奥斯曼帝国是另一个甚至更令人畏惧的敌人。土耳其的军事机器极为强大，其海军控制着地中海。从1526年开始，查理五世与苏丹苏莱曼一世（立法者）进行激烈的争斗，爭奪的目標是1526年國王戰死後的匈牙利王国，造成匈牙利的三分。為了對抗奥斯曼帝国，查理五世在1529年维也纳之围以後，嘗試建立哈布斯堡-波斯同盟，獲得一定的成效。1535年查理五世在突尼西亞取得了一次关键的胜利，然而1536年弗朗索瓦一世与苏莱曼一世结成反查理五世的同盟，並占領薩伏依公國。尽管弗朗索瓦一世于1538年被说服签署一项和约，他并没有放弃和土耳其人结盟的想法，也沒有歸還薩伏依（法國一直到1559年才歸還薩伏依公國）。