עלילת הסרט מתרחשת בשנת 1957, בזמן המלחמה הקרה. אינדיאנה ג'ונס ושותפו מאק נחטפים על ידי סוכנים סובייטים בראשות קולונל ד"ר אירינה ספאלקו ומובאים למחסן צבאי באזור 51 שבנבדה, בו מוחבאים פריטים מסוימים בעלי ערך וכוח רב על ידי הממשלה האמריקאית. הסוכנים מאלצים את השניים לגלות להם את מקום הימצאותה של גופה חנוטה מתקרית רוזוול המכילה כוחות על טבעיים, כביכול. ג'ונס נלכד כאשר שותפו בוגד בו ובקושי מצליח להימלט מנבדה, תוך שהוא מגיע לעיירת ניסוי לפיצוץ גרעיני, ונמלט ממנו בעור שיניו. במהלך המהומה במחסן בעת הימלטותו של ג'ונס, מתרסקת פינה באחד הארגזים, שבתוכו נחשף ארון הברית, תזכורת לסרט הראשון.