## OPTIMALISASI PRODUKSI ENZIM KITINASE PADA ISOLAT JAMUR KITINOLITIK DARI SAMPEL TANAH RIZOSFER
Eka Corneliyawati 1) , Massora 2) , Khikmah 2) & As’ad Syamsul Arifin 3)
1)3) FPIEK, IKIP Budi Utomo, Jl. Simpang Arjuno 14B, Malang 65119
2) Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada, Bulaksumur, Yogyakarta 55284 E-mail: eka.corneliyawati@gmail.com

## ABSTRACT
The rhizosphere  is the zone of soil surrounding a plant root where  plant roots,  soil  and  the  soil  biota  interact  with  each  other.  Chitinolytic  fungi has  been  effectively  used  in  biological  control  agens.  The  chitinase activity  causes  lysis  of  the  fungi  cell  wall  pathogen.  The  aim  of  the research  was  to  find  optimization  of  activity  chitinase  enzyme  from rhizosphere  soil  was  conducted  in  vitro.  Optimal  growth  chitinase production  for  TKR3  fungi  isolate  were  concentration  of  chitin  0,2% (b/v), pH 5,5, temperature 30ºC, agitation 150 rpm and incubation time at four  days.  The  optimum  yield  of  chitinase  production  is  influenced  by fungal species and environmental conditions.
Keywords : chitinase enzyme, chitinolytic fungi, rhizosphere.

## PENDAHULUAN
Rizosfer  adalah  tanah  di  sekitar  akar tanaman  (beberapa  mm)  yang  memiliki aktivitas  mikrobiologi  lebih  besar  dari  pada daerah  yang  jauh  dari  akar  tanaman (Simarmata et al ., 2007). Tanah yang banyak mengandung bahan organik tinggi merupakan habitat yang cocok bagi pertumbuhan  jamur.  Jamur  mempunyai peranan yang penting dalam proses degradasi bahan-bahan  organik  di  tanah  seperti selulosa, lignin ataupun kitin. Kitin merupakan biopolimer kedua di alam setelah selulosa  dan  senyawa  ini  dapat  ditemukan pada  cangkang  kepiting,cangkang  udang, moluska,  nematoda,  alga  dan  dinding  sel jamur.
Kitin pada jamur merupakan komponen utama penyusun dinding sel jamur kelas  Ascomycetes,  Basidiomycetes  dan Deuteromycetes . Kandungan  kitin  pada jamur  bervariasi  tergantung  spesies  atau
strain jamurnya. Kitin pada dinding sel jamur berkisar antara 22 - 40% (Muzzarelli, 1985).
Beberapa  genera  jamur  yang  mampu menghasilkan  enzim  kitinase  diantaranya adalah Fusarium , Mucor , Mortierella ,
Trichoderma , Aspergillus , Gliocladium ,
Penicillium , Thamnidium dan Absidia (Alexander,  1990), Stachbotrys  elegans (Tweddell et al ., 1994), Verticillium biguttatum (McQuilken dan Gemmell, 2004) dan Trichothecium  roseum (Li et  al .,  2004). Kitinase (Poli {1,4- ß [2 asetamido-2-deoksi- D-glukosamine]}  glikano  hidrolase)  adalah enzim  yang  menghidrolisis  ikatan ß -1,4- asetamido-2-deoksi-Dglikosida dari kitin dan kitodekstrin  (Bielka et  al .,  1984).  Enzim kitinase  dapat  dimanfaatkan  sebagai  agens pengendalian jamur patogen tanaman ataupun agen pengurai limbah berkitin.
Kitinase jamur bersifat  aktif pada pH asam,  memiliki  temperatur  optimal  yang tinggi,  mempunyai  berat  molekul  lebih  dari
30.000  Daltons,  tingkat  kestabilan  yang tinggi  dan  mempunyai  endokitinase  dan eksokitinase  (Sahai  dan  Manocha,  1993). Beberapa  hasil  penelitian  sampai  saat  ini mengindikasikan  bahwa  ekspresi  enzim kitinolitik  bersifat  indusibel.  Pada  umumnya ekspresi enzim akan meningkat dengan cepat apabila  pada  medium  tumbuh  mengandung kitin  sebagai  satu-satunya  sumber  karbon, yang  dapat  berbentuk  kitin  murni  atau turunannya,  dinding  sel  dan  miselium  jamur patogen.  Induksi  tidak  terjadi  bila  jamur ditumbuhkan dalam medium yang mengandung  glukosa  dan  beberapa  gula sederhana yang lain (Harman et al ., 1993).
