ISSN: 1410-8917
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 17 (3) (2014) : 95 – 99
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi Journal of Scientific and Applied Chemistry
Journal homepage: http://ejournal.undip.ac.id/index.php/ksa
Isolasi dan Karakterisasi Enzim Xilanase dari Bacillus Subtilis pada Media Nutrient Broth dengan Penambahan Xilan Hasil Isolasi Jerami Padi
Yanidya Tanjihah Ardiansyah a , Nies Suci Mulyani a* , Purbowatiningrum Ria Sarjono a
a Biochemistry Laboratory, Chemistry Department, Faculty of Sciences and Mathematics, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang
* Corresponding author: niessuci@live.undip.ac.id A r t i c l e   I n f o

## A b s t r a c t
Keywords: Rice straw, Bacillus subtilis , Xylan, Xylanase
Rice straw is a lignocellulosic waste containing xylan. Xylan in rice straw can be utilized as carbon source, substrate and inducer on Bacillus subtilis growth medium to produce xylanase which has the ability to hydrolyze xylan into xylose or xylooligosaccharide. In this  research,  several  stages  were  conducted  i.e.  xylan  isolation  of  rice  straw, determination of growth curve of Bacillus subtilis, xylanase production, purification of xylanase with fractionation of ammonium sulfate and dialysis. The xylanase activity test was performed using DNS method, while protein content was tested using Lowry method. The specific activity of xylanase was calculated by xylanase activity unit per mg of protein. Characterization  was  then  performed  on  fractions  with  the  highest  specific  activity including  temperature,  pH  and  incubation  time.  The  result  showed  that  the  highest specific activity was obtained at fraction of F2 that is 5,178 Unit/mg protein. The optimum condition of xylanase obtained from the characterization was at 40°C, pH 8, incubation time  30  minutes  and  specific  activity  of  F2  fraction  at  optimum  condition  of  6,088 Unit/mg protein.

## A b s t r a k
Kata Kunci: Jerami padi, Bacillus subtilis , Xilan, Xilanase Jerami padi merupakan limbah lignoselulosa yang mengandung xilan. Xilan pada jerami padi  dapat  dimanfaatkan  sebagai  sumber  karbon,  substrat  dan  inducer  pada  media pertumbuhan Bacillus subtilis untuk menghasilkan xilanase yang memiliki kemampuan menghidrolisis xilan menjadi xilosa atau xilooligosakarida. Pada penelitian ini dilakukan beberapa  tahap,  yaitu  isolasi  xilan  dari  jerami  padi,  penentuan  kurva  pertumbuhan Bacillus  subtilis,  produksi  xilanase,  pemurnian  xilanase  dengan  fraksinasi  bertingkat amonium  sulfat  dan  dialisis.  Pengujian  aktivitas  xilanase  dilakukan  dengan menggunakan metode DNS, sedangkan kadar protein diuji dengan menggunakan metode Lowry.  Aktivitas  spesifik  xilanase  dihitung  berdasarkan  unit  aktivitas  xilanase  per  mg protein.  Selanjutnya  dilakukan  karakterisasi  pada  fraksi  dengan  aktivitas  spesifik tertinggi  meliputi  suhu,  pH  dan  waktu  inkubasi.  Hasil  menunjukkan  bahwa  aktivitas spesifik tertinggi diperoleh pada fraksi F2 yaitu sebesar 5,178 Unit/mg protein. Kondisi optimum  xilanase  yang  diperoleh  dari  hasil  karakterisasi  yaitu  pada  suhu  40°C,  pH  8, waktu inkubasi 30 menit dan aktivitas spesifik fraksi F2 pada kondisi optimum sebesar 6,088 Unit/mg protein.
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 17 (3) (2014) : 95 – 99

