标题：微繁殖
微繁殖介绍
微繁殖是过去30年中发展起来的一项技术，也是植物组织培养应用最广、最多和最有成效的一个方面。Georges Morel最早应用茎尖培养作为无性繁殖手段，1960年他在兰花、兰属植物无性系建立以后，为离体无性繁殖开辟了广阔的前景。自1974年以来，已经对130个属的近1000种植物种类进行了微繁殖，创造了巨大的经济效益，其中最主要是花卉观赏植物，已经进行微繁殖的有近80个属的450种植物，其次为果树林木、蔬菜和农作物等。
微繁殖的优缺点
1.优点与常规的有性繁殖和无性繁殖相比，微繁殖可以在短期内，利用少量外植体或起始材料，在较小的空间内快速生产，具有小型、高效、高产、高经济效益等特点，并可加速优良品种、新引入品种和育种材料的繁殖推广过程，缩短打入市场所用的时间。 
许多果树和园艺植物高度杂合，或种子为雌雄株产生的自然杂种，利用实生繁殖常会产生分离和变异，与亲本植物在遗传和表型上不一致。而无性繁殖则可避免上述缺点，产生出与亲本完全一致的后代。另外，某些植物种类，如香蕉、葡萄、无花果、矮牵牛花和菊花等，产生的种子很少或种子不能成活，而三倍体或多倍体植物材料，也只能通过无性繁殖手段进行。
有一些植物种子的休眠期很长，或从播种到开花结实的周期极长，这些植物一般也采用营养繁殖。利用植物组织培养技术进行微繁殖，不仅具有上述营养繁殖优势，而且某些植物种类只能通过组织培养来繁殖，因为只有离体培养才可能发生真正的复幼。
微繁殖的另一个优点是在超净环境下繁殖和保存苗木，具有无病、无毒、无虫害等优点。一般微繁殖的起始材料是经严格选择的材料，或是经茎尖培养或茎尖培养与热处理结合的脱病毒材料、微繁殖生产出的大量脱病毒植株既可直接种植，又可作为常规繁殖面建立原种圃，如观赏植物水仙属（Narcrissus）、鸢尾属（Ivis）、百合属（Lilium）以及浆果作物如草莓和醋栗。这方面的一个最好的例子就是脱病毒微型薯生产。马铃薯在田间种植容易感染病毒，种植若干代后会引起产量下降、品质变劣，所以须经常更换脱病毒微型薯，而微繁殖可快速地生产出脱病毒种薯来。
组织培养生产的苗木比常规繁殖出来的苗木生长更快、更旺盛。这可能是由于复幼或脱除病害的原因。
微繁殖由于环境条件（培养基和物理条件）的可控制性，可以做到有计划、定时、定量生产，可灵活适应市场需求，还可避免季节和气候的影响，实现周年生产。
微繁殖有时可以越过植物发育的幼年阶段，直接成花或结实。
微繁殖生产自根苗，不必经嫁接或芽接到根砧上，节省了劳动力，对于杜鹃花、玫瑰和
百合花繁殖具有重要意义。以生产自根苗为目的，对果树接穗品种进行微繁殖将打牙一个新的研究领域，为传统的果树园艺带来新的变化（如建立离密度种植园等）。
微繁殖可以结合低温种质保存建立基因库或种质库。微繁殖材料便于国内国际间种质交换。
2.缺点①遗传稳定性差。
②离体繁殖植株表现丛生（bushiness，侧枝重复增生）或向幼年阶段的完全逆转。
③某些木本植物难以诱导形成根，或离体形成的根没有功能，移栽后需产生新的根系，适应外界土壤环境。
④某些植物驯化移栽极为困难。
⑤微繁殖植物在向大田移栽后，由于缺乏免疫能力，存在被新的病源微生物感染的危险。在热带作物油棕的种植中，采用多克隆种植可以避免出现这样的问题。同时要严格控制田间病虫害的发生。
