标题：载脂蛋白CⅢ
概述
载脂蛋白C是极低密度脂蛋白胆固醇的主要载脂蛋白，也存在于高密度脂蛋白-胆固醇和低密度脂蛋白-胆固醇中，有3种不同的载脂蛋白C，即ApoCⅠ、ApoCⅡ、ApoCⅢ，它是CM、VLDL他和HDL的少量结构蛋白。
载脂蛋白CⅢ医学检查
分类
血液生化检查
脂类测定
原理
（1）免疫透射比浊法：血清ApoCⅢ与试剂中的特异性抗人ApoCⅢ抗体相结合，形成不溶性免疫复合物，使反应液产生混浊，以光度计在波长340nm测出吸光度，代表混浊程度，浊度高低反映血清标本中ApoCⅢ的含量，后者可由校准血清所作校准曲线读出。
试剂中聚乙二醇（PEG）有促进抗原抗体反应的作用。ApoCⅢ主要存在于HDL颗粒表面，血清稀释及表面活性剂有助于HDL ApoCⅢ抗原位点的暴露，使之能充分地与特异性抗体起反应，表面活性剂还可减轻血清空白浊度。
（2）火箭电泳法：火箭免疫电泳法是单向免疫扩散法的一种改进，通过应用直流电（稳压稳流）使抗原（ApoCⅢ和B）在含有特异性抗体的琼脂糖凝胶中扩散，pH 8.6时抗原向阳极移动，在泳动途中与凝胶中的抗体反应，逐渐形成类似火箭的沉淀峰。其峰高（或峰面积）与抗原浓度成正比，故可作抗原定量。[1]
试剂（1）免疫透射比浊法：
①样品稀释剂：pH 7.4的磷酸盐缓冲液（0.01mol/L磷酸盐中含0.15mol/L氯化钠），内含PEG-6000 40g/L及表面活性剂适量（选用聚氧乙烯月桂醚类，如Thesit或Tween-20），用GS玻芯漏斗抽滤后用。本试剂的吸光度A340nm<0.05，在2～6℃冰箱中可存放半年。如半年后A值仍0.05可按上述条件抽滤后再用。
②羊或兔抗人ApoCⅠ抗血清：原血清效价以1∶32～1∶64为宜。抗血清可用含PEG-6000的磷酸盐缓冲液（不含表面活性剂）或用硫酸铵沉淀法纯化。抗血清应用液浓度因各批抗血清的效价及免疫亲和力而异（应按试剂盒说明书，临用前稀释）。抗血清中含防腐剂，在2～6℃冰箱中可存放半年。原血清（冻干）在低温冰箱中（－20℃以下）可贮存数年。
③参考血清：现在已有国际标准，即WHO ApoCⅠ参考物质SPI-01（冻干血清）。符合国际标准的校准血清由卫生部北京老年医学研究所提供。
校准血清保存在－20℃以下，至少稳定半年，化冻后必须彻底混匀后才能应用。最好备有高、中、低浓度（例如apoAⅠ 2.0，1.3与0.6g/L左右）的校准血清各1份。便于作校准曲线。
（2）火箭电泳法：
①巴比妥缓冲液，离子强度0.05，pH8.6。
②10g/L琼脂糖（标准电内渗）用巴比妥缓冲液配制，加热溶化，混合后，分装10ml/管，冷后4℃贮存。
③0.15mol/L NaCl溶液。
④兔（或羊）抗人ApoCⅠ抗血清（效价不低于1∶16）及apoB抗血清（效价不低于1∶32）。
⑤校准血清（同比浊法）。
⑥染色液：考马斯亮蓝R-250 0.25g溶于甲醇45ml中，加入冰醋酸10ml及水45ml，混合，溶后备用。
⑦脱色液：每升含冰醋酸50ml及甘油100ml。
操作方法（1）免疫透射比浊法
①标本应是及时分离的空腹血清，可密封存放在2～6℃冰箱中，1周内测定，－20℃可存放半年。
②用全自动分析仪时，应根据不同仪器设计参数，合理选择抗原抗体比例及反应时间。也可作速率法散射比浊测定ApoCⅠ如用Beckman比浊仪ICS或protein array system）。
③手工法所用仪器：精密光度计，具有340nm滤光片（或分光器），样品池体积以0.5ml为宜（为节省抗血清），最好用流动杯，样品稀释最好用稀释器、经校正的加样器。
  ④标本处理：将血清标本及质控血清各用样品稀释剂作1∶200稀释，即先作1∶20稀释（5.Oμl血清+95μl稀释剂）后，再作1∶10稀释（多余的1∶20血清作测定apoB用）。然后按表1操作。
质控同上处理。
混匀后，25～37℃放置30min，在波长340nm比浊，根据U-UB的A值，在标准曲线上读出结果。
本法批间CV<5%。
⑤校准曲线：在手工与半自动操作中每批测定均需作校准曲线，可将校准血清稀释成1∶100、1∶200、1∶300和1∶400等4种浓度，与标本同样操作，根据定值计算出每个标准管apoAⅠ浓度，以浓度（X）与其相应的A值（Y）作图（用直线回归计算），基本上成直线，但在Y轴上有一定截距，所以不能用单点标准。操作准确时浓度与A值的相关系数应在0.985以上。
如有高、中、低浓度的三份校准血清时，可与标本同样操作，做三点定标，也可作五点定标（即高、中浓度的血清等量混合，及中、低浓度的血清等量混合，成为另两份校准血清）。
本法线性范围：0.4～2.5g/L。　
（2）火箭电泳法
①浇板：每板用10g/L琼脂糖10ml，沸水浴中融化，混匀，冷至50～55℃时加入apoAⅠ抗血清50μl，apoB抗血清8μl（用量视抗血清效价而定），迅速混匀后倒在预置在水平台上的玻璃板上，冷后放在4℃，20min后打孔，孔在板的阴极端，孔径3mm，孔间距至少5mm，孔容量5μl。把板放入电泳槽，用滤纸搭桥。
