Vol. 7 No.2 Desember 2020: hal.53-58

## ISOLATION OF Salmonella typhoid 16s rRNA GENE FRAGMENT BASED ON POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
Salman Farisi*, Wawan A. Setiawan, Suratman
Jurusan Biologi FMIPA Universitas Lampung Jl. Prof. Dr. Soemantri Brodjonegoro No. 1 Bandar Lampung 35145 e-mail: alfarisi.mdr@gmail.com

## ABSTRACT
This study is a further step for the development of a diagnosis of typhoid fever. Through previous research, it was found that typhoid Salmonella bacteria isolates from a sample of patients indicated typhoid fever in Bandar Lampung. Local typhoid Salmonella DNA has been isolated. The maximum quality and quantity of DNA were obtained by adding 3% Polyvinylpyrrolidone (PVP). The next step of DNA analysis becomes easier because the optimal method of isolating typhoid Salmonella DNA has been known. However, for the accuracy of the development of PCR-based molecular markers, species-specific information from the Salmonella typhoid bacterial isolate is required to be used as a  template.  Information  on  the  specific  species  of  typhoid  Salmonella  can  be  determined  by performing  PCR  using  16s  rRNA  fragments.  The  highly  conserved  nature  of  rRNA  makes  it possible  to  synthesize  universal  primers  for  PCR  processes  capable  of  attaching  to  conserved sequences  of  the  rRNA  genes  of  the  three  phylogenic  domains:  Archaea,  Bacteria  and  Eukarya. PCR is a technique used to amplify nucleic acid sequences using repeated polymerization of DNA sequences. The  simplicity  and  high success  rate  of  amplification  of the DNA  sequences  obtained have  made  this  technique  more  widely  used.  In  carrying  out  PCR,  the  DNA  extract,  DNA polymerase  enzyme,  and  primer  are  reacted  in  a  suitable  buffer  solution.  The  PCR  reaction  is carried  out  with  the  help  of  a  thermocycle  device.  Through  this  research,  a  single  band  of  local typhoid  Salmonella  genomic  DNA  amplification  was  obtained  through  PCR  using  16s  rRNA primers. It is known that the amplicon size is in the range of 1400 bp.
Keywords: Amplicon, DNA genom, Fragmen 16s rRNA, Local tyroid Salmonella, PCR

## PENDAHULUAN
Demam tifoid atau demam enterika disebabkan oleh bakteri golongan Salmonella Typhoidal
serotip Salmonella typhi,
Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B,  dan  Salmonella  paratyphi  C.  Salmonella merupakan  bakteri  berbentuk  batang,  gram negatif, tidak membentuk spora, tidak berkapsul,  dan  bersifat  motil  (Sanderson, 2015).  Menurut  World  Health  Organization (WHO) 2004, sebanyak 21 juta kasus demam tifoid mencapai angka kematian 216.000 jiwa tiap  tahunnya  (Zhou  dan  Pollard,  2012).  Di Indonesia,  rata-rata  terdapat  900.000  kasus per tahun dengan kematian sebanyak 20.000 per  tahun  (WHO,  2003).  Rahmajati  (2011) mengemukakan  bahwa  angka  kematian
demam tifoid yang masih tinggi salah satunya disebabkan oleh diagnosis yang kurang cepat dan akurat.
Sampai  saat  ini,  metode  standar  diagnosis demam  tifoid  yang  direkomendasikan  oleh Kementrian  Kesehatan  Republik  Indonesia adalah  melalui  uji  WIDAL.  Uji  WIDAL merupakan  suatu  metode  serologi  baku  dan digunakan  sejak  tahun  1896.  Prinsip  uji WIDAL  adalah  memeriksa  reaksi  antara antibodi  aglutinin  dalam  serum  penderita yang telah mengalami pengenceran berbeda- beda  terhadap  antigen  somatik  (O)  dan flagela  (H)  yang  ditambahkan  dalam  jumlah yang  sama  sehingga  terjadi  aglutinasi. Menurut Eriksson E. dan Aspan A. (2007), uji WIDAL  ini  masih  menimbulkan  bias  yaitu
adanya  hasil  negatif  palsu  (false  negatif) sehingga bisa menimbulkan kesalahan dalam penanganannya yang bisa berakibat kematian pasien. Pemeriksaan serologi menggunakan  Widal  test  memiliki  nilai akurasi  38.8%  sensitivitas  16.7%,  dan spesivitas  73.7%  (Rahmajati,  2011).    Selain tes  Widal,  untuk  menegakkan  diagnosis demam  tifoid  dapat  menggunakan  rapid  test. Rapid  test  memiliki  nilai  sensitivitas  dan spesifisitas  yang  lebih  tinggi  dibandingkan dengan  Widal  test  dengan  nilai  sensitivitas sebesar 72,7% dan spesifitas 65,9% (Loman, 2012).  Persentasi  tersebut  menunjukan  perlu adanya  uji  penunjang  yang  lebih  cepat, spesifik,  dan  sensitif.  Keakuratan  dalam mendiagnosa  penyakit  demam  tifoid  ini menjadi hal yang mutlak.
