标题：眼镜蛇毒神经生长因子
简介
1948年，美国生物学家Backer惊奇的发现，将小鼠肉瘤组织移入鸡胚体壁可使移植区神经节数量增加，这一发现引起了生物学界和医学界的极大兴趣，并致力于这种现象的研究。经过几年的研究，美国科学家Levi-montalcini和Cohen等发现，不但鸡胚体壁内神经节数量会受小鼠肉瘤组织的影响而增加，而且交感神经节数也会受到影响而增加，远离移植区的神经节数亦有增加。由此他们推测，小鼠肉瘤组织可能释放了一种可以在血液中起刺激神经纤维和神经节生长作用的因子。1954年Cohen和Levi-montalcini成功的从小鼠肉瘤-37和38中分离出了这种因子，从而证明了这种因子的存在，他们将这种因子命名为Never Growth-Stimulating Factor（神经生长刺激因子）。1956年，他们又在Dried Mocasin（Aglcistrodon Piscivorus）和Rattlesnake（CrotalusAdamantrus）两种蛇毒中分离得到了这种刺激神经生长的因子，并且研究了它们刺激体内和体外鸡胚背根神经节生长的生物活性。随后，Cohen于1958-1959年又分别从Mocasin蛇毒和Aglcistrodon Piscivorus，Naja naja等蛇毒中也提取了这种刺激神经生长的因子，并且对它们的性质进行了初步研究。人们将这种能够刺激神经生长的因子统称神经生长因子（Never Growth Factor，NGF）。Cohen因对神经生长因子的突出研究贡献获得了1986年诺贝尔生理学和医学奖。[1-3]神经生长因子是神经系统最重要的生物活性分子之一，是一种可由多种细胞产生的能促进神经修复的多肽类因子。它与周围神经和中枢神经的存活及发育密切相关,在神经系统、内分泌系统和免疫系统的网络调控中起重要的作用。NGF生物学功能的实现是通过NGF与效应细胞表面的NGF受体结合而介导。[4-5]
它能够维持并促进外周及中枢神经系统中部分神经元的发育和分化，营养成熟的神经元，维持其存活及正常的生理功能，并且在它们受到损伤后，促进其修复和再生。它在外周神经系统的病变及一些神经元退行性疾病，例如早老年性痴呆症、帕金森症的治疗方面显示了良好的应用前景。对眼镜蛇毒NGF的研究多数是理论方面的研究，应用研究较少。中国对眼镜蛇毒NGF的研究主要集中在舟山眼镜蛇、江浙蝮蛇（Agkistrodon halys Pallas）、白眉蝮蛇毒（Agkistrodon halys ussuriensis）和尖吻蝮蛇毒（Agkistrodonacutus）蛇毒中的眼镜蛇毒NGF，对舟山眼镜蛇眼镜蛇毒NGF的研究较深入。根据现有的资料分析，眼镜蛇科蛇毒多数含眼镜蛇毒NGF，而且含量较高； 蝰科蝰亚科NGF的分布和含量次之； 响尾蛇科和蝰科蝮亚科蛇毒中NGF含量很低。[6-7]
眼镜蛇毒NGF的生物学效应广泛，主要通过以下几个方面表现：（1）神经再生作用：直接于再生轴突，通过受体介导细胞内信号传导，激活各种分化因子，发挥神经趋化作用，引导和加快轴突生长；调控雪旺细胞的增殖和分化。（2）促进神经的芽生作用。（3）保护受损的神经元：减少受损神经细胞的死亡和调控受损神经元的基因表达。（4）促进炎性反应趋化作用和再生神经的血管形成。眼镜蛇毒NGF具有促进新血管形成作用，其机制在于眼镜蛇毒NGF能促进神经细胞内Ca2+向细胞外释放，Ca2+外流导致神经细胞紧张性增强，兴奋性降低，使血管扩张增强，从而加大血流量；眼镜蛇毒NGF能促进神经病损后的肌梭的细胞分化，可促进皮肤和肺的成纤维细胞的修复。有研究发现，眼镜蛇毒NGF能增强葡萄糖引起的胰岛素分泌作用，有可能是细胞自分泌或旁分泌调节的机制之一。另外，有研究发现成骨细胞存在眼镜蛇毒NGF的低亲和力受体L眼镜蛇毒NGFR，内源性和外源性的眼镜蛇毒NGF可与L眼镜蛇毒NGFR结合，达到细胞间信息传递的作用，从而使成骨细胞发生磷酸化，成骨能力增强。[8-9]
理化性质
