## JIPK JURNAL ILMIAH PERIKANAN DAN KELAUTAN

## Research Article
Pengaruh Dunaliella  Salina Terhadap  Polimorfonuklear  Leukosit  Ikan  Kerapu Cantang  ( Epinephelus  fuscoguttatus x Epinephelus  lanceolatus )  Yang  Diinfeksi Viral Nervous Necrosis (VNN)
Effect  of Dunaliella  Salina on  Polymorphonuclear  Leukocytes  of  Cantang  Grouper ( Epinephelus  fuscoguttatus x Epinephelus  lanceolatus )  Infected  by Viral  Nervous Necrosis (VNN)
Rani Yuwanita* 1 , Nanik Retno Buwono 1 , dan Handian Febyadi Eka Putra 2
1) Dosen Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Brawijaya
2) Mahasiswa Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Brawijaya

## ARTICLE INFO
Received: September 03, 2018 Accepted: November 20, 2018
*) Corresponding author: E-mail: ry.ranita126@gmail.com
Kata Kunci :
Dunaliella salina , VNN , Polimorfonuklear, Kerapu Cantang
Keywords :
Dunaliella salina , VNN,
Polymorphonuclear, Cantang grouper

## Abstrak
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  pengaruh Dunaliella  salina terhadap  jumlah  polimorfonuklear  leukosit  ikan  kerapu  cantang  yang diinfeksi VNN. Seratus delapan puluh ekor larva ikan kerapu cantang ditebar ke  dalam  15  buah  bak  bervolume  16  L  dengan  kepadatan  10  ekor/bak. Sebelum  diinfeksi  VNN,  ikan  kerapu  cantang  diberi  perlakuan  pakan  pelet yang mengandung tepung Dunaliella dengan dosis: K- (0 gr/kg pakan), A(6 gr/kg  pakan),  B  (12  gr/kg  pakan)  dan  C  (18  gr/kg  pakan)  secara adlibitum selama  10  hari.  Setelah  10  hari  perlakuan,  ikan  kerapu  cantang  diinfeksi VNN selama 96 jam melalui injeksi intramuscular dengan dosis 0,1 ml/ekor ikan. Berdasarkan hasil pengamatan, Dunaliella salina berpengaruh terhadap jumlah  polimorfonuklear  leukosit  ikan  kerapu  cantang  yang  diinfeksi  VNN dengan  nilai  tertinggi  pada  perlakuan  C  (18  gr/kg  pakan)  yang  mempunyai nilai  rerata  leukosit  45,9  x  10 3 sel/ml,  neutrofil:  4,24  x  10 3 sel/ml  dan eusinofil 13,38 x 10 3 sel/ml.

## Abstract
This study aimed to determine the effect of Dunaliella salina on the number of  crocodile grouper  leukocyte polymorphonuclear  infected  with VNN. One hundred  and  eighty  larvae  of  cantang  grouper  fish  were  stocked  into  15 pieces of 16 L volumes with a density of 10 fish/tube. Before being infected with  VNN,  the  groupers  were  treated  with  pellet  feed  containing  doses  of Dunaliella flour with a dose: K- (0 g/kg feed), A (6 g/kg of feed), B (12 g/kg of  feed)  and  C  (18  g/kg of  feed)  in adlibitum for 10  days.  After  10  days  of treatment,  cantang  groupers  were  infected  with  VNN  for  96  hours  through intramuscular injection with a dose of 0.1 ml/fish. Based on the observations, Dunaliella  salina has  an  effect  on  the  number  of  VNN  infected  grouper cucumber leukocyte polymorphonuclear with the highest value in treatment C (18  g/kg  feed)  which  has  a  leukocyte  mean  value  of  45.9  x  103  cells/ml, neutrophils: 4.24 x 103 cells/ml and eosinophils 13.38 x 103 cells/ml.
