Applicable to the enumeration of viable aerobic
bacteria in food الهدف من هذه الطريقة هي
الطريقة اللي هي من الـ Aerobic Colony Count أو
مسميها Total Viable Count الهدف منها enumeration
عدّ لبكتيريا بتكون حية وهوائية بتعتمد على وجود ال
oxygen في النمو، رح نعدّها في الـ food سواء كانت هي
البكتيريا psychrophilic إيش هي psychrophilic؟ محبة
لدرجات الحرارة اللي منخفضة أو محبة للبرودة
mesophilic محبة لدرجات الحرارة المعتدلة، و
thermophilic محبة لدرجات الحرارة العالية The
Aerobic Colony Count الـ ACC بتقدر، بتستطيع تقدير number
of viable aerobic bacteria سواء كانت بالجرام أو
بالمللي حسب الحالة الفيزيائية للـ product، a portion
of the product بناخد جزء من الـ sample اللي هي عبارة
عن الـ analytical unit، بعدين بنعمل سلسلة من التخفيفات
بروحي آخد من كل تخفيف وبعمله is mixed with a
specified agar medium بروحي أزرعه على الـ agar، و
incubated under a specific condition of time and
temperature بحطه في الـ incubator، بوفر للبكتيريا الـ
time والـ temperature حسب نوع البكتيريا اللي بدي إياها
تنمو، it's assumed that each viable aerobic
bacteria will multiply under these conditions بقول
لي، فبالتالي البكتيريا اللي كانت بالأساس ما بقدر
أشوفها بالـ naked eye، لما وبوفرلها الظروف هي من
ناحية الـ time والـ temperature، رح يصير بإمكانها
multiplication تتضاعف بالـ binary fission، و تنقسم
أكثر و تظهر على شكل visible colonies، بقدر أشوفها
بالـ naked eye، وبالتالي بعدها which can be counted
الـ Psychrophilic bacteria هي البكتيريا المحبة
للبرودة which grows optimally at or below 15°C which
has an upper limit أقصى درجة حرارة ممكن أنها تنمو
عليها هي 20°C وأقل درجة حرارة has a lower limit of
growth 0°C يعني ده هي البكتيريا بتنمو على درجة حرارة
من 0°C لـ 20°C، لكن أفضل نمو لإلها على درجة حرارة 15°C، الـ
range من 0°C لـ 20°C، والأفضل على درجة حرارة 15°C، الـ
Mesophilic bacteria an organism whose optimum
growth temperature أفضل نمو لإلها بتكون على درجة
حرارة 37°C أو 30°C، لكنها بتنمو في الـ range من 20°C لـ 45°C
الـ Thermophilic Bacteria هي البكتيريا المحبة
للحرارة المرتفعة، فبتنمو بِمعدّل أعلى من 45°C
لكنها بتفضل الـ 55°C، هاي شغلات ممكن نحتاجها
في المعمل، رح نحتاج لـ Colony Counting Device هذا
جهاز بيعّد الـ Colonies، لكن إحنا في ما عملنا هنعدّ
باستخدام الـ naked eye، يعني إحنا مش بحاجة للجهاز
هذا، لـ Stomacher أو لـ Blender، جهاز بنستخدمه لطحن
الطعام، بنحولّه من solid إلى liquid، الـ pH meter بيعمل
على ضبط الـ pH، الـ HCl والـ NaOH هدول حمض
وقاعدة، بيقول لي أول ما بيجي لي الـ food بروح أقيس الـ
pH لإله، لو كان حامضي الـ food، لو كان حامضي بروح
أضيف عليه NaOH، فبالتالي بظلّ أضيف أضيف لعند ما
يصير الوسط متعادل، الـ food متعادل، لو كان الـ Food
جييني قاعدي بضيف عليه HCl لعند ما يتعادل، طيب ليش
لازم أضبط الـ pH للـ Food؟ بيقول لي في وسط اسمه الـ
MSA، هاد رح تأخذوه بالتفصيل في المعمل القادم إن شاء
الله، MSA Media اسمها Mannitol Salt Agar تمام؟ هاد
وسط خاص بنمي فيه البكتيريا لـ Staphylococcus aureus، اسم الوسط
