标题：抗原修复
基本信息
在免疫组化染色后的镜下观察中，有发现这样的结果，阳性物反应不强，时隐时现，表达不均匀，有时可出现假阴性，这是因为： 
1.组织在用甲醛固定的过程中所形成的醛键可封闭抗原的决定族。甲醛与组织蛋白质类的反应是多样而复杂的，因为它能和多种不同的功能基团结合，在多数情况下在其间形成桥键8。这也是甲醛的一个作用，因为它是一种聚合固定剂，因而能在相邻的蛋白质键间形成桥键的作用。 
2. 甲醛在保存进程中会形成羟甲基，也可封闭抗原决定族。据French和Edsall的研究认为，最常遇到的甲醇反应，就是加到一个含反应性氢原子的化合物中，形成一个羟甲基化合物。 
3.在组织固定过程中，甲醛与蛋白质发生交联，形成醛交联蛋白，这种化合物封闭了抗原，使之无法表达出来。 
为了解决上述存在的问题，更好地暴露出抗原，将其很好地显示出来，目前世界上公认的方法就是必须进行抗原修复。 
至今为止，抗原修复有许多种方法，在这些方法中，有的是根据抗体的要求来进行，有的是根据抗原的表达程度来进行，我们则对每种病例每项检测，都要求必须进行抗原修复，以达到抗原全面表达的最佳状态。
物理化学试剂抗原修复法。
1. 真空负压抗原修复法： 
① 切片脱蜡至水。 
②0.3%H2O2甲醇真空负压处理5分钟。 
③自来水洗，蒸馏水洗。 
④0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），真空负压干燥箱预先调至95℃，真空负压处理10分钟。 
⑤待修复注降至室温的一，PBS洗3次，随后按选好的免疫组化染色方法进行染色。 
这是一种操作简单，效果特佳，温度恒定，能一次性处理大量切片的方法。该法的最大的特点有四：一是各物质的分子在失重的情况下四处飘游，增加各分子间的碰撞机会；二是有恒定的温度，既能使甲醛固定的蛋白发生变性，又不需要使抗原修复液达到沸腾，不会导致切片因抗原修复液的沸腾而离开载片，保证了染色的成功率，减少了因掉片而反复制片的麻烦，保证了病理报告的及时发生，为病人争取更多的时间；三是不受条件限制，不管是金属性的不是非金属的都可以进行操作；四是可以一次性制作大批的切片。 
2.微波辐射抗原修复法：
①切片脱蜡至水。 
②0.3%H2O2甲醇处理10分钟。 
③自来水洗，蒸馏水洗。 
④ 0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），于微波炉内微波辐射10分钟，如检测Er和Pr则需要20辐射分钟左右。 
⑤待修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学的染色方法进行染色。
该法与上法相比，从实验结果看，都不分上下。它是利用微波每秒以24亿5千万次的快速运动产生瞬间热。当然，光靠微波的作用是不够的，还必须依靠热的作用，方能达到目的。应用微波辐射，它有双重作用，微波辐射可以使各物质分子作极性运动。促进形成的醛键断裂开。分子间运动所产生的瞬间热，当达到有效的温度后，就可导致甲醛固定后的蛋白的变性。该法的特点是：产热迅速，容易操作，也容易引起抗原修复液的沸腾，使用微波炉时禁止使用金属性的器皿，以防引起失火或爆炸。 
3.高压抗原修复法： 
①切片脱蜡至水。 
②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。 
③自来水洗，蒸馏水洗。 
④切片放入抗原修复液中，边同容器放入高压锅中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续1－4分钟。 
⑤待修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。 
该法高压和高热来促进醛键的断裂，当加热至开锅，加上高压阀后，汽体喷出，此时的温度已达121℃左右。该法被应用于一些较难修复的抗原，经多次实验认为，该法效果不错。
