V únoru 1563 byl František de Guise zavražděn. Zatímco byl vrah chycen a ihned usmrcen, Anna udělala všechny potřebné kroky, aby mohla zažalovat vůdce francouzských hugenotů, Gasparda de Coligny, kterého z vraždy vinila. Během následujících tří let vyvíjela vdova svými žádostmi tlak na krále a jeho dvořany, ale v lednu 1566 prohlásila králova rada admirála Colignyho za nevinného a uložila věčné mlčení v této věci. Většina jejích současníků vinila vévodkyni vdovu de Guise odpovědnou za výstřel na Colignyho z 22. srpna 1572, který byl signálem pro začátek Bartolomějské noci.