Sigismund förlorade dock sedermera sitt svenska rike till sin farbror Karl IX (1600–1611) i Avsättningskriget mot Sigismund. En av anledningarna anses vara att Sigismund var katolik och krävde religionsfrihet, vilket hertig Karl inte kunde acceptera, då han var rädd för att Sverige skulle återgå till katolicismen. Under sitt uppror sökte Karl IX stöd hos riksdagen. Därigenom stärktes ytterligare det inslag av folkligt självstyre som redan från början ingått i den nya statsordningen.