Ese octubre de 1535 también se vio marcado por la muerte del último Sforza, recomenzando los conflictos en Italia tras la expedición de Túnez. Pese a los proyectos de Fernando, su hermano Carlos finalmente reclamó para sí el ducado de Milán, comenzando una nueva guerra en la que Francia a su vez ocuparía el Piamonte. La cuestión de Milán volvió a tensar las relaciones entre Fernando y Polonia, pues la reina Bona era otra potencial heredera del ducado. Mientras, en Croacia la dieta amenazó con nombrar a otro rey si Fernando no garantizaba la defensa contra los turcos.