หลังจากพระเจ้าบุเรงนองตีกรุงศรีอยุธยาแตกเมื่อ พ.ศ. 2112 มะเส็งศก วันอาทิตย์ เดือน 9 แรม 11 ค่ำ และได้สถาปนาสมเด็จพระมหาธรรมราชาครองกรุงศรีอยุธยาในฐานะประเทศราชของหงสาวดีแล้ว พระองค์ได้หนีกลับมายังกรุงศรีอยุธยาโดยที่พระเจ้าบุเรงนองทรงยินยอมอันเนื่องมาจากพระสุพรรณกัลยาทรงขอไว้ เมื่อเสด็จกลับมาถึงกรุงศรีอยุธยาในปี พ.ศ. 2115 สมเด็จพระมหาธรรมราชาพระราชทานนามให้พระองค์ว่า "พระนเรศวร" และโปรดเกล้าฯ ให้เป็นพระมหาอุปราช พระชนมายุ 17 พรรษา ไปปกครองเมืองพิษณุโลก พระองค์ทรงปกครองเมืองอย่างดีและทรงเริ่มเตรียมการที่จะกอบกู้เอกราชของกรุงศรีอยุธยา