标题：核酸疫苗
核酸疫苗简介
核酸疫苗(nucleic acid vaccine),也称基因疫苗(gene  核酸疫苗tic vaccine),是指将含有编码的蛋白基因序列的质粒载体，经肌肉注射或微弹轰击等方法导入宿主体内，通过宿主细胞表达抗源蛋白，诱导宿主细胞产生对该抗源蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。
核酸疫苗是利用现代生物技术免疫学、生物化学、分子生物学等研制成的，分为DNA疫苗和RNA疫苗两种。但目前对核酸苗的研究以DNA疫苗为主。DNA疫苗又称为稞疫苗，因其不需要任何化学载体而得此名。DNA疫苗导入宿主体内后，被细胞（组织细胞、抗原递呈细胞或其它炎性细胞）摄取，并在细胞内表达病原体的蛋白质抗原，通过一系列的反应刺激机体产生细胞免疫和体液免疫。
核酸疫苗产生
核酸疫苗的发展史真正开始于20世90年代。
在过去的20世纪中，疫苗研究取得了巨大成功，它是继柯赫、巴斯德等  基因疫苗的分子路线人的科学突破而迅速发展起来的，经历了一个由“期盼”到“实现”这样一个伟大的历史转变过程。疫苗免疫接种所经过的第一次重大变革是由Pasteur等研制开发的减毒或灭活的疫苗，第二次是使用完整生物体的天然成分即亚单位疫苗。它们虽然在一定程度上提高了免疫效应，但安全性不够，尤其是对免疫功能低下患者的风险较大。为此，人们进行了大量的试验。
1990年wolff等偶然发现给小鼠肌肉注射外源性重组质粒后，质粒被摄取并能在体内至少两个月稳定地表达所编码蛋白。
1991年Williams等发现外源基因输入体内的表达产物可诱导产生免疫应答。
1992年Tang等将表达人生长激素的基因质粒DNA导入小鼠皮内，小鼠产生特异性抗体，从而提出了基因免疫的概念。
1993年Ulmer等证实小鼠肌肉注射含有编码甲型流感病毒核蛋白（NP）的重组质粒后，可有效地保护小鼠抗不同亚型、分离时间相隔34年的流感病毒的攻击。随后的大量动物实验都说明在合适的条件下，DNA接种后既能产生细胞免疫又能引起体液免疫。因此，1994年在日内瓦召开的专题会议上将这种疫苗定名为核酸疫苗。
核酸疫苗的出现与发展是疫苗发展史上的第三次革命。
核酸疫苗-特点
优势
与传统的灭活疫苗、亚单位疫苗和基因工程疫苗相比，核酸疫苗具有如下优点：1 免疫保护力增强
接种后蛋白质在宿主细胞内表达，直接与组织相容性复合物MHC  DNAI或II类分子结合，同时引起细胞和体液免疫，对慢性病毒感染性疾病等依赖细胞免疫清除病原的疾病的预防更加有效。
2 制备简单，省时省力
核酸疫苗作为一种重组质粒，易在工程菌内大量扩增，提纯方法简单，且可将编码不同抗原基因的多种重组质粒联合应用，制备多价核酸疫苗，这样可大大减少人力、物力、财力以及多次接种带来的应激反应。 　　 
3 同种异株交叉保护
这是基因疫苗的最大优点之一。在制备基因疫苗时，可通过对基因表达载体所携带的靶基因进行改造，从而选择抗原决定簇。 　　
4 应用较安全
接种核酸疫苗后，蛋白质抗原在宿主细胞内表达，无因毒力返祖或残留毒力病毒颗粒而引发疫病的危险，也不会引起对机体的不良反应。 　　
5 产生持久免疫应答
免疫具有持久性，一次接种可获得长期免疫力，无需反复多次加强免疫。Wolff等报道，在注射后19个月仍可检测到外源基因相当数量的表达。 　　 
6 贮存、运输方便
核酸疫苗的质粒DNA稳定性好，便于贮存和运输，无须冷藏。 　　 
7 可用于防治肿瘤
CTL应答也是机体杀死癌变细胞的有效清除途径。若能找到在细胞恶性转化过程中的关键蛋白，就能制备肿瘤的CTL疫苗。该基因疫苗接种后，可诱发机体产生CTL免疫应答，对细胞的恶变进行免疫监视，对癌变的细胞产生免疫应答，从而为癌症的预防和免疫治疗提供强有力的新式武器。
潜在危险
1 质粒DNA可能诱导自身免疫反应，但是人和动物的许多试验表明质粒DNA诱发自身免疫性疾病的可能性较小。目前已有一项DNA疫苗的接种研究表明，免疫动物血清中未检测到抗DNA抗体。但在DNA疫苗的临床试验中。应对接种者进行抗DNA抗体检测。 　　
