## SUKSESI MIKROBIA TERHADAP PENURUNAN ETANOL, ASAM LAKTAT DAN ASAM ASETAT SELAMA FERMENTASI BIJI KAKAO

## Mulono Apriyanto
Program Studi Teknologi Pangan, Fakultas Pertanian, Universitas Islam Indragiri Jln. Propinsi Parit 1 Tembilahan Hulu, Indragiri Hilir mulonoapriyanto71@gmail.com

## Abstrak
Tujuan  penelitian  adalah:  1)  mengetahui  komposisi pulp biji  kakao  asalan sebagai subtrat untuk fermentasi; 2) mengevaluasi pengaruh variasi teknik fermentasi biji  kakao  asalan  terhadap  populasi  mikrobia.  Tahapan  penelitian  yang  dilakukan adalah sebagai berikut (1) pengujian komposisi dan kadar air pulp biji kakao asalan sebagai subtrat fermentasi. (2)  Fermentasi biji kakao asalan dengan 3 variasi teknik fermentasi  yaitu  pertama  perlakuan  tanpa  penambahan  inokulum  (kontrol),    kedua menggunakan  inokulum S.  cerevisiae (FNCC  3056), L.  lactis (FNC  0086)  dan A. aceti (FNCC  0016),  masing–masing  sekitar  108    cfu/g  diberikan  serentak  diawal fermentasi  (IA).  (3)  pemberian  inokulum  secara  bertahap  yeast  di  awal  fermentasi, bakteri asam laktat pada jam ke 24 dan bakteri asam asetat pada jam ke 48  dengan populasi  mikrobia  sama  dengan  perlakuan  kedua  (IB).  Fermentasi  dilaksanakan selama  120  jam.  Suhu  diatur  selama  fermentasi,  berturut-turut  35 o C  (24  jam pertama), 45 o C (24 jam kedua), 55 o C (24 jam ketiga) dan 35 o C  (48 jam terakhir). Hasil  penelitian  menunjukan  bahwa  selama  fermentasi  biji  kakao  asalan menunjukan  seluruh  perlakuan  terjadi  peningkatan  kosentarsi  etanol  sejalan  dengan meningkatnya  populasi S.  cerevisiae diawal  fermentasi.  Selanjutnya L.  lactis meningkat  diikuti  asam  laktat,  diakhir  fermentasi A.  aceti meningkat  diikuti  asam asetat.  Dari  hasil  penelitian  ini  dapat  disimpulkan  bahwa  rehidrasi pulp biji  kakao asalan  dapat  memperbaiki  komposisi pulp sebagai  subtrat  fermentasi.  Populasi mikrobia  menunjukan  telah  terjadi  suksesi  mikrobia  ditunjukan  pada  perlakuan penambahan inokulum secara bertahap.
Kata Kunci : Biji kakao asalan, fermentasi, inokulum, etanol, asam laktat dan asam asetat

## PENDAHULUAN
Produksi  biji  kakao  kering  dari perkebunan  rakyat  pada  umumnya  tidak menggunakan  proses  fermentasi  baik secara alami maupun dengan penambahan  inokulum.  Pada  umumnya petani kakao hanya merendam biji kakao segar  dalam  air  dalam  upaya  untuk membantu  menghilangkan pulp dan
menjemur.  Biji  kakao  kering  yang  tidak diketahui  kadar  airnya,  dijual  tanpa memperhatikan  kualitas  baik  dari  aspek kadar  air  maupun  kondisi  biji  kering disebut sebagai biji kakao asalan.
Fermentasi adalah salah satu faktor penting  dalam  pengolahan  biji  kakao khususnya  dalam  pembentukan  senyawa prekusor  flavor.  Fermentasi  biji  kakao
segar  terdiri  atas  2  tahap  yaitu  tahap pertama  dimulai  dengan  pelepasan  pulp dari  permukaan  biji  dan  kedua  reaksi hidrolitik didalam kotiledon biji.
Perubahan  jenis  dan  jumlah  mikrobia selama  berlangsungnya  fermentasi  biji kakao  lebih  dikenal  dengan  istilah suksesi  mikrobia.  Pada  tahap  awal fermentasi keberadaan
mikrobia didominasi oleh yeast, selanjutnya diikuti oleh bakteri asam laktat dan akhir fermentasi  oleh  bakteri  asam  asetat (Aprotosoaie et al, 2016; Mulono, 2016).
