标题：短裸甲藻毒素
简介
短裸甲藻属于裸甲藻目（Gymnodiniales），裸甲藻科（Gymnodiniaceae），裸甲藻属（Gymnodinium）。短裸甲藻毒素（Brevetoxin，BTX）主要是由双鞭甲藻（Karenia bravisbrevis）产生的一类赤潮藻毒素，其他藻类如剧毒冈比甲藻（Gambierdiscums toxincus）、褐胞藻（Chattonella）、卡盾氏藻（Chattonella antiqua）、海洋褐胞藻（Chattonella marina）、针胞藻（Fibrocapsa japonica）和赤潮异弯藻（Heterosigma akashiwo）等也可产生BTX。[1]
此类毒素可富集到贝类等生物体中，并导致消费者产生诸如恶心、呕吐、腹泻、痉挛、支气管收缩、麻痹、昏迷等神经性中毒症状，因此也曾被广泛称为神经性贝毒（Neurotoxic Shellfish Poisoning，NSP）。不过，由于其他毒素如麻痹性贝毒（Paralytic Shellfish Poisoning，PSP）也可以导致消费者出现神经性中毒症状，所以原有的分类方法已不能满足管理和科研的需求。因此，2004年由联合国粮农组织、世界卫生组织和政府间海洋委员会共同组建的双壳软体生物毒素工作组，根据毒素的基本结构和化学性质对现有贝类毒素进行了重新分类，从而将原有的神经性贝毒命名为短裸甲藻毒素组毒素（Brevetoxin-group，BTX），简称为BTX毒素。产生该毒素的贝类主要分布在美洲墨西哥湾沿岸及新西兰豪拉基海湾等海域。[2-3]
物化特性
化学性质从化学性质上来看，BTX属于聚醚类的脂溶性藻类毒素（Lipophilic Phycotoxins，LPs），具热稳定性，易溶解于甲醇、乙醚等非极性有机试剂，该特性导致这类毒素在贝类等生物体中的消除半衰期长达数十天甚至数月，且加热、微波等常规加工方式因降低了水产品中的含水量而导致毒素浓度更高，因此这类毒素对消费者带来的潜在危害更加严重。[4]
BTX是无臭、无味、热稳定的脂溶性聚醚类海洋生物毒素，具有独特的结构和药理功能。BTX难溶于中性及酸性水溶液，可溶于1%NaOH溶液和二硫化碳、氯仿、苯、乙醚、丙酮、甲醇、乙醇等有机溶剂。[4]  短裸甲藻毒素及其衍生物分子结构[5]
墨西哥湾贝类中的BTX代谢产物最初是通过对东方牡蛎（Crassostreavirginica）组织提取物和水华水体进行分离发现的。随后的研究表明纯毒素，游离的PbTx-2主要在东方牡蛎中代谢，而游离的PbTx-3则主要以其原有的形态蓄积于牡蛎中。鉴定的东方牡蛎中PbTx-2的主要代谢产物包括还原产物PbTx-3，半胱氨酸硫氧化物结合物BTX-B2（之前在新西兰贝类中发现的）和S-脱氧-BTX-B2。S-脱氧-BTX-B2可以稳定的氧化成BTX-B2，用作贝类的检测和定量鉴定。[6]
就稳定性与构型关系而言，A型毒素较B型稳定。在干燥状态下或在有机溶剂内，A型毒素的结构仍完整不变。该毒素具耐热性，在300℃时仍保持稳定。pH值变化对稳定性影响大。当pH< 2或>10时可加速><型毒素的分解。在0.1mol/L NaOH水溶液中，毒素可用A环内醋的皂化而灭活。经臭氧分解，或在氯水（aqueous chloride）中亦使毒素活性受影响。[5]
在东方牡蛎中，BTX代谢物的消除率和与其相关的极性和疏水性不是一致的。PbTx-1和PbTx-2的半胱氨酸结合物属于极性最强的BTX代谢物，而同时也是持续最久的。Plakas等假设认为PbTx-1和PbTx-2与半胱氨酸蛋白的二分之一相结合，从而使半胱氨酸-BTX通过蛋白水解作用内收而缓慢释放。游离的半胱氨酸或包含肽段的半胱氨酸（如谷胱甘肽）也可与PbTx-1和PbTx-2结合。贝类组织中半胱氨酸结合物最初快速消除的状态表示此类结合物可能形成于游离的半胱氨酸或谷胱甘肽结合物的分解作用。[7]
