PENGARUH KADAR GLUKOSA TERHADAP EKSPRESI PROTEIN AdhO36

## BAKTERI Salmonella Typhi
Sri Winarsih*  , Hidayat Sujuti**, Aulia Yasmin*

## Abstrak
Demam tifoid yang disebabkan oleh Salmonella Typhi merupakan salah satu penyakit infeksi terbanyak penyebab  rawat  inap  penderita  di  Indonesia.  Sehingga  diperlukan  penelitian  tentang  faktor-faktor  yang mempengaruhi patogenesitas dari S .Typhi salah satunya adalah kadar glukosa. S. Typhi diketahui memiliki molekul adhesin pada bagian outer membrane protein (OMP) dengan berat molekul 36 kDa atau disebut juga AdhO36. Molekul adhesin ini berfungsi sebagai perlekatan bakteri pada sel hospes. Pada penelitian ini ingin diketahui pengaruh kadar glukosa terhadap ekspresi protein AdhO36 OMP S. Typhi. Perlakuan glukosa diberikan pada lima kelompok bakteri yaitu konsentrasi 40 mg/100mL, 80 mg/100mL, 160 mg/100mL, 240 mg/100mL dan 320 mg/100mL. Hasil elektroforesis OMP pada lima kelompok bakteri tersebut menunjukkan peningkatan  ketebalan  pita  protein,  yaitu  semakin  tinggi  kadar  glukosa  akan    semakin  tebal  protein  yang terekspresi. Ketebalan pita protein OMP 36 kDa dibaca menggunakan program Corel Photo Paint 11. Hasil analisis statistik menunjukkan perbedaan yang tidak bermakna (ANOVA, p = 0,559), namun secara deskriptif terlihat adanya peningkatan ketebalan protein OMP 36 kDa pada perlakuan konsentrasi glukosa yang makin besar. Kesimpulan penelitian ini adalah peningkatan kadar glukosa cenderung akan meningkatkan ekspresi protein AdhO36 S . Typhi.
Kata kunci : AdhO36, Kadar Glukosa, OMP, Salmonella Typhi
THE INFLUENCE OF  GLUCOSE CONCENTRATION TO AdhO36 Salmonella Typhi PROTEIN EXPRESSION

## Abstract
Typhoid fever caused by Salmonella Typhi is one of the most infectious disease which causes patient hospitalization in Indonesia. It needs some research to determine factors contributed to the pathogenicity of S . Typhi and glucose concentration is one of the factors. The outer membrane protein (OMP) of S . Typhi with molecular weight of 36 kDa named AdhO36 is known as adhesin molecule. Adhesin has function to adhere the bacteria to host cell. This study aimed  is to know the influence of  glucose with different concentration to the AdhO36 S . Typhi protein expression.  There are 5 groups of bacteria that treated with different glucose concentration,    40  mg/100mL,  80  mg/100mL,  160  mg/100mL,  240  mg/100mL,  and  320  mg/100mL.  The electrophoregram of S . Typhi OMP  showed that the thickness of AdhO36 protein were in line with glucose concentration,  the  higher  the  glucose  concentration  the  thicker  the  AdhO36  protein  band.  The electrophoregram was analyzed using Corel Photo Paint 11 and statistical analysis showed that there were no significant differences between groups (ANOVA, p = 0.559). However, the thickness of OMP 36 kDa band was  increased    by  increasing  glucose  consentration,  descriptively.    The  conclusion  was  glucose concentration tend to increase AdhO36  protein expression.
