بسم الله الرحمن الرحيم والصلاة والسلام على أشرف
المرسلين سيدنا محمد وعلى آله وصحبه أجمعين، طلبتنا
الأكارم، نرجو من الله الكريم أن تكونوا جميعا بخير
وبصحة جيدة، اليوم سوف نستكمل ما تقطع من شرح
الرابع، حيث تحدثنا في المحاضرات السابقة عن القَالية
والنظام المتبع من أجل تحفيز المبيض للسيدة التي
تخضع لعمليات التلقيح الصناعي أو الزراعة من أجل
الحصول على أكبر عدد من البويضات الناضجة وذات
الجودة العالية، وقُسّمت هذه الأنظمة المستخدمة إلى
الـ Agonist Protocol والـ Antagonist Protocol. الـ Agonist
Protocol على سبيل المثال قُسّم إلى Ultra Short و
Short و Long، والـ Antagonist Protocol قُسّم إلى One
Dose أو Single Dose أو Multi Dose. نادي بالنسبة إلى
ما تحدثنا عنه في المحاضرة السابقة، ثم انتقلنا
للتحدث عن حالة مرضية تسمى Hyperovarian Stimulation
Syndrome والتي تحدث عند بعض السيدات بسبب الإفراط
في عملية إعطاء الأدوية التي تعمل على تحفيز المبيض
مما يؤدي إلى إنتاج بويضات غير ناضجة أو الوصول إلى
فوليكل ناضج تحتوي على fluid بدون أي mature oocyte.
اليوم سوف نتكلم عن المرحلة الثانية من مراحل تحضير
السيدة، فبعد إعطاء السيدة هرمون الـ HCG لـ Human
Chronic Gynadotropin الذي يعمل عمل الـLH من أجل
عمل ovulation، يجب أن ننتقل وننتقل إلى نقطة جديدة
اسمها أو oocyte pick up بمعنى
آخر عملية الحصاد، عملية الـ harvest، بعد ما تم تحفيز
المبيض ووصل الفوليكل لعدد معين وبعدد مناسب إلى
قطر مناسب، أكبر من أو يساوي 18 ملي متر، معناه إن
هذه الفوليكل تحتوي على بويضة ناضجة تكون صالحة
للتلقيح الصناعي إذا كانت متوقفة في الـ Metaphase 2
Metaphase التاني، يعني الـ Metaphase الخاص بالقسم
الميوزي الثاني، والذي يدل على هذا الأمر وجود الـ
Ferrous Polar Body، ننتقل إلى مرحلة جديدة وهي مرحلة
الـ Collection أو الـ Oocyte Retrieval أو الـ Ovum
Pick Up، بمعنى آخر إن كل follicle وصلت إلى الـ
maturation stage، المفروض تحتوي على بويضة ناضجة،
المفروض بعد إعطاء الكورونادوتروبين administration
نستطيع هذه الـ follicle أن تقوم بعملية ovulation.
ليه بتضبط بعد الكورونادوتروبين؟ لأن هذا الهرمون
مسؤول عن عمل الـ LH أو عمله يحاكي عمل الـ LH، وهو
عبارة عن عملية الـ ovulation and oocyte pickup is
performed approximately 36 hours later by
ultrasound transvaginal aspiration. بمعنى آخر إن
عملية جمع البويضات تحدث بعد 36 ساعة من إعطاء إبرة
التفجير اللي بنسميها بالوضع العام، بإبرة التفجير أو
sheregon، يعني إبرة التفجير، إبرة الشيرجون، وهي عبارة
عن إبرة تحتوي على كورونات جونادوتروبين، هرمون طبعاً،
عملية بتصير، عملية الـ collection عن طريق ال
aspiration، باستخدام needle معينة، بجوج معينة، تدخل
من خلال ما يُعرف باسم الـ Transvaginal aspiration.
هذه العملية ككل، في لحظة عمل الـ Oocyte Collection
لازم نعمل Clearing للفاجينة بالـ Normal Saline
بدون استخدام أي مطهر، على سبيل المثال الـ Betadine
لا يمكن ولا ينصح باستخدامه كنوع من أنواع المطهرات
قبل عملية الـ Egg Collection، لأنه very toxic، وممكن
يؤثر على الـ egg بشكل سلبي وبشكل غير مرغوب فيه.
