UJI IN VITRO ANTIBAKTERI MINYAK ATSIRI KULIT JERUK NIPIS ( Citrus aurantifolia )

## DALAM MENGHAMBAT PERTUMBUHAN BAKTERI Streptococcus agalactiae
Ajeng Shanaz Santya Putri*  , Noorhamdani AS**, Khuznita Dasa Novita***

## Abstrak
Minyak  atsiri  kulit  jeruk  nipis  ( Citrus  aurantifolia )  mempunyai  efek  antibakteri  pada  pertumbuhan Streptococcus  agalactiae melalui  penghancuran  struktur  sel  bakteri.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mem- buktikan kemampuan antibakteri minyak atsiri kulit jeruk nipis dalam mencegah pertumbuhan bakteri Strep- tococcus agalactiae secara in vitro dan mengetahui konsentrasi hambat minimum yang diperlukan. Desain penelitian yang digunakan adalah experimental post test only group menggunakan metode difusi sumuran. Tujuh  konsentrasi  berbeda  dari minyak  atsiri  (0%;  3,125%;  6,25%;  12,5%;  25%;  50%;  100%)  digunakan dalam  penelitian  ini.  Zona  hambat  yang  didapat  kemudian  diukur  menggunakan  jangka  sorong.  Hasil penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  kenaikan  konsentrasi  minyak  atsiri  kulit  jeruk  nipis  berbanding  lurus dengan bertambahnya diameter zona hambat di sekitar sumuran. Nilai konsentrasi hambat minimum (KHM) minyak atsiri kulit jeruk nipis didapat pada konsentrasi 25%. Uji korelasi Spearman menunjukkan korelasi kuat dan signifikan (r = 0,799, p = 0,000), dan uji komparasi Kruskall Wallis menunjukkan adanya perbe- daan yang signifikan antar rerata tiap kelompok (p = 0,000). Dari percobaan ini, bisa disimpulkan apabila minyak atsiri kulit jeruk nipis dapat mencegah pertumbuhan Streptococcus agalactiae secara in vitro pada konsentrasi 25%.
Kata kunci: kulit jeruk, minyak atsiri, Streptococcus agalactiae
IN VITRO ANTIBACTERIAL ASSAY OF LIME ( Citrus aurantifolia ) PEEL ESSENTIAL OIL IN INHIBITING Streptococcus agalactiae GROWTH

## Abstract
Essential oil of lime peel ( Citrus aurantifolia ) has antibacterial effect against Streptococcus agalactiae by destroying the bacterial cell structure. The objective of this research was to prove the antibacterial activity of the essential oil of lime peel against the growth of Streptococcus agalactiae bacteria in vitro and to deter- mine  the  required  minimum  inhibitory  concentration.The  research  design  used  was  an  experimental  post test only group with the well diffusion method. This study used d i fferent concentrations of essential oil (0%; 3.125%; 6.25%; 12.5%; 25%; 50%; 100%). The inhibition zone was then measured using a Vernier scale. Results showed that the increase of concentration of essential oil of lime peel was directly proportional to the increase of the inhibition zone diameter around the well. The minimum inhibitory concentration (KHM) of essential oil of lime peel was 25%. Spearman’s correlation test showed a strong and significant correlation (r  =  0.799, p = 0.000), and the Kruskall Wallis comparison test showed a significant difference between the means of each group (p = 0.000). It can be concluded that lime peel essential oil can inhibit the growth of Streptococcus agalactiae in vitro at a concentration of 25%.
Keywords: essential oils, lime peel, Streptococcus agalactiae
* Jurusan Pendidikan Dokter, Fakultas Kedokteran, Universitas Brawijaya ** Departemen Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Brawijaya *** Departemen Kedokteran Keluarga, Fakultas Kedokteran, Universitas Brawijaya
 E-mail: ajengshanaz@student.ub.ac.id

