Penentuan  Derajat  Toksisitas  Akut  Ekstrak  Air  Buah  Pepaya  ( Carica  papaya

## L.) Muda Pada Mencit Menggunakan Purposed New Recommended Method
Laila Dinda Nadiyah * , Yuktiana Kharisma , Yuniarti

## Fakultas Kedokteran, Universitas Islam Bandung, Indonesia

## Abstrak
Papaya  ( Carica  papaya L.)  fruit  was  proven  scientifically  in  having  medicinal  effects: such  as  gastroprotective,  laxative,  galactagogues,  and  antibacterial  effect.  Unripe papaya  fruit  contains  saponin,  alkaloid,  tannin,  flavonoid,  triterpenoid,  and  quinone which may reveal toxicities as adverse effect when it consumed in high dose. The aim of this  study  is  to  determine  the  acute  toxicity  degree  of  unripe Carica  papaya L.  fruit aqueous extract in mice using proposed new recommended method. The acute toxicity degree  conducted  by  determination  of  lethal  dose 50 (LD 50 ) using  new  recommended method to 12 female mice. The subjects were divided into three stages and each mouse was  given  different  dose  of  the  extract.  LD 50 calculated  by  mean  of  mortality  lowest dose and non mortality highest dose then the result classified into the degree of acute toxicity.  The  study  showed  there  was  no  mortality  in  all  groups  of  the  experimental subject.  LD 50 of  unripe Carica  papaya L.  aqueous  extract  was  found  >5000 mg/kg  BW and classified as Practically Non Toxic (PNT) substance.

## Pendahuluan
Obat  tradisional  Indonesia  merupakan  warisan  budaya  yang  perlu  dilestarikan, diteliti, dan dikembangkan. Penelitian di bidang tanaman obat penting untuk dilakukan guna  memanfaatkan  tanaman  tersebut  sebagai  bahan  pengobatan  bagi  manusia. Penelitian  obat  tradisional  yang  berasal  dari  bahan  alam  umumnya  berupa  jenis penelitian  budidaya  tanaman  obat,  analisis  kandungan  kimia,  toksisitas, farmakodinamik, formulasi dan uji klinik (Dewoto 2007).
Salah  satu  jenis  bahan  alam  yang  secara  umum  dimanfaatkan  oleh  masyarakat adalah  buah  pepaya.  Efek  gastroprotektif,  laksatif,  laktagogum,  dan  antibakterial merupakan khasiat yang terbukti secara ilmiah dari buah pepaya  (Aravind et  al. 2013; Kharisma et  al. 2011).  Pepaya  mengandung  substansi  beberapa  fitokimia  seperti saponin,  alkaloid,  tanin,  flavonoid,  triterpenoid,  dan  kuinon  (Iwuagwu et  al. 2013). Konsumsi  buah  pepaya  dengan  kandungan  substansi  fitokimia  dalam  jumlah  tinggi diketahui dapat menimbulkan efek samping bagi tubuh berupa efek toksik, sehingga uji toksisitas  akut  sebagai  salah  satu  jenis  uji  preklinik perlu  dilakukan  untuk  mengetahui
Penulis Afiliasi

## Kata Kunci
 Unripe Carica papaya L. fruit aqueous extract  degree of acute toxicity  LD 50
Diterima 7 September  2015
Direvisi 7 Desember 2015
Disetujui 4 Maret 2016

