Volume 1, Nomor 11, November 2021 p-ISSN 2774-7018 ; e-ISSN 2774-700X

## OPTIMALISASI WAKTU INKUBASI DAN KONSENTRASI  PEPSIN PADA AKTIVITAS PRODUKSI SERUM ANTI TETANUS M. Ambri Saputra Maelandri dan Rida Emelia
Politeknik Piksi Ganesha Bandung, Indonesia E-mail: m.ambri46@gmail.com dan emeliarida1310@gmail.com
Diterima:
23 Oktober 2021 Direvisi: 10 November 2021 Disetujui: 15 November 2021

## Abstrak
Tetanus  merupakan  penyakit  yang  disebabkan  oleh  kuman Clostridium  tetani .  Penyakit  ini  termasuk  mematikan  di  negara berkembang.  Melihat  masih  tingginya  kasus  tetanus  di  negara berkembang  serta  untuk  memberikan  pelayanan  terbaik  dan pengobatan efektif terhadap pasien yang terkena penyakit tetanus, maka diperlukan optimalisasi pada proses pembuatan serum anti tetanus,  sehingga  dapat  meningkatkan  kapasitas  produksi  dan kualitas  serum  yang  dihasilkan.  Berdasarkan  latar  belakang tersebut,  penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  optimalisasi waktu  inkubasi  dan  konsentrasi    pepsin  pada  aktivitas  produksi serum anti tetanus. Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif kuantitatif  dengan  teknik  pengumpulan  data  melalui  observasi dan  studi  pustaka. Berdasarkan  hasil  analisis  menggunakan
software khusus  densitometri Design  of  Experiment (DoE) dengan  metode Sodium  Dodecyl  Sulphate  Polyacrylamide  Gel
Elektroforesis (SDS  PAGE)  bahwa  konsentrasi  optimum didapatkan  pada  sampel  anti  tetanus  ke-7  dengan  konsentrasi pepsin sebesar 0,18 % dalam waktu inkubasi 5 jam.
Kata kunci: Inkubasi, pepsin, SDS Page, tetanus

## Abstract
Tetanus is a disease caused by the bacterium Clostridium tetani. This disease is one of the deadliest in developing countries. Seeing the high number of tetanus cases in developing countries and to provide  the  best  service  and  effective  treatment  for  patients affected  by  tetanus,  it  is  necessary  to  optimize  the  process  of making  anti  tetanus  serum,  so  as  to  increase  the  production capacity  and  quality  of  the  serum  produced.  Based  on  this background,  this  study  aims  to  determine  the  optimization  of incubation time and pepsin concentration on anti tetanus serum production  activity.  This  research  is  quantitative  descriptive research with data collection techniques through observation and literature  study.  Based  on  the  results  of  the  analysis  using  a special densitometry  software Design of Experiment (DoE) with the Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis  (SDS  PAGE)  method  that  the  optimum concentration was obtained in the 7th anti tetanus sample with a pepsin concentration of 0.18% in an incubation time of 5 hours.
Keywords: incubation, pepsin, SDS Page, tetanus
Profil  Penggunaan  Obat  Tradisional  di  Apotek  Sumber Waras

