Online : http://farmasiindonesia.setiabudi.ac.id/
Pengaruh Superoksida Dismutase Rekombinan Staphylococcus equorum Terhadap Viabilitas Sel dan Deposisi Kolagen Pada Sel Fibroblas 3T3 Yang Dipaparkan UVA
Ana Indrayati 1 , Sukmadaja Asyarie 2 , Tri Suciati 2, dan Debbie Soefie Retnoningrum 2* 1 Fakultas Farmasi Universitas Setia Budi Surakarta , Jalan Letjen Sutoyo Mojosongo Surakarta, 57127
2 Sekolah Farmasi Institut Teknologi Bandung, Jalan Ganesha 10 Bandung, 40132
* E-mail: retnoningrum@indo.net.id

## Abstrak
UVA merupakan  faktor  eksternal  utama penyebab  penuaan kulit.  UVA meningkatkan produksi  matrik  metalloproteinase  (MMP)  yang  mendegradasi  kolagen  tidak  langsung  melalui pembentukan reactive oxygen species. Superoksida dismutase (SOD) mengkatalisis perubahan anion  superoksida  menjadi  hidrogen  peroksida  dan  oksigen. SOD  dapat  digunakan  sebagai komponen  kosmetik  untuk  mencegah  penuaan  kulit. Tujuan  penelitian  ini  adalah,  mengetahui pengaruh rSOD S. equorum dalam meningkatkan deposisi kolagen pada sel fibroblas 3T3 yang dipaparkan UVA.
Penelitian  diawali  dengan  konfirmasi E.  coli BL21(DE3)  yang membawa pJExpress ® 414- sod . Overproduksi rSOD dilakukan dengan IPTG hingga konsentrasi akhir 1 mM selama 4 jam pada  suhu  37  C. Pemurnian  rSOD dilakukan  menggunakan  kromatografi  afinitas  kolom  nikel dengan  gradien  konsentrasi  imidazol  untuk  elusi. Viabilitas  sel ditentukan menggunakan Alamar blue, sedangkan deposisi kolagen dengan Sirius red.
Hasil uji menunjukkan bahwa, paparan UVA selama 45 menit pada sel dengan 4, 8, dan 16 unit  rSOD  tidak mempengaruhi  viabilitas  sel  secara  bermakna. Namun, mampu meningkatkan deposisi kolagen  berturut-turut sebesar 3,02%;  20,03%  dan  35,75%  dibandingkan  dengan sel tanpa  rSOD. Hasil  ini  menunjukkan  bahwa rSOD mempunyai  potensi  sebagai  agen  anti fotoaging .
Kata kunci : rSOD S. equorum, fibroblas 3T3, UVA, viabilitas sel, deposisi kolagen

## Abstract
UVA  is  the  main  external  factors  causing  skin  aging.  UVA  increase  matrix metalloproteinase  (MMP) synthesis that  degrade  collagen indirectly through  reactive  oxygen species.  Superoksida  dismutase  (SOD) catalyzes  the  conversion  of  superoxide  anions  to hydrogen peroxide and oxygen. SOD can be used as a cosmetic’s component to prevent skin aging. The objective of this research to determine rSOD S. equorum ability to increase collagen deposition using fibroblast  3T3 against UVA.
The  research  was  initiated  by  the  confirmation  of  E.  coli  BL21(DE3)  carrying pJExpress®414-sod. rSOD was overproduced in E. coli BL21(DE3) by IPTG induction to a final concentration of 1 mM for 4 hours  at 37  C. rSOD purification was done using an Ni-NTA affinity column with gradient imidazole concentrations for elution. Various concentrations of rSOD was added  to    fibroblast  3T3  cell  culture  after  UVA  irradiation  to  determine  its  role  in  collagen deposition.  The  effect  of  rSOD  was  analyzed  by  fibroblast  viability  using  Alamar  blue and collagen deposition with picro sirius red.
The  results  showed  that  fibroblast  cell  viability  exposed  with  UVA  for  45  minutes  in  the presence  of  4,  8,  and  16  unit  rSOD  was  not  significantly  affected,  however,  the  collagen deposition  was  significantly  increased  about    3.02%; 20.03%  and  35.75%  respectively compared to cell without rSOD. This result indicates that rSOD is a good candidate for an anti photoaging agent.
Key word : rSOD S. equorum, fibroblast 3T3, UVA, cell viability, collagen deposition
Pendahuluan Kulit merupakan organ tubuh terluar  dan  terluas  sebagai  pelindung dari  paparan  sinar  matahari,  infeksi mikroba,  suhu  ekstrim,  dehidrasi,  dan trauma  mekanik (Rabe et  al . 2006).
