Tra il 1966 e il 1973 condusse infatti l'inchiesta sull'assassinio del presidente John Fitzgerald Kennedy, inchiesta che sfociò nel clamoroso e fallimentare processo del 1967 contro Clay Shaw, membro della Permindex, nel cui corso Garrison cercò di dimostrare sia l'esistenza di una cospirazione dietro al delitto, sia che le conclusioni della commissione Warren erano errate. Garrison sosteneva che Shaw fosse in realtà Clay Bertrand, un personaggio noto nella comunità gay locale (dove sarebbe stato, secondo lui, organizzato il delitto), nonché un importante membro della CIA. Il procuratore Garrison rinviò a giudizio Shaw per il reato di cospirazione e omicidio, accusandolo di aver voluto eliminare Kennedy per conto della CIA, che lo aveva da tempo reclutato, e degli anticastristi delusi che frequentava abitualmente. Garrison sapeva che Shaw rischiava principalmente l'accusa di cospirazione, e la condanna a 10 anni, per cui cercò di accordarsi con lui (e anche con David Ferrie, ex superiore di Oswald, cacciato dai Marines per omosessualità, prima della sua morte): se si fosse dichiarato colpevole e avesse collaborato la pena sarebbe stata notevolmente ridotta, ma solo se avesse testimoniato contro uno dei presunti sicari, l'unico che Garrison sarebbe riuscito a identificare pur non avendo prove, un certo Manuel García Gonzalez, esule cubano anticomunista residente a Miami; Shaw rifiutò e si dichiarò innocente.