## HUBUNGAN ANTARA STATUS INVASI MIOMETRIUM DENGAN EKSPRESI CLAUDIN-4 DAN MATRIX METALLOPROTEINASE-2 PADA KARSINOMA ENDOMETRIOID ENDOMETRIUM
Neviana Fitri Lestari*  , Endang Joewarini*,  Alphania Rahniayu*

## Abstrak
Karsinoma  endometrium  merupakan  keganasan  terbanyak  kelima  pada  organ  reproduksi  wanita dengan jenis  subtipe terbanyak adalah tipe endometrioid. Salah satu parameter penentuan stadium adalah kedalaman  invasi  miometrium  yang  menentukan  peningkatan  agresifitas  dan  progresifitas  tumor  yang berhubungan  dengan  luas  tindakan  operasi.    Protein  claudin-4  dan  matrix  metalloproteinase-2 ( MMP-2) adalah protein penentu dalam invasi karsinoma.  Penelitian ini bertujuan mengungkap peran claudin-4 dan MMP-2 dalam invasi myometrium karsinoma endometrioid endometrium. Penelitian ini merupakan penelitian analitik  observasional  dengan  pendekatan cross  sectional menggunakan  sampel  44  blok  parafin  sampel karsinoma endometrioid endometrium di RSUD Dr. Soetomo periode 1 Januari-31 Desember 2017. Sampel dibagi  menjadi  kelompok  status  invasi  kurang  dan  lebih  dari  separuh  tebal  miometrium.  Pulasan imununohistokimia  menggunakan  antibodi  monoklonal  claudin-4  dan  MMP-2,  ekspresi  dinilai  berdasarkan nilai scoring semikuantitatif. Hubungan berbagai variabel dianalisis menggunakan tes korelasi Spearman rho. Hasil penelitian menunjukkan  hubungan yang bermakna antara status invasi miometrium dengan  ekspresi claudin-4 (p = 0,005). Tidak didapatkan hubungan yang bermakna antara status invasi miometrium dengan ekspresi  MMP-2  (p  =  0,549).  Didapatkan  hubungan  yang  bermakna  antara  ekspresi  claudin-4  dengan ekspresi MMP-2 (p = 0,001). Kesimpulan dari penelitian ini adalah e kspresi claudin-4 berhubungan dengan status invasi miometrium karsinoma endometrioid endometrium, ekspresi MMP-2 tidak berhubungan dengan status invasi miometrium karsinoma endometrioid endometrium serta terdapat hubungan bermakna antara ekspresi claudin-4 dan MMP-2 pada karsinoma endometrioid endometrium.
Kata kunci: claudin-4, karsinoma endometrioid endometrium, MMP-2.

## CORRELATION BETWEEN MYOMETRIAL INVASION STATUS  WITH CLAUDIN-4 AND MATRIX METALLOPROTEINASE-2 EXSPRESSION IN ENDOMETRIOID CARCINOMA OF ENDOMETRIUM

## Abstract
Endometrial carcinoma is the fifth most frequent type of malignancy found in the female reproductive system,  and  the  most  common  subtype  is  endometrioid. M yometrial  invasion  is  one  of  the  staging parameters  used  to  determine  tumor  aggresivity  and  progressivity  that  influence  the  surgery  extention. C laudin-4  and matrix  metalloproteinase-2 ( MMP-2)  proteins  determine  the  growth  and  invasion  of  the carcinoma. A nalysis of claudin-4 and MMP-2 expression was conducted to reveal their roles in myometrial invasion of the endometrioid endometrial carcinoma. An analytical observational study was conducted on 44 parrafin blocks of endometrioid endometrial carcinoma at Dr. Soetomo Hospital Surabaya during 1 January- 31 December 2017. Samples were divided into 2 groups, less and more than half of the myometrial depth. Immunohistochemistry  staining  was  performed  to  detect  claudin-4  and  MMP-2  expression.  Data  was statistically  analysed  using  Spearman  rho  correlation  test.  The  result  showed  there  were  significant correlation  between  myometrial  invasion  status  with  claudin-4  expression  (p  =  0.005),  there  were  no significant  correlation  between  myometrial  invasion  status  with  MMP-2  (p  =  0.549).  There  were  significant correlation  between  claudin-4  with  MMP-2  expression  (p  =  0.001).  This  study  concludes  claudin-4 significantly correlates with myometrial invasion status, MMP-2 does not correlate with myometrial invasion status, and claudin-4 expression significantly correlates with MMP-2 expression in endometrioid endometrial carcinoma.
Keywords: claudin-4 , endometrioid endometrial carcinoma, MMP-2.
* Departemen Patologi Anatomi, Fakultas Kedokteran, Universitas Airlangga, Surabaya.
 E-mail:nevianafl@gmail.com
Pendahuluan Karsinoma endometrium adalah keganasan yang menduduki peringkat kelima terbanyak  pada  wanita  di  seluruh  dunia. Kasus  baru  karsinoma  endometrium    yang didiagnosis  setiap  tahunnya  berrjumlah sekitar  319,605  kasus  di  dunia. 1 Data  dari International Agency for Research on Cancer tahun  2018  menunjukkan  bahwa  kasus  baru karsinoma  endometrium  di  Indonesia diperkirakan    sejumlah  6.745  kasus  dengan jumlah  kematian  2407  kasus  per  tahun. 2
Angka kejadian tumor ganas endometrium ini meningkat berdasarkan usia, terbanyak pada wanita post menopause dengan usia rata-rata sekitar  63  tahun.  Karsinoma  endometrium bisa  juga  didapatkan  pada  wanita premenopause terutama  yang  mengalami hiperestrogenisme. 3
Status  (kedalaman)  invasi    miometrium adalah  indikator  prognostik  pada  karsinoma endometrium.  Status  invasi  miometrium merupakan  prediktor  independen  untuk penyebaran  tumor  secara  hematogen  dan penting  untuk  menentukan  terapi  adjuvant. Status  invasi  miometrium  diperlukan  untuk staging, menentukan  prognostik  dan  terapi adjuvant. 4 Sorbe  membuat  klasifikasi  risiko preoperasi.  Tujuan  dari  klasifikasi  ini  adalah untuk  mengelompokkan  pasien  yang memerlukan  dan  yang  tidak  memerlukan pengambilan  nodus  limfe.  Hasil  analisisnya menunjukkan  stadium  FIGO,  kedalaman (status) infiltrasi miometrium, dan ploidy DNA memberikan  informasi  prediktif  terbaik sehubungan dengan risiko rekurensi tumor. 5
Claudin-4  adalah tight  junction (TJ) berupa  protein  membran tetraspan yang tersusun  dari  terminal  amino  dan  terminal karboksil,  4  transmembran  domain  dan  2
ekstra selular loop intrasel. 6 Claudin-4 diduga merupakan  bagian  standar  pada  setiap  TJ. Claudin-4 secara fungsional menjaga TJ dari aliran  ion-ion,  dan  mampu  menghalangi pertukaran makromolekul paraselular. 7
Claudin-4 terekspresi terutama pada membran  sel  dan  peningkatan  ekspresinya berkorelasi dengan onset dan perkembangan karsinoma endometrium.
