标题：rna干涉
RNAi简介
  RNAi[1]　　RNA干涉又称RNA干扰，是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。RNAi的作用提供了一种经济、快捷、高效的抑制特异基因表达的技术手段，有助于研究该基因在生物模型系统中的作用，是研究基因功能的重要工具，并且逐步成为病毒性疾病、遗传性疾病以及肿瘤等的基因治疗研究的一种手段。通过该过程，双链RNA诱导目标基因沉默。
1995年，康乃尔大学的Su Guo博士在试图阻断秀丽新小杆线虫（C. elegans）中的par-1基因时，发现了一个意想不到的现象。她们本是利用反义RNA技术特异性地阻断上述基因的表达，而同时在对照实验中给线虫注射正义RNA（sense RNA）以期观察到基因表达的增强。但得到的结果是二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释正好相反的。该研究小组一直没能给这个意外以合理解释。
直到1998年2月，华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire和马萨诸塞大学医学院的Craig Mello才首次揭开这个悬疑之谜。通过大量艰苦的工作，他们证实，Su Guo博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。当他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。该小组将这一现象称为RNA干扰（RNA interference ,简称RNAi）。
由于基因的功能无法表达而不能显现,故又将此现象称基因沉默(gene silencing)。现在研究证明，RNAi现象存在于各种无脊椎动物、脊椎动物、哺乳动物中，例如果蝇、锥虫、涡虫、水螅、线虫、斑马鱼以及小鼠，甚至在原核生物如大肠埃希菌中都广泛存在。
RNAi的机制
基因所携带遗传信息(即单个基因的具体功能)的传递是通过名为信使RNA的分子进入细胞蛋白合成“工厂”而实现的，而基因功能的研究方法一直是研究工作的拦路虎。Fire和Mello通过线虫实验证实：某些分子触发了特定基因上RNA的破坏，导致蛋白无法合成，出现“基因沉默”，而这一过程便被称为RNAi。天然的RNAi现象存在于植物动物和人类等真核生物的体内，在调解基因活力和预防病毒感染方面起到重要作用。同时他们还发现了有效关闭基因表达的方法，这样当某一特定基因被“沉默”后，其功能便反向的体现出来了。
RNAi的作用机制尚未完全清楚，据目前的研究成果看来主要有3种形式，即转录水平、翻译水平和转录后水平。其中转录后水平是RNAi在各种生物中实现的主要方式，其机制研究也较深入。转录水平和翻译水平转录水平上的干扰机制是通过对靶基因染色质结构的改变，使其基因转录受限，导致表达系统的关闭。dsRNA被降解成21个～23个核苷酸长的小片段RNA 时,这些小的RNA分子在细胞核可以诱导组蛋白H3的基因及相应DNA的甲基化[1]。这种序列特异性甲基化的信号与RNA和DNA结合有关。当dsRNA 含有与启动子同源的序列,即可使同源靶启动子序列甲基化,从而使靶启动子失去功能,导致下游基因沉默，则转录不能进行。若甲基化出现在编码区，转录能进行，但在转录后水平上沉默。非致病病毒造成转录水平的基因沉默，最先发现于菜花样花叶病毒上,其35 S启动子转录得到含有胭脂碱合成酶启动子(NOSpro)序列的NOSpro RNA。在转基因烟草中,据报告未腺苷酸化的NOSpro dsRNA可以诱导同源NOSpro DNA的甲基化,并使拷贝在转录水平上反式失活。在链孢霉属,DNA的甲基化可能是异染色质的siRNA介导的组蛋白H3 K9的甲基化,是由H3甲基转移酶催化的[2]。翻译水平上的干扰机制，是通过抑制相应mRNA的翻译,使相应的蛋白质表达受阻。其中起重要作用的是微RNA(micro-RNA，miRNA)，它是由长度约70 nt的RNA形成的茎环样前体,经?Dicer?酶作用后形成长约21 nt～25 nt的单链RNA,与相关蛋白结合成RISC复合体。然后识别并结合在mRNA的3′末端非翻译区上,阻止核糖体与mRNA的结合及核糖体的移行，从而抑制翻译的进行。转录后水平目前, 在有关RNAi发生机制的研究中, 转录后水平上的干扰是研究的最多、最清楚的一种机制。其作用大致可分为以下两个阶段。
