Penulis
Zulhan Arif 1* , Maryani Yunita 1 , Latifah Kosim Darusman 1,2
Afiliasi
1 Departemen Kimia Institut Pertanian Bogor
2 Pusat Studi Biofarmaka Tropika, Lembaga Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat-Institut Pertanian Bogor

## Kata Kunci
 Elektrode pasta karbon
 Ferosena
 Inhibitor tirosinase
 Rhizopora apiculata
 Zeolit
Diterima 15 Oktober 2017 Direvisi 3 Desember 2017 Disetujui 8 Februari 2018

## * Penulis Koresponding Zulhan Arif
Jl Tanjung Kampus IPB Darmaga, Bogor, 16680 zulhanarif@ipb.ac.id/zulhanari f@apps.ipb.ac.id

## ABSTRAK
Ekstrak  metanol    tanaman Rhizopora  apiculata telah  dibuat  untuk  biosensor inhibitor  enzim  tirosinase  menggunakan  elektrode  pasta  karbon  dengan  termodifikasi zeolit dan mediator ferosena. Enzim tirosinase merupakan enzim yang  mengkatalisis 2 tahap reaksi biosintesis melanin pada mamalia dan berperan dalam reaksi pencokelatan enzimatis.  Enzim  diimobilisasi  pada  permukaan  transduser  untuk  menjaga  aktivitas enzim.  Aktivitas  tirosinase  diukur  menggunakan  substrat  L-DOPA.  Kondisi  optimum aktivitas  tirosinase  berdasarkan  pengoptimalan  respon  adalah  tirosinase  50  U/mL  dan zeolit 150 mg/mL dalam larutan penyangga fosfat. Penggunaan mediator ferosena dan material penyangga zeolit meningkatkan aktivitas tirosinase. Nilai K M app dan I maks app tirosinase  ditentukan  dengan  metode  Lineweaver-Burk.  Nilai K M app dan I maks app sebesar 6.04 mM dan sebesar 6.42 mM. Biosensor menggunakan zeolit sebagai matriks imobilisasi dan ferosensa sebagai mediator mempunyai stabilitas respon sampai 2 jam, dengan penurunan aktivitas sebesar 19%.

## PENDAHULUAN
Tirosinase  (EC  1.  14.  18.  1)  merupakan  enzim  yang  berperan  dalam  biosintesis melanin  dengan  mengkatalisis  reaksi  hidroksilasi  monofenol  menjadi o- difenol  (reaksi monofenolase)  dan  oksidasi o- difenol  menjadi o- kuinon  (reaksi  difenolase).  Substrat yang  berperan  dalam  reaksi  monofenolase  dan  difenolase  yaitu  L-tirosin.  Tirosinase banyak ditemukan pada mamalia, buah-buahan, dan juga di dalam proses pencoklatan jamur secara enzimatik (Chang 2009). Saat ini telah banyak dilakukan penelitian tentang senyawa  inhibitor  tirosinase  yang  berasal  dari  bahan  alam.  Arung et  al .  (2006) menemukan  Artocarpanone  dari Artocarpus  heterophyllus memiliki  kemampuan menghambat  biosintesis  melanin.  Batubara et  al . (2010)  telah  melakukan  penelitian terhadap tanaman obat Indonesia dari 35 spesies dan diperoleh bahwa ekstrak metanol dari  kayu Rhizophora  sp memiliki  kemampuan  inhibisi  yang  cukup  baik  terhadap tirosinase.
Ekstrak Metanol Rhizopora apiculata Sebagai Biosensor Penghambatan Aktivitas Tirosinase Menggunakan Elektrode Pasta Karbon Termodifikasi Ferosena Dan Zeolit
Senyawa-senyawa  inhibitor  tirosinase  telah  banyak ditemukan baik senyawa bahan alam maupun sintetik. Penghambatan  enzim  tirosinase  ditentukan  oleh keberadaan tirosine dan L-3,4-dihidroksifenilalanina (L- DOPA) sebagai substrat serta pembentukan dopakrom. Senyawa yang berasal dari bahan alam telah dilaporkan dapat  menghambat  enzim  tirosinase,  seperti  senyawa yang  berasal  dari  golongan  flavonol  (kuersetin, mirisetin,  kaempferol),  golongan  isoflavon,  flavanol, kalkon,  dan  stilbenoid  (Chang  2009).  Penghambatan pembentukan  melanin  umumnya  dilakukan  dengan menghambat  aktivitas  tirosinase  (Hartanti  dan Setiawan  2009).Penentuan  aktivitas  hambatan  suatu enzim  umumnya  digunakan  dengan  metode Enzyme- Linked  Immunosorbent  Assay (ELISA)  (Sheng et  al. 2009)  atau  spektrofotometri  (Arung et  al. 2006). Metode  tersebut  memiliki  beberapa  kekurangan diantaranya  ialah  memerlukan  bahan  kimia  dalam jumlah  besar  serta  penanganan  yang  cukup  rumit dalam preparasi contoh.
Metode  alternatif  yang  dapat  digunakan  untuk pengukuran  aktivitas  inhibisi  enzim  yaitu  biosensor. Biosensor  adalah  suatu  piranti  yang  memanfaatkan interaksi  hayati  untuk  mendeteksi analat  (Serra 2010). Biosensor  memiliki  beberapa  keunggulan  yaitu instrumentasinya  sederhana,  tidak  mahal,  serta memiliki  sensitivitas  dan  selektivitas  tinggi  dengan pendeteksian  yang  cepat  (Zhang et  al .  2011) memanfaatkan  enzim.  Metode  ini  memerlukan  proses penstabilan/imobilisasasi  enzim  pada  permukaan biosensor.  Imobilisasi  enzim  yang  dapat  dilakukan diantaranya  pengikatan  kimia  ( covalent  binding ), penjebakan ( entrapment ), taut silang ( cross-link ), serta adsorbsi  (Serra  2010).  Pada  penelitian  yang  telah dilakukan  pembuatan  biosensor  yang  digunakan berupa elektrode pasta karbon dengan modifikasi zeolit dan ekstrak metanol dari tanaman famili Rhizhoporaceae dengan mengimobilisasi enzim tirosinase. Pemanfaatan zeolit alam, suatu kristal silikat aluminat,  dapat  meningkatkan  aktivitas  biosensor karena keberadaan  pori dari zeolit yang ada dan dapat bersifat  semi  konduktor.  Ferosena  digunakan  sebagai mediator  karena  peranan  yang  sangat  baik  dalam penghantaran  elektron  sehingga  memudahkan  dalam berbagai  proses  oksidasi  dan  reduksi  suatu  senyawa. Ferosena  juga  punya  sifat  fisik  yang  stabil,  elektrofil superaromatik,  tingkat  oksidasi  menengah  dan reversibel,  kelarutan  yang  baik  di  pelarut  non-air,  dan stabil di udara terbuka (Astruc 2016).

