## PENGARUH PEMBERIAN  EKSTRAK PROPOLIS TERHADAP KETEBALAN  OTOT POLOS BRONKIOLUS PADA MENCIT ASMA
Dian Arsanti Palupi, 1 Nadhifah Luqyana¹ Prodi D3 Farmasi Sekolah Ilmu Tinggi Kesehatan Cendekia Utama Kudus Email address: arsanti_palupi@yahoo.com

## ABSTRAK
Asma bronkial ditandai dengan peradangan saluran nafas kronis, dan  timbul secara klinis penyempitan  jalan  nafas  (mengi  dan  dyspnea)  dan  batuk.  Tujuan  penelitian  untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak propolis sebagai terapi asma terhadap ketebalan otot polos bronkiolus pada mencit asma. Mencit betina Balb/C  25 ekor  yang  memenuhi kriteria  inklusi  dibagi  menjadi  5  kelompok.  Kontrol  normal  (K1),  kontrol  negatif  (K2), teofilin (K3), ekstrak propolis (K4), kombinasi teofilin + ekstrak propolis (K5). Pada hari ke-0 mencit disensitisasi dengan  10µg  OVA+ 1 mg Alhidrogel dalam 0,5 mL NaCl steril 0,9%  secara  intraperitoneal.  Pada  hari  ke-14    20µg    OVA+  2  mg  Alhidrogel  dalam  0,5 mL  NaCl  steril    0,9%  secara  intraperitoneal  Pada  hari  ke-21,  ke-23,  ke-25  mencit diinhalasi  OVA1%.  Pada  hari  ke-26  sampai  ke-39  kelompok    K3  diberi  teofilin  0,338 mg/hari,  kelompok  K4  diberi  ekstrak  propolis  dosis  4 mg/  hari  dan  kelompok  K5  diberi kombinasi teofilin + ekstrak propolis. Pada hari ke-40 mencit diterminasi untuk dianalisis ketebalan otot polos bronkiolus. Perbandingan antara kelompok negatif rata-rata rata-rata 5,35±  0,06  µm  dapat  diturunkan  dengan  ekstrak  propolis  (K4)  rata-rata  3,73±  0,2  µm, nilai  p=0,01  artinya  antara  kelompok  kontrol  negatif  dan  kelompok  ekstrak  propolis  ada perbedaan  yang  bermakna  secara  statistik.  Ekstrak  propolis    terbukti  dapat  menurunkan ketebalan otot polos bronkiolus mencit asma
Kata Kunci: Asma, ketebalan otot polos bronkiolus, ektrak propolis

## ABSTRACT
Bronchial asthma is characterized by chronic airway inflammation, and clinically arises airway narrowing (wheezing and dyspnea) and coughing. The purpose of this study was to  determine  the  effect  of  propolis  extract  as  asthma  therapy  on  bronchiolus  smooth muscle thickness in asthma mice. 25 female Balb / C mice that met the inclusion criteria were  divided  into  5  groups.  Normal  control  (K1),  negative  control  (K2),  theophylline (K3), propolis extract (K4), combination of theophylline + propolis extract (K5). On day 0, mice were sensitized with 10 µg OVA + 1 mg of Alhydrogel in 0.5 mL of sterile 0.9% NaCl intraperitoneally. On the 14th day 20µg OVA + 2 mg Alhydrogel in 0.5 mL sterile NaCl 0.9% intraperitoneally On the 21st, 23rd, 25th mice were inhaled OVA1%. On the 26th to 39th day the K3 group was given theophylline 0.338 mg / day, the K4 group was given a propolis extract dose of 4 mg / day and the K5 group was given a theophylline + propolis extract combination. On the 40th day the mice were terminated for bronchiolus smooth  muscle  thickness  analysis  Comparison  between  the  average  negative  group  on average  5.35 ± 0.06 μm can be derived with propolis extract (K4) an average of 3.73 ± 0.2 μm, p value = 0.01 meaning between the control group negative and propolis extract group there were statistically significant differences. Propolis extract has been proven to reduce the thickness of bronchiole smooth muscle in asthma  mice
Keywords: Asthma, bronchial smooth muscle thickness, propolis extract
http://cjp.jurnal.stikescendekiautamakudus.ac.id

