## Pengaruh Konsentrasi Glutaraldehida Terhadap Aktivitas Transesterase Enzim Lipase Terimobilisasi pada Proses Pembuatan Biodiesel dari Minyak Goreng Bekas

## ABSTRAK

## ABSTRACT

## BIOMEDIKA
ISSN : 1979 - 035X (printed edition) ISSN : 2302 - 1306 (electronic/Portal e-Journal)

## The Effect of Glutaraldehyde Concentration for Transesterase Activities of Immobilized Lipase on Biodiesel Production Process from Used Cooking Oil

## Susan Primadevi* dan Dian Kresnadipayana
Fakultas Ilmu Kesehatan, Universitas Setia Budi
* Corresponding author: sanchemic.nnes@gmail.com
Volume 10, No. 1, Maret 2017
Penggunaan lipase sebagai biokatalis mempunyai beberapa kelemahan yaitu lipase tidak dapat digunakan kembali karena terlarut dalam media reaksi, struktur lipase sangat tidak stabil terhadap adanya perubahan lingkungan (suhu, pH, kekuatan ionik), sehingga menyebabkan enzim terdenaturasi. Solusi untuk mengatasi kelemahan penggunaan en- zim tersebut adalah dengan imobilisasi enzim pada chitosan beads dengan metode crosslinking. Tujuan  penelitian ini adalah mengetahui pengaruh variasi konsentrasi glutaraldehida terhadap aktivitas transesterase enzim lipase terimo- bilisasi pada proses pembuatan biodiesel .
Penelitian diawali dengan pembuatan kitosan dari limbah cangkang rajungan. Kitosan serbuk kemudian dimodifi- kasi bentuknya melalui proses swelling menjadi chitosan beads. Tahap kedua adalah pemurnian minyak goreng bekas melalui tahap despicing, netralisasi dan bleaching. Tahap ketiga yaitu imobilisasi enzim lipase pada chitosan beads dengan metode crosslinking dengan menggunakan variasi konsentrasi glutaraldehida. Tahap terakhir adalah pembuat- an biodiesel dari minyak goreng bekas. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kitosan yang dihasilkan memiliki rende- men sebesar 39,43%, derajat deasetilasi 83,83%, kadar abu 0,73%, kadar air 4,74% dan kadar nitrogen 7,18%. Chi- tosan beads yang dihasilkan memiliki diameter sebesar 3,55±0,38 mm. Konsentrasi metil ester tertinggi dihasilkan pa- da saat konsentrasi glutaraldehida 2%.
Kata kunci: chitosan beads, imobilisasi lipase, glutaraldehida, biodiesel
The usage of lipases as a biocatalyst have several weakness, namely lipases can not be reused because it dissolved in the medium of reaction, it is unstable to a environmental changes (temperature, pH, ionic strength), causing the de- naturation of enzymes. The solution to overcome disadvantages of lipases usage is immobilization of enzymes on chi- tosan beads with crosslinking method. The purpose of this study was to determine the effect of glutaraldehyde concen- tration to transesterase activity of immobilized lipase on the process of biodiesel making.
This first step of this research was making the chitosan from crab shell waste, then chitosan powder modified through swelling process into chitosan beads. The second step was the purification of used cooking oil through despicing, neu- tralization  and  bleaching.  The  third  step  was  the  immobilization  of  lipase  on  chitosan  beads  via  crosslinking  method using  variations  of  glutaraldehyde  concentration.  The  last  step  was  the  making  of  biodiesel  from  used  cooking  oil. The  results  showed  that  chitosan  produced  yield  of  39,  43%,  deacetylation  degree  of  83,83%,  ash  content  of  0,73%, water content of 4,74% and nitrogen content of 7,18%. Chitosan beads had a diameter of 3,55 ± 0,38 mm. The highest methyl ester was produced on concentration glutaraldehyde of 2%.