## METODE Bahan
Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah, Rhizopora apiculata diperoleh dari Makassar,  Sulawesi selatan,  enzim  tirosinase  (Sigma-aldrich,  St  Louis, Amerika, 333 unit/mL dalam larutan penyangga fosfat), zeolit  (asal  Cikalong),  grafit  (Merck,  Darmstadt, Jerman), ferosena (Merck, Darmstadt, Jerman),  parafin cair  (Merck,  Darmstadt,  Jerman),  dimetil  sulfoksida (DMSO)  (Merck,  Darmstadt,  Jerman),    larutan  larutan penyangga  fosfat  pH  7  dan  pH  6.5,  membran  dialisis (Sigma-aldrich,  St  Louis,  Amerika),  L-DOPA  (Sigma- aldrich, St Louis, Amerika) dan  L-tirosin (Sigma-aldrich, St  Louis,  Amerika),  metanol  (Merck,  Darmstadt, Jerman),  dan  gliserol  (Merck,  Darmstadt,  Jerman). Semua  bahan  kimia,  terkecuali  sampel  dac  zeolit, berkualitas GR ( grade reagent ).

## Alat
Alat  dan  instrumen  yang  akan  digunakan  adalah Potensiostat–Galvanostat  yang  dilengkapi  perangkat lunak Echem v2.1.0 (eDAQ, New South Wales, Autralia), laminar air  flow ,  Spektroscopy  UV-Pharmaspec  1700 (Shidmazu,  Kyoto,  Japan),  pipet  mikro,  tabung  gelas elektrode  (diameter  dalam  tabung  3  mm,  ketebalan lapisan  pasta  karbon  5  mm),  sel  elektrokimia  tiga elektrode , dan Minitab 16 (Pennsylvania, Amerika).
Preparasi dan Ekstraksi Tanaman Rhizopora apiculata (Batubara et al . 2010)
Sampel  dikeringkan  dan  dihaluskan  menjadi  serbuk lolos  saringan  60 mesh .  Maserasi  dilakukan  dengan metanol 50% dengan nisbah 1:10 (1 g = 10 mL metanol) masing-masing  selama  12  jam  sebanyak  tiga  kali ulangan.  Ekstrak  yang  diperoleh  disaring  dengan menggunakan  kertas  saring  Whatman nomor  1  dan dipekatkan dengan penguap putar pada suhu 30 °C.
Uji Aktivitas Inhibitor Tirosinase (Batubara et al. 2010) Ekstrak  sampel  dilarutkan  dalam  pelarut  DMSO hingga  konsentrasi  20 mg/mL.   Larutan  ini  selanjutnya disebut  sebagai  larutan  stok.  Larutan  stok  disiapkan dengan  melarutkan  ekstrak  pekat  hingga  diperoleh konsentrasi  2000  µg/mL  dalam  50  mM  Kalium  buffer fosfat  (pH  6.5).  Dilakukan  pengujian  ekstrak  dengan rentang  konsentrasi  7.89-2000  µg/mL.  Asam  kojat digunakan  sebagai  kontrol  positif  dan  dilakukan pengujian  pada  rentang  konsentrasi  7.8125  -2000 µg/mL.  Pada  pelat  tetes  96  sumur,  masing-masing
Ekstrak Metanol Rizhoporaceae Sebagai Biosensor Penghambatan Aktivitas Tirosinase Menggunakan Elektrode Pasta Karbon Termodifikasi Ferosena Dan Zeolit
3
dimasukkan sebanyak 70 µL ekstrak ditambahkan 30 µL tirosinase (333 units/mL dalam buffer fosfat) kemudian campuran diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit. Setelah  inkubasi  sebanyak  110  µL  substrat  (2  mM  L- tirosin atau 12 mM L-DOPA) ditambahkan pada masing- masing  sumur      dan  diinkubasi  selama  30  menit  pada suhu  ruang.  Dilakukan  pengukuran  absorbansi  larutan masing-masing  sumur  dengan  menggunakan micro plate  reader pada  panjang  gelombang  510  nm  untuk menentukan persen inhibisi dan konsentrasi hambat 50 % (LC 50 ). Persen inhibisi ditentukan dengan persamaan berikut:
% Inhibisi - (Batubara et al. 2010)
Keterangan:
A = Absorbans sampel tanpa penambahan ekstrak B = Absorbans sampel dengan penambahan ekstrak

