Maria sollte ursprünglich zwischen 1536 und 1545 einen der Söhne des französischen Königs Franz I. heiraten. Nach dem Schmalkaldischen Krieg war Karl allerdings der Ansicht, die habsburgischen Familienverbindungen enger zu gestalten und durch die Verbindung der spanischen mit der österreichischen Linie des Hauses, die Unterstützung der letzteren in der spanischen Thronfolge der Habsburger zu erreichen. Maria heiratete am 13. September 1548 in Valladolid Maximilian, ihren Cousin 1. Grades und späteren Kaiser. Der Ehevertrag war während des Reichstages in Augsburg ausgearbeitet worden. Maria leistete dabei auch den traditionellen Erbverzicht auf alle territorialen Ansprüche, ihr wurde lediglich eine jährliche Rente garantiert.