Journal of Aquaculture and Fish Health Vol. 9(3) - September 2020 DOI : 10.20473/jafh.v9i3.16562
Studi Pendahuluan: Pengaruh Krioprotektan yang Berbeda terhadap Persentase Kerusakan dan Penetasan Embrio Ikan Lele

## Dumbo ( Clarias gariepinus )
Preleminary Study: The Effects of Different Cryoprotectants on Damage and Hatching Rates of African Catfish ( Clarias gariepinus )
Akhmad Taufiq Mukti 1* , Septuresty Hartri Eka 2 , Woro Hastuti Satyantini 1 dan Ahmad Shofy Mubarak 3
1 Departemen Manajemen Kesehatan Ikan, Fakultas Perikanan dan Kelautan, Universitas Airlangga, Jl. Dr. Ir. H. Soekarno, Mulyorejo, Surabaya 60115, Indonesia
2 Program Studi Bioteknologi Perikanan dan Kelautan, Fakultas Perikanan dan Kelautan, Universitas Airlangga, Jl. Dr. Ir. H. Soekarno, Mulyorejo, Surabaya 60115, Indonesia
3 Departemen Kelautan, Fakultas Perikanan dan Kelautan, Universitas Airlangga, Jl. Dr. Ir. H. Soekarno, Mulyorejo, Surabaya 60115, Indonesia

## Abstrak
Tujuan  penelitian  ini  adalah  mengetahui  pengaruh krioprotektan  yang  berbeda  dalam  kriopreservasi  embrio terhadap  persentase  kerusakan  dan  penetasan  embrio  ikan lele  dumbo  ( Clarias  gariepinus ).  Embrio  ikan  lele  pada  fase gastrula diberi perlakuan larutan dimethyl sulfoxide (DMSO), propylene  glycol  (PG),  madu,  dan  kombinasinya  dengan konsentrasi  5%  untuk  masing-masing  perlakuan.  Embrio disimpan  pada  suhu  4  dan  0ºC,  masing-masing  selama  30 menit, 1, 2, 3, 4, 5, dan 6 jam. Thawing embrio dilakukan pada suhu  28ºC.  Selanjutnya,  embrio  diinkubasi  dalam  akuarium pada  suhu  28ºC.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa perbedaan  krioprotektan  dalam  kriopreservasi  embrio  fase gastrula  memberikan  perbedaan  kerusakan  dan  penetasan embrio  ikan  lele  pada  lama  waktu  penyimpanan  yang berbeda.  Persentase  kerusakan  embrio  meningkat  seiring dengan  lama  waktu  penyimpanan  dan  suhu  penyimpanan yang  berbeda.  Kombinasi  larutan  krioprotektan  DMSO  dan madu serta PG dan madu menunjukkan persentase kerusakan embrio yang  lebih  rendah  dan  persentase  penetasan embrio yang  lebih  tinggi  dibandingkan  perlakuan  krioprotektan lainnya (p<0,05).

## Abstract
This  study  was  aimed  to  observe  the  effects  of  different cryoprotectants  in  embryo  cryopreservation  on  damage  and hatching rates of African catfish ( Clarias gariepinus ) embryo. The gastrula-staged embryos were treated 5% (v/v) solutions concentration of dimethyl sulfoxide (DMSO), propylene glycol (PG), honey, and combined cryoprotectants, respectively and preserved at temperatures of 4 and 0ºC for 30 min, 1 h, 2 h, 3
*Correspondence : akhmad-t-m@fpk.unair.ac.id
Received : 2019-12-09 Accepted : 2020-06-01
Kata Kunci : Krioprotektan, Kriopreservasi embrio, Embrio fase gastrula, Kerusakan dan penetasan embrio, Ikan Lele
Keywords : Cryoprotectant, Embryo cryopreservation, Gastrula-staged embryo, Damage and hatching, African Catfish
h,  4 h,  5  h,  and  6 h,  respectively. Thawing of  embryos  was conducted in freshwater at a temperature of 28ºC. Then, the embryos were incubated in the aquaria at 28ºC temperature. The  result  showed  that  the  different  cryoprotectants  in gastrula-staged  embryo  cryopreservation  affect  damage  and hatching rates of African catfish embryos at different length of preservation.  The  percentage  of  catfish  embryo  damage increases with different length of preservation and the storage temperature.  A  combination  of  DMSO-honey  and  PG-honey has the lowest damage percentage and the highest hatching rate  of  catfish  embryo  compared  to  other  treatments (p<0.05).

