Phytochemical Analysis and Determination of MIC and MFC of Cacao Leaves Extract ( Theobroma cacao L.) against Malassezia furfur
Analisis Fitokimia dan Penentuan KHM, serta KBM Ekstrak Daun Cokelat ( Theobroma cacao L.) terhadap Malassezia furfur
Siti Marwah Lestari 1 *, Leonyta Camelia 1 , Widya Twini Rizki 1 , Septa Pratama 1 , Chindiana Khutami 1 , Amraini Amelia 1 , Rahmadevi 1 , Yuni Andriani 1
1 Undergraduate Pharmacy Study Program, Faculty of Health Sciences, Adiwangsa Jambi University, Sergeant Muslim Street No.RT 24, The Hok, South Jambi District, Jambi City, Jambi, Indonesia
*Corresponding author: sitimarwahlestari@gmail.com; (+62)81994745553
Received February 10, 2024; Accepted February 23, 2024; Available online May 03, 2024

## ABSTRACT
Pityriasis versicolor is a disease caused by Malassezia furfur . One of the plants that can potentially act as antifungal is cacao leaves ( Theobroma cacao L.), which contain several secondary metabolite compounds, including alkaloids, flavonoids, tannins, quinones, terpenoids, and saponins. This study aims to determine the phytochemical analysis and the Minimum Inhibitory Concentration  (MIC)  and  Minimum  Fungicidal  Concentration  (MFC)  of  cacao  leaves  ethanolic  extract  against M.  furfur . Extracts were obtained by maceration using 70% ethanol and phytochemicals analysis using Herborne’s method. Furthermore, the extracts were made into concentrations’ variations of 3.125%; 6.25%; 12.5%; 25%; 50%; and 100% for testing antifungal activity, with 10% DMSO as negative control and 2% Ketoconazole and Itraconazole as positive controls. MIC was performed with liquid macrodilution method, and MFC was performed with spread method. The results of phytochemical analysis showed that the extract contained alkaloids, flavonoids, phenols, tannins, quinones, terpenoids and saponins. MIC value was obtained at concentration of 50% and MFC value was obtained at 100%. Cacao leaves ethanolic extract with concentration of 50% can inhibit M. furfur’s growth and with 100% can eliminate M. furfur . Keywords : Ethanolic extract of cacao leaves, Malassezia furfur , minimum fungicidal concentration (MFC), minimum inhibitory concentration (MIC), pityriasis versicolor.

## ABSTRAK
Panu  adalah  penyakit  yang  disebabkan  oleh  jamur Malassezia  furfur .  Salah  satu  tanaman  yang  dapat  berpotensi  sebagai antijamur adalah Daun Cokelat ( Theobroma cacao L.) yang diketahui mengandung beberapa senyawa metabolit sekunder, seperti alkaloid, flavonoid, tanin, kuinon, terpenoid, dan saponin. Penelitian ini bertujuan untuk menguji analisis fitokimia dan menentukan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dan Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM) ekstrak etanol daun cokelat terhadap M.  furfur .  Ekstrak  diperoleh  dengan  metode  maserasi  menggunakan  pelarut  etanol  70%  dan  diuji  fitokimianya menggunakan metode Harborne. Selanjutnya ekstrak dibuat variasi konsentrasi 3,125%; 6,25%; 12,5%; 25%; 50%; dan 100% untuk pengujian aktivitas antijamur, dengan pelarut DMSO 10% sebagai kontrol negatif, serta Ketokonazol dan Itrakonazol 2% sebagai kontrol positif. Uji KHM dilakukan dengan metode makrodilusi cair, dan uji KBM dilakukan dengan metode sebar ( spread ). Hasil analisis fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak mengandung alkaloid, flavonoid, fenol, tanin, kuinon, terpenoid dan saponin. Nilai KHM didapatkan pada konsentrasi 50% dan nilai KBM didapatkan pada konsentrasi 100%. Ekstrak etanol daun cokleat dengan konsentrasi 50% mampu menghambat pertumbuhan M. furfur dan dengan konsentrasi 100% mampu membunuh M. furfur .
Kata Kunci : Ekstrak etanol daun cokelat, Malassezia furfur, konsentrasi bunuh minimum (KBM), konsentrasi hambat minimum (KHM), panu.

## Research Article
DOI: https://doi.org/10.29244/jji.v9i2.316

## PENDAHULUAN
Malassezia  furfur merupakan  salah  satu  jamur yang  menyerang  kulit  manusia  dan  dapat menyebakan infeksi dermatofitosis seperti ketombe, panu,  dermatitis  seboroik,  dan  dermatitis  atopic (Saunte et al., 2020). Prevalensi penyebaran penyakit kulit  ini  bervariasi  sesuai  dengan  perbedaan geografis dan sosio-ekonomi, di mana kondisi tempat tinggal  yang  ramai,  dekat  dengan  hewan,  sanitasi dan higienitas yang rendah, serta iklim yang hangat dan  lembab  di  daerah  tropis  seperti  Indonesia meningkatkan potensi penyebaran M. furfur (Urban et al., 2021).
Terdapat  tiga  golongan  antijamur,  yaitu golongan  azol,  ekinokadin,  dan  polien,  di  mana diketahui  golongan  azol  seperti  ketokonazol  dan itrakonazol  memberikan  efek  aktivitas  fungistatik yang lebih tinggi dibanding golongan lain terhadap M.  furfur (Park  et  al.,  2020),  tetapi  penyakit  kulit yang  disebabkan M.  furfur memiliki  tingkat kekambuhan yang  tinggi dan  pemakaian antijamur berulang  dan  dalam  jangka  panjang  berpotensi menimbulkan  resistensi  (Dyląg  et  al.,  2020).  Oleh karena itu, alternatif pengobatan untuk infeksi kulit dicari  dan  diteliti,  salah  satunya  adalah  cokelat ( Theobroma cacao L.) yang merupakan tanaman yang terdistribusi  luas  di  negara-negara  tropis  seperti Indonesia (Febrianto et al., 2022a).
Bersumber  pada  penelitian-penelitian  yang pernah  dilakukan,  tanaman  cokelat  memiliki aktivitas  sebagai  antijamur.  Beberapa  di  antaranya meliputi penelitian yang menggunakan ekstrak kulit biji  cokelat  terhadap  jamur Trichophyton  rubrum (Hutasoit  et  al.,  2020) , ekstrak  kulit  buah  cokelat terhadap jamur Fusarium oxysporum (Rachmawaty et al., 2018) , dan ekstrak daun cokelat terhadap jamur Candida  albicans (Permataningrum  et  al.,  2019),  di mana  ketiga  penelitian  ini  membuktikan  bahwa bagian  tanaman Theobroma  cacao yang  dibuat sebagai ekstrak memiliki potensi sebagai antijamur. Candida albicans dan Trichophyton rubrum merupakan jamur  Gram-positif  (Prastiyanto  et  al.,  2021)sama halnya dengan M. furfur .
Daun cokelat dapat digunakan sebagai antijamur karena  mengandung  beberapa  senyawa  metabolit sekunder, seperti alkaloid  yang dapat menghambat sintesis  dinding  sel  jamur  (Permataningrum  et  al., 2019), flavonoid yang dapat merusak pembentukan dinding  sel  jamur  (Aboody  &  Mickymaray,  2020), dan terpenoid yang dapat menghambat pertumbuhan
jamur  (Bawa  dan  Perbhawa,  2020).  Berdasarkan berbagai hal yang telah dipaparkan di atas, meliputi dampak  yang  ditimbulkan  infeksi  jamur,  efek penggunaan jangka panjang obat sintetik, banyaknya populasi  pohon  cokelat  di  Indonesia,  serta  potensi kemampuan daun cokelat sebagai antijamur menjadi alasan  perlu  dilakukannya  pengujian  untuk mengetahui  golongan  senyawa  metabolit  sekunder serta nilai konsentrasi hambat minimum (KHM) dan konsentrasi  bunuh  minimum  (KBM)  dari  ekstrak daun cokelat sebagai  antijamur, terutama terhadap jamur M. furfur .

