标题：电喷雾萃取电离质谱
原理和装置
经典质谱离子化技术包括电喷雾电离（ESI，Electrospray ionization）1、大气压化学电离（APCI）2、基体辅助激光解吸电离（MALDI）3、电子轰击电离（EI）4和化学电离（CI）3等虽然各有优点，但也有一些共同的特点，包括：1）封闭式电离，分析样品需要封闭在一定的管道（如ESI，APCI）或者一定的真空环境（如经典的MALDI, EI, CI等）中；2）需要样品预处理，不同物质形态的样品均须经过2步以上的预处理才能转化成为分析样品，供后续的ESI/APCI-MS分析。
根据能量守恒和电荷不灭的基本原理可知，能量传播和电荷传递可以在常压条件下进行。以此为出发点，结合实验研究过程中的大量事实总结出复杂基体样品直接离子化的基本工作模式大体分为二维模型和三维模型（如图1 a所示）两种类型。在离子化过程中，不同类型的能量源（如光子，电场等）通过关键步骤①作用于特定载体（如试剂，微小液滴等）使其形成具有一定能量的带电体（如初级试剂离子，带电液滴等），然后采用一定手段将此电荷和能量的载体与二维表面或三维空间中的原生态样品直接作用（关键步骤②），在相对开放的空间内把能量和电荷传递给待测物分子，完成待测物的离子化，最后形成的待测物离子进入质谱仪进行后续分析。
图1 b图示了三维模型下电喷雾萃取电离（EESI）5, 6技术的工作原理和基本过程。在步骤①中将电场的能量转移到带电的载体中，这些载体在三维空间内与中性物质相互接触，发生能/荷传递作用，从而完成三维空间中待测物分子的离子化过程，即关键步骤②。
复杂基体样品在EESI离子源中被分散在一个相对较大的三维空间内，能量与电荷的传递以及中性物质的萃取和离子化过程均在此三维空间内完成。根据能量和电荷载体的不同，三维空间内可以根据需要发生选择性的萃取或化学反应，增加了该过程的灵活性。由于进一步分散了复杂基体，EESI对各种复杂基体的承受能力相比于二维模型进一步加强，并可对各种样品进行长时间的稳定监测，使得EESI成为实时、在线质谱分析的重要工具。独特的三维模型决定了EESI具有更高的灵活性和宽广的应用范畴，目前EESI已逐步成为生物活体分析、原位在线分析和远距离分析的有效质谱方法。诺贝尔奖得主、ESI技术发明人John Fenn教授也曾公开预言了EESI技术的广阔用途和良好分析性能7。二维模型与三维模型之间既存在本质的区别，在一定的条件下也可以相互转化（如图1 a所示）。如将液体样品滴加在固体样品的表面干燥后既可采用典型的二维技术如DESI，DAPCI等进行分析，也可以将液体样品直接引入到三维空间内利用EESI等三维技术进行分析。与此类似，于固体表面的样品可以直接采用DESI等进行分析，也可以采用中性解吸（ND）的办法将样品引入到一个相对开阔的三维空间内，然后采用
  图1 直接电离质谱的基本方式EESI技术进行分析。
图 1 直接电离质谱技术的基本方式； a 复杂基体样品直接电离技术研究的二维模型和三维模型；b 三维模型下EESI电离技术的工作原理和基本过程8, 9
在大多数的实验中，电喷雾萃取电离（EESI）装置主要由电喷雾通道和中性样品通道两部分以一定角度交叉组成，如图2所示。通过调节样品雾化管与质谱进样口的角度（α）、电离试剂雾化管与质谱进样口距离（a）以及两个通道间的角度（β）、距离（b），在合适的雾化气流速、电离试剂、电离电压等条件下对某些物质（如尼古丁等）甚至可以获得比ESI更好的检测限。与其它技术不同，EESI中，样品的主体与电场或带电粒子等隔离，不受刺激性试剂如甲醇、乙酸等的污染，而且是一种比ESI更温和的软电离技术10，能够在质谱分析时最大限度地保证样品不受试剂和操作环境的影响，从而在生物样品、化学反应体系、动植物的活体质谱分析，在活体代谢组学等方面具有巨大的应用潜力。
