Identifikasi Pengaruh Proses Perebusan dan Penggorengan Kacang Tolo ( Vigna unguiculata L. Walp.) terhadap Komposisi Fitosterol
Noor  Erma  Nasution  Sugijanto 1 *,  Citra  Hayu  Adi  Makayasa 2 ,  Gita  Deseria 1 ,  Rahmania  Alrika  Ilma  Bridgeta 1 , Miftakhul Rohmah Putri 1 , Catur Dian Setiawan 3 , Sugijanto 1
1 Departemen Kimia Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Airlangga, Surabaya, Indonesia
2 Magister Ilmu Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Airlangga, Surabaya, Indonesia
3 Departemen Farmasi Komunitas, Fakultas Farmasi, Universitas Airlangga, Surabaya, Indonesia
*Corresponding author: noor-e-n@ff.unair.ac.id
Submitted: 10 Januari 2020 Accepted: 10 Februari 2020 Published: 25 Juni 2020

## Abstract
Background :  Cowpea  (Vigna  unguiculata  L.  Walp.)  is  a  multipurpose  legume  which  has  hypocholesterolemic effect.  It  contains  high  protein  also  low  fat  and  is  usually  consumed  as  food form  by  boiling  and frying  them. Objective : This  study aims to  investigate  the phytosterol  composition  on boiling  and frying  process in  cowpea also to investigate boiling and frying process effects of cowpea on phytosterol composition. Methods : All of the samples were obtained from markets X, Y, and Z, East Java. Each sample was extracted with n-hexane, acetone, and  chloroform  then  analysed  by  Thin  Layer  Chromatography  (TLC),  Attenuated  Total  Reflection-Fourier Transform  Infrared  (ATR-FTIR),  Gas  Chromatography-Flame  Ionization  Detector  (GC-FID),  and  Gas Chromatography-Mass  Selective  Detector  (GC-MSD). Results :  The  TLC  and  ATR-FTIR  analysis  showed  the phytosterol content in cowpea. GC-FID showed that cholesterol, campesterol, stigmasterol, and sitosterol  were identified in  raw and boiled from three markets whilst  in fried cowpea from one of the markets only contained stigmasterol  and  sitosterol.  GC-MSD  showed  cholesterol,  campesterol,  stigmasterol,  and  sitosterol  were identified  in  raw,  boiled,  and  fried  cowpea. Conclusion :  Raw,  boiled,  and  fried  cowpea  contained  the phytosterol  composition,  such  as  cholesterol,  campesterol,  stigmasterol,  and  sitosterol.  Boiling  and  frying process of cowpea could affect the phytosterol composition.
Keywords : Vigna unguiculata L. Walp., cowpea, phytosterol, boiling, frying

## Abstrak
Pendahuluan :  Kacang  tolo  ( Vigna  unguiculata L.  Walp.)  merupakan  polong-polongan  multiguna  dapat berfungsi  sebagai  hipokolesterolemik.  Kacang  tersebut  mengandung  protein  tinggi  dan  rendah  lemak,  sebagai bahan  makanan  dikonsumsi  dengan  cara  direbus  maupun  digoreng. Tujuan :  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengidentifikasi  komposisi  fitosterol  pada  kacang  tolo  yang  mentah,  direbus,  dan  digoreng  serta mengidentifikasi  pengaruh  proses  perebusan  dan  penggorengan  kacang  tolo  terhadap  komposisi  fitosterol. Metode : Seluruh sampel diperoleh dari Pasar X, Y, dan Z, area Jawa Timur. Masing-masing sampel diekstraksi dengan n -heksana,  aseton,  dan  kloroform  kemudian  dianalisis  dengan  Kromatografi  Lapis  Tipis  (KLT), Attenuated  Total  Reflection-Fourier  Transform  Infrared (ATR-FTIR),  Kromatografi  Gas -Flame  Ionization Detector (KG-FID), dan Kromatografi Gas -Mass Selective Detector (KG-MSD). Hasil : Analisis KLT dan ATR- FTIR  menunjukkan  adanya  kandungan  fitosterol  pada  kacang  tolo.  Analisis  dengan  KG-FID  menunjukkan adanya kolesterol, kampesterol, stigmasterol, dan sitosterol pada kacang tolo mentah dan direbus dari Pasar X, Y, dan  Z  sedangkan  kacang  tolo  yang  digoreng  dari  Pasar  X  hanya  mengandung  stigmasterol  dan  sitosterol.  KG- MSD  menunjukkan  adanya  kolesterol,  kampesterol,  stigmasterol,  dan  sitosterol  pada  kacang  tolo  mentah, direbus, dan digoreng. Kesimpulan : Kacang tolo mentah, direbus, dan digoreng dapat diidentifikasi adanya ke-
empat  fitosterol,  yaitu  kolesterol,  kampesterol,  stigmasterol,  dan  β-sitosterol.  Proses  perebusan  dan penggorengan kacang tolo berpengaruh terhadap komposisi fitosterol.
Kata kunci : Vigna unguiculata L. Walp., kacang tolo, fitosterol, perebusan, penggorengan

## PENDAHULUAN
Penyakit  Jantung  Koroner  (PJK)  merupakan penyebab  utama  kematian  di  seluruh  dunia,  terhitung sebesar  31,4%  kematian  terjadi  pada  tahun  2012 (Wadhera  dkk.,  2016).  Data  riset  kesehatan  dasar (Riskesdas)  2018  menunjukkan  prevalensi  PJK  di Indonesia berdasarkan diagnosis dokter pada penduduk semua  umur  sebesar  1,5%  (Badan  Litbangkes,  2018). Penyakit  ini  disebabkan  oleh  penyempitan  dinding arteri  koronaria  akibat  pembentukan  plak  lemak, sehingga  menurunkan  aliran  darah  di  pembuluh  darah (Setyaji  dkk.,  2018).  Tingginya  kadar  kolesterol  atau disebut juga hiperkolesterolemia merupakan salah satu pemicu terjadinya PJK. Umumnya kondisi hiperkolesterolemia  lebih  besar  terjadi  pada  wanita (14,5%) dibandingkan pria (8,6%) (Aurora dkk., 2012).
Salah  satu  faktor  penting  untuk  menjaga  kadar kolesterol  di  dalam  tubuh  agar  tidak  melebihi  batas normal  adalah  jenis  makanan.  Pada  beberapa  buah, sayur,  gandum,  dan  kacang-kacangan  telah  dilaporkan dapat  membantu  menurunkan  kadar  kolesterol  karena mengandung fitosterol dan serat larut air ( soluble fiber ) (Ilmi  dkk.,  2015;  Rahman  &  Probosari,  2014). Fitosterol  merupakan  metabolit  struktural  di  membran sel  tanaman  dan  memiliki  struktur  menyerupai kolesterol.  Di  dalam  tubuh  fitosterol  dan  kolesterol saling bersaing menempati site -aktif enzim pengangkut kolesterol,  menyebabkan  terjadinya  pengurangan jumlah  kolesterol  yang  terserap,  sehingga  kadarnya  di dalam tubuh akan menurun (Talreja dkk., 2017).