## METODE

## 1. Alat dan Bahan
Daun Cokelat diperoleh dari kebun yang terletak di Kecamatan Kota Baru, Kota Jambi, Indonesia dan dideterminasi
di
Herbarium
Jatinangor, Laboratorium  Taksonomi  Tumbuhan,  Jurusan Biologi  FMIPA  Universitas  Padjajaran  (UNPAD). Alat-alat yang digunakan meliputi blender (Miyako), ayakan 60 mesh, autoklaf (GEA), hotplate (MS-H280- Pro), inkubator (Memmert IN55), kapas bulat steril (Medisoft), kasa steril (Hexa Husada), kertas cakram (Macherey-Nagel), labu ukur (Pyrex), laminar air flow (LAF),  mikroskop  binokuler  (XSZ  107BN),  pipet mikro  (Topette  Pipettor), rotary  vacuum  evaporator (Biobase), spektrofotometer UV-Vis (BEL photonics), waterbath , dan alat-alat gelas. Bahan  yang  digunakan  meliputi  daun  cokelat, air suling (Merck), amil alkohol (Merck), asam asetat anhidrat (Merck), asam klorida (Merck), asam sulfat pekat  (Merck),  barium  klorida  1%  (Arrow  Fine Chemicals),  daun  cokelat  segar,  dimetil  sulfoksida (Merck),  etanol  70%  (PT  Indo  Classica),  gelatin (Eurotade World Commerce), jamur Malassezia furfur ATCC  14521 (ThermoScientific),  kloroform, lactophenol cotton blue (LPCE) (HiMedia), media uji Sabouraud Dextrose Agar (SDA) (HiMedia), media uji Sabouraud  Dextrose  Broth (SDB)  (HiMedia),  minyak zaitun  ( olive  oil )  (Textron),  natrium  hidroksida (Merck),  natrium  klorida  (Merck),  kloroform (Merck),  larutan  besi  klorida  (FeCl 3 )  1%  (Devam ChemTech),  larutan  NaCl  0,9%  (PHARMCO), pereaksi  Bouchardat  (Merck),  pereaksi  Mayer (Merck),  pereaksi  Wagner  (Merck),  serbuk Magnesium (Merck), tablet Itrakonazol (Bernofarm), dan tablet Ketokonazol (HexPharm Jaya).

## 2. Pembuatan Simplisia
Daun cokelat segar dikumpulkan sebanyak 2000 g,  kemudian  disortasi  basah,  dicuci,  kemudian dijemur selama 24-48 jam yang ditutupi dengan kain hitam.  Daun  cokelat  yang  telah  kering  kemudian disortasi kering sebelum dihaluskan menjadi serbuk simplisia daun cokelat menggunakan blender, yang diayak menggunakan ayakan Mesh 60 (Mandhaki et al., 2021; Sartika, 2022).
3. Ekstraksi Daun Cokelat ( Theobroma cacao L.)
Ekstraksi  daun  cokelat  menggunakan  metode maserasi.  Sebanyak  500  g  serbuk  kering  simplisia daun  cokelat  dimasukkan  ke  dalam  maserator, kemudian ditambahkan 2.500 mL pelarut etanol 70% dan direndam sambil sesekali diaduk selama 6 jam pertama,  lalu  diamkan  selama  18  jam.  Maserat dipisahkan  dengan  cara  filtrasi,  kemudian  diulangi proses penyarian dengan jenis pelarut yang sama dan jumlah  volume  pelarut  sebanyak  setengah  kali jumlah  volume  pelarut  pada  penyarian  pertama hingga diperoleh maserat yang agak jernih. Setelah itu,  semua  maserat  dikumpulkan  dan  diuapkan dengan rotary  vacuum  evaporator pada  suhu  40 o C- 60 o C hingga diperoleh ekstrak kental (Kementerian Kesehatan RI, 2017).

## 4. Skrining Fitokimia
Larutan  uji  fitokimia  dibuat  dengan  cara melarutkan  200  mg  sampel  dengan  25  mL  etanol 70%, kemudian tiap pengujian direplikasi sebanyak 3 kali (Isnaini et al., 2021; Putra et al., 2018).

## 5. Identifikasi Alkaloid
Larutan uji sebanyak 2 mL diuapkan, kemudian residu dilarutkan dalam 4 mL HCl 2N, lalu larutan dibagi ke dalam 4 tabung reaksi yang diberi label A, B,  C,  dan  D.  Tabung  A  sebagai  blanko,  tabung  B ditambahkan  pereaksi  Mayer  sebanyak  3  tetes, tabung C ditambahkan pereaksi Wagner sebanyak 3 tetes,  dan  tabung  D  ditambahkan  pereaksi Bouchardat sebanyak 3 tetes. Terbentuknya endapan putih pada tabung B, endapan cokelat muda hingga kuning  pada  tabung  C,  dan  endapan  cokelat kehitaman  pada  tabung  D  menandakan  adanya alkaloid.

## 6. Identifikasi Flavonoid
Sebanyak  2  mL  larutan  uji  diuapkan  hingga diperoleh filtrat yang kemudian ditambahkan 0.1 g
serbuk Magnesium, 5 mL HCl, dan 4 mL amil alkohol. Campuran  dikocok  dan  dibiarkan  memisah. Terbentuknya  warna  kuning  hingga  merah menandakan  adanya  flavonoid  yang  dapat  ditarik dengan amil alkohol.

## 7. Identifikasi Polifenol dan Tanin
Sebanyak  3  mL  larutan  uji  dibagi  ke  dalam  3 bagian yaitu tabung A, B, dan C. tabung A digunakan sebagai blanko, tabung B ditambahkan larutan NaCl- gelatin (larutan gelatin 1% dalam larutan NaCl 10%), dan tabung C direaksikan  dengan larutan  besi  (III) klorida  1%.  Hasil  positif  polifenol  golongan  tanin ditunjukkan  dengan  terbentuknya  endapan  putih yang terbentuk pada tabung B, dan warna biru tua yang  menunjukkan  adanya  tanin  terhidrolisis  atau warna  hitam  kehijauan  yang  menunjukkan  adanya tanin terkondensasi pada tabung C.

## 8. Identifikasi Kuinon
Sebanyak 3 mL larutan uji dimasukkan ke dalam 10  mL  air  panas,  kemudian  dipanaskan  sampai mendidih selama 5 menit, kemudian ditambahkan 3 tetes NaOH. Terbentuknya endapan berwarna merah menunjukkan adanya senyawa kuinon.

## 9. Identifikasi Steroid dan Terpenoid
Larutan  uji  sebanyak  2  mL  diuapkan,  residu dilarutkan  dengan  0.5  mL  kloroform,  ditambahkan 0.5  mL  asam  asetat  anhidrat.  Ditambahkan  2  mL asam sulfat P melalui dinding tabung. Terbentuknya cincin  biru  kehijauan  menandakan  adanya  steroid dan  cincin  kecokelatan  atau  violet  menandakan adanya terpenoid.

## 10. Identifikasi Saponin
Larutan  uji  sebanyak  10  mL  dikocok  vertikal dalam  tabung  reaksi  selama  10  detik  kemudian dibiarkan  selama  10  detik.  Pembentukan  busa setinggi 1-10 cm yang stabil akan terbentuk selama tidak kurang dari 10 menit. Setelah itu ditambahkan 1  tetes  HCl  2N,  jika  busa  tersebut  tidak  hilang menunjukkan adanya saponin.
11. Identifikasi Jamur Malassezia furfur
Morfologi  jamur M.  furfur diidentifikasi  secara makroskopis dengan mengamati warna, bentuk, dan tekstur  jamur,  dan  secara  mikroskopis  dengan mengamati  struktur  pembentuk  jamur  yang diletakkan  di  atas  kaca  objek  yang  telah  diberi pewarna lactophenol  cotton  blue (LPCE)  dan
diencerkan  dengan  satu  tetes  etanol  70%.  Kaca preparat  kemudian  diletakkan  di  atas  gelas  objek, kemudian diamati menggunakan mikroskop dengan pembesaran 100x (Alsohaili & Bani-Hasan, 2018).
12. Uji  Pendahuluan  Aktivitas  Antijamur M. furfur
Larutan uji ekstrak daun cokelat dibuat dengan konsentrasi 100%, 80%, 60%, 40%, dan 20% yang dibuat masing-masing sebanyak 5 mL. Dilakukan uji pendahuluan untuk menentukan konsentrasi larutan uji. Inokulum M. furfur diusap menggunakan cotton swab pada cawan petri yang berisi media SDA dan minyak  zaitun.  Kertas  cakram  dengan  ukuran diameter 6 mm direndam dalam larutan uji selama 15  menit,  kemudian  diletakkan  di  atas  media  uji. Cakram  Ketokonazol  dan  Itrakonazol  dengan konsentrasi  2%  berperan  sebagai  kontrol  positif, sementara kontrol negatif dalam pengujian ini adalah larutan  DMSO  10%.  Cawan  petri  kemudian diinkubasi  selama  48  jam  dengan  suhu  37 o C,  lalu diameter  zona  hambat  yang  muncul  di  sekeliling kertas cakram diukur dan dievaluasi sebagai aktivitas antijamur (Intan et al., 2021; Permataningrum et al., 2019).

## 13. Penetapan  Konsentrasi  Hambat  Minimum (KHM)
Uji  aktivitas  antijamur  menggunakan  metode makrodilusi cair. Disiapkan sebanyak 6 tabung reaksi yang setiap tabung berisi 0.5 mL larutan uji dengan konsentrasi  100%,  50%,  25%,  12.5%,  6.25%,  dan 3.125%,  kemudian  ditambahkan  4  mL  media Sabouraud  Dextrose  Broth (SDB)  yang  sebelumnya telah  ditambahkan  minyak  zaitun.  Kemudian sebanyak 0.5 mL suspensi M. furfur dimasukkan ke dalam setiap tabung dan diinkubasi selama 48 jam dengan  suhu  37 o C.  Percobaan  ini  direplikasi sebanyak 3 kali (Fitriana et al., 2019; Yanthi et al., 2022).  Larutan  diukur  nilai  absorbansinya menggunakan  spektrofotometer  sebelum  dan sesudah  inkubasi  dengan  panjang  gelombang  600 nm,  untuk  menghitung  nilai optical  density (OD) dengan rumus:
𝑁𝑖𝑙𝑎𝑖 𝑂𝐷 = 𝐴 𝑠𝑒𝑠𝑢𝑑𝑎ℎ 𝑖𝑛𝑘𝑢𝑏𝑎𝑠𝑖 − 𝐴 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑙𝑢𝑚 𝑖𝑛𝑘𝑢𝑏𝑎𝑠𝑖 di mana A merupakan nilai aborbansi dan nilai KHM dapat ditentukan dari nilai OD yang mendekati nol (Agustina et al., 2021; Angiolella et al., 2018).

