Journal of Aquaculture and Fish Health Vol. 9(3) - September 2020 DOI : 10.20473/jafh.v9i3.16015

## Kombinasi Ekstender Larutan Sari Kurma ( Phoenix dactylifera ) dan Ringer Laktat dalam Kualitas Spermatozoa Beberapa Ikan Air Tawar
Extender Combination of Date Palm Juice ( Phoenix dactylifera ) and Lactatic Ringer on Spermatozoa Quality of Freshwater Fish
Fani Fariedah 1* dan Maheno Sri Widodo 1
1 Program Studi Budidaya Perairan, Jurusan Manajemen Sumbedaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Brawijaya, Jl. Veteran, Malang 65141, Indonesia

## Abstrak
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  pengaruh kombinasi larutan ekstender kurma dan ringer laktat terhadap kualitas  spermatozoa  beberapa  ikan  air  tawar  dalam  proses pengawetan  spermatozoa.  Proses  pengawetan  sperma tergantung  pada  nutrisi  yang  disediakan  oleh  bahan ekstender.  Ringer  laktat  telah  digunakan  sebagai  ekstender dalam  proses  pengawetan  sperma  yang  berguna  sebagai penyedia energi. Energi lain dapat diperoleh dari bahan yang mengandung  fruktosa  atau  glukosa.  Sari  kurma  merupakan salah  satu  bahan  yang  memiliki  kandungan  fruktosa  dan glukosa  yang  diharapkan  dapat  membantu  memberikan energi  bagi  sperma  selama  proses  pengawetan  sperma. Penelitian ini melakukan percobaan pengawetan sperma dari beberapa ikan air tawar ikan mas ( Carassius auratus ), ikan lele siam  ( Pangasius  hypophthalmus ),  dan  Koi  ( Cyprinus  carpio ) menggunakan  ekstender  yang  dibuat  dalam  kombinasi  dari ringer  laktat  dan  larutan  sari  kurma.  Penelitian  ini menggunakan berbagai konsentrasi ekstrak kurma yaitu 0,5%, 1%, 2,5%, 2% menggunakan desain rancangan acak kelompok dengan ikan sebagai kelompok. Hasil penelitian menunjukkan bahwa rata-rata motilitas ikan patin mencapai nilai tertinggi (52,00%) sedangkan rata-rata laju fertilisasi tertinggi terjadi pada spermatozoa ikan mas dengan nilai 97,06%. Larutan sari kurma mampu memberikan nutrisi pada spermatozoa selama proses pengawetan karena kurma mengandung fruktosa dan glukosa  sehingga  spermatozoa  yang  diawetkan  tetap  dapat membuahi secara normal.

## Abstract
This  study  aims  to  determine  the  effect  of  the  extender combination of dates and ringer lactate extracts on the quality of  spermatozoa  of  some  freshwater  fish  in  the  process  of preserving  spermatozoa.  The  process  of  sperm  preservation depends on the nutrients provided by the extender material.
*Correspondence : fanifariedah@ub.ac.id
Received : 2019-11-06 Accepted : 2020-05-29
Kata Kunci : Larutan sari kurma, Ringer laktat, Ekstender, Spermatozoa, Ikan air tawar
Keywords : Date palm solution, Ringer lactatic, Extender, Spermatozoa, Freshwater fish
Ringer lactate has been used as an extender in the process of preserving sperm which is useful as an energy provider. Other energy can be obtained from materials that contain fructose or glucose. Date palm juice is one ingredient that has a fructose and glucose content that is expected to help provide energy for  sperm  during  the  process  of  sperm  preservation.  In  this study  an  experiment  of  sperm  preservation  of  several freshwater  fishes  carp  ( Carassius  auratus ),  Siamese  catfish ( Pangasius  hypophthalmus ),  and  Koi ( Cyprinus carpio )  using an extender made in combination from ringer lactate and date palm solution. This study used different concentrations of date extracts  i.e.  0.5%,  1%,  2.5%,  2%  used  randomized  group design with fish as group. The results showed that the average of the Siamese’s motility achieved the highest value (52,00%) while the highest average fertilization rate occurred on Carp spermatozoa with a value of 97,06%. Palm juice solution can provide nutrients to the spermatozoa during the preservation process  because  the  juice  of  dates  contains  fructose  and glucose  so  that  preserved  spermatozoa  can  still  fertilize normally.

