Deteksi Molekuler Ekson 2 Gen Beta Globin pada Pasien Beta Talasemia Mayor di RSUD DR. Soeroto Ngawi menggunakan Metode
Polymerase Chain Reaction- Single Strand Conformation Polimorfism
Molecular Detection of Exon 2 of Beta Globin Gene from Thalassemia Beta Major Patients in RSUD DR. Soeroto Ngawi using Polymerase Chain Reaction –Single Strand Conformation Polimorfism

## Method
Yahya Febrianto 1,* , Ana Indrayati 2,* , Elfahmi. 3,* 1)2) Jurusan S2 Farmasi, Falkutas Farmasi, Universitas Setia Budi Surakarta-57127, Indonesia *email: yahyafebri15@gmail.com
3) Jurusan Farmasi, Falkutas Farmasi, Insitut Teknologi Bandung-40132, Indonesia

## ABSTRAK
Beta  talasemia  adalah  kelainan  darah  herediter  akibat  kelainan  genetik  pada  gen globin.Hal  ini  menyebabkan  kerusakan  pada  sel  darah  merah  sehingga  harus  dilakukan transfusi darah secara teratur.
Penelitian ini bertujuan mengetahui adanya mutasi pada ekson 2 gen beta globin   dari pasien  talasemia  menggunakan  metode  PCR-SSCP.Sebanyak  5  sampel  diisolasi  DNA  dan diamplifikasi  dengan  metode  PCR.Selanjutnya  hasil  amplifikasi  dikarakterisasi  dengan  metode elektroforesis. Region 2 gen beta globin merupakan hasil amplifikasi dari primer forward 4 dan primer  reverse  5  dengan  ukuran  target  350  bp.  Produk  PCR  dari  setiap  region  kemudian dianalisis  lebih  lanjut  dengan  metode  SSCP.  Hasil  analisis  menunjukkan  terdapat  indikasi mutasi pada sampel 1,2,3,6 dan tidak terdapat mutasi pada sampel 5
Berdasarkan  hasil  penelitian  yang  dilakukan  dapat  ditarik  kesimpulan  bahwa  metode PCR-SSCP dapat mengetahui jenis dan letak muta si pada ekson 2 gen β globin dari pasien β talassemia.
Kata kunci : talasemia, beta talasemia, pcr, sscp

## ABSTRACT
Beta  thalassemia  is  a  hereditary  blood  disorder  that  caused  by  genetic  disorder  of globin  gene.The  condition  leads  to  red  blood  cell  damage  so  regular  blood  transfusion  is needed.
This study was aimed to determine the presence of mutations in exon 2 gene beta  from beta  globin  thalassemia  patients  using  PCR-SSCP  method.  The  DNA  was  isolated  from  5 samples  and  amplified  using  PCR.  The  amplified  product  was  characterizaed  using electrophoresis. Region 2 of beta globin was product of primer forward 4 and primer reverse 5 with 350 bp of target size. The PCR products of each region then futher analyzed using SSCP method.  There  was  indication  of  mutation  in  1,2,3,and  6  samples  whereas  no  mutation  in sample 5.
Based  on  the  results  of  research  can  be  concluded  that  PCR-SSCP  method  can  be used  to  determine the  type  and  location  of  mutations  in  exon  2  genes  β  globin  from  β thalassemia .
Keywords: thalassemia, beta thalassemia, pcr, sscp

## PENDAHULUAN
Talasemia  merupakan  kelainan genetik yang disebabkan adanya mutasi gen penyandi rantai globin, yaitu gen HBA yang menyandi α globin atau gen  HBB  yang  menyandi  β  globin (Galanello, 2010). Talasemia
disebabkan  oleh  penurunan  kecepatan sintesis atau kemampuan produksi satu atau lebih rantai globin α dan β. Hal ini terjadi  karena  delesi  total  atau  parsial, substitusi,  atau  insersi  nukleotida  gen globin. Beta talassemia adalah kelainan darah  herediter  yang  ditandai  dengan berkurangnya kadar haemoglobin akibat  sintesis  rantai  globin  yang  tidak seimbang. Kondisi tersebut
menyebabkan  anemia  dan  harus  di lakukan  penanganan  melalui  transfusi darah  secara  teratur  agar  keadaan kembali  normal.  Penderita  thalassemia yang melakukan transfusi darah secara rutin  dapat  meningkatkan  zat  besi dalam tubuh (Weatherall,1997).
Salah  satu  cara  yang  sering digunakan untuk mengetahui pembawa sifat  β  talassemia  adalah  dengan analisis  hematologi.  P embawa  sifat  β- talassemia  dapat  dilihat  dengan  gejala mikrositik  dan  penurunan  jumlah  Hb pada  eritrosit  (Cao  &  Galanello,  2010). Selain  itu  digunakan  metode  PCR-
SSCP sebagai metode untuk mendeteksi  mutasi  pada  pasien  β talasemia  mayor.  Metode  ini  telah dikembangkan untuk
mendeteksi adanya  mutasi  pada  pembawa  sifat thalasemia (Priyambodo, 2014; Onggo, 2014).
