BioEksakta: Jurnal Ilmiah Biologi Unsoed Volume 4 Nomor 1 (2022):  9-13 E-ISSN: 2714-8564

## Induksi Kalus Nepenthes mirabilis (Lour.) Druce Menggunakan NAA dan TDZ
Nina Nurussakinah, Murni Dwiati * , Iman Budisantoso
Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman Jalan dr. Suparno 63 Purwokerto 53122 *Email : murni.dwiati@unsoed.ac.id
Rekam Jejak Artikel:
Diterima  : 23/05/2021 Disetujui  : 22/06/2022 Abstract Nepenthes sp. has a characteristic in the form of a modified leaf tip into a pitcher. Nepenthes mirabilis (Lour.)  Druce  in  its  original  habitat  is  widely  hunted  for  sale.  Propagation  of N. mirabilis in nature has very little success rate, to overcome this it is necessary to propagate it by means of in vitro culture and use young leaf explants to form callus. Growth regulators such as Auxins (NAA) and Cytokinins (TDZ) can stimulate callus growth. Auxins can stimulate callus formation by stimulating cell expansion and cytokinins can stimulate the cell division process. The purpose of this study was to determine the effect of NAA and TDZ in inducing N. mirabilis callus and to determine the interaction between NAA and TDZ in inducing N. mirabilis callus. The experimental design used was a factorial CRD pattern, with two factors, namely NAA and TDZ. NAA consists of four levels, namely, 0 mg / L (N0); 0.5 mg / L (N1), 1 mg / L (N2) and 1.5 mg / L (N3). TDZ also consists of four levels, namely 0 mg / L (T0); 1 mg / L (T1); 2 mg / L (T2) and 3 mg / L (T3). Each treatment was repeated three times. The results showed that the addition  of  NAA  and  TDZ  had  an  effect  on  callus  induction  of N.  mirabilis .  The  TDZ concentration of 1 mg / L (T1) stimulated callus induction, especially the percentage of callus formation and callus diameter. Meanwhile, NAA 1 mg / L (N2) boosted the percentage of N. mirabilis callus formation. Key Words : Callus, NAA, Nepenthes mirabilis , and TDZ

## Abstrak
Nepenthes sp.  memiliki  ciri  khas  berupa ujung  daun  mengalami modifikasi  menjadi  kantong. Nepenthes  mirabilis (Lour.)  Druce  di  habitat  aslinya  banyak  diburu  untuk  diperjualbelikan. Perbanyakan N.  mirabilis di  alam  sangat  kecil  tingkat  keberhasilannya,  untuk  mengatasi  hal tersebut perlu dilakukan perbanyakan dengan cara kultur in vitro dan menggunakan eksplan daun muda  untuk  membentuk  kalus.  Zat  pengatur  tumbuh  seperti  Auksin  (NAA).  Sitokinin  (TDZ) dapat  memacu  pertumbuhan  kalus.  Auksin  dapat  merangsang  pembentukan  kalus  dengan memacu  pembentangan  sel  dan  sitokinin  dapat  memacu  proses  pembelahan  sel.  Tujuan penelitian ini untuk mengetahui pengaruh NAA dan TDZ dalam menginduksi kalus N. mirabilis dan  mengetahui  Interaksi  antara  NAA  dan  TDZ  dalam  menginduksi  kalus N.  mirabilis . Rancangan  percobaan  yang  digunakan  adalah  RAL  pola  Faktorial,  dengan  dua  faktor,  yaitu NAA dan TDZ. NAA terdiri atas empat taraf yakni, 0 mg/L (N0); 0,5 mg/L (N1), 1 mg/L (N2) dan 1,5 mg/L (N3). TDZ juga terdiri atas empat taraf yakni 0 mg/L (T0); 1 mg/L (T1); 2 mg/L (T2)  dan  3  mg/L  (T3). Masing-masing  perlakuan diulang  sebanyak  tiga kali.  Hasil penelitian menunjukkan  bahwa  penambahan  NAA  dan  TDZ  berpengaruh  terhadap  induksi  kalus N. mirabilis . Tidak terdapat interaksi antara NAA dan TDZ dalam menginduksi kalus. Konsentasi TDZ 1 mg/L (T1) memacu  induksi kalus khususnya persentase pembentukan kalus dan diameter kalus. Sementara itu, NAA 1 mg/L (N2) memacu  persentase pembentukan kalus N. mirabilis . Kata kunci : Kalus, NAA, Nepenthes mirabilis , dan TDZ

## PENDAHULUAN
Populasi Nepenthes sp.  di  habitat  aslinya diperkirakan  semakin  sedikit  yang  disebabkan  oleh kebakaran hutan, alih fungsi lahan hutan dan semak belukar  menjadi  kawasan  pemukiman,  perladangan, perkebunan, pertanian, ataupun pertambangan. Oleh karena  itu,  Pemerintah  menetapkan Nepenthes
sebagai  salah  satu  spesies  yang  harus  dilindungi (Mardhiana et al ., 2012).
