标题：蜂毒肽
基本介绍
蜂毒是工蜂毒腺分泌出来的一种具有芳香气味的成分复杂的混合物，主要含有蛋白质多肽类、酶类、生物胺类和其他物质。蜂毒中研究较多的是蜂毒溶血肽，又称蜂毒肽(melittin)。蜂毒肽占蜂毒干重的50%，是蜂毒中主要功能物质。蜂毒肽可以抗菌、抗病毒、消炎、抗辐射，近年来又有对其抗癌作用进行研究的报道。但是其临床应用却有很多局限，主要原因是现有技术难以将蜂毒中有致敏反应并与蜂毒肽分子量接近的磷脂酶A2完全去除。基因工程的出现不失为一条有效途径。[1]通过基因工程获得蜂毒肽的方法已经取得一定进展，但仍有许多不足之处，距离大规模生产还有很长的一段路。[1]结构介绍蜂毒肽是由 26 个氨基酸残基组成的多肽,分子量 2 840 , 其一级结构的氨基酸残基顺序为
NH2- GLY- ILE- GLY- ALA- VAL- LEU- LYS- VAL- LEU- THR- THR- GLY- LEU- PRO- ALA- LEU- ILE- SER-TRP- ILE- LYS- ARG- LYS- ARG- GLN- GLN- COOH。  蜂毒肽在通常情况下, C- 末端有 4 个氨基酸残基携带正电荷,N- 末端有 2 个氨基酸残基携带正电荷, 整个分子 带 6 个正电荷。蜂毒肽的 N- 末端起前 20 个氨基酸残基主要是疏水的, C- 末端的 6 个氨基酸残基主要是亲水的。分子的 3 个赖氨酸和 2 个精氨酸残基使其成为强碱性肽。在中性水溶液中, 蜂毒肽作为单体是以随机的卷曲结构存在的, 而随着 pH 值以及离子强度的增高, 蜂毒肽自我交联, 形成螺旋的四聚体结构，有研究发现在不同的溶液中蜂毒肽的螺旋结构区域及螺旋间的角度是不同的。 螺旋结构中前 21 个氨基酸是极性的, 位于螺旋的表面, 而非极性氨基酸在螺旋的另一面。这个两亲性(am-phiphilie)是膜结合肽和膜蛋白跨膜螺旋的特征。所以这个特性决定蜂毒肽既可以溶于水中, 又可以与膜自然结合, 进而溶解细胞。药物机理辅致癌因素抗生素的毒性很小，由于β-内酰胺类作用于细菌的细胞壁，而人类只有细胞膜无细胞壁，故对人类的毒性较小，除能引起严重的过敏反应外，在一般用量下，其毒性不甚明显.是化疗指数最大的抗生素。但其青霉素类抗生素常见的过敏反应在各种药物中居首位，发生率最高可达5%～10% ，为皮肤反应 ，表现皮疹、血管性水肿，最严重者为过敏性休克，多在注射后数分钟内发生，症状为呼吸困难、发绀、血压下降、昏迷、肢体强直，最后惊厥，抢救不及时可造成死亡。各种给药途径或应用各种制剂都能引起过敏性休克，但以注射用药的发生率最高。过敏反应的发生与药物剂量大小无关。对该品高度过敏者，虽极微量亦能引起休克。注入体内可致癫痫样发作。大剂量长时间注射对中枢神经系统有毒性(如引起抽搐、昏迷等)，停药或降低剂量可以恢复。
蜂毒肽是迄今为止人类所知的抗炎活性最强的物质之一，其抗炎活性是氢化可的松的100倍，可以抑制20多种革兰氏阴性和阳性细菌的生长繁殖，尤其是蜂毒肽可以抗对青霉素具有耐药性的金黄色葡萄球菌。蜂毒肽还能增强磺胺类和青霉素类药物的抗菌效力，对多种真菌、病毒也具有毒性。它具有类激素样的作用，但无激素的不良反应。蜂毒肽的镇痛作用也十分显著，其对前列腺素合成酶的抑制作用是吲哚镁辛的70倍，镇痛强度为吗啡的40%，镇痛持续时间较长。实验研究证明，全蜂毒、蜂毒肽、神经毒多肽、MCD均能刺激垂体肾上腺系统使皮质激素释放增加而产生抗炎作用。蜂毒肽还能抑制白细胞转移，从而抑制了局部的炎症反应。
