标题：植物细胞培养反应器
概述
出现了许多有别于传统微生物反应器的植物细胞培养反应器并在不断完善。用于植物细胞培养的反应器主要有搅拌式、非搅拌式及其改进型反应器，另外还有植物细胞固定化反应器和膜反应器等。
类型及其特点
植物细胞培养具有周期长、细胞抗剪切能力弱、易团聚等特点。同时，植物细胞规模培养的目的是生产天然产物，而这些天然产物均为细胞生长代谢物。所以，植物细胞培养反应器的设计，不仅要考虑有利于细胞生长，同时还要考虑有利于产物的积累和分离。总体上讲，适合植物细胞的反应器应该具有适宜的氧传递、良好的流动  植物细胞培养反应器性和较低的剪切力。根据不同植物细胞生长和代谢产物积累的特点，目前已研究设计出多种类型的反应器用于植物细胞培养。
反应器的选择取决于生产细胞的浓度、通气量以及所提供的营养成分的分散程度。根据通气和搅拌系统的类型可将生物反应器分为以下几类：
1　机械搅拌式生物反应器　　    机械搅拌式生物反应器有较大的操作范围，混合程度高，适应性广，在大规模生产中广泛使用。搅拌罐中产生的剪切力大，容易损伤细胞，直接影响细胞的生长和代谢，特别对于次级产物生成影响极大。搅拌转速越高，产生剪切力越大，对植物细胞伤害越大。对于有些对剪切力敏感的细胞，传统的机械搅拌罐不适用。为此，对搅拌罐进行了改进，包括改变搅拌形式、叶轮结构与类型、空气分布器等，力求减少产生的剪切力，同时满足供氧与混合的要求。
Kaman等采用带有1个双螺旋带状叶轮(helicalribbonimpeller)和3个表面挡板的搅拌罐，证明适于剪切力敏感的高密度细胞培养。Jolicoeur等进行了类似的研究，在反应器中得到与摇瓶相同的高浓度生物量。钟建江等通过培养紫苏细胞进行比较，发现带以微孔金属丝网作为空气分布器的三叶螺旋桨反应器(MRP)能提供较小的剪切力和良好的供氧及混合状态，优于六平叶涡轮桨反应器，并认为在高浓度细胞培养时，MRP型反应器将显示更大的优越性。离心式叶轮反应器(centrifugalimpellerbioreactor)与细胞升式反应器(cell-liftbioreactor)相比具有较高升液能力，较低剪切力，较短混合时间，在高浓度下具有高得多的溶解氧系数，表明有用于剪切力敏感的生物系统的巨大潜力。另有方框型桨式搅拌、蝶型涡轮搅拌等不同形式的机械搅拌罐用于植物细胞培养的生产和研究，结果证明不同叶轮产生剪切力大小顺序为涡轮状叶轮>平叶轮>螺旋状叶轮。一种升流式生物反应器(lift-streambioreactor)利用罐中心一根连有多孔板的杆上下移动达到搅拌的目的，可用于培养剪切力敏感细胞。2　非搅拌式生物反应器相对于传统搅拌式反应器，非搅拌式反应器所产生的剪切力较小，结构简单，因此被认为适合植物细胞培养，其主要类型有鼓泡式反应器、气升式反应器和转鼓式反应器等。
通过对培养紫苏细胞的生物反应器比较发现鼓泡式反应器优于机械搅拌式反应器。但由于鼓泡式反应器对氧的利用率较低，如果用较大通气量，则产生的剪切力会损伤细胞。研究表明，喷大气泡时，湍流剪切力是抑制细胞生长和损害细胞的重要原因。较大气泡或较高气速导致较高剪切力，从而对植物细胞有害。
气升式反应器广泛应用于植物细胞培养的研究和生产。通过胡萝卜细胞培养研究发现，比较搅拌罐、气体喷射罐和带通气管的气升式反应器，最高细胞浓度和最短倍增时间可从气升罐中得到。气升式反应器用于多种植物细胞悬浮培养或固定化细胞培养，但其操作弹性较小，低气速时，尤其H/D大，高密度培养时，混合性能欠佳。过量供气，过高的氧浓度反而会影响细胞的生长和次生代谢产物的合成。将气升式发酵罐与慢速搅拌结合使用可弥补低气速时混合性差的弱点，采用分段的气升管，也有利于氧的利用与混合。