عملية جمع البويضات تسمى الـ oocyte pick up أو الـ
oocyte harvest أو harvest، the harvesting is
carried out using the aspiration unit composed of
vacuum pump، A collection tube connected to 70 gauge
needle and collection test tube، يعني الوحدة
المسؤولة عن عملية جمع البويضات تتكون من ثلاثة مكونات
أساسية، المكون الأول هو الـ vacuum pump، مضخة تعتمد
على الـ suction، سحب الأوعية، والشغلة الثانية وسحب الـ
fluid، الشغلة الثانية الـ collection tube متصلة
بنيدل الجوج تبعها 17، بالإضافة إلى collection test
tube، وهي الـ test tube التي تجمع بها البويضات، هذه
عبارة عن الـ oocyte collection unit، ثلاثة مكونات
vacuum pump، collection tube متصلة بالـ جوج نيدل 17، و
collection test tube. الـ fluid الموجود داخل الـ
follicle يجب أن يُسحب كله، ويجب أن يُسحب من كل
follicle وصلت إلى 18 mm على الأقل، سواء كان في الـ
ovary اليمين أو في الـ ovary اليسار، فبالتالي أنا أسحب
كل fluid الموجود، معناه إن أنا بسحب الـ fluid مع ال
oocyte، سواء كانت mature أو immature، لأن ال
immature في خارج جسم الإنسان لها استخدامات شتى بعد
كده ببدأ أعمل examination للـ fluid اللي جمعته في ال
test tube علشان أشوف كم عدد البويضات الموجودة، و
أبدأ أعمل collection لهذه البويضات، وأنقلها من
هذا الـ fluid إلى a new media اللي اسمها maturation
media أو IVF media. During the collection يجب أن
يستخدم ضغط يقدر على أقصى حد مائة وعشرين ميلي متر
زئبقي، هذا الضغط الموصى به خلال عملية الجمع وإلا
زيادة الضغط بيعمل rupture في الـ follicle، وهذا شيء
غير مطلوب، to avoid the risk of damage of oocyte
such as stripping the cumulus cell or the zona
plucida، بمعنى آخر إنه مهم جداً أستخدم ضغط يقدر
بـ 120 ميلي متر ذئبقي خلال عملية الجمع، ما أزيد هذا
الضغط، لأن زيادته ممكن تؤثر على الـ oocyte بشكل سلبي
وتدمرها أو تدمر الـ cumulus الموجودة حوالي ال
oocyte أو تدمر الـ zona pellucida، ودمرت
الـ zona pellucida يعني أنا فقط الـ cytoplasm والمادة
النووية، once the oocyte are collected they are
placed or put in culture plate with neutron media
and then placed into incubator. بمجرد ما أحصل على
الـ oocyte، الـ fluid اللي جمعته من الـ follicle و
ابتدأ أعمل examination تحت الـ inverted microscope
وأجمع البويضات، هذه البويضات بأخذها بـ sterile
dropper وبنقلها على طبق يحتوي على قطرات من ال
media المغذية، وبنقل هذا الطبق وبضعه في ال
incubator. بقولي ببساطة جداً، هذه العملية كلها تحدث
عملية الـ oocyte collection تحت تخدير موضعي أو تخدير
كلي ولكن خفيف لفترة زمنية قصيرة، الفترة الزمنية
المفروض تاخدها العملية كلها، عملية الـ egg
collection والـ fluid aspiration من 10 إلى 15
دقيقة، والطبيب الشاطر ما بيطلع blood في الـ fluid
المسحوب من الـ follicle. Therefore, during a system
reproductive technology procedure, cumulus cells
surrounding the oocyte should be removed to
improve oocyte evaluation and manipulation. هنعرف
إيش يعني cumulus cell؟ واتكلمنا عنها، cumulus cell
فيما سبق إنه في خلايا خفيفة موجودة حول الـ oocyte
تسمى cumulus cell، هذه الـ cumulus cell لازم أخفف
عددها بشكل كبير جداً أو أزيلها علشان يسهل عملية
evaluation للـ oocyte وأحدد هل هي mature ولا
immature ويسهل عملية الـ manipulation، وما المقصود
فيها الـ injection، مهم جداً أعرّي الخلية، أخفف عدد الـ
Cumulus Cell اللي حوالها، أزيل الـ Cumulus Cell
اللي حوالها. بعض الأحيان بيكون عندي بويضات أو بيكون
عندي فولكل وصلت للـ 18 مليمتر، ولكن البويضات لم
تصل إلى درجة النضوج، فبالتالي في هذه الحالة أعملها
maturation outside، in vitro maturation، تحت مصطلح
oocyte maturation في الـ clinical IVF laboratories.
