Penulis Silvi Agusri Putri 1 , Rudi Heryanto 1,2 , Eti Rohaeti 1*
Afiliasi
1 Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor,
Indonesia
2 Pusat Studi Biofarmaka Tropika, Institut Pertanian Bogor, Indonesia

## Kata Kunci
 Daun wungu ( Graptophyllum pictum )  PCA
 PLS-DA
 Quali-vis
 Sidikjari KLT
Diterima 25 Juli 2018 Direvisi 1 September 2018
Disetujui 3 Oktober 2018
* Penulis Koresponding

## Eti Rohaeti
Jl. Tanjung Kampus IPB, Dramaga, Babakan, Dramaga, Bogor, Jawa Barat 16680 Email: er_a444@hotmail.com

## ABSTRAK
Spektrofotometer  Quali-Vis  digunakan  untuk  mengklasifikasikan  3  sampel  daun wungu  dengan  usia  panen  berbeda.  Penelitian  ini  bertujuan  mengevaluasi  model klasifikasi  menggunakan  spektrofotometer  Quali-Vis  secara  kualitatif.  Model dikembangkan  dengan  akuisisi  data  menggunakan principle  component  analysis (PCA) dan partial least square-discriminant analysis (PLS-DA). Karakteristik awal sampel daun wungu  ditentukan  dengan  analisis  sidik  jari  kromatografi  lapis  tipis  (KLT)  yang menampilkan  profil  yang  berbeda  pada  masing-masing  usia  panen.  Perbedaan  ini menjadi  dasar  klasifikasi  untuk  model  PLS-DA  yang  terdiri  atas  model  usia  1  bulan,  2 bulan, dan 3 bulan, yang menghasilkan rerata R 2 pred = 0.7794 dan root mean square error predict (RMSEP)  =  0.2180.  Model  divalidasi  dengan  menentukan  nilai  parameter sensitivitas,  spesifitas,  presisi,  dan  akurasi  yang  menghasilkan  nilai  rerata  masing- masing 0.95, 0.99, 0.98, dan 0.98 kesesuaian prediksi. Nilai-nilai ini menunjukkan bahwa model yang dikembangkan memiliki kemampuan klasifikasi yang cukup baik.

## PENDAHULUAN
Tanaman  obat  menjadi  semakin  populer  di  kalangan  masyarakat  karena penggunaan obat dari tanaman dianggap relatif lebih aman dibandingkan obat sintetis. Kualitas obat herbal ini ditentukan oleh komposisi senyawa kimia aktif yang terkandung didalamnya.  Adapun  komposisi  senyawa  kimia  yang  beragam  pada  suatu  tanaman dipengaruhi kondisi geografis, budidaya, metode pemanenan, dan proses pasca panen (Singh et  al .  2010).  Faktor  lain  yang  dapat  memengaruhi  komposisi  senyawa  kimia adalah  perbedaan  umur  dari  tanaman  obat  tersebut  (Anuradha  2010).  Perbedaan  ini menyebabkan  diperlukannya  kendali  mutu  untuk  mengontrol  kualitas  dari  tanaman obat.
Kendali  mutu  dapat  dilakukan  dengan  teknik  kromatografi  maupun spektrofotometri (Singh et al . 2010). Spektrofotometri sinar tampak merupakan teknik, yang  umum  digunakan  pada  berbagai  analisis  komponen  kimia  pada  rentang  variasi
Spektrofotometer Quali-Vis dan Kemometrika untuk Klasifikasi Kualitas Daun Wungu ( Graptophyllum pictum )
Putri et al.
matriks  yang  cukup  luas.  Teknik  ini  memiliki  cara pengukuran tipe absorbans, transmitans, dan reflektans  dalam  analisisnya.  Tipe  absorbans  paling sering digunakan, namun pengukuran absorbans hanya terbatas pada sampel campuran homogen atau larutan. Oleh  sebab  itu,  dibutuhkan  alternatif  lain  pada  anlisis sampel campuran heterogen berupa padatan, misalnya pengukuran  reflektans.  Reflektans  adalah  jumlah  fluks yang dipantulkan suatu permukaan sebagai fungsi dari panjang gelombang. Basis reflektans memiliki kelebihan  dapat  diaplikasikan  pada  sampel  campuran heterogen  (pada  wujud  padatan  atau  serbuk),  waktu analisis  cepat,  dan  dapat  diterapkan  untuk  jumlah sampel  yang  besar  (Andor  2014).  Sistem  reflektans dipilih karena dalam penggunaannya, spektrofotometer  dapat  digunakan  untuk  padatan secara langsung tanpa preparasi.
Spektrofotometer  reflektans  sinar  tampak  yang digunakan  pada  penelitian  ini  merupakan  alat  yang sudah  dirancang  secara  mandiri  dengan  komponen elektronik  berdasarkan  Public  Laboratory  (2014)  dan memiliki  desain  komponen  sesuai  dengan  Rahma (2016)  yang  disebut Quali-Vis .  Komponen-komponen dari  alat  ini  terdiri  dari  lampu  LED  senter  Police  Swatt 1300  lumen,  kompartemen  sampel  yang  dilengkapi kaca  preparat  sebagai  medium  pemantul,  pemilih panjang  gelombang  berupa  monokromator  kisi  yang dibuat dari lapisan optik DVD berukuran 2×2 cm 2 , serta detektor  berupa  web  kamera  yang  dilengkapi  sensor charge  couple  device (CCD)  sebagai  detektor  yang dihubungkan  dengan  peranti  lunak  berbasis  web Spectral  Workbench (Lampiran  3) . Spektrofometer Quali-vis digunakan  dalam  penelitian  ini  untuk  kendali mutu tanaman obat yaitu daun wungu.
Tanaman  wungu  ( Graptophyllum  pictum (L.)  Griff) merupakan  tanaman  obat  yang  sering  dimanfaatkan masyarakat sebagai tanaman hias di pekarangan rumah karena  warnanya  yang  unik.  Tanaman  ini  memiliki khasiat  untuk  mengatasi  penyakit  wasir  dan  sembelit, melancarkan  buang  air  seni,  dan  melancarkan  haid (Aminah et  al 2016).  Jiangseubchatveera et  al .  (2017) melaporkan  adanya  kandungan  flavonoid,  steroid, tanin,  saponin  dan  fenolik  dalam  daun  wungu  yang membuat daun wungu berpotensi menjadi antioksidan. Penelitian  ini  melakukan  kendali  mutu  daun  wungu berdasarkan  usia  panennya.  Usia  panen  yang  dipilih adalah  usia  1  bulan,  2  bulan  dan  3  bulan.  Studi mengenai  pengaruh  usia  panen  terhadap  senyawa metabolit  daun  wungu  belum  dilakukan.  Namun,
penelitian  lain  mengenai  pengaruh  usia  panen  daun tanaman  herbal  terhadap  kandungan  senyawa metabolitnya sudah dilakukan, seperti yang dilaporkan Blum-Silva et  al .  (2015),  bahwa  adanya  variasi kandungan  senyawa  metilxantin  dan  total  fenolik dalam daun teh yerba mate ( Ilex  paraguariensis ) pada umur 1 bulan, 2 bulan dan 6 bulan. Karakterisasi awal dilakukan  dengan  menggunakan  teknik  kromatografi lapis  tipis.  Pola  sidik  jari  yang  dihasilkan  menunjukkan perbedaan luas puncak pita untuk senyawa yang sama pada  masing-masing  bulan.  Selanjutnya  klasifikasi menggunakan  spektrofotometer Quali-Vis dilakukan dengan  memanfaatkan  karakteristik  optik  dari  ketiga sampel uji.

