自1526年起，波希米亚开始处于哈布斯堡王朝的统治之下。鲁道夫二世在位时（1576-1612年），再次将神圣罗马帝国的首都设在布拉格。他除了热衷于占星术和魔法，同时也热爱艺术，使得布拉格成为欧洲的文化之都，聚集了开普勒等一批天文学家、画家。1617年，狂热的天主教徒，皇帝斐迪南二世登基，决意不再容忍新教徒。1618年，布拉格再次发生拋窗事件，引发了残酷的三十年战争。1621年在城外不远处进行的白山战役中，捷克军队战败，27名新教徒贵族在老城广场被处死。1648年，瑞典军队攻占并洗劫了布拉格，神圣罗马帝国皇帝将宫廷迁往维也纳，此后布拉格进入一段萧条时期，城市人口也从战前的6万下降到2万。