AKTIVITAS ANTIBIOFILM FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK DAUN PUTRI MALU (Mimosa pudica) PADA BAKTERI METHICILIN-RESISTANT Staphylococcous aureus (MRSA)

## SECARA IN VITRO
Sri Winarsih*  , Uswatun Khasanah**, Abu Hasan Alfatah**

## Abstrak
Methicillin-Resistant  Staphylococcus  aureus  (MRSA)  merupakan  salah  satu  bakteri  yang  dapat membentuk  biofilm.  Biofilm  dapat  menghambat  kerja  antibiotik  sehingga  dapat  menyebabkan  resistensi antibiotik.  Daun  putri  malu  (Mimosa  pudica)  memiliki  senyawa  metabolit  sekunder  di  antaranya  yaitu senyawa  flavonoid.  Senyawa  flavonoid  yang  didapatkan  dari  fraksi  etil  asetat  daun  Mimosa  kemungkinan dapat memberikan efek merusak biofilm sekaligus antibakteri bagi bakteri MRSA. Senyawa flavonoid dapat diperoleh  melalui  proses  fraksinasi  menggunakan  pelarut  etil  asetat.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui  pengaruh  pemberian  fraksi  etil  asetat  terhadap  kerusakan  biofilm  dan  terhadap  jumlah  koloni bakteri, berdasarkan lama inkubasi. Dosis fraksi etil asetat yang digunakan yaitu 3 mg, 6 mg, 9 mg, 12 mg, 15  mg.  Lama  inkubasi  yang  digunakan  yaitu  satu  jam  dan  dua  jam.  Jumlah  koloni  bakteri  dihitung menggunakan skor. Skor tertinggi +6 untuk pertumbuhan koloni bakteri yang sangat padat dan skor terendah +1 untuk pertumbuhan koloni bakteri yang renggang. Hasil penelitian menunjukkan bahwa besar kerusakan biofilm  seiring  dengan  dosis  fraksi  etil  asetat  (Spearman,  r  =  0,426,  p  =  0,01),  dan  besar  kerusakan perlakuan waktu 2 jam lebih tinggi dari pada perlakuan 1 jam (Paired t test, semua dosis menunjukkan p < 0,00). Jumlah koloni menunjukkan penurunan, namun tidak ada perbedaan  bermakna  antara waktu 1 jam dengan 2 jam (Paired t test, semua dosis p > 0,00). Kesimpulan pada penelitian ini adalah fraksi etil asetat dari ekstrak daun putri malu (Mimosa pudica) dapat merusak biofilm dari bakteri MRSA, dan perlakuan waktu 2  jam  menunjukkan  kerusakan  yang  lebih  tinggi  dari  pada  1  jam,  namun  tidak  ada  perbedaaan  dalam menurunkan jumlah koloni MRSA yang berada dalam lapisan biofilm antara waktu 1 jam dan 2 jam.
Kata kunci: bakteri MRSA, fraksi etil asetat, kerusakan biofilm, Mimosa pudica.

## ANTIBIOFILM ACTIVITY OF ETHYL ACETIC FRACTION OF Mimosa pudica LEAF EXTRACT ON METHICILLIN-RESISTANT Staphylococcous aureus (MRSA) BACTERIA IN VITRO

## Abstract
Methicillin-  Resistant  Staphylococcus  aureus  (MRSA)  is  one  of  the  bacteria  that  produces  biofilm. Biofilm  inhibits  antibiotics  contact  with  bacteria  causing  antibiotic  resistance.  Mimosa  leaves  contains secondary  metabolites  that  includes  flavonoids.  Flavonoid  compounds  obtained  from  the  ethyl  acetate fraction of Mimosa leaves may have the detrimental effect biofilms as well as antibacterials effect for MRSA bacteria.  Flavonoid  compounds  can  be  obtained  through  the  fractionation  process  using  ethyl  acetate solvents.  This  study  aims  at  determining  the  effect  of  ethyl  acetic  fraction  administration  on  biofilm degradation  level  and  on  the  number  of  bacterial  colonies,  based  on  incubation  time.  The  dose  of  ethyl acetate fraction used were 3 mg, 6 mg, 9 mg, 12 mg, and 15 mg. The incubation time used were one hour and  two  hours.The  dose  of  ethyl  acetate  fraction  used  were  3  mg,  6  mg,  9  mg,  12  mg,  and  15  mg.  The incubation time used were one hour and two hours. The number of bacterial colonies was calculated using a score.  The  highest  score  was  +6  for  high  density  bacterial  colonies  and  the  lowest  score  was  +1  for  the lowest density bacterial colonies. The results showed that biofilm degradation level increased along with the increasing dose of ethyl acetate fraction (Spearman, r = 0.426, p = 0.01), and degradation level on 2 hours treatment was higher than 1 hour treatment (Paired t test, all doses showed p < 0,00). There was a reduction in the number of colonies demonstrated, however the difference between the time of 1 hour and 2 hours was insignificant  (Paired  t  test,  all  doses  showed    p  >  0.00).  The  conclusion  of  this  study  is  that  ethyl  acetic fraction from Mimosa pudica leaf extract capable  to degrade biofilm produced by  MRSA bacteria, and the rate of degradation is higher in 2 hours treatment compared to those of 1 hour, but no significant difference effect on decreasing colonies number of MRSA in the biofilm layer was found between the two treatments.
Keywords: biofilm degradation, ethyl acetict fraction, Mimosa pudica,  MRSA bacteria.
* Departemen Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Brawijaya
** Jurusan Farmasi, Fakultas Kedokteran, Universitas Brawijaya
 E-mail: wiensri238@gmail.com

