标题：衍生化方法
简介
衍生化是一种利用化学变换把化合物转化成类似化学结构的物质。一般来说，一个特定功能的化合物参与衍生反应，溶解度，沸点，熔点，聚集态或化学成分会产生偏离。由此产生的新的化学性质可用于量化或分离。 样品的衍生化的作用主要是把难于分析的物质转化为与其化学结构相似但易于分析的物质，便于量化和分离。 当检测物质不容易被检测时，如无紫外吸收等，可以将其进行处理，如加上生色团等，生成可被检测的物质。在仪器分析中被广泛应用。气相色谱中应用化学衍生反应是为了增加样品的挥发度或提高检测灵敏度，而高效液相色谱的化学衍生法是指在一定条件下利用某种试剂(通称化学衍生试剂或标记试剂)与样品组份进行化学反应，反应的产物有利于色谱检测或分离。一般化学衍生法主要有以下几个目的：提高样品检测的灵敏度；改善样品混合物的分离度；适合于进一步做结构鉴定，如质谱、红外或核磁共振等。进行化学衍生反应应该满足如下要求：对反应条件要求不苛刻，且能迅速、定量地进行；对样品中的某个组份只生成一种衍生物，反应副产物及过量的衍生试剂不于扰被测样品的分离和检测；化学衍生试剂方便易得，通用性好。
我们一般是遇到-NH -OH极性基团，才进行衍生化，改善色谱行为
-NH 一般加TFA
-OH 一般加TMS
分类
分衍生化常用的反应有酯化、酰化、烷基化、硅烷化、硼烷化、环化和离子化等。虽然气相色谱已有许多衍生化方法，但它有一个致命的缺点是不能用于热不稳定化合物。此外，对于一些有复杂基质的实际样品，除分离上的困难外，还容易污染进样器和损坏柱子。
衍生化反应从是否形成共价键来说，可分为两种：标记和非标记反应。标记反应是在反应过程中，被分析物与标记试剂之间生成共价键；所有其它类型的反应，如形成离子对、光解、氧化还原、电化学反应等都是非标记反应。另一种区分衍生化反应是从衍生反应的场所来分，有柱前衍生化(pre-columnderivatization)，柱上衍生化(on-columnderivatization)和柱后衍生化(post-columnderivatization)三种。从是否与仪器联机的角度来分有：在线(on-line)、离线(off-1ine)和旁线(at-line)(自动化)三种。目前在HPLC中以离线的柱前衍生法(简称柱前衍生法)与在线的柱后衍生法(简称柱后衍生法)使用居多，旁线衍生化方法是发展方向。
柱前衍生法和柱后衍生法各有其优缺点。柱前衍生法的优点是：相对自由地选择反应条件；不存在反应动力学的限制；衍生化的副产物可进行预处理以降低或消除其干扰；容易允许多步反应的进行；有较多的衍生化试剂可选择；不需要复杂的仪器设备。缺点是：形成的副产物可能对色谱分离造成较大困难；在衍生化过程中，容易引入杂质或干扰峰，或使样品损失。柱后衍生法的优点有：（1）形成副产物不重要，反应不需要完全，产物也不需要高的稳定性，只需要有好的重复性即可；（2）被分析物可以在其原有的形式下进行分离，容易选用已有的分析方法。缺点是：（1）对于一定的溶剂和有限的反应时间来说，目前只有有限的反应可供选择；（2）需要额外的设备，反应器可造成峰展宽，降低分辨率。
衍生化试剂
衍生化试剂很多，简单的说：它能帮你将不能分析的样品通过衍生化试剂反应转化为可分析的化合物.衍生化试剂比如有：烷基化试剂、硅烷化试剂、酰化试剂类、荧光衍生化试剂、 紫外衍生化试剂、苯甲酰氯衍生化试剂、羟基衍生化试剂 、 手性衍生化试剂、氨基衍生化试剂、气相色谱和液相色谱中常用的柱前衍生化方法、固相化学衍生化法。高效液相色谱法有甲醛与2，4－二硝基苯肼（DNPH）反应生成腙，衍生化产物醛腙用有机溶剂萃取富集后，在一定温度下蒸发、浓缩，再以甲醇或乙腈溶解或稀释，最后进行色谱测定。
