Online : http://ejurnal.setiabudi.ac.id/ojs/index.php/farmasi-indonesia
Deteksi Molekuler Ekson 3 Gen Beta Globin pada Pasien Beta Talasemia Mayor di RSUD DR. Soeroto Ngawi menggunakan Metode Polymerase Chain Reaction- Single Strand Conformation Polimorfism
Molecular Detection of Exon 3 of Beta Globin Gene from Thalassemia Beta Major Patients in RSUD DR. Soeroto Ngawi using Polymerase Chain Reaction –Single Strand Conformation Polimorfism Method
Choirul Huda 1 , Ana Indrayati 2 , Elfahmi 3
1 STIKES Karya Putra Bangsa, Jl. Raya Tulung Agung, Blitar Km. 04,
2 Fakultas Farmasi, Universitas Setia Budi Surakarta, Jl. Letjen Sutoyo, Mojosongo, Surakarta-57127,
3 Sekolah Farmasi, Insitut Teknologi Bandung, Jl. Ganesa No.10 Bandung-40132 email: hudacoy85@gmail.com

## Abstrak
Talasemia  merupakan  penyakit  genetik  yang  menyebabkan  gangguan  sintesis  rantai globin,  komponen  utama  molekul  hemoglobin.  Sintesis  rantai  globin  yang  tidak  seimbang menyebabkan penurunan produksi sel darah merah.
Penelitian ini bertujuan mengetahui adanya mutasi pada ekson 3 gen beta globin pasien talasemia  menggunakan  metode  PCR.  Sebanyak  5  sampel  diisolasi  DNAnya  dan  dilanjutkan amplifikasi menggunakan primer forward 8 dan primer reverse 9 dengan target sebesar 214 bp. Hasil  amplifikasi  dielektroforesis,  disekuensing  dan  dianalisis  jenis  mutasinya  dengan  metode SSCP.
PCR-SSCP  dapat  digunakan  untuk  menganalisis  terjadinya  mutasi  pada  ekson  3  gen beta  globin.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa,  dari  kelima  sample  yang  dianalisa  tidak ditemukan mutase pada ekson 3 gen beta globin.
Kata kunci : talasemia, exon 3, PCR-SSCP

## Abstract
Talasemia  is  a  genetic  disease  that  causes  globin  chain  synthesis  disorder,  a  major component  of  the  hemoglobin  molecule.  With  the  synthesis  of  unbalanced  globin  chains  will decrease the production of red blood cells.
This  study  aims  to  determine  the  presence  of  mutations  in  exon  2  gene  beta  globin thalassemia patients using PCR method, where 5 samples in DNA isolation and continued PCR amplification, the amplification result of electrophoresis region 2 beta globin gene Region II is the result of amplification of primary 4 and primer primer reverse 5 with a target of 350  bp, on PCR there is amplification or doubling of the desired DNA sequence based on the primary selection for the reaction, the PCR product of each of these regions which is subsequently performed by SSCP.
PCR-SSCP could analysis the mutation in exon 3 beta globin genes. In the PCR-SSCP result, there was no mutation in region 4 exon 3 in five samples but probably there was mutation in another regions.
Keywords: thalassemia, beta thalassemia, pcr

## PENDAHULUAN
Talasemia  merupakan  penyakit genetik  yang  menyebabkan  gangguan
sintesis  rantai  globin,  komponen  utama molekul  hemoglobin  (Hb).  Eritrosit mengandung hemoglobin yang tersusun
atas  heme  dan  globin.  Hemoglobin dewasa atau HbA ( α2β2) terdiri atas dua tipe  protein  globin  yaitu  alfa  dan  beta. Penurunan  sintesis  protein  globin  akan memicu  munculnya  gejala  talasemia. Penurunan  jumlah  alfa-globin  yang disebabkan oleh mutasi gen hemoglobin alfa  (HBA)  pada  kromosom  16  disebut alfa-talassemia sedang penurunan pada b-globin  oleh  mutasi  gen  hemogoblin beta  (HBB)  pada  kromosom  11  akan berakibat pada beta-talasemia.
