Die Machtübernahme durch die Nationalsozialisten führte zur Änderung zahlreicher Besitzverhältnisse im Bezirk. Die Poliklinik und das Allgemeine Krankenhaus gelangten in das Eigentum der Stadt Wien, das St. Anna Kinderspital wurde in die Verwaltung des Deutschen Roten Kreuzes aufgenommen. Im Wasagymnasium wurde zudem die Gauleitung von Niederdonau untergebracht, da diese nicht in der Gauhauptstadt Krems residieren wollte. Auch der Verkehr wurde völlig umgestellt. 1938 wurde die Rechtsfahrordnung eingeführt und alle Straßenbahnen über Nacht umgestellt. Über Nacht begann auch die massive Diskriminierung und Verfolgung der jüdischen Bevölkerung. Das (jüdische) Sanatorium Loew wurde geschlossen, der jüdische Direktor des AKH, Otto Glaser, wurde ebenso wie seine jüdischen Ärztekollegen seines Amtes enthoben. Die Vereinssynagoge Müllnergasse wurde während des Novemberpogroms 1938 von einem SS-Trupp in Brand gesteckt. Hatten sich 1923 noch 25,10 % der Bezirksbevölkerung (23.746 Menschen) und 1934 23,3 % (rund 19.400 Menschen) zum Judentum bekannt, so waren am 1. Oktober 1939 nur noch 12.191 Juden auf dem Bezirksgebiet sowie der benachbarten Josefstadt registriert. 1943 waren nur noch 7242 Personen mosaischen Glaubens am Alsergrund verblieben. Der Großteil von ihnen wurde in der Folge in den nationalsozialistischen Konzentrationslagern ermordet.