Gambaran Leukosit dan Histologi Hepar, Ren, dan Lien Mencit BALB/c ( Mus musculus ) yang Terinfeksi  Virus Dengue 3 (DEN-3) dengan Imunohistokimia
ABSTRAK

## ABSTRACT

## BIOMEDIKA
ISSN : 1979 - 035X (printed edition) ISSN : 2302 - 1306 (electronic/Portal e-Journal)
Volume 9, No. 1, Maret 2016
The Determination of Soybean
Milk
Bacteriological Mojosongo Surakarta
Overview Leukocytes and Histology Hepar, Ren , and Lien of the Infected Mice BALB/c (Mus musculus) with Dengue 3 (DEN-3) Virus by Immunohostochemistry
*1 2 Dewi Sulistyawati  dan Sitti Rahmah Umniyati
1 Fakultas Ilmu Kesehatan, Universitas Setia Budi Surakarta, Jl. Letjen Sutoyo, Mojosongo, Surkarata 57127
2 Bagian Parasitologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada,
* Corresponding author, e-mail : dewi_biousb@yahoo.com Jl.Farmako Sekip Utara, Kec. Sleman, Daerah Istimewa Yogyakarta, 55284
Pengamatan efek infeksi virus dengue 3 (DEN-3) terhadap leukosit dan histologi dari organ dalam (hepar, ren dan lien) dilakukan untuk mendukung pengembangan vaksin dan antiviral virus DEN 3. Penelitian dilakukan pada mencit BALB/c dengan  pertimbangan  mencit  merupakan  hewan  coba  yang  secara  anatomi  dan  fisiologi  mirip  dengan  manusia  dan hewan  ini  relatif  mudah  ditangani  dan  mudah  berkembang  biak.  Untuk  serotipe  virusnya  dipakai  serotipe    DEN-3, karena serotipe ini merupakan serotipe yang dominan (50 % kasus DBD di Indonesia disebabkan oleh serotipe ini) dan banyak berhubungan dengan kasus berat.
Pada pengamatan histopatologi hepar mencit perlakuan menunjukkan adanya keadaan patologis berupa nekrosis, degenerasi melemak pada hepatosit, infiltrasi limfosit disertai perdarahan dan banyak sel binukleat. Pada ren mencit perlakuan terdapat infiltrasi limfosit, degenerasi melemak dan perdarahan. Pada lien mencit perlakuan menunjukkan pulpa merah yang lebih luas dan eritrosit dengan jumlah lebih banyak dibanding lien mencit kontrol. Pada organ-organ mencit kontrol tidak ditemukan keadaan patologis seperti mencit perlakuan.  Virus dengue 3 (DEN-3) dapat ditemukan pada darah (leukosit) dan organ-organ mencit (hepar, ren dan lien). Pada pengamatan histopatologi hepar, ren dan lien mencit perlakuan menunjukkan adanya keadaan patologis diantaranya berupa nekrosis, degenerasi melemak, infiltrasi limfosit dan perdarahan.
Design penelitian ini adalah eksperimental. Pengamatan yang dilakukan antara lain : keberadaan antigen dengue pada darah (leukosit) dan organ (hepar, ren dan lien) beserta perhitungan infection rate-nya, dan histopatologi organ (hepar,  ren  dan  lien).  Infeksi  dilakukan  secara  intra  vena.  Keberadaan  antigen  dengue  diamati  dengan  metode Imunohistokimia (IHC). Pengamatan histopatologi dilakukan dengan pewarnaan Hemotoxylin Eosin.
Penelitian untuk keberadaan antigen dengue, membuktikan bahwa virus DEN-3 dapat ditemukan pada darah (leukosit) dan  organ-organ  mencit  (hepar,  ren  dan  lien).  One-Sample  Kolmogorov-Smirnov  Test  digunakan  untuk  melihat  data terdistribusi  normal  atau  tidak.  Hasilnya  menunjukkan  nilai  p=0,289,  ini  menunjukkan  data  rerata  infection  rate terdistribusi  normal  (p>0,05),  sehingga  analisis  dilanjutkan  dengan  uji  Oneway  anova  untuk  melihat  ada  tidaknya perbedaan  yang  signifikan  diantara  data.  Hasil  Anova  menunjukkan  ada  perbedaan  yang  signifikan  pada  rerata infection  rate  leukosit  (p=0,045;  p<0,05).  Perhitungan  infection  rate  pada  darah  mencit  yang  dianalisa  menggunakan Multiple  Comparisons  Post  Hoc,  diperoleh  hasil  perbedaan  paling  signifikan  terlihat  pada  rerata  infection  rate  hari ke  10  p.i.  (pasca  infeksi)  dengan  rerata  infection  rate  hari  ke  13  p.i.  (p=0,007),  ini  menunjukkan  rerata  infection  rate paling tinggi terlihat pada hari ke 10 p.i. dan paling rendah pada hari ke 13 p.i.
Kata Kunci : virus dengue 3 (DEN-3), imunohistokimia.
Observation of the effects of infection with dengue 3 virus (DEN-3) o ? ?n leukocytes and histology of organs (liver, ren and spleen) to support the development of vaccines and antiviral DEN-3 virus. The study was performed in mice BALB/c with a consideration of the experimental animals that are anatomically and physiologically similar to humans and animals is relatively easy to handle and easy to breed. Dengue 3 serotypes are used   since this serotype is dominant ( 50 % of cases of dengue fever in Indonesia caused by these serotypes ) and are associated with severe cases.
Design of this study is experimental. Observations made ? ? include : the presence of dengue antigen in the blood (leukocytes) and organs (liver, ren and spleen) along with the calculation of its infection rate, and histopathology of organs  (liver,  ren  and  spleen).  Infection  is  done  intravenously.  The  existence  of  dengue  antigen  was  observed  by
Research for the presence of dengue antigen, proving that the dengue 3 virus  (DEN-3) can be found in the blood (leukocytes)  and  the  organs  of  mice.  Calculation  infection  rate  in  the  blood  of  mice  were  analyzed  using  Post  Hoc Multiple Comparisons, the result of the most significant differences seen in the average infection rate of the day 10 p.i. (post-infection) with an average infection rate of the 13th day p.i. (P = 0.007),  indicating the average infection rate is the highest seen at day 10 p.i. and the lowest on day 13 p.i. In observation of hepatic histopathology treated mice showed a pathological state such as necrosis, fat degeneration, lymphocyte infiltration and bleeding. In lien treated mice showed a wider red pulp and erythrocytes with the number more than the control mice lien. In the treated mice contained  ren  lymphocyte  infiltration,  fat  degeneration  and  bleeding.  In  the  organs  of  control  mice  was  not  found pathological conditions such as treated mice.
the method of Immunohistochemistry (IHC). Histopathological observations performed with Hemotoxylin eosin staining.
D engue 3 virus (DEN-3) c? ?an be found in the blood ( leukocytes ) and the organs of mice ( liver, ren  and spleen). In observation of histopathology of the liver, ren and spleen treated mice showed a pathological state such form of necrosis, fat degeneration, lymphocyte infiltration and bleeding .
Keywords: D engue 3 virus (DEN -3), immunohistochemistry (IHC)

