Em 2 de maio de 1866, participou do Combate de Estero Bellaco, uma depressão de terreno pela qual as águas do rio Paraná se unem às águas do Rio Paraguai, onde o inimigo passou a retardar as tropas aliadas, buscando melhor posição para combater. Esteve presente, em 24 de maio de 1866, na Batalha de Tuiuti, o maior combate travado na América do Sul, na qual teve importante papel ao comandar o centro do dispositivo militar do exército brasileiro contra o ataque paraguaio. Registrou na Ordem do Dia nº 56: "A glória é a mais preciosa recompensa dos bravos". Em 15 de julho de 1866, ainda em Tuiuti, os aliados aguardavam a chegada das forças do General Porto Alegre, enquanto o inimigo fustigava diariamente. Gravemente ferido na batalha de Tuiuti e insatisfeito com o longo período da tropa estacionada, Osório passa o comando das tropas brasileiras ao General Polidoro da Fonseca Quintanilha Jordão.