## LATAR BELAKANG
Prevalensi asma di Indonesia tertinggi terdapat di Sulawesi Tengah (7,8%), di  Jawa  Tengah  prevalensi  asma  4,3%  sedangkan  di  DI  Yogyakarta  6,9%. Prevalensi  asma  menurut  Riset  Kesehatan  Dasar  (RISKESDAS)  lebih  sering terjadi  pada  wanita  usia  ≤  45  tahun (Badan  Penelitian  dan  Pengembangan Kesehatan, 2013). Asma merupakan penyakit pernapasan kronis, yang menyerang 1 – 18% populasi di  berbagai  negara  yang dapat dipicu oleh beberapa  faktor yaitu alergen,  cuaca,  infeksi  saluran  pernapasan  oleh  virus  dan  olah  raga.  (GINA, 2016).    Tujuan  dari  pengobatan  asma  adalah  untuk  memungkinkan  pasien  asma dapat mencapai fungsi paru normal dan tanpa gejala (Ichinose et al. , 2017).
Obstruksi  jalan napas pada penderita asma disebabkan oleh produksi  lendir yang berlebihan dan pada epitel serta lumen bronkiolus menunjukkan hiperplasia sel mukosa, dengan pengendapan lendir yang berlebihan ke dalam saluran napas. Epitel  bronkiolus  penderita  asma,  tampak  membran  basal  lebih  tebal  yang mengandung  beberapa  faktor  matriks  ekstraseluler  bila  dibandingkan  dengan bronkiolus normal., massa otot pada penderita asma  meningkat, yang disebabkan oleh  kombinasi hipertrofi otot polos dan hiperplasia.(Heart and Columbia, 2011) Propolis  adalah  zat  mirip  resin  yang  dikumpulkan  oleh  lebah  madu  dari tanaman  tertentu,  dimana  yang  paling  umum  adalah  tanaman Eucalyptus citriodora , Baccharis dracunculifolia dan Araucaria angustifolia (Szliszka et al. , 2013). Propolis merupakan getah dari lebah madu yang terdapat pada pepohonan, atau aliran getahyang dimanfaatkan   lebah untuk menutupi celah pada sarangnya (Wagh,  2013).    Propolis  mengandung  flavonoid  yang  tinggi  yang  berkhasiat sebagai antioksidan dan antiinflamasi dan memiliki aktivitas antimikroba. Ekstrak propolis telah dievaluasi memiliki efek sebagai imunomodulator dan terapi untuk asma  (El-Aidy et  al. ,  2015)  Tujuan  penelitian  ini  untuk  membuktikan  efek propolis sebagai antiasma terhadap  penurunan ketebalan  otot polos bronkioulus mencit asma.

## METODE PENELITIAN Jenis Penelitian
Jenis  penelitian  adalah  penelitian  eksperimen  dengan  desain posttest  only control  group  design. Penelitian  telah  mendapat ethical  clearance /  persetujuan dari  Komisi  Bioetika  Penelitian  Kedokteran/  Kesehatan  Fakultas  Kedokteran Universitas Islam Sultan Agung Semarang. Ethical Clearence
No. 65/II/2019/Komisi Bioetik.
Mencit Randomisasi K4 K1 K2 K1 O4 O3 O2 O1 K5 O5 OVA
Keterangan : R  : Randomisasi K1: Kelompok  normal K2: Kelompok negatif K3: Kelompok teofilin 0,338 mg/ hari K4: Kelompok ekstrak propolis 4mg/ hari K5 : Kelompok kombinasi teofilin  + ekstrak propolis O1 -  O5 : Observasi ketebalan  Otot Polos Bronkiolus
Populasi pada penelitian ini adalah mencit galur Balb/C jenis kelamin betina berumur  2-3  bulan  dengan  bobot  25-30  gram.  Sampel  penelitian  sesuai  dengan kriteria  inklusi,  yaitu  mencit  sehat,  bergerak  aktif  dan  tidak  mempunyai  cacat fisik.  Jumlah sampel keseluruhan adalah 25 ekor.
Instrumen penelitian terdiri dari sonde mencit, alat gelas,  mikroskop cahaya olympus, timbangan analitik, nebulizer, alat bedah minor (scalpel, pinset,gunting), alat  pembuatan  preparat  histopatologi.  Bahan  utama  yang  digunakan  antara  lain ekstrak  propolis  (PT.  Momen  Global  International)  POM-TR  :133673951, Theophylline  Anhydrous  (Shandong  Xinhua  Pharmaceutical.China).  Ovalbumin/ OVA ( Worthington Biochemical Corporation , USA)

