Após a secessão da Virgínia, Lee tornou-se comandante das forças estaduais organizadas para defender o estado contra a intervenção federal. Com a formação da Confederação, ainda em 1861, Lee incorporou-se ao novo Exército Confederado com a patente de General e a função de conselheiro militar do Presidente da Confederação, Jefferson Davis. Em 1862, recebeu o comando do Exército da Virgínia do Norte, principal força militar dos Estados Confederados da América. No comando dessa força Lee derrotou os exércitos federais e seus diferentes comandantes em várias batalhas, como Segunda Batalha de Bull Run (ou Segunda Batalha de Manassas), Chancellorsville e Fredericksburg, tornando-se o mais temido e respeitado General da Confederação. Em 1863, Lee comandou seu exército na sua segunda invasão do norte, e chegou a ameaçar Filadélfia. No entanto, no verão de 1863, na Batalha de Gettysburg, cometeu o maior erro da sua carreira, ordenando um desastroso assalto frontal contra o bem defendido centro das posições inimigas. Após essa derrota, Lee ofereceu sua demissão a Jefferson Davis, que não a aceitou.