Keywords: chitosan beads, immobilization of lipases, glutaraldehyde, biodiesel
Enzim adalah biokatalisator yang banyak di- gunakan  pada  berbagai  bidang  industri  seperti makanan, kimia, dan medis. Aktivitas enzim li- pase yang menarik untuk dipelajari adalah akti- vitas transesterase. Keuntungan penggunaan en-
zim  lipase  pada  reaksi  transesterifikasi  adalah kondisi  operasi  dapat  dilakukan  pada  keadaan lunak  ( mild )  dan  proses  pemisahan  gliserol  da- pat dilakukan dengan mudah tanpa perlu dilaku- kan proses pemurnian atau menghasilkan limbah kimia. Hal tersebut menyebabkan reaksi enzima-
tis berpotensi untuk diaplikasikan pada pembuat- an biodiesel karena bisa menghasilkan biodiesel dengan  kualitas  baik,  rendemen  yang  tinggi, energi dan biaya produksi yang rendah. Penggunaan lipase sebagai biokatalis ternyata juga  mempunyai  beberapa  kelemahan  diantara- nya lipase tidak dapat digunakan kembali karena terlarut dalam media reaksi. Menurut Krajewska (2004) struktur lipase sangat tidak stabil terhadap adanya perubahan lingkungan (suhu, pH, kekuat- an  ionik,  dan  gangguan  lainnya),  sehingga  me- nyebabkan  enzim  terdenaturasi  (Chibata,  1978). Tingginya  harga  enzim  juga  menjadikan  proses enzimatis menjadi tidak ekonomis.
Salah  satu  cara  mengatasi  kelemahan  dalam penggunaan  enzim  tersebut  adalah  dengan  imo- bilisasi  enzim.  Salah  satu  metode  yang  banyak digunakan  adalah  metode  pengikatan  silang ( crosslinking )  enzim  pada  matriks  pendukung dengan glutaraldehida sebagai crosslinking agent . Keuntungan metode ini adalah ikatan antara en- zim  dan  matriks  pendukungstabil  sehingga  en- zim tidak mudah lepas ke dalam larutan dan sub- strat  dapat  dengan  mudah  berinteraksi  karena enzim  berada  pada  permukaan  matriks  pendu- kung (Brena et al ., 2006).
Matriks pendukung yang digunakan pada pro- ses  imobilisasi  harus  mempunyai  bentuk  dan ukuran  pori  yang  cocok,  area  permukaan  yang luas, tidak larut dalam air, memiliki stabiltas ter- mal  dan  kimia  yang  tinggi  serta  dapat  diregene- rasi. Kitosan menarik digunakan sebagai matriks pendukung  karena  mempunyai  beberapa  sifat yang  menguntungkan  antara  lain  hidrofilisitas, biokompatibilitas,  biodegradabilitas,  anti  bakte- ri  dan  mempunyai  afinitas  yang  besar  terhadap enzim.
Kitosan  serbuk  dapat  dimodifikasi  menjadi c hitosan bead melalui proses swelling. Chitosan bead dapat meningkatkan efektivitas pengguna- an ulang kitosan sebagai matriks pendukung se- lama proses imobilisasi.
silang  yaitu  waktu  imobilisasi,  pH,  konsentrasi matriks  pendukung,  konsentrasi  glutaraldehida dan  konsentrasi  enzim.  Penelitian  ini  bertujuan untuk  mempelajari  pengaruh  konsentrasi  gluta- raldehida terhadap aktivitas transesterase enzim lipase terimobilisasi pada proses pembuatan bio- diesel dari minyak goreng bekas.
Bahan-bahan yang digunakan dalam peneliti- an  ini  adalah  cangkang  rajungan  (diperoleh  dari CV.  Sekawan  Mina),  enzim  lipase  (Merck),  mi- nyak  goreng  bekas  (diperoleh  dari  penjual  go- rengan  di  wilayah  Surakarta),  abu  sekam  padi, kertas  saring  Whatman41,  kertas  saring,  kertas indikator pH, akuades, bahan dari Merck berkua- litas p.a, yaitu: glutaraldehida, natrium hidroksida (NaOH), asam klorida (HCl), metanol (CH OH), 3 etanol  (C H OH),  asam  asetat  (CH COOH),  n- 2 5 3
heksana,  BF   dalam  metanol,  natrium  hidrogen
3 .
fosfat  (Na HPO 2H O),  natrium  dihidrogen  fos-
2 4 2 . . fat (NaH PO 2H O), tembaga (II) sulfat (CuSO 2 4 2 4 .
