标题：软骨藻酸
简介
软骨藻酸（Domoic acid，DA）是一种天然神经性氨基酸，从污染贝类中分离、提取获得或拟菱形藻+尿素可以产生大量的软骨藻酸。兴奋性脯氨酸衍生物和神经毒素，是浮游植物代谢的产物，可以在被藻类污染的海洋食物特别是贝类中检测到，其结构与红藻氨酸和谷氨酸相似，是红藻氨酸受体的兴奋剂。主要由某些拟菱形藻属和菱形藻属的海洋硅藻产生，人们食用毒化的贝类，可引起记忆丧失、眩晕、昏迷甚至死亡等症状，根据这种毒素的中毒特征，被命名为记忆丧失性贝毒（Amnesic Shellfish Poisoning，ASP）。[1-4]
1987年加拿大爱德华王子岛东海岸发生因食用紫贻贝而造成的中毒死亡事件，造成100多人中毒，3人死亡。中毒者主要表现为腹痛、腹泻、呕吐，并伴有严重的头痛、记忆丧失、意识混乱、昏迷等症状。其中12人病愈后记忆丧失长达18个月之久。后经加拿大国立大西洋研究中心的专家们鉴定，发现中毒物质为由多列拟菱形藻（Pseudo2nitzschia multiseries）产生的软骨藻酸（domoic acid）。此后，在加拿大、美国海岸拟菱形藻产生软骨藻酸而引起危害事件不断被报道。[5-6]
1989年在加拿大东部的Fundy海岸，从贻贝中也检测出了由伪优美拟菱形藻产生的DA。1991-1994年，太平洋海岸连续爆发由澳洲拟菱形藻形成的赤潮，由此造成鱼贝类被DA严重污染。1991年，美国的太平洋海岸爆发了有毒拟菱形藻赤潮，加利福尼亚的蒙特利湾有100多只褐色鹈鹕和鸬鹚吃了富集有DA的凤尾鱼而死亡，产毒藻为澳洲拟菱形藻。同年10-11月份，从华盛顿州及俄勒冈州产的竹鳋、加州产的壳菜及蟹类中也检出高浓度的DA。1992年12月，日本从美国进口的蟹（Cancermagister）内脏DA阳性。1996年，墨西哥Baja地区，成百上千只海鸟因食用体内富集高浓度DA的螃蟹、凤尾鱼、沙丁鱼中毒死亡。1998年美国加利福尼亚州中部沿海发生400多头海狮中毒死亡事件，存活的海狮中有神经功能失调症状，从海狮的体液中检测出了高浓度DA。[7-8]
由硅藻门（Baciilariophyta）、羽纹硅藻纲（Pennatae）、管壳缝目（Aulonoraphidinals）、菱形藻科（Nitzschiaceae）中的拟菱形藻属（Pseudo-nitzschia）和菱形藻属（Nitzschia）中硅藻的某些种产生。水中的蛤蜊、蚌类及鱼均可富集水中藻类产生的软骨藻酸，并对软骨藻酸有较强的耐受力，软骨藻酸经食物链富集后，将对所在地区的生态环境造成影响，并引起动物发病和死亡Walz等检测了水中Pseudonitzschia australis藻含量及软骨藻酸的浓度，当该藻类在水中的含量仅为4000个/L时，即可检出软骨藻酸。因此应在赤潮和水华发生的前后，加强藻类及软骨藻酸污染的检测，并开展软骨藻酸对中枢神经系统损害机理的研究，对预防和治疗软骨藻酸中毒是十分必要的。[9-11]
软骨藻酸可以干扰哺乳动物及人的神经信号传递。软骨藻酸可以与谷氨酸神经递质的受体相结合，它的结合效率比谷氨酸高得多。这种结合过程使神经细胞产生错误指令，误认为谷氨酸浓度过剩，而将其排除出去，直到所有的谷氨酸都被消耗完，以致使神经细胞死亡。它的一种结构类似物，海人草酸也是从红藻如Digenea simplex，Palmeria plamata，Centrocetos clvulatum中发现的，但是，它对神经受体的结合力没有软骨藻酸高。由此开发成功了非常灵敏的软骨藻酸测定方法。先将海人草酸进行放射性标记，并使其与神经受体结合。当出现软骨藻酸时，海人草酸就从受体上释放下来，通过测定游离的放射性强度，就可以测定软骨藻酸的浓度。软骨藻酸的基本骨架是谷氨酸，其侧链是单萜，即异戊二烯的二聚体。其基本的生物合成途径是谷氨酸与3，4-二甲基辛二烯-2，6-焦磷酸（Geranyl py-rophosphate）发生环化反应。[12-13]  软骨藻酸色谱[14]
软骨藻酸可以毒化双壳贝及其它甲壳类动物。它的毒作用机制与兴奋性氨基酸受体和突触传导有关。兴奋性氨基酸L-谷氨酸和L-精氨酸作为神经递质与其受体结合，有开启膜上Na+通道的作用，导致Na+内流及膜的去极化。软骨藻酸属于一种兴奋性氨基酸类似物，与L-谷氨酸和L-精氨酸竞争地与兴奋性氨基酸受体结合，且其亲合力更强，使Na+通道开放，导致Na+内流及膜的去极化。另外被软骨藻酸激活的受体打开的通道可对Ca2+高度通透，导致致死性细胞Ca2+内流。[15-16]  软骨藻酸紫外光谱[17]
测定贝类中软骨藻酸的方法主要有高效液相色谱法、毛细管电泳法、小白鼠生物学试验法等，其中高效液相色谱法是检测贝类中DA公认的有效方法。高效液相色谱对贝毒素的分析应用最成功的是对软骨藻酸的分析。一般条件下HPLC-UV可使软骨藻酸得以分离并有效地检测。为保证分析的回收率，在样品处理时，应尽可能减少酸性溶液在空气中的暴露时间。[18-20]
软骨藻酸可影响人和动物的消化道、心血管系统、中枢神经系统，它对与内脏功能有关的脑干区域具有兴奋作用，而对与记忆有关的脑区域具有明显的神经毒性作用。此外，也会损害脊髓、视网膜。研究发现，贝组织中软骨藻酸含量达到40mg/kg时可引起食用者中毒，150mg/kg时有致死危险，人类通过进食可耐受的最大限量为20mg/kg，加拿大首先制定了安全限量标准为20μg/g贝肉，欧洲、日本也相继将该种毒素列为贝类常规检测项目。[21-22]  软骨藻酸离子扫描图[23]
理化性质
软骨藻酸的分子式为C15H21NO6，分子量为311.33。结构与红藻氨酸和谷氨酸相似，是红藻氨酸受体的兴奋剂。纯品为白色固体粉末，溶于水，微溶于甲醇，熔点223-224℃，在紫外光谱区最大吸收波长为242nm，在体积比为1:9的乙腈/水溶液和-12℃黑暗条件下可保持稳定一年左右。在常温或光照下在碱性溶液中不会降解，但它在酸性溶液（pH=3）中一星期降解50%。分子中含有三个羧基和一个仲氨基，羧基结构的pKa分别为2.10、3.72、4.97，氨基结构的pKa为9.82，因此它在溶液中的存在受pH的影响。软骨藻酸共有A-H八种异构体。其中异构体A、B、C的毒性远低于其余五种。[24-27]  软骨藻酸及其异构体结构[27]
毒性
中毒特征软骨藻酸是比PSP毒素弱一些的神经性毒素，中毒者症状奇特，多数在食后3-6h发病，主要表现为腹痛、腹泻、呕吐、流涎，同时出现记忆丧失、意识混乱、平衡失调、不能辨认家人及亲朋好友等严重精神症状，严重者处于昏迷状态，重症者多为老人，并伴有肾脏损害，曾有12人病后记忆丧失长达18个月之久的报道。软骨藻酸的LD50约10mg/kg体重（小鼠，ip）。从中毒死亡者的病理解剖可见脑的海马体、丘脑和杏仁核都有损伤，这与用软骨藻酸进行动物试验的病理结果相同。以高效液相色谱法分析软骨藻酸，其食用标准安全浓度为2mg/100g。[28-31]  不同贝类中软骨藻酸含量的变化[31]
