标题：麻痹性贝毒
毒素来源
麻痹性贝毒素（Paralytic shellfish poisoning，PSP）来源于赤潮中的有毒藻类。赤潮一般分为有毒赤潮和无毒赤潮，已知中国沿岸海域中能引起赤潮的生物有260余种，其中能产生赤潮毒素的就有78种，与有毒赤潮相关的赤潮藻毒素（贝毒素）主要有麻痹性贝毒（PSP）、腹泻性贝毒（DSP）、神经性贝毒（NSP）、记忆丧失性贝毒（ASP）和雪卡毒素（Ciguatera）五大类。其中，PSP被公认为对公众健康危害最严重。[1]麻痹性贝毒毒素（Paralytic shellfish poisoning，PSP）主要由塔玛亚历山大藻（Alexandrium tamarensis）、微小亚历山大藻（A.minutum）、链状亚历山大藻（A. catenella）、A.fraterculus、A. fundyense、A. cohorticula、Pyrodinium bahamense、Gymnodinium catenatum等分泌产生。此外，细菌、蓝藻、红藻（Janiasp.）中的一些种类也可以产生PSP毒素。1999年在淡水蓝藻Cylindrospermopsis raciborskii，Lyngbya wollei（Onodera et al.，1997）中也发现了PSP毒素。[2]  贝类中PSP含量均值变化[3]有毒赤潮发生时，贝类大量摄食有毒藻，其藻毒素在贝类体内累积，当毒素含量超过人类食用安全标准时，人类食用此类贝类产品往往就会发生中毒的危险。染毒贝类不能通过外观与味道的新鲜程度来加以分辨，而且冷冻和加热不能使其完全失活。[4-5]
化学结构
麻痹性贝毒是一类四氢嘌呤的三环化合物，已发现的毒素根据取代基的不同进行分类C11上存在同分异构现象，在贝类体内，β异构体可以转化成更加稳定的α异构体，其摩尔比（α/β）可以用来分析贝类的染毒时间。[6]  麻痹性贝毒化学结构[7]根据基团的相似性，麻痹性贝毒可分为四类：氨基甲酸酯类毒素（Carbamate toxins），包括石房蛤毒素（Saxitoxin，STX），新石房蛤毒素（Neosaxitoxin，NEO），膝沟藻毒素（Gonyautoxin），包括膝沟藻毒素GTX1，GTX2，GTX3和GTX4；N-磺酰氨甲酰基类毒素（N-sulfocarbamoyl toxins），包括C1、C2、C3、C4、GTX5（B1）和GTX6（B2）；脱氨甲酰基类毒素（Decarbamoyltoxins），包括Decarbamoyl saxitoxin（dcSTX），Decarbamoyl neosaxitoxin（dcneoSTX），Decarbamoylgonyautoxins1-4（dcGTX1-4）；脱氧脱氨甲酰基类毒素（Deoxydecarbamoyl toxins）。关于PSP的研究主要集中在对石房蛤毒素的研究上。[8-9]
  麻痹性贝毒标准品HPLC谱[10]
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中毒机理
