标题：肝素酶
简介
肝素酶（heparinase）是一类作用于肝素或者乙酰肝素分子的多糖裂解酶，编号为EC 4.2.2.－。广义上的肝素酶既包括微生物产生的以裂解方式降解肝素或硫酸乙酰肝素的酶类，又包括动物体内产生的以水解方式降解硫酸乙酰肝素的内源性（类）肝素酶（heparanase）。
来源
肝素酶主要从一些利用肝素为碳源的细菌中分离得到，最初来源于肝素黄杆菌（Flavobacterium heparinum或Pedobacter heparinus）。此外，在许多微生物中也发现了肝素酶的存在，如棒杆菌（Corynebacterium sp.）、鞘胺醇杆菌（Sphingobacterium sp.）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）、解肝素拟杆菌（Prevotella heparinolytica）以及粪便拟杆菌（Bacteroides stercoris HJ-15）等。但至今肝素黄杆菌仍然是商品肝素酶的唯一来源。已从肝素黄杆菌中分离纯化出的肝素酶有三种，分别为肝素酶I、II、III，这三种酶的酶学特性各不相同。在肝素黄杆菌纯化出的三种肝素酶中，只有肝素酶II的结构被解析，它的底物特异性也最差；肝素酶I则最适用于低分子量肝素的制备。
应用
肝素酶具有许多重要的医药用途，主要用途如下： 　
（1）制备低分子和超低分子肝素 　
低分子量肝素和超低分子量肝素具有抗凝血功能，在抑制血管增生，阻止肿瘤转移，治疗癌症，抗过敏等方面也有特殊的功效。利用肝素酶生产低分子肝素条件比较温和，环境友好而且不会作用于硫酸基团，是理想的工业生产方法。 　
（2）体外循环血液中肝素的消除 　
某些重症病人例如尿毒症患者在手术过程中需要进行血液的体外循环，在体外循环的过程中为防止血液凝固需要加入肝素。为防止肝素残存在血液中影响血液凝固，临床上需要加入鱼精蛋白来中和肝素。临床研究发现鱼精蛋白严重损害血小板，影响动脉血压得稳定，而肝素酶没有这种副作用，因此是理想的替代材料。需要注意的是，由于肝素酶对细胞外基质也有降解作用，因此用于血液肝素化去除的肝素酶也需进行固定化，并且要求肝素酶不能有免疫原性。 　
（3）肝素精确结构的确定 　
将待分析的肝素先用来自肝素黄杆菌的经过纯化所得到的肝素酶进行降解，得到四糖产物，然后再用同样来自肝素黄杆菌的经过纯化所得到的乙酰肝素酶进行深层降解处理，通过对最终的产物分析，就可以推测出相应的肝素的结构。 　
（4）制备抗肿瘤药物 　
由于肝素酶与肿瘤转移密切相关，因而越来越受到重视。许多研究人员试图寻找肝素酶的抑制剂，如硫酸海带多糖等，抑制肿瘤的生长和转移。 　
（5）抑制新血管生成及碱性成纤维细胞生长因子介导血管内皮细胞的增殖 　
新血管的形成关系到组织的分化，伤口的愈合和肿瘤的转移。大多数的研究者都把精力放在肝素类物质在新血管的形成过程中所起的作用。其实众多的体外还是体内的新血管生成及碱性成纤维细胞生长因子介导血管内皮细胞的增殖实验表明，肝素酶I和III（不包括肝素酶II）可以有效地抑制它们的发生。其作用的机理可能是在过程中起重要作用的乙酰肝素的某一部分被肝素酶切除，使新血管的形成得到抑制。 　
（6）肝素酶在产科领域中的应用 　
胚泡植入需要子宫内膜细胞表面成分发生相应的变化。肝素酶能调节胚泡滋养层细胞，使其更易粘附和植入子宫内膜。同时，肝素的侧链可结合多种活性因子:如表皮生长因子，血管内皮细胞生长因子，肝素结合的表皮生长样因子及其他生长因子与细胞因子。肝素酶分解肝素侧链后，这些因子释放，可以促进滋养细胞分裂、增殖和血管生成。 　
胎盘组织是一种细胞滋养细胞侵入子宫内膜后形成的特殊结构，滋养细胞有很强的侵入能力。肝素酶通过分解肝素侧链，释放出细胞因子，促进滋养细胞侵入血管基底膜，使新生血管形成，为胚胎组织生长发育奠定基础。肝素酶与妊娠的成功和分娩的发动也有一定的关系。
肝素酶生产技术简介
目前，酶降解法中的肝素酶产品来源主要是肝素黄杆菌（Flavobacterium heparinum）中肝素酶I的分离纯化。但此法所得到的肝素酶产量低、纯化困难，造成酶的成本非常昂贵，也极大地限制了酶法制备低分子肝素的发展。而利用重组菌株生产肝素酶I是一条极有前景的途径，但通常的表达体产生的肝素酶I容易形成包涵体，无法直接利用。 　
