## IDENTIFIKASI MOLEKULER BERBASIS MARKA GEN 16S rRNA TERHADAP BAKTERI COLIFORM TERKULTUR YANG DISIOLASI DARI FORAMINIFERA JENIS CALCARINA ASAL PERAIRAN PULAU PRAMUKA,

## KABUPATEN KEPULAUAN SERIBU, DKI JAKARTA

## THE 16S rRNA GENE MARKER-BASED MOLECULAR IDENTIFICATION OF CULTURABLE COLIFORM BACTERIA ISOLATED FROM FORAMINIFERA
CALCARINA DERIVED FROM PRAMUKA ISLAND WATERS,

## THE SERIBU ISLAND DISTRICT, JAKARTA PROVINCE
Mochamad Untung Kurnia Agung 1) , Agus Tri Askar 1) , Yuli Andriani 1) , Lintang Permatasari Yuliadi 1)
1) Departemen Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Padjadjaran Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Padjadjaran, Jatinangor, Sumedang,
Jawa Barat 45363 Indonesia
* Email: mochamad.untung@unpad.ac.id

## ABSTRAK
Kontaminasi bakteri coliform pada foraminifera bentik telah dilaporkan terjadi akibat pencemaran limbah organik  pada  lingkungan  perairan  di  sekitar  ekosistem  terumbu  karang  dan  kejadian  ini  diketahui  dapat mengganggu  proses  pembentukan  cangkang  foraminifera  yang  pada  akhirnya  berakibat  pada terganggunya  peran  foraminifera  dalam  proses  pembentukan  sedimen  dasar  terumbu  karang.  Penelitian ini  bertujuan  mengidentifikasi  secara  molekuler  isolat  bakteri coliform terkultur  yang  mengkontaminasi foraminifera  jenis Calcarina yang  disolasi  dari  perairan  Pulau  Pramuka,  Kabupaten  Kepulauan  Seribu, DKI Jakarta dengan menggunakan marka gen 16S rRNA. Pengambilan sampel foraminifera dilakukan di perairan  Pulau  Pramuka,  Kabupaten  Kepulauan  Seribu,  DKI  Jakarta  pada  5(  lima)  stasiun,  sementara proses  isolasi  bakteri  dan  identifikasi  molekuler  dilakukan  di  Laboratorium  Mikrobiologi  dan Bioteknologi  Molekuler  (MICROMOL),  Fakultas  Perikanan  dan  Ilmu  Kelautan  (FPIK),  Universitas Padjadjaran. Identifikasi molekuler dilakukan dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) berbasis marka gen 16S rRNA. Sekuensing  dilakukan dengan mengirim amplikon hasil PCR  ke perusahaan jasa sekuensing 1st  Base  di Singapura dan proses pencocokan  hasil sekuensing  dengan database  di  genBank dilakukan  dengan  bantuan  program Basic  Local  Alignment  Search  Tool (BLAST TM )  yang  tersedia  di website National  Center  for  Biotechnology  Information (NCBI).  Hasil  amplifikasi  gen  16S  rRNA  dari kelima isolat menghasilkan amplikon dengan panjang ±1400 bp dengan konsentrasi berkisar antara 157,5 µg/  mL-230  µg/  mL  dan  dengan  rasio  kemurnian  berkisar  antara  1,477-1,769. Sementara  hasil  BLAST  dan analisis  filogenetik  menunjukkan  bahwa  kelima  isolat  memiliki  kekerabatan  erat  dengan  isolat  bakteri Eschericia  coli strain inspire99 (Acc  No.  JQ315935.1),  yang  diisolasi  dari  perairan  Teluk  Benggala, India.  Hasil  ini  juga  menunjukkan  adanya  konektivitas  ekologi  antara  perairan  Teluk  Benggala  di  India dengan perairan Pulau Pramuka di Indonesia.