## Pendahuluan
Tetanus  adalah  penyakit  yang  disebabkan  oleh  kuman Clostridium  tetani ,  dengan gejala utama spasme otot tanpa gangguan kesadaran, disebabkan oleh tetanospasmin yaitu eksotoksin yang dihasilkan oleh Clostridium tetani (Leman & Tumbelaka, 2016) . Menurut Harum, spora Clostridium tetani biasanya masuk ke dalam tubuh melalui luka pada kulit disebabkan terpotong, tertusuk, luka bakar, gigi berlubang, atau infeksi pada tali pusat yang biasa dikenal sebagai tetanus neonatorum (Harum, 2014). Saat terinfeksi, toksin ini akan dibawa  menuju  terminal  syaraf  sehingga  menurunkan  fungsi  sel  saraf  motorik  yang bertanggung  jawab  mengaktifkan  otot  secara  sadar.  Gambaran  klinis  tetanus  diawali dengan  kejang  otot  di  sekitar  luka,  lemah,  cemas,  gelisah,  mudah  tersinggung  dan  sakit kepala, kemudian kaku pada rahang, perut dan punggung yang mengeras serta kesukaran untuk menelan (Ade, 2016).
Penyebaran  penyakit  tetanus  menyebar  di  seluruh  dunia  terutama  di  negara berkembang dengan frekuensi penderita yang bervariasi. Penyakit ini termasuk mematikan di  negara  berkembang  karena  telah  membunuh  kurang  lebih  500.000  orang  pertahun (Rahmanto  &  Farhanah,  2017).  Menurut  WHO  penyebab  kematian  yang  diakibatkan tetanus neonatorum TN  di  negara-negara  berkembang  adalah  sebanyak  135  kali  lebih tinggi dari pada negara maju. Pada tahun 2007, 2011, dan 2014 diantara jumlah kasus TN di  negara-negara  ASEAN,  Indonesia  menempati  urutan  kedua  setelah  Philipina,  yaitu dengan jumlah penderita lebih dari 100 orang. Disamping itu, tingkat kasus kematian yang diakibatkan penyakit TN di Indonesia cenderung mengalami kondisi yang cukup tinggi di tahun  2014  (Yani  &  Munawaroh,  2020).  Angka  kematian  ( case  fatality  rate )  Tetanus neonatorum  dari  tahun  2007-2011  berada  di  kisaran  angka  48%-61%.  Pada  tahun  2013 case  Fatality  Rate  tetanus neonatorum sebesar  49,6%.  Terdapat  sebanyak  84  kasus  TN yang terjadi di Indonesia pada tahun 2014 dengan kematian mencapai 54 orang atau 64,3% (Sari, 2017).
Penyakit  tetanus  pernah  meningkat  di  Indonesia  saat  terjadi  tsunami  di  provinsi Nanggroe Aceh Darussalam pada 26 Desember 2004 silam. Pasien tetanus mencapai 106 kasus  dalam  kurun  waktu  yang  sangat  singkat.  Penyebab  kematian  dilaporkan  karena adanya  manifestasi  klinik  peneumonia,  dan  sarana  prasarana  kesehatan  yang  rusak  dan hilang  selama  kurun  waktu  yang  singkat  (Prawira,  Witari,  &  Tini,  2018).  Hal  ini menunjukkan  bahwa  tetanus  dapat  terjadi  kapan  saja,  termasuk  ketika  bencana  alam melanda.  Penyakit  ini  menjadi  ancaman  bagi  orang-orang  yang  berpotensi  terinfeksi Clostridium  tetani, terutama  yang  tidak  menerima  vaksin  tetanus.  Infeksi  dapat  terjadi akibat  tingkat  kebersihan  yang  masih  sangat  kurang,  perawatan  luka  yang  kurang diperhatikan, mudah terjadi kontaminasi, serta kurangnya kesadaran masyarakat terhadap pentingnya kebersihan dan kekebalan terhadap tetanus.
