Uji Sitotoksik Ekstrak Etanol Daun Stevia ( Stevia Rebaudiana Bertoni) pada Kultur Sel Hela
Cytotoxic Test of Ethanol Extract of Stevia Leaves ( Stevia Rebaudiana Bertoni) in Hela Cell Culture
Ghani Nurfiana Fadma Sari, Endang Sri Rejeki Program Studi S1 Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Setia Budi *email : ghani.nurfiana@rocketmail.com
(diterima tanggal 09-07-2020, disetujui tanggal 19-10-2021)

## INTISARI
Di Indonesia kanker serviks menempati urutan kedua setelah kanker payudara yang dialami oleh wanita. Stevia secara umum merupakan tanaman yang dimanfaatkan sebagai pemanis rendah kalori. Stevia diduga memiliki beberapa senyawa aktif yang menghasilkan kerja fisiologis pada tubuh manusia salah  satunya  mampu  menghambat  pertumbuhan  sel  kanker.  Tujuan  dari  penelitian  ini untuk mengetahui efek sitotoksik ekstrak etanol daun stevia terhadap sel HeLa dengan menentukan nilai IC 50 . Ekstraksi daun stevia dilakukan dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanol 96%. Ekstrak etanol daun stevia diuji efeknya terhadap sel HeLa menggunakan metode MTT. Cisplastin (Kalbe)  digunakan  sebagai  kontrol  positif.  Respon  serapan  uji  dikonversikan  kedalam  rumus viabilitas  sel.  Nilai  IC 50 dihitung  menggunakan  persamaan  regresi  linear  hubungan  antara  log konsentrasi sampel uji dengan persen viabilitas sel HeLa.
Hasil uji efek sitotoksik ekstrak etanol daun stevia terhadap sel HeLa berdasarkan metode MTT diperoleh nilai IC 50 sebesar 511,07 µg/mL. Dapat disimpulkan bahwa ekstrak etanol daun stevia tidak bersifat toksik pada sel HeLa.
Kata kunci : Stevia rebaudiana ; sel HeLa; sitotoksik

## ABSTRACT
In Indonesia, cervical cancer is the second most common cancer among women after breast cancer. Stevia is generally a plant that is used as a low-calorie sweetener. Stevia is believed to contain a number of active compounds that serve physiological functions in the human body, one of which is able to inhibit cancer cell growth. The aim of this study is to determine the cytotoxic effect of ethanol extract of stevia leaves on HeLa cells by determining the IC 50 value.
The maceration method was carried out to extract the stevia leaves with ethanol 96% as the solvent. The MTT method was utilized to test the effect of an ethanol extract of stevia leaves on HeLa cells. Meanwhile, Cisplastin (Kalbe) was used as a positive control. The test's absorption response was  converted  into  a  cell  viability  formula.  The  linear  regression  equation  for  the  relationship between the log of the test sample concentration and the percentage viability of HeLa cells was used to calculate the IC 50 value.
Based on the MTT method, the result of cytotoxic effect test of ethanol extract of stevia leaves on HeLa cells obtained an IC 50 value of 511.07 µg/mL. It can be concluded that ethanol extract of stevia leaves was found to be non-toxic to HeLa cells.
Keyword : Stevia rebaudiana ; HeLa cells; cytotoxicity

## 1. PENDAHULUAN
Usaha untuk menemukan dan mengembangkan agen antikanker yang aman dan efektif sangat dibutuhkan. Upaya tersebut dapat melalui penelitian-penelitian dengan memanfaatkan bahan dari alam yang berkhasiat  untuk antikanker. Stevia adalah tanaman    tradisional    yang    memiliki   khasiat   sebagai   antikanker .
Stevia ( Stevia rebaudiana Bertoni) adalah salah satu jenis tumbuhan tahunan dari family Asteraceae yang merupakan tanaman perdu dengan tinggi 60-90 cm dan daun panjangnya sekitar 3-7 cm, mempunyai banyak cabang. Stevia mengandung diterpen,  triterpen,  tannin,  stigmasterol,  minyak  yang  mudah  menguap,  dan diterpen glikosida. Tingkat kemanisan Stevia  200 sampai 300 x gula sukrosa [1]. Penelitian lain menyebutkan ekstrak daun stevia mengandung senyawa bukan gula yang larut pada pelarut polar yaitu klorofil, alkaloid, tanin, steroid, flavonoid, dan makromolekul [2]. Daun stevia mengandung senyawa glikosida yaitu steviosida 5- 10%  dan  rebaudiosida  A  2-4%  yang  masing-masing  mempunyai  kemanisan  110- 270 dan 140-400 kali dari sukrosa [3]. Daun stevia walau memiliki rasa manis, tapi juga  memiliki  rasa  pahit  setelah  dikonsumsi.  Hal  ini  sebanding  dengan  adanya kandungan polifenol sebesar 4,15% dari berat kering daun stevia [4].
