Efek  Kapsul  Ekstrak  Etanol  Kelopak  Bunga  Rosella  ( Hibiscus  sabdariffa L.)  terhadap  Kadar  Bilirubin Sukarelawan Sehat
Nur Azizah 1,2* , Endang Darmawan 1 , Laela Hayu Nurani 1 1 Fakultas Farmasi, Universitas Ahmad Dahlan, Yogyakarta
2 Akademi Farmasi Muhammadiyah, Kuningan, Jawa Barat
*Corresponding author: mom_zie80@yahoo.co.id

## Abstract
Background : Hibiscus sabdariffa is one of traditional herbs that has a lot of benefits including immunostimulant effect, because  it  contains  antioxidant  compunds  including  anthocyanin  and flavonoid. Based on its activity on preclinical tests, H.sabdariffa has been qualified to proceed to clinical trial phase. Objective : The study aimed to investigate the effect of ethanol extract capsule of rosella petals (Hibiscus sabdariffa L.) on bilirubin levels on 11 healthy  male  volunteers  and  10  healthy  female  volunteers. Methods :  This  study  used  pre-and  post  treatment design.  Healthy  volunteers  consume  ethanol  extract  capsule  of  rosella  petals  for  30  days  at  a  dose  of  500  mg once daily at night. Bilirubin test was conducted at day 0; 31 and 45, using Jendrassik and Grof method. Results were analyzed using SPSS with paired t-test and Wilcoxon test. Results : The result showed that the comparison of the mean value at day 0 and 31, with day 31 and 45, and the comparison of the mean value between day 0 and 45 showed no significant difference regarding total and direct (p > 0.05) and indirect bilirubin levels (p = 0.05), but this is still within the normal range of values for indirect bilirubin. Conclusion : The ethanol extract capsule of rosella petals had no affects on total, direct and indirect bilirubin levels in healthy volunteers.
Keywords : ethanol, Hibiscus  sabdariffa, bilirubin levels

## Abstrak
Pendahuluan : Hibiscus sabdariffa adalah salah satu ramuan tradisional yang memiliki banyak manfaat termasuk efek imunostimulan, karena banyak mengandung antioksidan di dalamnya termasuk anthocyanin dan flavonoid. Berdasarkan aktivitasnya pada tes praklinis, H.sabdariffa telah  memenuhi  syarat untuk melanjutkan ke  fase uji klinis. Tujuan : Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh kapsul ekstrak etanol kelopak bunga rosella ( Hibiscus  sabdariffa L.)  pada  kadar  bilirubin    11  sukarelawan  sehat    pria  dan  10  sukarelawan  sehat  wanita. Metode :  Penelitian  ini  menggunakan  rancangan  pre-post  treatment.  Sukarelawan  sehat  mengkonsumsi  kapsul ekstrak  etanol  kelopak  bunga  rosella  selama  30  hari  dengan  dosis  500  mg  sekali  sehari  pada  malam  hari.  Tes Bilirubin  dilakukan  pada  hari  ke-0;  31  dan  45,  menggunakan  metode  Jendrassik  dan  Grof.  Hasil  dianalisis menggunakan SPSS dengan paired t-test dan uji Wilcoxon. Hasil : Perbandingan nilai rata-rata pada hari ke-0 dan 31,  dengan  hari  ke-31  dan  45,  dan  perbandingan  nilai  rata-rata  antara  hari  ke-0  dan  ke-45  tidak  menunjukkan perbedaan yang signifikan pada kadar bilirubin total dan direct (p > 0,05), sedangkan perbandingan nilai rata-rata untuk  kadar  bilirubin  in direct hari  ke-0  dan  ke-45  menunjukkan  adanya  perbedaan  yang  signifikan  (p  =  0,05) akan  tetapi  kadar  bilirubin  in direct tersebut  masih  dalam  rentang  nilai  normal. Kesimpulan :  Kapsul  ekstrak etanol  kelopak  bunga  rosella  tidak  mempengaruhi  kadar  bilirubin  total, direct dan indirect pada  sukarelawan sehat.