⑥愈伤组织和细胞悬浮液多次继代培养后会丧失再生能力。
⑦某些情况下难以无菌游离。
⑧微繁殖目前属于劳动力密集型产业，除了需要昂贵的专用设备和仪器外，还需工人技术、操作熟练，因而成本较高，所以一般只用来生产那些具有重要商业价植的植物或植物次生代谢产物。
植物的微繁殖:微繁殖阶段的划分
在微繁殖阶段的划分上，Murashige（1974，1977,1978）将微繁殖划分为三个阶段:阶段Ⅰ,无菌培养的建立；阶段Ⅱ，苗芽增殖;阶段Ⅲ，对首芽进行移栽。Debergh和Maene（1981）提出四个阶段的划分法，即阶段0，在卫生环境下准备原种株；阶段Ⅰ，无菌培养的建立;阶段Ⅱ，诱导分生组织中心区，使其迅速发育成增殖芽；阶段Ⅲa，苗芽伸长及形成茎齐一致的无根苗；阶段Ⅲb，生根及试管苗在无土基质中初步生长。Pierik(1987)及Debersh和Read（1991）则将微繁殖划分为如下几个阶段：
阶段0：准备阶段。在这个阶段主要对起始材料进行恰当的预处理，如将植物材料种植在无病虫害的温室或进行水培，保持植物材料干燥，防止病虫害的发生等。
阶段Ⅰ：起始培养，无菌培养的建立或初代培养的建立。对分生组织、茎尖或其他外殖体进行消毒，无菌游离和接种，使生长和发育不受污染影响。
阶段Ⅱ：增殖或繁殖阶段。该阶段主要目的是进行数量上的扩大繁殖，并保证遗传稳定性。
阶段Ⅲ：伸长及根的诱导和发育。准备对阶段Ⅱ中得到的无根苗或植株进行移栽，包括停止腋芽增殖、启动苗芽伸长生长（或壮苗生长）、根诱导和根发育。生根既可离体生根，也可在后一个阶段中进行瓶外生根。
阶段Ⅳ：驯化和移栽。将完茎植株向温室和大田的土壤进行移栽。然而上述划分并非绝对，微繁殖阶段的划分与植物种类和微繁殖方式有关。在许多植物的微繁殖中，伸长培养是同生根培养阶段结合在一起的，也有的是同增殖及生根阶段结合在一起的，如葡萄及枣树采用单芽茎段繁殖时就是这样。但在另一些植物中，伸长培养是作为单独一个培养阶段，如苞叶芋（Spathi phyllhum）和扁桃。这是因为增殖后形成的微型苗芽在培养后期中单个苗芽不便于操作;不够健壮的苗芽在生根中反应也差，如生根率低或单株生根数少等，而且直接影响到以后的移栽成活率。难生根的果树微繁殖中，在加有较搞浓度的CK的增殖阶段后，紧接着进行一个低浓度CK或缺省CK的壮苗阶段，可以改变植物体内内源激素水平的平衡，有利于生根。如果采用瓶外生根的方法，那么阶段Ⅲ和阶段Ⅳ也可以合二为一。采用田间或野外的植物材料进行培养，则无需阶段0。一般而言，在不同的繁殖阶段，培养基成分也有差异，有时培养条件也会发生较大的变化。
植物的微繁殖:微繁殖方式
不同的植物种类微繁殖的难易程度不同。木本植物和草本植物相比，再生能力相对弱一些，增殖率也低。一般木本植物生长在野外，消毒较为困难，易受生长条件、气候和季节变化影响。另外，休眠现象和褐化现象会对本本植物的微繁殖造成较大的影响。木本植物比农业和园艺作物更易发生遗传变异，一般在成龄阶段才被用来进行无性繁殖；但成龄材料又极难进行离体培养，尤其是难以生根。同时木本植物又难以诱导复幼。所以，这些都对微繁殖方式和微繁殖阶段造成重大影响。其中最主要的因素是再生能力，除基因型存在的差异之外。起始材料的发育阶段显著影响再生能力。一般幼嫩的植物比成龄的植物具有较高的再生能九由于一般选用成龄木本植物进行营养繁殖，因而必须在使用前进行复幼。