Aktivitas mikrobia tersebut menghasilkan  etanol,  asam  laktat  dan asam  asetat  selama  fermentasi  diikuti oleh kenaikan suhu lingkungan fermentasi.  Alkohol  dan  asam  asetat didifusi  kedalam  biji  kakao  dan  diikuti oleh  kenaikan  suhu  yang  berdampak pada kematian biji (tidak dapat berkecambah).
Proses fermentasi kakao umumnya berlangsung  secara  alami  dibantu  oleh mikrobia  dari  udara  berlangsung  selama 6  hari  serta  dilakukan  pembalikan pertama  dihari  ke  2  dan  selanjutnya dilakukan  pada  setiap  24  jam  (Afoakwa et  al,  2014). S.  cerevisiae memiliki beberapa kelebihan seperti pertumbuhannya  sangat  baik,  toleran terhadap etanol, serta aktivitas pektinolitik  dan  tahan  terhadap  pH rendah. Lactobacillus  sp yang  dijumpai pada  media  fermentasi  biji  kakao  segar adalah L.  lactis, dengan  kelebihannya yaitu  lebih  kompetitif,  lebih  toleran terhadap  asam  dan  etanol  dan  tahan dikondisi  lingkungan  dengan  jumlah oksigen  lebih  banyak.  Bakteri  asam asetat  didominasi A.  aceti dengan kemampuan  tumbuh  dikosentrasi  etanol sampai  6,0  %,  suhu  45°C  dan  pada  pH 3,5 serta etanol dioksidasi menjadi asam asetat  dan  dikonversi  lanjut  asam  asetat menjadi    CO 2 dan  air  (Cortes  et  al, 2012).
Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui suksesi mikrobia dan perubahan kosentrasi  etanol,  asam  laktat dan asam asetat selama fermentasi

## METODOLOGI PENENITIAN

## Bahan
Bahan  yang  digunakan  dalam peneitian  ini  adalah  ;  buah  kakao  jenis lindak  ( bulk  cacao) diperoleh  dari  desa Bunder, Patuk, Gunung Kidul, Yogyakarta  dengan  karakteristik  yang dimiliki  yaitu  panjang  buah  ±15  cm, diameter  ±8  cm,  kulit  buah  masak optimal  berwarna  orange,  jumlah  biji tiap pod ±35 keping biji.
Kemudian  nokulum S.  cerevisiae (FNCC 3056) , L. lactis (FNC 0086) dan A.  aceti (FNCC  0016) diperoleh  dari laboraturium  mikrobiologi  Pusat  Studi Pangan  dan  Gizi  Universitas  Gadjah Mada. Aseton 80%, BSA (bovien serum albumin),  buffer  pospat,  asam  asetat, tricloroacetat  acid, HCl,  larutan  buffer pH  4,  pH  7  dan  pH  9,  hexan,    larutan Folin-Ciocalteu , Na 2 CO 3.

## Pelaksanaan Penelitian
Fermentasi terkendali dengan penambahan  inokulum  mikrobia  dan pengaturan suhu inkubator dengan perlakuan  control  mengacu  Mulono et al .,  2016b.  Biji  kakao  kering  terhidrasi yang  digunakan  pada  tahap  ini  adalah yang  terpilih.  Biji  kakao  rehidrasi sebanyak  100  gram  difermentasi  selama 5x24  jam  dengan  tiga  variasi  perlakuan: a)  tanpa    penambahan  inokulum  disebut kontrol, b)  dengan  penambahan  inokulum S.  cerevisiae (FNCC  3056), L.  lactis (FNC  0086)  dan A.  aceti (FNCC  0016) secara  serentak  pada  awal  fermentasi dengan populasi masing-masing sebanyak 10 8 cfu/g,  dan  c)  dengan  penambahan inokulum  mikrobia  secara  bertahap sebagai  berikut  : S.  cerevisiae (FNCC
3056)  pada  awal  24  jam  pertama, L. lactis (FNC  0086)  pada  awal  24  jam kedua  dan A.  aceti (FNCC  0016)  pada awal  24  jam        ketiga,  masing  masing dengan populasi sebanyak 10 8 cfu/g. Fermentasi dilakukan
secara berurutan  dengan  suhu  terkendali:  35  ± 0,1 o C  pada awal 24 jam pertama,  45 ± 0,1 o C  pada  awal  24  jam  kedua,    55  ± 0,1 o C pada awal 24 jam ketiga dan 35 ± 0,1 o C pada awal 24 jam keempat hingga jam  ke  120.  Total  waktu  fermentasi adalah 120 jam.
