## OPTIMASI METODE LOOP MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION UNTUK DETEKSI GEN gyrB Mycobacterium tuberculosis PADA SPESIMEN URIN
Patricia Gita Naully 1  , Sevyya Risna Putri Hidashanti 1 , Fini Ainun Qolbi Wasdili 2

## Abstrak
Salah satu metode alternatif untuk pemeriksaan tuberkulosis (TB) adalah Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP) dengan gen gyrB sebagai penandanya. Spesimen yang umumnya digunakan untuk pemeriksaan tersebut adalah sputum, namun proses pengambilan dan penanganannya cukup sulit. Maka dari  itu,  beberapa  penelitian  menyarankan  menggunakan  spesimen  urin.  Tujuan  penelitian  ini  adalah menentukan  kondisi  optimum  metode  LAMP  dalam  mengamplifikasi  gen  gyrB  dari  Mycobacterium tuberculosis (MTB) pada spesimen urin. Spesimen urin yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari penderita TB di Puskesmas Cimahi Selatan. Penelitian diawali dengan isolasi deoxyribonucleic acid (DNA) dari  urin,  lalu  gen  gyrB  diamplifikasi  dengan  metode  LAMP.  Amplifikasi  dilakukan  pada  berbagai  varian suhu yaitu 59–62 o C dan konsentrasi DNA template sebesar 25 ng/µL, 50 ng/µL, 100 ng/µL serta 200 ng/ µL. Amplikon divisualisasi dengan metode elektroforesis agarose. Hasil penelitian menunjukkan bahwa gen gyrB yang berukuran 320 bp hanya berhasil diamplifikasi dari DNA template dengan konsentrasi sebesar 100 ng/µL dan 200 ng/µL. Pita amplikon yang paling jelas dan tebal terlihat pada konsentrasi 200 ng/µL. Berdasarkan optimasi suhu amplifikasi diketahui bahwa gen  gyrB berhasil diamplifikasi pada suhu 59–62 o C, namun pita yang paling tebal terbentuk pada suhu 61 o C. Berdasarkan hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa gen gyrB dapat diamplifikasi secara optimum menggunakan metode LAMP pada suhu 61 o C dan dengan konsentrasi DNA template sebesar 200 ng/µL.
Kata kunci: gyrB, LAMP, tuberkulosis, urin
OPTIMIZATION OF LOOP MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION FOR THE DETECTION OF THE Mycobacterium tuberculosis gyrB GENE IN URINE SPECIMENS

## Abstract
Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP) is an alternative method for identifying tuberculosis (TB) using gyrB gene as a marker. However, sputum collection for specimens is facing handling difficulties. Therefore,  the  usage  of  urine  specimens  is  gaining  potential  interest  in  exploration.  The  purpose  of  this study was to determine the optimum conditions for the LAMP method to amplify the gyrB gene from Myco- bacterium tuberculosis (MTB) in urine specimens. The urine specimens were obtained from TB patients at the  South  Cimahi  Public  Health  Center.  Initially,  deoxyribonucleic  acid  (DNA)  from  urine  was  isolated followed by amplification of gyrB gene using LAMP method. Amplification was conducted at various tempe- ratures, 59–62 o C and DNA template concentrations of 25 ng/µL, 50 ng/ µL, 100 ng/ µL and 200 ng/ µL. Amplicons were visualized by gel agarose electrophoresis. The results showed that the 320 base pair (bp) of gyrB gene was successfully amplified at DNA template concentrations 100 ng/ µL and 200 ng/ µL with the most optimum band was shown at concentration of 200 ng/ µL. Range of temperature 59–62 o C were successfully amplified gyrB gene with optimum band at  61 o C. This study concluded a temperature of 61 o C and 200 ng/ µL DNA template concentration are optimum settings for gyrB gene amplification using the LAMP method.
Keywords: gyrB, LAMP, tuberculosis, urine
1 Program Studi D4 Teknologi Laboratorium Medis, Fakultas Ilmu dan Teknologi Kesehatan, Universitas Jenderal Achmad Yani
2 Program Studi D3 Teknologi Laboratorium Medis, Fakultas Ilmu dan Teknologi Kesehatan, Universitas Jenderal Achmad Yani
 E-mail: patriciagitanaully@gmail.com