## 1. Pendahuluan
Perkembangan  dan  kemajuan  bidang  pertanian  di Indonesia  telah  menimbulkan  peningkatan  limbah pertanian  dimana  sebagian  besar  merupakan  limbah yang  mengandung  lignoselulosa.  Limbah  lignoselulosa yang  mempunyai  potensi  cukup  besar  bagi  proses industri  yang  memerlukan  bahan  baku  berkadar hemiselulosa  antara  lain  jerami,  biji  kedelai,  onggok, bonggol  dan  kulit  jagung,  sabut  serta  tandan  kosong kelapa sawit dan lain sebagainya [1]. Kandungan terbesar dalam  hemiselulosa  adalah  xilan  [2],  oleh  karena  itu diharapkan  xilan  dari  jerami  padi  dapat  ditambahkan pada  media  pertumbuhan  sebagai  sumber  karbon, substrat  dan inducer bagi Bacillus  subtilis untuk menghasilkan enzim xilanase.
Xilanase merupakan enzim ekstraseluler yang dapat menghidrolisis xilan (hemiselulosa) menjadi xilosa dan xilo-oligosakarida.  Xilanase  dapat  dimanfaatkan  untuk proses  pemutih  kertas,  penjernihan  sirup,  pembuatan gula xilosa dan sebagainya. Penggunaan xilanase untuk mengurangi  pemakaian  khlorin  dalam  pemutih  kertas, telah  memberikan  peluang  untuk  aplikasi  bioteknologi [3, 4].
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  memperoleh  enzim xilanase yang dihasilkan dari Bacillus subtilis pada media yang  telah  ditambahkan  dengan  xilan  dari  jerami  padi sebagai  sumber  karbon,  substrat  dan inducer , memperoleh  karakter  enzim  meliputi  pH,  suhu  dan waktu  inkubasi  optimum  serta  menentukan  aktivitas spesifik enzim xilanase pada kondisi optimumnya.

## 2. Metode Penelitian

## Isolasi Xilan dari Jerami Padi
Xilan  dari  jerami  padi  digunakan  sebagai  sumber karbon,  substrat dan  inducer pada media  pertumbuhan Bacillus  subtilis  untuk  dapat  menghasilkan  xilanase. Xilan  dari  jerami  padi  diekstrak  menggunakan  NaOCl, disaring  kemudian  residunya  ditambahkan  NaOH  10% selama  24  jam.  Setelah  disaring  filtratnya  dinetralkan dengan  CH 3 COOH  selanjutnya  ditambahkan  etanol berlebih hingga terbentuk endapan.

## Peremajaan (Refreshing) Bacillus subtilis
Komposisi  media  untuk  peremajaan  (g/L):  Pepton 5,0;Yeast Ekstrak1,0; K 2 HPO 4 1,0; MgSO 4 ·7H 2 O 0,2. Media diatur  pada  pH  7  dengan  inkubasi  pada  kecepatan  250 rpm, suhu 40°C selama 24 jam.

## Penentuan Kurva Pertumbuhan
Kurva  tumbuh  ditentukan  dengan  mengukur absorbansi  kultur  bakteri  setiap  2  jam  sekali  dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis.

## Produksi Xilanase
Komposisi  media  untuk  produksi  xilanase  (g/L): Xilan 10,0 1% (w/v); Pepton 5,0;Yeast Ekstrak1,0; K 2 HPO 4 1,0; MgSO 4 ·7H 2 O 0,2. Penambahan xilan dilakukan pada awal  fase  log.  Media  diatur  pada  pH  7  dengan  inkubasi
pada  kecepatan  250 rpm,  suhu  40°C. Proses  fermentasi dihentikan sampai akhir fase log.

## Isolasi dan Pemurnian Xilanase
Isolasi  dan  pemurnian  xilanase  dilakukan  dengan pemisahan  (sentrifugasi),  supernatan  yang  diperoleh selanjutnya  difraksinasi  dengan  ammonium  sulfat. Fraksinasi  dilakukan  secara  bertingkat  menggunakan ammonium  sulfat  dengan  tingkat  kejenuhan  yang berbeda,  yaitu  untuk  kejenuhan  0-20%  (F1),  20-40% (F2),  40-60%  (F3),  60-80%  (F4)  dan  80-100% (F5).Endapan  hasil  fraksinasi  selanjutnya  didialisis. Selama proses dialisis kandungan ammonium sulfat diuji dengan BaCl 2 . Dialisis dihentikan hingga tidak terbentuk endapan BaSO 4 .

## Uji Aktivitas Xilanase
Uji aktivitas xilanase dilakukan dengan menggunakan  reagen  DNS  ( Dinitrosalicylic  acid ). Sebanyak 0,1 mL enzim; 0,4 mL 0,05 M buffer fosfat (pH 7); 0,5 mL oat spelt xylan 1% (w/v). Campuran diinkubasi pada suhu 40°C selama 30 menit, kemudian ditambah 1 mL  reagen  DNS  dan  dipanaskan  selama  10  menit. Selanjutnya  dilakukan  pengukuran  pada λ 446 dengan spektrofotometer UV-Vis.

