Z Zamku św. Anioła ucieka do kościoła św. Andrzeja della Valle więzień Cesare Angelotti. W kościele tym jego siostra, markiza Attavanti, zostawia przebranie i klucz, potrzebne zbiegowi do ucieczki i znalezienia kryjówki. W międzyczasie w kościele pojawia się malarz i przyjaciel Angelottiego, Mario Cavaradossi, który maluje dla kościoła obraz Marii Magdaleny. Jest on zakochany w słynnej śpiewaczce Tosce. Kiedy zbieg się ujawnia, postanawia mu pomóc i wskazuje miejsce ukrycia w swoim domu. Zaraz potem do kościoła przybywa Tosca. Widząc zaskoczenie kochanka, posądza go o zdradę, ale malarz sprytnie przekonuje kobietę, że jest w błędzie. Odprawia ją czym prędzej i umawia się z nią na wieczór, po czym razem z Angelottim wymykają się z kościoła. Po ich wyjściu w kościele odbywa się nabożeństwo dziękczynne po – jak sądzą Rzymianie – wygranej przez Austrię bitwie pod Marengo. Do kościoła przybywa też demoniczny baron Scarpia – prefekt policji rzymskiej. Przeszukuje budynek w celu znalezienia dowodów na pobyt tu zbiega. Jego ludzie znajdują jedynie wachlarz z herbem Attavanti. Pokazuje go obecnej na nabożeństwie Tosce. Scarpia oczywiście wie, że Atavantti pomogła w ucieczce bratu, ale sugeruje jej, że Attavanti spotyka się na schadzkach miłosnych z Cavaradossim. Ma w tym dwa cele: rozbić związek Toski, której pożąda, oraz znaleźć Angelottiego (jest przekonany, że śpiewaczka wie, gdzie się ukrywa). Kiedy zazdrosna Tosca wybiega z kościoła, by rozmówić się z narzeczonym w jego willi, Scarpia rozkazuje ją śledzić. Akt kończy aria okrutnego Scarpii, który ujawnia swe niecne plany względem Toski.