晶体结构董跃伟等通过离子交换色谱、凝胶过滤及FPLC色谱分离纯化得到中华眼镜蛇蛇毒神经生长因子，NGF在SDS-PAGE中为单一条带，由两个分子质量为13500 u的亚基组成一个完整的分子，分子量为27000 u左右，紫外吸收光谱测定显示在279.6 nm处有一个最大吸收值，N端蛋白质序列测定显示中华眼镜蛇毒NGF与其它蛇毒NGF的N端蛋白序列相似。Gu等利用X射线衍射分析了通过悬滴蒸气扩散法从眼镜蛇毒液中纯化得到的β-NGF的晶体结构，该晶体为四方空间群P4（1）2（1）2，其对映异构体为P4（3）2（1）2，晶胞参数为a=b=61.75，c=154.40A，β-NGF以二聚体形成存在于晶体不对称单元中。刘一平等从眼镜蛇毒中分离的NGF用于治疗外周神经损伤、视神经损伤和早老性痴呆等有一定疗效。[10-12]
化学性质眼镜蛇毒NGF分为两类：一类是分子量为25KD的由两个相同或相似的亚基组成的二聚体，每个亚基分子量为13KD，不含糖基，亚基具有和鼠的β-NGF非常相似的性质；另一类是分子量为35KD的糖蛋白，含有10%～20%的糖基，这一类中有一部分是二聚体结构，而还有一些分子是未知的。有人认为这两类眼镜蛇毒NGF也有着相同的蛋白质，也许两者的差别仅在于是否含有糖基。[13-15]  SDS电泳相对分子质量标准曲线[15]
Angeletti发现眼镜蛇毒NGF由两个同源亚基构成，每个单位含117个氨基酸，分子量大约为28kD，眼镜蛇毒NGF等电点偏低，无蛋白水解酶或其它酶的活性。具有很高的稳定性，在一些极端条件，如0.1N HCl、0.1N NaOH存在下也不失活，对一些常见的蛋白酶如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶具有抵抗能力。在相同蛋白质浓度下，眼镜蛇毒NGF能引起小鸡胚胎背侧根神经节轴突最大限度的生长，但较少的轴突生长和较大的细胞移行。[16-17]眼镜蛇毒神经生长因子电泳图(2张)
眼镜蛇毒神经生长因子电泳图图册参考资料。[18-19]
分离纯化已有多种从蛇毒中提取NGF的层析法报道。Hogue-Angeletti等人于1968年利用四步层析法第一次从蛇毒中提取到了NGF，每步的色谱填料分别为Sephadex G-I00，DEAF cellulose，SephadexG-75 and CM-Cellulose。测得的活性物质的分子量为20-40kD，说明他们此次得到的并非纯品。1976年他们提出了两步纯化程序，即，凝胶过滤色谱连接一阳离子纤维素色谱的方法，但其中采用了透析脱盐的过程，大大的延长了纯化时间，而且增大了眼镜蛇毒NGF的活性损失。采用这种方法得到的蛋白产率为0.15%，耗用的色谱分离时间约为310hr。同年，Furukawa用凝胶过滤柱+离子交换柱+凝胶过滤柱的方法从中华眼镜蛇蛇毒中分离出了眼镜蛇毒NGF，并证明了蛇毒中所含有的NGF的等电点约为7.02。采用这种方法得到的蛋白产率为0.45%，耗用的色谱分离时间约为150hr。1985年Khamiclov等人用凝胶色谱+离子交换色谱+G-75Superfine Sephadex薄层色谱等电聚焦法从眼镜蛇蛇毒中纯化了眼镜蛇毒NGF。1986年Siiguir等人从vipera berus berus venom中得到了纯化的眼镜蛇毒NGF，采用的工艺为Sephadex G-100凝胶柱+DEAESephadex A-50离子交换柱+PBE 11层析聚焦法。他们所得的眼镜蛇毒NGF蛋白的产率为0.41，耗用的色谱分离时间约为170hr。[20-25]  凝胶过滤色谱分离[19]
提纯的方法由实验条件和技术决定。Furukawa等从眼镜蛇科的Naja naja atra中提取眼镜蛇毒NGF时采用了凝胶过滤，低压冻干，离子交换层析和透析法。Siigur等使用单克隆抗体亲合层析从10多种蛇毒中获得了眼镜蛇毒NGF。Kostiza等用阳离子交换色谱，真空冷冻干燥法和RPLC色谱从蛇毒中分离了眼镜蛇毒NGF。虽然使用不同的纯化方案，来自不同腺体的蛇毒纯化得到的眼镜蛇毒NGF产率有所不同，但大致都为0.2%～0.5%（w/w），而来自小鼠颌下腺的NGF产量仅为0.002%～0.0025%，相对而言，眼镜蛇毒NGF产率很高。利用PC-12细胞系可以很好地检测眼镜蛇毒NGF的生物活性，因此，这个检测系统被用来筛选层析法得到的眼镜蛇毒NGF。PC-12细胞培养检测必须保证没有细胞毒性物质，蛇毒中的磷脂酶A2、细胞毒、心脏毒、多肽外切酶、多肽内切酶、核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶等都是影响细胞培养检测的有毒或有害物质。Kostiza等用PC-12细胞检测眼镜蛇毒NGF，发现即使高度稀释的蛇毒溶液也能检测出来，但前提是提纯的溶液中细胞毒性物质必须失活。[26-29]  色谱分离工艺流程[29]