图2 EESI装置示意图 
  图2 EESI装置示意图
技术进展
EESI技术最早是为了实时在线地连续监测液体样品而发明的一种快速质谱分析技术，后来逐渐拓展到气溶胶、固体、胶体和粘稠物的分析，其分析对象已经涵盖了各种样品形态，在活体质谱分析和粘稠物分析中显示了较为优越的性能。为了将难以雾化的样品（如粉末、固体、粘稠物、非均相样品等）进行EESI-MS分析，一般可用合适的中性气流解吸出少量样品，并通过密闭的管道输送到EESI源中进行萃取电离，如图3所示。这种与中性解吸（ND）联用的ND-EESI11-16技术结合了样品解吸方法与三维空间内萃取电离的优点，并将采样与电离过程从时间和空间上截然分开，因此可作为远程分析，特别是恶劣环境如高温、低温、生物危害或放射性等进行远距离的质谱分析。此外，中性气体解吸采样技术是一种没有明显损伤的温和技术，在取样过程中可根据分析对象的需要采用氮气或氩气等惰性气体，对样品尤其是生物体无化学污染，对动植物生理或病理状态没有明显干扰，因此特别适合进行生物体表的活体分析。ND-EESI技术将采样和电离过程分开，通过中性气流对蔬菜、水果表面进行解吸采样，然后将采集的样品引入到EESI进行电离，可以进行在线分析和远程分析，对食品等样品没有化学污染和破坏作用。
图3 典型用于冷冻生物样品快速质谱分析的ND-EESI-TOF-MS原理示意图 
  图3 用于冰冻样品的典型ND-EESI-MS装置为了配合小型质谱仪器进行现场分析，Li等17开发可用于现场直接分析的新型纳升电喷雾萃取电离（nanoEESI）技术。这种新型的nanoEESI-MS技术装置无需辅助气体即可产生作为试剂离子的带电液滴，中性复杂基质样品则通过挤压手动喷雾器产生样品喷雾并从质谱仪入口的反方向导入，有效地避免了“脏”的样品污染或损伤质谱仪。由于不需要辅助气体或放电气体的设备（如钢瓶等），手动喷雾器价格便宜，甚至可以一次性使用，减少了样品间的交叉污染，易于集成和小型化，适用于复杂基质样品的现场分析。
应用进展
因EESI-MS所具有的独特优越性， EESI技术已逐步应用于食品、环境、药物、呼出气体等实际样品的分析，近年来EESI更进一步尝试应用于生物样品的活体分析中。
Li等17采用nanoEESI-MS法，无需样品预处理即可实现(1)牛奶中的三聚氰胺的现场直接测定，测定结果与DAPCI-MS法的测定结果相一致；(2)功能饮料（如红牛）的功能成分如牛磺酸、咖啡因、赖氨酸、肌醇、烟酰胺、维生素B6和软饮料（如可口可乐、百事可乐等）中的主要成分如咖啡因、磷酸、果糖和脱水果糖等的高通量、快速的现场测定。Hu等18采用nanoEESI-MS法快速、灵敏地筛检饮料中的可卡因等痕量禁用物质，检测限可达7~15 fg。Chen等19利用 ND-EESI对各种水果散发出的挥发物进行快速指纹图谱分析，实现了香蕉、葡萄和草莓成熟度的区分。与水果成熟度检测类似，根据微生物在鱼肉上代谢的生物胺，Chen等还成功地实现了鱼肉新鲜程度的区分11，并且检测出受大肠杆菌污染的蔬菜。
医药药品真伪和质量的好坏，直接影响着疾病的治疗效果。EESI-MS技术在原料药的质量检测、药品微生物检测、药品包装材料以及对成品的西药片剂、注射剂和中药的有效成份的检测中有重要应用。Gu等20采用nanoEESI-MS在无需样品预处理的情况下，直接喷雾即可实现对多种气雾剂药物的高通量检测，如：治疗疼痛的复方水杨酸甲酯苯海拉明喷雾剂、治疗哮喘的沙丁胺醇和硫酸特布他林气雾剂有效成分的现场快速测定，该方法对活性成分的检测限为10 pg/mL，单个样品检测时间约1 秒，可应用于药品质量的现场监测（如监测药品是否过期等）。
