## JIPK JURNAL ILMIAH PERIKANAN DAN KELAUTAN

## Research Article
Identifikasi  Bakteri  Endofit  Mangrove  Api-Api  Putih  ( Avicennia  marina )  Penghasil Enzim L-asparaginase
Identification  of  Mangrove  Endophyte  Bacteria  of  Api-Api  Putih  ( Avicennia  marina) as Producing L-asparaginase Enzyme
Asep Awaludin Prihanto 1,2,3 *, Alifatul Fatchiyah 1 , Hartati Kartikaningsih 1,2 , dan Ken Audia Pradarameswari 1
1 Department of Fishery Product Technology, Faculty of Fisheries and Marine Science, Brawijaya University, Jl. Veteran Malang 65145, East Java, Indonesia.
2 Bio-Seafood  Research  Unit,  Faculty  of  Fisheries  and  Marine  Science,  Brawijaya  University,  Jl.  Veteran  Malang 65145, East Java, Indonesia.
3 Halal  Thoyib  Research  center,  Ged.  Layanan  bersama,  Brawijaya  University,  Jl.  Veteran  Malang  65145,  East  Java, Indonesia.

## ARTICLE INFO
Received: September 10, 2018 Accepted: November 16, 2018
*) Corresponding author: E-mail: asep_awa@ub.ac.id
Kata Kunci : Endofit mangrove , Pseudomonas aeruginosa , L-asparaginase, Mikroorganisme
Keywords : Endophytes mangrove, Pseudomonas aeruginosa , L- asparaginase , Microorganism

## Abstrak
Enzim  L-asparaginase  (E.C  3.5.1.1)  adalah  protein  tetramer  yang  termasuk dalam  kelompok  keluarga  amidohydrolases  homolog.  ).  L-asparaginase secara selektif menghidrolisis L-aspargin (L-Asn) menjadi amonia (NH3) dan asam  aspartat.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mendapatkan  spesies  bakteri penghasil  enzim  L-asparaginase  yang  diisolasi  dari  mangrove Avicennia marina yang berasal dari Pantai Bajul Mati, Malang, Jawa Timur, Indonesia. Penelitian  ini  dilakukan  beberapa  tahapan  yaitu  pengambilan  dan  preparasi sampel,  skrining  L-asparaginase,  dan  identifikasi  menggunakan  uji mycrobact  system. Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  isolat  dengan aktivitas  enzim  L-asparaginase  terbesar  adalah  isolat  DAM6  yang  berasal dari daun Avicennia marina . Isolat DAM6 adalah bakteri merupakan bakteri gram negatif, berbentuk basil, bentuk koloni oval, tepi koloni  tidak rata dan elevansi  cembung.  Berdasarkan  analisis  microbact,  isolat  DAM6  adalah bakteri spesies Pseudomonas aeruginosa .

## Abstract
The  L-asparaginase  enzyme  (E.C  3.5.1.1)  is  a  tetramer  protein  belonging  to the  family  group  of  amidohydrolases.  L-asparaginase  selectively  hydrolyzes L-aspargin (L-Asn) to ammonia (NH3) and aspartic acid. This study aims to obtain  species  of  L-asparaginase  enzyme  producing  bacteria  isolated  from Avicennia  marina mangroves  from  Bajul  Mati  Beach,  Malang,  East  Java, Indonesia. This research carried out several stages such as took and prepared samples, screened L-asparaginase, and identified using the mycrobact system test.  The  results  showed  that  the  isolates  with  the  largest  L-asparaginase enzyme  activity  were  DAM6  and  it  was  originated  from  the  leaves  of Avicennia marina . DAM6 isolate is a gram negative with oval shape, uneven edges and conves elevation. Based on microbact analysis, DAM6 isolates are Pseudomonas aeruginosa .
Cite this as: Asep, A. P., Alifatul, F., Hartati, K., & Ken, A. P. (2018). Identifikasi Bakteri Endofit Mangrove Api-Api Putih ( Avicennia marina ) Penghasil Enzim L-asparaginase . Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan, 10(2):84-90. http://doi.org/10.20473/jipk.v10i2.10467

