标题：钙蛋白酶
钙蛋白酶资料
概述目前多种动物的这两种钙蛋白酶的cDNA已被克隆，提取mRNA并使其表达，这方面好多分子生物学实验已经做了。主要是看此蛋白酶是怎样的对蛋白质进行调控，但到目前为止没有对calpain的作用机理作出明确并权威的结论来，大部分是猜测和推理。有对于这方面研究感兴趣的朋友，或者已经开始研究的朋友来共同研讨，本人也是关注没有多久，但已经确定做这方面的课题了。
摘 要：大量的研究表明钙蛋白酶在蛋白质降解方面起着重要作用，为了提高骨骼肌的生长速度和家畜宰后的肉品质，人们对钙蛋白酶系统的作用机理进行了大量研究，发现钙蛋白酶系统中的多种钙蛋白酶与骨骼肌生长及宰后嫩化有很大的相关性。本文就钙蛋白酶在骨骼肌生长及其嫩化中的作用的研究作一概述。
关键词：钙蛋白酶；骨骼肌；生长；嫩化
骨骼肌生长速度最终取决于骨骼肌细胞的数量、肌肉蛋白合成速度和降解速度。激素注射、饲料添加剂的使用、营养状况和饲养管理等都能通过调节以上3个基本因素中的1、2个或3个而影响整体蛋白质的沉积速度，从而影响肌肉生长速度。骨骼肌蛋白降解速度相对降低或蛋白合成速度相对升高都会导致肌肉生长速度的增加，也会提高摄入营养物质的肌肉转化率。依赖钙的钙蛋白酶途径是骨骼肌蛋白降解的一种非常重要的途径。肌原纤维蛋白质降解的第1步是肌原纤维解装配成肌丝，这一步可能是肌原纤维蛋白质降解过程中限速的一步。大量的研究表明钙蛋白酶系统参与这一解装配过程。近年的研究表明，calpain是细胞质中主要的蛋白水解酶，在肌原纤维蛋白降解中起着重要作用。肌肉增长和宰后嫩度的变化与蛋白质水解程度密切相关。因此钙蛋白酶的活性会影响畜禽肌肉增长和肉的嫩度，并对肉质产生一定的影响。
结构钙蛋白酶（EC3，4，22，17）是细胞内依钙中性半胱氨酸内肽酶。在体内，通过Ca2+激活及自溶而表现出蛋白水解酶的活性，并通过钙蛋白酶抑制活化的钙蛋白酶活性。钙蛋白酶系统的主要作用对象是细胞骨架蛋白、蛋白激酶和磷酸酶以及激素受体。广泛存在的钙蛋白酶有钙蛋白酶1（u-calpain）、钙蛋白酶2（m-calpain），还有钙蛋白酶3（p94）。前两者都由2个亚基组成，分子量相近，但两者表现最高活性所需的Ca2+浓度不同。u-calpain所需的Ca2+为1～12umoL/L，而m-calpain所需的钙离子为250～750u moL/L。它们的小亚基相同，而大亚基是两个相关基因的产物，两种大亚基之间存在一定的免疫交叉反应。有功能的钙蛋白酶是由大亚基（催化区，80kd）和小亚基（调节区，30kd）组成，小亚基是单个基因的产物，而大亚基则是不同基因的产物。不同来源的钙蛋白酶cDNA序列发现其大亚基由4个结构域组成，其中结构域Ⅱ是表现水解活性的关键部位，它约占大亚基氨基酸残基数的35%左右；结构域Ⅳ，位于羧基端，占氨基酸残基数的20%，是钙离子结合部位；结构域I和结构域Ⅲ分别占氨基酸残基的10%和35%，可能起活性调节作用。calpain3（p94）也是一个与肌肉的嫩度密切相关的蛋白酶。
活性调节