Pengujian  jumlah S.  cerevisiae , L. lactis dan A.  aceti menggunakan metode pour  plate  count (Kustyawati dan  Setyani,  2008),  kosentrasi  etanol, asam  laktat  dan  asam  asetat  (metode Kresnowati et al, 2013).

## Rancangan Percobaan
Rancangan percobaan yang dilakukan menggunakan Rancangan
Acak  Lengkap  (RAL).  Data  seluruhnya dianalisa  statistik  secara  oneway  anova pada  tingkat  signifikasi  95%  jika berbeda  nyata  dilanjutkan  dengan  uji lanjut  LSD  ( least  Significant different) menggunakan program SPSS 17.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Populasi Mikrobia awal
Hasil penelitian menunjukan selama  pengeringan  biji  kakao  terjadi penurunan  komposisi pulp biji  kakao kering  dan  populasi S.  cerevisiae , L. lactis dan A.  aceti, untuk  dapat berlansungnya  proses  fermentasi pulp biji kakao         kering harus memenuhi syarat sebagai subtrat. Penurunan populasi S. cerevisiae karena  air  dalam
pulp biji    kakao    menguap  sehingga pertumbuhan S. cerevisiae terganggu dan menyebabkan kematian sel. L. lactis mengalami  penurunan  diduga  karena suhu  pengeringan  menurunkan  kadar  air bebas  sehingga  bakteri  tidak  dapat tumbuh  optimal.  Pertumbuhan  bakteri membutuhkan  air  bebas  yang  lebih banyak  dibandingkan  yeast.  Pada  proses pengeringan Aw turun, artinya air bebas yang  tersisa  tidak  mencukupi  untuk kebutuhan  pertumbuhannya,  walaupun pulp menyediakan nutrisi yang diperlukan. Proses  pengeringan  menguapkan air dalam pulp serta seluruh alkohol hasil perombakan  gula  oleh S.  cerevisiae berakibat pada tidak berkembang populasi A. aceti. Populasi S. cerevisiae, L.  lactis  dan  A.  aceti sebesar  berturut-
turut 3,5 x 10 5 cfu/g, 4,7 x 10 6 cfu/g dan
4,2  x  10 4 cfu/g    (cfu=  Colony  Forming Unit).    Populasi S.  cerevisiae , L.  lactis dan A. aceti yang terdapat pada pulp biji kakao  segar  dan pulp biji  kakao  kering tersaji pada Tabel 1.
Tabel 1.  Populasi S.  cerevisiae , L.  lactis dan A.  aceti pada pulp biji  kakao  segar dan pulp biji kakao kering Mikrobia Pulp biji kakao segar (cfu/g) Pulp biji kakao kering (cfu/g) S. cerevisiae 4,5 x 10 6 3,5 x 10 5 L. lactis 4,2 x 10 7 4,7 x 10 6 A. aceti 4,6 x 10 5 4,2 x 10 4
Hasil penelitian tahap ini menunjukan  bahwa  pada  biji  kakao kering  telah  memiliki  populasi S.
cerevisiae,  L.  lactis  dan  A.  aceti , meskipun populasi tersebut belum memadahi untuk berlangsungnya fermentasi biji kakao terutama pada awal fermentasi,  sejalan  dengan  penelitian Kresnowati  et  al  (2013),  dan  Mulono  et al, (2017).

