标题：多酚氧化酶
简介
多酚氧化酶是一种蛋白体，在茶树生命活动和茶叶加工过程中参与一系列由酶促活动而引起的化学变化，故又被称为生物催化剂。茶叶中的酶较为复杂，种类很多，包括氧化还原酶、水解酶、裂解酶、磷酸化酶、移换酶和同工异构酶等几大类。酶蛋白具有一般蛋白质的特性，在高温或低温条件下有易变性失活的特点。各类酶均有其活性的最适温度范围，一般在30C～50℃范围内酶活性最强。酶若失活、变性，则就丧失了催化能力。酶的催化作用具有专一性，如多酚氧化酶，只能使茶多酚物质氧化，聚合成茶多酚的氧化产物茶黄素、茶红素和茶褐素等；蛋白酶只能促使蛋白质分解为氨基酸。茶叶加工就是利用酶具有的这种特性，用技术手段钝化或激发酶的活性，使其沿着茶类所需的要求发生酶促反应而获得各类茶特有的色香味。如绿茶加工过程中的杀青就是利用高温钝化酶的活性，在短时间内制止由酶引起的一系列化学变化，形成绿叶绿汤的品质特点。红茶加工过程中的发酵就是激化酶的活性，促使茶多酚物质在多酚氧化酶的催化下发生氧化聚合反应，生成茶黄素、茶红素等氧化产物，形成红茶红叶红汤的品质特点。
研究概况
多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）是自然界中分布极广的一种金属蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性。由于其检测方便，是被最早研究的几类酶之一。自1883年Yoghid发现日本漆树液汁变硬可能和某种活性物质相关，1938年Keilin D.和Mann G.研究了蘑菇多酚氧化酶的提取和纯化，得到多酚氧化酶并将这类酶称为polyphenol oxidase。多酚氧化酶又称儿茶酚氧化酶，酪氨酸酶，苯酚酶，甲酚酶，邻苯二酚氧化还原酶，是六大类酶中的第一大类氧化还原酶。
多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。在广义上，多酚氧化酶可分为三大类：单酚单氧化酶（酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.14.18.1）、双酚氧化酶（儿茶酚氧化酶catechol oxidse,EC.1.10.3.2）和漆酶（laccase,EC.1.10.3.1）。在这三大类多酚氧化酶中，儿茶酚酶主要分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶。现在大部分文献所说的多酚氧化酶一般是儿茶酚氧化酶和漆酶的统称。
自然界分布
植物中的多酚氧化酶及作用在植物（如苹果、荔枝、菠菜、马铃薯、豆类、茶叶、桑叶、烟草等）组织中，PPO是与内囊体膜结合在一起的，天然状态无活性，但将组织匀浆或损伤后PPO被活化，从而表现出活性。在果蔬细胞组织中，PPO存在的位置因原料的种类、品种及成熟度的不同而有差异，绿叶中PPO活性大部分存在于叶绿体内[7]；马铃薯块茎中几乎所有的亚细胞部分都含有PPO，含量大约与蛋白质部分相同[8]；在茶叶中的PPO分为游离态和束缚态，前者主要存在于细胞液中属可溶态PPO，而后者则主要存在于叶绿体、线粒体等细胞器中，与这些细胞器的膜系统或其他特异部位结合呈不溶态[9]，ThanarajS.N.（1990）研究了茶树新梢中PPO活性及多酚含量对红茶品质的影响，发现PPO活性强，多酚含量高，对红茶品质有利，相反则利于绿茶的生产[10]；新鲜的苹果中，多酚氧化酶几乎全部存在于叶绿体和线粒体中。从这两部分分别制备的PPO，其底物专一性稍有差异[11]。刘乾刚认为，PPO在细胞内除了存在于叶绿体及线粒体上外，细胞壁也可能存在PPO，且对发酵产生影响，细胞只要轻微破损便有PPO的作用。多酚氧化酶是一种质体酶，有些研究人员认为多酚氧化酶可能仅存在于质体中[12]，缺乏质体的组织就不存在多酚氧化酶，例如筛管和筛胞等，但是有质体的组织也可能没有多酚氧化酶，如C4植物叶。含有质体的植物组织不一定都存在多酚氧化酶，而多酚氧化酶一定在含有质体的植物组织中。
随分子生物学的发展，象西红柿、苹果等的多酚氧化酶的基因已被克隆。浙江大学赵东等[12]对茶树多酚氧化酶的克隆及其序列进行了比较。从已经克隆的多酚氧化酶的基因看，均属于基因家族，多则6-7个基因。这些基因的表达具有时空差异和组织特异性（PPO在幼龄组织中表达，在成熟组织中不表达），表明多酚氧化酶的基因在植物中所起的作用不同。高等植物组织发生褐变主要是PPO作用的结果，PPO催化多酚氧化为醌，醌聚合并与细胞内蛋白质的氨基酸反应，结果产生黑色素沉淀。