## PENDAHULUAN
Permasalahan  yang  terjadi  pada pemijahan  ikan,  baik  secara  alami  dan buatan  adalah  pematangan  gamet  yang kadang  tidak  terjadi  secara  bersamaan. Hal tersebut secara langsung berpengaruh pada  ketersediaan  benih  di  kalangan pembudidaya baik ikan hias maupun ikan konsumsi.  Permasalahan  tersebut  selama ini  dapat  dipecahkan  melalui  teknik pengawetan  sperma  dengan  menyimpan pada suhu dingin untuk mempertahankan kualitas  sperma  dengan  didukung  bahan yang  dapat  mempertahankan  kehidupan dan  mengurangi  aktivitas  spermatozoa. Menurut  Salisbury et  al. (1985),  energi yang  dibutuhkan  oleh  spermatozoa disediakan oleh gula sederhana (monosakarida)  seperti  fruktosa  dan glukosa. Salah satu bahan yang memenuhi kriteria  sebagai  bahan  tambahan  dalam larutan  pengencer  sperma  adalah  sari kurma ( Phoenix dactylifera ).
Widyaningsih  (2016)  sebelumnya telah  melakukan  penelitian  tentang penggunaan larutan sari kurma terhadap viabilitas dan motilitas spermatozoa ikan nilem  ( Oseteocilus  hasseltii  Valenciennes ), namun belum ada informasi penggunaan larutan  sari  kurma  pada  proses pengawetan  spermatozoa  ikan  mas,  ikan
lele,  dan  ikan  koi,  sehingga  perlu dilakukan penelitian tentang penggunaan larutan  sari  kurma  pada  proses pengawetan  spermatozoa  ikan  mas,  ikan lele, dan ikan koi.
Prinsip  kerja  pengawetan  sperma pada  dasarnya  adalah  pengenceran  dan penyimpanan  pada  suhu  dingin.  Dalam hal  ini  membutuhkan  bahan  yang  dapat mempertahankan kehidupan dan mengurangi aktivitas spermatozoa.
Menurut  Salisbury et  al. (1985), penambahan fruktosa atau glukosa dalam pengencer  berguna  untuk  mendukung proses pembentukan Adenosine Triphosphate (ATP)  dan Adenosine Diphosphate (ADP) yang harus berlangsung. Selain itu, media
penyimpanan  harus  mampu  memberikan sifat  penyangga  ( buffer )  dan  dapat melindungi  sperma  terhadap cold  shock agar  keadaan  sperma  tetap  stabil.  Salah satu  bahan  yang  memenuhi  kriteria sebagai  bahan  tambahan  dalam  larutan pengencer  sperma  adalah  sari  kurma ( Phoenix dactylifera ).
Menurut  Retnowati  dan  Kusnadi (2013),  buah  kurma  mengandung komponen yang sebagian besar merupakan gula pereduksi, yaitu glukosa
dan  fruktosa  20-70%  (bobot  kering) sehingga dapat digunakan sebagai sumber energi pada sperma untuk tetap bertahan hidup pada larutan pengencer.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui pengaruh ekstender
kombinasi  larutan  sari  kurma  dan  ringer laktat  terhadap  kualitas  spermatozoa beberapa  ikan  air  tawar  dalam  proses pengawetan spermatozoa.

## METODOLOGI Waktu dan Tempat
Penelitian  ini  dilaksanakan  di Fakultas Perikanan dan Kelautan
Universitas Brawijaya.

