I EM 2000 startade Di Biagio tillsammans med Demetrio Albertini på innermittfältet. I den sista gruppspelsmatchen mot Sverige så gjorde han ett av målen i segern som även innebar gruppseger. I semifinalen mot Nederländerna, som Italien vann på straffar, gjorde han mål på sin straff under straffsparksläggningen. I finalen väntade Frankrike som såg ut att förlora, men lyckades kvittera till 1-1 i den 93:e minuten. I förlängningen avgjorde sedan David Trezeguet och Italien fick nöja sig med silver.