标题：金黄色葡萄球菌A蛋白
简介
  金黄色葡萄球菌A蛋白金黄色葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal Protein A、简称SPA)是细胞壁抗原的主要成分，几乎90%以上的菌株均含有这种成分，但不同的菌株含量差别十分悬殊。SPA占整个细胞壁蛋白成分的6.7%，通过胞壁肽聚糖以共价键与之结合。其它葡萄球菌如表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌不含SPA。观察分析金黄色葡萄球菌A蛋白胶体金（SPA-CG）分子的特征性构象特点，探讨其作为原子力显微镜观测原位标记物的可行性。观察方法应用原子力显微镜扫描生理状态下分布在云母表面的金黄色葡萄球菌A蛋白胶体金分子，并进行结构分析及理论计算。结果极少数平卧的SPA-CG呈中部球形隆起，两端长短不一的弯曲棒状肽链环抱球形隆起的独特结构，形成反“C”字形结构，球形隆起直径为单个胶体金直径的3～4倍；极少数SPA-CG呈逗号样；绝大多数SPA-CG呈一侧面稍凹的椭球形结构，结构稳定、均一，长径为（40．88±1．58）nm，宽径为（20．82±0．68）n，高度（Z轴）为（10．51±0．28）nm。
单个胶体金标记的金黄色葡萄球菌A蛋白分子具有独特、稳定、均一的特征性构象，可作为原子力显微术观测的原位标记物。
SPA的理化性质
SPA是一种蛋白质,由亮、缬、脯、丙、苏、甘、丝、谷丙、天门冬及赖氨酸等十种氨基酸组成。由于不含有胱氨酸及半胱氨酸，所以无二硫键。紫外光谱和吸收系数为A275nm %=1.65，等电点为pH5.1。SPA十分稳定，用4mol/L尿素、硫氰盐酸、6mol/L的盐酸胍和pH2.5的酸性条件，以及加热煮沸均不影响其活性。其分子量因测定方法不同而有所差异。
SPA部分理化参数
分子量  金黄色葡萄球菌A蛋白42 000
沉降系数S 20w(ˊS )
2.10
扩散系数D20W(cm2/s)
4.3×10－7
Stocks半径(nm)
5.00
摩擦比f/f,min
2.10
粘度(n) (ml/g)
2.90
Hμggins常数
0.66
比容V(ml/g)
0.72
SPA的免疫学性质
SPA能与人及多种哺乳动物血清IgG分子中的Fc片段结合，结合的亲和性次序依次是猪、狗、兔、人、  金黄色葡萄球菌A蛋白猴、鼠、小鼠及牛；对大白鼠、绵羊的亲和力差；对马、犊牛、山羊等无亲和力；对所有的鱼类、两栖类、爬行类、鸟类（除少数例外）均不能与之结合。鸡的IgG必须与相应的抗原形成复合物才能与SPA结合，原因可能是Ag－Ab复合物改变了IgG的Fc片段的构象。
SPA与IgG结合的亚类主要是IgG1、IgG2和IgG4。
SPA除与IgG结合外，还能与血清中少量的IgM和IgA结合，SPA菌对各类免疫球蛋白的吸附率：IgG为90%～98%，IgM为2%～30%，IgA为1.5%～20%。
出现共沉反应的SPA与IgG必须有两个结合部位，它们分别在Fc和Fab段上,缺一虽能与SPA结合，但不出现共沉反应，这种Fab的参与并非SPA－抗体反应。现已研究表明，IgG与SPA的结合部位是CH2和CH3的交界处。
SPA的生物学特性
1．免疫原性与过敏原性 SPA做为免疫原能刺激免疫活性细胞合成Ig，又能与其相应抗体的Fab段结合  金黄色葡萄球菌A蛋白呈现抗原抗体的特异性反应。SPA－IgG注射家兔皮下可引起Arthus样反应，还可引起豚鼠的迟发性超敏反应。SPA体外试验，能刺激豚鼠离体回肠收缩。
2．抗吞噬作用 由于IgG的Fc段结合点既是lgG调理活性结合点，又是SPA反应点。因此，SPA可与吞噬细胞竞争，结果抑制了多形核白细胞的吞噬作用，也可能是SPA阻断调理素与吞噬细胞作用的结果。
3．固定补体 SPA－IgG和免疫复合物一样可以固定人和某些动物(如豚鼠、猪、狗等)血清中的补体，主要是通过补体传统激活途径。
4．促有丝分裂因子 SPA是一种B细胞激活剂，固相SPA作用明显，并不需要T细胞辅助,可容性SPA作用微弱，必须有T细胞参与。
5．去封闭作用 固相SPA能部分去除肿瘤病人和带瘤动物血清中的封闭活性，从而降低了血清对淋巴细胞介导的细胞毒的封闭作用。
SPA的应用
SPA应用很广，但所有应用的原理都离不开SPA具有与IgG的Fc段的结合能力，主要应用方面如下：  金黄色葡萄球菌A蛋白1．SPA菌的协同凝集作用
