标题：显微摄影
简介
  从视神经中伸出的血管显微摄影显微摄影，教学和科技影片常采用的摄影方法。即连接显微镜与摄影装置，使通过显微镜观察到的物象记录于感光胶片上，从而获得镜头画面的摄影方法。它是揭示肉眼看不见的微观世界的技术手段。用显微摄影能记录如细菌繁殖、成长等活动过程，从而使人们能真切地认识各种微观现象。 
为求得高分辨率的显微影像，须选用复消色差物镜与摄影专用目镜或平周目镜配合。显微摄影的照明方法，分为透射照明、落射照明（垂直照明）和明视野与暗视野照明。同时还应注意各种滤色片的选用。
显微摄影是把显微镜的物镜和目镜所组成的光学成像系统作为照相机的镜头去拍摄一般用肉眼无法看清的标本。这种对微小物体“放大录像”，可直接为教学，科研提供方便。根据显微镜的结构可知：当被观察的标本放在物镜前焦点稍外一点的位置时，将在目镜前焦点内侧且靠近焦点的位置处形成一个放大倒立的实像，这时再通过目镜（这时的作用象普通放大镜）就可看到一个放大倒立的虚像。
如果调节物镜成像的位置（可使标本适当远离物镜或升高目镜，即增大目镜与物镜间的距离，使中间成像介于目镜的一倍焦距与两倍焦距之间），使物镜所成的像位于目镜前焦点的外侧，此像再经过目镜放大，即可在目镜的另一侧得到一个经二次放大的正立实像，当光源足够强时，此像可使底片或相纸感光，或者使数码相机、摄像机的CCD光电元件感光成像，这就是显微摄影的原理。
操作方法
  耳毛细胞显微摄影要获得一张好的显微摄影照片，必须注意满足以下几个条件：1制作清晰的标本片，其中组织切片应厚薄适度，染色片不应有多余的染料等。2选择性能优良干净的载玻片和盖玻片。3使用高性能的物镜（最好用复消色差的平场物镜）和聚光器。4采用Kohler照明法。5选择好合适的拍摄胶片。⑥拍摄时应准确地聚焦和选择合理的曝光时间。⑦正确的冲印方法。
下面以日本Olympus PM-10AD全自动显微摄影装置为例来介绍具体的操作步骤。
（1） 装配
Olympus PM-10AD显微摄影系统的装配图。
加选择135相机拍摄时，首先应将适配器PM-PBS的上部装上135照相机，前端装上聚焦用望远镜PM-VTM。然后在显微镜的直筒部分加上适当倍数的NFK摄影目镜（如3.3x），并将上述PM-PBS安装在该目镜上。最后应将PM-PBS与自动曝光控制器PM—CBAD之间的连接线装好并分别将显微镜和PM-CBAD的电源接通，并注意检查电压选择范围是否与所用电源相匹配。
（2）用前检查
在开启显微镜和曝光控制器电源后，在安装胶卷前，应按以下方法先检查该装置的工作是否正常。其方法是：先将曝光装置PM-PBS上的光路控制拉杆向外拉出—个位置（绿色环）并把曝光控制器PM—CBAD上的曝光方式调至“AUT0”位，ASA速度至所用胶卷的感光速度ASA数值，这时再按下法检查：
1）曝光控制器上的“SAFETY”绿色指示灯应亮。
2）轻按快门按钮时，“WORK”灯应亮。
3）当快门关闭时，“WORK”灯应熄灭，并同时可见“WINDING”灯亮和听见卷片的马达声。
（3）胶卷的安装
  肺癌细胞显微摄影操作时一般不取下相机，直接在本装置上装片或退片。正确的装片方法如下：
1）将倒片钮向外拉出，后盖即打开。 将135胶片放入倒片钮下方的片槽内然后让倒片钮复位。
2）将片头插入卷片轴缝隙中，注意不要让片尖从袖缝的另一端伸出。按控制器上的进片按钮（TIME OFF／WINDING）拖片直至使胶片两端的片孔全部嵌入卷片齿轮中为止。
3）将后盖重新盖好，再按进片钮拖片2-3次，直至计数器上显示出“1”为止。
