Powróciwszy do zdrowia wziął udział w ostatnich zmaganiach wojny krymskiej, by w grudniu 1856 roku wrócić wraz z Burtonem do Afryki. Celem ekspedycji, która wyruszyła z Bagamoyo koło Zanzibaru było poszukiwanie, na zlecenie Królewskiego Towarzystwa Geograficznego w Londynie, źródeł Nilu. W lutym obaj podróżnicy dotarli do Udżidżi na brzegach Jeziora Tanganika. Wobec choroby Burtona Speke samotnie eksplorował jezioro szukając ujścia, które mogłoby być wodami Nilu. Badania wykazały jednak, że wody jeziora są tylko o 3 metry wyżej niż Nil w Gondokoro w Sudanie.