## 1. Pendahuluan
L-asparaginase  (E.C  3.5.1.1)  adalah protein tetramer yang termasuk dalam kelompok  keluarga  amidohydrolases  homolog (Abdel et  al .,  2002).  L-asparaginase  secara selektif menghidrolisis  L-aspargin  (L-Asn) menjadi  amonia  (NH3)  dan  asam  aspartat (Hendriksen et al., 2009). Enzim L- asparaginase memiliki banyak manfaat baik di dunia  medis  maupun  industri  pangan.  Pada dunia medis L-asparaginase digunakan sebagai agen  antikanker,  penghambat  pertumbuhan tumor,  dan  untuk  pengobatan  leukemia lifositik  akut.  Sedangkan  pada  industri pengolahan pangan enzim ini digunakan untuk mengurangi senyawa akrilamid (Trilockchandra et.al ,  2016).  Prihanto  dan Wakayama  (2014)  menemukan  B-ASNase sebagai enzim dari
B.
Subtilis (mikroorganisme  food  grade  seperti A.  oryzae dan Arthrospira  platensis ) yang  mampu menekan pembentukan akrilamid.
L-asparaginase di alam banyak ditemukan  pada fungi,  algae, tanaman  dan mikroba.  Mikroorganisme  sebagai  sumber  L- asparaginase  saat  ini  banyak  diaplikasikan untuk medis dan industri pengolahan makanan karena  mudah  dikultur.  Salah  satu  yang berhasil  dan  sudah  dikomersilkan  adalah  dari bakteri Escherichia  coli dengan  nama  dagang Elspar, dari Erwinia  chrysanthemi dengan nama  dagang Erwina ,  selain  itu  dapat  juga berasal dari
Enterobacter
aerogene,
Corynebacterium glutamicum, Candida utilis, Staphylococcus aureus, Thermus thermophiles, dan Pisum sativum (El-Bessoumy et al. , 2004).
Salah  satu  tanaman  yang  memiliki potensi  sebagai  sumber  mikroorganisme  yang adalah mangrove. Endofit mangrove mengandung  koloni  yang  diduga  dapat menghasilkan  enzim  L-asparaginase.  Batang tanaman  mangrove Rhizopora  mucronata , daun Sonneratia  caseolaris dan  batang Excoecaria  agalloca yang  berasal  dari  hutan mangrove di pesisir selatan Kerala diketemukan  bakteri  endofit  yang  positif menghasilkan  enzim  L-asparaginase.  Akar mangrove Avicennia  marina mengandung senyawa  Asparagin.  Asparagin  adalah  asam amino  yang  berfungsi  sebagai  substrat  untuk tumbuh  bakteri  yang  menghasilkan  enzim  L- asparaginase  (Medrofa et  al .,  2015).  Menurut Nur et al ., (2013), tanaman mangrove
Rhizopora apiculata juga mengandung senyawa asparagin. Hal ini juga didukung oleh Pate  (1980),  bahwa  asparagin  adalah  asam amino  utama  dengan  prosentase  60-80%  dari total asam amino pada akar, daun dan buah. Pantai  Bajul  Mati  berada  di  Desa Gajahrejo,  Kecamatan  Gedangan,  Kabupaten Malang.  Jaraknya  sekitar  58  Km  dari  Kota Malang. Pantai Bajul Mati ditumbuhi beraneka macam jenis mangrove seperti Sonneratia alba, Avicennia  marina , Ceriops  tagal,  Excoecaria agallocha , dan Rhizopora mucronata . Penelitian  yang  dilakukan  oleh  Prihanto  dan
Wakayama (2016) menyarankan bahwa wilayah  laut  dan  pesisir  adalah  sumber  utama enzim  yang  belum  dieksplorasi.  Oleh  karena itu  dengan  mengeksplorasi  daerah  ini,  enzim baru  dapat  ditemukan.  Kurniawan et  al .,
(2018)  menemukan  bakteri  yang  diisolasi  dari sedimen  mangrove  di  Pulau  Bangka  yaitu Bacillus  pumilus , Pseudomonas sp., Bacillus amyloliquefacien,  Bacillus  alvei,  Bacillus coagulant.
Saat  ini,  penelitian  tentang  enzim  L- asparaginase  masih  belum  berjalan  maksimal, akan  tetapi  permintaan  akan  sumber  baru semakin  meningkat.  Oleh  karena  itu  melihat pentingnya  peranan  enzim  L-asparaginase dalam bidang industri pangan maupun nonpangan  maka  perlu  dilakukan  penelitian sebagai  terobosan  sumber  baru  penghasil enzim  L-asparaginase  yang  dihasilkan  dari bakteri  yang  berasal  dari  mangrove  sebagai langkah  awal  untuk  dilakukannya  pengkayaan sumber L-asparaginase.