Diasetilkitobiose  merupakan  substrat yang  baik  untuk ß -N-asetilheksosamidinase tetapi tidak dapat didegradasi oleh endokitinase maupun kitobiosidase, sehingga dapat digunakan untuk membedakan aktivitas  endokitinase  atau  kitobiosidase  dan ß -N-asetilheksosamidinase. Dasar inilah yang  digunakan  oleh  Harman et  al .,  (1993) untuk  memakai  koloidal  kitin  sebagai substrat  dalam  optimalisasi  produksi,  uji aktivitas  dan  purifikasi  enzim  endokitinase. Mengingat  manfaat  enzim  kitinase  yang cukup  penting  sebagai  agen  pengendali hayati,  maka  penelitian  ini  bertujuan  untuk mengkaji  optimalisasi  aktivitas  produksi enzim  kitinase  pada  isolat  jamur  kitinolitik hasil isolasi dari sampel tanah rizosfer.

## METODE PENELITIAN
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium  PAU  Universitas  Gadjah Mada,  Yogyakarta.  Bahan  yang  digunakan untuk  uji  optimalisasi  adalah  isolat  jamur kitinolitik  unggul  (TRK3)  hasil  seleksi  dari isolasi  sampel  tanah  yang  berasal  dari  tanah rizosfer tanaman kentang dan cabai.

## Cara kerja
Preparasi  Kitin . Preparasi  atau  pembuatan koloidal  kitin  dilakukan  menurut  metode Vessey dan  Pegg  (1973)  yang  dimodifikasi. Isolasi  Jamur  Kitinolitik . Sampel  isolat jamur  kitinolitik  dilarutkan  dalam  aquades steril  dan  dibuat suspensi  dengan  tingkat pengenceran  10 -1 -10 -5 ,  kemudian  0,1  ml suspensi  pada  tingkat  pengenceran  10 -2 -10 -5 diinokulasikan  pada  medium  kitin agar. Inokulasi dilakukan dengan dua kali pengulangan.  Biakan  diinkubasi  selama 7 hari pada temperatur 30°C.
Optimalisasi  produksi  kitinase (Singh et al ., 1999). Isolat terpilih ditumbuhkan dalam medium  kitin  cair  dengan  berbagai  variasi kondisi meliputi konsentrasi kitin 0,2% (b/v), pH  5,5  ,  temperatur  inkubasi  30°C,  agitasi 150 rpm dan  waktu  inkubasi  7  hari. Optimalisasi  dilakukan  secara  bertahap  dan untuk  setiap  tahap  diukur  aktivitas  enzim, kadar protein total dan berat kering miselium. Konsentrasi  kitin . Variasi  konsentrasi  kitin yang  digunakan  adalah  0,1;  0,2  dan  0,3% (b/v). Konsentrasi  inokulum  dan  pH  yang digunakan adalah hasil optimalisasi sebelumnya dan waktu inkubasi 7 hari.
pH  medium . Variasi  pH  yang  digunakan adalah  4;  4,5;  5;  5,5;  6;  6,5;  7  dan  8. Konsentrasi inokulum yang digunakan adalah hasil optimalisasi sebelumnya, sedangkan  kondisi  lain  adalah  konsentrasi kitin  0,2%  (b/v)  dan  waktu  inkubasi  7 hari. Temperatur  inkubasi . Variasi  temperatur yang  digunakan  adalah  30°C  dan  37°C. Konsentrasi  inokulum,  pH  dan  konsentrasi kitin yang digunakan adalah hasil optimalisasi  sebelumnya  dan  waktu  inkubasi 7 hari.
Agitasi . Variasi  agitasi  yang  digunakan adalah  125,  150  dan  175 rpm .  Konsentrasi inokulum, pH, konsentrasi kitin dan temperatur  inkubasi  yang  digunakan  adalah
hasil  optimalisasi  sebelumnya  dan  waktu inkubasi 7 hari.
