EFEK EKSTRAK ETANOL DAUN KELOR ( Moringa oleifera ) TERHADAP NUCLEAR FACTOR KAPPA BETA (NF-kB) AKTIF DAN APOPTOSIS CELL LINE KANKER MCF-7
Nabila Andjani*, Hidayat Sujuti**  , Sri Winarsih***

## Abstrak
Aktivasi NF- ĸB, suatu parameter apoptosis kanker, menyebabkan induksi beberapa fungsi seluler antara lain  proliferasi  sel  meningkat  dan  penurunan  apoptosis.  Daun  kelor  ( Moringa  oleifera )  secara  ayurveda  telah terbukti dalam mencegah penyakit leukemia dan skin papilomagenesis . Tujuan penelitian ini ialah membuktikan bahwa  pemberian  ekstrak  daun  kelor  menurunkan  aktivitas  sel  kanker  payudara  MCF-7.  Penelitian  ini menggunakan true experimental in vitro design dengan sel MCF-7. MTT Assay dilakukan dengan menggunakan dosis  terapi  dari  rentang  7,1825–20000  µg/ml  untuk  menentukan  IC 50 pada  sel  MCF-7.  IC 50 yang  didapatkan adalah  dosis  2200  µg/ml.  Immunositokimia  dan  TUNEL  assay  dengan  kelompok  kontrol  negatif,  kelompok perlakuan  dosis  1100,  2200,  4400  µg/ml.  Terdapat  perbedaan  signifikan  yang  lebih  rendah  pada  perlakuan dosis 2200 µg/ml (p = 0,000) dan dosis 4400 µg/ml (p = 0,000) dibandingkan kontrol tanpa terapi pada aktivitas NF-ĸB.  Besar  persentase  aktivitas  NF-ĸB  pada  dosis  2200  µg/ml    adalah  31,651%  dan  4400  µg/ml    adalah 36,575%. Namun, apoptosis pada MCF-7 tidak dapat dilihat. Kesimpulan dari penelitian ini ialah ekstrak daun kelor  dapat  menurunkan  aktivitas  sel  MCF-7,  ekstrak  daun  kelor  dapat  menurunkan  jumlah  NF-ĸB  aktif  pada dosis 2200 dan 4400 µg/ml. Dosis IC 50 yang diperoleh adalah 2200 µg/ml, dan peristiwa apoptosis tidak dapat diamati.
Kata kunci: daun kelor ( Moringa oleifera ), kanker payudara, MCF-7, NF-kB.
EFFECTIVITY OF ETHANOLIC EXTRACT MORINGA LEAVES ( Moringa oleifera ) AGAINST NUCLEAR FACTOR KAPPA BETA (NF-kB) ACTIVE AND APOPTOSIS IN CANCER CELL LINE MCF-7

## Abstract
Activation  of  NF-ĸB  (cancer  apoptosis  parameter)  caused  induction  of  some  cellular  function,  including increased of cell proliferation and decreased apoptosis. Moringa leaves ( Moringa oleifera ) based on ayurvedic was reported can prevent leukimia and skin papilomagenesis. The aim of this research  was to prove Moringa leaves extract can reduce the activity of breast cancer cells MCF-7. This research was used true experimental in vitro  design . MTT  Assay  performed  by  administering  the  therapeutic  dose  range  of  7.1825–20000  ug/ml  to determine the IC 50 in MCF-7 cells. IC 50 obtained was 2200 ug/ml. Immunocytochemystry and TUNEL assay with negative control group, treated with different dosage group 1100, 2200, 4400 ug/ml. There were lower significant differences in therapeutic dose 2200 ug/ml (p = 0.000) and dose 4400 ug/ml (p = 0.000) compared to controls without therapy on the activity of NF ĸB. The percentage of NF-ĸB activity at doses 2200 µg/ml was 31.651% and 4400 µg/ml was 36.575%. Apoptosis of cells MCF-7 can not be observed. To  conclude, moringa leaves extract  can  inhibit  activity  of  MCF-7,  IC 50 was  2200  µg/ml  and  moringa  leaves  extract  can  decrease  NF-ĸB activity at dosage 2200 and 4400 µg/ml, and apoptosis can not be observed.
Key words: breast cancer, MCF-7, moringa leaves ( Moringa oleifera ), NF-kB.
* Program Studi Farmasi, FKUB ** Laboratorium Biokimia, FKUB *** Laboratorium Mikrobiologi, FKUB
 E-mail: hidayatsujuti@yahoo.com