## Preparasi Zeolit Alam (Arif 2011)
Aktivasi  zeolit  dilakukan  dengan  dua  cara  yaitu aktivasi fisika dan aktivasi kimia. Zeolit yang digunakan pada penelitian diperoleh dari daerah Cikalong. Batuan zeolit  dihancurkan  dengan  penggilingan  hingga diperoleh  ukuran  lolos  saringan    200 mesh .  Serbuk zeolit kemudian dicuci dengan akuades dan dikeringkan pada  suhu    5  ˚C  selama  3  jam.  Sebanyak  5   gram zeolit  selanjutnya  direndam  dengan  menggunakan asam  klorida  (HCl)  4  M  selama  90  menit,  selanjutnya dienaptuangkan  dan  disaring.  Zeolit  hasil  penyaringan dicuci dengan menggunakan akuades hingga pH netral dan bebas klorida.

## Preparasi  Elektrode  Pasta  Karbon  Termodifikasi Ferosena (Trivadilla 2011)
Elektrode dibuat dengan melarutkan 3 mg ferosena dalam  1  mL  DMSO  dan  ke  dalam  larutan  tersebut ditambahkan  100  mg  grafit.  Campuran  didiamkan selama  2  jam.  Setelah  2  jam  pelarut  dikeringkan menggunakan  pengering  vakum,  sehingga  diperoleh grafit termodifikasi mediator ferosena. Grafit termodifikasi  dicampur  dengan  35  μL  paraffin  cair hingga  membentuk  pasta  karbon  dan  dimasukkan  ke dalam badan  elektrode. Permukaan elektrode dihaluskan dan dibersihkan dengan digosok menggunakan kertas minyak.
Imobilisasi Enzim (Saiapina et al. 2011)
Matriks  nanokomposit  divariasikan  pada  selang massa zeolit 50-250 mg yang disuspensikan dalam 1 mL
buffer fosfat yang mengandung enzim dengan rentang konsentrasi  50-250  U/mL.  Sebanyak  15  µL  ekstrak tirosinase  dalam  larutan  penyangga  fosfat  pH  6.8 diteteskan  pada  permukaaan  elektrode  pasta  karbon didiamkan hingga pelarutnya menguap, dilapisi dengan membran  dialisis,  ditutup  dengan  jaring  nilon,  dan diikat  dengan  parafilm.  Elektrode  dapat  langsung digunakan  untuk  pengukuran  metode  voltammetri siklik. Elektrode direndam dalam larutan penyangga pH 7.5  pada  suhu  4  ºC  ketika  tidak  digunakan  untuk memberikan  keadaan  yang  sama  dengan  lingkungan sebenarnya.

## Optimasi Aktivitas Tirosinase
Optimasi  yang  dilakukan  adalah  menggunkan rentang konsentrasi enzim tirosinase 50-250 U/mL dan massa  zeolit    200 mesh dengan  rentang  25-250  mg. Elektrode  pasta  karbon  yang  telah  termodifikasi ferosena dan enzim tirosina dengan rentang yang telah ditentukan  dan  pemodifikasi  zeolit  pada  massa  yang telah  ditentukan  untuk  modifikasi  digunakan  untuk mengukur  subtrat  L-DOPA.  Metode  yang  digunakan untuk  pengoptimuman  aktivitas  tirosinase  adalah Response Surface Method (RSM). Metode ini dilakukan dengan  cara  memasukkan  kombinasi  faktor-faktor peubah bebas pada  perangkat  lunak statistika Minitab 16.  Selanjutnya  percobaan  dilakukan  sesuai  dengan kombinasi  yang  dihasilkan  untuk  mendapatkan  nilai optimum masing-masing peubah.
Pengukuran Elektrokimia (Wang et al . 2006) Pengukuran  elektrokimia  dilakukan  dengan  metode voltametri siklik dengan menggunakan eDAQ Potensiostat–Galvanostat  yang  dilengkapi  perangkat lunak  Echem  v2.1.0.  Elektrode  yang  digunakan  adalah elektrode  Ag/AgCl  sebagai  elektrode  rujukan,  platina sebagai counter dan  elektrode  pasta  karbon termodifikasi  sebagai  elektrode  kerja.  Parameter pengukuran  dibuat  sebagai  berikut: Mode :  Cyclic; Initial :  -800  mV; Final :  -800  mV; Rate :  250  mV/s; Step W: 20 ms Uppe r E: 1000 mV; Lower E: -800 mV; Range : 5 V.
Pengukuran  dilakukan  pada  setiap  elektrode  pada suhu 25 ° C dengan menggunakan sel elektrokimia yang diisi  dengan  5 mL  larutan penyangga  fosfat  5 mM  (pH 7).  Elektrode yang telah disiapkan dimasukan dalam sel elektrokimia lalu  dilakukan  pengukuran  dengan menggunakan  parameter  seperti  di  atas.  Sinyal  yang dihasilkan  dicatat  sebagai  blangko,  kemudian  substrat
Arif et al. berupa L-DOPA dengan konsentrasi 0-5 mM dimasukan dalam  sel  elektrokimia  dan  dibiarkan  selama  30 menit kemudian  dilakukan  pengukuran  arus  kembali. Pengukuran  dilanjutkan  dengan  menggunakan  ekstrak metanol  tanaman Rhizhoporaceae sebagai  inhibitor. Ekstrak ditambahkan dengan rentang konsentrasi 250 - 2000 µg/mL sebanyak 35 µL dan dilakukan pengukuran arus kembali.

