## HUBUNGAN ANTARA PENANDA sCD28 DAN sCTLA-4 TERHADAP PERSENTASE SEL LIMFOSIT T CD8+CD45RA+ PADA PENUAAN IMUN
Kusworini Handono 1 , Hani Susianti 1 , Mirza Zaka Pratama 2 , Handono Kalim 2 ,
Caesarius Singgih Wahono 2 , Siti Roziah Ria Famuji 3 , Norma Hanifah Sumarta 3  , Nimas Eka Firdaningrum 3 , Ade Wlidan Rizky Fachry 3

## Abstrak
Penuaan merupakan proses alami dan kompleks yang ditandai  dengan penurunan fungsi fisiologis manusia  sehingga  berakibat  pada  perubahan  sistem  imun.  Sampai  saat  ini,  deteksi  penuaan  imun (immunosenescence)  masih  memiliki  kendala  yang  berarti.  Penanda  satu-satunya  yang  diyakini  sebagai prediktor  penuaan  imun  adalah  immune  risk  profile  (IRP).  Namun,  IRP  hanya  dapat  diamati  dengan pemeriksaan flow sitometri yang membutuhkan alat canggih dan keterampilan khusus. Untuk itu, diperlukan penelitian  yang  menemukan  suatu  penanda  deteksi  penuaan  imun  melalui  metode  yang  lebih  mudah. Beberapa marker kostimulator memiliki bentuk terlarut di dalam serum. Penanda CD28 dan CTLA-4 pada membran memainkan peran utama pada regulasi aktivasi limfosit T dan marker diagnostik pada autoimun ataupun  penuaan  imun.  Meskipun  demikian,  bentuk  terlarut  dari  penanda  tersebut  masih  belum  banyak diteliti.    Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  meneliti  kaitan  antara  penanda  sCD28  dan  sCTLA-4  terhadap persentase  IRP  sel  limfosit  T  CD8+CD45RA+  pada  penuaan  imun.  Molekul  kostimulator  sCD28  dan sCTLA4 diukur menggunakan ELISA, sedangkan presentase sel limfosit T CD8+CD45RA+ menggunakan flow sitometri. Pada penelitian ini didapatkan 87 responden terdiri dari 23,0% responden kelompok individu muda, 40,2% kelompok pasien lupus eritematosus sistemik (LES), dan 36,8% responden kelompok lansia. Kadar  sCD28  dan  sCTLA-4  terhadap  persentase  sel  limfosit  T  CD8+CD45RA+  memiliki  hubungan  yang tidak  signifikan  pada  penuaan  imun.  Pada  penuaan  imun,  fungsi  sel  limfosit  T  yang  mengekspresikan CD45RA menampilkan cacat proliferatif dan pensinyalan, tetapi tetap polifungsional.
Kata kunci: limfosit T CD8+CD45RA+, penuaan imun, sCD28, sCTLA-4

## RELATIONSHIP BETWEEN sCD28 AND sCTLA-4 MARKER ON THE PERCENTAGE

## Abstract
Aging is a natural and complex process that is characterized by a decline of physiological function including  immune  system  function.  The  detection  of  immunosenescence  remains  a  significant  challenge. The established predictor of immunosenescence is limited to the immune risk profile (IRP) marker. How- ever, the measurement of IRP markers using flow cytometry assay requires complex tools and skill compe- tencies. Thus, further exploration of simple methods is needed to detect immunsenescence markers using soluble costimulator. Previous detection markers of autoimmune or immunosenescence are limited to cell membrane expression of CD28 and CTLA-4 as essential molecules for the regulation of T lymphocyte acti- vation. However, the exploration of soluble CD28 and CTLA-4 remains underexplored. Therefore, this study aimed  to  examine  the  relationship  between  the  sCD28  and  sCTLA-4  markers  on  the  IRP  percentage  of CD8+CD45RA+  T  lymphocytes  in  immunosenescence.  Molecul  costimulatory  sCD28  and  sCTLA-4  used ELISA examinations, then the percentage of CD8+CD45RA+ T lymphocytes used flow cytometry examina- tions. The results show that among the 87 respondents, 23.0% are young individuals, 40.2% are systemic lupus erythematosus ( SLE) patients, and 36.8% are in the elderly group. The levels of sCD28 and sCTLA-4 on the percentage of CD8+CD45RA+ T lymphocytes have an insignificant relationship with immune aging. Based on the results, although the CD45RA-expressing T lymphocytes exhibit proliferative and signaling defects in immune   aging, these cells remain polyfunctional.
Keywords: CD8+CD45RA+ T Lymphocytes, immune aging, sCD28, sCTLA-4
1 Departemen Patologi Klinik, Fakultas Kedokteran, Universitas Brawijaya-RSUD Dr. Saiful Anwar Malang 2 Divisi Reumatologi dan Imunologi, Departemen Ilmu Penyakit Dalam, Universitas Brawijaya- RSUD Dr. Saiful Anwar Malang
3 Program Studi Magister Ilmu Biomedik, Fakultas Kedokteran, Universitas Brawijaya
 E-mail: Norma.hanifah12@gmail.com

