しかし、ドイツではマルティン・ルターの宗教改革がはじまり、神聖ローマ帝国は動揺した。弟のフェルディナントはモハーチの戦いで敗死したラヨシュ2世からハンガリー・ボヘミア王の位を継承し、ハンガリー、ボヘミアもハプスブルク家の支配下におかれた。これによってハプスブルク帝国は多民族化が進むと同時に第一次ウィーン包囲以来オスマン帝国と勢力圏が接するようになった。1556年カール5世が退位すると、息子のフェリペ2世がスペイン王位を継承し、フェルディナントがオーストリアと皇帝位を継承した。フェルディナント1世は1555年のアウクスブルクの和議で兄皇帝に代わりプロテスタントに一定の譲歩を示す形で和解したが、以後の皇帝たちはカトリック重視の政策をとりプロテスタント諸侯との対立を強めた。