Studi Komparasi Media Kultur Coco Blood Malachite Green (CBM) dengan Lowenstein Jensen (LJ) untuk Diagnosis Cepat, Spesifik, dan Sensitif pada Sputum Pasien Suspek Tuberkulosis
Anisful Lailil Munawaroh*, Dwi Yuni Nur Hidayati ** , Yulian Wiji Utami *

## ABSTRAK
Di  Indonesia,  TB  merupakan  permasalahan  kesehatan  utama,  bahkan  masuk  ke  dalam  10  negara dengan  beban  TB  terbanyak  di  dunia.  Diagnosis  laboratorium  penyakit  TB  masih  menjadi  permasalahan yang  penting  di  Indonesia.  Media  biakan  yang  menjadi gold  standard untuk  menegakkan  diagnosis  TB adalah media lowensten-jensen (LJ). Akan tetapi, metode ini memerlukan inkubasi yang lama yaitu sekitar 8 minggu  setelah  waktu  inokulasi.  Untuk  meminimalkan  risiko  penularan  lebih  luas  dan  perjalanan  penyakit yang lebih berat, diagnostik TB memerlukan medium biakan yang lebih cepat. Coco blood malachite green (CBM)  merupakan  inovasi  media  kultur  yang  memiliki  komposisi  air  kelapa  muda ,  malachite  green ,  darah domba, agar darah, dan gliserol. Air kelapa merupakan cairan yang kaya nutrisi dan steril, malachite green memiliki sifat bakteriostatik, hal ini memiliki efek positif dalam mencegah adanya kontaminan dalam media kultur  CBM.  Agar  darah  mengandung  protein,  lemak,  karbohidrat  serta  elemen  nutrisi  penting  yang  dapat mempercepat  pertumbuhan  dari  beberapa  jenis  bakteri  termasuk Mycobacterium .  Darah  domba mengandung protein hematin sebagai sumber nutrisi bakteri. Gliserol sebagai sumber karbon. Penelitian ini merupakan  eksperimental  murni post  test  only  control  group  design dengan  31  sampel  sputum  penderita suspek  tuberkulosis  yang  di  inokulasi  pada  31  media  CBM  dan  31  media  LJ  sebagai  kontrol  positif. Pengamatan  makroskopis  dilakukan  maksimal  8  minggu,  pertumbuhan  koloni  dikonfirmasi  dengan pengecatan BTA. Hasil uji Mann Whitney didapatkan nilai p sebesar 0,000 (p < 0,05). Nilai spesifitas 96,6 % dan sensitivitas 100 %. Dapat disimpulkan bahwa CBM lebih cepat dan sensitif daripada LJ, namun LJ lebih spesifik daripada CBM.
Kata kunci : Media kultur, Mycobacterium tuberculosis , Sputum suspek TB.
Comparative Study of Coco Blood Malachite Green Culture Media with Lowenstein Jensen (LJ) for Rapid Diagnostic, Specific, and Sensitive on Sputum of Tuberculosis Suspect
Patient

## ABSTRACT
In Indonesia, TB remains as one of the major health problems, even belonging to the most 10 countries with the highest TB burden in the world. Laboratory diagnosis of tuberculosis remains an important problem. Culture  medium  which  is  gold  standard  to  diagnose  TB  is  lowensteen  jensen  media  (LJ).  However,  this method requires long time incubation that is approximately 8 weeks. To minimize the spreading risk and the worse  prognosis,  TB  diagnostic  requires  a  faster  culture  media. Coco  blood  malachite  green  (CBM)  is  an innovative  modification  media  for  culturing  TB  bacteria  which  consists  of  coconut  water,  malachite  green, blood sheep, blood agar and glycerol. Coconut water is sterile liquid that rich of nutrition.  Malachite green plays  as  bacteriostatic  to  prevent  contamination.  Blood  agar  contains  protein,  fat,  carbohydrates  and essential  nutritional  elements  which  can  accelerate  the  growth  of  several  types  of  bacteria  including Mycobacterium . Blood sheep consist of hematin protein as nutritional source for bacteria. Glycerol as source of carbon.  This research was pure experimental post test only control group design with 31 sputum samples from tuberculosis suspect patient which inoculated in 31 CBM and 31 LJ as a positive control. Macroscopic observation  was  done  maximum  in  8  weeks.  Bacteria  growth  was  confirmed  with  Ziehl-Neelsen  staining. Mann  Whitney value  was  0,000  (p  <  0,05),  specifity  value  was  96,6  %  and  sensitivity  was  100  %.  To conclude, CBM media was faster and more sensitive than LJ, but LJ more specific than CBM media.
Keywords : Culture media, Mycobacterium tuberculosis , Sputum suspect TB.
*  Program Studi Ilmu Keperawatan,  FKUB
** Laboratorium Mkrobiologi, FKUB

