## ANALISIS PERBANDINGAN FIKSASI MENGGUNAKAN LARUTAN FORMALIN DAN LARUTAN CARNOY PADA SOMIT, NEURAL TUBE, DAN VASKULAR EMBRIO AYAM USIA 48 JAM DENGAN PEWARNAAN HEMATOXYLIN-EOSIN
Ernst Randy Nuralim*, Indriati Dwi Rahayu**  , Rachmad Sarwo Bekti***

## Abstrak
Penelitian  embriologi  memiliki  peran  penting  dalam  dunia  kesehatan,  oleh  karena  itu  diperlukan pengetahuan  berbagai  faktor  pendukung  salah  satunya  adalah  larutan  fiksatif.  Meskipun  telah  diketahui bahwa  larutan  Carnoy  memberikan  efek  pengerutan  hingga  dapat  menghancurkan  sitoplasma,  banyak penelitian  yang  menggunakan  larutan  Carnoy  sebagai  pilihan  utama  untuk  larutan  fiksatif  pada  penelitian embrio ayam. Penelitian ini bertujuan untuk menguji kualitas gambaran embrio yang difiksasi menggunakan larutan  Carnoy  dan  membandingkannya  dengan  kualitas  gambaran    embrio  yang  difiksasi  menggunakan larutan formalin. Telur ayam yang digunakan diperoleh dari peternakan ayam Randu Agung Singosari. Telur ayam  diinkubasi  selama  48  jam,  lalu  satu  kelompok  difiksasi  menggunakan  larutan  Carnoy  dan  kelompok yang lain difiksasi menggunakan larutan formalin. Hasil fiksasi kemudian dibuat preparat dan diwarnai dengan pewarnaan  hematoxylin-eosin  (HE),  untuk  selanjutnya  dilakukan  evaluasi  terhadap  somit,  vaskuler,  dan neural  tube .  Hasil  penelitian  dianalisis  menggunakan paired  T  test menunjukkan  bahwa  larutan  Carnoy memberikan  hasil  yang  signifikan  berbeda  (p  <  0,05)  dengan  larutan  formalin  pada  evaluasi  somit  dan vaskuler  embrio  ayam  usia  48  jam,  namun  memberikan  hasil  yang  signifikan  tidak  berbeda  (p  >  0,05) penggunaan  larutan  Carnoy  dengan  larutan  formalin  pada  evaluasi neural  tube embrio  ayam  usia  48  jam. Kesimpulan dari penelitian ini adalah fiksasi dengan larutan formalin menunjukkan hasil yang berbeda dengan fiksasi menggunakan larutan Carnoy pada evaluasi somit dan vaskuler, namun tidak berbeda pada evaluasi neural tube embrio ayam usia 48 jam.
Kata kunci: embrio, hematoxylin-eosin, larutan Carnoy, larutan formalin, somit, neural tube, vaskular.

## COMPARATIVE ANALYSIS OF FIXATION USING CARNOY SOLUTION AND FORMALIN SOLUTION IN CHICKEN EMBRYO’S SOMITES, NEURAL TUBE, AND VASCULAR AGE OF 48 HOURS WITH HEMATOXYLIN-EOSIN STAINING

