## Isolasi Bakteri Penghasil Poli- â- Hidroksi Butirat (PHB) dari Limbah Cair Tapioka
Isolation Bacteria produce Poly-â-Hi droxy Butirate (PHB) from Tapioca Liquid Waste
Ifandari, Reny Pratiwi
Fakultas Ilmu Kesehatan Universitas Setia Budi Surakarta, email: if7099@yahoo.com, reny.pratiwi@gmail.com

## ABSTRAK
Tapioca liquid waste is the source of carbon waste and  potencial source  as raw  material  making  of  PHB. This  Waste  not  yet  been  exploited  optimaly.  The  aim  of  this  research  was  getting    bacterium    isolat  produces  PHB so that tapioca liquid waste can be exploited  optimal   as  raw  material  making of PHB without added  other baktreri agent outside waste.
Penelitian  ini  dilakukan  di  laboratorium  Mikrobiologi  USB  dan  laboratorium  Biologi  Tanah,  UNS.  Sampel  limbah cair tapioka didapatkan dari daerah desa Margoyoso, kab. Pati, prov. Jawa Tengah. Teknik isolasi bakteri dengan seri pengenceran dari 2 6 10   sampai  10   yang  ditumbuhkan  secara  taburan  pada  medium  nutrient  agar.  Dari  46  koloni  yang  dipisahkan, didapatkan  15  plate  yang  positif  menghasilkan  PHB.  Komunitas  bakteri  yang  ada  pada  tiap  biakan  dari  ke  15  plate terdiri dari 4 jenis. Jenis bakteri yang adalah bentuk bacill panjang, basil pendek, cocus dan spiral.
Limbah cair tapioka merupakan limbah yang kaya akan sumber karbon dan berpotensi sebagai bahan baku pembuatan Poli- â - Hidroksi Butirat (PHB). Limbah ini belum dimanfaatkan secara optimal. Tujuan dari penelitian ini adalah mendapatkan isolat bakteri yang menghasilkan PHB sehingga limbah cair tapioca dapat dimanfaatkan secara optimal sebagai bahan pokok pembuatan PHB tanpa penambahan agen baktreri lain di luar limbah.
Kata kunci: isolasi, bakteri, limbah, tapioka, PHB

## ABSTRACT
This research conducted by researcher in  Microbiological laboratory USB and Biological  soil laboratory UNS. Sampel tapioka liquid waste got from Margoyoso area, Pati , Central Java. Isolation  bacterium  done with dilution 2 6 series  from  10   until  10   which  was  growth  by  pour  plate  at  nutrient  agar  medium.  The  result  got    46  dissociated colony,  from  its  got  15  plate  which  are  positive  yield  PHB.  Community  Bacterium  was  founded    in  every  breeding from  to 15 plate consist of 4 type.  There was four Bacterium  types  which is form long bacillus, short bacillus, spiral and cocus.
Kata kunci: isolation, bakteria, tapioca waste, PHB

## PENDAHULUAN
Plastik  pada akhir – akhir ini seakan menjadi bahan pokok bagi kehidupan.  Pengunaan plastik sangat vital di kehidupan.  Semua produk dalam proses pengemasannya menggunakan plastik. Hal ini  membawa  dampak  dengan  meningkatnya limbah plastik buangan yang dihasilkan. Sampah plastik  menjadi  masalah  yang  paling  susah dipecahkan.  Limbah  plastik  tergolong  limbah yang  tidak  bisa  diuraikan  dan  menjadi  masalah sendiri  dalam  tanah.  Adanya  limbah  plastik dalam  tanah  menghalangi  keterserapan  air  dari permukaan  tanah  ke  dalam  tanah,  belum  lagi masalah  kesuburan  tanah  yang  menurun  akibat adanya plastik dalam tanah. Oleh kerena itu perlu dilakukan  pemecahan  permasalahan  agar  semua
proses pengemasan dan higenisitas terjadi dan juga  limbahnya  tidak  merusak  lingkungan. Solusi  dari  keadaan  tersebut  adalah penggunaan  plastik  terdegradasi.  Plastik terdegradasi  adalah  plastik  yang  berasal  dari bahan bahan organik yang dapat didegradasi oleh mikroorganisme  di  lingkungan.  Bahan  utama plastik  terdegradasi    adalah  bahan  dari  hasil pertanian  seperti  singkong,  jagung  dan  dapat juga  dari  hidrolisis  limbah  sawit  (Artianto, 2003).  Salah  satu  jenis  plastik  terdegradasi adalah  golongan  Polihidroksil  Alkanoat  (PHA). PHA  dan  kopolimernya    diproduksi  dari substrat tertentu yang kaya sumber karbonya tapi minimum  kandungan  mineralnya  (Yogesh  et  al. 2012).