软骨藻酸和作为神经递质的谷氨酸（Glu）一样具有引起神经细胞兴奋的功能，但其强度比Glu高100多倍，比红藻氨酸（KA）高2-3倍。DA可通过与谷氨酸机制相同的脑部通路进入脑，即血脑屏障的高亲和性转运系统进入脑。中毒后，人体会出现恶心、呕吐、胃炎，严重时可以导致头晕眼花、视觉障碍、记忆丧失、昏迷等。Vale等通过对葡萄牙贝类的研究发现不同的贝类品种在不同的时空对于DA的生物积累作用也是不同的。其中，春季捕捞的花蛤（Venerupis）对DA的生物积累作用最大。Wekell等于1991～1993年对不同季节的蛤蜊、蛤蜊的组织进行软骨藻酸含量测定，发现其可食用部分DA含量在12月达到最高，平均可达106mg/kg，此后逐渐下降，但在浓度达到高峰后16个月，蛤蜊体内的DA仍不能完全消失；此外，蛤蜊的各个部位均能检出DA，其中足部浓度最高，可达223mg/kg，虹吸管部位的浓度最低。Lefebvre等对大马哈鱼（Oncorhynchuskiautch）体内不同组织的DA含量进行了分析，发现DA在大马哈鱼的肾和胆中的含量较高。人类通过食用海产品摄入DA，多通过食用贻贝、蛤类在体内积累。与贝类相比，人类通过食用鱼类而受到的影响较小。据研究，当人体内DA含量在0.2～0.3mg/kg（湿重）时，机体不受影响；当达到0.9～2.0mg/kg（湿重）时，机体会出现轻度眩晕等症状；当达到1.9～4.0mg/kg（湿重）时，机体会出现方位障碍等症状。Costa等通过对欧洲食品安全委员会数据的研究，发现欧洲居民对于贝类的实际消费量比之前研究所得的数据高，尤其是德国和荷兰，并总结出欧盟主要国家居民对于软骨藻酸的暴露水平。另外，DA具有热稳定性，一般的烹饪过程并不能够破坏软骨藻酸的毒性。虽然一般家庭的蒸和煮的过程会减少贝类组织中的DA含量，但是DA仍会随烹饪过程进入到烹饪油中，进而通过消化道进入人体。软骨藻酸作为一类神经毒素、递质和阻断剂在贝类组织中积累，进而间接地影响着人类的健康。对由DA引起的健忘性贝中毒没有较好的疗法，仅在小鼠实验中发现用苯二氮草（Diazepan，5mg/kg）可减少震颤行为，但无法完全恢复受损的海马结构或空间记忆能力。同时，研究表明软骨藻酸对昆虫有杀灭能力，其对嶂螂、苍蝇的杀死效果不逊于r-BHC等。[32-36]  软骨藻酸标准质谱图[23]
美国、加拿大、北欧一些国家以及澳大利亚、日本等国的科学工作者也先后从紫贻贝（Myltilus edulis）、扇贝（Pecten maximus）、文蛤（Callista chione）等贝类体内以及鱼是鱼、鲭鱼和石蟹的内脏中检测到了软骨藻酸。美国食品药品管理局（FDA）将它确定为4种主要海洋生物毒素之一，并首先和加拿大制定了贝肉中软骨藻酸的安全剂量为20μg/g的规定。[37]  软骨藻酸在大马哈鱼体内分布情况[37]
虽然在1987年就报道了人类的ASP事件与DA有关，但到1991年九月才第一次明确发现有水产动物死亡与DA毒素有关。在贝类和鱼类体内存在DA使得毒素有可能通过食物链进行传播，即使DA没有累积到致死剂量，也会对健康造成慢性影响。然而，尚无有效方法预测到DA有何慢性影响。对于DA的研究还有待于检测技术的进一步发展。[38-39]
软骨藻酸可引起人和动物较严重的中枢神经损害。动物实验表明，软骨藻酸对与内脏功能有关的脑干区域具有兴奋作用，而对与记忆有关的脑区域具有明显的神经毒性作用。大鼠腹腔注射软骨藻酸的LD50为3600μg/kg。大鼠脑室内染毒（0.03-3nmol）时，低剂量组出现颤抖、运动过强、面部阵挛，高剂量组出现癫痫征候群。小鼠染毒亦获得同样结果。幼年和成年猴静脉注射软骨藻酸（0.25-4mg/kg）一周后，用组织化学方法在海马部位发现受损伤变性的神经细胞和轴突；大剂量可引起幼年动物锥体神经元和轴突末端及海马的广泛损害，剂量超过1.0mg/kg时，可在成年动物海马齿状回中诱导产生c-fos蛋白。大鼠静脉注射软骨藻酸0.5-1.0mg/kg，可引起海马癫痫样放电，兴奋性痉挛，几天后死亡。苯甲二氮卓可防止实验大鼠的痉挛和死亡，但大鼠的迷宫实验能力仍受到损害。在大鼠海马CA3部位注射软骨藻酸，可引起癫痫发作性放电。将小鼠中枢神经系统用软骨藻酸染毒后15min，c-fos mRNA的量增加，1h后其mR-NA的产物c-fos蛋白亦增加。[40-41]  软骨藻酸二级质谱图[42]
Wang等给出生后7d的大鼠皮下注射软骨藻酸，剂量分别为0.10、0.17、0.25、0.33、0.42和0.50mg/kg，各个剂量组均出现软骨藻酸引起的抓挠、尾部轻弹及游泳样运动等症状。高剂量组进一步出现后肢麻痹、前肢颤动，2小时内出现死亡。在0.33mg/kg剂量组出现死亡和麻痹的百分率分别为47%和65%。记录该剂量组的动物皮层脑电图和同步干扰电活动，未见脑损伤。软骨藻酸注射后1-2h出现麻痹和震颤的动物，解剖发现以点状出血、神经细胞肿胀及神经细胞形成空泡为特征的脊髓损伤。这种损伤可发生在脊髓的各个部位。神经细胞变性主要发生在腹侧和中间的灰质，而脊髓背侧部分的细胞较少发生。研究结果显示，所观察到的行为变化主要是由脊髓损伤而非脑损伤引起。[43-44]  软骨藻酸作用细胞2h后氨基酸释放色谱[45]
无脊椎动物对拟菱形藻和DA的反应也存在着种与种的不同。当暴露在Pseudo-nitzschiapungens中4小时后，Pacificoys-ters的壳就会紧紧闭合，这是一个典型的双壳贝类受到微藻胁迫的原初反应。在48小时暴露于藻中时，oysters内的毒素水平都升高。而血细胞的数量和活跃性在4小时时达到峰值，由于体内净化使DA逐步下降，使血细胞恢复正常状态。在翡翠贻贝中，DA只发现存在于内脏中。当DA以溶解或食物脂质体的形式提供给活体的贻贝时，只有不到1%的溶解的DA和占6%的食物DA与贻贝组织结合。以食物的方式摄入的DA集中在消化腺和肾脏中。贻贝组织内的DA浓度并不会在一个48小时的净化阶段后持续降低，DA也不会转变成任何组织储存起来。在72小时后，大部分DA出现在内脏中，超过50%的DA在刚开始的24小时内已消除。因为DA具有亲水性，毒素很可能被分泌到体外而不是被利用于生物合成。而且在贻贝的摄食系统中DA可以被转化成DA的异构体。在海洋扇贝Placopectenmagellanicus中曾经测到组织中含有浓度高达3100μg/g的DA，即使过了15天后毒素水平仍然极高。在razorclams中，DA不仅在内脏，在足部、体管中也有分布，且在体内保留时间可以长达六个月。在另一种扇贝Pectenmaximus中，所有组织（除生殖腺和内收肌）中的DA浓度占了个体总负荷量的99%（580到760μg/g），而在生殖腺中的浓度为8.2到11.0ug/g，在内收肌中浓度为0.38到0.82μg/g（Campbelletal.，2001），比一般限制浓度（20μgDA）低。浮游生物可作为DA的载体，在加利福尼亚毒素通过鱼转移到鸟体内，明显可导致鸟类死亡。[46-49]  软骨藻酸作用细胞2h后游离钙浓度[45]
