Perbandingan Efek Ekstrak Daun Kayu Putih ( Melaleuca leucadendra L.) sebagai Antibiofilm Staphylococcus aureus Isolat Darah dan Urin
Mayniar Ayu Rahmadianti*, Dewi Santosaningsih**, Noorhamdani AS**

## ABSTRAK
Staphylococcus aureus sering menyebabkan infeksi oportunistik dan nosokomial, terutama pada pasien dengan implanted medical devices (IMD). Hal ini disebabkan oleh kemampuan S. aureus dalam membentuk biofilm pada IMD. Adanya perbedaan kemampuan untuk membentuk biofilm dari berbagai strain S. aureus disebabkan oleh perbedaan regulasi gen ica-locus. Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan efek ekstrak daun kayu putih sebagai antibiofilm Staphylococcus aureus dari  isolat darah dan urin dan melihat apakah ada  perbedaan  efek  antibiofilm  antara  kedua  isolat.  Studi  eksperimental  ini  menggunakan post  test  only control group design . Variabel yang diukur pada penelitian ini adalah optical density (OD) dari pembentukan biofilm  yang  dibaca  dengan  menggunakan  spektrofotometer.  Untuk  melakukan  uji  hambat  pembentukan biofilm  digunakan  metode  mikrotiter  menurut  Christensen et  al (1987),  dengan  memberikan  ekstrak  daun kayu  putih  konsentrasi  2,5  x  10 -4 g/ml  –  3,2  x  10 -2 g/ml  pada  kelompok  perlakuan.  Hasil  uji  ANOVA menunjukkan adanya perbedaan OD antar kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan  (p < 0,05). Namun tidak ada peningkatan efek hambat yang bermakna pada konsentrasi di atas 2,5 x 10 -4 g/ml. Berdasarkan nilai  uji  regresi  linier  sederhana,  efek  antibiofilm  ekstrak  terlihat  lebih  kuat  pada S.  aureus isolat  darah (koefisien  = -980) meskipun perbedaan ini tidak terlalu bermakna. Dapat disimpulkan bahwa ekstrak daun kayu putih mempunyai efek antibiofilm serta kemampuan dalam menghambat S. aureus isolat darah dan urin namun tidak ada perbedaan yang bermakna antara kedua isolat.
Kata kunci: Biofilm, Ekstrak daun kayu putih, Staphylococcus aureus .
Comparative Effects of Eucalyptus ( Melaleuca leucadendra L.) Leaves Extract as Antibiofilm for Staphylococcus aureus Blood and Urine Isolates

## ABSTRACT
Staphylococcus aureus often causes opportunistic and nosocomial infections, especially in patients with implanted medical devices (IMD), this might be caused by the ability of S. aureus to form biofilm on it. Each strain from different clinical isolates has different strength in forming the biofilm due to different regulation of ica-locus gene. Thus, this research aimed to prove the effect of eucalyptus leaves extract as an antibiofilm for S.  aureus from  blood  and  urine  isolates  with  different  strains  and  to  determine  whether  there  are  any differences in antibiofilm effect between the two isolates. This experimental study used post test only controls group  design.  The  variable  measured  is  the  optical  density  (OD)  of  biofilm  formation  tested  by spectrophotometer.  Inhibition  test  of  biofilm  formation  is  carried  out  using  the  microtiter  plate  method,  by adding the eucalyptus extract with concentration ranging from 2.5 x 10 -4 g/ml - 3.2 x 10 -2 g/ml to the treatment group. The ANOVA results of this study showed that there are significant differences in the inhibitory effect on biofilm formation between treatment group and positive control (p < 0.05). However, there is no significant increase in inhibitory effect when the concentration in treatment group is above 2.5 x 10 -4 g/ml. The  linear regression test showed that antibiofilm effect of eucalyptus extract slightly stronger on blood isolate, but it is not considered significant. In conclusion, eucalyptus leaves extract has antibiofilm effect for both S. aureus blood and urine isolates and there is no significant different effect between them.
Keywords: Biofilm, Eucalyptus leaves extract, Staphylococcus aureus .
