Eine markante Zäsur in Bessarions Leben bildete die türkische Eroberung Konstantinopels im Mai 1453. Der Untergang des Byzantinischen Reichs erschütterte die westliche Welt. Nikolaus V. und seine Nachfolger Calixt III. (1455–1458) und Pius II. (1458–1464) planten die Rückeroberung und machten die Vorbereitung eines Kreuzzugs zum Hauptinhalt ihrer außenpolitischen Aktivitäten. Für Bessarion wurde dieses Ziel zum vorrangigen politischen Anliegen, dem er sich in seiner restlichen Lebenszeit unermüdlich widmete. Dabei kam der Republik Venedig eine Schlüsselrolle zu. Im Juli 1453 schrieb der griechische Kardinal dem Dogen Francesco Foscari, der Sultan werde den Balkan einnehmen und dann Italien angreifen, wenn die westliche Christenheit ihm nicht sofort mit geeinten Kräften entgegentrete, und der Republik drohe der Verlust ihrer Territorien in Griechenland. Diese Warnung blieb jedoch wirkungslos; Venedig schloss mit Sultan Mehmed II. Frieden, um seinen Seehandel zu schützen, und akzeptierte dabei die Bedingung, keine militärischen Unternehmungen gegen das osmanische Reich zu unterstützen.