Penentuan Aktivitas Gabungan Ekstrak Etanol Pulosari ( Alyxia reinwardtii ) dan  Secang  ( Sappan  Lignum )  Sebagai  Inhibitor  Tirosinase  Yang  Potensial Untuk Bahan Kosmetik Melalui Pendekatan In Silico dan In Vitro
Fadilah 1* , Aryo Tedjo 1 , Rudi Heryanto 2
1 Departemen Kimia Kedokteran, Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Indonesia
2 Pusat Studi Biofarmaka, LPPM, Institut Pertanian Bogor, Indonesia

## Abstrak
Tirosinase  atau  fenol  oksidase  adalah  enzim  utama  yang  terlibat  dalam  biosintesis melanin.  Untuk  menghindari  produksi  melanin  secara  berlebihan  pada  lapisan epidermal, maka dicari senyawa yang mampu menghambat tirosinase sehingga dapat digunakan  sebagai  bahan  pemutih  kulit.  Inhibitor  enzim  tirosinase  dapat  diperoleh dari senyawa bahan alam diantaranya, polifenol, kumarin, stilben sebagai pengganti senyawa  sintetik.  Tirosinase  telah  diketahui  struktur  molekular  sehingga  dapat diketahui  mekanisme  kerjanya  melaui  uji in-silico dan  pembuktian  secara in-vitro . Penelitian ini digunakan untuk mendeteksi keefektifan gabungan dari ekstrak etanol pulosari ( Alyxia reinwardtii ) dan secang ( Sappan lignum ) sebagai inhibitor tirosinase . Dari hasil in-silico pengujian aktivitas inhibisi tirosinase menggunakan software MOE 2008  menunjukkan  bahwa  dalam  ekstrak  etanol  dari  secang yaitu  senyawa  brazilin dan rhamnitin berturut-turut memiliki nilai ∆G -15.6582 kkal/mol, -13.3378 kkal/mol dengan  inhibisi  10.021  μM,  8.331  μM  dan  Hdon-acc  6,  8.  Sedangkan  dalam  ektrak etanol  dari  pulosari  dengan  senyawa  scopoletin  dan  zhebeiresinol  berturut-turut memiliki  nilai  ∆G  -12.1661  kkal/mol;  -13.8982  kkal/mol  dengan  inhibisi  7.279  μM; 9.104  μM  dan  Hdon-acc  5  dan  6.  Sedangkan  senyawa  parameter  L-DOPA  dan pembanding  asam  kojat  berturut-turut  memiliki  nilai  ∆G  -9.8247  kkal/mol;  -8.8047 kkal/mol  dengan  inhibisi  5.592  μM;  4.976  μM  dan  Hdon-acc  3;  3.  Dari  pembuktian secara in-vitro menunjukkan bahwa uji aktivitas inhibisi tirosinase berturut-turut dari secang (Sl),  pulosari (Ar),  gabungan  Sl  dan  Ar  dengan  pembanding  asam  kojat memiliki  nilai  IC 50 berturut-turut  797.090  ppm,  1962.934  ppm,  571.352  ppm  dan 93.557  ppm.  Sehingga  dari  hasil in-silico dan in-vitro disimpulkan  bahwa penggabungan  antara  pulosari dan  secang memiliki  tingkat  IC 50 lebih  baik dibandingkan pemberian masing-masing ekstrak.
Penulis
Afiliasi

## Kata Kunci
 Tirosinase
 Pulosari ( Alyxia reinwardtii)
 Secang (Sappan lignum)
 Polifenol
 Simulasi docking  uji in vitro
Diterima 20 Agustus 2015 Direvisi 8 Desember 2015 Disetujui 9 Februari 2016

## *Penulis korespondensi
Fadillah
Departemen Kimia
Fakultas Kedokteran
Universitas Indonesia Jl. Salemba Raya No.06 Jakarta Pusat, Indonesia fadilah81@gmail.com
Aktivitas Gabungan Ekstrak Etanol Pulosari ( Alyxia reinwardtii ) dan Secang ( Sappan lignum ) sebagai inhibitor tirosinase

## Pendahuluan
Tirosinase  (EC  1.14.18.1)  adalah  enzim multifungsi  yang  mengandung  Cu  yang  secara  luas terdistribusi  di  alam.  Enzim  ini  terutama  terlibat dalam dua langkah pertama dari biosintesis melanin, yang  terdiri  dari  hidroksilasi  L-tirosin  (aktivitas monofenolase) dan oksidasi dari produk ini reaksi, L- dopa (aktivitas difenolase) (Kim et al. 2005). Enzim ini juga  bertanggung  jawab  untuk  pigmentasi  kulit kelainan  seperti  bintik-bintik  dan  cacat  (Seo et  al. 2003).  Tirosinase  juga  terkait  dengan  Parkinson  dan lainnya  penyakit  neurodegenerative  (Asanuma et  al. 2003;  Xu et  al. 1998).  Enzim  tirosinase  berperan dalam  biosintesis  melanin  di  dalam  tubuh  makhluk hidup.  Melanin  memiliki  fungsi  yang  sangat  penting yaitu  untuk  melindungi  tubuh  dari  radiasi  sinar ultraviolet dari matahari (Artes et al. 1998).
