Yuqori samarali suyuqlik xromatografiya

thumb| Zamonaviy HPLC qurilmasi
thumb|300x300px| HPLC tuzilishi. (1) Erituvchi moddalar boʻlgan idishlar, (2) Solventni gazsizlantirish, (3) Gradient klapan, (4) Mobil fazani etkazib berish uchun aralashtirish idishi, (5) Yuqori bosimli nasos, (6) Injektor klapan „in“ holatida, (6 ')) „Yuklash“ holatida injektor klapan, (7) Namuna kiritish halqasi, (8) Old ustun (himoya ustuni), (9) Analitik ustun, (10) Detektor (masalan, IR, UV), (11) Maʼlumot yigʻuvchi, (12) Qoldiq yoki fraksiya kollektori.
Yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi (HPLC;ilgari yuqori bosimli suyuqlik xromatografiyasi) -aralashmadagi komponentlarni ajratish, aniqlash va dozalash uchun analitik kimyoda qoʻllanadigan usuldir. Uning asosiy konstruktiv xususiyati qattiq adsorbent materialdan tayyorlangan statsionar faza boʻylab mobil fazani yuqori bosim bilan siqib chiqaradigan nasoslardir. Namunadagi har bir komponent adsorbent moddasi bilan turlicha reaksiyaga kirishadi, shuning uchun ular ustun boʻylab turli tezlikda harakatlanib, aralashmaning ajralishiga olib keladi.

HPLC koʻp maqsadlarda qoʻllanadi:sanoatda (masalan, dori va oziq-ovqat mahsulotlarini oʻrganish uchun), qonunchilikda (masalan, dopingni aniqlash uchun), tadqiqotda (masalan, murakkab biologik materialning tarkibiy qismlarini ajratish uchun) va tibbiyot uchun (masalan, qon testlari).

Xromatografiya-bu massa oʻtkazuvchanligi bilan adsorbsiya. HPLC ning asosiy qismi namuna va erituvchi aralashmasini qattiq adsorbent bilan toʻldirilgan ustun orqali siqib chiqaradigan nasoslar boʻlib, bu ularning turli tezliklarda harakatlanishi va ajralishiga olib keladi. Ustunning faol komponenti adsorbent,statsionar faza va qattiq, donador materialdir (masalan, kremniy yoki polimerlar), koʻpincha oʻlchami 2-50 mkm. Komponentlarning ajralish sababi ularning adsorbent moddasi bilan turlicha oʻzaro taʼsiridir. Bosim ostidagi suyuqlik koʻpincha erituvchilar aralashmasidir (masalan, suv, asetonitril, metanol, suyultirilgan mineral kislotalarning suvli eritmalari), namuna va erituvchi birgalikda harakatlanuvchi faza deb ataladi. Mobil fazaning tarkibi va harorati ajratish jarayonida juda muhim rol oʻynaydi, chunki u komponentlarning adsorbsiya jarayoniga taʼsir qiladi. Ushbu oʻzaro taʼsirlarning koʻpchiligining tabiati fizik, masalan, hidrofobik, dipol-dipol, ionli oʻzaro taʼsirlar yoki ularning kombinatsiyasi.

HPLC anʼanaviy past bosimli suyuqlik xromatografiyasidan uning bosimi juda yuqori (50-350 atm gacha) boʻlishi bilan farq qiladi va anʼanaviy ustunli suyuqlik xromatografiyasida asosiy harakatlantiruvchi kuch tortishish hisoblanadi. HPLC tomonidan tahlil qilingan namunaning oʻlchami juda kichik boʻlgani uchun uning ustun oʻlchami ham kichik (diametri 2,1-4,6 mikron, uzunligi 30-250 mm).HPLC ustunlarining adsorbent zarralari ham juda kichik (2-50 mkm).Bunday oʻlchovlar HPLC ning aralashmalarni parchalash qobiliyatini koʻpaytiradi va bu hozirgi kunga qadar eng koʻp qoʻllanadigan usuldir.

HPLC qurilmasi odatda degasser, namuna oluvchi, nasos va detektordan iborat. Namuna oluvchi namunani harakatlanuvchi faza oqimiga yuboradi. Nasoslar harakatlanuvchi fazaning tarkibi va tezligini saqlab turadi. Va detektor ustundan chiqadigan oqimdagi ajratilgan komponentlar miqdoriga mutanosib signal beradi. Qurilma tahlil natijalarini chiqarish uchun raqamli mikroprotsessordan foydalanadi. Baʼzi HPLC modellarida nasoslar vaqt oʻtishi bilan harakatlanuvchi fazaning tarkibini oʻzgartirishi mumkin, bunday oqimlarning tarkibi gradient oqimi deb ataladi. Eng koʻp ishlatiladigan detektorlar UV-Vis, yorugʻlik chiqaradigan detektorlar (DAD) va massa-spektrometriya (MS) detektorlari. Koʻpgina HPLC qurilmalari ham haroratni oʻzgartirishga imkon beradi.