## Materi Penelitian
Alat-alat  yang  digunakan  dalam penelitian ini adalah mikroskop binokuler, gelas  objek,  gelas  penutup,  termometer Hg, beaker  glass 250  ml,  spuit  1  ml, handtally  counter ,  timbangan  digital analitik, gelas ukur, lap basah, micropipette , haemocytometer ,  ember plastik,  aerator  set,  pH paper ,  nampan, heater ,  lemari  pendingin  (suhu  5˚C), inkubator,  kolam,  bulu  ayam,  seser,  dan rak microtube .
Bahan-  bahan  yang  digunakan dalam  penelitian  ini  adalah induk  jantan dan  betina  ikan  mas  koki  ( C.  auratus ), ikan patin siam ( P. hypophthalmus ), ikan koi  ( C.  rubrofuscus ),  ringer  laktat, akuades,  air,  sari  buah  kurma  ( P. dactylifera ), NaCl Fisiologis, alkohol 70%, kertas label, dan hormon reproduksi.

## Rancangan Penelitian
Metode  penelitian  yang  digunakan adalah  metode  eksperimental  dengan Rancangan  Acak  Kelompok  dengan  tiga kelompok (ikan mas koki, ikan patin siam, dan ikan koi), empat perlakuan sari kurma (0,5%;  1%;  1,5%;  dan  2%)  yang kemudian  dibandingkan  dengan  kontrol pada masing-masing kelompok.

## Prosedur Kerja
Kolam yang akan digunakan sebagai wadah  untuk  pemeliharaan  indukan
disiapkan  dan  dibersihkan  kemudian dikeringkan  kemudian  diisi  dengan  air bersih  dengan  ketinggian ¾ dari  tinggi kolam.  Indukan  yang  akan  digunakan dilakukan  induksi  kematangan  gonad terlebih  dahulu  dengan  menggunakan ovaprim  dengan  dosis  0,5  ml/kg  pada bagian intramuskuler. Perbandingan dosis hormon  ovaprim  dengan  NaCl  fisiologis adalah 1: 1.
Indukan  yang  sudah  diinduksi kemudian diseleksi dengan cara mengurut bagian  perut  menuju  ke  bagian  lubang urogenital  apakah  mengeluarkan  cairan putih  kental.  Untuk  indukan  betina dilakukan  cara  yang  sama  apakah mengeluarkan telur yang matang  ditandai dengan  telur  berwarna  oranye.  Indukan yang  sudah  diseleksi  kemudian  di stripping untuk mengeluarkan sperma dan telur.
Tabung eppendorf 2 ml diisi dengan 0.1  ml  sperma  dari  masing-masing  ikan dan  0.9  ml  ringer  laktat  tanpa  ditambah sari kurma dengan perbandingan sperma dan ringer laktat 1:9 dan disimpan dalam rak pendingin dengan suhu 5°C.
Pembuatan ekstender kombinasi sari kurma  dan  ringer  laktat  disesuaikan berdasarkan  perlakuan  yang  telah ditetapkan.  Dosis  sari  kurma  yang ditambahkan  ke  dalam  larutan  ringer laktat  adalah  0.5%,  1%,  1.5%  dan  2%. Sperma  dimasukkan  ke  dalam  tabung eppendorf berisi  ekstender  dengan perbandingan sperma dan ekstender yaitu 1:9.
Induk  betina  ikan  mas  koki,  patin siam  dan  koi  yang  telah  dipilih  diambil dari  kolam  kemudian  ditimbang  dan diukur  berat  dan  panjangnya.  Induk betina kemudian disuntik dengan ovaprim dengan  dosis  0.5  ml/kg  pada  bagian intramuskuler . Perbandingan pengenceran hormon  ovaprim  dengan  NaCl  fisiologis adalah  1:1.  Induk  betina  yang  sudah disuntik  dengan  ovaprim  kemudian  di stripping ketika  waktu latency  time habis 9&-12  jam  setelah  penyuntikan).  Telur hasil  s tripping ditempatkan  pada  cawan arloji  dengan  jumlah  yang  sama  untuk dilakukan fertilisasi. Dilakukan
pengamatan pada telur yang terfertilisasi dan yang tidak terfertilisasi dan dihitung persentase  telur  yang  terfertilisasi  dan yang tidak terfertilisasi.

