Pod koniec kwietnia 1941 roku został dowódcą U-81 typu "VIIC". Po zakończeniu procesu szkolenia i zgrania załogi, okręt miał zostać skierowany do bazy w Breście, ale atak na Związek Radziecki pokrzyżował te plany. Bazujący w Trondheim okręt podjął działania przeciwko nieprzyjacielskiej żegludze na wodach arktycznych, podczas których zatopił dwa brytyjskie statki handlowe o łącznej pojemności prawie 9000 BRT. Później jednak zdecydowano o przerzuceniu go wraz z innymi okrętami na nieprzyjazne okrętom podwodnym Morze Śródziemne. Po pierwszej, nieudanej próbie pokonania Cieśniny Gibraltarskiej (uszkodzenie przez brytyjski samolot Consolidated PBY Catalina), w listopadzie U-81 osiągnął nakazany akwen. Wkrótce potem Guggenberger zaliczył swój największy sukces: 13 listopada 1941 roku strzałem z dużej odległości storpedował lotniskowiec HMS „Ark Royal” (22600 t wyporności), który zatonął następnego dnia. Mimo silnego kontrataku sił eskorty (naliczono 130 wybuchów bomb głębinowych) zdołał wyprowadzić okręt z zagrożenia. Za to zatopienie 10 grudnia 1941 roku został odznaczony Krzyżem Rycerskim.