LYCOPENE DAN MELATONIN MELINDUNGI KULTUR SEL RETINAL PIGMENT EPITHELIUM

## MATA KAMBING YANG DIPAPAR HIDROGEN PEROKSIDA
Aulia Abdul Hamid Abdullah* 

## Abstrak
Age Related Macular Degeneration (ARMD) adalah penyakit yang dapat menyebabkan kebutaan dan berkaitan dengan stres oksidatif pada retinal pigment epithelium (RPE). Lycopene dan melatonin merupakan antioksidan yang diduga berpotensi melindungi sel RPE. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui efek suplementasi lycopene dan melatonin terhadap kadar malondialdehyde (MDA) sel RPE mata kambing yang dipapar dengan hidrogen peroksida (H 2 O 2 ) . Kultur primer sel RPE mata kambing dibagi dalam beberapa kelompok perlakuan suplementasi lycopene atau melatonin dengan dosis 10 μM, 30 μM, dan 100 μM dilanjut dengan paparan H 2 O 2 250 μM. Kadar MDA pada sel kultur diukur dengan metode thiobarbituric assay (TBA). Pada kelompok lycopene , kadar MDA rata-rata adalah 1,2 μg/ml pada kelompok tanpa perlakuan, dan 1,8 μg/ml pada kelompok yang dipapar H 2 O 2 tanpa suplementasi. Sel yang diberi lycopene dengan kadar 10 μM, 30  μM,  dan  100  μM  memiliki  kadar  MDA  lebih  rendah  yaitu  0,7  μg/ml,  1,0  μg/ml,  dan  1,0  μg/ml  secara berurutan. Rerata kadar MDA pada kelompok melatonin, pada kelompok tanpa perlakuan adalah sebesar 2,3 μg/ml dan pada kelompok yang dipapar H 2 O 2 tanpa suplementasi sebesar 3,3 μg/ml. Kadar pada kelompok perlakuan melatonin 10 μM, 30 μM, dan 100 μM adalah sebesar 2,5 μg/ml, 1,7 μg/ml, dan 1,7 μg/ml secara berurutan. Analisis statistik dengan ANOVA menunjukkan bahwa lycopene dan melatonin secara signifikan menurunkan  kadar  MDA  dibanding  dengan  kelompok  tanpa  pemberian  suplementasi  (p  =  0,01  dan  p  = 0,001). Sebagai kesimpulan, lycopene dan melatonin dapat melindungi kultur sel RPE mata kambing yang dipapar dengan H 2 O 2 . Lycopene dan melatonin dapat mencegah stres oksidatif pada sel RPE dalam upaya menghambat ARMD.
Kata kunci: kultur sel, lycopene , malondialdehyde , melatonin, RPE.

## LYCOPENE AND MELATONIN PROTECT GOAT RETINAL PIGMENT EPITHELIUM CELL CULTURE EXPOSED BY HYDROGEN PEROXIDE

## Abstract
Age Related Macular Degeneration (ARMD) is a potentially blinding eye disease and is thought to be related  to  oxidative  stress  on  the  retinal  pigment  epithelial  cells  (RPE).  Lycopene  and  melatonin  are antioxidants  that  may  reduce  oxidative  stress  and  protects  RPE  cells.  The  purpose  of  this  study  was  to evaluate the effects of lycopene and melatonin supplementation on goat RPE cell culture exposed with H 2 O 2 . Primary culture of goat RPE cells were supplemented with various doses of lycopene or melatonin: 10 μM, 30 μM,  and  100  μM  followed  by  250  μM  H 2 O 2 .  The  cells  were  then  collected  and  levels  of  malondialdehyde (MDA) were assessed with thiobarbituric assay method (TBA). Average MDA level was increased from 1.3 μg/ml in the non-treatment group compared to 1.8 μg/ml in the H 2 O 2 treated cells. Cells treated with lycopene 10  μM,  30  μM,  and  100  μM  had  lower  MDA  levels  of  0.7  μg/ml,  1.0  μg/ml,  and  1.0  μg/ml  respectively. Average  MDA  level  of  melatonin  control  group  was  increased  from  2.3  μg/ml  in  the  non-treatment  group compared to 3.4 μg/ml in the H 2 O 2 treatment group. Cells treated with melatonin 10 μM, 30 μM, and 100 μM had lower MDA levels of 2.5 μg/ml, 1.7 μg/ml, and 1.7 μg/ml respectively. Statistical analysis with ANOVA showed that lycopene and melatonin significantly decreased the MDA level compared to positive controls (p =  0.01  and  p  =  0.001  respectively).  In  conclusion, lycopene  and  melatonin  supplementation  significantly reduced  oxidative  stress  goat  RPE  primary  cell  culture  and  may  be  beneficial  in  prevention  of  ARMD progression.
Keywords: cell culture, lycopene, malondialdehyde, melatonin, RPE.
* Departemen Ilmu Kesehatan Mata, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya
 E-mail: aulia_fkub@yahoo.com