## Analisis Data
Perhitungan  motilitas  spermatozoa dilakukan  dengan  dua cara  yaitu   secara massa  atau  kelompok  dan  individu.
Perhitungan motilitas spermatozoa mengacu pada penelitian yang dilakukan oleh  Sartoyo  (2005),  yaitu  dengan menghitung  secara  visual  dan  hasilnya dinyatakan  dalam  perbandingan  antara spermatozoa  yang  hidup  dan  yang  mati. Satu tetes sperma diletakkan di atas objek glass dan ditutup dengan cover glass dan diamati  di  bawah  mikroskop  dengan pembesaran  400x,  setelah  mendapatkan fokus  di  bawah  mikroskop  kemudian diteteskan  air  untuk  memicu  motilitas spermatozoa.
Motilitas = Spermatozoa motil Total spermatozoa x100%
Daya  fertilisasi  adalah  kemampuan sel telur dan sel sperma untuk melakukan fertilisasi.  Fertilisasi  adalah  proses bertemunya sel telur dan sel spermatozoa. Spermatozoa yang sudah diberi perlakuan kemudian  dicampurkan  dengan  sel  telur pada  cawan  petri.  Telur  pada  masing- masing wadah diamati dengan ketentuan: telur  berwarna  putih  bening  (fertil),
sedangkan  yang  berwarna  putih  keruh (infertil).  Untuk  menentukan  nilai persentase  laju  fertilisasi  menggunakan rumus:
FR = 78 9: 𝑥100% atau FR = 78 7<8 𝑥100% Keterangan : FR   : Daya Fertilisasi Tf : Telur terfertilisasi
Nt : Jumlah telur yang ditebar Tnf  : Telur tidak terfertilisasi

## HASIL DAN PEMBAHASAN Motilitas
Motilitas  merupakan  kemampuan gerak  maju  spermatozoa  di  dalam lingkungan  zat  cair.  Pergerakan  tersebut penting  dalam  membantu  spermatozoa menembus  sel-sel  pelindung  yang mengelilingi sel telur (Sujoko et al. , 2009). Dosis  kombinasi  larutan  sari  kurma  dan ringer laktat menunjukkan pengaruh pada motilitas  dengan  F  hit  55,06>F  tab  1%, kelompok  ikan  juga  terlihat  memberikan pengaruh  pada  motilitas  dengan  F  hit 303,39>F  tab  1%.  Hal  tersebut memberikan
pengertian bahwa penyimpanan spermatozoa dengan menggunakan ekstender kombinasi larutan sari kurma dan ringer laktat bisa dilakukan meskipun ada penurunan daya motilitas  pada  spermatozoa  ikan  yang digunakan  sebagai  hewan  coba  (Gambar 1).
Gambar 1.  Pengaruh  ekstender  terhadap  motilitas  sperma  ikan  koi,  mas  koki,  dan  patin siam.