Di  negara  yang  beriklim  tropis,  seperti Indonesia  tentunya  paparan  sinar  matahari  tidak dapat dihindari, terlebih apabila seseorang diharuskan  beraktivitas  di  luar  ruangan  dan  kulitnya mengalami  kontak  langsung  dengan  sinar  matahari. Namun,  apabila  pigmen  melanin,  diproduksi  secara berlebih  akan  terjadi  penumpukan  melanin  pada permukaan kulit (hiperpigmentasi). Untuk menghindari  produksi  melanin  berlebih  maka mekanisme  tirosinase  perlu  dihambat,  adanya inhibitor  tirosinase  ini,  akan  menghambat  reaksi enzimatis  dari  tirosinase.  Beberapa  inhibitor tirosinase  diantaranya  arbutin,  asam  askorbat,  asam kojat, merkuri dan hidrokuinon (Kim et al. 2005).
Beberapa  Inhibitor  tersebut  diperoleh  secara sintesis  dan  dari  bahan  alam.  Senyawa  alam diantaranya  turunan  polifenol  yang  berasal  dari tumbuh–tumbuhan  telah  diselidiki  sebagai  inhibitor tirosinase  untuk  menghindari  produksi  melanin secara  berlebihan  pada  lapisan  epidermal,  sehingga dapat digunakan sebagai bahan kosmetik (Zheng et al 2008).  Senyawa  alam  diantaranya  dalam  tanaman Secang  (Sappan  lignum) dan Pulosari  (Alyxia reinwardtii) memiliki  kandungan  kumarin,  flavonoid, kalkon dan iridoit yang diprediksikan bisa menghambat  aktivitas  tirosinase  (Kittagawa et  al. 1988; Topcu et al. 1990; Lin et al. 1993; Steffan et al. 2005; Chen et al . 2008; Rattanappani et al. 2012).
Penggunaan  senyawa  alam  terbukti  lebih  baik dan  aman  dibandingkan  senyawa  sintesis  dalam
menghambat  metabolisme  pigmentasi.  Beberapa analog  kumarin,  esculetin,  diisolasi  dari  biji Euphorbialathyris dan menunjukkan seperempat dari aktivitas  antitirosinase  asam  kojat  (Masamoto et  al. 2003).  Senyawa  analog  kumarin  baru-baru  ini terbukti  merupakan  substrat  tirosinase  dari  jamur (Sollai et al. 2008). Analog kumarin yang lain yaitu 9- hidroksi-4-metoksipsoralen yang diisolasi dari Angelica  dahurica terbukti  enam  kali  memiliki aktivitas inhibisi tirosinase dari pada asam kojat (Piao et al. 2004).
Baru-baru ini teknologi bioinformatik menemukan  struktur  tiga  dimensi  tirosinase,  maka pembentukan kompleks protein-ligan sebagai inhibitor dapat diprediksi dengan simulasi komputasi, dimana  prediksi  ikatan  dan  perubahan  konformasi kompleks  dapat  diketahui.  Salah  satu  cara  untuk mengetahui  apakah  terjadi  interaksi  ligan  dengan protein  adalah  dengan  simulasi docking .  Simulasi docking adalah suatu simulasi perhitungan mekanika kuantum  dan  penghitungan  energi  bebas  ikatan suatu  senyawa  (ligan)  terhadap  reseptor  (dalam  hal ini  protein)  untuk  mengetahui  apakah  senyawa tersebut mampu berinteraksi dengan reseptor (Leach 2001; Luchintes 2004; Funkhouser 2007).
