ISSN: 1410-8917
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 18 (2) (2015) : 73 – 78
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi

## Journal of Scientific and Applied Chemistry
Journal homepage: http://ejournal.undip.ac.id/index.php/ksa
Skrining Metabolit Sekunder Bakteri Endofit yang Berfungsi sebagai Antidiabetes dari Daun Mimba ( Azadirachta Indica )
Yuga Pratama a , Purbowatiningrum Ria Sarjono a* , Nies Suci Mulyani a
a Biochemistry Laboratory, Chemistry Department, Faculty of Sciences and Mathematics, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang
* Corresponding author: purbowatining@live.undip.ac.id
A r t i c l e   I n f o A b s t r a c t
Keywords: neem leaves, endophytic bacteria, secondary metabolites, α -
glucosidase enzyme
Research  on  secondary  metabolite  screening  of  endophytic  bacteria  that  acts  as  an antidiabetic of neem leaves (Azadirachta indica) has been performed. The objective of this study  was  to  obtain  morphological  data,  obtained  data  of  growth  curve  of  endophytic bacterial isolate from mimba leaf, obtained inhibition result of secondary metabolite of endophytic bacteria from miba leaf to α -glucosidase, and got information about chemical content  of  secondary  metabolite  of  endophytic  bacteria  isolate  obtained.  Antidiabetic activity was tested using α -glucosidase enzyme inhibiting method. The results obtained were endophytic bacteria A5 and A6 of neem leaves were bacteria with a type of gram- negative bacteria, with different forms of microscopic sightings. Based on data of growth curve of endophytic bacteria it could be concluded that to obtain secondary metabolite is at hour 33 until 48 hours for isolate A5 and hour 36 until hours 48 for isolate A6. The power of inhibition of optimal α -glucosidase activity from secondary metabolites A5 and A6 at concentrations  of  62.5  ppm  respectively  were  18.462%  and  20.173%.  Phytochemical screening in this study each of the secondary metabolites of endophytic bacteria A5 and A6 from neem leaves contain flavonoids, saponins, and terpenoids/steroids.

## A b s t r a k
Kata Kunci:
Daun mimba, bakteri endofit, metabolit sekunder,
enzim α - glukosidase
Telah  dilakukan  penelitian  tentang  skrining  metabolit  sekunder  bakteri  endofit  yang berfungsi  sebagai  antidiabetes  dari  daun  mimba  ( Azadirachta  indica ).  Penelitian  ini bertujuan  memperoleh  data  morfologi,  memperoleh  data  kurva  pertumbuhan  isolat bakteri endofit dari daun mimba, memperoleh hasil inhibisi metabolit sekunder bakteri endofit dari daun miba terhadap α -glukosidase, serta mendapatkan informasi mengenai kandungan kimia dari metabolit sekunder isolat bakteri endofit yang didapat. Aktivitas antidiabetes diuji menggunakan metode penghambatan enzim α -glukosidase. Hasil yang diperoleh adalah bakteri endofit A5 dan A6 dari daun mimba merupakan bakteri dengan jenis  bakteri  gram  negatif,  dengan  bentuk  penampakan  mikroskopis  yang  berbeda. Berdasarkan  data  kurva  pertumbuhan  bakteri  endofit  dapat  disimpulkan  bahwa  untuk memperoleh metabolit sekunder adalah pada jam ke-33 hingga jam ke-48 untuk isolat A5 dan  jam  ke-36  hingga  jam  ke-48  untuk  isolat  A6.  Adapun  daya  inhibisi  aktivitas α - glukosidase optimal dari metabolit sekunder A5 dan A6 masing-masing pada konsentrasi 62,5  ppm  berturut-turut  sebesar  18,462%  dan  20,173%.  Penapisan  fitokimia  pada penelitian  ini masing-masing  metabolit  sekunder  bakteri  endofit  A5 dan  A6 dari  daun mimba mengandung senyawa flavonoid, saponin, dan terpenoid/steroid.
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 18 (2) (2015) : 73 – 78