Prevalensi  beta-talasemia  di  Indonesia lebih  tinggi  dibanding  dengan  alfa- talasemia  (Nur  Afni  Suraya  B,  2015). Penderita  talasemia  yang  melakukan transfusi  darah  secara  rutin  dapat meningkatkan  zat  besi  dalam  tubuh (Weatherall,1997). Salah satu cara yang sering  digunakan  untuk  mengetahui pembawa  sifat  beta-talasemia  adalah dengan  analisis  hematologi.  Pembawa sifat beta-talasemia dapat dilihat dengan gejala  mikrositik  dan  penurunan  jumlah Hb  pada  eritrosit  (Cao  dan  Galanello, 2010).  Metode  PCR-SSCP  sebagai metode  untuk  mendeteksi  mutasi  pada pasien beta-talasemia mayor. Metode ini telah  dikembangkan  untuk  mendeteksi adanya  mutasi  pada  pembawa  sifat talasemia  (Priyambodo,  2014;  Onggo, 2014). Individu yang terdiagnosa individu  beta-talasemia mayor  di RSUD Dr. Soeroto Kabupaten Ngawi dilakukan pemeriksaan  Hb  elektroforesis  untuk penentuan  diagnosanya  dan  belum adanya  pemeriksaan  molekuler  untuk mengetahui  jenis  dan  letak  mutasi. Analisis  PCR-SSCP  terhadap  individu beta-talasemia menunjukan adanya
mutasi pada gen beta globin (Priyambodo,    2014).  Sehubungan dengan  hal  tersebut,  maka  tujuan  dari peneltitian ini adalah mengetahui mutasi pada  ekson  3  gen  beta  globin  pada pasien    pada  pasien  beta-talasemia mayor dengan metode PCR-SSCP.

## METODE PENELITIAN Alat dan Bahan
1. Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi  serangkaian  alat  gelas  berupa gelas  Beker,  gelas  ukur,  Erlenmeyer, pipet  tetes,  corong,  pengaduk,  pipet ukur, pipet  pump , microcentrifuge  tube ( microtube )  1,5  mL  dan  0,2  mL, mikropipet,  neraca  analitik,  vorteks sentrifuga, inkubator, microwave, lemari pendingin,  rangkaian  alat  elektroforator horizontal,
UV
transiluminator, thermocycler , fluorometer dan kamera
2. Bahan
Bahan  yang  digunakan  adalah  10 sampel  darah  pasien  talasemia  yang rutin  melakukan  tranfusi  di  RSUD  Dr. Soeroto  Kabupaten  Ngawi,  disimpan dalam tube  BD  vacutainer EDTA  dan satu sampel normal atau kontrol negatif digunakan  sebagai  pembanding  dalam penelitian. Bahan yang digunakan pada penelitian  ini  meliputi  akuades  steril, Geneaid  Genomic  DNA  Mini  Kit (Blood/Cultured  Cell), PCR master  mix KAPA 2G fast ready mix, primer forward dan reverse spesifik  untuk  pada  gen beta globin,  DNA loading  dye, Geneaid 100  bp  plus  DNA  ladder,  fluoroceft, gel agarosa, etanol absolut 96%, buffer Tris Borat  EDTA  (TBE), loading  buffer (campuran bromo phenol blue ,
formamide, EDTA, gliserol), gel poliakrilamid (acrylamide:bis-acrylamide 29:1) dan etidium bromida.
Jalannya Penelitian

## 1.  Pengambilan Sampel
Sampel darah diperoleh dari pasien beta thalasemia mayor yang rutin melakukan transfusi di RSUD Dr. Soeroto kabupaten  Ngawi.  Sampel  darah disimpan dalam tabung vacutaine EDTA 3 ml dan dimasukan dalam freezer-20 0 C. 1.  Isolasi DNA
Isolasi  DNA  sampel  dilakukan  dengan GSYNC TM DNA  Ekstraction  kit  sesuai dengan  protocol  kit.  Langkah-langkah isolasi DNA sebagai berikut
a. Lisis Sel
Sebanyak  200 µl sampel  darah  diambil dan dimasukkan dalam tabung
microtube 1,5 ml dan menambahkan 20 µl  Proteinase-K  dan  di  inkubasi  pada suhu  60 ℃ selama  5  menit,  kemudian ditambahkan GB buffer sebanyak 200 µl dan  dihomogenkan  dengan  vortex. Selanjutnya  sampel  diinkubasi  pada suhu  60 ℃ selama  5  menit,  selama inkubasi microtube dibolak-balik selama 2 menit.
b. Pengikatan DNA Setelah inkubasi selesai, sebanyak 200 µl  etanol  absolut  ditambahkan  dalam sampel lalu divorteks kemudian dipindahkan  dalam purification  columm (kolom  GD  ) yang  diletakakan  dalam tabung  pengumpul  berukuran  2  ml.