## *Penulis korespondensi
Laila Dinda Nadiyah Fakultas kedokteran Universitas Islam Bandung, Jalan Hariangbanga No.2 Tamansari-Bandung, West Java, Indonesia laila.dinda.nadiyah.xi.si.1@gmail .com
tingkat  keamanan  tanaman  obat  tradisional  (Dewoto 2007; Iwuagwu et al. 2013)
Pada  uji  toksisitas  akut  kali  ini  digunakan  buah pepaya  muda  yang  memiliki  kandungan  nutrisi  yang lebih  tinggi  dibandingkan  buah  yang  sudah  matang, berupa  kandungan  karbohidrat,  lemak,  protein,  serat, vitamin  C,  mineral  (kalsium,  kalium,  fosforus, magnesium),  dan  enzim  ( papain,  chymopapain ) (Iwuagwu et  al. 2013).  Pengamatan  terhadap mortalitas  hewan  uji  dilakukan  selama  24  jam.  Data yang  diperoleh  digunakan  sebagai  data  awal  evaluasi karakteristik toksik substansi fitofarmaka (BPOM 2014). Metode  kuantitatif  berupa  penentuan lethal  dose 50 (LD 50 )  merupakan  metode  tersering  yang  digunakan dalam  penilaian  uji  toksisitas  akut  (Paramveer et  al. 2010).  Hasil  LD 50 dapat  menentukan  kriteria penggolangan  derajat  toksisitas  substansi  fitofarmaka yang  diklasifikasikan  menjadi  luar  biasa  toksik,  sangat toksik, toksik sedang, toksik ringan, praktis tidak toksik, dan relatif tidak membahayakan (BPOM 2014).
Penelitian terbaru oleh Chinendu dkk menyebutkan  metode proposed  new  recommended disarankan  untuk  digunakan  dalam  menentukan  LD 50 suatu  substansi  fitofarmaka  karena  memiliki  beberapa keunggulan  dibanding  metode  sebelumnya  berupa hasil  akhir  yang  didapatkan  lebih  akurat,  penggunaan jumlah  hewan  uji  yang  minimal,  proses  uji  toksisitas yang  relatif  lebih  sederhana  dengan  durasi  penelitian yang  lebih  singkat  (Chinedu et  al. 2013).  Penelitian tentang  toksisitas  akut  ekstrak  air  buah  pepaya  muda pada  tahun  2007  yang  dilakukan  oleh  Oduola et  al. (2007) menggunakan metode Karber menunjukan hasil LD 50 sebesar  2520  mg/kgBB.  Sementara  itu,  toksisitas akut  ekstak  air  buah  papaya  muda  dengan menggunakan  metode proposed  new  recommended pada  penelitian  ini  didapatkan  LD 50 sebesar  >5000 mg/kgBB.  Kedua  hasil  tersebut  menunjukan  toksisitas ekstrak  air  buah  papaya  muda  yang  sangat  ringan. Hingga  saat  ini  di  Indonesia  belum  ada  laporan mengenai  efek  toksisitas  ataupun  efek  samping  yang membahayakan  dari  mengonsumsi  buah  pepaya.  Oleh karena  itu,  tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  untuk menentukan  derajat  toksisitas  akut  ekstrak  air  buah pepaya  muda  pada  mencit  menggunakan  metode proposed new recommended .