Fitosterol  dapat  ditemukan  pada  berbagai  spesies tanaman  diketahui  berjumlah  lebih  dari  200  jenis sterol.  β-sitosterol,  kampesterol,  dan  stigmasterol merupakan  jenis  sterol  paling  dominan  terdapat  di dalam tanaman (Nestola & Schmidt, 2016). Kandungan sterol  total  pada  kacang-kacangan,  diantaranya pistachio (276  mg/100  g), almond (183  mg/100  g), hazelnut (138  mg/100  g), walnut (127  mg/100 g), dan kacang  tanah  (104  mg/100  g)  (Marangoni  &  Poli, 2010).  Di  sisi  lain,  Indonesia  dikenal  sebagai  negara kaya  akan  biodiversitasnya,  khususnya  plasma  nutfah hayati dalam  hal  ini kacang-kacangan, salah satu jenis kacang  yang  belum  banyak  dilaporkan  kandungan fitosterolnya adalah kacang tolo.
Kacang  tolo  ( Vigna  unguiculata L.  Walp.) merupakan  jenis kacang dengan  famili Leguminoceae, mengandung komponen bioaktif, yaitu senyawa fenolik berperan  sebagai  antioksidan  untuk  melindungi  tubuh terhadap  berbagai  macam  penyakit  (Gonçalves  dkk., 2016).  Kacang  ini  berpotensi  sebagai  penurun  kadar kolesterol  dan  kadar  glukosa  di  dalam  darah  (Kumar dkk.,  2013).  Di  Indonesia,  produktivitas  kacang  ini cukup  tinggi  dan  pemanfaatannya  biasanya  diolah dengan  cara  direbus  untuk  dijadikan  sayur  atau digoreng.  Proses  perebusan  dilakukan  dalam  air mendidih  suhu  100 o C  selama  30  menit,  sedangkan proses  penggorengan  dengan  minyak  goreng  suhu 190 o C selama 5 menit (Dovlo dkk., 1976; Mulyatiningsih, 2007).
Penggunaan  panas  dalam  proses  pemasakan, seperti perebusan dan penggorengan dapat mempengaruhi  nilai  gizi  bahan  pangan,  salah  satunya fitosterol  (Sundari  dkk.,  2015).  Fitosterol  tidak  akan mengalami  perubahan  jika  diolah  pada  suhu  lebih rendah  dari  100 o C,  namun  apabila  dipanaskan  pada suhu melebihi 200 o C, maka lebih dari 50% sterol akan mengalami  perubahan  (Thanh  dkk.,  2006).  Telah dipublikasikan,  hasil  penelitian  di  dalam  kacang  tanah direbus  kadar  sterolnya  lebih  tinggi  dua  hingga  tiga kali  dari  kacang  tanah  mentah  (Chen  dkk.,  2009). Peningkatan  sterol  ini  dapat  terjadi  karena  kehilangan karbohidrat,  protein  atau  mineral  di  dalam  sel  kacang tersebut  (Normén  dkk.,  1999).  Penurunan  sterol  dapat terjadi  pada  sampel  yang  digoreng  dan  pada  suhu 150 o C  (Normén  dkk.,  1999;  Thanh  dkk.,  2006). Kehilangan  beberapa  sterol  dapat  terjadi,  diakibatkan oleh  pemecahan  sel  dan  jaringan  tanaman  (Normén dkk., 1999).
Tahap  awal  identifikasi  sterol  dapat  digunakan Kromatografi  Lapis  Tipis  (KLT)  dengan  pereaksi penampak  noda  tertentu  untuk  mengetahui  kandungan steroid  di  dalam  sampel  (Indrayanto  dkk.,  1994). Metode Attenuated Total Reflection-Fourier Transform Infrared (ATR-FTIR)  juga  dapat  digunakan  untuk melihat  persentase  kemiripan  suatu  senyawa  dengan mengkorelasi  sampel  dengan  standar  (Sulistyani, 2018). Metode analisis lain umumnya digunakan untuk mengidentifikasi  fitosterol  baik  kualitatif  maupun
kuantitatif  adalah  Kromatografi  Gas- Flame  Ionization Detector (KG-FID)  (Inchingolo  dkk.,  2014).  Metode ini  memiliki  resolusi  yang  baik,  keterulangan, reprodusibilitas,  presisi  serta  akurasi  tinggi  (Al- Bukhaiti  dkk.,  2017).  Metode  lainnya,  seperti Kromatografi Gas- Mass Selective Detector (KG-MSD) dapat  digunakan  untuk  mengidentifikasi  kemurnian puncak ( peak ) sterol (Inchingolo dkk., 2014). Mengkaji hal-hal  tersebut  di  atas,  penelitian  ini  bertujuan  untuk mengidentifikasi komposisi fitosterol pada kacang tolo mentah,  direbus,  dan  digoreng  serta  mengidentifikasi pengaruh  proses  perebusan  dan  penggorengan  kacang tolo terhadap komposisi  fitosterol. Dalam  hal  ini  tidak dilakukan  analisis  perbedaan  lokasi  pengambilan sampel  kacang  tolo  dari  Pasar  X,  Y,  dan  Z  terhadap komposisi fitosterol.

## BAHAN DAN METODE Bahan
Standar  kolesterol,  kampesterol,  stigmasterol,  dan β-sitosterol (Sigma-Aldrich). Pelarut n -heksana p.a, etil asetat p.a, aseton p.a, kloroform p.a, asam klorida p.a, natrium  hidroksida  p.a,  dan  plat  silika  gel  60  F254 diperoleh dari Merck. Penampak noda KLT anisaldehid-asam sulfat dan aquadest.
Sampel kacang tolo berasal dari tiga pasar di Jawa Timur. Pasar X berlokasi di Tegalsari, Surabaya, Pasar Y di Gunung Sari, Surabaya, dan  Pasar Z  berlokasi di Madyopuro,  Malang.  Ketiga  sampel  kacang  tersebut telah didentifikasi sebagai Vigna unguiculata L. Walp. oleh  Dr.  Sugeng  Budiharta,  M.Sc.  dari  Lembaga  Ilmu Pengetahuan  Indonesia  (LIPI),  Purwodadi,  Jawa Timur.
Alat
Chromatographic plate 20 cm x 10 cm Silica Gel 60  F254  TLC plate ,  Merck  (Darmstadt,  Germany), Camag chamber 20 cm x 10 cm, kapiler 2 µL. ALPHA
II FTIR spektrometer, Hewlett Packard Gas
Chromatograph 5890 Series II dengan Flame Ionization  Detector (FID)  dan  kolom  HP-5  ( cross- linked  5%  phenyl  methyl  silicone ,  25  m  x  0,32  mm  x 0,17  µm film  thickness ), Gas  Chromatograph 6890N
series-Agilent 7697A  dengan  detektor Agilent 5973 inert MSD  dan  kolom  HP-5MS  (30  m  x  0,25  mm  x 0,25 µm), alat suntik (Hamilton Micro Syringe 10 µL), moisture content (Mettler Toledo), ultrasonic (Branson 1510), vortex (IKA), dan centrifuge (EBA-20).

