标题：单核苷酸多态性分析
单核苷酸多态性分析简介
单核苷酸多态性分析全称Single Nucleotide Polymorphisms，是指在基因组上单个核苷酸的变异，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。从理论上来看每一个SNP 位点都可以有4 种不同的变异形式,但实际上发生的只有两种,即转换和颠换,二者之比为2 :1。SNP 在CG序列上出现最为频繁,而且多是C转换为T ,原因是CG中的C 常为甲基化的,自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。一般而言,SNP 是指变异频率大于1 %的单核苷酸变异。在人类基因组中大概每1000 个碱基就有一个SNP ,人类基因组上的SNP 总量大概是3 ×10E6 个 。 因此,SNP成为第三代遗传标志,人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关。 现在普遍认为SNP研究是人类基因组计划走向应用的重要步骤。这主要是因为SNP将提供一个强有力的工具，用于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究等。SNP在基因组中分布相当广泛，近来的研究表明在人类基因组中每300碱基对就出现一次。大量存在的SNP位点，使人们有机会发现与各种疾病，包括肿瘤相关的基因组突变；从实验操作来看，通过SNP发现疾病相关基因突变要比通过家系来得容易；有些SNP并不直接导致疾病基因的表达，但由于它与某些疾病基因相邻，而成为重要的标记。SNP在基础研究中也发挥了巨大的作用，近年来对Y染色体SNP的分析，使得在人类进化、人类种群的演化和迁徙领域取得了一系列重要成果。 单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。 SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。 理论上讲，SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，但实际上，后两者非常少见，几乎可以忽略。因此，通常所说的SNP都是二等位多态性的。这种变异可能是转换(C T，在其互补链上则为G A)，也可能是颠换(C A，G T，C G，A T)。转换的发生率总是明显高于其它几种变异，具有转换型变异的SNP约占2/3，其它几种变异的发生几率相似。Wang等的研究也证明了这一点。转换的几率之所以高，可能是因为CpG二核苷酸上的胞嘧啶残基是人类基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。 在基因组DNA中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说，位于编码区内的SNP(coding SNP,cSNP)比较少，因为在外显子内，其变异率仅及周围序列的1/5。但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此cSNP的研究更受关注。 从对生物的遗传性状的影响上来看，cSNP又可分为2种：一种是同义cSNP(synonymous cSNP),即SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；另一种是非同义cSNP(non-synonymous cSNP),指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能。这种改变常是导致生物性状改变的直接原因。cSNP中约有一半为非同义cSNP。 先形成的SNP在人群中常有更高的频率，后形成的SNP所占的比率较低。各地各民族人群中特定SNP并非一定都存在，其所占比率也不尽相同，但大约有85%应是共通的。 SNP自身的特性决定了它更适合于对复杂性状与疾病的遗传解剖以及基于群体的基因识别等方面的研究： 1、 SNP数量多，分布广泛。据估计，人类基因组中每1000个核苷酸就有一个SNP，人类30亿碱基中共有300万以上的SNPs。SNP 遍布于整个人类基因组中，根据SNP在基因中的位置，可分为基因编码区SNPs（Coding-region SNPs，cSNPs）、基因周边SNPs（Perigenic SNPs，pSNPs）以及基因间SNPs（Intergenic SNPs，iSNPs）等三类。 2、 SNP适于快速、规模化筛查。组成DNA的碱基虽然有4种，但SNP一般只有两种碱基组成，所以它是一种二态的标记，即二等位基因（biallelic）。 由于SNP的二态性，非此即彼，在基因组筛选中SNPs往往只需+/-的分析，而不用分析片段的长度，这就利于发展自动化技术筛选或检测SNPs。 