标题：冈田[软海绵]酸
简介
1976年6月日本发生因食用紫贻贝Mytilus edulisLinnaeus而引起的集体食物中毒事件，因中毒症状以腹泻为主，故称腹泻性贝毒。鉴于其对双壳贝类养殖业的严重威胁，日本学者纷纷对其毒素进行研究。从那时起，腹泻性贝类毒素（DSP）所引起的食物中毒在世界各地不断有报道。1997年6月，在英国49人因食用贝类而导致持续8h之久的急性恶心、呕吐、腹泻和腹痛等症状。研究者们对其食用贝类样品用小鼠生物鉴定，发现其作用因子为DSP毒素。采用高效液相色谱（HPLC）分离和X线量检测进一步分析证实该毒素主要成分为冈田软海绵酸（OkadaicAcid，OA）。[1]
DSP在海洋生物毒素中，尤其是在贝类毒素中占据重要地位，已成为影响贝类养殖业和食品卫生的一个严重问题。已经确认DSP的成分有3个组分：第1组分为冈田软海绵酸（OA）及其衍生物鳍藻毒素-1（DTXl）和鳍藻毒素-3（DTX3），第2组分为扇贝毒素-l（PTXl）、扇贝毒素-2（PTX2）、扇贝毒素-3（PTX3）、扇贝毒素-6（PTX6），第3组为虾夷扇贝毒素（YTX）及其衍生物45-OHYTX。至今至少有12种成分，其中9种的结构已明确，与腹泻有关的主要是第1组分。[2-4]
1981年Tachibana等从日本产软海绵属的冈田软海绵HalichondriaokadailKadota及美国佛罗里达州产的近缘种Halichondria melanodocia发现了具有特殊构造的聚醚（polyether）化合物。这就是冈田软海绵酸（Okadaic Acid，OA），它是一类长链脂肪酸，属于聚醚类毒素，由共生于冈田软海绵（halichondria okadai）和隐瓜海绵（H.melanodocia）中的利马原甲藻（P.lima）所产生。Tachibana首次从冈田软海绵（Halichondriaokadai）和隐海绵（H.melanodocia）中分离到OA，此后不久，Murakami等证实OA实际上是由与上述两种海绵共生的一种微藻—利马原甲藻（Prorocentrumlima）产生的，海绵通过滤食此种微藻而将OA浓集于体内。后来的研究均证实OA是海洋藻类的代谢产物，产生OA毒素的藻类在全球主要海域中几乎都有分布，主要甲藻有渐尖鳍藻（Dinophysis acuminata）、具尾鳍藻（Dinophysis caudata）、倒卵形鳍藻（Dinophysis fortii）、利玛原甲藻（Pyrophacus/Protoperidiniumlima）、帽状秃顶藻（Dinophysis mitra）和三角鳍藻（Dinophysis tripos）等。在贝类、鱼类和其他动物的滤食或摄食过程中，海水中产生OA的藻类作为食物转移到它们的胃或食道中，经胃和肠消化、吸收并导致OA在贝体内的积累。积累这类毒素的贝类有日本栉孔扇贝（Chlamysnipponesisakazara）、凹线蛤蜊（Mactra sulcatria）、紫贻贝（Mytilus cdulis）、牡蛎（Ostrea sp.）和锦蛤（Tapes japonica）等。[5-9]
当有毒微藻被双壳贝类滤食后，OA毒素会在贝类消化腺内累积。食用染毒贝类后，患者会出现腹泻、呕吐等急性中毒症状。OA的LD50（小鼠腹腔注射）为192μg/kg体重，LD50（小鼠静脉注射）为166μg/kg体重。尽管尚未见人OA中毒致死的报道，但OA是分布最广，发病率最高的海洋毒素之一，在随血液的循环转运和代谢过程中，还会对体内多种脏器造成损伤，且中毒后无特效药救治。OA虽然没有显著的急性毒性效应，但作为蛋白磷酸酶PP1和PP2A的烈性抑制剂，能抑制蛋白磷酸酶活性而导致蛋白质过磷酸化，从而对生物的多种生理功能造成影响，同时，由于对磷酸酶的抑制，可能影响到DNA复制和修复过程中的酶活性，从而带来致畸效应。OA被公认为是一种潜在的肿瘤促进剂甚至是原始致癌剂。其长期毒性效应对贝类养殖业的发展和公众健康构成了严重威胁。[10-11]
理化性质