## PENDAHULUAN
Kasus DBD yang sangat banyak dengan angka kematian  yang  cukup  tinggi  merupakan  alasan penting  dilakukannya  penelitian  secara  intensif mengenai infeksi virus dengue dan patogenitasnya beserta  pengembangan  vaksin  dan  antiviralnya. Untuk  mendukung  pengembangan  vaksin  dan antiviral  sangat  diperlukan  data  pengamatan leukosit  dan  histologi  organ  dalam  untuk  melihat efek  dari  vaksin  ataupun  antiviral  terhadap leukosit  dan  organ  dalam.  Sebelumnya  perlu dilakukan pengamatan efek infeksi virus dengue 3 (DEN-3)  terhadap  leukosit  dan  histologi  dari organ  dalam.  Dalam  rangka  itu,  penulis  ingin melakukan penelitian untuk mengamati gambaran leukosit  dan  histologi  hepar,  ren  dan  lien  yang terinfeksi  virus  dengue  3  (DEN-3).  Dipilihnya organ-organ  tersebut  dikarenakan  diduga  organ ren, hepar dan lien adalah organ-organ yang paling banyak  mengalami  kerusakan  pada  kasus  infeksi virus  Dengue.  Penelitian  dilakukan  pada  mencit BALB/c  dengan  pertimbangan  mencit  ini  meru- pakan hewan coba yang secara anatomi dan fisio- logi  mirip  dengan  manusia  dan  hewan  ini  relatif mudah  ditangani  dan  mudah  berkembang  biak. Untuk serotipe virusnya dipakai serotipe dengue 3
Demam Berdarah Dengue (DBD) disebabkan oleh  virus  dengue,  penyakit  arthropoda-borne virus  dengan  prevalensi-paling  tinggi,  setengah dari  populasi  dunia  berisiko  terinfeksi  dan  lebih dari  50  juta  orang  terinfeksi  virus  dengue  setiap tahun.
Mencit BALB/c diinfeksi dengan virus dengue 3 (DEN-3)  secara  intravena  dan  diinkubasi  selama 13  hari  dengan  pertimbangan  pada  penelitian yang  dilakukan  pada  leukosit,  virus  dengue  3 positif  hari  ke  2  sampai  hari  ke  14. Ada  tidaknya virus  dengue  3  pada  hepar,  ren  dan  lien  diamati dengan metode Imunohistokimia.
(DEN-3), karena serotipe ini merupakan serotipe yang  dominan  (50  %  kasus  DBD  di  Indonesia disebabkan oleh serotipe ini) dan banyak berhu- bungan dengan kasus berat.
Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental. Desain penelitian menggunakan rancangan Posttest Control  Group  Design. Subyek  penelitian  adalah mencit  BALB/c  yang  berumur  2  bulan  berjenis kelamin campuran jantan dan betina, yang diperoleh dari Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