## PENDAHULUAN
Teknis  kriopreservasi  pada  embrio ikan telah dimulai beberapa dekade yang lalu  (Chao  dan  Liao, 2001;  Beirao et  al ., 2006;  Lahnsteiner,  2009;  Fornari et  al. , 2011,  2012).  Pengembangan  protokol kriopreservasi  untuk  embrio  ikan  sangat penting  dalam  upaya  manajemen  stok perikanan,  pembuatan  bank  gen  ( gene bank )  spesies  ikan,  konservasi  populasi ikan,  dan  studi  pengujian  ekotoksikologi (Zhang et al. , 2005).
Pengetahuan  tentang  krioprotektan dan  toksisitasnya,  konsentrasi  dan kombinasi krioprotektan yang sesuai, dan metode  pendinginan  ( cooling )  sangat penting  untuk  menunjang  keberhasilan kriopreservasi  embrio  (Zhang et  al. , 2005).  Selain  itu,  pengetahuan  tentang sensitivitas embrio terhadap pendinginan sangat  penting  diketahui.  Hal  ini tergantung  pada  fase  perkembangan embrio.  Fase  awal  embrio  dan  pasca gastrulasi  merupakan fase  sangat  sensitif dari  fase  perkembangan  embrio  dalam kriopreservasi (Ahammad et al. , 2002). Krioprotektan permeabel yang umum  digunakan  dalam  kriopreservasi antara lain dimethyl sulfoxide (DMSO) dan propylene glycol (PG). DMSO adalah bahan yang  efektif  untuk  melarutkan  senyawa polar  dan  non  polar,  menghambat pertumbuhan  bakteri  dalam  sampel akuatik,  memiliki  tingkat  toksisitas  yang rendah, dan memiliki kemampuan sangat baik  untuk  menembus  membran  biologis tanpa menyebabkan perubahan integritas struktural  sel  (Kais et  al. ,  2013), sedangkan  PG  adalah  cairan  fungsional
sebagai  cairan  anti  beku  ( antifreeze ), mencegah  pembentukan  es  ( de-icing ), transfer  panas  ( heat  transfer ),  dan unsaturated polyester resins (Dasaria et al. , 2005).  Madu  sebagai  salah  satu krioprotektan  non-permeabel  memiliki kandungan fruktosa 38,4%, sukrosa 1,3%, dan  glukosa  30,3%  (Ball,  2007)  dan memiliki peran penting sebagai antibakteri, sumber energi dan antioksidan (Sheshtawy et al. , 2016). Beberapa studi tentang
kriopreservasi  embrio  telah  dilakukan pada beberapa spesies ikan (Ahammad et al. , 2002,  2003;  Xiao et  al. ,  2008;  Lin et al. , 2009a; Lin et al. , 2009b; Shaluei et al. , 2013;  Sharifuddin  dan  Azizah,  2014; Lopes et al. , 2015; Tian et al. , 2015) akan tetapi,  belum  menunjukkan  hasil  yang maksimal. Kriopreservasi embrio merupakan salah satu pendekatan dalam penyediaan  stok  larva  atau  benih  ikan dengan  kemudahan  transportasi  embrio melalui penyimpanan embrio dan material genetik spesies ikan untuk aplikasi di masa mendatang.  Studi  ini  bertujuan  untuk mengetahui pengaruh krioprotektan yang berbeda  dalam  kriopreservasi  embrio terhadap  persentase  kerusakan  dan penetasan  embrio  ikan  lele  dumbo ( Clarias gariepinus ).

## METODOLOGI Waktu dan Tempat
Penelitian  ini  dilaksanakan  pada bulan  Juli  -  September  2019  di Laboratorium  Basah  Fakultas  Perikanan
dan Kelautan dan Teaching Farm Fakultas Kedokteran  Hewan  Universitas  Airlangga serta  laboratorium  Reproduksi  Ikan Fakultas  Perikanan  dan  Ilmu  Kelautan Universitas Brawijaya.