## Pendahuluan
Methicilin-Resistant  Staphylococcus aureus  (MRSA)  merupakan  bakteri  bentuk kokus  Gram  positip  yang  bersifat  resisten terhadap  berbagai  jenis  antibiotika,  dan menjadi masalah yang serius di negara maju maupun  di  negara  sedang  berkembang seperti Indonesia. 1,2 MRSA adalah salah satu bakteri pembentuk biofilm. Bakteri penyebab infeksi mampu mempertahankan diri dengan membentuk  suatu  pelindung  atau  lapisan yang  disebut  biofilm.  Biofilm  merupakan salah  satu  produk  hasil  interaksi  quorum sensing (QS) dari masing-masing organisme sehingga  dapat  membentuk  suatu  lapisan akibat  dari  penempelan  bakteri  pada permukaan  yang  cocok. Adanya  biofilm tersebut  menyebabkan  antibiotika  tidak dapat  mencapai  target  kerja  pada  sel bakteri,  sehingga  bakteri  penyebab  infeksi tidak dapat dieradikasi. 3
Putri malu (Mimosa pudica) merupakan tanaman  yang  mudah  tumbuh  dan berpotensi  untuk  dimanfaatkan  sebagai antimikroba. Potensi Mimosa untuk mencegah  pembentukan  biofilm  sudah diteliti,  namun  belum  terdapat  penelitian terkait  perusakan  biofilm.  Salah  satu senyawa yang terkandung dalam daun putri malu  adalah  senyawa  flavonoid  golongan flavon  dan  flavonol. 4 Ekstrak  dari  tanaman yang  memiliki  senyawa  metabolit  sekunder flavonoid  memiliki  potensi  menghambat intercellular  adhesion  genes  icaA  dan  icaD. Adanya  gen  icaA  dan  icaD  pada  bakteri menjadi salah satu faktor dari pembentukan biofilm. 5 Disebutkan  bahwa  gugus  hidroksil yang  dimiliki  struktur  senyawa  flavonoid dapat menyebabkan pembentukan senyawa kompleks  dengan  protein  yang  dapat mengakibatkan biofilm terdenaturasi. 6
Senyawa  flavonoid  dapat  diisolasi menggunakan  pelarut  etil  asetat  melalui fraksinasi  terhadap  ekstrak  tanaman.
Penelitian  dengan  menggunakan  fraksi
memiliki  kelebihan  dibandingkan  ekstrak karena  pada  fraksi  akan  terkandung  jumlah senyawa  yang  lebih  sedikit  sehingga  dapat dioptimalkan  senyawa  yang  diharapkan memberikan efek.
Penelitian  ini  bertujuan  membuktikan bahwa  fraksi  etil  asetat  ekstrak  daun  putri malu (Mimosa pudica) dapat merusak biofilm dan sekaligus membunuh MRSA pembentuk biofilm  secara  in  vitro.  Hasil  penelitian diharapkan  menjadi  dasar  penemuan  obat baru  yang  dapat  merusak  biofilm  sehingga dapat  digunakan  secara  komplementer bersama  antibiotika  atau  bahkan  mungkin dapat  digunakan  sendiri  tanpa  antibiotika karena  mampu  merusak  biofilm  sekaligus. membunuh bakteri.

## Bahan dan Metode

## Alat dan Bahan
Alat  yang  digunakan  dalam  penelitian ini  yaitu  neraca  analitik  (OHAUS  CP214), Oven  (Memmert  UN  55),  rotary  evaporator (IKA ® RV  10  basic),  pompa  vakum (Vacuubrand ® ),  sonikator  (Sonica ® ),  Vortex, Spektrofotometer,
Cakram sefoksitin, Mikroskop, Microplate Reader (Biozatix ® ).
Simplisia  daun  putri  malu  (Mimosa pudica)  diperoleh  dari  UPT. Materia  Medica Batu.  Sampel  bakteri  MRSA  berjumlah  4 isolat (A, B, C, D) berasal dari  luka terinfeksi (dari  empat  penderita  yang  berbeda)  dan merupakan  bakteri  yang  disimpan  oleh Laboratorium  Mikrobiologi  FKUB.  Bahan lainnya  adalah:  akuades,  etanol  96%, DMSO,  Nutrient  Agar,  Nutrient  Broth,  NaCl 0,9%, kit pewarnaan Gram, plat Staphaurex, larutan  H 2 O 2 ,  Trypton  Soy  Broth-Glu  (TSB- glu),  Phosphate  Bufferd  Saline  (PBS), Isopropanol HCl.