## Penentuan Stabilitas Respon Biosensor
Stabilitas  elektrode  dilakukan  dengan  pengukuran secara  langsung  pada  elektrode  yang  telah  dibuat dengan  imobilisasi  enzim  tirosinase  pada  permukaan elektrode.  Nilai  aktivitas  yang  diperoleh  pada pengukuran  awal  dianggap  aktivitas  100%.  Aktivitas diukur ulang pada jam ke 0, 1, 2, 4, 8 dan 16. Aktivitas tirosinase ditentukan dengan persamaan:
Aktivitas = saa  ke-jam saa  a al x 100% (Bisswanger 2008)

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstraksi R. apiculata Ekstraksi  tanaman Rhizopora  apiculata dengan teknik maserasi  metanol memberikan hasil  rendemen 8.11%. Hasil yang didapatkan sesuai dengan yang telah dilakukan  oleh  Abdullah  (2011)  dengan  rendemen ekstraksi  pelarut  metanol  akar  dan  batang Rhizhopora apiculata berturut-turut  sebesar  8.85%,  dan  8.53%. Pelarut yang digunakan pada maserasi adalah metanol. Penggunaan  pelarut  yang  digunakan  bersifat  polar bertujuan  untuk  mengekstrak  senyawa  kepolaran sedang  sampai  senyawa  dengan  tingkat  kepolaran tinggi    dalam  sampel  dengan  rendemen  sebanyk- banyaknya.

## Aktivasi Zeolit
Aktivasi  zeolit  dilakukan    secara  fisik  dengan melakukan  pengecilan  ukuran  butir  dan  pengayakan
hingga  ukuran  200 mesh dan  pemanasan  pada  suhu 3    ˚C  ber ujuan  un uk  menghilangkan  pengo or- pengotor organik, memperbesar pori, dan memperluas permukaan.    Keluarnya  air  dari  pori-pori  zeolit menyebabkan  pori-pori  zeolit  menjadi  kosong  dan dapat  digunakan  sebagai  adsorben  .  Aktivasi  secara kimia  dilakukan  dengan  penambahan  asam  kuat  HCl 4 M.  Aktivasi  asam  ini  mengakibatkan  hilangnya pengotor  anorganik  pada  zeolit  melalui  pertukaran kation H + . Penambahan asam menyebabkan terjadinya proses dealuminasi pada zeolit. Dealuminasi merupakan  proses  penggantian  aluminium  dengan hidrogen  yang  melibatkan  perubahan  struktur aluminosilikat  Si-O-Al  menjadi  struktur  silika  yang berbentuk silanol –Si-OH (Heraldy et al . 2003).
Aktivitas Inhibitor Ekstrak Rhizopora apiculata Uji  aktivitas  inhibisi  digunakan  untuk  mengetahui daya  inhibisi  senyawa  bioaktif  pada  ekstrak  metanol batang  bakau.  Aktivitas  inhibisi  ekstrak  bakau ditentukan dengan metode spektrofotometri.  Aktivitas inhibitor    ekstrak  metanol  batang  bakau menunjukkan nilai  IC 50 sebesar  1690  µg/mL  (difenolase)  dan  2266 µg/mL  (monofenolase).  Abdullah  (2011)  memperoleh aktivitas  inhibitor terbaik ekstrak  bakau  diperoleh  dari ekstrak  metanol kulit batang  dengan nilai IC 50 1116.65 μg/mL   difenolase .  Ekstrak  bakau  menghambat aktivitas  tirosinase  melalui  mekanisme  penghambatan campuran, yaitu kompetitif dan nonkompetitif.

