标题：海葵神经毒素
简介
海葵（sea anemone），又名海菊花、海淀根，是最原始的多细胞海洋动物之一，在分类学上属于腔肠动物门（Coelenterata）、珊瑚动物纲（Anthozoa）、六放珊瑚亚纲（Hexacorallia）、海葵目（Actiniaria）。其下有3个目，包括海葵目Actiniaria、群体海葵目Zoanthidea 和角海葵目Ceriantharia。海葵种类繁多，分布广泛。海葵在中国海域分布较广，但产量较少。中国的海葵种类主要有:黄海葵（Anthopleura xanthogrammica）、纵条肌海葵（Haliplanella luciae）、日本侧花海葵（Anthopleura Japonica）、太平洋侧花海葵（Anthopleura pacifica）、暗侧花海葵（Anthopleura nigrescens）、青岛侧花海葵（Anthopleura Qingdaoensis）、华丽黄海葵（Anthopleura elegantissima）、须毛细指海葵（Metridium dianthus）、疣海葵（Adamsia palliata）、红海葵（Actinia equina）等。[1-2]
海葵身体呈辐射对称体制，体壁由内外两胚层组成，两层之间是非细胞形态的中胶层。头部由触手和口盘组成，触手内含有刺细胞，每个刺细胞里都有一个特殊囊状的细胞器，名为刺丝囊，内储存着毒液，刺丝管盘曲在刺丝囊内，刺丝尖端为刺针，是捕食和防御的重要武器。在受到外界物理或化学的刺激时，触手上特异的刺细胞能释放各种生物活性成分并通过刺丝管将毒素注入猎物体内，这些活性物质主要是肽类毒素，对人和动物具有多种生理活性。[3-4]
对海葵神经毒素研究始于20世纪70年代，1976年美国夏威夷大学Shibata等人从黄海葵（Anthopleura xanthogrammica）中分离纯化了海葵神经毒素A（an-thopleurin A，Ap-A）和海葵神经毒素B（anthopleurinB，Ap-B）2种毒素，发现有增强心肌收缩的作用。1977年，Tanaka等对Ap-A的氨基酸序列进行了测定，随后，又有多种海葵神经毒素被发现，并做了氨基酸序列测定，以及二级、三级结构的分析。1992年，Gallagher等根据天然的Ap-B的氨基酸序列，体外合成了编码Ap-B的基因，在大肠杆菌中进行了重组表达.重组蛋白与天然的Ap-B在氨基酸组成、序列、二级结构、高压液相图谱及生物活性方面相同。海葵神经毒素的药理研究结果显示，这类毒素专一地和钠离子通道膜蛋白3位点结合，能延迟钠通道的失活。一方面，毒素作为分子探针可用于钠通道的生物学研究;另一方面，毒素对心肌组织产生非常强的正性收缩作用，而且对实验动物的心率和血压没有影响。因此，研究开发海葵神经毒素用于治疗心衰，是一项很有意义的工作。[5-8]
己经从不同海葵物种中分离出多种毒素，研究者将来源不同的海葵毒素分为两种类型:神经毒素和溶胞素。海葵神经毒素的分子量范围为3-7kD，能阻断或延迟快钠通道的失活，从而增加了钠离子内流，使细胞内钠离子的浓度增高，延长细胞的动作电位时程。据研究，海葵毒素对哺乳动物心肌表现正性肌力作用，机制既不同于儿茶酚胺类，又不同于强心苷，不影响肾上腺素受体和ATP酶，也不是通过影响钙离子的转运分布而实现的。可能是通过Na+/Ca2+离子交换机制和继发的钙通道开放刺激内钙释放，导致细胞内的钙离子浓度增加。[9-10]
理化性质
