## EFEK PAPARAN PROGESTERONE TERHADAP EKSPRESI TIROSIN HIDROKSILASE DAN
AKTIFITAS LOKOMOTOR, SERTA PENGARUHNYA TERHADAP KADAR AROMATASE-B

## PADA EMBRIO ZEBRAFISH (Danio rerio)
Hanif*  , Setyawati Soeharto**, Hidayat Sujuti***

## Abstrak
Selain  berperan  dalam  sistem  reproduksi,  progesterone  juga  mempunyai  peran  dalam  sistem  saraf. Progesterone  diketahui  berperan  dalam  proses  perkembangan  sel  Purkinje  pada  tikus.  Sel  dopaminergik mempunyai  peran  penting  dalam  tubuh  khususnya  fisiologi  pergerakan.  Perubahan  konsentrasi  dopamin dapat berakibat pada timbulnya kelainan seperti Parkinson dan amyotropik lateral sklerosis. Pada zebrafish, sel dopaminergik dapat diidentifikasi dengan pengamatan pada tirosin hidroksilase dan pengamatan aktifitas pergerakan  dapat  dilakukan  penilaian  aktifitas  lokomotor.  Pemahaman  terhadap  hal  ini  akan  membantu upaya terapi penyakit-penyakit neurodegeneratif terkait dopamin.Tujuan penelitian  ini adalah membuktikan pengaruh progesterone pada sel saraf dopaminergik embrio zebrafish melalui pengamatan ekspresi tirosin hidroksilase,  aktifitas  lokomotor  dan  peran  progesterone  dalam  regulasi  estrogen  melalui  aromatase  B. Sebanyak  30  embrio  zebrafish  dipelihara  dan  dikultur  dalam  cawan  dengan  terpapar  progesterone  pada medium dengan konsentrasi 0,1, 1, dan 10 µM. Penelitian diulang tiga kali menggunakan masa peneluran yang  berbeda.  Teknik  imunositokimia  dengan  marker  fluoresens  digunakan  untuk  mengamati  perubahan ekspresi tirosin hidroksilase pada diensefalon saat 48 hpf. Pengukuran aktifitas lokomotor dilakukan dengan kuantifikasi gerakan larva selama 1 menit pada usia 144 hpf. Ekspresi mRNA aromatase B dinilai dengan metode RT-PCR menggunakan primer Arom-B pada usia 48, 72, dan 96 hpf. Analisis statistik menggunakan ANOVA  dengan  nilai  p  <  0,05.  Progesterone  menurunkan  ekspresi  tirosin  hidroksilase  pada  daerah diensefalon  embrio  zebrafish.  Progesterone  terbukti  menurunkan  aktifitas  lokomotor  larva.  Paparan progesterone  menyebabkan  peningkatan  ekspresi  mRNA  aromatase  B  terutama  pada  usia  72  hpf  dan  96 hpf.  Kesimpulannya,  progesterone  dapat  mempengaruhi  sel  dopaminergik  embrio  zebrafish  melalui penekanan ekspresi tirosin hidroksilase, aktifitas lokomotor, dan meningkatkan ekspresi mRNA aromatase B.
Kata kunci: aromatase B, progesterone, tirosin hidroksilase, zebrafish.

## THE EFFECT OF PROGESTERONE ON TYROSINE HYDROXYLASE EXPRESSION, LOCOMOTOR ACTIVITY, AND ITS ROLE IN AROMATASE B LEVELS IN ZEBRA FISH (Danio rerio) EMBRYO

