## ABSTRAK
Beberapa  tanaman  Asteraceae  mengandung  senyawa  fitokimia  yang  biasa dimanfaatkan  untuk  mengatasi  kesehatan.  Namun,  penelitian  tentang  penggunaan tanaman Asteraceae sebagai agen penghambat tirosinase masih jarang dilakukan. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk menyeleksi ekstrak dan/atau fraksi teraktif dari spesies Asteraceae sebagai inhibitor tirosinase dan menduga senyawa aktif yang berperan  di  dalamnya.  Sebanyak  12  spesies  Asteraceae  diekstraksi  menggunakan pelarut air. Filtrat yang dihasilkan difraksinasi sebagian menggunakan kloroform untuk mendapatkan  ekstrak  air,  fraksi  air,  dan  fraksi  kloroform.  Setiap  ekstrak  dan  fraksi masing-masing  tanaman  ditentukan  aktivitas  inhibitor  tirosinasenya  menggunakan microplate  reader  (ELISA)  dengan  substrat  L-DOPA.  Fraksi  air  tanaman Thitonia diversipholia memberikan aktivitas terbaik dari semua sampel yang diuji dengan IC 50 terkecil.  Senyawa  aktif  yang  terkandung  dalam  tanaman  dengan  aktivitas  inhibitor tirosinase terbaik dianalisis menggunakan LC-MS/MS. Senyawa yang berperan sebagai inhibitor  tirosinase  adalah  senyawa  golongan  alkaloid  yang  mendominasi  tanaman yaitu trigonelin.

## ABSTRACT
Some Asteraceae plants have phytochemicals that are commonly used to treat some illness. However, research on the use of Asteraceae plants as tyrosinase inhibitor agents is still rare. Therefore, this study aims to select the most active fraction of Asteraceae species  as  tyrosinase  inhibitors  and  suspect  active  compounds  that  play  a  role  in  it. About 12 species from Asteraceae are extracted using water. The resulting filtrate is partially fractionated using chloroform to obtain water extracts, water fractions, and chloroform fractions. Each extract and fraction of each plant determined the activity of its tyrosinase inhibitor using a microplate reader (ELISA) with L-DOPA as the substrate. Thitonia diversipholia water fraction provided the best activity of all the samples tested with the smallest IC 50. The active compounds contained are analyzed using LC-MS / MS. Compounds that act as tyrosinase inhibitors are alkaloid group that dominate the plant, namely trigonelline.
Penulis Veby Tri Yani 1 , Irma Herawati Suparto 1,2 , Irmanida Batubara 1,2 *
Afiliasi
1 Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB University, kampus IPB
Darmaga, Bogor.
2 Pusat Studi Biofarmaka Tropika LPPM, IPB University, Kampus IPB Taman Kencana Bogor
Dua Belas Spesies Asteraceae sebagai Inhibitor Tirosinase: Seleksi dan Dugaan Senyawa Aktifnya
Twelve Asteraceae Species as Tyrosinase Inhibitors: Selection and Assumption of Active Compounds
Kata Kunci  Asteraceae
 Tithonia diversifolia
 trigonellin
 tirosinase
Keywords  Asteraceae
 Tithonia diversifolia,
 trigonelline
 tyrosinase
Diterima 9 Desember 2021 Disetujui 4 Januari 2022
*Penulis Koresponding Irmanida Batubara email: ime@apps.ipb.ac.id

## PENDAHULUAN
Famili  Asteraceae  merupakan  kelompok  tumbuhan herba  yang  seringkali  dianggap  sebagai  gulma  atau pengganggu. Famili ini mudah ditemukan di mana saja karena  sifatnya  yang  mudah  tumbuh  dan  memiliki kemampuan  beradaptasi  yang  tinggi  serta  perlakuan silvikultur  yang  mudah.  Asteraceae  sendiri  banyak dimanfaatkan  oleh  masyarakat  sekitar  sebagai  obat tradisional,  baik  dalam  bentuk  ekstrak,  air  rebusan, maupun  digunakan  secara  langsung  untuk  mengobati luka,  deman,  sakit  perut,  diabetes,  dan  sebagainya (Wegiera  et  al.  2012).  Hal  ini  didukung  oleh  hasil penelitian  para  ahli  di  mana  famili  Asteraceae  telah terbukti  memiliki  aktivitas  seperti,  antioksidan, antibakteri,  antimelanogenesis,  antiglikasi,  antikanker, dan aktivitas lainnya (Budiarti et al. 2019; Hamamoto et al. 2019). Namun, aktivitas Asteraceae sebagai inhibitor tirosinase masih belum banyak diteliti.
Aktivitas  inhibitor  tirosinase  berkaitan  erat  dengan proses  melanogenesis.  Melanogenesis  adalah  proses fisiologis  dalam  memproduksi  melanin,  suatu  pigmen penyerap cahaya yang bertanggung jawab untuk warna kulit  dan  rambut  manusia,  bersama  dengan  tiga biokroma  lainnya  (Haryanti  et  al.  2018). Pembentukan melanin  ini  dikatalisasi  oleh  tirosinase,  yaitu oksidoreduktase  yang  mengandung  tembaga  yang merupakan  enzim  kunci  dalam  biosintesis  melanin. Enzim  ini  mengkatalisasi  langkah  pertama  dalam  dua reaksi sintesis melanin, yaitu mengkatalisasi hidroksilasi L-tirosin menjadi 4,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA) dan oksidasi  L-DOPA  menjadi  dopakuinon  yang  akan mengalami  polimerisasi  secara  spontan  membentuk melanin (Rauf et al. 2019).
