Infolge des Vierten Kreuzzuges 1204 fiel die Stadt an die Franken, 1278 konnten die Byzantiner kurzfristig die Kontrolle über Stadt und Insel zurückerlangen. Ab 1306 bemächtigte sich der Orden der Johanniter der Insel. Die Stadt Rhodos fiel nach längerer Belagerung 1309 während der Amtszeit des Großmeisters Fulko von Villaret. Der Orden verlegte sein Hauptquartier in die Stadt und wurde zu einer der beherrschenden Kräfte des östlichen Mittelmeeres. Rhodos gedieh und wuchs unter dieser Regierung wieder. Die Ritter verstärkten und erweiterten die Befestigungsanlagen der Stadt kontinuierlich. Zwischen 1421 und 1431 wurde zur Verstärkung der mittelalterlichen Stadtmauer die St. Georgs-Bastion errichtet, die um 1550 nach Plänen des Baumeisters Basilio della Scuola verstärkt wurde. Unter dem Großmeister Zacosta wurde zwischen 1464 und 1467 an der Mole des Mandraki-Hafen die eigenständige St. Nikolaus-Festung als zusätzlicher Schutz der Flotte des Ordens errichtet. Der Johanniterorden errichtete auch zahlreiche Kirchen, den Großmeisterpalast und zwei Hospitäler, darunter 1392 die Hospiz St. Katharina. 1507 entstand im Zentrum des mittelalterlichen Marktes die „Kastellania“, ein Gebäude das als Strafgerichtshof der Ordensritter fungierte. Der Seehandel war trotz andauernder Konflikte mit den Osmanen und Mamluken eine einträgliche Einkommensquelle für die Stadt. Das meiste Wissen über diese Zeit stammt aus dem sehr sorgfältig geführten Archiv der Ordensritter, das heute in der Nationalbibliothek von Malta aufbewahrt wird.