Owdowiała w 1586 roku, teoretycznie mogła nie zgodzić się na bezkrólewie i sama objąć rządy ze względu na fakt ogłoszenia jej „królem” w czasie elekcji w 1575 roku. Jednak z tej możliwości nie skorzystała i zrzekła się własnych praw do korony, popierając kandydaturę swojego siostrzeńca, królewicza szwedzkiego Zygmunta. W okresie bezkrólewia była najważniejszą osobą, na poparcie której mógł liczyć "interrex" Stanisław Karnkowski. Anna chorowała jednak w tym okresie i pomagała prymasowi jedynie sporadycznie, m.in. 3 marca 1587, kiedy załagodziła tumult wywołany przez Stanisława Żółkiewskiego i Zborowskich. Po konsultacjach z Anną prymas na krótko przystąpił do grupy zwolenników kandydatury habsburskiej (koło prokonwokacyjne), po czym stwierdziwszy, że nie sprzeciwi się woli szlachty, przystąpił do konkurencyjnego, tzw. koła czarnego, zrzeszającego osoby przeciwne Habsburgom i Zborowskim. Przekonał je do wyboru królewicza szwedzkiego Zygmunta na króla Polski. Zaraz po nominowaniu Zygmunta na ten urząd – 19 sierpnia 1587 – prymas niezwłocznie zawiadomił Annę o sukcesie. Anna stanowczo sprzeciwiała się kandydaturze habsburskiej (nastąpiła wówczas bowiem podwójna elekcja – obok królewicza szwedzkiego wybrano także arcyksięcia Maksymiliana z dynastii Habsburgów), co szczególnie uwidoczniło się już po zwycięstwie zwolenników Zygmunta pod Byczyną, kiedy wspierała nawet hetmana Jana Zamoyskiego w kwestii ukarania jeńców polskich rekrutujących się spośród zwolenników arcyksięcia.