## BIOMEDIKA
ISSN : 1979 - 035X (printed edition) ISSN : 2302 - 1306 (electronic/Portal e-Journal)
Available online at www.biomedika.ac.id Volume 7, No.2, September 2014
1.Apakah di dalam limbah cair tapioka terdapat bakteri  yang  dapat  menghasilkan  senyawa kelompok PHA?
PHA juga dihasilkan dari hasil penunbuhan bakteri  tertentu  pada  substrat  tertentu.  Salah satu kopolimer dari PHA adalah  Poli-â-hidroksi butirat  (PH B).  PHB  merupakan  salah  satu  biji plastik  yang  berkualitas  bagus.  Sehingga keberadaan  PHB  memiliki  nilai  ekonomi  yang penting.  Bakteri  yang  dapat  mensintesis  PHA antara lain  kelompok dari genus Pseudomonas, Bacillus,  Ralstonia,  Aeromonas,  Rhodobacter dan beberapa kelompok Arkhaea. (Ojumu et al, 2004).  Substrat  yang  telah  digunakan  sebagai bahan antara lain: hidrolisat  tapioka (Aremu et al 2011) , limbah  Pati Sagu (Atifah dkk, 2007), dan limbah cair tapioka (Sangyoka et al .2012). Keberadaan  limbah  cair  tapioka  di  beberapa wilayah  banyak    menjadi  masalah  yang  berarti bagi masyarakat . Adanya  limbah  yang dibuang lingkungan  menyebabkan  kontaminasi  air  tanah dan  penyakit  bagi  masyarakat  sekitar.  Limbah tapioka  jika  tidak  diolah  dengan  benar menimbulkan  banyak  penyakit  antara  lain;  gatal – gatal, bau tidak sedap, dan mencemari perairan. Kandungan  bahan  organik  sangat  tinggi  pada limbah cairnya. Bahan organik   yang ada dalam limbah  dapat  dimanfaatkan  sebagai  substrat hidup  bagi  mikrobia,  terutama  bakteri.  Limbah cair  yang  tidak  diolah  secara  benar  akan menimbulkan bau.  Adanya bau itu dapat terjadi akibat  adanya  aktivitas  mikrorganisme.  Adanya komunitas  bakteri  yang  ada  pada  limbah  cair tapioka,  dimungkinkan  terdapat    jenis  –  jenis bakteri  yang  dapat  menghasilkan  PHA  dan kopolimernya.
Permasalahan yang akan diteliti adalah :
2.Seberapa besar  isolate – isolate bakteri tersebut mampu menghasilkan senyawa PHB ?

## METODE

## Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah; elenmeyer, tabung reaksi,gelas benda, tabung  cuvet,  gelas  ukur,  gelas  kimia,  cawan petri, corong, sendok tanduk, rak tabung, ose, Bunsen,  pipet  tetes,  senrifuge,  spuit,  oven,
autoklaf , neraca analitik, incubator, enkas, hotplate , waterbath , shaker incubator , UV transluminator, spektrofotometer UV.
Bahan  yang  digunakan  adalah  limbah  cair tapioca yang diambil dari daerah desa Margoyoso, kab.  Pati,  medium Nutrien  Agar (NA),  Medium Nutrient  Broth (NB)    Medium  Minimal  Mineral (MSM), pewarna Sudan Black sebagai indikator, Sodium  hypoklorit ,  aseton,  dietil  eter,  H SO 2 4 pekat,  buffer  fosfat,  PHB  murni  sebagai standart, spiritus,  akuades steril.

