Карл воюва продължително с Османската империя и нейния султан Сюлейман Великолепни. Експедициите на османските сили по средиземноморския бряг представляват заплаха за Хабсбургските земи и християнския монопол в търговията по Средиземноморието. В Централна Европа турската инвазия е спряна при Виена през 1529. През 1535 Карл печели важна победа в Тунис (когато Сюлейман I е в свещените земи за да потуши въстание), но през 1536 Франсоа I се съюзява със Сюлейман срещу Карл. Докато Франсоа е убеден да подпише мирен договор през 1538, той отново се съюзява с османците през 1542. През 1543 Карл се съюзява с Хенри VIII и принуждава Франсоа да подпише мирен договор. По-късно Карл подписва унизителен договор с османците, за да получи малко отдих от огромните разходи по войната с тях, въпреки че тя не е приключила. Въпреки това протестантските сили в райхстага на Свещената Римска империя често гласуват против отпускане на средства за войните му с турците, тъй като много протестанти виждат в напредването на турците опозиция на католическите сили. Големият унгарски разгром в битката при Мохач от 1526 „изпраща вълна от ужас из Европа“.