Kata kunci : etanol, Hibiscus sabdariffa , kadar bilirubin

## PENDAHULUAN
Hibiscus  sabdariffa (rosella)  adalah  salah  satu tanaman  tradisional  yang  memiliki  banyak  manfaat bagi  kesehatan  tubuh.  Kandungan  senyawa  yang terdapat  dalam  rosella  terdiri  dari  antosianin, polisakarida, hydroxycitric  acid , hibiscus  acid dan flavonoid  yang  dapat  berperan  sebagai  antioksidan.
Selain itu juga rosella memiliki kandungan vitamin B1, B2, niasin,  vitmin D  serta 18 asam amino (Da-  Costa- Rocha  dkk.,  2014;  Mardiah  dkk.,  2009;  Rahmawati, 2012).  Sifat  antioksidan  yang  dimiliki  rosella  dapat meningkatkan  sistem  imun  dengan  cara  melindungi sel-sel  tubuh  dari  radikal  bebas  dan  kerusakan  akibat paparan sinar ultraviolet (Mardiah dkk. , 2009).
Sifat  antioksidan  yang  dimiliki  oleh  rosella disebabkan karena kandungan antosianinnya. Penelitian  yang  dilakukan  oleh  Wijaya  dkk.  (2014) membuktikan  bahwa  antosianin  yang  terkandung dalam  rosella  dengan  dosis  100  mg/KgBB  mampu menurunkan  kadar  malondialdehide  pada  tikus  yang hiperkolesterol,  sedangkan  penelitian  yang  dilakukan oleh  Nurkhasanah  &  Rahardhian  (2015),  menyatakan bahwa aktivitas antioksidan rosella mampu melindungi hati  hewan  uji  dari  kerusakan  akibat  radikal  bebas (DMBA).  Efek  antioksidan  rosella  juga  mampu melindungi  hati  dari  kerusakan  akibat  paparan  radikal bebas  dengan  menurunkan  kadar  enzim-enzim  pada hati.  Penelitian  yang  dilakukan  oleh  Bhavana dkk. (2017)  menyatakan  bahwa  ekstrak  air  daun  rosella merah  yang  diberikan  secara  oral  tidak  menunjukkan adanya  kerusakan  pada  hati  tikus  yang  diinduksi  oleh alkohol dengan menurunkan kadar bilirubin. Olanrewaju  dkk.,  (2017)  menyatakan  bahwa  ekstrak metanol  kelopak  bunga  rosella  memiliki  efek hepatoprotektif  dengan  menurunkan  kadar  bilirubin pada tikus yang diinduksi berulangkali dengan etanol.
Berdasarkan  penelitian  yang  dilakukan  oleh Nurkhasanah  (2015)  terhadap  hewan  uji  menyatakan bahwa pada dosis 50 mg/KgBB ekstrak kelopak bunga rosella memberikan potensi terapi sebagai imunostimulator, akan tetapi tidak memberikan potensi toksik  (dosis  dapat  ditoleransi),  maka  diharapkan  ini dapat  digunakan  pada  manusia.  Salah  satu  parameter yang  digunakan  dalam  mentolerir  dosis  adalah mengetahui  adanya  perubahan  pada  fungsi  hati  (kadar enzim-enzim  hati)  yang  merupakan  salah  satu rangkaian  dalam  uji  klinik  fase  1  (Robinson  dkk., 2009). Efek obat terhadap  fungsi  hati  sangat berkaitan dengan  efek  toksik  dalam  penelitian  keamanan  suatu obat.  Pengujian  keamanan  terhadap  obat  baru  yang berasal  dari  bahan  alam  amatlah  perlu  untuk mengetahui  apakah  dosis  obat  tersebut  aman  untuk digunakan dan tidak menimbulkan efek toksik.
