Det forble en svært skjør fredstid frem til august 1572. Da skulle Karl IXs søster Margrete av Valois gifte seg Henrik av Navarra, som var en av de store mennene innen hugenott-bevegelsen. Moren, Katarina de Medici, ville helst finne fred mellom de to tungt stridende partene. Hun ville ikke gi for mye makt verken til Guise eller til hugenottene. Hugenottene ivret for å støtte Nederlandene i kamp mot Spania, mens katolikkene med Guise i spissen ville holde seg unna krigen. Coligny var nær kongefamilien og den unge kong Karl XI (han var da 22), og den nye hertugen av Guise, Henrik, foraktet Coligny, som ikke hadde blitt straffet for mordet på faren. Da et attentat på Coligny ble mislykket, lyktes det Henrik av Guise å overbevise kongefamilien at den eneste løsningen på den svært spente situasjonen var å utslette mesteparten av lederne for hugenottene, som var i Paris i anledning bryllupet. Det ble så gjort, men dette førte til et ikke planlagt opprør også i gatene, der katolikker drepte hugenoter en masse den 24. august, Bartolomeusnatten. Det utviklet seg til et blodbad. Henrik av Navarra og kona ble plassert i husarrest. Dette spredte seg utover Frankrike, og til sammen minst 5000 hugenotter ble drept, med tall opp mot 30 000 også rapportert.