标题：健忘性贝毒
简介
健忘性贝类毒素（AmnesicShellfish Poisoning，ASP）是由一种海洋硅藻——拟菱形藻Pseudo-nitzschiasp.产生的强神经性生物毒素，化学名称为多莫酸（domoic acid，简称DA）。一种兴奋性脯氨酸衍生物和神经毒素，是浮游植物代谢的产物，可以在被藻类污染的海洋食物特别是贝类中检测到，其结构与红藻氨酸和谷氨酸相似，是红藻氨酸受体的兴奋剂。[1-2]
当某些种类的硅藻大量发生时，双壳贝类、虾蟹类、头足类等较为低等的海洋动物，就能通过摄食藻类饵料而在体内积累大量的DA；它们一旦被海洋哺乳类摄食，就可能引起这些动物中毒或死亡。通过对该毒素的病理学研究发现，DA能与人类中枢神经系统（大脑海马）的谷氨酸受体结合，引起神经系统麻痹，并能导致大脑损伤；轻者引起神志不清和记忆丧失，重者引起死亡。[3]
在1987年发生爱德华王子岛贝类中毒事件之后，加拿大政府就制定了贝肉中DA的限量标准。随后，美国、欧洲、以及澳大利亚等纷纷采用欧盟标准，即20μgDAg-1贝肉；根据欧盟委员会指令（2002/226/EC），一旦发现贝类样品中DA含量超标，则立刻关闭养殖场或捕捞水域。[4-5]
研究一直认为双壳贝类在积累了大量DA的情况下往往没有任何不良症状。但随着研究的深入，发现赤潮毒素对双壳贝类有多种亚致死或致死性影响；例如，产麻痹性贝毒Paralytic Shellfish Toxins（PST）的塔玛亚历山大藻对双壳贝类孵化率、存活率、运动能力、滤食率和生长都有影响，同时还能抑制贝类闭壳运动、滤食率和清滤率；含有ASP的拟菱形藻P. multiserie 会引起太平洋牡蛎Crassostrea gigas 呼吸性酸中毒和缺氧现象以及血液性质的变化；与此同时，毒藻赤潮还可能是造成养殖贝类大量死亡的主要原因。[6-7]
理化性质
化学结构健忘性贝毒（ASP）的毒素成分是多莫酸（domoic acid，DA）（又译为拟软骨藻酸）及其一系列异构体。由于DA与红藻氨酸（kainic acid，KA）结构上的相似性，也因为它们都是由某些海洋植物产生的氨基酸，所以二者一度被混淆。人们从红藻门（Rhodophyta）的Chondria armata 和Digenea simplex中提取其天然产物，即KA，用来杀灭肠道寄生虫。DA 最早是从Chondria armata中提取；Takemoto 等人于1966 年确定了其立体化学结构。Impellizzeri et al.还从另外一种红藻Alsidium corallinum中提取出了DA。不过，直到1987年才发现DA对人体有毒，并发现产生这种毒素的是一直被认为无毒的海洋硅藻。[8-10]  红藻氨酸结构式[11]
多莫酸的化学名称为[2S-[2α，3β，4β（1Z，3E，3R）]]-2-羧基-4-（5-羧基-1-甲基-1，3-已二烯）-3-毗咯烷乙酸。分子式C15H21NO6，分子量311.34，结构式为DA共有10种异构体，包括Isodomoic acid A-H和C5’非对映异构体，其中Isodomoic acid D、E、F是有毒的。这些异构体可能是DA受紫外线照射后的反应产物，而不是藻类的天然产物。污染贝类和甲壳类的主要是DA，其毒性在所有异构体中是最强的（Wright and Quilliam，1995）。DA的分子式是C15H21NO6，分子量为311.33。DA 纯品为白色固体粉末，溶于水，微溶于甲醇，熔点223-224℃，在紫外光谱区最大吸收波长为242nm，在体积比为1：9的乙腈/水溶液和-12℃黑暗条件下可保持稳定一年左右。DA在常温或光照下在碱性溶液中不会降解，但它在酸性溶液（pH=3）中一星期降解50%。DA分子中含有三个羧基和一个仲氨基，羧基结构的pKa分别为2.10、3.72、4.97，氨基结构的pKa为9.82，因此它在溶液中的存在受pH的影响。[12-15]  ASP结构式[11]
