Il sommergibile entrò in servizio ufficialmente il 1º luglio 1930, venendo quindi impiegato nei mesi seguenti in prove in mare ed esercitazioni nella zona tra Mare Island e San Francisco, con occasionali crociere lungo la costa occidentale degli Stati Uniti. Nel febbraio 1931 il battello raggiunse Balboa nell'allora Zona del Canale di Panama per partecipare a una vasta esercitazione delle unità della United States Pacific Fleet; nel corso del viaggio il battello ricevette ufficialmente un nome di senso compiuto, ovvero "Nautilus" come quello dell'omonimo mollusco: fu la terza unità della US Navy ad adottare questo nominativo. Nel marzo seguente il sommergibile si trasferì via canale di Panama a Portsmouth, conducendo poi manovre di addestramento in oceano Atlantico al largo delle coste del New Hampshire e del Maine; dopo alcune visite al New York Navy Yard, al Washington Navy Yard e ad Annapolis, il 14 maggio il "Nautilus" attraversò nuovamente il canale di Panama e raggiunse San Diego, dove per un mese fu sottoposto a lavori di messa a punto. Inserito nella Submarine Division (SubDiv) 12, nei mesi seguenti svolse manovre di addestramento facendo base nel porto di San Diego.