## 14. Penetapan  Konsentrasi  Bunuh  Minimum (KBM)
Media yang digunakan dalam pengujian adalah Sabouraud  Dextrose  Agar (SDA)  yang  mengandung minyak zaitun. Pada media dituang larutan hasil uji KHM sebanyak 100 µL yang diratakan menggunakan spreader .  KBM  dinilai  dari  konsentrasi  larutan  uji yang  tidak  memperlihatkan  pertumbuhan  koloni pada media padat (Albab et al., 2020; Singh Parihar et al., 2019).

## 15. Analisis Data
Pengujian dilakukan sebanyak 3 kali kemudian dihitung  nilai  rata-rata  dan  standar  deviasinya. Analisis data berupa nilai optical density (OD) yang menunjukkan  nilai  KHM  pada  penelitian  ini dilakukan secara analitik komparatif numerik lebih dari  dua  kelompok  tidak  berpasangan,  yang dianalisis menggunakan Uji Shapiro-Wilk menggunakan  aplikasi  JAMOVI  versi  2.4.8  untuk melihat  data  terdistribusi  normal  atau  tidak.  Jika terdapat data yang berdistribusi tidak normal, maka dilakukan  uji  non-parametrik  Kruskal-Wallis  yang kemudian dilanjutkan dengan uji Post-Hoc Dunn, dan jika  data  berdistribusi  normal,  maka  dilakukan  uji parametrik One-Way ANOVA  dengan  signifikansi  p < 0.05 yang kemudian dilanjutkan dengan uji Post- Hoc Tukey.

## HASIL & PEMBAHASAN
1. Rendemen  Ekstrak  Etanol  Daun  Cokelat ( Theobroma cacao L.)
Rendemen  adalah  perbandingan  ekstrak  yang dihasilkan  dengan  berat  serbuk  simplisia.  Nilai rendemen  yang  tinggi  menunjukkan  banyaknya komponen  bioaktif  yang  terkandung  di  dalamnya. Semakin  tinggi  rendemen  ekstrak,  maka  semakin tinggi  kandungan  zat  yang  tertarik  (Senduk  et  al., 2020).  Nilai  rendemen  pada  penelitian  ini  adalah 43.038%  (b/b).  Pada  penelitian  lain  yang menggunakan  ekstrak  etanol  daun  cokelat ( Theobroma  cacao L.),  hasil  rendemen  yang didapatkan  cukup  bervariasi,  yaitu  6.8%  setelah dimaserasi  selama  lima  hari  dalam  pelarut  96% (Mandhaki  et  al.,  2021),  dan  10.74%  setelah dimaserasi  selama  lima  hari  dalam  pelarut  etanol 70%  (Hasanah,  2016).  Meski  kedua  penelitian melakukan maserasi dengan jumlah hari yang sama, hasil  rendemen  yang  didapatkan  berbeda.  Hal  ini dikarenakan  perbedaan  konsentrasi  pelarut  yang
digunakan akan memengaruhi tingkat kepolarannya, di  mana  semakin  banyak  air  yang  terkandung  di dalam  pelarut  etanol,  kepolaran  pelarut  akan semakin  tinggi.  Pelarut  dengan  kepolaran  tinggi memiliki  kemampuan  mengekstraksi  jenis  senyawa yang lebih banyak, karena sebagian besar senyawa metabolit sekunder larut dalam air, sehingga etanol 70% yang lebih polar dibandingkan etanol 96% akan lebih  banyak  menyari  senyawa  yang  terkandung dalam  suatu  simplisia,  dan  persentase  rendemen yang  dihasilkan  akan  lebih  besar  (Fauziyah  et  al., 2022; Hikmawanti et al., 2021; Riwanti et al., 2020).
Banyak  faktor  yang  memengaruhi  nilai persentase  rendemen,  dimulai  dari  faktor  pola tanam,  faktor  manusia  sebagai  pelaku,  dan  faktor metode ekstraksi yang diterapkan. Faktor pola tanam dapat  meliputi  luas  lahan,  iklim  dan  cuaca, penggunaan pupuk dan pestisida, dan varietas yang digunakan.  Faktor  manusia  meliputi  waktu pemetikan daun dan cara pengolahan simplisia dan pembuatan  ekstrak.  Adapun  faktor  metode  yang dimaksud adalah metode ekstraksi yang dipilih, serta lama  waktu  metode  ekstraksi  tersebut,  di  mana semakin lama waktu ekstraksi yang digunakan, maka rendemen yang dihasilkan semakin tinggi (Ananta et al., 2021; Tranggono et al., 2023).

