标题：苜蓿黄萎病菌
基本信息
编号： 29  被苜蓿黄萎病菌侵染的植物
记录号： IO00029 
中文名： 苜蓿黄萎病菌 
英文名： Clover　Verticillium wilt 
拉丁学名： Verticillium albo-atrum Reinke & Rerthold 
门： 真菌门 
亚门： 半知菌亚门 
纲： 丝孢纲 
目： 丛梗孢目 
科： 丛梗孢科 
属： 轮枝孢属 
原产地： 瑞典 
入侵地： 尚未发现，但存在严重隐患 [1]
国外分布
主要分布于欧洲和北美北纬40。以北各国。包括德国、法国、英国、意大利、丹麦、瑞典、波兰、匈牙利、前捷克斯洛伐克、前苏联、加拿大、美国、新西兰、墨西哥和日本。[2]
寄主范围及危害特点
黄萎轮枝孢的寄主植物很广泛，但侵染苜蓿的菌系寄主较少，且各地菌株的致病性不一致。北美分离菌株主要为害苜蓿，也侵染马铃薯、蚕豆、草莓、冠状岩黄芪和红花菜豆等，并表现症状。羽扇豆、豌豆、红三叶、白三叶、草木犀、驴喜豆、大豆、罗马甜瓜、茄子、忽布、西瓜等带菌，但不表现症状。另有报道，大豆、花生和茄子等用苜蓿分离菌接种后表现严重症状。据杨家荣等(1997)接种测定，苜蓿黄萎病菌英国菌系对豌豆、番茄、茄子、西瓜、绿豆、豇豆和马铃薯具致病力，而对棉花、线椒、甜椒、向日葵、大豆无致病力。亦有报道称可侵染棉花，但需进一步鉴定明确。本菌引起系统性病害，全株发病。[2]
苜蓿被侵染后表现黄化、矮缩、萎凋等症状，第二年产草量降低15%～50%，第二年后期至第三年初期病株陆续衰弱死亡，缩短了产草期。导致严重的苜蓿产量损失，大大缩短了苜蓿草地的使用寿命，影响苜蓿干草及种子出口。[1]
典型症状
发病早期病株上部叶片在温度较高时表现暂时性萎蔫，继而中、下部叶片失绿变黄，严重时变枯白色，整株萎凋，横切病株茎部可见维管束变褐。发病后期植株因生育停滞而严重矮化。该病重要诊断特征还有：(1)小叶顶端出现V字形黄变坏死斑块，严重时病叶卷缩扭曲；(2)病株叶片枯萎，但茎部在较长时间内仍保持绿色；(3)在潮湿条件下，枯死茎表面敷生灰色霉状物，即病菌的分生孢子梗。[2] 
病原形态生物学特性
在PDA培养基上菌落白色至灰色，绒毛状，后因生成暗色休眠菌丝，菌落中央变黑褐色。分生孢子梗直立，有隔，无色至淡色，但在植物基质上生长的老熟孢梗基部膨大，暗色。梗上每节轮生2～4个小梗(轮枝)，可有1～3轮，小梗尺度20～30(～50)μm×1.4～3.2μm，顶端亦生小梗(顶枝)。小梗端部的产孢瓶体连续产生分生孢子，聚集成易散的头状孢子球。有时小梗发生二次分枝。由苜蓿茎长出的分生孢子梗长55～163μm，宽3.8～5.6μm。梗的顶枝长30～49μm，宽2．2～4.4μm，轮枝长22～27μm，枝层间距29～46μm。分生孢子无色，单胞，椭圆形、圆筒形，大小3.5～10.5(12.5)μm×2～4μm。休眠菌丝暗褐色至黑褐色，直径3～7μm，分隔规则，隔膜间膨大，成念珠状，有时集结成菌丝结或瘤状菌丝体。
黄萎轮枝孢在琼脂培养基平板上菌落生长适温为20～22.5℃，在30℃不能生长。苜蓿菌系对温度的要求有所不同，其生长适温高达25～26℃，在15℃和27℃时生长较差，在5℃和33℃时停止生长。在PLYA平板上培养，温度20～27℃，20d后形成暗色菌丝体。培养温度为10℃或15℃时，延迟数周后方能形成。黄萎病菌产生的毒素为蛋白质一脂多糖复合物，其中蛋白组分具有致萎作用。苜蓿黄萎病菌毒素粗提液经长期贮存和在100℃以上高温下处理后仍有致萎活性。[2]  苜蓿黄萎病菌
发病条件
黄萎病菌的休眠体随病残体在土壤中越冬，翌年环境适宜时，产生菌丝由幼苗根部侵入寄主造成系统发病。病原菌可由健株刈割后茎部的伤口侵入。田间早期病株和死株茎秆上产生的气传分生孢子，可引起当季再侵染，但再侵染的作用很小。 
苜蓿黄萎病的发生和消长变化，与品种抗病性、病菌致病性和环境因素有密切关系。土壤中已积累了相当数量的病原菌接种体，并连续种植感病品种后，若遇适宜环境条件，黄萎病就会严重发生。苜蓿黄萎病在灌区，或降水频繁，土壤湿度较高的地区发生较重。在黏土、壤土和富含有机质的土壤中发生较重，对土壤酸碱度没有明显的选择性，该病发生的温度范围较广，病菌生长适温较高，在较高温度下发病严重度仍较高。因而适生地区较广。[2]
