标题：银环蛇毒素
简介
银环蛇（Krait，Bunga rus Spp.）属动物界，脊索动物门，爬虫纲，有鳞目，眼镜蛇科，环蛇属。全身背面是黑白相间的环纹，具30~50个白色或乳黄色窄横纹，是世界十大毒蛇之一。主要分布在泰国、缅甸、印度、中国的南部和中国台湾等地，有12种亚种。其中分布在中国南部和中国台湾省的Bungarus multicinctus，Blyth的毒液成分研究报道较多，台湾产银环蛇蛇源已枯竭，而银环蛇在中国有两个亚种-指名亚种（即中国银环蛇，Bungarus multicinctusBlyth Chinese Krait）和云南亚种（B.muticinctus Pope）。[1-3]
银环蛇属前沟牙类毒蛇，被银环蛇咬伤的主要症状为伤口疼痛、局部肿胀、嗜睡、运动神经失调、眼睑下垂、瞳孔散大、局部无力、颚咽麻痹、口吃、垂涎、恶心、呕吐、昏迷、呼吸困难、呼吸衰竭,8～72 h内死亡。其一次排毒4.6mg，1mg干毒就能致人于死地。毒腺分泌的蛇毒含多种多肽成分，具有不同的生物学活性。[4]随着捕食者和被捕者的相互作用，毒素随之进化，功能性的生理活性发生相应的变化。银环蛇毒素的主要成分为蛋白质和多肽，包括α-银环蛇毒素（α-BGT）、β-银环蛇毒素（β-BGT）、κ-银环蛇毒素（κ-BGT）、γ-银环蛇毒素（γ-BGT）和磷脂酶A等酶类。Qian等报道了银环蛇毒素中还存在心脏毒素（cardiotoxin）和一些心脏毒素样碱性蛋白（CLBPs）以及神经毒素类似物（neurotoxin-likeproteins）（BMNTL1-4）。α-BGT与运动终板乙酰胆碱受体结合，从而抑制了乙酰胆碱对横纹肌细胞膜的除极化作用，导致神经传导阻断，引起横纹肌松弛。α-BGT并不影响神经末梢乙酰胆碱的释放。β-BGT作用于运动神经突触前膜产生一种三相变化，首先是传出递质数量的迅速降低，其次是释放增加，随后是进一步抑制，从而阻断突触间神经冲动传递，使骨骼肌不能兴奋收缩而转入持续性麻痹，其毒性比突触后毒素高得多。[5]
在中国，被银环蛇咬伤占各类毒蛇咬伤的8.12%，居第5位，而死亡人数居首位。银环蛇毒液以神经毒为主，并且有神经肌肉阻断作用，引起横纹肌弛缓性瘫痪，可导致外周型呼吸麻痹，是临床上主要致死原因。被银环蛇咬伤，中毒症状为伤口轻微疼痛，肢体感觉异常，嗜睡，运动神经失调，眼睑下垂，吞咽困难，乏力，一旦呼吸衰竭，易造成死亡。它主要通过两条途径起作用：（1）毒液作用于突触后运动终板上的菸碱型乙酰胆碱受体，阻止乙酰胆碱的去极化作用，从而阻断神经肌肉传导；（2）毒液作用于运动神经末梢突触前，通过线粒体对钙离子的积累，抑制小泡释放乙酰胆碱，引起神经肌肉传导阻滞。以上两条途径均可引起呼吸肌麻痹致呼吸衰竭。其次，毒液可作用于植物神经系统，抑制颈动脉窦化学感受器使缺氧加重，亦可直接抑制呼吸中枢，引起呼吸衰竭。[6]
银环蛇毒素的蛋白质结构相当复杂，随着蛋白质生物学技术的高速发展，特别是逆相HPLC和自动化氨基酸测序仪的问世，从银环蛇毒素中分离纯化出了α-BGT、β-BGT、κ-BGT、γ-BGT等神经毒素，并测定了氨基酸序列，还对部分神经毒素的空间结构和化学修饰进行了研究。[2]
物化性质
化学性质根据神经毒素的作用靶点不同，把银环蛇神经毒素分为两类：一类为突触后神经毒素或α-神经毒素，这类毒素竞争性的与神经肌肉接头处的乙酰胆碱受体结合，阻断神经递质的传导；另一类为突触前神经毒素或β-神经毒素，其直接作用于运动神经突触前膜，阻断乙酰胆碱的释放，使骨骼肌失去收缩功能而麻痹。根据相对的分子质量大小和二硫键的数目把突触后神经毒素又分为短链神经毒素（60~62个氨基酸残基，4对二硫键）和长链神经毒素（70~74个氨基酸残基，5对二硫键）。其中短链神经毒素的阻断作用具有一定的可逆性。[7-9]  α银环蛇毒素紫外光谱[10]
银环蛇毒素新鲜毒液呈灰白色，粘稠具有特殊的腥味，毒性较强，是一种碱性多肽，是典型的长链突触后神经毒素，由74个氨基酸残基组成，含有较多的碱性氨基酸残基和10个半胱氨酸残基，所有的半胱氨酸残基都参与二硫键的形成，含有5对二硫键，具有蛋白质的通性，加热和受紫外线照射会产生絮状沉淀，导致毒性部分或全部丧失，强酸、强碱、氧化剂、还原剂、消化酶、重金属盐、酒精、酚类均能破坏其毒性；经甲醛和戊二醛处理其毒性丧失，但抗原性仍能保留。通常采取甲酰基化的方法脱毒后免疫动物，制备抗血清。[11-12]
银环蛇毒素的主要成分为蛋白质和多肽，其中毒性成分主要是多种毒性多肽中的神经毒素（Tu A T，1996）。李镇源等曾先后报道了从台湾银环蛇中分离鉴定出α-银环蛇毒素（α-BGT）、β-银环蛇毒素（β-BGT）、κ-银环蛇毒素（κ-BGT）和一些酶类如磷脂酶A、凝血酶因子等。钱友存等通过RT-PCR方法从银环蛇中克隆到神经毒素，心脏毒素（cardiotoxin）和一些心脏毒素样碱性蛋白（CLBPs）以及4个神经毒素类似物（neuro-toxin-likeproteins）（BMNTL 1-4）和1个三环结构蛋白（BML-CL）。Aird S D等从银环蛇毒腺细胞中分离出一种新的神经毒素γ-银环蛇毒素（γ-BGT），并利用质谱分析法和Edman降解法测定了γ-BGT的一级结构。[10]  银环蛇毒素粗毒电泳图[13]
β-银环蛇毒素（Beta-bungarotoxin，β-Butx）来源于银环蛇（Bungarus multicinctus）蛇毒中，是一种突触前多肽神经毒，表现出Ca2+依赖性磷脂酶A2（Phospholipase A2，PLA2）活性。首先由Chang于1963年在台湾银环蛇（Bungarus multicinctus）中发现，是第一个具有药理特征的突触前蛇神经毒素。[14]分子量（Mr）为20500，由两个亚基通过二硫键共价连接成二聚体，分子量较大的A亚单位（Mr=13500）上存在PLA2活性中心，分子量较小的B亚单位（Mr=7000）与蛋白激酶抑制物有一些序列同源性。当亚基间二硫键断裂时，或PLA2活性中心被共价修饰时，都可导致β-BuTx的神经毒性和PLA2活性丧失。[13]  纯化后的蛇毒蛋白电泳图[15]
