El febrer de 2016, Johnson va donar suport a Vote Leave, grup de campanya a favor de la sortida del Regne Unit de la Unió Europea, en el referèndum sobre la permanència a la UE de 2016. Va titllar les advertències de Cameron sobre sortir-ne de "molt exagerades". Després de l'anunci, que els mercats financers van interpretar que faria el Brexit més probable, la lliura esterlina va caure un 2% contra el dòlar, arribant al nivell més baix des del març de 2009.