标题：彗星电泳法
彗星电泳法
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它主要包括测定DNA双链断裂的中性单细胞凝胶电泳技术和测定DNA单链断裂的碱性单细胞凝胶电泳技术。此技术已经被广泛应用于放射生物学、DNA断裂与修复、毒理学、肿瘤治疗评价、细胞凋亡等领域的研究。 这个方法也存在缺陷，就是彗星试验检测到的DNA断裂其实是DNA损伤与修复的共同作用的结果?而且DNA修复的一个重要方式就是核苷酸切除修复?因此DNA修复过程也会造成DNA链的断裂?所以彗星试验所反映的时间?效应关系?可能与真实的DNA损伤有偏差?因为它无法鉴别修复过程中的DNA断裂。 
原理
细胞核中的DNA为负超螺旋结构，而且很致密，通常DNA双链以组蛋白为核心，盘旋而形成核小体。一般情况下，偶然的DNA单链断裂对核酸分子双股结构的连续性影响不大，而且不易释放出来，但是，如果用去污剂破坏细胞膜和核膜，用高浓度盐提取组蛋白，DNA残留而形成类核。如果类核中的DNA有断裂?断裂点将引起DNA致密的超螺旋结构松散，在类核外形成一个DNA晕圈。将类核置于电场中电泳，DNA断片可从类核部位向阳极迁移，经荧光染色后，在阳极方向可见形似彗星的特征性图像，故称“彗星试验”。彗星尾部即为迁移出类核的DNA片段。此时彗星尾部有可能还与头部以单链或双链的形式相连。DNA损伤越严重，导致DNA超螺旋结构越松散，产生的断裂点越多，DNA片段越小，从而在彗星尾部出现的DNA断片越多，则慧尾的长度、面积和荧光强度越大。通过测量彗星尾部的长度、面积或荧光强度等指标，可以对DNA的损伤程度进行定量分析。 
实验方法
简而言之就是将单个细胞悬浮于琼脂糖凝胶中，经裂解处理后，再在电场中进行短时间的电泳，并用荧光染料染色，凋亡细胞中形成的DNA降解片段，在电场中泳动速度较快，使细胞核呈现出一种彗星式的图案，而正常的无DNA断裂的核在泳动时保持圆球形，这是一种快速简便的凋亡检测法。
在实验前准备好样品，进行DNA损伤的诱导处理后，制备细胞悬液，并用PBS调整细胞浓度为10~10个/ml，细胞用低熔点琼脂糖溶解。确保在铺到载玻片上前不凝固。
1 制片
有3种类型:(1) “三明治”凝胶,第1层为100-110μl的1%普通熔点琼脂糖凝胶,凝固后普第二层，第2层为溶有细胞悬液的低熔点琼脂糖70-80μl,第3层仍为低熔点琼脂糖75μl。(2)双层凝胶,即不铺第3层胶;直接盖上盖玻片。 (3)单层凝胶,为改善其易与玻片分离的特点,可在玻片上制一凹槽进行单层灌胶。经实验发现，一层胶法的效果不好，胶太薄容易漂浮；三层胶虽然解决了脱落漂浮的问题，但会影响观察的效果；而二层胶法既能使胶面较好的附着，又能使细胞尽可能多的处于同一平面，染色效果更好。
2 细胞裂解
目的是去除细胞浆，只留核中的DNA，裂解时间多为1小时。为了避免脱胶，裂解液在使用前需预冷，同时裂解液中要加入1%DMSO为减少裂解中自由基对DNA的额外损伤。在有的实验中还需要加入蛋白酶K，以清除蛋白质残基，避免DNA修复酶的作用。
3 解旋 
裂解后在碱性溶液（1 m mol/L Na2EDTA,300 m mol/L NAOH p H13）中使DNA双链打开，时间约为60分钟。
4 电泳 
一般在低电压（0.5~5V/cm）和短时间（20~30min）内进行。电压过高或电泳时间过长，彗星细胞拖尾以致彗星消失，而非彗星细胞也会泳出尾部形成假阳性结果；反之，电压过低或时间过短，DNA断片不易泳出，受损细胞无拖尾而造成假阴性结果。
5 阅片 
在玻片上滴加溴乙锭、DAPI（根据实验的不同，采用不同的浓度）等，加盖盖玻片，即可在荧光显微镜下观察。
上述过程均应在黄光或暗室中操作，避免引起额外的DNA损伤。
6 实验结果分析 在荧光显微镜下放大200倍或400倍进行图象观察，观察指标有尾长即DNA迁移的长度，在低损伤剂量范围内与DNA损伤呈线性关系；尾矩即尾长与尾部DNA百分含量之乘积，在高损伤剂量下与损伤程度呈线性关系；尾惯量是与每个尾块的面积、平均荧光强度、在X轴上与彗星中心距离有关的综合性指标。彗星图象分析方法有：目镜测微尺直接测量，显微照相后用两脚规测量，经图象分析仪进行分析，或借助专门的图象分析软件如Lucia、Auto Gentox等彗星图象分析软件进行分析。
