Elképzelhető, hogy ő adott parancsot 1572. augusztus 22-én az atyja halálával kapcsolatban gyanúba keveredett Coligny elleni merényletkísérletre, bár ebben az időben még nagybátyjaié, a bíborosé és II. Claude aumale-i hercegé volt a döntő szó a Guise-házban. Mindenesetre augusztus 24-én, Szent Bertalan éjszakáján a hugenotta vezetők megölésére indított csapatok élén állt Aumale hercegével együtt. Egyes szemtanúk emlékezései szerint örömmel nézte végig Coligny holttestének defenesztrációját (az ablakon át az utcára hajítását), majd bele is rúgott az admirális földi maradványaiba. Eztán a Szajna déli partján lakó hugenotta vezetők – elsősorban I. Gabriel de Montgomery, II. Henrik hajdani, vétlen gyilkosa – után indult, de azok egy őrizetlen kapun keresztül meg tudtak menekülni. Guise csak augusztus 25-én tért vissza, eredménytelenül.