分子结构BTX毒素基本结构是由10到11个环状结构构成的大环多醚类物质。根据结构的骨架不同可以分为A型（BTX-A，也即PbTx-A）和B型（BTX-B，也即PbTx-B），也可以称之为1型和2型，这两种基本结构分别于1981年和1987年被确定，其它组分则是从这两类基本结构衍生而来。  BTX毒素三维分子静电势图[8][9]
贝类中的BTX代谢物A型和B型骨架结构的内酯环（A环）是通过水解形成的，这些包括PbTx-1和PbTx-2的半胱氨酸结合物形成的开环A环。A型BTX代谢产物的内酯环比B型更倾向于水解。发生在贝类体内的水解的范围是未知的，PbTx-1和PbTx-2形成的A环开环化合物广泛存在于短裸甲藻培养物和水华中。[9]  短裸甲藻毒素分子轨道模拟分布图[10]
将优化得到的7个化合物的空间结构叠加在一起，发现它们末端4个环可以很好地重合，从倒数第五个环开始，分子骨架出现弯曲，A型分子弯曲较小，近似直线型，而B型分子向上弯曲较大，这是由于B型H环构象发生了不同程度的变化。可见分子骨架弯曲程度同各自的生物活性强弱是很好对应的。因为A型比B型活性高，因此A型构象更适宜同受体结合。[11]
A型与B型中段不饱和环与端部烯键的距离有明显不同，在A型的PbTx-1中，E和F不饱和环与A环的空间距离为1. 46nm，与另一端R烯键的距离为1.48nm。在B型的PbTx-2中，H不饱和环与A环距离为1. 99nm，与R烯键相距0.97nm。由于A型活性强于B型，故推测A型中段不饱和环的位置更有利于同受体正电中心结合。A型的E，F环与两端活性部位距离几乎相等，正好位于骨架中心，由此推测与之结合的长约3n}n的受体活性区域，中间是正电中心，与两端负电中心的距离大致相等。由于B型的H环偏离中心位置，在与受体正电中心结合时产生偏差，造成活性下降。[11]  BTX毒素空间结构对比模拟示意图[12]
毒性
对动物体毒性BTX-2（B型）是涡鞭毛藻产生最多的BTX毒素。当然，其他一些藻类，如古卡盾氏藻、海洋卡盾藻、针胞藻、赤潮异弯藻等也曾被报道可产生似BTX的生物毒素。BTX-2在贝类等生物体内的代谢产物主要是BTX-3、BTX-B1、BTX-B2、S-desoxy-BTX-B2、BTX-B3、BTX-B4和BTX-B5。因此消费者食用受污染的贝类和鱼类导致的中毒主要是由BTX毒素的代谢产物引起的，而非BTX毒素直接作用的结果。[13]
BTX主要蓄积在东方牡蛎（Crassostreavirginica）、文蛤（Mercenaria）、峨螺（Busycon contrarium）、海扇（Austrovenus stutchburyi）、绿壳贻贝（Pernacanaliculus）等贝类中。贝类可通过摄食短裸甲藻细胞或从水中直接吸收BTX，并使其快速蓄积。牡蛎中的短裸甲藻水平较好地反映了短裸甲藻水华的进展和强度。已证实BTX可在接触了纯的BTX和短裸甲藻培养物的贝类中快速蓄积。在捕食双壳贝类的食肉峨螺中发现，贝类中的营养转移也是间接的。[14-15]
BTX可在一些贝类体内进行代谢。BTX代谢的第一例报道是1992～1993年在新西兰爆发的NSP。几年以后，美国发现的大范围的BTX代谢证实是由接触了短裸甲藻水华的贝类产生的，此次水华发生于墨西哥湾。其后发现BTX的代谢在多种贝类中都具有特征性。因为在短裸甲藻中B型BTX分布广泛，所以最初从贝类中分离和鉴定出的BTX代谢物是B型BTX。[16]
BTX-2和BTX-3的小鼠急性毒性试验24 h半致死剂量分别为200mg/kg b.w.和170 mg/kg b.w.。小鼠腹腔注射BTX-B3 在剂量浓度在300mg/kg b. w.时不具有毒性，而BTX-B4和BTX-B5的最小致死剂量分别为100和300-500mg/kg b. w.。小鼠分别腹腔注射BTX-B2、BTX-3和S-desoxy-BTX-B2所产生的中毒症状基本相似。致死剂量毒素导致的症状主要包括：15min后不动，死亡前呼吸麻痹，眼球突出，快速弹动后腿；而亚致死剂量毒素则造成腹式呼吸速率先迅速上升后急剧下降，四肢完全瘫痪，但3-5h后运动能力恢复。在接下来的7d观察期结束时未出现进一步病理异常。通过静脉注射给药，小鼠立即中毒死亡。[17]