## Penentuan Kadar Protein
Kadar protein ditentukan dengan metode Lowry dan diguanakan BSA ( Bovine Serum Albumin ) sebagai standar. Sebanyak  0,1  mL  enzim  ditambah  2  mL  larutan  Lowry C(50 mL Lowry A (Na 2 CO 3 ; NaOH; K-Na Tartrat) + 1 mL Lowry B (CuSO 4 ·5H 2 O)), diinkubasi pada 37°C selama 30 menit. Selanjutnya ditambahkan 0,2 mL Lowry D (reagen folin-ciocalteau ) dan diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit.

## Karakterisasi Xilanase
Karakterisasi xilanase dilakukan dengan penentuan suhu  optimum,  dengan  variasi:  30°C,  35°C,  40°C,  45°C dan 50°C. Penentuan pH optimum dengan variasi pH: 5, 6,  7,  8  dan  pH  9.  Penentuan  waktu  inkubasi  optimum dengan variasi waktu: 20, 25, 30, 35 dan 40 menit.

## 3. Hasil dan Pembahasan

## Isolasi Xilan dari Jerami Padi
Xilan  yang  diperoleh  dari  jerami  padi  hasil  isolasi berupa  serbuk  berwarna  putih.  Selanjutnya  diuji kemampuannya secara kualitatif sebagai substrat untuk menghasilkan  xilosa  dibandingkan  dengan oat  spelt xylan .

## Peremajaan (Refreshing) Bacillus subtilis
Hasil peremajaan antara kultur dan kontrol negatif menunjukkan pada kultur Bacillus subtilis dapat tumbuh pada  media,  ditunjukkan  dengan  terjadinya  kekeruhan pada media. Sedangkan pada kontrol negatif media tetap jernih.

## Penentuan Kurva Pertumbuhan
Kurva pertumbuhan yang diperoleh dapat memberikan informasi mengenai fase-fase
pertumbuhan Bacillus subtilis. Sehingga dapat diketahui waktu  penambahan inducer dan  waktu  penghentian fermentasi.
Gambar 1. Kurva Pertumbuhan Bacillus subtilis
Data  kurva  pertumbuhan  (Gambar  1)  dapat menunjukkan  pada  jam  ke-0  sampai  jam  ke-2 Bacillus subtilis mengalami  fase  pertumbuhan  awal  (fase  lag). Mulai  jam  ke-2  sampai  jam  ke-12  merupakan  fase eksponensial  (fase  logaritmik),  Pada  jam  ke-12  sampai jam  ke-14  sel Bacillus  subtilis telah  mencapai akhir  fase eksponensial  sehingga  kecepatan  pertumbuhan  mulai menurun  (lambat),  Pada  jam  ke-14  sampai  jam  ke-18 Bacillus  subtilis mulai  memasuki  fase  stasioner,  Setelah jam ke-18 Bacillus subtilis mengalami fase kematian.

## Produksi Xilanase
Produksi xilanase dilakukan dengan menambahkan xilan 1% (w/v) ke dalam media produksi pada jam ke-4 (awal fase log) sesuai kurva pertumbuhan. Penambahan xilan  bertujuan  untguk  menginduksi  sintesis  xilanase sehingga diharapkan xilanase yang dihasilkan maksimal. Proses fermentasi dihentikan pada jam ke-10 (akhir fase log)  karena  pada  fase  ini  jumlah  sel  Bacillus  subtilis maksimal dan metabolit sekunder yang terbentuk masih sedikit  sehingga  diharapkan  xilanase  yang  dihasilkan optimal.

## Isolasi dan Pemurnian Xilanase
Pemisahan  xilanase  dilakukan  dengan  metode sentrifugasi  pada  kecepatan  6000  rpm.  Tahap  ini bertujuan  untuk  memisahkan  enzim  dari  komponen media  dan  sel-sel  bakteri.  Supernatan  yang  diperoleh merupakan  ekstrak  kasar  xilanase  ( crude  enzyme ).
Selanjutnya  ekstrak  kasar  yang  diperoleh  difraksinasi menggunakan  amonium  sulfat,  yang  bertujuan  untuk memisahkan  protein  enzim  xilanase  dengan  protein lainnya.  Endapan  yang  diperoleh  dari  hasil  fraksinasi merupakan  protein  enzim  dengan  tingkat  kejenuhan yang berbeda yaitu, F1, F2, F3, F4 dan F5. Fraksi tersebut selanjutnya didialisis yang merupakan proses pemurnian lanjutan  terhadap  protein  enzim  [5].  Dimana  amonium sulfat yang masih terdapat dalam endapan protein enzim harus dipisahkan, dengan demikian hanya protein enzim saja  yang  diperoleh.  Dialisis  dihentikan  jika  tidak  lagi terbentuk  endapan BaSO 4 ,  hal  ini  berarti  protein  enzim telah terbebas dari ion sulfat.

