标题：双标水法
定义
双标水（doubly labelled water，DLW）法：是20世纪80年代出现的一种人体能量消耗测量技术，是以稳定的同位素标记的 H2O它以稳定同位素标记的水作为示踪物，通过稳定性核素氕（2H）标记水中的H，用重氧（18O）标记水中和二氧化碳中的O ,通过分析尿液中标记物的峰度值变化 ,了解机体的能量代谢情况 ,其精确度 2 %～8 % ,准确度 1 %～3 % ,被誉为能量消耗测定的“ 金标准 ” 。
基本原理
在营养代谢研究中 ,稳定同位素常被用作示踪剂来描述营养物质被摄入体内以后所经历的代谢动力学过程,最常用的稳定同位素包括15N、 13C、 2H、18O、 42Ca、 44Ca等等 ,其中双标记水 (2H218O)常用来作为能量代谢的示踪剂。
双标记水中的稳定性同位素2H和18O丰度远高于自然界中水的丰度 (水中天然丰度:2H 0 . 015%,18O 0 . 204% ) ,当受试者摄入一定量的双标记水(2H218O)后 ,机体即被这两种同位素所标记。 2H参加水的代谢,其速率常数 KD 反映水的代谢率rH2O;18O既参加水的代谢 ,又参加 CO2 的代谢 ,由于碳酸酐酶的催化作用使得18O在 H2O和CO2之间处于反应平衡 ,其速率常数 KO 反映水的代谢率rH2O和 CO2 的代谢率或生成率 rCO2 ,当 H2O和CO2 反应平衡时 , KO - KD 可得到 CO2 的生成率rCO2。通过呼吸商 (Res p irat ory Quotient, RQ)和得到的 CO2生成率可算出 O2 消耗量 ,最后利用经典的 Weir公式[ 6 ]就能计算出单位时间内平均能量的消耗量。
实验方法
双标水来源国际上主要重氧水 (H218O)的生产厂家有:美国 Cambridge Is ot ope Laborat ories, Inc (简称: C I L) ;Sigma2 Aldrich Corporati on等。其中 ,美国剑桥同位素实验室公司是全球最大的医用18O同位素分离单位 ,年生产能力为 250 kg,并通过 G MP和美国 FDA认证 ,重氧水的规格分别有: 10 . 0 at om%、 9510 at2om%和 97 . 0 at om%。国内仅有极少生产厂家报道生产重氧水 (H218O)产品:上海化工研究院采用“ 水精馏路线 ” ,生产 3种规格的重氧水 (H218O)产品:10 . 0 at om%、 95 . 0 at om%和 97 . 0 at om%;江苏华益埃索托普公司采用高效的精馏分离技术 ,可根据不同用户的要求提供 2%～97%各种规格的重氧水以及双标水 ,年生产能力达 100 kg。给药途径及剂量双标水一般采用口服的方式给药 ,事先按照一定的比例配制 ,消毒灭菌后用于人体。目前双标水的应用剂量为:
2H (0 . 05 ～0 . 70) g/ kg T BW (TotalBodyWater) ,18O ( 0 . 12～0 . 40) g/ kg T BW,未成年人剂量要稍微高于成人。二者的浓度没有严格的比例限制 ,以同位素测试仪器的精确度为准。同位素的剂量与同位素丰度测试的误差有关 ,剂量大 ,费用增加 ,剂量小 ,精度低于 5%。根据以往的研究经验 ,2H和18O的最适同位素剂量见表 1。
表1 最适同位素剂量及实验周期 对象2H/g·( kg- 1T BW)18O /g·( kg- 1T BW)实验期 / d婴儿0.160.403~10儿童0.140.303~15成人0.150.155~18实验周期及样品收集实验周期与同位素的生物半衰期有关 ,实验期过短 ,同位素丰度值变化太小增加偏差;实验期过长 ,后期样品的同位素丰度接近本底值增加测量误差 ,通常收集时间为 1～3周 ,最适实验周期见表 1。双标水法收集的样品可以是尿液、 唾液或者血液 ,通常样品为尿液 ,婴儿可收集唾液或尿液。样品收集有多点法和两点法 ,多点法是指收集全实验过程的样品并分析 ,两点法是指只收集实验开始一天和结束一天的样品并分析 ,大多数情况下 ,两种方法都能得到正确的结果 ,但在某些特殊情况下每种方法都有其优点和缺点[ 7—9 ]。收集到的样品分装于密封管中 , - 20℃冰箱保存备用。样品分析及结果计算样品经过预处理 ,采用气体同位素比质谱仪( Isotope Rate Mass Spectr ometer, I RMS)进行测定 ,得到样品的δ 18O和δ 2H。上海第二医科大学罗伟等[ 10 ]用双标水示踪法测定 13例正常成年人的能量消耗 ,首次在国内建立了双标水样品测定方法 ,尿样双复管测定的平均 CV%小于 1% ,最大不超过215%。得到样品δ值后 ,结果计算参照以下步骤。