人类的DA中毒反应主要根据1987年加拿大爱德华王子岛DA中毒事件，患者在摄入DA数小时后出现恶心、呕吐、腹绞痛、腹泻、出血性胃炎和食欲减退等中毒症状和体征，严重者在出现胃肠道症状后数小时至3天内出现严重的头痛、共济失调、头晕眼花、视觉障碍和记忆丧失、意识混乱、方向感丧失、失语、自主神经系统功能紊乱、不自主咀嚼、苦笑面容、肌阵挛、惊厥和昏迷等，并伴有永久性后遗症如记忆丧失和外周多发性神经病（peripheral polyneuropathy）。记忆缺失多发生在男性和年长者。四例死亡患者的神经病理学研究结果显示，大脑的海马和杏仁核的神经元损伤严重。用从导致中毒的贝类中提取的DA进行体外实验，结果发现对培养的人神经元的毒性强于DA纯品。DA作为驱蛔虫药的服用剂量是20mg/人。1987年导致加拿大人类中毒爆发事件中被测贝类中的DA含量为31-128mg/g，推算有症状病人DA的摄入量是60-290mg/人。对贝体内DA的食用安全性研究发现，贝组织中DA量达到40mg/kg时可引起食用者中毒，150mg/kg时有致死危险。人类通过膳食可耐受的最大限量为20mg/kg。[50-52]毒源及分布软骨藻酸是由硅藻门、羽纹硅藻纲（Pennatae）、管壳缝目（Aulonoraphidinals）、菱形藻科（Nitzschiaceae）中的拟菱形藻属（Pseudo-nitzschia）和菱形藻属（Nitzschia）中硅藻的某些种产生的一种兴奋性神经毒素。1958年，Takemoto和Diago首次从日本鹿儿岛县的大型藻类树枝软骨藻（Chondria armata domoi）中分离出，并以该藻的日文名命名。该藻在传统医学中被用作驱肠虫剂。1975年Impellizzeria等人从生长在地中海的一种红藻（Alsidium Corallinum）中也分离出DA。1987年加拿大爱德华王子岛发生由DA导致的人类贝类中毒，进一步的研究发现DA的产生藻为硅藻中尖刺拟菱形藻的多列变种（Pseudo-nitzschia Pungens.f.multiseries），并首次发现硅藻也能产生藻毒素。随后发现，在适宜的条件下，拟菱形藻属中的伪优美拟菱形藻（P.pseudodelicatissima）、澳洲拟菱形藻（P.australis）、成列拟菱形藻（P.seriata）和菱形藻属的Nitzschiaactydrophila以及人工养殖的双眉藻属的咖啡形双眉藻（Amphora coffaeiformis）也可产生DA，特别是拟菱形藻属和菱形藻属中的海洋硅藻大量繁殖形成赤潮后的初始阶段DA产量较高，可见DA是与赤潮发生密切相关的一种生物毒素。[53]拟菱形藻的光学电子图谱(2张)[54]
拟菱形藻光学电子图谱参考文献。[55]
拟菱形藻属已有12种被报道可产生软骨藻酸，其中澳洲拟菱形藻（P.australis）、成列拟菱形藻（P.seriata）与多列拟菱形藻（P.multiseries）的产毒性已得到广泛的认可。而其他9种：靓纹拟菱形藻（P.calliantha）、细弱拟菱形藻（P.cuspidata）、拟柔弱拟菱形藻（P.pseudodelicatissima）、多纹拟菱形藻（P.multistriata）、尖刺拟菱形藻（P.pungens）、柔弱拟菱形藻（P.delicatesima）、P.fraudulenta、P.turgidula和P.galaxiae的毒性在不同地域则表现不同，拟菱形藻也同样广泛分布于中国沿海，自南到北已报道的拟菱形藻有澳洲拟菱形藻、细弱拟菱形藻、柔弱拟菱形藻、多列拟菱形藻、多纹拟菱形藻、尖刺拟菱形藻、拟柔弱拟菱形藻、成列拟菱形藻、中华拟菱形藻、P. subpacifica，P. subfraudulenta，P. turgidula共12种。其中有9种是潜在产毒种，在非中国海区均有产毒报道，它们是:澳洲拟菱形藻、细弱拟菱形藻、柔弱拟菱形藻、多列拟菱形藻、多纹拟菱形藻、尖刺拟菱形藻、拟柔弱拟菱形藻、成列拟菱形藻、P. turgidula。虽然陈西平等（2001）检测到中国渤海等海域部分海产品中存在低浓度的软骨藻酸，李大志等（2002）也报道大连海域黑石礁省区的扇贝受到了软骨藻酸的污染，但是尚无关于中国海域拟菱形藻产生软骨藻酸的直接相关报道。[56-62]
在以下区域的贝类样品中发现有软骨藻酸的存在：北美、新西兰、日本、丹麦、苏格兰、法国、西班牙、葡萄牙。虽然有毒拟菱形藻在世界各地的海岸都有分布，但在不同地区是有不同种的拟菱形藻（或混合种）占优势。（加拿大的爱德华王子岛东部是由P.multiseries 占优势；加拿大的Fundy湾是P.pseudodelicatissima；而在北美的西海岸则是P.multiseries，P.australis，和P.pseudodelicatissima共存；在荷兰是P.multiseries和P.delicatissima；丹麦是P.seriata；西班牙是P.australis；新西兰是P.australis和P.delicatissima。）而且这些种在有时在某地有毒性，在另一地则会无毒。（如P.pseudodelicatissima在加拿大的Fundy湾；P.delicatissima 源自加拿大东部，现在在丹麦和新西兰也发现有毒；P.seriata在丹麦。）虽然极为稀少，但仍然存在着有毒的P.pungens 菌株（只在太平洋中出现）以及无毒的P.multiseries 菌株，必须用最灵敏的检测技术才能确定是否有毒性。已知P.multiseries赤潮通常发生在较寒冷的季节（秋季到春季），而P.pungens，P.pseudodelicatissima和P.australis赤潮多发生在温暖的季节。Rhodes等在1996年发现新西兰某地生长的尖刺拟菱形藻（P.pungens）能产生DA，而该藻在新西兰的其它地区却不产毒；1994年Lundholm等发现原被认为不产毒的成列拟菱形藻在欧洲海域却产毒；而在加拿大Fundy湾等地发现产毒的伪优美拟菱形藻在澳大利亚的Tasmanian和Victorian海域却是无毒藻。共发现拟菱形藻属20多个种，可产毒者有7种，包括多列拟菱形藻、伪优美拟菱形藻、澳洲拟菱形藻、优美拟菱形藻（P.delicatissima）、成列拟菱形藻、尖刺拟菱形藻（P.pungens）和虚假拟菱形藻（P.fraudulenta）。其中多列拟菱形藻、伪优美拟菱形藻和澳洲拟菱形藻为普遍认同的3个产毒藻种。[63-65]
