## VIABILITY AND PRODUCTION CALCIFYING BACTERIAL ENDOSPORE ON SAND-CEMENT CARRIER
Devinta Apriliani 2 dan Enny Zulaika 1 *
Departemen Biologi, Fakultas Sains dan Analitika Data, Institut Teknologi Sepuluh Nopember Jl. Raya ITS, Sukolilo, Surabaya 60111 Indonesia
*Email: enny@bio.its.ac.id , * ennyzulaika123@gmail.com

## Abstract
Carbonatogenic  bacteria  have  the  ability  ability  to  precipitate  calcium  carbonate  (CaCO 3 )  and  many calcareous areas are found. Some of its species formed endosporas which resistant to harsh physical condition  such  as  very  alkaline  pH.  The  objectives  of  this  study  were  to  obtain  spore  biomass  and determine endosporas viability in tested carrier media such as sand-cement. The tested isolates were Bacillus JA1, JB3, SU1, AK4, Lysinibacillus JB2, and Sporosracina JA4. The production of endosporas was carried out on yeast urea broth with a temperature treatment of 70°C for 20 minutes. The formed endosporas  were  stored  in  carrier  medium  of  sand,  cement,  and  a  mixture  of  cement  sand.  Spore viability was conducted using total plate count method. The results showed that all isolates were able to produce endosporas with the highest endosporas dry biomass is Bacillus AK4 which was 196 mg/L. After 2 hours of storage, endosporas were still able to grow by forming colonies on nutrient agar media.
Keywords: carbonatogenic bacteria; carrier media; YU; endospora; viability

## Pendahuluan
Bakteri
karbonatogenik mampu menghasilkan kalsium karbonat (CaCO 3 ), dapat ditemukan  di  tanah,  perairan,  pegunungan kapur, gua-gua karst dan sedimen [1,2]. Bakteri yang diisolasi dari tanah kapur mampu hidup di lingkungan alkali dengan pH 7,6 - 8,6 [3], bakteri tersebut  berpotensi  digunakan  sebagai  agen biobeton sebab bahan baku beton mempunyai pH  sangat  alkali  yaitu  diatas  10  [4].  Biobeton dengan  penambahan  bakteri  karbonatogenik mempunyai  struktur  konstruksi  yang  kuat  dan tahan  lama  dengan  kuat  tekan  lebih  baik daripada beton tanpa bakteri [5].
Bacillus JA1, JB3, SU1, AK4, Lysinibacillus JB2, dan Sporosracina JA4 merupakan bakteri karbonatogenik yang diisolasi dari pegunungan kapur  [6].  Semua  bakteri  tersebut  mampu membentuk  endospora,  yaitu  suatu  morfologi tidak  aktif  yang  dibentuk  oleh  bakteri  ketika berhadapan  dengan  stres  lingkungan  seperti kekurangan  nutrisi,  suhu  tinggi  atau  pH  alkali. Endospora memiliki keunggulan dapat bertahan hidup  dalam  keadaan  tidak  aktif  sampai bertahun-tahun,  tahan  terhadap  panas,  kering dan paparan zat kimia [7], sehingga endospora pada bakteri lebih menguntungkan daripada sel vegetatif ketika diaplikasikan pada beton untuk
konstruksi  bangunan  yang  memiliki  kondisi lingkungan ekstrem tersebut [8].
Pembentukan  endospora  lebih  optimal dilakukan  dengan shock  treatment suhu  70°C selama 20 menit pada media Yeast Urea (YU) broth dibandingkan media lain [9]. Penelitian ini bertujuan  untuk  memproduksi  endospora  dan mengetahui viabilitasnya pada media pembawa pasir-semen setelah 2 jam inkubasi.

## Bahan dan Metode Isolat Bakteri Karbonatogenik
Isolat yang digunakan adalah Bacillus JA1, JB3,  SU1,  AK4, Lysinibacillus JB2  dan Sporosarcina  JA4  yang  berasal  dari  bukit Jaddih, Bangkalan, gua Akbar, Tuban dan Suci, kawasan perbukitan kapur Gresik, Jawa Timur, Indonesia [6].

