มีหลักฐานว่าชาวโปรตุเกสปรากฏตัวในอาณาจักรอยุธยามาตั้งแต่คริสต์ศตวรรษที่ 16 เมื่อโปรตุเกสยึดครองเมืองมะละกาได้ใน ค.ศ. 1511 จึงมีการส่งทูตชื่อดูวาร์ตึ ฟือร์นังดึช () เข้าเฝ้าถวายพระราชสาส์นและเครื่องบรรณาการแก่สมเด็จพระรามาธิบดีที่ 2 ซึ่งทรงต้อนรับอย่างดีและมีพระราชประสงค์จะเจริญสัมพันธไมตรีกับพระเจ้ากรุงโปรตุเกสด้วย โปรตุเกสจึงส่งทูตชื่ออังตอนียู ดึ มีรันดา ดึ อาเซเวดู () เพื่อติดต่อด้านการค้าและสนับสนุนด้านการทหารให้แก่อยุธยาด้วย ซึ่งสมเด็จพระรามาธิบดีที่ 2 ทรงตอบรับข้อเสนอ และเริ่มทำการค้าข้าวสารกับเมืองมะละกาใน ค.ศ. 1513 หลังจากนั้นเป็นต้นมา จึงเริ่มมีพ่อค้าและทหารรับจ้างเชื้อสายโปรตุเกสเดินทางเข้าไปพำนักอยู่ในกรุงศรีอยุธยา พวกเขาเป็นทหารชั้นล่างของโปรตุเกส () ที่ผันตัวเป็นพ่อค้าและตั้งชุมชนการค้าเองไม่ขึ้นกับรัฐบาลโปรตุเกส ในกรุงศรีอยุธยา พวกเขาถูกดึงดูดด้วยสิทธิพิเศษด้านการค้าและการยกเว้นภาษี ดังจะพบว่าชาวโปรตุเกสที่อาศัยในกรุงศรีอยุธยาประกอบอาชีพอย่างหลากหลาย เช่น ช่างอัญมณี นักเดินเรือ แพทย์แผนตะวันตก ช่างหล่อปืน สถาปนิก วิศวกร พ่อค้า เสมียน นักดนตรี หรือแม้กระทั่งพราหมณ์ ปลายรัชสมัยสมเด็จพระรามาธิบดีที่ 2 พบว่ามีพ่อค้าโปรตุเกสอาศัยอยู่ในอยุธยาราว 300 คน เอกสารของฟือร์เนา เม็งดึช ปิงตู () ระบุว่ามีทหารชาวโปรตุเกสจำนวน 160 นาย ร่วมทัพอยุธยาไปตีเมืองเชียงใหม่ใน ค.ศ. 1545 และมีทหารโปรตุเกสอีก 120 นายร่วมทัพอยุธยาไปตีเชียงใหม่อีกครั้งในสองปีต่อมา และเมื่อคราวเสียกรุงศรีอยุธยาครั้งที่หนึ่งใน ค.ศ. 1569 มีชาวโปรตุเกสถูกสังหารประมาณ 27 คน และอีกจำนวนหนึ่งถูกกวาดต้อนไปเมืองพะโค