Bei der Wahl 2000 wurde Nelson für Florida in den Senat der Vereinigten Staaten gewählt. Mit einem Stimmanteil von 51 Prozent siegte er knapp gegen den Republikaner Bill McCollum. Bei der Wahl 2006 wurde er mit 60,3 Prozent der Wählerstimmen gegen Katherine Harris bestätigt. Auch bei der Senatswahl 2012 konnte sich Nelson mit über 55 Prozent gegen den republikanischen Kandidaten Connie Mack durchsetzen. Er erhielt für seinen Wahlkampf eine Spende von Donald Trump. Nelson war "Ranking Member", also ranghöchster Demokrat, im Handelsausschuss und hatte den zweithöchsten Rang im Streitkräfteausschuss.