ISSN: 1693-8615 EISSN : 2302-4291                Online : http://ejurnal.setiabudi.ac.id/ojs/index.php/farmasi-indonesia

## DETEKSI MOLEKULER EKSON 1 GEN BETA GLOBIN PADA PASIEN TALASEMIA BETA MAYOR DI RSUD DR. SOEROTO NGAWI DENGAN METODE POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
MOLECULAR DETECTION OF EXON 1 OF THE BETA GLOBIN GENE IN BETA THALASSEMIA MAJOR PATIENTS IN RSUD DR. SOEROTO NGAWI WITH POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) METHOD
Agus Supriadi ,* , Ana Indrayati 2,* , Elfahmi. 3,* 1)2) Jurusan S2 Farmasi, Falkutas Farmasi, Universitas Setia Budi Surakarta-57127, Indonesia *email: agoes.pharm@gmail.com
3) Jurusan Farmasi, Falkutas Farmasi, Insitut Teknologi Bandung-40132, Indonesia

## ABSTRAK
Talasemia merupakan kelainan akibat mutasi gen yang bersifat autosumal resesif yang disebabkan kekurangan sintesis rantai globin pembentuk hemoglobin darah dengan gejala mirip anemia  maka  akan  menurunkan  produksi  sel  darah  merah,  dan  harus  dilakukan  penanganan dengan dilakukan transfusi darah secara teratur.
Penelitian ini bertujuan mengetahui adanya mutasi pada ekson 1 gen beta globin pasien talasemia  menggunakan  metode  PCR,  dimana  5  sampel  di  isolasi  DNA  dan  dilanjutkan amplifikasi PCR, hasil amplifikasi dielektroforesis region 1 gen beta globin Region I merupakan hasil  amplifikasi  dari  primer  forward  4  dan  primer  reverse  5  dengan  target  yaitu  322  bp,  pada PCR terjadi amplifikasi atau penggandaan sekuen DNA yang diinginkan berdasarkan pemilihan primer untuk reaksi, produk PCR dari tiap region ini yang selanjutnya dilakukan SSCP.
Pada  region  I  gen  beta  globin  yang  telah  dilakukan  analisis  SSCP,  satu  sampel menunjukkan dua pita dengan pola yang berbeda dengan sampel N yaitu sampel 6 sedangkan pada  empat    sampel  sisanya  yaitu  sampel  1,2,3,5  menampilkan  tiga  pita.  Seluruh  sampel menunjukkan pola yang berbeda dengan kontrol negatif (sampel N). Hal ini menunjukkan pada seluruh sampel ada indikasi mutasi.

## Kata kunci : talasemia, beta talasemia, pcr

## ABSTRACT
Talasemia  is  an  autosumal  recessive  gene  mutation  caused  by  a  lack  of  synthesis  of hemoglobin-forming  globin  chains  of  blood  with  anemia-like  symptoms  will  decrease  the production of red blood cells, and should be treated with regular blood transfusions.
This  study  aims  to  determine  the  presence  of  mutations  in  exon  2  gene  beta  globin thalassemia patients using PCR method, where 5 samples in DNA isolation and continued PCR amplification, the amplification result of electrophoresis region 2 beta globin gene Region II is the result of amplification of primary 4 and primer primer reverse 5 with a target of 350 bp, on PCR there is amplification or doubling of the desired DNA sequence based on the primary selection for the  reaction,  the  PCR  product  of  each  of  these  regions  which  is  subsequently  performed  by SSCP.
In the SSCP result the five samples were found in one sample showing different ribbon pattern  with  the  sample  N,  there  was  sample  6,  while  the  remaining  four  samples,  there  were 1,2,3,5 showed three bands. All the samples showed different from the N sample pattern. This shows that all samples indicated there were mutation.
Keywords: thalassemia, beta thalassemia, pcr

## PENDAHULUAN
Talasemia  merupakan  kelainan genetik akibat mutasi gen yang bersifat aotosumal  resesif  yang  disebabkan kekurangan sintesis rantai globin pembentuk  hemoglobin  darah  dengan gejala  mirip  anemia  (Handayani  dan Onggo,  2014).Talasemia  merupakan kelompok  kelainan  yang  diturunkan karena  terjadi  mutasi  atau  delesi  pada gen  yang  menyandikan  salah  satu rantai globin sehingga terjadi penurunan  kecepatan  sintesis  atau ketiadaan sintesis dari rantai globin. Hal ini menyebabkan penurunan kecepatan sintasis hemoglobin dan terjadi
mikrositis (Bain, 2014).
