标题：体内药物分析
学科介绍
基本概念体内药物浓度，尤其是血浆（或血清）药物浓度直接与药效相关，并受多种因素影响。例如，不同给药途径（如口服、吸人、静脉注射、肌肉注射、透皮等）可直接影响药物的吸收、分布、代谢和排泄，从而影响体内药物的浓度以及经时行为，并最终影响疗效。患者的生理因素（性别、年龄等），病理状态（疾病的类型和程度），基因类型，吸收、代谢及分泌排泄功能，都影响药物在体内的经时行为。许多药物需经肝脏代谢或经肾脏排泄，所以对于肝或肾病患者，由于他们的肝脏生物转化及代谢功能降低、或肾脏的分泌排泄功能降低，往往会造成药物在体内蓄积，进而发生药物毒性反应。
随着现代医学的不断进步，人们对医疗质量也提出了更高的要求。治疗药物监测（Therapeutic Drug Monitoring，TDM）就是以灵敏可靠的方法，检测病人在给药后的血液或其他体液中的药物浓度，并应用药物代谢动力学理论，指导最适个体化用药方案的制定和调整，以避免用药剂量过大及可能产生的毒性反应，保证药物治疗的有效性和安全性。学科特点体内药物分析的特点是样品成分复杂，被测组分含量低。学科关联体内药物分析学科发展的最大推动力来自于生物医学及新药药物动力学研究领域巨大的要求和分析技术上的飞跃性进步。与药代动力学、临床药理学和生物药剂学等学科互相关联、密不可分。
分析方法
光谱分析法包括比色法(colorimetry)、紫外分光光度法（UV ）和荧光分析法（Fluor ）。光谱法虽然仪器简单、测定快速，但选择性和灵敏度都较低，本法不具备分离功能，受结构相近的其他药物、代谢产物和内源性杂质的干扰，因此用光谱法分析体液样品时，除少数样品外，一般都需经过组分分离、纯化等预处理过程。光谱法的灵敏度低，不适用于测定药物浓度低的生物样品。色谱分析法包括高效液相色谱法（HPLC ）、气相色谱法（GC ）及其与质谱（Ms ）联用（HPLC 一MS , GC 一MS ）的方法，以及毛细管电泳色谱法( HPCE ）。
色谱法具有对组分进行分离和分析的双重作用，能排除与药物结构相近的代谢产物和某些内源性杂质的干扰，具有很高的选择性和较高的检测灵敏度，常作为评价其他方法的参比方法。在某些情况下色谱法应用也受到一定限制，如HPLC 大多数仪器配备的是紫外和荧光检测器，只限于测定具紫外吸收或产生荧光的组分，虽然对某些组分可通过衍生化方法使之具备紫外吸收或荧光性质，这势必增加测定时的操作步骤。又如用GC 法测定生物样品时，还受被测组分的挥发性和热稳定性的限制。此外，对于测定浓度很低的样品（如地高辛有效血药浓度仅0 . 9 一2 . 2 拌g / L ）时，色谱法的灵敏度难以达到要求。免疫分析法包括放射免疫分析法（RIA ）、酶免疫分析法（EIA ）和荧光免疫分析法（EIA ）。
免疫分析是利用半抗原药物与标记药物竞争抗体结合原理的一种分析方法，具有快速、简便和灵敏度高的特点，尤其适用于分析低药物浓度的体液样品及大量又需长期分析（如常规监测）的样品。该法可直接测定体液样品，并且耗费样品量少。免疫分析法建立时，需针对每一种药物制备特异性的抗体和标记药物，费时、费力，在一般实验室中难于办到。目前通常采用试剂盒（又称药盒），但测定的药物品种受试剂盒供应的限制。同位素标记药物它们主要应用于放射免疫分析法（RIA） 、同位素逆稀释分析，或作为GC - MS 分析中的内标，以及在药物分离中作示踪应用等。微生物测定利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较样品与药物标准品两者对接种的试验菌产生的抑菌圈的大小，借以测定样品内抗生素的浓度。
样品种类
