标题：鱼腥藻毒素a
简介
随着工农业生产的发展，大量氮、磷排入水体中，导致水体富营养化日益严重，内陆水体富营养化的加剧必将引起有害藻类菌绒（Harmful algal bloom，HAB）频繁发生，其中蓝细菌水菌绒（Water bloom）是淡水水体中危害最严重的一类，中国一些学者将Water bloom译为“水华”或“水花”。淡水水体富营养化危害最大的一个表征是蓝细菌菌绒的出现，菌绒形成后，水面被一层蓝色油膜所覆盖，在岸边也大量堆积，就象一层厚厚的绿色油漆，它的疯长泛滥速度甚至可跟海洋赤潮相提并论；菌绒疯长时，不仅大量消耗水中的溶解氧，散发腥臭，严重影响环境，而且释放毒素，导致大量生物死亡，破坏生物多样性。[1]
鱼腥藻毒素a由蓝细菌（Cyanobacterium）的水华鱼腥藻（Anabaena flos-aquae）属产生，其他种的鱼腥藻也能产生毒素，不同的种产生毒素的量和种类也不一样，而且随着季节变化较大。Stanier用电子显微镜研究了上述藻类细胞结构，发现构成蓝绿藻的细胞并不是真核细胞，他认为，命名为蓝细菌要比蓝绿藻更科学、准确，20世纪90年代以后国外文献亦逐渐使用Cyanobacterium替代Blue-green algae。他取鱼腥藻的英文词头ana-和toxin命名鱼腥藻毒素，与生物学名词蛋白质类化合物anatoxin（类毒素，变性毒素，去毒毒素，英文词头ana-有类似、变化、没有的意思）相同纯属巧合，因此，在文献中以anatoxins（鱼腥藻毒素总称）或anatoxin-X（某种鱼腥藻毒素）的形式区别于anatoxin，而anatoxin的生物学意义是相对于某种蛋白毒素，具有与毒素类似的结构（免疫识别的氨基酸残基序列），没有毒性，能产生免疫作用对抗该种毒素，毒素变性灭活或化学修饰后可成为anatoxin，具有与毒素类似结构的同源蛋白是天然的anatoxin，中国一些学者将鱼腥藻毒素误译为类毒素或变性毒素。[2]
鱼腥藻毒素a属鱼腥藻毒素，由蓝细菌（Cyanobacterium）的水华鱼腥藻（Anabaena flos-aquae）属包括水华鱼腥藻（Anabaenaflos-aquae）、颤藻（Oscillatoria）、束丝藻（Aphainizomenon）、节球藻（Nodularia）等产生。其它种的鱼腥藻也能产生毒素，但不同种所产毒素的量和种类不同，而且随季节变化较大。通常鱼腥藻毒素被划分为anatoxin-a（antx-a，鱼腥藻毒素a）、homoanatoxin-a（homoantx-a，鱼腥藻毒素同系物a）、anatoxin-a（s）（antx-a（s），鱼腥藻毒素a（s））以及antx3/b、antx-b（s）等种类，其中前3种的化学结构已经确定。[3-4]  鱼腥藻毒素结构式[5]
物化特性
化学性质及结构鱼腥藻毒素a的晶体结构和绝对构型经Huber和Koskinen等测定为S-trans-（1R，6R）-（+）2-乙酰基-9-氮杂双环[4，2，1]-壬-2-烯，相对分子质量165，AnTX-a（s）的结构在1989年由Matsunaga等确定，相对分子质量252，CD谱测定AnTX-a（s）的光学活性为（-）的光活体，1H和13C NMR解析的分子结构中存在S构型的手性碳，极性强，溶于水等极性溶剂，在碱性条件下不稳定。HomoAnTX-a是AnTX-a的乙酰基被丙酰基取代的结构类似物，药理作用与AnTX-a相似。[6]  鱼腥藻毒素紫外光谱[7]
