Am 24. Mai 1866 kommandierte Barrios eine der vier paraguayischen Angriffskolonnen in der Ersten Schlacht bei Tuyuti. Diese Schlacht, die von López als groß angelegter Überraschungsangriff konzipiert worden war, mit dem die alliierte Armee zerschlagen und wieder aus Paraguay vertrieben werden sollte, endete allerdings mit einer schweren Niederlage seiner Streitmacht. Die Abstimmung der paraguayischen Heeresverbände, die durch schwieriges Gelände zu marschieren gehabt hatten, war nicht gelungen. Das hatte dazu geführt, dass sie nicht zeitgleich, sondern nacheinander angegriffen hatten – Barrios Angriffskolonne beispielsweise hatte ihr Einsatzgebiet erst einige Stunden nach dem Schlachtbeginn erreicht – und jeweils mit schweren Verlusten zurückgeschlagen worden waren.