体内样品包括各种体液和组织。但是，在体内药物分析中最为常用的样本是血液，它能够较为准确地反映药物在体内的状况。尿液中常含有丰富的药物代谢物，也被较多地使用。唾液因采集便利，且有时与血浆游离药物浓度具有相关性而时有使用。而脏器组织，除非特别需要，在临床治疗药物监测中很少使用。采集时间体内样品的采集时间对测定结果的临床价值影响很大，是开展临床治疗药物监测必须考虑的基本问题。采集时间应在药代动力学理论的指导下，根据临床治疗药物监测的不同目的确定。
用药方案的确定和调整是开展临床治疗药物监测的主要工作。应该在用药达到稳态后再采样，以保证稳态血药浓度是否维持在治疗浓度范围内，以巩固疗效或控制症状的发作。
对于用药已达疗效、但需了解长期用药是否会致慢性毒性时，也需要进行临床治疗药物监测。取样宜在达稳态后的血药峰浓度时间点进行，以确定稳态峰浓度是否接近或超过中毒浓度，以便做出相应处理。
急性药物中毒诊断时，应立即取样测定。治疗效果监测则可根据临床需要确定取样时间，监测剧药效果。
临床药代动力学及药效学研究时，大都采集给药前及给药后，药物及其代谢产物在体内的吸收、分布、代谢和消除排泄各阶段多个时间点的样本，以便获得完整的经时行为，为临床用药提供参考。血样血样  血液样品包括全血（whole blood）、血浆（plasma）和血清（serum），它们是最为常用的体内样品。血药浓度监测，除特别说明是全血外，通常都是指血浆或血清中药物浓度的测定。当药物在体内达到稳定状态时，血浆中药物的浓度能够反映药物在靶器官的状况，因而，血浆药物浓度可作为体内药物浓度的可靠指标。
1.血样（全血）的采集
动物实验时，可直接从动脉或心脏取血。对于患者或志愿者，通常采集静脉血，有时根据血药浓度和分析方法的灵敏度，也可用毛细管采血。血样的采集时间由测定目的和药代动力学参数决定。全血采集后置含有抗凝剂（例如：肝素、EDTA、草酸盐、枸橼酸盐等，防止凝血后影响测定）的试管中，混合均匀，即得。血浆或血清由采集的全血制备。
2.血浆的制备
将采集的全血置含有抗凝剂的试管中，混匀后，以约1000×g力离心5～10分钟，促进血红细胞沉降分离，分取上清液即为血浆。
3.血清的制备
将采集的全血在室温下放置至少0.5～1小时，待血液凝固后，再以约600×g力离心5～10分钟，促进血细胞沉降分离，分取上清液即为血清。
因为药物与血浆纤维蛋白几乎不结合，所以，血浆与血清中药物的浓度通常相同。血浆比血清分离快、制取量多（约为全血的50%），因而较血清更为常用。如果抗凝剂对药物可能发生作用，并对药物浓度测定产生干扰，则以血清为检测标本。
血样采集后应及时分离血浆或血清，并最好立即进行分析。如不能立即进行测定，应根据药物在血样中的稳定性及时处置，置于具塞硬质玻璃试管或聚塑管（Eppendorf）中密塞保存。短期保存时可置冰箱冷藏（4℃），长期保存时需在-20℃或-80℃下冷冻贮藏，以保障样本不变质和药物稳定，保障监测浓度的准确。因冰冻有时可引起细胞溶解，妨碍血浆或血清的分离；或因溶血影响药物浓度变化；所以全血未经分离时，不宜直接冷冻保存。
如果待测药物在样本中易受酶或酸碱等的作用发生进一步变化，则须根据其自身性质选择合适的方法进一步处置。通常的处置方法包括低温冷冻、调节酸碱度、加酶抑制剂等。尿液尿液  尿液样品包括随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿及时间尿几种。健康成人一日排尿量为1～5L，尿液的pH值在4.8～8.0之间。尿液的主要成分是水、含氮化合物（其中大部分是尿素）及盐类。
体内药物清除主要是通过肾脏排泄，经尿液排出。采集的尿液应该是自然排尿。尿液在放置时可因细菌繁殖而变混浊，因此，尿液采集后应立即测定。若不能立即测定（如需收集24小时的尿液），必须采集后立即处置、或低温保存、或加入防腐剂后冷藏保存。常用的防腐剂有二甲苯、三氯甲烷、醋酸或盐酸等。二甲苯等有机溶剂可以在尿液的表面形成薄膜，醋酸等可以改变尿液的酸碱性，以抑制细菌的繁殖。保存时间在36小时以内，可置冰箱冷藏；若需长时间保存，则应冰冻贮藏。
