Vid mitten av 1520-talet genomfördes Reformationen i Tartu. I januari 1525 skadades katedralen av protestantiska ikonoklaster, och så småningom övergavs den och lämnades att förfalla. Under Livländska kriget (1558–1583) förstörde ryska trupper staden och kyrkan. Efter att staden 1582 tillfallit Polen, planerade de nya katolska härskarna att återuppbygga katedralen, men dessa planer skrinlades på grund av det uppkommande Andra polska kriget 1600–1611. En brand 1624 förorsakade ytterligare skador på byggnaden.