## Ekstraksi Maserasi Daun Putri Malu
Sebanyak  300  gram  serbuk  simplisia daun putri malu dimasukkan ke dalam toples kaca,  dicampurkan  etanol  96%  sebanyak  3
L. Diaduk dengan stirrer kecepatan 400 rpm selama  30  menit.  Didiamkan  1x24  jam, campuran disaring dan filtrat yang disimpan. Residu  dimaserasi  tiga  kali  dengan  etanol 96%  sebanyak  3  L  selama  3x24  jam. Disaring  dan  dicampurkan  dengan  filtrat hasil maserasi pertama. Selanjutnya filtrat di pekatkan  dengan  rotary  evaporator  pada suhu  40±2  °C  kecepatan  70  rpm  hingga pelarut  menguap,  dilanjutkan  pengeringan menggunakan  oven  pada  suhu  40±2 °C.Hasil  ekstrak  kental  ditimbang  dan dihitung  persen  rendemen  menggunakan rumus:
% rendemen = 𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑎𝑘ℎ𝑖𝑟 𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑎𝑤𝑎𝑙 𝑥 100%

## Fraksinasi Ekstrak Daun Putri Malu
Ekstrak  etanol  daun  putri  malu ditimbang  20  gram.  Disuspensikan  dalam akuades  100  ml.  Dimasukkan  ke  dalam corong  pisah,  ditambahkan  n-heksana  100 ml.  Dikocok  selama  5  menit,  sesekali  gas dikeluarkan,  diamkan  hingga  terbentuk  dua lapisan.  Dipisahkan  lapisan  yang  terbentuk. Proses  diulang  hingga  fraksi  n-heksana menjadi  jernih  atau  warna  terlihat  konstan. Residu  fraksi  n-heksana  ditambahkan dengan 100 ml etil asetat, dikocok selama 5 menit,  sesekali  gas  dikeluarkan,  diamkan hingga  terbentuk  dua  lapisan.  Kemudian dipisahkan,  prosedur  diulang  hingga  fraksi etil asetat menjadi jernih atau warna terlihat konstan.  Fraksi  dipekatkan  dengan  rotary evaporator  pada  suhu  40±2  °C  kecepatan 70 rpm hingga pelarut menguap, dilanjutkan pengeringan menggunakan oven pada suhu 40±2  °C.  Hasil  fraksi  kental  ditimbang  dan dihitung  persen  rendemen  menggunakan rumus:
% rendemen = 𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑎𝑘ℎ𝑖𝑟 𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑎𝑤𝑎𝑙 𝑥 100%

## Identifikasi Bakteri Bakteri MRSA
Pewarnaan Gram:
Koloni  bakteri  diambil  menggunakan ose,  diletakkan  pada  gelas  objek.  Difiksasi
kemudian  diteteskan  larutan  kristal  violet, diamkan selama 1 menit.  Dibilas dengan air mengalir.  Diteteskan  lugol,  diamkan  selama 1  menit.  Dibilas  dengan  air  mengalir. Diteteskan  alkohol  96%  sampai  luntur. Dibilas  dengan  air  mengalir.  Diteteskan safranin,  diamkan  selama  30  detik.  Dibilas dengan  air  mengalir.  Dikeringkan  dengan kertas  penghisap,  setelah  kering  ditetesi minyak  emersi  diamati  menggunakan mikroskop  dengan  perbesaran  1000kali. MRSA  merupakan  bakteri  Gram  positif (berwarna ungu) berbentuk kokus.
Uji katalase:
Koloni  bakteri  pada  gelas  objek disuspensikan  dengan  akuades  steril. Ditambahkan  larutan  H 2 O 2 ,  kemudian diamati reaksi yang terjadi, dikatakan positif apabila terdapat gelembung udara.
Uji koagulase:
Koloni  bakteri  diambil  menggunakan ose.  Digoreskan  pada  plat  Staphaurex. Ditambahkan  reagen  Staphaurex.  Diamati reaksi yang terjadi, dikatakan positif apabila terjadi penggumpalan atau aglutinasi.
Uji sensitivitas sefoksitin:
Suspensi  bakteri  diinokulasi  pada permukaan  media  Nutrient  Agar,  kemudian diberikan  cakram  sefoksitin  30  µg. Diinkubasi  37 0 C  selama  18  jam.  Dihitung diameter  zona  hambat  yang  terbentuk.  Jika zona hambat yang terbentuk ≤21 mm, maka dikatakan positif bakteri MRSA. 7

## Pembuatan Suspensi Bakteri
Setelah  diidentifikasi  sebagai  bakteri MRSA,  disiapkan  bakteri  10 6 CFU/mL menggunakan  spektrofotometri  panjang gelombang 625 nm. Optical Density  (OD)  = 0,1 setara dengan kepadatan sel bakteri 10 8
CFU/mL. 8
Dosis  Fraksi  Etil  Asetat  Ekstrak  Daun

## Mimosa
Ditimbang  fraksi  etil  asetat  sebanyak 75  mg  dan  dilarutkan  dengan  1  mL  DMSO 10%  sehingga  didapatkan  konsentrasi  75 mg/mL.  Selanjutnya  dilakukan  pengenceran bertingkat  untuk  mendapatkan  dosis larutan uji untuk setiap 200 µL adalah 15 mg/mL, 12 mg/mL, 9 mg/mL, 6 mg/mL dan 3 mg/mL.