Individu  yang  terdiagnosa β
talassemia mayor di RSUD Dr. Soeroto Kabupaten  Ngawi  dideteksi  melalui pemeriksaan Hb
elektroforesis.
Pemeriksaan  berbasis  molekuler  untuk mengetahui  jenis  dan  letak  mutasi belum  pernah  dilakukan.  Penelitian  ini melakukan  deteksi  molekuler  dengan metode  PCR-SSCP  untuk  mengetahui mutasi  pada  ekson  2  gen  BETA  globin di  RSUD  Dr.  Soeroto  Kabupaten Ngawi.
Berdasarkan penelitian Priyambodo,  2014,  dilaporkan  bahwa analisis PCR- SSCP terhadap individu β talassemia dapat dilakukan untuk mengetahui mutasi  pada  gen  β  globin (Priyambodo, 2014).

## METODE PENELITIAN
Alat dan Bahan 1.  Alat
Alat  yang  digunakan  dalam  penelitian ini meliputi alat-alat gelas berupa gelas beker,  gelas  ukur,  Erlenmeyer,  pipet tetes,  corong,  pengaduk,  pipet  ukur beserta pipet  pump berfungsi  untuk preparasi  larutan  baik  bahan,  sampel dan reagen; microcentrifuge tube
(mictotube) 1,5 mL dan 0,2 mL sebagai tempat penyimpanan sampel ; mikropipet  untuk  mengambil  sampel dan  bahan  dalam  skala  mikroliter; neraca analitik untuk menimbang bahan, Erlenmeyer untuk tempat pencampuran  bahan,  vorteks  untuk homogenasi  larutan,  sentrifuge  untuk memisahkan komponen larutan berdasar  berat  jenis, incubator sebagai tempat  inkubasi, microwave untuk pembuatan gel agarose, lemari pendingin sebagai tempat penyimpanan  bahan,  rangkaian  alat elektroforator horizontal untuk memisahkan  komponen  atau  molekul berdasarkan perbedaan tingkat
migrasinya dalam sebuah medan listrik,
UV transiluminator untuk visualisasi pita
DNA, thermocycler untuk  amplifikasi
DNA,  fluorometer  untuk  mengukur konsentrasi  sampel,  program  Chromas Lite  2.1  untuk  membaca  DNA  hasil sekuensing, software MEGA  6.0  untuk alignment  dan  analisis  sekuen  DNA, dan  kamera  digital  untuk  dokumentasi selama penelitian.
2.   Bahan Bahan  yang  digunakan  adalah  5 sampel  darah  pasien  thalasemia  yang rutin  melakukan  tranfusi  di  RSUD  Dr. Soeroto  Kabupaten  Ngawi,  disimpan dalam tube  BD  vacutainer EDTA  dan
satu  sampel  normal  atau control negative digunakan sebagai pembanding dalam penelitian ini.
Akuades  steril, Geneaid  Genomic  DNA Mini  Kit  (Blood/Cultured  Cell), PCR master  mix  KAPA  2G  fast  ready  mix, primer forward dan reverse spesifik untuk  pada  gen  beta  globin,  DNA loading  dye,  Geneaid100bp  plus  DNA ladder,  fluoroceft, gel  agarosa,  ethanol absolut  96%, buffer Tris  Borat  EDTA
(TBE), loading buffer (campuran bromo
phenol blue, formamide, EDTA, gliserol), gel poliakrilamid (acrylamide:bis-acrylamide 29:1). ethidium bromide dan pipet tip. Jalannya Penelitian
1.  Pengambilan Sampel Sampel  darah  diperoleh  dari  pasien beta  thalasemia  mayor  yang  rutin melakukan  transfusi  di  RSUD  Dr. Soeroto  kabupaten  Ngawi.  Sampel darah disimpan dalam tabung
vacutaine EDTA  3  ml  dan  dimasukan dalam freezer-20 0 C. 2.  Isolasi DNA Isolasi  DNA  sampel  dilakukan  dengan GSYNC TM DNA  Ekstraction  kit  sesuai dengan  protocol  kit.  Langkah-langkah isolasi DNA.