التكنولوجيست اللي بيشتغلوا في هذا المجال بيميلوا
إلى استغلال البويضات الغير ناضجة وإنضاجها في
المختبر، ثم استخدامها في عملية الحَقْن من أجل زيادة
عدد البويضات المحقونة مما يؤدي لزيادة معدل الحقن أو
معدل الـ fertilization. وخدوا بالكم، بعض البويضات اللي
بالشكل هذا بتنجح وبتعطيني embryo، وبعضها لا ينجح
ولا يعطي embryo، في بعض البويضات في بتكون في مرحلة
الـ GV وهي التي تسمى germinal vesicle، وفي مرحلة ال
M1 وهي القسم الميوزي الأول، وفي الـ M2 القسم الميوزي
الثاني. فبالتالي، myotic maturation actually is a
continuous process and some oocyte aspirated from
follicle of various size would be expected to be
intermediate stage of maturation، يعني في بعض
الأحيان بيصير في عندي بعض الـ follicle تحتوي على
بويضات، أنا بسحب هذه الـ fluid وبما فيها من بويضات
ولكنّ بلاج البويضات غير ناضجة أو وقفت في أحد ال
stages الذي يُعتبر intermediate stage خلال عملية ال
maturation. من أشهر هذه البويضات زي ما حكينا هي ال
GV من أشهر هذه البوايضات التي تُعتبر إما pure
oocyte هي الـ GV وهي الـ germinal vesicle و الـ
metaphase I إذن أنا عندي أربع .. ثلاث أقسام
للبوايضة ممكن أحصل عليها إما GV أو M1 أو M2 M2
معناه إن البويضة وقفت في انقسام الميوز الثاني في
الـ Stage Metaphase فهي صالحة للحقن الـ GV الـ
Germinal Vesicle و الـ M1 يعني انقسام الميوز الأول
في الـ Metaphase الأول أو انقسام الميوز الأول
معناه هذه البويضات إما pure oocyte تكون غير صالحة
للحقن إلا بعض بعد الإنضاج ومش كلهم بيصلوا للـ level
الخاص بالـ maturation break down of germinal
vesicle indicates the continuance of meiosis and
ejection of the first polar body indicates
complete the first meiotic division in human
oocyte عشان أقول والله الخلية أو الويضة التي
سُحِبت وهي في مرحلة الـ GV الـ germinal vesicle لازم
أوضعها في ظروف تشبه الظروف الموجودة داخل الـ Ovary
الخاصة بالسيدة يعني في ظروف شبه طبيعية في media
تحاكي الظروف التي تعيش فيها البوايضة عشان أسمح لها
بالنضوج والدليل على نضوجها أو تحويلها من GV إلى
مثلا M2 تكون عند إذن صالحة للحقل أنه يزيد حجمها
وتقضف الـ first polar body الخاص بها للخارج فبتطيني
خلية أو بويضة اسمها بويضة ناضجة في مرحلة الـ M2 عند
هذا اللحظة أو عند تلك اللحظة تكون صالحة للإخصاب
إذن ثلاث حالات للبويضة تلخيص الحدث GV M1 M2 هذه
حالات البويضة التي يمكن أن نراها الـ M2 تكون هي
الوحيدة الصالحة لعملية الإخصاب الـ GV هي عبارة عن
خلية غير ناضجة والـ M1 خلية غير ناضجة أيضًا يمكن
أن تنضج في المختبر صورة توضح الكلام اللي احنا
حكيناه عن طبيعة انقسام البويضة هي في عندي الـ GV
الخاص بالبويضة على سبيل المثال هذه GV وهي عبارة عن
Germinal Vesicle وهي عند الـ M1 وهي عبارة عن البويضة
التي وقفت في أحد الـ stages خاصة بالانقسام الميوزي
الأول وهي M2 وهي عبارة عن البويضة البويضة دخلت
وأنهت الانقسام الميوزي الأول واتوقفت في الانقسام
الميوزي الثاني في مرحلة الـ metaphase مما أدى إلى
ظهور الـ first polar body بعد الـ maturation و الـ
fertilization يظهر الـ second polar body لأنه حكينا
أن الـ first polar body هو أول indication على أن
البويضة أنهت الانقسام الميوزي الأول و أنهت جزء كبير
من انقسام الميوز الثاني و توقفت في الـ stage الاسم
metaphase 2 يعني الـ metaphase الثاني من انقسام الثاني
أو الـ metaphase الخاص بالانقسام الميوز الثاني أما
بالنسبة إلى الـ two polar body أو الـ second polar
body لا يظهر إلا بعد عملية ونجاح عملية الـ
fertilization تلقيح البويضة من خلال وجود الـ sperm
هذه عبارة عن مراحل البويضة بشكل الكامل طيب the
immature oocyte are incubated in the original
Culture Media or Original Tissue Culture Dish
بتكون من واحد أو يحتوي على واحد ملليمتر من الـ
Oocyte Maturation Media يعني الميديا المستخدمة
لتطوير ونضوج الـ Oocyte حيث تحتوي هذه الميديا على
75 مللي International Unit لكل ملليمتر من الـ FSH
بالإضافة إلى 75 من الـ LH وموجودة في إنكبيوتير 37
درجة مئوية يعني كل هذه الميديا هي مواد مغذية ودرجة
حرارة مناسبة بالإضافة إلى هرمونات الـ FSH
والـ LH المستخدمان في إنضاج البوايضات طبعًا بوضعوها
في إنكبيوتير على 37 درجة مئوية في وجود 5% carbon
dioxide و 95% air with high humidity ويجب أن تكون
في نسبة عالية من الرطوبة طبعًا يفضل إنها تحضن
البوايضات الغير ناضجة لكي تنضج في وجود إنكبيوتير فيه