## METODE PENELITIAN
Design Penelitian
Variabel bebas yaitu masa inkubasi virus dengue 3  (DEN  3) . Variabel  terikat  yaitu infection  rate virus  DEN-3  pada  leukosit  mencit  BALB/c (Mus musculus) (Tabel 1) .

## Variabel Penelitian
Mencit BALB / c diinfeksi dengan virus DEN-3, supernatan  virus  DEN-3  berasal  dari  kultur  sel
Prosedure Penelitian
C6 / 36 yang telah diinfeksi dengan virus DEN-3 dengan masa inkubasi 7 hari; darah mencit diambil untuk  dibuat  preparat  apusan  darah  tebal  dan diikuti  dengan  pewarnan  imunositokimia/IHC pada hari ke-6, 8, 10 dan 13 p.i. untuk menghitung infection  rate  leukosit/darah  mencit;  pada  hari ke-13  p.i.,  hepar,  ren  dan  lien  diambil  dibuat preparat yang diwarnai dengan metode IHC untuk mengamati keberadaan antigen dengue dan dibuat preparat  dengan  pewarnaan Hematoxylin  Eosin untuk mengamati histopatologisnya.
Oneway Anova digunakan untuk mengetahui perbedaan infection rate pada darah yang diambil dari  kelompok  mencit  yang  diinfeksi  pada  hari ke  6,  8,  10  dan  13  p.i.  serta  kelompok  mencit kontrol. Hasil dikatakan signifikan apabila diper- oleh angka P  < 0,05. Hasil dikatakan signifikan apabila diperoleh angka P  < 0,05.