检测方法研究人员已经开发出了多种健忘性贝毒检测方法，包括小鼠生物检测、HPLLC-MS、荧光HPLC、GC-MS、TLC（薄层色谱）、氨基酸分析、CE（毛细管电泳）、CEC（Capillary electrochromatography）、ELISA、受体结合实验（Receptorbinding assay）等，其中荧光HPLC和受体结合实验的灵敏度（limits of detection，LOD）能达到0.001-0.002 μg ml-1，而ELISA方法的检测下限（LOD）对贝肉样品是3.3μgkg-1，对海水样品是6.8 ngL-1；小鼠生物检测由于时间较长，又不够灵敏（只适合检测40-100μg g-1以上浓度的DA），已经不适用于20μg g-1的DA限量标准了。欧盟的官方DA检测方法是高效液相色谱（HPLC）法，而ELISA法及其试剂盒（ASP Direct cELISAtest kits，BiosenseLaboratories，Norway）也因具有方便、快速、灵敏等特点，于2006年被国际分析化学家协会（AOAC）核准为官方检测方法。[16]
高效液相色谱（HPLC）法的运用HPLC方法是AOAC（1991）推荐使用的DA检测方法，也是欧美各国自1987年ASP事件后所采用的官方DA检测方法。HPLC-UVD（高效液相色谱-紫外探测）法的检测下限是10-80 ng ml-1，需要使用酸性流动相来抑制羟基离子化反应。由于DA具有一个强大的紫外色素团，所以利用简单的无梯度HPLC和紫外探测就可以检出；因此，ASP也是所有海洋生物毒素中最容易检测的。[17-18]
LC/MS（液相色谱/质谱联用）法利用甲醇水溶液抽提组织匀浆，用乙腈水溶液稀释后，再用C18固相萃取，并采用离子喷射界面。LC/MS或LC/MS/MS检测法相当可靠，检测下限与HPLC-UV 近似。Dahlmann et al.使用一种改进的LC-ESI-MS（电子喷射电离液质联用法）可以一次性同时检测包括DA在内的7种生物毒素。[19]
毒理学
毒源多莫酸DA最早是从Chondria armata中提取；Takemoto 等人于1966年确定了其立体化学结构。Impellizzeri et al.还从另外一种红藻Alsidium corallinum中提取出了DA。不过，直到1987年才发现DA对人体有毒，并发现产生这种毒素的是曾经一直被认为无毒的海洋硅藻。拟菱形藻属已有12种被报道可产生软骨藻酸，其中澳洲拟菱形藻（P.australis）、成列拟菱形藻（P.seriata）与多列拟菱形藻（P.multiseries）的产毒性已得到广泛的认可。而其他9种：靓纹拟菱形藻（P.calliantha）、细弱拟菱形藻（P.cuspidata）、拟柔弱拟菱形藻（P.pseudodelicatissima）、多纹拟菱形藻（P.multistriata）、尖刺拟菱形藻（P.pungens）、柔弱拟菱形藻（P.delicatesima）、P.fraudulenta、P.turgidula和P.galaxiae的毒性在不同地域则表现不同。[20]  产毒菱形藻表面微观结构[17]
主要通过监测水中产毒藻的存在和数量，来对可能出现的贝毒风险提前发出警报。但是，这个属的硅藻，特别是某些产毒种（如P. multiseries）和微毒种（如P. pungens）在普通光镜下非常难分辨；通用的办法是在2000倍扫描电镜（SEM）下区分有毒藻种。因为利用扫描电镜（SEM） 可以看到藻细胞的细微结构；在高倍率下，甚至可以看清硅藻壳上的肋纹及肋纹间拟孔的形状、大小和数量。SEM 照片显示了三种拟菱形藻的壳面细微结构：（1）P.pseudodelicatissima，是在近期发生的一次西北太平洋有史以来规模最大的由该藻引发的赤潮中采集的；（2）P. multiseries；（3）P. pungens。它们的主要区别在于肋纹间的拟孔：P.pseudodelicatissima 的肋纹之间只有1排方形拟孔；P. multiseries 有3-4 排孔；而P. pungens 有2-3 排孔，并且其孔径比P. multiseries 的大。[21]拟菱形藻细胞微结构(2张)