## PENDAHULUAN
Tuberkulosis  (TB)  adalah  penyakit menular  yang  disebabkan  oleh  bakteri Mycobacterium tuberculosis. 1 Hingga saat ini TB masih menjadi masalah kesehatan dunia yang  belum  dapat  terselesaikan.  Bahkan, WHO  memperkirakan  antara  tahun  2002 sampai 2020 secara total sepertiga populasi di  dunia  pernah  terinfeksi  TB  dan  8,7  juta merupakan  kasus  baru  (penderita  TB  aktif) dan tiap tahunnya 1,7 juta meninggal karena TB. 2 Indonesia memiliki prevalensi TB tinggi dan masih menjadi permasalahan kesehatan utama. Indonesia termasuk dalam 10 negara dengan beban TB terbanyak di dunia.
Seperti  dilaporkan  oleh  Organisasi Kesehatan  Dunia  (WHO)  dalam  Global Report  tahun  2011  menyatakan  bahwa Indonesia  memiliki  total  kasus  tuberkulosis baru  sebanyak  450  ribu  per  tahun  dan prevalensi sekitar 690 ribu per tahun. 3 Pada tahun  2010  Indonesia  mempunyai  angka insiden  TB  sebanyak  450.000  kasus  atau 189  kasus  per  100.000  penduduk,    angka prevalensi TB sebanyak 690.000 kasus atau 289  kasus  per  100.000  penduduk. Sedangkan  angka  kematian  karena  kasus TB  sebesar  64.000  atau  27  kematian  per 100.000.
4 Angka  penjaringan  suspek  terhadap  TB di  Indonesia  dari  tahun  2007  hingga  2011 cenderung mengalami peningkatan. Peningkatan berarti terjadi pada tahun 2010 dan  2011,  dari  687  suspek  per  100.000 penduduk  pada  tahun  2009  menjadi  744 suspek  per  100  penduduk  pada  tahun  2010 dan  pada  tahun  2011  angka  penjaringan suspek menjadi 807 per 100.000 penduduk. Angka  proporsi  persentase  pasien  baru dengan  BTA  positif  yang  ditemukan  pada suspek  yang  diperiksa  dahaknya,  di Indonesia  sekitar  5  %  hingga  15  %. 3 Di Kabupaten Malang berbagai upaya pengendalian  TB  sudah  dilakukan  namun masih  jauh  dari  sempurna.  Terutama  yang
masih  menjadi  kendala  adalah  pada  saat penemuan  penderita.  Angka  penemuan penderita TB paru dengan bakteri tahan asap positif  di  Kabupaten  Malang  mengalami peningkatan  dari  36,42  %  pada  tahun  2010
44,4  %  pada  tahun  2011,  namun  masih dibawah  target  nasional.  Pada  tahun  2012 sampai September 2012 ditemukan penderita  TB  paru  positif  sebanyak  827 orang  sedangkan  target  penderita  dengan BTA positif yang harus ditemukan sebanyak
2627 orang. 5
Sifat Mycobacterium  tuberculosis yang lambat  pada  waktu  pembelahan    sekitar  20 jam,  sehingga  di  kultur  pertumbuhan  baru tampak setelah 4 sampai dengan 8 minggu. Untuk  dapat  tumbuh  di  media  kultur diperlukan  50  sampai  100  bakteri/ml sputum. 6 Media  perbenihan  bertujuan  untuk memperbanyak bakteri Mycobacterium tuberculosis dalam  spesimen  sputum, sehingga  dapat  meningkatkan  deteksi tuberkulosis.  Sekarang  ini  banyak  media yang  dapat  digunakan  sebagai  kultur  dari
Mycobacterium tuberculosis seperti lowenstein-jensen, Mycobacteria  growth indicator  tube (MGIT).    Tetapi  semua pemeriksaan  di  atas  memakan  biaya  yang tidak  murah.    Dengan  demikian  masih berkembang  teknik  lain  dalam  penelitian kultur  guna  mendeteksi Mycobacterium tuberculosis guna  mendapatkan  metode kultur yang murah dan tingkat sensitifitas dan spesitifitasnya tinggi. 7 Kultur Mycobacterium  tuberculosis dari dahak  penderita  merupakan gold  standard untuk  penegakan  diagnosa  TB  saat  ini. Media  yang  umum  digunakan  adalah  media lowenstein  jensen (LJ)  yaitu media  berbasis telur yang digabungkan dengan penggunaan elektrolit dan malachite green
direkomendasikan sebagai isolasi, kultur dan studi  kerentanan  terhadap  obat. 8 Koloni makroskopis Mycobacterium  tuberculosis pada  media  LJ  timbul  antara  minggu  ke  2 sampai minggu ke 6 dan hasil kultur negatif
baru bisa dinyatakan setelah 8 minggu waktu kultur. 9 Pada  kasus  kronik  atau  gagal pengobatan  maka  dilakukan  pemeriksaan kultur  atau  biakan  yang  merupakan pemeriksaan baku  emas dan berperan pada pemeriksaan  uji  kepekaan Mycobacterium tuberculosis terhadap Obat Anti Tuberkulosis
(OAT). 9
Pada  penelitian  sebelumnya  modifikasi media  kultur coco  blood  malachite  green (CBM) memiliki  komposisi  bahan  dasar coconut atau air kelapa muda, darah domba, agar  darah  ( blood  agar ),  dan malachite green .  Keunggulan  penelitian coco  blood malachite green (CBM) antara lain komposisi yang  sederhana  dapat  diaplikasikan  pada laboratorium  dengan  fasilitas  yang  terbatas, berhasil  menumbuhkan  kuman  kontrol standar WHO yaitu H37RV yang menunjukkan  bahwa  media coco  blood malachite green (CBM) termasuk bagus dan berpotensi  untuk  menjadi  alternatif  media kultur.  Hasil  penelitian  menunjukkan pertumbuhan Mycobacterium  tuberculosis lebih  cepat  dibandingkan  LJ  dan  bermakna secara  statistik  (p  <  0,001).  Kekurangan pada  penelitian coco  blood  malachite  green
(CBM)  terletak  pada  tingkat  sensitivitas  dan spesifikasi  yang  hasilnya  tidak  valid.  Hal  ini dikarenakan  jumlah  sampel  yang  sedikit. Selain itu, koloni Mycobacterium tuberculosis yang  dilihat  dengan  pewarnaan  Ziehl Neelsen diketahui struktur bakteri lebih kurus dibandingkan dengan yang tumbuh di media LJ, hal ini diduga bakteri kekurangan nutrisi. Sampel yang digunakan adalah  bakteri hasil subkultur,  sehingga  pada  penelitian  lanjutan akan  dilakukan  modifikasi  sampel  yaitu menggunakan  sampel  sputum  dan  pada komposisi media ditambahkan gliserol.
Perawat memiliki berbagai peran seperti pemberi  perawatan,  pengambil  keputusan klinik,  advokat,  peneliti,  dan  pendidik. 10 Perawat  memiliki  peran  juga  dalam  respon biologis  manusia,  sehingga  permasalahan biologis  manusia  juga  dapat  diteliti  oleh
perawat, seperti halnya permasalah tuberkulosis  dan  diagnosisnya  yang  masih menjadi permasalahan di negara berkembang. Melihat pemeriksaan diagnosis yang  mahal  tersebut  maka  perawat  peneliti memiliki  peran  untuk  menemukan  inovasi dan alternatif bagi pasien, sehingga perawat juga  berperan  sebagai  advokat  untuk memberikan  pilihan  diagnosis  yang  efektif bagi pasien.
Oleh  karena  itu,  dengan  adanya penelitian  lanjutan  modifikasi  media  kultur bakteri coco  blood  malachite  green (CBM) diharapkan  menjadi  salah  satu  inovasi  yang dapat diinformasikan kepada interprofesional tim  medis  untuk  dapat  dijadikan  kolaborasi dalam strategi sarana diagnostik tuberkulosis yang  cepat,  spesifik  dan  sensitif,  sehingga dapat bermanfaat untuk masyarakat.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui perbedaan kecepatan pertumbuhan  koloni,  tingkat  spesifisitas  dan sensitivitas  antara  media  LJ dan  CBM  pada sputum pasien suspek tuberkulosis.
Manfaat  teoritis  penelitian  ini  adalah dapat  dijadikan  sebagai  dasar  teori  untuk menambah  wawasan  ilmu  pengetahuan sekaligus sebagai dasar untuk pengembangan penelitian selanjutnya dalam bidang kesehatan, khususnya tentang media kultur untuk pertumbuhan bakteri
Mycobacterium .  Sementara  manfaat  praktis penelitian ini adalah dapat dijadikan sebagai alternatif media kultur bakteri Mycobacterium yang  lebih  cepat,  spesifik,  dan  sensitif  yang mudah diaplikasikan pada masyarakat, dapat diinformasikan dan diaplikasikan
interprofesional  tim  medis  untuk  kolaborasi screening tuberkulosis,  dan  dijadikan alternatif bagi pasien.