## METODE
Penelitian  ini  terdiri  dari  5  tahapan:  (i)  persiapan sampel dimulai dari pemangkasan, penumbuhan daun, pemanenan, pencucian, penyerbukan, serta pengeringan  sampel  menggunakan  oven  hingga  kadar airnya  konstan,  (ii)  pembuatan  pola  sidikjari  dengan kromatografi  lapis  tipis  dan  pengolahan  pola  dengan piranti  lunak image  J, (iii)  kalibrasi  spektrofotometer reflektans  Quali-Vis  dengan  BaSO 4 ,  (iv)  desain  sampel dan  pengukuran  reflektans  sampel  menggunakan spektrofotometer Quali-Vis, serta (v) analisis multivariat PCA dan PLS-DA menggunakan piranti lunak The Unscrambler X 10.4 (Lampiran 1) .

## Persiapan Sampel
Sampel  diambil  dari  kebun  percobaan  Pusat  Studi Biofarmaka  Tropika  LPPM IPB  Cikabayan.  Sebanyak  21 batang tanaman wungu yang tersedia dipangkas bersih tidak  meninggalkan  1  daun  tersisa,  lalu  diamati pertumbuhannya  secara  berkala  tiap  3  hari,  dan ditandai  tanggal  daun  tumbuh.  Perlakuan  tambahan dilakukan  seperti  mengatasi  hama  atau  ulat  secara manual  dan  pemberian  pupuk  organik.  Lalu  pada  saat pemanenan diambil daun yang berumur satu bulan (30 hari) sebanyak lebih kurang 1 kg dan disisakan untuk 2 bulan  berikutnya.  Sampel  bulan  ke-1  dikeringkan menggunakan oven dengan suhu 60  C. Setelah kering, sampel  selanjutnya  dihaluskan  menjadi  serbuk berukuran 60 mesh dan disimpan.

## Penentuan Kadar Air
Metode  penentuan  kadar  air  mengacu  pada  AOAC 935.29 2012. Cawan porselin kosong dikeringkan dalam oven  bersuhu  103-105  C  selama  30  menit,  kemudian

## Studi Etnofarmasi Tanaman Obat Untuk Perawatan  Dan Penumbuh Rambut
Pada Beberapa Daerah Di Indonesia
didinginkan  dalam  desikator  selama  30  menit  dan ditimbang  bobot  kosongnya.  Sebanyak  5  gram  sampel ditimbang  ke  dalam  cawan  yang  telah  diketahui bobotnya. Cawan berisi sampel dikeringkan dalam oven bersuhu  103-105  C  selama  3  jam.  Cawan  didinginkan dalam  desikator  selama  30  menit  dan  ditimbang bobotnya.  Proses  pengeringan  dalam  oven  dilakukan hingga bobot konstan. Penentuan kadar air dilakukan 3 kali ulangan.
Kadar air (%) =
 100%
Keterangan : A = bobot sampel sebelum pengeringan (g)
B = bobot sampel setelah pengeringan (g)

## Pembuatan  Pola  Sidikjari  dengan  Kromatografi  Lapis Tipis
Pola  sidikjari  kromatografi  lapis  tipis  dibuat  dengan mengacu pada Farmakope Herbal Indonesia (Depkes RI 2010). Sebanyak 1 gram serbuk daun wungu ditimbang dan diekstraksi secara sonikasi dengan 10 mL metanol p.a  selama  40  menit.  Hasil  sonikasi  disaring  dan filtratnya  dipindahkan  ke  wadah  lain.  Ekstrak  setiap sampel  daun  wungu  dalam  metanol  ditotolkan  pada pelat silika gel F 254 menggunakan syringe 15 µL dibantu dengan KLT sampler semiautomatik CAMAG Linomat 5 dengan lebar pita tiap sampel adalah 8 mm. Pelat yang akan  digunakan  dielusi  terlebih  dahulu  dengan methanol  p.a  kemudian  dikeringkan.  Eluen  yang digunakan  adalah  etil  asetat-asam  format-asam  asetat glasial-air  (10:1.1:1.1:2).  Eluen  tersebut  dijenuhkan selama  30  menit  di  dalam  bejana  kromatografi.  Pelat yang  telah  diaplikasikan  sampel  dimasukkan  ke  dalam bejana  kromatografi  untuk  proses  elusi.  Deteksi  pola sidikjari  dilakukan  dengan  CAMAG  TLC scanner Reprostar 3 dengan sinar UV 254 nm dan 366 nm. Pola sidikjari  yang  diamati  pada  sinar  uv  366  nm  diolah menggunakan peranti lunak Image J.
Pengolahan  Pola  Sidikjari Kromatogram  Daun  Wungu menggunakan Piranti Lunak Image J Perangkat  lunak Image  J dibuka  lalu  dipilih  menu File-Open .  Lalu  dipilih  gambar  KLT  yang  telah didokumentasi  dengan  CAMAG  Reprostar  3  dengan format  .jpg.  Menu Rectangular diaktifkan  lalu  diblok pada  gambar  target  yang  akan  dianalisis,  dipilih  menu Analyze-Gels-Select First Lane . Gambar diatur
kontrasnya  dengan  cara  memilih  menu Image-type- dan  dipilih  RGB colour ,  lalu  dipilih  menu Adjust dan diatur Brightness dan Contrast sesuai  kebutuhan sampai  didapat  gambar  titik  yang  jelas.  Kemudian dipilih kembali menu Analyze-Gels-plot line , maka akan muncul kurva densitogram yang sesuai dengan gambar KLT.  Kurva  densitogram  ini  akan  menunjukkan  jumlah pita  yang  terdapat  pada  pelat  KLT.  Kurva  tersebut kemudian  diubah  menjadi Line  Graph dengan  cara menu Rectangular diaktifkan  lalu  bagian  kurva  diblok, kemudian  dipilih  menu Analyze-Tools-Analyze  line graph sehingga  akan  muncul  tampilan  kurva dalambentuk kurva Xycoordinat . Lalu dipilih menu Copy untuk  mengubah  gambar  menjadi  informasi  dalam bentuk  angka.  Kemudian Paste pada  piranti  lunak MS.Excel untuk pengolahan kurva selanjutnya.
Menentukan luas puncak densitogram, dibuka kurva densitogram kemudian dipilih salah satu puncak  kurva dan dipilih menu Straight diaktifkan lalu ditarik  bagian dasar puncak ujung satu ke ujung lainnya (jika terdapat beberapa  puncak  kurva  buat  garis  dasar  pada  masing- masing  puncak  kurva),  kemudian  menu Wand diaktifkan.  Masing-masing  daerah  puncak  kurva  diberi Highlight dengan  mengarahkan  kursor  pada  daerah kurva  yang  dipilih  tersebut  kemudian  akan  muncul Report berupa luas puncak.

