Câu hỏi: Cách tiến hành chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm sú giống trong phòng thí nghiệm với phương pháp Nested PCR như thế nào?
Trích dẫn pháp luật: "6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm
6.1 Phương pháp Nested PCR (Polymerase Chain Reaction)
6.1.4 Cách tiến hành
6.1.4.1 Tách chiết ADN
Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.3) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
VÍ DỤ: Sử dụng kit tách chiết ADN của Qiagen: DNeasy® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506) [1]) (xem phụ lục B1).
Hoặc Sử dụng kit tách chiết TACO RNA/ADN extraction Kít (GeneReach Cat. No. atc-d/rna, 320 tests) [2]) (xem phụ lục B2).
6.1.4.2 Chuẩn bị mồi
Phương pháp Nested PCR sử dụng cặp mồi 146F1/146R1 và 146F2/146R2 (3.2.1) để phát hiện vi rút đốm trắng. Trình tự cặp mồi (xem phụ lục C, Bảng C.1).
Mồi được chuẩn bị như sau:
- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy ly tâm nhanh spindown (4.1.5) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Dùng dung dịch đệm TE (3.2.9) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM làm gốc.
- Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 µM: pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.11) (10 µl mồi gốc và 40 µl nước tinh khiết không có nuclease).
6.1.4.3 Tiến hành phản ứng Nested PCR
Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.1.1) theo phương pháp nested PCR bao gồm 2 giai đoạn (hoặc 2 bước): Giai đoạn 1 (bước 1), thực hiện phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 146F1/146R1; Giai đoạn 2 (bước 2), thực hiện phản ứng nested PCR sử dụng cặp mồi 146F2/146R2, sử dụng kít nhân gen (3.2.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất (xem phụ lục C).
6.1.4.4 Điện di
6.1.4.4.1 Chuẩn bị bản gel
Pha thạch với nồng độ agarose (3.2.12) từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (3.2.6) vào chai thủy tinh 250 ml, lắc đều rồi đun sôi;
Khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 °C đến 50 °C thì bổ sung 10 µl chất nhuộm màu (3.2.7) vào mỗi 100 ml thạch. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để chất nhuộm màu tan đều.
Tiến hành đổ thạch vào khay điện di đã được cài lược; không nên đổ bản thạch dày quá 0,8 cm.
Khi bản thạch đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản thạch.
Chuyển bản gel vào bể điện di (4.1.6), đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) cùng loại với dung dịch pha thạch agarose đã đun vào bể điện di cho tới khi ngập bản thạch.
CHÚ THÍCH: Có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm ADN để pha chế thạch agarose (ví dụ: Sybr safe ADN gel stain[3]) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất.
6.1.4.4.2 Chạy điện di
Thực hiện điện di trong bộ điện di (4.1.6), chạy kèm theo thang chuẩn ADN (ladder) (3.2.10) để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 µl thang chuẩn ADN (ladder) (3.2.10) vào một giếng trên bản thạch.
Điện di ở hiệu điện thế 100 V trong thời gian 25 min.
6.1.4.5 Đọc kết quả
Sau khi điện di, đọc kết quả trên máy đọc gel (4.1.7).
Điều kiện phản ứng được công nhận khi:
- Mẫu đối chứng âm không có vạch sáng (không có sản phẩm khuếch đại);
- Mẫu đối chứng dương có vạch sáng kích thước 941 bp.
Với điều kiện phản ứng trên:
Kết quả mẫu thử dương tính khi:
- Tại giếng mẫu thử xuất hiện vạch sáng có kích thước 941 bp.
- Thang chuẩn ADN phân vạch rõ ràng.
Kết quả mẫu thử âm tính khi:
- Tại giếng mẫu thử không xuất hiện vạch sáng.
- Thang chuẩn ADN phân vạch rõ ràng"