## Suksesi Mikrobia
Hasil  penelitian  ini  menunjukan bahwa  pada  perlakuan  kontrol    populasi S.  cerevisiae,  L.  lactis  dan  A.  aceti di awal  fermentasi  berturut-  turut  5,55, 6,66  dan  4,65  log  (cfu/g).  Hasil  analisis statistik  evaluasi  hasil    fermentasi melalui perubahan kimia dan
mikrobiologi  dengan  perlakuan  kontrol,
IA dan IB tersaji pada Tabel 2. Pada  perlakuan  kontrol  diawal fermentasi  kosentrasi etanol, asam laktat dan asam asetat seluruhnya 0%.  Pada 24 jam fermentasi terjadi perubahan populasi S.  cerevisiae,  L.  lactis  dan  A. aceti berturut – turut yaitu 7,24; 6,70 dan 6,71 log (cfu/g). Kosentrasi etanol, asam laktat  dan  asam  asetat  berturut  –turut yaitu 4,83, 1,83 dan 1,53%. Pada 48 jam fermentasi  populasi S.  cerevisiae,  L. lactis dan A. aceti masing – masing yaitu 5,88,  8,66  dan  6,64  log  (cfu/g). Kosentrasi  etanol,  asam  laktat  dan  asam asetat  berturut  –  turut  yaitu  2,63,    3,44 dan  2,35%.    Pada  72    jam  fermentasi populasi S.  cerevisiae,  L.  lactis dan A. aceti berturut – turut yaitu 4,23, 8,43 dan 6,11 log (cfu/g). Kosentrasi etanol, asam laktat  dan  asam  asetat  berturut  –  turut yaitu  1,02,  4,03  dan  3,46%.  Hasil analisis  statistik  ANOVA  satu  arah menunjukan  bahwa  rata  –  rata  populasi S.  cerevisiae perlakuan  kontrol,  IA  dan IB  berturut  –  turut  yaitu  4,93,  5,86  dan 5,66 log (cfu/g) dan tidak berbeda nyata (p≤0,05).  Hal  ini  dapat  diduga  bahwa
pengendalian  suhu  lingkungan  menjadi ideal untuk pertumbuhan S. cerevisiae.
Rata  –  rata  populasi L.  lactis menunjukan  bahwa  perlakuan  kontrol, penambahan  inokulum  secara  serentak dan secara bertahap berturut – turut yaitu 6,90,  8,6  dan  8,55  log(cfu/g)  dan perlakuan  kontrol  menunjukan  berbeda nyata  terhadap  perlakuan  yang  lain. Rata- rata populasi A. aceti menunjukan bahwa    perlakuan  kontrol,  penambahan inokulum  secara  serentak  dan    secara bertahap  yaitu  5,57,  7,78  dan  8,74  log (cfu/g). Hasil  uji  statistik  menunjukan bahwa  perlakuan  kontrol  berbeda  nyata (p≤0,05) terhadap perlakuan penambahan  inokulum  secara  serentak dan secara bertahap. Perubahan populasi
S. cerevisiae , L. lactis dan A. aceti yang hasilkan perlakuan kontrol sesuai dengan hasil  penelitian  Kresnowati  et  al,  (2013) dan  Afoakwa  et  al , (2014),  yang  telah mempelajari  pertumbuhan  yeast,  bakteri asam  laktat  dan  bakteri  asam  asetat selama fermentasi biji kakao segar. Hasil analisis Anova penelitian ini menunjukan  bahwa  rata-rata  produksi etanol,  asam  laktat  dan  asam  asetat selama  fermentasi  tidak  berbeda  nyata (p≤0,05)  sesuai  dengan  hasil  penelitian Kustyawati  dan  Setyani,  (2008)  yang telah mempelajari ekologi mikrobia pada fermentasi biji kakao di Indonesia.
Jika  ditinjau  kosentrasi  etanol, asam  laktat  dan  asam  asetat  selama fermentasi pada perlakuan kontrol masih  relatif  rendah,  dapat  diduga rendahnya kosentrasi  etanol,  asam  laktat dan  asam  asetat  disebabkan  oleh populasi  dan  aktivitas S.  cerevisiae , L. lactis  dan  A.  aceti rendah.  Rendahnya populasi dan aktivitas S. cerevisiae dapat disebabkan  karena  kondisi  suhu  dan  pH yang  tidak  ideal,  sejalan  dengan  hasil penelitian  Ganda et  al, (2008)  bahwa kondisi  suhu  dan  pH  optimum  aktivitas
enzim poligalaturonase (PG) akan terjadi depolimerisasi pulp biji kakao.
Selajutnya  hubungan  populasi S. cerevisiae, L. lactis dan A. aceti terhadap konsentrasi etanol, asam laktat dan asam asetat biji  kakao  pada  kontrol  selama fermentasi tersaji pada Gambar 1.