## 2. Bahan dan Metode
2.1 Alat dan Bahan Bahan-bahan  yang  di  gunakan  dalam penelitian  ini  meliputi  yaitu  bahan  utama berupa  sampel  (batang,  akar,  daun)  mangrove Api-Api Putih Avicennia marina yang diambil dari  kawasan  Pantai  Bajul  Mati  Malang  Jawa Timur, bahan media isolasi bakteri yaitu Luria Bertani Agar (LBA). Bahan media skrining L- asparaginase  yaitu  media  M9  Modifikasi  dan Bromthymol  Blue (BTB),  dan  bahan  lainnya seperti  NaFis  steril  0,9%,  aquadest,  alkohol 70%. Peralatan yang  digunakan dalam penelitian  ini  adalah  autoklaf,  refrigator, inkubator, laminar air flow , timbangan digital, mikropipet, pipet serologis, bola hisap, mortal, alu, cawan petri, tabung reaksi, dan pH meter.
2.2 Preparasi Sampel Pengambilan sampel dilakukan
mengikuti  Prihanto et  al .,  (2011)  di  daerah Pantai  Bajul  Mati,  Malang,  Jawa  Timur, Indonesia.  Mangrove  yang  digunakan  untuk penelitian  ini  adalah Avicennia  marina .  Tiga bagian  tanaman  (daun,  batang,  dan  akar) dipotong dengan pemotong etanol- didesinfeksi. Setiap bagian ditempatkan secara terpisah  dalam  kantong  plastik  steril  untuk menghindari  hilangnya  kelembaban.  Bahan- bahan  itu  diangkut  ke  laboraturium  dalam waktu  12  jam  dan  disimpan  pada  4°C  sampai prosedur isolasi dilakukan.

## 2.3 Isolasi bakteri
Isolasi bakteri mengikuti metode Prihanto  (2018).  Koloni  bakteri  yang  tumbuh dimurnikan  dengan  metode  strik  plate  pada media  LBA  untuk  didapatkan  biakan  murni atau isolat tunggal. Kemudian seal cawan petri dengan  wrap  dan  lakukan  inkubasi  pada  suhu 37 0 C  selama  24-48  jam.  LBA  mengandung komposisi  pepton,  NaCl, yeast  extract , bakterial.  Setelah  didapatkan  biakan  murni, koloni tunggal tersebut kemudian di pindahkan kedalam  media  agar  miring  dengan  cara mengambil isolat tunggal yang  terbentuk pada cawan  pemurnian  dengan  menggunakan  ose lalu  dipindahkan  kedalam  tabung  reaksi  yang berisi media LBA yang sudah di miringkan

## 2.4 Skrining Enzim L-Asparaginase
Skrining  bakteri  mengikuti  metode Gulati et al ., (1997). Isolat murni diambil dari stok  isolat  menggunakan  tusuk  gigi  steril  lalu digoreskan  pada  cawan  petri  berisi  media modifikasi M9  dengan komposisi D-glucose 2
g/l,  L-asparagin  5  g/l,  Na2HPO4  6  g/l, KH2PO4  3  g/l,  MgSO4  7H2O  0,02  g/l,  NaCl 0,5  g/l,CaCl2  0,02  g/l,  Agar  15  g/l  untuk selanjutnya dilarutkan dengan aquades.
Kemudian  tambahkan Bromothymol  blue 0,007  g/l,  sebagai  indikator  warna.  pH  diatur dengan  kisaran  antara  5.5  hingga  6.5. Kemudian  inkubasi  selama  72  jam  pada  suhu 37 0 C.

