Pada bulan Februari 1563 François, Adipati Guise, dibunuh. Sementara pembunuh itu ditangkap dan segera dihukum mati, Anna mengambil semua langkah yang mungkin untuk menuntut pemimpin Huguenot Prancis, Gaspard de Coligny, yang dia bertanggung jawab. Selama tiga tahun ke depan, janda memberikan tekanan pada raja dan pengadilannya dengan petisi-petisinya, tetapi pada bulan Januari 1566 dewan raja mengumumkan laksamana Coligny tidak bersalah dan membekukan masalah ini. Akibatnya, sebagian besar orang sezamannya menganggap janda Adipati Guise bertanggung jawab atas penembakan pada Coligny pada tanggal 22 Agustus 1572 dan yang menjadi peristiwa awal Pembantaian de la Saint-Barthélemy.