5H O), kalium natrium tatrat (KNaC H O 4H O),
2 4 4 6 2
BSA (Bovin Serum Albumin) , kaporit teknis.

## BAHAN DAN METODE
Bahan
Metode Penelitian A.   Pembuatan Kitosan dan Chitosan Beads

## a.    Pembuatan kitosan
Cangkang  rajungan  dicuci  dan  direndam  da- lam  larutan  kaporit  teknis  4  %  selama  15  menit, kemudian  cangkang  kepiting  dikeringkan  pada suhu  kamar.  Cangkang  rajunganyang  sudah  ke- ring,  ditumbuk  sampai  setengah  kasar,  diblender sampai halus dan diayak dengan ayakan 250 mesh agar ukuran butirannya homogen.
Deproteinasi dilakukan dengan cara mencam- purkan  50  g  serbuk  cangkang  kepiting  dengan 500  mL  larutan  NaOH4%  (b/v)  dan  campuran
o dipanaskan selama 2 jam pada suhu 65  C. Resi- du  dicuci  dengan  akuades  sampai  netral  dan  di-
o keringkan  dalam  oven  pada  suhu  65 C  selama 2 jam.
Demineralisasi dilakukan dengan cara men-
campurkan residu dengan larutan HCl 1 M de- ngan perbandingan 1 : 15 dan diaduk selama 3 jam  pada  suhu  kamar.  Residu  dicuci  dengan akuades sampai netral. Kitin yang diperoleh di-
o keringkan dalam oven pada suhu 65 C selama 2 jam.
Deasetilasi  dilakukan  dengan  cara  mencam- purkan  kitin  yang  diperoleh  dengan  larutan NaOH 50 % (b/v) dengan perbandingan 1:10, dan campuran  dipanaskan  selama  1  jam  pada  suhu o 100  C. Residu dicuci dengan akuades hingga ne- tral.  Kitosan  yang  diperoleh  kemudian  dikering- kan  dalam  oven  selama  2  jam  pada  suhu  65  ºC dan dianalisis dengan spektrofotometer FTIR.
Satu gram kitosan serbuk dilarutkan ke dalam larutan asam asetat 1% (v/v), kemudian dimasuk- kan melalui jarum syringe (26G) ke dalam 100 mL zat koagulan (larutan NaOH 1 M dalam 26% (v/v) etanol).  Campuran  dibiarkan  selama  3  jam,  sam- pai terbentuk gel berbentuk bulat. Chitosan beads yang terbentuk disaring dan dicuci sampai netral.
b.   Pembuatan chitosan beads
Minyak goreng bekas ditambah dengan akua- des  dengan  perbandingan  1:1  dan  dipanaskan sampai  volume  akuades  menjadi  setengahnya. Campuran  disaring  dengan  kertas  saring  untuk memisahkan kotoran-kotoran yang mengendap.
Minyak  goreng  bekas  hasil despicing dipanas- o kan sampai suhu 35 C, kemudian tambahkan la- rutan NaOH 16% dengan komposisi 4 ml setiap 100 ml minyak. Campuran diaduk selama 10 me- o nit  pada  suhu  40 C.Campuran  didinginkan,  ke- mudian  disaring  untuk  memisahkan  minyak  go- reng dengan kotoran.
o kan sampai suhu 70 C, kemudian abusekam padi dimasukkan ke dalam larutan minyak goreng (de- ngan perbandingan 6,25 gram abu sekam padiper 100 gram minyak goreng). Larutan diaduk meng- gunakan magnetic  stirrer selama  60  menit  dan o suhu ditingkatkan sampai 100 C.Campuran disa- ring  untuk  memisahkan  minyak  goreng  dari  ko- toran.
