标题：遗传毒性试验
定义
遗传毒性试验能检出DNA损伤及其损伤的固定。遗传毒性研究在药物研发中处于比较的重要位置。
作用
遗传毒性试验能检出DNA损伤及其损伤的固定。以基因突变、较大范围染色体损伤、重组和染色体数目改变形式出现的DNA损伤的固定，一般被认为是可遗传效应的基础，并且是恶性肿瘤发展过程的环节之一（这种遗传学改变仅在复杂的恶性肿瘤发展变化过程中起了部分作用）。染色体数目的改变还与肿瘤发生有关和可提示生殖细胞发生非整倍体的潜在性。在检测这些类别损伤的试验中呈阳性的化合物为潜在人类致癌剂和/或致突变剂。由于在人体中已建立了某些化合物的暴露和致癌性之间的关系，而对于遗传性疾病尚难以证明有类似的关系，故遗传毒性试验主要用于致癌性预测。但是，因为已经确定生殖细胞突变与人类疾病有关，所以对可能引起可遗传效应的化合物与可能引起癌症的化合物应引起同样的关注；此外，这些试验的结果可能还有助于致癌性试验分析。
遗传毒性研究在药物研发中处于比较的重要位置，尤其是在药物筛选阶段，在很大程度上遗传毒性试验结果将影响到药物开发的进程。但是遗传毒性的假阳性和假阴性结果难以避免，尤其是近年来体外哺乳动物细胞试验系统阳性结果（该结果与人用危险不相关）过高的问题已引起的广泛关注。因此对结果进行综合分析尤为重要。FDA于2006年出台了推荐的遗传毒性试验结果综合分析法指导原则（Guidanceforindustyandreviewstaff:Recommendedapproachestointegrationofgenetictoxicologystudyresults），对遗传毒性试验出现阳性结果如何评价和处理进行了讨论。现介绍ICHS2（R1）中的遗传毒性结果评价和追加试验策略。
对比试验已明确显示，在预测药物对啮齿类动物致癌性时每种体外检测系统均可产生假阴性和假阳性结果。遗传毒性试验组合（包括体内和体外试验）检测的是被认为主要通过直接的遗传损伤机制的致癌剂，如绝大多数已知的人类致癌剂。因此，这些组合无法检测出非遗传毒性致癌剂。体外试验的一些实验条件，如体外代谢活化系统有限的能力，可能导致假阴性结果。试验组合方法的设计是为了减少有潜在遗传毒性化合物的假阴性结果的风险，但是，任何一种遗传毒性试验中的阳性结果并不一定能说明受试物对人体真正具有遗传毒性或致癌性的危险。
实验方法
近十几年,随着遗传毒理学相关领域特别是分子生物学的研究进展,遗传毒性测试评价方法也在不断改进。据报道,目前已建立的遗传毒性短期检测法已超过200种。根据其检测的遗传学终点可分为4种类型:1检测基因突变;2检测染色体畸变;3检测染色体组畸变;4检测DNA原始损伤。
1　现行组合试验方案由于一种遗传毒性检测方法通常只能反映一个或两个遗传学终点。没有一种检测方法能涵盖所有的遗传学终点,故需用一组试验配套进行试验。200多种检测方法中,真正经过验证有合适灵敏度和特异度的大概不到10种。目前多数国家规定,如体内诱变试验显示1个或以上试验呈阳性结果,则需要进行生殖细胞遗传毒性测试。
2　各类遗传毒性试验方法的研究进展
2.1　检测基因突变
遗传毒性试验 
2.1.1　Ames试验　Ames试验是检测化学物质基因突变的常用方法。常规的Ames试验选用四个测试菌株(TA97、TA98、TA100、TA102),最近有人提出增加TA1535测试菌株,该菌株特别适用于检测混合物的致突变性。目前出现的新生菌株具有更高的敏感性和特异性,如YG7014、TG7108,缺乏编码O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基化转移酶的ogtST基因,专用于对烷化剂引起的DNA损伤检测;引入乙酰转移酶基因的YG1024、YG1029菌株,对硝基芳烃和芳香胺的敏感性比原菌株高100倍以上[4]。测试代谢活化系统一般采用由Aro-clor1254(PCBs)诱导大鼠肝微粒体酶的S9;国外也有用人肝S9的报道,试验证明其代谢活性明显高于鼠S9[5,6]。为了克服S9制备上的困难和不稳定性,Josephy等将沙门氏菌的芳香胺N-乙酰转移酶基因和人类细胞色素P-450基因Cyp1A2引入细胞,构建了在无外源S9时也可检出芳香胺诱变性的Ames测试菌株如DJ4501A2[7]。