虽然已有许多的衍生化试剂被使用，但是目前开发新的衍生化试剂仍然是一个活跃的研究领域，其主要目的是不断提高灵敏度和选择性以及扩大应用范围。
衍生化试剂要求：①衍生剂必须过量且稳定；不过量反应不完全，检测不充分。不稳定，重现性差；②衍生物、衍生产物和衍生副产物至少是好分离的。当然如果只能检测到衍生产物最好；③衍生反快速完全。反应慢，柱前衍生还可以，但柱后不行。因为流速固定，衍生池管路长度一定，留给衍生化的时间是一定的。柱前衍生可以在系统外等衍生完毕后进样，但也是影响效率的。1. 硅烷化试剂硅烷基指三甲基硅烷Si(CH3)3或称TMS。硅烷化作用是指将硅烷基引入到分了中，一般是取代活性氢。活性氢被硅烷基取代后降低了化合物的极性，减少了氢键束缚。因此所形成的硅烷化衍生物更容易挥发。同时，由于含活性氢的反应位点数目减少，化合物的稳定性也得以加强。硅烷化化合物极性减弱，被测能力增强，热稳定性提高。
硅烷化在GC分析中用途最大。许多被认为是不挥发性的或是在200～300℃热不稳定的羟基化合物经过硅烷化后成功的进行色谱分析。
硅烷化试剂作用同时受到溶剂系统和添加的催化剂的影响。催化剂的使用(如三甲基氯硅烷，吡啶)可加快硅烷化试剂的反应。确定好硅烷化反应的时间和温度至关重要。必须知道衍生化的转化速率，以实现对未知样品的定最分析。硅烷化试剂一般都对潮气敏感，应密封保存以防止其吸潮失效。这些硅烷化试剂适用于范围较广，但如果使用过最，则可能给火焰离子化检测器造成些麻烦。
三甲基硅烷是GC分析最常用的通用硅烷化基团。引入此基团可改善色谱分离，并使得特殊检测技术的应用成为可能。
硅烷化试剂还可以用于对玻璃器具（如GC的内衬管）和色谱的担体进行去活化。
硅烷化试剂主要是（氯）甲基硅烷系列。见下：
双（三甲基硅烷基）乙酰胺——（BSA） 
N,O-二（三甲基硅烷）乙酰胺——（BSA） 
双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺——（BSTFA） 
二甲基二氧硅烷——（DMDCS） 
六甲基二硅胺——（HMDS） 
1,1,1,3,3,3六甲基硅氮烷——（HMDS） 
N-(叔丁基二甲基硅烷基)-N-甲基三氟乙酰胺——(MTBSTFA) 
N-甲基三氟乙酰胺——(MTBSTFA) 
三氟乙酸——（TFA） 
三甲基氯硅烷——（TMCS） 
三甲基硅烷咪唑——（TMSI） 
二甲基二氯硅烷——（DMDCS） 
N-甲基-n-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺2. 酰基化试剂酰化作用作为硅烷化的代替方法，可通过羧酸或共衍生物的作用将含有活泼氢合物（如-OH、-SH、-NH）转化为酯、硫酯或酰胺。含有卤离了的羰基基团可增强电了捕获检测器酞化作用具有很多优点： 
保护不稳定基团，从而增加了化合物的稳定性；
可提高如糖类，氨基酸等物质的挥发性。这些物质常带有大量的极性官能团，加热时易分解；
有助于混合物的分离；
使用ECD检测，分析物检测下限可降低很多。