## Pendahuluan
Kanker  adalah  pertumbuhan  sel  yang tidak  normal  atau  terus  menerus  dan  tidak terkendali, dapat merusak jaringan sekitarnya serta  dapat  menjalar  ke  tempat  lain  yang disebut metastasis. 1 Salah satu parameter dari pertumbuhan  kanker  adalah  NF-ĸB.  NF-ĸB adalah faktor transkripsi dengan suatu urutan spesifik tertentu yang dikenal sebagai molekul kunci  dalam  inflamasi,  karena  mengatur program  transkripsi  proinflamasi  yang mengatur dan melaksanakan respon inflamasi.  NF-ĸB  juga  berfungsi  untuk mengatur  ekspresi  dari  beberapa  gen  yang dapat  menekan  apoptosis,  meningkatkan transisi epitel ke mesenchymal (yang memiliki peran  penting  dalam  invasi  tumor),  dan merangsang progresi siklus sel tumor. 2 Pengobatan  yang  dilakukan  untuk mengatasi kanker payudara selama ini adalah dengan  operasi,  radioterapi,  kemoterapi  dan obat-obatan,  yang  banyak  menimbulkan  efek samping. 3 Oleh  karena  itu,  penggunaan produk  herbal  merupakan  salah  satu  cara untuk  mengatasi  kanker  payudara  yang dianggap  lebih  aman  dibandingkan  dengan obat-obatan sintetis. Salah satu tanaman yang berdasarkan ethnomedicine telah  terbukti berkhasiat  sebagai  anti  kanker  adalah  daun kelor ( Moringa oleifera ).
Daun  kelor  ( Moringa  oleifera )  secara ayurveda  telah  terbukti  dalam  mencegah penyakit  leukemia, skin  papilomagenesis , proteksi  terhadap  radiasi  pada  sum-sum tulang,  dan  dapat  juga  digunakan  untuk mengurangi efek samping dari terapi radiasi. 4
Menurut  penelitan  sebelumnya,  daun  kelor ( Moringa  oleifera )  dapat    menghambat  dari pertumbuhan  sel  kanker  pankreas. 5 Oleh karena itu, ingin diteliti pengaruh ekstrak daun kelor  ( Moringa  oleifera )  sebagai  terapi alternatif antikanker payudara.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  membuktikan efek  pemberian  ekstrak  daun  kelor  ( Moringa oleifera )  dalam  menurunkan aktivitas cell line kanker payudara MCF-7.

## Bahan dan Metode
Penelitian  ini  telah  mendapatkan  surat keterangan  kelaikan  etik  ( Ethical  Clearance ) No.  235/EC/KEPK–S1–FARM/03/2014  yang dikeluarkan pada tanggal 24 Maret 2014 oleh Komisi  Etik  Penelitian  Kesehatan,  Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya.

## Sampel Penelitian
Sampel penelitian yang digunakan adalah sel  MCF-7  yaitu cell  line kanker  payudara. Dosis  untuk  memperoleh  IC 50 dengan  MTT assay  yaitu  7,1825–20000  µg/ml.  Sementara itu,  dosis  yang  digunakan  untuk  uji  aktivitas dan  uji  apoptosis  menggunakan  dosis  IC 50 yang diperoleh melalui MTT assay yakni dosis IC 50 ,  ½xIC 50 dan  2xIC 50 serta  kontrol  (tanpa antibodi primer).

## Ekstraksi Daun Kelor
Serbuk  ekstrak  daun  kelor  ditimbang sebanyak  100  gram,  selanjutnya  diekstraksi dengan  metode  maserasi  menggunakan pelarut  etanol  sebanyak  1  liter.  Remaserasi dilakukan  sebanyak  dua  kali.  Hasil  maserasi yang  diperoleh  kemudian  diuapkan  dengan rotary evaporator suhu 50 ᵒ C, kecepatan 500 rpm  selama  30  menit.  Selanjutnya  ekstrak kental  yang  diperoleh  dikeringkan  dengan menggunakan vacuum oven .

## Penentuan Kualitatif Fitokimia Uji Tanin
Sebanyak  10  mg  sampel  ditimbang dengan  menggunakan  gelas  arloji,  dilarutkan dalam  15  mL  aquades  pada  tabung  reaksi, ditambahkan  3  tetes    FeCl 3 ,  diamati  warna yang  terbentuk,  sampel  mengandung  tanin jika  berwarna  coklat  kehijauan  sampai  biru kehitaman.