Talasemia adalah penyakit
kelainan  darah  yang  disebabkan  oleh sintesis  globin  yang  tidak  seimbang sehingga  mengakibatkan  kerusakan hemoglobin  dan  diturunkan  secara resesif menurut hukum Mendel (Syamsudin, 2007). Talasemia disebabkan oleh penurunan kecepatan sintesis atau kemampuan produksi satu atau  lebih  rantai  globin  α,  β.  Hal  ini terjadi  karena  delesi  total  atau  parsial gen  globin,    substitusi,  atau  insersi nukleotida.  Beta  talassemia  adalah kelainan  darah  herediter  yang  ditandai dengan  berkurangnya  kadar  HbE  atau adanya  sintesis  β  globin,  dengan adanya sintesis rantai globin yang tidak seimbang  maka  akan  menurunkan produksi  sel  darah  merah.  Hal  ini menyebabkan  anemia  dan  harus  di lakukan penanganan dengan dilakukan transfusi  darah  secara  teratur  agar keadaan kembali normal.
Penderita thalassemia yang melakukan transfusi darah secara rutin dapat  meningkatkan  zat  besi  dalam
tubuh  (Weatherall,1997).  Salah  satu cara  yang  sering  digunakan  untuk mengetahui pembawa sifat β talassemia  adalah  dengan  analisis hematologi, pembawa sifat β- talassemia  dapat  dilihat  dengan  gejala mikrositik  dan  penurunan  jumlah  Hb pada eritrosit (Cao & Galanello,  2010). metode  PCR-SSCP  sebagai  metode untuk mendeteksi mutasi pada pasien β talasemia  mayor.  Metode  ini  telah dikembangkan untuk mendeteksi
adanya  mutasi  pada  pembawa  sifat thalasemia (Priyambodo, 2014; Onggo, 2014). Individu yang terdiagnosa individu  β  talassemia  mayor  di  RSUD Dr. Soeroto Kabupaten Ngawi dilakukan pemeriksaan Hb elektroforesis untuk penentuan diagnosanya dan belum adanya pemeriksaan molekuler untuk
mengetahui  jenis  dan  letak  mutasi. Analisis PCR- SSCP terhadap individu β talassemia menunjukan adanya mutasi pada gen β globin (Priyambodo, 2014).
Sehubungan  dengan  hal  tersebut, maka  dirumuskan  permasalahannya yaitu apakah metode PCR-SSCP dapat mengetahui  mutasi  pada  ekson  1  gen BETA  globin,  dengan  ini  sehingga tujuan  penilitian  dapat  tercapai  yaitu mengetahui adanya mutasi pada pasien talasemia ekson 1.

## METODE PENELITIAN

## Alat dan Bahan
1. Alat Alat  yang  digunakan  dalam  penelitian ini  meliputi  serangkaian  alat  gelas berupa  gelas  beker,  gelas  ukur, Erlenmeyer, pipet  tetes, corong, pengaduk,  pipet  ukur  beserta pipet
pump berfungsi untuk preparasi larutan baik  bahan,  sampel  dan  reagen, microcentrifuge tube (mictotube) 1,5 mL dan 0,2 mL sebagai tempat penyimpanan sampel, mikropipet untuk mengambil  sampel  dan  bahan  dalam skala  microliter,  neraca  analitik  untuk menimbang  bahan,  erlenmeyer  untuk tempat  pencampuran  bahan,  vorteks untuk  homogenasi  larutan,  sentrifuge untuk  memisahkan  komponen  larutan berdasar berat jenis, incubator sebagai tempat  inkubasi, microwave untuk pembuatan gel agarose, lemari pendingin sebagai tempat penyimpanan  bahan,  rangkaian  alat elektroforator horizontal untuk memisahkan  komponen  atau  molekul berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik,
UV transiluminator untuk visualisasi pita DNA, thermocycler untuk  amplifikasi DNA,  fluorometer  untuk  mengukur konsentrasi sampel, dan kamera digital untuk dokumentasi selama penelitian. 2. Bahan
Bahan yang digunakan adalah 5 sampel darah  pasien  thalasemia  yang  rutin melakukan  tranfusi  di  RSUD  Dr. Soeroto  Kabupaten  Ngawi,  disimpan dalam tube  BD  vacutainer EDTA  dan satu  sampel  normal  atau control
negative digunakan sebagai
pembanding  dalam  penelitian  ini. Bahan yang digunakan pada penelitian ini  meliputi  akuades  steril, Geneaid Genomic DNA Mini Kit (Blood/Cultured Cell), PCR master  mix  KAPA  2G  fast ready mix, primer forward dan reverse spesifik  untuk  pada  gen  beta  globin, DNA loading  dye,  Geneaid100bp  plus DNA  ladder,  fluoroceft, gel  agarosa, ethanol  absolut  96%, buffer Tris  Borat
EDTA (TBE),  loading  buffer (campuran bromo  phenol  blue,  formamide,  EDTA, gliserol), gel poliakrilamid (acrylamide:bis-acrylamide 29:1). ethidium bromide dan pipet tip.