Matrix  metalloproteinase (MMP)  adalah keluarga  endopetidase  yang berperan dalam degradasi kolagen dan makromolekul matriks ekstraseluler  sehingga  memiliki  implikasi pada  kondisi  patologik,  termasuk  inflamasi, invasi tumor dan metastasis. Telah diketahui bahwa overekspresi proMMP-2 oleh fibroblas di stroma pada jaringan karsinoma ditangkap dan  diaktifkan  oleh  sel  karsinoma.  Hasilnya aktivitas MMP-2 memicu perbedaan stimulus kemotaktik  yang  memicu  migrasi  sel mengarah pada invasi sel tumor. 8,9
Penelitian  ini  bertujuan  mengetahui hubungan  antara  status  invasi  miometrium dengan ekspresi claudin-4 dan MMP-2,  serta mencari    hubungan  antara  kedua  protein tersebut  dengan  karsinoma  endometrioid endometrium (KEE), sehingga dapat digunakan sebagai marker prognostik.

## Bahan dan Metode

## Desain Penelitian
Penelitian  ini  merupakan  penelitian analitik  observasional  dengan  pendekatan cross sectional menggunakan 44 blok parafin penderita  KEE  yang  didiagnosis    di  Instalasi Patologi Anatomik Rumah Sakit Dr. Soetomo, Surabaya  periode  1  Januari  hingga  31 Desember  2017.  Penelitian  ini  telah mendapat  persetujuan  etik  dari  Komite  Etik Penelitian  Kesehatan  RSUD  Dr.  Soetomo dengan nomor surat 0381/KEPK/VII/2018.
Deteksi Ekspresi Claudin-4 dan MMP-2 pada Karsinoma Endometrioid Endometrium dengan Metode Imunohistokimia (IHK) Sampel  terbagi  menjadi  2  kelompok yaitu  kelompok  status  invasi  kurang  dari separuh  tebal  miometrium  dan  kelompok status  invasi  lebih  dari  separuh  tebal miometrium yang ditentukan secara
makroskopis  dan  mikroskopis, 5 masing- masing  berjumlah  22  sampel.  Kedua kelompok  sampel  kemudian  dipulas  dengan pengecatan imununohistokimia (IHK) menggunakan antibodi monoklonal  claudin-4, clone sc-376643  (Santa  Cruz  Biotechnology, Inc.)  dengan pengenceran  1:400,  dinyatakan positif  apabila  terpulas  pada  membran  dan sitoplasma  sel  tumor.  Kontrol  claudin-4 menggunakan  sel  karsinoma  mamma. Deteksi  MMP-2  menggunakan  antibodi monoklonal  MMP-2 clone sc-13595  (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) dengan pengenceran 1:250, dinyatakan positif apabila terpulas  pada  membran  sel  tumor.  Kontrol
MMP-2  menggunakan  sel  urothelial  normal. Slide jaringan  diperiksa  menggunakan mikroskop cahaya binokuler, merek Olympus tipe  CX31.    Hasil  pulasan  IHK  dinilai  secara semikuantitatif  dari perkalian  intensitas dan persentase atau immunoreactive score (IRS). Penilaian  dilakukan  pada  seluruh  lapang pandang  dalam  1 slide ,  dengan  skor intensitas yaitu 0 = no stain ; 1 = lemah; 2  = sedang; 3 = kuat. Skor  persentase yaitu 0 = negatif/tidak  terpulas;  +1  =  terpulas  pada <10%  sel  tumor;  +2  =  terpulas  pada  10%- 50%  sel  tumor;  +3  =  terpulas  pada  >51%- 80% sel tumor; +4 = terpulas pada >80% sel tumor. 10 Hubungan  antara  status  invasi
miometrium  dengan  ekspresi  claudin-4  dan MMP-2, serta hubungan antara kedua protein claudin-4  dan  MMP-2  dianalisis  dengan  uji korelasi Spearman rho.

## Hasil
Ekspresi Claudin-4 pada Karsinoma Endometrioid Endometrium Karsinoma  endometrioid  endometrium
(KEE)  dengan  invasi  kurang  dari  separuh tebal miometrium, ekspresi claudin-4 dengan immunoreactive  score (IRS)  paling  banyak adalah  skor  1  atau  lemah  yaitu  10  sampel (45,5%) dan pada KEE dengan status invasi miometrium  lebih  dari  separuh  tebal,  yang terbanyak  adalah  skor  3  atau  kuat  yaitu  10 sampel  (45,5%)  (Tabel  1).  Pada  Gambar  1 ditunjukkan  ekspresi  claudin-4  hasil  pulasan IHK.