从蛇毒中提取NGF有分子筛层析、离子交换层析、亲和层析和基因工程制备等方法。分子筛层析，离子交换层析是最常用的方法，但缺点是步骤繁琐，蛋白的活性损失大。至于是先进行还是后进行分子筛层析要依具体情况而定，部分眼镜蛇毒NGF分离过程还要其他方法辅助。从分离介质的化学稳定性、商品的可获得性和商品成本方面考虑，具有实际用途的方法则是比较经典的、且在文献上大量使用的凝胶过滤十离子交换+凝胶过滤模式。但是这种方法存在这以下两个致命的弱点：（1）第一步的凝胶过滤过程中一般都需要100多个小时，不但操作时间长，而且蛋白与介质的长时间接触，使得所需的目标蛋白的活性有可能降低。（2）在第一步中采用的凝胶过滤法，由于凝胶介质吸附容量较小，使得样品的处理量很小，因此，只能用于实验室少量样品的制备，很难放大到中试和生产规模上。[30-31]
用层析方法可分离出多种眼镜蛇毒NGF，例如吴鹏等采用DEAE-Sepharose F.F和Sephadex G-50二步柱色谱工艺从舟山眼镜蛇（Najanaja atra）蛇毒中分离得到电泳和色谱纯的眼镜蛇毒NGF。由于眼镜蛇毒NGF在粗毒中的含量较低，加上一些未知的因素，使得它的分离纯化成为一件非常困难的工作，经过反复层析导致眼镜蛇毒NGF失活，得率较低，利用亲和层析一步法分离眼镜蛇毒NGF是今后分离工作的方向。鉴于眼镜蛇毒NGF在蛇毒中含量少，而眼镜蛇毒NGF在临床应用中存在的巨大潜在价值，科学工作者探索利用基因工程的方法获得具有生物活性的眼镜蛇毒NGF，郭丽英等已经将江浙蝮眼镜蛇毒NGF的基因转入大肠杆菌和家蚕幼虫，并表达出具有生物活性的眼镜蛇毒NGF，基因工程制备眼镜蛇毒NGF将是今后研究工作的重点之一。[32-35]
检测检测是分离纯化、功能研究和应用研究的基础。眼镜蛇毒NGF的检测包括纯度检测和活性检测，纯度检测采用蛋白质纯度检测的常规方法进行，例如SDS-PAGE、色谱法等。活性检测主要有2种方法：鸡胚背根神经节组织培养检测法和PC12细胞培养检测法。前者是眼镜蛇毒NGF活性测定的经典方法，实验条件要求简单。该法最早由Levi-Montalcini于1954年创立；而PC12细胞培养检测法灵敏性高，但实验条件要求较高，所以鸡胚背根神经节组织培养检测法仍是最为常用的眼镜蛇毒NGF活性测定方法。[36]  鸡胚背根神经节法测定NGF生物活性[36]
方法一：鸡胚背根神经节组织培养检测法是活性检测的经典方法。取8d龄鸡胚背根神经节，接种于涂有鼠尾胶的细胞瓶中，贴壁后，加入不同浓度眼镜蛇毒NGF，同时设空白对照，37℃5%CO2孵箱培育24 h，倒置显微镜下观察，以引起神经节树突生长达7 nm 的最低浓度为一个眼镜蛇毒NGF活性单位，乘稀释倍数，换算成每mL 含活性单位数，再使用Lowry 法测定蛋白含量。根据测得的眼镜蛇毒NGF活性单位和蛋白含量，计算出每mg 蛋白所含活性单位数，即为比活性。方法二：大鼠肾上腺嗜铬细胞（pheochro-mocytoma cells，PC12）培养检测法，此法的理论依据是眼镜蛇毒NGF能在无血清培养液中与PC12细胞上的受体结合，使PC12细胞长出轴突向神经细胞方向分化。两种检测方法的简单比较：方法一优点是特异性高，实验条件简单；缺点是操作复杂，干扰因素多（自备鸡血浆、鸡胚浸液和鼠尾胶原，易污染），实验结果主观，重复性差，一般用于定性测定。方法二优点是灵敏性高，操作简单，干扰因素少，实验结果客观，重复性好，用于定性和定量分析；缺点是实验条件要求高（眼镜蛇毒NGF中细胞毒性物质须失活，需要合适的PC12细胞亚系等）。[37]
空间结构