1.  Pengambilan Sampel Sampel  darah  diperoleh  dari  pasien beta  thalasemia  mayor  yang  rutin melakukan  transfusi  di  RSUD  Dr. Soeroto  kabupaten  Ngawi.  Sampel darah disimpan dalam tabung vacutaine EDTA  3  ml  dan  dimasukan  dalam freezer-20 0 C.
2.  Isolasi DNA Isolasi  DNA  sampel  dilakukan  dengan GSYNC TM DNA  Ekstraction  kit  sesuai dengan  protocol  kit.  Langkah-langkah isolasi DNA sebagai berikut
a. Lisis Sel Sebanyak 200 µl sampel darah diambil dan dimasukkan dalam tabung microtube 1,5 ml dan menambahkan 20 µl  Proteinase-K  dan  di  inkubasi  pada suhu  60 ℃ selama  5  menit,  kemudian ditambahkan  GB buffer sebanyak  200
µl    dan  dihomogenkan  dengan  vortex. Selanjutnya  sampel  diinkubasi  pada suhu  60 ℃ selama  5  menit,  selama inkubasi microtube dibolak-balik selama 2 menit.
b. Pengikatan DNA
Setelah inkubasi selesai, sebanyak 200
µl  etanol  absolut  ditambahkan  dalam sampel lalu divorteks kemudian dipindahkan dalam purification columm (kolom  GD  ) yang  diletakakan  dalam tabung  pengumpul  berukuran  2  ml. Sampel  kemudian  dipindahkan  dalam kolom  GD.  Sampel  selanjutnya  di sentrifugasi  pada  12.000  rcf  selama  5 menit kemudian larutanan hasil sentrifugasi  dibuang  dan kolom  GD ditempatkan  pada    tabung  pengumpul yang baru.
c. Pencucian Sebanyak  400  µl wash  buffer 1 ditambahkan ke  dalam  kolom  GD  dan disentrifugasi pada 12.000 rcf selama 2 menit.  Larutan  sisa  pencucian  pada tabung pengumpul dibuang. Kolom GD dimasukan ke dalam tabung pengumpul yang  baru  dan  ditambahkan  600  µl wash  buffer II  dan  selanjutnya disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 2 menit. Larutan sisa pencucian dalam tabung  pengumpul  dibuang,  kemudian kolom  GD  disentrifugasi  lagi  dengan kecepatas 12.000 rpm selama 4 menit.
d. Pengelusian Setelah selesai, kolom GD ditempatkan dalam  tabung microtube 1,5  ml, kemudian  ditambahkan  75  µl  buffer elusi yang diinkubasi pada suhu 60 0 C.
Selanjutnya  larutan  diinkubasi  pada suhu  kamar  selama  5  menit  dan disentrifugasi pada 12.000 rcf selama 2 menit. Proses elusi diulangi 2 kali untuk
memaksimalkan  pelepasan  DNA  dari silica gel pada kolom GD . Selanjutnya, kolom  GD dikeluarkan  dari  microtube 1,5  mL  dan  disimpan  di  dalam  lemari pendingin.
3. Fluorometer dan Elektroforesis DNA Pada penelitian ini digunakan uji kuantitatif dengan metode
fluorometri,  Qubit  fluorometer  adalah perangkat  kuantifikasi  DNA  yang didasarkan  pada  intensitas  fluoresensi dari label fluorosen yang mengikat DNA beruntai ganda (sdDNA) (Nakayama et al. 2016), selanjutanya skema fluoromrter  disiapkan  microtube  berisi sampel  dan  2  microtube  tambahan untuk  standard  atas  dan  bawah  (nol).