## Pendahuluan
Mycobacterium  tuberculosis  (MTB) adalah  bakteri  yang  dapat  menyebabkan penyakit  tuberculosis  (TB).  Infeksi  paru-paru tersebut masih menjadi masalah kesehatan di dunia,  khususnya  di  negara  berkembang seperti  Indonesia.  Berdasarkan  data  World Health Organization (WHO), jumlah kasus TB di  Indonesia  mencapai  845  ribu  sehingga Indonesia  menjadi  negara  kedua  dengan jumlah kasus TB terbanyak di dunia. 1,2 Angka kematian  akibat  TB  di  Indonesia  juga  tinggi. Pada  tahun  2020  tercatat  lebih  dari  98  ribu orang  yang  meninggal  akibat  TB. 1 Untuk menanggulangi kasus tersebut salah satu hal dibutuhkan  adalah  metode  deteksi  TB  yang cepat,  akurat,  dan  tidak  membutuhkan banyak biaya.
Metode  yang  rutin  digunakan  untuk pemeriksaan  TB  di  Indonesia  adalah mikroskopis  Bakteri  Tahan  Asam  (BTA), kultur MTB, dan Tes Cepat Molekuler (TCM). 3
Ketiga metode tersebut memiliki keterbatasan dalam  hal  akurasi,  waktu  pemeriksaan,  dan alat  pemeriksaan.  Pemeriksaan  mikroskopis BTA  merupakan  pemeriksaan  yang  cepat namun sering kali ditemui hasil negatif palsu. 4
Kualitas  hasil  pemeriksaan  mikroskopis tergantung  pada  kualitas  spesimen  sputum. Spesimen  yang  digunakan  harus  memiliki volume  yang  cukup,  warna  kuning  kehijauan dan  viskositas yang  benar. 5 Selain itu, untuk mendapatkan  hasil  positif  pada  pemeriksaan mikroskopis  dibutuhkan  bakteri  MTB  dengan jumlah minimal 10.000 CFU/mL. 6 Kultur MTB memang  lebih  akurat  dibandingkan mikroskopis  namun  membutuhkan  waktu hingga  2  bulan. 4 TCM  juga  memiliki kekurangan  yaitu  memerlukan  alat  khusus yang mahal dan terkadang menunjukkan hasil negatif  palsu  karena  proses  amplifikasi  yang singkat. 7
Menanggapi  keterbatasan  ketiga metode  tersebut,  para  peneliti  di  bidang kesehatan  terus  melakukan  penelitian  untuk
menemukan  metode  alternatif  pemeriksaan TB yang cepat dan akurat. Pada tahun 2012 Kementerian  Kesehatan  Republik  Indonesia menerbitkan  pedoman  pemeriksaan  TB berbasis  molekuler  metode  Loop  Mediated Isothermal  Amplification  (LAMP)  dengan  gen gyrB  sebagai  penandanya. 8 Gen  tersebut sudah umum digunakan sebagai penanda TB karena merupakan gen lestari yang berfungsi mengkode enzim topoisomerase pada MTB. 31 Metode LAMP mirip dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) namun tidak ada tahap denaturasi  dan  annealing  sehingga  waktu amplifikasinya  lebih  cepat. 9 Metode  ini  juga hanya  menggunakan  satu  suhu  sehingga tidak  membutuhkan  alat  thermocycler. 10 Selain itu, metode LAMP memiliki sensitivitas, spesifisitas,  nilai  duga  positif  dan  nilai  duga negatif  yang  tinggi  untuk  pemeriksaan  TB. 11 Oleh  karena  keunggulan  metode  LAMP sudah  banyak  terbukti,  WHO  merekomen- dasikan  metode  tersebut  untuk  digunakan sebagai  tes  pengganti  mikroskopis  BTA dalam  mendiagnosis  TB  khususnya  saat pengujian  mikroskopis  menunjukkan  hasil negatif. 12
Spesimen  yang  umumnya  digunakan untuk pemeriksaan TB dengan metode LAMP adalah sputum. Spesimen tersebut sulit untuk diambil  karena  tidak  semua  pasien  paham cara  mengeluarkan  sputum. 13 Sputum  juga lebih  berisiko  menularkan  penyakit  sehingga penanganannya  di  laboratorium  perlu  per- hatian lebih. Selain itu, sputum harus segera diperiksa  dengan  sistem  Sewaktu-Pagi- Sewaktu  sehingga  pengambilan  spesimen dilakukan sebanyak tiga kali. 14
Atas  dasar  tersebut,  beberapa  peneliti mengembangkan pemeriksaan TB yang tidak menggunakan  sputum  melainkan  urin. 15–18
Dalam  urin  penderita  TB  dapat  ditemukan transrenal cell free DNA (tr-cfDNA) dari MTB. DNA  tersebut  dihasilkan  dari pemecahan sel MTB kemudian masuk ke dalam aliran darah dan  melewati  glomerulus. 18 Gen  gyrB kemungkinan dapat dideteksi pada tr-cf DNA.
Pengambilan  spesimen  urin  jauh  lebih mudah  dibandingkan  sputum,  sedikit kontaminasi,  tidak  dapat  menularkan  TB  dan hanya  memerlukan  satu  kali  pengambilan spesimen. 16 Meskipun demikian, masih jarang penelitian  yang  mengaplikasikan  metode LAMP  dengan  penanda  gen  gyrB  untuk mendeteksi  TB  pada  spesimen  urin.  Oleh karena  itu,  penelitian  ini  bertujuan  untuk menentukan  kondisi  optimum  metode  LAMP dalam  mengamplifikasi  gen  gyrB  dari  MTB pada spesimen urin.

