Perbandingan Efektivitas Kitosan (2-Acetamido-2-Deoxy-D-Glucopyranose) dan Nano Kitosan terhadap Pertumbuhan Bakteri Enterococcus faecalis secara In Vitro
Debrina Candra Mardy Qudsi*, Sudjari**, Siwipeni Imawanti Rahayu***

## ABSTRAK
Enterococcus  faecalis merupakan  bakteri  penyebab  vaginitis  aerobik  pada  wanita.  Saat  ini  resistensi bakteri Enterococcus  faecalis terhadap  antimikroba  sering  dilaporkan  sebagai  permasalahan  yang  harus diperhatikan  di  seluruh  dunia.  Kitosan  merupakan  salah  satu  alternatif  bahan  terapi.  Dalam  bidang nanoteknologi,  kitosan dapat diolah menjadi nano kitosan yang mempunyai daya absorbsi yang tinggi jika dibandingkan  dengan  kitosan  biasa.  Penelitian  ini  bertujuan  untukmembuktikan  dan  membandingkan efektivitas kitosan dan nano kitosan dalam menghambat pertumbuhan bakteri Enterococcus faecalis secara in vitro. Penelitian ini adalah true experimental post test only design dengan metode difusi sumur. Kitosan dan nano kitosan dilarutkan menggunakan asam asetat. Konsentrasi kitosan dan nano kitosan yang  digunakan adalah 1  %; 0,5  %; 0,25  %; 0,125  %, dan 0,0625  %.  Data hasil penelitian dianalisis dengan uji one way ANOVA, uji  korelasi  dan  regresi  dengan  tingkat  kepercayaan  95  %  (α  =  0,05).  Dari  hasil  penelitian didapatkan kadar kitosan pada konsentrasi 1%; 0,5 %; 0,25 %; 0,125 %, dan 0,0625 % menghasilkan zona hambat sebesar 36,68 mm, 31,18 mm, 30,56 mm, 26,50 mm, dan 19,81 mm. Sementara  kadar nano kitosan dengan konsentrasi 1 %; 0,5 %; 0,25 %; 0,125 %, dan 0,0625 % menghasilkan zona hambat sebesar 35,52 mm, 31,18 mm, 29,94 mm, 25,75 mm, dan 22.23 mm. Kesimpulan penelitian ini adalah kitosan dan nano kitosan  mempunyai  efektivitas  sebagai  antimikroba  terhadap  bakteri Enterococcus  faecalis secara in  vitro dan  tidak  terdapat  perbedaan  efektivitas  yang  bermakna  pada  nano  kitosan  dalam  menghambat pertumbuhan Enterococcus faecalis jika dibandingkan dengan kitosan.
Kata kunci : Enterococcus faecalis , Kitosan, Nano kitosan, Vaginitis aerobik.
Effectiveness Comparation of Chitosan (2-Acetamido-2-Deoxy-D-Glucopyranose) and Nano Chitosan on the Growth of Enterococcus faecalis In Vitro

## ABSTRACT
Enterococcus  faecalis is  an  aerobic  bacterium  that  causes  aerobic  vaginitis  in  women.  Currently, Enterococcus faecalis is frequently reported as a problem in developed countries and developing countries due  to  its  resistance  to  antimicrobial  drugs.  One  of  some  drugs  alternative  therapies  is  chitosan.  In nanotechnology,  chitosan  can  be  processed  as  nano  chitosan  which  has  high  absorption  rate  when compared to regular chitosan. This study aimed was to verify and compare the effect of chitosan and nano chitosan  to  prevent  the  growth  of Enterococcus  faecalis in  vitro.  This  research  was  true  experimental research  post  test  only  design  with  well  diffusion  method.  Chitosan  and  nano  chitosan  were  dissolved  in acetic acid. The concentration of chitosan and nano chitosan using in this study were 1 %; 0.5 %; 0.25 %; 0.125 % and 0.0625 %. The result was analyzed using one way ANOVA, correlation test and regression test with 95 % confidence level (α = 0.05). The result showed that inhibitory zone of chitosan with concentration 1 %; 0.5  %; 0.25  %; 0.125  %, and 0.0625  %  were 36,6875 mm,  31,1875 mm, 30,5625 mm, 26,5 mm, and 19.8125. The inhibitory zone of nano chitosan with the same concentration were 35,525 mm, 31,1875 mm, 29,9375 mm, 25,75 mm, and 22 225 mm. This study concluded that chitosan and nano chitosan are effective as antimicrobial agents for Enterococcus faecalis bacteria in vitro but there are no significant beetwen nano chitosan and chitosan for inhibiting the growth of Enterococcus faecalis .
Keywords :  Aerobic vaginitis, Chitosan, Enterococcus faecalis, Nano chitosan.
* Program Studi Kebidanan, FKUB
** Laboratorium Parasitologi, FKUB
*** Laboratorium Mikrobiologi, FKUB