化学性质及结构冈田软海绵酸因其来源为海绵Hailchondriaodadail和H.melanodocia，故命名为okada-ic acid。相继的研究发现，它并不是由贝类、海绵自身合成，而是由与海绵共生的涡鞭毛藻所产生。海洋中其它涡鞭毛植物如P.maculosum，P.concavum，P.hoffmanianum等也产生OA毒素。免疫定位实验表明，OA位于涡鞭毛植物外周的叶绿体和溶酶体里面，可能与膜磷脂相联。贝类通过滤食作用将藻毒素浓缩积累，经食物链传递，影响和危害人体健康。双壳贝毒化的季节因地域、年次而有所差异，但通常发生在六、七月份。其实日本民间早有传说，日本泡桐（Paulownia）开花季节壳贝类有毒。因毒化而造成危害的双壳贝类在日本主要有紫贻贝、贻贝、扇贝及黑浅蛤，在欧洲几乎全是紫贻贝。[12-14]  OA红外光谱[14]
OA属于聚醚类海洋生物毒素，是C38多环聚醚类脂肪酸的衍生物，分子式为C44H68O13，基本骨架几乎全部由乙酸构成。C-1位羧酸基团经化学修饰可显著降低毒素对磷酸酯酶活性的抑制作用，C-1位接甲醚基的OA完全失去抑制作用。对OA及其17种衍生物的构象关系研究表明，C-2、C-7、C-24和C-27位羧基和4个羟基是影响磷酸酯酶活性的关键基团，4个羧基位氧原子甲基化显著降低OA的毒性效应。与OA结构相近的鳍藻毒素（Dinophysistoxin，DTX）DTX-1、DTX-2、DTX-3 也构成DSP 有毒成份。无毒性的DTX-4是OA生物合成的前体，在其无活性部位二元醇酯键处断开便得到有毒性的OA。[15-16]  OA标准品荧光光谱[14]
OA是一种脂溶性化合物，无色晶体，不溶于水，但可溶于甲醇、乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂，不吸收紫外线，熔点为134℃。OA有很强的稳定性，对一般加工处理，如冷冻、取内脏、臭氧化及热处理无明显影响。有研究称电离辐射对DSP 的降解有一定的效果，但尚不能确定剂量和方式对降解程度的影响。[17-18]
OA是基本骨架几乎全部由乙酸分子构成。Holmes等研究表明，C-1位羧酸基团经化学修饰可显著降低这种毒素对磷酸酯酶活性的抑制能力，而C-1位接甲醚基的OA则完全失去抑制磷酸酯酶活性作用。Nishiwaki等对OA结构修饰的研究表明，C-2、C-7、C-24和C-27位的羟基基团影响磷酸酯酶活性，C-2、C-7、C-24和C-27位氧原子甲基化明显降低OA的毒性效应。与OA结构相近的轮状鳍藻毒素（Dinophysistoxin，DTX）DTX-1、DTX-2T DTX-3也构成DSP有毒成份。无毒性的DTX-4是OA生物合成的前体，在其无活性部位二元醇酯键处断开便得到有毒性的OA。另外，Traore等对受污染贝类进行的研究发现，远远低于可接受浓度范围内的金属离子（Al3+、Cu2+、Pb2+、Hg2+、Cd2+）能协同增强培养细胞中低浓度OA的细胞毒性。这一作用的机制还不很明确，可能与OA的特殊结构有关。[15-16]  OA标准曲线[12]食用标准有关OA等DSP毒素的食用标准，各国所建议食用标准的安全浓度不同，日本规定扇贝中肠腺OA为2.5μg/g，紫贻贝中肠腺1.5μg/g，澳大利亚规定100g可食部分含OA低于25μg，1g中肠腺含OA低于2μg，欧洲规定1g可食部分允许含0.2-0.6μgOA等价物。法国、西班牙、丹麦和新西兰用小鼠方法表示为“有毒素检出”，加拿大、英国等为16μg/100g软组织，荷兰定为0.12-0.14μg/g消化腺。中国，1993年，中国原进出口商品检验局出台了《出口贝类腹泻性贝类毒素的检验方法》（SN0294），明确以小鼠法作为贝类产品中DSP毒素的标准检验方法。此后，由中国国家质量监督检验检疫总局2001-08-06发布，于2001-10-01实施的国家标准《无公害食品水产品中有毒有害物质限量》（GB18406.4-2001）中规定水产品中DSP限量标准为60μg/100g可食部分，而农业部2006-01-26发布，于2006-04-01实施的行业标准《无公害食品水产品中有毒有害物质限量》（NY5073-2006）中规定无公害水产品DSP不得检出。2008年，卫生部出台国家标准《贝类中腹泻性贝类毒素的测定》（GB/T5009.212），沿用了小鼠法作为标准检验方法，该方法是在SN0294基础上的进一步完善。[19]  OA及其同系物结构式[9]
毒理学