②稀释抗原：用0.15mol/L NaCl液将校准血清稀释成1∶100，1∶150，1∶200，1∶300，及1∶400（作校准曲线之用），血清标本按1∶200稀释，放4℃冰箱不得超过3天。
③加样：在低电流状态（10mA/板）将稀释好的定值血清及标本分别吸取5μl（准确），加入琼脂糖凝胶加样孔内。每板都要做一系列标准。
④通电：稳流24mA/板，端电压6～8V/cm，以流水冷却使琼脂糖保持15℃，电泳3～4h。
⑤脱杂蛋白及制干胶膜：电泳后的琼脂糖板浸泡在0.15mol/L NaCl中30min，将胶膜托置于聚酯薄膜上，用多层滤纸在轻轻加压下吸干胶内水分，然后将滤纸、胶膜与聚酯膜三者一起自然干燥，或用热吹风器吹干，干后胶膜会自然与滤纸及聚酯膜分开。
⑥染色：将琼脂糖胶膜平铺浸泡于染色液内20～30min。
⑦脱色：用脱色液浸泡已染色的胶膜至火箭峰清晰，背景基本无色。可在水中用两片玻璃纸将胶膜夹住，晾干后可长期保存。也可以用流水浸泡脱色至背景干净。[1]
附注（1）免疫透射比浊法
①关于抗血清：比浊测定与其他方法相比对抗血清的要求更高。比浊法以用多克隆抗体为宜。抗血清中必须不含杂抗体。必须十分重视从人血清中提取的apoA-Ⅰ达到免疫纯、色谱纯与电泳纯，这不是一般实验室都能做到的。抗血清效价（滴度）不可低于16。目前国内某些商品试剂中，apoA-Ⅰ抗血清效价极低，选购试剂盒时必须注意。如果没有在选购前鉴定抗血清质量的经验，应请有条件的单位鉴定之。
②上法中标本（血清）稀释200倍是为了便于手工操作（加样100μl），如有精密加样器，可作20倍稀释（用10μl）。为了适合不同实验室的条件（如不同类型的自动化仪器），作适当修改时应注意抗原抗体的比例，必须十分注意反应体系中不可有抗原过量，线性上限不可低于2.5g/L。换言之，抗血清用量必须充裕，否则标本中apoA-Ⅰ高水平时测出结果偏低。目前国内某些商品试剂盒不但抗血清效价过低，操作中所定标本用量又过大（如3～5μl），抗体明显不足，测出结果必然不准确。
③为了达到准确测定的目的，apoA-Ⅰ与B比浊测定（终点法）中必须作校准曲线计算结果。一定范围（低标本用量）浓度（X）与浊度（Y）基本上成直线关系，直线回归计算出在Y轴上有一定截距（A值<0.1），所以用单点校准计算结果偏差较大，使测出结果不能准确反映浓度的高低（高的偏低，低的偏高）。千万不要因为单点法简便而忽略了测定的准确性。无论用何种自动化仪器，必须先试作校准曲线。如果在所用仪器及特定条件下反复测试，回归线的截距不明显时，才能采用单点校准法。标本用量在3～5μl时，即使加大抗血清用量，浓度与浊度也不成直线关系，只能用曲线直线化转换后计算。
④主要干扰因素是血清本身的混浊（如高脂血清），用超离心或脂肪酶水解等标本预处理方法都不实用。用表面活性剂消浊的作用也有限，所以在测定中必须作标本空白管。除了自动分析中可采用两点法外，手工法用单一试剂而不扣除标本空白的做法是错误的。为了减少基质效应对浊度反应的影响，必须用定值血清作校准物。此外，尘埃粒子、比浊皿划痕等干扰也必须排除。
⑤有的商品试剂盒（包括某些进口产品）所附校准血清定值不准确，是误差的重要来源。
（2）火箭电泳法
①抗原稀释倍数与抗血清用量的选择，应以火箭峰清晰、校准曲线斜率适中并成直线为宜。本法同时测定apoA-Ⅰ与apoB，应调整两种抗血清用量，使二者峰高有区别，apoB峰高不小于1cm。
②不同种类来源的抗血清（如兔与羊），在等效价的情况下进行试验，结果会有差异。apoA-Ⅰ测定以兔抗血清为好。用兔血清时峰形尖细，而羊血清所产生的峰粗，峰尖圆钝，有时在峰顶前出现虚影。校准血清所作校准曲线斜率也不同。但不论用何种抗血清，定量结果差别不大。
③在一定条件下电泳，不同稀释度校准血清的峰高不会有明显变动，校准曲线斜率基本一致。如标本峰高超出校准曲线范围时，应调整标本稀释倍数后重测。板间CV通常小于5%。
④火箭电泳结果可以用染色法或直接肉眼观察可见的火箭峰。前者用标本少，节省抗血清，但如适当增加标本及抗血清用量，不染色更为方便。所用琼脂糖应为标准电渗或低电渗的，凝胶中加入适量葡聚糖或聚乙二醇可使火箭峰更清晰。
⑤火箭峰的测量可以计算面积或峰高，面积是峰高乘以峰宽（峰半高处的宽度）。测量精度最好能达0.1mm。须用机械或电子放大设备。标准曲线范围内峰高以1～4cm为宜。
⑥本法适用于少量标本分析。也适用于apoAⅡ、CⅠ、CⅡ、CⅢ、D、E及Lp（a）测定。
正常值单向免扩散法：90～164mg/L。
临床意义升高：高脂血症。
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