有报道东南亚诸岛红藻（C.armata）中DA的含量随季节变化而异，最高可达1000mg/kg，从该海域采集的其它红藻（如Jania capillacea、Coelothrix irregularis）中也含有大量的DA。日本产的贝类中至今尚未检出DA，可能是日本的贝类被DA污染的途径与北美和加拿大不同所致。公认的鱼贝类被DA污染的原因是生物链外因学说，即与赤潮发生有关。水中的贝类和鱼类对DA有较强的耐受力，它们可以富集藻类产生的DA，再经食物链的传递对所在地区的生态环境造成影响，人类食用被DA污染的海产品后即可引起中毒。在中国海域共发现拟菱形藻属的5个种，分别是:中国拟菱形藻（P.sinica）、亚太平洋拟菱形藻（P.subpacific）、多列拟菱形藻、伪优美拟菱形藻和尖刺拟菱形藻。其中伪优美拟菱形藻在厦门海域发现并大量存在，但是否产毒尚不清楚。中国对拟菱形藻属的研究主要集中在尖刺拟菱形藻上，中国近海尖刺拟菱形藻分为尖刺型（f.pungens）和多列型（f.multiseries）两个型，前者不产毒，后者产毒。尖刺拟菱形藻是中国沿海普遍存在的种类，并且是引发赤潮的重要种类，在大连、青岛、黄海长江口、厦门港及南海各港湾都引起过赤潮。1990年6月以来，中国南海大鹏湾多次爆发过尖刺拟菱形藻赤潮。赤潮生态研究结果显示，硅藻中的尖刺拟菱形藻和伪优美拟菱形藻是优势藻种，而且由尖刺拟菱形藻引发的赤潮最频繁，几乎全年都有发生，多出现于夏季。1997年7月-1998年6月对大亚湾海域拟菱形藻种群的研究发现，大亚湾水域的优势藻种为拟菱形藻属的尖刺拟菱形藻和伪优美拟菱形藻，一年四季均有出现，其中秋季、春季为两个高发期，最高频发次数出现在秋季，达1.80×106cells/L。而适宜在较冷环境中引发赤潮的多列拟菱形藻未检测到，可能与该地区水温较高有关，在水温较低的香港海域发现有该藻的存在。[66-67]
毒理学
作用于谷氨酸受体软骨藻酸是一种混合性兴奋剂，可直接或间接激活谷氨酸受体。脊椎动物中枢神经系统至少有3种突触后谷氨酸受体亚型：（1）N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA，N-methyl-D-aspartate NMDA）受体亚型，（2）α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸盐（AMPA，α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionate）受体亚型和（3）红藻氨酸（kainate或kainic acid，KA）受体亚型。这些受体分布在中枢神经系统的不同区域中并且在不同的生理条件下被激活。[68]  软骨藻酸对神经胶质细胞HO-1蛋白表达的影响[69]
利用培养的鼠新皮质神经元研究软骨藻酸的神经毒性行为，发现这3种谷氨酸受体进行性参与神经毒性:（1）间接激活NMDA受体参与神经毒性，（2）由AMPA受体介导的毒性，（3）当受体的脱敏作用被阻断时，可由KA受体介导神经毒性。软骨藻酸的剂量-反应关系研究表明，软骨藻酸可活化KA和AMPA受体，亲和力分别约为5和0.07μmol/L。KA受体系统的一个明显特性是，它在海马CA3区大量表达。许多动物实验研究发现它的失控激活可导致癫痫发作和选择性神经元损伤。体外培养12 d的大脑皮层神经元经软骨藻酸染毒处理后，有MK-801（一种NMDA受体拮抗剂）和GYKI53655（一种选择性AMPA受体拮抗剂）存在时，可观察到小却显著的神经元毒性作用，表明此种毒性是由KA受体介导。研究认为可引起明显神经元毒性剂量水平的软骨藻酸的作用是通过KA受体的过度激活或兴奋毒性刺激而中断兴奋性氨基酸系统，从而损伤学习和记忆功能。Jensen等发现，当GYKI53655存在时可部分消除软骨藻酸引起的神经毒性，这表明AMPA受体介导部分神经毒性。[70-71]
MK-801能阻断部分软骨藻酸毒性，有人推测NMDA受体间接参与软骨藻酸的毒性作用，可能是软骨藻酸作用于神经细胞促进谷氨酸释放，释放的谷氨酸继发激活NMDA受体。在一定的受体位点，阈值水平的软骨藻酸可能引起内源性兴奋氨基酸的过量释放，例如谷氨酸和天冬氨酸，这些内源性神经递质可能会增强软骨藻酸对小鼠脑组织NM-DA受体位点的反应程度。因此当软骨藻酸的浓度不足以引起神经毒性时，如有NM-DA受体兴奋剂的存在，同样能够引起神经毒性，因此Antonello等推测，大脑中亚毒性剂量的软骨藻酸通过持续增强内源性兴奋性氨基酸作用于NMDA受体而引起癫痫。在脊椎动物中枢神经系统中，谷氨酸、天冬氨酸是主要的兴奋性神经递质，γ-氨基丁酸是一种重要的抑制性神经递质。谷氨酸是γ-氨基丁酸的前体。软骨藻酸可通过促进谷氨酸、天冬氨酸等释放，抑制谷氨酸摄取及抑制谷氨酸脱羧酶等过程来增加细胞间谷氨酸水平。Dak等曾发现软骨藻酸可促进大鼠海马切片释放谷氨酸，Cunha等报道，3μmol/L软骨藻酸可抑制24%的γ-氨基丁酸释放。给妊娠小鼠尾静脉注射软骨藻酸，可致后代海马功能发生重大损害，并伴随有大脑皮层和海马γ-氨基丁酸水平下降，而谷氨酸水平升高。释放出的谷氨酸有助于进一步地兴奋毒性损伤，如可加剧软骨藻酸对分离鸡胚视网膜的神经毒性作用。在纹状体神经元，KA受体的激活可抑制γ-氨基丁酸的作用[5]。谷氨酸介导的损伤主要是经过NMDA受体介导的，软骨藻酸直接激活AMPA/KA受体释放谷氨酸和天冬氨酸，谷氨酸和天冬氨酸再激活NMDA受体从而产生兴奋毒性。总之，完全程度的神经元衰退是经NMDA受体和非-NMDA受体（AMPA受体和KA受体）协同作用产生的，软骨藻酸与谷氨酸等内源性氨基酸协同作用以增强其神经毒性。[72-73]