## Kalibrasi Spektrofotometer Reflektans
Spektrofotometer Quali-Vis dikalibrasi menggunakan lampu  neon.  Pengukuran  dilakukan  terhadap  BaSO4 sebagai  matrik.  BaSO4  dibentuk  menjadi  lapisan  film tipis  yang  melekat  pada  kaca  preparat  kemudian diletakkan pada kompartemen sampel dan diukur. Hasil pengukuran  berupa  spektrum  cahaya  dan  spektrum intensitas  RGB.  Spektrum  disimpan  dengan  memilih menu Save. Kemudian  dibuatkan  suatu  identitas  pada spektrum  dan  dipilih  menu Save  &  Calibrate later. Setelah itu, spektrum yang memiliki intensitas tertinggi dipilih  pada  warna  biru  dan  hijau,  dan  dipilih  menu Save kemudian  menu Calibrate .  Kalibrasi  dilakukan untuk  mendapatkan  skala  panjang  gelombang  yang tepat  sehingga  dapat  dijadikan  sebagai  acuan  panjang gelombang pada saat pengukuran.

## Pengukuran Reflektans Sampel
Pengukuran  reflektans  sampel  mengacu  pada  yang dilakukan  Hafsah  (2017), sampel  dibagi  menjadi  A mewakili  usia  1  bulan,  B  untuk  usia  2  bulan,  dan  C untuk  usia  3  bulan.  Sampel  masing-masing  dibagi
Putri et al. menjadi  dua  bagian, yaitu training  set dan testing  set . Training  set  merupakan  set  sampel  yang  akan  diukur reflektansnya  untuk  menghasilkan  model  klasifikasi, sedangkan testing set merupakan set sampel yang akan menguji  kemampuan  klasifikasi  model  yang  telah dihasilkan (Gambar 1).

## Gambar  1 Penampang bagian sampel
Tabel 1 Desain sampel daun wungu
Sebanyak  60  sampel  dan  20  sampel  diperoleh  dengan teknik random  picking menggunakan  tabel  bilangan acak  (Tabel  1).  Teknik random  picking tersebut dilakukan dengan meratakan masing-masing sampel A, B  dan  C  pada  permukaan  datar  dan  memisahkan sampel menjadi 100 bagian dengan bobot 300 mg yang kemudian dinamai setiap bagiannya. Kemudian, dipilih 60  sampel  dari  Ms  Excel  sebagai  sampel  representatif untuk  menghasilkan  model  klasifikasi.  Setelah  set sampel  diperoleh,  sampel  daun  wungu  yang merupakan padatan berbentuk serbuk dicetak menjadi pelet  dengan  pencetak  pelet.  Pelet  diletakkan  pada kompartemen  sampel Quali-Vis. Sinar  polikromatik yang  berasal  dari  sumber  sinar  senter  LED  dikirim menuju  sampel  melewati  celah  dan  kompartemen sampel  yang  sekaligus  berperan  sebagai  medium pemantul  (kaca  preparat).  Saat  mengenai  pelet,  sinar mengalami  serapan  dan  pantulan  bergantung  pada warna dan banyaknya kandungan matriks yang mampu menyerap  sinar  tampak  pada  sampel.  Detektor  akan menangkap  intensitas  pantulan  pada  kisaran  panjang gelombang tertentu dengan pemilih panjang gelombang  berupa  monokromator  kisi.  Data  yang diperoleh  berupa  data  spektrum  cahaya  yang  diubah menjadi  data  intensitas  RGB  terhadap  panjang gelombang  dalam  format  .csv.  Nilai  rerata  intensitas RGB  dikonversi  menjadi  nilai  reflektans  menggunakan
persamaan  persen  intensitas  (persamaan  1)  dan reflektans  (persamaan  2)  sehingga  diperoleh  nilai reflektans  sampel.  Selanjutnya,  pengolahan  data dilanjutkan  dengan  pengenalan  pola  data  spektrum menggunakan piranti lunak The Unscrambler X 10.1 .
% I =  100% (persamaan 1) R = (persamaan 2) Keterangan : %I = persen instensitas
R  = reflektans I blanko = persen intensitas blanko I sampel = persen intensitas sampel