## Pendahuluan
Stres oksidatif diduga merupakan faktor penyebab  dari  penyakit  neurodegeneratif, penyakit  jantung,  beberapa  jenis  kanker, katarak, dan degenerasi makula terkait usia atau Age  Related  Macular  Degeneration (ARMD). Di bidang mata, ARMD merupakan salah  satu  penyebab  kebutaan  yang  perlu mendapat  perhatian  khusus.  Prevalensi
ARMD  stadium  awal  yang  ditandai  dengan adanya  drusen  dan  degenerasi  retinal pigmen epithelium (RPE) atau hiperpigmentasi  adalah  sebesar  18%  pada populasi  usia  65-74  tahun  dan  30%  pada populasi  di  atas  74  tahun.  Dengan meningkatnya  usia  harapan  hidup,  beban dari penyakit ini akan terus meningkat. Stres oksidatif  pada  tingkat  seluler  dapat  dilihat melalui  beberapa  indikator,  salah  satunya adalah dari tingginya kadar malondialdehyde (MDA).  MDA  cukup  sering  digunakan sebagai  indikator  stres  oksidatif  karena berhubungan  dengan  kerusakan  protein seluler  dan  peroksidasi  lipid  serta pengukurannya cukup mudah dan akurat. 1-4
Lycopene adalah  suatu  karotenoid yang  memiliki  sifat  antioksidan  yang  kuat. Bahan  ini  banyak  terdapat  pada  buah- buahan seperti tomat dan pepaya. Melatonin adalah  hormon  alami  tubuh  yang  berfungsi dalam  pengaturan  siklus  sirkadian  dan reproduksi. Lycopene dan  melatonin diketahui  memiliki  efek  antioksidan,  namun manfaatnya pada pencegahan ARMD belum banyak  diteliti  karena  jumlahnya  pada makula  tidak  sebanyak  lutein  dan zeaxanthin. 5,6 Lycopene telah  dilaporkan ditemukan  dalam  bentuk  metabolit  aktifnya pada RPE dan badan siliaris. Khachik et al. mengemukakan bahwa didapatkannya metabolit  dari lycopene pada  retina,  RPE, dan  badan  siliaris  menunjukkan  bahwa lycopene sangat mungkin berfungsi melindungi  jaringan  tersebut  dari  stres oksidatif.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk
mengetahui  pengaruh  pemberian lycopene dan melatonin secara terpisah, dengan dosis 10 μM, 30 μM, and 100 μM terhadap kadar MDA  pada  kultur  sel  RPE  mata  kambing yang dipapar dengan H 2 O 2 . 7-10

## Bahan dan Metode
Penelitian    dilakukan  di  Laboratorium Fisiologi  Fakultas  Kedokteran  Universitas Brawijaya Malang.

