标题：眼镜蛇毒细胞毒素
简介
眼镜蛇毒素是由眼镜蛇的毒腺分泌的一种天然毒蛋白，其化学成分非常复杂，含有多种  广西眼镜蛇细胞毒素色谱图[1]蛋白质、多肽、酶类和其他小分子物质，具有广泛的生物学活性，可作为天然的药用资源，如溶血、抗肿瘤等。其中约75%~85%为蛋白质。蛋白质成分有100种以上，其中25%～40%左右为细胞毒素(Cytotoxin)，又称为膜毒素(Membrane toxin)或心脏毒素(Cardiotoxin)，是眼镜蛇毒的主要毒性成分之一，是一类既具有心脏毒性，又具有细胞毒性，尤其是对肿瘤细胞有毒性的组分，在蛇毒抗肿瘤作用的研究中占首要地位。[2-3]
细胞毒素(cytotoxin，CTX)是眼镜蛇毒中重要的一类活性蛋白，它们的氨基酸序列和空间结构相当保守，但生物学活性却多种多样，如引起可兴奋性组织(骨骼肌、心肌及神经组织)去极化、溶解肿瘤细胞、心脏毒性和抗菌活性等。不同地区、不同蛇种的蛇毒中含有不同的CTX，且同种蛇毒中也含有2～5个CTX，它们的结构及生物学活性有一定差别，对它们的结构与功能的研究是生物毒素研究的热点之一。[4-5]
细胞毒素是蛇毒三指蛋白家族的一员，是眼镜蛇毒的主要毒性成分之一，具有心脏毒、抑制骨吸收、引起可兴奋组织去极化、抗菌等多种生物学活性，并可诱导多种肿瘤细胞凋亡。眼镜蛇毒细胞毒素对癌细胞的抑制作用的确切机制尚不清楚，有些学者认为细胞毒破坏细胞的作用机制主要是依赖毒素分子有较多的碱性基团与细胞膜表面磷脂的酸性基团结合，进而由毒素分子内高含量的疏水侧链与脂层作用，从而扰乱双层膜达到破坏细胞膜的作用。而有的学者却不支持这一观点，但不论其机制如何，对肿瘤细胞的杀伤作用是确实的，与眼镜蛇毒粗毒比较，48h对鼻咽癌的半数抑制浓度为22mg·L-1，可提高约10倍左右。[6-7]
物化性质
理化性质从蛇毒中分离纯化得到不含PLA2的CTX是进一步研究其理化性质、准确测定其生物学活性细胞毒素质谱分析(3张)等的先决条件。根据蛇毒和磷脂酶A2分子量大小，电荷，以及疏水性不同，可以将含CTX组分纯化。许多学者都相继从不同来源的蛇毒中分离提纯出CTXs。对CTXs的分离多采用阳离子交换层析合并凝胶过滤的方法。[8-9]
眼镜蛇毒CTX是蛇毒的主要活性成分，约占粗毒的20%-40%，其化学本质为蛋白质，是强碱性的小分子单肽，由15~17种氨基酸的60~62个残基组成，相对分子质量为6000-7000，易溶于水，耐强酸、强碱，对水解酶具有抗性作用，在室温下极为稳定。等电点11~12，含有较多的赖氨酸和亮氨酸，有25个疏水氨基酸，其8个半胱氨酸交叉联结成4对二硫键。[10]
图册“细胞毒素质谱分析”参考资料。[11]
结构特点CTX含大量疏水性残基，占全部残基的一半。二级结构主要由单一折叠组成，缺乏α-螺旋结构，通过X射线衍射和核磁共振方法分析其三维空间结构，呈三指形，4个二硫键聚集在一起形成一个致密内  中国中南六省区眼镜蛇毒细胞毒素HPLC图[2]核，从此球状区域伸出的3个紧邻的富含β折叠的指( loop)，形成典型的“三指”结构。二级结构分析结果显示它缺乏α－螺旋结构，主要由β折叠组成。在第三环和第二环之间的裂隙的大小与该细胞毒的毒性正相关，而二级结构中的三重和两重的反平行β折叠则是第三环移位的关键。细胞毒素对热稳定．对水解酶有抗性，能引起可兴奋性细胞如骨骼肌、心肌和神经组织去极化，可增加细胞膜通透性，阻滞轴突传导，以及溶解肿瘤细胞等，而其主要作用点在细胞膜上。[12-13]