Tabel 2.   Hasil  analisis  statistik  populasi S.  cerevisiae,  L.  lactis,  A.  aceti, etanol, asam laktat, asam asetat, total polifenol dan asam amino hidrofobik. Parameter Perlakuan Kontrol IA IB S. cerevisiae (log cfu/g) 4,93 ± 0,35a 5,86 ± 0,95a 5,66 ± 0,05a L. lactis (log cfu/g) 6,90 ± 0,37a 8,6± 0,46b 8,55± 0,66b A. aceti (log cfu/g) 5,57 ± 0,27a 7,78 ± 0,48b 4,67 ± 0,81b Etanol (%) 1,81 ± 0,50a 1,93 ± 0,57a 1,94 ± 0,6a Asam laktat (%) 2,64 ± 0,37a 2,47 ± 0,39a 2,54 ± 0,40a Asam asetat (%) 3,09± 0,58a 3,25 ± 0,62a 3,43 ± 0,70a Keterangan :   Huruf    berbeda  dibelakang  angka  pada  baris  sama  menunjukan  beda nyata p<0,05
Hasil rata-rata 2 ulangan dengan 3 ulangan analisis
Gambar 1.   Hubungan  populasi S.  cerevisiae,  L.  lactis  dan  A.  aceti terhadap konsentrasi  etanol,  asam  laktat  dan  asam  asetat selama  fermentasi  biji kakao  hasil  perlakuan  kontrol  .  Awal  (0)  –  24  jam  fermentasi  suhu inkubator 35°C, 24  – 48 jam fermentasi suhu inkubator 45°C, 48  – 72 jam fermentasi suhu inkubator 55°C dan 72 – 120 jam fermentasi suhu inkubator 35°C.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 2 4 6 8 10 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 ko se n tra si (% )
log (C FU /g) Lama fermentasi (jam) S. cerevisiae etanol
L. lactis asam laktat A. aceti asam asetat
Hasil penelitian ini pada perlakuan penambahan  inokulum S.  cerevisiae
(FNCC  3056) ,  L.  lactis (FNCC  0086) dan A.  aceti (FNCC  0016)  secara serentak  diawal  fermentasi  menunjukan bahwa  populasi S.  erevisiae,  L.  lactis, dan A.  aceti diawal  fermentasi  berturut –  turut  yaitu  8,28,  8,58  dan  8,57  log (cfu/g) . Hubungan  antara  populasi S. cerevisiae , L. lactis dan A. aceti terhadap kosentrasi  etanol,  asam  laktat  dan  asam asetat  pada  perlakuan  penambahan inokulum  secara  serentak  tersaji  pada Gambar  2.    Pada  24  jam  fermentasi populasi S. cerevisiae , L. lactis, A. aceti masing  –  masing  yaitu  12,41,  8,39  dan 8,38  log  (cfu/g),  terjadi  kenaikan populasi S. cerevisiae dari awal fermentasi.  Pada  48  jam  fermentasi populasi S. cerevisiae , L. lactis, A. aceti berturut – turut 5,88, 11,82 dan 8,82 log (cfu/g), populasi L. lactis tertinggi terjadi di  48  jam  fermentasi.  pada  72  jam fermentasi  populasi S.  cerevisiae,  L. lactis dan A.  aceti berturut  –turut  yaitu 4,23,  9,11  dan  10,72  log  (cfu/g),  terjadi populasi A.  aceti tertinggi  disini. Selanjutnya  populasi S.  cerevisiae,  L. lactis dan A. aceti menunjukan penurunan berturut – turut yaitu 2,5, 6,39 dan 5,45 log (cfu/g).
Jika  ditinjau  kosentrasi  etanol, asam laktat dan asam asetat menunjukan berturut  –  turut  diawal  fermentasi  yaitu 0%.  Pada  24  jam  fermentasi  dihasilkan kosentrasi  etanol,  asam  laktat  dan  asam asetat  berturut  –  turut  yaitu  5,23,  1,433 dan  1,87%.  Pada  48  jam  fermentasi dihasilkan  kosentrasi  etanol,  asam  laktat dan  asam  asetat  berturut  –  turut  yaitu 3,02,  3,46  dan  2,05%.  Pada  jam  ke  72 fermentasi menunjukan kosentrasi etanol,  asam  laktat  dan  asam  asetat berturut  –  turut  yaitu  1,35,  3,64  dan 3,54%.  Diakhir  fermentasi  menujukan penurunan  kosentrasi  etanol  asam  laktat
dan  asam  asetat  berturut  –  turut  yaitu 0,33, 1,82 dan 6,32%.