Di sisi lain, perkembangan diagnosa molekuler berbasis Polymerase Chain Reaction  (PCR)  bagi  patogen  Salmonella penyebab demam tifoid telah banyak dilakukan  (Eriksson  E.  dan  Aspan  A.  2007; Khan  et.  al.  2012;  Zhou  dan  Pollard.  2012). Kualitas  maupun  kuantitas  DNA  templat merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan
PCR.
Melalui penelitian sebelumnya  telah  didapatkan  isolat  bakteri Salmonella tifoid dari sampel pasien terindikasi  demam  tifoid  di  Bandar  Lampung. DNA Salmonella tifoid telah berhasil diisolasi. Kualitas  dan  kuantitas  DNA  maksimum didapatkan melalui penambahan Polyvinylpyrrolidone  (PVP)  sebanyak  3% (Setiawan  dan  Ekowati,  2015).    Ini  berarti langkah  analisis  DNA  selanjutnya  menjadi lebih  mudah  karena  metode  optimal  isolasi DNA  Salmonella      tifoid      telah      diketahui. Namun, untuk   keakuratan   pengembangan marka  molekuler  berbasis  PCR,  diperlukan informasi  spesies  spesifik  dari  isolat  bakteri Salmonella  tifoid  yang  akan  digunakan sebagai  templat.  Informasi  spesies  spesifik Salmonella  tifoid  tersebut  dapat  diketahui dengan melakukan PCR menggunakan fragmen 16s rDNA.

## METODE
Penelitian  ini  dilakukan  di  laboratorium Zoologi  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu
Pengetahuan  Alam  Universitas  Lampung pada Juli - Agustus 2016.
Alat-alat  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini meliputi  thermocycler,  laminar  air  flow cabinet,  autoclave,  freezer,  kulkas,  tabung reaksi  dan  sumbat,  cawan  petri,  neraca analitik,  inkubator,  alat  elektroforesis  DNA, alat spin, mikropipet 1000 μL, mikropipet 200 μL,  mikropipet  20  μL,  erlemeyer,  botol akuades, bunsen, dan gelas ukur.
Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah  akuades  steril,  ddH 2 O  steril,  ekstrak DNA  Salmonella  tifoid,  agarose,  ethidium bromide  TAE  1x,  loading  dye,  marker  PCR 100  pb,  mikrotube  1,5  ml,  mikrotip  1000  μL, mikrotip 100 μL, mikrotip 20 μL, plastic wrap, alkohol 70%, etanol 95%, dan spirtus.
Primer yang digunakan adalah primer universal  untuk  domain  bakteri  berupa forward  primer 63f  (5’-CAG  GCC  TAA  CAC ATG  CAA  GTC- 3’)  dan reverse  primer  1387r (5’-GGG  CGG  WGT  GTA  CAA  GGC-3’) (Marchesi  et  al.  1998).  Semua  komponen reaksi  dicampur  ke  dalam  microtube  dan dimasukkan  ke  dalam  mesin  PCR.  Tahapan PCR  terdiri  dari  pre-  denaturasi  94 o C,  2 menit; tahap denaturasi 92 o C, 30 detik; tahap annealing  55 o C,  30  detik,  tahap  elongasi 72 o C selama 1 menit. Proses PCR terdiri dari 30  siklus.  Selanjutnya  post  PCR  pada  suhu 75 o C  selama  20  menit  dan  tahap  stop  PCR pada  suhu  4 o C.  Hasil  PCR  disimpan  pada suhu -20 o C atau langsung dielektroforesis.
