Po smrti posledního legitimního mužského dědice mantovské linie rodu Gonzaga, Vincenza II. roku 1627, zdědil titul prostřednictvím dohody Karel. Jeho syn se oženil s Marií Gonzagovou, dcerou dřívějšího vévody Františka IV. Nicméně jeho následnictví pobídlo nepřátelství Karla Emanuela I. Savojského, který se zaměřil na gonzagovské Monferrato, a především Španělska a Svaté říše římské, kteří neměli rádi frankofilského vládce Mantovy. To vedlo k válce o dědictví mantovské. V roce 1629 poslal císař Ferdinand II. armádu Lancknechtů k obléhání Mantovy. Karel odešel bez slíbené podpory Ludvíka XIII. Obléhání trvalo až do roku 1630, kdy bylo město, již zasaženo morem, surově vypleněno. Mantova se z této pohromy nikdy nezotavila.