## Produksi Endospora pada Media YU Broth
Isolat dikultur pada media Yeast Urea (YU) broth dengan komposisi per liter 3 g NB; 2,12 g NaHCO 3 dan  10  g  urea.  Koloni  penuh  dari tabung  reaksi  diinokulasi  secara  aseptis  ke dalam 750 ml media YU broth , diinkubasi pada suhu  ruang  selama  7  hari  diatas shaker (100 rpm).  Selanjutnya  dilakukan  pemanasan  di dalam waterbath pada  suhu  70°C  selama  20
menit untuk melisiskan sel bakteri. Sebanyak 1 ml digunakan untuk uji viabilitas endospora dan sisa  kultur  dipanen  endosporanya  untuk disimpan di media pasir-semen [8].

## Konfirmasi, Kepadatan dan Viabilitas Endospora
Konfirmasi terbentuknya endospora dilakukan dengan pewarnaan malachite green .
Indikasi keberhasilan terbentuknya endoendospora adalah 90% sel berwarna hijau yang
menunjukkan terbentuknya endoendospora [8].
Kepadatan  endospora  dihitung  menggunakan haemocytometer. Keberadaan endospora diamati di bawah mikroskop dengan pewarnaan malachite green . Sel bakteri yang mengandung ruang warna hijau adalah endospora selanjutnya    dihitung  menggunakan hand  tally counter [8].  Uji  viabilitas  endospora  dilakukan dengan menumbuhkan 100µl suspensi endospora pada media NA-agar cawan dengan metode pour  plate ,  diinkubasi  24  jam  atau sampai  terbentuk  koloni  tunggal  yang menandakan  endospora  mampu  membentuk sel  vegetatif  kembali.  Selanjutnya  1  ose  isolat diperiksa  ulang  kemampuannnya  membentuk endospora dengan pewarnaan malachite green [10].

## Biomassa Endospora
Endospora dipanen
dengan cara sentrifugasi 5.000 rpm selama 25 menit. Pelet endospora  dicuci  dua  kali  dengan  0,8%  (b/v) NaCl  [8].  Disaring  dengan  kertas  saring whatman  dan  dikeringkan  dalam  oven  pada suhu  50°C  hingga  berat  konstan  [11], endospora yang telah kering ditimbang dengan neraca analitik.

## Media Pembawa
Media  pembawa  yang  digunakan  adalah pasir,  semen  dan  campuran  pasir  semen dengan  kontrol  endospora  tanpa  media. Penyimpanan  endospora  dilakukan  di  dalam tabung  reaksi  steril  dengan  headspace  25% dan  media  pembawa  75%.  Semua  media pembawa  perlakuan  ditimbang  dan  disterilkan
menggunakan autoklaf (121°C, 15 menit). Pada campuran media pembawa pasir semen dibuat 3  variasi  dengan  perbandingan  pasir  dan semen yaitu 1:1, 2:1 dan 1:2.

## Viabilitas Endospora pada Media Pembawa
Uji  viabilitas  dilakukan  dengan  cara mengambil  1  g  media  pembawa  yang mengandung  endospora  ditambah  9  ml akuades steril sehingga didapatkan pengenceran  10 -1 .  Pengenceran  yang  telah dilakukan  diambil  100µL  ditumbuhkan  pada media  NA-agar  cawan  dengan  metode pour plate ,  diinkubasi  24  jam,  viabilitas  ditandai dengan  pertumbuhan  koloni.  Koloni  dihitung dengan  parameter  CFU/g  media,  apabila jumlah  koloni  lebih  dari  300  CFU  maka dilakukan pengenceran dan dilakukan preparasi  seperti  diatas  sampai  didapatkan jumlah koloni dengan rentang 30-300 CFU [8].