毒素作用过程麻痹性贝类毒素很强的毒素之一，其毒性与河豚毒素相当。在1999年之前，中国已有24人死于麻痹性贝毒中毒。中国政府规定上市贝类麻痹性贝毒必须低于4Mu/g。虾夷扇贝各组织器官PSP的毒性高低依次是：消化腺>裙边>腮>性腺>贝柱。PSP毒素的毒性很强，摄入1mg就可致人死亡。[12]对动物神经系统和心血管系统有高度特异性，使人中毒的范围在600~5000Mu之间（Mu为毒力单位，1Mu是指使18~22g的小白鼠在15min内死亡的毒力），致死剂量为3000~30 000Mu。它由20多种结构不同的甲藻产生的毒素组成，这些甲藻既可在热带水域又可在温带水域生长。这种毒素溶于水且对酸稳定，在碱性条件下易分解失活；对热也稳定，一般加热不会使其毒性失效。PSP毒素属于胍类毒素，其活性部位为7，8，9位的胍基，与可兴奋细胞膜上的电压门控Na+通道位点1的氨基酸残基高亲和，通过选择性阻断Na+内流，阻碍动作电位的形成而起抑制作用。由于神经钠通道、脑钠通道、心钠通道、骨骼肌钠通道等各种钠通道存在差别，PSP毒素7，8，9位的胍基与钠通道氨基酸残基的结合也有所不同，但都是与更靠近钠通道外口的氨基酸残基结合。在成年兔骨骼肌钠通道，STX通过7，8，9位的胍基与通道上的Asp400和Glu755高亲和。此外，PSP毒素的C-12位的羟基（作为水合酮）和氨甲酰基侧链官能团对通道阻断也起一定作用，但不是关键性作用。在成年兔的骨骼肌钠通道，STX 1，2，3位的胍基与通道上的Asp1532亲和，也增加了其对钠通道的阻断作用；而neoSTX在N1位比STX多了一个羟基，此羟基能够与Asp400和Tyr401作用，与Tyr401可能形成氢键，因此比STX有更高的亲和力。通过研究龙虾巨轴突、枪乌贼巨轴突和青蛙郎飞氏结，发现PSP毒素能够抑制去极化刺激产生的膜瞬时钠传导。PSP毒素各衍生物对膜的作用机理相似，均以剂量-依赖型方式阻断钠离子内流，而对静息膜电位或钾通道无作用。[13]  钠通道α亚基结构[14]PSP在贝类体内呈结合状态，因而贝类摄入此毒素对自身不会造成危害；当人摄入含麻痹性贝类毒素的食物后，毒素会迅速释放并呈现毒性作用，潜伏期仅数分钟或数小时，症状包括四肢肌肉麻痹、头痛恶心、流涎发烧、皮疹等，严重者肌肉麻痹、呼吸困难、甚至窒息而死亡。[15]
临床表征PSP毒素中毒的最初症状为唇、口和舌感觉异常和麻木，这是由于口腔黏膜局部吸收了PSP毒素。继而这些感觉波及到靠近脸和脖子的部分，指尖和脚趾常有针刺般痛的感觉，并伴有轻微的头痛和头晕。有时在早期阶段出现恶心和呕吐。中毒稍微严重，出现胳膊和腿麻痹，随意运动障碍，经常有眩晕感。中毒严重时，则会出现呼吸困难，咽喉紧张；随着肌肉麻痹不断扩展加重，最终导致死亡。中毒致死的突出特点是患者临终前意识始终清晰。危险期为12~14h，度过此期者，可望恢复。PSP毒素中毒的严重程度由摄入的PSP毒素的特异毒性、摄入数量和排出速率决定。PSP毒素各衍生物毒性大小与其结合Na+通道位点1的牢固程度密切相关。[16]  小白鼠PSP染毒病理照片[17]
急救措施PSP 食物中毒很难诊断，一般诊断主要是依据进食史，即发病前摄入过可能含有PSP 的水产品，临床症状是以神经系统和神经机能支配紊乱为主要症状，以及有很明显的心脏血管的表现等综合判断，并且需要与抗胆碱酯酶（如毒扁豆碱）杀虫剂中毒、河豚鱼中毒等进行鉴别。没有特效的实验室检测方法来协助诊断，然而，可以收集中毒水产品的捕捞地水样检测有毒双鞭甲藻及对可疑食物PSP 定量定性检测来确定是否为麻痹性贝类中毒。中毒早期可皮下注射盐酸阿朴吗啡5mg引吐，或洗胃后灌入2%碳酸氢钠1L，口服活性碳吸附剂使毒素被吸附排出。对肌肉麻痹者可在急性期后给予士的宁2~3mg皮下或肌肉注射。一旦发现呼吸困难，必须立即实行人工呼吸、气管插管或机械呼吸，及时供氧。对PSP毒素中毒尚无特效解毒药。[18]
