איזבלה נולדה ב-2 באוקטובר 1470 בדוניאס, פלנסיה, פרננדו השני, מלך אראגון ולאיזבלה הראשונה, מלכת קסטיליה. בילדותה נלחמו הוריה במלחמת הירושה הקסטיליאנית נגד בת דודתה חואנה, נסיכת קסטיליה, בתו של אנריקה הרביעי, מלך קסטיליה, אשר נתמכה על ידי אפונסו החמישי, מלך פורטוגל. בעוד הוריה נלחמו בפורטוגל, איזבלה נותרה בסגוביה, בעוד העיר הונחה תחת שליטתם של אנדרס דה קבררה ואשתו ביאטריס דה בובדילה. תושבי העיר, שלא היו מרוצים מהממשל הזה, קמו והתנפלו על העיר. איזבלה שהייתה אז בת 7 הייתה לכודה במגדל אלקאסאר זמן מה עד שאמה חזרה לסגוביה והשתלטה על המצב.