标题：变性梯度凝胶电泳系统
简介
英文缩写DGGE，这个方法是应用最早也是最常用的突变筛查方法之一,在过去的十年中经历了很大的改进,并被诊断室所广泛使用,最近有篇关于该问题的综述(Fodde>和 Losekoot 1994 年)。
原理
如果 DNA 双链分子全长不断增加温度或用化学变性剂处理,两条链就会开始分开(解链)。首先解链的区域由解链温度较低的碱基组成。 G.C 碱基对比 A.T 碱基对结合得要牢固,因此 G. C 含量高的区域具有较高的解链温度。同时影响解链温度的因素还有相邻碱基间的吸引力(称作“堆积”)。解链温度低的区域,通常位于端部称作低温解链区( lower melting domain )。如果端部分开,那么双螺旋就由未解链部分束在一起,这一区域便称作高温解链( high melting domain ) 。如果温度或变性剂浓度继续升高,两条链就会完全分开。变性梯度凝胶电泳法依据首要的一点是： DNA 双链末端一旦解链,其在凝胶中的电泳速度将会极剧下降。第二个根据是,如果某一区域首先解链,而与其仅有一个碱基之差的另一条链就会有不同的解链温度,因此,将样品加入含有变性剂梯度的凝胶进行电泳就可将二者分开。最终,如果一双链在其低温解链区碱基错配(异源双链),而与另一等同的双链相比差别仅在于此,那么,含有错配碱基的双链将在低得多的变性剂浓度下解链。事实上,样品通常含有突变、正常的同源双链以及配对的异源双链,后者是在 PCR 扩增加时产行的。而含有错配的双链通常可以远远地与两个同源双链分开,这种分离效果使该方法灵敏度很高。发展阶段主要事件变性梯度凝胶电泳的发展经过： 1979 电泳系统发明（ Fisher 和 Lerman）1979 年， 1983 分离仅有一个碱基之差的 DNA 双链 （Fisher 和 Lerman）1983 年， 1985 于基因组 DNA 中检测出一地中海贫血突变 （Myers 等） ；1985 年 使用异源双链技术（ Myers 等 ）；1985 年 ，首次使用“ GC 夹板”技术 （Myers 等）；1985 年 1987 预测解链行为及分析用计算机程序出现 （Lerman 和 Silverstein）；1987 年 ，1989 “ GC 夹板”技术与 PCR 技术相连接（ Sheffield 等） ，1989 年 ，非标记检测法问世 （Sheffield 等）其他改进1，在 PCR 反应过程中加入“ GC 夹板”( Top1992 年)，由一端进行 PCR 反应的引物有：带有 15bp 碱基接头的引物和由 15bp 接头和 35bp “ GC 夹板”构成的接头 / 夹式引物。当然这就要求一个用特定引物扩增,另一个用带有“夹板”的引物扩增,而且要用校读多聚酶( Proof reading polymerase )以防止引入人为突变，而不是应用含有“ GC 夹板”的特定引物,这一方法也有可能减少耗费。
2，去除“ GC 夹板”或用化学“夹板”代替可能都会使操作简便( Costes 等 1993 年 a ； Fernandez 等 1993 年)。此外,“ GC 夹板”由连接补骨脂的多个碱基 A 替代,经过扩增,它就会与新加上去的配对碱基 T 结合在一起,经光照射后与末端共价连接在一起。现已对此方法进行了深入的研究( Costes 等 1993 年 b )。 DNA 片段中特定突变通常会产生特定的异源双链和同源双链图,所以检测人员要能够区分所检测到的突变是否为以前所描述的突变。但是,两个或更多突变产生的双链图可能比较相像,所以要确定检测出的突变是否为新发现的突变,就可以通过再次分析前加入已知突变样品( Guldberg 和 Guttler1993 年)而予以解决。如果已知突变与所检测到的突变相同,那么就会产生复合双链图,这种方法可以不用进行序列分析而对突变做出鉴定。
3，Russ 和 Medjugorac(199 年 ) 报道用恒温平板代替了培养槽。
4，最后,从安全角度出发,Guldberg等人(1994年)介绍了一种方法,将甲酰胺从恒变性剂凝胶电泳中去掉,他们还推测可以将变性剂从变性梯度凝胶电泳中去掉。
优缺点
优点几乎可以检验出所有突变 ，可将突变分子完好无损地同野生型分子分开用于进一步的分析 ，无须标记 ，电泳前只需一步操作， 可用于未经扩增的基因组 DNA ，也可检测出象甲基化这样的 DNA 修饰，缺点需要专门设备 需要用计算机对序列进行分析,需要进行预实验 ，需要昂贵的“ GC 夹板”， 无法确定突变在 DNA 片段中位置， 需要用含有毒性物质甲酰胺的梯度凝胶 ，DNA 片段大小限制在 100-500bp 。
