Papst Urban VIII. kreierte Mario Theodoli im Konsistorium vom 13. Juli 1643 zum Kardinalpriester, den Kardinalshut und die Titelkirche "Sant’Alessio" verlieh der Papst ihm am 31. August 1643. Als Kardinal nahm Mario Theodoli am Konklave 1644 teil, bei dem Papst Innozenz X. gewählt wurde. Kardinal Theodoli wurde Minister Frankreichs beim Heiligen Stuhl, als Kardinal Alessandro Bichi abwesend war.