Nepenthes  mirabilis (Lour.) Druce  adalah tanaman dioecious yang  bernilai  ekonomi  tinggi karena  keunikannya. Nepenthes  mirabilis dihabitat aslinya  banyak  diburu  untuk  diperjualbelikan (Chaveerach et al ., 2006). Perbanyakan N. mirabilis lebih  banyak  dilakukan  dengan  stek  batang  karena memiliki  pertumbuhan  tunas  daun  yang  lebih  cepat
dibandingkan Nepenthes yang  lain  (Mansur,  2013). Namun perbanyakan dengan metode ini  mengalami kendala  pada  lamanya  waktu,  adanya  keragaman individu  akibat  segregasi  dan  terbatasnya  jumlah buku (Dinarti et al., 2014).  Salah satu alternatif yang dapat digunakan adalah perbanyakan dengan kultur in vitro.
Kultur in  vitro adalah  metode  mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, jaringan dan  organ,  serta  menumbuhkannya  dalam  kondisi aseptik,  sehingga  bagian  tanaman  tersebut  bisa memperbanyak  diri  dan  beregenerasi  menjadi tanaman lengkap (Rosmaina & Aryani, 2015).
Kultur  kalus  adalah  salah  satu  teknik  kultur in vitro yang  banyak  digunakan  untuk  menghasilkan bibit  tanaman  bebas  penyakit.  Kultur  kalus merupakan  tahap  awal  dalam  proses  perkembangan embriogenesis somatik. Salah satu kunci keberhasilan menggunakan  teknik  kultur in  vitro  N.  mirabilis adalah penggunaan zat pengatur tumbuh.
Zat  pengatur  tumbuh  (ZPT)  yang  digunakan yaitu  auksin  (NAA)  dan  sitokinin  (TDZ).  NAA adalah  ZPT  yang  dapat  merangsang  pembentukan kalus dan memacu pembentangan sel. TDZ adalah zat pengatur  tumbuh  yang  dapat  memacu  proses pembelahan  sel,  pembentukan  organ  dan  memacu faktor  multiplikasi  tunas  dengan  bantuan  auksin (Munggarani et  al .,  2018) . Penggunaan  konsentrasi zat pengatur tumbuh NAA dan TDZ yang tepat yang diberikan  di  dalam  media  pertumbuhan  dapat menstimulasi  eksplan  dalam  membentuk  kalus (Ariani et  al .,  2016).  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui  Pengaruh  dan  interaksi  NAA  dan  TDZ dalam menginduksi kalus N. Mirabilis .

## MATERI DAN METODE
Objek  penelitian  yang  digunakan  dalam penelitian  ini  adalah  daun  planlet N.  mirabilis yang berumur 1,5 tahun yang ditanam pada media ½ MS padat.  Penelitian  dilaksanakan  di  Laboratorium Fisiologi  Tumbuhan  Fakultas  Biologi  Universitas Jenderal  Soedirman  pada  bulan  November  2020 hingga  Januari  2021.  Penelitian  dilakukan  secara eksperimental menggunakan Rancangan Acak Lengkap  (RAL)  pola  Faktorial,  dengan  dua  faktor yaitu NAA dan  TDZ. NAA terdiri atas  empat   taraf yakni, 0 mg/L (N0); 0,5 mg/L (N1), 1 mg/L (N2) dan 1,5 mg/L (N3). Sementara itu, TDZ yang digunakan terdiri  atas  empat  taraf  yakni  0  mg/L  (T0);  1  mg/L (T1); 2 mg/L (T2) dan 3 mg/L (T3). Masing-masing perlakuan diulang sebanyak tiga kali.
