Am 7. Januar 1591 wurde Giustiniani zum Kardinalpriester erhoben und erhielt die Titelkirche San Marcello. Er wurde am 30. Januar desselben Jahres zum Legaten in den Marken dem Innozenz IX. als Papst hervorging. Ebenso nahm er 1592 am Konklave teil, das Kardinal Aldobrandini als Clemens VIII. auf den Stuhl Petri brachte. Mit letzterem ging Giustiniani 1598 nach Ferrara und wurde dort zum Präfekten der Kongregation für die Bischöfe und Regularen ernannt. Am 17. März 1599 wechselte er zur Titelkirche Santa Prisca. Im März 1605 wr er Teilnehmer des ersten Konklave von 1605, bei dem Leo XI. zum Papst gewählt wurde; im Mai desselben Jahres nahm er auch am zweiten Konklave des Jahres teil, das in der Wahl von Papst Paul V. mündete. Vom 25. September 1606 bis zum August 1611 war er Legat in Bologna. Er wechselte am 17. August 1611 zur Titelkirche San Lorenzo in Lucina und wurde Kardinalprotopriester.