Er immatrikulierte sich danach an der Universität zu Berlin, wo er die Hauptfächer Philologie und Geographie belegte, aber auch Vorlesungen und Seminare in Germanistik, Geschichte und Recht besuchte. Seine Interessenschwerpunkte waren Archäologie und Handelsgeschichte. Nach einer Studienreise, die ihn bis nach Sizilien führte, promovierte er 1844 bei dem berühmten Altphilologen August Boeckh mit einer Doktorarbeit über die antike Handelsgeschichte im östlichen Mittelmeer, Zweitgutachter der Dissertation war der Begründer der modernen Geographie, Carl Ritter. Drei Jahre später, nach einer Studienreise durch Nordafrika und den Vorderen Orient, habilitierte er sich mit einer Arbeit über den Mittelmeerraum in der Antike für Geographie (inklusive Geschichte der Geographie) an der Universität zu Berlin und wurde Privatdozent. Angesichts der revolutionären Ereignisse von 1848, die Barth kaum zur Kenntnis nahm, fanden sich nur wenige Hörer in seinen Vorlesungen und Seminaren ein. Überdies war der Dozent kaum in der Lage, seinen Unterrichtsstoff fesselnd und strukturiert vorzutragen. Angesichts der restriktiven Stellenpolitik des preußischen Staates eröffnete sich für Barth auf absehbare Zeit keine Möglichkeit, zum ordentlichen Professor berufen zu werden. Daher griff er zu, als ihm die Beteiligung an einer britischen Expedition angeboten wurde. Eine unglückliche Liebesbeziehung, die zuweilen in der biographischen Literatur erwähnt wird, ist quellenmäßig nicht belegt und dürfte kaum den Ausschlag für Barths Entscheidung gegeben haben. Die Expedition stellte ein kalkulierbares Risiko dar, da die Route zum Tschadsee bereits von Europäern genutzt worden war und sich als relativ sicher erwiesen hatte: Die Gefahr, an Malaria zu erkranken, schien gering zu sein, und die dort lebenden Völker – vornehmlich Tuareg und Kanuri – hatten sich stets fremdenfreundlich gezeigt.