## Uji Aktivitas dan Aktivitas Spesifik Xilanase
Definisi 1 unit aktivitas xilanase dalam penelitian ini adalah aktivitas xilanase yang dapat membentuk 1 µmol xilosa  per  menit  pada  kondisi  optimum  [6].  Aktivitas xilanase  ditentukan  melalui  identifikasi  produk  xilosa yang  terbentuk  akibat  adanya aktivitas  sejumlah  enzim yang diuji dengan DNS [7].
Kadar  protein  ditentukan  dengan  metode Lowry . Aktivitas  spesifik  adalah  unit  aktivitas  per  miligram protein [8].
Gambar 2. Penentuan Aktivitas Spesifik Xilanase
Hasil  penentuan  aktivitas  spesifik  (gambar  2) menunjukkan bahwa aktivitas spesifik tertinggi xilanase pada fraksi 2 (F2) sebesar 5,178 Unit/mg protein. Hasil ini dapat menunjukkan bahwa sebagian besar protein enzim pada  F2  adalah  xilanase,  sehingga  tingkat  kemurnian xilanase  yang  tertinggi  adalah  pada  F2  dibandingkan fraksi lainnya.

## Karakterisasi Xilanase
Karakterisasi  dilakukan  untuk  mengetahui  kondisi optimum  xilanase  yang  meliputi  suhu,  pH  dan  waktu inkubasi.

## Penentuan Suhu Optimum
Hasil  penentuan  suhu  optimum  menunjukkan aktivitas xilanase meningkat dengan meningkatnya suhu sampai  40°C,  selanjutnya  pada  suhu  yang  lebih  tinggi aktivitasnya menurun (Gambar 3). Suhu optimum adalah suhu  yang  paling  tepat  bagi  suatu  reaksi  enzimatis berlangsung  untuk  dapat  menghasilkan  produk  [9]. Aktivitas xilanase pada suhu 40°C adalah 5,290 Unit/mg protein.
Gambar 3. Hubungan Antara Suhu Terhadap Aktivitas Spesifik Xilanase
0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350 0.400 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Waktu (jam) A b so rba n si 0.364 2.191 5.178 1.591 1.170 2.326 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 EK F1 F2 F3 F4 F5 Fraksi A kt iv ita s S pe si fik (U ni t/m g P ro te in ) 4.577 4.976 4.805 5.290 4.434 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4 25 30 35 40 45 50 55 Suhu( 0 C) A kti fita s Sp es ifi k
(U ni t/m g pr ote in )

## Penentuan pH Optimum
Hasil  penentuan  pH  optimum  menunjukkan aktivitas  xilanase  meningkat  dengan  meningkatnya  pH sampai  pH  8,  pada  pH  yang  lebih  tinggi  aktivitasnya menurun  (Gambar  4).  pH  optimum  adalah  pH  yang menyebabkan  aktivitas  enzim  maksimum  [8].  Aktivitas spesifik xilanase pada pH 8 adalah 5,461 Unit/mg protein. pH  akan  berpengaruh  terhadap  sisi  aktif  xilanase  yang berupa  Glu-78  dan  Glu-172.  Pada  kondisi  pH  di  bawah atau di atas pH optimum, konsentrasi H + dan OH - dapat mempengaruhi  gugus  karboksil  (-COOH)  dari  Glu-78 sebagai nukleofil dan gugus karboksil (-COOH) dari Glu- 172 sebagai elaktrofil. Sisi aktif xilanase tidak dapat tepat berikatan  dengan  substrat,  sehingga  komplek  Enzim- Substrat yang terbentuk tidak optimal dan produk yang dihasilkan rendah.
Gambar 4. Hubungan Antara pH Terhadap Aktivitas Spesifik Xilanase

## Penentuan Waktu Inkubasi Optimum
Hasil  penentuan  waktu  inkubasi  optimum menunjukkan  aktivitas  xilanase  meningkat  sampai waktu inkubasi 30 menit, pada waktu inkubasi lebih dari waktu  inkubasi  optimum  aktivitasnya  akan  menurun (Gambar  5).  Waktu  inkubasi  merupakan  waktu  kontak antara enzim dengan substrat untuk membentuk produk. Aktivitas spesifik xilanase pada 30 menit inkubasi adalah sebesar 5,917 Unit/mg protein.
Gambar 5. Hubungan Antara Waktu Inkubasi Terhadap Aktivitas Spesifik Xilanase

## Penentuan Aktivitas Spesifik Xilanase Pada Kondisi Optimum
Penentuan  aktivitas  spesifik  xilanase  pada  kondisi optimum (suhu 40°C, pH 8 dan waktu inkubasi 30 menit) dilakukan  pada  semua  fraksi,  bertujuan  untuk mengetahui aktivitas xilanase yang bekerja pada kondisi
optimum  untuk  dapat  menghasilkan  produk  yang maksimum.

