Pengaruh Ekstrak Etanol Tangkai Begonia multangula Blume Terhadap Biofilm Bakteri Aggregatibacter actinomycetemcomitans ATCC 6514
Effect Etanol Extract of The Stalk Begonia multangula Blume Against Biofilm Aggregatibacter actinomycetemcomitans ATCC 6514
Haidy Lailatun Nabila 1 , Dwi Nur Indah Sari 1 , Rinawati Satrio 1 *, Nur Amalia Choironi 2 , Maulina Triani 1 , Christiana Cahyani Prihastuti 1 , Restian Febi Andini 1 1 Departement of Dentistry, Faculty of Medicine, University of Jenderal Soedirman, Dr Gumbreg Street Number 1 Mersi, Purwokerto, 53112, Indonesia
2 Pharmaceutical Biology Laboratory, Department of Pharmacy, Jendral Soedirman University, Karangwangkal Purwokerto Campus, 53123, Indonesia email: haidynabila88@gmail.com , rinawati.satrio@unsoed.ac.id (tanggal diterima: 19-05-2022, tanggal disetujui: 06-09-2022)

## INTISARI
Periodontitis agresif merupakan salah satu jenis penyakit gigi dan mulut yang menyerang jaringan periodontal dengan perkembangan penyakit dan kerusakan yang sangat cepat. Pencegahan periodontitis agresif dapat dilakukan dengan mencegah terbentuknya biofilm bakteri gigi. Salah satu bakteri tersebut adalah Aggregatibacter actinomycetemcomitans . Tangkai Begonia multangula Blume diketahui  memiliki  aktivitas  antibakteri,  tetapi  aktivitasnya  terhadap  biofilm A. actinomycetemcomitans belum  diketahui.    Tujuan  penelitian  ini  untuk  mengetahui  aktivitas antibiofilm ekstrak etanol tangkai B. multangula Blume terhadap bakteri A. actinomycetemcomitans . Penelitian ini terdiri dari 5 kelompok perlakuan ekstrak etanol tangkai B. multangula Blume (6,25,  12,5,  25,  50  dan  100%), k ontrol  negatif  (akuades  steril)  dan  kontrol  positif  (CHX  0,2%). Pengukuran biofilm dilakukan menggunakan microtitter plate biofilm assay pada panjang gelombang 620 nm dengan pewarna kristal violet. Uji statistik one way ANOVA dan post hoc LSD dilakukan untuk menganalisis perbedaan ketebalan biofilm tiap perlakuan.
Hasil  menunjukkan  bahwa  ketebalan  biofilm  pada  perlakuan  ekstrak  etanol  tangkai B. multangula Blume semakin rendah seiring dengan peningkatan konsentrasi. Penghambatan biofilm tertinggi  terdapat  pada  konsentrasi  ekstrak  100%  (74,92%)  dengan Minimum  Biofilm  Inhibition Concentration 50  (MBIC 50 )  terdapat  pada  konsentrasi  ekstrak  25%  (54,42%).    Uji  statistik menunjukkan  adanya  perbedaan  signifikan  (p≤0,05)  pada  pemberian  ekstrak  etanol  tangkai B. multangula Blume konsentrasi 6,25, 12,5, 25, 50 dan 100% dengan kontrol negatif serta tidak ada perbedaan signifikan (p≥0,05) pada perlakuan konsentrasi 50 dan 100% jika dibandingkan dengan kontrol positif dengan Simpulan penelitian ini ekstrak etanol tangkai B. multangula Blume memiliki aktivitas antibiofilm terhadap bakteri A. actinomycetemcomitans .
Kata  kunci  :  Aggregatibacter  actinomycetemcomitans;  Begonia  multangula  Blume;  Biofilm; Periodontitis agresif

## ABSTRACT
Aggressive  periodontitis  is  a  type  of  peridontitis  with  rapid  disease  progression  and destruction.  One  of  the  causes  of  aggressive  periodontitis  is  the  presence  of  Aggregatibacter actinomycetemcomitans biofilm. Prevention of biofilm formation is one way to prevent aggressive periodontitis. The stalk of B. multangula Blume has antibacterial activity and has the potential to be used as an antibiofilm.  This research aimed to determined antibiofilm activity of etanol extract of the stalk B. multangula Blume against A. actinomycetemcomitans..
This research used 5 concentration of extract (6,25, 12,5, 25, 50 and 100%), negative control (qquades  sterile)  and  positive  control  (CHX  0,2%).  Inhibition  biofilm  test  using  microtitter  plate biofilm assay with crystal violet staining at anaerobic incubation for 24 hours and using microplate reader  at  620  nm.  One  way  ANOVA  and  post  hoc  LSD  were  used  to  analyze  the  differences  in antibiofilm activity.
The result showed inhibition biofilm activity of A. actinomycetemcomitans by the extract increased as increasing of the concentration. The highest biofilm inhibition was at 100% (74,92%) of the extract concentration and Minimum Biofilm Inhibition Concentration 50 (MBIC 50 ) against A. actinomycetemcomitans  was  found  at  25%  (54,42%)  of  the  extract  concentration.  There  were significant difference (p≤0,05) between treatment group of etanol extract (concentration 6,25, 12,5, 25, 50, and 100%) with negative control and there were no significant difference  (p≥0,05) in the positive control with 50 and 100% of the extract concentration. This study concluded that there was an antibacterial activity etanol extract of the stalk B. multangula Blume against inhibition biofilm of A. actinomycetemcomitans.
Keyword  :  Aggregatibacter  actinomycetemcomitans;  Aggressive  Periodontitis;  Begonia multangula Blume; Biofilm

## 1. PENDAHULUAN
Periodontitis  merupakan  penyakit  inflamasi  kronis  yang  dapat mempengaruhi  jaringan  pendukung  gigi,  mengurangi  perlekatan  jaringan periodontal hingga menyebabkan kehilangan gigi [1] . Salah satu jenis periodontitis yang  memiliki  perkembangan  penyakit  dan  kerusakannya  sangat  cepat  adalah periodontitis  agresif.  Periodontitis  agresif  dapat  menyebabkan  hilangnya perlekatan  jaringan  ikat  dan  kerusakan  tulang  alveolar  yang  lebih  cepat  dari periodontitis  kronis  walaupun  dengan  faktor  etiologi  yang  minimal [2] .  Bakteri spesifik  dan  dominan  yang  dapat  menyebabkan  periodontitis  agresif  yaitu Aggregatibacter actinomycetemcomitans [3] .