## 2.5 Uji Morfologi
Uji  morfologi  sel  bakteri  meliputi  dua tahap yaitu uji pewarnaan gram dan bentuk sel bakteri.  Pewarnaan  gram  dilakukan  mengikuti metode  Hadioetomo  (1993).  Pengujian  ini bertujuan  sama  dengan  uji  gram  yaitu  untuk membedakan  bakteri  apakah  gram  positif  atau gram negatif, bakteri dicampur dengan tetesan air  steril  pada  gelas  objek,  kemudian disebarkan  ditengah  gelas  objek  sehingga membentuk lapisan tipis dan difiksasi. Dengan kristal  violet  olesan  bakteri  digenangi  selama dua menit, lalu dicuci dengan air mengalir dan dikering  anginkan.  Diberikan  yodium  selama dua  menit,  dicuci  dengan  air  mengalir  dan dikering  anginkan.  Selanjutnya  diberi  larutan pemucat  yaitu  alkohol  95%,  tetes  demi  tetes sampai  zat  warna  ungu  tidak  terlihat  lagi,  lalu dicuci  pada  air  mengalir  dan  dikering anginkan.  Kemudian  digenangi  lagi  dengan safranin  selama  30  detik,  lalu  dicuci  dan dibiarkan  kering  di  udara.  Warna  merah  pada olesan  bakteri  menujukkan  bakteri  gram negatif  dan  jika  warna  ungu  menunjukkan bakteri  gram  positif.  Uji  morfologi  koloni meliputi  beberapa  tahap  antara  lain  bentuk koloni,  warna  koloni,  tepi  koloni,  elevasi
Gambar 1. Hasil Skrining L-asparaginase
24 jam 48 jam
72 jam
Daun Batan g Akar
koloni  yang  dapat  dilakukan  secara  visual dengan menggunakan mata.

## 2.6 Karakterisasi biokimia bakteri
Karakterisasi biokimia dilakukan menggunakan sistem Microbact . Untuk menentukan identitas bakteri, karakter biokimia  mereka  akan  dibandingkan  dengan Manual Bakteri Determinatif Bergey's
(Kurniawan et al ., 2018).