## BAHAN DAN METODE
Desain Penelitian
Desain  penelitian  ini  adalah true experiment  post  test  only  control  group design dengan  melakukan uji  diagnostik media  kultur coco  blood  malachite  green (CBM) dibandingkan dengan media lowenstein jensen (LJ) sebagai gold standar . Dalam rancangan ini dilakukan randomisasi, artinya  pengelompokan  kelompok  kontrol dan  kelompok  eksperimen  dilakukan berdasarkan  acak  atau  random.  Jumlah sampel  sputum  pasien  suspek  tuberkulosis yang  sudah  melakukan informed  consent adalah  31.  Sputum  suspek  tuberkulosis  di tanam pada 31 media CBM dan 31 media LJ.
Alur Kerja Penelitian

## Proses Pembuatan CBM
1. Masukkan  4  g  serbuk  agar  darah  dan
1,25  ml  gliserol  ke  dalam  20  ml  air distilasi  dan  ratakan.  Setelah  rata tuangkan  0,4  g malachite  green ke dalam  campuran  agar  darah  dan gliserol.
2. Sterilisasi  campuran  tersebut  dengan menggunakan  autoklaf  pada  suhu  121 o C selama 15 menit.
3. Agar  yang  telah  disterilisasi  dibiarkan dingin hingga mencapai suhu 50 o C.
4. Air  kelapa  yang  digunakan  adalah kelapa  jenis Cocos  nucifera yang  di petik  maksimal  48  jam  dari  pohon. Kelapa  muda  dilubangi  secara  aseptis menggunakan spuit filter dan air kelapa dikumpulkan  ke  dalam conical  flasks
steril  dengan  tetap  menjaga  sterilisitas dari air kelapa muda.
5. Sebagian kecil air kelapa diambil untuk lakukan pengukuran pH.
6. 80  ml  air  kelapa  muda  dimasukkan menggunakan  teknik  aseptik  ke  dalam conical flask steril.
7. Tetap  menjaga  sterilisitas,  air  kelapa muda  tadi  ditambahkan  kedalam  agar dengan  tetap  mengaduk  perlahan  agar secara  terus  menerus.  Sehingga didapatkan coconut nutrient agar .
8. Siapkan  darah  yang  diambil  dari  vena jugularis  domba  sebanyak  25  ml  dan dicampurkan dengan 5 ml sodium sitrat (3,8 %).
9. 7  ml  dari  campuran  darah  domba  dan sodium citrate kemudian dimasukkan ke dalam coconut nutrient agar.
Persiapan inokulasi
Sputum direct smear (-, +1, +2, +3) Kontrol (+) Media LJ Media CBM
Observasi hasil pertumbuhan makroskopis koloni Mycobacterium pada masing-masing media kultur maksimal selama 8 minggu
Membuat hapusan dari koloni yang tumbuh di media kultur dengan menggunakan pewarnaan Ziehl-Neelsen dan dilakukan pembacaan mikroskopis perbesaran 100x
Pembuatan Media Kultur
CBM dan LJ
10. Campuran  ini  lalu  diaduk  hingga  rata dan 6-8 ml campuran ini dimasukkan ke dalam botol anulir.
11. Diamkan hingga media siap digunakan.
12. Media  yang  sudah  siap  harus  di inkubasi pada suhu 37 °C selama 2x24 jam  untuk  uji  sterilisitas.  Media  yang menunjukan pertumbuhan koloni apapun harus dibuang.
13. Setelah uji sterilisitas, media kultur CBM (Coconut  Blood  Malachite) dapat langsung  digunakan  untuk  inokulasi Mycobacterium  tuberculosis atau disimpan pada suhu 2-8 °C Dekontaminasi Sputum 1. Tuang  contoh  uji  ke  dalam  tabung sentrifus 50 ml 2. Ditambahkan NaOH 3. Kocok sampai homogen, tidak lebih dari
30  detik  dan  diamkan  selama  15  menit pada suhu kamar.
4. Tambah  PBS  sampai  volume  45  ml. Bolak-balik tabung beberapa kali
5. Timbang  agar  posisi  pada  waktu sentrifus seimbang.
6. Centrifuge selama 20 menit, 4 o C
7. Buang supernatant kemudian  ditambah
1 ml PBS
8. Inokulasi  pada  media  sebanyak  100  μl (4 tetes pipet plastik vol 1 ml) 9. Inkubasi pada suhu 37 o C

