标题：免疫组化技术
前言
免疫组织化学（Immunohistochemistry）又称免疫细胞化学。它是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。1．发展简史——1941年  Coons 首先用荧光素标记抗体—检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。
—— 60年代  Nakane建立酶标抗体技术——铁蛋白标记Ab技术。
—— 70年代  Stemberger 改良上述技术，建立辣根过氧化物酶——抗体过氧化物酶（PAP）技术，使免疫细         胞化学得到广泛应用。
—— 80年代  Hsu 等建立了抗生物素—生素（ABC）法之后，免疫金—银染色法、半抗原标记法、免疫电镜           技术相继问世。
—— 90年代  分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展。
——2000年  各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的          一项有力工具。其应用范围深达医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。2．免疫组织化学的技术分类（1）根据染色方式分成：① 贴片染色
② 漂浮染色
（2）根据Ag—Ab结合方式分成：
①  直接法
②  间接法
③  多层法
（3）按标记物的性质分成：
①  免疫荧光技术（免疫荧光法）
②  免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PAD 法、 ABC法）
③  免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金 染色法、蛋白A金法）3．标记物（1）必要性：组织细胞内Ag—Ab结合反应一般是不可见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。
（2）常用标记物
①  荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光素（Fluorescein  isothiocyanate ，FITC） —— 荧光显微镜下                               呈绿色荧光
四乙基罗达明（rho—damine  RB200）——荧光显微镜下发橙红色荧光
②  酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。
③  生物素：（Biotin）
④  铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）4．应用凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等等均可用免疫组织化学方法显示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。最近几年，分子生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上来。用免疫组织化学方法对所研究的大分子分子进行定位，进而深入研究其功能。
免疫组织化学技术
（一）染色方法1．直接法
荧光素直接标记特异性抗体（—抗）上，标记抗体与抗原结合（在切片上）荧光显微镜下观察→检测抗          原。 
△  酶标抗体要显示后镜检。   
直接法优点：简单，时间短，特异性强。缺点：灵敏度低，所需抗体量大（不经济）。应用：基本不用！
2．间接法     荧光素标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动物的 IgG抗体）。
※显色后镜检    
特点：较直接法灵敏，可标记一种抗体→ 鉴定多种抗原。
3．非标记Ab桥法：
“桥法”是酶标记抗体的改进，经过三次抗体，其二抗为未标记桥抗体。
（1）单桥法
(2)双桥法
在三抗之后，将二抗和三抗再重复一次，
可增大染色强度。
★  特别提示：注意动物种属关系
4．PAP法（过氧化物酶—抗过氧化物酶法 Peroxidase anti—peroxidase method， PAP法）
~ 是桥法的改良，既先形成PAP复合物→抗原—抗体—抗IgG抗体—PAP复合物。
该法简化了操作步骤，提高了灵敏度，所染标本可长期保存。
5．ABC法（亲和素—生物素—过氧化物酶复合物法，Avidin—biotin—peroxidase Complex   method，ABC        法）
Avidin：  亲和素，一种糖蛋白，其上有4个与生物素相结合的位点。
Biotin ： 生物素—维生素H，两者亲和力巨大，牢不可破。
ABC法与PAP法的区别是：以ABC复合物代替PAP复合物。
（1）ABC复合物的制备：
（2）ABC法反应原理
6．SP或SAP法（过氧化物酶标记的链霉卵 白素或过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染色）                                        Streptavidin/peroxidase or strepta-vidin/alkaline phosphatase）
※ 该法是ABC法基础上的进一步改良，使卵白素与链霉（而非生物素）结合，而后再结合PO 。
它有4个亚基可与生物素结合，灵敏特异，   背景低，成本低。
现在还有plus盒。优点是：更简便，放大倍数↑，等电点中性更适合组织。分子量小，穿透力↑。
7．蛋白A—金法（Protein—A gold method）