## Metode Preparasi sampel
Kacang  tolo  mentah  digunakan  sebagai  kontrol, dihomogenisasi  dengan  blender  kemudian  diayak. Kacang  tolo  diolah  dengan  merebus  kacang  di  air mendidih  suhu  100 o C  selama  30  menit  sedangkan kacang  digoreng  diolah  dengan  menggoreng  kacang pada  minyak  panas  suhu  190 o C  selama  5  menit. Setelah  dilakukan  pemasakan,  kacang  tolo  yang direbus dan digoreng dihomogenisasi dengan blender.
Kadar  air  pada  kacang  tolo  mentah,  direbus,  dan digoreng ditentukan dengan  alat Mettler Toledo. Hasil pengukuran  kadar  air  digunakan  sebagai  dasar perhitungan dalam penimbangan kacang agar diperoleh sampel  sejumlah  kurang  lebih  1  gram  berat  kering. Replikasi  dilakukan  sebanyak  tiga  kali  pada  seluruh sampel.

## Ekstraksi fitosterol
Kacang  tolo  mentah,  direbus,  dan  digoreng diekstraksi  dengan n -heksana  selama  15  menit menggunakan  ultrasonik,  di-vorteks  10  menit,  dan  di- sentrifugasi pada 2.500 rpm selama 10  menit (tahapan ini diulangi lima kali). Seluruh filtrat dikumpulkan dan diuapkan hingga kering, diperoleh ekstrak n -heksana. Residu  kacang  tolo  diekstraksi  dengan  aseton menggunakan  tahapan  yang  sama  seperti  sebelumnya dan diulangi tiga kali. Seluruh filtrat dikumpulkan dan diuapkan  hingga  kering,  diperoleh  ekstrak  aseton. Selanjutnya  residu  kacang  tolo  dihidrolisis  dengan asam  klorida  (HCl)  2  N  pada  suhu  90-100 o C  selama 30  menit,  didinginkan,  dinetralisasi  dengan  natrium hidroksida  (NaOH)  12  N  hingga  pH  10,  dan  disaring kemudian filtrat diekstraksi dengan kloroform menggunakan tahapan seperti sebelumnya dan diulangi tiga  kali.  Seluruh  filtrat  dikumpulkan  dan  diuapkan hingga kering, diperoleh ekstrak kloroform (Indrayanto dkk., 1994).

## Identifikasi fitosterol dengan KLT
Standar (kolesterol, kampesterol, stigmasterol, dan β-sitosterol)  dan  ekstrak n -heksana  kacang  tolo (mentah,  direbus,  dan  digoreng)  dilarutkan  dengan 0,5  mL  kloroform  kemudian  ditotolkan  sebanyak 2-4  µL  pada  plat  silika  gel  60  F254  dan  dieluasi dengan  fase  gerak n -heksana  :  etil  asetat  (4:1)  v/v kemudian  disemprot  dengan  pereaksi  penampak  noda anisaldehid-H 2 SO 4 (Indrayanto dkk., 1994).

## Identifikasi fitosterol dengan ATR-FTIR
Standar (kolesterol, kampesterol, stigmasterol, dan β-sitosterol)  dan  ekstrak n -heksana  kacang  tolo (mentah,  direbus,  dan  digoreng)  dalam  kloroform, masing-masing  ditempatkan  pada plate  platinum yang dilengkapi dengan  material kristal  ZnSe.  Ujung kristal diposisikan  menyentuh  larutan  dengan  sedikit  tekanan untuk memastikan adanya kontak penuh antara larutan dan  kristal.  Pengukuran  dilakukan  pada  panjang gelombang 4000 cm -1 hingga 600 cm -1 . Hasil spekrum inframerah  senyawa  standar  dan  sampel  dibandingkan kemiripannya sebagai persentase korelasi.

## Identifikasi fitosterol dengan KG-FID
Standar (kolesterol, kampesterol, stigmasterol, dan β-sitosterol)  dan  ekstrak  ( n -heksana,  aseton,  dan kloroform)  kacang  tolo  (mentah,  direbus,  dan digoreng) dalam  kloroform, diidentifikasi dengan KG- FID  ( Hewlett  Packard  Gas  Chromatograph  5890 Series II, Flame Ionization Detector (FID) , dan kolom HP-5 ( cross-linked 5% phenyl methyl silicone, 25 m
0,32  mm 0,17  µm film  thickness ),  gas  pembawa helium  dengan  kecepatan  alir  1,7  kg/cm 2 ,  rasio split 25  :  1,  diinjeksikan  2  µL  pada  suhu  isotermal  290 o C dengan waktu analisis 30 menit.
Analisis kualitatif pada ekstrak ( n -heksana, aseton, dan  kloroform)  kacang  tolo  (mentah,  direbus,  dan digoreng)  dilakukan  dengan  membandingkan  waktu retensi  relatif  sampel  dan  standar.  Jika  waktu  retensi relatifnya  sama,  diperkirakan  sampel  mengandung senyawa yang sama dengan standar (McNair & Miller, 2009).  Hal  ini  perlu  dilakukan  analisis  lainnya  untuk konfirmasi, dalam penelitian ini dengan KG-MSD.
Analisis  semi-kuantitatif  pada  ekstrak n -heksana kacang  tolo  (mentah,  direbus,  dan  digoreng)  dihitung dalam  persentase  relatif  fitosterol  berdasarkan  rumus (McNair & Miller, 2009):
% Area X = [ ∑ ]
% Area X = persentase relatif sterol X (%); A x = Area sterol X; A i = Area sterol total.

## Identifikasi fitosterol dengan KG-MSD
Standar (kolesterol, kampesterol, stigmasterol, dan β-sitosterol)  dan  ekstrak n -heksana  kacang  tolo (mentah,  direbus,  dan  digoreng)  dalam  kloroform, diidentifikasi  dengan  KG-MSD  ( Gas Chromatograph 6890N series-Agilent 7697A , Agilent 5973 inert MSD equipped with a capillary column (30 m x 0,25 mm i.d x  0,25  µm film  thickness HP-5MS),  kecepatan  alir 9,2 mL/menit, splitless, diinjeksikan 0,4 µL pada  suhu 220-270 o C dengan kenaikan 10 o C/menit menggunakan metode Selected Ion Monitoring (SIM).