Proses  pembentukan  melanin  dapat  dihambat dengan  cara  menghambat  interaksi  antara  enzim tirosinase dengan substrat L-DOPA, sehingga antitirosinase dapat digunakan untuk mencegah proses pencoklatan enzimatik atau hiperpigmentasi pada kulit (Juwita  et  al. 2013).  Berbagai  inhibitor  tirosinase  telah banyak  ditemukan  dalam  bahan  kosmetik  sebagai pencegah  hiperpigmentasi,  diantaranya  adalah  asam askorbat, arbutin, asam kojat, merkuri, dan hidrokuinon. Dari  beberapa  senyawa  tersebut,  asam  kojat  memiliki efek inhibisi dan kestabilan paling besar dalam produk kosmetik,  namun  asam  kojat  bersifat  karsinogenik (Miyazawa  dan  Tamura  2007),  sehingga  diperlukan suatu  senyawa  yang  mampu  menghambat  aktivitas enzim tirosinase dan aman digunakan pada kulit.
Menurut  Wegiera et  al. (2012),  famili  Asteraceae memiliki  komponen  senyawa  bioaktif  dari  golongan polifenol,  seperti  flavonoid  dan  tanin,  serta  golongan terpena,  seperti  seskuiterpena,  lakton,  triterpena pentasiklik,  alkaloid,  saponin,  dan  sterol.  Senyawa bioaktif  yang  didapat  dari  ekstrak  famili  Asteraceae berupa senyawa polifenol, terpenoid, dan alkaloid yang berperan  sebagai  agen  depigmentasi  (Juwita et  al. 2011).  Oleh  sebab  itu  penelitian  ini  bertujuan  untuk menyeleksi  fraksi  teraktif  spesies  Asteraceae  sebagai inhibitor  tirosinase  dan  menduga  senyawa  aktif  yang berperan di dalamnya.

## METODE
Penelitian dimulai dengan preparasi 12 spesies famili Asteraceae ( Tabel 1 ). Bagian tumbuhan yang digunakan adalah herba atau bagian atas tanah. Sampel kemudian diekstraksi menggunakan air, lalu ekstrak air difraksinasi menggunakan  kloroform  hingga  didapat  fraksi  air  dan fraksi  kloroform.  Ekstrak  air,  fraksi  air,  dan  fraksi kloroform ke-12 spesies ditentukan aktivitas penghambatan  enzim  tirosinase.  Ekstrak/fraksi  yang paling aktif kemudian ditentukan kandungan metabolit sekundernya  secara  kualitatif  dan  semikuantitatif. Selanjutnya dugaan senyawa aktif ditentukan menggunakan  kromatografi-cair-spektrometri  massa (LC-MS/MS).

## Preparasi Sampel
Sebanyak  12  spesies  famili  Asteraceae  dibersihkan dan dikeringkan. Setelah kering, sampel digiling hingga menjadi  serbuk  dengan  ukuran  40  mesh.    Setelah  itu sampel siap digunakan untuk prosedur selanjutnya.

## Ekstraksi dan Fraksinasi Sampel
Ekstraksi  dilakukan  dengan  secara  maserasi menggunakan  pelarut  air  pada  suhu  50 ℃ .  Simplisia ditimbang,  lalu  dimasukkan  ke  dalam  Erlenmeyer  dan ditambahkan pelarut dengan nisbah 1:10 selama 24 jam. Ekstraksi  dilakukan  secara  triplo.  Ekstrak  disaring menggunakan  kertas  saring  Whatmann,  lalu  sebagian filtrat yang diperoleh difraksinasi menggunakan corong pisah dengan menggunakan pelarut kloroform. Setelah diperoleh  fraksi  air  dan  fraksi  kloroform,  kemudian dilakukan penguapan dengan rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak air, fraksi air dan fraksi kloroform.

## Tabel 1. Daftar nama 12 spesies Asteraceae yang digunakan pada penelitian ini
No Nama Latin Nama Lokal Indonesia Gambar Tumbuhan 1 Mikania micrantha Kunth Sembung rambat 2 Widelia trilobata L. Pruski Widelia 3 Chromalaena. Orodata Kirinyuh 4 Tithonia diversifolia Hemsl.) A. Gray Kipahit 5 Vernonia cinerea (L.) Less .
Sawi langit
6 Synedrella nodiflora L. Jotang kuda
No Nama Latin Nama Lokal Indonesia Gambar Tumbuhan 7 Adenostema Lavenia (L.) kunth  Legetan warak
8 Acmella  paniculata (Wall.ex DC.) R.K.
Jotang 9 Ageratum conyzoides (L.) L
Bandotan
10 Crassocephalum  crepidioides (Benth.) S. Moore Sintrong
11 Galinsoga parviflora (Cav.) Loseh 12 Eclipta alba Urang aring
Penentuan Aktivitas Penghambatan
Tirosinase (Batubara dan Adfa 2013)
Penentuan  aktivitas  inhibisi  tirosinase  terhadap ekstrak dan, fraksi, dan minyak atsiri sampel dilakukan ditentukan  dengan  menggunakan  L-DOPA  sebagai substrat dan asam kojat sebagai kontrol positif. Nilai IC 50 yaitu  konsentrasi  ekstrak  (mg/mL)  yang  mempu menghambat  aktivitas  enzim  tirosinase  sebesar  50% kemudian ditentukan.

## Uji fitokimia kualitatif (Harbone 1987)
Uji  alkaloid .  Sebanyak  0,05  g  ekstrak/fraksi  sampel terpilih dilarutkan dengan beberapa tetes NH 3 dan 5 mL CHCl 3 kemudian  disaring.  Filtratnya  dimasukkan  ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 1 mL H 2 SO 4 2 M dan  dikocok  hingga  terbentuk  dua  lapisan  terpisah. Lapisan atas atau lapisan asamnya dipisahkan ke dalam pelat  tetes.  Lapisan  tersebut  kemudian  diteteskan pereaksi Meyer,  Wagner, dan  Dragendoroff yang  akan menimbulkan  endapan  berwarna  berturut-turut  putih, coklat, dan merah jingga jika di dalam sampel terdapat alkaloid.