## Pendahuluan
Streptococcus  agalactiae atau Streptokokus  Grup  B  (SGB)  adalah  patogen penting  dalam  tubuh  manusia  yang berkolonisasi  di  traktus  urogenital  dan gastrointestinal  bagian  bawah  dari  40% wanita  sehat  berusia  produktif,  sehingga dapat  menimbulkan  sepsis  serta  meningitis pada neonatus. Sepsis adalah salah satu kon- disi yang dapat mengancam nyawa bayi. Pa- da  tahun  2015,  berdasarkan  data  dari  26 negara menunjukkan prevalensi global sepsis pada  unit  perawatan  intensif  anak  sebesar 8,2%.  Disebutkan  juga  bahwa  rata-rata  usia sepsis  tiga  tahun  dengan  infeksi  terbanyak terdapat pada sistem respirasi (40%).          Di Indonesia sendiri angka kejadian sepsis neo- natorum  dilaporkan  sebesar  8,7%  hingga 30,29% dengan angka kematian 11,56% hing- ga 40,9%. 1 Selain itu, Streptococcus agalactiae juga dapat  menginfeksi  orang  tua  dan  pasien dewasa dengan masalah imun. Seperti bakteri gram positif lainnya, Streptococcus agalactiae dapat membentuk struktur tiga dimensi seperti biofilm  yang  dapat  meningkatkan kemampuannya  untuk  berkolonisasi  dan bertahan hidup. 2
Jeruk  adalah  salah  satu  herbal  paling efektif  dalam  obat  tradisional  yang  tergolong dalam genus Citrus dan famili Rutaceae.  Ge- nus Citrus atau  jeruk  adalah  genus  asli  area tropis dan subtropis di Asia. Anggota genus ini dikenal  memiliki  banyak  metabolit  sekunder yang  aktif  secara  biologis  seperti  flavonoid, limonoid,  furamin  dan  furanokumarin,  sterol, minyak  atsiri,  asam  organik,  serta  alkaloid. Banyak  spesies  jeruk  diakui  karena  aktivitas fisiologi dan farmakologi meliputi aktivitas anti- mikroba, antioksidan, antikanker, antiinflamasi, serta aktivitas hipo-glikemik. 3
Berdasarkan  kandungannya,  jeruk  nipis ( Citrus  aurantifolia )  terutama  minyak  atsiri yang  dapat  diambil  dari  kulitnya  berpotensi untuk  menjadi  antibakteri.  Walaupun  telah
banyak  penelitian  yang  menguji  efek  minyak atsiri jeruk nipis, sangat sedikit penelitian yang menggunakan  minyak  atsiri  dari  bagian  kulit- nya.  Selain  itu,  masih  belum  ada  penelitian yang  menguji  kemampuan  anti-bakteri  milik minyak  atsiri  kulit  jeruk  nipis  secara  spesifik terhadap  bakteri Strepto-coccus  agalactiae serta  konsentrasi  hambat  minimum  yang  di- perlukan.  Kulit  jeruk  nipis  seringkali  menjadi limbah  yang  dibuang,  namun  masih  ada manfaat  dari  kulit  jeruk  nipis  ini.  Oleh  karena itu, peneliti ingin mengetahui kemampuan anti- bakteri  minyak  atsiri  kulit  jeruk  nipis  dalam mencegah pertumbuhan bakteri Streptococcus agalactiae secara in vitro .

## Bahan dan Metode
Desain dan Metode Penelitian Dalam  penelitian  ini  digunakan rancangan  penelitian  eksperimental  labora- toris  dengan  desain  penelitian post-test  only control  group  design serta  memakai  metode difusi  sumuran (well  diffusion  test) guna melihat efektivitas minyak atsiri kulit jeruk nipis sebagai  antibakteri  terhadap Streptococcus agalactiae secara in  vitro .  Metode  yang digunakan dalam penelitian ini dilakukan untuk menentukan  kadar  hambat  minimal  (KHM) berdasarkan  area  hambat  yang  terbentuk  di sekitar  sumuran.  Variabel  bebas  dalam penelitian ini adalah konsentrasi minyak atsiri kulit jeruk  mulai dari 0%, 125%, 6,25%, 12,5 %, 25%, 50%, 100%.

## Isolat Bakteri Streptococcus agalactiae
Sampel bakteri Streptococcus agalactiae diambil  dari  stok  kultur  milik  Rumah  Sakit Umum Daerah Dr. Saiful Anwar  Malang.