## Abstract
Embryology research has an important role in health, therefore need to know variety of supporting factors such as  fixative solutio.. It has been known that Carnoy solution’s have the shrinkage effect to cytoplasm, but many research still used Carnoy solution as a fixative solution to study the chicken embryo. This study was aimed  to  examine  the  image  quality  of  chicken  embryo  that  is  fixed  using  Carnoy  solution  compared  to formalin  solution. Fertilized  chicken  eggs  used  were  obtained  from  chicken  farms  at  Randu  Agung Singosari. Fertilized chicken eggs were incubated for 48 hours, and then one group were fixed using Carnoy solution and the other group were fixed in a formalin solution. After fixation process, the slides were stained with hematoxylin-eosin (HE) method and evaluated the somit, vascular and neural tube of the embryo. The comparative analysis  using paired T test showed that Carnoy solution were significantly different (p < 0.05) with formalin to evaluate the chick embryo somites and vascular age of 48 hours. The results also showed that Carnoy solution were not significantly different (p > 0.05) with formalin to evaluate the neural tube of chick embryos at age of 48 hours.  As the conclusion, the fixation using Carnoy solution and  formalin is significantly different in evaluating somites and vascular, but is not different significantly in evaluating neural tube on 48 hours age of chick embryo.
Keywords: Carnoy solution, embryo, formalin solution, hematoxylin-eosin, somite, neural tube , vascular.
* Program Studi Pendidikan Dokter, FKUB ** Lab Anatomi dan Histologi, FKUB *** Lab Patologi Anatomi, FKUB
 indri.fkub@gmail.com

## Pendahuluan
Embriologi  merupakan  ilmu  yang mempelajari  tentang  perkembangan  embrio sejak  dari  masa  pembuahan  telur  sampai dengan  pembentukan  janin.
1 Penelitian dalam  bidang  ini  sangat  penting  untuk mencegah terjadinya kegagalan perkembangan  embrio  yang  pada  akhirnya dapat menyebabkan kecacatan atau bahkan kematian  pada  janin.  Oleh  karena  itu, diperlukan  metode,  sampel,  serta  bahan fiksatif  yang  dapat  memberikan  gambaran perkembangan  embrio  yang  serupa  dengan perkembangan embrio pada manusia. Dalam penelitian  ini  penulis  menggunakan  embrio ayam  sebagai  sampel  dan  beberapa  bahan fiksatif,  yaitu  larutan  Carnoy  dan  larutan formalin.
Embrio  ayam  merupakan  model  yang cocok untuk memberikan gambaran perkembangan biologi, penelitian embriologi, serta teratologi. Perkembangan embrio ayam secara  umum  memiliki  pola  perkembangan dan fungsi yang identik dengan perkembangan embrio manusia. 2 Di samping
itu,  penggunaan  embrio  ayam  sebagai sampel  dalam  penelitian  perkembangan embrio  dan  teratologi  memiliki  keuntungan yaitu  peneliti  dapat  membuka  telur, memeriksa  embrio,  dan  memberikan pemaparan  yang  tepat  pada  tahap perkembangan  yang  spesifik,  sehingga embrio  ayam  menjadi  pilihan  utama  untuk diaplikasikan dalam penelitian embriologi.
Dalam  pembuatan  sediaan  histologi yang  baik  diperlukan  berbagai  macam tahapan  yang  salah  satunya  adalah  tahap fiksasi.  Tahapan  fiksasi  merupakan  tahapan yang paling penting dalam membuat sediaan histologi,  karena  jika  terjadi  kesalahan  pada tahap  ini  akan  memberikan  gambaran  yang buruk yang buruk pada sediaan histologi.
3 Selama ini, penelitian pada embrio ayam telah banyak dilakukan dengan menggunakan  bahan  fiksatif  larutan  Carnoy.
Hal  ini  disebabkan  karena  larutan  Carnoy memiliki  daya  penetrasi  yang  cepat,  akan tetapi  memiliki  efek  pengerutan  yang  kuat sehingga  menghancurkan  sitoplasma  dan berakibat pada penurunan kualitas gambaran sediaan  histologi.  Selain  itu,  harga  larutan carnoy  cukup  mahal  serta  sulit  untuk didapatkan sehingga membatasi penggunaan  larutan  Carnoy  dalam  jumlah besar. 3 Di  samping  itu,  proses  fiksasi  yang memakan  waktu,  prosedur  yang  kompleks, serta golden periode untuk pengecatan yang sempit menyebabkan kemungkinan kerusakan  sediaan  histologi  lebih  besar.
Larutan formalin telah menjadi bahan fiksatif yang  paling  sering  digunakan  dan  mudah untuk  mendapatkannya.  Dengan  prosedur yang  sederhana  serta golden  periode yang lebih panjang membuat fiksasi menggunakan larutan  formalin  memiliki  kemungkinan kerusakan  histologi  lebih  kecil.  Penelitian  ini bertujuan untuk membuktikan bahwa larutan formalin dapat digunakan sebagai pengganti larutan  Carnoy  dalam  memfiksasi  embrio ayam.