Hubungan antara status invasi miometrium  KEE  dengan  ekspresi  claudin-4 diuji  secara  statistik  dengan  uji  korelasi Spearman ’s rho , mendapatkan nilai p sebesar 0,005  yang  ber arti ada  hubungan  status invasi miometrium dengan ekspresi claudin-4. Koefisien korelasi sebesar 0,414 yang bernilai positif  menunjukkan  semakin  tinggi  ekspresi claudin-4  sejalan  dengan  peningkatan  status invasi.
Tabel 1. Ekspresi claudin-4 pada karsinoma endometrioid endometrium (KEE).
Tabel  2. Hasil u ji Spearman’s rho pada ekspresi claudin-4.
Status invasi Claudin-4 Spearman's rho Status invasi  Correlation Coefficient 1.000 .414 Sig. (2-tailed) .005 N 44 44 Claudin-4 Correlation Coefficient .414 1.000 Sig. (2-tailed) .005 N 44 44 Status Invasi Skor IRS Negatif Lemah Sedang Kuat Kurang dari separuh tebal miometrium 0 (0%) 10 (45,5%) 9 (40,9%) 3 (13,6%) Lebih dari separuh tebal miometrium 1(2,56%) 8 (20,51%) 9 (23,07%) 18 (46,1%)
Gambar 1. Ekspresi claudin-4 (tanda panah) hasil pulasan IHK pada karsinoma endometrioid endometrium (400x).
Keterangan:  A. Kontrol, B. Ekspresi claudin-4 lemah (skor 1), C. Ekspresi claudin-4 sedang (skor 2), dan D. Ekspresi claudin-4 kuat (skor 3).
Ekspresi MMP-2 pada Karsinoma Endometrioid Endometrium Karsinoma  endometrioid  endometrium (KEE)  dengan  invasi  kurang  dari  separuh tebal  miometrium,  ekspresi  MMP -2 paling banyak  adalah  skor  2  atau  sedang  yaitu sebanyak 12 sampel (54,5%), dan pada KEE dengan invasi miometrium lebih dari separuh tebal,  yang  terbanyak  adalah skor  2  atau sedang  yaitu  sebanyak  9  sampel  (40,9%). Pada Gambar 2 ditunjukkan ekspresi MMP-2 hasil pulasan IHK. Hubungan antara status invasi miometrium    KEE  dengan  ekspresi  MMP-2 diuji secara statistik dengan uji korelasi
Spearman’s rh o, mendapatkan nilai p sebesar 0,549, artinya  tidak ada  hubungan  status invasi miometrium dengan ekspresi MMP-2.
Hubungan antara Ekspresi Claudin-4 dengan Ekspresi MMP-2 pada Karsinoma Endometrioid Endometrium Hubungan ekspresi claudin-4 dan MMP- 2 pada karsinoma endometrioid endometrium dengan  invasi  kurang  dari  dan  lebih  dari separuh  tebal  miometrium  diuji  secara statistik  dengan  uji  korelasi  Spearman  rho. Hasil  uji  Spearman  rho  (Tabel  5) mendapatkan  nilai  p  sebesar  0,001,  artinya ada  hubungan  ekspresi  claudin-4  dengan MMP-2,  pada  total  sampel  kedua  kelompok
D C B A
invasi  kurang  dan  invasi  lebih  dari  separuh tebal miometrium. Koefisien korelasi sebesar 0,493  yang  bernilai  positif  menunjukkan
semakin  tinggi  ekspresi  claudin-4,  maka ekspresi  MMP-2  juga  semakin  tinggi.
Tabel 3. Ekspresi MMP-2 pada karsinoma endometrioid endometrium (KEE).
Tabel  4. Uji statistik Spearman’s  rho ekspresi MMP -2.
Gambar 2. Ekspresi MMP-2 (tanda panah) hasil pulasan IHK pada karsinoma endometrioid endometrium (400x).
Keterangan:   A. Kontrol, B. Ekspresi MMP-2  lemah (skor 1), C. Ekspresi MMP-2  sedang (skor 2), dan D. Ekspresi MMP-2  kuat (skor 3).
Status Invasi Skor IRS Negatif Lemah Sedang Kuat Kurang dari separuh tebal miometrium 0 (0%) 6 (27,3%) 12 (54,5%) 4 (18,2%) Lebih dari separuh tebal miometrium 0 (0%) 6 (27,3%) 9 (23,07%) 7 (31,8%) Status invasi Claudin-4 Spearman's rho Status invasi  Correlation Coefficient 1.000 .093 Sig. (2-tailed) .549 N 44 44 Claudin-4 Correlation Coefficient .093 1.000 Sig. (2-tailed) .549 N 44 44
D C B A
Tabel  5. Uji statistik Spearman’s  rho ekspresi claudin -4 dan MMP-2.
Pembahasan Hubungan  antara  Status  Invasi  Miometrium dengan  Ekspresi Claudin-4  Karsinoma Endometrioid Endometrium (KEE) Hasil penelitian ini menunjukkan adanya hubungan  antara  ekspresi  claudin-4  dengan status  invasi  miometrium  pada    total  sampel kedua  kelompok  status  invasi  kurang  dan lebih  dari  separuh  tebal  miometrium karsinoma endometrioid endometrium , semakin tinggi ekspresi claudin-4, maka akan meningkat status invasi.