Sampel  kemudian  dipindahkan  dalam kolom  GD.  Sampel  selanjutnya  di sentrifugasi  pada  12.000  rcf  selama  5 menit kemudian larutanan hasil sentrifugasi  dibuang  dan kolom  GD ditempatkan  pada    tabung  pengumpul yang baru.
c. Pencucian
Sebanyak  400  µl wash  buffer 1 ditambahkan ke  dalam  kolom  GD  dan disentrifugasi pada 12.000 rcf selama 2 menit.  Larutan  sisa  pencucian  pada tabung  pengumpul  dibuang.  Kolom  GD dimasukan ke dalam tabung pengumpul yang baru dan ditambahkan 600 µl wash buffer II  dan  selanjutnya  disentrifugasi pada  12.000  rpm  selama  2  menit. Larutan  sisa  pencucian  dalam  tabung pengumpul  dibuang,  kemudian  kolom GD disentrifugasi lagi dengan kecepatas 12.000 rpm selama 4 menit.
d. Pengelusian
Setelah selesai, kolom GD ditempatkan dalam  tabung microtube 1,5  ml,
kemudian ditambahkan 75 µl buffer elusi yang  diinkubasi  pada  suhu  60 0 C.
Selanjutnya  larutan  diinkubasi  pada suhu  kamar  selama  5  menit  dan disentrifugasi pada 12.000 rcf selama 2 menit. Proses elusi diulangi 2 kali untuk memaksimalkan  pelepasan  DNA  dari silica  gel  pada kolom  GD .  Selanjutnya, kolom GD dikeluarkan dari microtube 1,5 mL  dan  disimpan  di  dalam  lemari pendingin.
2. Fluorometer  dan  Elektroforesis DNA
Pada  penelitian  ini  digunakan  uji kuantitatif  dengan  metode  fluorometri, Qubit  fluorometer  adalah  perangkat kuantifikasi DNA yang didasarkan pada intensitas fluoresensi dari label fluorosen yang  mengikat  DNA  beruntai  ganda (sdDNA)  (Nakayama et  al. 2016),
selanjutanya skema fluoromrter disiapkan microtube berisi sampel dan 2 microtube  tambahan  untuk  standard atas  dan  bawah  (nol).  Selanjutnya dilakukan pembuatan larutan uji (Working  Solution)  dengan  cara  : Larutan dihomogenasikan dengan vortex selama 2-3 detik, dipastikan tidak ada  gelembung  terbentuk.  Larutan standard dibuat dengan cara Sebanyak 1-20  μL  sampel  dicampurkan  dengan 199-180 μL larutan uji untuk mendapatkan  larutan  dengan  volume akhir  200  μL.  Microtube  berisi  sampel divorteks  selama  2-3  detik  tanpa terbentuk gelembung kemudian diinkubasi  pada  suhu  ruang  selama  2 menit. Setelah itu, dilakukan pembacaan dengan  mesin  Qubit  yang  telah dinyalakan.  Larutan  uji  dibaca  terlebih
dahulu  selanjutnya  sampel.  Microtube dimasukkan  pada  Qubit  fluorometer kemudian  ditekan  “Read”  dan  ditekan “Save” untuk menyimpan data.
Selanjutnya,  uji  kualitatif  dengan elektroforesis  pada  gel  agarosa  0,8%. Mula-mula sebanyak 0,32 gram agarosa ditimbang kemudian ditambahkan 40 mL Tris  Borate-EDTA  (TBE)  1X  dan dilarutkan  sampai  homogen.  Larutan tersebut  dipanaskan  dalam  microwave selama  30  detik.  Setelah  sedikit  dingin ditambahkan fluoroceft sebanyak  2  μL dan  dilarutkan  hingga  homogen.  Gel dituang  pada  cetakan  yang  telah  diberi sisir  untuk  sumuran.  Gel  didiamkan hingga  mengembang  lalu  sisir  dilepas dan  gel  dipindahkan  ke  dalam  alat elektroforesis dan ditambahkan dengan TBE 1x hingga gel terendam.
