标题：菌种衰退
定义
菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退（degeneration）。
过程
菌种衰退不是突然发生的，而是从量变到质变的逐步演变过程。开始时，在群体细胞中仅有个别细胞发生自发突变（一般均为负变），不会使群体菌株性能发生改变。经过连续传代，群体中的负变个体达到一定数量，发展成为优势群体，从而使整个群体表现为严重的衰退。
原因
经分析发现，导致这一现象的原因有以下几方面。
有关基因发生负突变菌种衰退的主要原因是有关基因的负突变。如果控制产量的基因发生负突变，则表现为产量下降；如果控制孢子生成的基因发生负突变，则产生孢子的能力下降。菌种在移种传代过程中会发生自发突变。虽然自发突变的几率很低(一般为10-6～10-9)，尤其是对于某一特定基因来说，突变频率更低。但是由于微生物具有极高的代谢繁殖能力，随着传代次数增加，衰退细胞的数目就会不断增加，在数量上逐渐占优势，最终成为一株衰退了的菌株。
表型延迟造成菌种衰退表型延迟现象也会造成菌种衰退。如，在诱变育种过程中，经常会发现某菌株初筛时产量较高，进行复筛时产量却下降了。
质粒脱落导致菌种衰退质粒脱落导致菌种衰退的情况在抗生素生产中较多，不少抗生素的合成是受质粒控制的。当菌株细胞由于自发突变或外界条件影响（如高温），致使控制产量的质粒脱落或者核内DNA和质粒复制不一致，即DNA复制速度超过质粒，经多次传代后，某些细胞中就不具有对产量起决定作用的质粒，这类细胞数量不断提高达到优势，则菌种表现为衰退。
连续传代连续传代是加速菌种衰退的一个重要原因。一方面，传代次数越多，发生自发突变（尤其是负突变）的几率越高；另一方面，传代次数越多，群体中个别的衰退型细胞数量增加并占据优势越快，致使群体表型出现衰退。
不适宜的培养和保藏条件不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的另一个重要原因。不良的培养条件如营养成分、温度、湿度、pH值、通气量等和保藏条件如营养、含水量、温度、氧气等，不仅会诱发衰退型细胞的出现，还会促进衰退细胞迅速繁殖，在数量上大大超过正常细胞，造成菌种衰退。
防止
合理的育种选育菌种时所处理的细胞应使用单核的，避免使用多核细胞；合理选择诱变剂的种类和剂量或增加突变位点，以减少分离回复；在诱变处理后进行充分的后培养及分离纯化，以保证保藏菌种纯碎。这些可有效的防止菌种的退化。
选用合适的培养基有人发现用老苜蓿根汁培养基培养“5406”抗生菌——细黄链霉菌可以防止它的退化。在赤霉菌产生菌——藤仓赤霉的培养基中，加入糖蜜、天门冬素、谷氨酰胺、5-核苷酸或甘露醇等物质时，也有防止菌种退化的效果。也有选取营养相对贫乏的培养基做菌种保藏培养基，如培养基中适当限制容易利用的糖源葡萄糖等的添加，因为变异多半是通过菌株的生长繁殖而产生的，当培养基营养丰富时，菌株会处于旺盛的生长状态，代谢水平较高，为变异提供了良好的条件，大大提高了菌株的退化几率。
创造良好的培养条件在生产实践中，创造和发现一个适合原种生长的条件可以防止菌种退化，如低温、干燥、缺氧等。在栖土曲霉3.942 的培养中，有人曾用改变培养温度的措施(从20－30℃提高到33－34℃)来防止它产孢子能力的退化。
控制传代次数由于微生物存在着自发突变，而突变都是在繁殖过程中发生而表现出来的。所以应尽量避免不必要的移种和传代，把必要的传代降低到最低水平，以降低自发突发的机率。菌种传代次数越多，产生突变的几率就越高，因而菌种发生退化的机会就越多。这要求不论在实验室还是在生产实践上，必须严格控制菌种的移种传代次数，并根据菌种保藏方法的不同，确立恰当的移种传代的时间间隔。如同时采用斜面保藏和其它的保藏方式（真空冻干保藏、砂土管、液氮保藏等），以延长菌种保藏时间。
利用不同类型的细胞进行移种传代在有些微生物中，如放线菌和霉菌，由于其菌的细胞常含有几个核或甚至是异核体，因此用菌丝接种就会出现不纯和衰退，而孢子一般是单核的，用它接种时，就没有这种现象发生。有人在实践中发现构巢曲霉如用分生孢子传代就容易退化，而改用子囊孢子移种传代则不易退化；还有人采用灭过菌的棉团轻巧地沾取“5406”孢子进行斜面移种，由于避免了菌丝的接入，因而达到了防止退化的效果。
采用有效的菌种保藏方法用于工业生产的一些微生物菌种，其主要性状都属于数量性状，而这类性状恰是最容易退化的。因此，有必要研究和制定出更有效的菌种保藏方法以防止菌种退化。
菌种的复壮
定义菌种的复壮（rejuvenation）：使衰退的菌种恢复原来优良性状。
狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；
广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种。
措施① 纯种分离。采用平板划线分离法、稀释平板法或涂布法均可。把仍保持原有典型优良性状的单细胞分离出来，经扩大培养恢复原菌株的典型优良性状，若能进行性能测定则更好。还可用显微镜操纵器将生长良好的单细胞或单孢子分离出来，经培养恢复原菌株性状。