## Analisis Multivariat
Nilai reflektans yang diperoleh dari hasil pengukuran selanjutnya dianalisis menggunakan analisis multivariat berupa  PCA  dan  PLS-DA.  Berikut  merupakan  tabulasi data  multivariat  yang  akan  dianalisis  pada  penelitian ini.
Principle Component Analysis (PCA).
Proses pengolahan data reflektans sampel A, B dan C dilakukan  dengan  penentuan  pola  distribusi  kelompok sampel menggunakan PCA dengan memanfaatkan data reflektans  pada  rentang  panjang  gelombang  450-600 nm.  Hasil  analisis  menggunakan  PCA  diharapkan mampu  memisahkan  sel  data  ke  dalam  3  kelas  yaitu sampel A, B, dan C.
Partial  Least  Square-Discriminant  Analysis (PLS-DA). Akuisisi  data  selanjutnya  adalah  pembuatan  model klasifikasi  dan  uji  diskriminan  menggunakan  metode PLS-DA  dengan  peranti  lunak The  Unscrambler  X  10.1. Model  PLS-DA  dibuat  menggunakan  matriks  data reflektans  hasil  analisis  spektrofotometer  (matriks  x) dan  data  rujukan dummy  variable (matriks  y).  Model terdiri dari ModA (1, 0, 0),  ModB (0, 1, 0), dan ModC (0, 0, 1) dengan Kebaikan model prediksi diukur dengan nilai R 2 mendekati 1 dan root mean square error (RMSE) mendekati 0.
Sampel A/B/C Training set Testing set
Sampel Training set Testing set A 60 20 B 60 20 C 60 20
Studi Etnofarmasi Tanaman Obat Untuk Perawatan  Dan Penumbuh Rambut Pada Beberapa Daerah Di Indonesia 93
Tabel 2 Tabulasi  nilai  prediksi  sampel  testing  set dengan model PLS-DA Model PLS-DA Sampel Nilai prediksi Nilai referensi A 1 bulan 0 atau 1 1 2 bulan 0 atau 1 0 3 bulan 0 atau 1 0 B 1 bulan 0 atau 1 0 2 bulan 0 atau 1 1 3 bulan 0 atau 1 0 C 1 bulan 0 atau 1 0 2 bulan 0 atau 1 0 3 bulan 0 atau 1 1
Pembuatan  Tabulasi  Silang  dan  Validasi  Kualitatif (Cuadros-Rodríguez et al. 2016)
Uji  kinerja  kualitatif  metode  menggunakan  sampel testing  set yang  telah  dipersiapkan.  Sebanyak  masing- masing 20 sampel A, B dan C diukur nilai reflektansnya, kemudian diolah nilai prediksinya menggunakan model yang  diperoleh  dari  PLS-DA.  Jumlah  ketepatan klasifikasi  dari  masing-masing  pengukuran  akan memengaruhi  4  kemampuan  kualitatif  metodenya. Terdapat  lima  kemungkinan  klasifikasi  yang  terjadi, misalkan untuk contoh model A, yaitu A terklasifikasi A (TP),  A  terklasifikasi  B  atau  C  disebut  NotA  (FP),  NotA terklasifikasi  A  (FN),  NotA  terklasifikasi  NotA  (TN).  Ini dipermudah  dengan  pembuatan confusion  matrix untuk masing-masing model. Parameter validasi terdiri dari 4 yaitu sensitivitas (SENS), spesifitas (SPEC), presisi, dan akurasi.
Sensitivitas. Sensitivitas  menunjukkan  kepekaan metode  memisahkan  sampel    ke  dalam  usianya.  Nilai terbesar  sensitivitas  sebesar  1,  yang  artinya  dapat mengklasifikasikan  sampel  A,  B,  atau  C  secara sempurna. Nilai sensitivitas dihitung dengan membandingkan  jumlah  TP  ( True  Positive )  dengan jumlah FN ( False Negative ).
SENS =
Spesifisitas. Spesifisitas menunjukkan kepekaan metode memisahkan sampel yang bukan usianya. Nilai terbesar  spesifitas  sebesar  1,  yang  artinya  dapat mengklasifikasikan  sampel  NotA,  NotB,  atau  NotC secara  sempurna.  Nilai  sensitivitas  dihitung  dengan
membandingkan  jumlah  TN  ( True  Negative )  dengan jumlah FP ( False Positive ).
SPEC =
Presisi. Nilai  presisi  menunjukkan  ketelitian  dan kesalahan yang  terjadi  pada  klasifikasi  sampel.  Nilai presisi 1 menunjukkan tidak terdapat kesalahan dalam klasifikasi  sampel.  Nilai  presisi  dihitung  dengan membandingkan nilai TP dengan total TP ditambah FP.

## Presisi  =
Akurasi. Nilai  akurasi  menunjukkan  kedekatan  nilai prediksi  dengan  nilai  sebenarnya.  Nilai  akurasi  1 menunjukkan  sampel  terprediksi  benar  100%  kedalam kelompokya. Nilai akurasi dihitung dengan membandingkan  TP  dan  TN  dengan  total  keseluruhan sampel.
Akurasi =

## HASIL DAN PEMBAHASAN Karakteristik Sampel Daun Wungu
Tanaman  wungu  ( Graptophyllum  pictum (L.)  Griff) ditemukan  pertama  kali  di  Irian  dan  Polynesia,  dapat ditemukan  dari  dataran  rendah  sampai  pegunungan dengan ketinggian 1.250m dpl (Dalimartha 1999). Daun tanaman  wungu  selain  dimanfaatkan  untuk  mengatasi wasir, juga banyak digunakan untuk penyembuhan luka dan memar pada tubuh oleh masyarakat asia tenggara (Wiart et  al .  2006).    Tanaman  wungu  terdiri  dari  21 batang.  Sehingga  terdapat  7  batang  untuk  tiap bulannya.  Jumlah  batang  yang  digunakan  lebih  dari satu untuk memaksimalkan keragaman sehingga model yang telah dibuat menjadi lebih akurat. Setelah semua batang  dipangkas  daunnya,  dilakukan  pengontrolan selama  daun  mengalami  pertumbuhan  dengan memberi label dan menyingkirkan hama/ulat. Sebelum analisis  dilanjutkan  perhitungan  kadar  air  penting dilakukan  untuk  mengetahui  cara  penyimpanan sampel.  Kadar  air  yang  diperoleh  memiliki  rerata 10.16%,  yang  telah  memenuhi  syarat  yang  diajukan Depkes ( 010) yaitu ≤ 10%.

## a)                 b)              c)
Gambar  2 Daun  wungu  (a)  usia  1  bulan,  (b)  usia  2 bulan, dan (c) usia 3 bulan
Daun  berumur  satu  bulan  yang  telah  dipangkas umumnya  memiliki  ukuran  daun  yang  lebih  kecil dibandingkan usia 2 bulan dan 3 bulan. Dari segi warna daun, daun yang berumur 3 bulan memancarkan warna ungu khas yang lebih pekat dibandingkan umur 1 bulan yang  sepenuhnya  hampir  berwarna  hijau  terang (Gambar  2).  Sehingga  korelasi  perubahan  warna  daun dari  usia  1  bulan  hingga  3  bulan  ini  dengan  senyawa metabolit  yang  dikandungnya  dilihat  dari  pola  sidikjari kromatografi lapis tipis (Gambar 3).
Kromatografi  lapis  tipis  (KLT)  merupakan  teknik kromatografi  yang  digunakan  untuk  memisahkan campuran komponen berdasarkan distribusi komponen tersebut  diantara  dua  fase,  yaitu  fase  diam  dan  fase gerak  (Stoenoiu  2006).    KLT  akan  menunjukkan perbedaan keterpisahan dari kandungan senyawa pada ketiga  sampel  daun  wungu.  Prinsip  kerja  KLT  adalah sampel  diaplikasikan  pada  lapisan  tipis  lempeng  KLT kemudian dilakukan pengembangan di dalam chamber yang  berisi  fase  gerak  sehingga  sampel  akan  terpisah
menjadi  komponen-komponennya.  Fase  diam  yang umum  digunakan  adalah  silika  gel,  aluminium  oksida, selulosa beserta turunannya, dan poliamida. Komponen  yang  ingin  dipisahkan  akan  terjerap  pada permukaan  fase  diam  atau  disebut  dengan  prinsip adsorbsi.
Analisis  sidik  jari  menggunakan  KLT  pada  penelitian ini  bertujuan  untuk  membandingkan  model  hasil pengukuran menggunakan spektrofotometer reflektans Quali-Vis  dengan  metode  primer.  Pola  sidik  jari  KLT yang  dihasilkan  dapat  menunjukkan  pita  senyawa- senyawa  yang  dikandung  oleh  tanaman  daun  wungu pada  usia  1  bulan,  2  bulan,  dan  3  bulan.  Hasil  analisis ini menunjukkan perbedaan intensitas warna pita pada nilai Rf yang sama dengan kata lain adanya perbedaan konsentrasi  suatu  senyawa  antara  usia  1,  2,  dan  3 bulan. Terdapat 2 pita yang tidak muncul di usia 1 dan 2  bulan,  sedangkan  muncul  di  usia  3  bulan  yang terletak  diantara  pita  9  dan  10  (Gambar  3c).  Ini menandakan  kemungkinan  senyawa-senyawa  baru akan muncul pada usia yang lebih tua.
Gambar  3  menunjukkan  hasil  totolan  ekstrak  daun wungu  dalam  metanol  menghasilkan  senyawa berwarna  ungu  yang  terdeteksi  pada  sinar  tampak, sehingga  jika  dikaitkan  dengan  uv-vis  maka  senyawa berwarna ungu akan menyerap warna komplementernya yaitu kuning pada panjang gelombang  570-590  nm.  Ini  terlihat  pada  spektrum reflektans terukur Quali-vis pada gambar 8
(a)                      (b)                                   (c)
Gambar  3 Pita sidik jari kromatografi lapis tipis daun wungu pada (a) UV tampak, (b) UV 254 nm dan (c)  UV
366 nm