## Pendahuluan
Penuaan  adalah  suatu  proses  yang alami,  kompleks,  dan  multifaktorial,  ditandai dengan  penurunan  fungsi  fisiologis  setiap individu. 1 Penuaan  merupakan  proses  biolo- gis yang kompleks karena faktor intrinsik (dari dalam  tubuh)  dan  faktor  ekstrinsik  (dari  ling- kungan). 2 Proses penuaan ini mengarah pada peningkatan  kerentanan  terhadap  berbagai penyakit  kronis,  kecacatan,  kegagalan vaksinasi,  perkembangan  kanker,  bahkan sampai  kematian. 3 Studi  epidemiologi  dari Perserikatan  Bangsa-Bangsa  (PBB) menunjukkan bahwa sebanyak 11% populasi di  dunia  dengan  usia  di  atas  60  tahun,  dan diprediksi  akan  semakin  meningkat  di  tahun 2050  menjadi  sebanyak  22%  dari  jumlah populasi.    Hal  ini  menyebabkan  terjadinya lonjakan  masalah  kesehatan  yang  cukup berarti, khususnya di negara berkembang. 4
Penuaan  menyebabkan  penurunan berbagai  fungsi  fisiologis  tubuh,  salah satunya  berakibat  pada  perubahan  berbagai kompartemen sistem imun. Perubahan sistem imun dan keadaan proinflamasi kronis tingkat rendah  atau  yang  disebut  inflammaging. Penuaan  berdampak  pada  sistem  imun  baik secara  kuantitatif  maupun  kualitatif,  yang mengarah pada respons penurunan integritas fisiologis,  kapasitas  fungsional  pada  organ tubuh  sehingga  memicu  terjadinya  suatu keadaan  mulai  dari  infeksi,  autoimunitas, peradangan,  kerusakan  jaringan  yang berlebihan  dan  lamanya  penyembuhan  luka. Hal tersebut berakibat pada penurunan fungsi fisiologis tubuh serta usia hidup akibat proses penuaan  sistem  imun,  disebut  sebagai immune  aging  atau  immunosenescence. Kondisi  ini  dapat  mempengaruhi  kelompok individu  tua,  bahkan  pada  individu  tua  yang sehat dan bebas dari faktor risiko. 5
Penuaan  imun  merupakan  kondisi disfungsi  sistem  imun  yang  mengacu  pada proses  degenerasi,  kompensasi  dan rekonstruksi sel imun akibat proses penuaan. 6
Hal  ini  ditandai  dengan  adanya  suatu penanda  yang  disebut  sebagai  immune  risk profile  (IRP),  seperti:  peningkatan  jumlah  sel limfosit  T  CD8+  memori  (sel  limfosit  T CD8+CD45RO+), dan penurunan jumLah sel limfosit  T  CD8+  naïve  (sel  limfosit  T CD8+CD45RA+). 7 Beberapa  penanda  lain yang  juga  terkait  dengan  penuaan  sistem imun, yaitu: rasio sel T limfosit CD4:CD8 yang terbalik,  penurunan  ekspresi  CD27,  CD28, CD45RA,  CD80  dan  CD86,  peningkatan ekspresi  CD57,  CD45RO,  CTLA-4,  KLRG-1, IL-10,  IFN-γ,  dan  sel  yang  terinfeksi  CMV d i ke t ah u i   be r pe n ga r uh   t e r h ad a p keberlangsungan penuaan imun. 8
Penuaan  sistem  imun  ini  umumnya hanya  terjadi  pada  individu  tua,  namun penelitian  Hoogen  pada  tahun  2015 menyebutkan  bahwa  penuaan  sistem  imun juga ditemukan terjadi pada kasus autoimun, seperti  lupus  eritematosus  sistemik  (LES). 9 LES  merupakan  penyakit  autoimun multisistem  yang  ditandai  dengan  fluktuasi hiperaktivitas  respons  imun. 10 Penuaan  sis- tem  imun  pada  pasien  LES  berperan terhadap  penurunan  kualitas  hidup, peningkatan  derajat  aktivitas  penyakit  LES, serta  tingkat  mortalitas  pasien  LES,  terjadi akibat  immune  exhaustion  akibat  aktivasi sistem  imun  kronis  pada  autoimun. 11 Angka mortalitas  dan  morbiditas  pasien  LES  di Indonesia hingga saat ini masih cukup tinggi, akibat  disfungsi  kognitif,  terutama  dalam domain atensi, ingatan dan visuospasial. 10
Sampai  pada  saat  ini,  deteksi  penuaan sistem  imun  masih  memiliki  kendala  yang berarti.  Penanda  satu-satunya  yang  diyakini sebagai prediktor penuaan imun adalah IRP. Namun, penanda IRP yaitu CD28 dan CTLA- 4,  hanya  dapat diamati dengan  pemeriksaan flow  sitometri  yang  cenderung  sulit,  karena membutuhkan alat canggih dan keterampilan khusus  sehingga  tidak  dapat  dilakukan banyak  orang,  khususnya  di  negara berkembang  seperti  di  Indonesia.  Oleh karena  itu,  diperlukan  penelitian  yang
menemukan  suatu  penanda  untuk  deteksi penuaan  imun  khususnya  pada  lansia  dan individu  yang  memiliki  risiko,  seperti  pasien LES.
Studi  terdahulu  menunjukkan  bahwa beberapa  marker  kostimulator  memiliki bentuk  terlarut  (soluble)  di  dalam  serum. Penanda  terlarut  terbentuk  akibat  adanya pelepasan  dari  membran  atau  adanya produksi  alternatif  saat  proses  splicing mRNA.  Penanda  CD28  dan  CTLA-4  pada membran  memainkan  peran  utama  pada regulasi  aktivasi  sel  limfosit  T  dan  sebagai marker  diagnostik  pada  autoimun  ataupun penuaan  imun.  Penanda  CD28  dan  CTLA-4 homolog  dan  termasuk  dalam  superfamili immunoglobulin.  Kedua  molekul  tersebut berinteraksi  dengan  ligan  yang  sama  B7 ‐ 1 (CD80)  dan  B7 ‐ 2  (CD86)  pada  APCs.
Walaupun  secara  struktural  keduanya memiliki banyak kesamaan, fungsi CD28 dan CTLA-4  hampir  sepenuhnya  berlawanan. Penanda CD28 mengatur sinyal kostimulatori untuk  meningkatkan  aktivasi  sel  limfosit  T, sedangkan  CTLA-4  mengatur  sinyal penghambatan pada sel limfosit T. 12
Meskipun  demikian,  bentuk  terlarut  dari penanda tersebut masih belum banyak diteliti. Kelebihan  dari  marker  terlarut  dibandingkan dengan  marker  pada  reseptor  yaitu kemampuannya  untuk  dapat  dideteksi  di dalam  serum  dengan  uji  yang  lebih  mudah (ELISA)  dibandingkan  dengan  flow sitometri. 13 Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah untuk  meneliti  hubungan  antara  penanda sCD28 dan sCTLA-4 terhadap persentase sel limfosit  T  CD8+CD45RA+  pada  proses penuaan  imun,  sehingga  dapat  diketahui peran  penanda  tersebut  dapat  dalam  proses penuaan  sistem  imun  serta  dikembangkan sebagai  sarana  diagnostik  penuaan  sistem imun yang lebih effisien.

## Bahan dan Metode
Rancangan Penelitian
Penelitian  ini  adalah  penelitian  analitik observasional,  dengan  desain  penelitian kasus  kontrol.  Penelitian  ini  telah mendapatkan  persetujuan  etik  dari  Komite Etik  Penelitian  Kesehatan  RSUD  Dr.  Saiful Anwar Malang (No. 400/085/K.3/302/2020).

## Lokasi Penelitian
Pengambilan  sampel  dilakukan  di  Poli Reumatologi RSUD Dr. Saiful Anwar Malang (RSSA)  dan  Puskesmas  Junrejo  Batu. Pemeriksaan  molekuler  dilakukan  di Laboratorium Fisiologi Hewan Fakultas MIPA dan Laboratorium Sentral RSSA.

