Corresponding Author: Diah Pratimasari Bachelor Pharmacy, Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan Nasional, Indonesia Jl. Raya Solo - Baki, Bangorwo, Kwarasan, Kec. Grogol, Kabupaten Sukoharjo, Jawa Tengah 57552 Email: diah_pratimasari@stikesnas.ac.id
This is an open-access article under the CC BY-SA license.
Uji Aktivitas Ekstrak Terpurifikasi Daun Umbi Bit ( Beta vulgaris ) Sebagai Antioksidan dan Penetapan Kadar Flavonoid Totalnya
Activity Test Of The Purified Extract Bit Leaves (Beta vulgaris) as Antioxidant and Determination Of Total Flavonoid Content
Diah Pratimasari 1* , Dian Puspitasari 2 , Noor Anisa Mahanani 3 1,2,3 Bachelor Pharmacy, Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan Nasional, Indonesia
Article Info ABSTRAK Article history: Received    10,20,2021 Revised      11,29,2023 Accepted    12,12,2023
Ekstrak etanol  daun umbi bit memiliki kandungan senyawa fenol dan flavonoid yang tinggi, sehingga dapat berpotensi sebagai antioksidan. Ekstrak etanol daun umbi bit memiliki kelemahan masih tercampur dengan komponen lain yang tidak diperlukan sehingga  pengembangan  sediaannya  menjadi  terbatas.  Terkait  hal  tersebut, penelitian  ini  bermaksud  untuk  menghilangkan  senyawa  yang  tidak  dibutuhkan sebagai  antioksidan,  serta  untuk  melihat  pengaruh  purifikasi  terhadap  aktivitas antioksidan dan kadar flavonoid total dalam ekstrak. Ekstrak terpurifikasi diperoleh melalui  fraksinasi  suspensi  ekstrak  daun  umbi  bit  dengan  menggunakan  pelarut yang  berbeda  polaritasnya  secara  berurutan  yaitu  n-heksana  dan  etil  asetat.  Uji aktivitas antioksidan dilakukan terhadap Ekstrak Etanol Daun Umbi Bit (EEDUB), Ekstrak Terpurifikasi Daun Umbi Bit (ETDUB) dan kuersetin sebagai kontrol positif. Aktivitas  antioksidan  dilakukan  dengan  menggunakan  2,2-Diphenyl-1- Picrylhyidrazil  (DPPH).  Kadar  flavonoid  total  dari  EEDUB  dan  ETDUB  ditentukan dengan spektrofotometer menggunakan AlCl3. Aktivitas antioksidan yang dihasilkan EEDUB adalah  IC50 157,87  µg/mL, sedangkan ETDUB  memiliki nilai IC50 129,60 µg/mL. Kadar flavonoid total dari EEDUB adalah 2,82% ± 0,85 QE, sedangkan kadar flavonoid  total  ETDUB  adalah  2,90  ±  1,16  %  QE.  Hasil  penelitian  menunjukkan bahwa EETDUB memiliki kadar kandungan flavonoid dan aktivitas antioksidan yang lebih baik dibandingkan EEDUB. Hal ini juga menunjukkan proses purifikasi ekstrak pada daun umbi bit belum maksimal
Kata kunci DPPH Kolorimetri Spektrofotometer UV Fraksinasi Keywords: DPPH
Colorimetry
Spectrophotometer UV
Fractionation

## ABSTRACT
The ethanol extract of beetroot leaves contains high levels of phenolic and flavonoid compounds, making it potentially beneficial as an antioxidant. However, the ethanol extract  of  beetroot  leaves  has  a  disadvantage  as  it  is  still  mixed  with  other components  that  are  not  necessary,    limiting  its  formulation  development.    In relation to this,  the purpose of this research is to eliminate unwanted compounds as antioxidants and to observe the impact of purification on the antioxidant activity and total  flavonoid  content  of  the  extract.  The  production  of  purified  extract  involves fractionating the suspension of beetroot leaf extract using solvents  with  different polarities, namely n-hexane and ethyl acetate, in sequence. Antioxidant activity tests are conducted on Ethanol Extract of Beetroot Leaves (EEDUB), Purified Extract of Beetroot Leaves (ETDUB), and quercetin as a positive control. Antioxidant activity is assessed using 2,2-Diphenyl-1-Picrylhydrazyl (DPPH). The total flavonoid content of EEDUB  and  ETDUB  is  determined  with  a  spectrophotometer  using  AlCl3.  The antioxidant activity of EEDUB is indicated by an IC50 value of 157.87 µg/mL, while ETDUB has an IC50 value of 129.60 µg/mL. The total flavonoid content of EEDUB is 2.82% ± 0.85 QE, and for ETDUB, it is 2.90% ± 1.16 QE. The research results show that  ETDUB  has  a  higher  flavonoid  content  and  antioxidant  activity  compared  to EEDUB. This also indicates that the purification process of the beetroot leaf extract has not reached its maximum effectiveness.