triple gas نيتروجين كاربون دايوكسايد أكسجين
النيتروجين يشكل 90% والكربون 5% والأكسجين
5% و الـ humidity الرطوبة 100% عشان كده إما بيكون
في عندي normal saline bottle معلقة في الانكبيوتير
من الخارج موصولة بأنبوب لداخل الانكبيوتير عشان توفر
الرطوبة المناسبة أو بيضعوا يعني زي حاوية بسيطة
فيها distilled water أو ultra pure water داخل الـ
incubator علشان في درجة حرارة 37 بتتبخر الماء
فبتكون لي كمية مناسبة ودرجة مناسبة من الرطوبة التي
تبقي البوايضة في حالة جيدة جدًا الـ oocyte
maturation media should be prepared بنسبة .. طبعًا
الـ media التي تستخدم لإنضاج الـ oocyte يجب أن تحضر
قبل ساعتين من وضع البويضة الغير ناضجة ويفضل أن
تحضر قبل بيوم يعني بنحضرها و بنحط لها drops أو
بنحط الـ media في الـ petri dish و الـ petri dish
بندخله داخل الـ incubator اللي فيه الـ triple gas و
37 درجة مئوية علشان يصير في عندي balance و عملية
اتزان في الـ pH مهم جدًا علشان ما تروح البويضة على
atmosphere أو تروح على media مختلفة اختلاف كل فبيصير
فيها shock وممكن يصير failure فتحضير الـ media قابل
بساعتين من خلال وضعها في الطبق ويدخل الطبق للـ
incubator بيخلي فيه اتزان واستقبال وتكييف للميديا
مع الظروف المحيطة بها الـ oocyte will be arrived to
the metaphase of the second meiotic division stage
on the day of collection are stripping
and fertilized يعني بمعنى آخر بيسميها الـ
denudation بمعنى آخر أن البوايضة اللي كانت في حالة
الـ maturation وسحبناها وهي mature لازم في يوم
السحب تتعرض لحالتين أو خطوتين الخطوة الأولى الـ
Denudation أو الـ Stripping بسموها التعرية وإزالة
الـ cumulus cells والنقطة الثانية الـ fertilization
طبعًا together with any in vitro matured oocyte
while immature oocyte are collected in IVM media
for 24 to 48 hours يعني أي بويضة ناضجة وكانت ناضجة
في يوم السحب يجب أن يحدث لها denudation أو
stripping و fertilization في نفس اليوم مش أجيبها من
أي يوم ثاني لا في نفس يوم السحب بيصير الـ
injection أما بالنسبة للبويضة الغير ناضجة لازم
أوضعها في الـ IVM media و يعني ما يطلق عليها in
vitro maturation media لمدة 24 ساعة على الأقل وعلى
الأكثر 48 ساعة لكي يسمح أو نسمح لهذه البويضة
بالنضوج الـ Follicle is the basic functional unit
of mammalian ovary which each follicle contained a
single oocyte surrounded by inner layer of
granulosa cells and outer layer of theca cells
الفوليكل هي الوحدة الأساسية التي تحتوي على البويضة
الناضجة أو غير ناضجة فبالتالي هذه البويضة و
كل بويضة ناضجة تكون محاطة بطبقة خفيفة ورقيقة جدًا
من الـ granulosa cells بالإضافة .. طبعًا هذه طبقة
داخلية أو طبقات في بعض الأحيان بتكون داخلية من الـ
granulosa cells بالإضافة إلى طبقة أو طبقات متعددة
من الخارج تسمى theca cells وحنشوفها كمان شوية
بالصورة يعني في المركز بويضة حواليها طبقات متعددة
من الخلايا تسمى الـ granulosa cells ومن الخارج طبقات
متعددة من الـ theca cells الـ granulosa cells بتلعب
دورًا مهمًا جدًا بتعمل زي الـ nursing يعني زي كأنها
بتعمل خادمة أو ممرضة أو يعني حاجة بتسهر على راحة
البويضة توفر الأمور اللازمة للبويضة nurse أو
nursing the oocyte and differentiated and
proliferation in response to gonadotropin التي مهمة
لتطبيب وتضميد وإنعاش البويضة لمعنى الـ Granulosa
cells بالمجمل تلعب دورًا مهمًا جدًا في تطبيب وتضميد و
إنعاش البويضة كما أنها تلعب دورًا مهمًا جدًا في تميز و
نمو البويضة كما أنها تلعب مهمًا جدًا في استجابة و
زيادة استجابة البويضة للـ gonadotropin الهرمون الذي
يُعطى فبالتالي فهي تلعب دورًا حاسمًا ودورًا مهمًا في
نجاح نمو البوايضة ونجاح عملية الـ ovulation هذا
بالنسبة إلى الـ granulosa cells بدونها البوايضة لن
تنمو بدونها البوايضة لن تنضج بدونها الـ ovulation
لن يحدث لأن حكينا إنها بتلعب دورًا كبيرًا وسرفنا إيش
الدور اللي بتلعبه من أهمها الـ response for
gonadotropin على سبيل المثال There are bi
-directional communication between the oocyte and
the surrounding somatic cells من خلال الـ Gap
Junctions and Paracrine Signals طبعًا الـ Somatic
Cells أو الـ Oocyte خليني أسميها بالمجمل ما بتكون
في معزل عن الخلايا الأخرى أو البيئة المحيطة فيها
لأ في عندي connection تؤثر وتتأثر تتأثر بالبيئة
المحيطة وتؤثر على البيئة المحيطة من خلال Junctions
gap موجودة ما بينها وما بين الـ somatic cell