4）为避免忘记所用的胶片类型，最好将包装盒的一角撕下，插入后盖外部的插片腔中。
（4）退片
当胶卷全部拍摄完毕之后，控制器上的“FILM END”灯将点亮并出现报警
铃声。在取下相机或直接倒片后按“TIME OFF”钮可使报警声停止。
1）将相机上的退片钮反时针旋转90。
2）向外拉出退片手柄，顺时针方向将胶片倒入暗盒，至拉力突然降低
转无阻力时则表明胶片已全部倒入暗盒。此时即可开盖取出已拍完的胶卷。
3）退片手柄在胶片完全退回后将自行复位。
（5）黑白显微摄影
  肺气泡显微摄影先将拍摄标本准确聚焦，并用调焦望远镜选好待拍标本区。拍摄步骤如下：
1）将“MODE／EXPOSURE TIME”调至“AUTO”；按下“FORMAT”选择键中的“35”；把“ASA”调至所用胶片的感光速度ASA值；将“RE-CIPROCITY，调至胶片的相应数值（可参见控制器底部的塑料说明板，除特殊要求外，通常应放在”4“位上）。
2）检查SAFETY指示灯是否为绿色，若为红灯应作以下检查：A.若红灯
闪现并同时有报警声，说明曝光过度，应用中性滤光片降低照明亮度，一般不宜
采用降低电压以减小照明亮度的方法。B.若红灯连续亮则表明曝光不足，应增
加亮度。
3）将”EXPOSURE ADJ“调至适当值。一般用明视野照明而样品又均匀分布时，应调至（1）；若样品分布不均匀或用其他方式照明时则应进行适当的调整：
4）拉下控制器上的曝光钮，”WORK“灯将随着曝光而开启，曝光结束”WORK“灯灯灭，胶片将自动驱进一个片位。
（6）135彩色胶卷显微摄影
  红血球显微摄影进行彩色摄影的基本方法除色温调节外，其余均与黑白显微摄影相同。下面仅介绍调温法；
1）将色温检测器PM-CTR安装么自动曝光器PM-PBS的左侧。
2）将标本片聚焦后让视野移至无样品的地方。
3）将光路控制拉杆移至最外部（黄色带）；把色温调节旋至”D“（日光型胶卷）或”T“（灯光型胶卷）。
4）在显微镜上加LBT（灯光型胶卷）或LBD-2（日光型胶卷）滤光片，调节显微镜的亮度使色温调节器上的指示灯亮至A处（黄色）；若A处以上的绿灯亮表明色温过高；A处以下的红灯亮时表明色温过低。
5）将光路控制杆向内推一步至绿环处，这时即可按上述黑白胶片的方法进
行显微摄影。
（7）手动显微摄影
在持殊情况下常常需要人为地改变曝光条件以求得更好的摄影效果经验的操作者也可以选择手动进行显微摄影，其方法如下：
1）用”MODE／EXP0SURE TIME“钮自行选择曝光时间（可从1s-40min）。
2）按快门钮，这时的快门将按设定的时间曝光。
3）若需要曝光时间超过40m可将”MODE钮旋至T再按下快门钮，快门将一直开启，直至按动“TIME OFF／WINDING”钮。
（8）自动曝光锁定装置的应用
  开叉头发显微摄影在对同一标本片的不同位置或不同成分进行摄影时，常常要采用相同的曝光
时间，这时可按下“AE LOCK”键。在此后的拍摄中将维持相同的曝光时间，“TIME RECALL”灯将闪亮，直至“AE LOCK”键被重新按动后才被解除。
（9）多次重复曝光：其操作如下：
A.先将“ASA”钮旋至8倍于胶片ASA值处（如将100ASA胶卷旋至800处）。
B.将“FORMAT” 选择的“L” 键按下，这时就能对同一底片进行多次曝光。
C.结束后按下“35”键和“WINDING键，胶片将自动前进一个片位。
曝光控制
  普尔基涅神经元显微摄影虽然现在的相机均有自动测光或自动曝光功能，但是如果一个视野中亮处面积超过二分之一，则易出现曝光不足的现象，所以如果标本主体小，又处在亮背景中，就要适当增加曝光时间。
