Yuniarta et al.;Desain Senyawa Derivat Halofuginon…..Pharmacoscript Volume 7 No. 2, Agustus 2024

## DESAIN SENYAWA DERIVAT HALOFUGINON TERHADAP ENZIM PROLIL- tRNA SINTET ASE Plasmodium falciparum SECARA IN SILICO
Tegar Achsendo Yuniarta*, Fransisco Candra Gonsalez, Arif Maulana Azis, Dini Kesuma
Fakultas Farmasi, Universitas Surabaya *Email: tegar.achsendo@staff.ubaya.ac.id
Received: 12/06/2024 , Revised: 12/07/2024 , Accepted: 03/08/2024, Published: 08/08/2024

## ABSTRAK
Malaria  adalah  salah  satu  penyakit  infeksi  yang  memiliki  tingkat  kematian  cukup  tinggi. Penyakit  ini  disebabkan  oleh  parasit  Plasmodium  yang  ditularkan  melalui  gigitan  nyamuk Anopheles  betina.  Sejak  tahun  2004  obat  pilihan  utama  untuk  malaria  adalah  obat  kombinasi artemisinin  (ACT).  Salah  satu  obat  yang  dapat  dikembangkan  sebagai  calon  obat  antimalaria saat  ini  yaitu  halofuginon  dan  turunannya.  Halofuginon  bekerja  dengan  metode  inhibisi  enzim prolil-tRNA  sintetase  pada Plasmodium  falciparum (PfPRS).  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengoptimasi  struktur senyawa halofuginon  untuk  mendapatkan senyawa baru  yang  poten dan tidak  toksik.    Tahapan  modifikasi  senyawa  dilakukan  dengan  bantuan webserver ADMETopt untuk  memperoleh  beberapa  rekomendasi  senyawa  derivat.  Senyawa  turunan  ini  kemudian disikrining  menggunakan webserver SwissADME  dengan  melihat  parameter  absorbsi  serta deteksi  gugus  fungsi  PAINS  dan  toksikofor.  Senyawa  yang  memenuhi  kriteria  dilakukan molecular  docking untuk  mendapatkan  nilai binding  energy dan  untuk  mengetahui  interaksi ikatannya dengan residu asam amino enzim PRS. Hasil penelitian ini diperoleh 2 senyawa: 8‐[3‐ (7‐bromo‐6‐kloro‐4‐okso‐3,4‐dihidrokuinazolin‐3‐il)‐2‐oksopropil]‐7‐hidroksi‐3,4‐dihidro‐2H‐ 1,3‐benzoksazin‐2,4‐dion dan 3‐(3‐{2‐amino‐5‐okso‐5H,6H‐imidazo[4,5‐d]azepin‐4‐il}‐2‐ oksopropil)‐7‐bromo‐6‐kloro‐3,4‐dihidrokuinazolin‐4‐on.  Kedua  senyawa  ini  memiliki  nilai energi  interaksi  sebesar  -10,79  kkal/mol  dan  -10,19  kkal/mol  yang  mendekati  nilai  dari halofuginon sebesar -10,98 kkal/mol. Selanjutnya perlu dilakukan verifikasi dengan melakukan uji in  vitro terhadap  enzim  PRS  dan  parasit Plasmodium  falciparum ,  serta  uji  toksisitas  agar didapat turunan febrifugin yang poten dan non-toksik.
Kata kunci : Antimalaria, Halofuginon, Optimasi senyawa penuntun, Prolil-tRNA sintetase

## ABSTRACT
Malaria is one of the infectious diseases with a relatively high mortality rate. It is caused by the Plasmodium  parasite,  transmitted  through  the  bite  of  the  female  Anopheles  mosquito.  Since 2004,  the  primary  treatment  for  malaria  has  been  artemisinin-based  combination  therapy (ACT).  Currently,  one  of  the  potential  candidates  for  antimalarial  drug  development  is halofuginone  and  its  derivatives.  Halofuginone  functions  by  inhibiting  the  enzyme  prolyl-tRNA synthetase  in  Plasmodium  falciparum  (PfPRS).  This  study  aims  to  optimize  the  structure  of halofuginone to obtain new, potent, and non-toxic compounds. The modification of compounds was  conducted  using  the  ADMETopt  web  server  to  obtain  several  derivative  compound
Yuniarta et al./Pharmacoscript, Volume 7, No, 2, Agustus 2024, 331 - 345
recommendations.  These  derivatives  were  then  screened  using  the  SwissADME  web  server  by examining  absorption  parameters  and  detecting  PAINS  and  toxicophore  functional  groups. Compounds that met the criteria were subjected to molecular docking to determine their binding energy  and  to  analyze  their  interactions  with  the amino  acid  residues  of  the  PRS  enzyme.  The results  of  this  study  identified  two  compounds:  8-[3-(7-bromo-6-chloro-4-oxo-3,4- dihydroquinazolin-3-yl)-2-oxopropyl]-7-hydroxy-3,4-dihydro-2H-1,3-benzoxazin-2,4-dione  and 3-(3-{2-amino-5-oxo-5H,6H-imidazo[4,5-d]azepin-4-yl}-2-oxopropyl)-7-bromo-6-chloro-3,4- dihydroquinazolin-4-one.  These  two  compounds  exhibited  interaction  energies  of  -10.79 kcal/mol  and  -10.19  kcal/mol,  respectively,  which  are  close  to  the  interaction  energy  of halofuginone  at  -10.98  kcal/mol.  Further  verification  through  in  vitro  testing  on  PRS  enzyme and  Plasmodium  falciparum,  as  well  as  toxicity tests,  are  necessary  to  obtain  potent  and  non- toxic febrifugin derivatives.
