Az 1521-es wormsi birodalmi gyűlés után Károly az osztrák örökös tartományokat (amelyekhez egy évvel később Tirolt is hozzácsatolta), öccse, Ferdinánd gondjaira bízta. Ferdinánd II. Lajos magyar és cseh király nővérét, Jagelló Annát vette feleségül, így amikor az örökös nélküli Lajos 1526-ban a mohácsi csatában elesett, Ferdinánd újabb két, jelentős területű országot csatolhatott a Habsburg-birodalomhoz. Csehországi koronázása 1526-ban rendben le is zajlott, de Magyarországon hosszas polgárháború tört ki hívei és Szapolyai János megkoronázását támogató főurak között. Tényleges uralmat csak az ország nyugati és északi részein gyakorolt, míg keleten Szapolyai volt az úr (annak halála után pedig a formálisan török vazallus Erdélyi Fejedelemség), Magyarország déli és középső részei pedig török megszállás alá kerültek.