三指(loopⅠ、loopⅡ、loopⅢ)指端为疏水性氨基酸，指侧则带有正电荷的精氨酸、赖氨酸。有学者认为CTX通过静电力、疏水力与脂质生物膜结合，并通过loopⅡ和loopⅠ插入膜中，产生作用，CTXs在loopⅡ的顶端存在阳电荷，可能通过静电吸引力在膜上定位，loopsⅠ和Ⅱ的指表面带有较多的疏水氨基酸，插入细胞膜中形成孔洞，导致细胞溶解。在loopⅡ顶端有一个典型的Ω-样结构，此结构使得loopsⅠ和Ⅱ插入膜的深度相同，并增加它们的作用范围。ZaheerA比较了三种蛇毒多肽的结构及它们对正常细胞和癌细胞的功能，发现它们结合于膜上不同的受体，而这种选择性是由它们所带的电荷以蛋白质结构决定的，但不存在单一的功能区，多肽链上的许多位点都和其活性有关。[14-16]  毒素作用细胞线粒体的电镜图[17][18]
由于蛋白质结构分析技术的发展，从而对CTX的作用机制提出了新的看法。结构分析表明，CTX的三指状结构有利于其与细胞膜结合，破坏膜结构而产生毒性作用。有人通过研究及计算机模拟技术，提出了CTX与细胞膜结合的模拟示意图，认为CTX通过经典吸引力吸附在带负电荷的膜上，然后通过三指顶端的疏水残基插入膜中。当结合在膜上的CTX量达到临界浓度会发生寡聚同时诱导膜脂质重新排列形成孔道，孔道的形成可能是CTX产生细胞毒性、导致细胞碎裂的主要原因。[19-20]
分离鉴定1967年Braganca等采用Sephadex-G50凝胶过滤、CM-cellulose层析等对眼镜蛇(Naja naja atra)粗毒进行洗脱，从洗脱的4个吸收峰中分离出CTXP6。杜雨苍等采用SP-Sephadex C-25柱上平衡层析方  眼镜蛇毒细胞毒素氨基酸排列[21]法，从广东产眼镜蛇毒中纯化出细胞膜毒素D1。Kaneda N等利用反相高效液相色谱一步法从眼镜蛇毒中分离CTX。Ohkura K等以Sephadex-G75凝胶及CM-cellulose层析从泰国眼镜蛇毒中分离获得CTX。许云禄等采用SP-Sephadex C-25阳离子交换法及Sephasil Peptide C18反相高效液相色谱法从舟山眼镜蛇毒中纯化出细胞毒素，并测定其N端20个氨基酸序列。Gomes等从印度眼镜蛇(Ophiophagus hannah)中分离出一种独特的细胞毒素CM55，其分子量为21.5～22.5kD，豚鼠实验表明，CM55能导致豚鼠心电图异常，其中包括使QSR波群变宽和室性心动过速。1993 年，Hung et al首先从台湾地区舟山眼镜蛇毒中分离出CTXn，并确定了其一级结构，其氨基酸序列和其他细胞毒素相似度达到80-92%。其空间结构呈三指结构，由4对二硫键偶联而成。其后Chen 等分别运用离子交换色谱和reverse-phase HPLC两种分析方法证明台湾东部地区蛇毒含有CTXn（CTXA6），西部地区则不含该成分。[22-24]
CTX具有多种生物活性，可引起心脏挛缩，停跳在收缩期，这是CTXs心脏毒性的典型表现。另外，CTXs可引起肌细胞膜不可逆去极化及细胞毒作用，对刺激神经间接产生的肌肉收缩及直接刺激肌肉产生的收缩均有阻断作用，据此可与眼镜蛇毒中另一主要成分-神经毒素相鉴别，后者仅阻断刺激神经引起的收缩，对直接刺激肌肉引起的收缩无影响。CTX的常规鉴定方法即为离体心脏毒性实验和离体膈神经-膈肌毒性实验。[25-26]
毒性理学
有关CTX毒性的研究开展已久，半数致死剂量为2.4795mg/kg，但其作用机制尚未明了。CTXs作用后期常表现为溶细胞作用，细胞膜裂解成碎片（故又名膜毒素），因此关于CTXs的作用机制，多数学  细胞毒素对大鼠心脏作用图[27]者长期以来把目光聚焦在细胞膜上。CTXs属于三指毒素家族（three-fingertoxins），其4个高度保守的二硫键使得CTX的空间结构呈“三指”状，三指指端为疏水性氨基酸，指侧则带有正电荷的精氨酸、赖氨酸，研究认为，这种两性指状结构有利于CTXs与细胞膜结合，CTXs发生寡聚同时诱导膜脂质重新排列形成孔道（poreformation），孔道的形成可能是CTXs产生细胞毒性、导致细胞碎裂的主要原因。