Menurut Leman & Tumbelaka, (2010) bahwa Secara klinis tetanus dibagi menjadi 4 derajat,  yaitu  derajat  I  (ringan),  derajat  II  (sedang),  derajat  III  (berat),  dan  derajat  IV (stadium terminal). Pengobatan infeksi penyakit ini dapat dilaksanakan dengan pemberian antibiotik, menetralkan toksin, pemberian obat antikonvulsan dan memberikan perawatan pada luka. Saat ini Indonesia telah memiliki beberapa pilihan untuk netralisasi toxin tetanus yaitu Anti Tetanus Serum (ATS) yang dihasilkan oleh plasma kuda (equine) atau Human Tetanus Immunoglobulin (HTIG)  yang  berasal  dari  plasma  darah  manusia.  Penggunaan serum  merupakan  bentuk  imunisasi  pasif  yang  diberikan  dengan  cara  menginjeksikan antibodi dalam tubuh sebagai pengobatan atau langkah preventif terhadap infeksi tetanus (Murwani, 2015).
Serum anti tetanus diproduksi dengan cara imunisasi aktif. Hewan donor diimunisasi dengan toksin yang telah dilemahkan, kemudian akan memicu dihasilkannya antibodi pada serum darah yang digunakan untuk melawan toksin yang sebelumnya telah diinjeksikan. Kuda merupakan donor yang sering digunakan karena kapasitas volume darahnya besar, sekitar  8%  dari  berat  tubuh.  Kuda  memiliki  kadar imunoglobulin G  yang  paling  tinggi sehingga  cocok  sebagai  hewan  donor  untuk  tujuan  penggunaan  protein  plasma  sebagai pengobatan teurapetik (Bertolini, J, Goss, N, Curling, 2013).
Serum  merupakan  produk  farmasi  yang  tergolong  sebagai  sediaan steril .  Sediaan steril adalah sediaan yang bebas dari cemaran mikroba patogen atau non patogen , mikroba vegetatif atau non vegetatif . Serum anti tetanus berfungsi untuk menetralkan toksin yang diproduksi  oleh  kuman  tetanus,  penggunaan  serum  anti  tetanus  secara  terus-menerus dianjurkan bagi orang yang mudah terserang tetanus dari luka, seperti orang dengan sejarah imunisasi yang tidak lengkap atau status imunisasinya tidak jelas (Sitti Fatmayani Marhaes &  Zaenab,  2018).  Rute  pemberian  serum  adalah  melalui  parenteral  yang  artinya disuntikkan langsung pada membrane kulit atau mukosa, sehingga sediaan ini harus bebas dari kontaminasi mikroba dan  toksin serta memiliki kemurnian yang tinggi. Oleh karena itu seluruh bahan, proses yang terlibat langsung dengan produksi sediaan ini harus dapat menjamin sterilitas, dan keamanan.
Proses  digestasi  enzim  pepsin  (pepsin  asi)  merupakan  metode  untuk  memisahkan fragmen F(ab)2 dari molekul antibodi (Satria Nugraha, 2020). Melalui proses ini didapat (Fab’)2  yang  merupakan  bagian  yang  spesifik  mengikat  antigen  sehingga  dapat menetralkan racun yang masuk ke dalam tubuh. Melihat masih tingginya kasus tetanus di negara  berkembang  serta  untuk  memberikan  pelayanan  terbaik  dan  pengobatan  efektif terhadap pasien yang terkena penyakit tetanus, maka diperlukan optimalisasi pada proses pembuatan  serum  anti-tetanus  sehingga  dapat  meningkatkan  kapasitas  produksi  dan kualitas serum yang dihasilkan. Oleh karena itu penelitian ini bertujuan untuk mengetahui optimalisasi  waktu  inkubasi  dan  konsentrasi  pepsin  pada  aktivitas  produksi  serum  anti tetanus .