## Studi Etnofarmasi Tanaman Obat Untuk Perawatan  Dan Penumbuh Rambut
Pada Beberapa Daerah Di Indonesia
menghasilkan  spektrum  yang  khas  dengan  penurunan nilai  reflektans.  Terdapat  10  pita  yang  muncul  pada pelat dengan campuran eluen etil asetat ; asam format ; asam asetat glasial ; air  (10;1.1;1.1;2).
Gambar  4 Pelat KLT 366 nm dan interpretasi dengan imageJ ( — ) usia 1 bulan, ( — ) usia 2 bulan, ( — ) usia 3 bulan
Pita menunjukkan perbedaan yang jelas terdapat pada pita d untuk masing-masing usia 1, 2 dan 3 bulan. Pita d pada  pita  klt  untuk  usia  3  bulan  menunjukkan intensitas  pita  yang  lebih  besar,  yang  menunjukkan bahwa    senyawa  yang  dikandungnya  juga  lebih  besar. Gambar  4  menunjukkan  interpretasi  pita  menjadi puncak.  Masing-masing  pita  yang  memiliki  ketebalan yang  berbeda-beda  dapat  diketahui  nilainya  melalui luas area puncak yang muncul tersebut. Semakin tebal pita,  maka  luas  puncak  yang  dihasilkan  pun  semakin besar.  Berikut  tabel  dan  nilai  Rf  yang  menunjukkan puncak yang telah ditandai tersebut.
Masing-masing  puncak  memiliki  luas  yang  berbeda. Pembacaan  Tabel  3  dimulai  dari  membandingkan puncak  a  untuk  masing-masing  bulan.  Begitu  pun
seterusnya untuk puncak b, c, dan d. Beberapa puncak menunjukkan  data  yang  menarik  dimana  usia  1  bulan memiliki pita yang lebih tebal dibandingan dengan pita pada  usia  2  bulan  pada  beberapa  puncak.  Ini menunjukkan  bahwa  beberapa  senyawa  memiliki jumlah konsentrasi optimal pada usia yang lebih muda. Pada puncak c dan puncak d menunjukkan luas puncak yang besar berturut-turut untuk  usia 1 bulan, 2 bulan, dan  3  bulan.  Sehingga  klasifikasi  yang  baik  oleh spektrofotometer  reflektans  Quali-Vis  dan  pemodelan kemometrika  mampu  terbentuk  karena  pola  sidikjari KLT  menghasilkan  perbedaan  pada  luas  puncak  untuk sampel usia 1 bulan, 2 bulan dan 3 bulan.
Perbedaan  warna  daun  wungu  pada  masing-masing usia  berhubungan  dengan  perbedaan  pola  sidikjari yang  dihasilkan.  Pola  sidikjari  yang  berbeda  untuk masing-masing  usia  panen  menjadi  dasar  klasifikasi sampel dengan menggunakan spektrofotometer. Metode  spektrofotometer  uv-vis  sangat  berkaitan erat  dengan  warna  yang  dapat  dilihat  pada  rentang sinar  tampak  yaitu  350-750,  yang  mana  juga merupakan  rentang  panjang  gelombang  yang  dapat dilihat  oleh  mata  manusia.  Spektrofotometer  sinar tampak  reflektans  Quali-Vis  ini  akan  menghasilkan reflektans yang rendah seiring dengan banyaknya sinar yang dapat diserap oleh warna tertentu. Semakin pekat warna,  maka  sinar  yang  akan  diserap  akan  semakin banyak sehingga nilai reflektans tinggi.