## Metode Penelitian
Bahan  penelitian  berupa  buah  pepaya  muda varietas Paris yang tidak dikupas (termasuk biji) dengan umur buah sekitar 2.5-3 bulan, buah keras padat, kulit buah  berwarna  hijau,  dan  biji  berwarna  putih.  Buah pepaya  berasal  dari  perkebunan  pepaya  di  Kecamatan Leles,  Kabupaten  Garut,  Jawa  Barat.  Dua  belas  ekor mencit betina ( Mus musculus ) galur Swiss Webster usia 6-8  minggu  dengan  berat  badan  25-30  gram  dibagi  ke dalam tiga tahap uji toksisitas yaitu uji toksisitas tahap satu  menggunakan  dosis  tunggal  pada  konsentrasi rendah,  uji  toksisitas  tahap  dua  menggunkan  dosis tunggal  pada  konsentrasi  sedang,  dan  uji  toksisitas tahap  tiga  menggunakan  dosis  tunggal  pada konsentrasi  tinggi  serta  satu  tahap  uji  konfirmasi digunakan sebagai subjek penelitian.
Penelitian eksperimental laboratorium ini dilaksanakan  di  Laboratorium  Biologi  Medik  Fakultas Kedokteran  Universitas  Islam  Bandung  (UNISBA). Metode proposed  new  recommended dipilih  untuk digunakan  dalam  penelitian  uji  toksisitas  ini.  Dosis tunggal pada tahap pertama sebesar 50, 200, 400, 800 mg/kg  BB;  tahap  kedua  sebesar  1000,  1500,  2000 mg/kg  BB;  dan  tahap ketiga  sebesar  3000, 4000, 5000 mg/kgBB (berat badan) masing-masing diberikan secara peroral  (Chinedu et  al. 2013).  Pada  tahap  pertama, mencit  diamati  tingkah  lakunya  selama  1  jam  setelah diberi  sampel  kemudian  diamati  selama  10  menit  tiap dua jam selama 24 jam. Tingkah laku yang menunjukan toksisitas  dan  mortalitas  dicatat.  Jika  pada  tahap pertama  tidak  didapatkan  mencit  yang  mati  maka dilanjutkan  ke  tahap  kedua.  Pada  tahap  kedua pengamatan  yang  dilakukan  sama  dengan  tahap pertama.  Jika  pada  tahap  kedua  tidak  didapatkan mencit yang mati maka dilanjutkan ke tahap ketiga dan pengamatan  yang  dilakukan  sama  dengan  tahap pertama dan kedua. Jika tidak didapatkan mencit yang mati  maka  dosis  tertinggi  pada  uji  toksisitas  tahap ketiga  digunakan  sebagai  dosis  toksisitas  sampel  yang akan  divalidasi  melalui  uji  konfirmasi.  Uji  Konfirmasi dilakukan  menggunakan  dosis  terendah  yang  tidak menimbulkan  kematian.  Apabila  pada  uji  konfirmasi dengan  dosis  tertinggi  sampel  yaitu  sebesar  5000 mg/kgBB tidak didapatkan mencit yang mati maka LD 50 dinyatakan sebesar >5000 mg/kgBB. Pada penelitian ini dosis  uji  yang  digunakan  mulai  dari  dosis  terendah hingga tertinggi yang bertujuan untuk melihat batasan toksisitas mulai dari dosis terendah.
Penentuan Derajat Toksisitas Akut  Ekstrak Air Buah Pepaya ( Carica papaya L.) Muda
Pada Mencit Menggunakan Purposed New Recommended Method
63
Hasil  LD 50 dihitung  melalui  rumus  yang  telah ditentukan  oleh  metode proposed  new  recommended berupa  hasil  rata-rata  penjumlahan  dosis  tertinggi ekstrak  yang  tidak  menimbulkan  kematian  dan  dosis terendah  ekstrak  yang  menimbulkan  kematian.  Pada analisis  akhir,  nilai  LD 50 yang  didapat  menentukan ekstrak air buah pepaya muda tersebut diklasifikasikan pada  derajat  toksisitas  akut  tertentu  dari  suatu substansi fitofarmaka.
Keterangan : M 0 = dosis tertinggi dari ekstrak air buah pepaya muda yang tidak menimbulkan kematian.
M 1 = dosis terendah dari ekstrak air buah pepaya muda yang menimbulkan kematian.

## Hasil
Pada  penelitian  ini  diperoleh  hasil  berupa  tidak ada  hewan  uji  yang  mati  ataupun  tingkah  laku  mencit
yang  menunjukkan  gejala  toksisitas  seperti  piloereksi, grooming, straub, tremor, kejang, peningkatan righting reflex, dan  eksoptalamus  pada  keseluruhan  tahap  uji toksisitas  setelah  24  jam  pemberian  dosis  tunggal ekstrak  air  buah  pepaya  muda  (dosis  50  s.d.  5000 mg/kg  BB).  Pada  uji  konfirmasi  hasil  yang  sama diperoleh  berupa  tidak  ada  hewan  uji  yang  mati  dan menunjukan  gejala  toksisitas  setelah  pemberian  dosis tertinggi  ekstrak  strsebesar  5000  mg/kg  BB.  LD 50 ekstrak  air  buah  pepaya  muda  didapatkan  sebesar >5000  mg/kg  BB  dan  diklasifikasikan  ke  dalam  kriteria derajat  toksisitas  akut  sebagai  substansi  yang  Praktis Tidak Toksik (PTT).