المحيطة بها ومن خلال ما يُعرف باسم الـ Paracrine
Signal ويعرف الناس اللي أخذت Endocrine في حسمة
Autocrine في Paracrine وفي أنواع مختلفة من الـ
signal من Endocrine و Paracrine و Autocrine هذه
أنواع مختلفة من الـ signal بتفرز بالفعل الخلايا
الموجودة طبعاً هذه العملية بتسهل بشكل كبير جداً نمو
البوايضة وتطور البوايضة الموجودة داخل الـ
follicle مما يؤدي إلى نجاح عملية الـ
folliculogenesis عملية تطور البوايضة نجد المرحلة
الأولى التي تحدث والعملية الأولى التي تحدث بعد
عملية الـ collection وهي ما يُعرف باسم oocyte
denudation أو denoding في الغالب بيسموها stripping
أو denudation يعني التعرية أو الإزالة طبعاً لما
أقول oocyte denuding تعني إزالة الـ somatic cell
المحيطة بالـ oocyte لأن أنا ما بدي أثناء عملية الـ
injection أدخل somatic cell داخل الـ oocyte خلال
عملية الـ injection أو جزء من المادة الوراثية
الخاصة بالـ somatic cell تدخل مع الإبرة خلال عملية
الـ injection فبدي أزيل أغلب الـ somatic cell
المحيطة بالـ oocyte علشان أعمل injection بشكل صحيح
ومضمون 100% The removal of cumulus cell becomes
critical step, very necessary step, very important
step before fertilization since it allow an
evaluation of oocyte nuclear maturity and easily
handling of the oocyte During manipulation عملية
الإزالة عملية الـ stripping تسمح لي أنا كـ تكنولوجيست
أقيم الـ Oocyte بشكل صحيح هل هي M1 ولا M2 ولا GV
أيضاً بسهل عملية الـ injection أن أعمل injection في
منطقة بعيدة عن الـ polar body أعمل injection في
منطقة تحتوي على كمية قليلة جداً من الـ somatic cell
The cumulus and corona cell are removed before any
step of micromanipulation procedure by using two
methods enzymatic method و mechanical treatment أنا
ممكن أعمل denudation أو stripping قبل ما أعمل أي
خطوة من خطوات الـ injection إما بستخدم إنزيم، هنعرف
إيش هو الإنزيم وكيف بستخدمه أو بستخدم طريقة يدوية،
ميكانيكية من أشهر الإنزيمات اللي بتستخدم هو إنزيم
يؤثر على مادة تسمى الـ Hyaluronic Acid الـ
Hyaluronic Acid مادة بتعمل عملية تلاحم ما بين
الخلية و تلاصق ما بين الخلية فبيصير عملية زعزعة
الخلايا أو إزالة الخلايا صعب هذا الـ Hyaluronic
Acid فبدي مادة تشتغل عليه وتزيلّه Hyaluronic Acid هو
مجموعة كبيرة من مجموعة Cumulus المتحركة التي تجمع
الـ Hyaluronic Acid فبالتالي بستخدم إنزيم اسمه
Hyaluronidase اللي بيلعب دور كبير جداً في إزالة وتقطيع
الـ Hyaluronic Acid مما يؤدي إلى إزالة الخلايا ده
الـ procedure عادةً يتم تفعيله تحت ميكروسكوب Stereomicroscope
الأنواع الأجهزة الموجودة أشهر على الـ
Stereomicroscope In different well or micro drop
containing culture buffer media usually covered by
oil on the warm thermoplate Stereomicroscope هو
عبارة عن ميكروسكوب الـ stage الخاص بيه بيكون فيه
heating stage يعني موصول ببطارية بتعطي حرارة أو
heater بيعطي حرارة 37 درجة مئوية عشان تكون قريبة
من درجة حرارة الجسم وأنا بستخدم طبق فيه drop أو
فيه well كل well فيها media موجود بداخلها البويضات
الناضجة ومغطى بالـ oil عشان أمنع الـ contamination
دخول أي شيء من الخارج داخل الـ media فبالتالي بيؤثر
سلباً على البويضات كيف أنا ممكن أسرّع وأدّي عملية الـ
removing للـ cumulus وللـ corona cell بستخدم إنزيم
اسمه اللي هي Hyaluronidase enzyme أو ممكن أعمل
stripping شو يعني stripping ببساطة جداً بجيب
plastic dropper استرايه plastic dropper إلى gauge
معين أو diameter معين هيكون أكبر بقليل أو أصغر بقليل
من الـ oocyte وبعمل suction و releasing suction و
releasing حوالي 7-8 مرات خلال عملية الـ suction و
الـ releasing أو الـ aspiration و الـ releasing للـ
oocyte بيصير خلخلة في الـ cumulus cell و تفتت أنا
كده بكون خلصتها بعد ما أعمل عشر مرات في الـ drop
هذه باخد الـ oocyte و بنقله لـ drop جديدة ونظيفة
ما فيها أي شوائب أو ما في حدث فيها Suction و
Releasing للـ oocyte يعني ما فيها خلايا طبعاً هذه
العملية عملية الـ aspiration و الـ releasing للـ
oocyte ممكن تكرر بالعدد 20 مرة أو لمدة عملها
كررها لمدة 30 ثانية يعني أنت بدك بالوقت أو بدك
بالعدد Since initial cell this خلينا نسميها
removing is observed oocyte are removed to the
second well droplet containing buffer media taking
care to carry over minimum amount of enzyme طبعاً