## PENDAHULUAN
Vaginitis  seperti  candidiasis,  vaginosis bakterial,  dan  trichomoniasis  merupakan suatu  kondisi  klinis  yang  sering  ditemukan pada  vagina. 1 Dalam  kasus-kasus  sedang dan berat reaksi terhadap bakteri penyebab VA ini dapat dilihat dari adanya peningkatan jumlah leukosit dan terkadang dapat disertai adanya toksin di dalam tubuh. 2
Prevalensi VA masih cukup tinggi yakni mencapai  51  %,  dengan  rincian  kandidiasis 17  %  dan  vaginosis  bakterial  (BV)  sebesar 15  %. 1 Penelitian  di  Karnataka  menemukan bahwa  prevalensi  VA  sebesar  40,8 %  pada usia 26–30 tahun. 3 Penyebab  VA terbanyak disebabkan  oleh  bakteri  Gram  positif  yakni sebesar 59,7 % sedangkan yang disebabkan oleh  Gram  negatif    sebesar  10,5  %. Beberapa  bakteri  aerob  patogen  yang ditemukan  dalam swab vagina  antara  lain Enterococcus spp., Staphylococcus spp., Klebsiella spp.,  dan Escherichia  coli . 4
Pengobatan  yang  dilakukan  pada  infeksi vagina  yang  disebabkan  oleh  bakteri Enterococcus  faecalis dapat  dilakukan dengan  menggunakan  antibiotik  secara topikal  maupun  oral.
5,6 Namun  resistensi bakteri  tersebut  terhadap  antimikroba  kini makin sering dilaporkan sebagai permasalahan  yang  harus  diperhatikan  di seluruh  dunia, baik  di  negara  maju  maupun negara  berkembang,  Infeksi  bakteri  ini  tak hanya dilaporkan di rumah sakit, namun juga pada komunitas . 7,8
Kitosan  adalah  suatu  bahan  alami  dan terdapat  banyak  di  alam  yang  diduga dapat menghambat  pertumbuhan Enterococcus faecalis . Kitosan merupakan biopoliaminosakarida  linear  alami  yang diperoleh  dari  deasetilasi  kitin. 9 Dalam
bidang  kedokteran  kitosan  dapat  digunakan untuk  mencegah  pertumbuhan Candida albicans dan Staphylococcus aureus . Selain sebagai  antimikroba  dan  antijamur,  kitosan memiliki sifat sebagai antikoagulan,
antitumor dan antivirus. 10 Kitosan merupakan jenis  polimer  alam  yang  mempunyai  rantai tidak linier dan disebut sebagai poli β-(1,4)-2 amino-  2-deoksi-D-glukopiranosa.  Kitosan merupakan  turunan  utama  dari  kitin  yang berasal dari kulit crustaceae , serangga, dan fungi. 11,12
Kitosan  berpotensi  untuk  dijadikan sebagai  bahan  antimikroba  karena  kitosan mengandung  enzim  lisozim  dan  gugus aminopolisakarida  yang  dapat  menghambat pertumbuhan  mikroba.  Kemampuan  dalam menekan  pertumbuhan  bakteri  kitosan berasal  dari  adanya  polikation  bermuatan positif  pada  kitosan  yang  mampu menghambat  pertumbuhan  bakteri  dan kapang  (jamur  multiseluler). 13 Sekarang  ini, banyak  ahli  yang  mengolah  kitosan  dengan nanoteknologi  dan  menghasilkan  substansi yang  disebut  dengan  nanokitosan. 14 Nanokitosan  merupakan  kitosan  dengan ukuran  partikel  100-400  nm.  Menurut Cheung et al (2008) nanokitosan mempunyai daya absorbsi yang tinggi jika dibandingkan dengan kitosan biasa. Dalam dunia farmasi, partikel  nano  sering  digunakan  karena  jauh lebih mudah diserap oleh tubuh dan memiliki daya  kelarutan  yang  tinggi.  Selain  itu, partikel  nano  terbukti  unggul  dalam  hal stabilitas,  sehingga  diharapkan  dapat mengobati  penyakit  dengan  cepat,  efektif, dan efisien. 15 Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan dan membandingkan efektivitas  kitosan  dan  nano  kitosan  dalam menghambat pertumbuhan bakteri
Enterococcus faecalis. Diharapkan penelitian ini  dapat  berguna  untuk  masyarakat  luas dalam  hal  terapi  penyakit,  terutama vaginosis  aerobik,  yang  disebabkan  oleh bakteri Enterococcus faecalis.

## BAHAN DAN METODE

## Desain Penelitian
Desain  penelitian  yang  digunakan adalah  penelitian  true  eksperimental laboratorik  dengan post  test  only  control group  design .  Uji  efektivitas  kitosan  dan nanokitosan  sebagai  antimikroba  dilakukan secara in  vitro menggunakan  metode  difusi sumur  untuk  mengetahui  KHM  (kadar hambat minimal).

## Variabel Penelitian
Variabel  bebas  dalam  penelitian  ini adalah  dosis  kitosan  dan  nano  kitosan  dan variabel  tergantung  adalah  pertumbuhan bakteri Enterococcus faecalis . Sampel Penelitian Sampel yang digunakan dalam penelitian  ini  adalah  bakteri Enterococcus faecalis koleksi  Laboratorium  Mikrobiologi Fakultas  Kedokteran  Universitas  Brawijaya. Isolat  bakteri Enterococcus  faecalis ATCC
29212 yang  digunakan  berasal  dari  BBLK Yogyakarta. Dalam penelitian ini, banyaknya pengulangan  yang  dilakukan  ditentukan berdasarkan perhitungan rumus 16 : p (n-1) ≥ 15 5 (n-1) ≥ 15 5n – 5 ≥ 15 n ≥ 4 Keterangan :
p : jumlah perlakuan n : jumlah sampel tiap kelompok. Jadi  dalam  penelitian  ini  jumlah  sampel pengulangan adalah sebanyak 4 kali.

