Papst Sixtus V. kreierte Benedetto Giustiniani im Konsistorium vom 16. November 1586 zum Kardinal. Den Kardinalshut und die Titeldiakonie San Giorgio in Velabro erhielt er am 14. Januar 1587. Zum 11. September 1587 wechselte er zur Titeldiakonie Sant’Agata in Suburra und am 20. März 1589 zu der von Santa Maria in Cosmedin. Während der Abwesenheit von Kardinal Enrico Caetani als Legat in Frankreich (1589–1590) war Benedetto Giustiniani amtierender Camerlengo der Römischen Kirche. Sixtus V. ernannte ihn 1588, zusammen mit den Kardinälen Giulio Antonio Santori, Scipione Lancellotti und Giovanni Battista Castagna, zum Mitglied einer Kommission für die Anerkennung der Ordensregel der Minderen Regularkleriker. Als Kardinal nahm Benedetto Giustiniani im September 1590 am ersten Konklave des Jahres teil, bei dem Urban VII. zum Papst gewählt wurde. Auch am zweiten Konklave von Oktober bis Dezember nahm er teil und war unter den Kardinälen, die Papst Gregor XIV. wählten. Er wurde Präfekt der Apostolischen Signatur und unterstützte die Absolution von König Heinrich IV. von Frankreich. Zum Dank hierfür ernannte der König ihn zum Vize-Protektor Frankreichs beim Heiligen Stuhl.