标题：生物芯片技术
定义
生物芯片（biochip）是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等等生物样品有序地固化于支持物的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。由于常用硅片作为固相支持物，且在制备过程模拟计算机芯片的制备技术，所以称之为生物芯片技术。
  DNA 芯片荧光扫描分析图[1]
简介
目前，最成功的生物芯片形式是以基因序列为分析对象的“微阵列（microarray）”，也被称为基因芯片（Gene chip）或DNA芯片（DNA chip）。1998年6月美国宣布正式启动基因芯片计划，联合私人投资机构投入了20亿美元以上的研究经费。世界各国也开始加大投入，以基因芯片为核心的相关产业正在全球崛起，目前美国已有8家生物芯片公司股票上市，平均每年股票上涨75%，据统计全球目前生物芯片工业产值为10亿美元左右，预计今后5年之内，生物芯片的市场销售可达到200亿美元以上。生物芯片技术通过微加工工艺在厘米见方的芯片上集成有成千上万个与生命相关的信息分子，它可以对生命科学与医学中的各种生物化学反应过程进行集成，从而实现对基因、配体、抗原等生物活性物质进行高效快捷的测试和分析。它的出现将给生命科学、医学、化学、新药开发、生物武器战争、司法鉴定、食品与环境监督等众多领域带来巨大的革新甚至革命。
发展历史
​ 自从1996年美国Affymetrix公司成功的制作出世界上首批用于药物筛选和实验室试验用的生物芯片，并制作出芯片系统，此后世界各国在芯片研究方面突飞猛进，不断有新的突破。美国的Hyseq公司、Syntexi公司、Nanogen公司、Incyte公司及日本、欧洲各国都积极开展DNA芯片研究工作；摩托罗拉、惠普、IBM等跨国公司也相继投以巨资开展芯片研究。1998年12月Affymefrix公司和Molecular Dynamics公司宣布成立基因分析协会（genetic analysis technology consortium）以制定一个统一的技术平台生产更有效而价廉的设备，与此相呼应，英国的Amershcem?Pharmacia?Biotechnology公司也在同一天宣布将提供部分掌握的技术以推动这项技术的应用。美国芯片技术召开了两次会议，克林顿总统在会上高度赞赏和肯定该技术，将芯片基因技术看作是保证一定横健康的指南针。预计在今后5年内生物芯片销售可达200～300亿美元；据预测，在21世纪，生物芯片对人类的影响将可能超过微电子芯片。 
我国在生物芯片研究方面刚刚起步，1998年10月，中科院将基因芯片列为“九五”特别支持项目，利用中科院在微电子技术、生化技术、物理检测技术方面的优势，组织跨所、跨学科合作。在微阵列芯片和基于MEBS的芯片方面有大突破，在DNA芯片设计、基本修饰、探针固定、样品标记、杂交和检测等方面的技术有较大进展，已研制出肝癌基因差异表达芯片、乙肝病毒多态性检测芯片、多种恶性肿瘤病毒基因芯片等有一定实用意义的基因芯片和DNA芯片检测仪样机。中科院上海冶金所等开发重大传染性疾病的诊断芯片及检测设备，如HBV、HCV、TB三种基因诊断芯片。上海细胞所正在进行人类全套基因组的c?DNA阵列和微阵列制备，为我国科研所和开发提供了一个技术平台，并使之产业化。同时，清华、复旦、东南大学、北京军事医学科学院、华东理工大学、第一军医大学等单位都在积极进行芯片研究，现已有部分产品问世。[2]
研究背景
