Il 9 febbraio 1941 Iachino guidò l'infruttuoso tentativo di intercettare la Forza H dopo che questa aveva bombardato Genova. Comandò poi la flotta italiana durante la Battaglia di Capo Matapan (26-29 marzo 1941), che sfociò nella più grande sconfitta mai subita dalla Regia Marina: considerando errati o esagerati i rapporti sulla presenza nelle vicinanze di corazzate britanniche, Iachino inviò l'intera I Divisione dell'ammiraglio Carlo Cattaneo in soccorso dell'incrociatore "Pola", immobilizzato da aerosiluranti, il che portò la I Divisione ad essere annientata dal fuoco delle tre corazzate dell'ammiraglio Cunningham. Il suo comportamento a Capo Matapan è stato oggetto di molte critiche e discussioni, ma Iachino mantenne il comando della flotta.