## Populasi dan Subjek Penelitian
Populasi pada penelitian ini yaitu pasien LES  dewasa  muda  di  Poli  Reumatologi RSSA,  lansia  ≥60  tahun  dan  individu  muda sehat  usia  produktif  (20-30  tahun).  Kriteria inklusi  kelompok  kasus  dalam  penelitian  ini adalah  pasien  dewasa  muda  (20-30  tahun) yang  terdiagnosis  LES  menurut  klasifikasi SLICC (Systemic Lupus International Collabo- rating  Clinics)  tahun  2012  dengan  aktivitas penyakit yang aktif (skor SLEDAI ≥ 3) di Poli Reumatolgi  RSSA,  Lansia  usia  ≥60  tahun  di Puskesmas  Junrejo  Batu.  Kelompok  kontrol yaitu  individu  muda  yang  dinyatakan  sehat (usia 20-30 tahun) di Malang.Kriteria eksklusi dalam penelitian ini adalah pasien LES yang sakit  parah  sehingga  tidak  memungkinkan untuk  diambil  sampel  darah  venanya  dan responden  tidak  komunikatif  sehingga  tidak bisa memberikan keterangan tentang keluhan yang dirasakan oleh pasien tersebut.

## Variabel Penelitian
Variabel bebas dalam penelitian ini ada- lah  IRP  rasio  sel  limfosit  T  CD8+CD45RA+. Variabel  terikat  dalam  penelitian  ini  adalah penanda sCD28 dan penanda sCTLA-4.

## Variabel Penelitian
Variabel bebas dalam penelitian ini ada- lah  IRP  rasio  sel  limfosit  T  CD8+CD45RA+.
Variabel  terikat  dalam  penelitian  ini  adalah penanda sCD28 dan penanda sCTLA-4.

## Prosedur Penelitian
Pengambilan  sampel  darah  vena, Sebanyak  3  mL  sampel  darah  vena  subjek penelitian dimasukkan ke dalam tabung vacu- tainer  EDTA.  Kemudian  disentrifugasi  1000 rpm  selama  30  menit,  lapisan  PBMC  yang terbentuk  kemudian  dipindahkan  ke  tabung baru, kemudian digunakan dalam analisis flow sitometri.
Sampel  darah  vena  dalam  vacutainer serum dibiarkan dalam suhu ruang selama 15 -30  menit  kemudian  sentrifugasi  dengan  ke- cepatan  3000  rpm  selama  30  menit.  Serum yang berada di lapisan teratas diambil secara perlahan  menggunakan  mikropipet.  Serum dipindahkan ke dalam tabung 1,5 mL, disim- pan  pada  suhu  -20 O C  untuk  kemudian digunakan dalam uji ELISA.
Pengukuran  sel  limfosit  T  CD8+CD45+ dengan  metode  flow  sitometri  yaitu  PBMC yang telah dicuci dengan PBS, disentrifugasi dengan kecepatan 1300 rpm selama 10 me- nit.  Pelet  kemudian  diproses  lebih  lanjut sesuai  intruksi  pabrik  dan  ditambahkan dengan staining PerCP anti-human CD8 dan PE anti-human dalam kondisi terlindungi dari cahaya. Pelet kemudian dipindahkan ke kuvet flow  sitometri  untuk  dilakukan  pembacaan. Pengukuran  dilakukan  pada  10.000  sel  dan hasil  dalam  bentuk  persentase  (%)  sel  dan dihitung  menggunakan  software  BD  Cell Quest.
Pengukuran  sCD28  dan  sCTLA4 dengan  uji  ELISA  yaitu  semua  reagen, sam- pel,  dan  standar    disiapkan  sesuai  instruksi
pabrik  dan  ditempatkan  pada  suhu  ruang. Kadar  sCD28  dan  sCTLA4  diukur menggunakan  kit  ELISA  Human  Soluble sCD28  dan  Human  Soluble  Cytotoxic  T- Lymphocyte Associated Antigen 4 ELISA Kit. Kemudian  optical  density  (OD)  dibaca  pada panjang  gelombang  450  nm  menggunakan Microelisa Strip Plate Reader.

## Analisis Data
Data  hasil  penelitian  ini  dianalisis menggunakan uji normalitas Saphiro Wilk dan uji  homogenitas  Levene.  Kemudian  per- bandingan  antar  kelompok  dianalisis menggunakan  uji  Mann  Whitney.  Uji  korelasi pada penelitian ini menggunakan uji Pearson, apabila  data  tidak  terdistribusi  normal, digunakan uji Spearman.

## Hasil

## Karakteristik Subjek Penelitian
Hasil penelitian pada Tabel 1 didapatkan sebanyak 87 sampel, sebagian besar (40,2%) adalah  kelompok  pasien  LES.  Sebanyak  32 kelompok  lansia  sebagian  besar  berusia  60 sampai  65  tahun.  Sebanyak  35  kelompok pasien  LES  sebagian  besar  (25,7%)  berusia 36 sampai 40 tahun. Sebagian besar  (70%) kelompok  individu  muda  yang  terlibat  dalam penelitian ini berusia 21 sampai 25 tahun.