## Abstract
Progesterone has a role in the reproductive system, also in the nervous system. Progesterone is known to play a role in the process of Purkinje cell development in mouse. Dopaminergic cells have an important role, especially in the physiology of movement. Dopamine concentration changes can result in several disor- ders such as Parkinson’s disease and amyotrophic lateral sclerosis. In zebrafish, dopaminergic cells can be identified by observing tyrosine hydroxylase, and movement activities can be assessed by locomotor activity observation.  A  good  comprehension  of  these  variables  is  expected  to  be  able  to  enhance  the  therapeutic efforts of dopamine-related neurodegenerative diseases. This research was to verify the effect of progester- one on dopaminergic nerve cells in zebrafish embryos by observing tyrosine hydroxylase expression, loco- motor activity and progesterone role in estrogen regulation through aromatase B. There were 30 zebrafish embryos maintained and cultured in each well exposed with progesterone in a medium with concentrations of 0.1, 1, and 10 μM. The experiment was repeated three times using different stages of breeding ages. Im- munocytochemistry with fluorescent markers is used to observe changes in tyrosine hydroxylase expression in diencephalon at 48 hpf. The measurement of locomotor activity was carried out by quantifying larval move- ments for 1 minute at the age of 144 hpf. Aromatase  B mRNA  expression was assessed by the RT-PCR method using Arom-B primers at ages 48, 72, and 96 hpf. Statistical analysis was done using ANOVA with a p-value < 0.05. Progesterone decreases the expression of tyrosine hydroxylase in the diencephalon region of a zebrafish embryo. Progesterone has been shown to reduce locomotor activity of the larvae. Exposure to progesterone resulting in an enhanced expression of aromatase B mRNA especially at the age of 72 hpf and 96 hpf. To conclude, progesterone can affect zebrafish embryos dopaminergic cells by suppressing the ex- pression of tyrosine hydroxylase, locomotor activity and enhance the expression of aromatase B mRNA.
Keywords: aromatase B, progesterone, tyrosine hydroxylase, zebrafish.
* Departemen Ilmu Fisiologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Brawijaya ** Departemen Farmakologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Brawijaya *** Departemen Biokimia-Biomolekuler, Fakultas Kedokteran, Universitas Brawijaya
 E-mail: dokterhanip@yahoo.com
Hanif, et al.                                         Efek Paparan Progesterone terhadap Ekspresi Tirosin Hidroksilase …..

## Pendahuluan
Progesterone bersama dengan estrogen dikenal sebagai hormon penting dalam sistem reproduksi.  Selain  itu,  kedua hormon  ini  juga berperan  dalam  sistem  lain,  misalnya  dalam sistem saraf. Progesterone diketahui berperan dalam memodulasi proses perkembangan sel Purkinje  pada  tikus,  sedangkan  estrogen terbukti  memiliki  sifat  protektif  terhadap  sel syaraf,  dan  merupakan  modulator  dalam perkembangan  otak  mamalia. 1,2,3 Tetapi peran progesterone  dalam  sistem  dopaminergik masih perlu diteliti lebih jauh.
Penelitian sebelum ini umumnya didasari oleh  peran  estrogen  dan  xenoestrogen sebagai  endocrine  disruptor.  Penelitian terdahulu  membuktikan  bahwa  estrogen dengan  berikatan  dengan  reseptornya  di dalam  sel,  dapat  mempengaruhi  sel dopaminergik  otak  dalam  perkembangan embrio zebrafish melalui penekanan ekspresi tirosin  hidroksilase. 4 Paparan  estrogen  juga terbukti  meningkatkan  ekspresi  aromatase  B, suatu enzim kunci dalam sintesis estrogen di dalam sistem saraf pusat. Adanya kesamaan struktur  antara  estrogen  dan  progesterone karena keduanya adalah hormon steroid, dan juga  reseptor  untuk  keduanya  yang  berasal dari  superfamily  yang  sama  dapat  dijadikan dasar  untuk  meneliti  apakah  progesterone juga  mempunyai  efek  yang  serupa  dengan estrogen. 1
Progesterone  umumnya  disintesis  di organ  reproduksi,  tetapi  juga  diproduksi  di tempat lain, salah satunya adalah sistem saraf pusat.  Steroid  yang  diproduksi  di  dalam sistem  saraf  pusat  ini  dikenal  dengan  istilah neurosteroid. 1 Ini menjadikan dasar pemikiran bahwa  progesterone  mempunyai  peran penting  di  dalamnya.  Penelitian  sebelumnya telah menunjukkan bahwa progesterone dapat memacu  perkembangan  sel  saraf  (Purkinje), dan  juga  dapat  meningkatkan  jumlah  sel dopamin pada stem sel pluripoten. 3,4 Sel  dopaminergik  mempunyai  peran
penting  dalam  tubuh  khususnya  fisiologi pergerakan.  Gangguan  pada  sel dopaminergik  yang  akhirnya  mengganggu jumlah  neuro-transmiter  dopamin,  dapat berakibat  pada  timbulnya  kelainan  seperti Parkinson  dan  amyotropik  lateral  sklerosis (ALS).  Penyakit  Huntington  juga  dikaitkan dengan  sistem  dopaminergik  dalam  upaya pengobatannya. 3 Pemahaman terhadap hal ini akan  membantu  penerapan  terapi  di  bidang kesehatan  khususnya  dalam  kaitannya dengan penyakit-penyakit neurodegeneratif.
Zebrafish merupakan model hewan coba standar  untuk  penelitian.  Banyak  penelitian yang  telah  menggunakan  zebrafish  sebagai hewan  coba  untuk  penelitian  penyakit- penyakit  neurodegeneratif.  Penggunaannya telah  diterima  secara  luas  dalam  berbagai penelitian  karena  banyaknya  keuntungan menggunakan  hewan  coba  ini. 4 Jumlah embrio  yang  banyak  dan  transparan, kemiripan sistem saraf dengan  mamalia,  dan telah  diketahuinya  gene  map  secara  utuh, menjadikan  hewan  ini  sebagai  pilihan  ideal dalam penelitian saat ini. 5
Pada  zebrafish,  sel  dopaminergik  dapat diidentifikasi dengan pengamatan pada tirosin hidroksilase,  suatu  enzim  penting  dalam sintesis  dopamin.  Sementara  untuk pengamatan  aktifitas  pergerakan  dapat dilakukan  pengamatan  aktifitas  lokomotor seperti  jarak  renang  dan  respons  embrio terhadap  sentuhan.  Sejauh  ini  belum  ada penelitian  yang  secara  spesifik  meneliti pengaruh  progesterone  terhadap  sel dopaminergik  khususnya  ekspresi  tirosin hidroksilase  dan  aktifitas  lokomotor  pada embrio.

