标题：RNA剪接
概念
RNA剪接是真核细胞基因表达中非常重要的一个生物过程，通过RNA剪接，可以产生许多具有功能的，带有编码信息的mRNA，它对生物的发育及进化至关重要。所以RNA剪接识别是正确理解基因表达过程的重要一步，而剪接的识别的关键是依赖于剪接位点的判定，本文的工作即是针对剪接位点的正确识别进行研究。真核细胞pre-mRNA的剪接位点处存在一定的序列保守性，对于它所对应的cDNA序列而言，内含子5’端（供体位点）和3’端（受体位点）的碱基几乎都是GT和AG，因此称为GT-AG规则。[1]
RNA的剪接机制
RNA的剪接就是要把断裂基因的转录本中的内含子除去。酵母细胞核中400个tRNA基因中约有40个是断裂基因。这些基因均只有一个内含子，位于与反密码子的3'侧相隔一个核苷酸之处，长度为14至46bp。不同氨基酸的tRNA基因中的内含子不相同，因此，剪接酶类看来并不能识别任何共同顺序。所有内含子中均有一段与tRNA的反密码子互补的序列，因而使反密码臂的构象发生了改变，即反密码子被配对而使反密码臂伸长了很多。在前体中仅反密码臂受到影响，tRNA分子的其他部分仍保持其正常结构。
酵母tRNAphe中的内含子能与其反密码子碱基配对，从而改变了反密码臂的结构。此剪切过程可分为两个阶段。第一步是磷酸二酯键的断裂，这不需要ATP。这一步由一种内切核酸酶所催化。第二步是连接反应，需要ATP的存在，由RNA连接酶所催化。在无ATP时，产生的两个tRNA半分子不能连接起来。这两个半分子具有独特的末端:其5'端有OH基，而3'有一个2'，3'-环磷酸基。当加入ATP时，即发生第二步反应：两个tRNA半分子先发生碱基配对，形成成熟tRNA分子的构象，然后由RNA连接酶形成磷酸二酯键而将两个半分子共价连接起来。2'，3'-环磷酸基的存在并不限于酵母，在植物和哺乳动物的tRNA剪接反应中也有环状基团的产生。在人的HeLa细胞中，RNA连接酶能将带有2'，3'-环磷酸基的RNA和另一带有5'-OH基的RNA直接连接起来。酵母tRNA前体也可以在爪蟾的卵母细胞核提取液中正确地被剪接。这表示剪接反应没有种属特异性。爪蟾具有能识别酵母tRNA的内含子的酶类。自身剪接反应以前一直认为只有蛋白质有酶活性。这个概念在生物化学界已根深蒂固。然而近期发现RNA也可有酶活性。这种有酶活性的RNA有人称之为ribozyme。
一种四膜虫Tetrahumenathermophila的两个主要rRNAs的基因和其他真核生物相类似（见前文），被转录在同一个初级转录本中。此转录本称为35S前体RNA，较小的rRNA的序列在5'侧，较大的rRNA(26S)序列则在3'侧。在编码26SrRNA序列存在一个单一的，短的（约400bp)内含子。如将这个35S前体RNA在体外温育，可以发生自动剪接作用：内含子从前体中被切出，先呈线性RNA片段，后来又环化为环状RNA。这个反应仅需要加入一种一价阳离子，一种二价阳离子，和一种鸟嘌呤核苷酸（G)。其他碱基均不能代替G.但并不一定需要GTP;GDP;GMP和鸟苷都可以应用。这表示此反应并不需要能量供应。此外，此鸟嘌呤核苷酸必须有一个游离的3'-OH基。这个G要连接到内含子的5'端上（通过通常的磷酸二酯键）。当线性的内含子成为环状时，其3'端可连接在距离5'端15个核苷酸之处，从而将原来5'端和15个碱基的节段(包括G在内）排除出去。这种反应基本上是一种磷酸酯转移反应。外显子A的3'-OH基可直接和外显子B的5'端相连接。亦即一个磷酸酯可以直接被转移到另一个上去，不需要经过中间步骤（如水解作用之类），因此磷酸酯键的能量被保存着。这解释了为什么此反应不需要水解ATP或GTP来供应能量。同时，两次磷酸酯转移反应似乎是紧密相连的，因为始终没有找到过游离的外显子（A或B)。而线性内含子的环化则可以被看作是第三个磷酸酯转移反应。在体外系统中进行剪接时，并不需要蛋白质的存在。RNA有能力自行剪接，故称为自身催化作用（auto catalysis)。