4.隔水热抗原修复法： 
①切片脱蜡至水。 
②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。 
③自来水洗，蒸馏水洗。 
④切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0）中，边同容器一起放入水溶锅中加热，其间应不断用温度计测其温度，待抗原修复液的温度达到有效温度后（92℃↑）。即开始计时，持续40分钟。 
⑤待抗原修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选定好的免疫组化染色方法进行染色。
该法应用隔水热方法，效果不及前面三种方法，它需要较长时间的热的作用，在早期应用于Er和Pr染色的抗原修复时，我们的修复时间为40分钟，如果达不到这时间，效果将不理想。 
5.电炉加热抗原修复法： 
①切片脱蜡至水。 
②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。 
③自来水洗，蒸馏水洗。 
④ 将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时用温度计测量温度，当达92℃后，即可拔离电源，当温度低于92℃时，再插上电源，如此反复持续至10分钟左右。 
⑤待抗原修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选定的免疫组化染色方法进行染色。 
对各种抗原修复方法的评价。
该法是在没有上述的设备时才选用的一种方法，当然效果是最差的，因为它只是单靠热的作用，这是远远不够的，另外，电炉加热必须常用温度计来测量温度，对其温度不好控制，有时需要多次关闭电源来维持所需的温度。
抗原修复，必须注意以下问题：
1、PH值的应用范围及选择。 
应用于抗原修复的物质很多，但至今为止，大家公认的最好的抗原修复液还是柠檬酸盐缓冲液PH6.0，据多年来的实践认为，该液确实很好，它适合于大多数的抗原，在常规应用的临床标记抗体中基本都适用，经用该液修复后的抗原表达增强，抗原的定性和定位很理想，结果不错。但近来也有文献报道，应用抗原修复液PH8.0的效果也不错。 
2.抗原修复时应选择最佳温度。 
据Masson等研究表明：70℃－90℃的温度对没有经固定的蛋白可发生变性，但经福尔马林固定的蛋白，要使其发生变性，温度必须在92℃↑。据实验认为温度在92℃－98℃是合适的，尤其在95℃为最好，这是因为：①这种温度未达沸腾，切片不容易脱离裁片；②能够解离和破坏与蛋白交联的甲醛醛键等，处理时可以随意选择和确定抗原修复的作用时间。 
3.抗原修复时有效温度所需持续时间根据各单位的设备条件以及使用的仪器不同，抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间也不一样。例如：真空负压抗原修复法，当达到预定的温度和所需的负压（66.7KPa）后可持续5-10分钟，微波辐射抗原修复法温度不好控制，抗原修复液容易沸腾，如果切片附贴任凭其沸腾持续5-10分钟。如果切片附贴很牢固，为了防止脱片，一发现抗原液已沸腾，即可关掉电源，待温度下降后，又可重开电源。如此反复数次，使之持续10分钟。不过似这种停停开开着的做法效果不如开着的，因为开着的除了热效应以外，还有足量的微波辐射。应用高压抗原修复法，当发现抗原修复液沸腾后，加上压力阀，出现喷气后，可持续时间达2-4分钟。隔水热加热抗原修复法，要特别注意内外液体的温度，内液指抗原修复液，外指浸泡抗原修复液容器的水，应用时用温度计浸入抗原修复液测试，使之保持在有效的温度（92℃↑）范围内。持续时间在40分钟，电炉加热抗原修复法，其持续时间在10分钟以上。由于效果较差，该法目前较少使用。 
