La victòria de Carles a la Batalla de Pavia l'any 1525, va sorprendre a molts italians i alemanys i va suscitar les preocupacions que Carles s'esforçaria per guanyar encara més poder. El Papa Climent VII va canviar de bàndol i es va unir a França i a importants estats italians contra l'Emperador Habsburg a la Guerra de la Lliga de Cognac. En 1527, a conseqüència de la incapacitat de Carles per pagar als seus exèrcits al Nord d'Itàlia, aquests es van amotinar i van saquejar Roma, forçant Climent i els successius papes a ser considerablement més prudents en els seus tractes amb les autoritats seculars; l'any 1533, el rebuig de Climent per anul·lar el matrimoni d'Enric VIII d'Anglaterra amb Caterina d'Aragó va ser una conseqüència directa del seu desig de no ofendre l'emperador i tenir potser la seva capital saquejada una segona vegada. La Pau de Barcelona, signada entre Carles i el Papa l'any 1529, va establir una relació més cordial entre ambdós líders. De fet, el Papa nomenà Espanya com a protectora de la causa Catòlica i va reconèixer a Carles com a rei de Llombardia, a canvi de la intervenció espanyola per derrocar la rebel República de Florència.