1862. április 6-án Johnston összevont hadseregével erőteljes és váratlan támadást indított Grant erői ellen a Shiloh-i csatában. Miközben a konföderációs csapatok lerohanták az uniós tábort, Johnston szinte mindenütt ott volt. Lováról személyesen vezette és bátorította a katonákat a harcvonal minden pontján megjelenve. Délután 2:30 tájékán, miközben a barackfákkal beültetett gyümölcsösben vezette az uniós erők elleni rohamot, térdhajlatán lőtt sebet kapott. Úgy tűnik, hogy vagy nem gondolta súlyosnak a sebét, vagy észre sem vette és személyi orvosát elküldte, hogy kezelje a foglyul esett uniós sebesülteket. Lehetséges, hogy Johnston 1837-es párbajában kapott idegsebesülése és jobb lábának ernyedtsége miatt nem érezte meg a sebesülést. A golyó azonban felsértette a térdhajlati artériáját és csizmája megtelt vérrel. Pár percen belül Johnston stábja azt vette észre, hogy a tábornagy az ájulás határára került. Egyik tisztje, Isham G. Harris, Tennessee kormányzója meglátta, hogy Johnston arcából eltűnt a szín és mindjárt leesik a nyeregből, ezért megkérdezte "Tábornagy, megsebesült?". Johnston lenézett lábsebére, majd nagyon gyenge hangon azt felelte "Igen... és azt hiszem súlyosan". Harris és a közelben álló tisztek leemelték Johnstont a nyeregből és a "Hornets Nest" melletti kis vízmosáshoz vitték. Megpróbálták a vérzést elállítani, de mivel Johnston túl sok vért veszített, hamarosan elvesztette az eszméletét és pár perccel később meghalt. Ez körülbelül egy órával a találat után lehetett. Harris és társai pokrócba göngyölték, hogy a csapatok morálját ne veszélyeztesse halott parancsnokuk látványa. Johnston testét és a Tűznyelő névre hallgató sebesült lovát a Corinth felé vezető úton levő tábori főhadiszállásra vitték, ahol azok a sátorban várakoztak a másnapi konföderációs visszavonulásig. William Inge ezredes vitte vissza Corinth-ba a holttestet, ahol a főhadiszálláson pár órára letakarták a Konföderációs lobogóval.