标题：双炔失碳酯
基本资料
药物名称：双炔失碳酯  双炔失碳酯拼音读法：shuāngquēshītànzhǐ
英文名称：Anordrin
简写拼音：SQSTZ
药物别名：53号抗孕片、探亲避孕片53号、双炔失碳酯片
所属类别：女性短效避孕药
药物说明：规格，片剂（53号抗孕片）
为具有抗着床作用的避孕药、并无孕激素活性，其雌激素活性为炔雌醇的1/36。小剂量与孕激素有协同作用，大剂量则有抗孕激素活性。能抑制子宫内膜腺体的发育，同时影响受精卵的运行速度，使其与内膜发育不同步，从而不利于着床。如在月经周期前期服药有排卵抑制作用。该品不受月经周期的限制，只需在房事后服用1片即可，适用于探亲或新婚夫妇使用，特别是探亲两周以上多次房事的妇女。
用法用量
口服：每次房事后立即服53号抗孕片1片，但第一次房事后次日晨须加服1片；以后每天最多1片，每月不少于12片。如果探亲结束时还未服完12片，则需每天服1片，直至服满12片。
注意事项
⑴服药初期常见有恶心、呕吐、头晕、乏力、嗜睡等类早孕反应，必要时可对症处理，每天服用维生素B620mg或维生素C100mg。偶有阴道出血、白带增多、乳胀、乳头发深色、腹胀、食欲不振、口干等。  双炔失碳酯⑵少数人月经周期、经量有不同程度改变。对月经周期延长或闭经者，可加服甲孕酮25mg和炔雌醇0.015mg。
⑶肝、肾病患者、人工流产未满半年者、哺乳期或腹泻妇女忌用。
⑷如必须在房事前服药者，可在事前1小时内服用。
对软骨肉瘤的研究
研究课题双炔失碳酯对Swarm大鼠软骨肉瘤在小鼠肾囊膜下生长的抑制作用。  甲孕酮
目的研究双炔失碳酯（ANO）及其α异构体（α-ANO）、三苯氧胺(TAM）、顺铂（CDDP）、全反式维甲酸(ATRA）对Swarm大鼠软骨肉瘤（SRCS）体内外生长的影响和机制。方法：观察药物SRCS在小鼠肾囊腺下体内生长的影响；vonKossa法观察药物治疗对SRCS中钙盐沉积的作用；用台盼蓝排染法观察了药物对SRCS细胞体外生长的影响；以对硝基苯酚磷酸酯为底物研究药物对SRCS细胞中碱性磷酸酯酶(ALPase）活性的影响；用邻甲酚酞络合酮比色法测定SRCS细胞中的钙含量。
结果：几种药物对SRCS在小鼠肾囊膜下体内生长均有程度不一的抑制作用，α-ANO在20mg/kg剂量下的生长抑制率为79。4%；CDDP、ATRA、TAM、α-ANO和ANO作用96h对SRCS细胞体外生长的IC50分别为0。45、1。47、115。2、161。7和241。5μmol/L；α-ANO和ATRA在体内可引起SRCS中出现钙盐沉积；在体外作用96h可使SRCS细胞中ALPase活性和钙含量显著性升高；而CDDP和TAM无上述现象。
结论：α-ANO和ATRA抑制SRCS生长与其诱导SRCS向成骨化方向分化有关，提示诱导分化治疗可能为临床治疗软骨肉瘤的新的有效途径。
Swarm大鼠软骨肉瘤（Swarmratchondrosarcoma，SRCS）由一18个月的雌性Sprague-Dawley大鼠中形成  试验中的数据的自发肿瘤经连续传代分离建株而成，参照O′Neal氏软骨肉瘤分级标准，SRCS属2级恶性程度较高的一种，可以作为研究人软骨肉瘤的一个良好实验模型。
双炔失碳酯（Anordrin，ANO）是一种A环失碳的雄甾烷衍生物，对雌激素有部分拮抗活性，作为抗着床避孕药已被广泛应用。1989年本实验室首先发现它具有抗肿瘤活性，并且该活性主要来自其α异构体。
材料和方法一、瘤株。SRCS从中国医科院药物研究所引种。Wistar大鼠皮下接种，每6周传代1次。
二、药物与主要试剂。ANO，上海第十九制药厂生产，α-ANO由本所植化室用氧化铝低压层析法分离制备；CDDP，齐鲁制药厂生产；ATRA、Ⅱ型胶原酶，Sigma产品；TAM，上海华联制药厂生产；胰蛋白酶，Serva产品；DMEM培养基，GIBCO产品；小牛血清，华东理工大学产品；对硝基苯酚磷酸酯(p-NP），Merck产品；邻甲酚酞络合酮，上海第三试剂厂产品。