常用的酰基化试剂有：乙酸酐（AA）、三氟乙酸酐（TFAA）、五氟丙酸酐（PFPA）、七氟丁酸酐（HFBA）、N-甲基双（三氟乙酸酐）咪唑（MBTFA）、1-(三氟乙酰)咪唑（TFAI）等。3. 烷基化试剂烷基化作用是将烷基官能团(脂肪族或脂肪，芳香族)添加到活性官能团(H)上。以烷基基团代替氢的重要性在于生成的衍生物与原来化合物相比极性大为下降。该试剂常用于修饰改良含有酸性氢的化合物如羧酸和苯酚。
生成的产物有醚，酯，硫醚，硫酯，正烷基胺和正烷基酰胺。弱酸性官能团(如醇)的烷基化要求有强碱催化剂（氢氧化钠，氢氧化钾）。酸性稍强的OH基团如苯酚和羧酸，弱碱催化剂(氯化氢，三氟化硼)即可。
常用的烷基化试剂有重氮甲烷、2,2二甲基丙烷（DMP）、18-冠醚-6、硼酸正丁酯（NBB）、O-盐酸甲氧基胺、五氟苄基溴（PFBBr）、N-甲基-N-亚硝基对甲苯磺酰胺（Diazald）、N,N-二甲基甲酰胺二缩叔乙醛（DMF-DBA）、N,N-二甲基甲酰胺二缩乙醛（DMF-DEA）、N,N-二甲基甲酰胺二缩甲醛（DMF-DMA）、N,N-二甲基甲酰胺二缩丙醛（DMF-DPA）、1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍（MNNG,97%） 、三甲基苯胺——（TMAH）等。4.用于改善检测性能的衍生化试剂分类常用紫外衍生化试剂 
⑴2,4-二硝基氟苯（最大吸收波长350nm，摩尔吸收系数>104） 
⑵ 对硝基苯甲酰氯（最大吸收波长254nm，摩尔吸收系数>104） 
⑶ 对甲基苯磺酰氯（最大吸收波长224nm，摩尔吸收系数=104） 
⑷ 异硫氰酸苯酯 （最大吸收波长244nm，摩尔吸收系数=104） 
⑸ 对硝基苯基溴（最大吸收波长265nm，摩尔吸收系数6200 ） 
⑹ 对溴代苯甲酰甲基溴（最大吸收波长260nm，摩尔吸收系数=1.8×104） 
⑺ 萘酰甲基溴（最大吸收波长248nm，摩尔吸收系数=1.8×104） 
⑻N,N对硝基苄基异丙基异脲(最大吸收波长265nm，摩尔吸收系数6200） 
⑼3,5二硝基苯甲酰氯（最大吸收波长248nm，摩尔吸收系数=104） 
⑽ 对甲氧基苯甲酰氯（最大吸收波长262nm，摩尔吸收系数=1.6×104） 
⑾2,4二硝基苯肼（最大吸收波长254nm，摩尔吸收系数=1.8×104） 
⑿ 对硝基苯甲氧胺盐酸盐（最大吸收波长254nm，摩尔吸收系数=6200） 
常用荧光衍生化试剂
⑴ 丹磺酰氯（激发波长340nm，发射波长355nm） 
⑵ 丹磺酰肼（激发波长340nm，发射波长525nm） 
⑶ 荧光胺 （激发波长340nm，发射波长525nm） 
⑷ 邻苯二甲醛（激发波长340nm，发射波长455nm） 
⑸4-溴甲基-7-甲氧基香豆素（激发波长365nm，发射波长420nm） 
⑹ 芴代甲氧基酰氯（激发波长260nm，发射波长310nm） 
⑺ 荧光素异硫氰酸酯（激发波长350nm，发射波长383nm） 
⑻4-氯-7-硝基苯一氧二氮杂茂（激发波长380nm，发射波长530nm）
GC/MS中的衍生化
作用在GC/MS方法分析样品时，对羟基、胺基、羧基等官能团进行衍生化有十分重要的作用，主要表现在：
1、改善样品的气相色谱性质。如羟基、羧基等气相色谱特性不好。
2、改善样品的热稳定性。
3、改善样品的分子质量。分子量增大，有利于样品与基质的分离。
4、改善样品的质谱行为。
5、引入卤素或吸电子基团，是样品可用CI检测，提高灵敏度。
6、分离手性化合物。GC/MS方法中常用的衍生化方法1、硅烷化(silylation)