Keywords: AdhO36, glucose concentration, OMP , Salmonella Typhi
* Laboratorium Mikrobiologi ,FK UB ** Laboratorium Biokimia, FK UB *** Program Studi Pendidikan Dokter, FK UB
 E-mail: Wiensri238@gmail.com

## Pendahuluan
Demam  tifoid  merupakan  suatu penyakit  infeksi  yang  disebabkan  oleh bakteri  Gram    negatif Salmonella Typhi  ( S . Typhi).  Demam  tifoid  ditularkan  melalui kontaminasi  makanan  dan  minuman  atau biasa disebut oral-fecal transmission. 1 Pada tahun  2000,  terdapat  21,7  juta  penderita demam  tifoid  dan  217.000  kematian karena demam  tifoid. 2 Berdasarkan The  Global Burden  of  Typhoid ,  Indonesia  termasuk dalam  kategori high  incidence yang  apabila diestimasikan  terdapat  110  penderita demam  tifoid  dari  100.000  penduduk  setiap tahunnya. 3 Demam  tifoid  dan  paratifoid berada  pada    urutan  ke-3  dalam  peringkat penyakit  yang  menyebabkan  rawat  inap  di Indonesia di tahun 2010. 4 S. Typhi  merupakan  bakteri  Gram negatif yang memiliki banyak faktor virulensi yang  dapat mempengaruhi  patogenesis
infeksi  dari  bakteri  ini. 5 Telah  diketahui bahwa S .  Typhi  memiliki  protein  adhesin yang  berasal  dari  OMP  dengan  berat molekul  36  kDa  yang  bernama  AdhO36. Protein  adhesin  ini  berfungsi  untuk  melekat pada  sel  hospes.  Setelah  terjadi  perlekatan dan  invasi  ke  sel  hospes,  selanjutnya terjadilah  infeksi  dari  bakteri  ini.  Imunisasi protein  AdhO36  secara  oral  telah  terbukti meningkatkan protektivitas dalam menghambat perlekatan S . Typhi pada usus mencit.  Lebih  lanjut  dilaporkan  bahwa protein  AdhO36  bersifat  imunogenik  yaitu mampu  merangsang  imunitas  humoral  baik mukosal  maupun  sistemik.  Protein  AdhO36 juga mampu merangsang imunitas seluler. 6 Diabetes  mellitus (DM) adalah sindroma  metabolik  yang  ditandai  dengan peningkatan  kadar  glukosa  darah.  Kondisi hiperglikemia  ini  adalah  kondisi  yang  tidak menular  dan  akan  meningkat  terus jumlahnya di masa yang akan datang. WHO membuat perkiraan bahwa pada tahun 2025 akan  ada  300  juta  orang  yang  menderita
diabetes  melitus  di  seluruh  dunia. 7 Pasien dengan  kadar  glukosa  darah  yang  tinggi lebih  rentan  terhadap  berbagai  macam infeksi.  Kadar  glukosa  yang  melebihi  150 mg/dL berkaitan dengan terjadinya pneumonia  pada  pasien  kritis. 8 Selain  itu, kondisi  hiperglikemia  berkaitan  dengan komplikasi  setelah  operasi  kolektomi. 9 Hiperglikemia  juga  berhubungan  dengan durasi  opname  pada  pasien  post  operasi abdomen. 10 Penyebab meningkatnya  infeksi pada penderita hiperglikemia adalah melalui terbentuknya  biofilm.  Massa  biofilm  dari bakteri  akan  meningkat  seiring  dengan meningkatnya  kadar  glukosa. 11 S. Typhi adalah    salah  satu  bakteri  yang memproduksi biofilm, sehingga virulensi dari Salmonella akan  meningkat  seiring  dengan bertambahnya  kadar  glukosa.  Biofilm terbentuk  atas  berbagai  macam  struktur, salah  satunya  adalah  OMP.  Sebelum terbentuknya  biofilm  tentunya Salmonella harus      melekat  kepada    hospes  melalui faktor adhesin.
Oleh  karena  itu,  pada  penelitian  ini ingin  diketahui    ekspresi  protein  AdhO36 sebagai  faktor  adhesin  akibat  perubahan kadar  glukosa  pada  media  kultur.  Protein AdhO36  yang  merupakan  OMP S. Typhi diduga    mengalami  perubahan  ekspresi pada lingkungan dengan kadar glukosa yang berbeda  sehingga  turut    mempengaruhi proses  adhesi  dan  invasi.  Ekspresi  protein dapat  dideteksi  dengan  melihat  ketebalan pita  protein hasil elektroforesis SDS-PAGE.