## Perbedaan Kadar sCD28 pada Individu Muda, LES, dan Lansia
Perbedaan rata-rata kadar sCD28 pada individu  muda,  pasien  LES  dan  lansia  yang memberikan  hasil  statistik  uji  Chi-square 4,093 (Tabel 2) dengan probabilitas 0,129.
Tabel 1. Karakteristik subjek penelitian Karakteristik Frekuensi Persentase (%) Kelompok Individu Muda 20 23,0 Pasien LES 35 40,2 Lansia 32 36,8 Total 87 100
Karakteristik Frekuensi Persentase (%) Lansia 60 - 65 Tahun 11 34,4 66 - 70 Tahun 3 9,4 71 - 75 Tahun 3 9,4 76 - 80 Tahun 7 21,9 > 80 Tahun 8 24,9 Total 32 100 Pasien LES ≤ 20 Tahun 7 20,0 21 - 25 Tahun 6 17,1 26 - 30 Tahun 4 11,4 31 - 35 Tahun 4 11,4 36 - 40 Tahun 9 25,7 > 40 Tahun 5 14,3 Total 35 100 Individu Muda ≤ 20 Tahun 1 5,0 21 - 25 Tahun 14 70,0 26 - 30 Tahun 5 25,0 Total 20 100 Tabel 1. Karakteristik subjek penelitian (lanjutan)
Hal tersebut menunjukkan adanya perbedaan yang  tidak  signifikan  kadar  sCD28  pada individu  muda,  pasien  LES.  dan  lansia.  Ke- lompok lansia memiliki rata-rata kadar sCD28 yang  paling  tinggi,  sedangkan  kelompok  indi- vidu muda paling rendah (Gambar 1).
Perbedaan Kadar sCD28 pada Individu Muda, LES, dan Lansia
Perbedaan  rata-rata  kadar  sCD28  pada individu  muda,  pasien  LES.  dan  lansia  ber- dasarkan hasil uji Chi-square 4,093 (Tabel 2) dengan  probabilitas  0,129,  menunjukkan adanya perbedaan yang tidak signifikan kadar sCD28  pada  individu  muda, pasien LES,  dan lansia.  Kelompok  lansia  memiliki  rata-rata kadar  sCD28  yang  paling  tinggi,  sedangkan kelompok  individu  muda  paling  rendah (Gambar 1).
Perbedaan  Kadar  sCTLA-4  pada  Individu Muda, LES, dan Lansia
Hasil menunjukkan ada perbedaan kadar sCTLA-4  pada  individu  muda,  pasien  LES, dan lansia berdasarkan uji Chi-square sebesar 2,279  dengan  probabilitas  0,320  (Tabel  2). Standar  deviasi  pada  penelitian  ini  sangat
lebar  karena  heterogenitas  dari  sampel  yang tinggi.  Sehingga,  dinyatakan  bahwa  terdapat perbedaan  tidak  signifikan  antara  kadar sCTLA-4  pada  individu  muda,  pasien  LES, dan  lansia.  Berdasarkan  hasil  analisis deskriptif dapat diketahui bahwa individu muda memiliki rata-rata kadar sCTLA-4 paling tinggi, sedangkan  pasien  LES  memiliki  rata-rata  ka- dar sCTLA-4 paling rendah (Gambar 1).

## Perbedaan  Persentase  Sel  Limfosit  T CD8+CD45RA+ pada Individu Muda, LES, dan Lansia
Pada  penelitian  ini,  perbedaan  persen- tase sel limfmosit T CD8+CD45RA+ pada indi- vidu muda, pasien LES, dan lansia menunjuk- kan hasil uji Chi-square 12,582 dengan proba- bilitas 0,002 (Tabel 2). Oleh karena itu, dapat dinyatakan bahwa minimal terdapat sepasang kelompok  dengan  persentase  sel  limfosit  T CD8+CD45RA+ yang berbeda signifikan. Hasil menunjukkan  bahwa  kelompok  pasien  LES memiliki  rata-rata  persentase  sel  limfosit  T CD8+CD45RA+ yang paling tinggi, sedangkan kelompok lansia memiliki rata-rata persentase sel limfosit T CD8+CD45RA+ yang paling ren- dah (Gambar 1).
Gambar 1. Rata-rata kadar sCD28, sCD86 dan persentase sel limfosit T CD8+CD45RA+ pada individu muda, pasien LES, dan lansia
Tabel 2. Perbedaan kadar sCD28, sCTLA-4 dan persentase sel limfosit T CD8+CD45RA+
Variabel Kelompok Uji Chi Square Probabilitas Individu Muda Pasien LES Lansia Kadar sCD28 23,31 24,93 25,78 4,093 0,129 Kadar sCTLA-4 33,75 22,17 29,19 2,279 0,320 Persentase Sel Limfosit T CD8+CD45RA+ 9,45 52,68 5,69 12,582 0,002* Keterangan: * sig < 0,05
Tabel 3. Hasil analisis Mann Whitney
Kelompok Rata-rata Probabilitas Mann Whitney Notasi Lansia Individu Muda SLE Lansia 5,69 0,000 0,012 a Individu Muda 9,45 0,000 0,733 b SLE 52,68 0,012 0,733 b
Hubungan  antara  Peningkatan  Kadar  sCD28 dengan Penurunan Persentase Sel Limfosit T CD8+CD45RA+ pada Penuaan Imun
Hubungan  antara  kadar  sCD28  dengan persentase sel limfosit T CD8+CD45RA+ pa- da  pasien  LES  menghasilkan  koefisien  ko- relasi  0,229  dengan  probabilitas  0,185.
Dengan  demikian,  dapat  dinyatakan  bahwa terdapat  hubungan  tidak  signifikan  antara kadar  sCD28  dengan  kadar  CD8+CD45RA+ pada  LES.  Koefisien  korelasi  sebesar  0,229 menunjukkan  bahwa  ada  hubungan  positif (searah)  dan  lemah.  Hal  tersebut  menunjuk- kan bahwa semakin tinggi kadar sCD28 pada
LES  maka  persentase  sel  limfosit  T
CD8+CD45RA+ akan semakin meningkat dan begitu juga sebaliknya.
Hubungan  antara  kadar  sCD28  dengan persentase sel limfosit T CD8+CD45RA+ pa- da  lansia  menghasilkan  koefisien  korelasi -0,104 dengan probabilitas 0,572. Oleh sebab itu,  dapat  dinyatakan  bahwa  terdapat  hu- bungan  yang  tidak  signifikan  antara  kadar sCD28  dengan  persentase  sel  limfosit  T CD8+CD45RA+  pada  lansia.  Koefisien  ko- relasi  -0,104  menunjukkan  bahwa  ada  hu- bungan  negatif  (berlawanan)  dan  sangat lemah.  Hal  ini  berarti  semakin  tinggi  kadar sCD28  pada  kelompok  lansia  maka  persen- tase  sel  limfosit  T  CD8+CD45RA+  akan  se- makin  menurun,  begitupun  sebaliknya  (Tabel 4).

