Chamberlain fue comisionado como teniente coronel en el 20.º Regimiento de Infantería Voluntaria de Maine en 1862 y luchó en la Batalla de Fredericksburg. Se convirtió en comandante del regimiento en junio de 1863. El 2 de julio, durante la batalla de Gettysburg, el regimiento de Chamberlain ocupó el extremo izquierdo de las líneas de la Unión en Little Round Top. Los hombres de Chamberlain resistieron los repetidos ataques de la Infantería de Alabama del 15.º Regimiento y finalmente echaron a los Confederados con una carga de bayoneta cuesta abajo. Chamberlain fue gravemente herido mientras comandaba una brigada durante la Segunda Batalla de Petersburgo en junio de 1864, y recibió lo que pretendía ser un ascenso en el lecho de muerte a general de brigada. En abril de 1865, luchó en la Batalla de Five Forks y tuvo el honor de comandar las tropas de la Unión en la ceremonia de rendición de la infantería del ejército de Robert E. Lee en Appomattox Court House, Virginia.