在控制曝光时，要注意以下因素：
光源强度的影响： 由于电压的变化，光源亮度可能产生5-10倍的变化。 光源的距离及对标本的照射面积。 光源的波长及色温。 光源的波长长、色温低，色光偏红时，曝光时间要长些。光波短，色温高，色光偏青时，曝光时间要短些。 电压的波动会引起曝光量的改变，所以摄制过程中要保持电压的相对稳定。 聚光器的位置经过实验固定后不宜改动。 使用滤色镜、乳白玻璃、偏振镜等都要按其曝光指数增加曝光时间（手动曝光）。 目镜的放大倍率。 以×5倍的目镜作曝光基准1时，×10倍目镜要4倍的曝光量，×15倍目镜要增至9倍的曝光。 物镜的倍率和N·A值： 如果把×10倍的目镜作为1时，×40倍目镜要2.5倍的曝光，×100倍的物镜要4倍的曝光。 从目镜出射点到感光片的距离 标本的染色也会对曝光产生影响 标本与目镜间的介质折射率大、曝光时间短，反之，曝光时间长。曝光时间与折射率成反比。 聚光镜的光阑孔径变化能使曝光产生2～20倍的变化。
反差控制
  舌头上的味蕾显微摄影光学显微摄影的反差强一些为好，影响反差的因素有以下五个方面：
标本本身对反差的影响
标本切片厚会产生光的折反射，同时细部结构产生重叠。
标本新鲜、色彩鲜艳反差强。
标本载物片厚或盖片厚、有色、有水纹都会降低反差。
照明对反差的影响： 照明应适中，否则会降低反差，太亮会冲击标本细部结构，太暗会使光路中的脏物呈现在影屏上。
光束直径与视场直径一致时反差强，光束直径大于视场直径就会降低反差。
集光器与虹彩对反差的影响： 集光器过低、虹彩与光栏小，都会降低反差，所以要依具体情况升降集光器或开放虹彩。虹彩光阑的直径必须与物镜口径一致。
滤色片对反差的影响： 用补色滤色片反差强，用统一色滤色片反差弱。
  带有冠细胞的人类卵子显微摄影光学显微摄影的反差虽然是大些为好，但也要适当处理，不然反差过大就会损失细部结构， 同时也会影响分辨率，同样不能得到完美的效果。
附：光学显微镜的构造、成像和性能
现代光学显微镜，基于不同用途、种类繁多，如有生物显微镜、金相显微镜，解剖显微镜 等，但基本结构仍为光学和机械两个部分。
单式光学显微镜（通常用的放大镜、解剖镜等）光学结构简单、放大倍数小、光行差明显， 不宜进行显微摄影，在这里就不作介绍了。
复式显微镜光学系统比较完善、机械装置比较复杂，适合于显微工作的开展：
1.显微镜的成像
显微镜的成象光路：
它通过目镜、物镜等光学器件构成放大光路，而使所得虚像A”B“的距离恰好等于人眼的鸣视距离——250毫米，以获得将标本放大10～200倍的可见影像。
2.光学显微镜的基本结构
光学显微镜的基本构造分为两部分。一部分是光学系统，如接目镜、接物镜、聚光器、光源等，另一部分是机械系统，如镜脚、镜臂、镜筒、载物台、物镜转换器、大小螺旋、推进器等。
（1）接物镜
  卵子表面的精子显微摄影接物镜是光学显微镜的关键部件，整个显微镜系统的成像质量与分辨率都由接物镜决定。它 由一组精密的透镜组成，其作用是将检视标本做第一次放大。显微接物镜生产时做过各种像 差校正，它有一个光阑——孔径光阑，可以控制入射光束的直径，其作用是减小或扩大视场 而不改变像的明亮度。[1]
接物镜有不同倍率其中干燥系用在正常情况下观察。水浸系或油浸系在观察时要 在接物镜口与标本结合处点水或点油。
由于接物镜的成像质量影响摄影效果和观察效果，所以接物镜也是显微摄影的重要组成部分 。
接物镜有三个主要参数——数值孔径N·A值、放大率和盖片厚度。它们都标在镜头壳上。
①N·A值