Cite this as: Rani, Y., Nanik R. B., & Handian, F. E. P.  (2018). Pengaruh Dunaliella Salina Terhadap Polimorfonuklear Leukosit Ikan Kerapu Cantang ( Epinephelus fuscoguttatus x Epinephelus lanceolatus )Yang Diinfeksi Viral Nervous Necrosis (VNN). Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan, 10(2):124-130. http://doi.org/10.20473/jipk.v10i2.9797

## 1. Pendahuluan
VNN  ( viral  nervous  necrosis )  adalah penyakit  yang  terdaftar  oleh The  Office International  des  Epizooties (OIE)  dan  menjadi masalah utama di dalam produksi perikanan laut di  dunia.  Identifikasi  virus  penyebab  VNN merupakan  anggota  famili  Nodaviridae  dan pertama kali diidentifikasi darijaringan otak larva stripped  jack  (Mori et  al .,  1992).  Berdasarkan taksonomi,  VNN  diklasifikasikan  ke  dalam genus  betanodavirus  (Schneemann et  al .,  2005).
Betanodavirus  merupakan  virus  yang  tidak memiliki envelope ,  berbentuk spherical dan mempunyai diameter 25 nm. Genom betanodavirus  terdiri  dari  dua  untai  tunggal molekul RNA positif-sense. Segmen genom yang lebih  besar  (RNA1)  berukuran  3,1  kb,  berperan dalam mengkode polimerase RNA yang tergantung RNA ( RNA-dependent RNA
polymerase ).  Sedangkan  segmen  genom  yang lebih  kecil  (RNA2)  berukuran  1,4  kb,  bertugas dalam mengkode protein selubung ( coat protein ) (Nishizawa et al ., 1995).
VNN  pertama  kali  ditemukan  di  Indonesia pada  tahun  2000  oleh  Yuasa  dan  kawan-kawan melalui  metode  deteksi  PCR  pada  ikan  kakap putih  (Yuasa et  al .,  2000). Piscine  nodaviruses (betanodaviruses)  menginfeksi  lebih  dari  30 spesies ikan laut, khususnya pada stadia larva dan juvenil,  yang  mengakibatkan  mortalitas  yang sangat  tinggi  (Maeno et  al .,  2007).  Ikan  yang terinfeksi  VNN  menunjukkan  gejala  saraf  tidak normal ( neurological disorder ) dan sering disertai dengan vakuolasi pada sistem saraf pusat Central Nervous  System (CNS)  dan  retina  (Thiery, et  al ., 2006).
Penyebaran  VNN  harus  segera  diatasi untuk  mencegah  terjadinya  kerugian  pada kegiatan  budidaya.  Bahan  alternatif  yang  diduga dapat  digunakan  sebagai  antivirus  terhadap penyebaran  VNN  adalah Dunaliella  salina . Dunaliella  salinamengandung  57%  protein,  32% karbohidrat  dan  6%  lemak  dari  berat  keringnya (Becker, 2007). Campo et al., (2007) melaporkan bahwa  dalam  2  gram  berat  kering Dunaliella salina terdapat  100  mg  β-karoten.  Hui  Chen  dan Jian-Guo  Jiang  (2009)  juga  menambahkan terdapat  50  mg  β-karoten  dalam  1  gram  berat kering Dunaliella  salina .  Supamattaya, et  al.
(2005)  menjelaskan,  bahwa  dengan  pemberian 300  mg  β-karoten  mikro  alga Dunaliella per  kg pakan  menghasilkan Survival  Rate (SR)  tertinggi pada  ikan  atau  udang  yang  terinfeksi  virus  yaitu sebesar 33,3 %. Pemberian tepung Dunaliella
salina sebesar 11 g/kg pakan dapat meningkatkan pertumbuhan serta menstimulasi sistem imun ikan (Amaninejad et al., 2012).

