标题：图位克隆法
图位克隆法介绍
图位克隆(Map-based cloning)又称定位克隆(positional cloning)，1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出，用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法，在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，使用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库，从而构建目的基因区域的物理图谱，再利用此物理图谱通过染色体步行逼近目的基因或通过染色体登陆的方法最终找到包含该目的基因的克隆，最后通过遗传转化和功能互补验证最终确定目的基因的碱基序列。
图位克隆的特点是无需预先知道基因的DNA顺序，也无需预先知道其表达产物的有关信息，但应有以下两方面的基本情况。一是有一个根据目的基因的有无建立起来的遗传分离群体，如F2、DH、BC、RI等。二是开展以下几项工作：
1)首先找到与目标基因紧密连锁的分子标记；
2)用遗传作图和物理作图将目标基因定位在染色体的特定位置；
3)构建含有大插入片段的基因组文库(BAC或YAC库)；
4)以与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库；
5)用获得阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群；
6)通过染色体步行、登陆或跳跃获得含有目标基因的大片段克隆；
7)通过亚克隆获得带有目的基因的小片段克隆；
8)通过遗传转化和功能互补验证最终确定目标基因的碱基序列，步骤见图4-10。下面将对其中几个关键环节予以叙述。
图位克隆的技术环节
1.1  构建遗传作图群体用于作图群体的类型可有多种。一般说来，在这类群体中，异花授粉植物分子标记的检出率较自花授粉植物的高。但是对于基因的图位克隆而言，培育特殊的遗传群体是筛选与目标基因紧密连锁的分子标记的关键环节。这些遗传材料应该满足这样的条件，即除了目标基因所在座位的局部区城外，基因组DNA序列的其余部分都是相同的，在这样的材料间找到的多态性标记才可能与目标基因紧密连锁。
目标基因的近等基因系(NILs)是符合条件的一类群体。近等基因系是指几乎仅在目标性状上存在差异的两种基因型个体，这可通过连续回交的途径获得。由于NILs的遗传组成特点，一般凡是能在近等基因系间揭示多态性的分子标记就极有可能位于目标基因的两翼附近。Martin等(1993)就是用RAPD技术分析番茄PTO基因的近等基因系而获得了与该基因表现共分离的分子标记，以该分子标记为探针筛选基因组文库而实现了染色体登陆。又如在玉米上，利用AFLP技术分析玉米CMS-S型雄性不育的恢复基因及近等基因系，已获得与目标基因紧密连锁的分子标记并以其用作分离RF3基因的探针。
一般说来，当标记为显性遗传时，欲获得最大遗传信息量的F2群体，须借助于进一步的子代测验，以分辨F2中的杂合体。为此，Michelmore等(1991)发明了分离群体分组分析法(bulked segregant analysis，BSA)以筛选目标基因所在局部区域的分子标记。其原理是将目标基因的F2(或BC1)代分离体的各个体仅以目标基因所控制的性状按双亲的表型分为两群，每一群中的各个体DNA等量混合，形成两个DNA混合池(如抗病和感病、不育和可育)。由于分组时仅对目标性状进行选择，因此两个DNA混合池之间理论上主要在目标基因所在局部区域的差异，这非常类似于NILs，故也称作近等基因池法。研究表明，近等基因系法、分离群体分组分析法再结合AFLP等强有力的分子标记技术使人们能够在短时间内从数量众多的分子标记中筛选出与目标基因紧密连锁的标记。更为有意义的是，这种策略在尚未构建遗传图谱的物种中也是可行的。
1.2  筛选与目标基因连锁的分子标记筛选与目的基因连锁的分子标记是图位克隆技术的关键，常用的分子标记有RFLP、RAPD、SSR和AFLP等。这些技术有别于最初的形态标记、细胞学标记和生化标记，一般表现出稳定、可靠的特点，有的使用成本也相对较低，特别适用于筛选与目标基因紧密连锁的标记，尤其是与目标基因共分离的标记。因此能够加快克隆基因的进程，研究者可依据不同的研究目标、对象、目的、条件等，选择使用这些技术。值得提及的是随着分子标记技术的发展，一些植物的遗传图谱构建和比较基因组的研究也有了长足的进步，它们相得益彰，互为促进，为基因的图位克隆提供了有益的借鉴。
