标题：分子系统学
简介
分子系统学是指通过对生物大分子(蛋白质、榜酸等)的结构、功能等的进化研究，来阐明生物各类群(包括已绝灭的生物类群)间的谱系发生关系[ ．相对于经典的形态系统分类研究，由于生物大分子本身就是遗传信息的载体，含有庞大的信息量，且趋同效应弱，因而其结论更具可比性和客观性．尤为重要的是，一些缺乏形态性状的生物类群(如微生物和某些低等动、植物)中，它几乎成为探讨其系统演化关系的唯一手段．由于分子系统学的上述特点，自其诞生之日起，就逐渐在各种生物类群的系统发生研究中得到了广泛的应用．总的说来，迄今分子系统学的研究所获得的生物类群间亲缘关系的结果，大多都和经典的形态系统树相吻合．但是，在一些生物进化谱系不明或模糊关键环节上，它得出的结果却往往和形态系统学的推测大相径庭．
研究的一般步骤
分子系统学研究的主要方法是根据分子生物学数据构建生物类群的谱系发生树．它一般包括以下程序：
首先确定所要分析的生物类群，选择该类群中相关亚类群的一些代表种类；确定所要分析的目的生物大分子
(包括DNA序列、蛋白质序列等)或它们的组合；设法获得它们的序列数据或其它相关数据(如限制性内切
酶(I LP)、随机扩增多态DNA( )、DNA序列等)，DNA序列的数据可以通过GenBank获得，也可以
通过实验室的研究(设计特异引物进行PCR扩增和序列测定)而获得；对获得的相关数据进行比对(pairwise
alignment)或其它的数学处理，如转变成遗传距离数据矩阵；通过一些遗传分析软件(常用的计算机软件如：PHYLIP J、PAI J、MEGA[J等)对这些处理后的数据，并基于一定的反映DNA序列进化规律的数学模型
构建分子系统树；对构建的系统树做相应的数学统计分析以检验系统树的可靠性等．值得注意的是，在分析
具体的研究对象时，上述各个环节是紧密联系的一个整体，要获得一个正确的结论，必须综合考虑每一环节
之间的内在联系．比如目的基因的选择、数据处理和分析的分类群之间、构树方法和分析软件的选择之间都
有密切的联系．
研究涉及到的重要议题
2．1 基因树和物种树
分子系统学的目的就是通过基因树来推测物种树．基因树是根据生物大分子的序列数据(主要为DNA
序列数据)构建的谱系树，物种树则是反映物种实际种系发生的谱系树．人们期待着得到的基因树和物种树
相一致，然而实际情况往往并非如此．Nei(1987)描绘了二种谱系树之间所有可能的关系，认为二种谱系树之间至少存在二个方面的差异：一是基因树的分化时间早于物种树，二是基因树的拓扑结构可能与物种树不一致(二个或多个基因树之间存在着差异)[77，如何将由多个基因或基因组建立的基因树综合成一个物种树，是分子系统学面临的一个主要难题．Maddison(1997)认为：基因重复所导致的并源而非直源关系的产生，不同生物类群问基因的水平转移，系统演化分歧事件发生后产生的分子性状的多型性引起的谱系选择等生物学因素是造成二者不一致的主要原因[8]．
相应地，分子系统学研究中一定要选择直源基因而非并源基因，选择水平转移事件较少的树，采用基于大量独立进化的基因位点进行分析等等，都不失为一种行之有效的方法，更有利于获得一个可靠的树．
2．2 分类群的选择
分子系统学研究中如何选择所研究的对象—— 内类群的选择是一个非常值得注意的问题．内类群选择
(内类群的数目及选择依据等)的科学性与否直接影响到所得结论的可靠性．关于内类群的数目，目前大多数
分子系统学家认为，当所分析的序列长度一定时，尽量选择较多的分类群有助于获得更准确的结论，加j．而内类群选择的依据主要体现在：(1)结合古生物学，形态学等各方面证据，尽量保证所选择的分类群确为一个单系发生的类群；(2)分类群的选择并非是随机的，尽量使其在所研究的生物类群中具有代表性；(3)在某些因具有明显长枝效应(或短枝效应)而导致的系统关系不确定的分支间增加分类群有助于减弱或消除这种效应[91．另外，在构建分子系统树中，同样需要选择外类群以确定系统发生树的基部位置，从而确定进化的方向．外类群的选择可以是单个(单一外类群)，也可以是多个(复合外类群)．
在所研究的内类群数目不多且二者之间的极性关系十分确定的情况下，单个外类群足以说明问题．而在较为复杂的分析中，通常选择复合外类群以保证所得结论的可靠性[11]．随机选择的外类群，极有可能因为亲缘关系较远，导致所得结果的不确定性增大．因此，在选择外类群时，必须结合其它分类学上的证据，或者在做详细的系统发育研究之前，首先对所研究的内、外群的关系进行初步探讨，以便于选择较为理想的外类群．最理想的外类群应该是该内群的姐妹群，因为二者间拥有较多的共近裔性状．
2．3 目的基因的选择
分子系统学研究中目的基因的选择也是一个至关重要的问题．一般来说，要根据所研究的具体分类群选
择适宜的基因：在高级分类阶元(科级以上)间的系统发生分析中，选择一些在进化中较为保守的基因或基因
片段(如核编码的蛋白质(酶)基因、核糖体基因(18S rRNA基因、28S rRNA基因)等)；在较低级的分类阶元
间，可以选择进化速率较快的基因或基因片断(如某些核编码基因的内含子或转录间隔区(ITS)以及一些细
胞器基因(线粒体基因和叶绿体基因)等)．