## 1. Pendahuluan
Diabetes  mellitus  adalah  gangguan  metabolisme dari  sistem  endokrin.  Penyakit  ini  ditemukan  di  semua bagian  dunia  dan  meningkat  dengan  pesat  di  seluruh dunia.  Orang  yang  menderita  diabetes  tidak  dapat memproduksi  atau  menggunakan  insulin,  sehingga mereka  memiliki  glukosa  darah  tinggi.  Studi  mengenai antidiabetes  yang  sedang  berkembang  saat  ini  adalah dengan  menghambat  aktivitas  enzim α -glukosidase dengan suatu senyawa inhibitor α -glukosidase.
Inhibitor α -glukosidase  adalah  senyawa  yang memiliki kemampuan menginhibisi pencernaan karbohidrat  kompleks  (amilum)  menjadi  glukosa sehingga  asupan  glukosa  ke  dalam  darah  dapat dikurangi.  Karbohidrat  komplek  seperti  pati  dipecah menjadi gula sederhana di usus halus oleh α -glukosidase sebelum  diabsorpsi.  Dengan  menggunakan  inhibitor α - glukosidase,  aktivitas  dari  enzim α -glukosidase  dapat diinhibisi,  sehingga  pemecahan  karbohidrat  yang dikonsumsi  dapat  dicegah  dan  kadar  glukosa  dalam darah  berkurang  [1].  Senyawa  inhibitor α -glukosidase dapat dihasilkan oleh mikroba endofit yang bersimbiosis di dalam tumbuhan [2].
Mikroba endofit adalah mikroba yang hidup diantara sel tanaman dan bersimbiosis dengan tanaman inangnya [3].  Mikroba  endofit  yang  hidup  dalam  tanaman  dapat menghasilkan senyawa metabolit sekunder sama dengan yang dihasilkan inangnya [2].
Daun  mimba  ( Azadirachta  indica )  mengandung beberapa  senyawa  yang  terbukti  mampu  menginhibisi aktivitas  enzim α -glukosidase  yaitu  ekstrak  aseton dengan  nilai  IC 50 sebesar  5,00  mg/mL,  ekstrak  ethanol dengan  nilai  IC 50 sebesar  8,70  mg/mL,  dan  ekstrak  air dengan nilai IC 50 7,25 mg/mL [4]. Priosoeryanto dkk. [5] menyatakan  bahwa  kadar  glukosa  darah  pada  tikus menurun setelah diberi perlakuan menggunakan ekstrak daun mimba yang sebelumnya glukosa darah pada tikus diinduksi  dengan  aloksan  untuk  meningkatkan  glukosa darah  awal  pada  tikus,  dengan  demikian  dapat disimpulkan  bahwa  daun  mimba  berpotensi  sebagai antidiabetes.
Pemanfaatan daun mimba sebagai obat antidiabetes masih  terbatas  pada  khasiat  dari  berbagai  komponen bioaktif yang terkandung dalam daun mimba, disisi lain beberapa tanaman yang memproduksi senyawa bioaktif seperti  daun  mimba  juga  bersimbiosis  dengan  mikroba endofit  yang  memiliki  kemampuan  memproduksi senyawa bioaktif yang sama dengan tanaman inangnya [6].  Pujiyanto dkk. [7]  telah  melakukan  uji  aktivitas inhibisi  enzim α -glukosidase  mikroba  endofit  jenis aktinomiset  yang  diisolasi  dari  beberapa  tanaman  obat Indonesia, namun belum mencakup daun mimba.
Hasil penelitian Maharani [8] diperoleh tujuh isolat bakteri endofit dari daun mimba ( Azadirachta indica ), dari tujuh  isolat  tersebut  kemampuan  inhibisi  tertinggi terhadap α -glukosidase  dari  metabolit  sekunder  yang dihasilkan isolat A6 sebesar 45,07% dan tertinggi kedua dari  metabolit  sekunder  isolat  A5  sebesar  38,52%. Penelitian  Maharani  [8]  belum  didapatkan  data
morfologi, data kurva pertumbuhan yang menunjukkan karakterisasi bakteri endofit, serta kandungan kimia dari metabolit  sekunder  bakteri  endofit.  Pada  penelitian  ini bertujuan untuk mendapatkan data kurva pertumbuhan, data  karakterisasi  dengan  pewarnaan  gram,  dan  data kandungan  kimia  dari  metabolit  sekunder  yang dihasilkan.

## 2. Metode Penelitian

## Bahan dan Alat
Bahan  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  terdiri atas  isolat  bakteri  endofit  A5  dan  A6  dari  daun  mimba dalam  stok  gliserol,  media  Yeast  Malt  Agar  (YMA), pepton,  soluble  starch.  Enzim α -glukosidase  (Sigma; USA), Na 2 CO 3 , DMSO, Bufer fosfat ( Larutan A NaH2PO4 dan  B  Na 2 HPO 4 ),  Acarbose  (Glucobay),  HCl,  Safranin, alcohol, aseton, lugol iodin, pewarna kristal ungu violet, metanol,  HCl,  asam  klorida  2N,  amoniak  25%, kloroform,  pereaksi  Dragendorff  (bismut  nitrat  dan merkuri  klorida  dalam  nitrit  berair),  pereaksi  Meyer (kalium iodida dan merkuri klorida), serbuk magnesium, asam klorida pekat, besi (III) klorida, gelatin, anhidrida asam asetat, amil alkohol, eter, asam sulfat pekat dan p- nitrofenil α -D glukopiranosida.
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini terdiri atas  erlenmeyer  250  mL  (Pyrex)  ;  gelas  ukur  100 mL(Pyrex);  gelas  beker  1000  mL  (Herma),  500  mL (Pyrex),  dan  50  mL(Pyrex);  neraca  analitik,  inkubator, spirtus,  pengaduk,  kaca  arloji,  kawat  ose,  mikro  pipet, shaker,  inkas  ,  sentrifuge  (Hettich  Zentrifugen  Micro 200R), autoklaf ( Clinical Autoclave Prestige Medical Series 2100 ).

