بكمل في الـ procedure Handling of Sample Unit زي
ما قلنا في كل مرة الأساس العينة بدها تكون على الـ
room temperature إلا إذا كانت العينة من الثلاجة، بدي
أحافظ عليها من الثلاجة، إذا كانت من المجمدة، بدي أحافظ
عليها من المجمدة طيب، لو بدي أشتغل على عينة مجمدة،
المفترض أنه أستناها عند إذابتها، بدي أعملها
thawing الـ thawing بيكون أول شيء بقى نزلها على
الـ refrigerator، على الثلاجة طيب لو مستعجلة عليها
و بدي أشتغل عليها بسرعة بدي أسرع عملية ال
«thawing» أنه بحطها في ال «water bath» تحت «time
and temperature conditions which prevent microbial
growth or death»درجة الحرارة والـ Time ما بيسمحوا
أن يزيد أو يقلل عدد الـ microorganism اللي
بالعينة فبحطها في الـ water bath درجة ما تزيد عن
45 و الـ Time ما يزيد عن ربع ساعة Analyze sample
unit as soon as possible المفترض أنه مجرد ما تصل
العينة بدي أشتغل عليها مباشرة preparation for
analysis إيش هي التحضيرات اللي بعملها من ناحية أو
إيش بدي أجهز ال media تعتيفي الحاجات اللي بدنا
نشتغل عليها ميديا إبراط موديوفايد اتريبتك سويبروت ود
نوفو بيوسين أو ممكن أستخدم الـ AEP كمان بدي أعقم
المكان اللي بدي أشتغل عليه باستخدام الـ suitable
disinfectantبالنسبة للـ preparation للـ sample
العينة لو كانت liquid ما عليّ إلا أن أعملها
agitation لأن هيك بتصير homogeneous طيب لو كانت
solid معناته بدي آخذ من أكثر من مكان، من فوق أو من
تحت، من الجانب، من الوسط، وبعدين بحط عليها محلول
معقم و بعملها باستخدام الـ stomacher أو الـ
blender وهيك و بتحول من solid إلى liquid و
بيصير homogeneousIt's recommended that a composite
contain not more than five analytical units أحنا
قلنا أنه ال lot العينة الكلية بدي أحطها في
containers ومنها بدي آخذ ال sample unit فال
containers هاي مش لازم منها تزيد عن خمسة بعد هيك
بالنسبة للسامبل بدي أعمل تخفيف واحد لعشرة كيف بعمل
تخفيف واحد لعشرة باخد خمسة وعشرين جرام أو مل من
العينة بتاعتي وبحطها في مية وخمسة وعشرين مل من
ال enrichment ال broth والتي تكون مثلًا ال modified
tryptic soy broth أو ال EEP بعد هيك باستخدام ال
stomacher أو ال blenderمتابلجة لـ Secondary
Enrichment بروث بدأت مباشرة في الـ EEB يجب أن يكون
فعّله عندما يكون هناك عدد كبير من البكتيريا التي
تقاتل العميل في المجموعة
بنجألها لما يكون فيه high microbial load في العينة
عدد كبير من الـ microorganism ممكن هي تيجي و تنافس
الإشارة شكولاي O15707 على الـ nutrient فتيجي هي و
تستولي على الـ nutrient وبالتالي الإشارة شكولاي
بتضعف عندها الظروف وبالتالي مش هتنموSome spices
such as onion and garlic powder are antimicrobial
in nature معروف أنه التوابل البصل الثوم عندها
antimicrobial effect يعني زي تأثير ال antibiotic
على البكتيريا ممكن أنها تقلل من عدد ال micro
organism when analyzing spices or a product
containing large amount of spices لما بدي أتعامل
مع عينة التوابل أو عينة فيها كميات كبيرة من
التوابل اللي بدي أعمله بدي أضيف نصف المية بوتاسيوم
كبريتات، شو بتعمل هاي؟ بتقلل من الـ Antimicrobial
effect لـ spices، فبروح أضيف النصف المية على ال
media اللي عندي، Modified, triptoxoic broth قبل
اللي أحطهم بال Autoclave، يعني بجهز ال media lip
broth بعدين بحط فيها نصف المية بوتاسيوم كبريتات
بداخلهم على الـ autoclave بتعقّمه بعد ما يتعقّم
بروح أخد 25 جرام أو مل من العينة وبحطها في ال media
اللي فيها نصف المية بوتاسيوم كبريتات Garlic
especially effects Escherichia coli O157therefore
garlic or garlic containing product need to be
diluted واحد لمية معناته لما بتكون عندي العينات هي
garlic بدي أعمل secondary enrichment فبصير التخفيف
واحد لمية كمان ممكن يعني لو لو لاحظت أنه مافي نمو
ورحت عملت من واحد لمية وبعدين رحت زرعتو كملت
بالـ procedure عادي لقيت مافي نمو معناته فيه تأثير
للـ garlic على البكتيريا بروح أخفف من تأثير الـ
