Biblioteket ble tidlig plassert i Helligåndshuset. I perioden 1553–1652 holdt det til i «Liberihuset» som lå der universitetets hovedbygning ligger i dag. I 1653 ble biblioteket flyttet til loftet over Trinitatis kirke. I forbindelse med Københavns brann i 1728 gikk det nesten til grunne da bind gikk opp i flammer og kun de ulovlig hjemlånte verker ble reddet (først i 1788 ble hjemlån tillatt for studenter). I 1731 var kirken bygget opp igjen og gjenoppbyggingen av bibliotekets samlinger kunne begynne.