（1）siRNA形成阶段。外源性（如病毒RNA复制的中间体或人工导入的dsRNA）或内源性（如细胞中单链RNA在RdRP的作用下形成的dsRNA）dsRNA通过Argonaute家族基因编码的蛋白质的识别，进一步诱导dsRNA与Dicer结合。目前已经分离出多个Argonaute家族蛋白,包括线虫中的RDE-1,果蝇中的AGO-1、AGO-2、Aubergine,锥虫中的TbAGO1和TbPWI1[3],人类细胞中的PI-WI亚族(4 个)和eIF2C/AGO亚族(4个)。dsRNA和Dicer结合后，在ATP的参与下被Dicer酶（RNase Ⅲ）切成21 nt～23 nt长度的小干扰RNA（small interfering RNA ，siRNA）。Billy E等[5] 在小鼠畸胎瘤细胞F19和P19的细胞质提取物中发现长727 bp的dsRNA被剪切为约21 nt～23 nt 片段,即siRNA,其强烈抑制了同源基因的表达。?Elbashir S M[6]等从发生沉默的果蝇细胞中分离出siRNA ,可在果蝇胚胎裂解液和果蝇S2细胞中(标准果蝇细胞系)诱发特异性的基因抑制。Dicer切出的siRNA两条链末端均为5′-P和3′-OH，3′末端各有两个突出的核苷酸。切割后的siRNA的一条链与蛋白复合物结合成RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。它由多种蛋白质成分组成,包括内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA链搜索活性酶等。Zamore P D等[7] 报道，无活性RISC存在于胚胎细胞中,并以250 ku分子质量的前体形式存在,在ATP激活下加工成100 ku的RISC,切割底物mRNA。RISC与互补的靶mRNA结合，在酶的催化下切割、降解，从而达到干扰基因表达的作用。
（2）扩增循环阶段。RNAi的扩增循环机制，是由Lipardi等通过对果蝇胚胎提取物研究后提出的。如果特异性siRNA与靶mRNA结合后,没有被活性酶切割、降解；而是以siRNA中的一条链为引物, 以靶mRNA为模板, 在RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polym erase, RdRp)的作用下, 延伸形成新的dsRNA,被Dicer内切酶或相关酶切割为新的21 nt～23 nt siRNA (即次级siRNA)。Dicer内切酶是Bernstein E等[8]从果蝇中分离出一种能特异性降解dsRNA的核酸酶,属于RNase Ⅲ核酸酶家族成员。Dicer具有以下结构域，即与Argonaute家族同源的PAZ区域、Ⅲ 型RNA酶活性区域、dsRNA结合区域以及DEAH/DExH RNA解旋酶活性区，在其进化中高度保守[9]。试验发现,在对dsRNA分子降解时,2个Dicer能够形成二聚体。每个二聚体包括4个活性中心, 在降解RNA时其中的2个要失活, 从而使降解过程间隔进行。这个间隔正好为22个核苷酸, 即每隔22个核苷酸Dicer将dsRNA降解一次。然而, Dicer结构上的微小改变将会引起间隔的改变, 所以不同的物种产生的siRNA长度也略有不同。次级siRNA又能再次与相关蛋白质形成RISC, 继续反作用于靶mRNA, 令其切割、降解。这就使作为模板的dsRNA 和作为引物的siRNA都能得到循环扩增, 从而使RNAi具有惊人的潜力和强大的扩增效应。转基因RNA和病毒RNA都在RdRP的识别下启动RNAi的反应过程。此外,RNAi 的扩增效应还可能存在另外两种机制:①Dicer 将长dsRNA 切成初级siRNA ,这一放大水平取决于dsRNA的长度。②siRNA 在酶的作用下可以多次应用,产生进一步的放大效应。这些扩增机制只是一种推测,是否存在尚需进一步的实验研究确定。