Hal  ini  sejalan  dengan  penelitian  Pan dkk.,  di Department  of  Gynecology,  Qi  Lu Hospital  of  Shan  Dong  University  dan  the
Affiliated  Hospital  of  Qing  Dao  University Medical  School , pada  Juli  2005  hingga November  2005.  Sampel   berusia 19  hingga 68 tahun. Penelitian Pan mengamati ekspresi claudin-4  pada  endometrium  normal, hiperplasia  tanpa  atipia  dan  dengan  atipia serta  karsinoma  endometrioid  endometrium. Adanya peningkatan ekspresi claudin-4 pada jaringan  karsinoma  dibandingkan  jaringan endometrium  normal.  Peningkatan  ekspresi claudin-4  pada  sel  karsinoma  ovarium mengarah pada pertumbuhan dan metastasis kanker.  Hasil  ini  paradoks  dengan  hasil penelitian  pada cell line pankreas  yang memperlihatkan ekspresi claudin-4 mengarah pada  penurunan  invasi,  dan  penurunan potensi metastasis. Alasan dari perbedaan ini kemungkinan  adalah  fungsi  yang  bersifat spesifik  jaringan  dan  mungkin  tergantung pada  sirkuit  molekular  tertentu.  Kesimpulan penelitian Pan bahwa ekspresi claudin-4 yang terus-menerus mungkin diperlukan dalam
perkembangan karsinoma endometrium. Pan menemukan  bahwa  terdapat  kecenderungan peningkatan  ekspresi  claudin-4  sejalan dengan grade dan stadium, walaupun secara statistik  tidak  signifikan.  Hasil  statistik  juga menunjukkan bahwa ekspresi claudin-4 yang tinggi berhubungan dengan invasi miometrium.  Membran  sel  kanker  bagian lateral  tersusun    kurang  padat  dan  tampak bergelombang.  Morfologi tight  junction mengalami kerusakan dan peluruhan. 11
Penelitian  oleh  Agarwa l,  D’Souza  dan Morin (2005) mengkonfirmasi peran claudin-4 pada  tumorigenesis  ovarium.  Mereka menggunakan  sel human  ovarian  surface epithelial (HOSE) yang mengandung claudin- 4 wild-type .  Ekspresi  claudin-4  pada  sel HOSE  meningkatkan invasi dan motilitas sel, fenomena  ini  diamati  dengan boyden chamber  assays dan  eksperimen  proses penyembuhan luka ( wound-healing experiments ).  Perubahan  morfologik  sel tampak  dan  diduga  berkaitan  dengan peningkatan  ekspresi  claudin-4.  Sel  tumor yang  mengekspresikan  claudin-4  memiliki morfologi  yang  lebih  fibroblastik,  dengan bentuk yang iregular dan memanjang. Selain itu, sel epitel ovarium yang mengekspresikan claudin-4 memiliki aktivitas matrix metalloproteinase -2 (MMP-2) yang
meningkat.  Hal  ini  mengindikasikan  bahwa invasi  yang  dimediasi  oleh  claudin  mungkin difasilitasi melalui aktivasi protein MMP. 12 Peran  claudin-4  dalam  perkembangan tumor  diduga  terletak  pada  perannya  pada migrasi,  invasi  dan  metastasis  sel  kanker, yang  bersifat  spesifik-jaringan.  Studi  terakhir
Claudin-4 MMP-2 Spearman's rho Status invasi  Correlation Coefficient 1.000 .493 Sig. (2-tailed) .001 N 44 44 Claudin-4 Correlation Coefficient .493 1.000 Sig. (2-tailed) .001 N 44 44
memperlihatkan  bahwa  claudin  berperan pada epithelial  to  mesenchymal  transition (EMT),  pembentukan cancer  stem  cells atau tumor-initiating  cells (CSCs/TICs),  dan kemoresistensi.  Disregulasi  ekspresi  claudin- 4  terjadi  pada  level  transkripsional  dan  level post-transkripsional. Sejumlah bukti mengindikasikan bahwa mekanisme epigenetik  antara  lain  metilasi  DNA, modifikasi  histon  atau micro RNAs  (miRNAs) penting  untuk  pengaturan  ekspresi  claudin . Claudin  dapat  berperan  sebagai cancer- promoting atau tumor suppressor . 13
Ekspresi claudin-4 yang meningkat atau menurun diatur oleh fosforilasi melalui kinase. Contohnya  adalah  fosforilasi  claudin-4  oleh protein kinase A (PKA) atau protein kinase C (PKC) meningkatkan permeabilitas paraselular  pada  sel  karsinoma  ovarium, dengan  cara  perpindahan  lokasi  claudin.
Perpindahan  lokasi  claudin-4  memicu penurunan  kekuatan  barrier tight  junction yang  mengarah  pada  invasi  tumor. 13,14
Agarwal dkk., menemukan bahwa C terminus pada claudin - 3 merupakan substrat yang baik untuk  protein  kinase  cAMP- dependent pada threonin  192.  Overekspresi  protein  yang memiliki mutasi T192D, menyerupai keadaan fosforilasi,  mengarah  pada  penurunan kekuatan tight  junction cell line karsinoma ovarium  OVCA433.  Hal  ini  mungkin merupakan  mekanisme  perusakan tight junction pada karsinoma. 12 Ekspresi claudin-4 yang meningkat pada karsinoma  ovarium  dihubungkan  dengan hipometilasi DNA, sedangkan amplifikasi gen tidak berhubungan dengand ekspresi claudin-