数值孔径N·A是标志物镜工作性能的重要参数，它决定了物镜的分辨率。N·A=n·sinθ  式中n为介质折射系数，Q为入射角。
表明了物镜数值孔径与介质折射系数、入射角的关系。理论上的最大入射角为180°， 它的一半（90°）的正弦等于1，而空气的折射系数为1.0，水的折射系数为1.33，松节油的折射系数为1.5，所以在同样入射角情况下液浸物镜数值孔径比干燥物镜的大，因此分辨能力也大得多。
N·A值越大，分辨率越大，N·A值越小，景深与焦深越长。
N·A值尚与镜口角有关，镜口角越大，进光量越大，所视像野中的影像越清楚，分辨率就越 大。反之，分辨率就小以致看不清楚。由于低倍物镜的镜口角小于高倍物镜的镜口角， 所以低倍物镜的分辨率就不如高倍物镜的分辨率大。（这是指干燥系而言，油浸系物镜有介 质的折射率，可提高分辨率。
分辨率还受照明强度及光源波长的影响，在一定范围内，照明强度大，分辨力就大。
②放大率
放大率是指检视的放大倍率（即虚像放大倍率），倍率越大，工作距离越近。对每个具体物 镜来讲，它的放大倍率是不变的，工作距离也是不变的。如果采用10×目镜、40×物镜，观 察时放大了400倍，但对显微摄影来讲，由于要增加目镜到 感光片的这段距离就不是400倍了，有些显微摄影的摄影倍率是显微镜放大倍率的1/2。
③对盖片厚度的要求
显微镜对盖片的厚度要求为抽筒的1/100,达0.16～0.17毫米，每差±0.01毫米抽筒则必须相 应改动10毫米，否则其放大倍率就不是标示的倍率了。
油浸镜是借点油的折射率来提高视野的亮度和分辨率。点油后使接物镜 与标本构成一个光具组。
常用于油浸镜的点油及折射率为：
洋杉木油1.51
檀香木油1.51
甘油1.46
树胶1.52
苏合香1.58
折射率越大呈像亮度越强，分辨率也就越大。
（2）接目镜
接目镜主要有以下两个作用一是将物镜送来的初级放大影像再作第二次放大。
二是矫正接物镜成像中的相差、色差和照度。 接目镜的放大率一般从×4～×25，其镜筒长的放大倍率大，反之，放大倍率则小。
眼点是目镜的一个主要参数，在显微摄影中为尤重要。眼点即显微镜对清焦点后在目镜上形 成的出射点。一般眼点距离目镜0.5厘米左右，放大倍率越大，这段距离越短，放大倍率越 小，这段距离越长。目视时，瞳孔恰与此点相接，用带镜 头的照相机摄影时，镜头的前片透镜表面要与此点相接，用不带镜头的摄影装置拍摄时，要 从眼点计算所加近摄装置（伸缩皮腔形式或近摄接圈）的伸长尺寸，以计算实际倍率。
（3）聚光器
显微镜的聚光器有明视野聚光器、暗视野聚光器和特殊用途聚光器（如偏振光、相位差等等 ）。
①明视野聚光器
明视野聚光器由集光器、虹彩、滤色镜环和反射镜四个部分组成。
其中集光镜由两个或两个以上透镜组成，象一个简单的照相机镜头，它的数值孔径（N·A） 值为1.20～1.40左右。它的主要作用是提高象野的亮度和提高接物镜对标本的分辨率。
②虹彩
结构像照相机的光圈，它不但可以调节照明强度，同时还具有改变分辨率和反差的作用，即 ：虹彩开大，分辨力高，反差弱，虹彩缩小则相反。滤色镜环用来放置滤色片或毛玻璃，可 用来改变光色或亮度。
反光镜分为平凹两面，并要使光束正好对准反光镜中央。
③暗视野聚光器的视野背景是暗的，被摄体是发光的或明亮的。
暗视野聚光器通常用于拍摄极微小的物体，如化学明胶、梅毒螺旋体或明视野看不见、看不 清没有染色的标本。它也常常用于荧光显微摄影。 使用暗视野聚光器拍摄时光源亮度要强些，不能使用滤色镜。为防止外来光线干扰，暗视野 显微摄影最好在暗室中进行。
3.光学显微镜的主要性能
光学显微镜的主要性能从两方面体现，即放大倍率和分辨率。