Pertimbangan untuk melakukan penelitian ini melalui pendekatan molecular  docking adalah  cara  ini  akan membantu  menseleksi  komponen  senyawa  yang akan  diuji  secara in  vitro sehingga  membuat pekerjaan  ekstraksi,  isolasi,  dan  elusidasi  senyawa aktif menjadi lebih efisien.
Mekanisme kerja enzim diduga akan menghasilkan  senyawa  yang  lebih  berdaya  guna. Senyawa  yang  lebih  menghambat  kejadian  dan proses  yang  spesifik  dalam  sistem  pigmentasi. Diantara  pilihan  yang  ada,  penggunaan  komponen bahan  alam  yang  memiliki  sifat  memperbaiki  dan kinerja  lebih  baik  dari  sintesis  dapat  dicoba  pada enzim  tirosinase.  Oleh  karena  itu,  Penelitian  ini bertujuan  untuk  mengembangkan  senyawa  yang berasal dari tanaman asli  Indonesia  terpilih  (pulosari dan  secang)  yang  dapat  berfungsi  sebagai  inhibitor tirosinase.  Secara  khusus  penelitian  ini  bertujuan untuk  memperoleh  kandidat  senyawa  polifenol penghambat tirosinase dari pulosari dan secang yang berasal  dari  ekstrak  etanolnya.  Selain  itu  didapatkan pula  bukti  ilmiah  penggunaan  bahan  alam  gabungan
Fadillah et al. dalam  bentuk  ekstrak  kasar  terkait  keberadaan senyawa kandidat yang dapat menghambat. Hasil lain yang  diharapkan  dalam  penelitian  ini  adalah didapatkan  alur/model  bagi  penelitian  bahan  alam berdasarkan  database  yang  ada  sehingga  dapat dihindari pengulangan penelitian yang telah dilakukan,  sehingga  akan  mempercepat  aplikasi penerapan bahan-bahan alam. Manfaat penelitian ini diharapkan dapat mendukung pengembangan produk pemutih  kulit  yang  akan  membantu  masyarakat dunia  untuk  memperoleh  senyawa-senyawa  dalam ekstrak  yang  ampuh  dan  meningkatkan  penggunaan bahan-bahan alam Indonesia serta mampu mengeksplorasi  sumber  alam  kekayaan  Indonesia  ke kancah  dunia.  Riset  ini  juga  diperlukan  untuk mengembangkan  produk-produk  lebih  jauh  lagi sebagai  bahan-bahan  fitofarmaka  modern  yang nantinya  dapat  diakui  di  pasar  dan  diekspor  ke negara lain.

## Metode Penelitian
Penelitian  ini  dilakukan  di  Laboratorium  Pusat Studi  Biofarmaka  LPPM  Institut  Pertanian  Bogor  dan Laboratorium Kimia Kedokteran Fakultas  Kedokteran Universitas  Indonesia.  Bahan  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  kulit  batang  tanaman  pulosari dan secang dari daerah Bogor, etanol, bufer fosfat pH 6.5, NH4OH, alkohol, HCl 37%, etanol 95%, DMSO, L- DOPA, L-tirosin, asam kojat, dan enzim tirosinase dari jamur  (Sigma,  333  unit/mL  dalam  bufer  fosfat).  Alat yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu-UV 1700), multi- plate  reader , multi-well  plate ,  penguap  putar,  dan alat-alat gelas.
Uji in-vitro aktivitas inhibitor tirosinase Preparasi  awal  sampel  dilakukan  dengan memngambil  sampel  kulit  batang  dari  secang  dan pulosari.  Sampel  dikeringkan  dan  diserbukkan. Serbuk  yang  dihasilkan  dimaserasi  menggunakan etanol  sebanyak  3  kali  ulangan.  Ekstrak  yang diperoleh kemudian disaring dan filtratnya dipekatkan  dengan  menggunakan  penguap  putar pada suhu 30 °C.