转鼓式反应器用于烟草细胞悬浮培养的研究发现，与有一个通风管的气升式反应器相比，相同条件下转鼓式反应器中生长速率高，其氧的传递及剪切力对细胞的伤害水平方面均优于气升式反应器。3　光生物反应器许多植物细胞培养过程中需要光照，往往考虑在普通反应器基础上增加光照系统，但在实际中存在很多问题，如光源的安装、保护，光的传递，还有光照系统对反应器供气、混合的影响等。小规模实验往往采用外部光照，反应器表面有透明的照明区，光源固定在反应器外部周围。但大规模生产时透光窗的设置，内部培养物对光的均匀接受等问题难以解决，因此许多人对采用内部光源的反应器进行了研究。
Mori等发明的反应器将多个透明圆柱体平行安装在反应器罐内，光源放置在透明圆柱体中，供给CO2的气体交换器在罐内两个圆柱之间。Ogbonna等研制了一种用于大规模培养光合细胞的新型内部光照搅拌式光生物反应器，它由每个单元都包含光源的多个单元组成。大的光生物反应器通过增加单元数目得到。每个单元中心固定一个玻璃管，光源插入其中，由搅拌桨实现混合，该搅拌浆设计成旋转时不接触玻璃管，玻璃管同时作为挡板，该反应器在低转速下仍有较高混合程度，而且剪切力较小。由于发光体并非机械固定在反应器上，且通过玻璃管与发酵液分离，因此反应器可高压灭菌，而发光体在冷却后插入玻璃管。Yamamurak等研究固定CO2的光反应器，特别之处在于搅拌器具有发光作用。
其他新型反应器　　
根据植物细胞的特性，许多有别于传统微生物反应器的新型反应器正用于植物细胞的研究生产，如各种固定化植物细胞反应器和膜反应器等。Dubuis等用新型环回式流化床反应器(loopfluidizedbedreactor)进行coffeaarabica培养，测定了生长和产物合成的动力学参数，认为该反应器操作方便，消除了气体直接喷射引起的剪切力，易于测定放大所需的参数，适合中试和工业化生产。Nagai等用固定床反应器培养固定化烟草细胞，生长速率与摇瓶相同，胞内合成与摇瓶无明显区别。
Tyler等报道了一种植物细胞表面固定化培养系统，避免了传统搅拌罐悬浮培养中的流体流动力或剪切力问题，并促进植物细胞凝聚的特性，使次级代谢产物合成和积累增加，而且该系统培养基交换简单，次级产物提取容易。Lang也研究了植物细胞膜反应器，将细胞固定在膜上3mm厚一层，培养基在膜下封闭回路循环流动，营养透过膜扩散至细胞层，次级代谢物分泌透过膜扩散至培养基。
Humphrey对植物细胞培养微孔膜通气反应器进行了研究，分析了氧传递，为需要小剪切力的植物细胞培养的膜通气反应器提供设计依据，设计应考虑的因素包括管的长度、直径和膜厚度，进气的组成和压力，细胞生长培养阶段等。
条件
光照：离体培养的植物细胞对光照条件不甚严格，因为细胞生长所需要的物质主要是靠培养基供给的。但光照不但与光合作用有关，而且与细胞分化有关，例如光周期可对性细胞分化和开花调控作用，所以以获得植株为目的的早期植物细胞培养过程中，光照条件特别重要。以植物细胞离体培养方式获得重要物质，如药物的过程，植物细胞大多是在反应器中悬浮培养。激素：植物细胞的分裂和生长特别需要植物激素的调节，促进生长的生长素和促进细胞分裂的分裂素是最基本的激素。植物细胞的分裂，生长，分化和个体生长周期都有相应的激素参与调节。和动物细胞相比，植物细胞离体培养对激素要求的原理已经了解，其应用技术也已相当成熟，已经有一套广泛作为商品使用的培养液。同时解决了植物细胞对水、营养物、激素、渗透压、酸碱度、微量元素等的需求。