复幼的方法有分生组织培养；连续扦插；将分生组织或望尘嫁接到实生苗根砧上；游离幼嫩区；过度修剪，挺进幼嫩侧技产生。另外，不定芽发生或胚胎发生虽然常可诱导复功，但这两种方式有可能产生变异，所以通常通过分生组织培养来诱导复幼。分生组织培养可以保持遗传稳定性，消除真菌和细菌，甚至可得到脱病毒材料。如果采用成龄植物材料进行离体营养繁殖遇到困难时，可先采用实生苗或幼态材料进行研究（种子消毒后离体播种萌发；得到的实生苗材料进行离体器官形成）然后从中获得有关信息，再利用成龄树体材料进行微繁殖。 
在微繁殖方式划分上，这里根据起始培养材料和植株再生或发育方式，划分为单芽茎段培养、腋芽增殖、不定芽（器官）发生、原球茎增殖、体细胞胚胎发生、细胞和原生质体再生。这种划分并不严格，只是为了方便论述。实际上，目前切实可行的只有前面四种，而且也是绝大多数植物的最主要的微繁殖方式。
2．2．1、单芽茎段培养
单芽茎段培养也称单节培养（Single-node culture）或微型扦插（microcutting）。它与传统的扦插法进行营养繁殖极为类似，是指离体培养带一个芽的茎段（单个茎节或微型插条），使顶芽或腋穿发育成苗（有根苗或无根苗），继代增殖培养时，再将新形成的苗按芽数或叶数分割成单芽茎段进行培养，新形成的叶的叶腋中有腋芽，它会同顶芽一样分别发育成苗。如此继续下去，直到达到一定的苗数，然后进行生根或移栽。这种方法一般不需要添加细胞分裂素来打破顶端优势，促使腋芽发育。有时可加入少量生长素，不仅腋芽得到发育，同时也会产生较好的根。
这种微繁殖方式的增殖速度同其地方式相比并不高，增殖率依赖于每一次继代培养结束时的有效芽数（或节段数），一般为4～6周内增殖3~5倍。叶数越多，腋芽数也就越多，增殖率也就越快。如果丛簇病感染机会高时，该方式不能对丛簇（病）植物如凤梨科（Bromeliaceae）和非洲菊等进行繁殖。为了减少污染或感染几率，须采用未萌发的芽。如果存在内部感染，必须首先采用分生组织培养获得卫生植株。温带果树存在休眠现象时，可在离体培养后采用下述办法打破休眠：低温处理（0～5°C），长日照处理（每天光照16小时），或低温处理后接着长日照处理。有时加入赤霉素或（和）细胞分裂素可以打破休眠，促进萌发。黄化处理（黑暗或低强度光照）也可打破休眠。许多情况下（主要是草本植物）既不需要低温也不需要长日照就可打破休眠。幼龄枝条生长一般比成龄枝条迅速。木本植物成龄材料难以生根，须首先采用幼嫩材料或诱导复幼。
单芽茎段方法还可将离体花芽原基（花序）转变成营养枝条，如花椰菜。该法还适用于番茄、黄瓜和茄子的培养。番茄具有极强的顶端优势，无法用腋芽丛生的方法繁殖，而单芽茎段培养却十分有效。
该法较为简单，一般可保持遗传稳定性，步骤少（可一次成苗），但仅适用于自然状态下能生（侧）枝的植物。
2．2．2、促进腋芽分枝
