标题：眼镜蛇毒因子
简介
眼镜蛇毒因子（Cobra venom factor，CVF），又称为眼镜蛇毒抗补体蛋白（Cobra anticomplementary protein），是眼镜蛇毒中的主要抗补体成分。20世纪初Flexner和Noguchi即发现眼镜蛇毒具有抗补体作用。到20世纪60年代，Nelson、Muller等发现眼镜蛇毒中抗补体的主要成分是CVF。从20世纪60年代到20世纪80年代的二十年里，许多实验室用各种方法分离提纯眼镜蛇毒因子，其理化性质、体内代谢动力学、分子生物学特性、免疫学作用才逐渐被阐明。1994年Fritzuger等还克隆得到了CVF的cDNA序列。由于CVF具有长效的脱补体作用，因此被广泛应用于基础医学的研究，具有广阔的临床应用前景，正日益受到人们的关注。[1-4]
所谓抗补体作用，指对抗生物体的排斥反应的能力。超急性排斥反应主要由于天然抗体与异种抗原结合和（或）受者补体系统的激活产生过敏素C3a和C5a，C3a可致平滑肌收缩，增加血管通透性，嗜碱性白细胞脱粒并释放组胺，导致供器官血管内皮细胞的激活而表现为供器官组织间隙水肿、出血、血管充血及广泛血管内血栓形成等病理改变致使供器官迅速失活凋亡。超急性排斥反应是异种移植的第一道障碍，研究表明，单独消除补体就能使非协调性异种移植存活明显延长，使超急性排斥反应得以控制。补体抑制剂主要包括CVF，ScR1，C1抑制因子，以CVF作用最强。其作用机制是与B因子结合，在D因子作用下将C3裂解为C3a和C3b，从而消耗C3，达到将补体经典途径和旁路途径同时抑制的作用。传统的免疫抑制剂环磷酰胺（CYP）和激素只能短时延缓超急性排斥反应的发生。眼镜蛇毒因子具有特异性抗补体C3生物活性，其结构与功能类似补体组分C3，在血清中其它蛋白因子的参与下，与补体系统中的C3成分形成复合物，代替内源性的组分C3b，激活旁路途径，降解C3（和C5），导致体内补体C3（和C5）的耗竭，因而产生抑制体液免疫作用。研究人员用不同产地眼镜蛇毒提纯的CVF应用于异种移植获得明显效果，在豚鼠至大鼠异种心脏、肾脏移植能将存活延长至3d左右。[5-7]
CVF生化性质
化学性质CVF是一种带负电荷较多的球状糖蛋白分子，由α、β、γ三个亚基通过二硫键及其它非共价键的次级键相互联接而成。在电子显微镜下，CVF分子呈圆柱形，一端稍宽（137±13×82±11）。它的分子量因各实验室提纯方法、测定分子量的方法及眼镜蛇毒来源的不同而有所差异。全分子CVF的分子量为130000-230000（道尔顿，以下同），三个亚基的分子量分别为：α：66000-87000；β：47000-75000；γ：28000-66000。等电点（pI）为5.2-6.5。CVF对温度有较好的稳定性，10-65℃稳定，65℃以上迅速变性失活。[8-11]  眼镜蛇毒因子糖链结构[12]
氨基酸序列CVF的氨基酸组成没有特殊性，含有较多的酸性氨基酸，二级结构以β折叠为主，占47%；α-螺旋占11%。CVF经碳水化合物分析发现，其糖的含量约占2.8-7.4%，其中有较多的岩藻糖，极少有唾液酸。α链有2-3个糖基化位点，β链有一个，γ链则没有。寡糖链主要是双天线复合型，末端为非还原的α-半乳糖残基，以N-糖苷键与肽链上的天冬酰胺连接。CVF脱糖基化后，其二级结构无明显变化，对其补体激活作用亦没有较大的影响。由此推测CVF的寡糖链不是其补体激活作用所必需的，而可能与CVF的热稳定性有关。[13-14]  眼镜蛇毒因子合成路线模拟图[11]