## Bahan dan Metode
Pemeliharaan Ikan dan Kultur Embrio Desain  penelitian  ini  adalah  post  test only  control  group  design.  Penelitian  ini dilakukan  di  laboratorium  New  Frontier Science  and  Technology,  GSST  Kumamoto University.
Zebrafish  dewasa  diperoleh  dari  toko  lokal yang  memiliki  sertifikat  dari  institusi  yang berwenang.  Zebrafish  dipelihara  dalam sebuah tanki air dengan volume 60 liter, berisi 30  ekor  ikan.  Suhu  air  dipertahankan  pada kisaran  26-28 O C.  Ikan  berada  pada pencahayaan  dengan  siklus  14  jam  kondisi terang  diikuti  10  jam  dalam  kondisi  gelap. Telur  diperoleh  melalui  proses  fertilisasi alami.  Embrio  dipelihara  dalam  medium embrio  yang  mengandung  0,1%  NaCl, 0,163%  MgSO 4 ,  0,004%  CaCl 2 ,  dan  0,003% KCl. Pemeliharaan dilakukan dalam inkubator dengan  suhu  28 O C.  Embrio  dikultur  pada cawan  kultur  (30  embrio  dengan  medium sebanyak 8 ml tiap cawan).
Paparan Progesterone Dimethyl  sulfoxide  (DMSO)  digunakan sebagai  pelarut  progesterone  (4-Pregnene- 3,20-dione,  SIGMA-Aldrich)  untuk  membuat larutan  stok  dengan  konsentrasi  20  mM. Pemaparan terhadap progesterone  dilakukan di  dalam  medium  embrio  dengan  tiga  dosis berbeda  yaitu  0,1  µM,  1  µM,  dan  10  µM. Pemaparan  dilakukan  sejak  2  jam  setelah fertilisasi  (hours  post  fertilization/hpf)  sampai hari  ke  enam  perkembangan.  Untuk  proses imunositokimia,  embrio  dipelihara  dengan tambahan  fenil-tiourea  (PTU)  dengan konsentrasi  0,003%  yang  dilarutkan  dalam medium embrio sejak 6 hpf.

## Analisis Perkembangan Embrio
Dilakukan  pencatatan  pengaruh progesterone pada perkembangan embrio, di antaranya laju kematian, laju penetasan, dan defek  morfologi.  Penghitungan  dilakukan pada saat embrio berusia 24, 48, 72, 96, dan 120  hpf.  Defek  morfologi  diamati menggunakan mikroskop fluoresens (Leica M 165  FC)  dengan  perbesaran  40x  pada  saat larva hidup berusia 72 hpf. Penelitian diulang sebanyak  tiga  kali  menggunakan  masa peneluran yang berbeda.