## Kultur sel RPE
Kultur  sel  RPE  dilakukan  dengan metode  sesuai  dengan  yang  dideskripsikan oleh  Engelmann et  al .  dengan  modifikasi pada  tahap  pembilasan  antibiotika. 11 Sel RPE  didapat  dari  mata  kambing  yang  baru disembelih  untuk  kepentingan  konsumsi (kurang  dari  6  jam).  Mata  dicuci  dengan povidone  iodine  10%  dan  dibilas  dengan larutan ringer laktat kemudian dibuka secara steril  dengan  potongan  mengelilingi  limbus. Jaringan segmen anterior, lensa, vitreus dan retina  dibuang  secara  mekanis  sehingga menyisakan  lapisan  RPE  pada  mangkuk mata.  Mangkuk  mata  diisi  dengan  2  ml trypsin  0,1%  dan  didiamkan  pada  suhu ruangan  selama  10  menit.  Sel  RPE dilepaskan  dari  dinding  dalam  mangkuk mata  dengan  irigasi  secara  berulang menggunakan  cairan  trypsin.  Selanjutnya ditambahkan  medium  M199  sebanyak  2  ml dan sel disentrifugasi pada 2000 rpm selama 10  menit.  Selanjutnya  sel  diresuspensi dengan  medium  M199  dan  fetal  bovine serum  (FBS)  10%.  Sel  yang  berhasil diisolasi,  dicuci  dengan  medium  antibiotika dosis  tinggi  yang  mengandung  Penicillin 100.000  unit,  Streptomycin  200  mg, Gentamycin  25  mg,  dan  Amphotericin  B  2 mg (dalam 100 ml medium kultur) selama 30 menit. Kultur sel dilakukan pada plate 12 well dengan  medium  M199 dan FBS  10%  pada suhu  37  °C  dan  konsentrasi  CO 2 5%.  Sel
didiamkan  selama  48  jam  untuk  terjadinya pertumbuhan dan menjadi lebih rapat. 11
Pemaparan Lycopene, Melatonin,  dan H 2 O 2 Medium  kultur  sel  RPE  yang  telah tumbuh  diganti  dengan  medium  M199 dan FBS 10% baru yang mengandung lycopene
( Sigma-Aldrich )  atau  melatonin  ( Sigma- Aldrich )  dengan  konsentrasi  10  M
(kelompok 3), 30  M (kelompok 4), dan 100
 M  (kelompok  5),  kemudian  diinkubasi selama  24  jam.  Medium  dibuang,  dan  sel dipapar dengan medium M199 dan FBS 10% yang mengandung H 2 O 2 dengan konsentrasi 250  M, kemudian diinkubasi selama 1 jam.
Pada plate kontrol  positif  (kelompok  2) ditambahkan  H 2 O 2 tanpa  pemberian lycopene atau melatonin sebelumnya. 12,13
Pengukuran kadar MDA dan Analisis Data MDA diukur dengan metode Trichlorasetic  Acid  (TCA)  dan  Thiobarbituric Acid  1%  (TBA)  dengan  pengamatan spektrofotometer. 14 Data  dianalisis  dengan uji  homogenitas  Levene, one  way ANOVA, dan  analisis post  Hoc dengan Least
Significant  Difference (LSD).  Software statistik yang  digunakan  adalah  SPSS  versi 16.  Perlakuan  dilakukan  dengan  tiga pengulangan ( triplicate ).

## Hasil

## Kultur Sel RPE
Kultur  sel  RPE  yang  ditampilkan  pada Gambar  1  menunjukkan  pertambahan kerapatan  sel  RPE  yang  berbentuk  bulat setelah  inkubasi  selama  48  jam.  Sel  RPE tampak  berwarna  kehitaman  dan  berbentuk bulat.