Kata Kunci : coliform, foraminifera, 16S rRNA, konektivitas ekologi

## ABSTRACT
Contamination of coliform bacteria in benthic foraminifera has been reported due to pollution of organic wastes in the aquatic environment around coral reef ecosystems and this event was known to interfere the
process of foraminifera shell formation which in turn resulted the disruption of the role of foraminifera in the process of formation of coral reef bottom sediments. The aim of this research is to identify the isolates of  culturable coliform bacteria that contaminate foraminifera Calcarina species  isolated from the  waters of  the  Pramuka  Island,  the  Seribu  Island  district,  Jakarta  Province  using  the  16S  rRNA  gene  markers. Foraminifera sampling was carried out in the waters of Pramuka Island, the Seribu Island district, Jakarta Province  in  5  (five)  stations,  while  the  process  of  bacterial  isolation  and  molecular  identification  were carried  out  at the  Laboratory  of  Microbiology  and  Molecular  Biotechnology  (MICROMOL),  Faculty  of Fisheries  and  Marine  Sciences  (FPIK),  University  Padjadjaran.  Molecular  identification  was  carried  out using the Polymerase Chain Reaction (PCR) method based on the 16S rRNA gene markers. Sequencing is  done  by  sending  PCR  results  to  1st  Base,  sequencing  service  company,  in  Singapore  and  then,  the aligning  of  sequencing  results  with  databases  in  genBank  was  done  using    the Basic  Local  Alignment Search  Tool (BLAST TM )  program  available  on  the National  Center  for  Biotechnology  Information (NCBI) website. The results of 16S rRNA gene amplification from the five isolates produced amplicons of ± 1400 bp length with concentrations ranging from 157.5 µg / mL-230 µg / mL and with a purity ratio ranging  from  1.477-1.769.  While  the  results  of  BLAST  and  phylogenetic  analysis  showed  that  the  five isolates were closely related to the isolate Eschericia coli strain inspire99 (Acc No. JQ315935.1), which was  isolated  from  the  waters  of  the  Bay  of  Bengal,  India.  These  results  also  indicate  the  existence  of ecological  connectivity  between  the  waters  of  the  Bay  of  Bengal  in  India  and  the  waters  of  Pramuka Island in Indonesia.
Keywords : coliform, foraminifera, 16S rRNA, ecological connectivity

## PENDAHULUAN
Foraminifera  merupakan  mikrobiota  laut yang  diketahui  berperan  dalam  proses pembentukan  terumbu  karang.  Beberapa jenis  foraminifera  bentik  diketahui  telah membantu  pembentukan  sekitar  30%  dari total  hamparan  terumbu  karang  di  kawasan Great  Barrier  Reef ,  Australia  (Yamano et al.,
2000). Dalam
penelitian mikropaleontologi, foraminifera dapat dijadikan  indikator  dalam  penentuan  umur lapisan  batuan  sedimen  serta  sebagai penentuan kondisi lingkungan
(Pringgoprawiro  dan  Kapid,  2000).  Selain berasosiasi dengan terumbu karang, foraminifera  juga  dapat  berasosiasi  dengan alga atau diatom (Talge  and Hallock, 1995) dan bakteri (van Bruggen et al., 1983)  yang dapat  ditemukan  baik  pada  foraminifera besar  (Richardson  and  Rutzler,  1999) maupun foraminifera kecil (Bernhard, 2006).
Perubahan  kondisi  lingkungan  perairan dapat menyebabkan gangguan pada foraminifera,  termasuk  kontaminasi  yang disebabkan oleh aktivitas  bakteri (Dewi dan Darlan, 2008). Pertumbuhan populasi bakteri pada suatu perairan dapat dipicu oleh adanya aktivitas buangan  limbah organik ke perairan,  yang  dapat  juga  menyebabkan meningkatnya  populasi  bakteri  patogen. Keberadaan  bakteri  patogen  tersebut  dapat menyebabkan  terganggunya  metabolisme foraminifera  dalam  pembentukan  cangkang. Prazeres et al. (2017) berhasil mengidentifikasi
keberadaan bakteri
coliform dari  kelompok firmicutes dan bacteroides pada foraminifera jenis Amphistegina lobifera .
Bakteri coliform merupakan  kelompok bakteri  yang  dapat  dijadikan  sebagai biondikator  terjadinya  pencemaran  limbah organik  di  suatu  perairan.  Keberadaan bakteri coliform pada  suatu  lingkungan perairan  juga  dapat  meningkatkan  jumlah
populasi  bakteri  patogen  seperti vibrio , salmonella, dan shigella yang dapat menginfeksi dan mengganggu proses pembentukan  cangkang  foraminifera  dan pada  akhirnya  dapat  berpengaruh  terhadap aktivitas  pembentukan  terumbu  karang  di kawasan tersebut.