## Deteksi Ekspresi Tirosin Hidroksilase dengan Teknik Imunositokimia
Un tuk   me nge ta hui   pe ng ar uh progesterone  pada  ekspresi  tirosin hidroksilase  pada  sel  dopaminergik  otak, dilakukan  pemeriksaan  dengan  metode imunositokimia  whole-mount  dengan  marker fluoresens.  Pengamatan  dilakukan  pada daerah  diencefalon  dari  otak  embrio  yang merupakan  daerah  utama  sel  dopaminergik pada  usia  embrio  48  hpf.  Metode  ini mengikuti  metode  yang  telah  dilakukan sebelumnya oleh McLean dan Fetcho (2004), dengan  sedikit  modifikasi. 5 Metode  ini  terdiri dari  3  tahap  yaitu  fiksasi,  pengecatan  dan yang  terakhir  adalah  pengamatan  dan analisis. Embrio yang berusia 48 jam setelah fertilisasi  didekorionisasi  dan  difiksasi  dalam larutan  PBS  yang  mengandung paraformaldehid  4%  selama  24  jam  pada suhu 4 O C. Embrio yang telah terfiksasi dicuci dengan  PBS,  kemudian  diinkubasi  dengan metanol  100%  sebanyak  tiga  kali  masing- masing 15 menit dan disimpan dalam metanol pada suhu -20 O C.
Proses  pengecatan  diawali  dengan pencucian  larva  dengan  PBS  yang mengandung 0,1% Tween-20 dan 0,5% Triton X-100  (PBSTX).  Kemudian  larva    diinkubasi dalam  air  destilata  selama  satu  jam, dilanjutkan  dengan  larutan  aseton  selama  8 menit  pada  suhu  -20 O C.  Ikatan  nonspesifik dari  antibodi  diblok  dengan  inkubasi menggunakan  serum  kambing  normal  (NGS) 1%  dan  serum  albumin  dari  sapi  (BSA)  3% selama  3  jam.    Setelah  dicuci  beberapa  kali dengan  PBSTX,  larva  diinkubasi  dalam antibodi  primer  untuk  tirosine  hidroksilase yang  merupakan  antibodi  monoklonal  yang berasal  dari  tikus  (Immunostar  #22941). Konsentrasi  antibodi  primer  yang  diberikan sebesar  1:1000  pada  suhu  4 O C  selama semalam.
Hanif, et al.                                         Efek Paparan Progesterone terhadap Ekspresi Tirosin Hidroksilase …..
Antibodi  sekunder  yang  digunakan merupakan  IgG  anti-tikus  dari  kambing  yang sudah  terikat  dengan  fluoresens  sebagai marker  (Alexa  Fluor  488  Invitrogen).  Larva diinkubasi  dalam  antibodi  sekunder  dengan konsentrasi  1:200  selama  2  jam.  Setelah dicuci  dengan  PBSTX,  larva  yang  sudah tercat  dapat  diamati  dalam  jangka  waktu sekitar 30 menit.
Pengamatan  dilakukan  menggunakan mikroskop  fluoresens  (Leica  M  165  FC) dengan  perbesaran  100x  dan  area  ekspresi dari  tirosin  hidroksilase  dianalisis  dengan perangkat lunak (ImageJ) yang menggunakan referensi perhitungan area berdasarkan pixel. Untuk  analisis  statistik,  masing-masing  dosis perlakuan digunakan 3-4 larva, dan penelitian diulang menggunakan empat kelompok larva yang berbeda masa penelurannya.

## Tes Aktivitas Lokomotor
Untuk  menilai  aktifitas  lokomotor,  larva yang  berusia  6  hari  dipindahkan  ke  wadah kultur  12  sumur,  berisi  satu  ekor  larva  tiap sumur di dalam medium embrio 2 mL. Dasar sumur diberi  garis  pembatas untuk membagi menjadi 4 area sama luas. Setelah dilakukan habituasi  selama  5  menit,  dilakukan perekaman  selama  1  menit.  Pengukuran aktivitas  lokomotor  dilakukan  pada  usia embrio  144  hpf.  Kuantifikasi  dilakukan dengan  menghitung  jumlah  garis  yang dilewati oleh larva dalam satu menit. Masing- masing  dosis  perlakuan  menggunakan  24 ekor larva, dan penelitian diulang dengan tiga kelompok  larva  yang  berbeda  masa penelurannya. 5