## Optimasi Aktivitas Tirosinase
Optimasi  konsentrasi  enzim  dan  zeolit  pada elektrode  menggunakan  perangkat  lunak  Minitab 16.2.1  metode  respon  permukaan  (RSM)  dengan melakukan  unit  eksperimen  seperti  terdapat  pada Tabel 1.  Optimasi dilakukan pada elektrode termodifikasi
ferosena (Tir/Zeolit/PCf) dan
nonmodifikasi  ferosena  (Tir/Zeolit/PC).  Optimasi
Tabel 1 Optimasi enzim tirosinase dan zeolit dari RSM Modifikasi Mediator ferosena Tanpa Mediator Enzim (U/mL) Zeolit (mg) Arus Puncak I (µA) E (mV) Vs Ag/AgCl (mV) Arus Puncak I (µA) E (mV) Vs Ag/AgCl (mV) Ipa Ipc Epa Epc Ipa Ipc Epa Epc 79 221 3.44 -2.44 745 -250 4.54 -5.01 665 -220 150 150 2.70 -0.44 830 -275 4.3 -3.99 720 -240 250 150 10.76 -8.01 660 -115 5.26 -4.81 605 -65 50 150 7.94 -5.55 620 -370 4.19 -2.12 670 -210 150 250 1.04 -1.02 620 -60 0.30 -0.64 995 -640
Ekstrak Metanol Rizhoporaceae Sebagai Biosensor Penghambatan Aktivitas Tirosinase Menggunakan Elektrode Pasta Karbon Termodifikasi Ferosena Dan Zeolit
5
didapatkan  pada  elektrode  Tir/Zeolit/PCf  konsentrasi Tirosinase  sebesar 50 U/mL dengan zeolit  sebesar 150 mg.  Arus  puncak  anode  pada  kondisi  tersebut  adalah 7.85 µA pada potensial 620 mV. Hasil ini lebih kecil jika dibandingkan  dengan  Wang et  al .  (2013)  yaitu  respon arus sebesar 492 µA  dengan mengimobilisasi tirosinase 15  mg/ml  pada  nanokomposit  karbon  taut  silang polianilin, Kim dan Yong-Lee (2002) melaporkan respon arus sebesar 200 μ  dengan mengimobilisasi  irosinase 1  mg/mL  pada  film  sol-gel  silikat/Nafion  dengan substrat  fenol.  Perbedaan  respon  arus  ini  disebabkan perbedaan  matriks  penyangga  serta  mediator  yang digunakan.
Reaksi  enzimatis  relatif  sulit  terjadi  sehingga diperlukan  suatu  mediator  yang  dapat  mengalirkan arus  dari  reaksi  enzimatis  menuju  elektrode  pasta karbon  (Trivadilla  2011).  Gambar  1  menunjukkan voltammogram  siklik  hasil  optimasi  zeolit  150  mg/mL dan  tirosinase  50  U/mL.  Voltammogram  siklik menunjukkan  bahwa  tanpa  keberadaan  substrat  dan waktu  inkubasi  tidak  dihasilkan  puncak  reduksi  dan oksidasi.  Reaksi  enzimatis  antara  enzim  tirosinase  dan substrat L-DOPA memerlukan waktu inkubasi (dipenelitian  ini  digunakan  waktu  30  menit  waktu inkubasi).    Mediator  ferosena  yang  digunakan  pada penelitian  ini  dapat  mentransfer  elektron  dari  reaksi enzimatis  menuju  permukaan  elektrode  tetapi  tidak dapat mengkatalisis reaksi enzim dan substrat sehingga perlu  waktu  respons  terlebih  dahulu  agar  enzim mampu bereaksi dengan substrat.
Tirosinase  merupakan  enzim  yang  berperan  dalam proses  oksidasi  senyawa  fenolik.  L-DOPA  merupakan salah satu substrat dari tirosinase yang dapat dioksidasi menjadi  dopakuinon.  Potensial  oksidasi  L-DOPA  yang diperoleh pada kondisi optimum sebesar 620 mV (Tabel 1). Eslami et  al . (2012) memperoleh potensial oksidasi pada  745  mV.  Dopakuinon  ini  selanjutnya  akan direduksi  kembali  oleh  enzim  yang  diimobilisasi  pada permukaan  elektrode  pasta  karbon  yang  ditunjukkan oleh puncak katodik (Gambar 1) dengan arus sebesar - 5.55  µA  pada  potensial  -370  mV  seperti  yang  tertera pada  Tabel  1.  Eslami et  al. 2012  menjelaskan  reaksi antara  tirosinase  dan  L-DOPA  berlangsung  seperti Gambar 2.

