В античности город имел две гавани (военную и торговую) и обладал сильными укреплениями (со времен Пелопоннесской войны). Митилена славилась высокой образованностью и покровительством искусству и литературе: родина Питтака, Алкея, Сапфо, Гелланика и др. В 493 год до н. э. Лесбос был подчинен персам и должен был принимать участие в походах персов на Грецию. При персах тираном был Коес, сын Эвандра (убит в ходе восстания против персов ок. 493 г. до н. э.). Когда же персы потерпели поражение, то Лесбос примкнул к Делосскому союзу. С течением времени, однако, жители Лесбоса стали тяготиться зависимостью от Афин, и Митилена стала главным пунктом освободительного движения; афинское войско после долгой осады 428—427 гг. до н. э. заставило город сдаться. Побеждённых обязали разобрать все укрепления и отдать корабли, навсегда лишив морского могущества. Земли вокруг Митилены были розданы афинским поселенцам-клерухам. Около 333 — 332 до н. э. известен Диоген, а затем Аристоник — тираны, зависимые от персов.