Setiap  perlakuan  dibutuhkan  90  mL  untuk  3 cawan petri sehingga total media yang dibuat adalah 1440  mL.  Komposisi  Media  ½  MS  (Murashige  and Skoog 1962), dibuat dengan cara mencampur 72 mL larutan stok A (hara makro); 1,44 mL larutan stok B (hara mikro); 1,44 mL larutan stok C (iodin); 0,72 mL larutan  stok  D  (vitamin);  1,44  mL  larutan  stok  E
(bufer),  dan  28,8  g  sukrosa  dicampur  dan dihomogenkan.  Selanjutnya  ditambahkan  akuades hingga mencapai volume 800 mL dihomogenkan dan dituangkan ke dalam 16 Beaker glass masing-masing sebesar 50 mL. Setelah itu,  ditambahkan NAA dan TDZ  sesuai  perlakuan  dan  ditambahkan  akuades hingga  mencapai  volume  85  mL.  Setelah  homogen pH larutan diukur,  pH media yang digunakan adalah 5,2  (ditambahkan  NaOH  untuk  menaikkan  pH  dan HCl  untuk  menurunkan  pH).  Larutan  media ditambahkan akuades hingga 90 mL dan 0,72 g  agar. Larutan media dipindahkan ke tabung erlenmeyer dan ditutup dengan alumunium foil dan diberi label sesuai dengan  perlakuan.  Selanjutnya,  media  disterilisasi menggunakan  autoklaf  dengan  suhu  121°C  dan tekanan 2 atm selama 20 menit. Setelah media suam- suam kuku, media dituang ke dalam cawan petri steril yang  telah  dipersiapkan  sebelumnya.  Cawan  petri ditutup menggunakan wrap

## Penanaman Eksplan
Penanaman  eksplan dilakukan  di  dalam  LAF yang telah disterilkan dengan sinar UV selama 2 jam. Daun planlet N. mirabilis dipotong dengan ukuran 0,5 cm X 0,5 cm menggunakan skalpel di dalam cawan petri steril yang dialasi dengan kertas saring. Eksplan ditanam  pada  cawan  petri  steril  yang  telah  berisi media ½ MS padat sesuai dengan perlakuan. Eksplan diinkubasi di dalam  rak gelap yaitu  rak yang tidak terkena cahaya pada suhu 20-25°C.

## Pengamatan Eksplan.
Pengamatan  eksplan  dilakukan  setiap  hari setelah penanaman eksplan. Parameter yang diamati adalah waktu inisiasi kalus (hari), persentase eksplan yang tumbuh menjadi kalus (%) , diameter (mm) dan ketebalan kalus (mm).

## Analisis Data
Data  yang  diperoleh  dianalisis  menggunakan analisis ragam (Uji F) dengan taraf uji 0,05 dan 0,01. Uji  lanjut  menggunakan  BNT  pada  taraf  uji  0,05 dilakukan  untuk  parameter  persentase  kalus  yang terbentuk dan diameter kalus.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  analisis  ragam  pengaruh  NAA  dan  TDZ terhadap  waktu  inisiasi  pembentukan  kalus N. mirabilis menunjukkan bahwa interaksi antara NAA dan  TDZ  tidak  berpengaruh  nyata,  demikian  pula untuk perlakuan NAA dan TDZ secara mandiri tidak berpengaruh nyata. Berdasarkan pengamatan, waktu tercepat inisiasi kalus eksplan N. mirabilis adalah 14 hari  setelah  tanam  (hst).  Kombinasi  auksin  dan sitokinin  yang  terdapat  di  dalam  media  dan  tipe jaringan  yang  digunakan  dapat  mempengaruhi kecepatan pembentukan kalus (Mastuti et al ., 2020). Kalus yang terbentuk dari eksplan daun planlet N. mirabilis adalah kalus proliferatif yaitu kalus yang
Gambar 1. Kalus Daun N. mirabilis berumur 35 hari A. Kalus prolifertif pada perlakuan N0T3, B. Kalus senesen pada perlakuan N0T1 .