蜂毒肽可以作用于神经系统，其对N-胆碱受体有选择性阻滞作用，使中枢神经系统的兴奋传导阻滞，并表现出中枢性烟碱型胆碱受体阻滞作用；蜂毒肽还能抑制周围神经冲动传导。
用蜂毒肽代替蜂毒全毒不仅对辐射有预防作用，而且还有治疗作用。高纯度的蜂毒肽可以明显提高抗辐射效应，而且和全蜂毒比较差别非常明显。蜂毒肽对肿瘤细胞的毒性作用也引起了人们的注意。蜂毒肽具有膜活性，直接对细胞的磷脂膜起溶解作用，抑制细胞发育，对肿瘤细胞有强烈的细胞毒素作用。蜂毒肽分子量小，免疫原性低，不易产生过敏反应；因其是破坏细胞膜而导致细胞的死亡，因此它不用进入细胞，在细胞外即可显示出其破坏肿瘤细胞毒性。澳大利亚联邦科学与工业研究组织(CSIRo)DE Riven博士领导的分子生物学研究小组正在对蜂毒肽的抗癌作用进行研究，他们制造的以蜂毒肽为“弹头”的抗毒素也可对前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌产生疗效。《中国医药报》也曾报道，蜂毒素可抑制肝癌细胞的生长、增殖，并且减少增殖细胞中和抗原附性细胞的表达，影响细胞周期的比率，为蜂毒素临床应用于抗肿瘤提供了实验依据。[1]使用方法使用该品必须先做皮内试验。青霉素过敏试验包括皮肤试验方法(简称青霉素皮试)及体外试验方法，其中以皮内注射较准确。皮试本身也有一定的危险性，约有25%的过敏性休克死亡的病人死于皮试。所以皮试或注射给药时都应作好充分的抢救准备。在换用不同批号青霉素时，也需重作皮试。注射液、皮试液均不稳定，以新鲜配制为佳。而且对于自肾排泄，肾功能不良者，剂量应适当调整。此外，局部应用致敏机会多，且细菌易产生抗药性，故不提倡。
生物机制
至今为止，对于蜂毒素的杀菌及溶血机理仍然很不确定，以往研究认为，抗细菌素类是通过穿孔模型形成膜空洞机制引起杀菌的。但深入研究发现，有些抗细菌素与细胞膜的作用方式与穿孔模型有明显不同，后来便提出了一种新的作用模式--地毯模式。
目前，抗细菌素侵膜机理占主导地位的观点仍然是穿孔模型和地毯模式机理。根据蜂毒素的这种侵膜机制，赵亚华等通过实验有目的地改造了蜂毒素的氨基酸的一级结构序列以及所要表达的蜂毒素基因。尽量使蜂毒素在与细菌细脑膜相互作用时，主要采取地毯模式侵膜而引起杀菌，同时，由于带电荷数与分子构象的改变，大大降低了它与血细胞膜两亲性作用的几率，从而达到抑制溶血性的目的。改造后的蜂毒素的溶血性与标准样品的溶血活性相比，有较大幅度降低，大约降低了14.3倍。
蜂毒肽发挥其众多功能的主要机理是因为蜂毒肽可以使细脑膜的透性增加，细胞内容物泄露，细胞裂解所以蜂毒肽与天然或是模型膜的作用成为蜂毒肽研究的热点。Benachir等利用钙黄绿素作为荧光标记物，系统研究了蜂毒肽诱导的膜渗漏。他们认为蜂毒肽与囊泡的结合会非常迅速，因为在蜂毒肽作用几分钟之后，内容物的流出达到最大值，并且停止；而且蜂毒肽诱导的磷脂双分子层的裂解的发生机制是“全或无”，也就是说蜂毒肽作用下，有的囊泡的内容物全部释放，而有的则保持完整，没有渗漏，这与Schwarz 等观察的一致。内容物释放的比例与蜂毒肽/脂质的摩尔比率有关，只有达到一定量的蜂毒肽才可能有内容物渗出。更为特别的是蜂毒肽可以区别出完整的和已经有物质渗出的囊泡，说明这两类脂质双分子层的性质有很大的不同。最近有很多报道认为，微粒表面的负电荷可以抑制蜂毒肽对细胞的裂解作用，Benachir等的工作表明卵磷脂双分子层表面负电荷的存在对蜂毒肽的裂解能力有抑制作用，并且与负电荷的密度成一定比例。这可能是由于静电作用吸附蜂毒肽，而不能更加深入破坏囊泡而形成渗漏。