毒性及分布虽尚未见人类因OA中毒而致死的报道，但在所有海洋毒素中，它的分布范围最广，发病率最高，几乎所有发达国家都在本国海域发现和检出本类毒素，最严重的是日本，自从1976年发生首例164人中毒的事件以来，到1982年的几年中就有1300人次发生DSP中毒。中国1996和1997年在深圳的一项调查显示，89份贝类样品中有26份含有OA，6份样品毒素含量超过规定的限量（20μg/100g软组织），最高的达84mg/100g。随着海洋污染的加剧，赤潮的经常爆发也增加了有毒藻类的出现，2002年-2004年7月，对北海区十个重点海域进行贝毒检验和有毒赤潮生物的调查发现腹泻性贝毒在大连、烟台、威海、青岛、天津等近岸海域均有分布，染毒的种类主要有虾夷扇贝（Patinopectenyessoensis）、栉孔扇贝（Chlamys farreri）、贻贝（Mytilus edulis）和菲律宾蛤仔（Ruditapes variegata）、四角蛤蜊（Mactra Veneriforznis）等经济贝类。[20-22]
中毒症状类似于食物中毒，极易与细菌性胃肠炎混淆，所以从卫生角度上对它们进行检测特别重要。DSP患者的临床症状发生的频率为：腹泻92%，恶心79%，腹痛53%，寒颤10%。潜伏期由30min到几小时，但很少有达到12h，大约70%的患者在4h之内出现症状，严重的病情可持续3d以上，但无后遗症，从未有过死亡病例的报道。虽然腹泻性贝毒没有强烈的急性毒性，但OA是强烈的致癌因子，对人体的肝细胞，神经细胞都具有破坏作用，其长期毒性效应当引起足够重视。[23-24]
已证实OA是蛋白磷酸酶PP1和PP2A的烈性抑制剂，具有强烈的促肿瘤和致癌作用。由于其多种衍生物均能引起腹泻症状而同称腹泻性贝毒，可能导致食源性疾病，它们的结构相似，化学性质十分接近，均是聚醚或大环内酯化合物。其引起的中毒症状包括绞痛，寒颤，恶心，呕吐，腹泻，中度至重症腹疼和痉挛，发冷，无致死报道，一般在3d内基本完全康复。极易与细菌性胃肠炎混淆，因此往往未引起足够的重视，所以从卫生角度上对它们进行检测特别重要。流行病学和公共卫生的研究证实，OA引起腹泻症状，主要是通过激活肠道细胞cAMP介质系统而引起水样泻。在细胞和组织中的急性和慢性毒性效应往往表现为细胞凋亡及肿瘤促进，已知肝脏是腹泻性贝类毒素的靶器官。当细胞内cAMP升高时，依赖cAMP的蛋白激酶被激活，致使一种或多种蛋白质发生磷酸化从而刺激肠隐窝细胞大量分泌水、氯及碳酸盐，同时抑制肠绒毛细胞对钠的正常吸收，结果导致严重的水泻。OA的小鼠i.p.LD50为192μg/kgBW、小鼠i.v.LD50为166μg/kgBW、i.p.LD99为160μg/kg。无特效药治疗；检测也十分困难，其毒素标准品很贵，也很难获得，中国国内还没有此毒素的标准品。[25-28]毒性作用机制由于OA毒性作用机制复杂，因此至今尚未完全阐明其作用机理。对OA的肠道、肝脏、神经毒性研究较为透彻，而对OA通过胎盘屏障引起生殖毒性的研究还相对不足。流行病学研究结果表明，OA是通过激活肠道细胞内cAMP介质系统而引起水泻。依赖cAMP的蛋白激酶随着细胞内cAMP的升高而被激活，蛋白质磷酸化，细胞大量分泌水、氯及碳酸盐，抑制细胞对钠的正常吸收，从而导致水泻。Fernández等通过培养小脑神经元研究了OA的神经毒性，OA可能通过电压依赖的钙通道（VSSC）增强钙内流，OA在浓度低至0.5nmol/L时就会产生神经毒性，首先以神经炎的蜕变和细胞体溶胀为特征，随后细胞死亡。OA产生的神经毒性不被VSCC对抗物降低，也不被兴奋性氨基酸对抗物（EAA）受体降低，VSCC对抗物和EAA受体对抗物完全受KCl去极化的神经毒性所保护。Ma-tias等研究结果发现，OA通过胎盘屏障引起生殖毒性，胎儿组织比肝脏或肾脏包含更多的OA，用9-蒽基重氮甲烷（ADAM）衍生，通过液相色谱和荧光检测分别为5.60%与1.90%和2.55%。OA的不利影响损害胎儿发育，促进新生儿肿瘤发生。OA是蛋白磷酸酶PP1和PP2A的有效抑制剂已得到了普遍证实，所以它具有诱导癌变和促进凋亡的双重效应。OA与PP1、PP2A催化亚单位特异性结合，抑制其活性，使体内蛋白质过磷酸化，使细胞产生一系列形态和功能变化，进而导致腹泻和促进癌变发展。[29-32]  细胞凋亡及其信号通路[33]
