В августе 1940 года был назначен на должность начальника штаба Северо-Кавказского, с января 1941 года — на должность командующего войсками Среднеазиатского военных округов. С началом Великой Отечественной войны Сергей Трофименко продолжил командовать округом, и одновременно, с августа по октябрь 1941 года — 53-й армией, развёрнутой в округе и охранявшей границу СССР в Средней Азии и принимавшей участие в Иранской операции.