蜂毒肽可以作用多种酶及细胞蛋白，在裂解的细胞中蜂毒肽能结合或改变几种蛋白质功能。如蜂毒肽可以抑制蛋白激酶C；与钙调蛋白(calmodulin)具有高度亲极性。Fukushi-ma实验中观察到蜂毒肽抑制小鼠大脑皮质的突触膜上依赖鸟苷酸的腺苷酸环化酶活性；还发现蜂毒肽能明显刺激Gil和Gll活性，但却抑制Gs活性。动力学研究表明蜂毒肽抑制Gs活性是因为抑制GDP的释放，从而增加了鸟苷酸造成的。而激活Gi与抑制Gs很可能与抑制腺苷酸环化酶的活性有关。细胞脂酶的活性产物包括三磷酸肌醇(IP3)、甘油二酯(DG)和脂肪酸(FA)等是细胞生理活动重要的第二信使系统，而有实验表明蜂毒肽可以激活细胞脂酶，包括磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)、磷脂酶Az(PLAJ及甘油三酯酶等。磷脂和甘油三酯是细胞内主要的酰化酯(包含脂肪酸)。而甘油三酯的相对含量可占细胞总脂量的5%～60%。[1]
基因工程
生物工程技术的发展为获得蜂毒肽提供了一条新的途径，Kindas等从处女蜂王的毒腺中提取得到了总mRNA，发现蜂毒肽mRNA含大约400个碱基对和1个短的poly A尾。Vlasak等用mRNA-DNA逆转录的方法，利用质粒pBR322构建了蜂王毒腺的cDNA文库，用蜂王毒腺总mRNA制作探针从此文库中分离得到了蜂毒肽的cDNA，再进一步将其克隆到质粒pUC18上进行DNA序列分析，由DNA的序列分析结果推测出的蜂毒肽序列与实际测得的完全相同。张青文从1991年开始提取了蜂王毒腺的RNA，用于棉铃虫卵中的转译，成功地合成了Promelittin，并对提取的mRNA成分进行了研究，结果发现总RNA在除去rRNA后就可得到高纯度的蜂毒肽mRNA。李继周等于1997年通过mRNA-cDNA反转录的方法合成了蜂毒肽基因，用lgtll 建立了蜂毒肽的cDNA文库，并用抗体探针筛选出了附性克隆。陈仲兵等进一步将蜂毒肽cDNA克隆到大肠杆菌质粒Pucl8上，并进行了序列分析。王关林等从蜜蜂毒腺中提取总RNA，通过RT-PCR方法扩增得到了蜂毒肽前体蛋白的cDNA，再进一步通过定点诱变在蜂毒肽序列前引入了经胺裂解位点，构建了与β-半乳糖昔酶部分序列相融合的蜂毒肽诱变蛋白表达载体，序列分析结果表明，成功地引入了目的密码子，且与β-半乳糖苷酶部分序列构成正确的读码框，并在大肠杆菌中表达了诱变蛋白。王关林克隆了蜂毒肽前体蛋白的cDNA，并在大肠杆菌中表达了与β-半乳糖苷酶部分序列相融合的蜂毒肽前体蛋白。王秋波等报道通过人工合成含特异性酶切位点的AB两条寡核苦酸片段，在Klenow 酶作用下形成目的基因，用限制型内切酶Hind Ⅲ，Xmn Ⅰ同时酶切目的基因和表达载体Pmalp2质粒，在T4连接酶的作用下构建两者的重组体，通过α-互补筛选出附性克隆，并通过特异性酶切和测序分析进行鉴定，获得重组蜂毒肽的原核表达克隆。