1994年Fritzinger等首先报道CVF的cDNA序列。CVF的mRNA全长5924核苷酸（nt），5'端前3nt和3'端的994nt不翻译，中间为—4962nt的开放读码框，可翻译成1642个氨基酸的前蛋白原，如图2所示。CVF前蛋白原的N-端22个氨基酸残基为信号肽，富含疏水性氨基酸。信号肽后为627个氨基酸残基的α链，α链有3个N-糖苷化位点（131，136，187）。α链的C端连接4个精氨酸残基及一个类似C3a的79氨基酸残基的肽段，类C3a肽段的640位有一个糖苷化位点。γ链始于711位氨基酸残基，但其C末端未确定，可能具有种间特异性。γ链C末端连接279个氨基酸残基的类C3d肽段。CVF的β链从1242位氨基酸起延伸379个氨基酸残基，在1324位有一个N-糖苷化位点。CVF的前蛋白原的类C3a，类C3d肽段在翻译后被切除，成熟的CVF中没有这两个肽段。[15]  眼镜蛇毒因子DNA序列及延伸氨基酸序列[14]
医学作用
CVF的免疫学作用补体系统（complement）是机体免疫系统的一个重要组成部分，由30余种血浆蛋白和膜蛋白组成的一个庞大而复杂的非特异免疫系统，补体系统的过度激活会产生大量的过敏毒素（C3a、C4a和C5a），进一步激活单核巨噬细胞及中性粒细胞迅速产生TNF-α、IL-1及IL-6等大量的促炎细胞因子及其他炎症介质，参与肺损伤的发生与发展。眼镜蛇毒因子（CVF）是从眼镜蛇毒液中提取的一个无毒的糖蛋白。它能裂解C3和C5，是补体的旁路激活物。既能激活补体又能最终耗竭补体。[16-17]  眼镜蛇毒因子对补体激活替代途径的影响[18]
CVF是一个球形的糖蛋白，与补体C3是在进化中形成的同源分子，结构类似C3a，在Mg2+存在下，与B因子可逆结合。复合物CVF-B随即被血清中的D因子水解成两个片段，CVF-Bb和Ba，CVF-Bb在血液中可存在6-7 h，小片段Ba被释放出来。产物CVF-Bb是个补体激活替代途径（Alternative pathway）的C3/C5转化酶，具有丝氨酸蛋白酶活性，能水解C3的α链77位肽键（Arg-Ser）及C5的α链74位肽键（Arg-Leu），形成C3b、C5b，释放过敏毒素C3a、C5a。C3b、C5b促使膜攻击复合物的形成，导致细胞膜穿孔、细胞溶解。同时造成C3、C5-C9成分耗竭，大鼠腹腔注射CVF（1 mg/kg）2 h后血中C3基本耗竭。[19-21]
1983年Eggersten等利用免疫印迹技术证实了CVF的α链与C3的β链有相同的抗原决定簇，而CVF的β、γ链与C3的抗血清无免疫交叉反应。随后Vogel等人从CVF与C3氨基酸组成、N-末端序列、远紫外、近紫外、圆二色光谱二级结构、等电点及超微结构等方面进行比较分析，推测CVF与C3是同一祖先蛋白分子进化而来，是C3存在的另一种选择形式。比较CVF与C3的mRNA，发现两者相似程度超过50%，蛋白质水平的相似程度更超过70%，尤其是27个半胱氨酸残基，形成硫酯键的位点，B因子的结合位点高度保守。另一方面，CVF与C3中糖的含量与类型有很大的差异。①CVF的糖含量（2.8-7.4%）明显高于人的C3（1.7%）。②CVF的α、β链的寡糖链为高岩藻糖取代的复合型，而人类C3的α、β链的寡糖链为高甘露糖型。③CVF寡糖链末端为α-半乳糖残基，而哺乳动物体内的α-半乳糖转移酶基因是被抑制的。[22-25]
CVF与C3的降解产物C3b片段相似，都以1∶1的比例可逆地与B因子结合成复合物，经D因子水解活化后，形成C3转化酶，催化膜攻击复合物的形成。然而，CVF与C3主要有三方面的不同：①CVF-Bb比C3b-Bb更稳定。37℃时CVF-Bb的半衰期为7h，而C3b-Bb的半衰期只有1.5分钟；②与C3b不同，CVF有抗调节蛋白H、I因子的作用，因此CVF-Bb不易被解离，这可能是CVF-Bb有较长半衰期的原因；③CVF-Bb不仅能激活C3，同时也能激活C5，而C3b-Bb只能激活C3，对C5没有激活作用。[26-28]
