ISSN: 1693-8615     EISSN : 2302-4291
Online : http://farmasiindonesia.setiabudi.ac.id/
Identifikasi Steviosida pada Kalus Daun Stevia yang Ditumbuhkan dengan 2,4-D dan Kinetin
Identification of Stevioside on Stevia Leaf Callus Grown by 2,4-D and Kinetin

## KARTINAH WIRYOSOENDJOYO*, SUPRIYADI
Fakultas Farmasi, Universitas Setia Budi Jln. Letjen Sutoyo-Mojosongo Surakarta-57127 Telp. 0271-852518 * Korespondensi: kartinahws@yahoo.com
(Diterima 17 Januari 2014, disetujui 17 Februari 2014)
____________________________________________________________________________________________

## ABSTRAK
Tanaman  Stevia  dipanen  daunnya  karena  terasa  manis.  Rasa  manis  daun  Stevia  karena mengandung steviosida, rebaudiosida dan dulkosida. Keunggulan steviosida dan rebaudiosida adalah rendah  kalori,  tidak  dapat  difermentasi  oleh  bakteri  dalam  mulut  serta  bersifat  nonkarsinogenik. Keunggulan  ini  menyebabkan  steviosida  dapat  digunakan  sebagai  pengganti  gula,  khususnya  bagi penderita  diabetes  mellitus;  penderita  obesitas  dan  untuk  pemanis  pasta  gigi. Tujuan  penelitian  ini adalah  untuk  mendapatkan  medium  tanam  eksplan  daun  Stevia  yang  mampu  menghasilkan  kadar steviosid  paling  tinggi.  Eksplan  berasal  dari  tanaman  Stevia  yang  tumbuh  di  Surakarta.  Medium tumbuh yang digunakan adalah medium New Phaleonopsis (NP) ditambah zat pengatur tumbuh (zpt) kombinasi 2,4-dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D) dan Furfuril Amino Purin (kinetin), masing-masing dengan kadar kinetin 1 ppm; 2,4-D 0,25 ppm dan kinetin 0,75 ppm; 2,4-D 0,5 ppm dan kinetin 0,5 ppm;  2,4-D  0,75  ppm  dan  kinetin  0,25  ppm  dan  2,4-D  1  ppm.  Kalus  dimaserasi  dengan n-butanol, diteruskan analisis dengan KLT densitometri. Kadar steviosida dalam kalus dibandingkan dengan kadar steviosid  pada  tanaman  asal.  Kadar  steviosida tertinggi  didapatkan  pada  kalus  yang  tumbuh  pada medium  NP  ditambah  1  ppm kinetin,  yaitu  sebesar  10,625  ppm.  Kadar  steviosida  lebih  tinggi  dari tanaman asal. Kadar steviosida pada daun Stevia 0,65 ppm.
Kata kunci : steviosida, kalus, daun Stevia.
________________________________________________________________________________

## ABSTRACT
Stevia  leaves  are  harvested  because  of their  sweetness. This  special  characteristic  is  contributed by steviosida, rebaudiosida and dulkosida. Steviosida and rebaudiosida are low calorie, not able to be fermented by bacteria in the mouth and non carcinogenic. These superiorities make steviosida able to act as sugar subtitute, especially for diabetics; obese and as sweetener for toothpaste. The aim of this research was to find planting medium of Stevia leaf explants which is capable of producing the highest level  of  stevioside.  The  explants were  grown  in Surakarta.  The  medium  was New  Phaleonopsis  (NP) within the addition of growth regulator substance, the combination of 2,4 Dichlorophenoxyacetic Acid (2.4-D), and Furfuril Amino Purin (kinetin) each by kinetin 1 ppm; 2,4-D 0.25 ppm and kinetin 0,75 ppm; 2,4-D 0,5 ppm as well as kinetin 0,5 ppm; 2,4-D 0,75 ppm and kinetin 0,25 ppm  2,4-D 1 ppm. Callus levels were macerated by n-butanol, then were analyzed by TLC densitometry. Stevioside levels in  callus were  compared  with the  steviosid levels  in  the  original  plants. The  highest  stevioside level was found in  the  callus  grown  in NP medium  by  adding  1  ppm  kinetin,  amounting to  10,625  ppm. The steviosid level was higher than the original plants. Stevioside level in Stevia leaf was 0,65 ppm.
Keywords : stevioside, callus, Stevia leaves.
________________________________________________________________________________