## Hasil pengukuran MDA
Hasil  pengukuran  dan  rata-rata  kadar MDA  pada  berbagai  kelompok  ditampilkan pada Tabel 1 dan Gambar 2. Pada Tabel 1
tampak  bahwa  rata-rata  kadar  MDA  pada kultur  sel  RPE  tanpa  perlakuan  adalah sebesar  1,3  µg/ml.  Dengan  perlakuan pemaparan  H 2 O 2 konsentrasi  250  µM selama  60  menit  terlihat  peningkatan  rata- rata  kadar  MDA  menjadi  1,8  µg/ml. Sementara  itu,  pada  kelompok  perlakuan yaitu  kultur sel  yang  telah dipapar lycopene selama  24  jam  sebelum  pemaparan  H 2 O 2 tampak  terjadi  kecenderungan  adanya penurunan kadar MDA. Kadar MDA rata-rata pada  kelompok lycopene 10  µM  (kelompok 3),  30  µM  (kelompok  4),  dan  100  µM (kelompok  5)  berturut-turut  adalah  sebesar 0,7  µg/ml,  1,0  µg/ml,  dan  1,0  µg/ml  (p  = 0,01).  Untuk  kelompok  melatonin,  kadar
MDA pada kultur sel tanpa perlakuan adalah 2,3  µg/ml.  Dengan  pemaparan  H 2 O 2 kadar MDA  meningkat  menjadi  3,4  µg/ml. Perlakuan  dengan  suplementasi  melatonin memberikan hasil kadar MDA 2,5 µg/ml, 1,7 µg/ml, dan 1,7 µg/ml untuk dosis 10 µM, 30 µM, dan 100 µM secara berturut-turut.
Hasil analisis dengan ANOVA dan LSD pada  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa lycopene dengan dosis 10 µM, 30 µM, dan 100 µM secara signifikan dapat menurunkan kadar  MDA  pada  kultur  sel  RPE  yang dipapar  H 2 O 2 dibandingkan  dengan  kontrol positif.
Gambar 1 . Kultur sel RPE mata kambing pasca isolasi (400x), dan kultur sel RPE mata kambing setelah inkubasi selama 48 jam (400x).
Tabel 1. Rerata kadar MDA pada kultur sel RPE mata kambing dengan pemberian lycopene atau melatonin pada berbagai dosis dengan paparan H 2 O 2 250 μM. Kelompok Sel Kultur RPE Kadar MDA (µg/ml) Lycopene Melatonin Rata-rata +SD Rata-rata +SD Kelompok 1 (tanpa suplemen tanpa H 2 O 2 ) 1,3 0,1 2,3 0,7 Kelompok 2 (tanpa suplemen dengan H 2 O 2 ) 1,8 0,1 3,4 0,6 Kelompok 3 (suplemen 10 µM + H 2 O 2 ) 0,7 0,1 2,5 0,2 Kelompok 4 (suplemen 30 µM + H 2 O 2 ) 1,0 0,1 1,7 0,2 Kelompok 5 (suplemen 100 µM + H 2 O 2 ) 1,0 0,4 1,7 0,1
Gambar 2. Rata-rata kadar MDA pada kultur sel RPE mata kambing keterangan: kelompok 1. Kultur RPE tanpa perlakuan; kelompok 2. Kultur RPE dengan paparan H 2 O 2 250 µm; kelompok 3,4,5 Kultur RPE dengan perlakuan suplemen lycopen atau melatonin dengan dosis 10 µm, 30 µm, dan 100 µm secara berturut-turut dengan paparan H 2 O 2 250 µm.