## Metode Penelitian

## Desain Penelitian
Penelitian  ini  merupakan  penelitian  deskriptif  kuantitatif  dengan  teknik pengumpulan  data  melalui  observasi  dan  studi  pustaka.  Hasil  penelitian  merupakan deskripsi dari data kuantitatif pada desain penelitian eksperimental yang diperoleh selama observasi. Observasi penelitian dilakukan di Laboratorium QC PT. Bio Farma (Persero)
Profil  Penggunaan  Obat  Tradisional  di  Apotek  Sumber Waras
2021
yang beralamat di Jl. Pasteur No. 28, Pasteur, Kec. Sukajadi, Kota Bandung, Jawa Barat 40161.  Penelitian  dilakukan  selama  2  bulan,  yaitu  dari  bulan  April  sampai  Juni  2021. Penelitian  ini  meliputi  desain  penelitian,  bahan  penelitian,  alat  penelitian,  jalannya penelitian,  dan  analisis  data.  Analisis  data  menggunakan software khusus  densitometri pada Design  of  Experiment (DoE)    dengan  metode Sodium  Dodecyl  Sulphate Polyacrylamide Gel Elektroforesis (SDS PAGE).

## Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah plasma kuda anti tetanus, water for injection, stacking buffer, bis acrylamide 30%, resolving buffer, SDS 10 %, TEMED, larutan coomassie blue , larutan destaining (asam asetat), APS, tip kuning dan putih, dan microtube.

## Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah satu set SDS Page, waterbath, pH meter, timbangan elektrik, beaker glass, gelas ukur, syringe 30 mL, syringe filter 0,22 µm, termometer,  kulkas suhu 2-8° C, magnetic stirrer, magnetic bar, pipet tetes, tabung falcon 45 mL, stopwatch, vortex, termomixer, gel scanner, densitometry software program, spatel logam, mikropipet (0,1 µL, 10 µL, 2 mL), poolbox, dan nanodrop spektrofotometer.

## Jalannya Penelitian Pembuatan design of experiment
Pembuatan desain eksperimen meliputi proses yang telah diuji menggunakan tujuh sampel. Berikut hasil konsentrasi pepsin pada sampel anti tetanus.
Tabel 1. Hasil konsentrasi pepsin pada sampel anti tetanus No Sampel Waktu Konsentrasi Pepsin 1. ATS 1 1 jam 0,12 % (g/ml) 2. ATS 2 5 jam 0,12 % 3. ATS 3 3 jam 0,15 % 4. ATS 4 3 jam 0,15 % 5. ATS 5 3 jam 0,15 % 6. ATS 6 1 jam 0,18 % 7. ATS 7 5 jam 0,18 %

## Preparasi sampel plasma
Plasma  Kuda  anti  tetanus  dari  batch  yang  sama  diencerkan  dengan  WFI  dengan perbandingan  1:2,  disiapkan  gelas  beaker  1000  mL  dan  diisi  40 mL  sampel  plasma  anti tetanus dan diencerkan dengan 80mL WFI. Kemudian pH sampel disesuaikan dengan pH optimum  pepsin  asi  yang  sudah  ditentukan  yaitu  3,2  dengan  menambahkan  larutan  HCl dan dihomogenkan dengan menggunakan magnetic stirrer.

## Preparasi pepsinasi
Proses pepsinasi dilakukan di waterbath dengan suhu inkubasi 37ºC dengan waktu inkubasi dan konsentrasi pepsin disesuaikan Design of Experiment (DOE). Sampel plasma dimasukkan  waterbath  hingga  suhu  sampel  mencapai  37ºC,  kemudian  pepsin  Bovine ditimbang dan dimasukkan pada sampel. Setelah proses inkubasi selesai, sampel di filter dengan  menggunakan  syringe  filter  0,22  µm.  Proses  pepsinasi  dihentikan  dengan menaikkan pH sampel menjadi 6,5 dengan NaHCO3.
Volume 1, Nomor 11, November 2021 p-ISSN 2774-7018 ; e-ISSN 2774-700X

## Pengukuran konsentrasi
Sampel  plasma  hasil  pepsinasi  ditentukan  konsentrasinya  dengan  menggunakan Nanodrop  Spectrofotometer.  Instrumen  dinyalakan  kemudian  dipilih  menu  protein  UV, kemudian  dipilih  menu  Igg  Human  untuk  membaca  sampel  plasma.  Blanko  yang digunakan adalah WFI. Sebanyak 2µL sampel diukur dengan Nanodrop Spectrofotometer. Konsentrasi yang didapat digunakan untuk menyeragamkan konten yang akan dimasukkan dalam sumur gel SDS Page.