1.3  借助连锁图谱筛选分子标记当基因图位克隆策略刚刚提出的时候，植物分子连锁图谱的构建尚处于萌芽阶段，当时找到一个与目标基因连锁的分子标记通常要花费数月甚至数年的时间。在过去的十年里，这种状况有了显著改善，由于可以很方便的建立和维持建图所必需的较大的分离群体，因而植物分子连锁图构建工作的发展速度超过了动物的同类研究。现在业已建图的植物已多达几十种，其中包括了所有重要的农作物，水稻，玉米，番茄，小麦，马铃薯，拟南芥等重要经济作物和模式植物的遗传图谱已相当精细，含有数百甚至数千个标记。高密度分子连锁图的绘制为筛选与目的基因紧密连锁的分子标记提供了良好的开端。比如，番茄的遗传图谱含有1000个分子标记，其基因组大小约为1000×106bp，因此对任何基因，都可以找到与之相距在1000 kb之内的分子标记。
1.4  借助比较基因组共享分子标记比较基因组研究主要是利用相同的DNA分子标记(主要是cDNA标记和基因克隆)在相关植物种之间进行遗传或物理作图，比较这些标记在不同物种基因组中的分布特点，揭示染色体或染色体片段上的基因及其排列顺序的相同(共线性)或相似性(同线性)，并由此对相关物种的基因组结构和起源进化进行分析。已有的研究表明，存在生殖隔离的不同植物物种之间在标记探针的同源性、拷贝数及连锁顺序上都具有很大程度的保守性。如番茄、马铃薯和辣椒；水稻、小麦和玉米；小麦、黑麦和大麦；高粱和玉米；拟南芥和芸薹属；以及大麦和水稻。更为有趣的是，Moore等(1995)同时对水稻、小麦、玉米、谷子、甘蔗及高粱等6种主要禾本科物种的基因组进行了比较作图研究，结果表明其中基因组最小的水稻居于中枢的位置，即这些禾本科植物基因组的保守性可归结到水稻基因组的19个连锁区段上。由这19个区段可实现对所研究的全部禾谷类作物染色体的重建，并可构成一个禾谷类作物祖先种的染色体骨架。通过这一研究，人们对禾谷类作物的进化演变历程有了更深入的认识。植物比较基因组的研究成果表明，在更广的范围上，包括禾本科、十字花科、豆科植物及一些树木的基因组在基因组成和基因排列顺序上都存在很大程度的一致性。而在包括小麦、玉米和水稻等重要农作物的禾本科作物上，基因组成和排列顺序的一致性非常完好，人们可以在模式植物水稻上用图位克隆技术克隆相关物种的大多数重要基因。此外，比较基因组研究还给人们一个重要的启示，那就是模式植物上遗传作图的成果可推而广之，这对那些遗传作图工作相对滞后的植物尤其重要。比较基因组作图使建立高密度遗传连锁图可资利用的标记显著增加，从而大大提高获取离目标基因很近的分子标记的可能性。
比较基因组作图是利用分子标记技术在1个目标性状的分离群体中把目的基因定位于染色体的一定区域内，然后通过利用高密度的分子连锁分析，以精细定位目的基因。目前，作图的类型可分为2类，分别是遗传图谱和物理图谱。遗传图谱对图位克隆虽然非常重要，但更精细的物理图谱尤为重要。而增加图谱上的分子标记数目是精细作图的基础，增加分子标记的方法—是整合已有的遗传图谱，再者就是寻找新的分子标记。现在已有越来越多的植物的遗传图谱趋于饱和，如水稻已有3275个分子标记的图谱，覆盖基因组的1512.5 cM和10400个EST标记。目前利用稀有切点内切酶结合PEGE技术已成功用于植物基因组的大规模物理作图，从而可以确定连锁标记与目的基因间的实际物理距离的大小，为基因的克隆奠定了基础。
1.5  局部区域的精细定位、作图一旦把目标基因定位在某染色体的特定区域后，接下来就要对其进行精细的作图及筛选与目标基因紧密连锁的分子标记。目前的作图类型分为两类，分别是遗传图谱和物理图谱。
（1）遗传图谱的构建