悬浮培养生物反应器
1机械搅拌生物反应器尽管机械搅拌反应器已成功用于许多细胞的培养中，反应器内的温度、pH、溶氧及营养物质浓度较其他反应器更易控制等优点，但由于机械搅拌造成的剪切力以对植物细胞造成较大的损伤，对次级代谢产物的合成也会产生影响，同时会带来染菌和机械上的问题，因此需筛选出抗剪切力的细胞系，也可对反应器结构进行改造，尤其是搅拌桨的结构和类型的改进，使其具有缓和、充分的搅拌效果。2非机械搅拌式反应器植物细胞的培养比较多地采用各种非机械搅拌生物反应器，其中常用的是气体搅拌生物反应器。气体搅拌生物反应器没有活动的搅拌装置，在很大程度上减少了剪切力，并能在长期操作中保持无菌。气体搅拌生物反应器包括鼓泡塔和气升式反应器等。气体搅拌生物反应器结构较简单，氧传递效率高，剪切力低，对细胞的损伤小，容易实现长期无菌培养，较适用于植物细胞培养。
缺点：操作弹性小，低气速时尤其在培养后期细胞密度较高时，混合效果较差。如果提高通气量，又会产生大量泡沫，也易于驱除培养液中的二氧化碳和乙烯，对细胞生长有阻碍作用。过高的溶氧对植物细胞合成次级代谢产物不利。
固定化细胞生物反应器
1填充床生物反应器细胞可以位于支撑物表面，也可包埋于支撑物之中，培养液流经支撑物颗粒，不断被细胞利用。优点：单位体积固定细胞量大。缺点：混合效果低，对必要的氧传递、pH、温度控制和气体产物的排除造成困难，影响细胞的培养。2流化床生物反应器利用液体的能量来悬浮颗粒。颗粒呈流化状态所需的能量与颗粒大小成正比，因此常采用小固定化颗粒，这些小颗粒良好的传质特性是流化床反应器的优点，缺点：剪切力和颗粒碰撞会损坏固定化细胞。3膜生物反应器采用具有一定孔径和选择透性的膜固定植物细胞。营养物质通过膜渗透到细胞中，细胞产生的次级代谢产物通过膜释放到培养液中。主要有：中空纤维反应器和螺线式卷绕反应器，优点：可以重复使用。
植物细胞反应器的选择和设计
植物细胞反应器的选择和设计需注意：
1氧的供给对于间歇培养，体积溶氧系数klα需要10-15h-1;
2剪切力反应器的剪切力尽可能小；
3细胞的黏附细胞培养过程容易黏附在反应器壁上，并产生大量的泡沫，导致细胞量和代谢产物减少，严重时培养过程被迫中止；
4细胞高密度培养时，混合情况变差，培养基中营养物质和氧的供给不足，细胞收率下降；
5温度、pH、营养物质的浓度须控制在合适的范围内。
指标及配置
罐体系统：罐盖和罐底采用SUS316L优质不锈钢，罐体采用耐高温硅硼玻璃，装液系数70%，工艺结构先进，操作简单。搅拌系统：采用上悬挂强磁力搅拌系统，无机械密封不易泄漏，底部无顶针，采用优质铝合金马达及进口调速器确保转速稳定；高性能搅拌桨、消泡桨，无级调速。罐内件全部安装在罐盖上，维护、清洗十分方便;发酵专用标准桨，桨片高度可调，亦可根据发酵工艺的特殊要求更换不同类型的搅拌桨。马达与罐体分离的设计使罐体重量大大减轻，操作更加轻松方便，节省了大量人力。磁力搅拌系统采用特殊永磁材料，特有加工工艺，永不褪磁，最高搅拌转速在发酵罐寿命期限内不会低于980rpm，在高粘度介质中亦可达到最高转速，全自动设定控制范围50~1000rpm±5rpm。通气控制：手动控制，流量计显示。包括转子流量计、进口滤膜空气除菌过滤器，过滤精度高达0.02μm温度控制：夹套水浴电加热，自动控制，温度控制冷却水温度+5℃~65℃±0.2℃泡沫控制：全自动PID测控与报警，蠕动泵自动添加消泡剂补料控制：PID全自动设定蠕动泵开关控制，自动流加并计量。