Durante il regno di Giustiniano I, salito al trono nel 527, si assistette all'ultimo concreto tentativo di riconquistare le regioni occidentali, per ristabilire l'unità dell'Impero romano ("renovatio imperii"). Tale tentativo fu coronato da un parziale, anche se in taluni casi effimero, successo. Sotto il comando dei generali Belisario prima e Narsete poi, i Bizantini riuscirono a riconquistare le province dell'Africa Settentrionale (533-534), parte della Spagna meridionale e, al termine della sanguinosissima guerra gotica (535-555) combattuta contro gli Ostrogoti, l'intera Italia. Se la maggior parte di quest'ultima fu persa una quindicina d'anni più tardi a seguito dell'invasione longobarda, iniziata nel 568, la Spagna bizantina fu persa solo un secolo più tardi (intorno al 624), mentre l'Africa nord-occidentale fece parte dell'Impero romano d'Oriente per oltre un secolo e mezzo (fino al 698). Sotto Giustiniano l'Impero bizantino raggiunse, attorno alla metà del VI secolo, la massima espansione territoriale della sua storia (395-1453).