激活调节细胞中钙蛋白酶活性受到Ca2+和钙蛋白酶抑制蛋白（calpastatin）、钙蛋白酶激活蛋白（calpain activator）的调节，其中calpain activator是calpain的正调节因子。提高Ca2+浓度，钙蛋白酶的活性增强，Ca2+浓度进一步提高将导致构象变化而表现蛋白水解酶活性。当钙蛋白酶被Ca2+激活后，如果附近有钙蛋白酶抑制蛋白存在，将迅速与之结合，抑制蛋白酶活性，从而保证钙蛋白酶对底物只进行局部的特定位点的水解。由于激活钙蛋白酶所需的Ca2+浓度大于1umol/L，而胞内的Ca2+浓度为0.2～0.8umol/L，不足以激活钙蛋白酶。在活体中，钙蛋白酶如何被激活一直是一个令人困惑的问题。目前发现的钙蛋白酶激活蛋白有2种，一种是UK114，另一种是ACBP-酰基辅酶A结合蛋白，前者是calpain1的激活因子，后者是calpain2的激活因子。目前牛羊的UK114的cDNA序列已经得到克隆。calpain是钙依赖蛋白酶，只有在Ca2+激活的状态下才具有活性，当calpain的大小亚基相结合时，它不具有活性。在表现水解活性时，大致发生以下4个过程的变化：calpain大小亚基的分离；小亚基的自溶，30kd亚基迅速降解为17kd；大亚基自溶，80kd转化成78kd再变成76kd；calpain构象发生变化而表现蛋白水解酶活性；calpain受激活后呈自溶状态，从而表现活性。calpain受浓度调控，高Ca2+浓度能加速calpain的活化。除了Ca2+浓度，calpain的活性还受离子强度、pH、底物等因素的影响。
抑制调节calpastatin是高效的、专一的calpain活性抑制剂，并且在大多数组织中，calpastain的浓度可抑制calpain的活性。当calpain被Ca2+ 激活，如果附近有calpastatin存在，将迅速与之结合，影响u-calpain的自溶稳定性，抑制calpain活性，从而保证calpain对底物只进行局部的特定位点的水解（Roman等，1999）。钙蛋白酶抑制蛋白与钙蛋白酶结合后，降低calpain的活性，可能起到防止钙蛋白酶被随机激活的作用。一些抑制剂可以以共价键的方式与酶的巯基牢固结合，使酶失去活性，如碘乙酰胺、碘乙酸、E-64等可对calpain发生不可逆抑制作用。根据这些特性，人工合成一些多肽以抑制calpain的活性，如leupeptin、三肽氯甲基酮，它们在P2位点都含有亮氨酸，对calpain发生竞争抑制作用。
作用
骨骼肌生长骨骼肌钙蛋白酶存在于肌细胞内部，在Z线中浓度最高。快速萎缩肌肉中钙蛋白酶活性是正常肌肉的数倍，它的一个特征是Z线的降解，而肌动蛋白和肌球蛋白保持完整。肌原纤维蛋白质降解的第1步必须是肌原纤维解装配成肌丝。大量研究表明，钙蛋白酶系统参与这一解装配过程。钙蛋白酶引发肌原纤维蛋白质降解的可能机制如下：钙蛋白酶使Z线（使细肌丝固着于肌原纤维）和肌联蛋白、伴肌动蛋白（使粗肌丝和细肌丝固着于肌原纤维）降解，肌原纤维释放出肌丝。细肌丝的肌原蛋白和原肌球蛋白以及粗肌丝的C-蛋白降解，粗肌丝和细肌丝分别解离出肌球蛋白和肌动蛋白，释放出的粗肌丝和细肌丝可与母体或其他肌原纤维重新装配，也可被胞质蛋白酶或溶酶体组织蛋白酶降解成氨基酸。肌原纤维的残留部分功能完整，收缩力量减弱。
研究表明，calpain的作用可能仅在细胞内蛋白质的降解过程中起调节作用，而并非整个降解过程的直接参与者。推测calpain可能通过对肌原纤维蛋白进行特异的局部降解而对其结构、功能进行调控。calpain导致肌肉降解可分为两步：首先攻击肌原纤维的肌节（两个相邻Z盘之间的一段肌原纤维）部位，释放肌丝降解为小片段，然后被溶酶体所捕获进一步降解。calpain主要集中于Z盘，因此认为，降解从此处开始。但近期研究发现，calpain首先水解的是N2线。calpain参与骨架蛋白的降解是蛋白质水解过程中的限速步骤。杨晓静等试验发现，对猪注射重组生长激素后，背最长肌calpain3mRNA的表达有上升趋势，半腱肌中calpain3mRNA的相对丰度显著上升，在肌肉增长的过程中calpain3也可能参与蛋白的降解。