β-BGT是一种高碱性多肽，其分子量为20-22KD，等电点为8.8-9.7。由A、B两条链构成，二者通过一个链间二硫键共价连接。A链含有120个氨基酸残基，分子量为13500D，具有磷脂酶A2的活性，在结构上与哺乳动物胰腺分泌的磷脂酶A2及其它蛇毒液中的磷脂酶A2有同源性。B链含有60个氨基酸，分子量为7000D，与哺乳动物胰腺、蛇毒及蜗牛毒中的kunitz型蛋白酶抑制剂、毒素Ⅰ及树眼蛇毒素具有序列同源性。但是β-BGT对胰岛素、胰凝乳蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、弹性蛋白酶无任何抑制活性，说明B链并不是作为蛋白酶抑制剂起而作用的。β-BGT中的碱性氨基酸含量较高，半胱氨酸含量也较多，但尚未发现β-BGT中有自由的巯基。不同的学者分离到的β-BGT性质有差异，有的学者认为是分离时的交叉污染造成的。[16-17]
通过氨基酸序列分析及DNA序列分析表明，存在5个以上的A链变异体，4个以上的B链变异体，组成7个以上的β亚型毒素。其中A1、A2及A3与B1及B2组成β1-β5，β6也已获得分离纯化。它们之间存在非常高的序列同源性，具有高度的保守区，包括了活性位点。其中各链之间氨基酸差异数目分别为A1和A2：5个，A和A3：9个，A2和A3：12个，B1和B2：22个。[15][18]
α-BGT蛋白质结构α-BGT是1963年发现的。是一种碱性多肽，含较多的碱性氨基酸和10个半胱氨酸残基，半胱氨酸残基都参与5对二硫键的形成。属于长链突触后神经毒素，由74个氨基酸组成，相对分子质量为8000 D，空间结构复杂，几乎每一个氨基酸都对空间结构的形成发挥着重要作用。虽然分子量并不大，但α-BGT具有相当丰富的空间结构，该分子中几乎每一个氨基酸残基对其空间结构的形成都发挥着重要的作用，因此是探讨蛋白质一级结构与高级结构以及结构与功能很好的材料。[19]α-BGT结构如三指形，4个二硫键聚集在一起形成一个致密的内核，由此核心伸展出3个肽链环仿佛3个手指，长的C末端尾巴从致密的二硫键核心伸出。4对二硫键与结构稳定性有关，大部分集中在中间大环上且分布于环的一侧，形成一个活性表面。α-BGT不存在α螺旋，主要由β-折叠和β-转角组成。长链和短链的蛇毒突触后神经毒素主要区别在于尾巴表面存有不同的识别位点，在一级结构上的差别是长链蛇神经毒素比短链的蛇神经毒素多10~15个氨基酸和一对二硫键，空间结构上的差别在于长链神经毒素的第5对二硫键存在于中央大环loopII的顶部，产生一个循环螺旋样的动态的构象，使得长链神经毒素适应不同受体亚型。具有三指形结构的蛇神经毒素一般由60~80个氨基酸残基组成一条多肽链，氨基酸残基的组成及相对位置具有很大的同源性。长链和短链的蛇毒突触后神经毒素都属于这类结构，三指型毒素折叠的可塑性已经历了最佳的进化，可利用功能基团的不同组合特异性识别nAChR亚型间的细微差别。[20-21]
Ohta M等（1987）的研究结果显示了在N-末端的9-11，67-68和71-72位置分别存在Ser-ProIle，Pro-His和Gln-Arg，而非先前报道的Ile-Pro-Ser，His-Pro和Arg-Gln氨基酸排列顺序。Love RA等（1986）利用X射线晶体衍射法进行α-BGT蛋白质结构的研究表明，α-BGT蛋白质晶体结构的解析度为2.5A。其晶体结构是与眼镜蛇神经毒素和埃布拉神经毒素相比较而言的，它的溶液结构由质子-NMR分光镜方法推导而来，主要的不同是α-BGT的β-sheet飘带比其它神经毒素少，而且在不变的色氨酸结晶中有不同寻常的定位。Tali Scherf等利用二维质子-核磁共振光谱学方法解决了α-BGT和第13个氨基酸残基肽库（MRYYESSLKSYPD）的复合物溶液结构，其肽谱是采用1个由Tyr-11肽组成的疏水核心环绕三圈而成的球状骨架结构和飘带结构。[22]Moise L等报道了一个新的更高清晰度的α-BGT核磁共振结构，它定义了决定二硫化物的核心和β-sheet图的区域范围。[23-24]
乙酰胆碱受体种类很多，α-BGT是与N-型的乙酰胆碱受体结合，其结合是专一性的，饱和的和不可逆性的，具很高的亲和力。乙酰胆碱受体α2βγδ的α-亚基是结合乙酰胆碱和毒素的亚基，关键氨基酸位于125~147残基之间。[25-26]
β-BGT蛋白质结构β-银环蛇毒素最初是从台湾银环蛇（Bungarus multicinctus）中分离鉴定出的为突触前碱性多肽神经毒素，由A链和B链两条链构成，其分子量为20~22kD，等电点为8.8~9.7。A链通过Cys15和B链的Cys55相连，把2条链连接起来。[27]A链含120个氨基酸，有13个半胱氨酸，分子量为13500D，一级结构类似于蛇毒和哺乳动物胰腺中的磷脂酶A2（PLA2），但活性比较弱。His48，Asp99和Tyr52的侧链互相影响形成一个氢键中心，组成活性中心区域，处于活性中心的氨基酸是相当保守的。B链由60个氨基酸组成，分子量为7000 D，与胰蛋白酶抑制剂、毒素I及树眼镜蛇毒素具有序列同源性，并且有阻断钾离子通道的功能。其中树眼镜蛇毒素分离自非洲的曼巴蛇，选择性地阻断神经元的电压门控钾通道。[28-29]
从台湾银环蛇（Bungarus multicinctus）中已分离出7种β-银环蛇毒素异构体。除了A2链外，A1和A3链的cDNA还未克隆到。然而，另外三个A链异构体（A4~A6）的cDNA已被克隆。化学修饰研究结果表明，A链是具有较弱磷脂酶A2活力的亚基，并且具有神经毒性效应。眼镜蛇蛇毒中并没有发现突触前神经毒素即β-神经毒素。眼镜蛇中克隆到的磷脂酶A2含119个氨基酸和7对二硫键，为酸性蛋白质，具有较强的PLA2活性。[30-31]