## Uji Saponin
Ekstrak dilarutkan dalam aquades dengan perbandingan  1  :  1.  Sebanyak  2  ml  sampel diambil  dengan  menggunakan  gelas  ukur, ditambahkan  2    ml  aquades,  dikocok  selama 15  menit,  diamati  sampel,  mengandung saponin jika terbentuk lapisan buih.

## Uji Flavonoid
Ekstrak dilarutkan dalam aquades dengan perbandingan  1  :  1,  1  ml  sampel  diambil dengan menggunakan gelas ukur, ditambahkan  5%  NaOH  sebanyak  5  tetes, diamati  warna  yang  terbentuk,  sampel mengandung flavonoid jika berwarna kuning.

## Uji Terpenoid
Ekstrak dilarutkan dalam aquades dengan perbandingan  1  :  1.  Sebanyak  5  mL  larutan ekstrak  diambil  dengan  menggunakan  gelas ukur,  ditambahkan  kloroform  sebanyak  2  ml, ditambahkan  H 2 SO 4 pekat  sebanyak  3  ml, diamati  warna  yang  terbentuk,  sampel mengandung  terpenoid  jika  berwarna  coklat kemerahan.

## Uji Alkaloid
Sebanyak  125  mg  sampel  ditimbang, dilarutkan dalam HCl sebanyak 5 ml, disaring dengan  menggunakan  kertas  saring,  diambil filtratnya  sebanyak  2  ml,  ditambahkan  2–3 tetes reagen dragendorf dengan menggunakan  pipet  tetes,  diamati  perubahan warna  yang  terbentuk,  sampel  berwarna kecokelatan jika mengandung alkaloid.

## Uji Fenol
Sebanyak  50  mg  ekstrak  ditimbang, dilarutkan  dalam  5  ml  aquades,  ditambahkan 23 tetes larutan 5% FeCl, diamati warna yang terbentuk,  sampel  mengandung  fenol  jika berwarna hijau gelap.

## Pemaparan  Ekstrak  Daun  Kelor  pada Kultur Sel
Ekstrak  daun  kelor  diencerkan  sesuai konsentrasi  yang  diinginkan  di  medium  sel MCF-7.  Larutan  ekstrak  daun  kelor
ditambahkan  ke  dalam plate dan  didiamkan selama 24 jam. Dicuci kembali larutan ekstrak daun kelor dengan medium sel.
Penentuan IC 50 dengan MTT Assay
Pengujian  MTT  assay  menggunakan plate  sumur  96.    Media  dipindahkan  dan diresuspensikan  sel  1.0  ml  dengan  media lengkap.  Diencerkan  sel  (cv=cv)  hingga 75.000  sel  per  ml  dan  digunakan  media lengkap  untuk  mencairkan  sel.  Ditambahkan 100  µl  sel  (7500  jumlah  sel)  ke  masing- masing  sumur  dan  diinkubasi  selama semalam.  Hari  berikutnya  ditambahkan  20  µl 5  mg/ml  MTT  masing-masing  pada  sumuran. Disertakan satu set sumur dengan MTT tetapi tidak  dengan  sel-sel  kontrol.    Diinkubasi selama  3,5  jam  pada  suhu  37 o C  dalam culture  hood .  Dikeluarkan  media  secara  hati- hati. Ditambahkan 150 µl pelarut MTT. Ditutup dengan  kertas  timah  dan  dikocok  sel  pada orbital  shaker selama  15  menit.  Dibaca absorbansi  pada  590  nm  dengan  filter referensi  dari  620  nm.  Dihitung  hambatan proliferasi  sel  dengan  rumus. 6 Kemudian dibuat  grafik  garis  linier  untuk  menentukan IC 50 .