2.1.2　TK基因突变试验　TK基因突变试验是一种哺乳动物体细胞基因正向突变试验,近年来其应用价值有明显的提高。TK基因编码胸苷激酶,该酶催化胸苷的磷酸化反应,生成胸苷单磷酸(TMP)。如果存在三氟苷(TFT)等嘧啶类似物,则产生异常的TMP,掺入DNA中导致细胞死亡。如受检物能引起TK基因突变,胸苷激酶则不能合成,而在核苷类似物的存在下能够存活。TK基因突变试验可检出包括点突变、大的缺失、重组、染色体异倍性和其他较大范围基因组改变在内的多种遗传改变。试验采用的靶细胞系主要有小鼠淋巴瘤细胞L5178Y以及人类淋巴母细胞TK6和WTK1等。其基因型均为tk+/-。Honma(本间正充)和张立实(1999)指出原用染毒时间3～6h对于充分检出断裂剂和锤体来说这个时间太短,获阴性结果时应延长至24h。据资料显示对于同一阳性受检物,WTK1细胞的突变频率远高于TK6细胞,认为与WTK1存在p53基因突变有关。Do-brovolsky(1999)建立了tk+/-转基因小鼠,可用于体内试验。
2.1.3　转基因小鼠基因突变试验　转基因小鼠基因突变试验可在整体状态下检测基因突变,比较不同组织(包括生殖腺)的突变率,确定靶器官,对诱发的遗传改变作精确分析等[8]。1989年Gossen等报道了LacZ转基因小鼠突变测试系统。近年来,国外已陆续发展了多种用于突变检测的转基因动物,其中3种已投入商品化生产,MutaTM小鼠、Big-BlueTM小鼠和Xenomouse小鼠,它们分别采用大肠杆菌乳糖操纵子的LacZ和/或Lacl作为诱变的靶基因。陈建泉等人(1997)已经以穿梭质粒pESnx载体,以xy1E基因因为诱变靶基因建立了携带xy1E的转基因小鼠,并对转基因小鼠进行了繁殖建系。并已实验证明xy1E转基因小鼠是一个研究体内基因突变的有效模型,它可望成为一种新的转基因小鼠突变检测系统[9]。Heddle等(2000)建立了1个种gptdelta转基因小鼠。HiroyukiHayashi等(2003)将载有E.coligpt基因和λ噬菌体的red/gam基因λEG10DNA整合到SD大鼠每个单倍体基因组q24～q31位点。这种转基因大鼠对乙基亚硝基脲(ENU)和苯并芘(B[a]P)的肝脏毒性显示了很好的敏感性,它也有助于研究遗传毒性物质对小鼠和大鼠的种间差异[10]。
2.1.4　反向限制性酶切位点突变分析法(inverserestrictionsitemutation,iRSM)由英国威尔士大学分子遗传和毒理中心建立并完善的[11]。iRSM适用于快速检测诱变剂所致体内外DNA的突变,但这些突变的特点是使某一酶切位点变为另一酶切位点。该方法建立者Jenkins等首先将iRSM应用于化学诱变剂所致动物体内p53基因的突变检测,取得了良好的结果:小鼠分别口服N-乙基N-亚硝基脲(ENU)、2-乙酰氨基芴(2-AAF)和二甲基酰肼(DMH)3天后,以iRSM方法相应地检测小鼠脾、骨髓和肝组织p53基因第6内含子区域的Apa→Ava位点反向突变。结果表明ENU诱发肝组织p53基因突变的发生率为33%,2-AAF使肝组织突变的发生率为25%,这一阳性突变率反映出了不同诱变剂对相应组织的致突变强度,进一步验证了该方法的高灵敏度和准确性。它具有灵敏度高、快速、操作简便、以及突变检测部位明确等优点,应当说是一种较具实用价值和生命力的突变检测手段。但是,iRSM的不足之处是仅能检测诱发限制性酶切位点反向的DNA突变。根据文献资料分析,化合物致突的发生具有一定的规律性,即结构类似的一组化合物常常引起一些特定序列较固定的碱基改变。例如,烷化剂和芳香胺类虽易使一连串鸟嘌呤(G)3′端G发生突变[12,13],这可能与该部位电荷密集有关,多数活性氧生成物质的DNA致突作用也具有类似规律[14];CpG二核苷常常是DNA加成物致突变作用部位[15],所以CpG突变的检测在化合物致突检测中具有重要意义,而CpG突变常引发某些固定酶切位点的变化。很显然,iRSM可较广泛地应用于遗传毒性化合物致突作用的检测。
2.2　检测染色体和染色体组畸变