Kulit  tersusun  atas  tiga  lapisan  yaitu epidermis,  dermis  dan  hipodermis. Pada  lapisan  dermis  terdapat  kolagen, elastin, glikosaminoglikan, dan proteoglikan yang dihasilkan dan disekresikan  oleh  sel  fibroblas  menuju lingkungan  ekstrasel  untuk  menjaga integritas  dan  struktur  kulit (Park & Hwang 2011). UVA  merupakan  faktor eksternal  utama  penyebab  penuaan kulit  (fotoaging)  melalui  pembentukan ROS. Fotoaging ditandai oleh pigmentasi  tidak  merata,  kulit  kering, kasar,  pucat,  berkerut  serta  penurunan kekuatan dan elastisitas (Lyons & Brien 2002).
Mekanisme fotoaging belum diketahui  secara  pasti, diduga  paparan UVA  pada  kulit  memicu  produksi  ROS yang dapat meningkatkan ekspresi gen pengkode matrik metalloproteinase (MMP).  MMP  (EC:3.4.24.X-Y) adalah Zn-protease yang mendegradasi
kolagen,  elastin,  dan  protein-protein lain  di  jaringan  ikat  serta  tulang.  MMP berperan
dalam embriogenesis, penyembuhan luka, angiogenesis,
peradangan,
dan perkembangan kanker. MMP dihasilkan sebagai
zimogen  oleh  sel fibroblas,  keratinosit, endotel, mastosit, eosinophil, osteoblas, makrofag, dan limfosit (Walterova et al . 2006). Aktivitas enzim proteolitik  seperti  serin  protease,  furin dan  plasmin  membantu  menghasilkan MMP  aktif. Aktivitas  MMP  diregulasi oleh tissue inhibitors of matrix
metalloproteinase (TIMP) endogen yang  terdiri  dari  TIMP-1,  2,  3,  dan  4.
Inaktivasi TIMP oleh ROS menginduksi sintesis MMP (Quan et al . 2009).
Tubuh  manusia  memiliki  sistem pertahanan antioksidan untuk melawan dampak  negatif  radikal bebas.  SOD merupakan garis depan sistem pertahanan yang berfungsi mengkatalis dismutasi anion superoksida menjadi hidrogen peroksida dan oksigen.
SOD dikelompokkan  menjadi  empat  tipe berdasarkan  kofaktor  logamnya  yaitu mangan  (MnSOD),  besi  (FeSOD), tembaga-seng  (CuZnSOD)  dan  nikel (NiSOD).  Kemampuan  SOD  untuk mengeliminasi  radikal  bebas  dalam jumlah  yang  berlebih  dimanfaatkan sebagai  bahan  aktif  dalam  sediaan kosmetik untuk mengatasi penuaan dini dan saat ini banyak dilakukan penelitian penggunaan SOD untuk tujuan terapeutik penyakit-penyakit karena tekanan oksidatif. Berdasarkan penelitian sebelumnya Indrayati  et  al  (2014), rekombinan SOD (rSOD) S.  equorum
relatif stabil terhadap pengaruh berbagai  faktor  lingkungan  seperti suhu,  pH,  reduktor,  oksidator,  deterjen, dan  paparan  sinar  UV.  Berdasarkan karakter  tersebut  rSOD S.  equorum sangat  berpotensi  sebagai  bahan  aktif untuk  kosmetik  anti  penuaan  dini, namun mekanisme SOD dalam melindungi  kolagen  dari  paparan  UVA belum  diketahui.  Oleh  karena  itu  perlu dilakukan  penelitian  untuk  mengetahui pengaruh rSOD S.  equroum dalam memberikan perlindungan terhadap kolagen dari  paparan UVA. Parameter yang  akan  ditentukan  adalah  viabilitas
sel  dan  deposisi  kolagen  dari  sel fibroblas  3T3  yang  dipaparkan  UVA in vitro.
