标题：蛋白芯片
基本原理
蛋白芯片是以蛋白质代替DNA作为检测对象，与在mRNA水  蛋白芯片设备平上的检测基因表达的基因芯片不同，它直接在蛋白水平上检测表达模式，在基因表达研究中基因芯片有着更加直接的应用前景。
它的基本原理是将各种蛋白质有序地固定于载玻片等各种介质载体上成为检测的芯片，然后，用标记了有特定荧光物质的抗体与芯片作用，与芯片上的蛋白质相匹配的抗体将与其对应的蛋白质结合，抗体上的荧光将指示对应的蛋白质及其表达数量。在将未与芯片上的蛋白质互补结合的抗体洗去之后利用荧光扫描仪或激光共聚扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白之间相互作用的关系，由此达到测定各种基因表达功能的目的。为了实现这个目的，首先必须通过一定的方法将蛋白质固定于合适的载体上，同时能够维持蛋白质天然构象，也就是必须防止其变性以维持其原有的特定生物的活性。
另外，由于生物细胞中蛋白质的多样性和功能的复杂性，开发和建立具有多功能样品处理能力、能够进行快速分析的高通量蛋白芯片技术将有利于简化和加快蛋白质功能研究的进展。
是以蛋白质代替DNA作为检测对象，与在mRNA水平上的检测基因表达的基因芯片不同，它直接在蛋白水平上检测表达模式，在基因表达研究中基因芯片有着更加直接的应用前景。
阵列形式
蛋白阵列（protein arrays）主要有两种形式：一种是抗体阵列（antibody arrays），利用阵列上的抗体识别样品中的蛋白或其他分子；另一种则是我们今天要谈到的靶蛋白阵列（target protein arrays），通过阵列上的蛋白检测这些我们感兴趣的蛋白和其他分子，如药物、抗体、核酸、脂类或其他蛋白的作用。由于有高通量的优点，蛋白阵列是研究蛋白功能的好工具。
它的基本原理是将各种蛋白质有序地固定于载玻片等各种介质载体上成为检测的芯片，然后，用标记了有特定荧光物质的抗体与芯片作用，与芯片上的蛋白质相匹配的抗体将与其对应的蛋白质结合，抗体上的荧光将指示对应的蛋白质及其表达数量。在将未与芯片上的蛋白质互补结合的抗体洗去之后利用荧光扫描仪或激光共聚扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白之间相互作用的关系，由此达到测定各种基因表达功能的目的。为了实现这个目的，首先必须通过一定的方法将蛋白质固定于合适的载体上，同时能够维持蛋白质天然构象，也就是必须防止其变性以维持其原有的特定生物的活性。
另外，由于生物细胞中蛋白质的多样性和功能的复杂性，开发和建立具有多功能样品处理能力、能够进行快速分析的高通量蛋白芯片技术将有利于简化和加快蛋白质功能研究的进展。液相蛋白芯片在功能基因组时代，为了揭示生命活动的规律，蛋白质研究是必然的发展方向面对动态的多因素的生命活动时，识别和检测蛋白质以及认识其生理功能是非常艰巨的和繁重的工作。体系构成液相芯片体系由许多不同的小球体为主要基质构成，每种小球体上固定有不同的探针分子，将这些小球体悬浮于一个液相体系中，就构成了一个液相蛋白质芯片系统，利用这个系统，我们可以对同一个样品中的多个不同的分子同时进行检测，这种检测技术我们称之为xMAP(flexible Multi-Analyte Profiling) 技术。 
在液相系统中，为了区分不同的探针，每一种用于标记探针的球形基质都带有一个独特的色彩编号。在球形基质的制造过程当中，掺入了两种不同的红色分类荧光，根据这两种红色分类荧光的比例不同，可以把球形基质分为100种。利用这100种球形基质，可以标记上100种不同的探针分子，同时对一个样本中的100种不同的目的分子进行检测。 
为了便于探针分子的固定，在球形基质的表面进行了一系列的修饰，可适合各种蛋白，肽，核酸等生物分子的固定 