NMDA受体与突触的可塑性和学习、记忆密切相关，通过该受体本身、其共轭的离子通道（即NMDA通道）及调节部位三者形成一复合体而发挥功能。每个NMDA受体上含有2个谷氨酸和2个甘氨酸结合识别位点，谷氨酸和甘氨酸均是谷氨酸受体的特异性激活剂。1991年，日本Nakanishi实验室首次从大鼠脑中成功地克隆出了一种NMDA受体亚基的cDNA（NMDAR1）。此后，人们又相继克隆出了4个新的NMDA受体亚基的cDNA（NMDAR2 A-D）。NMDAR1可单独形成功能性纯寡聚体NMDA受体，但NMDAR2亚基却不具备该功能。当NMDAR1与不同的NMDAR2共同表达后，由谷氨酸诱导的电流比对仅NMDAR1独自表达诱发的电流大数十倍到上百倍，此特性表明NMDA受体可能是由NMDAR1和不同的NMDAR2亚基组成的一个异寡聚体。NMDAR1是由938个氨基酸残基组成的跨膜蛋白，分子量为105kD，有4个跨膜区。1992年，Novelli等发现，含软骨藻酸的蚌类对神经培养物的损害与兴奋性氨基酸有协同作用，而且他们的资料表明，亚毒作用剂量的软骨藻酸能促进谷氨酸和精氨酸的兴奋毒作用。该协同毒性作用可能是通过降低Mg2+对NMDA受体离子通道的阻碍效应而实现的。Berman等在体外培养的神经元中，利用KA/AMPA及NMDA受体抑制剂，研究了软骨藻酸对小脑颗粒细胞的毒作用机制。他们的资料显示，由于NMDA竞争性和非竞争性拮抗剂均能降低软骨藻酸诱导的内源性兴奋性氨基酸的外流，所以NMDA受体不仅能介导大部分软骨藻酸引起的神经损伤，而且是兴奋性氨基酸外流的一个主要部位。这些结果更直接地支持了Novelli等人的观点。Berman和Heron等还发现，暴露在软骨藻酸下，内源性腺苷能抑制谷氨酸的释放。但是，软骨藻酸和内源性腺苷相互作用的机制还不十分清楚。软骨藻酸能促进谷氨酸和精氨酸的释放，而释放的谷氨酸和精氨酸又可激活NMDA受体，进而促进内源性兴奋性氨基酸的释放。所以软骨藻酸可协同性地加强谷氨酸/精氨酸介导的神经兴奋作用。NMDA受体激活后，细胞外的Ca2+大量进入细胞，细胞内钙库贮存的Ca2+大量释放，引起细胞内Ca2+过负载，造成细胞损伤。高浓度的Ca2+可活化与NMDA受体NR1和NR2B亚基结合的钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ（Ca2+/CaM-dependent proteinkinaseⅡ，CaMKⅡ），CaMKⅡ又能磷酸化AMPA受体，进而提高该受体通道的敏感性。[74-77]
KA/AMPA受体是最重要的离子型非NMDA型兴奋性氨基酸受体。AMPA受体家族包括4个结构极为相似的亚基，各亚基的氨基酸序列的同源性高达70%。由于氨基酸残基疏水性分布，在靠近羧基端的部分构成4个跨膜区。AMPA、L-谷氨酸及KA均可激活这类离子通道，并有AMPA的高亲和力结合位点。天然AMPA受体是一个仅由这4种亚基组成的五聚体，每个单体的分子量为108kD。AMPA受体的4种亚基在第4个跨膜区的上游均含有1个由38个氨基酸残基组成的特殊区段，该区存在2个结构相似区，分别由受体基因上2个相邻的外显子编码。但各亚基的DNA编码在翻译后要经过一些如磷酸化、糖基化及棕榈酮化等修饰，这些修饰是通道功能重要的调节方式。离子型谷氨酸受体功能的多样性是通过不同亚基的组装、选择性基因接合、转录前mRNA的编辑等方式来实现的。特别对于AMPA和KA受体，它们不同于NMDA受体，还要通过RNA编辑进行特殊的修饰。最近发现通道小孔区的氨基酸是编辑酶的作用位点，所以该部位的修饰会影响到离子的通透性。人们继续研究发现，在AMPA受体GluR5亚基或KA受体GluR5和GluR6亚基的通道小孔区内或附近关键位置的RNA编辑，将中性的谷氨酸替换成带正电荷的精氨酸，谷氨酸和精氨酸的互换会引起Ca2+的内流。成年大鼠的GluR2基因全部经过编辑，而GluR5和GluR6编辑不完全，分别为39%和75%。这种现象可能与编辑有关的腺苷脱氨酶识别和碱基配对所需的特定内含子序列的位置有关。GluR2的内含子序列在谷氨酸-精氨酸互换点的位置附近，而GluR5和GluR6的内含子序列却远离该互换点1900个核苷酸。Seeburg等人研究发现，AMPA受体的电导性和通透性由GluR2决定，这是因为GluR2的第2个跨膜区与其它3个亚基不同，谷氨酸突变为精氨酸。他们还发现，AMPA受体各亚基的基因编码中，谷氨酸/精氨酸位点均是谷氨酸的编码。正是由于高度特异性的mRNA编辑才实现了定点突变。结果提示脑细胞具有选择表达含未编辑GluR2亚基，从而实现选择对Ca2+通透的AMPA受体数量的能力。[78-82]细胞内钙离子超载兴奋毒素最初通过过度激活谷氨酸受体参与神经元去极化而干扰神经元的调节机制，导致离子渗透压和电化学的改变，最终引起细胞的死亡。神经毒理学研究表明，软骨藻酸作用于谷氨酸受体丰富的神经细胞，特别是海马和锥体细胞，导致大量细胞外Ca2+内流，细胞钙稳态发生异常改变，信号转导紊乱；可引起能量代谢障碍，从而引起神经细胞发生退行性变化。[83-84]
NMDA受体介导细胞内Ca2+浓度的升高是兴奋性氨基酸介导的神经元损伤和死亡的一个重要原因。然而非NMDA受体通过细胞膜去极化和激活电压依赖性Ca2+通道也能引起细胞内Ca2+升高。当神经元去极化，结合软骨藻酸的AMPA受体打开了配体门控离子通道允许Na+内流，K+外流，氯化物随Na+进入细胞，随后在渗透压的作用下水也内流；这样就产生了长时间的突触后肿胀，继之造成细胞内钙离子超载并发展为持久的神经元损伤。而Bureau等发现星形胶质细胞的AMPA受体对Ca2+有渗透性，Ca2+可通过AMPA受体通道直接进入细胞。KA受体的过度兴奋引起癫痫活动的扩散，通过内源性谷氨酸致使其它谷氨酸受体包括NMDA受体激活，可引起大量细胞去极化，并激活电压依赖性Ca2+通道促使细胞内Ca2+升高。长时间的细胞内游离Ca2+的升高是有毒的，并且最终引起神经元变性。NMDA受体激活后细胞外的Ca2+大量进入细胞，细胞内钙库储存的Ca2+大量释放，引起细胞内Ca2+超载，造成细胞损伤。而AMPA/KA受体介导的去极化也可能通过降低Mg2+对NMDA受体离子通道的阻碍效应而提高胞质内游离Ca2+浓度。同时，由软骨藻酸刺激释放的内源性谷氨酸也与NMDA受体相互作用促使突触后膜去极化，引起电压依赖性Ca2+通道和兴奋剂激活的Ca2+通道的开放，促使Ca2+大量内流，造成细胞内钙积聚，结果引起细胞坏死。NMDA受体的电压依赖本质及其与第二信使钙离子的作用相结合，在学习记忆机制中起主要作用。[85-87]能量代谢紊乱局部大脑功能活动与局部大脑葡萄糖代谢率相关。在软骨藻酸中毒人群中，用正电子发射体层摄影术观察到在海马和杏仁核的葡萄糖代谢率降低。在一定的病理条件下，神经元不具有足够的代谢能量来维持正常的静息膜电化学梯度。当神经元胞体表面或树突附近谷氨酸过量时，产生神经元去极化和胞浆膜渗透性持续性升高，随后细胞离子组成不平衡激活了利用能量维持功能的膜泵。由于胞浆内游离钙过多，随后进入和积聚在线粒体内，损伤氧化磷酸化，造成ATP合成不足；另一方面由于肌纤维、肌浆网和线粒体中钙依赖性ATP酶的超常活动，使ATP消耗增多。而神经元的持续激活将导致储存能量的不可逆衰竭和神经元细胞不能维持离子平衡。这必然导致细胞功能和结构的破坏，通过细胞离子成分的改变有可能伴随着水运动的改变，导致胞浆空泡的形成，细胞肿胀，最后组织坏死。另外，由于缺少ATP而使Ca2+-ATP酶活性降低，这似乎有助于促进软骨藻酸升高细胞内Ca2+水平。由兴奋性氨基酸引起的神经毒性在低能量的神经元大大增加，因此软骨藻酸对年纪大的人的危害更严重。[88]