Metode Penelitian Alat Peralatan  yang  digunakan  selama penelitian adalah perangkat
elektroforesis Mini Protean II (Bio-Rad), tabung  kultur  sel  25  dan  175  cm 2 (Thermo  Scientific™ Nunc™),    pelat ELISA  96  sumur  ( Nunc-Immuno  ™ MicroWell  ™ ),  tabung  Falcon    15  dan 59  ml  (Thermo  Scientific™ Nunc™), pipet ukur 10 ml (Pyrex ® ), hemositometer  (Neubauer), 24 sumur pelat kultur
jaringan (Thermo
Scientific™ Nunc™), cryotube (Life Technology,  Inc). sentrifuga  (Mikro 200R Allegra X-15R Centrifuge Beckman),  pH  meter  (Mettler  Toledo S20), autoklaf  (ALP  Co.  Ltd.,  Jepang), inkubator goyang 37 ° C (GSL), timbangan  elektrik  (Sartorius  BP3105), lemari  pendingin  4 ° C  (Sharp),  lemari pendingin -20 ° C (Denpoo), lemari pendingin -80 ° C (Life Technology, Inc.), tabung  sentrifugasi  protein  (Beckman DU7500i), sonikator  (Fisher  Sonic Dismembrator  Model  300), inkubator CO 2 (Esco), mikroskop inverted (Olympus  TH4-200),  membran  dialisa (MD  Bio),  tabung  Nanosep  (PALL,  Life Sciences),    jarum    suntik  berbagai ukuran,  membran  mikro  filter  0,45  dan 0,22  µM  (Sartorius  Stedim  Biotech, Jerman),  lampu  spiritus,  lampu  UV  λ 254 dan 365 nm (Vilbert Lourmat-6.LC, Perancis),
Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam  penelitian  ini  adalah  bakteri E.
coli BL21(DE3) yang membawa pJExpress ® 414- sod digunakan  untuk overproduksi  rhybSOD,  Sel lini  BALB/c fibroblas  3T3 (ATCC).  Bahan-bahan kimia  yang  terdiri  dari:  bakto  agar (Difco),    tripton  (Difco),  ekstrak  ragi
(Difco), (Merck), glisin (Promega), IPTG (Sigma),  fenil  metil  sulfonil  florida (PMSF) (Bio Basic, Inc), SDS (Promega), akrilamid-bisakrilamid (Promega),  amonium  persulfat  (APS) (Merck), tris basa (Promega), Coomassie Briliant Blue R-250 (Pharmacia),  marka  protein unstained (Amersham),  kit  pemurnian  protein resin Ni 2+ -NTA (Amersham), NaH 2 PO 4 .H 2 O  (Merck),  imidazol  (Bio Basic  Inc),  asam klorida  (HCl)  (Merck), natrium  hidroksida  (NaOH)  (Merck), metanol  (Merck),  dan  asam  asetat glasial  (Merck).  Albumin  serum  sapi (Invitrogen),  larutan  Bradford  (Biorad), DTT  (Merck),  Dulbecco’s  Modified Eagle’s  Medium  (DMEM)  (Sigma), penisilin-streptomisin
(Invitrogen),
Hanks'  balanced  salt  solution (HBSS) (Invitrogen),  Alamar  Blue ® (Invitrogen), sirius  red  (asam  pikrat, fast  green , direct Red 80, Sigma), tripsin (Invitrogen), FBS (Invitrogen),) (Invitrogen), alkohol 70%, alkohol 95%,
lisol,  aluminiuum  foil,  spiritus,  sarung tangan,  masker,  kertas  tissu,  akuades steril, dan akuadeion steril.

## Jalannya penelitian
Sel  Fibroblas  3T3  yang  digunakan dalam penelitian ini dalam bentuk beku sehingga  sel  harus  dicairkan terlebih dahulu  untuk  mengaktifkan  kembali  sel ( thawing ). Sel fibroblas 3T3 ditumbuhkan  dalam Dulbecco  Modified Eagle Medium (DMEM) yang mengandung    4,5  g/L  D  glukosa,  2
mmol/L L-glutamin, 100 µg/L
streptomisin,  100  unit/L  penisilin,  dan 10%  Fetal  Bovine  Serum  (FBS).  Sel diinkubasi  pada suhu 37 ◦ C  dengan kelembaban  5%  CO 2 selama  72  jam. Setelah  sel  mencapai  kepadatan  80%, sel disubkultur ke dalam 24 well tissue
culture plate . Jumlah sel yang
dimasukkan ke dalam sumur ditentukan dengan  pewarna  Tripan  blue  0,4%
menggunakan  bilik  hitung improved Neuebauer (hemositometer).  Jumlah sel yang dimasukkan ke dalam masing- masing  sumur  adalah  1  ml  kultur  sel dengan konsentrasi akhir 1x10 5 sel/ml. Sel  dipaparkan UVA  selama 45 menit pada jarak  5  cm  kemudian sebanyak 4, 8,  dan  16  U/ml rSOD digunakan untuk mempelajari pengaruh rSOD  terhadap  viabilitas sel dan
deposisi kolagen. Kontrol yang digunakan  adalah sel  fibroblas  3T3 tanpa  rSOD. Viabilitas  sel  ditentukan dengan pereaksi Alamar
blue menggunakan spektrofotometer UV-Vis λ 570 nm, sedangkan deposisi kolagen ditentukan  dengan pereaksi  sirius  red pada λ 550  nm. Pada  penelitian  ini masing-masing kelompok dilakukan tiga  kali  ulangan. Data  yang  diperoleh dianalisis  secara  statistik  dengan one way  ANOVA menggunakan  program Graphad Instat 3.