## Uji Perusakan Biofilm
Uji perusakan biofilm dilakukan pada 4 sampel bakteri yaitu isolat A, isolat B, isolat C,  isolat  D,  masing-masing  isolat  diulang triplo. Sebanyak 100 μL suspensi bakteri 10 6 CFU/mL  dimasukkan  ke  dalam  well  pada plat  mikrotiter  beserta  100  μL  media  TSB- glu, kemudian plat mikrotiter diinkubasi pada suhu 37 0 C selama dua hari (telah terbentuk biofilm). Setelah dua hari, suspensi dibuang dan  well  dicuci  dengan  air  mengalir sebanyak  3  kali.  Selanjutnya  ditambahkan 200  μL  sampel  fraksi  etil  asetat  dengan dosis  15  mg/mL,  12  mg/mL,  9  mg/mL,  6 mg/mL,  dan  3  mg/mL  pada  well.  Sebagai “Kontrol  negatif”  adalah  well  berisi  bakteri yang diberi larutan DMSO 10% (tanpa fraksi etil asetat). Perlakuan tersebut diulang pada 2  plat  mikrotiter,  1  plat  diinkubasi  selama  1 jam  dan  1  plat  diinkubasi  selama  2  jam. Setelah  diinkubasi,  cairan  dibuang.  Plat mikrotitter  dicuci  dengan  PBS  200  μL. Kemudian ditambahkan 200 μL kristal violet 0,1%  ke  dalam  setiap  well.  Didiamkan  15 menit  pada  suhu  ruang.  Dicuci  dengan  air mengalir sebanyak 3 kali. Ditambahkan 200 μL  isopropanol  HCl  ke  setiap  well. Selanjutnya  dilakukan  pembacaan  optical density  (OD)  pada  panjang  gelombang  630 nm.  Persentase  kerusakan  biofilm  dihitung menggunakan rumus sebagai berikut. 9

## % Kerusakan biofilm  =
Nilai OD Kontrol negatif−Nilai OD fraksi Nilai OD Kontrol negatif x 100%

## Uji Jumlah Koloni Bakteri
Diambil  dari  setiap  sumur  (suspensi biofilm  sebelum  dilakukan  pewarnaan dengan kristal violet) sebanyak satu ose dan digoreskan pada media Nutrient Agar secara merata  di  seluruh  permukaan  media. Kemudian diinkubasi selama 24 jam. Jumlah koloni  yang  tumbuh  dihitung  dan diinterpretasikan  menggunakan  penilaian skor.  Skor  tertinggi  +6  untuk  jumlah  koloni bakteri yang amat sangat padat, +5 terdapat koloni  bakteri  yang  sangat  padat  tetapi terlihat jarak antar koloni, +4 terdapat koloni bakteri  yang  padat  dan  terlihat  jarak  antar koloni, +3 terdapat koloni bakteri yang cukup padat  dan  terlihat  jarak  antar  koloni,  +2 terdapat koloni bakteri yang tidak padat dan terlihat jarak antar koloni, +1 terdapat koloni bakteri  dengan  jumlah  yang  sangat  tidak padat dan jarak antar koloni lebih jauh.

## Analisis Data
Data  yang  diperoleh  kemudian dianalisis menggunakan uji korelasi
Spearman  dan  Paired  t-test  dengan  tingkat kepercayaan 95% (α = 0,05).

## Hasil

## Fraksi Etil Asetat dari Ekstrak  Daun Mimosa
Ekstrak  daun  Mimosa  berupa  cairan kental  berwarna  hijau  coklat  memiliki  bau khas  aromatik.  Hasil  rendemen  ekstrak adalah  sebesar  8,88%  b/b,  sedang  hasil rendemen  fraksi  etil  asetat  dari  ekstrak adalah 9,47% b/b.

## Identifikasi Bakteri MRSA

## Pewarnaan Gram
Hasil  pewarnaan  Gram  terhadap sampel  bakteri  (isolat  A,  B,  C,  dan  D) menunjukkan  gambaran  bakteri  bentuk kokus berwarna ungu (Gram positip), seperti terlihat pada Gambar 1.
Uji Katalase dan Uji Koagulase Hasil pengamatan uji katalase diperoleh  semua  isolat  bakteri  terdapat gelembung  udara,  dan  pada  uji  koagulase terlihat  adanya  clumping  berwarna  putih (Gambar 2).

## Gambar 1. Pewarnaan Gram.
Keterangan:  Terlihat  semua  isolat  bakteri (A,B,C,D)  berbentuk  kokus  Gram  positip, perbesaran 1000x.

## Gambar 2. Hasil uji katalase dan uji koagulase bakteri MRSA.
Keterangan:  Semua  80solate  bakteri  (A,B,C,D) menunjukkan  katalase  positip  dan  koagulase positip.

## Uji Sensitivitas Terhadap Sefoksitin
Hasil uji sensitivitas terhadap sefoksitin menunjukkan  bahwa  tidak  terbentuk  zona hambat  pada  semua  80solate  bakteri (resisten) seperti pada Gambar 3.  Dari hasil tersebut  dapat  diinterpretasikan  bahwa 80solate  A,  80solate  B,  80solate  C  dan 80solate D adalah bakteri MRSA.
Gambar 3. Hasil uji sensitivitas terhadap
cefoxitin
Keterangan:  Tidak  terbentuk  zona  hambat  pada semua isolat bakteri (A,B,C,D) (resisten terhadap sefoksitin) .

## Hasil Uji Kerusakan Biofilm
Hasil  uji  kerusakan  biofilm  dengan inkubasi  1  jam  dan  2  jam  menunjukkan bahwa terjadi peningkatan kerusakan seiring dengan  peningkatan  dosis  fraksi  etil  asetat ekstrak  daun  Mimosa  seperti  ditunjukkan pada Gambar 4.
Dari  Gambar  4.  tersebut,  dapat  dilihat bahwa  secara  deskriptif  ada  perbedaaan hasil  persen  kerusakan  biofilm,  baik terhadap dosis maupun waktu. Berdasarkan hasil  persen  degradasi  biofilm  terhadap waktu  pada  bakteri  Methicillin-Resistant Staphylococcus  aureus  (MRSA),  pada perlakuan  1  jam  diperoleh  hasil  persen degradasi tertinggi hingga terendah berturut- turut yaitu dosis 15 mg, dosis 12 mg, dosis 9 mg, dosis 6 mg, 3 mg (Spearman, r = 0,426, p  =  0,01);  sedangkan  untuk  waktu  2  jam tidak  ada  perbedaan  bermakna  antara perlakuan  dosis  (Spearman,  r  =  0,142,  p  = 0,278).  Berdasarkan  perbedaan  perlakuan waktu, terlihat bahwa degradasi bioflm pada perlakuan waktu 2 jam lebih tinggi dibanding waktu  1  jam  untuk  semua  macam  dosis (Paired t test, semua dosis menunjukkan p < 0,00) (Lihat Gambar 4).