## Peremajaan Isolat Bakteri Endofit dari Daun Mimba ( Azadirachta indica)
Peremajaan ini menggunakan isolat bakteri endofit A5 dan A6 dari daun mimba dalam stok gliserol, isolat A5 dan  A6  yang  berada  dalam  stok  gliserol  ditanam  pada permukaan media YMA secara aseptik. Media yang telah berisi  sampel  tersebut  kemudian  diinkubasi  pada  suhu ruang  selama  tiga  hari.  Koloni  bakteri  yang  tumbuh kemudian dipisahkan menurut kenampakan morfologisnya  sehingga  menjadi  isolat  tunggal.  Isolat bakteri  yang  telah  dipisahkan  selanjutnya  diuji  dengan pewarnaan  gram  dan  dilakukan  penentuan  kurva pertumbuhan metabolit sekunder bakteri endofit.

## Karakterisasi Bakteri Endofit dengan Perwarnaan Gram Isolat A5 dan A6
Pengamatan  morfologi  koloni  dilakukan  dengan pewarnaan  gram.  Satu  ose  isolat  bakteri  endofit disuspensikan  ke  dalam  akuades  steril  dan  difiksasi  di atas  kaca  benda  bersih.  Olesan  bakteri  diberi  2-3  tetes pewarna Kristal  violet  (gram A)  dan dibiarkan selama  1 menit. Zat warna berlebih dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan.  Olesan  bakteri  digenangi  dengan  2 tetes  larutan  lugol  iodin  (gram  B),  dibiarkan  selama  1 menit. Zat warna berlebih dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan. Olesan dicuci dengan larutan alkohol aseton  (gram  C)  selama  30  detik.  Zat  pewarna  berlebih dibilas  dengan  air  mengalir  dan  dikeringanginkan.
Olesan  diberi  cat  safranin  (gram  D)  selama  2  menit, dicuci  dengan  air  mengalir  dan  dikeringanginkan. Preparat diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran kuat (1000x) menggunakan minyak emersi.

## Kurva Pertumbuhan Metabolit Sekunder Bakteri Endofit
Hasil  peremajaan  isolat  bakteri  endofit  A5  dan  A6 dari  masing-masing  diambil  menggunakan  kawat  ose steril dan dimasukkan pada Erlenmeyer yang berisi 200 mL media cair. Media cair yang digunakan mengandung pepton,  soluble  starch,  yeast  dan  akuades  [9].  Isolat kemudian  diinkubasi  dalam  shaker  incubator  dengan kecepatan  100  rpm  pada  suhu  ruang.  Pada  botol  lain berisi  100  mL  media  cair  dijadikan  sebagai  kontrol negatif  yaitu  tidak  ditanami  isolat  bakteri  endofit  yang kemudian  diinkubasi  dalam  shaker  incubator  dengan kecepatan  100  rpm  pada  suhu  ruang  juga.  Setiap  3  jam dilakukan pengambilan sebanyak 10 mL sampel dan botol lain  berisi  kontrol  negatif  dan  isolat  bakteri  endofit. Pertumbuhan  jumlah  sel  bakteri  diukur  dengan menggunakan  spektrofotometer  UV-VIS  pada  panjang gelombang 600 nm.

