La Real Audiencia ejerció jurisdicción formalmente sobre toda las islas cercanas, incluyendo Cuba, Puerto Rico, y Jamaica, y también sobre Tierra Firme del Mar Océano, como era conocido en ese entonces, alcanzando su mayor importancia entre los años 1526 y 1540. También desde ahí se discutían los conflictos principales, como fueron la Rebelión de Enriquillo, Rebelión de los Indios del Cuzco, establecer las diferencias entre Alvarado y Almagro, buscar la forma de solucionar los problemas territoriales de América Central, Venezuela y la Florida, Luisiana, entre otros.