## Pengujian  Aktivitas  NF-ĸB  menggunakan Metode Imunositokimia
Kultur sel MCF-7 dipanen sesuai dengan protokol  panen.  Jumlah  sel  MCF-7  dihitung sesuai  dengan  protokol  penghitungan  sel (jumlah  sel  yang  dibutuhkan  untuk  uji imunositokimia  adalah  5x10 4 sel/sumuran (5x10 4 sel/1000  μl    DMEM  1640).  Disiapkan 24 well plate dan cover slip. Ditransfer 1000 μl DMEM  1640  suspensi  sel  ke  atas cover  slip . Sel  diinkubasi  di  dalam  inkubator  selama semalam.  Dibuat  tiga  konsentrasi  sampel ekstrak  daun  kelor,  yaitu  pada  IC 50 ,  dua  kali IC 50 ,  dan  setengah  kali  IC 50 ,  untuk  perlakuan sebanyak  1000  μl.  Untuk  imunositokimia, minimal  diperlukan  3  perlakuan:  a.  perlakuan dengan  ekstrak  daun  kelor,  b.  kontrol  sel
tanpa  antibodi  primer  (akan  menunjukkan warna  biru),  c.  kontrol  sel  dengan  antibodi primer  (akan  menunjukkan  warna  coklat). Diambil 24 well plate yang telah berisi sel dari inkubator  CO 2 .  Dibuang  semua  media  kultur dari  sumuran  dengan  pipet  tetes  secara perlahan-lahan.  Diisikan  PBS  masing-masing 500 μl ke dalam sumuran untuk mencuci sel. Dibuang PBS dari sumuran dengan pipet tetes secara  perlahan.  Dimasukkan  tiga  sampel dengan konsentrasi ekstrak daun kelor sesuai poin 10 sebanyak 1000 μl ke dalam sumuran. Dimasukkan  1000  μl  media  kultur  untuk kontrol sel. Diinkubasi di dalam inkubator CO 2 selama 15 jam. Disiapkan metanol dingin dan PBS.  Diinkubasi  dengan  sampel  dihentikan pada  jam  ke-15.  Dibuang  semua  media  dari sumuran dengan pipet tetes secara perlahan. Disikan PBS 500 μl ke dalam masing-masing sumuran  secara  perlahan  untuk  mencuci  sel. Dibuang PBS dari sumuran dengan pipet tetes secara  perlahan.  Diberi  label  pada  masing- masing  sumuran.  Diteteskan  300  μl  metanol dingin,  diinkubasi  10  menit  di  dalam freezer. Diberikan  metanol  secara  perlahan,  jangan sampai cover  slip terbalik.  Dilakukan pencucian  dengan  PBS  dan  akuades sebanyak  2  kali.  Diteteskan  larutan  hidrogen peroksida  ( blocking  solution) ,  dan  diinkubasi selama  10  menit,  dibuang  larutan  dengan mikropipet.  Diteteskan prediluted  blocking serum ,  diinkubasi  selama  10  menit,  dibuang larutan. Diteteskan antibodi monoklonal primer untuk  antigen  yang  ingin  diamati,  yaitu  untuk
NF-ĸB    (p50).  Ditambahkan  500  μl  PBS, diinkubasi  selama  5  menit,  dan  dibuang. Diteteskan  antibodi  sekunder  yang  dilabel biotin ( biotinylated  universal  secondary antibody ),  diinkubasi  selama  10  menit. Ditambahkan 500 μl PBS, diinkubasi selama 5 menit,  lalu    dibuang.  Diteteskan  reagen  yang berisi kompleks streptavidin-enzim
peroksidase,  diinkubasi  selama  10  menit.
Ditambahkan 500 μl PBS, diinkubasi selama 5 menit,  dibuang  PBS.  Diteteskan  larutan substrat kromogen DAB, diinkubasi selama 10 menit.  Ditambahkan  500  μl  akuades,
kemudian dibuang kembali. Diteteskan larutan Mayer  Haematoxylin dan diinkubasi selama 3 menit.  Ditambahkan  500  μl  akuades, kemudian  dibuang  kembali. Cover  slip diangkat  dengan  pinset  secara  hati-hati, kemudian  dicelupkan  dalam    xylol.  Lalu dicelupkan  dalam  alkohol,  dan  dikeringkan. Cover slip diletakkan di atas object glass , dan ditetesi  dengan  lem  ( mounting  media ).  Sel diamati dan dihitung jumlah NF-ĸB aktif di inti sel dengan mikroskop cahaya.

## Pengujian Apoptosis menggunakan TUNEL Assay
Sel  pada cover  slide dicuci  dengan menggunakan  PBS . Kemudian  sel  diinkubasi dengan blocking solution 10 menit pada suhu 15–25 o C. Sel pada cover slide dicuci dengan menggunakan PBS setiap setelah melekukan perlakuan. Preparat diinkubasi  dengan permeabilization  solution selama  2  menit  di atas    es  dengan  suhu  2–8 o C. Keringkan daerah  sekitar  sampel. Ditambahkan  TUNEL Reaction Mixture sebanyak 25 µl. Ditutup dan diinkubasi selama 60 menit pada suhu 37 o C dalam kondisi lembab dan gelap.
Ditambahkan 25 µl converter POD. Diinkubasi pada  tempat  lembab  30  menit  pada  suhu  37 o C. Ditambahkan  DAB  substrat. Diinkubasi selama  10  menit  pada  suhu  15–25 o C. Ditambahkan  reagen  Mayer  Haematoxilyn. Dicuci dengan PBS dan akuades . Dikeringkan dengan oven selama ±24 jam.