## Hasil dan Pembahasan Produksi Endospora
Semua isolat mampu tumbuh pada media YU broth dan  membentuk  endospora  setelah diinkubasi  7  hari  diatas rotary  shaker . Pembentukan endospora menggunakan media YU broth mampu  menciptakan  kondisi kekurangan nutrisi bagi sel bakteri karbonatogenik  sehingga  membentuk  struktur tidak aktif yaitu endospora (Gambar 1).
A B
Gambar 1. Produksi endospora bakteri karbonatogenik  (A.  Kultur  bakteri  karbonatogenik pada  media  YU broth ;  B.  Endospora  dengan pewarnaan malachite  green. Tanda  panah menunjukkan endospora).
Bakteri melakukan proses sporulasi ketika berada  dalam  kondisi  ekstrem  seperti kekurangan nutrisi, komposisi mineral berlebihan  dan  suhu  tinggi  [12].  Berdasarkan penelitian  [9],  produksi  endospora  lebih  tinggi pada  media  YU broth dibandingkan  media CCP,  sebab  media  CCP  memiliki  komposisi nutrisi yang lebih lengkap dibandingkan media YU broth. Sedangkan shock  treatment suhu 70°C selama 20 menit dalam waterbath dapat menginduksi  pembentukan  endospora  dan melisiskan  sel  vegetatif. Hal  tersebut  sesuai dengan penelitian [11] yang menyatakan shock treatment 80°C  selama  20  menit  dalam waterbath mampu menghasilkan endospora.
Kepadatan dan Viabilitas Endospora
Semua isolat mampu membentuk endospora  yang  ditandai  dengan  bentuk organel  berwarna  hijau  setelah  diberi pewarnaan malachite green (Gambar 2).
Endospora bakteri karbonatogenik terbentuk  karena  nutrisi  yang  tersedia  pada media  terbatas,  bakteri  akan  merespon  hal tersebut  dengan  membentuk  endospora, proses  ini  disebut  sporulasi.  Sporulasi merupakan strategi bertahan hidup bagi bakteri ketika  menghadapi  kondisi  lingkungan  yang ekstrem,  seperti  nutrisi  yang  terbatas,  suhu tinggi,  kekeringan  dan  paparan  senyawa antimikroba [13].
Kepadatan  endospora  yang  dihasilkan dapat  dipengaruhi  oleh  perlakuan  yang bervariasi.  Menurut  penelitian  [14],  endospora yang  dihasilkan  pada  media Mueller  Hinton (MH)  dan Trypton  Soy  Broth (TS)  adalah  10 8 dan  10 7 karena  kedua  media  ini  memiliki  nilai pH 7,3 yang lebih tinggi dari pH media YU broth . pH  dapat  mempengaruhi  keadaan  muatan membran sel, mengubah permeabilitas membran  sel,  mempengaruhi  penyerapan nutrisi dan pembentukan metabolit. Ketika nilai pH  7  atau  8  akan  mempengaruhi  jumlah  sel total  bakteri  menjadi  rendah.  Selain  itu,  suhu juga  mempengaruhi  kepadatan  sel  yang dihasilkan [15]. Pada penelitian [16], perubahan suhu  yang  drastis  yaitu  dari  suhu  65°C kemudian  dicuci  dalam ice-cold  sterile  HPLC water dapat  menghasilkan  endospora  sampai dengan 10 9 endospora/mL.
Pada penelitian ini, kepadatan endospora yang  diproduksi  di  media  YU broth mencapai kepadatan  10 6 . Bacillus AK4  memiliki kepadatan  tertinggi  yaitu  7,1x10 6 ,  secara keseluruhan kepadatan endospora dapat dilihat pada Tabel 1 berikut:
Tabel 1. Kepadatan endospora yang dihasilkan pada media YU broth No. Isolat Kepadatan endospora/ml x 10 6
1. Lysinibacillus
JB2
4,5 2. Bacillus JB3 1,7 3. Bacillus AK4 7,1 4. Bacillus JA1 1,1 5. Bacillus SU1 5,6 6. Sporosarcina
JA4 3,5
Viabilitas  endospora  yang  ditumbuhkan kembali  pada  media  NA  mampu  membentuk koloni  sel  vegetatif,  setelah  dilakukan pewarnaan kembali menunjukkan sel vegetatif mampu membentuk endospora (Gambar 3 dan Gambar 4).
Gambar  2.  Endospora  bakteri  karbonatogenik setelah inkubasi 7 hari. (1. Lysinibacillus JB2;
2. Bacillus JB3; 3. Bacillus AK4; 4. Bacillus JA1;
5. Bacillus SU1; 6. Sporosarcina JA4.
*Tanda panah menunjukkan endospora)
Endospora  mampu  tumbuh  kembali menjadi sel vegetatif ketika nutrisi dan kondisi lingkungan  mendukung  untuk  pertumbuhan, yaitu  dapat  berubah  secara  cepat  dari  bentuk dorman  menjadi  sel  vegetatif  secara  penuh ketika  terdapat  nutrisi.  Endospora  akan mengalami rehidrasi dan membongkar struktur pelindungnya,  mengaktifkan  kembali  sintesis makromolekul, melepaskan mantel endospora, kemudian melanjutkan pertumbuhan vegetatifnya  [17].  Selain  ketersediaan  nutrisi, germinasi  endospora  juga  dipicu  oleh  agen non-nutrient  seperti  CaDPA,  surfaktan  atau dodecylamine,  dan  perlakuan  fisik  seperti hyperbaric  treatment [18].  Sel  vegetatif  isolat mampu membentuk endospora kembali setelah dikulturkan  di  media  NA,  karena  bakteri  telah mencapai  umur  lebih  dari  48  jam  dan  nutrisi pada  media  sudah  tidak  mencukupi  untuk
pertumbuhannya  atau  bakteri  sudah  tua umurnya sehingga bakteri merespon kekurangan nutrisi dengan membentuk endospora.  Endospora  merupakan  bentuk pertahanan  hidup  terhadap  stress  lingkungan seperti  kekurangan  nutrisi,  komposisi  mineral tinggi, pH, suhu dan kepadatan sel yang tinggi. Endospora tahan pada suhu ekstrim disebabkan  adanya  faktor  resistensi  termasuk perlindungan  DNA  endospora  oleh small-acid soluble protein , akumulasi kation divalen pada inti  endospora,  dehidrasi  inti  endospora,  dan keberadaan asam dipicolinic (DPA) [20].