## 1. PENDAHULUAN
Ketidakseimbangan radikal bebas dalam tubuh dapat mengakibatkan berbagai macam penyakit diantaranya diabetes melitus, heart disease , atherosclerosis , penyakit liver dan kanker [1] Kondisi tersebut memerlukan asupan antioksidan dari luar tubuh untuk menyeimbangkan reaksi dari radikal bebas tersebut. Flavonoid adalah senyawa bahan alam dengan potensi antioksidan [2]
Senyawa flavonoid tersebar luas di alam dalam buah-buahan maupun sayuran, salah satunya adalah daun umbi bit [3], [4]. Tanaman bit adalah tanaman yang berasal dari wilayah mediterania. Tanaman ini banyak dimanfaatkan sebagai asupan untuk diet [3]. Buah bit mengandung pigmen betalanin yang menyebabkan warna umbi buah bit ( Beta vulgaris ) memiliki warna merah keunguan. Pigmen tersebut juga terdapat dalam daun umbi bit. Selain mengandung betalanin, daun umbi bit juga kaya akan flavonoid, terutama  kuersetin  dan  kaemferol,  vitamin,  mineral,  glikosida,  saponin,  tannin  dan komponen fenolik lainnya[4].
Ekstrak etanol  daun umbi bit memiliki kandungan fenolik yang tinggi yaitu 16,55 mg  GAE/g  FW  dan  kandungan  flavonoid  yang  juga  tinggi  yaitu  1,5  mg  QE/g  FW[3]. Namun, ekstrak kasar memiliki kelemahan yaitu masih tercampur dengan komponen lain yang tidak diperlukan sehingga pengembangan sediaannya akan terbatas. Purifikasi ekstrak dapat dilakukan untuk menghilangkan senyawa-senyawa yang tidak dinginkan seperti klorofil, lemak, dan resin dari ekstrak terpurifikasi daun umbi bit ( Beta vulgaris L) sebagai antioksidan.
Penelitian  sebelumnya  menunjukkan  bahwa  proses  purifikasi  ekstrak    secara langsung  menggunakan  etil  asetat  menghasilkan  total  flavonoid  yang  tidak  berbeda signifikan  dengan  ekstrak  kasarnya  [5].  Hal  tersebut  mendasari  penelitian  ini  untuk melakukan  proses  fraksinasi  secara  bertingkat  dengan  menggunakan  pelarut  yang berbeda  polaritasnya.  Kebaruan  pada  penelitian  ini  adalah  adanya  proses  purifikasi terhadap  ekstrak  etanol  daun  umbi  bit,  sehingga  diharapkan  dapat  menghasilkan berupa ekstrak umbi bit yang terpurifikasi dengan baik sehingga lebih optimal dalam memberikan aktivitas antioksidan.

## 2. METODE

## 2. 1. Alat dan Bahan
Alat yang dipergunakan oven (Memmert®), rotary evaporator (IKA®), waterbath (Memmert®),  spektroskopi  UV-Vis  (Shimidzu®),  kuvet  (Hellma®), moisture  balance (Radwag®), corong pisah (Iwaki®). Bahan yang dipergunakan diantaranya adalah daun Beta  vulgaris var  Ribra  (L)  Moq.),  pelarut  teknis  (etanol  70%,  n-heksana,  etil  asetat), pelarut  pro  analisis:  etanol  (Merck®), 2,2-Diphenyl-1-Picrylhyidrazil (Sigma  Aldrich®), AlCl3 ((Merck®), Standar kuersetin (Sigma Aldrich®).

## 2. 2. Cara kerja Persiapan Bahan
Daun Beta  vulgaris yang  dipanen  dari  Kecamatan  Selo,  Boyolali,  Jawa  Tengah disortasi basah, dilanjutkan dengan pencucian dan perajangan. Rajangan daun umbi bit kemudian dikering anginkan selama kurang lebih 24 jam. Selanjutnya proses pengeringan dilakukan  menggunakan  oven  pada  suhu  40 o C,  dihaluskan  menggunakan  blender  dan diayak dengan mesh no 60.
Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Umbi Bit (EEDUB).
Serbuk simplisia daun umbi bit sebanyak 1 kg di maserasi dengan 7,5 Liter etanol teknis  70%  selama  total  5  hari.  Pada  hari  ke-3  dilakukan  proses  penyaringan  dan
perendaman kembali dengan pelarut yang sama sebanyak 2,5 liter selama sisa waktunya. Ekstrak cair yang dihasilkan perendaman pertama serta kedua kemudian digabung dan dipekatkan hingga kental.