原定于2005年竣工的人类30亿碱基序列的测定工作（Human Genome Project，基因组计划）由于高效测序仪的引入和商业机构的介入已经完成，。怎样利用该计划所揭示的大量遗传信息去探明人类众多疾病的起因和发病机理，并为其诊断、治疗及易感性研究提供有力的工具，则是继人类基因组计划完成后生命科学领域内又一重大课题。现在，以功能研究为核心的后基因组计划已经悄然走来，为此，研究人员必需设计和利用更为高效的硬软件技术来对如此庞大的基因组及蛋白质组信息进行加工和研究。建立新型、高效、快速的检测和分析技术就势在必行了。这些高效的分析与测定技术已有多种，如DNA质谱分析法，荧光单分子分析法，杂交分析等。其中以生物芯片技术为基础的许多新型分析技术发展最快也最具发展潜力。早在1988年，Bains等人就将短的DNA片段固定到支持物上，以反向杂交的方式进行序列测定。当今，随着生命科学与众多相关学科（如计算机科学、材料科学、微加工技术、有机合成技术等）的迅猛发展，为生物芯片的实现提供了实践上的可能性。生物芯片的设想最早起始于80年代中期，90年代美国Affymetrix公司实现了DNA探针分子的高密度集成，即将特定序列的寡核苷酸片段以很高的密度有序地固定在一块玻璃、硅等固体片基上，作为核酸信息的载体，通过与样品的杂交反应获取其核酸序列信息。生物芯片由于采用了微电子学的并行处理和高密度集成的概念，因此具有高效、高信息量等突出优点。
基因芯片技术的前景
基因芯片用途广泛，在生命科学研究及实践、医学科研及临床、药物设计、环境保护、农业、军事等各个领域有着广泛的用武之地。这些无疑将会产生巨大的社会和经济效益。有着广泛的经济、社会及科研前景。因此，国际上一些著名的政治家，投资者和科学家均看好这一技术前景。认为基因芯片以及相关产品产值有可能超过微电子芯片，成为下一世纪最大的高技术产业，具有巨大的商业潜力。
一、社会前景基因芯片可为研究不同层次多基因协同作用提供手段。这将在研究人类重大疾病的相关基因及作用机理等方面发挥巨大的作用。人类许多常见病如肿瘤、心血管病、神经系统退化性疾病、自身免疫性疾病及代谢性疾病等均与基因有密切的关系。
生物芯片能为现代医学发展提供强有力的手段，促进医学从“系统、血管、组织和细胞层次”（第二阶段医学）向“DNA、RNA、蛋白质及其相互作用层次”（第三阶段医学）过渡，使之尽快进入实际应用。
DNA芯片技术可用于水稻抗病基因的分离与鉴定。水稻是中国的主要粮食作物，病害是提高水稻产量的主要限制因素。利用转基因技术进行品种改良，是目前最经济有效的防治措施。而应用这一技术的前提是必须首先获得优良基因克隆，但目前具有专一抗性的抗病基因数量有限，限制了这一技术的应用。而基因芯片用于水稻抗病相关基因的分离及分析，可方便的获取抗病基因，产生明显的社会效益。
在医药设计、环境保护、农业等各个领域，基因芯片均有很多用武之地，成为人类造福自身的工具
二、经济前景美国总统克林顿在1998年1月对全国的演讲中指出“未来十二年，基因芯片将为我们一生中的疾病预防指点迷津”。1998年6月27日华盛顿邮报在报道Motorola进入基因芯片领域时，认为这将造福于子孙后代。美国“Fortune”杂志在1997年3月重点介绍了基因芯片技术，论述了未来产业化的前景，该文预测“在2005年仅仅在美国用于基因组研究的芯片销售额将达约50亿美元，2010年有可能上升为400亿美元”。这还不包括用于疾病预防及诊治以及其它领域中的基因芯片，这部分预计比基因组研究用量还要大上百倍。
由于生物芯片的重大意义和巨大的商业潜力，北美和欧洲许多国家的政府和公司投入大量人力物力来推动此项研究工作。如美国的国立卫生研究院、商业部高技术署、国防部、司法部和一些大公司以及风险投资者投入了数亿美元的巨资。基因芯片以及相关产品产业有可能成为下一世纪最大的高技术产业之一。
三、社会前景1、高密度芯片的批量制备技术：利用平面微细加工技术，结合高产率原位DNA合成技术，制备高密度芯片是重要的发展趋势。
2、高密度基因芯片的设计将会成为基因芯片发展的一个重要课题，它决定基因芯片的应用和功能。利用生物信息学方法，根据被检测基因序列的特征和检测要求，设计出可靠性高，容错性好，检测直观的高密度芯片是决定其应用的关键。
3、生物功能物质微阵列芯片的研制：发展高集成度的生物功能单元的微阵列芯片，特别是发展蛋白质、多肽、细胞和细胞器、病毒等生物功能单元的高密度自组装技术，研制和开发有批量制备潜力的生物芯片制备技术。
表达谱基因芯片
表达谱基因芯片是用于基因功能研究的一种基因芯片。是目前技术比较成熟，应用最广泛的一种基因芯片