三、动物。昆明种小鼠23～25g，雌性，由中国科学院上海实验动物中心提供。
四、方法。1。小鼠肾囊膜下移植SRCS及药物治疗。实验前1天小鼠腹腔注射环磷酰胺（150mg/kg）作免疫  雌激素抑制。选取生长4周的SRCS，在DMEM（含15%小牛血清）中无菌条件下剪成均匀的2mm3左右大小的瘤块备用。小鼠先用水合氯醛麻醉，从背部暴露肾脏，用16号穿刺针将瘤块移植到肾囊膜下，然后把肾脏复位，缝合切口，随机分组，第2天开始给药，剂量和给药途径见表1，共5天，第7天观察结果。
取出荷瘤肾脏，在装有目镜测微尺的解剖镜下测量瘤块的最长径（a）和最短径（b），理论瘤体积（mm3）=0。52ab2，肿瘤生长抑制率（%)=（1-给药组瘤体积/对照组瘤体积）×100%。2。vonKossa法观察钙盐沉积。荷瘤肾脏10%福尔马林固定，常规包埋切片。切片覆以5%硝酸银溶液，紫外灯下照射30～40min，然后于5%硫代硫酸钠水溶液中处理3～5min，1%中性红复染数秒，中性树胶封片。3。几种药物对SRCS细胞体外生长的影响。
SRCS原代培养：在靠近边缘、无坏死和瘀血区域无菌剪取SRCS10g左右，去除包膜等结缔组织，剪成小  胰蛋白酶块。于5%(W/V）胰蛋白酶（含等体积1mmol/LEDTA）中37℃消化1h，再用胶原酶（160u/ml)37℃消化2h，然后用100目和400目筛网过滤，收集滤液，用DMEM（含15%小牛血清，2mmol/LGln，1μmol/L氢化可的松，15mmol/LHEPES洗3次，稀释到106/ml培养，台盼蓝染色证明90%以上为活细胞。
96孔培养板上每孔接种150μlSRCS细胞（3×105/ml），4h后加入不同浓度的各种待试药物，培养4天后用台盼蓝排染法计数各组活细胞数，计算细胞生长抑制率，由Logit法计算各药物的IC50值。4。几种药物体外对SRCS细胞中碱性磷酸酯酶（ALPase）活性的影响。接种SRCS细胞（2×105/ml)4h后加入不同浓度的各种药物，作用96h后收集细胞，用台盼蓝排染法计数活细胞数，然后用0。9%NaCl溶液（含0.2%TritonX-100）悬浮，0℃匀浆，12000×g离心15min，取上清与0.01mol/LTris-HCl反应缓冲液（pH9.0，含0.5mmol/Lp-NP和0.5mmol/LMgCl2）混匀，37℃精确保温30min，用0.25%体积的1mol/LNaOH终止反应，在410nm处测OD值。用对硝基苯酚作标准曲线。一个酶活力单位（u）定义为37℃和pH9。0条件下，以p-N为底物30min内水解释放出1μmol/L对基苯酚的酶量。结果以u/106细胞表示。
双炔失碳酯
5。几种药物对SRCS细胞中钙含量的影响，收集不同浓度的几种药物作用96h后的SRCS细胞，用0.1N盐酸悬浮，4℃过夜后1500r/min离心5min，取上清。用邻甲酚酞络合酮直接比色法和Bradford法分别测定上清中的钙浓度和蛋白质浓度，SRCS细胞中钙含量以nmol/mg蛋白表示。
6。统计学处理。实验数据以±s表示，先作两组资料的方差齐性分析，方差齐时，用Student'st检验，方差不齐时，用Mann-Whitney检验比较均数差异的显著性。
结果一、几种药物对SRCS在小鼠肾囊膜下生长的影响。在几种药物中，CDDP和ATRA作用最强，前者在1。  氢化可的松5mg/kg剂量下抑瘤率为87。5%(P<0。01），后者在20mg/kg剂量下的抑制率为90。3%(P<0。01）。α-ANO次之，混合体ANO和TAM也有一定的抑制作用，OXL在200mg/kg剂量下对SRCS在小鼠肾囊膜下的生长无明显影响。
