglesia católica. Aunque fue sepultado inicialmente en el monasterio de Santo Domingo de Niza, su cuerpo fue mandado traer a Toledo por su viuda doña Elena dos años después, en 1538, depositándose en la capilla del Rosario del convento de San Pedro Mártir. En 1869 los restos fueron exhumados para su conducción al Panteón de Hombres Ilustres , y restituidos a la capilla familiar en 1900.