## Pewarnaan Ziehl-Neelsen
1. Ambil objek glass
2. Beri  etiket  dan  lingkari  objek  glass dengan spidol permanen kira - kira 1 - 2 cm dibelakang objek glass
3. Oleskan  koloni  diatas  objek  glass  dan keringkan pada suhu kamar
4. Fiksasi diatas api selama 3 kali
5. Teteskan  karbol  fukhsin  kuat  pada sediaan  sambil  diuapkan  selama  5 menit.  Lalu  bilas  menggunakan  air mengalir.
6. Kemudian  teteskan  alkohol  asam  pada sediaan.  Lalu  tunggu  selama  30  detik kemudian bilas dengan air mengalir.
7. Setelah itu teteskan methyien blue pada sediaan dan biarkan selama 2 menit lalu bilas menggunakan air mengalir.
8. Tunggu  sampai  kering  dan  periksa dibawah mikroskop dengan menggunakan  imersi  dan  pembesaran 100 x.

## HASIL
Hasil kecepatan pertumbuhan didapatkan dari pengamatan secara makroskopis  koloni  yang  tumbuh  pada masing-masing media. Perbedaan karakteristik koloni dapat dilihat pada gambar di bawah ini :
Gambar  1.  Morfologi  koloni  TB  pada  media  CBM  dan  LJ. Keterangan: A. Karakteristik  koloni  yang tumbuh pada media CBM adalah berwarna putih, tampak tipis dan menyebar; B. Karakteristik koloni pada media LJ adalah berwarna kekuningan seperti bunga kol.

## Kecepatan Pertumbuhan Koloni
Dari  hasil  pengamatan  makroskopis maka  dilakukan  perbandingan  kecepatan pertumbuhan  antara  media  LJ  dan  media CBM selama maksimal 8 minggu pengamatan  pada  31  sampel.  Jika  koloni tidak  tumbuh  dalam  pengamatan  selama  8 minggu,  dapat  disimpukan  hasil  pelaporan pengamatan  mikroskopis    adalah  BTA negative. 9
Gambar 2. Perbandingan kecepatan pertumbuhan koloni TB pada media CBM dan media LJ
Pada  media  CBM  100  %  terdapat pertumbuhan  koloni,  jumlah  durasi  kultur tercepat  adalah  2  hari  dan  terlama adalah  6
hari,  sedangkan  koloni  yang  tumbuh  pada media  LJ  sebesar  22,5  %,  jumlah  durasi kultur tercepat adalah 6 hari dari sampel kode
1005 dan terlama adalah 49 hari dari sampel kode 1272.

## Tingkat Spesifisitas dan Sensitivitas
Dari  hasil  pengamatan  31  media  kultur
CBM yang terdapat pertumbuhan didapatkan hasil  kode  1005  dan  1007  terdapat  BTA
0
20 40 60 1000 997 986 1041 1011 1007 1005 1107 1134 1133 1070 1148 1098 1050 1120 1199 1181 1178 1207 1206 1188 1179 1182 1250 1256 1286 1274 1287 1269 1272 1369 LJ CBM Hari A B
positif  dan  29  media  CBM  lainnya  BTA negatif.  Pada  media  LJ  hanya  media  kode 1005,  1007,  1050,  1269,  1286,  1272 menunjukkan  pertumbuhan  koloni,  namun dari  hasil  pengamatan  mikroskopis  hanya kode  1007  yang  menunjukkan  hasil  BTA positif.  Media  LJ  selain  kode  tersebut  tidak terjadi  pertumbuhan  koloni,  sampa  dengan batas  maksimal  8  minggu,  sehingga  dapat disimpulkan pada hasil pelaporan pengamatan ditulis BTA negatif.
Gambar 3. Morfologi sel bakteri TB yang merupakan bakteri tahan asam dengan pengecatan Ziehl- Neelsen. Keterangan: A . Bakteri tahan asam yang dikultur pada media CBM kode 1005; B . Bakteri tahan asam yang dikultur pada media CBM kode 1007; C . Bakteri tahan asam yang dikultur pada media LJ kode 1007.
Setelah  hasil pembacaan  mikroskopik,  maka dilakukan  uji  2x2  untuk  mengetahui  nilai sensitifitas dan spesifisitas.
Analisis Data Data-data yang didapatkan dari dianalisis dengan  software  SPSS  21 for  windows. Metode  analisis  menggunakan  uji  normalitas data  dengan  uji  Kolmogorov-Smirnov (p  >
BTA + BTA + BTA + C B A
0,05).  untuk  melihat  perbedaan  kecepatan pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis pada media CBM dengan media LJ  menggunakan  uji independent t-test .
Apabila  distribusi  data  tidak  normal
menggunakan Mann Whitney test (p < 0,05).
Analisis spesifisitas dan sensitivitas dilakukan dengan  menggunakan  tabel  uji  diagnostik yang disajikan dalam tabel 2x2.
Tabel 1. Uji normalitas Kolmogorov-Smirnov Hasil  uji  normalitas  menggunakan  uji Kologorov-Smirnov, didapatkan angka signifikansi p <  0,05  yaitu  0.00  untuk kecepatan pertumuhan koloni. Dengan  demikian,  dapat  disimpulkan bahwa  data  berdistribusi  tidak  normal.  Maka langkah  selanjutnya  tidak  dapat  melakukan uji parametric  t-test  independent ,  namun dilakukan uji non parametrik Mann Whitney. Tabel 2. Hasil uji Mann Whitney Hasil Uji Media LJ Hasil Uji Media CBM Positif  Negatif  Total Positif a = 1 b = 1 2 Negatif c = 0 d = 29 29 Total 1 30 31 Tests of Normality Kolmogorov-Smirnov a Shapiro-Wilk Statistic df Sig . Statisti c d f Sig . Kecepatan Pertumbuhan LJ .485 31 .00 0 .425 3 1 .00 0 Kecepatan Pertumbuhan CBM .437 31 .00 0 .497 3
1 .00 0 Test Statistics Kecepatan Pertumbuhan Mann-Whitney U 216.000 Wilcoxon W 712.000 Z -3.996 Asymp. Sig. (2- tailed) .000
Dari  hasil  uji  perbedaan  kecepatan pertumbuhan  koloni  pada  kedua  kelompok didapatkan  nilai p sebesar  0,000.  Dengan demikian  dapat  disimpulkan  bahwa  media CBM memiliki pertumbuhna koloni lebih cepat dibandingkan media LJ.
Uji  2x2  digunakan  untuk  mengetahui tingkat  spesifisitas  dan  sensitivitas  media CBM dibandingkan dengan media LJ. Berikut hasil perhitungan uji 2x2 :
 Uji 2x2
a. Spesifisitas d     x 100% = 29      x 100% = 96,6 % b +d 29+1 b. Sensitivitas a     x 100% = 1     x 100% = 100 % a + c 1+0
Dari  hasil  perhitungan  komparasi spesifisitas dan sensitivitas media CBM dibandingkan LJ didapatkan  nilai  spesifisitas  96,6  %  dan sensitivitas 100 %.