骨细胞
二、几种药物对SRCS中的钙盐沉积的作用。vonKossa法染色发现对照组SRCS中基本没有黑色颗粒，而ANO、α-ANO和ATRA治疗组SRCS中出现黑色颗粒，ATRA治疗组尤其明显，表明出现了钙盐沉积，而在OXL、TAM和CDDP治疗组中无此现象。
三、几种药物对SRCS体外生长的影响。CDDP和ATRA对SRCS细胞体外的生长抑制作用最显著，与体内结果相一致，而TAM、α-ANO和ANO的作用较弱，ANO在100μmol/L浓度以下基本没有作用。由Logit法得CDDP、ATRA、TAM、α-ANO和ANO作用96h对SRCS体外生长的IC50，依次为0。45、1。47、115。2、161。7和241。5μmol/L。
四、几种药物对SRCS细胞中ALPase活性的影响。α-ANO作用96h，可使SRCS细胞中ALPase活性显著地升高，具有剂量依赖性，ATRA的作用较α-ANO更显著，而CDDP和TAM无此作用。
讨论软骨肉瘤是直源于软骨的恶性肿瘤，发病率在恶性骨肿瘤中仅次于骨肉瘤居第二位。外科手术是临床治疗  双炔失碳酯软骨肉瘤的主要手段，但由于软骨肉瘤多发生在髋骨、股骨、肩胛骨以及颅底等重要部位，手术治疗往往为保守治疗，病人最终的转移复发率和死亡率较高，所以作为全身治疗的化疗越来越受到临床上的重视。但软骨肉瘤象其他骨和软组织肿瘤一样，对许多常用的化疗药不敏感。本文应用CDDP实验治疗SRCS取得了较好的疗效，但毒副作用明显，动物体重下降，甚至有动物死亡。ATRA对SRCS的生长抑制作用也较显著，在20mg/kg剂量下取得了90。3%的抑制率，但无明显毒副反应。本文还首次发现α-ANO和TAM对SRCS也有一定的生长抑制作用。在体外发现，CDDP作用后，SRCS细胞大多为被台盼蓝染为蓝色的死细胞，而另外四种药物作用后则多为细胞膜完整、不被台盼蓝着色的活细胞，说明CDDP为典型的细胞毒药物，而后四种药物对于SRCS细胞应属于细胞抑制型药物。
影响
目的探讨双炔失碳酯α单体（α?anordrin，α?ANO）对激素依赖人前列腺癌细胞LNCaP生长的影响。方法采  骨细胞用氧化铝柱层析分离纯化双炔失碳酯（ANO）的α和β差向异构体，SRB细胞染色法检测α?ANO对LNCaP细胞生长的影响及对抗雄激素拟似剂R1881促细胞生长的作用；观察α?ANO作用下细胞形态学变化；ELISA法检测α?ANO对LNCaP细胞分泌前列腺特异性抗原（PSA）的影响。结果常规培养液中α?ANO（8，12，16，24，32μmol/L）作用LNCaP细胞后，细胞存活率分别为85。8%，51。5%，40。8%，29。2%，1。0%；在去除激素培养液中，α?ANO抑制细胞生长作用更强，能对抗R1881的促细胞生长作用，经α?ANO处理的LNCaP细胞分泌PSA能力降低。结论：αANO抑制激素依赖人前列腺癌细胞LNCaP的增殖，具有抗雄激素促细胞生长的作用。
选择性雌激素受体调节剂（selectiveestrogenreceptormodulators，SERM）是指能与雌激素受体相互作用，依据靶组织和激素内环境的不同而产生特异作用的-类化合物。它们对雌激素有双相作用，即能抗雌激  细胞间质素又具有拟雌激素样作用。SERM已被证实可治疗乳癌、骨质疏松和心血管疾病；并可能预防前列腺癌（prostatecancer，Pca）。寻找新的理想的SERM是目前研究热点。
细胞株与细胞培养，人前列腺癌细胞LNCaP（美国加洲大学洛杉矶分校癌症中心陈德桂博士惠赠）。LNCaP培养于含10%胎牛血清、青霉素100IU/mL、链霉素100IU/mL的IMDM培养液中，细胞贴壁成簇生长，与底物贴附力弱，增殖慢，倍增时间为72h，细胞间粘连紧密，需用含0。02%EDTA的0。25%胰酶消化。每5天换液1次，每8天传代1次。细胞培养于37℃恒温，体积分数为0。05的CO2，饱和湿度的培养箱中。