## Identifikasi Bakteri
Pengecatan  Gram  dilakukan  dengan cara  satu  ose  bakteri  dari  biakan  cair diletakkan pada object glass ditunggu hingga kering kemudian difiksasi dengan memberikan  pemanasan  secukupnya  lalu diberi larutan kristal violet, didiamkan 1 menit lalu  bilas  dengan  air  yang  mengalir.
Kemudian  diberi  larutan  lugol  didiamkan  1 menit dan dibilas dengan air yang mengalir. Beri larutan alkohol 96 % selama 5-10 detik, bilas  dengan  air  yang  mengalir.  Kemudian diberi  larutan  safranin,  diamkan  30  detik, dibilas dengan air yang mengalir lalu sediaan dikeringkan  dengan  kertas  penghisap. Tetesi  minyak  emersi  dan  dilihat  di  bawah mikroskop  dengan  perbesaran  100x  dan dicari  adanya  sel  bakteri  Gram  positif. Selanjutnya  bakteri  diuji  menggunakan  uji katalase  dengan  cara  mengambil  sebagian perbenihan  cair  dan  diletakkan  pada  glas objek  dan  menetesi  dengan  larutan  H 2 O 2 3 %.  Lalu  dilakukan salt  tolerance  test dilakukan  dengan  cara  Tube :  BHI  +  6,5  %
NaCl + pH indikator (bromcresol purple) dan memasukan  maksimal  3  koloni  dari  kultur berusia 18-24 jam, diinkubasi selama 24-72 jam  pada  suhu  37 ⁰ C.  Uji  biokimia  (L- arabinose,  arginin  dihirdrolase  dan  manitol) menggunakan  strip  microbact  dengan mengambil ±5 koloni dari kultur berusia 18- 24  jam,  dilarutkan  kedalam  1  cc  NS  lalu memasukan  reagen  L-arabinose,  arginin dihidrolase  dan  manitol  dalam  sumuran  uji biokimia  kemudian  memasukan  100  µl larutan  berisi  bakteri  dalam  sumuran,  tutup dengan selotip dan diinkubasi selama 24 jam pada  suhu  37 ⁰ C.  Kemudian  kultur Enterococcus  faecalis ditanam  dalam  BAP selama  18-24  jam  untuk  melakukan  uji hemolisis.

