Trong thập niên 330 TCN, quân vương người Macedonia là Alexandros Đại đế chinh phục khu vực, khu vực sau đó đổi chủ nhiều lần trong các cuộc chiến Diadochi rồi các cuộc chiến Syria. Cuối cùng khu vực rơi vào tay đế quốc Seleukos khoảng 219–200 TCN. Năm 116 TCN, một cuộc nội chiến tại Seleukos dẫn đến một số khu vực trở nên độc lập trong đó có Hasmoneus tại dãy núi Judae. Từ năm 110 TCN, người Hasmoneus bành trướng quyền lực của mình ra phần lớn Palestine, tạo nên một liên minh Judaea–Samaria–Idumaea–Ituraea–Galilee. Người Judaea (Do Thái) kiểm soát khu vực rộng lớn hơn khiến nó cũng được gọi là Judaea, một thuật ngữ trước đó chỉ đề cập tới khu vực nhỏ là dãy Judaea. Trong khoảng 73–63 TCN, Cộng hoà La Mã bành trướng ảnh hưởng đến khu vực trong Chiến tranh Mithridates lần thứ ba, chinh phục Judea vào năm 63 TCN, và tách vương quốc Hasmoneus cũ thành 5 huyện. Ba năm thánh chức của Giê-su, với đỉnh điểm là việc ông bị đóng đinh lên thánh giá, được ước tính diễn ra từ 28–30 CN, song một thiểu số học giả tranh luận về tính lịch sử của Giê-su. Năm 70 CN, Titus cướp phá Jerusalem, khiến người Do Thái và Cơ Đốc trong thành phân tán đến Yavne và Pella. Năm 132, Hadrian sáp nhập tỉnh Iudaea với Galilee và Paralia để tạo thành tỉnh mới Syria Palaestina, và Jerusalem đổi tên thành "Aelia Capitolina". Trong năm 259–272, khu vực nằm dưới quyền cai trị của Odaenathus với tư cách là quân chủ của Đế quốc Palmyra. Sau thắng lợi của hoàng đế Cơ Đốc giáo Constantinus trong nội chiến tứ đế, quá trình Cơ Đốc giáo hóa đế quốc La Mã bắt đầu, và năm 326 mẹ của Constantinus là Helena đến Jerusalem và bắt đầu cho xây các nhà thờ và đền. Palestine trở thành một trung tâm của Cơ Đốc giáo, thu hút nhiều tăng lữ và học giả tôn giáo. Khởi nghĩa của người Samaria trong giai đoạn này khiến họ gần tuyệt diệt. Năm 614, Palestine bị triều đại Sassanid Ba Tư sáp nhập, rồi về tay Đông La Mã vào năm 628.