## PENDAHULUAN
Tanaman Stevia atau Stevia
rebaudiana Bertonii  M.  atau  Eupatorium rebaudianum L.  termasuk  tanaman  perdu yang  tumbuh  pada  tempat  dengan ketinggian 500-1000 m di atas permukaan laut. Bila tumbuh di dataran rendah Stevia akan  cepat  berbunga  dan  mudah  mati apabila  sering  dipanen.  Suhu  yang  cocok untuk pertumbuhannya berkisar antara 14- 27 0 C  dan  cukup  mendapat  sinar  matahari sepanjang  hari.  Perkembangbiakan  Stevia dilakukan  dengan  mengecambahkan  biji, stek  batang,  pemisahan  rumpun  ataupun dengan kultur jaringan.
Bagian tanaman
Stevia yang
digunakan  sebagai  pemanis  adalah  daun. Daun  stevia  dapat  langsung  digunakan sebagai pemanis, dengan cara dikeringkan. Proses  pengeringan  tidak  memerlukan suhu tinggi.
Keunggulan  Stevia  antara  lain  tingkat kemanisannya  mencapai  200-300  kali kemanisan  tebu  serta  rendah  kalori sehingga aman dikonsumsi oleh  penderita diabetes  dan  obesitas.  Selain  itu,  Stevia juga bersifat non-karsinogenik. Zat pemanis dalam Stevia yaitu steviosida dan rebaudiosida,  senyawa  ini  tidak  dapat difermentasikan  oleh  bakteri  di  dalam mulut  menjadi  asam.  Asam  ini  yang apabila  menempel  pada  email  gigi  dapat menyebabkan gigi berlubang. Oleh karena itu,  stevia  tidak  menyebabkan  gangguan pada gigi (Anonim 1 ).
Daun  Stevia  mengandung  tiga  jenis glikosida  yaitu  steviosida,  rebausida  dan dulkosida,  yang  ketiganya  terikat  pada karbohidrat,  seperti  rhamnosa,  fruktosa dan  glukosa,  silosa,  arabinosa.  Senyawa lain  yang  terdapat  dalam  daun  Stevia adalah  sterol,  tannin  dan  karotenoid. Selain  itu  daun  Stevia  mengandung protein, serat, fosfor, besi, kalsium, kalium,
natrium, magnesium, rutin (flavonoid), zat besi, zink, vitamin C dan vitamin A. Tubuh manusia  tidak  dapat  memetabolisme steviosida,  oleh  karena  itu  steviosida dibuang  dari  tubuh  tanpa  penyerapan kalori.
Keuntungan  Stevia  sebagai  pemanis yaitu  tidak  berkalori  sehingga  tidak menaikan  kadar  gula darah  dan  tidak memungkinkan  pertumbuhan  bakteri  dan ragi  pada  pangan,  stabil  terhadap  panas hingga  suhu  200 0 C,  berfungsi  sebagai
penguat rasa, memperlambat
pembentukan  plak  dari  karies  gigi  dan tidak toksik, serta merupakan bahan alami dan bukan pemanis buatan (Anonim 2 ).
Stevia rebaudiana Bertonii M.
mempunyai  habitus  semak,  semusim, tinggi  tanaman  30  – 90  cm;  batang  bulat, berbuku,  beruas,  bercabang,  hijau;  daun tunggal,  berhadapan,  bulat  telur,  ujung tumpul,  pangkal  runcing,  tepi  rata, panjang  2  – 4  cm,  lebar  1  – 5  cm, pertulangan  daun  menyirip,  berbulu, tangkai  pendek,  hijau.  Bunga  majemuk, bentuk malai, di ujung dan di ketiak daun, bentuk  terompet,  kelopak  bentuk  tabung, berbulu, berbagi  5, hijau,  tangkai benangsari  dan  tangkai  putik  pendek, kepalasari  kuning,  putik  bentuk  silindris, putih.  Buah  kotak,  berambut,  coklat. Akartunggang, putih kotor. Daun berkhasiat  sebagai  obat  kencing  manis. Tanaman ini termasuk divisio Spermatophyta, sub divisio Angiospermae, classis Dicotyledoneae, familia Compositae, genus Stevia (Anonim 2 ). Pemanenan Stevia harus harus memperhatikan adalah faktor keamanannya. Jangan menggunakan
Stevia  secara  langsung  apabila  daun terpapar  pestisida  atau  bahan  kimia  lain yang  berbahaya  bagi  kesehatan  (Anonim
1 ).
Kultur  jaringan  dilakukan  dengan mengambil bagian kecil tanaman (eksplan),  umumnya  potongan  organ, disterilkan  sehingga  bebas  mikrobia, kemudian  ditanam  pada  medium  yang sesuai. Setiap sel memiliki potensi genetik untuk  menghasilkan  organisme  lengkap, atau dikatakan bahwa sel mempunyai sifat totipotensi (Zulkarnaen 2009).
Keberhasilan  pertumbuhan  eksplan sangat ditentukan pada pemilihan medium pertumbuhan,  karena  eksplan  bersifat heterotrof.
Medium pertumbuhan
mengandung  unsur-unsur  makro,  unsur- unsur  mikro  dan  unsur-unsur lain  yang dibutuhkan untuk pertumbuhan sel tanaman.  Penggunaan  medium  tertentu umumnya  berdasarkan  jenis  eksplan  yang ditanam. Eksplan tanaman tertentu membutuhkan medium
tertentu.
Kemampuan eksplan tumbuh pada medium  diketahui  dari  penelitian  yang telah dilakukan (Kartinah 2009).
Medium Murashige Skoog (MS) termasuk  medium  yang  paling  banyak digunakan, terutama untuk tanaman herba, karena  tingkat  keberhasilan  pertumbuhan eksplan  tinggi.  Medium  ini  mempunyai konsentrasi  garam-garam  mineral  yang tinggi,  dan  senyawa  N  dalam  bentuk amonium  dan  nitrat,  sehingga  medium  ini paling banyak digunakan untuk kultur kalus dan tunas (George & Sherrington 1984).
Eksplan  daun  Stevia  tumbuh  baik pada  medium  MS.  Penanaman  eksplan daun Stevia pada medium New Phaleonopsis  (NP)  ternyata  juga  berhasil tumbuh  membentuk  kalus  dengan  baik, bahkan  dalam  waktu  yang  lebih  cepat. Masing-masing medium diberi zat pengatur  tumbuh  (zpt)  Benzyl  Amino Purin (BAP) dan 2,4- Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D)
masing-masing  0,5  ppm.  Medium  NP cocok  untuk  pertumbuhan  eksplan  daun
Stevia,  sehingga    dari  penelitian  diketahui bahwa medium NP dapat digunakan untuk budidaya jaringan daun Stevia.
Deteksi adanya steviosida dalam kalus daun  stevia  dapat  dilakukan  dengan Kromatografi
Lapis
tipis (KLT), menggunakan  fase  diam  Silika  gel  60  F 254
dan  fase  gerak  butanol  : asam  asetat  : air (6:2:1) dengan Lieberman Burchard sehingga bercak steviosida dapat memisah dengan baik (Wagner 1996).