## Hasil Perhitungan Jumlah Koloni
Dari  hasil  perhitungan  jumlah  koloni yang  tumbuh,  pada  perlakuan  dengan inkubasi  1  jam  maupun  2  jam  terjadi penurunan  jumlah  koloni  seiring  dengan
A B C D A C B D A C B D A C B D
Uji katalase Uji koagulase
peningkatan  dosis  seperti  ditunjukkan  pada Gambar 5. Hasil analisis statistik perlakuan 1 jam  menunjukkan  penurunan  jumlah  koloni seiring dengan peningkatan dosis (Spearman,  r  =  -  0,509,  p  =  0,022).  Untuk perlakuan  waktu  2  jam,  menunjukkan penurunan  jumlah  koloni  yang  tidak bermakna  (Spearman,  r  =  -  0,389,  p  = 0.093).    Tidak  ada  perbedaan  yang signifikan antara jumlah koloni padaperlakuan  waktu  1  jam  dengan  2  jam (Paired t test, semua dosis menunjukkan p > 0,00).

## Pembahasan
Pada penelitian ini, dimaksudkan untuk mendapatkan  informasi  terkait  daun  putri malu  (Mimosa  pudica)  dapat  digunakan
sebagai  perusak  biofilm  yang  dibentuk  oleh bakteri  Methicilin-Resistant  Staphylococcus aureus  (MRSA).  Selain  itu,  pada  ekstraksi maserasi  tidak  ada  pemanasan  sehingga senyawa  aktif  tidak  menjadi  terurai. 10 Pemilihan  pelarut  etanol  96%  digunakan karena  kemampuan  etanol  yang  bagus dalam  melarutkan  senyawa  semipolar  di antaranya flavonoid.
Untuk  menarik  senyawa  flavonoid  dari ekstrak,  selanjutnya  dilakukan  fraksinasi menggunakan  pelarut  etil  asetat  setelah sebelumnya  digunakan  n-heksan.  Dengan fraksinasi  ini,  akan  terpisahkan  senyawa berdasarkan tingkat kepolaran yang berbeda karena  menggunakan  dua  pelarut  yang memiliki tingkat kepolaran yang berbeda. 11,12
Gambar 4. Diagram persentase kerusakan biofilm.
Gambar 5. Diagram jumlah koloni bakteri berdasarkan penilaian skor.
38.79 40.94 49.10
59.72 60.19 71.66 75.42 76.46 77.21 77.47 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 3mg 6mg 9mg 12mg 15mg % K eru sakan B io fil m Dosis Inkubasi 1 Jam Inkubasi 2 jam 5.75 3.50 2.25 2.75 3.25 4.50 3.00 2.50 1.75 3.00 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 3mg 6mg 9mg 12mg
15mg
Skor Ju ml ah Ko lo n i Bakt er i Dosis Inkubasi 1 jam Inkubasi 2 jam
Pada  penelitian  sebelumnya  dilaporkan bahwa    fraksi  etil  asetat  dari  ekstrak  daun putri  malu  (Mimosa  pudica)  mengandung senyawa flavonoid dan alkaloid. 13
Pada  penelitian  ini,  yang  digunakan sebagai  sampel  adalah  bakteri  MRSA  dari penderita  yang  mengalami  luka  infeksi, sehingga  dapat  menggambarkan  efek mimosa  terhadap  MRSA  di  klinik.  Pada  uji koagulase,  bakteri  sampel  menunjukkan koagulase positif karena terjadi penggumpalan  (clumping)  seperti  yang ditunjukkan  pada  Gambar  3.  Menurut Andreasen 14 ,  Bakteri  stafilokokus  yang menghasilkan enzim koagulase diinterprretasikan sebagai true pathogen dan disebut  sebagai  Staphylococcus  aureus,
sedangkan  stafilokokus  koagulase  negatif biasanya  sebagai  patogen  oportunistik. 14,15
Koagulase adalah salah satu faktor virulensi dari  Staphylococcus,  merupakan  protein yang  serupa  dengan  enzim  dan  memiliki kemampuan  untuk  menggumpalkan  plasma dengan  bantuan  faktor  yang  terdapat  pada serum. 16 Selain  itu,  bakteri  stafilokokus menggunakan  enzim  katalase  untuk  dapat melindungi  diri  dari  hidrogen  peroksida (H 2 O 2 )  dengan  cara  mengubahnya  menjadi air  dan  oksigen. 17 Untuk  identifikasi  bakteri Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, saat ini menggunakan uji resistensi terhadap antibiotika  sefoksitin.  Pada  uji  sensitivitas terhadap  sefoksitin,  diketahui  bahwa  semua isolat  sampel  resisten  terhadap  sefoksitin (zona  hambat  <21  mm),  sehingga disimpulkan  bahwa  semua  isolat  bakteri sampel adalah bakteri MRSA. MRSA adalah bakteri Staphylococcus aureus yang bersifat multiresisten  terhadap  berbagai  jenis antibiotika  sehingga  sering  menimbulkan masalah  pengobatan  terhadap  penyakit infeksi. 7,18
Uji perusakan biofilm pada penelitian ini dilakukan  dengan  menggunakan  metode mikrodilusi  menggunakan  plat  mikrotitter. Metode  mikrodilusi  tepat  digunakan  apabila
fraksi/senyawa  yang  ingin  diuji  jumlahnya terbatas,  namun  jenis  mikroorganisme  atau variabel yang diujikan tetap dapat beragam. Keuntungan  dari  metode  mikrodilusi  ini adalah  mudah  dilakukan,  serta  memberikan efisiensi dalam segi bahan dan peralatan. 19 Berdasarkan  persentase  kerusakan biofilm,  hasil  penelitian  ini  menunjukkan terdapat  hubungan  antara  dosis  dengan peningkatan  perusakan  biofilm.  Pada  dosis terendah yaitu 3 mg, fraksi etil asetat sudah memberikan  efek  perusakan  biofilm  dan meningkat  seiring  dengan  peningkatan dosis.  Hasil  peneltian  ini  juga  menunjukkan bahwa waktu inkubasi yang lebih lama akan menghasilkan  persentase  kerusakan  yang lebih tinggi.