## Pembahasan
Berdasarkan  hasil  penelitian,  toksisitas  akut ekstrak  air  buah  pepaya  muda  menggunakan  metode proposed  new  recommended didapatkan  nilai  LD 50 sebesar  >5000  mg/kg  BB.  Hodge  dan  Sterner mengklasifikasi  nilai  LD 50 ke  dalam  substansi  yang derajat  toksisitas  akutnya  bersifat  Praktis  Tidak  Toksik
LD 50 = (M 0 + M 1 ) 2
Tabel 1. Toksisitas Hewan Coba Pada Beberapa Dosis Dalam Uji Tahap I, II, III, dan Uji Konfirmasi
Tahapan Uji Dosis* (mg/kgBB per oral) Toksisitas Akut (Mati/Hidup) (Gejala Toksisitas) Uji Tahap I 50 Hidup Tidak ada gejala piloereksi, grooming, straub, tremor, kejang, righting reflex, eksopthalamus. 200 Hidup 400 Hidup 800 Hidup Uji Tahap II 1000 Hidup Tidak ada gejala    piloereksi, grooming, straub, tremor, kejang, righting reflex, eksopthalamus. 1500 Hidup 2000 Hidup Uji Tahap III 3000 Hidup Tidak ada gejala piloereksi, grooming, straub, tremor, kejang, righting reflex, eksopthalamus. 4000 Hidup 5000 Hidup Uji Konfirmasi 5000 Hidup Tidak ada gejala piloereksi, grooming, straub, tremor, kejang, righting reflex, eksopthalamus. 5000 Hidup
Keterangan: *Dosis ditentukan berdasarkan proposed (new) recommended method (Chinedu et al. 2013) .
Tabel 2. Kriteria Penggolongan Derajat Toksisitas Sediaan Uji Berdasarkan Hodge dan Sterner
Tingkat Toksisitas LD50 oral Klasifikasi 1 <1 mg/kgBB Luar biasa toksik 2 1-50 mg/kgBB Sangat toksik 3 50-500 mg/kgBB Toksik sedang 4 500-5000 mg/kgBB Toksik ringan 5 5-15 g/kgBB Praktis tidak toksik 6 >15 g/kgBB Relatif tidak membahayakan
Dikutip dari : Peraturan Kepala Badan Pengawasan Makanan RI No. 7 Tahun 2014
(PTT). 5 Saponin, alkaloid, tanin, flavonoid, triterpenoid, dan  kuinon  dikonfirmasi  sebagai  substansi  fitokimia pada  ekstrak  air  buah  pepaya  muda  setelah  dilakukan skrining fitokimia dengan metode kualitatif.
Kandungan  suatu  substansi  (toksin  atau  racun) berpotensi  menimbulkan  gejala  toksisitas  bagi  tubuh manusia  tergantung  pada  kuantitas  zat  metabolit tersebut  pada  obat  tradisional.  Penelitian  mengenai toksisitas fitofarmaka penting dilakukan guna mengetahui  efek  samping  yang  bersifat  fatal  dan membahayakan  (Hodgson  2004).  Pada  penelitian  ini dimungkinkan  kandungan  substansi  fitokimia  tersebut berkontribusi  terhadap  efek  toksisitas  yang  minimal dari ekstrak air buah pepaya muda. Efek yang minimal dapat  terjadi  akibat  interaksi  yang  terjadi  antar substansi  fitokimia  yang  dapat  bersifat  saling menguatkan  atau  dikenal  dengan  efek  positif  ataupun efek  yang  saling  melemahkan  bahkan  meniadakan aktivitas biologis substansi fitokimia satu sama lain atau yang dikenal dengan efek negative (Lila & Raskin 2005).
Faktor  lain  yang  kemungkinan  berpengaruh terhadap  keberagaman  kandungan  substansi  fitokimia yang  dalam  hal  ini  berperan  sebagai  zat  yang  mampu menimbulkan  efek  yang  positif  dan  negatif  pada tanaman obat adalah faktor eksternal dan internal dari tumbuhan  obat  tersebut.  Faktor  internal  meliputi faktor  genetik  dan  varietas  tanaman  sementara  faktor eksternal berupa perbedaan letak geografis dan kondisi lingkungan.  Pada  penelitian  ini  digunakan  pepaya varietas  Paris  yang  memiliki  keunggulan  berupa kandungan  lateks  yang  lebih  tinggi  dibanding  dengan varietas lain (Figueiredo et al. 2008).
Pada  penelitian  ini,  penilaian  faktor  yang mempengaruhi  variasi  kandungan  fitokimia  pada
tanaman  obat  kemungkinan  diarahkan  lebih  terhadap faktor eksternal berupa perbedaan letak geografis yang saling terkait dalam mempengaruhi kondisi lingkungan tempat  tanaman  obat  tersebut  tumbuh  dan berkembang.  Buah  pepaya  yang  digunakan  dalam penelitian ini berasal dari perkebunan pepaya di Leles, Kabupaten  Garut.  Suhu,  kelembapan,  intensitas cahaya, kandungan mineral, suplai air, dan karbondioksida  diketahui  sebagai  komponen  dari kondisi lingkungan yang mempengaruhi perkembangan tanaman obat (Ramakrishna & Ravishankar 2011).
Keberagaman  substansi  fitokimia,  interaksinya dalam  menimbulkan  efek  dari  suatu  tanaman  obat, serta  faktor  eksternal  maupun  internal  berpengaruh terhadap  efek  toksisitas  yang  timbul.  Pada  penelitian ini,  dimungkinkan  varietas  buah  pepaya  yaitu  varietas Paris,  letak  geografi  serta  kondisi  lingkungan mempengaruhi  kandungan  substansi  fitokimia  dan interaksi  yang  terjadi  diantara  substansi  tersebut. Interaksi  yang  terjadi  antar  substansi  fitokimia  pada ekstrak  air buah pepaya muda ini kemungkinan belum cukup  secara  kuantitas  maupun  kualitas  sehingga belum  memadai  untuk  menimbulkan  efek  kematian pada  hewan  uji  dan  memberikan  hasil  akhir  berupa derajat  toksisitas  akut  yang  tergolong  Praktis  Tidak Toksik (PTT).