球形基质,探针分子,被检测物,报告分子是液相蛋白芯片的4个主要构成部分。反应步骤1） 探针分子的固定， 
2） 将这种标记好探针的球形基质与样品反应。探针可以与相应的目的分子特异性的结合，带有绿色报告荧光的报告分子也与目的分子特异性的结合，对反应进行定量。 
3） 反应结果的检测
蛋白芯片-抗体芯片
蛋白组学研究是即基因组学研究后的生命科学发展的一个大方向之一。蛋白质的结构和功能最终直接影响着生命活动的变化，基因转录水平的研究只能在一定程度上反映基因表达产物的变化，而真正发挥功能的蛋白要经过转录后加工、翻译调控以及翻译后加工等许多步骤和调控才能形成，因而对蛋白质的直接研究才能真实的解释各种生命现象。但是目前研究蛋白质的手段和方法还没有很大的发展，所以寻找有效、快捷的蛋白分析技术成为了至关重要的一个环节。
蛋白芯片技术的出现给蛋白组学研究带来新思路。蛋白组学研究中一个主要的内容就是要研究在不同生理状态或病理状态下蛋白水平的量变，微型化，集成化，高通量化的抗体芯片就是一个非常好的研究工具，它也是蛋白芯片中发展最快的芯片，而且在技术上已经日益成熟。这些抗体芯片有的已经在向临床应用上发展，比如肿瘤标志物抗体芯片等，还有很多已经用在研究的各个领域里。 
第一张商品化的抗体芯片是由美国BD Clontech公司推出的。这是一张用于研究的抗体芯片，芯片上排列了378种已知蛋白的单抗（Ab Microarray 380， 目录号 K1847-1），这些单抗对应的蛋白都是细胞结构和功能上十分重要的蛋白，涉及信号传导、肿瘤、细胞周期调控、细胞结构、细胞凋亡和神经生物学等广泛的领域。通过这张芯片，我们在一次实验中就能够比较几百种蛋白的表达变化。 
Ab Microarray 380上抗体是经过精心挑选的，这些抗体不仅可以识别人源的蛋白，对小鼠和大鼠样品同样有效。另外，每个抗体的结合亲和力都经过了实验测定，从多种抗体来源的克隆中筛选出反应特异性好，交叉反应程度小，信号明显的抗体，并且还要保证信号与抗原浓度有着良好的线性关系。优化的抗体探针才可以保证反应的特异和灵敏（可检测20pg/ml的抗原浓度）。芯片的检测是用荧光报告分子，常用的荧光扫描仪都能够完成。
第一代的蛋白芯片和DNA芯片一样是作为一种定性分析的工具，可用于分析样品之间相关蛋白的相对表达丰度；还可以作为DNA芯片的补充，用于研究蛋白和基因表达之间的关系。
形成过程
Ab Microarray 380抗体芯片并不要求特殊的实验操作，只要一
  蛋白芯片检测分析实验般常规的操作就可以完成以往极为复杂耗时的工作。整个操作流程包括：从50—200mg组织或细胞、体液中进行蛋白质抽提——用Cy5和Cy3两种不同颜色的荧光分子分别标记两个样品——洗去多余的标记分子——与芯片杂交孵育——扫描分析结果。整个过程从样品制备到结果分析只要一天即可完成，你只要准备好样品、荧光染料、脱盐纯化柱（处理体液样品时用）和荧光扫描仪，其他的试剂全部由试剂盒提供。
随芯片试剂盒提供的蛋白抽提/标记缓冲液，是专门为抗体芯片而设计的，非常温和的去垢剂在能高效抽提膜结合蛋白（相比SDS煮沸法能抽提95%以上的蛋白）的同时能保持蛋白的天然活性（非变性条件），这样能够保证抽提的蛋白的溶解性和代表性，保证以后的实验结果的真实性，和原始材料的一致性。
差异对比
内源标准化处理可以得到一个内源标准化信噪比（INR），内源标准化处理是指对两个样品（A、B）中分别用两种荧光标记分子（Cy3和Cy5）标记，并交叉与芯片杂交（见图，A-Cy5和B-Cy3一组,A-Cy3和B-Cy5一组分别和芯片杂交），可以作为消除抗原—抗体结合效率差异的对照，也可以消除潜在的不同荧光分子的标记效率差异。假如Cy5标记效率高于Cy3，单纯一个实验的结果就会有偏差（Cy5标记的样品信号偏高），用这种双向交叉反应就可以消除这种偏差。两芯片杂交结果分别得到两组Ratio值，通过免费下载的工具就可以自动算出每个抗体抗原的INR值，这就代表在两个样品间某个蛋白的相对丰度。这种内源标准化处理可以大大减小样品分析的偏差。 