## Identifikasi senyawa kimia pada ekstrak propolis
Identifikasi  senyawa  kimia  dilakukan  untuk  mengetahui  kandungan flavonoid, saponin dan tanin.
a. Identifikasi flavonoid dilakukan dengan cara menambahkan serbuk Magnesium dan 5 tetes HCl pekat terbentuk warna kuning merah
b. Identifikasi saponin dilakukan dengan cara menambahkan air 10 mL kemudian dikocok selama 10 detik. Terbentuk busa
c. Identifikasi  tanindilakukan  dengan  cara  menambahkan  pereaksi  FeCl3  1% terbentuk warna hijau violet

## Pengujian In-vivo ekstrak propolis pada mencit asma
Pengujian in-vivo pada mencit asma, (Palupi and Hasanah, 2018). Mencit di aklimatisasi  selama  7  hari  dengan  tetap  diberi  pakan  dan  minum  air  secara  ad libitum. Selain kelompok normal, pada hari ke-0 mencit disensitisasi  secara  intra peritoneal (i.p) dengan 10 μg Ovalbumin (OVA) + 1 mg alhidrogel dalam 0,5 mL larutan steril NaCl 0,9%. Pada hari ke- 14 diberi 20 μg Ovalbumin (OVA) +  2 mg alhidrogel  dalam  0,5  mL  larutan  steril  NaCl  0,9%.  Hari  ke-21,  ke-23,  ke-25, mencit diinhalasi dengan OVA 1  mg/mL dalam  larutan steril  NaCl 0,9% dengan menggunakan alat nebulizer.  Hari ke-26 sampai  hari ke-39 Kelompok K3 diberi teofilin  1  kali  sehari  dengan  dosis  0,338  mg/hari,  kelompok  K4  diberi  ekstrak propolis  1  kali  sehari  dengan  dosis  4  mg/hari,  kelompok  K5  diberi  kombinasi teofilin  dan  ekstrak  propolis  Hari  ke-40  dilakukan  dislokasi  leher  pada  mencit yang  sebelumnya  sudah  dianestesi  dengan  injeksi  ketamin  dosis  0,1  mg/kgBB secara  intraperitonial,  kemudian  diambil  organ  paru-paru  nya,  direndam  dalam PBS  Formalin  10%,  kemudian  dibuat  preparat  dan  dilakukan  uji  histopatologi untuk mengetahui ketebalan otot polos bronkiolus.
Analisis  data  statistik  dilakukan  dengan one  way  ANOVA kemudian dianalisis post hoc test untuk mengetahui beda antar 2 kelompok perlakuan. Data disajikan  dengan  nilai  rata-rata  ±  SD.  Signifikansi  didefinisikan  pada  tingkat  p <0,05

## HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Analisis Senyawa Kimia Ekstrak Propolis
Tabel 1. Hasil Analisis Senyawa Kimia Ekstrak propolis Identifikasi Hasil Ekstrak propolis Flavonoid Warna kuning merah + Saponin Terbentuk busa + Tanin Warna hijau violet +
Ekstrak propolis mengandung senyawa aktif flavonoid, saponin dan tannin. Propolis  mengandung  resin  (50%),  lilin  (30%),  penting  dan  minyak  aromatik (10%),  bee  pollen  (5%),  dan  zat  lainnya  (5%)  (Anjum  et  al.,  2019).  Kandungan kimia  propolis  lebih  dari  300  senyawa  termasuk  polifenol,  aldehida  fenolat, kuarsa  sequiterpene,  coumarin,  asam  amino,  steroid,  dan  senyawa  anorganik. Polifenol  merupakan  salah  satu  sumber  utama  pada  propolis  yang  mengandung flavonoid, asam fenolik dan ester. (De Castro et al., 2013)

## Hasil Analisis Normalitas Data Ketebalan Otot Polos Bronkiolus Bronkiolus
Tabel 2. Hasil analisis normalitas Shapiro Wilk Data Ketebalan Otot Polos
Tabel  2    menunjukkan  bahwa  ketebalan  otot  polos  bronkiolus  pada  semua kelompok  nilai p >0,05 artinya data berdistribusi normal.

