اليوم هنشتغل فقط المرحلة الأولى هي إنه هيكون فيه
عينة water مش مخففة فـundiluted sample وراح أعمل
منها serial dilution لا تخفيف يعني عشرة أقصال
بواحد وعشرة أقصال باتنين راح أحط لكل تخفي فيما
فيهم العينة الأصلية هحط لهم خمس إتيوبات وكل إتيوب
فيه تسعة مل من ال media لـ broth و بعد هيك أعملهم
incubation و بقى أشوف هل فيه تربيتي أو لأالتests
is a method to estimate the concentration of
viable microorganism in sample يعني طريقة ال NPN
بستخدمها لحتى أكشف عن ال viable microorganism
الكائنات الحية يعني لو كانت البكتيريا ميتة هل راح
أعرف أستدل على وجودها؟ الجواب لأ، ميتة يعني مش راح
تتموم ما راح تعطي عقارة ولا راح تغير في رون الـ pH
indicator by means of replicate liquid growth
الgrowth in tin-fold dilutionsبعمل تخفيفات وبنمي
البكتيريا فيها باستخدام Media Ebroth متى باستعمل
طريقة الـ NPN باستخدمها it's particularly useful
with samples that contain particulate material لما
تكون عند العينات condensed sample عينا فيها
particles كمان باستخدمها في حالة and useful for
low concentration of organisms لما تكون العينةفيها
بكتيريا قليلة Low concentration خاصة في عينات الـ
liquid زي الملك والواتر Most probable number
analysis is a statistical method هي طريقة إحصائية
بتعتمد أن يكون فيه توزيع عشوائي للـ micro organism
في العينات Based on the random dispersion توزيع
عشوائي للـ micro organismلهيك ممكن إنه من
الخمستيوبات إيش يطلع فيها positive وإيش يطلع
negative لإنه واحد من اللي لما أاخده ممكن أول واحد
منه يكون فيه بكتيريا التاني إنه مثلا مايكون فيه
بكتيريا فهو بيكون باعتماد على التوزيع العشوائي لل
micro organism فيه العيناتIn this method, measured
volumes of water بروح أخد volumes محددة من عينتي
اللي هي ال water بروح أحطها في تيوبات is added to
a series of tube هاي التيوبات containing a liquid
indicator ال growth media يعني هيكون فيها media ال
growth فيها BH indicatorبدنا BH Indicator موجود في
الميديا لنشوف هذي البكتيريا عملت fermentation لأ
لكتوز أو لأ طيب، الـ media receiving one or more
indicator bacteria show growth and characteristic
color change لو العينة فيها indicator bacteria أو
indicator organism المقصود فيهايعني الكوليفاروم،
الفيك الكوليفاروم، الأشريشا كولاي والإنتيرو كوكاس
لو كانت موجودة، بالتالي هيصير فيها Lomo وكمان
هتغير من لون الـ BH Indicator لأن أحنا قلنا كيف
بقى أستدل على وجود البكتيريا إما من خلال الـ
turbidity لو ما كان فيها BH Indicator أو من خلال
الـ change in color لو كان فيها BH IndicatorColor
change is absent يعني مش هيصير تغيير في اللون متى
بتكون هذه الحالة in those receiving an inoculum of
water without indicator bacteria لو كانت عينات
الوطر مافيها indicator bacteria مافيها بكتيريا
بتعمل fermentation لالكتاز فبالتالي مش هيصير تغيير
في اللون للـ BH indicator
فقط الكائنات الحية اللي بقدر يعدها بطريقة الـ NPN
أو اللي بقدر أكشف على وجودها لإن الطول ما هي حية
معناته بتقدر أنها تعمل تربيت أو تعمل تغيير إيه كده
إذا في تجربة الميكروبيولوجيا البكتيريا في مجموعة