## Bahan dan Metode

## Rancangan Penelitian
Penelitian  ini  menggunakan  pendekatan kualitatif  dengan  metode  penelitian  bersifat eksperimental  semu.  Desain  penelitian  yang dipakai  yaitu  non-equivalent  control  group design.  Hasil  amplifikasi  gen  gyrB  pada spesimen  urin  yang  menggunakan  berbagai varian  suhu  amplifikasi  dan  konsentrasi  DNA template  dibandingkan  untuk  menentukan kondisi  optimum  metode  LAMP.  Proses amplifkasi  tersebut  dikontrol  dengan  kontrol positif  dan  negatif.  Kontrol  positif  yang digunakan  adalah  sputum  dari  penderita  TB sedangkan  kontrol  negatif  yang  digunakan berupa  NFW,  sputum,  dan  urin  orang  sehat. Seluruh prosedur penelitian ini sudah lolos uji etik  di  Komisi  Penelitian  Kesehatan,  Fakultas Ilmu  dan  Teknologi  Kesehatan,  Universitas Jenderal  Achmad  Yani  dengan  nomor persetujuan  etik  09/KEPK/FITKES-UNJANI/ IV/2022.

## Populasi dan Sampel
Populasi  dalam  penelitian  ini  adalah penderita  TB  paru  di  Puskesmas  Cimahi Selatan.  Sampel  yang  digunakan  adalah  urin dari  pasien  TB  paru  di  Puskesmas  Cimahi Selatan  yang  berjumlah  10  orang.  Jumlah sampel tersebut dianggap cukup karena fokus penelitian  ini  adalah  mendapatkan  kondisi o p t i m u m   m e t o d e   L A M P   d a l a m
mengamplifikasi  gen  gyrB  dari  urin,  bukan untuk  menentukan  akurasi  dari  metode tersebut.  Semua  sampel  penelitian  telah memenuhi  kriteria  inklusi  yaitu  penderita  TB yang  belum  melakukan  pengobatan  atau sudah  melakukan  pengobatan  maksimal  2 minggu.

## Variabel Penelitian
Variabel  bebas  dalam  penelitian  ini adalah suhu amplifikasi dan konsentrasi DNA template  yang  digunakan  untuk  mengamplifi- kasi gen gyrB sedangkan hasil amplifkasi gen gyrB  pada  spesimen  urin  yang  berasal  dari penderita  TB  di  Puskesmas  Cimahi  Selatan merupakan variabel terikat.

## Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian  ini  dilaksanakan  pada  bulan Maret-Juli  2022.  Pengambilan  sampel  dilaku- kan di Puskesmas Cimahi Selatan sedangkan pemeriksaan TB menggunakan metode LAMP dilakukan  di  Laboratorium  Biologi  Molekuler, Fakultas  Ilmu  dan  Teknologi  Kesehatan, Universitas Jenderal Achmad Yani.

## Isolasi Deoxyribonucleic Acid (DNA)
Penelitian ini diawali dengan isolasi DNA. DNA  diisolasi  dari  spesimen  urin  yang  telah dipreparasi dengan phospate buffer saline 1x. DNA  diisolasi  menggunakan  kit  Promega ReliaPrep TM Blood  gDNA  Miniprep  System. Proses  isolasi  terdiri  dari  tahap  pelisisan  sel dengan  proteinase  K,  pengikatan  DNA  pada kolom  dengan  binding  buffer,  purifikasi  DNA dengan column wash solution, dan pelepasan DNA  dari  kolom  dengan  nuclease  free  water (NFW).  Isolat  DNA  divisualisasi  dengan metode  elektroforesis  gel  agarose  1%. Konsentrasi dan kemurnian isolat DNA diukur dengan metode spektrofotometri. 19