## Bahan dan Metode
Desain Penelitian:
Desain  penelitian  yang  digunakan adalah  penelitian  eksperimental  laboratorik. Pengaruh kadar glukosa akan diamati pada lima  perlakuan  yang  diinkubasi  dalam medium  Luria  Bertani  Broth.  Kadar  glukosa masing-masing   perlakuan  yaitu perlakuan 1
(40 mg/100mL), perlakuan 2 (80 mg/100mL), perlakuan  3  (160  mg/100mL),  perlakuan  4 (240  mg/100mL),  dan  perlakuan  5  (320 mg/100mL).
Sampel Penelitian:
Sampel  penelitian  yang  digunakan  adalah bakteri S. Typhi  isolat  444-D  yang didapatkan  dari  Laboratorium  Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Brawijaya, Malang, Jawa Timur. Definisi Operasional:  Bakteri S .  Typhi  diambil  dari  stock bakteri S .  Typhi  di  Laboratorium Mikrobiologi  FKUB  yang  berasal  dari darah  penderita  demam  tifoid  di  RSU dr. Saiful Anwar Malang.
 Protein AdhO36 adalah outer membrane  protein (OMP) S .  Typhi dengan  berat  molekul  sekitar  36  kDa pada  SDS-PAGE  yang  diisolasi menggunakan SDS terhadap permukaan bakteri S . Typhi.

## Hasil
Identifikasi S. Typhi:
Sebelum  memberi  perlakuan  glukosa, terlebih  dahulu  dilakukan  identifikasi  bakteri
S .Typhi  yang  tersedia  di  Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas  Brawijaya. S .Typhi  yang digunakan  berasal  dari  darah  penderita demam  tifoid  di  RSU  dr.  Saiful  Anwar
Malang. Identifikasi bakteri dilakukan melalui 4 tahap. Tahap pertama adalah pengecatan Gram  yang  menunjukkan  bakteri  berbentuk batang berwarna merah yaitu ciri khas Gram negatif  (Gambar  1).  Tahap  kedua  yaitu penanaman pada medium MacConkey yang menunjukkan  koloni  bulat,    tepi    tajam,  dan permukaan  halus,  tidak  berwarna,  dan berdiameter  1-3  mm  (Gambar  2).  Tahap ketiga  yaitu  penanaman  pada  medium Bismuth  Sulfite  Agar ( BSA )  yang menunjukkan gambaran khas S . Typhi yaitu koloni  berwarna  hitam  ( black  jet  colony ) karena S . Typhi menghasilkan H ₂ S (Gambar 3). Tahap keempat yaitu test Microbact 12A yang  memberikan  hasil  positif  pada  lysin, ornitin, glukosa,  H2S,  manitol, xylose, dan citrat. Test microbact 12A memberikan hasil negatif  pada  ONPG,  indole,  urease,  voges- proskauer serta TDA (Gambar 4).
Gambar  1. Morfologi bakteri Gram negatif S . Typhi berbentuk batang berwarna merah (1000x).
Gambar 2. Koloni S .Typhi pada medium MacConkey berbentuk bulat dan tidak berwarna.
Gambar  3.  Koloni  bakteri S .Typhi  pada  medium bismuth  sulfite  agar berwarna  hitam  ( Black  Jet Colony ).
Gambar 4. Hasil tes microbact 12A S .Typhi
Profil OMP Setelah Perlakuan Glukosa dengan SDS-PAGE:
Penelitian  ini  dilakukan  sebanyak empat  kali  pengulangan  sesuai  dengan desain penelitian. Protein OMP S .Typhi pada berbagai kelompok perlakuan dielektroforesis  pada  gel  SDS-PAGE  untuk mengetahui profil pitanya (Gambar 5).
Gambar 5. Profil OMP S. Typhi setelah diberi perlakuan glukosa. Keterangan: protein marker (PM), 40 mg/100 mL (perlakuan 1), 80 mg/100 mL (perlakuan 2), 160 mg/100 mL (perlakuan
3), 240 mg/100 mL(perlakuan 4), 320 mg/100 mL (perlakuan 5).