 Qoʻllanishi 
Ajratilgan aralashmaning namunasi ustunning kichik hajmidan oqib oʻtadigan mobil fazaning oqimiga kiritiladi. Namunadagi komponentlar adsorbent (statsionar faza) bilan boshqacha reaksiyaga kirishadi va shuning uchun ustun boʻylab turli tezliklarda harakatlanadi. Har bir komponentning tezligi uning tabiatiga, statsionar fazaning tabiatiga va mobil fazaning tarkibiga bogʻliq. Tahlil qiluvchi moddaning kolonnadan suzilishi (oqishi) uchun ketadigan vaqt sekinlashuv vaqti deyiladi. Agar bir xil analit bir xil sharoitlarda oʻlchanadigan boʻlsa, u bir xil sekinlashuv vaqtini koʻrsatadi, shuning uchun undan analitni sifat jihatidan aniqlash uchun foydalanish mumkin.

Hozirgi vaqtda adsorbentning oʻlchamlari va sirt xususiyatlariga koʻra farq qiluvchi koʻplab turdagi ustunlar mavjud. Toʻldiruvchi materialning zarralari qanchalik kichik boʻlsa, uning boʻylab harakatlanuvchi fazani oʻtkazish uchun zarur boʻlgan bosim shunchalik yuqori boʻladi, ammo bu piksellar sonini oshiradi. Adsorbentlar ham hidrofobik, ham qutbli boʻlishi mumkin.
thumb| HPLC mahsulotlarini yigʻuvchi aylanadigan fraksiya kollektori. Tizim E. coli bakteriyalarining plazma membranasidan Kompleks Ini ajratish uchun ishlatilgan. Ushbu fraktsiyani olish uchun taxminan 50 litr bakteriya ishlatilgan.
Koʻchma faza sifatida koʻpincha asetonitril,metanol kabi suvda eriydigan organik erituvchilarning aralashmalari ishlatiladi. Baʼzi HPLC usullari suvsiz mobil fazadan foydalanadi (normal fazali suyuqlik xromatografiyasi (NPLC)).Mobil fazaning suvli komponentida kislotalar (formik kislota, fosforik kislota, trifluoroasetik kislota,sirka kislotasi), tuzlar boʻlishi mumkin. Va mobil fazaning tarkibi tahlil (izokratik elyusiya) yoki oʻzgarish (gradient elyusiya) vaqtida doimiy boʻlishi mumkin. Izokratik elyusiya koʻpincha juda boshqacha xususiyatlarga ega boʻlgan molekulalarni ajratish uchun ishlatiladi. Gravitatsion elutsiya jarayonida elutsiya koʻpincha past kuchli tarkibdan yuqori quvvatli tarkibga oʻzgaradi. Harakatlanuvchi fazaning elutsiya kuchi uning tahlil qiluvchi moddalarni qanchalik tez harakatlanishini koʻrsatadi (yaʼni, sekinlashuv vaqti qisqa). Teskari fazali suyuqlik xromatografiyasida ishlatiladigan gradientli elyusiyaga misol sifatida 5% suv yoki suvli buferdagi asetonitril eritmasini 5-25 daqiqa ichida 95% gacha oshirish mumkin. Baʼzi gradient elyusiya dasda harakatlanuvchi fazaning tarkibi maʼlum vaqt davomida doimiy boʻlib qolishi mumkin. Misol uchun, 5% li asetonitril eritmasini 1-3 daqiqa davomida infuzion qiling va keyin asta-sekin konsentratsiyani chiziqli funksiya bilan 95% eritmaga oshiring.

Harakatlanuvchi fazaning tarkibi (elyuent deb ham ataladi) tahlil qiluvchi moddalar va statsionar faza oʻrtasidagi oʻzaro taʼsir kuchiga qarab tanlanadi, chunki tahlil qiluvchi moddalarni ajratish ularning ikki fazaga yaqinligi sababli taqsimlanishiga asoslanadi. Bu jarayon suyuqlik-suyuqlik ekstraktsiyasiga oʻxshaydi, ammo xromatografiya paytida bu jarayon uzluksizdir. Misoldagi suv/asetonitril gradientini koʻrib chiqaylik, bunda hidrofobik analizatorlar keyin elutsiya (kolonkadan oqib chiqish) sodir boʻladi, chunki dastlab harakatlanuvchi fazadagi suv miqdori katta boʻladi, keyin undagi organik erituvchi miqdori ortib borishi bilan hidrofobik analitlar mobil fazada koʻproq eriy boshlaydi

Ustun toʻldiruvchining tabiatiga va namunadagi tarkibiy qismlarga qarab, mobil fazaga turli xil qoʻshimchalar (masalan, kislotalar, tuzlar) qoʻshilishi mumkin. Koʻpincha eng yaxshi taqsimotni beradigan vaziyatni aniqlash uchun bir nechta tajribalar oʻtkaziladi. Bu jarayon usul ishlab chiqish deb ataladi.

