Od 1936 roku, kiedy zaczęto produkcję serii wstępnej YB-17, do roku 1945, kiedy zakończono produkcję wersji B-17G, wyprodukowano blisko 13 000 egzemplarzy B-17 różnych wersji, z czego w działaniach bojowych utracono około 4750. Wykorzystywano je przede wszystkim do nalotów strategicznych podczas II wojny światowej – na cele na terenie III Rzeszy, na terytoriach jej sojuszników oraz na terytoriach przez nią okupowanych – prowadzonych przez siły United States Army Air Forces stacjonujące w Wielkiej Brytanii, w Afryce i we Włoszech. W skład wielu amerykańskich wypraw bombowych wchodziło po kilkaset B-17; maszyny te były najczęściej spotykanymi amerykańskimi samolotami bombowymi podczas wojny w Europie. Łącznie B-17 zrzuciły na cele w Europie ponad 640 tysięcy ton bomb. W latach 1941–1943 Amerykanie w ograniczonym zakresie wykorzystywali B-17 również na Pacyfiku, a pewna liczba bombowców służyła także w brytyjskim RAF-ie.