Ekstrak etanol kelopak bunga rosella memiliki nilai toksisitas  LD 50 sebesar  850,90  mg/KgBB  pada  tikus sprague  dawley dengan  kategori  toksisitas  ringan  dan tidak  memiliki  pengaruh  terhadap  aktivitas  enzim SGOT,  SGPT,  ALP,  dan  bilirubin  (Sari  dkk ., 2016; Bhavana dkk., 2017) yang mana enzim-enzim tersebut merupakan  indikator  adanya  kerusakan  atau  kelainan pada  hati.  Suwandi  (2012)  juga  melaporkan  bahwa ekstrak  etanol  kelopak  bunga  rosella  pada  tikus memiliki  LD 50 sebesar  ≥15  g/KgBB  hasil  tersebut masuk  ke  dalam  kategori  praktis  tidak  toksis. Pemanfaatan  rosella  seperti  saat  ini  perlu  diimbangi
dengan  informasi  kepastian  keamananya  terhadap manusia.  Beberapa  penelitian  yang  telah  dilakukan terhadap hewan uji menimbulkan pertanyaan mengenai kemanan dari H. sabdariffa (rosella) terhadap manusia. Penelitian  ini  dilakukan  untuk  dapat  mengetahui bagaimana  pengaruh  setelah  mengkonsumsi  ekstrak etanol  kelopak  bunga  rosella  yang  dikemas  dalam kapsul terhadap kadar bilirubin sukarelawan sehat.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Bahan  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  adalah kapsul yang berisi serbuk ekstrak etanol kelopak bunga rosella  terstandari  yang  di  peroleh  dari  PT.  Natura (Product  code:  5055C,  Batch:  RH162703).  Reagen yang digunakan untuk mengukur kadar bilirubin adalah reagen  bilirubin  total  dan direct Clona test ,  REF  CT 1009050)

## Alat
Alat    yang  digunakan  adalah Random  Acces Clinical  Analyzer Metrolab  2300  plus  dengan  metode Jendrassik  dan  Grof,  tabung  mikrosentrifugasi  berisi ethylenediaminetetraacetic  acid (EDTA)  sebagai antikoagulan,  spuit  5  cc,  tensimeter  (Corona),  falcon, vortex Mixer         (FV-2400 Microspin Biosan, 220 V, 60 Hz)

## Metode
Penelitian  ini  merupakan  penelitian pre  and  post treatment . Subjek  yang digunakan  adalah sukarelawan sehat  yang  berjumlah  21  orang  terdiri  11  orang  laki- laki  dan  10  orang  perempuan  (jumlah  tersebut  sesuai dengan ketentuan  BPOM RI (2014),  mengenai  jumlah subjek  dalam  penelitian  uji  klinik  fase  I  yaitu  20  -  80 orang).  Sukarelawan  sehat  yang  dapat  mengikuti penelitian  ini  harus    memenuhi  kriteria  inklusi,  yaitu sehat dibuktikan dengan  surat keterangan dari dokter, usia 18 - 45, IMT 18 - 30 Kg/m 2 , tidak merokok, tidak mengkonsumsi herbal  lain atau vitamin dan suplemen. Kriteria eksklusi dari penelitian  ini  yaitu  wanita  hamil dan  menyusui,  memiliki  faktor  resiko  penyakit  imun seperti lupus dan leukemia, memiliki riwayat gangguan fungsi hati dan fungsi ginjal.
Sukarelawan sehat diberi kapsul yang berisi ekstrak etanol  kelopak  bunga  rosella  selama  30  hari  dengan dosis  500  mg  sebanyak  1  kali  sehari,  setelah  makan pada  malam  hari.  Pemeriksaan  kadar  bilirubin dilakukan pada hari ke-0 (sebelum mengkonsumsi); ke- 31 (setelah  mengkonsumsi) dan ke-45 (15 hari setelah tidak  mengkonsumsi)  dengan  menggunakan  metode metode Jendrassik dan Grof.

## Persiapan dan pemeriksaan kesehatan
Penelitian  diawali  dengan  pengajuan Ethical Clearance kepada  Komite  Etik  Fakultas  Kedokteran dan  Ilmu  Kesehatan  Universitas  Muhammadiyah Yogyakarta.  Kelayakan  etika  dari  penelitian  ini dibuktikan dengan terbitnya surat keterangan layak etik ( Ethical  Clearance) dengan  nomor  255/EP-FKIK- UMY/IV/2017.