## PEMBAHASAN
Penelitian  ini  merupakan  lanjutan  dari penelitian sebelumnya yaitu hanya menggunakan  sampel  sub  kultur  dan M. tuberculosis H37RV.  Didapatkan  data  hasil pertumbuhan Mycobacterium  tuberculosis pada  media  CBM  lebih  cepat  dibandingkan LJ dan bermakna secara statistik (p < 0,001).
Seperti  yang  telah  dijelaskan  pada  bab sebelumnya  perbedaan  dengan  bakteri lainnya  yaitu M.  tuberculosis resisten terhadap  agen  antibakterial  seperti  penisilin dan  mampu  bertahan  dalam  kondisi kekeringan dalam waktu yang lama. 11 Sifat M. tuberculosis yang  lambat  pada  waktu pembelahan    sekitar  20  jam,  sehingga  pada media  kultur,  pertumbuhan  baru    tampak setelah  4  sampai  dengan  8  minggu.  Untuk
dapat  tumbuh  di  media  kultur  diperlukan  50 sampai  100  bakteri/ml  sputum.
6 Pada penelitian ini dilakukan pengamatan makroskopis  kecepatan  pertumbuhan  koloni dan  pengamatan  mikroskopis  BTA  untuk konfirmasi  koloni  yang  tumbuh  untuk mengetahui  nilai  spesifisitas  dan  sensitivitas antara media LJ dan CBM.

