Durch den Augustinerorden, der in Verbindung mit Martin Luther stand, fand die Reformation schon früh Anhänger in der Stadt. Aber bereits 1522 ließ die habsburgische Regentin Margarete von Österreich erste Evangelische verhaften, 1523 wurden die beiden Augustinermönche Johannes van Esschen und Hendrik Vos nach Verurteilung durch die Inquisition in Brüssel verbrannt. Das war der Beginn einer ersten Verfolgung von Protestanten in den südlichen Niederlanden. Er führte in der Folge zur Flucht von etwa 40.000 Personen nach Amsterdam und Emden. 1556 setzte sich nach heftigen Kämpfen die Reformation in Antwerpen – wie auch in den gesamten Spanischen Niederlanden – durch. Im 16. Jahrhundert war die Stadt reichste Handelsstadt Europas. Durch die darauffolgenden Konflikte zwischen den Habsburgern und den vom Reich losgelösten Niederlanden folgte der Niedergang. Im November 1576 kam es zu Brand und Plünderung in der sogen. Spanischen Furie. 1585 eroberte der spanische Statthalter Alessandro Farnese Antwerpen. Alle protestantisch bleibenden Einwohner mussten die Stadt verlassen, die meisten flüchteten in die Nordprovinz.