Uji aktivitas inhibitor tirosinase (Batubara et al. 2010),  ekstrak  tanaman  pulosari  dilarutkan  di  dalam DMSO  hingga  konsentrasi  20  mg/mL.  Larutan  stok disiapkan  dengan  cara  melarutkan  ekstrak  pekat  ke
dalam bufer fosfat 50 mM (pH 6.5) hingga diperoleh konsentrasi  600  μg/mL.  Setelah  itu,  ekstrak  diuji dengan  konsentrasi  31–2000  μg/mL.  Asam  kojat sebagai  kontrol  positif  juga  diuji  pada  variasi konsentrasi  yang  sama  dalam  pelat  tetes  96  sumur. Ekstrak sampel masing-masing ditambahkan sebanyak  70  μL  ke  dalam  pelat  tetes  96  sumur. Kemudian  ke  dalam  tiap  sumur  ditambahkan  30  μL enzim  tirosinase  (Sigma,  333  unit/ml  dalam  bufer fosfat)  dan  campuran  diinkubasi  selama  5  menit. Setelah itu, sebanyak 110 μL substrat (L-tirosin 2 mM atau L-DOPA 12 mM) ditambahkan dan campurannya diinkubasi pada suhu 37 °C selama 30 menit. Larutan pada  masing-masing  sumur  diukur  absorbansnya dengan  menggunakan microplate  reader pada panjang  gelombang  492  nm  untuk  menentukan persen  inhibisi  dan  nilai  konsentrasi  hambat  50% (IC 50 ).  Persen  inhibisi  dihitung  dengan  cara membandingkan absorbans sampel tanpa penambahan  ekstrak  ( A )  dan  dengan  penambahan ekstrak ( B ) pada panjang gelombang 492 nm.
Uji in-silico
Preparasi tirosinase, sekuen tirosinase dapat di unduh  dari database NCBI  yang  ada  di National Center  for  Biotechnology  Information melalui  alamat situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/flu/ dengan  menggunakan  perangkat  komputer  yang terhubung  dengan internet .  Sekuen  dari  hasil searching dialignment menggunakan program Clustal W2 . Program  Clustal  W2  disediakan  secara  online dengan
mengakses www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html . Hasil
alignment diinterpretasikan dengan score yang paling tinggi.  Proses editing  alignment digunakan software Bioedit. Pencarian struktur tiga dimensi tapak sekuen dilakukan  dengan  menggunakan  Swiss  model  yang dapat diakses melalui http://swissmodel.expasy.org/SWISS-MODEL.html. yang  dilakukan  dengan  menggunakan  bantuan perangkat  komputer  yang  terhubung  dengan internet .  Sistem  operasi  yang  digunakan  adalah Microsoft  Windows  XP dengan browser  Mozilla Firefox  2.0. selanjutnya  hasil  struktur  tiga  dimensi dioptimasi  geometri  dan  minimisasi  energi  struktur tiga  dimensi  tirosinase  dilakukan  menggunakan software MOE  yang  telah  diunduh  dengan  format pdb.  Kemudian  dilakukan  penambahan  atom
Aktivitas Gabungan Ekstrak Etanol Pulosari ( Alyxia reinwardtii ) dan Secang ( Sappan lignum ) sebagai inhibitor tirosinase
21
hidrogen  dan  dilakukan  protonasi  dengan  program protonate  3D.  Selanjutnya  dilakukan  pengaturan muatan  partial  dengan  menggunakan  partial  charge dan  optimasi  dengan  force  field  MMFF94x.  Saat optimasi, solvasi enzim dalam bentuk gas phase  dan dilakukan  fix  charge  dengan  RMS  gradient  0.05 kcal/Amol,  dan  parameter  yang  lain  menggunakan standar yang telah ada di software MOE.
Perancangan  senyawa  bioaktif,  senyawa bioaktif  dari  pulosari  dan  secang  dari  studi  jurnal dimodelkan  ke  dalam  struktur  tiga  dimensi. Pemodelan  ini  dilakukan  dengan  menggunakan software  ACD  Lab s.  Bentuk  tiga  dimensi  didapatkan dengan menyimpan dalam 3D viewer pada ACDLabs, dan  struktur  tiga  dimensi  disimpan  dalam  format MDL molfile. Selanjutnya format MDL Molfile diubah kedalam  format  MDL  Mol  menggunakan software Vegazz agar sesuai untuk proses docking . Selanjutnya kandidat ligan yang dirancang disimpan dalam format Mol  dibuka  dengan software MOE  dalam  bentuk database  viewer .  Selanjutnya  ligan  di wash dengan program compute ,  dilakukan  penyesuaian  muatan partial ligan  dengan partial  charge dan  optimasi menggunakan forcefield MMFF94.  Selanjutnya  ligan diminimasi  menggunakan energy  minimize dengan RMS gradient 0.001  Kcal/Amol.  Parameter  lainnya sesuai  dengan default yang  ada  dalam software docking  tirosinase terhadap  ligan.  Proses docking diawali dengan preparasi file docking yang dilakukan dengan  menggunakan  program docking yang terdapat dalam software MOE.
