Ved krigens utbrudd valgte han å forbli lojal mot hjemstaten Virginia, som løsrev seg fra Unionen til fordel for sørstatene etter Lincoln beordret tropper fra alle stater etter angrepet på Fort Sumter. Lee nøt flere, store seiere tidlig i borgerkrigen, som det andre slaget ved Bull Run og ved Fredericksburg. Hans største bragd kom ved slaget ved Chancellorsville, da uniongeneral Joseph Hooker ble knust av Lees halvparten så store styrke. Etter slaget ble Stonewall Jackson drept av egen soldat etter en rekognoseringstur. Dette var et stort tap for Lee, som mente det var som å "miste sin høyre arm". Lee og sørstatene klarte aldri å gjenvinne overtaket i krigen etter slaget ved Gettysburg.