## Hubungan antara Peningkatan Kadar sCTLA-
4 dengan Penurunan Persentase Sel Limfosit T CD8+CD45RA+ pada Penuaan Imun Hubungan  antara  kadar  sCTLA-4 dengan  persentase  sel  limfosit  T CD8+CD45RA+  pada  pasien  LES menghasilkan  koefisien  korelasi  -0,106 dengan probabilitas 0,546. Dengan demikian, dapat  dinyatakan  bahwa  terdapat  hubungan tidak signifikan antara kadar sCTLA-4 dengan persentase sel limfosit T CD8+CD45RA+ pa- da  pasien  LES.  Koefisien  korelasi  -0,106 menunjukkan  bahwa  ada  hubungan  negatif
(berlawanan)  dan  sangat  lemah.  Hal  ini  ber- arti  semakin  tinggi  kadar  sCTLA-4  pada pasien  LES  maka  persentase  sel  limfosit  T CD8+CD45RA+  akan  semakin  menurun,  be- gitu juga sebaliknya, Hubungan antara kadar sCTLA-4  dengan  persentase  sel  limfosit  T CD8+CD45RA+  pada  lansia  menghasilkan koefisien  korelasi  -0,077  dengan  probabilitas 0,674. Oleh sebab itu, dapat dinyatakan ada- nya  hubungan  tidak  signifikan  antara  kadar sCTLA-4  dengan  persentase  sel  limfosit  T CD8+CD45RA+  pada  lansia.  Koefisien  ko- relasi -0,077 menunjukkan adanya hubungan negatif  (berlawanan)  dan  sangat  lemah.  Hal tersebut berarti semakin tinggi sCTLA-4 pada kelompok lansia maka persentase sel limfosit T  CD8+CD45RA+  akan  semakin  menurun, begitupun sebaliknya (Tabel 5).

## Pembahasan
Perbedaan Kadar sCD28 pada Individu Muda,

## LES, dan Lansia
Pada penelitian ini menunjukkan adanya perbedaan yang tidak signifikan kadar sCD28 pada individu muda, pasien LES, dan lansia. Kelompok  lansia  memiliki  rata-rata  kadar sCD28  yang  paling  tinggi,  sedangkan kelompok  individu  muda  paling  rendah.  Hal tersebut  sejalan  dengan  penelitan sebelumnya yang menyebutkan bahwa kadar sCD28  mengalami  peningkatan  seiring Tabel 4. Hubungan kadar sCD28 dengan persentase sel limfosit T CD8+CD45RA+ pada individu muda, LES, dan lansia Hubungan Kadar sCD28 Persentase Sel Limfosit T CD8+CD45RA+ Koefisien Korelasi (r) Probabilitas Individu Muda 23,31 9,45 -0,288 0,218 LES 24,93 52,68 0,229 0,185 Lansia 25,78 5,69 -0,104 0,572 Tabel 5. Hubungan kadar sCTLA-4 dengan persentase sel limfosit T CD8+CD45RA+ pada individu muda, LES, dan lansia Hubungan Kadar sCTLA-4 Persentase limfosit T CD8+CD45RA+ Koefisien Korelasi (r) Probabilitas Individu Muda 33,75 9,45 0,254 0,281 Pasien LES 22,17 52,68 -0,106 0,546 Lansia 29,19 5,69 -0,077 0,674
dengan  bertambahnya  usia,  bahkan  juga memainkan  peran  yang  penting  dalam terjadinya onkogenesis pasien usia lanjut. 14
Studi  ini  menunjukkan  bahwa  penanda kostimulatori  terlarut  lebih  tinggi  pada  orang tua.  Tingkat  penanda  kostimulatori  terlarut secara positif berkaitan dengan adanya sitokin pro-inflamasi,  seperti  TNF-  α,  IL-6,  IL-1α,  IL- 1β,  dan  IFN-γ  serta  IL-8,  yang  menunjukkan adanya  proses  inflamasi  kronis  yang  terjadi pada  lansia.  Penelitian  sebelumnya  juga menyatakan  bahwa  proses  inflamasi  kronis adalah  asal  muasal  dari  banyaknya komorbiditas  pada  lansia  dan  penyakit kronis terkait  usia,  seperti  aterosklerosis,  obesitas, diabetes,  dan  gangguan  neurodegeneratif. Pada diabetes melitus tipe II, reaksi inflamasi ini  bergantung  pada  bantuan  sitokin  sel limfosit  T  dan  sinyal  kostimulatori,  salah satunya adalah interaksi pelepasan CD28 dan B7 (CD80 dan CD86). Selain diabetes melitus tipe  II,  beberapa  penelitian  juga  menyatakan bahwa  aktivasi  sel  limfosit  T  yang berkepanjangan  pada  lansia  dengan myasthenia  gravis  dapat  melepaskan  sCD28 di awal respons imun. 15
Selain  pada  lansia,  pada  penelitian  ini juga  menunjukkan  adanya  peningkatan molekul  kostimulatori  terlarut  sCD28  pada pasien  LES.  Hasil  penelitian  ini  sejalan dengan penelitan terdahulu yang menyatakan jika  konsentrasi  plasma  sCD28  dari  semua pasien  LES  secara  signifikan  lebih  tinggi daripada  konsentrasi  pada  subjek  kontrol. 16 Peningkatan  kadar  serum  CD28  mungkin merupakan  hasil  dari  ekspresi  berlebih  gen CD28,  yang  dapat  dikaitkan  dengan penurunan sel limfosit T CD28+, hiporesponsif sel  limfosit  T  dan  gangguan  kekebalan  yang terjadi pada pasien LES. 17 Molekul sCD28 ini dapat  diproduksi  dengan  pelepasan  bentuk membran, atau dari splicing  mRNA alternatif, tetapi hasil analisis PCR terbaru menunjukkan bahwa  peningkatan  sCD28  dalam  sirkulasi darah  lebih  mungkin  disebabkan  karena pelepasan dari bentuk membran. 16
Dari  penjelasan  di  atas,  dapat  diketahui bahwa  molekul  kostimulatori  terlarut  sCD28 dapat  dikembangkan  sebagai  biomarker prediktif  yang  menjanjikan  dari  sistem penuaan  imun  di  masa  yang  akan  datang. Selain  itu,  sCD28  juga  berpotensi  untuk memprediksi  adanya  penyakit  penyerta  pada lansia.