## METODE PENELITIAN

## Bahan
Tanaman  Stevia  diperoleh  dari  petani Stevia  di daerah  Tawangmangu.  Di Surakarta,  tanaman  dipangkas,  sehingga tumbuh  tunas-tunas  baru.  Eksplan  diambil dari daun yang berasal dari tunas muda.
Medium  yang  digunakan  adalah medium  New  Phaleonopsis  (NP).  Zat pengatur    tumbuh  yang  digunakan  adalah 2,4-D dan kinetin dengan konsentrasi 2,4- D  1  ppm;  2,4-D  0,25  ppm  dan  kinetin 0,75 ppm; 2,4-D 0,5 ppm dan kinetin 0,5 ppm;  2,4-D  0,75  ppm  dan  kinetin  0,25 ppm; kinetin 1 ppm.
Sterilisasi  eksplan  dengan  larutan NaOCl,  kemudian  dicuci  aquadest  steril. Perlakuan  sterilisasi  dilanjutkan  dengan larutan  alkohol  70  %  selama  1  - 2  menit. Sterilan  dihilangkan  dengan  pembilasan aquadest steril sebanyak 3 kali.
Bahan  kimia  untuk  uji  steviosida, n-butanol,  alkohol  96%,  alkohol  70%, kloroform,  pereaksi  Lieberman  Burchard, standard steviosida.