A.  actinomycetemcomitans merupakan  bakteri  Gram  negatif,  bersifat fakultatif  anaerob,  dan  banyak  ditemukan  di  rongga  mulut  manusia,  seperti  plak supragingiva,  plak  subgingiva,  saliva,  mukosa  bukal,  gingiva,  permukaan  dorsum dan  lateral  dari  lidah,  palatum  durum  dan  tonsil [4] .  Bakteri A. actinomycetemcomitans bersifat oportunistik dan memiliki faktor virulensi seperti leukotoksin, cytolethal  distending  toxin (CDT),  lipopolisakarida  (LPS)  dan Heat Shock  Proteins (HSP)  yang  mendukung  kemampuannya  bertahan  hidup  dalam rongga  mulut  serta  menghindari  sistem  pertahanan host sehingga  dapat menyebabkan  destruksi  jaringan  periodontal  hingga  kehilangan  tulang  alveolar [3,5] . Selain itu, A. actinomycetemcomitans memiliki kemampuan untuk membentuk biofilm  yang  dapat  melindungi  bakteri  dari  respon  imun host sehingga menyebabkan  pelepasan  mediator  inflamasi  yang  kontinyu  dan  menyebabkan kerusakan  jaringan  periodontal [2] .  Hal  ini  akan  menyebabkan  meningkatnya inflamasi  subgingival  dan  pembentukan  poket  periodontal  sebagai  proses terjadinya periodontitis [1] .
Pencegahan  terjadinya  periodontitis  dapat  dilakukan  dengan  mencegah pembentukan biofilm dengan meningkatkan oral hygiene . Chlorhexidine gluconate (CHX)  sering  digunakan  sebagai  agen  antimikroba  untuk  mengurangi  plak  gigi.
Namun,  penggunaan chlorhexidine  gluconate dapat  memberikan  beberapa  efek samping antara lain menyebabkan stain pada gigi, memiliki efek yang merugikan pada jaringan vital hingga menyebabkan perkembangan hipersensivitas [6] . Oleh karena itu, penggunaan bahan herbal dapat dijadikan sebagai alternatif yang efektif dalam menghambat patogen dan tidak memiliki efek samping [7] . Beberapa  penelitian  sudah  dilakukan  mengenai  penggunaan  bahan  herbal yang  mampu  memberikan  efek  terhadap    pembentukan    biofilm A.actinomycetemcomitans, salah  satunya  adalah Matricaria  chamomilla yang memiliki kandungan saponin, alkaloid, fenol, flavonoid dan tanin [7] . Tanaman lain yang  memiliki  potensi  sebagai  antibiofilm  adalah Begonia  multangula Blume. B. multangula Blume merupakan  tanaman  yang  dapat  ditemukan  di  kawasan perhutanan  daerah  Jawa  dan  Bali [8] . B.  multangula Blume dapat  ditemukan  di Kebun  Raya  Baturaden,  Jawa  Tengah  dan  memiliki  kandungan  senyawa  anti mikroba yang berpotensi untuk dikembangkan sebagai tumbuhan obat [9] . Ekstrak etanol tangkai B. multangula Blume memiliki kandungan fitokimia yaitu, saponin, alkaloid,  fenol,  flavonoid  dan  tanin [10] .  Potensi  kandungan  fitokimia  ekstrak tersebut memiliki efek antibakteri yang mampu menghambat pembentukan biofilm bakteri A.    actinomycetemcomitans .  Namun  demikian,  penelitian  mengenai  efek antibiofilm  tangkai B.  multangula Blume terhadap A.    actinomycetemcomitans belum pernah diteliti. Oleh karena itu, peneliti tertarik untuk meneliti lebih lanjut mengenai  ekstrak  etanol  tangkai B.  multangula Blume terhadap  penghambatan pembentukan biofilm A. actinomycetemcomitans . Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui  aktivitas  antibiofilm  ekstrak  etanol  tangkai B.  multangula Blume terhadap penghambatan pembentukan biofilm A. actinomycetemcomitans .

## 2. METODE PENELITIAN

## 2. 1. ALAT DAN BAHAN
Alat yang digunakan pada penelitian ini antara lain, cawan petri, jarum ose, bunsen,  gelas  ukur,  tabung  reaksi  (Pyrex),  rak  tabung  reaksi,  inkubator  CO 2 , timbangan digital (AND), autoklaf (All American), mikropipet,  96- well flat bottom microplate , alumunium foil, tabung erlenmeyer (Pyrex), hotplate stirrer (Cleaver), microplate reader (Elisa Reader 270), oven, blender, toples kaca, rotary evaporator , kertas saring, dan penangas air.
Bahan yang digunakan pada penelitian ini antara lain, tangkai B. multangula Blume dewasa,  isolat  bakteri A.  actinomycetemcomitans ATCC  6514,  etanol  96%, kristal  violet  1%, de  Man  Ragosa  and  Sharpe (MRS) agar (HiMedia), Brain  Heart Infusion (BHI) broth (HiMedia),  akuades  steril,  larutan  standar  McFarland  0,5, alkohol  70%, chlorhexidine  gluconate 0,2%, phosphate  buffer  saline (PBS), isopropanol 5%, FeCl3, HCl 2N, larutan Dragendroff dan serbuk Mg.

## 2. 2. CARA KERJA

## Ethical Clearance
Ethical  clearance didapatkan  dari  Komite  Etik  Penelitian  Fakultas Kedokteran Universitas Jenderal Soedirman dengan nomor surat
219/KEPK/X/2021 kerja dituliskan sejelas mungkin.
Sterilisasi Alat
Sterilisasi alat berbahan kaca dan logam menggunakan autoklaf selama 15 menit dengan suhu 121 0 C dan tekanan 2 atm. Alat yang menggunakan bahan plastik dibersihkan menggunakan alkohol 70% [11] .
Pembuatan Ekstrak Etanol Tangkai B. multangula Blume Tangkai B. multangula Blume diambil dari Kebun Raya Baturaden kemudian dilakukan determinasi tanaman di Laboratorium Biologi Farmasi Fakultas Farmasi Universitas  Muhammadiyah  Purwokerto  untuk  memastikan  tanaman  yang digunakan  adalah  tangkai B.  multangula Blume.  Tangkai B.  multangula Blume selanjutnya  diekstraksi  dengan  cara  maserasi.  Tangkai  dicuci  sampai  bersih kemudian dipotong dengan ketebalan 1-2 mm. Potongan tangkai dijemur dibawah sinar matahari tidak langsung selama ±10 jam. Hasil penjemuran kemudian dioven selama  ±  10  menit  dengan  suhu  70 0 C.  Tangkai  yang  telah  kering  dihaluskan menggunakan  blender.  Sebanyak  10  g  tangkai  yang  sudah  dihaluskan  direndam dalam 100 mL akuades dan 100 mL etanol 96% selama 3x24 jam pada suhu ruang tanpa cahaya matahari. Pergantian pelarut dilakukan selama 24 jam pertama dan kedua dengan menyaring filtrat terlebih dahulu. Hasil saringan pertama, kedua dan ketiga  disatukan  ke  dalam  wadah  untuk  diuapkan  pelarutnya  menggunakan penangas  70 0 C  hingga  diperoleh  ekstrak  sebanyak  setengah  dari  volume  awal. Ekstrak  yang  di  dapatkan  dilakukan  uji  pH  dengan  menggunakan  kertas  pH universal dengan nilai yang diharapkan pada pH 6-7. Ekstrak dilakukan uji bebas etanol  dengan  memasukkan  sampel  ekstrak  ke  dalam  tabung  reaksi  yang ditambahkan asam asetat dan asam sulfat kemudian dipanaskan. Ekstrak dikatakan bebas etanol jika tidak terdapat bau ester yang khas dari etanol [10] . Selanjutnya dilakukan  pembuatan  konsentrasi  ekstrak  6,25,  12,5,  25,  50  dan  100%  dengan ditimbang ekstrak etanol tangkai B. multangula Blume kental kemudian dilarutkan dengan akuades steril [12,13] .

