La sceneggiatura, scritta da Snyder e Johnstad e ispirata al fumetto "Xerxes" di Miller, è stata concepita con l'intenzione di raccontare fatti precedenti, intermedi e successivi a quelli mostrati nel primo film "300". Murro ha spiegato: «L'idea è sempre stata quella di fare un film ambientato nello stesso intervallo di tempo del primo. Come se si stesse zoomando all'indietro per avere il quadro generale del tutto». La sceneggiatura del film fa riferimento principalmente alla Battaglia di Capo Artemisio, svoltasi nello stesso intervallo di tempo della Battaglia delle Termopili. La pellicola di Murro, tuttavia, non si limita a raccontare solo gli avvenimenti della battaglia di Capo Artemisio, ma anche l'ascesa di Serse da uomo a divinità in terra. Questo aspetto è stato molto voluto dal regista, da Snyder e da Rodrigo Santoro, interprete del re Persiano nel film. Il film, tuttavia, non ha per protagonista l'iconico re Persiano, bensì i personaggi di Temistocle e Artemisia. In merito a questi nuovi personaggi, Murro ha spiegato: «I nuovi personaggi qui sono Temistocle e Artemisia. Sono il cuore del film, sono loro a portarlo avanti. Non voglio rivelare nulla, ma tutto dipende davvero da loro. La presenza di Serse è ben tangibile, ma i protagonisti sono loro. Da un punto di vista tematico, però, ha una funzione fondamentale del lungometraggio».