Pengaruh Ekstrak Etanol Daun Kelor ( Moringa Oleifera Lam.) Terhadap Apoptosis Sel Granulosa Pada Mencit ( Mus Musculus ) Model Endometriosis
Yusri Dwi Lestari 1 , Hendy Hendarto 2 , Widjiati 3
1 Mahasiswa Magister Ilmu Kesehatan Reproduksi, Fakultas Kedokteran, Universitas Airlangga Surabaya
2 Departemen Obstetri dan Ginekologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Airlangga,
RSUD Dr. Soetomo
3 Departemen Embriologi Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga e-mail : ucchie.ay@gmail.com

## ABSTRAK
Endometriosis  adalah  suatu  kondisi  inflamasi  kronis  dan  terdapat  jaringan endometrium  yang    tumbuh  diluar  kavum  uteri.  Jaringan  endometrium  ini  berkaitan dengan  nyeri  kronis,  radang  panggul,  dan  infertilitas  yang  sering  diderita  perempuan usia  reproduksi.  Apoptosis  sel  granulosa  yang  meningkat  pada  endometriosis menyebabkan  folikel  tidak  dapat  berkembang  menjadi  folikel  de  graf  sehingga menyebabkan  infertilitas.  Daun  kelor  mengandung  flavonoid  yang  dapat  menghambat NFkβ kemudian menghambat apoptosis melalui jalur TNF-α. Tujuan dari penelitian ini untuk  membuktikan  apoptosis  sel  granulosa  pada  mencit  model  endometriosis  yang diberi  ekstrak  etanol  daun  kelor  lebih  rendah  dari  pada  yang  tidak  diberi.  Jenis penelitian ini true eksperimental dengan desain randomized post test only kontrol group design.  Sampel  24  mencit  betina  yang  dibagi  2  kelompok  terdiri  kelompok  kontrol  dan kelompok  perlakuan.  Kelompok  kontrol  dan  perlakuan  dijadikan  endometriosis  selama 14  hari,  kemudian  14  hari  berikutnya    kelompok  kontrol  diberi  plasebo  (Na-CMC)  dan kelompok  perlakuan  yang  diterapi  dengan  ekstrak  etanol  daun  kelor  selama  14  hari dengan  dosis  0,35  mg/gBB.  Hari  ke  29  mencit  di  terminasi  dengan  dislokasio  os cervikalis  dan  diambil  organ  ovarium  untuk  dilakukan  pemeriksaan  imunohistokimia. Hasil penelitian di uji menggunakan U Mann Whitney didapatkan nilai signifikan 0,001, p<0,005.  Kesimpulan  dari  penelitian  ini  adalah  pemberian  ekstrak  etanol  daun  kelor dapat menekan jumlah apoptosis sel granulosa pada mencit model endometriosis.
Kata kunci : endometriosis, sel granulosa, daun kelor

## ABSTRACT
Endometriosis  is  a  chronic  inflammation  condition  with  the  presence  of endometrial  tissue  outside  of  cavum  uteri.  This  endometrial  tissue  is  related  to  the chronic  pain,  pelvic  inflammatory  disease,  as  well  as  infertility  mostly  in  reproductive aged woman. Increased apoptosis of granulosa cells in endometriosis causes follicles to develop  into  de-graf  folikel  causing  infertility.  Moringa  oleifera  leaf  has  a  flavonoid compound that affects the attenuation of NFkB and prevention of  the apoptosis through TNF-a  pathway.  The  aim  of  this  study  was  to  assess  the  effect  of  ethanol  extract  from Moringa  oleiferaleaf  to  granulosa  cell  apoptosis  in  the  endometriosis  mice  model.  The design  of  this  study  is  a  true  experimental  with  the  randomized  post  test  only  control group design. Twenty four mice were divided into 2 groups, 1 control group and 1 treated group.  For  the  first  14  days,  each  group  were  treated  to  be  endometriosis,  in  the subsequent  14  days,  the  control  group  was  treated  with  placebo  (Na-CMC)  and  the treated group was administered by ethanol extract from  Moringa oleifera leaf in a dose dependent  manner  of    0,35  mg/g  BB.  The  29th  day  of  the  mice  was  terminated  with  a cervical  dislocation os  and  an  ovarian  organ  was  taken  for  immunohistochemistry.  The results of the test using U Mann Whitney obtained significant value 0.001, p <0.005. The conclusion of this research is giving of leaf kelur ethanol extract can suppress the amount of granulosa cell apoptosis in mice of endometriosis model.
