A bécsi kormány halogatása miatt a múzeum alapítására csak az 1848-49-es szabadságharc után, 1859-ben került sor. Fő szervezője és támogatója Mikó Imre volt, aki megszerezte a kormány hozzájárulását és a múzeumnak adományozta kolozsvári nyári kastélyát a hozzá tartozó kerttel. Az Erdélyi Múzeum-Egyesület alapszabálya kimondta, hogy az egyesület a múzeumi gyűjtésre, a gyűjtött tárgyak megőrzésére, az anyag feldolgozására és általában a tudományok magyar nyelven való művelésére alakult. Alapításakor a múzeum anyaga 15 439 könyvből, 1083 oklevélből, 128 arany-, 2841 ezüst-, 1738 bronzéremből, valamint 10 092 darab régészeti tárgyból, természeti ritkaságból, ásványból, kövületből, állatból és növényből állott. A múzeum első őre Brassai Sámuel, az első könyvtáros Szabó Károly volt.