Waktu  inkubasi .  Pengamatan  dilakukan secara periodik setiap 24 jam selama 10 hari.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Konsentrasi kitin
Substrat  kitin  yang  digunakan  pada penelitian  ini  dalam  bentuk  koloidal  kitin, yang merupakan substrat yang dapat digunakan untuk menginduksi enzim kitinase
kompleks  seperti  endokitinase,  kitobiosidase dan  N-asetilglukosamin  (Haran et  al .,  dan Chernin et  al .,  1995).  Variasi  konsentrasi kitin  yang  digunakan  pada  optimalisasi adalah  0,1;  0,2  dan  0,3%  (b/v).  Kondisi pertumbuhan lainnya adalah pH 5,5; temperatur  30 o C,  agitasi  150 rpm dan  waktu inkubasi  7  hari.  Aktivitas  spesifik  kitinase yang  diperoleh  dari  optimalisasi  konsentrasi kitin  0,1;  0,2  dan  0,3%  (b/v)  adalah 131,6458; 1496,0610 dan 319,4800 U/mg.

## Gambar  1.  Pengaruh  konsentrasi  kitin  terhadap  aktivitas  spesifik  kitinase  dan  berat  kering  miselium isolat jamur TRK3
Hasil optimalisasi menunjukkan bahwa konsentrasi kitin berpengaruh terhadap  aktivitas  spesifik  kitinase.  Pada konsentrasi  kitin  0,1%  diduga  ketersediaan substrat  belum  cukup  untuk  menginduksi kitinase sehingga perombakan substrat belum maksimum. Akibatnya aktivitas spesifik juga masih  belum  maksimum  dibandingkan  pada konsentrasi  kitin  0,2%.  Aktivitas  enzim kitinase  yang  bervariasi  erat  kaitannya dengan ketersediaan substrat didalam medium  pertumbuhannya  (Wahyudi et  al .,
2005). Apabila substrat  cukup tersedia maka enzim kitinase akan dipacu untuk melakukan perombakan substrat.

## pH medium
Variasi pH 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7 dan 8.  Konsentrasi  kitin  0,2%  (b/v),  temperatur 30 o C,  agitasi  150 rpm dan  waktu  inkubasi  7 hari.  Aktivitas  spesifik  kitinase  tertinggi diperoleh  pada  pH  medium  5,5  yang merupakan  pH  optimum  kitinase  dalam mengkatalisis hidrolisis kitin untuk menghasilkan produk maksimum.

## Gambar  2.  Pengaruh  pH  medium  terhadap  aktivitas  spesifik  kitinase  dan  berat  kering  miselium  isolat jamur TRK3
Enzim  yang  dihasilkan  oleh  jamur pada  umumnya  mempunyai  pH  optimal antara  5  dan  5,5  (Deacon,  1984),.  pH medium  pertumbuhan  akan  berpengaruh pada  permeabilitas  membran  sitoplasmik dalam proses pengangkutan nutrien dan pada reaksi  enzim.  Pada  saat  pH  optimum,  enzim akan  mempunyai  konformasi  sisi  aktif  yang sesuai  dengan  substrat  yang  mengakibatkan terbentuknya  kompleks  enzim  substrat  yang maksimal  sehingga  menghasilkan  produk yang paling besar. Produk-produk pemecahan  kitin  akan  dimanfaatkan  oleh jamur untuk pertumbuhannya. Hal ini terlihat dari  berat  kering  miselium  yang  mencapai berat  maksimum  2,7000  mg/ml  pada  saat aktivitas  spesifik  kitinase  mencapai  hasil optimal.
Hasil pH optimum 5,5 yang cenderung  asam  ini  juga  didukung  oleh beberapa hasil penelitian sebelumnya.
Produksi  kitinase  akan  meningkat  pada  pH asam  (pH  5,5)  (Elad et  al .,  1983).  pH  asam juga dilaporkan merupakan parameter pertumbuhan  yang  penting  untuk  produksi kitinase  dalam  mekanisme  mikoparasitisme Trichoderma  harzianum .  Dalam  penelitian yang  dilakukan  oleh  Sandhya et  al .,  (2004) didapatkan  hasil  bahwa  produksi  maksimum kitinase Trichoderma  harzianum diperoleh pada pH 5,5.