Keywords :, Endometriosis, Granulosa, Moringa oleifera

## PENDAHULUAN
Endometriosis  merupakan  penyakit yang  menyebabkan  rasa  sakit,  dan kemudian dapat menyebabkan peradangan  pada  panggul,  adhesi,  nyeri kronis,  dan  infertilitas,  dan  dapat berkembang menjadi ganas sebesar 31%
(Lee et al ., 2015).
Tiga teori untuk menjelaskan penyebab endometriosis yaitu : Transplantasi ektopik jaringan endometrium oleh menstruasi retrograde atau oleh aliran limfatik dari rahim ke ovarium. Transformasi
(metaplasia)  dari  epitel  coelomic  ke dalam  jaringan  endometrium,  dan  aktor biokimia endogen dapat menginduksi sel peritoneal  yang  tidak  berdiferensiasi berkembang menjadi jaringan endometrium.  Endometriosis  ditemukan pada  70  -  90%  wanita  dengan  gejala nyeri  panggul  (Wang et  al .,  2014).
Gejala  khas  meliputi  nyeri  pelvis, dismenore,  dan  infertilitas  (Kennedy et al ., 2005 ).
Mekanisme  terjadinya  apoptosis dapat  terjadi  melalui  enzimatik  jika dilihat  dari  aktifitas caspase .  Apoptosis dapat  terjadi  melalui  FAST ligand (FAST-L).  Sel  T  sitotoksik  dan  NK  sel untuk  membunuh  sel  target  dapat dengan menggunakan sitotoksin. Sitotoksin  ini  mengandung  bahan  yaitu perforin  dan granzym ,  dengan  adanya perforin maka membrane sel target akan mengalami  proliferasi,  melalui  lubang tersebut akan diinjeksikan granzym yang kemudian  akan  mengaktifasi caspase secara  bertahap. Caspase yang  aktif akan mengaktivasi DNAse yang akhirnya  akan  merusak  DNA  (Goldsby et al , 2000). Adanya  peningkatan  apoptosis  pada penderita dengan endometriosis menyebabkan jumlah folikel
berkembang  dan  oosit  matang  menjadi lebih sedikit (Hendarto, 2012). Pengobatan yang dapat dilakukan  untuk  endometriosis  meliputi kontrasepsi  oral  kombinasi ,  gestrinone, medroxyprogesterone acetate , dan
agonis  gonadotropin  releasing  hormone (aGnRHs). Penggunaan obat-obatan hormonal,  selain  tingkat  keberhasilan yang  tinggi  dapat  pula  menyebabkan berbagai  macam  efek  samping  dan komplikasi (Kennedy et al ., 2005).
Apoptosis adalah program kematian  sel  melaui  mekanisme  gen. Apoptosis  dapat  terjadi  secara  fisiologis maupun secara patologis.
Sinyal  kematian  mengaktifkan  Bcl-2 pro-apoptosis  (Bid  dan  Bax)  sehingga menyebabkan Cytochrome C keluar dari mitokondria. Cytochrome  C berikatan dengan  Apaf-1  yang  terikat  pada caspase 9 , yang kemudian mengaktifkan caspase  3 dan  menyebabkan  kematian sel  (Hussein et  al .,  2003). Caspase meliputi caspase inisiator  (8  dan  9)  dan caspase efektor  (3,  6  dan  7).  Aktifasi dari caspase mampu  membelah  enzim dan protein yang penting untuk kelangsungan hidup sel. Komplek apoptosome merupakan kompleks multi- protein  yang  terdiri  dari cytochrom  c ,
Apaf-1, caspase-9 dan ATP. Pembentukannya dimulai dengan pelepasan sitokrom  c dari  mitokondria ke  dalam  sitosol  dimana  ia  mengikat Apaf-1,  kemudian  mengikat caspase  9 , yang kemudian  menyebabkan caspase 3 mengalami auto activation untuk terjadinya
apoptosis.
