Il 14 dicembre 1558, in concistoro, Paolo IV nominò il cardinale Ghislieri "Grande Inquisitore della Santa Romana e Universale Inquisizione" con facoltà illimitate e "ad vitam". L'anno successivo, alla morte del pontefice, il Ghislieri partecipò al suo primo conclave, aderendo al partito vicino ai Carafa. Dopo aver sostenuto la candidatura del cardinale Antonio Carafa, appoggiò Giovanni Angelo Medici, che fu eletto con il nome di Pio IV. Il Ghislieri fu confermato nel suo ruolo di inquisitore ma le divergenze con il pontefice, distante dalla linea intransigente del predecessore, lo portarono a essere nominato vescovo di Mondovì il 17 marzo 1560, dove si trasferì; prese possesso della diocesi il 4 giugno 1561.