Prezydent, jako zwolennik Boskiego Przeznaczenia, starał się o wyłączność na kanał międzyoceaniczny, jaki miał powstać w Ameryce Środkowej. Ostro krytykował układ z Wielką Brytanią z 1900 roku; początkowo był zwolennikiem kanału w Nikaragui, lecz zmienił zdanie, opowiadając się za kanałem panamskim (teren ówczesnej Kolumbii). W 1903 roku podpisano układ z Kolumbią, opiewający na 10 milionów dolarów rocznie, jednak władze kolumbijskie żądały 25 milionów. Wówczas Stany Zjednoczone wystosowały groźbę wobec kraju Ameryki Południowej, co spotkało się z natychmiastowym odrzuceniem układu przez kolumbijski parlament. Wobec takiej sytuacji pojawiły się głosy, by powrócić do planów budowy kanału w Nikaragui lub podjąć kroki militarne wobec Kolumbii. Zanim Roosevelt zdążył zdecydować, 3 listopada 1903 roku w Panamie wybuchło powstanie niepodległościowe. Dzięki wsparciu finansowemu prywatnych przedsiębiorców amerykańskich, a także żołnierzy USA, wojska kolumbijskie wycofały się, a Panama ogłosiła niepodległość. Wówczas Kolumbia powróciła do rokowań z USA, proponując układ na starych warunkach, w zamian za pomoc w stłumieniu rewolucji panamskiej, jednak Roosevelt odmówił. 18 listopada sekretarz stanu John Hay i poseł panamski w USA Philippe Bunau-Varilla podpisali układ amerykańsko-panamski. W myśl niego Panama miała otrzymać 10 milionów dolarów, a Stany Zjednoczone miały prawo fortyfikować i okupować strefę kanału wedle własnego uznania. Wszelkie próby powrotu do rokowań na linii Kolumbia-USA były odrzucane przez Roosevelta. Dopiero w 1914 roku, Stany Zjednoczone wypłaciły Kolumbii 25 milionów dolarów odszkodowania. 15 sierpnia 1914 kanał panamski został otwarty.