*  Program  Studi Pendidikan Dokter,  FKUB **  Laboratorium Mikrobiologi,  FKUB

## PENDAHULUAN
Staphylococcus  aureus ( S.  aureus ) merupakan  flora  normal  tubuh  yang  tidak berbahaya  pada  manusia  dengan  sistem imun yang normal. Namun bakteri ini sering menyebabkan  infeksi  oportunistik  dan nosokomial,  terutama  pada  pasien  dengan implanted medical devices. 1 Staphylococcus aureus telah  diakui  sebagai  patogen  yang penting dalam penyebab infeksi selama lebih dari  100  tahun.  Sebelum  timbul  resistensi tehadap  penisilin,  pada  tahun  1941  angka mortalitas mencapai 82 % dari 122 pasien S. aureus septikemia  di  Boston  City  Hospital. 2
Angka  mortalitas  terhadap S.  aureus turun setelah  dikenalkannya  penisilin  sebagai terapi Staphylococcus bakteremia.  Namun setelah  ditemukannya methicillin ,  terjadi peningkatan insiden infeksi akibat methicillin resistant  staphylococcus  aureus  (MRSA). Seperti yang terjadi di Queensland, Australia selama tahun 2000-2006 terdapat peningkatan  kasus  infeksi  MRSA  dari  71 kasus  menjadi  315  kasus  per  satu  juta pasien. 3 Infeksi  yg  diakibatkan  oleh S.  aureus ini biasanya  tidak  mudah  untuk  diatasi  karena sering  kambuh.  Faktor  penting  yang menyebabkan hal tersebut adalah kemampuannya  membentuk  biofilm.  Sifat dari  struktur  dan  atribut  fisiologi  dari  biofilm
S.  aureus yang  menyebabkan  sulit  untuk diatasi  secara  tuntas  adalah  perlekatan  sel bakteri  yang  kuat  pada implanted  medical devices , produksi endotoksin untuk melawan respon  imun  dari  inang,  tidak  mampunyai sistem  imun  untuk  mengeliminasi  bakteri yang  berkembang  dalam  biofilm,  serta adanya  pertukaran  plasmid  dalam  biofilm yang  membawa  gen  resisten  terhadap antimikroba tertentu. 4
Biofilm  dari S.  aureus sering  terdapat pada  alat-alat  kedokteran  yang  dipasang
pada tubuh pasien, seperti pada kateter urin dan central venous catheters (CVC)sehingga sering menyebabkan infeksi saluran kencing dan sepsis, dengan angka kejadian masing- masing 10–50 % dan 3-5 %. Pada isolat urin dan  darah  terdapat  perbedaan  kekuatan S. aureus dalam  membentuk  biofilm,  pada isolat  darah  ke-18  dari  32  sampel  (56,2  %) S. aureus menghasilkan biofilm 5 , sedangkan pada  isolat  urin  ke-15  dari  18  sampel  (83,3 %) S. aureus menghasilkan biofilm. 6 Penelitian terkini banyak yang memfokuskan  pada  identifikasi  bahan  baru yang  memiliki  sifat  antibiofilm.  Bahan  alami seperti  ekstrak  dari  tanaman  telah  banyak diteliti  sebagai  alternatif  potensial  untuk menangani  berbagai  macam  penyakit infeksi 7 ,  salah  satu  dari  bahan  alam  yang berpotensi  adalah  ekstrak  daun  kayu  putih. Ekstrak  dari  daun  kayu  putih  ( Melaleuca leucadendra L.)  ini  telah  diteliti  mempunyai efek  toksik  yang selektif  terhadap  mikroba. 8 Pada  penelitian  sebelumnya  ditemukan ekstrak  kayu  putih  mengandung  flavonoid 9 , terpenoid 10 ,  tannin 11 ,  1,8-cineole 12 dan  lain- lain  sehingga  diduga  memiliki  efek antibiofilm.  Belum  diketahui  perbedaan  efek antibiofilm  ekstrak  daun  kayu  putih ( Melaleuca  leucadendra L. ) terhadap S. aureus isolat  darah  maupun  isolat  urin  baik untuk  sel  planktonik  maupun  biofilmnya. Perbedaan  efek  tersebut  perlu  diketahui agar  ekstrak  daun  kayu  putih  sebagai antibiofilm S.aureus dapat  digunakan dengan  tepat.  Penelitian  ini  bermaksud untuk  mengetahui  efek  antibiofilm  ekstrak daun  kayu  putih  sebagai  antibiofilm S. aureus serta  membandingkan  efektifitas ekstrak  daun  kayu  putih  ini  sebagai antibiofilm S.  aureus isolat  darah  dan  isolat urin.  Diharapkan  penelitian  ini  dapat
memberikan informasi baru mengenai bahan alternatif untuk menangani biofilm S. aureus .