促进腋芽分枝（enhanced axillary branching）又称腋芽法（axlllary bud method）或腋芽丛生法。该法与腋芽茎段培养相似，都是通过茎节书段或茎尖或茎尖切块的胞芽进行增殖，只是前者通常在含适量细胞分裂素（常为BA）的培养基（合或不含生长素）上以丛生芽的方式〔clulster of Shoots或multiple shoots）增殖，而单芽茎段则在无细胞分裂素的培养基上以单个不分枝的萌芽发育。在继代增殖培养中，丛生芽被分割成单个苗芽或小苗芽团，转接在新鲜的培养基上继续增殖。这种过程可以无限制地进行下去。草莓采用这种方式增殖，在2周内可增加10倍，一年内一颗草莓母株可产生几百万株（156～256）的草莓试管苗。一般作物也可以在一月内实现5～10的增殖率。实际上，增殖程度受劳力和设备的限制而达不到这么高。
腋芽位于叶腋中，每个腋芽都有潜力发育成一个枝条。在自然状态下的不同时期内，根据植物生长格局，这些腋芽保持休眠状态。对那些受顶端优势抑制腋芽萌发的植物，去除或损伤顶芽常可刺激腋芽发育成主干枝条。顶端优势受生长调节物质相互作用控制。施用细胞分裂素可解除顶端优势的抑制作用，在顶芽存在的情况下也可刺激侧芽生长，产生早生腋芽（precocious axillary shoots）或丛生芽。这种效果是暂时的，当外源生长调节物质减少时，腋芽就停止生长。
目前这种方法已成为最重要的离体繁殖方法，广泛用于园艺、农林果树作物的繁殖。之所以如此是由于其方法简便，繁殖速度快，还有一点就是可保持遗传稳定性。由于茎尖或分生组织均为二倍体（对于二倍体植物），受遗传严格控制，不易受培养条件影响而产生基因型变化。腋芽增殖产生的枝条是自原本存在的营养分生组织发育而来，保持原无性系的基因型和表现型。
利用成龄植株的茎尖或分生组织进行培养，在若干次继代培养后就可得到复幼。这种方法类似于传统的非离体条件下的连续扦插。复幼程度取决于离体分生组织大小、继代培养次数和培养基中生长调节物质的浓度。同样，嫩芽法繁殖速度也不稳定，受继代培养次数影响；继代培养次数越多，复幼就越快。例如，在一年内继代培养12次，就可将30年树龄的巨桉（Eucalyptus grandis）复幼；同样也可将30～50年树龄的丁香灌丛（Syringa vulgaris）复幼。复幼材料同成年阶段的材料相比，形态特征发生改变（例如叶形），生根潜力得到很大提离，这对于难以生根的果树林木尤为重要。另外，茎尖过氧化物酶活性也发生变化。在红杉（Sequoia semperviens）微繁殖中，复幼植物材料内K/Ca比例随继代培养次数的增加而增加，并且高于成龄材料。复劫材料内源IAA/ABA比例也高于成龄材料。
2．2．3、不定芽形成
除叶腋和茎端以外，从植物体上芽以外的任何部位或组织产生的芽，都称之为不定芽（adventitious bud）。不定芽发生一般分直接不定芽形成和间接不定芽形成。直接不定芽形成是指不经愈伤组织阶段，直接从植物器官及片段产生的不定芽;而间接不定芽形成则先脱分化形成愈伤组织，尔后再分化形成芽。
（一）直接不定芽形成
在传统的园艺植物无性繁殖中，许多植物都可从不同器官（根、球茎、叶片等）产生不定芽。这种不定苗芽的形成主要来自机械切割分离引起组织内部激素重新分配或刺激合成的结果。如果在特定的培养条件下，这种繁殖率可大大提离。如秋海棠属（Begonia）通常情况下只沿切口端形成芽；而如果培养在含BA的培养基上，则插条的全部表面都可形成苗芽。该方法的另一个优点是可以利用小到20～50 mg的外植体进行繁殖，在自然情况下是不可能存活的。直接不定芽形成的繁殖速率比腋芽增殖方法都高，对于那些叶片较少（与之相联系的叶腋分生组织也少），而体细胞组织具有很高再生能力的植物尤为如此。