Beberapa  penelitian  menyebutkan  bahwa  steviosida  yaitu  rebaudiosida  A, steviol,  dan  isosteviol  selain  memiliki  rasa  manis  juga  mempunyai  khasiat antihiperglikemia,  antihipertensi,  antiinflamasi,  antioksidan,  antitumor,  antidiare, diuretik, dan immunomodulator [5].  Menurut Tadhani et al . [6] daun stevia kering mengandung fenolik total sebesar 25.18 mg/g, senyawa flavonoid 21.73 mg/g, dan antioksidan total (TAC) antara 9.66 - 38.24 mg eq ekstrak dalam pelarut air serta 11.03 - 36.40 mg eq ekstrak dalam pelarut metanol.
Stevia  merupakan  sumber  antioksidan  alami  yang  mengandung  senyawa opigenin,  kaempferol,  dan  quereitrin  yang  dapat  menghambat  kerusakan  rantai DNA. Isosteviol adalah turunan dari stevioside mampu menghambat pembentukan reactive oxygen species (ROS) [7].  Produksi  radikal bebas turunan  oksigen yang tidak seimbang dapat menyebabkan berbagai penyakit seperti kanker. Mekanisme perlindungan antioksidan menjadi tidak seimbang karena berbagai faktor misalnya penurunan fungsi fisiologis menyebabkan penyakit kanker. Daun stevia sangat kaya akan  senyawa  terpenoid  dan  flavonoidnya  sehingga  memiliki  keefektifan  untuk digunakan sebagai pengobatan [8].
Menurut  Jayarahman et  al .  [9]  ekstrak  aceton  daun  stevia  mempunyai aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker HEp2 tetapi tidak bersifat toksik pada sel normal (Sel Vero). Menurut penelitian sebelumnya [10] senyawa steviol dalam daun stevia mempunyai aktivitas sitotoksik dengan nilai IC 50 185 µM terhadap sel MCF-7, sehingga  memiliki  potensi  untuk  dikembangkan  lebih  lanjut  terhadap  sel  kanker lain.  Mekanisme  kerja  dari  steviol  yaitu  menghambat  pertumbuhan  sel  kanker dengan  cara  menekan  viabilitas  sel  dan  menghentikan  siklus  sel.  Pada  dosis tertentu,  senyawa  steviol  dapat  menghambat  proliferasi  sel  MCF-7  dengan  cara menginduksi apoptosis dalam mitokondria [10].
Penelitian ini menggunakan etanol pada proses ekstraksi. Menurut Yulianti et.al [11]  semakin  tinggi  konsentrasi  etanol  maka  semakin  banyak  senyawa  gula yang terekstraksi. Senyawa gula mudah larut pada pelarut etanol, jika konsentrasi etanol  yang  digunakan  semakin  tinggi  maka  senyawa  yang  mudah  larut  dalam etanol lebih banyak yang terekstraksi. Senyawa gula yang dimaksudkan dalam daun stevia ini yaitu stevioside dan rebaudiosida. Menurut Isdianti [2], air dan alkohol adala pelarut yang paling sesuai untuk mengekstraksi daun stevia.
Beberapa  tahun  terakhir  tidak  banyak  ditemukan  penelitian  aktivitas antikanker dari daun stevia ini padahal beberapa senyawa aktif dari dari daun stevia mempunyai potensi sebagai agen anti kanker. Latar belakang itulah yang menjadi alasan dilakukan penelitian ini. Tujuan dilakukan penelitian ini adalah mengetahui aktivitas  sitotoksik ekstrak  etanol  daun  stevia  terhadap  sel  kanker  serviks menggunakan  metode  MTT  pada  kultur  sel  HeLa  yang  ditunjukkan  dengan parameter IC 50 . Pengujian sitotoksik ekstrak tersebut terhadap sel HeLa selama ini belum dilakukan.

## 2. METODE PENELITIAN

## 2. 1. ALAT DAN BAHAN
Bahan  penelitian  yang  digunakan  yaitu  daun  stevia,  etanol  96%  (Merck), kultur  sel  HeLa,  DMEM  (Merck),  fungizon  (Merck),  Dimethil  Sulfoxide  (DMSO) (Merck), Phospat Buffer Saline (PBS) (Merck), Fetal Bovine Serum (FBS) (Merck), Methyl-Thiazolyl-Tetrazolium  (MTT)  (Merck),  Tripsin  (Merck),  Sodium  Dodesil Sulfat (SDS) (Merck), 1% HCl 0,1N (Merck), serta Cisplastin (Kalbe).
