PENGARUH PAPARAN GENISTEIN TERHADAP MOTORIK ZEBRAFISH ( Danio rerio )

## MELALUI PENGAMATAN EKSPRESI TIROSIN HIDROKSILASE DAN RESEPTOR ESTROGEN
Hanif *  , Habiba Aurora**

## Abstrak
Motorik dipengaruhi oleh neuron dopaminergik pada otak, yang maturasi fungsi dan morfologi pada masa  awal  pembentukan  dipengaruhi  oleh  kadar  estrogen.  Pemberian  genistein  sebagai  fitoestrogen dengan dosis tinggi pada masa awal perkembangan menyebabkan hambatan perkembangan motorik pada zebrafish.  Penelitian  ini  bertujuan  membuktikan  mekanisme  kerja  genistein  pada  neuron  dopaminergik, melalui  pengamatan  ekspresi  tirosin  hidroksilase ( TH),  respons  taktil,  dan  tes  lokomotor  pada  embrio zebrafish. Embrio zebrafish dibagi menjadi enam kelompok, yaitu kontrol (DMSO 0,05%), paparan genistein 5 µM, paparan genistein 10 µM, paparan ICI 182.780 10 µM, paparan genistein 5 µM + ICI 182.780 10 µM, paparan genistein 10 µM + ICI 182.780 10 µM dan diamati pada 2, 24,48, 72,120 dan 144 hpf ( hours post  fertilization ).  Pengamatan  ekspresi  TH  dilakukan  pada  48  hpf,  respons  taktil  pada  72  hpf  dan  tes lokomotor pada 144 hpf. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa pemberian antagonis estrogen ICI 182.780 memperbaiki ekspresi TH, respon taktil dan kemampuan lokomotor embrio zebrafish secara optimal pada zebrafish yang dipapar genistein 5 µM.
Kata kunci : genistein, motorik, reseptor estrogen, tirosin hidroksilase, zebrafish.
THE EFFECTS OF GENISTEIN EXPOSURE TOWARDS ZEBRAFISH ( Danio rerio ) MOTOR FUNCTION BY TYROSINE HYDROXYLASE AND ESTROGEN RECEPTORS EXPRESSION OBSERVATION

## Abstract
The  motor  is  affected  by  dopaminergic  neurons  in  the  brain,  whose  function  and  morphology maturation in early formation is  determined by estrogen levels.  Administration of high-dose genistein as a phytoestrogen in the early developmental stages causes inhibition of motor development in zebrafish. This study aims to prove the mechanism of action of genistein in dopaminergic neurons, through observation of tyrosine hydroxylase (TH) expression, tactile response, and locomotor tests on zebrafish embryos. Zebrafish embryos  are  divided  into  six  groups,  namely  control  (0.05%  DMSO),  5  µM  genistein  exposure,  10  µM genistein exposure, 182,780 ICI 182,780, µM genistein exposure, 5 µM genistein + 182,780 10 µM genistein exposure,  182,780  ICI  exposure  10  µM  and  observed  at  2,  24.48,  72.120  and  144  hpf  (hours  post- fertilization). Observations of TH expression were carried out at 48hpf, the tactile response at 72 hpf, and locomotor tests at 144 hpf. The results of this study indicate that administration of the ICI 182,780 estrogen antagonist  improves  TH  expression,  tactile  response,  and  optimal  locomotor  zebrafish  ability  in  zebrafish exposed to 5 μ M genistein, while higher doses of genistein exposure showed decreased performance.
Keywords : estrogen receptor, genistein, motor, tyrosine hydroxylase, zebrafish.
^ Departemen Anestesiologi dan Terapi Intensif, Fakultas Kedokteran, Universitas Brawijaya ** Departemen Radiologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Brawijaya