## Amplifikasi Gen gyrB
Setelah DNA berhasil diisolasi, dilakukan amplifikasi  gen  gyrB  yang  berukuran  320  bp dengan metode LAMP. Primer yang digunakan
berjumlah  tiga  pasang.  Urutan  primer  yang digunakan  berdasarkan  Pedoman Operasional  Baku  Uji  Diagnostik  Molekuler LAMP  untuk  Deteksi  Cepat  TB  Paru  di Indonesia. 24 Volume  total  reaksi  yang digunakan adalah 25 µL.
Reaksi  tersebut  terdiri  dari  2,5  μL  Bsm DNA  polymerase  buffer  (Thermo  Fisher Scientific) 10X; 4 μl MgCl 2 (Thermo Scientific) 5 mM; 4 μL betaine (Sigma-Aldrich) 5 M; 3,5 μL  dNTP  mix  (Thermo  Fisher  Scientific)  10 mM; 1 μl primer inner FIP dan BIP 40 μM; 0,5 μl primer outer F3 dan B3 10 μM; 1 μl primer loop F dan B 10 μM; 5,5–6,5 μL NFW; 1 μL Bsm  DNA  polymerase  (Thermo  Fisher Scientific)  8U/μL;  dan  1–2  μL  DNA  template dengan varian konsentrasi sebesar 25 ng/µL, 50 ng/µL, 100 ng/µL, serta 200 ng/µL. Varian suhu amplifikasi yang digunakan yaitu 59–62 °C.  Setelah  diinkubasi  selama  1  jam,  reaksi amplifikasi  diinaktivasi  pada  suhu  80  °C selama  2  menit.  Amplikon  divisualisasi dengan  metode  elektroforesis  gel  agarose 2%.  Kondisi  amplifikasi  optimum  ditandai dengan  adanya  pita  DNA  yang  terlihat  jelas pada gel (tidak tipis ataupun samar). Setelah mendapatkan  kondisi  optimum,  dilakukan deteksi gen gyrB pada 10 sampel penelitian.

## Hasil
Pada  penelitian  ini  DNA  dari  spesimen
urin  berhasil  diisolasi  (Gambar  1).  Pada elektroforegram  terlihat  adanya  pita  DNA berukuran  lebih  dari  10.000  bp  (Gambar  1, Lajur  4).  Hasil  pengukuran  menggunakan spektrofotometer  menunjukkan  bahwa  DNA berhasil  diisolasi  sebanyak  111,67  ng/µL dengan  nilai  kemurnian  sebesar  1,9.  Pada proses  isolasi  ini  dilakukan  juga  isolasi  DNA dari  sputum  yang  berfungsi  sebagai  kontrol positif.
Penelitian  dilanjutkan  dengan  optimasi konsentrasi  DNA  template  hasil  isolasi  dan suhu amplifikasi. Hasil optimasi menunjukkan bahwa  konsentrasi  DNA  template  sebesar 200  ng/µL  merupakan  konsentrasi  optimum untuk  mengamplifikasi  gen  gyrB.  Pita amplikon  berukuran  320  bp  yang  terbentuk dari  DNA  template  konsentrasi  200  ng/µL (Gambar 2D) terlihat lebih tebal dibandingkan konsentrasi  100  ng/µL  (Gambar  2C),  50  ng/ µL (Gambar 2B) dan 25 ng/µL (Gambar 2A). Ukuran pita amplikon tersebut sesuai dengan gen gyrB yang ditargetkan untuk diamplifikasi. Berdasarkan  hasil  optimasi  suhu  amplifikasi diketahui bahwa suhu 61 o C merupakan suhu amplifikasi  yang  optimum.  Meskipun  pita amplikon  berhasil  terbentuk  pada  suhu amplifikasi  59–62 o C  namun  pita  amplikon yang  dihasilkan  pada  suhu  61 o C  terlihat paling  jelas  dan  tebal  dibandingkan  suhu yang lainnya.
Gambar 1. Hasil isolasi DNA dari urin
Keterangan: Lajur 1= Marker DNA ladder Thermoscientific (M), Lajur 2 = Spesimen sputum (S), Lajur 3 = Nuclase Free Water (NFW), Lajur 4 = Spesimen urin (U)

