In 1989 werd hij lid van de Tweede Kamer, eerst voor het GPV en later voor de ChristenUnie toen de RPF en het GPV in 2001 fuseerden. Hij was voorzitter van een parlementaire commissie die onderzoek deed naar klimaatverandering en had zitting in een tijdelijke commissie ter voorbereiding van de parlementaire enquête over de Val van Srebrenica. Ook was hij initiatiefnemer van een motie die ertoe leidde dat de Tweede Kamer instemmingsrecht kreeg bij uitzending van militairen, de artikel 100-brief. Van Middelkoop was bij de Tweede Kamerverkiezingen 2002 nummer drie op de kandidatenlijst van de ChristenUnie, maar werd niet gekozen omdat nummer vier, Tineke Huizinga, via voorkeurstemmen de derde zetel verkreeg.