## Bahan dan Metode

## Desain Penelitan
Penelitian  ini  berjenis  eksperimental dengan  menggunakan  rancangan purposive sampling untuk membandingkan hasil fiksasi menggunakan  larutan  Carnoy  dan  larutan formalin.  Hewan  coba  yang  digunakan adalah ayam fase embrio dalam telur ayam. Embrio  ayam  pada  telur  ayam  yang  telah dibuahi, diperoleh dari perusahaan pembibitan  ayam  PT  Randu  Agung  Jaya,
Kabupaten  Malang.  Spesies  ayam  adalah Gallus gallus strain Cobb. Tahap perkembangan embrio ayam mengikuti tabel Hamburger  dan  Hamilton.    Telur  diinkubasi pada  suhu  100-102 o F  dengan  kelembaban relatif 60-70% selama 48 jam.

## Pengambilan dan Fiksasi Bahan Coba
Pecahkan  cangkang  telur  dengan mengetukkan  dasar  telur  pada  bidang  yang agak  tajam,  dengan  tidak  merubah  posisi telur.  Tuang  telur  dalam  mangkuk  plastik yang telah setengahnya diisi dengan Larutan NaCl  0,9%  (NS).  Letakkan  bingkai  kertas saring  di  atas  blastodisk  (embrio)  sehingga nampak  perlahan-lahan  menjadi  basah. Kemudian gunting vitelinne membrane di sisi luar  bingkai  kertas.  Angkat  bingkai  kertas saring, sehingga embrio ikut menempel/berada  dalam  lubang  pada bingkai  kertas  saring.  Masukkan  ke  dalam larutan NS yang lain dan goyang-goyangkan beberapa  kali.  Kemudian  pindahkan  lagi dalam  larutan  NS  yang  lain  dan  goyang- goyangkan  beberapa  kali.  Setelah  itu, masukkan dalam larutan Carnoy atau larutan formalin.

## Pewarnaan Hematoxylin-Eosin
Setelah  proses  fiksasi,  embrio  ayam diangkat dan dibuat irisan pada object glass , kemudian  dikeringkan.Tahap  pewarnaan  HE yaitu  akuades  diteteskan  pada object  glass menggunakan  pipet  sebanyak  3  tetes  lalu dikeringkan. Kemudian hematoxylin sebanyak  3  tetes,  tunggu  10  menit,  dibilas dengan  air.  O bject  glass dicelupkan  dalam larutan  alkohol  asam  sebanyak  1  kali, kemudian  bilas  dengan  air.  O bject  glass dicelupkan  dalam  larutan  litium  karbonat sebanyak 1 kali, kemudian bilas dengan air. Pada object glass diteteskan eosin sebanyak 5 tetes, tunggu 3 menit kemudian buang sisa
eosin  pada object  glass.  Object  glass dicelupkan  dalam  larutan  alkohol  96% sebanyak  3  kali.  O bject  glass dicelupkan dalam  larutan  xylol  sebanyak  3  kali.   O bject glass ditutup dengan cover glass. Kemudian preparat  dapat  dievaluasi  di  bawah mikroskop  dengan  mengamati  morfologi embrio  ayam  usia  48  jam  (somit,  vaskuler, dan neural tube ).