## Alat
Alat-alat yang digunakan untuk penelitian  ini  adalah  otoklaf  untuk sterilisasi  media  dan  aquadest,  entkas untuk  menanam  eksplan  dan  sub  kultur kalus;  inkubator  yang  dilengkapi  dengan penerangan lampu TL; timbangan electrik;
lemari  pendingin  untuk  menyimpan persenyawaan  yang  tidak  tahan  disimpan pada  suhu  kamar;  oven  untuk  sterilisasi pinset,  skalpel,  cawan  Petri  dan  botol- botol  medium  bertutup  karet;  gunting, kertas  Aluminium  Foil;  labu  takar;  pipet tetes;  pengaduk kaca;  lampu  spirtus;  pH stick;  chamber,  lempeng  Kromatografi Lapis  Tipis;  Densitometer,  kertas  saring, corong  gelas,  gelas  ukur,  lempeng  Silica gel  60  F 254 ,  mikropipet  untuk  penotolan cuplikan, penyemprot, oven binder.

## Pengambilan Bahan Tanam (Eksplan)
Daun  Stevia  yang  digunakan  untuk eksplan  berasal  dari  tunas-tunas  muda tanaman  Stevia  yang  sudah  beradaptasi tumbuh  di  Surakarta.  Bagian  yang digunakan  sebagai  eksplan  adalah  helaian daun yang masih muda.

## Penyiapan Medium Tanam
Medium  tanam  yang  digunakan adalah  medium  New  Phaleonopsis  (NP). Komposisi  Medium  NP  (mg/l)  adalah NH 4 NO 3 32;  (NH 4 ) 2 SO 4 303,9  ;  KNO 3 424,6; MgNO 3 .6H 2 O 256,4;
Ca(NO 3 ).4H2O  637,6;  KH 2 PO 4 462,7; Na 2 EDTA 37,3; FeSO 4 .7H 2 O 27,8; MnSO 4 .H 2 O  22,3  ;  ZnSO4.4H 2 O  8,6; H 3 BO 3 6,2 ; KI 0,83 ; NaMoO 4 .2H 2 O 0,25
; CuSO 4 .5H 2 O 0,025; CoCl 2 .6H 2 O 0,025 ; Glisin  2  ;  nicotinic  acid  0,5  ;  pyridoxin- HCl  0,5  ;  thiamin-HCl  0,1  ;  myoinositol 100 ; Agar 8.000 – 10.000 ; pH 5,7 – 5,8. Zpt  yang  ditambahkan  adalah  2,4-D  dan kinetin.
Disiapkan  bahan-bahan  penyusun medium  NP.  Unsur  makro  ditimbang.
Unsur mikro diberi
perlakuan pengenceran  100  mg/100  ml  atau  10 mg/100 ml. Unsur-unsur makro dan unsur- unsur  mikro  dilarutkan  dengan  aquadest, ditambah  zat  pengatur  tumbuh  (zpt) kombinasi    2,4-D  dan  kinetin  masing- masing  konsentrasi  kinatin  1  ppm
(medium  1);  2,4-D  0,25  ppm  dan  kinetin 0,75 ppm (medium 2); 2,4-D 0,5 ppm dan kinetin  0,5  ppm  (medium  3);  2,4-D  0,75 ppm  dan  kinetin  0,25  ppm  (medium  4); kinetin  1  ppm  (medium  5).  Semua  bahan dicampur,  dilarutkan,  dituang  ke  botol- botol  medium,  kemudian  disterilkan dengan  otoklaf  suhu  1210C  selama  30 menit.  Uji  sterilitas  medium  dilakukan dengan  inkubasi  medium  pada  suhu inkubator selama 5 – 7 hari. Medium yang steril digunakan untuk penanaman eksplan daun Stevia.

## Sterilisasi dan Penanaman Eksplan
Sterilisasi  eksplan  daun  muda  Stevia dilakukan  dengan  larutan  NaOCl  2,5% selama 10 – 15 menit, dilanjutkan dengan larutan  NaOCl  1,25%  selama  10  – 15 menit,  dicuci  aquadest  steril,  dilanjutkan dengan larutan alkohol 70 % selama 1 - 2 menit,  kemudian  dibilas  aquadest  steril tiga  kali. Eksplan  dipotong  secara  aseptis dengan  menggunakan  scalpel  disposable. Potongan eksplan steril dimasukkan dalam medium tumbuh dengan pinset steril.