Alat  yang  dipakai  dalam  penelitian  ini  adalah  plate  96  wells  (Biologix), inkubator  CO 2 (Biobase),  inverted  microscope  (Olympus),  serta  ELISA  reader (Drawel).

## 2. 2. CARA KERJA
Membuat  ekstrak  daun  stevia.  Serbuk  daun  stevia  1  kg  dimasukkan  alat maserasi, kemudian ditambahkan 10 L  etanol 96%. Serbuk direndam 6 jam sambil sekali diaduk, didiamkan selama 18 jam. Hasil maserasi yang diperoleh dipisahkan. Pengendapan,  sentrifugasi,  dekantasi,  atau  filtrasi  adalah  cara  pemisahan  yang dapat dilakukan. Penyarian diatas diulangi dengan cara yang sama menggunakan pelarut setengah dari pelarut pertama yaitu sebanyak 5 L etanol 96%.  Maserat yang diperoleh  dikumpulkan  jadi  satu,  kamudian  diuapkan  menggunakan  rotary evaporator sampai diperoleh ekstrak kental [12].
Skrining  fitokimia  ekstrak  daun  stevia.  Pengujian  senyawa  kimia  ekstrak daun  stevia  dilakukan  adalah  senyawa  flavonoid,  alkaloid,  saponin,  tanin,  dan triterpenoid. Pengujian dilakukan menggunakan pereaksi kimia yang sesuai dengan masing-masing uji.
Uji  sitotoksik  terhadap  sel  HeLa.  Larutan  uji  sebanyak  100  μL  disuspensi dengan  100  μL  sel  dalam  medium  DMEM  untuk  sel  HeLa  (kepadatan  2  x  10 4 sel/sumuran).  Sampel  dimasukkan  dalam microplate 96.  Sel  diinkubasi  dalam inkubator CO 2 5 % selama 24 jam. Sampel dibuat seri konsentrasi 500; 250; 125;
62,5; 31,25; 15,6 μg/mL kemudian dimasukkan dalam plate .  Kontrol positif yang digunakan adalah Cisplatin. Kontrol positif dibuat seri konsentrasi 100; 50; 25; 12,5; 7,125 µg/mL dan kontrol negatif menggunakan kontrol sel. Plate diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 24 jam dalam inkubator CO 2 5 %. Sel HeLa yang bereaksi dengan MTT akan membentuk warna ungu (formazan), selanjutnya media sel dibuang dan ditambahkan  100  μL  reagen  MTT  pada  setiap  sumuran,  termasuk  kontrol  media (tanpa  sel).  Semua  sel  yang  sudah  dilakukan  perlakuan  selanjutnya  diinkubasi selama  4  jam,  dan  ditambahkan  100  μL  SDS  10  %  untuk  menghentikan  reaksi. Selanjutnya serapan dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm [13].
Hasil  uji  sitotoksik  pada  sel  HeLa  didapatkan  data  absorbsi.  Persamaan regresi linear y = bx+a diperoleh dari log konsentrasi dengan persen sel hidup. IC 50 dapat dihitung dengan cara mensubtitusi nilai 50 pada Y sehingga didapatkan nilai x  dimana  nilai  IC 50 adalah  antilog  x.  Persentase  inhibisi  dapat  dihitung menggunakan rumus persamaan 1.
𝐏𝐫𝐨𝐬𝐞𝐧𝐭𝐚𝐬𝐞 𝐬𝐞𝐥 𝐡𝐢𝐝𝐮𝐩  = (𝐀𝐛𝐬𝐨𝐫𝐛𝐚𝐧𝐬𝐢 𝐩𝐞𝐫𝐥𝐚𝐤𝐮𝐚𝐧 –  𝐀𝐛𝐬𝐨𝐫𝐛𝐚𝐧𝐬𝐢 𝐤𝐨𝐧𝐭𝐫𝐨𝐥 𝐦𝐞𝐝𝐢𝐚) (𝐀𝐛𝐬𝐨𝐫𝐛𝐚𝐧𝐬𝐢 𝐤𝐨𝐧𝐭𝐫𝐨𝐥 𝐬𝐞𝐥 –  𝐀𝐛𝐬𝐨𝐫𝐛𝐚𝐧𝐬𝐢 𝐤𝐨𝐧𝐭𝐫𝐨𝐥 𝐦𝐞𝐝𝐢𝐚) 𝒙 𝟏𝟎𝟎%
Persamaan 1. Persamaan pengukuran persentase sel hidup aktivitas sitotoksik

## 3. HASIL DAN PEMBAHASAN
Proses ekstraksi pada penelitian ini menggunakan metode maserasi dengan pelarut  etanol  96%,  tujuannya  untuk  menarik  komponen  senyawa  metabolit sekunder dalam daun stevia yang bersifat polar  dan non polar. Steviosida adalah salah satu senyawa dalam daun stevia yang mempunyai kelarutan dalam air-etanol. Hasil rendemen ekstrak daun stevia yang diperoleh sebesar 31,62%. Hasil tersebut tidak  jauh  berbeda  dari  hasil  penelitian  Septiani et.al [14],  diperoleh  rendemen sebesar 33,77% dimana penelitian juga menggunakan cara ekstraksi maserasi serta pelarut etanol 96%. Ekstrak daun stevia memiliki warna ekstrak  hijau tua pekat, kental, rasa manis dan berbau khas. Menurut Mahdani et.al ekstrak stevia memiliki viskositas  4,5  cP,  dan  PH  5,46.  Hal  tersebut  sama  seperti  yang  dijelaskan  oleh Buchori [15] bahwa range pH ekstrak stevia berkisar antara 5-6.