3、 SNP等位基因频率的容易估计。采用混和样本估算等位基因的频率是种高效快速的策略。该策略的原理是：首先选择参考样本制作标准曲线，然后将待测的混和样本与标准曲线进行比较，根据所得信号的比例确定混和样本中各种等位基因的频率。 4、 易于基因分型。SNPs 的二态性，也有利于对其进行基因分型。对SNP进行基因分型包括三方面的内容：(1)鉴别基因型所采用的化学反应，常用的技术手段包括：DNA分子杂交、引物延伸、等位基因特异的寡核苷酸连接反应、侧翼探针切割反应以及基于这些方法的变通技术；(2)完成这些化学反应所采用的模式，包括液相反应、固相支持物上进行的反应以及二者皆有的反应。(3)化学反应结束后，需要应用生物技术系统检测反应结果。
单核苷酸多态性分析服务
背景介绍单核苷酸多态性，是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态。一般来说，一个SNP位点只有两种等位基因，因此又叫双等位基因。SNP在人类基因组中的发生频率比较高，大约平均每1000个碱基中就有一个多态位点。有些SNP位点还会影响基因的功能，导致生物性状改变甚至致病。单核苷酸多态性是研究人类家族和动植物品系遗传变异的重要依据，因此被广泛用于群体遗传学研究（如生物的起源、进化及迁移等方面）和疾病相关基因的研究，在药物基因组学、诊断学和生物医学研究中起重要作用。根据实验目的和通量的不同，阅微基因通过以下五种方式来提供SNP检测服务：服务项目1．TaqMan探针法　　
针对染色体上的不同SNP位点分别设计PCR引物和TaqMan探针，进行实时荧光PCR扩增。探针的5’-端和3’-端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当溶液中存在PCR产物时，该探针与模板退火，即产生了适合于核酸外切酶活性的底物，从而将探针5’-端连接的荧光分子从探针上切割下来，破坏两荧光分子间的PRET，发出荧光。通常用于少量SNP位点分析　　
2．SNaPshot法 　　　
该技术由美国应用生物公司（ABI）开发，是基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术，也称小测序，主要针对中等通量的SNP分型项目。在一个含有测序酶、四种荧光标记ddNTP、紧临多态位点5’-端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止，经ABI测序仪检测后，根据峰的移动位置确定该延伸产物对应的SNP位点，根据峰的颜色可得知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型。对于PCR产物模板可通过多重PCR反应体系来获得。通常用于10-30个SNP位点分析　　
3．HRM法　　
高分辨率熔解曲线分析（HRM）是近几年兴起的SNP研究工具，它通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，来判断是否存在SNP，而且不同SNP位点、是否是杂合子等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM分析能够有效区分不同SNP位点与不同基因型。这种检测方法不受突变碱基位点与类型的局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨率熔解，即可完成对样品基因型的分析。该方法无需设计探针，操作简便、快速，成本低，结果准确，并且实现了真正的闭管操作　　
4．Mass Array法　　　　
MassARRAY分子量阵列技术是Sequenom公司推出的世界上领先的基因分析工具，通过引物延伸或切割反应与灵敏、可靠的MALDI-TOF-MS技术相结合，实现基因分型检测。基于MassARRAY平台的iPLEX GOLD技术可以设计最高达40重的PCR反应和基因型检测，实验设计灵活，分型结果准确性高。根据应用需要，对数十到数百个SNP位点进行数百至数千份样本检测时，MassARRAY具有最佳的性价比，特别适合于对全基因组研究发现的结果进行验证，或者是有限数量的研究位点已经确定的情况。　　
5．Illumina BeadXpress法 　　　
采用Illumina公司的BeadXpress系统进行批量SNP位点检测，可以同时检测1-384个SNP位点，往往用于基因组芯片结果确认，适合高通量检测。微珠芯片具有高密度、高重复性、高灵敏度、低上样量、定制灵活等特点，极高的集成密度，从而获得极高的检测筛选速度，在高通量筛选时可显著降低成本。送样要求细胞（≥10 ）、组织（≥300mg）、血液（≥1ml）、基因组DNA（≥20μl，浓度≥50ng/μl）。