Keywords : Antimalarial, Halofuginone, Lead optimization, Prolyl-tRNA Synthetase

## PENDAHULUAN
Malaria  adalah  penyakit  menular dengan  tingkat  kematian  tinggi  di  banyak negara-negara  Asia,  Afrika,  dan  Amerika. Menurut  WHO,  terdapat  241  juta  kasus klinis  dan  627.000  kematian  pada  tahun 2020.  Jumlah  ini  meningkat  dari  227  juta kasus  klinis  dan  558.000  kematian  yang tercatat  pada  tahun  2019.  Beberapa  negara di  benua  Afrika  menyumbang  95%  dari semua  kasus  malaria  di  seluruh  dunia (WHO,  2021).  Hal  ini  memiliki  pengaruh merugikan  terhadap  pertumbuhan  ekonomi dan  sosial  negara-negara  ini,  yang  sebagian besar  memiliki  pendapatan  per  kapita rendah  (Sachs  &  Malaney,  2002).  Malaria disebabkan  oleh  parasit  Plasmodium,  yang menyebar  melalui  gigitan  nyamuk  betina Anopheles. Parasit Plasmodium yang menginfeksi  manusia  saat  ini  dikategorikan ke dalam lima spesies: Plasmodium falciparum , Plasmodium vivax , Plasmodium ovale , Plasmodium malariae , dan
Plasmodium  knowlesi .  Sejak  tahun  2004, terapi  kombinasi  artemisinin  (ACT)  telah menjadi  pilihan  utama  dalam  pengobatan malaria.  Terapi  ini  dipilih  karena  memiliki dampak terapeutik yang lebih besar daripada klorokuin  (International  Artemisinin  Study Group,  2004).  Namun  demikian,  jumlah kasus  malaria  yang  tinggi  di  dunia mendorong para peneliti untuk mengembangkan obat antimalaria baru yang lebih  kuat  dan  lebih  mudah  diperoleh  guna menghindari  kasus  resistensi  terhadap  obat yang  saat  ini  tersedia  (Taylor  &  Juliano, 2014).
Telah  diketahui  beberapa  golongan senyawa  yang  memiliki  aktivitas  sebagai inhibitor  enzim  PfPRS,  diantaranya  adalah golongan  febrifugin,  pirazol-urea,  dan piridin-pirolidinon    (Yuniarta et  al .,  2022; Yuniarta et  al. ,  2023).  Akan  tetapi  sejauh ini,  febrifugin  dan  analognya  adalah  salah satu kandidat yang memiliki aktivitas paling poten  terhadap  enzim  ini.  Senyawa  ini
Yuniarta et al.;Desain Senyawa Derivat Halofuginon…..Pharmacoscript Volume 7 No. 2, Agustus 2024
ditemukan  dalam  tanaman  obat  tradisional Tiongkok  Chang  Shan  ( Dichroa  febrifuga Lour.), yang telah digunakan dalam pengobatan tradisional sebagai agen terapetik  antimalaria  (McLaughlin et  al .,
2014).  Analog  lainnya  adalah  halofuginon, yang  memiliki  aktivitas  antimalaria  yang lebih  kuat,  serta  aktivitas  antifibrosis, antikanker,  dan  antiinflamasi  (Pines  & Spector,  2016).  Namun,  pengembangan kedua senyawa ini sebagai agen antimalaria prospektif telah terhambat oleh toksisitasnya (McLaughlin et  al .,  2014;  Pines  &  Spector,
2016).  Selain  itu,  studi  terbaru  juga menyatakan  adanya  potensi  resistensi  terapi halofuginon sebagai antimalaria (Fagbami et al ., 2019). Baik febrifugin maupun halofuginon  terdiri  dari  dua  sistem  cincin (kuinazolinon  dan  hidroksipiperidin),  yang dihubungkan oleh gugus oksopropana (Gambar  1) .  Kedua  senyawa  ini  diketahui aktif  sebagai  inhibitor  enzim  prolil-tRNA sintetase  pada P.  falciparum (PfPRS).