MSA
الـ Media هي من ضمن مكوناتها pH Indicator، فالـ pH
Indicator اسمه Phenol Red، لما الـ pH يكون حامضي بيعطيني لون
أصفر، لو كان الـ pH alkaline أو قاعدي بيعطيني لون
أحمر، تمام، الـ Staphylococcus aureus راح تيجي وتنمو على هذا
الوسط اللي لونه بالأساس بيكون beige، طبعا البكتيريا
أثناء نموها بتستهلك من السكر الموجود في الـ media
بتعمله fermentation بتطلع acid، fermentation للسكر
بيعطي acid، acid يعني pH منخفضة، يعني هيصير الـ Phenol
Red، أو الـ pH هيكون acidic، acidic هيعطي لون لون
أصفر، ناتج عن شو؟ إن البكتيريا عملت fermentation
فطلعت acid، فمن اللون الأصفر بقدر أعرف أن هذه
البكتيريا بتطلع acid، طيب، فيه معلومات كنت عاملة تضبط
الـ pH للـ food وكان مثلا جاينة أنه عينة، أنه مثلا
لبن، واللبن عينة، هاد حامضي، فبالتالي الـ pH
Indicator هيتحسس لوجود الحمض اللي بالـ food، و
هيظهر اللون أصفر، إحنا هنفكر أن هذا الأصفر ناتج إن
فيه بكتيريا Staphylococcus aureus عملت fermentation للسكر
فطلعت acid، لكن لأ، هي الـ acid جايه من الـ food، وهيك
هيعطيني رقم Colonies أكثر من المتوقع، حتى
لو كانت نامية أيّ بكتيريا غير الـ Staphylococcus aureus وهي
البكتيريا بطبيعتها ما بتعمل fermentation للسكر
فبالتالي هيظهر لون الـ Colonies لهذه البكتيريا أصفر
ليش؟ لأن فيه acid أتي من الـ food، فرح أعدّ هذه الـ
Colonies على أنها من ضمن الـ Staphylococcus aureus، وهذا أساسًا
خطأ، البروسيجر بتحدّد أيّ نوع من البكتيريا الهوائية
اللي بنستخدمها لازم أول شيء نعرف شو نوع البكتيريا
اللي رح أنميها، ليش؟ مش هنعرف شو نوع الوسط اللي
رح نستخدمه، فبنوّفر الوسط أو الـ media حسب البكتيريا
اللي رح أنميها، analyze each sample unit
individually، كلّ عينة بتيجي لي بدي أتعامل معها بشكل
منفصل، the test shall be carried out in accordance
with the following instructions، بدي أمشي على هي
التعليمات، handling of sample unit بالنسبة لها
الـ التعامل مع الـ sample unit هي اللي بناخدها من الـ
lot during storage and transport أثناء عمليات
النقل والتخزين بدي أتبع الشغلات هي، أول شيء بيقول لي
إن العينة المتلجة بحافظ عليها متلجة من صفر لـ
أربعة، العينة المتلجة بحافظ عليها متلجة، وبخزنها
درجة حرارة سالب عشرين، لو … لو بدي أشتغل حاليًا
على عينة frozen مجمدة، شو بعمل؟ بدي أعملها thawing
التسيح، يا إما بنزلها بالتلاجة من إثنين لخمسة، لو
كنت مستعجلة عليها، بحطها في الـ water bath، درجة
حرارة أقل من خمسة وربعين، ولمدة لا تزيد عن خمسة عشر
minute، Sample unit of a frozen product shall be
kept frozen Though frozen sample in a refrigerator
ممكن أحطها بالتلاجة، بتسيح، أو under time and
temperature أو تحت time و temperature معينين which
prevent microbial growth or death، درجة هيدا الـ
water bath بأطبطها بحيث أنها ما بتعمل نمو أو قتل
للـ microorganism، فبتحافظ على العدد زي ما هو
analyze sample unit as soon as possible after
receipt in the laboratory، بدي أحلّل الـ sample
بمجرد ما تصِل للمعمل، بالنسبة لتحضير الـ media زي ما
عملنا في المعمل الماضي، بدنا نحضر الـ media كيف؟
بأجيب أيّ Media بدي إياها مثلا للـ Nutrient Agar، بتطلع
على الـ instructions من برا، قداش بحتاج قلوات من الـ
