ISSN: 2085-6237 (Print) ISSN: 2685-6794 (Electronic)

## Majalah Sainstekes
ISSN: 2085-6237 (Print) ISSN: 2685-6794 (Electronic)
Journal homepage https://academicjournal.yarsi.ac.id/sainstekes
Identifikasi Senyawa Kelompok Antosianin dalam Ekstrak Bunga Telang (Clitoria ternatea) dengan menggunakan uHPLC-MS/MS
Identification of Anthocyanins Compounds in Butterfly Flower Extract (Clitoria ternatea) using uHPLC-MS/MS
Lusy Indranita 1 , Nunung Ainur Rahmah 1 , Juniarti 1 , Moch Abdussalam 2
1 Departemen Sains Biomedis, Sekolah Pascasarjana, Universitas YARSI 2 Lembaga Penelitian, Universitas YARSI

## Article Info
________________ History of article: Received: 17-10-2023 Accepted: 02-05-2024
________________
Keywords: anthocyanins, clitoria ternatea, uhplc-ms/ms

## Abstract
Butterfly  pea  flower  (Clitoria  ternatea  L)  is  a  plant  that  has  many  good pharmacological effects. This plant has purple flowers which are compounds from the  anthocyanin  group.  This  research  aims  to  identify  anthocyanin  group compounds  in  butterfly  pea  flower  extract  using  ultra  high  performance  liquid chromatography – mass  spectroscopy/mass  spectroscopy  (uHPLC-MS/MS). Measurements  using  uHPLC-MS/MS  can  show  that  the  anthocyanin  group compounds  in  sea  cucumber  extract  are  Delphinidin-3-(6 ″ -  p  -coumaroyl)- rutinoside,  Cyanidin  3-(6 ″ -  p  -coumaroyl)-rutinoside,  Delphinidin-3-(  cis  -  p  - coumaroyl-glucoside) and Cyanidin-3- (p -coumaroyl) glucose. Therefore, butterfly pea  flower  extract  has  been  successfully  proven  to  contain  anthocyanin  group compounds.
Kata kunci: antosianin, clitoria ternatea, uhplc-ms/ms

## Abstrak
Bunga telang (Clitoria ternatea L) merupakan tanaman yang banyak memiliki efek farmakologis yang cukup baik. Tanaman ini memiliki bunga dengan warna ungu yang menarik yang diduga mengandung senyawa kelompok antosianin. Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi senyawa kelompok antosianin dalam ekstrak bunga telang dengan menggunakan ultra high performance liquid chromatography – mass spectroscopy/mass spectroscopy (uHPLC-MS/MS). Pengukuran dengan uHPLC- MS/MS  dapat  diketahui  senyawa  kelompok  antosianin  dalam  ekstrak  telang adalah  Delphinidin-3-(6 ″ -p-coumaroyl)-rutinosida,  Sianidin  3-(6 ″ -p-coumaroyl)- rutinosida,  Delphinidin-3-(cis-p-coumaroyl-glukosida)  dan  Cyanidin-3-(p  - coumaroyl) glukosa. Oleh karena itu, ekstrak bunga telang telah berhasil dibuktikan mengandung senyawa kelompok antosianin.

