Espanjan sisällissodan alettua heinäkuussa 1936 Durruti osallistui tasavaltalaisten puolella kenraali Francon ja kansallismielisten fasistien vastaiseen taisteluun. Hän johti yli 3 000 anarkistin sotilasosastoa, Durrutin kolonnaa, joka oli mukana muun muassa pysäyttämässä kenraali Manuel Goded Llopisin Barcelonan valtausta. Marraskuussa 1936 Durrutti marssi joukkoineen Madridiin, joka oli Francon armeijan piirittämänä. Durruti kaatui myöhemmin samassa kuussa Casa de Campon puistossa käydyissä taisteluissa. Historioitsija Anthony Beevorin mukaan Durruti kuoli omiensa vahingonlaukaukseen, mutta anarkistien mukaan hän joutui tarkka-ampujan uhriksi.