La nova divisió de tancs va ser enviada a Romania i Bulgària a principis de 1941, però es va mantenir en reserva i no va participar en la invasió alemanya de Iugoslàvia i Grècia. Va tornar breument a Alemanya abans de ser enviada a Polònia per a la preparació de la invasió de la Unió Soviètica. La divisió va lluitar al sector meridional del front oriental, participant en la batalla de Kíev i l'avanç alemany cap el mar d'Azov. A finals de novembre, la 16a Divisió Panzer s'havia quedat sense subministraments i només es va poder retirar després d'haver estat reaprovisionada durant una contraofensiva soviètica. Va lluitar en posicions defensives durant l'hivern de 1941–42 i va participar en operacions antipartisanes a la regió de Stalino. La divisió va participar en la lluita de la segona batalla de Khàrkiv i, després d'aquesta, l'ofensiva estiuenca alemanya, Cas Blau.