## BAHAN DAN METODE
Dalam penelitian ini digunakan rancangan  penelitian true  experimental dengan post  test  only control  group  design . Penelitian  ini  menggunakan  metode microtiter  plate untuk  mengetahui  efek ekstrak daun kayu putih ( M. leucadendra L.) terhadap  pembentukan  biofilm S.  aureus
isolat  darah  dan  urin. Minimal  biofilm inhibitory  concentration (MBIC)  diukur menggunakan mikrotiter  plate  method yang kemudian dibaca dengan spektrofotometer. 13 Kelompok  kontrol  adalah  kelompok yang  tidak  mendapat  perlakuan  berupa pemberian  ekstrak.  Sementara  kelompok perlakuan  adalah  kelompok  yang  mendapat perlakuan berupa pemberian ekstrak dengan dosis 2,5 x 10 -4 g/ml, 5 x 10 -4 g/ml, 1 x 10 -3 g/ml,  2  x  10 -3 g/ml,  4  x  10 -3 g/ml,  8  x  10 -3 g/ml,  1,6  x  10 -2 g/ml,  dan  3,2  x  10 -2 g/ml pada tiap-tiap isolat.
Ekstrak  daun  kayu  putih  adalah  hasil ekstrasi  berbentuk  pasta  daun  kayu  putih dengan  pelarut  etanol  96  %.  Ekstrak  yang didapat dianggap dapat memiliki kandungan ekstrak  sebesar  100  %.  Daun  kayu  putih berasal dari kota Batu yang telah disertifikasi oleh Balai Materia Medika. Daun dipillih yang muda,  segar,  berwarna  hijau,  dan  berasal dari satu pohon.
Sebelum dilakukan uji hambat pembentukan  biofilm  diakukan  reidentifikasi bakteri dari stock culture di Lab. Mikrobiologi FKUB  untuk  tiap-tiap  isolat  seperti pewarnaan  Gram,  tes  katalase,  tes koagulase,  inokulasi  pada chrom  agar . Proses ini dilanjutkan dengan menginokulasi bakteri  pada congo  red  agar untuk  melihat apakan strain yang  digunakan  merupakan strain pembentuk biofilm.
Uji  hambat  pembentukan  biofilm  pada penelitian  ini  sesuai  dengan  metode Chritensen et  al 14 dengan  modifikasi.
Perbenihan  cair  dengan  konsentrasi  10 6 CFU/ml  dimasukkan  sebanyak  0,1  ml  ke dalam  mikrotiter  96- well diinkubasi  selama 24  jam.  Setelah  itu  diberi  ekstrak  sesuai kelompok  perlakuan  dengan  konsentrasi ekstrak 2,5 x 10 -4 g/ml, 5 x 10 -4 g/ml, 1 x 10 -3 g/ml,  2  x  10 -3 g/ml,  4  x  10 -3 g/ml,  8  x  10 -3
g/ml,  1,6  x  10 -2 g/ml,  dan  3,2  x  10 -2 g/ml sebanyak  0.1  ml  pada  tiap-tiap  isolat  dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 ºC. Isi  dari  tiap well selanjtnya  diaspirasi  dan dicuci 3 kali menggunakan 0,2 ml phosphate buffered  saline (PBS).  Proses  pewarnaan biofilm  menggunakan  0,2  ml  kristal  violet  2
%  lalu  dibilas  dengan  akuades  steril  dan dikeringanginkan.  Untuk  pembacaan  nilai optical density (OD) menggunakan spektofotometer  yang  sebelumnya  tiap well diberi 0,2 ml HCL isopropanol.
Hasil  pengukuran  OD  biofilm  pada  tiap isolat  dianalisis  dengan  menggunakan program SPSS for Windows.

## HASIL
Pada  tahap  reidentifikasi  didapatkan gambaran  bakteri  kokus  Gram  positif,  tes katalase  positif,  tes  koagulase  positif  serta koloni  berwarna  merah  muda  pada chrom agar pada  kedua  isolat  menandakan  koloni
Staphylococcus aureus . Uji deteksi pembentukan  biofilm  memberikan  hasil koloni yang berwarna hitam pada congo red agar pada kedua isolat menandakan bahwa strain yang  digunakan  merupakan strain pembentuk biofilm.
Perincian  hasil  dari  uji  hambat pembentukan biofilm dari kedua isolat dapat dilihat pada Tabel 1 dan Tabel 2.