## Pembuatan Suspensi Bakteri
Koloni Enterococcus faecalis dari media blood agar plate (BAP) ditanam pada media brain  heart  infusion sebanyak  5  ml. Kemudian  diukur  ODnya  pada  panjang gelombang  625  nm  untuk  mendapatkan konsentrasi bakteri sebesar 10 8 CFU/ml yang setara  dengan  OD  =  0,1.  Untuk mendapatkan  bakteri  dengan  konsentrasi 10 6 CFU/ml  maka  dilakukan  penghitungan rumus sebagai berikut:
Keterangan: N 1 = Konsentrasi bakteri yang dicari V 1 =  Volume  bakteri  yang  akan ditambah dengan pengencer N 2 =  OD  (0,1  setara  dengan  10 8 CFU/ml) V 2 =  Volume  suspensi  bakteri  uji  (10 ml)
Uji  Daya  Antibakteri  Kitosan  dan  Nano Kitosan  terhadap Enterococcus  faecalis secara In Vitro Pada  medium  BHI  (hard  agar  dan  soft agar)  dibuat  sumuran  berdiameter  6  mm pada  medium  hard  agar  kemudian ditambahkan  suspensi  bakteri Enterococcus faecalis sebanyak 0,1 ml bakteri 10 6 CFU/ml diteteskan  pada  Hard  Agar  dalam  cawan petri lalu diratakan. Lalu dituangkan medium soft  agar  (hangat–hangat  kuku),  goyang searah  jarum  jam  dan  membiarkan  hingga dingin  dan  memadat  kemudian  mengambil alat  sumuran.  Masukkan  larutan  kitosan maupun nano kitosan dengan konsentrasi 1 %,  0,5  %,  0,25  %,  0,125  %,  0,0625  %  ke dalam  masing-masing  lubang  sebanyak  50 µl.  Plate  kemudian  dimasukan  ke  dalam inkubator  selama  24  jam  pada  suhu  37  ºC. Daya  antibakteri  yang  terjadi  ditentukan dengan  mengukur  diameter  zona  hambatan pertumbuhan  dengan  menggunakan  jangka sorong dan pengulangan perlakuan sebanyak 4 kali. 17 HASIL Hasil pewarnaan Gram bakteri Enterococcus faecalis adalah ungu, berbentuk  kokus  dan  merupakan  bakteri Gram positif. Hasil pewarnaan Gram bakteri
Enterococcus  faecalis dapat  dilihat  pada Gambar 1.
Gambar  1.  Hasil  identifikasi Enterococcus faecalis dengan  pewarnaan  Gram  adalah berbentuk kokus dan bersifat Gram positif.
Hasil uji katalase adalah negatif karena tidak  terbentuk  gelembung  ketika  ditetesi H 2 O 2 .  Hal  ini  menunjukan  bahwa  bakteri Enterococcus  faecalis tidak  memproduksi enzim  katalase  (Gambar  2).  Hasil  uji hemolisis  menandakan  bahwa  bakteri Enterococcus  faecalis merupakan  bakteri gamma  hemolisis  (γ) atau  disebut  juga  non hemolisis (Gambar 3). Pada uji salt tolerance tidak  didapatkan  perubahan  warna  pada medium  setelah  diinkubasi  selama  24  jam akan tetapi terjadi perubahan kekeruhan. Hal ini  menandakan  adanya  pertumbuhan bakteri  (Gambar  4).  Pada  uji  biokimia  L- arabinose adalah  negatif  (warna biru), uji arginin  positif  (warna  biru),  uji manitol  negatif  (warna  biru  tua–hijau) (Gambar 5).
Gambar  2.  Hasil  identifikasi Enterococcus faecalis dengan  uji  Katalase  (katalase negatif, bakteri anaerob)
N 1 x V 1 = N 2 x V 2
Staphylococcus  aureus
Enterococcus fecalis
Gambar  3.  Hasil  identifikasi Enterococcus faecalis dengan uji hemolisis (BAP) (Gamma hemolisis (γ), tidak ada perubahan warna).
Gambar  4.  Hasil  identifikasi Enterococcus faecalis dengan uji salt tolerance setelah 24 jam  (turbiditas  (+),  tidak  ada  perubahan warna medium).
Gambar  5.  Hasil  identifikasi Enterococcus faecalis dengan  uji  biokimia        (Arginin dihidrolase (+), Manitol (-), L-arabinose (-)). Hasil Pengukuran Diameter Zona Hambat antara  Kitosan  dan  Nano  Kitosan terhadap Enterococcus faecalis Penelitian  ini  menggunakan  beberapa macam  konsentrasi  dari  kitosan  dan  nano kitosan  yaitu  1  %,  0,5  %,  0,25  %,  0,125  % dan  0,0625  %.  Penentuan  perbedaan  daya antibakteri  antara  kitosan  dan  nano  kitosan dilakukan  dengan  metode  difusi  sumuran. Perbedaan  daya  antibakteri  ditentukan berdasarkan besar diameter zona hambatan pada  medium  BHI  yang  telah  dicampurkan dengan  bakteri Enterococcus  faecalis kemudian  diteteskan  kitosan  atau  nano kitosan.  Perubahan  yang  diamati  pada penelitian  ini  yakni  terbentuknya  diameter zona hambatan bakteri yang ada di sekeliling sumuran.  Hasil  uji  daya  antibakteri  kitosan dan  nano  kitosan  pada  masing–masing konsentrasi yakni 1 %, 0,5 %, 0,25 %, 0,125 %  dan  0,0625  %  dengan  menggunakan metode  difusi  sumuran  disajikan  pada Gambar 6 dan 7 berikut.
Gambar 6. Zona hambat Enterococcus faecalis pada medium NAP dengan berbagai konsentrasi kitosan: (a).  1 %,  (b). 0,5 %, (c). 0,25 %, (d).  0,125 % dan (e). 0,0625 %.
a a c b d a e
Gambar 7. Zona hambat Enterococcus faecalis pada medium NAP dengan berbagai konsentrasi nano kitosan: (a).  1 %,  (b). 0,5 %, (c). 0,25 %, (d). 0,125 %, (e). 0,0625 %  dan  (f). Kontrol.
Berdasarkan  hasil  uji  difusi  sumuran dapat  diukur  zona  hambatan  bakteri  dan dapat ditentukan perbedaan daya antibakteri antara  kitosan  dan  nano  kitosan  terhadap Enterococcus  faecalis. Hasil  perhitungan diameter  zona  hambat  kitosan  dan  nano kitosan disajikan pada Tabel 1 dan 2.
Tabel 1.  Hasil  perhitungan  zona  hambat bakteri Enterococcus  faecalis 10 6 cfu/ml pada berbagai konsentrasi perlakuan kitosan.
Konsentrasi (%) Zona Hambatan Kitosan Rerata (mm) Standar Deviasi Pengulangan I II III IV 1 36 33,25  37,25 36,25 36,6875 ± 1,172 0,5 31 29,75 32 32 31,1875 ± 1,068 0,25 30,25 31,25  30,25 30,5 30,5625 ± 0,473 0,125 27,5 25 27,5 26 26,5 ± 1,225 0,0625 19,5 20 20 19,75 19,8125 ± 0,239 Pada  Tabel  1  di  atas  dapat  dilihat perbedaan  zona  hambat  pada  setiap perlakuan  yang  menunjukan  adanya perbedaan  kemampuan    kitosan  dalam menghambat  pertumbuhan  bakteri  pada masing–masing kelompok perlakuan. Kitosan dengan konsentrasi 1 %, 0,5 %, 0,25 %,  0,125  %,  dan  0,0625  %  menghasilkan
zona  hambatan  yang  mengartikan  bahwa kitosan  memiliki  sifat  antibakteri  terhadap Enterococcus  faecalis. Zona  hambatan sudah  terbentuk  pada  konsentrasi  kitosan 0,06  %,  sedangkan  pada  konsentrasi  1  % menunjukan zona hambatan terbesar.
a b c d f e
Tabel  2.  Hasil  perhitungan  zona  hambat  bakteri Enterococcus  faecalis 10 6 cfu/ml  pada  berbagai konsentrasi perlakuan nano kitosan.
Konsentrasi (%) Zona Hambatan Nano Kitosan Rerata (mm) Standar Deviasi Pengulangan I II III IV 1 35,0 34 36,6 36,5 35,525 ± 1,253 0,5 29,5 31,75 31,5 32 31,1875 ± 1,143 0,25 29,75 28,75 31,25 30,0 29,9375 ± 1,028 0,125 25 25,75 25,75 26,5 25,75 ±0,612 0,0625 23 22,25 21,65 22,0 22.225 ± 0,572
Pada  Tabel  2  di  atas  dapat  dilihat perbedaan  zona  hambat  pada  setiap perlakuan  yang  menunjukan  adanya  sifat nano  kitosan  yang  dapat  menghambat pertumbuhan  yang  berbeda  pada  masing– masing  kelompok  perlakuan.  Nano  kitosan dengan  konsentrasi  1  %,  0,5  %,  0,25  %, 0,125 %, dan 0,0625 % menunjukkan bahwa kitosan  memiliki  sifat  antibakteri  terhadap Enterococcus  faecalis. Zona  hambatan sudah  terbentuk  pada  konsentrasi  kitosan 0,06  %,  sedangkan  pada  konsentrasi  1  % menunjukan zona hambatan terbesar.
Gambar  8.  Nilai  zona  hambat  bakteri Enterococcus  faecalis terhadap  perubahan konsentrasi kitosan dan nano kitosan.
Berdasarkan  Gambar  8  nilai  zona hambat  bakteri Enterococcus  faecalis terhadap  konsentrasi  kitosan  dan  nano kitosan  terlihat  perbedaaan  nilai  zona
hambat  bakteri  hanya  pada  konsentrasi kitosan  dan  nano  kitosan  0,0625 % dengan nilai zona hambat 19,81 mm dan 22,22 mm. Namun  pada  konsentrasi  lainnya  tidak terlihat  adanya  perbedaaan  yang  nyata terhadap  pemberian  kitosan  dan  nano kitosan  terhadap  nilai  zona  hambat  bakteri Enterococcus  faecalis .  Pada  Gambar  8    di atas juga dapat dilihat bahwa semakin tinggi konsentrasi  maka  zona  hambatanya semakin besar.