Pengaruh Kadar Glukosa terhadap Ekspresi Protein AdhO36: Hasil elektroforesis yang telah diperoleh  kemudian  diamati  secara  visual dan  dinilai  ketebalannya  menggunakan aplikasi  Corel Photo-Paint 11, sehingga bisa dikonversikan dalam bentuk angka (Tabel 1). Angka  yang  muncul  tersebut  berupa  nilai means yaitu  perbandingan  kontras  warna yang  diukur  dengan  warna  hitam.  Semakin kecil means menunjukkan  semakin  tidak kontras warna  yang  diukur  dengan   warna hitam (mendekati hitam) atau semakin tebal pita yang diukur.
Pengulangan 1
Pengulangan 2
Pengulangan 3
Pengulangan 4
Tabel 1. Hasil pengukuran ketebalan pita protein AdhO36 menggunakan Corel Photo Paint 11
Pengulangan Ketebalan Protein 40mg/100mL (P1) 80mg/100mL (P2) 160mg/100mL (P3) 240mg/100mL (P4) 320mg/100mL (P5) 1 186.43 172.95 169.07 172.12 167.84 2 201.77 199.22 200.36 196.29 187.37 3 196.80 192.15 189.99 190.46 188.98 4 184.75 182.10 175.02 174.60 170.39 Rerata +(SD) 192.44+ (8.19) 186.60+ (11.49) 183.61+ (14.21) 183.37+ (11.84) 178.65+ (11.07) Nilai  rerata  dari  angka means pada masing-masing  pengulangan  yang  didapat dari  pengukuran  ketebalan  pita  protein AdhO36  dengan  menggunakan  Corel Photo-Paint  11  dapat  ditampilkan  dalam bentuk diagram batang seperti terlihat  pada Gambar 6.
Gambar  6.  Rerata  nilai means ketebalan  pita  protein  AdhO36  dengan  Corel  Photo-Paint  11. Keterangan : Huruf yang sama (a) menunjukkan tidak berbeda secara bermakna
Berdasarkan  Gambar  6  diketahui bahwa  perlakuan  glukosa  320  mg/100mL menunjukkan  nilai means paling  kecil  yang berarti  memiliki  kepekatan  warna  yang paling  besar.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa pada perlakuan  320  mg/100mL didapatkan protein  AdhO36  paling  banyak  yang diketahui  dari  pita  proteinnya  yang  paling tebal. Berdasarkan nilai means di atas
diketahui  pita  protein  AdhO36  paling  tebal terdapat pada perlakuan kadar glukosa 320 mg/100mL,  kemudian  240  mg/100mL,  160 mg/100mL, 80 mg/100mL, dan   yang paling tipis pada perlakuan 40 mg/100mL. Berdasarkan uji normalitas menggunakan  Shapiro-Wilk  pada  rerata means masing-masing kelompok perlakuan, didapatkan nilai signifikasi ketebalan protein AdhO36  p  >  0,05,  yang  berarti  data  hasil
penelitian  terdistribusi  normal.  Berdasarkan analisis  uji homogeneity  of    variances didapatkan  taraf  signifikansi  menunjukkan ketebalan protein AdhO36 S . Typhi sebesar 0,442,  sehingga  disimpulkan  p  >  0,05  yang berarti data hasil penelitian homogen.
Data  hasil  penelitian  terdistribusi normal  dan  homogen,  sehingga  dapat dilanjutkan dengan analisis one-way ANOVA yang mendapatkan nilai signifikansi sebesar 0,559,  sehingga  disimpulkan  p  >  0,05  yang berarti  tidak  terdapat  perbedaan  yang bermakna antara kelompok perlakuan.