用已知的标准血清，吸附到SPA菌的表面,使之成为吸附抗体的载体,再以此去诊断相应的未知抗原而产生肉眼可见的凝集颗粒,诊断的抗原可以是颗粒性的,也可以是可溶性的。此种凝集相当于反向间接血凝,但省去间接血凝中的抗体纯化,红血球鞣化等复杂手续,而只需要 SPA菌体及粗制免疫血清即可。所以此法简单、快速,特异性敏感性均较满意。目前已用于许多细胞和病毒的检测及分型。
协同凝集只适用于检测抗原，未见应用于检测抗体的报道。
2．作为广谱第二抗体 用SPA代替抗体IgG的第二抗体，有如下优点：①SPA制备容易，性质稳定，易纯化，　　　　对人和多种哺乳动物的IgG都能应用,不受种属限制。而第二抗体的制备比较麻烦，且需多次免疫动物，在应用上要受同种属的限制；②SPA的结合力强，相当于游离抗体与抗原的结合力，对人和兔的亲和常数均为103 L/克分子，结合后对IgG的活性无影响。无论在0℃、37℃、44℃及56℃几乎均能立即结合而无需长时间的孵育，因此可以缩短试验时间，第二抗体在较长的孵育中，出现抗原分解的问题也可以得到解决；③SPA容易标上125 I、荧光素、辣根过氧化物酶、铁蛋白等，因此可与多种技术相结合；④在检查细胞上的病毒抗原时，第二抗体往往特异性不强，会非特异性地与细胞膜上的Fc受体结合。SPA分子高度均一，它不是免疫球蛋白，不受Fc受体影响，所以有较高的抗IgG特异性；⑤用第二抗体做免疫沉淀试验时，必须将抗免疫球蛋白的浓度调整至等价，才能产生最佳的沉淀作用。而用SPA菌沉淀，不受此限制，能保证彻底的沉淀；⑥SPA与lgG结合是可逆的，用4mol/L尿素、4mol/L硫氰酸、盐酸(pH2.5)或鸟嘌呤盐酸盐等都可以使之重新解离。
3．用于提取纯化IgG 利用SPA与IgG的结合特性提取IgG，比常规采用硫酸铵、Sephadex柱，DEAE柱或免疫梯度离心等法要简便得多，而且纯度好。
4．检测和提纯IgM IgM在病毒的早期诊断中具有重要意义，为了检测特异性IgM抗体，必须首先在血清中除去IgG。采用SPA菌吸附IgG是目前快速而又理想的办法，利用此法也为IgM的提纯开辟了道路。
5．其它方面 用于免疫复合物的检测、体外激活补体功能试验、细胞表面标记以及肿瘤表面抗原的检测等。
6、SPA在免疫细胞化学染色中的应用
SPA可为多种示踪物如荧光素、酶、胶体金、铁蛋白等所标记，应用较广的为酶标记SPA和金标记SPA技术，后者将在第七章 中叙述。标记SPA常用的酶为HRP。可应用于间接法。SPA在PAP法中可代替桥抗体。 1.SPA—HRP用于间接法的操作步骤 
  金黄色葡萄球菌A蛋白(1)切片经脱蜡后用0.5%H2O2—纯甲醇液处理5min以抑制内源性过氧化物酶活性。
(2)用Tris盐酸缓冲液洗2次，每次3min。
(3)以第一抗体血清覆盖处理切片，37℃，孵育30min，或4℃24～48h。
(4)用Tris-HCl缓冲液洗3次，每次5min。
(5)加SPA-HRP处理30min。
(6)Tris-HCl缓冲液洗3次，每次5min。
(7)DAB-H2O2显色。
(8)复染、脱水、透明、封固。反应物为棕色。
2.SPA用于PAP法的操作步骤
(1)切片脱蜡至水洗。
(2)80%甲醇(含0.6%H2O2)封闭内源酶活性5min。
(3)10%卵白蛋白Tris缓冲液，20min。
(4)第一抗体作用37℃，30min或4℃ ，16～48h。
(5)0.05mol/l pH7.6 Tris-HCl缓冲盐液洗片5min。
(6)SPA(1μg/ml)5min。
(7)Tris-HCl盐液洗5min。
(8)PAP复合物(无种属限制)，5min。
(9)Tris-HCl盐液洗切片5min。
(10)DAB(0.6mg/ml)，加0.01%H2O2反应5min，然后水洗。
(11)复染：常用Mayer’s苏木精液数秒至1min，水洗。
(12)脱水、透明、封固、镜检。 3.SPA-HRP的制备 应用Nakane和Kawaoi1974年建立的过碘酸法，酶：SPA=2：1，即HRP10mg，SPA5mg。
(1)10mg 溶于新鲜配制的pH8.1、0.3mol/L碳酸氢钠溶液1ml，加入0.1ml 1%二硝基氟苯无水乙醇溶液以封闭酶分子中的氨基，使不发生酶的自身聚合，室温轻轻搅拌1h。
(2)加入1ml0.04～0.08mol/L的NaIO4，室温搅拌30min。
(3)加入1ml0.16mol/L乙二醇，室温轻搅1h。