## Analisis Data
Data  yang  telah  terkumpul  diolah  dan dilakukan  analisis  uji  normalitas  dan  uji homogenitas.  Uji  normalitas  dilakukan  untuk mengetahui  apakah  data  berdistribusi  normal atau  tidak.  Uji  normalitas  dilakukan menggunakan  rumus  dari Saphiro  Wilk. Distribusi  data  dikatakan  normal  bila  hasil signifikansi  lebih  besar  dari  0,05  (p  >  0,05). Bila  data  berdistribusi  normal,  maka digunakan  uji  statistik  parametrik.  Uji homogenitas  dilakukan  untuk  mengetahui apakah  data  memiliki  varian  yang  sama.  Uji
homogenitas  dilakukan  menggunakan  tingkat kepercayaan  95%.  Bila  data  memiliki  varian yang  sama  maka  selanjutnya  dilakukan  uji ANOVA.  Setelah  uji  Anova  kemudian  diuji korelasinya  dengan  menggunakan  uji post- hoc . Jika data yang didapatkan tidak homogen secara  ANOVA  maka  selanjutnya  dilakukan analisis  non  parametrik  dengan  metode Spearman .

## Hasil

## Hasil Ekstraksi dan Uji Kualitatif
Hasil  ekstraksi  daun  kelor  didapatkan ekstrak    sebesar  37,81  g.  Pengamatan organoleptik  didapatkan  hasil  ekstrak  kental pekat  berwarna  hijau  kehitaman  dan  berbau khas  daun  kelor.  Hasil  uji  fitokimia  yang didapatkan  antara  lain  ekstrak  daun  kelor positif  mengandung  tanin,  alkaloid,  fenol, flavonoid, dan saponin tetapi tidak ditemukan kandungan terpenoid.

## Dosis IC
50 dengan MTT Assay Penentuan  IC 50 dengan  MTT  assay didapatkan  hasil  persen  hambatan  proliferasi yang  mendekati  hambatan  sebesar  50% (Tabel 1) sebagai berikut:
Tabel 1. Dosis dan persen hambatan proliferasinya
Dosis  yang  dipakai  adalah  dosis  dengan persen  hambatan  proliferasi  sebesar  50%. Kemudian  data  persen  hambatan  proliferasi yang  didapat  tersebut  dibuat  kurva  regresi liniernya untuk menentukan dosis IC 50 .
Gambar 1. Grafik MTT assay hubungan dosis ekstrak  terhadap  persen  hambatan  proliferasi sel MCF-7.
Persamaan  regresi  diperoleh  untuk menentukan dosis IC 50 (Gambar 1), yang akan diberikan  pada  kultur    sel  MCF-7  guna mengetahui  aktivasi  dari  NF-ĸB.  Dosis  yang diperoleh  berdasarkan  persamaan  tersebut adalah  2168,92 µg/ml dan dibulatkan menjadi 2200 µg/ml.
Deteksi aktivasi dan distribusi NF-ĸB pada sel MCF-7 dengan Metode