## Deteksi Ekspresi mRNA Aromatase B dengan Metode RT-PCR
Un tuk   me nge ta hui   pe ng ar uh progesterone  terhadap  ekspresi  mRNA aromatase  B,  dilakukan  pemeriksaan  RT- PCR  (Reverse  Transcriptase-Polymerase Chain  Reaction).  Tahapan  pemeriksaan metode ini adalah isolasi RNA, reaksi reverse transcriptase  (RT)  dan  polymerase  chain reaction  (PCR)  dengan  urutan  basa  untuk
Aromatase B.
Untuk isolasi RNA, digunakan 20 embrio setiap  dosis  perlakuan.  Embrio  dibekukan pada  suhu  -80 O C  pada  usia  48  hpf,  72  hpf dan  96  hpf.  Metode  isolasi  dilakukan  sesuai petunjuk dari Isogen (Nippon Gene Co., Ltd.). Sebanyak  1  µg  RNA  total  yang  didapat  dari isolasi  digunakan  untuk  proses  reverse transcriptase menggunakan kit dari Promega. Sebanyak 1 µL hasil RT kemudian digunakan dalam proses PCR (34 siklus) menggunakan goTag,  dengan  primer  aromatase  B.  Berikut a d a l a h   u r u t a n   b a s a   f o r w a r d : 5’GCAAATCGTACAGGAGATACAG3’,  dan reverse: 5’ CGTCCAATGTTCAGGATTAG 3’.
Hasil  reaksi  RT-PCR  kemudian dijalankan pada alat elektroforesis dan difoto untuk  dianalisis  perbedaan  intensitas  pita yang terbentuk.

## Analisis Statistik
Penentuan  jumlah  sampel  dalam  setiap perlakuan dan pemeriksaan didasarkan pada penelitian  sebelumnya  yang  dilakukan  oleh Chen  (2009). 6 Analisis  statistik  dalam penelitian  ini  menggunakan  single  factor analysis  of  varian  (ANOVA)  yang  terdapat dalam perangkat lunak Microsoft Excel 2010. Nilai  perbedaan  dianggap  bermakna  jika  p  < 0,05.

## Hasil
Laju  Kematian,  Laju  Penetasan,  Defek

## Morfologi
Dalam  penelitian  ini  diamati  pengaruh paparan  progesterone  terhadap  laju kematian,  laju  penetasan,  dan  terjadinya defek morfologis pada embrio zebrafish.
Pengamatan  yang  dilakukan  pada  tiga kali  masa  peneluran  yang  berbeda menunjukkan  bahwa  paparan  progesterone dengan  dosis  10  µM  menyebabkan peningkatan  laju  kematian  secara  bermakna pada  saat  120  hpf  dibandingkan  dengan kelompok  kontrol  maupun  kelompok  yang terpapar  progesterone  0,1  µM  dan  1  µM (Gambar 1).
Paparan  progesterone  10  µM menyebabkan  embrio  cenderung  mengalami penundaan laju penetasan, walaupun secara statistik tidak terlihat secara bermakna (Tabel 1).  Pemberian  progesterone  10  µM  juga meningkatkan  terjadinya  defek  morfologis (Gambar  2)  yang  terlihat  berupa  bentuk
embrio  yang  melengkung  pada  usia  96  jam setelah  fertilisasi  (Gambar  3).  Dari pengamatan  juga  tampak  bahwa  larva  pada kelompok yang terpapar progesterone 10 µM memiliki  tubuh  yang  lebih  pendek  dibanding kelompok lain (data tidak disertakan).
Gambar 1. Pengaruh progesterone pada laju kematian embrio zebrafish.
Tabel 1. Rerata laju penetasan embrio zebrafish. Kelompok 24 hpf (%) 48 hpf (%) 72 hpf (%) 96 hpf (%) 120 hpf (%) Kontrol 0 21,07 98,04 100 100 0,1 µM 0 36,07 97,22 100 100 1 µM 0 39,46 99,58 100 100 10 µM 0 18,86 61,09 76,78 81,74
Gambar 2. Pengaruh progesterone pada terjadinya defek morfologis.
Gambar 3. Larva zebrafish usia 96 hpf.
Keterangan: A. Larva pada kelompok kontrol, B. Larva pada kelompok yang terpapar progesteron 10 µM.
Hanif, et al.                                         Efek Paparan Progesterone terhadap Ekspresi Tirosin Hidroksilase …..

## Ekspresi Tirosin Hidroksilase
U n t u k   m e n g a m a t i   p e n g a r u h progesterone  terhadap  ekspresi  tirosin hidroksilase,  pada  penelitian  ini  dilakukan pemeriksaan dengan metode imunositokimia. Tabel  2  menunjukkan  hasil  dari  3 pengulangan  yang  telah  dinormalkan terhadap  kontrol.  Hasil  analisis  menunjukkan paparan  progesterone  menurunkan  ekspresi tirosin hidroksilase (Gambar 4). Penurunan ini bermakna  pada  semua  kelompok  perlakuan bila  dibandingkan  dengan  kelompok  kontrol, tetapi  tidak  terdapat  perbedaan  yang signifikan  antar  kelompok  yang  terpapar progesterone.  Penurunan  luas  area  ekspresi ini  tidak  menunjukkan  hubungan  dose- dependent.