## Analisis Data
One way ANOVA One way ANOVA merupakan pengujian untuk  mengetahui  perbedaan  nyata  pada konsentrasi  kitosan  dan  nano  kitosan terhadap  rerata  pertumbuhan  koloni Enterococcus faecalis . Dari hasil uji one way ANOVA    didapatkan  angka  signifikansi kitosan  sebesar  0,000  ( p  <  0,05 )  dan  nano kitosan  sebesar  0,000  ( p  <  0,05 ).  Hal  ini berarti  efek  perubahan  konsentrasi  kitosan dan  nano  kitosan  terhadap  jumlah  rerata koloni Enterococcus faecalis adalah berbeda secara  signifikan  pada  taraf  kepercayaan 95 %.
Post Hoc Test Tukey
Uji post  hoc Tukey  merupakan  uji pembandingan berganda ( multiple comparisons ). Uji ini menunjukkan pasangan kelompok sampel (kelompok perlakuan atau konsentrasi  dan  jumlah  koloni)  yang
0 5 10 15 20 25 30 35 40 Kitosan Nano Kitosan Zona Hambat Konsentrasi
memberikan  perbedaan  yang  signifikan  dan yang  tidak  memberikan  perbedaan  secara signifikan.Dari  hasil  uji post  hoc Tukey diketahui  bahwa  ada  perbedaan  yang signifikan  pada  setiap  pasangan  kelompok sampel  kitosan  (K)  dan  nano  kitosan  (N) yang  ditunjukkan  oleh  angka  signifikansi kurang dari 0,010 (p < 0,05). Pada kelompok K 1 % yang tidak signifikan adalah N 1 %, K 0,5 % yang tidak signifikan adalah K 0,25 %, N 0,5 % dan N 0,25 %, K 0,25 % yang tidak signifikan adalah K 0,25 %, N 0,5 % dan N 0,25  %,  K  0,125  %  yang  tidak  signifikan adalah  N  0,125  %,  K  0,06  %  yang  tidak signifikan adalah N 0,06 %, N 1 % yang tidak signifikan adalah K 1 %, N 0,5 % yang tidak signifikan adalah K  0,5 %, K 0,25 % dan N 0,25  %,  N  0,25  %  yang  tidak  signifikan adalah  K  0,5  %  dan  K  0,25  %,  N  0,125  % yang tidak signifikan adalah K 0,125 %, dan N  0,06  %  yang  tidak  signifikan  adalah  K 0,06 %. Pada kelompok yang tidak signifikan adalah  kelompok  yang  tidak  menunjukkan perbedaan  efek  yang  signifikan  pada pertumbuhan jumlah koloni. Nilai signifikansi dari  N  1  %  adalah  1,000  (p  >  0,05).  Nilai signifikansi  antara  konsentrasi  K  0,25  %,  K 0,5 %, N 0,5 % dan N 0,25 % adalah 0,997 (p  >  0,05).  Nilai  signifikansi  antara konsentrasi N 1 %, N 0,5 %, K 0,5 % dan K 1 adalah  1,000  (p  >  0,05).  Nilai  signifikansi antara konsentrasi N 0,125 % dan K 0,125 % adalah  0,967  (p  >  0,05).  Nilai  signifikansi antara konsentrasi N 0,25 %, K 0,5 % dan N 0,5 adalah 0,773 (p > 0,05). Nilai signifikansi antara konsentrasi  N  0,06 % dan  K 0,06 % adalah 0,060 (p > 0,05). Hal ini menunjukan bahwa  perbedaan  konsentrasi  yang  sama antara  kitosan  dan  nano  kitosan  tidak menunjukkan perbedaan pertumbuhan koloni bakteri yang bermakna. Tabel  3.  Hasil    uji  statistik  homogeneous subsets
Pada  Tabel  3  diketahui subset mana saja  yang  mempunyai  perbedaan  reratanya yang  tidak  signifikan.  Pada homogeneous subsets ini  keenam  kelompok  koloni  bakteri masuk ke dalam empat subset. Pada subset 1  diisi  oleh  2  kelompok  dengan  konsentrasi kitosan  0,06  %  dan  nano  kitosan  0,06  % ( v /v).  Pada subset 2  diisi  oleh  2  kelompok dengan  konsentrasi  kitosan  0,125  %  dan nano  kitosan  0,125  %  ( V / V ).  Pada subset 3 diisi  oleh  4  kelompok  dengan  konsentrasi kitosan 0,25 %, nano kitosan 0,25 %, kitosan 0,5  %  dan  nano  kitosan  0,5%  ( v / v ).  Pada subset 4  diisi  oleh  2  kelompok  dengan konsentrasi  kitosan  1  %  dan  nano  kitosan 1 % ( v / v ). Hasil pada homogeneous subsets sesuai dengan hasil yang telah didapat pada uji post hoc Tukey.

## Uji  Korelasi  Kitosan  terhadap  Bakteri

## Enterococcus faecalis
Uji  korelasi  menunjukkan  angka signifikansi  0,000  (p  <  0,05)  yang  berarti terdapat  hubungan  yang  bermakna  antara pemberian  kitosan  dengan  jumlah  koloni bakteri Enterococcus  faecalis. Besar koefisien  korelasi  Pearson  yaitu  r  =  0,843. Tanda  positif  menunjukkan  bahwa  semakin tinggi  konsentrasi  kitosan  maka  semakin luas zona hambat yang diperoleh. 18
Zona Hambat Tukey  HSD a 4 1.98125 4 2.22250
4 2.57500 4 2.65000 4 2.99375
4 3.05625 4 3.11875 4 3.11875 4 3.55250 4 3.56875
.060 .987 .773 1.000 Kelompok K 0, 06 N 0,06 N 0,125
K 0, 125
N 0,25
K 0, 25 K 0, 5 N 0,5 N 1 K 1 Sig. N 1 2 3 4 Subset f or alpha = .05 Means  f or groups  in homogeneous subsets are display ed. Uses Harmonic Mean Sample Size = 4.000. a.
Uji  Korelasi  Nano  Kitosan  terhadap
Bakteri Enterococcus faecalis
Uji  korelasi  menunjukkan  angka signifikansi  0,000  (p  <  0,05)  yang  berarti terdapat  hubungan  yang  bermakna  antara pemberian  nano  kitosan  dengan  jumlah koloni  bakteri Enterococcus  faecalis. Besar koefisien  korelasi  Pearson  yaitu  r  =  0,905. Tanda  positif  menunjukkan  bahwa  semakin tinggi  konsentrasi  kitosan  maka  semakin luas zona hambat yang diperoleh. 18