SCGE研究的类型
用于SCGE的生物种类很多，哺乳类有人、大鼠、小鼠、兔等；非哺乳类有鲫鱼、泥鳅、蚯蚓等。植物类的烟草；谷康定等还将此技术应用到真核单细胞微生物（四膜虫），且认为从方法上完全可以与动物原代和传代细胞互相替代。细胞类型主要包括外周血淋巴细胞、肝细胞、脾细胞、胸腺细胞、骨髓细胞、肺泡细胞、鼻黏膜细胞、肿瘤细胞、睾丸细胞、神经细胞、精子及培养细胞、植物细胞等。
用于SCAG的研究因子大致可分为3类，物理因素包括各种放射性元素、射线、冰冻、光照等；化学因素包括重金属及其化合物、过氧化物、臭氧、石棉、有机致癌物、有机染料、麻醉剂、抗癌药物、抗真菌剂等；生物因素包括细胞类型、细胞生长周期、细胞的DNA修复能力及年龄、生活习惯（如吸烟）等影响因素。
应用与发展
随着SCGE技术的发展，可测量的指标也越来越多，而且更准确。目前，用于SCGE分析的指标主要分为四类，包括形状指标、距离指标、强度指标和矩类指标。其中形状指标有彗星细胞率，距离指标包括彗星尾长、彗星全长、彗星头部半径、尾部半径?强度指标包括头部DNA百分含量、尾部DNA百分含量、头部面积、尾部面积等?矩类指标包括尾矩、Olive尾矩等依靠目镜测微尺人工测量彗星距离指标，主观性较强，人为误差较大，?而且矩类指标更需要人工通过公式计算得出?使研究人员的工作量加大。因此?研究人员渴望开发出一种专用的彗星图像分析软件。近年来?各国研究机构纷纷推出各自的图像分析软件?这些分析软件可以快速提供一系列评价参数?如彗星总长、尾长、尾DNA含量、尾矩和Olive尾矩等?更好地客观定量DNA损伤。目前?用于彗星分析的软件包括英国Kinetic Imaging公司的Komet5.5、Perceptive Instruments公司的Comet Assay Ⅲ、LAI公司的LACAAS、美国NIH的ImagJ、TriTek公司的CometScoreTM、印度原子能研究所的SCGE-Pro、奥地利癌症研究所开发的自动分析软件等。其中的部分软件可以到其相应网站下载，但最好与相应的彗星分析系统硬件设备配套使用?价格昂贵?提高了研究成本。新近研发的彗星分析软件，Comet Assay Software Project, CASP?很好地解决了这一问题?该软件可以在普通微机上运行，界面友好，使用方便，分析速度快，可以一次同时给出最多达13个指标，分析结果避免了人为误差，更加客观和准确，结果可以以txt文件直接输出，SPSS等统计软件可以直接读取其输出结果，便于统计学分析，节省大量人力物力。
其具体应用可分为以下几个部分：
1 在遗传毒理学中的应用：SCAG是一种评价遗传毒理损伤非常敏感的方法，可在体内、体外对细胞进行DNA损伤诱导，以探讨已知遗传毒物和诱变剂的特异活性，包括体外细胞特异代谢和DNA修复，体内相关途径给予化合物的代谢动力学和剂量反应的关系，以及某些化合物的遗传毒性等，而有些环境中的一些毒物常常是组织特异性或细胞特异性的。致突变效应、致癌效应是遗传毒性的长期效应，突变的程度和类型又与DNA链损伤修复的情况相关。SCGE能检测出各种理化因素所致的DNA链断裂、DNA切除修复、氧化损伤及DNA交联。Sardas等对吸入性麻醉药isofiurane进行分析发现，麻醉后1h ,彗星平均尾矩明显增加，2h后达到高峰，1d后下降，5d后则恢复正常，实验显示该药物具有遗传毒性，遗传损伤可以修复，但着色性干皮病人则损伤修复不完全。进行体内实验的SCGE分析可减少假阴性结果，并提供各组织、器官、细胞中的DNA损伤和修复的信息，推测组织和细胞特异性。对于有争议的化合物，用SCGE检测DNA，可以评价该化合物在某剂量下是否具有遗传毒性。