## Identifikasi Bakteri Streptococcus agalactiae Pewarnaan Gram
Dilakukan  dengan  mengambil  koloni Streptococcus  agalactiae dengan  ose  dari nutrient agar ke object glass yang sebelumnya telah diberi tanda lingkaran.
Kemudian menunggu sediaan sampai kering, dan difiksasi di atas api bunsen , dan diayun- kan sebanyak 3-5 kali. Setelah itu, diteteskan larutan  kristal  violet,  larutan  lugol,  larutan alkohol  96%,serta  larutan  safranin.  Setelah kering,  diamati  di  bawah  mikroskop menggunakan perbesaran lensa objektif 100x dengan minyak imersi. 5

## Uji Katalase
Suspensi  bakteri  yang  diduga  koloni Streptococcus agalactiae diambil dengan ose steril  lalu  diusapkan  ke object  glass. Setelah itu, diteteskan hidrogen peroksida 3% di atas preparat  dan  diamati  pembentukan  buih/ gelembung.  Katalase  positif  ditunjukkan dengan terbentuknya gelembung. 6
Uji VITEK ® 2 Vitek  merupakan  metode  uji  bakteri terbaru  yang  memiliki  3  tahap  pemeriksaan, yaitu  persiapan  serta  pembakuan  atau standarisasi  kekeruhan  inokulum,  kemudian memasukkan  data  dengan  sistem barcode , dan  memasukkan  kartu  ke  dalam  alat. Kemudian  semua  tahapan  mulai  dari  inoku- lasi, inkubasi, pembacaan, validasi, dan inter- pretasi  hasil  akan  dilakukan  secara  otomatis oleh  alat.  Hasil  pemeriksaan  bisa  berupa rekam  cetak  ( print-out )  otomatis,  sedangkan kartu identification / antimicroba  sensitivity  test (ID/AST)  oleh  sistem  akan  secara  otomatis akan  dibuang  ke  tempat  sampah.  Hasil pemeriksaan ini juga bisa langsung terhubung dengan Laboratory Information System (LIS). 7

## Uji Hemolisis
Pengujian terhadap patogenisitas Strep-
tococcus  agalactiae dilakukan  pada blood agar  plate (BAP).  Koloni Streptococcus  aga- lactiae diambil  dengan  metode  gores menggunakan ose dan ditanam di media yang telah disediakan, kemudian diinkubasi selama
24-48  jam. Streptococcus  agalactiae ditandai dengan  kemampuan  melisiskan  sel  darah
merah  yang  dapat  dilihat  dengan  ter- bentuknya zona bening di sekitar koloni pada media BAP . 8

## Penyulingan Minyak Atsiri Kulit Jeruk Nipis
Kulit  jeruk  nipis  diperoleh  dari  Simplisia Medika  Batu  dan  kemudian  dilakukan penyulingan minyak atsiri di Institut Atsiri Uni- versitas  Brawijaya.  Minyak  atsiri  kulit  jeruk nipis  yang  digunakan  dibuat  dari  kulit  jeruk nipis    sebanyak  1,140  kilogram.  Kulit  jeruk nipis  yang  telah  dipisahkan  dari  isinya, kemudian  dipotong  kecil-kecil,  dicuci,  dan diangin-anginkan.  Kemudian  dilakukan penimbangan  ulang  untuk  mengetahui persentase  rendemen  dari  minyak  yang dihasilkan. Setelah itu, dilakukan destilasi uap selama 6 jam pada suhu 98 °C. Cairan yang keluar  dari  kondensor  didiamkan  selama  24 jam  untuk  memisahkan  minyak  dan  air. Lapisan air dibuang dan lapisan minyak atsiri diambil  lalu  ditambahkan  dengan  Na 2 SO 4 untuk  menyerap  akuades  yang  masih  ter- dapat  dalam  minyak  atsiri.  Kemudian  diten- tukan persentase rendemen dan massa jenis minyak  serta  minyak  atsiri  dianalisis  dengan metode GC-MS. 4

## Uji Aktivitas Antibakteri Minyak Atsiri
Uji  aktivitas  antibakteri  menggunakan Brain  Heart  Infusion  Agar (BHIA)  yang  su- dah padat, lalu dibuat lubang menggunakan blue tip sebanyak 7 lubang. Pada penelitian ini  dgunakan  7  konsentrasi  yaitu  0%; 3,125%;  6,25%;  12,5%;  25%;  50%;  dan 100%  serta  dilakukan  pengulangan sebanyak  4  kali.  Konsentrasi  minyak  atsiri 0%  adalah  kelompok  kontrol  bakteri  yang diberikan  larutan  NaCl  tanpa  minyak  atsiri. Masing-masing  konsentrasi  ini  dimasukkan ke  dalam  lubang  yang  berbeda.  Lalu  dil- akukan  inkubasi  di  suhu  37  °C  selama  18 hingga 24 jam untuk kemudian diukur diam- eter  area  hambat  yang  terbentuk  di  sekitar sumuran. 9