(4)对1000ml 0.01mol/L pH95 碳酸盐缓冲液充分透析，换缓冲液3次。
(5)加入5mg SPA的0.1mol/l pH7.4碳酸钠缓冲液1ml，室温轻搅2～3h。
(6)加5mg硼氢化钠终止氧化，置4℃冰箱3h或过夜。
(7)对PBS透析24h，4℃离心去沉淀，半饱和硫酸铵洗沉淀结合物3次，溶于1ml 0.02mol/L pH7.4的PBS中。
(8)对PBS充分透析，经测定后分装，贮于-20℃冰箱中保存备用。
用过碘酸钠法可以得到很高标记率的HRP-SPA标记物，而且保存了抗体的全部活性，敏感度高，稳定性强，大大优于戊二醛标记抗体法，现在也有HRP-SPA的标记物供应，但要注意由于各家所用的SPA可能来源于不同菌株，在性质上可能存在一些差异。
标准菌种
目前国内使用的大致如下： 
1．含A蛋白的葡萄球菌菌株 
⑴ No 1800株：系中国科学院微生物研究所保存的由上海市分离出的菌株，其SPA含量、活性及湿菌体收获量与Cowan 1株相似，且不易出现自凝现象。 
⑵ Cowan 1株：为SPA丰富的日本引进标准株，中国科学院微生物研究所编号为ASI 1476 
⑶ 799型菌株：从化脓性骨科病人的骨标本中分离出含SPA丰富的菌株。 
⑷ 丹麦1972株：由丹麦引进。 
2．不含SPA的葡萄球菌株 
⑴ Wood 46株：由日本引进，编号为ASI 1477。 
⑵ 乙5—株：遵义医学院保存的SPA菌株。
培养基
常用的培养基配方如下： 
1． 配方一 
蛋白胨 10.00g 
葡萄糖 1.00g 
氯化钠 3.00g 
Na2HPO4·12H2O 2.00g 
牛肉浸液(或5%牛肉膏) 1 000.0ml 
混合，调pH 7.8 
欲配固体培养基则另加琼脂25.00g 
2． 配方二 
胰酶消化酪蛋白 17.00g 
大豆胨 3.00g 
氯化钠 5.00g 
葡萄糖 25.00g 
Na2HPO4 25.00g 
混和，调pH 7.3 
3． 配方三 
水解蛋白胨 10.00g 
氯化纳 5.00g 
牛肉膏 10.00g 
酵母膏 25.00g 
色氨酸 5.00mg 
半胱氨酸 100.00mg 
琼脂 40.0g 
H2O pH 7.6 1 000.00ml
性质特点
(1)SPA存在于大多数金黄色葡萄球菌中，而不存在于表皮葡萄球菌中。并且主要存在于血浆凝固酶阳性菌株，而不存在于阴性菌株中。前者是致病的，后者是非致病的，但在体内研究中尚未发现SPA和菌株致病性之间有任何肯定的关系。不同菌株间的SPA含量有明显差异，以I株金黄色葡萄球菌含SPA量最高，SPA和细胞壁的肽聚糖呈共价结合。抗二甲氧基苯青霉素突变株能产生分泌性SPA，它较之细胞壁所含的SPA在免疫学性质上相似，但易分离，损失少。 (2)SPA为蛋白质成分，仅含少量或不含碳水化合物，其分子量因提取方法不同而异，用脱氧核糖核酸酶消化细胞壁后超速离心或用加热油提法，所测分子量为12000～15000。用沉淀平衡分析和在6mol/L鸟嘌呤盐酸盐中凝胶过滤，测出分子量为42000。SPA为多肽单链，内含3个高度相似的Fc段结合区，每区由50个以上的氨基酸组成，不含色氨酸和半胱氨酸。其羧基末端是赖氨酸，氨基末端结构尚未肯定。SPA粘度高于球蛋白，等电点为pH5.1，其天然结构十分稳定，在应用6mol/L鸟嘌呤盐酸盐变性剂的条件下，尚能保存某些三级结构，如将此变性剂除去，则能自然矫正而恢复原有结构。
(3)SPA之所以引起免疫学家的重视，是因为它具有的免疫学特性。SPA具有和人与许多动物如豚鼠、猪、小鼠、猴等IgG结合的能力。SPA结合部位是Fc段而不是Fab段，这种结合不会影响抗体的活性。SPA具有的结合力是双价的，每个SPA分子可以同时结合两个IgG分子，也可一方面同IgG相结合，一方面与标记物如荧光素、过氧化物酶、胶体金和铁蛋白等相结合。还有一个饶有兴趣的事实是，和SPA结合后的IgG可用4mol/L鸟嘌呤盐酸盐等使之解离。SPA对IgG免疫球蛋白亚型的结合有选择性，如SPA与人IgG亚型：IgG1、IgG2、和IgG4有结合力，唯独不结合IgG3。只结合IgA2，而不结合IgA1。SPA和禽类血清IgG不结合。
(4)SPA具有多种生物学作用，如引起豚鼠解离体回肠和收缩，在吞噬反应中抑制IgG调理素吞噬和杀菌作用，SPA—Igg 复合物能固定人的补体和人、狗、猪的新鲜补体，对人类B细胞具有促有丝分裂因子的作用等。