После поражения последователей Яна Гуса в Гуситских войнах университет постепенно стал терять свой универсальный статус (с преподаванием всего спектра науки того времени). Сокращался также поток иностранцев, приезжающих из-за границы, что связано с представлением о чехах как об отступниках истинной веры. Карлов университет в Европе стал всё больше восприниматься как местный университет Чешского королевства, теряя свой международный статус, чему также активно способствовала его чёткая гуситская ориентация.