## Hasil Analisis Homogenitas Data Ketebalan Otot Polos Bronkiolus
Tabel 3. Hasi Analisis Homogenitas Ketebalan Otot Polos Bronkiolus
Levene statistik df1 df2 Sig. 1,754 4 10 0,215
Berdasarkan  tabel  3  uji  homogenitas    menunjukkan  bahwa  ketebalan  otot polos bronkiolus nilai p > 0,05 artinya data homogen
Hasil analisis statistik rerata, SD, nilai F dan nilai p data ketebalan otot polos bronkiolus
Tabel 4. Rarata, SD, nilai F dan nilai p ketebalan otot polos bronkiolus
Kelompok Variabel Normal Negatif Teofilin Ekstrak Propolis Kombinasi Teofilin+ Ekstrak propolis Ketebalan  otot polos bronkiolus 0,694 0,915 1,000 0,463 0,463
Kelompok Variabel Normal Negatif Teofilin Ekstrak Propolis Kombinasi teofilin + Ekstrak propolis Rerata 3,52 5,35 3,70 3,73 3,66 SD 0,13 0,06 0,1 0,21 0,21 Nilai F 74,372 Nilai p 0,001
Tabel 4 menunjukkan nilai F 74,372 dan nilai p= 0,001 (<0,05) artinya ada perbedaan  yang  bermakna  ketebalan  otot  polos  bronkiolus  pada  masing  masing kelompok  penelitian.  Kelompok  negatif    mempunyai  nilai  rerata  paling  tinggi dibandingkan  dengan  kelompok  normal,  kelompok  teofilin,  kelompok  ekstrak propolis dan kelompok kombinasi teofilin dan ekstrak propolis.
Gambar  2.    Perbandingan  hasil  pemeriksaan  ketebalan  otot  polos  bronkiolus  pada  (K1) kelompok  normal,    (K2)  kelompok    negatif  ,  (K3)  kelompok  teofilin,    (K4) kelompok  Ekstrak  propolis.    (K5),  kelompok  kombinasi  teofilin  dan  ekstrak propolis dengan pewarnaan HE (Hematoxylin Eosin), perbesaran 400x
Gambar 3. Grafik Rerata Ketebalan Otot Polos Bronkiolus Mencit (µm)