② 通过寄主体内生长进行复壮（如Bacillus thuringiensis的复壮）。主要是对一些寄生性的菌株，可以将衰退的菌株接种到相应的宿主体内，提高其寄生性能及其它性能。
③ 淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。可以采用各种外界不良理化条件,使发生衰退的个体死亡,从而留下群体中生长健壮的个体.如:对"5406"抗生菌的分生孢子进行-30-10度的低温处理5-7天,使80%死亡,在抗低温个体中可找到健壮的个体.
④ 采用有效的菌种保藏方法。
常用保藏方法
斜面低温保藏法将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2－8℃的冰箱中保藏。
保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2－4个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。
此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。
液体石蜡保藏法（1）将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，1.05kg/cm2>，121.3℃灭菌30分钟，然后放在40℃温箱中，使水汽蒸发掉，备用。
（2）将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。
（3）用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准（图Ⅶ-12），使菌种与空气隔绝。
（4）将试管直立，置低温或室温下保存（有的微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长）。
此法实用而效果好。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1－2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌，在37℃温箱内，亦可保藏3个月之久。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。从液体石蜡下面取培养物移种后，接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特别注意。
滤纸保藏法（1）将滤纸剪成0.5×1.2cm的小条，装入0.6×8cm的安瓿管中，每管1－2张，塞以棉塞，1.05kg/cm2>，121.3℃灭菌30分钟。
（2）将需要保存的菌种，在适宜的斜面培养基上培养，使充分生长。
（3）取灭菌脱脂牛乳1－2ml滴加在灭菌培养皿或试管内，取数环菌苔在牛乳内混匀，制成浓悬液。
（4）用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内，使其吸饱，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。
（5）将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中，用真空泵抽气至干。
（6）将棉花塞入管内，用火焰按图Ⅶ-13熔封，保存于低温下。
（7）需要使用菌种，复活培养时，可将安瓿管口在火焰上烧热，滴一滴冷水在烧热的部位，使玻璃破裂，再用镊子敲掉口端的玻璃，待安瓿管开启后，取出滤纸，放入液体培养基内，置温箱中培养。
细菌、酵母菌、丝状真菌均可用此法保藏，前两者可保藏2年左右，有些丝状真菌甚至可保藏14－17年之久。此法较液氮、冷冻干燥法简便，不需要特殊设备。
沙土保藏法（1）取河沙加入10%稀盐酸，加热煮沸30分钟，以去除其中的有机质。
（2）倒去酸水，用自来水冲洗至中性。
（3）烘干，用40目筛子过筛，以去掉粗颗粒，备用。
（4）另取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。
（5）烘干，碾碎，通过100目筛子过筛，以去除粗颗粒。
（6）按一份黄土、三份沙的比例（或根据需要而用其他比例，甚至可全部用沙或全部用土）掺合均匀，装入10×100mm的小试管或安瓿管中，每管装1g左右，塞上棉塞，进行灭菌，烘干。
（7）抽样进行无菌检查，每10支沙土管抽一支，将沙土倒入肉汤培养基中，37℃培养48小时，若仍有杂菌，则需全部重新灭菌，再作无菌试验，直至证明无菌，方可备用。
（8）选择培养成熟的（一般指孢子层生长丰满的，营养细胞用此法效果不好）优良菌种，以无菌水洗下，制成孢子悬液。
（9）于每支沙土管中加入约0.5ml（一般以刚刚使沙土润湿为宜）孢子悬液，以接种针拌匀。
（10）放入真空干燥器内，用真空泵抽干水分，抽干时间越短越好，务使在12小时内抽干。
（11）每10支抽取一支，用接种环取出少数沙粒，接种于斜面培养基上，进行培养，观察生长情况和有无杂菌生长，如出现杂菌或菌落数很少或根本不长，则说明制作的沙土管有问题，尚须进一步抽样检查。
