קרל נלחם בצרפת פעמים רבות במסגרת המלחמות האיטלקיות, שהראשונה שבהן הייתה ב-1521 בצפון איטליה. ב-1525 כבש מידי הצרפתים את מילאנו ואת פראנש-קונטה, לאחר ניצחונו בקרב פאביה. הוא הכריח את פרנסואה הראשון, מלך צרפת, שאותו שבה במלחמה, לחתום על הסכם מדריד, שבו נכתב כי צרפת מוותרת על תביעותיה לצפון איטליה. עם זאת, לאחר שחרורו הורה מלך צרפת לפרלמנט לחזור בו מההסכם, כיוון שחתם עליו תחת לחץ. הצרפתים מצידם חתמו על ברית עם האימפריה העות'מאנית. הסולטאן סולימאן הראשון הצליח אכן במהלכיו הצבאיים נגד האימפריה הרומית הקדושה וכבש את הונגריה לאחר קרב מוהאץ'. ההתקדמות העות'מאנית נעצרה רק עם כישלונם במצור על וינה ב-1529. באותה שנה חתם קרל על הסכמים עם מלך צרפת ועם האפיפיור, לפיהם צפון איטליה ייוותר ברשותו.