（1）放大倍率
理论上讲，光学显微镜的放大倍率在镜筒长度为16～17厘米时为物镜×目镜倍率，但是我们 要 将实物看清，不仅仅是要将其放大，更主要的是分辨出它的细部形态，所以放大倍率要与物 镜、分辨率同时考虑。如，同样是放大200倍的显微镜目镜与物镜，可以有三种组合方式，4 0×5、20×10、10×20，但是三种组合形式的分辨率、焦点深度与成像面的亮度、拍摄时需 要使用的快门速度有很大差别。
物镜 （1） 20×10 （2） 41×5 （3） 10×20
物镜的数值孔经 分辨能力 焦点深度 焦平面亮度比 照相快门速度 0.40 0.70? 1.25? 1.0 1/30秒 0.65 0.43? 0.77? 0.8 1/200秒 0.25 1.1? 2.0? 0.4 1/40秒
在显微摄影中，其放大倍率与出射点至感光片的距离有关，所以显微摄影的放大 倍率的计算公式为M=物镜倍率×目镜倍率×目镜出射点至底片的距离/250毫米。这个公式说 明，只有当目镜出射 点至感光片的距离为250毫米时，显微摄影的放大倍率才等于物镜倍率×目镜倍率，若将目 镜 出射点到感光片的距离加大，其放大倍率也随着加大，但这只是形态增大而分辨率不变。将 底片用来放大照片时也只是形态的放大，而不增加分辨率。
感光材料
一般为溴化银乳剂，将其涂在胶片上就成为胶卷（底片），如果将其涂在纸上就成为感光纸，曝光时在光的作用下部分溴化银粒子被还原成金属银而形成潜像，这就是拍照过程。再经过显影液的作用，潜像就变成黑色金属银留在乳剂中，金属银还原的多少即黑度的深浅与曝光时间的长短和光的强弱及波长有关，再经过定影液作用，将未还原的溴化银熔解在定影液中，底片该处就呈透明，这时底片呈现与实物相反的影像，叫做负片。用印相纸复印，就能得到平常所见的照片，（复印是将印相纸的药膜面和底片的药膜面紧贴后曝光，再经显影、定影处理后即得照片）。
实用显微摄影的方法主要有三种（注：不包括本实验所用的相纸感光）：
第一种方法是利用传统的菲林相机，让被摄物体成像于黑白或彩色胶片上，制成负片，再把它冲印放大成照片（正片），以便观察研究和永久保存。或者让被拍摄物体成像于反转片上，直接制成正片，用于幻灯投影。要求不高时也可直接成像于相纸上，成为一负片，并不影响相片的分辨率。本物理实验室为本、专科学生提供这一显微摄影广方法。
第二种方法是利用数码相机，通过专用接筒或外接专用镜头，把被摄物体成像于数码相机的内存中。成为一个压缩的JPEG文件，传输到计算机中，再利用图像显示软件把图像显示于监视器上，或者直接通过打印机输出相片来。也可把图像存贮于媒介上，如软盘、闪存盘、光盘等，再通过数码冲印商店，冲印出数码相片。由于目前市场上大多数数码相机都是不可变换镜头的相机（除了个别昂贵的专用数码相机，如Nikon的Ｄ1型相机外），所以显微镜不设连接数码相机的卡口，而通过加设一镜头接筒的方法，再连接某些特殊镜头结构的数码相机，如本实验采用的Nikon Coolpix 4500型数码相机。
第三种方法，则是在显微镜上加接专用连接镜头，接上CCD摄录镜头，再把动态的图像传送到计算机，通过软件在显示器上表现出动态图像来，可把Video图像存储成某种格式的文件，如avi、mpeg或mov等。也可把瞬间的影像保存到计算机中，成为储存器上的一静态图像的文件，如bmp、tif或jpg等，与数码相机所获得的图像相似。这种方法的优点是能够获得动态图像，在视觉效果上更生动、更胜一筹。不过其静态图像的分辩率一般只能用于电视机或显示器上的显示，并不适合于打印输出和印刷等领域。