B.   Pemurnian Minyak Goreng Bekas (Siswani et al ., 2012): a.  Proses despicing
b.   Proses netralisasi
c.   Proses bleaching Minyak goreng bekas hasil netralisasi dipanas-
Satu gram chitosan beads dimasukkan ke da- lam botol Falcon 50 mL dan direndam dalam la- rutan glutaraldehida berbagai konsentrasi (0,125%, 0,25%, 0,50% dan 1%,2%) selama 10 menit. Chi- tosan  beads kemudian  disaring  dan  dicuci  lalu direndam dalam larutan enzim lipase 1% (30 mg dalam 3 mL bufer fosfat pH 6) selama 60 menit.
C.   Imobilisasi Enzim Lipase

## D.   Pembuatan Biodiesel
Minyak goreng bekas ditambah dengan meta- nol dengan perbandingan 1:6 dan dimasukkan ke dalam  botol  falcon  50  mL.  Ke  dalam  campuran ditambahkan  1  g chitosan  beads terimobilisasi dan  direaksikan  selama  5  jam  pada  temperatur 37  °C  dalam shaker  incubator .  Filtrat  dianalisis kandungan  senyawa  metil  ester  asam  lemak (FAME) dengan menggunakan GC.
Proses pembuatan kitosan dilakukan dengan metode  No  dan  Meyer  (1989)  yang  terdiri  dari tiga tahap yaitu: (1) deproteinasi, (2) deminerali- sasi, dan (3) deasetilasi. Isolasi kitin diawali de- ngan  tahap  deproteinasi  kemudian  dilanjutkan dengan  tahap  demineralisasi,  karena  menurut Johnson  dan  Peniston  (1982)  deproteinasi  yang dilakukan pada tahap awal dapat memaksimum- kan hasil dan mutu protein serta mencegah kon- taminasi protein pada proses demineralisasi.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
A.   Pembuatan Kitosan
Tahap deproteinasi diawali dengan merefluks serbuk  cangkang  rajungan  menggunakan  larutan NaOH  4%  (1:10).  Pada  tahap  ini,  protein  akan terlepas dari serbuk cangkang rajungan dan mem-
bentuk Na-proteinat yang dapat larut dan hilang selama proses pencucian dan penyaringan (Rus- wati, et  al., 2007).  Hal  ini  ditunjukkan  dengan perubahan warna larutan dari jernih menjadi co- klat. Reaksi yang terjadi sebagai berikut:
Protein + NaOH Na proteinat + H 2 O Residu hasil deproteinasi ditambahkan larutan HCl  1  M  dengan  perbandingan  1:15  (w/v).  Tu- juan  tahap  demineralisasi,  yaitu  menghilangkan mineral-mineral  yang  terkandung  dalam  cang- kang  rajungan  ( P. pelagicus ), yaitu  kalsium kar- bonat  [CaCO ]  dan kalsium  fosfat  [Ca (PO ) ] 3
3
4 2 menggunakan   larutan   HCl. Pada tahap ini, ke- tika larutan HCl 1 M direaksikan dengan serbuk cangkang  rajungan  akan  terbentuk  buih  yang yang terkumpul pada permukaan larutan. Setelah kurang  lebih  30  menit  buih  akan  berkurang  dan larutan  berwarna  kuning  keruh.  Terbentuknya buih  tersebut  menandakan  adanya  gas  karbon dioksida (CO ) dan uap air. Hasil  demineralisasi 2 berbentuk  serbuk  berwarna  coklat  tua. Residu yang  dihasilkan  pada  tahap  ini  disebut  kitin. Reaksi yang terjadi selama proses demine- ralisasi sebagai berikut :
CaCO 3  (s) 2 HCl (aq) CaCl 2 (aq) H 2 O (l) CO 2 (g) + + +
Ca 3 (PO 4 ) 2 (s) 4 HCl (aq) 2 CaCl 2 (aq) Ca(H 2 PO 4 ) 2 (aq) + + Tahap  terakhir  adalah  penghilangan  gugus asetil  pada  kitin  yang  disebut  tahap  deasetilasi. Proses deasetilasi diawali dengan merefluks kitin dengan larutan NaOH 40% dengan perbandingan (1:10).  Pada  tahap  ini  digunakan  larutan  NaOH konsentrasi yang cukup tinggi karena bisa meng- optimalisasi  transformasi  gugus  asetil  yang  ber- ikatan  dengan  atom  nitrogen  membentuk  gugus
Tabel 1. Karakterisasi Kitosan No. Karakter Kitosan Persentase 1 Rendemen 39,43% 2 Derajat deasetilasi 83,83% 3 Kadar abu 0,73% 4 Kadar air 4,74% 5 Kadar nitrogen 7,18%
amina.  Perendaman  dengan  larutan  NaOH  kon- sentrasi  tinggi  akan  meningkatkan  derajat  deas- tilasi  dan  mengakibatkan  depolimerisasi  yaitu memutuskan ikatan rangkap antara gugus karbok- sil dengan atom nitrogen (Rochima, et al. , 2007). Hasil  karakterisasi  kitosan  yang  dihasilkan  disa- jikan pada Tabel 1.

