1387 wurde Tvrtkos Cousine Elisabeth ermordet. Deren Tochter Maria machte dafür ihren Ehemann Sigismund verantwortlich. Gegen den neuen König von Ungarn führte Tvrtko 1388 Krieg in Kroatien und Dalmatien. Im selben Jahr konnte ein erster Angriff der Osmanen auf Bosnien in der Schlacht bei Bileća (27. August 1388) erfolgreich zurückgeschlagen werden. Tvrtko sah nun die Notwendigkeit, sich stärker der Verteidigung seines Landes gegen die Türken zu widmen. Unter seinem Heerführer Vlatko Vuković kämpften 1389 bosnische Truppen in der berühmten Schlacht auf dem Amselfeld an der Seite des Serbenfürsten Lazar Hrebeljanović. Obwohl der bosnische Flügel der gegen die Osmanen eingesetzten Armee bei dieser Schlacht ungeschlagen blieb, führte die im Allgemeinen verlorene Schlacht dazu, dass Tvrtko große Teile seiner serbischen Gebiete verlor, deren Fürsten nun die Oberherrschaft der Osmanen anerkannten. 1390 konnte Tvrtko dagegen in Dalmatien die Ungarn besiegen, die lediglich die Stadt Zadar halten konnten. Die meisten Städte und Inseln erkannten Tvrtko als König an.