## Pemeriksaan kesehatan
Relawan  yang  telah  menyetujui informed  consent diperiksa  oleh  dokter  bersertifikat  untuk  menentukan kesesuaian  kriteria  sehat.  Kriteria  sehat  meliputi vital sign ,  yaitu  tekanan  darah  (TD),  suhu  tubuh,  denyut nadi  ( heart  rate ,  HR)  dan  tingkat  pernapasan ( respiration  rate, RR),  hasil  pemeriksaan  dokter dinyatakan  dalam  surat  keterangan  sehat  dengan didukung  oleh  pemeriksaan  laboratorium  klinis  yang meliputi bilirubin total, langsung dan tidak langsung.

## Persiapan pengambilan sampel darah
Sampel  darah  diambil  pada  median cubital  vein atau brachial vein dengan menggunakan jarum suntik 5 cc  untuk  darah  4  cc.  Sampel  kemudian  disimpan  di tabung  mikro  sentrifugal  yang  mengandung  EDTA sebagai koagulan. Pemisahan plasma dilakukan dengan sentrifugasi  dengan  kecepatan  3.500  rpm  selama  5 menit, kemudian diambil larutan yang berwarna kuning jernih (serum) (Khasanah, 2016)

## Pemeriksaan bilirubin
Penetapan  kadar  bilirubin  ditetapkan  berdasarkan metode  Jendrassik  &  Grof  (1938)  menggunakan  alat autoanalyzer spectrophotometer dengan prinsip bilirubin  akan  membentuk  senyawa  azo  berwarna merah  dalam  larutan  alkali  dengan  adanya  garam diazonium  asam  sulfonat  (panjang  gelombang  546 nm). Prosedur kerja pemeriksaan bilirubin total adalah campurkan  40  μl  reagen  nitrit  total  dengan  1000  µL
reagen  bilirubin  total  kemudian  tambahkan  100  µL serum,  inkubasi  campuran  selama  10  -  30  menit  pada suhu kamar lalu ukur pada panjang gelombang 546 nm. Prosedur  kerja  untuk  pemeriksaan  bilirubin direct adalah  campurkan  40  μl  reagen  nitrit direct dengan 1000  µL  reagen  bilirubin direct kemudian  tambahkan 100  µL  serum,  inkubasi  campuran  selama  10  -  30 menit  pada  suhu  kamar  lalu  ukur  pada  panjang gelombang 546 nm.
Total Bilirubin = Bilirubin Direct + Bilirubin Indirect

## Analisis data
Analisis  data  dihitung  secara continue dengan menyajikan  mean  ±  SD  menggunakan  statistik  SPSS 20.  Hasil  pemeriksaan  bilirubin  total, direct dan indirect pada sukarelawan sehat yang diukur pada hari ke-0  (sebelum  mengkonsumsi),  hari          ke-31  (setelah mengkonsumsi) dan hari ke-45     (15 hari setelah tidak mengkonsumsi)  diuji  terlebih  dahulu  normalitasnya dengan  uji Shapiro-Wilk .  Selanjutnya,  jika  data terdistribusi  normal  dianjutkan  dengan  melakukan paired t-test , sedangkan  jika tidak terdistribusi  normal maka  analisis  dilanjutkan  dengan  melakukan  uji Wilcoxon pada taraf kepercayaan 95% (Dahlan, 2014).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  pemeriksaan  perbandingan  rata-rata  bilirubin total  dan direct sukarelawan  sehat  yang  diberi  kapsul ekstrak  etanol  kelopak  bunga  rosella  menunjukkan tidak  ada  perbedaan  bermakna  karena  nilai  p  >  0,05, sedangkan  untuk  kadar  bilirubin indirect ditemukan perdaan dalam rata-rata antara hari ke 0-45 (p = 0,05). Secara klinis tingkat kadar bilirubin masih dalam batas normal. Hasil penelitian dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Rata-rata Nilai Bilirubin Sukarelawan Sehat yang diberi Kapsul Ekstrak Etanol Kelopak Bunga Rosella (n =