Askar dkk (2018) telah berhasil mengisolasi kelompok bakteri coliform yang mengkontaminasi  jenis  foraminifera  besar yaitu Calcarina dari  lingkungan  perairan  di ekosistem  terumbu  karang  Pulau  Pramuka, Kepulauan  Seribu,  DKI  Jakarta.  Dari penelitian  tersebut  diketahui  bahwa  bakteri coliform ditemukan pada foraminifera Calcarina dengan kelimpahan <3-16 mpn/100 ml. Identifikasi molekuler terhadap isolat  bakteri coliform tersebut  dilakukan pada  penelitian  ini  dengan  berbasis  pada
marka  gen  16S  rRNA,  yang  merupakan marka  universal  pada  kelompok  prokariotik (Lane, 1991).

## METODE PENELITIAN

## Pengambilan Sampel
Pengambilan  sampel  dilakukan  di  perairan Pulau  Pramuka,  Kab.  Kepulauan  Seribu, DKI Jakarta. Pengambilan sampel dilakukan pada  5  (lima)  stasiun  (Gambar  1).  Sampel yang  diambil  berupa  sampel  sedimen  dasar perairan.  Pada  saat  pengambilan  sampel, sedimen  dimasukkan  ke  dalam  plastik ziplock .  Semua  sampel  diberi  label  dan dimasukkan ke dalam coolbox sampai tiba di laboratorium.  Selama  kegiatan  pengambilan sampel juga dilakukan pengukuran parameter fisik lingkungan seperti : salinitas, suhu,
DO dan pH perairan.
Gambar 1. Lokasi dan Stasiun Pengambilan Sampel di Pulau Pramuka,
Kabupaten Kepulauan Seribu, DKI Jakarta Pemisahan dan Identifikasi Jenis Foraminifera Identifikasi  jenis  foraminifera  dilakukan  di Laboratorium
Mikrobiologi
dan Bioteknologi  Molekuler  (MICROMOL), Fakultas  Perikanan  dan  Ilmu  Kelautan,
Universitas  Padjadjaran.  Metode  pemisahan
foraminifera  mengacu  pada  Kennedy  and Zeidler  (1976).  Pencucian  sampel  sedimen dilakukan  di  atas  saringan  berukuran  0,063 mm hingga bersih dan dikeringkan menggunakan oven pada suhu 30 ºC selama 2 jam. Sampel  yang sudah kering kemudian diayak menggunakan  saringan  dengan
ukuran  mata  saring  0,0250  mm,  0,125  mm dan  0,063  mm.  Tahap  selanjutnya  adalah pemisahan  foraminifera  dari  sedimen  yaitu menyebarkan  sedimen  yang  telah  dicuci pada extraction  tray di  bawah  mikroskop binokuler  secara  merata.  Foraminifera  yang tampak dan terdapat dalam sedimen tersebut kemudian  diambil  dan  disimpan  pada foraminifera  slide .  Kemudian  dilakukan proses  identifikasi  jenis  yang  didapat.  Jenis Calcarina yang didapat kemudian dipisahkan. Isolasi Bakteri Coliform dari Foraminifera Jenis Calcarina
Bakteri coliform diisolasi  dari  foraminifera jenis Calcarina dengan  menumbuhkannya pada  medium  Endo  Agar  (Oxoid TM ), medium spesifik coliform , dengan pelarut air laut  steril  (salinitas  30 ‰) .  Foraminifera jenis Calcarina yang  didapat  dari  proses pemisahan  kemudian  diencerkan  dengan larutan  NaCl  fisiologis  (0,85%)  di  atas cawan keramik steril, digerus dan dimohogenkan.  Sebanyak  100  µL  larutan homogen kemudian dituang di atas permukaan Endo Agar yang sudah memadat, diratakan  dengan L-glass dan  diinkubasi pada  suhu  30 0 C  selama  16  jam.  Koloni bakteri coliform tumbuh  di  atas  permukaan agar  dengan  warna  hijau  metalik.  Koloni bakteri coliform yang  tumbuh  kemudian dipindahkan  ke  medium  baru  dengan menggunakan jarum Ose, diinkubasi kembali  pada  30 0 C  selama  16  jam.  Proses ini dilakukan beberapa kali hingga didapatkan isolat tunggal.