Caspase-3
kemudian  membelah  substrat  targetnya untuk  mempengaruhi  perubahan  yang terkait dengan apoptosis (Hussein et al ., 2003).
Sel  granulosa  merupakan  sel somatik  yang  berkaitan  erat  dengan folikulogenesis.  Sel  granulosa  berfungsi
© (2018) Sekolah Pascasarjana Universitas Airlangga, Indonesia
memproduksi growth  factor dan  steroid yang  berinteraksi  dengan  oosit  selama perkembangan folikel di ovarium.
kejadian  apoptosis  pada  sel  granulosa memainkan  peran  penting  dalam  proses atresia folikel. (Inoue et al ., 2011).
Daun  kelor  ( Moringa  oleifera
Lam.)  adalah  salah  satu  tanaman tanaman  berkhasiat  obat.  Daun  kelor berpotensi  meningkatkan  status  gizi, serta dapat mencegah dan menyembuhkan berbagai penyakit (Krisnadi, 2015). Daun kelor mengandung  mineral,  asam  amino essensial,  antioksidan seperti  vitamin  C,
vitamin  E,  flavonoid,  tanin,  dan  masih banyak  lainnya.  Salah  satu  yang  paling menonjol  dari  kandungan  daun  kelor adalah quercetine dan chaempherol
yang  merupakan  grup  flavonoid  tinggi. Flavonoid  ini  yang  berfungsi  sebagai anti inflamasi yang mampu menghambat Nfkβ  yang  merupakan  suatu  penanda adanya reaksi inflamasi pada endometriosis (Anjani et al ., 2016).

## BAHAN DAN METODE
Penelitian ini menggunakan jenis  penelitian true  eksperimental dan rancangan yang digunakan adalah
randomized post test only control group design. Populasi  penelitian  ini  adalah
mencit  ( Mus  musculus )  galur  Balb/c
betina. Sampel yang digunakan sebanyak  24  ekor  yang  terbagi  dalam  2 kelompok. Kriteria inklusi dalam penelitian  ini  adalah  mencit  ( Mus
musculus )  sehat,  berat  badan  20-25 gram,  tidak  cacat,  bulu  bersih  dan  tidak rontok,  tidak  luka,  sebelumnya  tidak pernah digunakan untuk penelitian.
Penelitian ini menggunakan bahan berupa organ ovarium dari mencit model endometriosis, ekstrak daun kelor yang  dibuat  di  UPT  Materia  Medica Batu Malang, jaringan endometrium dari
pasien  dengan  tumor  jinak  uterus, siklosporin  A  ( sandimmun ), water  fluid injection ,  Na  CMC, ethynil  estradiol , apoptek  kit, phosphate  buffered  saline (PBS).
Pembuatan mencit model
endometriosis  dimulai  dari:  mencit diadaptasi  selama  1  minggu,  kemudian mencit  disuntik  siklosporin  A  10 mg/kgBB  IM  pada  paha  tikus  pada  hari ke 1. Jaringan endometrium disimpan di PBS,  di washing 2x  dan  di sentrifuse 2500rpm, supernatant dibuang, ditambah
PBS  dan  penicillin  200IU/ml  dan streptomycin  200µg/ml.  Menggunakan spuit  3ml  untuk  mengambil  jaringan basah endometrium.
Penyuntikan jaringan  endometrium  dilakukan  secara intra  peritoneal sebanyak  0,1ml/mencit. Penyuntikan  estrogen  ( ethynil  estradiol ) secara IM pada femur pada hari 1 dan 5 sebanyak 0,1 ml menggunakan spuit 1cc di  paha  mencit.  Kemudian  mencit dilakukan  perawatan  dengan  pemberian makan  dan  minum  seperti  biasa  sampai hari  ke  14  mencit  telah  menjadi  model endometriosis.