Hasil  PCR,  kontrol  positif  berupa  marker 100bp, dan kontrol negatif ddH20 dielektroforesis.  Gel  elektroforesis  disiapkan dengan 0,8 % agarose dalam  1x buffer TAE (0,24  gr  agarose  dalam  30  ml  1xTAE)  (50x tris-asetat  EDTA  (TAE):1  l  dH20,  242  gr Trisbasa,  37,2  gr  Na2EDTA,  57,  1  ml  asam asetat  glasial),  dipanaskan  dan  setelah  larut didinginkan sampai
50 o C  kemudian  dituang  pada  cetakan  gel. Wadah yang sudah berisi gel diberi buffer 1x TAE  secukupnya  kemudian  memasukkan sampel  hasil  digesti  pada  sumur-sumur  gel. Sampel hasil PCR, kontrol positif, dan kontrol negatif  masing- masing  sebanyak  10  μl dicampur  dengan  1  μl  loading  dye  lalu dimasukkan ke dalam sumur gel.
Elektroforesis  dilakukan  pada  tegangan    100
Volt    selama    28    menit.    Gel    lalu dipindahkan    ke    dalam    larutan    ethidium bromide  (EtBr)  0,5  mg/l  selama  5  menit  dan selanjutnya  visualisasi  pita  DNA  diamati  di atas
UV setelah sebelumnya dicuci dengan dH2O. Setelah didapatkan pita DNA, amplikon PCR yang  didapat  bisa  dijadikan  templat  untuk sekuensing  dengan  metode  Sanger.  Hasil PCR yang baik ditunjukkan dengan didapatnya  pita  DNA  yang  bersih  tanpa adanya smear.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Amplifikasi  gen  16S-rRNA  dengan  PCR
Primer yang digunakan adalah primer universal untuk domain bakteri berupa forward  primer  63f  (5’-CAG  GCC  TAA  CAC ATG  CAA  GTC- 3’)  dan reverse  primer  1387r (5’-GGG  CGG  WGT  GTA  CAA  GGC-3’) (Marchesi et al. 1998).
Untuk  masing-masing  tube  PCR,  dilakukan mix:
Nama Bahan Volume
(µl) ddH2O                                     7 Template DNA                        2 Master Mix PCR                   10 Primer Forward                       0,5 Primer Reverse                        0,5 Setting alat PCR: Tahapan PCR Suhu ( 0 C ) Waktu (menit) Pradenaturasi (pra PCR) 95 5 Denaturasi 94 0,5 Annealing 50 1 Extensi 72 2 Extensi akhir 72 5 Pendinginan 20 10

## Elektroforesis Hasil PCR
Hasil PCR, kontrol positif berupa marker 1 kb dari  fermentas,  dan  kontrol  negatif  ddH 2 O dielektroforesis.  Gel  elektroforesis  disiapkan dengan  1  %  agarose  dalam      1x  buffer  TAE (0,  4  gr  agarose  dalam  40  ml  1xTAE)  (50x tris-asetat  EDTA  (TAE):1  l  dH20,  242  gr Trisbasa,  37,2  gr  Na2EDTA,  57,1  ml  asam asetat  glasial),  dipanaskan  dan  setelah  larut
ditambahkan gelred sebanyak 0,4 μl. Larutan didinginkan  sampai  50oC  kemudian  dituang pada  cetakan  gel.  Wadah  yang  sudah  berisi gel  diberi  buffer  1x  TAE  secukupnya kemudian  dimasukkan  sampel  hasil  digesti pada  sumur-sumur  gel.  Sampel  hasil  PCR, kontrol  positif,  dan  kontrol  negatif  masing- masing sebanyak 10 μl dicampur dengan 1 μl loading dye lalu dimasukkan ke dalam sumur gel.  Elektroforesis  dilakukan  pada  tegangan 100  Volt  selama  28  menit.  Visualisasi  pita DNA  diamati  di  atas  UV.  Setelah  didapatkan pita  DNA,  amplikon  PCR  yang  didapat  bisa dijadikan  templat  untuk  sekuensing  dengan metode Sanger.