Simulasi docking dilakukan  dengan  program Compute-Simulation dock dengan operating  system Microsoft  Windows  XP  Professional.  Metode penempatan  menggunakan triangle  mathcer dengan pengulangan pembacaan energi tiap posisi 2.000.000 dan parameter yang lain sesuai yang ada dalam MOE. Selanjutnya scoring  function menggunakan  longdon dG, refinement  forcefield dengan  konfigurasi pengulangan  populasi  1000.  Pengulangan  yang pertama sebanyak seratus (100) kali dan pengaturan kedua hanya ditampilkan satu dari hasil yang terbaik dari 100 pengulangan .
Analisis docking, Hasil  pembentukan  kompleks docking  enzim  ligan  ditampilkan  dalam database viewer output pada  halaman  MOE.  Parameter  yang ditampilkan  dan  digunakan  untuk  analisis  adalah energi bebas ikatan (Gbinding), Log P, bobot molekul,
konstanta  inhibisi,  ikatan  hidrogen,  konformasi inhibitor  terhadap binding  site enzim.  Analisis dilakukan  terhadap  ligan  kandidat  dan  sebagai parameter  dilakukan  analisis  terhadap  pembanding asam kojat dan L-dopa.

## Hasil dan Pembahasan
Penapisan aktivitas ekstrak kasar etanol sampel pulosari  dilakukan  untuk  mengetahui  ekstrak  yang berfungsi sebagai inhibitor enzim tirosinase. Aktivitas inhibitor  enzim  tirosinase  ditunjukan  dari  daya inhibisi  yang  tertera  pada  Tabel  1.  Ekstrak  etanol yang  digunakan  adalah  kulit  batang  pulosari  dan secang,  dengan  pembanding  asam  kojat  dan parameter  L-DOPA.  Tabel  1  menunjukan  bahwa sampel  yang  memiliki  aktivitas  sebagai  inhibitor enzim  tirosinase  yang  baik  adalah  campuran  antara pulosari dan secang dengan komposisi 1:1. Beberapa senyawa  flavonoid  yang  diketahui  memiliki  aktivitas sebagai  inhibitor  enzim  tirosinase  diantaranya golongan  senyawa  flavonol  (kuersetin),  flavon (noratokarpetin),  flavanon  (stepogenin),  flavanol (dihidromorin  dan  taksifolin),  isoflavan  (gliasperin  C, glabridin), kalkon, dan isoflavon (Kalikosin) (Chang et al. 2009).
Hasil  yang  diperoleh  mendukung  pendugaan senyawa  aktif  gabungan  dari  keduanya  banyak mengandung  senyawa  flavonoid  dan  kumarin. Dimana  senyawa  golongan  flavonol  telah  diketahui mempunyai  potensi  sebagai  inhibitor  tirosinase. Senyawa  flavonol  yang  aktif  sebagai  inhibitor tirosinase  diantaranya  adalah  kaempferol,  misertin, dan  kuersetin  (Chang et  al. 2009).  Perbedaan senyawa  flavonol  dengan  senyawa  flavonoid  lainnya dapat  dilihat  dari  strukturnya.  Senyawa  flavonol memiliki  gugus  3-hidroksi.  Hal  ini  juga  yang  dapat menyebabkan  flavonol  lebih  aktif  sebagai  inhibitor tirosinase. Sisi tempat gugus hidroksi menempel pada struktur  benzena  dan  juga  jumlah  gugus  hidroksil pada suatu flavonoid berperan penting dalam proses penginhibisian  aktivitas  enzim  tirosinase  (Donghyun et  al. 2006). Hal ini ditunjang oleh data dari hasil uji in-silico  pada  Tabel  2.  Dari  hasil  uji  in-silico pendekatan docking interaksi antara enzim tirosinase dengan  ligan  dari  senyawa  bioaktif  pulosari  dan secang Sl  sebagaimana  Tabel  2.  Hasil  docking menunjukkan  bahwa  dari  8  senyawa  bioaktif  dari pulosari  (Rattanappani et  al. 2012)  dan  13  senyawa