## 2. Bahan dan Metode
Persiapan pakan dimulai setelah melakukan kultur Dunaliella  salina selama  7  hari.  Hasil pemanenan Dunaliella  salina kemudian  diubah menjadi  tepung.  Sebanyak  350  liter  kultur menghasilkan  53,9  gram  tepung Dunaliella salina .  Selanjutnya  dilakukan  pembuatan  pakan secara repelleting dengan  cara  mencampurkan tepung Dunaliella  salina dengan  beberapa  dosis yang telah ditentukan, yaitu: K- (0 g/kg pakan), A (6 g/kg pakan), B (12 g/kg pakan) dan C (18 g/kg pakan)    ke  dalam  pelet  merek Stella no.  2  dan dilakukan  pencetakan  ulang  secara  manual menggunakan alat penggiling pakan.
Hewan  uji  yang  digunakan  pada  penelitian ini  adalah  ikan  kerapu  cantang  yang  diperoleh dari  BBAP  Situbondo  dengan  ukuran  antara  7-9 cm  dan  berat  5-8  gram  sebanyak  180  ekor.  Ikan kerapu  cantang  dimasukkan  ke  dalam  masing- masing stoples kapasitas 16 L yang telah diisi 10 liter  air  laut  sebagai  media  hidup  ikan  dan  diberi aerasi.  Air  laut  sebelumnya  telah  disterilisasi menggunakan  kaporit  60  ppm  dan  dinetralkan dengan Na-thiosulfat 30 ppm. Sebelum digunakan untuk  penelitian,  ikan  diaklimatisasi  selama  ±5 hari.  Pada  proses  aklimatisasi,  ikan  mulai dibiasakan  diberi  pakan  pelet  2  kali  sehari  secara adlibitum untuk mempermudah pada saat perlakuan pemberian pakan.
Selama  10  hari  masa  pemeliharaan,  ikan kerapu  cantang  diberi  pakan  hasil repelleting yang mengandung Dunaliella salina 2 kali sehari, yaitu  pada  pukul  08.00  WIB  dan  pukul  16.00 WIB  secara adlibitum .  Selain  itu,  dilakukan pengukuran suhu, pH, salinitas dan DO setiap hari pada pagi dan sore untuk mengontrol kualitas air.
Setelah  masa  pemeliharaan  ikan  kerapu cantang  dengan  pemberian  pakan  mengandung Dunaliella  salina selama  10  hari  selesai,  isolat VNN  diinjeksikan  pada  ikan  kerapu  cantang melalui intramuscular dengan  dosis  0,1  ml/ekor ikan. Gejala klinis pada ikan mulai diamati pasca ikan  diinfeksi  oleh  VNN  sampai  96  jam berikutnya  dengan  selang  waktu  12  jam  sekali atau  sampai  menunjukkan  TCID 50 yang  berarti sebanyak  50%  ikan  dari  total  populasi  ikan  telah terinfeksi  virus  yang  ditandai  dengan  munculnya gejala  klinis  Pada  hari  terakhir  pengamatan  atau setelah  96  jam  pengamatan  gejala  klinis,
dilakukan  pengambilan  sampel  darah  untuk pengamatan polimorfonuklear leukosit.
Menurut Mahasri et al ., (2011), pengambilan  sampel  dan  uji  polimorfonuklear leukosit  dapat  dilakukan  dengan  mengambil sampel darah pada bagian arteri caudalis sebanyak 1  ml  menggunakan  spuit  1  ml  yang  sudah  diberi
Ethylen Diamine Tetra Acetic Acid (EDTA).
Kemudian  membuat  ulasan  darah  pada object glass lalu keringkan dan fiksasi menggunakan  metanol  selama  3  menit  dan dikeringkan  kembali.  Kemudian  diberi  pewarna giemsa  20%  selama  15  menit  dan  dikering anginkan  lalu  bilas  menggunakan  akuades  dan biarkan  mengering.  Ulasan  darah  kemudian diamati  di  bawah  mikroskop  dengan  pembesaran 1000  kali  untuk  mengamatidan  menghitung jumlah leukosit, neutrofil, dan eosinofil.