## Aktifitas Lokomotor (Motilitas)
Data  aktifitas  lokomotor  diperoleh  dari perekaman selama  satu  menit  pada masing- masing  kelompok  perlakuan  (24  ekor)  dan
dilakukan  pengulangan  sebanyak  tiga  kali. Hasil  analisis  mendapatkan  bahwa  paparan progesterone menurunkan aktifitas lokomotor larva  bila  dibandingkan  dengan  kelompok kontrol,  walaupun  secara  statistik  penurunan aktifitas  lokomotor  pada  dosis  0,1  µM  tidak terlihat  signifikan  (Tabel  3).  Pada  metode  ini tidak  dianalisis  pengaruh  paparan progesterone  pada  dosis  tertinggi  (10  µM) karena pada usia 6 hari hampir seluruh larva telah mati. Hasil rata-rata dari tiga percobaan dapat dilihat pada Tabel 3.

## Ekspresi Aromatase B
Hasil  RT-PCR  menunjukkan  bahwa paparan progesterone meningkatkan ekspresi mRNA  aromatase  B  pada  embrio  zebrafish pada  48,  72,  dan  96  hpf.  Peningkatan  ini khususnya  terjadi  pada  papaparan progesterone  dengan  dosis  10  µM  dan terlihat  lebih  jelas  pada  saat  embrio  berusia 72 hpf dan 96 hpf (Gambar 5).
Gambar 4. Pengaruh progesterone terhadap ekspresi tirosin hidroksilase (tanda panah putih) dengan teknik imunositokimia (100x).
Keterangan: A. kelompok kontrol, B. kelompok perlakuan dengan paparan progesteron 10 µM.
Tabel 2. Rerata luas area ekspresi tirosin hidroksilase dari tiga pengulangan (%/kontrol).
Kelompok Exp. 1 Exp. 2 Exp. 3 Rerata SD kontrol 100 100 100 100 ±0 0,1 μM 36,53 62,60 62,53 53,89* ±8,67 1 μM 24,58 37,49 50,93 37,67* ±7,60 10 μM 36,81 76,34 64,28 59,14* ±11,69
Tabel 3. Rerata aktifitas lokomotor dari tiga pengulangan (garis/menit).
Perlakuan Exp. 1 Exp. 2 Exp. 3 Rerata ±SD Kontrol 5,42 7,00 8,96 7,13 ±1,02 0,1 μM 5,38 6,88 4,96 5,74 ±0,58 1 μM 2,54 2,92 3,33 2,93* ±0,22 48 hpf 96 hpf 72 hpf 48 hpf 72 hpf 96 hpf

## Gambar 5. Pengaruh progesterone pada ekspresi mRNA aromatase B.
Keterangan: Progesterone meningkatkan ekspresi mRNA aromatase B pada embrio zebrafish pada 48, 72, dan 96 hpf