Yang等研究β1-BGT的免疫化学性质时，通过定量沉淀反应和研究Fab片段组成的可溶性复合物的分子量分析发现β1-BGT A链，B链的抗原决定簇的数目分别为5和2。其制备了23个单克隆抗体，其中7个能抑制PLA270%的活性，中和毒素的毒性。免疫印迹显示，6个单克隆抗体识别连续的表位。A链的序列31-37，46-51，91-98，100-106是可以被中和的表位。[32-33]
通过比较分析眼镜蛇和海蛇科PLA2的cDNA序列，发现5′-，3′-非编码区和信号肽编码区十分保守。1.5 g/L琼脂糖泳分析表明，在500 bp左右有特异的PCR产物条带，和预期的cDNA大小基本一致。经低熔点琼脂糖回收PCR产物，连接于pGEMT载体，转化DH5α，进行蓝白斑筛选。对阳性克隆进行PCR和ApaI/PstI双酶切鉴定。抽质粒进行双链DNA测序。cDNA序列分析表明，一种新的A链被克隆到，其全长486bp，编码27个氨基酸的信号肽和120个氨基酸的成熟蛋白，命名为A7链。该信号肽和A4的信号肽有较高的同源性，仅有3个氨基酸的不同，即26位的Tyr→Asn，3位的His→Glu和2位的Pro→His。但A7的信号肽和A2的信号肽差异较大，其差异主要在N-端的10个氨基酸。A7的信号肽和A4的信号肽在数量上一样，为27个氨基酸，而A2的信号肽为25个氨基酸。A5和A6的信号肽不完整，而A1及A3的cDNA尚未被克隆到。新的A链即A7链，和其他A链一样，含13个半胱氨酸。氨基酸序列同源性比较表明，A7链和其他A链（A1~A6）具有很高的同源性，分别为89.2%，86.7%，94.2%，92.5%，88.3%和89.2%。cDNA序列同源性分析结果表明，A7链的cDNA和A2，A4~A6cDNA的同源性分别是92.2% ，94.7%，93.7%，92.9%。尽管从台湾银环蛇中鉴定出6种A链异构体（A1~A6），但从大陆银环蛇中只克隆到一种A链（A7）。是否大陆银环蛇也存在A链多态性还有待进一步阐明。从中国大陆眼镜蛇（Naja naja atra）中RT-PCR扩增PLA2cDNA，克隆并测定了全序列。序列分析表明，该cDNA和从台湾产眼镜蛇（Naja naja atra）中克隆到的cDNA仅差一个碱基，且为沉默突变。该cDNA编码一个27个氨基酸的信号肽和一个119个氨基酸的成熟蛋白，即眼镜蛇PLA2。[34-36]
银环蛇毒素DNA排列(4张)银环蛇毒素DNA排列图册参考资料。[37-38]
κ-BGT蛋白质结构κ-BGT是1983年从台湾产银环蛇毒素中首次分离、分子量6500，等电点为9.1的一种神经毒素，由于k-BGT能选择性地阻断α3β2亚型，被认为是少数能作为神经元烟碱乙酰胆碱受体（nAChRs）分型的特异性工具之一。κ-BGT的蛋白质一级结构由A、B两条链构成，每条链由66个氨基酸残基组成，含有五对二硫键，其分子量均为7258。[39]
GrantG A等报道了作为神经元烟碱型受体探针的κ-BGT的完整氨基酸序列，以后陆续有人从银环蛇毒素中分离纯化到六种新的κ-神经毒素（κ1-κ6），并分别报道分析了其前体细胞和完整氨基酸排列顺序。根据其基因编码的序列可以看出，κ1-κ6存在着高度的同源性。κ-神经毒素和与其在结构上相关的α-神经毒素有决定性的区别。例如，κ4-BGT缺乏Try-残基，而Try-残基在α-BGT的功能位点上是无变化的且相当重要的。κ-BGT在决定性序列位点上有一个无变化的Pro-残基也不同于α-神经毒素。从κ2-BGT和κ3-BGT中还检测到了包含一个亚单位的异二聚体。[40]
γ-BGT蛋白质结构γ-BGT是从银环蛇毒腺中分离出的一种新的突触后神经毒素。Aird SD等（1999）利用质谱测量法和Edman降解法测定了其一级结构。γ-BGT的一级结构由68个氨基酸残基构成，分子量为7524.7。其氨基酸序列为：MQCKTCSFYT CPNSETCPDGKNICVKR-SWT AVRGDGPKRE IRRECAATCP PSKL-GLTVFC CTTDNCNH。在结构上γ-BGT类似于κ-BGT和眼镜蛇长链突触后神经毒素，C-末端九个氨基酸残基与κ-BGT完全相同。然而，静脉注射小鼠LD50为0.15μg/g，其毒性是其它毒素的30-150倍，可与α-nAchR拮抗物的毒性相比较。[41]
分离纯化从粗毒液中分离纯化毒素一般采取离子交换层析柱及高效液相层析法。将粗毒素溶于0.05mol/L pH值5.8醋酸铵中，加于CM-Sephadex C-25柱中，采用两相线性梯度醋酸铵洗液洗脱：Ⅰ为从50mmol/L（pH值5.8）到500mmol/L（pH值7.0），Ⅱ为从500mmol/L到1.0mmol/L（pH值7.0），可得到12种蛋白组份。其中Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ-1、Ⅻ-2和Ⅸ分别为β1至β5，每一种组份可用Sephadex G-75或高效液相层析进一步纯化。[42]  银环蛇毒素层析分离图谱[43]
对于毒素中A链与B链的分开一般采用Chang（1993）的方法，即用二硫苏糖醇还原链间二硫键，蛋白与二硫苏糖醇的分子比率为1∶4，然后在Syn Chropak RP-P柱（4.6mm×250mm，用0.1%TFA平衡，25%-30%的乙腈线性梯度液洗脱）上进行高效液相层析分离纯化。A、B链的分离也可以选用2-巯基乙醇还原，然后用碘乙酸烷化。[44]
毒素作用机理