4.抗原修复液必须遵循自然降温规律，否则效果不好或达不到抗原修复的目的。 
抗原修复持续时间过后，取出放于室温中让其慢慢地降温，决不能为了争取时间，强行用冰块或冷水令其降温。这是因为当高温中的抗原蛋白分子链脱离了其它的束缚或联结，要有一个自然环境让其自然放松下来，随着温度的降低，它们会慢慢地恢复原来的形态和构型。如果用冰块和冷水强行令其降温，松开后的蛋白分子肽链突遇降温而固定下来，恢复不了原有的构型，达不到预想的效果。 
5.尽量使用足量的抗原修复液。 
抗原修复的方法，都采用加热的方法，尤其是微波辐射加热法，该法由于产热快。液体容易挥发直至干涸。因此，应用于抗原修复的液体，一定要充足，防止切片干涸。用于抗原修复的切片，如果由于液体少而导致切片的干涸，则应丢弃切片，因为热干涸的切片中的抗原是没办法补救的，因它是一种不可逆的现象。据实验认为，用于微波辐射抗原修复的液体，量大可多至1000ml。应用大量的抗原修复液时，由于它的量较大，可延缓了液体的沸腾时间，增加了切片受微波辐射的量，对抗原修复将达到彻底。 
6.切片必须附贴牢固。 
用于抗原修复的切片，必须附贴牢固，否则发生掉片，则前功尽弃。
化学试剂抗原修复法：
1. 胃蛋白酶消化法： 
①切片脱蜡至水。 
②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。 
③自来水洗，蒸馏水洗。 
④PBS洗3次，1分钟/次。 
⑤滴上配制好或商品化的胃蛋白酶，处理切片20分钟左右。 
⑥PBS冲洗3次，2分钟/次。 
⑦后按选择好的免疫组化该法进行染色。
2.胰蛋白酶消化法： 
①切片脱蜡至水。 
②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。 
③自来水洗，蒸馏水洗。 
④PBS洗3次，1分钟/次。 
⑤滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，处理切片20分钟左右。 
⑥PBS洗3次，2分钟/次。 
⑦后按选好的免疫组化染色方法进行染色。 
评价：上面介绍了胃蛋白酶和胰蛋白酶两种酶的使用方法，因这两种酶在平常较常被使用，故而专门进行介绍，除此之外，无有几种酶如链霉蛋白酶，无花果蛋白酶菠萝蛋白酶等也可被用来消化切片。其用法基本一样。 
现今应用酶来消化切片，主要是根据抗体的要求来进行的，否则都应用物理化学试剂抗原修复法来进行。因为酶消化不适合于多数的抗体，效果也没有其它方法好，因此临床上都较好用它。
作好免疫组化染色必须注意的问题
I、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好。 
在免疫组化最后结果的判断时，常可见到均匀一片的似非特异性染色的现象，经多方研究认为，它是一种假性非特异性的染色。因为肿瘤组织中含有的抗原较易发生扩散弥散，肿瘤细胞无限制的生长和生长过速，导致肿瘤中间部分组织血液供给困难，造成缺血坏死，坏死细胞中的抗原由于机体的作用，可以被均匀地散布于细胞与细胞间的间质，这是抗原发生弥散的一种方式。另一种抗原弥散的方式就是，由于组织没有及时的固定所引起的。离体的组织不及时固定，组织就会自溶，抗原就会扩散，这是一非常普通的常识，但要做好却是极不容易。标本从外科切除到浸入固定液需要经过一段时间，在这段时间里，有的抗原就可以发生扩散。虽然已浸入了固定液，但标本较大，固定液的量又不足，当然由于固定液的渗透需要时间，当渗入到组织之中时，中间的细胞已发生了变化，抗原也随着发生扩散，这种现象在产酶多的器官是比较明显的，如胃癌，当切除后标本较大，虽然在手术室期间已放入了固定液，但固定液要透过肌层达到胃粘膜面起码需要几个小时的时间，当固定液发挥作用时，组织已经发生变化。因此，这了达到免疫组织化学染色的要求，对于离体的组织尽量快的进行固定，有条件的应将其剖开，早取材，早固定。 