1977年，Devlin首先从水花鱼腥藻NRC-44-1中分离出了鱼腥藻毒素a，证明它是一种神经毒碱，相对分子质量量为166D，小鼠的90%致死剂量为0.3mg/kg。Huber和Koskinen等测定了antx-a的晶体结构和绝对构型，为：S-trans（1R，6R）-（+）2-乙酰基-9-氮杂双环[4，2，1]-壬-2-烯，相对分子质量165。由于它的分子结构具有半刚性，酷似乙酰胆碱，不被酶解，因而活性高，毒性大。但神经毒素不稳定，半衰期短，尤其在光照和高pH条件下，可迅速降解为无毒。[8]
Homoantx-a在结构上和antx-a很相似，只是其中的乙酰基换成了丙酰基，由Wonnacott等在1992年首次合成，其毒力也与antx-a相近。1992年，Skulberg等从中国台湾Osillatoria中分离homoantx-a，采用腹膜注入的方式时，对小鼠的致死剂量为288~578μg/mL。2003年，Watanabe等鉴定了有毒菌株Raphidiopsis mediterranea LBRI 48的毒素成分。[9]接着，Namikoshi等改良了以前的分离步骤，对同株菌分泌的antx-a、homoantx-a和一种新的homoantx-a衍生物4-羟基homoantx-a毒素进行了分离鉴定，这是对同一株蓝藻细菌同时产生antx-a和homoantxn-a的第1次报道。[10]  鱼腥藻毒素分离纯化光谱[11]
鱼腥藻毒素a（s）最早是从水华鱼腥藻NRC52517中分离到的有机磷酸酯。研究表明，同鱼腥藻毒素a一样，鱼腥藻毒素a（s）也为生物碱类物质，具有与鱼腥藻毒素a类似的拟胆碱作用，可影响乙酰胆碱的正常释放，导致神经肌肉过度兴奋而痉挛，最后致使动物呼吸受限窒息死亡。但是，鱼腥藻毒素a（s）并不像鱼腥藻毒素a那样具有直接的激动剂和神经肌肉阻断剂活性，它是一种潜在的乙酰胆碱酯酶抑制剂，和神经致毒剂甲氟膦酸异丙酯具有相同的功效。鱼腥藻毒素a（s）的结构在1989年由Matsunaga等确定，相对分子质量252，CD谱测定鱼腥藻毒素a（s）的光学活性为（-）的光活体，二维核磁共振测定其分子结构中存在S构型的手性碳，极性强，溶于水等极性溶剂，在碱性条件下不稳定。鱼腥藻毒素a（s）对小鼠有高于鱼腥藻毒素a10倍的毒性，Mahmood等研究了酶抑制反应动力学，进一步确定了鱼腥藻毒素a（s）是非竞争性胆碱酯酶抑制剂，且对酶有不可逆抑制作用。[12]
合成鱼腥藻毒素a在结构被解析后，许多学者对其进行了全合成研究：Cambell等（1977）用天然（2R，3S）-盐酸可卡因合成了（+）-AnTX-a；Bates等（1979）用甲基吡咯合成了AnTX-a；Petersen等（1984）用DL谷氨酸合成了光学纯度的（+）和（-）的AnTX-a；Tufariello等（1984）用吡咯-1-氧化物合成了（±）AnTX-a；Danheiser等（1985）分别用环庚-4-酮和四溴三环辛烷合成了（±）AnTX-a；Wiseman等（1986）用（1，5）-环辛二醇合成了（±）AnTX-a；唐洪春等（1990）改进了Cambell的合成方法，经8步反应合成了（+）AnTX-a。[13-15]
由于AnTX-a活性高（IC50，10-9mol·L-1），是N-受体激动剂最典型的代表物，许多学者运用分子力学、量子力学、二维核磁和X-光晶体衍射的方法研究了AnTX-a与N受体相互作用的结构特点，发现：（1）AnTX-a的乙酰基不被酶水解；（2）N9与受体作用时能形成强的静电作用；（3）羰基O与受体能形成氢键；（4）C=C-COCH3的α，β不饱和酮平面结构保证了与受体的很好结合，并且能形成疏水作用。