## pada semua kelompok perlakuan
Hasil  pengamatan  histopatologi,  yang  paling  tinggi  ada  pada  kelompok negatif (K2) rata-rata 5,35 ±0,06 µm. Perbandingan antara kelompok negatif (K2) rata-rata  5,35  ±0,06 µm  dengan  kelompok teofilin  (K3)  rata-rata  3,70±  0,10  µm nilai  p=0,001  artinya  antara  kelompok  negatif  dan  kelompok  teofilin  ada
0 1 2 3 4 5 6 NORMAL NEGATIF TEOFILINEKSTRAK PROPOLIS TEOFILIN + EKSTRAK PROPOLIS µm KELOMPOK KETEBALAN OTOT POLOS BRONKIOLUS K5 K4
perbedaan  yang  bermakna.  Perbandingan  antara  kelompok  negatif  (K2)  rata-rata 5,35 ±0,06 µm dengan kelompok ekstrak propolis (K4) rata-rata 3,73 ± 0,21 µm nilai p =0,001 artinya antara kelompok negatif dan kelompok ekstrak propolis ada perbedaan  yang  bermakna.  Perbandingan  antara  kelompok  negatif  (K2)  rata-rata 5,35 ±0,06 µm  dengan kelompok kombinasi teofilin + ekstrak propolis (K5) rata- rata 3,66 ± 0,21 µm nilai p =0,001 artinya antara kelompok negatif dan kelompok kombinasi teofilin dan ekstrak propolis ada perbedaan yang bermakna.
Pada  penelitian  Sriwahyuni  2010  ovalbumin  akan  meningkatkan  kadar Imunoglobulin E (IgE), sehingga  mengakibatkan  degranulasi  sel  mast  yang  akan melepaskan mediator vasoaktif antaralain histamin. (Sriwahyuni, Risza and Yuni, 2010).
Propolis  sebagian  besar  terdiri  dari  fenol,  terpen,  asam  amino,  vitamin,dan gula  (Bankova,  Popova  and  Trusheva,  2014).    Suplementasi  propolis menunjukkan  efek  potensial  dan  positif  dapat  menurunkan  secara  signifikan penanda  inflamasi  yaitu  interleukin-6  (IL- 6).  TNFα  dan  CRP  yang  dikaitkan dengan  sejumlah  besar  penyakit  tidak  menular  (Zhao  et  al.,  2016).  Propolis mempunyai  efek  antiinflamasi  yang  secara  langsung  dapat  mempengaruhi penurunan sitokin pro inflamasi (Al-Waili et al., 2012)
Pemberian  ekstrak  propolis  pada  mencit  asma  yang  diinduksi  conalbumin menunjukkan penurunan skor inflamasi secara signifikan dan dapat memperbaiki asma,  hal  tersebut  dikarenakan  ekstrak  propolis  mengandung  flavonoid  dan fenolik  yang  mempunyai  aktivitas  antioksidan  (El-Aidy  et  al.,  2015). Perbandingan antara kelompok teofilin (K3) ketebalan otot polos bronkiolus rata- rata 3,70± 0,10 µm dengan kelompok ekstrak propolis (K4) dengan ketebalan otot polos bronkiolus rata-rata 3,73 ± 0,21 µm nilai p=0,795, artinya antara kelompok teofilin  dan  kelompok  ekstrak  propolis  tidak  ada  perbedaan  yang  bermakna. Perbandingan  antara  kelompok teofilin  (K3)  diperoleh  hasil  ketebalan  otot  polos bronkiolus  rata-rata  3,70±  0,10  µm  dengan  kelompok  kombinasi  teofilin  dan ekstrak propolis (K5) dengan ketebalan otot polos bronkiolus rata-rata 3,66±0,21 µm  nilai  p=0,795,  artinya  antara  kelompok  teofilin  dan  kelompok  kombinasi teofilin dan ekstrak propolis tidak ada perbedaan yang bermakna.
Teoflin  merupakan  obat  golongan  methylxanthine  penghambat  reseptor adenosine (reseptor A1 dan A2) poten, yang dapat melebarkan saluran pernapasan dan  merelaksasi  otot-otot  pada  saluran  pernapasan  sehingga  bernapas  menjadi lancar  (Momeni  and  Mohammadi,  2009).    Injeksi  aminofilin  dapat  menurunkan ketebalan otot polos bronkiolus pada  mensit asma (Palupi, 2017). Hipertrofi otot polos,  dan  dinding  saluran  napas  yang  menebal  diduga  berkaitan  dengan  airway hyperresponsiveness (AHR) (Halwani, Al-Muhsen and Hamid, 2010).
Pemberian  teofilin  dapat  merelaksasi  otot  polos  saluran  nafas  oleh penghambatan  aktivitas  fosfodiesterase  (PDE),  namun  denmikian  dibutuhkan konsentrasi  yang  tinggi  untuk  relaksasi  maksimal.(Barnes,  2010).  Aktivitas biologis  propolis  dikarenakan  tingginya  kadar  asam  fenolik  dan  flavonoid  yang bertanggung jawab dalam mengontrol respon peradangan (MacHado et al., 2012)

## SIMPULAN DAN SARAN

## Simpulan
Ekstrak  propolis  dapat  menurunkan  ketebalan  otot  polos  bronkiolus  pada mencit asma.

## Saran
Diperlukan  penelitian  dengan  variasi  dosis  ekstrak  propolis  dan  penelitian lanjutan  dengan  memeriksa  diameter  epitel  bronkiolus,  dan  jumlah  eosinofil mencit asma.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Ucapan  terimaksih  kami  haturkan  kepada  program  studi  Farmasi  STIKES Cendekia Utama Kudus yang telah memfasilitasi penelitian ini