## 2. Skrining Fitokimia
Penambahan  HCl  pada  sampel  dalam  skrining alkaloid  bertujuan  untuk  mengekstraksi  senyawa alkaloid yang bersifat basa, sehingga dengan adanya penambahan  asam  akan  memicu  pembentukan garam  alkaloid.  Ketika  garam  alkaloid  direaksikan dengan reagen tertentu seperti Mayer, Wagner, dan Bouchardat,  endapan  akan  terbentuk.  Alasan digunakannya  tiga  pereaksi  dalam  pengujian dikarenakan ketiga pereaksi mengandung ion logam yang  tidak  sama,  yang  dapat  membentuk  endapan ketika bereaksi dengan garam-garam alkaloid. Hasil positif  alkaloid  dengan  pereaksi  Mayer  ditandai dengan  pembentukan  endapan  kompleks  kalium- alkaloid berwarna putih. Komposisi Pereaksi Mayer terdiri  dari  merkuri  klorida  (HgCl 2 )  dan  kalium iodida (KI) yang dapat bereaksi membentuk endapan merah  merkuri  iodida  (HgI 2 ).  Penambahan  kalium iodida  yang  berlebih  akan  membentuk  kalium tetraiodomerkurat(II).  Sementara  itu,  alkaloid mengandung  atom-atom  nitrogen  yang  memiliki pasangan  elektron  bebas,  yang  dapat  membentuk ikatan kovalen koordinasi dengan ion logam. Ketika direaksikan  dengan  pereaksi  Mayer,  atom  nitrogen
yang  dimiliki  alkaloid  bereaksi  dengan  ion  logam kalium  (K + )  dalam  kalium  tetraiodomerkurat(II) membentuk kompleks kalium-alkaloid (Fatmawati et al., 2022; Hanifa et al., 2021; Sabdoningrum et al., 2021). Hasil  positif  alkaloid  dengan  pereaksi  Wagner dan  Bouchardat  ditandai  dengan  pembentukan endapan  kalium-alkaloid  berwarna  cokelat  muda hingga  kuning.  Pereaksi  Wagner  dibuat  dari mereaksikan iodin (I 2 ) dengan ion  I- dalam  kalium iodida (KI) sehingga terbentuk ion I 3 - yang berwarna cokelat.  Dalam  pengujian,  ion  logam  K+  akan membentuk  ikatan  kovalen  koordinasi  dengan nitrogen  dalam  alkaloid,  yang  menyebabkan pembentukan  endapan  berwarna  kuning  dengan pereaksi  Wagner  atau  cokelat  dengan  pereaksi Bouchardat.  Meski  pereaksi  Wagner  dan  pereaksi Bouchardat  memiliki  komposisi  yang  sama,  secara kuantitas  pereaksi  Bouchardat  mengandung  lebih banyak  kalium  iodida  dibandingkan  pereaksi Wagner,  sehingga  warna  endapan  yang  dihasilkan lebih  gelap  dan  pekat  (Hanifa  et  al.,  2021; Sabdoningrum  et  al.,  2021;  Sadik  &  Zulfian  Disi, 2023; Viogenta et al., 2023).
Hasil  positif  flavonoid  dengan  uji  Shinoda ditandai  dengan  terbentuknya  larutan  berwarna merah.  Serbuk  magnesium  (Mg)  mereduksi  inti benzopiron  pada  flavonoid  dan  membentuk  garam flavilium. Sementara itu, penambahan asam klorida (HCl)  menyebabkan  terhidrolisisnya  senyawa flavonoid  menjadi  aglikon  O-glikosil,  dan  suasana asam  yang  terbentuk  setelahnya  dapat  memicu tereduksinya
garam
flavinium sehingga menyebabkan  perubahan  warna  larutan  menjadi merah (Marwati et al., 2020; Parbuntari et al., 2018; Ramayani et al., 2020; Supriadin et al., 2021).
Hasil positif tanin dengan penambahan gelatin ditandai  dengan  terbentuknya  endapan  putih. Gelatin  dan  tanin  dapat  membentuk  ikatan kopolimer stabil yang tidak larut dalam air, sehingga protein  yang  tidak  larut  akan  mengkristal  dan membentuk  endapan  putih.  Penambahan  larutan NaCl  dapat  meningkatkan  kadar  garam  dalam larutan tanin-gelatin, sehingga uji ini akan menjadi lebih sensitif dan endapan putih protein akan lebih banyak terbentuk (Sabdoningrum et al., 2021).
Hasil positif polifenol dengan penambahan FeCl 3 ditandai  dengan  perubahan  warna  larutan  menjadi gelap, yang disebabkan akibat terjadinya reduksi ion Fe 3+ menjadi  Fe 2+ ketika  polifenol  direaksikan dengan FeCl 3 .  Warna biru  tua menandakan larutan memiliki  senyawa  metabolit  tanin  terhidrolisis,
sedangkan  warna  hijau  kehitaman  menandakan larutan  memiliki  senyawa  metabolit  tanin terkondensasi  (Fatmawati  et  al.,  2022).  Setelah direaksikan,  larutan  uji  memiliki  warna  hijau kehitaman, menandakan ekstrak etanol daun cokelat positif mengandung tanin terkondensasi.
Hasil  positif  kuinon  dengan  penambahan aquadest  panas  dan  NaOH  ditandai  dengan perubahan  warna  larutan  menjadi  kuning  hingga merah.
Penambahan
NaOH 1N dapat mendeprotonasi  gugus  fenol  yang  dimiliki  kuinon, sehingga  ion  enolat  akan  terbentuk.  Ion  enolat mampu  menyerap  cahaya  dan  memberi  warna kuning atau merah pada larutan uji (Kusumo et al., 2022). Pada pengujian, larutan ekstrak etanol daun cokelat memberikan warna merah yang menandakan positif mengandung kuinon.
Hasil positif steroid dengan pereaksi Lieberman- Buchard  (asam  asetat  anhidrat  ((CH 3 CO) 2 O)  dan asam  sulfat  (H 2 SO 4 )  ditandai  dengan  terbentuknya cincin  biru  kehijauan,  dan  hasil  positif  terpenoid ditandai  dengan  terbentuknya  cincin  kecokelatan atau  violet.  Pada  pengujian,  larutan  ekstrak  etanol daun  cokelat  memperlihatkan  hasil  berupa terbentuknya cincin kecokelatan, yang menandakan positif  mengandung  terpenoid.  Residu  larutan  uji dilarutkan  dalam  kloroform  terlebih  dahulu  untuk melarutkan senyawa non-polar seperti steroid/terpenoid,  yang  akan  mengalami  asetilasi gugus  hidroksil  ketika  ditambahkan  asam  asetat
anhidrat.  Penambahan  asam  sulfat  menyebabkan terjadinya  eliminasi  gugus  asetil  dan  hidrogen, sehingga  terbentuk  ikatan  rangkap  terkonjugasi. Munculnya  warna  cincin  tertentu  pada  larutan  uji disebabkan karena senyawa metabolit steroid/terpenoid  mengalami  reaksi  oksidasi  yang menghasilkan  gugus  kromofor  (karbon  tak  jenuh terkonjugasi) (Asmara, 2017; Rustiani et al., 2021).
Hasil positif saponin ditandai dengan busa yang terbentuk dengan kisaran tinggi 1-10 cm yang tidak hilang  selama  sepuluh  menit,  dan  busa  tidak menghilang  setelah  diberikan  asam  klorida  (HCl). Saponin  adalah  senyawa  yang  memiliki  gugus hidrofilik  yang  berikatan  dengan  air,  dan  gugus hidrofobik  yang  berikatan  dengan  udara  sehingga busa terbentuk ketika dikocok. Busa yang terbentuk menandakan  adanya  glikosida  yang  terhidrolisis menjadi glukosa dan aglikon-aglikonnya. Terbentuknya  busa  disebabkan  saponin  yang mengandung  senyawa  polar  dan  non-polar  yang membentuk  misel,  di  mana  misel-misel  tersebut menyebabkan senyawa polar muncul di permukaan, sedangkan senyawa non-polar menghadap ke dalam. Penambahan  HCl  2N  dimaksudkan  untuk meningkatkan  kepolaran,  sehingga  gugus  hidrofilik memiliki  ikatan  yang  lebih  kuat  dan  busa  yang terbentuk  menjadi  lebih  stabil  (Dewi  et  al.,  2019; Fatmawati et al., 2022; Sabdoningrum et al., 2021). Hasil  skrining  fitokimia  pada  penelitian  ini  dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Hasil Skrining Fitokimia Ekstrak Etanol Daun Cokelat ( Theobroma cacao L.)
Skrining Pereaksi Hasil Alkaloid HCl 2N + Mayer + (Endapan putih) HCl 2N + Wagner + (Endapan kuning) HCl 2N + Bouchardat + (Endapan cokelat) Flavonoid Serbuk Mg + HCl + amil alkohol + (Warna dan terbentuk cincin merah) Polifenol dan Tanin Larutan gelatin 10% + (Endapan putih) Larutan gelatin 1% dalam NaCl 10% FeCl 3 1% + (Larutan hitam kehijauan, tanin terkondesasi) Kuinon Aquadest panas + NaOH + (Endapan merah) Steroid/ Terpenoid CHCl 3 + (CH 3 CO) 2 O + H 2 SO 4 pekat + terpenoid (Cincin kecokelatan) Saponin HCl 2N + (Tinggi busa ± 1.2 cm)
Keterangan: (+) mengandung senyawa yang diuji dan (-) senyawa yang diuji tidak terdeteksi
3. Identifikasi Jamur M. furfur
Jamur M.  furfur diidentifikasi  secara makroskopik dan mikroskopik setelah diinokulasikan.  Secara  makroskopik, M.  furfur
berbentuk  bulat  cembung  dan  berwarna  putih kekuningan.  Ketika  diamati  secara  mikroskopik, morfologi  sel  jamur M.  furfur berbentuk  lonjong, memanjang, dan bertunas pendek ( Gambar 1 ).

