Avec les guerres d'Italie, les Pouilles sont le théâtre d'affrontements et de batailles entre Français et Espagnols pour la domination du royaume de Naples. Plusieurs batailles importantes s'y déroulent comme celle de Cérignole. L'Espagne l'emporte en 1503 et parvient à asseoir sa domination malgré les tentatives de reconquête des Français. Le sud de l'Italie perd ainsi son indépendance jusqu'en 1734, le royaume de Naples devenant dès lors un vice-royaume espagnol. Les Pouilles voient se développer les latifundia alors que Lecce commence à dominer culturellement la région à partir de la Renaissance : elle devient la capitale officielle de la Terre d'Otrante. De grandes familles aristocratiques napolitaines dominent le nord des Pouilles où elles possèdent d'immenses domaines, tandis qu'au sud la noblesse est plus autochtone et les domaines moins étendus. La production et l'exportation d'huile d'olive est la principale activité économique de la région, en particulier dans le Salento, le port de Gallipoli devenant la principale place européenne pour ce commerce.