眼镜蛇毒神经生长因子含有α、β、γ3个亚基，可表示为α2βγ2。其中α和γ亚基的作用是维持β亚基的稳定性，调节其生物活性。而β亚基由2条各含有188个氨基酸残基的相同肽链组成，是神经生长因子的活性亚单位，发挥全部生物学效应。眼镜蛇毒NGF通过与细胞表面的两类受体结合而发挥作用。但两类受体在亲和力、稳定性、分布和生物学功能等方面有所不同。一类是高亲和力的酪氨酸激酶受体（TrkA），它是由原癌基因TrkA编码的蛋白酪氨酸激酶，是眼镜蛇毒NGF的功能性受体。另一类是低亲和力的p75受体（p75NTR），属于肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族。二者均为跨膜蛋白受体，参与调节以神经元为主的某些细胞的生长、分化、存活、修复以及凋亡等多种生物学效应。研究表明，二者间的信号转导及生物学效应既相互协同又彼此拮抗，既紧密联系又有显著区别。TrkA一般介导“正性”信号，TrkA的激活会导致一系列磷酸化级联反应，促进神经元生长、存活和分化；而p75NTR则具有多种生物学效应，除可促进神经元存活、生长外，还可诱导神经元凋亡、抑制神经元轴突生长以及参与细胞周期的调节，即可介导“正性”和“负性”两种效应，但以介导“负性”促凋亡效应为主，这与p75NTR所在细胞的类型、生理与功能状态、发育阶段以及局部环境有关。[38-40]  眼镜蛇毒NGF蛋白单体三级结构[39]
分子量为140000的糖蛋白，由α、β、γ三种肽链按α2βγ2的比例构成，肽链间以共价键结合；人的眼镜蛇毒NGF受体基因位于第17号染色体，为单拷贝基因，有6个外显子，第一个外显子编码信号肽，第二、三个外显子编码膜外区，第四个外显子编码跨膜区，第五、六个外显子编码胞内区。经过几十年的研究，眼镜蛇毒NGF的蛋白结构已基本了解清楚，三维结构已从其晶体图像证实。它由两个相同的亚单位组成，亚单位由三个β转角连接的三对反平行β折叠组成。亚单位间通过“半胱氨酸结点”连接。发现的眼镜蛇毒NGF均为糖蛋白，其构型至关重要的氨基酸在神经营养素家族中保守，不同于眼镜蛇毒NGF的特性由可变区的氨基酸决定，可变区的变化不影响它们的基本结构，但对特异性受体的结合起决定作用。眼镜蛇毒NGF单体保守结构主要包括两对反向平行的β链，β链构成了眼镜蛇毒NGF长而扁平的形状，其中包括六个半胱氨酸残基，组成三对二硫键，这三对二硫键为组成眼镜蛇毒NGF的结构提供刚性支持，其中的两对及其相连的残基形成了一个环状结构（Cys58-Cys108，Cys68-Cys110），第三对（Cys15-Cys80）穿过此环形成紧密包裹的“半胱氨酸结”，这种结构使得两个眼镜蛇毒NGF单体中的β链互相包裹，组成一个较大的由芳香族氨基酸残基构成的疏水单体交界面，沿着两个单体平面的轴形成了眼镜蛇毒NGF二聚体的活性分子，组成疏水面的氨基酸残基对眼镜蛇毒NGF三维结构的形成起了主要作用，还有一些氨基酸残基通过氢键和盐键，辅助支持三维结构的稳定性。当与高亲和力受体结合时，保守结构，尤其是β3β4链形成配体受体复合物起到支持作用，因为这种结合需在眼镜蛇毒NGF二聚体的疏水面上进行。眼镜蛇毒NGF结构中位于转角Ⅰ区和Ⅴ区的正电荷区参与p75的结合，该区域由至少3个带电荷的赖氨酸残基组成。眼镜蛇毒NGF与TrkA的结合需要至少眼镜蛇毒NGF分子中5个不同区域参与，结合的位点分布于眼镜蛇毒NGF的二聚体，并集中在眼镜蛇毒NGF二聚体一边。整个结合位点呈一平面并与眼镜蛇毒NGF的二重旋转轴基本平行。由于眼镜蛇毒NGF二聚体呈二重旋转轴对称，眼镜蛇毒NGF有两个TrkA的结合位点，有利于TrkA受体二聚体的形成。[41-42]
眼镜蛇毒神经生长因子氨基酸序列参考资料。[43]
眼镜蛇毒神经生长因子氨基酸序列(2张)
TrkA主要由一种跨膜酪氨酸激酶gp140 Trk组成，它是原癌基因Trk的产物。当眼镜蛇毒NGF与TrkA结合后，在眼镜蛇毒NGF作用下gp140 Trk能够自我催化酪氨酸残基磷酸化，从而增强自身的酪氨酸激酶活性，这是眼镜蛇毒NGF发挥生物效应的始动阶段，活化后的Trk A将接受到的信号向细胞内传送则需通过ras原癌基因编码蛋白p21ras，随后通过RAS/MAPK信号通路的激活，影响基因的转录和翻译，表现为对细胞生长的调控。眼镜蛇毒NGF与Trk A之间的相互作用是影响恶性肿瘤细胞生长、扩展和播散的重要因素。眼镜蛇毒NGF低亲和力受体p75参与介导细胞凋亡。