Journal of Vocational Health Studies
www.e-journal.unair.ac.id/index.php/JVHS

## PRIMARY SLX TEST USING REAL-TIME PCR BASED ON HIGH RESOLUTION MELTING (HRM) ON MICROFILARIA EXAMINATION

## UJI PRIMER SLX MENGGUNAKAN REAL-TIME PCR BERBASIS HIGH RESOLUTI ON MELTING (HRM) PADA PEMERIKSAAN MIKROFILARIA
Bagus Muhammad Ihsan *   , Cecep Dani Sucipto , Khayan Khayan
Jurusan Teknologi Laboratorium Medis, Poltekkes Kemenkes Banten , Banten-Indonesia.

## A B S T R A C T
Background: Filariasis patients can be a source of transmission if their blood still contains microfilariae. One of the Polymerase Chain Reaction (PCR) methods used is High Resolution Melting (HRM), using primary specificity testing. Purpose: To test the specificity of SLX primer. The samples used for this test were isolates of Salmonella., Klebsiella, Pseudomonas, negative and positive controls for Brugia malayi and Wuchereria bancrofti. Method: The design in this study is a quasi-experiment by testing the specificity of SLX primer using HRMbased real-time PCR based on the Cycle Threshold (CT) value observed through the amplification curve. Result: The real-time PCR results showed that no CT was released in the bacterial samples, and there was a CT value in the positive control. The results of this study indicate that specific SLX primer can be used in identifying microfilariae. Conclusion: SLX primer have a reasonable specificity because they cannot detect the existence of microorganisms in the samples other than microfilariae.

## A B S T R A K
Latar belakang: Penderita filariasis dapat menjadi sumber penular filariasis bila masih mengandung mikrofilaria dalam darahnya. Salah satu metode Polymerase Chain Reaction (PCR) yang dapat digunakan adalah High Resolution Melting (HRM), dengan cara pengujian spesifitas primer yang digunakan. Tujuan: Untuk menguji spesifitas primer SLX. Sampel yang digunakan untuk uji ini adalah isolate bakteri Salmonella, Klebsiella, Pseudomonas, Enterobacter clocae ,kontrol negatif dan positif Brugia malayi dan Wuchereria bancrofti . Metode: Desain dalam penelitian ini adalah eksperimental Laboratorium dengan menguji spesifitas dari primer SLX menggunakan real-time PCR berbasis HRM berdasarkan pengamatan nilai Cycle Threshold (CT) melalui kurva amplifikasi. Hasil: Pada hasil real-time PCR didapat bahwa tidak keluarnya nilai CT pada sampel bakteri dan terdapat nilai CT pada kontrol positif. Hasil penelitian ini menunjukan bahwa primer  SLX spesifik dapat digunakan dalam mengidentifikasi mikrofilaria. Kesimpulan: Primer SLX memiliki spesifitas yang baik karena tidak dapat membaca sampel mikroorganisme lain selain mikrofilaria.
Research Report Penelitian

## A R T I C L E   I N F O
Received 20 May 2020 Revised 28 June 2021 Accepted 15 July2021 Online 31 July 2021
Correspondence : Bagus Muhammad Ihsan E-mail : bagusfillah@gmail.com
Keywords: Mikrofilaria, Real-time PCR, Spesifitas, Primer SLX
Kata kunci: Mikrofilaria, Real-time PCR, Spesifitas, Primer SLX
Journal of Vocational Health Studies p-ISSN: 2580–7161; e-ISSN: 2580–717x DOI: 10.20473/jvhs.V5.I1.2021. 26-30 Copyright © Journal of Vocational Health Studies. Open access under Creative Commons Attribution-Non Commercial-Share A like 4.0 International Licence (CC-BY-NC-SA)
Bagus Muhammad Ihsan et al . | Journal of Vocational Health Studies 05 (2021): 26-30 27