## Pendahuluan
Sistem  endokrin  memainkan  peran penting  dalam  semua  vertebrata  dan mengatur  fungsi  biologis  penting  sebagai metabolisme,  pengembangan,  reproduksi, dan  perilaku.  Namun,  paparan endocrine disrupting chemicals (EDCs) semakin banyak ditemukan. 1 Sebagian  besar  EDCs  bersifat lipofilik,  dapat  menembus  membran  sel,  dan bekerja  dalam  sel  melalui  reseptor intraselular. Suatu EDC dapat berikatan pada satu atau lebih reseptor hormon dan berperan sebagai  agonis,  antagonis,  maupun keduanya. Beberapa EDC dapat berpengaruh terhadap metabolisme dan degradasi hormon sehingga  mengubah  kemampuan  kerja hormon dalam suatu organisme. 1,2
Akhir-akhir  ini,  banyak  dilakukan penelitian  terkait  EDCs,  terutama  terkait perannya  melalui  jaras  reseptor  estrogen. EDCs  dapat  bersifat  antiestrogenik, androgenik,  antiandrogenik,  pengacau  tiroid, serta  bekerja  pada  reseptor  hormon membran.  EDCs  banyak  ditemukan  baik dalam bentuk sintetis maupun senyawa alami yang  berdampak  pada  kesehatan  dan lingkungan. Salah satu bentuk senyawa alami EDCs  adalah  genistein. 1 Genistein  (4′,5,7 - trihydroxyisoflavon)  merupakan  suatu isoflavon  yang  berasal  dari  kedelai  dan turunan  kedelai  yang  dikategorikan  sebagai fitoestrogen lemah.  Genistein  hingga  saat  ini merupakan senyawa fitoestrogen yang paling banyak  diteliti,  dan  ditemukan  bahwa senyawa ini memiliki aktivitas estrogenik dan antiestrogenik  pada  manusia,  rodensia,  dan ikan. 3,4
Pada  praktik  klinis,  genistein  memiliki peran  yang  penting  dalam  mencegah  atau sebagai  terapi  kanker,  osteoporosis, premenopause,  menurunkan  risiko  kanker tiroid, kanker kolorektal, kerusakan ginjal, dan penyakit  jantung.  Walaupun  penelitian terhadap  genistein  menunjukkan  bahwa senyawa  ini  merupakan  kompetitor  yang
sangat  kuat  bagi  estradiol  terhadap  reseptor estrogen  (ER). 4 Genistein  merupakan fitoestrogen dengan kemampuan transaktifasi yang paling tinggi terhadap reseptor estrogen, walaupun  afinitasnya  lebih  rendah  dari coumestrol ,  genistein  memiliki  struktur menyerupai  estrogen  dan  dapat  berikatan dengan reseptor estrogen (ER) α maupun β. Senyawa ini menunjukkan afinitas yang tinggi terhadap ER β hingga 9 kali lipat dibandingkan dengan  ER α pada  manusia.  Dari  struktur ikatan  genistein  dengan  estrorgen  reseptor, genistein  membentuk  ikatan  sebagai  partial agonis dari estrogen. 3,4
Zebrafish ( Danio rerio ) merupakan salah satu  spesies  yang  dikenalkan  oleh  Ankley dan  Johnson  (2004)  sebagai  model vertebrata  yang  dapat  digunakan  untuk mengidentifikasi  dan  menilai  efek  dari endocrine  disrupting  chemicals (EDCs) karena  embriogenesis  yang  cepat  dan memiliki  larva  yang  transparan  sehingga mudah  untuk  dievaluasi  serta  srtuktur  umum dan  domain  fungsi  dari  reseptor  estrogen serupa dengan manusia. 3-6
Paparan  genistein  dalam  dosis  tinggi dapat  menimbulkan  efek  teratogenik  pada embrio  zebrafish. Penelitian  terdahulu menunjukkan bahwa paparan genistein pada embrio  zebrafish  meningkatan  ekspresi mRNA  aromatase-B,  serta  menurunan ekspresi  tyrosine  hydroxylase  (TH)  pada neuron  dopaminergik  dari  larva  zebrafish. Penelitian  terdahulu  menunjukkan kemungkinan  genistein  bekerja  melalui reseptor  estrogen  dalam  mempengaruhi neuron dopaminergik. 4,7
Terdapat  berbagai  macam  modulator reseptor  estrogen  agonis,  antagonis,  dan selektif  yang  telah  digunakan  untuk memahami  lebih  baik  peran  dari  reseptor spesifik  dalam  berbagai  proses  fisiologis. Antiestrogen  tipe  I  seperti  ICI  182,780 merupakan suatu antagonis murni nonselektif yang  bekerja  dengan  menghambat  seluruh aktivitas estrogen pada semua jaringan.
Penelitian  terdahulu  menunjukkan  bahwa antagonis  reseptor  estrogen  ICI  182,780 mampu menghambat aktivasi transkripsi yang diinduksi  17 β -estradiol  (E2)  pada  zebrafish dalam semua isoform. 6,8
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  me- ngetahui  mekanisme  kerja  genistein  dan kombinasinya  dengan  ICI  182,780  terhadap fungsi  motorik  dengan  menggunakan zebrafish sebagai model.