## Preparasi gel sds page
Gel  dibuat  dengan  menggunakan  bahan  poliakrilamid.  Gel  SDS-  PAGE  dibuat  2 jenis gel yaitu resolving gel dan stacking gel. Resolving gel adalah gel yang berada dibawah dan memiliki pori yang lebih kecil, berfungsi untuk memisahkan protein berdasarkan berat molekulnya. Sedangkan stacking gel adalah gel yang berada di atas mempunyai pori yang lebih  besar  yang  berfungsi  untuk  meratakan  dan  menyamakan  posisi  sampel  agar  dapat bermigrasi  secara  bersamaan.  Gel  dibuat  dengan  menggunakan  kaca  khusus  yang berukuran pendek dan panjang, dan menggunakan cetakan sisir untuk membentuk sumur pada stacking gel yang nantinya akan menjadi tempat meletakkan sampel. Gel yang telah dibuat  sebelum  digunakan  dapat  disimpan  di  dalam  buffer  running  yang  mengandung Tris/glycine/SDS.
Tabel 2. Komposisi gel SDS Page No Resolving gel Stacking gel 1 WFI 1700 µL WFI 975 µL 2 Bis Acrylamide 2000 µL Bis Acrylamide 268 µL 3 Resolving buffer 1250 µL Resolving buffer 415 µL 4 SDS 10 % 50 µL SDS 10 % 50 µL 5 APS (Ammonium Persulfat ) 70 µL APS (Ammonium Persulfat ) 20 µL 6 TEMED 10 µL TEMED 3,5 µL

## Preparasi sampel SDS Page
Sampel  plasma  hasil  pepsinasi  yang  telah  diukur  konsentrasinya  dengan menggunakan Nanodrop Spectrofotometer ditentukan volume yang akan dimasukkan pada sumur gel SDS Page dengan menyamakan konten. Dengan perhitungan yaitu Konten (µg) = Konsentrasi x Volume Sampel (µL). Kemudian siapkan microtube untuk masing-masing sampel.  SDS-  PAGE  yang  digunakan  pada  percobaan  ini  adalah  SDS-PAGE  Non- Reducing yaitu tidak menggunakan mercaptoethanol. Sampel dimasukkan pada microtube kemudian  ditambahkan  buffer  sampel  sebanyak  2  x  volume  sampel,  kemudian ditambahkan WFI sebagai pelarutnya, dengan volume total setiap sampel 10 µL, dengan konten  20  µg.  Sampel  kemudian  divortex  selama  7  detik  menggunakan  mini  spin  dan dipanaskan  menggunakan  thermo  mixer  dengan  suhu  70ºC  selama  10  menit.  Kemudian sampel terlebih dahulu dimasukkan ke dalam mini spin untuk memastikan tidak ada sampel yang masih menempel di dinding microtube .

## Running sds page
Set alat SDS Page disiapkan yang terdiri dari chamber, buffer DAM, buffer running, sumber tegangan, gel yang telah dibuat dan sampel. Gel dipasang pada chamber kemudian
chamber diisi dengan menggunakan buffer running hingga merendam seluruh gel. Bagian sumur  berada  diatas.  Kemudian  dimasukkan  ladder  atau  marker  protein  sebagai  tanda sebanyak  3  µL.  Sampel  dimasukkan  pada  sumur  dengan  menggunakan  mikropipet sebanyak  10  µg.  Setelah  selesai  chamber  ditutup  dan  dialiri  arus  listrik  dari  anoda  ke katoda. tegangan yang digunakan 100 V dengan waktu 110 menit.

## Staining and gel
Gel kemudian diangkat dari chamber dan dilepaskan dari kaca untuk dipotong pada bagian sumur. Kemudian gel dicuci dengan WFI dan  direndam dalam larutan staining yang berisi coomassie  blue selama  1  jam  dengan  bantuan  roller  mixer  agar  proses  pewarnaan merata. Kemudian gel didistaining selama 2 jam dengan bantuan roller mixer.

## Analisis Data
Gel  yang  sudah  diwarnai  kemudian  di  scan  dengan  menggunakan  UV  Scanner. Kemudian hasil scan dianalisis menggunakan software khusus densitometri untuk melihat ukuran pita-pita protein setelah dilakukan proses pepsinasi.