## Gambar 1. Daun stevia
Gambar 2. Ekstrak daun stevia
Maserat  serbuk  daun  stevia  berwarna  coklat  tua.  Maserat  tersebut kemungkinan masih mengandung senyawa yang bukan gula. Hasil maserasi daun stevia dapat dilihat pada gambar 2.
Uji  skrining  fitokimia  ekstrak  daun  stevia  positif  mengandung  golongan alkaloid,  saponin,  flavonoid,  tanin,  dan  triterpenoid.  Dari  hasil  penelitian sebelumnya  menunjukkan  bahwa  senyawa  bukan  gula  (aglikon)  yang  terdapat dalam ekstrak daun stevia yaitu alkaloid, tanin, steroid, flavonoid, dan fenol [16]. Hasil uji skrining fitokimia ekstrak daun stevia dapat dilihat pada tabel 1.
Tabel 1. Hasil uji skrining fitokimia ekstrak daun stevia
Golongan senyawa Prosedur Hasil uji Pustaka Sangi et.al [17] Ket Tanin 5 ml sampel ditambah etanol ditambah besi (III) klorida Warna hijau kehitaman Hasil positif jika warna larutan akan berubah menjadi biru kehitaman atau hijau kehitaman + Saponin 0,05 gram Sampel + aquadest panas, kocok kuat Terbentuk buih Adanya buih yang stabil + Alkaloid Sampel + 5ml aquades + HCl 2M hingga asam, saring. Filtrat + 1mL pereaksi Dragendroff Endapan jingga Hasil positif dengan pereaksi mayer terbentuk endapan putih atau dengan pereaksi dragendorff terbentuk endapan berwarna kuning jingga + Triterpenoid Sampel + Liebermann Bourchard Terbentuk warna merah jingga Hasil positif yaitu terjadinya warna merah jingga atau ungu, sedangkan adanya steroid ditunjukkan dengan adanya warna biru. + Flavonoid Sampel + 5 ml air suling + 0,1 serbuk mg + 1 ml larutan alkohol + asam klorida pekat + amil alkohol Terbentuk warna merah jingga pada lapisan amil alkohol Terbentuk warna merah jingga atau kuning jingga pada lapisan amil alkohol +
Flavonoid  secara  umum  mempunyai  peranan  menghambat  proliferasi  sel kanker  dengan  cara  menginhibisi  aktivitas  protein  kinase  sehingga  menghambat jalur  tranduksi  sinyal  dari  membran  sel  ke  inti  sel  [18].  Golongan  Alkaloid  juga mempunyai mekanisme kerja sebagai antikanker dengan mengaktifkan apoptosis sel  kanker  sehingga  proses  pembelahan  sel  dapat  dikendalikan  [19].  Senyawa terpenoid  memiliki  peranan  dalam  aktivitas  sitotoksik, senyawa  tersebut  mampu menginduksi  kalisium (Ca + )  sehingga mampu  menstimulasi  apoptosis  pada  sel  kanker. Senyawa  steroid  memiliki  aktivitas  memblok  siklus  sel  pada  fase  G2/M  dengan menstabilkan  benang-benang  sponde  pada  fase  mitosis  sehingga  proses  tersebut  bisa terhambat [20].