## Materi Penelitian
Peralatan  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  yaitu,  akuarium  berukuran 1 × 0,5 × 0,5 m (volume 100 L), termostat, cold  box ,  saringan,  mangkok  melamin, refrigerator (4  dan  0ºC),  dan  mikroskop binokuler (Olympus CX41, Japan) beserta kamera.
Bahan  penelitian  yang  digunakan dalam penelitian ini adalah induk ikan lele jantan dan betina, embrio ikan lele stadia gastrula,  bulu  ayam,  ovaprim TM (Sundle, USA),  NaCl  fisiologis  (0,9%),  DMSO (Merck, Germany), PG (Merck, Germany), madu  (Tawon  Lawang  Agro  Tourism, Malang), dan es kering ( dry ice ).

## Rancangan Penelitian
Rancangan penelitian yang
digunakan adalah rancangan acak lengkap
(RAL)  faktorial  dengan  faktor  pertama adalah jenis dan kombinasi krioprotektan (DMSO, PG, dan madu) dan faktor kedua adalah  suhu  kriopreservasi  (4  dan  0ºC). Masing-masing perlakuan diulang sebanyak tiga kali.
Prosedur Kerja Pemijahan Buatan dan Koleksi Telur dan Sperma Ikan Pemijahan  buatan  induk  ikan  lele dilakukan  melalui  induksi  hormonal (ovaprim TM )  0,5  dan  0,3  ml/kg  bobot tubuh  induk  ikan,  masing-masing  untuk betina  dan  jantan.  Injeksi  hormonal dilakukan  secara intramuscular (Mukti et al ., 2019). Setelah sekitar 12 jam induksi hormonal,  induk  ikan  lele  betina di stripping untuk  koleksi  telur  dan diletakkan pada wadah mangkok melamin yang  kering  dan  disimpan  pada  suhu ruang,  sedangkan  induk  ikan  lele  jantan dibedah untuk mendapatkan sperma ikan. Sperma  ikan  ditampung  dalam  spuit dengan  pengenceran  menggunakan  NaCl
fisiologis  sebanyak  10  kali  dan  disimpan dalam refrigerator suhu 4ºC.

## Fertilisasi Buatan
Fertilisasi buatan dilakukan melalui pencampuran sekitar 40 ribu telur dengan 3  ml  larutan  sperma  dan  diaduk  rata secara perlahan menggunakan bulu ayam selama lebih kurang 1 menit. Selanjutnya, air bersih dengan suhu 28ºC ditambahkan sebanyak 1-2 ml pada campuran telur dan sperma  untuk  proses  fertilisasi  telur  dan diaduk  secara  perlahan  menggunakan bulu  ayam  yang  berbeda  selama  lebih kurang  1  menit.  Telur  dicuci  dengan  air bersih sebanyak dua kali.
Inkubasi telur terfertilisasi dilakukan pada akuarium dengan suhu air inkubasi 28ºC  hingga  perkembangan  embrio mencapai stadia gastrula (sekitar 6,5 jam setelah fertilisasi). Kemudian, embrio ikan lele  yang  mencapai  stadia  gastrulasi dimasukkan  ke  dalam cryotube 2  ml, masing-masing sebanyak 50 embrio untuk tiap perlakuan dan tiap perlakuan diulang sebanyak tiga kali.

## Perlakuan Krioprotektan
Pada  penelitian  ini,  perlakuan krioprotektan  yang  digunakan  adalah larutan DMSO, PG, madu, serta kombinasi DMSO-madu  dan  kombinasi  PG-madu. Konsentrasi krioprotektan yang digunakan adalah 5% dalam pelarut NaCl fisiologis. Masing-masing perlakuan larutan krioprotektan dimasukkan dalam cryotube 2 ml. Kemudian, 50 embrio ikan lele fase gastrula  yang  baik  dimasukkan  dalam larutan  NaCl  fisiologis  pada  suhu  28ºC selama  5  menit.  Masing-masing  embrio dalam cryotube sesuai perlakuan ditambahkan larutan krioprotektan menggunakan metode ekuilibrium modifikasi dari protokol Tian et al. (2015) dan Shaluei et al. (2013) pada suhu 28ºC selama 30 menit.