Hasil dan Pembahasan Pengaruh  rSOD  terhadap  viabilitas sel fibroblas 3T3
Paparan UVA  selama 45  menit pada  jarak  5  cm dengan penambahan 4,  8,  dan  16  U/ml  rSOD menyebabkan viabilitas  sel  tidak  berbeda  nyata dibandingkan sel tanpa rSOD. Viabilitas sel relatif  masing-masing  grup  adalah
UV-/SOD- (97%);  UV+/SOD- (90,5%); UV+/SOD4  (91,8%); UV+/SOD8  (98%) dan  UV+/SOD16  (99%)  (Gambar.1). Viabilitas  sel merupakan kemampuan sel untuk hidup dan menjalankan fungsi metabolismenya.  Viabilitas  sel  yang tinggi  menentukan  keberhasilan  kultur sel.  Viabilitas  sel  ditentukan  dengan pewarnaan Alamar blue  yang  bersifar impermeabel terhadap  membran  sel. Peningkatan  permeabilitas  membran sel  mengakibatkan    trypan  blue dapat masuk ke dalam sel.
Sel hidup berbentuk bulat utuh dan berwarna  jernih  sedangkan  sel  mati berwarna biru akibat masuknya pewarna  trypan  blue  (Skowron  & Lidia 2004). Berdasarkan Gambar. 1, diketahui bahwa paparan  UVA  selama 45  menit  menurunkan  viabilitas  sel namun pemberian rSOD mampu mengembalikan  viabilitas  sel  tersebut yang menunjukkan bahwa rSOD mampu  melindungi  sel  dari  paparan UVA.  Hal  ini  diperkuat  oleh  penelitian Sasaki et  al (2002)  yang  menyatakan bahwa SOD mampu memberikan perlindungan  terhadap  sel lini HaCaT dari  paparan  sinar  UVB,  meskipun mekanisme
molekulernya belum diketahui.
III.2 Pengaruh rSOD terhadap deposisi kolagen Peningkatan jumlah rSOD pada sel yang dipaparkan UVA menaikkan jumlah kolagen secara bermakna dibandingkan  dengan  sel  tanpa  rSOD (Gambar.  2).  Sekitar  95%  radiasi  UV yang  mencapai  bumi  terdiri    dari  sinar UVA.  Intensitas  sinar  UVA  untuk mencapai  lapisan  dermis  1000  kali lebih  besar  dibandingkan sinar  UVB di
Gambar.1 Pengaruh rSOD terhadap viabilitas sel
dalam  lapisan  dermis  terdapat  sel-sel fibroblas  sebagai  sel  utama  penghasil kolagen yang berfungsi untuk kekuatan mekanik dan penyangga kulit.
Matriks ekstraseluler
dermis tersusun atas kolagen tipe  1  (80-85%), elastin,  fibronektin,  dan  proteoglikan (Tiedtke et  al .  2007).    Kolagen merupakan  komponen  utama  matriks ekstrasel yang sebagian besar disintesis  di  dalam  sel  fibroblas. Kolagen didegradasi oleh MMP menjadi gelatin  selanjutnya  oleh  gelatinase dipecah dan disekresi ke luar tubuh (Xu et al . 2004).
Radiasi  UVA  menghasilkan  ROS  yang dapat mengaktivasi reseptor sitokin dan faktor  pertumbuhan pada  membran  sel fibroblas. Aktivasi reseptor menginduksi sinyal  intraseluler  MAP  kinase  yang selanjutnya mengaktivasi kompleks
faktor  transkripsi  nukleus activator
protein-satu (AP-1).  Aktivasi  AP-1 berlebihan pada
sel fibroblas menyebabkan  peningkatan  ekspresi
gen  MMP-1  (kolagenase),  MMP-3 (stromelisin)  dan  MMP-9  (gelatinase) yang  dapat  merusak  kolagen  dan protein-protein lain pada dermis. Selain itu  aktivasi  AP-1  dapat  menekan ekspresi  gen  prokolagen  sehingga terjadi  penurunan  sintesis  kolagen (Yaar & Gilchrest 2007).