## PENDAHULUAN
Bunga telang atau yang disebut Clitoria ternatea L, merupakan tanaman yang tergolong istimewa  karena  memiliki  senyawa  yang  penting  dalam  pengobatan  tradisional.  Berdasarkan kandungan  senyawa  fitokimianya  Clitoria  ternatea  L  memiliki  berbagai  manfaat  penting  bagi kesehatan manusia, karena seluruh bagiannya dari akar sampai bunga dapat dimanfaatkan bagi kesehatan.
Beberapa  efek  farmakologis  yang  ada  pada  Clitoria  ternatea  L  antara  lain  sebagai antimikroba,  antiparasit,  anti  inflamasi,  antikanker,  antioksidan,  antidepresan,  antidiabetes, antihistamin,  antimikroorganisme,  antihiperlipidemik,  dan  regulasi  kolesterol,  anti  asma, antikatarak dan lainnya (Rizal, 2023). Berikut adalah taksonomy dari Clitoria ternatea L:
Kingdom : Plantae Divisi : Tracheophyta Infrodivisi : Angiospermae Kelas : Mangnoliopsida Ordo : Fabales Familia : Fabacea Genus : Clitoria Spesies : Clitoria Ternatea L
Bagian dari kembang telang yang biasanya digunakan sebagai obat adalah daun, biji, kulit, kecambah,  batang,  bunga,  dan  akar.  Kandungan  fitokimia  dari  kembang  telang  yaitu  tanin, flobatanin,  saponin,  triterpenoid,  karbohidrat,  flavonoid,  flavonol  glikosida,  protein  alkaloid, atrakuinon, antosianin, stigmasit 4-ena-3, 6 dion, minyak atsiri, dan steroid (Jeyaraj, Yau dan Wee, 2021). Biji bunga telang mengandung asam sinamat, finotin, dan beta sitosterol. Mahkota bunga  telang  mengandung  flavonoid,  antosianin,  flavanol  glikosida,  kaempferol  glikosida, quersetin glikosida, dan mirisetin glikosida.
Laporan  hasil  berbagai  penelitian  Clitoria  ternatea  L  memiliki  pengaruh  farmakologis sebagai  antimikroba,  antiparasit,  anti  inflamasi,  antikanker,  antioksidan,  antidepresan, antidiabetes,  antihistamin,  immonomodulator,  dan  potensi  berperan  dalam  susunan  syaraf (Zahara, 2022).
Identifikasi  senyawa  antosianin  pada  bunga  telang  dilakukan  secara  UPLC  ditambah dengan instrumen spektrometer UV dan Massa. Kromatogram MS/MS elektrospray ion positif dan negatif serta spektrum senyawa antosianin ditentukan. Dengan menganalisis kromatogram dan spektrum untuk setiap ion, lima antosianin diidentifikasi dalam ekstrak bunga telang. Karena penelitian yang terbatas mengenai bioaktivitas fraksi kaya antosianin dari bunga Clitoria ternatea L, penelitian ini bertujuan untuk menentukan metode kromatografi kolom yang efisien untuk mendapatkan  fraksi  kaya  antosianin  dari  bunga  ini  dan  mengkarakterisasi  komposisinya, antioksidan,  antibakteri,  dan  aktivitas  sitotoksik.  Antosianin  hadir  dalam  tanaman  sebagai glikosida di mana antosianidin terikat pada gugus gula, dengan glukosa, galaktosa, rhamnosa, xilosa, atau arabinosa terikat pada aglikon. Enam jenis utama antosianidin yang paling banyak terdapat  pada  tumbuhan  yaitu  sianidin,  delphinidin,  petunidin,  peonidin,  pelargonidin,  dan malvidin (Gamage, 2021)
Antosianin merupakan pigmen penting yang larut dalam air termasuk dalam keluarga flavonoid.  Ada  lebih  dari  600  antosianin  berbeda  telah  dikarakterisasi.  Secara  struktural, antosianin merupakan turunan polihidroksi dan polietoksi terglikosilasi dari garam flavylium dan juga memiliki bentuk aglikon yang disebut antosianidin (Widowati, 2023).
Senyawa  kelompok  Cyanidin,  delphinidin,  pelargonidin,  peonidin,  malvidin,  dan petunidin adalah antosianin yang paling umum ada pada tanaman yang berpigmen. Struktur yang berbeda  bergantung  pada  jumlah,  posisi  gugus  hidroksil  dan  metoksil  pada  cincin  flavilium. Antosianidin sering terikat pada gula dan memberikan stabilitas serta kelarutan dalam air. Di antara gula, yang paling umum yaitu glukosa, galaktosa, arabinosa, rhamnosa dan xilosa, yang biasanya hadir dalam bentuk 3-monoglikosida dan 3,5-diglikosida (Gupta, 2015).
Aktivitas  antioksidan  yang  dilakukan  oleh  Jelantik  dan  Cahyaningsih  (2022)  dengan ekstrak  etanol  kemudian  diukur  dengan  uji  pendahuluan  fitokimia  didapatkan  kandungan flavonoid, saponin, terpenoid, tanin dengan menunjukkan hasil positif, sedangkan alkaloid dan antrakuinon menunjukkan hasil negatif, dan didapatkan hasil IC50 antioksidan yang kuat. Hal tersebut  juga  dilakukan  oleh  Cahyaningsih,  Sandhi  dan  Santoso  (2019)  bahwa  senyawa  yang terkandung pada Clitoria ternatea L merupakan senyawa yang diduga termasuk dalam kelompok antosianin (Andriani dan Murtisiwi, 2018).
Berdasarkan hal tersebut di atas, penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi senyawa spesifik dari jenis antosianin yang telah dilaporkan oleh peneliti sebelumnya.