Sumuran  pertama  diisi  sebanyak 3,5 μL marker DNA berupa 100 pb. Hasil isolasi DNA diambil sebanyak 5 μL dan dicampur dengan 1 μL (6x) loading dye . Campuran  DNA  dan loading  dye dimasukkan dalam sumuran gel agarosa.  Elektroforesis  DNA  dilakukan dengan  menghubungkan  katoda  dan anoda  pada  sumber  tegangan  100  volt selama 15 menit. Pengamatan pita DNA dilakukan  dengan  menggunakan  UV transiluminator.
3. Amplifikasi  Region  IV  Gen  β- globin
Hasil isolasi DNA akan digunakan sebagai cetakan pada proses amplifikasi dengan  metode polymerase  chain reaction (PCR). PCR dilakukan berdasarkan  prosedur  KAPA  Biosystem (2013).  PCR  mix  dibuat  dengan
menggunakan PCR
Master mix
KAPA2G fast ready mix, Setelah semua komponen dimasukan ke dalam tabung PCR,  selanjutnya  dimasukan  ke  dalam mesin thermal  cycler .  Kondisi  siklus PCR  yang  digunakan  untuk  amplifikasi gen  β-globin  adala  sebagai  berikut:
(Pryambodo, 2014)
4. Elektroforesis  Hasil    Amplifikasi PCR Hasil  PCR  dielektroforesis  pada gel  agarosa  dengan  konsentrasi  2%. Sebanyak  0,8  gram  agarosa  ditimbang kemudian  ditambahkan  100  mL  Tris Borate-EDTA  (TBE)  1X  dan  dilarutkan sampai  homogen.  Larutan  tersebut dipanaskan dalam microwave selama 50 detik. Setelah sedikit dingin ditambahkan fluoroceft sebanyak 3,5 μL dan  dilarutkan  hingga  homogen.  Gel dituang  pada  cetakan  yang  telah  diberi sisir  untuk  sumuran.  Gel  didiamkan hingga  mengembanglalu  sisir  dilepas dan  gel  dipindahkan  ke  dalam  alat elektroforesis dan ditambahkan dengan TBE 1x hingga gel terendam. Sumuran  pertama  diisi  dengan sebanyak 3 μL marker DNA berupa 100 pb. Sampel diambil sebanyak 4 μL dan dimasukkan dalam sumuran gel agarosa.  Elektroforesis DNA  dilakukan dengan  menghubungkan  katoda  dan anoda  pada  sumber  tegangan  50  volt. Elektroforesis dihentikan setelah migrasi DNA  mencapai  2/3  panjang  gel  yang ditunjukkan dengan warna biru pada gel agarosa. Pengamatan pita DNA
dilakukan  dengan  menggunakan  UV Transiluminator.
5. Analisis PCR-SSCP
Analisis polymerase  chain  reaction- single strand conformation
polymorphism (PCR-SSCP)  dilakukan berdasarkan  metode  Fitriani  (2009) dengan modifikasi sebagai berikut :
a. Pembuatan gel Larutan gel
disiapkandengan Erlenmeyer  125  ml  yang  terdiriatas  5,6 ml aquabides 2,6 ml, poliakrilamid 30% (akrilamid : bisaakrilamid 29:1), 1 ml TBE 10x,  0,68  ml  gliserol  87%,  45  μl ammonium  persulfat  10%,  dan  10  μl tetramethyl ethylene diamine (TEMED). Setelah  TEMED  ditambahkan,  larutan gel  dihomogenkan,  selanjutnya  segera dituangkan dengan menggunakan mikropipet  ke  dalam  cetakan.  Sisir dipasang  pada  cetakan  dan  gel dibiarkan selama 60 menit.
Setelah  60  menit,  gel  dipasang  pada tangki elektroforator vertikal dan ditambahkan TBE 1,5x hingga mencapai batas kolom. Sisir diangkat dengan hati- hati  dan  dilakukan pre-running selama 20 menit.
b. Penyiapan sampel Sebanyak 10 μl produk PCR ditambahkan  15  μl loading  buffer dihomogenasi dengan
vortex.
Campuran  sampel  dan loading  buffer dipanaskan dalam waterbath pada suhu 95 0 C selama 10 menit untuk denaturasi.