## Pembahasan
Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui  pengaruh  kadar  glukosa terhadap ekspresi protein AdhO36 S . Typhi. Setelah  dilakukan  identifikasi  bakteri, dilakukan kultur dengan lima perlakuan yang berbeda  kadar  glukosanya.  Kelompok perlakuan pertama dengan kadar glukosa 40 mg/100mL,  perlakuan  kedua  dengan  kadar glukosa  80  mg/100mL,  perlakuan  ketiga dengan  kadar  glukosa  160  mg/100mL, kelompok perlakuan keempat dengan kadar glukosa  240  mg/100mL  dan  kelompok perlakuan kelima dengan kadar glukosa 320 mg/100mL. Masing-masing perlakuan dikultur  pada  media  kultur  Luria  Bertani Broth  yang  diinkubasikan  pada  suhu  37 ⁰ C selama 2x24 jam.
Dalam    penelitian    ini  dilakukan pembandingan  ketebalan  pita  protein AdhO36  pada  masing-  masing  kelompok perlakuan  setelah  proses  pemisahan protein  dengan  metode  SDS-PAGE. Secara  kasat  mata,  tampak  bahwa ketebalan  pita  protein  makin  meningkat sebanding  dengan  bertambahnya  kadar glukosa.  Pada  Tabel  1  diketahui  bahwa nilai  rerata means ketebalan  protein berkurang  sebanding  dengan  peningkatan kadar  glukosa,  yang  artinya  ketebalan protein  AdhO36  meningkat  sebanding
dengan peningkatan kadar glukosa. Namun demikian,  secara  statistik  tidak  berbeda secara  signifikan.  Hal  ini  kemungkinan disebabkan karena  banyaknya  factor yang mempengaruhi  ekspresi  protein  AdhO36 seperti  pH  medium,  osmolaritas,  dan glikasi protein.
Perbedaan  kadar  glukosa  media kultur  pada  penelitian  ini  mengacu  pada kadar glukosa darah manusia. Berdasarkan Konsensus  Pengelolaan  dan  Pencegahan Diabetes Melitus Tipe 2 di Indonesia yang disusun  oleh  Perhimpunan  Endokrinologi
Indonesia,  kadar  glukosa  darah  normal puasa  adalah kurang dari 100mg/dL. Pada keadaan  puasa,  kadar  GDPT  (Glukosa Darah  Puasa  Terganggu)  adalah  100-125 mg/dL.  Diagnosis  Diabetes  Melitus ditegakkan  bila  kadar  gula  darah  puasa ≥126  mg/dL  dengan  gejala  klasik  DM. Pada  pemeriksaan  glukosa  darah  TTGO (Tes  Toleransi Glukosa Oral)  dengan  cara mengukur  kadar  glukosa  darah  2    jam setelah pemberian 75 gram glukosa, kadar TGT  (Toleransi  Glukosa    Terganggu) adalah    140–199  mg/dL.  Sedangkan diagnosis  Diabetes  Melitus  pada  TTGO adalah  ≥200  mg/dL.  Kadar  hipoglikemia atau glukosa darah rendah ditandai dengan menurunnya  kadar  glukosa  darah  <60 mg/dL.  Salah  satu  komplikasi  diabetes mellitus    adalah    ketoasidosis    diabetik yang  salah  satunya  ditandai  dengan peningkatan  glukosa  darah  ≥300  mg/dL. Berdasarkan  uraian  di  atas,  dipilih  kadar glukosa media kultur yaitu  40  mg/100mL, 80  mg/100mL,  160    mg/100mL,    240 mg/100mL  dan  320  mg/100mL  yang mewakili  keadaan  hipoglikemia,  keadaan normal  glukosa  darah,  keadaan    TGT, keadaan  diabetes  melitus  dan  juga keadaan  ketoasidosis  diabetik  mulai muncul. Hal ini untuk mengetahui pengaruh kadar  glukosa  pada  manusia  dan pengaruhnya  terhadap  ekspresi  protein AdhO36.