药物可以原型（母体药物）或代谢物及其缀合物（conjugates）等形式排出。尿液中药物浓度大都较高，采集方便、且采集量大，但尿液浓度通常变化较大。所以，尿液药物浓度测定的目的通常与血液或唾液样品的不同，主要用于药物尿液累积排泄量、尿清除率或生物利用度的研究，以及药物代谢物及其代谢途径、类型和速率等的研究。在临床上，亦可推断患者是否违反医嘱用药。
尿液中药物浓度的改变不能直接反映血药浓度，即与血药浓度相关性差。受试者的肾功能正常与否直接影响其对药物的排泄能力，因而，尿液样品的采集和测定应当与肾功能指标进行关联分析。婴儿的排尿时间难于掌握，且尿液不易采集完全。
测定尿液中药物浓度时应采用时间尿（一定时间区间的尿液）。测定尿液中药物的总量时，应收集用药后一定时间内（如24小时，或至基本完全排泄的其他时间）各时间段排泄的全部尿液，记录体积后，量取一部分用于药物浓度的测定，再乘以尿液量，计算即可求得尿药排泄总量。唾液唾液是由腮腺、颌下腺、舌下腺和口腔黏膜腺体分泌的黏液在V1腔里混合而成的消化液。一般成人每天分泌约1～1.5L.口腔黏膜受到机械或化学刺激时，各唾液腺的分泌会受到影响，造成唾液组成发生较大的变化；感官刺激所产生的条件反射以及思维、情绪也会影响唾液腺的分泌；随年龄不同，唾液的分泌量也不同：小儿的唾液分泌量多，老年人的分泌量减少。通常得到的唾液含有黏蛋白，其黏度是水的1.9倍。唾液的pH值受分泌量变化的影响，分泌量增加时趋向碱性而接近血液的pH值，其波动范围为6.2～7.6.
唾液的采集应尽可能在安静状态下进行。一般在漱口后15分钟收集，1分钟内大约可采集1ml.唾液采集后应立即测量其除去泡沫部分的体积，并以1000×g力离心10分钟，分取上清液作为药物浓度测定的样品。
若分泌量少，可转动舌尖促进唾液的分泌；也可采用物理的（如嚼石蜡块）或化学的（如维生素C、酒石酸）等方法刺激，使在短时间内获得大量的唾液。但经刺激后唾液中的药物浓度往往会受到影响。特殊需要时，可采集腮腺、颌下腺及舌下腺分泌的单一唾液。这种单一唾液的采集必须采用特殊唾液采集器收集。
唾液采集后，应在4℃以下保存。若分析时无影响，则可用碱处理唾液，以使黏蛋白溶解而降低其黏度。冷冻保存的唾液在解冻后应充分搅匀后再使用，以避免因浓度不均匀而产生测定误差。
样品处理
处理目的治疗药物监测中，除少数方法可以对采集的样品直接进行分析外，大多需要对样品进行必要的预处理。预处理的目的是在不破坏待测定成分的前提下，用适当的方法分离纯化或浓缩待测药物，以减少干扰、提高检测灵敏度和特异性、降低对仪器的污染和损害。所以，体内样品的预处理是体内样品分析的重要环节。常用方法体内样品的预处理方法的选择需要综合考虑多种因素，包括体内样品的种类、被测药物的性质和浓度、以及所采用的测定方法等三方面。
如血浆或血清需除蛋白，使药物从蛋白结合物中释出；尿液样品则常采用酸或酶水解使药物从缀合物中释出；唾液样品主要采用离心去除黏蛋白沉淀。
被测定药物的结构、性质、存在形式与浓度范围等，均直接影响到样品前处理方法的选择与应用。例如，药物的酸碱性（pKa）与溶解性影响到药物的萃取分离条件的选择，药物的极性、稳定性、官能团性质和光谱特性影响到其色谱测定条件的优化选择。不同药物在样品中的浓度相差悬殊，浓度大的样品对前处理要求稍低，浓度越低则样品前处理要求越高。
体内样品前处理的方法以及分离纯化的程度，均取决于测定要求和所采用的测定方法。测定方法的耐受污染程度和抗干扰能力越强、专属性越好、灵敏度越高，则对前处理的要求越低。通常，免疫测定法由于具有较高的灵敏度和抗干扰能力，体内样品只需经离心分离即可直接用于测定。而高效液相色谱和色谱-质谱联用等方法，为防止蛋白质等在色谱柱上沉积、内源性干扰、或基质效应影响，色谱分析前均需对体内样品进行去除蛋白、溶剂萃取、甚至制备衍生物等前处理。
