Zu Beginn ihrer sportlichen Karriere war Barbora Špotáková zunächst Siebenkämpferin und versuchte sich auch im Zehnkampf, bis sie sich schließlich auf ihre stärkste Disziplin konzentrierte, den Speerwurf. 2000 nahm sie im Siebenkampf an den Juniorenweltmeisterschaften in Santiago de Chile teil und belegte dort mit 5689 Punkten den vierten Platz. 2002 nahm sie erstmals an den Europameisterschaften in München teil und schied dort im Speerwurf mit einer Weite von 51,71 m in der Qualifikation aus. Im Jahr darauf wurde sie bei den U23-Europameisterschaften in Bydgoszcz mit 56,65 m Sechste und anschließend erreichte sie bei der Sommer-Universiade im südkoreanischen Daegu mit 55,31 m Rang vier. 2004 versuchte sie sich im Zehnkampf für Frauen und stellte in Talence mit 6749 Punkten eine nationale Bestleistung auf. 2005 nahm sie erstmals an den Weltmeisterschaften in Helsinki teil, schied dort aber mit einer Weite von 58,74 m in der Qualifikation aus, siegte aber im Anschluss bei den Studentenweltspielen in Izmir mit 60,73 m. 2006 gewann sie bei den Europameisterschaften in Göteborg mit 65,64 m die Silbermedaille und musste sich dabei nur der Deutschen Steffi Nerius geschlagen geben. Im Anschluss stellte sie beim World Athletics Final in Stuttgart mit 66,21 m einen neuen Landesrekord auf und löste damit Nikola Brejchová als Rekordhalterin ab.