β-BGT毒理β-BuTx主要作用于神经系统，在外周神经系统中它能不可逆地阻断神经肌肉的兴奋传递；在中枢神经系统中它能特异地抑制某些神经元突触前膜递质的释放。为了进一步研究β-BuTx对中枢神经系统的作用机理，大多数实验研究都是在分离出的突触体上进行的。β-BGT主要作用于神经系统，在外周神经系统中不可逆地阻断神经肌肉的兴奋传递，在中枢神经系统中特异地抑制某些神经元突触前膜递质的释放。其毒性作用依赖于PLA2活性，A链的Lys64与PLA2活性和β-BGT其他毒性有关。当亚基间二硫键断裂，或PLA2活性中心被共价修饰时，都可导致β-BGT的神经毒性丧失。PLA2活性具有间接溶血作用，在Ca2 +存在下能水解卵磷脂（专一水解C-2酯键），生成能溶解红细胞的溶血卵磷脂及脂肪酸，两者促进突触囊泡和突触前膜的融合，在膜表面暴露出突触囊泡蛋白的内部表位，诱导突触囊泡分泌到胞外，伴随着细胞外的大量钙离子流向神经末梢。这两者还使神经末梢的突出囊泡储存库消失。用谷胱甘肽还原链间二硫键可提高β-BGT的膜破坏活性。B链识别特定靶细胞膜，阻断电压门控钾通道，但也需要A链的相互作用及钙离子的参与。但Cheng等发现B链引起人类神经节SK-N-SH细胞凋亡，这种细胞毒性与A链的PLA2活性没有多大关系。Pei-Fung Wu等发现当β-BGT的浓度为357 nM时，内化为NB41A3细胞时并不引起胞质的钙离子浓度变化，其中，钙离子的增加与PLA2有关。所以当EGTA（钙离子螯合剂）存在时，也不会影响细胞的突起生长。这说明，β-BGT的内化与A链的PLA2的活性是独立的。是否只与B链有关，还需要进一步的实验来确定。利用瓜蟾的神经肌肉组织研究β-BGT A链和B链的作用，发现β-BGT能增强自发突触电流（SSC）的发生频率，用5’-磷酸-吡哆醛修饰β-BGT或用Ba2+代替缓冲液中的Ca2+则能消除β-BGT的磷酸酶A2活性，减少SSC的发生频率。针对A链或B链的特异性抗体均能有效地抑制磷酸酶A2活性，但对SSC的发生频率没有太大影响。说明A链和B链对增强瓜蟾的神经肌肉SSC的发生频率都是必不可少的。[45-46]
β-BuTx对神经系统作用的研究最早是从外周神经、肌肉组织起始的，1963年Chang等首先从银环蛇蛇毒中分离出这种突触前神经毒，发现它可阻断由刺激引起的运动神经末梢ACh的释放。随后对β-BuTx进行了毒理学、电生理学、药理学、形态学等研究，获得大量实验证据，对其机理研究取得了一些进展。电生理学和组织学研究表明：在神经肌接头处，β-BuTx广泛作用于突触前膜，导致神经递质释放的阻断，最终引起运动神经末梢的破坏。[47]当β-BuTx孵育从大鼠中分离出的神经肌肉标本时，大约1.5~3小时后，β-BuTx引起完全的神经肌肉阻断。如果标本孵育期间反复刺激神经，则阻断发生的更快。将β-BuTx用bromophenacyl bromide进行化学修饰后，可使β-BuTx的PLA2活性失活。用无PLA2活性的β-BuTx对神经肌肉标本进行孵育，结果使β-BuTx同族毒素对同一神经肌肉的阻断作用所需时间增加，因此说明：同族毒素可能结合于神经末梢的特殊位点，这个位点能被修饰后的β-BuTx竞争性占据。Howard认为，β-BuTx引起神经肌肉阻断在电生理方面表现为三个阶段。第一阶段：神经肌肉标本经过5~10分钟的β-BuTx孵育后，终板电位（End Plate Potential，EPP）幅度先出现一个轻微的下降；第二阶段：以后30~60分钟期间EPP幅度出现增高现象；第三阶段：然后EPP幅度出现进行性下降直至EPP观察不到。第三个阶段小终板电位（Miniature End PlatePotential，MEPP）的频率也逐渐降低，直到神经肌肉完全阻断时，MEPP也几乎观察不到。但β-BuTx不影响MEPP的振幅。[48]
关于β-BuTx作用于神经肌肉标本初期可使EPP振幅轻微下降的机理仍不清楚，但是其随后引起EPP振幅增高的机理多数学者认为：它是由于神经末梢内游离Ca2+增高所致，而神经末梢内游离Ca2+增高可能是β-BuTx阻断K+通道，使神经末梢膜去极化时程延长，电压依赖性Ca2+通道开放时间比正常时延长，则进入神经末梢内的Ca2+增加，使递质释放增加，Mallart在20世纪80年代用大量实验证实这个观点。Petersen等在猪背根神经节电压钳的实验中进一步发现：β-BuTx可以选择性地阻断K+电导成份。除以上β-BuTx通过阻断K+能道引起EPP振幅增加之外，还有其他一些关于此现象的解释：β-BuTx可通过某种方式使突触前递质囊泡与膜融合的可能性增高；β-BuTx通过某种机制使Ca2+释放的结构敏感性增加；β-BuTx直接使神经末梢动作电位时Ca2+进入神经末梢内的量增加。Chen和Lee认为：电子显微镜下发现递质囊泡被排空，递质耗竭，最终使神经-肌肉兴奋传递阻断；而Kelly和Brow在神经末端观察到Coated囊泡累积。Bowerd认为是神经末梢ATP的耗竭。Intira等认为是β-BuTx抑制胆碱转运系统造成ACh囊泡含量减少，最终导致ACh耗竭。[49]
肉毒毒素（Botulin，BoTx）可拮抗β-BuTx，当神经肌肉标本用这两种毒素同时处理时，神经肌肉阻断所需的时间比用其中任一种毒素阻断所需时间要长，因此实验中可知β-BuTx是通过增加细胞内游离Ca2+浓度来拮抗BoTx的，但这两种毒素相互拮抗的本质还不清楚。Othman用鼠脑突触体研究β-BuTx作用机理时发现，β-BuTx在脑突触体上结合位点可被dendrotoxin占据，但dendrotoxin却没有引起突触体膜的去极化。[50]