微生物漆酶漆酶是三大类多酚氧化酶中作用底物最广的一类。漆酶最早是在1883年由Yoshida首先从漆树液中发现的，后来人们又从大量的真菌体中发现了漆酶。漆酶来源很多，结构各异，不同来源的漆酶表现出来的催化特性相差较大。即便是同一来源，如同一白腐菌菌种，也可分泌出不同性质的漆酶组分，包括氧化能力、最适pH、底物专一性等，因此催化氧化作用也各不相同。漆酶分子中的铜离子是漆酶催化反应的活性中心，在催化氧化过程中起决定作用。
在真菌中，漆酶大多分布在担子菌（Basidimycetes）、多孔菌（Polyporus）、子囊菌（A-somycetes）、脉孢菌（Neurospora）、柄孢壳菌（Po-dospora）和曲霉菌（Aspergillus）等真菌中。担子菌中的白腐菌是目前获得漆酶的主要来源。Givaudan等还从稻根上的生脂固氮螺菌（Azospirillum lipoferum）中分离出细菌漆酶。 
黄乾明等以粗毛栓菌(Trametes gallica）为出发菌，通过紫外诱变处理其担抱子、PDA-RBBR平板变色法初筛、ABTS法测定培养液漆酶酶活力复筛，获得1株漆酶高产诱变菌株SAH-12。
黄俊等（2006）从森林树木根部土壤中分离得1株具有漆酶活性的细菌菌株，并鉴定该细菌属于克雷伯氏菌(Klebsiella）属，命名其为Klebsiella sp-601。这是首例报道Klebsiella细菌具有漆酶活性。
微生物酪氨酸酶酪氨酸酶，又叫单酚氧化酶，它可以氧化L-酪氨酸合成L-多巴和黑色素。在高等动物和人类中酪氨酸酶的活性高低与黑色素的形成速率有关，缺乏此酶活性将引起白化病。
有报道说，一种假单胞菌（Pseudomonas sp.）具有高产酪氨酸酶的能力，另一种细菌即弗氏柠檬杆菌（Cibrobacter freundii）在L一酪氨酸诱导下能高效表达酪氨酸酶的催化活性，经小试试验可获得L-多巴产量9.5g/L，为其中试生产奠定了基础。
蔡信之等分离并鉴定出嗜麦芽假单胞菌（Pseudomonas maltophilia)AT18能够稳定地产生酪氨酸酶，并催化产生黑色素。他们已将该菌的酪氨酸酶基因（mel）片断克隆到E.coli质粒载体pUC18上，构建了产生黑色素的工程菌E.coli/pwSY。
现状展望
植物PPO的研究现状及展望PPO与抗病性的关系人们已进行了广泛的研究[32]。植物在抵御病原微生物的侵染过程中，抗性相关酶发挥了重要作用，这主要包括了酚类代谢系统中的一些酶和病原相关蛋白家族PPO通过催化木质素及醌类化合物形成，构成保护性屏蔽而使细胞免受病菌的侵害，也可以通过形成醌类物质直接发挥抗病作用。目前已比较成功的有：黄瓜对黑星病的抗性，苹果对轮纹病的抗性，香蕉对束顶病的抗性，柠檬对流胶病的抗性，甘薯对蔓割病的抗性，水稻对白叶枯病的抗性等等。
茶叶中所有化学成分中，儿茶素与多酚氧化酶尤为重要，除绿茶、黄茶外，各种茶叶的加工都是基于儿茶素在多酚氧化酶催化下的氧化作用，即所谓的“发酵”过程。有的学者在红碎茶加工中，利用茶幼果作为外源PPO的载体，以一定比例用于红碎茶加工过程，结果发现能明显提高成茶的TF含量，减少TB含量。还有的学者进行了内源酶发酵研究，以期望能在茶饮料中有所应用，改善滋味。
多酚氧化酶是引起果蔬酶促褐变的主要酶类，PPO催化果蔬原料中的内源性多酚物质氧化生成黑色素，严重影响制品的营养，风味及外观品质。这些情况对生产者与消费者均是不希望看到的，仅在少数几种食品的生产中，人们利用了PPO的作用，如茶叶、咖啡、黑葡萄中的多酚氧化酶。
微生物PPO的研究现状及展望随着微生物发酵投人少、见效快、易控制等特点的凸显，开发微生物中的多酚氧化酶成了研究者关注的热点。微生物中的漆酶对氧化酚类或芳胺类等多种底物的氧化起催化作用，从而使其在含酚废水的处理、环境中酚类毒物的降解、饮料加工、食用和药用菌生产、饲料工业及医药卫生等各个领域有着广泛应用[33]。而利用微生物发酵合成酪氨酸酶也已成为研制治疗白瘫风、帕金森病和老年痴呆症等疾患药物的努力方向。
由于自然界中存在着大量结构不同的多酚类物质，而催化这些酚类物质氧化的多酚氧化酶也是不同的。如果从微生物中筛选出有效的酶源或者利用酶修饰、基因异源表达和基因工程菌的构建等技术创造出有效的微生物酶源，这将着深远意义。
活性测定
常用检压法和分光光度法。前者应用多酚氧化酶（PPO）可催化儿茶素等底物在有氧条件下的氧化还原反应，根据底物的氧化速率与单位酶浓度和单位时间内的耗氧量成正比这一原理，用瓦氏呼吸仪测定反应过程中的耗氧量求得PPO活性的大小，此方法设备简便，但操作复杂，误差较大。后者利用邻苯二酚和D-儿茶素在PPO催化下生成有色产物.其显色物质在460纳米处有最大吸收，吸收值在单位时间内的变化和单位酶活性成正比，计算PPO活性强度。操作方法简便，重现性好。与检压法原理相似的方法有氧电极法，应用也较多。