在Trk A受体通路未被激活的情况下，p75在促进细胞凋亡的过程中尤为重要。当过量表达p75时，p75部分活化导致细胞凋亡，Trk A处于被抑制状态；在与眼镜蛇毒NGF结合后p75被激活，表现出与Trk A相互作用，解除了对它的抑制，从而表现出TrkA的高亲和能力，发挥TrkA高亲和受体作用，启动了促细胞存活信号。在细胞水平上，眼镜蛇毒NGF与p75结合可导致几条细胞内信号通路的活化，包括NF-κB、Jun激酶激活以及激活酸性鞘磷脂酶产生神经酰胺等。NF-κB通路可促进细胞存活，而Jun激酶通路和鞘磷脂的水解则促进细胞凋亡。[44-46]
广西眼镜蛇眼镜蛇毒NGF的克隆结果为：RT2PCR扩增得到单一条带，其大小与预期一致，800 bp左右。将该条带克隆至pMD218T载体中，序列分析结果显示我们所得到的cDNA长802 bp，其中编码框有723 bp，编码由241个氨基酸组成的眼镜蛇毒NGF前体。其前体N端18个氨基酸组成的信号肽，很好的吻合21/13信号肽切割位点识别规则。K124和R125位点是潜在的蛋白质加工位点，加工为由119个氨基酸构成的成熟蛋白质。另外145~147位的NKT为潜在的N端糖基化位点。将不同氨基酸相同的化学性质计算在内，同源性更高。其中在prepro区域中，由18个氨基酸残基构成的信号肽及功能域Ⅰ和功能域Ⅱ被认为对眼镜蛇毒NGF前体加工、切割、折叠形成有生物活力的眼镜蛇毒NGF至关重要。另外，还有一些重要的氨基酸为眼镜蛇毒NGF维持其空间结构、保证其生物活力所必需，尤其是6个特征性的半胱氨酸。广西眼镜蛇眼镜蛇毒NGF在这些重要的区域及氨基酸与已知的眼镜蛇毒NGFS具有严格的保守性。[47-50]
毒理
毒蛇蛇腺中高浓度眼镜蛇毒NGF的存在预示着眼镜蛇毒NGF可能与毒蛇毒性有关，或是直接的毒性，或是间接的毒性。1970 年，Angeletti等实验发现纯化的眼镜蛇眼镜蛇毒NGF在体内和体外均无直接毒性作用。但是这不能排除眼镜蛇毒NGF对毒蛇毒性的影响，提示人们对眼镜蛇毒NGF间接毒性作用重要性的研究。后来人们发现，眼镜蛇毒NGF可与其它毒素发生协同作用。眼镜蛇毒因子（Cobra venom factor）与眼镜蛇毒NGF即可发生协同作用，当眼镜蛇叮咬后，眼镜蛇毒因子入侵，进入血液，使循环系统中C3、C5补体成分大量减少，形成过敏毒素C3a、C5a。这些过敏毒素除了趋化作用外，还能促进肥大细胞和嗜碱性粒细胞介质的释放。而C3a在眼镜蛇毒NGF的协同作用下剧烈引发嗜碱性粒细胞的脱颗粒作用，远远强于它们的单独作用，从而带来强烈的免疫系统过敏反应。因此，眼镜蛇毒NGF的作用可看成是对其他毒物机理的增强。[51]
眼镜蛇毒NGF可以使嗜碱性粒细胞发生过敏性的脱颗粒反应，使其具有一定的免疫学功能甚至一定的毒性。Kositza 等研究了纯化的Naja naja atra眼镜蛇毒NGF在全血、离体粒细胞、血小板和血管活动中的活性。发现眼镜蛇毒NGF能诱导全血细胞中血浆外渗和组胺释放。眼镜蛇毒NGF引起组胺分泌上升，同时可能促进或拮抗炎症反应。前者是由于组胺作用于毛细血管壁受体使毛细血管通透性上升，其效应可被H1阻抗剂有效抑制；后者是通过H2受体引起靶细胞cAMP水平上升，从而抑制靶细胞的组胺的释放而实现。组胺可以抑制免疫系统，这是组胺抗炎症的一个原因。因此，眼镜蛇神经生长因子的非神经元效应可能用来解释在炎症反应时的免疫调制活动。[52]
生理功能
分布眼镜蛇毒NGF在体内可由不同来源的细胞分泌，包括神经细胞和非神经细胞。在中枢神经系统主要分布于胆碱能神经元，尤以海马齿状回的颗粒细胞层及CA1~CA3区的锥体细胞层以及大脑皮层中含量最高。在外周神经分布在有交感神经或感觉神经支配的组织中。在这些组织中，靶区NG-FmRNA的含量与交感神经或胆碱能神经的分布密度呈正相关。[53]