~多用于电镜
8．双重组化染色法
应用双重免疫组织化学激素可在同一张切片，同一细胞或亚细胞结构内同时显示两种不同的抗原。
9．免疫金—银染色法
（Immunogold—silver staining  IGSS）（二）固定——见前述注意事项：
1．固定剂的选择：因组织而不同，注意质量和
性能。
2．固定方式的选择：①  浸渍固定（参考文献）
②  灌注固定（+后固定）
③  蒸汽固定（三）免疫组化染色步骤（以ABC法为例）1．切片脱蜡入水，入PAS 洗三次/15分钟。
2．封闭内源性过氧化物酶。用新配置的0.3%H2O2 （在PAS或0.05Tris—HCL缓冲液PH7.6中或甲醇中）室        温，30 分钟。
3．水洗，入PBS，洗三次，每次5分钟。
4．减少非特异性着色用稀释20倍的正常血清（产生二次抗体动物血清！），室温，30分钟。
5．滴加第一抗体，4℃过液或室温5′~1 hour。
6．0.1MPBS，洗三次，每次5分钟。
7．滴加第二抗体，室温15′~  60′。
8．0.1MPBS 洗净，洗三次，每次5分钟。
9．滴加ABC复合物，室温15~60分钟。
10．0.1MPBS 洗三次，每次5分钟。
11．0.05M Tris –HCL 5~10分钟，此步可省略。
12．DAB—H2O2 显色：用0.01%H2O2的DAB溶液，室温5~30分钟，随时镜检（DAB用时新配）
13．自来水洗净。
14．用Mayer 苏木精或0.5%甲基绿，复染胞核（可不染）。
15．常规脱水、透明、封固、镜检。
结果：棕褐色反应产物代表抗原X的定位。（四）免疫组化染色基本技术及注意事项1．实验计划
①  根据课题的内容选用动物，选用配套的Ab。如Ab—I鼠抗人的抗体，与其他种属间无 交叉，则不能用其他     动物，而且Ab-Ⅱ必须是羊抗鼠，若PAP法Ab-Ⅲ必须来源于鼠，否则不能连接成复合物。
② 若要比较染色深浅在对照组与实验组间的差异，在贴片方面最好贴于同一张载片上，否则无可比性。
③  选用的试剂可靠，货源充足，随时可取。
2．Ab稀释度  （如系购买的药盒有工作液和原液）
（1）工作液：无须稀释
（2）原液：
①  应参照其提供的工作液浓度进行预试验验。
如：工作液浓度为1∶1000， 可选1∶500，1∶1000，1∶1500试验；
若:  1∶500有背景，1∶1000阳性反应稍浅，可选1∶750进行试验。
② 原液的保存（—20℃）冻存——应选最佳稀度冻存。
③  若工作浓度大于1∶500则要先将原液稀释十倍，而后分装10μl/瓶→冻存（-20 ℃）于 冰箱备用。
④  关于Ab保存应参照说明书。
（3）Ab浓度的选择
Ab浓度不可太高或太低，因为Ag-Ab结合需在一定浓度范围内进行，若一方过剩则形成复合物小且少；极      过剩时已形成的复合物亦会解体而呈现假阴性。——并非Ab浓度越高越好。
3．Ab滴片技术
—— 所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。
[注意]  滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能干片。 
要领：甩净组织周围的水。
4．PBS洗涤技术
（1）洗涤的目的 
①  保证离子浓度和PH值。
②  减少非特异反应（平时Ab不可靠很纯）
（2）方法：洗三次，每次5分钟。
5．Ab孵育技术
（1）必须在湿盒内进行，以防抗体的蒸发和干片。
（2）温度与时间  4℃：过夜；
37℃：2 h  or  参考说明书
6．光镜控制显色方法
（1）室内操作：注意温度与时间的关系，室温最宜5分钟。
（2）染色稍浅亦可拿出，脱水，封片后颜色可加深。（五）对照组和染色结果的评价从以下几 个方面综合评价：
1．阳性染色特点
①  Ag定位，胞浆、胞核、胞膜、间质具有结构性。（非特异性～细胞与组织无区别）
②  染色强度不同：颜色深浅不一（非特异性染色 弥散性均匀）
2．组织切片制作过程的影响
①  固定不良—非特异性染色，显示不均。
②  边缘干燥—非特异性染色（常见），加抗体时勿干片。
3．人工假象与特异性结果显示不在同一平面上。
阳性对照：
用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色。对照切片呈阳性结果，标为阳性对照。
阴性对照：
用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，称阴性对照。其实这只是阴性对照中的一种，阴性对照    还应包括空白、替代、吸收和抑制实验。
▲  染色失败的几种原因：
（1）所染的全部切片均为阴性结果，包括阳性 对照在内。全部（－）原因可能：
①  染色未完全严格按照操作步骤进行；
②  漏加一种抗体，或抗体失效；
③  缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性；
④  底物中所加H2O2 量少或失效；
⑤  复染或脱水剂使用不当
（2）所有切片均呈阳性反应，原因可能是：
①  切片在染色过程中抗体过浓，或干燥了。
②  缓冲液配置中未加氯化钠和PH值不准确，洗涤不彻底。
③  使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反应时间过长。
④  抗体温育的时间过长。
⑤ H2O2 浓度过高，呈色速度过快。粘附剂太厚。
（3）所有切片背景过深，原因可能是：
①  未加酶消化处理切片。
②  切片或涂片过厚。
③  漂洗不够。
④  底物呈色反应过久。
⑤  蛋白质封闭不够或所用血清溶血。
⑥  使用全血清抗体稀释不够。
（4）阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应。
最常见的原因是：标本的固定和处理不当。