标题：辅助孵化
基本信息
适用于35岁以上行体外授精-胚胎移植及单精子卵母细胞浆内注射的女性不孕患者。因其卵母细胞透明带过厚、过硬，利用此项技术可有利于囊胚孵化，提高妊娠率。
  辅助孵化透明带是环绕在卵细胞外的一种非细胞结构，其主要组成为糖蛋白。在结构上透明带为2层，一层是比较厚而易于穿透的外层，另外一层是比较薄但不易穿透的内层。透明带在卵子受精至胚胎早期发育这一复杂的过程中起着重要作用。如作为一种物理屏障，保护卵子和胚胎免遭外来有害物的侵袭；在受精过程中通过受体协助精子穿入，同时在精子进入之后通过自身结构的改变，阻碍其他精子进入，从而防止多精子受精引起的异常受精卵；受精后，由于透明带的存在，使得不断进行分裂的胚胎保持结构上的完整性。如果人为地去除发育早期胚胎的透明带，胚胎的发育似乎受影响不大，但存活率明显降低。正常生理情况下，透明带在胚胎进行第一次或第二次有丝分裂时开始逐渐变薄，到晚期囊胚期，透明带已薄到极易被突破的程度。在多种物理的以及生化的因素作用下，晚期囊胚最终突破透明带，从中完全逸出(这一过程被称之为孵化)，准备植入子宫内。如果由于某种原因，胚胎不能完成孵化过程，则无法植入子宫内，导致妊娠失败。在体外受精的临床实践中，人们观察到：经过体外培养后的母体的卵子，在体外受精形成胚胎之后，弹性降低。同时来自于年龄较大的母体的卵子，在体外授精形成胚胎之后，其透明带硬度较高。这种透明带硬度改变的现象，可能是造成一部分胚胎在转移回子宫后，不能成功地植入内膜，导致着床失败的原因之一。
原理机理
一、辅助孵化的由来及依据
最早提出辅助孵化概念的是．jacquescohen。他认为：在ivf—et过程中，胚胎不能从透明带中孵化出来，是造成胚胎植入失败高的原因之一。如果对体外受精的胚胎进行辅助孵化(即人为地在透明带上开口，或使其变薄)，将有助于提高胚胎的植入率。
他们的依据是：
①无论是人或者老鼠的胚胎经过辅助孵化的显微手术后，胚胎开始孵化的时间和孵化的形态学特征都会发生改变，说明辅助孵化的显微手术对胚胎的孵化过程确实可造成影响；
②人为地在透明带上开口之后，胚胎的植入率提高。可能是因为辅助孵化增加了胚胎吻合子宫内膜植入窗口开放的机会；
③透明带较薄的胚胎易于植入；
④任何影响孵化的因素都会导致胚胎孵化过程的延误和缺失，致使植入失败。
1991年cohen的实验室使用酸化的方法对人类体外培养胚胎成功地进行了辅助孵化。经过辅助孵化之后的胚胎，其植入率虽然有所改善，但与对照组相比，并无统计学上的差异。进一步的观察和分析表明：辅助孵化并不是对所有的病人和所有的胚胎都有提高植入率的作用，而仅是对于那些因某种原因导致自身孵化困难的胚胎有帮助，如透明带过厚的胚胎，透明带异常的胚胎，母体年龄偏大的病人，和fsh水平过高的病人等。由此，产生了选择性辅助孵化的概念。即根据母体以及每个胚胎自身的具体情况，选择自身孵化困难的胚胎，给予辅助性孵化。辅助性孵化有助于提高胚胎的植入率，可能是与帮助透明带厚度和硬度异常的胚胎突破机械性屏障，以及帮助质量差而无足够能量完成自身孵化的胚胎突破透明带有关。
二、辅助孵化的特征由于辅助孵化并不是对每一个胚胎都有提高植入的作用，为了避免使胚胎暴露于不必要的操作程序和刺激，(iohen根据他的实验室的观察结果，提出了进行辅助孵化的指征。在以后的ivf实践中，其他的ivf中心又对这些指征进行了不断的扩增和补充。虽然不同的ivf中心对指征的掌握有所不同，但总的说来，在决定某个胚胎是否需要进行辅助孵化时，通常考虑的因素包括：母体的年龄、fsh水平、ivf治疗史、胚胎自身质量、胚胎自身发育速度、透明带的厚度、均匀度以及形状。
1．透明带
(1)透明带的厚度：透明带的厚度大于13um的胚胎应予辅助性孵化；
(2)透明带的形状：当胚胎的形状不规则时，如椭圆形，常常提示透明带有某种功能上的缺陷。因此，胚胎形状不规则，通常是需要辅助孵化的指征；
(3)透明带的颜色：透明带的颜色偏深，如呈现偏棕色或偏深色，应予以辅助性孵化。
2．母体年龄
母体的年龄是考虑是否需要给予辅助性孵化的一个重要因素。随着母体年龄的增大，其胚胎的透明带通常会变厚变硬，失去弹性，造成胚胎自然孵化困难。同时，来自母体年龄较大的胚胎，其质量通常较差，也会给胚胎的自然孵化带来困难。有的ivf中心以母体年龄38岁为界，凡母体年龄38岁或大于38岁，其所有用于et的胚胎都应给予辅助l生孵化。而有的ivf中心是以母体年龄40岁为界。
3．胚胎的质量
对于质量较差，含有较多碎片的胚胎，其植入的能力通常较差。进行辅助性孵化之后，其植入能力也许有所提高。
4．胚胎的发育速度
发育速度迟缓的胚胎，其自然孵化能力常常减弱，孵化过程常常延迟。辅助性孵化之后，有助于胚胎保持与子宫内膜植入窗口开放时间的一致性。受精后第3d细胞数目仍少于6个的胚胎，经过辅助性孵化后，其植入率高于未经辅助性孵化的对照组。
