标题：眼镜蛇毒神经毒素
简介
蛇毒是由蛇的毒腺分泌的一种天然蛋白质，含有多种蛋白质、多肤、酶类和其他小分子物质，具有较好的生物学活性，是人类研究最多、利用最多的动物毒素。从眼镜蛇毒中分离出来的α-神经毒素可以特异的、几乎不可逆的状态与乙酞胆碱受体结合(AChR)，是研究AChR结构和功能的理想研究工具。同时因为α-神经毒素具有高的稳定性，含有多对二硫键，有大量的天然同源蛋白，也使得它们成为研究蛋白折叠和结构功能关系的良好模型。[1]　
神经毒素是眼镜蛇毒的主要成分之一。自从1965年第一次从台湾产眼镜蛇毒中分离出NTX以来，NTX的生物化学及生物活性得到了广泛的研究。它是分子量约7kD的碱性蛋白质，因其能与胆碱能受体特异性结合，因此从20世纪60年代以来，一直是进行受体研究的重要工具之一。[1]
眼镜蛇毒中含有大量的神经毒素。我国有2种眼镜蛇，分别是舟山眼镜蛇(naja atra)和孟加拉眼镜蛇(naja kaouthia)，前者过去又称为中华眼镜蛇。舟山眼镜蛇毒主要含突触后神经毒素，与神经肌肉接头处N_型乙酰胆碱受体(nAChR)结合，阻碍化学神经递质乙酰胆碱与受体结合，从而阻断肌肉兴奋。[2]
眼镜蛇毒神经毒素(cobra neurotoxin)是眼镜蛇毒中最主要的致死成分，它的主要作用是选择性的与骨骼肌运动神经终板上的乙酰胆碱受体结合，从而起拮抗乙酰胆碱的作用。班建东等人的研究发现，眼镜蛇毒神经毒素经胃液水解后超滤得到分子质量小于3000的低分子水解产物，该产物在小鼠热板及大鼠嘶叫测痛实验中都显示出明显的镇痛作用，并有剂量效应关系。由于眼镜蛇毒神经毒素止痛无成瘾性，无耐药性，因此在吸毒者戒毒方面前景广阔。[3]  眼镜蛇毒神经毒素紫外光谱图[4]
理化性质
化学性质徐彭等从江西产中华眼镜蛇(Naja naja atra)蛇毒中分离提纯得到电泳纯的神经毒素，它对大鼠膈神经膈肌标本及清醒家兔具有典型的箭毒样作用，等电点为pH8.8，分子质量为6800~7000u。[5]眼镜蛇毒神经毒素HPLC图(2张)
眼镜蛇毒神经毒素图册参考资料。[6]
分离提纯选择SP-Sephadex C-50阳离子交换介质进行分离。采用醋酸铵缓冲液作为洗脱液，以酸性醋酸铵缓冲液平衡色谱柱，使带正电荷的神经毒素与色谱柱上负电荷基团结合，再通过逐步升高洗脱液的pH和增加离子强度洗脱神经毒素。升高洗脱液的pH可使神经毒素所带的正电荷减少，与色谱柱的结合力降低；而增加离子强度可使带正电荷的无机离子置换结合在色谱柱上的神经毒素，两者同时运用可产生相加作用，使洗脱液在pH和盐浓度都不太高的条件下，即可获得较好的分离效果。[6]  眼镜蛇毒神经毒素毛细管电泳谱图[3]
生化结构眼镜蛇毒神经毒素以突触后神经毒素为主。突触后神经毒素一般由60-80个氨基酸残基形成一条多肤链，氨基酸残基的组成及相对位置具有很大的同源性。分子中含有4-5个二硫键，其中4个二硫键聚集在一起形成一个致密的内核，由此核心伸展出三环就象三个手指，因此又被形象地称为三指蛋白(three-finger protein)。此类神经毒素属小分子蛋白，有长链和短链之分。短链含6062个氨基酸，四对二硫键，长链含66-74个氨基酸，五对二硫键。二级结构分析结果显示它不存在。广西眼镜蛇神经毒素的分子量为7862道尔顿，属于长链神经毒素。神经毒素(neurotoxin )富含碱性氨基酸，氨基酸的组成为：门冬氨酸，苏氨酸，丝氨酸，谷氨酸，甘氨酸，丙氨酸，胱氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，组氨酸，精氨酸，脯氨酸，蛋氨酸。[7-8]  眼镜蛇毒神经毒素分子结构[8]