## Kalibrasi  Quali-Vis  dan  Karakteristik  spektrum reflektans
Rentang  panjang  gelombang  yang  tepat  akan mempengaruhi  pengukuran  sampel,  oleh  sebab  itu
Tabel 3 Luas puncak dan nilai RF pita KLT 366 nm Sampel Peak Area Intensitas (%) RF value Usia 1 bulan a 2716.26 30.76 0.29 b 5579.43 63.18 0.36 c 535.65 6.07 0.41 d 739.41 19.55 0.56 Usia 2 bulan a 3949.50 30.42 0.28 b 8361.47 64.41 0.33 c 671.53 5.17 0.41 d 1477.36 39.06 0.55 Usia 3 bulan a 2196.86 18.43 0.28 b 6078.74 51.00 0.35 c 3643.88 30.57 0.41 d 1565.62 41.39 0.56
Putri et al. perlu  dilakukan  kalibrasi  terhadap  spektrofotometer reflektans  sinar  tampak  Quali-Vis.  Kalibrasi  penting dilakukan  agar  tercapai  kesesuaian  hasil  pengukuran, serta dapat ditentukannya nilai penyimpangan (Morris 2001).  Kalibrasi  secara  khusus  dilakukan  pada spektrofotometer  Quali-Vis  dengan  mengganti  lampu LED  menjadi  lampu  neon  sebagai  sumber  cahaya  dan pelet  BaSO 4 sebagai  referensi  berwarna  putih.  Lampu neon  sebagai  lampu  CFL  digunakan  sebagai  sumber cahaya untuk kalibrasi sebab lampu neon mengandung gas inert dan uap merkuri yang memiliki spektrum khas pada panjang gelombang 436 nm dan 546 nm (Gambar 5).
Menurut spectralworkbench , kalibrasi yang baik yaitu jika  mencapai  fit  kurang  dari  10,  yang  mana  kalibrasi yang  didapatkan  memiliki  fit  8.  Hasil  kalibrasi  yang paling  baik  sejauh  ini  adalah  milik  Jeffrey  Warren co- founder publiclab  yang  mendapatkan  fit  7.  Panjang gelombang yang didapatkan dari hasil kalibrasi ini akan menjadi rentang panjang gelombang untuk pengukuran reflektans sampel, yaitu pada rentang dari 293.6-860.0 nm.
Spektrofotometer  Quali-Vis  yang  telah  dikalibrasi, selanjutnya  diamati  spektrum  blanko  dan  sampel. Blanko  yang  digunakan  adalah  BaSO4  yang  berwarna putih  dan  transparan  pada  sinar  tampak.  Menurut BPOM  (2016),  BaSO 4 tidak  memiliki  efek  klinis  yang serius  meskipun  adanya  kontak  langsung  pada  kulit kecuali  jika  tertelan.  Selain  itu  harga  yang  ekonomis, membuat BaSO4 selalu digunakan pada penelitian yang berkaitan dengan Quali-Vis. Blanko diharapkan mampu memantulkan  seluruh  sinar  datang  ke  detektor sehingga diperoleh spektrum sinar pantul dengan nilai maksimum.  Blanko  BaSO4  yang  mampu  memantulkan seluruh  sinar  datang  akan  menghasilkan  spektrum dengan  intensitas  pantulan  yang  tinggi  pada  seluruh
panjang  gelombang  serta  meminimumkan  tranmisi sinar.  Sebaliknya,  sampel  yang  memiliki  matriks  dan pigmen yang berpengaruh pada pemantulan sinar akan menghasilkan  spektrum  dengan  intensitas  pantulan lebih rendah (Gambar 6). Sampel yang memiliki warna tidak  putih  atau  berwarna  menyebabkan  adanya serapan  pada  panjang  gelombang  tertentu.  Adanya serapan menyebabkan berkurangnya intensitas pantulan yang terukur.
Gambar 6 Spektrum  intensitas  (a)  blanko  dan  (b) sampel
Wadah sampel terdiri atas dua kaca preparat sejajar yang  diantara  kedua  kaca  tersebut  diletakkan  sampel. Selain  sebagai  wadah  sampel,  kaca  preparat  juga berfungsi sebagai medium tranmisi dan pantulan sinar. Bahan  utama  berupa  borosilikat  pada  kaca  preparat mampu menyerap sinar pada panjang gelombang UV (< 350  nm).  Sehingga  pengamatan  spektrum  dalam panjang  gelombang  sinar  tampak  pada  penelitian  ini dapat  menghasilkan  sinyal  yang  tepat.  Hasil  yang diperoleh  berupa  sinar  yang  terpantulkan  ketika mengenai  sampel  akan  diubah  menjadi  spektrum warna  oleh  kisi.  Kisi  berupa  optik  DVD  yang ditempelkan  pada  bagian  depan  detektor  yang merupakan  kisi  difraksi  yang  memiliki  1350  garis/mm
Gambar 5 Hasil kalibrasi spektrofotometer Quali-Vis menggunakan lampu neon
Studi Etnofarmasi Tanaman Obat Untuk Perawatan  Dan Penumbuh Rambut Pada Beberapa Daerah Di Indonesia 97 (Wakabayashi & Hamada 2006). Komponen senyawa kimia akan menyerap, mentransmisikan  ataupun  memantulkan  cahaya  pada rentang panjang gelombang tertentu atau biasa disebut radiasi  elektromagnetik.  Perbedaan  yang  nyata diantara komponen tertentu adalah dari warna. Sampel  yang  berwarna  memiliki  intensitas  pantulan yang  lebih  rendah  dibandingkan  intensitas  pantulan blanko.  Hal  ini  menunjukkan  adanya  serapan  pada sampel.  Tablet  serbuk  daun  wungu  yang  berwarna hijau  akan  menyerap  warna  komplementernya  yaitu warna ungu-merah. Hijau merupakan warna yang unik karena  penyerapan  warna  komplementer  berupa merah  yang  mendekati  panjang  gelombang  800  juga sebaik  warna  komplementer  berupa  ungu  yang mendekati 400 (Gambar 7). Spektrofotometer Quali-Vis merupakan  spektrofotometer  reflektans  uv-vis  yang masih  dalam  pengembangan  dan  mampu  mendeteksi sinyal  pada  rentang  panjang  gelombang  400-600. Sehingga untuk tahap pengembangan model selanjutnya dilakukan pengamatan menyeluruh reflektans dari panjang gelombang 400-600. Lalu dipilih rentang  pada  reflektans  yang  mulai  memberikan perbedaan yang nyata pada sampel yakni pada rentang 450-600.
Gambar 7 Warna komplementer (Sanda et al. 2012)
Daun wungu usia 1 bulan memiliki warna yang lebih muda atau terang dibandingkan daun usia 2 bulan dan 3  bulan.  Daun  wungu  usia  1  bulan  memiliki  intensitas serapan yang lebih rendah karena kandungan senyawa metabolit yang lebih sedikit dibandingkan daun dengan usia  yang  lebih  tua.  Sehingga  konversi  nilai  intensitas serapan menjadi reflektans menjadikan nilai reflektans usia  1  bulan  lebih  tinggi.  Daun  wungu  usia  3  bulan memiliki  intensitas  serapan  yang  lebih  tinggi  sehingga
nilai  reflektans  yang  dihasilkan  paling  rendah dibandingkan  usia  daun  yang  lebih  muda  lainnya (Gambar 8). Ini sesuai dengan pendapat Hafshah (2017) yang  meneliti  temulawak  yang  segar  dan  sudah  lama disimpan.  Temulawak  segar  yang  memiliki  kandungan senyawa  metabolit  yang  lebih  tinggi  memiliki  nilai reflektans yang lebih rendah.
Gambar 8 Spektrum  reflektans  daun  wungu  usia  1 bulan  ( — ),  usia  2  bulan  ( — ),  dan  usia  3 bulan ( — )

