Im Konsistorium vom 17. Mai 1570 erhob Pius V. ihn zum Kardinalpriester und verlieh ihm am 9. Juni desselben Jahres den Kardinalshut und die Titelkirche "San Callisto". Als Kardinal nahm Marcantonio Maffei am Konklave 1572 teil, bei dem Papst Gregor XIII. gewählt wurde. Marcantonio Maffei war von 1576 bis zu seinem Tode Präfekt der Kongregation für die Bischöfe, unter Gregor XIII. war er zudem Präfekt der Apostolischen Breven.