Gambar 2. Letak Kemunculan Kalus pada Daun N. mirabilis berumur  35 hari.: A. Kalus yang muncul diujung tulang daun pada perlakuan N2T1, B. Kalus yang muncul ditepi daun pada perlakuan N2T2
aktif  membelah  (proliferasi)  namun  tidak  dapat tumbuh  menjadi  embrio  (Gambar  1a).  Kalus proliferatif  dicirikan  oleh  morfologi  kalus  terlihat bening,  berdinding  tipis  dan  berbutir-butir.  Kalus yang  terbentuk  tidak  berkembang  ke  tahap selanjutnya,  bahkan  dalam  perkembangannya  kalus ini  mengalami senesens (Gambar 1b).
Kalus N.  mirabilis terbentuk  pada  dua  tempat yaitu  daerah  tepi  daun  dan  ujung  tulang  daun  yang mengalami bekas potong. Kalus yang terbentuk pada ujung tulang daun memiliki diameter dan tebal kalus yang  lebih  besar  dibandingkan  dengan  kalus  yang terbentuk di daerah tepi daun (Gambar 2). Kecepatan tumbuh  kalus  pada  eksplan  yang  beragam  diduga karena kemampuan eksplan dalam menyerap hara dan kemampuan sel melakukan pembelahan yang berbeda pada  setiap  eksplan.  Setiap  sel  memiliki  kepekaan yang berbeda terhadap ZPT sehingga kecepatan waktu pembelahan sel menjadi tidak sama karena siklus sel yang berbeda-beda (Saptiani et al ., 2020).
Hasil  analisis  ragam  pengaruh  penambahan NAA dan TDZ pada media tanam terhadap persentase kalus yang terbentuk menunjukkan tidak ada interaksi antara NAA dan TDZ. Sementara itu, pengaruh  NAA dan TDZ secara mandiri berpengaruh nyata terhadap persentase kalus yang terbentuk.
Berdasarkan  hasil  uji  BNT  pengaruh  NAA terhadap, persentase kalus yang terbentuk (Tabel 1). Perlakuan  terbaik  terjadi  pada  perlakuan  N3  yaitu media  yang  diperkaya  dengan  NAA  1,5  mg/L. Persentase  pembentukan  kalus  pada  perlakuan  N3 mengalami kenaikan sebesar 42,7% jika dibandingkan dengan perlakuan kontrol  (N0). Antara Perlakuan NAA 1 mg/L (N2) dan 1,5 mg/L (N3) tidak signifikan.  Artinya,  perlakuan  N2  adalah  perlakuan yang efektif dan efisien. Sementara itu,  berdasarkan uji  BNT  pengaruh  TDZ  terhadap  persentase  kalus yang  terbentuk  ternyata  persentase  kalus  terbaik terjadi  pada perlakuan  T2  (2 mg/L)  dan  T1  (TDZ 1 mg/L).  Konsentrasi  TDZ  efisien  dicapai  pada perlakuan  T1  (Tabel  2).  Persentase  kalus  yang terbentuk  pada   perlakuan T1  mengalami  kenaikan
Tabel 1. Pengaruh  Penambahan  NAA  terhadap Persentase  Kalus  yang  Terbentuk  pada  Eksplan N. mirabilis
Perlakuan Persentase pembentukan kalus N0 2,158 ab N1 1,994 a N2 2,799 bc N3 3,079 c
Keterangan  :  Angka  yang  diikuti  huruf  yang  sama  tidak berbeda nyata pada taraf uji  0,05
A B B A
Tabel 2. Pengaruh  Penambahan  TDZ  terhadap Persentase  Kalus  yang  Terbentuk  pada  Eksplan N.