## Bahan dan Metode

## Pemeliharaan Ikan dan Pengambilan Telur
Zebrafish  dewasa  dipelihara  pada akuarium  60  L,  dengan  suhu  air  25- 30  ˚C. Siklus  periode  terang  14  jam  dan  periode gelap 10 jam. Pengambilan telur dilakukan 15 -25 menit setelah periode terang dimulai. 7

## Kultur Embrio
Telur  yang  terfertilisasi  diletakkan  pada culture plate dengan 6 wells (30 embrio/8 mL embrio  medium/ plate ),  dan  diinkubasi  pada suhu  28±0,5  ˚C.  Paparan  dimulai  2  jam setelah  telur  terfertilisasi.  Kemudian, dibentuk enam kelompok, yaitu kontrol (DMSO 0,05%), paparan  genistein  5  µM,  paparan  genistein 10 µM, paparan ICI 182.780 10 µM, paparan genistein 5 µM + ICI 182.780 10 µM, paparan genistein  10  µM  +  ICI  182.780  10  µM. Pengamatan dilakukan pada 2, 24,48, 72,120 dan 144 hpf.

## Pengamatan Motorik
Pengamatan  motorik  dievaluasi  melalui defek  morfologi,  respons  taktil  dan  tes aktifitas lokomotor. Defek morfologi dievaluasi dengan  membandingkan  secara  visual morfologi  larva  yang  terpapar  genistein  dan genistein+ICI  dengan  kontrol  yang  dinilai pada  72  hpf.  Respons  taktil  dinilai  pada embrio  berumur  48  dan  72  hpf,  dengan melakukan  sentuhan  pada  ekor  embrio  yang diam  menggunakan  jarum.  Dihitung  jumlah embrio yang berenang melewati garis setelah
distimulasi. Tes aktifitas lokomotor dievaluasi pada  144  hpf  menggunakan culture plate dengan  12 wells yang  masing-masing  dibagi menjadi  empat  bagian.  Pengamatan dilakukan dengan merekam aktifitas zebrafish selama  1  menit,  dan  dihitung  jumlah  garis yang dilewati oleh larva zebrafish.

## Pengamatan Ekspresi Tirosin Hidroksilase
Embrio dikeluarkan dari cangkang pada 48 hpf, difiksasi dalam paraformaldehyde 4% pada  suhu  4  °C,  kemudian  disimpan  dalam methanol  100%  pada  -20  °C.    Dilanjutkan dengan  tahapan  permeabilisasi  embrio menggunakan aquades dan aceton selama 8 menit. Blocking menggunakan  1% normal goat  serum dan  3% bovine  serum  albumin . Antibodi  primer  TH  monoklonal  (immunostar #22941) digunakan dalam 1:1000 selama 24 jam  dan  antibodi  sekunder  Alexa  Fluor  488 Invitrogen  A11001  1:200  selama  2  jam. Embrio  difiksasi  pada  agarose  gel  1%  dan diamati  dengan  mikroskop  fluoresens Olympus  di  Laboratorium  Biologi,  FMIPA Universitas  Brawijaya,  kemudian  dianalisis dengan Image - J  software .  Dalam  meng- gunakan Image - J  software, hasil  gambar fluoresens  yang  dievaluasi  dikalibrasi  ke dalam  ukuran  pixel,  kemudian  dilakukan perhitungan  rata-rata  dari  hasil  masing- masing kelompok perlakuan.

