El castillo de oro sobre gules es el emblema de Castilla, el cual representa las fortalezas levantadas durante la Reconquista. En el contexto de Tlaxcala, representa a dicha ciudad como una nueva Castilla, vencedora de los mexicas durante la Conquista. El águila en sable sobre oro es la imagen heráldica de la Casa de Habsburgo, a la cual pertenecía Carlos I, quien concedió el escudo. La orla de argén (bordura en lenguaje heráldico) representa la fe católica, que los tlaxcaltecas habrían abrazado sin oposición. Las iniciales corresponden a las de los nombres latinizados de la reina Juana de Castilla, el propio Carlos y el entonces príncipe Felipe. Las dos coronas representan a la mencionada Juana, reina de Castilla y a su hijo Carlos V monarca de la misma Corona. Las palmas son símbolo de victoria, en este caso sobre los mexicas. Los cráneos y las tibias evocan los glifos prehispánicos similares y pueden referirse a los sacrifcios humanos en la cultura mesoamericana; se ha sugerido que representan a los mexicas muertos durante la toma de Tenochtitlan en 1521.