## Gambar 1. Morfologi Jamur M. furfur
Keterangan: Jamur M. furfur secara Makroskopik ( a ); Jamur M. furfur secara Mikroskopik menggunakan Pewarna Lactophenol Cotton Blue (LPCE) dengan Perbesaran 100x ( b )
4. Uji Pendahuluan Aktivitas Antijamur M. furfur
Uji  pendahuluan  aktivitas  antijamur  ditujukan untuk menentukan konsentrasi larutan uji yang akan digunakan  dalam  pengujian  KHM.  Uji  yang digunakan  adalah  metode  difusi  cakram.  Hasil  uji aktivitas antijamur ekstrak daun cokelat ( Theobroma cacao L.)  dengan  variasi  konsentrasi  100%,  80%, 60%,  40%,  dan  kontrol  positif  ketokonazol  dan itrakonazol  membentuk  zona  hambat  di  sekitar kertas  cakram  setelah  diinkubasi.  Alasan digunakannya dua kontrol positif adalah karena telah banyak  ditemukan  kasus  resistensi  ketokonazol terhadap  varian M.  furfur ,  karena  ketokonazol merupakan antijamur yang paling umum digunakan untuk  mengatasi  panu  ( pityriasis  versicolor ).  Maka dari  itu,  digunakan  kontrol  positif  kedua  yaitu itrakonazol  untuk  melihat  apakah M.  furfur yang diujikan dalam penelitian ini telah resisten terhadap ketokonazol  dan/atau  golongan  azol  lainnya (Muslimin et al., 2018).
Terbentuknya  zona  hambat  menunjukkan adanya hambatan pertumbuhan jamur, yang hasilnya dapat dilihat pada Tabel 2 . Berdasarkan data pada Tabel 2 , kontrol negatif tidak memberikan aktivitas antijamur, ditandai dengan tidak terbentuknya zona bening.  Kontrol  negatif  yang  digunakan  dalam penelitian ini ditujukan untuk membuktikan bahwa zona  hambat  yang  terbentuk  pada  kontrol  positif ataupun  konsentrasi  uji  tidak  dipengaruhi  oleh pelarut  yang  digunakan  untuk  melarutkan  sampel, tetapi berasal dari senyawa aktif yang terkandung di dalam ekstrak daun cokelat (Septiani et al., 2021). Dalam penelitian ini, kontrol negatif yang digunakan
adalah  DMSO  10%  dan  kontrol  positif  yang digunakan  adalah  Ketokonazol  2%  dan  Itrakonazol 2%.  Alasan  dipilihnya  DMSO  10%  sebagai  pelarut adalah  karena  DMSO  merupakan  pelarut  yang mampu melarutkan senyawa yang bersifat non polar seperti  ketokonazol  dan  itrakonazol,  maupun senyawa  yang  bersifat  polar  seperti  ekstrak  etanol daun cokelat ( Theobroma cacao L.) (Febrianto et al., 2022b).  Ketokonazol  dan  itrakonazol  adalah  obat antijamur golongan azol yang efektif terhadap ragi dan  dermatofit(Santoso  et  al.,  2020).  Berdasarkan hasil  pengukuran,  zona  hambat  itrakonazol  lebih besar  dibandingkan  dengan  zona  hambat ketokonazol  dengan  konsentrasi  dan  pelarut  yang sama,  sesuai  dengan  sebuah  penelitian  yang menyatakan  bahwa  itrakonazol  lebih  efektif dibandingkan dengan ketokonazol dalam menghambat  pertumbuhan M.  furfur (Wang  et  al., 2020).
Pada  uji  antijamur,  konsentrasi  ekstrak  100% memiliki diameter zona hambat terbesar, sedangkan konsentrasi ekstrak 20% tidak menunjukkan adanya zona  hambat,  sesuai  dengan  pernyataan  bahwa semakin  tinggi  konsentrasi  yang  digunakan,  maka daya hambat yang terjadi semakin besar (Maulana et al.,  2022).  Hal  ini  dipengaruhi  oleh  keberadaan metabolit  sekunder  yang  memberikan  pengaruh terhadap  pertumbuhan  jamur  dalam  pengujian. Selain  senyawa  aktif,  difusi  dalam  media  juga dipengaruhi  oleh  jumlah  jamur  yang  diujikan, kecepatan  tumbuh  jamur,  dan  tingkat  sensitivitas jamur  terhadap  aktivitas  senyawa  aktif  antijamur yang dimiliki ekstrak (Santoso et al., 2020; Septiani et al., 2021).
Tabel 2. Hasil Pengukuran Diameter Zona Hambat Ekstrak Etanol Daun Cokelat ( Theobroma cacao L.)
terhadap Jamur M. furfur Sampel Rata-rata Diameter Zona Hambat (mm) ± SD Keterangan Kontrol negatif (-) 0 ± 0 Tidak menghambat Kontrol + (Ketokonazol) 21.73 ± 1.09 Sangat kuat Kontrol + (Itrakonazol) 31.31 ± 1.04 Sangat kuat Ekstrak 20% 0 ± 0 Tidak menghambat Ekstrak 40% 4.38 ± 0.36 Lemah Ekstrak 60% 7.57 ± 0.95 Lemah Ekstrak 80% 7.78 ± 0.72 Lemah Ekstrak 100% 10.96 ± 0.34 Sedang
Selain  senyawa  aktif,  difusi  dalam  media  juga dipengaruhi  oleh  jumlah  jamur  yang  diujikan, kecepatan  tumbuh  jamur,  dan  tingkat  sensitivitas jamur  terhadap  aktivitas  senyawa  aktif  antijamur yang dimiliki ekstrak (Santoso et al., 2020; Septiani et  al.,  2021).  Menurut  hasil  skrining  fitokimia sebelumnya,  ekstrak  daun  cokelat  mengandung senyawa metabolit alkaloid, flavonoid, tanin, kuinon, terpenoid,  dan  saponin.  Mekanisme  kerja  alkaloid sebagai  antijamur  adalah  mengganggu  komponen penyusun  peptidoglikan  pada  sel,  sehingga menyebabkan  lapisan  dinding  sel  jamur  tidak terbentuk secara utuh dan mengakibatkan kematian sel.  Mekanisme  kerja  flavonoid  sebagai  antijamur adalah  mendenaturasi  protein  dengan  mengganggu lapisan lipid dan mengakibatkan kerusakan dinding sel,  mengganggu  permeabilitas  membran  sel, merusak  struktur  protein  yang  mengakibatkan  sel jamur menjadi lisis. Mekanisme kerja tanin sebagai antijamur  adalah  mampu  memperkecil  dinding  sel jamur  dengan  menghambat  proses  sintesis  kitin, sehingga  pertumbuhan  jamur  menjadi  terhambat. Mekanisme  kerja  kuinon  sebagai  antijamur  adalah menghasilkan  radikal  bebas  yang  stabil  dan membentuk  kompleks  ireversibel  dengan  asam amino  nukleofilik  pada  protein,  sehingga  protein kehilangan  fungsinya.  Mekanisme  kerja  terpenoid sebagai antijamur adalah berikatan dengan molekul protein  dan  lipid  yang  dapat  menurunkan permeabilitas membran sel jamur. Mekanisme kerja saponin sebagai antijamur adalah melisis sel jamur dengan  gugus  monosakarida  yang  dapat mengganggu stabilitas membran sel jamur (Hersila et al., 2023; Komala et al., 2019; Permataningrum et al., 2019).
Berdasarkan uji statistik, nilai signifikansi pada uji parametrik One-Way ANOVA adalah <0.001 (p <  0.05),  sehingga  dinyatakan  hasil  pengujian
bersifat  signifikan.  Uji  parametrik  ini  dilanjutkan dengan uji Post-Hoc Tukey untuk melihat signifikansi antar kelompok uji. Uji Post-Hoc Tukey menyatakan antar  seluruh  kelompok  uji  selain  kelompok  uji konsentrasi ekstrak 60% dan 80% bersifat signifikan. Akan tetapi, respons hambatan pertumbuhan jamur diklasifikasikan berdasarkan diameter zona hambat menjadi empat kategori, yaitu < 10 mm (lemah), 10- 15 mm (sedang); 16-20 mm (kuat); dan > 20 mm (sangat  kuat),  dan  hasil  pengujian  ekstrak  tiap konsentrasi  tidak  terlalu  berbeda  secara  signifikan karena  kelompok  ekstrak  daun  cokelat  ( Theobroma cacao L.)  dengan  konsentrasi  40%,  60%,  dan  80% masih dalam kategori lemah, dan konsentrasi 100% masuk ke dalam kategori sedang (Alioes et al., 2018; Santoso et al., 2020).

## 5. Penetapan  Konsentrasi  Hambat  Minimum (KHM)
Setelah uji
pendahuluan dilakukan menggunakan  metode  difusi  cakram,  uji  KHM ekstrak  etanol  daun  cokelat  ( Theobroma  cacao L.) terhadap M. furfur dilakukan dengan menggunakan pengenceran  bertingkat  dengan  perbandingan  1:2 bobot/volume (w/v) yaitu 100%; 50%; 25%; 12.5%; 6.25%;  dan  3.125%.  Pada  penelitian  ini,  hasil diamati secara kualitatif dengan melihat kekeruhan secara  visual  (turbidimetri)  sesudah  inkubasi,  dan secara kuantitatif dengan mengukur nilai absorbansi menggunakan spektrofotometer UV-Vis sebelum dan sesudah  inkubasi  ( Tabel  3,  Gambar  2 ).  Setelah diinkubasi  selama  48  jam  dengan  suhu  37 o C, dilakukan uji turbidimetri terlebih dahulu terhadap sampel.  Secara  visual,  baik  larutan  uji  maupun larutan  kontrol  positif  terlihat  keruh.  Hal  ini disebabkan oleh salah satu kelemahan dari metode turbidimetri,  yaitu  mata  manusia  saat  melakukan pengamatan  kekeruhan  tidak  bisa  membedakan
antara sel jamur hidup dengan sel jamur mati, serta larutan  bisa  saja  mencapai  warna  yang  pekat. Larutan  kontrol  positif  dan  larutan  uji  memiliki warna yang keruh saat dilarutkan dalam DMSO 10%, sehingga  tidak  dapat  diketahui  dengan  pasti penyebab  kekeruhan  larutan.  Oleh  sebab  itu, diperlukan  pengamatan  secara  kuantitatif  dengan mengukur  nilai  absorbansi  menggunakan  alat spektrofotometer (Ramschie et al., 2017; Rori et al., 2018).
Berdasarkan Tabel  3 dan Gambar  2 ,  pada pengujian  menggunakan  metode  spektrofotometer, terjadi  kenaikan  nilai  rata-rata  absorbansi  pada konsentrasi 25%; 12.5%; 6.25%, dan 3.125%. Hal ini menandakan  bahwa  suspensi  jamur  yang  diujikan pada  konsentrasi  tersebut  masih  mengalami pertumbuhan dan konsentrasi ekstrak tidak mampu menghambat pertumbuhan tersebut. Sementara itu, rata-rata absorbansi pada konsentrasi 50% dan 100% mengalami  penurunan  yang  menandakan  bahwa
kedua  konsentrasi  ini  dapat  menghambat pertumbuhan jamur (Assauqi et al., 2023; Mere et al., 2021). Setelah dilakukan pengukuran absorbansi dan perhitungan nilai optical density (OD), data nilai OD dianalisis  secara  statistika  menggunakan  uji parametrik One-Way ANOVA  dan Post-Hoc Tukey. Hasil  uji  statistika  menunjukkan  aktivitas penghambatan  jamur  ekstrak  daun  cokelat ( Theobroma cacao L.) terhadap M. furfur antar kontrol berbeda  secara  nyata,  karena  nilai  signifikansi <0.001 (p < 0.05).
Berdasarkan  hasil  analisis  pengamatan  dan perbandingan nilai absorbansi, ekstrak daun cokelat ( Theobroma  cacao L.)  dengan  konsentrasi  50% ditetapkan  sebagai  nilai  KHM,  karena  konsentrasi tersebut  merupakan  konsentrasi  terendah  di  mana terjadi  penurunan  nilai  absorbansi  sesudah dilakukannya  inkubasi,  yang  menunjukkan penghambatan pertumbuhan jamur telah terjadi.
Tabel 3. Hasil Pengujian Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) Ekstrak Etanol Daun Cokelat ( Theobroma cacao L.) terhadap M. furfur Menggunakan Spektrofotometer UV-Vis
Sampel Rata-rata Hasil Absorbansi ± SD Optical Density (OD) Sebelum Sesudah Kontrol - 0.15 ± 0.00038 1.27 ± 0.00209 1.12 Kontrol + (Ketokonazol) 1.01 ± 0.00076 0.89 ± 0.00096 -0.12 Kontrol + (Itrakonazol) 1.24 ± 0.0008 0.78 ± 0.00076 -0.46 Ekstrak 100% 1.29 ± 0.00074 0.99 ± 0.00228 -0.39 Ekstrak 50% (KHM) 0.94 ± 0.00082 0.88 ± 0.0015 -0.06 Ekstrak 25% 0.57 ± 0.00216 0.69 ± 0.0106 0.12 Ekstrak 12.5% 0.52 ± 0.00254 0.61 ± 0.00107 0.09 Ekstrak 6.25% 0.50 ± 0.00156 0.84 ± 0.00029 0.34 Ekstrak 3.125% 0.48 ± 0.00035 0.79 ± 0.00137 0.31

