Током нацистичког режима (1933—1945), Хајделберг је био снажно упориште Нацистичке партије, која је била и најјача странка на изборима пре 1933. Због тога, сви неаријевски радници Универзитета су били дискриминисани, а до почетка рата 1939. Универзитет је изгубио трећину запослених из расних и политичких разлога. Током Кристалне ноћи 9. новембра 1938, становници Хајделберга су спалили обе синагоге које су постојале у граду. Следећи дан је започела систематска депортација Јевреја, а сматра се да је тада око 150 Јевреја послано у концентрациони логор Дахау. Непуне две године касније, 22. октобра 1940. током акције назване „Вагнер-Биркел“ око 6 хиљада Јевреја из околине, укључујући њих 280 из града Хајделберга депортовано је у концентрациони логор Герс у Француској. Током 1934/35. нацисти су направили огромни амфитеатар на брду Хајлигенберг на северном делу старог дела града, који им је служио за одржавање пригодних прослава, културних догађаја и слично, којима се славио националсоцијализам.