Uji triterpenoid/steroid . Sebanyak 0,05 g ekstrak/fraksi sampel  terpilih  dilarutkan  dengan  5  mL  etanol  panas kemudian  disaring  ke  dalam  tabung  reaksi.  Filtratnya diuapkan  hingga  kering  dan  ditambahkan  1  mL  dietil eter kemudian dipindahkan ke dalam pinggan porselin. Larutan  ditambahkan  1  tetes  H 2 SO 4 pekat  dan  1  tetes CH 3 COOH  anhidrat.  Warna  merah  atau  ungu menunjukkan adanya triterpenoid dalam sampel. Uji  flavonoid .  Sebanyak  0,05  g  ekstrak/fraksi  sampel terpilih  dilarutkan  dengan  5  mL  akuades  kemudian dididihkan  selama  5  menit  dan  disaring.  Filtrat  yang diperoleh  ditambahkan  serbuk  Mg,  1  mL  HCl,  1  mL etanol,  dan  1  mL  amil  alkohol.  Campuran  kemudian dikocok  kuat  selama  beberapa  menit.  Hasil  positif ditandai dengan munculnya warna merah, kuning, atau jingga pada lapisan amil alkohol.

## Penentuan  Kadar  Flavonoid  Total  Ekstrak/Fraksi Teraktif
Penentuan  kadar  flavonoid  total  dilakukan  sesuai dengan metode yang disampaikan dalam Budiarti et al (2019).  Total  flavonoid  dilaporkan  sebagai  gram kuersetin ekivalen /g sampel.
Penentuan senyawa aktif tumbuhan terbaik menggunakan LC-MS/MS
Ekstrak/fraksi  terpilih  dilarutkan  dengan  asetonitril, kemudian  disaring  menggunakan  milipore  filter  unit dengan  ukuran  0,54  µm.  Sebanyak  1  µL  filtrat  sampel diinjeksikan  ke  dalam  sistem  instrumen  LC-ESI-QTOF. Analisis  LC-MS/MS  dilakukan  dengan  UPLC-MS  yang dilengkapi dengan pompa biner. Kromatografi cair (LC) dihubungkan spektrometer massa Quadrupole Time-of- Flight  (QTOF)  dilengkapi  dengan  sumber  ionisasi Electrospray  Ionization  (ESI).  Spektrometri Massa  (MS) yang  digunakan,  yaitu  sistem  QTOF  dengan  mode ionisasi positif. Parameter ESI yang digunakan meliputi suhu kapiler 40 o C dan gas pengabut 1000 L/jam, sumber tegangan 2 kV. Modus full scan dari m/z 50-1200. Kolom UPLC  yang  digunakan  Acquity  UPLC  HSS  C-18  1.8  µm (2,1×150 mm). Eluen yang digunakan adalah H 2 O (A) dan asetonitril p.a (B). Eluen diatur pada laju aliran total 0.3 mL/menit. Sistem elusi dijalankan dengan gradien linier pelarut A dari 95% hingga 5% dari menit 0-2, menit ke 2- 8  elusi  gradien  linier  pelarut  A  dari  60%  hingga  40%, menit ke 8-10 elusi isokratik perbandingan 60:40, menit ke  10-11  elusi  isokratik  perbandingan  0:100,  menit  ke 11-13  elusi  gradient  linier  pelarut  A  dari  0%  hingga 100%,  menit  ke-16  elusi  isokratik  perbandingan  95:5, menit  ke-16  elusi  gradient  linier  pelarut  A  dari  95% hingga  5%.  Data  kromatogram  yang  dihasilkan dikonversi menjadi format NetCDF untuk mempermudah dalam mengolah data dengan MZmine. Pemrosesan data MZmine terdiri atas beberapa tahap, yaitu  membuat  kromatogram  sampel,  mengurangi noise,  identifikasi  berdasarkan  berat  molekul,  dan penyusunan data.

## Analisis data
Analisis statistika diperlukan untuk mengetahui ada atau tidaknya  perbedaan  yang  signifikan  dari  hasil  yang diperoleh pada 40 36 ekstrak/fraksi tumbuhan. Analisis statistika  dilakukan  menggunakan  program  SPSS  16.0 dengan  analisis  menggunakan  One  Way  ANOVA  dan dilanjutkan dengan analisis lanjutan berupa uji Duncan. Analisis  ini  membandingkan  aktivitas  setiap  sampel berupa  nilai  IC 50 dengan  menggunakan  selang kepercayaan 95%.

## HASIL & PEMBAHASAN Rendemen Ekstrak dan Fraksi
Ekstrak air kedua belas spesies Asteraceae memiliki bervariasi, yang paling besar pada ekstrak air bandotan ( A.  conyzoides ).  Setelah  difraksinasi  menggunakan kloroform  sebagian  senyawa  semipolar  akan  terlarut pada  fraksi  kloroform  dan  sisanya  masih  berada  pada fraksi air.  Rendemen fraksi air tiap ekstrak  ditemukan lebih  besar  dibandingkan  rendemen  fraksi  klorofrom. Hanya sekitar 10% dari ekstrak air yang dapat terlarut ke dalam klorofrom, bahkan beberapa rendemennya tidak mencapai 1% ( Tabel 2 ).

