En 1627, la lignée aînée s'étant éteinte, le duché passe à une branche cadette de la famille, les Gonzague-Nevers, française. La succession d'un « Français », Charles Ier de Mantoue, duc de Nevers et de Rethel, dans un fief impérial, entre autres d'une importance stratégique énorme, ne peut que susciter une vive réaction de la part de l'empereur germanique. Entre-temps le nouveau duc Charles , se trouvant en difficulté économique, vend au roi d'Angleterre, Charles, environ 90 tableaux, objets précieux et statues antiques : c'est le début de la dispersion de la collection, constituée d'objets d'arts extraordinaires accumulés par des générations de Gonzague. En 1630, l'empereur du Saint-Empire romain germanique, lors de la Guerre de Succession de Mantoue (1627-1631), conflit s'inscrivant dans le cadre général de la Guerre de Trente Ans, envoie une armée de 36 000 lansquenets, qui prend d'assaut la ville, la dévastant et répandre la peste. Les habitants sont réduits à seulement 6 000 et Mantoue est profondément transformée : les gloires du passé et le prestige ne restent qu'un vague souvenir. Le traité de Ratisbonne du 13 octobre 1630 et le traité de Cherasco du 6 avril 1631 consacrent la légitimité de la succession des Gonzague Nevers qui est officiellement reconnue par Ferdinand II (empereur du Saint-Empire).