## Hasil

## Perbandingan Fiksasi pada Somit Embrio
Berdasarkan  hasil  yang  diperoleh, pengambilan  data  menggunakan  metode Likert scale dengan menilai somit (kejelasan batas dan kemampuan hitung) embrio ayam usia  48  jam , didapatkan  hasil  rata-rata larutan  formalin  6±1,03  dan  larutan  Carnoy 3,12±0,68.  Selanjutnya,  dengan interrater reliability  (kappa), didapatkan  nilai  kappa 0,43  yang  menurut  Landis  dan  Koch  (1977) memiliki  interpretasi moderate  agreement. 4 Analisis menggunakan paired T test diketahui bahwa fiksasi menggunakan larutan formalin dan  larutan  Carnoy  pada  evaluasi  terhadap somit embrio  adalah berbeda signifikan (p < 0,000).  Pada  Gambar  1,  ditampilkan perbandingan somit embrio ayam usia 48 jam yang difiksasi menggunakan  larutan Carnoy dan formalin.
Gambar 1. Somit embrio ayam usia 48 jam (tanda lingkaran) yang difiksasi dengan larutan formalin (A,B) dan larutan Carnoy (C, D) dengan pewarnaan HE.
Perbandingan  Fiksasi  pada Neural  Tube Embrio Berdasarkan  penelitian  yang  telah dilakukan,  pengambilan  data  menggunakan metode Likert  scale dengan  menilai neural tube (kejelasan  batas)  embrio  ayam  usia  48 jam , didapatkan  hasil  rata-rata  larutan formalin  5,78±0,32  dan  larutan  Carnoy 5,98±0,17. Analisis interrater reliability
(kappa) didapatkan  nilai  kappa   0,32 yang menurut Landis  dan  Koch  (1977)  memiliki interpretasi moderate agreement. 4
Selanjutnya,  dilakukan  uji paired  T  test, didapatkan  hasil  p  =  0,054,  sehingga diinterpretasikan bahwa fiksasi menggunakan larutan  formalin  dan  larutan  Carnoy  pada pemeriksaan neural  tube embrio  tidak berbeda signifikan (lihat Gambar 2).
A B A C D
Gambar 2. Neural tube embrio ayam usia 48 jam (tanda lingkaran)  yang difiksasi dengan larutan formalin (A, B) dan larutan Carnoy (C, D) dengan pewarnaan HE.
Perbandingan  Fiksasi  pada  Vaskular
Embrio
Berdasarkan  penelitian  yang  telah dilakukan,  pengambilan  data  menggunakan metode Likert  scale dengan  menilai neural tube (kejelasan batas) embrio ayam usia 48 jam , didapatkan  hasil  rata-rata  larutan formalin  4,6±0,41  dan  larutan  Carnoy 6,27±0,59.  Kemudian  penulis  menggunakan interrater  reliability  (kappa), dan  didapatkan nilai  kappa  0,33yang  menurut  Landis  dan Koch  (1977)  memiliki  interpretasi moderate
agreement. 4 Selanjutnya data tersebut dianalisis menggunakan paired T test, dan didapatkan hasil  p  =  0,00  (<0,05),  sehingga diinterpretasikan bahwa fiksasi menggunakan larutan  formalin  dan  larutan  Carnoy  pada pewarnaan neural tube embrio menunjukkan perbedaan  hasil  secara  signifikan  (lihat Gambar 3).
B A D C A
Gambar 3. Vaskular embrio ayam usia 48 jam (tanda lingkaran) yang difiksasi dengan larutan formalin (A, B) dan larutan Carnoy (C, D) dengan pewarnaan HE.