对海葵毒素的研究自20世纪70年代开始，已经从约40种海葵中分离到超过300种毒素，根据分子量以及生物学功能的不同，可以分为海葵溶细胞毒素（分子量约20 kDa）以及海葵多肽类神经毒素（分子量3～7kDa）两大类。已发现超过70种的海葵神经毒素，根据其作用靶点的不同可以分为三大类，分别为作用于电压门控钠离子通道（Nav）的毒素，分子量为3～5kDa；作用于电压门控钾离子通道（Kv）的毒素，分子量为3.5～6.5kDa；以及作用于其他离子通道的多肽毒素；此外，还有部分海葵多肽类神经毒素能特异地作用于甲壳动物，但尚不清楚其具体分子靶标。[11-12]  海葵神经毒素rhk2a 的HPLC 图谱[13]
海葵神经毒素是一类能与神经、心脏等细胞上的离子通道发生特异性结合，并改变离子通道功能的一类多肽毒素。这类毒素通常由27-59个氨基酸所组成，分子量范围在3-7KDa 之内，大多数毒素的氨基酸序列中含有多个Cys残基，形成分子内二硫键。在已报导的氨基酸残基数介于46～49的海葵神经毒素中（另外还有几个毒素的氨基酸残基数介于27～31，称短链神经毒素），有12个氨基酸保守。根据它们的氨基酸序列又可分为两个亚类，以Ap-A、Ap-B为代表，属第一亚类；以ShⅠ、RpⅠ为代表，属第二亚类。两个亚类之间，氨基酸序列的同源性为30%左右，而属同一个亚类的毒素蛋白，氨基酸序列之间的同源性超过60%。[14-15]  几种海葵神经毒素氨基酸序列比较[16]
发现的海葵神经毒素中，Ap-B表现出最强的心肌收缩活性。Ap-A和Ap-B在序列上有7个氨基酸不同，而Ap-A的活性只有Ap-B的十分之一。研究人员运用点突变技术，对Ap-B的结构与功能进行了研究。结果显示，Arg-14、His-34、His-39和Lys-48的单点突变对活性影响不大，Asp-9和Lys-37的单点突变使Ap-B的活性下降7～12倍，而Asp-7的突变甚至使Ap-B不能正确折叠。对疏水性氨基酸Leu-18的突变研究表明，L18V和L18A突变体的生物学活性分别下降了231倍和672倍。此外，Arg-12和Lys-49对Ap-B分辨Na+通道理化性质有决定性的作用。海葵神经毒素蛋白rhk2a和Ap-C、AsV有很高的同源性，因此推测它们也有同样的心肌收缩活性。而且，它们的一级结构差异也可能会反映在生物活性上。[16-18]
王磊等人用激光飞行时间质谱分析测定重组表达得到的神经毒素分子量，海葵神经毒素rhk2a的分子量为5078.5Dal，其半数致死量（LD50）是1.4mg/kg（i.p.）。用ProtParam 软件预测的rhk2a等电点为8.34。按照海葵毒素结合离子通道类型的不同，可以将该类毒素大致分为Na+通道毒素和K+通道毒素两大类，以及结合其它类型离子通道的毒素。[13][19]
毒理学
钠离子通道作用在1968年Shapiro从海葵Condylactis gigantea中纯化出百慕大银莲花毒素（Condylactis toxin）的海葵毒素，该毒素可使龙虾巨轴突神经元的动作电位持续时间增加。1975年，Beress等在沟迎风海葵Anemonia sulcata中首次发现了三种多肽类海葵毒素，按照1991年Norton提出的分类方法, 可以依据氨基酸序列的不同, 将这些海葵Na+通道毒素分为3种类型ATX I，ATX II和ATX III。在此基础上，KlausHartung利用小龙虾巨大神经元研究ATX I，ATX II和ATX III对Na+通道的作用方式，说明三种毒素对动作电位具有相似的影响。之后更多实验证明，海葵神经毒素与蝎子毒素（α-scorpion）类似，可与Na+通道受体位点3（site 3）结合，延长Na+通道在去极化过程中的开放时间，抑制Na+通道的快速失活，从而引起一系列相关的细胞调控活动。[20-22]  作用于钠通道的海葵神经毒素[14]