## Uji Regresi Linier
Analisis  regresi  digunakan  untuk menentukan model yang paling sesuai untuk pasangan data serta dapat digunakan untuk membuat  model  dan  menyelidiki  hubungan antara  dua  variabel  atau  lebih.  Dalam penelitian  ini  uji  regresi  digunakan  untuk mengetahui  sejauh  mana  hubungan  antara peningkatan konsentrasi dengan kemampuan penghambatan terhadap koloni. Koefisien  determinasi  R  Square  (r 2 )  kitosan sebesar 0,710 menyatakan besarnya derajat keeratan  hubungan  antara  konsentrasi kitosan  dengan  jumlah  koloni  bakteri
Enterococcus  faecalis yaitu  79,9  %.  Hal  ini berarti  kontribusi  pemberian  kitosan  dalam menurunkan jumlah koloni bakteri Enterococcus  faecalis sebesar  71,0  % sedangkan sisanya 29,0 % disebabkan oleh faktor-faktor  lain  yang  tidak  diteliti. 18 Sedangkan  R  Square  (r 2 )  nano  kitosan sebesar 0,819 menyatakan besarnya derajat keeratan hubungan antara konsentrasi nano kitosan  dengan  jumlah  koloni  bakteri Enterococcus  faecalis yaitu  81,9  %.  Hal  ini berarti  kontribusi  pemberian  nano    kitosan dalam  menurunkan  jumlah  koloni  bakteri Enterococcus faecalis sebesar 81,9 %.

## PEMBAHASAN
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui  perbedaan  efektivitas  antara kitosan (2-acetamido-2-deoxy
glucopyranose)  dan  nano  kitosan  sebagai antimikroba  terhadap  bakteri Enterococcus faecalis secara in  vitro .  Selain  untuk mengetahui  hubungan  antara  kitosan maupun  nano  kitosan  dengan  pertumbuhan Enterococcus  faecalis ,  penelitian  ini  juga bertujuan  untuk  mengetahui  kadar  hambat minimum  (KHM)  kitosan  maupun  nano kitosan  terhadap  bakteri Enterococcus faecalis .  Metode  yang  digunakan  dalam penelitian ini adalah well difusion atau difusi sumur  untuk  mengetahui  KHM  melalui diameter  zona  inhibisi  yang  diukur  dalam mm. 19 Pada  penelitian  ini  tidak  mencari kadar  bunuh  minimal  dikarenakan  peneliti hanya  mencari  perbandingan  efektivitas kadar  hambat  minimum  antara  kitosan  dan nano kitosan pada konsentrasi yang sama.

## Kadar Hambat Minimum Kitosan
Kadar  hambat  minimum  (KHM)  pada penelitian  ini  diperoleh  dengan  mengukur zona  hambat  kitosan  setelah  diinkubasikan selama  24  jam.  Pada  penelitian  ini  rerata zona  hambat  yang  didapat  secara  berturut- turut pada konsentrasi  1 %, 0,5 %, 0,25 %, 0,125 % dan 0,0625 % adalah  36,6875 mm; 31,1875  mm;  30,5625  mm;  26,5mm;  dan 19,8125  mm.  Jadi,  semakin  luas  diameter zona  hambat  berarti  semakin  sedikit  jumlah bakteri  yang  tumbuh.  Hal  ini  menunjukan adanya  aktivitas  antimikroba  dari  kitosan dalam menghambat pertumbuhan
Enterococcus faecalis.  Kitosan  dapat membunuh  bakteri  dengan  mengganggu dinding  sel  bakteri  sehingga mengakibatkan adanya  kerusakan  struktur,  fungsi  dan permeabilitas  bakteri  kemudian  terjadi kebocoran  komponen  intraseluler  dan  sel lisis. 20

## Kadar Hambat Minimum Nano Kitosan
Kadar  hambat  minimum  (KHM)  pada penelitian  ini  diperoleh  dengan  mengukur zona  hambat  kitosan  setelah  diinkubasikan selama  24  jam.  Pada  penelitian  ini  rerata
zona  hambat  yang  didapat  secara  berturut- turut pada konsentrasi  1 %; 0,5 %; 0,25 %; 0,125  %  dan  0,0625  %  ialah  35,525  mm; 31,1875  mm;  29,9375  mm;  25,75  mm  dan 22.225  mm.  Jadi,  semakin  luas  diameter zona  hambat  berarti  semakin  sedikit  jumlah bakteri  yang  tumbuh  di  sana.  Nano  partikel kitosan menunjukkan kemampuan antibakteri  lebih  tinggi.  Nano  kitosan  dapat menghambat  pertumbuhan  bakteri  lebih tinggi  dibandingkan  dengan  kitosan,  hal  ini dikarenakan  adanya  permukaan  bermuatan negatif  dari  sel  bakteri  sel  yang  merupakan target  dari  polikationik  Oleh  karena  itu, kitosan  nano  partikel  dengan  kerapatan muatan  polikationik  permukaan  yang  lebih tinggi  berinteraksi  dengan  bakteri  ke  tingkat yang  lebih  besar  daripada  kitosan  sendiri. Partikel  nano  kitosan  memberikan  afinitas yang  lebih  tinggi  dengan  sel  bakteri  karena luas  permukaan  yang  lebih  besar  nano partikel kitosan. Nanopartikel bisa teradsorpsi pada permukaan sel bakteri dan mengganggu membran yang mengakibatkan kebocoran  komponen  intraseluler,  sehingga membunuh bakteri. 21