Temperatur inkubasi
Optimasi temperatur terhadap produksi  kitinase  dilakukan  pada  temperatur 30 o C  dan  37 o C,  pH  5,5;  konsentrasi  kitin 0,2%  (b/v),  agitasi  150 rpm dan  waktu inkubasi  7  hari.  Aktivitas  spesifik  kitinase pada  temperatur  30 o C  dan  37 o C  adalah 1408,4507  dan  166,2061  U/mg.  Hasil optimalisasi  menunjukkan  bahwa  aktivitas spesifik  kitinase  dan  pertumbuhan  jamur menurun dengan meningkatnya temperatur.
Gambar  3.  Pengaruh  temperatur  terhadap  aktivitas  spesifik  kitinase  dan  berat  kering  miselium  isolat jamur TRK3
Pengaruh
temperatur pada pertumbuhan  jamur  berhubungan  dengan aktivitas  enzim.  Aktivitas  enzim  akan semakin  meningkat  seiring  dengan  kenaikan temperatur sampai tingkat optimal, kemudian akan menurun. Pada temperatur 30 o C diduga hampir  semua  substrat  bereaksi  dengan enzim  yang  menghasilkan  produk  maksimal, sehingga  aktivitas  spesifik  kitinase  menjadi optimal.  Aktivitas  spesifik  kitinase  pada temperatur 37 o C menurun. Hal ini dikarenakan kenaikan temperatur yang melampaui temperatur optimal menyebabkan kerusakan  pada  gugus  aktif  enzim  (terjadi denaturasi),  sehingga  enzim  mengalami hambatan dalam berinteraksi dengan substrat yang  menyebabkan  menurunnya  aktivitas
katalitik  enzim  (Murray et  al .,  1997). Sebagian besar enzim mempunyai temperatur optimal  yang  sesuai  dengan  temperatur  asal mikroorganisme.  Sebagian  besar  jamur adalah  mesofilik  dengan  temperatur  optimal untuk  pertumbuhan  20 o C  -  35 o C  (Deacon, 1984).
Agitasi
Sebagian  besar  jamur  bersifat  aerob yang membutuhkan oksigen untuk pertumbuhannya.  Suplai  oksigen  dalam medium pertumbuhan dapat dilakukan dengan  agitasi.  Aktivitas  spesifik  kitinase yang diperoleh dari hasil optimalisasi  agitasi pada  kecepatan  125,  150  dan  175 rpm berturut-turut adalah 230,6012; 442,2963 dan 88,9483 U/mg.
Gambar 4. Pengaruh agitasi terhadap aktivitas  spesifik  kitinase dan  berat  kering  miselium  isolat jamur TRK3
Agitasi  mempunyai  peranan  yang penting  dalam  fermentasi  substrat  cair  untuk percampuran nutrien dalam medium, transfer oksigen dan transfer panas. Agitasi juga akan menyebabkan  kontak  jamur  dengan  substrat menjadi  lebih  homogen,  sehingga  akan mempercepat  perombakan  substrat  (Cui et al .,  1997).  Pada  agitasi  dengan  kecepatan rendah  menyebabkan  percampuran  nutrien dan  transfer  oksigen  kurang  merata  karena miselium  jamur  akan  tumbuh  berbentuk berupa  suatu  lapisan,  yang  semakin  lama menjadi  tebal  (Gandjar et  al .,  2006), sehingga kurang mendukung bagi pertumbuhan jamur yang akan mengakibatkan penurunan aktivitas kitinase.
Peningkatan kecepatan agitasi memang  akan  meningkatkan  percampuran nutrien  dan  transfer  oksigen,  akan  tetapi dapat  menyebabkan  perubahan  morfologi seperti fragmentasi pada miselium, vakuolasi,  autolisis  dan  pecahnya  sel. Akibatnya pertumbuhan jamur tidak sempurna  sehingga  produksi  kitinase  juga menurun (Cui et al ., 1997). Pada optimalisasi agitasi  terhadap  aktivitas  kitinase  yang dilakukan  Liu et  al .,  (2003),  menunjukkan
bahwa agitasi dengan kecepatan 225 dan 300 rpm menghasilkan  aktivitas  kitinase  yang rendah.  Pada  penelitian  ini  dipilih  agitasi dengan kecepatan 150 rpm yang menghasilkan  aktivitas  spesifik  kitinase tertinggi.
