Hartley war ein Pionier der Spektroskopie in der Chemie. Er stellte Untersuchungen über den Zusammenhang von Struktur und Spektren organischer Verbindungen an (beginnend 1872 mit der Entdeckung von Infrarotspektren organischer Moleküle mit A. K. Huntingdon) und war einer der Ersten, der einen Zusammenhang von Spektren und Position im Periodensystem aufstellte (1883). 1881 vermutete er das Vorhandensein von Ozon in der Atmosphäre. Eine von ihm 1880 gefundene Absorptionsbande von Ozon im Ultravioletten trägt seinen Namen (Hartley-Bande). 1889 legte er quantitative Grundlagen für die Stahlhärtung und er befasste sich mit für Irland wichtigen angewandten Themen wie Farbstoffen für die Textilindustrie, Brauerei und Alkoholdestillation und Mittel gegen Kartoffelfäule (Auslöser der Großen Hungersnot in Irland).