## Aktivitas Penghambatan Aktivitas Enzim Tirosinase
Pengujian  penghambatan  tirosinase  dilakukan menggunakan  spektrofotometri  menggunakan  enzim tirosinase yang diisolasi dari jamur dan L-DOPA sebagai substrat. Prinsip pengukuran yaitu enzim tirosinase akan mengatalisis pembentukan L -DOPA menjadi DOPAkuinon yang kemudian terbentuk dopakrom yang dapat  terukur  intensitasnya  pada  panjang  gelombang 492 nm (Miyazawa et al. 2006). Dalam proses alaminya, dopakuinon melalui serangkaian reaksi akan membentuk melanin yang memicu terjadinya pencoklatan  pada  kulit  (Likhitwitayawuid  2008).  Hasil skrining aktivitas 12 spesies Asteraceae sebagai inhibitor tirosinase disajikan pada Tabel 3 .
Tabel 2. Rendemen ekstrak air, fraksi air, dan fraksi kloroform dua belas spesies Asteraceae
No Nama Latin Rendemen (%) Ekstrak Air Fraksi Air Fraksi Kloroform 1 M. micrantha Kunth 14.91±1.55 11.04±1.50 1.64 ±0.24 2 W. trilobata L. Pruski 19.77±2.51 15.16 ±1.37 2.05 ±0.76 3 C. orodata 12.03±2.67 11.37±2.01 0.91±0.13 4 T. diversifolia Hemsl.) A. Gray 21.43±2.81 15.71±1.49 6,87 ± 6,61 5 V. cinerea (L.) Less . 18.41±1.66 15.22±1.58 2,69 ± 1,58 6 S. nodiflora L. 12.16±2.36 11.05 ±1.10 0.75 ±0.16 7 A. lavenia (L.) kunth 15.71±1.49 13.61±2.67 3.06 ±0.82 8 A. paniculata (Wall.ex DC.) R.K. 15.87±2.91 12.31±2.11 2.96±0.73 9 A. conyzoides (L.) L 34.18±4.75 27.93±1.26 0.89 ±0.04 10 C. crepidioides (Benth.) S. Moore 9.07±1.44 5.26±1.13 3.47±1.56 11 G. parviflora (Cav.) 14.06±2.73 13.30±2.50 2.11 ±0.65 12 E. alba 10.06±1.77 8.71±1.66 1.09±0.53
Tabel 3. Aktivitas inhibitor tirosinase (IC 50 ) ekstrak air, fraksi air, dan fraksi kloroform beberapa spesies Asteraceae
No Sampel IC 50 (μg ektrak kering/mL larutan) Ekstrak Air Fraksi Air Fraksi Kloroform 1 M. micrantha 589.65 ± 28.07 i 311.98 ± 5.34 b 372 ± 16.92 cd 2 W. trilobata 348.51 ± 9.97 bc 411.25 ± 9.06 def 319.24 ± 3.03 b 3 C. orodata 619.17 ± 24.35 ij 301.34 ± 7.89 b 308.70 ± 2.99 b 4 T. diversifolia 639.83 ± 26.08 j 143.03 ± 0.77 a 449.03 ± 12.46 fg 5 V. cinerea 761.33 ± 13.90 k 328.75 ± 4.31 b 380.35 ± 2.18 cd 6 S. nodiflora 735.52 ± 53.59 k 328.34 ± 22.61 b 314.48 ± 13.50 b 7 A. lavenia 869.19 ± 64.60 l 950.96 ± 65.28 m 430.23 ± 1.12e fg 8 A. paniculata 521.32 ± 14.95 h 514.23 ± 6.44 h 426.65 ± 6.97 efg 9 A. conyzoides 467.14 ± 11.63 g 623.47 ± 11.49 ij 327.32 ± 5.50 b 10 C. cripidioides 612.47 ± 12.65 ij 582.30 ± 9.80 i 395.52 ± 5.24 de 11 G. parviflora 764.93 ± 40.30 k 1139.45 ± 64.75 n 318.80 ± 4.32 b 12 E. alba 862.52 ± 40.90 l 604.46 ± 12.77 ij 320.18 ± 7.37 b Asam kojat (kontrol +) 66.79 ± 0.99
Keterangan: Huruf yang berbeda di belakang angka pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang signifikan pada α =0.05.
Penghambatan aktivitas enzim tirosinase ditunjukkan  dengan  nilai  IC 50 .  IC 50 merupakan  nilai konsentrasi  penghambatan  tirosinase  yang  dapat menghambat 50% aktivitas tirosinase (Rauf et al. 2019). Menurut  Miyazawa  dan  Tamura  (2007),  sampel tergolong aktif sebagai inhibitor tirosinase jika memiliki nilai  IC 50 <1000  µg/ml.  Nilai  IC 50 <100  µg/ml menunjukkan potensi penghambatan aktivitas tirosinase  yang  paling  kuat,  nilai  IC 50 100-450  µg/ml menunjukan  potensi  penghambatan  sedang,  dan  450- 700 µg/ml menunjukan potensi penghambatan aktivitas tirosinase sangat lemah. Asam kojat digunakan sebagai kontrol positif dalam penelitian ini. Asam kojat memiliki efek  inhibisi  terhadap  enzim  tirosinase  paling  besar (66,79  µg/ml)  diantara  seluruh  sampel.  Hasil  ini  juga didukung  oleh  penelitian  yang  dilakukan  Purnamasari dan Sagala (2020), dengan nilai IC 50 asam kojat sebesar 67,2 µg/ml.