诱导不定芽形成一般需要一定的生长素和细胞分裂素组合。大多数植物受生长调节物质作用的“Skoog-Miller模式”控制。一般采用细胞分裂素来促进芽形成，有时高的细胞分裂素与较低的生长素配合有较好的效果。但也有不需要加入任何生长调节物质就可直接再生不定芽的例子，但这并不意味着增加细胞分裂素或（和）生长素就没有作用，如毛蕊花属（Verbascum）和虎眼万年青属（Ornithogalum）。通常为了高离产生苗芽数目和速度，常加入一定种类及浓度的生长调节物质，尽管加入什么、加入多少主要根据植物种类和经验而定。
许多具有特化贮藏器官的单子叶植物也具有很强的不定芽产生能力。风信子  （Hyacinthus）和虎眼万年青（Ornithogalum thyrsoides）的每一种器官几乎都可以在无激素的培养基上丛生不定芽。
与腋芽丛生法相比，这种直接产生不定芽的方法较为少用，其原因是:能形成不定芽的植物数量小于能形成不定根的植物数量，而且产生变异的几率高于单芽段培养和腋芽丛生法。另外，这种方法不能对遗传嵌合体品种进行繁殖。不定芽形成会使嵌合体得到分割，从而产生纯粹型植株。从疏芽的苹果树节间部位诱导产生的不定芽，在生长习性、坐果特征及果实着色方面与亲本无性系存在差异。这种原因可以归咎于苹果无性系存在复杂的嵌合体特性。天竺葵品种Mme salleron是一种遗传嵌合体，叶片色彩斑驳。如果利用叶柄片段作外植体，不通过愈伤组识阶段直接产生不定芽，叶片没有显示斑驳色彩，而是绿色叶片或白化叶片。与此相反，茎尖培养产生的植株，其叶片则显示典型的斑驳色彩。天竺葵品种Rober’s  Lemon Rose的叶切段不论是在自然状态下繁殖，还是离体条件下繁殖，可以产生4～5种不同的类型。
（二）间接不定芽发生
有些植物的细胞可以在培养中无限增殖。植物细胞全能性可以允许植物细胞以不定器官发生方式再生，如果切实可行，这种方法不失为一种增殖率最快的繁殖方法。但是，这种方法由于涉及脱分化和再分化过程，因而有可能产生基因型和表现型上的变异，通过愈伤组织培养以不定芽发生会引起细胞的遗传不稳定性。例如，石刁柏（Asparagus officinalis）通过细胞和愈伤组织培养表现出多倍性和非茎倍性，而通过芽培养获得的植株均为二倍体。这种研究主要用于植物品种改良，若要通过这种途径进行微繁殖，则必须首先进行大量的、长期的工作，对不定芽产生的植株进行田间评价和检测，得到可靠的遗传稳定性数据。这种繁殖方法的另一个缺点是不适用于许多重要的作物。这些作物的再生能力有限。但即便是可以适用的作物，愈伤组织再生能力也会随着培养时间的延长而下降，甚至完全丧失。虽然如此，一些重要的作物如柑橘属（Citrus）、咖啡、小苍兰属和棕榈科植物仍只能采用这种方法进行离体繁殖。
（三）根的诱导
所有经单芽茎段培养法、腋芽丛生法，直接和间接不定芽发生发育好的无根苗都要进行生根培养。
2．2．4、原球茎增殖
兰花的离体繁殖方法与前述几种微繁殖方法有很明显的差异。Morel（1960）提出的兰花离体微繁殖方法如下:离体茎尖或侧芽培养不形成带叶的植株，而是形成基部有根状体的小球状结构。这种结构形态上与种子萌发时胚形成的原球茎（protocorm）相似，故也称为原球茎。
