Nel 1503 Marcantonio si distinse nella celebre Battaglia di Ruvo, ove avvenne la completa disfatta delle truppe del Maresciallo Jacques de La Palice. Alle truppe francesi prigioniere furono requisiti più di 1 000 cavalli, rafforzando così la propria cavalleria. Nello stesso anno Marcantonio prende parte alla Battaglia di Cerignola assieme a suo zio, Prospero Colonna e suo Cugino, Fabrizio I Colonna, il quale anch'esso, prese parte ai precedenti scontro di Ruvo. Durante gli scontri, insieme al fratello Marcello, salva la vita al cardinale italiano, Pompeo Colonna, che stava per essere ucciso da alcuni soldati spagnoli. Ma, alla fine degli scontri il trionfo spagnolo fu completo, nonostante la brevissima durata della battaglia, circa mezz’ora, sgretolando il tentativo dei francesi di dominare il sud Italia. Nel dicembre 1503 Marcantonio I Colonna, assieme ai suoi famigliari, prende parte alla Battaglia del Garigliano. Insieme al generale spagnolo, Gonzalo Fernández de Córdoba, dopo violenti scontri, riuscirono a sbaragliare le truppe francesi comandate dal Marchese Ludovico II del Vasto. La ritirata francese fu coperta per circa mezz’ora dal celebre militare francese, Pierre Terrail de Bayard.