2 持续表达外源抗原可能产生一些不良后果。质  核酸疫苗粒长期过高水平地表达外源抗原，可能导致机体对该抗原的免疫耐受或麻醉。在成年动物，尚未见到因DNA疫苗接种而诱发免疫耐受的例子。但新生动物的免疫系统尚未成熟，可能将外源抗原认为自己成分而形成耐受。另外，持续低水平表达的抗原可能会被血中的中和抗体清除，不能引起足够的免疫应答，从而使疫苗的预防作用得不到充分的体现。 　　 
3 肌肉注射质粒后，仅有很少部分被肌细胞所摄取，反复用PCR技术检查血中质粒，结果为阴性，揭示肌注后逸入血流的疫苗质粒数量是微不足道的，质粒去向如何尚待进一步阐明。
4 影响核酸疫苗诱发机体免疫应答的因素很多，目前已知的主要有载体设计、核酸疫苗的导入方法、佐剂及辅助因子会对其免疫效果有影响。另外年龄和性别因素、肌注剂量和体积、预先注射蔗糖溶液等都会对肌注质粒DNA表达有影响。 　　
5外源DNA注入体内后，可能整合到宿主基因组上，使宿主细胞抑癌基因失活或癌基因活化，使宿主细胞转化成癌细胞，这也许是核酸疫苗的诸多安全性问题中最值得深入研究的地方。Whalen等认为：通常用于实验核酸免疫的剂量（100ug质粒）相当于1013拷贝，当注入肌肉后，绝大部分被降解和清除，但此问题仍待进一步研究证明。
免疫机理
核酸疫苗的免疫机理主要可以归纳为以下几点：
1 核酸疫苗是近年发展的一种核酸介导的免疫接种疫苗，其本质是含有病原体抗原基因的真核表达载体当它被导入机体后，可被机体细胞所摄取并表达病原体的抗原蛋白，从而诱发机体对该蛋白的免疫反应。随着导入途径和部位的不同可引发全身或局部的免疫反应。在全身性的免疫应答反应中，既可激活体液免疫，也可诱发细胞免疫。
2 核酸疫苗可以引发全面的免疫应答
当带有高效表达调控序列的保护性抗原基因导入动物体细胞（任何  机理试验有核细胞）后，只有少量被细胞摄取而进入细胞核，在载体上的启动子调控下，转录出抗原基因mRNA，后者进入胞浆而转译出相应的抗原蛋白。
抗原呈几种方式而呈递到免疫系统：①抗原在细胞内经加工后与MHCI分子结合呈递到细胞表面，刺激细胞毒性T淋巴细胞（CTL）；②蛋白质从细胞中释放出来与B细胞受体结合，刺激B细胞；③部分释放出的蛋白质被抗原呈递细胞所吸收、降解，然后与MHCII分子结合后刺激辅助性T细胞，最终引发了免疫系统的响应。免疫系统的响应程度，它与不同的免疫部位、细胞的表达程度和是否增加免疫调节基因有关。
3 核酸疫苗还可诱发局部的免疫应答和免疫记忆
如果用基因枪将包裹有核酸疫苗的金颗粒导入粘膜下，即可能被粘膜下丰富的粘膜相关淋巴组织中的淋巴细胞或粘膜上皮细胞摄取并表达，产生的抗原蛋白也很容易被局部丰富的抗原提呈细胞（APC）识别、摄取、加工并提呈给TH细胞，进一步激活局部淋巴滤泡中的B细胞分化为浆细胞和Bm细胞，后者产生免疫记忆，前者可合成IgA，且两个IgA单体有J链连接在一起，通过粘膜时，由粘膜上皮细胞产生的分泌片与双体IgA连接，组成稳定的分泌型IgA随粘膜分泌液一起排出细胞，分布于粘膜表面，在粘膜局部防御感染中起十分重要的作用。 　 
4 近年来发现细菌DNA本身也是一种免疫佐剂，可有效地激活免疫效应细胞
介导这一作用是一类具有特征性的短核苷酸序列，被称为免疫刺激DNA序列。ISS的发现以及对其生物学功能研究的不断深入，扩展了人们对DNA生物学的新认识。有学者认为，对ISS的研究有望提供一种高效、低毒、适用于人类及动物的新型佐剂。  
5 还有人认为DNA免疫时，肌细胞和抗原提呈细胞（APC）均被转染，引起CD4+、CD8+T细胞亚群的同时活化，产生了特异性免疫应答。肌肉细胞如何吸收质粒DNA，机制尚不明确。有人提示可能与骨骼肌纤维有丰富的含多处内折的T小管系统有关，其独特的解剖结构有助于质粒DNA的吸收。
影响因素
质粒载体和启动子的选择