Superoksida dismutase (SOD) merupakan  antioksidan  enzim  yang menetralkan  aktivitas  ROS  melalui perubahan  anion  superoksida  menjadi hidrogen peroksida (H 2 O 2 ) dan oksigen (O 2 ). Radikalisme dari radikal bebas ini bisa  diredam  dengan  antioksidan  SOD yang  akan  mendonasikan  elektronnya sehingga  radikal  bebas  menjadi  stabil.
Mekanisme kerja SOD diduga memblock aktivasi reseptor dan ekspresi gen-gen AP-1 dan MMP. SOD mengaktifkan  jalur  sintesis  kolagen melalui  aktivasi  ekspresi  gen  TGF-b dan prokolagen (Helfrich et al . 2008).
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 UV-/SOD- UV+/SOD- UV+/SOD4 UV+/SOD8 UV+/SOD16 Viabilitas sel Fibroblas 3T3 (OD) Kelompok perlakuan
Gambar 2. Pengaruh rSOD terhadap deposisi kolagen

## Kesimpulan
Penelitian ini menyimpulkan bahwa rSOD  dengan  jumlah  yang  digunakan tidak  mempengaruhi viabilitas  sel, namun  pemberian  16  U/ml  rSOD meningkatkan jumlah  kolagen  secara bermakna.

## Ucapan terima kasih
Ucapan  terima  kasih  disampaikan kepada Indonesia Toray Science Foundation (ITSF, 2013) atas pendanaan penelitian ini.

## Daftar pustaka
Helfrich Y. Sachs  J,  Voorhees.  2008.
Overview of skin aging and
photoaging,  Dermatology  Nursing, Vol. 20(3). Indrayati  A.  Asyarie  S,  Suciati T  & Retnoningrum  DS.  2014.  Study  on the Properties of Purified Recombinant Superoxide Dismutase  from Staphylococcus equorum ,  a  Local  Isolate  from
Indonesia.  IntJ  Pharm  Pharm  Sci.
6(11).
Lyons NM & Brien O. 2002. Modulatory Effects of An Algal Extract Containing  Astaxanthin  on  UVA-
Irradiated  Cells  in  Culture.    J. Dermatol. Sci. 30 .
Park HM & Hwang E. 2011. Royal Jelly
Protects  Againts  Utraviolet  B- Induced Photoaging in Human Skin Fibroblasts Via Enhancing Collagen  Production.  J.Med.Food 1-9. Quan T.  Qin Z, Xia, Shao Y, Voorhees JJ, Fisher  GJ.  2009.  Matrix- Degrading  Metalloproteinases  in Photoaging. J. Investig. Dermatology  Symp.  Proc. 14 ,  20- 24.
Rabe JH. Mamelak AJ, McElgunn PJS,
Morison  WL,  Sauder  DN.  2006. Photoaging: Mechanisms and Repair. J. Am. Acad. Dermatol. 55 , 1-19.
Sasaki H. Hirohiko A, Takeshi H. 2000.
Protective  role  of  copper,  zinc superoxide dismutase against UVB-induced  injury  of  the  human keratinocyte  cell  line  HaCaT, J
Deposisi kolagen (OD)
Kelompok perlakukan
Invest  Dermatol,  Vol.114(3):  502- 507.
Skowron J & Lidia Z. 2004. Cytotoxicity
of resorcinol under short- and long- term exposure in vitro, International Journal of Occupational Safety and Ergonomics  (JOSE),  Vol.  10  (2): 147-156. Tiedtke AJ & MarksO. 2007. Stimulation  of  Collagen  Production in Human Fibroblasts. Cosmet. Sci.
Technol. 15-18.
Walterova D  &    Vostalova J.  2006.
Ultraviolet  Light  Induced  Alteration to the Skin. Biomed Pap Med. 150 ,
25-38.
Xu  X. Wang  Y,  Steffensen  B.  2004. Contributions of the MMP-2 Collagen Binding Domain to Gelatin Cleavage Substrate Binding  Via  the  Collagen  Binding Domain  is  Required  for  Hydrolysis of  Gelatin  but  not  Short  Peptides. Matrix Biol. 23 , 171-181. Yaar M &  Gilchrest BA.  2007. Photoageing: Mechanism, Prevention  and Acidithiobacillus ferrooxidans Therapy. Br. J.
Dermatol. 157 , 874-887.