У трећем грађанском рату (1568—1570) хугеноти односе победу и задржавају слободу вероисповести. Колињи предлаже уједињење Француске путем рата са Шпанијом. Шарл прихвата предлог; Катарина је против њега. Колињи постаје прва личност у држави, па Катарина мења политику и одлучује да га убије. Прилика за то је венчање Анрија Наварског (вође хугенота) и Маргарете Валоа, ћерке Катарине Медичи. Први атентат не успева. Катарина, заплашена да ће у истрази бити откривена, убеђује краља да хугеноти спремају заверу. У зору 23. августа 1572. године, на дан Светог Вартоломеја, Катаринин син, Гиз, војвода Анжуја, градске власти Париза и разјарена гомила нападају и убијају 4000 хугенота, а међу њима и Колињија. Вартоломејска ноћ изазвала је одушевљење широм католичких држава. Папа и католичке државе упућују своје честитке. Протестанти догађај приказују као пример католичког фанатизма. Масакр не решава ништа, али има негативне последице по католике. Хугеноти прелазе у дефанзиву, али су католици разједињени. Политичари устају против Гиза и траже уједињење које се не постиже. На престо 1574. године ступа слаби Анри III (1574—1589). Катарина 1580. настоји да преговара са обе стране и постиже привидну равнотежу. Хугенотске и католичке трупе заједно учествују у рату против Шпанаца у Низоземској што је шпанског краља Филипа II навело да поново подстакне грађански рат у Француској. Анри Наварски одбија његове предлоге.