T.Cech和S.Altman各自独立地发现RNA具有催化作用。从而改变了生物催化剂的传统概念。为此他们共同获得了1989年Nobel化学奖。1978年Altman从纯化的RNA酶P中分离出一种多肽和一种RNA(M1RNA)。最初的实验结果表明，蛋白质和M1RNA单独都没有酶活性，但二者混合在一起又可恢复活性。其它生物材料的实验结果表明M1RNA是RNA酶P活性所必须的。1983年Altoman证明，在较高浓度的Mg2+存在下，单独的M1RNA就可以催化tRNA前体的成熟，而单独的蛋白质则没有这种能力。这样，RNA即可看作是个酶。事实上，M1RNA的酶活性并不比RNA酶P的粗制品的活性低。原来认为蛋白质赋予酶的活性，RNA只起某种辅助作用（例如帮助蛋白质与其底物结合），但现在发现这两种功能已经倒转。Cech给具有催化活性的RNA定名为ribozyme。
很长时间以来，人们就试图自己设计和生产酶分子，但因蛋白质分子结构上的复杂性，迄今为止，尚无成功的例子。近年来随着ribozyme的发现，人工酶（新概念下的酶，它的构件分子是核苷酸）的设计又产生了新的希望。澳大利亚的科学家就设计了九个ribozyme分子，它们都具备内切酶的活性，且切割位点有高度特异性。同时，ribozyme的活性随pH、温度、及阳离子浓度的变化而变化，显示出典型的酶特性。由于ribozyme的作用位点高度特异，故可以用来切割特定的基因转录产物（RNA)。有人将这种切割作用叫做抗基因活性。因为切割的结果破坏了RNA，也就是抑制了基因的表达。这种特性为我们进行基因和病毒的治疗提供了一个可行的途径。
某些线粒体中的内含子也是自身剪接的内含子。一些常见的真菌，如粗糙脉孢菌（Neurosporacrassa)，酒酵母（Saccharomycescerevisiae)等的线粒体内含子都能进行自身剪接，像四膜虫中进行的磷酸酯转移反应一样。能编码蛋白质的内含子某些真菌线粒体中的内含子有很不寻常的结构，这些内含子有编码顺序，这些顺序的翻译对于该顺序所在的内含子的剪接是必须的。编码细胞色素b的box基因在仅剪去内含子1时，会产生RNA成熟酶的mRNA。当内含子2亦被剪去时，才是细胞色素b的编码顺序的开端。线粒体中的box基因是编码细胞色素b(cytb)的。box基因中的外显子1有417bp，编码cytb的N端139个密码子。内含子1有765bp，不编码。外显子2非常短，仅有5个密码子。其后是一个很长的内含子2。内含子2的特点是其开头840bp是一个开放读框（ORF)，有280个密码子，其最后一个密码子为终止密码子。当将内含子1剪去后，翻译即从外显子1起始，通读过外显子2而进入内含子2的ORF，产生一个有423个氨基酸残基的蛋白质（其中144个是cytb的N端氨基酸，279个则由内含子2编码，称为RNA成熟酶（maturase)。RNA成熟酶是特异地用来剪去内含子2的。这样，这个酶促反应便成为一个非常敏感的负反馈径路。去除内含子2后，外显子1和2即与外显子3相连接，因而破坏了编码成熟酶的顺序。细胞核中的剪接连接点剪接连接点（splicing junctions)是指在切断和重接位点处的两旁的顺序。在内含子左侧的连接点称为供体（donor)，在内含子右侧的称为受体（acceptor)。在细胞核的结构基因（即编码多肽的基因）中的所有内含子在外显子-内含子连接处均有GT．..AG的共同顺序。较详细的共同顺序如下，供体位点受体位点：
外显子...AG↓GTAAGT...内含子...Py10CAG↓...外显子
箭头表示切断的键。这些还是较短的共同顺序，存在于几乎所有的真核生物中。