Alur Penelitian
a.  Lisis Sel Sebanyak 200 µl sampel darah diambil dan dimasukkan dalam tabung microtube 1,5 ml dan menambahkan 20
µl  Proteinase-K  dan  di  inkubasi  pada suhu  60 ℃ selama  5  menit,  kemudian ditambahkan  GB buffer sebanyak  200 µl    dan  dihomogenkan  dengan  vortex. Selanjutnya  sampel  diinkubasi  pada suhu  60 ℃ selama  5  menit,  selama inkubasi microtube dibolak-balik selama 2 menit.
b.  Pengikatan DNA Setelah inkubasi selesai, sebanyak 200 µl  etanol  absolut  ditambahkan  dalam sampel lalu divorteks kemudian dipindahkan  dalam purification  columm (kolom  GD  ) yang  diletakakan  dalam
Penyiapan sampel Isolasi DNA Elektroforesis dan spektrofotometri DNA hasil isolasi Amplifikasi fragmen gen beta

## globin
Elektroforesis produk PCR Analisis PCR-SSCP
Konfirmasi  hasil PCR-SSCP dengan sekuensing
tabung  pengumpul  berukuran  2  ml. Sampel  kemudian  dipindahkan  dalam kolom  GD.  Sampel  selanjutnya  di sentrifugasi  pada  12.000  rcf  selama  5 menit kemudian larutanan hasil sentrifugasi  dibuang  dan kolom  GD ditempatkan pada tabung pengumpulyang baru. c.  Pencucian Sebanyak 400 µl wash buffer 1ditambahkanke  dalam  kolom  GD  dan disentrifugasi pada 12.000 rcf selama 2 menit.  Larutan  sisa  pencucian  pada tabung  pengumpul  dibuang.  Kolom  GD dimasukan ke
dalam tabung pengumpul yang baru dan ditambahkan
600  µl wash  buffer II  dan  selanjutnya disentrifugasi  pada  12.000  rpm  selama 2  menit.  Larutan  sisa  pencucian  dalam tabung  pengumpul  dibuang,  kemudian kolom  GD  disentrifugasi  lagi  dengan kecepatas 12.000 rpm selama 4 menit. d.  Pengelusian Setelah selesai, kolom GD ditempatkan dalam  tabung microtube 1,5  ml, kemudian  ditambahkan  75  µl  buffer elusi  yang  diinkubasi  pada  suhu  60 0 C. Selanjutnya  larutan  diinkubasi  pada suhu  kamar  selama  5  menit  dan disentrifugasi pada 12.000 rcf selama 2 menit. Proses elusi diulangi 2 kali untuk memaksimalkan  pelepasan  DNA  dari silica  gel  pada kolom  GD .  Selanjutnya, kolom  GD dikeluarkan  dari  microtube 1,5  mL  dan  disimpan  di  dalam  lemari pendingin.
3.  Fluorometer dan Elektroforesis DNA Pada  penelitian  ini  digunakan  uji kuantitatif  dengan  metode  fluorometri,
Qubit  fluorometer  adalah  perangkat kuantifikasi DNA yang didasarkan pada intensitas fluoresensi dari label
fluorosen  yang  mengikat  DNA  beruntai ganda  (sdDNA)  (Nakayama et  al. 2016),  selanjutanya  skema  fluoromrter disiapkan  microtube  berisi  sampel  dan 2  microtube  tambahan  untuk  standard atas  dan  bawah  (nol).  Selanjutnya dilakukan pembuatan larutan uji (Working  Solution)  dengan  cara  : Larutan dihomogenasikan dengan vortex  selama  2-3  detik,  dipastikan tidak ada gelembung terbentuk. Larutan standard dibuat dengan cara Sebanyak 1- 20  μL  sampel  dicampurkan  dengan 199- 180 μL larutan uji untuk
mendapatkan  larutan  dengan  volume akhir  200  μL.  Microtube  berisi  sampel divorteks  selama  2-3  detik  tanpa terbentuk gelembung kemudian diinkubasi  pada  suhur  uang  selama  2 menit. Setelah itu, dilakukan
pembacaan  dengan  mesin  Qubit  yang telah  dinyalakan.  Larutan  uji  dibaca terlebih  dahulu  selanjutnya  sampel. Microtube  dimasukkan  pada  Qubit fluorometer  kemudian  ditekan  “Read” dan  ditekan  “Save”  untuk  menyimpan data.
Uji kualitatif dengan elektroforesis  pada  gel  agarosa  0,8%. Mula-mula sebanyak 0,32 gram agarosa ditimbang kemudian
ditambahkan  40  mL  Tris  Borate-EDTA (TBE)  1X  dan  dilarutkan  sampai homogen.  Larutan  tersebut  dipanaskan dalam  microwave  selama  30  detik. Setelah  sedikit  dingin  ditambahkan fluoroceft sebanyak 2 μL dan dilarutkan hingga  homogen.  Gel  dituang  pada cetakan  yang  telah  diberi  sisir  untuk sumuran. Gel didiamkan hingga mengembang  lalu  sisir  dilepas  dan  gel dipindahkan ke dalam alat
elektroforesis dan ditambahkan dengan TBE 1x hingga gel terendam. Sumuran pertama diisi sebanyak 3,5 μL marker  DNA  berupa  100  pb.  Hasil isolasi DNA diambil sebanyak 5 μL dan dicampur dengan 1 μL (6x) loading dye . Campuran  DNA  dan loading  dye
dimasukkan dalam sumuran gel agarosa.  Elektroforesis  DNA  dilakukan dengan  menghubungkan  katoda  dan anoda  pada  sumber  tegangan  100  volt selama  15  menit.  Pengamatan  pita DNA  dilakukan  dengan  menggunakan UV transiluminator.