## Kecepatan Pertumbuhan Koloni
Kecepatan pertumbuhan pada penelitian ini  dilihat  dari  hasil  jumlah  hari  yang dibutuhkan  media  LJ  dan  CBM  untuk menumbuhkan  koloni.  Media  LJ  dijadikan acuan untuk mengetahui perbedaan kecepatan  pertumbuhan  koloni  karena  LJ merupakan  media gold  standard untuk diagnosis tuberkulosis. Dari hasil pengamatan secara maskroskopis  didapatkan  data  pertumbuhan pada media LJ pertumbuhan tercepat yaitu 6 hari dan waktu terlama adalah 49 hari. Pada media CB pertumbuhan tercepat yaitu 2 hari dan waktu terlama adalah 6 hari. Bedasarkan data  uji  Mann  Whitney  terdapat  perbedaan kecepatan  pertumbuhan  yang  signifikan  dan dapat  disimpulkan  media  CBM  memiliki pertumbuhan  koloni  yang  lebih  cepat dibandingkan media LJ.
Hal  ini  disebabkan  oleh  komposisi modifikasi media kultur CBM yang terdiri dari air  kelapa  muda,  agar  darah,  darah  domba, malachite  green,  dan  gliserol  yang  kaya nutrisi  untuk  mempercepat  pertumbuhan koloni.  Air  kelapa  merupakan  cairan  yang steril,  mengandung  protein,  lemak  dan  kaya akan  karbohidrat.  Selain  itu,  air  kelapa  juga mengandung banyak elemen nutrisi penting.
12 Penelitian oleh  Sevilla et al (2001) juga  berhasil  mengisolasi M.  tuberculosis pada  media coconut  water  egg  malachite green media . 13
Berdasarkan  penelitian  Mathur  (2009) yang membandingkan antara media lowenstein  jensen  dengan  agar  darah
didapatkan  hasil  deteksi  koloni M. tuberculosis makroskopik lebih cepat (13,6 ±
5,2  hari)  pada  media  agar  darah dibandingkan  media  LJ  (20,4  ±  5,1  hari). 14
Darah  domba  memiliki  nutrisi  berupa  protein hematin  yang  berfungsi  sebagai  sumber nutrisi  bagi  bakteri. 15 Jadi  darah  domba berpotensi  sebagai  pengganti  telur  bebek. Syarat  penggunaan  telur  ayam/bebek  pada poses pembuatan media LJ harus segar yang berumur  tidak  lebih  7  hari  dan  pakan  ternak tidak boleh yang memakai antibiotik . 16 Malachite green memiliki sifat bakteriostatik  terhadap  bakteri  lain,  dapat diinkorporasikan  ke  dalam  media  tanpa menghambat  pertumbuhan  basil  tuberkel. Basil tuberkel masih dapat hidup dalam asam dan  alkali  sehingga  dapat  membantu mengeliminasi/menghilangkan organisme terkontaminasi sekaligus meningkatkan pertumbuhan  dini  dari Mycobacteria. 13
Penambahan  gliserol  bertujuan  untuk dijadikan  sumber  karbon  dan  energi  untuk metabolisme dan mempercepat pertumbuhan M.  tuberculosis . 17 Jadi  pada  penelitian  ini terdapat  31  sampel  yang  menumbuhkan koloni lebih cepat secara makroskopis.
Selain  itu,  keunggulan  dari  media  CBM ini adalah risiko kontaminasi media lebih kecil dibandingkan media LJ. Hal ini dibuktikan dari hasil  uji  sterilitas  media  LJ  lebih  banyak terjadi  kontaminasi,  sedangkan  pada  media CBM  tidak  terjadi  kontaminasi.  Setelah dilakukan  inokulasi  dari  36  sampel didapatkan 5 sampel yang ditanam di media LJ  terjadi  kontaminasi.  Berdasarkan  studi literatur  diketahui  bahwa  air  kelapa  ini merupakan cairan kaya nutrisi yang steril dan ditambahkan malachite green yang berfungsi sebagai  bakteriostatik  tanpa  menghambat pertumbuhan  basil  tuberkel,  sehingga berpotensi mencegah terjadinya kontaminasi.
Dari  hasil  data  kecepatan  pertumbuhan yang  diamati  selama    8  minggu  hanya  7 sampel  yang  tumbuh  pada media  LJ.  Koloni makroskopis M.  tuberculosis pada  media  LJ
timbul antara minggu ke-2 sampai minggu ke- 6 dan hasil kultur negatif baru bisa dinyatakan setelah  8  minggu  waktu  kultur. 9 Dari  hasil penelitian  didapatkan  sampel  1005  tumbuh tercepat pada media LJ yaitu dalam waktu 6 hari.  Berdasarkan  alur  petunjuk  teknis pemeriksaan  biakan,  identifikasi,  dan  uji kepekaan Mycobacterium  tuberculosis pada media  padat. 16 Jika  koloni  pada  media  LJ tumbuh  kurang  dari  7  hari  diduga Mycobacterium sp.  selain M.  tuberculosis . Berdasarkan  alur  kerja  di  Laboratorium Mikrobiologi  Klinik  RS  Saiful  Anwar  jika terdapat pertumbuhan koloni harus dilakukan pembacaan secara mikroskopis.
Hasil  pengamatan  selama  8  minggu terdapat  24  media  LJ  yang  tidak menunjukkan  pertumbuhan  koloni,  hal  ini dikarenakan positif pada salah satu, dua atau tiga  pewarnaan  tetapi  tidak  menunjukkan adanya  pertumbuhan M.  tuberculosis atau Mycobacterium sp.  lain  pada  medium kemungkinan  terjadi  karena  bakteri  dalam sputum  sudah  mati  atau  pertumbuhan beberapa Mycobacterium  sp .  lain  seperti Mycobacterium  bovis dapat  dihambat  oleh kandungan  gliserol  dapat  menjadi  penyebab tidak tumbuhnya koloni. 18 Pada penelitian ini kandungan  dari  media  adalah  gliserol, sehingga  diduga  jika  bakteri  tersebut  adalah Mycobacterium  bovis maka  tidak  terjadi pertumbuhan koloni.