## B.   Pembuatan Chitosan Beads
Chitosan bead dibuat dengan proses swelling yaitu  pelarutan  kitosan  serbuk  dalam  larutan asam asetat kemudian diteteskan ke dalam larutan NaOH. Chitosan bead yang dihasilkan berbentuk bola  gel  yang  berwarna  putih  dengan  diameter rata-rata  sebesar  3,55±0,38  mm.  Modifikasi  ki- tosan  serbuk  menjadi chitosan  bead bertujuan untuk  meningkatkan  efektivitas  penggunaan ulang  kitosan  sebagai  matriks  pendukung  dalam proses  imobilisasi,  karena  setelah  akhir  reaksi enzim  lipase  terimobilisasi  pada chitosan  bead lebih  mudah  dipisahkan  dari  produk  daripada enzim  lipase  terimobilisasi  pada  kitosan  serbuk. Proses swelling hanya  mengubah  bentuk  fisik dari  kitosan  sehingga  diharapkan chitosan  bead mempunyai gugus fungsi yang hampir sama de- ngan  kitosan.  Gugus  fungsi chitosan  bead yang hampir sama dengan kitosan memungkinkan ter- bentuknya  interaksi  yang  sama  pula  antara  kito- san  serbuk-enzim  serta chitosan  bead -enzim.

## C.   Imobilisasi Enzim Lipase
Imobilisasi enzim dengan pengikatan silang memiliki beberapakeuntungan yaitu ikatan kova- len yang terbentuk tidak mudah putus akibat ada-
nya  pengaruh  pH,  kekuatan  ion  atau  substrat, dan  stabilitas  enzim  imobil  yang  tinggi.  Efekti- vitas  imobilisasi  bergantung  pada  padatan  pen- dukung  yang  digunakan  dan  teknik  imobilisasi yang dipilih. Teknik imobilisasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah dengan metode peng- ikatan  silang  ( crosslinking )  pada  suatu  padatan pendukung. Padatan pendukung yang digunakan pada  penelitian  ini    adalah chitosan  bead yang diikat  silang  dengan  jembatan  bifungsional  glu- taraldehida.
Enzim  dan  kitosan  susahberikatan  secara  lang- sung  pada  proses  imobilisasi,  oleh  karenaitu  di- perlukan  glutaraldehida  sebagai  jembatan  peng- hubung ( Miao  dan  Swee,  2000).  Glutaraldehida merupakan jembatan bifungsional yang memiliki dua gugus karbonil (-CHO). Pada proses imobi- lisasi  gugus  amina  (-NH ) chitosan  bead akan 2 berikatan  dengan  salah  satu  gugus  -CHO  gluta- raldehida,  demikian  juga  gugus  amina  (-NH ) 2 enzim  akan  berikatan  dengan  gugus  -CHO  glu- taraldehida  pada  ujung  lainnya.  Interaksi  yang terjadi antara gugus karbonil (-CHO) glutaralde- hida  dengan  gugus  amina  (-NH )  baik  pada  en- 2 zim dan chitosan bead yaitu melalui reaksi basa Schiff. Chitosan  bead yang  sudah  diimobilisasi dengan  enzim  lipase  melalui  pengikatan  silang menggunakan  glutaraldehida  warnanya  menjadi kuning dan teksturnya lebih keras atau kaku.