应用意义
对来源于不同个体（正常人与患者）、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同病变、不同刺激（包括不同诱导、不同治疗阶段）下的细胞内的mRNA或逆转录后产生的cDNA与表达谱基因芯片进行杂交，可以对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合的分析和判断，迅速将某个或几个基因与疾病联系起来，极大地加快这些基因功能的确立，同时进一步研究基因与基因间相互作用的关系。所以，无论何种研究领域，利用表达谱基因芯片可以获得大量与研究领域相关的基因，使研究更具目的性和系统性，同时也拓宽研究领域。
芯片分类
根据芯片上的固定的探针不同，生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片，另外根据原理还有元件型微阵列芯。
表达谱基因芯片与传统Northern Blot比较
采用表达谱基因芯片研究基因表达与传统的Northern Blot相比有许多重要的优点：
检测系统的微型化，对样品等需要量非常小
同时研究上万个基因的表达变化，研究效率明显提高
能更多地揭示基因之间表达变化的相互关系，从而研究基因与基因之间内在的作用关系
检测基因表达变化的灵敏度高，可检测丰度相差几个数量级的表达情况
节约费用和时间
制作技术
光引导原位合成
原位合成适于制造寡核苷酸和寡肽微点阵芯片，具有合成速度快、相对成本低、便于规模化生产等优点。照相平板印刷技术是平板印刷技术与DNA和多肽固相化学合成技术相结合的产物，可以在预设位点按照预定的序列方便快捷地合成大量寡核苷酸或多肽分子。在生物芯片研制方面享有盛誉的美国Affymetrix公司运用该技术制造大规模集成Genechip。原位合成后的寡核苷酸或多肽分子与玻片共价连接。它用预先制作的蔽光板和经过修饰的4种碱基，通过光进行活化从而以固相方式合成微点阵。合成前，预先将玻片氨基化，并用光不稳定保护剂将活化的氨基保护起来。聚合用单体分子一端活化另一端受光敏保护剂的保护。选择适当的挡光板使需要聚合的部位透光，不需要发生聚合的位点蔽光。这样，光通过挡光板照射到支持物上，受光部分的氨基解保护，从而与单体分子发生偶联反应。每次反应在成千上万个位点上添加一个特定的碱基。由于发生反应后的部位依然接受保护剂的保护，所以可以通过控制挡光板透光与蔽光图案以及每次参与反应单体分子的种类，就可以实现在特定位点合成大量预定序列寡核苷酸或寡肽的目的。由于照相平板印刷技术每步的合成效率较低（95%）[2]，合成30nt的终产率仅为20%，所以该技术只能合成30nt左右长度的寡核苷酸。在此基础上，有人将光引导合成技术与半导体工业所用的光敏抗蚀技术相结合，以酸作为去保护剂，将每步合成产率提高到99%，但制造工艺复杂程度增加了许多[3]。所以如何简便地提高合成产率是光引导原位合成技 术有待解决的问题。（见下图）
打印原位合成
压电打印原位合成的方式类似于喷墨打印机，合成原理与传统的核酸或寡肽固相合成技术相同。合成过程为：合成前以与光引导原位合成类似的方式对芯片片基进行预处理，使其带有反应活性基团，例如伯氨基。同时，将合成用前体分子（DNA合成碱基、cDNA和其它分子）放入打印墨盒内，由电脑依据预定的程序在xyz方向自动控制打印喷头在芯片支持物上移动，并根据芯片不同位点探针序列需要将特定的碱基合成前体试剂（不足纳升）喷印到特定位点。喷印上去的试剂即以固相合成原理与该处支持物发生偶联反应。由于脱保护方式为酸去保护，所以每步延伸的合成产率可以高达99%，合成的探针长度可以达到40~50nt。以后每轮偶联反应依据同样的方式将需要连接的分子喷印到预定位点进行后续的偶联反应。类似地重复此操作可以在特定位点按照每个位点预定的序列合成出大量的寡核苷酸探针。
点 样 法