## Bahan
Prosedur kerja pada penelitian ini terdiri dari bagian  persiapan,  proses  isolasi  bakteri,  proses pengkulturan  isolate  pada  medium  MSM  dan pengukuran produk PHB.
Prosedur Kerja
Pembuatan medium Nutrient Agar (NA)
Ditimbang  5  gram  bactopepton,  5  gram ekstrak ragi dan 20 gram bacto agar . Bahan – bahan yang ditimbang dilarutkan  dengan 1 liter dan  dipanasi  sampai  larut  sempurna.  Medium yang telah larut kemudian disterilisai pada suhu
0 121  C dengan tekanan 2 atm selama 15 menit.
Pembuatan medium Nutrient Broth (NB) Ditimbang   5 gram bactopepton dan 5 gram ekstrak  ragi.  Bahan  –  bahan  yang  ditimbang dilarutkan    dengan  1  liter  dan  dipanasi  sampai larut sempurna. Selanjutnya disterilisai pada suhu
0 121  C dengan tekanan 2 atm selama 15 menit.

## Pembuatan Medium Minimal Mineral (MSM)
Bahan  yang  digunakan  dalam  pembuatan Medium Minimal Mineral  adalah  3 gr sodium klorida, 1,5 gr dipotasium hydrogen orto posfat , 1  gr  magnesium  sulfat,  5  gr  sukrosa,  0.5  gram ammonium  nitrate,  dan  1  liter  akuades  diatur pada pH 7. Medium kemudian disterilisasi pada
0 suhu  121  C  dengan  tekanan  2  atm  selama  15 menit. Untuk medium MSM agar dibuat dengan menambahkan  agar  pada  MSM  cair  sebanyak 1,5 %.
16    IFANDARI, RENY PRATIWI Biomedika
Isolate yang ditanam pada NB diambil 1 ml ditanam pada medium MSM agar dengan metode
0 pour  plate.  Diinkubasi  pada  suhu  36  C  selama 3  x  24  jam.  Plate  diambil  diamati  pertumbuhan koloninya.  Koloni  kemudian  diwarnai  dengan pewarna sudan black 0,02 % (w/v) pada pelarut etanol  70%.  Waktu  kontak  koloni  dengan  cat antara  15  –  20  menit,  setelah  itu  dicuci  dengan etanol  96%.  setelah  itu  diamati  warna  koloni setelah di- washing .

## Pengambilan Sampel limbah
Sampel diambil dari ketiga titik pemgambilan. Masing – masing sampel dimasukkan pada wadah berupa  botol  gelap  dan  dibawa  menggunakan thermostat.  Hal  ini  dimaksudkan  agar  aktivitas mikrobia  terminimalkan.  Sampel  kemudian dibawa  ke  laboratorium  mikrobiologi  dan dilakukan  penananam  pada  media  yang  telah dipersiapkan.

## Isolasi bakteri dari limbah
Diambil 1 mL limbah cair tapioca  dimasukkan dalam  tabung  dan  ditambah  9  mL  aquades  steril.
2 Setelah  itu  dibuat  seri  pengenceran  pada  10 ,
3 4 5 6
10 ,  10 ,  10   dan  10 .    Setelah  itu  diambil  1  mL dan  ditambahkan  medium  NA  cair  sebanyak 20  ml  dan  dicampur.  Setelah  itu  diinkubasi  pada
0 suhu  28  C  selama  24  –  48  jam.  Koloni  pada plate dihitung,  jika  masih spreading dilakukan pengenceran  sampai  didapatkan  koloni  yang dapat terpisah dengan baik.

## Pemurnian Isolat
Setiap  koloni  kemudian  ditanam  pada  NA plate untuk  dilakukan  proses  pemurnian isolate . Setelah  didapatkan  koloni  yang  sama  pada setiap plate diambil satu koloni dan ditanam pada medium NB.

