В октябре 1626 года, после смерти Фердинанда, герцога Мантуи и Монферрато, ему, под именем Винченцо II, наследовал другой младший брат Маргариты. Он не имел детей и был слаб здоровьем. С его смертью в декабре 1627 года пресеклась прямая линия дома Гонзага — герцогов Мантуи и Монферрато. Непрямые наследники Винченцо II — Карл I, герцог Невера, поддерживаемый французским королём, Ферранте II, герцог Гвасталлы, поддерживаемый испанским королём, и Карл Эммануил I, герцог Савойи, развязали войну за мантуанское наследство. На этом этапе Маргарита вмешалась в ситуацию, по мнению некоторых исследователей, чтобы вернуть своей старшей дочери правление в лотарингском герцогстве в случае признания её прав как наследницы во владениях отца. В апреле 1628 года она отправила эмиссара к имперскому двору в Вене с просьбой признать её регентом в герцогстве Монферрато, где власть могла передаваться и по женской линии. Претензии Маргариты не нашли понимания у послов Французского королевства и Венецианской республики, и даже у её сестры-императрицы. Летом 1628 года двор в Мадриде предложил ей продать своё право на герцогство Монферрато. Она отказалась из-за симпатий к Неверской ветви дома Гонзага, но продолжила требовать соблюдения её прав как наследницы. Договор в Регенсбурге, подписанный воевавшими сторонами 13 октября 1630 года, предусматривал лишь возможность компенсации Маргарите за отказ от прав на наследство.