Prusy Książęce zerwały tym samym swój związek podległości wobec papiestwa i Świętego Cesarstwa Rzymskiego. Już jednak w 1573 przedstawiciel bocznej linii Hohenzollernów Jerzy Fryderyk von Ansbach, powołując się na postanowienia traktatu krakowskiego zażądał przekazania mu kurateli nad chorym umysłowo księciem pruskim Albrechtem Fryderykiem. W latach 1578 - 1618 w Prusach Książęcych rządzili faktycznie regenci. Strona polska nie chciała się jednak zgodzić na trwałe przejście tego lenna we władanie brandenburskiej linii Hohenzollernów. W 1603 kuratelę tę przejął Joachim Fryderyk Hohenzollern, co bez zgody Sejmu Zygmunt III Waza potwierdził 11 marca 1605. W 1609 regencję przejął Jan Zygmunt Hohenzollern. Dopiero w 1611, wynagradzając wsparcie jakiego udzielili Hohenzollernowie Rzeczypospolitej w wojnie polsko-rosyjskiej 1609–1618, Zygmunt III zgodził się na formalne złożenie hołdu przez margrabiego brandenburskiego. Margrabia Jerzy Wilhelm Hohenzollern złożył homagium w 1621 roku, a jego syn, Fryderyk Wilhelm w 1641 roku. Był to ostatni hołd pruski, ponieważ Prusy Książęce odpadły od Rzeczypospolitej w 1657 w wyniku podpisania traktatów welawsko-bydgoskich.