Selanjutnya, embrio dalam cryotube disimpan  pada  suhu  4  dan  0ºC menggunakan metode pendinginan cepat atau vitrifikasi. Masing-masing perlakuan disimpan selama 30 menit dan 1-6 jam.

## Thawing
Setelah masa penyimpanan, cryotubes yang  berisi  embrio  diambil secara cepat dari suhu penyimpanan dan dihangatkan ( thawing ) pada suhu air 28°C selama 30 menit. Setelah thawing , embrio diinkubasi  pada  akuarium  suhu  28ºC hingga menetas. Selama inkubasi, embrio diamati perkembangan dan kerusakannya hingga  embrio  menetas.  Pengamatan embrio  dilakukan  di  bawah  mikroskop cahaya binokuler.

## Analisis Data
Data  dianalisis  secara  statistik menggunakan  analisis  varian  (ANAVA).
Perbedaan  perlakuan  diuji  menggunakan Tukey’s  test .  Analisis  statistik  dilakukan menggunakan  IBM  SPPS  20 software dengan tingkat kepercayaan 95%.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  penelitian  ini  menunjukkan bahwa  perlakuan  krioprotektan  yang berbeda  dalam  suhu  penyimpanan (preservasi) yang berbeda pada kriopreservasi  embrio  ikan  lele  stadia gastrula mempengaruhi persentase kerusakan  (Tabel  1)  dan  penetasan embrio (Tabel 2) ikan lele. Tabel 1. Persentase kerusakan embrio ikan lele pada perlakuan krioprotektan dan suhu preservasi yang berbeda. Perlakuan Suhu Lama penyimpanan (jam) (ºC) 0,5 1 2 3 4 5 6 Madu 4 48,7±1,2 c 48,7±1,2 d 52,0±0,0 d 53,3±1,2 d 56,0±0,0 c 62,7±1,2 d 70,0±0,0 b 0 61,3±1,2 f 62,7±1,2 f
83,3±1,2 f 100,0±0,0 h 100,0±0,0 e 100,0±0,0 g 100,0±0,0 c DMSO 4 41,3±1.2 b 39,3±1,2 c 48,0±0,0 c 50,0±0,0 c 51,3±1,2 b 65,3±1,2 e 69,3±1,2 b 0 58,7±1,2 e 61,3±1,2 f 89,3±1,2 g 96,7±1,2 g 100,0±0,0 e 100,0±0,0 g 100,0±0,0 c PG 4 40,7±1,2 b 38,7±1,2 bc 42,0±0,0 b 46,0±0,0 b 49,3±1,2 b 60,7±1,2 c 69,3±1,2 b 0 58,7±1,2 e 59,3±1,2 ef 83,3±1,2 f 88,7±1,2 f
100,0±0,0 e 100,0±0,0 g 100,0±0,0 c DMSO- Madu 4 39,3±1.2 b 36,7±1.2 ab 36,7±1,2 a 38,0±0,0 a 40,0±0,0 a 44,0±0,0 b 63,3±1,2 a 0 56,7±1,2 de 59,3±1,2 ef 80,7±1,2 ef 88,0±0,0 f 90,7±1,2 d
100,0±0,0 g 100,0±0,0 c PG-Madu 4 38,0±0,0 a 34,7±1,2 a 36,0±0,0 a 38,7±1,2 a 40,7±1,2 a 42,7±1,2 a 64,0±0,0 a 0 55,3±1,2 d 58,0±2,0 e 79,3±1,2 e 86,0±0,0 e 88,7±1,2 d 96,7±1,2 f 100,0±0,0 c Keterangan:  Superskrip  yang  berbeda  pada  kolom  yang  sama  menunjukkan  perbedaan  nyata (p<0.05).