## Pembuatan Ekstrak Terpurifikasi Daun Umbi Bit (ETDUB).
EEDUB ditimbang sebanyak 20 gram dan disuspensikan dalam 50 mL etanol 30%. Kemudian  dilakukan  purifikasi  dengan  metode  fraksinasi  menggunakan  pelarut  yang berbeda polaritasnya secara berurutan. Pelarut pertama yang digunakan adalah pelarut n-heksana  dengan  perbandingan  1:1  dengan  etanol  30%.  Setelah  itu  fraksinasi dilanjutkan  dengan  pelarut  etil  asetat.  Fraksi  etil  asetat  yang  diperoleh  selanjutnya dipekatkan, hingga diperoleh ekstrak kental terpurifikasi daun umbi bit (ETDUB) [6]

## Kontrol Kualitas EEDUB dan ETDUB
Kontrol kualitas EEDUB dan ETDUB dilakukan berdasarkan pengamatan tampilan fisik masing-masing ekstrak dan analisis kandungan fitokimianya. Kandungan fitokimia yang dianalisis adalah senyawa polifenol, flavonoid, saponin, alkaloid dan steroid dengan menggunakan reagen untuk skrining fitokimia [7]

## Uji Aktivitas Antioksidan EEDUB dan ETDUB
Aktivitas antioksidan EEDUB dan ETDUB dilakukan menggunakan metode yang disesuaikan  dari  penelitian  Murwanto  dan  Santosa  (2012).  Konsentrasi  larutan  baku DPPH adalah 0,4 mM dalam etanol pa. Larutan uji dibuat dengan mereaksikan 2,0 mL larutan baku DPPH dan sampel uji pada beberapa konsentrasi kemudian dicukupkan volumenya dengan etanol pa dan ditunggu selama 35 menit. Larutan uji yang dihitung aktivitas  penghambatan  oksidannya  adalah  EEDUB,  ETDUB  dan  kontrol  positif  yaitu kuersetin.  Larutan    kontrol  dan  berbagai  larutan  uji  setelah  ditunggu  35  menit, kemudian  dilanjutkan  dengan  pengukuran  absorbansi  menggunakan  alat spektrofotometer  UV-Vis.  Absorbansi  tersebut  selanjutnya  di  hitung  %  penangkap radikal dengan menggunakan persamaaan 1 :
𝐀𝐛𝐬 𝐤𝐨𝐧𝐭𝐫𝐨𝐥 𝐃𝐏𝐏𝐇  − 𝐀𝐛𝐬 𝐒𝐚𝐦𝐩𝐞𝐥
𝐀𝐛𝐬 𝐤𝐨𝐧𝐭𝐫𝐨𝐥 𝐃𝐏𝐏𝐇
Pengujian untuk masing-masing larutan uji kemudian dibuat persamaan regresi liniernya dimana  (x)  merupakan  konsentrasi  sample,  dan  (y)  adalah  %  penghambatan  radikal. Hasil persamaan regresi linier selanjutnya digunakan untuk menentukan nilai Inhibitory Concentration ( IC50) [8]

## Penentuan Kadar Flavonoid Total EEDUB dan ETDUB
Kadar  flavonoid  total  ditentukan  dengan  Metode  yang  dimodifikasi  dari  penelitian Krisridwani et al. (2021). Penentuan kadar diawali dengan membuat persamaan regresi linier kuersetin pada 5 konsentrasi baku kuersetin yaitu 50, 70, 90, 110 dan 130 dalam pelarut etanol pa. 1,0 mL masing-masing varian konsentrasi kuersetin ditambahkan 1,0 mL  AlCl 3 10%  dan  8  mL  CH 3 COOH  5%.  Larutan  tersebut  direaksikan  selama  OT  dan absorbansinya dianalisis menggunakan panjang gelombang maksimum. 0,035 g EEDUB dan 0,035 g ETDUB dilarutkan dengan etanol pa hingga volumenya 10,0 mL. Selanjutnya, direaksikan  dengan  proses  yang  sama  seperti  kuersetin,  hingga  diperoleh  absorbansi pada masing-masing sampel [9]

## 3. HASIL
Persentase rendemen dari EEDUB dan ETDUB ditampilan pada Tabel 1. Tabel 1. Persentase Rendemen No Jenis Ekstrak Presentase (%) 1 EEDUB 7,25 2 ETDUB 32
Identifikasi  terhadap  kandungan  kimia  EEDUB  dan  ETDUB  dilakukan  dengan  mengamati terbentuknya endapan dan atau perubahan warna yang terjadi pada EEDUB dan ETDUB. Hail identifikasi tersebut ditampilkan pada Tabel 2.
Tabel 2. Perbandingan kandungan kimia EEDUB dan ETDUB
Senyawa EEDUB ETDUB Polifenol + + Flavonoid + + Saponin + + Alkaloid + + Steroid - -
Keterangan : (+) Mengandung senyawa, (-) Tidak mengandung senyawa
Aktivitas antioksidan EEDUB, ETDUB dianalisis melalui kurva hubungan antara konsentrasi EEDUB dan  ETDUB  dengan  %  penghambatan  radikal  yang  dituangkan  pada Gambar  1 ,  sedangkan  hubungan konsentrasi kuersetin dengan % penghambatan radikal ditampilkan pada Gambar 2 . Nilai IC 50 dari EEDUB dan ETDUB dibandingkan dengan nilai flavonoid total yang diperoleh pada Gambar 3.
