Первые годы жизни Изабеллы прошли в период Войны за кастильское наследство, поскольку Энрике IV не назвал конкретного наследника. Борьба за престол шла между Изабеллой I и её племянницей Хуаной Кастильской, которая была известна под прозвищем "ла Бельтранеха" из-за слухов о том, что она была внебрачным ребёнком супруги Энрике IV Жуаны Португальской и её любовника Бельтрана де ла Куэва. Король Португалии Афонсу V выступил на стороне племянницы и, таким образом, Изабелла I и Фердинанд II вынуждены были вступить в войну.