4. Amplifikasi Region 2 Gen β-globin
Hasil  isolasi  DNA  akan  digunakan sebagai cetakan pada proses amplifikasi  dengan  metode polymerase chain  reaction (PCR).  PCR  dilakukan
berdasarkan prosedur KAPA Biosystem
(2013).  PCR  mix  dibuat  dengan menggunakan PCR Master mix
KAPA2G fast ready mix,
Setelah  semua  komponen  dimasukan ke  dalam  tabung  PCR,  selanjutnya dimasukan  ke  dalam  mesin thermal cycler .  Kondisi  siklus  PCR  yang digunakan  untuk  amplifikasi  gen  β-
globin adalah sebagai berikut: (Pryambodo, 2014) 5.  Elektroforesis  Hasil    Amplifikasi PCR Hasil  PCR  dielektroforesis  pada  gel agarosa dengan konsentrasi 2%.
Sebanyak  0,8  gram  agarosa  ditimbang kemudian  ditambahkan  100  mL  Tris Borate-EDTA  (TBE)  1X  dan  dilarutkan sampai  homogen.  Larutan  tersebut dipanaskan  dalam microwave selama 50 detik. Setelah sedikit dingin ditambahkan fluoroceft sebanyak  3,5 μL dan dilarutkan hingga homogen. Gel dituang  pada  cetakan  yang telah  diberi
sisir  untuk  sumuran.  Gel  didiamkan hingga  mengembanglalu  sisir  dilepas dan  gel  dipindahkan  ke  dalam  alat elektroforesis dan ditambahkan dengan TBE 1x hingga gel terendam. Sumuran pertama  diisi  dengan  sebanyak  3  μL marker  DNA  berupa  100  pb.  Sampel diambil sebanyak 4 μL dan dimasukkan dalam sumuran gel agarosa. ElektroforesisDNA  dilakukan  dengan menghubungkan  katoda  dan  anoda pada sumber tegangan 50 volt. Elektroforesis dihentikan setelah migrasi DNA mencapai 2/3 panjang gel yang  ditunjukkan  dengan  warna  biru pada  gel  agarosa.  Pengamatan  pita DNA  dilakukan  dengan  menggunakan UV Transiluminator.
6.  Analisis PCR-SSCP Analisis polymerase  chain  reaction- single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP)  dilakukan berdasarkan  metode  Fitriani  (2009) dengan modifikasi sebagai berikut : a.  Pembuatan gel Larutan gel disiapkan dengan
Erlenmeyer 125 ml yang terdiri atas 5,6 ml aquabides 2,6 ml, poliakrilamid 30% (akrilamid  :  bisaakrilamid  29:1),  1  ml TBE  10x,  0,68  ml  gliserol  87%,  45  μl ammonium  persulfat  10%,  dan  10  μl
tetramethyl ethylene diamine (TEMED).Setelah TEMED ditambahkan, larutan gel dihomogenkan, selanjutnya segera dituangkan dengan menggunakan mikropipet  ke  dalam  cetakan.  Sisir dipasang pada cetakan dan gel dibiarkan selama 60 menit. Setelah  60  menit,  gel  dipasang  pada tangki elektroforator vertikal dan ditambahkan TBE 1,5x hingga mencapai  batas  kolom.  Sisir  diangkat
dengan  hati-hati  dan  dilakukan pre-
running selama 20 menit.
b.  Penyiapan sampel
Sebanyak 10 μl produk PCR ditambahkan  15  μl loading  buffer dihomogenasi dengan vortex. Campuran  sampel  dan loading  buffer dipanaskan  dalam waterbath pada suhu  95 0 C  selama  10  menit  untuk denaturasi.  Setelah  proses  denaturasi, sampel  segera  dimasukkan freezer suhu  -20 0 C  selama  10  menit.  Setelah proses  thawing,  sebanyak  25  μl
campuran tersebut dimasukkan
kedalam  masing-masing  sumuran  gel. Elektroforesis  dilakukan  dengan  TBE 0,5x  pada  100V  50mA  selama  100 menit.
