Bereits im August 1808 marschierte das vergrößerte 2. Herzogliche Nassauische Infanterieregiment mit 1732 Mann nach Spanien zur Unterstützung der französischen Truppen. Es war aus dem 2. und 3. Bataillon, je einer Kompanie der anderen Bataillone, einer Eskadron reitender Jäger und 300 neuen Rekruten gebildet worden. Jedes Bataillon bestand aus einer Grenadierkompanie, vier Füsilierkompanien und einer Voltigeurkompanie. Der Einsatz dauerte fast fünf Jahre. In dieser Zeit nahmen die Truppen an sieben Schlachten und 33 Gefechten teil. In Spanien verlor das 2. Regiment rund 2.700 Mann. Die Voltigeure wurden in der Schlacht bei Talavera vollständig aufgerieben. Während des Spanienfeldzugs wurde das Regiment insgesamt mit 1675 Mann verstärkt.