ต่อมาในรัชสมัยสมเด็จพระมหาธรรมราชา มีบาทหลวงจากคณะดอมินิกันจากเมืองกัวเข้ามาในอยุธยาสองรูป คือ บาทหลวงเจรูนิมู ดา กรุซ () และบาทหลวงเซบัสเตียว ดึ กังตู () เมื่อ ค.ศ. 1567 ในช่วงการเสียกรุงศรีอยุธยาครั้งที่หนึ่งใน ค.ศ. 1569 ทหารพม่าทำการประหารบาทหลวงสามรูปด้วยการตัดศีรษะขณะท่านกำลังสวดภาวนาอยู่ในโบสถ์ เมื่อรัชสมัยสมเด็จพระนเรศวรมหาราชทรงตีเมืองละแวกได้จึงกวาดต้อนเชลยซึ่งมีส่วนหนึ่งเป็นชาวโปรตุเกสและนักบวชแพร่ธรรมอยู่ในเมืองเขมร ต่อมาพระองค์ปลดปล่อยให้เชลยเหล่านี้เป็นอิสระ แต่รัชสมัยของสมเด็จพระเจ้าปราสาททอง พระองค์ไม่โปรดคนโปรตุเกสนัก คริสต์ศาสนิกชนโปรตุเกสถูกชาวฮอลันดาและคนต่างศาสนาเบียดเบียน แต่ภายหลังสมเด็จพระเจ้าปราสาททองทรงฟื้นฟูสัมพันธไมตรีกับโปรตุเกสและไม่วางพระทัยชาวฮอลันดาแทน จึงพระราชทานที่ดินโบสถ์คริสต์ร้างแห่งหนึ่งแก่คริสตัง แม้จะประสบปัญหาหลายอย่าง แต่การเผยแผ่ศาสนาคริสต์ของชาวโปรตุเกสได้เผยแผ่ออกไปกว้างขวางในหมู่ชาวไทยสยาม และยุโรปชาติอื่น ๆ ที่ไม่มีโบสถ์ของตนเอง นอกจากนี้โบสถ์ของบาทหลวงโปรตุเกสยังครอบคลุมไปถึงกลุ่มผู้ลี้ภัยศาสนาชาวญี่ปุ่นและญวนในกรุงศรีอยุธยาอีกด้วย ในบันทึกของบาทหลวงกีย์ ตาชาร์ บรรยายบรรยากาศของงานรื่นเริงที่จัดขึ้นในค่ายโปรตุเกส ตรงกับรัชสมัยสมเด็จพระนารายณ์มหาราชไว้ อันแสดงให้เห็นถึงมโนทัศน์ของชาวโปรตุเกสในสยามถึงจิตสำนึกความเป็นโปรตุเกส ความว่า