## Pembahasan
Pada  penelitian  ini  dilakukan pengamatan  pengaruh  paparan  progesterone terhadap ekspresi tirosin hidroksilase, aktifitas lokomotor  dan  ekspresi  aromatase  B  pada embrio  zebrafish.  Hal  ini  bertujuan  untuk membuktikan  bahwa  progesterone  dapat mempengaruhi  sel  saraf  khususnya  yang berhubungan  dengan  sistem  dopaminergik selama  masa  perkembangan.  Selain  itu, juga diamati  efek  progesterone  terhadap  laju kematian, laju penetasan dan timbulnya defek morfologi.  Embrio  zebrafish  digunakan  pada penelitian  ini  karena  pada  masa perkembangan  otak  lebih  sensitif  terhadap paparan  suatu  zat  kimia  dibandingkan  otak dewasa,  dan  paparan  pada  saat perkembangan  mempunyai  implikasi terjadinya penyakit neurologis.
Paparan  progesterone  10  µM  diketahui meningkatan  laju  kematian  embrio dibandingkan  kelompok  kontrol  sejak  awal perkembangan  dan  terlihat  nyata  pada  usia 120  hpf.  Kelompok  yang  dipapar  dengan progesterone  dosis  10  µM  mengalami kematian hampir 100% pada usia setelah 120 hpf. Paparan progesterone 10 µM cenderung menyebabkan  penundaan  penetasan  pada embrio.Terjadinya  defek  morfologi  yang diamati  saat  embrio  berusia  96  hpf  sangat tinggi  pada  kelompok  yang  terpapar progesterone  10  µM  (76%).  Pada  kelompok embrio  yang  terpapar  progesterone  1  µM terdapat sedikit embrio yang mengalami defek morfologis (2,6%), dan tidak ada embrio yang mengalami  defek  pada  kelompok progesterone 0,1 µM dan kelompok kontrol.
Hanif, et al.                                         Efek Paparan Progesterone terhadap Ekspresi Tirosin Hidroksilase …..
Hasil  pengamatan  menunjukkan  bahwa paparan  progesteron  10  µM  menyebabkan toksisitas  yang  mematikan  dan  terjadi  defek morfologis  pada  embrio.  Selama  ini, progesterone  telah  digunakan  sebagai  obat untuk  mempertahankan  kehamilan  pada kondisi yang mengancam kehamilan terutama pada  awal  kehamilan.  Progesterone  juga dapat  menjadi  zat  yang  menyebabkan gangguan  perkembangan,  sehingga  menjadi bahan  pertimbangan  kembali  terhadap penggunaannya  selama  kehamilan  karena dapat  memberikan  efek  samping  bagi  janin. Penelitian  sebelumnya  membuktikan  bahwa paparan  estrogen  menunjukkan  hasil  yang serupa dengan penelitian ini. 1
Pengaruh  progesterone  pada  ekspresi tirosin  hidroksilase  yang  diamati  dengan metode  imunositokimia  menunjukkan  bahwa progesterone  menurunkan  ekspresi  tirosin hidroksilase pada daerah diencefalon embrio. Area  ini  merupakan  area  spesifik  untuk  sel dopaminergik  pada  embrio  zebrafish  saat berusia  48  hpf.  Oleh  karena  regulasi  enzim tirosin  hidroksilase  melalui  mekanisme transkripsional,  maka  dapat  diasumsikan bahwa  penurunan  ekspresinya  juga menunjukkan  adanya  penurunan  aktifitas enzim.  Teori  dan  penelitian  sebelum  ini membuktikan  bahwa  tirosin  hidroksilase berperan  penting  dalam  pembentukan dopamin,  sehingga  penurunan  dari  aktifitas enzim ini akan menyebabkan turunnya jumlah dopamin yang terbentuk dalam sel.
Dopamin berperan penting dalam sistem pergerakan  di  dalam  tubuh.  Turunnya  kadar dopamin  akan  menyebabkan  timbulnya kelainan  dalam sistem  saraf khususnya yang berkaitan dengan pergerakan seperti penyakit Parkinson.  Sebaliknya,  penekanan  aktifitas dopamine  merupakan  suatu  upaya  terapi untuk  mengurangi  gejala  chorea  pada penyakit  Huntington.  Pada  zebrafish,  adanya gangguan  dalam  sistem  motorik  ini  dapat diamati melalui beberapa cara, salah satunya adalah  pengamatan  aktifitas  lokomotor. Dugaan awal kami adalah progesterone dapat
menurunkan  aktifitas  lokomotor  pada  larva zebrafish yang dibuktikan dengan mengamati aktifitas lokomotor larva saat berusia 144 hpf. Pada  usia  ini  larva  telah  menunjukkan beberapa  perilaku  seperti  berenang  bebas, mencari makanan, dan perilaku menghindar. 7 Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa progesterone  menurunkan  aktifitas  lokomotor larva. Seiring dengan efek progesterone yang menurunkan  ekspresi  enzim  tirosin hidroksilase.  Maka  dapat  dikatakan  bahwa paparan  progesterone  dapat  mempengaruhi sel  dopaminergik  embrio  melalui  penurunan ekspresi  tirosin  hidroksilase  yang menyebabkan penurunan aktifitas lokomotor.
Efek  progesterone  terhadap  ekspresi tirosin  hidroksilase  dan  aktifitas  lokomotor  ini tidak  berbeda  jauh  dengan  penelitian  lain yang  menggunakan  estrogen  sebagai  bahan paparan.  Adanya  paparan  estrogen  pada embrio  zebrafish  menyebabkan  penurunan ekspresi  tirosin  hidroksilase  dan  aktifitas lokomotor. 1,7 Hal  ini  memunculkan  sebuah pertanyaan  baru  apakah  progesterone mempunyai  peran  dalam  regulasi  aktifitas estrogen  selama  masa  perkembangan. Mengingat  bahwa  reseptor  estrogen  dan progesterone  berasal  dari  superfamily  yang sama,  tersebar  luas  pada  area  otak  yang sebagian  besar  sama,  dan  kedua  zat  ini mempunyai  kemiripan  struktur  steroid,  maka dugaan  bahwa  progesterone  dapat mempengaruhi  reseptor  estrogen  tidak  dapat diabaikan. 3
Bukti  lain  menunjukkan  bahwa  paparan estrogen  menyebabkan  peningkatan  ekspresi mRNA  aromatase  B,  maka  dugaan  awal dalam  penelitian  ini  adalah  progesterone dapat  menyebabkan  hal  yang  serupa.  Hasil pengamatan  terhadap  ekspresi  mRNA aromatase  B  menunjukkan  bahwa progesterone  meningkatkan  ekspresi aromatase B.  Peningkatan ini mencapai dua kali lipat pada usia 72 hpf dan lebih dari tiga kali lipat pada usia 96 hpf (dosis progesterone 10 µM dibanding kelompok kontrol).
Hal  ini  kemungkinan  karena  progesterone masih  membutuhkan  waktu  untuk  berefek pada sistem regulasi estrogen dan aromatase B.  Temuan  ini  masih  perlu  diperjelas  untuk mengetahui  apakah  efek  progesterone bersifat  langsung  terhadap  reseptor  estrogen ataukah melalui mekanisme lain.
Terdapat  dua  jenis  reseptor progesterone di dalam inti yaitu PR-A dan PR- B. 7 Salah  satu  metode  yang  dapat  dilakukan untuk  membuktikan  bahwa  progesterone bekerja  melalui  reseptornya  di  dalam  inti adalah dengan menggunakan reseptor bloker yang spesifik untuk progesterone.
Diperlukan  pula  penelitian  mengenai kemungkinan  penggunaan  progesterone dalam  upaya  terapi  pada  keadaan  kadar dopamin  yang melebihi  normal.  Upaya  terapi yang  digunakan  untuk  mengurangi  gejala chorea  pada  penyakit  Huntington  adalah neuroleptik  tipikal  dan  atipikal  yang merupakan  penghambat  reseptor  dopamin, dan agen penekan dopamin (tetrabenazine). 3 Penggunaan obat-obat ini menyebabkan efek samping  yang  sangat  mengganggu  dan karena  itu  penggunaannya  masih  terbatas. Hasil penelitian ini, yang menunjukkan bahwa progesterone  dapat  menurunkan  aktifitas dopamin  melalui  penekanan  kerja  tirosin hidroksilase,  menjadi  awal  kemungkinan penggunaan  progesterone  sebagai  alternatif terapi penyakit Huntington.