4.  Selain  metilasi  DNA,  penelitian    Kwon melaporkan  bahwa  hilangnya  histon  represif metilasi, termasuk H3K27me3 dan H4K20me3,  juga  berhubungan  dengan ekspresi  claudin-3  dan  claudin-4  yang  tinggi pada karsinoma ovarium. Penelitiannya pada karsinoma  ovarium  menunjukkan  bahwa derepressi  epigenetik  selain  juga  inaktivasi epigenetik dari gen supresor tumor, mungkin
merupakan  suatu  mekanisme  pada  aktivasi gen cancer-associated .  Penelitian  terdahulu menunjukkan  bahwa  faktor  transkripsi  dan modifikasi  epigenetik  berperan  dalam pengaturan  transkripsional  level  claudin. Faktor trasnkripsi Sp1 penting untuk aktivitas promoter  CLDN3  dan  CLDN4,  dan  status epigenetik  termasuk  metilasi  DNA  dan asetilasi  histon  H3,  pada  region  yang mengandung binding  site Sp1  juga  memiliki peran  dalam  regulasi  ekspresi  CLDN3  dan CLDN4 pada sel karsinoma ovarium. 13 Evaluasi  invasi  miometrium  pada jaringan  histerektomi  dihubungkan  dengan insiden  metastasis  kelenjar  getah  bening, yang  diharapkan  dapat  digunakan  untuk memprediksi penyebaran tumor. Nenad dkk., meneliti tentang faktor prognostik penyebaran karsinoma  endometrium  melalui  kelenjar getah  bening,  antara  lain  status  invasi miometrium,  ukuran  tumor  dan  invasi limfovaskular.  Penelitian  yang  dilakukan  di University  Clinic  for  Gynecology  and Obstetrics di Banja Luka, pada periode 2010 hingga  2015  pada  221  jaringan  karsinoma endometrium.  Karsinoma  endometrium  risiko rendah  yaitu  dengan  invasi  miometrium kurang  dari  separuh,  ukuran  tumor  kurang dari  2  cm,  tidak  didapatkan  invasi limfovaskular,  dan  tumor grade I,  memiliki tingkat  metastasis  kelenjar  getah  bening pelvis yang rendah. 15
Parameter  tersebut  penting  untuk mengurangi  jumlah  tindakan  limfadenektomi pelvis.  Penderita  yang  memiliki  risiko metastasis  limfatik  yang  tinggi,  yaitu  dengan invasi  tumor  lebih  dari  separuh  tebal miometrium,  ukuran  tumor  lebih  dari  2  cm, invasi limfovaskular, tumor grade 2 dan grade 3,  didapatkan  tingkat  metastasis  kelenjar getah  bening  pelvis    yang  tinggi,  sehingga memerlukan  tindakan  limfadenektomi  pelvis dan paraaorta. Tindakan ini bisa menurunkan tingkat  kematian  lebih  dari  50%  dan meningkatkan masa survival 5 tahun. 15
Sebagian besar karsinoma endometrium menyebar  melalui  jalur  limfogen.  Dua  puluh lima persen dari tumor grade 3 bermetastasis melalui  limfe.  Invasi  tumor  pada  2/3  tebal miometrium dihubungkan dengan 22% kasus penyebaran  limfogen  dan  15%  bila  tampak invasi  sel tumor dalam pembuluh darah. Dua per  tiga  pasien  dengan  metastasis  limfogen hanya mengenai kelenjar getah bening pelvis, tetapi  juga  bisa  mengenai  lebih  dari  10% kelenjar getah bening paraaorta. Terapi yang direkomendasikan  untuk  karsinoma grade 3 dengan  invasi miometrium lebih dari separuh tebal adalah histerektomi dengan adnesektomi  dengan  limfadenektomi  pelvis dan  paraaorta.  Karsinoma grade 1  atau  2 dengan  invasi  miometrium  yang  lebih dangkal, disarankan untuk dilakukan histerektomi  dengan  bilateral  adnexektomi tetapi tanpa limfadenektomi. 16
Hubungan  antara  Status  Invasi    Miometrium dengan  Ekspresi  MMP-2 pada  Karsinoma Endometrioid Endometrium Hubungan  antara  ekspresi  MMP-2
dengan  status  invasi  kurang  dari  dan  status invasi  lebih  dari  separuh  tebal  miometrium karsinoma  endometrioid  endometrium  diuji secara  statistik  dengan  uji  korelasi Spearman’s rho. Hasil uji menunjukkan tidak didapatkan hubungan antara ekspresi MMP-2 dengan  status  invasi  miometrium  pada karsinoma endometrioid endometrium.
Hasil  penelitian  ini  sesuai  dengan penelitian  Aglund,  dkk  pada  88  orang penderita  karsinoma  endometrium,  dirawat tahun  1988  hingga  1993  di  Rumah  Sakit Ume,  Finlandia.  Studi  imunohistokimia antibodi  MMP-2  menunjukkan  bahwa peningkatan  ekspresi  MMP-2  berhubungan dengan  peningkatan grade histologi.  MMP-2 tidak berhubungan dengan invasi miometrium maupun  invasi  vaskular/limfatik.  Faktor penentu perilaku invasi adalah aktivasi MMP. Studi in situ zymography menunjukkan bahwa proporsi  MMP  yang  terdeteksi  pada  jaringan
karsinoma  endometrium  berbentuk  aktif, sehingga disimpulkan bahwa MMP yang aktif berhubungan dengan sel tumor . 17