Kemampuan  spermatozoa  untuk tetap  menghasilkan  daya  motilitas didukung  oleh  larutan  sari  kurma  dan ringer  laktat  pada  kombinasi  ekstender dalam  pengawetan  sperma.  Sari  kurma
yang  digunakan  sebagai  ekstender kombinasi  mampu  menyediakan  energi selama pengawetan
spermatozoa berlangsung,  seperti  yang  dikatakan Adipu et  al .  (2011), bahwa  di  luar  testis
0 10 20 30 40 50 60 70 0.5 1 1.5 2 mo ti li ta s (%) Dosis Larutan Sari Kurma (%) C. auratus Siamese catfish C. carpio
spermatozoa  mampu  memakai  sumber energi  dari  luar  untuk  melanjutkan hidupnya.  Bahan  utama  yang  dipakai sebagai  sumber  energi  dari  luar  adalah fruktosa yang akan diubah menjadi asam laktat  dan  energi  dalam  bentuk  ATP dengan  bantuan  enzim  fruktosilin. Pemberian  larutan  fruktosa  sebagai pengencer  untuk  spermatozoa  ikan dimaksudkan  untuk  memberikan  energi dan  nutrisi  untuk  spermatozoa  ikan  agar dengan energi yang berupa ATP tersebut dapat meningkatkan atau memperpanjang waktu motillitas dan viabilitas spermatozoa. Menurut  Arsetyo et  al. (2012),
nutrisi yang berupa glukosa dan fruktosa yang akan dipakai sebagai sumber energi yang berguna untuk menjaga
kelangsungan  hidup  dan  motilitas spermatozoa.  Dalam  keadaan  normal energi  yang  dilepaskan  dapat  dipakai sebagai energi mekanik (pergerakan) atau sebagai  energi  kimiawi  (biosintesis),  jika tidak  dipergunakan  akan  menghilang sebagai panas. Apabila persediaan energi habis, maka kontraksi fibril-fibril spermatozoa akan terhenti dan spermatozoa  tidak  bergerak.  Untuk melangsungkan pergerakan kembali, ATP dan ADP harus disintesis kembali dengan penambahan  gugusan  fosforil  yang membutuhkan  sumber  energi  dari  luar. metabolisme  gula  sederhana  ini  melalui respirasi  sel  spermatozoa  menghasilkan ATP.
Nilai  motilitas  pada  ikan  Mas  Koki mengalami  penurunan  paling  banyak dibandingkan  dengan  spermatozoa  pada kedua  ikan  yang  lain  meskipun  tidak terlalu  berbeda  hal  ini  sesuai  dengan penelitian  yang  dilakukan  oleh  Sunarma et  al. (2008)  bahwa  pengawetan spermatozoa pada ikan Mas Koki dengan menggunakan  glukosa  sebagai  bahan ekstender  mengalami  penurunan  daya motilitas, dengan mengacu pada Babiak et al. (2001)  bahwa  ekstender  berbahan dasar  ion-ion  garam  lebih  mampu mempertahankan motilitas daripada ekstender  berbahan  glukosa,  sejalan dengan  yang  disampaikan  oleh  Sutoyo
(2000)  bahwa  media  pengencer  harus bersifat isotonik terhadap sperma.
Larutan  pengencer  yang  bersifat hipotonik  ataupun  hipertonik  akan mempengaruhi menergilisme spermatozoa.  Khususnya  sel  bersifat semipermeabel, sehingga
larutan pengencer  baik  yang  bersifat  hipotonik maupun  hipertonik  akan  mempengaruhi transfer  air  melalui  metabolisme  sel  dan menyebabkan rusaknya integritas sel yang kemudian  menyebabkan  kematian  pada spermatozoa.
Fertilisasi
Pembuahan  atau  disebut  juga dengan fertilisasi adalah proses bergabungnya inti sperma dengan inti sel telur dalam sitoplasma sehingga membentuk zigot. Pada dasarnya fertilisasi merupakan penyatuan atau fusi sel  gamet  jantan  dan  sel  gamet  betina untuk  membentuk  satu  sel  (zigot) (Affandi dan Tang, 2000).
Menurut  Lesmana  dan  Dermawan (2001), masuknya spermatozoa ke dalam sel  telur  melalui  mikrofil dan  bergabung dengan  inti  sel  telur  merupakan  proses pembuahan  atau  fertilisasi.  Bersatu  atau fusi  dari  inti  sel  jantan  yang  haploid  (n) dan berada dalam sperma dengan inti sel telur  yang  juga  haploid  (n)  ini  akan menjadikan  sel  pertama  somatis  yang diploid (2n) dan disebut zigot. Proses ini akan  memacu  proses-proses  selanjutnya yaitu  tumbuhnya  badan-badan  atau kutub-kutub polar sel yang nantinya akan berkembang menjadi embrio.