powder، قداش بحتاج عليها من distilled water، بحطّهم
مع بعض في الـ flask، وبعدين بحطّهم على الـ hot
plate، إذا بحتاج لتعقيم، بَعقّمهم بالـ Autoclave
تمام، بعد هيك بقصبهم and dispense in appropriate
quantities sterilized بصّبهم في الأطباق، قلنا بنصبّ
من 15 ل 20 سم مكعب أو ملي لتر، A clean surface of
working area with a suitable disinfectant، بدي أعقّم
المنطقة اللي رح أشتغل عليها باستخدام disinfectant
اللي هو مادة بتعمل على قتل فقط الـ pathogenic bacteria
مش جميع أنواع الـ microorganisms، Clearly marked
deduplicate Petri dishes باستخدام الـ marker راح أكتب
على كلّ طبق التخفيف لإله، بيقول لي ممكن نستخدم
duplicate لكلّ تخفيف، مثلا للـ tube الأول كان تخفيفه
عشرة أس سالب اثنين، بقدر أستخدم له هاد طبقين، الطبق
الأول بحط عليه 100 μl، الطبق الثاني 100 μl،
أما الأثنين بحطهم في الـ incubator، بعد 24 ساعة بعد
الـ QnA في الأثنين، وبأخذ الـ average لإلهم، لو
كانت واقعة ضمن الـ range من 25 لـ 250 بعوّض في
القانون، الـ concentration بيساوي أنا على SVD، أو
ممكن أعمل duplicate لكل تخفيف، واحد بحطه بالتلاجة
والتاني بحطه بالـ incubator، ليش هي؟ مش هي الـ
interfering particles أو اللي إحنا بدنا نمشي عليها
بس بعمل طبق واحد لكل تخفيف بحطه في الـ incubator، و
بعد عدّ الـ colonies لو كانت واقعة ضمن الـ range بعوّض في
القانون، بالنسبة لـ dilution preparation of
dilutions هم بيحكوا لي بدي نحضر واحد و عشرة بيبتون
water diluent لكن إحنا راح نشتغل عليها في ما عملنا
normal saline 85 من 100% بقول لي to ensure truly
مشان أضمن أنه أخذ تعيين ممثل من الـ analytical unit
لازم أعمل agitation للـ sample unit until the
content are homogeneous لو كانت solid بحطها في الـ
blender لو كانت liquid بعملها mix If the sample
unit is solid لو كانت الـ sample unit عندي solid زي
مثلا طحين، لحمة، سلطة، شو بعمل؟ obtain the
analytical unit by taking a portion from several
locations within the sample unit راح أخد من كل
مكان، من فوق، من تحت، من الوسط، من الأطراف بيقول
لي prepare واحد لعشرة dilutions of food كيف بقدر
أحضر واحد لعشرة؟ ممكن باستخدام 25 جرام من الـ sample و
225 مل من الـ diluent أو ممكن 11 جرام من الـ sample
و 99 مل من الـ diluent أو 10 جرام sample و 90 مل من
الـ diluent بغض النظر عن الكميات بقدر أحضر تخفيف 1
ل 10 الـ slide اللي بعده هاي مش مهمة لكن المقصود
فيها إن إحنا بنبدأ بتخفيف 1 ل 10 و بدنا نمشي
على مضاعفة العشرة 1 ل 10، 1 ل 100، 1 ل 1000، وهكذا
Check the pH of the food suspension بيقول لي لازم
أنّه انحافظ على الـ pH للـ food بحيث أنّه تكون
واقعة من خمسة ونصف لسبعة فاصلة ستة طيب لو كان الـ pH
للـ food لما قستّه بالـ pH Meter كان عندي مثلا أربعة
أربعة يعني هاتش مالها acidic بدي أضيف عليها NaOH
بظن أضيف لعند ما يصل عندي ل الـ range الموجود هذا
هو الـ range بحيث أنّه يكون فيه الـ food متعادل لو كان
عندي الـ food الـ pH لإله ثمانية شو بعمل؟ بضيف HCl
بحيث أنّه ينزل الـ pH للـ food و يصير ضمن الـ range
prepare succeeding decimal dilution يعني بدي أعمل
serial dilution كذا تخفيف as required using a