## Uji  Diagnostik  Tingkat  Spesifisitas  dan Sensitivitas
Uji  diagnostik  merupakan  suatu  uji penelitian yang bertujuan untuk menegakkan diagnosis  atau  menyingkirkan  penyakit, screening ,  pengobatan  pasien  dan  studi epidemiologi.  Uji  diagnostik  baru  harus memberi  manfaat  yang  lebih  dibanding  uji yang sudah ada, meliputi beberapa hal yaitu:
 Nilai  diagnostik  tidak  jauh  berbeda dengan uji diagnostik standar
 Memberi kenyamanan bagi pasien (tidak invasif)
 Lebih mudah atau sederhana
 Lebih  murah  atau  dapat  mendiagnosis pada fase lebih dini
Sensitivitas  adalah  kemampuan  suatu tes untuk mengidentifikasi atau mendiagnosa individu  dengan  tepat,    hasil  tes  positif  dan benar  sakit.  Semakin  tinggi  nilai  sensitivitas sebuah  tes  maka  semakin  baik  kemampuan mendeteksi  seseorang  menderita  penyakit tertentu  sehingga  dapat  memperoleh penanganan  dini.  Tujuan  pengukuran sensitivitas  untuk  menghitung  jumlah  orang yang  memang    dinyatakan  terkena  penyakit dengan  hasil  tes  positif.  Spesifisitas  adalah kemampuan suatu tes untuk mengidentifikasi atau mendiagnosa dengan tepat dengan hasil tes  negatif  dan  benar  tidak  sakit.  Semakin tinggi  nilai  spesifisitas  sebuah  tes screening maka  semakin  baik  kemampuan  mendeteksi seseorang tidak menderita penyakit tertentu.
Tujuan  pengukuran  spesifisitas  untuk menghitung  banyaknya  orang  yang  tidak mengidap  suatu  penyakit  dengan  hasil  tes negatif. Penilaian dari hasil uji sensitifitas dan spesifisitas untuk menggetahui dari beberapa kelemahan  seperti,  tidak  semua  hasil  dari pemeriksaan dapat dinyatakan dengan tegas atau  tidak  terkenanya  penyakit.  Untuk mengatasi kelemahan ini dilakukan perhitungan  nilai  kecermatan  dengan  tujuan untuk menaksir banyaknya orang yang benar- benar  menderita  dari  semua  hasil  tes  yang positif. 19 Untuk  menguji  nilai  spesifisitas  dan sensitivitas didapatkan dari hasil pengamatan mikroskopis dengan ditemukannya BTA pada koloni yang tumbuh pada media.
Sampel pada penelitian ini didapatkan 29 pasien  tersangka  penderita  tuberkulosis dengan direct  smear negatif  dan  2  sampel dengan  direct  smear  kode  pasien  1005 adalah +2, kode pasien 1007 adalah +3. Dari hasil  pengamatan  mikroskopis  29  sampel dengan direct  smear negatif  dapat menumbuhkan  koloni  pada  media  CBM. Namun  setelah  dilakukan  pembacaan
mikroskopis dari koloni yang tumbuh hasilnya adalah  BTA  negatif,  sedangkan  kode  1005 dan 1007 hasilnya adalah BTA positif.
Hasil  pengamatan  mikroskopis  pada media  LJ  7  koloni  yang  tumbuh  yaitu  kode 1005,  1007,  1269,  1272,  1286,  dan  1250. Hanya  pasien  sampel  kode  1005  yang sebelumnya direct smear +2 hasil mikrosopis dari  koloni  yang  tumbuh  adalah  BTA  negatif dan kode pasien 1007 memiliki direct smear +3  hasil  pembacaan  mikrosopis  dari  koloni yang  tumbuh adalah  BTA  positif.  Sementara pada media CBM pasien dengan kode  1005 didapatkan BTA positif dan BTA negatif pada media LJ, walaupun direct smear pada kode 1005 adalah +2. Pasien kode 1005 ini adalah tersangka  penderita  TB  MDR  dikarenakan manajemen  terapi  OAT  yang  tidak  sesuai prosedur. Hal ini ditunjang oleh studi literatur hasil  kultur  yang  negatif  dikarenakan  pada penderita yang mendapat terapi OAT, kuman
M. tuberculosis dapat kehilangan kemampuan untuk tumbuh pada media kultur atau  kuman  telah  mati.
20 Hasil  kultur  yang negatif  juga  diduga  disebabkan  oleh  kurang tepatnya penanganan sampel dahak dan atau prosedur  pembuatan  kultur.  Penanganan sampel  dahak  kurang  tepat  bila  sampel dahak  terpapar  dengan  sinar  matahari  atau temperatur yang tinggi, disimpan terlalu lama, mengering,  atau  terkontaminasi.  Prosedur dekontaminasi  yang  berlebihan  sebelum dilakukan  inokulasi,  pemanasan  yang berlebihan  selama  sentrifugasi,  media  kultur yang  tidak  adekuat,  dan  kurangnya  masa inkubasi merupakan beberapa keadaan yang dapat menyebabkan hasil kultur negative. 20 Selain  kode  pasien  kode  1005,  pasien dengan  kode  1007  ditemukan  BTA  positif pada  media  LJ  dan  media  CBM.  Namun, perbedaan  karakteristik  saat  dilakukan pengamatan  pada  mikroskop  pembesaran 100x  ditemukan  BTA  pada  media  LJ  lebih subur,  banyak  ditemukan  di  setiap  lapang pandang,  dan  morfologinya  tidak  tampak kurus  dibandingkan  pada  media  CBM.
Diduga  dengan  penambahan  gliserol  dapat memberikan  nutrisi  sehingga  pada  media CBM  sehingga  akan  memberikan  hasil mikroskopis  yang  lebih  baik  dibandingkan dengan  media  LJ.  Hal  ini  diduga  telor  pada media  LJ  lebih  memberikan  nutrisi  yang banyak  pada  bakteri  dibandingkan  protein hematin  yang  terdapat  pada  darah  domba, sehingga  untuk  penelitian  selanjutnya  bisa digunakan altternatif lain selain darah domba.
Setelah  mendapatkan  data  mikroskopis maka  dilakukan  uji  2x2  untuk  mengetahui nilai sensitivitas dan spesifisitas dari media LJ dan CBM. Dari hasil uji 2x2 didapatkan hasil nilai  spesfisitas  96,6  %  dan  sensitivitas  100 %.  Berdasarkan  Levinson  (2008)  media  LJ memiliki  sensitivitas  dan  spesifisitas  masing- masing  99  %  dan  100%. 21 Dari  hasil perbandingan studi literatur dapat disimpulkan bahwa media CBM lebih sensitif daripada  media  LJ,  namun  media  LJ  lebih spesifik dibandingkan media CBM.

## Keterbatasan Penelitian
Koloni  yang  dikonfirmasi  dengan pewarnaan Ziehl Neelsen menghasilkan BTA positif  belum  tentu  hasil  tersebut  adalah Mycobacterium  tuberculosis .  Pengamatan secara  mikroskopis  antara  media  LJ  dan CBM  masih  lebih  subur  dan  lebih  banyak ditemukan BTA dari media LJ. Hal ini diduga protein  media  LJ  yang  berasal  dari  telor bebek  lebih  banyak  menutrisi  dibandingan protein  hematin  yang  berasal  dari  darah domba.

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  dan  pembahasan penelitian,  maka  dapat  diambil  kesimpulan bahwa  Media coco  blood  malachite  green (CBM)  terbukti  dapat  menumbuhkan  koloni lebih  cepat,  sehingga  dapat  menyingkat durasi  kultur,  lebih  sensitif,  namun  kurang spesifik  dibandingkan  media  Lowenstein Jensen (LJ).