garlic الـ antimicrobial effect للـ garlic بروح
أعمل تخفيفات أكثر، واحد لألف، واحد لعشر آلاف other
spices also may need to be analyzed using larger
dilution ممكن كمان أنه بحتاج أعمل تخفيفات أكثر
after the addition of sample to the broth بحتاج
أن أضبط الـ pH ليش؟ لأنه قلت بدي يكون ال food
متعادل لإنه أي تغيير سواء حمضي أو basic بدي فقط
يكون ناتج من البكتيريا أو يأثر على ال pH indicator
اللي عندي في ال media فكيف بدي أضبط ال pH باستخدام
ال NaOH والHCl حمضي أو basic؟كمان و أثناء شغلي على
العينة بدي أمشي معيّ controlات positive and
negative control should be set up at the same time
في نفس الوقت اللي أنا بشتغل فيه عينتي، بدي أعمل ال
controlات بعمل incubation لعينة وال controlات لمدة
24 ساعة على درجة حرارة 42 Celsiuseither screen the
enrichment growth for E.coli O157 by using rapid
test في بيكون فحوصات زي فحص الحمل أنه بس بدي أحط
العينة في مكان للـ sample وبعدين بقى ألاحظ هل
موجود E.coli أو لا النتيجة طبعًا هي بتكون سريعة
فبظهر أنه يعني في خط معناته في موجود E.coli متى
بيستدعي الأمر أنه أعمل secondary enrichment بس في
ميديا الـ EEPThis step must be used when a rabbit
test has identified the presence of Escherichia
coli O157 يعني أنا لما حطيت عينتي في ال media
لبروث اللي عندي ورحت حطيت جزء من هاي ال media مع
البروث حطيتها في ال rabbit test في الكاسيت اللي هو
اللي مش بهتبع الحمل اللي ال pregnancy test لحظة إنه
في وجود الإشريشية KOLI 015787 روحت بعد هيك فكملت
الـ procedure وعملتها فعملت بعد هيك الـ selective
culture agar وعملت الـ biochemical أبدًا ما كان في
عندي نمو مافي نمو للإشريشية KOLI مع أنه كان موجود
في الـ rapid test معناته بأفهم تلقائيًا أنه
العينات فيها تأثير Anti-microbial effect راح أثر
على الـ Escherichia coli أو ممكن يكون فيه عدد كبير
من البكتيريا other than Escherichia coli O157 عندها
في العينة راحت هي أخذت الـ nutrient وبالتالي الـ
O157 أشتفت ما نمت يعني طلع معي positive في ال
rapid test but it was not isolated from the
primary enrichment broth اللي هي لماذا لم أعمل أخد
من ال primary و أزرع على ال selective agar على
مثلًا الأسماك بلاحظ ما فيه نمو فالاشريشيا IO157 may
be difficult to isolate from samples with high ACC
levels ACC اللي هي aerobic calorie count أو
بنسميها total viable count يعني لما يكون فيه عدد
كبير من microorganism other than الشيريشاكولاي
O157007 After agitation of the enrichment broth،
شو بعمل؟ هي عندي ال primary، بروح بعمل agitation،
بآخذ 1 مل من ال primary، بروح أزرعه في تسعة مل من
ال EEP طبعًا هاي بتكون selectiveفقط بتنمي لإشريشك
و IO157H7 وبتعمل inhibition لباقي الأنواع بعد هيك
بروح أعملها incubation على درجة حرارة 35 أو 37 لمدة
24 ساعة وبعدين follow confirmation steps for
typical kidneys أنه بدي أعمل ال biochemical و ال
confirmatory test الـ Selective Isolation المقصود
فيها اللي هي خطوة الـ Selective Culture Agar يعني
بدي آخذ و أزرع على أجار بلاي ال dilution of each
enrichment broth يعني لو أنا كنت عاملة ال primary
enrichment ما كان في داعي أن أعمل ال secondary
فبروح بعمل تخفيفات هي قلنا ال primary تخفيف واحد
لعشرة بروح بعمل إيتيوباتبعمل تخفيف واحد ل 100 و
واحد ل 1000 و واحد ل 10 ألف و واحد ل 100 ألف كيف؟
بروح أخد من عندي اللي بالفلوسك واحد مل بحطه على
تسعة مل في التيوب بعدين صار تخفيفه هيك عشر قصارى
باتنين بروح أخد واحد مل منه على التيوب اللي بعده و
هكذا هيك صار عندي serial dilution من كل التيوب
بروح أخد 100 مايكرون وبزرع على البلات طيب بلاي دي
ليوشنز of each enrichment broth onto modified
hemorrhagic coli and sorbitol مكونكي أجاري بلاد
بأزرع في الـ media high أو في الـ media التانية
بعملهم incubation على درجة حرارة 42 لمدة 24 ساعة
due to the increased selectivity of sorbitol