c.  Pewarnaan Gel  dilepas  dari  gelas,  lalu  diencerkan dalam  larutan etidium  bromida selama 45  menit  dan  diamati  dengan  UV transilluminator. Hasil didokumentasikan dengan kamera digital. d.  Interpretasi hasil
Interpretasi  data  dilakukan  dengan mendeskripsikan pita hasil SSCP dengan  membandingkan  perbedaan jarak  migrasi  pita  ( Single  strand  DNA ) subyek  yang  diteliti  dengan  individu normal.  Individu  yang  memiliki  genotip homozigot,  baik  homozigot  dominan maupun  resesif   menunjukkan  dua  pita DNA  pada  gel,  sedangkan  individu heterozigot menunjukan tiga atau empat pita DNA.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
a.  Identifikasi Sampel Penelitian  ini  menggunakan  sampel darah  pasien  Beta  Thalasemia  RSUD Dr.Soeroto  Ngawi  Jawa  Timur,  dengan
prosedur pengambilan sampel memenuhi  kelayakan  etik  atau  Ethical Clearance. Identifikasi Ethical Clearance digunakan  untuk  memenuhi  kelayakan etik dalam penggunaan sampel melibatkan makluk hidup yang menyatakan  bahwa  suatu  penelitian layak untuk dilakukan. b.  Pengambilan Sampel Sampel darah diperoleh dari 5
(Sembilan)  pasien  beta  thalasemia mayor yang rutin melakukan transfusi di RSUD  Dr.  Soeroto  kabupaten  Ngawi. Sampel  darah  disimpan  dalam  tabung vacutaine  EDTA  3  ml  dan  dimasukan dalam freezer-200C.
c.  Hasil Isolasi DNA Hasil Isolasi DNA dilakukan menggunakan  kit  isolasi  yang  dapat mengekstraksi  DNA  dari  darah  beku dan telah ditambahkan zat antikoagulan (EDTA).    DNA  hasil  isolasi  selanjutnya dilakukan  uji  baik  secara  kualitatif maupun  kuantitatif,  uji  kualitatif  DNA dilakukan  dengan  elektroforesis  pada gel  agarosa  dengan  konsentrasi  0,8%. Hasil elektroforesis DNA seluruh sampel  disajikan  pada  Gambar  1.
Selanjutnya  dilakukan  Uji  kuantitatif DNA  dapat  dilakukan  dengan  metode fluorometri untuk mngetahui konsentrasi  DNA  hasil  isolasi.  Hasil spektrofotometri  sampel  disajikan  pada Gambar 1. Pada elektroforesis DNA seluruh
sampel  menghasilkan  pita  DNA  yang terlihat  jelas.  Selain  5  sampel  tersebut isolasi dan elektroforesis juga dilakukan pada  satu  sampel  normal  (N)  dan  satu sampel  control  positif  (K+)  (gambar tidak  ditampilkan).  Sampel  normal digunakan  sebagai  kontrol  negatif
mutasi.  Sedangkan  sampel  K+  yang digunakan  merupakan  sampel  darah dari  penyandang  thalassemia  yang telah diketahui mutasinya melalui sekuensing  DNA.  Kedua  kontrol  ini digunakan  untuk  mengevaluasi  setiap tahapan metode dari uji molekuler yang dilakukan.
Gambar 1. Elektroforesis DNA seluruh sampe l Ukuran  genom  manusia  berdasarkan International Human Genome Sequencing Consortium secara keseluruhan  diestimasikan  2.916  gb,
dengan  ukuran  molekul  DNA  pada  23 kromsosomnya  berkisar  dari  21,8  mg (kromosom  Y)  hingga  2692,9  mg (kromosom  1)  dan  molekul  DNA  pada mitokondria  yang  berukuran  16.569  bp (Lander et al.,2001). Dikarenakan ukuran  DNA  nya  yang  besar  sehingga pada  hasil  elektroforesis  pita  DNA genom  sampel  terlihat  jauh  diatas marker.  Setiap  sampel  menampilkan pita  dengan  ketebalan  yang  beragam berdasarkan  konsentrasi  DNA  yang diperoleh dari isolasi yang dilakukan.
Konsentrasi DNA sampel Nilai  konsentrasi  DNA  hasil  isolasi sampel  dengan  metode  fluorometri menggunakan Qubit Fluorometer
ditampilkan  pada  Tabel  1.    Pada
sampel, konsentrasi DNA berkisar 55,2- 82  ng/μL.  Qubit  Fluorometer  adalah
perangkat kuantifikasi DNA yang didasarkan  pada  intensitas  fluoresensi dari label fluorosen yang mengikat DNA beruntai ganda (sdDNA)  (Nakayama  et al. 2016). DNA pada sampel menunjukkan, konsentrasi yang bervariasi dengan sesuai dengan kenampakan  tebal  tipis  pita  pada elektroforesis. Setiap sel diploid manusia  mengandung  sekitar  6  pg DNA. Untuk isolasi DNA dari darah tepi umumnya diperoleh 30 ng/μL hingga 60 ng/μL dari 1 ml darah yang berasal dari 5-10 juta leukosit (Baechtel, 1989).