研究策略与方法
siRNA的制备和获得途径包括：化学合成、载体表达、PCR表达框、酶促合成等等。其中每种方法都有自己的优缺点，不过相较而言化学合成方法因高通量、合成快速、容易控制、实验重复性好及可以根据各种要求做相应的修饰，而且在临床应用中在安全性、低副作用、高通量生产等方面的优势受到广泛的关注！[2]
RNAi应用前景
抗病毒感染方面dsRNA出现在许多病毒(包括单链RNA病毒)感染的细胞内,诱发RNAi,封闭病毒生存和繁殖所必需的基因,产生抗病毒效应。病毒感染后, dsRNA的出现使PKR和2′,5′-寡核苷酸聚合酶大量增加,干扰素合成增加。siRNA可望成为防治病毒的有效工具,尤其是对RNA病毒。Capodici J等[10]将靶向抵抗HIV的siRNA双链转染到培养细胞中后能特异性的抑制HIV感染细胞株及CD4+ T 细胞。同时还发现在T细胞株和原代淋巴细胞中该siRNA 能有效的抑制HIV 的基因表达和增殖。Gag蛋白的表达可阻碍HIV感染细胞[11 ]。所以应用siRNA可能成为防止HIV-1感染的一种有效手段。Mccaffrey A P等[12]用RNAi来抑制乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)的复制，将HBV质粒和能抑制同源HBV基因表达的短发夹结构RNA(shRNA)一起转染入小鼠肝脏,Northern和Southern Blot检测发现HBV RNA和蛋白质表达水平明显降低,HBV表面抗原(HbsAg)在培养细胞中降低94.2%,在小鼠血清中降低84.5%;通过免疫组化检测HBV核心抗原(HbcAg)降低99 %。这提示RNAi 技术为抑制肝炎病毒基因的表达和感染的基因治疗提供了新的手段。Hamasaki B M等[13]构建的siRNA特异性表达载体与HBV病毒DNA共转染人肝癌细胞Hu H7和Hep G2,降低了RNA 及其复制中间体的水平,并引起HBeAg分泌的下降。还有许多研究人员利用RNAi技术，在流感病毒、脊髓灰质炎病毒等其他病毒的繁殖方面，做出了可喜的成果。基因治疗和抗肿瘤方面RNAi作用的高度特异性，有可能特异地抑制致病的突变等位基因,但又不影响正常等位基因功能,所以RNAi在基因治疗上有广阔的应用前景。Zhang L等[14]针对血管内皮细胞生长因子（VEGF）不同亚型设计的特异性siRNA进行RNAi技术体外试验，结果表明可使不同亚型的VEGF发生特异性的抑制,为分析各种VEGF亚型的生物学功能提供了帮助。Elbashir S M等[15]分别用合成的仅21 nt siRNA转染入包括人Hela SS6 在内的几种培养的哺乳动物细胞中,结果发现有21种基因发生沉默,其中13种基因为细胞生长所必需的基因。值得注意的是，用RNAi技术研究的这13种基因的功能表型与过去运用其他方法研究它们的表型是一致的,说明利用RNAi 技术研究基因功能具有快速性和可靠性。
肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结构,传统技术诱发的单个癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长,而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性,设计针对这一序列的dsRNA分子,只导入一种dsRNA 即可以产生多个基因同时沉默。在体外合成21 nt的siRNA转染入哺乳动物细胞中，能引起特异性基因抑制。转染特异性siRNA入人胚胎肾细胞系(273细胞)和Hela细胞系后,结果靶mRNA所表达的蛋白质的量比转染前低了90% ,但并未发现非特异性基因抑制及细胞死亡。Maen等应用RNAi技术成功地阻断了MCF27乳腺癌细胞中一种与细胞增殖分化相关的基因（核转录因子基因Sp21）的异常表达。Scherr M等[16]以引起慢性髓性白血病和bcr-abl阳性急性淋巴细胞白血病的bcr-abl癌基因为靶基因,设计了对应的siRNA ,并获得了87%的有效抑制率。Shu X等[17]针对鞘氨醇激酶(SPK)的siRNA转染入培养细胞中,阻滞了VEGF诱导的Ras-GTP和磷酸化的细胞外信号调节激酶的积累,同时发现只有针对靶SPK1的siRNA具有该作用。此研究结果不仅提示了SPK对VEGF兴奋作用的证据,即它对内皮细胞信号传导和肿瘤细胞表达VEGF受体的促进作用，同时也说明通过靶作用于SPK1的siRNA对VEGF的干扰也能间接抑制其新血管的生成及肿瘤的生长。
