"Neptune" входил в состав колонны вице-адмирала Нельсона в битве при Трафальгаре 21 октября, и был третьим кораблём в линии, между своим собратом "Temeraire", и 74-пушечным "Leviathan". Капитану Фримантлу была обещана позиция второго корабля в линии, сразу за флагманом Нельсона Victory, и к 10 часам утра "Neptune" развил достаточную скорость, чтобы нагнать его. Фримантл хотел обогнать "Victory", и повести линию в бой, но Нельсон приказал "Neptune" вернуться на своё место в колонне. "Neptune" вступил в бой вслед за флагманом Нельсона, пройдя за кормой французского флагмана "Bucentaure". Когда он проходил мимо "Bucentaure", "Neptune" дал по противнику залп орудиями левого борта, с ужасными последствиями для уже поврежденного флагмана Вильнева. Капитан Фримантл, который лично стоял у руля, затем повернул к своему противнику правым бортом, и оказавшись на траверзе "Bucentaure", дал по нему ещё два бортовых залпа из почти 50 орудий с расстояния менее 100 метров.