 Tarix va rivojlanish 
HPLC usuli paydo boʻlishidan oldin olimlar oddiy suyuqlik xromatografiyasidan foydalanganlar.Erituvchilarning tezligi faqat tortishish kuchiga bogʻliq boʻlganligi sababli, bunday tizimlarning oqim tezligi juda past edi. Baʼzi topshiriqlar soatlab, baʼzan bir necha kun davom etdi. Oʻsha paytda gaz xromatografiyasi (GK) suyuq xromatografiyaga (LC) nisbatan kuchliroq usul hisoblangan, ammo yuqori qutbli, yuqori molekulyar ogʻirlikdagi biopolimerlarni gaz bilan ajratish mumkin emas edi.GC biokimyogarlar uchun juda samarasiz boʻldi, chunki koʻplab tahlilchilar yuqori haroratga toqat qilmaydilar.Henry, Richard A. (1 February 2009) „The Early Days of HPLC at Dupont“ . Chromatography Online. Avanstar Communications Inc. Natijada, yangi usullar taklif qilindi va HPLC ning rivojlanishiga olib keldi.

1941-yilda Martin va Singxning fundamental ishlaridan soʻng,1960-yillarda Kal Giddins,Jozef Xuber va boshqalar zarrachalar hajmini (zarralar oʻsha paytda taxminan 150 mkm edi) va yuqori bosim bilan oqim tezligini kamaytirish orqali LC samaradorligini oshirish mumkinligini taklif qilishdi..1960-yillarning oʻrtalarida boshlangan ushbu farazlarga asoslangan keng koʻlamli tajribalar 1970-yillargacha davom etdi. Dastlabki tadqiqotlar LC qismlarini yaxshilashga intildi, natijada HPLC qurilmalarini ishlab chiqishda katta rol oʻynagan yuqori gözenekli Zipax materiali paydo boʻldi.Iler, R. K. (1979) The Chemistry of Silica. John Wiley & Sons. New York.

1970-yillarda koʻplab asboblar va qurilmalar ishlab chiqildi. Tadqiqotchilar turli xil nasoslar va injektorlar yordamida HPLC tizimlarining original dizaynlarini ishlab chiqdilar.Ushbu tadqiqotlarda gaz kuchaytirgich nasoslari tez-tez ishlatilgan, chunki ular doimiy bosimni saqlab turishga qodir va muhrlanish va nazorat valflarini talab qilmaydi.Qurilmaning rivojlanishiga eng katta hissa Dupont IPD sanoat polimerlari boʻlimi tomonidan qoʻshildi. Misol uchun, ular birinchi boʻlib past hajmli gradient qurilmalarini ishlab chiqdilar va septik injektorlarni pastadirli injektor klapanlari bilan almashtirdilar.

Asboblarni ishlab chiqish juda muhim boʻlsa-da,HPLC tizimlarining rivojlanishi koʻp jihatdan zarrachalar materiallarini ishlab chiqishga bogʻliq.Gozenekli qatlamli zarrachalar paydo boʻlishi bilan, tadqiqotlar asosan mahsuldorlikni oshirish uchun ularning hajmini kamaytirishga qaratilgan.Biroq, xodimlarni qisqartirish koʻproq muammolarni keltirib chiqardi. Buning sababi shundaki, suyuqlik fazasini juda kichik zarrachalar bilan toʻldirilgan ustunlar orqali oʻtkazish uchun katta bosim kerak va bunday ustunlarni bir tekisda toʻldirish katta muammo edi.Giddings, J. Calvin (1965) Dynamics of Chromatography, Part I. Principles and Theory. Marcel Dekker, Inc., New York. p. 281.Shuning uchun zarrachalar hajmi kamayganligi sababli u orqali harakatlanuvchi fazani oʻtkaza oladigan qurilmani ixtiro qilish kerak edi

Ushbu muammolar ultra yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasining (UHPLC) rivojlanishiga olib keldi. Ushbu usullarning zarracha hajmi 2 mikrondan kam, bosim esa 1200 atmosferaga yetishi mumkin