在功能基因组研究中,需要对特定基因进行功能丧失或降低突变,以确定其功能。由于RNAi具有高度的序列专一性,可以特异地使特定基因沉默,获得功能丧失或降低突变,因此RNAi可以作为一种强有力的研究工具,用于功能基因组的研究。在寄生虫基因功能研究和抗寄生虫药物方面研究表明, 多种寄生虫内均存在RNAi的现象,RNAi技术已成功地应用于多种寄生虫和媒介昆虫。迄今,运用RNAi技术已鉴定了多种布氏锥虫基因的功能,如抑制TbPMC1/2 会使钙离子流通速度下降,胞内Ca2 + 浓度上升[18]。TbARL1对哺乳动物体内虫体的正常发育有重要作用,对TbARL1进行RNAi后可出现虫体形态异常,多鞭毛,运动能力丧失[19]。Vayssie L等[20]用浸泡的方法,将针对γ-微管蛋白(γ-tubulin)siRNA质粒导入溶组织内阿米巴原虫,结果显示γ-微管蛋白位于细胞核内,能介导微管的形成。RNAi后表型有明显的改变,抑制效应与dsRNA的量有关。Cheng G F等[21]用RNAi技术对日本血吸虫的抱雌沟蛋白(SjGCP)进行实验发现,SjGCP被抑制后影响了雌雄虫的合抱,这种抑制效应也是与dsRNA的量有关。
用RNAi研究布氏锥虫的Trys基因，发现Trys被抑制后,T(SH2)和GSP被消耗,GSH积聚,细胞表现出明显的H2O2 的增加,同时伴随着发育和繁殖受损,因此,他们认为Trys可成为抗锥虫药物作用的一个靶点[22]。William等[23]对伊氏锥虫的AT1进行研究时,发现AT1 能控制腺苷的运输,对AT1进行RNAi作用可产生杀灭锥虫的效应。所以，AT1可能成为药物作用的一个靶点。在自身免疫性疾病方面通过与Fas和Caspase 8同源的siRNA可抑制Fas和Caspase 8在肝脏中的表达，可治疗由它们介导的自身免疫性肝脏疾病。Zender L等?[24]用干扰RNA考察对不同鼠急性肝脏衰竭模型的治疗效果。Caspase 8是死亡受体接到凋亡的一个关键酶，采用RNAi抑制的Caspase 8基因在肝脏中的表达，从而防止Fas介导的凋亡。由于siRNA抑制Caspase 8基因对肝脏的保护，可以减弱Fas抗体或腺病毒表达的Fas配体诱导的急性肝脏衰竭。因此，siRNA最可能用于急性肝脏衰竭。Song E等??[25]在小鼠内用RNAi实现对Fas表达的干扰。通过给血管内注射siRNA，用RNA酶保护试验测得Fas-mRNA减少8倍～10倍，用蛋白质免疫印迹测得Fas蛋白减少至与背景一致，并且该效果在10 d内没有减少的迹象。用Fas-siRNA处理的肝细胞对Fas抗体介导的细胞凋亡和由ConA引起的凋亡产生抗性。用ConA处理前2 d将Fas-siRNA作用于肝脏细胞，可使其不发生坏死和炎性的浸润，并且血清中转氨酶浓度降低。用ConA处理1周后再注射Fas-siRNA，则能阻止小鼠肝细胞纤维化。其他应用RNAi还可用于细胞周期调控、代谢、膜转运以及DNA损伤反应、转录或甲基化等多种方面的基因功能研究。近来的研究发现,用RNAi技术阻断Nrdpl(为ErbB3 成员)、BRUCE(为一个530×10的膜相关凋亡蛋白抑制因子)、Chkl、Weel和Mytl等进一步解释了细胞凋亡的机制,其中BRUCE通常可抑制凋亡,而Nrdpl在凋亡初始阶段起到特别重要的作用[26]。
结语
RNAi技术的应用,不仅能推进人类后基因组计划的发展,还有可能设计出RNAi芯片,高通量地筛选药物靶基因,逐条检测人类基因组的表达抑制情况来明确基因的功能,并且它还将应用于基因治疗、新药开发、神经系统研究、生物医学研究等领域,同时用RNAi技术来抑制基因的异常表达,为治疗癌症、遗传病等疾病开辟了一条新的途径。