Kombinasi  ekstender  larutan  sari kurma dan ringer laktat tidak memberikan pengaruh  terhadap  daya  fertilisasi  pada spermatozoa kelompok ikan yang
dicobakan  dengan  F  tab  4,30<F  Hit  5%, namun kelompok ikan terlihat memberikan  pengaruh  terhadap  daya fertilisasi dengan F Hit 33,97>F tab 1%. Hal  tersebut  memberikan  pengertian bahwa  ekstender  sari  kurma  dan  ringer laktat  sekalipun  dapat  dijadikan  sebagai penyedia  nutrisi  untuk  spermatozoa selama  proses  pengawetan  namun  tidak
berpengaruh  pada  keberhasilan  daya fertilisasi. Kelompok ikan koki mempunyai laju  fertilisasi  tertinggi  (97,23%)  diikuti dengan  kelompok  patin  siam  (88,66%),
dan  laju  fertilisasi  paling  rendah dihasilkan  oleh  kelompok  ikan  koi  yaitu 80,09% (Gambar 2).
Gambar 2.  Daya  fertilisasi  spermatozoa  ikan  koi,  mas  koki,  dan  patin  siam  yang  telah diawetkan dengan ekstender kombinasi larutan sari kurma dan ringer laktat.
Nutrisi yang diberikan oleh larutan sari  kurma  berasal  dari  glukosa  dan fruktosa  sekitar  20-70%  (bobot  kering). Sehingga buah kurma mudah dicerna dan cepat  mengganti  energi  yang  hilang (Retnowati dan Kusnadi, 2013). Menurut Hidayaturrahmah  (2018),  bahan  utama yang dipakai spermatozoa sebagai sumber energi dari luar testis adalah fruktosa yang diubah  menjadi  asam  laktat  dan  energi dengan  bantuan  enzim  fruktolisin  dalam proses glikolisis gula sederhana (monosakarida)  yang  dibutuhkan  oleh spermatozoa untuk menjaga kelangsungan hidupnya. Kurniawan et al. (2013) menambahkan bahwa
metabolisme  gula  sederhana  ini  melalui respirasi  sel  spermatozoa  menghasilkan
ATP.
KESIMPULAN Berdasarkan
penelitian yang
dilakukan  diperoleh  kesimpulan  bahwa ekstender  kombinasi  larutan  sari  kurma dan  ringer  laktat  dapat  memberikan pengaruh  terhadap  motilitas  dan  daya fertilisasi  berbagai  ikan  air  tawar. Meskipun mengalami penurunan motilitas namun  daya  fertilisasi  yang  ditunjukkan masih  bisa  mencapai  97,23%  sehingga ekstender  kombinasi  larutan  sari  kurma dan  ringer  laktat  bisa  digunakan  sebagai penyedia  nutrisi  untuk  spermatozoa selama proses pengawetan spermatozoa.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Peneliti  mengucapkan  terima  kasih kepada  Fakultas  Perikanan  dan  Kelautan Universitas Brawijaya.