(1) δ值的修正 　实验测得的各时间点18O和2H的δ值首先要使用下面的公式进行修正 ,换算成百分数
x = ( ( dpost - dp re ) / ( ddose - dtap ) ) ×(18 . 02a /WA )
x为18O或2H的丰度; dpost为样品的丰度比值(相对于工作标准的比值 δ‰) ; dp re为口服双标水前 ,基线样品的丰度比值 (相对于工作标准的比值δ‰) ; ddose为稀释后双标水的丰度比值 (相对于工作标准的比值δ‰) ; dtap为现场自来水的丰度比值 (相对于工作标准的比值δ‰) ; a为分析用双标水重量( g) ;W为稀释口服双标水所用的重量 ( g) ; A为口服双标水的重量 ( g)。
(2) 同位素消除曲线的绘制 　分别用样品18O和2H的丰度值取自然对数为纵坐标 ,以时间为横坐标作图 ,分别得到两条直线 ,即为同位素的消除曲线 ,见图 1。 18O和2H的速率常数分别为各自消除曲线的斜率 KO 和 KD。由两条消除曲线反推到 t = 0,得到截距 ,把截距反对数后再取倒数 ,得出 NO 和ND ,它们分别代表18O和2H代谢池的大小 ,二者的比值应在 1 . 015 - 1 . 06之间。
  尿样中同位素的消除曲线(3) CO2的产生速率 　由同位素的消除曲线 ,可以得到18O和2H的速率常数 KO 和 KD 以及18O和2H代谢池的大小 NO 和 ND ,从而得到 CO2的产生速率。由于尚需考虑标记水分子的分馏因素而加入校正因子 ,因此实际计算用的公式各家报道不尽相同 ,目前国内外文献中常用的是 Speakman mod2el
[ 11 ],它是在 L ifs on model[ 4 ]和 Schoeller model[ 12 ]的基础上 ,综合了 161份双标水测定数据得到的 ,根据Speakman model算出 CO2的产生速率。
rCO2 = (N /2 . 196) ×( Ko - 1 . 0427KD )。
其中 ,N = (N o +ND /1 . 042 7) /2。
(4) 呼吸商 (RQ) 　呼吸商是指一定时间内机体 CO2产量与 O2消耗量的比值 , RQ随着受试者摄入的混合食物中蛋白质、 脂肪、 碳水化合物的比例不同会产生 0 . 7～1 . 0的变化。当受试者处于热量平衡状态 (体重恒定 )时 ,可用食物商 ( Food Quo2tient, FQ)代替 RQ,食物商 ( FQ)可由实际摄入的食物组成计算得到[ 13—15 ]。已知食物商 FQ和 CO2 生成率 rCO2 ,则 O2的消耗速率 r O2 = rCO2 /FQ。
(5) 总的能量消耗 ( TEE) 　最后 ,总的能量消耗可以依据经典的 Weir公式计算得到。
TEE = 3 . 941 ×r O2 + 1 . 106 ×rCO2 - 2 . 17 × UN
(UN为每天的尿氮量 g/d)
优缺点评价
优点首先 ,双标水法测定结果准确 ,与常规的能量代谢测定方法相比 ,其精确度 (2%～8% )和准确度(1%～3% )都比较高 ,被称为能量代谢测定的金标准[ 16—20 ]。其次 ,双标水法基本不干扰受试者的一切正常活动 ,它测定的是人体在自由活动情况下的能量消耗 ,与实际情况更为接近 ,可以实现对不能合作者及活动不应受限制者的能量消耗的测定。最后 ,双标水法无毒、 无损伤 ,它使用的示踪物2H和18O是无放射性的稳定同位素 ,对人体无害;样本的收集过程较为简单 ,仅收集尿液来计算体内同位素的残留量 ,对人体无创。此外 ,双标水法在测定能量代谢的同时 ,可以评价总体水及体成分。缺点首先 ,双标水法实验费用昂贵 ,不仅试剂双标水价格昂贵 ,而且测试需要灵敏度和精确度较高的同位素质谱仪和高技术素质的分析人员 ,这限制了此方法在营养科学和流行病学大样本人群中的应用。其次 ,双标水法只能测定人体总的能量消耗量 ,它是对某时间段内尿液中的稳定同位素进行分析 ,只能获得这一时间段内总能量消耗方面的信息 ,难以了解每天或每小时的能量消耗模式。最后 ,双标水法还存在分析准确性上的缺陷。因为双标水法是建立在一些假设和理想条件下的 ,当应用于实际环境时容易产生误差 ,需要进行相应的校正。在理想条件下 ,2H只以水形式代谢 ,18O也只以水和二氧化碳形式代谢 ,但实际上机体组织会发生同位素捕获或者交换。例如 ,合成脂类时有2H的掺入 ,同位素还会以尿素、 碳酸氢盐等非水的形式排泄。当受试者的体重在研究期间发生变化时 ,这种现象造成的误差会很明显 ,导致低估能量消耗。但如果机体处于稳定阶段 ,这种误差则可以忽略[ 21 ]。