Selanjutnya dilakukan pembuatan larutan  uji  (Working  Solution)  dengan cara  :  Larutan  dihomogenasikan dengan  vortex  selama  2-3  detik, dipastikan tidak ada gelembung terbentuk.  Larutan  standard  dibuat dengan cara Sebanyak 1-20 μL sampel dicampurkan  dengan  199-180  μL larutan  uji  untuk  mendapatkan  larutan dengan volume akhir 200 μL. Microtube berisi sampel divorteks selama 2-3 detik tanpa  terbentuk  gelembung  kemudian diinkubasi  pada  suhur  uang  selama  2 menit. Setelah itu, dilakukan pembacaan  dengan  mesin  Qubit  yang telah  dinyalakan.  Larutan  uji  dibaca terlebih  dahulu  selanjutnya  sampel. Microtube  dimasukkan  pada  Qubit fluorometer  kemudian  ditekan  “Read” dan  ditekan  “Save”  untuk  menyimpan data.
Selanjutnya, uji kualitatif dengan elektroforesis pada gel agarosa 0,8%.  Mula-mula  sebanyak  0,32  gram agarosa ditimbang kemudian
ditambahkan  40  mL  Tris  Borate-EDTA (TBE)  1X  dan  dilarutkan  sampai homogen. Larutan tersebut dipanaskan dalam  microwave  selama  30  detik. Setelah  sedikit  dingin  ditambahkan fluoroceft sebanyak 2 μL dan dilarutkan hingga  homogen.  Gel  dituang  pada cetakan  yang  telah  diberi  sisir  untuk sumuran.  Gel didiamkan hingga mengembang lalu sisir dilepas dan gel dipindahkan ke dalam alat
elektroforesis dan ditambahkan dengan TBE 1x hingga gel terendam. Sumuran pertama diisi sebanyak 3,5 μL marker  DNA  berupa  100  pb.  Hasil isolasi DNA diambil sebanyak 5 μL dan dicampur dengan 1 μL (6x) loading dye .
Campuran  DNA  dan loading  dye dimasukkan dalam sumuran  gel agarosa.  Elektroforesis  DNA  dilakukan dengan  menghubungkan  katoda  dan anoda pada sumber tegangan 100 volt selama 15 menit. Pengamatan pita DNA dilakukan  dengan  menggunakan  UV transiluminator.
4. Amplifikasi Region 2 Gen β-globin Hasil  isolasi  DNA  akan  digunakan sebagai cetakan pada proses amplifikasi dengan metode polymerase chain  reaction (PCR).  PCR  dilakukan berdasarkan prosedur KAPA Biosystem (2013).  PCR  mix  dibuat  dengan menggunakan PCR Master mix
KAPA2G fast ready mix,
Setelah  semua  komponen  dimasukan ke  dalam  tabung  PCR,  selanjutnya dimasukan  ke  dalam  mesin thermal cycler .  Kondisi  siklus  PCR  yang digunakan  untuk  amplifikasi  gen  β-
globin adala
sebagai berikut:
(Pryambodo, 2014).
5. Elektroforesis  Hasil    Amplifikasi PCR
Hasil  PCR  dielektroforesis  pada  gel agarosa  dengan  konsentrasi  2%. Sebanyak 0,8 gram agarosa ditimbang kemudian  ditambahkan  100  mL  Tris Borate-EDTA  (TBE)  1X  dan  dilarutkan sampai  homogen.  Larutan  tersebut dipanaskan  dalam microwave selama 50  detik.  Setelah  sedikit  dingin ditambahkan fluoroceft sebanyak 3,5 μL dan  dilarutkan  hingga  homogen.  Gel dituang pada cetakan yang telah diberi sisir  untuk  sumuran.  Gel  didiamkan hingga  mengembanglalu  sisir  dilepas dan  gel  dipindahkan  ke  dalam  alat elektroforesis dan ditambahkan dengan TBE 1x hingga gel terendam.
