Mit 25 Jahren wurde Jan Koller am 9. Februar 1999 erstmals im tschechischen Nationalteam eingesetzt; seit 2000 war er dort Stammspieler. Mit Tschechien nahm er an der EURO 2000, 2004 und 2008 sowie der WM 2006 teil. Seit Juni 2005 ist Koller alleiniger Rekordtorschütze der tschechischen Nationalmannschaft, nachdem er mit seinem 35. Länderspieltor den Rekord von Antonín Puč aus den Jahren 1926–39 einstellte (zur offiziellen Statistik des tschechischen Teams zählen auch die Begegnungen der Tschechoslowakei aus den Jahren 1920 bis 1992).