## PENDAHULUAN
Filariasis adalah penyakit menular yang disebabkan oleh infeksi cacing Filaria sp. yang ditularkan melalui gigitan berbagai jenis nyamuk antara lain nyamuk Mansonia sp., Anopheles sp., Culex sp. dan Armigeres sp. Filariasis di Indonesia disebabkan oleh 3 spesies cacing Filaria sp. yakni Wuchereria bancrofti, Brugia malayi dan Brugia timori . Dari ketiga spesies ini B. malayi mempunyai penyebaran paling luas di Indonesia sedangkan W. Bancroftit terdapat di pulau Jawa, Bali, NTB dan Papua (Kementrian Kesehatan RI, 2016). Menurut Santoso dan Suryaningtyas (2015), penyakit filariasis dapat menyerang semua golongan tanpa melihat usia dan jenis kelamin.
Pada tahun 2002-2015, penderita kasus filariasis mengalami kenaikan yaitu 6.571-13.032 penderita (Kementrian Kesehatan RI, 2016). Meskipun filariasis bukan penyebab pertama kematian manusia, tetapi penyakit ini dapat membuat penderita menjadi cacat atau cacat permanen (Thanchomnang et al ., 2013). Pada kesepakatan global di tahun 2020 ( The Global Goal of Elimination of Lymphatic Filariasis as a Public Healthproblem by The Year 2020), World Health Organization menetapkan untuk mengeliminasi filariasis. Salah satu strategi eliminasi filariasis bukan hanya pada pemberian obat secara berkala namun harus juga memperkuat surveilens, jejaring laboratorium dan mengembangkan penelitian terkait filariasis (Kementrian Kesehatan RI, 2016).
Di Indonesia, kondisi penderita filariasis hanya ditemukan saat penyaringan awal yang dilakukan oleh petugas puskesmas dengan melihat kondisi fisik seperti kaki yang membengkak, demam saat malam hari dan belum pernah ditemukannya mikrofilaria menggunakan teknik mikroskopis. Dari hal tersebut, untuk menentukan apakah pasien benar terkena filariasis atau tidak, maka masih diperlukan adanya uji lanjutan setelah dilakukan tes mikroskopis. Dengan demikian, perlu pengembangan metode baru untuk diagnosis dalam mengidentifikasi dan mengkonfirmasi pemeriksaan mikrofilaria dan spesiesnya.
Identifikasi mikrofilaria yang sedang banyak dikembangkan yaitu menggunakan pelacak DNA dengan primer yang spesifik menggunakan metode Polymerase Chain Reaction (PCR). Di Negara Thailand, B. malayi, B. pahangi dan D. immitis pada sampel darah dapat diidentifikasi dengan High Resolution Melting (HRM) berbasis PCR real-time . Pada penelitian terdahulu, pemeriksaan PCR dengan HRM menggunakan primer spesifik yaitu SLX-F (5’GGAATCCCAGGTGTTGTAGACAT3’) dan SLX-R (5’GGGCTGAAACATTCAATTACCTC 3’), dirancang dari gen B. Malayi 5S rRNA dan urutan SL1 (aksesi GenBank no D87037) yang memiliki kepekaan yang baik dalam mendeteksi DNA filariasis (Thanchomnang et al ., 2013). Menurut Aris et al ., (2013), pemilihan primer yang tepat sangat mempengaruhi kualitas deteksi molekuler berbasis PCR.
Terdapat komponen pengujian yang sangat penting dioptimalkan yakni pada tahap annealing untuk menentukan seberapa optimal primer menempel pada template DNA dengan uji spesifitas primer dan reagen (Siswanto et al., 2019).

## MATERIAL DAN METODE
Desain penelitian ini adalah eksperimental laboratorium dengan menguji spesifitas dari primer SLX menggunakan real-time PCR berbasis HRM berdasarkan pengamatan nilai Cycle Threshold (CT) melalui kurva amplifikasi. Populasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah primer SLX sedangkan sampel dalam penelitian ini adalah kontrol positif, negatif dan hasil ekstraksi bakteri Salmonella, Klebsiella, Pseudomonas, Enterobacter clocae yang telah diekstraksi mengunakan DNA Purification dari PROMEGA.

