标题：荷瘤小鼠
材料与方法
成为患者被迫放弃治疗的重要原因。因此，保护骨髓，促进造血功能和免疫功能的恢复乃是肿瘤防治工作中的一个重要方面。当归补血汤（Danggui Buxue Tang, DBT）为一传统补益气血经典方剂，临床应用广泛。我们及他人的研究已证明当归补血汤可以增强正常小鼠免疫功能。本实验以荷EL-4淋巴瘤C57BL/6小鼠为动物模型，研究当归补血汤对荷瘤小鼠的影响，探讨DBT抑瘤作用与免疫功能的关系。又采用荷瘤小鼠给予环磷酰胺化疗的方法，造成荷瘤小鼠化疗骨髓抑制模型，观察当归补血汤对接受环磷酰胺化疗的荷瘤小鼠骨髓抑制及免疫功能的影响，为临床应用提供更充分的理论依据。1  材料与方法
1.1  实验材料
1.1.1  动物  C57BL/6小鼠（H-2b），雌雄各半，10～12周龄，（20±2）g，购自北京大学医学部动物实验研究部；BALB/c小鼠（H-2d），雌雄各半，10～12周龄，（20±2）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
1.1.2  细胞株  MX-87、EL-4和L929细胞株液氮保存，均为北京大学医学部免疫药理研究室惠赠。
1.1.3  药物  黄芪和当归中药饮片，均购自北京中医药大学国医堂。按传统方法水煎煮2次(黄芪∶当归=5∶1)，混合后加热浓缩成100%，即相当于含生药量1 g/ml，置于4 ℃的冰箱保存备用；注射用环磷酰胺（cytoxan, CTX），上海华联制药有限公司，生产批号041109，临用前用生理盐水配制成0.3 mg/ml溶液。
1.1.4  仪器与试剂  96孔细胞培养板，BIB公司产品；CO2培养箱，Napco公司产品；倒置光学显微镜，Nikon公司产品；∑960全自动酶标仪，华萼企业公司产品；ZT-Ⅲ像头细胞收集器，绍兴卫星机械有限公司产品。IPMI 1640培养基，Gibco公司产品；新生牛血清，Hyclone公司产品；甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT），Sigma公司产品。放射性同位素氚标记的嘧啶核苷（[3H] thymidine incorporation, 3H-TdR），中国科学院上海原子能研究所产品。绵羊红细胞取自北京大学医学部实验动物科学部。自制补体（经小鼠脾细胞吸收的豚鼠血清）。其他常规实验用试剂按常规配制。
1.2  实验方法
1.2.1  荷瘤小鼠模型制备  参考文献[1]制备荷瘤小鼠模型。取EL-4瘤株生长最佳状态的传代细胞，按细胞数5×106/ml，0.2 ml接种于10～12周龄C57BL/6小鼠近右后肢的背部皮下。
1.2.2  分组及用药  肿瘤接种1周后，将荷瘤小鼠随机分为4组：肿瘤模型组，DBT组，CTX组，DBT+CTX组，每组40只，另设10只正常小鼠作为对照。正常对照组和肿瘤模型组每天以0.5 ml生理盐水灌胃和0.5 ml生理盐水腹腔注射；DBT组以0.5 ml DBT[相当于生药量24 g/（kg·d）]灌胃和0.5 ml生理盐水腹腔注射；CTX组给予0.5 ml生理盐水灌胃和0.5 ml CTX[7.5 mg/（kg·d）]腹腔注射；DBT+CTX组以0.5 ml DBT灌胃和0.5 ml CTX腹腔注射。每天用游标卡尺测量并用下列公式计算肿瘤结节大小：瘤径(mm)=（长径+短径）/2[1]。以上处理均连续进行15 d。各组内又随机分为4组，每组10只，用于不同指标测定，并给予相应处理。组内分成的4组中，一组留作生存时间观测（采用中位生存时间[2]生存曲线图表示）；一组进行免疫学相关指标及血象变化测定；其余2组分别用于溶血空斑试验和对同种异型抗原的迟发型超敏反应测定。
