Zambrotta debuteerde voor het Italiaans nationaal elftal op 10 februari 1999 tegen Noorwegen. Hij kwam in totaal tot 92 interlands, waarin hij twee doelpunten maakte. Op het EK 2000 was hij basisspeler, maar miste hij de verloren finale door een schorsing die de Italiaan kreeg vanwege zijn twee gele kaarten in de halve finale tegen Nederland. Zambrotta was ook basisspeler op het WK 2002 en het EK 2004, maar beide toernooien verliepen teleurstellend voor de "Squadra Azzurra". In de aanloop naar het EK maakte hij op 30 mei in een oefenduel tegen Tunesië wel zijn eerste interlanddoelpunt. Op het gewonnen WK 2006 speelde Zambrotta zes van de zeven wedstrijden en bovendien maakte hij in de kwartfinale tegen Oekraïne (3-0) de openingstreffer. Hij was in Duitsland een van de uitblinkers bij Italië en speelde zowel links- als rechtsachter in de verdediging. In de finale werd uiteindelijk na strafschoppen gewonnen van Frankrijk nadat de wedstrijd in 1-1 was geëindigd.