（12）若经检查没有问题，用火焰熔封管口，放冰箱或室内干燥处保存。每半年检查一次活力和杂菌情况。
（13）需要使用菌种，复活培养时，取沙土少许移入液体培养基内，置温箱中培养。
此法多用于能产生孢子的微生物如霉菌、放线菌，因此在抗生素工业生产中应用最广，效果亦好，可保存2年左右，但应用于营养细胞效果不佳。
液氮冷冻保藏法（1）准备安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受温度突然变化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，或能容1.2mm液体的。
（2）加保护剂与灭菌保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时，则将空安瓿管塞上棉塞，1．05kg/cm2，121.3℃灭菌15分钟：若作保存霉菌菌丝体用则需在安瓿管内预先加入保护剂如10%的甘油蒸馏水溶液或10%二甲亚砜蒸馏水溶液，加入量以能浸没以后加入的菌落圆块为限，而后再用1.05kg/cm2>，121.3℃灭菌15分钟。
（3）接入菌种将菌种用10%的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液，装入已灭菌的安瓿管；霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块，放入含有保护剂的安瓿管内，然后用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。
（4）冻结再将已封口的安瓿管以每分钟下降1℃的慢速冻结至-30℃。若细胞急剧冷冻，则在细胞内会形成冰的结晶，因而降低存活率。
（5）保藏经冻结至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷冻保藏器（图Ⅶ-14）的小圆筒内，然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氮保藏器内的气相为-150℃，液态氮内为-196℃。
（6）恢复培养保藏的菌种需要用时，将安瓿管取出，立即放入38－40℃的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止。再打开安瓿管，将内容物移入适宜的培养基上培养。
此法除适宜于一般微生物的保藏外，对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞均可长期保藏，而且性状不变异。缺点是需要特殊设备。
冷冻干燥保藏法（1）准备安瓿管用于冷冻干燥菌种保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形状可用长颈球形底的，亦称泪滴型安瓿管（图Ⅶ-15），大小要求外径6－7.5mm，长105mm，球部直径9－11mm，壁厚0.6－1.2mm。也可用没有球部的管状安瓿管。塞好棉塞，1.05kg/cm2>，121.3℃灭菌30分钟，备用。
（2）准备菌种，用冷冻干燥法保藏的菌种，其保藏期可达数年至十数年，为了在许多年后不出差错，故所用菌种要特别注意其纯度，即不能有杂菌污染，然后在最适培养基中用最适温度培养，使培养出良好的培养物。细菌和酵母的菌龄要求超过对数生长期，若用对数生长期的菌种进行保藏，其存活率反而降低。一般，细菌要求24－48小时的培养物；酵母需培养3天；形成孢子的微生物则宜保存孢子；放线菌与丝状真菌则培养7－10天。
（3）制备菌悬液与分装以细菌斜面为例，用脱脂牛乳2ml左右加入斜面试管中，制成浓菌液，每支安瓿管分装0.2ml。
（4）冷冻冷冻干燥器有成套的装置出售，价值昂贵，此处介绍的是简易方法与装置，可达到同样的目的。
将分装好的安瓿管放低温冰箱中冷冻，无低温冰箱可用冷冻剂如干冰（固体CO2>）酒精液或干冰丙酮液，温度可达-70℃。将安瓿管插入冷冻剂，只需冷冻4－5分钟，即可使悬液结冰。
（5）真空干燥为在真空干燥时使样品保持冻结状态，需准备冷冻槽，槽内放碎冰块与食盐，混合均匀，可冷至-15℃。装置仪器如图Ⅶ-16，安瓿管放入冷冻槽中的干燥瓶内。
抽气一般若在30分钟内能达到93.3Pa（0.7mmHg）真空度时，则干燥物不致熔化，以后再继续抽气，几小时内，肉眼可观察到被干燥物已趋干燥，一般抽到真空度26．7Pa（0.2mmHg），保持压力6－8小时即可。
（6）封口抽真空干燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管（图Ⅶ-17）继续抽气，约10分钟即可达到26.7Pa（0.2mmHg）。于真空状态下，以煤气喷灯的细火焰在安瓿管颈中央进行封口。封口以后，保存于冰箱或室温暗处。
此法为菌种保藏方法中最有效的方法之一，对一般生活力强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用，即使对一些很难保存的致病菌，如脑膜炎球菌与淋病球菌等亦能保存。适用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年，但设备和操作都比较复杂。