## Pengaruh Media Imobilisasi Enzim
Enzim merupakan material yang memiliki selektivitas dan  sensitivitas  yang  tinggi  dalam  keadaan  bebas, namun  sangat  sensitif  terhadap  perubahan  pH  dan suhu  lingkungan.  Untuk  mempertahankan  sifat  enzim maka  dilakukan  suatu  proses  imobilisasi.  Pada penelitian  ini  dilakukan  imobilisasi  enzim  tirosinase pada  elektrode  pasta  karbon  yang  dimodifikasi menggunakan zeolit. Modifikasi yang dilakukan dengan membandingkan  tirosinase  diimobilisasi  dengan  zeolit kemudian  diteteskan  di  atas  permukaan  pasta  karbon termodifikasi  ferosena  (Tir/zeolit/  PCf),  tirosinase diimobilisasi dengan zeolit diteteskan pada permukaan elektrode  pasta  karbon  (Tir/zeolit/PC)  dan  tirosinase diteteskan  pada  permukaan  elektrode  pasta  karbon
Gambar 1 Voltammogram siklik hasil pengoptimuman enzim dan zeolit ( penyangga; Tir/DOPA;
Tir/DOPA 30 menit)
(Tir/PC).  Tabel 2  menunjukkan elektrode Tir/zeolit/PCf memiliki  arus  yang  lebih  besar  dari  Tir/  Zeolit/PC  dan lebih besar dibandingkan Tir/PC dengan nilai berturut- turut sebesar 13.76 µA, 8.34 µA,dan 2.85 µA.
Penggunaan  mediator  ferosena  pada  modifikasi elektrode  pasta  karbon  (Tir/zeolit/PCf)  menghasilkan respon  arus  yang  dihasilkan  lebih  besar  dibanding elektrode  tanpa  modifikasi  (Tir/zeolit/PC)  atau  pun yang  tanpa  modifikasi.  Puncak-puncak  arus  yang terdeteksi dari media-media imobilisasi dapat dilihat di Gambar 3.
Pada  elektrode  dengan  modifikasi  ferosena  terjadi transfer  elektron  melalui  mediator  ferosena  sehingga respon  arus  yang  dihasilkan  lebih  besar.  Potensial puncak memberikan informasi tentang identitas analat dan  proses  kinetika  oksidasi  atau  reduksi,  sedangkan arus puncak memberikan informasi tentang konsentrasi analat dan stabilitas spesi (Trivadilla 2011). Arus  puncak  anode  pada  penyapuan  maju  ( forward scan )  berhubungan  dengan  oksidasi  inti  ferosena  (Fc) menjadi  ion  ferosenaium  Fc+  ([  Fe III (C 5 H 5 ) 2 ] + ), sedangkan  penyapuan  balik  ( reverse  scan )  pada  arus puncak  katode  muncul  akibat  reduksi  Fc + menjadi  Fc
(Trivadilla  2011).  Siklus  reaksi  redoks  tersebut mengikuti persamaan reaksi berikut:
Fe II (C 5 H 5 ) 2 → [Fe III (C 5 H 5 ) 2 ] + +  e - [ Fe III (C 5 H 5 ) 2 ] + + e - → Fe II (C 5 H 5 ) 2 Imobilisasi  enzim  dengan  menggunakan  matriks penyangga  zeolit  dapat  meningkatkan  arus  puncak yang  dihasilkan.  Penggunaan  zeolit  sebagai  material penyangga  pada  biosensor  dapat  meningkatkan aktivitas enzim terimobilisasi ditandai dengan terjadinya  penngkatan  arus  puncak  oksidasi  pada voltammogram  (Gambar  3).  Enzim  yang  telah teradsorbsi pada permukaan zeolit dapat meningkatkan  aktivitas  dan  stabilitas  biosensor. Kemampuan zeolit dalam menjaga efektivitas biosensor disebabkan sifatnya yang hidrofilik oleh adanya gugus – OH  disekitar  pori  sehingga  baik  digunakan  sebagai matriks imobilisasi enzim.

## Penentuan Kinerja Elektrode
Ekstrak  metanol  kulit  batang  bakau  diketahui mempunyai  aktivitas inhibisi tirosinase.  Enzim tirosinase  yang  diimobilisasi  dengan  zeolit  pada permukaan elektrode pasta karbon akan mengoksidasi L-DOPA menjadi dopakuinon ditandai dengan
Gambar 2 Reaksi oksidasi L-Dopa menjadi dopakuinon (Eslami et al. 2012)
Tabel 2 Puncak arus dan potensial modifikasi media imobilisasi Modifikasi Arus Puncak (µA) E (mV) Vs Ag/AgCl (mV) Ipa Ipc Epa Epc Tir/PC 2.85 -2.85 865 -445 Tir/Zeolit/PC 8.34 -2.12 690 -210 Tir/Zeolit/PCf 13.76 -5.55 650 -375
munculnya  puncak  arus  anode  dan  katode  dengan metode  voltametri  siklik.  Penambahan  suatu  inhibitor tirosinase  akan  menghambat  reaksi  oksidasi  L-DOPA menjadi dopakuinon sehingga puncak arus reduksi yang dihasilkan  akan  berkurang.  Tinggi  arus  puncak  yang terbaca  dari  voltammogram  siklik  menyatakan besarnya  konsentrasi  analat  dalam  pengukuran (Trivadilla 2011).
Ekstrak  metanol Rhizopora  apiculata yang digunakan  pada  penelitian  ini  dengan  rentang konsentrasi 250-2000 ppm. Pada penambahan substrat sebesar 250 ppm arus puncak  oksidasi  turun  dari 9.91 µA  menjadi  9.28  µA  dan  pada  penambahan  ekstrak 2000 ppm arus berubah dari 2.78 µA menjadi 2.15 µA. Terjadinya  penurunan  arus  pada  voltammogram  patut diduga adanya inhibitor tirosinase dari ekstrak metanol tanaman Rhizopora  apiculata sehingga  menurunkan aktivitas  tirosinase  dalam  mengoksidasi  L-DOPA (Gambar 4).
Gambar 4 Arus  puncak  aktivitas  tirosinase  ( tanpa inhibitor; dengan inhibitor).
Kinerja  biosensor  yang  dihasilkan  juga  ditentukan oleh  kinetika  enzim  terimobilisasi  pada  elektrode. Kinetika enzim menunjukkan kespesifikan enzim dalam bereaksi  dengan  substrat.  Aktivitas  tirosinase  diukur dengan  variasi  konsentrasi  L-DOPA  antara  0.5-4  mM. Proses  pengukuran  dilakukan  pada  suhu  ruang  dan kondisi  optimum.  Gambar  5  menunjukkan  hubungan antara  konsentrasi  L-DOPA  dengan  aktivitas  tirosinase pada  rentang  konsentrasi  dari  0.5-4  mM.  Peningkatan konsentrasi  substrat  meningkatkan  aktivitas  tirosinase secara  linear  hingga  konsentrasi  4  mM.  Penambahan konsentrasi  substrat  mencapai  maksimum  pada konsentrasi  tertentu.  Pada  konsentrasi  maksimum penambahan  substrat  tidak  meningkatkan  aktivitas enzim. Hal ini disebabkan karena penambahan substrat yang  lebih  banyak  dapat  menghambat  aktivitas  enzim dan  semua  tapak  aktif  enzim  telah  bereaksi  dengan substrat  (Arnaut et  al. 2007).    Keadaan  maksimum diperoleh pada konsentrasi substrat 4 mM dengan arus oksidasi sebesar 6.04 µA.
Gambar 5 Arus  puncak  aktivitas  tirosinase  dengan perubahan konsentrasi L-DOPA
Gambar 3 Voltammogram puncak arus anode dan katode ( Tir/PC; Tir/zeolit/PC; Tir/zeolit/PCf)
-1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 -25,0µ -20,0µ -15,0µ -10,0µ -5,0µ 0,0 5,0µ 10,0µ 15,0µ 20,0µ 25,0µ 30,0µ I (A) E (mV) vs. Ag/AgCl
Arif et al.
Penentuan  rentang  linear  pengukuran  bertujuan untuk  mengetahui  daerah  kerja  maksimum  dari elektrode yang digunakan. Kisaran linearitas substrat L- DOPA ditunjukkan oleh Gambar 6. Berdasarkan gambar tersebut  rentang  linearitas  diperoleh  pada  rentang konsentrasi  0.5-4  mM.  Persamaan  regresi  yang diperoleh  y  =  1.5043x  +  0.121  dengan  nilai  R 2 yang diperoleh pada pengukuran aktivitas tirosinase sebesar 98.24%.
Gambar 6 Rentang  linier  antara  L-DOPA  dengan tirosinase
Parameter kinetika enzim terimobilisasi adalah K M app dan laju reaksi nyata V maks app yang dianalogikan dengan arus  maksimum  nyata  ( I maks app ).  Kinetika  enzim mengikuti  alur  Lineaweaver  –  Burk  dengan  nilai  R sebesar  0.9634  (Gambar  7).  Nilai K M app menunjukkan afinitas  atau  daya  ikat  enzim  tirosinase  terhadap substrat L-DOPA. Nilai K M app semakin  kecil maka enzim akan  semakin  kuat  mengikat  substrat  sehingga  untuk menjenuhkan  enzim  hanya  memerlukan  substrat  yang lebih sedikit. Nilai K M app pada penelitian ini sebesar 6.04 mM dan I maks app sebesar 6.42 mA.  Hasil yang diperoleh jauh  lebih  besar  jika  dibandingkan  dengan  hasil  yang didapatkan oleh Liu et al. (2003) yang mengimobilisasi tirosinase  pada  elektrode  pasta  karbon  termodifikasi emas yang memeperoleh nilai K M app sebesar 53 × 10 -3 mM dan nilai I maks app sebesar 12.3 × 10 -3 mA. Perbedaan ini  dapat  disebabkan  oleh  perbedaan  jenis  material penyangga yang digunakan sebagai matriks pengimobilisasi  dan  teknik  pengimobilisasi  yang digunakan.