Pada  Tabel  1  terlihat  bahwa persentase  kerusakan  embrio  tidak berbeda nyata antara perlakuan kombinasi  DMSO-madu  dan  kombinasi PG-madu  dan  menunjukkan  persentase terendah dibandingkan dengan perlakuan krioprotektan  yang  lain  (p<0,05), sedangkan suhu preservasi 0ºC menghasilkan persentase kerusakan embrio  yang  lebih  besar  daripada  suhu preservasi 4ºC (p<0.05). Pada perlakuan larutan madu, kerusakan embrio ikan lele total  (100%)  terjadi  sejak  lama penyimpanan  3  jam  pada  suhu  0ºC, sedangkan  pada  perlakuan  krioprotektan DMSO  dan  PG,  masing-masing  terjadi pada lama penyimpanan 4 jam.
Tabel  2  memperlihatkan  bahwa persentase  penetasan  embrio  juga  tidak berbeda nyata antara perlakuan kombinasi  DMSO-madu  dan  kombinasi PG-madu  dan  menunjukkan  persentase tertinggi dibandingkan dengan perlakuan krioprotektan  yang  lain  (p<0,05). Sebagaimana persentase kerusakan embrio  ikan  lele,  perlakuan  madu  pada suhu  preservasi  0ºC  selama  3  jam  sudah tidak  menghasilkan  penetasan  embrio ikan  lele  (0%).  Berdasarkan  data  pada Tabel  2  menunjukkan  bahwa  persentase penetasan  embrio  pada  suhu  preservasi 4ºC lebih besar daripada suhu preservasi 0ºC (p<0,05).
Tabel 2.   Persentase penetasan embrio ikan lele pada perlakuan krioprotektan dan suhu preservasi yang berbeda.
Perlakuan Suhu Lama penyimpanan (jam) (ºC) 0,5 1 2 3 4 5 6 Madu 4 51,3±1,2 bc 51,3±1,2 ab 48,0±0,0 b 46,7±1,2 d 44,0±0,0 c 37,3±1,2 c 30,0±0,0 b 0 38,7±1,2 d 37,3±1,2 c 16,7±1,2 b 0,0±0,0 h 0,0±0,0 f 0,0±0,0 f 0,0±0,0 c DMSO 4 58,7±1,2 b 60,7±1,2 ab 52,0±0,0 b 50,0±0,0 c 48,7±1,2 b 34,7±1,2 d 30,7±1,2 b 0 41,3±1,2 d 38,7±1,2 c 10,7±1,2 b 3,3±1,2 g 0,0±0,0 f 0,0±0,0 f 0,0±0,0 c PG 4 59,3±1,2 b 61,3±1,2 a 58,0±2,0 b 54,0±0,0 b 50,7±1,2 b 39,3±1,2 c 30,7±1,2 b 0 41,3±1,2 d 40,7±1,2 c 16,7±1,2 b 11,3±1,2 f 6,0±0,0 e 0,0±0,0 f 0,0±0,0 c DMSO-Madu 4 60,7±1,2 a 63,3±1,2 a 63,3±1,2 a 62,0±2,0 a 60,0±0,0 a 56,0±0,0 b 36,7±1,2 a 0 43,3±1,2 d 40,7±1,2 c 19,3±1,2 b 12,0±0,0 f 9,3±1,2d 0,0±0,0 f 0,0±0,0 c PG-Madu 4 62,0±0,0 a 65,3±1,2 a 64,0±0,0 a 61,3±1,2 a 59,3±1,2 a 57,3±1,2 a 36,0±0,0 a 0 44,7±1,2 d 42,0±2,0 c 20,7±1,2 b 14,0±0,0 e 11,3±1,2 d 3,3±1,2 e 0,0±0,0 c
Keterangan:  Superskrip  yang  berbeda  pada  kolom  yang  sama  menunjukkan  perbedaan  nyata (p<0.05).
Hasil penelitian ini mengindikasikan bahwa perbedaan krioprotektan dan suhu preservasi yang digunakan dalam kriopreservasi embrio ikan lele mengakibatkan kerusakan dan penetasan embrio  ikan  lele  yang  berbeda.  Secara umum,  kerusakan  embrio  lebih  cepat terjadi pada suhu
preservasi (penyimpanan)  lebih  rendah.  Demikian pula  pada  penetasan  embrio  ikan  lele, suhu  preservasi  yang  lebih  rendah  (0ºC) mengakibatkan  rendahnya  penetasan embrio ikan lele. Hal ini juga sebagaimana hasil yang diperoleh oleh Eka et al. (2020) bahwa  suhu  penyimpanan  -196ºC menghasilkan persentase kerusakan embrio  total  (100%)  dan  persentase penetasan  terendah  dibandingkan  suhu preservasi -4ºC.