## Immunositokimia
Berdasarkan  pengamatan  menggunakan mikroskop  cahaya  dengan  perbesaran  1000x dapat  dilihat  aktivasi  dan  distribusi  NF-ĸB pada  sel  MCF-7  pada  kontrol  sel  tanpa perlakuan dan dengan dosis IC 50 , 2xIC 50 , dan ½xIC 50 ekstrak  daun  kelor  didapatkan  hasil pada Gambar 2.
y = 0,0121x + 23,756 R² = 0,8704 0 20 40 60 80 100 0 1000 2000 3000 4000 5000 H amb atan Pr o lif e rasi S e l ( % ) Dosis Ekstrak (μg/ml) Kurva Dosis Ekstrak terhadap Hambatan Proliferasi Sel
Dosis µg/ml % Hambatan Proliferasi Dosis µg/ml % Hambatan Proliferasi 4400 79,04 2500 54,17 4200 77,07 2400 50,86 4000 70,3 2200 50,86 3800 63,97 2000 54,9 3600 60,78 1800 51,34 3400 64,50 1600 51,34 3200 62,62 1400 33,4 3000 62,5 1250 34,93 2800 62,62 1200 30,9 2600 58,58
Gambar  2.  Gambaran  mikroskopik  kultur  sel MCF-7 menggunakan metode immunositokimia  yang  menunjukkan  NF-ĸB aktif dengan warna cokelat kehitaman (panah biru) dan NF-ĸB tidak aktif dengan warna ungu kecokelatan (panah hijau) (1000x). Keterangan:
(1). kelompok perlakuan dosis 2xIC 50 , (2) kelompok perlakuan dosis IC 50 , (3) kelompok perlakuan dosis ½xIC 50 ,  (4)  kelompok  kontrol  dengan  antibodi,  (5) kelompok kontrol tanpa antibodi.
Perhitungan  sel  dilakukan  dengan menghitung  jumlah  sel  MCF-7  yang mengalami  aktivasi  NF-ĸB,  ditandai  dengan warna  sel  yang  kecokelatan  pada  inti  sel. Kemudian  dibandingkan  dengan  jumlah  total sel  sehingga  didapatkan  hasil  indeks  NF-ĸB aktif.
Gambar  3.  Pengaruh  dosis  ekstrak  terhadap rata-rata indeks aktivitas NF-ĸB.
Berdasarkan  hasil  analisis  uji  ANOVA untuk  menguji  antara  berbagai  kelompok perlakuan  terhadap    persentase  NF-ĸB  aktif, menunjukkan nilai yang signifikan (p=0,000 < 0,005).  Uji post-hoc menunjukkan perbedaan yang  bermakna  pada  kelompok  sel  MCF-7 yang  diberi  perlakuan  ekstrak  daun  kelor dengan  dosis  2200  µg/ml  dan  4400  µg/ml dengan  nilai  p  yaitu  0,000  dibanding  dengan kelompok kontrol. Sementara pada  kelompok dosis  1100  µg/ml  tidak  memiliki  perbedaan yang  bermakna  bila  dibandingkan  dengan kelompok  kontrol  (p=0,081).  *P  <  0,05 berbeda  signifikan  dibanding  kontrol.  Pada kelompok terapi dengan dosis 2200 µg/ml dan 4400  µg/ml  berbeda  bermakna  dengan kelompok kontrol (p=0,000).

## Hasil  Uji  Apoptosis  menggunakan  TUNEL Assay
Uji  apoptosis  dengan  menggunakan metode  TUNEL  assay  menunjukkan  bentuk sel dengan inti tidak  terlihat jelas saat diamati menggunakan  mikroskop  cahaya  dengan perbesaran 1000x (Gambar 4).
(1) (2) (4) 36,5% 59,8% 61,0% 31,6% (3) (5)
Gambar  4.  Gambaran  mikroskopik  apoptosis  sel  MCF-7  yang  ditandai  dengan  warna  coklat  gelap pada inti sel  (panah merah) (1000x). Keterangan:  (A)  kelompok  kontrol,  (B)  kelompok  perlakuan  ekstrak daun kelor dosis  ½xIC 50 , (C) kelompok perlakuan ekstrak daun kelor dosis IC 50 , (D) kelompok perlakuan ekstrak daun kelor dosis 2xIC 50 .
Pada  penelitian  ini  dilakukan  TUNEL  assay untuk  melihat  apoptosis  dari sel  MCF-7  yang diberi  perlakuan  ekstrak  daun  kelor  dengan dosis  ½xIC 50 1100  µg/ml,  IC 50 2200  µg/ml,
2xIC 50 4400  µg/ml,  dan  kontrol  tanpa perlakuan  ekstrak.  Tetapi  hasil  yang didapatkan  tidak  dapat  dilihat  bentuk  sel  dan apoptosisnya.  Meskipun  demikian,  ada beberapa  hasil  yang  dapat  terlihat  tetapi jumlahnya  sedikit  dan  tidak  representatif, sehingga  tidak  dapat  dilakukan  perhitungan jumlah  sel  dan  analisis  lebih  lanjut.  Namun, dengan  melihat  hasil  uji  apoptosis  pada Gambar  4,  dapat  diinterpretasikan  bahwa makin  tinggi  dosis  cenderung  makin  banyak sel  yang  mengalami    apoptosis  (berwarna cokelat).