肌肉嫩化肉的嫩度主要决定于肌纤维、肌节长度、肌内脂肪和结缔组织等。哺乳动物肌纤维在胚胎形成过程中受到MyoD家族的调控，MyoD家族包括MyoDI、肌细胞生成素（myogenin，MYOD）、myf-5和myf-6，它们通过调节肌肉分化阶段特异性蛋白的表达来参与肌细胞的分化。MyoD基因控制启动成肌细胞融合和肌纤维形成，在肌肉分化过程中起关键作用。Esson Gustavsson(1993)研究发现肌纤维的数量在出生时就决定了，生后肌纤维生长只限于肌纤维长度和横切面积的增长；同时发现肌肉品质受到肌纤维类型和直径的影响，用肌球蛋白ATP酶可将肌纤维分为3种类型，即1、IIA和IIB型。红肌（即I型纤维）较白肌(即Ⅱ型纤维)的纤维含量多、肌纤维细、肌肉较嫩。肌原纤维的状态对嫩度具有决定性的作用，肌原纤维越碎裂、越舒张，剪切力越低、嫩度越好（陈代文等，2001）。嫩化是尸僵发生后一定时间内，肌纤维碎裂，肌肉重新变软，嫩度增加的过程。钙蛋白酶系统在细胞内参与机体生长与代谢过程，还在肌原纤维更新和宰后嫩化中扮演重要角色。calpain表达减少以及calpastatin表达量的增加，都会导致肌肉蛋白水解率及宰后肉嫩度的下降，这表明calpain水解作用是导致肉嫩化的主要因素。在宰后嫩化的过程中m-calpain的活性几乎不变，而u-calpain的活性显著下降，钙蛋白酶活性下降是其发挥水解作用的体现。由于活体宰后Ca2+浓度可以激活u-calpain而不能激活m-calpain，大量研究表明在肌肉的熟化过程中u-calpain的活性增高，含量急剧下降，因此u-calpam被认为是改善肉质嫩度的候选基因。Morgan等（1993）和Koohmaraie等（1996）认为u-calpain是肉嫩化的基本酶类。Ilian等（2001）研究发现肉的嫩度与u-calpain的活性具有相关性。calpastatin可抑制钙蛋白酶的活性，降低蛋白质水解，但钙蛋白酶系统调节肌肉嫩化的具体机制还不甚清楚。
结论家畜整体蛋白质的增加受两个过程制约：整体蛋白质合成和降解，控制蛋白质降解和合成可以提高肌肉生长速度。许多研究表明，calpain在肌原纤维蛋白的降解，特别是在早期肌肉转化过程中起着重要的调节作用，抑制其活性有可能抑制蛋白质的降解从而提高肌肉生长。但是现有的抑制剂除抑制calpain的活性外还或多或少地抑制其他蛋白酶的活性，缺乏专一性。而calpastatin是高效的、十分专一的calpain活性抑制蛋白，因此可以通过基因调控技术提高其在肌肉组织中的表达来抑制calpain的活性，从而达到提高肌肉生长的目的。我们可以重组DNA技术超表达钙蛋白酶抑制蛋白或有缺陷的钙蛋白酶，然后研制细胞系，钙蛋白酶抑制蛋白或钙蛋白酶的超表达均可能在其中被肌肉特异启动子启动，从而控制肌原纤维蛋白质降解以加快蛋白质积累。肉的嫩化与calpain的活性有关，因此可以通过激活calpain或降低calpastadn活性的方式提高肉的嫩度，改善肉质，也就是说可以在家畜生长阶段提高calpastadn的活性来抑制calpain的活性，促进蛋白质的沉积，提高骨骼肌的生长速度，在屠宰前提高calpain的活性以增加骨骼肌的嫩度。但总的来说钙蛋白酶系统的具体调控机理还不很清楚，还需要利用分子生物学等技术手段进行深入的研究。