## Stabilitas Respon Biosensor
Penggunaan  voltammetri  juga  dapat  dilakukan untuk  menentukan  stabilitas  dari  aktivitas  tirosinase yang  diimobilisasi  permukaan  elektrode  pasta  karbon termodifikasi  zeolit  dan  mediator  ferosena.  Stabilitas
biosensor  ditentukan  dengan  pengukuran  pada  waktu ke-0  hingga  16  jam.  Hasil  pengukuran  stabilitas menunjukkan  semakin  lama  penyimpanan  aktivitas biosensor  yang  dihasilkan  semakin  menurun,  sampai mencapai keadaan stabil mulai jam ke-8 (Gambar 8).
Gambar 7 Alur  Lineweaver-Burk    substrat  L-DOPA dengan tirosinase
Gambar 8 Pengaruh  penyimpanan  biosensor  terhadap kestabilan aktivitas
Aktivitas  biosensor  mengalami  penurunan  hingga 19%  pada  jam  ke-2  penyimpanan.  Penyimpanan biosensor selama 8 jam mengakibatkan aktivitas tersisa 19%. Penurunan aktivitas biosensor disebabkan karena penggunaan  secara  terus  menerus.  Ketika  biosensor digunakan  secara  terus  menerus  seluruh  tapak  aktif enzim  pada  biosensor  telah  jenuh  oleh  substrat, sehingga  ketika  biosensor  digunakan  kembali  enzim tidak  mampu  mengikat  substrat  dan  bereaksi membentuk produk (Bisswanger 2008).

## SIMPULAN
Penggunaan  zeolit  sebagai  matriks  pengimobilisasi dan  mediator  ferosena  dapat  meningkatkan  aktivitas biosensor. Kondisi optimum diperoleh pada konsentrasi enzim  50  U/mL  dan  150  mg  zeolit.  Kinetika  enzim terimobilisasi  mengikuti  kinetika  enzim  Lineweaver  & Burk  dengan  nilai K M app sebesar  6.04  mM  dan I maks app
y = 1.5043x + 0.121 R² = 0.9824 0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 I ( µ A ) [L-DOPA] mM
Ekstrak Metanol Rizhoporaceae Sebagai Biosensor Penghambatan Aktivitas Tirosinase Menggunakan Elektrode Pasta Karbon Termodifikasi Ferosena Dan Zeolit
6.42  mM.  Penurunan  aktivitas  biosensor  berbanding lurus dengan waktu penyimpanan

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan  terima  kasih  diberikan  untuk  Dr  Irmanida Batubara,  M.Si.  dan  Pusat  Studi  Biofarmaka  Tropika LPPM IPB atas bantuan serbuk  tanaman Rizhoporaceae dan preparasi awal sampel.