## Pembahasan
Sesuai  dengan  hasil  penelitian  terdahulu dan  uji  kualitatif  dari  ekstrak  daun  kelor menunjukkan  adanya  kandungan  tannin, alkaloid, fenol, flavonoid, dan saponin. 7 Tetapi pada  uji  kandungan  terpenoid  daun  kelor menunjukkan hasil yang negatif. Hal ini diduga dikarenakan reagen yang digunakan masih
belum  dapat  mendeteksi  adanya  kandungan kimia  terpenoid.  Terdapat  metode  lain  yang dapat mendeteksi kandungan kimia terpenoid, salah  satunya  dengan  metode  Lieberman- Burchard. 8 Pengujian  dengan  metode Lieberman-Burchard  ini  masih  belum  dapat dilakukan  dikarenakan  keterbatasan  bahan dan  waktu  penelitian.  Selain  itu,  kandungan terpenoid  pada  daun  kelor  tidak  dapat ditemukan pada penelitian ini juga bisa diduga karena  metode  ekstraksi  yang  digunakan, kemungkinan  pada  ekstraksi  maserasi kandungan terpenoid tidak dapat terekstraksi.
MTT  assay  dilakukan  untuk  menentukan IC 50 ( Inhibition Concentration 50%) atau dosis daun  kelor  yang  memiliki  aktivitas  hambatan proliferasi  pada  sel  kanker  payudara  MCF-7 sebesar  50%.  Berdasarkan  penelitian sebelumnya  didapatkan  IC 50 daun  kelor terhadap  kanker  pankreas  sebesar  1100 µg/ml. 5 Pada  kanker  kolon  tipe  sel  HCT15, SW48,  dan  SW480  adalah  masing-masing 264,83; 102,40; dan 197,20 µg/ml. 9 Dari data tersebut  yang  mendasari  penggunaan  dosis pada  penelitian  ini.  Tetapi  dosis  IC 50 yang diperoleh sebesar 2200 µg/ml pada sel kanker payudara  MCF-7.  Terdapat  perbedaan  dosis
IC 50 dapat dikarenakan perbedaan sel kanker yang  digunakan  dan  asal  daerah  daun  kelor yang dimanfaatkan.
Pada  penelitian  ini,  pengaruh  daun  kelor terhadap  aktivitas  NF-ĸB  diamati  dengan metode immunositokimia.  Dosis ekstrak daun kelor  diperoleh  melalui  MTT  Assay  yaitu  IC 50 (2200 µg/ml), ½xIC 50 (1100 µg/ml), dan 2xIC 50 (4400 µg/ml), serta kontrol negatif. Kemudian dihitung jumlah inti sel dengan NF-ĸB aktif dan dibandingkan  dengan  total  sel  keseluruhan dalam  10  lapang  pandang  sehingga didapatkan  indeks  NF-ĸB  aktif.  Hasil  analisis dengan  uji  ANOVA,  menunjukkan  adanya perbedaan  yang  signifikan  pada  tiap  dosis. Namun  uji post  hoc tidak  menunjukkan perbedaan  yang  signifikan  antar  kelompok kontrol  dengan  kelompok  dosis  ½xIC 50 dengan  hasil  signifikansi  0,081.  Sedangkan kelompok  dosis  lainnya  memiliki  hasil perbedaan  yang  signifikan.  Uji  pearson  pada kelompok  kontrol,  dosis  ½xIC 50 ,  dosis  IC 50 , dan  dosis  2xIC 50 didapatkan  nilai  korelasi sebesar -0,834 dan nilai signifikansinya 0,000. Jadi, dapat disimpulkan bahwa semakin tinggi konsentrasi ekstrak daun kelor  maka semakin terjadi  penurunan  terhadap  jumlah  NF-ĸB aktif.  Walaupun  terjadi  peningkatan  aktivitas NF-ĸB pada kelompok perlakuan dosis 2xIC 50 . Terjadinya  hambatan  aktivitas  NF-ĸB pada sel kanker HeLa karena adanya paparan ekstrak  daun  kelor.  Ekstrak  daun  kelor mengandung senyawa kimia benzyl isothiocyanate  dan  phenethyl  isothiocyanate yang    terbukti  memiliki  aktivitas  anti  kanker dengan menghambat aktivitas NF-ĸB pada sel kanker  pankreas  dan  kanker  ovarium. 10 Ekstrak  daun  kelor  juga  dapat  menurunkan aktivitas  NF-ĸB  dengan  cara  menghambat pembentukan  ROS  sehingga  IKb  tidak terfosforilasi  dan    NF-ĸB  dapat  dihambat. Kandungan zat aktif yang diduga memiliki efek tersebut  adalah  quercetin  dan  kaempferol, yang  termasuk  flavonoid  yang  berfungsi sebagai  “scavenging”  terhadap  radikal  bebas sehingga  tidak  terbentuk  ROS  secara berlebihan. 11 Pada  penelitian  ini,  dosis tertinggi yang dapat menurunkan aktivitas NF-
ĸB    IC 50 yaitu  2200  µg/ml,  tetapi  tidak  dapat dipastikan jika  dosis  semakin  menigkat  maka aktivitas NF-ĸB semakin menurun.
Hasil  pengamatan  mikroskop  dengan perbesaran  1000x  menunjukkan  tidak  dapat diamatinya  bentuk  sel  secara  jelas  serta  inti sel yang mengalami apoptosis, sehingga tidak dapat  dilakukan  perhitungan  sel  secara kuantitatif.    Oleh  karena  itu  apoptosis  hanya dilihat  secara  kualitatif,  yaitu  dari  gradasi warna  yang  tampak.  Pada  sel  Hela  ekstrak daun  kelor  dapat  meningkatkan  apoptosis namun  tidak  terlalu  besar. 10 Tetapi  pada penelitian  ini,  belum  dapat  dilihat  pengaruh ekstrak  daun  kelor  terhadap  apoptosis  sel MCF-7.  Jadi  perlu  dilakukan  penelitian  lebih lanjut  agar  pengaruh  ekstrak  daun  kelor terhadap apoptosis sel MCF-7 dapat dilihat.