Tabel 2. Hasil docking dan minimasi energi antara ligan dengan tirosinase
Ligan Ar1 Ar5 Sl1 Sl8 L-dopa AK Energi -12.1661 -14.8982 -15.1582 -13.3378 -9.8247 -8.9047 pKi 7.979 9.104 10.021 8.331 5.592 4.976 H Don 5 6 6 8 3 5
Hacc
Ket : Ar1: Scopoletin, Ar5: Zheberesinol, Sl1: Brazilin, Sl8: Rhamnitin, AK: Asam kojat
Tabel 1. Hasil uji penghambatan ekstrak etanol terhadap tirosinase
Nama sampel Identitas sampel Parameter Hasil (ppm) Secang Ekstrak etanol 90% IC 50 -enzim tirosinase L-DOPA 797.090 Pulosari Ektrak etanol 90% 1962.934 campuran (Sl:Ar) = (1:1) 415.897 Asam Kojat 93.557
bioaktif dari secang (Chen et al. 2008) dengan enzim tirosinase,  ada  4  senyawa  aktif  yang  mampu menginhibisi tirosinase lebih baik dan memiliki energi Gibbs  rendah  dibandingkan  dengan  senyawa pembanding  asam  kojat.  Energi  Gibbs  ikatan merupakan  energi  ikatan  antara  enzim  dengan inhibitor  pada  kondisi  kesetimbangan,  maka  dengan terhitungnya  energi  gibbs  kekuatan  dan  kestabilan interaksi  antara  kompleks  enzim  dan  ligan  dapat diketahui.  Dalam software MOE  energi  Gibbs dilambangkan  dengan  S  yang  menunjukkan  jumlah total  dari  tahapan  akhir  docking.  Nilai  S  memiliki score yang  sama  dengan E_refine ,  dimana E_refine merupakan energi total dari ikatan kompleks docking . Dari tabel 2 menunjukkan bahwa tingkat nilai S yang paling  rendah  adalah  senyawa  Sl1  dari  secang  dan Ar5  dari  pulosari berturut-turut  dengan  nilai  S  -
15.1582 kkal/mol; 13.8982 kkal/moldan pKi 10.021μM,; 9.104 μM dan lebih rendah dibandingkan dengan senyawa  pembanding asam kojat dengan S  - 8.8047  kkal/mol.  Dimana  ΔG  adalah  energi  bebas gibbs,  R  adalah  tetapan  gas  konstan  (J/mol  K),  T adalah  temperatur  absolut  (K)  dan  KA  adalah konstanta  aktifitas  enzim,  Ki  adalah  konstanta inhibitor (Kitchen et al. 2004) Dari persamaan diatas, maka semakin kecil nilai Ki kesetimbangan reaksi dan afinitas  ikatan  cenderung  stabil  dalam  pembentukan kompleks.  Data docking dari software MOE menunjukkan  nilai  konstanta  inhibisi  dalam  pKi. Artinya  semakin  besar  nilai  pKi,  maka  ligan  memiliki Ki  yang  kecil.  Maka  nilai  pKi  ini  dapat  digunakan untuk  mengetahui  tingkat  keefektifan  dalam pembentukan kompleks enzim dengan ligan.
Aktivitas Gabungan Ekstrak Etanol Pulosari ( Alyxia reinwardtii ) dan Secang ( Sappan lignum ) sebagai inhibitor tirosinase
23
Dari hasil docking nilai pKi dari ligan Sl1 dan Ar5 yaitu 10.021 μM; 10.021 μM, nilai ini menunjukkan bahwa ligan  Sl1  dan  Ar8  memiliki  afinitas  dan  berinteraksi lebih  kuat  dalam  membentuk  kompleks  dengan tirosinase dibandingkan dengan senyawa pembanding  dengan  pKi  4.976  μM.  Analisis  ikatan hidrogen dan interaksi merupakan gaya antramolekul yang terjadi pada atom yang memiliki keelektronegatifan  tinggi  dengan  hidrogen  yang terikat  secara  kovalen  pada  atom  elektronegatif. Ikatan hidrogen dari kompleks tirosinase dengan ligan hasil docking diidentifikasi  dengan software MOE program  LigX interactions .  Hasil  identifikasi  ikatan hidrogen antara residu asam amino tirosinase dengan ligan Sl1 dan Ar8 dan ligan pembanding seperti dalam Tabel 2.