Kerusakan  embrio ikan  akibat  suhu preservasi  kemungkinan  dikarenakan perbedaan osmotik dan tingginya sensitivitas  embrio  ikan  lele  yang dikriopreservasi.  Pendinginan  secara cepat  dapat  menyebabkan  kerusakan intraseluler  sel  secara  serius,  sehingga dapat  menyebabkan  kematian  sel  akibat penyusutan  sel  (Bhattacharya  dan Prajapati,  2016).  Penyusutan  embrio berhubungan  erat  dengan  permeabilitas membran sel dan sensitivitas pendinginan. Hagedorn et  al. (1998)  menyatakan bahwa  pembatas  permeabilitas  pada embrio  adalah yolk  synchronization  layer (YSL). Lapisan syncytial dari membran sel telur  secara  fisiologis  akan  mencegah
masuknya krioprotektan ke dalam sel dan pelepasan air dari dalam sel. Akan tetapi, pada kondisi tertentu, krioprotektan dapat masuk ke dalam lapisan syncytial dari sel telur dan mengeluarkan cairan dalam sel telur.
Kriopreservasi dengan metode vitrifikasi sebenarnya lebih efektif karena kerusakan sel dan jaringan sangat sedikit. Metode  vitrifikasi  dapat  mengurangi  air dari  dalam  sel  dan  digantikan  oleh krioprotektan
untuk mencegah terbentuknya
crystals ice ketika pendinginan. Akan tetapi, beberapa faktor merupakan pembatas dalam keberhasilan kriopreservasi  embrio,  seperti  ukuran  sel yang besar, tipisnya korion, permeabilitas membran  yang  kurang,  struktur  yang kompleks  dalam  perkembangan  embrio, dan kandungan yolk yang tinggi (Lin et al. , 2009b)  serta  embrio  lebih  sensitif terhadap krioprotektan (Tian et al. , 2015) bila dibandingkan dengan gamet.
Penggunaan  larutan  pengencer
(NaCl fisiologis)
krioprotektan memungkinkan  sebagai  salah  satu  faktor yang  mempengaruhi  kerusakan  embrio ikan  lele.  Beberapa  studi  tentang penggunaan  larutan  pengencer  atau ekstender dalam kriopreservasi juga telah dilakukan  oleh  beberapa  peneliti  lain sebelumnya, seperti Shaluei et al. (2013) pada  embrio  ikan  mas  koki  ( Carassius auratus auratus ), Keivanloo et al. (2017) pada  embrio  ikan Persian sturgeon ( Acipenser persicus ), dan Tian et al. (2015)
pada  embrio  ikan  kerapu  ( Epinephelus septemfasciatus ).

## KESIMPULAN
Jenis  dan  kombinasi  krioprotektan dan  suhu  preservasi  atau  penyimpanan sangat  berpengaruh  terhadap  kerusakan dan  penetasan  embrio  ikan  lele  hasil kriopreservasi embrio pada stadia gastrula.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima  kasih  penulis  sampaikan kepada Kementerian Riset, Teknologi, dan
Pendidikan Tinggi atas sponsor pendanaan  melalui  Hibah  Penelitian
Terapan  Unggulan  Perguruan  Tinggi (PTUPT)  tahun  2019.  Terima  kasih  juga penulis sampaikan kepada Rektor melalui Ketua  Lembaga  Penelitian  dan  Inovasi (LPI)  Universitas  Airlangga  yang  telah mendukung kelancaran penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Ahammad,  M.M.,  Bhattacharyya,  D.  dan Jana,  B.B.,  2002.  The  hatching  of common  carp Cyprinus  carpio L.
embryos in response to exposure to different concentrations of cryoprotectant at low temperatures.
Cryobiology , 44 ,  pp.  114-121. https://doi.org/10.1016/s0011- 2240(02)00012-3.
