Im Konsistorium vom 18. Dezember 1585 kreierte Sixtus V. ihn zum Kardinalpriester. Den Kardinalshut und die Titelkirche "Santa Maria in Aracoeli" erhielt Giovanni Battista Castrucci am 15. Januar 1586. Noch 1585 war er zum Präfekt der Apostolischen Signatur ernannt worden. Kardinal Castrucci nahm am ersten Konklave von 1590 teil, das Urban VII. zum Papst wählte. Nach dessen nur zwölf Tage währenden Pontifikat war Kardinal Castrucci Teilnehmer am zweiten Konklave von 1590, aus dem Gregor XIV. als Papst hervorging. Vor dem 20. März 1591 verzichtete er auf den Erzbischofssitz von Chieti zugunsten seines Verwandten Orazio Saminiati. Als dieser 1592 starb, ging das Erzbistum Chieti an dessen Cousin Matteo Saminiati. Giovanni Battista Castrucci war unter den Kardinälen beim Konklave 1591, auf dem Innozenz IX. gewählt wurde; ebenso nahm er am Konklave 1592 teil, das Clemens VIII. zum Papst erhob. Am 14. Februar 1592 optierte er für die Titelkirche "Santi Giovanni e Paolo".