## METODE PENELITIAN

## Alat dan bahan
Bunga Clitoria ternatea L, Etanol 96%, Metanol grade HPLC (Merck), H2O ultrapure (Milli-Q) Rotary evaporator (Buchi), Ultra High Performance Liquid Chromatography – Mass spectroscopy/ Mass spectroscopy (uHPLC-MS/MS) Triple Sigle Quadropole (TSQ) Quantum Access MAX (Thermo Ficher Scientific).

## Cara Kerja
Sebanyak satu kilogram simplisia Clitoria ternatea L dikeringanginkan pada suhu kamar sehingga kadar air pada serbuk menjadi minimal. Serbuk kering diekstraksi dengan menggunakan etanol  dengan  campuran  HCl  0,3%  dengan  metode  maserasi  selama  1  hari,  kemudian  filtrat dikeringkan dengan menggunakan rotary evaporator. Hasilnya didapatkan ekstrak pekat dengan massa 216 gram.
Sebanyak 10 mg ekstrak tersebut dilarutkan dalam 10 metanol dengan campuran asam formiat  0,1  %  untuk  mendapatkan  larutan  dengan  konsentrasi  1000  mg/L.  Larutan  tersebut difiltrasi  ulang  dengan  syiringe  filter  0.22  µm  sehingga  didapatkan  larutan  siap  diukur menggunakan uHPLC-MS/MS.
Sebanyak 2 µL larutan dimasukan kedalam uHPLC MS/MS dengan menggunakan eluen pembawa  kombinasi  A  (H2O  +  HCOOH  0,1%)  dan  B  (CH3CN  HCOOH  0,1%)  dengan komposisi pada 0-1 menit (95:5) kemudian diubahkan secara bertahap hingga pada menit ke-15
(5:95) dan ditahan hingga menit ke 17. Komposisi pelarut dikembalikan pada keadaan awal dari menit ke-17 hingga menit ke 20 (95 : 5).
Pengukuran massa dilakukan dengan Quadrupole pertama (Q1) dan Quadrupole ketiga (Q3) diatur parameter spray voltage 3500 V, vaporizer temperature 325oC, sheath gas pressure 30 psi, aux gas pressure 5 psi, capillary temperature 270oC. Pada Collision Cell (Q2) diatur energi tumbukan sebesar 30 V dan tekanan gas argon 1,5 psi. Sehingga didapatkan spektrum massa parent peak dari Q1 dan spektrum massa fragmentasi yang dihasilkan dari Q3.

## HASIL
Pengukuran  dengan  menggunakan  uHPLC-MS/MS  pada  ekstrak  bunga  telang dihasilkan  kromatogram  uHPLC  sebanyak  empat  senyawa  diduga  antosianin  seperti  yang ditampilkan pada Tabel 1. Sinyal MS1 merupakan hasil pengukuran molekul tanpa mengalami proses  fragmentasi.  Pengukuran  dilakukan  pada  mode  positif  sehingga  sinyal  yang  muncul ditafsirkan  sebagai  [M+H]+,  Sementara  MS2  merupakan  sinyal  fragmen  molekul  yang  telah lakukan collision dengan energi 30 Volt.

