สมเด็จพระมหินทราธิราชสืบราชสมบัติอีกครั้ง แล้วทรงมอบหมายให้พระยารามบัญชาการรบแทน ส่วนพระองค์ประทับแต่ในพระราชวัง ไม่เอาพระทัยใส่ในการศึก ฝ่ายพระเจ้าบุเรงนองมีพระราชสาส์นถึงสมเด็จพระมหินทราธิราชว่าถ้าส่งตัวพระยารามมาให้จะยอมเป็นพระราชไมตรี สมเด็จพระมหินทราธิราชก็ยอมทำตาม พระเจ้าบุเรงนองก็ให้กองทัพพักรบไว้ ต่อมามีรับสั่งให้พระสังฆราชกรุงศรีอยุธยาไปแจ้งแก่กรุงศรีอยุธยาว่าถ้าพระเจ้าแผ่นดินและขุนนางทั้งปวงออกมาถวายบังคมแก่พระองค์ ก็จะรับพระราชไมตรี ทรงรออยู่ 7 วันยังไม่ได้คำตอบ สมเด็จพระมหาธรรมราชาออกไปเจรจาก็ไม่สำเร็จ พระเจ้าบุเรงนองจึงรับสั่งโจมตีกรุงศรีอยุธยาต่อ ระหว่างนั้นพระเจ้าลูกเธอพระศรีเสาวราชนำกองพล 15,000 มาช่วยป้องกันพระนครโดยไม่ได้ปรึกษาพระราชบิดา สมเด็จพระมหินทราธิราชเห็นว่าพระราชโอรสทำตามอำเภอใจ จึงรับสั่งให้พระยาธรรมาคุมตัวพระศรีเสาวราชไปสำเร็จโทษ ณ วัดพระราม บรรดาทหารก็เสียใจ แต่เห็นแก่สวัสดิภาพของครอบครัวจึงมุ่งรักษาพระนครต่อ ฝ่ายสมเด็จพระมหาธรรมราชาคิดอุบายให้พระยาจักรีเป็นไส้ศึก พระเจ้าบุเรงนองก็ยินดีตามแผน สมเด็จพระมหินทราธิราชหลงเชื่อว่าพระยาจักรีหนีมาได้จริง ก็พระราชทานรางวัลและมอบหมายให้บัญชาการรักษาพระนคร พระยาจักรีทำหน้าที่เข้มแข็งอยู่เดือนหนึ่งจึงเริ่มทำให้กองกำลังกรุงศรีอยุธยาอ่อนกำลังลง พระเจ้าบุเรงนองทรงทราบก็รับสั่งให้นายทัพนายกองเข้าโจมตีกรุงศรีอยุธยา จึงเสียกรุงในวันแรม 11 ค่ำ เดือน 9 พระมหาอุปราชากรุงหงสาวดีและสมเด็จพระมหาธรรมราชาธิราชพาสมเด็จพระมหินทราธิราชไปเข้าเฝ้าพระเจ้าบุเรงนองที่พลับพลาวัดมเหยงคณ์ พระเจ้าบุเรงนองตบพระหัตถ์ที่พระราชอาสน์ทูลเชิญสมเด็จพระมหินทราธิราชให้เข้ามานั่ง สมเด็จพระมหินทราธิราชก็คลานเข้าไปแต่ไม่ถึงที่พระราชอาสน์ พระเจ้าบุเรงนองยื่นพานพระศรีให้ สมเด็จพระมหินทราธิราชไม่ทรงรับ เมื่อพระเจ้าบุเรงนองหยิบพระศรีให้ ทรงรับมาไว้ครูหนึ่งจึงเสวย พระเจ้าบุเรงนองเชิญสมเด็จพระมหินทราธิราชไปอยู่กรุงหงสาวดี โดยระหว่างรอเสด็จให้อยู่ในความดูแลของสมเด็จพระมหาธรรมราชา และให้พระมหาอุปราชาเข้าไปกวาดต้อนครัวเรือนชาวกรุงศรีอยุธยาและรูปหล่อส่งไปกรุงหงสาวดีทั้งหมด