## 3 . Hasil dan Pembahasan
Ikan  kerapu  yang  telah  diinfeksi  VNN
mulai  menunjukkan  gejala  klinis  setelah  12  jam pasca  infeksi.  Gejala  klinis  yang  ditunjukkan sangat  dikenali  sebagai  akibat  adanya  infeksi VNNyaitu  nafsu  makan  yang  berkurang,  gerakan berenang vertikal dan sering menabrakkan diri ke dinding  dan  dasar  bak,  dan  warna  tubuh  yang menggelap (Tabel 1).
Menurut  Sudaryatma et  al .,  (2012),  gejala klinis yang ditunjukkan pada ikan terinfeksi VNN dimulai  dari  ikan  berdiam  diri  di  dasar  perairan diikuti  dengan  posisi  berenang  yang  terbalik. Amelia  dan  Prayitno  (2012)  menambahkan  pada hari  ke-4  pasca  terinfeksi  VNN  menunjukkan gejala berenang secara vertikal ke permukaan air, berenang  memutar  dan  juga  warna  tubuhnya menjadi lebih gelap karena stres.
Penurunan  nafsu  makan  dipengaruhi  oleh faktor  stres  sehingga  respons  saraf  yang  bekerja untuk  meningkatkan  sistem  imun  mengalami gangguan  fisiologis.  Menurut  Setyorini et  al ., (2009),  penggelapan  warna  kulit  akibat  infeksi
Tabel 1 . Gejala klinis pasca infeksi VNN
Waktu Pasca Infeksi Gejala Klinis 12 jam Nafsu makan ikan beragam, terdapat ikan yang merespon pakan dengan baik dan terdapat pula ikan yang tidak merespon pakan serta terdapat beberapa ikan pasif di dasar perairan. 24 jam Ikan pasif di dasar perairan dengan tubuh miring dan tidak merespons pakan yang diberikan. Terdapat beberapa ikan yang menjadi pucat warna tubuhnya dan beberapa ikan gesit sehingga menabrakkan tubuhnya ke dinding wadah serta beberapa ikan perutnya membuncit. 36 jam Ikan pasif di dasar perairan dengan nafsu makan yang berkurang dan bergerombol dengan memiringkan tubuhnya di dasar perairan. Beberapa ikan terlihat perutnya membuncit. 48 jam Ikan pasif di dasar perairan dan tidak merespons adanya pakan dan beberapa perutnya membuncit, warna tubuh menggelap. 60 jam Beberapa ikan tidak merespons pakan dan pasif di dasar perairan dengan berenang miring dan perut membuncit. 72 jam Nafsu makan ikan menurun drastis dengan berdiam di dasar perairan dan beberapa ikan terlihat perutnya membuncit. 84 jam Banyak ikan yang tidak merespons pakan dan berdiam diri di dasar perairan secara bergerombol. Beberapa berwarna pucat dan gelap dengan perutnya membuncit. 96 jam Ikan tidak merespon pakan dan pasif di dasar perairan, berenang berputar-putar di dasar perairan dan berenang miring.
VNN  berhubungan  dengan  produksi  lendir. Sebagai  respon  fisiologis,  ikan  yang  terinfeksi virus  akan  memproduksi  lendir  berlebih,  dan selanjutnya  produksi  lendir  akan  menurun  drastis sehingga  tubuh  ikan  terasa  kesat  dan  kulit berwarna lebih gelap.
Pemberian Dunaliella salina dapat merangsang  peningkatan  jumlah  leukosit  dan polimorfonuklear  ikan  kerapu  cantang,  dan  dosis 18  g/kg  pakan  dapat  meningkatkan  lebih  banyak leukosit  dan  polimorfonuklear  dibandingkan dengan  dosis  yang  lainnya  (Tabel  2).  Hal  ini menunjukkan bahwa pemberian Dunaliella salina
pada  ikan  kerapu  dapat  merangsang  peningkatan jumlah leukosit ikan kerapu cantang. Menurut Jun Dai et  al .  (2010), Dunaliella salina mengandung polisakarida  (glukosa,  galaktosa,  xilosa,  manosa dan  rhamnosa)  mencapai  12-40%.  Menurut Rustikawati (2012), polisakarida dapat meningkatkan sel imun yaitu dengan menginduksi
sel pembentuk leukosit untuk menghasilkan lebih banyak sel-sel yang terdapat dalam leukosit.