## Simpulan
Ekstrak  air  buah  pepaya  muda  memiliki  LD 50 pada  mencit  sebesar  >5000  mg/kg  BB  menggunakan metode proposed  new  recommended dan  dengan derajat  toksisitas  akut  Praktis  Tidak  Toksik  (PTT). Pemberian ekstrak air buah pepaya muda hingga dosis uji  tertinggi  tidak  menimbulkan  gejala  toksisitas  pada
Tabel 3. Kandungan Fitokimia Ekstrak Air Buah Pepaya ( Carica papaya L.) Muda Secara Kualitatif No.  Golongan Senyawa Reaksi Hasil Uji* Keterangan 1 Alkaloid Sampel + Dragendroff + CHCl 3 + HCl (+) Terbentuk warna jingga 2 Flavonoid Sampel + Mg + HCl + Amil Alkohol (+) Terbentuk warna merah bata 3 Saponin Sampel + HCl (dikocok) (+) Terbentuk busa 4 Tannin Sampel + pereaksi Steasny* (dipanaskan) (+) Terbentuk endapan merah 5 Quinon Sampel + NaOH (+) Terbentuk warna coklat pekat 6 Steroid/ Triterpenoid Sampel + Eter + H 2 SO 4 + Asam asetat glasial (+) Terbentuk warna merah, ungu, hitam
*Keterangan:
(+) = ada kandungan senyawa fitokimia pada ekstrak Perekasi Steasny = campuran formaldehida 30% dan asam klorida pekat (HCl) dengan perbandingan 2:1
Penentuan Derajat Toksisitas Akut  Ekstrak Air Buah Pepaya ( Carica papaya L.) Muda Pada Mencit Menggunakan Purposed New Recommended Method
mencit.  Saran  pada  penelitian  ini  adalah  perlunya dilakukan  uji  toksisitas  terhadap  efek  sistemik  seperti pemeriksaan histopatologi organ, pemeriksaan biokimia  berupa  kadar  enzim  dan  metabolit  yang menunjukan  kerusakan  organ,  serta  pemeriksaan komponen hematologi.

