标题：15联呼吸道病毒荧光标记PCR检测试剂盒
产品简介
试剂盒针对流行性感冒病毒A型和流行性感冒病毒B型（FluA和FluB）、呼吸道合胞病毒A（RSVA）和呼吸道合孢病毒B（RSVB）、腺病毒（AdV）、人偏肺病毒（MPV）、冠状病毒OC43（OC43）、冠状病毒229E/NL63（229E/NL63）、副流感病毒1型（PIVl）、副流感病毒2型（PIV2）、副流感病毒3型（PIV3）、副流感病毒4型（PIV4）、鼻病毒A/B/C（HRV）、肠道病毒（HEV）、和人博卡病毒1/2/3/4（HBoV）共15种常见呼吸道病毒进行检测。可以应用于季节性呼吸道疾病的病原学检测，突发疫情状态下的疫源病原体的排除检测，结核病人的伴随呼吸道病原体感染检测，免疫低下患者的呼吸道病原体机会感染检测以及区域网络病原体监测等场合。
该试剂盒针对各型病原体设计了独特的扩增引物，分成三组进行PCR混合反应，避免了多重反应相互之间的干扰，同时每组反应内部加设内参照，可以区分真实阴性反应或者由于反应体系不正确导致的假阴性反应。PCR体系中采用Premix技术，预混合液中直接含有rTaq、反应Buffer、dNTP 等，加入模板即可进行反应。
PCR引物中还设计了独特的荧光标记物，产物可经由目前普及使用的ABI3730测序仪进行仪器性的图谱判读，避免了人眼识别的经验差异的干扰。在有经验的实验室内，各组PCR产物也可以直接进行琼脂糖凝胶电泳，经EB染色后，直接在紫外下观察和记录结果，本手册中也描述了这样的流程。
该试剂盒由“博易医学”研发，目前已经过临床初步验证，检测灵敏度高，比国际同类产品质量相当，价格仅为其几分之一，可在国内多数场合被接受应用。预计于2012年12月在国内市场推出。
附件：
15联呼吸道病毒荧光标记PCR检测试剂盒
（BE-R15FPCRVersion 1.0, 50次量）
应用范围
本试剂盒用于人鼻咽拭子（鼻腔擦拭液）、鼻咽分泌物和支气管肺泡灌洗液标本中15种常见呼吸道病毒的定性检测。15种呼吸道病毒为: 
流行性感冒病毒A型(FluA)流行性感冒病毒B型(FluB)呼吸道合胞病毒A (RSVA)呼吸道合孢病毒B (RSVB)腺病毒(AdV)人偏肺病毒(MPV)冠状病毒OC43 (OC43)冠状病毒229E/NL63 (229E/NL63)副流感病毒1型(PIVl)副流感病毒2型(PIV2)副流感病毒3型(PIV3)副流感病毒4型(PIV4)鼻病毒A/B/C (HRV)肠道病毒(HEV)人博卡病毒1/2/3/4 (HBoV)腺病毒Adv：可以检测大部分的B、C、E亚群和部分A、D亚群。
流行性感冒FluA：本引物可以检测高致病性禽流感H5N1和2009年H1N1亚型。
检测原理
聚合酶链式反应（PCR）DNA扩增技术具有强特异性和高灵敏度的特点，但是凝胶电泳判读PCR产物容易受人经验影响与干扰。本试剂盒检测主要分为2个步骤：分三组进行多重PCR扩增目标DNA；目标DNA扩增获得的荧光标记产物合并进行ABI3730毛细管电泳图谱检测。
本试剂盒针对流行性感冒病毒A型和流行性感冒病毒B型（FluA和FluB）、呼吸道合胞病毒A（RSVA）和呼吸道合孢病毒B（RSVB）、腺病毒（AdV）、人偏肺病毒（MPV）、冠状病毒OC43（OC43）、冠状病毒229E/NL63（229E/NL63）、副流感病毒1型（PIVl）、副流感病毒2型（PIV2）、副流感病毒3型（PIV3）、副流感病毒4型（PIV4）、鼻病毒A/B/C（HRV）、肠道病毒（HEV）、和人博卡病毒1/2/3/4（HBoV）设计了独特的扩增引物，分成三组进行PCR混合反应，避免了多重反应相互之间的干扰，同时每组反应内部加设内参照，可以区分真实阴性反应或者由于反应体系不正确导致的假阴性反应。