Setelah  proses  denaturasi,  sampel segera  dimasukkan freezer suhu  -20 0 C selama  10  menit.  Setelah  proses thawing,  sebanyak  25  μl  campuran tersebut  dimasukkan  kedalam  masing- masing  sumuran  gel.  Elektroforesis
dilakukan dengan TBE 0,5x pada 100V 50mA selama 100 menit.
c. Pewarnaan
Gel  dilepas  dari  gelas,  lalu  diencerkan dalam  larutan etidium  bromida selama 45  menit  dan  diamati  dengan  UV transilluminator. Hasil didokumentasikan dengan kamera digital.
d. Interpretasi hasil Interpretasi  data  dilakukan  dengan mendeskripsikan  pita  hasil  SSCP dengan  membandingkan  perbedaan jarak  migrasi  pita  ( Single  strand  DNA ) subyek  yang  diteliti  dengan  individu normal.  Individu  yang  memiliki  genotip homozigot,  baik  homozigot  dominan maupun  resesif    menunjukkan  dua  pita DNA  pada  gel,  sedangkan  individu heterozigot menunjukan tiga atau empat pita DNA.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## A. Identifikasi Sampel
Sampel pada penelitian ini adalah darah pasien  beta  talasemia  mayor  di  RSUD Dr.Soeroto,  Kabupaten  Ngawi,  Jawa
Timur,
pengambilan sampel
menggunakan prosedur yang memenuhi kelayakan etik atau Ethical Clearance .
B. Pengambilan Sampel
Sampel  darah  diambil  dari  5 (sembilan) pasien beta talasemia mayor yang rutin melakukan transfusi darah di RSUD  Dr.  Soeroto,  Kabupaten  Ngawi. Pengambilan  sampel  dilakukan  di Instalasi Laboratium RSUD Dr. Soeroto, Kabupaten  Ngawi.  Sampel  darah  yang telah  diambil  disimpan  dalam  tabung vacutaine EDTA  3  ml  dan  dimasukan dalam freezer-20 0 C.

## C. Hasil Isolasi DNA
Lima  sampel  dilakukan  isolasi DNA  menggunakan gSYNC TM DNA Ekstraction  (Blood  Protocol  Prosedur) . Isolasi DNA dilakukan dengan mengekstraksi  DNA  dari  darah  beku yang telah ditambahkan zat antikoagulan  (EDTA).  Hasil  uji  kualitatif dan kuantitatif DNA genom dapat dilihat di gambar 1. Uji kualitatif DNA dilakukan dengan running elektroforesis  pada  gel agarosa  dengan  konsentrasi  0,8%. Metode  fluorometri  di  pakai  untuk  uji kalitatif  DNA  sehingga  dapat  dietahui konsentrasi DNA hasil isolasi.
Gambar 1. Hasil elektroforesis isolasi DNA sampel penelitian
Tabel 1. Konsentrasi DNA sampel
Hasil  elektrofooresis  kesembilan sampel  memperlihatkan  pita  DNA  yang sangat  jelas,  menunjukkan  keberadaan DNA dan keberhasilan isolasi DNA yang dilakukan. Selain 5 sampel diatas, satu sampel  normal  (N)  dan  satu  sampel control positif (K+) juga dilakukan isolasi, namun  tidak  pada  hasil  elektroforesis yang berbeda. Sampel normal digunakan  sebagai  kontrol  negative mutasi.  Sampel  K+  yang  digunakan merupakan  sampel  darah  pasien talasemia yang telah diketahui mutasinya  melalui  sekuensing  DNA.
Kedua  kontrol  ini  digunakan  untuk mengevaluasi  setiap  tahapan  metode dari uji molekuler yang akan dilakukan.
Ukuran genom manusia berdasarkan International Human Genome Sequencing Consortium
secara keseluruhan diestimasikan 2.916 gb,  dengan  ukuran  molekul  DNA  pada 23 kromsosomnya berkisar dari 21,8 mg (kromosom  Y)  hingga  2692,9  mg (kromosom  1)  dan  molekul  DNA  pada mitokondria  yang  berukuran  16.569  bp (Lander et  al., 2001).  Dikarenakan ukuran  DNA  nya  yang  besar  sehingga pada  hasil  elektroforesis  pita  DNA genom  sampel  terlihat  jauh  diatas marker . Ketebalan
pita hasil
elektroforesis yang
beragam menunjukkan  perbedaan  konsentrasi hasil isolasi DNA yang dilakukan.