## Berat Kering Endospora
Berat  kering  endospora  tertinggi  terdapat pada  isolat Bacillus AK4  dengan  berat  196 mg/L.  Berat  kering  endospora  isolat  yang  lain dapat dilihat pada Gambar 5. Panen endospora dengan cara sentrifugasi membantu memisahkan  endospora  dari  sel  vegetatif  dan debris [19]. Pencucian endospora dengan NaCl dapat  membersihkan  residu  dan  juga meciptakan  kondisi  lingkungan  yang  isotonik, hal ini penting dilakukan untuk memulihkan sel maupun  endospora  dari  stress  akibat  tekanan osmosis [8].

## Gambar 5. Berat kering endospora

## Viabilitas Endospora pada Media Pembawa
Endospora  yang  disimpan  di  media pembawa  setelah  2  jam  inkubasi,  mampu tumbuh  kembali  pada  media  NA,  isolat menghasilkan  jumlah  koloni  berkisar  10 2 -  10 5
CFU/g  media  pembawa.  Semua  isolat  pada kontrol dan media pembawa pasir menunjukkan jumlah koloni paling banyak (Tabel 2).
Kemampuan  endospora  tumbuh  menjadi  sel vegetatif,  karena  endospora  memiliki  struktur dan  kemampuan  resistensi  yang  tahan terhadap  lingkungan  ekstrem  serta  dapat bergerminasi  kembali  ketika  dipicu  adanya
88,4 196 76,8 109,5 133,3 71,7 0 50 100 150 200 250 Bac ill us SU 1 Bac ill us A K4 Bac ill us JA 1 Bac ill us JB 3 Spo ros ar ci…
Ly sin ibac il… Be ra t En do sp or a (m g/ L)
Gambar 3. Sel vegetatif yang ditumbuhkan kembali pada media  NA  (1. Lysinibacillus JB2;  2. Bacillus JB3;  3. Bacillus AK4;  4. Bacillus JA1;  5. Bacillus SU1;  6. Sporosarcina JA4).
Gambar  4.  Viabilitas  dari  endospora,  tanda  panah menunjukkan endospora (1. Lysinibacillus JB2; 2. Bacillus JB3; 3. Bacillus AK4; 4. Bacillus JA1; 5. Bacillus SU1; 6. Sporosarcina JA4).
nutrisi. Jumlah koloni yang paling banyak ada di media pembawa pasir, disebabkan pasir
Tabel 2. Viabilitas endospora setelah 2 jam inkubasi di media pembawa
memiliki rongga yang lebih besar dibandingkan semen  sehingga  endospora  tetap  mendapat ruangan  dan  lebih  terlindungi  dari  gesekan media  pembawa. Menurut  [11],  pasir  memiliki rongga  antar  partikel  yang  lebih  besar  dari semen  yaitu  4,75  mm  sehingga  dapat melindung  endospora  bakteri.  Sedangkan semen  memiliki  pori  yang  lebih  kecil  dan memiliki  pH  tinggi  antara  12-13  dapat mengekspos bakteri ke lingkungan ekstrem dan memberikan  kondisi  stres  fisik  pada  bakteri [21].
Kesimpulan
Semua  isolat  bakteri  karbonatogenik mampu membentuk endospora pada media YU broth dengan shock  treatment suhu  70°C,  20 menit. Bacillus AK4  memproduksi  endospora dengan  berat  kering  tertinggi  yaitu  196  mg/L. Setelah  2  jam  inkubasi  di  media  pembawa, semua isolat mampu tumbuh kembali di media NA dengan viabilitas tertinggi pada kontrol dan