Pada  penelitian  ini,  fraksi  etil  asetat ekstrak daun Mimosa dengan dosis 3 mg, 6 mg,  9  mg,  12  mg,  dan  15  mg  secara deskriptif  menunjukkan  efek  membunuh bakteri  yang  didalam  biofilm  (jumlah  koloni yang  tumbuh  menurun  seiring  dengan meningkatnya  dosis),  namun  terlihat  kurang konsisten  sehingga  kekuatan  hubungan antara dosis dan efek rendah. Pada Gambar 5,  dapat  dilihat  bahwa  perlakuan  dosis  3 mg/mL,  6  mg/mL,  dan  9  mg/mL  jelas menunjukkan  penurunan  jumlah  koloni bakteri yang tumbuh, sedangkan pada dosis 12  mg/mL  dan  15  mg/mL  terlihat  jumlah koloni  yang  lebih  tinggi  meskipun  tidak berbeda  bermakna  dengan  dosis  9  mg/mL. Hasil  yang  menunjukkan  efek  antibakteri tersebut sesuai dengan penelitian Kamelia 13 yang  melaporkan  bahwa  fraksi  etil  asetat memiliki  aktivitas  antibakteri  terhadap MRSA. Dengan demikian, berdasarkan hasil penelitian  ini  dapat  dibuktikan  bahwa  fraksi etil  asetat  ekstrak  daun  Mimosa  mampu merusak  biofilm,  dan  membunuh  bakteri yang berada didalam lapisan biofilm.
Pada  Gambar  5,  dapat  dilihat  pula bahwa  efek  membunuh  bakteri  pada perlakuan  waktu  inkubasi  1  jam  tidak  ada perbedaan dengan waktu inkubasi 2 jam. Hal
ini  kemungkinan  disebabkan  pengamatan jumlah  koloni  yang  sangat  kasar  yaitu menggunakan skoring yang dipengaruhi oleh subyektivitas  yang  mengamati,  sehingga menghasilkan  standar  deviasi  (SD)  yang sangat  lebar  membuat  secara  statistik  tidak berbeda  bermakna.  Untuk  itu,  disarankan dilakukan  penelitian  serupa  dengan  metode yang  lebih  objektif  yaitu  dilakukan pengenceran  sebelum  dikultur  agar  jumlah koloni  dapat  terhitung,  sehingga  didapatkan data  yang  lebih  baik  untuk  dianalisis. Kemungkinan  yang  lain  adalah  fraksi  etil asetat  ekstrak  daun  Mimosa  belum  optimal dalam  merusak  biofilm  sehingga  masih banyak  bakteri  yang  terlindungi  oleh  biofilm dan tumbuh saat dikultur. Beberapa penelitian yang menggunakan ekstrak herbal atau fraksinya, menunjukkan hasil yang positif yaitu ekstrak herbal  mampu  menghambat  pembentukan maupun  merusak  biofilm  bakteri.  Pada penelitian  yang  telah  dilakukan  Mutmainah dkk. 20 ,  efektivitas  ekstrak  etanol  Mimosa pudica terhadap pembentukan biofilm bakteri Staphylococcus  aureus  menunjukkan  hasil bahwa  adanya  penurunan  nilai  rerata pembentukan biofilm dimulai pada konsentrasi 50 mg/mL dan meningkat seiring bertambahnya konsentrasi. Menurut penelitian  Yuliandari 21 yang  juga  menguji aktivitas  degradasi  biofilm  dari  sari  buah belimbing wuluh terhadap bakteri Pseudomonas  aeruginosa  menunjukkan bahwa  semakin  besar  konsentrasi  ekstrak yang  digunakan  maka  semakin  besar degradasi  biofilm  yang  terjadi.  Meskipun ekstrak  herbal  potensial  sebagai  bahan antibiofilm,  namun  bahan  berupa  ekstrak mengandung banyak senyawa aktif sedangkan  bahan  berupa  fraksi  hanya mengandung  beberapa  senyawa  aktif. Dengan demikian, uji antibiofilm menggunakan  fraksi  ekstrak  herbal  akan lebih  mudah  dilakukan  standarisasi  dosis untuk aplikasinya di klinik.
Menurut penelitian yang telah dilakukan oleh  Kamelia 13 ,  diketahui  bahwa  fraksi  etil asetat  ekstrak  etanol  daun  putri  malu (Mimosa  pudica)  mengandung  senyawa metabolit sekunder flavonoid. Menurut Lee et al. 5 ,  senyawa  flavonoid  memiliki  potensi menghambat  intercellular  adhesion  genes icaA  dan  icaD.  Gen  icaA  dan  icaD  adalah gen  penyandi  protein  yang  memperantarai perlekatan  antar  sel  bakteri,  sehingga menjadi salah satu faktor dari pembentukan biofilm.  Flavonoid  juga  memiliki  aktivitas dalam merusak biofilm. Mekanisme flavonoid sebagai  agen  yang  dapat  merusak  biofilm adalah  dengan  cara  gugus  hidroksil  pada struktur  flavonoid  berikatan  dengan  protein yang  ada  dalam  biofilm  dan  membentuk senyawa  kompleks  yang  menyebabkan biofilm  terdenaturasi. 6 Selain  itu,  flavonoid juga  disebutkan  memiliki  efek  antibakteri. Aktivitas flavonoid dalam membunuh bakteri yaitu  dengan  menghambat  sintesis  asam nukleat, serta mengganggu fungsi membran sel  dan  metabolisme  energi. 22,23 Flavonoid menunjukkan  aktivitas  menghambat  sintesis asam nukleat yaitu pada cincin A dan cincin B  dalam  proses  interkalasi  dalam  ikatan hidrogen,  menghasilkan  penumpukan  basa nukleat, dengan akibat hambatan pembentukan  DNA  dan  RNA  bakteri. Flavonoid  juga  dapat  menyebabkan kerusakan  permeabilitas  dinding  sel  bakteri, mikrosom  maupun  lisosom. 23 Mekanisme kerja  flavonoid  dalam  menghambat  fungsi membran  sel  adalah  membentuk  senyawa kompleks  dengan  protein  ekstraseluler  dan terlarut  sehingga  merusak  membran  sel bakteri. 24
Berdasarkan  pada  penelitian  yang dilakukan  oleh  Kamelia 13 ,  diketahui  bahwa selain  flavonoid,  juga  terdapat  senyawa alkaloid  yang  tertarik  pada  fraksi  etil  asetat.
Alkaloid juga menunjukkan aktivitas antibakteri.  Mekanisme  alkaloid  sebagai antibakteri  adalah  sebagai  interkalator  DNA dan menghambat dari enzim topoisomerase
pada  sel  bakteri. 25 Selain  itu,  mekanisme alkaloid  sebagai  antibakteri  adalah  dengan mengganggu komponen penyusun peptidoglikan sehingga peptidoglikan sebagai lapisan penyusun dinding sel bakteri tidak terbentuk secara utuh dan mengakibatkan kematian bakteri.
26