## Hasil
Pada  penelitian  ini  embrio  zebrafish dibedakan berdasarkan enam kelompok yaitu kontrol  (DMSO  0,05%),  paparan  genistein  5 µM,  paparan  genistein  10  µM,  paparan  ICI 182.780 10 µM, paparan genistein 5 µM + ICI 182.780  10  µM,  paparan  genistein  10  µM  + ICI  182.780  10  µM  untuk  mengamati pengaruh  genistein  dan  kombinasinya dengan ICI 182.780 terhadap terjadinya defek morfologi  dan  aktivitas  motorik  melalui penilaian  pada  respons  taktil  dan  aktivitas lokomotor.

## Senyawa ICI 182.780 adalah blocker ER
– kompetetif  inhibitor,  yang  berfungsi  untuk mengurangi  efek  E2  endogen.  Kemudian, pada 72 hpf dilakukan pengamatan terhadap embrio.  Embrio  yang  dipapar  genistein sejak 2  hpf  menunjukkan  hambatan  pertumbuhan dibanding  kelompok  kontrol  (Gambar  1), terlihat  defek  morfologi  berupa  pembesaran perikardium,  tulang  belakang  tidak  terbentuk sempurna, dan dapat ditemukan embrio yang tidak  menetas.  Defek  morfologi  pada  embrio zebrafish  mulai  teramati  pada  paparan genestein  5  µM  dan  pada  dosis  10  µM
seluruh  embrio  mengalami  defek  morfologis (Gambar 2).
Pada evaluasi respons taktil didapatkan adanya  penurunan  respons  terhadap stimulasi  taktil  pada  embrio  yang  diam  yang dipapar  genistein,  dan  ditemukan peningkatan  respons  taktil  pada  kelompok yang  diberi  perlakuan  kombinasi  genistein  + ICI  182.780.  Penurunan  respons  taktil terbesar  didapatkan  pada  kelompok  paparan genistein 10 µM (14% dan 0% respons taktil pada  48  hpf  dan  72  hpf,  secara  berurutan) (Tabel 1).
A

## B

## Gambar 1. Embrio zebrafish pada 72 hpf.
Keterangan: (A) Embrio zebrafish yang tidak dipapar genistein, (B) Embrio yang dipapar genistein sejak
2  hpf  dan  dikeluarkan  dari  cangkang  secara  manual,  menunjukkan  adanya  defek morfologis.