Gambar 1. Grafik Hubungan Konsentrasi dan % Penghambatan Radikal dari EEDUB dan ETDUB
Gambar 2. Grafik Hubungan Konsentrasi dan % Penghambatan Radikal dari Kuersetin
Gambar 3. Profil nilai IC 50 dan kadar flavonoid total pada EEDUB serta ETDUB
Kadar  flavonoid  total  EEDUB  dan  ETDUB  ditetapkan  menggunakan  metode  kolorimetri  dengan spektrofotometer,  pada  panjang  gelombang  414  nm.  Hasil  penetapan  kadar  flavonoid  total  tersebut ditampilkan pada Tabel 3.
Tabel 3. Hasil Penetapan Kadar Flavonoid Total EEDUB dan ETDUB
Sampel Kadar Flavonoid (%QE) Kadar Flavonoid rata- rata ± SD (%QE) EEDUB 2,79 2,82± 0,02 2,85 2,81 ETDUB 2,86 2,90 ± 1,16 2,90 2,94

## 4. PEMBAHASAN
Daun umbi bit merah yang digunakan pada penelitian ini adalah daun umbi bit yang dipanen pada pagi hari. Hal ini bertujuan untuk menghindari proses transpirasi yang dapat menurunkan kualitas dari simplisia [10]. Daun umbi bit yang telah dipanen di  sortasi  basah  untuk  menghilangkan  tanah,  maupun  komponen  lain  yang  tidak diinginkan dan dilanjutkan dengan proses pencucian. Daun umbi bit yang sudah bersih kemudian  di  rajang  untuk  memudahkan  proses  pengeringan.  Proses  pengeringan dimulai  dengan  mengering-anginkan  daun  umbi  bit  yang  telah  dicuci  selama  kurang lebih  24  jam,  untuk  mempersiapkan  daun  umbi  bit  sebelum  dikeringkan  dengan menggunakan oven. Hal ini dilakukan agar mencegah terjadinya kebusukan pada daun umbi bit, karena daun umbi bit memiliki sifat yang cenderung basah. Setelah dilakukan kering-angin, sampel daun bit kemudian di keringkan dengan menggunakan oven pada suhu 40 o C untuk meminimalisir terjadinya kerusakan senyawa flavonoid yang bersifat termolabil [11]
Metode ekstraksi yang digunakan untuk mengekstraksi simplisia daun umbi bit adalah maserasi. Metode ini merupakan metode ekstraksi dingin sehingga sesuai untuk menarik  senyawa  metabolit  sekunder  yang  termolabil  seperti  flavonoid.  Kadar flavonoid dalam bahan alam dapat berkurang 15-78% jika mengalami pemanasan pada proses  ekstraksinya  [12].  Pada  proses  maserasi  dilakukan  penggantian  pelarut  yang bertujuan  untuk  mencegah  kejenuhan  larutan,  sehingga  proses  ekstraksi  berjalan dengan optimal.
Rendemen ekstrak kental daun umbi bit (EEDUB) yang diperoleh adalah 7,25%. Ekstrak  kental  kemudian  dipurifikasi  dengan  menggunakan  metode  partisi  cair-cair.
15 7.87 12 9.6 2.82 2.9 E E D U B E T D U B IC50 (µg/mL)
Kadar Flavonoid Total (%QE)
Purifikasi  ekstrak  bertujuan  untuk  menghilangkan  komponen-komponen  yang  tidak dibutuhkan pada ekstrak seperti klorofil, lemak maupun klorofil, sehingga ekstrak yang dihasilkan  diharapkan  dapat  menghasilkan  aktivitas  yang  lebih  baik.  Purifikasi dilakukan  melalui  partisi  cair-cair  menggunakan  corong  pisah.  Prinsip  metode purifikasi dengan metode partisi adalah memisahkan zat-zat dengan polaritas tertentu menggunakan  pelarut  yang  sesuai  polaritasnya.  Hal  ini  didasarkan  pada  prinsip like dissolve like. Pelarut pelarut n-heksan yang bersifat non polar digunakan untuk menarik senyawa-senyawa  yang  bersifat  non  polar  dan  dilanjutkan  dengan  penarikan menggunakan  etil  asetat  yang  bersifat  semi  polar . Rendemen  Ekstrak  Terpurifikasi Daun Umbi Bit (ETDUB) yang dihasilkan dibandingkan dengan ekstrak kasarnya adalah 32%.
Kontrol kualitas terhadap masing-masing ekstrak dilakukan dengan melakukan analisis  terhadap  tampilan  fisik  dari  masing-masing  ekstrak  dan  kandungan fitokimianya. EEDUB memiliki warna coklat kehijauan yang pekat, sedangkan ETDUB memiliki  warna  yang  coklat  yang  lebih  terang  dan  sedikit  kemerahan.  Selanjutnya, dianalisis kandungan fitokimia pada EEDUB dan ETDUB dengan menggunakan reagen tertentu. Hasil pengujian kandungan fitokimia ditampilkan pada tabel 2. Berdasarkan tabel 2 terdapat kesamaan profil kandungan fitokimia pada EEDUB dan ETDUB yaitu sama-sama  mengandung  polifenol,  flavonoid,  saponin  dan  alkaloid,  serta  negatif mengandung  steroid.  Hal  ini  dapat  menunjukkan  bahwa  proses  purifikasi  yang dilakukan pada EEDUB belum maksimal memisahkan kandungan-kandungan yang ada pada  ekstrak.  Namun  berdasarkan  data  rendemen  ETDUB  terhadap  ekstrak  dapat dilihat ada kemungkinan senyawa yang dihilangkan pada proses purifikasi. Hal tersebut juga  diperkuat  dengan  tampilan  fisik  dari  kedua  ekstrak  tersebut.  ETDUB  memiliki warna  yang  lebih  cerah  dibandingkan  dengan  EEDUB.  Hal  ini  dapat  disebabkan  oleh hilangnya  kandungan  klorofil,  lipid  ataupun  zat  ballast  yang  terjadi  pada  proses purifikasi dengan menggunakan n-heksana. Selain itu warna kemerahan pada ETDUB dapat  disebabkan  karena  kandungan  pigmen  warna  yang  lebih  tertarik  pada  pelarut yang lebih polar dibandingkan n-heksana.