OA的作用可能与霍乱弧菌相似，通过激活腺苷酸环化酶而引起一系列导致cAMP增加的事件。OA不仅能特异性抑制PP1和PP2A，同时也能刺激许多包括肌浆球蛋白P轻链蛋白的磷酸化。PP2A、PP1和PP2B在tau蛋白AD样异常磷酸化中起重要作用，而tau磷酸化是通过OA敏感型蛋白磷酸酯酶来调节的。疏水性和细胞渗透性好的性质有可能使OA成为一种对OA敏感型磷酸酯酶细胞功能研究的工具药。OA能诱导多种类型细胞的凋亡，如表皮细胞、神经细胞、髓细胞、造骨细胞和肝细胞等。除人体细胞外，OA对非人体细胞也有诱导凋亡的作用。Goto等和Kawai等一致认为，OA对细胞的凋亡诱导机制与FasL的活化有关，FasL活化后通过自分泌的形式激活了特异性跨膜Fas受体，从而调节了细胞的凋亡活动。OA通过抑制PP1和PP2所介导的OA途径，在各种器官中普遍促癌，同时具有遗传毒性。[33-35]
OA作用小鼠胚胎细胞凋亡图册参考资料。[36]OA导致小鼠胚胎细胞凋亡电镜图(2张)
根据这些酶对抑制剂的敏感性、对阳离子的需求性和体外底物特异性可将他们分为PP-1、PP-2A、PP-2B和PP-2C组。另外一些具有蛋白磷酸酯酶（protein phosphatases，PPP）基因家族的蛋白丝/苏氨酸磷酸酯酶催化亚单位包括PP-4、PP-5、PP-6和PP-7也被鉴定出。1987年Takai等发现，OA是一种强有力的磷酸酯酶抑制剂，且特异性地抑制PP-1c和PP-2Ac。OA对PP-2Ac的抑制作用比对PP-1c强10-100倍。研究者们认为，这种差异是由PP-2Ac的L7环内氨基酸突变所致。[37-39]
研究发现，OA在短期实验中能阻止细胞凋亡，而在长期实验中则无此效应。又如，在细胞培养时间和所用药物浓度不同条件下，OA对视网膜母细胞瘤肿瘤抑制蛋白磷酸化的影响完全不同。在成神经细胞瘤与神经胶质瘤杂交细胞NG-10815中，OA前处理能使由缓激肽诱导的胞质钙浓度升高抑制63%，但这种抑制决定于OA的浓度（IC为0.15nmol·L-1）。[40-44]OA对肝细胞影响显微镜图(2张)
OA对肝细胞影响显微镜图。[45]
OA不仅能特异性抑制PP-1c和PP-2Ac，同时也能刺激许多蛋白磷酸化。OA能引起从人脐动脉和兔主动脉中分离出的血管平滑肌持续收缩，这表明OA能引起肌浆球蛋白P轻链磷酸化增加。OA引起DSP可能就是通过刺激那些肠细胞内控制钠离子分泌的蛋白磷酸化。OA通过联结催化亚单位而抑制磷酸酯酶活性。OA能特异性地抑制磷酸酯酶活性，且疏水性和细胞渗透性好的性质有可能使OA成为一种对OA敏感型磷酸酯酶细胞功能研究的工具药。[46-49]
OA已用于阿尔茨海默病（Alzheimer' sdisease，AD）模型研究，来提高各种蛋白主要是微管结合蛋白（microtubule-associatedprotein，MAP）的磷酸化程度。蛋白tau是神经细胞内含量最高的微管结合蛋白，其功能是促进微管组装并维持微管的稳定性。在AD患者，tau过度磷酸化而失去其上述特有生物功能，并自身聚结为双螺旋纤丝（pairedhelicalfilaments，PHFs）和神经原纤维缠结（neurofibrillarytangles，NFT）。微管结合蛋白MAP-2和tau异常沉积是AD的一个病理特征。MAP-2和tau是高度热稳定性蛋白，但易受磷酸化/去磷酸化速率升高的影响。这些蛋白磷酸化的状态调节着它们对微管的亲和性，从而影响神经细胞骨架的结构。在培养的鼠皮质神经元和一种成神经细胞瘤细胞系（MSN）中，OA能诱导MAP-2和tau磷酸化增加并伴随早期神经细胞骨架变化，最后导致细胞死亡，表明MAP-2和tau去磷酸化速率降低影响神经细胞骨架的稳定。OA同样影响星形胶质细胞的变化。AD病人脑中tau蛋白异常磷酸化与蛋白磷酸酯酶调节失衡有关。已知多种蛋白磷酸酯酶，如PP-2A、PP-1和PP-2B在tau蛋白的AD样异常磷酸化中起重要作用。Harris等利用OA来诱导人脑切片中tau的过磷酸化型，结果表明tau磷酸化以一种剂量依赖方式发生变化。通过OA处理产生的移动最慢型tau，称为双螺旋纤丝样tau（PHF-liketau），能被精制的PP-2B去磷酸化，这说明tau磷酸化是通过OA敏感型蛋白磷酸酯酶来调节。[34][50-52]促癌作用OA是一族独特的促癌剂：（1）通过抑制PP-1和PP-2所介导的OA途径，在各种器官中普遍促癌。（2）OA与teleocidin（一种TPA型促癌剂）同时存在时，在促癌方面并没有显示协同效应。