ประมาณปี 2000–2010 ราชอาณาจักรอยุธยาควบคุมคาบสมุทรมลายูและฝั่งทะเลเบงกอล คือ ทวายและตะนาวศรี ทำให้สามารถควบคุมการค้านานาชาติ ทำให้เรือสินค้าไม่ต้องอ้อมแหลมมะละกา การยึดครองมะละกาของโปรตุเกสในปี 2054 ทำให้อยุธยาเริ่มการติดต่อกับชาติตะวันตก โปรตุเกสส่งทูตเข้ามาเจริญสัมพันธไมตรีกับทั้งจัดหาปืนและอาวุธให้ ในช่วงนี้เองกรุงศรีอยุธยาเริ่มพัฒนาวัฒนธรรมของตนเองโดยมีรูปแบบการแสดงออกทางภาษา วรรณคดีและพิธีกรรม และมีภูมิหลังจากมอญ เขมรและไท-ไตผสมกัน ซึ่งนับเป็นเอกลักษณ์นิยามความเป็น "สยาม" ต่างจากไทยวนล้านนาและลาวล้านช้าง ครั้นพระเจ้าตะเบ็งชะเวตี้ (ครองราชย์ 2074–93) แห่งตองอูพิชิตอาณาจักรมอญโบราณที่หงสาวดีและตีเมืองเชียงกรานซึ่งเป็นประเทศราชของกรุงศรีอยุธยา สมเด็จพระไชยราชาธิราช (ครองราชย์ 2077–90) ทรงยกทัพไปชิงเมืองคืน สมเด็จพระไชยราชาธิราชยังทรงกังวลกับล้านนาด้วยจึงยกทัพไปตีเมืองเชียงใหม่สองครั้งแต่ไม่สามารถยึดเมืองหลวงได้ หลังสิ้นรัชกาลเกิดการชิงราชสมบัติกัน ท้าวศรีสุดาจันทร์ยกขุนวรวงศาธิราชชู้รักของพระนางให้เป็นพระมหากษัตริย์ แต่ทรงราชย์ได้หกสัปดาห์ ก็ถูกบรรดาขุนนางสมคบกันลอบปลงพระชนม์และยกสมเด็จพระมหาจักรพรรดิ (ครองราชย์ 2091–2108 และ 2110–1) ให้สืบราชสมบัติ พระเจ้าตะเบ็งชะเวตี้ทรงยกกองทัพเรือนแสนมาล้อมกรุงศรีอยุธยาในปี 2092 แต่ไม่สำเร็จ พระเจ้าบุเรงนอง (ครองราชย์ 2094–2124) ทรงยกทัพมาตีอาณาจักรอยุธยาอีกครั้ง หลังสามารถควบคุมอาณาจักรล้านนาทั้งหมดไว้ได้ ครั้งนี้พระมหาธรรมราชาเป็นผู้สนับสนุนพม่า และสุดท้ายสมเด็จพระมหาจักรพรรดิต้องยอมตามข้อเรียกร้องของพม่าและส่งพระราเมศวร พระราชโอรส เป็นองค์ประกัน สมเด็จพระมหาจักรพรรดิพยายามอภิเษกสมรสทางการเมืองกับล้านช้าง แต่พระมหาธรรมราชาส่งข่าวให้พม่าชิงตัวเจ้าหญิงอภิเษก สมเด็จพระมหาจักรพรรดิส่งกองทัพไปตีพิษณุโลกเพื่อตอบโต้ แต่ถูกอุบายทำให้ถอนทัพกลับไป ในปี 2111–2 พระเจ้าบุเรงนองส่งกองทัพขนาดใหญ่มาตีกรุงศรีอยุธยาอีก กรุงศรีอยุธยารับศึกได้หนึ่งปีแต่สุดท้ายเสียกรุงให้แก่พม่าในวันที่ 8 สิงหาคม 2112