毒性季节变化特征PSP在贝体内的累积有一定的季节变化特征，这种变化因贝的种类、海域、年度、采样点而有所不同。一般来说，PSP在贝体内的含量春冬季较高，夏秋季偏低。调查显示：1996~1997年，大亚湾和大鹏湾的贻贝和扇贝消化腺中的PSP含量是春季最高，夏季和秋季有所下降，冬季回升。1997~1999年，大亚湾东山海湾染毒高峰期在冬季，大亚湾澳头海湾染毒高峰期却在春季，染毒贝种均为华贵栉孔扇贝。海湾扇贝PSP毒性最强出现在春季，秋季PSP未检出。华贵栉孔扇贝PSP毒性最强出现在冬季，夏秋两季毒性下降，全年均检测出PSP。不同海域贝类的染毒特点基本符合，即：春季和冬季是染毒高峰期，检出率比夏、秋季高。[19]  扇贝消化腺PSP含量变化[20]
PSP生化合成
Shimizu 等通过在培养产毒蓝藻时，喂养稳定同位素13C和15N 标记的小分子有机物，培养后提纯毒素进行核磁共振分析，发现是由乙酸（acetate）、精氨酸（arginine）、腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine）以及其他未知的化合物通过一条未知的途径先合成石房蛤毒素，后或再经过其他修饰酶的作用转化为其他种类的麻痹性贝毒。[21]Shimizu 等还提出了一个可能的关键步骤：一个乙酸单元或衍生物与精氨酸或其前体在α碳上的CLAISEN 聚合。这个步骤完善了Chevolot提出的精氨酸前体理论，使精氨酸或其前体的结构可以完整地合并入毒素分子中，同时符合试验的观测结果。Shimizu 等研究发现了毒素分子环状结构中所有碳分子的来源。Kellmann 等对产毒蓝藻Cylindrospermopsis raciborskii T3 提取蛋白进行体外试管试验，发现石房蛤毒素的生物合成前体是乙酸、精氨酸、腺苷甲硫氨酸、氨基甲酰磷酸（carbamoyl phosphate），参与合成的酶都来自于细胞质组分，同时试验中所需的一种未知的辅酶，可以使用极性溶液从膜组分中提取到。在此基础上，Moustafa 等利用sxt 基因簇（含26个推定的基因）作为模板或“饵”，通过全基因组测序、16S rRNA 分析、RAST 快速标注、发生树分析等技术，研究在产毒蓝藻（STX +）、不产毒蓝藻（STX－）和其他非蓝藻产毒生物如细菌、甲藻之间的同源和进化关系。结果发现，26个目标基因中有17个的起源是来自蓝藻自身，这17个中有4个（Group I）属于STX +和STX-所共有，另外13个只存在于STX + 中，这13个基因包括O-carbamoyltransferase、Sulfotransferase、Acyl-CoAN-acyltransferase、Saxitoxin-binding protein等；还有9个基因属于非蓝藻起源，其中5个起源于变形细菌（Proteobacteria），它们包括Cytidine deaminase、Amidinotransferase、Phytanoyl-CoA dioxygenase、Chaperone-likeprotein和1个未知基因；而关键的sxtA基因，BLAST 搜索发现其有2 个起源，前面的800 个氨基酸序列与Myxococcus xanthus（一种δ-变形细菌）的Polyketide synthase 基因是同源的，后390 个氨基酸序列与Frankia sp．（一种放线细菌）的classI&IIaminotransferase 基因是相似的。STX+的某个祖先获取这些基因的方式为水平基因传递（horizontal gene transfer，HGT）和基因融合。[22]  扇贝肠腺中PSP提取流程[23]蓝藻和甲藻都有部分种可产生石房蛤毒素，但在进化上它们属于多源起源。石房蛤毒素的生物合成机制为何会独立地发生于2 个不同的类群，一种假设是甲藻从蓝藻或其他细菌处通过HGT 或其他方式获得这些基因，另一种假设是甲藻体内的细菌共生体是石房蛤毒素的主要贡献者。这可能是未来该领域学者研究的一个重要方向。[24]  麻痹性贝毒生化合成步骤[25]