## Produksi Metabolit Sekunder Isolat Bakteri Endofit A5 dan A6
Isolat  bakteri  endofit  A5  dan  A6  diambil  dengan kawat  ose  steril  dan  dimasukkan  dalam  media  cair  100 mL.  Media  cair  yang  digunakan  mengandung  pepton, soluble starch , yeast dan akuades [9]. Inkubasi dilakukan pada  suhu  ruang  menggunakan  inkubator  bergoyang dengan  kecepatan  75  rpm  selama  7  hari  [10].  Kultur disentrifugasi 4000 rpm pada suhu 4 0 C selama 15 menit. Filtrat  dari  kultur  ini  selanjutnya  dipekatkan menggunakan freeze  dryer .  Residu  yang  diperoleh merupakan  metabolit  sekunder  yang  digunakan  untuk menentukan  daya  hambat  larutan  tersebut  terhadap aktivitas enzim alfa glukosidase.
Uji Aktivitas Antidiabetes Metabolit Sekunder Melalui Mekanisme Inhibisi α -Glukosidase
Uji  Inhibisi α -glukosidase  dari  metabolit  sekunder menggunakan  metode  dari  Sancheti  dan  Seo  [11]. Masing-masing  hasil  pemekatan  kemudian  dibuat larutan  induk  1000  ppm,  selanjutnya  larutan  induk diencerkan  menjadi  500  ppm,  250  ppm,  125  ppm,  dan 62,5  ppm.  Setiap  konsentrasi  dipipet  sebanyak  10  µL kedalam  microplate  ditambahkan  25  µL  substrat  (p- nitrophenil- α -D-glukopiranosida),  50  µL  buffer  posfat pH  7.0,  dan  25  µL  enzim α -glukosidase,  kemudian diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37˚C. Reaksi enzim dihentikan  dengan  penambahan  100  µL  Na 2 CO 3 dan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 410 nm.
Tabel 1: Sistem reaksi penentuan inhibisi metabolit sekunder bakteri endofit terhadap enzim α -glukosidase
Sampel Blanko μL Kontrol negatif μL Sampel μL Larutan metabolit sekunder - 10 10 Buffer 25 25 25 Substrat (p- nitrophenil- α -D- glukopiranosida) 25 25 25 Enzim α -glukosidase 25 - 25 Inkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit Na 2 CO 3 100 100 100
Aktivitas enzim diukur berdasarkan hasil absorbansi p -nitrofenol.  Apabila  sampel  memiliki  kemampuan menghambat  aktivitas  enzim α -glukosidase  maka p- nitrofenol yang dihasilkan akan berkurang. Apabila nilai absorbansi p -nitrofenol  tinggi  maka  kemampuan inhibisi  dari  sampel  rendah.  Sebaliknya,  jika  nilai absorbansi dari p -nitrofenol rendah, maka kemampuan inhibisi yang dimiliki sampel tinggi. Daya inhibisi dapat dihitung dari persamaan:
% inhibisi = (Absorbansi blanko – Absorbansi sampel)
Absorbansi blanko x 100

## Penapisan Fitokimia
Penapisan  fitokimia  berdasar  metode  yang digunakan oleh Farnsworth [12] dilakukan pada masing- masing  metabolit  sekunder  bakteri  endofit  yang  telah dipekatkan melalui tahap freeze dryer dan simplisia daun mimba.  Senyawa  yang  diidentifikasi  adalah  senyawa golongan  alkaloid,  flavonoid,  saponin,  tanin  dan steroid/triterpenoid.

## Uji Alkaloid
Sebanyak  1g  sampel  uji  ditambahkan  dalam  10  mL kloroform  lalu  penambahan  5  tetes  NH 4 OH,  Campuran disaring dan filtratnya di kocok dengan penambahan 10 tetes  H 2 SO 4 2  M.  Kemudian  lapisan  asam  (atas)  dibagi menjadi  dua  ke  dalam  tabung  reaksi.  Tabung  pertama ditetesi  dengan  pereaksi  Dragendorff  dan  uji  positif ditandai dengan terbentuknya warna merah atau jingga. Tabung  kedua  ditambahkan  setetes  pereaksi  Meyer. Terbentuknya  kabut  putih  hingga  endapan  putih menunjukkan adanya alkaloid.

## Uji Flavonoid
Sebanyak 0,5 g sampel ditambahakan 10 mL metanol dan 10 mL akuades kemudian disaring. Lalu ditambahkan 5  mL  eter  kemudian  dikocok  dan  didiamkan.  Ambil lapisan  metanol  dan  uapkan  pada  suhu  40°C  kemudian larutkan  dalam  5  mL  etil  asetat,  penambahan  1  mL etanol, ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium, 1 mL asam klorida  pekat  lalu  dikocok  kuat-kuat  dan  dibiarkan memisah.  Adanya  flavonoid  ditunjukkan  dengan timbulnya warna merah, kuning.

## Uji Saponin
Sebanyak 0,5 g sampel ditambahkan 10 mL akuades panas  dan  didihkan  selama  10  menit  lalu  di  saring, kemudian  dikocok  kuat  secara  vertikal  selama  10  detik. Adanya  saponin  ditandai  dengan  terbentuknya  busa setinggi 1 – 10 cm yang stabil sekitar 10 menit dan tidak hilang ketika ditambahkan 1 tetes asam klorida 2N.

## Uji Tanin
Sebanyak  1  g  sampel  ditambahkan  10  mL  akuades panas  dan  didihkan  selama  10  menit  lalu  di  saring, ditambahkan larutan besi (III) klorida 1%. Adanya tanin bebas  ditandai  dengan  terbentuknya  warna  hijau kehitaman.