来自海葵Anthopleura Xanthogrammica中的AP-A和AP-B为研究较多的海葵神经毒素。通过对AP-B进行氨基酸序列定位诱变后研究发现，AP-B中由8-17个残基构成的不规则环状结构在其与Na+通道接合过程中起到关键作用。AP-A可作用在枪乌贼、蟑螂的巨大神经轴突上，延迟INa失活而不影响其激活动力学，当作用于豚鼠心室乳头状肌时，50~100nmol/LAP-A可显著减弱INa衰减速率，并增大钠电导，使INa峰值呈使用依赖性减小，即改变其激活的电压依赖性。[23-24]
钾离子通道作用20世纪90年代后，人们发现海葵神经毒素对K+通道亦具有高度选择性作用。Middleton RE等经研究证明，提取自海葵Stichodactyla helianthus毒液的多肽ShK对电压门控型K+通道Kv1.1和Kv1.3有高度亲和性，并能阻断K+通道作用，而其合成衍生物ShK-Dap22对Kv1.3的亲和力是ShK的10倍。[25]  作用于钾通道的海葵神经毒素[22]
Kv3K+通道由于具有快速门控能力和高通量的性质，广泛存在于很多中枢神经系统组织中。研究表明Kv3K+通道与一些主要的中枢神经系统失调疾病，如帕金森氏症和阿耳茨海默氏症有关。来自海葵Anemonia sulcata的海葵神经毒素BDS能特异抑制Kv3K+通道家族中的亚单位Kv3.1、Kv3.2和Kv3.4。虽然BDS与AP-A和ATX II具有25%的序列同源性，但是BDS对心脏和骨骼肌细胞上的Na+通道却没有任何影响。[26-27]
此外，提取自海葵Anthopleura elegantissima的海葵毒素APETx1与BDS-I、BDS-II具有42%的序列同源性，而且结构也很类似，但是两种毒素的靶通道不同。APETx1能选择性地抑制HERG （human ether-a-go-go-related gene）编码的K+通道。[28]
其他离子通道从海葵Anthopleura elegantissima中分离出另一种多肽类毒素APETx2与BDS和APETx1分别具有36%和64%的序列同源性。但是，APETx2并不阻碍K+通道，它主要作用于感觉神经元上与调节痛觉有关的酸敏感型离子通道（ASICs）。APETx2通过与ASICs上部分亚基特异地结合，从而影响ASICs的功能。[29]
应用
海葵神经毒素的应用价值很大。它不仅可以作为分子探针，作为研究钠离子通道的结构与功能的工具药，而且因其能增强心肌收缩作用又对心率和血压没有影响，成为研究新的抗心衰药物的热点。另外值得注意的是与癫痫的关系，癫痫是由于钠离子通道突变引起的，钠通道的状态对病情有直接的影响。许多抗癫痫的药物是钠通道的阻断剂，有的药物是作用于钠通道失活过程从而达到治疗的效果。因此，海葵神经毒素可能是一种潜在的抗癫痫药物。已有四种新的基因克隆重组海葵神经毒素Hk2a、Hk7a、Hk8a和Hk16a，它们从中国南海的Anthopleurin sp.海葵分离出来。分离的SD大鼠离体心房的收缩实验己经研究了它们在心肌方面的作用机制，证明了Hk7a使心肌收缩时间最长，Hk2a使其心肌收缩程度最强。另外，在分离的SD乳鼠急性分离的神经元上，己经研究了它们对海马神经元钠通道的影响，结果表明Hk7a对钠通道开放时间和概率的作用最明显。由于这类毒素对不同的离子通道有高度的特异性和亲和性，因此，不仅可以作为一种研究离子通道结构和功能的工具，而且有望开发成为诊断和治疗离子通道相关疾病的药理学试剂。[13][30]