从上述共同顺序可见供体和受体位点之间并无互补现象，所以不可能想像这两个位点会通过碱基配对而结合一起，以便于内含子的切除。正确的剪接并依赖于天然前体RNA分子的完整性。一个外源基因如果存在于病毒顺序中，仍能很好地被剪接。另外，前体RNA亦能在不同的组织，或甚至不同物种的细胞中被正确地剪接。这都表示剪接作用是很保守的。一个真正基因中一个外显子可以和另一个基因的外显子连接起来。例如，将SV40(猴病毒40)的早期转录单位的第一外显子和小鼠β珠蛋白的第三外显子相连，这样形成的杂交内含子仍能正确地被剪接。即SV40的内含子的供体位点（1I)可以剪接到小鼠β珠蛋白的内含子的受体位点（r2)上。套索的产生HeLa细胞的核提取液能够剪接纯化的RNA前体，这表示剪接作用并不与转录作用相关连。RNA的修饰也和剪接无关，例如珠蛋白RNAs即使缺少poly(A)尾链，也没有加帽，仍能正常地被剪接。剪接过程可分为两个阶段，与上文所述自身剪接不需能量不同，核内剪接需要用ATP。
在第一阶段中，内含子左端（供体位点）处被切断，形成两个分离的RNA分子，即左外显子和右内含子-外显子。左外显子此时为-线性分子，但右内含子-外显子则不然：内含子左端（5'端）以5'-2'键与在内含子右端上游约30碱基处的CTGAC序列（共同序列）中的A相连接，于是形成一个"套索"(lariat)"。在第二阶段，在受体位点处被切断而将此套索状的内含子剪去；同时分离的右外显子即与左外显子相连接。套索然后被"脱支（debranch)"而形成一线性内含子。在这种剪接机构中，有三个很短的共同顺序，即供体和受体位点处于一个和套索分支处的一个序列。用酵母做的实验证明：分支处的共同顺序如果发生突变或缺失将使剪接不能进行。这个共同顺序常称为TACTAAC盒。它和左侧的供体位点共同顺序互补，但研究证明两者并不发生碱基配对。在高等真核生物中此分支靶顺序的保守性较小。snRNAs的作用真核细胞有细胞核和细胞浆中都含有许多小RNA，它们约有100到300个碱基，每个细胞中可含有105-106个这种RNA分子。它们是由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ所合成的，其中某些像mRNA一样可被加帽。在细胞核中的小RNA称为snRNA，而在细胞浆中的称为scRNA。但在天然状态下它们均与蛋白质相结合，故分别称为snRNP和scRNP。某些snRNPs和剪接作用有密切关系。有些snRNPs分别和供体及受体剪接位点以及分支顺序相互补。snRNAs中最受注意的一个是U1，它普遍存在于哺乳动物、鸟类和昆虫细胞中。人U1snRNP中除RNA外还8个蛋白质分子。人U1snRNA的可能二级结构如图。其5'端的11个核苷酸是单链的，并有一段和内含子左侧的供体序列互补。在供体位点处的互补序列通常为4-6bp。在体外，完整的U1snRNP粒子能和左侧共同顺序结合，但纯化的U1snRNA却不能。U1snRNA参与剪接的证据是抗U1snRNP的抗体可以在体外抑制剪接作用；而且如果从系统中将U1snRNP除去，剪接即不能进行。事实上，除去U1sn RNA5'端的几个核苷酸即可抑制体外剪接作用。
有可能U5snRNA能识别右侧（受体位点）共同顺序；而U2snRNA，则具有与分支位点互补的顺序。抗U2snRNP的抗体可以和U2snRNA及包括分支位点在内的内含子所形成的复合体发生免疫沉淀。U1和U2可能参与剪接反应的起始阶段，因为U1和U2的灭活将阻止左侧连接点的切断和套索的形成。另外两个snRNAsns(U4和U6)可能亦参与剪接作用，但它们的功能尚不详。一般认为，脊椎动物细胞有6种不同的snRNAs，称为U1、U2、U3、U4、U5和U6。最小的是U6，有约100核苷酸长。最大的是U3，也不过215核苷酸长。它们和蛋白质结合成snRNPs。系统性红斑狼疮（SLE)患者和某些风湿病患者的血清中常可检出对snRNPs中某些蛋白质的自身抗抗体。核内不均一RNA编码蛋白质的结构基因是在核浆中被转录的。但是核浆中的RNA却并不像mRNA。核浆RNA要大得多，很不稳定，并且其顺序的复杂性也要大得多。由于它的大小很不一致，故称核内不均一RNA(hnRNA)。已经证明mRNA确实是从hnRNA生成的。