1.3  检测项目及方法  检测项目主要包括：（1）肿瘤生长速度及荷瘤小鼠生存时间；（2）小鼠脾细胞抗体形成细胞，即空斑形成细胞（plaque-forming cell, PFC）[3]；（3）小鼠迟发型超敏反应（delayed type hypersensitivity, DTH）[4]；（4）采用空斑减少实验测定小鼠细胞毒性T细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）活性[5]；（5）检测小鼠自然杀伤细胞（natural killer cell, NK）活性[6]；（6）用L929细胞株细胞毒法测定鼠腹腔巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α, TNF-α）[7]；（7）尾静脉取血20 μl，测定白细胞和红细胞计数，观察外周血象变化；（8）脱臼处死小鼠，剥离股骨，每根股骨用Hank’s液反复冲洗骨髓腔，显微镜下计数白细胞、红细胞及骨髓有核细胞。
1.4  统计学方法  采用SPSS 12.0软件处理数据，先进行正态性检验和方差齐性检验。组间比较采用单因素方差分析。
2  结  果
2.1  DBT对荷EL-4小鼠肿瘤生长速度的影响  连续给予相应处理15 d后，肿瘤模型组、DBT组、CTX组和DBT+CTX组肿瘤平均直径分别为26.50、19.85、14.60和9.10 mm。与肿瘤模型组比较，以上干预（DBT、CTX和DBT+CTX）均可明显减缓肿瘤生长速度，抑制肿瘤生长（P<0.05）。DBT+CTX组与CTX组比较，肿瘤生长速度差异有统计学意义（P<0.05），说明DBT可以增加CTX的化疗效果，延缓肿瘤的生长速度。见图1。（略）
2.2  DBT对荷EL-4小鼠生存时间的影响  连续给予相应处理15 d后，肿瘤模型组小鼠从接种肿瘤第21天开始出现死亡，生存时间最长只有28 d。DBT组小鼠接种肿瘤的第27天开始有第1只死亡，最长生存时间为40 d，与肿瘤模型组比较，荷瘤小鼠生存时间显著延长，说明一定剂量的DBT具有抑制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠生存时间的功效。CTX组与DBT+CTX组小鼠分别从肿瘤接种第30天、第35天起出现死亡，最长生存时间分别为48 d和57 d，与肿瘤模型组比较，CTX和DBT+CTX均可使荷瘤小鼠生存时间显著延长。且与CTX组比较，DBT+CTX组荷瘤小鼠生存时间显著延长，说明DBT还可以增加CTX的化疗效果，使荷瘤小鼠生存时间延长。见图2。（略）
2.3  DBT对荷瘤小鼠脾脏PFC的影响  用100%浓度的DBT 0.5 ml经灌胃给药连续15 d，于给药后第11天用5%绵羊红细胞（sheep erythrocyte, SRBC）免疫小鼠，在给药第15天后24 h内检查脾免疫球蛋白M（immunoglobulin M, IgM）抗体分泌细胞数。结果表明，与肿瘤模型组比较，其余各组荷瘤小鼠脾脏IgM分泌细胞数差异均有统计学意义（P<0.05）。与肿瘤模型组比较，DBT可显著增强小鼠IgM分泌细胞数（P<0.05），但还未到正常水平，说明DBT能明显增强荷瘤小鼠对特异抗原产生抗体的功能。
与肿瘤模型组比较，CTX可使小鼠IgM分泌细胞数显著降低（P<0.05），比肿瘤模型组均值下降了50%；与CTX组比较，DBT+CTX可显著增小鼠IgM分泌细胞数（P<0.05），可达正常对照组平均值的70%，说明DBT可以显著增强给予CTX治疗的荷EL-4小鼠脾脏B淋巴细胞对特异抗原产生抗体的功能。见表1。 表1  DBT对荷瘤小鼠脾细胞抗体分泌细胞的影响（略）
2.4  DBT对荷瘤小鼠对同种异体脾细胞的迟发型超敏反应的影响  各组小鼠均给予相应处理15 d，肿瘤模型组小鼠足垫肿胀度平均为（0.7±0.1）mm，DBT组小鼠足垫肿胀度平均为（1.0±0.13）mm。DBT组与肿瘤模型组比较，迟发型超敏反应明显增强（P<0.05），甚至超过正常小鼠的足垫肿胀度平均值（0.9±0.2）mm，提示该方剂能增强荷瘤小鼠迟发型超敏反应T细胞的功能。与肿瘤模型组比较，CTX组小鼠足垫肿胀度平均为（0.4±0.14）mm，迟发型超敏反应明显减弱（P<0.05）；DBT+CTX组小鼠足垫肿胀度平均为（0.85±0.17）mm，与CTX组比较，DBT+CTX可显著增强小鼠迟发型超敏反应（P<0.05），说明DBT可以显著增强给予CTX治疗的荷EL-4小鼠迟发型超敏反应T细胞的功能。见表2。表2  DBT对荷瘤小鼠对同种异型细胞诱导 的迟发型超敏反应的影响（略）