## Pengujian Titer Plasma
Pengujian  nilai  titer  plasma  berfungsi  untuk  mengetahui  kadar  potensi  dari  suatu antibodi.  Pengujian  titer  dilakukan  dengan  prinsip  pembentukan  flokulan  (metode flokulasi)  dengan  mereaksikan  antigen  dengan  antibodi.  Antibodi  direaksikan  dengan antigen  (toksoid  tetanus)  dalam  NaCl  0,85  %  fisiologis.  Kemudian  reaksi  dipercepat dengan bantuan panas. Penghitungan nilai titer antibodi menggunakan satuan Lf (Limit of Flocculation)  yang  menyatakan  jumlah  toksoid  yang  direaksikan  dengan  1  IU (International  standard  Antitoxin ).  Waktu  yang  diperlukan  untuk  terbentuk  flokulan pertama (Kf) menunjukan indikator pada kualitas antigen dan antibodi (Coombs, Rigsby, Sesardic, & Stickings, 2016).

## Hasil dan Pembahasan
Proses pembuatan fragmen poliklonal antibodi untuk tujuan pengobatan dilakukan melalui beberapa step design dalam perkembangannya untuk meningkatkan efektifitas dan mengurangi efek samping dari produk antibodi. Proses pembuatan serum anti tetanus yang berasal dari kuda dilakukan dengan mengimunisasi hewan donor dengan racun yang telah dilemahkan  secara  berulang  dan  terjadwal,  hingga  mendapatkan  potensi  atau  titer  yang tinggi  untuk  diproduksi  sebagai  serum.  Hewan  donor  kemudian  diambil  darahnya  dan dipisahkan plasma dengan sel-sel darah yang lain.
Pepsin  merupakan  protease  yang  dapat  memotong  antibodi  menjadi  fragmen- fragmennya. Dalam memproduksi serum anti tetanus atau anti venom yang lain fragmen yang dituju adalah (Fab’) yang merupakan bagian yang spesifik mengikat antigen sehingga dapat  menetralkan  racun  yang  masuk  kedalam  tubuh.  Fragmen  crystallizable  (Fc) merupakan fragmen yang berfungsi sebagai situs pengenalan sel-sel efektor yang spesifik (Mentari, 2018). Dilaporkan bahwa keberadaan Fc dan protein agregat dapat menimbulkan efek  samping  dalam  penggunaan  serum  yang  berasal  dari  kuda  (equine).  Pepsin  dapat memotong antibody menjadi fragmen (Fab’)2 dan Fc dengan cara memutus secara spesifik ikatan amida dengan terminal N dari asam amino aromatic seperti ( fenilalanin, tirosin dan triptofan sehingga residu asam amino hasil hidrolisis dengan pepsin diharapkan memiliki berat molekul yang lebih kecil (Hermanto. S., Sumarlin. L.O., Fatimah. W., 2013).
Volume 1, Nomor 11, November 2021 p-ISSN 2774-7018 ; e-ISSN 2774-700X
Percobaan ini dilakukan dengan memvariasikan konsentrasi pepsin yang digunakan dan  waktu  inkubasi  plasma.  Respon  yang  diamati  adalah  luasan  area  (Fab’)2  dengan menggunakan  SDS  PAGE  dan  Densitometri  serta  respon  titer  plasma  dengan menggunakan  uji  flokulasi.  Pepsin  yang  digunakan  adalah  pepsin  Bovine,  plasma  diatur pH  3,2  dengan  penambahan  HCl  dan  suhu  inkubasi  37ºC.  Proses  pepsinasi  dihentikan dengan menaikkan pH menjadi 6,5 meggunakan NaHCO 3 . Berdasarkan hasil SDS PAGE, dapat diamati ditiap line terapat pita-pita protein yang diduga merupakan IgG ± 150 kDa, (Fab’)2 ± 110 kDa dan Fab ± 55 kDa. Berikut gambar gel SDS Page setelah di Scan dan hasil densitometri selama percobaan di PT Bio Farma:
Gambar 1. Gel SDS Page setelah di Scan (Percobaan di PT Bio Farma)
Gambar 2. Hasil densitometri (Percobaan di PT Bio Farma)
Berdasarkan densitomeri, didapatkan luas area (Fab’)2 setiap sampel yaitu:
Profil  Penggunaan  Obat  Tradisional  di  Apotek  Sumber Waras
Tabel 3. Luasan (Fab’)2 hasil densitometri Sampel Luas (Fab’) 2 (Pixel) A1 5.980 A2 5.292 A3 6.298 A4 4.824 A5 6.030 A6 4.992 A7 16786 (Fab) = 13.244 dan (Fab’)2 = 3.542
Berdasarkan analisis titer menggunakan uji flokulasi, diperoleh titer plasma setelah proses pepsinasi sebagai berikut:
Tabel 4. Hasil uji titer plasma ATS No Sampel Titer (LF) 1 Sebelum 240 2 A1 240 3 A2 260 4 A3 260 5 A4 260 6 A5 220 7 A6 220 8. A7 5000
Berdasarkan tabel di atas, pada A7 sampel plasma dengan konsentrasi pepsin 0,18 % dan inkubasi selama 5 jam diperoleh nilai titer yang sangat tinggi. Analisis menggunakan design  of  experiment  dilakukan  dengan  menggunakan software  mode .  Faktor  yang dimasukkan adalah konsentrasi pepsin dan waktu inkubasi. Sedangkan respon yang hendak diamati yaitu luasan area (Fab’)2 dan nilai titer plasma. Kemudian dapat dilihat interpretasi hasil analisis design of experiment .
Gambar 3. Area Fab’2 dan titer plasma pasca pepsinasi (PT Bio Farma)
Volume 1, Nomor 11, November 2021 p-ISSN 2774-7018 ; e-ISSN 2774-700X
Dari  grafik  diatas  diperoleh  hasil  area  merah  merupakan  hasil  pepsinasi  optimum yang  diperoleh,  dapat  diamati  bahwa  A7  menggambarkan  respon  yang  paling  optimum namun  dengan  luas  (Fab’2)  yang  sebetulnya  kecil.  Luasan  area  yang  diduga  Fab memberikan  gambaran  linear  dengan  hasil  titer  yang  didapatkan.  Dugaan  penulis konsentrasi pepsin 0,18 % dengan waktu inkubasi 5 jam menyebabkan (Fab’)2 terpotong lagi menjadi Fab dengan berat molekul ± 55 kDa. Hal itu kemungkinan dapat terjadi saat pepsin  memotong  ikatan  disulfida  yang  menghubungkan  antar  Fab.  Fab  merupakan antibody  binding  site  dengan  dengan  satu  sisi  perlekatan  antigen  (monovalen).  Fragmen (Fab’)2 karena memiliki berat molekul yang lebih besar, penggunaannya pun akan lebih efektif  dilihat  dari  prinsip  toxin  serta  farmakokinetik  dan  farmakodinamik,  waktu  paruh dari  (Fab’)2  lebih  lama.  Penggunaan  Fab  dalam  netralisasi  suatu  toxin  memiliki karakteristik  yaitu  cepat  dieliminasikan  oleh  tubuh  karena  memiliki  berat  molekul  yang lebih  rendah,  Fab  akan  sangat  efektif  dalam  menetralkan  toxin  atau  neurotoxin  dengan berat  molekul  rendah  yang  akan  cepat  di  distribusi  dan  cepat  dieliminasikan  dari  tubuh, seperti racun kalajengking dan laba-laba (World Health Organization, 2017).