中国海域内PSP分布
在中国南方海域PSP毒素研究中，不同地域间毒素的组成和含量虽有差别，但大体上比较相似，广东沿海PSP毒素主要成分为低毒力的GTX5、C1和C2，高毒力的GTX1~4也占一定比例，STX类毒素很低，在深圳大亚湾的有毒贝类中，α型毒素都多于β型毒素，α/β介于1.6~4.4之间[12]。在广东沿海的120个检测的样品中，只有13个被检测出含有PSP毒性数据，检出率为10.8%；PSP毒性范围为152~198 MU·（100 g）-1。其中北津港（东平）的托氏毛蚶和神泉港（神泉）的近江牡蛎样品中的PSP毒性，在1 h内致小白鼠的死亡率非常高，但毒性并不强，检测出的毒性量值大大低于中国暂定的警戒标准[对KM系小白鼠而言，约423 MU·（100 g）-1]。[26]  贝类采集站位图[27]20世纪90年代春季广东近岸海域PSP毒性的检出率和毒性值均处于较高的水平。但自2003年以来广东近岸海域的PSP毒性呈偏低状况。国家海洋局南海环境监测中心在2003、2004年春季对南海区的多处地点和众多样品进行贝毒素检测，大多出现检不出贝毒素的情况，检测出的贝毒素最高值也低于200 MU·（100 g）-1。[28]  中国沿海PSP毒素分布[29]而在北方，大连的虾夷扇贝中PSP毒素成分也是以低毒力的C1和C2为主，占60%以上，其次为GTX2和GTX3，STX和neoSTX含量最低，为5%左右；但未发现GTX5、GTX1和GTX4；在检出的麻痹性贝毒组分中，α型毒素包括C1和GTX2，β型毒素包括C2和GTX3，α/β接近于1，表明扇贝累积麻痹性贝毒毒素的时间还较短。[30]　在黄海北部海域发现的麻痹性贝毒存在于虾夷扇贝（Patinopecten yessoensis）体内，证实中国北方海域有麻痹性贝毒存在。有毒虾夷扇贝样品都出现在5月和6月，其中2003年6月25日检出的贝毒毒性为445 MU/100 g，2005年5月25日检出的贝毒毒性为419 MU/100 g，均已超出食用安全标准（400 MU/100 g）。值得关注的是，12个扇贝样品中有9个直接采自大连附近海域；另外3个样品购自青岛，其中有2个检出麻痹性贝毒毒性，其原产地也是大连。由此可以看出，染毒贝类的运输和异地销售有可能危及其它区域的消费者健康，同时也给毒素来源分析造成困难。虾夷扇贝样品检出含有麻痹性贝毒的同期，在大连海域检测的紫石房蛤、紫贻贝和栉孔扇贝却都没有检出麻痹性贝毒，研究期间大连海域表层海水中未发现毒赤潮生物，有毒赤潮生物可能以孢囊的形式沉于海底，通过虾夷扇贝的滤食作用累积毒素。不同的亚历山大藻藻种间毒素组成和毒性高低有很大差异，而即便对于同一藻种，来自不同海域的藻株之间毒素组成和毒性高低也有差别，毒素在贝类体内也会发生复杂的转化。因此，仅参照国内有毒藻种的分析结果，很难确定贝类样品中的毒素来源，有关虾夷扇贝毒素来源还应做深入的研究。  虾夷扇贝PSP含量变化[31][32]
毒素检测