## Analisis data
Hasil  dianalisis  dengan Statistical  Product  and Services  Solutions (SPSS) Statistics 17.0  dengan membandingkan  proses  pemasakan  kacang  tolo (mentah,  direbus,  dan  digoreng)  terhadap  komposisi fitosterol  menggunakan Multivariate  Analysis  of Variance (MANOVA).  Nilai  signifikansi  <  0,05 menunjukkan adanya perbedaan yang signifikan.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Fitosterol terdiri dari kerangka steroid sejumlah 27 hingga 30 atom karbon sebagai kerangka utama dengan gugus  hidroksil  pada  posisi  C-3,  ikatan  rangkap  pada posisi C-5, dan rantai samping alifatik pada posisi C-17 (Jannah  dkk.,  2013;  Wadikar  dkk.,  2017).  β-sitosterol, kampesterol,  dan  stigmasterol  memiliki  kelimpahan  di alam  sekitar  65%,  30%,  dan  3%  (Brufau  dkk.,  2008), namun  hal  ini  dipengaruhi  jenis  tumbuhannya. Kacang-kacangan  memiliki  komposisi  nutrisi  yang baik  bagi  kesehatan,  seperti  asam  lemak  tidak  jenuh, serat,  mineral,  vitamin,  fitosterol,  dan  kandungan bioaktif  lainnya,  mengkonsumsinya secara rutin, dapat menurunkan  resiko  penyakit  kardiovaskular  (Guasch- Ferré dkk., 2017).
Kacang  tolo  dapat  tumbuh  dan  beradaptasi  di daerah  tropis  dan  subtropis  dengan  kandungan  gizi, diantaranya  protein  24,6  g,  karbohidrat  66,6  g,  serat 1,6  g,  dan  kalsium  0,481  g  per  100  g  kacang  tolo mentah.  Proses  pemasakan  kacang  tolo,  seperti perebusan  dan  penggorengan  dapat  mengurangi kandungan gizi di dalam kacang tolo, sehingga sangat penting  untuk  memperhatikan  cara  pengolahan  bahan pangan  sebelum dikonsumsi agar  manfaat nutrisi  yang terkandung di dalamnya dapat diperoleh secara optimal (DepKes RI, 1995). Kacang ini oleh masyarakat diolah sebagai  bahan  campuran  pada  makanan  lodeh,  gudeg, lepet ketan, dan  bubur  juga disajikan dengan digoreng sebagai makanan ringan.
Pada  penelitian  ini  kacang  tolo  mentah,  direbus, dan  digoreng  dari  Pasar  X,  Y,  dan  Z  diambil  untuk mewakili  kacang  tolo  yang  dipasarkan  di  masyarakat namun demikian dalam hal ini tidak dilakukan analisis perbedaan  lokasi  kacang  tolo  terhadap  komposisi fitosterol. Kacang tolo dihomogenisasikan hingga halus menjadi  serbuk  kemudian  kadar  air  diukur  untuk memperhitungkan  penimbangan  berat  kering  sampel pada tahap ekstraksi. Hasil kadar air dan penimbangan kacang  tolo  mentah,  direbus,  dan  digoreng  dapat diamati pada Tabel 1.
Tabel 1. Kadar air dan penimbangan kacang tolo mentah, direbus, dan digoreng Pasar Kacang tolo Kadar air (%) Berat kacang (g) I II III X Mentah 9,46 ± 1,45 1,0020 1,0025 1,0020 Direbus 57,76 ± 0,52 2,3531 2,3736 2,3593 Digoreng 1,18 ± 0,98 1,1029 1,1014 1,1012 Y Mentah 9,45 ± 0,11 1,1913 1,2001 1,1964 Direbus 52,54 ± 0,20 2,1941 2,1892 2,1909 Digoreng 1,58 ± 0,01 1,0254 1,0233 1,0239 Z Mentah 12,22 ± 0,04 1,2387 1,2453 1,2316 Direbus 56,50 ± 0,31 2,4585 2,4348 2,4394 Digoreng 3,18 ± 0,04 1,1247 1,1299 1,1275
Kadar  air  terendah  pada  kacang  tolo  digoreng, dibawah  5%  disebabkan  oleh  proses  oksidasi  cairan pada  bahan  pangan  selama  proses  penggorengan, sehingga  menghasilkan  olahan  kering  (Guallar  dkk., 2007). Kadar air di atas 50% pada kacang tolo direbus merupakan kadar air tertinggi karena terjadinya proses difusi  panas  dan  massa  air  pada  matriks  kacang, sehingga  kadar  air  meningkat  (Pangastuti  dkk.,  2013). Kandungan  air  dalam  sampel  melebihi  18%  dapat menurunkan  efisiensi  ekstraksi  (Nagy  &  Simándi, 2008).  Perbedaan  kepolaran  antara  air,  bersifat  polar, sebagai  media  proses  perebusan  dan n -heksana, bersifat non-polar, sebagai pelarut pengekstraksi  dapat menurunkan  efisiensi  proses  ekstraksi.  Upaya  yang dapat  dilakukan  untuk  memperoleh  hasil  ekstraksi secara optimal, melalui proses pengeringan ulang pada suhu  45  -  50 o C  setelah  sampel  ditimbang  secara seksama. Hal ini bertujuan untuk memperoleh kadar air kurang dari 18% pada kacang tolo direbus.
Proses ekstraksi mengacu pada prosedur Indrayanto  dkk.  (1994),  menggunakan  pelarut n - heksana untuk mengekstraksi fitosterol bebas, selanjutnya digunakan pelarut aseton untuk memastikan fitosterol bebas telah terekstraksi sempurna  pada  ekstraksi  sebelumnya.  Selain  fitosterol bebas,  fitosterol  terdapat  dalam  bentuk  terikat (teresterifikasi  atau  terglikosilasi),  sehingga  dilakukan pemutusan  ikatan  ester  pada  fitosterol  terikat  melalui tahapan  hidrolisis  menggunakan  HCl  2  N  pada  suhu 90-100 o C (Indrayanto dkk., 1994; Moreau dkk., 2002).
Proses  netralisasi  dengan  NaOH  12  N  dilakukan setelahnya untuk memisahkan senyawa asam karboksilat  dari  proses  hidrolisis  agar  membentuk garam,  sehingga  asam  karboksilat  ini  tidak  ikut terekstraksi  dan  akan  terlarut  dalam  fase  air.  Pelarut kloroform digunakan dalam proses ekstraksi berikutnya  untuk  memperoleh  fitosterol  bebas  yang telah  terlepas  dari  senyawa  lain  (Indrayanto  dkk., 1994).
Kromatografi lapis tipis digunakan dalam identifikasi  awal  secara  kualitatif  untuk  mengetahui keberadaan  fitosterol  di  dalam  sampel.  Dalam pengujian ini, noda sampel berwarna ungu dengan nilai Retention  Factor (Rf)  sampel  sama  dengan  standar, yaitu  stigmasterol  sebagai  pembanding.  Bercak  noda berwarna  ungu  menandakan  adanya  terpenoid  atau steroid  (Sherma  &  Fried, 2003). Inti struktur fitosterol adalah  steroid  dan  berdasarkan  hasil  tersebut keseluruhan  sampel  mengandung  terpenoid  atau steroid.  Kandungan  yang  diduga  terdapat  di  dalam sampel  adalah  golongan  sterol.  Pemastian  keberadaan kolesterol,  kampesterol,  stigmasterol,  dan  β-sitosterol di  dalam  sampel  dapat  diidentifikasi  dengan  metode analisis selanjutnya.