## Analisa Data
Peneltian ini sudah mendapatkan persetujuan dari komisi etik Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah  Mada  (Medical  and  Health  Research Ethics Committee/MHREC).
Ethical Clearence
Hasil penelitian dan pembahasan dibagi menjadi dua  sub  pokok  bahasan  meliputi  pengaruh  infeksi virus  dengue-3  secara  intra  vena  terhadap:  1) keberadaan  antigen  viral  dengue  pada  leukosit; (2)  keberadaan  antigen  viral  dengue  pada  organ hepar, ren, dan lien.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
1.   Pengaruh Infeksi Virus DEN-3 terhadap Keberadaan  Antigen  Viral  Dengue  pada Leukosit Mencit BALB/c.
a.   Hasil Imunositokimia Apusan Darah Tebal Pada  Gambar  1  menunjukkan  leukosit  yang tidak  terinfeksi,  sitoplasma  berwarna  biru  karena menyerap  warna Hematoxylin sedangkan  pada Gambar 2 menunjukkan bahwa dengan pewarnaan imunositokimia,  leukosit  yang  positif  terinfeksi virus DEN-3 terlihat sitoplasma berwarna coklat.
b.   Pengaruh Infeksi Virus DEN-3 terhadap infection rate Leukosit Mencit BALB/c Pada  Gambar  3  menujukkan  bahwa  Grafik infection rate leukosit pada setiap hari pengamatan dihitung  berdasarkan  jumlah  rerata  leukosit  yang positif dibagi dengan jumlah leukosit yang diamati dikalikan  100%.  Pengamatan  dilakukan  pada
KLP Infeksi Virus DEN-3 (hari ke - p.i.) - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 A - - - - - 0 - 0 - 0 - - + B x x x x x 0 x 0 X 0 x x + Tabel 1. Variabel Penelitian -: tidak diinfeksi x: diinfeksi virus DEN-3 0:diambil darah untuk IHC +: dieutanasi untuk IHC Keterangan : A    :  Kelompok mencit kontrol (tidak diinfeksi virus DEN-3) B    :  Kelompok mencit yang diinfeksi virus DEN-3. p.i. :  pasca infeksi
Gambar 1. Gambaran imunositokimia leukosit mencit kontrol dengan perbesaran 1000x (kiri), memperlihatkan warna biru pada sitoplasma maupun nukleus (negatif antigen dengue).
Gambar 2. Leukosit mencit yang diinfeksi virus dengue-3 secara intra vena memperlihatkan sitoplasma berwarna coklat (positif antigen dengue).
sepuluh bidang pandang dan masing-masing diulang tiga kali.
Gambar 3. Leukosit mencit BALB/c yang diinfeksi virus dengue-3 secara intra vena menunjukkan fluktuasi rerata infection rate pada pada hari ke-6, 8, 10, dan 13 p.i.
Hasil  analisa Oneway  Anova menunjukkan ada perbedaan yang signifikan pada rerata infection rate leukosit  (p=0,045;  p<0,05).  Untuk  memban- dingkan perbedaan rerata infection rate pada masing- masing  waktu  pengamatan,  digunakan Multiple Comparisons  Post  Hoc  Test dan  diperoleh  hasil perbedaan  paling  signifikan  terlihat  pada  hari  ke- 10 p.i. dengan hari ke 13 p.i. (p=0,007), ini menun-
1.  Pengaruh  Infeksi  Virus  DEN-3  terhadap Keberadaan Antigen Viral Dengue pada Organ Hepar, Lien dan Ren Mencit BALB/c.
a.   Hasil Imusitokimia Hepar (Gambar 4 dan 5)
Gambar 4. Gambaran imunohistokimia hepatosit mencit kontrol dengan perbesaran 400x, memperlihatkan warna biru pada sitoplasma maupun nukleus (negatif antigen dengue). Keterangan: SIT: sitoplasma, NU: nukleus.
b.   Hasil Imunohistokimia Lien (Gambar 6 dan 7)
Gambar 5. Gambaran hepatosit mencit yang diinfeksi virus dengue-3 secara intra vena dengan perbesaran 400x, memperlihatkan sitoplasma berwarna coklat (positif antigen dengue) pada hari ke-13 p.i. Keterangan: SIT: sitoplasma, NU: nukleus.
Gambar 6. Gambaran imunohistokimia lien mencit kontrol dengan perbesaran 400x, memperlihatkan warna biru pada sitoplasma maupun nukleus (negatif antigen dengue).
c.   Hasil Imunohistokimia Ren (Gambar 8 dan 9)
jukkan  rerata infection  rate paling  tinggi  terlihat pada hari ke 10 p.i. dan paling rendah pada hari ke- 13 p.i.
Gambar 7. Gambaran imunohistokimia lien mencit perlakuan pada perbesaran 400x, memperlihatkan sitoplasma berwarna coklat (positif antigen dengue) pada hari ke-13 p.i. (tanda panah ).
Gambar 8. Gambaran imunohistokimia ren mencit kontrol pada perbesaran 400x, memperlihatkan warna biru pada sitoplasma maupun nukleus (negatif antigen dengue). Keterangan: SIT : sitoplasma, NU : nukleus, TR : Tubulus renalis.
Gambar 9. Gambaran imunohistokimia ren mencit perlakuan pada perbesaran 400x, memperlihatkan sitoplasma berwarna coklat (positif antigen dengue) pada hari ke-13 p.i. Keterangan: SIT : sitoplasma, NU : nukleus, TR : tubulus renalis.
Virus dengue merupakan virus RNA di mana virus  ini  bereplikasi  dalam  sitoplasma,  dengan pewarnaan  IHC  sitoplasma  sel  yang  terinfeksi akan  berwarna  coklat  karena  menyerap  warna DAB-chromogen  sedangkan  inti  sel  tetap  biru. Pada  Gambar  4-9  menunjukkan  bahwa  warna coklat dalam sitoplasma hepar, lien dan ren mencit perlakuan, menunjukkan bahwa tiga organ tersebut merupakan organ target virus dengue.
3.   Pengaruh infeksi virus DEN-3 terhadap gambaran  histopatologik  beberapa  organ mencit BALB/c pada hari ke 13 p.i. dengan metode pewarnaan Hematoxylin-Eosin a.   Gambaran Histopatologi Hepar (Gambar 10)
Gambar  10.  Gambaran  histopatologi  dengan  pewarnaan  hematoksilin  eosin  hepar  mencit  perlakuan  pada  perbesaran 400x, menunjukkan adanya perdarahan, nekrosis dan sel inflamasi. Keterangan: ER : eritrosit, N : nekrosis, SI : sel inflamasi.
Pada  Gambar  10  menunjukkan  pengamatan histologi  hepar  pada  hari  ke-13  p.i.,  terlihat  adanya infiltrasi  lemak/degenerasi  melemak  pada  hepatosit, banyaknya sel yang binukleat, selain itu juga nampak ada gejala perdarahan yang ditandai adanya eritrosit di  luar  pembuluh  darah,  dan  nekrosis  dengan inflamasi sel. Pada gambaran histologi hepar mencit kontrol tidak terdapat gejala-gejala seperti di atas.
Pada  Gambar  11  menunjukkan  gambaran histopatologi  lien  dengan  pewarnaan  HE  dari mencit perlakuan pada hari  ke-13 p.i. menunjuk- kan adanya perbedaan dengan lien mencit kontrol. Lien mencit perlakuan menunjukkan daerah pulpa merah  yang  lebih  luas  dibanding  lien  mencit kontrol,  disamping  itu  terlihat  eritrosit  pada  lien mencit perlakuan jauh lebih banyak dibanding lien mencit kontrol .
b.   Gambaran Histopatologi Lien