## Uji Flavonoid
Ekstrak etanol tangkai B. multangula Blume diambil sebanyak 5 ml kemudian ditambahkan  2  ml  HCl  2N,  serbuk  Mg  dan  amil  alkohol  kemudian  dikocok  dan dibiarkan  hingga  memisah.  Jika  terdapat  perubahan  warna  menjadi    jingga  atau kuning pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya flavonoid[14] .
Uji Tanin
Sebanyak 3 ml ekstrak yang diekstraksi akuades panas kemudian disaring dan  didinginkan.  FeCl 3 dimasukkan  sebanyak  3  tetes.  Jika  terdapat  perubahan warna menjadi biru tua atau hitam kehijauan menunjukkan adanya fenol [15] .
Uji Saponin
Sebanyak 5 ml ekstrak dikocok secara vertikal pada tabung reaksi selama 10 detik  dan  ditambahkan  HCl  2  N.  Pembentukan  buih  menyerupai  sarang  lebah setinggi  1-10  cm  yang  stabil  selama  10-15  menit  maka  menunjukkan  adanya saponin [14].

## Uji Fenol
Sebanyak 3 ml  ekstrak yang diekstraksi akuades panas kemudian disaring dan  didinginkan.  FeCl 3 dimasukkan  sebanyak  3  tetes.  Jika  terdapat  perubahan warna menjadi biru tua atau hitam kehijauan menunjukkan adanya fenol [15] .
Uji Alkaloid
Larutan  ekstrak  sebanyak  3  ml  dipanaskan  di  atas  penangas  air  selama  2 menit. Residu larutan ditambahkan 5 ml HCl 2N kemudian didinginkan dan disaring. Sampel yang telah dingin ditambahkan reagen Dragendroff sebanyak 3 tetes. Jika terdapat endapan jingga menandakan terdapat kandungan alkaloid [16] .
Pembuatan Media Pembuatan media de Man Ragosa and Sharpe (MRS) agar sebanyak 62 gram MRSA  dilarutkan  dalam  1  L  akuades  kemudian  dihomogenkan  menggunakan hotplate stirrer . Sterilisasi media menggunakan autoklaf selama 15 menit dengan suhu  121 0 C  dan  tekanan  2  atm.  Media  yang  sudah  steril  dituang  ke  cawan  petri sebanyak 15 ml [17] . Pembuatan media Brain Heart Infusion (BHI) broth sebanyak 37 gram BHIB dilarutkan  dalam  1  L  akuades  kemudian  dihomogenkan  menggunakan hotplate stirrer . Sterilisasi media menggunakan autoklaf selama 15 menit dengan suhu 121 0 C dan tekanan 2 atm. Media yang sudah steril dituang ke tabung reaksi sebanyak 10 ml [18] .
Peremajaan Bakteri Bakteri A.  actinomycetemcomitans dilakukan  peremajaan  dalam  MRSA dengan  metode streak  plate kemudian  dilakukan  inkubasi  secara  anaerob menggunakan  inkubator  CO 2 pada  suhu  37 0 C  selama  24  jam.  Morfologi  koloni bakteri A. actinomycetemcomitans pada medium MRSA berwarna putih kekuningan dan memiliki permukaan cembung
Suspensi Bakteri Pembuatan suspensi bakteri A. actinomycetemcomitans dalam BHIB. Satu ose bakteri dari kultur bakteri MRSA diambil dan dimasukkan ke dalam larutan BHIB 2
ml pada tabung reaksi steril. Bakteri dihomogenkan menggunakan vortex. Tabung reaksi  tersebut  dimasukkan  ke  dalam  desicator  kemudian  diinkubasi  secara anaerob menggunakan inkubator CO 2 selama 24 jam dengan suhu 37 0 C. Suspensi tersebut dibandingkan secara visual dengan konsentrasi 0,5 standar Mc Farland (1,5 x 10 8 CFU/ml) yang dilakukan oleh 2 orang pengamat. Suspensi bakteri dilakukan dilusi 1:100 dengan media yang baru [19,20] .
Uji Pembentukan Biofilm Uji pembentukan biofilm dilakukan dengan metode microtitter plate biofilm assay menggunakan  kristal violet sebagai  pewarna sel-sel yang masih hidup atau mati  dan  matriks  biofilm.  Sebanyak  150  µL  BHIB  dan  50  µL  suspensi  bakteri A. actinomycetemcomitans dimasukkan  ke  dalam  96-well flat  bottom  microplate sebagai  kontrol  uji.  Sebanyak  200  µL  BHIB  sebagai  kelompok  kontrol.  Inkubasi dilakukan secara anaerob pada suhu 37 0 C dengan waktu inkubasi 24 jam. Setelah proses  inkubasi  selesai,  isi  dari  96-well flat  bottom  microplate dikeluarkan  dan dicuci  tiga  kali  dengan  200  µL  PBS  menggunakan  mikropipet  dan  dikeringkan selama  15  menit.  Larutan  kristal  violet  1%  dimasukkan  sebanyak  200  µL  dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu ruang. Isi larutan dalam 96-well flat bottom microplate dibuang dan dicuci dengan air deionisasi dan dibiarkan kering pada suhu ruang.  Setelah  96-well flat  bottom  microplate kering,  200  µL  isopropanol dimasukkan  kedalam  96-well flat  bottom  microplate dan  diinkubasi  selama  15 menit pada suhu ruang. Prosedur selanjutnya dilakukan pengukuran densitas optik (DO) menggunakan microplate reader dengan panjang gelombang 620 nm [21] . Uji pembentukan biofilm dilakukan dengan ulangan sebanyak 3 kali.