研究现状
历史渊源用双标水测定动物能量消耗率的方法由Lifson[ 4 ]等始创于 20世纪 50年代 ,最初的研究主要局限于小动物。直到 20世纪 80年代才开始应用于人体研究。其主要原因是18O的价格昂贵 ,当时每公斤体重所需的同位素价格为 1 500美元。后来 ,随着生产同位素的成本下降 ,特别是由于高灵敏度和高精确度的同位素比质谱仪 ( Is ot ope Rate Mass Spec2trometer, I RMS)的应用 ,使得同位素的用量大大减少 ,从而费用降低 ,才有可能将此方法推广到人体。采用双标水法对人体活动时的能量消耗进行测定最早见于 Schoeller和 Van Santen的研究[5 ],它是一种能够准确测量人体在日常生活和工作中总能量消耗的能量代谢测定方法。应用人群双标水法目前已广泛应用于不同人群能量消耗的研究 ,如早产儿、 儿童、 艾滋病人、 肥胖人群、 孕妇、 哺乳期妇女和老年人 ,这些人群如果采用其他能量测定方法则会遇到很多问题。譬如 ,以往因检测方法的限制 ,研究婴儿能量消耗很困难 ,只有在睡觉时才能较容易测定。现在由于双标水法的优势 ,使这方面的研究有了很大进展[ 22—24 ]。国内也开展了这方面的工作 ,广东中山大学蒋卓勤等用双标水法对 4月龄或 6月龄婴儿的能量需要量进行了研究[ 25 ];中国疾控中心王京钟等用双标水法测定了54例 4月龄和 6月龄婴儿的体成分[ 26 ]。近几年双标水方法在成人和儿童肥胖、 慢性病等流行病学方面的研究成果也引人关注[ 27, 28 ],这些研究充分显示了该法的突出优点 ,即对不能合作者及活动不应受限制者的能量消耗的测定。准确性利用双标水方法的准确性 ,以双标水法为参照来评定其它能量代谢测定方法的有效性和可靠性 ,有关这方面的报道很多[ 35—39 ]。如美国约翰 ·霍普金斯学院 Joan等[ 40 ]将“7日体力活动回顾问卷法 ”与双标水法做了比对研究 ,结果表明体力活动问卷能够较为准确地评估个体总能量消耗 ,但是需要良好的个体依从性及严格的督导。国内关于这方面也有报道 ,如中国疾控中心刘爱玲等[ 41 ]应用双标水法对加速度计 (CSA) 测量成人日常体力活动的效
度进行验证 ,结果表明两者测得的能量消耗值存在显著的正相关关系 (R = 0 . 31, P < 0 . 01)。研究意义WHO的报告建议[ 43 ],各国应尽可能以实际测定的能量消耗量为基础 ,来确定人体的能量需要量。制定能量需要量应以准确的能量消耗测定值为基础。因此 ,双标水法在制定新的能量推荐需要量中发挥了重要的作用。目前 ,西方国家已经积累了大量的人体能量代谢数据。Black等[ 45 ]收集了12年中 576例关于双标水的研究 ,结果显示美国于1989年制定的能量摄入标准中 ,婴儿和儿童的偏高 ,而青少年和成年人的偏低。Davis[ 46 ]综述了双标水研究中 400多个婴儿的资料 ,认为目前对 1周岁内婴儿能量摄入的推荐值比用双标水法测定的能量消耗值高 10 %Bandini[ 47 ]等对 109名 ( 8～12)岁儿童的研究发现 ,他们的平均能量消耗比Black等的评估要高 ( 100～200 ) kcal / d。Bratter2by[ 48 ]等对 46名青春期少年的研究与 B lack等的评估基本相符。Car penter等[ 49 ]对 164名 (65～70)岁的老年人的研究资料显示 ,男性受试者能耗量与Black的评估值基本相符 ,而女性受试者的能耗值与 Black结果有较大差距。这些人体能量代谢数据对于 RN I的修订和补充具有重要的参考价值。在我国 ,有关这方面的报道很少。目前 ,只有中国疾控中心姚漫江等与美国 Tufts大学合作[ 50 ],以 (35～49)岁北京市民为受试对象 ,用双标水法测定了其日常活动能量消耗。对于我国能量 RN I的进一步修订 ,则需要更多、 更新的中国人的实测数据来支持。
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