细胞浆内的mRNA平均只有1800-2000个碱基。而哺乳动物的hnRNA平均有8000-10000个碱基，其范围很广泛，从2000-14000碱基均有，所以一般要比mRNA大4-5倍。如果以5倍计算，由于正常哺乳动物细胞中测得mRNA仅占hnRNA量的5%，则相当于有25%的hnRNA可转变为mRNA。这意味着有3/4的hnRNA即在核内降解。hnRNA被切除内含子后即成为mRNA，并进入细胞浆内。但在切除内含子之前，hnRNA可先加帽和加poly(A)尾链。有一种称为poly(A)聚合酶的酶可以用ATP为底物，以加上poly(A)尾链，这是hnRNA转变为成熟的mRNA所必须的。在哺乳动物细胞中，仅约30%的hnRNA被多聚腺苷酸化，而mRNA中却约70%是有poly(A)尾链的。可能多聚腺苷酸化是hnRNA分子要被加工的信号。hnRNA的尾端要被切去一段，然后才加上poly(A)。因为RNA聚合酶在转录时即已通过了相当于加上poly(A)的位点，故hnRNA尾端的多余部分要由内切核酸酶切去，才能加上poly(A)。
RNA的编辑
RNA的编辑是某些RNA，特别是mRNA前体的一种加工方式，如插入、删除或取代一些核苷酸残基。介导RNA编辑的机制有两种：一 特异性脱氨基作用比如：哺乳动物的载脂蛋白mRNA的编辑 其蛋白编码区的DNA序列在所有组织中都一样；在肝脏中该基因转录为完整的蛋白质，而在肠中合成的Pr长度只有其一半（只是全长载脂蛋白的N端），是由于2153位上的密码子从CAA突变为UAA（使编码谷氨酰胺的密码子变为终止密码子）。还有一个例子 大鼠脑中的谷氨酸受体蛋白mRNA经编辑后，分子中有多个编码谷氨酸的密码子变成了在控制通过神经递质的离子流过程中又主要作用的精氨酸，表明RNA的编辑可能是充分发挥生理功能必需的。
以上两种情况分别由胞嘧啶和腺嘌呤脱氨酶所催化；通常情况下该酶促反应的特异性不强，腺嘌呤脱氨酶可作用于双链RNA区的任何腺苷酸残基；但是，RNA的编辑发生在带有具催化作用的脱氨酶亚基的复合体中，有附加的RNA结合区能帮助识别所编辑的特异性靶位点。二 尿嘧啶插入或删除指导RNA：特异性插入这些残基的信息来自因为它含有与编辑后mRNA互补的核苷酸序列，指导RNA与被编辑区及周围部分核酸序列虽然有相当程度的互补性，但该RNA上存在一些未能配对的腺嘌lin，形成缺口为插入尿嘧啶提供了模板。
RNA编辑具有重要的生物学意义：
校正作用；调控翻译；扩充遗传信息[2]
RNA的再编码
mRNA在某些情况下不是以固定的方式翻译，而可以改变原来的编码信息，以不同的方式进行编码 包括：+1/-1移位；核糖体跳跃[2]
RNA的化学修饰
六大类化学修饰：甲基化；去氨基化，硫代（S代替碱基的O分子），碱基的同分异构化（尿嘧啶变构生成假尿嘧啶）；二价键的饱和化；核苷酸的替代（用不常见的核苷酸替换常见的核苷酸） 核酶
核酶（ribozyme）是指一类具有催化功能的RNA分子，通过催化靶位点RNA链中磷酸二酯键的断裂，特异性地剪切底物RNA分子，从而阻断基因的表达.
核酶的催化功能与其空间结构有密切关系，目前已知有多种特殊结构的核酶：
RNaseP的RNA碱基（M1 RNA）、锤头型、发夹型丁型肝炎病毒RNA、1类内含子和2类内含子，大多有hammerhead structure。
不同的核酶可分为两类：
1 剪切型核酶：只剪不接，如M1 RNA
2 剪接型核酶：该酶具有序列特异的内切核酸酶、RNA连接酶等多种酶活性，如1类和2类内含子[2]
RNA剪接和基因沉默之间的联系
为了识别在RNA干涉(RNAi)和微RNA介导的基因表达调控中所涉及的因素，Gary Ruvkun及其同事对86种真核生物进行了系统发生分析，所得到的候选物再用转录和蛋白组相互作用数据进行Bayesian分析，来估计它们参与小RNA调控的概率。所识别出的小RNA辅因子中大约一半是RNAi沉默所必需的，其他当中的很多参与剪接，说明在这两个过程之间存在一个联系。[3]