环境污染不仅影响人们的工作和生活，而且直接威胁人们的身体健康。随着生活水平的提高，人们对环境质量的要求越来越高。通过环境监测及时、准确、全面地反映环境质量状况，为公共安全、环境管理、环境科学研究提供依据。常压质谱技术与其它环境检测技术相比具有快速、现场、准确、灵敏的特点，在大气、水体、物体表面等中的痕量有毒、有害的化学品以及爆炸物的检测有广泛的应用。比如，Li等21采用EESI检测了塑胶等饰材建造的运动场地上方空气中的游离甲苯-2, 4-二异氰酸酯，具有操作简单，无需样品前处理，1 s内能完成单个样品的测定，无干扰，检出限低于0. 04% (S/N = 100, n = 5)等优点。Luo等9采用EESI串联质谱检测了天然水中的痕量铀，可获得铀的形态信息和同位素丰度，表明该方法不但可检测水体中铀的浓度，且可用于快速准确地筛查核武器试验现场，对核工业和核能的和平利用具有积极的作用。Li等17采用nanoEESI-MS法，无需任何样品预处理，可对杂环类农药百草枯和拟除虫菊酯类农药氯氰菊酯进行了现场快速直接检测，百草枯和氯氰菊酯的检测限分别可达10 ng/mL和6 ng/mL，均低于它们的工业排放标准（前者为0.1 μg/mL，后者为0.01 μg/mL）。
粘稠物在日常生活中很常见且在众多领域中发挥着重要作用，但是对基质复杂的粘稠物中的待测物的快速灵敏检测却一直是分析科学中极具挑战性的工作。Law等16采用改装的ND-EESI，如图4a所示，在无需样品预处理的条件下即实现了粘稠物的快速直接分析，并成功地将该方法应用于蜂蜜、橄榄油等复杂基质粘稠样品的快速直接分析以及粘性离子液体中化学反应过程的跟踪，不但为粘稠物的快速分析打开了一个窗口，而且使EESI-MS的应用范围得到了进一步扩展。
图4 用于分析粘稠物的ND-EESI原理与结构示意图， a) 用于粘度较小的粘稠液体分析的ND-EESI-MS的原理和结构简图b)用于粘度较大的粘稠物分析的ND-EESI-MS的原理和结构简图 
  图4 用于分析粘稠物的ND-EESI示意图对于粘度较大的粘稠物如牙膏，采用图4 b所示的ND-EESI-MS技术装置，将一定压力的氮气从牙膏的表面吹入其内部使产生一个小洞，非挥发性的待测物如二甘醇（DEG）等以气溶胶的方式被氮气带出产生样品喷雾，然后与EESI中的喷雾溶剂交叉并发生在线液-液萃取和电离，进行质谱检测15。由于DEG分子不容易直接离子化，为了提高DEG的离子化效率，可在喷雾溶剂中加入少量醋酸铵以产生大量的NH4+，而后所产生的NH4+与DEG分子发生选择性离子/分子反应，生成较强的离子配合物DEG + NH4+，从而有效的提高了DEG的检测灵敏度。实验结果表明，基于选择性离子/分子反应的ND-EESI-MS技术，无需样品预处理即可实现牙膏中非挥发性DEG的定量检测，定量范围可达5个数量级，检测限200 pg，单个样品分析时间不超过2秒，从而使得高粘稠物的快速测定或表征成为可能。该方法引起国外同行和媒体的重视22。
活体质谱分析是在不作任何预处理的情况下对活体样品直接进行质谱分析。目前原位活体分析主要包括生物体表的代谢分析、人或动物的呼吸气体分析。代谢产物的微量成份分析可为考察内在的生化过程提供有益的参考，揭示有关代谢动力学的相关信息，尤其是对生理病理研究方面具有重要意义。Chen等6, 23基于 EESI-ToF-MS 方法对活体呼吸气体进行在线质谱分析，在1秒钟内即获得了样品的指纹谱图并对结果进行比较分析得出众多有益信息。例如，人体在极端饥饿或病理条件下呼出气体中尿素含量大幅度增加，该结果与体内采用蛋白质、脂肪来代替糖类供能的结果吻合；检测到吸烟者呼吸气体的生物标志物，如2，3，5-三甲基吡啶，异前列腺素，和花生四烯酸等，并检测了人吸烟前后不同时间的呼吸气体中尼古丁与代谢物甲基吗啡的信号比，揭示了新陈代谢的动态变化过程，也给许多疾病的诊断提供了依据。Chen等6利用 ND-EESI对人不同部位的皮肤代谢产物进行检测，从不同表皮的质谱指纹谱图揭示人体皮肤的代谢。Ding等15采用电喷雾萃取电离质谱（EESI-MS），利用多级串联质谱平台进行快速呼吸气体分析考察新陈代谢的变化，在无需样品预处理的情况下，对尼古丁的检测限为0.05 fg/mL (S/N =3, RSD=5.0%, n=10)；线性范围是0.0155 pg/ mL~ 155 pg/ mL。