检测标准有关赤潮毒素的毒性标准各国规定不一，分析方法也有差异。80%以上的国家和地区使用小白鼠生物分析法分析PSP毒性，仅荷兰、丹麦及英国（苏格兰）规定同时使用HPLC（高效液相色谱）方法分析PSP毒性。警戒（安全）PSP毒性一般规定为80μg STXeq·（100 g）-1，即相当于400 MU·（100 g）-1，这在整个欧洲国家属于政府规定标准。美国、日本、韩国和澳大利亚等国均采用这一标准，这一标准也是联合国卫生组织和联合国粮农组织规定及推荐的标准。菲律宾和挪威的PSP毒性警戒标准限制为40μg STXeq·（100 g）-1[相当于200 MU·（100 g）-1]。英国的北爱尔兰则将PSP毒性警戒标准规定为32μg STXeq·（100 g）-1。[33]依据上述情况，中国将PSP毒性的警戒标准暂定为80μg STXeq·（100 g）-1，即每100 g贝类软组织中PSP毒性的STX当量值不得高于80μg[对KM系小白鼠而言，约423 MU·（100 g）-1]。检测方法有小鼠生物测定法、电泳法、高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法等。在这些检测方法中小鼠生物法是最常用的方法。[34]
生物分析法小鼠生物法是利用麻痹性贝毒易溶于酸性溶液，酸性条件下热稳定的性质，在pH值2~3，煮沸5 min提取麻痹性贝类毒素，对小鼠进行腹腔注射，小鼠产生特殊的抽搐麻痹症状并死亡，根据小鼠死亡时间，判断毒性大小。该法易掌握，不需要使用专门仪器，但操作繁琐，灵敏度不高，且在酸性环境中加热有可能导致磺酰氨甲酰基类毒素转变为相应的氨基甲酸酯类毒素，使毒性增大，而且花费高、重现性差、可比性低、需大量使用小鼠，不适合大规模的现场检测。基于麻痹性贝毒特异结合钠离子通道的特性，细胞毒性试验也被用于麻痹性贝毒的检测。基于抗原抗体反应原理的酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbentassays，ELISA）具有方便迅速的优点，已有售商品化的酶联免疫分析试剂盒。由于抗体可能存在交叉反应等缺陷，还不能取代小鼠生物法。[35]
理化分析法理化分析法是将毒素分子通过碱性氧化成为荧光衍生物或有色生物后通过紫外或荧光检测系统进行分析检测。高效液相色谱法 （HPLC）是最常用的理化分析法。HPLC法检测不同PSP时采用不同的洗脱体系及洗脱方法，且衍生过程也不同。同小鼠生物检测法相比HPLC具有检测速度快、检出限低、灵敏度高等诸多优点。但是需要根据小鼠生物测定法进行标定且缺乏PSP 分析的标准品是HPLC法的主要缺点。另外，影响HPLC法普遍推广的另一个原因是PSP 类似物的毒性种类都是唯一的且类似物间易相互转化，判断样品中的原始或潜在总毒性较困难。[36]
免疫化学法20 世纪60 年代起科研人员开始研究应用免疫检测技术检测PSP；80年代末建立的酶联免疫吸附技术和放射性免疫因交叉反应低，不能检测所有的毒素而未能得到推广。90年代初成功的建立了酶联免疫吸附检测技术。免疫化学技术应用于PSP 检测主要以单克隆抗体（MAb）为基础。国外学者尝试制备PSPMAb 抗体及定量测定PSP，取得令人满意的结果。PSP 为小分子物质，不具有免疫原性，需要将其连接到大分子载体上，使其成为完全抗原，再用来免疫动物。一般采用小剂量长周期免疫方案制备单克隆抗体。免疫化学检测法检出限低且干扰少，对样品前处理要求较低、简便、快速、特异、经济，因此具有极高的推广价值。但免疫技术检测贝毒存在产生抗体的交叉反应、系列标准毒素的缺乏等问题，这些问题限制着该技术的深入应用。而且抗体往往只是针对某一种毒素所建立，对于其他贝毒常常表现出较低的交叉反应，不能检测所有的贝毒等。[37]