## Uji Triterpenoid/Steroid
Sebanyak  2  g  sampel  ditambahkan  dengan  5  mL etanol  panas  selama  1  jam,  kemudian  disaring  dan residunya  di  tambahkan  eter.  Ekstrak  ditambahkan  3 tetes anhidrida asam asetat dan 1 tetes asam sulfat pekat ke plat tetes. Adanya steroid ditunjukkan jika terbentuk warna  biru  atau  ungu,  sedangkan  bila  terbentuk  warna merah menandakan adanya triterpenoid.

## 3. Hasil dan Pembahasan

## Isolasi Bakteri Endofit
Tahap peremajaan isolat bakteri endofit A5 dan A6 pada penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan isolat bakteri  yang  masih  dalam  kondisi  baik.  Langkah  awal dari tahap peremajaan ini adalah pembuatan media YMA (Yeast Malt Agar) sebagai media untuk peremajaan isolat yang telah didapat. Media YMA merupakan media padat untuk  penumbuhan  atau  penginokulasian  mikroba endofit  secara  selektif  dan  juga  disebut  media  ISP (International Streptomyces Project) no. 2, yakni media selektif  untuk  menumbuhkan  bakteri  dari  jenis streptomyces  [13].  Media  ini  berisi  yeast  extract,  malt extract,  dextrose,dan  agar  bakteriologi.  Dextrose  dan malt extract berfungsi sebagai sumber karbon sedangkan yeast  extract  sebagai  sumber  nitrogen  yang  diperlukan mikroba untuk tumbuh.
Pada  jam  ke-24  masa  penginkubasian  media  telah ditumbuhi  mikroba,  sedangkan  pada  waktu  yang  sama media kontrol negatif tetap bersih dan tidak ditumbuhi mikroba.  Untuk  meyakinkan  bahwa  mikroba  yang tumbuh  adalah  bakteri  endofit,  masa  penginkubasian dilanjutkan  hingga  hari  ke  tiga.  Pada  hari  ketiga  masa penginkubasian  media  semakin  banyak  ditumbuhi mikroba  dengan  bentuk  yang  sama,  sedangkan  media kontrol  negatif  tetap  bersih  dan  tidak  ditumbuhi mikroba. Ini  menguatkan bahwa mikroba  yang  tumbuh pada  media  sampel  merupakan  bakteri  endofit  hasil peremajaan  dari  sebelumnya.  Isolat  yang  telah  melalui tahap  peremajaan  selanjutnya  adalah  karakterisasi bakteri endofit dengan pewarnaan gram.

## Pewarnaan Gram
Tujuan  dari  pewarnaan  gram  pada  penelitian  ini adalah  memastikan  bahwa  kelima  isolat  yang  dipilih
memiliki  bentuk  morfologis  yang  berbeda.  Hasil pewarnaan gram dapat dilihat pada tabel 2 berikut.
Tabel 2: Penampakan morfologis isolat bakteri endofit daun mimba ( Azadirachta indica ) Isolat Penampakan mikroskopis Hasil Pewarnaan Gram A5 Bulat, berkelompok (stafilokokus) Merah Negatif A6 Batang yang khas (basilus) Merah Negatif
Pengamatan  pewarnaan  gram  dilakukan  pada mikroskop  dengan  pembesaran  1000x.  Kedua  bakteri endofit merupakan jenis bakteri gram negatif dan bentuk yang berbeda. Hasil penampakan mikroskopis menunjukkan  bahwa  isolat  A5  memiliki  bentuk morfologis yang berbeda dengan isolat A6. Perbedaan ini memungkinkan  menjadi  penyebab  perbedaan  aktivitas antidiabetes dari metabolit yang dihasilkan.

## Kurva Pertumbuhan Isolat Bakteri Endofit
Pertumbuhan  bakteri  dapat  ditandai  dengan peningkatan jumlah dan massa sel sedangkan kecepatan pertumbuhan  tergantung  pada  lingkungan  fisik  dan kimianya.  White  [14]  menyatakan  bahwa  setiap  bakteri menghasilkan pola pertumbuhan bakteri yang berbeda- beda,  tergantung  dari  gen  yang  dimiliki  dan  sumber karbon  yang  digunakan.  Pertumbuhan  bakteri  diamati dengan  cara  mengukur  nilai  absorbansi  menggunakan spektrofotometer UV/VIS pada  panjang  gelombang  600 nm setiap tiga jam sekali hingga jam ke-48.
Gambar 1. Kurva pertumbuhan isolat bakteri endofit dari daun mimba A5 dan A6
Pemanenan metabolit sekunder dari mikroba dapat dilakukan  pada  fasa  stasioner  menuju  kematian. Berdasarkan  data  grafik  kurva  pertumbuhan  yang didapat  pemanenan  metabolit  sekunder  A5  dapat dilakukan dari jam ke-33 hingga jam ke-48, sedangkan untuk  metabolit  sekunder  A6  dapat  dilakukan  dari  jam ke-36 hingga jam ke-48.