Secara umum konsentrasi DNA sampel pada  penelitian  ini  sesuai  referensi. Adanya  variasi  pada  konsentrasi  DNA dapat  disebabkan  karena  perbedaan kualitas darah yang dipengaruhi lamanya waktu penyimpanan darah. Hasil amplifikasi region gen beta globin
DNA sampel diamplifikasi sesuai dengan  region  target.  Penelitian  ini mengacu pada pembagian region berdasarkan Gupta and Argawal (2003) dengan  hanya  3  region  saja  yang digunakan  yaitu  region  I,  II  dan  IV. Pemilihan  3  region  ini  didasarkan  atas keberadaan  daerah  ekson  pada  ketiga region  tersebut.  Mutasi  yang  terjadi pada ekson dapat menyebabkan
No Nama Sampel Konsentrasi (ng/ μl) 1 Sampel 1 63,6 2 Sampel 2 68 3 Sampel 3 82 4 Sampel 5 70,8 5 Sampel 6 62
kesalahan translasi pada sintesis asam amino  sehingga  dapat  memberikan efek  secara  langsung  pada  rantai  beta globin  yang  disintesis,  pada  penelitian ini  difokuskan  pada  region  II  yang didalamnya  terdapat  ekson  2.  Proses amplifikasi  atau  perbanyakan  DNA dilakukan dengan metode PCR.
Gambar 2. Hasil elektroforesis region II gen beta globin pada sampel
Pada gambar diatas menunjukkan hasil amplifikasi  dari  region  II  gen  beta globin.  Region  II  merupakan  hasil amplifikasi  dari  primer  forward  4  dan primer  reverse  5  dengan  target  yaitu 350 bp. Region ini mencakup sebagian daerah  intron  1,  seluruh  daerah  ekson II  dan  sebagian  daerah  intron  2  gen beta globin.
Pada  PCR  terjadi  amplifikasi  atau penggandaan sekuen DNA yang diinginkan berdasarkan
pemilihan primer untuk reaksi. Penggandaan DNA secara  alami  terjadi  pada  organisme melalui  proses  replikasi  DNA  dengan
DNA helikase berperan dalam membuka  pita  ganda  DNA  sehingga DNA polimerase dapat memulai penggandaan.  Pada  PCR  peran  DNA helikase  digantikan  dengan  menaikkan suhu  ketika  reaksi  sehingga  DNA terdenaturasi dan terbentuk untai
tunggal  DNA,  kemudian  titik  untuk memulai  polimerasi  ditentukan  oleh primer yang spesifik yang melekat pada untai  tunggal  dan  kemudian  oleh  DNA polimerase  penggandaan  sekuen  DNA target  terjadi.  PCR  memerlukan  enzim polimerasi  DNA  yang  tahan  terhadap panas  (thermostable)  contohnya  Taq Polymerase  (Bustin,  2010).  Produk
PCR  dari  tiap  region  inilah  yang selanjutnya dilakukan SSCP. Visualisasi  produk  PCR  pada  tiap region  dapat  ditampilkan  pada  Gambar 2. Hasil SSCP region gen beta globin Single Strand Conformation Polymorphism atau yang dikenal sebagai  SSCP  merupakan  salah  satu teknik  untuk  mendetesi  mutasi.  Prinsip dari  SSCP  adalah  fakta  bahwa  single strand DNA (ssDNA) memiliki konformasi tertentu. Perubahan konformasi  karena  adanya  perubahan basa pada sekuen DNA dapat
menyebabkan perbedaan migrasi ssDNA  pada  elektroforesis  sehingga DNA  wild-type  atau  normal  dan  DNA yang mengalami mutasi akan menunjukkan  pola  pita  yang  berbeda. Analisis  SSCP  sendiri  terdiri  dari  4 tahapan yaitu 1) amplifikasi target DNA dalam  hal  ini  yaitu  region  II  gen  beta globin, 2)denaturasi dsDNA dari produk PCR menjadi ssDNA dengan penambahan agen denaturasi (formamida) dan pemanasan,
3)pendinginan  hasil  denaturasi  DNA yaitu  ssDNA  untuk  memaksimalkan self-annealing  sehingga  membentuk konformasi  tertentu,  dan  4).  Deteksi perbedaan  migrasi  konformasi  ssDNA pada elektroforesis kondisi non denaturasi  (Dong  dan  Zhu,  2005).
Elektroforesis  yang  dilakukan  adalah PAGE atau Polyacrilamide Gel Electroforesis konsentrasi 39,7% dengan elektroforator vertical. Hasil dari analisis  SSCP  pada  region  II  yang didalamnya  juga  termasuk  bagian ekson  2  yang  dilakukan  ditampilkan pada Gambar 3
Gambar  3.Hasil  SSCP  pada  region  II. Pola pita pada gel poliakrilamid.
Gambar  4.  Hasil  SSCP  region  II  gen beta  globin  pada  sampel.  Skema  pola pita gel poliakrilamid.
Pada  region  II  gen  beta  globin yang  telah  dilakukan  analisis  SSCP, lima  sampel  manunjukkan  dua  pita.