## Hasil
Hasil Identifikasi Bakteri Hasil  pengamatan  mikroskop  me- nunjukkan  bentukan  bulat  tersusun  seperti rantai berwarna ungu yang menunjukkan bah- wa  bakteri  merupakan Streptococcus Gram positif seperti yang terlihat pada Gambar 2a.
Gambar 2a. Bakteri Streptococcus agalactiae merupakan Streptococcus Gram positif Keterangan:  1.  Bakteri  berbentuk  kokus  (bulat) yang tersusun seperti strepto (rantai)

## Uji Katalase
Setelah ditetesi hidrogen peroksida 3%, tidak timbul gelembung, maka dapat disimpul- kan  bakteri  bersifat  katalase  negatif  yang ditunjukkan pada Gambar 2b.
Gambar 2b. Uji katalase menunjukkan tidak terbentuk gelembung yang menandakan katalase  negatif (tanda panah)

## Uji Hemolisis
Uji  hemolisis Streptococcus  agalactiae pada  BAP  yang  diinkubasi  di  suhu  37  °C selama 18 hingga 24 jam menunjukkan area beta hemolytic seperti pada Gambar 2c.
Uji VITEK ® 2 Uji  Vitek  pada  Gambar  2  menunjukkan
bahwa  bakteri  adalah Streptococcus  agalac- tiae.
Gambar 2c. Terlihat zona bening di sekitar koloni bakteri yang mendekati warna dasar, menunjukkan beta-hemolisis (tanda panah)
Gambar 2d. Hasil uji VITEK ® 2
Uji  Aktivitas  Antibakteri  Minyak  Atsiri  Kulit

## Jeruk Nipis
Hasil  uji  menunjukkan  bahwa  minyak atsiri kulit jeruk nipis sensitif pada konsentrasi 25%  dalam  mencegah  pertumbuhan  bakteri Streptococcus  agalactiae .  Hasil  pengamatan dan  pengukuran  diameter  zona  hambat ditunjukkan pada Gambar 2 dan Tabel 1.

## Analisis Data
Uji  normalitas  menggunakan  Kolmogo- rov-Smirnov menunjukkan bahwa data terdis- tribusi normal (p  > 0,05).  Kemudian dilaku- kan uji homogenitas Levene yang menunjuk- kan bahwa data tidak bervariasi homogen (p <  0,05).  Analisis  data  dilanjutkan  dengan  uji post hoc metode Mann-Whitney untuk melihat signifikansi  setiap  kelompok  data  terhadap kelompok lainnya  (Tabel 2). Uji korelasi rank Spearman mendapatkan nilai p = 0,000 yang bermakna  adanya  hubungan  yang  signifikan antara  konsentrasi  minyak  atsiri  dengan diameter  zona  hambat  yang  terbentuk, dengan nilai korelasi (r) = 0,799.
Berikutnya  adalah  uji  regresi  linear, didapatkan nilai a = 1,108 b = 0,263 dan nilai R  square yang  didapatkan  adalah  sebesar 0,714.
Gambar 3. Aktivitas antibakteri minyak atsiri kulit jeruk nipis pada pertumbuhan Streptococcus agalactiae
Keterangan: 1. Minyak atsiri kulit jeruk nipis konsentrasi 0%, 2. konsentrasi 3,125%, 3. konsentrasi 6,25%, 4. Konsentrasi 12,5%, 5. Konsentrasi 25%, 6. Konsentrasi 50%, 7. Konsentrasi 100%

