Kaple byla používána i pro farní účely i přes to, že vlastní fara byla od města poměrně vzdálena. Všechny bohoslužebné úkony, které prováděly farní kostely, byly prováděny v kostele sv. Markéty. Vyplývá to také z toho, že zde byl přibližně koncem 14. století zřízen hřbitov, který sloužil strakonickým obyvatelům až do 16. století, kdy byl zřízen hlavní hřbitov pro městské pohřby u kostela sv. Václava v Lomu. Rozhodujícím činitelem ve vývoji kostela byl zejména johanitský převor s celým konventem a správou města. Podle rozhodnutí velkopřevora Jana ze Švamberka z roku 1482 dostává strakonický cech krejčích potvrzení svých cechovních privilegií a cechovní oltář. Další zpráva o kostele je až z doby po polovině 16. století, ve které je v roce 1557 kostel nazýván „kostelem v malým městě“. V té době zde měli řezníci svůj cechovní oltář, který byl hlavním oltářem kostela. V 16. století byla většina městského obyvatelstva ve Strakonicích vyznání podobojí. Kostel, ačkoliv byl pod patronátem maltézských převorů ze strakonického hradního konventu, zůstal kostelem podobojí až do Bílé hory. V této době se poprvé písemně připomíná kostel sv. Markéty v souvislosti s obdarováním špitálu stojícím při tomto kostele od převora Benedikta z Bratčic.