II、组织脱水必须彻底干净 
组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程。如果取材太厚，在较短的时间内脱水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。由于先天不足，导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败，或者由此反复操作，造成人力物力的浪费，造成病理报告的延期发出等。因此，对取材的要求是除了要求要有艺术性外，即平整、外观好看，还要求适中。 
III、切片必须完整、均匀、平展、无邹折、 
应用于免疫组织化学染色的切片，对切片的质量要求较高，切片必须完整，平展、无汽泡，无邹折，这样有利在染色时的冲洗，有利于切片的牢固附贴。如果切片不平展，免疫组化染色后，可出现染色不均匀的现象，颜色深浅不一，　不平。如果切片有汽泡切片在烘烤时，由于汽泡的破裂影响了汽泡周围的组织，在其周围可观察到深浅不一的染色。如果切片有邹折，免疫组化染色后，在邹折的地方有深浅不一的颜色，这是一种假阳性，容易引起混淆。 
IV、切片的附贴必须牢固，必须使用合适的粘贴剂。 
免疫组织化学染色前的前期准备工作，就是必须对新的载玻片进行处理，新的载玻片表面看起来很干净，有人认为不需要进行任何的处理，都能够适合使用，这是一种错误的想法。新出厂的载玻片，表面复盖着开一层油脂样的物质，如果不加以处理，对切片的附贴是极为不利的。我们的做法是：新的载玻片，放于玻璃清洗液中浸泡4小时甚至过夜，然后取出，经自来水彻底冲洗后，浸入酒精中达2小时以上，取出擦干备用或烘干也可。然后再将载玻片浸入了－氨基－三乙氧基－硅烷（3－Aminopropyl triethoxy-silane）的稀释液（1：50用丙酮或无水乙醇稀释都可以）中硅化10分钟，后经无水乙醇洗2次，烘干即可使用。 
V、切片必须烘烤附贴牢固，既要经得起抗原修复时高温的作用而不使轻易脱片，又不至于破坏抗原。 
应用于免疫组化染色的切片。由于整个过程需经几个阶段的处理，如抗原修复时抗原修复液的沸腾且需持续十几分钟，PBS的反复冲洗，有的甚至于4℃冰箱中孵育达十几小时。因此，对切片的质量要求很高，尤其是切片的附贴程度。以往有人主张切片在60℃以下烘烤30-60分钟即可按此进行结果是切片掉片严重，切片松动率占100%。切片究竟烘烤多长时间才合适，既不脱片和适合各项要求，又不至于破坏抗原。几组实验[]诊断P173认为，切片在60℃的恒温干燥箱中烘烤2-5小时最为合适。这是因为：抗原可耐受如此的温度，病理科一般使用的石蜡，其熔点在60℃左右，组织浸蜡时，浸蜡箱中的温度，一般都调在65℃左右，组织在这样温度中要浸泡2小时以上，才能达到彻底地浸蜡。组织中的抗原已经受了65℃的温度考验，保存下来的抗原，都已具有耐热性。另外，经上述时间烘烤出来的切片，附贴牢固，抗原保存好，染色成功率达100%，保证了病理诊断的及时性和准确性。 
特需要注意的是，不管是应用于诊断的切片还是研究用的切片，烘烤后应尽快进行染色。如果切片切完后，迟迟不进行染色，存放于室温中或工作冰箱中，切片中的抗原将会随着时间的延长而逐渐消失，甚至出现假阴性。原则上是新鲜切片，即行染色，染多少张切多少张，这样才能尽可能的保存表达更多的抗原。 
VI、切片脱蜡必须干净，否则将会影响免疫组化染色的最后结果。