在一定条件下，通过电子显微镜观察，β-BuTx能引起蟾蜍神经末梢质膜的大范围损伤，但是，研究证实如此损伤并不是产生神经毒性作用，即引起神经肌肉阻断所必需的。β-BuTx阻断的大鼠外周神经末梢在递质囊泡数目方面表现出轻微降低及质膜内折数目增加。[51]Chen等认为这种形态学的变化是由于蛇毒导致递质囊泡在出胞作用释放出递质后囊泡膜再循环受到抑制而引起的。早期研究报道称β-BuTx引起的神经末梢阻断标本中ACh数量正常，而Gunderson等研究称：经β-BuTx孵育的膈神经-膈肌标本ACh水平增加了2~3倍。[52]
β-BGT具有β类神经毒素的共同特点，在作用于神经末梢之前有一个5-20min的延迟期，为结合突触细胞膜所必需，能够阻碍可兴奋膜上的K+的转运；选择性抑制神经末梢释放乙酰胆碱。它作用于运动神经末梢产生一种三相变化，首先是传出递质数量的迅速降低，即短暂抑制，继而是释放易化，随后是进一步抑制，导致不可逆的传导阻滞。该毒素诱导的系列变化可以通过测量单极运动终板记录的动作电位或在低Ca2+浓度介质中测量孵育的离体小鼠膈肌神经-横膈膜制备物的收缩力观察到。β-BGT中毒后的运动神经末梢在轴膜上出现Ω型被膜窦数量的特征性增加，而这时突触前泡的数量及形状变化不大。[53]
β-BuTx阻断胆碱转运到Torpedo电器官的神经末梢内，这与β-BuTx对鼠脑突触体作用类似，但有些学者认为β-BuTx抑制胆碱转运过程不能解释β-BuTx导致的神经肌肉阻断作用。另外，β-BuTx也作用于非胆碱结构，如GABA能神经元突触体，这一现象同样使β-BuTx在神经末梢的特殊作用位点是胆碱转运系统的提法不成立。Emmanuilo Delot在Torpedo突触体上对多种突触前PLA2神经毒的比较研究发现：Crotoxin和β-BuTx对突触体的ACh释放和膜去极化程度不同，认为这两种毒素是从不同作用位点或不同机理来影响神经递质释放过程的。Howard认为：从β-BuTx对鼠脑突触体和对Torpodeo突触体的影响可得出，β-BuTx是通过改变离子通道或/和离子泵而发挥作用的。Ng和Howard提出：由于质膜上磷酸甘油酸分解可抑制膜蛋白的活性，β-BuTx可能通过水解某些特殊磷酸甘油酸，调节离子通道或/和离子泵的活化状态。[54]
磷脂酶活性β-BGT的药理学作用较为复杂，它的突触前毒性作用依赖于内源性磷脂酶A2的效应，因此β-BGT具有神经毒素和磷脂酶A2的双重作用，除了可抑制运动神经末梢释放乙酰胆碱和摄取胆碱以及阻断运动神经肌肉接头部位的冲动传递外，还具有间接溶血作用。这是因为PLA2在Ca2+存在下能水解卵磷脂（专一水解C-2酯键）生成能溶解红细胞的溶血卵磷脂。另外β-BGT还能减少膜结合的乙酰胆碱数，抑制膜结合酶的活性等。[55]
实验证明β-BGT的A链具有PLA2酶活性而B链没有。PLA2可催化3-sn -磷酸甘油酯2-乙脂键的水解。用p-BromophenocylBromide烷化活性位点的组氨酸残基，不可逆地抑制了酶活性，同时也破坏了毒性。这说明在β-BGT中PLA2起到了不可缺少的作用。也有人对此提出了异议。但不管怎样，既然存在不具有毒性的PLA2，就说明β-BGT毒性不能单独归于PLA2的活性。[56]PLA2的活性与分析的条件有关。PLA2酶活性是否是β-BGT毒性的必要因素，Rosenberg列举了正反两方面的证据。关于PLA2对β-BGT所引起的运动神经末梢三相变化的影响研究表明初期的释放抑制及其后的释放易化都与PLA2无关，Strong（1976）首次报道了PLA2的催化活性在由β-BGT所引起的自发神经递质释放降低方面起着重要的作用。[57]虽然A链具有PLA2活性，在毒素中具有重要作用，但是考虑到毒素与鸡肌肉的结合能够被树眼蛇毒素、毒素I及曼巴蛇毒素k所抑制，所以B链在毒素中的结构和作用也就不能被忽视。B链作为识别亚单位可特异识别靶细胞膜阻断电压门控钾通道。[58]
β-BGT受体β-BGT的受体（β-BGTR）主要位于胞突结合处的质膜上，在神经组织以外的地方不存在。这种受体可能是一种K+通道。常利用放射性标记来鉴定β-BGTR。研究检测到了一些非组织特异性的低亲和力的结合位点，一些作为潜在受体的高亲和力的结合位点，这些受体呈低密度分布（150fmol/mg蛋白）于小鼠和鸡脑的突触质膜上，而其他组织没有。β-BGT的与受体的结合可通过用蛋白水解酶预处理而消除，说明是一种蛋白，分子量为430000D，与β-BGT有很高的亲和力（Kd=1nM），可用Tritonx-100从鸡细胞膜上溶解下来。在鸡脑SPM上还有一个95000D的多肽，也能够标记，这种结合可以被树眼蛇毒素非竞争性抑制，但不被其他β-神经毒素抑制。由β-BGT所引起的神经传递阻断可由于预先用树眼蛇毒素处理而减弱，考虑到β-BGT的B链与树眼蛇毒素的同源性，说明这两种毒素可能作用于突触前细胞膜的同一受体上，但却通过两种不同的机制起作用，这种受体是一种钾通道。[59]
对大鼠脑突触体作用用β-BuTx对大鼠制备的脑突触体进行短时间孵育后，Howard归纳出以下突触体的改变：①接纳和保留几种递质和非递质复合物的能力降低，包括γ-氨基丁酸、去甲肾上腺素、5-羟色胺、胆碱等；②ATP减少；③用荧光碳花青苷染色测得质膜电位降低。β-BuTx产生以上变化并没有溶解突触体，而且Howard认为β-BuTx最初的效果是突触体质膜电位的降低，随这发生突触体ATP量减少，故ATP量减少的部分原因是由于它被Na+/K+-ATP酶所利用试图去重新建立原有的膜电位。且他推测β-BuTx引起多种突触体递质释放过程抑制是继发效果，可能由于膜去极化和ATP库的耗竭，但还没有证据证实β-BuTx导致突触体膜去极化中所涉及的离子流。Ng和Howard早期研究认为：β-BuTx对突触体上述作用的强弱不依赖于细胞外的Na+浓度，故认为β-BuTx不是通过开放质膜上的Na+通道或抑制Na+/K+-ATPase活性而使突触体去极化的。但Yates SL在实验中发现β-BuTx在低浓度时（0.05~5nmol/L）不影响Na+/K+ATPase活性，当β-BuTx浓度较高时（50nmol/L）使Na+/K+-ATPase活性增加；通过与无神经毒性PLA2的比较研究发现，β-BuTx对突触体膜去极化影响是通过β-BuTx上的PLA2作用使自由脂肪酸产量改变而介导的。[60]