Dari Tabel 2 menunjukkan bahwa ligan Sl1 dan Ar5 dan ligan standar asam kojat membentuk ikatan hidrogen  secara  berturut-turut  6,  6  dan  3  ikatan. Ikatan  hidrogen  berperan  terhadap  afinitas  ligan dalam membentuk kompleks dengan enzim tirosinase hal  ini  disebabkan  adanya  interaksi  elektrostatik antara  atom  oksigen  atau  hidrogen  ligan  dengan atom  hidrogen  asam  amino  ataupun  sebaliknya. Kontak  residu  merupakan  interaksi  residu  enzim tirosinase  dengan  ligan  (inhibitor).  Interaksi  yang terjadi  antar  kompleks  enzim  ligan  adalah  interaksi
hidrogen, selain itu juga terjadi interaksi non kovalen yang sangat mempengaruhi stabilitas enzim. Interaksi hidrofob yang menyebabkan protein dapat mempertahankan  integrasinya  karena folding ,  serta interaksi  aromatik  yang  mempengaruhi  stabilitas struktur  tersier.  Kontak  residu  antara  ligan  dengan enzim  tirosinase  hasil docking dapat  diketahui dengan software MOE  program  LigX interaction . Berdasarkan  hasil  yang  diperoleh  menunjukkan bahwa  kontak  residu  antara  semua  ligan  dengan tirosinase  menunjukkan  mekanisme  penghambatan kompetitif  dengan  substrat  yaitu  L-DOPA  memiliki konformasi penempatan penghambatan sama dengan ligan-ligan lainnya.
Gambar  1-6  menunjukkan  bahwa  interaksi ligan  dengan  sisi  katalitik  tirosinase  terlihat  bahwa senyawa  Sl1  dan  Ar5  memiliki  interaksi  lebih  baik dibandingkan  dengan  senyawa  asam  kojat.  Menurut hasil ini melalui pendekatan docking bahwa senyawa diatas  dapat  digunakan  sebagai  senyawa  inhibitor tirosinase. Pemberian ekstrak yang bersamaan dalam in-vitro  membuktikan  bahwa  kedua  tanaman  ini mengandung  senyawa  golongan  flavonoid  dan kumarin  yang  telah  diketahui  mempunyai  potensi sebagai  inhibitor  tirosinase.  Senyawa  flavonol  yang aktif  sebagai  inhibitor  tirosinase  diantaranya  adalah kaempferol, misertin, dan kuersetin (Chang 2009).
Gambar 1. Kompleks Ar1-tirosinase Gambar 2. Kompleks Ar5-tirosinase
Gambar 3. Komplek Sl1-tirosinase Gambar 4. Komplek Sl8-tirosinase
Gambar 5. Komplek asam kojat-tirosinase Gambar 6. Komplek L-DOPA-tirosinase

## Kesimpulan
Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa gabungan  ekstrak  etanol  kulit  batang  pulosari  dan secang  dapat  digunakan  sebagai  inhibitor  tirosinase, melalui pendekatan in silico senyawa dalam Ar dan Sl memiliki  nilai  inhibisi  yang  lebih  baik  dibandingkan senyawa  pembanding  asam  kojat  dan  sebagai  ligan kompetitif  yang  mengisi  katalitik  site  sesuai  dengan konformasi  L-DOPA.  Pembuktian  secara in  vitro menunjukkan  bahwa  pemberian  ekstrak  yang bersamaan  memiliki  nilai  inhibisi  yang  lebih  tinggi dibandingkan  dengan  pemberian  masing-masing ekstrak.

## Daftar Pustaka
Artés F, Castañer M, Gil MI. 1998.  Review: enzymatic browning  in  minimally  processed  fruit  and vegetables. Journal  of  Agricultural  and  Food Chemistry. 4 :377-389.
Asanuma  M,  Miyazaki  I,  Ogawa  N.  2003.  Dopamine- or  L-DOPA  induced  neurotoxicity:  the  role  of dopamine quinone formation and tyrosinase in a  model  of  Parkinson’s  disease. Neurotoxicity Research. 5 :165-176.