（3）2种不同类型的促癌剂OA与TPA共同诱导小鼠皮肤上肿瘤坏死因子α（tumornecrosis factor-alpha，TNF-α）基因的表达。OA通过联结蛋白磷酸酯酶（PP-1和PP-2A）催化亚单位而抑制他们的活性，从而引起细胞内磷酸蛋白增加。已发现OA能诱导人成纤维细胞中波形蛋白（Vimentin）过磷酸化和细胞角蛋白（Cytokeratin）肽CK5、CK6、CK7、CK16、CK19及27kDa热休克蛋白（heat shock protein）过磷酸化。同时OA也可诱导体外和体内人成纤维细胞中成视网膜细胞瘤蛋白，以及再生鼠肝核中p53过磷酸化。肿瘤抑制蛋白的过磷酸化与肿瘤促进和体外细胞转化也与OA的作用有关。另外，经过OA处理的细胞能导致原癌基因c-fos表达增加。由于c-fos能提高染色体的自发畸变水平，通过不断活化c-fos表达，OA可促进癌形成。Nishina等研究F9胚胎癌性细胞（F9 embryonalcarcinomacells）时发现，OA可诱导c-fun和junB的mRNA水平迅速提高，通过转录因子AP-1的活化可引起F9细胞中分化标记的基因表达。[53-54]
研究者们曾认为，OA的促癌活性是通过对蛋白激酶C（protein kinase c，PKC）信号转导通路的调控而实现的。OA通过使信号转导通路中抑制各成份去磷酸化和灭活磷酸酶，活化PKC通路。随后一些研究小组相继证实，OA的促癌活性是通过活化丝裂原激活蛋白激酶（mitogen activated pro- teinkinase，MAPK）信号转导通路来实现的。Thévenin等发现，核因子kappaB（nu-clear factor kappaB，NF-kappaB）可被OA所激活，而NF-kappaB活化需要降解蛋白抑制剂IkappaB-α和IkappaB-β。已经证实经OA处理过的细胞蛋白磷酸化增强及随后的蛋白抑制剂降解。就IkappaB-α而言，磷酸化增加是通过细胞外常备的蛋白激酶-1（ex-tracellular regular proteinkinases1，ERK-1）的间接活化所介导，而ERK-1则是MAPK家族一成员。OA通过激活MAPK激酶，进一步促使细胞活化与转化，在DNA复制完成前，促使分化的神经细胞进入有丝分裂期，引起细胞凋亡。OA能诱导成人神经细胞瘤（neuroblastoma）细胞系TR14和NTEN程序性细胞死亡。Taraounas等推断OA可能活化酪氨酸激酶，因为他们在做经OA处理的老鼠粗线期精母细胞的减数分裂活化实验中发现，当加入一种酪氨酸激酶抑制剂染料大黄酮（genistein）时，OA对染色体代谢的作用完全消失。[55-58]
OA在细胞和组织中的急性和慢性毒性效应往往表现为细胞凋亡及肿瘤促进，OA可以通过抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡的方式对HL－7702肝细胞产生毒性效应，且呈现剂量－效应关系。而OA在凋亡和癌变两种相互矛盾的生命取向中都发挥了一定的作用，细胞内的蛋白质去磷酸化主要是由蛋白磷酸酶1和蛋白磷酸酶2A来催化，对蛋白磷酸酶无抑制或只有低抑制作用的物不会导致细胞凋亡。蛋白质磷酸化平衡在细胞是凋亡还是癌变的选择中发挥了重要作用。胰岛素样生长因子－I（GF－1）可能通过抑制tau蛋白过度磷酸化对OA诱导的细胞损伤具有保护作用。关于OA的促癌机制尚不完全清楚，以前曾有学者发现，OA在促癌过程能诱导细胞凋亡，影响线粒体凋亡通路相关基因和抗氧化基因的表达。但是对于OA促癌的浓度仍需进一步探讨。[59-62]
此外，OA在体外具有显著的抗癌活性，5μg/L时对KB细胞抑制率为80%，还可诱导体外和体内人成纤维细胞中成视网膜细胞瘤蛋白，再生鼠肝核中p53过磷酸化。[63-65]
检测方法
