Η πρώτη παράσταση δόθηκε στις 5 Μαρτίου 1940 με την οπερέτα του Γιόχαν Στράους "Η Νυχτερίδα".Ωστόσο, η επίσημη πρεμιέρα έγινε με τη "Μαντάμα Μπατερφλάι" του Τζάκομο Πουτσίνι στις 25 Οκτωβρίου του 1940, τρεις μέρες πριν την κήρυξη του Ελληνοϊταλικού πολέμου, παρουσία πολλών πρεσβευτών, αλλά και του γιου του Πουτσίνι, Αντόνιο. Στις 20 Ιουνίου του ίδιου έτους, η Ελληνίδα υψίφωνος Μαρία Κάλλας υπογράφει το πρώτο της επαγγελματικό συμβόλαιο με την ΕΛΣ.