Hasil elektroforesis ditunjukkan pada gambar
berikut:
Gambar 1.  Visualisasi hasil PCR dengan
Elektroforesis. Ket: M = Marker
1kb;
- = kontrol negatif; S = sampel
Melalui visualisasi hasil PCR dengan elektroforesis tersebut diketahui bahwa dihasilkan  pita  tunggal  hasil  PCR  dengan primer    16s-rRNA.    Menurut  Marchesi  et  al. (1998)  mendesain  dan  mengevaluasi  primer 63f  dan  1387r  untuk  amplifikasi  gen  16S- rRNA  dari  domain  bakteri.  Pasangan  primer ini  mampu  mengamplifikasi  gen  16S-rRNA dengan ukuran sekitar 1400 pasang basa.  Ini menandakan    bahwa    hasil    amplifikasi tersebut    dapat    dilanjutkan  untuk  dilakukan sekuensing.
KESIMPULAN
± 1400p b
pb
Melalui penelitian ini disimpulkan bahwa DNA Salmonella  tifoid  sampel  teramplifikasi  pada PCR  menggunakan  primer  16s-rRNA.  Hasil ini selanjutnya bisa digunakan untuk
dilakukan sekuensing dengan metode
Sanger.

## DAFTAR PUSTAKA
Alberts    B,  Johnson    A,  Lewis  J,  Raff  M, Roberts K, Walter P.  2002.  Molecular Biology  of  the  Cell.  Fourth  Edition.  Garland Science: New York.
Bauman  RW.  2012.  Microbiology  With Diseases By Body System 3rd Edition. Benjamin Cummings. San Francisco.
Case RJ, Boucher Y, Dahllöf I, Holmström C, Doolittle WF, Kjelleberg S.  2007. "Use of  16S  rRNA  and  rpoB  genes  as molecular markers for microbial
ecology studies". Appl. Environ.
Microbiol. 73 (1), 278 –88.
Drancourt  M,  C  Bollet,  A  Carlioz,  R  Martelin, JP  Gayral,  D  Raoult.  2000.  16s Ribosomal DNA Sequence Analysis of a  Large  Collection  of  Environmental and  Clinical  Unidentifiable  Bacterial Isolates.  J.  Clin.  Microbiol.  38:3623-
3630.
Eriksson  E,  Aspan  A.  2007.  Comparison  of culture,  ELISA  and  PCR  techniques for  salmonella  detection  in  faecal samples  for  cattle,  pig  and  poultry. BMC Veterinary Research. 3:21
doi:10.1186/1746-6148-3-21.
Kayser  FH,  Bienz  KA,  Eckert  J,  Zinkernegel RM.  2004.  Medical  Microbiology. Thieme. New York.
Khan  S,  Harish  BN,  Menezes  GA,  Acharya NS,  dan  Parija  SC.  2012.  Early
diagnosis  of  typhoid  fever  by  nested PCR  for  flagellin  gene  of  Salmonella enterica  serotype Typhi.  Indian  J  Med Res.  136:850-854.Sanderson,  K.  E., Shu-Lin  L.,  Le  Tang,  Randal  N.  J.
2015. Salmonella typhi and Salmonella  paratyphi  A.  Molecular Medical Microbiology.  Chapter 71 Loman GA. 2010. Uji Diagnostik Pemeriksaan Imunoserologi  IgM  Anti  Salmonella Metode IMBI dan Rapid Test Terhadap Baku Emas Kultur
Salmonella  typhi  pada  Penderita Tersangka  Demam  Tifoid.  Universitas Kristen Maranatha.
Madigan  MT,  Martinko  JM,  Stahl  DA,  Clark
DP. 2012. Brock Biology of Microorganisms. Ed ke-13. San Francisco: Pearson Education. ISBN:9780321649638.
Marchesi JR, Sato T, Weightman A.J., Martin TA,Fry JC, Hiom SJ, Wade WG. 1998. Design  and  evaluation  of  useful bacterium-specific  PCR  primers  Thar amplify genes coding for bacterial 16S rRNA.    Appl    Environ.  Microbiol. 64:795-9.
Menkes. 2006. Keputusan Menteri Kesehatan Republik Indonesia Nomor 364/MENKES/SK/V/2006 Tentang Pedoman Pengendalian Demam Tifoid. Kementerian Kesehatan. Jakarta