## Kesimpulan
Ekstrak  daun  kelor  dapat  menurunkan aktivitas NF-ĸB pada sel MCF-7 dibandingkan dengan  kontrol.  Penurunan  aktivitas  NF-ĸB dengan  dosis  IC 50 2200  µg/ml  sebanyak 31,6% dan dosis 2xIC 50 4400 µg/ml sebanyak 36,5%.  Secara  deskriptif  ekstrak  daun  kelor cenderung  meningkatkan  apoptosis  sel  MCF- 7.

## Daftar Pustaka
1. (Depkes  RI)  Departemen  Kesehatan  RI. Buku  Saku  Pencegahan  Kanker  Leher Rahim  dan  Kanker  Payudara .  Jakarta: Depkes RI. 2009.
2. Khiong  K,  Adhika  OA,  Chakravitha  M. Inflammation,  Immunity,  and  Cancer:  The Role  of  Transcription  Factors  NF-kB  and STAT3. Majalah  Kedokteran  Indonesia.
2010; 60(8):369-373.
3. (NHMRC)  National  Health  and  Medical Research  Council  .  Clinical  Practice Guidelines:  Management  of  Early  Breast Cancer. Australia. 2001.
4. Balachandran  A,  Govindarajan  R.  Cancer
An Ayurvedic Perspective.
Pharmacological  Research .  2005;  51:19– 30.
5. Berkovich  L et  al . Moringa  oleifera
Aqueous  Leaf  Extract  Down-Regulates Nuclear  Factor-KappaB  and  Increases
Cytotoxic  Effect  of  Chemotherapy  in Pancreatic Cancer Cells. BMC Complementary  and  Alternative  Medicine .
2013;13:212.
6. Putra A, Tjahjono W. Ekstrak Keladi Tikus (Typhonium flagelliforme) Fraksi Diklorometanolik  dan  Ekspresi  Caspase-3 dan p21 Cell-Line Kanker Payudara MCF-
7. Media  Medika  Indonesiana. 2011; 45(2): 95-105.
7. Yudistira  F,  Murwani  A,  Trisunuwati  SW.
Potensi  Antimikroba  Ekstrak  Air  Daun
Kelor ( Moringa oleifera ) terhadap Salmonella  enteritiditis secara in  vitro . Tugas Akhir. Malang: Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Brawijaya.  2013.
8. Gunawan IWG, Bawa IGAG, Sutrisnayanti NL.  Isolasi  dan  Identifikasi  Senyawa Terpenoid  yang  Aktif  Antibakteri  Pada
Herba  Meniran (Phyllantus  niruri) .  Tugas Akhir. Fakultas MIPA. Denpasar: Universitas Udayana. 2008.
9. Paliwal  R,  Sharma  V,  dan  Pracheta.  A Review  on  Horse  Radish  Tree  ( Moringa oleifera )  A  Multipurpose  Tree  with  High Economic  and  Commercial  Importance.
Asian  Journal  of  Biotechnology. 2011;
3(4):317-328.
10. Hermawan A, Nur KA, Samoko DD, Putri P,  dan  Meiyanto  E.  Ethanolic  Extract  of Moringa  oleifera Increased  Cytotoxic Effect  of  Doxorubicin  on  Hela  Cancer
Cells. Journal  of  Natural  Remedies.
2012; 12(2):106–114 .
11. Wihastuti  AT,  Sargowo  D,  Rohman  MS. The  Effect  of Moringa  oleifera Leaf Extract  in  Inhibition  of  NF-κB  Activation, TNF-α  and  ICAM-1  Expression  in Oxydized  LDL  treated  HUVECS. Jurnal Kardiologi Indonesia. 2007; 28:181-188.