V roce 1994 nastoupil do týmu Williams. Nevyhrál již ani jednu velkou cenu. První dvě GP v Brazílii a v Pacifiku nedokončil. Během GP San Marina v Imole 1.5.1994 jeho monopost vyjel v zatáčce Tamburello z trati a při následném nárazu do betonové zdi podél trati Ayrton Senna zemřel. Náraz vozu způsobil utržení sloupku řízení a tento kus způsobil smrtelné poranění hlavy Ayrtona Senny v oblasti spánkové tepny a krvácení do spodiny lebeční. Po vyproštění z vozidla byl Ayrton Senna položen na betonový podklad u okraje trati, kde byl ošetřován do doby, než přiletěl vrtulník. Během záchranářských prací lékařů zhluboka vydechl. I podle lékářů přímo u nehody a také poněvadž byl silně věřící, se říká, že tímto výdechem jeho duše opustila jeho tělo.