拟菱形藻Pseudo-nitzschia细胞微结构图册参考资料。[22]
作为产生DA的主要微藻类群（eu nitzschia sp.）广泛分布于温带和寒带水域，在春、秋季大量降雨、河流和上升流带来丰富营养盐时容易暴发生长形成赤潮；淡水注入和海流交汇也为拟菱形藻赤潮的形成创造了条件。Felhling et al.发现光照周期对不同种类拟菱形藻赤潮的发生有一定诱导作用。[23-24]
值得注意的是，ASP的出现并非一定伴随着拟菱形藻赤潮；有时在藻细胞浓度很低的时候，也会在贝类体内检测到DA。不同的藻种以及同一种藻不同的藻株之间在毒素产量上是有较大差异的。从同一次赤潮水样中取得的P. australis的DA含量可高达78pg cell-1，而P. multiserie的DA含量则只有6 pg cell-1；而在实验室中培养的P. multiserie，的产毒量是1-20 pg cell-1。[15]
很多海洋动物都能积累DA而不发生明显的中毒反应，包括鸟蛤（CerASPoderma edule）、太平洋荚蛏（Siliqua patula）、太平洋巨蟹（又名黄道蟹）（Cancer magister）、泳蟹（Polybius henslowii）、鳀鱼等（Vale and Sampayo，2001；Wekell et al.，2002；Costa et al.，2003），这可能是因为它们的神经生理机制与高等动物不同，或者它们对DA有较强的耐受能力。DA在动物的各种组织中积累的程度是不同的，一般在消化道积累较多；例如，DA在梭子蟹肌肉和内脏中的含量可分别达到323.1μg g-1和571.6μg g-1，是其他身体组织的4-12倍。不过，DA的积累能力在生物个体间可能差别很大。鱼类对DA的吸收很差，因而毒素一般只积累在肠道中并可能在短时间内达到很高的水平（2300μg .g-1）；而肌肉的DA含量则很低。欧洲大扇贝（Pecten maximus）有可能是发现的对DA积累能力最强的贝类，它富集的DA有94%以上存在于消化道中（Blanco et al.，2002a）。Douglas et al发现，DA在海洋扇贝（Placopecten magellanicus）软组织中蓄积量的顺序是：消化腺>>其他软组织>>闭壳肌；在投喂人工培养的P. multiseries（DA含量4.0-6.7 pg cell）6 天后，消化腺中DA的含量可高达3108μg g ，而闭壳肌中DA的含量只有0.7-1.5μg g-1。[25-27]
人类通过食用海产品摄入健忘性贝毒，多通过食用贻贝、蛤类在体内积累。与贝类相比，人类通过食用鱼类而受到的影响较小。据研究，当人体内贝毒含量在0．.2～0.3 mg/kg（湿重）时，机体不受影响；当达到0.9～2.0 mg/kg（湿重）时，机体会出现轻度眩晕等症状；当达到1.9～4.0 mg/kg（湿重） 时，机体会出现方位障碍等症状。另外，ASP具有热稳定性，一般的烹饪过程并不能够破坏软骨藻酸的毒性。虽然一般家庭的蒸和煮的过程会减少贝类组织中的ASP含量，但是ASP仍会随烹饪过程进入到烹饪油中，进而通过消化道进入人体。[28-29]