蜡不溶于水，不与其它的临床使用的抗体相融合。它只能靠特用的试剂，处理足够的时间，才能将其除去。如果脱蜡不干净，少许蜡存留于切片上，将会引起许多弊病，如染色不均匀，阳性物时隐时现，真假难辨，背景染色增加等。为了解决上述的问题，切片在染色前必须彻底脱蜡，目前用于脱蜡的试剂主要是二甲苯，因它脱蜡力强，脱蜡时间较短。较受使用者的青睐。脱蜡的时间要根据季节，室温和试剂的新鲜程度采用不同脱蜡时间。如果在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5分钟就已足够。如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20分钟或更长。总之，操作时应根据不同的季节，不同的室温，不同的试剂来决定脱蜡的时间，原则上是要彻底，干净，完全地脱去切片上的蜡。为了做到这一步，切片在脱蜡前的加温将有助于完成上述的要求。比如：当天切的切片，烧烤2小时后进行染色，切片带有温度进行脱蜡这将可加速脱蜡的过程，如果预先切好烤好的切片，在染色前，还必须对切片进行加温10-20分钟，然后再行脱蜡，这样脱蜡速度加快，效果也会更好。 
VII、必须彻底抑制内源性过氧化物酶的活性，才能降低背景的染色。 
在各种组织中都含有很多的内源性过氧化物酶，尤其在红细胞，中性粒细胞，单核细胞嗜酸性细胞，出血的组织坏死的组织等等。含有这种酶的各细胞和组织如果在染色前不对其进行处理和抑制，它们将会在DAB底物的显色时，与HRP一样催化底样，使之显色，使之生成与阳性物一样的黄棕色，造成混乱。为止，在免疫组化染色前，都必须对内源性过氧化物酶进行抑制。当然，对它们进行彻底的消除是不行的，因为抑制太厉害，对抗原也会有相同的抑制作用。氢在抑制内源性过氧化物酶时，也要注意对抗原的保护，抑制也只能针对它们中的大部分，在DAB显色后，显示出淡黄色，这就足以与真正阳性物区别。抑制剂常用的是0.3%的H2O2，也可将其称为1%H2O2，因为市售的H2O2的浓度为30%，按其净含量则为0.3%，如果按其溶液的用量则为1%。 
关于H2O2的使用，有的使用是单纯的H2O2稀释溶，有的使用是H2O2甲醇混合物。根据实验，认为H2O2甲醇较适合于大多数的情况，因为除了H2O2外，甲醇对各种酶，都有钝化的作用，因此H2O2甲醇的双重作用效果较好。陈尚平等认为在多数情况中，用甲醇H2O2已经获得令人满意的结果。 
VIII、须适当合理地使用封闭试剂 
为了减少背景产生的非特异性染色，在免疫组化染色的过程中，在加入一抗孵育前，常常加入非免疫动物血清，以减少背景的染色，陈尚季等认为：抗体是高度的电荷分子，可能与带有相应电荷的组织成分无特异性地结合（如胶原）。由于这种非特异性结合，将导致标记的部分局部化（轭合物）和胶原的假阳性染色。要用一种不相干的抗体居先处理，可能减少和标记的抗体无特异性结合。 
以往，血清的使用有很多，如：小牛血清，马血清，山羊血清，绵羊血清，兔血清，浓度也有很多种，如：1%.2%.或1：5、1：10、和1:20. 
必须选择合适的抗体以及对作适当的保存和配制。 
VVI、选择合适的抗体 
至今为止，应用于临床的常用抗体有几十种，在这当中又可分为两种类型。
浓缩型抗体
根据近几年来使用的情况认为，它有许多优点，但也有许多不足之处： 
①可作为各种疾病检测的常备抗体。在各单位的常规活检诊断中，有常见的病例，也有罕见的病例，尤其是后者，有时很长时间才遇到一例，这就给抗体的应用和备用提出了更高的要求，如除了常用的抗体外，还需备用一些较为罕见病例的抗体。这样才能解决临床的诊断问题，如临时购买，则需较长的时间，这样就会延误诊断。实践证明：浓缩型抗体，可作为常备检测抗体。当购买抗体后，根据检测病例的数量，在无菌的条件下，将抗体分成小包装，然后用蜡膜封起来，于－30℃的低温冰箱中保存，临用时取出一支，用指温促其回升至室温，然后用PBS稀释即可使用，这种抗体可保存3年左右。 
②成本低，价格较便宜。 
它与即用型的抗体相比较，价格要便宜好多，如以某公司2002年-2003年的CK为例，浓缩型的抗体0.1ml，价格260元，该抗体可稀释为5000ml，以每张切片所需抗体为50ul计，可标记100例，每例一抗体所需2.6元，而即用型抗体1.5ml，价格150元，可标记30例，每例一抗体需5元。 
