El 1524, el papa Climent VII el va enviar a Madrid en qualitat de "nunci apostòlic" (ambaixador de la Santa Seu), va seguir l'emperador Carles V a Toledo, Sevilla i Granada. Al maig de 1527 les tropes imperials van envair i saquejar Roma i el papa va reprotxar Castiglione el fet de no haver-lo informat de les intencions de l'emperador. Castiglione va trametre una carta al papa, datada el 10 de desembre de 1527, en què li deia que el saqueig havia estat motivat per l'ambigüitat i les contradiccions de la política papal.