Jumlah  neutrofil  ikan  kerapu  cantang setelah  pemberian Dunaliella  salina dijumpai pada  perlakuan  C  (6  g/kg)  yakni  sebesar  3,90 sel/mm 3 .  Hal  ini  diduga  karena  kandungan polisakarida yang terdapat pada Dunaliella salina .
Menurut Purnamasari (2017), pemberian polisakaridamempunyai potensi sebagai
imunomodulator    sehingga  dapat  mengaktifkan sel  imunokompeten  yang  dapat  meningkatkan sistem  imunitas.  Peningkatan  produksi  neutrofil yang  berfungsi  untuk  mempertahankan  respon
inflamasi  akut  dalam  tubuh,  dalam  hal  ini neutrofil sedang melakukan fagositosis.
Dunaliella  salina juga  mengandung  betakaroten yang  dapat  berperan  sebagai  antioksidan.  Pada saat  fagositosis  akibat  infeksi  VNN  akan menghasilkan Reactive  Oxygen  Species (ROS) yang merupakan radikal bebas.
(a) (b)
Gambar 1. Gejala klinis ikan kerapu cantang yang diinfeksi VNN. (a). ikan diam di dasar. (b). Ikan berenang berputar ( whirling )
(a) (b)
Gambar  2. Neutrofil  dan  Eusinofil  ikan  kerapu  cantang  setelah  infeksi  VNN.  (a).  neutrofil  (b). eusinofil (Pembesaran 400x).
Polisakarida yang terkandung di dalam Dunaliella salina juga dapat  meningkatkan jumlah eusinofil. Menurut  Shaktivel et  al .,  (2015),  penambahan polisakarida  telah  terbukti  mampu  meningkatkan lisozim. Peningkatan lisozim sendiri  menandakan
adanya aktivitas fagositosis sel imun non-spesifik pada tubuh ikan, salah satunya eusinofil.
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan  diketahui  bahwa Dunaliella  salina berpengaruh  terhadap  jumlah  polimorfonuklear leukosit ikan kerapu cantang yang diinfeksi VNN . Jumlah  neutrofil  ikan  kerapu  cantang  tertinggi pada  perlakuan  C  (6  g/kg)  yakni  sebesar  4,24 sel/mm 3 (Tabel  3).  Tingginya  jumlah  neutrofil pada  perlakuan  C  tersebut  diduga  sebagai  akibat dari  adanya  infeksi  dalam  tubuh  ikan.  Menurut Utami et al ., (2013), peningkatan jumlah neutrofil akan  terjadi  ketika  ada  infeksi.  Peningkatan jumlah neutrofil merupakan akibat dari mekanisme kekebalan tubuh yang bekerja sebagai respons  imun.  Hal  ini  berkaitan  dengan  fungsi utama  neutrofil  yaitu  penghancuran  bahan  asing melalui proses fagositosis. Peningkatan jumlah sel neutrofil  mengindikasikan  adanya  peningkatan kegiatan  makrofag  yang  menghancurkan  partikel
asing (Rahma et al. , 2015).
Neutrofil yang teraktivasi cenderung
menghasilkan  ROS  dan Reactive  Nitrogen Species (RNS)  yang  bersifat  toksik  terhadap berbagai  patogen.  Selain  dapat  membatasi
replikasi virus, ROS yang terlalu tinggi juga dapat menyebabkan  kerusakan  pada  area  sel  sehingga menyebabkan inflamasi. Betakaroten yang dihasilkan  oleh Dunaliella  salina merupakan prekursor  vitamin  A  yang  memiliki  antioksidan sehingga dapat menetralisir adanya radikal bebas, seperti  ROS.  Vitamin  A  juga  berperan  dalam menjaga  sel  dan  jaringan  dari  kerusakan  serta berperan dalam fungsi kekebalan tubuh.