Tabel  1.  Nilai optical  density biofilm  bakteri S.  aureus isolat  urin  yang  diukur  dengan spektrofotometer
Konsentrasi Pengulangan Mean ± SD I II III IV V VI 3.2 x 10 -2 g/ml 4,7 x 10 -2 4,5 x 10 -2 3,5 x 10 -2 7,9 x 10 -2 5,5 x 10 -2 4,8 x 10 -2 5,1 x 10 -2 ± 1,4 x 10 -2 1.6 x 10 -2 g/ml 4,5 x 10 -2 4 x 10 -2 3,7 x 10 -2 7,2 x 10 -2 6 x 10 -2 5,6 x 10 -2 5,1 x 10 -2 ± 1,3 x 10 -2 8 x 10 -3 g/ml 4,5 x 10 -2 5,1 x 10 -2 4,6 x 10 -2 7,7 x 10 -2 8,1 x 10 -2 6,9 x 10 -2 6,1 x 10 -2 ± 1,6 x 10 -2 4 x 10 -3 g/ml 4,3 x 10 -2 4,9 x 10 -2 5,4 x 10 -2 10,2 x 10 -2 5,9 x 10 -2 8,5 x 10 -2 6,5 x 10 -2 ± 2,3 x 10 -2 2 x 10 -3 g/ml 4,6 x 10 -2 4,9 x 10 -2 6,7 x 10 -2 9,1 x 10 -2 6,1 x 10 -2 10,5 x 10 -2 6,9 x 10 -2 ± 2,4
x 10 -2 1 x 10 -3 g/ml 3,1 x 10 -2 4,4 x 10 -2 5,4 x 10 -2 7,1 x 10 -2 6,2 x 10 -2 5,9 x 10 -2 5,3 x 10 -2 ± 1,4 x 10 -2 5 x 10 -4 g/ml 4,9 x 10 -2 4,4 x 10 -2 6,2 x 10 -2 7,9 x 10 -2 6,3 x 10 -2 7,7 x 10 -2 6,2 x 10 -2 ± 1,4 x 10 -2 2.5 x 10 -4 g/ml 4 x 10 -2 3,9 x 10 -2 5,2 x 10 -2 7,3 x 10 -2 6 x 10 -2 6 x 10 -2 5,5 x 10 -2 ± 1,5 x 10 -2 0 g/ml 25 x 10 -2 29 x 10 -2 24 x 10 -2 22 x 10 -2 27 x 10 -2 31 x 10 -2 26 x 10 -2 ± 3,3 x 10 -2
Tabel  2.  Nilai optical  density biofilm  bakteri S.  aureus isolat  darah  yang  diukur  dengan spektrofotometer
Konsentrasi Pengulangan Mean ± SD I II III IV V VI 3.2 x 10 -2 g/ml 3,9 x 10 -2 3,1 x 10 -2 2,9 x 10 -2 4,7 x 10 -2 4,6 x 10 -2 3,9 x 10 -2 3,8 x 10 -2 ± 0,7 x 10 -2 1.6 x 10 -2 g/ml 3,8 x 10 -2 3,7 x 10 -2 3,9 x 10 -2 5,2 x 10 -2 4,8 x 10 -2 3,5 x 10 -2 4,1 x 10 -2 ± 0,6 8 x 10 -3 g/ml 4,2 x 10 -2 4 x 10 -2 4,7 x 10 -2 6,2 x 10 -2 6,5 x 10 -2 6,4 x 10 -2 5,3 x 10 -2 ± 1,1
x 10 -2 4 x 10 -3 g/ml 4,2 x 10 -2 3,5 x 10 -2 4,5 x 10 -2 6,8 x 10 -2 6,5 x 10 -2 5,7 x 10 -2 5,2 x 10 -2 ± 1,3 x 10 -2 2 x 10 -3 g/ml 4,2 x 10 -2 4,2 x 10 -2 4,8 x 10 -2 6,3 x 10 -2 6,5 x 10 -2 5,4 x 10 -2 5,2 x 10 -2 ± 1 x 10 -2 1 x 10 -3 g/ml 3,2 x 10 -2 3,6 x 10 -2 4 x 10 -2 5,2 x 10 -2 5,1 x 10 -2 4,1 x 10 -2 4,2 x 10 -2 ± 0,8 x 10 -2 5 x 10 -4 g/ml 3,3 x 10 -2 3,5 x 10 -2 4,9 x 10 -2 5,9 x 10 -2 5,3 x 10 -2 4,3 x 10 -2 4,5 x 10 -2 ± 1 x 10 -2 2.5 x 10 -4 g/ml 4,3 x 10 -2 4,1 x 10 -2 5,3 x 10 -2 5,7 x 10 -2 6,5 x 10 -2 5,9 x 10 -2 5,3 x 10 -2 ± 0,9 x 10 -2 0 g/ml 33 x 10 -2 32 x 10 -2 32 x 10 -2 36 x 10 -2 41 x 10 -2 32 x 10 -2 34 x 10 -2 ± 3,6 x 10 -2
Gambar 1. Nilai rata-rata OD biofilm bakteri S. aureus isolat urin
Gambar 2. Nilai rata-rata OD biofilm bakteri S. aureus isolat darah
