Delar av fästningen användes från 1720-talet fram till några år efter revolutionen 1917 som fängelse. Det var ökänt som fängelse för politiska fångar. Fortets sydvästra bastion, kallad Trubetskojbastionen, var den största fängelseavdelningen. Den nordvästra delen av fästningen, Alexisravelinen, var också fängelse. I dessa internerades dekabrister efter upproret 1825, polacker som deltagit i det polska Novemberupproret 1830–1831 och medlemmar av partiet Narodnaja volja som låg bakom attentaten mot tsarerna på 1880-talet. Författarna Fjodor Dostojevskij (1821–1881) och Maksim Gorkij (1868–1936), revolutionären Michail Bakunin (1814–1876), anarkisten Peter Kropotkin (1842–1921) och kommunisten Lev Trotskij (1879–1940) är några av de mest namnkunniga personer som suttit fängslade i Peter-Paulfästningen. Även den finske generallöjtnanten Waldemar Schauman satt häktad här några månader 1904 efter hans sons (Eugen Schauman) attentat mot den ryske generalguvernören Nikolaj Bobrikov i Finland. Efter den ryska revolutionen 1917 internerades här medlemmar i Aleksandr Kerenskijs regering och oppositionella till Vladimir Lenin.