Jurnal Farmasi Indonesia, November 2014, hal 109-113
ISSN: 1693-8615 EISSN : 2302-4291 Online : http://farmasiindonesia.setiabudi.ac.id/
Uji Aktivitas Sitotoksik Senyawa Analog  3,4-Diklorokalkon terhadap Sel Hela secara MTT
The Cytotoxic Activity Test of 3,4-Dichlorochalcone Analog Against Hela Cell by MTT Method

## NURAINI HARMASTUTI*, MUHAMMAD MUCHALAL
Fakultas Farmasi, Universitas Setia Budi Jln. Letjen Sutoyo-Mojosongo Surakarta-57127 Telp. 0271-852518 * Korespondensi: nuraini_harmastuti@yahoo.co.id
(Diterima 20 September 2014, disetujui 22 Oktober 2014)
________________________________________________________________________________________________________________________________________________

## ABSTRAK
Kalkon  telah  dibuktikan  mempunyai  bermacam-macam  aktivitas  biologis,  salah  satu  di antaranya  sebagai  antitumor.  Penelitian  ini  bertujuan  mensintesis  senyawa  analog  3,4- diklorokalkon dan  meneliti  efek  sitotoksiknya  terhadap  sel  HeLa.  Senyawa  tersebut  disintesis dengan  memodifikasi  cincin  aromatik  yang  diserang  pada  posisi β pada  karbonil  keton.  Cincin aromatiknya  berupa furanil  aromatik.  Sintesis  senyawa  analog  3,4  diklorokalkon  menggunakan metode  Vogel  menggunakan material awal  furanilbenzaldehida dan  3,4-dikloroasetofenon. Kemurnian  hasil  sintesis  dianalisis  dengan  kromatografi  lapis  tipis,  jerak  lebur,  dan  kromatografi gas.  Elusidasi  struktur  ditentukan  dengan  analisis spektrofotometer  UV,  spektrofotometer  IR, spektrometer H1-NMR, dan spektrometer massa. Senyawa lalau diamati efek sitotoksiknya terhadap sel  HeLa  dengan  metode  MTT,  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  senyawa  analog  3,4 diklorokalkon  telah  disintesis,  murni,  dan  strukturnya  adalah furanil-3’,4’-diklorokalkon sesuai yang diprediksikan dengan nilai IC 50 aktivitas sitotoksik terhadap sel HeLa sebesar 23,5 µg/ml.
Kata kunci : analog 3,4 diklorokalkon, sel HeLa, sintesis, sitotoksik.
________________________________________________________________________________________________________________________________________________

## ABSTRACT
Chalcones has been known to have many biological activities, for example as an antitumour. These  research  synthesized  and    observed  the  cytotoxicity  effects  against  HeLa  cells  of  the  3,4- dichlorochalcone  analog  compound.    These  compounds  were  synthesized  by  modifying  in  the aromatic ring  which  attached  at β position  to  the  keton  carbonyl.    The  aromatic  ring  was furanylaromatic.    Synthesis  of    3,4-dichlorochalcone  analog  compound  was  carried  out  by  Vogel method  using  starting  materials  of  furanylbenzaldehide  and  3,4-dichloroacetophenone.  These purity test of synthesized compound was analyzed using thin layer chromatography, melting range, and  GC  methods.    Structure  elucidation  was  determined  by  using  physical  methods,  such  as  UV spectrophotometer,  IR  spectrophotometer,  H1-NMR  spectrometer,  and  MS  spectrometer  analysis. The compound was then observed the cytotoxicity effects against HeLa cells by MTT method. The result indicated that the 3,4-dichlorochalcone analog compound had been able to be synthesized, purified,  and  it  had  structure as  a  predicted  compound, furanyl-3’,4’-dichlorochalchone .    The cytotoxic results shown that the 3,4-dichlorochalcone analog compound with the IC 50 value of 23,5 µg/ml.
Keywords : 3,4-dichlorochalcones analog, HeLa cell, synthesis, cytotoxic.
________________________________________________________________________________________________________________________________________________