Mekanisme kerjanya adalah sebagai inhibitor  ganda  dari  situs  aktif  tRNA  dan prolin, dimana cincin kuinazolinon memiliki kemiripan  dengan  struktur  dengan  basa RNA,  sementara  cincin  hidroksipiperidin meniru  struktur  dari  asam  amino  L-prolin.
Adanya  senyawa  ini  akan  mencegah  reaksi esterifikasi  antara  L-prolin  dengan  tRNA, sehingga mengakibatkan asam amino tersebut  tidak  dapat  diinkorporasi  dalam
sintesis  peptida  pada  P.  falciparum  (Jain et al ., 2015).
Gambar 1. Struktur febrifugin dan halofuginon Studi ini bertujuan untuk mengoptimalkan struktur halofuginon secara in  silico untuk  mendapatkan  senyawa- senyawa baru yang setara potensinya namun kurang  toksik.  Optimasi  senyawa  dilakukan dengan  memodifikasi  cincin  kuinazolinon dan hidroksipiperidin dari senyawa tersebut, karena  keduanya  dianggap  sebagai  gugus farmakofor  yang  penting  dalam  interaksi enzimatik  yang meniru  kerangka tRNA dan prolin  (Kikuchi et  al .,  2014;  Jain et  al ., 2015). Modifikasi yang dihasilkan kemudian  diuji  karakteristik  ADMET-nya sebelum  dievaluasi  berdasarkan  energi ikatan dan interaksi melalui studi molecular docking serta molecular  dynamics terhadap enzim PfPRS.

## METODE PENELITIAN

## Alat dan Bahan
Alat  yang  digunakan  pada  penelitian ini  meliputi  piranti  keras  dan  piranti  lunak.
Pemodelan molekul dilakukan
menggunakan  PC  standar  (Intel®  Core  i7-
9700F,  RAM  16GB,  Sistem  Operasi
Windows 10). MarvinSketch 19.22
digunakan  untuk  membuat  struktur  dua dimensi  (ChemAxon),  Avogadro  digunakan untuk mengoptimalkan struktur tiga dimensi molekul  (Hanwell et  al .,  2012). Webserver ADMETopt ( http://lmmd.ecust.edu.cn/admetsar2/admeto pt/ )  digunakan  untuk  melakukan  optimasi senyawa  acuan  berdasarkan  kesesuaian dengan parameter drug-likeness serta parameter  toksikologi  (Yang et  al .,  2018).
Webserver SwissADME ( http://www.swissadme.ch/index.php ) digunakan untuk menskrining senyawa yang telah dirancang berdasarkan kriteria absorbsi  saluran  cerna,  toksikofor,  dan PAINS  (Daina et  al .,  2017).  Autodock  4.2 digunakan  untuk  melakukan  molecular docking  pada  senyawa-senyawa  yang  telah difilter  (Morris et  al .,  2009).  Discovery Studio  Visualizer  2020  digunakan  untuk mengevaluasi  interaksi  senyawa  uji  dengan asam-asam amino pada situs ikatan (Dassault  Système). Webserver CHARMM- GUI ( https://www.charmm-gui.org/ ) digunakan  untuk  menyiapkan  file  yang diperlukan untuk simulasi molecular dynamics  (Jo et  al .,  2008),  yang  dilakukan menggunakan  GROMACS  2021.5  pada
platform  Google  Colaboratory  (Arantes et al. , 2021).
Bahan yang digunakan pada penelitian ini  meliputi  struktur  ligan  maupun  protein yang  berfungsi  sebagai  input  dalam  proses pemodelan molekul. Struktur ligan halofuginon  yang  digunakan  sebagai  acuan pada  tahap  desain  derivat  diperoleh  dari PubChem. Sementara enzim PfPRS diperoleh  dari  repositori  Protein  Data  Bank (ID: 4YDQ) (Jain et al ., 2015).
Jalannya Penelitian
1. Desain Senyawa Turunan

## Halofuginon dan Uji ADMET
Struktur
SMILES halofuginon digunakan  sebagai  acuan  untuk  proses optimasi senyawa pada webserver ADMETopt. Modifikasi dilakukan pada dua sistem  cincin  utama  senyawa  tersebut (kuinazolinon dan hidroksipiperidin). Analog  halofuginon  yang  dihasilkan  sesuai dengan  kaidah  Lipinski  (Lipinski et  al ., 1997) dan kriteria non-toksik (karsinogenisitas, toksisitas Ames, toksisitas oral akut, inhibitor hERG, inhibitor Pgp, dan inhibitor  CYP)  (Yang et  al .,  2018).  Analog yang  diperoleh  kemudian  diskrining  lebih lanjut  di  SwissADME  berdasarkan  nilai absorbsi gastrointestinal serta mengeliminasi senyawa-senyawa yang memiliki  substruktur  PAINS  (Baell et  al .,
2010)  atau  gugus  fungsi  toksikofor  (Brenk et al ., 2008).