## • Isolasi DNA bakteri
Isolasi DNA bakteri sesuai dengan protokol dari PROMEGA. Terlebih dahulu ditambahkan 300 μl sampel ke dalam tabung mikrosentrifuge dan 900μl lysis solution cell . Kemudian diaduk lalu homogenkan. Selanjutnya, inkubasi selama 10 menit pada temperatur kamar, disentrifugasi selama 3 menit dengan kecepatan 15.000 rpm. Lalu supernatant dibuang kemudian vortex pelletnya. Nuclei lysis solution ditambahkan dalam tabung untuk kemudian ditambahkan protein precipitation solution dan vortex selama 20 detik. Disentrifugasi selama 3 menit dengan kecepatan 15.000 rpm. Supernatan dipindahkan ke tabung yang baru berisikan isopropanol,  lalu ditambahkan isopropanol 300 μl. Campurkan dicentrifuge dengan kecepatan 15.000 rpm selama 1 menit. Supernatan dibuang kemudian dicampurkan 70% etanol sebanyak 300 μl, sentrifugasi dengan kecepatan 15.000 rpm selama 1 menit. Selama 15 menit, tabung tube dimiringkan pada tisu. Kemudian ditambahkan DNA rehydration solution sebanyak 100 μl, kemudian diinkubasi pada waterbath selama 1 jam dengan suhu 65 0 C.
• Real-time PCR
Proses selanjutnya dilakukan pemeriksaan real- time PCR berbasis HRM. Master mix PCR untuk HRM berisi 2x SensiFAST HRM mix 10 μL,10 μL Forward Primer 0.8 μL, 10 μL Reverse Primer 0,8 μL, H 2 O 16 μL. Sampel hasil ekstraksi bakteri (4 μL) ditambahkan ke dalam tabung berisi master mix tersebut. Sehingga total yang digunakan sebanyak 20 μL. Begitu juga dengan kontrol positif dan negatif. Kemudian tube PCR ditutup dengan penutupnya, kemudian dimasukkan ke dalam alat PCREsco Health Care . Pada siklus PCR untuk memperoleh kurva HRM harus dijalankan pada kondisi siklus pra- inkubasi 2 menit pada suhu 95 °C, 40 siklus 95˚C selama 5 detik (denaturasi), 60-65˚C selama 10 detik (annealing), dan 72˚C selama 5-20 detik (extension). Setelah reaksi selesai, dilakukan melting curve analisis. (Bioline, 2020).
Bagus Muhammad Ihsan et al . | Journal of Vocational Health Studies 05 (2021): 26-30
Pada  metode  ini,  secara  umum  konsentrasi  DNA yang  diperoleh  telah  mencukupi  untuk  digunakan dalam kegiatan  PCR.  Hal  ini  sesuai  rekomendasi KapaBiosystem  yakni  berkisar  antara  10-100  ng/µl (Biosystems, 2017)
Tahapan berikutnya pada penelitian ini adalah uji spesifitas yang bertujuan menguji kelayakan reagen dan primer yang digunakan untuk membaca DNA yang telah diekstraksi seperti bakteri Salmonella, Klebsiella, Pseudomonas, Enterobacter clocae dan kontrol negatif NTC ( Negative Temperature Coefficient ), kontrol positif B.malayi dan W. bancrofti .