Daun  kelor  melalui  proses ekstraksi menggunakan metode maserasi dengan  pelarut  etanol  96%.  Daun  kelor yang  digunakan  didapatkan  pohon  kelor dengan usia pohon yang sama (3 tahun) dan  dari  kebun  yang  sama.  Daun  kelor digrinder  hingga  berbentuk  bubuk, dimasukkan  ke  dalam Erlenmeyer , kemudian  ditambahkan  etanol  96%, dilarutkan  dengan  dikocok  selama  2-3 jam. Selanjutnya, ditutup dengan
alumunium foil .
Setelah  dilakukan  penyaringan dan  didapatkan  filtratnya  kemudian diuapkan  untuk  memisahkan  ekstrak dengan pelarutnya dengan rotary evaporator sampai  didapatkan  hasil ekstrak  daun  kelor  yang  bebas  dari etanol (pelarut).
Perhitungan dosis ekstrak berdasarkan penelitian sebelumnya yaitu penelitian  yang  dilakukan  pada  tikus dengan  dosis  sebesar  250  mg  /kg  BB. Dosis  tersebut  dikonversi  ke  dosis
mencit berdasarkan tabel konversi Kusumawati  (2004),  kemudian  melalui proses perhitungan dan didapatkan dosis sebesar 0,35 mg/g BB. Ekstrak
disuspensi  menggunakan  larutan  Na CMC  0,5%  agar  larut  dalam  air  dan diberikan  peroral  menggunakan  sonde lambung.  Terapi  dengan  ekstrak  etanol daun  kelor  diberikan  sebelum  mencit diberi  makan  di  pagi  hari  agar  seluruh ekstrak  dapat  diabsorbsi  oleh  mencit, terapi ini dilakukan selama 14 hari.
Penelitian  ini  dilakukan  di kandang  hewan  coba  dan  Laboratorium Patologi  Veteriner  Fakultas  Kedokteran Hewan  Universitas  Airlangga  pada bulan  Maret  2018  sampai  dengan  bulan Mei 2018.
Pada hari ke 29 mencit dikorbankan  dengan  cara dislokasi  os cervikalis , kemudian dilakukan pembedahan untuk mengambil ovariumnya.  Setelah  selesai,  mencit kemudian dikuburkan.

## HASIL DAN DISKUSI
Jumlah  apoptosis  sel  granulosa diukur  dengan  imunohistokimia . Data dari    setiap  sampel  dinilai  secara semikuantitatif  menggunakan  metode Remmele  yang  sudah  dimodifikasi
(Novak et  al .,  2007),  dimana  Indeks skala Remmele ( Immuno Reactive
Score /IRS)  merupakan  hasil  perkalian antara skor persentase sel immunoreaktif dengan  skor  intensitas  warna  pada  sel immunoreaktif. Kemudian hasilnya dilakukan analisis statistik untuk membuktikan  bahwa  jumlah  apoptosis sel granulosa mencit model endometriosis yang diberi ekstrak etanol
daun  kelor (Moringa  oleifera) dengan dosis  0,35  mg/g  BB  lebih  rendah dibandingkan yang tidak diberi.
Gambar 1 Jumlah apoptosis sel granulosa pada  jaringan endometriosis mencit ( Mus  musculus )  model endometriosis pada kelompok kontrol Gambar 1 Jumlah apoptosis sel granulosa pada  jaringan endometriosis mencit ( Mus  musculus )  model endometriosis pada kelompok  yang  diterapi ekstrak etanol daun kelor.