## Kesimpulan
Berdasarkan  hasil  penelitian  dan pembahasan,  disimpulkan  bahwa  fraksi  etil asetat dari ekstrak daun putri malu (Mimosa pudica)  mampu  merusak  biofilm  bakteri MRSA,  dan  waktu  inkubasi  2  jam menunjukkan  kerusakan  biofilm  yang  lebih tinggi dari pada 1 jam. Fraksi etil asetat dari ekstrak  daun  putri  malu  juga  mampu membunuh bakteri yang membentuk biofilm, namun  tidak  ada  perbedaan  antara  waktu inkubasi 1 jam dan 2 jam.

## Saran
Dilakukan  penelitian  serupa  dengan cara  penghitungan  jumlah  koloni  secara objektif  (dilakukan  pengenceran  sebelum dikultur)  sehingga  didapatkan  data  yang lebih baik untuk dianalisis.

## Daftar Pustaka
1. Chen  CJ  &  Huang  YC.  New Epidemiology  of  Staphylococcus  aureus Infection  in  Asia.  Clin  Microbiol  Infect. 2014; 20(7):605-606.
2. Kurniawati AFS, Satyabakti P, Arbianti N. Perbedaan  Risiko  Multidrug  Resistance Organisms  (MDROS)  Menurut  Faktor Risiko  dan  Kepatuhan  Hand  Hygiene. Jurnal  Berkala  Epidemiologi.  2015; 3(3):277-289.
3. Arjuna A, Pratama WP, Sartini, Mufidah. Uji  Pendahuluan  Antibiofilm Ekstrak  Teh Hijau dan Teh Hitam pada Streptococcus mutans Melalui  Metode  Microtitter  Plate.
Jurnal Farmasi Galenika. 2018; 4(1):44 – 49.
4. Mehingko  L,  Awaloei  H,  Wowor  MP.  Uji Efek Antimikroba  Estrak Daun Putri Malu (Mimosa  pudica  Duchaas  &  Walp)
Secara  In  Vitro.  Jurnal  Biomedik.  2010;
2(1):44-49.
5 .  Lee J-H, JH Park, HS Cho, SW Joo, MH
Cho,  J  Lee.  Antibiofilm  Activities  of Quercetin  and  Tannic  Acid  Against Staphylococcus  aureus.  Biofouling:  The Journal  of  Bioadhesion  and  Biofilm Research. 2013; 29(5).
6. Kining E. Aktivitas Antibiofilm Ekstrak Air Daun Melinjo, Daun Singkong, dan Daun Pepaya  terhadap  Bakteri  Pseudomonas aeruginosa secara In Vitro. Tesis. Bogor:
Program Studi Biokimia Institut Pertanian Bogor. 2015.
7. Khan F, Shukla I, Rizvi M. Cefoxitin Disc Test as a Marker for Detecting Methicillin Resistence  in  Staphylococcus  aureus Isolates.  Journal  of  Pure  and  Applied
Microbiology. 2010; 4(2):831-835.
8. Murray  PR,  Baron  EJ,  Pfaller  MA, Tenover  FC,  and  Yolken  RH.  Manual  of Clinical  Microbiology.  7 th Edition.
Washington  DC:  American  Society  for Microbiology. 1999. Pp. 284.
9. Sandasi  LCM,  Viljoen  AM.  The  In  Vitro Antibiofilm  Activity  of  Selected  Culinary Herb and Medical Plants Against Listeria monocytogenes.  Letters  in  Applied Microbiology (50). 2010. P. 30-35.
10. Puspitasari  AD  dan  Prayogo  LS. Perbandingan Metode Ekstraksi Maserasi  dan  Sokletasi  Terhadap  Kadar Fenolik  Total  Ekstrak  Etanol  Daun Kersen (Mutingia calabura). Jurnal Ilmiah
Cendekia Eksakta. 2017.
11. Pratiwi  ST.  Mikrobiologi  Farmasi. Jakarta: Penerbit Erlangga. 2008.
12. Soeksamanto.  Mahkota  Dewa,  Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl. (Thymelaceae)  Biodiversita.  2010;  8(2): 92-95.
