前作のヒットを受けて、製作側は2008年公開を目指して続編の製作を開始（当時の仮タイトルは『Another Night at the Museum』）。舞台は前作のアメリカ自然史博物館からスミソニアン博物館に移っており、一部のシーンは開館時間に一般入場者の見守る中で撮影された。全米脚本家組合ストライキの影響で製作が1年間延期されるというハプニングにも見舞われるが、監督ショーン・レヴィ、主演ベン・スティラーのコンビも続投し無事撮影も終了。北米では「メモリアル・デイ」の週末である2009年5月22日に公開され、同時期公開の『ターミネーター4』を抑え、2週連続1位を記録した。