## Tabel 1. Senyawa antosianim pada ekstrak telang
Waktu retensi (menit)
M+H (MS 1 ) Massa molekul Fragmentasi (MS 2 ) Dugaan senyawa 5.31 757 756 464, 301 Delphinidin-3- (6″ - p - coumaroyl)-rutinoside 5.53 611 610 302 Sianidin 3- (6″ - p - coumaroyl)-rutinosida 5.63 741 740 449, 433, 328 Delphinidin-3-( cis - p - coumaroyl-glukosida) 5.87 595 594 433, 395, 328 Cyanidin-3-( p - coumaroyl)glukosa
Gambar 1. Kromatogram uHPLC yang menunjukan kelompok antosianin
Gambar 2. Spektrum massa puncak 5.31 menit (atas) spektrum MS 1 (bawah) spektrum MS2
Gambar 3. Spektrum massa puncak 5.53 menit (atas) spektrum MS 1 (bawah) spektrum MS2
Gambar 4. Spektrum massa puncak 5.63 menit (atas) spektrum MS 1 (bawah) spektrum MS2
Gambar 5. Spektrum massa puncak 5.87 menit (atas) spektrum MS 1 (bawah) spektrum MS2

## PEMBAHASAN
Ekstraksi  kelompok  senyawa  antosianin  dalam  bunga  telang  dilakukan  dengan menggunakan  pelarut  etanol  dengan  campuran  HCl  0,1  %.  Penggunaan  HCl  dalam  proses ekstraksi ini diharapkan dapat membantu solvasi pelarut terhadap antosianin sehingga proses ekstraksi akan semakin maksimal. Antosianin merupakan kelompok flavonoid yang bermuatan positif pada atom oksigen. Oleh karena itu suasana diharapkan akan membantu ekstraksi lebih selektif terhadap antosianin.
Pemisahan  pelarut  menggunakan  bantuan  rotary  evaporator  bertujuan  untuk  dapat menguapkan pelarut secara cepat pada suhu lebih rendah. Instrumen rotary evaporator bekerja pada tekanan lebih rendah sehingga menurunkan titik didih pelarut etanol. Pada suhu operasi 50 o C penguapan etanol dalam filtrat secara maksimal telah menghasilkan ekstrak kasar yang kaya antosianin.  Pengukuran  menggunakan  uHPLC  MS/MS  bertujuan  untuk  mengindentifikasi senyawa  kelompok  antosianin  berdasarkan  massa  molekul  dan  fragmentasi  setelah  diberikan energi pada collision cell.
Kromatogram  uHPLC  dari  ekstrak  telang  menunjukan  ada  empat  puncak  senyawa antosianin, yaitu pada waktu retensi 0.48; 5.31; 5.53 dan 5.63 menit seperti yang ditunjukan pada Gambar  1.  Pada  puncak  sinyal  5.31  menit  terukur  senyawa  dengan  m/z  757  (M+H)+  yang mengindikasikan molekul dengan massa 756. Fragmentasi terbentuk pada 303 yang menunjukan molekul  induk  Delphinidin.  Sementara  gugus  sisanya  adalah  coumaroyl  dan  rutinosida  yang ditunjukan  pada  fragmentasi  464.  Hal  ini  mengindikasikan  bahwa  senyawa  tersebut  adalah Delphinidin-3- (6″ - p -coumaroyl)-rutinosida. Spektrum dengan sinyal pada waktu retensi 5.31 menit ditunjukan pada Gambar 2.
Pada  puncak  sinyal  5.53  menit  terukur  senyawa  dengan  m/z  611  (M+H)+  yang mengindikasikan molekul dengan massa 610. Fragmentasi molekul terdeteksi pada 302. Hal ini mengindikasikan  bahwa  senyawa  tersebut  adalah  Sianidin  3- (6″ -  p-coumaroyl)-rutinosida. Spektrum massa senyawa pada waktu retensi 5.53 ini ditunjukan oleh Gambar 3. Pada puncak sinyal  5.63  menit  terukur  senyawa  dengan  m/z  741  (M+H)+  yang  mengindikasikan  molekul dengan massa 470. Fragmentasi terbentuk pada 449, 433 dan 328 yang menunjukan terdapat gugus  Coumaroyl  dan  glukosa.  Hal  ini  mengindikasikan  bahwa  senyawa  tersebut  adalah Delphinidin-3-(  cis  -  p  -coumaroyl-glukosida).  Kemungkinan  senyawa  ini  bercampur  dengan Delphinidin-3-(trans- p -coumaroyl-glukosida). Pada puncak sinyal 5.87 menit terukur senyawa dengan  m/z  595  (M+H)+  yang  mengindikasikan  molekul  dengan  massa  594.  Fragmentasi terbentuk pada 433, 395 dan 328. Fragmen 328 menunjukan gugus Cyanidin, sementara gugus 433  menandakan  hilangnya  gugus  glukosa.  Keterangan  kersebut  mengindikasikan  bahwa senyawa tersebut adalah Cyanidin-3-( p -coumaroyl) glukosa.