## Gambar 2. Temuan defek morfologi berdasarkan dosis paparan genistein.
Keterangan: Paparan genistein pada embrio zebrafish dengan dosis 5 µM mulai menunjukkan terjadinya defek  morfologis,  sementara  pada  dosis  10  µM  seluruh  embrio  mengalami  defek morfologis.
Hasil  pengukuran  aktivitas  lokomotor pada  144  hpf  menunjukkan  terdapat penurunan  aktivitas  lokomotor  pada kelompok yang diberi paparan genistein baik 5 µM maupun 10 µM dibandingkan kelompok kontrol.  Kemudian,  penilaian  pada  kelompok paparan  genistein  yang  dikombinasi  dengan ICI  182.780  menunjukkan  peningkatan aktivitas lokomotor yang signifikan (p < 0,05) dibandingkan  kelompok  yang  tidak dikombinasi dengan ICI (Tabel 2).
Sementara,  pada  Gambar  3  diketahui hasil  pengamatan  ekspresi  TH  dari  embrio berusia  48  hpf  didapatkan  penurunan ekspresi  TH  pada  kelompok  yang  terpapar genistein dibandingkan kelompok kontrol (p < 0,05).  Sementara  pada  kelompok  kombinasi genistein  dan  ICI  menunjukkan  ekspresi  TH yang  lebih  tinggi  dibandingkan  pada kelompok genistein saja (Tabel 3).
Tabel 1. Rata-rata jumlah embrio zebrafish dengan respons taktil pasca stimulasi Kelompok (48 hpf)+SD (72 hpf +SD Nilai p Kontrol 43,67+1,20 44,67+0,67 0,000 Genistein 5 µM 40,33+2,03 43+1,00 Genistein 10 µM 7+3,79 0 ICI 182.780 39,67+0,67 42+1,15 ICI 182.780 + Genistein 5 µM 39,67+0,33 41,3+0,33 ICI 182.780  + Genistein 10 µM 34,33+1,45 33,67+1,76 Tabel 2. Rata-rata hasil pengukuran aktivitas lokomotor embrio zebrafish (144 hpf) Kelompok Aktivitas lokomotor+SD Nilai p Kontrol 10,18+1,10 0,000 Genistein 5 µM 6,5+0,89 Genistein 10 µM 0 ICI 182.780 9,58+0,87 ICI 182.780  + Genistein 5 µM 8,61+1,43 ICI 182.780 + Genistein 10 µM 4,26 + 0,79
Gambar 3. Ekspresi tirosin hidroksilase pada embrio zebrafish berusia 48 hpf pasca perlakuan. Keterangan: a. kontrol positif; b. paparan genistein 5 µM; c. paparan genistein 10 µM ; d. paparan ICI 182.780 10 µM; e. paparan ICI 182.780 10 µM + genistein 5 µM; f. paparan ICI 182.780 10 µM + genistein 10 µM.
Tabel 3. Rata-rata ekspresi tirosin hidroksilase pada embrio zebrafish 48 hpf Kelompok Ekspresi TH + SD Nilai p Kontrol 58,99+0,32 0,000 Genistein 5 µM 48,15+0,57 Genistein 10 µM 44,31+3,11 ICI 182.780 56,18+1,61 ICI 182.780 + Genistein 5 µM 53,61+1,09 ICI 182.780 + Genistein 10 µM 49,69+1,30

