标题：生精细胞检测
生精细胞检测技术
生精细胞检测技术是由中国男性不育专家曹兴午教授创立的。曹兴午教授，曾任北京中日友好医院男科主任，现任中国性学会常务理事、性医学专委会秘书长、学术工作部副部长；《中国性科学》、《中国医学检验》、《中国社区医学》等三种杂志编委、研究员。参编20部著作，发表论文近100篇，科普文章400篇，曾多次获优秀论文奖励。从医五十多年来通过在北京协和医院，北京中日友好医院的临床医疗、教学、科研工作生涯锤炼了扎实独到的细胞形态学基本功，加以其丰富的临床经验积累，成为国内知名的专家，率先在国内开辟了男性学的临床与实验室检测研究，其中有关精液细胞学和精子形态学的分析资料对我国泌尿外科、男科事业的发展做出了卓越贡献，曹教授率先在国内提出应当重视精子形态学与精液细胞学检查在诊断男性不育、评价男性生殖功能的临床价值。
什么是生精细胞？
生精细胞(germ cells)，包括精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子。实质上这是一个连续的分化发育过程，称为精子发生。精原细胞精原细胞(spermatogonia)是成熟睾丸中最幼稚的生精细胞，位于曲细精管生精上皮的最外层。直接与曲细精管基膜相接触。根据精原细胞核的形态、大小，染色质的染色及致密度，核仁的位置及数量，胞质中有无糖原等形态结构特点，一般精原细胞分为三型：暗型精原细胞(dark type A，Ad)、亮型精原细胞A(Pale type A, Ap)和B型精原细胞(type B)。
Ad型精原细胞核呈圆形或卵圆形，染色质呈细粒状，深染，核中常有1—2个浅染区，核仁明显，胞质中有糖原及微管，还有Lubarsch氏晶体，它是由很多小管组成，每个小管直径约为8—12μm，互相平行，并由致密物质连结起来形成片层状结构。AP型精原细胞大而圆，附于基膜，核圆形，染色质呈细颗粒状，核浅染，有l—2个核仁，紧贴核膜，胞质中无糖原，无微管，无Lubarsch氏晶体。在邻接的Ap型精原细胞间有桥粒样结构。在Ad型精原细胞中，线粒体常成堆分布，线粒体间有深染的电子致密物质将线粒体连结在一起。在Ap型精原细胞中可单个存在，也可成双存在，相互间有致密物质连结。
B型精原细胞圆形与曲线精管基底膜接触面较少，有时仅有一个狭窄的胞质突起与之接触。核球形，核染质呈颗粒状，大小各异，沿核膜分布或附于核仁。核仁不规则，一般位于核中心，线粒体分散在整个胞质中。根据超微结构和组织化学的研究，在人的精原细胞核中，存在几种小体。在B型精原细胞中，除了几个核仁之外，还有碎片状染色质，缺乏固定的结构。在A型精原细胞核中有五中不同的小体，分别称为I、Ⅰ型、Ⅱ型，Ⅲ型及Ⅳ型，Ⅴ型小体。I及Ⅰ型小体具有核仁结构成分，主要存在于核染质较淡的核中。Ⅱ型小体最常见，常存在于有中央空泡的核中。Ⅲ型及Ⅴ型小体被认为是非典型核仁。Ⅳ型小体是一些小的致密的染色质。不同类型的精原细胞实际上反映了精原细胞的连续的增殖过程。各种类型的精原细胞间存在着恒定的数量关系，Ad型与AP型之间为I与Ⅰ之比，Ad与B型，Ap与B型之间为2与l或4与1之比。通过放射自显影研究发现Ad型精原细胞周期很长，分裂很慢。因而认为Ad型精原细胞是生精细胞的干细胞。由此人们提出了精原细胞增殖的模式。根据这个模式，一个生精干细胞通过第一次有丝分裂，产生两个新的Ad型精原细胞。其中一个Ad型精原细胞再分裂产生两个Ad型精原细胞，而另一个Ad型精原细胞则分裂产生两个AP型精原细胞，继而又先后分裂分化形成B型精原细胞及初级精母细胞。
精原细胞的增殖具有重要的生理意义。在增殖过程中，通过精原细胞的分裂和分化，由精原细胞产生精母细胞，进入成熟分裂，因而通过增殖可大大增加精母细胞的数量。按理论推算，一个精原细胞通过数次细胞分裂，可形成上百个初级精母细胞。但在生精过程早期，生精细胞很易发生变性，故实际上少于这个数字。在精原细胞的增殖过程中，有一部分Ad型精原细胞不再继续分裂，而是保留下来，成为新的精原干细胞，因此通过增殖不仅能使精原干细胞不断得到更新，且能使精原干细胞保持一定数量，从而使精于发生持续地进行下去，不会枯竭。