β-BuTx在大鼠脑室内注射时可引起大鼠死亡，死亡率高于用β-BuTx处理外周神经系统引起的大鼠死亡。脑内注射β-BuTx引起的死亡率次于脑室内注射引起的死亡率，脑内注射β-BuTx引起广泛的神经元损伤，没有明显的胆碱能结构的选择性，如将β-BuTx注射到大鼠齿状回，谷氨酸脱羧酶（ghitamatedecarboxylase，一种GABA能神经元的标记物）的活性下降时间过程与同一脑区的胆碱乙酰基转移酶（Cholineacetytransferas，一种胆碱能神经元的标记物）活性下降的时间过程相平行。但仍不明白：非胆碱能结构的损伤是β-BuTx对它的单独直接作用，还是β-BuTx特异地作用于胆碱能神经元末梢引起的继发效应。[61]
PLA2活性无神经毒性的PLA2酶活性是β-BuTx的PLA2活性的20倍，但无神经毒性的PLA2在改变突触体膜电位和膜转运过程方面远比β-BuTx低得多。关于这一点的进一步证据来源于对β-BuTx的化学修饰实验，用ethoxyformicanhydride（EOFA）处理后的β-BuTx，其PAL2活性和神经毒性都丧失；如果EOFA处理时加入dihexnoyllecithin（DiC6），则β-BuTx的PLA2活性保留；但是，EOFA仍降低了β-BuTx的致死率和它引起神经肌肉标本阻断的能力，故用EOFA和DiC6处理的最终结果是将β-BuTx从一种具有神经毒性的PLA2转变到无神经毒性的PLA2。[62]Howard和Troug提出：EOFA至少对β-BuTx进行了两点改变：PLA2活性部位和神经毒性所需要的另一部位。酶分析实验发现经EOFA和DiC6处理后无神经毒性的β-BuTx具有表面上正常的PLA2活性，但其已失去了改变突触体膜电位和ATP贮存及膜转运能力，故可得出结论β-BuTx的PLA2活性部位与其神经毒性部位是分离开的，但β-BuTx的神经毒性的发挥是这两个部位的共同作用结果，甚至神经毒性部位比PLA2活性部位更重要。在有关β-BuTx与无神经毒性的PLA2的特异底物的比较研究方面，研究未发现二者在突触体膜磷酯酰胆碱、磷酯酰丝氨酸和磷酯酰乙醇胺的水解比例和释放出突触体脂肪酸类型方面有显著性差异。而Ghassemi等在鼠脑突触体质膜得出与以上相矛盾的结果，发现β-BuTx可引起质膜上磷酯酰乙醇胺和磷酯丝氨酸内外二层分布的改变，认为此改变可能与β-BuTx引起ACh释放增加有关。[63]
在有关β-BuTx与无神经毒性的PLA2对蛋白激酶作用的比较研究方面，Eiko Veno和PhilipRosenbergp发现：β-BuTx可抑制脑突触体内大量蛋白（如突触蛋白Ⅰ）的磷酸化作用，且作用比无神经毒性的PAL2强。即使在磷酸酯酶存在的情况下，β-BuTx抑制磷酸化作用也未见降低，说明β-BuTx对磷酸化作用的抑制可能与ACh释放受抑制有关。Eiko进一步研究还发现无神经毒性的PLA2可抑制依赖cAMP的蛋白激酶、蛋白激酶C（PKC）的活性，而β-BuTx则无此效应，且无神经毒性的PLA2对蛋白激酶活性的抑制是通过产生自由脂肪酸来介导的，Eilo推测β-BuTx与无神经毒性的PLA2对磷酸化作用的抑制途径是不同的。β-BuTx对中枢神经系统ACh释放也有特异性。Chakpell在大鼠脑突触体上发现低浓度β-BuTx对完整突触体ACh释放既有促进作用又有抑制作用。Chapell[39]认为β-BuTx对突触体ACh释放的抑制作用可能不发生在突触体内囊泡与突触质膜的相互作用水平上，而是发生在神经递质释放过程的早期。[43]
毒素与基因工程
基因组α-BGT的cD-NA序列包括信号肽序列，编码成熟蛋白的序列和5，，3，-UTR序列。不同来源的α-BGT的cDNA有很高的同源性，其中信号肽序列和5，，3，-UTR序列保守并与眼镜蛇科和海蛇科的序列完全一样，由此可以推断它们由同一个祖先进化而来的。α-BGT的cDNA全长约500 bp，其中5，-端约30bp，3，-端约200 bp为非蛋白编码区域。编码区编码一个由21个氨基酸残基组成的信号肽和一个74个氨基酸残基组成的成熟蛋白质。Liu等从银环蛇毒腺中提取α-BGT的总mRNA，扩增了α-BGT cDNA片段，其全长为530 bp，5，-UTR 33 bp，信号肽63 bp，编码区222 bp，3，-UTR 195 bp，有一个终止密码子TGA和AATAA信号polyA序列。α-BGTmRNA在同一个体中也存在多样性，是由转录后编辑形成，还是由于实验中反转录过程的错误、基因克隆中的偏差以及测序过程的误差造成，或两者都有，一直存有争论。[64]
α-BGT的基因组DNA有3个外显子，被2个内含子分隔开。外显子、内含子连接遵循GT/AG法则，启动子序列和3，-UTR是高度保守的，TATA盒位于转录起始位点上游25~33 bp。Chang等从银环蛇毒中提取了2个约2700bp的基因组DNA，即α-Bgt（A31）和α-Bgt（V31），它们表现出完全一样的基因结构，含有3个外显子基因，在同样的位置插入2个内含子，且它们的核苷酸序列具有98%的同源性。内含子1的长度约为1800 bp，内含子2的长度约为540bp。跟短链神经毒素相比，发现内含子2的长度变化比较小，比内含子1保守，短链神经毒素和长链神经毒素的外显子区域比内含子区域更具多样化。林鲁萍用引物扩增得到2655 bp的α-BGT基因。α-BGT编码区共有288 bp，第1个外显子包括58 bp的编码区部分，编码信号肽部分N端的20个氨基酸；外显子2全长105 bp，编码信号肽剩余的4个氨基酸和成熟肽N端的33个氨基酸；外显子3全长128 bp，包括编码剩余41个氨基酸部分和1个终止密码子，翻译出来的蛋白序列符合V31变体。得到序列的2个内含子分别为1790 bp和538 bp。[65]
