标题：多肽类毒素
概述
海洋生物中蕴藏着大量结构新颖、生理活性和功能独特的生物活性物质及其基因，这使海洋生物成为具有独特功能和药用价值的生物活性物质的重要源泉。而海洋生物毒素是海洋活性物质中研究发展最迅速的领域之一，也是海洋新型药物研究的热点。[1]
海洋生物毒素种类多，分布广，结构奇特，活性广泛且活性强。其中，由基因直接编码的多肽蛋白毒素是天然海洋生物毒素中毒性最强的。比较具有代表性的海洋多肽类毒素包括芋螺毒素、海蛇毒素、海葵毒素、水母毒素和海胆毒素等。这些多肽毒素具有毒性作用强烈、药效高和作用剂量小等特点。[2]
芋螺毒素
芋螺毒素（conotoxin，CTX）是由热带海洋中肉食性软体动物芋螺（Conus）分泌的毒液中的一大类活性多肽，用于麻醉猎物和防御敌害。在所有的动物毒素中，来自海洋软体动物芋螺毒液中的多肽类毒素－芋螺毒素可能是迄今为止最具有多样性的代表。全世界大约有500~700个芋螺物种，每一种类的芋螺所含有的不同序列结构的肽类毒素多达100~200种，而且任何两种芋螺所含有的毒素很少重叠，因此，据估计现有的芋螺毒素种类可高达50000种以上。[3]
  芋螺毒素分子三维结构[4]芋螺毒素通常为10~30个氨基酸残基组成的小肽。大多富含半胱氨酸残基，具有高度保守的二硫键骨架，使之形成高度紧凑的立体构象。与蜘蛛、蝎、蛇、海葵等许多动物的毒素相比，芋螺毒素的肽链短的多，二硫键丰富，分子结构更紧密，但是生物活性却更高。芋螺毒素尽管很小，但是具有显著的多样性。这主要是因为在一级结构上，成熟肽区的半胱氨酸之间的序列是高度可变的。不仅在种类上高度可变，而且数目也不尽相同。另一个导致芋螺毒素高度多样化的原因是其氨基酸残基存在不同程度的翻译后修饰，例如脯氨酸羟基化、色氨酸溴化、谷氨酸的 γ羧化、丝氨酸和苏氨酸糖基化、酪氨酸硫化、羧基末端酰胺化或氨基酸残基从L型转变到D型的差向立体异构化修饰等。这些翻译后修饰更增加了芋螺毒素结构的多样性和复杂性。[5]　芋螺毒素虽然种类众多，但是按照其结构特征（保守的信号肽序列和半胱氨酸骨架）可归纳为几个超家族（superfamily）：A-、L-、I-、M-、O-、P-、S-、T-等，每个超家族按照其作用的受体又可分为不同的家族，如α-、μ-、ψ-、ω-、δ-、σ-等若干家族（family）。[6]　自二十世纪六十年代来的研究表明，CTX 通常是由7－46个氨基酸残基组成的，富含半胱氨酸（Cys） 的动物神经肽毒素。它们化学结构新颖，生物活性强，作用靶位的选择性高，已成为药理学和神经科学的有力工具和新药开发的新来源。由于不同种芋螺所含的活性肽不同，即使同种芋螺因海域不同，其毒素成分也可存在差别。因此，自然界中存在约50 万种活性不同的CTX，是一个丰富的天然神经肽库。[7]
海蛇毒素
海蛇属于海蛇科（Hydrophiidae），大约有50种，广泛分布于印度洋和太平洋的热带及亚热带海域。海蛇毒液中含有20种以上的活性物质，包括酸性磷酸酶、磷脂酶A、长链和短链神经毒素等，且大多数属于低分子量蛋白质。[8]它们均能高度专一性地与运动终板烟碱乙酰胆碱受体结合，阻断神经传导成为突触后神经毒素，成为研究烟碱乙酰胆碱受体的重要工具。[9]由于海蛇毒素（sea snake toxins）具有多种多样的毒理和药理活性，且在治疗肿瘤、心血管及神经系统疾病方面有极高的药用价值。除了海蛇科外，海蛇毒素还广泛存在于眼镜蛇科毒液中。相同干重的海蛇致死毒性远高于眼镜蛇，但是，海蛇的排毒量比陆地蛇低8~10 倍。这给进行海蛇蛇毒的研究带来很大困难。国内关于海蛇毒素的研究非常少，大多数是关于海蛇蛇毒的毒理学和抗海蛇毒血清的研究。[10]　迄今为止，已经发现了100 多种蛇突触后神经毒素，根据它们的氨基酸序列特征和与不同乙酰胆碱受体亚型结合的能力，可将其分为短链α－神经毒素、长链α－神经毒素、κ－神经毒素、γ－神经毒素和弱毒神经毒素五类。短链α－神经毒素一般由60~62 个氨基酸组成，含有4 对链内二硫键，长链α－神经毒素一般由66~74 个氨基酸组成，含有5 对链内二硫键，两者之间氨基酸同源性较高。两者的空间结构都有一个三指结构。长链和短链的海蛇神经毒素都是有效的阻断神经肌肉接头的烟碱乙酰胆碱受体。[11]  海蛇毒素分子结构[12]