البريبيرد يمكن أن تجد كواس شين مرتبطin chains بقول
ليه ممكن أن البكتيريا تكون موجودة على شكل سلاسل
وهي ما بتنفك حتى لو عملت dilution لإلها not
separated لهيك ما بقدر أحكي أن الوحدة المستخدمة في
ال NBN هي coin forming unit per gram او مل انما
بحكي شو NBN coin forming unit او NBN growth unit
from the number and distribution of positive and
negative reaction the NPN of indicator organism in
the sample may be estimated by reference to
statistical tables يعني أنا قلت بدي أشتغل اليوم
فقط لأول مرحلة اللي هي الـ Pre-Sumptive Test روح
يكون عندي إيتيوبات فيهم growth media روح أشوف مين
بيصير فيها turbidity مثلا في العين الـundeluded
طلع عندي خمسةإن كلهم صار فيهم تغيير في اللون عشرة
أسالب واحد صار فيه أنه مثلا واحد تغيير في اللون
عشرة أسالب اتنين واحد برضه بروح أاخد الرقم هاد و
بروح على جدول و بشوف قداش ال concentration اللي له
فاليوم بدنا نزرع هنيجي تاني يوم أو بعد 48 ساعة
طبعا هذا الاشي باعتمد على الـ microorganism اللي
ببحث عنه هل ببحث على فيكال الكوليفارم زي الـ
Escherichia coli أو بابحث على الكوليفارم فإحنا
اليوم بدنا نبحث عن الـ Escherichia coli يعني راح
أعمل incubation اللي فيها أربعات، أربعة و ربعين و
نص سيليزيا سنة لمدت 24 ساعة هنيجي نشوف الأنابيب
طبعا احنا اليوم ما راح نستخدم الـmeconic broth ولا
الأل أستيرا لأن هم دول مش موجودين عندنافحنلجأ لـ
Nutrient Growth طبعاً هاي مافيها pH Indicator
فستدلع النمو من خلال الـ Turbidity هشوف مين اللي
عمل الـ Turbidity و بكتب عنده positive و بالنهاية
بشوف أكم من positive في كل تخفيف و بروح على جهة
دول و بشوف قداش ممكن يكون الـ concentration اللي
لهم فالـ NBN إلها تلات مراحل الـ Brain Sumptive أو
الـ Screening التانية هي الـ Confirm Test و التالت
الـ Completed Testأول مرحلة هي الـ Pre-Sumptive أو
الـ Skinny Test الهدف منها بتعمل detection أو
estimation للكوليفورم في عينت الواتر for
estimation of coliform لو بدي أبحث عن الكوليفورم
فأنا عارفة في ميزة للكوليفورم أنه بيعمل
fermentation للـ Lactose معناته، الـmedium of
broth اللي عندي ضروري يكون فيها سكر الـ Lactose
Lactose containing broth medium is usedبالأمثل على
الـ Broth media اللي فيها اللكتوز إلما Conkey
Broth هذه فيها BH Indicator اسمه Bromocresol
Purple أو ممكن أستخدم الـ L-St-Lyral Sulfate
Tryptose الـ Broth طيب، إحنا قولنا إن الكوليفور
بتعمل fermentation لسكر اللكتوز، بتطلع عنه acid
weed gasطيب، لو كان فيه pH Indicator باللاحظ أنه
صار fermentation من خلال تغيير في لون الـ pH
Indicator طيب، الـ Gas كيف بدي ألاحظه؟ من خلال
بستخدم الـ Inverted Dermatope يعني بحط الـ
Dermatope بالمقلوب وبالتالي بعمله Incubation
والغاز إذا كان موجود حين حجز في الـ Dermatope The
color of media change into yellow لما يتغير اللون
إلى لون أصبر واللاحظ أنه فيه Gas في الـ Dermatope
معناته البكتيريا highبنفترض إنها تكون كوليفار لكن
مش متأكدة لإن هاي Scenic Test number of positive
tubes are counted بقى أشوف أكام من التيوب عندى
positive أكام من التيوب صار فيه تربيتي اتغير فيه
اللون و بعد هيك بروح أشوف ال NPN المستمرة من ال
