L'elezione di Carlo V d'Asburgo (già arciduca d'Austria e re di Spagna) a imperatore del Sacro Romano Impero nel 1519 fece precipitare le relazioni tra Francia e gli Asburgo, innescando la Quarta guerra d'Italia (1521-1526) in cui Francia e Venezia furono contrapposte a Inghilterra, Papato, e possedimenti di Carlo d'Asburgo. Prospero Colonna batté i francesi alla battaglia della Bicocca, cacciandoli dalla Lombardia. Numerosi fallimentari tentativi di invadere la Francia da parte degli alleati, e di invadere l'Italia da parte della Francia, si susseguirono fino al 1524, quando Francesco guidò personalmente un esercito francese in Lombardia, ma venne sconfitto e catturato alla battaglia di Pavia; catturato in battaglia e imprigionato (prima a Pizzighettone e poi a Madrid), Francesco fu costretto ad ampie concessioni. Liberato nel 1526, Francesco rinnegò le clausole dell'accordo, si alleò con Venezia, Papato, Milano, e Inghilterra, e scatenò la Guerra della Lega di Cognac. Nel 1527 le truppe imperiali arrivarono a saccheggiare perfino Roma; la spedizione francese per prendere Napoli fallì l'anno successivo, spingendo Francesco e Carlo a concludere il trattato di Cambrai. Carlo poi siglò una serie di patti a Barcellona e a Bologna che toglievano di mezzo tutti i suoi avversari fuorché la Repubblica di Firenze, che però fu debellata con l'assedio di Firenze (1529-1530), restaurando al potere i Medici.