## M        S    NFW   U
Gambar 2. Hasil optimasi konsentrasi DNA template dan suhu pada amplifikasi gen gyrB

## dengan metode LAMP
Keterangan:  (A)  Konsentrasi  25  ng/µL,  (B)  Konsentrasi  50  ng/µL,  (C)  Konsentrasi  100  ng/µL,  (D) Konsentrasi  200  ng/µL.  Lajur  1-5  berturutan  adalah  Marker  DNA  ladder  Thermoscientific, suhu amplifikasi 59 o C, suhu amplifikasi 60 o C, suhu amplifikasi 61 o C, dan suhu amplifikasi 62 o C M       59 o C 60 o C 61 o C 62 o C M       59 o C 60 o C 61 o C 62 o C M       59 o C 60 o C 61 o C 62 o C M        59 o C 60 o C 61 o C 62 o C
Kondisi  optimum  tersebut  digunakan untuk  mendeteksi  gen  gyrB  pada  10  sampel urin  penderita.  Pada  elektroferogram  terlihat adanya  pita  DNA  berukuran  320  bp  dari semua sampel penelitian (Gambar 3). Hal ini menunjukkan bahwa gen gyrB yang terdapat dalam  sampel  urin  berhasil  diamplifikasi.
Ukuran  pita  amplikon  yang  terbentuk  dari sampel  penelitian  sama  dengan  kontrol positif.  Proses  amplifikasi  gen  gyrB  terjadi secara spesifik. Hal ini ditandai dengan tidak adanya pita DNA yang terbentuk pada kontrol negatif  berupa Nuclease  Free  Water  ( NFW), sputum dan urin dari orang sehat.
Gambar 3. Hasil amplifikasi Gen gyrB pada sampel penelitian Keterangan: Lajur 1 = Marker DNA ladder Thermoscientific (M), Lajur 2 = Sputum penderita TB (SP), Lajur 3 = Sputum orang sehat (SS), lajur 4 = Urin orang sehat (US), Lajur 5 = Nuclease Free Water (NFW),  Lajur  6-10  =  Sampel  urin  penderita  1-5  (UP1–UP5)  (A)  dan  penderita  6-10  (UP6– UP10) (B) M    SP   SS  US  NFW  UP1 UP2 UP3 UP4 UP5 M    SP   SS  US  NFW  UP6 UP7 UP8 UP9 UP10

