Již v 60. letech se rozcházel v mnohých otázkách s názory hlavního proudu české politiky tak, jak ji reprezentovali František Ladislav Rieger a František Palacký. V roce 1863 to byla například otázka postoje k polskému povstání proti carské vládě, kde Rieger i Palacký razili proruské, slavjanofilské stanovisko. Eduard Grégr tehdy sice přijal Palackého stati k otištění, ale redakční pozice Národních listů byla odlišná. Rieger v roce 1863 proto zahájil vydávání vlastního politického deníku Národ a Národní listy zůstaly nadále sice nejvýznamnějším českým periodikem, ale trvale si udržovaly vlastní pozici, více či méně odlišnou od oficiálního Riegrova proudu. Oba bratři Grégrové se roku 1864 účastnili schůzek, jež svolal Rudolf Thurn-Taxis, na kterých se profiloval program samostatné liberální politické strany. Nakonec ale k formálnímu ustavení nezávislé mladočeské formace nedošlo a oba proudy české politiky i nadále existovaly ve volné alianci. Eduard Grégr tak například roku 1865 spolupodepsal jako jeden z 66 českých poslanců takzvaný "Pamětní spis" formulovaný Františkem Palackým, coby jednotný programový manifest české opozice v rámci mocnářství. Nadále si ale zachovával vlastní postoje. V roce 1866 tak na zemském sněmu podal interpelaci ve věci pobytu jezuitů v Čechách. Návrh vyvolal ostré polemiky, nejen kvůli vlastnímu antiklerikálnímu obsahu, ale hlavně kvůli tomu, že Grégr jej podal společně s několika českoněmeckými poslanci.