Identifikasi fitosterol dengan ATR-FTIR digunakan  untuk  memastikan  keberadaan  fitosterol pada proses perebusan dan penggorengan kacang tolo. Kolesterol  memberikan  serapan  spesifik,  gugus  O-H pada  3430  cm -1 ,  gugus  C-O  pada  1055  cm -1 ,  gugus C=C  pada  1464  cm -1 ,  dan  gugus  C-C  pada  955  cm -1 (Ferrero dkk., 2015). Stigmasterol memberikan serapan spesifik, gugus O-H pada 3335 cm -1 , gugus C=C pada 1667  cm -1 ,  dan  C-H  pada  879  cm -1 sedangkan  β- sitosterol, gugus O-H pada 3331 cm -1 , gugus C=C pada 1654 cm -1 , dan gugus C-C pada   1062 cm -1 (Rajput & Rajput,  2012).  Hasil  identifikasi  spektra  inframerah ATR-FTIR  standar  fitosterol  (kolesterol,  kampesterol, stigmasterol,  dan  β-sitosterol)  menunjukkan  serapan spesifik,  gugus  O-H  pada  3020  cm -1 ,  gugus  C-O  pada 1214 cm -1 , gugus C=C pada 1474 cm -1 , dan gugus C-C pada  928  cm -1 .  Kemiripan  spektra  inframerah  ATR- FTIR pada ke-empat standar fitosterol disebabkan oleh struktur  inti  steroid  di  dalam  senyawa  tersebut  relatif sama.  Spektra  inframerah  ATR-FTIR  kacang  tolo mentah  menunjukkan  serapan  spesifik,  gugus  O-H pada  3019  cm -1 ,  gugus  C-O  pada  1214  cm -1 ,  gugus C=C  pada  1467  cm -1 ,  dan  gugus  C-C  pada  929  cm -1 . Kacang  tolo  direbus  memberikan  serapan  spesifik,
gugus O-H pada 3019 cm -1 , gugus C-O pada 1214 cm - 1 , gugus C=C pada 1476 cm -1 , dan gugus C-C pada 929 cm -1 .  Kacang  tolo  digoreng  menghasilkan  serapan spesifik,  gugus  O-H  pada  3019  cm -1 ,  gugus  C-O  pada 1214 cm -1 , gugus C=C pada 1465 cm -1 , dan gugus C-C pada  928  cm -1 .  Perbedaan  bilangan  gelombang  pada standar  dan  sampel  disebabkan  karena  adanya pengaruh  matriks  yang  terdapat  pada  sampel  (Duarte dkk.,  2002).  Hasil  identifikasi  spektra  inframerah ATR-FTIR  pada  standar  dan  sampel  dianalisis
kemiripannya menggunakan parameter persen korelasi. Dalam  pengujian  ini,  kacang  tolo  mentah  dan  direbus menunjukkan  persen  korelasi  100%  terhadap  standar sedangkan  persen  korelasi  kacang  tolo  digoreng sebesar 99,7%. Hal tersebut disebabkan oleh pengaruh minyak, sebagai media proses penggorengan, kemungkinan  ikut  masuk  ke  dalam  matriks,  sehingga mempengaruhi  hasil  analisis  ATR-FTIR.  Salah  satu contoh hasil persen korelasi antara kacang tolo mentah terhadap stigmasterol dapat diamati pada Gambar 1.
Gambar 1. Spekta inframerah ATR-FTIR persen korelasi kacang tolo mentah dan stigmasterol
Analisis kualitatif menggunakan KG-FID dilakukan dengan membandingkan waktu retensi relatif sampel  dan  standar.  Waktu  retensi  relatif  standar fitosterol  dan  sampel  dari  ekstrak n -heksana  kacang tolo mentah, direbus, dan digoreng dapat diamati pada Tabel  2  dan  Tabel  3.  Dalam  pengujian  ini,  waktu
retensi  relatif  sampel  dan  standar  adalah  sama, sehingga  sampel  memiliki  probabilitas  senyawa  sterol yang  sama  dengan  standar.  Kromatogram  KG-FID standar  fitosterol  dan  salah  satu  contoh  kromatogram KG-FID  ekstrak n -heksana  kacang  tolo  mentah, direbus, dan digoreng disajikan pada Gambar 2.
Tabel 2. Waktu retensi relatif standar fitosterol Standar Waktu retensi standar (menit) Waktu retensi relatif standar* Kolesterol 19,733 0,80 Kampesterol 23,525 0,95 Stigmasterol 24,768 1,00 β-Sitosterol 27,278 1,10
*Waktu retensi relatif dihitung dengan membandingkan waktu retensi tiap sterol terhadap waktu retensi stigmasterol