media pembawa pasir yaitu sebesar 20,55 x 10 6 dan 10,10 x 10 6 .
Daftar Pustaka:
Talaeikhozan, A. Keyvanfar, A. Shafaghat, A. Andalib, R. Majid, M.Z.A, Fulazzaky, M.A. Zin, R.M.  Lee,  C.T.,  Hussin,  M.W.  Hamzah,  N. Marwar, N.F. and Haidar, H.I. 2014. A Review of Self-healing Concrete Research Development. Journal  of  Environmental Treatment Techniques . 2:1 1-11.
Wei, S., Cui, H., Jiang, Z., Liu, H., He, H., and Fang,  N.  2015.  Biomineralization  Processes Of Calcite Induced By Bacteria Isolated From Marine  Sediments. Brazilian  journal  of Microbiology . 46:2 455-464.
Tagavifar, M., Jang, S.H., Sharma, H., Wang,
D., Chang, L.Y., Mohanty, K., and Pope, G.A. Viabilitas isolat Isolat Media CFU/gr x 10 6 Media CFU/gr x 10 6 Bacillus AK4 Kontrol 1,11 Pasir:Semen 1:1 0,17 Pasir 0,27 Pasir:Semen 1:2 0,03 Semen 0,07 Pasir:Semen 2:1 0,09 Sporocarcina JA4 Kontrol 0,26 Pasir:Semen 1:1 0,13 Pasir 0,92 Pasir:Semen 1:2 0,08 Semen 0,04 Pasir:Semen 2:1 0,12 Lysinibacillus JB2 Kontrol 20,55 Pasir:Semen 1:1 0,51 Pasir 10,10 Pasir:Semen 1:2 1,21 Semen 1,68 Pasir:Semen 2:1 1,75 Bacillus JA1 Kontrol 0,13 Pasir:Semen 1:1 0,06 Pasir 0,34 Pasir:Semen 1:2 0,005 Semen 0,004 Pasir:Semen 2:1 0,005 Bacillus SU1 Kontrol 6,20 Pasir:Semen 1:1 1,57 Pasir 5,83 Pasir:Semen 1:2 1,39 Semen 1,49 Pasir:Semen 2:1 4,11 Bacillus JB3 Kontrol 0,03 Pasir:Semen 1:1 0,01 Pasir 0,01 Pasir:Semen 1:2 0,01 Semen 0,01 Pasir:Semen 2:1 0,01
2018.  Effect  of  pH  on  Adsorption  of  Anionic Surfactants  on  Limestone:  Experimental Study  and  Surface  Complexation  Modeling. Colloids and Surfaces A . 538 549-558
Ivanov  V.,  Chu  J.,  and  Stabnikov  V.  2015.
Basics of Construction
Microbial Biotechnology.  In:  Pacheco  Torgal  F., Labrincha  J.,  Diamanti  M.,  Yu  CP.,  Lee  H. (eds)  Biotechnologies  and  Biomimetics  for Civil Engineering. Springer, Cham .
Rukmana,  G  dan  Zulaika,  E.  2017.  Isolasi Bakteri  Karbonoklastik  dari  Pegunungan Kapur. Jurnal Sains dan Seni ITS . 6:2 2337- 3520.
Utomo,  M.A.P  dan  Zulaika,  E.  2018.  Bakteri Karbonatogenik  Sebagai  Agen  Biosemen Untuk Alternatif Memperbaiki Retakan Beton. Tesis . Departemen Biologi.
Fakultas Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam. Institut Teknologi Sepuluh Nopember
Xu,  J  and  Wang,  X.  2018.  Self-Healing  of Concrete  Cracks  by  Use  of  Bacteria- Containing  Low  Alkali  Cementitious  Material. Construction and Building Materials . 167 1-14.
Pungrasmi, W., Intarasoontron, J.,
Jongvivatsakul, P., and Likitlersuang, S. 2019. Evaluation of Microencapsulation Techniques for  MICP  Bacterial  Spores  Applied  in  Self- Healing Concrete. Scientific Reports . 9 12484.
