У Другом свјетском рату када је Њемачка напала СССР авиони Тупољев АНТ-6/ТБ-3 су били лоцирани у средишњем делу Совјетског Савеза и тиме били ван домашаја Луфтвафе. Тако је на дан напада 22. јуна 1941. ваздушне снаге Совјетског Савеза имале 516 оперативних ТБ-3, а поморско ваздухопловство још 25 примерака. У првих месец дана ратних операција совјетско војно ваздухопловство је претрпело огромне губитке тако да су у августу месецу 1941. авиони АНТ-6/ТБ-3 по броју представљали 25% бомбардерских ресурса, иако су ови авиони избачени из војне употребе још 1939. почело је њихово поновно оперативно коришћење. С обзиром да је авион био застарео и јако рањив у систему противваздушне одбране какву је имала Луфтвафе, авион се као бамбардер користио углавном као ноћни бомбардер. Учествовао је као бомбардер у свим великим биткама на простору Совјетског Савеза, битка код Смоленска, битка за Москву, битка за Стаљинград, опсаде Лењинграда и Курске битке. Авиони АНТ-6/ТБ-3 из састава црноморске флоте су бомбардовали циљеве у Румунији (мост на Дунаву), Украјини и Белорусији. Из бомбардерских операција је искључиван у току 1942 и 1943. године како су пристизали модерни бомбардери Петљаков Пе-2, &lt;a href="%D0%9F%D0%B5%D1%82%D1%99%D0%B0%D0%BA%D0%BE%D0%B2%20%D0%9F%D0%B5-8"&gt;Петљаков П-8/Тупољев АНТ-42/ТБ-7&lt;/a&gt; и Иљушин Ил-2.