number للمية من ال water لعينتي من خلال chart معين
أو في tables فيه جداول بقى أشوف من خلالها المرحلة
التانية هي ال confirmed testنلجأ للـ confirmed
test لأن في بعض لصبار forming بكتيريا بإمكانها
تنمو على الـ pre-sumptive test أو الـ pre-sumptive
media وبتعطي false positive يعني لا هي كوليفورم
ولا هي أشريشا كولاي مع ذلك بتعطيني positiveresult
فبتلون ال media و بتعطي لون أصفر الحل أنه لازم
أعمل confirmed test ليش بأعملهم علشان أتأكد من
البكتيريا هل هي أشريشة coli أو لا، هل هي coliform
أو لا، شو بعمل؟التيوبات اللي طلعت معي positive في
الـ pre-sumptive test بروح بزرع البكتيريا منها على
Endo-agar أو EMB بعد هيك بعمل incubation حسب هل
بدوي على الـ total coliform أو على الاشريشا كولاي
لإن احنا قلنا ال temperature والterminal
incubation بختلفوا حسب نوع ال micro organism لو
طلع اللون أخضر معناته اشريشا كولاي لو طلع من درجات
ال pink to purple معناته had coliform
Some spore-forming bacteria give false positive
tests in a presumptive test لهيك وروح نرجع لـ
Confirm Test بدي أشوف هل هي كوليفورم، هل هي
فيكالكوليفورم، هل هي أشريشيا كولاي أو لأ For this
positive presumptive test are inoculated in
selective media أروح أستخدم ميديا selective EMB أو
Endoagar بعملهم incubation حسب ال temperature قلنا
Presence of typical colonies ع درجة حرق 37
confirmed positive coliform ع درجة حرق 44.5 بتأكد
على إن هاي هي Escherichia coli بالنسبة لأ ال
completed test بروح من ال colonies اللي طلعت معي
على الIndo agar أو ال EMB بروح أاخد منهم بعمل sub
culture بروح أحطها في تلت إيتيوبات و بعدين بعملهم
incubationفبدي أدور على الإشريشة كولاي على درجة
حرق 44 ونص الإشريشة كولاي هتعمل fermentation و
هيطلع معها جاز فبلاحظ الجاز على درجة حرق 44 ونص
بناته هاي إشريشة كولاي قولنا بدي أحطهم في تلت
إيتيوبات أول إيتيوب بدي يكون تلاتة مل لكتوز بروث
أو BGLB بروث بعدين بروح أحط على slant أجار، slant
بدي يكون مائلالهدف منه «for a gram stain» أشتغل
التالتة بروح أحط فيه الـ «Trypton water» هذا يعتبر
شرط الميديا مشان أشتغل عليها الـ biochemical tests
و الفحوصات التعريفية لـ ال micro organism مثلا فحص
للـ Indoleهيبت بيفسر للمرحلة الأولى اللي هي الـ
Brace Sumptive أو الـ Skinneck Test هيكون فيه عند
العينة الأصلية Undiluted Sample و بعدين اعملنا
منها تخفيف 1 ل 10 و 1 ل 100 لكل تخفيف لإضافة للـ
Undiluted Sample هيكون لخمس إيتيوبات فيهم تسعة مل
من الـ Broth Media فيها Lactose وكمان حطوا فيها BH
Indicator اسمه PhenolRed لو البكتيريا بتعمل
fermentation لإلكتوز هتغير لون البيئة كده ان دكاتر
و هيصير لونها أصفر بعد هيك بعد فترة ال incubation
هنشوف كده طلع معي لونهم أصفر و بنروح للجدول و
بنشوف كده ال most probable number if one
replicated tube of media receive a dilution of the
sample that contains a bacteria cell لو كان فيه
بكتيريا في الثيوب هذا فبالتاليthat tube will turn
turbid حيصير فيه turbidity فبأستدل على وجود
البكتيريا من خلال الـ turbidity its neighbor an
identical replicate لو أخدت نفس الـ volume من نفس