2. Penambatan  Molekul  ( Molecular Docking )
Tahapan  selanjutnya  adalah  proses molecular  docking yang  dimulai  dengan preparasi  protein  dan  ligan.  Enzim  PfPRS yang  diperoleh  dari Protein  Data  Bank kemudian  dipisahkan  dari  ligan  alaminya (halofuginon)  dan  hanya  meninggalkan kofaktor  Magnesium.  Langkah  selanjutnya adalah  penambahan  atom  hidrogen  dan muatan  parsial  Kollman.  Sementara  itu, molekul  halofuginon  juga  ditambahkan dengan  atom  hidrogen  dan  muatan  parsial Gasteiger.  Setelah  itu,  validasi  dilakukan dengan  melakukan redocking ligan  alami halofuginon kembali ke sisi aktif proteinnya.  Evaluasi  dilakukan  dengan menghitung  nilai  RMSD  ( Root  Mean Square  Deviation )  dari  posisi  docking dibandingkan  terhadap  konformasi  mula- mula,  yang  seharusnya  kurang  dari  2  Å. Kemudian  semua  senyawa  yang  dirancang diujikan  menggunakan  parameter  docking yang  telah  divalidasi.  Metode  pencarian konformasi  hasil docking dilakukan  dengan algoritma  genetik  ( Genetic  Algorithm ) dengan  jumlah run 10  dan  ukuran  populasi 150.  Hasilnya  dievaluasi  berdasarkan  skor docking dan interaksi antara ligan dan asam amino.
3. Dinamika Molekul ( Molecular Dynamics ) Simulasi molecular dynamics dilakukan  untuk  senyawa-senyawa  dengan nilai  skor docking yang  terbaik.  Piranti lunak  GROMACS  2021.5  digunakan  untuk menjalankan  proses  simulasi  secara cloud- based pada platform Google  Colaboratory. Mula-mula, kompleks ligan-protein dipreparasi  dengan  menggunakan  medan gaya  ( force  field )  CHARMM  General Forcefield  (CGENFF)  (Vanommeslaeghe et al ., 2012). Sistem kemudian disolvasi dalam model air TIP3P (Transferable
Intermolecular  Potential  with  3  Points)  dan counterion ditambahkan untuk menyetimbangkan  muatan  pada  kompleks. Minimisasi  energi  kemudian  dilakukan menggunakan  algoritma steepest  descent dan disetimbangkan menggunakan termostat Nosé-Hoover,  sebelum  menjalani  simulasi selama  50  ns.  Semua  berkas  persiapan dibuat dengan bantuan webserver CHARMM-GUI  (Jo et  al .,  2008).  Evaluasi dilakukan berdasarkan nilai fluktuasi RMSD ligan dan protein.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Target enzimatik dari senyawa halofuginon  dan  analognya  adalah  prolil- tRNA  sintetase  (PRS).  PRS  adalah  enzim kelas  II  subkelas  aaRS  yang  mengkatalisis reaksi aminoasilasi antara prolin dan tRNA.
Enzim  ini  dapat  ditemukan  pada  berbagai spesies, seperti pada Plasmodium falciparum (Rubio  Gomez  &  Ibba et  al ., 2020). Berdasarkan data struktural, diketahui  bahwa  interaksi  halofuginon dengan  enzim  akan  meniru  interaksi  antara L-prolin (identik dengan cincin hidroksipiperidin)  dan  adenin  76  (A76) tRNA (identik dengan cincin kuinazolinon), yang  dikatalisis  dengan  ATP  (Jain et  al ., 2015).  Dalam  penelitian  ini,  struktur halofuginon digunakan sebagai  acuan untuk mengembangkan  analog  yang  non-toksik menggunakan webserver ADMETopt. Algoritma webserver ini  didasarkan  pada prinsip scaffold-hopping dari  sistem  cincin yang  telah  ditentukan  dari  senyawa  acuan, dimana cincin tersebut diubah menjadi sidik jari  ( fingerprint )  berdasarkan  sifat  atomik dan  cincin,  vektor  jarak,  titik  keragaman, farmakofor,  dan  bentuk  (Rabal et  al ., 2015;Yang et al., 2018). Sistem cincin yang akan  dimodifikasi  kemudian  diskrining  ke library fragmen ADMETopt. Kriteria penerimaan  disesuaikan  untuk  mematuhi kriteria drug-likeness dan  ADMET  yang telah  disebutkan  sebelumnya.  Hasilnya menghasilkan  total  60  senyawa  modifikasi untuk  gugus  hidroksipiperidin (Gambar  2)
dan  kuinazolinon (Gambar  3) .  Skrining lanjutan dilakukan di webserver SwissADME  untuk  mengeliminasi  senyawa
yang  mengandung  gugus  PAINS  (Baell et al .,  2010)  dan  gugus  toksikofor  (Brenk et al .,  2008).  Pendeteksian  gugus  PAINS  ini telah  menjadi  aturan  standar  untuk  skrining senyawa  untuk  menghindari  pemilihan senyawa positif palsu pada tahap uji in vitro (Schuffenhauer et  al .,  2020).  Sementara eliminasi gugus toksikofor dilakukan menggunakan  kriteria  dari  Brenk et  al ., diantaranya  adalah  senyawa  dengan  gugus reaktif,  minim  substituen,  serta  yang mengandung  terlalu  banyak  substituen (Brenk et al ., 2008). Selain itu, SwissADME  digunakan  untuk  menilai senyawa  mana  yang  memiliki  prediksi penyerapan  gastrointestinal  yang  dapat diterima berdasarkan model statistik BOILED-Egg  (Daina  &  Zoete,  2016). Proses  ini  berhasil  menghasilkan  39 senyawa yang memenuhi parameter absorbsi gastrointestinal serta tidak mengandung gugus-gugus positif palsu serta toksikofor (Tabel  1) ,  yang  kemudian dilanjutkan ke tahapan molecular docking .