## c. Gambaran Histopatologi Ren
Pada  Gambar  12  menunjukkan  pengamatan histopatologi  ren  (ginjal)  dengan  pewarnaan  H.E. menunjukkan  bahwa  ren  mencit  perlakuan  pada hari  ke-13  p.i.  menunjukkan  adanya  infiltrasi  sel- sel  inflamasi  terutama  dekat  pembuluh  darah  dan ada perdarahan, sedangkan pada ren mencit kontrol tidak menunjukkan gejala tersebut.
Gambar 11. Gambaran histopatologi lien mencit perlakuan pada hari ke-13 p.i. pada perbesaran 400x, menunjukkan eritrosit lebih banyak dibanding lien mencit kontrol. Keterangan : ER : eritrosit.
Gambar 12. Gambaran histopatologi ren mencit perlakuan pada hari ke-13 p.i. pada perbesaran 40x memperlihatkan adanya infiltrasi sel inflamasi dan perdarahan. Keterangan : SI : sel inflamasi, ER : eritrosit.
1.   Keberadaan antigen virus dengue 3 (DEN-3) pada  leukosit  mencit  BALB/c  tergantung  pada

## KESIMPULAN
2.   Keberadaan antigen virus dengue 3 (DEN-3) dapat ditemukan pada organ hepar, ren dan lien. Virus  dengue  3  menyebabkan  kerusakan  pada organ-organ mencit.
masa inkubasi, dimana rerata infection rate yang paling tinggi pada masa inkubasi ke 10 (25,97) dan paling rendah pada masa inkubasi hari ke 13 (3,54).
Zompi, S and Harris, E. 2012. "Animal Models of Dengue Virus Infection." Viruses 4 (1).

## DAFTAR  PUSTAKA
Barth,  O.M.,  Barreto,  D.F.,  Paes,  M.V.,  Takiya,  C.M.,  Pinhao, A.T., Schatzmayr., Morphological Studies in a model for dengue-2 virus infection in mice. 2006. Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro , Vol. 101(8):905-915.
Halstead, S.B. 2008. Dengue. Tropical Medicine . Vol. 5. Imperial College Press. Korea. Hal. 171-173.
Sudaryono, 2011. Perbedaan Manifestasi Klinis dan Laborato- rium  Berdasarkan  Jenis  Imunoglobulin  Pada  Penderita Demam  Berdarah .  Fakultas  Kedokteran,  Universitas Sebelas Maret. Hal : 9-20.
Yauch,  L.E.,  and  Shresta,  S.  2008.  “Mouse  models  of  dengue virus infection and disease”. Antiviral Rest, 80(2) : 87-93.
Marbawati, D. 2006. “Virus Dengue”. Jurnal Litbang Pengen- dalian Penyakit Bersumber Binatang, 3(2) : 20-22.