Osiem lat później, dowodzony przez kontradmirała Balthasara Hidalgo de Cisnerosa, jako część połączonej floty hiszpańsko-francuskiej, wziął udział w bitwie pod Trafalgarem dnia 21 października 1805 roku. "Santísima Trinidad" był największym okrętem w bitwie, aczkolwiek nie był już wtedy największym okrętem świata. W szyku "Santísima Trinidad" płynął przed flagowym okrętem sprzymierzonej floty francuskiej - "Bucentaure", stając się jednym z głównych celów floty brytyjskiej. Został wkrótce otoczony, walcząc podczas bitwy z liniowcami "Victory" adm. Nelsona, "Temeraire" (98 dział), "Neptune" (98 dział), "Leviathan", "Conqueror" i "Africa" (64 działa). Po stracie masztów od ognia "Neptune", okręt został obezwładniony i wyszedł z walki, a po kilku godzinach jego załoga poddała się liniowcowi "Prince". Uszkodzony okręt był następnie holowany do portu w Gibraltarze przez "Prince", dowodzony przez komandora Thomasa Fremantle, lecz zatonął po drodze w silnym sztormie 23 października 1805. W bitwie zginęło 205 marynarzy "Santisimy", a rannych zostało 108, z 1048 osób załogi.