В конце XV века в Киевской митрополии основаны Дерманский и Супрасльский монастыри. В 1500 году Иван III начал вторую войну с ВКЛ, в результате которой московскими войсками было занято около трети земель Киевской митрополии. Брянская и Черниговская епископии были ликвидированы, а их епархии подчинены иерархам Московской митрополии. В подчинение московскому митрополиту были переведены и христиане Торопецкого повета. Жители Смоленска, вдохновляемые смоленским епископом Иосифом (Солтаном), выдержали осаду московскими войсками и в 1507 году православные литвины избрали Иосифа митрополитом Киевским и всея Руси. В 1509 году Иосиф провёл в Вильне собор православных христиан Киевской митрополии и 20 сентября 1509 года подписал грамоту, которой разрешал проводить православные богослужения в польских и немецких землях на подвижном антимине, полученном от патриарха представителями виленского братства прихожан Пречистенского собора. В 1510 году Василий III захватил Псков. В 1511 году митрополит Иосиф получил от короля Сигизмунда I подтверждение своей власти над всеми церквями греческого закона в Литве и Польше. В 1514 году московские войска захватили Смоленск и двинулись вглубь Литвы, но 8 сентября московское войско было разгромлено близ Орши войском под командованием Константина Ивановича Острожского. В честь Оршанской победы в Вильне была устроена триумфальная арка, названная народом Острожской брамой (позднее называемая Острой брамой), известной как местопребывание Остробрамской иконы Божией Матери. На деньги Константина Ивановича Острожского в Вильне был перестроен кафедральный Пречистенский собор, Троицкая и Никольская церкви. В 1517 году полочанин Франциск Скорина начал печатание церковно-православных книг в Праге, а в 1520 году основал типографию в Вильне.