Pemberian Dunaliella salina pada perlakuan  A,  B,  C  maupun  D  menunjukkan terjadinya  eosinophilia  (peningkatan  jumlah eosinofil  dalam  darah).  Tingginya  jumlah eosinofil  pada  dosis  18  g/kg  pakan  juga  diduga sebagai  akibat  dari  adanya  infeksi  iridovirus dalam  tubuh  ikan.  Eosinofil  bersama-sama dengan neutrofil melawan infeksi yang disebabkan  oleh  VNN.  Menurut  Suhermanto et al .,  (2011),  eosinofil  merupakan  sel  kedua  dalam sistem  meiloid,  sel  ini  tidak  seefisien  neutrofil
Tabel 4. kisaran parameter kualitas air
Parameter Kualitas Air Kisaran Kualitas Air selama Penelitian Kisaran Optimal Menurut Pustaka Suhu 24-27,5 0 C 24-31 0 C** pH 7,1-8,1 5-9* DO 5,01-6,96 >4,9 ppm** Salinitas 31-33 ppt 30-33 ppt** *DJPB KKP (2013) **Yoshimitsu et al ., (1986)
Tabel 2. Data rerata polimorfonuklear leukosit setelah pemberian Dunaliella salina Perlakuan Total Leukosit (10 3 sel/mm 3 ), Neutrofil (10 3 sel/mm 3 ) Eosinofil (10 3 sel/mm 3 ) K – (0 g/kg pakan) 44,4 ± 0,005 3,83 ± 0,002 3,19 ± 0,007 A (6 g/kg pakan) 44,7 ± 0,104 3,86 ± 0,003 3,22 ± 0,007 B (12 g/kg pakan) 45,0 ± 0,013 3,88 ± 0,007 3,25 ± 0,008 C (18 g/kg pakan) 45,2 ± 0,001 3,90 ± 0,005 3,28 ± 0,007
Tabel 3. Rerata polimorfonuklear leukosit setelah infeksi
Perlakuan Total Leukosit Neutrofil Eosinofil K – (0 g/kg pakan) 45,1 ± 0,008 3,94 ± 0,015 10,58 ± 0,80 A (6 g/kg pakan) 45,6 ± 0,014 3,96 ± 0,007 12,06 ± 0,23 B (12 g/kg pakan) 45,8 ± 0,007 3,97 ± 0,006 12,57 ± 0,20 C (18 g/kg pakan) 45,9 ± 0,004 4,24 ± 0,015 13,38 ± 0,25
Rani Yuwanita et al. / JIPK, 10(2): 124-130
dalam fagositosis.  Eosinofil pada ikan diperlukan untuk  melawan  infeksi,  serta  untuk  menarik leukosit menuju area infeksi.
Parameter  kualitas  air  yang  diukur  pada penelitian ini meliputi suhu, DO, pH dan salinitas. Berdasarkan  pengamatan  parameter  kualitas  air selama  penelitian,  kisaran  kualitas  air  masih tergolong dalam kisaran optimal untuk kelangsungan  hidup  ikan  kerapu  cantang  (Tabel 4).

## 4. Kesimpulan
Berdasarkan  hasil  pengamatan, Dunaliella salina
berpengaruh terhadap jumlah polimorfonuklear  leukosit  ikan  kerapu  cantang yang  diinfeksi  VNN  dengan  nilai  tertinggi  pada perlakuan  C  (18  g/kg  pakan)  yang  mempunyai nilai  rerata  leukosit  45,9  x  103  sel/ml,  neutrofil: 4,24  x  103  sel/ml  dan  eusinofil  13,38  x  103 sel/ml.