## Perbandingan Kitosan dan Nano Kitosan
Berdasarkan  beberapa  hasil  penelitian yang  telah  disebutkan  di  atas  maka  dapat disimpulkan bahwa kitosan dan nano kitosan mempunyai  efek  anitimikroba  terhadap bakteri,  khususnya Enterococcus  faecalis dikarenakan  mengandung  enzim  lysosim dan  gugus  aminopolysacharida  yang  dapat menghambat  pertumbuhan  mikroba  dan efisiensi  daya  hambat  kitosan  terhadap bakteri tergantung dari konsentrasi pelarutan kitosan.  Kemampuan  dalam  menekan pertumbuhan bakteri karena kitosan memiliki polikation  bermuatan  positif  yang  mampu menghambat  pertumbuhan  bakteri  dan kapang (jamur multiseluler). 13 Pada penelitian ini tidak ada perbedaan yang  bermakna  antara  kitosan  dan  nano kitosan  dalam  menghambat  pertumbuhan
bakteri Enterococcus  faecalis. Hal  ini  dapat dilihat  pada  Tabel  3 homogeneous  subsets yang  menunjukkan  bahwa  ada  tidak  ada perbedaan efektivitas yang bermakna antara kitosan  dan  nano  kitosan  sebagai antimikroba  terhadap  bakteri Enterococcus faecalis. Bukti  tersebut  dapat  disebabkan oleh adanya perbedaan derajat deasetilisasi dan berat molekul yang mempengaruhi daya hambat  sebagai  antimikroba.  Perbedaan- perbedaan  tersebut  dapat  disebabkan  oleh faktor  derajat  deasetilisi  (DD)  yang menunjukkan  karakter  kitosan  dan  berat molekulnya.  Derajat  deasetilasi  merupakan persentase  atau  yang  menunjukkan  gugus asetil yang hilang digantikan dengan amina. Derajat  deasetilasi  kitosan  menunjukkan keberadaan  atau  jumlah  sisi  kationik potensial  yang  ada  di  sepanjang  rantai polimer. Derajat deasetilasi kitosan dipengaruhi oleh konsentrasi NaOH sebagai penghidrolisis kitin dan suhu proses. Larutan
NaOH  konsentrasi  tinggi  (≤40  %)  berfungsi untuk  memutuskan  ikatan  antar  gugus karboksil dengan atom nitrogen dari N-asetil. Tingginya  konsentrasi  NaOH  menyebabkan gugus  fungsional  amino  (-NH 3+ )  yang mensubstitusi  gugus  asetil  di  dalam  sistem larutan  semakin  aktif  sehingga  proses deasetilasi  semakin  baik. 22 Menurut  Candra P (2008) semakin besar konsentrasi NaOH, temperatur  dan  waktu  maka  derajat deasetilasi  (DD)  kitosan  yang  dihasilkan semakin  besar.  Proses  redeasetilasi  secara signifikan  memperbesar  derajat  deasetilasi (DD)  kitosan.  Selain  itu,  kekentalan  larutan kitosan    maupun  nano  kitosan  yang  rendah dapat  mengakibatkan  dengan  mudah berdifusi  ke  media  Agar  tempat  tumbuhnya Enterococcus  faecalis .  Jadi  hasil  penelitian ini  masih  belum  dapat  diaplikasikan  secara langsung  dalam  kasus-kasus  infeksi  yang disebabkan  oleh  bakteri Enterococcus faecalis . 23 Oleh  karena  itu  diperlukan penelitian  yang  lebih  luas  agar  nantinya dapat  diaplikasikan  secara  klinis  pada
manusia.  Penelitian  ini  memiliki  beberapa kekurangan,  diantaranya  adalah  tidak dibandingkanya daya antibakteri kitosan dan nano kitosan dengan obat standar yang telah diketahui efektivitasnya terhadap Enterococcus  faecalis  seperti  gentamisin. Perhitungan  berat  molekul  dari  kedua  zat yakni  kitosan  dan  nano  kitosan  tidak dilakukan  serta  pengukuran  nano  kitosan melalui  SEM.  Pada  penelitian  selanjutnya dapat  lebih  dilakukan  untuk  mencari  kadar bunuh  minimal  dengan  kisaran  konsentrasi dibawah  0,0625  %  serta  mengukur  berat molekul  dan  derajat  deasetilisasi  sebelum membandingkan  antara    kitosan  dan  nano kitosan.

## KESIMPULAN
1. Kitosan  dan  nano  kitosan  mempunyai efektivitas sebagai antimikroba terhadap bakteri Enterococcus  faecalis secara in vitro . 2. Tidak  terdapat  perbedaan  efektivitas yang bermakna antara kitosan dan nano kitosan dalam menghambat pertumbuhan Enterococcus  faecalis pada  konsentrasi  yang  sama  (1  %;  0,5
%; 0,25 %; 0,125 %, dan 0,0625 %).