Ekstraksi  DNA  genome  Isolat  Bakteri Coliform
Isolat  tunggal  bakteri coliform dikultur dalam  medium  Endo  Broth  (Oxoid TM )  pada inkubator  shaker  dengan  kecepatan  putaran 150 rpm pada suhu 30 0 C  hingga didapatkan Optical  Density (OD)  kultur  =  0,5.  Kultur dipanen  dengan  bantuan  sentrifugasi  pada kecepatan 5000 rpm selama 30  menit. Pelet
sel bakteri coliform yang ada di dasar tabung digunakan  untuk  proses  ekstraksi  DNA genom.  Proses  ekstraksi  dilakukan  dengan menggunakan Wizard Genomic DNA Purification  Kit (Promega TM )  dan  tahapan dilakukan  sesuai  dengan  instruksi  dari perusahaan  (Promega,  2014).  Genome  yang didapat  kemudian  diukur  konsentrasi  dan kemurniaanya dengan menggunakan spektrofotometer  UV-vis.  DNA  genome disimpan  pada freezer dengan  temperatur  - 20 o C  sampai  diperlukan  untuk  tahap penelitian berikutnya.
Amplifikasi  fragmen  marka  gen  16S rRNA  dengan  metode Polymerase  Chain Reaction (PCR) Pasangan primer 27F (5'-
AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') dan 1492R(5'- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'), yang  secara  khusus  menargetkan  amplikon sepanjang 1,465 bp dari gen 16S rRNA yang dimiliki  bakteri  (Lane,  1991),  digunakan untuk  mengamplifikasi  fragmen  gen  16S rRNA  dari  DNA  genom  dengan  metode PCR.  Komponen  reaksi  PCR  ( cocktail ) terdiri  dari  :  1X  GoTaq  Green  Master  Mix (Promega TM ),  10  pmol  dari  masing-masing primer, disesuaikan dengan volume akhir 25 μL  dengan  NFW.  Adapun  program  PCR diatur  sebagai  berikut:  95 o C  selama  120 detik (pre-denaturasi), diikuti oleh 30  siklus 95 o C  selama  45  detik  ( denaturasi ),  51 o C selama  60  detik  ( annealing ),  dan  72 o C selama  60  detik  ( elongasi ),  kemudian perpanjangan  akhir  72 o C  selama  5  menit ( elongasi  akhir ).  Produk  PCR  kemudian divisualisasikan  dengan  elektroforesis  pada gel  agaros  1%  yang  diwarnai  dengan GelRed (Biotum TM ). Produk PCR kemudian dikirim ke perusahaan jasa layanan sekuensing  1 st Base TM di  Singapura  untuk disekuensing dengan metode Sanger (Agung et al., 2020).

## BLAST dan Analisis Filogenetik
Urutan  nukleotida  hasil  sekuensing  dari fragmen  gen  16S  rRNA  dari  isolat  bakeri coliform kemudian dianalisis ( contig ) menggunakan  BioEdit TM .  Urutan  fragmen kemudian diidentifikasi dengan
mensejajarkan  ( aligning )  dengan  database yang tersedia di NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) menggunakan program Basic Local Aligment Search Tool / BLAST TM .
Pensejajaran ( aligning ) dilakukan  dengan  menggunakan  program ClustalW TM dan pohon filogeni dikonstruksi menggunakan metode Neighbor-Joining dengan  1000  ulangan bootstrap dengan
bantuan  perangkat  lunak  MEGA TM 7.0 (Agung et al., 2020).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  Ekstraksi  DNA  Genom  Bakteri

## Coliform
DNA  genom  isolat  bakteri coliform dari  5 (lima) stasiun berhasil diekstraksi. Konsentrasi  DNA  genom  dari  kelima  isolat dapat  dilihat  pada  Tabel  1.  Konsentrasi berkisar  antara  157,5  µg/mL  -  230  µg/mL dengan  rasio  A 260 /A 280 berkisar  antara 1,477-1,769.
