Вторая экспедиция, которая продолжалась 14 месяцев в 1535—1536 году, занималась исследованием реки Святого Лаврентия. Во время зимовки в форту около селения ирокезов Картье составил справочник, описав в нём быт и обычаи индейцев, растительный и животный мир. Возвращаясь из плавания, он был уверен что нашёл проход в Азию, к волшебной стране Сегеней, где много золота, рубинов и других сокровищ. Картье решил взять вождя Доннакону во Францию, чтобы он смог лично рассказать королю об этой стране. Доклад был принят благосклонно, и Картье был дарован один из кораблей второй экспедиции, "Grande Hermine". Однако новой экспедиции помешала Итальянская война (1536—1538).