## Pembahasan
Perbandingan Kualitas Penampakan Somit pada Bahan Fiksatif Formalin dan Larutan Carnoy Dari hasil penilaian dengan menggunakan  metode Likert  scale antara
bahan  fiksatif  formalin  dan  larutan  Carnoy diketahui  kualitas  penampakan  dari  somit lebih  baik  pada  bahan  fiksatif  formalin  (6  > 3,12).  Pada  analisis  lanjutan  menggunakan paired T test, didapatkan nilai signifikansi (p <    0,05)  yang  menunjukkan    bahwa  hasil perhitungan  yang  didapat  berbeda  secara signifikan. Hal ini menunjukkan bahwa bahan fiksatif  formalin  memberikan  penampakan somit  yang  lebih  baik  jika  dibandingkan dengan  larutan  Carnoy.  Penampakan  somit pada  bahan  fiksatif  larutan  Carnoy  yang kurang  optimal  dapat  disebabkan  oleh beberapa  faktor.  Larutan  Carnoy  merupakan bahan fiksatif yang sebagian besar terdiri dari alkohol.  Sifat  denaturasi  alkohol  dalam preservasi jaringan dapat menyebabkan efek shrinking yang  menyebabkan  kerusakan jaringan  akibat  bentukan  yang  mengkerut.
Kerusakan  jaringan  yang  didasari  oleh  efek denaturasi  juga  diikuti  oleh  kerusakan sitoplasma  yang  menyebabkan  tampak sediaan  menjadi  buram.  Selain  itu,  bahan fiksatif  yang  mengandung  alkohol  seperti larutan  Carnoy  yang  memiliki  kemampuan instant coagulant, terkadang dapat menyebabkan    kerusakan  pada  mikro anatomi  hewan  seperti  embrio  yang  pada penelitian  ini  didapatkan  hasil  yang  serupa yaitu berupa gambaran somit yang tidak jelas dan  hilangnya  bentukan  somit  pada  embrio. 5 Hal ini berbeda pada gambaran bahan fiksatif formalin,  selain  struktur  somit  yang  dapat terevaluasi dan terhitung dengan jelas jarang terdapat  bentukan,  serta  menghindarkan otolisis  jaringan  yang  dapat  terjadi  akibat perlakuan fiksasi. Hal ini menunjukkan bahwa pada  penelitian  yang  menekankan  pada kualitas  penampakan  somit  embrio,  bahan fiksatif  pilihan  yang  digunakan  adalah formalin.
D C A B A
Perbandingan Kualitas Penampakan Neural Tube pada Bahan Fiksatif Formalin dan Larutan Carnoy Dari hasil penilaian dengan menggunakan  metode Likert  scale antara bahan  fiksatif  formalin  dan  larutan  Carnoy diketahui  kualitas  penampakan  dari neural tube tidak  jauh  berbeda  pada  bahan  fiksatif formalin  (5,78  :  5,98).  Pada  analisis  lanjutan menggunakan paired T test, didapatkan nilai yang tidak signifikan berbeda (p > 0,05) yang menunjukkan  bahwa hasil perhitungan yang didapat  tidak  berbeda  secara  signifikan.  Hal tersebut kemungkinan didasari oleh bentukan neural  tube yang  merupakan  sebuah canal, sehingga  kerusakan  sitoplasma  pada  bahan fiksatif  larutan  Carnoy  yang  menyebabkan pewarnaan  yang diffuse tidak  terlalu mempengaruhi penampakan neural tube dan masih dapat terevaluasi dengan baik. 6 Perbandingan Kualitas Penampakan Vaskularisasi pada Bahan Fiksatif Formalin dan Larutan Carnoy Dari hasil penilaian dengan menggunakan  metode Likert  scale antara bahan  fiksatif  formalin  dan  larutan  Carnoy diketahui kualitas penampakan dari vaskularisasi  berbeda  pada  bahan  fiksatif formalin  (6,27  >  4,6).  Pada  analisis  lanjutan menggunakan paired T test, didapatkan nilai yang signifikan (p < 0,05) yang menunjukkan bahwa  hasil  perhitungan  yang  didapat  tidak berbeda secara signifikan. Pada penelitian ini, bentukan  struktur  antara  jaringan  dengan bahan  fiksatif  formalin  dan  larutan  Carnoy memiliki perbedaan gambaran yang signifikan.    Perbedaan  utama  kualitas  yang jelas  terdapat  pada  vaskular  yang  terwarnai oleh  pengecatan  hematoxyilin-eosin.  Pada fiksasi  larutan  formalin,  vaskular  terwarnai dengan baik tetapi jika dibandingkan dengan vaskular  yang    difiksasi  dengan  larutan Carnoy,  perbedaaan  warna  vaskuler  dengan lingkungan  lebih  terlihat  jelas.  Sehingga batas-batas  vaskular  terlihat  lebih  jelas  dan memudahkan dalam mengevalusi perkembangan  sistem  vaskular.  Reaksi
oksidatif yang disebabkan oleh bahan fiksatif formalin  pada  jaringan menyebabkan afinitas jaringan  embrio  terhadap  pewarnaan berkurang. 7 Hal  ini  menyebabkan  warna  HE pada  embrio  yang  difiksasi  menggunakan formalin  akan  lebih  pudar  sehingga  batas antara  jaringan  vaskuler  dan  lingkungan sekitar  tidak  sejelas  pada  bahan  fiksatif larutan Carnoy.