Tabel  1:  Rerata  dan  simpangan  baku jumlah apoptosis sel granulosa
Rerata dan simpangan baku jumlah apoptosis sel granulosa Apoptosis  sel granulosa K1 K2 0,63 ± 0,36 0,20 ± 0,12 Keterangan : K1 : Kelompok kontrol
K2 : Kelompok perlakuan
Tabel 1 menunjukkan rerata dan simpangan  baku  jumlah  apoptosis  sel granulosa pada mencit model endometriosis  kelompok  kontrol  dan kelompok  yang  mendapat  terapi  yang menunjukkan adanya penurunan apoptosis  sel  granulosa  pada  kelompok yang diterapi. uji Shapiro  Wilk digunakan
untuk  analisis  statistik  untuk  normalitas data  karena  sampel  kurang  dari  50.
Berdasarkan  hasil  uji Shapiro  Wilk, asumsi  normalitas  data    tidak  terpenuhi karena nilai kelompok kontrol menunjukkan hasil 0,03, sehingga
p<0,05 yang berarti distribusi data tidak normal.  Asumsi  selanjutnya  adalah homogenitas  varian  dengan  uji Levene didapatkan  hasil  0,13  sehingga  lebih besar  dari  0,05  (p>0,05)  yang  berarti homogenitas  varian  data  terpenuhi. Karena  normalitas  data  tidak  terpenuhi, maka  untuk  membandingkan  nilai  dua kelompok  digunakan  uji U  Mann- Whitney dengan  hasil  signifikan  yang sebesar 0,001, sehingga p<0,05. Kesimpulan  dari  penelitian  ini  adalah terdapat  perbedaan  yang  signifikan antara  apoptosis  sel  granulosa  pada kelompok kontrol dan kelompok perlakuan.

## DISKUSI DAN PEMBAHASAN
Sel  granulosa  merupakan  sel somatik  yang  berkaitan  erat  dengan folikulogenesis.  Sel  granulosa  berfungsi memproduksi growth  factor dan  steroid yang  berinteraksi  dengan  oosit  selama perkembangan folikel di ovarium.
kejadian  apoptosis  pada  sel  granulosa memainkan  peran  penting  dalam  proses atresia folikel. (Inoue et al ., 2011).
Peningkatan  reaksi  radang  di peritoneum pada penderita endometriosis  berpengaruh  pada  folikel
ovarium  yang  menyebabkan  terjadinya proses  apoptosis  sel  granulosa  yang patologis  sehingga  folikel  tidak  dapat berkembang dan menyebabkan infertilitas,  sejalan  dengan  penelitian Nakahara  (1998)  yang  menjelaskan proses apoptosis patologis akan menyebabkan penurunan kesuburan dari ovarium  sehingga  dapat  menyebabkan infertilitas. Tinggi  rendahnya  apoptosis  sel granulosa berkaitan dengan perkembangan folikel menjadi folikel de graff.  Semakin  tinggi  jumlah  apoptosis maka folikel akan mengalami atresia dan tidak berkembang menjadi folikel matang  mengakibatkan  tidak  terjadinya ovulasi. Tidak terjadinya ovulasi menyebabkan terjadinya infertilitas.
Mencit  betina  digunakan  sebagai hewan  coba  model  endometriosis  dalam penelitian ini karena memiliki homologi anatomi  dengan  manusia. Mencit  dibagi menjadi  2  kelompok.  Pembuatan  hewan model  endometriosis  selama  14  hari, kemudian satu kelompok diterapi dengan  ekstrak  etanol  daun  kelor  dosis 0,35  mg/g  BB/hari  selama  14  hari  dan kelompok  yang  lain  sebagai  kelompok kontrol.
Daun  kelor  memiliki  kandungan flavonoid  yang  tinggi,  salah  satu  yang paling  menonjol adalah quercetine yang berfungsi sebagai antiinflamasi. Penelitian Anjani dkk (2016) quercetine
berfungsi  sebagai  anti  inflamasi  yang mampu menghambat NfkB yang merupakan suatu penanda adanya reaksi inflamasi pada endometriosis. Penelitian wihastuti  dkk  (2007)  membuktikan bahwa.  Kandungan  antiinflamasi  yang tinggi  pada  daun  kelor  juga  mampu menghambat TNF-α. Penghambatan pada  NFkB  dan  TNF-α  menyebabkan tidak  terbentuknya  ikatan  antara  TNF-α
dan  TNF-α  reseptor  yang  merupakan reseptor kematian sel menjadi terhambat. Pemeriksaan  jumlah  apoptosis sel granulosa menggunakan imunohistokimia dilakukan setelah mencit  dikorbankan  pada  hari  ke-29 .