I. II. III. IV.
Gambar 2. Kromatogram KG-FID ( Hewlett packard gas chromatograph 5890 series II, flame ionization detector (FID) , kolom HP-5 ( cross-linked 5% phenyl methyl silicone, 25 m 0.32 mm 0,17 µm film thickness ), gas pembawa helium kecepatan alir 1,7 Kg/cm 2 , rasio split 25 : 1, volume injeksi 2 µL, suhu isotermal 290 o C selama 30 menit. standar fitosterol (I) dan ekstrak n -heksana kacang tolo mentah (II), direbus (III), digoreng (IV). kolesterol (A), kampesterol (B), stigmasterol (C), dan β-sitosterol (D)
P-ISSN: 2406-9388 E-ISSN: 2580-8303
Tabel 3. Waktu retensi relatif ekstrak n -heksana kacang tolo mentah, direbus, dan digoreng
Pasar Kacang tolo Waktu retensi (menit) Kolesterol Kampesterol Stigmasterol β-sitosterol I II III I II III I II III I II III X Mentah 19,768 19,751 19,766 23,568 23,545 23,565 24,844 24,816 24,830 27,369 27,342 27,355 Direbus 19,744 19,773 19,787 23,530 23,578 23,606 24,801 24,837 24,871 27,321 27,355 27,410 Digoreng - - - - - - 24,721 24,667 24,341 27,271 27,190 26,833 Y Mentah 19,712 19,882 19,780 23,509 23,554 23,559 24,776 24,861 24,820 27,039 27,404 27,340 Direbus 19,746 19,848 19,832 23,543 23,663 23,618 24,802 24,900 24,878 27,326 27,450 27,422 Digoreng 19,702 19,726 19,833 23,511 23,559 23,680 24,761 24,831 24,946 27,261 27,331 27,486 Z Mentah 19,786 19,717 19,721 23,620 23,500 23,491 24,873 24,759 24,751 27,390 27,273 27,274 Direbus 19,793 19,811 19,773 23,619 23,629 23,581 24,873 24,888 24,840 27,412 27,413 27,374 Digoreng 19,684 19,745 19,883 23,493 23,596 23,680 24,739 24,830 24,946 27,247 27,367 27,486 Waktu retensi relatif* 0,80 0,95 1,00 1,10
*Waktu retensi relatif sampel dihitung dengan membandingkan waktu retensi tiap sterol terhadap waktu retensi stigmasterol
Tabel 4. Persentase fitosterol* ekstrak n -heksana kacang tolo mentah, direbus, dan digoreng
Pasar Kacang tolo Kolesterol (%) Kampesterol (%) Stigmasterol (%) β-sitosterol (%) I II III I II III I II III I II III X Mentah 5,24 3,97 4,67 10,05 10,56 10,95 41,80 42,69 42,69 42,91 41,69 41,69 Direbus 5,92 5,33 4,86 10,43 9,89 10,16 43,35 44,87 44,58 40,30 39,91 40,40 Digoreng - - - - - - 50,09 45,27 50,23 49,91 54,73 49,77 Y Mentah 4,57 9,22 5,00 10,40 8,50 9,83 44,66 41,62 44,27 40,38 40,66 40,90 Direbus 19,98 5,53 5,40 9,66 9,24 7,92 37,02 47,73 45,24 33,34 37,50 41,44 Digoreng 2,74 5,65 16,61 11,17 10,26 14,56 39,40 37,27 29,97 46,69 46,82 38,86 Z Mentah 4,81 5,22 4,40 9,53 9,78 10,37 45,18 45,91 46,42 40,49 39,09 38,81 Direbus 17,56 6,51 19,76 9,81 9,45 9,15 39,27 45,26 38,02 33,36 38,78 33,07 Digoreng 13,46 14,90 16,61 10,02 21,07 14,56 31,10 27,36 29,97 45,52 36,66 38,86
*Persentase fitosterol dihitung berdasarkan area sterol yang terdeteksi dibandingkan dengan area sterol total yang terdeteksi
Tabel  4  menunjukkan  komposisi  fitosterol  pada ekstrak n -heksana  di  dalam  kacang  tolo  mentah, direbus,  dan  digoreng.  Komposisi  fitosterol  diperoleh dari  hasil  perhitungan  area  kromatogram  KG-FID secara  semi-kuantitatif  sebagai  kadar  relatif  fitosterol. Cara  perhitungan  mengacu  pada  McNair  &  Miller (2009)  dan  juga  telah  digunakan  pada  publikasi Kaloustian  dkk.  (2008)  dengan  membandingkan  area sterol  “x”  terhadap  area  sterol  total.  Kacang  tolo digoreng  dari  Pasar  X  memiliki  perbedaan  komposisi fitosterol  dibandingkan  Pasar  Y  dan  Z,  yaitu  hanya mengandung  stigmasterol  dan  sitosterol.  Perbedaan tersebut  dapat  disebabkan  oleh  proses  difusi  panas dengan  mekanisme  transfer  panas  dari  media pemasakan ke dalam bahan disertai laju panas terdifusi keluar  masuk  ke  dalam  bahan  secara  natural  untuk mendistribusikan  panas  ke  seluruh  bagian  produk. Proses  ini  mengakibatkan  terbawanya  fitosterol  ke media  pemasakan,  yaitu  minyak,  sehingga  fitosterol berkurang  saat  proses  penggorengan  (Fontana  dkk., 2001). Terjadinya  proses  degradasi  saat  penggorengan pada suhu tinggi juga dapat menyebabkan berkurangnya  fitosterol  pada  bahan  (Cantrill  & Kawamura,  2008).  Pada  pengujian  ini  dilakukan replikasi  tiga  kali,  meskipun  bersifat  semi  kuantitatif, namun  pada  beberapa  sampel  terlihat  data  persentase fitosterol  yang  cukup  bervariasi.  Hal  ini  berkaitan dengan  analisis  fitosterol  dalam  sampel  dari  bahan alam,  yaitu  kacang  tolo  dengan  kandungan  fitosterol relatif  kecil,  sehingga  untuk  bahan  alam  Horwitz (2013) memberikan kelonggaran persen rekoveri cukup lebar, yaitu 80-110%.
Dalam pengujian ini, ekstrak aseton dan kloroform kacang tolo mentah, direbus, dan digoreng menunjukkan  tidak  adanya  puncak  sterol  yang terdeteksi.  Hal  tersebut  membuktikan  seluruh  sterol telah  terekstraksi  sempurna  pada  ekstraksi n -heksana sebelumnya  dan  tidak  terdapat  fitosterol  terikat  di dalam ekstrak kloroform.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengidentifikasi pengaruh  proses  perebusan  dan  penggorengan  kacang
tolo  terhadap  komposisi  fitosterol.  Analisis  data menggunakan  uji  MANOVA  dengan  membandingkan proses  pemasakan  (mentah,  direbus,  dan  digoreng) terhadap  area  fitosterol  (kolesterol,  kampesterol, stigmasterol,  dan  β-sitosterol)  dari  kromatogram  KG- FID.  Hasil  analisis  statistika  menunjukkan  perbedaan signifikan  pada  area  sitosterol  antara  kacang  tolo direbus  dan  digoreng  sedangkan  pada  area  kolesterol, kampesterol,  dan  stigmasterol  antara  kacang  tolo direbus  dan  digoreng  tidak  berbeda  signifikan. Komposisi  fitosterol  pada  kacang  tolo  direbus  sama dengan  kacang  tolo  mentah  dan  keduanya  tidak berbeda signifikan. Sementara itu, perbedaan komposisi  fitosterol  pada  kacang  tolo  direbus  dan kacang tolo digoreng dapat disebabkan perbedaan suhu saat proses pemasakan kacang tolo, diantaranya proses perebusan  pada  suhu  100 o C  sedangkan  proses penggorengan pada suhu 190 o C.
Penentuan  senyawa  hasil  analisis  KG-MSD mengacu  pada European  Commission  Decision 2002/657/EC, yaitu dalam identifikasi harus menunjukkan  kesamaan  empat  fragmen  spesifik dengan  intensitas  yang  tidak  jauh  berbeda  dengan pembanding database . Dalam pengujian  ini digunakan database  Wiley 7.0  dari  instrumen  KG-MSD.  Ekstrak n -heksana  kacang  tolo  mentah,  direbus,  dan  digoreng dianalisis  dengan  KG-MSD.  Kacang  tolo  mentah dijadikan  acuan  sebagai  pembanding  dengan  proses pemasakan,  yaitu  perebusan  dan  penggorengan.  Hasil analisis  menunjukkan  inti  steroid  pada  fragmen  ion spesifik  di  m/z  255,  271,  dan  273  (Zhao  dkk.,  1989). Senyawa fitosterol pada ekstrak n -heksana kacang tolo mentah,  direbus,  dan  digoreng  memiliki  fragmen  khas dan  dapat  diamati  pada  Tabel  5.  Fragmen  tersebut digunakan untuk mengkonfirmasi kandungan fitosterol dari  pengujian  KLT  dan  KG-FID.  Dalam  pengujian KG-MSD  membuktikan  bahwa  kacang  tolo  mentah, direbus,  dan  digoreng  mengandung  fitosterol,  yaitu kolesterol, kampesterol, stigmasterol, dan β-sitosterol.