Substrat yang digunakan sebagai bahan baku pembuatan  biodiesel  adalah  minyak  goreng  be- kas. Mutu minyak dapat ditentukan dari beberapa faktor seperti kandungan air, asam lemak, kotor- an dalam minyak, warna, dan bilangan penyabun- an (Ketaren, 1986). Selama proses penggorengan, minyak  goreng  akan  mengalami  perubahan  sifat fisika  dan  kimia.  Minyak  setelah  penggorengan mengalami  beberapa  perubahan  fisika  yaitu  pe- nurunan  titik  cair,  kenaikan  indeks  bias,  warna minyak  menjadi  lebih  gelap,  peningkatan  visko- sitas  dan  berat  jenis  serta  terbentuknya  busa  se- lama  proses  penggorengan.  Perubahan  sifat  ki-
D.   Pemurnian Minyak Goreng Bekas
mia  minyak  yang  terjadi  selama  penggorengan meliputi kenaikan kandungan asam lemak bebas, penurunan  bilangan  iod  dan  kenaikan  bilangan peroksida  yang  berhubungan  dengan  kerusakan flavor.
Minyak goreng bekas sebelum diolah menjadi biodiesel  terlebih  dahulu  dimurnikan  melalui proses despicing ,  netralisasi  dan bleaching .  Pro- ses despicing bertujuan  untuk  menghilangkan bumbu-bumbu  yang  terlarut  dalam  minyak  sete- lah  proses  penggorengan,  sedangkan  netralisasi bertujuan  untuk  mengurangi  asam  lemak  bebas dalam  minyak  goreng  bekas.  Penetralan  adalah suatu  reaksi  antara  asam  dengan  basa,  sehingga menghasilkan suatu senyawa yang netral. Dalam proses  penetralan  sebagai  asamnya  adalah  asam lemak sedangkan sebagai basanya adalah natrium hidroksida  (NaOH). Bleaching (pemucatan)  ber- tujuan  untuk  menguapkan  air,  asam  lemak  de- ngan  berat  molekul  rendah,  aldehid  dan  keton hasil  degradasi  minyak.  Minyak  goreng  bekas yang  awalnya  berwarna  coklat  setelah  dimurni- kan berubah menjadi kuning jernih.
Aktivitas enzim lipase terimobilisasi diuji de- ngan  menggunakan  reaksi  transesterifikasi  mi- nyak kelapa sawit dengan metanol. Hasil reaksi dianalisis  dengan  menggunakan  kromatografi gas (GC). Keberhasilan enzim terimobilisasi da- lam  mengkatalisis  reaksi  transesterifikasi  ditan- dai dengan terbentuknya FAME ( Fatty Acid Me- thyl Ester ). Kromatogram hasil uji GC tunjukkan pada Gambar 1.
E.   Pembuatan Biodiesel
Pada  kromatogram  muncul  puncak-puncak yang  merupakan  metil  ester  yang  dihasilkan  dari reaksi  transesterifikasi.  Metil  ester  yang  muncul pada  waktu  retensi  sekitar  16  menit  digunakan sebagai  acuan  untuk  mengamati  aktivitas  enzim lipase karena memiliki resolusi yang baik dan ben- tuk  puncak  yang  simetris.  Analisis  kuantitatif  di- lakukan dengan menghitung luas area yang diha- silkan.
Pengaruh konsentrasi glutaraldehida yang di-
gunakan pada proses imobilisasi dapat diketahui dari luas area metil ester yang dihasilkan seperti yang ditunjukkan pada Tabel 2.