关于精原干细胞问题，目前看法尚不一致。有人认为Ad型精原细胞不是精原干细胞。有一种长型精原细胞(简称AL)才是真正的干细胞。AL型精原细胞很扁，与曲细精管基膜接触面积最大，有很多特征与Ad型精原细胞相类似．所不同的是，AL型精原细胞核膜外形没有Ad型规则，核电子密度较低，核中无稀疏区。精母细胞精母细胞位于生精上皮中层，分初级精母细胞(Primary spermatocyte)和次级精母细胞(secondary spermatocyte)两种。各种精母细胞又处于细胞周期的不同阶段，因此在切片上可看到不同形态的精母细胞。
由B型精原细胞直接分裂形成的初级精母细胞，称为前细线期精母细胞，其细胞结构特点和B型精原细胞相类似，体积稍大，开始时同曲细精管基膜还有少量接触，进而完全离开基膜。支持细胞的突起将前细线期精母细胞同基膜和邻接细胞相隔开。前细线期精母细胞被认为是静止期细胞。其实，它除了复制DNA外，还积极参与转录和转运，合成在精子发生过程中需要的大部分蛋白质和酶，并进行贮存，因而细胞质增多，细胞体积增大，可达18μm左右。不久即进入成熟分裂，由于其分裂前期很长，可达22天以上，因此在切片上可以看到大量的处于分裂前期的初级精母细胞。从初级精母细胞开始，细胞器增多，高尔基体发达，线粒体逐步变成为泡状线粒体。胞质密度比精原细胞深。
初级精母细胞经第一次成熟分裂，形成两个次级精母细胞。体积较小，直径约8—9μm。核球形，染色质呈细网状，但也可有一些大的染色质颗粒。次级精母细胞的间期很短，很快进行第二次成熟分裂，故在切片上所看到的多为分裂期的次级精母细胞，间期者不易看到。
成熟分裂(meiossis)，又名减数分裂。这是生殖细胞发育过程中特有的一种细胞分裂方式，它包括了两次连续的细胞分裂，即初级精母细胞的第一次成熟分裂和次级精母细胞的第二次成熟分裂。初级精母细胞的染色体是双倍体(44+xY)，有44条常染色体及2条性染色体(X和Y)。在细胞分裂间期或细线前期，初级精母细胞复制DNA，使DNA的量达到4n。接着细胞进入分裂期。
细胞分裂期分前期、中期、后期和末期。前期持续时间可长达24天。在前期，初级精母细胞核染色质变化很复杂。根据染色质的形态变化，可分为细线期、合线期、粗线期、双线期和终变期。在细线期，染色质浓缩，形成细丝状染色体。然后进入合线期，来自两个亲本的同源染色体双双配对，联结在一起，构成一对对较粗的染色体复合结构，称双价体或联会复合体，这种现象叫联会(synapse)。在电镜下，联会复合体呈二分体结构：两侧为两条平行的电子致密粗线，中间为电子透亮的细丝。在合线期，染色体螺旋进一步变紧，于是染色体进—步变短变粗，染色加深，同源染色体全部配对联结在一起，并且每条染色体出现明显纵裂，使每条染色体均包涵有两条染色单体。由着丝粒将它们联结在一起。接着进入双线期，染色体变得更加粗短，同源染色体对开始分离，但分离不完全，相互间有交叉点相连，这种现象称为染色体交叉。这不是一种简单的同源染色体间接触，而是通过染色体交叉，在来自父系和母系的同源染色体间进行遗传物质的交换，具有重要的生物学意义。至终变期，同源染色体对明显分离，核仁核膜消失，同源染色体对排列于赤道板上，位于细胞两端的中心粒发出纺锤丝，连于染色体，构成纺锤体。在分裂后期，同源染色体各沿着染色体臂，移向细胞两极。到末期，核仁核膜又出现，胞体分成两半，终于形成两个子细胞——次级精母细胞。每个次级精母细胞染色体数为23条，为单倍体，比原来减少一半，这时DNA为2n。