## Kesimpulan
Progesterone  dapat  mempengaruhi  sel dopaminergik  embrio  zebrafish  melalui penekanan  ekspresi  tirosin  hidroksilase, aktifitas  lokomotor,  dan  meningkatkan ekspresi mRNA aromatase B.

## Daftar Pustaka
1. Zheng P. Neuroactive Steroid Regulation of Neurotransmitter  Release  in  the  CNS: Action,  Mechanism  and  Possible Significance.  Progress  in  Neurobiology.
2009; 89:134-152.
2.  Diaz  NF,  Diaz-Martinez  NE,  Velasco  I,
Camacho-Arroyo  I.  Progesterone Increases  Dopamine  Neuron  Number  in Differentiating  Mouse  Embryonic  Stem Cells. J Neuroendocrinol. 2009; 21(8): 730 -736.
3.  Roos  R.Huntington’s  Disease:  a  Clinical Review.  Orphanet  Journal  of  Rare Diseases. 2010; 5: 40.
4. Filippi A, Mahler J, Schweitzer J, Driever W. Expression  of  the  Paralogous  Tyrosine Hydroxylase Encoding Genes th1 and th2 Reveals  the  Full  Complement  of Dopaminergic and Noradrenergic Neurons in Zebrafish Larval and Juvenile Brain. The Journal  of  Comparative  Neurology.  2010; 518: 423-438.
5.  Kabashi  E,  Brustein  E,  Champagne  N, Drapeau  P.  Zebrafish  Models  for  the Functional  Genomics  of  Neurogenetic Disorder.  Biochimica  et  Biophysica  Acta.
2011; 1812(3):335-45.
6. Chen Q, Huang N, Huang J, Chen S, Fan J,
Li  C,  Xie  F.  Sodium  Benzoate  Exposure Downregulates the Expression of Tyrosine Hydroxylase and Dopamine Transporter in Dopaminergic  Neurons  in  Developing Zebrafish.  Birth  Defect  Research  Part  B. 2009; 86: 85-91.
7.  Fatimah  R  and  Kishida  M.  Estrogen Regulates  Motility  through Dopamine Signaling  in  Early  Development  of Zebrafish (Danio rerio). 2010.