هذه الـ media ممكن تكون media وفيها إنزيم الإنزيم
المسؤول عن خلخلة الـ Hyaluronic Acid بالإضافة إلى
الـ aspiration و الـ releasing فبيصير عندي mechanical
aspiration releasing و enzymatic وجود الإنزيم بعد
ما أعمل aspiration و releasing لمدة 30 ثانية بنقل
البوايضة هذه إلى قطرة جديدة لم يحدث فيها عملية
removing للـ Oocyte طبعاً بكرر هذه العملية مرة و
مرتين وثلاثة حتى أتأكد أن كمية الـ Cumulus cell
المحيطة بالـ Oocyte قليلة جداً جداً جداً جداً
طبعاً في القطرة الأولى بستخدم الـ dropper بـ diameter
معين في القطرة التالية بستخدم الـ dropper بـ diameter
أقل لأن كل ما نقلت البويضة من قطرة لقطرة جديدة الـ
Oocyte الـ diameter بتقل و الـ Cumulus cell حواليها
بتقل فبالتالي بدي Dropper جديدة بـ Diameter أقل
عشان أقدر أعمل قوة احتكاك أثناء دخول وخروج
البوايضة من الفوهة... من الفوهات الأنبوبة طيب،
لازم أعمل Washing للـ Oocyte بشكل كامل علشان أوقف
عملية عمل الـ Enzyme عشان ما يضلش فيه Enzyme مرتبط
بخلايا الـ Cumulus cell المتبقية وبالتالي أنا بعمل
Stopping لعمل الـ Enzyme فلازم أعملها Washing بعد
after partially removal of the cumulus cell by
short exposure أو exposure to buffered media
contained an enzyme the oocyte are removed and put
in the culture media and placed back to the
incubator for 30 minutes أنا عملت Denudation كامل
ما خليت ولا Cumulus cell حوالين الخلية أو عدد قليل
جداً باخد الـ oocyte بضيفه في media Clear Media بدخل
الطبق للإنكبيوتير عشان الخلية تستقر لأجل أن أنا
كانت مجهدة بفعل وجود الإنزيم وعملية الـ aspiration
والـ releasing لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الـ
injection يعني قبل... ما بين الـ stripping وما بين
الـ injection في فترة زمنية تسمى rested stage خاصة
بالراحة لازم تحتاجها الـ oocyte عشان لا تجهد في نوع
من أنواع الاستقرار المادة الوراثية بداخلها تقدر
بـ 30 دقيقة على حد أدنى فـ future step أو this
future step led to طبعاً عملية الـ mixing للبوايضة
مع الـ media اللي بتحتوي على الـ Hyaluronidase as enzyme
تعمل عملية tweaking لقوة الترابط ما بين الخلايا
فبسهل عملية الـ removing بعد الـ denudation الـ
Oocyte should be examined under inverted
microscope to assess integrity and the stage of
maturation عملت الـ denudation جاب المداخلة في الـ
incubator لمدة 30 دقيقة طلعت البويضة نقولها عن
inverted microscope فشوفها تحت الـ inverted
microscope شو الـ integrity تبعتها؟ جداش الـ
maturation stage تبعتها؟ هل هي M1 ولا M2؟ ولا أي
نوع من أنواع يعني تصلح أم لا تصلح لعملية الـ
fertilization the incomplete denudation of oocyte
before eggsy يعني في بعض الناس بيقول لك لأ أنا بعمل
complete denudation ما بتخلي أي Cumula cell بهدوء
لازم يكون فيه جزء من الـ Cumula cell لأن هذا بيفيد
الـ oocyte كيف بيفيد الـ oocyte؟ لأنه في دراسات
بتقول لك عملية الـ denudation الغير كاملة يعني التي
تترك عدد قليل من الـ Cumulus cell طبقة محيطة بالـ
Oocyte تساعد في تحسين جودة الـ embryo بعد الـ
fertilization وتساعد في تحسين الـ developmental
embryo أيضًا تلعب دور كبير جداً في الـ assist
embryonic metabolism و الـ stimulation gene
expression تعمل Reduction للـ oxidative stress يعني
مش شذوذ ولا دقة في الأداء إنك تعرّض الخلية بشكل
الكامل وما تخلّي أي كيوم للخلايا حولها، لأخفف قدر
الإمكان وافقي ولو two layers حولها عدد قليل من
الخلايا إنك أنت ما تضرك الخلايا أثناء عملية ال
injection وما تضر الجنين لأن وجودها مفيد في أربع
أو خمس نقاط بتساعد الـ embryo quality أو بتحسن الـ
embryo quality والـ embryo development وبتعمل أسس
embryonic metabolism بتعمل stimulation للـ Angelic
suppression وتعمل reduction للـ oxidative stress
خمس فوائد مهمة لبقاء كمية من كيوم الـ cell حوالين
الـ Oocyte طبعا هذه ببساطة جدا شكل الـ Oocyte لما
تطلع هذا شكل الـ Oocyte لما تطلع من الـ fluid وأنا
أحصلها من الـ fluid لو أنقلها لقطرة جديدة هذه بتكون
كلها عبارة عن الـ Oocyte ولكن لو أنا فرغت هذه الـ
Oocyte وهذه كلها cumulus cell و corona cell حولها
بعد الـ denodation لازم تكون بهذا الشكل طبعا هذا
اللي باللون الأحمر هذا خلينا نسميه هذا الـ zona
وهذا الـ polar body وهذا الـ polar body وهذه كلها
طبقة من الـ cytoplasm هاي الـ oocyte اللي باللون
الأخضر الفاتح بيسموها cumulus cell اللي باللون
