Em 2 de maio de 2006, Mastroeni foi convocado para a Copa do Mundo pela segunda vez em sua carreira. Em 17 de junho, numa partida da Copa do Mundo da FIFA contra a Itália, Mastroeni recebeu cartão vermelho por uma entrada dura em Pirlo no final do primeiro tempo. Mastroeni foi multado em 7500 francos suíços e recebeu uma suspensão de três jogos, perdendo o último jogo dos EUA da Copa do Mundo e os dois primeiros jogos da Copa Ouro da CONCACAF de 2007.