Pada  lingkungan  dengan  keadaan glukosa  yang  tinggi,  perlekatan dari Enterobacteriaceae Eschericia coli terhadap  epitel  mengalami  peningkatan  5 kali  lipat  dibanding  dengan  kadar  glukosa normal.  Kemampuan clearance bakteri juga    mengalami    penurunan  pada  tikus dengan  diabetes  melitus.  Kedua  hal tersebut  berkontribusi  pada  patogenesis dan perpanjangan waktu infeksi. Bakteri S . Typhi  termasuk  dalam  Enterobacteriaceae sehingga  peningkatan  ekspresi  AdhO36 sebagai  salah  satu  faktor  adhesin  bakteri dapat  dihubungkan  dengan  peningkatan kadar glukosa lingkungan. 12 Keadaan hiperglikemia dapat meningkatkan endothelial  permeability dan mengubah struktur membran basalis epitel pada    bakteri  Gram  negarif Helicobacter pylori . Peningkatan adhesi dari Helicobacter  pylori terhadap  epitel  secara signifikan  meningkat  pada  kadar  glukosa
200 mg/dL jika dibandingkan dengan kadar glukosa  100  mg/dL  dan  150  mg/dL. Pertumbuhan      bakteri  ini  juga  meningkat pada  kadar  glukosa  yang  lebih  tinggi. S . Typhi  termasuk  bakteri  Gram  negatif sehingga hal ini bisa diasosiasikan dengan peningkatan  ketebalan  protein  AdhO36 sebagai faktor adhesi. 13
Dalam  penelitian  ini  ekpresi  protein AdhO36 diasumsikan juga dipengaruhi oleh glikasi protein. Protein mampu membentuk ikatan  kovalen  dengan  glukosa  tanpa bantuan  enzim  yang  disebut  dengan glikasi.  Pada  kadar  glukosa  yang  makin tinggi dapat terjadi glikasi protein sehingga ketebalan  di  posisi  36  kDa  menjadi  tidak jelas atau justru pindah pada posisi sekitar 74 kDa. Pada  Gambar 5 tampak ketebalan protein  di  sekitar  molekul  74  kDa  yang menunjukkan respons terhadap perubahan kadar glukosa.
Kekurangan  pada  penelitian  ini  yaitu tidak  bisa  menggunakan  jumlah  bakteri yang  sangat  akurat  pada  setiap
perlakuannya, sehingga dapat mempengaruhi  ekspresi  protein  AdhO36. Apabila  semakin  banyak  jumlah  bakteri maka  protein  AdhO36  yang  terekspresi juga  meningkat. Pada penelitian ini hanya digunakan    satu  isolat S .  Typhi,  sehingga belum  diketahui  apakah  isolat S .  Typhi yang  lain  juga  merespons  terhadap perubahan kadar glukosa. Kekurangan lain pada  penelitian  ini  adalah  digunakannya pewarna  yang  kurang  sensitif  yaitu coomassie blue .
Pada  Gambar  6  ditunjukkan  ekspresi protein  AdhO36  terhadap  kadar  glukosa. Meskipun  secara  statistik  tidak  bermakna namun  secara  visual  ada  kecederungan peningkatan  ketebalan  protein  AdhO36. Tidak  hanya  protein  AdhO36,  namun  OMP secara  keseluruhan  tampak  lebih  tebal seiring dengan meningkatnya kadar glukosa seperti  tampak  pada  elektroforegram  pada Gambar  5.  Hal  ini  menunjukkan  adanya peningkatan  faktor    virulensi  dari  bakteri S . Typhi  melalui  peningkatan  faktor  adhesi. Jadi,  bakteri  akan  melekat  lebih  kuat  pada usus penderita dan lebih mudah melakukan invasi.  Setelah  terjadinya  invasi  tentunya akan terjadi infeksi dari bakteri S. Typhi.

## Kesimpulan
Dari hasil penelitian  mengenai pengaruh  kadar  glukosa  terhadap  ekspresi protein  AdhO36  bakteri S .  Typhi,  dapat disimpulkan  bahwa  peningkatan  kadar glukosa  cenderung  meningkatkan  ekspresi protein AdhO36 bakteri S . Typhi.