从银环蛇毒中已分离出7种β-银环蛇毒素异构体，除了A2链外，A1和A3链的cDNA还未克隆到。另外4个A链异构体（A4-A7）的cDNA已被克隆，3个B链cDNA已被克隆。现代色谱技术及氨基酸分析揭示至少有16种β-BGT亚型。A链与B链的分开可用二硫苏糖醇还原链间二硫键，也可用2-巯基乙醇还原，然后用碘乙酸烷化。Long-Sen Chang等通过PCR扩增β-BGT的A链和B链基因，分析A链和B链基因的编码区，发现有3个外显子被2个内含子分隔开，外显子和内含子连接遵循GT/AG法则。分析启动子序列，得出结论：A链和B链由不同的基因编码。这个结论支持完整的β-BGT来自转录后的A链和B链配对这个观点。克隆到的A链样基因全长3022 bp，外显子1编码5，-UTR，25个氨基酸残基组成的信号肽和氨基酸残基1-43，外显子2编码氨基酸残基43-81，外显子3编码氨基酸残基81-120和3，-UTR。克隆到的B1链基因长5062bp，外显子1编码5，-UTR，24个氨基酸残基组成的信号肽，氨基酸残基1-5，外显子2编码氨基酸残基5-59，外显子3编码氨基酸残基59-61和3，-UTR。[66]
Cheng等根据β-BGT的B1链启动子区域，非编码区，B1链cDNA分别设计引物，扩增从银环蛇提取的β-BGT的基因组，克隆到B1、B2、B4、B5、B6链的基因组，B2、B4链的长度分别为4699 bp、3243 bp。B5、B6链约为2000 bp，但不包括启动子序列。同源比较6条B1链的氨基酸序列，显示信号肽有24个氨基酸组成，2个内含子在相同的位置分隔编码区域，B2和B4链第61位上的氨基酸不同，B5、B6在C末端和N末端缺少2个氨基酸，但是所有的B链都有7个半胱氨酸，位于7个不同的保守位点。比较6条链的基因组，发现内含子1长度几乎一样，内含子2长度变化很大，B4、B5、B6链缺少内含子2的2个区域，但是6条链在剪接位点附近的内含子2的序列是高度保守的。和眼镜蛇的胰凝乳蛋白酶抑制剂基因作比较，发现有共同的基因组结构，而且核苷酸序列高度相似。[67]
在研究银环蛇毒蛋白酶抑制剂类蛋白质（PILP）时，Chang等克隆并表达了PILP-1，PILP-2，PILP-3。蛋白酶活性试验表明，重组PILP-1能抑制胰蛋白酶的活性。比较PILP和B链的基因序列，发现有相同的基因结构，除了编码信号肽的外显子外，编码蛋白质的外显子比内含子更具多样性。这表明，PILP基因和B链基因起源于公共的祖先，进化的加速可能使PILP基因和B链基因具多样化。Wen-MinChou等发现PILP-3还是基质金属蛋白酶-2的抑制剂，能抑制神经母细胞瘤的侵袭和迁移。[68]
克隆和表达蛇毒神经毒素主要来源于捕蛇或养蛇提取蛇毒后进行纯化的方法进行。银环蛇由于人工养殖成本高、周期长、越冬存活率极低，因此通过人工养殖获得大量银环蛇毒有较大困难，而野生银环蛇也由于过度捕猎使银环蛇种群数量逐年下降，加上银环蛇列入国家一级保护野生动物，从野生来源获得银环蛇毒也有很大问题。因此从天然蛇毒中分离纯化得到足够数量的α-BGT、β-BGT以供科学研究和临床治疗比较困难，而通过基因工程得到足够的α-BGT、β-BGT成为一条很好的途径。[69]
钱友存等从银环蛇毒腺中抽提总RNA，RT-PCR扩增编码β-银环蛇毒素A链的cDNA，克隆并测定了一个新的β-BGT-cDNA全序列，命名为A7链，编码含有27个氨基酸的信号肽和120个氨基酸的成熟蛋白，该成熟蛋白和其他β-银环蛇毒素A链一样，具有13个位置固定的半胱氨酸，而且和这些A链具有很高的同源性。将β-银环蛇毒素A链cD-NA亚克隆到表达载体pMAL-p2上，转化大肠杆菌BL21菌株，得到高效的可溶性融合蛋白，表达产物经Xα因子酶切后显示较弱的磷脂酶A2活性。为阐明磷脂酶A2的作用机制和生物活性的研究提供了材料。[70]
Wu等构建了β-银环蛇毒素B链（B1和B2）的cD-NA。B链cDNA编码24个氨基酸组成的信号肽和精氨酸为起始的由61个氨基酸组成的成熟蛋白。B1链cDNA全长425 bp，B2链cDNA全长328 bp。将B链亚克隆到表达载体PET-32α（+），转化大肠杆菌BL21（DE3）。用His-Bind树脂柱纯化表达的硫氧还蛋白融合蛋白。B链用Ser代替Cys-55，亲和纯化的融合蛋白量至少增加100倍。如果用肠激酶切掉融合的硫氧还蛋白，则分离的B链不溶于水。[71]林鲁萍等用已经构建的pGEX-BgTX（P22-A31）质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中表达，并用谷胱甘肽SepharoseFF纯化GST-α-银环蛇毒素融合蛋白，再用凝血酶切掉融合标签谷胱苷肽转移酶（Glutathione S-transferase，GST），得到了较纯的重组α-银环蛇毒素同工毒素，得率约为1.225 mg/L。用重组α-银环蛇毒素制备多克隆抗体，经ELISA和Wastern杂交鉴定后确定重组α-银环蛇毒素与天然α-银环蛇毒素的抗原性一致。[72]
胡延春等将扩增获得的α-BGT基因连接至pUCm-T载体构建克隆质粒pUCm-α-BGT，克隆质粒双酶切后连接至融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中，转化大肠杆菌BL21（DE3）进行IPTG诱导表达，表达产物经15% SDS-PAGE分析，得到约34 kD的重组α-BGT，其表达量约占细菌总蛋白的32.16%。Wastern blotting和间接ELISA检测结果表明，α-BGT的融合表达蛋白也与天然的α-BGT标准品具有相似的抗原性。在大肠杆菌BL21（DE3）中的非融合型表达α-BGT占细菌总蛋白的11.98%，主要以包涵体形式存在，也与天然α-BGT标准品具有相似的抗原性。α-BGT基因失望克隆、表达和活性研究，为改造α-BGT基因，降低其毒性和用表达的重组α-BGT研究乙酰胆碱受体提供了有效的途径。[73-74]