## Pembahasan
Hasil pengamatan didapatkan hambatan pertumbuhan  pada  kelompok  embrio  yang dipapar  genistein  mulai  dosis  5  µM  yang terlihat sebagai defek morfologi dibandingkan dengan  kelompok  kontrol.  Hasil  tersebut memperkuat  dugaan  tentang  paparan genistein  pada  dosis  tertentu  yang  bersifat teratogenik  pada  embrio zebrafish.  Senyawa ICI  182.780  merupakan  suatu  antiestrogen murni  yang  bekerja  dengan  mengikat reseptor  estrogen,  baik  ER α maupun  ER β , bersifat  inhibitor  kompetitif  bagi  senyawa estrogen dan turunannya. 17 Hal ini kemudian mengakibatkan  penurunan  aktivitas  senyawa estrogen,  baik  estrogen  endogen  maupun eksogen seperti genistein.
Penelitian terdahulu menemukan bahwa toksisitas  genistein  terhadap  perkembangan embrio  zebrafish  bergantung  pada konsentrasi  dan  waktu  paparan,  pada  dosis genistein  10  mg/L  merupakan  dosis  letal untuk embrio dan paparan genistein  5 mg/L menyebabkan  penurunan  dalam  ke- langsungan  hidup  dalam  24  hpf  diikuti  oleh kematian 100%  embrio pada 72 hpf. 9
Bukti lain menunjukkan bahwa lebih dari 60%  embrio  zebrafish  yang  diberi  paparan genistein 6,75 mg/L pada 24 hpf hanya dapat bertahan hidup hingga 84 hpf. Sementara itu, 90%  embrio  yang  diberi  paparan  genistein 4,7  mg/L  mampu  bertahan  hidup  hingga  96 hpf  dan  tidak  ditemukan  efek  paparan genistein  terhadap  embrio  zebrafish  pada dosis ≤2,7 mg/L. 10
Terjadi  penurunan  sebesar  43%,  12% dan  0%  terhadap  keberhasilan  per- kembangan  embrio  zebrafish  pada  paparan genistein dengan  konsentrasi  6,75,  13,5  dan 27  mg/L.  Gangguan  pertumbuhan  maupun diferensiasi  sel  dapat  terjadi  akibat keterlibatan  genistein  dalam  regulasi  siklus sel,  antiangiogenesis,  serta  aktivitas antioksidan. 11
Genistein  memiliki  kemampuan  untuk menyebabkan  apoptosis  di  otak  dan perubahan  ukuran  kepala  dan  warna  kulit. Pada  embrio  zebrafish  dapat  terjadi  defek morfologis  atau  perilaku.  Perubahan morfologi  lain  yang  diamati  pada  larva  yang diberi  perlakuan  genistein  adalah  perubahan morfologi  jantung  dan  penurunan  detak jantung. 7 Perubahan  morfologi  yang disebabkan  oleh  genistein  pada  embrio zebrafish  termasuk  penurunan  tingkat pigmentasi tubuh. Efek genistein pada suplai nutrisi  berkurang  ke  organ  yang  sedang berkembang,  seperti  kulit.  Ini  menyebabkan juga  adanya  pembesaran  ekstensi  kuning telur  dan  pembentukan  pembuluh  darah. 12 Ciri  lain  yang  diberi  perlakuan  genistein adalah  adanya  malformasi  ekor.  Konsentrasi genistein  yang  menyebabkan  efek  ini  (≥2,5 mg/L)  juga  menyebabkan  malformasi  sumbu tubuh. 9 Hal  ini  dapat  menjelaskan  alasan mengapa pada penelitian ini embrio zebrafish yang dipapar genistein mengalami gangguan respons  taktil dan aktivitas lokomotor seperti yang  diamati  pada  penelitian  ini,  dan pemberian  ICI  182.780  sebagai  antagonis murni  dari  reseptor  estrogen  memberikan perbaikan hasil pengamatan.
Keterlibatan  reseptor  estrogen  dalam sinyal  estrogen  pada  embrio  zebrafish menunjukkan  bahwa  jalur  reseptor  estrogen tergantung  oleh  banyak  faktor  yang  mungkin juga  dipengaruhi  oleh  senyawa  estrogenik. Dalam  konteks  ini,  neuron  gonadotropin- releasing-hormone  (GnRH)  penting  sebagai target hormon steroid dan menurut penelitian terbaru  menyebutkan  ontogeni  neuron (GnRH)  dapat  dimodifikasi  dalam ketergantungan  reseptor  estrogen  setelah paparan  EE2.    Oleh  karena  neuron  GnRH juga  pengatur  penting  perkembangan  gonad dan  diferensiasi  seksual,  maka    disregulasi neuron  GnRH  dapat  menyebabkan  efek reproduktif  yang  berat  pada  zebrafish dewasa. 13
Secara  khusus  di  zebrafish,  jaras estrogenik dan dopaminergik terkait erat pada vertebrata,  melalui  sumbu  hipotalamus- hipofisis-gonad  (HPG).  Dopaminergik  neuron diaktivasi  oleh  peningkatan  konsentrasi  E2, yang  selanjutnya  menghambat  pelepasan hormon  pelepas  gonadotropin  (GnRH),  dan hormon  gonadotropin  (GtH),  keduanya disintesis  oleh  hipotalamus  dan  hipofisis. Dopamin  disintesis  dari  tirosin  oleh  tirosin hidroksilase  (TH)  yang  merupakan  enzim langkah pembatas laju dalam biosintesis DA. Pensinyalan  estrogenik  terutama  terjadi melalui aktivasi ER. 14,15
Selain  memiliki  efek  estrogenik, genistein  juga  memiliki  efek  antioksidan  dan memiliki  kemampuan  untuk  menghambat tirosin  hidroksilase  yang  berakibat  pada penurunan  aktivitas  motorik.  Namun, pemberian kombinasi ICI 182.780 berlawanan dengan efek yang ditimbulkan genistein, yang mengindikasikan  bahwa  aktivitas  genistein berkaitan dengan reseptor estrogen. 16
Bukti  penelitian  di  atas  mendukung temuan  penelitian  ini  bahwa  paparan genistein  memiliki  efek  terhadap  terjadinya penurunan  ekspresi  TH  dan  ICI  182.780 berperan  sebagai  antagonis  dari  efek genistein.