Waktu inkubasi
Optimalisasi waktu inkubasi dilakukan  selama  10  hari.  Hasil  optimalisasi menunjukkan bahwa aktivitas enzim spesifik kitinase dan berat kering miselium dipengaruhi  oleh  waktu  inkubasi.  Aktivitas spesifik  kitinase  dan  berat  kering  miselium dari  hari  ke  0  akan  meningkat  sampai  hari keempat, kemudian akan mengalami penurunan  mulai  hari  kelima  sampai  hari kesepuluh.  Pada  hari  ke  0  jamur  belum menghasilkan  kitinase  karena  jamur  belum menunjukkan adanya pertumbuhan.
Kitinase  mulai  dihasilkan  sesudah inkubasi  1  hari  dengan  aktivitas  spesifik kitinase  160,2426  U/mg.  Pada  hari  ke  4, aktivitas  spesifik  kitinase  dan  berat  kering miselium jamur  mencapai hasil yang tertinggi  berturut-turut  yaitu  587,7950  U/mg dan 2,7450 mg/ml.

## Gambar 5. Pengaruh waktu inkubasi terhadap aktivitas spesifik kitinase dan berat kering miselium isolat jamur TRK3
Waktu  inkubasi  isolat  jamur  TRK3 menghasilkan  aktivitas  kitinase  dan  berat kering  miselium  tertinggi  berhubungan dengan pertumbuhan jamur yang berada pada fase  logaritma.  Pada  fase  ini  sel-sel  akan tumbuh  dan  membelah  secara  eksponensial sampai  mencapai  jumlah  maksimum  sesuai dengan  kondisi  lingkungannya.  Semakin banyak  jumlah  jamur  yang  tumbuh  maka kemampuan merombak kitin menjadi senyawa  yang  lebih  sederhana  menjadi meningkat. Hal ini dapat dilihat dari aktivitas spesifik kitinase yang tinggi.
Pada  hari  ke  5  sampai  10,  produksi kitinase mengalami  penurunan  yang  ditandai dengan menurunnya aktivitas spesifik kitinase.  Hal  ini  disebabkan  karena  jumlah sel yang hidup mulai berkurang, metabolisme dan  pertumbuhan  sel  mulai  mengalami penurunan  dikarenakan  makin  berkurangnya substrat.  Selain  itu  dimungkinkan  oleh adanya  produk  akhir  yang  berakibat  pada terhambatnya aktivitas kitinase dalam memecah substrat.

## SIMPULAN DAN SARAN
Pada  penelitian  ini  aktivitas  produksi kitinase jamur TRK3 yang optimum diperoleh  pada  konsentrasi  kitin  0,2%  (b/v), pH  optimal  5,5,  temperatur  30ºC,  agitasi dengan  kecepatan  150  rpm,  dan  waktu inkubasi  optimal  adalah  pada  hari  keempat. Berdasarkan  hasil  optimalisasi  produksi kitinase  diketahui  bahwa  kemampuan  jamur dalam memproduksi enzim selain ditentukan oleh  spesies  jamur,  juga  sangat  dipengaruhi oleh  kondisi  lingkungan  tempat  tumbuh. Pada  kondisi  optimal  diduga  hampir  semua substrat  bereaksi  dengan  enzim  sehingga menghasilkan produk yang maksimal.

## RUJUKAN
Alexander,  M.  1990. Introduction  to  Soil Microbiology .  John  Wiley  and  Sons Inc, New York.
Bielka,  H.,  H.B.F.  Dixon,  P.  Karlson,  C.
Liebeeg, N. Sharon, F.J. Van  Lenten, S.F.  Velix,  J.F.G.  Vliegenhart  and E.C. Webb.
1984. Enzymes
Nomenclature .  Academic  Press  Inc,
New York. Cui,  Y  Q.,  Van  der  Lans,  R.G.J.M  and Luyben,  K.C.A.M.  1997.  Effect  of Agitation Intensities on Fungal Morphology of Submerged
Fermentation. Biotechno. Bioeng . 55 : 715 - 726.
Deacon,  J.W.  1984. Introduction  to  Modern
Mycology . Blackwell Scientific Publications, London.
Elad,  Y.,  I.  Chet,  P.  Boyle  and  Y.  Henis.