ملاحظين أن الـ media sorbitol مكونكي فيها
selectivity أعلى من الـ hemorrhagic coli selectivity
أعلى يعني فقط بتنمي الإشريكية الكولاي O157H7 وبتعمل
inhibition لباقي الأنواع فرصة إنه ينمو شغلات تانية
و بتعطي لهم colorless هاي بتكون قليلة جدا لما
أستحضر الـ media تحت الـاسمك لهيك الـ count may be
one log less than on modified hemorrhagic coli
هلاحظ العدد اللي راح يطلع معي colorless هيكون قليل
لما أستخدم ميدة الأسماك لكن هيكون أكثر في الـ
hemorrhagic coli ليش أكثر في الـ hemorrhagic coli
لأن الـ selectivity فيها أقل on the modified
hemorrhagic coli typical الإشريكية coli O157H7 كونه
نزق كبير colorless بدي تكتبوا كلمة blue تكتب بدلها
colorless لاحظوا أن الإشريكية كولاي O157 مابتعمل
fermentation لسكر السوربيتول الموجود في الـ
hemorrhagic كولاي فلون الكوليس بدي يكون colorless
نفس الأشياء على الصوربيتول مكونكي لاحظوا أن
الإشريكية اكولاي O157H7-colon is a beer colorless
أو ممكن تاخد بير دا tint of the media ممكن تاخد
لون الـ media نفسه or a gray to pink with smoky
centers Other Serovars of Escherichia coli
including O157 not H7 Serovar يعني Serotype
Serotypes غير Escherichia coli O157 H7 هتاخد اللون
الأصفر على الـ Modified Hemorrhagic coli ليش أخدت
اللون الأصفر؟ حسب الـ pH Indicator اللي فيها
فلأنها بتعمل fermentation لسكر السوربيتول فبتغير
لون الكولونيز إلى لون أصفر أما الشريشة كولاي لما
تعمل fermentation لسكر السوربيتول في الـ media
سوربيتول ماكنكي بتعطي لون أحمر some of these
sorbitol positive colonists may be pathogenic also
مش فقط الإشريكية Coli O157H7 هي اللي بتكون
pathogenic ممكن كمان أنواع تانية sorbitol positive
وبرضه بتكون pathogenic
Use the purified colonies and continue
confirmation steps نفس الشيء بدي أكمل الـ
biochemical و بدي أكمل الـ confirmatory بأكملهم على
مين بالظبط؟ على الـ colonies اللي بتطلع لونها
colorless في حالة الـ اسمك أو في حالة الـ modified
hemorrhagic coli Do a gram stain طيب الشريشة coli
O157H7 هتكون بالجرام stain red لأنها جرام negative
بستخدم Rapid Identification Kits confirm isolate as
an O157 باستخدام الـ latex agglutination kits برضه
راح أعمل الـ invic و باستخدم اليوريا slant اليوريا
slant هذا فحص أنه بيدور على الـ .. بيدور هل الـ
organism عنده يورياز أو لا لو فيه يورياز معناته
هتكسر اليوريا هتطلع أمونيا الأمونيا بترفع الـ pH
معناته بيغير لون الـ media من لون أصفر إلى لون pink
Complete Serological Testing باستخدام O157
Antisera و O87 Antisera بعد هيك لما أعزلها بدي
أعملها Resuscitation بدي أعملها NH بروح أحطها في
Media Growth من نازي Growth أو ممكن أحطها في
Motility Agar أكثر من مرة على الأقل إنها تكون ثلاث
مرات الهدف إنها بتعمل الـ Resuscitation بتعمل NH
إلها نيجي على المخطط HAD لو بأدور على أشريشة Koli
O157H7 فالتسلسل بدي يكون أول شيء بدي أزرع على
الأسماك الـCT هدول اللي بالأول الـC هي اختصار
لـCefexime هي antibiotic والـT لـTeluride كـ
selective agent زرعت عليه ولو كانت Sorbitol fermenter
معناته خلاص بدي أكس عليها أنا high ما بتعني ليه
لأنه أنا عارف الإشريكية كلها O157H7 ما بتعمل
fermentation فلو كان لون الكولونيز pink أو red معناته
مش high طلبي طيب لو كانت non-sorbitol fermenter
يعني لون الكولونيز بيكون colorless لسه أنا هيك مش
متأكدة بحاجة إنه أعمل فحوصات تأكيدية أكثر زي مثلا الـ
agglutination test أنه بيكون في عندي Anti O157 و
Anti H7
لو طلع negative ما عندها O157 ولي عندها H7 معناته
هذه مش هي الشريشة كلها O157 وH7 فبتخلص منها خلاص
discard لو طلع positive طلع عندها O157 وH7 برضه
بحاجة أتأكد في فحوصات تأكيدية أكثر زي الـ biochemical
test كمان بقدر أنه أرسلها ل الـ reference
laboratory to confirm الـ ID إلها مثلا أنه الـ gene
typing و الـ phage typing