pH控制：采用瑞士原装进口梅特勒电极（兼容高质量国产电极），蠕动泵自动添加酸、碱，精确控制pH，显示范围：0.00~14.00±0.01，全自动控制范围：2.00~12.00±0.05DO控制：采用瑞士原装进口梅特勒电极（兼容高质量国产电极），与转速（空气流量、补料等可选）关联控制，0-150±3%，显示精度0.1%压力控制：手动控制（自动控制可选），仪表显示控制系统：单罐可采用BIOTECH-2002生物过程控制器辅以BIOTECH-FCS发酵监控软件是您既能在现场实地观察发酵变化也可对发酵过程实施远程监控；若采用多联或多级发酵罐则可采用BIOTECH-3000生物过程控制器实现更多测控功能。（更多控制功能请参见相关生物过程控制器及发酵监控软件的介绍）可扩展功能:a空气流量、罐压、液位自动检测控制；b排气O2、CO2检测；c可增加两路补料；d可增加电子天平称重系统
技术
培养中的植物细胞特性植物细胞的大规模培养技术是在微生物生物反应器技术的基础上建立起来的，但是植物细胞培养过程的操作条件与微生物培养具有较大的差异。这些差异主要表现在：a、植物细胞的体积与微生物相比要大得多，其平均直径是微生物细胞的30-100倍。b、植物细胞很少单细胞的形式悬浮生长，通常是以直径2mm大小的多细胞团方式存在于培养系统中，由于组成细胞团的细胞数量差异，容易在培养系统中形成非均匀相的集合细胞团。c、植物细胞的纤维素细胞壁虽然使细胞具有很强的抗张强度，却使其抗剪切的能力相当弱。d、植物细胞生产速度慢，因此操作周期厂，因此，植物细胞培养中维持无菌环境的难度也较大。
植物小培养液的流变特性
产业特点
产值不大作用大生物反应器产业本身很难有每年达数十亿元的产值，但其在生物技术产业链中却起着再生产和扩大再生产的作用，达上百亿元以上。有时一个新的生物反应器技术的应用和推广，就可能促进某一生物技术产品的产业化形成，提高生产能力，或降低生产成本，可节约能耗达数十亿元之巨。产品多样性目前用于生产的细胞和生物材料有微生物、动植物细胞、藻类、各种酶类等。不同细胞或酶有不同特点，因而有不同生物反应器设计要求。
生物反应器种类有气升式反应器和机械搅拌反应器；常规反应器和光生物反应器；好氧和厌氧反应器；液体深层培养反应器和固体发酵反应器；根据不同机械结构划分的反应器；不同控制原理划分的反应器等。此外，生物反应的规模也可由几十毫升到上百M3不等。
很难规定几个通用产品进行大批量生产，大多数用户根据自己的研究或生产特点，提出不同的定货要求，反应器研制厂家必需有足够的技术力量和经验进行非定型化设计，以满足用户要求。
生物过程优化与放大技术具有先进的生物过程优化和放大能力是生物反应器设计的核心技术。由于在生物反应器中所发生的反应是在分子水平的遗传特性、细胞水平的代谢调节和反应器工程水平的混和传递等多尺度（水平）上发生的。因此，如何利用生物反应器中的多参数检测技术和在线计算机控制与数据处理技术，把细胞在反应器中各种表型数据与代谢调控有关的基因结构研究关联起来，是反应器过程优化与放大的重要内容，也是当前国内外竞相发展的具有原创性的知识产权技术，对促进生物技术产业化发展具有重要意义。由此可见，提供包含以上功能并具有自主知识产权的商品化生物反应器应是我国生物反应器产业的重点之一。生物技术发展要求性能更高的生物反应器为了适应各种生物技术的实验室成果向产业化转化的需要，对生物反应器的性能要求愈来愈高，目前主要表现为：
用于基因工程高密度高表达，符合GMP标准的生物反应器以及一些新技术的应用等。其中关于供氧问题，快速升温、SIP自动灭菌、CIP自动清洗、机械密封、排气处理、取样处理等问题以及培养液成份的流动注射分析（FIA）分析等都需很好解决。