长链和短链的蛇毒突触神经毒素在空间结构上的差别在于长链神经毒素中央大环顶部形成分叉，这是第5对二硫键的存在引起的;而且它还有一个长的尾巴从致密的二硫键核心伸出，这一突出的的尾部表面是其独特免疫学性质的结构基础。[9]  眼镜蛇毒神经毒素氨基酸排列[8]
毒理
Chang等利用离子交换色谱和反相HPLC从台湾产中华眼镜蛇(Naja naja atra)中分离出的一种神经毒素，与其它已知神经毒素不同的是，此神经毒素分子在N-端含有由两个额外的半胱氨酸残基连接形成的二硫键，圆二色谱和计算机模拟分子结构揭示其二级结构含较少的β-折叠。此外， Chang等从印度眼镜蛇(Indian King cobra，Ophiophagus hannah)中分离得到一种不同于α-神经毒素的新的神经毒素-Oh9-1，氨基酸序列测定表明Oh9-1由57个氨基酸和8个半胱氨酸残基组成，圆二色谱揭示其主要含β-折叠。Oh9-1能不可逆地抑制氯化氨甲酰胆碱诱导271的肌肉收缩，其IC50值相当于α-环蛇毒素的4倍。[10-11]  眼镜蛇毒神经毒素离子交换色谱图[10]
对人体作用
神经毒素后30min和2h，多数脏器的放射性掺入量高于对照组，说明中华眼睛蛇毒神经毒素对组织具有较强的亲和力，在体内分布广泛。其中血供丰富的器官，肾上腺、肝、脾等放射性掺入量相对较高，其亲和力无明显的组织特异性。[4][12]  大鼠静脉注射毒素后在器官内分布示意图[12]
125I-NTX 50μg·kg-1，给药后30min，分布最多的是肾脏，在其他脏器的分布多少依次为：膀胱及尿>肺>肠及内容物>肾上腺>肝>膈肌>脾>心>胸腺>脑。给药后2h，分布最多的仍是肾脏，但已减少至30min时的一半左右，在其他脏器的分布依次为：膀胱及尿>脾>胸腺>肠及内容物>心>肝>肾上腺>肺>脑>膈肌。125I-NTX在肾脏以外的各实质性脏器的分布，无明显的差异，均较肾脏少很多，在脑的分布较低。给药后2h，在脾和胸腺的分布较30min时有比较明显的增加。[13]
神经毒素后30min和2h，多数脏器的放射性掺入量高于对照组，说明中华眼睛蛇毒神经毒素对组织具有较强的亲和力，在体内分布广泛。其中血供丰富的器官，肾上腺、肝、脾等放射性掺入量相对较高，其亲和力无明显的组织特异性。各脏器以肾脏和膀胱及内容物中分布最高，为对照组的11倍，说明该毒素以其分解产物能迅速由肾脏排泄。脑组织的放射性掺入量在给毒后30min与对照组比较无显著性差异，在给毒后2h仍未见有显著差异，说明其在脑组织中的分布很低，可能是其不能透过血脑屏障之故。虽然可阻断N2胆碱受体，但NTX在骨骼肌中的分布却很低，说明NTX对骨骼肌没有特别的亲和力。[14]  神经毒素在大鼠和兔器官中的分布示意图[14]
医学作用
眼镜蛇神经毒素的免疫原性强，而分子量较小，免疫接种于动物，可制成实验性自身免疫性重如肌无力的模型，有助该病的发病机理研究。眼镜蛇神经毒素的特异性好、亲和力强用作研究神经递质受体组织及细胞特异性分布的探针及，用来分离提纯特异的神经递质受体如从银环蛇毒中分离的。NT进行放射性标记，再用放射自显影方法检测。可以确定N-AchR的位置以及受体通道的结构。神经毒素分子侧链基因进行氧化修饰制成变构神经毒素用于临床治疗脊髓前角、延髓和大脑皮质的运动神经元发生“退行变性病”。[15-16]
不同的蛇毒物质可能有对不同的细胞的凋亡产生不同的影响，研究其机制有利于对细胞凋亡的深入了解。Araki等人报道将眼镜蛇毒、海蛇毒等神经毒素作用于培养细胞时，不发生凋亡，表现为坏死。神经性蛇毒也有诱导细胞凋亡的作用。1994年Striahkov等人报道眼镜蛇外里海亚种神经毒素能诱导肿瘤细胞的凋亡，Renshaw等人用金环蛇毒鸡胚腹腔内注射，追踪到碘化。实验证明。神经性蛇毒也有抑制细胞凋亡的作用。蛇神经毒素可以各种神经痛用来进行戒毒治疗。应用蛇神经毒素止痛，不会成瘾，无赖药性，而且在显示疗效后剂量反可减少，已经用于吸毒成瘾者戒毒。[17]