Kosentrasi  etanol,  asam  laktat  dan asam asetat yang dihasilkan lebih  tinggi dari  perlakuan  kontrol  dapat  diduga bahwa penambahan inokulum meningkatkan  populasi S.  cerevisiae,  L.
lactis dan A.  aceti sebanyak  10 8 cfu/g.Setelah  24  jam  fermentasi  terjadi kenaikan  suhu  fermentasi  dan  pH lingkungan  fermentasi  berakibat  pada kondisi optimum aktivitas enzim PG dan dihasilkan  etanol  lebih  banyak  sehingga kondisi  tidak  sesuai  untuk S.  cerevisiae dan  perannya  digantikan  oleh L.  lactis. Setelah  48  jam  fermentasi  subtrat  gula sudah relatif sedikit, aerasi semakin baik dan kosentrasi etanol yang relatif  tinggi, pH pulp semakin  kecil  menjadikan kondisi ideal untuk A. aceti.
Hasil  analisis  Anova  satu  arah menunjukan  bahwa  populasi L.  lactis dan A. aceti pada perlakuan penambahan    inokulum  diawal    berbeda nyata (p≤0,05) terhadap kontrol. Pertumbuhan  populasi S.  cerevisiae,  L.
lactis dan A.  aceti yang  dihasilkan sesuai dengan yang diperoleh Mulono et al .,  (2016a);  yang  telah  mempelajari penambahan S. cerevisiae (FNCC 3056) ,
L.  lactis (FNCC  0086) dan A.  aceti (FNCC 0016) pada proses fermentasi biji kakao  segar  varietas  lindak.  Hasil penelitian  ini  juga  sesuai  dengan  hasil yang  diperoleh  Widianto et  al, (2013) yang  mempelajari  perbaikan  proses fermentasi  dengan  penambahan  tetes tebu  dan  penambahan  yeast,  bakteri asam laktat dan bakteri asam asetat.
Hasil  penelitian  ini  menunjukan bahwa perlakuan secara bertahap populasi S.  cerevisiae,  L.  lactis dan A. aceti diawal  fermentasi  berturut  –  turut yaitu  8,66,  6,64  dan  4,67  log  (cfu/g). Pada  24  jam  fermentasi  populasi S. cerevisiae,  L.  lactis dan A.  aceti naik menjadi  berturut  –  turut  12,55, 8,23 dan
5,53 log (cfu/g). Pada 48 jam fermentasi populasi S.  cerevisiae,  L.  lactis dan A. aceti terjadi  perubahan  berturut  –  turut yaitu  6,54,  12,53  dan  8,73  log  (cfu/g). Pada  72  jam  fermentasi    populasi S. cerevisiae, L. lactis dan A. aceti berturut
–  turut  yaitu  3,87,  10,64  dan  12,13  log (cfu/g).  Selanjutnya  diakhir  fermentasi populasi S.  cerevisiae,  L.  lactis dan A. aceti turun    menjadi  berturut  –  turut
2,22, 6,23 dan 9,22 log cfu/g.
Gambar 2.  Hubungan  populasi S.  cerevisiae,  L.  lactis  dan  A.  aceti terhadap konsentrasi  etanol,  asam  laktat  dan  asam  asetat  selama  fermentasi  biji kakao hasil perlakuan penambahan inokulum secara serentak. Awal (0) – 24  jam  fermentasi  suhu  inkubator  35°C,  24  –  48  jam  fermentasi  suhu inkubator  45°C,  48  –  72  jam  fermentasi  suhu  inkubator  55°C  dan  72  – 120 jam fermentasi suhu inkubator 35°C
Perlakuan  penambahan  inokulum secara  bertahap  mempunyai  kosentrasi etanol,  asam  laktat  dan  asam  asetat diawal  fermentasi  seluruhnya  0%.  Pada 24  jam  fermentasi  ditunjukan  kosentrasi etanol, asam laktan dan asam asetat naik berturut  –  turut  yaitu  5,54,  1,55  dan
1,70%. Pada 48 jam fermentasi menunjukan  kosentrasi  etanol,  asam laktat  dan  asam  asetat  berturut  –  turut yaitu 2,84, 3,67 dan 2,37%.  Pada 72 jam fermentasi ditunjukan konsentrasi etanol, asam  laktat  dan  asam  asetat  berturut  – turut  yaitu  1,23,  3,83  dan  3,32%  sejalan
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 2 4 6 8 10 12 14 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 Kos en tra si (% ) Ju m lah s el (l ogC FU /g ) Lama fermentasi (jam) S. cerevisiae
etanol L. lactis asam laktat A. aceti asam asetat
dengan  penelitian  Campos et  al ,  (2012), bahwa lama fermentasi akan menunjukan  peningkatan  senyawa  asam organic  yang  menghasilkan  senyawa aroma.    Hubungan  antara  populasi S.