次级精母细胞形成后很快进入分裂间期，但为期甚短，不复制DNA，就进行第二次成熟分裂。次级精母细胞的23条染色体均由两条染色单体组成，染色单体间由着丝粒相连。第二次成熟分裂时，着丝粒断裂，染色单体分别移向细胞两极。一个次级精母细胞经过第二次成熟分裂，形成两个精子细胞。其染色体数为23条，单倍体，DNA为ln。精子细胞精子细胞(spermatid)靠近管腔，呈球形，体积较小，约9μm，为初级精母细胞的一半大小，但核相对体积较大，约6μm，圆形，位于细胞中央，染色质呈细颗粒状，染色淡。在胞质中可见一系列细胞器：线粒体较少，沿着细胞膜排成一圈。还有中心粒、内质网和高尔基体等。高尔基体是精子细胞中一种活跃的细胞器，它是联系各种细胞器的一个中心环节。在精子形成过程中起重要作用。在形态上，高尔基体有两个明显不同的部分—皮质和髓质。高尔基体外周部分是皮质，它由几个扁平膜囊堆组成，面向细胞核弯曲成弓形。高尔基体皮质—内质网—溶酶体系统(GERL)。高尔基体髓质由一些形状不同、大小不等的泡状与管状结构组成。在精子发育过程中，高尔基体的超微结构有着规律性的变化。
精子细胞不再分裂，但要经历一个形态结构的复杂变化过程，才形成蝌蚪状的精子，这个过程称精子的形成(spermiogenesis)。在形态上，哺乳动物的精子发育过程一般分为四个时期，即高尔基期、顶帽期、顶体期和成熟期。
1．高尔基期(Golgi stage) 在高尔基期，开始高尔基体呈球形，以后变成半球形，位于细胞核的一侧。在高尔基期的主要特征是在髓质内先出现几个圆形小泡，称前顶体囊泡，内有致密的颗粒称前顶体颗粒。随后这些前顶体囊泡融合成一个大的顶体泡与核膜相贴，称顶体囊泡，前顶体颗粒也融合成为顶体颗粒，这时在高尔基体髓质内或髓质附近还可见多泡体结构。它常与核外染色质伴随。以后多泡体与核外染色质一起离开高尔基体，移向细胞核尾侧中心粒(如下图)。
2．顶帽期(cap stage) 在顶帽期顶体变成扁平状，覆盖于精细胞核表面。顶体泡扩大并向细胞核两侧延伸形成顶帽。此时顶体颗粒并不增大，仍位于原来的部位，顶体颗粒与顶帽一起称为顶体系统。到这期末．顶帽可包绕细胞核的前半。在顶帽期的精子细胞中，高尔基体体积增大，CERL高度发育，多泡体移到细胞核尾侧的中心粒附近。
3．顶体期(acrosome stage)在顶体期顶体帽进一步扩大，顶体物质弥散于整个顶体帽中，于是顶体帽变成了顶体。高尔基体离开顶体系统与细胞核，在形态上由半球形变成球形，GERL退化并消失。与此同时，细胞核由细胞中央部位移向细胞一端，形态由圆形变为扁平的梨形，体积逐步缩小，染色质颗粒逐步增粗，电子密度逐步增强，最后形成致密均质状结构。在精子细胞核伸长和浓缩期间，大量的赖氨酸从核膜逸出，以摄入的精氨酸代之，使精子细胞核蛋白结构发生显著改变。精子细胞核内与DNA结合的是富于精氨酸的碱性蛋白质，可以抑制核中RNA的合成，从而抑制核内基因的转录，使基因更为稳定，具有保护作用。　当顶体形成时，细胞质内的两个中心粒迁移到与顶体相对的一端。从远侧中心粒长出一根细长的轴丝，形成了鞭毛；近侧中心粒贴近核尾端，围绕鞭毛的基部形成一致密的终环。线粒体聚集在核与终环之间的鞭毛周围，形成螺旋状的线粒体鞘。
4．成熟期 精子细胞的部分细胞质浓缩成为不规则的细胞质块，连于尾部中段，称多余胞质。进一步脱去多余胞质，至此精子形成并离开支持细胞，释放至曲细精管管腔。脱下的多余胞质称残余体。在成熟期，高尔基体再次由球形变成半球形，并开始退化，碎裂直至消失。
根据精子细胞核的形态变化，又可将精子细胞分成四种类型：
精子细胞Sa型：精子细胞直径6—7μm，核圆，位于细胞中央，染色质呈细粒状，染色较浅，但也有散在的不规则的块状染色质。用PAS染色，在核的一端有一圆形小区是PAS阳性反应。这一型相当于高尔基期。因此在电镜下可见高尔基期的一系列超微结构特点。
精子细胞sb1型：涉及到顶帽期和顶体期。核体积变小，核染色质开始变致密而不规则，位于核一端的帽状PAS阳性区更为明显。在电镜下发现，顶体颗粒可仍位于顶体囊泡中央，顶体囊泡在核的前端扩延，形成头帽，随后顶体颗粒散在于整个头帽并充满头帽，于是形成顶体，覆盖核的1/3。
精子细胞Sb2型：高尔基体己离开核上区，核向前移动造成核的偏位现象。核形改变伸长成梨形。由于核的进一步移动，外顶体膜与细胞一端的胞质膜相接触。在与顶体相对的另一极，开始形成鞭毛。