Berdasarkan Ruchi et al. [21] hasil DO dapat dihitung nilai DO cut off dengan rumus sebagai berikut :
𝑫𝑶 𝒄𝒖𝒕 = 𝑫𝑶 𝒌𝒐𝒏𝒕𝒓𝒐𝒍 + ( 𝟑 𝒙 𝒔𝒕𝒂𝒏𝒅𝒂𝒓 𝒅𝒆𝒗𝒊𝒂𝒔𝒊 𝑫𝑶 𝒌𝒐𝒏𝒕𝒓𝒐𝒍) 𝑫𝑶 𝒔𝒖𝒔𝒑𝒆𝒏𝒔𝒊 = 𝑫𝑶 𝒖𝒋𝒊 − 𝑫𝑶 𝒄𝒖𝒕
Berdasarkan  Ruchi et  al. [21] hasil  perhitungan  DO  suspensi  dilakukan interpretasi dalam kategori, sebagai berikut :
a. Non biofilm producer yaitu nilai DO suspensi ≤ DO cut
b. Weak biofilm producer yaitu nilai DO cut < DO suspensi ≤ 2x DO cut
c. Moderate biofilm producer yaitu nilai 2x DO cut < DO suspensi ≤ 4x DO cut
d. Strong biofilm producer yaitu nilai 4x DO cut ≤ DO suspensi
Uji Penghambatan Pembentukan Biofilm
Uji  penghambatan  pembentukan  biofilm  dilakukan  dengan  metode microtitter plate biofilm assay menggunakan kristal violet. Sebanyak 130 µL BHIB dimasukkan  ke  dalam  96- well  flat  bottom microplate .  Sebanyak  20  µL  suspensi bakteri A.  actinomycetemcomitans dimasukkan  ke  dalam  96- well  flat  bottom microplate . Ekstrak etanol tangkai B. multangula Blume juga dimasukkan sebanyak 50 µL dengan masing-masing konsentrasi 6,25, 12,5, 25, 50, dan 100% kedalam 96- well flat bottom microplate serta 50 µL akuades steril sebagai kontrol negatif dan 50 µL clorhexidine  gluconat 0,2%  sebagai  kontrol  positif.  Inkubasi  dilakukan  secara
anaerob pada suhu 37 0 C dengan  waktu inkubasi 24 jam. Setelah proses  inkubasi selesai,  isi  dari 96-well  flat  bottom  microplate dikeluarkan  dan  dicuci  tiga  kali dengan  200  µL  PBS  menggunakan  mikropipet  dan  dikeringkan  selama  15  menit. Larutan kristal violet 1% dimasukkan sebanyak 200 µL dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu ruang. Isi larutan dalam 96-well flat bottom microplate dibuang dan dicuci dengan air deionisasi dan dibiarkan kering pada suhu ruang. Setelah 96-well flat bottom microplate kering, 200 µL  isopropanol dimasukkan kedalam 96-well flat bottom  microplate dan  diinkubasi  selama  15  menit  pada  suhu  ruang.  Prosedur selanjutnya  dilakukan  pengukuran  densitas  optik  (DO)  menggunakan microplate reader dengan panjang gelombang 620 nm dan dilakukan dengan 2 orang pengamat [2,20,22] .  Uji  penghambatan  biofilm  dilakukan  dengan  ulangan  sebanyak  3  kali. Berdasarkan Dinda et al. [2,20,22] persentase penghambatan pembentukan biofilm dihitung menggunakan rumus:
% 𝐩𝐞𝐧𝐠𝐡𝐚𝐦𝐛𝐚𝐭: 𝐃𝐎 𝐊𝐨𝐧𝐭𝐫𝐨𝐥 𝐏𝐞𝐫𝐭𝐮𝐦𝐛𝐮𝐡𝐚𝐧 −𝐃𝐎 𝐒𝐚𝐦𝐩𝐞𝐥
𝐃𝐎 𝐊𝐨𝐧𝐭𝐫𝐨𝐥 𝐏𝐞𝐫𝐭𝐮𝐦𝐛𝐮𝐡𝐚𝐧 𝐱 𝟏𝟎𝟎%

## [18]
Penentuan MBIC 50 Penentuan Minimum Biofilm Inhibition Concentration 50 (MBIC50) dilakukan dengan  menentukan  konsentrasi  ekstrak  yang  dapat  menghambat  minimal  50% dari hasil uji pembentukan biofilm [23] .

## 3. HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  uji  fitokimia  yang  dilakukan  untuk  mengetahui  kandungan  senyawa antibakteri ekstrak etanol tangkai B. multangula Blume tersaji pada Tabel 1.
Tabel 1. Hasil uji fitokimia ekstrak Senyawa Fitokimia Hasil Uji Pustaka Flavonoid + [16] Tanin + [15] Saponin + [16] Fenol + [15] Alkaloid + [16]
Sumber : Data primer, 2021
Hasil uji fitokimia menunjukkan ekstrak etanol tangkai B. multangula Blume mengandung senyawa golongan flavonoid, tanin, saponin, fenol, dan alkaloid. Peran etanol sebagai pelarut universal yang dapat menarik senyawa polar, semi-polar dan non-polar sehingga  dapat menarik berbagai senyawa pada simplisia  [24]. Hal ini sesuai  dengan  penelitian  Ghani [10] bahwa  ekstrak  etanol  tangkai B.  multangula Blume memiliki kandungan flavonoid, tanin, saponin, fenol dan alkaloid. Senyawa tersebut  merupakan  senyawa  metabolit  sekunder  yang  berfungsi  sebagai ketahanan tanaman terhadap patogen [25] . Selain itu, senyawa-senyawa tersebut telah lama diketahui berperan sebagai antibakteri pada produk herbal [26] . Uji  pembentukan  biofilm  digunakan  untuk  mengukur  kemampuan  adhesi isolat  bakteri  pada  substrat  atau  dinding well pada microtiter  plate sehingga membentuk  koloni  bakteri.  Uji  pembentukan  biofilm  dapat  membantu
mengidentifikasi  jenis  bakteri  yang  beresiko  tinggi  dan  membantu  penentuan pencegahan  atau  pengobatan  yang  tepat [27] .  Uji  pembentukan  biofilm A. actinomycetemcomitans pada  penelitian  ini  dilakukan  dengan  menggunakan microplate  reader pada  densitas  optik  620  nm  setelah  dilakukan  inkubasi  secara anaerob  pada  suhu  37 0 C  selama  24  jam.  Prosedur  ini  dilakukan  tiga  kali pengulangan dengan hasil dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Nilai DO pembentukan biofilm Kelompok Perlakuan Rerata DO Pustaka Kelompok uji : Suspensi A. actinomycetemcomitans 1,72±0,05 [21] Kelompok kontrol : Media BHIB 0,17 ± 0,07 [21]
Sumber : Data primer yang diolah, 2021
Hasil  perhitungan  pembentukan  biofilm A.  actinomycetemcomitans didapatkan nilai DO cut sebesar 0,38 dan DO suspensi sebesar 1,34. Berdasarkan hasil  uji  tersebut  pembentukan  biofilm A.  actinomycetemcomitans termasuk kategori moderate biofilm producer karena memenuhi 2x DO cut < DO suspensi ≤ 4x DO cut . Aktivitas antibiofilm A. actinomycetemcomitan pada penelitian ini dilakukan dengan  metode microtiter  plate  biofilm  assay menggunakan  kristal  violet.  Kristal violet  mengikat  muatan  negatif  pada  permukaan  molekul  dan  polisakarida  dari matriks  ekstraseluler,  sehingga  kristal  violet  tetap  melekat  setelah  dilakukan pencucian dengan air. Kristal violet mewarnai sel-sel yang masih hidup atau mati dan  matriks  biofilm.  Penggunaan  kristal  violet  menunjukkan  kuantitas  massa biofilm [23] . Menurut Malik et al. [5] kemampuan bakteri A. actinomycetemcomitans dalam  membentuk  biofilm  menunjukkan  perannya  yang  penting  dalam  proses terjadinya  periodontitis  agresif.  Oleh  karena  itu,  pencegahan  terhadap pembentukan biofilm bakteri menjadi salah satu cara untuk mencegah terjadinya periodontitis agresif.