Sumuran pertama diisi dengan sebanyak 3 μL marker DNA berupa 100 pb. Sampel diambil sebanyak 4 μL dan dimasukkan dalam sumuran  gel agarosa.  Elektroforesis DNA  dilakukan dengan  menghubungkan  katoda  dan anoda  pada  sumber  tegangan  50  volt. Elektroforesis dihentikan setelah migrasi DNA mencapai 2/3 panjang gel yang  ditunjukkan  dengan  warna  biru pada  gel  agarosa.  Pengamatan  pita DNA  dilakukan  dengan  menggunakan UV Transiluminator.
6. Analisis PCR-SSCP
Analisis polymerase  chain  reaction- single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP)  dilakukan berdasarkan metode dengan modifikasi sebagai berikut :
a. Pembuatan gel Larutan gel disiapkandengan Erlenmeyer 125 ml yang terdiriatas 5,6 ml aquabides 2,6 ml, poliakrilamid 30% (akrilamid  :  bisaakrilamid  29:1),  1  ml
TBE  10x,  0,68  ml  gliserol  87%,  45  μl ammonium  persulfat  10%,  dan  10  μl tetramethyl ethylene diamine (TEMED). Setelah  TEMED  ditambahkan,  larutan gel  dihomogenkan,  selanjutnya  segera dituangkan dengan menggunakan mikropipet  ke  dalam  cetakan.  Sisir dipasang  pada  cetakan  dan  gel dibiarkan selama 60 menit.
Setelah  60  menit,  gel  dipasang  pada tangki  elektroforator  vertikal  dan ditambahkan TBE 1,5x hingga mencapai  batas  kolom.  Sisir  diangkat dengan  hati-hati  dan  dilakukan pre- running selama 20 menit.
b. Penyiapan sampel
Sebanyak  10  μl  produk  PCR ditambahkan  15  μl loading  buffer dihomogenasi dengan vortex. Campuran  sampel  dan loading  buffer
dipanaskan dalam waterbath pada suhu 95 0 C selama 10 menit untuk denaturasi. Setelah  proses  denaturasi,  sampel segera dimasukkan freezer suhu -20 0 C selama  10  menit.  Setelah  proses thawing,  sebanyak  25  μl  campuran tersebut  dimasukkan  kedalam  masing- masing  sumuran  gel.  Elektroforesis dilakukan dengan TBE 0,5x pada 100V 50mA selama 100 menit.
c. Pewarnaan Gel  dilepas  dari  gelas,  lalu  diencerkan dalam  larutan etidium  bromida selama
45  menit  dan  diamati  dengan  UV transilluminator. Hasil didokumentasikan  dengan  kamera digital.
d. Interpretasi hasil Interpretasi  data  dilakukan  dengan mendeskripsikan  pita  hasil  SSCP dengan  membandingkan  perbedaan jarak  migrasi  pita  ( Single  strand  DNA )
subyek  yang  diteliti  dengan  individu normal.  Individu  yang  memiliki  genotip homozigot,  baik  homozigot  dominan maupun resesif  menunjukkan dua pita DNA  pada  gel,  sedangkan  individu heterozigot  menunjukan  tiga  atau empat pita DNA.
HASIL PENELITIAN

## DAN PEMBAHASAN
A.  Identifikasi Sampel Penelitian ini menggunakan
sampel darah pasien yang terdiagnosa beta  talasemia  mayor  dan  melakukan transfusi  darah  secara  rutin  di  RSUD Dr.Soeroto,  Kabupaten  Ngawi,Jawa Timur,  dengan  prosedur  pengambilan sampel  memenuhi  kelayakan  etik  atau Ethical Clearance .
B.  Pengambilan Sampel
Sampel  darah  diperoleh  dari  5 (lima)  pasien  beta  talasemia  mayor yang rutin melakukan transfusi darah di RSUD Dr. Soeroto, Kabupaten Ngawi.
Sampel  darah  disimpan  dalam tabung vacutaine EDTA  3  ml  dan dimasukan dalam freezer-20 0 C.