软骨藻酸能促进谷氨酸、天冬氨酸释放，抑制谷氨酸摄取及抑制谷氨酸脱羧酶增加突触间隙谷氨酸浓度。谷氨酸、天冬氨酸是最为重要的兴奋性氨基酸递质。中枢的谷氨酸并非来自外周，主要是在中枢以谷氨酰胺为前体在谷氨酰胺酶作用下自身合成。同时激活代谢型受体，导致细胞内三磷酸肌醇和甘油三脂形成增加，胞内储存的Ca2+释放，进一步提高胞内Ca2+水平，导致钙稳态失衡，从而引起神经兴奋和（或）兴奋性毒性。实验中，细胞在中、高剂量的软骨藻酸作用2h后，释放出胞外的天冬氨酸和谷氨酸显著升高，这与Ross等报道的软骨藻酸引起大鼠胶质细胞兴奋性氨基酸升高相一致，提示软骨藻酸确可引起胶质细胞兴奋性氨基酸升高。各剂量软骨藻酸均使胞内[Ca2+]升高，且有明显的剂量-效应关系，提示软骨藻酸对[Ca2+]变化的影响比对氨基酸释放影响更加敏感。兴奋性氨基酸浓度与胞内[Ca2+]有高度的相关性，胞内[Ca2+]蓄积可通过CaM或直接作用于细胞膜，最终导致神经细胞膜的通透性增高，水分增多，细胞肿胀损伤。同时，胞内[Ca2+]浓度的升高和细胞的肿胀有直接促进兴奋性氨基酸的释放，从而加重兴奋性神经毒性。[89-90]
抑制性氨基酸表现为抑制效应，与兴奋性氨基酸共同作用调节神经系统的兴奋性和兴奋毒性。γ-氨基丁酸（GABA）是中枢神经系统主要的抑制性神经递质，通过谷氨酸脱羧酶（glutamic acid devarboxylase，GAD）催化谷氨酸脱羧而成，主要通过线粒体的GABA-α-谷氨酸转移酶分解代谢再生成谷氨酸。实验中，各剂量组GABA均比对照组显著下降，呈剂量-效应关系，与Sobotka等报道的软骨藻酸抑制GABA释放相符，可能是由于胞内GABA的前体---谷氨酸浓度降低所致。甘氨酸变化不显著，仅高剂量组较对照组明显升高。研究中发现甘氨酸与兴奋性氨基酸递质升高的同步性揭示甘氨酸在软骨藻酸的兴奋性神经毒性中可能也发挥着一定的作用。另外，研究提示在软骨藻酸的兴奋性神经毒性中，兴奋性氨基酸发挥主要作用，抑制性氨基酸起协同作用。[91-92]
检测方法
小白鼠生物检测法该法是根据美国公职化学家协会（AOAC）所标定的麻痹性贝中毒（PSP）的小鼠生物分析法加以变化的，是最早用于DA检测的一种经典方法。其原理是将毒素注射入小白鼠体内，根据注射后小鼠的存活时间和中毒症状来评价毒性，一般用半致死剂量表示。1987 年该方法首次应用于加拿大DA 中毒事件中DA 的测定，结果显示该方法适于检测贝类组织中高浓度的DA（高于30μg/g），DA 浓度较低时无法检测（低于20μg/g）。[93]
该法更加注重研究DA的毒性效应和毒理研究。这是一般其他方法无法取代的，而且采用小白鼠生物检测法可以检测一些未知的毒性物质，通过半数致死剂量来评价该物质的毒性效应，因此小白鼠生物检测法在各个国家仍有很广泛的应用。但是，该方法的检出限较高，适用于检测贝类组织中高浓度的DA（300-1000μg/g），不适用于DA含量低于20μg/g组织的检测。[94]
小白鼠生物检测法方法检测周期大于24h，特异性较差，干扰因素较多，样品处理为粗略提取，样品批次单一。小白鼠生物检测法检测DA是最早使用的一种方法，但是其试验结果受外部影响因素较为复杂，试验结果与小白鼠的品系和试验者本身操作有很大关系，并且小白鼠生物检测法一般要有至少1d的检测周期，该方法的检出限较低。此外，小白鼠生物法仅能测定毒性的大小，无法确定毒素的组成和各成分的含量。小白鼠生物检测法最大的局限性是小鼠本身造成结果的高变异性和低敏感性，而且对鼠种的要求较高。[95]高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）是检测DA应用最广的方法，已被多国列为国家标准方法，中国国家标准中规定使用反相高效液相色谱法检测海产双壳类贝肉、贝柱、外套膜及其制品（不包括盐渍制品）中的DA含量，该方法检测限为1μg。生物分析法注重的是样品毒性的分析，其专一性和灵敏度低，而高效液相色谱法则能灵敏、快速、准确地确定各种毒素成分，被广泛用于研究和确认实验。HPLC检测DA是利用其在242nm处具有最大吸收值的特征使用紫外或二极管检测器进行检测，或者将DA衍生后通过荧光检测器进行分析，或使用质谱进行检测。高效液相色谱的检测器有紫外检测器、荧光检测器和质谱检测器，由于贝类提取液中干扰组分复杂，光度检测往往不能提供化合物的充分结构信息，因此会引起假阳性的结果。高效液相色谱法检出限低，方法成熟，但仪器昂贵、笨重，一次只能测定一个样品，不适合快速现场检测。对设备条件要求较高，也不能大量用于基层的日常监测工作。[96-98]软骨藻酸HPLC曲线(3张)
软骨藻酸HPLC曲线参考文献。[55][99]
DA-HPLC检测DA的方法主要有两大类，一种方法是贝类样品被提取后，经浓缩纯化后进行HPLC配紫外检测器（HPLC-UVD）分析。由于DA在242nm的紫外光谱区有最大吸收峰，因此反相高效液相色谱（RP-HPLC）-UV可有效而快速地对样品进行分离和检测，其基本原理是使用酸性流动相以抑制羧基的电离作用，并选用C18键合硅胶柱分离DA及其衍生物。HPLC-UVD法特别适用于分析贝类组织内的DA含量，其检测限在10-80ng/ml之间，且依提取和提纯方法的不同而异，如粗提取物未经提纯，其检测限约为1μg/g，适用于毒素含量超过20μg/g的检测。水中DA的检测与样品量及藻类的含量和种类等因素有关。另一种方法是针对海水和硅藻中DA进行的甲氧基芴甲酸（9-fluorenylmethyloxycarbonyl，FMOC）衍生化/HPLC配荧光检测器（HPLC-FLD）法，该法在DA分子上引进了荧光基团而使FLD检测的灵敏度提高，对海水中DA的检测限为1.5pg/ml。Hummert等提出了柱切换系统，它能有效降低提取物中的干扰，直接分析粗提的样品，省去了复杂的样品预处理过程。流动相的配比影响DA的保留时间，随着流动相中乙腈比例的减小，DA保留时间增加，DA色谱峰对称性增强，DA与DAC′5非对映异构体分离度增大。中国报道用RP-HPLC-UVD测定贝类中DA，经甲醇:水（1：1）溶液提取，强阴离子（stronganion exchange，SAX）固相萃取柱净化，C18反相色谱柱分离，流动相为乙腈:水（13：87），242nm波长下检测，最低检出限为0.2μg/g，在1.0-25.0μg/ml范围内有良好的线性关系，平均回收率为（97.23±2.43）%。流动相采用甲醇:水（22：78，pH2），最低检出限为10ng（1.0μg/ml），检测范围50-250ng（5-25μg/ml），DA的回收率可达（99.9±2.4）%。另有报道流动相为甲醇:乙腈:三氟乙酸（80：20：0.1），最低检出限为10ng（1.0μg/ml），在1-40μg/ml范围内线性关系良好。[100-103]
