W lutym 1861, po ogłoszeniu secesji Teksasu od Unii, Lee został wezwany do Waszyngtonu. Został awansowany do stopnia pułkownika i otrzymał dowództwo nad wojskami liniowymi mającymi wziąć udział w walkach z siłami południa. 23 kwietnia został głównodowodzącym armii i floty Wirginii i objął pod swą komendę Armię Północnej Wirginii. Przez rok był doradcą wojskowym prezydenta CSA Jeffersona Davisa. W lutym 1865 został wodzem naczelnym wszystkich sił wojskowych Konfederacji. Dwa miesiące później był zmuszony poddać się gen. Ulyssesowi S. Grantowi w miejscowości Appomattox Court House, co stanowiło zakończenie długotrwałych zmagań Północy i Południa. Najważniejsze bitwy, w których dowodził, to bitwa siedmiodniowa, bitwa nad Antietam, II bitwa nad Bull Run, Fredericksburg, Chancellorsville, bitwa pod Gettysburgiem, Wilderness, Spotsylvania, Cold Harbour i Petersburg (oblężenie). Pod koniec wojny z powodzeniem (podobnie jak gen. J.E. Johnston) wprowadził taktykę umocnień polowych i walki w okopach, dzięki czemu przez wiele miesięcy blokował armię Granta oblegającą Petersburg. Będąc jednym z najwyższych dowódców Konfederacji, nie odsuwał od walki swych synów: W.H.F. Lee, Robina R. Lee – dowódców kawalerii.