Ihre Kindheit verbrachte Eleonora am Hof in Mantua. Sie heiratete am 2. Februar 1622 in Innsbruck den Kaiser Ferdinand II., dessen erste Gattin Maria Anna von Bayern 1616 verstorben war. Doch die Familie Gonzaga profitierte nicht wie erhofft durch ihre Verbindung mit dem Kaiser. Denn diese Ehe wurde von einigen seiner Berater nicht gern gesehen. Dies berichtete der Gesandte der Gonzagas kurz nach der Hochzeit. Kaiserliche Armeen eroberten und verwüsteten 1630 im Rahmen des Mantuanischen Erbfolgekrieg sogar die Residenz Mantua, als sie einen habsburgfreundlichen Thronprätendenten als Nachfolger von Eleonoras 1627 verstorbenem Bruder Vincenzo II. Gonzaga durchsetzen wollten.