21). Parameter Fungsi Hati Rata-rata Nilai Fungsi Hati Sukarelawan Sehat ( Mean ± SD) P value Nilai Normal Hari Ke-0 Hari Ke-31 Hari Ke-45 Hari Ke 0 - 31 Hari Ke 31 - 45 Hari Ke 0 - 45 Total Bilirubin 0,69 ± 0,46 0,77 ± 0,41 0,74 ± 0,41 0,140 0,639 0,237 ≤ 1,4 mg/dL Direct Bilirubin 0,39 ± 0,10 0,46 ± 0,21 0,42 ± 0,11 0,125 0,363 0,324 ≤ 0,4 mg/dL Indirect Bilirubin 0,22 ± 0,34 0,13 ± 0,19 0,12 ± 0,21 0,186 0,806 0,050 ≤ 1,0 mg/dL
Keterangan: Nilai Normal Kadar Bilirubin (Kemenkes RI, 2011)
Pengukuran  kadar  bilirubin  menggunakan  alat Random  Acces  Clinical  Analyzer Metrolab  2300  plus
dengan metode Jendrassik & Grof (1938). Pengukuran kadar  bilirubin  dilakukan  sebelum  sukarelawan  sehat
mengkonsumsi  kapsul  ekstrak  etanol  kelopak  bunga rosella  (hari  ke-0),  setelah  mengkonsumsi  kapsul ekstrak  etanol  kelopak  bunga  rosella  (hari  ke-31)  dan setalah  15  hari  tidak  mengkonsumsi  kapsul  ekstrak etanol  kelopak  bunga  rosella  (hari  ke-45).  Data  hasil analisis  kadar  bilirubin  yang  disajikan  pada  Tabel  1 menunjukkan adanya perubahan rata-rata nilai bilirubin total, direct dan indirect sukarelawan  sehat.  Kadar bilirubin total hari  ke-0 adalah 0,69  mg/dL, untuk hari ke-31  adalah  0,77  mg/dL  dan  hari  ke-45  adalah  0,74 mg/dL.  Kadar  bilirubin direct di  hari ke-0 adalah 0,39 mg/dL,  hari  ke-31  adalah  0,46  mg/dL  dan  hari  ke-  45 adalah  0,42  mg/dL  sedangkan  untuk  hasil  pengukuran kadar  bilirubin indirect hari  ke-0  adalah  0,22  mg/dL, hari  ke-31  adalah  0,13  mg/dL  dan  hari  ke-45  adalah 0,12 mg/dL. Hasil analisis perbandingan rata-rata kadar bilirubin  total  dan direct hari  ke-0  dan  hari  ke-31 dengan  hari  ke-31  dan  hari  ke-45  dan  perbandingan antara  hari  ke-0  dan  ke-45  tidak  terdapat  perbedaan yang bermakna karena nilai p > 0,05, sedangkan untuk kadar  bilirubin indirect pada  perbandingan  hari  ke-0 dan ke-45, terdapat perbandingan bermakna karena p = 0,05,  namun  nilai  kadar  masih  dalam  rentang  nilai normal.  Perubahan  yang  terjadi  pada  setiap  kali pengukuran masih dalam rentang nilai normal sehingga hasil  ini  dapat  disimpulkan  bahwa  kapsul  ekstrak etanol kelopak bunga rosella  secara klinis  relatif  aman karena  tidak  mempengaruhi  jumlah  kadar  bilirubin total, direct dan indirect pada sukarelawan sehat. Nilai kadar  bilirubin  normal  menurut  Kemenkes  RI  (2011) adalah  bilirubin  total  sebesar  ≤  1,4  mg/dL,  bilirubin direct sebesar  ≤  0,4  mg/dL  dan  untuk  kadar  bilirubin indirect sebesar ≤ 1,0 mg/dL.