## Gambar 6. Penentuan Aktivitas Spesifik Xilanase Pada Kondisi Optimum
Hasil  penentuan  aktivitas  spesifik  xilanase  pada kondisi  optimum  (Gambar  6)  menunjukkan  bahwa aktivitas  spesifik  xilanase  tertinggi  pada  fraksi  2  (F2) mengalami peningkatan menjadi 6,088 Unit/mg protein.

## 4. Kesimpulan
Xilan hasil isolasi dari jerami padi dapat digunakan sebagai  pengganti  xilan  murni  ( oat  spelt  xylan )  yang merupakan  sumber  karbon,  substrat  dan inducer pada media  pertumbuhan  dengan  menggunakan Bacillus subtilis untuk  menghasilkan  xilanase.  Berdasarkan penelitian  diperoleh  hasil  aktivitas  spesifik  tertinggi sebesar 5,178 Unit/mg protein pada fraksi F2. Dari hasil karakterisasi  diperoleh  kondisi  optimum  xilanase  pada suhu  40°C,  pH  8,  dan  waktu  inkubasi  30  menit  dengan aktivitas spesifik F2 pada kondisi optimum sebesar 6,088 Unit/mg protein.

## 5. Daftar Pustaka
[1]  Nur  Richana,  Produksi dan  prospek  enzim  xilanase dalam  pengembangan  bioindustri  di  Indonesia, Buletin AgroBio , 5, 1, (2002) 29-36
[2]  Saurabh  Sudha  Dhiman,  Jitender  Sharma,  Bindu Battan, Industrial applications and future prospects of microbial xylanases: a review, BioResources , 3, 4,
(2008) 1377-1402
[3]  R Bourbonnais, MG Paice, B Freiermuth, E Bodie, S Borneman,  Reactivities  of  various  mediators  and laccases  with  kraft  pulp  and  lignin  model compounds, Applied and environmental microbiology , 63, 12, (1997) 4627-4632
[4]  Alberto  Ruiz-Arribas,  Jose  M  Fernández-Abalos, Pilar Sanchez, Ana Lila Garda, Ramon I Santamariá, Overproduction,  purification,  and  biochemical characterization  of  a  xylanase  (Xys1)  from Streptomyces halstedii JM8, Applied and environmental microbiology , 61, 6, (1995) 2414-2419
[5]  Tim  Bugg,  Introduction  to  Enzyme  and  Coenzyme Chemistry, John Wiley & Sons, 2004.
[6]  Kilunga  Bruno  Kubata,  Hiroyuki  Horitsu,  Keiichi Kawai,  Kazuhiro  Takamizawa,  Tohru  Suzuki, Xylanase I of Aeromonas caviae ME-1 isolated from the intestine of a herbivorous insect (Samia cynthia pryeri), Bioscience,  biotechnology,  and  biochemistry ,
4.805 5.119 5.461 4.634 4.491 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0 4 5 6 7 8 9 10 pH A kt ifi ta s Sp es ifi k (U ni t/m g pr ot ei n) 5.603 5.261 5.917 5.746 5.176 5.0 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 6.0 15 20 25 30 35 40 45 Waktu (menit) A kti fita s Sp es ifi k
(U ni t/m g pr ote in ) 0.401 2.546 6.088 3.224 1.598 3.058 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 EK F1 F2 F3 F4 F5 Fraksi A kt if it as S p es if ik (U n it /m g P ro te in )
56, 9, (1992) 1463-1464
http://dx.doi.org/10.1271/bbb.56.1463
[7]  Gail  Lorenz  Miller,  Use  of  dinitrosalicylic  acid reagent  for  determination  of  reducing  sugar, Analytical  chemistry ,  31,  3,  (1959)  426-428 http://dx.doi.org/10.1021/ac60147a030
[8]  Albert  L  Lehninger,  Dasar-Dasar  Biokimia,  M. Thenawidjaja, Erlangga, Jakarta, 1990.
[9]  R  Raswil,  M  Wirahadikusumah,  Isolation  and identification of phospholipid of ribbed smoke sheet, Buletin Perkebunan Rakyat (Indonesia) , (1989)