Analisis  dari  uji  hambat  pembentukan biofilm  untuk  kedua  isolat  didapatkan  hasil yang  signifikan  (p  >  0.05)  untuk  uji normalitas dan uji homogenitas. Uji one way ANOVA  juga  didapatkan  hasil  yang signifikan  (p  <  0.01)  untuk  kedua  isolat. Untuk  melihat  konsentrasi  mana  saja  yang memberikan  efek  hambatan  pembentukan biofilm yang bermakna dibandingkan kontrol dilakukan uji post hoc ANOVA menggunakan metode  LSD.  Didapatkan  konsentrasi  yang memiliki  nilai  OD  yang  berbeda  bermakna dengan kontrol positif adalah 2,5 x 10 -4 g/ml untuk  kedua  isolat.  Sehingga  diperlukan  uji
tambahan  yaitu  uji independent  t-test untuk konsentrasi  2,5  x  10 -4 g/ml  dengan  kontrol positif, didapatkan hasil yang signifikan (p < 0,01). Selanjutnya dilakukan uji regresi linier sederhana untuk konsentrasi 2,5 x 10 -4 g/ml dengan  kontrol  positif  dan  didapatkan  hasil Standardized  coefficients sebesar  -975 untuk isolat urin dan -980 untuk isolat darah.

## PEMBAHASAN
Menurut Karatan  dan Watnick, terdapat beberapa mekanisme untuk menghancurkan biofilm. 15 Diantaranya  adalah  degradasi 5,1 5,1 6,1 6,5 6,9 5,3 6,2 5,5 26 1 2 3 4 5 6 7 8 9 OD (x 10 -2 ) Konsentrasi 3,8 4,1 5,3 5,2 5,2 4,2 4,5 5,3 34 1 2 3 4 5 6 7 8 9 O D ( x 1 0 -2 ) Konsentrasi Keterangan: 1  = 3,2 x 10 -2 g/ml
2  = 1,6 x 10 -2 g/ml
3  = 8 x 10 -3 g/ml
4  = 4 x 10 -3 g/ml 5  = 2 x 10 -3 g/ml 6  = 1 x 10 -3 g/ml 7  = 5 x 10 -4 g/ml
8  = 2,5 x 10 -4 g/ml 9  = 0 g/ml Keterangan: 1  = 3,2 x 10 -2 g/ml 2  = 1,6 x 10
-2 g/ml
3  = 8 x 10 -3 g/ml 4  = 4 x 10 -3 g/ml
5  = 2 x 10 -3 g/ml
6  = 1 x 10 -3 g/ml
7  = 5 x 10 -4 g/ml
8  = 2,5 x 10 -4 g/ml 9  = 0 g/ml
matriks  biofilm, cell  death dan cell  lysis . Kandungan ekstrak daun  kayu putih seperti tannin,  terpenoid,  flavanoid ,  dan  1,8- cineole dapat  digunakan  untuk  menghambat pembentukan  biofilm  karena  mempunyai mekanisme  yang  menyebabkan  terjadinya degradasi matriks biofilm, cell lysis, dan cell death seperti  yang  telah  dijelaskan  oleh Karatan and Watnick. 1,8 cineole dan tannin mempunyai  efek cell  death and cell  lysis pada biofilm karena 1,8 cineole menginduksi system  apoptosis,  sedangkan  tannin mempunyai  efek  bakteriosidik. 16-17 Tannin dan  flavonoid  juga  mempunyai  efek  inhibisi terhadap  molekul  adhesin  yang  sangat dibutuhkan  dalam  pembentukan  biofilm. 18-19 Terpenoid  memiliki  efek  disrupsi  membran lipophilic  compound yang  diduga  dapat mengganggu  sifat  hidrofobik  dari  bakteri penyusun biofilm. 18 Hydrophobicity merupakan  faktor  virulensi  yang  berkaitan dengan  peningkatan  agregasi  bakteri  pada substrat, sehingga perubahan sifat hidrofobik akan merubah virulensinya dalam membentuk biofilm.