但不同方法对AnTX-a的药效构象研究却有不同结果：晶体结构研究表明，反式是稳定构象；二维核磁研究表明，两种构象同时存在；MMP2程序计算表明，顺式比反式构象稳定；MMX、MOPAC、COSMIC和GAUSSIAN程序计算表明，反式比顺式构象稳定；Hacksell等应用“活性类似物方法”和Nicolotti等运用经典的Hansch方法和比较分子场分析法（CoMFA）分析，认为AnTX-a的药效构象为反式构象。对于AnTX-a（s），含活泼P-O-N键的磷酸酯基、胍基和三级胺基是重要的活性基团，胍基和三级胺基2个基团与胆碱酯酶形成双阴离子位点作用，保证了它的高活性。[16-18]  鱼腥藻毒素合成示意图[19]
毒理
毒性鱼腥藻毒素a及其异构体AnTX-a（s）是最重要的两种鱼腥藻毒素，他们毒性大，活性高，对环境影响大，因而受到关注。鱼腥藻毒素-a（AnTX-a）在蓝细菌的水华鱼腥藻（Anabena flos-aquae NRC-44-1）的细胞里是含量最高的一种毒素，因而，最先分离提取到，这个生物碱作用于突触后膜，是强效拟胆碱去极化神经肌肉阻断剂。进一步的药理研究表明，AnTX-a是烟碱样胆碱受体激动剂，在与烟碱样受体相互作用时，（+）的异构体比（-）的异构体强1000倍，它的分子结构具有半刚性，酷似乙酰胆碱（乙酰基与双键形成的平面结构，相当于乙酰胆碱的酯桥平面），不被酶解，因而活性高，毒性大，有“极速致死因子”（very fast death factor）之称，LD50=200μg·kg-1（ip. mouse），由于其分子的刚性和高活性，它是研究配基与烟碱样胆碱受体相互作用的很好探针。antx-a是一种毒性剧烈的生物碱神经毒素（例如：对老鼠的半致死量为200μg/mL），具有很强的烟碱样神经肌肉去极化阻断作用，动物中毒后会出现肌束抽搐、角弓反张、呼吸肌痉挛、流涎等症状。[20-21]
关于antx-a对动物的毒性研究已报道甚多，但对植物的毒性作用知之甚少，Mitrovic等首次报道了antx-a对水生植物的毒力影响。[22]
鱼腥藻毒素-a（s）（AnTX-a（s））最早是从水华鱼腥藻（anabaena flos-aquaeNRC-525-17）中分离到的有机磷酸酯，研究表明，AnTX-a（s）具有与AnTX-a类似的拟胆碱作用，但并不像AnTX-a具有直接的激动剂和神经肌肉阻断剂活性，它的药理作用分子机制完全不同于AnTX-a。用实验室培养产毒藻株（Anabaena flos-aquaeNRC-525-17）的方法产生毒素，然后分离纯化，得到毒素，由于毒素不纯，测得LD50（ip. mouse）在40~60μg·kg-1的范围内，大约50μg·kg-1，而且小鼠死亡时间在30~6min，急性毒性症状有：流涎、流泪、尿失禁、缩瞳、痉挛、呼吸抑制等。分别用阿托品和d-筒箭毒碱对抗An-TX-a（s）的药理作用，实验表明，前者能延长小鼠的存活时间，后者能使肌肉痉挛完全消失，说明AnTX-a（s）可能是胆碱酯酶抑制剂，既能引起烟碱样作用，也能引起毒蕈碱样作用。Mahmood等研究了酶抑制反应动力学，进一步确定了AnTX-a（s）是非竞争性胆碱酯酶抑制剂，而且对酶进行不可逆抑制。[23]
毒代动力学酶的亲合作用比DFP强110倍，双分子抑制常数比DFP强22倍。在进行毒性评价时，毒素含量只有70%~80%（TLC），测得LD50（ip. mouse）为大约40μg·kg-1，死亡时间小于30min。研究表明LD50（ip. mouse）30~50μg·kg-1的数据，毒素含量大约80%（TLC），0.44μg·mL-1的毒素在3min内能抑制酶的全部活性，用水稀释不能使酶恢复活性，即使稀释100倍，1h内仍不能使酶恢复丝毫活性。Hyde等的研究表明，用高浓度的解磷定（2-PAM）、双解磷（TMB4）能使被毒素抑制的酶有效恢复，而可逆抑制剂毒扁豆碱、阿托品能有效地保护酶和对抗毒素的抑制，同时测得酶活性Ic953.1×10-8mol·L-1，LD50（ip. mouse）大约20μg·kg-1。[24-25]