1.去除蛋白质法
在测定血样及组织匀浆等样品中的药物时，首先应去除蛋白质。去除蛋白质既可使蛋白结合型的药物释放出来以便测定药物的总浓度，又可避免进一步的溶剂萃取过程中乳化的形成，并可消除内源性干扰，同时保护仪器性能（如保护HPLC柱不被蛋白污染），延长使用寿命。去除蛋白质常用的方法包括蛋白沉淀法和蛋白分解法。
2.缀合物水解法
药物在体内经二相代谢可以形成葡糖醛酸苷或硫酸酯缀合物，并经尿液或胆汁排泄。为了准确测定体内样品中药物的含量，首先需将缀合物水解释放出缀合的药物或其代谢物后，再进行进一步的处理测定。常用的缀合物水解方法包括酸水解和酶水解。
酸水解通常使用无机酸，如盐酸或磷酸溶液等。酸的浓度、水解时间和温度等条件，应根据具体药物进行优化确定。酸水解的优点是简便、快速，但是专属性较差，并需注意避免药物的进-步降解。对于遇酸及受热不稳定的药物，可采用酶水解法。
酶水解法常用葡糖醛酸苷酶或硫酸酯酶，或二者的混合物。酶解时应当注意控制反应的pH、酶试剂用量、孵育温度、酶解时间，并在厌氧条件下进行。尿液样本进行酶解时，需要首先隐蔽会抑制酶活力的阳离子。
虽然酶水解法存在水解时间长、酶试剂带人的黏液蛋白可能导致乳化及色谱柱污染等缺点，但酶水解法具有较高的选择性，很少使被测药物或共存物发生降解，所以常被优先选用。
3.分离纯化与浓集法
对于浓度较高的样品，或检测方法具有足够灵敏度时，体内样品在经去除蛋白质或缀合物水解等前处理步骤后即可直接用于测定。但当药物浓度较低或分析方法的特异性或灵敏度不够高时，体内样品需进行分离、纯化与浓集处理，或在去除蛋白质或缀合物水解的基础上进一步进行处理。
萃取法是应用最多的分离、纯化方法。萃取的目的是为了从大量共存的内源性物质中分离出所需要的微量组分一药物及其代谢物，并通过溶剂的蒸发使样品得到浓集，残留物采用适宜的溶剂复溶后再进行分析测定。萃取法包括液-液萃取法和液-固萃取法。
4.化学衍生化法
治疗药物监测的体内样品色谱分析时，可根据待测物的化学结构和检测方法的要求，通过化学衍生化方法，特异性地引入功能基团后再进行分析。通常对药物分子中含有活泼H的极性基团，如含-COOH、-0H、-NH2、-NH-和-SH等，进行化学衍生化。化学衍生化的目的包括：改变待测药物的色谱行为；增强药物的稳定性；改善（手性拆分）分离能力；提高检测灵敏度等。
GC分析中常对待测物进行硅烷化（silylation）、酰化（acylation）、烷基化（alkylation）或酯化（esterification）等。硅烷化应用最广泛。硅烷化试剂有：三甲基氯硅烷（TMCS）、双-三甲基硅烷乙酰胺（BSA）、双-三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）、三甲基硅烷咪唑（TMTS）等。酰化试剂有：乙酸酐、丙酸酐、五氟苯甲酸酐等。烷基化及酯化试剂有：五氟碘乙烷、重氮甲烷、对溴苄基溴、三氟化硼-甲醇等。
化学衍生化HPLC分析包括柱前和柱后衍生化两种方法。柱前衍生化分析中，衍生化胺、氨基酸和氨基醇类化合物的试剂有：丹酰氯、荧光胺、9-芴甲氧羰酰氯、邻苯二醛等；衍生化羰基化合物的试剂有：2，4-二硝基苯肼、丹酰肼等；衍生化羧酸常用的试剂为2，4'-二溴苯乙酮；衍生化醇类化合物常用的试剂为3，5-二硝基苯甲酰氯、五氟苯甲酰氯等。
由于柱前衍生化法是在分离前使药物与衍生化试剂反应。故与药物具有相同官能团的干扰物质也同样会生成衍生物，并有可能妨碍药物的检测。如果干扰物质含量高时，甚至会影响待测成分的衍生化效率。因此，应尽可能将样品进行分离纯化后再衍生化。
柱后衍生化是药物经色谱分离后在流出液中进行衍生化，以形成对检测器具有高灵敏度响应的衍生物，从而提高检测灵敏度。如氨基酸分析仪中的柱后茚三酮衍生化。
