Im Dezember 1940 fungierte die 16. Panzer-Division unter dem Code Lehrstab-R II als Lehr-Division in Rumänien für den Aufbau des dortigen Heeres. Während des Balkanfeldzugs diente sie als Reserve und wurde im Juni 1941 für den Überfall auf die Sowjetunion bereitgestellt. Nördlich von Tomaszów überquerte die 16. Panzer-Division den Bug und nahm an der Panzerschlacht bei Dubno-Luzk-Riwne teil. Es folgten die Kesselschlachten bei Uman und Kiew. Bei Perwomaisk wurde der Bug erneut überquert, dabei kam es zu Verfolgungskämpfen mit der Roten Armee im Dnepr-Bogen. Nachdem Nikolajew erobert war, konnte ein größerer Verband der Sowjetarmee bei Kiew eingeschlossen werden. In der Schlacht am Asowschen Meer vom 26. September bis zum 11. Oktober 1941 wurde ein weiterer operativer Erfolg verzeichnet. Im Donezbecken und ostwärts des Mius war die 16. Panzer-Division an weiteren Schlachten beteiligt. Weitere Stationen auf dem Vormarsch nach Stalingrad waren Barwenkowo, Charkow, Woltschansk und Isjum, bis die Division den mittleren Don erreichte.