PCR体系中采用Premix技术，预混合液中直接含有rTaq、反应Buffer、dNTP 等，加入模板即可进行反应。
PCR引物中还设计了独特的荧光标记物，产物可经由目前普及使用的ABI3730测序仪进行仪器性的图谱判读，避免了人眼识别的经验差异的干扰。
在有经验的实验室内，各组PCR产物也可以直接进行琼脂糖凝胶电泳，经EB染色后，直接在紫外下观察和记录结果，本手册中也描述了这样的流程。
试剂组成（50次量）
PCR Premix*
500 μl × 3
Primer Mix A（2 pmol/μl）
30 μl × 2
Primer Mix B（2 pmol/μl）
30 μl × 2
Primer Mix C（2 pmol/μl）
30 μl × 2
Marker 
100 μl × 1
Negative control（sterilize water）
45 μl
*PCR Premix中含有rTaq、反应用Buffer、dNTP Mixture等，应尽量避免反复冻融。
保存温度
-20℃保存，应尽量避免反复冻融。
注意事项
本产品用于实验室研究。本检测适用于人鼻咽拭子（鼻腔擦拭液）、鼻咽分泌物和支气管肺泡灌洗液样本。实验过程中应使用一次性耗材，以防污染。PCR Premix中含有rTaq，应尽量避免反复冻融。背景信息
呼吸道感染病原学复杂，包括细菌、病毒、支原体、衣原体、真菌等，其中80%以上是病毒性的[1-4]。该病四季、任何年龄均可发病，通过含有病毒的飞沫、雾滴，或经污染的用具进行传播。常于机体抵抗力降低时，如受寒、劳累、淋雨等情况，原已存在或由外界侵入的病毒或/和细菌，迅速生长繁殖，导致感染，一般5-7天痊愈。常继发支气管炎、肺炎、副鼻窦炎，少数人可并发急性心肌炎、肾炎、风湿热等。呼吸道感染是世界范围内低龄儿童（<5岁）死亡的首位原因[5]，每年可造成约5百万儿童死亡。儿童上呼吸道感染的患病次数平均为3-8次/年，下呼吸道感染率比URTI低，在1岁儿童中感染的比例约1~3%，学龄儿童至5%~10%[6-7]。呼吸道病毒习惯上是指侵害呼吸道的病毒，至少涉及到8个科，200多种型别的病毒。临床常见的可导致呼吸道感染的病毒有腺病毒(AdV)、甲型流感病毒(FluA和FluB)、呼吸道合胞病毒(RSV)，人偏肺病毒(MPV)、副流感病毒1-4型(PIvll-PIV4)、鼻病毒(HRV)、冠状病毒(OC43、229E/NL63)、肠道病毒(HEV)和人博卡病毒(HBoV)等[8-12]。
腺病毒（AdV） 腺病毒（familyAdenoviridae）是一种没有包膜的直径为70～90 nm的颗粒，线状双链DNA病毒。分为两个属，6个亚群（A-F），包括51个血清型。腺病毒可通过人、水、媒介物和器械传播, 室温条件下, 腺病毒在污物中存在周期可延长至3周。腺病毒在儿童和军营人员中更易发生感染和大规模流行, 大多数婴幼儿在出生后的5年内至少感染过1种腺病毒株。该病毒可导致肺炎、发热上呼吸道疾病、结膜炎、膀胱炎、肠胃炎等，根据感染者的免疫和心肺功能的不同可导致严重的呼吸窘迫甚至死亡。ADV感染全年散发，冬春季相对较多，阳性检出率最高可达15%[13]。
甲型流感病毒和乙型流感病毒(FluA和FluB) 流感病毒（familyOrthomyxoviridae）主要包括内部的核心和外部的病毒囊膜，核心是由核蛋白卷曲包绕螺旋形RNA组成，核蛋白的抗原稳定，很少发生变异，具有型特异性。根据核蛋白抗原性的不同，将流感病毒分甲( A) 、乙( B) 、丙( C) 三型，三型病毒具有相似的生化和生物学特征。猪和禽类可携带甲型流感，乙、丙型流感仅在人之间转播。甲型和乙型流感的临床症状相似，但是甲型流感病毒导致的住院率四倍于乙型流感病毒。乙型流感通常有肌炎及胃肠道症状。