L'éventualité de l'organisation d'un second référendum sur l'indépendance de l'Écosse resurgit après le vote, l'Écosse ayant largement voté pour un maintien dans l'UE, au contraire notamment de l'Angleterre. Nicola Sturgeon, première ministre d'Écosse actuelle, déclare quelques jours après le vote que « le Royaume-Uni pour lequel l'Écosse a voté pour rester en 2014 n'existe plus ». Alex Salmond, ancien Premier ministre d'Écosse, estime possible qu'un référendum écossais ait lieu dans les deux ans et demi et souhaite l'ouverture de discussions avec Bruxelles pour le maintien de l’Écosse dans l'UE, même s'il s'attend à une opposition de l'Espagne, qui craindrait une contagion à la Catalogne et au Pays basque. La Première ministre Theresa May a assuré de son côté que l’Écosse serait intégrée aux négociations sur le Brexit, tout en précisant que la tenue d'un autre référendum sur l'indépendance de la région était hors de question.