Hasil  penelitian  ini  juga  sesuai  dengan hasil  penelitian  yang  dilakukan  oleh  Nezza dkk.,  yang  melakukan  penelitian  pada  29 spesimen  penderita  karsinoma  endometrium di  Monash  Medical  Centre  dan  the  Royal Women’s Hospital, Melbourne, Australia yang meneliti  MMP-2  dan  MMP-9.  Penderita berumur 45 hingga 88 tahun dengan rata-rata usia  64.  Penelitian  tersebut  menunjukkan bahwa  MMP-9  dan  MT1-MMP    pada    sel tumor berhubungan secara signifikan dengan invasi miometrium dan invasi vaskular/limfatik.  MMP-2  tidak  berhubungan dengan  invasi  miometrium  dan  invasi vaskular/limfatik. 18 MT1-MMP  ( membrane- type MMPs)  mengaktifkan  pro-MMP-2  dan memecah  kolagen  tipe  I,  II,  III,  gelatine, fibronectin,  laminin-1,  vitronectin,  cartilage proteoglycans,  dan    fibrillin-1,  dan diekspresikan  oleh  sel  epitel. 8 Pro-MMP-2 yang  diekspresikan  oleh  sel  fibroblast  pada jaringan  karsinoma  atau  yang  diubah  dari serum  ditangkap  dan  diaktifkan  pada  sel karsinoma  oleh  MT1-MMP.  Overekspresi MT1-MMP berhubungan dengan overekspresi MMP-2. TIMP-2 dibutuhkan untuk aktifasi pro- MMP-2 oleh MT1-MMP. 19
TIMP-2  adalah  anggota  dari  keluarga TIMP  yang  dalam  proses  inhibisi  MMP berinteraksi  dengan  MT1-MMP  untuk memfasilitasi  pengaktifan  pro-MMP2.  Fungsi TIMP-2  adalah  sebagai  inhibitor  MMP  dan sekaligus  juga  diperlukan untuk    pengaktifan pro-MMP2. 20
Hasil    penelitian  ini  mengkonfirmasi penelitian  sebelumnya    yang  meneliti  peran prognostik ekspresi  MMP-2 dan TIMP-2 pada karsinoma  endometrium,  yang  menunjukkan bahwa ekspresi MMP-2 diketahui berkorelasi dengan  prognosis  yang  buruk  dan  ekspresi TIMP-2  yang  tinggi  berhubungan  dengan tingkat survival pada karsinoma endometrium. Ekspresi  MMP-2  yang  kuat  dan  ekspresi
TIMP-2  yang  lemah  terdeteksi  pada subkelompok karsinoma endometrium dengan  klinis  yang  agresif,  sehingga keduanya mungkin memiliki potensi prognosis.  MMP-2  nampak  lebih  akurat dibandingkan  TIMP-2  dalam  menentukan prosnosis  karsinoma  endometrium  bila digunakan terpisah. 21 Penelitian  Fan  dkk.  menunjukkan adanya  ekspresi  MMP-2  dan  TIMP-2  pada karsinoma  kandung  empedu.  Mereka menemukan  bahwa  MMP-2  berhubungan dengan  stadium  Nevin.  Ekspresinya  pada stadium  lanjut  lebih  kuat  daripada  stadium awal,  tetapi  tidak  berkorelasi  dengan  status kelenjar getah bening dan level infiltrasi. Hasil ini  tampak  kontradiktif  dengan  laporan penelitian  terdahulu.  Alasan  perbedaan  ini adalah  metode  penelitian  dan  antibodi  yang digunakan  berbeda,  dan  adanya  efek  ganda TIMP-2.  TIMP-2  tidak  hanya  menghambat aktifitas MMP-2, namun juga berperan dalam aktifasi  MMP-2  pada  permukaan  sel.  Jika hubungan  antara  MMP-2  dan  TIMP-2  tidak diteliti  bersamaan,  maka  karakteristik  invasif tumor  tidak  bisa  jelas  terlihat  dengan  hanya memeriksa  MMP-2.  Ekspresi  TIMP-2  tidak berbeda  signifikan  pada  tumor  dengan  tipe histologis dan grade yang berbeda. Ekspresi TIMP-2  pada  stadium  awal  lebih  tinggi daripada  tumor  stadium  lanjut  dan berhubungan dengan level infiltrasi, metastasis  lokal  kelenjar  getah  bening  dan invasi  hepar.  Hal  ini  menunjukkan  ada hubungan  antara  ekspresi  TIMP-2  dengan parameter klinikopatologi stadium, invasi dan metastasis  kelenjar  getah  bening  untuk penentuan  prognosis  penderita  karsinoma kandung empedu. 22 Keseimbangan  MMPs/TIMPs  adalah faktor  penting  untuk  mempertahankan integritas  ECM,  dan  peran  MMP  pada metastasis  tumor  tidak  bergantung  pada konsentrasi  absolut  MMP  pada  area  lokal, tetapi  pada  rasio  MMPs/TIMPs.  Bila TIMP tidak mampu menghambat kerja MMP, maka
matriks  ekstraseluler akan  dihancurkan sehingga terjadilah invasi. Ketika keseimbangan  MMPs/TIMPs  rusak,  akan mengarah  pada  degradasi  ECM.  TIMPs mungkin  berperan  sebagai  faktor  prognostik invasi  dan  metastasis.    Hasil  penelitian  Fan dkk, menunjukkan bahwa rasio MMP-2/TIMP- 2 berhubungan dengan stadium, level infiltrasi dan  rekurensi.  Rasio  MMP-2/TIMP-2 menunjukkan sifat invasi dan metastasis yang lebih  akurat  pada  karsinoma  kandung empedu  bila  dibandingkan  dengan  ekspresi MMP-2 ataupun TIMP-2 tersendiri. 22
Penelitian  ini  tidak  menilai  ekspresi TIMP-2 sehingga tidak dapat menilai korelasi antara ekspresi MMP-2  dan ekspresi TIMP-2, dan  membuktikan  pengaruh  TIMP-2  yang dapat  menghambat  peningkatan  ekspresi MMP-2.
Hubungan antara Ekspresi Claudin-4 dengan Ekspresi MMP-2 pada Karsinoma Endometrioid Endometrium Penelitian  ini  mendapatkan  ada hubungan ekspresi claudin-4 dengan ekspresi MMP-2,  pada  total sampel kedua kelompok invasi  kurang  dan  invasi  lebih  dari  separuh tebal  miometrium  KEE.  Koefisien  korelasi sebesar  0,493  yang  bernilai  positif menunjukkan semakin tinggi ekspresi claudin- 4, maka ekspresi MMP-2 juga semakin tinggi.