Aktivitas penghambatan enzim tirosinase pada Tabel 3  menunjukkan,  bahwa  ekstrak  air  12  spesies Asteraceae  tergolong  lemah,  Hanya  ekstrak  air W. trilobata yang  tergolong  sedang.  Setelah  ekstrak  air dibagi menjadi fraksi air dan fraksi kloroform hasil yang berbeda  ditemukan.  Fraksi  air  yang  sudah  kehilangan sekelompok  senyawa  golongan  semipolarnya  sebagian besar  menjadi  lebih  aktif  dibandingkan  ekstrak  airnya. Sekitar 50% fraksi air memiliki aktivitas yang tergolong sedang dengan aktivitas tertinggi ditemukan pada fraksi air T.  diversifolia (IC 50 143  µg/ml).  Berbeda  dengan sebagian  besar  fraksi  air,  fraksi  air  A.  lavenia  dan G. parviflora lebih  kecil  dibandingkan  ekstrak  airnya, bahkan  fraksi  air G.  parviflora tidak  mampu menghambat 50% hingga konsentrasi 1000 µg/ml. Fraksi kloroform  yang  mengandung  senyawa  semipolar memiliki  aktivitas  tergolong  sedang  seluruhnya  (IC 50 308.7  µg/ml  -  449  µg/ml).  Hasil  uji  statistika menunjukkan bahwa dari keseluruhan sampel, fraksi air T.  diversifolia merupakan sampel  paling  aktif  ( α=0.05). Untuk itu, selanjutnya fraksi air T. diversifolia ditentukan dugaan senyawa aktifnya.
Tithonia  diversifolia di  Indonesia  dikenal  dengan nama  kipahit.  Secara  tradisional  tumbuhan  ini  telah banyak  dimanfaatkan  sebagai  pakan  ternak  (Susanti & marhaeniyanto  2016).  Sementara  daunnya  banyak dimanfaatkan  untuk  mengatasi  diabetes  terutama dilaporkan  dimanfaatkan  di  Yogyakarta,  Kalimantan Selatan,  ataupun  Kalimantan  Barat  (Amanatie  & Sulistypwati 2015; Anwar et al 2016, Meisia et al 2020).
Kandungan  senyawa  metabolit  sekunder  fraksi  air T. diversifolia secara kualitatif
Dugaan senyawa aktif pada  tumbuhan T. diversifolia dimulai dengan uji fitokimia kualitatif untuk mengetahui golongan  senyawa  metabolit  sekundernya.  Golongan metabolit  sekunder  yang  dipilih  adalah  alkaloid, flavonoid, dan terpenoid/steroid yang banyak dilaporkan  sebagai  penghambat  aktivitas  enzim tirosinase.  Hasil  uji  menunjukkan  bahwa  fraksi  air T. diversifolia mengandung flavonoid dan tidak mengandung  alkaloid,  terpenoid,  maupun  steroid.  Hal ini  sesuai  dengan  hasil  penelitian  yang  dilakukan  oleh Ahmed  dan  Samson  (2020).  Namun  berbeda  dengan yang  telah  dilaporkan  oleh  Yazid et  al. (2021)  yang menyatakan  bahwa T.  diversifolia juga  mengandung alkaloid yaitu trigonellin. Selain itu, Fauzi`ah dan Hajati (2020)  menyatakan  bahwa  tumbuhan  ini  banyak mengandung  senyawa  golongan  terpenoid  seperti, limonena, β pinena, α pinena,  trans  kariofilena, bisiklogermakrena, β felandrena, dan lainnya. Perbedaan  hasil  yang  diperoleh  pada  penelitian  ini dapat  disebabkan oleh  beberapa  faktor  seperti,  teknik ekstraksi dan pelarut yang digunakan, bagian tumbuhan yang  digunakan  dalam  ekstraksi,  usia  tumbuhan  yang digunakan,  dan  masih  banyak  faktor  lain  yang  dapat mempengaruhi hasil penelitian yang dilakukan.
Kandungan  senyawa  metabolit  sekunder  fraksi  air T. diversifolia secara semikuantitatif Berdasarkan kandungan flavonoid, ditentukan kadar total flavonoidnya. Hasilnya menunjukkan bahwakadar total  flavonoid  pada  ekstrak  air  sebesar 5,27  mg kuersetin ekuuivalen/g ekstrak kering dan pada fraksi air lebih kecil yaitu 3,57 mg kuersetin ekuivalen/g ekstrak kering. Fenolik maupun flavonoid memiliki cincin fenol dengan  adanya  substituen  hidroksil  yang  mampu menghambat  ROS,  mereduksi  ion  logam,  memodulasi fosforilasi protein yang berhubungan dengan penghambatan  aktivitas  enzim  dan  penghambatan perosidasi  lipid  (Karim et  al .  2014;  Hamamoto et  al. 2019). Golongan flavonoid yang diduga berperan dalam aktivitas  tersebut  adalah  flavonol  dan  turunannya (Chang 2009; Karim et al. 2014) . Hasil penelitian Yazid et al .  (2021),  menyatakan  bahwa  senyawa  golongan flavonol  yang  terdapat  pada T.  diversifolia adalah kaempferol.  Senyawa  flavonoid  lainnya  yaitu,  5- hydroksi-6,4'-dimetoksiflavon-7-O- β -D-glukopiranosida dan  5-O-metilvisamminol.  Mekanisme  penghambatan yang  terjadi  adalah  penghambatan  kompetitif  untuk oksidasi  L-DOPA  oleh  enzim  tirosinase  dan  bagian  3- hidroksi-4-keto  dari  struktur  flavonoid  yang  berperan
sebagai  pengelat  logam  tembaga  (Cu)  dari  struktur enzim  tirosinase.  Pada  umumnya  satu  molekul  enzim tirosinase mengandung dua atom Cu yaitu CuA dan CuB yang terikat dengan tiga asam amino histidin. Logam Cu berperan  sebagai  kofaktor  pada  aktivitas  enzim tirosinase.  Kemampuan  katalitik  enzim  tirosinase menjadi berkurang dengan hilangnya Cu dari situs aktif enzim,  sehingga  dopakrom  tidak  terbentuk  (Chang 2009).