健忘性贝毒作为一类神经毒素、递质和阻断剂在贝类组织中积累，进而间接地影响着人类的健康。对由DA引起的健忘性贝中毒还没较好的疗法，仅在小鼠实验中发现用苯二氮草（Diazepan，5mg /kg）可减少震颤行为，但无法完全恢复受损的海马结构或空间记忆能力。同时，研究表明软骨藻酸对昆虫有杀灭能力，其对嶂螂、苍蝇的杀死效果不逊于r-BHC。主要靠预防，在毒素容易暴发的季节里（如每年的4、5月份和9、10月份），不吃或少吃贝类产品，来减轻或避免贝类毒素中毒事件的发生。[30]
中毒机制健忘性贝毒的毒作用机制与兴奋性氨基酸受体和突触传导有关。兴奋性氨基酸L-谷氨酸和L-精氨酸作为神经递质与其受体结合，有开启膜上Na+通道的作用，导致Na+内流及膜的去极化。软骨藻酸属于一种兴奋性氨基酸类似物，与L-谷氨酸和L-精氨酸竞争地与兴奋性氨基酸受体结合，且其亲合力更强，使Na+通道开放，导致Na+内流及膜的去极化。另外被软骨藻酸激活的受体打开的通道可对Ca2+高度通透，导致致死性细胞Ca2+内流。[31]
ASP是比PSP毒素弱一些的神经性毒素，中毒者症状奇特，多数在食后3-6h发病，主要表现为腹痛、腹泻、呕吐、流涎，同时出现记忆丧失、意识混乱、平衡失调、不能辨认家人及亲朋好友等严重精神症状，严重者处于昏迷状态，重症者多为老人，并伴有肾脏损害，曾有12人病后记忆丧失长达18个月之久的报道。软骨藻酸的LD50约10mg/kg体重（小鼠）。从中毒死亡者的病理解剖可见脑的海马回、丘脑和杏仁核都有损伤，这与用软骨藻酸进行动物试验的病理结果相同。[32]
中毒事件历史上唯一一次有完整记录的健忘性贝毒中毒事件是1987年发生在加拿大爱德华王子岛（Prince Edward Island）的食用贻贝中毒事件。受害者表现出（头痛和短期记忆缺失），共有150人有中毒反应，其中107人确诊为DA中毒，9人入院治疗，4人死亡。最后确定引发这一事件的是拟菱形藻（Pseudo-nitzschia f. multiseries）赤潮，当时贻贝肉中DA的含量是300-1000μgg-1，而人摄入的毒素量可能达到了1-2 mg kg-1。[33]
1991年，在美国加州的Monterey湾发现了死亡或垂死的海鸟，很多垂死海鸟都表现出了类似神经中毒的症状，而在死鸟的胃含物中检测到大量DA。这些海鸟主要以湾内的鳀鱼（Engraulis mordax）为食，而在鳀鱼的肠道中发现了拟菱形藻P. australis。1998年，在加州又发生了400多头海狮（Zalop uscalifornianus）因摄食莎瑙鱼（Sardinops sagax）和鳀鱼中毒死亡的事件，这些饵料鱼类也是因摄食了P.australis而含有大量的DA（Scholin et al.，2000）。这已成为威胁当地渔业的一大问题；据报当地已经发现多种有毒拟菱形藻，其中P.multiseries，P.australis，P.pungens和P.psedudodelicatissima 等种类都能产生DA，但其DA含量上有较大差异。[34]
毒素环境监测
拟菱形藻赤潮在世界范围内越来越频繁地发生，而且ASP毒素对包括人类在内的多种动物都有强烈致毒作用，因而赤潮监测和减灾措施就显得非常重要。正是因为有了相对完善的赤潮监测和管理系统，作为拟菱形藻赤潮多发地区的加拿大、美国和欧洲各国，自从1987年爱德华王子岛贝毒事件之后，ASP导致人类中毒的事件就再也没有发生过。[35]
建立完备的赤潮监测网和管理体系，是人们抵御赤潮风险的首要措施。一方面可以通过监测水中的产毒拟菱形藻或ASP毒素来进行预测预报；另一方面也可基于对毒素经食物链传递途径的清楚认识，开展毒素污染指示生物的定期检测。作为赤潮指示生物的必要条件是：常见种，个体较大的非养殖生物，对毒素敏感并能快速积累而达到较高浓度；最好是积累的毒素较不容易净化。比如加拿大和美国己经利用浪贻贝（California Surf Mussel Mytilus californianus）作指示生物。[36]