## DAFTAR PUSTAKA
Abdullah. 2011. Potensi Bakau Rhizophora apiculata BL sebagai inhibitor tirosinase dan antioksidan [tesis]. Bogor (ID): Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Arif  Z.  2011.  Karakterisasi  dan  modifikasi  zeolit  alam sebagai  bahan  media  pendeteksi  studi  kasus: kromium  heksavalen  [tesis].  Bogor  (ID):  Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Arnaut  L,  Formosinho  S,  Burrows  H.  2007. Chemical Kinetics  from  Molecular  Structure  to  Chemical Reactivity . Amsterdam (ND):Elsevier.
Arung ET, Shimizu K, Kondo R. 2006. Inhibitory effect of artocarpanone  from Artocarpus  heterophyllus on melanin  biosynthesis. Journal  of  Biology. 29:1966- 1969.
Astruc  D.  2016.  Why  is  ferrocene  is  so  exceptional?. European Journal of  Inorganic Chemistry . 0000: 1- 25. DOI: 10.1002/ejic.201600983.
Batubara I, Darusman LK, Mitsunaga T, Rahminiwati M,
Djauhari  E.  2010.  Potency  of  Indonesia  medicinal plants  as  tyrosinase  inhibitor  andantioxidants agent. Journal of Biological Science. 10:138-144. Bisswanger  H.  2008. Enzyme  Kinetics  Prinsiples  and Methods . Weinheim (DE): Wiley-VCH.
Chang  TS.  2009.  An  update  review  of  tyrosinase inhibitors. Journal  of  Molecular  Sciences. 10:2440- 2473. doi:10.3390/ijms10062440.
Eslami  M,  Zare  H  R,  Namazian  M.  2012. Thermodynamic  parameters  of  electrochemical oxidation  of  l-DOPA:  Experimental  and  Theoretical Studies. Journal  of  Physical  Chemistry.  B 41:116. doi: 10.1021/jp3054229.
Hartanti  L,  Setiawan  KH.  2009.  Inhibitory  of  some synthetic cinnamic acid derivates towards tyrosinase enzyme. Indonesian Journal of Chemistry. 9(1):158-168.
Heraldy E, His Yam SW, Sulistiono. 2003.
Characterization  and  activation  zeolite  from ponorogo. Indonesian  Journal  of  chemistry .  3  (2): 91-97.
Liu S, Jiuhong Y, Huangxian J. 2003. Renewable phenol biosensor  based  on  a  tyrosinase-colloidal  gold modified  carbon  paste  electrode. Journal  of Electroanalytical Chemistry. 540: 61-67.
Kim  MA,  Yoong-Lee  W.  2002.  Amperometric  phenol biosensor  based  on  sol–gel  silicate/Nafion composite  film. Analytica  Chimica  Acta. 479:43– 150. doi:10.1016/S0003-2670(02)01538-6.
Saiapina OY, Pyeshkova VM, Soldatkin OO,  Melnik  VG, Akata  Kurç  B,  Walcarius  A,  Dzyadevych  SV, Jaffrezic-Renault  N.  2011.  Conductometric  enzyme biosensors based on natural zeolit clinoptilolite for urea  determination. Materials  and  Science Engineering C. 31:1490-1497. doi:10.1016/j.msec.2011.06.003
Serra PA. 2010. Biosensor . Croatia (HR): Intech. Sheng,  W,  Xua,  T,  Maa  H,  Wanga  X,  Li  Q,  Li  J.  2009.
Development  of  an    indirect  competitive  enzyme linked  immunosorbent  assay  for  detection  of danofloxacin  Residues  in  Beef,  Chicken  and  Pork Meats. Journal  of  Food  And  Agricultural Immunology . 20:35-47
Trivadila.  2011.  Biosensor  antioksidan  menggunakan superoksida  dismutase Deinococcus  radiodurans diimobilisasi  pada  permukaan  elektrode  pasta karbon  dan  parameter  kinetikanya.  Tesis.  Bogor (ID):  Sekolah  Pascasarjana,  Institut  Pertanian Bogor.
Wang  B,  Zheng  J,  Hae  Y,  Sheng  Q.  2013.  A  sandwich- type  phenolic  biosensor  based  on  tyrosinase embeddinginto  single-wall  carbon  nanotubes  and polyaniline nanocomposites. Sensors and Actuators B: Chemical. 186 :417– 422.
Wang  X,  ChenL,  Xia  S,  Zhu  Z,  Zhao  J,  Chovelomad  J. 2006. Tyrosinase biosensor based on interdigitated electrodes for herbicides determination. Journal of Electrochemistry Sciences. 1:55-61.
Zhang  Q,  Qu  Y,  Zhou  J,  Zhang  X,  Zhou  H,  Ma  Q,  Li  X. 2011.  Optimization  of  2,3-dihydroxybiphenyl  1,2- dioxygenase  expression  and  its  application  for biosensor. Bioresource  Technology. 102:10553- 10560.