## Pembahasan
Studi  dengan  kultur  sel  RPE  yang diisolasi dari mata kambing merupakan yang
pertama  kali  dilakukan  di  Indonesia,  dan berdasar  pengetahuan  penulis  belum  ada publikasi  mengenai  kultur  RPE  dari  sumber ini. Pemilihan mata kambing sebagai bahan
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 Kelompok 1 Kelompok 2 Kelompok 3 Kelompok 4 Kelompok 5 Kad ar M DA (µ g/m l) Lycopene Melatonin
untuk kultur  sel  RPE adalah sebagai  bahan alternatif  yang  dapat  dicoba.  Kultur  RPE sebelumnya  telah  ditumbuhkan  dari  mata sapi, babi, tikus, kelinci, dan manusia (kultur primer  dan cell  line ). 11 Mata  kambing termasuk  bahan  yang  relatif  paling  mudah didapatkan  di  Indonesia  dan  proses  diseksi untuk  memperoleh  sel  RPE  relatif  lebih mudah.  Pada  penelitian  ini,  telah  dicoba mengkultur  sel  RPE  dengan  teknik  yang standar  dan  telah  dipublikasi  sebelumnya dengan sedikit modifikasi, khususnya dalam optimasi  sterilisasi  bahan  kultur.  Sel  RPE mata  kambing  pada  penelitian  ini  dapat tumbuh  selama  7-10  hari  dan  mencapai kerapatan  yang  cukup  untuk  dilakukan perlakuan  yang  direncanakan.  Namun, peluang  optimasi  kultur  masih  dapat dilakukan  sehingga  bisa  didapat  sel  yang tahan  lebih  lama  dan  dapat  disubkultur beberapa  kali.  Untuk  tujuan  tersebut tentunya  diperlukan  persiapan  bahan  dan kemampuan  teknis  laboratorium  yang  lebih baik 11,12 .
Lycopene memiliki  sifat  protektif sebagai antioksidan yang kuat. Pengamatan ini  bersesuaian  dengan  beberapa  penelitian lain dan menguatkan bukti potensi lycopene sebagai terapi antioksidan. 10,12,13 Di sisi lain, pada penelitian ini tidak terlihat adanya efek relasi  dosis lycopene dengan  peningkatan efek  yang  diharapkan,  yaitu  makin menurunnya kadar MDA dengan dosis yang lebih  tinggi.  Sebaliknya,  pada  dosis  30  µM dan  100  µM    kadar  MDA  terlihat  pada kisaran  sedikit  lebih  tinggi,  yaitu  1,0  µg/ml. Analisis    LSD  menunjukkan  bahwa  kadar tersebut  tidak  berbeda  signifikan  dengan kadar  MDA  pada lycopene dosis  10  µM. Peningkatan kadar MDA  pada  dosis  30  µM dan  100  µM  kemungkinan  merupakan variasi  dari  pengukuran  dalam  kelompok. Jadi,  dapat  disimpulkan  bahwa  pada peneltian  ini  tidak  terlihat  efek  perbedaan dosis lycopene. Diketahui pula bahwa dosis
lycopene 10  µM  telah  cukup  untuk menurunkan kadar MDA secara signifikan.
Pemberian  melatonin  pada  kultur  sel RPE  mata  kambing  yang  dipapar  dengan H 2 O 2 menyebabkan  terjadinya  penurunan kadar MDA. Hal ini ditunjukkan dengan hasil analisis  dengan one  way  ANOVA yang menunjukkan  bahwa  pemberian  melatonin dosis  10  µM,  30  µM,  dan  100  µM  dapat secara  signifikan  ( p =  0,001)  menurunkan kadar  MDA  pada  kultur  sel  RPE  mata kambing  yang  dipapar  H 2 O 2 dibandingkan dengan paparan H 2 O 2 saja. Penurunan kadar MDA  ini  menjelaskan  bahwa  pemberian melatonin  dapat  menghambat  proses peroksidasi  lemak  membran  sel  RPE  mata kambing akibat stres oksidatif paparan H 2 O 2 . Hal ini membuktikan  hipotesis penelitian dan mendukung  penelitian  sebelumnya  bahwa melatonin  memiliki  efek  protektif  sebagai antioksidan  yang  kuat.  Pada  penelitian  ini tampak  pula  adanya  efek  relasi  dosis melatonin  dengan  efek  yang  diharapkan yaitu makin menurunnya kadar MDA dengan pemberian  dosis  yang  lebih  tinggi.  Dosis melatonin  yang  dapat  menurunkan  kadar MDA  lebih  rendah  dari  kelompok  tanpa perlakuan  adalah  dosis  30  µM,  dan  100 µM. 6,10
Lycopene dan  melatonin  bekerja dengan  menangkap  singlet  oksigen  dan mencegah  terbentuknya  reaksi  oksidasi berantai.  Berkurangnya  peroksidasi  lemak dan  turunnya  MDA  merupakan  salah  satu mekanisme  antioksidan  dalam  melindungi sel.  Dengan  makin  banyaknya  cadangan antioksidan pada RPE, diharapkan berbagai bentuk stres
oksidatif termasuk pembentukan lipofuscin dapat ikut berkurang sehingga  dapat  memperpanjang  ketahanan hidup  RPE  dan  selanjutnya  mencegah degenerasi  makula.  Hasil  penelitian  ini sejalan  dengan  penelitian  sebelumnya  oleh Sundelin et  al. yang  menunjukkan  bahwa lycopene dapat  mengurangi  pembentukan lipofuscin  pada  kultur  sel  RPE  dan  oleh
Chichili et  al. yang  membuktikan  sifat protektif  ekstrak  tomat  pada  kultur  sel  RPE
10,13,15,16 .
Penelitian  ini  memiliki  beberapa keterbatasan  yang  pertama,  pengukuran variabel penanda stres oksidatif yang hanya satu jenis yaitu MDA. Kedua, kultur RPE dari mata  kambing  sendiri  belum  berhasil mendapatkan  subkultur  yang viable  atau aktif, sehingga penyediaan jumlah sel kultur menjadi terbatas.