Tabel 5. Ion molekular dan fragmentasi kolesterol, kampesterol, stigmasterol, dan β-sitosterol yang teridentifikasi pada ekstrak n -heksana kacang tolo mentah, direbus, dan digoreng
Ion molekular [M]+ dan fragmen Senyawa pada kacang tolo ( m/z ) Mentah Direbus Digoreng Kolesterol [M] +
[M-H 2 O] + [M-C 5 H 7 -H 2 O] + [M- side chain ] + [M- side chain -H 2 O] +
386 368 303 275 255 386 368 303 275 255 - - - - -
Kampesterol [M] + [M-H 2 O] + [M-C 5 H 7 -H 2 O] + [M- side chain ] + [M- side chain -H 2 O] +
400 382 315 273 255 400 382 - 273 255 - - - - -
Stigmasterol [M] + [M-H 2 O] + [M-C 3 H 7 -H 2 O] + [M- side chain -2H] +
[M- side chain -H 2 O] + 412 394
351 271 255 412 394 351 271 255 412 - 351 271 255
β-sitosterol [M] + [M-H 2 O] + [M-C 3 H 7 -H 2 O] + [M- side chain -2H] +
[M- side chain -H 2 O] + 414 396
303 273 255 414 396 303 - 255 414 396 303 273 255

## KESIMPULAN
Kacang tolo  mentah, direbus, dan digoreng dapat diidentifikasi adanya keempat fitosterol, yaitu kolesterol,  kampesterol,  stigmasterol,  dan  β-sitosterol. Proses  perebusan  dan  penggorengan  kacang  tolo berpengaruh terhadap komposisi fitosterol.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis  berterimakasih  kepada  Prof.  Dr.  rer.nat. Gunawan Indrayanto yang telah memfasilitasi penyediaan  keempat  senyawa  standar  fitosterol ( Sigma-Aldrich ).

## DAFTAR PUSTAKA
Al-Bukhaiti,  W.  Q.,  Noman,  A.,  Qasim,  A.  S.  &  Al- Farga, A.  (2017).  Gas  Chromatography:
Principles,  Advantages  and  Applications  in
Food Analysis. International Journal of Agriculture  Innovations  and  Research ; 6 ;  123–
128.
Aurora,  R.  G.,  Sinambela,  A.  &  Noviyanti,  C.  H.
(2012).  Peran  Konseling  Berkelanjutan  pada Penanganan Pasien Hiperkolesterolemia.
Journal  of  the  Indonesian  Medical  Association ;
62 ; 194–201.
Badan  Penelitian  dan  Pengembangan  Kesehatan (Badan  Litbangkes).  (2018).  Hasil  Utama  Riset Kesehatan  Dasar  2018.  Jakarta:  Kementerian Kesehatan RI.
Brufau,  G.,  Canela,  M.  A.  &  Rafecas,  M.  (2008).
Phytosterols: Physiologic and Metabolic Aspects Related to Cholesterol-Lowering
Properties. Nutrition Research ; 28 ; 217–225. Cantrill,  R.  &  Kawamura,  Y.  (2008).  Phytosterols, Phytostanols,  and  Their  Esters.  London:  Forbes Medi-Tech Inc.
Chen, Q., Gruber, H., Pakenham, C., Ratnayake, W. M. N.  &  Scoggan,  K.  A.  (2009).  Dietary Phytosterols and Phytostanols Alter the Expression  of  Sterol-Regulatory  Genes  in SHRSP  and  WKY  Inbred  Rats. Annals  of Nutrition and Metabolism ; 55 ; 341–350. Departemen Kesehatan RI (DepKes RI). (1995). Daftar Komposisi  Zat  Gizi  Pangan  Indonesia.  Jakarta: Direktorat Jenderal Pembinaan Kesehatan Masyarakat.
Dovlo,  F.  E.,  Williams,  C.  E.  &  Zoaka,  L.  (1976). Cowpeas:  Home  Preparation  and  Use  in  West Africa.  Canada:  International  Development Research Centre.
Duarte,  M.  L.,  Ferreira,  M.  C.,  Marvão,  M.  R.  &
Rocha,  J.  (2002).  An  Optimised  Method  to
Determine  the  Degree  of  Acetylation  of  Chitin and Chitosan by FTIR Spectroscopy. International Journal of Biological Macromolecules ; 31 ; 1–8.
Ferrero,  F.,  Mossotti,  R.,  Innocenti,  R.,  Coppa,  F.  & Periolatto,  M.  (2015).  Enzyme-aided  Wool Dyeing: Influence of Internal Lipids. Fibers and
Polymers ; 16 ; 363–369.
Fontana, A. J., Wacker, B. & Champbell, C. S. (2001).
Simultaneous  Thermal  Conductivity,  Thermal Resistivity, and Thermal Diffusivity Measurement  of  Selected  Foods  and  Soils California, USA. American Society of
Agricultural  and  Biological  Engineers ; 95 ;  45– 48.
Gonçalves,  A.,  Goufo,  P.,  Barros,  A.,  Domínguez- Perles, R., Trindade, H., Rosa, E. A. S., Ferreira, L.  &  Rodrigues,  M.  (2016).  Cowpea  ( Vigna unguiculata L. Walp.), a Renewed Multipurpose
Crop for  a More Sustainable  Agri-food System: Nutritional Advantages and Constraints. Journal of  the  Science  of  Food  and  Agriculture ; 96 ;
2941–2951.
Guallar,  C.  P.,  Rodriguez,  A.  F.,  Fornes,  N.  S., Banegas, J. R., Etxezarreta, P. A. & Ardanaz, E. (2007). Intake of Fried Foods is Associated with
Obesity  in  the  Cohort  of  Spanish  Adults  from the  Europian  Prospective  Investigation  into Cancer  and  Nutrition. American  Journal  of Clinical Nutrition ; 86 ; 198–205.
Guasch-Ferré,  M.,  Liu,  X.,  Malik,  V.  S.,  Sun,  Q., Willett,  W.  C.,  Manson,  J.  A.  E.,  Rexrode,  K. M.,  Li,  Y.,  Hu,  F.  B.  &  Bhupathiraju,  S.  N.
(2017).  Nut  Consumption  and  Risk  of Cardiovascular Disease. Journal of the American  College  of  Cardiology ; 70 ;  2519–
2532.
Horwitz.  (2013).  AOAC  Guidelines  for  Single
Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary Supplements and Botanicals. http://www.aoac.org/Official_Methods/slv_guid elines.pdf. Accessed: 10 Januari 2020.
Ilmi,  I.  M.  B.,  Ali,  K.  &  Sri,  A.  M.  (2015).  Cara Pengolahan Makanan Rumah Tangga Indonesia. Jakarta: Indonesian Food Technology.