## SARAN
Perlunya penelitian lebih lanjut untuk:
 Menguji  aktivitas  antimikroba  kitosan dan nano kitosan terhadap mikroba lain.
 Mengetahui  perbedaan  kbm  antara kitosan  dan  nano  kitosan  terhadap Enterococcus faecalis .
 Penggunaan  kitosan  dan  nano  kitosan yang  memiliki  derajat  deasetilisasi  dan berat molekul sama.
 Menguji  daya  antimikroba  kitosan  dan nano  kitosan  dengan  menggunakan metode  lainya,  seperti  dilusi  agar  atau difusi cakram.
 Mengetahui perbandingan daya antimikroba dengan obat standar.
 Penelitian lebih lanjut secara in vivo
 Mengetahui dosis efektif, toksisitas, dan efek  samping  yang  ditimbulkan  oleh kitosan  dan  nano  kitosan  pada  hewan coba yang nantinya dapat diaplikasikan pada manusia sebagai daya antimikroba terhadap Enterococcus faecalis.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Jahic M,  Mirsada  M,  Jasmina  N,  Elmir J,  Midhat  N.  Clinical  Characteristics  of
Aerobic Vaginitis and Its Association to Vaginal  Candidiasis,  Trichomonas
Vaginitis  and  Bacterial  Vaginosis. Med Arh . 2013; 67(6):428-430.
2. Donders GGG, Vereecken A, Bosmans E,  DekeersmaeckerA,  Salembier  G, Spitz  B.  Definition  of  a  Type  of Abnormal  Vaginal  Flora  that  is  Distinct from Bacterial Vaginosis: Aerobicvaginitis. Br J Obstet Gynaecol .
2002; 109:34.
3. Sangeetha.  Study  of  Aerobic  Bacterial Pathogens Associated  with Vaginitis  in
Reproductive  Age  Group  Women  (15-
45 Years) and Their Sensitivity Pattern.
Department  Of  Microbiology  Dr.  B.R.
Ambedkar Medical College. 2014.
4. Tansarli  GS,  Kostaras  EK,  Athanasiou SME,  Falages.  Prevalence  and Treatment  of  Aerobic  Vaginitis  among Non-Pregnant  Women:  Evaluation  of The  Evidance  For  An  Underestimated Clinical  Entity. Eur  J  Clin  Microbiol Infect Dis . 2013; 32:977-984.
5. Tempera  G,  Furneri  PM.  Management of  Aerobic  Vaginitis. Gynecol  Obstet
Invest 2010; 70: 244-249.
6. Larsson  PG.Treatment  of  Bacterial Vaginosis. Int J Std AIDS. 1992; 3: 239-
247.
7. Lestari  ES,  Severin  JA,  Verbrugh  HA. Antimicrobial Resistance among Pathogenic Bacteria in Southeast Asia: a Review. Southeast Asian J Trop Med
Public Health. 2009; 43(2):385-422.
8. Okeke IN, Laxminarayan R, Bhutta ZA, Duse  AG,  Jenkins  P,  O’Brien  TF,  dan Pablas-Mendez A. Antimicrobial Resistance  in  Developing  Countries. Part  I:  Recent  Trends  and  Current
Status. Lancet . 2005; 5:481-493. 9. Ismarani PDI, Darusman LK. Mikroenkapsulasi  Formula  Pegagan- Kumis Kucing-Sambiloto sebagai Inhibitor  Angiotensin  I  Converting Enzyme  secara In  Vitro . Jurnal Agribisnis dan Pengembangan Wilayah . 2011; 3(1). 10. Sugita  P,  Sjahriza  A,  Wukirsari  T, Wahyono D. Kitosan Sumber Biomaterial  Masa  Depan .  Bogor:  IPB Press. 2009. 11. Adriana  CW,  Arguelles,  Mound  FM. Goycoolea  CP.  Diffusion  through
Membrane  of  Polyelectrolyte  Complex of  Chitosan  and  Alginate. Macromol Biosci . 2003.
12. Sanford  PA,  GP  Hutchings.  Industrial Polysaccharides.  Di  dalam: Genetic Engineering, Structure/Property Relation  and  Application .  Amsterdam: Elsevier. 1987. p 363-375.
13. Cheung  WH,  S  Szeto,  G  McKay. Enchancing  the  Adsorption  Capacities of  Acid  Dyes  by  A  Chitosan  Nano Particle.  Hongkong:  Department  of Chemical  Engineering.  University  of
Science and Technology. 2008.
14. Szeto  Yau-shan  and  Zhigang  Hu. Article  Exploring  Nanochitosan. ATA- Journal  for  Asia  on  Textile&Apparel .
2007. 15. Hamirsia D. Application Nanotechnology to Medicine. Kharagpur: ITT. 2010. 16. Solimun. Diklat Metodologi Peneliti IKIP dan  PKM  Kelompok  Agrokompleks.
Malang: Universitas Brawijaya. 2001.
17. Dart RK. Imicrobiology of the Analytical Chemist. London: The Royal Society Of
Chemistry. 1996.
18. Riduwan  dan  Sunarto.  Pengantar Statistika  untuk  Penelitian  Pendidikan, Sosial,  Komunikasi,  Ekonomi,  dan Bisnis.  Bandung:  Alfabeta.  2007.  Hlm 304.
19. Daniyan SY and HB Mahammad. Afri J of Biotec . 2008; 7(14):2451-2453.
20. Fang  Li  X,  Feng  X,  Yang  S,  Fu  G, Wang    T,  Su  Z.  Chitosan  Kills Escherichia coli through Damage to be of  Cell  Membrane  Mechanism. Carbohydrate Polymers . 2010; 79:493– 499 21. Avadi  MR,  Sadeghi  AMM,  Tahzibi  A, Bayati Kh, Pouladzadeh M, Zohuriaan- Mehr  MJ,  Rafiee  TM. Eur  Polym  J.
2004; 40:1355–1361.
22. Rochima  E,  Sugiyono  DS,  MT Suhartono.  Derajat  Deasetilasi  Kitosan Hasil Reaksi Enzimatis Kitin Deasetilasi Isolate  Bacillus  Papandayan  K29-14.
Makalah  Seminar  Nasional  dan Kongres PATPI. 2004.
23. Candra  P.  Kitosan  dari  Cangkang Udang  dan  Aplikasi  Kitosan  Sebagai Bahan  Antibakteri  pada  Kain  Katun. Skripsi. Jogjakarta : Fakultas Mipa dan Ilmu  Pengetahuan  Alam  Universitas Gajah Mada. 2008.