Pada pengujian aktivitas sitotoksik, sel HeLa yang telah konfluen  memiliki morfologi  yang  berbentuk  bulat  yang  menempel  rapat  pada  dasar  flask  seperti ditunjukkan  pada  gambar  3a.  Ekstrak  yang  sudah  berinteraksi  dengan  Sel  HeLa bentuk morfologinya berubah, terlihat tidak bulat (gambar 3b). Sel HeLa yang telah mati akan berwarna lebih gelap, tidak beraturan dan memiliki kepadatan rendah. Sel HeLa yang hidup memiliki karakteristik lebih padat dan lebih terang. Sel HeLa
yang telah ditambah MTT akan menghasilkan enzim mitokondria reduktase yang selanjutnya akan bereaksi dengan cara mereduksi MTT sehingga membentuk kristal jarum formazan berwarna ungu yang berarti sel tersebut masih hidup (gambar 3c). Kristal jarum farmazan tidak dapat larut dalam air tetapi larut dalam SDS. Kristal formazan tersebut mampu menembus membran sel dan terakumulasi di dalam sel sehat. Sel HeLa yang mati tidak dapat terwarnai oleh MTT sehingga tidak mampu membentuk warna ungu seperti pada sel hidup [21].
Gambar 3. Morfologi Sel HeLa normal tanpa perlakuan (a), Sel HeLa setelah perlakuan dengan konsentrasi 500 µg/mL (b), dan Sel HeLa setelah pemberian MTT membentuk kristal formazan (c).  Keterangan  : (       ) sel hidup, (       ) sel Mati, (       ) kristal formazan.
Hasil  pengujian  dengan  ELISA  reader  menunjukkan  bahwa  persentase  sel HeLa  yang  hidup  akan  terus  menurun  berbanding  terbalik  dengan  kenaikan konsentrasi ekstrak yang diberikan yang artinya semakin besar konsentrasi ekstrak yang diberikan maka persentase kematian sel HeLa semakin meningkat (gambar 4). Nilai  IC 50 dapat  ditentukan  dari nilai  absorbansi  yang  diperoleh  dari  pembacaan dengan ELISA reader. Hasil dari regresi linier diperoleh persamaan y = -41,137x + 161.48 dengan r2 = 0.7117. Dari hasil penelitian dipeoleh nilai IC 50 sebesar 511,07 μg / ml.
Gambar 4. Kurva persen sel hidup sel HeLa vs ekstrak Stevia rebaudiana dengan konsentrasi 500; 250; 125; 62.5; 31,25; 15, 6 µg/mL.
y = -41,137x + 161,48 R² = 0,7117 0 20 40 60 80 100 120 140 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 V Ii ab ili tas se l ( µ g/ ml ) Log Konsentrasi ekstrak Stevia rebaudiana b c
Berdasarkan  penelitian  sebelumnya,  senyawa  steviol  dalam  daun  stevia diketahui  memiliki  nilai  IC 50 185  µM  beraktivitas  sitotoksik  terhadap  sel  kanker payudara  MCF-7.  Steviol  merupakan  aglikon  dari  steviosida  yang  mempunyai potensi  dalam  uji  sitotoksik.  Senyawa  steviol  memiliki  mekanisme  kerja  dalam menekanan  viabilitas  sel  kanker  dan  induksi  apoptosis  dalam  mitokondria  sel kanker.  Pada  pengujian  apoptosis,  senyawa  steviol  pada  konsentrasi  10-250  µM menunjukkan  bahwa  sel  MCF-7  secara  bertahap  meningkat  dalam  keadaan  fase G2/M yang melibatkan jalur pensinyalan dengan ROS artinya sel dalam fase istirahat dan  tidak  mengadakan  replikasi.  Hal  tersebut  bisa  dianggap  bahwa  sel  MCF-7 sedang dalam mengalami proses kematian. Selain itu juga ditemukan kumpulan sel dalam keadaan fase sub-G0/G1, hal tersebut menegaskan bahwa steviol mempunyai peranan dalam menginduksi apoptosis [10].
Senyawa  stevioside  murni  yang  terkandung  dalam  daun  stevia  juga dilakukan  uji  sitotoksik  terhadap  sel  kanker  payudara  pada  sel  MDA-MB-231 diperoleh  sebesar  nilai  IC 50 55  µM  dan  66  µM  SKBR3.  Stevioside  merupakan glikosida  diterpenoid  yang  terdiri  atas  aglikon  (steviol)  dan  3  molekul  glukosa. Stevioside mempunyai mekanisme kerja menghambat proliferasi sel kanker dengan cara  meningkatkan  produksi Bax sehingga  menginduksi  pelepasan  Cytochrom  C dalam  mitokondria  yang  akan  membentuk  kompleks  dengan  APAF-1  ( Apoptotic Protease Activiting Factor-1 ) yang mengaktivasi caspase 3 dan 9 dan menghasilkan proses  apoptosis.  Stevioside  yang  dikombinasi  dengan  obat  5  fluorouracil  juga menunjukkan hasil yg sinergis yaitu memperkuat kerja dari obat kemoterapi pada sel kanker payudara MDA-MB-231 serta SKBR3 [22].