Yuniarta et al.;Desain Senyawa Derivat Halofuginon…..Pharmacoscript Volume 7 No. 2, Agustus 2024
Tabel  1. Docking  score dari  39  senyawa modifikasi halofuginon
Senyawa Modifikasi Cincin Hidroksipiper idin Docki ng score Senyawa Modifikasi Cincin Kuinazoli non Docki ng score 1_2 -8,35 2_3 -7,98 1_3 -8,01 2_4 -6,71 1_4 -7,83 2_6 -6,83 1_5 -7,88 2_8 -6,59 1_8 -7,91 2_9 -6,38 1_9 -9,56 2_11 -6,33 1_10 -9,46 2_12 -6,92 1_12 -10,19 2_13 -6,58 1_13 -8,85 2_14 -6,49 1_14 -7,79 2_15 -7,36 1_17 -7,62 2_16 -6,03 1_18 -8,76 2_18 -6,67 1_20 -10,79 2_19 -7,63 1_21 -8,79 2_20 -5,88 1_26 -8,29 2_23 -6,12 1_27 -7,66 2_25 -6,63 1_28 -8,42 2_26 -6,30 1_30 -8,93 2_27 -6,61 2_28 -7,27 2_29 -7,53 2_30 -6,08
*warna  kuning  mengindikasikan  senyawa  dengan nilai docking score optimal
Proses molecular  docking bertujuan untuk  memberikan  gambaran  bagaimana suatu  senyawa  akan  berinteraksi  dengan protein  target (Pinzi  &  Rastelli,  2019).
Tahapan ini dapat digunakan untuk mengidentifikasi  senyawa  yang  berpotensi sebagai  inhibitor  enzim  PfPRS  dengan melihat  pola  interaksi  ligan-reseptor  serta skor  interaksinya.  Enzim  PfPRS  dengan PDB  ID  4YDQ  digunakan  pada  studi  ini dikarenakan  strukturnya  memiliki  ligan alami  halofuginon  (Jain et  al .,  2015) sehingga dapat dijadikan acuan untuk proses
validasi maupun evaluasi hasil. Hasil proses redocking pada  ukuran grid  box 15x15x15 Å 3 memberikan nilai RMSD yang memenuhi  kriteria  validitas  dengan  nilai kurang  dari  2,0  Å,  dimana  diperoleh  nilai sebesar  1,62  Å.  Hasil molecular  docking memunculkan  dua  senyawa  dengan  nilai skor docking yang  optimal,  yaitu  8‐[3‐(7‐ bromo‐6‐kloro‐4‐okso‐3,4‐ dihidrokuinazolin‐3‐il)‐2‐oksopropil]‐7‐ hidroksi‐3,4‐dihidro‐2H‐1,3‐benzoksazin‐ 2,4‐dion  (senyawa  1_12)  dan  3‐(3‐{2‐ amino‐5‐okso‐5H,6H‐imidazo[4,5‐d]azepin‐ 4‐il}‐2‐oksopropil)‐7‐bromo‐6‐kloro‐3,4‐ dihidrokuinazolin‐4‐on (senyawa  1_20). Kedua  senyawa  ini  (1_12  dan  1_20) memiliki  nilai  skor docking berturut-turut sebesar  -10,19  dan  -10,79  kkal/mol. (Tabel 1) .  Baik  senyawa  1_12  dan  1_20  tersebut adalah  produk  modifikasi  dari  gugus hidroksipiperidin, yaitu  dengan cincin karsalam  (senyawa  1_12)  dan  2‐amino‐6H‐ imidazo[4,5‐d]azepin‐5‐on  (senyawa  1_20). Tidak ada analog modifikasi cincin kuinazolinon yang menghasilkan skor docking yang signifikan (Tabel 1) , dikarenakan modifikasi yang direkomendasikan oleh webserver ADMETopt  sebagian  besar  merupakan analog  dengan  struktur  cincin  tunggal daripada  bisiklik  seperti  pada  kuinazolinon (Gambar 2) .