العينة وروحت زراعته على الـ tube تاني may not
receive any bacteria ممكن مايكن فيها بكتيريا
وبالتالي مارح يظهر turbidity ليش قلنا هاد؟ لأنه
بيكون فيه توزيع random توزيع عشوائي للـالبكتيريا
في العينة this information is particularly useful
at low numbers of organism فهذه الطريقة بتفيد حتى
لو كانت البكتيريا كتير قليلة عندى انه ممكن يكون
اكتر من اتيوب فبالتالي لو ما طلع في الأول ممكن
يطلع في التانيبالنسبة للـ Confidence Interval اللي
بدي .. بدي ياكم تفهموه من هذا إنه في طريقة الـ NPN
بأكون متأكدة أو بأثبت وجود البكتيريا أو عدمه بنسبة
95% يعني بنكون واثقين إنه هل هي coliform أو لأ، هل
هي Escherichia coli أو لأ بنسبة 95% لما أستخدم
طريقة الـ NPNالجدول هاد بيوضح الـ advantages and
disadvantages لطريقة ال NBN بالنسبالها ال
advantage relatively simple and sensitive هي طريقة
بسيطة ما بتحتاج إلى أجهزة معقدة بالإضافة إليها
sensitive عندها القدرة تكشف عن low concentration
of bacteria in samplecan count a specific type in
the presence of others يعني بيكون موجود أكتر من
نوع من البكتيريا وأنا بدي أكشف عن الكوليفورم
فبأجيب ميديا خاصة فيها lactose فبأكشف عن هالنوع
بالذات عن طريقة اللي هي بتعمل fermentation أو لأ
Can use large sample volumes احنا قلنا على الأقل
Meat Meal ممكن أنها تكون أكتر من هيك الـ
Disadvantage، time-consuming and labor intensive
يعني أنها تستغرق وقت وجهد الشغلة التانية، require
large volumes of glassware فيها زجاجيات، يعني
بتحتاج إلى اتيوبات كتيرة لكل تخفيف تحتاج من 3 إلى
5 اتيوبات بالإضافة كمان لأ لتيوبات اللي بنعملهم لأ
التخفيفاتdoesn't give the real value هي ما بتعطيني
التركيز الأكيد هي بتعطيني ال most probable number
العادل الأكثر احتمالا doesn't give isolated
colonialism من خلالها ما بحصل على isolated
colonialism نيجي لل summaryThe basic concept للـ
MPN method إنه حيصير فيه تخفيف للـ sample to such
a degree that a niculum in that tubes بعمل تخفيفات
و بعد هيك من كل تخفيف راح أخد و راح أزرع على اتيوب
في broth media ممكن هاي الاتيوبات sometimes but
not always contain viable organism لو كان فيها
بكتيريا حية معناته هي البكتيريا هتغير لون ال media
لو مافيها بكتيريا حية not viable معناته مش هيصير
أي تغييربعض الـ replicates و الـ dilution series
هذا سيكون نتيجة لإجراء عدد مؤكد من عدد الـ most
probable number هي ما بتعطيني exact value قيمة
محددة لما بتعطيني عدد ممكن يكون أكثر احتمالThe
outcome اللي هو الـ number of nucleate producing a
growth at each dilution العدد اللي بحصل عليه
بالنهاية و ال employ رح يعطينا هو بمثابة مؤشر
لأستمتع لل original undiluted concentration of
bacteria مؤشر لقداش كمية البكتيريا في العيدة اللي
مش مخففة estimation not exact valuewhile this
method is most commonly used طبعا الطريقة هي الـ
NPN بيستخدموها في حالة الـ personal product في ال
medical device في ال quality control اللي بيشوفوا
له ال water جودة المياه بالاضافة كمان it has
significant potential for other applications إيها
كمان في applications تانية ممكن تكون مفيدة الطريقة
هذه وبهيك بيكون خلصنا المعمل