2.5  DBT对荷瘤小鼠CTL活性的影响  C57BL/6小鼠的CTL（H-2b）被丝裂霉素灭活的BALB/c小鼠脾细胞（H-2d）激活后，与MX-87靶细胞（H-2d）混合，温育2 h后，计数空斑数。肿瘤模型组与正常对照组和DBT组比较，空斑数明显增多，肿瘤小鼠CTL活性明显减弱。通过计算，肿瘤模型组杀伤率为35.1%，DBT组杀伤率为47.3%，2组比较小鼠CTL活性差异显著（P<0.05）。说明DBT具有一定的增强荷EL-4小鼠CTL杀伤功能的作用。
与肿瘤模型组比较，CTX组小鼠CTL杀伤率平均为19.0%，小鼠CTL活性明显减弱（P<0.05）；DBT+CTX组小鼠CTL杀伤率平均为32.2%，与CTX组比较，DBT+CTX可显著增强小鼠CTL活性（P<0.05），说明DBT可以显著增强给予CTX治疗的荷EL-4小鼠CTL活性。见表3。
2.6  DBT对荷瘤小鼠NK细胞活性的影响  用EL-4细胞作为NK细胞的靶细胞，采用细胞增殖MTT法测定荷EL-4小鼠NK细胞活性，以杀伤率表示。肿瘤模型组小鼠NK细胞杀伤率为49.78%，DBT组小鼠NK细胞杀伤率为72.98%。DBT组与肿瘤模型组比较，小鼠NK细胞活性明显增强（P<0.05），已达正常小鼠NK细胞活性的85.7%（正常对照组小鼠NK细胞杀伤率为84.21%）。说明DBT具有一定的增强荷EL-4小鼠NK细胞活性的作用。
与肿瘤模型组比较，CTX组小鼠NK细胞杀伤率平均为29.02%，小鼠NK细胞活性明显减弱（P<0.05）；DBT+CTX组小鼠NK细胞杀伤活性平均为52.65%，与CTX组比较，DBT+CTX可显著增强小鼠NK细胞活性（P<0.05），说明DBT可以显著增强给予CTX治疗的荷EL-4小鼠NK细胞活性。见表4。表3  DBT对荷瘤小鼠CTL活性的影响（略）表4  DBT对荷瘤小鼠NK细胞活性的影响（略）
2.7  DBT对荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF-α的影响  采用对TNF-α敏感的小鼠成纤维细胞系L929细胞进行细胞毒实验，MTT法作细胞增殖实验，用酶标仪测定波长570 nm的吸光度（A）值，间接反映小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α生物学活性。TNF-α生物学活性高，对L929细胞的杀伤作用强，L929细胞增殖水平低，光密度（optical density, OD）570值低。肿瘤模型组所测OD570值为0.313，DBT组测得OD570值为0.253，可见肿瘤模型组小鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α的能力比DBT组小鼠较弱，差异有统计学意义（P<0.05）。提示DBT具有一定的增强荷EL-4小鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α的作用。
与肿瘤模型组比较，CTX组小鼠所测OD570值为0.409，TNF-α生物学活性明显降低（P<0.05）；DBT+CTX组小鼠所测OD570值为0.291，与CTX组比较，DBT+CTX可使小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α生物学活性显著增强（P<0.05），说明DBT可以显著增强给予CTX治疗的荷EL-4小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α生物学活性。见表5。