2 DNA损伤与修复的检测：SCGE不只是反映DNA链断裂，也包括酶介导的损伤和修复。用UV-射线照射T淋巴细胞，发现T淋巴细胞的损伤和修复与DNA链的再聚合有关。损伤后的切除修复是通过细胞核酸内切酶来完成的。SCGE可进行从损伤到修复、合成、连接的单步骤各时间点观察；马爱国等曾报道不同种类细胞DNA氧化损伤及自我修复能力有不同，增殖率较高的细胞（如Hela细胞）对H2O2的作用比非增殖细胞（如淋巴细胞）较敏感，其修复速度Hela细胞也明显大于淋巴细胞。同时也用于对一些外来因素，如蛋白、抑制剂、脱氧核苷酸等对细胞DNA损伤与修复的研究，并用于修复缺陷型细胞DNA损伤与修复的研究。
3 生物检测和流行病学研究：DNA链断裂作为鱼和其他水生生物遗传毒性的生物标志物可以通过SCGE检测。体内、体外试验都表明，化学毒物确实影响了一系列脊椎和非脊椎水生生物的细胞类型。胡晓磐等研究了氯化镉对鲫鱼淋巴细胞DNA的损伤，随着镉剂量的增加，DNA的损伤加重。同时诱发鱼类细胞染色体畸变，导致红细胞核异常及不同组织中蛋白质发生质和量的变化。SCGE还可用于有害物存在的场所中各类人群DNA损伤的检测。在对长期接触高浓度苯的工人，苯暴露水平为3 mg/m加油站服务人员以及接触高温、CO工人的外周血淋巴细胞检测后，发现其淋巴细胞DNA损伤都有显著提高。吸烟者戒烟后彗星尾长显著降低。在人群检测中应考虑年龄、性别、吸烟、饮酒等多种因素的影响，因此在采样时，对照与暴露个体都应处在相同的生理阶段。
4 在肿瘤学中的应用：SCGE能够检测单个细胞DNA的损伤，能够用来评价细胞的损伤与修复能力，可以用于探讨肿瘤的病因、发生、发病机制。肿瘤细胞和正常细胞对理化治疗所致DNA损伤与修复能力将决定治疗方案的对与否，如果肿瘤细胞有高于正常细胞的修复能力，则意味着增大了治疗的危险性，治疗必将失败。在癌细胞中有一种缺氧细胞，它的DNA断裂比有氧细胞低，用SCGE分析可估量缺氧细胞数，进一步识别与检查癌细胞对抗癌剂的反应，主要用于接受化疗的肿瘤细胞，有助于评估肿瘤对放、化疗反应的不同，预测治疗方案的效果。Olive PL等用SCGE验证尼克酰胺可以减少肿瘤的缺氧细胞，从而增加肿瘤细胞对射线的敏感性，同时显示该药可更多地阻止肿瘤细胞修复而达到抗癌目的。Rao用SCGE对口腔上皮细胞鳞癌患者外周血淋巴细胞检测，结果显示在不同的临床期细胞DNA电泳结果明显不同，和临床期对比存在统计学差异。
5 在环境检测中的应用：用SCGE检测DNA断裂在环境监测中的应用范围极其广泛，在某种程度上可以将它作为环境污染物对健康的早期评价指标。苑宇哲等以蝌蚪为指示生物，利用SCGE检测DNA断裂，来判断水体是否污染。国外以这种方法检测水体污染进行较早，也比较规范，已经建立了比较科学、实用、规范的检测体系。1998年，Steven等就运用这种体系检测了美国南部10个水体的污染程度；泥鳅红细胞的SCGE检测方法的建立也有助于揭示不同污染物对水生生物的危害及作用本质，特别是将它与红细胞微核试验的结果综合起来进行分析，对于水环境质量的评价将具有重要意义。1998年，Gichner等将SCGE技术用于植物细胞，建立起了新的环境检测系统。另外，SCGE在研究大气污染物、重金属、醛类、辐射等环境污染方面也是一种较理想的检测技术。
6 其它：SCGE也可用于细胞凋亡、免疫学、氧化损伤以及临床病因学、诊断学等领域。刘强等更是首次该技术用于辐射生物剂量计，通过研究全身照射和离体照射致DNA双链断裂的一致性，明确了SCGE作为辐射生物剂量计的可行性。在实际应用中应考虑年龄、细胞类型、细胞生长周期等对实验结果的影响。要注意的是，在碱性条件下，单细胞电泳出现的泳带可能是DNA断裂的结果，也可能是亲碱性区域的结果。采用精子标本时应特别注意这种情况。
结语
SCGE能敏感检测单细胞水平的DNA断裂，具有快速、简便、价廉等优点，广泛应用于遗传毒理学、生物检测、肿瘤学等多个领域的研究。但在实验中还有一些问题尚待改进和解决，如“彗星”形成原理、电泳条件的探索、玻片制备方法的改进、图象分析软件的发展等。随着实验方法的不断改进，这些问题都将得到解决，SCGE在个领域的应用将进一步拓宽。