作用机制眼镜蛇毒NGF在损伤早期应用能减轻神经纤维发生的溃变，从结构和功能上促进受损神经的再生修复；而持续在损伤局部注射眼镜蛇毒NGF，术后30天则发现神经纤维大量再生，结构紊乱，轴突消失，未见新生郎氏结，再生神经纤维数量已明显超过对照组和术后10d组水平（P<0.01），行为学评价结果支持组织学的改变：术侧肢体在术后16d左右出现足底刺激反应消失，肢体瘫痪的改变。说明眼镜蛇毒NGF能持续刺激神经纤维大量再生，再生的神经纤维结构紊乱，已不具有正常的组织结构，致使神经纤维的传导功能丧失。有关资料显示：有限的内源性眼镜蛇毒NGF在周围神经损伤再生中没有明显的作用，而给以超生理剂量的外源性眼镜蛇毒NGF能显著改善神经损伤后的功能和神经化学的缺陷，因此认为周围神经受损后，给以高剂量的眼镜蛇毒NGF可能获得较好的疗效。[54-55]
眼镜蛇毒NGF通过与神经元细胞膜表面受体结合而发挥作用，发现有两类受体：一种是结合配基后又很快释放的低亲和力受体（L NGFR），低亲和力受体系一相对分子质量为75 ku的跨膜糖蛋白，称P75（L NGFR）。所有眼镜蛇毒NGF家族成员的低亲和力结合都是通过P75（L NGFR）。现已知P75（LNG-FR）具备一种诱导细胞凋亡的作用，由于结合了眼镜蛇毒NGF而被抑制。另一种是结合后缓慢释放的高亲和力受体（H NGFR），该受体是由原癌基因酪氨酸激酶（TrK）编码的蛋白质构成，包括3种类型（TrKA、TrKB和TrKC）。眼镜蛇毒NGF的高亲和力受体是TrKA，相对分子质量为140 ku，称为P140（TrKA），可引导细胞的神经营养效应，TrKB是BDNF和NT24/NT25的高亲和力受体，相对分子质量为145 ku，称P145（TrKB）。TrKC是NT23的高亲和力受体，相对分子质量约为145 ku，称P145（TrKC），NT23在高浓度时还可结合TrKA、TrKB和TrKC。TrKs和眼镜蛇毒NGFs结合后，Trk被激活，自身发生酪氨酸磷酸化，同时引起一系列反应，如激活细胞内的信号传递系统、激活细胞分裂蛋白激酶及激活并诱导某些基因表达。[56-57]
对神经系统的作用在胚胎发育期，眼镜蛇毒NGF为神经元发育所必需。眼镜蛇毒NGF能诱导神经纤维定向生长，刺激胞体和树突的发育，增加神经纤维支配区的密度，促进神经元的分化发育，使感觉神经、交感神经节数目增加、体积增大、纤维延长，促进蛋白质合成，糖和脂类代谢，促进亚细胞器的发育，尤其影响与神经分化密切相关的结构和功能蛋白的表达与修饰。在胚胎发育早期，中枢眼镜蛇毒NGF的含量决定胆碱能神经的密度。但在无胆碱能神经支配的小脑和下丘脑，眼镜蛇毒NGF含量也较高，表明除胆碱能神经外，眼镜蛇毒NGF对其他类神经元也有营养作用。在神经元发育成熟期，眼镜蛇毒NGF和眼镜蛇毒NGF受体明显减少，主要效应神经对眼镜蛇毒NGF的依赖性也显著降低，只有部分交感神经元仍需依赖眼镜蛇毒NGF存活。[58]
眼镜蛇毒NGF能维持神经损伤后轴突再生的需要，刺激轴突发芽和突触形成，促进神经细胞的再生。当眼镜蛇毒NGF的效应神经元受损时，可引起相应区域的眼镜蛇毒NGF和眼镜蛇毒NGF受体表达明显增加。眼镜蛇毒NGF能通过抑制自由基的损害和防止组织内钙离子浓度的升高来维持钙离子的稳定状态，从而保护神经元免受兴奋性氨基酸等引起的损伤。另外，眼镜蛇毒NGF还能通过抑制P75介导的细胞凋亡等机制减轻或防止继发性病理损害的发生。中枢胆碱能神经元为眼镜蛇毒NGF依赖性神经元。眼镜蛇毒NGF可引起中枢胆碱能神经元增生和存活时间延长，有效保护胆碱能神经元受损伤所致的神经变性，改善学习和认知功能。同侧脑室注入眼镜蛇毒NGF可以防止内隔核胆碱能神经元的死亡，并明显减轻隔核、海马胆碱乙酰化酶降低的程度。[59-60]
转铁蛋白（Transferrin，Tf）受体存在于大脑毛细血管内皮细胞膜上，当Tf与其结合以后，可介导Tf透过血脑屏障（Blood-brain barrier，BBB）。张春燕等建立AD大鼠模型，将眼镜蛇毒NGF与Tf通过生物素（Biotin）-亲和素（Avidin）系统偶联，形成眼镜蛇毒NGF-T，f由鼠尾静脉注入。结果显示：眼镜蛇毒NGF-Tf能成功穿透BBB，一方面眼镜蛇毒NGF作用于基底前脑胆碱能神经元的眼镜蛇毒NGF受体，有效防止胆碱能神经元变性和胆碱乙酰转移酶活性下降，促进功能恢复，另一方面眼镜蛇毒NGF促进未损伤纤维侧支发芽到达失神经支配的海马，有效改善学习记忆和方向辨别障碍。大量的研究表明凋亡参与阿尔茨海默病（Alzhemi er dis-ease，AD）患者神经元的变性丢失。