Ahammad,  M.M.,  Bhattacharyya,  D.  dan Jana,  B.B.,  2003.  Stage-dependent hatching  responses  of  rohu Labeo rohita embryos to different concentrations  of  cryoprotectants and  temperatures. Cryobiology , 46 , pp.  2-16.  https://doi.org/10.1016/ s0011-2240(02)00138-4. Ball,  D.W.,  2007.  The  chemical composition  of  honey. Journal  of Chemical Education , 84(10), pp. 43- 46.  https://doi.org/10.1021/ed084 p1643.
Beirao,  J.,  Robles,  V.,  Herraez,  M.P., Sarasquete,  C.,  Dinis,  M.T.  dan Cabrita,  E.,  2006.  Cryoprotectant microinjection  toxicity  and  chilling sensitivity  in  gilthead  seabream (Sparus aurata) embryos.
Aquaculture , 261 (3),  pp.897-903. https://doi.org/10.1016/j.aquacult ure.2006.07.039 Bhattacharya, S. dan Prajapati, B.G., 2016. A Review on cryoprotectant and its modern  implication  in  cryonics. Asian  Journal  of  Pharmaceutics ,  10 (3), pp. 154-159. https://dx.doi.org /10.22377/ajp.v10i3.721.
Chao,  N.H.  dan  Liao,  I.C.,  2001.
Cryopreservation  of  finfish  and shellfish  gametes  and  embryos. Aquaculture ,  197,  pp.  161-189. https://doi.org/10.1016/B978-0- 444-50913-0.50011-4.
Dasaria, M.A., Kiatsimkula, P.P., Sutterlin, W.R. dan Suppesa, G.J., 2005. Low- pressure  hydrogenolysis  of  glycerol to propylene glycol. Applied Catalysis , 281 , pp. 225-231. https:// doi.org/10.1016/j.apcata.2004.11. 033.
Eka,  S.H.,  Mukti,  A.T.,  Satyantini,  W.H. dan Mubarak, A.S., 2020.
Preliminary  study:  the  effect  of cryopreservation  on  the  gastrula- staged  embryo  of  African  catfish ( Clarias gariepinus ). IOP Conference Series:  Earth  and  Environmental Science , (inpres). https://iopscience. iop.org/article/10.1088/1755-1315 /441/1/012124.
Fornari, D.C., Ribeiro, R.P., Streit Jr., D.P., Godoy,  LC.,  Neves,  P.R.,  Oliveira, D.D. dan Sirol, R.N., 2011. Effect of cryoprotectants  on  the  survival  of cascudo  preto  ( Rhinelepis  aspera ) embryos  stored  at -8 o C. Zygote , 22, pp. 58-63. https://doi.org/10.1017/ S0967199411000517.
Fornari, D.C., Ribeiro, R.P., Streit Jr., D.P., Vargas,  L.,  Godoy,  L.C.,  Oliveira, C.AL, Digmayer, M., Galo, J.M. dan Neves,  P.R.,  2012.  Increasing storage capability of pacu ( Piaractus mesopotamicus ) embryos by chilling: development of a useful methodology for hatcheries
management. CryoLetters ,  33,  pp. 125-134.  https://pubmed.ncbi.nlm. nih.gov/22576116/.
Hagedorn, M., Kleinhans, F.W., Artemov,
D. dan Pilatus, U., 1998. Characterization of a major permeability barrier in the zebrafish embryo. Biology of Reproduction , 59, pp. 40-50. https://doi.org/10.1095/ biolreprod59.5.1240.
Kais, B., Schneider, K.E., Keiter, S., Henn, K.,  Ackermann,  C.  dan  Braunbeck, T.,  2013.  DMSO  modifies  the permeability of the zebrafish ( Andio rerio )  chorion-implications  for  the fish  embryo  test  (FET). Aquatic Toxicology , 33, pp. 229-238. https://
doi.org/10.1016/j.aquatox.2013.05
.022.
Keivanloo,  S.,  Mohammad,  S.  dan Hajibeglou,  A.,  2017.  Effect  of vitrification  by  propylene  glycol- based solutions on the survival rate of  the  persian  sturgeon Acipenser persicus embryos. Turkish Journal of Fisheries  and  Aquatic  Sciences ,  17, pp.  681-687.  https://doi.org/10. 4194/1303-2712-v17_4_04.