## Uji Skreening Produksi PHB

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil yang didapat dari penelitian ini adalah didapatkan  46  kultur  dari  tiap  koloni  yang dipisahkan.  Pemilihan  koloni  yang  dipisahkan berdasarkan perbedaan penampakan koloni yang tumbuh.  Kultur  murni  yang  tumbuh  ada  yang bersifat  aerob  43  isolat  dan  3  isolat  bersifat fakultatif  anaerob.
Kultur murni kemudian ditanam pada medium MSM  agar,  setelah  itu  diinkubasi  selama  3  hari
0 pada suhu 35  C. Koloni yang tumbuh kemudian dicat  dengan  Sudan  Black.  Berdasarkan perulangan  pengambilan  dan  pengkulturan didapatkan 15 sampel yang positif menghasilkan PHB. Isolat positif menghasilkan PHB berwarna biru kehitaman koloninya jika dicat dengan sudan black (Gambar 4). Isolat yang tidak menghasilkan PHB berwarna putih (Gambar 3).
Gambar 1. Hasil Penanaman Limbah             Gambar 2. Pemisahan Koloni
Gambar 3.Isolat tidak menghasilkan PHB   Gambar 4. Isolat yang menghasilkan PHB
Biomedika    17
Medium  MSM  merupakan  medium  yang minimal  nutrisi  yang  dapat  digunakan  sebagai medium  tumbuh  beberapa  jenis  bakteri  yang berpotensi penghasil PHA ataupun PHB. Medium ini disuplement  sumber karbon baik berupa gula maupun  karbohidrat  rantai  panjang  seperti  pati. Bakteri  yang  positif  terhadap  pewarnaan  Sudan Black,  memiliki  cadangan  karbon  di  dalam  sel yang  berupa  PHB.  Granula  PHB  mampu menyerap  pewarna  sudan  Black  sehingga warnanya  tetap  biru  kehitaman  walau  sudah dilakukan  pembilasan.  Hal  ini  sesuai  dengan penelitian  Panigrahi  and  Ujwala  (2013) Screening dan Isolasi bakteri dari tanah.
Tabel 1. Koloni yang menghasilkan PHB
No No Kultur koloni Berat Kering gr / ml 1 37 0,880 2 36 0,900 3 19 0,830 4 31 0,585 5 13 0,760 6 23 0,770 7 18 0,855 8 28 0,900 9 211 0,900 10 22 0,905 11 172 0,855 12 24 0,910 13 232 0,825 14 222 0,680 15 192 0,940
Sisa  pati  pada  limbah  cair  tapioka  masih cukup banyak. Hanya saja sifat dari limbah cair tapioca  mempunyai  pH  rendah  antara  4  –  5,5. Keberadaan  komunitas  bakteri  yang  ada  di limbah  terbatas  jenisnya.  Jenis  –  jenis  bakteri yang ada pada limbah dilihat potensinya dalam menghasilkan  PHB.  Pengujian  potensi  bakteri dalam  memproduksi  PHB  diuji  dalam  medium MSM cair dengan sumber karbon glukosa 20%. Inokulum dari 15 plate uji dengan nomer seperti pada Tabel 1. ditanam pada MSM cair sebanyak
Setelah  itu  bakteri  dari  tiap  koloni  juga  dicat dengan pewarna gram . Berdasarkan hasil pengecatan didapatkan hasil seperti pada Gambar 5.
0 100µL sel. Setelah 3 x 24 jam pada suhu 36  C dipanen  dengan  cara  mensentrifuge  pada kecepatan  1500  rpm  selama  10  menit. Supernatan  yang  berupa  sel  dipipet  sebanyak 1 mL diukur berat  basah dan berat kering masa sel.  Besarnya  produksi  PHB  dilihat  dari  berat kering massa sel saja.
Berdasarkan hasil pengujian didapatkan berat kering massa sel yang berkisar antara 0,585 gr/mL hingga  0,940  gr/mL.  Hasil  yang  tidak  berbeda jauh  antar  no  koloni  hasil  isolasi.  Jumlah  ini dimungkinkan karena massa sel dari jenis – jenis bakteri sama besar.
Berdasarkan hasil pengamatan morfologi bakteri yang  ada  dalam  medium  MSM,  didapatkan  hasil semua  slide  bakteri  membentuk  koloni  yang masih  bercampur  yang  terdiri  dari  empat  bentuk bakteri  yaitu  :  batang  panjang,  batang  pendek, cocus dan  spriral.  Komunitas  jenis  bakteri  yang terbanyak  adalah  batang  panjang>batang  pendek >cocus>spiral.  Komunitas  ini  yang  membentuk PHB pada medium MSM.
18    IFANDARI, RENY PRATIWI
Biomedika
Limbah  cair  tapioca  memiliki  sifat  yang  pH sangat  rendah  antara  4  –  5,5  dan  ditambah  lagi kandungan  sianida  yang  tinggi.  Hal  ini mempengaruhi  pada  jenis  –  jenis  bakteri  yang dapat  tumbuh  pada  keadaan  lingkungan  yang ekstrim. Jenis – jenis bakteri yang telah diketahui dapat menghasilkan PHB antara lain Pseudomonas sp,  Bacillus  sp,  E.coli,  Rastonia  eutropha, Azotobacter,   Micrococcus,   Alcaligenes, Cupriavidus  necator dan  lain  –  lain.  Jika  dilihat dari  bentuk  morfologi,  komunitas  bakteri  yang ada  dalam  limbah  cair  tapioca  adalah  dari  genus Bacillus sp, Pseudomonas sp  dan  jenis  lain  yang berbentuk spiral.
Gambar.5. Morfologi Bakteri dengan Pengecatan Gram
Terdapat  komunitas bakteri penghasil PHB pada limbah cair tapioca yang dapat ditumbuhkan pada  medium  MSM.  Komunitas  bakteri  terdiri dari  empat  jenis  bakteri  dengan  bentuk  batang panjang, batang pendek, cocus dan spiral.