## Analisisa Kadar Steviosida
Analisis  steviosida  pada  kalus  daun Stevia  dilakukan  secara  kualitatif  dan kuantitatif. Analisis secara kualitatif dengan Kromatografi  Lapis  Tipis  dengan  cara membandingkan larutan standar steviosida dan sampel dari kalus daun Stevia. Analisis secara kuantitatif (penetapan kadar) dilakukan  secara  KLT  – densitometri, dengan  cara  membandingkan  luas  area bercak  dari  sampel  dengan  luas  area standard  steviosida.  Pengukuran  kadar steviosida  juga  dilakukan  terhadap  daun Stevia  yang  ditanam  di  Solo  (sebagai kontrol).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Kultur Jaringan Daun Stevia
Eksplan  mampu  tumbuh  membentuk kalus bila terdapat hormon atau zpt auksin dan  kinetin  (George &  Sherrington 1984). Ternyata  eksplan  daun  Stevia  mampu tumbuh  dengan  baik  pada  medium  New Phaleonopsis (NP) ditambah zpt 2,4-D dan kinetin.  Pertumbuhan  kalus  umumnya terjadi  minggu  ke  dua  sampai  minggu  ke enam  setelah  penanaman  eksplan.  Pada medium  NP  ditambah  2,4-D  saja  (1  ppm) tampak eksplan tumbuh membentuk kalus. Hal  ini  disebabkan  2,4-D  termasuk kelompok  zpt  auksin  yang  mampu menghasilkan  kalus  dengan  baik,  dan kemungkinan  di  dalam  eksplan  sudah terdapat  hormon  sitokinin.  Pada  medium NP ditambah kinetin saja (1 ppm), eksplan segera  tumbuh  membentuk  kalus,  bila tidak  segera  dilakukan  sub  kultur  akan segera terbentuk planlet; hal ini menunjukkan bahwa dalam eksplan sudah terdapat hormon auxin yang cukup tinggi, sehingga dengan penambahan zpt golongan  sitokinin  saja  eksplan  sudah mampu  menghasilkan  kalus  dan  segera membentuk planlet, tetapi tanpa pembentukan akar.
Eksplan  yang  ditumbuhkan  pada medium  NP  ditambah  2,4-D  saja  ternyata mampu  tumbuh  membentuk  kalus  saja. Hal  ini  disebabkan  2,4-D  merupakan auksin  yang  sangat  baik  untuk  memacu pertumbuhan kalus. Kemungkinan eksplan juga  mengandung  hormon  sitokinin. Akibatnya  kalus  tumbuh  baik,  hal  ini sesuai  pendapat  George  &  Sherrington (1984). Kalus tumbuh pada minggu ke dua sampai minggu ke enam.
Kalus  yang  tumbuh  dipotong  secara aseptis,  kemudian  dipindah  pada  medium baru/segar  (sub kultur) dengan kandungan nutrisi yang sama, dan diinkubasi kembali.
Tujuan  perlakuan  sub  kultur  adalah  untuk menambah suplai medium sehingga dapat terjadi pertumbuhan kalus. Kalus dibutuhkan  dalam  jumlah  cukup  untuk analisa  kadar  steviosida  secara  kualitatif dan kuantitatif.
Pertumbuhan  eksplan  pada  medium NP  ditambah  2,4-D  dan  kinetin  dengan kombinasi  2,4-D  0,25  ppm  dan  kinetin 0,75  ppm  serta  2,4-D  0,75  ppm  dan kinetin 0,25 ppm menunjukkan pertumbuhan  kalus  yang  baik,  tanpa disertai  pembentukan  planlet.  Eksplan yang  ditanam  pada  medium  NP  ditambah zpt 2,4-D 0,5 ppm dan kinetin menunjukkan  pertumbuhan  kalus  yang baik,  tetapi  keterlambatan  sub  kultur menyebabkan  terjadinya  pertumbuhan planlet.  Kemungkinan  hal  ini  terjadi karena  kebutuhan  zpt  seimbang  mampu memacu pembentukan planlet.

