Nel 1515 fu alla difesa della Borgogna contro gli attacchi Imperiali, sempre nello stesso anno seguì il nuovo sovrano Francesco I nell'ennesima discesa in Italia. Il 13 e il 14 settembre combatté a Marignano contro le fanterie svizzere in quella che il Trivulzio definì la "Battaglia dei Giganti". Lo scontro che durò per ben due giorni vide infine la vittoria francese, determinata anche dall'intervento della cavalleria veneziana guidata da Bartolomeo d'Alviano che all'alba del secondo giorno caricò alle spalle gli svizzeri. Alla fine della battaglia si contarono complessivamente quasi 20.000 tra morti e feriti, l'armata svizzera aveva perduto non meno del 30% dei suoi effettivi, quella francese circa il 15%. Fu una battaglia estremamente importante, sia per gli effetti che avrebbe avuto sulle sorti della Lombardia e dell'Italia tutta, ma anche per la sua enorme valenza simbolica poiché a seguito della vittoria il monarca francese Francesco I fu fatto cavaliere sul campo dal cavalier Baiardo; per i meriti conseguiti nella campagna Carlo III fu nominato Connestabile di Francia e Viceré di Milano, poiché capitano dell'avanguardia aveva retto l'urto del primo giorno e gran parte della vittoria fu suo merito. Durante lo scontro gli morì il fratello Francesco, Duca de Châtellerault.