El 24 de mayo de 1866 se produjo la Batalla de Tuyutí: ante la instalación del ejército aliado en el Potrero de Tuyutí, López respondió con un ataque combinado con la mayor parte de sus tropas disponibles, divididas en cuatro columnas. El plan podría haber tenido éxito en condiciones de superioridad numérica, pero el jefe paraguayo destinó a la operación poco más de la mitad que las fuerzas aliadas que debían enfrentar. Si bien en un comienzo – gracias a la sorpresa – el ataque tuvo éxito, una de las columnas tardó demasiado en unirse al ataque, dando tiempo a las divisiones aliadas a contraatacar, lo que lograron con absoluto éxito gracias a su superioridad en armamento. Debido a la tenacidad de los paraguayos, que se negaban a retroceder aun cuando quedó claro que estaban siendo derrotados, la batalla resultó en una matanza de alrededor de 6.000 soldados paraguayos, que conformaban las tropas más veteranas y los oficiales más destacados del ejército de López. Fue la batalla más sangrienta de la historia de América del Sur.