## Produksi Metabolit Sekunder Isolat Bakteri Endofit A5 dan A6
Tahap  ini bertujuan  untuk memproduksi  metabolit sekunder  bakteri  endofit  yang  diharapkan  memiliki aktivitas  inhibitor α -glukosidase.  Tahap  produksi  ini menggunakan  metode  Chen dkk. [9].  Media  cair  yang digunakan mengandung yeast, pepton, soluble starch , dan
akuades. Yeast dan pepton merupakan sumber nitrogen, sedangkan soluble  starch berfungsi  sebagai  sumber karbon yang digunakan mikroba untuk tumbuh. Karbon merupakan  senyawa  yang  digunakan  sebagai  penyusun utama  sel,  sedangkan  nitrogen  digunakan  mikroba sebagai bahan untuk mensintesis asam-asam amino.
Hasil  produksi  bakteri  endofit  tersebut  kemudian disentrifugasi pada kecepatan 5000rpm selama 20 menit pada  suhu  4°C.  Sentrifugasi  bertujuan  untuk memisahkan  filtrat  dan  residu  yang  dimana  filtrat mengandung  senyawa  metabolit  sekunder  dari  bakteri endofit daun mimba.
Uji Aktivitas Antidiabetes Metabolit Sekunder Isolat Melalui Mekanisme Inhibisi α -Glukosidase
Tahap  ini  bertujuan  untuk  mendapatkan  data aktivitas  antidiabetes  metabolit  sekunder  dari  isolat bakteri  endofit  yang  didapatkan.  Metode  pengujian dilakukan  secara in  vitro yakni  melalui  mekanisme inhibisi  enzim α -glukosidase  terhadap  substrat p - nitrofenil α - D- glukopiranosida. Mekanisme reaksi dari hidrolisis  substrat p- nitrofenil α -D-  glukopiranosida oleh  enzim α -glukosidase  dapat  dilihat  pada  gambar  2 berikut:
Gambar 2. Persamaan reaksi enzimatik α -glukosidase dan p – nitrofenil- α -D glukopiranosida
Adapun hasil pengujian dapat dilihat pada gambar 3.
Gambar 3. Grafik hasil uji kemampuan inhibisi metabolit sekunder isolat bakteri endofit terhadap α -glukosidase
Berdasarkan  gambar  3  menunjukkan  bahwa besarnya  nilai  inhibisi  dipengaruhi  oleh  tingginya konsentrasi  senyawa  inhibitor.  Semakin  tinggi konsentrasi senyawa inhibitor akan semakin besar pula kemampuan  inhibisinya,  meskipun  tidak  dengan kenaikan yang signifikan. Kenaikan kemampuan inhibisi ini  dikarenakan  senyawa  inhibitor  dari  metabolit sekunder  dimungkinkan  memiliki  kemampuan  untuk menghambat  aktivitas  enzim  secara  kompetitif,  non kompetitif,  ataupun  inkompetitif.  Proses  inhibisi
kompetitif,  non  kompetitif,  dan  inkompetitif  akan berlangsung  optimal  apabila  konsentrasi  inhibitor tinggi,  karena  konsentrasi  inhibitor  yang  tinggi  akan memperbesar peluang inhibitor untuk menutup sisi aktif enzim  ataupun  berikatan  dengan  enzim  dan  kompleks enzim substrat.
Pada  gambar  4  menunjukkan  bahwa  metabolit sekunder  A6  pada  konsentrasi  1000  ppm  memiliki kemapuan inhibisi α -glukosidase tertinggi yaitu sebesar 36,881%, sedangkan untuk metabolit sekunder A5 pada konsentrasi  1000  ppm  memiliki  kemampuan  inhibisi terhadap α -glukosidase  tertinggi  sebesar  28,481%. Kemampuan  inhibisi  dari  metabolit  sekunder  isolat  A6 dan  A5  pada  konsentrasi  62,5  ppm  tidak  terpaut  jauh dengan kemampuan inhibisi pada konsentrasi 1000 ppm, yaitu  untuk  A6  pada  konsentrasi  62,5  ppm  inhibisi terhadap α -glukosidase  sebesar  20,173%  sedangkan untuk A5 pada konsentrasi 62,5 ppm inhibisi terhadap α - glukosidase  sebesar  18,462%.  Oleh  karena  itu  dari  data kemampuan  inhibisi  dapat  diperoleh  informasi  bahwa konsentrasi  optimal  untuk  aktivitas  inhibisi  dari metabolit sekunder isolat A6 dan A5 adalah 62,5 ppm.