Inchingolo, R., Cardenia, V. & Rodriguez-Estrada, M.
T.  (2014).  Analysis  of  Phytosterols  and Phytostanols in Enriched Dairy Products by Fast
Gas  Chromatography  with  Mass  Spectrometry. Journal of Separation Science ; 37 ; 2911–2919.
Indrayanto,  G.,  Studiawan,  H.  &  Cholies,  N.  (1994).
Isolation  and  Quantitation  of  Manogenin  and Kammogenin  from  Callus  Cultures  of Agave amaniensis . Phytochemical Analysis ; 5 ; 24–26. Jannah,  H.,  Sudarma,  I.  M.  &  Andayani,  Y.  (2013).
Analisis Senyawa Fitosterol dalam Ekstrak Buah Buncis  ( Phaseolus  vulgaris L.). Journal Chemical Program ; 6 ; 70–75.
Kaloustian,  J.,  Alhanout,  K.,  Amiot-Carlin,  M.  J., Lairon,  D.,  Portugal,  H.  &  Nicolay,  A.  (2008). Effect  of  Water  Cooking  on  Free  Phytosterol Levels  in  Beans  and  Vegetables. Food Chemistry ; 107 ; 1379–1386.
Kumar, S., Jyotirmayee, K. & Sarangi, M. (2013). Thin
Layer Chromatography: a Tool of Biotechnology  for  Isolation  of  Bioactive Compounds  from  Medical  Plants. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research ; 18 ; 126–132.
Marangoni,  F.  &  Poli,  A.  (2010).  Phytosterols  and
Cardiovascular Health. Pharmacological
Research ; 61 ; 193–199.
McNair,  H.  M.  &  Miller,  J.  M.  (2009).  Chapter  8. Qualitative  and  quantitave  analysis.  In: Basic Gas  Chromatography .  New  York:  John  Willey
& Sons, Inc.
Moreau, R. A., Whitaker, B. D. & Hicks, K. B. (2002).
Phytosterols, Phytostanols, and Their Conjugates  in  Foods:  Structural  Diversity, Quantitatively  Analysis,  and  Health-promoting Uses. Progress in Lipid Research ; 41 ; 457–500. Mulyatiningsih,  E.  (2007).  Teknik-teknik  Dasar Memasak.  Yogyakarta:  Universitas  Negeri Yogyakarta.
Nagy, B. & Simándi, B. (2008). Effects of Particle Size Distribution,  Moisture  Content,  and  Initial  Oil Content on the Supercritical  Fluid Extraction of Paprika. Journal  of  Supercritical  Fluids ; 46 ; 293–298.
Nestola, M. & Schmidt, T. C. (2016). Fully Automated Determination  of  the  Sterol  Composition  and Total Content in Edible Oils and Fats by Online Liquid  Chromatography-Gas  Chromatography- Flame Ionization Detector. Journal of
Chromatography A ; 1463 ; 136–143.
Normén,  L.,  Johnsson,  M.,  Andersson,  H.,  Gameren, Y.  &  Dutta,  P.  (1999).  Plant  Sterols  in Vegetables  and  Fruits  Commonly  Consumed  in
Sweden. European Journal of Nutrition ; 38 ; 84–
89.
Pangastuti,  H.  A.,  Affandi,  D.  R.  &  Ishartani,  D.
(2013).  Karakterisasi  Sifat  Fisik  dan  Kimia
Tepung  Kacang  merah  ( Phaseolus  vulgaris L.) dengan Beberapa Perlakuan Pendahuluan. Jurnal Teknosains Pangan ; 2 ; 20–29.
Rahman, M. & Probosari, E. (2014). Perbedaan Kadar Kolesterol  LDL dan HDL Sebelum dan Setelah Pemberian Sari Bengkuang ( Pachyrrhizus erosus )  pada  Wanita. Jurnal  of  Nutrition College ; 3 ; 587–594.
Rajput,  A.  P.  &  Rajput,  T.  A.  (2012).  Isolation  of Stigmasterol  and  β-sitosterol  from  Chloroform Extract  of  Leaves  of Corchorus  fascicularis Lam. International  Journal  of  Biological Chemistry ; 6 ; 130–135.
Setyaji, D. Y., Prabandari, Y. S. & Gunawan, I. M. A.
(2018). Aktivitas  Fisik dengan Jantung  Koroner di  Indonesia. Jurnal  Gizi  Klinik  Indonesia ; 14 ; 115–121.
Sherma, J. & Fried, B. (2003). Steroids . In : Handbook of  Thin-Layer  Chromatography, 3rd  edition. New York: Marcel Dekker, Inc.
Sulistyani, M. (2018). Spektroskopi Fourier Transform Infra  Red dengan  Metode  Reflektansi  (ATR- FTIR)  pada  Optimasi  Pengukuran  Spektrum Vibrasi  Vitamin  C. Jurnal  Teknologi  dan Manajemen  Pengelolaan  Laboratorium ; 1 ;  39–
43.
Sundari,  D.,  Almasyhuri,  A.  &  Lamid,  A.  (2015).
Pengaruh Proses Pemasakan terhadap
Komposisi  Zat  Gizi  Bahan  Pangan  Sumber Protein. Media  Penelitian  dan  Pengembangan Kesehatan ; 25 ; 235–242.
Talreja,  T.,  Kumar,  M.,  Goswami,  A.,  Gahlot,  G., Jinger,  A.  K.  &  Sharma,  T.  (2017).  Qualitative and  Quantitative  Estimation  of  Phytosterols  in Achyranthes  aspera and Cissus  quadrangularis by  HPLC. The  Pharma  Innovation  Journal ; 6 ;
76–79.
Thanh,  T.  T.,  Vergnes,  M.  F.,  Kaloustian,  J.,  El- Moselhy, T. F., Amiot-Carlin, M. J. & Portugal, H.  (2006).  Effect  of  Storage  and  Heating  on Phytosterol  Concentrations  in  Vegetable  Oils Determined  by  GC/MS. Journal  of  the  Science of Food and Agriculture ; 86 ; 220–225. Wadhera, R. K., Steen, D. L., Khan, I., Giugliano, R. P. &  Foody,  J.  M.  (2016).  A  Review  of  Low- Density  Lipoprotein  Cholesterol,  Treatment Strategies,  and  Its  Impact  on  Cardiovascular Disease  Morbidity  and  Mortality. Journal  of Clinical Lipidology ; 10 ; 472–489.
Wadikar,  D.,  Lakshmi,  I.  &  Patki,  P.  (2017). Phytosterols:  An  Appraisal of Present Scenario. Acta Scientific Nutritional Health ; 1 ; 25–34.
Zhao,  H.,  Zhao,  S.,  Sun,  C.  &  Guillaume,  D.  (1989).
Glucosylsterols  in  Extracts  of Euryale  ferox Identified  by  High  Resolution  NMR  and  Mass Spectrometry. The  Journal  of  Lipid  Research ; 30 ; 1633–1637.