## C.  Hasil Isolasi DNA
Isolasi DNA ke sembilan sampel penelitian menggunakan gSYNC TM DNA Ekstraction (Blood Protocol Prosedur) . Isolasi DNA dilakukan dengan mengekstraksi DNA dari darah beku  dan  telah  ditambahkan  zat antikoagulan (EDTA). Hasil uji kualitatif dan kuantitatif DNA genom dapat dilihat di  gambar  5  dan  tabel  4.  Uji  kualitatif DNA  dilakukan  dengan  elektroforesis pada  gel  agarosa  dengan  konsentrasi 0,8%.Uji  kuantitatif  DNA  dilakukan dengan metode fluorometri untuk
Agus Supriadi , , Ana Indrayati * , Elfahmi
mengetahui  konsentrasi  DNA  hasil isolasi. Pada elektroforesis DNA seluruh sampel didapat pita DNA yang terlihat  jelas  pada  semua  sampel menunjukkan  keberadaan  DNA  dan keberhasilan isolasi DNA yang
dilakukan. Selain 5 sampel diatas, satu sampel  normal  (N)  dan  satu  sampel kontrol  positif  (K+)  juga  dilakukan isolasi, namun tidak pada hasil
elektroforesis yang sama. Gambar 1.Hasil elektroforesis isolasi

## DNA sampel penelitian
Sampel normal digunakan sebagai kontrol negatif mutasi. Sedangkan sampel K+ yang digunakan merupakan sampel darah dari
penyandang  talasemia  yang  telah diketahui mutasinya melalui sekuensing DNA. Kedua kontrol ini digunakan untuk mengevaluasi  setiap  tahapan  metode dari uji molekuler yang dilakukan.
Ukuran genom manusia berdasarkan International Human Genome Sequencing Consortium secara keseluruhan diestimasikan 2.916 gb, dengan ukuran molekul DNA
pada  23  kromsosomnya  berkisar  dari
21,8  mb  (kromosom  Y)  hingga  2692,9 mb  (kromosom  1)  dan  molekul  DNA pada  mitokondria  yang  berukuran 16.569  pb  (Lander, et  al ,  2001).
Dikarenakan  ukuran  DNA  nya  yang besar sehingga pada hasil
elektroforesis  pita  DNA  genom  sampel terlihat  jauh  diatas  marker.  Setiap sampel  menampilkan  pita  dengan ketebalan  yang  beragam  berdasarkan konsentrasi  DNA  yang  diperoleh  dari isolasi  yang  dilakukan.  Pita  yang  tebal dan  terang  menunjukan  bahwa  DNA yang berhasil diisolasi memiliki konsentrasi yang lebih banyak, sedangkan pita tipis dan kurang terang menunjukan  konsentrasi  DNA  yang lebih sedikit. Untuk memastikan konsentrasi dan kualitas DNA, kemudian dilakukan fluorometri. Nilai  konsentrasi  DNA  hasil isolasi sampel dengan metode fluorometri menggunakan Qubit Fluorometer  ditampilkan  pada Tabel  1. Pada sampel, konsentrasi DNA berkisar 55,2- 82  ng/μL.  Qubit  Fluorometer adalah  perangkat  kuantifikasi  DNA yang didasarkan pada intensitas fluoresensi  dari  label  fluorosen  yang mengikat DNA beruntai ganda (dsDNA) (Nakayama, et  al. 2016).  DNA  pada sampel menunjukkan, konsentrasi yang bervariasi dengan  sesuai dengan kenampakan  tebal  tipis  pita  pada elektroforesis. Setiap sel diploid manusia  mengandung  sekitar  6  pg No Nama Sampel Konsentrasi (ng/ μl) 1 Sampel 1 63,6 2 Sampel 2 68 3 Sampel 3 82 4 Sampel 5 70,8 5 Sampel 6 62
DNA. Untuk isolasi DNA dari darah tepi umumnya diperoleh 30 ng/μL hingga 60 ng/μL dari 1 ml darah yang berasal dari 5-10  juta  leukosit.  Secara  umum konsentrasi yang diperoleh relatif sesuai  referensi  diatas. Adanya  variasi pada konsentrasi DNA
dapat disebabkan karena kualitas darah yang berbeda  salah  satunya  dikarenakan beda waktu saat penyimpanan darah.
Hasil  Amplifikasi  Region  I  Gen  Beta

## Globin
Penelitian  ini  mengacu  pada pembagian  region  berdasarkan  Gupta dan  Argawal  (2003)  dengan  hanya difokuskan pada region (daerah) I yang dilakukan  amplifikasi.  Region  I  dipilih berdasarkan keberadaan daerah ekson I. Mutasi yang terjadi pada ekson dapat menyebabkan kesalahan translasi pada sintesis  asam  amino  sehingga  dapat memberikan  efek  secara  langsung pada rantai beta globin yang disintesis. Proses  amplifikasi  atau  perbanyakan DNA dilakukan dengan metode PCR.