separate sterile pipet for making H-transfer رح
أستخدم بيبت و أستخدم معاه tip معقم و رح آخد من كل
tube واحد مل للـ tube اللي بعده mix واحد مل وهكذا
Shake all dilutions immediately prior to making a
transfer يعني أنا كنت عمال بشتغل على أول tube
فعملت له mix روحت أخدت منه واحد مل وبعدين للـ tube
التاني واحد مل وهكذا فطول ما أنا هيك على الـ tube
الأول بدي أجي حاليا آخد 100 micro من أول تخفيف
أحطه على الطبق طبعا أنا أستنيت عليه فترة لعين ما
أخلص باقي الـ tubes معناه للكلام أنّه البكتيريا نسلت
تحتصار عندي التوزيع مش متساوي فلازم أعمل vortex
كمان مرة، mix بعمل mix وبعدين باخد 100 micro و
بأزرع على الطبق ليش؟ to ensure uniform
distribution of the microorganism present الشكل
هذا بيقولك كيف لما يكون في عندي أكتر من تخفيف مثلا
1 ل 10، 1 ل 100، 1 ل 1000، شو بعمل؟ باخد 100
microliter من كل .. من كل tube بحطه على الطبق
بزرعه بستنى عليه شوية بعدين بقلبه inverted
position upside down بعدين بحطه في الـ incubator 24
ساعة لمدة على .. على 37 بعد الـ colonies لاحظوا أن أول
tubeين كان عندي الـ colonies كتير كبيرة مليانة بدي أجي
أعدّها هلاحظ أنّه عددها already أكثر من 250 فالنتيجة
إليهم هتكون too numerous to count ما بقدر أستخدم
القانون عليهم الـ 2 بالتالي لما عدّوها 65 هي واقعة
ضمن الـ range من 25 إلى 250 وبالتالي بقدر أعوض في
القانون الـ 4 والخامس 6 colonies و 0 هدول بنسميهم
negative أو too few to count، TFTC ما بقدر أعوض في
القانون بدي أزرع حاليا لـ plating يعني بدي آخد من
الـ tube و أحط على الطبق agitate each dilution
bottle to resuspend material that may have settled
out during preparation برضه بروح أحط على الـ vortex
تاني لحتى آخد الـ microorganisms و أحطها على الـ plates لحتى
يصير uniform distribution of microorganism شو بعمل
بعد هي خلاص فزرعت بحطهم في الـ incubator لكن
inverted position مقلبين الغطايا بدها تكون للأسفل
Incubation temperature is dependent on the growth
temperature requirement of the target organism
بيقول لي درجة الحرارة والـ time أنا بتحكم فيهم
بأضبطهم حسب نوع البكتيريا اللي بدي أزرعها هل هي
psychrophilic محب لدرجة حرارة منخفضة mesophilic
معتدلة thermophilic عالية avoid a crowding or
excessive stacking of plates بدي أمنع أن يكون عندي
الأطباق فوق بعض بشكل كبير أو يكون في عندي ازدحام
في الـ incubator ليش؟ لأن هذا الشيء مش راح يسمح أنّه
بتوزيع منتظم للحرارة على كل الأطباق فبدي أراعي أنّه
ما تكون الأطباق مكدسة فوق بعض وأكتر من الـ tubes
أكتر من الـ plates بالنسبة اللي بيعدّ الـ colonies
count colonies promptly after the incubation بيجد
okay أنّه هي البكتيريا بتحتاج 24 ساعة خلاص خلصت الـ
24 ساعة مباشرة بروح بعد الـ colonies ما بسمح بوقت
إضافي if possible select plates with من 25 ل 250
colonies حتى بما فيها يعني الـ colonies اللي بتكون
pinpoint اللي صغيرة كتير زي رأس الدبوس هاي برضه
كمان بعدها إيه في plates contain colonies which
spread؟ بقول لي لو كان عندي الطبق فيه colonies موزع
بالتساوي أو بانتظام على طول الطبق يعني مش أن يكون
في عندي فيه جهة مكدس فيها الـ colonies جهة تانية وفاضية