## Kesimpulan
Proses  Pepsinasi  dilakukan  dengan  mengoptimalkan  pH  di  3,2  dan  suhu  inkubasi 37ºC, kemudian diberi pepsin sebagai enzim protease, kemudian dihentikan aktivitas enzim dengan  menaikkan  pH  menjadi  6,5  menggunakan  NaHCO 3, kemudian  dianalisis  hasil pepsinasi  dengan  menghitung  titer  ATS  dan  analisis  area  (Fab’)2  dengan  menggunakan SDS  PAGE.  Konsentrasi  optimum  didapatkan  pada  sampel  Anti  Tetanus  ke  7  dengan konsentrasi pepsin sebesar 0,18 % dengan waktu inkubasi 5 jam.
. Bibliografi . Ade,  Siam  Wulandari.  (2016). Laporan  Tugas  Akhir  Asuhan  Kebidanan  Komprehensif Pada Ny.” A” G2p1001 Dengan Anemia Ringan Wilayah Kerja Puskesmas Graha Indah Balikpapan .
Bertolini,  J,  Goss,  N,  Curling,  J.  (2013).  Production  of  Plasma  Proteins  for  Therapeutic Use. In Proteomics (Vol. 13). https://doi.org/10.1002/pmic.201370099
Coombes,  Laura,  Rigsby,  Peter,  Sesardic,  Dorothea,  &  Stickings,  Paul.  (2016). Collaborative  study  for  the  calibration  of  a  replacement  International  Standard  for diphtheria  toxoid  for  use  in  flocculation  test. Biologicals , 44 (6),  556–566. https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2016.07.005
Harum, Aroma. (2014). Dental Caries as a Risk Factor of Tetanus. Jurnal Medula, 3(02), Hermanto. S., sumarlin. L.O., Fatimah. W. (2013). Differentiation of Bovine and Porcine Gelatin Based on Spectroscopic and Electrophoretic Analysis. Analytical Chemistry , 24 (12), 1949–1952. https://doi.org/10.1021/ac60072a021
Leman, Martinus M., & Tumbelaka, Alan R. (2016). Penggunaan Anti Tetanus Serum dan Human Tetanus Immunoglobulin pada Tetanus Anak. Sari Pediatri , 12 (4), 283–288. Mentari,  Anoraga  Mona  Larasati  Sekar.  (2018). Engaruh  Cheral  Terhadap  Kuantitas Relatif  Sel  Natural  Killer,  Tnf-Α  Dan  Ifn-Γ  Pada  Mencit  (Mus  Musculus)  Model Kanker Payudara . Malang: Universitas Brawijaya. Murwani, Sri. (2015). Dasar-dasar Mikrobiologi veteriner . Malang: Universitas Brawijaya Press.
Prawira, Tu Bagus Adnan Angga, Witari, Ni Putu, & Tini, Kumara. (2018). Faktor–faktor yang berhubungan dengan luaran klinis pasien tetanus di RSUP Sanglah pada bulan
Januari 2018–Oktober 2019. Metode , 2019 . Rahmanto, Danawan, & Farhanah, Nur. (2017). Faktor-Faktor Risiko yang Berpengaruh pada Kematian Pasien Tetanus di RSUP Dr. Kariadi Semarang . Faculty of Medicine. Sari, Selvy Novita. (2017). Risk Analyses Factor of Infant Mortality Caused by Tetanus Neonatorum in East Java. Jurnal Berkala Epidemiologi , 5 (2), 231–239. Satria  Nugraha,  Reza.  (2020). Optimalisasi  Proses  Digestasi  Enzim  Pepsin  pada Serum Anti Difteri Menggunakan SDS PAGE .
Sitti Fatmayani Marhaes, Penulis, & Zaenab, Sitti. (2018). Pengaruh Pemberian Imunisasi Dpt  Terhadap  Perubahan  Suhu  Tubuh  Pada  Bayi  Usia  3–12  Bulan  Di  Puskesmas Poasiakota  Kendari  Provinsi  Sulawesi  Tenggara  Tahun  2018 .  Sulawesi  Tenggara: Poltekkes Kemenkes Kendari. World Health Organization. (2017). Guidelines for the production, (Vol. 148).
Yani,  Wine  Frindi,  &  Munawaroh,  Madinah.  (2020).  Sikap  Ibu,  Dukungan  Suami  dan Peran Tenaga Kesehatan Berhubungan dengan Pelaksanaan Imunisasi TT Ibu Hamil. Jurnal Ilmiah Kebidanan Indonesia , 10 (02), 34–41.
This work is licensed under a Creative Commons Attribution- ShareAlike 4.0 International License.