Ärkehertig Ferdinand av Österrike valdes 1526 till kung av Böhmen. Som gemål till Ludvigs syster Anna framställde han arvsanspråk på såväl Böhmen och Ungern, vilka sedan 1490 varit förenade. Genom honom kom den fram till 1918 varande föreningen mellan Österrike, Böhmen och Ungern i det habsburgska väldet till stånd. Religionen vållade dock fortfarande problem. Under Maximilian II utnyttjade de utrakvistiska ständerna i Böhmen hans friare hållning i religiösa frågor till att 1575 få sin trosbekännelse, den "böhmiska konfessionen" erkänd. I gengäld gav ständerna sitt samtycke till hans son, Rudolf II:s kröning. Dennes första tid som regent blev lugn. Visserligen bredde protestantismen ut sig hos adeln och borgarna, men motreformationen började också göra sig gällande. Rudolfs senare försök att ingripa mot protestantismen misslyckades, och han måste 1609 utfärda "majestätsbrevet", där han garanterade ständernas religiösa och politiska rättigheter. Under Rudolfs bror och efterträdare Mattias gjordes nya försök att undertrycka protestantismen, något som slutligen ledde till 30-åriga krigets utbrott. Böhmens 1619 valde kung Fredrik V av Pfalz besegrades redan 1620 i Slaget vid Vita berget, och Böhmens frigörelseförsök hade misslyckats. De följande årens förtryck och krigsår ledde till en kraftig ekonomisk nedgång i Böhmen. Efter fredsslutet 1648 stärktes tyskheten i Böhmen genom invandring från det katolska Sydtyskland, och en helt ny adel drog in i landet.