لو كانت الـ colonies موزعة بالتساوي و بانتظام في جميع
الطبق شو بعمل Select representative portion of the
plate free from spreader if possible and count
the colonies in this area بقى شوف بقسم الـ .. بقسم
الـ plate عندي إلى أربع أرباع باخد بس ربع واحد بعيد
قديش فيه colonies وبالتالي بقدره في أربعة وهيك بصير
زي كإني عديت الـ colonies اللي في الطبق ككل The total
count of the entire plate is estimated by شو بعمل
multiplying the count بدي أضرب قداش عندي العدد في
المنطقة اللي أنا عديتها في أربعة على سبيل المثال
بقول لي لو طلع منك لو طلع بس 30 colony في ربع
واحد بدي في كل الطبق 30 في 4 بطلع 120
colony العدد هذا واقع ضمن الـ range
وبالتالي بطبق القانون differentiation of colonies
from interfering particles كيف بدي أميز هل هاي
اللي عندي colonies أو هل هي interfering particles
بيقول لي الـ food particles أو الـ interfering
particles زي مثلا اللحمة لما ضال في منها جزيئات مش
ذائبة أو مثلا الـ milk powder البودرة often
interfere with the enumeration of the colonies هيصير
فيه تداخل أو في لبس بين عدّ الـ colonies وعدّ
الـ interfering particles الكفة دي أتخلص منها عن
طريق by making one extra plate of each dilution
لكل تخفيف بحط له كمان طبق تاني وهذا الطبق التاني قلنا
بحطّه في التلاجة كـ control بشوف قداش طالع عندي شكل
قداش طالع عندي عدد الـ interfering particles وشكلها
وموقعها و بقارنها مع موقعها اللي في الطبق اللي في
الـ incubator Alternatively ممكن طريقة تانية After
incubation بعد ما أطلع الطبق من الـ incubator بدي
أجي أعدّ شو بعمل؟ قبل اللي أعدّ بحط 2 مل TTC
Triphenyl Tetrazolium Chloride المادة دي هي بحط
منها 2 مل على الطبق ككل و بوزعها على الطبق Gently
rock plate from side to side يعني بدي أحرك الطبق
لحتى إنّه هاي المادة تتوزع على كل الطبق اللي عندي
بعد هيك بخليها على الـ room temperature لمدة 3
ساعات حطيتها okay بحطها على الـ room temperature و
بقلبها بعد كده بدي أطلع على لون الـ colonies لو كان
لو كان لونها أحمر معناته هاي colony أو إنّه
بكتيريا لو ما تلوّنت معناته interfering particle أيش
بيخليها تتلوّن أنّه البكتيريا بتعمل reduction للـ TTC
بتحوّلها لحاجة اسمها Formazan وهذه اللي لونها أحمر
فبالتالي and aids in distinguishing the food
particles هتساعد إنّها تتميّز الـ food particles عن
الـ colonies لكن قلنا المشكلة اللي بتواجهني colonies
cannot be picked for isolation after this method
has been used ما بقدر أستخدم الـ colonies هاي اللي
تم معالجتها بالـ TTC لأنّها هتفقد بعض من خواصّها وما
راح تعطيني نتائج صحيحة recording result طبعا هدول
لما نرجع إن شاء الله على الجامعة هنعمل التقارير شو
بعمل؟ لو أنا مستخدمة طبقين لكل تخفيف والاتنين في
الـ incubator بروح أعدّ الـ colonies في الاتنين و باخد
الـ average ليهم بعوض في القانون لو كان العدد
واقع ضمن الـ range الـ concentration بيساوي N على S
في دي الـ N هي الـ number of colonies الـ S هي الـ
الـ volume اللي اتت دي، لازم تكون بالمل و هو الـ volume
اللي أخدته من الـ tube و حطيته على الـ plate و الـ D هو
الـ dilution الخاص بكل tube