EEDUB dan ETDUB kemudian dianalisis aktivitas antioksidannya menggunakan DPPH.  DPPH ● adalah  suatu  molekul  radikal  yang  memiliki  sifat  stabil.  Penentuan aktivitas antioksidan suatu senyawa didasarkan pada kemampuan suatu senyawa untuk mendonorkan elektron maupun atom hidrogennya pada radikal DPPH, sehingga dapat menetralkan sifat radikal DPPH [13]. Reaksi netralisasi radikal ditandai dengan peruban warna  dari  ungu  pekat  menjadi  kuning  pucat  sampai  tidak  berwarna  [14].  Reaksi tersebut ditampilkan pada Gambar 4. Proses tersebut juga ditandai dengan terjadinya penurunan absorbansi DPPH ketika diamati dengan spektrofotometer UV-Vis.
Gambar 4. Reaksi antioksidan dan radikal DPPH [14]
Panjang  gelombang  DPPH  yang  diperoleh  pada  masing-masing  konsentrasi adalah  515  nm.  Panjang  gelombang  ini  mendekati  panjang  gelombang  DPPH  yang digunakan  oleh  Purwanto et  al .  (2021)  [15].  Selain  penetapan  panjang  gelombang maksimal,  salah  satu  parameter  yang  ditentukan  sebelum  pengujian  aktivitas antioksidan  adalah Operating  Time  (OT). OT  diamati  terhadap  kuersetin  yang direaksikan dengan DPPH pada setiap menit hingga diperoleh absorbansi yang konstan. Hal  tersebut  menunjukkan  bahwa  reaksi  yang  terjadi  antara  DPPH dengan  kuersetin telah terjadi sempurna. OT yang digunakan pada penelitian ini adalah 35 menit. Penetapan  aktivitas  antioksidan  dilakukan  terhadap  EEDUB,  ETDUB  dan kuersetin.  Kuersetin  berperan  sebagai  kontrol  positif.  Hal  ini  dikarenakan,  kuersetin merupakan senyawa flavonoid yang memiliki aktivitas antioksidan [8]. Kontrol positif digunakan  untuk  memastikan  validitas  metode  yang  digunakan.  Persentase penghambatan  radikal  didapatkan  dari  hubungan  antara  konsentrasi  dengan  % penghambatan  radikal.  Gambar  1  memberikan  informasi  bahwa  konsentrasi  EEDUB dan ETDUB yang bereaksi dengan DPPH semakin tinggi akan menghasilkan persentase penghambatan radikal yang semakin tinggi. Hal ini serupa juga dengan kuersetin yang memiliki  %  penghambatan  yang  semakin  tinggi    ketika  konsentrasinya  ditingkatkan. Selain informasi tersebut, Gambar 1 dan Gambar 2 menunjukkan terjadinya perbedaan konsentrasi  yang  cukup  jauh  antara  EEDUB  dan  ETDUB  jika  dibandingkan  dengan kuersetin  dalam  menghambat  radikal.  Konsentrasi  penghambatan  antioksidan dituangkan dalam nilai IC 50 . IC 50 adalah konsentrasi  penghambatan 50% radikal oleh suatu senyawa. Nilai IC 50 diperoleh dengan memasukkan nilai 50 sebagai nilai Y pada kurva  baku  yang  diperoleh  dengan  membuat  hubungan  antara  konsentrasi  dan  % penghambatan pada tiap sampel pengujian.
IC 50 dapat  digunakan  untuk  melihat  kekuatan  aktivitas  antioksidan  dari  suatu senyawa.  Tabel  4  menunjukkan  kategori  kekuatan  aktivitas  antioksidan  berdasarkan nilai IC 50 .
