Bei der Lufthansa gehörte die Ju 90 in den Jahren 1940 und 1941 zu den drei wichtigsten Flugzeugen im Planverkehr. 1942 musste der größte Teil der Flugzeuge an die Luftwaffe abgegeben werden, die sie bis Kriegsende als Transporter einsetzte. Das letzte Lufthansa-Flugzeug ging bei einem Luftangriff auf Stuttgart-Echterdingen am 9. August 1944 verloren. Insgesamt flog die Ju 90 bei der DLH 3,8 Mio. Kilometer im Planverkehr. Zwischen dem 15. April 1940 und 15. Juli 1940 führte die DLH den „Frachtsonderdienst Wien“ durch. Dabei flog sie mit reichseigenen Flugzeugen auf der Strecke Wien–Viterbo–Barcelona Wolframerz und Zinn aus Spanien ins Reich. Nach dem Waffenstillstand mit Frankreich konnte die Strecke über Lyon geführt werden, bis am 20. August 1940 wieder der normale Luftverkehr mit Spanien aufgenommen werden konnte. Der schwerste Unfall der DLH erfolgte mit der Ju 90 D-AVMF, die am 8. November 1940 bei Brauna wegen Vereisung abstürzte. Dabei kamen 23 Passagiere und sechs Besatzungsmitglieder ums Leben.