Al comienzo de la Guerra de la Independencia el Regimiento partió de Cartagena pasando por Valencia y Madrid con dirección a Zaragoza para auxiliar al general José de Palafox en el primer asedio que sufrió la ciudad, y consiguieron vencer a las tropas francesas comandadas por el general Jean-Antoine Verdier. El Regimiento sacó de las trincheras a los franceses, que abandonaron el asedio el 25 de agosto. Poco después Napoleón se presentó con cien mil soldados y venció a las tropas españolas, entre ellas, al Regimiento Voluntarios de Castilla. En esa derrota, que tuvo lugar en Tudela en 1808, el Regimiento sufrió un durísimo revés al serle arrebatada por los franceses la Bandera Coronela del Regimiento, que fue llevada como trofeo al Museo de Los Inválidos de París.