## Tabel 1. Hasil pengukuran diameter zona hambat minyak atsiri kulit jeruk nipis pada pertumbuhan Streptococcus agalactiae
Perlakuan Diameter Zona Hambat (mm) I II III IV Minyak atsiri 0% (Kontrol -) 0 0 0 0 Minyak atsiri 3,125% 0 0 0 0 Minyak atsiri 6,25% 0 0 0 0 Minyak atsiri 12,50% 0 0 0 0 Minyak atsiri 25,00% 11 17 22 10 Minyak atsiri 50,00% 25 19 24 21 Minyak atsiri 100,00% 28 21 18 22 Tabel 2.  Hasil uji Mann-Whitney Konsentrasi 0% 3,125% 6,25% 12,5% 25% 50% 100% 0% - - - + + + 3,125% - - - + + + 6,25% - - - + + + 12,5% - - - + + + 25% + + + + + + 50% + + + + + - 100% + + + + + -
Keterangan: Sig (+) = p < 0,05,  (-), p > 0,05

## Pembahasan
Pada  penelitian  ini  didapatkan  bahwa minyak atsiri kulit jeruk nipis konsentrasi 25% mampu  menghambat  pertumbuhan  bakteri Streptococcus  agalactiae yang  bersifat  kuat melalui  pengamatan  pada  diameter  zona hambat (>20-30 mm). 10 Penelitian yang dilaku- kan oleh Safitri et al . (2017) juga menunjukkan bahwa bakteri Streptococcus agalactiae dapat dihambat menggunakan ekstrak buah mahko- ta  buah  ( Phaleria  macrocarpa L.)  pada  kon- sentrasi  50%  menghasilkan  diameter  zona hambat  sebesar  10  mm. 11 Selain  itu, penelitian yang dilakukan oleh Vajriana (2013) membuktikan  bahwa  minyak  atsiri  kulit  jeruk nipis  mampu  mencegah  tumbuhnya  bakteri Staphylo-coccus  aureus pada  konsentrasi 30%. 12 Namun, hasil penelitian oleh Ly (2017) menunjukkan  bahwa  minyak  atsiri  kulit  jeruk nipis  mampu  mencegah  tumbuhnya  bakteri Streptococcus  pyogenes pada  konsentrasi 25%  dengan  diameter  zona  hambat  sebesar 8,4 mm. 13 Berbeda dengan hasil penelitian ini yang  menunjukkan  rata-rata  diameter  zona hambat  sebesar  15  mm  pada  konsentrasi 25%,  maka  pada    penelitian  yang  dilakukan Yuwanda  (2014)  menunjukkan  hasil  konsen- trasi bunuh minimum (KBM) pada konsentrasi minyak  atsiri  kulit  jeruk  nipis 0,3%  pada  bak- teri Streptococcus mutans . 14
Minyak  atsiri  kulit  jeruk  nipis  dapat menghambat  pertumbuhan  bakteri  karena  di dalam  minyak  atsiri  terdapat  kandungan senyawa  hidrokarbon  teroksigenasi  (fenol) yang bersifat hidrofobik  dan dapat membelah lapisan lemak pada membran sel bakteri dan mitokondria  yang  membuat  sel  rusak.  Hal  ini kemudian  membuat  kebocoran  luas  dari  sel bakteri  yang  berujung  pada  kematian  sel. 15
Terdapat  beberapa  keterbatasan  dalam penelitian  ini,  di  antaranya  belum  diteliti pengaruh  waktu  penyimpanan  terhadap  kan- dungan minyak atsiri serta potensi zat      ak- tifnya dalam mencegah pertumbuhan bakteri.

## Kesimpulan
Dari hasil penelitian disimpulkan bahwa minyak  atsiri  kulit  jeruk  nipis  dapat mencegah tumbuhnya bakteri Streptococcus agalactiae dengan konsentrasi hambat mini- mum (KHM) 25% dengan rata-rata diameter zona  hambat  yang  tergolong  kuat  (>20-30 mm).