真核表达质粒是核酸疫苗的主体，表达载体表达抗原蛋白的能力越强，诱发宿主产生的免疫应答能力越强。不同类型的启动子/增强子、内含子序列、翻译起始序列、转录终止序列、mRNA的稳定性等调控元件可直接影响基因表达效率，其中启动子是影响核酸疫苗表达的最重要因素。RSV启动子/增强子的表达水平比SV高1000倍，CMV启动子/增强子的表达水平又比RSV高2倍。一般认为CMV是最理想的启动子。强启动子可以产生较好的免疫应答，但弱启动子可能诱导长期的持续性免疫应答。总之，要求用作核酸疫苗的载体必须具备以下特点：在哺乳动物细胞内能高水平的表达目的基因；本身不复制；不会整合到宿主染色体中。注射途径与方法核酸疫苗免疫接种的方法主要分为三种：①可产生高转染效率的途径，如肌肉接种；②转染效率虽不高，但是经常被用于实验动物接种的途径，如皮下、腹腔内接种；③转染效率不高，但有高水平的局部免疫监视，如皮肤、呼吸道接种。一般地，用注射器直接注射要求DNA为10～200ug枪注射要求的DNA量可少至亚纳克级。Frnan用50～100ug甲型流感病毒血凝素（HA因的纯DNA于0及4周各接种一次小鼠，比较了不同的注射途径和方法对核酸疫苗的免疫效果的影响。结果发现静脉内、腹腔内和肌肉内合并免疫及单独肌肉内、静脉内、鼻腔内、皮内、腹腔内和皮下免疫的各组存活率分别为95%、95%、83%、76%、75%、67%和0。说明多种途径合并注射免疫效果最好，其它依次为肌肉内、静脉内、鼻腔内、皮内和皮下接种。随着技术的发展，目前最为有效的核酸疫苗免疫途径是使用基因枪将DNA包被的金颗粒注入表皮。这种方法只需比普通注射法低2～3个数量级的DNA，即0.4ugDNA免疫2次即可产生95%的保护作用。Hui等首先报道了基因枪转染法诱导细胞介导的免疫应答。他们以1～2KbMHC抗原基因通过外科手术暴露小鼠靶细胞后进行肌肉或脾内接种，结果产生了同样特异的CTL应答。基因枪技术使有效的转染与有效的抗原提呈和识别相结合。DNA包被的金颗粒射入表皮后，DNA随之提呈细胞（APC）。此外，一些学者报道，用无针喷气注射器的免疫效果明显，优于常规注射器免疫。这种装置以压缩空气驱动活塞，高压下使接种物形成细流而穿过组织。临床上已被用于肌注传统疫苗及皮下接种药物（胰岛素）。以此法注射含报告基因的质粒后可测出报告基因的表达，虽然仅及肌注表达水平的1/10，但能同时产生针对抗原的抗体和CTL。接种部位的预处理Davis等报告，试验组小鼠免疫前肌肉注射100ul10mmol/L心肌毒素，对照组注射高渗蔗糖（25%W/V，用PBS溶解），然后两组分别接种等量HBsAgDNA疫苗。结果试验组抗～HBs水平较对照组高10倍以上。Danko等报告，在DNA接种前7天注射0.5%～0.75%丁哌卡可使外源基因的表达提高40倍以上，它能选择性地破坏肌细胞，引起肌细胞再生，而再生肌细胞表达外源DNA的能力高于成熟肌细胞。接种剂量与次数核酸疫苗的特点是在体内的表达量低，但是持续时间长。核酸疫苗在动物或临床试验中的免疫程序一般都是3次，大动物或人体的接种量一般为500～1000ug。多数加强免疫在小动物中可以达到增强免疫应答和获得理想免疫保护效果的目的。Ulmer等报告，给小鼠分别注射1～100ug甲型流感病毒HA或NP DNA疫苗，结果抗～HA和抗～NP水平与接种剂量呈正相关。免疫佐剂免疫佐剂指与抗原同时或预先应用，能增强机体针对抗原的免疫应答能力，或改变免疫应答类型的物质，包括无机佐剂（如氢氧化铝）、有机佐剂（如脂多糖、分支杆菌）及合成佐剂穴如双链多聚肌苷酸,胞苷酸眼。近年来随着细胞因子研究的进展，发现许多细胞因子也具有明显的免疫佐剂效应，能增强特异抗原的免疫原性或增强机体对抗原的反应性，这些细胞因子包括IL－1、IL－2、IFN－r、GM－CSF、IL－6、 IL－12等。Weiner等用包含CpG序列（质粒骨架中含CpG序列）的DNA作为免疫佐剂和一种淋巴瘤抗原共同免疫小鼠，发现免疫后小鼠能抵抗攻毒试验，而且CpG佐剂的毒性远低于完全福氏佐剂，另外，CpG佐剂也能显著提高抗肿瘤单克隆抗体在小鼠中的抗肿瘤效果。