除了以呼出气体为样品外，EESI还可以结合ND技术，将不同生物体表的物质采集到EESI中进行萃取电离，获得满意的分析结果。目前的研究主要集中在采用ND技术进行微生物11、人体皮肤12、植物19等方面的研究中中。如Chen等12采用ND-EESI远程检测了人体皮肤上的TNT、RDX、NG、HMX和TATP等爆炸物。与DESI等技术相比，ND-EESI更加灵敏，而且具有较强的远程在线分析的能力，这对于安全检测、反恐防爆等具有积极的意义。研究表明，EESI-MS是一个功能强大的分析平台，为生命科学尤其是生物体代谢组学中复杂样品的半定量分析提供了一种高灵敏度、高特异性及高效率的研究平台。但是，作为活体质谱分析的重要技术，这些工作刚刚起步，还有许多工作需要做。
代谢组学通常采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）的方法24，需要对样品进行多个步骤的预处理，从而存在分析速度低、样品耗量大等缺点。在无需样品预处理的情况下，Gu等25用EESI监控分析了不同饮食（正常进食、整夜不进食、喂食火鸡）大鼠的尿样，对比了尿样中的四氧嘧啶、3-羟基犬尿氨酸、葡萄糖酸和葡萄糖的信号强度，研究了尿素循环和氨基酸的新陈代谢途径，并对尿样的EESI-MS和NMR数据进行分析，成功区分了三组大鼠饮食的生物代谢物之间的差异，表明EESI具有监测特定的生化变异途径的潜在应用。
EESI用于蛋白质检测的研究目前还鲜见报道。Zhou等26与Chen等10采用EESI分别检测了多肽与蛋白质，对比与ESI检测的信号，发现EESI能检测价态更低的蛋白质的峰，这也表明了气相萃取机理与解吸机理的显著不同。最近，Chen等27再次证明EESI能够最大程度地保持蛋白质的原始构象，而且很少受基体等物质的影响。这无疑对蛋白质分析具有积极的意义。
前景展望
EESI技术目前虽然在食品和生活用品质量监测、药物检测、环境监测、过程分析、核工业检测、活体分析、代谢组学、蛋白质组学、法医刑侦等研究领域均有应用，但是，这些应用都还仅仅在初级阶段，离工业化大规模应用还有很大的距离。不过，根据EESI的结构可知，EESI技术具有如下特点：1）在敞开环境下的三维空间内发生选择性萃取、化学反应等过程，完成能量和电荷的交换从而获得待测物离子；2）电离之前无需样品预处理，能承受复杂基体样品，获得更为丰富的样品信息；3）待测样品由中性通道引入离子源，避免受到电场作用、化学污染或物理损伤；4）能对多种形态，包括气体、液体、膏体、胶体、固体表面的样品进行分析；5）易于小型化和集成化，方便与小型质谱仪联用； 6）分析速度快，与高灵敏质谱串联质谱联用时，能够在极短时间内（数秒）完成单个样品的分析测定，从而实现对样品的高通量检测。因此，EESI-MS将在实时在线分析、远程分析、过程控制、粘性物质分析、活体分析等方面发挥一些有特色的作用。此外，根据EESI的机理可以将EESI用作合成工具，比如在纳米材料的制备、纳米器件的组装、特殊反应中间体的制备和探测等方面可能具有潜在的应用前景。
EESI的历史还不到5年，技术还有待于完善。在国际上，EESI技术具有一定的影响，但从事EESI技术研究的小组不多。因此，EESI相关的研究结果可以比较方便快捷地进行发表。但是，相关领域的进步还有待于大家共同努力。