## Daftar Pustaka
1.  Wulandari  A,  Martuti  S,  Kaswadi  P. Perkembangan  Diagnosis  Sepsis  pada Anak. Sari  Pediatr. 2018;  19(4):237. Mi- crobiol. 2015; 5(FEB):2013 – 6.
2.  Rosini  R,  Margarit  I.  Biofilm  Formation by Streptococcus  agalactiae :  Influence of  Environmental  Conditions  and  Impli- cated Virulence Factor. Front Cell Infect Microbiol. 2015; 5(FEB):2013 – 6.
3.  Saeb  S,  Amin  M,  Seyfi  Gooybari  R, Aghel  N.  Evaluation  of  Antibacterial  Ac- tivities  of  Citrus  limon, Citrus  reticulata , and Citrus  grandis Against  Pathogenic Bacteria. Int  J  Enteric  Pathog. 2016;  4
( 4 ) : 1 1 – 5 .   D O I :   h t t p : / /
dx.doi.org/10.15171/ijep.2016.13.
4.  Wibaldus,  Jayuska  A,  Ardiningsih  P. Biokativitas  Minyak  Atsiri  Kulit  Buah Je- ruk  Nipis  ( Citrus  aurantifolia )  terhadap Rayap  Tanah  ( Coptotermes sp.). J  Kim Khatulistiwa . 2016; 5(1):44 – 51.
5.  Noorhamdani,  Dzen  S,  Winarsih  S, Roekistiningsih  S,  Sumarno  I. Bakte- riologi  Medik .  Malang:  International  Re- search  and  Development  for  Human Beings. 2003. P. 108 – 109.
6.  Hayati  LN,  Tyasningsih  W,  Praja  RN,
Chusniati  S,  Yunita  MN,  Wibawati  PA. Isolasi  dan  Identifikasi Staphylococcus aureus pada  Susu  Kambing  Peranakan Etawah  Penderita  Mastitis  Subklinis  di Kelurahan Kalipuro, Banyuwangi. J Med Vet . 2019; 2(2):76.
7.  Prihartini,  Aryati,  Hetty.  Identifikasi  Ce- pat  Mikroorganisme  Menggunakan  Alat VITEK-2. Indones  J  Clin  Pathol  Med
Lab . 2018; 13(3):129.
8.  Sukmadewi DKT, Anas I, Widyastuti R,
Cintaresmini A. Uji Fitopatogenitas, He- molisis serta Kemampuan Mikrob dalam Melarutkan  Fosfat  dan  Kalium. J  Ilmu Tanah dan Ling . 2017; 19(2):68 – 73. 9.  Särndal  CE,  Swensson  B,  Wretman  J. Model  Assisted  Survey  Sampling . Springer  Science  &  Business  Media. 2003.
10.  Morales G, Sierra P, Mancilla, Parades
A,  Loyola  LA,  Gallardo  O,  Borquez  J. Secondary  Metabolites  from  Four  Me- dicinal  Plants  from  Northern Chile, Antimicrobial Activity, and Biotoxi- city  against Artemia  salina . Journal  Chile  Chem .  2003;  48:13-18.
D O I : 1 0 . 4 0 6 7 / S 0 7 1 7 - 97072003000200002.
11.  Safitri  L,  Susilorini  T,  Surjowardojo  P.
Evaluasi  Aktivitas  Antimikroba ( S t r e p t o c o c c u s   a g a l a c t i a e )
Menggunakan  Exstrak  Buah  Mahkota Buah  ( Phaleria  macrocarpa L.)  dengan
Pelarut  yang  Berbeda. J  Ilmu  dan Teknol Has Ternak . 2017; 12(1):8 – 15.
12.  Vajriana  E.  Aktivitas  Antibakteri  Minyak
Atsiri  Kulit  Buah  Jeruk  Nipis  ( Citrus aurantifolia )  terhadap  Isolat Staphylo- coccus aureus Secara In Vitro . (Skripsi). Aceh: Fakultas Kedokteran,  Universitas Syiah Kuala. 2013. 13.  Ly WM. Uji Aktivitas Antibakteri Minyak Atsiri Kulit Buah Jeruk Nipis ( Citrus au- rantifolia  Swingle )  terhadap Streptococ- cus  pyogenes .  (Skripsi).  Surabaya: Fakultas  Kedokteran,  Universitas Katolik Widya Mandala. 2017.
14.  Yuwanda  R.  Pengaruh  Minyak  Atsiri Kulit  Jeruk  Nipis  ( Citrus  aurantifolia ) terhadap  Pertumbuhan  Bakteri Strepto- coccus  mutans .  (Skripsi).  Malang: Fakultas  Kedokteran  Gigi,  Universitas Brawijaya. 2014.
15. Pratiwi  D,  Suswati  I,  Abdullah  M.  Efek Antibakteri  Ekstrak  Kulit  Jeruk  Nipis ( Citrus aurantifolia ) terhadap Salmonella Typhi Secara In  Vitro . Saintika  Medika: Jurnal  Ilmu  Kesehatan  dan  Kedokteran Keluarga . 2013; 9 (2):110-115.