海葵毒素
海葵（anthopleura）属于腔肠动物门（soelenterata），在热带和温带海域广泛分布。它的口周围有许多触手，触手上分布着腔肠动物所特有的刺丝囊，能分泌大量的肽类毒素。海葵毒素多肽是一类相对分子质量范围在3000~6000、由2~3个二硫键交联着的单链碱性分子。根据作用方式的不同，可将这些肽类毒素分为海葵神经毒素（sea anemone neurotoxin，SAN）、海葵溶细胞素（sea anemone cytolysin，SAC）和钾离子通道抑制剂（Sea anemone potassium Channel inhibitor ）。[13]这些海葵毒素（anthoplerin toxin）能特异作用于神经和肌肉可兴奋细胞膜上的关键靶位即神经受体或离子通道，从而影响一系列细胞调控活动，具有广泛的神经系统活性、心血管系统活性和细胞活性。因此，海葵毒素作为分子探针用以研究钠通道有巨大潜力，并且发现更多有应用前景的海葵毒素并进行基因重组、表达，极具重要意义。[11]对于海葵神经毒素的研究始于1976年美国夏威夷大学Shibata等的工作，他们从黄海葵（Anthopleura xanthogrammica）中分离纯化了海葵神经毒素A（anthopleurin A，Ap-A）和海葵神经毒素B（anthopleurin B，Ap-B）两种毒素。[1]  砂海葵毒素分子结构[14]
水母毒素
水母（jellyfish） 也属于腔肠动物门（Soelenterata），亦称海蜇，它们种类多、数量大且广泛分布于温带、亚热带及热带海域。水母的触手中也分布有能分泌大量毒液的刺丝囊，肽类毒素是其中主要的毒液成分，它们结构新颖独特，具有溶血性、酶活性、神经毒性、皮肤坏死、肌肉毒性、肝脏毒性、心脏毒性以及细胞毒性等多种生物活性。[15]这些毒素通过作用于离子通道，对心脏、血管产生影响，进而引起血压和心电图改变及造成细胞毒性。因此，水母毒素（jellyfish venom） 有望开发为作用于心血管系统、中枢神经系统和肌肉的药物。[16]  水母触手[17]
海胆毒素
海胆属于棘皮动物门（Echinodermata），是海洋中一类常见的无脊椎动物，在世界各大海域的海底中均有分布。海胆中的毒素主要由叉棘（pedicellariea）和棘（spine）产生。海胆毒素可引起动物呼吸困难、肌肉麻痹、溶血、引起心脏激活以及使肌肉对非直接刺激不起反应。因此，海胆毒素具有潜在的药用价值。近几年来，科学工作者主要集中研究刺胞毒素的分离提取、功能基因的克隆、毒素的单克隆抗体检测等。[18]
合成毒素的PCR方法
生物肽类毒素分子量相对较小，可以通过人工合成和基因工程技术进行重组表达、大批量生产。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR），即PCR 反应技术，是由美国Cetus 公司人类遗传研究室的科学家Mullis于1983 年发明的一种能在生物体细胞外通过酶促合成反应快速扩增两段已知序列之间的DNA序列的方法，又称无细胞分子克隆技术。目前，PCR 技术已被广泛应用于分子生物学、工业、农业、食品科学医药学和法医学等各领域，而其技术本身也获得长足进步，可靠性不断提高，因而具有更广阔的发展前景。PCR反应的主要过程是，先在临近沸点的高温下双链模板DNA变性形成两条单链DNA，然后在低温下引物与单链DNA互补序列结合，最后在适温下DNA聚合酶以互补合成的DNA链为起点，以单链DNA为模板并利用4种脱氧核苷三磷酸合成新的DNA互补链。在整个反应过程中，高温变性、低温退火、适温延伸等3个步骤反复循环，每一循环中所合成的新链，都可以作为下一循环中的模板。经过数次循环后，特定DNA 序列的产量随着循环次数呈指数增加。对于每一个特定的应用而言，需要对PCR 条件进行优化，以探索选择最佳的PCR 条件，获得高产率、高纯度的特异产物。[19]  各类主要 PCR 方法及其比较[19]