Tabel 2. Luas Area Metil Ester
No Konsentrasi
Glutaraldehid Puncak ke - Luas Area 1 2% 11 1.167.649 2 1% 5 555.212 3 0,5% 10 377.696 4 0,25% 5 355.903
5 0,125% 5 350.343 (a) (d) (b) (e) (c)
Tabel 2 memperlihatkan bahwa semakin ting- gi konsentrasi glutaraldehida yang digunakan pa- da proses imobilisasi, maka semakin tinggi pula konsentrasi  metil  ester  yang  dihasilkan.  Jumlah metil  ester  yang  dihasilkan  dari  minyak  goreng bekas tidak sebanyak metil ester yang dihasilkan dari minyak goreng baru karena pada minyak go- reng bekas banyak mengandung asam lemak be- bas  dan  air  yang  bisa  menghambat  proses  pem- bentukan  produk  pada  reaksi  transesterifikasi.
1.    Kitosan yang dihasilkan memiliki rendemen sebesar 39,43% dengan derajat deasetilasi sebe- sar 83,83% dengan kadar abu 0,73%, kadar air 4,74% dan kadar nitrogen 7,18%.

## KESIMPULAN
3.    Semakin tinggi konsentrasi glutaraldehida yang digunakan  pada  proses  imobilisasi,  semakin  ting- gi pula konsentrasi metil ester yang dihasilkan.
2.    Chitosan beads yang dihasilkan memiliki dia- meter sebesar 3,55±0,38 mm.
Brena, B. M., dan Batista-Viera F., 2006, Immobilization of En- zymes , di dalam Immobilizationof Enzymes and Cells , Hu- mana Press, Spanyol.

## DAFTAR PUSTAKA
Chibata, I., 1978, Immobilized Enzymes, Research and Develop- ment, Kodansha LTD, Tokyo.
Johnson, E. L, and Peniston, Q. P, 1982, Utilization of Shellfish Waste for Production of Chitin and Chitosan Production , in Chemistry and Biochemistry of Marine Food Product, AVI Publ., Westport Connecticut.
Ketaren, S., 1986, Pengantar Teknologi Minyak danLemak Pa- ngan, UI-Press, Jakarta.
Krajewska, B., 2004, Application of Chitin and Chitosan-Based Materials for Enzyme Immobilizations : a Review, Enz. Mi- crob. Technol. , 35, 126-139.
Miao,  Y.,  and  Swee,  N.  T.,  2000, Amperometric  Hydrogen  Pe- roxide  Biosensor  Based  on  Immobilization  of  Peroxidase in Chitosan Matrix Crosslinked with Glutaraldehide, Analyst, 125, 1591-1594.
No,  H.  K., And  Meyer,  S.P.,  1989, Preparation  of  Chitin  and Chitosan , di dalam Chitin Handbook, Muzzarelli, R. A. A., and Peter, M. G., European Chitin Soc., Grottamare. Rochima, et al ., 2007, Viskositas dan Berat Molekul Kitosan Ha- sil Reaksi Enzimatis Kitin Deasetilasi Isolat, Makalah Na- sional , IPB, Bogor.
Ruswanti, et al ., 2007, Membran Kitosan Padat dari Cangkang Rajungan  ( Portunus  pelagicus )  dan  Aplikasinya  Sebagai Adsorben Ion Mangan(II) dan Besi(II), Jurnal , Universitas Diponegoro, Semarang.
Siswani, E. D., Kristianingrum, S., dan Suwardi, 2012, Sintesis dan Karakterisasi Biodiesel dari  Minyak Jelantah pada Ber- bagai  Waktu Dan Suhu, Prosiding Seminar Nasional Pene- litian,  Pendidikan  dan  Penerapan  MIPA,  Fakultas  MIPA, Universitas Negeri Yogyakarta, 2 Juni 2006, K-103-K-112.6
Gambar 1. Konsentrasi glutaraldehid : (a) 2%, (b) 1%, (c) 0,5%, (d) 0,25%, (e) 0,125%