479 v. Chr. wurde die Insel nach der Schlacht von Mykale von der persischen Herrschaft frei und im gleichen Jahr Mitglied des 1. Attischen Seebundes als nicht steuerzahlendes Glied. Der Aufstand der Inselbewohner im Jahr 440 v. Chr. wurde von Perikles niedergeschlagen, Samos wurde wieder zu einem Vasallen Athens. Während des Peloponnesischen Krieges (431–404 v. Chr.) stand Samos daher auf dessen Seite gegen Sparta und stellte seinen Hafen der athenischen Flotte zur Verfügung. In den späteren Kriegsjahren erhielt Samos deshalb seine Privilegien zurück. Samos fiel im Jahr 387 v. Chr. erneut an Persien, wurde jedoch 366 v. Chr. von Athen zurückerobert.