β-淀粉样蛋白（Amyloidprotein，Aβ）是脑内细胞外老年斑的主要成分，AD病人的Aβ含量明显高于正常。在体外培养和转基因小鼠试验中Aβ作为一种细胞毒性物质可引起神经细胞的坏死和凋亡。何艳通过Aβ毒性片断Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡建立体外AD细胞模型，检测眼镜蛇毒NGF干预下细胞凋亡的变化。发现眼镜蛇毒NGF能部分对抗PC12细胞凋亡，当神经生长因子被剥夺，可引起PC12细胞凋亡。眼镜蛇毒NGF能够保护PC12细胞因血清撤退所致的凋亡，其机制与激活TrkA-PI3-K（磷脂酰肌醇3-激酶，phosphatidylinostol3-kinase）/Akt（蛋白激酶B，PKB）途径，并促进Bcl-2的表达和抑制caspase-3的激活相关。[61-65]  眼镜蛇毒NGF对神经节的刺激作用[66]
眼镜蛇毒NGF在抑制细胞凋亡的作用方面其他学者也做了大量的研究。文亮等通过四血管闭塞法建立大鼠全脑缺血-再灌注模型，通过侧脑室注射眼镜蛇毒NGF，免疫组织化学法检测凋亡相关因子P75NTR、Bcl-2、Bax的表达，TUNEL法检测神经元凋亡，发现再灌注后海马CA1区P75NTR、Bax的表达增加，推测眼镜蛇毒NGF的抗凋亡作用可能通过其受体来调节。李强等[9]试验发现眼镜蛇毒NGF对小脑皮层神经细胞凋亡有明显抑制作用。[67-68]
杜秀娟等用新生大鼠视网膜神经细胞体外原代培养技术，加入不同浓度的眼镜蛇毒NGF进行培养，观察视网膜神经节细胞（retinalganglion cells，RGCs）在体外的存活时间，比较实验组和对照组的RGCs个数、胞体直径和轴突长度。结果显示眼镜蛇毒NGF能促进体外视网膜神经细胞和RGCs的存活及轴突的伸长，有保护视神经的作用。[69]
桑延智等用链脲佐菌素制作糖尿病大鼠动物模型，观测糖尿病大鼠视网膜的超微结构变化，发现给予眼镜蛇毒NGF后大鼠视网膜血管、感光细胞和RGCs的超微结构有明确的改善作用。Eugenia等发现眼镜蛇毒NGF能显著抑制糖尿病患者背根神经节细胞的减少，并能增强神经纤维的再生。[70]
对免疫系统作用许多免疫细胞上都存在NGF受体，眼镜蛇毒NGF能增强特异性和非特异性免疫反应，通过影响免疫细胞的活性调节免疫系统的功能。张学荣等给颅脑创伤大鼠模型腹腔注射眼镜蛇毒NGF，发现大鼠脾细胞体外增殖能力、脾细胞分泌IL-2能力、外周血ANAE阳性细胞百分比和腹腔巨噬细胞吞噬活力显著增高。陈丽华等临床上用眼镜蛇毒NGF与胶原蛋白联合治疗急性感染控制后痤疮病人，发现两者联用可提高痤疮皮肤的免疫功能，加速皮肤修复，不留疤痕，无色素沉着，美容效果明显提高。[71-72]
对血液和血管的作用纯化的眼镜蛇毒NGF无论在体内或体外都被证实没有直接的毒性作用。程勃超等猜测眼镜蛇毒NGF与磷脂酶A2产生协同作用，分解脂肪酸，释放花生四烯酸，产生前列腺素、前列环素、血栓素等，这些产物作用于局部或全身，破坏细胞膜结构，引起大量溶血。Kostiza等发现局部注射眼镜蛇毒NGF后，由于血管通透性增高导致血浆外渗，造成毒性物质释放。加入组胺拮抗剂可以降低该反应，表明内源性组胺参与了对眼镜蛇毒NGF的响应。[73-74]
对生殖系统作用徐天瑞等证明，中华眼镜蛇（Naja naja atra）毒液中的眼镜蛇毒NGF对大鼠雄性生殖系统有影响。眼镜蛇毒NGF改善雄性大鼠的附睾精子活力，增加交配雌性大鼠的妊娠率和胎儿数目，改善了雄性大鼠的生育力。眼镜蛇毒NGF对睾丸有保护效应，给药眼镜蛇毒NGF-棉酚的雄性大鼠的促黄体激素（LH）和促卵泡激素（FSH）的血清水平比给药棉酚的雄性大鼠的低，眼镜蛇毒NGF抑制了棉酚对睾丸的有害效应，但机制有待更进一步的研究。[75-80]
医学作用
抗肿瘤眼镜蛇毒NGF通过抑制肿瘤细胞的有丝分裂促进肿瘤向良性方向分化。报道眼镜蛇毒NGF对一些神经和非神经肿瘤如前列腺癌、肺癌、乳腺癌等有抗肿瘤作用。在人类小细胞癌，眼镜蛇毒NGF可抑制癌细胞的增殖，阻止克隆生长，在体外可削弱它们的入侵能力。研究表明眼镜蛇毒NGF可通过细胞毒作用、增殖抑制、抑制肿瘤血管形成等多种机制产生抗肿瘤作用，对体外培养的前列腺癌人白血病细胞株K562、人胰癌细胞株JF305、人肺癌细胞株AGZY-83a和人胃癌细胞株MG-803均具有细胞毒性和生长抑制作用。[81]
