W 1701 Berlin został stolicą nowo utworzonego Królestwa Prus. W latach 1701–1705 hugenoci wybudowali Katedrę Francuską. W 1708 wzniesiono Katedrę Niemiecką. W 1709 zjednoczono miasta i gminy Berlin, Cölln, Friedrichswerder, Dorotheenstadt i Friedrichstadt w jedno miasto "Berlin". Wkrótce powstały dalsze przedmieścia. W 1742 otwarto Królewski Teatr Dworski. W połowie wieku miasto liczyło ponad 100 000 mieszkańców. W 1760 roku Berlin był przez kilka dni okupowany przez wojska rosyjskie. W latach 1747–1773 w protestanckim Berlinie wybudowano katolicki kościół św. Jadwigi. W 1774 świątynię konsekrował Ignacy Krasicki, który został w niej pochowany w 1801 roku. W latach 1788–1791 wzniesiono Bramę Brandenburską, będącą obecnie jednym z symboli miasta. W 1800 Berlin był największym miastem (co najmniej 170 000 mieszkańców) krajów niemieckich po Wiedniu. W 1806 został zajęty przez Napoleona. W latach 1816–1821 stolica rejencji berlińskiej w prowincji Brandenburgia, a w latach 1822–1875 rejencji poczdamskiej w tej samej prowincji. W XIX wieku w Berlinie funkcjonowały rozmaite organizacje polskie: w 1818 powstały studencki Związek Przyjacielski oraz Stowarzyszenie Polskie, w 1819 Związek Polski, w 1869 Towarzystwo Naukowe Akademików Polskich w Berlinie. W latach 1837–1840 w Berlinie nauki u Carla Friedricha Rungenhagena pobierał Stanisław Moniuszko. W 1847 miał tu miejsce tzw. "proces berliński" przeciwko 254 Polakom, oskarżonym o przygotowanie powstania wielkopolskiego z 1846 roku. W kolejnym roku miastem wstrząsnęły niemieckie wystąpienia rewolucyjne. W 1861 obszar miasta został ponownie rozszerzony, gdy włączono miejscowości Wedding, Moabit oraz przedmieścia po stronie Tempelhofu i Schönebergu. W 1863 w więzieniu Moabit za pomoc powstańcom styczniowym byli więzieni przez Prusaków Wojciech Kętrzyński i Maksymilian Jackowski. W 1864 w Berlinie odbył się kolejny "proces berliński", tym razem przeciwko 149 osobom, związanym z powstaniem styczniowym.