## Pembahasan
TB  adalah  infeksi  paru-paru  yang disebabkan  oleh  MTB.  Dinding  sel  bakteri tersebut  terdiri  dari  60%  asam  lemak mikolat. 20 Hal  tersebut  menyebabkan  MTB tahan terhadap asam saat proses pewarnaan dan dikenal juga dengan sebutan BTA. Infeksi MTB  dapat  dideteksi  dengan  beberapa metode seperti kultur, mikroskopis, dan mole- kuler. 4 Pemeriksaan MTB berbasis molekuler menawarkan  cukup  banyak  keunggulan dibanding  kultur  dan  mikroskopis.  Gen  yang sering  dijadikan  penanda  keberadaan  MTB pada  pemeriksaan  molekuler  adalah  gyrB. Gen  tersebut  merupakan  gen  lestari  pada MTB  yang  berfungsi  untuk  mengkode  enzim topoisomerase. 21
Salah  satu  metode  molekuler  yang dapat digunakan untuk mendeteksi gen gyrB adalah  LAMP. 8,22 Metode  ini  memiliki keunggulan  dalam  hal  waktu,  alat,  dan akurasi  jika  dibandingkan  metode  molekuler yang lain. Selama ini metode LAMP diaplika- sikan  untuk  mendeteksi  gen  gyrB  dari spesimen  sputum,  padahal  beberapa penelitian  melaporkan  bahwa  urin  dapat dijadikan  alternatif  spesimen  pemeriksaan. 15–
18 Pada  urin  terdapat  tr-cfDNA  yang  bisa dideteksi  dengan  metode  berbasis  molekuler dan  dijadikan  penanda  diagnostik  untuk pengobatan  TB  paru  atau  ekstra  paru. Penelitian  sebelumnya  melaporkan  bahwa pemeriksaan molekuler TB yang memanfaat- kan  tr-cfDNA  memiliki  nilai  sensitivitas sebesar  83,7%  dan  spesifisitas  sebesar 100%. 17
Tr-cfDNA  berhasil  diisolasi  meng- gunakan  kit  yang  umum  digunakan  untuk mengisolasi DNA dalam sel. Konsentrasi dan kemurnian Tr-cfDNA hasil isolasi cukup baik. Menurut  de  Almeida  et  al.  konsentrasi  isolat DNA  yang  ideal  adalah  5–100  ng/µL sedangkan kemurnian DNA sekitar 1,8–2,0. 23 Tr-cfDNA  dapat  berhasil  diisolasi  dalam penelitian ini karena menggunakan spesimen
urin  pasien  TB  yang  baru  menjalani pengobatan  selama  dua  minggu.  Hasil berbeda  mungkin  didapatkan  dari  pasien dengan  masa  pengobatan  yang  lebih  lama. Tr-cfDNA  memang  dapat  ditemukan  pada urin,  namun  keberadaannya  akan  berkurang dan  tidak  dapat  dideteksi  lagi  setelah menjalani pengobatan yang efektif. 16
Gen gyrB yang terdapat dalam tr-cfDNA berhasil  diamplifikasi  menggunakan  metode LAMP.  Proses  amplifikasi  gen  gyrB melibatkan  primer  inner,  outer,  dan  loop dengan  perbandingan  1:2:8.  Urutan  dan perbandingan  konsentrasi  primer  yang digunakan dalam penelitian ini sudah pernah digunakan  pada  penelitian  sebelumnya  dan terbukti  dapat  mengenali  gen  gyrB  secara spesifik. 8,22
Hasil  amplifikasi  paling  optimum didapatkan  dari  DNA  template  konsentrasi 200  ng/µL.  DNA  template  merupakan  faktor penting  yang  menentukan  kualitas  pita amplikon.  Konsentrasi  DNA  template  yang terlalu  sedikit  mengakibatkan  rendahnya jumlah  amplikon  yang  terbentuk,  namun konsentrasi  DNA  yang  terlalu  tinggi  juga dapat menghambat reaksi amplifikasi. 19
Selain  itu,  hasil  optimasi  menunjukkan bahwa  suhu  61 o C  merupakan  suhu  amplifi- kasi  yang  optimum.  Hasil  ini  cukup  berbeda dengan suhu optimum yang umum digunakan untuk  mengamplifikasi  gen  gyrB  dengan LAMP.  Beberapa  penelitian  sebelumnya menggunakan  suhu  63 o C  dan  65 o C. 22,24,25 Perbedaan  suhu  ini  disebabkan  perbedaan enzim  polimerase  yang  digunakan.  Suhu amplifikasi  berpengaruh  pada  kerja  enzim polimerase.  Penelitian  yang  menggunakan suhu 63 o C  dan  65 o C  memanfaatkan  enzim Bst  polymerase. 22,24,25 Namun,  pada penelitian  ini  memanfaatkan  enzim  Bsm polymerase  produksi  Thermo  Fisher Scientific. Enzim tersebut berasal dari bakteri Bacillus  smiithii  dan  memiliki  suhu  optimum sekitar  59–62  °C. 26 Suhu  amplifikasi  yang terlalu  rendah  atau  terlalu  tinggi  dapat
menyebabkan  aktivitas  enzim  berkurang sehingga menghasilkan jumlah amplikon yang tidak optimum.
Di samping hasil yang telah didapatkan, penelitian  ini  masih  memiliki  beberapa keterbatasan. Jumlah sampel yang digunakan masih  sedikit  dan  semuanya  berasal  dari pasien  penderita  TB  yang  baru  melakukan pengobatan  selama  dua  minggu.  Selain  itu, dalam  penelitian  ini  belum  dapat  ditentukan nilai  sensitivitas  dan  spesifisitas  metode LAMP  yang  digunakan.  Melalui  penelitian  ini hanya  dapat  diketahui  kondisi  optimum metode  LAMP  yang  dapat  digunakan  untuk mengamplifikasi  gen  gyrB  dari  MTB  pada spesimen urin.

## Kesimpulan
Metode  LAMP  dapat  menjadi  metode alternatif  untuk  mendeteksi  TB  pada spesimen  urin.  Gen  gyrB  dapat  diamplifikasi secara optimum dengan metode LAMP pada suhu  61 o C  dan  dengan  konsentrasi  DNA template sebesar 200 ng/µL.

## Saran
Bagi  penelitian  selanjutnya  disarankan untuk  mengukur  nilai  sensitivitas  dan spesifisitas metode LAMP dalam mendeteksi TB  pada  urin.  Hasil  pemeriksaan  TB  pada urin  menggunakan  metode  LAMP  perlu dibandingkan  dengan  hasil  pemeriksaan metode gold standard.