Tabel 2. Peta interaksi ligan-asam amino dari dua senyawa terbaik
Senyawa Ikatan Hidrogen Interaksi Lain 1_12 Glu361, Arg390, Thr478 Interaksi π-π : Phe335, Trp407 Interaksi π-alkil : Pro358 1_20 Arg390, Thr478, His480, Trp501 Interaksi π-π : Phe335,Trp407 Interaksi π-alkil : Pro358 Interaksi π-kation : Glu409 Halofuginon Thr359, Glu361, Arg390, Thr478, His480 Interaksi π-π : Phe335 Interaksi π-alkil : Pro358 Interaksi π-kation : Arg390
Gambar 2. Modifikasi cincin hidroksipiperidin

## Pharmacoscript Volume 7 No. 2 Agustus 2024
Gambar 3. Modifikasi cincin kuinazolinon
Telah diamati dalam penelitian sebelumnya  bahwa  modifikasi  tersebut membuat  senyawa  desain  mejadi  inaktif pada  uji in  vitro (Kikuchi et  al .,  2014).
Pengamatan  lebih  lanjut  terhadap  interaksi ligan-protein  menunjukkan  bahwa  kedua senyawa  tersebut  menghasilkan  interaksi ikatan  hidrogen  yang  identik  dengan halofuginon,  terutama  dengan  Arg390  dan Thr478. Perbedaan ditemukan pada senyawa
1_20,  di  mana  senyawa  ini  membentuk interaksi  dengan  Trp501.  Hasil  validasi metode molecular  docking terhadap  enzim PfPRS  (PDB  ID:  4YDQ)  menunjukkan bahwa hasil redocking ligan alami halofuginon memberikan nilai RMSD sebesar 1,62 Å. Pengaturan  yang digunakan adalah  volume grid  box sebesar  15x15x15 Å 3 .  Dengan  mengimplementasikan  metode tersebut,  diperoleh  dua  senyawa  dengan
Yuniarta et al.;Desain Senyawa Derivat Halofuginon…..Pharmacoscript Volume 7 No. 2, Agustus 2024
skor docking optimal  dibandingkan  dengan halofuginon (Tabel  1) .  Kedua  senyawa  ini (1_12 dan 1_20) memiliki nilai skor docking berturut-turut  sebesar  -10,19  dan  -10,79 kkal/mol. Selain itu dilakukan evaluasi lebih lanjut  terhadap  interaksi  ligan-protein  pada kedua senyawa tersebut (Tabel 2) . Berdasarkan hasil evaluasi, diketahui bahwa kedua  senyawa  tersbeut  memiliki  interaksi hidrogen  yang  identik  dengan  halofuginon, yaitu Glu361, Arg390, Thr478, dan His480. Interaksi  lain  yang  dapat  diidentifikasi adalah  interaksi  tipe  π  yang  khususnya terbentuk  dengan  gugus  kuinazolinon  pada kedua senyawa.
Tahap terakhir adalah dengan dilakukan simulasi dinamika molekul ( molecular  dynamics )  selama  50  ns  yang bertujuan  untuk  mengevaluasi  stabilitas interaksi  ligan-protein  dengan  implementasi
gaya  Newtonian  dalam  sistem  tersolvasi (Liu et al ., 2017). Hasil simulasi menunjukkan bahwa kedua senyawa tersebut  cukup  stabil  dalam  situs  ikatan dengan  nilai  fluktuasi  RMSD  ligan  kurang dari  1  Å (Gambar  4) .  Pada  plot  RMSD ligan  senyawa  1_12  teramati  memiliki  nilai sedikit  lebih  tinggi  dibandingkan  pada senyawa  1_20.  Sedangkan  hasil  plot  RMSF menunjukkan  bahwa  residu  asam  amino  ke 300  hingga  400  menunjukkan  fleksibilitas yang cukup tinggi selama simulasi molecular  dynamics ,  khususnya  teramati pada  ligan  1_20.  Residu  asam-asam  amino juga teramati mengalami fluktuasi, khususnya pada residu 300-400 (Gambar 5) yang  merupakan  region  antarmuka  dimer dari enzim, sekaligus lokasi situs ikatan dari senyawa (Jain et al ., 2014).
