Леонора родилась в марте 1553 года в семье Гарсии Альварес де Толедо и Осорио, маркиза Вилльяфранка-дель-Бьерсского и герцога Фернандинского, и Виттории д’Асканио Колонна; была третьей дочерью и четвёртым ребёнком пары. Мать девочки по отцу была племянницей известной поэтессы Виттории Колонна. Гарсия Альварес был сыном испанского вице-короля Неаполя Педро Альвареса де Толедо; сам же Гарсия Альварес был вице-королём Каталонии (1558—1564) и вице-королём Сицилии (1564—1566) от имени короля Филиппа II Испанского, а также участвовал в битве при Лепанто в 1571 году в качестве командующего испанской армией. Семейство Альварес де Толедо принадлежало к испанским грандам; представители династии часто становились вице-королями на испанских территориях и во владениях Габсбургов. Семейство так же называли «богатейшими бенефициями христианского мира». В 1539 году дочь Педро, Элеонора, вышла замуж за герцога Флорентийского Козимо I Медичи; этот брак был призван легитимизировать герцогский титул Медичи, полученный от Габсбургов только в 1532 году.