丙型流感很少有下呼吸道症状，但偶尔会造成上呼吸道疾病。可引起急起高热、显著乏力，全身肌肉酸痛，而鼻塞、流涕和喷嚏等上呼吸卡他症状相对较轻。本病具有自限性，但在婴幼儿、老年人和存在心肺基础疾病的患者容易并发肺炎等严重并发症而导致死亡。一般出现于冬季，北半球通常在1、2月份达到高峰，南半球的流行时间较晚，热带地区可常年发病。世界性大流行常有2～3个流行波，一般流行3～4周会自然停止。世界卫生组织估计北半球每年1亿人感染流感，5000万次就诊，30万次住院，主要是高危人群和老年人，每年1万人死于流感，主要是虚弱的老年人[14]。
呼吸道合胞病毒(RSV)呼吸道合胞病毒（family Paramyxoviridae）是一种RNA病毒。多见于新生儿和6 个月以内的婴儿，可由空气飞沫和密切接触传播，潜伏期3～7日，传染性强。应用单克隆抗体可将RSV分为A、B两个亚型,有文献报道RSV A亚型感染起病急,病情重; B亚型感染病情相对较轻。RSV是世界各地婴幼儿病毒性肺炎和毛细支气管炎的主要病原体之一，严重威胁婴幼儿健康，尤其是早产儿、先天性心脏病患儿、免疫缺陷的婴儿和儿童易发严重性RSV感染。从新生儿到成年人任何年龄组都会感染合胞病毒。婴幼儿症状较重，可有高热、鼻炎、咽炎及喉炎，以后表现为细支气管炎及肺炎。少数病儿可并发中耳炎、胸膜炎及心肌炎等。成人和年长儿童感染后，主要表现为上呼吸道感染。有研究表明RSV流行季节集中于每年的冬春季(11月至翌年3月，高峰出现在12月至翌年1月)，我国北京地、杭州、苏州及其他温带国家(如日本、美国)均一致，就诊的儿童患者阳性率可达42.50% [15]。
偏肺病毒(MPV) 偏肺病毒（familyParamyxoviridae）是有包膜的大约13kb单股负链RNA病毒。MPV是2001年Vanden Hoogen等首次报道的一类与人类, 特别是婴幼儿呼吸道感染相关的新病毒。MPV与近10%病因不明的呼吸道感染有关, 是非流感病毒流行季节儿科急性呼吸道感染仅次于呼吸道合胞病毒的第二位病毒病原。MPV 感染的临床表现与RSV 非常相似, 可引起上呼吸道感染以及严重的毛细支气管炎、肺炎, 是引起婴幼儿喘息主要原因之一，可诱导或加重哮喘急性发作。MPV 在全世界流行，可以感染儿童、老人、免疫缺陷者，尤其以儿童为主要感染对象。MPV感染具有明显季节性，在大多数地区全年散发，好发于晚冬和春天，其流行高峰常与RSV活动高峰相同或稍后。研究报道，我国2007-2008年MPV感染主要发生冬春季，占全年MPV感染的84.4%[16]。
副流感病毒1,2,3,4型(PIVl,2,3,4) 副流感病毒（familyParamyxoviridae）多形有包膜的病毒, 直径约125～250 nm, 负单链RNA 基因组, 核衣壳蛋白紧密包饶。可通过人与人直接接触或飞沫传播, 进入人体于呼吸道上皮细胞中增殖。PIV可引起所有年龄组的人上呼吸道感染, 尤其是可引起婴幼儿及儿童哮喘、细支气管炎和肺炎, 更易于引起严重下呼吸道感染, 并可引起急中耳炎, 与急性和慢性神经系统疾病有关。PIV感染呈全球性分布, 是常见的社区获得性呼吸道感染的病原, 2岁以下的儿童感染率最高, 成人感染较少。机体对PIV 不能产生有效、持久的免疫保护, 终生可感染此病毒。根据遗传学和血清学可分为4型, PIV1～4,每种亚型主要的结构和生物学特征相似，但流行病学和所引发疾病的临床特征有差异。PIV1一般为隔年发生一次较大的交替流行, 全球都可发病。美国已报道从1973 年以来每个奇数年的秋天发生PIV1 流行; 每次PIV1流行时, 约有0. 57 ~ 2. 89 万儿童( < 5 岁) 住院。PIV2一般为每两年一次或与PIV1交替流行, 在美国每年因PIV2 感染住院的儿童约0. 