Tabel 2. Hasil rata-rata absorbansi, persentase viabilitas sel HeLa dan nilai IC 50 Konsentrasi sampel (μg/mL) Rata-rata absorbansi Rata-rata viabilitas sel HeLa (%) IC 50 (μg/mL) Ekstrak daun stevia 500 250 125 62,5 31,25 15,62 0,293 ± 0,01 0,664 ± 0,02 0,907 ± 0,03 1,009 ± 0,06 1,024 ± 0,05 1,1048 ± 0,05 22,241± 1,51 71,189 ± 2,35 94,890 ± 4,78 101,331 ± 8,88 104,551 ±7,30 110,863 ± 6,90 511,07 ± 1.62 Cisplatin 100 50 25 12.5 6.25 3,12 0,154 ± 0,01 0,135 ± 0,01 0,208 ± 0,01 0,356 ± 0,01 0,433 ± 0,03 0,480 ± 0,02 8,134 ± 2,09 9,051 ± 1,38 24,053 ± 2,79 59,523 ±8,46 87,797 ± 9,49 102,57 ± 5,33 16,819 ± 1.75
Suatu  ekstrak  yang  didalamnya  mengandung  senyawa  yang  beragam  dan kompleks dapat berinteraksi kuat atau lemah. Interaksi tersebut belum tentu dapat memberikan efek yang sinergis seperti yang diharapkan. Metabolit sekunder yang ada  di  dalam  daun  stevia  bisa  jadi  meniadakan  atau  mengurangi  efektifitas  dari senyawa aktif yang berpotensi sebagai antikanker. Senyawa pengganggu tersebut seperti senyawa klorofil dan tanin yang terkandung dalam daun stevia. Perbedaan
sel  kanker  yang  diuji  dengan  penelitian  sebelumnya  juga  menghasilkan  aktivitas sitotoksik dari daun stevia yang berbeda-beda. Perbedaan tersebut perlu dilakukan lagi penelitian terkait metode ekstraksi yang lain atau menggunakan pelarut yang berbeda untuk memperoleh hasil yang lebih bagus.
Pada  penelitian  ini  dapat  dibuktikan  bahwa  cisplatin  lebih  efektif  dalam menghambat pertumbuhan sel HeLa. Berdasarkan hasil dari Tabel 1, ekstrak daun stevia  memiliki  nilai  IC 50 lebih  besar  dari  kontrol  positif  (Cisplatin)  sehingga cisplatin  lebih  toksik  terhadap  sel  HeLa  daripada  ekstrak  daun  stevia.  Nilai  IC 50 ciplatin yang diperoleh hampir sama dengan penelitian sebelumnya. Pada pengujian sitotoksik fraksi temu  putih terhadap sel HeLa juga menggunakan  kontrol positif cisplatin  dengan  nilai  IC 50 20,823  μg/mL  [23]. Tujuan  menggunakan  kontrol positif adalah untuk mengetahui apakah sampel mempunyai  efek sitotoksik yang sebanding  dengan  kontrol  positif.  Cisplatin  merupakan  obat  sitotoksik  dengan efektivitas tinggi yang bekerja tidak selektif karena menyababkan toksik pada sel kanker  dan  sel  normal,  terutama  sumsum  tulang  belakang  yang  merupakan  sel normal dengan tingkat proliferasi tinggi [24].
Penelitian  lain  menunjukkan  bahwa  ekstrak  aceton  daun  stevia  pada pengenceran pelarut 1:8 yang merupakan konsentrasi efektif  mampu menghambat pertumbuhan sel kanker HEp2 lebih dari 50% dan tidak toksik terhadap sel Vero. Pengenceran  lebih  lanjut  membuat  ekstrak  kurang  berpotensi  ditandai  dengan tingginya nilai viabilitas sel HEp2. Ekstrak aseton menunjukkan aktivitas tertinggi dibandingkan dengan ekstrak etil asetat dan kloroform daun stevia. Pada penelitian tersebut  disebutkan  bahwa  ekstrak  air  daun  stevia  tidak  mempunyai  potensi terhadap sel kanker HEp2 [9].
Dari penelitian tersebut bisa terlihat bahwa perbedaan pelarut dalam proses ekstraksi sangat mempengaruhi hasil uji. Pelarut polar akan menarik senyawa yang bersifat polar. Untuk itu diperlukan beberapa penelitian lanjutan untuk mengetahui efektifitas pelarut pada saat ekstraksi yang memiliki potensi terhadap sel kanker. Berdasarkan  klasifikasi  aktivitas  ekstrak  bersifat  sitotoksik  terhadap  sel  kanker dapat dikategorikan sebagai berikut : kategori sangat kuat bila nilai IC 50 <10 μg/mL, kategori  kuat  bila  nilai  IC 50 adalah  10-100  μg/mL,  kategori  sedang  bila  nilai  IC 50 adalah 100-500 μg/mL dan lemah bila > 500 μg/mL  [25]. Menurut Awik [26] nilai IC 50 <  100  μg/mL  merupakan  agen  antikanker  poten  sedangkan  nilai  IC 50 >  100 µg/mL adalah agen kemopreventif yang poten.