## Perbedaan  Kadar  sCTLA-4  pada  Individu Muda, LES, dan Lansia
Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa terdapat  perbedaan  tidak  signifikan  antara kadar  sCTLA-4  pada  individu  muda,  pasien LES, dan lansia. Individu muda memiliki rata- rata  kadar  sCTLA-4  paling  tinggi,  sedangkan pasien LES memiliki rata-rata kadar sCTLA-4 paling  rendah.  Hasil  penelitian  ini  sejalan dengan  studi  terdahulu  yang  menyatakan bahwa sirkulasi sCTLA-4 rendah pada pasien LES  dan  infeksi  kronis. 18 Pada  penelitian García ‐ Chagollán  (2020)  juga  menyebutkan bahwa  kadar  sCTLA-4  lebih  rendah  pada pasien  autoimun. 19 Pada  penelitian  Lange tahun  2017  juga  melaporkan  bahwa konsentrasi  sCTLA-4  rendah  atau  bahkan tidak  terdeteksi  pada  pasien  sepsis. 20 Hal tersebut  juga  sejalan  dengan  pendapat terdahulu  bahwa  sirkulasi  sCTLA-4  dapat digunakan  sebagai  biomarker  terjadinya peradangan,  yang  berpotensi  menimbulkan disfungsi  sel  limfosit  T  pada  lansia  yang memiliki  usia  lebih  dari  70  tahun. 21 Molekul kostimulator  terlarut  ini  dilepaskan  oleh  sel Treg,  monosit,  dan  DC  yang  belum  matang. Penurunan  kadar  sCTLA-4  dapat menyebabkan  peningkatan  kadar  sitokin, terutama  IFN-γ  yang  turut  berperan  dalam proses  inflammaging. 22 Penjelasan  yang mungkin sesuai dengan hasil ini adalah bahwa efek sCTLA-4 bergantung pada status aktivasi sel  yang  terlibat.  Dari  penjelasan  tersebut, dapat  disimpulkan  bahwa  molekul kostimulatori  terlarut  sCTLA-4  dapat dikembangkan  sebagai  biomarker  prediktif penuaan imun dan peradangan kronis di masa yang akan datang.
Perbedaan  Persentase  Sel  Limfosit  T CD8+CD45RA+  pada  Individu  Muda,  LES, dan Lansia
Pada penelitian ini menunjukkan bahwa kelompok  pasien  LES  memiliki  rata-rata persentase  sel  limfosit  T  CD8+CD45RA+ yang  paling  tinggi,  sedangkan  kelompok lansia  memiliki  rata-rata  persentase  sel limfosit T CD8+CD45RA+ yang paling rendah. Hasil  penelitian  ini  sejalan  dengan  teori terdahulu  yang  mengatakan  bahwa  penuaan disertai  dengan  pengurangan  sel  limfosit  T dengan  fenotipe  naïve  (mengekspresikan reseptor  permukaan  seperti  CD45RA  dan CD28),  sementara  sel  limfosit  T  yang  lebih terdiferensiasi menumpuk. Sel limfosit T naïve mewakili  kumpulan  sel  yang  tidak berpengalaman mengenali antigen dan belum memiliki  respons  imun  yang  memadai terhadap  patogen  yang  baru  ditemui. Pengurangan sel limfosit T naïve mengurangi repertoar  TCR,  terutama  sebagai  akibat  dari involusi timus dan proses diferensiasi seluler, yang didorong oleh stimulasi antigenik kronis dan peradangan. 23
Sel  limfosit  T  yang  mengekspresikan CD45RA+  pada  awalnya  dianggap  sebagai sel  limfosit  T  naïve  yang  merupakan prekursor  sel  limfosit  T  CD45RO+  berisi kumpulan  sel  limfosit  T  memori.  Namun pembelahan sel limfosit T menjadi CD45RA+ (sel  limfosit  T  naïve)  dan  CD45RO+  (sel limfosit  T  memori)  ditemukan  menjadi penyederhanaan yang berlebihan, karena sel limfosit  T  manusia  dapat  kembali  dari CD45RO+  menjadi  CD45RA+  yang  sudah dibuktikan,  baik  secara  in  vivo  maupun  in vitro.  Disebutkan  juga  bahwa  sel  limfosit  T pengekspresi  ulang  CD45RA  yang terdiferensiasi  dalam  kompartemen  CD4  dan CD8  meningkat  pesat  selama  penuaan, infeksi,  dan  keadaan  inflamasi. 24 Sehingga hal  tersebut  dapat  menjadi  alasan  mengapa persentase  sel  limfosit  T  CD8+CD45RA+ pada  pasien  LES  justru  mengalami
peningkatan,  bertolak  belakang  dengan persentasenya pada lansia.
Selain  itu,  disebutkan  juga  bahwa  sel- sel limfosit T yang mengekspresikan CD45RA mengalami  penurunan  kapasitas  proliferasi, peningkatan  aktivasi  jalur  pensinyalan penuaan  dan  kerentanan  yang  lebih  besar terhadap apoptosis. Namun sel-sel ini mampu melakukan  beberapa  fungsi  efektor  dan dengan  demikian  menanggung  semua keunggulan  sel  limfosit  T  efektor  yang berumur pendek. Hal ini menunjukkan bahwa pensinyalan  penuaan  dapat  mengatur karakteristik unik sel limfosit T efektor. 24 Pada  penelitian  yang  terdahulu  juga disebutkan  bahwa  akumulasi  sel  limfosit  T dan  sel  NK  senescent  sering  diamati  pada individu  dengan  infeksi  kronis  dan  lansia. Pada  fenomena  penuaan,  sel  tidak  dapat bereplikasi  karena  pemendekan  telomernya dengan  setiap  replikasi  sel.  Untuk  sebagian besar  jenis  sel,  ketika  mereka  menjadi  tua, ada  sistem  pemeliharaan  yang menghilangkan  sel imun (apoptosis), di mana sistem  ini  sangat  penting  untuk  mencegah gangguan imunitas.
Namun,  hal  ini  berbeda  dengan  sel limfosit  T,  karena  pada  sel  limfosit  T  CD8+ senescent  memiliki  sifat  bawaan  berupa ekspresi  reseptor  NKG2D,  sehingga  menjadi bersifat sitotoksik terhadap berbagai spektrum sel  yang  mengekspresikan  ligan  NKG2D. Oleh karena itu, sel T CD8+ senescent dapat mengeliminasi  sel-sel  lain  yang  mengalami penuaan  melalu  mekanisme  NKG2D- dependent  killing.  Hal  ini  menunjukkan manfaat  keberadaan  sel  limfosit  T  dalam sirkulasi, walaupun juga terjadi involusi timus yang  mengakibatkan  pengurangan  produksi sel limfosit T naïve baru yang kompeten. Oleh karena  itu,  proses  ini  kemudian  dapat  dilihat sebagai  adaptasi  meskipun  tidak  optimal untuk  memerangi  infeksi  di  masa  lalu  yang dihadapi  oleh  sel  inang  untuk  mencegah reaktivasi infeksi kronis. 25
Hubungan  antara  Peningkatan  Kadar  sCD28 dengan Penurunan Persentase Sel Limfosit T CD8+CD45RA+ pada Penuaan Imun
Hasil  penelitian  ini  menyatakan  bahwa terdapat  hubungan  tidak  signifikan  antara kadar sCD28 dengan persentase sel limfosit T CD8+CD45RA+ pada LES. Koefisien korelasi sebesar  0,229  menunjukkan  bahwa  ada hubungan  positif  (searah)  dan  lemah.  Hal tersebut  menunjukkan  bahwa  semakin  tinggi kadar sCD28 pada LES maka persentase sel limfosit  T  CD8+CD45RA+  akan  semakin meningkat  dan  begitu  juga  sebaliknya.  Hasil penelitian  menyatakan  bahwa  terdapat hubungan  yang  tidak  signifikan  antara  kadar sCD28  dengan  persentase  sel  limfosit  T CD8+CD45RA+  pada  lansia.  Koefisien korelasi  -0,104  menunjukkan  bahwa  ada hubungan  negatif  (berlawanan)  dan  sangat lemah.  Hal  ini  berarti  semakin  tinggi  kadar sCD28  pada  kelompok  lansia  maka persentase  sel  limfosit  T  CD8+CD45RA+ akan  semakin  menurun,  begitupun sebaliknya.
Hal  tersebut  sejalan  dengan  penelitian terdahulu  yang  menyebutkan  bahwa  kadar sCD28  mengalami  peningkatan  dan persentase  sel  limfosit  T  CD8+CD45RA+ menurun  pada  penuaan  imun.  Hubungan tersebut dikatakan lemah, sebab sel limfosit T manusia  dapat  kembali  dari  CD45RO+ menjadi  CD45RA+  yang  sudah  dibuktikan, baik secara in vivo maupun dan in vitro . Pada penuaan  imun,  fungsi  sel  limfosit  T  yang mengekspresikan  CD45RA  menampilkan cacat proliferatif dan pensinyalan, tetapi tetap sangat  polifungsional,  oleh  karena  itu mungkin  untuk  meningkatkan  kekebalan dapat dilakukan dengan meningkatkan fungsi sel limfosit  T yang  mengekspresikan  kembali CD45RA. Jalan potensial untuk memanipulasi fungsinya,  yaitu  dengan  mengganti  molekul kostimulator  yang  hilang,  seperti  CD28  atau memblokir  sinyal  reseptor  penghambat. 24
Hilangnya  CD28  berpengaruh  terhadap peningkatan  sCD28  akibat  dari  splicing
mRNA.  Oleh  karena  itu,  peningkatan  sCD28 diduga  berkaitan  dengan  penurunan proliferasi  sel  limfosit  T  CD8+CD45RA+ sehingga  persentase  sel  limfosit  T CD8+CD45RA+  pada  penuaan  imun mengalami penurunan.