## Saran
Adapun  saran  untuk  penelitian selanjutnya  adalah  perlu  mengakuratkan jumlah  bakteri  secara  lebih  tepat  dan menggunakan lebih dari satu isolat S . Typhi. Pada  pewarnaan  SDS-PAGE  dapat menggunakan  pewarna  yang  lebih  sensitif
seperti silver  staining. Dapat  dilakukan  uji adhesi  protein  AdhO36  yang  diinkubasikan pada  kadar  glukosa  yang  berbeda  pada enterosit  mencit.  Untuk  pengembangan vaksin  berbasis  protein  adhesin,  hasil penelitan  ini  dapat  digunakan  sebagai pertimbangan  bahwa  peningkatan  kadar glukosa bersifat menaikkan ekspresi protein AdhO36,  sehingga  pemberian  vaksin  per oral  sebaiknya  mempertimbangkan  kadar glukosa pasien.
Daftar Pustaka 1. Nelwan  HR.  Tata  Laksana  Terkini Demam Tifoid. Cermin Dunia Kedokteran . 2012; 39(4):247 – 250. 2. Crump JA,   Luby   SP,  Mintz ED. The Global  Burden  of  Typhoid  Fever. Bulletin of the World Health Organization. 2004; 82(5):346-353. 3. (WHO)  World  Health  Organization.
Background  Document:  The Diagnosis, Treatment,  and  Prevention  of  Typhoid Fever. (Online). 2003. www.who.int/vaccines-documents/. Diakses 11 Desember 2013. 4. Kementerian Kesehatan Republik Indonesia.  Profil  Data  Kesehatan Indonesia  Tahun    2011.  Jakarta: Kementerian Kesehatan Republik Indonesia. 2012. 5. Dzen  SM,  Roeskitiningsih,  Santoso  S, Winarsih S. Bakteriologi Medik. Surabaya:  Penerbit  Putra  Media Nusantara. 2010. Hlm 225 – 237. 6. Winarsih  S.  Imunitas  Seluler  dan Protektivitas in  vivo Protein  AdhO36
Salmonella Typhi.  Disertasi.  Malang: Program  Pasca  Sarjana  Universitas
Brawijaya. 2005.
7. Suyono  S.  Diabetes  Mellitus  di Indonesia.  Di  dalam:  Sudoyo  AW,
Setiyohadi  B,  Alwi  I,  Simadibrata  M, Setiati  S  (Editor).  Buku  Ajar  Ilmu Penyakit  Dalam.  Jakarta:  Interna Publishing. 2009.
8. Kraft R, Hemdon DN, Mlcak RP, Finnerty CC, Cox RA, Williams FN, Jeschke MG. Bacterial Respiratory Tract Infections are Promoted  by  Systemic  Hyperglycemia after  Severe  Burn  Injuries  in  Pediatric Patients. Burns. 2014;  40(3):428-435. doi:10.1016/j.burns.2013.07.007. 9. Jackson  RS,  Amdur  RL,  White  JC, Macsata RA. Hyperglycemia is Associated  with  Increase  Risk  of Morbidity  and  Mortality  after  Colectomy for  Cancer. J  Am  Coll  Surg .
2012;214(1):68- 80.doi:10.1016/j.jamcollsurg.2011.09.016 .Epub
10. Wu  Y  et  al.  Hyperglycemia  and  Its Association with Clinical Outcomes in the
Pediatric  Intensive  Care  Unit  after Abdominal Surgery. J  Pediatr  Surg.
2013; 48(4):801-805.
11. Waldrop  R.  McLaren  A.      Calara  F. McLemore  R.  Biofilm  Growth  has  a
Threshold Response to Glucose in vitro.
Clin  Orthop  Relat  Res .  2014;
472(11):3305-10.  doi:  10.1007/s11999- 014-3538-5.
12. Ozer A. Increased  Bacterial Adherence and  Decreased  Bacterial  Clearance  in Urinary  Tract  Infections  with  Diabetes Mellitus.  Ohio:  Case  Western  Reserve University.2013.