方法氧化铝柱层析法分离纯化药物取α，βANO混合物1g，以1∶50氧化铝低压柱（E。Merck氧化铝G）分离，  前列腺柱压0。5kg/cm2，苯∶石油醚=2∶1洗脱，每流分20mL，各流分用上述流动相薄层条件检查，单一斑点流分合并。第6～11流分合并蒸干，用正已烷重结晶，得纯β体120mg，熔点136～137℃，第18～22流分合并蒸干，得纯α单体560mg，熔点155～156℃。α单体以无水乙醇配制成12。8mmol/L的贮存液，临用前用培养液稀释至所需浓度，乙醇在培养液的最终体积分数不超过0。2%。
SRB法检测α：ANO对细胞生长的作用取在常规培养液中生长的对数生长期的LNCaP细胞经充分消化后，接种于96孔板，细胞接种量约每孔8000个，每孔100μL，24h后细胞贴壁达到80%，α?ANO组每孔加含不  骨质疏松同终浓度α?ANO（8，12，16，24，32μmol/L）的培养液100μL，对照组加等量培养液，设3个复孔，药物与细胞共孵育5d，作用时间结束时，用SRB染色法检测药物对细胞生长的抑制作用：每孔加入预冷的30%三氯醋酸50μL，放置5min后置4℃固定1h，吸弃固定液，去离子水洗5遍，甩干，空气干燥，每孔加入SRB液100μL，室温放置10min，未与蛋白结合的SRB用1%醋酸洗5遍，空气干燥，加入10mmol/L的非缓冲Tris碱液150μL溶解，震荡15min，515nm波长处读取D值。计算各浓度组的存活率。存活率=D加药组/D对照组×100%
SRB法检测α：ANO对抗雄激素的作用用无酚红的IMDM与活性炭处理过的血清配制成特殊的去除激素的培  试验数据养液。细胞在加药物干预前在无激素培养液中预培养24h以消除常规培养液中的激素对实验结果的干扰，在去除激素的培养液中细胞生长较为缓慢，细胞接种量提高至每孔10000个。实验设：对照组（加等量培养液），α?ANO（3，6，12，24μmol/L）与1nmol/LR1881的单独与联合组，给药后各组终体积相同，每个加药组设3个复孔，与细胞共孵育5d，SRB法染色，酶标仪测D值，计算各浓度组的存活率。
细胞形态学观察：取常规培养液中生长的对数生长期的LNCaP细胞消化后，常规培养液稀释，接种于6孔板，细胞量每孔50000个，加入含不同终浓度α?ANO（3，6，12，24μmol/L），对照组加等量培养液，药物作用48h后，于相差显微镜下观察LNCaP细胞形态的变化。
ELISA法测药物对细胞分泌PSA的影响：取对数生长期细胞，在去除激素的IMDM培养基中培养72h后，以含0。02%EDTA的0。25%胰酶消化液充分消化成单细胞悬液，接种于96孔板，细胞量约为每孔10000个，每个浓度设3个复孔，每孔100μL，置培养箱孵育24h，细胞贴壁后每孔加含不同浓度药液的培养液100μL，药物作用24h后，吸取每孔上清，离心以去除上清中的少许细胞碎片。用收集到的上清液测PSA含量。为了消除由于细胞数量的变化而造成的对PSA变化的影响，将每个浓度组的细胞数量用对照组细胞数量校正，计算抑制率。检测步骤按ELISA试剂盒说明书。
结果αANO对LNCaP细胞生长的影响在常规培养液中，αANO（8，12，16，24，32μmol/L）作用LNCaP细胞5d  血清后，细胞存活率分别为85。8%，51。5%，40。8%，29。2%，1。0%，低浓度表现为抑制生长，高浓度表现为细胞毒作用，呈剂量依赖性。