الأخضر الداكن موريلا وهذا الـ theca cell طبعا لما
أجي أعمل aspiration و releasing suction و releasing
هتروح كل هدوء يدل اللي باللون الأخضر الفاتح وهي
الـ cumulus cell لازم أنا أتجنب كمية كبيرة جدا من الـ
granulosa cell هي عبارة عن خليط من الـ mural cell والـ
cumulus cell دعونا نرى هذا الفيديو المتعلق بعملية
الـ denotation علشان تكون الأمر أوضح إن شاء الله
طبعا
هيتكلم عن الـ denotation تحت الـ microscope طبعا
هذه الـ Pasteur tube أو Pasteur pipet أو dropper
طبعا هنا هذه البوايضات اللي موجودة فيها بيعمل
suction بداخل البيضات للداخل وبعدين بيعملها
releasing أكثر من مرة وشوف كيف بيصير تفتت للـ
cumulus
واخدوا بالكم في الخطوة الثانية أغير الـ pipet يا
جماعة أقل الـ diameter تبعها أقل لأن الخلية أو
البويضة فقدت الـ granulosa cell فقدت الـ cumulus cell
فصغر حجمها فابدي بـ steer pipet الـ diameter أقل
شايفين في كل مرة بيعمل aspiration و releasing
بيعمل في منطقة جديدة علشان ما يصير الشواقب حولها
وفي كل مرة بعد فترة زمنية بعد ما يعمل يعني خمسين
عشر مرات عشرين مرة خمسين ثانية بنقل هذه الـ oocyte
كلها بداخلها داخل الـ dropout أو داخل الـ pasture
pipe وبنقلها لـ drop جديد
شوف كيف شكل البوايضات هي عندي واحدة ..اثنتين ..ثلاثة
..أربعة ..خمسة ..ستة ..سبعة ..ثمانية ..عشرة
..أحد عشر بويضة من سيدة واحدة اللي كانت مفروضة تطلع
فقط ثلاث بويضات كحد أقصى هذا طبعا بعد الـ
stimulation هذه
طريقة الـ stripping أو الـ denodation الخاصة
بالبويضات خليني أشوف فيديو ثاني يتكلم عن هذا
الموضوع
طبعا هذا شكل البوايضات أول ما نحزلهم من الـ fluid
أو من الـ follicular fluid بكون شكلهم بهذا الشكل زي
ما شوفناها تحت الصورة هذه البويضة وهذه كل
الـ theca cell والـ cumulus cell والـ mural cell والـ
somatic cell كلها محيطة فيها بده يعملها pipetting
الوقت بيجي بالـ dropper بيعملها suction و releasing
لمدة ثلاثين ثانية على الأقل مش وجدش الـ diameter
الخاصة بالـ Pasteur pipet أو الخاصة بالـ dropper اللي
لازم تكون ست مرات خمسة، ستة، سبعة، ثمان مرات أو
ثلاثين ثانية كحد أدنى وبعدين بيعملهم transfer إلى
a new drop علشان يتخلص من كمية الشباب هاي فالـ new
drop عملها releasing وبعدين بيعملهم suction و
releasing بس بده يغير الـ pipet يغير pipet لأنه بده
pipet الـ diameter تبعته أقل علشان يقدر يصير قوة
احتكاك ما بين الجدار الداخل للأنبوبة والبويضة
واحدة واحدة وفي بعضهم بيعملها كاملة ولكن أفضل
واحدة واحدة علشان ما يصيرش تزاحم ومما يدي لتهتك
الخلايا في بعض الأحيان ممكن يعيدها ثلاثين ثانية زي
ما قلنا وينتقل إلى drop جديدة فيما بعد هينقل إلى
drop جديدة هيغير الـ pipet المفروض يغير الـ Pipet
علشان يعطيني نتائج أفضل يعطيني Diameter Pipet with
low diameter أكبر
البويضات هتشوفهم بهذا الشكل هذه فكرة الـ
Denotation بشكل أساسي كيف بتصير عملية الـ
Denotation تعرّفنا عنها بعد ما حكينا عن الـ
Denotation الـ timing للـ oocyte denodation الـ
oocyte denodation is usually performed between 37
and 40 hours after HCG يعني عملية الـ denodation
بتصير بعد عملية الـ injection للشريجون أو للـ human
chronic gonadotropin اللي بيعمل ovulation بـ 37
إلى 40 ساعة ولكن يجب أن تحدث قبل الـ insemination
بساعة أو نصف ساعة على الأقل الإنزيمات التي تستخدم
وتركيزها بشكل عام وtraditionally الـ denodation أو
الـ denoding process أو procedure involve a
hyaluronidase derivative هيالورونيداز يعني هيالورونيداز
مع مشتق من الـ hyaluronidase بشكل أساسي in order to
minimize any potential toxic effect on oocyte for
this type of enzyme we should be reduce the
enzymatic concentration أو الـ enzyme
concentration أو reduce that duration for oocyte
exposure to this type of enzyme يعني أنا ممكن أقلل
الـ toxicity الخاصة بهذا الإنزيم بطريقة ثانية
الطريقة الأولى أنه أقلل الـ time اللي بتتعرض فيه
الخلية لهذا الإنزيم أو أقلل ما يُعرف باسم الـ
concentration الخاصة فيه وفي بعضهم بيقلل الـ time
أفضل لأن الـ concentration بيكون fixed أقل الـ
concentration ممكن أن أستخدم خلال الـ denotation
80 international units per milliliter يعني لو الـ
one drop فيها 80 unit ممكن أن أضع هذه الـ one drop
من الإنزيم على 1 مليليتر من الـ media وكل ما كان
أقل تركيزه وكل ما كان تأثيره السلبي أقل أو الـ
toxicity أقل فممكن أنا أخفض درجة حرارته ..عفوا..