Nilai konsentrasi DNA hasil isolasi sampel  dengan  metode  fluorometri menggunakan Qubit Fluorometer ditampilkan pada Tabel 1.Pada sampel, konsentrasi DNA berkisar 55,2-82 ng/μL. Qubit  Fluorometer  adalah  perangkat kuantifikasi DNA yang didasarkan pada intensitas fluoresensi dari label fluorosen yang  mengikat  DNA  beruntai  ganda (sdDNA) (Nakayama et al. 2016).
Sampel  DNA  menunnjukkan  seri konsentrasi  yang  berbeda.  Setiap  sel diploid  manusia  mengandung  sekitar  6 pg  DNA.  Untuk  isolasi  DNA  dari  darah tepi umumnya diperoleh 30 ng/μL hingga 60  ng/μL  dari  1  ml  darah  yang  berasal dari 5-10 juta leukosit (Baechtel, 1989). Secara umum konsentrasi yang diperoleh  relative  sesuai  referensi diatas.  Perbedaan  konsentrasi  DNA dapat disebabkan karena kualitas darah sampel  yang  berbeda  salah  satunya dikarenakan beda waktu saat penyimpanan darah.
D. Hasil  amplifikasi  region  gen  beta globin
Amplifikasi  perlu  dilakukan  pada region  IV  sebelum  prosedur  SSCP dengan  elktroforesis  vertical  dilakukan. Pembagian  region  pada  penelitian  ini mengacu  berdasarkan  Gupta  and Argawal (2003) dengan hanya 3 region saja yang digunakan yaitu region I, II dan IV.  Pemilihan  3  region  ini  didasarkan atas  keberadaan  daerah  ekson  pada ketiga  region  tersebut.  Mutasi  yang
No  Nama Sampel Konsentrasi (ng/μl) 1 Sampel 1 63,6 2 Sampel 2 68 3 Sampel 3 82 4 Sampel 5 70,8 5 Sampel 6 62
terjadi pada ekson dapat menyebabkan kesalahan translasi pada sintesis asam amino sehingga dapat memberikan efek secara langsung pada rantai beta globin yang disintesis. Proses amplifikasi atau perbanyakan  DNA  dilakukan  dengan metode PCR.
Amplifikasi  atau  penggandaan sekuen DNA yang diinginkan berdasarkan  pemilihan primer untuk reaksi. Penggandaan DNA secara alami terjadi  pada  organisme  melalui  proses replikasi  DNA  dengan  DNA  helikase berperan  dalam  membuka  pita  ganda DNA  sehingga  DNA  polimerase  dapat memulai penggandaan. Amplifikasi DNA dilakukan dengan menggunakan primer untuk melipatgandakan daerah ekson II pada  gen  HBB  penyandi  beta  globin. DNA  hasil  isolasi  kemudian  dijadikan template  dalam  proses  amplifikasi. Amplifikasi  dilakukan  pada  daerah  IV gen beta globin, karena daerah tersebut merupakan tempat ekson III. Amplifikasi menghasilkan  ukuran  aplikon  214  pb, yang  meliputi  daerah  3’ Untranslated Region (UTR), seluruh daerah ekson III dan  sebagian  daerah  intron  II  atau
Intervening Sequence (IVS) II gen beta globin.  Produk  amplifikasi  kemudian dianalisis  dengan  elektroforesis  pada agarosa konsentrasi 0,8% untuk memastikan  ada  tidaknya  amplikon target.
Hasil  produk  PCR  dari  region  IV selanjutnya dilakukan SSCP .Visualisasi hasil  produk  PCR  pada  region  IV ditampilkan pada Gambar 2.
Pada  gambar  2  menunjukkan  hasil amplifikasi  dari  region  IV  gen  beta globin.  Region  IV  merupakan  hasil amplifikasi  dari  primer  forward  8  dan primer reverse 9 dengan target yaitu 214 bp.  Region  ini  mencakup  sebagian daerah intron 2, seluruh daerah ekson III dan sebagian daerah 3’ UTR.