cerevisiae , L. lactis dan A. aceti terhadap kosentrasi  etanol,  asam  laktat  dan  asam asetat  pada  perlakuan  penambahan inokulum  secara  bertahap  tersaji  pada
Gambar 3.
Gambar 3.  Hubungan  populasi S.  cerevisiae,  L.  lactis  dan  A.  aceti terhadap konsentrasi  etanol,  asam  laktat  dan  asam  asetat selama  fermentasi  biji kakao hasil perlakuan penambahan inokulum secara bertahap. Awal (0) – 24 jam fermentasi suhu inkubator 35°C, 24 – 48 jam fermentasi suhu inkubator 45°C, 48 – 72 jam fermentasi suhu inkubator 55°C dan 72 – 120 jam fermentasi suhu inkubator 35°C
Kosentrasi  etanol,  asam  laktat  dan asam  asetat  tertinggi  terjadi  berturut  – turut  di  24,  60,  dan  108  jam  fermentasi hal  ini  dapat  diduga  inokulum  yang ditambahkan  mengalami  adaptasi  dan kompetisi  dengan  mikrobia  endogenus yang  ada.  Hasil  analisis  ANOVA  satu arah  menunjukan  bahwa  populasi S. cerevisiae,  L. pada  perlakuan  inokulum
secara  bertahap  tidak  berbeda  nyata terhadap perlakuan kontrol dan perlakuan  penambahan  inokulum  secara serentak,  sedangkan  populasi L.  lactis, populasi A. aceti berbeda nyata terhadap kontrol. Perlakuan secara bertahap menujukan  rata  –  rata  populasi S. cerevisiae, L. lactis dan A. aceti berturut
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 2 4 6 8 10 12 14 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 ko n se n ta rs i (% ) Ju m lah s el (log CFU /g) Lama fermentasin (jam) S. cerevisiae etanol
L. lactis asam laktat A. aceti asam asetat
–  turut  yaitu  5,66,  8,55  dan  4,47  log (cfu/g).  Jika  ditinjau  dari  perlakuan variasi  teknik  fermentasi  menunjukan kosentrasi  etanol,  asam  laktat  dan  asam asetat  naik,  diduga  suhu  lingkungan yang  dihasilkan  penambahan  inokulum yaitu 39-51°C merupakan suhu optimum untuk aktivitas enzim pektinolitik seperti enzim  Poli  Galaktoranase  (PG)  dan menaikan kemapuan depolimerisasi pulp biji kakao sejalan dengan hasil penelitian Ganda et  al, (2008)  yang  melakukan optimasi kondisi depolimerisasi pulp biji kakao  oleh  enzim  bahwa  kondisi optimum  untu  aktivitas  enzim    PG  pada suhu  42,5°C  dan  pH  4,6.  Jika  ditinjau dari kosentrasi asam asetat yang dihasilkan maka dapat diartikan perlakuan  secara  bertahap  adalah  yang terbaik.  Asam  asetat  merupakan  asam organik  yang  terdifusi  kedalam  keping biji  sehingga  mengakibatkan  aktifnya enzim polifenol oksidase yang mengoksidasi  polifenol  (Supriyanto et al , 2007).