具有光学异构体的药物，由于R（-）与S（+）构型的不同，使之具有不同的药效和药动学特性。因此，异构体的分离检测十分重要。光学异构体的分离可采用不对称试剂衍生化，使其生成非对映异构体衍生物，再进行色谱分离测定。常用的不对称衍生化试剂有：（-）-1-（9-芴基）乙基氧甲酰氯、（+）-樟脑磺酰氯、2，3，4，6-四-O-苯甲酰-β-D-葡萄吡喃糖基异硫氰酸酯、（R）-（+）-1-（1-萘基）乙胺等。
样品测定
常用方法体内样品分析常用的方法有免疫分析法和色谱分析法[1]。
免疫分析法是基于抗体与抗原或半抗原之间的高选择性反应而建立起来的一种生物化学分析法。具有很高的选择性和很低的检出限，可以应用于测定各种抗原、半抗原或抗体。免疫分析法分为荧光免疫法、发光免疫法、酶免疫法及电化学免疫法等非放射免疫法和放射免疫法，测定的量可以达到μg甚至ng的水平。这些分析方法多配有专用设备和试剂，操作相对简便，适合常规实验室使用，多应用临床治疗药物监测。
色谱分析包括：气相色谱（GC）、高效液相色谱（HPLC）和色谱-质谱联用（GC-MS、LC-MS）等，这些方法适用于复杂样品中微量药物的专属准确定量，多用于药代动力学研究。定量分析由于体内样品取样量少、药物浓度低、内源性物质的干扰（如无机盐、脂质、蛋白质、代谢物）及个体差异等多种因素影响体内样品测定，为了保证方法的可靠性，必须在建立体内样品分析方法的同时对方法进行验证。
（一）特异性
必须证明所测定的物质是原形药物或特定的活性代谢物，内源性物质和相应的代谢物及同时服用的其他药物不得干扰样品的测定。对于色谱法至少要提供6个不同来源的空白体内样品色谱图、空白体内样品外加标准物质色谱图（注明浓度）及用药后的体内样品色谱图。
（二）标准曲线与线性范围
根据所测定物质的浓度与响应的相关性，用回归分析方法获得标准曲线。标准曲线的高低浓度范围为线性范围，在线性范围内浓度测定结果应达到试验要求的精密度和准确度。
必须用至少6个浓度建立标准曲线，应使用与待测样品相同的生物介质，线性范围要能覆盖全部待测浓度，不允许将线性范围外推求算未知样品的浓度。建立标准曲线时应随行空白体内样品，但标准曲线不包括零点。
标准曲线上各浓度点的实测值与标示值的偏差（bias）在可接受范围内时，可判定标准曲线合格。偏差可按下式计算：
式中，回归值系将各浓度点的响应值代人标准曲线计算所得的浓度值；标示值系指制备标准曲线时，各相应浓度点的配制浓度。
标准曲线上各浓度点偏差的可接受范围一般规定为：最低浓度点的偏差在±20%以内，在其余各浓度点的偏差在±15%以内。只有合格的标准曲线才能用于临床待测样品的浓度计算。当线性范围较宽时，推荐采用加权最小二乘法（weighted least square method）进行同归计算。
（三）定量下限
定量下限（LLOQ）是标准曲线上的最低浓度点，：要求至少能满足测定3～5个半衰期时样品中的药物浓度，或Cmax的1/10～1/20时的药物浓度，其准确度应在真实浓度的80%～120%范围内。RSD应小于20%，S/N应大于5.应由至少5个标准样品测试结果证明。
（四）精密度与准确度
要求选择高、中、低3个浓度的质控（quality control，QC）样品同时进行方法的精密度和准确度验证。其中，低浓度接近定量下限（lower limit of quantitation，LLOQ），在LLOQ的3倍以内；高浓度接近标准曲线的上限（即定量上限，upper limit of quantitation，ULOQ），中间选一个浓度，每一浓度至少测定5个样品。
精密度用QC样品的批内（intra-batch）和批间（inter-batch）RSD表示，RSD一般应小于15%，在LLOQ附近应小于20%.