染色体的交换与重组是遗传图谱构建的理论基础，通过作图群体的分析，如果一个基因与两侧最近的分子标记距离均在2 cM以上，就需要作精细的遗传图谱。因为即使是在小基因组水稻中，平均1 cM也相当于250 kb左右的物理距离，如果在着丝粒附近就可能相当于1000 kb左右，需要进行若干步的染色体步行，非常费时费力。因此，精细的遗传图谱对图位克隆显得非常重要，而增加遗传图谱上的分子标记数目是精细作图的基础。在一个已知区域内增加分子标记有两种方法，第一种方法是整合已有的遗传图谱。如将生理、生化、分子标记图在同一区域内整合在一起，就会提高分子标记的密度。另一种方法是寻找新的分子标记。在植物上，精细作图的发展速度超过了动物的同类研究，这主要是因为在植物上可很方便地建立和维持较大的分离群体，并建立了几种不同的检测标记间连锁关系的统计软件。现在，业已建图的植物已多达几十种，其中包括了所有重要的农作物(Tanksley，1995)，如玉米、番茄、水稻、小麦、大麦、燕麦、大豆、高粱、油菜、莴苣、马铃薯等。尤其值得一提的是，过去被公认为难以开展遗传作图的木本植物，如今也涌现出了许多密度可观的分子标记连锁图，如苹果和松树等。由于许多科学家的共同努力和连年的工作积累，已有越来越多生物的遗传图谱趋于饱和，这就为生物的物理图谱的构建奠定了基础。
（2）物理图谱的构建
由于分子标记与目标基因之间的实际距离是按碱基数(bp)来计算的，它会因不同染色体区域基因重组值不同而造成与遗传距离的差别，所以物理图谱是真正意义上的基因图谱。物理图谱的种类很多，从简单的染色体分带图到精细的碱基全序列都是物理图谱。最为常用的物理图谱有限制酶切图谱、跨叠克隆群和DNA序列图谱等。限制酶切图谱是用几种限制性内切酶消化DNA，通过电泳检查限制性片段长度的办法确定它们的排列顺序；对于较大的基因组，可以利用稀有切点限制性内切酶和脉冲电脉。制作跨叠克隆群则需具有一定容量的大片段基因组文库。比较各个克隆的插人片段，将它们排列成与原来在染色体中的顺序一样的连续克隆群，即跨叠克隆群(也叫重叠克隆群)。    
跨叠克隆群的制作方法有三种：
1）菌落杂交法。其基本原理是利用基因组某一区域特有的或与所需分离的目标基因紧密连锁的DNA分子标记为探针筛选大片段基因组文库，可以分别得到一系列的阳性克隆，这些克隆之间有部分片段是重叠的，根据其重叠部分可以把它们有序地呈线状排列成跨叠群(contig)。在两个跨叠群之间会出现空隙，需要通过染色体步行来填补。该技术从分离大片段阳性克隆群的左、右末端人手，以它们为探针再次筛选基因组文库，获得新的克隆即为沿着染色体向前走了一步，重复这一过程，就能一步一步地将空隙填满，将两个克隆群整合在一起，这一方法能利用各种分子标记扫描文库，准确得到携带分子标记的阳性克隆，是构建跨叠克隆群的首选策略。
2）PCR法。即以PCR技术为基础发展了一系列技术，包括STS、RAPD、AFLP和Alu-PCR等已被广泛应用于跨叠克隆群的构建。STS策略是利用已知核酸序列，从两端合成两个与其配对的引物，利用PCR进行扩增，理论上讲具有相同扩增带型的克隆，也可以说共享一个或数个STS位标的克隆肯定是跨叠的。这个方法具有简便、快速、精确度高等优点，是人类基因组计划所采用的主要策略之一。另一重要的基于PCR的策略是A1u-PCR技术，该技术利用人类基因组的Alu重复序列，合成一对特异性引物，进行PCR扩增，然后以PCR产物为探针，从文库中筛选出阳性克隆。这一方法简便，但有时会出现一些误差，当与限制性内切酶物理图谱结合使用时，就可以比较精确地排列出阳性克隆的重叠顺序。
3）DNA指纹—锚标法。其原理是首先对随机克隆的DNA选定一个6碱基识别位点的限制性内切酶消化，然后用放射性同位素进行末端标记，经标记后DNA片段用另一个4个碱基识别位点的限制性内切酶消化，用序列分析胶分离这些片段，然后经放射性自显影检测。这些指纹图谱数据经计算机处理后，根据片段的相似性，构建跨叠克隆群。
荧光原位杂交技术(Fiber-FISH)是最近几年新发展的方法，它使FISH技术的分辨力接近其理论值1 Kb，在光学显微镜的识别范围内。Fiber-FISH适宜于基因组的数量作图，而且由于可以在荧光显微镜下同时观察几种探针的位置和顺序，将有效地排除染色体步行过程中经常遇到的复重序列带来的因难。这些物理图谱的构建，无疑给图位克隆感兴趣的基因奠定了坚实的基础。
（3）构建高质量的基因组文库 
在基因的图位克隆技术中，高质量的基因组文库的构建也是克隆成功的另一关键。图位克隆的基因组文库主要有Cos质粒文库和人工染色体(YAC)文库。作为被克隆的载体。可以采用Cos质粒，它是1种含有λ噬菌体的cos位点的质粒载体，大小在10 kb左右，可高效地克隆25~35 kb的DNA片段。当要克隆大片段DNA时。需要YAC作载体，以YAC为载体，可将300~1000 kb的DNA片段克隆：因此，以YAC为载体可以构建高等植物的完整基因组文库。除YAC外。后来又陆续发展了BAC、PAC等几种以细菌为寄主的载体系统。