Tabel 1. Konsentrasi dan Kemurnian DNA genom isolat bakteri coliform
No Kode Sampel Absorbansi pada ʎ 260 nm Absorbansi pada ʎ 280 nm Kemurnian (A 260 / A 280 ) Konsentrasi gDNA (µg/ mL) 1 IS-1 0,063 0,041 1,537 157,5 2 IS-2 0,065 0,044 1,477 162,5 3 IS-3 0,087 0,052 1,673 217,5 4 IS-4 0,092 0,052 1,769 230,0 5 IS-5 0,072 0,044 1,636 180,0 Keterangan : IS-1, -2, -3, -4, dan -5 : Isolat dari sampel stasiun ke-1, -2, -3, -4, dan -5
Konsentrasi  dan  kemurnian  DNA  genom akan  mempengaruhi  keberhasilan  proses berikutnya.  Konsentrasi  merepresentasikan sebarapa  banyak  molekul  DNA  genome yang  berhasil  diekstraksi  dari  sel  bakteri. Sementara kemurniaan menunjukkan kondisi  kontaminasi  molekul  RNA  ataupun protein  dalam  campuran  DNA  genom. Menurut Fatchiyah dkk (2011), DNA genom yang  baik  memiliki  kemurnian  sekitar  1,8. Dari  Tabel  1  di  atas,  terlihat  bahwa konsentrasi dan kemurnian DNA genom dari isolat  bakteri coliform yang  diisolasi  dari kelima stasiun sudah sesuai dengan kelayakan untuk pengerjaan proses selanjutnya yaitu amplifikasi gen 16S rRNA dengan  metode  PCR.  Genom  dari  isolat
bakteri  yang  diisolasi  dari  stasiun  4 diketahui memiliki konsentrasi dan kemurnian  yang  paling  tinggi  yaitu  sebesar 230  µg/mL  dengan  kemurnian  mencapai 1,769, bila dibandingkan dengan isolat yang lain.
Hasil  amplifikasi  fragmen  gen  16S  rRNA juga memperlihatkan hasil yang positif. Pita- pita DNA amplikon muncul terang di ukuran antara 1000 s.d. 1500 bp (Gambar 2). Hal ini menunjukkan  bahwa  proses  amplifikasi fragmen  DNA  gen  16S  rRNA  dari  genom isolat  bakteri coliform dari  kelima  stasiun berhasil  dilakukan  oleh  pasangan  primer 27F  dan  1492R,  yang  mentarget  amplikon sepanjang 1465 bp.
Gambar 2. Elektroferogram hasil amplifikasi fragmen gen 16S rRNA dari DNA genom isolat bakteri coliform yang mengkontaminasi foraminifera jenis Calcarina pada gel agarosa 1% IS-1, -2, -3, -4, -5 : Isolat dari sampel stasiun ke-1, -2, -3, -4, dan -5
L : 1 kb DNA Ladder (Fermentas TM )
Secara  kualitatif,  ketebalan  pita  DNA  dapat merepresentasikan konsentrasinya (Fatchiyah  dkk,  2011).  Dari  gambar  2, terlihat  bahwa  amplikon  fragmen  gen  16S rRNA pada isolat yang diisolasi dari stasiun 4  memiliki  konsentrasi  yang  lebih  tinggi dibandingkan  dengan  isolat  yang  lain,  di mana  isolat stasiun 4  juga  merupakan  isolat dengan  konsentrasi  dan  kemurnian  DNA
genom  yang paling tinggi bila dibandingkan dengan isolat yang lain.
Hasil analisis pensejajaran sekuen (BLAST) nukleotida  fragmen  gen  16S  rRNA  dari kelima  isolat  bakteri coliform dengan database  di  genBank  NCBI  menunjukkan bahwa  kelima  isolat  memiliki  kedekatan dengan  isolat  bakteri Eschericia  coli strain inspire99 (Acc No. JQ315935.1) (Tabel 2).