Steffan  B,  Wätjen  W,  Michels  G,  Niering  P,  Wray  V, Ebel  R,  Edrada  R,  Kahl  R,  Proksch  P.  2005. Polyphenols  from  plants  used  in  traditional Indonesian  medicine  (Jamu):  uptake  and antioxidative  effects  in  rat  H4IIE  hepatoma cells. Journal  of  Pharmacy  and  Pharmacology . 57:233-240.
Batubara  I,  Darusman  LK,  Mitsunaga  T,  Rahminiwati M,  Djauhari  E.  2010.  Potency  of  Indonesia medicinal  plants  as  tyrosinase  inhibitor  and antioxidant  agent. Journal  of  Biological Sciences. 10:138-144.
Chang  TS.  2009.  An  update  review  of  tyrosinase inhibitors. J Mol Sci 10:2440-2473.
Donghyun  K,  Jiyeoun  P,  Jinhee  K,  Cheolkyu  H,
Jeonghyeok Y, Namdoo K, Jinho S,
Choonghwan L. 2006. Flavonoids as mushroom tyrosinase inhibitors: a fluorescence quenching study. Journal  of  Agricultural  and  Food Chemistry. 54:935-941. Funkhouser,  Thomas.  2007. Lecture  :  Protein-Ligand Docking Methods. Princeton University. Topcu  G,  Che  CT,  Cordell  GA,  Ruangrungsi  N.  1990.
Iridolactones from Alyxia reinwardti .
Phytochemistry. 29(10), 3197-3199.
Kitagawa I, Shibuya H, Baek NI, Yokokawa Y, Nitta A,
Wiriadinata H, Yoshikawa M. 1988.
Pulosarioside, a new bitter trimeric- iridoiddiglucoside  from  an  Indonesian  Jamu, the bark of Alyxia reinwardtii BL. (Apocynaceae). Chemical  and  Pharmaceutical Bulletin . 36:4232-4235
Lin  LJ,  Lin  LZ,  Ruangrungsi  N,  Cordell  GA.  1993.  3- Hydroxycoumarin  glycosides  from Alyxia reinwardtii var. Lucida . Phytochemistry. 34:825-830.
Leach  RA.  2001. Molecular  Modelling  Principle  and Application. Ed ke-2. Chichester (UK) : Pearson Education Limited.
Lucientes,  Gil  MT.  2004 .  Protein  Docking  and

## Interactions Modeling
Masamoto Y, Ando H, Murata Y, Shimoishi Y, Tada M,
Takahata  K.  2003.  Mushroom  tyrosinase inhibitory  activity  of  esculetin  isolated  from seeds  of Euphorbia  lathyris L. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry . 67: 631-634. Piao XL, Baek SH, Park MK, Park JH. 2004. Tyrosinase- inhibitory  furanocoumarin  from Angelica
Aktivitas Gabungan Ekstrak Etanol Pulosari ( Alyxia reinwardtii ) dan Secang ( Sappan lignum ) sebagai inhibitor tirosinase 25 dahurica. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 :1144-1146.
Rattanapani J, Sichaem J, Tip-pyang S. 2012. Chemical Constituents and Antioxidant Activity from the Stems of Alyxia reinwardtii. Records of Natural Products . 6:3. 288-291
Seo  SY,  Sharma  VK,  Sharma  N.  2003.    Mushroom tyrosinase:  recent  prospects. Journal  of Agricultural  and  Food  Chemistry.  51 :2837- 2853.
Sollai F, Zucca P, Sanjust E, Steri D, Resciqno A. 2008.
Umbelliferone  and  esculetin:  inhibitors  or substrates  for  polyphenol  oxidases. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 31 :2187-2193.
Xu  Y,  Stokes  AH,  Roskoski  RJr.  Vrana  KE.  1998. Dopamine,  in  the  presence  of  tyrosinase, covalently  modifies  and  inactivates  tyrosine hydroxylase. Journal of Neuroscience Research. 54 :691-697.
Chen YP, Liu L, Zhou YH, Wen J, Jiang Y, Tu PF. 2008.
Chemical  constituents  from Sappan  lignum. Journal  of  Chinese  Pharmaceutical  Sciences.
17:82-86.
Zheng  ZP,  Cheng  KW,  Chao  J,  Wu  J,  Wang  M.  2007. Tyrosinase  inhibitors  from  paper  mulberry ( Broussonetia papyrifera ). Journal Food
Chemistry. 106:529-535.