哺乳类动物细胞大规模培养是当前生产高附加值的糖基化活性蛋白医药产品的重要发展趋势。根据动物细胞无细胞壁，对剪切极端敏感，在细胞生长控制上，要防止细胞分化和细胞凋亡，有时还要考虑对产品糖基化质量的要求。所以反应器要具备低剪切效应，混合性能好等特点，要提供细胞形态在线观察和活细胞数量的传感技术，严格控制反应器的操作条件以及有关防污染的灌注系统、取样系统等都需要研究解决。
用于细胞过程生理特性和过程传递特性研究的生物反应器研制，其中主要解决用于过程分析的各种传感器选型研制和数据处理软件包的研制。特别是近年来随着微生物基因组测序和系统生物学研究工作的深入展开，发酵过程检测与控测已经从基于参数传感技术的反馈控制发展为以信息处理为基础的生物过程检测与分析。各种谱分析与生物反应器实验数据关联起来，提供各种表型数据具有重要意义。因而对反应器设计提出了新的要求。
随着生物技术在各领域的推广应用，用于海洋藻类、微生物肥料、微生态饲料、环境污染处理等大规模细胞培养需要高强度低造价的生物反应器。特别是近年来利用生物质生产燃料乙醇等能源物质的战略部署，需要应用大型高效节能生物反应器降低生产成本。产品型号更新换代与部件技术研究生物反应器是多专业技术发展的综合体，由于反应器零部件技术的进步，必须及时更新产品设计，为用户提供性能更好且价格合理的反应器产品。这些零部件技术包括计算机软硬件技术、各种传感技术、反应器流型设计，新机械结构和材料等等。此外，随着信息处理技术的发展，如何实现大批量数据处理、贮存与通信，把生物信息学与过程信息结合起来实现复杂生物系统的分析与控制，也以软件包的形式逐渐从实验室研究走向商品化。产品生产的标准化、规范化作为商品化装置的市场化，建立生物反应器生产标准，实施IS09001管理是发展生物反应器产业的重要内容，只有这样才能提供合符用户要求及质量稳定的产品。主要内容有：
产品装置成套加工的工艺技术路线的确定与质量控制研究。在生物反应器制造过程中，如材料、焊接、表面处理、零部件机加工、外购件、易耗品…、直到安装流程工艺、器材仓库管理…等都要严格实施质量检验；
原材料、半成品、成品标准等的确立与实施。如有关传感器及一些如空气过滤器、阀件、质量流量计等关键部件的测试标准的建立与研究，整机性能测试标准的建立与研究；
产品质量过程控制程序的确立与实施等；整机性能测试标准的建立与研究。高品质的售后技术支持由于生物反应器中的反应是在基因、细胞和反应器工程水平上多尺度发生的，因而真正利用生物反应器实现过程优化是有难度的，从理论到实践的提高，并进一步在生物技术产品生产中发挥作用，需要有一个过程，应该把售前宣传和售后服务等与整体应用技术提高结合起来才能取得好的效果。
作用
许多实验证明，在植物细胞培养过程中，抑制细胞生长和损伤细胞的主要是剪切力，而不是氧供应不足，相反，过高的氧浓度往往抑制细胞生长和产物合成。提高混合程度，减低剪切力，是目前设计适于植物细胞培养反应器的主要原则，但如果能提高植物细胞对剪切力的耐受程度，将大大简化反应器的选择和设计问题。很多情况下，剪切力抑制产物的合成，但对生长影响不大，探讨其机理有助于采取相应措施解决。对于需要光照的细胞，还要考虑光源的设置、光传递及光的产热问题。       不同植物细胞的特性，如对剪切力的耐受性、结团情况、倍增时间、对氧和光的需求等各不相同，没有哪种反应器能满足所有植物细胞的要求，实验中应根据细胞特性采用合适的反应器，进一步研究各种植物细胞和不同反应器中流体力学的性质，可为选择和设计植物细胞培养反应器提供可靠的依据。