③需要稀释抗体，手续较为复杂。
对于新购入的浓缩型的抗体，使用时必须将稀释为工作液，才能使用，对于从未用过的抗体，还必须实验其实际的稀释度，因为各种抗体，厂家都做了相应的稀释度的实验，但这是大概的稀释度，要使抗体真正适合于本单位的稀释度，就必须对抗体的稀释度进行实验，如1:100.1:75.1:50.1:25等，如果结果在1：50上是最佳结果，这就是最佳的稀释点，如果在这范围内找不出最佳稀释点，则应继续实验直到找出最佳稀释点为止。 
④需要配置各型号的微量加样器，以利于量取精确的抗体量。 
⑤需要具备一定的英语水平，因为浓缩型的抗体多为进口试剂，其使用书都以英文为主，其中涉入抗体的来源，适应让稀释对什么组织或细胞可起反应等。
即用型抗体。
近几年来，免疫组化技术应用的推广，即用型抗体的应用越来越受到人们的欢迎，根据几年来的使用，认为它有许多优点和不足： 
①使用方便。对于初学者来说，它是一种最好的抗体，不管什么样的病例和切片，只要有抗体，不需要自己摸索稀释度，拿起试剂瓶一滴即可，极不方便。 
②对于不具备或基本不懂免疫组化技术的人，只要按照说明书的方法使用，也能获得理想的结果。 
③不需要配置多种昂贵的微量加样器。现今的微量加样器，如为进口货，贵者多达两千多元。而即用型抗体无需再行稀释，即买即用，无需配备其余器械。
④特别适合于基层单位。基层单位，无需多大的投资，就能开展免疫组化的工作，这对于提高诊断的准确率，极有好处。 
⑤价格较浓缩型抗体贵。 
⑥即用型抗体不可作为常备贮存抗体。即用型抗体，一般有效期为一年。如果用量大的单位，对于3ml一个包装的抗体，一年需要用几支，这对抗体来说，不会造成浪费。但如果为较小的单位，一年中标记的病例较少，购买抗体时也尽量选小包装的抗体，如1.5ml。如果碰上罕见的病例，有时一年也标记不了几例，这样就应采用浓缩的了。即用型的抗体，有效期为一年，但真正购买到的抗体使用期就不可能为一年，因为抗体从生产商到销售商的手里，需要一定的时间，如果运气好的话，你购买到的抗体，是刚交到销售商的手里，那么，使用的时间可能长些，但如果在销售商的手中滞留了一段时间，抗体的有效使用期就可能不会太长，五个月、六个月或者三个月。如果在有效的时间内不能使用完。稍为超过一些时间还可以，如果时间过长，就应当丢弃，因为会影响标记的质量。有人抱怨，刚买的抗体标记很好，后来就渐渐不好了。这是因为随着时间的延长，抗体的活性会逐渐失去生物活性，导致了标记质量的下降。
（2）抗体的适应症。
在众多的抗体中，按它们的实际使用范围，把它们分为两个类： 
1. 适合于冰冻切片，涂片，细胞培养片。 
2. 适合于石蜡切片，冰冻切片，涂片和细胞培养片。
（3）选择合适的单克隆或多克隆抗体。
抗体除了分为上述的两个类外，从其克隆的高度讲，也有单克隆和多克隆之分。 
1.单克隆抗体，在目前临床常用的抗体当中，大部分都是单克隆抗体。这要归功于生物技术的不断提高。在早些时候，应用于临床的抗体，大多数为多克隆抗体。 
2. 多克隆抗体，在临床应用的抗体中，还有少部分的抗体为多克隆抗体。
（4）抗体的加入。
这看似很简单的问题，如果处理不好也可导致不同的结果，如果应用自动免疫组织化学染色仪，将程序输入即可，如为手工操作，就必须注意以下的问题： 
1. 当PBS冲洗完毕后，在加入抗体，如一抗，二抗或三抗。必须将存留于切片上的多余的PBS摔干，但不能让切片干涸，切片干涸，往往可产生非特异性染色，切片上PBS存留过多，将会稀释加入的抗体，影响加入抗体的浓度，同时也将影响最后的结果，如假阴性等。 
2. 加入的抗体以一滴为佳。 
当擦干组织块周边多余的PBS后，切片保持着一定的湿润度，此时加入另外的抗体为最佳时候，滴入抗体以一滴50μl为好，加入后，轻微地摇匀地覆盖于切片上，使最后的结果稳定均衡，不至于有的地方有反应，有的地方无反应。 