Tabel 4. Kategori antioksidan berdasarkan nilai IC 50 [16] Nilai IC 50 (µg/mL) Sifat Antioksidan 50 < Sangat kuat 50 – 100 Kuat 100 – 150 Sedang >150 Lemah
IC 50 yang  diperoleh  dari  EEDUB,  ETDUB  dan  kuersetin  pada  penelitian  ini masing-masing adalah 157,87 µg/mL; 129,60 µg/mL dan 5,63 µg/mL.  Berdasarkan data tersebut maka EEDUB memiliki aktivitas antioksidan dengan kekuatan antioksidan yang lemah,  ETDUB  termasuk  dalam  senyawa  dengan  kemampuan  aktivitas  yang  sedang sedangkan  kuersetin  merupakan  suatu  antioksidan  dengan  kategori  sangat  kuat. Aktivitas  antioksidan  dari  kuersetin  ini  selaras  dengan  penelitian  sebelumnya  yang menunjukkan  bahwa  kuersetin  merupakan  antioksidan  dengan  kategori  yang  sangat kuat  [8].  Aktivitas  antioksidan  ETDUB  lebih  baik  dibandingkan  dengan  EEDUB.  Hal tersebut  disebabkan  karena  pada  ETDUB  komponen-komponen  yang  tidak  memiliki kontribusi  dalam  aktivitas  antioksidan  seperti  klorofil,  lemak  dan  lipid  telah terpisahkan.  Hilangnya  komponen-komponen  yang  tidak  diinginkan  tersebut mengakibatkan kemampuan aktivitas senyawa yang memiliki kemampuan antioksidan dalam sampel tersebut lebih bisa bekerja secara efisien, karena tidak terganggu dengan
senyawa-senyawa yang tidak dibutuhkan. Sejalan dengan itu Nurfiana et al . (2017) yang membuktikan bahwa  aktivitas antioksidan pada fraksi etil asetat lebih baik dibanding ekstrak kasarnya [17].
Kadar flavonoid total dari EEDUB dan ETDUB ditetapkan dengan menggunakan metode kolorimetri. Metode kolorimetri merupakan metode penetapan kuantitatif yang melibatkan  bahan  yang  berwarna.  Perbedaan  intensitas  warna  yang  dihasilkan  akan menghasilkan absorbansi yang berbeda [18]. Metode kolorimetri memiliki keunggulan yaitu  kemudahannya  dalam  menetapkan  jumlah/kadar  zat  yang  sangat  kecil  [19]. Kombinasi antara prinsip kolorimetri dan penggunaan instrumentasi spektrofotometer UV-Vis akan memudahkan dalam penetapan kuantitatif suatu senyawa. Kadar flavonoid total yang ditetapkan secara kolorimetri dilakukan dengan mereaksikan larutan sampel dan reagen AlCl 3 10%. AlCl 3 akan membentuk kompleks dengan flavonoid pada gugus hidroksil dan keton yang saling bertetangga atau dengan gugus hidroksil yang saling bertetangga. AlCl 3 akan berikatan dengan gugus keton pada C 4 dan gugus OH pada C 3 atau C 5 flavonoid sehingga membentuk senyawa kompleks yang stabil berwarna kuning. Baku  pembanding  yang  digunakan  pada  penentuan  kadar  flavonoid  total  ini  adalah kuersetin. Hal ini disebabkan kuersetin merupakan senyawa flavonoid yang terkandung dalam daun umbi bit dan memiliki gugus keton pada C 4 dan gugus OH pada C 3 atau C 5 , sehingga dapat bereaksi dengan AlCl 3 [4]. Reaksi pembentukan kompleks yang terjadi antara flavonoid dengan AlCl 3 ditampilkan pada Gambar 5.
Gambar 5. Reaksi pembentukan kompleks flavonol dan AlCl 3 [20]
Penetapan  kadar  dimulai  dengan  pengukuran  OT  dan  panjang  gelombang maksimal. OT diperoleh dengan mereaksikan kuersetin dengan reagen AlCl 3 10% dan CH 3 COOH  5%,  kemudian  dibaca  serapannya  pada  setiap  menit  sampai  diperoleh absorbansi  yang  stabil.  OT  yang  diperoleh  pada  penelitian  ini  adalah  18 – 21  menit. Waktu  tersebut  merupakan  waktu  terjadinya  reaksi  yang  optimal  antara  kuersetin dengan reagen pengkompleks yaitu AlCl 3 10% dan CH 3 COOH 5%. Panjang gelombang maksimal  kuersetin  yang diperoleh  adalah 414  nm,  nilai  ini  tidak berbeda  siknifikan dengan  penelitian  sebelumnya[21].  Kurva  kalibrasi  kuersetin  dibuat  dengan menghubungkan  konsentrasi  kuersetin  dan  serapan  yang  dihasilkan  pada  tiap konsentrasi tersebut. Nilai koefisien korelasi (r) pada kurva kalibrasi tersebut adalah 0,996278.