1983. Parasitism of Trichoderma spp. on Rhizoctonia  solani and Sclerotium rolfsii . Phytopathology . 73: 85 - 88. Gandjar,  I.,  W.  Sjamsuridzal  and  A.  Oetari. 2006. Mikologi  Dasar  dan  Terapan . Yayasan Obor Indonesia, Jakarta. Haran, S., H. Schickler, A. Oppenheim and I.
Chet.  1995.  New  Components  of Chitinolytic  System  of Trichoderma harzianum . Mycol.  Res .  94  :  441  - 446.
Harman,  G.E.,  C.K.  Hayes,  M.  Lorito,  R.M. Broadway, A. Di Pietro, C.
Peterbauer  and  A.  Tronsmo.  1993. Chitinolytic Enzymes of Trichoderma harzianum : Purification of
Chitobiosidase  and  Endochitinase. Phytopathology . 83 (3) : 313 - 318. Li,  D.C.,  S.H.  Zhang,  K.Q.  Liu  and  J.  Lu. 2004. Purification and Partial Characterization  of  A  Chitinase  from the Mycoparasitic Fungus Trichothecium  roseum . J.  Gen.  Appl. Microbiol . 50 : 35 – 39.
Liu,  B.L., P.M. kKao, Y.M. Tzeng and K.C. Feng.  2003  Production  of  Chitinase from Verticillium  lecanii F091  Using Submerged  Fermentation.  Enzyme
Microb. Technol . 33 : 410 - 415.
McQuilken,  M.P  and  J.  Gemmell.  2004.
Enzyme Production by the Mycoparasite Verticillium  biguttatum against Rhizoctonia solani . Mycopathologia . 157 : 201 - 204.
Murray, R.K., D.K. Granner, P.A. Mayes and V.W. Rodwell. 1997. Biokimia Harper .  Penerbit  Buku  Kedokteran EGC, Jakarta.
Muzzarelli,  R.A.A.  1985.  Chitin.  In  G.  O. Aspinal  (Ed). The  Polysaccharides .
Volume  3.  Academic  Press  Inc,  New York.
Sahai,  A.S  and  M.S.  Manocha.  1993. Chitinases of Fungi and Plants : Their Involvement  in  Morphogenesis  and Host  Parasite  Interaction. FEMS Microbiol. Rev . 11 : 317 - 338. Sandhya,C., L.K. Adapa, K.M. Nampoothiri,
P.  Binod,  G.  Szakacs  and  A.  Pandey. 2004. Extracellular Chitinase
Production  by Trichoderma harzianum in  Submerged  Fermentation. J.  Basic Microbiol . 44 (1) : 49 -58.
Simarmata,  R.,  Lekatompessy,  S.  and Sukiman,  H.  2007.  Isolasi  Mikroba Endofitik dari Tanaman Obat Sambung
Nyawa  ( Gynura  procumbens) dan Analisis Potensinya Sebagai Antimikrobia. Jurnal Penelitian Berkala Hayati : 13 (85-90).
Singh,  P.  P.,  YC.  Shin,  C.S.  Park  and  Y.R. Chung.  1999.  Biological  Control  of Fusarium Wilt  of  Cucumber  by Chitinolytic  Bacteria. Phytopathology . 89 (1) : 92 - 99.
Tweddell,  R.J.,  S.H.  Jabaji-Share  and  P.M.
Charest. 1994. Production of Chitinases  and  â-1-3  Glukanases  by Stachybotyrs  elegans a  Mycoparasite of Rhizoctonia  solani . Appl.  Environ. Microbiol .  489  -  495.  Vessey,  J.C  and G.F.  Pegg.  1973.  Autolysis  and Chitinase  Production  in  Cultures  of Verticillium  albo-atrum . Trans.  Br. Mycol. Soc . 60 : 133 - 134.
Wahyudi,  P.,  U.  Suwahyono,  Harsoyo,  A. Mumpuni dan D. Wahyuningsih. 2005. Pengaruh  Pemaparan  Sinar  Gamma Isotop  Cobalt-60  Dosis  0,25-1kGy terhadap Daya Antagonistik Trichoderma harzianum pada Fusarium oxysporum.  Berk.  Penel.
Hayati . 10 : 143 - 151.