## 4. KESIMPULAN
Hasil uji sitotoksik ekstrak etanol daun stevia sebesar 511,07 μg/mL. Nilai IC 50 tergolong tidak bersifat toksik terhadap sel HeLa.

## 5. DAFTAR PUSTAKA
[1]. Indra, D. S. (2013). Empat Teknik Perbanyakan Tanaman Stevia . Pengawas Benih Tanaman BBPPTP. Surabaya.
[2]. Isdianti,  F.  (2007).  Penjernihan  Ekstrak  Daun  Stevia  (Stevia  rebaudiana Bertoni)  Dengan  Ultrafiltrasi  Aliran  Silang.  [Skripsi].  Fakultas  Teknologi Pertanian. Institut Pertanian Bogor. Bogor
[3]. Contreras,  Soledad  M.  (2013).  Anticariogenic  properties  and  effects  on periodontal  structures  of  Stevia  rebaudiana  Bertoni.  Journal  of  Oral Research. 2(3):158–166. DOI: https://doi.org/10.17126/joralres.2013.034
[4]. Kaushik R, Narayanan P, Vasudevan V, Muthukumaran G, Antony U (2010). Nutrient  composition  of  cultivated  Stevia  leaves  and  the  influence  of polyphenols and plant pigements on sensory and antioxidant properties of leaf extracts. J. Food Sci. Tech. 47:27-33
[5]. Lemus-Mondaca,  R.,  Vega-Galves,  A.,  Zura-Bravo,  L.,  Ah-Hen,  K.  (2012). Stevia  rebaudiana  Bertoni,  source  of  a  high-potency  natural  sweetener:  A comprehensive  review  on  the  biochemical,  nutritional  and  functional aspects. Food chemistry, 132 (3). 1121–1132.
[6]. Tadhani,  M.B.,  Patel,  V.H.,  Rema  Subhash.  (2007).    In  vitro  antioxidant activities  of  Stevia  rebaudiana  leaves  and  callus.  Journal  of  Food Composition and Analysis. 20: 323–329. https://doi.org/10.1016/j.jfca.2006.08.004
[7]. Gupta, R., Yadav, V.,Rastogi, M. (2014). A Review on Importance of Natural Sweetener, A Zero Calorie Plant – Stevia – Having Medicinal and Commercial Importance. International Journal of Food and Nutritional Sciences, 3(3), 90- 94.
[8]. Sichani MM, Karbasizadeh V, Aghai F, Mofid MR. (2012). Effect of different extracts  of  Stevia  rebaudiana  leaves  on  Streptococcus  mutans  growth.
Journal of Medicinal Plants Research. 6(32):4731– 4734.   https://doi.org/10.5897/JMPR11.1622
[9]. Jayaraman  Sathishkumar,  Muthu  Saravanan  Manoharan,  Seethalakshmi Illanchezian.  (2008).  In-vitro  Antimicrobial  and  Antitumor  Activities  of Stevia  Rebaudiana  (Asteraceae)  Leaf  Extracts.  Tropical  Journal  of Pharmaceutical Research ; 7 (4): 1143-1149. DOI: 10.4314/tjpr.v7i4.14700
[10]. Gupta  Ena,  Shweta  Kaushik,  Shalini  Purwar,  Ramesh  Sharma,  Anil  K. Balapure, Shanthy Sundaram. (2017). Anticancer Potential of Steviol in MCF- 7 Human Breast Cancer Cells. Pharmakognosy Magazine. 13(51): 345–350. doi: 10.4103/pm.pm_29_17
[11]. Yulianti  Dian,  Susilo  Bambang,  Yulianingsih  Rini.  (2014).  Pengaruh  Lama Ekstraksi  Dan  Konsentrasi  Pelarut  Etanol  Terhadap  Sifat  Fisika-Kimia Ekstrak  Daun  Stevia  (Stevia  Rebaudiana  Bertoni  M.)  Dengan  Metode Microwave Assisted Extraction (Mae). Jurnal Bioproses Komoditas Tropis. 2 (1) : 35-41.