20
Hasil analisis statistik pada kedua isolat bakteri Staphylococcus  aureus (urin  dan darah)  didapatkan  data  OD  dalam  batas normal dan homogen untuk tiap isolat. Pada isolat  darah  dan  urin,  pembentukan  biofilm telah  menurun  secara  signifikan  pada perlakuan  dengan  konsentrasi  yang  paling rendah  yaitu  2,5  x  10 -4 g/ml.  Hasil  rata-rata OD pada rentang konsentrasi 2,5 x 10 -4 g/ml –  3,2  x  10 -2 g/ml  menunjukkan  angka  yang tidak konsisten dalam menghambat pembentukan  biofilm.  Pada  Gambar  1  dan Gambar 2, dapat terlihat bahwa dalam suatu rentang konsentrasi ekstrak daun kayu putih cenderung menginduksi pembentukan biofilm  sebelum  akhirnya  menghambat pembentukannya. Namun tidak ada perubahan  nilai  yang  bermakna  pada  naik turunnya  nilai  OD  tersebut  dan  dari  uji one way ANOVA didapatkan konsentrasi optimal untuk  ekstrak  daun  kayu  putih  untuk
menghambat  pembentukan  biofilm  adalah pada konsentrasi 2,5 x 10 -4 g/ml untuk kedua isolat  karena itu dilakukan uji independent t- test untuk  mengetahui  besar  pengaruh ekstrak  daun  kayu  putih  2,5  x  10 -4 g/ml terhadap pembentukan biofilm Staphylococcus aureus dibandingkan dengan kontrol positif terhadap setiap isolat. Nilai  OD  yang  fluktuatif  kemungkinan disebabkan oleh gen yang mengekspresikan pembentukan biofilm mempunyai mekanisme  untuk  menstimulasi  produksi biofilm lebih banyak pada kondisi yang tidak menguntungkan  sampai  batas  tertentu.  Hal ini mengingat fungsi biofilm untuk membantu bakteri planktonic agar selamat pada kondisi yang buruk.  Namun  belum diketahui  secara pasti  regulasi  dari  gen  ini  sehingga  perlu diteliti  lebih  lanjut.  Kemungkinan  adanya human  error yang  mempengaruhi  hasil tersebut  juga  besar,  karena  dalam  proses penelitian  ini  diperlukan  proses pipetting yang kekuatannya dapat berbeda untuk tiap well.
Dari  hasil  uji  regresi  linier  sederhana didapatkan  nilai  koefisien  determinasi sebesar  -975  untuk  isolat  urin  dan  -986 untuk  isolat  darah.  Dari  angka-angka  ini dapat  disimpulkan  bahwa  97  %  penurunan pembentukan biofilm Staphylococcus aureus isolat  urin  dipengaruhi  oleh  adanya pemberian ekstrak daun kayu putih sebesar 2,5  x  10 -4 g/ml  serta  98  %  penurunan pembentukan biofilm Staphylococcus aureus isolat  darah  dipengaruhi  oleh  adanya pemberian ekstrak daun kayu putih sebesar 2,5 x 10 -4 g/ml. Hal ini menunjukkan bahwa pemberian ekstrak daun kayu putih sebesar 2,5  x  10 -4 g/ml  mempunyai  efek  yang  kuat terhadap  penghambatan  pembentukan biofilm Staphylococcus  aureus baik  isolat urin  maupun  isolat  darah,  serta  tidak didapatkan  perbedaan  efek  hambatan pembentukan  biofilm  yang  bermakna  dari kedua isolat.
Analisis menggunakan metode microtiter  plate  test nilai  MBIC  untuk  isolat urin dan darah adalah 2,5 x 10 -4 g/ml ekstrak daun kayu putih. Disarankan untuk penelitian selanjutnya  menggunakan  konsentrasi  yang lebih  dirapatkan  lagi  rentangnya  karena dinilai  efek  esktrak  daun  kayu  putih  pada konsentrasi 2,5 x 10 -4 g/ml sudah optimal. Dari hasil uji regresi linier tidak nampak adanya  perbedaan  yang  bermakna  antara pengaruh  ekstrak  daun  kayu putih  terhadap hambatan    pembentukan  biofilm S.  aureus pada  isolat  darah  dan  urin.  Namun  hal  ini belum  dapat  dikonfirmasi  karena  pada  saat awal penelitian tidak diukur secara kuantitatif apakan  kedua  strain  membentuk  biofilm dalam kapasitas yang sama, sehingga perlu dilakukan  pengukuran  terlebih  dahulu  pada penelitian  selanjutnya.  Adanya  sedikit perbedaan  nilai  uji  regresi  linier  sederhana pada kedua isolat bisa terjadi karena adanya perbedaan  kekuatan  dalam  membentuk biofilm  antara  kedua  isolat.  Hal  ini disebabkan  oleh  adanya  perbedaan  strain dari bakteri S. aureus. Dengan digunakannya  strain  yang  berbeda,  besar kemungkinan  kedua  strain  ini  memiliki perbedaan  fenotip  yang  berkaitan  dengan kekuatan  pembentukan  biofilm.  Jadi  tidak dapat  diketahui  perbedaan  secara  pasti kekuatan  tiap  strain  dalam  membentuk biofilm.  Perbedaan  nilai  uji  regresi  linier sederhana  juga  dapat  disebabkan  adanya genotypic  instability .  Menurut  Nuryastuti (2010), genotypic  instability pada ica-locus dapat  menyebabkan  perubahan  yang reversible pada  fenotip,  fenotip ica-positive bisa  berubah  menjadi ica-negative dan kemampuan switching ini juga berbeda pada strain  yang  berbeda.  Hal  ini  dapat dipengaruhi oleh lingkungan biakan dan juga freshness  of  the  culture .  Karena  itu disarankan untuk melakukan penelitian lebih lanjut  untuk  menilai  apakah  hasil  dari penelitian  ini  berlaku  secara  general  untuk
seluruh  strain  dari  isolat  darah  dan  isolat urin.