αANO对抗雄激素的促生长作用：在无激素培养液中预培养24h，LNCaP细胞经不同浓度αANO和1nmol/LR1881处理5d后，呈现不同的增殖抑制情况。单独给予1nmol/LR1881具有促细胞生长的作用，细胞存活率为120。8%；单独给予α?ANO（3，6，12，24μmol/L）细胞存活率分别为92。9%，80。1%，44。8%，22。1%。两者联合应用，R1881促细胞生长作用被完全抵消，存活率分别为77。9%，67。9%，37。2%，19。5%，与相同浓度无R1881组比较呈下降的趋势（图2），与单独给予R1881组比较，差别有显著统计学意义（P<0。01）。
细胞形态学变化：12μmol/LαANO作用于LNCaP细胞48h，细胞数量减少，部分细胞发生变形，细胞变圆，  细胞体积变小；24μmol/Lα?ANO作用下LNCaP细胞形态发生明显变化，细胞形状变圆，体积变小，部分细胞碎裂，细胞质空泡化，细胞表面变粗糙，呈现颗粒状，胞间粘连减少，细胞大部分为分散的个体。
αANO对LNCaP细胞分泌PSA的影响：αANO能抑制LNCaP细胞分泌PSA，在1nmol/LR1881存在下，α?ANO抑制PSA分泌的作用更强。R1881本身可使LNCaP细胞分泌PSA增长近10倍，α?ANO作用细胞24h后，细胞数量变化不大，最高给药剂量15μmol/L，细胞数量相当于对照的90%，而细胞分泌的PSA量只有对照的35%左右，降低幅度远远大于细胞数量的变化。有R1881组，在α?ANO浓度为1μmol/L和5μmol/L时，抑制率均高于无R1881组（P<0。01）。
αANO：双炔失碳酯α单体。n=3。与对照组比较，☆：P<0。05，☆☆：P<0。01；与R1881比较，P<0。01。
讨论Pca是与激素密切相关的恶性肿瘤，其发病与体内雄激素与雌激素之间的平衡紊乱有关，雄激素及其受体（androgenreceptor，AR）在前列腺癌变过程中起主导作用；雌激素及其受体（estrogenreceptor，ER）在前列腺癌作用尚不清楚，有学者认为雌二醇（estradiol，E2）导致老年动物高分级的前列腺上皮内瘤，E2的增加可能上调AR对睾酮的敏感性。
ANO在中国于20世纪60年代首次合成，早期作为避孕药应用于临床，效果良好。ANO的抗生育作用主要是因其具有较强的抗雌激素作用，但药理研究表明ANO也有弱雌激素活性，具有与SERM类药物相似特点。目前国外已有多种SERM类药物用于Pca预防和治疗的实验研究。
本实验结果显示，常规培养液中α?ANO作用LNCaP细胞5d，对细胞生长呈现剂量依赖性的抑制作用。LNCaP是典型的激素依赖性细胞，含有突变型AR，可表达AR和ER，并能产生人类前列腺酸性磷酸酶和PSA，在雄激素刺激下，LNCaP细胞生长增快[8]。本实验中1nmol/LR1881与LNCaP细胞共孵育5d，促生长作用可达1。2倍左右，R1881是一种合成的雄激素受体激动剂[9]，是目前国外常用的替代雄激素的实验试剂。1nmol/LR1881刺激LNCaP细胞的生长，但在同时含有α?ANO和R1881组，这部分促生长作用被完全抵消，存活率与相同浓度无R1881组比较反而下降，表明α?ANO在雄激素存在时，对细胞抑制作用增强，能对抗雄激素引起的细胞增殖。
PSA由前列腺上皮细胞产生，在腺体的腺泡和上皮细胞内合成，其合成分泌由雄激素受体调控，与雄激素成正相关，是目前Pca治疗的敏感的指标之一。ELISA检测结果表明，雄激素能使LNCaP分泌PSA升高近10倍，而α?ANO能显著对抗由雄激素引起的PSA增加。这个结果再次证实了α?ANO具有对抗雄激素的作用。由于早期Pca是激素依赖性，体内的细胞增殖主要由于雄激素水平的升高引起，α?ANO对抗雄激素的特点在Pca早期治疗中具有一定的潜在价值。但是，α?ANO抗雄激素作用与其抗雌激素和弱雌激素样作用有何联系，通过何种机制实现，α?ANO抗Pca的活性与AR及ER之间有何关系，均有待进一步研究。