## 3. Hasil dan Pembahasan
Sampel  yang  digunakan  adalah  endofit mangrove  berupa  akar  batang  dan  daun  dari Avicennia marina . Setelah ditumbuk, dilakukan pengenceran dan penanaman diketahui  bahwa  bakteri  yang  ada,  dapat tumbuh  baik  pada  media Luria  Bertani  Agar (LBA). Dari hasil isolasi bakteri didapatkan 12 isolat bakteri dari sampel mangrove Avicennia marina .  Dari  sampel  daun  terbentuk  4  isolat, sampel  batang  terbentuk  4  isolat,  sampel  akar terbentuk  4  isolat.  Ciri-ciri  isolat  sebagian besar  berbentuk  bulat,  tepi  tidak  rata,  koloni
berwarna  putih,  dan  elevansi  cembung.  Hasil skrining  menggunakan  media  M9  Modifikasi sampel  daun  batang  dan  akar  diketahui  positif mengandung bakteri yang menghasilkan enzim L-asparaginase Hasil analisis menunjukkan bahwa isolat sampel  daun  yang  memiliki  aktivitas  enzim terbesar  adalah  isolat  DAM4  dan  DAM6. Sedangkan sampel batang tidak terlihat adanya aktivitas enzim dan sampel akar yang memiliki aktivitas enzim terbesar adalah isolate KAM4. Aktivitas  enzim  ini  dapat  dilihat  dari  kuatnya bakteri  tersebut  untuk  menghidrolisi  L- asparagin  pada  media  skrining  L-asparaginase yang  ditandai  dengan  berubahnya  media skrining  menjadi  warna  biru.  Isolat  bakteri yang mampu menghasilkan enzim L- asparaginase  akan  menghidrolisis  asam  amino L-asparagin  menjadi  asam  aspartat  dan amoniak.  Hasil  dari  pembentukan  amoniak adalah  meningkatnya  pH  medium.  Meningkat atau  tidaknya  pH  medium  dapat  dilihat  dari perubahan warna yang terjadi. Indikator warna
Tabel 1. Aktivitas enzim L-asparaginase pada bagian tumbuhan mangrove
Sampel No Kode Jam Jam Jam ke- ke- ke- 24 48 72 Daun 1 DAM3 - ++ ++ 2 DAM4 + ++ ++ 3 DAM5 - + ++ 4 DAM6 + ++ ++ Batang 5 BAM3 - - - 6 BAM4 - - - 7 BAM5 - - - 8 BAM6 - - - Akar 9 KAM3 - - - 10 KAM4 + + + 11 KAM5 - - - 12 KAM6 - + +
Keterangan: + : Aktivitas Hidrolisis Rendah ++ : Aktivitas Hidrolisis Sedang +++ : Aktivitas Hidrolisis Besar
BTB berwarna kuning pada suasana asam dan akan berubah menjadi biru pada suasana basa. Apabila isolat menghasilkan enzim asparaginase  maka  medium  sekitar  isolat menjadi  alkali  atau  basa  hal  ini  ditandai
dengan berubahnya  media  menjadi  warna biru karena kemampuannya menghasilkan senyawa amoniak (Gulati et al ., 1977).
Hasil uji morfologi isolat bakteri sampel daun mangrove Avicennia marina kode DAM6 didapatkan  hasil  bahwa  warna  koloni  adalah hijau kebiruan sedangkan bentuk koloni adalah oval,  tepi  koloni  tampak  tidak  rata.  Elevansi koloni  adalah  cembung  sedangkan  konsistensi koloni adalah kering. Sedangkan pada pewarnaan  gram,  isolat  DAM6  merupakan bakteri  gram  negatif.  Bakteri  gram  negatif akan  memberikan  warna  merah  setelah diberikan safranin karena lipid yang terdapat di dalam  dinding  selnya  akan  larut  pada  waktu pencucian dengan alkohol sehingga pori-pori
dan dinding sel akan membesar dan menyebabkan  terlepasnya  kompleks  kristal violet  yang  diserap  sebelumnya  (Pelczar, 2001).
Dari dari hasil identifikasi menggunakan
Microbact  system ,  isolat  bakteri  kode  DAM6 dengan  sampel  daun  dari  mangrove Avicennia marina pada  pengenceran  10-6  didapatkan jenis  spesies  yaitu Pseudomonas  aeruginosa. Pseudomonas  aeruginosa termasuk  dalam family pseudomonadaceace . Pseudomonas aeruginosa merupakan  bakteri  Gram  negatif, aerob,  dan  bergerak  dengan  menggunakan flagel,  dan  merupakan  bakteri  oportunistik (Todar,  2004). Pseudomonas  aeruginosa berbentuk batang lurus atau lengkung, berukuran sekitar 0,6 x 2 mm dapat ditemukan satu-satu,  berpasangan,  dan  kadang-kadang membentuk  rantai  pendek,  tidak  mempunyai spora,  tidak  mempunyai  selubung  ( sheath ) (Jawez, 2011).
Gambar 2. Hasil pewarnaan gram isolate DAM6
Tabel 2 . Hasil Uji Morfologi Koloni
Parameter Hasil Warna koloni Hijau Biru Bentuk Koloni Oval Tepi Koloni Tidak Rata Elevansi Koloni Cembung Konsistensi Kering

## 4. Kesimpulan
Mikroorganisme  penghasil  enzim  L- asparaginase dengan aktivitas tinggi didapatkan dari isolat DAM6 yang berasal dari daun mangrove Avicennia
marina .
Berdasarkan analisis microbact , isolat tersebut
adalah spesies bakteri
Pseudomonas aeruginosa .