Amplifikasi DNA dilakukan dengan  menggunakan  primer  untuk melipatgandakan  daerah  ekson  I  pada gen  HBB  penyandi  beta  globin.  DNA hasil isolasi kemudian dijadikan template dalam  proses  amplifikasi.
Amplifikasi dilakukan pada daerah I gen beta globin (gambar 4), karena daerah tersebut  merupakan  tempat  ekson  I berada. Amplifikasi
menghasilkan ukuran  aplikon  322  pb,  yang  meliputi daerah 5’ Untranslated  Region (UTR), seluruh  daerah  ekson  I  dan  sebagian daerah intron atau Intervening Sequence (IVS)  1  gen  beta  globin.
Produk  amplifikasi  kemudian  dianalisis dengan  elektroforesis  pada  agarosa
konsentrasi 2 % untuk memastikan ada tidaknya amplikon target. Hasil
elektroforesis  produk  amplifikasi  DNA sampel  penelitian  dapat  dilihat  pada gambar 2.

## Gambar 2. Hasil elektroforesis region I gen beta globin pada sampel
Gambar  2  menunjukan  DNA target  dari  semua  sampel  penelitian berhasil  teramplifikasi.  Hasil  tersebut dapat dikonfirmasi dengan
membandingkan  ukuran  DNA  marker dengan  ukuran  amplikon  dari  sumber acuan (Gupta and Agrawal, 2003).
Pada  PCR  terjadi  amplifikasi atau  penggandaan  sekuen  DNA  yang diinginkan berdasarkan pemilihan primer untuk reaksi. Penggandaan DNA
secara  alami  terjadi  pada  organisme melalui  proses  replikasi  DNA  dengan DNA helikase berperan dalam membuka  pita  ganda  DNA  sehingga
DNA polimerase dapat memulai penggandaan.  Pada  PCR  peran  DNA helikase digantikan dengan menaikkan suhu  ketika  reaksi  sehingga  DNA terdenaturasi dan terbentuk untai tunggal  DNA,  kemudian  titik  untuk memulai  polimerasi  ditentukan  oleh primer yang spesifik yang melekat pada untai  tunggal  dan  kemudian  oleh  DNA polimerase  penggandaan  sekuen  DNA target  terjadi.  PCR  memerlukan  enzim polimerasi  DNA  yang  tahan  terhadap
Agus Supriadi , , Ana Indrayati * , Elfahmi
panas  ( thermostable )  contohnya Taq Polymerase (Bustin,  2010).  Produk PCR  dari  region  1  yang  selanjutnya dilakukan SSCP.
Hasil SSCP Region I Gen Beta Globin Single Strand Conformation Polymorphism atau yang dikenal
sebagai  SSCP  merupakan  salah  satu teknik untuk mendetesi mutasi. Metode SSCP  dilakukan  untuk  melihat  pola migrasi  untai  tunggal  DNA  pada  gel poliakrilamid.  Setiap  amplikon  DNA pada  region  1  dipisahkan  dalam  gel poliakrilamid selanjutnya diwarnai
dengan ethidium bromide.
Prinsip dasar dari SSCP adalah fakta bahwa single strand DNA (ssDNA) memiliki konformasi tertentu. Perubahan  konformasi  karena  adanya perubahan  basa  pada  sekuen  DNA
dapat menyebabkan perbedaan migrasi ssDNA  pada  elektroforesis  sehingga DNA wild-type atau  normal  dan  DNA yang mengalami mutasi
akan menunjukkan pola pita yang berbeda.
Analisis SSCP sendiri terdiri dari 4  tahapan  yaitu  :  1).  Amplifikasi  target
DNA  dalam  hal  ini  yaitu  region  I  gen beta globin, 2). Denaturasi dsDNA dari produk  PCR  menjadi  ssDNA  dengan penambahan agen
denaturasi
(formamida) dan pemanasan, 3). Pendinginan hasil denaturasi DNA yaitu ssDNA  untuk  memaksimalkan self- annealing
sehingga
membentuk
konformasi  tertentu,  dan  4).  Deteksi perbedaan  migrasi  konformasi  ssDNA
pada elektroforesis kondisi non
denaturasi  (Dong  dan  Zhu,  2005).
Elektroforesis  yang  dilakukan  adalah PAGE atau Polyacrilamide Gel
Electroforesis
konsentrasi 39,7%dengan elektroforator vertikal.