## 6. Penetapan Nilai Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM)
Nilai KBM ditentukan dengan membuat variasi konsentrasi sampel 25%, 50%, dan 100% ke dalam media Sabouraud Dextrose Agar (SDA). Metode yang digunakan  adalah spread  plate ,  yaitu  mengambil sampel yang sudah dilakukan uji KHM sebanyak 100 µL  lalu  dituangkan  ke  dalam  media  dan  diratakan menggunakan spreader yang  sudah  disterilisasi. Alasan pemilihan konsentrasi 50% dan 100% adalah karena  kedua  konsentrasi  tersebut  menunjukkan penghambatan  pertumbuhan  jamur  pada  uji  KHM, sementara  konsentrasi  25%  juga  diujikan  sebagai kontrol  negatif  (Br.  Tarigan  et  al.,  2021).  Setelah diamati  sesudah  diinkubasi  dalam  waktu  48  jam
pada suhu 37 o C secara visual, uji KBM menghasilkan data yaitu pada media yang berisi larutan hasil uji KHM konsentrasi ekstrak 25% sebagai kontrol negatif menunjukkan pertumbuhan jamur. Pada konsentrasi ekstrak  50%  memperlihatkan  adanya  pertumbuhan jamur,  tetapi  secara  visual,  koloni  yang  terbentuk lebih sedikit bila dibandingkan dengan koloni yang tumbuh pada media dengan konsentrasi ekstrak 25%. Hal  ini  sejalan  dengan  suatu  pernyataan  bahwa semakin tinggi konsentrasi ekstrak, maka koloni yang tumbuh semakin sedikit (Muchtaromah et al., 2020). Pada  media  yang  mengandung  larutan  hasil  uji konsentrasi  100%,  pada  salah  satu  replikasi memperlihatkan  pertumbuhan  jamur.  Hal  ini kemungkinan  disebabkan  karena  terjadinya kontaminasi  eksternal  dari  lingkungan  pada  saat
pengujian,  yang  dapat  muncul  2-3  hari  setelah penanaman.  Sumber  kontaminasi  eksternal  berasal dari  alat  dan  bahan  yang  tidak  steril, mikroorganisme lain yang masuk ke dalam suspensi jamur  uji,  dan  dari  udara  (Andriani  &  Heriansyah, 2021).  Berdasarkan  hasil  tersebut,  disimpulkan bahwa  konsentrasi  ekstrak  daun  cokelat  100% merupakan nilai KBM terhadap M. furfur.

## KESIMPULAN
Berdasarkan  penelitian  yang  telah  dilakukan, dapat  disimpulkan  bahwa  ekstrak  etanol  daun cokelat ( Theobroma cacao L.) mengandung senyawa alkaloid,  flavonoid,  tanin,  kuinon,  terpenoid,  dan saponin. Selain itu, konsentrasi ekstrak etanol daun cokelat  terendah  yang  memperlihatkan  efek fungistatik  (menghambat  pertumbuhan  jamur) dalam  uji  Konsentrasi  Hambat  Minimum  (KHM) adalah  konsentrasi  50%,  dan  konsentrasi  ekstrak terendah  yang  memperlihatkan  efek  fungisidal (membunuh  jamur)  dalam  uji  Konsentrasi  Bunuh Minimum (KBM) adalah konsentrasi 100%.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Kami  mengucapkan  terima  kasih  pada Universitas  Adiwangsa  Jambi  yang  telah menyediakan  fasilitas  untuk  penelitian  ini,  serta Rahmayuni Faddilah  R. dan Becek Hamisah selaku laboran laboratorium biologi dan mikrobiologi Prodi Farmasi Universitas Adiwangsa Jambi.