## Kesimpulan
Berdasarkan  hasil  perbandingan  fiksasi menggunakan  larutan  formalin  dan  fiksasi menggunakan  larutan  Carnoy  pada  embrio ayam  usia  48  jam  yang  dicat  menggunakan hematoxylin-eosin, maka disimpulkan bahwa: 1. Fiksasi  larutan  formalin  dan  Carnoy memiliki  hasil  yang  cukup  baik  dan  tidak berbeda  signifikan  dalam  pengecatan hematoxylin-eosin  pada neural  tube embrio ayam usia 48 jam.
2. Fiksasi  larutan  formalin  memiliki  hasil yang  lebih  baik  dan  berbeda  secara signifikan  dibandingkan  dengan  fiksasi larutan  Carnoy  dalam  pengecatan hematoxylin-eosin  pada  somit  embrio ayam usia 48 jam.
3. Fiksasi larutan Carnoy memiliki hasil yang lebih  baik  dan  berbeda  secara  signifikan dibandingkan  dengan  fiksasi  larutan formalin  dalam  pengecatan  hematoxylin- eosin pada vaskular embrio ayam usia 48 jam.

## Saran
1. Penelitian  serupa  perlu  menggunakan mesin  penetas  telur  dengan  kapasitas lebih  besar  dengan  tujuan  mengurangi kemungkinan error yang disebabkan  oleh waktu proses fiksasi dan pewarnaan yang tidak seragam.
2. Diperlukan  pembuatan  standar  kriteria dalam  evaluasi  kualitas  penampakan embrio ayam, sehingga dapat memudahkan peneliti lain dalam evaluasi.

## Daftar Pustaka
1. Guus  van  der  Bie. Early  Development from  a  Phenomenological  Point  of  View. Amsterdam: Louis Bolk Instituut. 2001.
2. Drake VJ, Koprowski SL, Lough JW, Smith SM.  Gastrulating  Chick  Embryo  as  a Model  for  Evaluating  Teratogenicity:  A Comparison  of  Three  Approaches.  Birth Defects  Research  (PartA). Clinical  and Molecular Teratology . 2006; 76:66–71.
3. Jusuf  AA.  Histoteknik  Dasar.  Tesis. Jakarta:  Fakultas  Kedokteran  Universitas Indonesia.  2009.
4. Landis  JR  and  Koch  GG.  The Measurement  of  Observer  Agreement  for
Categorical  Data.  Biometrics.  1977; 33:159-74. 5. Talukder  SI.  Histopathology  Techniques: Tissue  Processing  and  Staining.  (Online). 2007.http://www.talukderbd.com/lectures/ti ssue_processing_note.pdf.
6. Sumida  SS.  Biology  340,  Comparative Embryology,  Laboratory  Exercise  3 .
(Online).  2008.  http://www.  stuartsumida. com/ BIOL340/340Lab3A.pdf. 7. Meyer  W  and  Hornickel  IN.  Tissue Fixation–The Most Underestimated Methodical Feature of Immunohistochemistry.  Méndez-Vilas  and Díaz  J  (Editors). Microscopy:  Science, Technology,  Applications  and  Education . 2010. P 953–959.