Peloponnesolaissodan lopulla Arginusain taistelu käytiin kaupungin edustalla. Myöhemmin Mytilene oli liitossa Makedonian kanssa, minkä seurauksena sinne hyökkäsivät Memnonin joukot. Myöhemmin mytileneläiset, tunnetuimpina Laomedon ja Erigyios, ottivat osaa Aleksanteri Suuren sotaretkiin. Rooman valtakunnan noustessa Mytilene oli Mithridateen puolella, minkä seurauksena roomalaiset valtasivat ja tuhosivat kaupungin Marcus Minucius Thermuksen johdolla. Taisteluun otti osaa myös nuori Julius Caesar. Myöhemmin kaupunki sai roomalaisilta vapaakaupungin aseman. Vespasianus riisti kaupungin oikeudet pois, mutta Hadrianus palautti ne.