Ekspresi claudin telah lama dihubungkan dengan matrix metalloproteinases  (MMPs).  MMP  adalah zinc-endopeptidases  yang  diekskresikan untuk  mendegradasi  matriks  ekstrasellular dan  meningkatkan  motilitas  sel,  khususnya pada  migrasi  sel  kolektif.  Penelitian Agarwal dkk.,  menemukan  bahwa  sel line HOSE ( Human  Ovarian  Surface  Epithelial ) yang mengandung  claudin-4  mengekspresikan peningkatan aktifitas MMP-2 dibandingkan sel HOSE yang tidak mengekspresikan claudin-4. Hasilnya menunjukkan bahwa protein claudin- 4 berperan  pada  kontrol  motilitas  dan  invasi melalui  MMP-2,  setidaknya  pada  tumor
ovarium. 12 Takehara  dkk. ,  juga  menemukan bahwa  pada  sel  Caco-2  yang  memiliki overekspresi  claudin-4,  tampak  peningkatan aktifitas MMP-2 dan MMP-9, dibandingkan sel Caco-2 tiruan. Hasil penelitian Takehara dkk., sejalan dengan hasil penelitian Miyamori dkk., yang menemukan bahwa claudin berhubungan  dengan  MT1-MMP  untuk mengaktifkan  MMP-2,  menandakan  bahwa claudin mungkin meningkatkan aktifitas MMP untuk  mendegradasi  matriks  ekstraselular dan memicu motilitas sel. 23
Webb  dkk.,  meneliti  apakah  claudin memerlukan  protein  matriks  ekstrasellular khusus  untuk  memicu  motilitas,  sel  normal dan  sel  tumor  ditumbuhkan  dalam  media dengan Cell-Tak , suatu matriks non fisiologik derivat  dari  protein  polifenol  moluska. Hasilnya menunjukkan bahwa motilitas kedua tipe  sel  melibatkan  interaksi  ekstrasellular claudin  yang  tampak  memerlukan  matriks kolagen. 23
Mekanisme  sebab  dan  efek  hubungan antara claudin-4 dan MMP-2 pada karsinoma endometrioid  endometrium  belum  banyak diteliti  dan  diketahui.  Agarwal  dkk., melakukan  penelitian  pada cell line ovarium, mereka melakukan knockdown claudin -3 dan claudin -4  yang  dimediasi  oleh  siRNA  pada OVCAR-5. Penghambatan ekspresi claudin -3 dan claudin -4 pada sel OVCAR-5 mengurangi kemampuan  invasi  sel  ini  secara  signifikan. Knockdown claudin -3  dan claudin -4  yang dimediasi  siRNA  pada  sel  OVCAR-5  tidak mengarah  pada  penurunan  aktivitas  MMP-2 pada sel itu. Hasil ini menunjukkan bahwa sel karsinoma  ovarium  mungkin  memiliki  jalur tambahan  atau  jalur  alternatif  untuk mengaktifkan MMP-2. 12
Oku  dkk.,  melakukan  penelitian  yang mencari  mekanisme  hubungan  claudin dan MMP. Mereka melakukan penelitian pada cell line karsinoma  sel  skuamus oral . Ekspresi claudin-1, MMP-2 dan pembelahan rantai ɣ 2 laminin - 5  dengan  analisis western  blot ,  IHC dan  zymografi.  Ekspresi  MT1-MMP  dan
MMP-2 aktif menurun ketika siRNA claudin-1 dimasukkan  ke  dalam  sel,  hal  ini membuktikan bahwa claudin-1 meningkatkan ekspresi MT1-MMP melalui mekanisme sinyal tertentu. Cell line yang  memiliki  ekspresi MT1-MMP  dan  pro-MMP2  yang  tinggi bersifat invasif.  Pada cell line OSC-4 dengan ekspresi claudin yang tinggi, terdapat tingkat MT1-MMP  dan  MMP-2  aktif  yang  tinggi. Aktivitas  invasi  dihambat  oleh  masuknya siRNA  claudin-1  ke  dalam  OSC-4.  Hal  ini menunjukkan  bahwa  peningkatan  aktivitas claudin-1  dimediasi  melalui  peningkatan ekspresi  MT1-MMP  dan  aktivasi  MMP-2. Penelitian  sebelumnya  menunjukkan  bahwa terdapat overekspresi rantai ɣ 2  laminin-5 tepi invasi sel  karsinoma yang memiliki sejumlah besar bentuk pemecahan rantai ɣ 2 laminin-5. Penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  rantai ɣ 2 laminin-5 dipecah oleh MT1-MMP dan MMP-2 aktif,  kemudian    rantai ɣ 2    laminin-5  yang terpecah  menempel  pada  EGFR  permukaan sel  kanker,  sejumlah  sitokin  dan  faktor pertumbuhan,  selanjutnya  memacu  sinyal pengaktifan  invasi  sel.  Aktifitas  invasi  sel yang  tinggi  ini  dihambat  ketika  sel  diberi antibodi anti MT1-MMP atau inhibitor MMP-2. Kesimpulannya  ekspresi  MT1-MMP  dan MMP-2 aktif dipicu oleh claudin-1, diikuti oleh pemecahan rantai ɣ 2  laminin-5 . 24

## Kesimpulan
Terdapat  hubungan yang positif antara status  invasi  miometrium  dengan  ekspresi claudin-4  pada  karsinoma  endometrioid endometrium.  Tidak  terdapat    hubungan status  invasi  miometrium  dengan  ekspresi MMP -2 pada  karsinoma  endometrioid endometrium.  Terdapat  hubungan  yang positif  antara  ekspresi  claudin-4  dengan ekspresi MMP-2, pada karsinoma endometrioid endometrium.
Saran Claudin-4 dapat diaplikasikan sebagai alat bantu  untuk  penentuan  prognosis  pada karsinoma endometrioid endometrium sediaan  kuretase  sebelum  operasi.  Perlu dilakukan  penelitian  lebih  lanjut  untuk mengetahui  faktor  lain  yang  berperan  pada kejadian  invasi  miometrium  karsinoma endometrioid  endometrium,  seperti  TIMP-2 sehingga dapat dijadikan faktor prognosis dan terapi untuk karsinoma endometrioid endometrium .

## Daftar Pustaka
1. Fernandez-Montoli  ME,  Sabadell  J, Martínez-García JM, Contreras Perez NA.
Fertility-Sparing  Treatment  for  Atypical Endometrial Hyperplasia and Endometrial Cancer. Cochrane Database of Systematic Reviews . 2018. Issue 8. 2. International  Agency  for  Research  on Cancer. GLOBOCAN 2018: Estimated Cancer Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in 2018 . Lyon (Fr): IARC Press. 2018. Available from: http://globocan.iarc.fr/.
3. Kurman  J,  Carcangiu  L,  Herrington  S, Young H. Tumours of the Uterine Corpu’s .
In: WHO  Classification  of  Tumours  of Female  Reproductive  Organs. Lyon  (Fr): IARC Press. 2014. p. 124-128.