## Ucapan Terima kasih
Terimakasih kepada pihak Laboratorium Biomedik  Fakultas  Kedokteran  Universitas  Islam Bandung  (UNISBA)  atas  segala  fasilitas  yang  diberikan selama  penelitian  ini,  serta  staff  laboratorium  atas bantuan  teknis  yang  diberikan  sehingga  peneltian  ini dapat terlaksana dengan lancar.

## Daftar Pustaka
Aravind  G,  Bhowmik  D,  Duraivel  S,  Harish  G.  2013. Traditional  and  medicinal  uses  of Carica papaya . Journal  of  Medicinal  Plants  Studies . 1(1):7 – 15.
BPOM. 2014. Pedoman uji toksisitas nonklinik secara in vivo .  Peraturan  Kepala  Badan  Pengawas  Obat dan  Makanan  Republik  Indonesia  No.  7  Tahun 2014.
Chinedu E, Arome D, Ameh FS. 2013. New recomended method  for  determining  acute  toxicity  in animal  models. Toxicology  International. 20(3):224 – 6.
Dewoto  HR.  2007.  Pengembangan  obat  tradisional Indonesia  menjadi  fitofarmaka. Maj  Kedokt Indon . 57(7):205 – 11.
Figueiredo AC, Barroso JG, Pedro LG, Scheffer JJC. 2008. Factors affecting secondary metabolite production  in  plants:  volatile  components  and
essential  oils. Flavour  and  Fragrance  Journal . 23(4):213 – 26.
Kharisma  Y,  Ariyoga  A,  Sastramihardja  HS.  2011.  Efek ekstrak  air  buah  pepaya  (Carica  papaya  L.) muda  terhadap  gambaran  histologi  kelenjar mamma mencit laktasi. MKB .43(4):160 – 5.
Hodgson  E.  2004.  Introduction  to  toxicology.  In: Hodgson  E,  penyunting.  A textbook  of modern toxicology. Edisi ke-3. New Jersey (AS):Wiley & Sons, Inc.
Iwuagwu M, Chukwuka KS, Uka UN. 2013. Evaluation of nutritional  components  of Carica  papaya L.  at different  stages  of  ripening. Journal  of
Pharmaceutical and Biological Sciences . 6(4):13 – 6.
Lila  MA,  Raskin  I.  2005.  Health-related  interactions  of phytochemical. Journal  of  Food  Science . 70(1):21 – 7.
Paramveer D, Chancal M, Paresh M, Rani A, Nema RK. 2010.  Effective  alternative  methods  of  LD50 help  to  save  number  of  experimental  animals . Journal  of  Chemical  and  Pharmaceutical Research . 2(6):450 – 3.
Oduola  T,  Adeniyi  FAA,  Ogunyemi  EO,  Bello  IS,  Idowu TO,  Subair,  HG.  2007.  Toxicity  studies  on  an unripe Carica  papaya aqueous  extract: biochemical  and  haematological  effects  in wistar  albino  rats. Journal  of  Medicinal  Plants Research . 1(1):1 – 4.
Ramakrishna  A,  Ravishankar  GA.  2011.  Influence  of abiotic stress signals on secondary metabolites in  plants. Plant  Signaling  and  Behavior Landes Bioscience . 6(11):1720 – 31.