通过以上研究证明，用基因工程的方法获得蛇神经毒素是可行的，且融合表达效率高，具有较好的可溶性。得到的重组毒素蛋白具有一定的生物活性，并与天然的蛋白有相似的免疫原性。但表达的重组α-BGT、β-BGT与天然的蛋白相比生物活性有所降低，这可能是因为α-BGT、β-BGT都具有多对二硫键，从而造成无论真核还是原核表达都不能完全正确折叠恢复成天然构象，也可能是在表达纯化的过程中一些试剂的影响，使部分蛋白构象改变而导致生物活性降低。[75]
免疫学特性α-BGT与乙酰胆碱受体结合的亲和力高，因此是研究乙酰胆碱受体结构的理想探针，可用于显示完整细胞膜表面乙酰胆碱受体的分布和密度，观察各种药物、毒物和其他致病因子对乙酰胆碱受体动力学变化的影响，也是从组织中分离和纯化乙酰胆碱受体的重要工具。20世纪70年代末，应用I125标记的α-BGT作配体来探测nAchR的数量对阐明重症肌无力（myastherniagravis，MG）的发病机制起了极大的作用。MG是nAchR自身免疫性疾病，利用α-BGT纯化的nAchR作为抗原，免疫接种于动物，可制成自身免疫性重症肌无力的模型，为免疫调节诊疗的研究提供了必不可少的工具。莫雪安等利用α-BGT能特异性地不可逆地与突触后膜乙酰胆碱受体结合，β-BGT能特异性地不可逆地与突触前膜的相应蛋白质结合的特性，将α-BGT和β-BGT混合一起包被酶标板，结合随后加的肌肉提取液中相应蛋白质为抗原，以ABC-ELISA法检测重症肌无力病人血清中混合的抗乙酰胆碱受体抗体（AchRab）和抗突触前膜受体抗体（PsmRab），称为抗突触受体抗体。结果：75名正常人均阴性。80例临床对照组中，除2例运动神经元疾病和1例多发性肌炎阳性外，其余均阴性。122例重症肌无力病人中98例阳性（80.3%，其中全身型阳性87.5%），阳性率明显高于单独检测AchRab（P<0.001）。创建了重症肌无力诊断的一个阳性率较高的实验室指标。[76-77]
Yang和Chang在1998年利用杂交瘤技术制备了23种抗β-BGT单克隆抗体，其中7株可抑制β-BGT70%的PLA2的活性并中和毒素，在这7株中和单抗中有6株可识别A链上连续抗原表位，1株识别毒素的共同表位。[78]利用合成肽段及蛋白酶分析确定了A链上6种单抗识别的氨基酸位点，其中单抗17识别位点31-37，单抗2和8识别46-51，单抗21和22识别91-98，单抗6识别100-106。水化位点分析显示单抗17、21和22识别的抗原表位在亲水区，单抗2和8的识别表位在中性区。一方面，抗原的外形结构信息预示单抗21和22的识别表位具有高免疫原性，单抗2和8的识别表位具有中等免疫原性，而单抗6和7的识别表位具有低免疫原性。链的弹性分析表明单抗2、8、17、21和22的识别表位在中等弹性区域，而单抗6的识别表位则位于低的弹性区域。从这些可以看出单抗6识别的抗原表位位于一个亲水、钢性和不易接近的位置，表明这个区域抗原性不高。在单抗2和8的结合位点46-51上存在PLA2酶活性所必需的His-48和Asp-49两个位点，所以封闭这两个位点能够抑制β-BGT的酶活性和神经毒性，由于单抗8的亲和活性大于单抗2，所以单抗8抑制β-BGT的酶活性和神经毒性的能力更大一些。同样Asp-92也是PLA2酶活性所必需的位点，因此单抗21和22也能抑制β-BGT的生物活性。参考牛胰PLA2的晶体结构，Tyr-28、Gly-30D羧基，Gly-32，和氧笼一起捕获Ca2+。从以上观察可知单抗17能够结合Gly-32，从而抑制β-BGT的PLA2活性。[79-80]
竞争性抗体结合抑制实验表明这些中和抗体与抗原的亲和性与合成的短肽兼容。利用合成的短肽A（31-37）、A（46-51）、A（91-98）和A（100-106）含有β-BGT的中和抗原表位，将这些短肽与BSA偶联，注射小鼠，4周后小鼠体内抗体达到最高水平，可起到很好的免疫保护作用，为研究毒素疫苗做了准备。1999年Yang和Chang利用木瓜蛋白酶水解纯化的单抗制备并研究了Fab片段的活性。通过研究Fab片段组成的可溶性复合物的分子量表明β-BGT、A链及B链的抗原决定簇数目分别为7、5和2。另外23种β-BGT单抗还用来确定β-BGT与β-BGT家族其他成员及其他毒素的交叉反应。[81]
应用
蛇毒神经毒素能抑制中枢神经系统，尤其是延髓呼吸中枢，对周围神经系统的作用主要是阻断神经-肌肉接头处冲动的传导，导致骨骼肌尤其是呼吸肌瘫痪。林鲁萍等采用小鼠化学法镇痛试验表明，重组α-银环蛇毒素有一定的镇痛药效，在外周镇痛作用中呈一定的量效关系。于是人们根据蛇毒α-神经毒素这一性质开发出了不成瘾的新型镇痛药，用于镇痛、麻醉和戒毒。神经毒素的镇痛作用与阿片类镇痛药物相比起效较慢，一般肌肉注射或腹腔注射的起效时间在1h以上，3-5h达高峰。β-银环蛇毒素主要用于医学药理学和分子免疫学，制备单克隆抗体，在蛇毒的检测、蛇咬伤中毒的预防和救治等方面具有重要意义。通过研究PLA2酶活性可以帮助了解磷脂在生理生化过程中的作用。利用β-BGT还可以研究突触前神经递质传递的机制。[82-83]
银环蛇毒素可作为抗癌药物使用，抑癌的主要成分是精氨酸酯酶类，能破坏癌细胞的物质是磷酯酶A2，此类物质可与敏感的细胞膜磷脂成分结合，破坏细胞膜结构而使细胞溶解其膜活性多肽，对细胞膜有特殊作用，能增加细胞膜的通透性，有利于抗癌药物进入癌细胞而增强抑癌效果。[84]