Gambar 4 Plot RMSD ligan selama simulasi molecular dynamics 50 ns

## Pharmacoscript Volume 7 No. 2 Agustus 2024
Gambar 5 Plot RMSF residu asam amino selama simulasi molecular dynamics 50 ns

## KESIMPULAN
Secara  keseluruhan,  metode  in  silico telah berhasil mengidentifikasi dua senyawa yang  berpotensi  menginhibisi  enzim  PfPRS dengan baik, yaitu 8‐[3‐(7‐bromo‐6‐kloro‐4‐ okso‐3,4‐dihidrokuinazolin‐3‐il)‐2‐ oksopropil]‐7‐hidroksi‐3,4‐dihidro‐2H‐1,3‐ benzoksazin‐2,4‐dion  dan  3‐(3‐{2‐amino‐5‐ okso‐5H,6H‐imidazo[4,5‐d]azepin‐4‐il}‐2‐ oksopropil)‐7‐bromo‐6‐kloro‐3,4‐ dihidrokuinazolin‐4‐on.  Kedua  senyawa tersebut  juga  memenuhi  karakteristik  drug- likeness, absorbsi, toksisitas, serta parameter PAINS.  Studi  lebih  lanjut  perlu  dilakukan untuk  memverifikasi  aktivitasnya  melalui uji enzimatik serta terhadap parasit Plasmodium falciparum

## DAFTAR PUSTAKA
Arantes,  P.  R.,  Polêto,  M.  D.,  Pedebos,  C.,
&  Ligabue-Braun,  R.  (2021).  Making it Rain: Cloud-Based Molecular
Simulations  for  Everyone.  Journal  of Chemical  Information  and  Modeling, 61(10), 4852–4856.
Baell  J.B.,  &  Holloway  G.A.  (2010).  New Substructure  Filters  for  Removal  of Pan  Assay  Interference  Compounds (PAINS) from Screening Libraries and for  Their  Exclusion  in  Bioassays. Journal  of  Medicinal  Chemistry, 53(7), 2719–2740.
Brenk R., Schipani A., James D., Krasowski
A., Gilbert I. H., Frearson J., & Wyatt, P.  G.  (2008).  Lessons  Learnt  from Assembling  Screening  Libraries  for
Yuniarta et al.;Desain Senyawa Derivat Halofuginon…..Pharmacoscript Volume 7 No. 2, Agustus 2024
Drug Discovery for Neglected
Diseases.  ChemMedChem,  3(3),  435– 444.
Daina, A., & Zoete, V. A. (2016). BOILED-
Egg To Predict Gastrointestinal
Absorption  and  Brain  Penetration  of Small  Molecules.  ChemMedChem, 11(11), 1117–1121.
Daina,  A.,  Michielin,  O.,  &  Zoete,  V.
(2017).  SwissADME:  a  free  web  tool to  evaluate  pharmacokinetics,  drug- likeness  and  medicinal  chemistry friendliness of small molecules.
Scientific Reports, 42717.
Fagbami, L., Deik, A. A., Singh, K., Santos,
S.  A.,  Herman,  J.  D.,  Bopp,  S.  E., Lukens, A. K., Clish, C. B., Wirth, D. F.,  &  Mazitschek,  R.  (2019).  The Adaptive  Proline  Response  in  P. falciparum  Is  Independent  of  PfeIK1 and  eIF2α  Signaling.  ACS  Infectious Diseases, 5(4), 515-520.
Hanwell, M. D., Curtis, D. E., Lonie, D. C., Vandermeersch,  T.,  Zurek,  E.,  & Hutchison,  G.  R.  (2012).  Avogadro: an advanced semantic chemical editor, visualization,  and  analysis  platform. Journal of Cheminformatics, 4(1), 17. International  Artemisinin  Study  Group.
(2004).  Artesunate  combinations  for treatment  of  malaria:  meta-analysis. The Lancet, 363(9402), 9-17.
Jain,  V.,  Kikuchi,  H.,  Oshima,  Y.,  Sharma, A.,  &  Yogavel,  M.  (2014).  Structural and  functional  analysis  of  the  anti- malarial  drug  target  prolyl-tRNA synthetase.  Journal  of  Structural  and Functional Genomics, 15(4),181–190. Jain, V., Yogavel, M., Oshima, Y., Kikuchi, H.,  Touquet,  B.,  Hakimi,  M.  A.,  & Sharma,  A.  (2015).  Structure  of Prolyl-tRNA Synthetase- Halofuginone Complex Provides
Basis  for  Development  of  Drugs against  Malaria  and  Toxoplasmosis. Structure, 23(5), 819–829.
Jo, S., Kim, T., Iyer, V. G., & Im W. (2008). CHARMM-GUI: A web-based graphical user interface for CHARMM.  Journal  of  Computational Chemistry, 29(11), 1859–1865.
Kikuchi,  H.,  Horoiwa,  S.,  Kasahara,  R.,
Hariguchi,  N.,  Matsumoto,  M.,  & Oshima,  Y.  (2014).  Synthesis  of febrifugine derivatives and development  of  an  effective  and  safe tetrahydroquinazoline-type antimalarial.  European  journal  of medicinal chemistry, 76, 10–19.