根据联合国粮农组织（Food and agriculture organizationof the united nations，FAO）于2004年发布的《Marine biotoxins》，可将对于OA的分析方法分为生物学分析检测法，它包括生物体内试验（小白鼠生物检测法、大蚤分析法、大鼠分析法、肠回路分析法）和生物体外试验--细胞毒性分析，生物化学分析方法（免疫学方法、蛋白磷酸酶抑制法、生物传感器检测）以及化学分析检测法（薄层层析色谱分析法、气相色谱检测、毛细管电动色谱检测法、高效液相色谱及相关联用检测技术）。[66]小白鼠生物检测法小白鼠生物检测法（mousebioassy，MBA）适用于所有藻毒素的检测，被许多国家用来定量检测毒素的毒力，是最常用的OA检测方法，其原理是将贝类样品的酸提液腹腔注射进小鼠体内，并记录死亡时间，根据麻痹性贝类毒素标准品建立的剂量效应曲线进行样品毒力的计算，结果用鼠单位（mouseunit，MU）表示（使体重20g的小鼠在15min时死亡的毒力为1个鼠单位）。小鼠生物法应用广泛，但其存在许多不足之处，如（1）动物使用带来的伦理问题；（2）灵敏度低，准确性和重现性差，易出现假阳性；（3）不具有特异性，无法确定毒素的成分和含量；（4）所测得的毒性和小鼠的品系有关，可比性较差及分析时间长等问题。因此，快速高效灵敏的检测方法亟待研究和发展。[67-68]  OA与DTX1毒素标准品和样品HPLC-MS图[69]理化检测法薄层层析色谱分析法（thin layerchromatography，TLC）、气相色谱分析法（gaschromatography，GC）及胶束毛细管电动色谱分析法（micellarelectrokineticchromatography，MEKC）等仪器分析方法均可用于OA的检测，但在高效液相色谱及相关联用技术在其研究中应用最多。高效液相色谱法常与荧光检测或质谱分析联用，对样品中的毒素进行定性、定量分析，给出各组分的毒素含量。由于OA分子在紫外光区无吸收，通常利用毒素分子中的羧基与荧光试剂发生衍生反应，使毒素分子具有荧光生色基团后进行高效液相色谱荧光检测（HPLC with fluorescencedetector，HPLC-FLD），此方法最早由Lee等人采用9-亚甲基重氮蒽（9-anthryldiazomethane，ADAM）对OA衍生生成OA-AM，其衍生化效果好，衍生反应易于操作且检测灵敏度高而广泛应用，但ADAM保存条件要求在-80℃而受到限制。荧光剂9-蒽基重氮甲烷虽然具有良好的检测限，但价格昂贵，化学性质不稳定，容易分解，且分析时间较长，需要1h左右。采用TMAH和9-CA衍生法，OA的检测限可达到12-20ng/g，且分析时间仅需要15min，适合大批量样品的检测。Louppis等利用ADAM作前柱衍生试剂，通过HPLC-FLD法、LC-MS/MS法和鼠生物法检测OA、DTX-1及其相关酯类，HPLC-FLD方法与LC-MS/MS法检测结果相关性为100%，和鼠生物法检测结果相关性为97.1%。袁祺曾利用这一技术对舟山渔场及其邻近海域腹泻性贝毒素OA进行了检测，检出率高达33%-57%，发现该毒素在中国分布区域较广，且在某些地区含量较高。[70-72]  OA与DTX1标准品和样品荧光谱图[69]
随后出现多种衍生方法，其衍生剂有2，3-（anthracenedicarboximido）ethyltrifluoromethanesulfonate（AE-OTf）、4-溴甲基-7-甲氧基香豆素（4-bromomethyl-7-methoxycoumarin，BrMmc）和BAP，此类方法不能避免大量干扰锋的出现，如衍生试剂以及未除去的小分子游离脂肪酸等，而这些杂质峰对荧光检测势必要造成干扰，同时繁杂的样品前处理及柱层析成为制约此类方法发展的又一技术难题。液相色谱-质谱法（LC-MS）和液相串联质谱技术（LC-MS/MS）是检测OA最有效的方法，其低检出限可达到ng/g，但因其仪器昂贵，对分析人员的要求高、前处理繁琐不适用于基层检测单位对大量样品的分析，而且大量有机试剂的使用会对环境造成污染。[73-80]  OA的HPLC检测流程图[81]