Terdapat
sau sampel yang
menunjukkan  pola  pita  yang  sama dengan  sampel  N  yaitu  sampel  5.  Hal ini  menunjukkan  pada  4  sampel)  ada indikasi mutasi atau perbedaan sekuen pada  region  ini  karena  terbentuk konformasi  yang  berbeda  sehingga terjadi perbedaan migrasi dan menampilkan  pola  pita  yang  berbeda-
beda.  Indikasi  adanya  mutasi  pada sekuen  region  II  gen  beta  globin diketahui  dengan  melihat  adanya  pola pita  yang  berbeda  dengan  kontrol negative (sampel N). Berdasarkan pada region  II,  terdapat  4  sampel  yang berdasarkan  analisis  SSCP    ada indikasi  mutasi  sedangkan  1  sampel sisanya tidak ada indikasi.

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  yang dilakukan  dapat  ditarik  kesimpulan bahwa metode PCR-SSCP dapat mengetahui jenis dan letak mutasi pada ekson  2  gen  β  globin  dari  pasien  β talassemia. Hasil analisis sampel pasien  RSUD    Dr.  Soeroto  Kabupaten Ngawi  menunjukkan  indikasi  mutasi pada sampel 1,2,3,6 dan tidak terdapat mutasi pada sampel 5.

## DAFTAR PUSTAKA
Bustin, S. A., 2010. The PCR Revolution:  Basic  Technologies and Applications. Cambridge University  Press.  New  York.  hal 17.
Calzolari, Roberta, McMorrow Calzolari, R.,  McMorrow,  T.,  Yannoutsos, N., Langeveld, A., & Grosveld, F. 1999 . Deletion of a Region that is a  Candidate  for  the  Difference between  the  Deletion  Forms  of Hereditary  Persistence  of  Fetal Hemoglobin  and  β-thalassemia Affets  beta-Globin  Gene  but  not ŷ-Globin Gene Expression . European Molecular Biology Organization 18(4): 949 – 958. Danckwardt, S., Neu-yilik, G., Thermann,  R.,  Frede,  U.,  Hentze,
M.W.,  nd  aKulozik,  A.E.  2012. Abnormally  spliced  β  -globin mRNAs :  a  single  point  mutation generates  transcripts  sensitive and  insensitive  to  nonsense- mediated  mRNA  decay.  Blood 99(5): 1811 –7.
Dong  Y.  Zhu  H.  2005.  Single-strand
conformational
polymorphism analysis:  basic,  principle  and routine  practice.  Methods  Mol
Med; 108:149-157.
F.  S.  Baechtel,  1989.  The  extraction,
purification  and  quantification  of
DNA.  in Proceedings  of  the International Symposium on theForensic Aspects of
Galanello, R., and Origa, R., 2010, Beta
Thalasemia,  Orphanet    Journal of Rare Disease, 5:11.
Galanello,  R.,  Cao,  A.  2011.  Alpha- thalassemia. Genetics in Medicine, 13(2): 83-88 Gruszczynska  J,  Brokowska  K,  Charon KM,  &  Swiderek  WP.  2005 . Restriction Fragment Length Polymorphism  of  Exon  2  Ovar- DRB1  Gene  in  Polish  Heath Sheep and Polish Lowland Sheep .  J  Appl  Genet  46:311- 314. Guo, CY., Xu, XF., Wu, JY., & Liu, SF. 2008. PCR-SSCP-DNA Sequencing  Method  in  Detecting PTEN  Gene  Mutation  and  its Significance  in  Human  Gastric Cancer. World Journal of Gastroenterology, 14(24): 3804 – 3811. Gupta,  A.  2003.  Efficiency  and  cost effectiveness: PAGE-SSCP
versus  MDE  and  Phast  gels  for the  identification  of  unknown thalassaemia mutations. Molecular  Pathology  56(4):  237-
239.
Gupta,  A.  and  Agrawal,  S.,  2003, Efficiency and Cost Effectivennes : Page-SSCP versus  MDE  and  Phast  Gels  for the Indentification of Unknown β- Thalasemia Mutation, Jurnal Molecular  Pathology,  56,  237-
239.
Handayani,  N.S.N.,    and  Purwanto,  R. 2015.  Cd35  (Del  C)  Frameshift Mutation  in  Exon  2  of  β-Globin Gene  on  β-Thalassemia  Carriers.
Biomedical  Engineering  1(1):19- 23.
Handayani,N.S.N.  dan  Onggo,  A.T., 2014,  Identifiasi  Mutasi  Gen  β Globin  Ekson  1  pada  Pembawa Thalasemia,  Jurnal  Biogenesis, Vol. 2,I, hal. 63-69.
