Jan Matejko był dziewiątym dzieckiem, z jedenastu, jakie mieli państwo Matejkowie (było wśród nich dziewięciu chłopców i dwie dziewczynki). Gdy Matejko miał siedem lat, zmarła jego matka; dziećmi zajęła się jej siostra. Śmierć matki niewątpliwie wywarła wpływ na osobowość przyszłego malarza. Jego dzieciństwo "obfitowało w lęki i przykrości", nie zaznawał także raczej przesadnie starannej opieki (jego złamany nos nie zwrócił niczyjej uwagi i zrósł się krzywo). Ojciec nie okazywał dzieciom swoich uczuć, był surowy i pozbawiony akceptacji dla artystycznej pasji syna. Od 1847 r. Jan Matejko uczęszczał do szkoły św. Barbary. Wkrótce został przeniesiony do Gimnazjum św. Anny (obecnie I Liceum Ogólnokształcące im. Bartłomieja Nowodworskiego w Krakowie). Mimo zdradzanych od najmłodszych lat niepospolitych zdolności plastycznych, z pozostałymi dziedzinami radził sobie z ogromnym trudem. Także koledzy nie byli dla niego wyrozumiali i, jak pisał Marian Gorzkowski, "doświadczał od swych współtowarzyszy pewnego znęcania się nawet". Choć Matejko i jego rodzeństwo z pochodzenia w połowie byli Czechami, czuli się polskimi patriotami, o czym świadczy działalność wyzwoleńcza dwóch starszych braci Jana, Edmunda i Zygmunta, uczestników powstania węgierskiego (1848–1849).