Tabel 2. Hasil BLAST sekuen gen 16S rRNA isolat bakteri coliform dengan database NCBI
No. Kode Isolat Spesies Terdekat Identity (%) Query Cover (%) Accession Number 1 IS-1 Eschericia  coli  strain  inspire99  16S  ribosomal RNA gene, partial sequence 99 100 JQ315935.1 2 IS-2 Eschericia  coli  strain  inspire99  16S  ribosomal RNA gene, partial sequence 99 100 JQ315935.1 3 IS-3 Eschericia  coli  strain  inspire99  16S  ribosomal RNA gene, partial sequence 99 98 JQ315935.1 4 IS-4 Eschericia  coli  strain  inspire99  16S  ribosomal RNA gene, partial sequence 99 98 JQ315935.1 5 IS-5 Eschericia  coli  strain  inspire99  16S  ribosomal RNA gene, partial sequence 98 99 JQ315935.1
1000 bp 1500 bp IS-1 IS-2  IS-3 IS-4  IS-5
L
Sementara  itu,  hasil  konstruksi  pohon filogenetik  (Gambar  3)  juga  menunjukkan bahwa kelima isolat memiliki kedekatan erat dengan  isolat  bakteri Eschericia  coli strain inspire99 (Acc  No.  JQ315935.1),  yang disolasi dari perairan Teluk Benggala, India,
dengan  nilai bootstrap yang  cukup  tinggi, berkisar  antara  89-100.  Menurut  Hillis  and Bull  (1993),  nilai boostrap di  atas  70 menunjukkan  kemungkinan  ≥  95  % organisme  tersebut  memiliki  persamaan yang besar dan dapat dipercaya.
Gambar 3. Pohon Filogenetik ( Neighbor-joining ) Berbasis Marka Gen 16S rRNA dari Isolat Bakteri Coliform yang diisolasi dari Foraminifera jenis Calcarina di Pulau Pramuka, Kabupaten Kepulauan Seribu, DKI Jakarta, dengan 1000 ulangan bootstrap
Kekerabatan  yang  sangat dekat antara isolat bakteri coliform yang diisolasi dari foraminifera  jenis Calcarina yang  berasal dari  perairan  Pulau  Pramuka,  Kabupaten Kepulauan  Seribu,  DKI  Jakarta  dengan bakteri E.  coli yang  diisolasi  dari  perairan Teluk  Benggala,  India  bisa  terjadi  karena adanya konektivitas ekologi yang terbuka di perairan  laut,  yang  menyebabkan  distribusi mikrobiota  dari  berbagai  perairan  dengan karakteristik  lingkungan  yang  hampir  mirip (Frank et  al., 2016;  Bishop et  al., 2017). Teluk Benggala terletak masih satu
hamparan dengan perairan Indonesia,
termasuk perairan Pulau Pramuka, Kabupaten Kepulauan Seribu, DKI Jakarta.

## KESIMPULAN
Hasil  identifikasi  molekuler  berbasis  marka gen  16S  rRNA  terhadap  bakteri coliform yang  mengkontaminasi  foraminifera  jenis Calcarina yang diisolasi dari Perairan Pulau Pramuka,  Kabupaten  Kepulauan  Seribu, DKI  Jakarta  menunjukkan  bahwa  5  (lima) isolat  tunggal  bakteri coliform yang  berasal dari  5  (lima)  stasiun  pengambilan  sampel
memiliki  kedekatan  dengan  isolat  bakteri Eschericia  coli strain inspire99 (Acc  No. JQ315935.1),  yang  disolasi  dari  perairan Teluk Benggala, India, dengan nilai bootstrap yang  cukup  tinggi  berkisar  antara 89-100. Kedekatan genetik ini juga menunjukkan  adanya  konektivitas  ekologi antara  perairan  Teluk  Benggala  di  India dengan perairan Pulau Pramuka di Indonesia.

## DAFTAR PUSTAKA
Agung,  M.U.K;  I  Maqbul,  S  Astuty,  and  Y Mulyani  (2020)  Bacterial  Community Composition  among  Coral Diseases  in Biawak  Island  using  Denaturating Gradient Gel Electrophoresis. Res.J.Chem.Environ. 24 (1). Askar, A.T; M.U.K Agung, Y Andriani, dan L.P Yuliadi (2018) Kelimpahan
Bakteri  Coliform  pada  Air  Laut, Sedimen,  dan  Foraminifera  Jenis Calcarina  di  Ekosistem  Terumbu Karang  Pulau  Pramuka,  Kepulauan
IS-1 IS-2 Escherichia coli strain Inspire99 (JQ315935.1) IS-5 IS-3 IS-4 Escherichia coli strain KL 48(2) (KF768069.1) 97 100 89 0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010 0.012
Seribu,  DKI  Jakarta. Jurnal  Akuatika Indonesia . Vol 3 (1): 36-41
Bernhard  J.M;  A  Habura,  and  S.S  Browser (2006) An Endobiont-bearing Allogromiid  from  the  Santa  Barbara Basin:  Implications  for  the  Early Diversification of Foraminifera. Journal  of  Geophysical  Research: Biogeosciences, Vol. 111. doi:10.1029/2005JG000158
Bishop,  M.J;  M.M  Pinto,  L  Airoldi,  L.B Firth,  R.L  Morris,  L.H.L  Loke,  S.J Hawkins,  L.A  Naylor,  R.A  Coleman, S.Y  Chee,  and  K.A  Dafforn  (2017) Effects of Ocean Sprawl on Ecological Connectivity:  Impacts  and  Solutions.