Hasil  pengamatan  biofilm A.  actinomycetemcomitans dapat  dilihat  pada Tabel 3.
Tabel 3. Nilai DO penghambatan biofilm Konsentrasi ekstrak (%) Rerata DO 6,25 0,67 ±0,02 12,5 0,54 ±0,15 25 0,45 ±0,14 50 0,33 ±0,06 100 0,30 ±0,05 Kontrol Positif 0,25 ±0,03 Kontrol Negatif 0,99 ±0,32 Sumber : Data primer, 2021
Hasil  uji  penghambatan  biofilm A.  actinomycetemcomitans pada  kelompok perlakuan  menunjukkan  nilai  DO  semakin  rendah  seiring  dengan  peningkatan konsentrasi  ekstrak  etanol  tangkai B.  multangula Blume.  Nilai  DO  tertinggi  pada kelompok perlakuan terdapat pada konsentrasi 6,25% dengan nilai rerata 0,67 ±
0,02, sedangkan nilai DO terendah terdapat pada  konsentrasi 100% dengan  nilai rerata  0,30  ±  0,05.  Hal  ini  menunjukkan  aktivitas  penghambatan  pada  tiap konsentrasi ekstrak berbeda dan semakin tinggi konsentrasi ekstrak semakin tinggi aktivitas  penghambatannya.  Namun,  aktivitas  penghambatan  biofilm  pada konsentrasi  ekstrak  100%  tampak  lebih  rendah  dibandingkan  dengan  kontrol positif  ( clorhexidine  gluconat 0,2%).  Hal  ini  dapat  diketahui  dari  nilai  DO konsentrasi  100%  masih  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  nilai  DO  kelompok kontrol  positif  ( clorhexidine  gluconat 0,2%)  dengan  nilai  rerata  0,25  ±  0,03. Sebaliknya, nilai DO konsentrasi 6,25% lebih rendah dibandingkan nilai DO pada kelompok  kontrol  negatif  dengan  nilai  rerata  0,99  ±  0,32.  Hal  ini  membuktikan adanya pengaruh pemberian ekstrak etanol tangkai B. multangula Blume terhadap penghambatan biofilm bakteri A. actinomycetemcomitans .
Hasil  nilai  DO  selanjutnya  dilakukan  perhitungan  persentase  aktivitas antibiofilm  ekstrak  etanol  tangkai B.  multangula Blume  terhadap  penghambatan pembentukan biofilm A. actinomycetemcomitans yang dapat dilihat pada grafik.
Grafik 1. Persentase Penghambatan Pembentukan Biofilm A. actinomycetemcomitans Keterangan : KP : Kontrol Positif, KN : Kontrol Negatif
Grafik  1  menunjukkan  aktivitas  antibiofilm  ekstrak  etanol  tangkai B. multangula Blume terhadap biofilm A. actinomycetemcomitans meningkat seiring dengan bertambahnya konsentrasi. Rerata penghambatan pada konsentrasi ekstrak 100%  sebesar    69,70%  sedikit  lebih  rendah  dibandingkan  dengan  rerata penghambatan  Kontrol  Positif  sebesar  74,75%.  Ekstrak  etanol  tangkai B. multangula Blume dengan konsentrasi 100% memiliki nilai penghambatan biofilm paling tinggi dibandingkan dengan konsentrasi ekstrak lain. Hal ini sejalan dengan penelitian  Ghani [10] menunjukkan  konsentrasi  100%  ekstrak  etanol  tangkai B.
multangula Blume  memiliki  nilai  penghambatan  biofilm  paling  tinggi  terhadap bakteri F. nucleatum dibandingkan konsentrasi lainnya. Kandungan  flavonoid  dalam  ekstrak  etanol  tangkai B.  multangula Blume yaang diduga berperan sebagai antibiofilm dan antibakteri. Flavonoid memiliki sifat semipolar  [28].  Flavonoid  sebagai  antibiofilm  berperan  dengan  menghambat ekspresi  gen  spesifik  bakteri  terhadap  pembentukan  biofilm  dan  menurunkan fungsi  hidrofobik  bakteri.  Penurunan  fungsi  hidrofobik  bakteri  selanjutnya  akan mempengaruhi  penurunan  kemampuan  adhesi  sel  sehingga  tidak  terjadi pembentukan biofilm [29] .
Aktivitas antibiofilm ekstrak etanol tangkai B. multangula Blume terhadap bakteri A. actinomycetemcomitans kemungkinan juga dipengaruhi adanya senyawa saponin  pada  ekstrak.  Saponin  dapat  mempengaruhi  sistem  biofilm  dalam  dua aspek.  Aspek  yang  pertama,  saponin  dapat  menurunkan  tegangan  permukaan dalam larutan air dan membentuk misel hingga mencapai titik kritis menyebabkan terjadinya perubahan makromolekul yang dapat menyebabkan degradasi dinding sel hingga menyebabkan disrupsi membran sitoplasma dan kebocoran sel. Aspek yang  kedua  saponin  dapat  mengikat  permukaan  sterol  dalam  membran  sel eukariotik  sehingga  menyebabkan  perforasi  dan  pecahnya  membran  sel  yang menyebabkan sistem biofilm runtuh [30] . Hasil penelitian ini menunjukkan ekstrak etanol tangkai B. multangula Blume juga mengandung tanin, suatu senyawa yang telah lama diketahui memiliki aktivitas sebagai antibiofilm dan antibakteri. Peran tanin dalam menghambat biofilm dengan menurunkan  permukaan  lapisan  peptidoglikan  dan  meningkatkan  interaksi komponen  bioaktif  tanin  dengan  reseptor  sel  adhesi  yang  menyebabkan ketidakseimbangan  potensial  elektrisitas  sel  bakteri  serta  menghambat  sintesis senyawa adhesi intrasel polisakarida [31] .
Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  terdapat  kandungan  fenol  dan  alkaloid dalam  ekstrak  etanol  tangkai B.  multangula Blume yang  kemungkinan  dapat berperan sebagai antibakteri. Mekanisme antibakteri fenol dengan menginaktivasi protein  pada  membran  sel,  merusak  membran  sitoplasma  dan  menyebabkan kebocoran  pada  inti  sel [32] .  Alkaloid  memiliki  mekanisme  antibakteri  dengan mengganggu  komponen  penyusun  peptidoglikan  sel  bakteri  sehingga  lapisan dinding  sel  tidak  terbentuk  utuh  dan  menyebabkan  kematian  sel.  Alkaloid  juga dapat  menyebabkan  perubahan  keseimbangan  genetik  pada  rantai  DNA  bakteri hingga  mendorong  terjadinya  lisis [33] .  Selain  itu,  fenol  dan  alkaloid  juga memberikan efek sinergistik dan mempengaruhi aktivitas antioksidan [34].
Hasil  uji  statistic one  way  ANOVA menunjukkan  terdapat  perbedaan  yang bermakna (p<0,05). Hal ini menunjukkan adanya pengaruh perlakuan penambahan ekstrak etanol tangkai B. multangula Blume terhadap pembentukan biofilm bakteri A. actinomycetemcomitans . Hal ini diperkuat dengan adanya hasil uji post hoc yang menunjukkan perbedaan signifikan (p≤0,05) antar perlakuan ekstrak etanol tangkai B.  multangula Blume konsentrasi  6,25,  12,5,  25,  50,  dan  100%  dengan  kontrol negatif.
