В началото на 17 век противопоставянето между чехите и хабсбургите, както и между католици и реформираната църква, започва да се разгаря отново. През 1618 година двама католически имперски съветници са хвърлени от прозорец на Пражкия замък (Втора пражка дефенестрация), с което е дадено началото на нов бунт срещу хабсбургите, както и на опустошителната Тридесетгодишна война. Бохемските съсловия събират армия, разпореждат изгонването на йезуитите и обявяват бохемския престол за избираем. Съсловията са сразени от имперско-испанската войска в Белогорската битка на 8 ноември 1620. Разгромът в този сблъсък има дълбоки последици за Бохемия. Много чешки благородници са екзекутирани, почти всички останали напускат Бохемия, а имотите им са конфискувани. Голяма част от протестантите също емигрират, Карловият университет е слят с йезуитската школа, всички некатолически свещеници за изгонени, събранията на Бохемия и Моравия са разтурени, и всички чешки земи стават наследствена собственост на хабсбургската фамилия. По този начин Бохемското кралство е практически ликвидирано. С приключването на Тридесетгодишната война през 1648 е юридически потвърден статутът на Бохемия като част от хабсбургска монархия със седалище във Виена, и така автономната чешка аристокрация, реформирана църква и обособена култура биват почти изцяло загубени.