Individu  yang  memiliki  genotip homozigot hanya akan menunjukan dua pita  DNA  pada  hasil  elektroforesis  gel poliakrilamid,  baik  homozigot  dominan maupun  resesif,  sedangkan  individu dengan genotip heterozigot mempunyai sepasang  alel  yang  berbeda,  satu  alel normal  dan  satu  alel  mutan,  sehingga hasil  elektrofiresis  gel  poliakrilamid akan  menunjukan  lebih  dari  dua  pita. Individu  dengan  genotip  heterozigot dapat menunjukan tiga atau empat pita DNA  pada  gel  poliakrilamid.  Sampel penelitian  yang  menunjukan  tiga  pita pada  hasil  PCR-SSCP  dikarenakan adanya asosiasi antara basa nukleotida penyusun  untai  tunggal  DNA  sehingga membentuk
konformasi yang
sama.Hasil  dari  analisis  SSCP  pada region I yang didalamnya juga termasuk bagian  ekson  I  ditampilkan  pada gambar 3 dan gambar 4.
Indikasi  adanya  mutasi  pada sekuen  region  I  gen  beta  globin diketahui  dengan  melihat  adanya  pola pita  yang  berbeda  dengan  kontrol negatif (sampel N).
Gambar  3.Hasil  analisis  SSCP  pada region  I  gen  beta  globin.  Pola  pita pada gel poliakrilamid.
Gambar  4.  Hasil  analisis  SSCP region  Igen  beta  globin.  Skema pola pita gel poliakrilamid.
Berdasarkan gambar 4 diketahui untuk region  I  seluruh  sampel  menunjukkan pola  yang  berbeda  dengan  sampel  N sehingga  seluruh  sampel  terdapat adanya indikasi terjadi mutasi

## KESIMPULAN
Pada  region  I  gen  beta  globin yang  telah  dilakukan  analisis  SSCP, satu  sampel  menunjukkan  dua  pita dengan  pola  yang  berbeda  dengan sampel  N  yaitu  sampel  6  sedangkan pada  empat    sampel  sisanya  yaitu sampel  1,2,3,5  menampilkan  tiga  pita. Seluruh  sampel  menunjukkan  pola yang  berbeda  dengan  kontrol  negatif (sampel  N).  Hal  ini  menunjukkan  pada seluruh sampel ada indikasi mutasi.

## DAFTAR PUSTAKA
Bain, B.,J.,2014, Hematologi, Kurikulum Inti,  alih  bahasa Anggraini  Iriani,
Buku Kedokteran , EGC. Bustin, S. A., 2010. The PCR Revolution:  Basic  Technologies and  Applications. Cambridge University  Press.  New  York.  hal
17.
Cao,  A.  &  Galanello,  R.  2010.  Β- thalassemia.  GeneTest  Review.
Genetics in Medicine . 12 (2), 61-
76.
Gupta,  A.  and  Agrawal,  S.,  2003, Efficiency and Cost Effectivennes : Page-SSCP versus  MDE  and  Phast  Gels  for the Indentification of Unknown β- Talasemia Mutation, Jurnal Molecular  Pathology ,  56,  237-
239.
Handayani,N.S. dan Onggo, A.T., 2014,
Identifikasi  Mutasi  Gen  β  Globin Ekson 1 pada Pembawa Talasemia, Jurnal  Biogenesis ,
Vol. 2,I, hal. 63-69.
Nakayama Y. Yamaguchi  H.  Einaga  N. and  Esumi  M.  2016.Pitfalls  of DNA  Quantification  Using  DNA-
Binding  Fluorescent  Dyes  and Suggested Solutions. Plos One;11(3): e0150528. doi: 10.1371/journal.pone.01505
28
Priyambodo  dan  Handayani,  N.S.N., 2014,  Deteksi  mutasi  Ekson  2 Gen  β-Globin  dan  Daerah
Pengapitnya  Pada  Pembawa Sifat β-Talasemia dengan Metode Polymerase Chain Reaction-Singgle Strand Conformation Polymorphism (PCR-SSCP),
Prosiding  Seminar  Nasional  dan Rapat  Tahunan  Bidang  MIPA, Fakultas  MIPA  Institut  Pertanian Bogor. Weatherall, D.,J.,1997, The Thallasemias, Fortnightly Review, British  Medical  Journal ,
314, 1675-1678.