Hasil  uji post  hoc lainnya  menunjukkan  tidak  ada  perbedaan  signifikan (p≥0,05) antar perlakuan ekstrak etanol tangkai B. multangula Blume konsentrasi 50 dan 100% dengan kontrol positif berupa chlorhexidine gluconate 0,2%. Hal ini mungkin  terjadi  karena  ekstrak  etanol  tangkai B.  multangula Blume pada konsentrasi 50 dan 100% memiliki aktivitas penghambatan pertumbuhan biofilm yang  sepadan  dengan  kemampuan chlorhexidine  gluconate 0,2%.  Namun, persentase  penghambatan  biofilm A.  actinomycetemcomitans konsentrasi  ekstrak 100% masih lebih rendah dibandingkan dengan kontrol positif yaitu chlorhexidine gluconate 0,2%.  Hal  ini  sejalan  dengan  penelitian  Diana et  al. [35] yang menunjukkan chlorhexidine  gluconate 0,2%  mampu  menghambat  pembentukan biofilm A.  actinomycetemcomitans lebih  baik  daripada  konsentrasi  100%  ekstrak etanol Curcuma  xanthorrhiza .  Ekstrak  etanol  tangkai B.  multangula Blume berpotensi untuk dijadikan sebagai alternatif bahan antiseptik sebagai pencegahan penyakit periodontitis agresif. Namun, perlu dilakukan pengembangan lebih lanjut pada penelitian ini.
Pemilihan chlorhexidine gluconate 0,2% sebagai kontrol positif dikarenakan larutan tersebut  sering digunakan sebagai obat kumur untuk  mengontrol biofilm atau  plak  gigi  sehingga  mencegah  terjadinya  karies  pada  gigi [36] . Chlorhexidine gluconate juga diketahui menjadi gold standard dari antiseptik untuk rongga mulut. Pada  penelitian  ini  kontrol  positif  mampu  menghambat  pembentukan  biofilm A. actinomycetemcomitans sebesar 74,75%.
Chlorhexidine  gluconate merupakan  antibakteri broad  spectrum . Chlorhexidine yang mengikat dinding sel bakteri akan menyebabkan perubahan dan kerusakan struktur permukaan sel yang menyebabkan terjadinya ketidakseimbangan osmotik. Hal tersebut akan menyebabkan keluarnya sitoplasma yang menyebabkan kematian sel [37] . Konsentrasi Minimum  Biofilm  Inhibition  Concentration 50  (MBIC 50 ) dilakukan  dengan  menentukan  konsentrasi  ekstrak  yang  dapat  menghambat minimal 50% dari pembentukan biofilm [23] . Hasil uji penelitian ini mendapatkan nilai MBIC 50 terlihat pada konsentrasi 25% atau 0,250 µg/ml dengan nilai 54,55%. Teanpaisan et  al. [38] melakukan  penelitian  mengenai  ekstrak  tanaman  herbal Thailand  yaitu  ekstrak  etanol Piper  betle pada  pertumbuhan  biofilm A. actinomycetemcomitans dan  didapatkan  nilai  MBIC 50 0,100  µg/ml  dengan persentase penghambatan sebesar 60%. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol Piper  betle memiliki  kemampuan  menghambat  pembentukan  biofilm A. actinomycetemcomitans yang  lebih  tinggi  daripada  ekstrak  etanol  tangkai B. multangula Blume.
Penelitian  sebelumnya  mengenai  antibiofilm  ekstrak  etanol  tangkai B. multangula Blume telah  dilakukan  terhadap  beberapa  bakteri  Gram  negatif. Penelitian  Ghani [10] menunjukkan  bahwa  ekstrak  etanol  tangkai B.  multangula Blume pada  konsentrasi  100%  dapat  menghambat  biofilm  bakteri F.  nucleatum sebesar 78,12% dan memiliki nilai MBIC 50 25%. Penelitian Gusri [39] menunjukkan bahwa ekstrak etanol tangkai B. multangula Blume pada konsentrasi 100% dapat menghambat biofilm bakteri P. gingivalis sebanyak 82,5% dan memiliki nilai MBIC 50
50%.  Hasil  penelitian  ini,  ekstrak  etanol  tangkai B.  multangula Blume pada konsentrasi  100%  dapat  menghambat  biofilm  bakteri A.  actinomycetemcomitans 69,70%  dan  memiliki  nilai  MBIC 50 25%.  Hal  ini  kemungkinan  disebabkan  oleh beberapa  faktor  salah  satunya  perbedaan  penggunaan  pelarut  konsentrasi  dan sensitifitas  bakteri  terhadap  ekstrak.  Larutan  yang  digunakan  untuk  membuat konsentrasi ekstrak dalam penelitian Ghani [10] dan Gusri [39] adalah DMSO 1%, sedangkan  pada  penelitian  ini  menggunakan  akuades  steril.  Penggunaan  DMSO dinilai lebih efektif dalam melarutkan senyawa ekstrak dibandingkan akuades steril. Hal ini sejalan dengan penelitian Rachmawaty et al. [40] yang menyatakan bahwa ekstrak daun Piper crocatum dengan pelarut DMSO lebih efektif dalam menghambat bakteri S.  aureus dibandingkan  dengan  pelarut  ekstrak  akuades  steril.  Terkait sensitifitas  bakteri,  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  bakteri A. actinomycetemcomitans kurang  sensitif  terhadap  ekstrak  etanol  tangkai B. multangula Blume dibandingkan dengan bakteri P. gingivalis dan F. nucleatum. Hal ini sesuai dengan penelitian  Sulistyani et al. [41] yang melakukan uji  antibiofilm ekstrak kelopak bunga rosela ( Hibiscus sabdariffa ) terhadap bakteri patogen rongga mulut diantaranya bakteri A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis dan F. nucleatum . Hasil  penelitian  tersebut  menyatakan  bahwa  bakteri A.  actinomycetemcomitans kurang  sensitif  dibandingkan  dengan  bakteri P.  gingivalis dan F.  nucleatum dikarenakan  bakteri A.  actinomycetemcomitans memiliki  kemampuan  untuk memodulasi faktor virulensi serta kemampuan adaptasi sel yang baik untuk tumbuh pada kondisi yang terbatas [41] .

## 4. KESIMPULAN
Simpulan dari hasil penelitian ini yaitu, ekstrak etanol tangkai B. multangula Blume mampu menghambat pembentukan biofilm A. actinomycetemcomitans dan tidak  ditemukan  konsentrasi  paling  efektif  dalam  mengahambat  biofilm  namun hanya  didapatkan  konsentrasi  paling  tinggi  untuk  menghambat  pembentukan biofilm bakteri A. actinomycetemcomitans yaitu ekstrak etanol tangkai B. multangula Blume dengan konsentrasi 100%. MBIC50 dari ekstrak etanol tangkai B. multangula Blume terdapat pada konsentrasi 25%.