Penetapan kadar flavonoid total dilakukan terhadap EEDUB dan ETDUB dengan replikasi  sebanyak  3x  dengan  data  yang    dilihat  pada  Tabel  3.  Tabel  tersebut menunjukkan  ETDUB  memiliki  kadar  flavonoid  total  yang  lebih  besar  dibandingkan EEDUB. Hasil tersebut menggambarkan proses purifikasi pada ekstrak daun umbi bit tidak  mengurangi  kadar  flavonoid  totalnya,  bahkan  berdasarkan  data  tersebut  dapat dilihat bahwa proses purifikasi meningkatkan kadar flavonoid yang pada ekstrak daun umbi  bit.  Meskipun  berdasarkan  hasil  analisis  kandungan  fitokimia  menunjukkan purifikasi belum terjadi maksimal. Hal ini dapat dipengaruhi karena penggunaan etanol 30%  pada  purifikasi  mampu  melarutkan  flavonoid  dengan  lebih  luas.  Hal  ini  seperti
yang  ditunjukkan  pada  hasil  analisis  kualitatif  yang  dilakukan  pada  penelitian Puspitasari, D dan Pramono, S (2015) [6]. Berdasarkan hal tersebut, dapat dilakukan penelitian lanjutan untuk memaksimalkan proses purifikasi ekstrak.
Pada penelitian ini juga dapat dilihat hubungan antara kadar flavonoid total yang terdapat  dalam  EEDUB  dan  ETDUB.  Gambar  3  memperlihatkan  bahwa  ETDUB  yang memiliki kadar flavonoid total lebih besar menunjukkan nilai IC 50 yang lebih kecil. Hal tersebut  menjelaskan  bahwa  semakin  tinggi  kadar  flavonoid  yang  ada  pada  suatu sampel,  akan  menghasilkan  aktivitas  antioksidan  yang  semakin  tinggi.    Selain  itu  hal tersebut  membuktikan  bahwa  salah  satu  senyawa  yang  memiliki  peran  dalam menghasilkan aktivitas antioksidan pada daun umbi bit adalah flavonoid.

## 5. KESIMPULAN
Ekstrak  terpurifikasi  daun  umbi  bit  (ETDUB)  memiliki  persamaan  kandungan fitokimia yang menunjukkan proses purifikasi belum terjadi maksimal.  Kadar flavonoid dan aktivitas antioksidan ETDUB lebih tinggi dibandingkan ekstrak kasarnya (EEDUB).

## 6. UCAPAN TERIMAKASIH
Ucapan terima kasih peneliti sampaikan kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi  Kementerian  Pendidikan,  Kebudayaan,  Riset  dan  Teknologi  dalam  Hibah Penelitian Dosen Pemula Tahun 2020-2021 dan Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan Nasional No  kontrak  067/E4.1/AK/04/PT/2021  yang  telah  mendukung  terselenggaranya penelitian ini.

## 7. DAFTAR PUSTAKA
[1] A.  Elsayed  Azab,  A.  A  Adwas,  A.  S.  Ibrahim  Elsayed,  A.  A  Adwas,  A.  S.  Ibrahim Elsayed,  and  F.  A.  Quwaydir,  “Oxidative  stress  and  antioxidant  mechanisms  in human  body,” JABB ,  vol.  6,  no.  1,  pp.  43 – 47,  Feb.  2019,  doi: 10.15406/jabb.2019.06.00173.
[2] N. Andarwulan, R. Batari, D. A. Sandrasari, B. Bolling, and H. Wijaya, “Flavonoid content and antioxidant activity of vegetables from Indonesia,” Food Chemistry , vol. 121, no. 4, pp. 1231 – 1235, Aug. 2010, doi: 10.1016/j.foodchem.2010.01.033.
[3] U. Gawlik-Dziki, L. Dziki, J. Anisiewicz, E. Habza-Kowalska, M. Sikora, and D. Dziki, “Leaves of White Beetroot As a New Source of Antioxidant and Anti -Inflammatory Compounds,” Plants, vol. 9, no. 8, p. 944, Jul. 2020, doi: 10.3390/plants9080944.
[4] Z.  Mzoughi  et  al.,  “Wild  edible  Swiss  chard  leaves  (Beta  vulgaris  L.  var.  cicla): Nutritional, phytochemical composition and biological activities,” Food Research International, vol. 119, pp.
612 – 621, May 2019, doi:
10.1016/j.foodres.2018.10.039.
[5] B. H. A. Huda, H. Susanti, and N. Sugihartini, “Pengaruh purifikasi terhadap Profil Organoleptis, Rendemen, Total Fenol dan Total Flavonoid dari Ekstrak Etanol 96% daun kelor (Moringa oleifera. L).,” Jurnal Farmasi Indonesia, vol. 17, no. 2, 2020, doi : 10.31001/jfi.v17i2.983.
[6] A.  D.  Puspitasari  and  S.  Pramono,  “Perbandingan  Metode  Pembuatan  Ekstrak Terpurifikasi Bee Propolis Dari Lebah Madu (Apis Mellifera) Berdasarkan Kadar Flavonoid Total Dihitung Sebagai Rutin,” Trad. Med. J., Vol. 20(2), p 76 -81, 2015, doi : 10.22146/tradmedj.8076
[7] W.  P.  Jones  and  A.  D.  Kinghorn,  “Extraction  of  Plant  Secondary  Metabolites,”  in Natural Products Isolation, vol. 864, S. D. Sarker and L. Nahar, Eds., in Methods in
Molecular Biology, vol. 864. , Totowa, NJ: Humana Press, 2012, pp. 341 – 366. doi: 10.1007/978-1-61779-624-1_13.