## Daftar Pustaka
Amaninejad,  P.,  Emadi,  H.,  Emtyazjoo,  M.,  & Hossein,  Z.S.H.  (2012).  Effects  of Dunaliella salina on Different Levels of IGM, IGG, IGA and IGE Immuno globulins in Rainbow Trout ( Onchrohynchus Mykiss ).
Amelia,  N.,  &  Prayitno,  S.B.  (2012).  Pengaruh Ekstrak  Daun  Jambu  Biji  ( Psidium  guajava ) Untuk Menginaktifkan Viral Nervous Necrosis (VNN) Pada Ikan Kerapu Bebek ( Epinephelus fuscoguttatus ). Journal of Aquaculture Management and Technology 1 (1), 264-278.
Becker,  E.  W.  (2007).  Micro-algae  as  a  source  of protein. Biotechnology  advances , 25 (2),  207- 210.
Del Campo, J. A., García-González, M., & Guerrero, M.  G.  (2007).  Outdoor  cultivation  of microalgae  for  carotenoid  production:  current state  and  perspectives. Applied  microbiology and biotechnology , 74 (6), 1163-1174.
DJPB KKP. (2013). Leaflet Pembesaran Ikan Kerapu
Macan di KJA.
https://www.djpb.kkp.go.id/public/upload/dow nload/leaflet/Leaflet Pembesaran Ikan  Kerapu Macan di KJA. Diakses pada 23 Mei 2018.
Chen, H., & Jiang, J. G. (2009). Osmotic responses of Dunaliella to  the  changes  of  salinity. Journal of cellular physiology , 219 (2), 251-258.
Dai,  J.,  Wu,  Y.,  Chen,  S.  W.,  Zhu,  S.,  Yin,  H.  P., Wang,  M.,  &  Tang,  J.  (2010).  Sugar compositional  determination  polysaccharides from Dunaliella salina by modified RP-HPLC method  of  precolumn  derivatization  with  1- phenyl-3-methyl-5-pyrazolone. Carbohydrate Polymers , 82 (3), 629-635.
Mahasri,  D.,  Widyastuti,  P.,  &Sulmatiwi,  L.  (2011).
Gambaran  leukosit  darah  ikan  koi  ( Cyprinus carpio )  yang  terinfestasi Ichthyophthirius multifiliis pada  derajat  infestasi  yang  berbeda dengan  metode  kohabitasi. Jurnal  Ilmiah Perikanan dan Kelautan , 3 (1).
Mori,  K.  I.,  Nakai,  T.,  Muroga,  K.,  Arimoto,  M.,
Mushiake,  K.,  &  Furusawa,  I.  (1992). Properties  of  a  new  virus  belonging  to Nodaviridae  found  in  larval  striped  jack ( Pseudocaranx dentex ) with nervous necrosis. Virology , 187 (1), 368-371.
Nishizawa, T., Mori, K. I., Furuhashi, M., Nakai, T., Furusawa,  I.,  &  Muroga,  K.  (1995). Comparison  of  the  coat  protein  genes  of  five fish  nodaviruses,  the  causative  agents  of  viral nervous  necrosis  in  marine  fish. Journal  of General Virology , 76 (7), 1563-1569. OIE  ( Office  International  des  Epizooties) .  (2013).
Chapter  2.3.11  Viral  Encephalopathy  and Retinopathy in Manual of Diagnostic Test for Aquatic Animals 4th Edition. Office International des Epizooties. Paris. 456 hlm.
Purnamasari,  R.  (2017).  Polisakarida  Krestin  dari Jamur  Coriolus  versicolor  terhadap  hitung Jenis Leukosit Mencit yang diinfeksi
Mycobacterium  tuberculosis . BIOTROPIC The Journal of Tropical Biology , 1 (2), 16-30.