2.2.1　微核试验　传统的体内微核试验仍然是检测化学物质染色体损伤的基本方法。目前微核试验方法主要有以下改进:1体外微核试验　常用细胞有中国仓鼠肺细胞(CHL)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)及中国仓鼠成纤维细胞(V79)等,近年开始有用L5178Y小鼠淋巴瘤细胞和人的类成淋巴细胞TK6。也有用叙利亚仓鼠胚胎(SHE)细胞和BALB/c3T3细胞。体外试验比体内试验易于操作和控制。缺点是对直接作用的化合物有可能出现假阳性。2周围血微核试验　优点是可重复采样,自身对照,减少实验动物数。李尊爱(1999)报道刚断乳不久的小鼠(4～6周龄)用于外周血网织红细胞微核试验比年龄更大的敏感些[16]。3胞质分裂阻滞法微核试验(CB-MNT)　很好地排除了细胞分裂的影响。该法中,双核细胞是只分裂了一次的细胞,其结果更加稳定敏感。CB-MNT可观察到多种遗传学终点。观察不同分裂期的细胞比例,计算核分裂指数能检测诱变物对细胞周期的影响。还可检测切除修复,次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)位点变异,凋亡。认为该试验可使计数值提高,达到传统方法的两倍或以上。但也偶小于两倍的结果(李来玉,1996)。最近Garriott和Phelps等推荐了关于体外双核细胞微核试验的几个参数条件:细胞松弛素B不影响试验结果;计数2000个双核细胞;长时间暴露没有必要;结果用趋势检验分析;根据相应的细胞毒性选择适当的浓度[17]。
2.2.2　染色体畸变试验　染色体畸变试验是检测化学物质影响染色体数量和结构的基本方法。在化学物质安全性评价中常选体外CHL细胞染色体畸变、精原细胞染色体畸变试验等检测化学物质对染色体的影响。为了准确观察诱发的畸变频数,本试验收获细胞的时间应尽量提前至大多数细胞处于染毒后第1次有丝分裂时(Tucker,1996)。对于染色估数目改变,原则上只适合超倍体的观察。因为涂片时可能人为地把染色体推出细胞外(Tucker,1997),Danford曾建议在制备标本时减弱低渗处理能力,以免涨破细胞膜,从而能准确观察亚二倍体。经研究,认为以0.094mo1/LKC1弱低渗液处理2min～3min是达此目的的最佳条件(楼铁柱,1997)。
2.2.3　荧光原位杂交(FISH)技术　荧光原位杂交最早由Bauman(1980)建立,后由Lucas(1989)首先应用于染色体畸变分析。其原理是按检测目标准备恰当的DNA序列作为探针,并用生物素标记,对载玻片上待测标本中的DNA杂交,最后通过杂交位点的荧光观察染色体结构或数目的改变。应用特殊染色体和染色体某区域的荧光探针可在体内检测4种类型的细胞遗传学终点[18]。1检测中期细胞染色体畸变。2应用亚染色体区域的探针检测间期染色体断裂和非整倍体。3应用中心粒探针和/或抗着丝点抗体检测微核的形成。Schriever-Schwemmet等利用CREST间接免疫荧光法,以及小鼠次要和主要卫星DNA探针,在小鼠骨髓细胞证明了受试物引起微核的来源[19]。4哺乳动物精子非整倍体检测。徐德祥(1999)用双色FISH方法对丙烯腈接触男工精子性染色体数目畸变进行了检测,证明FISH技术用于检测精子染色体数目畸变实验结果稳定可靠。
2.3　检测DNA原始损伤2.3.1　单细胞凝胶电泳技术　单细胞凝胶电泳分析(singlecellgeleletrophoresis,SCGE)是Ostling等(1984)首创的,以后经Singh等(1988)进一步完善而逐渐发展起来的一种快速检测单细胞DNA损伤的实验方法,因其细胞电泳形状颇似慧星,又称慧星试验(cometassay)。Kizilian(1999)改进了一些试验条件,能明显将细胞调亡和细胞坏死的形象与“彗星”区分。MarkS.Rundell等(2003)报道彗星试验测行的损伤主要是由致突变剂引起的[20]。RichardD.Bowden等(2003)研究出了一种新的分析试验结果的彗星尾图谱,可以更加准确的分析彗星的长度及密度[21]。SCGE是评价遗传毒性损害非常敏感的实验,可以检测到每1.657×10-37kg中0.1个DNA的断裂。与经典的染色体畸变、微核、SCE相比,SCGE可以用于活细胞DNA的检测,也能用于死亡细胞DNA的分析,使SCGE不仅可以研究低剂量下的生物效应,也可用于研究高剂量下的生物效应;同时SCGE又可提供DNA修复能力的信息,这使得SCGE非常适用于评价受试物的遗传毒性