mirabilis Perlakuan Persentase pembentukan kalus T0 1,799 a T1 2,868 bc T2 2,980 bc T3 2,383 ab
Keterangan  :  Angka  yang  diikuti  huruf  yang  sama  tidak berbeda nyata pada taraf uji. 0,05
sebesar  59,4%  jika  dibandingkan  dengan  persentase kalus  yang  terbentuk  pada  perlakuan  kontrol  (T0). Pemberian  TDZ  dengan  konsentasi  rendah  terbukti lebih efisien dalam menginduksi pembentukan kalus. Tariq et  al (2014),  menunjukkan  bahwa  terdapat interaksi  antara  NAA  dan  TDZ  terhadap  persentase kalus yang terbentuk pada Artemisia absinthium Hasil  analisis  ragam  pengaruh  aplikasi  NAA dan TDZ  menunjukkan bahwa  interaksi antara NAA dan  TDZ  serta  NAA  secara  mandiri  tidak berpengaruh  nyata.  Namun,  pemberian  TDZ  secara mandiri  berpengaruh terhadap diameter kalus. Hasil uji BNT pengaruh perlakuan TDZ terhadap diameter kalus (Tabel 3) menunjukkan bahwa perlakuan T2 (2 mg/L) dan T1 (TDZ 1 mg/L) adalah konsentrasi yang paling efektif menghasilkan diameter  kalus terbesar. Sementara itu, T1 adalah perlakuan yang efektif dan efisien  dalam  memacu  diameter  kalus.  Diameter kalus perlakuan T1 mengalami kenaikan sebesar 20,8 %  jika  dibandingkan  dengan  diameter  kalus  pada tanaman  kontrol  (T0).  Hoesen et  al (2008), menyatakan bahwa konsentrasi TDZ dalam konsentrasi  rendah  dapat  meningkatkan  ukuran diameter kalus pada kultur Dendrobium lineale Rolfe. Soonthornkalump et  al. (2019)  mengungkapkan bahwa  TDZ  dapat  berperan  sebagai  penghambat enzim sitokinin oksidase, yang merangsang akumulasi sitokinin berbasis purin endogen di dalam jaringan.
Tabel  3. Pengaruh  Penambahan  TDZ  terhadap Diameter  Kalus  yang  Terbentuk  pada  Eksplan N.
mirabilis Perlakuan Diameter Kalus T0 0,809 a T1 0,977 bc T2 0,997 bc T3 0,965 b
Keterangan  :  Angka  yang  diikuti  huruf  yang  sama  tidak berbeda nyata pada taraf uji. 0,05
Hasil  analisis  ragam  pengaruh  aplikasi  NAA dan TDZ terhadap tebal kalus N.mirabilis menunjukkan bahwa interaksi antara NAA dan TDZ serta  NAA  dan  TDZ  secara  mandiri  tidak
berpengaruh terhadap rata-rata tebal kalus N.mirabilis . Restanto et al (2018) menyatakan bahwa lebih baik  mengkombinasikan  TDZ  dengan  konsentrasi yang  lebih  tinggi  dibanding  konsentrasi  NAA. Pengaruh  konsentrasi  ZPT  terhadap  pertumbuhan akan  meningkat  sampai  pertumbuhan  mencapai optimal  kemudian  akan  mengalami  penurunan pertumbuhan  ketika  konsentrasi  yang  digunakan lebih tinggi dari konsentrasi optimal.

## SIMPULAN
Penambahan  NAA  dan  TDZ  terhadap  induksi kalus N. mirabilis tidak terdapat interaksi antara NAA dan  TDZ . Konsentasi  TDZ  1  mg/L  (T1)  memacu induksi    kalus  khususnya  persentase  pembentukan kalus dan diameter kalus.  NAA 1 mg/L (N2) memacu persentase pembentukan kalus N. mirabilis .

## Ucapan Terimakasih
Penulis  mengucapkan  terimakasih  kepada proyek  penelitian  Terapan  Unggulan  Unsoed  tahun 2019 atas dukungan dana yang telah diberikan.

## DAFTAR REFERENSI
Ariani,  R.,  Anggraito,  Y.U.  &  Rahayu,  E.S.,  2016. Respon  Pembentukan  Kalus  Koro  Benguk ( Mucuna pruriens L.) Pada Berbagai Konsentrasi  2,4-D  dan  BAP. Jurnal  MIPA , 39(1), pp. 20-28.