## HASIL
Pada pemeriksaan PCR, terlebih dahulu mengekstraksi sampel yang didapatkan dengan menggunakan kit Wizard®Genomic DNA Purification dari PROMEGA. Dari hasil ekstraksi DNA bakteri kemudian dilakukan kuantifikasi dengan menggunakan nanodrop. Hasil kuantifikasi DNA hasil Isolasi DNA bakteri disajikan pada Tabel 1.
Hasil isolasi DNA menggunakan uji kuantifikasi dengan spektrofotometer nanodrop, DNA bakteri yang  diekstraksi  memiliki  kisaran  konsentrasi  dari 31.9 ng/µl pada sampel 2 hingga 58.9 ng/µl sampel 1.
Tabel 1. Rendemen pengeringan Sampel Konsentrasi DNA (ng/µL) Kemurnian DNA (260 / 280) Sampel 1 Salmonella 58.9 2.4 Sampel 2 Klebsiella 31.9 1.8 Sampel 3 Pseudomonas 32.3 2.0 Sampel 4 Enterobacter clocae
51.1 2.1 B A D C
Bagus Muhammad Ihsan et al . | Journal of Vocational Health Studies 05 (2021): 26-30
29
Hasil diatas menunjukkan bahwa reagen dan primer yang digunakan tidak dapat membaca DNA dari berbagai jenis bakteri. Hal tersebut dikarenakan hasil melting curve menunjukan garis lurus seperti hasil dari kontrol negatif yang diartikan sebagai hasil negatif kemudian menunjukan hasil positif pada pemeriksaan kontrol positif B. malayi dan W. bancrofti dengan hasil melting curve 78.40 C dan 80.50 C. Dari hasil yang didapatkan maka dapat disimpulkan bahwa primer dan reagen yang digunakan spesifik hanya untuk membaca DNA filariasis B. malayi dan W. bancrofti.

## PEMBAHASAN
Berdasarkan hasil pengukuran nanodrop pada Tabel 1, menunjukkan bahwa nilai kemurnian DNA A260/A280 4 pada hasil isolasi bakteri berkisar dari 1,8 hingga 2.4. DNA yang memiliki nilai perbandingan A260/A280 kurang dari 1.8 menunjukkan memiliki tingkat kontaminan oleh fenol atau senyawa lain yang ikut terbawa selama proses isolasi DNA berlangsung, sedangkan hasil kemurnian DNA yang memiliki nilai perbandingan lebih 2.0 tidak menunjukkan adanya kontaminasi (Scientific, 2011).
Hasil pengukuran nanodrop ini pun diperkuat oleh penelitian Dayati tahun 2019, yang menunjukan bahwa hasil kemurnian menggunakan kit Wizard®Genomic DNA Purification dari PROMEGA menunjukkan tingkat kemurnian yang paling tinggi dari ketiga metode ekstraksi DNA yang diuji coba yaitu 1.83 (Dayanti et al ., 2019). Tingginya nilai kemurnian DNA merupakan hasil ekstraksi dengan kit isolasi  DNA.
Untuk menghasilkan DNA murni, terdapat proses presipitasi dan pencucian yang berperan penting. Pada kit isloasi DNA, sebanyak tiga kali dilakukan proses presipitasi dan pencucian dengan penambahan isopropanol, protein precipitation solution dan etanol 70%. Hal tersebut dilakukan agar isolat DNA yang dihasilkan pada kit lebih murni serta dapat membuat perubahan struktur molekul DNA yang menyebabkan
terpresipitasi dari larutan dan senyawa debris. (Nurhayati and Darmawati, 2017).
Hasil penelitian pada Gambar 1, yakni uji spesifitas ini sama dengan penelitian (Rao et al ., 2006) yang menguji spesifitas alat dan reagen menggunakan berbagai macam mikroorganisme dengan tujuan ingin melihat apakah primer yang digunakan dapat membaca mikroorganisme lain selain mikrofilaria. Apabila dapat membaca selain mikrofilaria maka dapat dikatakan primer yang digunakan tidak spesifik (Rao et al ., 2006). Menurut penelitian (Siswanto et al ., 2019) menyatakan bahwa tahap uji spesifitas primer dan reagen adalah penting karena dapat menghindari dari resiko terjadinya hasil negatif  palsu. Identifikasi mikrofilaria B. malayi dan W. bancrofti dapat menggunakan SLX.

## KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian, maka dapat disimpulkan bahwa primer SLX yang akan digunakan memiliki spesifitas yang baik karena tidak dapat membaca sampel mikroorganisme lain selain mikrofilaria. Terbukti dengan uji spesifitas yang dilakukan spesifik membaca sampel yang mengandung mikrofilaria saja.
Rekomendasi dari penelitian ini adalah bahwa primer SLX sudah dapat digunakan untuk mengidentifikasi mikrofilaria dan dilanjutkan pada tahap berikutnya menggunakan sampel darah manusia yang terinfeksi oleh mikrofilaria.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih kepada PPM POLTEKKES KEMENKES BANTEN yang telah mendanai penelitian ini melalui Riset Penelitian Pemula dan semua pihak yang membantu dalam proses pengerjaan penelitian ini. Penulis menyatakan tidak ada konflik kepentingan dengan pihak yang terkait dalam penelitian ini.

## G
Keterangan: (A) Hasil uji spesifitas reagen dan primer menggunakan DNA bakteri Salmonella , (B) Klebsiella , (c) Pseudomonas , (d) Enterobacter clocae , (e) kontrol negatif NTC, (f) kontrol positif B. malayi dan (g) kontrol positif W.bacrofti. Gambar 1. Hasil uji spesifitas
Bagus Muhammad Ihsan et al . | Journal of Vocational Health Studies 05 (2021): 26-30

## DAFTAR PUSTAKA
Aris, M., Sukenda, S., Harris, E., Sukadi, M.F., 2013. Molecular Identification of Pathogenic Bacteria and PCR Specific Primer Design. e-Journal Budid. Perair. 1, 43–50.
Biosystems, K., 2017. KAPA2G Fast HotStart PCR Kit. v2.17.
Dayanti, F.G., Djuminar, A., Dermawan, A., Tantan, A., 2019. Perbandingan Nilai Pengukuran Kuantitatif Hasil Ekstraksi DNA Salmonella Typhi Menggunakan Metode Boiling, Naoh, Kit Komersial. J. Ris. Ris. Kesehat. POLTEKKES DEPKES BANDUNG 11, 350–357.
Kementrian Kesehatan RI, 2016. Situasi Filariasis di Indonesia Tahun 2015, Oktober Bu. ed. Pusat Data Informasi Kementerian Kesehatan RI, Jakarta.
Nurhayati, B., Darmawati, S., 2017. Biologi Sel dan Molekuler: Bahan Ajar Teknologi Labotarium Medis, 1st ed. Indo.Kemkes.BPPSDM, Jakarta.
Rao, R.U., Weil, G.J., Fischer, K., Supali, T., Fischer, P., 2006.
Detection of Brugia Parasite DNA in Human Blood by Real-Time PCR. J. Clin. Microbiol. 44, 3887–3893.
Santoso, S., Suryaningtyas, N.H., 2015. Spesies Mikrofilaria pada Penderita Kronis Filariasis secara Mikroskopis dan Polymerase Chain Reaction (PCR) di Kabupaten Tanjung Jabung Timur. Media Penelit. dan Pengemb. Kesehat. 25, 249–256.
Scientific, T., 2011. Assessment of Nucleic Acid Purity, T042 Technical Bulletin, NanoDrop Spectrophotometers. Wilmington, DE, USA Thermo Fish. Sci.
Siswanto, Y.P., Merdekawati, F., Ernawati, E., Hardiana, A.T., Kurniawan, E., 2019. Optimasi Suhu Annealing dan Konsentrasi Primer Untuk Deteksi Brugia Malayi Menggunakan Real-Time PCR. J. Ris. Kesehat. Poltekkes Depkes Bandung 11, 314–321.
Thanchomnang, T., Intapan, P.M., Tantrawatpan, C., Lulitanond, V., Chungpivat, S., Taweethavonsawat, P., Kaewkong, W., Sanpool, O., Janwan, P., Choochote, W., Maleewong, W., 2013. Rapid Detection and Identification of Wuchereria bancrofti, Brugia malayi, B. pahangi, and Dirofilaria immitis in Mosquito Vectors and Blood Samples by High Resolution Melting Real-Time PCR. Korean J. Parasitol. 51, 645–650.