Jezuité v Klementinu provozovali svoji školu, roku 1616 povýšenou na univerzitu, která byla protiváhou (soupeřem) tehdy protestantské Karlovy univerzity. V roce 1618 byli jezuité reformátory z Prahy vypovězeni. Po svém brzkém návratu v roce 1620 po Bílé hoře jim byla v rámci pokračující rekatolizace svěřena v roce 1622 i správa Karlovy univerzity. Roku 1638 byly právnická a lékařská fakulta od jezuitské koleje odděleny a bylo jim vráceno Karolinum. I když v roce 1654 došlo k opětnému sloučení v univerzitu Karlo-Ferdinandovu, v Klementinu zůstaly jen fakulty filozofická a teologická. Od počátku své existence budovala jezuitská kolej svou knihovnu a v roce 1622 sem byla přemístěna knihovna Karlových kolejí. Jezuité v Klementinu provozovali také tiskárnu, kterou získali koupí od dědiců Daniela Adama z Veleslavína. Významnou pozornost věnovali jezuité vědeckým disciplinám (od roku 1722 zde byla zvláštní matematicko-astronomická studia, matematické muzeum a později astronomická observatoř). V areálu se také nacházela lékárna s laboratoří. Již za jezuitů se v Klementinu konaly přednášky Stavovské inženýrské školy, která zde sídlila až do roku 1786.