## Dugaan senyawa aktif
Kromatogram  fraksi  air T.  diversifolia dapat  dilihat pada Gambar 1 . Terdapat 5 senyawa yang diduga dapat menjadi  kandidat  senyawa  bioaktif  dalam  aktivitas inhibitor tirosinase. Di antara kelima senyawa tersebut, trigonelline    dari  golongan  senyawa  alkaloid  (waktu retensi  1.70  menit)  memiliki  intensitas  paling  tinggi. Oleh  sebab  itu,  senyawa  ini  dipercaya  menjadi komponen  aktif  utama  yang  berperan  dalam  aktivitas penghambatan  tirosinase.  Terdapat  empat  puncak senyawa  lainnya  yang  perlu  diidentifikasi    yaitu  pada waktu retensi 1.61, 2.37, 3.10, dan 5.54 menit.
Mode  ionisasi  yang  digunakan  dalam  analisis tersebut  adalah  mode  positif  (ESI+),  yaitu  ionisasi dengan  penambahan  H + (prinsip  protonisasi)  sehingga ion  yang  teramati  berbentuk  [M-H + ].  Berdasarkan spektrum  massa  puncak  dengan  waktu  retensi  1.70 menit  diketahui,  senyawa  pada  puncak  ini  memiliki bobot  molekul  sebesar  137,04  m/z.  Pola  fragmentasi menunjukkan  senyawa  pada  waktu  retensi  ini merupakan  trigonelline.  Empat  puncak  lainnya
berdasarkan  pola  fragmentasi  massanya  diketahui memiliki  struktur  yang  mengandung  N  karena  bobot molekulnya  yang  bernilai  negative.  Dugaan  rumus molekulnya  adalah  C 10 H 19 NO 7 ,  C 19 H 31 NO 8 ,  C 20 H 31 NO 8 , dan C 20 H 29 NO 7 berturut-turut untuk waktu retensi 1.61, 2.37,  3.10,  dan  5.54  menit.  Walaupun  dugaan  rumus molekulnya telah diketahui namun, struktur senyawanya  belum  dapat  ditentukan  dan  perlu dianalisis  lebih  lanjut.  Di  dalam  analisis  kualitatif  tidak terdeteksi adanya alkaloid pada fraksi air, namun pada hasil  analisis  LC-MS/MS  ditemukan  alkaloid  dan turunannya. Hal ini dapat terjadi dimungkinkan karena perbedaan  limit  deteksi  pada  uji  kualitatif  dan  analisis menggunakan  LC-MS/MS.  Selain  senyawa  yang mengandung unsur N, beberapa puncak lainnya belum dapat  ditentukan  rumus  strukturnya  sehingga  perlu dianalisis lebih lanjut. Diduga golongan senyawa lainnya dapat berupa golongan flavonoid yang terdeteksi positif pada uji kualitatif.
Trigonellin  ( Gambar  2 )  sebagai  senyawa  dominan pada  penelitian  ini  belum  pernah  dilaporkan  sebagai inhibitor  tirosinase.  Namun  hasil  penelitian  yang dilakukan  oleh  Nazir et  al .  (2018),  menyatakan  bahwa trigonellin  merupakan  golongan  alkaloid  alami  dalam melindungi  fibroblas  kulit  manusia  dari  irradiasi  UV-B melalui pelemahan sel oksidatif, pemulihan homeostasis  kalsium  seluler  dan  pencegahan  stres retikulum  endoplasma  (ER).  Pada  penelitian  tersebut juga  disebutkan  bahwa  trigonellin  berpotensi  sebagai agen terapeutik / kosmetik dalam mencegah kerusakan foto  kulit  yang  ditandai  dengan  mengembalikan
pembentukan  kerutan,  warna  kulit,  kekeringan  dan peningkatan UPR yang dimediasi oleh ER-stres di Balb/C tikus yang terpapar UV-B.
Senyawa  alkaloid  lainnya  juga  telah  dilaporkan berperan  dalam  proses  penghambatan  tirosinase. Senyawa  alkaloid  sebagai  inhibitor  tirosinase  yang dilaporkan  umumnya  merupakan  senyawa  gabungan dari  terpenoid  dan  alkaloid.  Di  antara  senyawa gabungan  tersebut,  yaitu  alkaloid  oxindole  yang merupakan  senyawa  monoterpena  alkaloid  (Ahmad et al. 2010), alkaloid norditerpenoid tipe likoktonin seperti, lappakonitin dan puberanin (Shaheen et al. 2005). Selain itu,  dalam  beberapa  tahun  terakhir  beberapa  alkaloid aporfin seperti magnoflorin (Li dan Wang 2014) dan N- formilanonain telah diusulkan untuk digunakan sebagai agen  anti-pigmentasi  karena  sitotoksisitasnya  yang rendah  (Wang et  al. 2010).  Lebih  khusus  lagi,  boldin adalah  inhibitor  tirosinase  tipe  campuran  dengan  nilai IC 50 sekitar  6,52  mM,  mengikat  enzim  bebas  dan kompleksnya dengan L-DOPA (Si et al . 2013). Senyawa yang  terkait  secara  struktural  adalah  diasetilboldin, salah  satu  bahan  yang  dipatenkan  dari  Revitol Skin Brightener ,  sebuah  krim  pemutih  kulit  komersial  yang dilaporkan  menghambat  tirosinase  pada  tingkat ekspresi tanpa efek samping (Fuller et al . 2000).

