Масимо Амброзини прави своя международен дебют с екипа на Италия през април 1999 срещу Хърватска и попада в групата на Скуадра Адзура за Евро 2000 в Белгия и Холандия и Олимпийските игри в Сидни, като се появява и на финала срещу Франция на европейското първенство. Поради контузии и слаба форма, Амбро не попада в състава за СП 2002 и Евро 2004. Въпреки че не участва на СП 2006 и не взима медал за световен шампион, Амброзини отново намира място в състава на Италия и се завръща на 16 август 2006 г. За този мач, наставникът Роберто Донадони дава капитанската лента на Масимо, заради отсъствието на титулярния капитан Фабио Канаваро.