许多研究表明：肿瘤细胞凋亡与细胞周期的特异性有一定的联系。许多抗肿瘤药物正是通过诱导细胞周期特异性细胞凋亡，达到治疗目的。不同药物诱导的细胞凋亡可发生在细胞周期的不同时相，当细胞凋亡发生时，细胞先被阻滞在细胞周期的某一时相，然后发生细胞凋亡。经流式细胞仪检测发现，眼镜蛇毒NGF处理后的CNE-2细胞，细胞周期发生了变化。其中G0/G1期细胞增多，S期和G2/M期细胞数减少，使G0/G1期细胞堆积，说明眼镜蛇毒NGF使CNE-2细胞阻滞在G0/G1期。凋亡细胞的百分率随着眼镜蛇毒NGF浓度的增高而逐渐增高，凋亡率与对照组相比差异有显著性（P<0.05或0.01），通过诱导凋亡抑制肿瘤细胞的生长。眼镜蛇毒NGF抗肿瘤活性与诱导肿瘤细胞凋亡有关。说明眼镜蛇毒NGF具有一定的抗肿瘤作用。[82]
眼镜蛇毒NGF对HSCT6细胞生长形态影响(2张)眼镜蛇毒神经生长因子对HSC-T6细胞生长形态的影响图册参考资料。[83]
眼镜蛇毒NGF对PC12细胞生长形态的影响(3张)眼镜蛇毒神经生长因子对PC12细胞生长形态的影响图册参考资料。[83]
Kukhtina等发现从眼镜蛇Najakaouthia毒液中获得的眼镜蛇毒NGF在无血清培养基中比小鼠颌下腺眼镜蛇毒NGF更能有效防止PC12细胞的死亡；Khafizova 等用鼠类黑素瘤KML 细胞进行的体外实验表明中亚眼镜蛇Naja oxiana 眼镜蛇毒NGF对癌细胞作用的性质类似于小鼠眼镜蛇毒NGF，具有抗肿瘤活性，但是强度次于它，该眼镜蛇毒NGF增加了无毒的蛇毒蛋白质具抗肿瘤活性的目录。[84-85]
药剂学研究刘秀文等用125I 标记舟山眼镜蛇毒NGF，研究了125I-眼镜蛇毒NGF在大鼠体内的代谢动力学，发现坐骨神经放射性强度明显高于血清，提示眼镜蛇毒NGF与坐骨神经结合并发挥作用。杨坷等用131I标记舟山眼镜蛇毒NGF，对兔眼结膜下和玻璃体内分别进行注射给药。结果表明，结膜下注射眼镜蛇毒NGF后兔眼玻璃体内药物浓度在6h 达高峰，而玻璃体内注射在1h达高峰并能在眼内达到较高的药物浓度并维持较长时间，说明玻璃体内给药好于结膜下给药。[86-87]
对动物坐骨神经损伤模型的研究许多药效研究都是在动物坐骨神经损伤模型上进行的，眼镜蛇毒NGF的效用也是确定的。研究者所用的眼镜蛇毒NGF来源多样，但都从蛇毒中分离而来。刘宁宇等发现，大鼠坐骨神经损伤后乙酰胆碱酯酶（AchE）和酸性磷酸酶（ACPase）活性明显下降，给药舟山眼镜眼镜蛇毒NGF后AChE 活性恢复快于盐水对照组，ACPase 也逐渐增高，眼镜蛇毒NGF可能通过影响酶的活性而加快受损神经恢复。陈丽华等观察舟山眼镜蛇毒NGF对去部分背根猫脊髓背角内生长相关蛋白-43（GAP-43）表达的影响，发现眼镜蛇毒NGF能有效诱导脊髓损伤修复过程中神经元GAP-43的合成而促进背根的侧支出芽，出芽密度与眼镜蛇毒NGF的治疗剂量有关。[88-89]
如何生产出活性稳定的成品，赋形剂的作用不可忽视。王立兰等用舟山眼镜蛇毒NGF为主要成分，对赋形剂配方进行了系统的研究，确定了一个不容易引起外来物过敏反应、对眼镜蛇毒NGF活性保持比较好的配方，已用于眼镜蛇毒NGF成品生产。[90]
神经系统修复眼镜蛇毒NGF的发现，为人类神经系统损伤的修复带来了曙光，也为许多的疑难杂症的医治带来了希望。根据小鼠领下腺神经生长因子临床使用的有关资料证明，眼镜蛇毒NGF的主要疗效表现在以下凡个方面：（1）促进修复神经损伤。主要应用的临床病症有：神经炎、原发性癫痈、神经衰弱、血管神经性头痛、脑膜炎、脑外科手术后遗症、农药中毒性脑病后遗症、脑中风后遗症、神经性耳聋、小儿麻痹症、脑萎缩、肌肉侧索硬化症等疾病。（2）治疗和缓解Alzheimer型老年痴呆症、老年舞蹈症、帕金森氏综合症、格林巴利综合症等老年退行性病症。（3）能有效的抑制某些肿瘤的有丝分裂，促使其向良性分化。如眼镜蛇毒NGF对黑色素瘤、结肠癌等肿瘤有一定的疗效。（4）促使皮肤组织的愈合，特别是对长期性溃烂具有较好的疗效。（5）促使胚胎早期发育和调节抗体免疫功能。（6）具有防止学习和记忆功能缺陷的功能。[91-92]