眼镜蛇蛇毒中除了CVF，还有另外两种与补体系统相互作用的成分——高分子眼镜蛇蛇毒因子和补体抑制剂。高分子量眼镜蛇毒因子（High molecular weight cobra factor H-CVF）是Ballow等分离CVF时发现的，分子量大于800000，不水解血清中的C3。抗补体活性为眼镜蛇毒总抗体活性的3%，作用于补体激活途径的前几个步骤。补体抑制剂（Cobra Inhibitor，CI），是Von Zaber等在1981年发现的，它是一个小分子（分子量约为26000）、热不稳定的碱性糖蛋白。CI作用于补体影响系统的多个步骤，影响补体激活的经典途径和替代途径。[29-30]
研究发现CVF的重要靶器官是肝脏；小鼠静脉注射CVF后，其血浆清除半衰期为10h；而腹腔注射后，6h血中CVF的含量达到最大值，血浆清除半衰期是18h。由于CVF的性质稳定，半衰期长，因此能不断激活补体引起补体的耗竭。据文献报道，大鼠腹腔注射CVF15h后血中的C3的含量降低至正常水平的5%左右；分批注射CVF，则在1-4天内血浆中的C3能降低至正常的5%以下。豚鼠腹腔注射CVF 2天后，角膜的补体水平能降至很低，并能保持6天。随着对CVF理化性质和动物体内代谢动力学的研究的不断深入，CVF作为一种有效的脱补体剂，越来越广泛地应用于免疫学基础研究及临床研究。[31]
临床应用20世纪70年代，Pepys就发现了CVF能抑制大鼠体内依赖于胸腺的抗体特别是IgG组分的产生。[32]1986年Bottger等报道CVF能够抑制噬菌体φ×174（T细胞依赖性抗原）在豚鼠体内引起的体液免疫反应。[33]CVF多用于诱导补体缺陷的动物模型，或用于处理各种患病动物模型，以研究补体系统在疾病发病机制中的作用。[34]如Pang等发现CVF能抑制维生素D诱导的大鼠动脉硬化；[35]任先达等人发现CVF对家犬呼吸窘迫综合症具有保护作用。[36]
20世纪80年代初Vogel等就报道了CVF的一个相当重要应用，即利用CVF与肿瘤相关抗原的单克隆抗体共价结合，选择性地杀伤、消灭肿瘤。[37]20世纪90年代，CVF-单抗结合物的抗肿瘤作用的研究越来越广泛和深入，针对不同肿瘤的特异性杀灭方面的研究取得了长足的进展。Juhl等发现CVF-单抗结合物能促进肿瘤细胞特异性地摄入抗癌胚抗原的抗体；[38-39]不同的CVF-单抗结合物对人神经母胞瘤有不同的细胞毒性。Wang等报道CVF-单抗结合物对人鼻咽癌细胞具有选择性的细胞毒作用。[40]
CVF的另一重要的临床应用研究是利用它可以抑制补体系统，克服异种移植引起的超急排斥反应和急性血管排斥反应，是器官异种移植临床应用中有发展潜力的新型抗排斥药物。[41]1985年Knechtle等人在比较CVF、环孢霉素、全身淋巴照射在抗超急排斥反应方面的作用时发现，在同种异体大鼠心脏移植前，对超敏状态的大鼠进行全身淋巴照射或合并注射环孢霉素都无法有效延长大鼠的生存期；而用CVF耗竭补体，能使器官存活时间由20.4±16.6h（或35.6±6.2h）延长至114.4±31.0h，从而推测CVF能延迟超急性反应的发生。[42]CVF与环孢菌素联合，应用于仓鼠-大鼠的异种心脏移植；与环孢菌素、IgG EXAC（xenoreactive antibody）合用，应用于小鼠-大鼠的异种心脏移植，单独应用于在猪-狒狒的心脏移植；实验结果均表明CVF能有效抑制超急排斥反应而延长宿主的存活时间。[43-45]
不过，CVF作为一种异种蛋白,本身具有抗原性,注射后抗CVF抗体快速产生,减弱其效应;而且CVF耗竭补体为全身性,靶向性差,会增加感染的机会。此外,CVF激活补体过程中产生的补体片段会增强白细胞趋化、黏附和吞噬作用,对内皮细胞产生浓度依赖性损伤,并启动血管内凝血机制。因此在异种移植中应尽可能用较小剂量的CVF作补体抑制剂。[46]