2.8  DBT对荷瘤小鼠外周血象和骨髓有核细胞的影响  尾静脉取血，测定白细胞和红细胞计数，观察外周血象变化；脱臼处死小鼠，剥离股骨，每根股骨用Hank’s液反复冲洗骨髓腔。显微镜下计数白细胞、红细胞及骨髓有核细胞。CTX组与肿瘤模型组比较,白细胞、红细胞数降低（P<0.05)，骨髓有核细胞数减少（P<0.05)，并且几乎降至正常小鼠数值的50%以下；DBT+CTX组与CTX组比较，DBT+CTX则可使白细胞和红细胞回升（P<0.05），骨髓有核细胞数增加（P<0.05)，数值可达正常小鼠的80%左右。说明DBT可拮抗CTX化疗引起的荷瘤小鼠的骨髓抑制状态。见表6。表5  DBT对荷EL-4小鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α的影响（略）表6  DBT对荷EL-4小鼠外周血红细胞和白细胞及骨髓有核细胞的影响（略）
3  讨  论
我们及他人的研究已经证明当归补血汤能够增强正常小鼠的免疫功能。本实验以荷EL-4小鼠为模型，证实了DBT的抑瘤作用，结果表明相当于生药量24 g/（kg·d）剂量下肿瘤生长速度显著减缓，连续给予相应处理15 d后，其肿瘤直径平均大小为19.85 mm，而肿瘤模型组肿瘤直径平均为26.50 mm；并且荷瘤小鼠生存时间明显延长，最长可达40 d，明显长于肿瘤模型组的最长生存28 d。而相当于生药量12 g/（kg·d）剂量下小鼠肿瘤的生长速度及小鼠的生存时间与肿瘤模型组比较，则差异无统计学意义（P<0.05）（数据未列出）。说明DBT具有抑制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠生存时间的功效，其作用与剂量相关。
中医认为，机体之所以患肿瘤，正气虚弱是重要原因之一，免疫功能降低，从而使抗癌能力下降，因此可用扶正益气中药治疗调理。当归补血汤具有益气养血的作用，为扶正培本方剂。研究表明它对肿瘤细胞没有直接杀伤作用[8]，其抗癌作用可能在不同环节、不同程度上增强机体的抗肿瘤免疫反应，通过增强免疫细胞[9]和免疫因子[10]的活性，而达到间接抗肿瘤的目的[11]。本实验DBT抑制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠生存时间的事实又一次验证了DBT的抑瘤作用可能与其激活机体各方面免疫功能的综合作用有关这种观点。
连续给予相应处理15 d后，DBT+CTX组小鼠肿瘤直径平均为9.10 mm，而CTX组小鼠肿瘤直径平均为14.60 mm，肿瘤生长速度显著减缓；并且与CTX组相比较，DBT+CTX组荷瘤小鼠的生存时间明显延长（p<0.05），最长生存时间为57 d，CTX组荷瘤小鼠最长生存时间为48 d，说明DBT可明显增强CTX对小鼠移植肿瘤的抑瘤效果。
化疗药物多属于细胞毒性药物，对肿瘤细胞和正常细胞无选择性。本实验所用CTX是通过DNA为靶点杀伤肿瘤细胞，在杀伤肿瘤细胞的同时，导致增殖旺盛的骨髓造血细胞DNA结构破坏或阻止DNA合成，从而引起骨髓抑制[12]。免疫细胞属于血细胞，来源于造血干细胞[13]。因此化疗造成骨髓抑制的同时，也表现为机体免疫功能进一步下降，严重影响治疗效果。本实验采用荷瘤小鼠给予CTX化疗，造成荷瘤小鼠化疗骨髓抑制模型，以研究DBT对化疗所致骨髓造血系统的保护作用。中医学认为，减轻化疗的毒副作用应以清热解毒、益气养阴、补气益血、和胃降逆和健脾补肾为原则[14]。传统DBT由黄芪、当归按5∶1比例组成，重用黄芪大补脾肺之气，以滋生血之源，与当归合用，养血和营，则阳生阴长，气血两旺。两药相伍，共同发挥补气生血活血的作用，主治劳倦内伤、气弱血虚之证[15]。我们的实验结果提示，DBT对机体的获得性免疫和固有性免疫均有重要的调节能力，对CTX所致的小鼠免疫和骨髓抑制毒性有明显保护作用。提示临床用CTX或其他化疗药物治疗肿瘤时，同时应用DBT可降低化疗药物的毒副作用且可起到协同作用。