## DAFTAR PUSTAKA
Aboody,  M.  S.  Al,  &  Mickymaray,  S.  (2020).  Anti-fungal efficacy and mechanisms of flavonoids. Dalam Antibiotics
(Vol. 9, Nomor 2). MDPI AG. https://doi.org/10.3390/antibiotics9020045
Agustina, E., Andiarna, F., Hidayati, I., & Kartika, V. F. (2021).
Uji  aktivitas  antijamur  ekstrak  black  garlic  terhadap pertumbuhan jamur Candida albicans . Bioma : Jurnal Ilmiah Biologi , 10 (2), 143–157. https://doi.org/10.26877/bioma.v10i2.6371
Albab, L. U., Husin, U. A., Azhali, B. A., Respati, T., & Astuti, R.  D.  I.  (2020).  Efek  Antibakteri  Ekstrak  Aquades  Buah Kurma  ( Phoenix  dactylifera L.)  Varietas  Ajwa  terhadap Staphylococcus  aureus Secara  In  Vitro. Jurnal  Integrasi Kesehatan
& Sains , 2 (2), 135–139.
https://doi.org/10.29313/jiks.v2i2.5769
Alioes,  Y.,  Kartika,  A.,  Zain,  A.,  &  Azzura,  V.  (2018).  Uji potensi  antijamur Candida  albicans ekstrak  Daun Gelinggang ( Cassia alata L.) dibandingkan dengan sediaan Daun Sirih yang beredar di pasaran secara in vitro. Jurnal Kimia Riset , 3 (2), 108–115.
Alsohaili,  S.  A.,  &  Bani-Hasan, B.  M.  (2018).  Morphological and  Molecular  Identification  of  Fungi  Isolated  from Different Environmental Sources in the Northern Eastern Desert  of  Jordan. Jordan  Journal  of  Biological  Sciences , 11 (3), 329–337.
Ananta, D. A., Putra, G. P. G., & Arnata, I. W. (2021). Pengaruh suhu  dan  waktu  maserasi  terhadap  aktivitas  antioksidan ekstrak  kulit  buah  kakao  ( Theobroma  cacao L.). Jurnal Rekayasa dan Manajemen Agroindustri , 9 (2), 186–197. Andriani,  D.,  &  Heriansyah,  P.  (2021).  Identifikasi  Jamur Kontaminan  pada  Berbagai  Eksplan  Kultur  Jaringan Anggrek Alam ( Bromheadia finlaysoniana (Lind.) Miq. Agro
Bali :
Agricultural Journal , 4 (2), 192–199. https://doi.org/10.37637/ab.v4i2.723
Angiolella, L., Leone, C., Rojas, F., Mussin, J., Angeles Sosa, M. de  los,  &  Giusiano,  G.  (2018).  Biofilm,  adherence,  and hydrophobicity  as  virulence  factors  in Malassezia  furfur . Medical Mycology , 56 (1), 110–116. https://doi.org/10.1093/mmy/myx014
Asmara,  A.  P.  (2017).  Uji  Fitokimia  Senyawa  Metabolit Sekunder  Dalam  Ekstrak  Metanol  Bunga  Turi  Merah ( Sesbania grandiflora L. Pers). Al-Kimia , 5 (1), 48–59. Assauqi, N. F., Hafshah, M., & Latifah, R. N. (2023). Penentuan Nilai  Konsentrasi  Hambat  Minimum  (KHM)  dan Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM) Ekstrak Etanol Daun Pandan  ( Pandanus  amaryllifolius Roxb)  Terhadap  Bakteri Streptococcus mutans . JC-T (Journal Cis-Trans): Jurnal Kimia dan Terapannya , 7 (1), 1–8. https://doi.org/10.17977/um0260v7i12023p001
Bawa, I. G. A. G., & Perbhawa, I. G. A. G. C. A. (2020). Analisis senyawa  terpenoid  antijamur  pada  fraksi  aktif  ekstrak Kulit Kayu Cempaka Putih ( Michelia alba ) dengan metode gas chromatography-mass spectroscopy. Jurnal Kimia , 142. https://doi.org/10.24843/jchem.2020.v14.i02.p06
Br. Tarigan, B. M. C., Lelyana, S., & Sugiaman, V. K. (2021).
Kadar  hambat  minimum  dan  kadar  bunuh  minimum ekstral  etanol  Daun  Oregano  terhadap  pertumbuhan Candida  albicans. Jurnal  Ilmiah  dan  Teknologi  Kedokteran Gigi FKG UPDM (B) , 17 (2), 55–62.
Dewi, R., Febriani, A., & Wenas, D. M. (2019). Uji Aktivitas Antimikroba Ekstrak Metanol Daun Sirih (Piper betle L.) Terhadap  Pertumbuhan  Bakteri Propionibacterium  acnes dan Khamir Malassezia furfur . Dalam Sainstech Farma (Vol. 12, Nomor 1).
Dyląg,  M.,  Leniak,  E.,  Gnat,  S.,  Szepietowski,  J.  C.,  & Kozubowski, L. (2020). A case of anti-pityriasis versicolor therapy  that  preserves  healthy  mycobiome. BMC Dermatology , 20 (1). https://doi.org/10.1186/s12895-020-
00106-x
Fatmawati, S., Sjahid, L. R., Utami, N. M., & Kartini, K. (2022). Total Phenolic, Total Flavonoid Content and in vitro Sun Protection  Factor  test  of  Arabica  Coffee  Leaves  Extract ( Coffea  arabica L). Journal  of  Science  and  Technology
Research
for
Pharmacy , 1 (2), 57–66. https://doi.org/10.15294/jstrp.v1i2.51374
Fauziyah,  N.,  Widyasanti,  A.,  &  Sutresna,  Y.  (2022).  Kajian Pengaruh  Konsentrasi  Etanol  Terhadap  Karakteristik Oleoresin  Ampas  Jahe  Merah  ( Zingiber  officinale Roscoe) Limbah  Penyulingan. TEKNOTAN , 16 (3),  169–176. https://doi.org/10.24198/jt.vol16n3.6
Febrianto, N. A., Wang, S., & Zhu, F. (2022a). Chemical and biological properties of cocoa beans affected by processing: a  review.  Dalam Critical  Reviews  in  Food  Science  and Nutrition (Vol. 62, Nomor 30, hlm. 8403–8434). Taylor and
Francis Ltd.
https://doi.org/10.1080/10408398.2021.1928597
Febrianto, N. A., Wang, S., & Zhu, F. (2022b). Chemical and biological properties of cocoa beans affected by processing: a  review. Critical  Reviews  in  Food  Science  and  Nutrition , 62 (30),
8403–8434. https://doi.org/10.1080/10408398.2021.1928597
Fitriana,  Y.  A.  N.,  Fatimah,  V.  A.  N.,  &  Fitri,  A.  S.  (2019). Aktivitas Anti Bakteri Daun Sirih: Uji Ekstrak KHM (Kadar Hambat  Minimum)  dan  KBM  (Kadar  Bakterisidal Minimum). SAINTEKS , 16 (2), 101–108.
Hanifa, N. I., Wirasisya, D. G., Muliani, A. E., Utami, S. B., & Sunarwidhi,  A.  L.  (2021).  Phytochemical  Screening  of Decoction  and  Ethanolic  Extract  of Amomum  dealbatum Roxb.  Leaves. Jurnal  Biologi  Tropis , 21 (2),  510–518. https://doi.org/10.29303/jbt.v21i2.2758
Hasanah, M. (2016). Analisis Golongan Senyawa Kimia dan Uji Potensi Antioksidan dari Ekstrak Daun Cokelat ( Theobroma cacao L.)  Hasil  Ekstraksi  Maserasi. Jurnal  Ilmiah  Bakti Farmasi , 1 (2), 43–48.
Hersila, N., Chatri, M., Vauzia, & Irdawati. (2023). Senyawa metabolit  sekunder  (tanin)  pada  tanaman  sebagai antifungi. Jurnal Embrio , 15 (1), 16–22.
Hikmawanti, N. P. E., Fatmawati, S., & Asri, A. W. (2021). The effect of ethanol concentrations as the extraction solvent on antioxidant activity of Katuk ( Sauropus androgynus (L.) Merr.)  leaves  extracts. IOP  Conference  Series:  Earth  and Environmental Science , 755 (1), 1–8. https://doi.org/10.1088/1755-1315/755/1/012060
Hutasoit, C. M. D., Setyaningsih,  Y., & Pramono, A. (2020).
Antifungal  effectiveness  of  cacao  bean  shells  extract ( Theobroma  cocoa L.)  on Trichophyton  rubrum growth  in vitro.
Biomedika , 12 (2), 65–71.
https://doi.org/10.23917/biomedika.v12i2.10176
Intan,  K.,  Diani,  A.,  &  Nurul,  A.  S.  R.  (2021).  Kativitas antibakteri kayu manis ( Cinnamomum burmanii ) terhadap pertumbuhan Staphylococcus  aureus. Jurnal  Kesehatan Perintis , 8 (2), 121–127.
Isnaini, Biworo, A., Khatimah, H., Gufron, K. M., & Puteri, S. R.  (2021).  Aktivitas  Antibakteri  dan  Antijamur  Ekstrak Galam  ( Melaleuca  cajuputi subsp.  Cumingiana  (Turcz.) Barlow)  terhadap  Bakteri E.coli dan  Jamur C.  albicans. Journal of Agromedicine and Medical Sciences , 7 (2), 79–83. Kementerian Kesehatan RI. (2017). Farmakope Herbal Indonesia Edisi II: Vol. II .
Komala, O., Yulianita, & Siwi, F. R. (2019). Aktivitas antijamur ekstrak  etanol  50%  dan  etanol  96%  Daun  Pacar  Kuku Lawsonia inermis L. terhadap Trichophyton mentagrophytes . Ekologia:  Jurnal  Ilmiah  Ilmu  Dasar  dan Lingkungan  Hidup , 19 (1), 12–19.
Kusumo, D. W., Susanti, Ningrum, E. K., & Makayasa, C. H. A. (2022).  Skrining  fitokimia  senyawa  metabolit  sekunder pada  ekstrak  etanol  Bunga  Pepaya  ( Carica  papaya L.). Journal of Current Pharmaceutical Sciences , 5 (2), 478–483. Mandhaki,  N.,  Huda,  C.,  &  Putri,  A.  E.  (2021).  Aktivitas Antibakteri  Fraksi  Daun  Kakao  ( Theobroma  cacao L.)
terhadap  Bakteri Staphylococcus  aureus Secara  In  Vitro. Jurnal  Sains  dan  Kesehatan , 3 (2),  188–193. https://doi.org/10.25026/jsk.v3i2.269
Marwati,  A.  D.,  Yulianto,  A.  N.,  &  Setiyabudi,  L.  (2020). Formulasi dan evaluasi sifat fisik tablet hisap kombinasi ekstrak  Daun  Bakau  Hitam  ( Rhizophora  mucronata )  dan Vitamin  C  sebagai  antioksidan. Jurnal  Ilmiah  Jophus: Journal of Pharmacy UMUS , 2 (1), 21–27. Maulana, I., Hasanah, A. U., Tyas, R., & Rizkita, A. D. (2022).
Uji  Efektivitas  Sediaan  Obat  Kumur  Dari  Ekstrak  Etanol Daun  Prasman  ( Eupatorium  Triplinerve Vahl)  Terhadap Streptococcus  mutans. Jurnal  Kesehatan  Mahardika , 9 (1), 28–34. https://doi.org/10.54867/jkm.v9i1.96
