Das Institut wurde im Jahre 1810 durch den schwedischen König Karl XIII. gegründet, um die Ausbildung der Militärsanitäter zu verbessern, da im Krieg 1808–1809 gegen Russland ein Drittel der verwundeten Soldaten in den Feldlazaretten gestorben war. Zunächst erhielt es den Namen "Kongl. Carolinska medico-chirurgiska institutet". Einer der Gründer war unter anderem der Chemiker Jöns Jacob Berzelius. Im Jahre 1861 wurde das Institut in den Rang einer Universität erhoben. Alfred Nobel bestimmte in seinem Testament, dass das Karolinska-Institut die Preisträger des nach ihm benannten Nobelpreises in Medizin oder Physiologie ernennen sollte. Insgesamt haben seit dieser Zeit fünf Forscher des Karolinska-Institut den Nobelpreis erhalten. Im 20. Jahrhundert wurden mehrere Institutionen und Hochschulen an das Karolinska-Institut angegliedert, so dass es zurzeit rund 3000 Studenten hat.