Au Moyen Âge, la rue Ninau appartient au capitoulat de Saint-Étienne. Déjà connue en 1360 comme la "carraria Guilhermi Unaud", il est probable qu'elle porte depuis le début du le nom d'un de ses propriétaires, Guilhem Unaut ou Unaud. Ce dernier avait été un chevalier toulousain proche des comtes de Toulouse Raimond VI et Raimond VII, à leurs côtés durant la guerre des Albigeois. Il fut d'ailleurs l'un des défenseurs les plus remarquables de la ville durant le siège mené par les croisés de Simon de Montfort en 1219. La rue se trouve face à l'une des entrées de la ville, la porte Montoulieu, et à la place du même nom – c'est pour cette raison qu'elle a porté parfois le nom de rue Montoulieu. La population de la rue est alors principalement composée d'artisans. On trouve également des auberges, qui accueillent les voyageurs qui entrent dans la ville : la présence de l'auberge de l'Écu de Bretagne, au , témoigne de cette activité.