点样法在多聚物的设计方面与原位合成技术相似。只是合成工作用传统的DNA、多肽合成仪或PCR扩增或体内克隆等方法完成。大量制备好的核酸探针、多肽、蛋白等生物大分子再用特殊的自动化微量点样装置将其以较高密度互不干扰地印点于经过特殊处理的玻片、尼龙膜、硝酸纤维素膜上，并使其与支持物牢固结合。支持物需预先经过特殊处理，例如多聚赖氨酸或氨基硅烷等。亦可用其它共价结合的方法将这些生物大分子牢牢地附着于支持物上。现在已经有比较成型的点样装置出售，例如美国Biodot公司的“喷印”仪以及Cartesian Technologies公司的Pix-Sys NQ/PA系列“打印”仪。这些自动化仪器依据所配备的“打印”或“喷印”针将生物大分子从多孔板吸出直接“打印”或“喷印”于芯片片基上（见下图）。“打印”时针头与芯片片基表面发生接触而“喷印”时针头与片基表面保持一定的距离。所以，“打印”仪适宜制作较高密度的微阵列（例如2500点/cm2），“喷印”法由于“喷印”的斑点较大，所以只能形成较低密度的探针阵列，通常400点/cm2。点样法制作芯片的工艺比较简单便于掌握、分析设备易于获取，适宜用户按照自己的需要灵活机动地设计微点阵，用于科研和实践工作。　
目前，除了在生物芯片研制方面享有盛誉的Affymetrix公司等个别公司使用原位合成技术制造芯片外，大多中小型公司普遍采用点样技术制作生物芯片。
检测的原理
荧光标记和检测是利用荧光标记的DNA碱基在不同的波长下吸收和发射光。在微阵列分析中，多色荧光标记可以在一个分析中同时对二个或多个生物样品进行多重分析，多重分析能大大地增加基因表达和突变检测结果的准确性，排除芯片与芯片间的人为因素。荧光为基础的分析使得利用一些先进的数据获得技术成为可能，包括共聚焦扫描的CCD照相技术。用于芯片制备的无孔基质表面使得芯片检测中的生化反应大大受益。玻璃基质所需的反应体积（5-200ul）比传统的分析要小的多（5-50ml），小反应体积降低了试剂的消耗，增加了微阵列分析中核酸的反应物的浓度（0.1-1um），相对于传统分析（0.1-4pm）增加100000倍之多，浓度的增加又能加速杂交的速度，从而减少获得强荧光信号的时间，并可用盖玻片封闭杂交槽进行杂交反应。对于以核酸杂交为原理的检测技术，主要过程为：首先用生物素标记经扩增（也可使用其它放大技术）的靶序列或样品然后再与芯片上的大量探针进行杂交。用链霉亲和素（streptavidin）偶联的荧光素（常用的荧光素还有lassamine 和phycoerythrin）作为显色物质，图象的分析则用落谢荧光显微镜、激光共聚焦显微镜或其它荧光显微装置对片基扫描，由计算机收集荧光信号，并对每个点的荧光强度数字化后进行分析。由于完全正常的 Watson-Crick配对双链要比具有错配（mismatch）碱基的双链分子具有较高的热力学稳定性，所以，前者的荧光强度要比后者强出5-35%。从这一点来说，该检测方法是具有一定特异性的，而且荧光信号的强度还与样品中靶分子含量呈一定的线性关系。
荧光探针
目前用荧光探针作为检测信号的仪器，主要是考虑荧光标记所要检测的DNA的效率，以及荧光探针本身的发光效率和光谱特性。
一PCR过程中的DNA标记1.末端标记：在引物上标记有荧光探针，在DNA扩增过程时，使新形成的DNA链末端带有荧光探针。
2 .随机插入：选择四种缄机基，使其中一种或几种挂有荧光探针，在PCR过程中，带有荧光探针的碱基和不带荧光探针的碱基，同时参与DNA链的形成。由于带有荧光探针的碱基，可能影响PCR的产物，因此，需要调整荧光标记的碱基与未标记的碱基比率，以使得PCR产量和带有荧光探针的碱基在DNA的插入率达到一个平衡的水平，使杂交信号最强。
二RNA转录过程的荧光探针标记某一种碱基标记有荧光，但要求该种碱基标记与非标记按一定比率混合，以达到最佳转录效果。
三荧光探针的选择主要考虑以下几个因素：　 
荧光探针的激发和发射频谱； 
荧光探针的发光效率； 　 
荧光探针对PCR或逆转录效率的影响；
不同荧光探针的发射光谱是否有重叠。
常用的荧光探针：FITC，CY-3，ALEAX488，CY-5，ALEAX564
聚焦扫描和CCD扫描仪