## DAFTAR PUSTAKA
Adipu,  Y.,  Sinjal,  H.J.  dan  Watung,  J., 2011.  Ratio  Pengenceran  Sperma Terhadap  Motilitas  Spermatozoa, Fertilitas  dan  Daya  Tetas  Ikan  Lele (Clarias  sp.). Jurnal  Perikanan  dan Kelautan  Tropis , 7 (1),  pp.48-55. https://doi.org/10.35800/jpkt.7.1. 2011.16
Affandi, R. dan Tang, U.M., 2000. Biologi reproduksi ikan. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan IPB, Bogor , 155 . Arsetyo,  R.,  Abdulgani,  N.  dan  Trisyani, N.,  2012.  Pengaruh  konsentrasi larutan madu dalam NaCl fisiologis terhadap  viabilitas  dan  motilitas spermatozoa  ikan  patin  (Pangasius pangasius)
selama masa
penyimpanan. Jurnal Sains dan Seni ITS , 1 (1),  pp.E58-E63.  DOI  :
10.12962/j23373520.v1i1.917
Babiak,  I.,  Glogowski,  J.,  Goryczko,  K., Dobosz, S., Kuzminski, H., Strzezek, J.  dan  Demianowicz,  W.,  2001. Effect  of  extender  composition  and equilibration  time  on  fertilization ability  and  enzymatic  activity  of rainbow trout cryopreserved spermatozoa. Theriogenology , 56 (1),
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 100,00 0,5 1 1,5 2 Da ya f er ti li sa si ( % ) Dosis larutan Sari Kurma (%) C. auratus Siamese catfish C. carpio
pp.177-192. https://doi.org/10. 1016/S0093-691X(01)00553-2 Hidayaturrahmah,  H.,  2018.  Waktu Motilitas dan Viabilitas Spermatozoa  Ikan  Mas  (Cyprinus carpio L.) pada Beberapa Kosentrasi
Larutan Fruktosa. Bioscientiae , 4 (1), pp.9-18.  https:// http://ppjp.ulm. ac.id/journals/index.php/bioscienti ae/article/view/158
Kurniawan, I.Y., Basuki, F. dan Susilowati, T.,  2013.  Penambahan  air  kelapa dan  gliserol  pada  penyimpanan sperma  terhadap  motilitas  dan fertilitas  spermatozoa  Ikan  Mas (Cyprinus  carpio  L.). Journal  of Aquaculture Management and Technology , 2 (1),  pp.51-65.  http:// ejournal-s1.undip.ac.id/index.php/ jfpik Lesmana,  D.S.  dan  Dermawan,  I.,  2001. Budi  Daya  Ikan  Hias  Air  Tawar Populer . Penerbit Swadaya. Retnowati,  P.A.  dan  Kusnadi,  J.,  2013. Pembuatan Minuman Probiotik Sari Buah  Kurma  (Phoenix  Dactylifera) Dengan  Isolat  Lactobacillus  Casei Dan  Lactobacillus  Plantarum  [In Press  April  2014]. Jurnal  Pangan dan  Agroindustri , 2 (2),  pp.70-81. https://jpa.ub.ac.id/index.php/jpa/ article/view/39 Salisbury,  G.W.,  VanDemark,  N.L.  dan
Lodge,  J.R.,  1985. Physiology  of reproduction and artificial insemination  of  cattle (No.  Ed.  2). WH Freeman and Company.
Sartoyo, 2005. Pengaruh Konsentrasi dan
Suhu Penyimpanan
terhadap
Kualitas  Sperma  Ikan  Mas  Koki. Skripsi.  Fakultas  Kedokteran  Hewan
UNAIR. 58 hal. Sujoko,  H.,  Setiadi,  M.A.  and  Boediono,
A.,  2009.  Seleksi  spermatozoa domba  Garut  dengan  metode sentrifugasi Gradien Densitas Percoll. Jurnal  Veteriner , 10 (3), pp.125-132.  http:// https://ojs. unud.ac.id/index.php/jvet/article/d ownload/3356/2396 Sunarma, A., Hastuti, D.W.B., Saleh, D.M. dan  Sistina,  Y.,  2008.  Kombinasi
Efektif Ekstender Dan Krioprotektan
Pada  Kriopreservasi  Sperma  Ikan Nilem (Osteochilus hasseltii Valenciennes, 1842). Jurnal Perikanan Universitas Gadjah Mada ,
10 (1),  pp.76-84.  https://doi.org/ 10.22146/jfs.8931
Sutoyo,  A. Peranan  Bahan  Pengencer Terhadap Penyimpanan Spermatozoa Sampai  Penetasan  pada  Ikan  Mas ( Cyprinus carpio L .). Testis. Program Pasca Sarjana. Universitas Airlangga. Surabaya. 85 hal. 2000. Widyaningsih,  A.,  2016. Pengaruh Konsentrasi  Larutan  Sari  Kurma Dalam  NaCl  Fisiologi  Terhadap Viabilitas Dan Motilitas Spermarozoa Ikan  Nilem  (Oseteocilus  hasseltii Valenciennes) Selama Masa Penyimpanan (Doctoral dissertation, Universitas Brawijaya).