Während der Reformation, die in der Region 1568 stattfand, wandelte Herzog Julius von Braunschweig das katholische Nonnenkloster in ein evangelisches Damenstift mit 19 dort lebenden Damen um. Grund dafür war die Erhaltung des Klosters als gut gehender Wirtschaftsbetrieb. Gleichzeitig ließ der Herzog in einer Art Raubaktion wertvolle Kunstgegenstände und Handschriften sowie Bücher in seine Residenzstadt nach Wolfenbüttel abfahren. Während die Wertgegenstände eingeschmolzen und umgesetzt wurden, erhielten sich die Schriften bis heute in der Herzog August Bibliothek. 1616 lebten nur 8 Stiftsdamen im Kloster, das gesamte Personal in der Landwirtschaft, der Küche und auf dem Hof betrug aber 75 Personen. Wenige Jahrzehnte nach dem Wiederaufbau des Ortes brach 1618 der Dreißigjährige Krieg aus, der Lamspringe erneut hart traf. Nach der Schlacht bei Lutter am Barenberge 1626 plünderten Söldnertruppen den Ort und brannten erneut dutzende Häuser nieder. Nach dem Krieg befand sich die Klosteranlage in einem katastrophalen Zustand. Laut dem Visitationsbericht eines Abtes von 1649 war der Pferdestall baufällig, das Brau- und das Backhaus waren zusammengestürzt, ein 66 m langes Schlafhaus war baufällig und der Schweinestall war abgebrannt. Auch die Klosterkirche mit ihrem Inventar war stark heruntergekommen und das Gebäude drohte einzustürzen.