Cook等按照Mahamood的方法培养藻株，分离并纯化毒素，对小鼠腹腔注射，用吡啶斯的明（pyridostigmine），毒扁豆碱（physostigmine），对氧磷（paraoxon）对比实验，发现AnTX-a（s）并不抑制大脑等中枢神经系统的胆碱酯酶，被认为是由于AnTX-a（s）不能穿过血脑屏障，同时测得LD50（ip.mouse）约为31μg·kg-1，毒素含量80%~90%（TLC）。50mg·kg-1的阿托品能延长存活时间和增加致死剂量25%~35%，致死剂量的毒素能引起血压、心率、呼吸频率、肺活量突然下降，同时测得LD50（ip.mouse）约为21μg·kg-1，毒素含量90%~95%（TLC）。值得注意的是进一步的研究工作，用鼠进行毒性测定，分3组，每组8只鼠做LD50值测定实验，（a）1.5μg·kg-1剂量时，中毒症状不明显，只见到活动减少；（b）3.0μg·kg-1剂量时，产生明显中毒症状：流涎、流泪、缩瞳、尿失禁、运动减少、痉挛；（c）9.0μg·kg-1剂量时，在1h内全部死亡，按照“Bruce法”计算出LD50（ip.mouse）为5.3μg·kg-1，800μg·kg-1剂量的对氧磷（paraoxon）与3.0μg·kg-1剂量的AnTX-a（s）产生相同的中毒症状，同时测定鼠神经系统不同部位的酶活性，发现大脑和颈部以上脊髓无抑制，同样在下丘脑、延髓也未观察到酶的抑制现象，说明AnTX-a（s）是一个强的专一性外周神经胆碱酯酶抑制剂。由于获取的天然毒素不纯，急性毒性评价得到了不同的数据，但有学者认为，动物致死的主要原因是呼吸抑制，毒素专一性地作用于外周神经系统，而不抑制中枢神经系统，因而死亡过程缓慢，这种药理作用显然不同于G类（氟磷酸酯或氰基磷酸酯）和V类（全酯中有一个被硫取代的磷酸酯）战剂，而且也与作用于中枢的可逆性胆碱酯酶抑制剂不同，这些可逆性抑制剂常用于治疗老年性痴呆。[26-28]
毒素检测
鱼腥藻毒素a的检测方法主要分为生物测试法（主要为小鼠测试法）、化学分析法、免疫检测法3种。生物测试只可较为粗略地判断藻提取物是否有毒性，结果较为直观、快速，但无法定量；化学分析可做出精确定性定量测定，运用恰当可测到各组分的ng级含量；免疫检测比化学法具有更高的灵敏度，但由于鱼腥藻毒素a单克隆抗体的制备较难和普及使用率不广，故选择性略差。有些方法专一性相对较差，只能用于定性测试或鱼腥藻毒素总量测定，无法精确定量或鉴定毒素成分和区分毒素同系物。例如小鼠生物检测法（mouse bioassay，MBA）只能测出其毒性大小，无法确知其组成及含量，并且测试过程复杂，不确定的因素多，重复性和灵敏性差，所需时间也较长；神经结合受体结合检测法由于针对的是毒素的功能而非结构，因而不能对毒素进行分类。[29-30]
化学分析法是一种常规方法，主要包括高效液相色谱层析（HPLC）、薄层色谱层析（TLC）、气相色谱-质谱分析（GC -MS）、液相色谱-质谱分析（LC-MS）、毛细管电泳（CE）及HPLC-UV等。这类方法具有灵敏度高，检出限低，可比性和重复性好，分析速度快等优点。重要的是，它可实现生物法通常无法实现的对鱼腥藻毒素的精确定量和构型分析以及同分异构体鉴别。对鱼腥鱼腥藻毒素可进行定性定量检测，检出ng级含量以及确定其相对分子质量和结构特征。1999年，Takion等用LC-MS对淡水中蓝藻细菌产生的antx-a进行了测定，检测上下限分别达到15.2 ng/L和2.1 ng/L。[31-32]  鱼腥藻毒素电泳图[33]
