С началом войны находился на прежней должности. Свой первый бой принял на рассвете 22 июня под Брестом. 6-я стрелковая дивизия вела тяжёлые оборонительные боевые действия на брестском и бобруйском направлениях в ходе Белостокско-Минского оборонительного сражения Западного фронта. Полковник Осташенко возглавил часть дивизии, которая после чего наряду с 14-м механизированным корпусом принимала участие в контрударе советских войск под Брестом 24 июня, в результате чего попал в окружение, из которого успешно вышел 6 июля. В результате понесённых потерь в начале июля дивизия была выведена в резерв Западного фронта и после доукомплектования вела оборонительные боевые действия на левом берегу реки Сож в районе Пропойска. После гибели 1 августа командира дивизии М. А. Попсуй-Шапко Осташенко принял командование дивизией на себя.