## PENDAHULUAN
Kalkon  merupakan  prekursor  untuk sintesis sejumlah besar senyawa
flavonoid  yang  ada  di  alam  (Dewick 1997).  Kalkon  juga  merupakan  suatu molekul  kecil  enon  aromatis  yang merupakan  analog  kurkumin.    Suatu molekul enon aromatis dibagi menjadi 3 bagian  farmakofor  utama  yaitu  bagian  A (suatu  cincin  aromatis),  bagian  B  (suatu ikatan enon), dan bagian C (suatu cincin aromatis).    Dua  cincin  aromatis  baik simetris  maupun  tidak  simetris  dapat menentukan potensi ikatan antara senyawa  obat  dengan  reseptor,  sehingga salah  satu  upaya  modifikasi  molekul enon  dilakukan  pada  bagian  A  dan  C untuk  melihat  pengaruh  struktur  pada aktivitasnya (Robinson et al. 2003).
Kalkon telah dibuktikan mempunyai bermacam-macam aktivitas biologis, salah satu di antaranya sebagai antitumor (Iwata et al. 1995).  Penelitian mengenai hubungan  struktur  aktivitas  senyawa turunan kalkon dan usaha-usaha memodifikasi  struktur  turunan  kalkon yang  telah  dilakukan  melaporkan  bahwa modifikasi  pada  posisi  4  dari  aromatis A yaitu  cincin  aromatis  yang  berposisi β terhadap gugus karbonil dapat
mempengaruhi  aktivitas  turunan  kalkon pada  penghambatan  proliferasi  sel  Hela secara in  vitro,  dimana  substitusi  kloro berpotensi  menghambat  proliferasi  sel HeLa (Utami 2007).  Diketahui substitusi suatu  gugus  pendorong  dan  penarik elektron  pada  posisi  4’  dari  aromatis  C yaitu  cincin  aromatis  yang  langsung terikat  gugus  karbonil  pada  turunan  2,6- diklorokalkon dapat mempengaruhi
aktivitas  turunan  2,6-diklorokalkon  pada penghambatan  proliferasi  sel  endotelial (Robinson et al. 2003).
Berdasarkan hal tersebut, maka pada penelitian  ini  dilakukan  sintesis  analog kalkon  yang  termodifikasi  pada  posisi  3’ dan  4’  dari  aromatis  C  berupa  substitusi atom kloro dengan aromatis A termodifikasi  berupa  furanil  aromatik. Senyawa  yang  disintesis  adalah  furanil- 3’,4’-diklorokalkon. Selanjutnya dilakukan pemeriksaan terhadap aktivitas senyawa analog 3,4-diklorokalkon
tersebut terhadap efek sitotoksik pada sel HeLa.
Analisis  diskoneksi  dari  Stuart Warren  (Warren 1984)  digunakan  untuk mendesain sintesis senyawa furanil-3’,4’- diklorokalkon  ini  menggunakan  material awal  yaitu  furanilbenzaldehida  dan 3,4-dikloroasetofenon.  Reaksi  sintesis senyawa furanil-3’,4’-diklorokalkon melalui  mekanisme  reaksi  kondensasi Claisen-Schmidt  dengan katalis  basa (Carrey and Sunberg 1990).
Penelitian  ini  akan  mempelajari metoda  sintesis  senyawa  furanil-3’,4’- diklorokalkon,
menggunakan
furanilbenzaldehida
dan 3,4-dikloroasetofenon  sebagai  material pemula  menggunakan  katalis  NaOH dalam  pelarut  etanol  (Vogel 1959). Kemudian dilakukan uji kualitatif elusidasi struktur  dengan  analisis  spektrofotometer UV, spektrofotometer IR, spektrofotometer H1-NMR  dan GC-MS (Pavia et  al. 1979).
Berikutnya dilakukan uji aktivitas senyawa hasil sintesis terhadap efek sitotoksik pada sel  HeLa  secara in  vitro dengan  metode yang  terdapat  pada  Doyle and  Griffiths (2000) dan Freshney (1987).

## METODE PENELITIAN

## Bahan
Material  untuk  sintesis  senyawa furanil-3’,4’-diklorokalkon meliputi: furanilbenzaldehida 97% (Janssen
Chimica);  3,4-dikloroasetofenon 98% (E Merck)  ;  semua  reagent  yang  digunakan berkualitas p.a dan berasal dari E. Merck yaitu : etanol 96%, etanol 99%, natrium hidroksida, kloroform, n-heksana, metanol, etil asetat, dan plate alumunium TLC  silika  gel  60  F  254.    Pada  uji sitotoksisitas  digunakan cell  line HeLa; RPMI  1640 powder (GIBCO);  medium penumbuh  mengandung growth  factor 10 % FBS (Fetal Bovine Serum) – 0,5 % fungison  – 2  %  antibiotik  penisilin  dan streptomisin  (GIBCO)  dalam  medium RPMI  1640;  DMSO;  natrium  bikarbonat p.a  (Sigma);  aquabidest; hepes  powder (Sigma);  MTT  (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)- 2,5-difeniltetrazolium  bromida)  (Sigma); larutan sodium  dodecyl  sulphate (SDS) 10 % dalam HCl 0,01 N.

