Ambrosini w reprezentacji Włoch zadebiutował 28 kwietnia 1999 roku w spotkaniu przeciwko Chorwacji. Wcześniej rozegrał siedem meczów dla reprezentacji Italii do lat osiemnastu i osiemnaście meczów dla reprezentacji U-21. Razem z dorosłą kadrą pojechał na Letnie Igrzyska Olimpijskie w 2000 roku, na których Squadra Azzura dotarła do ćwierćfinału. W tym samym roku wystąpił również na mistrzostwach Europy, na których zdobył srebrny medal. Z powodu kontuzji nie pojechał na Mistrzostwa Świata 2002, nie znalazł się także w kadrze Włochów na Euro 2004. 16 sierpnia 2006 Massimo został powołany do kadry przez Roberto Donadoniego po dwuletniej przerwie w występach reprezentacyjnych. Pod wodzą nowego szkoleniowca Włoch przejął w drużynie opaskę kapitańską i wywalczył sobie miejsce w podstawowej jedenastce. W 2008 roku Ambrosini wraz z reprezentacją dotarł do ćwierćfinału mistrzostw Europy.