В Смутное время Троицкий монастырь выдержал 16-месячную осаду польско-литовских интервентов под предводительством Сапеги и А. Лисовского. Польско-литовские войска, подошедшие к монастырю в сентябре 1608 года, обстреливали крепость из 63 орудий и многократно предпринимали попытки штурма; в конце 1609 года в осаждённом монастыре началась цинга, во время эпидемии умерло свыше двух тысяч человек. Всех умерших относили в Успенский собор. К концу зимы людей, способных защищать монастырь с оружием в руках, осталось менее 200. Несмотря на все трудности монастырь стойко оборонялся, по характеристике самих поляков он был вооружён «людьми, железом и мужеством». В ходе успешных вылазок осаждённых большое количество людей теряли и поляки; во время одной из вылазок погиб сын Лисовского Станислав. Узнав о подкопе под Пятницкую башню, защитники возвели напротив подкопа вторую стену, а затем в ходе успешной вылазки взорвали подкоп. года осада была снята русскими войсками под предводительством Михаила Скопина-Шуйского. Монастырь стал одним из оплотов Второго ополчения Минина и Пожарского; большой вклад в дело освобождения внёс архимандрит Дионисий, помогавший Ополчению крупными пожертвованиями и поддерживавший дух войска. Ущерб, нанесённый монастырю, описан в «Сказании Авраамия Палицына»: