Zu Beginn des Zweiten Weltkriegs marschierte die deutsche Armee am 16. Juni 1940 in Besançon ein, wenngleich das französische Militär alle Brücken vor dem anrückenden Feind gesprengt hatte. Nach dem Einmarsch wurde Besançon Teil des für deutsche Besiedlung vorgesehenen Frankreich, wobei die Demarkationslinie nur 30 km westlich der Stadt verlief. Im Fall eines deutschen Siegs im Zweiten Weltkrieg wäre Besançon Teil des Deutschen Reichs geworden. Bis zum Bombenangriff durch die britische Luftwaffe in der Nacht vom 15. zum 16. Juli 1943, bei dem ein Bomber auf den Bahnhof stürzte und bei dem 50 Tote und 40 Schwerverletzte zu beklagen waren, war die Stadt von größeren Zerstörungen verschont geblieben. Die Résistance wurde in Besançon relativ spät aktiv: die ersten Attentate wurden im Frühling 1942 durchgeführt. Die Deutschen antworteten mit Verhaftungen, und am 26. September 1943 wurden in der Zitadelle von Besançon 16 Mitglieder der Résistance hingerichtet. 83 weitere erlitten in der Folge das gleiche Schicksal. Am 6. September 1944 wurde Besançon von der amerikanischen 3. und 45. Infanteriedivision, die in der Provence gelandet waren, zurückerobert. Das 6. Korps der amerikanischen Armee marschierte nach viertägigen Kampf am 8. September 1944 in Besançon ein, und General Charles de Gaulle besuchte das befreite Besançon am 23. September 1944. Zu den bekanntesten Mitgliedern der Résistance in Besançon gehören Gabriel Plançon, Jean und Pierre Chaffanjon, Henri Fertet, die Brüder Mercier, Raymond Tourrain, Marcelle Baverez, Henri Mathey und der Pater Robert Bourgeois.