Rahma,  F.  W.  (2016).  Pengaruh  pemberian  ekstraks argassum  sp.  Dengan  pelarut  methanol  pada pakan terhadap jumlah eritrosit dan differensiall  eukositikan  lele  dumbo  ( Clarias gariepinus) (Doctoral  dissertation)  Universitas Airlangga.
Rustikawati, I. (2012). Efektivitas Ekstrak Sargassum sp. Terhadap Diferensiasi   Leukosit Ikan Nila ( Oreochromis niloticus ) yang Diinfeksi
Streptococcus iniae . Jurnal Akuatika , 3 (2). Sakthivel,  M.,  Deivasigamani,  B.,  Rajasekar,  T., Kumaran,  S.,  &  Alagappan,  K.  M.  (2016). Immunostimulatory  Effects  of  Polysaccharide Compound  from  Seaweed Kappaphycus alvarezii on  Asian  seabass  ( Lates  calcarifer )
and it is Resistance against Vibrio parahaemolyticus . Journal  of  Marine  Biology
& Oceanography , 2015 . Schneemann, A., Ball,L.A., Delsert,C., Johnson, J.E. &  Nishizawa,T.  (2005).  Family  nodaviridae. In:  virus  taxonomy,  eighth  report  of  the international  committee  on  taxonomy  of viruses. Fauquet c.m.,  mayo  m.a.,  maniloff j., desselberger  u.  &  ball  l.a.,  eds.  Elsevier academic press, london, uk, 865–872
Sudaryatma,  P.  E.,  Lestari,  A.  T.,  Sunarsib,  N.  L., Widiarti, K. S., Hidayab, S. N., & Srinoto, D. (2012).  Imunositokimia  Streptavidin  Biotin:
Deteksi  Dini  Viral  Nervous  Necrosis  Virus pada Lendir Ikan Kerapu Macan ( Epinephelus fuscoguttatus ). Jurnal  Sain  Veteriner , 30 (2012).
Suhermanto,  A.,  Andayani,  S.,  &  Maftuch,  M.
(2011).  Pemberian  total  fenol  teripang  pasir ( holothuria  scabra )  untuk  meningkatkan leukosit  dan  diferensial  leukosit  ikan  mas ( cyprinus  carpio )  yang  diinfeksi  bakteri
Aeromonas Hydrophila . Jurnal Kelautan: Indonesian  Journal  of  Marine  Science  and Technology , 4 (2), 150-157.
Supamattaya,  K.,  Kiriratnikom,  S.,  Boonyaratpalin,
M.,  &  Borowitzka,  L.  (2005).  Effect  of  a
Dunaliella extract  on  growth  performance, health condition, immune response and disease resistance  in  black  tiger  shrimp  ( Penaeus monodon ). Aquaculture , 248 (1-4), 207-216.
Thiéry,  R.,  Cozien,  J.,  Cabon,  J.,  Lamour,  F.,  Baud, M., & Schneemann, A. (2006). Induction of a protective  immune  response  against  viral nervous  necrosis  in  the  European  sea  bass Dicentrarchus  labrax by  using  betanodavirus virus-like particles. Journal of virology , 80 (20), 10201-10207.
Utami, D. T., Prayitno, S. B., Hastuti, S., & Santika, A.  (2013).  Gambaran  parameter  Hematologis pada  ikan  nila  ( Oreochromis  niloticus )  yang diberi vaksin DNA Streptococcus iniae dengan dosis  yang  berbeda. Journal  of  Aquaculture
Management And Technology , 7-20.
Yushimitsu,  T.,  Eda,  H.,  &  Hiramatsu,  K.  (1986). Groupers  final  report  marine-culture  research and  development  in  Indonesia. ATA-192.
JICA , 103-129.
Yuasa,  K.,  Roza,  D.,  Koesharyani,  I.,  Johnny,  F.,  & Mahardika, K. (2000). General remarks on fish disease  diagnosis. Textbook  for  the  Training
Course on Fish Disease Diagnosis. Lolitkanta- JICA Booklet , (12), 5-18.