Hasil  penurunan  nilai  bilirubin  yang  didapat  ini sejalan  dengan  penelitian  sebelumnya  bahwa,    ekstrak kelopak  bunga  rosella  memiliki  efek  hepatoprotektif dengan  menurunkan  aktivitas  bilirubin  (Bhavana  dkk., 2017 dan Olanrewaju dkk., 2017).
Peningkatan kadar bilirubin direct dapat disebabkan obstruksi  biliar  intrahepatik  dan  ekstrahepatik,  juga disebabkan  oleh  kerusakan  sel-sel  parenkim  hepar. Bilirubin indirect adalah  bilirubin  yang  belum mengalami  konjugasi  di  hepar.  Bilirubin direct merupakan  bilirubin indirect yang  telah  mengalami tiga  tahap  metabolisme  (pengambilan,  konjugasi,  dan ekskresi),  bersifat  larut  dalam  air  dan  dapat diekskresikan ke dalam urin (Panjaitan dkk. , 2011).
Perubahan  kadar  bilirubin  total  dan direct pada sukarelawan  sehat  menunjukkan  bahwa  perubahan tersebut memiliki perbedaan nilai yang tidak bermakna atau  perubahan  tersebut  tidak  signifikan  karena  nilai
p > 0,05 sedangkan untuk kadar bilirubin indirect pada sukarelawan  di  hari  ke-0-45  menunjukkan  adanya perubahan  yang  signifkan  p  =  0,05  namun  kadar bilirubin  masih  dalam  rentang  nilai  normal.  Meskipun secara  statistik  mengalami  perubahan  dari  tiap-tiap parameter  namun  secara  klinis  tidak  bermakna. Penurunan  kadar  bilirubin  pada  sukarelawan  sehat disebabkan karena kandungan antioksidan dan flavonoid  dalam  ekstrak  etanol  kelopak  bunga  rosella sehingga  dapat  melindungi  fungsi  hati,  ini  sejalan dengan  penelitian Mardiah  dkk.  (2009)  yang menyatakan bahwa pigmen antosianin yang terkandung dalam  rosella  berfungsi  sebagai  antioksidan,  yang mampu    menjaga  fungsi  hati  dari  krusakan  akibat radikal  bebas.  Selain  itu  Bhavana  dkk.  (2017) menyatakan aktivitas hepatoprotektif Hibiscus sabdariffa dapat  disebabkan  oleh  adanya  bioflavonoid yang memiliki sifat hepatoprotektif.

## KESIMPULAN
Hasil penelitian menunjukkan bahwa kapsul ekstrak etanol  kelopak  bunga  rosella  selama  30  hari  tidak memberikan  efek  terhadap  nilai  bilirubin  total, direct dan indirect sukarelawan sehat.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Hibah penelitian unggulan Program Studi dari LPP Universitas Ahmad Dahlan Yogyakarta tahun 2017.

## DAFTAR PUSTAKA
Badan  Pengawas  Obat  dan  Makanan  Republik Indonesia  (BPOM  RI).  (2014).  Peraturan  Kepala Badan  Pengawas  Obat  dan  Makanan  Republik Indonesia Nomor 13 tentang Pedoman Uji Klinik Obat Herbal. Jakarta: BPOM RI.
Bhavana, G. R., Rajani, Mai, Babu, J. & Bonthagarala,
B.  (2017).  Hepatoprotective  Activity  of  Aqueous Extract  of Hibiscus  sabdariffa on  Alcohol Induced  Hepatotoxity  in  Rats. World  Journal  of Pharmacy  and  Pharmaceutical  Science; 6; 767- 778.
Da-Costa-Rocha,  I.,  Bonnlaender,  B.,  Pischela,  I.  & Heinrich,  M.  (2014). Hibiscus  sabdariffa L.  A Phytochemical  and  Pharmacological  review. Journal Food Chemistry; 424-443.
Dahlan,  S.  (2014).  Statistik  Untuk  Kedokteran  dan Kesehatan  Edisi.  6.  Jakarta:  Epidemiologi Indonesia.