高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV）特别适用于贝类组织中DA含量的测定，尤其适用于毒素含量超过20μg/g的情况。Lawrence等人建立[以及Quilliam等改进的HPLC-UV法采用了反相C18柱在242nm处检测DA，该方法已被英国、爱尔兰等国定为标准方法。后来，又有一些研究人员对此方法进行了改进。López-Rivera等建立了一种不需要固相萃取预处理检测DA的HPLC-UV法，通过等梯度淋洗以及控制流动相pH来分离化合物，结果表明，最佳pH为2.5，方法检测限为25ng/mL。该方法快速、灵敏，能成功检测大批量贝类样品。HPLC-UV法已经被很多研究人员用来检测贝类等动物组织中的DA含量。Costa等用HPLC-UV法检测了葡萄牙海岸的两种章鱼E.cirrhosa和E.moschata体内DA的含量，结果表明，DA含量超过了100μg/g，其中，E.moschata体内毒素含量更高，表明DA可能通过食物链由这种章鱼体内进入更高级消费者如人类体内，潜在危险性更大。中国对DA的检测大多采用HPLC-UV法，张一兵等在借鉴国外方法的基础上应用高效液相色谱-紫外可见检测法（HPLC-UVD）进一步优化了DA的高效液相色谱-紫外检测法，选定pH2的甲醇/水=22∶78（V/V）为流动相，LC-SAX作为浓缩纯化柱，检出限为10ng，回收率达到92%-94%。陈西平等采用该方法检测了部分水及水生动物中DA的含量，回收率达到70%-93%，检出限为10ng。结果表明，虽然在海水及地面淡水中未检出DA，但部分海洋贝壳动物体内有检出。因此，随着海洋污染的加剧，现阶段中国的DA污染问题不容忽视，应加强对其污染状况的监测。[104-108]
高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）联用技术可以不使用衍生试剂和毒素标准品，相比其他检测器，具有很大的优势。然而本方法对设备条件要求较高。Lawrence等建立的高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱法（HPLC/ESI-MS）法是一种高灵敏度、高选择性的方法，被应用到了环境中各种介质的检测中，并被后人不断改进，但是这种方法对样品预处理的要求较高。宋琍琍等参考了这种方法来测定DA残留。样品经50%甲醇提取，LC-SAX 柱净化，然后选用电喷雾离子源进行测定分析，该方法的定量限为0.02μg/g。Pardo等采用加压湿法萃取（PLE）来提取DA，然后用液相色谱-电喷雾电离双质谱（HPLC-ESI-MS-MS）法来检测DA，电离源采用电喷雾可以提高分析信号，方法经过优化后回收率在81%至95%之间，他们用此方法成功检测了46个西班牙超市里的贝类样品，表明该方法能进行大批量检测。Wang 等采用LC-MS 对水样和浮游植物中的DA 进行了定性和定量分析，样品预处理采用C18柱进行固相萃取，结果表明，酸性条件有利于在C18 柱上保留亲水性的DA，加标水样的回收率超过了90%，浮游植物样品的回收率则接近98%，方法检测限为0.03ng/mL。Iglesia等也采用LC-MS法检测了海水中的DA及它的异构体，但样品预处理采用的是固相萃取盘，该方法的检测限为0.02ng/mL，回收率为92.1%-110.6%，用此方法能检测海水中的痕量DA。Vale等利用HPLC-MS的方法，以1+1的甲醇溶液作为洗脱液，对葡萄牙鱼类和贝类体内的软骨藻酸含量进行测定，结果表明在春季样品中DA含量最高；在分析的众多样品中，蛤仔和鸟蛤被软骨藻酸污染最为严重，紫贻贝和牡蛎等物种受污染较轻。陈燕青等利用HPLC-MS法测定虾夷扇贝和长牡蛎中软骨藻酸的残留，样品经浓度50%甲醇提取，LC-SAX柱净化，3ml0.1mol/L甲酸溶液洗脱，电喷雾离子源（ESI），在正离子、多反应监测方式（MRM）模式下进行定性与定量，该方法的检出限达0.01μg/g，线性范围为0.02-10.00μg/g。[109-114]
高效液相色谱-荧光检测法是使用衍生剂将DA衍生成含荧光基团的物质，用荧光检测器进行检测，在DA分子上引入荧光基团可使方法的灵敏度提高。检出限可达到pg/ml。Maroulisb等利用柱后衍生法测定DA，加入4-氯-7-硝基-2，1，3-苯并氧杂恶二唑（NBD-Cl）与DA上的氨基反应生成荧光基团，提高了荧光检测检测器（FLD）的灵敏度，荧光检测器激发波长设为469和529nm，检出限低至25μg/kg。James等使用NBD-F来衍生化DA，用等梯度淋洗程序分离化合物，激发波长为470nm，发射波长为530nm，方法检测限高于1ng/mL，贝类组织中DA的回收率>95%，当用强阴离子交换SPE柱萃取DA时，检测限达到6ngDA/g贝类组织。Chan等参考了这种方法来检测DA，但他们改进了样品预处理方法，即在SPE柱中加入TiO2，可以更好地吸附DA，并探讨了最佳pH，结果表明，吸附的最佳pH为4，解吸时pH则为11，吸附平衡时间为2小时，最佳吸附剂装载量为0.67mgTiO2/ngDA。Maroulis等采用NBD-Cl柱后衍生DA进行检测，成功测得了贝类组织中DA含量为75μg/kg的样品，该方法检测限低至25ppb，能实现全自动化分析，对样品预处理要求低，干扰少。由于大多数衍生试剂价格昂贵、不稳定，且其分解产物可能出现在色谱图中，同时衍生试剂的变质也可能导致毒素的不完全衍生化，因此荧光检测法的实际应用很少。[115-116]酶联免疫分析法免疫分析法（ELISA）是基于抗体与抗原或半抗原之间的高选择性反应而建立起来的一种生物化学分析法，即根据抗原-抗体反应，采用特异性贝类毒素的抗体来检测DA。免疫分析法主要包括酶联免疫法、放射性免疫法、荧光免疫法等，具有方便、快速的特点，但缺点是费用较高，而且各毒素之间的交叉反应低，不能全面体现出样品的毒性。检测DA所采用的免疫分析方法主要是酶联免疫吸附法（ELISA）。ELISA是利用抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后的显色反应判定结果，是应用最广泛的免疫学检测技术，由于其实验结果可用目测，也可用酶标仪测定光密度值以反映抗原含量，所以有易定性定量的双重优点。Engvall和Perlmann于1971年最先应用该法进行IgG定量测定，并命名为Enzyme linked immunosor-bentassay（ELISA）。由于ELISA方法灵敏，特异性强不需要特殊设备，被广泛应用于各种抗原和抗体测定。将ELISA应用于DA的检测中，利用原-抗体反应，采用特异性贝类毒素的抗体来检测DA。[117-121]