Handayani,N.S.N.  dan  Purwanto,  R., 2015,  CD 35 (del  C)  Frameshit
Mutation  in  Exon  2  of  β  Globin Gene on β  Thalasemia Carriers, Biomedical Engineering, vol 1(1),
19-23. Harteved, C.,L., and Higgs, D.,R.,2010, Alpha Thalasemia, Orphanet Journal of Rare Disease, 5:13. Hoffbrand,  A.V.,  Pettit,  J.E.,  Moss, P.A.H. 2006. Essential Haematology Fifth Edition . Massachusetts: Blackwell Science, Inc.
Kakavas,  V,  Konstantinos,.,  Plageras, P., Vlachos, Antonios, Papaioannou, A. 2008. PCRSSCP:  A  Method  for  the Molecular  Analysis  of  Genetics Disease.  Mol  Biotechnol  (2008) 38:155 –163 Kanavakis  E,  Traeger-Synodinos  J, Vrettou  C,  Maragoudaki  E,Tzetis M, Kattamis C. Prenatal diagnosis  of  the  thalassemia syndromes by rapid DNA
analytical  methods.  Mol  Hum
Reprod 1997;3:523 –8.
Lander,  E.  S.,  Linton,  L.  M.,  Birren,  B., et al. 2001. Initial sequencing and analysis of human genome. Nature, 409: 860-920.
Lanni F, Gani RA, Widuri, Rochdiyat W, Verawaty  B,  Sukmawati,  dkk.
Βthalassemia  and  hemoglobin traits  in  Yogyakarta  population. Dipresentasikan pada 11th International Conference on Thalassaemia and Haemoglobinophaties & 13rd International  TIF  Conference  for Thalassaemia patients and parents. Singapore; 811 Oktober 2008. Lanni, F. 2002. Heterogenitas Molekular  Gena  Globin-â  di Indonesia: Kaitannya dengan Pola  Penyebaran  Thalassemia-â serta  Afinitas  Genetik  antar Populasi  di  Indonesia .  Disertasi, tidak diterbitkan. UGM. Yogyakarta.
Nakayama Y. Yamaguchi H. Einaga N. and  Esumi  M.  2016.  Pitfalls  of
DNA  Quantification  Using  DNA-
Binding  Fluorescent  Dyes  and Suggested Solutions. Plos One;11(3): e0150528. doi:  10.1371/journal.pone.015052 8
Peixeiro,  I.,  Silva,  A.,  and  Romao,  L. 2011.  Control  of  human    -globin mRNA  stability  and  its  impact  on beta-thalassemia phenotype. Haematologica 96(6): 905-913.
Priyambodo  dan  Handayani,  N.S.N.,
2014, Deteksi  mutasi  Ekson  2 Gen  β-Globin  dan  Daerah Pengapitnya Pada Pembawa Sifat β-Thalasemia dengan Metode Polymerase Chain Reaction-Singgle Strand Conformation Polymorphism (PCR-SSCP) ,  Prosiding  Seminar Nasional  dan  Rapat  Tahunan
Bidang  MIPA,  Fakultas  MIPA
Institut Pertanian Bogor.
Raut,  AA.,  Kumar,  A.,  Kala,  SN., Chhokar,  V.,  Rana,  N.,  Beniwal, V., Jaglan, S., Samuchiwal, S.K., Singh,  J.K.,  &  Mishra,  A..  2012. Identification  of  Novel  Single
Nucleotide Polymorphisms in the DGAT1  Gene  of  Buffaloes  by PCR-SSCP . Genetics and Molecular  Biology,  35(3):  610-
613.
Sanger, F. dan Coulson, A. R. 1975. A rapid  method  for  determining sequences  in  DNA  by  primed synthesis  with  DNA  polymerase. Journal  of  Molecular    Biology,
94(3): 441-448.
Smith,  L. M., Sanders, J. Z., Kaiser, R. J., et  al .  1986.  Fluorescence detection  in  automated  DNA
sequence analysis. Nature, 321(6071): 674 –9.
doi:10.1038/321674a0.
Sunarto,  1996, Diagnostik  Molekular Thalasemia ,  Jurnal  Berkala  Ilmu
Kedokteran, vol.26(1), 44-51.
Thermann, R. 1998. Binary specification  of  nonsense  codons by splicing and cytoplasmic
translation.  The  EMBO  Journal
17(12): 3484-3494.
Treisman, R., Orkin, S.H., and Maniatis, T.  1983.  Specific  Transcription and  RNA  Splicing  Defects  in  Five Cloned  β-Thalassaemia  Genes.
Nature 302: 591 –6.
Warsy,  A.,  ElHazmi,  M.,  Al  Momin,  A.,
AlHazmi, A., and Aleem, A. 2013. Extensive Polymorphisms in Saudi Beta Thalassaemia Patieants. Biosciences Biotechnology Research Asia 10(1): 127-132. Wintrobe, MM. 2009. Clinical
Hematology .  Philadelphia:  Lea
and Febringer.