## Kesimpulan
Kesimpulan  penelitian  ini  adalah semakin tinggi dosis paparan genistein maka semakin  besar  gangguan  yang  ditimbulkan terkait  aktivitas  motorik zebrafish,  baik  akibat terjadinya  defek  morfologis  maupun penurunan aktivitas neuron dopaminergik dari zebrafish.  Selain  itu,  juga  dibuktikan  bahwa ICI 182.780 sebagai antagonis murni reseptor estrogen  nonselektif  dapat  mengurangi gangguan  yang  timbul  akibat  paparan genistein.

## Daftar Pustaka
1.  Gore  AC,  Krishnan  K,  Reilly  MP. Endocrine-Disrupting  Chemicals:  Effects on  Neuroendocrine  Systems  and  the Neurobiology  of  Social  Behavior. Hormones and Behaviour . 2019; 111:7-22. DOI: 10.1016/j.yhbeh.2018.11.006. 2.  Balaguer  P,  Delfosse  V,  Grimaldi  M,
Bourguet  W,  Structural  and  Functional Evidences  for  the  Interactions  between Nuclear  Hormone  Receptors  and Endocrine  Disruptors  at  Low  Doses. Comptes Rendus Biologies . 2017; 340:412 -420.
3. Schiller  V,  Wichmann  A,  Kriehuber  R, Muth-Kohne  E,  Giesy  JP,  Hecker  M, Fenske  M.  Studying  the  Effects  of Genistein  on  Gene  Expression  of  Fish Embryos  as  an  Alternative  Testing Approach  for  Endocrine  Disruption. Comparative Biochemistry and Physiology Part  C:  Toxicology  and  Pharmacology. 2013; 157:41-53.
4.  Licata P, Tardugno R, Pergolizzi S, Capillo G,  Aragona  M,  Colombo  A,  Gervasi  T, Pellizzeri  V,  Cicero  N,  Calo  M.  In  Vivo Effects  of  PCB-126  and  Genistein  on
Vitellogenin  Expression  in  Zebrafish.
Natural  Product  Research .  2019;  33 ( 1 7 ) : 2 5 0 7 - 2 5 1 4 . D O I : 10.1080/14786419.2018.1455048.
5.  Zielinska  KA.,  The  Influence  of Environmental  Estrogens  on  Early-Life Stage  Zebrafish  Development.  Doctoral Thesis.  Galway  Ireland:  National University  of  Ireland.  2013.  Retrieved from http://hdl.handle.net/10379/3569.
6.  Notch  EG  &  Mayer  GD.  Efficacy  of Pharmacological  Estrogen  Receptor Antagonists  in  Blocking  Activation  of Zebrafish  Estrogen  Receptors. General and  Comparative  Endocrinology. 2011; 173:183 – 189.
7.  Aurora  H,  Lyrawati  D.  Efek  Waktu P a p a r a n   G e n i s t e i n   t e r h a d a p Pembentukan  Jantung  Embrio  Zebrafish. Jurnal  Kedokteran  Brawijaya .  2014;  28
(1):22-25.
8.  Lam SH, Lee SGP, Lin CY, Thomsen JS, Fu  PY,  Murthy  KRK,  Li  H,  Govindarajan KR,  Nick    LCH,  Bourque  G,  Gong  Z, Lufkin  T,  Liu  ET,  Mathavan S.  Molecular Conservation  of  Estrogen-Response Associated  with  Cell  Cycle  Regulation, Hormonal  Carcinogenesis  and  Cancer  in Zebrafish and Human Cancer Cell Lines. BMC  Medical  Genomics. 2011;  4(41):1- 15.
