Papst Gregor XIII. erhob ihn im Konsistorium vom 12. Dezember 1583 zum Kardinalpriester. François de Joyeuse begab sich nach Rom, traf jedoch zu spät dort ein, um noch am Konklave 1585 teilzunehmen. Aus der Hand des neuen Papstes Sixtus V. nahm er am 20. Mai 1585 den Kardinalshut entgegen, der Papst verlieh ihm zugleich die Titelkirche "San Silvestro in Capite". Im August desselben Jahres wurde François de Joyeuse Berater des Parlement von Paris. König Heinrich III. ernannte ihn am 16. Februar 1587 zum Vertreter Frankreichs beim Heiligen Stuhl, und de Joyeuse ließ sich in Rom nieder. Im Dezember 1587 wechselte er zur Titelkirche "Santissima Trinità al Monte Pincio", und am 4. November 1588 wurde er auf den erzbischöflichen Stuhl von Toulouse versetzt.