茎尖培养中产生的原球茎起源于叶的表皮和亚表皮细胞。将这些原球茎切成数块后继代培养，每一块又能形成若干个原球茎（由表皮细胞产生，原球茎内部组织没有再生新原球茎的潜力）。这种增殖过程可无限制地进行下去。最开始每个茎尖或侧芽大约2个月3～5个原球茎；尔后每个原球茎可切成4～6片，每一片在1个月内又可产生3～5个原球茎。使用这种方法，开始由一个不到lmm的茎尖在1年内可产生几百万株兰花。这种方法很快成为商业性生产的最主要方法。除兜兰（Paphiopedilum）外，几乎所有具有经济价植的兰花都可以通过原球茎增殖的方法进行离体繁殖。
2．2．5、体现胞胚胎发生
体细胞胚胎发生也是一种重要的微繁殖方法。体细胞胚胎发生可以分为直接体细胞胚胎发生和间接体细胞胚胎发生。前者是指不经愈伤组织阶段，直接从细胞或组织上产生体细胞胚胎。能发育成体细胞胚胎的细胞称为前胚决定细胞（pre－embryonic  determined Ce11s，PEDC’S）。这种类型的起始材料必须是完全复幼的材料，如柑橘属（Citrus）的珠心组织可形成多胚，以及野生胡萝卜、石龙芮（Ranunculus sceleratus）、亚麻（Linum usitatissimum）、芸苔（Brassica napus）品种Tower的下胚肢轴表皮细胞。利用直接体细胞胚胎发生进行微繁殖的树种还有椰子。
间接体细胞胚胎发生是经愈伤组织阶段的体细胞胚胎发生，即先经晚分化，细胞分裂后再决定成为胚性细胞。能够形成体细胞胚胎的这些细胞称为诱导胚性决定细胞（induced embryogenica11y determined cells，IEDS’s）。这种方法必须发生完全复幼，如咖啡（Coffea arabica）的叶外植体及胡萝卜的次生韧皮部。
体细胞胚胎几乎可以从各种外植体（包括原生质体和细胞悬浮培养）获得。利用细胞悬浮培养和愈伤组织培养既可从内部起源，也可从外表起源。一般容易诱导产生体细胞胚胎的起始材料有球心组织、下胚轴、花器官、合子胚，甚至包括花药、花粉和胚乳组织。
采用节段培养，腋芽丛生和不定芽发生需要先经器官发生途经产生单极性的枝条（或无根苗），然后经一个或一个以上的培养阶段才可生根形成完整的植株。与此相反，体细胞胚胎发生则产生具有双极性的不定胚，然后经历一个类似合子胚的发育过程直接形成完整植株，不仅分化频率极高，可以产生数量更多的植株，而且避开了极为困难的生根培养（木本植物尤为如此）和较长的培养周期。体细胞胚胎发生是从成龄树林上得到真正复幼的方法。体细胞胚胎发生可产生同步化和整齐一致的体细胞胚胎群，可以实现部分机械化，节省劳动力等成本，同时可以生产人工种子。文献中提到，这种方法会产生变异，但在实际生产中并非主要问题。例如，油棕离体繁殖中有时可以发现多倍体细胞，但体细胞胚胎无一例外是从二倍体细胞起源的，离体繁殖得到的油棕也未表现出值得注意的遗传变异。
2．2．6、大规模细胞培养和原生质体再生
大规模细胞培养可以用来进行体细胞胚胎发生及人工种子的制作。这种方法可以获得大量的游离的体细胞胚胎，但目前能从细胞悬浮培养再生体胚和完整植株的植物种类有限，而且这种方法容易产生变异。目前多用大规模细胞培养生产植物次生代谢物。利用原生质体培养多是出于育种的目的。由于从原生质体培养较为困难，能够产生植株的植物数量有限，而且这种方法也表现出显著的遗传变异。