## KESIMPULAN
Jenis senyawa antosianin dalam bunga telang telah didentifikasi menggunakan metode uHPLC-MS/MS  pada  ekstrak  etanol  dengan  HCl  0,1  %  terbukti  dapat  menarik  senyawa kelompok antosianin dalam bunga telang. Senyawa antosianin yang terindentifikasi pada antara waktu  retensi  antara  lima  hingga  tujuh  menit.  Senyawa  antosianin  yang  teridentifikasi
Delphinidin-3- (6″ -  p  -coumaroyl)-rutinosida,  Sianidin  3- (6″ -  p  -coumaroyl)-rutinosida, Delphinidin-3-( cis - p -coumaroyl-glukosida) dan Cyanidin-3-( p -coumaroyl)glukosa.

## SARAN
Untuk penelitian berikutnya disarankan memisahkan senyawa antosianin tersebut dan menguji aktivitas biologisnya.

## Ucapan Terima Kasih
Kami  mengucapkan  terima  kasih  sebesar-besarnya  kepada  laboratorium  Herbal Universitas YARSI dalam penyediaan fasilitas penelitian dan pengukuran uHPLC-MS/MS.

## DAFTAR PUSTAKA
Andriani D dan Murtisiwi L 2018. Penetapan kadar fenolik total ekstrak etanol bunga telang (Clitoria Ternatea L.) dengan spektrofotometri Uv Vis. Cendekia Journal of Pharmacy , 2(1), 32 – 38. Tersedia pada: https://doi.org/10.31596/cjp.v2i1.15.
Cahyaningsih E, Sandhi PE dan Santoso P 2019. Skrinning fitokimia dan uji aktivitas antioksidan ekstrak etanol bunga telang (Clitoria ternatea L.) dengan metode spektrofotometri UV-VIS.
Jurnal Ilmiah Medicamento , 5(1), 51 – 57. Tersedia
pada: https://doi.org/10.36733/medicamento.v5i1.851.
Escher  GB,  Wen  M,  Zhang  L,  Rosso  ND,  &  Granato  D  2020.  Phenolic  composition  by UHPLC-Q-TOF-MS/MS and stability of anthocyanins from Clitoria ternatea L.(butterfly pea) blue petals. Food chemistry , 331, 127341.
Fikayuniar L et al., 2023. Skrinning Fitokimia serta uji karakteristik simplisia dan ekstrak bunga telang (Clitoria ternatea L.) dengan berbagai metode. Jurnal Ilmiah Wahana Pendidikan , 9(15), 308 – 320. Tersedia pada: https://doi.org/https://doi.org/10.5281/zenodo.8208374. Gupta GK, Chahal J dan Bhatia M 2015. Clitoria ternatea (L.): Old and new aspects. Journal of Pharmacy Research , 3(11), 2610 – 2614.
Jelantik RCANP dan Cahyaningsih, E 2022. Potensi antioksidan bunga telang (Clitoria ternatea L.) sebagai penghambat hiperpigmentasi akibat paparan sinar ultraviolet. Scientific Journal of Pharmacy , 18(1), 45 – 54. Tersedia pada: https://doi.org/https://doi.org/10.20885/jif.vol18.iss1.art5.
Jeyaraj EJ,  Lim  YY,  & Choo  WS  2022.  Antioxidant,  cytotoxic,  and antibacterial  activities  of Clitoria ternatea flower extracts and anthocyanin-rich fraction. Scientific Reports , 12(1), 14890 Jeyaraj JE, Yau YL dan Wee SC 2021. Extraction methods of butterfly pea (Clitoria ternatea) flower and biological activities of its phytochemicals. Journal of Food Science and Technology , 58(6), 2054 – 2067. Tersedia pada: https://doi.org/10.1007/s13197-020-04745-3
Jeyaraj  JE,  Yau  YL  dan  Wee  SC  2022.  Antioxidant,  cytotoxic,  and  antibacterial  activities  of Clitoria ternatea flower extracts and anthocyanin-rich fraction. Scientific Reports , 12(1), 1 – 12. Tersedia pada: https://doi.org/10.1038/s41598-022-19146-z.
