בשנת 1517 נכבשה ח'אן יונס, בקרב ח'אן יונס, השני בקרבות המלחמה הממלוכית-עות'מאנית. קרב זה מסמן את כיבושה של כל ארץ ישראל על ידי האימפריה העות'מאנית. במקום לא ישבו משלמי מיסים במהלך המאה ה-16 שכן לא הופיע ברשימות המיסים של האימפריה העות'מאנית. אבל רשימות אלו מגלות כי שכן בו ח'אן ותחנה לגביית מסי דרך (כהן ולואיס, 1978). בתחילת המאה ה-17 ביצרו העות'מאניים את האכסניה והציבו בה חיל משמר. העיר נודעה בגניה הירוקים במאה ה-19, ובשנת 1868 הוערך מספר תושביה בכ-1,000 איש.