## Daftar Pustaka
Abdel, F.  Y.  R., & Olama,  Z.  A.  (2002).  L- asparaginase  production  by Pseudomonas aeroginosa by solid state culture: evaluation and optimization culture conditions using
factorial designs. Process Biochemistry, 38:115-22. El-Bossoumy,  A.  A.,  Sarhan,  M.,  &  Mansor,  J.
(2004).  Production,  isolation, and  purification of l-asparaginase from Pseudomonas aeruginosa 50071 using solid-state
fermentation. Journal  of  Biochemistry  and Molecular Biology, 4 (37):387-393.
Gulati,  R.,  Saxena,  R.  K.,  &  Gupta,  R.  (1997).  A Rapid  Plate  Assay  for  Screening  L-
Asparaginase  Producing  Micro-Organisme. Letter in Application Microbiology, 24(1):23-26.
Hendriksen, H. V., Kornbrust, B. A., Ostergaard, P. R.,  &  Mary,  A.  (2009).  Evaluating  the
Tabel 3. Hasil Uji Microbact dan Bergey Manual Uji Biokimia Uji Microbact Bergey Manual Keterangan Spora - Tidak diketahui - Oksidase + + Cocok Motilitas + Tidak diketahui - Nitrat + Tidak diketahui - Lysin + + Cocok Ornithin - + Tidak Cocok H2S - - Cocok Glukosa + + Cocok Manitol - + Tidak cocok Xylosa + - Tidak cocok ONPG - Tidak diketahui - Indole - Tidak diketahui - Urease - - Cocok V-P - - Cocok Sitrat + + Cocok TDA - - Cocok Gelatin + + Cocok Malonat + + Cocok Inositol - - Cocok Rhamnosa + - Tidak cocok Sukrosa - - Cocok Lactosa - - Cocok Arabinosa - - Cocok Adonitol - - Cocok Raffinosa - Tidak diketahui - Salicin - Tidak diketahui - Arginin + + Cocok Katalase - Tidak diketahui - Koagulase - Tidak diketahui - hemolisis Beta Tidak diketahui - Uji sensitive Novobiosin Tidak diketahui Tidak diketahui - Starch hydrolysis - - - Casein hydrolysis + Tidak diketahui -
potential for enzymatic acrylamide
mitigation in a range of food products using an  asparaginase  from Aspergillus  oryzae . Journal of Agricultural and Food Chemistry , 57:4168-4176.
Jawez,  E.,  Melnick,  &  Adelberg.  (2001).  Medical Microbiology  22  Edition.  USA:  MCGraw- Hill Companies.
Kurniawan,  A.,  Prihanto,  A.  A.,  Sari,  S.  P., Febriyanti, D., Sambah, A. B., & Asriani, E. (2018, April). Isolation and identification of cellulolytic bacteria from mangrove sediment in bangka island.  Paper presented at  the  International  Fisheries  Symposium, University of Brawijaya, Indonesia. Medrofa,  A.  N.,  Isidora,  K.  S.,  &  Mulawarmanti, D.  (2015).  Ekstrak  daun  mangrove  ( A. marina )  mempercepat  kesembuhan  ulkus traumatikus. Jurnal Dentofasial ,  14(1):11-
14.
Nur,  M.,  Nasruddin,  &  Wasiq,  J.  (2013). Penerapan teknologi plasma untuk
mempercepat persemaian mangrove sebagai upaya rehabilitasi green belt untuk mengatasi abrasi. Jurnal Riptek , 7(1):15-26.
Nurdiani,  R.,  Firdaus,  M.,  &  Prihanto,  A.  A. (2012).  Phytochemical  screening  and Antibacterial activity of methanol extract of mangrove  plant  (Rhyzophora  mucronata) from  Porong  River  Estuary. Journal  Basic Science And Technology , 1(2):27-29