Liniștea între catolici și hughenoți durează puțin. La doar câteva zile după nuntă are loc atentatul împotriva amiralului Coligny căpetenia protestanților. În noaptea de 24 august 1572 hughenoții au fost masacrați la Paris (unde veniseră în număr mare cu ocazia nunții), dar și în interiorul Luvrului. Ca să-și salveze viața Henric al III-lea de Navarra se preface că se convertește la catolicism. Un gentilom hughenot grav rănit, Gabriel de Levis, viconte de Leran, se ascunde în camera Margaretei, iar aceasta îi salvează viața. Masacrul nu sfârșește în acea noapte, ce va rămâne în istorie cu numele de Noaptea Sfântului Bartolomeu, ci continuă săptămâni întregi în toată țara. În 1574 Carol al IX-lea al Franței e pe moarte, iar hughenoții și catolicii moderați pregătesc un complot pentru a pune mâna pe putere. La conducere erau fratele mai mic al regelui François duce d'Alençon și Henric al III-lea de Navarra. Conspirația eșuează și doi complici sunt arestați și decapitați. Unul dintre aceștia e de La Môle presupus iubit a lui Margareta, cel care l-a inspirat pe Alexandre Dumas tatăl când a scris romanul Regina Margot. Henric și François sunt arestați și închiși în castelul Vincennes, dar apoi eliberați condiționat. În 1575 François fuge, iar Henric fuge și el în 1576, fără a o aviza pe Margareta. Raporturile dintre ei erau deteriorate mai ales din cauza amantei lui Henric, Charlotte de Sauve. Henric lua legătura cu soția doar pentru interesele lui, în rest o lăsa deoparte. După fuga fratelui și a soțului, Margareta este închisă în camerele sale la Luvru, cu gărzi în fața ușilor pentru că regele o considera complice. François, care preluase conducerea hughenoților refuză negocierile, atât timp cât ea e ținută prizonieră. Eliberată, ea participă cu mama sa la negocieri și se ajunge la un rezultat foarte avantajos pentru protestanți, Edictul de la Beaulieu.