## Hubungan antara Peningkatan Kadar sCTLA-
4 dengan Penurunan Persentase Sel Limfosit T CD8+CD45RA+ pada Penuaan Imun
Hasil  penelitian  menyatakan  bahwa terdapat  hubungan  tidak  signifikan  antara kadar sCTLA-4 dengan persentase sel limfosit T  CD8+CD45RA+  pada  pasien  LES. Koefisien korelasi -0,106 menunjukkan bahwa ada  hubungan  negatif  (berlawanan)  dan sangat  lemah.  Hal  ini  berarti  semakin  tinggi kadar  sCTLA-4  pada  pasien  LES  maka persentase  sel  limfosit  T  CD8+CD45RA+ akan  semakin  menurun,  begitu  juga sebaliknya.  Hasil  penelitian  juga  menyatakan bahwa  adanya  hubungan  tidak  signifikan antara kadar sCTLA-4 dengan persentase sel limfosit  T  CD8+CD45RA+  pada  lansia. Koefisien  korelasi  -0,077  menunjukkan adanya  hubungan  negatif  (berlawanan)  dan sangat  lemah.  Hal  tersebut  berarti  semakin tinggi  sCTLA-4  pada  kelompok  lansia  maka persentase  sel  limfosit  T  CD8+CD45RA+ akan  semakin  menurun,  begitupun sebaliknya.
Hasil  penelitian  tersebut  kurang  sejalan dengan  penelitian  terdahulu  yang menyebutkan bahwa kadar sCTLA-4 menurun dan persentase sel limfosit T CD8+CD45RA+ menurun  pada  penuaan  imun. 19 Sebab penelitian  terdahulu  menyebutkan  bahwa  sel limfosit  T  manusia  dapat  kembali  dari CD45RO+  menjadi  CD45RA+  yang  sudah dibuktikan,  baik  secara  in  vivo  dan  in  vitro. Sejumlah penelitian menyebutkan bahwa sel- sel ini memiliki karakteristik diferensiasi tahap akhir. Namun, penelitian yang lebih baru telah menunjukkan bahwa mereka dapat diaktifkan kembali  untuk  proliferasi  ketika  diberikan sinyal kostimulator yang tepat. 24

## Kesimpulan
Berdasarkan  penelitian  yang  sudah dilakukan dapat disimpulkan bahwa terdapat hubungan  yang  tidak  signifikan  antara penanda sCD28 dan sCTLA-4 terhadap per- sentase immune risk profile (IRP) sel limfosit T CD8+CD45RA+ pada penuaan imun.

