Gatlin iniciou no atletismo através da "Woodham High School", em Pensacola, na Flórida. Em 2000 chegou à Universidade do Tennessee, em Knoxville, com bom desempenho nos 110 metros com barreiras. Durante o ensino médio, Gatlin foi selecionado pelos treinadores Vince Anderson e Bill Webb, que logo perceberam seu potencial e fizeram dele um velocista, onde conquistou seis títulos consecutivos da NCAA. Se profissionalizou em 2002 e apenas dois anos mais tarde, ganhou a medalha de ouro nos 100 m durante os Jogos Olímpicos de Verão de 2004 com o tempo de 9,85 segundos, batendo Francis Obikwelu, de Portugal e o então campeão olímpico e compatriota Maurice Greene. Ele também ganhou uma medalha de bronze na prova dos 200 m, e uma medalha de prata como integrante da equipe do revezamento 4x100 m. Em 2005, no Campeonato Mundial de Atletismo em Helsinque, ele novamente conquistou a medalha de ouro nos 100 m, dessa vez sobre o campeão de 2003, Kim Collins.