Au , elle passe sous domination perse. Lors de la révolte de l'Ionie, les citoyens lapident le tyran Kôés et participent à la révolte contre les Perses ; en 493, l'île et la ville sont pillées, systématiquement ratissées par les Perses. Libérée au terme des guerres médiques, elle adhère à la Ligue de Délos. Contrairement aux autres alliés d'Athènes, elle ne verse pas de tribut (phoros), mais équipe ses propres trières et envoie ses propres troupes combattre aux côtés des Athéniens. De ce fait, les Mytiléniens se considèrent comme indépendants. La cité aristocratique se révolte en contre l'impérialisme athénien — Thucydide consacre à cet épisode de la guerre du Péloponnèse les cinquante premiers paragraphes de son livre III. La sécession s'étend rapidement à toute l'île ; après un an de siège, la cité doit capituler devant les Athéniens qui, après avoir décrété, à l'initiative de Cléon, la condamnation à mort de toute la population mâle de l'île, rapportent ce premier décret avant son exécution pour conclure une alliance et l'installation de clérouques.