## Model klasifikasi Sampel A, B, dan C
Sampel daun wungu dibagi menjadi A, B , dan C yang merupakan  representasi  dari  masing-masing  daun wungu  usia  1  bulan,  2  bulan,  dan  3  bulan.  Klasifikasi sampel  diawali  dengan  pembuatan  model.  Model dibuat  menggunakan  data  training  set.  Training  set terdiri atas 60 data reflektans dari masing-masing kelas yang  diukur  pada  waktu  kerja  yang  sama.  Data reflektans  tersebut  diolah  menggunakan  perangkat lunak The Unscrambler X versi 10.1. Proses pengolahan dimulai  dari preprocessing .  Tujuan  utama  dari preprocessing adalah  untuk  mengurangi  variasi  di dalam  data  yang  tidak  berpengaruh  pada  informasi analitik  (Zeaiter  dan  Rutledge  2009). Preprocessing atau  perlakuan  pendahuluan  yang  tepat  akan memberikan  pola  distibusi  yang  baik  antar  masing- masing  kelompok  sampel.  Sehingga  perlu  dilakukan eksplorasi  yang  menyeluruh  terhadap  data  terlebih dahulu. Preprocessing yang digunakan adalah smoothing Savitsky-Golay  dengan  15 moving  window . Algoritma  savitsky-golay  menyesuaikan  kurva  segmen dengan  bentuk  polinomial  serta  mengganti  nilai  awal dnengan  ragam  yang  lebih  sederhana.  Metode  ini sangat  baik  untuk  menghilangkan  noise  pada  spektra sekaligus menyimpan informasi analitik (CAMO 2006).
Putri et al.
Principle  component  analysis (PCA)  adalah  teknik yang digunakan  untuk  meringkas  struktur  dari  data  yang rumit dan kompleks sekaligus menunjukkan keberagaman  varians  serta  cara  sampel  dapat dibedakan dari sampel lain. Fungsi utama penggunaan PCA untuk membedakan tiap sampel yang ditunjukkan dengan  terbentuknya  kelompok  pada  PC  tertentu. Berikut  merupakan  hasil  akuisisi  data  menggunakan PCA.
Gambar  9 Plot skor PCA untuk usia 1 bulan (  ), usia 2 bulan (  ), usia 3 bulan (  ) PCA mampu merepresentasikan hasil analisis dengan baik  melalui  pengelompokan  berdasarkan  kemiripan sifat.  Sampel  A,  B,  dan  C  akan  terkelompok  sesuai bulannya karena kemiripan sifat yang dimiliki. Plot skor mendeskripsikan  struktur  data  dalam  bentuk  pola sampel,  dan  secara  umum  menunjukkan  perbedaan dan persamaan antara satu data  dengan yang lainnya. Berdasarkan  Gambar  9,  sampel  berhasil  dipisahkan menjadi 3 kelas, yaitu A, B, dan C dengan total PC 95%. Nilai  PC  yang  tinggi  menunjukkan  bahwa  model berhasil  menjelaskan  95%  bagian  dari  data  spektrum beserta  ragam  dan  komponennya.  Pada  usia  2  bulan terlihat  adanya  subkelas  yang  terjadi  karena  adanya kecendrungan  warna  sampel  usia  2  bulan  mendekati usia  1  bulan  dan  juga  3  bulan  yang  terlihat  pada spektrum reflektans terukur (Gambar 8).
Analisis  multivariat  lain  yang  digunakan  adalah  PLS- DA. Partial  least  square-discriminant  analysis (PLS-DA) merupakan analisis yang berguna untuk mengoptimalkan  pemisahan  antar  kelompok  sampel yang  berbeda.  Sedikit  berbeda  dengan  PCA,  PLS-DA dilakukan  untuk  mempertajam  pemisahan  antar kelompok sampel dan dapat mengetahui variabel mana yang  memisahkan  kelas  sampel  (Gromski et  al .  2015). PLS-DA mampu menentukan model prediktif yang akan diuji  kemampuan  kualitatifnya  dalam  mengklasifikasi sampel.  Matriks-x  yang  diperlukan  ada  pembuatan
model  ialah  hasil  pengukuran  spektra  reflektans, sedangkan matriks-y merupakan variabel referens acak yang  terdiri  dari  angka  1  dan  0  yang  disebut  dengan dummy  varible .  Terdapat  3    matriks-y  yang  digunakan sebagai  representasi  model  validasi  yang  dibuat  yaitu ModA, ModB, dan ModC. ModA dengan kombinasi 1, 0, dan  0  untuk  masing-masing  sampel  A,  B,  dan  C berturut-berturut.  Selanjutnya  diikuti  ModB  dengan kombinasi 0, 1, dan 0. Lalu ModC dengan kombinasi 0, 0, dan 1.
Tabel  4 Nilai  R- square dan Root  Mean  Square  Error model PLS-DA
Dari  tiga  model  yang  telah  dibuat  yaitu  model  A,  B dan  C  didapatkan  hasil  R-square  dan  RMSE  yang berbeda-beda  (Lampiran  4).  Jika  R-square  yang didapatkan mendekati 1 dan RMSE mendekati 0, maka model yang telah dibentuk  bisa dikatakan baik. Model A dan C memiliki nilai R yang lebih besar dari model B dan  memiliki  persen  error  yang  lebih  kecil,  sehingga dapat dikatakan model A dan C merupakan model yang lebih baik (Tabel 4). Berdasarkan nilai tersebut model A dan C yang dibentuk dapat mengklasifikasikan masing- masing  usia  1  bulan  dan  3  bulan  dengan  baik.  Hal  ini sebenarnya  sudah  digambarkan  cukup  jelas  dari  plot skor  PCA  (Gambar  9),  dimana  usia  1  dan  3  bulan terkelompok  cukup  baik  pada  1  kuadran,  sedangkan usia  2  bulan  pengelompokkannya  terpisah  dalam  2 kuadran.  Hal  ini  disebabkan  karena  usia  2  bulan memiliki warna yang mirip dengan usia 1 dan 3 bulan, sehingga  nilai  reflektans  yang  dihasilkan  juga  berkisar antara  nilai  reflektans  usia  1  bulan  dan  3  bulan. Pernyataan  ini  juga  diperkuat  dengan  plot line yang dihasilkan (Gambar 8), bahwa  usia 2 bulan mengalami tumpang  tindih  spektrum  dengan  spektrum  usia  1 bulan maupun 3 bulan.
Model  PLS-DA  yang  didapatkan  sudah  mampu memprediksi  data testing  set sesuai  kelompoknya dengan  cukup  baik  (Lampiran  5,  6,  7).  Hal  ini ditunjukkan  dengan  nilai  yang  mendekati  1  untuk semua  parameter  dengan  menggunakan  metode interpretasi tabulasi silang ( confusion matrix ) (Lampiran
Model Kalibrasi Validasi R 2 RMSE R 2 RMSE ModA 0.8782  0.1646 0.8366 0.1922 ModB 0.7289  0.2454 0.6370 0.2866 ModC 0.8870  0.1584 0.8645 0.1752
Studi Etnofarmasi Tanaman Obat Untuk Perawatan  Dan Penumbuh Rambut Pada Beberapa Daerah Di Indonesia 99 8).    Interpretasi  data  hasil  prediksi  menggunakan tabulasi silang memiliki kelebihan mampu menvisualisasikan  performa  suatu  model  dengan algoritma yang lebih sederhana. Parameter yang dapat ditentukan  dari  tabulasi  silang  ini  antara  lain  yaitu sensitivitas, spesifitas, presisi, dan akurasi.
Tabel  5 Interpretasi  hasil  prediksi  model  A,  model  B, dan model C dengan tabulasi silang
Model  A  menghasilkan  nilai  akurasi  maupun  semua parameter  yaitu  1,  yang  berarti  semua  sampel  testing set  untuk  usia  1  bulan  dapat  terprediksi  100%  pada kelompoknya.  Sedangkan  model  B  menunjukkan adanya 2 sampel yang tak masuk kedalam kelas usia 2 bulan,  dan  1  sampel  yang  bukan  merupakan  usia  2 bulan terdeteksi ke dalam kelas usia 2 bulan. Sehingga model  B  menghasilkan  nilai  akurasi  sebesar  0.95. Model C menunjukkan nilai parameter  yang lebih baik dibandingkan  model  B,  yang  mana  hanya  terdapat  1 sampel  usia  3  bulan  terdeteksi  ke  dalam  kelas  yang bukan  usia  3  bulan.  Sehingga  model  C  menunjukkan nilai  akurasi  0.98  (Tabel  5).  Berdasarkan  nilai  akurasi tersebut klasifikasi daun wungu dengan perbedaan usia panen  menggunakan  spektrofotometer  reflektans Quali-Vis dan analisis multivariat kemometrika PCA dan PLS-DA dapat mengelompokkan sampel sesuai kelasnya dengan baik.

