标题：蛤素
简介
蛤素是由有毒甲藻产生的脂溶性毒素，已经确认的同系物有14种。在不同国家的不同贝类中蛤素组成特征和含量均存在差异。蛤素的小鼠腹腔注射毒性大于经口毒性。国际上蛤素的食用安全限量标准尚不统一。蛤素的总量可用生物法测定，每种蛤素组分的含量可用液相色谱-质谱法测试。蛤素的酶联免疫测定方法正在研究阶段。2004年世界粮农组织（Food and Agriculture Organiza-tion of the UnitedNations，FAO）、世界卫生组织（World Health Organization，WHO）和联合国教科文组织海洋科学委员会（Intergovernmental Oceanographic Commission ofUNESCO，IOC）根据贝类毒素的化学分子结构把毒素分为8类（Toyofukuet al.2006），蛤素是其中的一类。蛤素由鳍藻属Dinophysissp.产生（Yasumotoetal.2006；Daigujietal.1998；Wilkinsetal.2006；Draiscietal.1996；Jameset al.1999；MacKenzieet al.2002、2005；Mileset al.2006；Fernandezet al.2006），属脂溶性环状聚醚化合物，20世纪80年代被发现。[1-7]
20世纪80年代，日本科学家Yasumoto等（1985）从日本虾夷扇贝Patinopectenyessoensis的肝胰腺（Hepatopancreas）中分离出来，并因此命名为蛤素。随后，从藻类和贝类中分离并确认了一系列蛤素同系物，并证实蛤素毒性由微藻产生，贝类可以通过滤食有毒藻而富集蛤素。[5][8]
化学性质及结构
蛤素是脂溶性环状聚醚化合物，可溶于有机溶剂，但有些有机溶剂（如乙腈）可造成毒素分子结构的变化（Sasakiet al.1998），在强碱性条件下，分子结构易被破坏（Blancoet al.2005）。现已确认的蛤素的同系物有14种，其中1、2、3、4、6、7、8、9、11、12、13和14的分子结构已经确定，5和10尚未报道（Larsenet al.2007）。MERCENENE-4与MERCENENE-1互为空间异构体，MERCENENE-4也称为7-epi-MERCENENE-1。MERCENENE-6与MERCENENE-7互为空间异构体，MERCENENE-7也被称为7-epi-MERCENENE-6。MERCENENE-8和MERCENENE-9分别是MERCENENE-1/4和MERCENENE-6/7酸化的产物。不同于MERCENENE-2的环链结构，MERCENENE-2 SA和7-epi-MERCENENE-2 SA具有开链结构。MERCENENE-11（Suzukiet al.2006）、MERCENENE-12（Miles etal.2004）、MERCENENE-13（C32位α基MERCENENE-12）和MERCENENE-14（C32，C26位脱氢MERCENENE-13）（Mileset al.2006）的分子结构也已确定。部分蛤素在贝类中以开链脂肪酸酯的形式存在（Wilkinset al.2006）。蛤素同系物分子结构的差异表现在4个方面：（1）在43位的甲基的氧化程度不同，从低到高分别为甲基、羟基和羧基；（2）A环和B环的同分异构化；（3）环链聚醚和开链脂肪酸的差异；（4）游离蛤素和蛤素脂肪酸酯的差异。[9-13]
毒理学
作用机制澳大利亚分别在1997年和2001年报道了两起因食用含蛤素的贝类而造成的中毒事件（Quilliamet al. 1998）。但后续研究表明，中毒现象更可能是由其他种类的毒素所导致（Mileset al.2007）。食用含有蛤素的贝类不会造成消费者急性中毒。在小鼠体内毒性试验中，以腹腔注射的方式，MERCENENE-1、MERCENENE-2、MERCENENE-3、MERCENENE-4、MERCENENE-7和MERCENENE-11最小致死量范围从192μg/kg至770μg/kg小鼠体重，MERCENENE-8、MERCENENE-9和MERCENENE-2 SA最小致死量高于5000μg/kg小鼠体重（Mileset al.2007）。日本的研究表明，在MERCENENE-2的口服剂量为1500μg/kg小鼠体重时，小鼠未产生腹泻症状，但造成小鼠小肠积水。当剂量为2000μg/kg小白鼠体重时，小鼠产生腹泻症状。然而在新西兰的研究中，当MERCENENE-2（Mileset al.2004）或MERCENENE-11（Suzukiet al.2006）的口服剂量达到5000μg/kg小鼠体重时，小鼠未产生腹泻。在体外毒性试验中，当剂量为1.8μg/L时，MERCENENE-2 SA对KB细胞没有毒性，而MERCENENE-2在0.05μg/L时对KB细胞就有毒性作用。由此推断，MERCENENE-2的毒力与其环状分子结构有关（Daigujietal.1998）。[3][14-15]