## DAFTAR PUSTAKA
Al- Waili, N. et al. (2012) ‘Synergistic effects of honey and propolis toward drug multi-resistant  Staphylococcus  Aureus,  Escherichia  coli  and  Candida Albicans isolates in single and polymicrobial cultures’, International Journal of Medical Sciences, 9(9), pp. 793 – 800.
Anjum, S. I. et al. (2019) ‘Composition and functional properties of propolis (bee glue):  A  review’,  Saudi  Journal  of  Biological  Sciences.  King  Saud University, 26(7), pp. 1695 – 1703.
Badan  Penelitian  dan  Pengembangan  Kesehatan  (2013)  ‘Riset  Kesehatan  Dasar (RISKESDAS) 2013’, Laporan Nasional 2013, pp. 1– 384. doi: 1 Desember 2013.
Bankova, V., Popova, M. and Trusheva, B. (2014) ‘Propolis volatile compounds: Chemical  diver sity  and  biological  activity:  A  review’,  Chemistry  Central Journal, 8(1), pp. 1 – 8.
Barnes, P. J. (2010) ‘Pharmaceuticals 2010, 3, 725 - 747’;, pp. 725– 747.
De  Castro,  P.  A.  et  al.  (2013)  Identification  of  the  cell  targets  important  for propolis-induced  cell  death  in  Candida  albicans,  Fungal  Genetics  and Biology. Elsevier Inc.
El- Aidy,  W.  K.  et  al.  (2015)  ‘Evaluation  of  propolis,  honey,  and  royal  jelly  in amelioration  of  peripheral  blood  leukocytes  and  lung  inflammation  in mouse  conalbumin-induced  asthma  mo del’,  Saudi  Journal  of  Biological Sciences. King Saud University, 22(6), pp. 780 – 788.
GINA,  G.  I.  for  A.  (2016)  ‘Global  Strategy  for  Asthma  Management  and Prevention’, Global Initiative for Asthma, p. update.
Halwani,  R.,  Al-Muhsen,  S.  and  Hamid,  Q.  (201 0)  ‘Airway  remodeling  in asthma’,  Current  Opinion  in  Pharmacology.  Elsevier  Ltd,  10(3),  pp.  236– 245.
Heart, P.  and  Columbia,  B. (2011)  ‘Clinical  update on the  use of  biomarkers  of airway inflammation in the management of asthma’, pp. 77– 86. Ichinose,  M.  e t  al.  (2017)  ‘Japanese  guidelines  for  adult  asthma  2017’, Allergology International. Elsevier B.V, 66(2), pp. 163 – 189.
MacHado,  J.  L.  et  al.  (2012)  ‘Brazilian  green  propolis:  Anti -inflammatory property by an immunomodulatory activity’, Evidence -based Complementary and Alternative Medicine, 2012.
Momeni, A. and Mohammadi, M. H. (2009) ‘Respiratory delivery of theophylline by  size- targeted  starch  microspheres  for  treatment  of  asthma’,  Journal  of Microencapsulation, 26(8), pp. 701 – 710. Palupi, D. A. (2017) ‘Gambaran Histopatologi Otot Polos Bronkus Mencit Asma Yang Diitervensi Aminofilin’, Prosiding HEFA, 53(9), pp. 1689– 1699. Palupi,  D.  A.  and  Hasanah,  F.  N.  (2018)  ‘Pengaruh  Pemberian  Suplementasi
Minyak Zaitun Terhadap Penurunan  Ketebalan Epitel Bronkus  Pada Menct Asma  Yang  Diinduksi  Ovalbumin’,  Cendekia  Journal  of  Pharmacy,  2(2), pp. 109 – 115.
Sriwahyuni,  E.,  Risza,  Q.  and  Yuni,  A.  .  (2010)  ‘Black  Seed  (Nigella  sativa) Extract  Prevent  The  Thickening  of  Bronchus  and  Increase  The Circumference  Of  Bronchial Lumen  in  Asthma  Model  Mice’,  Jurnal kedokteran Brawijaya, 26(1), pp. 37 – 42.
Szliszka,  E.  et  al.  (2013)  ‘Ethanolic  extract  of  polish  propolis:  Chemical composition  and  TRAIL-R2  death  receptor  targeting  apoptotic  activity against  prostate  cancer  cells’,  Evi dence-based  Complementary  and Alternative Medicine, 2013.
Wagh  (2013)  ‘Propolis:  A  wonder  bees  product  and  its  pharmacological potentials’, Advances in Pharmacological Sciences, 2013.
Zhao, L. et al. (2016) ‘Brazilian green propolis improves antioxidant function  in patients  with  type  2    diabetes  mellitus’,  International  Journal  of
Environmental Research and Public Health, 13(5)