3. 切片没擦好将会影响加入抗体的质量，切片没冲洗干净，没擦试好，当加入抗体后，它可缩于切片的一边，此时你为了使加入的抗体能够完全地覆盖整个切片，便会使劲地加入抗体，此时的结果是，抗体依然滑向一边，或者完全露出，这不光没达到目的，还浪费抗体，正确的做法就是彻底地用PBS冲洗，摔干切片擦干切片周边的PBS，再滴入一滴抗体轻轻摇匀即可。
（5）选择合适的孵育时间。
第一抗体的孵育时间，有较多的使用范围，应用于临床检测抗体的孵育时间。一般室温下孵育在30-60分钟，120分钟，对于研究性质的抗体孵育时间，也可按照上述的时间，但也有人提出于4℃冰箱中过夜孵育，根据我们的经验一般不主张于4℃冰箱中过夜，原因是： 
1.长时间的孵育可以使一些非特异性的物质沉淀下来，或者被吸附，造成背景的染色。 
2.目前销售的抗体，纯度较高，特异性较强，不需要长时间的孵育，也能够结合得很好　。 
3.长时间的孵育，较容易引起切片的脱落，造成染色的失败。 
4.长时间的孵育，不利于临床病理报告的发出。 
X、连接抗体的选用必须正确，否则可造成假阴性的现象。 
免疫组化染色方法较多，如ABC法，SP法和EV二步法等，如果使用的是SP法，或者ABC法，这时就必须要仔细地选择好连接抗体，第一抗体有单克和多克隆炎分，连接抗体则要根据选用的抗体来进行，例如：第一抗体选用的是单克隆鼠抗人**抗体，连接抗体也要选择相应的免抗鼠IgG，这样才能连接上（目前生产厂家已生产出混合型抗体，即既适合于单克隆抗体，也适合于多克隆抗体。使用者不用担心连接不上，随便使用都可，但如果没有订购混合型的试剂盒，就必须注意的型号，使之完全适合所选用的抗体。）孵育的时间可在10分钟，20分钟或者30分钟，一般在室温中进行，如果室温低于20℃以下，则可在37℃的孵育箱中进行。 
XI、复合物的使用及孵育时间的确定。 
各种方法有各自的复合物，如ABC法，复合物是卵白素和生物素结合的复合物，再带有HRP，SP法，（LsAB法）的复合物是链雪菌素蛋白复合物，再带有HRP，EV二步法的复合物则是二抗和三抗连接在一起的复合物，再带上HRP，除此之外，根据水解底物的不同，可产生不同的颜色，例如：带有HRP的酶，水解的底物一般为DAB产生黄棕色，带AP的酶，水解的底物一般为AEC产生红色。 
XII、PBS的冲洗 
免疫组化的染色过程，除了前面的处理和加入的抗体外，都在PBS的冲冲洗洗中度过，PBS冲洗的正确与否，也是导致最后结果的关键。
1.单独冲洗，防止交叉反应造成污染。　 
临床上每天检测的病例很多，所用的抗体种类及项目也多，如果在加入一抗孵育完后，将它们在一个缸内洗，这样就会造成交叉污染，影响最后的结果。正确的做法是单独地进行冲洗，冲洗的PBS为一次性，保证切片没有相互交叉污染的机会。 
2.温柔冲洗，防止切片的脱落。 
冲洗切片，取出切片，将PBS从上轻轻地冲洗，让PBS自上而下流下来，不要拿起切片将PBS对准切片冲洗，这样由于冲出的PBS有一定的冲击力，很容易使切片周边引起松动，导致切片的脱落。 
3.冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。 
冲洗切片有人提出用微振荡器振染，振下未结合的各种物，使之不产生背景，此种做法一是浪费时间，二是很容易导致切片的脱落。切片的冲洗据实践认为，用一小烧杯柔和地于切片上冲洗，就能彻底冲洗去未结合的物质，无需附加其它条件，冲洗好于切片上再注入PBS，持续2分钟左右就完全足够了。 
4.PBS的PH和离子强度的使用和要求。 
刘彦仿指出：中性及弱硷性条件（PH7－8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解。[]免疫组化P56我们目前常用的PBS的PH在7.4-7.6浓度是0.01M，根据本室十几年来的使用情况，认为该溶液价格便宜配制方面，使用效果好。 
