标题：保护碱基
定义
限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响的，被称为保护碱基。 
原理
在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
添加原则
添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。
添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的，见附表。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
附表
Fermentas提供的保护碱基数目和酶切活性对应值表
注：酶切活性值出现空格时参考前一格。
内切酶
碱基数目和酶切活性（%）

1
2
3
4
5
AarI
20-50

50-100


AasI
50-100




AatII
0
0-20
20-50 
50-100

Acc65I
0-20
50-100



AdeI
50-100




AjiI
50-100




AluI
0-20
20-50
50-100


Alw21I
50-100




Alw26I
50-100




Alw44I
0
20-50
50-100


ApaI
50-100




BamHI
50-100




BauI
0-20
20-50
50-100


BcnI
20-50

50-100


BclI
0
50-100



BcuI
50-100




BfiI
50-100




BfmI
50-100




BfuI
50-100




BglI
20-50
50-100



BglII
0
50-100



Bme1390I
20-50

50-100


BoxI
0
50-100



BpiI
50-100




Bpu10I
20-50
50-100



Bpu1102I
50-100




BseDI
0
50-100



BseGI
50-100




BseJI
0
50-100



BseLI
0
50-100



BseMI
0-20
50-100



BseMII
50-100




BseNI
0
50-100



BseSI
50-100




BseXI
20-50
50-100



Bsh1236I
50-100




Bsh1285I
0-20
50-100



BshNI
50-100




BshTI
20-50
50-100



Bsp68I
0
50-100



Bsp119I
50-100




Bsp120I
20-50
50-100



Bsp143I
50-100




Bsp1407I
20-50
50-100



BspLI
50-100




BspPI
0
50-100



BspTI
0
0-20
50-100


Bst1107I
0-20
50-100



BstXI
0

50-100


Bsu15I
50-100




BsuRI
0-20
20-50
50-100


BveI
0-20

50-100


CaiI
0
0-20
50-100


CfrI
0
50-100



Cfr9I
20-50
50-100



Cfr10I
20-50
50-100



Cfr13I
50-100




Cfr42I
50-100




CpoI
50-100




CseI
50-100




Csp6I
50-100




DpnI
50-100




DraI
0
0-20
50-100


Eam1104I
0
50-100



Eam1105I
0
50-100



Ecl136II
50-100




Eco24I
50-100




Eco31I
20-50

50-100


Eco32I
20-50
50-100



Eco47I
50-100




Eco47III
0
0-20
50-100


Eco52I 
0-20
50-100



Eco57I
50-100




Eco57MI
50-100




Eco72I
0-20
50-100



Eco81I
50-100




Eco88I
50-100




Eco91I
20-50
50-100



Eco105I
20-50
50-100



Eco130I
0

50-100


Eco147I
0
50-100



EcoO109I
50-100




EcoRI
50-100




EcoRII
0
0-20
20-50
50-100

EheI
20-50

50-100


Esp3I
50-100




FaqI
0-20
50-100



FspAI
0-20
20-50
50-100


FspBI
20-50
50-100



GsuI
50-100




HhaI
50-100




Hin1I
50-100




Hin1II
0
0-20
50-100


Hin6I
0

0-20
50-100

HincII
50-100




HindIII
0
0-20
50-100


HinfI
50-100




HpaII
0-20
50-100



HphI
0
50-100



Hpy8I
0-20
50-100



HpyF3I
20-50
50-100



HpyF10VI
50-100




KpnI
50-100




Kpn2I
0
50-100



KspAI
20-50
50-100



LguI
50-100




LweI
20-50
50-100



MbiI
0
0-20
50-100


MboI
50-100




MboII
50-100




MlsI
0-20
50-100



MluI
20-50

50-100


MnlI
0
50-100



Mph1103I
20-50
50-100



MspI
0-20
50-100



MssI
20-50
50-100



MunI
20-50
50-100



MvaI
0 
20-50
50-100


Mva1269I
0
50-100



NcoI
0
50-100



NdeI*
0-20
20-50
50-100


NheI
0
20-50

50-100

NmuCI
20-50
50-100



NotI
20-50
50-100



NsbI
0
0-20
50-100


OliI
0-20
20-50
50-100


PaeI
0
0-20

20-50
50-100
PagI
20-50
50-100



PasI
50-100




PauI
0
50-100



PdiI
0-20
50-100



PdmI
50-100




PfeI
50-100




Pfl23II
0-20
20-50
50-100


PfoI
0
20-50
50-100


Ppu21I
50-100




PscI
0
50-100



Psp5II
0
50-100



Psp1406I
0-20
50-100



PsuI
0-20
50-100



PstI
0-20
50-100



PsyI
0
50-100



PvuI
20-50

50-100


PvuII
50-100




RsaI
50-100




SacI
50-100




SalI
20-50

50-100


SatI
0
50-100



ScaI
0-20
50-100



SchI
50-100




SdaI
0-20
50-100



SduI
50-100




SfiI
50-100




SgsI
50-100




SmaI
50-100




SmiI
0-20
50-100



SmoI
0
50-100



SmuI
50-100




SsiI
50-100




SspI
0-20
50-100



TaaI
20-50
50-100



TaiI
50-100




TaqI
0
20-50

50-100

TasI
0
20-50
50-100


TatI
0-20

20-50
50-100

TauI
20-50
50-100



Tru1I
0
0-20

50-100

TsoI
20-50
50-100



Van91I
0
50-100



VspI
50-100




XagI
20-50
50-100



XapI
20-50

50-100


XbaI
20-50
50-100



XceI
0
50-100



XhoI
0-20
50-100



XmaJI
50-100




XmiI
50-100




I-SceI
50-100