Das Regiment trat im Deutschen Krieg mit dem I. und II. Feld-Bataillon in Stärke 48 Offiziere, 145 Unteroffiziere, 18 Spielleute, ca. 1500 Mann, sieben Trainsoldaten und zwei Ärzte an. Es wurde der 8. Brigade (Generalmajor von Cella)/4. Division (Generalleutnant Ritter von Hartmann) unterstellt. Zur Feuertaufe des Regiments in den Scharmützeln bei Immelborn am 2./3. Juli 1866 wurde der Oberstkommandant Oberst Aldoßer verwundet. Am 4. Juli musste es bei Roßdorf an Gefallenen drei Offiziere und vierzehn Mann, an Verwundeten drei Offiziere und 98 Mann sowie an Vermissten zehn Mann hinnehmen. In der Schlacht bei Kissingen am 10. Juli erlitt das III. Bataillon einige Verluste (vier Gefallene, zwanzig Verwundete, 65 Mann in Gefangenschaft). Tags darauf kam es bei Oerlenbach zu einem Zusammenstoß mit preußischen Truppen, wo zwei Mann verwundet sowie ein Offizier mit 47 Mann gefangen genommen wurde. Am 26. Juli war das Regiment an den letzten Gefechten des Krieges bei Uettingen, Roßbrunn und Hettstadt beteiligt (insgesamt 54 Mann gefallen, verwundet oder gefangen). Mit der Beschießung der Festung Marienberg durch preußische Artillerie am 27. Juli musste zum Ende des Krieges noch ein Offizier des IV. Bataillons sein Leben lassen, drei Mann (IV. Bataillon und V. Reserve-Bataillon) wurden verwundet.