蜂毒肽的溶血作用限制了它的临床应用。为克服其溶血毒副作用，人们尝试通过改变蜂毒素分子构像，将蜂毒素分子与肿瘤特异性抗体偶联成免疫毒素或制成缓释剂等方法来减轻其不良反应，增强抗肿瘤活性的目的。
赵亚华等为获得保留有抗菌活性而降低溶血作用的蜂毒素，对蜂毒素的分子结构进行了改造。将第5位的Val变为Arg，第15位Ala变为Arg，删除了第16位的Leu。用PCR技术获得了改造后的蜂毒素基因，将其克隆人酵母表达载体pPICZa-A，获得重组表达质粒PPICZa-A-MEA。该质粒转化毕赤酵母菌GS115，甲醇诱导下表达，发酵上清液经抑菌活性、溶血活性测定及亲和层析纯化，结果表明，蜂毒素基因成功地在毕赤酵母中表达，经改造后表达的蜂毒素保留了抗菌活性且溶血活性显著降低，经纯化后用Bradford法测定表达蜂毒素的含量约为0.29 mg/mL。
李柏、张晨等应用基因工程，构建携蜂毒素基因及甲胎蛋白(AFP)启动子(rAFP)的重组腺病毒载体，探讨rAFP驱动的蜂毒素基因在体外对肝癌细胞的特异性杀伤作用。结果发现：携蜂毒素基因重组腺病毒载体构建成功，MTr实验证明携蜂毒素基因重组腺病毒转染后，AFP附性肝癌细胞的增殖受到明显抑制，而对AFP阴性肝癌细胞及正常肝细胞无明显影响；无蜂毒素基因的重组腺病毒转染，则对各种细胞增殖均无抑制作用，他们等还发现蜂毒素基因重组腺病毒转染BEL-7402细胞后，肝癌细胞周期受到不同程度的影响，Go/G期细胞增多，细胞增殖核抗原(PCNA)标记指数较对照组明显下降，提示癌细胞较多被阻滞于G期，蜂毒素基因在癌细胞内的表达干扰了其细胞周期，抑制了癌细胞的增殖，而抑制PCNA的合成可能是其作用机制之一。细胞增殖与凋亡的失衡决定了肿瘤的生长速率。凋亡不仅直接影响着机体组织的正常发育、分化与死亡，它在肿瘤治疗中的作用已受到极大的重视。研究证明，蜂毒素具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。经携蜂毒素基因重组腺病毒转染后，倒置相差显微镜下观察到部分肝癌细胞出现凋亡形态学变化，体积变小、变圆，染色质边集等现象。携蜂毒素基因重组腺病毒可有效诱导肝癌细胞凋亡，凋亡率在20%左右，高于不舍蜂毒素基因重组腺病毒和未转染重组腺病毒对照组，提示诱导肿瘤细胞凋亡亦是蜂毒素基因治疗发挥作用的机制之一。[1]
研究历史
人类社会利用蜂毒的历史悠久，同时人们对蜂毒和蜂毒肽的研究也在不断深入。自从1952 年Neuman等人用电泳法分离获得蜂毒肽以来，关于蜂毒肽的研究拉开了帷幕，很多研究发现蜂毒肽对体内外多种肿瘤细胞都有杀伤作用。
1972 年，Haberman报道1 μmol/L 的蜂毒肽就能阻止肿瘤细胞增殖但却不抑制正常细胞的生长与克隆率。
1996 年，Arora通过对正常大鼠肝细胞与大鼠肝癌细胞抗缺氧损伤能力的实验对比，证实蜂毒肽激活磷脂酶 A2（PLA2）能够解除肝癌细胞对缺氧的抵抗。Dunn 等将来自于鼠抗人骨髓瘤细胞和淋巴瘤细胞表面特异蛋白的抗体 SCFV 基因同蜂毒肽基因相融合，构建了能杀肿瘤细胞的抗毒素基因，大肠杆菌中融合基因并表达，精制的抗毒素显示了体外杀死肿瘤细胞的效能 。
1999 年， Kubo 等通过 5 种细胞毒的测定方法对蜂毒肽与嗜酸性粒细胞的主要碱性蛋白进行比较，结果证实蜂毒肽能插入 K562 细胞的胞膜中进而形成孔道，引起 Ca2+内流，使胞内 Ca2+浓度升高，细胞裂解，最后导致在 1 h 内蜂毒肽对实验的白血病细胞均具杀伤效果。同年，Shamsher 等研究发现蜂毒肽可激活磷酸脂酶 D 进而裂解人单核白血病细胞（U937）。