核酸疫苗-应用现状
有关质粒DNA疫苗在人类及动物产生预防和治疗作用的研究报道不断增加，应用范围也逐渐扩大。人们期望用核酸疫苗来征服诸如微生物感染性疾病、寄生虫病等顽症，并用于肿瘤、遗传病和其他多种疾病的基因水平治疗，所以作了多方面的尝试。
非病毒微生物感染性疾病的核酸疫苗
非病毒微生物感染时，非病毒微生物蛋白都由微生物本身表达，而不是被宿主细胞表达，因此核酸疫苗免疫后，在真核细胞内表达的非病毒微生物蛋白有可能产生不同类型的非自然感染状态下的蛋白。但是迄今为止，许多实验表明，向动物体内注射编码非病毒微生物蛋白的核酸疫苗后，非病毒微生物蛋白可在注射部位原位表达，引发保护动物免受非病毒微生物攻击的免疫反应。目前，用于防治非病毒微生物引起的疾病主要有结核病、肺炎支原体感染、肺炎球菌感染、幽门螺旋杆菌感染、破伤风杆菌感染、布鲁杆菌感染、沙眼衣原体感染、考德里立克次体感染、莱姆病等。但是从目前的试验结果来看，核酸疫苗的预防疗效还存在着种种不足，尚进一步研究阐明。寄生虫核酸疫苗寄生虫所致疾病种类多、分布广、危害大。抗寄生虫感染是一个世界性的问题，但是由于虫体的抗药性，以及现有各种寄生虫疫苗存在的种种尚难解决的问题，寄生虫病还不能有效地进行防治。但是，核酸疫苗的出现给人类抗寄生虫感染带来了新的希望。迄今为止，主要开展了针对疟原虫、利氏曼原虫、血吸虫及囊虫病核酸疫苗的研究，取得了一定效果。肿瘤核酸疫苗肿瘤是机体中正常细胞在各种致瘤因素的长期影响和作用下，发生过度增生和异常分化所形成的新生物,通常表现为肿块。随着人类对肿瘤认识的加深，DNA疫苗开始应用于肿瘤的预防和治疗，而且偏重于治疗，在这个意义上肿瘤的核酸疫苗同时又是核酸药物。目前，随着研究的发展，DNA疫苗为治疗恶性肿瘤提供了新的思路，主要有：①激发免疫系统杀死致癌病毒；②激发免疫系统识别并消除表达共同癌细胞信号的癌细胞；③转染和表达基因工程蛋白，从而使癌细胞成为更好的免疫靶子。将编码肿瘤相关抗原的基因转导到肿瘤细胞内表达，可提高肿瘤的免疫原性，从而增强宿主抗肿瘤的免疫应答。
发展前景
核酸疫苗的研究只是近十几年发展起来的一项新的生物技术，它已成为疫苗研究领域中的热点之一，特别是其研究方向与世界卫生组织儿童疫苗计划的长远目标（用一种疫苗预防多种疾病）相吻合。现在已获得了迅速的发展。它的研究具有深远意义，可用于细菌、病毒、寄生虫等多种疾病的防治，其多价、高效、廉价等优点使其潜在的应用价值不可估量。核酸疫苗可能对人类疾病的防治以及畜牧业的健康发展起到划时代的作用。 　 
目前，人们对核酸疫苗的研究日益深入，其中艾滋病和T细胞淋巴瘤的核酸疫苗已进入了临床前阶段，前列腺癌、肺癌、乳腺癌等核酸疫苗也正处于研究阶段。美国FAD已批准乙肝疫苗等10余种DNA疫苗进入临床试验，这预示核酸疫苗在21将成为人类和动物与各种疾病抗争的有利武器，也显示出核酸疫苗的巨大潜力和应用前景。 　　
但是，人们对DNA免疫的作用机理和如何提高免疫水平仍然需要进一步研究。如外源DNA进入体内后，就无法认定控制其免疫途径，外源DNA在体内各器官是否表达，摄入DNA后如何进行抗原呈递？如何增强其免疫应答水平？同时DNA疫苗的构建以及生产方面还存在需要改进的地方。尽管核酸疫苗接种后引进的宿主细胞发生恶性转化的可能性很少，但在短期内很难代替目前大量使用的传统疫苗。 　　 
总之，核酸疫苗的未来研究方向是要朝着理想疫苗的方向发展，即从疫苗本身的角度出发，要朝向“原始疫苗的方向”发展，即注重个性，得到全息多表位的疫苗，还要注重载体及佐剂的研究。为此，要寻求病毒粒子中与致病力密切相关的安全性问题能够得到解决，再加上目前最有效的基因免疫接种方法——基因枪疫苗接种能够解决注射疫苗的费时、费力和需要反复注射（特别是对于动物）等问题，那么核酸疫苗就会成为疫苗的新希望，可能导致疫苗领域的一场革命。