Во время Второй мировой войны первыми B-17 стали применять Королевские военно-воздушные силы Великобритании в 1941; 8-я и 15-я воздушные армии США в 1942. Основное боевое применение — дневные стратегические бомбардировки немецкой промышленности. Также использовались во время высадки в Нормандии для нанесения ударов по немецким аэродромам ПВО (Операция Pointblank).