2、酰化(acylation)
3、烷基化(alkylation)判断衍生化反应的指标1、反应是否迅速、定量进行，反应重复性好坏，反应条件是否温和，是否容易操作。
2、反应选择性高，最好只于目标化合物反应。
3、衍生化产物只有一种，反应的副产物和过量的衍生化试剂应不干扰目标化合物的分离和检测。
4、衍生化试剂通用性好，价廉易得。衍生化方法应用不当的弊端1、柱上衍生化可能损伤色谱柱。
2、某些衍生化试剂需氮气吹干。
3、衍生化不完全，影响灵敏度。
4、衍生化试剂不当，产物分子量过大。
总之，GC/MS检测中选用衍生化试剂时，除了和气相色谱法相同的准则外，还应注意衍生物的质谱特性：质量碎片特征性强，分子量适中，适合质量型检测器检测，有利于与基质干扰物的分离。硅烷化衍生化方法是气相色谱样品处理中应用最多的方法，它是利用质子性化合物（如醇、酚、酸、胺、硫醇等）与硅烷化试剂反应，形成挥发性的硅烷化衍生物。
常用的硅烷化试剂
硅烷化试剂中的烷基硅烷基和反应物中的羟基或胺基上的氢发生交换，形成烷基硅烷基产物。常用的硅烷化试剂有：
1、N，O－双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）和N，O－双三甲基硅基乙酰胺（BTA）：能衍生化胺基和羟基。常用于体内药物及其代谢物的检测。
2、N－甲基叔丁基二甲基硅基三氟乙酰胺（MTBSTFA）：常用于药物、类固醇的检测。由于叔丁基二甲基硅基有较大的空间效应，有些胺基较难衍生化。在质谱检测中，该衍生物很容易失去叔丁基形成较强的(M-57)+离子，有利于作为MS-MS的母离子。
3、N－甲基三甲基硅基三氟乙酰胺（MSTFA）：最常用的硅烷化试剂之一。衍生化也是引入三甲基硅基。
硅烷化的技术要点
常用的硅烷化试剂的一般衍生化条件：
在吹干的提取物残渣中加入100&micro;l的MSTFA或BSTFA，加入50 &micro;l的吡啶或乙腈，或用事先配好的衍生化试剂中加催化剂（三甲基碘硅烷TMSI或三甲基氯硅烷TMSCI）和抗氧剂（硫代赤藓糖醇）。衍生化小瓶加盖后在60oC衍生化5～30min，或微波衍生化2～3min，视不同化合物而定。残渣吹干水分对衍生化十分关键。因为衍生化试剂MSTFA和BSTFA遇水立即分解。
应用实例
（1）硅烷化柱前衍生气相色谱法测定氯霉素残留：样品经提取，浓缩净化、微氮吹干后，加入100μL硅烷化试剂，经60℃30min反应。氯霉素的沸点降至可供气相色谱或气质联用仪分析用。采用DB-35MS（30m×0.25mm×0.25&micro;m）色谱柱。
（2）氧化铅后柱衍生—HPLC法测定孔雀石绿残留：孔雀石绿（malachite green，MG）属于三苯甲烷类染料。无色的母体形式（leuco malachite green，LMG）是孔雀石绿在鱼体及其他生物体内的主要代谢产物和存在形式，在检测孔雀石绿在鱼体内的残留，应同时检测MG与LMG。采用C18柱色谱柱（250×4.6mm I.D.，5μm）和Celite 545氧化铅后柱（纯PbO2（1：1），20mm×2.1mm I.D）。结果在MG、LMG与结晶紫（GV）、母体结晶紫同时检测时，保留时间分别为：MG 8.33min、GV 14.18min、LMG 18.19min和19.84min。使用氧化铅后柱衍生—HPLC法测定孔雀石绿残留，具有分离效率高、快速、重现性好、仪器设备简单等优点，是MG、LMG检测中最常用的方法。