Chaveerach,  A.,  Tanomtong,  A.,  Sudmoon,  R.  & Tanee,  T.,  2006.  Genetic  Diversity  Among Geographically  Separated  Populations  of Nepenthes mirabilis . Biologia , 61(3), pp. 295– 298.
Dinarti, D., Sayekti, U. & Alitalia, Y., 2014. Kultur
Jaringan Kantong Semar ( Nepenthes mirabilis ). Jurnal  Hortikultura  Indonesia , 1(2), pp. 59-65.
Hayati, S.K. & Nurchayati, Y., 2010. Induksi Kalus dari  Hipokotil  Alfalfa  ( Medicago  sativa ) secara  in  vitro  dengan  Penambahan  Benzyl Amino  Purine  (BAP)  dan  Naphtalene  Acetic Acid  (NAA)  Abstrak  eksplan. Bioma ,  12(1), pp. 6–12.
Hoesen, D.S.H., Witjaksono & Sukamto, L.A., 2008.
Callus Induction and Organogenesis of in vitro Culture Dendrobium  lineale Rolfe. Berita Biologi , 9(3), pp. 333–341.
Mansur,  M.,  2013.  Tinjauan  tentang Nepenthes (Nepenthaceae)  di  Indonesia. Berita  Biologi , 12(1), pp. 1–7.
Mardhiana, Parto, Y., Hayati, R. & Priadi, D.P., 2012. Karakteristik  dan  Kemelimpahan Nepenthes
di  Habitat  Miskin  Unsur  Hara. Jurnal  Lahan Suboptimal , 1(1), pp. 50–56.
Mastuti,  R.,  Widoretno,  W.  &  Harijati,  N.,  2020. Kultur  Kalus  Tanaman  Obat  Ciplukan ( Physalis  angulata L.). Journal  of  Tropical Biology , 8(1), pp. 26-35.
Munggarani,  M.,  Suminar,  E.,  Nuraini,  A.  & Mubarok,  S.,  2018.  Multiplikasi  Tunas Meriklon  Kentang  pada  Berbagai  Jenis  dan Konsentrasi  Sitokinin. Agrologia ,  7(2).  pp. 80-89.
Restanto,  D.P.,  Kriswanto,  B.,  Khizim,  M.N.  &
Soeparjono,  S.,  2018.  Kajian  Thidiazuron (TDZ) dalam Induksi PLB Anggrek Phalaenopsis sp  secara  In  Vitro. Agritrop: Jurnal  Ilmu-Ilmu  Pertanian ,  16(1),  pp.  176- 185.
Rosmaina, R. & Aryani, D., 2015. Optimasi NAA dan BAP Terhadap Pertumbuhan dan Perkembangan Tunas Mikro Tanaman Kantong Semar ( Nepenthes mirabilis ) Secara
In Vitro. Jurnal Agroteknologi , 5(2), pp. 29- 36.
Saptiani, E., Rahmi, H. & Muharam, (2020). Induksi Kalus  Dari  Eksplan  Daun  Tanaman  Kawista ( Limonia acidissima L.) Secara In Vitro pada Media  MS  dengan  Penambahan  Beberapa Konsentrasi  Air  Kelapa  ( Cocos  nucifera L.). Jurnal Agrotek Indonesia , 2(5), pp. 1–45.
Soonthornkalump,  S.,  Nakkanong,  K.  &  Meesawat,
U., 2019. In Vitro Cloning Via Direct Somatic
Embryogenesis And Genetic Stability Assessment Of Paphiopedilum niveum (Rchb.F.)  Stein:  The  Endangered  Venus’s Slipper  Orchid. In  Vitro  Cellular  and Developmental Biology-Plant , 55(3), pp. 265– 276.
Tariq,  U.,  Ali,  M.  &  Abbasi,  B.H.,  2014. Morphogenic  and  Biochemical  Variations Under  Different  Spectral  Lights  in  Callus Cultures  of Artemisia  absinthium L .  Journal of Photochemistry and Photobiology: Biology , 130, pp. 264–271.