أخفض تركيزه وأخفض effect تبعته إن أستخدم تركيز
عشرة international unit per milliliter بعض
الدراسات قالت إن هذا التركيز has also been shown
to be able to make denotation for mature oocyte
بشكل عالي جدا يعني الـ عشر international unit قادرة
أن تعمل denotation وبكفاءة عالية جدا فأنا ليش
أستخدم الـ 80؟ فلو بدي أستخدم الـ 80 بدي أقلل الـ
duration لازم
أقلل الـ duration خلصنا كده من عملية الـ denodation
والـ stripping جاهز لعملية الـ injection اللي
هناخدها في الشكتر الجديد ولكن قبل ما نخلص الموضوع
ده فيه موضوع صغير بتنوح له وهو هرمون الـ AMH الـ
AMH ببساطة جدا يا طلابنا الأعزاء هو عبارة عن
هرمون يطلق عليه protein هرمون يُفرز بشكل أساسي من
الـ granulosa cell in the ovarian follicle in the
ovarian follicle لما تكون أو يكون عند سيدة تفرز الـ
ovarian follicle هرمون أو الـ granulosa cell
الموجودة في الـ ovarian follicle تفرز هرمون
antimullerian هرمون خدوا بالكم هذا الهرمون مهم جدا
وبناء عليه بعض الاضطراب بيستخدموه عشان يحددوا هدى
الزوجة أو هدى السيدة تروح agonist أو antagonist
short protocol ولا long protocol وبعضهم بيستخدم الـ
AMH عشان يحدد الـ short protocol أو الـ long
protocol شو هيختار طبعا الـ AMH level بلعب دور
كبير جدا حيث أنه يزيد بعد الـ 25 سنة عند السيدات
ويبدأ في التناقص بعد الـ 30 أو عند 30 سنة الـ AMH
level بلعب دور كبير جدا في الـ development of sex
organ في الـ unborn baby كيف بلعب هذا الدور؟ بقول لك
ببساطة جدا في أول أسابيع من الحمل الـ baby will be
start reproductive organ development إذا كان الـ
baby male فهيفرز كمية كبيرة جدا من الـ AMH علشان
يمنع تكوين بالإضافة طبعا إلى الـ male hormone علشان
يمنع تكوين الـ female organ development ويسمح
بتكوين الـ male developed male organ يعني الـ AMH
يفرز في المرحلة الجنينية إذا كان الجنين ذكر يفرز
كمية كبيرة جدا من الـ AMH plus الـ sex hormone الخاص
بالذكور مما يمنع تكوين الـ organ الخاص بالـ female
ويسمح ويساعد على إنتاج وتكوين الـ organ الخاص
بالمال لو كان العكس عند الـ unborn baby في المرحلة
الجنينية female كمية اللي قد أبقاش هتقل، هتكون أقل
ما يمكن و تكاد تكون غير مذكورة مما يسمح بظهور الـ
organ related with female و عدم ظهور الـ organ
related with male مما يؤدي إلى ظهور الجنين كجنين
أنثى عشان كده بعض الأطباء وبعض المراكز ممكن تستخدم
الـ AMH تحديد مستوى الـ AMH في المرحلة الجنينية
لتحديد جنس المولود هل هو male أو female إذا كان
مستوى عالي جدا بيكون male إذا كان مستوى منخفض أو
منعدم بيكون female لإن وجوده يسمح بإنشاء الأعضاء
الذكرية ويمنع تكوين الأعضاء الجنثوية في المرحلة
الجنينية طبعاً الـ AMH has a different role for
female from or after puberty at the time of his
beginning making AMH the more egg cell there are
the high level of AMH الـ AMH يمكن أن يستخدم as
a marker or indicator for ovarian response جدّيش أنا
عند مستوى الـ AMH عند السيدات جدّيش بكون عندها
مخزون في المبيض ففي علاقة طردية ما بين مستوى الـ
AMH ومخزون المبيض كل ما كان الـ AMH عالي، معناه
فيه بيبايدات كتير جدا عند السيدة الـ AMH يمكن أن
يستخدم ليه؟ predict for started monobios متى كل ما
كان قليل المنوبيوز بتكون أقرب يستخدم في تشخيص الـ
polycystic ovarian syndrome الـ hormonal disorder
يستخدم في .. for infant .. infant .. chick infant
with genital that are not clear identified عند الـ
male و female monitoring women who have some type
of ovarian cancer we can use it as indicator for
fertility in women specifically in relation to the
number of egg in reserve of ovaries so AMH can be
used as indicator for ovarian response and ovarian
reserve
على مخزون المبيض ومدى استجابة المبيض so we can use
it as a predictor for ovarian reserve and
ovarian response سوف نكتفي بهذا القدر في المحاضرة
اليوم على أن نكمل ما تبقى من هذا الـ chapter في
المحاضرة القادمة إن شاء الله