4. Ganesan  R,  Singh  N,  McCluggage  WG. Standards  and  Datasets  for  Reporting Cancers:Dataset for Histological Reporting  of  Endometrial  Cancer. England:  The  Royal  College  Of Pathologist. 2014. 5. Sorbe  B. Predictive  and  Prognostic
Factors  in  Definition  of  Risk  Groups  in Endometrial  Carcinoma. ISRN  Obstetrics and Gynecology. 2012; (325790):8.
6. Fan  Y,  Zhang  J,  Yang  H,  Yang  Y.
Expression of MMP-2, TIMP-2 Protein and the Ratio of MMP-2/TIMP-2 in Gallbladder
Carcinoma  and  Their  Significance .  World
J Gastroenterol . 2002; 8(6):1138-1143. 7. Milatz S, Krug S, Rosenthal R, Gunzel D,
Muller  D,  Schulzke  JD,  Amasheh  S,
Frommzke M. Claudin-3 Acts as A Sealing Component of the Tight Junction for Ions of Either Charge and Uncharged Solutes.
Biochimica et Biophysica Acta- Biomembranes. 2010;  1798(11):2048 –
2057
8. Am ǎ linei  C,  Caruntu  I,  Giusca  SE,  Balan RA. Matrix Metalloproteinases Involvement  in  Pathologic  Conditions. Romanian  Journal  of  Morphology  and Embryology . 2010; 51(2):215 – 228. 9. Sato  H,  and  Takino  T.  Coordinate  Action of Membrane-Type Matrix Metalloproteinase-1  (MT1-MMP)  and MMP-2  Enhances  Pericellular  Proteolysis and  Invasion. Cancer  Science .  2010; 101(4):843 – 847.
10. Fedchenko  N,  Reifenrath  J.  Different Approaches  for  Interpretation  and Reporting of Immunohistochemistry Analysis  Results  in  the  Bone  Tissue – A
Review. Diagnostic  Pathology .  2014;
9:221.
11. Pan  XY,Wang B , Che YC, Weng ZP, Dai HY, Peng W. Expression of Claudin-3 and Claudin-4  in  Normal,  Hyperplastic,  and Malignant Endometrial Tissue. International  Journal  of  Gynecological Cancer . 2007; 17(1):233 – 241.
12. Agarwal R, D’Souza T, Morin PJ. Claudin-
3  and  Claudin-4  Expression  in  Ovarian Epithelial Cells Enhances Invasion and is Associated with Increased Matrix Metalloproteinase-2 Activity. Cancer Research . 2005; 65(16):7378 – 7385. 13. Kwon MJ. Emerging Roles of Claudins in Human  Cancer. International  Journal  of
Molecular  Sciences .  2013;  14(9):18148 – 18180.
14. Szabó  I,  Kiss  A,  Schaff    Z  ,  Sobel    G. Claudins  as  Diagnostic  and  Prognostic Markers  in  Gynecological  Cancer.
Histology  and    Histopathology .  2009; 24:1607-1615. 15. Lucic N, Draganovic D, Sibincic S, Ecim- Zlojutro  V,  Milicevic  S.  Myometrium Invasion, Tumour Size and Lymphovascular Invasion as A Prognostic  Factor  in  Dissemination  of Pelvic  Lymphatics  at  Endometrial Carcinoma. Med Arch . 2017; 71(5): 325- 329.
16. Mang  C,  BIrkenmaier  A,  Cathomas  G, Humburg  J.  Endometrioid  Endometrial
Adenocarcinoma:  An  Increase  of  G3
Cancers ?. Arch  Gynecol  Obstet .  2017; 295(6):1435-1440.  DOI  10.1007/s00404- 017-4370-4
17. Aglund  K,  Puistola  U,  Angstrom  T, Turpeenniemi-Hujanen  T,  Zackrisson  B, Stendahl U . Gelatinases A and B (MMP- 2  and  MMP-9)  in  Endometrial  Cancer  - MMP-9  Correlates  to  the Grade  and  the Stage. Gynecologic  Oncology .  2004; 94(3):699 – 704.
18. Di Nezza LA, Misajon A, Zhang J, et al. Presence  of  Active  Gelatinases  in
Endometrial  Carcinoma  and  Correlation of  Matrix  Metalloproteinase  Expression with  Increasing  Tumor  Grade  and
Invasion. Cancer. 2002; 94:1466 – 75.
19. Shiomi  T,  Okada  Y.  MT1-MMP  and MMP-7  in  Invasion  and  Metastasis  of Human  Cancers. Cancer  Metastasis Review. 2003; 22(2 – 3):145 – 152. 20. Honkavuori-toivola  M,  Santala  M,  Soini Y.  Combination  of  Strong  MMP-2  and Weak  TIMP-2  Immunostainings  is  A Significant Prognostic Factor in Endometrial Carcinoma. Disease Markers . 2013; 35(4):261 – 266.
21. Honkavuori-Toivola,  M.  The  Prognostic
Role of Matrix Metalloproteinase-2 and -9 and  Their  Tissue  Inhibitor-1  and  -2  in Endometrial Carcinoma. Thesis. Finland:
University of Oulu. 2014.
22. Fan  Y,  Zhang  J,  Yang  H,  Yang  Y.
Expression  of  MMP-2  ,  TIMP-2  Protein and  the  Ratio  of  MMP-2/TIMP-2  in Gallbladder  Carcinoma  and  Their Significance. World  J  Gastroenterol . 2002; 8(6):1138-1143 .
23. Webb  PG,  Spillman  MA,  Baumgartner HK. Claudins Play a Role in Normal and Tumor  Cell  Motility. BMC  Cell  Biology. 2013; 14(1):1.
24. Oku N, Sasabe E, Ueta E, Yamamoto T, Osaki T. Tight Junction Protein Claudin-1
Enhances  the  Invasive  Activity  of  Oral Squamous  Cell  Carcinoma  Cells  by Promoting  Cleavage  of  Laminin-5;  2 Chain  via  Matrix  Metalloproteinase (MMP)-2  and    Membrane-Type  MMP-1. Cancer Research. 2006; 66(10):5251-7.