Yu等采用匙孔血蓝蛋白（KLH）和小牛血清蛋白（BSA）为载体，进行直接酶联免疫测定，结果表明，蓝贻贝样品的检测限<25ng/g，回收率为81.1%，Yu等还将实验结果用HPLC方法进行了验证，最终发现15种被污染的贝类样品中有10种样品的DA含量<50ng/g。Maucher等结合ELISA技术使用血液采集卡来提取小鼠血液中的DA，这种方法可以避免DA在血液中被清除。一般说来，在4小时内，99%的DA会从血液中被清除，但使用该方法后，DA在24小时内仍然能被检测到。该方法灵敏度高，用血液采集卡提取样品方便，因此可用此方法来监测海洋哺乳动物体内的DA含量。Tsao等采用单克隆抗体ELISA检测法检测DA，并建立了基于单克隆抗体的胶体金免疫条检测法，免疫条检测法的检测限为5ng/mL，在十分钟内就可完成检测。Tsao等的实验结果表明，用免疫条检测得到的结果与用ELISA方法得到的结果有很好的吻合性，可以用来快速检测贝类样品中的DA。另外，Shaw等建立了基于基因工程单链抗体（scFv）竞争ELISA检测方法，相比传统方法，这种方法具有很多优势，基因工程单链抗体（scFv）可以在大肠杆菌中快速、大量地得到表达，且容易和其他小分子融合，形成融合蛋白以用于检测或其它用途。用该方法检测天然扇贝组织得到的数据与标准HPLC方法检测的结果基本相符。大多数ELISA法采用的都是直接法，而许道艳等则以DA-OVA为包被抗原，利用抗原抗体反应，建立了间接竞争酶联免疫吸附技术分析检测海水样品和海洋贝类中DA的方法。结果表明，该方法最低检出限为10μg/L，海水样品平均回收率为102.2%，贝类样品平均回收率为111.5%。ELISA方法能够进行批量检测，但特异性较差，因而主要用于DA的初步筛选。由于DA标准品昂贵，且DA分子量太小，因此制备免疫抗原较困难，从而限制了免疫方法在DA分析中的应用。[17][120][122-123]毛细管电泳法毛细管电泳法的基本原理是不同荷质比的带电粒子在电场中具有不同的迁移速度，以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，以样品的多种特性（电荷大小、等电点、极性、亲和行为、各组分之间淌度、相分配特性等）为依据的液相分离分析技术，然后再经过荧光或紫外检测器进行检测。该方法具有操作简单、分离速度快、灵敏度高、运行成本低等优点，是贝类等生物体内DA含量常规检测较理想的方法。Zhao等建立了毛细管电泳-紫外检测法来检测海洋食物中的DA，首先用SPE提纯，使用了强阴离子交换柱和强阳离子交换柱，避免了基体中色氨酸的干扰，然后用CE-UV在242nm处检测，该方法能用于检测贻贝、缢蛏、凤尾鱼等样品，最低能检出150ng/gDA。但是在实验同时发现毛细管电泳法的灵敏度要比液相色谱法（检测限20ng/g）低。李大志等也采用这种方法对2001年5月在大连海域（黑石礁海区）采集的5种贝类进行分析，结果表明大连海域黑石礁海区的扇贝受到了DA的污染。Kvasnika等则建立了一种在线毛细管等速电泳-毛细管区带电泳法来检测贝类和藻类中的DA。该方法优化了电解液系统，使DA能在25分钟内从甲醇提取液中分离出来，检测限为1.5μg/L。[14][124-127]  软骨藻酸毛细管电泳色谱[128]液质联用法液质联用（LC-MS/MS）技术几乎可以分析所有的贝毒。液质联用依赖于高效液相色谱把贝毒成分通过离子化带到质谱中。电喷雾电离源（ESI）和大气压化学电离源（APCI），这两种技术都已经应用于贝毒分析。由于食品（动物组织）的背景非常复杂，样品间差异又相当大，采用LC-MS（MS/MS）技术测定食品中贝类毒素的关键是样品的前处理。国外文献方法多采用甲醇-水溶液提取，然后固相萃取法进行净化与浓缩，最常用的固相萃取柱有Cl8烷基键合硅胶柱，CN柱和离子交换柱，最常用的是阴离子交换柱，非键合硅胶柱也有很好的纯化和萃取效果。此外还有溶剂提取方法、液相色谱制备法和超临界流体萃取法等。食品（水产品）中的贝类毒素残留量甚微，一般为μg/kg水平。2005年方晓明等利用液相色谱四极杆-飞行时间质谱（LC/Q-TOFMS）联用技术对贝类样品的失忆性贝毒进行了研究。样品经甲醇/水（体积比为1：1）提取，经SAX固相萃取柱净化后，用Zorbax Eclipse XDB-18柱（250mm×2.1mm，3.5μm）色谱分离，以乙腈/水含0.05%甲酸水溶液作流动相，梯度淋洗，流速为0.20mL/min。Q-TOFMS选择电喷雾正离子模式，以[M+H]+作为前体离子进行TOFMS扫描。结果表明：样品加标的平均回收率为87.8%-94.6%，相对标准偏差为8.4%-11.9%，检测低限（LOQ）为0.1μg/g。由于Q-TOFMS具有高分辨率，能进行精确测定而不降低灵敏度，因此本方法作为对贝类样品中失忆性贝毒的确证分析方法具有高灵敏度和选择性。2003年HollandPT等用LC-MS/MS的方法测定了贝类中软骨藻酸和其异构体的含量，以甲醇/水（体积比为1：1）作为提取剂，以乙腈/水（体积比为1：1）作为稀释剂，经SPE固相萃取后，用C18柱色谱分离。选用了4种不同的贝类，当软骨藻酸在样品中的含量为1μg/g贝-2μg/g贝时，软骨藻酸的回收率为93%（RSD大于7%）。2007年PardoO等用甲醇/乙腈（体积比为9：1）作为提取剂，经PLE萃取后，通过电喷雾电离（ESI）界面与质谱联用（ESI-MS-MS）分析测定软骨藻酸。使软骨藻酸在0.05-5μg/mL范围内具有良好的线性关系，相关系数r=0.999；当方法检出限为0.2μg/g，回收率为81%；当方法检出限为0.5μg/g，回收率为95%。此方法成功应用于46个贝类样品的检测中。2007年WangZH采用离子碎片的方式，使用多反应器，以甲醇/水（体积比为1：1）作为提取剂，以乙腈/水（体积比为1：1）作为稀释剂，用4mL0.15%甲酸洗脱，经SPE固相萃取后，用C18柱色谱分离，当检测浓度为30pg/mL，使得回收率从90%提高到98%，建立了一种定量和定性的方法。[129-130]