传播途径
苜蓿黄萎病菌传播途径很多，带菌种子和带菌植物材料、昆虫等是病菌传人新区的主要载体。种子是黄萎病菌远程传播的重要载体，种子外部和内部都能带菌，混杂在种子间的病残体也带菌传病。豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)、苜蓿象(Hyperapostica)、蝗虫和蕈蚊(Bradysia spp．)都是黄萎菌传播介体。加拿大苜蓿切叶蜂(Megachile rotundata)用苜蓿叶片筑巢也带菌，切叶蜂巢常由加拿大输往欧美，因而也可能是黄萎病远距离传病的途径。病区的带菌苜蓿草制品也是黄萎病远距离传播的主要途径。以晒制的干草作原料，生产苜蓿粉时，黄萎病菌经过脱水过程后仍可存活。
此外，在苜蓿田作业的农业机械、卡车、混杂有其他寄主残屑的种子、牲畜食用病草后的粪便等也都可能传播苜蓿黄萎病。[2]
检测方法
1．田间诊断用常规组织分离法由病株分离病原菌，即由病部切取小块组织，表面消毒后，置床于PDA或MA培养基平板上。在20～25℃下培养2～3周。在菌落中央产生暗色休眠菌丝体的为黄萎轮枝孢，近似种大丽轮枝孢则生成黑色微菌核。
分离和鉴定轮枝孢属真菌还常采用PLYA培养基(梅干煎汁培养基)，该培养基配方为：梅干煎汁100ml，乳糖5g，酵母浸膏1g，琼脂30g，蒸馏水900ml。制取梅干煎汁需将50g梅干切成小片，在100ml水中煮沸30rain,梅干渣滓榨出汁液后弃去，煎汁调节pH至5.8～6.0备用。黄萎轮枝孢用该培养基在25℃下培养15d左右，可由培养皿背面清晰观察到暗色休眠菌丝形成的辐射状结构，而大丽轮枝菌则生成多数微菌核，呈小瘤状或颗粒状。
鉴定大量标本时最好采用湿皿培养法，该法简单，可避免使用上述琼脂培养基常遇到的杂菌污染问题。该法是在直径9cm的玻璃培养皿底部铺2～3层吸水纸(滤纸)作成培养床，高压灭菌备用。使用前每皿滴加30ml灭菌水，浸湿吸水纸。取新鲜病株茎或叶柄切成1cm长的小段，用自来水冲洗掉表面的泥土杂物后，用含2%～3%有效氯的次氯酸钠液表面消毒1～2min，无菌水冲洗3次后，用灭菌解剖刀横切成厚度1～4mm的小片，并放置在湿皿内滤纸上，每皿5～10片，湿皿封闭在塑料袋中培养。黄萎病菌的菌丝可由病组织蔓延到吸水纸上并形成分生孢子梗、分生孢子和休眠结构。用实体显微镜观察，可清晰地看到分生孢子梗的暗色基部。另外，在吸水纸与皿底玻璃之间可形成轮枝孢的休眠结构。
2．种子带菌检验检验种子表面带菌可将种子样品放入灭菌水内，震荡洗涤15min后，取定量洗涤液，滴在培养皿内Czapek琼脂培养基平板表面，并充分展布，在22℃下培养7d后选取菌落，挑取分生孢子，在PDA或PLYA培养基平板上划线。菌落长成后根据病菌形态鉴定。为防止细菌污染，所用培养基中均可加入抗菌素(100mg/kg硫酸链霉素，50mg/k四环素)。
检验种子内部带菌，需先用含有效氯2%的次氯酸钠液或其他表面消毒剂，进行种子表面消毒，然后用无菌水充分洗涤，植床于上述PLYA培养基平板上或Christen选择性培养基平板上，在22℃下培养14d后根据病菌形态鉴定。检查种子中混杂的植株根、茎、叶柄等残体，洗净泥土后也可用检查种子内部带菌的方法检验。
Christen选择性培养基配方如下：在100ml蒸馏水中加入L-山梨糖2g，L-天门冬素2g，K2HP4Olg，KCl0.5g，MgS4O.7H2O0.5g，Fe-Na-EDTA 0.01g，75%五氯硝基苯1g(有效成分)，牛胆汁0.5g，NaB407.10H20lg，链霉素0.3g，高压灭菌后pH调至5.7。[2]
检疫措施与防治方法
禁止调运和种植疫区或疫情发生区生产的种子，禁止运销疫区或疫情发生区的苜蓿饲草和草制品。由发病国家和地区引进苜蓿切叶蜂(巢)时，也应检疫。 
苜蓿黄萎病的防治应以选育、使用抗病品种为主，采用综合措施，无病区应严格检疫，严防传人。种子带菌常是许多新建草地发病的初侵染来源，因而建立无病种子田，是重点防治措施。农业防病措施能减轻病害的发生，与非寄主植物轮作，病田休闲，推行豆科牧草与禾本科牧草混播、问作，适时早刈，实施田间和农业机具清洁措施等，都可以减轻或推迟黄萎病的发生。[2]