Na het overlijden van Vincenzo II Gonzaga, de laatste mannelijke erfgenaam van de Gonzaga-linie van hertogen van Mantua, erfde Carlo in 1627 het hertogdom Mantua en het hertogdom Monferrato. Omdat Mantua en Monferrato daardoor een pro-Frans staatshoofd kregen, leidde dit tot het verzet van hertog Karel Emanuel I van Savoye, die de steun kreeg van Spanje en het Heilige Roomse Rijk. Dit veroorzaakte uiteindelijk de Mantuaanse Successieoorlog. In 1629 stuurde keizer Ferdinand II een leger van Duitse landsknechten naar Mantua om te stad te belegeren. Omdat de beloofde steun van koning Lodewijk XIII van Frankrijk uitbleef, moest Carlo het bij dit beleg alleen op nemen tegen het huis Habsburg. In juli 1630 werd Mantua ingenomen en zwaar geplunderd.