9.  Sarasquete  C,  Úbeda-Manzanaro  M  & Ortiz-Delgado  JB.  Effects  of  the Isoflavone Genistein  in  Early Life  Stages of  the  Senegalesesole, Solea senegalensis :  Role  of  the  Surviving  and
Proliferation  Versus  Apoptosis Pathways. BMC  Vet  Res .  2018;  14 : 16.
DOI: doi.org/10.1186/s12917-018-1333-3. 10.  Sassi-Messai  S,  Gibert  Y,  Bernard  L,
Nishio  S,  Ferri  Lagneau  KF,  Molina  J, Andersson-Lendahl    M,  Benoit  G, Balaguer  P,  &  Laudet  V.  The Phytoestrogen  Genistein  Affects Zebrafish  Development  through  Two Different  Pathways. PloS  One .  2009;  4
(3):e4935.  DOI:  doi.org/10.1371/ journal.pone.0004935.
11.  Kim DJ, Seok SH, Baek MW, Lee HY, Na YR,  Park  SH,  Lee  HK,  Dutta  NK,
Kawakami  K,  Park  JH.    Developmental Toxicity  and  Brain  Aromatase  Induction by  High  Genistein  Concentrations  in Zebrafish  Embryos. Toxicology
Mechanisms  and  Methods .  2009;  19
(3):251256,  DOI:  10.1080/153765108025
3330.
12.  Bakkiyanathan A, Joseph AM, Tharani L, Malathi  R.  Genistein,  the  Phytoestrogen Induces Heart-and-Soul (has) Phenotypes in  Zebrafish  Embryo. Journal  of Developmental  Biology  and  Tissue Engineering . 2010; 2(2):18-22. 13.  Brown  AC,  Stevenson  LM,  Leonard  HM,
Nieves-Puigdoller  K,  Clotfelter  ED.
Phytoestrogens β -Sitosterol  and Genistein  have  Limited  Effects  on Reproductive  Endpoints  in  a  Female Fish,  Betta  Splendens. Biomed  Res  Int . 2014; 2014:681396.
14.  Vosges  M,  Kah  O,  Hinfray  N,  Chadili  E,
Le  Page  Y,  Combarnous  Y, Porcher JM, Brion  F.  17 α -Ethinylestradiol  and Nonylphenol  Affect  the  Development  of Forebrain  GnRH  Neurons  through  an Estrogen  Receptor-Dependent  Pathway. Reprod. Toxicol . 2012; 33 (2):198 – 204.
15.  Bertotto LB, Dasgupta S, Vliet S, Dudley S, Gan J, Voiz DC, Schlenk D. Evaluation of  the  Estrogen  Receptor  Alpha  as  a Possible Target of Bifenthrin Effects in the Estrogenic  and  Dopaminergic  Signaling Pathways in Zebrafish Embryos. Sci Total Environ . 2019; 651 (2): 2424-2431.
16.  Kyuhou S. Preventive Effects of Genistein on  Motor  Dysfunction  Following  6- Hydroxydopamine  Injection  in Ovariectomized  Rats. Neuroscience Letters . 2008; 448:10 – 14.
17.  Song  Z,  Yang  H,  Peckham  EM,  Becker JB.  Estradiol-Induced  Potentiation  of Dopamine  Release  in  Dorsal  Striatum Following  Amphetamine  Administration Requires Estradiol Receptors and mGlu5. E Neuro . 2019; 6(1): e0446-18.2019 1 – 8.