## Daftar Pustaka
1.  El-Naseery  NI,  Mousa  HSE,  Noreldin AE,  El-Far  AH,  Elewa  YHA.  Aging- Associated  Immunosenescence  Via Alterations  In  Splenic  Immune  Cell Populations  In  Rat.  Life  Sci. 020;241 :1171 68.  doi : 10.1016/ j.lfs.2019.117168
2.  Safitri  NA,  Puspita  OE,  Yurina  V.  Opti- masi  Formula  Sediaan  Krim  Ekstrak Stroberi  (Fragaria  x  ananassa)  sebagai Krim Anti Penuaan. Majalah Kesehatan. 2014; 1(4):235–46.
3.  Yang  J.  Effects  of  Aging  on  Immuno- senescence  and  Checkpoint  Inhibitor Efficacy  in  a  C57BL/6J  Syngeneic  Mo- del.  2020.  (Online).  https:// r e so ur ce s. ja x. or g /j ax -se ss io ns - immunology/effects -of-aging-on- immunosenescence-and-checkpoint- inhibitor-efficacy-in-a-c57bl-6j-syngeneic -model 4.  Fuster  V.  Changing  Demographics.
Journal of the American College of Car- diology.  2017;    69(24):3002–5. doi:10.1016/j.jacc.2017.05.013 5.  Gopal  A,  Kishore  Dhiraj,  Gambhir  IS, Diwaker  A.  Aging  Immunity,  Immuno- senescence,  or  Inflamm-Aging:  A  Com- parative  Study  of  Cytokines.  Journal  of Medical  Society.    2019;  33(1):  33-37. DOI: 10.4103/jms.jms_32_18 6.  Yu  Y,  Zheng  S.  Research  Progress  on Immune  Aging  and  Its  Mechanisms  Af- fecting  Geriatric  Diseases.  Aging  Med (Milton).  2019;    2(4):216-222.
doi:10.1002/agm2.12089 7.  Martin-Ruiz C, Hoffmann J, Shmeleva E, et  al.  CMV-Independent  Increase  in CD27-CD28+  CD8+  EMRA  T  Cells  is
Inversely Related to Mortality in Octoge- narians. NPJ Aging Mech Dis. 2020; 6:3.
doi:10.1038/s41514-019-0041-y
8.  Cao  Dinh  H,  Beyer  I,  Mets  T,  et  al. Effects of Physical Exercise on Markers of  Cellular  Immunosenescence:  A Systematic  Review.  Calcif  Tissue  Int.
2017;  100(2):193-215.  doi:10.1007/ s00223-016-0212-9.
9.  van  den  Hoogen  LL,  Sims  GP,  van Roon  JA,  Fritsch-Stork  RD.  Aging  and Systemic  Lupus  Erythematosus- Immunosenescence  and  Beyond.  Curr
Aging  Sci.  2015;  8(2):158-177. doi:10.2174/1874609808666150727111 904 10.  Kalim  H,  Pratama  MZ,  Mahardini  E, Winoto  ES,  Krisna  PA,  Handono  K. Accelerated  Immune  Aging  was Correlated  with  Lupus-Associated  Brain Fog  in  Reproductive-Age  Systemic Lupus  Erythematosus  Patients.  Int  J Rheum  Dis.  2020;  23(5):620-626. doi:10.1111/1756-185X.13816 11.  Xu  X,  Wang  B,  Ren  C,  et  al.  Age- Related  Impairment  of  Vascular Structure  and  Functions.  Aging  Dis. 2017;  8(5):590-610.  doi:10.14336/ AD.2017.0430 12.  Hosseini A, Gharibi T, Marofi F, Babaloo Z,  Baradaran  B.  CTLA-4:  from  Mecha- nism  to  Autoimmune  Therapy.  Int  Im- munopharmacol.  2020;    80:106221. doi:10.1016/j.intimp.2020.106221 13.  Pistillo MP, Fontana V, Morabito A, et al. Soluble CTLA-4 as a Favorable Predic- tive  Biomarker  in  Metastatic  Melanoma Patients  Treated  with  Ipilimumab:  an Italian Melanoma Intergroup Study. Can- cer  Immunol  Immunother.  2019;  68 (1):97-107.  doi:10.1007/s00262-018- 2258-1.
14.  Pan X, Wang L, Shi J, Zhang G, Zhang X.
Expression and Its Clinical Significance of the  Membrane  CD28  and  The  Serum Level of Soluble CD28 in Elderly Patients with  Primary  Non-Small  Cell  Lung  Can- cer  / 中 华 老年医学 杂 志 .  Chinese
Journal of Geriatrics. 2009; 12:445–8. 15.  Fulop  T,  Larbi  A,  Dupuis  G,  et  al.  Im- munosenescence  and  Inflamm-Aging  As Two Sides of the Same Coin: Friends or Foes?.  Front  Immunol.  2018;  8:1960. doi:10.3389/fimmu.2017.01960 16.  Wong  CK,  Lit  LC,  Tam  LS,  Li  EK,  Lam CW.  Aberrant  Production  of  Soluble  Co- stimulatory  Molecules  CTLA-4,  CD28, CD80  and  CD86  in  Patients  with  Syste- mic Lupus Erythematosus. Rheumatology (Oxford).  2005;  44(8):989-994. doi:10.1093/rheumatology/keh663 17.  Brambila-Tapia  AJ,  Gámez-Nava  JI, Salazar-Páramo M, et al. Increased CD28 Serum  Levels  are  Not  Associated  with Specific  Clinical  Activity  in  Systemic Lupus  Erythematosus.  Rheumatol  Int. 2011;  31(10):1321-1324.  doi:10.1007/ s00296-010-1479-1 18.  Wang H, Wang K, Zhong X, et al. Plasma sCD28, sCTLA-4 Levels in Neuromyelitis Optica  and  Multiple  Sclerosis  During Relapse.  J  Neuroimmunol.  2012;  243(1- 2 ) : 5 2 - 5 5 . d o i : 1 0 . 1 0 1 6 / j.jneuroim.2011.11.010 19.  García-Chagollán  M,  Ledezma-Lozano
IY,  Hernández-Bello  J,  Sánchez-
Hernández  PE,  Gutiérrez-Ureña  SR, Muñoz-Valle  JF.  Expression  Patterns  of CD28 and CTLA-4 in Early, Chronic, and Untreated  Rheumatoid  Arthritis.  J  Clin Lab  Anal.  2020;  34(5):e23188. doi:10.1002/jcla.23188 20.  Lange  A,  Sundén-Cullberg  J,  Magnuson A,  Hultgren  O.  Soluble  B  and  T Lymphocyte  Attenuator  Correlates  to Disease  Severity  in  Sepsis  and  High Levels Are Associated with an Increased Risk  of  Mortality.  PLoS  One.  2017;  12 ( 1 ) : e 0 1 6 9 1 7 6 .   d o i : 1 0 . 1 3 7 1 / journal.pone.0169176
21.  Sakthivel P, Wermeling F, Elmgren A, et al. Circulating Soluble CTLA-4 is Related to  Inflammatory  Markers  in  the  70  Year Old Population. Scand J Clin Lab Invest.
2 0 1 0 ; 7 0 ( 4 ) : 2 3 7 - 2 4 3 . doi:10.3109/00365511003695608.
22.  Gu  D,  Ao  X,  Yang  Y,  Chen  Z,  Xu  X. Soluble  Immune  Checkpoints  in  Cancer: Production,  Function  and  Biological SignificAnce.  J  Immunother  Cancer. 2018;  6(1):132.  doi:10.1186/s40425-018- 0449-0
23.  Weyh  C,  Krüger  K,  Strasser  B.  Physical Activity  and  Diet  Shape  the  Immune System during Aging. Nutrients. 2020; 12 (3):622. doi:10.3390/nu12030622
24.  Henson SM, Riddell NE, Akbar AN. Pro- perties of End-Stage Human T Cells De- fined  by  CD45RA  Re-Expression.  Curr Opin  Immunol.  2012;  24(4):476-481. doi:10.1016/j.coi.2012.04.001