13. Kamelia  NJ.  Aktivitas  Antibaktri  Fraksi Ekstrak Etanol Daun Putri Malu (Mimosa pudica)  Terhadap  Methicillin  Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) SecaraIn Vitro. Skripsi. Malang: Fakultas Kedokteran. Universitas Brawijaya. 2018. 14. Andreasen  CB.  Staphylococcosis  dalam Diseases  of  Poultry.  12 th Edition.  Saif YM,  Fadly  AM,  McDougald,  Nolan,  LK, Swayne  DE  (Editor).  USA:  Blackwell Publishing. 2008. p 892-896.
15. Yurdakul  NE,  Erginkaya  Z,  and  Unal  E. Antibiotic  Resistance  of  Enterococci, coagulase  negative  Staphylococci  and Staphylococcus  aureus  Isolated  from Chicken  Meat.  J  Food  Sci.  2013.
31(1):14 -19.
16. Karimela  EJ,  Ijong  FG,  Dien  HA. Karakteristik  Staphylococcus  aureus yang  Diisolasi  dari  Ikan  Asap  Pinekhe Hasil  Olahan  Tradisional  Kabupaten Sangihe.  Jurnal  Pengolahan  Hasil Perikanan Indonesia. 2017. 20(1).
17. Locke T, Keat S, Walker A, Mackinnon R. Microbiology and  Infectious Diseases on The  Move.  Jakarta:  Penerbit  Indeks. 2013.
18. Clinical  and  Laboratory  Standards Institute.  Performance  Standards  for Antimicrobial  Disk  Susceptibility  Test; Aproved Standard M02-A11. Clinical and Laboratory  Standards  Institute,  Wayne,
PA. 2012.
19. Jorgensen JH, Ferraro MJ. Antimicrobial Susceptibility  Testing:  A  Review  of General  Principles  and  Contemporary Practices.  Clinical  Infectious  Disease.
2009. 49:1749-55. 20. Mutmainah BQ, Supnawadi, Ni Matuzahroh.  Efektivitas  Ekstrak  Etanol Mimosa pudica L. Terhadap Pembentukan  Biofilm  Staphylococcus aureus.  Prosiding  Seminar  Nasional Pendidikan Biologi.  2018. 21. Yuliandari R. Uji Aktivitas Antibiofilm Sari Buah Belimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi L)  Terhadap  Pseudomonas  aeruginosa Secara  In  Vitro.  Skripsi.  UIN  Syarif Hidayatullah Jakarta: Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan. 2015. 22. Hendra  R,  Ahmad  S,  Sukari A.,  Shukor,
MY,  Oskouelan  E.  Flavonoid  Analyses and  Antimicrobial  Activity  of  Various Parts  of  Phaleria    macrocarpa  (Scheff). Boerl Fruit. Intr J Mol Sci. 2011; 12:3422- 3431.
23. Cushnie  TPTim,  Lamb  Andrew.  Journal Antimicrobial  Activity  of  Flavonoids. International  Journal  of  Antimicrobial Agents. 2005; 26:343-356.
24. Nuria  MC,  Faizaitun,  A  Sumantri.  Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Jarak Pagar (Jatropa curcas L) terhadap Bakteri Staphylococcus aureus ATCC25923,  Escherichia  coli  ATCC 25922,  dan  Salmonella  typhi  Atcc  1408. 2009; 2(6):26-37.
25. Karou D, Savadogo A, Canini A, Saydou Y,  Monstesano  C,  Simpore  J,  et  al. Antibacterial  Activity  of  Alkaloids  from Sida  Acuta.  African  Journal  of
Biotechnology. 2005; 4(12):1452-1457.
26. Darsana I, Besung I, Mahatmi H. Potensi Daun  Binahong  (Anredera  codifolia (Tenore)  Steenis)  dalam  Menghambat Pertumbuhan  Bakteri  Escherichia  coli Secara  In  Vitro.  Indonesia  Mediscus Veterinus. 2012.