## Daftar Pustaka
1.  World  Health  Organization.  Global Tuberculosis Report 2020. 2020. (Online). Geneva:  World  Health  Organization. Accessed  from:  https://www.who.int/ publications/i/item/9789240013131. 2.  Bhandari  S,  Balamurugan  S,  Verma  GK, Kenia  H.  Multisystem  Tuberculosis: Importance  of  Clinical  Signs,
Neuroimaging and Drug Compliance. The Official  Scientific  Journal  of  Delhi Ophthalmological Society. 2016; 27(2):114 –7.
3.  Kementerian  Kesehatan  Republik Indonesia.  Peraturan  Menteri  Kesehatan Republik Indonesia Nomor 67 Tahun 2016 Tentang  Penanggulangan  Tuberkulosis. Kementerian  Kesehatan  Republik Indonesia.  (Online).  2016.    http:// h u k o r . k e m k e s . g o . i d / u p l o a d s / p r o d u k _ h u k u m /
PMK_No._67_ttg_Penanggulangan_Tuber kolosis_.pdf.
4.  Susilawati  TN,  Larasati  R.  A  Recent
Update  of  the  Diagnostic  Methods  for Tuberculosis  and  Their  Applicability  in
Indonesia:  a  Narrative  Review.  Medical
Journal  of  Indonesia.  2019  Oct  4;28
(3):284–91.
5.  Misnarliah,  Mudrika,  Basir  AA.  Effect  of Preparate Coloring Delay Achid Resistant Bacteria with Ziehl Neelsen Method on the Result  of  Microscopic  Examination.
International  Journal  of  Science, Technology  &  Management.  2021  Feb  9; 2(2):536–41.  https://doi.org/10.46729/ ijstm.v2i2.181.
6.  Sumual  RL,  Wahongan  GJP,  Tuda  JSB. Deteksi Mycobacterium tuberculosis pada Sampel  Sputum  menggunakan  Teknik Loop-Mediated  Isothermal  Amplification
(LAMP-TB).  eBiomedik.  2017;  5(2):1-7. https://doi.org/10.35790/ebm.v5i2.18603. 7.  Rivani  E,  Sabrina  T,  Patricia  VP. Perbandingan  Uji  Diagnostik  GeneXpert
MTB/RIF  untuk  Mendeteksi  Resistensi Rifampicin  Mycobacterium  tuberculosis pada  pasien  TB  paru  di  RSUP  dr.  Moh. Hoesin  Palembang.  Jurnal  Kedokteran dan  Kesehatan:  Publikasi  Ilmiah  Fakultas Kedokteran  Universitas  Sriwijaya.  2019 Feb 12; 6(1):23–8.
8.  Kementerian  Kesehatan  Republik
Indonesia. Pedoman Operasional Baku Uji Diagnostik  Molekular  Loop  Mediated
Isothermal  Amplification  (LAMP)  Untuk
Deteksi  Cepat  TT  Paru  Di  Indonesia. Jakarta:  Kementerian  Kesehatan Republik Indonesia. 2012.
9.  Kim J, Park BG, Lim DH, Jang WS, Nam J,  Mihn  DC,  et  al.  Development  and Evaluation  of  a  Multiplex  Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Differentiation  of  Mycobacterium tuberculosis  and  Non-Tuberculosis Mycobacterium in Clinical Samples. PLoS One. 2021 Jan 6; 16(1):e0244753. 10.  Nagai  K,  Horita  N,  Yamamoto  M,
Tsukahara  T,  Nagakura  H,  Tashiro  K,  et al.  Diagnostic  Test  Accuracy  of  Loop- Mediated  Isothermal  Amplification  Assay for  Mycobacterium  tuberculosis: Systematic  Review  and  Meta-Analysis. Sci Rep. 2016 Dec 13; 6(1):39090. 11.  Wahid MH, Sjahrurachman A, Sitorus AH,
Burhan E. The Role of TB-LAMP Method in  Detecting  Mycobacterium  tuberculosis from  Sputum  of  Patients  Suspected  of Having  Pulmonary  Tuberculosis.  Acta
Medica  Indonesiana.  2020  Dec  28;  52 (4):352.
12.  World  Health  Organization.  The  Use  of Loop-Mediated  Isothermal  Amplification (TB-LAMP)    for  The  Diagnosis  of Pulmonary Tuberculosis. Vol 44. Jenewa: World Health Organization. 2016. 13.  Orina  F,  Mwangi  M,  Meme  H,  Kitole  B,