一旦荧光标记样品和微阵列反应后，未结合的成分就可洗去，结合到芯片的样品可通过荧光检测装置进行检测。聚焦扫描仪和CCD相机均已成功地应用于芯片的检测。聚焦扫描主要是利用玻璃基质小区域（约100um2）的激光发晒透镜（或两者）使整个影像聚集，每个位点上带荧光的样品发射的光通过一系列的反光镜，光片和晶体后与不要的光分开，然后被光电倍增管（或一种类似的装置）转换成一种电信号。聚焦扫描聚焦数据的速度（1-5min）要比传统实验中的放射自显影快的多（1-10天），快速的荧光检测技术是芯片检测技术的一次革命。CCD相机利用许多与聚焦扫描仪相同的原理聚焦荧光影像。
生化反应　杂交反应概述
该过程指将从生物样品分离到的蛋白、DNA或RNA样品与生物芯片进行反应，从固定于芯片的探针阵列得到样品的序列信息。由于玻片本身的荧光本底很低，所以可用荧光标记的方法来对生物芯片实施检测和分析，同时具有快速、精确和安全等优点。而且，还可用多个荧光素进行标记以实现一次性分析多个生物样品。玻片作为支持物还可使反应体积缩小到5-200μl，而通常的杂交反应体积为5-50ml。这样一方面节约了试剂，同时还可以提高反应试剂的有效浓度（0.1-1μM），是常规检测（0.4-4pM）的一万倍。因此促进了杂交速度减少了杂交时间，并可取得较强的荧光信号。
样品的制备 　核酸样品
RNA样品通常需要首先逆转录成cDNA并进行标记后才可进行检测。目前，由于检测灵敏度所限，尚难以普通探针对极少量的核酸分子进行杂交和检测，所以需要对样品或后续测试信号进行适当的放大。多数方法需要在标记和分析前对样品进行适当程度的扩增，例如通过PCR方法，以使样品核酸的拷贝数有所提高达到检测的灵敏度。但用DNA芯片进行检测分析时需要对样品大量的DNA片段进行扩增和标记，所以需要同时对样品核酸分子大量的区域进行扩增，这是一项工作量非常巨大的工作。顺应这一要求出现了许多解决办法，并在不同程度上减轻了工作量。例如，Mosaic Technologies公司引入的固相PCR方法，将多对引物固定于支持物上（其位置和序列信息预定），以类似于原位PCR的方式一次性对样品多个片段进行扩增和放大，而且不会由于引物种类过多而出现相互间的竞争和抑制（这种情况曾出现于多重PCR中）。引物具有较强的特异性，扩增反应也不存在交叉污染，因而省略了处理常规多重和多个PCR反应的繁琐工作。再如，Lynx Therapeutics公司引入的大规模并行克隆（massively parallel solid-phase cloning），可在一个样品中同时对数以万计的DNA片段进行克隆，且无需单独处理和分离每个克隆。
除了检测前对样品分子的放大外，通常仍需要有高灵敏度的检测设备来采集、处理和解析生物信息。但，亦有不经过对样品的扩增和放大而直接应用特殊处理的探针，例如分支探针技术，而达到较高的检测灵敏度水平。这种方法的原理是，设计具有庞大分支结构的分支核苷酸探针，分支末端以酶标记。这样，经过分支核苷酸与酶的双重放大作用而将标本杂交时极弱的信号转换为较强的化学信号。该技术比较成功的例子就是HCV与HBV的检测。它的最大优点在于其操作简便，具有较高的灵敏度，同时也可以保证检测结果的特异性[2]。当然，由于不同检测方式的灵敏度不同对于样品的处理和扩增情况的要求亦有所不同，具体的处理和放大方法仍需根据实际情况进行选择。
蛋白及其它生物样品
同样，基于生物大分子相互作用原理的生物芯片在检测时生物样品的处理遵循相似的方式，即信号的放大和样品的标记。例如，蛋白芯片在进行检测和分析时，可以将待分析的蛋白样品用荧光素或其它物质进行标记，然后与生物芯片上的生物大分子进行相互作用，最后依据标记物质的不同采取相应的检测方式采集和分析样品和芯片上生物大分子相互作用的结果。对与非核酸类的生物大分子，存在的问题是有时不便于对其进行扩增和放大，因为其它生物大分子的结构相对比较复杂不能进行简便的克隆或扩增。所以，这就向检测的灵敏度提出了更高的要求。其它生物大分子的检测和分析类似与蛋白分子。例如核酸与蛋白的相互作用，配体间的相互作用，糖与蛋白的相互作用等。