Berdasarkan  hasil  analisa  statistik U Mann  Whitney menunjukkan  perbedaan bermakna  antara  kelompok  perlakuan dan  kelompok  kontrol  dengan  nilai  p  < 0,05.

## KESIMPULAN DAN SARAN
Apoptosis  sel  granulosa  pada mencit ( Mus musculus ) model endometriosis kelompok perlakuan dengan  ekstrak  etanol  daun  kelor ( Moringa  oleifera Lam.)  lebih  rendah dibandingkan dengan kelompok kontrol. Dapat dilakukan penelitian untuk  melihat  ekspresi caspase untuk melihat  jalur  sinyal  apoptosis  telah berlangsung.

## DAFTAR PUSTAKA
Andjani, N., Sujuti, H., and Winarsih, S. 2016.’Efek  ekstrak  etanol  daun kelor  (moringa  oleifera)  terhadap nuclear factor kappa beta (Nf-kB) aktif  dan  apoptosis  cell  line kanker mcf-7’ . Majalah Kesehatan FKUB . 3 (4): 204-212.
Hendarto, H. 2012. ‘Pathomechanism of infertility  in  endometriosis.  in endometriosis-basic  concept  and current  research  trends’. Intech : 343-353.
Hussein, MR., Haemel, AK., and Wood,
GS. 2003.‘Apoptosis and melanoma:molecular mechanisms’. J Pathol . 199 : 275
– 288.
Inoue.,  Noriyuki.  2011.  ‘Role  of  cell- death  ligand-receptor  system  of granulosa cells in selective
follicular atresia in porcine ovary’. J  Reprod  Dev .  57(2)  :
169-175.
Kennedy, S., Bergqvist, A., Chapron, C.,
D’Hooghe,  T.,  and  Dunselman, G.2005.‘ESHRE guideline for the diagnosis and treatment of endometriosis’. HumReprod .  20:
2698–2704.
Krisnadi, A. 2015. Kelor Super Nutrisi .. Pusat Informasi Dan Pengembangan  Tanaman  Kelor Indonesia : Blora. Goldsby,  RA.,  Kindt,  TJ.,  and  Osborne,
BA.  2000. Kuby Immunology  4 th
edition . W.H Freeman and
Company : New York. Lee,  WL.,  Chang,  WH.,  Wang,  KC., Guo, CY., Chou, YJ., and Huang, N.  2015.‘Therisk  of  epithelial ovarian  cancer  of  women  with endometriosis may bevaried
greatly  if  diagnostic  criteria  are different’. Medicine .94: e 1633.
Nakahara, K., Saito,H., Saito, T., Ito,M., Ohta, N., Takahashi,T., and Hiroi,M. 1998. ‘Ovarian fecundity in patients with endometriosis can be  estimated  by  the  incidence  of apoptotic bodies’. Fertil Steril .69(5):931-5.
Wang,  KC.,  Chang,  WH.,  Lee,  WL., Huang, N., Huang, HY., and Yen,
MS.  2014.  ‘Anincreased  risk  of epithelial ovarian cancer in taiwanese  women  with  a  new surgico  pathological  diagnosis  of endometriosis’. BMC Cancer . 14:831.
Wihastuti,  T.A.,  Sargowo,  D.,  and Rohman, M. 2007. ‘The Effect of
Moringa  Oleifera  Leaf  Extract  in Inhibition  of  NFκB  Activation,
TNF-α  and  ICAM-1  Expression in Oxidized LDL treated
HUVECS’. J. Cardiol. Indonesia.
28:181-188.