在早期的研究中，Dimar等比较了大量蛇毒CTXs，提出细胞毒溶胞能力的大小与CTXs分子正负电荷多少成正比。Lauterwein等据此提出了CTXs与磷脂结合的模型，认为CTXs如同阳离子除垢剂，带正电荷的阳离子头端与磷脂双层极性层的阴离子部位结合而定位，疏水性基团部分插入细胞中而使细胞膜破坏。ZaheerA等认为CTX是通过抑制细胞膜上Na+-K+-ATPase干扰膜转运机制而起作用。CTXs的二硫键可能被转移至Na+-K+-ATPase的疏水基上，使该酶失活，细胞内外Na+、K+比例失调，使葡萄糖等等物质不能偶联转运，从而导致细胞肿胀、破裂。另外，由于眼镜蛇毒中另一主要成分———神经毒素发现能与乙酰胆碱竞争胆碱能受体，因此有学者推测CTXs也可能有膜受体蛋白。[28-30]
许多学者报道了CTXs与膜磷脂7-11或糖脂12-13有亲和力，阻断或抑制这种结合，会减弱CTXs的细胞毒作用。事实上多个研究室将CTXs作为研究蛋白质—脂质相互作用的工具，探索生物膜的物理及生化特性； 一些学者则认为细胞膜上存在CTXs的受体蛋白质，Su，S. H.等发现CTXs可与外周血单核细胞的膜蛋白结合，并确定该膜蛋白的分子量分别为92，77和68kD，据此提出CTXs可能通过与膜蛋白结合，启动相应的信号通路发挥作用。在对CTXs 的膜作用研究中，Chiou，S. H.等15-16报道CTXs抑制蛋白激酶C的活性，抑制程度与CTXs 的抗肿瘤作用相关。CTXs 结构的区别会反映到它们对PKC的抑制力上。Chia H.W.等的研究显示，CTX作用于不同的细胞可引起胞内Ca2+([Ca2+]i)，并出现凋亡或坏死：神经元细胞以凋亡为主，心肌细胞和胶质细胞以坏死为主。以3-硫基-半乳糖脂的单克隆抗体抑制CTX的膜结合，可抑制CTX升高[Ca2+]i 的作用，同时细胞毒性作用降低。[31-35]  毒素对大鼠膈神经影响[27]
CTXs能与线粒体特有的心磷脂结合，据此Wang，C. H.等（2005）以FITC标记CTX A3，在激光共聚焦显微镜下观察活的H9C2细胞，发现大部分CTX A3在15min内移入胞内定位于线粒体，显示线粒体是CTX A3的胞内结合靶点之一；同时检测到[Ca2+]i在数分钟内升高，1h 后线粒体明显水肿；以Ca2+鳌合剂去除胞内Ca2+后，对CTXs的线粒体定位无明显影响，但线粒体水肿、崩解现象有所减弱。表明作用于线粒体与升高[Ca2+]i是CTX A3的两条作用途径，两者对CTX-A3发挥细胞毒作用具有协同性。Arseniev AS等（2005）报道了CTXs对细胞内另一种膜结构—溶酶体的作用：以共聚焦色谱成像（confocal spectralimaging，CSI）技术观察荧光标记的不同种蛇毒来源的CTXs对A549细胞及HL60细胞的作用，发现CTXs轻易进入A549细胞及HL60细胞中，浓集于溶酶体，且CTXs的溶酶体浓度与其细胞毒作用呈现密切的量效关系，由此提出CTXs对细胞膜的作用可能是胞内作用的下游事件。以上研究显示，CTXs作为小分子多肽，在数分钟内即进入细胞内，产生效应。[36-40]
抗癌作用
基本情况  毒素对四种癌细胞杀伤剂量半对数曲线[41]20世纪50年代起即开始了应用蛇毒治疗恶性肿瘤的研究，结果发现蛇毒可使一些肿瘤生长缓慢、缩小甚至完全瘢痕化。有人应用9种蛇毒(眼镜王蛇、眼镜蛇、金环蛇、银环蛇等)的粗毒对多种人实体瘤细胞株，包括子宫颈癌、鼻咽癌、肝癌、胃癌细胞株等进行了直接毒性作用实验，结果发现眼镜蛇毒对肿瘤细胞的杀伤作用最强。其中，细胞毒素在体外实验中，对肿瘤细胞有很强的选择性、剂量依赖型的杀伤作用。需要注意，不同地区眼镜蛇毒的细胞毒素抗肿瘤效应不同，是细胞毒素生物学效应和结构不同所致。不同肿瘤对同一细胞毒素的反应也不一致，这与不同肿瘤细胞株的特性有关。[42-44]