18~ 1. 56万例, 其中约60% 发生于< 5 岁儿童, 高峰年龄为1~ 2 岁。英国报道PIV3感染占PIV总感染的71% , 主要流行于春夏季, 且常年均有散发, 北美、芬兰和澳大利亚HPIV3 流行和英国相似。美国每年因PIV3感染住院儿童约0. 87~ 5. 2万例[17], 尤其多见于合并有免疫抑制和慢性病患儿。PIV4分离和流行病学很少有报道, 且研究数据在各年龄组比较分散。临床上分离出来的主要为PIV4b 亚型, 可引起不同呼吸道症状, 但一般症状较轻, 住院率较低。PIV 可引起所有的呼吸道感染性疾病, 在婴幼儿严重下呼吸道感染的病原体中, 检出率仅次于RSV。血清学调查亦显示, 绝大多数6～10 岁儿童曾感染过PIV。
鼻病毒(HRV)鼻病毒（familyPicornaviridae）核心为无折叠的单股正链RNA, 长约7200bp。HRV是致呼吸道感染病毒中重要的致病因子, 可引起急、慢性呼吸道感染, 严重时会引发哮喘、慢性阻塞性肺炎等临床疾病。HRV 感染后常表现为感冒症状, 大约有10% - 20%的成年人感冒是由HRV 感染引起, 而婴幼儿感冒有15% 到30% 是由HRV 致病[18]。HRV的感染具有自限性, 但是有时会引起诸如哮喘、充血性心衰, 支气管扩张, 包囊纤维化等严重并发症, 并且HRV 多与其它呼吸道病毒合并感染, 例如呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、冠状病毒以及肠道病毒等。值得一提的是对于儿童和患有呼吸道基础疾病的易感群体, HRV 感染后还可能会出现较为严重的后遗症, 严重影响患者的生活质量。在世界范围内HRV感染存在于各年龄组并全年均可发生，但在温带地区HRV感染流行高峰主要集中于早春及秋季，检出率最高可达56.4%[19]。
冠状病毒(OC43、229E/NL63)冠状病毒（familyCoronaviridae）是单股正链RNA 病毒，其基因组长度约为30,000 bp，在目前已知的RNA病毒中是最大的。冠状病毒是人呼吸道感染的重要病原,也是成人慢性气管炎患者急性加重的重要病因之一。该类病毒感染广泛, 分布于世界各地, 多发生在冬春季节。人群中大约10%～30%的冬季上呼吸道感染是由冠状病毒引起的, 是普通感冒中居第二位的病因[20]。
肠道病毒(HEV) 肠道病毒（familyPicornaviridae）含有一个单股正链RNA 病毒, 大小约7- 8kb。肠道病毒可引发多种感染, 情况较为复杂。主要包括急性呼吸道疾病、无菌性脑膜炎、脑膜脑炎、心肌炎、手足口病、新生儿多器官衰竭和急性弛缓性麻痹等。其发病多以综合征出现, 婴幼儿患者可引发严重心肌炎或重症肺炎, 而导致死亡。HEV感染在夏秋季为主,多见于温暖季节5~ 10月, 有研究检出率可达26.4%[21]，热带和亚热带可一年四季流行.
人博卡病毒(HBoV)人博卡病毒（familyParvoviridae）是线性单链DNA。HBoV是由瑞典学者Allander等于2005年从呼吸道感染患儿鼻咽分泌物中进行病原检测, 分离得到的一种新病毒。HBoV 呈全球性分布, 世界各地相继报道从婴幼儿的鼻咽分泌物、血清及粪便和尿液中检测到HBoV。HBoV感染者的普遍症状是发热、干咳、呼吸难、轻微哮喘等, 部分出现呼吸困难, 伴有轻微哮喘症状, 而机体其他指标如白细胞计数、氧饱和度、C反应蛋白水平等均未出现异常, 部分患者X 线胸片异常。急性呼吸道感染患者(主要是儿童)的呼吸道分泌物中, HBoV的阳性率为3. 1% ~17. 1%，HBoV四季均可检测到, 有研究显示冬季检出率高。多数研究认为, HBoV感染的高峰季节为冬季, HBoV 的检出率是5. 2%[22]。