## Penapisan Fitokimia
Penapisan  fitokimia  terhadap  daun  mimba ( Azadirachta indica ) dan metabolit sekunder yang didapat bertujuan  untuk  mengetahui  jenis  metabolit  sekunder yang  terdapat  pada  daun  mimba  seperti  flavonoid, alkaloid,  kuinon,  tanin,  saponin,  triterpenoid  dan steroid.  Hasil  penapisan  fitokimia  menunjukkan  bahwa daun mimba mengandung senyawa golongan flavonoid, tanin,  saponin,  alkaloid,  kuinon,  triterpenoid  dan steroid,  sedangkan  pada  metabolit  sekunder  bakteri endofit  mengandung  saponin,  flavonoid,  triterpenoid dan  steroid.  Berikut  hasil  penapisan  fitokimia  dapat dilihat pada tabel 2.
Tabel 2: Hasil penapisan fitokimia senyawa metabolit sekunder isolat bakteri endofit daun mimba ( Azadirachta indica ) Jenis Uji Hasil A5 A6 Simplisia Alkaloid - - + Flavonoid + + + Kuinon - - + Saponin + + + Terpenoid/Steroid + + + Tanin - - +
Hasil penapisan fitokimia dapat diperoleh informasi bahwa  semua  isolat  bakteri  endofit  menunjukkan  hasil negatif  dalam  menghasilkan  senyawa  metabolit sekunder berupa alkaloid, kuinon, dan tanin, sedangkan pada  simplisia  daun  mimba  menunjukkan  hasil  positif untuk senyawa metabolit sekunder alkaloid, kuinon, dan tanin.  Hasil  tersebut  menunjukkan  bahwa  semua  isolat bakteri endofit yang didapat tidak mampu menghasilkan metabolit  sekunder  berupa  alkaloid,  kuinon,  dan  tanin. Pengujiaan  flavonoid,  saponin,  dan  terpenoid/steroid pada simplisia menghasilkan hasil uji positif, sedangkan pengujian  dari  senyawa  yang  dihasilkan  oleh  isolat
menunjukkan  hasil  positif  pada  semua  isolat.  Hasil  ini menunjukkan  bahwa  semua  isolat  bakteri  endofit mampu  menghasilkan  metabolit  sekunder  yang mengandung  senyawa  flavonoid,  saponin,  dan terpenoid/steroid.  Strobel dkk. [6]  menyatakan  bahwa beberapa tanaman yang memproduksi senyawa bioaktif juga  berasosiasi  dengan  mikroba  endofit,  dimana  akan memproduksi  senyawa  serupa  dengan  tanaman inangnya.
Dari  hasil  penapisan  fitokimia  dapat  diperoleh informasi  bahwa  ada  hubungan  antara  senyawa flavonoid,  saponin,  terpenoid/steroid  yang  terdapat dalam  daun  mimba  mempunyai  kemampuan  untuk menghambat α -glukosidase. Hasil tersebut menunjukkan  bahwa  senyawa  metabolit  sekunder flavonoid, tanin dan saponin memiliki efek antihiperglikemik,  dan  Mun'im  dan  Andriani  [15] menyatakan  bahwa  daun  mimba  yang  memiliki kandungan  senyawa  alkaloid,  terpenoid,  tanin, saponin,dan  flavonoid  memiliki  kemampuan  sebagai penghambat α -glukosidase.
Data  dan  informasi  yang diperoleh  pada penelitian ini  menunjukkan  bahwa  bakteri  endofit  daun  mimba berpotensi  sebagai  antidiabetes  sehingga  penggunaan daun  mimba  secara  langsung  sebagai  obat  antidiabetes dapat  diminimalisir  untuk  menjaga  kelestarian  daun mimba.

## 4. Kesimpulan
Bakteri  endofit  A5  dan  A6  dari  daun  mimba merupakan  bakteri  dengan  jenis  bakteri  gram  negatif, dengan bentuk penampakan mikroskopis yang berbeda. Berdasarkan  data  kurva  pertumbuhan  bakteri  endofit dapat disimpulkan bahwa untuk memperoleh metabolit sekunder adalah pada jam ke-33 hingga jam ke-48 untuk isolat A5 dan jam ke-36 hingga jam ke-48 untuk isolat A6. Adapun daya inhibisi aktivitas α -glukosidase optimal dari metabolit sekunder A5 dan A6 masing-masing pada konsentrasi  62,5  ppm  berturut-turut  sebesar  18,462% dan  20,173%.  Penapisan  fitokimia  pada  penelitian  ini masing-masing  metabolit  sekunder  bakteri  endofit  A5 dan  A6  dari  daun  mimba  mengandung  senyawa flavonoid, saponin, dan terpenoid/steroid.

