Nel 1557, alla morte del Gran Maestro Claude de la Sengle, i cavalieri, consapevoli dell'attacco che sarebbe sicuramente arrivato, elessero La Valette come Gran Maestro. Nel 1560 questi formò un'alleanza con l'Impero asburgico per riconquistare Tripoli, ma la spedizione provocò una sconfitta cristiana nella battaglia di Djerba. Nonostante ciò, le galee dell'Ordine furono in grado di salvare diverse altre navi cristiane, e più tardi durante il suo regno, La Valette rafforzò notevolmente la marina dell'Ordine.