精子细胞Sc型：其核进—步变长。在核内明显出现电子致密颗粒，粗约25—35μm，散在分布，核电子密度加深，但在核后区较透亮。
精子细胞Sd1型：染色质颗粒增粗，体积缩小。
精于细胞Sd2型：已接近成熟，染色质颗粒融合形成均质的致密团块。
精液中生精细胞的检测
精液中的生精细胞主要包括4类：①精原细胞：可分为3种类型（Ad、Ap及B型），Ad型（暗A型）精原细胞的核圆形或椭圆形，核内有许多细小染色质颗粒，可被铁苏木素深染。核中央有一块苍白区，不被染色。核膜内表面有半球状核仁，通常1~2个，大小不一，嗜伊红。胞质内常出现空泡，富含糖原颗粒，过碘酸反应呈强阳性。Ap型（亮A型）细胞核呈卵圆形，核内染色质颗粒较大，不易被铁苏木素着色。核膜处有1~3个核仁，嗜伊红。与Ad型细胞明显不同的是胞质内糖原颗粒极少，过碘酸反应呈阴性。B型精原细胞核较大，圆形，染色质颗粒着色很浅，但有时出现一些小片状或颗粒状的染色质，染色较深，且部分常附着于核膜上，有时附着于核仁。胞质内无糖原颗粒存在。Ad、Ap型精原细胞一般不易离开基膜脱落，精液中见到的常是B型精原细胞。B型精原细胞是对放射线最敏感的细胞。②初级精母细胞：这一类型的生精停滞常出现在第一次减数分裂前期的末尾。精液中可见到偶线期的联会（同源染色体配对）或晚粗线期的去联会（配对的同源染色体片断提前分离）细胞形态。
细胞体积较大，直径15~24 μm。③次级精母细胞：由初级精母细胞增殖分化而来。体积一般较初级精母细胞小，有单核及双核两种类型，双核形的细胞与蜻蜓的头眼相似。胞核染紫红色。次级精母细胞存在的时间很短，故切片中少见。④精子细胞：由次级精母细胞发育成熟而来。精子细胞变态成精子的过程包括8个不同阶段。精子细胞形态多样，核较小，着色较深，常呈球形或精子头的雏形。精液中生精细胞检查是评价男性生育能力的重要指标，也是判断阻塞性和非阻塞性无精子症的重要依据。
生精细胞的检查首先离不开涂片，液化精液3 000 g离心15分钟后，将上层精浆倒出，沉淀用生理盐水悬浮洗涤1~2次后，用生理盐水将精子调整到一定浓度后（约50×109/L）涂片，自然干燥或用电吹风吹干。少精子症和无精子症标本可直接用沉淀涂片，无需用生理盐水洗涤。
涂片中生精细胞的检查离不开染色，目前用于生精细胞分析的染色方法主要有：瑞－吉氏染色法、改良巴氏染色法和HE染色法。这些染色方法可参见精子形态学分析一节。
结果判读：根据细胞核的形态与大小，染色质固缩程度以及核浆比例可将生精细胞分为四种：精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞和精子细胞。在精液中除可观察到正常形态特征的生精细胞外，还可观察到异常生精细胞。
异常生精细胞主要表现
①胞核变性：这是异常生精细胞的主要特征。由于胞核受损，分化不良，瑞－吉氏染色核呈深紫色，可见到核固缩、溶解和核断裂等形态特征。核固缩，常使核变小、致密，均匀着色；核溶解，常呈胞核膨胀、疏松，染色质模糊，着色较浅，或核膜破碎，轮廓不清；核断裂，可见胞核呈断裂状态或为几个核碎片，明显可见着色深浅分明的断裂块。
②胞质破损：胞体变形肿大或缩小，甚至破碎，形态多样异常，胞质内空泡大小不一，着色深浅不一。常见有深紫色大小不一的颗粒，有时核裸露，偶见精子穿入生精细胞的胞质内。
③核分裂异常：生精细胞核分裂异常，可见有核内复制现象。在次级精母细胞、精子细胞阶段，有时可见三个或四个以上的核，有时可见核浆发育不平衡的生精细胞，核浆比例失调。
临床意义
①精液中生精细胞的检查能有效地与精液中其他细胞（如白细胞）区别，避免误诊。
②精液中生精细胞的检查结合精浆生化指标测定可鉴别阻塞性无精子症和非阻塞性无精子症，并可反映睾丸的生精功能。
③精液生精细胞检查可取代睾丸活检。采用睾丸活检观察生精细胞形态学，不仅给患者带来痛苦，而且易使患者体内产生抗精子抗体。
④可了解细胞毒类药物、温度等因素对生精细胞的影响。
⑤动态观察精液生精细胞的变化，可以作为男性不育症疗效观察和判断预后的指标之一。