Im März 1555 starb Julius III. und Kardinal Gonzaga kam am 3. April in Rom an. Im Konklave setzte er sich zwar zugunsten von Kardinal Ippolito d’Este ein, war aber ebenso zufrieden mit der Wahl von Marcellus II. am 9. April 1555. Am 10. April schrieb er an Ferrante Gonzaga, man könne endlich Hoffnung auf eine Reform der Kirche und ein Ende der Missbrauchsskandale haben. Er schien daher dem neu Gewählten sehr nahe zu stehen; aber kaum nach Mantua zurückgekommen, erhielt er die Nachricht vom plötzlichen Tod Marcellos II. und kehrte bereits Mitte Mai nach Rom zurück. Im Konklave nahm er entschieden Partei für die pro-habsburgischen Kardinäle und lehnte bis zum Ende die Kandidatur von Kardinal Carafa ab, der am 23. Mai unter dem Namen Paul IV. gewählter Papst wurde. Carafa, der Mitbegründer des Theatinerordens, galt als entschiedener Gegner der "Spirituali" und hatte am 5. Dezember 1549 im laufenden Konklave den erfolgreichsten Kandidaten auf die Papstnachfolge Kardinal Reginald Pole öffentlich der Häresie bezichtigt und damit damals dessen Wahl verhindert. Den erfolgreichsten Gegenkandidaten bei seiner eigenen Papstwahl, Kardinal Giovanni Morone, ließ Papst Paul IV. 1557 wegen Häresieverdachts verhaften und bis zum eigenen Tod im Jahr 1559 gefangen halten.