## 5. UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis  mengucapkan  terimakasih  kepada  LPPM  Universitas  Jenderal Soedirman  yang  telah  membantu  membiayai  penelitian  ini  melalui  Skema  Riset Penelitian Kompetitif Universitas Jenderal Soedirman tahun 2021.

## 6. DAFTAR PUSTAKA
[1] Kriswandini IL, Berniyati T, Tyas PNBN. Detection of Biofilm Proteins from  Aggregatibacter  actinomycetemcomitans  Induced  by  Glucose, Lactose,  Soy  Protein,  and  Iron  Along  with  Protein  Density  Analysis. Malaysian Journal of Medicine and Health Sciences 2020;16(4):12-16.
[2] Christabel  PF,  Hernando  M,  Sutanto  CA,  Parisihni  K.  Exploration  of Chlorella sp. as antibacterial to Aggregatibacter actinomycetemcomitans  biofilm.  IOP  Conference  Series:  Earth  and
Environmental Science, Institute of Physics Publishing 2019;217. DOI: https://doi.org/10.1088/1755-1315/217/1/012040.
[3] Ridhwana L, Panjaitan FUA, Wasiaturrahmah Y. Efektivitas Antibakteri Ekstrak  Daun  Kasturi  (Mangifera  casturi)  terhadap  Pertumbuhan Bakteri  Aggregatibacter  actinomycetemcomitans.  Jurnal  Kedokteran Gigi 2020;4(2):49-55.
[4] Llama-Palacios A, Potupa O, Sánchez MC, Figuero E, Herrera D, Sanz M. Aggregatibacter  actinomycetemcomitans  Growth  in  Biofilm  versus Planktonic  State:  Differential  Expression  of  Proteins.  Journal  of Proteome Research 2017;16:3158–67. DOI: https://doi.org/10.1021/acs.jproteome.7b00127. [5] Malik R, Changela R, Krishan P, Gugnani S, Bali D. Virulence factors of Aggregatibacter actinomycetemcomitans - A status update. Journal of the  International  Clinical  Dental  Research  Organization  2015;7:137. DOI : https://doi.org/10.4103/2231-0754.164390.
[6] Widyarman A, Suhalim O, Nandary D, Theodorea C. Pomegranate juice inhibits  periodontal  pathogens  biofilm  In  Vitro.  Scientific  Dental Journal 2018;2:101. DOI:  https://doi.org/10.26912/sdj.v2i3.2572.
[7] Nurrahman HF, Widyarman AS. Effectiveness of Matricaria chamomilla Essential  Oil  on  Aggregatibacter  actinomycetemcomitans  and Treponema denticola Biofilms. Indonesian Dental Association Journal of Indonesian Dental Association. 2020. DOI: https://doi.org/10.32793/jida.v3i2.563.
[8] Siregar HM, Purwanto RS, Sudarmono, Agusta A. Pengungkapan potensi obat  pada  tiga  jenis  begonia  terpilih  (B.  muricata  Blume.  B. multangulaBlume. B. ”Bacem Kebo”) melalui uji antibakteri Escherichia coli  dan  Staphylococcus  aureus  secara  in  vitro.  Prosiding  Seminar Nasional Sains 2. 2009.
[9] Efendi  M.  Begonia  alam  di  Kebun  Raya  Baturaden,  Jawa  Tengah. Prosiding  Seminar  Nasional  Masyarakat  Biodiversitas  Indonesia 2019;5. DOI: https://doi.org/10.13057/psnmbi/m050103.
[10]  Ghani  MH.  Aktivitas  Antibakteri  Ekstrak  Etanol  Tangkai  Begonia Multangula  Blume  Terhadap  Penghambatan  Pembentukan  Biofilm Fusobacterium  nucleatum  Penyebab  Periodontitis  Kronis.  Skripsi. Purwokerto:  Jenderal  Soedirman  University.  2021  (Tidak dipublikasikan).
[11]  Ahmad  S.  Efek  ekstrak  etanol  daun  teh  hijau  sebagai  penghambat pembentukan  biofilm  pada  bakteri  Burkholideria  cepacia  secara  in vitro. Tugas Akhir. Malang : Brawijaya University. 2017.
[12]  Nor TA, Indriarini D, Koamesah Smj. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Pepaya  (Carica papaya L) Terhadap Pertumbuhan Bakteri Escherichiacoli secara in vitro. Cendana Medical Journal 2018;15:327– 37.
[13]  Wulandari  D,  Isna  D,  Asih  J.  Uji  Aktivitas  Antibakteri  Ekstrak  Daun Suruhan  (Peperomia  pellucida  L.  Kunth)  terhadap  Klebsiella pneumoniae Antibacterial Activity of Suruhan Leaf Extract (Peperomia pellucida  L.  Kunth)  against  Klebsiella  pneumoniae.  Jurnal  Farmasi Indonesia 2017;15:33–9.
[14]  Ningsih  D,  Harsono  SB,  Kusumawati  AD,  Mahmudah  DN.  Efek Antihiperlipidemia  Kombinasi  Ektrak  Kelopak  Bunga  Rosella  dan Ekstrak Daun Bawang Kucai. Jurnal Farmasi Indonesia 2017;14:1–8.
[15]  Putra  GMD,  Satriawati  DA,  Astuti  NKW,  Yadnya-Putra  AAGR. Standarisasi  Dan  Skrining  Fitokimia  Ekstrak  Etanol  70%  Daun  Jeruk Limau  (Citrus  amblycarpa  (Hassk.)  Osche).  Jurnal  Kimia 2018;12(2):187-194.
[16]  Marliana  SD,  Suryanti  V,  Suyono.  Skrining  Fitokimia  dan  Analisis Kromatografi Lapis Tipis Komponen Kimia Buah Labu Siam (Sechium edule Jacq. Swartz.) dalam Ekstrak Etanol. Biofarmasi. 2005;3(1): 26- 31.
[17]  Ismail, Y.S., Yulvizar, C. Putriani. Isolasi, Karakterisasi dan Uji Aktivitas Antimikroba  Bakteri  Asam  Laktat  dari  Fermentasi  Biji  Kakao (Theobroma cacao L.). Jurnal Bioleuser 2017;1(2): 45-53.
[18]  Yunus  R,  Mongan  R.  Cemaran  Bakteri  Gram  Negatif  pada  Jajanan Siomay  di  Kota  Kendari.  Medical  Laboratory  Technology  Journal 2017;3:87–92.
[19]  Pargaputri  AF,  Munadziroh  E,  Indrawati  R.  Antibacterial  effects  of Pluchea  indica  Less  leaf  extract  on  E.  faecalis  and  Fusobacterium nucleatum  (in  vitro).  Dental  Journal  (Majalah  Kedokteran  Gigi) 2017;49:93. DOI: https://doi.org/10.20473/j.djmkg.v49.i2.p93-98.
[20]  Dinda AP, Asnani A, Anjarwati DU. The Activities of Streptomyces W-5A as  Antibacterial  and  Antibiofilm  towards  Methicillin-resistant Staphylococcus  aureus  2983,  Scitepress  2021:109–115.  DOI: https://doi.org/10.5220/0010488601090115.