[8] P.  E.  Murwanto  and  D.  Santosa,  “Penangkapan  Radikal  Dpph  (2,2 -Difenil-1- Pikrilhidrazil),” Majalah Obat Tradisional, 2012. doi : 10.22146/tradmedj.8011
[9] A. Krisridwany, M. R. Tatra, D. P. Sukamdi, and J. Brawijaya, “Perbandingan Total Flavonoid dan Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat Biji Kelor (Moringa oleifera L.) dan Biji Kecipir (Psophocarpus tetragonolobus L.),” Jurnal Farmasi Indonesia, vol. 19, no. 1, 2022. doi : 10.31001/jfi.v19i1.1264
[10] B.  R.  Prawoto  and  J.  G.  Kartika,  “Pengelolaan  Aspek  Produksi  dan  Pasca  Panen Sayuran Daun Secara Aeroponik dan Hidroponik : Studi Kasus Lembang, Bandung,” AGROB, vol. 4, no. 1, pp. 9 – 19, Jan. 2016, doi: 10.29244/agrob.v4i1.14994.
[11] S. N. Kautsari, A. Humaedi, D. R. Wijayanti, and M. Safaat, “Kadar Total Fenol dan Flavonoid  Ekstrak  Temu  Kunci  (Boesenbergia  pandurata)  Melalui  Metode Ekstraksi Microwave,” ALCHEMY J.Pen.Kim, vol. 17, no. 1, p. 96, Mar. 2021, doi: 10.20961/alchemy.17.1.46497.96-104.
[12] H.  Saadah,  H.  Nurhasnawati,  and  V.  Permatasari,  “Pengaruh  Metode  Ekstraksi Terhadap  Kadar  Flavonoid  Ekstrak  Etanol  Umbi  Bawang  Dayak  (Eleutherine Palmifolia(L.)Merr)  Dengan  Metode  Spektrofotometri”  Jurnal  Borneo  Journal  of Pharmascientech, vol. 01, no. 01, 2017. doi : 10.51817/bjp.v1i1.46
[13] P. Molyneux, “The use of the stable free radical diphenylpicryl - hydrazyl (DPPH) for  estimating  antioxidant  activity,”  Songklanakarin  Journal  of  Science  and Technology, vol. 26, no. 2, 2004.
[14] J. Teixeira, A. Gaspar, E. M. Garrido, J. Garrido, and F. Borges, “Hydroxycinnamic Acid Antioxidants: An Electrochemical Overview,” BioMed Research International, vol. 2013, pp. 1 – 11, 2013, doi: 10.1155/2013/251754.
[15] D.  S.  Purwanto,  H.  Susanti,  and  N.  Sugihartini,  “Pengaruh  Purifikasi  Terhadap Kandungan Zat Aktif dan Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol 50%  Daun Kelor (Moringa  oleifera  L.),”  jfi,  vol.  18,  no.  2,  pp.  97– 108,  Nov.  2021,  doi: 10.31001/jfi.v18i2.1232.
[16]  S. Feghhi- Najafabadi, L. Safaeian, and B. Zolfaghari, “In vitro antioxidant effects of different  extracts  obtained  from  the  leaves  and  seeds  of  Allium  ampeloprasum subsp. persicum,” J Herbmed Pharmacol, vol. 8, no. 3, pp. 256– 260, May 2019, doi: 10.15171/jhp.2019.37.
[17] G. Nurfiana, L. Mindi, and M. Novia, “Aktivitas Antioksidan Ekstrak dan Fraksi Daun Manggis  (Garcinia  mangostana)  terhadap  DPPH  (1,1-Difenil-2- Pikrilhidrazil)”, Jurnal Farmasi Indonesia, Vol.14 no 1, doi : 10.31001/jfi.v14i1.358 .
[18] S.  Gummadi  and  M.  Kommoju,  “Colorimetric  Approaches  To  Drug  Analysis  And Applications“  A  Review,”  AJPTR,  vol.  9,  no.  1,  pp.  14– 37,  Feb.  2019,  doi: 10.46624/ajptr.2019.v9.i1.002.
[19] “Kajian Perbandingan Buah Black Mulberry (Morus Nigra L.) Dengan Air Terhadap Karakteristik Spreadable Processed Cheese Black Mulberry,” PFTJ, Jan. 2020, doi: 10.23969/pftj.v6i3.2175.
[20] D. A. A. Makuasa and P. Ningsih, “The Analysis of Total Flavonoid Levels In Young Leaves  and  Old  Soursop  Leaves  (Annona  muricata  L.)  Using  UV-Vis Spectrofotometry Methods,” J. Appl. Sci. Eng. Technol. Educ., vol. 2, no. 1, pp. 11– 17, May 2020, doi: 10.35877/454RI.asci2133.
[21] T.  G.  Arikalang,  S.  Sudewi,  and  J.  A.  Rorong,  “Daun  Gedi  Hijau  (Abelmoschus Manihot  L.)  yang  Diukur,”  Jurnal  Farmasi  Indonesia,  vol.  7,  no.  3,  2018,  DOI: 10.30595/pji.v9i3.762