## 5. Daftar Pustaka
[1]  Jean-Louis Chiasson, Robert G. Josse, Ramon Gomis, Markolf  Hanefeld,  Avraham  Karasik,  Markku Laakso,  Acarbose  for  prevention  of  type  2  diabetes mellitus:  the  STOP-NIDDM  randomised  trial, The Lancet , 359, 9323, (2002) 2072-2077 http://dx.doi.org/10.1016/S0140-6736(02)08905-5
[2]  Maksum  Radji,  Peranan  bioteknologi  dan  mikroba endofit  dalam  pengembangan  obat  herbal, Pharmaceutical  Sciences  and  Research  (PSR) ,  2,  3,
(2012) 113-126
[3]  Shirly  Kumala,  Robert  Utji,  Pratiwi  Sudarmono, Leonardus BS Kardono, Isolation of endophytic fungi from  Brucea  javanica  L.(Merr.)  and  cytotoxic evaluation  of  their  n-butanol  extract  from fermentation  broth, Pak.  J.  Biol.  Sci ,  9,  (2006)  825-
[4]  MI Kazeem, TV Dansu, SA Adeola, Inhibitory Effect of Azadirachta  indica  A.  Juss  Leaf  Extract  on  the Activities  of  cz-Amylase  and  oz-Glucosidase, Pakistan  Journal  of  Biological  Sciences ,  16,  21,  (2013) 1358-1362
[5]  Bambang  Pontjo  Priosoeryanto,  Bayu  Febram Prasetyo,  Ietje  Wientarsih,  Rini  Madyastuti,  Efek antihiperglikemik  ekstrak  etanol  daun  mimba (azadirachta  indica  j)  pada  tikus  diabetes  yang diinduksi  Aloksan  dan  pengembangannya  menjadi sediaan  tablet  Menggunakan  metode  granulasi basah, IPB's Books, Bogor, (2009).
[6]  Gary  Strobel,  Eugene  Ford,  Jeerepun  Worapong, James K. Harper, Atta M. Arif, David M. Grant, Peter C. W. Fung, Raymond Ming Wah Chau, Isopestacin, an isobenzofuranone from Pestalotiopsis microspora,  possessing  antifungal  and  antioxidant activities, Phytochemistry ,  60,  2,  (2002)  179-183 https://doi.org/10.1016/S0031-9422(02)00062-6
[7]  Sri  Pujiyanto,  YULIN  Lestari,  Antonius  Suwanto,  S Budiarti,  LATIFAH  K  Darusman,  Alpha-glucosidase inhibitor activity and characterization of endophytic actinomycetes  isolated  from  some  Indonesian diabetic medicinal plants, Int J Pharm Pharm Sci , 4, 1,
(2012) 327-333
[8]  Lina  Maharani,  Isolasi  Aktinomiset  Endofit  dari Daun  Mimba (Azadirachta  Indica)  dan  Uji  Aktivitas Sebagai Antidiabetes Melalui Mekanisme Inhibisi α -
Glukosidase, Departemen Kimia, Universitas Diponegoro, Semarang
[9]  Haimin  Chen,  Xiaojun  Yan,  Wei  Lin,  Li  Zheng, Weiwei  Zhang,  A  New  Method  for  Screening  a- Glucosidase  Inhibitors  and  Application  to  Marine Microorganisms, Pharmaceutical  Biology ,  42,  6,
(2004) 416-421
http://dx.doi.org/10.1080/13880200490885987
[10] Sri Pujiyanto, Rejeki Siti Ferniah, Aktifitas inhibitor alpha-glukosidase  bakteri  endofit  PR-3  yang diisolasi dari tanaman pare (Momordica charantia), Bioma , 12, 1, (2010) 1-5
[11]  Shruti  Sancheti,  SungYum  Seo,  Chaenomeles sinensis:  a  potent α -and β -glucosidase  inhibitor, American Journal of Pharmacology and Toxicology , 4, 1,
(2009) 8-11
[12] Norman R. Farnsworth, Biological and phytochemical  screening  of  plants, Journal  of Pharmaceutical  Sciences ,  55,  3,  (1966)  225-276 http://dx.doi.org/10.1002/jps.2600550302
[13] A Nurkanto, M Rahmansyah, A Kanti, Teknik Isolasi Aktinomisetes, LIPI Press, Jakarta, 2008.
[14] David  White,  The  physiology  and  biochemistry  of prokaryotes, Oxford University Press, 1995.
[15] Abdul Mun'im, Ayu Andriani, Skrining Fitokimia dan Uji  Penghambatan  Aktivitas  alfa-glukosidase  pada Ekstrak  Etanol  dari  Beberapa  Tanaman  yang Digunakan sebagai Obat Antidiabetes, Pharmaceutical  Sciences  and  Research  (PSR) ,  9,  1,
(2014) 31-41 http://dx.doi.org/10.7454/psr.v9i1.3362