À la veille des Jeux olympiques de 2016, où la domination de Semenya est annoncée, la Britannique Paula Radcliffe déclare à son sujet et regrette que la Sud-Africaine puisse courir malgré son hyperandrogénie. À Rio de Janeiro, la Sud-Africaine décroche son deuxième titre olympique, en établissant un nouveau record personnel en 1 min 55 s 28, devant Francine Niyonsaba et Margaret Wambui. Le 9 septembre 2016, elle s'impose sur lors du Mémorial Van Damme de Bruxelles en 50 s 40, record personnel. Quelques jours plus tôt, elle s'était assuré le trophée de la Ligue de diamant 2016 sur en remportant le meeting de Zurich.