## SIMPULAN
Dari  12  spesies  Asteraceae  yang  memiliki  aktivitas inhibitor  tyrosinase,  fraksi  air Tithonia  diversifolia merupakan  fraksi  teraktif.  Dugaan  senyawa  aktif  pada fraksi  air T.  diversifolia adalah  trigonellin,  beserta turunan alkaloid dan flavonoid lainnya. Perlu dilakukan identifikasi  terhadap  4  senyawa  yang  telah  diketahui rumus  molekulnya  dan  puncak  lainnya  yang  belum diketahui. Terhadap senyawa/isolat tersebut pun perlu dilakukan pengujian aktivitas inhibitor tirosinasenya.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Tim  peneliti  menyampaikan  terima  kasih  kepada Taofik  Ridwan,  SP,  MSI  yang  telah  membantu menyediakan  foto  tumbuhan  pada  penelitian  ini. Sebagian  penelitian  ini  didanai  oleh  the  bilateral exchange  program  Direktorat  Jenderal  Pendidikan Tinggi  RI  /Japan  society  for  the  promotion  of  science joint research project 2021 No 103/E4.4/KU/2021.

## DAFTAR PUSTAKA
Ahmad I, Ijaz F, Fatima I, Ahmad N, Chen S, Afza N, Malik A.  2010.  Xanthine  oxidase/tyrosinase  inhibiting, antioxidant,  and  antifungal  oxindole  alkaloids  from Isatis  costata . Pharmaceutical  Biology .  48(6):  716 – 721.
Doi:
https://doi.org/10.3109/13880200903271298. Ahmed SO, Samson B. 2020. Preliminary phytochemical screening  of  bioactive  chemicals  in  sunflower ( Tithonia diversifolia ) roots. International Journal on Human Computing Studies . 2(6): 12-18. ISSN: 2615- 8159.
Amanatie, Sulistyowati, E. 2015. Structure of the leaf of Tithonia diversifolia (Hemsl) Gray. Journal of Science and Mathematics, 23(4), 101-106. Issn. 0854-0675 Anwar, K., Ngindra, A. P.  L., Hariadi, R. E.  P., Kamalia, N., Santoso, H. B. 2016. Comparison of the effects of ethanol  extract,  n-butanol  fraction,  and  petroleum fraction  of  the  moonflowerleaf  ether  ( Tithonia diversifolia (Hemsley)  A.  Gray)  against  decreased blood  glucose  levels  of  aloksan-induced  males. Journal of Pharmascience , 3(2), 80-88.
http://dx.doi.org/10.20527/jps.v3i2.5742. Batubara I, Darusman LK, Mitsunaga T, Rahminiwati M, Djauhari  E.  2010.  Potency  of  medicinal  plants  as tyrosinase inhibitor and antioxidant agent. Biological Science Journal . 10(2): 138-144. Doi: http://dx.doi.org/10.3923/jbs.2010.138.144.
Gambar 2. Struktur kimia senyawa trigonellin
Batubara  I,  Adfa  M.  2013.  Potensi  daun  kayu  bawang ( Protium  javanicum )  sebagai  penghambat  kerja enzim tirosinase. Jurnal Sains dan Matematika . 1(2): 52 – 56. ISSN: 2302-7290.
Budiarti  E,  Batubara  I,  Ilmiawati  A.  2019.  Potensi beberapa  ekstrak  tumbuhan  Asteraceae  sebagai antioksidan  dan  antiglikasi. Jurnal  Jamu  Indonesia . 4(3): 103-111.
Chang  TS.  2009.  An  updated  review  of  tyrosinase inhibitors. International Journal Molecule Science. 10 (6): 2440-2475.
doi:org/10.3390/ijms10062440.
Fauzi`ah L, Hajati SN. 2020. Komposisi kimia penyusun minyak  atsiri  daun  insulin  ( Tithonia  diversifolia (Hamsley)  A.  Gray)  dari  Kalimantan  Selatan. Jurnal Sains  dan  Edukasi  Sains .  3(2):  32-37.  Doi: https://doi.org/10.24246/juses.v3i2p32-37.
Fuller  BB,  Drake  MA,  Spaulding  DT,  Chaudhry  F.  2000.
Downregulation  of  tyrosinase  activity  in  human melanocyte  cell  cultures  by  yohimbine. Journal  of Investigative  Dermatology .  114  (2):  268-276.  Doi: 10.1046/j.1523-1747.2000.00860.x.
Hamamoto A, Isogai R, Maeda M, Hayazaki M, Horiyama E,  Takashima  S,  Koketsu  M,  Takemori  H.  2019.  The High  Content  of  Ent-11-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en- 19-oic  Acid  in  Adenostemma  lavenia  (L.)  O.  Kuntze Leaf Extract: With Preliminary in Vivo Assays.
Food Journal . 9(73): 1-12. Doi: 10.3390/foods9010073.
Harbone  JB.  1987. Metode  Fitokimia  Penuntun  Cara Modern  Menganalisis  Tumbuhan Edisi  I.  Bandung (ID): Institut Teknologi Badung.
Haryanti  R,  Suwantika  A,  Abdassah  M.  2018.  Artikel ulasan:  Tinjauan  bahan  berbahaya  dalam  krim pencerah kulit. Jurnal Farmaka . 16(2): 214-224. Doi: https://doi.org/10.24198/jf.v16i2.16932.g8801. Juwita  NK,  Djajadisastra  J,  Azizahwati.  2011.  Uji penghambatan tirosinase dan stabilitas fisik sediaan krim pemutih yang mengandung ekstrak kulit batang nangka  ( Artocarpus  heterophyllus ). Majalah  Ilmu Kefarmasian. 8(2):  127-164.  ISSN:  1693  9883.  Doi: http://dx.doi.org/10.7454/psr.v8i2.3477.
