Po raz drugi obiekt pełnił funkcję cerkwi prawosławnej w latach 1940-1945. Korzystali wówczas z niego m.in. Ukraińcy, którzy kolaborowali z okupacyjnymi władzami niemieckimi i byli przez te władze osiedlani w Biłgoraju. W 1945, po zakończeniu II wojny światowej, Biłgoraj stał się miastem jednolitym etnicznie, a świątynia po raz drugi znalazła się w rękach katolików.