## Alat
Alat  sintesis  digunakan  seperangkat alat gelas laboratorium berkualitas pyrex; timbangan  analitik  (Meltler,  AT-200); Termopan  (Reichert  Austria,  Nr.  340 579); alat penentu titik lebur (Buchi-530); seperangkat  alat  KLT;  Spektrofotometer UV (Milton  Roy  Spectronic  3000  Array); Spektrofotometer  IR  (FTIR-8201  PC, Shimadzu);
Spektrometer H1-NMR
(JEOL, JNM-MY 60); Spektrometer Massa (GC-17 AQP 5000, Shimadzu).  Pada uji sitotoksisitas  digunakan  sentrifus  Sigma 3K12  (B.  Braun  Biotech  International); Inkubator  CO2  (NuaireTM  IR  autoflow); Laminar  air  flow  cabinet  (Nuaire);  ELISA
reader  (SLT  240  ATC);  hemocytometer (Nebauer);  kamera  digital  (Canon  Power Shoot A 80, 4,0 mega pixel).

## Prosedur Sintesis
Sintesis  dilakukan  menurut  Vogel (1959):       NaOH (0,550 g ; 0,014 mol) dalam  3,75  ml  air  dan  dituangkan  ke dalam bejana erlenmeyer yang dilengkapi  dengan  pengaduk  magnet, kemudian dituang 3 ml etanol. Campuran  didinginkan  dengan  pecahan es,  selanjutnya  3,4-dikloroasetofenon (0,005  mol)  dalam  1,5  ml  etanol dituangkan  ke  dalam  campuran  dan segera diaduk. Furanilbenzaldehida (0,703  g  ;  0,005  mol)  dalam  1,5  ml etanol  ditambahkan  tetes  demi  tetes  ke dalam  campuran  dan  diaduk  pada  suhu 15-30 0 C selama 3 jam.  Campuran reaksi selanjutnya didinginkan di antara temperatur  10-15 0 C  24  jam,  selanjutnya didiamkan pada temperatur 28 0 C selama 1 jam.  Endapan hasil reaksi disaring dan dinetralkan dengan air dingin, kemudian dicuci  dengan  6  ml  etanol  dingin.
Selanjutnya endapan hasil reaksi direkristalisasi  dengan  etanol  untuk mendapatkan hasil yang murni.
Endapan  diambil  dan  ditentukan  sifat fisiknya  (jarak  lebur  dan  warnanya), selanjutnya dianalisis menggunakan spektrofotometer  inframerah  (pellet  KBr), spektrofotometer ultraviolet (pelarut kloroform), spektrometer 1H-NMR (pelarut  CDCl 3 ),  dan  GC-MS  (pelarut kloroform).

## Uji Sitotoksisitas
Preparasi sel
Suspensi  sel  dalam  medium  RPMI 1640  yang  ditempatkan  dalam tissue
culture flask.  Supernatan dipindahkan ke dalam  tabung conical steril  15  ml,
kemudian disentrifugasi
dengan kecepatan  7000  rpm  selama  10  menit, sehingga  dihasilkan  supernatan  dan pellet.  Selanjutnya pellet ditambah 1 ml RPMI  dengan  FBS  10%.  Kemudian  sel dihitung  menggunakan hemocytometer, dan  diencerkan  sehingga  memperoleh konsentrasi sel sebesar yang diperlukan.