免疫检测法的原理主要是利用放射性或荧光物质标记鱼腥藻毒素a抗体，以之特异性结合鱼腥藻毒素a类抗原物，通过检测放射性或荧光强度以测定样品中毒素含量。主要有酶联免疫测定法（ELISA）、放射免疫分析（RIA）和竞争性酶免疫分析（EIA）等类型。在具备鱼腥藻毒素单克隆抗体、标准纯毒素和有关试剂的前提下，尤其是使用商品化的试剂盒时，使用ELISA法是非常简便、高效、快速的方法。该方法的灵敏性要比相应的小鼠生物法或HPLC法高的多，检测毒素的含量在pg级，且专一性强。[34]
毒素去除方法
常用的鱼腥藻毒素a的去除方法主要包括物理、化学、光降解法和生物降解法等。[35]
物理降解法是常规的去除鱼腥藻毒素a的方法，包括凝絮、混凝沉淀、快速过滤及慢速砂滤、气体浮选及活性炭粉末（PAC）吸附、膜处理等。凝絮可以有效去除藻类细胞，但在去除水溶性藻类毒素方面却不是很有效；其去除藻类的效率主要取决于适宜的凝絮剂化学剂量及pH值，凝絮过程可能使藻类细胞裂解而释放出毒素。混凝沉淀通过加入混凝剂（例如硫酸铁）去除藻类而去除细胞内鱼腥藻毒素a，但对细胞外的溶解性鱼腥藻毒素a无去除作用。快速过滤通常是在凝絮过后采用的一种方法，主要用以去除凝絮产生的絮状物，而不能有效地去除藻类细胞。慢速砂滤可去除部分细胞外鱼腥藻毒素，对细胞内鱼腥藻毒素a的去除作用较弱。应用溶解气体浮选去除鱼腥藻毒素a的时候，应注意到不同藻类不同的物理特性。研究表明，氯化、砂滤、凝絮等并不能有效去除藻类毒素，只有活性炭粉末处理才能有效去除。而在应用活性炭粉末时，剂量是一个很重要的参数，同时，碳源种类也十分重要（煤，木头，椰子，泥等）。在用活性炭粉末处理水的时候会在接触表面产生生物膜，这层生物膜会显著削弱滤层去除毒素的能力，而且这层生物膜也很难降解。[36]
化学降解法主要有氯化处理和臭氧化处理。通常来讲，氯化处理在破坏毒素方面并不是一个十分有效的方法，其处理效率在很大程度上取决于氯化物的种类及采用的浓度。值得注意的是，氯化处理过程中也容易产生一些有毒的含氯副产物，如三氯甲烷。臭氧化处理对鱼腥藻毒素a有很强的去除能力，其氧化机制与ClO2完全不同。ClO2和O3均能有效杀灭藻类、破坏藻体，使鱼腥藻毒素a释放出来。但ClO2对鱼腥藻毒素a的去除能力有限，对水中鱼腥藻毒素a的最大去除率仅为27%；而臭氧对鱼腥藻毒素a的去除非常有效，对水中鱼腥藻毒素的去除率可达96%。除上述2种方法外，2004年苑宝玲等研究了高铁-光催化氧化体系去除水华鱼腥藻毒素a的效能，通过投加10mg/L的高铁到光催化体系中，由于高铁的强氧化性及其还原产物可作为电子捕获剂，可将光催化效率从63%提高到100%，可快速完全去除鱼腥藻毒素。[37]
鱼腥藻毒素a由于结构影响，在紫外灯和日光照射条件下不稳定，很容易被降解，并且鱼腥藻毒素a的降解程度与色素含量也有关。对滇池水华蓝藻中鱼腥藻毒素a光降解的研究发现，滇池水华蓝藻提取液中的鱼腥藻毒素a不仅可以在日光照射下降解，也可在紫外灯照射下降解，且在日光照射下降解速率更快。提取液中的色素对鱼腥藻毒素的光降解起重要作用，并且其含量将决定鱼腥藻毒素a的降解程度。为优化光降解法去除饮用水中的鱼腥藻毒素，分别使用了不同波段的UVA的UVC 2种紫外光源，不同波段的紫外光具有不同的催化效率和降解中间产物；毒素降解的反应速率常数UVC比UVA高了近2个数量级，表明光降解技术去除饮水中的鱼腥藻毒素a宜选用UVC光源。光降解可以克服常规物理降解去除鱼腥藻毒素a的效率不高以及氯化处理有毒副产物的弊端，是一种较安全也比较有效的去毒方法。