## KESIMPULAN

## DAFTAR PUSTAKA
Aremu  Mo,  Aransiola  E.F.  layokun  Sk.  And  Solomon.  2011. Production of Polyhydroxybutyrate (PHB)by Pseudomonas putida strain  KT  2440  on  Cassava  Hydrolisate  medium. Res .J. Chem Sci. Vol 1 (4) pp. 67 – 73
Yogesh C, Bhavana P, Fulekar. 2012. PHA production Application and its Bioremidiation in environment. I.Res.J.Environment Sci Vol 1 (2) pp. 46 – 52
Sangyoka,  S,  N.  Poomipuk  and A  Reungsang.2012.  Optimum condition for the production of Polyhydroxybutyrate from Cassava waste water by the newly Isolated Cupriavidus sp. KKU 38. Sains Malaysiana 41(10).pp 1211 – 1216.
Panigrahi Sunitha and Ujwala Badveli .2013.  Screening, Isolation and Quantification of PHB-Producing Soil Bacteria. www.ijesi.org Volume 2( 9)  PP.01-06
Ostle A and J.G Holt. 1982. Nile blue A as  a Fluoresencent stain for Poly – B- Hydroxybutirate. Applied and Environmental Microbiology.Vo l .44 (1).pp 238 – 241.
Ojumu  Tv,  Yu  J  and  Solomon  .2004.  Minireview:  Production of  Polyhydroxy alkanoates , bacterial biodegradable poliner. African J Of Biotecnology Vol 3 (1) pp 18 – 24.
Haedar N, Fahruddin, Firdaus Zenta dan Nurlaela.2013. Produksi Poly-â-hidroksi  butirat  (PH B)  pada  Isolat  Bakteri  dari Molasses dan Tanah pabrik gula. Respository.unhas.ac.id.
Atifah  N,  Khaswar  Syamsu,  Ani  Suryani.  2007.  Kajian Fermentasi Bioplastik Poli -3- Hidroksi Alkanoat (PHA) oleh  Ralstonia  Eutropha  Menggunakan  Sumber  Karbon Hidrolisat pati Sagu. Jurnal Teknologi Pertanian Vol 8(3) pp 160 - 171.
Volume 7, No.2, September 2014
Biomedika    19
Artianto,S  2003.Kajian  Biodegradasi Bioplastik  Poli-â- hidroksialkanoat  dengan  penambahan  Pemlastis  Dimetil Ftalat  dan  Dimetil  Glikol  dalam  Media  Padat  Buatan.
Skripsi. Jurusan Teknologi Industri Pertanian.Universitas Hasanudin.