图位克隆在理论上适用于任何物种，但目前主要还是用于真核生物。真核生物一般都有内含子，一个基因往往长达几个到几十个kb，只有容纳大片段插入子克隆载体，才能携带完整的基因。柯斯质粒从λ噬菌体改造而来，由于采用质粒的复制子，柯斯质粒克服了包装的限制，插人片段可达40~50 kb。虽然如此，柯斯质粒还是不敷应用，就又发展了人工染色体技术。人工染色体在细胞周期中可以正常复制，配对和分离。作为载体，人工染色体的插入片段可达2 Mb左右，能够覆盖完整的真核基因。最早发展的人工染色体是酵母人工染色体（YAC）。1983年，Murray等首次构建了总长度为55 kb的YAC。1987年，Burke等得到了能够克隆大片段DNA的YAC载体，证明YAC可以构建高等生物的完整基因组文库。YAC具有比较大的容纳能力，但不太稳定，嵌合体比例也较高，而且难以与酵母自身的染色体分开。后来陆续发展了P1、BAC、PAC等几种以细菌为寄主的载体系统。值得一提的是进展一直缓慢的哺乳动物人工染色体(MAC)和人类人工染色体(HAC)也已取得突破性进展。
1.6 染色体步行、登陆找到与目标基因紧密连锁的分子标记(最好分布在基因两侧)和鉴定出分子标记所在的大片段克隆以后，接着是以该克隆为起点进行染色体步行，逐渐靠近目标基因，以该克隆的末端作为探针筛选基因组文库，鉴定和分离出邻近的基因组片段的克隆，再将这个克隆的远端末端作为探针重新筛选基因组文库。继续这一过程，直到获得具有目标基因两侧分子标记的大片段克隆或重叠群。如果目标基因所在区域已经完成分子作图，就有一套现成的顺序排列的大片段克隆可以利用。当遗传连锁图谱指出基因所在的特定区域时，即可取回需要的克隆，获得目标基因。
染色体步行的主要困难在于，当必须经过一个无法克隆的片段时(如对寄主无害)，步行的过程会被打断；当克隆的一端是重复序列时，步行的方向会步入歧途。为了克服这些困难，发展了染色体登陆、跳步和连接等方法。染色体登陆是找出与目标基因的物理距离小于基因组文库插入片段的平均距离还小的分子标记，通过筛选文库直接获得含有目标基因的克隆，完全避开染色体步行的过程。染色体跳步—连接是使用一个识别位点很少的随机一个识别位点很多的酶构建跳步文库和连接文库。跳步文库的插入片段是大片段克隆末端经过双酶切的部分，由同样的文库进行克隆。连接文库的插入片段是由切点较少的酶产生的，具有切点较少的那个酶的识别位点。在染色体步行的过程中，交替应用两个文库进行跳步和连接，最终逼近目标基因。
1.7鉴定目标基因筛选和鉴定目的基因是图位克隆技术的最后环节，找到与目的基因紧密连锁的分子标记并鉴定出分子标记所在的大片段克隆后，接着是以该克隆为起点进行染色体步行，逐渐靠近目的基因。当遗传连锁图谱指出基因所在的特定区域时，即可取回需要的克隆，获得目的基因。在与目的基因紧密连锁的分子标记及大插入片段基因组文库都具备的情况下，就可以以该分子标记为探针通过菌落杂交，蓝、白斑挑选的方式筛选基因组文库而获得可能含有因的基因的阳性克隆。在用覆盖目的基因区域的大片段基因组DNA克隆筛选区域特异的cDNA后，仍需对目的基因编码的cDNA作进一步证实。现有证实目的基因编码的cDNA克隆的方法有：1) 精细作图来证实某候选基因克隆与目标性状共分离； 2) 证实某候选基因克隆的时空表达模式与目标性状的表现相同；3） 把候选基因序列与现有已知功能基因序列数据库进行同源性比较，推断其功能；4) 比较候选基因序列在野生型与突变型之间的差异，确定在二者之间变异的cDNA序列；5) 转化候选基因。
这些阳性克隆中可能含有多个候选基因，从一系列候选基因中鉴定基因是定位克隆技术的最后一个关键环节。现在最常用的方法是用含有目标基因的大片段克隆如BAC克隆或YAC克隆去筛选cDNA文库，并查询生物数据信息库，待找出候选基因后，把这些候选基因进行下列分析以确定目标基因：1) 精确定位法检查cDNA是否与目标基因共分离；2) 检查cDNA时空表达特点是否与表型一致；3) 测定cDNA序列，查询数据库，以了解该基因的功能；4) 筛选突变体文库，找出DNA序列上的变化及与功能的关系；5) 进行功能互补实验，通过转化突变体观察突变体表型是否恢复正常或发生预期的表型变化。功能互补实验是最直接、最终鉴定基因的方法。