Kazuma K, Noda N, & Suzuki M 2003. Flavonoid composition related to petal color in different lines of Clitoria ternatea. Phytochemistry , 64(6), 1133-1139.
Kazuma  K,  Noda  N,  & Suzuki  M  2003.  Malonylated  flavonol  glycosides  from  the  petals  of Clitoria ternatea. Phytochemistry , 62(2), 229-237
Marpaung AM 2020. Tinjauan manfaat bunga telang (clitoria ternatea l.) bagi kesehatan manusia. Journal  of  Functional  Food  and  Nutraceutical ,  1(2),  63 – 85.  Tersedia  pada: https://doi.org/10.33555/jffn.v1i2.30.
Muntaha FM 2019. Analisis bunga telang (Clitoria ternatea) dengan variasi pH metode high performance liquid chromatograph-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) (Doctoral dissertation, Universitas Pasundan).
Nair V, Bang WY, Schreckinger E, Andarwulan N, & Cisneros-Zevallos L 2015. Protective role of  ternatin  anthocyanins  and  quercetin  glycosides  from  butterfly  pea  (Clitoria  ternatea Leguminosae) blue flower petals against lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation in macrophage cells. Journal of Agricultural and Food Chemistry , 63(28), 6355-6365. Sumartini  S  2020.  Analisis  bunga  telang  (Clitoria  ternatea)  dengan  variasi  ph  metode  liquid chromatograph-tandem  mass  spectrometry  (lc-ms/ms). Pasundan  Food  Technology  Journal (PFTJ) , 7(2), 70-77.
Susanti  E,  &  Sari  MI  2022.  The  LC-MS/MS  Profile  and  Total  Phenolic  Content  of  Telang Flower  Extract  and  Roselle  as  NPC1L1  Inhibitor  Candidate. Journal  of  Agromedicine  and Medical Sciences , 8(3), 164-169.
Thuy NM, Minh VQ, Ben TC, Thi Nguyen MT, Ha HTN, & Tai NV 2021. Identification of Anthocyanin  Compounds  in  Butterfly  Pea  Flowers  (Clitoria  ternatea  L.)  by  Ultra Performance Liquid Chromatography/Ultraviolet Coupled to Mass Spectrometry. Molecules, 26(15), 4539. https://doi.org/10.3390/molecules26154539
Tripathi  S,  Annapureddy  SR,  &  Sahoo  S  2023.  Intra-specific  pharmacognostic  biochemical screening  of  various  populations  of  Clitoria  ternatea  L.  using  liquid chromatography/tandem mass spectrometry product ion scanning (LC-MS2 PIS). Industrial Crops and Products , 203, 117063.
Vidana Gamage GC, Lim YY, & Choo WS 2021. Anthocyanins from Clitoria ternatea flower: Biosynthesis,  extraction,  stability,  antioxidant  activity,  and  applications. Frontiers  in  Plant Science , 12, 792303.
Widowati W, Darsono LLucianus J, Setiabudi E, Obeng SS, Stefani S, & Rizal R 2023. Butterfly pea flower (Clitoria ternatea L.) extract displayed antidiabetic effect through antioxidant, anti-inflammatory, lower hepatic GSK- 3β, and pancreatic glycogen on Diabetes Mellitus and dyslipidemia rat. Journal of King Saud University-Science , 35(4), 102579. Zahara  M  2022.  Deskripsi  kembang  telang  dan  manfaatnya. Jurnal  Jeumpa ,  9(2),  719 – 728. Tersedia pada: https://doi.org/https://doi.org/10.33059/jj.v9i
Zona  AHA  2021.  Analisis  anti  inflamasi  senyawa  aktif  bunga  Clitoria  ternatea  L  dengan pendekatan  quantitative  structure-activity  relationship  dan  in  silico.  Pesquisa  Veterinaria Brasileira. Akademi Analis Farmasi dan Makanan Putra Indonesia Malang. Tersedia pada: http://www.ufrgs.br/actavet/31-1/artigo552.pdf