在测定批内RSD时，每一浓度至少制备并测定5个样品。为获得批间RSD应至少在不同天连续制备并测定3个分析批，至少45个样品。
准确度是指用特定方法测得的体内样品浓度与真实浓度的接近程度，一般应在85%～115%范围内，在LLOQ附近应在80%～120%范围内。
（五）样品稳定性
根据具体情况，对含药体内样品在室温、冰冻和冻融条件下以及不同存放时间进行稳定性考察，以确定体内样品的存放条件和时间。还应注意考查储备液的稳定性以及样品处理后的溶液中分析物的稳定性，以保证测试结果的准确性和重现性。
（六）提取回收率
应考察高、中、低3个浓度的提取回收率。其结果应一致、精密和可重现。
（七）质控样品
质控（QC）样品系将已知量的待测药物加入到生物介质中配制的样品，用于质量控制。
（八）质量控制
应在体内样品分析方法验证完成之后开始测试未知体内样品，每个样品一般测定一次，必要时进行复测。每个分析批均应建立相应的标准曲线，并随行测定高、中、低3个浓度的QC样品，每个浓度至少双样本。并应均匀分布在未知样品测试顺序中。当一个分析批中未知样品数目较多时，应增加各浓度QC样品数，使QC样品数大于未知样品总数的5%，QC样品数的增加以组（高、中、低3个浓度）为单位。QC样品测定结果的可接受标准为：偏差应小于15%，低浓度点偏差应小于20%，最多允许1/3不在同一浓度的QC样品结果超限。如QC样品测定结果不符合上述要求，则该分析批未知样品测试结果作废。浓度高于ULOQ的未知体内样品，应采用相应的空白介质稀释后重新测定。
（九）测试结果
应详细描述所用的分析方法，引用已有的参考文献，提供每个分析批的标准曲线、质控样品及未知样品的测试结果及计算过程。还应提供全部未知样品分析的色谱图，包括全部相关的标准曲线、质控样品的色谱图，以供审查。学科应用（一）治疗药物监测的对象
对于治疗安全浓度范围窄、治疗剂量与中毒剂量接近、毒副作用强、具有非线性药代动力学特征、长期使用药效和毒性不明确、以及联合用药可能发生相互作用的药物，通常都应当进行监测。应当进行治疗药物监测的药物包括部分抗癫痫药、抗心律失常药、强心苷类药、抗生素、抗精神病药、抗哮喘药、抗恶性肿瘤药和一些解热镇痛药，如表7-1所示。部分应当进行治疗药物监测的药物的治疗浓度范围和中毒浓度，如表7-2所示。治疗药物监测示例见第十章第一节“苯巴比妥体内样品的分析。
（二）在药代动力学研究中的应用
地高辛在临床上用于心衰治疗，其有效浓度（0.8～2.0ng/ml）与中毒浓度（>2.4ng/ml）接近。消除半衰期长，成人的约为36小时、儿童的约为30小时，属一级动力学。地高辛在肠部被吸收，60%～90%以原型经肾小球滤过或肾小管排泌，仅有约10%在体内通过氢化、水解、结合等反应代谢，另有约7%发生肠-肝循环。
以毛地黄毒苷为内标，对人血浆和尿液中地高辛浓度LC-MS测定如下。
（1）样品处理方法精密吸取血浆1.0ml，置具塞离心管中，精密加入内标溶液（20ng/ml）50μl，加浓氨水100μl和甲基叔丁基醚5.0ml，振荡混匀30分钟后，3000×g力离心10分钟，分取有机层，置另一离心管中，在减压离心条件下挥千，残留物用100μl 含0.25mmol/L醋酸钠的甲醇-水（40：60）流动相溶解，14000×g力离心2分钟，取上清液15μl进行LC-MS分析。尿样用空白血浆按1：10或1：50稀释后照血浆方法处理和测定。
（2）色谱和质谱条件色谱柱C8（2.1mm×50mm，5μm）柱，流动相含0.25mmol/L醋酸钠的甲醇（A）-水（B）梯度洗脱，流速0.25ml/min.电喷雾正离子化，喷雾电压5000V，传输裂解电压250V，干燥氮气温度350℃，流速10.0L/min，喷雾口气压25psi.选择性离子【M+Na】+监测（SIM），m/z分别为803.4（地高辛）和787.4（毛地黄毒苷）。
（3）测定结果血浆浓度线性范围为0.05～1.5ng/ml，应用于人体药代动力学研究，测得女性受试者口服0.25mg地高辛后的典型血浆浓度-时间曲线如图7-2所示，其尿液48小时累积排泄量为30.2%。