当然，每一个具体的研究对象，可以选择的基因数目可以是多个的，至于哪些是最有效的，这通常要依据具体情况做比较分析后才能得出结论．条件允许的话，可以作多基因或多基因组合分析后寻求一致树来加以解决．有时针对某些涉及到多种层次分类阶元的复杂分类群时，还可以采取组合分析的方法：即推断位于系统树基部的深层次的谱系发生时，运用较保守的基因作为目的基因；推断位于系统树中段的谱系发生时，采用进化速率较为适中的基因；在系统树顶端的终端分类单元时，采用进化速率较快的基因．这样可以在不同阶层的演化关系中都获得可信的结果[ ]．
2．4 基因序列数据的比对
选择了适宜的目的基因并通过基因的扩增(PCR技术)和序列测定后，就获得了各个目标生物类群的
DNA序列数据，对所获得的同源DNA序列进行比对是分析中的关键环节．所谓比对是指通过插入间隔
(gaps)的方法，使不同长度的序列对齐达到长度一致，并确保序列中的同源位点都排列在同一位置．其中间
隔的处理对后续的系统学分析有明显的影响[ ，：4]．序列比对目前通常基于以下二种原理：点标(dot plot)法和记分距阵(scoring ma仃ix)法[15]．
对于分类群数目较少且序列较短的对位排列，用肉眼判断，手工排序就能完成．但随着序列数目和长度的增加，即多序列对位排列(multiple sequence alignment)的l难度随之增大．因而计算机程序已成为多序列比对必不可少的工具，CLUSTAL系列软件[ ]是目前较为常用的排序程序．当然，软件自动排序的结果不可避免地会出现一些偏差，在此情况下，肉眼辨别和基于某些序列结构特征(如rRNA基因的二级结构等)的手工校正成为一种重要的补充手段．另外处理某些得失位点(indels)和多次替换位点是排序中一个十分棘手的事情，此时往往需要借助个人积累的经验和相应的数学方法、设计统计学模式以估算发生多次替换的数目而加以修正．
2．5 基因树的构建方法
目前，构建基因树的方法很多，常用的主要有二大类：即距离法(distancemethod)、和具体性状法(dis—cretecharacter method)．前者是将序列数据转变成数据(遗传距离)矩阵，然后通过此数据矩阵构建系统树；后者直接分析序列上每个核苷酸位点所提供的信息构建系统树，它又包括最大简约法(MP)和最大似然法
( )以及由ML法延伸的贝叶斯法(Bayesianmetl-,od)．
2．5．1 距离法：
该方法基于这样一种假设，即只要获得一组同源序列间的进化距离(遗传距离)，那么就可以重建这些序
列的进化历史．距离法中以邻接法(NJ)最为常用．NJ法是由Saitou和Nei(1987)提出，其原理是逐步寻找新
的近邻种类(序列)，使最终生成的分子树的遗传距离总长度为最小[17]．该法虽并不检验所有可能的拓扑结
构，但在每阶段诸物种(序列)聚合时都要应用最小进化原理，故而被认为是ME的一种简化方法．
由于分析
程序大大简化，费时较少，适于分析较大的数据集，目前已成为距离法分析中最通用的一种方法．NJ法不包
含速率一致的假设，通过采用“校正”距离矩阵来减少各分支速率的影响，因而系统树的正确与否依赖于校正距离系数的准确性．当序列较短时，计算仍可能有较大的统计误差．NJ法由于仅限于数据矩阵的统计值，相对于后述的具体位点的分析方法，其最大优势是运算十分简便而快捷．但是该法的不足之处是，由于不考虑各个位点的具体情况而丢失了一些有用的遗传信息，另外，通过这一方法得出的枝长估算值不具有确定的进化意义．
2．5．2 最大简约法
该方法源于形态学的分支系统学研究，而最早被Fitch(1971)用于核苷酸数据研究．它是一种最优化标准，遵循“奥卡姆剃刀(Ockharn’S razor)原理，即假设由一祖先位点替换为另一位点时，发生的替换数目最少的事件为最可能发生的事件[18]．在实际应用中，由于MP法只考虑所谓的“信息位点”，所得的进化树是最短的、也是变化最少的进化树．因而，简约法的“最小核苷酸替换数目”原则也意味着“异源同型事件(homoplastic event)(即平行替换、趋同替换、同时替换和回复突变等)最少．
就序列上的位点来说，它没有明确的假设，无须估计核苷酸替换时所用的各种数学模型，且当序列问的分化程度较小、序列长度较大且核苷酸替换率较稳定的情况下，该法能获得更为真实的拓扑结构[19]．反之，当序列较短且序列间的进化速率差异较大或替换形式不同时，异源同型事件出现的概率就大，产生所谓的“长枝吸引”或“短枝吸引”效应，而得出错误的拓扑结构．另外，由于MP法需要比较大量的拓扑结构，当序列数目和长度较大时，运算过程非常耗时．
2．5．3 最大似然法
该法最早由Felsenstein(1981)提出，其原理是以一个特定的替代模型分析一组既定的
序列数据，使获得的每一个拓扑结构的似然率均为最大，再挑出似然率值最大的拓扑结构作为最终树[ ．这
里所分析的参数是每个拓扑结构的枝长，并对似然率的最大值来估算枝长．
迄今的研究表明，在分类群数目较大、序列长度较长的复杂分析中，ML法的分析结果优于其它任何方法[15]．但由于该法涉及到全部序列的所有核苷酸位点的替换数，加之假设的替换模型包含一组可变参数(如转换/颠换比等)．所以该法和MP法一样，当序列数目和长度较大时，构建NIL树是极其耗时的，同时当序列数目足够大而序列长度很小时，和MP法一样，它也容易给出错误的拓扑结构．