5.常用试剂的配制和使用。 
在免疫组织化学的染色过程中，用得最多的试剂就是缓冲液，因为切片在整个染色中，抗体的加，换，切片的冲洗，DAB的配制都离不开缓冲液。可见缓冲液在整个染色中都起至关键的作用，缓冲液的过酸或偏碱，都将影响染色的结果。下面将介绍有关方面的内容：
（1）缓冲液的配制
1.磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer solution.PBS） 
Ⅰ液：0.2M　Na H2PO4贮存液（PH7.6） 
取一个具500ml的容量瓶，称量15.60g NaH2PO4﹒12H2O倒入瓶中，加入少量蒸馏水使劲摇晃，直至溶解，加入蒸馏水凑足500ml。放于4　冰箱保存，配制时应注意的事项： 
①在配制时，要先确定NaH2PO4的用量，因为该试剂有许多种类形，它们所含的水分子量不一样，因而它们的用量也不一样。如Na H2PO4含单个水分子时，配制时要称取13.80g，而当含有2个水分子时，则需要称取15.60g。 
②配制时根据要求选取蒸馏水。因为蒸馏水有数种，单蒸馏水，双蒸馏水，玻璃蒸馏水，去离子水。如没特别要求，选用一般的蒸馏水配制则可。 
③装缓冲液的瓶子须用玻璃浸洗液泡洗过，以防污染，导致溶液中有雪菌生长。 
Ⅱ液：0.2M NaHPO4贮存液(HP7.6) 
取500ml的容量瓶，称好17.91g NaHPO4﹒12H2O,倒入瓶中，边加水边搅拌，直至完全溶解再凑足500ml，贮存于4℃冰箱。
注意事项：
①该试剂也应注意有多种不同的含水分子量。 
②该贮存液久放后可出现结晶。每次使用前，先取出回至室温，摇晃其结晶溶解，也可用微波炉促其快速溶解，然后再用。 
0.01M PBS工作液的配制： 
取一2000ml的容量瓶一个，装入已称好的NaCt18g，加入少量蒸馏水让其彻底溶解，再加入 Ⅰ液13ml，Ⅱ液87ml，加蒸馏水凑足2000ml，即可使用，即可使用该溶液在室温下可保存3-4周，但以新配为佳。 
PBS工作液配制完毕后，都要测其PH值，如果偏酸，可用氢氧化钠来调试，如果偏碱可用HCl调试，测试有如下n种方法： 
①PH测试笔测试，这是一种简便、易行、结果较为准确的测试方法。当配制完PBS后，取一小杯，倒入配好的PBS，插入测试笔，打开开关，小屏幕上将可出现测出的PH结果。PH如果7.6不足，小量的可用0.2M Na2HPO4调校，大量的可用氢氧化钠调校。PH如果高于7.6，小量的用0.2M NaH2PO4调校，大量的可用HCL来调校。 
②用试纸来测试：PH试纸有两种，一种为广泛PH试纸，范围在1-14，另一种是精密试纸有各种各样的范围。但是，作为冲洗切片用的PBS，其精确度不需要十分精确，如配PH7.6时，测试时在PH7.5或7.7，都可使用。试纸测试PH值，停靠其反应的颜色来确定，十分简便，一般的试剂都可用它来测试。 
③仪器测试：对于要求较高，需较准确的PH值，须彩用仪器测试。 
1. Tris缓冲溶液(Tris buffer solution,TBS) 
①1N HCL ，浓HCL(双重1.19)8.3ml，先取50ml蒸馏水，加入HCL再加水到100ml。 
②0.5M Tris-HCL缓冲液(PH7.6) 
取Tris(羟甲基氨基甲烷)6.57g，加入少许的蒸馏水搅拌，直至溶解，再加入1N HCL42ml，然后用蒸馏水凑足100ml，于4℃冰箱保存。 
临用时，将上述溶液10稀释倍，即为0.05M工作液。
注意事项：
①配制1N HCL时，如果大量配制，HCL入水时可产生很大的热量，对的所用的玻璃器皿应特别小心，以防突然产热而使玻璃器皿爆裂。 
②调校PH值时，可参考上述的三种方法。