## Analisa Steviosida pada Kalus
Analisis  steviosida  secara  kualitatif dengan  Kromatografi  Lapis  Tipis  dengan cara  membandingkan  larutan  standar steviosida  dan  sampel  dari  kalus  daun Stevia.  Ternyata  bercak/noda  dari  kalus daun  Stevia  sama  dengan  standard steviosida.  Dengan  demikian  diketahui bahwa sampel kalus daun Stevia mengandung steviosida.
Analisis  steviosida  secara  kuantitatif dilakukan  secara  KLT  – densitometri, dengan  cara  membandingkan  luas  area bercak  dari  sampel  dengan  luas  area standard steviosida. Diperoleh kadar stevia dalam  sampel  kalus  daun  Stevia  daun Stevia  yang  ditanam  di  Solo  (sebagai kontrol) pada Tabel 1 dan Gambar 1.
Tabel 1. Kadar steviosida dalam kalus daun stevia dan daun stevia Bahan Kadar steviosida (ppm) Kalus pada kombinasi 2,4 D : kinetin (0:1) 10,625 Kalus pada kombinasi 2,4 D : kinetin (0,25:0,75) 1,390 Kalus pada kombinasi 2,4 D : kinetin (0,5:0,5) 0,946 Kalus pada kombinasi 2,4 D : kinetin (0,75:0,25) 0,815 Kalus pada kombinasi 2,4 D : kinetin (1:0) 2,245 Daun stevia 0,660
Gambar 1. Kadar steviosida pada kalus Stevia dan daun Stevia.
Pemeriksaan  kadar  steviosida  pada medium  NP  ditambah  2,4-D  dan  kinetin menunjukkan kadar steviosida lebih tinggi dari  kandungan  tanaman  asal.  Mungkin hal  ini  terjadi  karena  glukosa  yang berfungsi  sebagai  sumber  energi  tidak sepenuhnya digunakan untuk pembelahan sel-sel kalus, sehingga terjadi pembentukan senyawa steviosida. Uji  beda  kadar  steviosida  antara berbagai  formula  dalam  medium  NP ditambah 2,4 D dan kinetin
menyimpulkan  ada  beda  kadar  steviosida yang signifikan. Formula 2,4 D dan kinetin
(0:1) mempunyai  kadar  steviosida  paling tinggi secara signifikan.

## KESIMPULAN
Medium  New  Phaleonopsis  ditambah 2,4-D  dan  kinetin  mampu  menumbuhkan kalus  dan  atau  planlet  pada  eksplan  daun Stevia.  Kandungan  steviosida  pada  kalus yang tumbuh pada medium NP 2,4-D dan kinetin  lebih  tinggi  dari  tanaman  Stevia yang  tumbuh  di  Solo. Kalus  yang  tumbuh pada medium NP ditambah kinetin 1 ppm mengandung  steviosida  paling  tinggi.

## DAFTAR PUSTAKA
Anonim 1 .  Mengenal Stevia (Sweat Honey Leaf)
sebagai Pemanis. http://www.florabiz.net/flora/mengenal- stevia-sweat-honey-leaf-sebagai-sumber- pemanis.html Sumber:
ditjenbun.
deptan.go.id. Diakses 15 Maret 2012. Anonim 2 . Daftar  Komoditi  Binaan  Direktorat
Jenderal Perkebunan.Berdasarkan Keputusan  Menteri  Pertanian.  Nomor 511/KPTS/PD.310/9/2006. http://ditjenbun.deptan.go.id/web.old/ima ges/stories/fruit/komoditi%20binaan%20d itjenbun-8.pdf. Diakses 12 Maret 2012.
George & Sherrington. 1984. Plant Propagation by  Tissue  Culture,  Handbook  and Directory  of  Commercial  Laboratories. Exegetic Limited. England.
Kartinah  W. 2009. Short  Cut  Penanaman Explant  Daun  Stevia  Pada  Medium  New Phaleonopsis. Biomedika.  Jurnal  Ilmiah Biologi dan Kesehatan. 2(2): 51-55.
Wagner H, Bladt S. 1996: Plant Drug Analysis A  Thin  Layer  Chromatography  Atlas. 2 nd ed. Springer-Germann.
Zulkarnaen. 2009. Kultur  Jaringan  Tanaman. Cetakan  pertama. Yogyakarta:  Bumi
Aksara.