La stagione successiva si è aperta nel migliore dei modi per poi diventare negativa. Il centrocampista ha realizzato 3 gol in campionato tutti decisivi alla Juventus nella terza giornata, al Napoli nell'ottava e al Verona nell'undicesima, oltre a un altro in rovesciata contro la Fiorentina in Coppa Italia. Ma nel febbraio 2001, nelle battute finali della partita casalinga contro la , ha subito un grave infortunio al legamento crociato anteriore del ginocchio sinistro. È tornato in campo 10 mesi più tardi, andando anche in gol contro il Verona a San Siro. Nonostante gli infortuni, Ambrosini è riuscito a ritagliarsi uno spazio importante. Nella stagione 2001-2002 ha segnato contro il Torino il gol-vittoria, che ha smorzato la contestazione dei tifosi per i risultati negativi della squadra e ha dato inizio alla rincorsa al 4º posto, conclusasi poi positivamente.