Nilai  uji  regresi  linier  sederhana  yang sedikit  lebih  tinggi  pada  uji  hambat pembentukan  biofilm S.  aureus isolat  darah juga dapat dipengaruhi oleh cara pengerjaan prosedur penelitian. Protokol yang ada harus dilakukan sesuai dengan ketentuan dan juga harus dilakukan dengan hati-hati. Perbedaan dalam  melakukan  protokol  yang  ada  dapat mempengaruhi hasil OD biofilm. Karakteristik  ekstrak  juga  mempengaruhi hasil  yang  didapatkan.  Ekstrak  daun  kayu putih  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini memiliki  karakteristik  yang  pekat  dan menggumpal serta sedikit mengikat pewarna kristal  violet.  Sifat  dari  ekstrak  ini  dapat mempengaruhi  nilai  OD  dari  biofilm  karena pembacaan  nilai  OD  menggunakan  prinsip pembelokan  cahaya  oleh  bakteri  pada biofilm yang terwarna oleh kristal violet. Jika terdapat sisa ekstrak yang berikatan dengan kristal  violet  yang  masih  tertinggal  pada mikrotiter  saat  dibaca  pada  ELISA reader , akan  terbaca  sebagai false  positive . Mempertimbangkan  beberapa  faktor  di  atas yang dapat mempengaruhi hasil pembacaan OD  biofilm,  maka  dapat  disarankan  untuk menggunakan  metode  yang  berbeda  untuk penelitian  selanjutnya.  Metode  yang  dapat disarankan  adalah  metode  MTT  ((3-(4,5- Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, a yellow tetrazole)) assay atau XTT ((2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)- 2H-tetrazolium-5-carboxanilide)) assay , metode  ini  mengukur  proliferasi  sel  dan menghitung  sel  yang  masih  hidup  dengan mengubah  nilai  yang  didapat  dari pembacaan  ELISA reader .  Nilai  yang didapat  adalah  OD  dari  perubahan  MTT menjadi  formazan  yang  berwarna  ungu setelah  terpapar  enzim  reduktase  yang dihasilkan oleh mitokondria. 21

## KESIMPULAN
Ekstrak  daun  kayu  putih  mempunyai efek antibiofilm pada Staphylococcus aureus isolat  darah  dan  urin.  Tampak  tidak  ada perbedaan  efek  ekstrak  daun  kayu  putih sebagai  antibiofilm  yang  bermakna  untuk
Staphylococcus aureus isolat urin dan darah. Konsentrasi Minimal ekstrak daun kayu putih untuk menghambat biofilm (MBIC) Staphylococcus aureus isolat urin dan darah adalah 2,5 x 10 -4 g/ml.

## DAFTAR PUSTAKA
1.  Consterton JW, Stewart PS, Greenberg EP.  Bacterial  Biofilms:  A  Common Cause of Persistent Infections. Science. 2010. 284:1318.
2.  Skinner  D,  Keefer  CS.  Significance  of Bacteremia  Caused  by Staphylococcus aureus Colonization. Arch  Intern  Med. 1941. 68:851-875. 3.  David  MZ,  Daum  RS.  Community- Associated Methicillin Resistant Staphylococcus  aureus :  Epidemiology and  Clinical  Consequences  of  an
Emerging Endemics. Clin Microbiol Rev. 2010. 23(3):616-687.
4.  Donlan  MR,  Costerton  JW.  Biofilms: Survival  Mechanisms  of  Clinically Relevant Microorganisms. Clin Microbiol
Rev . 2002.15(2):167-193.