为开发高效的肝素酶生产技术，解决肝素酶应用的成本问题，清华大学化工系生物化工研究所联合思清源生物科技有限公司研发人员从一株肝素黄杆菌中克隆得到肝素酶I的基因，利用融合蛋白技术，设计和构建了高效生产可溶性的肝素酶I的基因工程菌株，实现了可溶肝素酶I的生产，获得了很高的酶活。研究表明，该重组可溶肝素酶I能和商品肝素酶一样有效地降解肝素, 制备出理想的LMWH。通过控制酶解反应条件，可得到平均分子量在5000—6000的低分子量肝素寡糖。另外，利用膜生物反应器通过控制酶反应时间和酶量，还能够制备出目前国际上备受关注超低分子量肝素（平均分子量2000-3000左右）。所以该融合表达法是一种具有广泛应用前景的低成本生产肝素酶I的方法。该法得到的重组肝素酶I只需进行一步亲和层析就能达到95%的纯化效果；同时利用融合蛋白的亲和吸附能力容易实现肝素酶I的定向固定化；融合酶的稳定性高，使酶的反复使用成为可能，从而提高酶反应效率，降低酶的使用成本和低分子量肝素的生产成本。实验结果表明，该融合酶摇瓶培养的酶活可以达到16000IU/L，5L发酵罐生产酶活达到了20000IU/L以上。同时，对多功能肝素酶的分子设计进行了系统的研究，得到了获得高活性和高亲和吸附融合酶的设计策略，而且也成功的用于肝素酶II和III的高效生产。由于采用了制备多功能酶的融合蛋白技术，该重组肝素酶I的生产、分离纯化和使用成本可以大幅度降低，因此利用该融合蛋白生产具有理想平均分子量且分子量分布范围窄的低分子量肝素的方法蕴含巨大的工业应用价值。[1]
现有产品情况
肝素酶I：[2]产品名称： rHeparinase I (rHep I)
基因来源：肝素黄杆菌（Flavobacterium heparinum, ATCC 13125）
适用底物：肝素
形态：溶液
产品货号及规格：RH-1107S 0.2IU / RH-1107M 0.5IU / RH-1107L 1IU
酶活：10000IU/L
分子量：84.4 KDa
适用pH值：最适7.4，适用范围4-9
贮存温度：-20℃
适用温度：最适30℃，适用范围20-37℃
酶活测定方法：232nm光吸收法，此法测定的1个国际单位（IU）是指在30℃，pH值为7.4的条件下能产生1 μmol 4，5-不饱和糖醛酸的效力。
酶的特性
肝素酶可选择地剪切硫酸化肝素聚糖中葡萄糖胺和糖醛酸之间α（1-4）糖苷键，三种不同的肝素酶（酶Ⅰ、酶Ⅱ、酶Ⅲ）具有非常不同的专属性。肝素酶Ⅰ切断肝素和硫酸乙酰肝素（相对活性约3:1）在葡萄糖胺和○-硫酸艾杜糖醛酸之间的连键，产物主要是二糖。此酶也能切断肝素分子中的抗凝血酶Ⅲ结合五糖位点。肝素酶II[3]产品名称： rHeparinase Ⅱ (rHep Ⅱ)
基因来源：肝素黄杆菌（Flavobacterium heparinum, ATCC 13125）
适用底物：肝素和硫酸乙酰肝素
形态：溶液
产品货号及规格：RH-2108S 0.2IU / RH-2108M 0.5IU / RH-2108L 1IU
酶活：4000IU/L
分子量：125.3 KDa
最适pH：最适7.6，适用范围4-9
贮存温度：-20℃
最适温度：最适39℃，适用范围20-37℃
酶活测定方法：232nm光吸收法，此法测定的1个国际单位（IU）是指在30℃，pH值为7.6的条件下能产生1 μmol 4，5-不饱和糖醛酸的效力。
酶的特性
肝素酶可选择地剪切硫酸化肝素聚糖中葡萄糖胺和糖醛酸之间α（1-4）糖苷键，三种不同的肝素酶（酶Ⅰ、酶Ⅱ、酶Ⅲ）具有非常不同的专属性。肝素酶Ⅱ主要在己糖胺和糖醛酸（葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸）的1-4连接位点剪切硫酸肝素和肝素，相对活性大约2:1，剪切反应的主要产物是二糖。肝素酶III[4]产品名称： rHeparinase Ⅲ (rHep Ⅲ)　　
基因来源：肝素黄杆菌（Flavobacterium heparinum, ATCC 13125）
适用底物：肝素或硫酸乙酰肝素（首选）
形态：溶液
产品货号及规格：RH-3109S 0.2IU / RH-3109M 0.5IU / RH-3109L 1IU
酶活：5000IU/L
分子量：116.3 KDa
最适pH：最适7.3，适用范围4-9
贮存温度：-20℃
最适温度：最适45℃，适用范围20-37℃
酶活测定方法：232nm光吸收法，此法测定的1个国际单位（IU）是指在30℃，pH值为7.3的条件下能产生1 μmol 4，5-不饱和糖醛酸的效力。
酶的活性
肝素酶可选择地剪切硫酸化肝素聚糖中葡萄糖胺和糖醛酸之间α（1-4）糖苷键，三种不同的肝素酶（酶Ⅰ、酶Ⅱ、酶Ⅲ）具有非常不同的专属性。肝素酶Ⅲ在己糖胺和葡萄糖醛酸之间的1-4连接位点剪切硫酸肝素，主要产生二糖。该酶对肝素和低分子量肝素不起作用。