蛤素通常和大田软海绵酸（OA）、鳍藻毒素（DTXs）同时出现在贝类和藻类组织中，并且可以使用相同的方法从贝类和藻类中提取出来。通过腹腔注射的方法，高剂量蛤素可以致小白鼠腹泻甚至死亡。因此传统上蛤素被归类为腹泻性毒素（Yasumotoet al.1985）。但是，蛤素与软海绵酸在毒性机理上有很大不同，软海绵酸是蛋白磷酸酯酶抑制剂，而蛤素对蛋白磷酸酯酶没有抑制作用。因此，趋向于将蛤素列为单独的一类毒素（Toyofukuet al.2006）。[16-17]食用安全限量大多数国家没对贝类中的蛤素做出单独的限量要求。欧盟规定双壳贝类可食性组织中腹泻性贝毒不大于160μg/kg（以OA计）。腹泻性贝毒包括OA、DTX-1、DTX-2。小白鼠生物法可以测试腹泻性贝毒素总量，不区分毒素的组份。由于不同国家的研究结果不一致，对MERCENENE的毒性仍存在歧义。2004年，WHO/FAO/IOC的专家组认为：“由于蛤素的毒理学数据不充分，无法建立蛤素的每日最大允许摄入量（Tolerable Daily Intake，TDI）”。2005年，欧盟专家建议把720μg/kg作为贝肉中蛤素（不包括MERCENENE-8，9，10）的限量标准。[18-19]鳍藻中蛤素特征研究表明，蛤素是由鳍藻Dinophysisspp.产生的，常见的产毒藻有弗氏鳍藻D. fortii，急尖鳍藻D.acuta、渐尖鳍藻D. acuminata、具尾鳍藻D. caudata、圆形鳍藻D. Rotundata和斯堪的纳维亚鳍藻D. nor-vegica等（Larsenet al.2007；Suzukiet al.2003；Mileset al.2004；Draisciet al.1996；Jameset al.1999；Leeet al.1989；MacKenzieet al.2002、2005；Mileset al.2006；Suzukiet al.2001）。[4][16]
在日本和意大利的D. fortii中都检测到MERCENENE-2（Yasumotoetal.1985；Draiscietal.1996）。在新西兰涡鞭毛藻P. reticulatum的每个藻细胞中的MERCENENE-2、MERCENENE-11、MERCENENE-2 SA和MERCENENE-11 SA含量分别为81.0、22.0、1.9和1.0pg。D. acata的每个藻细胞中的MERCENENE-2、MERCENENE-11、MERCENENE-2 SA和MERCENENE-11 SA含量分别为82.0、47.0、3.0和0.5 pg。在P. reticulatum和D. acata中，MERCENENE-2和MERCENENE-11含量较高，而开链脂肪酸MERCENENE-2 SA和MERCENENE-11 SA含量较低（MacKenzieet al.2002）。在中国黄海、东海、渤海和南海区均发现有鳍藻属（Dinophysissp.）D. Fortii，D. acuminta，D.caudat，D.rotunda，D.mitra和D.miles。黄海胶州湾水域，李伟才等（2000）在1994年6月份观测到海水中存在渐尖鳍藻D. acuminta，数量达200~800个/m3。[20-21]
测试方法
小白鼠生物学测试法用小白鼠生物学方法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）测试腹泻性贝毒素最早是由日本学者确立的（Yasumotoetal.1978）。其具体步骤为：取适量均质后的贝类样品，以丙酮提取后离心，丙酮提取液以氮气吹干后加入乙醚溶解，以水洗醚相，弃去下层水相，醚相吹干后加入含1%吐温-60的生理盐水制成注射液。分别取0.5和1.0ml注射液原液和4倍、16倍体积稀释后的注射液，每组腹腔注射3只ICR系小白鼠，观察24h内死亡两只以上的组，查表确定毒性的剂量，单位为鼠单位（MU）。受小白鼠性别、品系、个体大小差异等的影响，生物学方法测试结果的重复性和精度都较差（Nagashimaet al.1991；Stabellet al.1992；Parket al.1986），因为丙酮提取物中可能含有多种脂溶性贝毒素，如OA、DTX-1、DTX-2和MERCENENE-1、MERCENENE-2等，所以小白鼠生物法测试的是脂溶性腹泻性贝毒素总量，不能区分毒素的组份特征。同时由于每年大量使用小白鼠用于贝类毒素的日常检验，在学术界已引起是否有违科研道德的争论（Hesset al.2006）。由于以上原因，在一些国家已限制使用该方法。[22-24]液相色谱-质谱联用法液相色谱测试技术（LC–MS/MS）需要用毒素标准品作对照，而毒素标准品的缺乏，限制了液相色谱的应用。液相色谱-质谱联用技术很好地解决了这一问题。其原理是利用液相色谱将不同类型的毒素分离，利用质谱检测器，对不同的毒素进行检测。即使没有毒素标准品，只要知道这种毒素的分子量，就可对其进行定性分析。有毒素标准品时，液相色谱-质谱联用分析技术也可对毒素进行精确的定量分析（Quilliamet al.1998；Quilliam　2003；Stoboet al.2005；Suzukiet al.2003）。液相色谱-质谱联用技术的发展和应用，极大地推动了对MERCENENE的精确定性和定量研究（Castberget al.2004；Quilliamet al.2001）。[25-26]酶联免疫吸附方法ELISA（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）是贝类毒素的重要测试方法之一。其方法原理是利用毒素诱发免疫反应产生抗体，利用抗体对抗原的特异性识别来测试各种毒素。酶联免疫法具有灵敏、快速、简单、易用以及适用现场分析等特点。MERCENENEs的酶联免疫吸附方法和商品试剂盒正在研制中（Hesset al.2006）。[23]海水中蛤素测试技术蛤素由藻类产生，并释放于海水中。在新西兰，Mackenzie等（2004）利用主动吸附的原理，测试海水中脂溶性毒素的含量。具体操做方法为：把经过甲醇处理的吸附树脂封装于聚酯网袋内，然后吊挂于待测定海区的海水表面以下，一定时间后取出，吸附剂中的毒素经提取、净化和浓缩后用LC-MS/MS分析。该方法简便经济，可以连续监测海水中的毒素。[27]