中国对海洋生物毒素的检测分析能力还相对较弱，一些新的检测技术，如液-质联用分析技术（LC-MS）等在海洋生物毒素分析方面应用很少，但LC-MS的优势使其在海洋生物毒素分析方面具有巨大的应用潜力。李爱峰建立了LC-MS分析OA和DTX-1毒素的阴离子检测方法，检出限分别为110和220pg;同时建立了LC-MS同步分析OA、DTX-1、GYM、SPX和PTX2等生物毒素的阳离子检测方法，检出限分别为49.6、84.6、2.1、2.8和2.9pg。利用这些方法对采集自中国沿海的部分贝类、藻类样品中的毒素成分进行了分析，通过小鼠生物测试、蛋白磷酸酶活力抑制法及建立的生物学方法得到证实。利用LC-MS技术可同步分析多种毒素，对生物毒素的分析通量和检测效率大大提高。[70][82-83]  OA与DTX1毒素标准品和样品质谱图[69]免疫学检测法免疫学检测技术（Immunoassays）利用抗原与抗体专一、特异结合的特点，对毒素进行定性定量的检测，多以单克隆抗体或多克隆抗体为基础，主要包括酶联免疫吸附技术（EnzymeLinkedImmunosorbent Assay，ELISA）、放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA）、竞争性酶免疫分析（Competitive EnzymeImmunoassay，EIA）及固态免疫珠检测（Solid-phaseimmunobeadAssay，S-PIA）等，其中通常采用的方法为ELISA，此方法操作简单、灵敏度高，适合现场监测和大批量样品的快速筛选，它不需要非常复杂和昂贵的设备，并能够实现自动化，其敏感性要比相应的小白鼠生物法和HPLC高。[84-85]  负离子模式下OA与DTX1裂解方式比较[69]
酶联免疫吸附技术（ELISA）是将抗原抗体反应的高度特异性和酶的高效催化作用相结合发展建立的一种免疫分析方，其主要是基于抗原或抗体能吸附至固相载体的表面并保持其免疫活性，抗原或抗体与酶形成的酶结合物仍保持其免疫活性和酶催化活性的基本原理。通常用于藻毒素检测的ELISA 分析方法以单克隆抗体（monoclonalantibody，MAbs）或多克隆抗体（polyclonal antibody，PAbs）为基础，多种毒素均属于小分子物质，无抗原性，不能诱导产生抗体，须与载体蛋白偶联构建完全抗原才能刺激机体引发免疫应答。常用来作为小分子人工抗原的载体蛋白有牛血清白蛋白（BSA）、钥孔血蓝蛋白（KLH）、卵清蛋白（OVA）及人工合成的多聚赖氨酸（PLL）等。单克隆抗体源于一个永久性的细胞谱系，是针对单一抗原决定簇的化学结构完全相同的单一抗体，性质均一，能够为ELISA 提供与对应抗原高度特异和高度亲和的抗体，但在单克隆抗体的制备过程中存在细胞融合、筛选及杂交瘤细胞培养等技术性高、筛选繁琐的工作步骤，除此之外，腹水及细胞悬浮液不易保存，细胞杂交株分泌特性不稳定等问题也是单抗免疫技术的发展的缺点。多克隆抗体的制备中多种抗原决定簇刺激机体，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，但比单克隆抗体的生产更加简单快速而且价廉，对复杂表位具有较高的亲和力，可以得出异源性广谱分析，即与相应抗原更广泛的交叉反应。[86]  正离子模式下OA与DTX1裂解方式比较[69]
Campàs等基于间接竞争ELISA和酶再循环系统开发了电化学免疫传感器检测技术。利用OA-OVA固定在栅电极，竞争游离和固定的OA单克隆抗体，分别以碱性磷酸酶（ALP）和辣根氧化酶（HRP）为标记抗体产生信号。标准品检测限分别为1.07（ALP）和1.98（HRP）μg/L，基于硫辛酸脱氢酶（DI）循环信号放大系统，集成ALP免疫传感器，检测限降到0.03μg/L，检测范围扩大了2个数量级。利用该技术对贻贝和牡蛎提取物进行了检测，并与比色免疫检测法、蛋白磷酸酶抑制法（PPIA）及LC-MS/MS法进行对比分析，结果具有良好的相关性。[87]
荧光偏振免疫分析（FPIA）是均相竞争性免疫分析方法，原理是利用荧光标记的抗原与特异性抗体结合后导致荧光偏振（mp）值发生改变。荧光偏振溶液中包含检测物质（抗原）、荧光标记物（示踪物）和特异性抗体。在溶液温度和粘度固定不变条件下，FP 值将直接与荧光素分子的有效分子大小有关。小分子（如未结合抗体的荧光示踪物）在溶液中进行快速布朗运动，相应FP 值小，大分子（如荧光示踪物与抗体结合）FP值则较高。如果检测样品中不含有待检测物质，则示踪物与抗体结合，FP 值将较高。如果检测样品中含有待检测物质，则与荧光示踪物竞争抗体位点，这样未结合状态荧光示踪物量将显著增加，FP 值就会降低。[88]  肠腺中OA的HPLC检测图[89]