[12]. Departemen  Kesehatan  RI.  (2013).  Suplemen  III  Farmakope  Herbal Indonesia Edisi 1. Jakarta : Departemen Kesehatan RI
[13]. Ismiyati  N  dan  Nurhaeni  F.  (2016).  Efek  Ekstrak  Etanol  Daun  Kemangi (Ocimum  sanctum  L)  Sebagai  Agen  Kemopreventif  pada  Sel  Kaker  Leher Rahim  Hela  Melalui  Aktivitas  Sitotoksik  dan  Induksi  Apoptosis.  Media Farmasi 13:35-48. DOI: http://dx.doi.org/10.12928/mf.v13i1.5741
[14]. Septiani Tia, Effendi E.M, Yulianita. (2005). Uji Aktivitas Kombinasi Ekstrak Etanol 96 % Daun Teh Putih (Camelia Sinensis L.) Dan Daun Stevia (Stevia Rebaudiana  B.)  Sebagai  Antidiabetes  Pada  Tikus  Putih.  Jurnal  Farmasi-F. MIPA Universitas Pakuan.XX
[15]. Buchori L. (2007). Pembuatan gula non karsinogenik non kalori dari daun stevia. Reaktor.11(2):57–60
[16]. Preethi D, Sridhar, Josthna P and C.V.Naidu. (2011). Studies on Antibacterial Activity, Phytochemical Analysis of Stevia rebaudiana (Bert.) - An Important Calorie Free Biosweetner. Journal of Ecobiotechnology 2011, 3(7): 05-10
[17]. Sangi, M. M. R. J., Runtuwene, H. E. I.,Simbala, dan Makang, V.M. A.  (2008). Analisa fitokimia Tumbuhan Obat Di Minahasa Utara. Chem Prog, 1 (1); 47
[18]. Jacobo-Herrera  N,  Perez-Plasencia  C,  Castro-Torres  VA,  Martinez-Vazquez M,  González-Esquinca  AR,  &  Zentella-Dehesa  A.  (2019).  Selective Acetogenins  and  Their  Potential  as  Anticancer  Agents.  Frontiers  in Pharmacology, 10 (July), 1–12. doi.org/10.3389/fphar.2019.00783
[19]. Berek JS, dan Natarajan S. (2007). Ovarian and Fallopian Tube Cancer, in: Berek  &  Novak’s  Gynecology.  14th.  Ed.  California:  Lippincott  William  & Wilkins. p.1457-1531.
[20]. Pan M, Chen NJ, Lin S, Ho CH, Lin JK. (2007). Tangeretin Induces Cell Cycle Through Cyclin Dependent Kinase 2& 4 Activies as Wekkas Carsinogenesis. Oxford University Press. 23: 1677-1684.
[21]. Djajanegara  IRA,  and  Wahyudi  P.  (2009).  Pemakaian  Sel  HeLa  dalam  Uji Sitotoksisitas  Fraksi    Kloroform  dan  Etanol  Ekstrak  Daun    Annona squamosa. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia. 7 (1), 7–11.
[22]. Khare  Noopur,  Chandra  Sheela.  (2018).  Stevioside  mediated chemosensitization studies and cytotoxicity assay on breast cancer cell lines MDA-MB-231  and  SKBR3.  Saudi  Journal  of  Biological  Sciences.  XX https://doi.org/10.1016/j.sjbs.2018.10.009
[23]. Sumantri Apria W. (2018). Efektifitas Antikanker Fraksi (Curcuma Zedoaria) Dan Pengaruhnya Terhadap Ekspresi Gen Caspase 3 Pada Sel Hela Secara In Vitro. Jurnal Kesehatan Saelmakers Perdana. 1 (2).
[24]. Nissa  CK,  Oehadin  A,  Martakusumah  AH,  Dewi  YA.  (2015).  Accuracy Comparison of Various Formulas for Estimating Glomerular Filtration Rate in  Advanced  Nasopharyngeal  Carcinoma  Patients  before  Cisplatin Administration. Majalah Kedokteran Bandung; Vol.47 (1).
DOI: 10.15395/mkb.v47n1.396
[25]. Wzeerapreeyakul  N,  Nonpunya  A.  Barusrux  S,  Thitimetharoch  T  and Sripanidkulchai B. (2012). Evaluation of the anticancer potential of six herbs
against a hepatomacellline. J. Chinese Medicine. 7(15). doi: 10.1186/1749- 8546-7-15
[26]. Awik  PDN,  Sukardiman,  Hani  Tenia  Fadjri.  (2011).  Uji  Sitotoksisitas  Dan Efek Ekstrak Spons Laut Aaptos Suberitoides Terhadap Sel Kanker Serviks (Hela) Secara  In  Vitro. [skripsi].  Surabaya:  Fakultas  matematika  dan  Ilmu pengetahuan alam, Institut Sepuluh November.