小鼠口服的半致死剂量只有BTX-2（6600 mg/kg b. w.）和BTX-3（520 mg/kg b. w.）的。口服给药一般5h后才出现死亡，这与注射给药可致急性死亡不同。口服毒性效力BTX-2比BTX-3要低一个数量级以上。毒性效力差异主要是吸收率的不同引起的，而不是因为BTX-2在经过肝脏时进行了第一次代谢。[17]
对人体毒性人类接触短裸甲藻毒素有三个途径:在赤潮期间，沿海形成之气雾中杂有此种毒素，人类通过呼吸道吸入后导致哮喘样发作，类似毒覃碱受体兴奋之症状；赤潮毒化海洋环境污染了海洋鱼贝类，人类因摄食污染短裸甲藻毒素的海鲜品而导致“神经性贝中毒”。其中毒表现类似CTX中毒，主要有消化系统及神经系统症状;皮肤接触含短裸甲藻毒素的海水，导致皮肤及粘膜出现刺痒及水疤等表现。尽管尚无中毒死亡的报道，但此毒素的严重致病性已被临床及病理学家所证实。由于此种毒素可导致呼吸衰竭或心室纤颤，故对人类的潜在致死性不容忽视。[18-19]
发生NSP中毒的各地区对致毒贝类和鱼类体内BTX毒素的含量数据中，以1MU相当于4μg，BTX-2计（贝类中污染的BTX毒素含量多以MUs/100g为单位），致毒贝类中BTX毒素的浓度从880至49000μgBTX-2/kg b.w.不等。Naar 等应用竞争性ELISA 法测定鱼肉中的BTX毒素（以BTX-3为标准），浓度从580至6000μgBTX-3/kg b.w.。欧洲国家尚无关于BTX类毒素在贝类和鱼类中的限量标准。美国规定小鼠生物法安全标准为20 MUs/100g（0. 8 mgBTX-2/kg b. w.）。新西兰和澳大利亚最高限量为20MUs/100g，未规定哪一类BTX类。[20-21]
毒理
毒素体内循环一般来说，主要采用腹腔注射、静脉注射、口服等方式研究BTX毒素在小鼠体内的毒代动力学。有报道的仅限于BTX-2和BTX-3。结果表明，小鼠腹腔注射BTX-2和BTX-3，1h后血水平达到最高值，BTX-2组比BTX-3组先达到正常血水平的3倍，BTX-2在24h后主要以共轭半胱氨酸结合物的形式从尿液排出; 而采用静脉注射BTX-3，毒素在1 min内在血液循环中消失，24h后通过胆汁排泄进入粪便; 若采用口服的方式，BTX-3快速且广泛分散到各个器官，其中肝脏内含量最高，最后主要伴随尿液和粪便排出到体外，且两种方式含量相差不大。[22]
呼吸是BTX毒素引起神经性中毒的主要方式之一，因此通过向小鼠气管内滴入3H标记的BTX-3，研究该种方式引起的毒代动力学。结果发现，气管内80%毒素被迅速吸收，从肺进入血液并被所有组织器官吸收。大部分的BTX-3从肺、肝脏和肾脏代谢迅速排出体外，另外20%的毒素分散到其他器官保留了7d。小鼠组脂肪、心脏、肠、肾脏、肝脏和肌肉的消除半衰期为28h，而大脑和睾丸大概需要90h。大约90%的毒素在96 h内排出体外，其中11%从尿液、64%从粪便排出。[23]
BTX毒素主要对呼吸和心肌功能有抑制作用，产生自发、反复的剂量依赖性肌肉收缩，造成束颤，抽搐或跳跃，与剂量显著相关的呼吸速率下降，中枢和外周神经的支气管收缩。[24]
若干研究结果表明，BTX毒素可致染色体体外断裂。BTX-2可诱导中国仓鼠卵巢细胞染色体畸变。通过单细胞凝胶电泳发现用BTX-2、BTX-3和BTX-9 孵育人体淋巴细胞后DNA受损伤（链断裂）。在BTX-2、BTX-3和BTX-6孵育人T淋巴细胞白血病细胞Jurkat E6-1后也发现了DNA损伤。Leighfield等报告说，通过吸入暴露，BTX-2诱导了大鼠肝细胞DNA损伤，表明BTX-2也可引发体内染色体断裂。[25]
毒代动力学BTX是较强的钠通道激活毒素，可以与钠通道受体靶部位VI结合，开启兴奋膜上的钠通道，可以使细胞膜对钠离子的通透性增强，活化电压门控钠通道，产生较强的细胞去极化作用，引起神经肌肉兴奋的传导发生改变，对钾通道不起作用。因而，BTX具有胚胎毒性、发育毒性、免疫毒性、遗传毒性和致癌作用等毒性效应。[26]