Amukoye  E.  Intrinsic  and  Extrinsic Factors  Associated  with  Sputum Characteristics of Presumed Tuberculosis Patients.  PLoS  One.  2019  Dec  27;  14 (12):e0227107.  https://doi.org/10.1371% 2Fjournal.pone.0227107.
14.  Budiharjo  T,  Purjanto  KA.  Pengaruh Penanganan  Sputum  Terhadap  Kualitas Sputum Penderita TBC Secara Mikroskpis Bakteri  Tahan  Asam.  Jurnal  Riset Kesehatan. 2016 May 1; 5(1):40–4. 15.  Patel K, Nagel M, Wesolowski M, Dees S, Rivera-Milla  E,  Geldmacher  C,  et  al. Evaluation  of  a  Urine-Based  Rapid
Molecular  Diagnostic  Test  with  Potential to be Used at Point-of-Care for Pulmonary Tuberculosis:  Cape  Town  Cohort.  J  Mol Diagn. 2018 Mar; 20(2):215–24.
16.  Labugger  I,  Heyckendorf  J,  Dees  S, Häussinger  E,  Herzmann  C,  Kohl  TA,  et al.  Detection  of  Transrenal  DNA  for  the Diagnosis of Pulmonary Tuberculosis and Treatment Monitoring. Infection. 2017 Jun 1; 45(3):269–76. doi: 10.1007/s15010-016 -0955-2.
17.  MacLean E, Nathavitharana RR. Progress toward Developing Sensitive Non-Sputum -Based  Tuberculosis  Diagnostic  Tests: the  Promise  of  Urine  Cell-Free  DNA.  J
Clin  Microbiol.  2021  Jul  19;  59 (8):e0070621.
18.  Oreskovic  A,  Panpradist  N,  Marangu  D, Ngwane MW, Magcaba ZP, Ngcobo S, et al. Diagnosing Pulmonary Tuberculosis by Using  Sequence-Specific  Purification  of Urine  Cell-Free  DNA.  J  Clin  Microbiol.
2021 Jul 19; 59(8):e0007421.
19.  Puspitaningrum  R,  Adhiyanto  C,  Solihin. Genetika  Molekuler  dan  Aplikasinya. Attas  SG  (Editor).  Jakarta:  Deepublish. 2018.
20.  Ghazaei  C.  Mycobacterium  tuberculosis and  Lipids:  Insights  into  Molecular Mechanisms  from  Persistence  to Virulence. J Res Med Sci. 2018; 23(1):63.
21.  Mertaniasih  NM,  Wiqoyah  N,  Kuntaman,
Wahyunitisari  MR,  Kusumaningrum  D. Polymerase  Chain  Reaction  of
Mycobacterium  tuberculosis  gyrB  Gene Region  for  Rapid  Screening  Test  of Pulmonary  Tuberculosis.  Folia  Medica Indonesiana. 2013; 49(1):16–20.
22.  Lisdawati  V,  Oshibe  T,  Tsuji  H,  Sudiro TM,  Adianti  M,  Sukarso  T,  et  al. Evaluating  the  Use  of  Loop-Mediated Isothermal  Amplification  (LAMP)  Method for  Detection  of  Mycobacterium tuberculosis  in  Indonesian  clinical isolates.  Medical  Journal  of  Indonesia. 2012 Nov 1; 21(4):188–95.
23.  de  Almeida  IN,  da  Silva  Carvalho  W, Rossetti ML, Costa ERD, de Miranda SS.
Evaluation  of  Six  Different  DNA Extraction  Methods  for  Detection  of Mycobacterium tuberculosis by Means of PCR-IS6110:  Preliminary  Study.  BMC Research Notes. 2013 Dec 28; 6(1):561. 24.  Senarath  KD,  Usgodaarachchi  RB, Navaratne  V,  Nagahawatte  A, Wijayarathna CD, Alvitigala J, et al. Non- Specific  Amplification  with  the  LAMP Technique  in  the  Diagnosis  of
Tuberculosis  in  Sri  Lankan  Settings. Journal  of  Tuberculosis  Research.  2014 Nov 7; 2(4):168–72.
25.  Sharma  G,  Tewari  R,  Dhatwalia  SK, Yadav  R,  Behera  D,  Sethi  S.  A  Loop- Mediated  Isothermal  Amplification  Assay for  the  Diagnosis  of  Pulmonary Tuberculosis.  Letters  in  Applied Microbiology. 2019; 68(3):219–25.
26.  Thermo  Fisher  Scientific.  Bsm  DNA Polymerase,  Large  Fragment.  Thermo Fisher Scientific. 2020.