Dalam kedinasan RAF, Gladiator kebanyakan sudah digantikan oleh Hurricane dan Spitfire pada saat pecahnya Perang Dunia II, meskipun dua skuadron masih digunakan dalam Pertempuran Prancis dan Kampanye Norwegia. Selanjutnya pesawat ini bertugas dalam kampanye-kampanye tidak penting selama tahun-tahun awal Perang Dunia II. Pesawat tempur klasik ini adalah salah satu pesawat Britania masa sebelum perang yang sukses diekspor, dan bertugas di banyak negara. Gloster Gladiator menunjukkan performa yang baik dalam kedinasan Tentara Finlandia saat melawan pesawat-pesawat tempur Uni Soviet dalam Perang Musim Dingin, namun tampak kalah kelas dari pesawat-pesawat tempur Jerman di teater lainnya. Sea Gladiator yang berpangkalan di kapal induk lebih sukses lagi, karena kecepatan rendahnya membuatnya lebih cocok untuk operasi-operasi kapal induk dan juga kurang kemungkinan berhadapan dengan lawan yang lebih modern. Di Teater Afrika melawan Italia, Gladiator memakan banyak musuh.