Mere, J. K., Bintang, M., & Safithri, M. (2021). Antibacterial Effectiveness  of Syzygium  cumini (L.)  Skeels  Leaves  to Escherichia  coli pBR322. Indo.  J.  Chem.  Res. , 9 (1),  8–14. https://doi.org/10.30598//ijcr.2020.9-jan
Muchtaromah,  B.,  Safitri,  E.  S.,  Fitriasari,  P.  D.,  & Istiwandhani, J. (2020). Antibacterial activities of Curcuma mangga val.  extract  in  some  solvents  to staphylococcus aureus and Escherichia  coli. AIP  Conference  Proceedings , 2231 , 1–7. https://doi.org/10.1063/5.0002490 Muslimin,  C.,  V.  R.,  Yogiswara,  W.  D.,  Septiningrum,  A., Budiastuti,  A.,  &  S.,  I.  K.  (2018).  In  vitro  antifungal susceptibility of Malassezia spp. to azole drugs. Journal of Pakistan Association of Dermatologists , 28 (4), 502–506.
Parbuntari, H., Prestica, Y., Gunawan, R., Nurman, M. N., & Adella,  F.  (2018).  Preliminary  Phytochemical  Screening (Qualitative Analysis) of Cacao Leaves ( Theobroma Cacao L.). EKSAKTA , 19 (2), 40–45. https://doi.org/10.24036/eksakta/vol19-iss02/142
Park, M., Cho, Y. J., Lee, Y. W., & Jung, W. H. (2020). Genomic
Multiplication  and  Drug  Efflux  Influence  Ketoconazole Resistance in Malassezia restricta. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology , 10 .
https://doi.org/10.3389/fcimb.2020.00191
Permataningrum, N. I., Dewi, L. R., & Prihanti, A. M. (2019). Daya  hambat  ekstrak  Daun  Kakao  ( Theobroma  cacao L.) terhadap pertumbuhan Candida albicans . e-Journal Pustaka Kesehatan , 7 (3), 142–146.
Prastiyanto, M. E., Rohmah, N., Efendi, L., Arifin, R., Wardoyo, F.  A.,  Wilson,  W.,  Mukaromah,  A.  H.,  Dewi,  S.  S.,  & Darmawati, S. (2021). Antifungal activities of the rhizome extract  of  five  member  zingiberaceae  against candida albicans and trichophyton  rubrum. Biodiversitas , 22 (3),
1509–1513. https://doi.org/10.13057/BIODIV/D220355 Putra, G. M. D., Satriawati, D. A., Astuti, N. K. W., & Yadnya- Putra,  A.  A.  G.  R.  (2018).  Standarisasi  dan  skrining fitokimia  ekstrak  etanol  70%  Daun  Jeruk  ( Citrus amblycarpa (Hassk.) Osche). Jurnal Kimia , 12 (2), 187–194. Rachmawaty,  Mu’Nisa,  A.,  Hasri,  Pagarra,  H.,  Hartati,  & Maulana,  Z.  (2018).  Active  Compounds  Extraction  of Cocoa  Pod  Husk  ( Thebroma  Cacao l.)  and  Potential  as Fungicides. Journal of Physics: Conference Series , 1028 (1). https://doi.org/10.1088/1742-6596/1028/1/012013 Ramayani,  S.  L.,  Sandiyani,  R.  P.,  &  Dinastyantika,  V.  O.
(2020).  Pengaruh  perbedaan  bagian  tanaman  terhadap kadar total fenolik dan kadar total flavonoid ekstrak talas ( Colocasia  esculenta L). Media  Farmasi  Indonesia , 15 (2), 1611–1616.
Ramschie, L. M. L., Suling, P. L., & Siagian, K. V. (2017). Uji Konsentrasi  Hambat  Minimum  (KHM)  Ekstrak  Daun Mengkudu ( Morinda citrifolia L.) terhadap Candida albicans Secara In Vitro. Jurnal e-Gigi (eG) , 5 (2), 184–189.
Riwanti, P., Izazih, F., & Amaliyah. (2020). Artikel Penelitian Pengaruh  Perbedaan  Konsentrasi  Etanol  pada  Kadar Flavonoid Total Ekstrak Etanol 50,70 dan 96% Sargassum polycystum dari Madura. J-PhAM Journal of Pharmaceutical Care Anwar Medika , 82 (2), 2654–8364.
Rori, B. N. D., Khoman, J. A., &  Supit, A. S. R. (2018). Uji Konsentrasi  Hambat  Minimum  Ekstrak  Daun  Gedi ( Abelmoschus  manihot L.  Medik)  terhadap  Pertumbuhan Streptococcus mutans. Jurnal e-Gigi (eG) , 6 (2), 83–90.
Rustiani, E., Fitriani, A., & Wardatun, S. (2021). Analysis of Flavonids and Terpenoids in Ethanol Extract of Colocasia esculenta L. (Schoot) Stalk and Leaves. Journal of Tropical
Pharmacy
and Chemistry , 5 (4), 359–364. https://doi.org/10.25026/jtpc.v5i4.349
Sabdoningrum, E. K., Hidanah, S., Chusniati, S., & Soeharsono. (2021). Characterization and Phytochemical Screening of Meniran  ( Phyllanthus  niruri Linn)  Extract’s  Nanoparticles Used  Ball  Mill  Method. Pharmacognosy  Journal , 13 (6), 1568–1572. https://doi.org/10.5530/pj.2021.13.200
Sadik, F., & Zulfian Disi, M. A. (2023). Standarisasi Parameter
Spesifik Ekstrak Etanol Daun Jarak Pagar ( Jatropha Curcas L) sebagai Vasorelaxan. Journal Syifa Sciences and Clinical
Research , 5 (1), 54–62. https://doi.org/10.37311/jsscr.v5i1.18187
Santoso,  U.,  Utari,  M.,  &  Marpang,  M.  P.  (2020).  Aktivitas antibakteri  dan  antijamur  ekstrak  Batang  Akar  Kuning ( Fibraurea  chloroleuca Miers)  terhadap Escherichia  coli, Staphylococcus  aureus dan Candida  albicans. Jurnal Kesehatan  Bakti  Tunas  Husada:  Jurnal  Ilmu  Keperawatan, Analis Kesehatan dan Farmasi , 20 (2), 194–208.
Sartika,  G.  P.  (2022).  Pengaruh  variasi  konsentrasi  gula terhadap  derajat  keasaman  dan  aktivitas  antioksidan Kombucha  Daun  Kakao  ( Theobroma  cacao L.). Jurnal Inovasi Pendidikan dan Sains , 3 (2), 37–40.
Saunte, D. M. L., Gaitanis, G., & Hay, R. J. (2020). Malassezia- Associated  Skin  Diseases,  the  Use  of  Diagnostics  and Treatment.  Dalam Frontiers  in  Cellular  and  Infection Microbiology (Vol.  10).  Frontiers  Media  S.A. https://doi.org/10.3389/fcimb.2020.00112
Senduk, T. W., Montolalu, L. A. D. Y., & Dotulong, V. (2020). Rendemen  ekstrak  air  rebusan  Daun  Tua  Mangrove ( Sonneratia  alba ). Jurnal  Perikanan  dan  Kelautan  Tropis ,
11 (1),
9–15. https://ejournal.unsrat.ac.id/index.php/JPKT/index Septiani, D. A., Prabowo, W. C., & Rusli, R. (2021). Aktivitas antibakteri ekstrak Daun Lintut ( Hemigraphis sp) terhadap bakteri
Eschericia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis , dan Salmonella typhi. Proceeding of Mulawarman Pharmaceuticals Conferences , 62–67.
Singh Parihar, A., Kumar, V., Sinha, A., Sharma, S., & Ambika Singh  Parihar,  C.  (2019).  Characterization  of Malassezia furfur and its control by using plant extracts. International Journal of Chemical Studies , 550 (5), 550–553.
Supriadin,  A.,  Juliani,  H.,  &  Tanyela,  N.  (2021).  Isolation flavonoid compound chrysoeriol from ethyl acetate extract of  zaitun  leaves  ( Olea  europaea ). Journal  of  Physics:
Conference Series , 1869 (1), 1–7. https://doi.org/10.1088/1742-6596/1869/1/012052
Tranggono, Firnanda, L. A., Nurfiyanti, W. P., As Zahara, A. F.,
Angelina, V., & Nagara, N. P. (2023). Faktor-faktor yang mempengaruhi  rendemen  Tebu  yang  masih  belum memenuhi  kebutuhan  gula  nasional. AZZAHRA  Scientific Journal of Social Humanities , 1 (1), 63–71.
Urban, K., Chu, S., Scheufele, C., Giesey, R. L., Mehrmal, S., Uppal, P., & Delost, G. R. (2021). The global, regional, and national burden of fungal skin diseases in 195 countries and territories: A cross-sectional analysis from the Global Burden of Disease Study 2017. JAAD International , 2 , 22– 27. https://doi.org/10.1016/j.jdin.2020.10.003
Viogenta, P., Susanti, L., & Megasari, L. (2023). Antibacterial Activity and Bioautography of the Chloroform Fraction of Morel  Berry  ( Physalis  angulata L.)  Root  Against Staphylococcus  epidermidis and Pseudomonas  aeruginosa . Journal  of  Multidisciplinary  Applied  Natural  Science , 3 (1), 90–99. https://doi.org/10.47352/jmans.2774-3047.148 Wang,  K.,  Cheng,  L.,  Li,  W.,  Jiang,  H.,  Zhang,  X.,  Liu,  S.,
Huang, Y., Qiang, M., Dong, T., Li, Y., Wang, J., Feng, S.,
& Li, H. (2020). Susceptibilities of Malassezia strains from pityriasis versicolor, Malassezia folliculitis and seborrheic dermatitis  to  antifungal  drugs. Heliyon , 6 (6),  1–7. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2020.e04203
Yanthi, V., Mahyarudin, M., & Rialita, A. (2022). Antifungal Activity  of  Endophytic  Bacteria  isolated  from  Pegagan ( Centella asiatica L.) for Inhibition the Growth of Malassezia furfur . Jurnal Biologi UNAND , 10 (1), 23. https://doi.org/10.25077/jbioua.10.1.23-32.2022
Citation Format : Lestari, S. M., Camelia, L., Rizki, W. T., Pratama, S., Khutami, C., Amelia, A., Rahmadevi, & Andriani, Y. (2024). Phytochemical Analysis and Determination of MIC and MFC of Cacao Leaves Extract ( Theobroma  cacao L.)  against Malassezia  furfur . Jurnal  Jamu  Indonesia,  9 (2),  55–66. https://doi.org/10.29244/jji.v9i2.316