Juwita  NK,  Djajadisastra  J,  Azizahwati.  2013.  Uji penghambatan tirosinase dan stabilitas fisik sediaan krim pemutih yang mengandung ekstrak kulit batang nangka  ( Artocarpus  heterophyllus ). Majalah  Ilmu Kefarmasian. 8(2):  57 – 124.  ISSN:  1693  9883.  Doi: http://dx.doi.org/10.7454/psr.v8i2.3477.
Karim AA, Azlan A, Ismail A, Hashim P, Gani SSA, Zainudin BH,  Abdullah  NA.  2014.  Phenolic  composition, antioxidant,  anti-wrinkles  and  tyrosinase  inhibitory
activities of cocoa pod extract. BMC Complemantary and  Alternative  Medicine .  14(381):  1-13.  Doi: https://doi.org/10.1186/1472-6882-14-381. Likhitwitayawuid  K.  2008.  Stilbenes  with  tyrosinase inhibitory activity. Current Science . 94(1): 44 – 52. Doi: https://www.jstor.org/stable/24102028.
Li C, Wang M-H. 2014. Potential biological activities of magnoflorine: A compound from Aristolochia debilis Sieb . et Zucc. Kor J Plant Resour . 27(3): 223-228. ISSN: 2287-8203.
Meisia,  L.,  Rafdinal,  Ifadatin,  S.  2020.  Utilization  of medicinal  plants  by  malay  people  in  Sungai  Daun Village, Selakau District, Sambas Regency. Journal of Protobiont , 9(1), 7-16.
Miyazawa,  Mitsuo,  Tamura  N.  2006.  Inhibitory compound of tyrosinase activity from the sprout of Polygonum hydropiper L. Biological and Pharmaceutical  Bulletin .  30(3):  595-597.  Doi: https://doi.org/10.1248/bpb.30.595.
Miyazawa,  Tamura.  2007.  Inhibitory  compound  of tyrosinase  activity  from  the  sprout  of polygonum hydropiper L. (Benitade).
Biological and Pharmaceutical  Bulletin .  30(3):  595-597.  Doi: https://doi.org/10.1248/bpb.30.595.
Nazir LA, Tanveer MA, Shahid NH, Sharma RR, Tasduq S. 2018.  Trigonelline,  a  naturally  occurring  alkaloidal agent  protects  ultraviolet-B  (UV-B)  -irradiation  - induced  apoptotic  cell  death  in  human  skin fibroblasts  via  attenuation  of  oxidative  stress, restoration  of  cellular  calcium  homeostasis  and prevention  of  endoplasmic  reticulum  (ER)  stress. Journal of Photochemistry & Photobiology. 1-29. Doi: https://doi.org/ 10.1016/j.jphotobiol.2019.111720. Purnamasari  DR,  Sagala  Z.  2020.  Uji  aktivitas  inhibitor enzim  tirosinase  ekstrak  etanol  daun  Bidara  Arab ( Ziziphus  spina-christi L.)  secara  in  vitro. Іndоnеѕіа Nаturаl  Rеѕеаrсh  Рhаrmасеutісаl  Jоurnаl. 5(1):  35- 44.
Rauf A, Ningsi S, Nurdin H. 2019. Potensi penghambatan tirosinase  ekstrak  etanol  daun  tomat  ( Lycopersicon esculentum Mill, var. Pyriforme Alef). Jurnal Farmasi . 7(1): 1-7. Doi: https://doi.org/10.24252/jurfar.v7i1.10018.
Shaheen  F,  Ahmad  M,  Khan  MTH,  Jalil  S,  Ejaz  A,
Sultankhodjaev  MN,  Arfan  M,  Choudhary  MI, Rahman  A.  2005.  Alkaloids  of Aconitum  laeve and their  anti-inflamatory,  antioxidant,  and  tyrosinase inhibition  activities. Phytochemistry .  66:  935 – 940. Doi: 10.1016/j.phytochem.2005.02.010.
Si YX, Ji S, Wang W, Fang NY, Jin QX, Park YD, Qian GY,
Lee  J,  Han  HY,  Yin  SJ.  2013.  Effects  of  boldine  on
tyrosinase:  Inhibition  kinetics  and  computational simulation. Process  Biochem. 48(1):  152-161.  Doi: http://dx.doi.org/10.1016/j.procbio.2012.11.001. Susanti, S. Marhaeniyanto E. 2016. The proportion of the use of different types of plant leaves for goat animal feed  at  different  locations  and  heights  in  Malang Raya area. Journal of Animal Sciences , 26(3), 42-52. http://dx.doi.org/10.21776/ub.jiip.2016.026.03.07. Wang HM, Chen CY, Chen CY, Ho ML, Chou YT, Chang HC,
Lee  CH,  Wang  CZ,  Chu  IM.  2010.  (-)-N- Formylanonaine  from Michelia  alba as  a  human tyrosinase  inhibitor  and  antioxidant. Bioorg  Med Chem. 18(14): 5241-5247. Doi:
10.1016/j.bmc.2010.05.045.
Wegiera M, Smolarz HD, Jedruch M, Korczak M, Kopron K.  2012.  Cytotoxic  effect  of  some  medicinal  plants from Asteraceae family on J-45.01 leukemic cell line – pilot  study. Polish  Pharmaceutical  Society .  69(2): 263 – 268. ISSN: 0001-6837.
Yazid F, Salim SO, Rahmadika FD, Rosmalena R, Artanti N,  Sundowo  A,  Prasasty  VD.  2021.  Antidiabetic effevts of Tithonia diversifolia and Malus domestica leaf extracts in alloxan-induced sprague dawley rats. Systematic Review s in Pharmacy . 12(1): 1630-1638.