细胞毒素对体内外癌细胞杀伤作用差异大的原因在于CTX进入体内，其作用即被Ca2+所拮抗，作用减弱，加入EDTA后Ca2+被络合，疗效就提高，因此S180载瘤小鼠生命延长率从23%提高到40%，但不可能把体内生理所需的Ca2+都络合，这提示改良CTX给药方式，维持CTX长期低浓度发挥作用或利用CTX进行肿瘤的免疫导向治疗，从而减轻CTX的不良反应，是取得良好疗效的关键。[41]
细胞凋亡调控失调是肿瘤发生的主要原因之一，多种抗肿瘤药物通过诱导细胞凋亡来实现。研究表明，CTXs可引起多种肿瘤细胞凋亡或坏死。在细胞凋亡中线粒体的作用日益受到关注。线粒体是细  毒素对卵巢癌细胞作用剂量曲线[45]胞生命活动控制中心，它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，还是细胞凋亡调控的中心环节之一。线粒体感受多种刺激，发生线粒体渗透性转变孔（mitochondriapermeabilitytransition pore，MPTP）开放，线粒体形态功能发生改变，释放膜间隙中的促凋亡蛋白细胞色素c和凋亡诱导因子AIF等参与到caspase信号通路中。释放到细胞浆的细胞色素c在dATP存在的条件下能与凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）结合，使其多聚化而激活，从而召集caspase-9形成凋亡体（apoptosome），caspase-9被激活，继而激活下游的凋亡效应分子caspase-3，经蛋白水解级联作用引起细胞凋亡。有不同学者’13 - 14{在激光共聚焦显微镜卜观察到，CTX可在数分钟内进入线粒体并破坏其结构，眼镜蛇毒CTX可轻易进入活的肿瘤细胞内并浓集于溶酶体，其含量与CTX的细胞毒作用密切相关。由此说明CTX影响线粒体及溶酶体等胞内膜结构的功能可能是其主要抗肿瘤机制。[46-48]
体外抗肿瘤作用在体外，CTXs对多种肿瘤细胞具有直接的细胞毒作用。lwaguchiT等均从印度眼镜蛇  荧光染色观察毒素诱发癌细胞凋亡[49]毒中分离出CTX组分，发现其破坏吉田内瘤的能力远远大于对正常细胞(人或大鼠红细胞、脾细胞)的破坏能力;仲晓燕等测定了CTX对子宫颈癌细胞株(HeLa)、鼻咽癌细胞株(CNE)、胃癌细胞株(MGC)和乳鼠心肌细胞毒活性，结果表明对3种人癌细胞株均有明显的杀伤作用，对正常乳鼠心肌细胞也有破坏作用，但敏感性比人癌细胞低得多。谭获等研究了蛇毒组分C对8种白血病细胞(K562，J6-1，Mo7e，HPB，U937，Nalm-6，HL60，NB4)的作用，证实上述白血病细胞株对眼镜蛇毒组分C均较敏感。丁明霞等研究4种细胞毒素(CTX-10，CTX-11，CTX-12和CTX-13)对膀胱癌细胞株(BIU-87和EJ)的抑制作用，发现4种CTX对BIU-87和EJ均有明显的抑制作用。[50-53]
体内抗肿瘤作用在体内，CTX能抑制肿瘤生长，使肿瘤体积缩小，宿主寿命延长。Fawzia用黑颈眼镜蛇蛇毒对接种有艾氏腹水癌细胞的小鼠进行实验性治疗，结果发现能明显延长小鼠存活时间，降低癌细胞活力。  毒素对鼻癌细胞抑制效果图[54]许云禄等利用舟山眼镜蛇毒CTX-F，使艾氏腹水瘤荷瘤小鼠的存活时间明显延长，对小鼠宫颈癌U14及肉瘤S180有明显的抑瘤作用。GamalA. S等从角蝰蛇中分离得到的不含PLA2活性的细胞毒素组分F4对荷艾氏腹水癌细胞小鼠具有抑制肿瘤细胞生长，延长小鼠存活时间的作用。Chaim等研究了蛇粗毒及细胞毒素P4在体内外对B6-F10黑素瘤和软骨肉瘤的细胞毒性，结果发现有很强的、不可逆转的毒性作用，并且对肿瘤细胞有选择性。[55-56]