Duhita,  C.K  dan  Zulaika,  E.  2020.  Aplikasi Endospora  Bakteri  Karbonoklastik  pada Biobeton. Tesis . Departemen Biologi.
Fakultas  Sains  dan  Analitika  Data.  Institut Teknologi Sepuluh Nopember
Harley,  J.P  and  Prescott,  L.M.  2002. Laboratory  Exercises  in  Microbiology,  Fifth Edition . USA: The McGraw-Hill Companies.
Xu,  J.,  Wang,  X.,  Zuo,  J.,  and  Liu,  X.  2018. Self-Healing of Concrete Cracks by Ceramsite Loaded Microorganisms. Advances in Materials Science and Engineering . pg. 1-8.
Sella,  S.R.B.R.,  Vandenberghe,  L.P.S.,  and Soccol,  C.R.  2014.    Life  Cycle  and  Spore Resistance of Spore-Forming Bacillus atrophaeus. Microbiological  Research . 169
931–939
Beskrovnaya, P., Sexton, D.L., Golmohammadzadeh,  M.,  Hashimi,  A  and Tocheva, E.I. 2021. Structural, Metabolic and Evolutionary Comparison of Bacterial
Endospora  and  Exospore  Fomation. Front.
Microbiol . 12:630573
Cezario,  N.  S.,  Peres,  M.V.N.N.,  Fruet,  T.K., Nogueira,  G.S.F.,  Toralles,  B.M.T.,  and Cezario,  D.D.S.  2018.  Crack  Filling  in Concrete  by  Addition  of Bacillus  subtilis spores  –  Preliminary  study. Revista  DYNA . 85:205 132-139
Jiang, L., Jia, G., Wang, Y and Liu, Z. 2020. Optimization  of  Sporulation  and  Germination Conditions of Functional Bacteria for Concrete Crack-Healing and Evaluation of their Repair Capacity. ACS  Appl.  Mater.  Interfaces . 12 10938-10948
Movahedi,  S.,  and  Waites,  W.  2002.  Cold Shock  Response  in  Sporulating  Bacillus subtilis  and  Its  Effect  on  Spore  Heat Resistance. Journal  of  Bacteriology . 184:19
5275-5281
Mutlu, A., Charlotte K., Nils B., and Ilka B.B. 2020.  A  Spore  Quality-Quantity  Tradeoff Favors  Diverse  Sporulation  Strategies  in Bacillus subtilis. ISME Journal . 14 2703-2714
Isoard,  C.B.,  Véronique  B.,  and  Frédéric  C. 2018.  Sporulation  environment  influences spore  properties  in Bacillus:  evidence  and insights  on  underlying  molecular  and physiological mechanisms.
FEMS Microbiology Reviews . 42:5 614–626
Cliff,  J.B.,  Jarman,  K.H.,  Valentine,  N.B., Golledge, S.L., Gaspar, D.J., Wunschel, D.S., and Wahl, K.L. 2005. Differentiation of Spores of Bacillus subtilis Grown in Different Media by Elemental  Characterization  Using  Time-of Flight  Secondary  Ion  Mass  Spectrometry. Applied  and  Environmental Microbiology . 71:11 6524–6530
Tan,  I.  S.,  and  Kumaran  S.  R.  2014.  Spore formation  in  Bacillus  subtilis. Environmental microbiology reports . 6:3 212-215.
Jonkers,  H.M.,  Thijssen,  A.,  Muyzerb,  G., Copuroglua,  O.,  and  Schlangena,  E.  2010. Application of Bacteria as Self-healing Agent for The Development of Sustainable Concrete.
Ecological Engineering . 36 230-235