En mayo de 1938, el escuadrón empezó a utilizar aviones Lysander, continuando con sus funciones tácticas en tiempos de guerra, en Francia desde abril de 1940. En noviembre de 1942 regresó a Inglaterra y llevó a cabo patrullas marítimas, con dos objetivos: encontrar aliados derribados o fuerzas enemigas. Para abril de 1942, el escuadrón fue reequipado con aviones P-51 Mustang, encargado de llevar a cabo redadas de combate y tareas de reconocimiento sobre Francia. En febrero de 1943, utilizó aviones Spitfire Mk V para las funciones mencionadas. El 32 de junio de 1943 el escuadrón formó parte del Ala de Reconocimiento Estratégico de la 2.º Fuerza Aérea Táctica de la RAF, como una unidad de reconocimiento fotográfico de alta altura, utilizando aviones Spitfire PR Mk XI, con asentamiento en la base de la RAF en Blackbushe. en la preparación para el Día D, el 16.º escuadrón suministró fotografías para la planificación del desembarco aliado. Después de estas tareas esenciales, siguió con sus tareas de reconocimiento hasta el final de la guerra.