Margherita rimase vedova nel 1612 dopo solo quattro anni di matrimonio. Sia il marito, sia l'unico figlio maschio Ludovico rimasero vittime del vaiolo, e a succedere a Francesco fu suo fratello minore Ferdinando Gonzaga. Mentre il padre Carlo Emanuele I pretendeva che erede del Monferrato fosse sua nipote Maria, l'unica figlia dei duchi di Mantova a raggiungere l'età adulta, Ferdinando pensò anche di sposare sua cognata Margherita, ma gli eventi precipitarono e il 22 aprile 1613 scoppiò la prima guerra del Monferrato, conclusasi quattro anni dopo con la pace di Madrid e la rinuncia dei Savoia al Monferrato.