5.  Votava  M,  Woznicová  V.  Production  of Slime  by  Staphylococcal  Isolates  from Blood  Culture.  (Abstract). Cent  Eur  J Public Health. 2000. 8(1):18-20.
6.  Gad GFM, El-Feky MA, El-Rehewy MS, Hassan  MA,  Abolella  H,  El-Baky  RMA. Detection  of icaA,  icaD genes  and
Biofilm  Production  by Staphylococcus aureus and Staphyloccus  epidermidis isolated from Urinary Tract Catheterized Patients. J  Infect  Dev  Ctries. 2009. 3(5):342-351.
7.  Prabuseenivasan  S,  Jayakumar  M, Ignachimutu  S.  In  Vitro  Antibacterial Activity  of  Some  Plant  Essential  Oils.
BMC  Complementary  and  Alternative
Medicine . 2006. 6: 39.
8.  Valdéz  AFC,  Martínez  JM,  Lizama  RS, Vermeersch M, Cos P, Maes L. In vitro Anti-Microbial  Activity  of  the  Cuban
Medicinal Plants Simarouba glauca DC,
Melaleuca leucadendron L and Artemisia  absinthium L. Mem  Inst Oswaldo Cruz. 2008.103(6):615-618.
9.  Wollenweber E, Wehde R, Dörr M, Lang G,  Stevens  JF.  C-Methyl-Flavonoids from  the  Leaves  Waxes  of  Some Myrtaceae. Phytochem .  2000.  55:  965- 970. 10.  Lee  Ching-Kuo.  Ursane  Triterpenoids from Leaves of Melaleuca leucadendron . Phytochem. 1998.  49(4):
1119-1122. 11.  Yoshida T, Maruyama T, Nitta A, Okuda T.  An  Hydrolysable  Tannin  and Accompanying Polyphenols from Melaleuca  leucadendron . Phytochem.
1996. 42(4):1171-1173.
12.  Inouye  S,  Yamaguchi  H,  Takizawa  T. Screening of the Antibacterial Effects of a Variety of Essential Oil on Respiratory Tract  Pathogens,  Using  a  Modified Dilution  Assay  Method. J  Infect Chemother. 2001. 7:251-254. 13.  Nuryastuti  T. Environmental  Signals Affecting ica-Expression in Staphylococcus  epidermidis  Biofilms . Yogyakarta: Niaga Sejati. 2010. p 2-11.
14.  Christensen GD, Simpson WA, Younger JJ, Baddour LM, Barret FF, Melton DM, Beachey EH. Adherence of Coagulase- Negative Staphylococci to Plastic Tissue Culture Plates: a Quantitative Model for the  Adherence  of  Staphylococci  to Medical Devices. J Clin Microbiol. 1985. 22(6):996-1006.
15.  Karatan  E  and  Watnick  P.  Signals, Regulatory  Networks,  and  Materials
That Build and Break Bacterial Biofilms. Microbiol  Mol  Biol  Rev. 2009.  73(2): 310-347. 16.  Cha JD, Kim YH, Kim JY. Essential Oil
and 1,8-Cineole from Artemisia lavandulaevolia Induces  Apoptosis  in KB  Cells  via  Mitochondrial  Stress  and Caspase  Activation. Food  Sci
Biotechnol . 2010. 19(1):185-191.
17.  Funatogawa  K,  Hayashi  S,  Shimomura H, Yoshida T, Hatano T, Ito H, Hirai Y. Antibacterial  Activity  of  Hydrolyzable
Tannins  Derived  from  Medical  Plants Against Helicobacter  pylori . Microbiol Immunol . 2004. 48(4):251-261.
18.  Cowan  MM.  Plant  Products  as Antimicrobial Agents. Clin Microbiol Rev 1999. 10(4):564-582.
19.  Crespo  I,  García-Mediavilla  MV,
Gutiérrez B, Sánchez-Campos S, Tuñon MJ, González-Gallego J. A Comparison of  the  Effects  of  Kaempferol  and Quercetin  on  Cytokine-Induced  Pro inflammatory Status of Cultured Human Endothelial  Cells. Br  J  Nutr. 2008. 100:968-976.
20.  Qadri F, Hossain SA, Čižnár I, Haider K, Ljungh  Å,    Wadström  T,  Sack  DA. Congo  Red  Binding  and  Salt Aggregation as Indicators of Virulence in Shigella  Species. J  Clin  Microbiol.
1988. 26(7):1343-1348.
21.  Biotium Inc. XTT Cell Viability Assay Kit. (online).  Diakses  20  Agustus  2011  jam 20.00. http://www.biotium.com.