BTX毒素的毒性大小取决于两个因素：毒素和目标物的亲和力以及靶细胞中诱导反应的效力。BTX毒素最主要的致毒方式是通过与细胞膜上的电压门控钠离子通道位点5结合造成的。这种结合激活了通道5，失控的钠离子内流进入细胞，使神经元细胞和肌肉细胞的细胞膜去极化。在大鼠小脑颗粒神经元细胞原代培养过程中，受体位点5在接触BTX毒素后被激活，细胞内Ca2+浓度增加，致使急性神经损伤和细胞死亡，其中受BTX-1刺激组Ca2+浓度为BTX-2或BTX-3组的两倍。已证实BTX毒素会影响哺乳动物大脑皮质突触和神经肌肉的生成并可能使细胞肥大。所有这些反应都与大量持续性的细胞膜去极化有关。因吸入气雾性BTX毒素引起的呼吸困难，同样是由于神经细胞膜上钠离子传输通道的打开造成的。在大鼠脑细胞膜制备和HEK 细胞表达成骨骼肌或心脏过程中，BTX-B2和脱氧BTX-B2与钠离子通道结合位点亲和力比BTX-3的低8-16倍。而在神经母细胞中，它们的效力比BTX-3的分别低3倍和8倍。BTX毒素也可激活免疫细胞的钠离子通道，诱导发生生化反应例如细胞增殖、基因转录、细胞因子的产生和凋亡。[27]  BTX毒素电泳图[28]
检测方法
BTX毒素的分析法主要有小鼠生物法（Mousebioassay，MBA）、细胞毒性实验（Cytotoxicity assays）、受体结合试验（Receptor binding assays）、放射免疫法（Radioimmunoassay，RIA）、酶联免疫法（ELISA）和液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）。其中，小鼠生物法是发展最早、应用最广泛的分析方法，而高效液相色谱串联质谱法则是定性、定量和灵敏度最好的方法。[29]
BTX毒素所用的小鼠生物法是由美国公共卫生协会建立（APHA，1970）。标准方法使用乙醚从贝类中提取毒素，以MUs/100g贝肉为单位。1MU被定义为对体重为20g的小鼠腹腔注射粗提毒素使50%的小鼠在930min内死亡的用量，相当于4μgBTX-2。然而，一些研究指出乙醚并不能有效地提取BTX毒素（例如半胱氨酸结合物）。而且MBA方法的特异性、重现性和灵敏度都很差，不仅耗时太长，而且容易受到其他内源性化合物的影响，从而造成假阳性结果。[30]
对贝类中的BTX毒素现已应用多个端点和多种检测方式进行毒性实验。细胞毒性试验是基于BTX对钠离子运输通道的作用。多采用神经母细胞瘤，用藜芦碱通过打开钠离子运输通道从而促进钠离子的转运，同时用哇巴因（Na+/K+- ATP 酶抑制剂）阻断钠钾离子泵活性。BTX毒素结合藜芦碱打开的钠离子通道增加了离子流量。该细胞的生存力可以通过代谢溴化噻唑蓝四氮唑成紫色结晶物质的量测定，方法对贝类中BTX-1的最低检出限0.25mg/kg。但Dickey等人指出细胞毒性试验在实验室之间的重现性差，应用受到限制。[31]
受体结合法是基于BTX毒素与钠盐传输通道受体的结合力差异。通常用于测定鱼类和贝类中毒素含量的受体结合实验，原理是放射性3H-BTX-3与天然BTX毒素与受体结合位点的竞争机制。从兴奋性组织分离膜制备或通过全细胞制备用于试验。半胱氨酸结合物（BTX-B2和S-desoxy-BTX-B2）与钠离子通道受体的结合能力比BTX-3弱3-10倍。受体结合法的定量限是30μgBTX-3/kg牡蛎匀浆。[2]
高效液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）方法已被广泛地用于贝类、鱼类和藻类BTX毒素的定性和定量分析。Dickey等对实验室间LC-MS/MS 法检测数据的差异性进行了研究。实际上，所有LC-MS/MS方法可以很容易的检测出BTX-3加标样品，其含量水平比美国现行标准检出限20MUs/100g或0.8 mgBTX-2/kg贝肉低出一个数量级。[14]