5．ivf治疗史
对于曾有过失败的ivf治疗史的病人，应给予辅助性孵化治疗。因为，自然孵化失败很可能是导致他们ivf治疗失败的原因之一。
6．fsh水平
如果在周期的第3d，fsh水平过高(大于15miu/ml)，通常提示卵巢的功能状况较差。这类病人的透明带很可能会因为卵泡发育环境不良而结构异常或功能较差。辅助性孵化常常会提高这类胚胎的植入率。
7．冷冻胚胎
经过冷冻和解冻之后，胚胎的透明带会变硬。因此，冷冻胚胎是辅助性孵化的指征之一。
三、辅助孵化的方法及其操作目前有4种辅助孵化的方法：机械法、酸化法、激光法和酶消化法。其中酸化法和机械法在临床七．应用广泛，尤其是酸化法；激光法因为需要特殊的设备，在临床上较少使用；酶消化法是近年来出现的一种新方法。据报道，酶消化法对囊胚的植入有明显的帮助，此方法的效果尚待更多的临床实践予以证实。
(一)机械法
机械法在英文中称为pairtialzonadissection，简称pzd。
1．辅助孵化工作盘的制作
(1)用含有6%plasmanate(商品化的人类血浆蛋白制剂)的htf或pbs在falcon1006盘中做小滴。根据待辅助孵化的胚胎数目决定小滴的数目。每个小滴的体积中l0入；
(2)在小滴上面覆盖约4ml左右的经过处理的矿物油(minel·aloil)；
(3)盖好盘盖后，将工作盘放人37℃培养箱预热待用，一般需在使用前30min进行预热；
2．显微操作台的准备
将固定针安装在左手边的显微注射针支架上，将pzi)针安装在右手边的显微注射针支架上。
3．机械法辅助孵化的操作
(1)将待辅助孵化的胚胎放人工作盘的小滴中，每滴中放1个，一次以放2个胚胎为宜，以免操作时间长，使胚胎过久地暴露于非培养环境中。
(2)将固定针降入小滴，让卵黄间隙较大的区域处于11点至l点处，在9点钟处用固定针将胚胎固定。
(3)将pz[)针降入小滴，从胚胎的1点钟左右的部位进针，从1l点左右的部位穿出。操作时严格避免伤及胚胎的细胞。
(4)将固定胚胎的固定针放松，从9点钟处移至：pzi)针之上，用其反复磨擦pz[]针．盲至透明带被穿透，pzd针脱出透明带，裂隙形成为止。
(5)将胚胎旋转90度’，重复上述操作2次。最终在透明带上形成两条十字交叉的裂隙。
4．将经过辅助孵化的胚胎在干净的培养液中清洗3次，然后放回原培养盘的小滴中或者et盘中，等待et
(二)酸化法
酸化法是指使用Acid Tyde's Solution(简称AT Solution)溶解透明带，在透明带上形成一个直径约大于20gim的小洞。
1．辅助孵化工作盘的制作
(1)用at溶液在falcon1006盘的上方做一个10九的小滴，用红色记号笔在盘子底部将其圈起来，以示区别。
(2)用含有6%plasmanate．的htf或pbs在该盘的下部中做体积为10的小滴。小滴的数目等于待辅助孵化的胚胎的数目。
(3)在小滴上覆盖4ml左右的经过处理的矿物油。
(4)盖好盘盖后，将工作盘放入37℃培养箱预热待用，一般需在使用前30min进行预热；
2．显微操作台的准备
(1)将固定针安装在左手边的显微注射针支架上。
(2)将固定针安装在右手边的显微注射针支架上，并与嘴吸控制装置(moul：h—eontrolledsuc!ion)相连接。
3．酸化辅助孵化的操作
(1)在透明带上打洞
1)将固定针降人at小滴中，用嘴吸控制装置将at溶液吸入holdingpipette-，然后将固定针提出液面。
2)用固定针在胚胎的9点钟处将其固定，并使卵黄间隙较大的区域或者碎片较多的区域处于3点钟处。
3)将固定针置于胚胎的3点钟处，使用嘴吸控制装置小心地将at溶液吹在透明带上，使其溶解，固定针在吹入at溶液的同时，应做轻微的上下移动，使接触at溶液的透明带的范围约200um。
4)一旦透明带被溶解穿透，立即停止吹at溶液并迅速小心地开始回吸，以对该区域的at溶液进行清除。
5)继续用固定针固定胚胎，同时移动显微镜的载物台，使胚胎离开刚才的工作区域，减少酸与胚胎的接触。
(2)取出碎片对于含有碎片的胚胎，可利用刚刚在透明带上溶解出来的小洞，使用固定针将碎片吸出。进行此项操作时，严防伤害胚胎细胞或将胚胎细胞误吸出来。
4．酸化后胚胎的清洗将经过酸化法辅助孵化的胚胎在干净的培养液中清洗3次后，放回原培养盘的小滴中或者et盘中，等待et。
(三)酶消化法
近年来，有的ivf中心为了避免酸溶液对胚胎造成的可能性伤害，用pronast代替at溶液在局部溶解透明带，以达到辅助孵化的目的。随着囊胚植人受到越来越多的重视，有的中心采用在植入前将囊胚放入一定浓度的pr)nas溶液中培养24h，使得透明带完全被酶消化而消失，以促进囊胚的植入。
(四)激光法
[1]激光法是指采用激光光束在透明带上打洞，以起到辅助孵化的作用。[1]