## KESIMPULAN
Rehidrasi pulp dapat
meningkatkan  kadar  air pulp biji  kakao kering sehingga dapat digunakan sebagai subtrat fermentasi. Mutu biji kakao hasil fermentasi  dapat  ditingkatkan  melalui proses  fermentasi  terkendali.  Perlakuan penambahan  inokulum  secara  bertahap selama  fermentasi  dapat  menaikan  suhu fermentasi  (51°C),  indeks  fermentasi (1,03),  kadar  gula  reduksi  (10,79%), persentase  jumlah  warna  coklat  keping biji  (97,01%),  kosentrasi  asam  asetat (6,83%),  populasi S.  Cerevisiae (10 12 cfu/g) , L. lactis (10 12 cfu/g) dan A. aceti (10 12 cfu/g) , meskipun  pH  biji  kakao (4,22) masih rendah dibandingkan perlakuan  kontrol  dan  penambahan inokulum secara serentak fermentasi.

## DAFTAR PUSTAKA
Afoakwa,  E.O., Kongor,  J.  E.,Takrama, J. dan Budu, A. S., 2014. Changes in nib acidification and biochemical  composition  during fermentation of pulp pre- conditioned  cocoa  ( Theobroma cacao )  beans. Internasional  Food
Research  Journal 20(4): 1843-
1853
Aprotosoaie A. C., Luca S.V., dan Miron
A. , 2016.  Flavor  Chemistry  of Cocoa  and  Cocoa  Products—An Overview. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 15: 73-91
Cortes,  T.R.;  Olvera,V.R.,  Jimenes, G.R., dan  Lepe .M. R., 2012. Isol at  ion  and  characterization  of acetic  acid  bacteria  in  cocoa fermentation. African  Journal  of Microbiology Research. 6:339-347 Campos,R. J.,  Escalona-Buendía, H. B., Ramos.E.H.B.,    Avila,  C.S.M,,
Flores,  O.I.  J.E.,  dan  Cervantes, L.E.,  2012. Effect of fermentation time  and  drying  temperature  on volatile compounds in cocoa. Food
Chemistry , 132(1):277–288.
Ganda Putra, G.P., Harjiono, Susanto,T., Kumalaningsih,S., dan Aulanni’am, 2008. Optimasi kondisi  depolimerisasi  pulp  biji kakao oleh enzim poligalakturonase endojinus . Jurnal  Teknik  Industri. 9(1):  l24-
34.
Kresnowati  P,  M.  T.  A,  Suryani,  L  dan Affifah, M., 2013. Improvement of Cocoa  Beans  Fermentation  by LAB  Starter  Addition, Journal  of Medical  and  Bioengineering. 2:
274-278. Kustyawati  M.E.,  dan  Setyani  S.,  2008. Pengaruh  penambahan  inokulum campuran terhadap perubahan kimia  dan  mikrobiologi  selama
fermentasi coklat. Jurnal Teknologi
Industri dan Hasil Pertanian. 8: 73
- 84 Mulono  Apriyanto,  2016. Changes  in Chemical  Properties  of  Dreid
Cocoa  ( Theobroma  cacao )  Beans during Fermentation,. Intl. J. Food. Ferment. 5(1): 11-16, June 2016 Mulono Apriyanto., Sutardi., Harmayani,    E.,  dan  Supriyanto  ., 2016a. Perbaikan proses fermentasi biji kakao non fermentasi  dengan  penambahan biakan murni saccharomyces cerevisiae  ,  lactobacillus  lactis  , dan acetobacter aceti. Agritech 36, 410– 415. doi:: .10.22146. Mulono Apriyanto., Sutardi., E Harmayani.,  Supriyanto,  2016b.
Study  on  Effect  of    Fermentation to  The  quality  parameter  cocoa beans  in  Indonesia, Asian  J.  Dairy &  Food  Res.,  35  (2)  2016  :  160- 163.
Supriyanto, Haryadi, Rahardjo. B.,  dan Warseno.  D.W.,  2007.  Perubahan suhu,  kadar  air,  warna,  kadar polifenol,  dan  aktivitas  oksidatif kakao selama penyangraian dengan  enerji  gelombang  mikro.
AGRITECH. 27(1):176-182 Widianto,  D., Pramita,  A.  D.,  dan Wedhastri,  S.,  2013.  Perbaikan proses fermentasi biji kakao kering dengan  penambahan  tetes  tebu, khamir,  dan  bakteri  asam, Jurnal Tekno sains. 3(1):1-80