抗体芯片检测的结果不是蛋白的绝对含量而是378个目的蛋白在两个样品之间的相对丰度。值得注意的是由于抗体抗原结合的差异、标记差异等原因，根据芯片结果信号的强弱判断同一样品中两种不同蛋白的多少是不恰当的。 
蛋白芯片技术的研究现状
在多年的蛋白芯片技术的研究过程中，研究者为了寻找合适的物质作为蛋白的载体进行了不懈的探索。例如日本学者Velev利用含有阳离子表面活性剂（HTAB）脂质体作为载体，通过戊二醛作用使其与一种铁蛋白包裹外壳的成分结合组装制备成为一种纳米水平的装配体，这种装配体可以在适当的pH条件下，使铁蛋白分子进入并固定于包裹外壳内面，形成蛋白质的载体。Adachi等利用某些固体表面或薄膜覆盖上含有电解质的薄膜作为载体，可以将胶体蛋白质颗粒成分转移至薄膜上形成蛋白芯片。Uetz等在分析啤酒酵母基因组序列全长度阅读框架编码各种蛋白质的相互作用的过程，使用不同孔数的平板作为载体，建立了约含有6000个酵母转化株组成的平板蛋白芯片系统，平板上的每一个小孔中含有一个酵母转化株，可以根据其活性功能区开放阅读框架的编码表达生成一种蛋白质，利用这个系统可以用于蛋白质功能的检测和分析。Arenkov等利用聚丙烯酰胺凝胶板作为支持物，将蛋白样品置于凝胶上，然后经过电泳分离，使其成为蛋白的阵列用于进一步的研究。最近，哈佛大学蛋白芯片研究中心Gavin等利用制备DNA芯片的高精密度机械手的针状点样枪头在只有显微镜载玻片一半大小的玻片上，制备了第一张含有样品点数为10800的蛋白芯片。这张芯片用已纯化的蛋白，G按每点为1纳升的点样量点样10799次，另一次用FRB(FK-BR12-rapamycin binding domain of FKBP-rapamycin-associated protein)点样。为了确保不同分子量的点样蛋白质都能够被固定在玻片上，他们首先在玻片表面涂上BSA,然后使用N,N’-二琥珀酰胺碳酸（N,N,-disuccinimidyl carbonate）激活BSA表面的赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸残基成为BSA-NHS玻片，其作用是促进BSA与点样蛋白质的结合而使蛋白质被固定于玻片上。在制备芯片过程中，为了保证被固定在载体上的蛋白质依然保持天然的构象和生物学活性，他们在蛋白质点样的磷酸盐缓冲液中加入40%的甘油，以防止因体的蒸发而造成的蛋白质变性。点样后再经3h的温浴并将零片浸泡于含有小牛血清蛋白（BSA）的缓冲液中，使芯片表面含有一层小牛血清蛋白，用于封闭与其他蛋白质产生非特异性结合的部位及在表面未参加反应的醛基。为了检测芯片的应用，他们用不同荧光抗体分别标记能与蛋白G和FRB特异结合的IgG和FKBP12（12Kd FK506-binding protein）并作用于蛋白芯片，观察这些蛋白质与蛋白芯片的相互作用，其结果清晰地显示芯片上的蛋白G和单一的FRB点样分别被标上蓝色和红色荧光。该实验研究建立了蛋白质样品微量点样技术并使蛋白质固定于载体上时能够保留原有的构象和生物学活性，这将为今后对蛋白质多样品的并行研究或快速分析——为制备高通量功能检测的蛋白芯片奠定了技术基础。 
蛋白芯片的应用研究