[21]  Ruchi T, Sujata B, Anuradha D. Comparison of Phenotypic Methods for the Detection of Biofilm Production in Uro-Pathogens in a Tertiary Care Hospital  in  India.  International  Journal  of  Current  Microbiology  and Applied Sciences 2015;4(9): 840-849.
[22]  Oettinger-Barak  O,  Dashper  SG,  Catmull  D  v.,  Adams  GG,  Sela  MN, Machtei  EE,  et  al.  Antibiotic  susceptibility  of  aggregatibacter actinomycetemcomitans JP2 in a biofilm. Journal of Oral Microbiology 2013;5. DOI: https://doi.org/10.3402/jom.v5i0.20320.
[23]  Hamzah  H,  Pratiwi  SUT,  Hertiani  T.  Efficacy  of  thymol  and  eugenol against  polymicrobial  biofilm.  Indonesian  Journal  of  Pharmacy 2018;29:214–21.
DOI: https://doi.org/10.14499/indonesianjpharm29iss4pp221. [24]  Saptarini  O.  Uji  Aktivitas  Antibakteri  Ekstrak  Etanolik  Daun  Patikan
Kebo  (Euphorbia  hirta  Linn)  dan  Herba  Rumput  Mutiara  (  Hydeotis
carymbosa L) terhadap Bakteri Penyebab Pneumonia. Jurnal Farmasi Indonesia 2011;8:1–6.
[25]  Perangin-Angin  Y,  Purwaningrum  Y,  Asbur  Y,  Rahayu  MS,  Nurhayati. Pemanfataan  Kandungan  Metabolit  Sekunder  yang  dihasilkan Tanaman pada Cekaman Biotik. Agriland 2019;7(1) : 39-47.
[26]  Haqque N, Putri S, Nurdiwiyati D, Lestari S, Ramdhan B, Efendi M, et al. Aktivitas  Antibakteri  Ekstrak  Tangkai  dan  Daun  Begonia  Multangula Blume.  terhadap  Porphyromonas  Gingivalis  Antibacterial  Activity  of Begonia multangula Blume. Stem and Leaf Extract on Porphyromonas gingivalis. Jurnal Biologi Universitas Andalas (J Bio UA) 2019;7:51–8.
[27]  di Domenico EG, Toma L, Provot C, Ascenzioni F, Sperduti I, Prignano G,
et al. Development of an in vitro assay, based on the biofilm ring test®, for  rapid  profiling  of  biofilm-growing  bacteria.  Frontiers  in Microbiology 2016;7. DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2016.01429. [28]  al Huda BH, Susanti H, Sugihartini N. Purification effect on Organoleptic Profile,  Yield,  Total  Phenol  and  Total  Flavonoids  from  96%  Ethanol Extract  of  Moringa  (Moringa  oleifera.  L)  leaves.  Jurnal  Farmasi Indonesia 2020;17(2):188-198.
[29]  Górniak  I,  Bartoszewski  R,  Króliczewski  J.  Comprehensive  review  of antimicrobial  activities  of  plant  flavonoids.  Phytochemistry  Reviews 2019;18:241–72. DOI: https://doi.org/10.1007/s11101-018-9591-z.
[30]  Dong S, Yang X, Zhao L, Zhang F, Hou Z, Xue P. Antibacterial activity and mechanism of action saponins from Chenopodium quinoa Willd. husks against foodborne pathogenic bacteria. Industrial Crops and Products 2020;149. DOI: https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2020.112350.
[31]  Lahiri D, Dash S, Dutta R, Nag M. Elucidating the effect of anti-biofilm activity  of  bioactive  compounds  extracted  from  plants.  Journal  of Biosciences  2019;44.  DOI:    https://doi.org/10.1007/s12038-019- 9868-4.
[32]  Novita  W.  Uji  aktivitas  antibakteri  fraksi  daun  sirih  (Piper  betle  L) terhadap pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans secara in vitro. Jambi Medical Journal 2016;4(2):140–155.
[33]  Kining E, Falah S, Nurhidayat N. The in vitro antibiofilm activity of water leaf  extract  of  papaya  (Carica  papaya  L.)  against  Pseudomonas aeruginosa. Current Biochemistry 2016;2(3):150-163.
[34]  Krisridwany  A,  Tatra  R,  Primasari  DS.  Perbandingan  Total  Flavonoid dan Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat Biji Kelor (Moringa oleifera L.) dan Biji Kecipir (Psophocarpus tetragonolobus L.). Jurnal Farmasi Indonesia 2022;19(1):98-109.
[35]  Diana  R,  Joenoes  H,  Djais  AA.  The  effect  of  curcuma  xanthorrhiza ethanol  extract  on  the  viability  of  streptococcus  mutans  and aggregatibacter  actinomycetemcomitans  (Dental  biofilm  research:  In vitro  study).  Asian  Journal  of  Pharmaceutical  and  Clinical  Research
2017;10:30–3.
DOI:
https://doi.org/10.22159/ajpcr.2017.v10s5.23087.
[36]  Kunarti S, Subiwahjudi A, Dewi Tamara Yuanita R. Comparison of IPMP, Chlorine  Dioxide  and  Chlorhexidine  Gluconat  Contained  in Mouthwashes  for  Reducing  Exopolysaccharide  on  Streptococcus Mutans Biofilms. 2017.
[37]  Gary  Kaplowitz  by  J,  Cortell  M.  4  CE  credits  Chlorhexidine:  A  Multi- Functional  Antimicrobial  Drug  A  Peer-Reviewed  Publication  Written Educational Objectives. 2008.
[38]  Teanpaisan R, Kawsud P, Pahumunto N, Puripattanavong J. Screening for  antibacterial  and  antibiofilm  activity  in  Thai  medicinal  plant extracts  against  oral  microorganisms.  Journal  of  Traditional  and Complementary Medicine 2017;7:172–7. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jtcme.2016.06.007.
[39]  Gusri A. Aktivitas antibakteri ekstrak etanol tangkai begonia (Begonia multangula  Blume)  terhadap  penghambatan  pembentukan  biofilm Porphyromonas  gingivalis  secara  in  vitro.  Skripsi.  Purwokerto: Jenderal Soedirman University. 2021.  (Tidak dipublikasikan).
[40]  Juliantina Rachmawaty F, Mahardika Akhmad M, Hikmah Pranacipta S, Nabila  Z,  Muhammad  A.  Optimasi  Ekstrak  Etanol  Daun  Sirih  Merah (Piper Crocatum) sebagai Antibakteri terhadap Bakteri Staphylococcus Aureus.  Mutiara  Medika:  Jurnal  Kedokteran  Dan  Kesehatan  2018;18. DOI: https://doi.org/10.18196/mm.180109.
[41]  Sulistyani H, Fujita M, Miyakawa H, Nakazawa F. Effect of roselle calyx extract  on  in  vitro  viability  and  biofilm  formation  ability  of  oral pathogenic  bacteria.  Asian  Pacific  Journal  of  Tropical  Medicine 2016;9:119–24. DOI: https://doi.org/10.1016/j.apjtm.2016.01.020.