Die Regierungszeit des Bischofs Melchior Zobel von Giebelstadt (1544–1558) ist durch die Grumbachschen Händel bekannt. Julius Echter von Mespelbrunn (1573–1617) führte die Gegenreformation im Hochstift Würzburg durch und gründete 1579 das Julius-Spital sowie 1582 die Universität Würzburg. Auch wurden die Hexenprozesse in Würzburg wieder aufgenommen, die unter Philipp Adolf von Ehrenberg (1622–1631) ihren Höhenpunkt fanden und 1749 mit dem Tod der Maria Renata Singer von Mossau endeten. Als Mitglied in der katholischen Liga hatte das Bistum im Dreißigjährigen Krieg stark zu leiden. Der schwedische Kanzler Axel Oxenstierna übertrug am 20. Juni 1633 dem Herzog Bernhard von Sachsen-Weimar die Bistümer Würzburg und Bamberg als Herzogtum Franken, der sich jedoch nach der Niederlage bei Nördlingen nicht darin behaupten konnte. Bischof Franz von Hatzfeld (1631–1642) verwaltete, wie mehrere seiner Nachfolger, zugleich das Bistum Bamberg. Unter der Regierung des Bischofs Franz Ludwig von Erthal (1779–1795) erlebte das Hochstift eine letzte Blüte. Georg Karl von Fechenbach war der letzte der Würzburger Fürstbischöfe.