Lahnsteiner,  F.,  2009.  Factors  affecting storage  of  zebrafish  ( Danio  rerio ) embryos. Theriogenology , 72 ,  pp. 333-340.  https://doi.org/10.1016/ j.theriogenology.2009.03.003.
Lin,  C.,  Spikings,  S.,  Zhang,  T.  dan
Rawson,  D.M.,  2009a.  Effect  of chilling  and  cryopreservation  on expression of pax genes in zebrafish
Andio rerio embryos and blastomeres. Cryobiology , 59 ,  pp. 42-47.  https://doi.org/10.1016/j. cryobiol.2009.04.007.
Lin,  C.,  Zhang,  T.  dan  Rawson,  D.M., 2009b. Cryopreservation of zebrafish Andio rerio blastomeres by controlled slow cooling. Cryoletters ,
30 (2),  pp.  132-141.  https://pub med.ncbi.nlm.nih.gov/19448862/.
Lopes,  T.D.S.,  Sanches,  E.A.,  Okawara, R.Y.O.  dan  Romagosa,  E.,  2015.
Chilling of Steindachneridion parahybae ,  Siluriformes:  pimelo-
didae  embryos. Theriogenology ,  84,
pp. 538-544.https://doi.org/10. 1016/j.vas.2019.100046.
Mukti,  A.T.,  Mubarak,  A.S.  dan Wahyurini,  E.T.,  2019.  Aplikasi teknologi induced  spawning untuk mempercepat  pemijahan  ikan  lele pada  mitra  program  kemitraan masyarakat. Journal  of  Aquaculture and  Fish  Health, 8(1),  pp.  46-53. http://dx.doi.org/10.20473/jafh.v8 i1.12004.
Shaluei,  F.,  Imanpoor,  M.R.,  Shabani,  A. dan  Esfahani,  N.M.H.,  2013. Effect of  different  concentrations  of permeable and non-permeable cryoprotectants on the hatching rate of  goldfish Carassius  auratus embryos. Asian  Pacific  Journal  of Reproduction , 2 (3),  pp.  185-188. https://doi.org/10.1016/s2305- 0500(13)60144-x.
Sharifuddin,  M.M.  dan  Azizah,  M.N.S., 2014.  Preliminary  studies  on cryopreservation of snakehead Channa striata
embryos.
Cryobiology , 69 , pp. 1-9. https://doi. org/10.1016/j.cryobiol.2014.04.00
1.
Sheshtawy,  E.R.I.,  Badry,  E.D.A.,  Sisy, E.G.A.,  Nattat,  E.W.S.  dan  Almaty, A.M.A.,  2016. Natural  honey  as  a cryoprotectant  to  improve  Arab stallion post-thawing sperm
parameters. Asian Pacific Journal of Reproduction ,  5(4),  pp.  331-334. http://dx.doi.org/10.1016%2Fj.apj r.2016.06.004.
Tian, Y., Jiang, J., Song, L., Chen, Z., Zhai, J.,  Liu,  J.,  Wang,  N.  dan  Chen,  S., 2015. Effects of cryopreservation on the  survival rate  of  the  seven-band grouper Epinephelus  septemfasciatus embryos. Cryobiology ,  71,  pp.  499- 506. https://doi.org/10.1016/j. cryobiol.2015.10.147.
Xiao, Z.Z., Zhang, L.L., Xu, X.Z., Liu, Q.H., Li, J., Ma, D.Y., Xu, S.H., Xue, Y.P. dan  Xue,  Q.Z.,  2008.  Effect  of cryoprotectants on hatching rate of red  seabream  ( Pagrus  major ) embryos. Theriogenology , 70, pp. 86- 92.  https://doi.org/10.1016/j.the riogenology.2008.06.028.
Zhang,  Y.Z.,  Zhang,  S.C.,  Liu,  X.Z.,  Xu, Y.J.,  Hu,  J.H.,  Xu,  Y.Y.,  Li,  J.  dan
Chen,  S.L.,  2005.  Toxicity  and protective efficiency of cryoprotectants to flounder ( Paralichthys  olivaceus )  embryos.
Theriogenology , 63 ,  pp.  763-773. https://doi.org/10.1016/j.therioge nology.2004.04.011.