Lipinski,  C.  A.,  Lombardo,  F.,  Dominy,  B.
W., & Feeney, P. J. (1997). Experimental and computational approaches  to  estimate  solubility  and permeability  in  drug  discovery  and
development settings. Advanced Drug Delivery Reviews, 23(1-3), 3–25. Liu,  K.,  Watanabe,  E.,  &  Kokubo,  H.
(2017).  Exploring  the  stability  of ligand  binding  modes  to  proteins  by molecular dynamics simulations.
Journal of Computer-Aided Molecular Design, 31(2), 201–211. McLaughlin,  N.,  Evans,  P.  G.,  &  Pines,  M.
(2014).  The  chemistry  and  biology  of febrifugine and halofuginone.
Bioorganic  &  Medicinal  Chemistry,
(7), 1993–2004.
Morris,  G.  M.,  Huey,  R.,  Lindstrom,  W., Sanner, M. F., Belew, R. K., Goodsell, D.  S.,  &  Olson,  A.  J.  (2009). AutoDock4  and  AutoDockTools4: Automated  docking  with  selective receptor flexibility. Journal of
Computational Chemistry, 30(16),
2785–2791.
Pines, M., & Spector, I. (2015). Halofuginone  —  The  Multifaceted Molecule. Molecules, 20(1), 573–594.
Pinzi,  L.,  &  Rastelli,  G.  (2019).  Molecular
Docking:  Shifting  Paradigms  in  Drug Discovery.  International  Journal  of Molecular Sciences, 20(18), 4331.
Rabal,  O.,  Amr  F.  I.,  &  Oyarzabal,  J.
(2015).  Novel  Scaffold  Fingerprint (SFP): Applications in Scaffold
Hopping and Scaffold-Based
Selection  of  Diverse  Compounds. Journal  of  Chemical  Information  and Modeling, 13;55(1), 1–18.
Rubio  Gomez,  M.  A.,  &  Ibba,  M.  (2020).
Aminoacyl-tRNA  synthetases.  RNA, 26(8), 910–936.
Sachs,  J.,  &  Malaney,  P.  (2002).  The economic  and  social  burden  of malaria. Nature, 415(6872), 680–685. Schuffenhauer, A., Schneider, N., Hintermann,  S.,  Auld,  D.,  Blank,  J., Cotesta, S., Engeloch, C., Fechner, N., Gaul,  C.,  Giovannoni,  J.,  Jansen,  J., Joslin,  J.,  Krastel,  P.,  Lounkine,  E., Manchester,  J.,  Monovich,  L.  G., Pelliccioli,  A.  P.,  Schwarze,  M., Shultz,  M.  D.,  (…),  &  Baeschlin,  D. K.  (2020).  Evolution  of  Novartis’ Small  Molecule  Screening  Deck Design. Journal of Medicinal Chemistry, 63(23), 14425–14447.
Taylor,  S.  M.,  &  Juliano,  J.  J.  (2014).
Artemisinin  Combination  Therapies and Malaria Parasite Drug Resistance: The  Game  Is  Afoot.  Journal  of Infectious Diseases, 210(3), 335–337. Vanommeslaeghe,  K.,  Raman,  E.  P.,  & MacKerell,  A.  D.  (2012).  Automation of the CHARMM General Force Field (CGenFF)  II:  Assignment  of  Bonded Parameters and Partial Atomic Charges. Journal of Chemical
Information  and  Modeling,  52(12), 3155–3168.
WHO.  World  malaria  report  2021.  World
Health Organization; 2021.
Yang,  H.,  Sun,  L.,  Wang,  Z.,  Li,  W.,  Liu, G., & Tang, Y. (2018). ADMETopt: A Web Server for ADMET Optimization in Drug Design via Scaffold Hopping. Journal  of  Chemical  Information  and Modeling, 58(10), 2051–2056.
Yuniarta, T. A., Wawo, J. E., & Kesuma, D.
(2022).  MOLECULAR  DOCKING
STUDY OF 1‑(PYRIDIN-4-YL) PYRROLIDINE-2-ONE  DERIVATE AGAINST PROLYL-tRNA SYNTHETASE  IN  PLASMODIUM
FALCIPARUM. Pharmacoscript,
5(2), 157-171.
Yuniarta,  T.  A.,  Sumartha,  I.  G.  A.,  Fakih,
T.  M.,  Handayani,  R.,  &  Ramadhan,
D. S. F. (2023). Discovery of Potential
Prolyl-tRNA  Synthetase  Allosteric Inhibitor  Through  Virtual  Screening and In Vitro Assay against Plasmodium falciparum. Jordan
Journal  of  Pharmaceutical  Sciences,
16(4), 880-900.