Het kwam alsnog tot oorlog toen Otto von Bismarck Oostenrijk er in 1866 van beschuldigde het Verdrag van Gastein te hebben geschonden. De door Oostenrijk voorgestelde mobilisering van de troepen van de Duitse Bond leidde tot een Pruisische oorlogsverklaring. De Pruisisch-Oostenrijkse Oorlog (1866), die in werkelijkheid om de hegemonie in Duitsland ging, deed de Duitse Bond definitief uiteenvallen. Pruisen, onder Helmuth von Moltke, versloeg Oostenrijk beslissend in de Slag bij Königgrätz (3 juli 1866). Frans ongenoegen over de Pruisische overwinning leidde ertoe dat Bismarck Oostenrijk en de Oostenrijks gezinde Zuid-Duitse staten moest ontzien. Pruisen annexeerde wel Sleeswijk, Holstein en Lauenburg, alsmede de Oostenrijkse bondgenoten Hessen-Kassel, Nassau, Hannover en Frankfort in Noord-Duitsland. Sindsdien vormde het land een aaneengesloten geheel. Reeds gedurende de oorlog had het een nieuwe statenbond voorbereid, de door Pruisen geleide Noord-Duitse Bond, waarvan alle Duitse staten ten noorden van de Main - al dan niet gedwongen - lid werden. Wilhelm I werd bondspresident en Bismarck bondskanselier.