本方法的发展前景
1，由于 DGGE 法突变检出率高,所以该方法可能已被诊断室用了一段时间了,如果用不同的 DGGE 技术加上“ GC 夹板”方法在一块胶上可以筛查几千 bp 长的片段。按照筛查模式来讲,那将是比较理想的。从诊断角度考虑,理想的方法是在一块胶上筛查一位患者所有的外显子而不是对每一个外显子用不同的胶板。 Guldberg 和 Guttler(1994 年 ) 的“宽幅度”( broad range )凝脉电泳将来可能会受人青睐,但都可能使突变检出率有所损失,因此,“化学夹板”法可能会被广泛使用。
2，从两个方向上使用 DGGE 技术对于检查整个基因组( Uitterlinden 和 Vijg1994 年)和肿瘤诊断( Verwest 等 1994 年)可能会更加重要。同时,将 DGGE 法用于自动化测序仪也有可能。
主要应用
Fodde 和 Losekoot ( 1994 年)的综述给出了 DGGE 技术的大量应用。但,一些主要的应用在表 5 中给出。 DGGE 技术不仅可用于癌症和遗传病的筛查及诊断,而且,在癌症(残存性病灶、突变图谱研究等)突变定量实验中还用以检测少数突变等。  线粒体 ，DNA 筛查（ Yoon 等 1991 年）； 因子Ⅷ基因， 血友病 A 筛查（ Higuchi 等 1991 年）； APC FAP 筛查 （Fodde 等 1992 年） ；CFTR 胆囊纤维化 筛查（ Ferec 等 1992 年 ）；PAH 苯丙酮尿症 筛查 （Guldberg 等 1993 年）； c-Ki ras 密码子 12 (鼠) 定量，（ Soman 和 Wogan1993 年 ）；p53 急性白血病 筛查 （Pignon 等 1994 年） β血红蛋白基因， β地中海贫血诊断 （Dozy 和 Kan1994 年 ）；RBI 成视网膜细胞瘤筛查 （ Blanquet 等 1995 年） Hmshi HNPCC 筛查 16 个外显子 （Wijnen 等 1995 年）。
简要操作步骤
下面是用最常用的方法(即筛查外显子)分析 DNA 片段的操作梗概,其同时使用了“ GC 夹板”和异源双链技术。
步骤 1 仪器设备。已在很多场合下对此有所叙述(见下文),但也可以由研究者通过商业途径获得或自己制做。简要地讲,把凝胶灌到盒子里然后放入大的加热培养槽中,加入经充分搅拌的缓冲液。然后,将一个电极(阳极)与这个缓冲液相连,另一个电极(阴极)与上端的缓冲液相接,它可以将凝胶顶部与培养槽或低处缓冲液隔开。现在需要用一个小泵将缓冲液由外面(低处)泵到高处以抵消上端缓冲液向下面的流失。
步骤 2 对样品序列进行分析为筛查作准备。由于使用“ GC 夹板”技术可使多数突变落入低温解链区,所以用计算机程序选择最佳引物位置就非常重要了,但仍需决定对哪一端连接“ GC 夹板”较好。大多检测对外显子和一些内含子的序列都进行了分析,因为多数突变位于外显子中,而外显子的大小多在 100-400bp 范围内,所以可以有效地检测出突变分子。一旦基因组 DNA 引物位置确定,电泳条件就可由以下两步确定。
( a )使用 SQHTX 程序(另一个程序 MELT87 用于预测解链区,可作为校对,但如果使用了“ GC 夹板”就无须使用此程序。)这些程序可从 L. Lerman 博士那里得到。
( b )对样品进行正交凝胶电泳,见图 2 ,选择曲线陡峭部分两端作为梯度凝胶的化学变性剂浓度范围。
步聚 3 样品制备。用两个引的对基因组 DNA 进行扩增,一个引物的 5’ 端连以 40-45bp 富含 GC 的一段序列。因为必须有异源双链形成才能保证检出率接近 100% ,但由于可能形成突变纯合子,所以必须加入等摩尔正常 DNA 分子,以在分析前形成异源双链。
步聚 4 制胶。制胶时要选择梯度范围,这可用梯度混合器完成,两个容器分别放有变性剂的极端浓度和合适浓度的丙烯酰胺。
步聚 5 电泳。经过电泳和溴化乙锭染色可以很好地分辩 1-2ug 样品。当温度平衡到 60 ℃后,移去梳子,加入混合有缓冲液的样品,电压控制在 60 到 160V 之间,电泳完后,以标准方法用溴化乙锭染色。分析所花时间PCR 扩增需要几小时,凝胶准备 1 小时,电泳 3-6 小时,染色几分钟。因此 ,一项检测分析仅需 7 小时,接到样品 24 小时后分析就可完成分析工作。