Nach seiner Geburt in der mexikanischen Hauptstadt wuchs Mariano Matamoros in Ixtacuixtla (Tlaxcala) auf. 1789 absolvierte er seine Studien der Kunst und Theologie am Colegio de Santa Cruz de Tlatelolco in Tlatelolco, einem Viertel von Mexiko-Stadt. 1796 empfing er die Priesterweihe. Als Priester arbeitete er zunächst in Mexiko-Stadt, anschließend in Tepatitlán (Jalisco) und Pachuca (Hidalgo) sowie in der im heutigen Bundesstaat Querétaro gelegenen Mission Bucareli. Seine letzte Wirkungsstätte in seiner Eigenschaft als Priester war die im heutigen Bundesstaat Morelos gelegene Gemeinde Jantetelco, bevor Matamoros wegen seiner Sympathien für das Unabhängigkeitsstreben Mexikos kurz vor Ausbruch des Unabhängigkeitskrieges von den spanischen Behörden inhaftiert wurde.