2001年，黄雪强等[6]通过人白血病细胞观察蜂毒肽促凋亡的作用，结果发现对白血病细胞 5 mg/mL 蜂毒肽作用 4 h 与4μg/mL 蜂毒肽作用24h 都可见典型凋亡特征，进一步实验发现其诱导细胞凋亡同 bcl-2 基因表达显著下降相关。
2003年，刘岭等通过MTT 法对 SMMC-7721、BEL-7402 和 Hep-3B 三种肝癌细胞系进行研究，考察蜂毒肽抑制肿瘤的量效关系，结果显示：在 8～64 μg/mL 剂量时，蜂毒肽的抑瘤率直线上升，在体外表现显著的抗瘤效果。据此推测，可能与在高浓度中蜂毒肽的自聚集相关，高浓度下多呈四聚体的状态，与单体相比更能与细胞膜有效地结合，进而形成离子通道，改变胞膜通透性，裂解胞膜，表现出极强的体外杀伤肿瘤的效果。2004年，陈永强等利用不同浓度的蜂毒肽对敏感细胞系 U2OS 进行处理，64 mg/L 时对 U2OS 分别作用12 h 和24 h，其坏死率高达 80 %以上，而 16 mg/L 与 32 mg/L 剂量时对细胞增殖有显著抑制效果，还能够诱导细胞凋亡及坏死。Don Rivett 博士领导的分子生物学研究小组对蜂毒肽抗癌作用进行了研究，研发出以蜂毒肽为“弹头”的抗毒素，对前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌都具很好的疗效。
2009年8月11日英国《每日邮报》报道，日前美国华盛顿大学的科学家公布一项有意义的研究成果——他们借助纳米技术，开发出一种在显微镜下才能看到的“纳米蜜蜂”。“小蜜蜂”能钻进癌细胞，释放出杀癌良药，将癌细胞一个个消灭掉。而小蜜蜂比人的发丝还要小几千倍。　　“小蜜蜂”背上有一个特殊的包裹，包裹里装的是令常人闻之色变的蜂毒肽。研究人员称，蜂毒肽是非常好的杀癌良药。“小蜜蜂”内部还有专门的定位物质，能够指引它一路前行，直达患处。在实验中，纳米蜜蜂”已经令患有乳腺癌的小白鼠体内的癌细胞减少了45%，而患有皮肤癌的小白鼠体内的癌细胞则锐减了75%之多。
遏制艾滋
介绍2013年3月，美国科学家宣布，可以利用在蜂刺毒素中发现的化学物质毁灭艾滋病毒，防止艾滋病传播，但又不伤及周围正常细胞。美国华盛顿大学医学院的科学家经长期研究发现，蜂刺中的化学物质蜂毒肽可以刺穿艾滋病毒的保护外层，毁灭艾滋病毒。科学家们把这种毒素注入纳米粒中，上面配有特制的“缓冲器”，使之能够弹  血液中的艾滋病毒。离正常细胞，从而避免伤及正常细胞。当较小的艾滋病毒与它们接触时，会从缓冲器之间滑过，遭到毒素攻击。此前，大多数药物只能减缓艾滋病毒的生长，而最新研究出的这种蜂毒能够攻击并杀死病毒，第一时间防止感染。用途合作撰写研究报告的医学院专家约书亚·胡德介绍说，这种毒素可以用于制作防止艾滋病传播的凝胶。“我们希望，在艾滋病迅速传播的地区，人们能够利用这种凝胶作为阻止其初期感染的预防措施。我们破坏的是艾滋病毒的物理性能。从理论上说，艾滋病毒没有任何办法适应蜂毒的攻击。”
该研究报告发表在《抗病毒疗法》杂志上。科学家们认为，它有可能是开发遏制艾滋病毒猖獗传播药剂的重要步骤。医生们还认为，可以进一步开发纳米粒子，尝试杀死肿瘤细胞。[2]