Journal of Experimental Marine Biology  and  Ecology .  Vol.  492.  doi: 10.1016/j.jembe.2017.01.021
Dewi,  K.  T.  dan  Y.  Darlan  (2008)  Partikel Mikroskopis  Dasar  Laut  Nusantara . Pusat  Penelitian  dan  Pengembangan Geologi Kelautan (P3GL). Bandung
Fatchiyah,  E.L  Arumingtyas,  S.  Widyarti dan S. Rahayu (2011) Biologi Molekular:  Prinsip  Dasar  Analisis.
Erlangga, Jakarta. 191 hlm. Frank, A.H; J.A.L Garcia, G.J Herndl, and T Reinthaler (2016) Connectivity between  Surface  and  Deep  Waters Determines  Prokaryotic  Diversity  in the  North  Atlantic  Deep  Water. Environmental  Microbiology .  Vol.  18
(6). doi: 10.1111/1462-2920.13237
Hillis,  M.  D  and  Bull,  J.J  (1993)  An Emprical  Test  of  Bootstrapping  As  A Method  For  Assessing  Confidence  in Phylogenetic Analysis.
Syst.Biol. 42(2): 182-192
Kennedy,  C  and  W.  Zeidler  (1976)  The Preparation  of  Oriented  Thin  Sections In  Micropaleontology:  An  Improved Method  For  Revealing  The  Internal Morphology  of  Foraminifera  and Other Microfossils. Mycropaleontology 22  (1): 104-107 Lane, D.J (1991) 16S/23S rRNA Sequencing.  Nucleic  Acid  Techniques in Bacterial Systematics. E. Stackebrandt  and  M.  Goodfellow (Eds). John  Wiley  and  Sons. New York: 115-117
Prazeres.,  M.;  T  Ainsworth.,  T.  Edward Roberts.,  John  M.  Pandolfi  and William Leggat (2017) Symbiosis and microbiome  flexibility  in  calcifying benthic  foraminifera  of  the  Great Barrier Reef. Microbiome . 5 (38). doi: 10.1186/s40168-017-0257-7
Pringgoprawiro,  H.  dan  R.  Kapid  (2000) Foraminifera:  Pengenalan  Mikrofosil dan  Aplikasi  Biostratigrafi. Penerbit ITB . Bandung.
Promega  (2014)  Wizard TM Genomic  DNA Purification  Kit:  Technical  Manual ( www.promega.com )
Richardson,  S.L.and  K.  Rutzler  (1999)
Bacterial Endosymbiots in the Agglutinating Foraminiferan Spiculidendreon corallicolum . Sy mbiosis , (26) 299-312.
Talge, H.K and P Hallock (1995) Cytological  Examination  of  Symbiont Loss  in  a  Benthic  Foraminifera, Amphistegina gibbosa. Marine Micropaleontology .  Vol.  26.  doi:
10.1016/0377-8398(95)00015-1
van  Bruggen,  J.J.A;  C.K  Stumm,  and  G.D
Vogels (1983) Symbiosis of Methanogenic Bacteria and Sapropelic Protozoa. Arch.  Microbiol. Vol.  136.
doi: 10.1007/BF00404779
Yamano,  H.,  T.  Miyajima,  and  I.  Koike (2000)  Importance  of  foraminifera  for the  formation  and  maintenance  of  a coral sand cay: Green Island,
Australia. Coral  Reefs 19,51-58.  doi:
10.1007/s003380050226