В начале войны в той же должности. В октябре 1941 года генерал-майор Матвеенко был направлен на учебу в Академию Генштаба РККА им. К. Е. Ворошилова, после окончания ее ускоренного курса в апреле 1942 года назначен помощником начальника оперативной группы по вопросам комплектования войск Управления Северо-Кавказского направления. С июня исполнял должность заместителя командира 49-й стрелковой дивизии Московской зоны обороны. В конце августа она была направлена на Сталинградский фронт, где вошла в состав 66-й армии и вела тяжелые бои с противником, прорвавшимся к Волге севернее Сталинграда. С 20 сентября 1942 года временно вступил в командование дивизией. Части дивизии под его командованием в составе 24-й армии Донского фронта вели боевые действия в районе Самофаловка (северо-западнее Сталинграда). В боях генерал-майор Матвеенко неоднократно выезжал непосредственно в боевые порядки частей, показывал смелость и выносливость при боевой работе. 10 октября он был ранен и госпитализирован. После выздоровления в декабре 1942 года вернулся в 49-ю стрелковую дивизию, которая в это время входила в 24-ю армию Донского фронта. В должности зам. командира этой дивизии участвовал в боях по уничтожению окруженной Сталинградской группировки противника. По окончании боевых действий в Сталинграде в феврале 1943 года дивизия убыла на Западный фронт в 16-ю армию и вела оборонительные бои на жиздренском направлении. В июле — августе она в составе 50-й армии приняла участие в Орловской наступательной операции, в ходе которой форсировала реку Жиздра. Затем дивизия вошла в 10-ю армию и участвовала в Смоленской наступательной операции (наступала из района Кирова на Рославль, Снигирёвку, Чаусы). К началу октября она вышла к реке Проня восточнее Могилёва. В ходе этой операции 12 сентября генерал-майор Матвеенко был ранен и госпитализирован, после излечения в ноябре назначен военным комиссаром Николаевского областного военного комиссариата и в этой должности находился до конца войны.