E. Hasil SSCP region gen beta globin
Single Strand Conformation
Polymorphism atau  SSCP  merupakan teknik  untuk  mendeteksi  mutasi  gen. SSCP  digunakan  untuk  melihat  pola migrasi  untai  tunggal  DNA  pada  gel poliakrilamid. Setiap amplikon DNA pada region IV dipisahkan dalam gel
Gambar 2. Hasil elektroforesis region IV gen beta globin pada sampel
poliakirlamid selanjutnya diwarnai dengan ethidium bromide. Prinsip dasar dari  SSCP  adalah  fakta  bahwa single strand DNA (ssDNA) memiliki konformasi tertentu. Perubahan konformasi  karena  adanya  perubahan basa pada sekuen DNA dapat menyebabkan perbedaan migrasi ssDNA  pada  elektroforesis  sehingga DNA  wild-type  atau  normal  dan  DNA yang mengalami mutasi akan
menunjukkan  pola  pita  yang  berbeda. Tahapan  analisis  SSCP  sendiri  terdiri dari  :  1). Amplifikasi  target  DNA  dalam hal ini yaitu region IV gen beta globin, 2). Denaturasi  dsDNA  dari  produk  PCR menjadi  ssDNA  dengan  penambahan agen  denaturasi  (formamida)  dan pemanasan,  3).  Pendinginan  hasil denaturasi  DNA  yaitu  ssDNA  untuk memaksimalkan self-annealing
sehingga membentuk konformasi
tertentu  4).  Deteksi  perbedaan  migrasi konformasi  ssDNA  pada  elektroforesis kondisi  non denaturasi  (Dong  dan Zhu, 2005).  Elektroforesis  yang  dilakukan adalah Polyacrilamide Gel Electroforesis konsentrasi 39,7% dengan elektroforator vertical. Analisis hasil SSCP pada region IV  yang  didalamnya  juga  termasuk bagian  ekson  III  ditampilkan  pada gambar 3.
Pada  region  IV  gen  beta  globin  yang telah  dilakukan  analisis  SSCP,  seluruh sampel  dan  sampel  K+  menunjukkan dua pita dengan pola yang sama dengan kontrol  negative  (sampel  N).  Hal  ini menunjukkan berdasarkan analisis SSCP  tidak  ditemukan  indikasi  mutasi pada sekuen region tersebut.
Berdasarkan  gambar  4,  pada  seluruh sampel  bahkan  pada  sampel  K+  tidak ada indikasi mutasi.
Gambar 3 Hasil SSCP region IV gen beta globin pada sampel pola pita pada gel poliakrilamid.
Gambar 4.Hasil SSCP region IV gen beta globin pada sampel skema pola pita gel poliakrilamid.

## KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan  dapat  ditarik  kesimpulan bahwa metode PCR-SSCP tidak mendapatkan mutasi pada region IV dan pada ke lima sampel tidak terjadi mutasi gen  pada  daerah  ekson  3  tapi dimungkinkan  terjadi  mutasi  diregion lainya.

## DAFTAR PUSTAKA
Dong  Y.  Zhu  H.  2005.  Single-strand
conformational polymorphism
analysis:  basic,  principle  and routine  practice.  Methods  Mol Med; 108:149-157.
F.  S.  Baechtel,  1989.  The  extraction, purification  and  quantification  of DNA.  in  Proceedings  of  the International  Symposium  on  the
Forensic Aspects of
Anonim,  2008,  Riset  Kesehatan  Dasar
2007,  Jakarta  :  Badan  Penelitian dan  Pengembangan  Kesehatan, Departemen  Kesehatan  Republik
Indonesia.
Lander, E. S., Linton, L. M., Birren, B., et al. 2001.  Initial  sequencing  and analysis  of  human  genome.
Nature, 409: 860-920.
Nur  Afni  Suraya  B,  2015.  Analisis Sekuen  IVS  II  Gen  Beta-Globin pada  Carrier  Beta-Thalassemia.
Universitas Gadjah Mada, 2015
Priyambodo  dan  Handayani,  N.S.N.,
2014,  Deteksi  mutasi  Ekson  2 Gen β-Globin dan Daerah Pengapitnya Pada Pembawa Sifat β-Thalasemia dengan Metode Polymerase Chain Reaction-Singgle Strand Conformation Polymorphism (PCR-SSCP),
Prosiding  Seminar  Nasional  dan Rapat  Tahunan  Bidang  MIPA, Fakultas  MIPA  Institut  Pertanian Bogor.