目前，学者们正在开展有关蛋白芯片技术应用的研究，Holt等利用蛋白芯片技术筛选能够相互结合的特异抗体抗原成分，他们利用12种表达较强但尚未接触任何抗原的抗体片段筛选含有27648种人胎脑蛋白的蛋白芯片，从中找出了4组高度特异性的抗原（蛋白）-抗体复合物，其中有3种抗体结合的蛋白质功能未明，但是由于表达水平都较低，说明这种抗原-抗体的结合技术是一种具有较高特异性和敏感性的筛选方法，可以用于高通量筛选分离各种不同的抗体成分，或检测基因的表达和蛋白分子间的相互作用，这将有助于对某些疾病（包括肿瘤）的发病分子机理的研究，以及协助寻找疾病诊断和治疗的靶分子。根据蛋白芯片技术的基本原理，可以将不同的抗体固定于载体上成为抗体蛋白芯片，用于检测不同组织产生的蛋白质。 Ge在蛋白质的相互作用的研究中，采用了一种通用的蛋白质芯片系统，该系统敏感有效，用途广泛，可定量测定及重复使用，而且操作简易。Gavin等应用蛋白芯片技术观察代谢过程有关作用物和酶的相互作用关系。他们选择三对没的激酶-作用物系统，即依赖3’，5’-磷酸蛋白激酶-Kemptide; 酷蛋白激酶Ⅱ-蛋白质磷酸酶抑制因子2和p42促有丝分裂剂激活蛋白（MAP）激酶（ErK2）-E1K1,首先将各系统的作用物按顺序固定于三张BSA-NHS玻片上，分别在有同位素γ-&sup3;&sup3;P ATP的环境中，与不同蛋白激酶温浴，然后，玻片经用乳剂处理后可在光镜下观察到各种蛋白激酶催化特异的作用物产生磷酸化反应。其结果提示蛋白芯片技术可以应用于作用物与酶相互作用的研究及代谢机制的分析。 Gavin等还在蛋白芯片技术研究过程通过DIG、生物素和合成的六氢吡喧酮胺（即AP1497）等三种具有对应的蛋白受体的小分子特质，研究蛋白的受体蛋白按顺序固定的相互作用。他们首先将三种小分子物质的受体蛋白按顺序固定于同一载体上并制备成为相同的四张蛋白芯片，将BSA分别用没的荧光物质（Alexa488、Cy3，或Cy5）标记，并分与DIC、生物素和AP1497三种小分子物质结合成为探针，用每一种具有不同荧光标记的探针作用地芯片，结果只能有能与小分子对应的受体蛋白被标上荧光。上述结果说明使用的荧光剂之间没有交叉的荧光激发和发光作用，因此，将三种标记探针混合后作用于蛋白芯片，则可使三种不同的受体蛋白同时标记上不同的荧光。研究结果提示蛋白芯片技术对于新药的发掘是十分有用的，因为它对寻找新药作用的靶点非常方便。
面市和愿景
铭源医疗发展公司拥有专利的多肿瘤标志物检测（简称“C-12蛋白芯片检测”）已作为可报销的临床检测被正式列入《上海市医疗服务项目和价格表》（简
  蛋白芯片仪 qstar 质谱仪称“上海医保目录”）。根据相关规定，上海市基本医疗保险计划受保人可免费或只需支付核准价人民币280元中的28元或56元，便可在医院进行C-12蛋白芯片检测。作为国内最大的城市，上海市的常住人口已超过1880 万，目前约有820 万户籍居民参加基本医疗保险计划，这些居民均有资格部分报销此项临床检测费用。 
根据上海市医学会组织专家评审会的一致推荐，上海市卫生局根据卫生部发布的《医疗技术临床应用管理办法》将C-12 蛋白芯片检测归类为“第一类医疗技术”。第一类医疗技术是指“安全性、有效性确切，医疗机构通过常规管理在临床应用中能确保其安全性、有效性的技术”。此次归类将C-12 蛋白芯片检测由传统的健康筛查拓展至针对肿瘤病人的主流临床应用。 
自2002年，C-12蛋白芯片面市以来，铭源医疗发展公司已成为蛋白芯片的主要供货商。截止2009年6月底，公司已向中国、马来西亚及泰国的医院累计销售C-12蛋白芯片逾1040万片。此次C-12蛋白芯片检测成功列入上海医保目录将进一步促进其在上海的销售。同时，鉴于上海在长三角的特殊显要位置，此举将为公司继续申请将C-12蛋白芯片检测列入周边其它省市医保目录提供有效的案例研究。公司的C-12蛋白芯片检测为中国医院筛查及监控癌症肿瘤提供了一种具有成本效益并经过临床证实的解决方案。随着预防药物相对传统对症治疗药物的持续增长趋势，相信不远的将来肿瘤标志物市场将继续高速增长。