## Uji sitotoksik
Suspensi  sel  sebanyak  100  µl dengan  kerapatan  3  x  104  sel/sumuran dimasukkan  ke  dalam  mikroplate  96 sumuran berbeda. Kemudian ditambahkan  sampel  100  µl  dalam medium tiap sumuran sehingga diperoleh  kadar  akhir  sampel  dengan variasi kadar tertentu (100,00; 50,00; 25; 12,5) µM/sumuran. Selanjutnya mikroplate  diinkubasi  dalam  inkubator CO 2 5% selama 24 jam pada suhu 37 0 C. Pada  akhir  inkubasi,  medium  masing- masing  sumuran  dibuang  dan  dicuci dengan medium PBS, kemudian ditambahkan  100  µl  medium  baru  dan 10  µl    MTT  5 mg/ml  dalam  PBS. Mikroplate  diinkubasi  lagi  selama  4  jam pada suhu 37 0 C.  Sel hidup akan bereaksi dengan  MTT  membentuk  formazan berwarna  ungu.    Formazan  dilarutkan dalam  100  µl  larutan  SDS  10%  dalam 0,01  N  HCl,  diinkubasi  24  jam  pada suhu  kamar.    Serapan dibaca  dengan ELISA reader pada  panjang  gelombang maksimum 550 nm.  Pada sumuran yang terpisah  dilakukan  uji  kontrol  positif  (sel tanpa  perlakuan)  dan  uji  blanko  (sel dengan  perlakuan  pelarut  sampel)  dan deret variasi jumlah sel.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Elusidasi  struktur  diperoleh  data sebagai berikut: senyawa furanil- diklorokalkon-klorokalkon,       1-(3,4 di- klorofenil)- 3- (2-furanil) prop-2en-1-on, C 13 H 8 O 2 Cl 2. Kristal  memiliki  kemurnian 94,43%  dengan  rendemen  1,33  gram, berwarna kuning  kecoklatan dengan proses rekristalisasi  etanol.  Jarak  lebur senyawa sebesar 90,9 – 92,5ºC (0,6 0 ). Hasil kromatografi lapis tipis menunjukkan  Rf  0,72    pada  fase  diam silika  gel  dan  fase  gerak n-heksana : kloroform  (1  :  3). Hasil kromatografi  gas menunjukkan  waktu  retensi 16,756 menit. Analisis spektrofotometri UV menunjukkan panjang gelombang maksimum  350  nm  dan  275  nm dalam pelarut kloroform. Analisis
spektrofotometri  IR  menghasilkan  data sebagai  berikut ( υ maksimum,  cm-1,  KBr) =  1658,78  (C=O,  str,  keton);  3070,68 (=CH,  str,  alifatik);  3132,70  (=CH,  str, aromatis);  1604,77  (C=C,  str,  alkena); 1512,19  (C=C,  str,  aromatis).  Data  1H- NMR  =  CDCl 3 , δ (ppm);  8.00-8.16  (m, 2H,  Ar  2’’,  6’’-H);  7.35-7.73  (m,  1H,  Ar 3’’-H; 1H, CHB=;  2H, Ar 2’, 6’-H; 4H, Ar 3’, 5’, 3’’, 5’’-H; 1H, =CHA). Analisis MS = (EI, m/z); 266; 173; 145; 121; 93.
Berdasarkan  hasil  elusidasi  struktur di  atas, maka  diperoleh  struktur  furanil- 3’,4’-diklorokalkon  secara  umum  seperti Gambar 1 berikut.
Gambar 1. Struktur furanil-3’,4’-diklorokalkon hasil sintesis.
Senyawa  hasil  sintesis  dilakukan  uji sitotoksisitas  secara in  vitro dengan metode  yang  terdapat  pada Doyle and Griffiths  (2000)  dan Freshney  (1987). Berdasarkan  hasil  aktivitas  sitotoksik terhadap  sel  HeLa  diperoleh  harga  IC 50 sebesar 23,5 µg/ml.

## KESIMPULAN
Reaksi  kondensasi  Claisen-Schmidt dengan  katalis  NaOH  dalam  pelarut etanol  menggunakan    furanilbenzal-
dehida dan 3,4-dikloroasetofenon sebagai  material  awal menghasilkan furanil-3’,4’-diklorokalkon.  Uji  sitotoksik senyawa
furanil-3’,4’-diklorokalkon
terhadap sel HeLa memberikan nilai IC 50 sebesar 23,5 µg/ml.

## DAFTAR PUSTAKA
Carrey  FA and Sunberg  RI.  1990. Advanced Organic Chemistry Part B : Reaction and
Synthesis. edisi  3. New  York  dan
London: Plenum Press.
Dewick  PM. 1997. Medicinal  Natural Products,  A  Biosynthetic  Approach.
New York: John Wiley & Sons. p 136.
Doyle A and Griffiths JB (eds). 2000. Cell and
Tissue  Culture  for  Medical  Research. Chichester: Wiley.
Freshney  RI. 1987. Animal  Cell  Culture,  A Practical  Approach. England:  IRL  Press Limited. p 183-213.
Iwata  S,  Nishino  T,  Nagata  N,  Satomi  Y, Nishino  H,  Shibata  S. 1995. Anti- tumorigenic  activities  of  chalcones,  I. Inhibitory effects of chalcone derivatives on  pi-incorporation  into  phospholipids of HeLa cells promoted by
12-O-tetradecanoyl-phorbol  13  acetate (TPA), Biol. Pharm. Bull. 18:1710-1713.
Pavia  DL,  Lampman  GM,  Kriz  GS. 1979. Introduction  to Spectroscopy  :  A Guide for  Students  of  Organic  Chemistry. London: W.B. Saunders Company.
Robinson  TP,  Ehlers  T,  Hubbard  RB,  Xianhe B, Arbiser JL, Goldsmith DJ, and Bowen
JP. 2003. Design,  synthesis,  and biological  evaluation  of  angiogenesis inhibitors:  aromatic  enone  and  dienone analogues  of  curcumin. Bioorganic  and medicinal  Chemistry  Letters. 13: 115- 117.
Utami D. 2007. Sintesis senyawa kalkon dan turunannya  serta  uji  antiproliferasi terhadap sel HeLa. [Disertasi]. Yogyakarta:  Fakultas  Farmasi,  Sekolah Pascasarjana Universitas Gadjah Mada.
Vogel  AI. 1959. A  Text  Book  of  Prakctical Organic Chemistry Including Qualitative Organic  Analysis. London:  Longmans,
Green and Co Ltd. P 716.
Warren  S.  1984. Organic  Synthesis:  The Disconnection  Approach. New  York: John Wiley & Sons.