## SARAN
Mengingat  masih  banyaknya kelemahan dan keterbatasan yang penulis hadapi dalam melakukan  penelitian  ini,  maka  dari  hasil penelitian  ini  dapat  disarankan  sebagai berikut :
1. Modifikasi  komposisi  media coco  blood malachite green (CBM) dengan menggunakan  alternatif  sumber  protein lain  selain  darah  domba  atau  komposisi lainnya  untuk  menemukan  komposisi yang lebih bernutrisi pada bakteri.
2. Dapat  dilakukan  tes  niasin,  DNA probe atau sequencing untuk  konfirmasi  pasti Mycobacterium yang  tampak  pada  hasil pengamatan mikroskopis.
3. Pemilihan sampel yang lebih banyak dan kriteria  yang  lebih  mendukung  untuk membuktikan tuberkulosis.

## DAFTAR PUSTAKA
1. Price SA dan Lorraine MW. Patofisiologi Konsep  Klinis    Proses-Proses  Penyakit .
Jakarta: EGC. 2006.
2. Notoatmodjo  S. Metode  Penelitian Kesehatan . Jakarta: Rineka Cipta. 2010. 3. Ditjen  P2PL.  Laporan  Situasi  Terkini Perkembangan Tuberkulosis di Indonesia  Januari-Desember  2012. (Online).  2012.  Diakses  19  September 2013.http://www.tbindonesia.or.id/pdf/20 12/profil-tb_th2011.pdf. 4. [WHO]  World  Health  Organization.  New TB Cases 2011. (Online).  2011. Diakses 11 September 2013. http://www.globalhealthfacts.org/data/topi c/map.aspx?ind=12&gclid=CL2N5bW97L YCFcyF6wod5DcAPw.
5. Malik  A.  Seminar  Kesehatan  sebagai Rangkaian  Hari  Kesehatan  Nasional  ke 48  dan  Hari  Jadi  Kabupaten  Malang  ke 1252.  (Online).  2012.  Diakses  19
September 2013. http://www.malangkab.go.id/?page=91&i d=1204. 6. Frida E, Ibrahim dan Hardjoeno. Analysis of  Acid  Fast  Bacilli  (AFB)  Findings  and Concentrated  Slides  in  Suspected Tuberculosis. Clinical  Pathology  and  Medical Laboratory . 2006. 12(2).
7. Forbes  BA et  al . Bailey  &  Scott's
Diagnostic  Microbiology .  12 th Edition.  St Louis: Elsevier Mosby. 2007.
8. Coban  AY,  Cihan  CC,  Bilgin  K et  al . Blood  Agar  for  Susceptibility  Testing  of Mycobacterium  tuberculosis Against
First-Line  Drugs. Int  J  Tuberc  Lung  Dis.
2006.10:450–453.
9. Jawetz,  Melnick,  Adelberg.  Mikrobiologi Kedokteran. (H Hartanto, C  Rachman, A Dimanti, A Diani). Jakarta: EGC. 2007. 10. Potter  PA,  Perry  GA. Buku  Ajar Fundamental  Keperawatan  Konsep, Proses, dan Praktik . Jakarta: EGC. 2002.
11. PDPI.  Tuberkulosis  Pedoman  Diagnosis dan  Penatalaksanaan  di  Indonesia.
Jakarta: PDPI. 2006. 12. Supadi dan Nurmanaf RA. Pemberdayaan  Petani  Kelapa  dalam Upaya Peningkatan Pendapatan. Litbang
Pertanian. 2006; 25(1).
13. Sevilla VB. The Utilization of he Coconut Water  Egg  Malachite  Green  Media (CEM) for the Isolation of Mycobacterium tuberculosis and Corynebacterium diphtheriae . Phil  J  Microbiol  Infect  Dis. 2001;10(2):93–7).
14. Mathur  ML,  Jyoti  G,  Ruchika  S.  Rapid Culture  of Mycobacterium  tuberculosis
on  Blood  Agar  in  Resource  Limited Setting. Dan  Med  Bull. 2009;  (56):208- 10 . 15. Drancourt M, Carrieri P, Gévaudan MJ et al .  Blood  Agar  and Mycobacterium tuberculosis : the End of a Dogma. J Clin Microbiol. 2003; 41:1710–1711. 16. Kemenkes RI. Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, Identifikasi, dan Uji Kepekaan  Mycobacterium  tuberculosis pada  Media  Padat.  Jakarta:  Kemenkes.
2011 .
17. Kennedy  A D.   Biochemical  Profile  of Mycobacterium  tuberculosis Grown Under  Hypoxic  Conditions  (Snow  Globe Model,  SG7).  20 1 1.   (Online).  Diakses 19 September 2013. www.metabolon.com. 18. Karuniawati  A,  Risdiyani  E,  Nilawati  S,
Prawoto,  Rosana  Y,  Alisyahbana    B, Parwati  I,  Melia  W,  Sudiro  TM. Comparison  Tan  Thiam  Hok,  Ziehl Neelsen  and  Fluorochrom  Staining Method  for  Detect  of  Acid  Fast  Bacil  in Sputum  Samples.  Makara  Kesehatan. 2005. 9:29-33.
19. Steven  YK,  Bogia  IM,  I  Made  S,  Ketut ES.  Perbandingan  Sensitivitas  dan Spesifisitas  Uji  Pewarnaan  Sellers’  dan
Fluorescent  Antibody  Technique (FAT) dalam  Mendiagnosa  Penyakit  Rabies pada  Anjing  di  Bali. Indonesia  Medicus
Veterinus 2012; 1(1):12-21.
20. Toman  K.  What  is  the  Probability  of Obtaining  a  Negative  Culture  from  a Sputum  Specimen  Found  Positive  by Smear  Microscopy?.  In:  Frieden  T, Editor. Toman’s  Tuberculosis  Case detection,  treatment,  and  monitoring  – questions  and  answers .  2 nd Edition. Geneva:  World  Health  Organization. 2004. p 44-45.
21. Levinson  W. Review  of  Medical Microbiology  and  Immunology .  United States: The McGraw-Hill Companies Inc. 2008.