## SIMPULAN
Pengukuran  sampel  dengan  spektrofotometer reflektans  Quali-vis  dan  pemodelan  menggunakan kemometrika analisis multivariat menghasilkan klasifikasi yang baik untuk sampel usia 1 bulan, 2 bulan, dan  3  bulan.  Terlihat  dari  jumlah  PC  yang  besar  yaitu
95%  pada  pemodelan  menggunakan  PCA.  Model  PLS- DA  yang  terbentuk  memiliki  rerata  R-square  kalibrasi dan validasi berturut-turut sebesar 83.14% dan 77.94%. Hasil prediksi model PLS-DA menunjukkan nilai akurasi 1 dengan sampel terklasifikasi 100% sesuai kelompoknya  untuk  model  A.  Sehingga  model  A merupakan  model  yang  paling  baik  klasifikasinya,  dan model  B  merupakan  model  yang  cukup  baik  dalam mengklasifikasikan  daun  wungu  usia  2  bulan  dengan nilai  akurasi  prediksi  terkecil  dari  ketiga  model  yaitu sebesar  0.95.  Model  C  menghasilkan  nilai  akurasi prediksi  sebesar  0.98.  Sehingga  spektrofotometer Quali-Vis  mampu  mengklasifikasikan  sampel  daun wungu berdasarkan perbedaan usia panen yaitu usia 1 bulan, 2 bulan, dan 3 bulan.

## DAFTAR PUSTAKA
[AOAC] Association of Official Analytical Chemist. 2007. Official  method  of  Analysis  of  Analysis.  Ed  ke-14. Aelington: AOAC.
CAMO.  2006. The  Unscrambler  User  Manual:  The Unscrambler Methods . New York (US): CAMO Software AS.
[Depkes RI] Departemen Kesehatan Republik Indonesia.
2010. Farmakope  Herbal  Indonesia  Edisi  I .  Jakarta (ID): Depkes RI.
Antari  PD.  2015.  Spektrofotometer  Uv-Vis  reflektans dan  kemometrika  sebagai  teknik  klasifikasi spesimen  jaringan  kanker  serviks  dan  normal. [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Anuradha  VE,  Jaleel  CA,  Salem  MA,  Gomathinayagam M, Panneerselvam R. 2010. Plant growth regulators induced  changes  in  antioksidant  potential  and andrographolide content in Andrographis paniculata  Wall  ex  Nees. Pestic  Biochem  Physiol . 98:312-316.
Aminah,  Muflihunna  A,  Abidin  Z.  2016.  Uji  aktivitas antioksidan  fraksi  etil  asetat  daun  wungu ( Graptophyllum pictum (Linn) Griff ) dengan metode FRAP  ( Ferric  Reducing  Antioxidant  Power ). As- syifaa . 8(1):39-44
Astuti  AI.  2015.  Kuantifikasi  kurkuminoid  dalam temulawak menggunakan spektrofotometer reflektans  berbasis  CCD.  [skripsi].  Bogor  (ID): Institut Pertanian Bogor.
Blum-Silva  CH,  Chaves  VC,  Schenkel  EP,  Coelho  GC, Reginatto  FH.  2015.  The  influence  of  leaf  age  on methylxanthines,  total  phenolic  content,  and  free
Actual class A Not A Predicted class A 20 0 Not A 0 40 B Not B B 18 1 Not B 2 39 C Not C C 19 0 Not C 1 40
Putri et al. radical  scavenging  capacity  of Ilex  paraguariensis aqueous extracts. Rev. Bras. Farmacogn. 25:1-6 Cuadros-Rodriguez  L,  Perez-Castano  E,  Ruiz-SamblasC. 2016.  Quality  performance  metrics  in  multivariate classification  methods  for  qualitative  analysis. TRAC-Trend Anal Chem . 80:612-624 Dalimartha. 1999. Ramuan Tradisional Untuk
Pengobatan Hepatitis . Jakarta: Penebar Swadaya. Gromski  P,  Muhammadali  H,  Ellis  D,  Xu  Y,  Correa  E. 2015.  A  tutorial  review:  metabolomics  and  partial least  squares-discriminant  analysis-a  marriage  of convenience  or  a  shotgun  wedding. Anal  Chim Acta . 879:10-23
Hafsah  N.  2017.  Validasi  kualitatif  model  klasifikasi kualitas temu lawak menggunakan spektrofotometer reflektans Quali-Vis dan Kemometrika[skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Jiangseubchatveera N, Liawruangrath S,
Teerawutgulrag  A,  Santiarworn  D,  Pyne  SG, Liawruangrath  B.  2017.  Phytochemical  screening, phenolic  and  flavonoid  contents,  antioxidant  and cytotoxic  activities  of Graptophyllum  pictum  (L.) Griff . Chiang Mai J SCI . 44:193-202.
Mardiana E. 2017. Uji kinerja analitik spektrofotometer sinar  tampak  berbasis    reflektans  menggunakan pewarna  sudan.  [skripsi].  Bogor  (ID):  Institut Pertanian Bogor.
Morris  AS.  2001. Measurement  and  Instrumentation Principles . London (GB): Butterworth-Heinemann.
Rahma  N.  2016.  Spektrofotometer  reflektans  sinar tampak  dan  kemometrika  sebagai  kendali  mutu daun  jati  belanda  ( Guazuma  ulmifokia ).  [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Sanda  Fm,  Victor  Me,  Monica  Ta,  Alina  C.  2012.
Spectrophotometric  Measurements  Techniques  for Fermentation  Process .  Romania:  University  Of Oradea
Singh SK, Jha SK, Chaudhary, Yadava RDS, Rai SB. 2010.
Quality  control  of  herbal  medicines  by  using spectroscopic techniques and multivariate statistical analysis. Phram Biol. 48:134-141 Stoenoiu  CM,  Bolbocoa  AD,  Jansthi  L.  2006.  Mobile phase  optimization  for  steroid  separation. Med Informatics. 16:141-148
Wakabayashi F, Hamada K. 2006. A DVD spectroscope:
a  simple,  high-resolution  classroom  spectrosope. J Chem Educ . 83:56-58 Wiart  C.  2006. Medicinal  Plants  of  the  Asia-Pacific: Drugs  for  the  Future .  Singapura:  World  Scientific Publishingh Co, Ltd .
Zeaiter  M,  Rutledge  DN.  2009. Comprehensive Chemometrics . Amsterdam (NL): Elsevier.