Jendrassik,  L. &  Grof, P. (1938).  Estimation of  Total Serum Bilirubin Level by Spectrophotometrically
in  Serum  and  Plasma. Biochem  Zeitschrift;  297; 81-89.
Kementrian Kesehatan Republik Indonesia (Kemenkes RI).  (2011).  Pedoman  Interpretasi  Data  Klinik.
Jakarta: Kemenkes RI.
Khasanah,  U.  (2016).  Perbedaan  Hasil  Pemeriksaan
Hitung  Jumlah  Trombosit  pada  Darah  Vena  dan Darah  Kapiler  dengan  Metode  Tabung. Skripsi;
Fakultas  Ilmu  Keperawatan  dan  Ilmu  Kesehatan Universitas Muhammadiyah, Semarang.
Mardiah,  Hasibuan,  S.,  Ashadi,  R.  W.  &  Rahayu,  A.
(2009).  Budi  Daya  dan  Pengolahan  Rosela  Si Merah  Segudang  Manfaat . Jakarta:  Agromedia Pustaka.
Nurkhasanah.  (2015).  The  Effect  of  Rosella  ( Hibiscus sabdariffa L.)  Treatment  on  IL-10  and  IL-14 Secretion  on  Dimethylbenz  (α)  Antrachene (DMBA). International  Journal  Pharmaceutical Science; 7; 402-402.
Nurkhasanah  &  Rahardhian,  M.  R.  R.  (2015). Hepatoprotective  Effect of  Hibiscus  sabdariffa L Extract on 7,12-dimethylbenz(α)antracene
(DMBA)  Induced  Rat. International  Journal  of Biological and Medical Research; 6; 4705-4708.
Olanrewaju, E., Anyaehie, B., Ezeh, C. O., Onyekwelu, K. C. & Ezeh, R. C. (2017). Effect of Methanolic Extract  of Hibiscus  sabdariffa in    Ethanol-
Induced Hepatotoxicity. African Journal Biomedical Research; 20; 99-102.
Panjaitan,  R.  G.  P.,  Handharyani,  E.,  Chairul  &
Manalu,  W.  (2013).  Hepatoprotective  Activity  of
Eurycoma  longifolia Jack.  Roots. Indian  Journal of Traditional Knowledge; 12; 225-230.
Rahmawati, R. (2012). Budidaya Rosella. Yogyakarta: Penerbit Pustaka Baru Press.
Robinson, S., Kathryn, C., Shirley, H., Sue S., Derrick Spencer-Briggs,  Andy  D.,  Rose  H.,  David  E., Brigitte M., Fulcrum P., Sally O., Christopher B. (2009).  Guidance  on  Dose  Level  Selection  of Regulatory  General  Toxicology  Studies  for Pharmaceuticals.  UK:  The  Association  of  the British  Pharmaceutical  Industry  (ABPI)  and  the British Toxicology Society (BTS).
Sari,  F.,  Nurkhasanah  &  Moch,  S.  B.  (2016).  Uji Toksisitas  Akut  Ekstrak  Etanol  Kelopak  Rosella (Hibiscus  sabdariffa L.)  dan  Pengaruhnya terhadap Fungsi Hepar. Tesis; Program Pascasarjana Farmasi Universitas Ahmad Dahlan, Yogyakarta.
Suwandi, T. (2012). Pengembangan Potensi Antibakteri  Kelopak  Bunga Hibiscus  sabdariffa L.  terhadap Streptococcis  Sanguinis Penginduksi Ginvitis Menuju Obat Herbal Terstandar. Disertasi; Fakultas  Kedokteran  Gigi  Universitas Indonesia, Jakarta.
Wijaya,  A.,  Nurani,  L.  H.  &  Nurkhasanah.  (2014).
Aktivitas  Antioksidan  Sediaan  Nanopertikel Kitosan Ekstrak Etanol Kelopak Rosella ( Hibiscus sabdariffa L.) pada Tikus Hiperkolesterol: Pengukuran Kadar Melondialdehid  (MDA). Kartika  Jurnal  Ilmiah Farmasi; 2; 1-6.