FPIA相对于其它免疫方法相比有许多优点[5-6]。第一：合成的示踪物通常都比较稳定，易于保存，并且具有较强的免疫活性；第二：FPIA标准曲线重复性较好，荧光偏振值变异性较低（3%-5%）；第三：FPIA是均相反应系统，操作简单，同时检测过程中不需要分离结合和未结合的抗体，检测时间短，易于实现自动化。但是FPIA也有其局限之处。第一：FPIA检测限一般低于ELISA方法，通常在0.1-10ng之间；第二：FPIA易于受到光散射、样品中内源性荧光素和样品基质成分对示踪物的影响；第三：FPIA需要专门FP测量仪器。[90-91]
中国对OA 的ELISA 方法的研究建立上也有了许多突破，孙迎春等人首次分泌抗OA MAb 的杂交瘤细胞株。卢士英在此理论基础上以鼠源单克隆抗体可变区引物扩增并克隆了抗OA 单链抗体基因，并建立直接和间接竞争抑制性ELISA方法，确定两种方法OA 的最低检出质量浓度分别为0.6 μg/L 和0.18 μg/L。刘仁沿等人用OA-BSA 和OA-KLH 免疫小鼠，分别制备单克隆抗体和多克隆抗体，结果表明OA-KLH 的免疫效果优于OA-BSA，单克隆抗体优于多克隆抗体，此外，刘仁沿等人还对快速检测OA 的免疫层析试纸条法进行了初步的研究。随后，王权等人再次用OA-BSA 免疫小鼠得到检测限为0.175 ng/mL 的单克隆抗体。[92-95]蛋白磷酸酶抑制法蛋白磷酸酶抑制法（protein phosphataseinhibition assay，PPIA），该方法利用OA对PP2A酶活力抑制特性，选择一种在酶催化反应后能产生荧光产物的物质作底物，根据产物产生的速率来表示酶活力受抑制程度，进而计算抑制剂OA浓度。最初以硝基苯磷酸盐为底物，改进后以磷酸甲基酮为底物。酶活力抑制法具有定量准确、检测灵敏、重现性好、回收率高等优点，不足的是只能给出反映毒性相对大小的数据，不能给出毒素组成成分，且酶价格较高，所用多通道连续分光/荧光光度计也不普及，限制了其广泛应用。李爱峰等利用酶活力抑制法建立了OA的检测方法，有效检测范围为0.75-30nmol/L，贝组织中OA检出限为0.9μg/kg。其他腹泻性贝毒成分对蛋白磷酸酶有同样的抑制作用，但此法却不能鉴定。Prassopoulou等利用鼠生物法，PP2A抑制法（试剂盒）、HPLC-FLD法检测OA，HPLC-FLD检测限为5.86μg/kg，3种检测方法比较，结果显示出极好的一致性。该方法继承了鼠生物法能直接建立剂量-效应关系的优势，显著降低了检出限，可在短时间内检测大量样品，有望发展成为一种标准检测方法。[96-99]生物传感器生物传感器（Biosensor）是将生物活性物质固定在某种特殊材料上作为识别元件与适当的理化换能器（如氧电极、光敏管、压电晶体等）及信号放大装置构成的分析工具。根据分子部件的不同，可分为酶传感器、微生物传感器、免疫传感器及DNA 传感器等，根据信号转换部分的不同，可分为电化学、半导体、生物电极等生物传感器。因其操作简便、可重复使用、可实现连续在线监控等优点，在环境污染及食品安全得到广泛研究，而其在赤潮毒素检测的应用上的研究也在不断发展和更新。用于检测OA的生物传感器主要以免疫学为基础，根据ELISA 分析的反应原理，利用抗原抗体结合产生的某些理化性质的改变来进行分析，其次还有以蛋白磷酸酶抑制法（PPIA）为基础，利用OA 和DTXs 毒素对蛋白磷酸酶抑制的特性制作的生物传感器。生物传感器的形式主要分两类，一类是表面等离子体共振技术（Surface PlasmonResonance，SPR）制成的传感器，另一类是电化学反应制成的生物传感器。[100-103]
Volpe等组装电化学探针用于监控OA对PP2A的抑制。PP2A具有肝糖磷酸化酶（PHOSa）特性，能催化肝糖转化成葡萄糖-1-磷酸盐（G-1-P）。而PP2A受OA及其同系物的强烈抑制，根据这一特性，将PP2A应用于开发离线酶培育检测系统中（OA/PP2A，PP2A/PHOSa，PHOSa/肝糖+磷酸盐），通过酶反应的最终产物过氧化氢（H2O2）进行电化学检测，即糖原（glycogen）转化为G-1-P，与碱性磷酸酶（AP）反应产生葡萄糖（glucose，G），G与葡萄糖氧化酶（GOD）反应生成H2O2。AP与GOD两种酶固定在尼龙网薄膜上，其上嵌入流动注射分析（FIA）系统的H2O2铂探针。校准后的检测系统工作范围是30-250 pg/mL，生物传感器响应时间为4 min。[104]