## Kesimpulan
Kesimpulan  dari  penelitian  ini  adalah lycopene dan  melatonin  memiliki  efek protektif pada kultur sel RPE mata kambing yang  ditunjukkan  dengan  kemampuannya menurunkan  secara  signifikan  kadar  MDA pada  sel  yang  dipapar  dengan  H 2 O 2 .
Penelitian  lebih  lanjut  dapat  dilakukan secara in  vitro adalah  pemberian lycopene dan melatonin sebagai kombinasi antioksidan  untuk  melihat  apakah  dapat memberikan hasil proteksi yang lebih efektif terhadap sel RPE. Penelitian in vivo dengan lycopene dan melatonin pada binatang coba atau  manusia  juga  dapat  dilakukan  untuk dapat  menilai  efek  suplementasi lycopene dan melatonin terhadap stres oksidatif pada RPE.

## Daftar Pustaka
1. American  Academy  of  Ophthalmology Staff.  Basic  and  Clinical  Science Course:  Retina  and  Vitreous.  San Fransisco:  American  Academy  of Ophthalmology.  2008-2009. P. 60-75.
2. Bressler  SB,  Do  DV,  Bressler  NM.  Age Related  Macular  Degeneration:  Drusen and  Geographic  Atrophy.  In:  Albert  DM (Editor). Principles  and  Practice  of
Ophthalmology .  3 rd Edition.  Vol  II.
Philadelphia:  Saunders.  2008.  P.1901- 16.
3. Zarbin  MA.  Current  Concepts  in  the Pathogenesis  of  Age-Related  Macular Degeneration. Arch  Ophthalmol .    2004; 122(4):598-614.
4. Winkler  BS,  Boulton  ME,  Gottsch  JD, Sternberg  P.  Oxidative  Damage  and Age-Related Macular Degeneration. Mol
Vis . 1999; 5:32.
5. Rao  AV,  Ray  MR,  Rao  LG.  Lycopene. Adv Food Nutr Res. 2006; 51:99-164.
6. Brzenzinski  A.  Melatonin  in  Humans .
NEJM . 1997. 336: p. 186-95. 7. Fraser  SE.  New  Sight  for  Old  Eyes.
Engineering  and  Science .  2006;  3:22- 31.
8. Thumann G, Hinton DR. Cell Biology of the Retinal Pigment Epithelium. In: Ryan SJ,  Schachat  AP,  (Editors). Retina .  4 th Edition.  Vol  1.  St.Louis:  Mosby.    2006. P.104-122.
9. Khachik  F,  Carvalho  L,  Bernstein  PS, Muir GJ, Zhao DY, Katz NB. Chemistry, Distribution,  and  Metabolism  of  Tomato Carotenoids  and  Their  Impact  on Human  Health. Exp  Biol  Med .  2002;
227(10):845-51. 10. Osborne NN, Nash MS, and Wood JPM. Melatonin Counteracts Ischemia- Induced  Apoptosis  in  Human  Retinal Pigment Epithelial Cells . Invest Ophthalmol Vis Sci . 1998; 39:2374-83. 11. Engelmann  K,  Valtink  M.  RPE  Cell Cultivation. Graefe’s  Arch  Clin  Exp Ophthalmol . 2004; 242:65–67.
12. Kim MH, Chung J, Yang JW, Chung SM, Kwag NH, Yoo JS. Hydrogen Peroxide- Induced Cell Death in A Human Retinal Pigment  Epithelial  Cell  Line  ARPE-19. Korean J Ophthalmol. 2003;17(1):19-28. 13. Sundelin  SP,  Nilsson  SE.  Lipofuscin- Formation  in  Retinal  Pigment  Epithelial Cells  is  Reduced  by  Antioxidants. Free
Radic Biol Med . 2001; 31(2):217-25.
14. Nielsen  F,  Mikkelsen  BB,  Nielsen  JB, Andersen  HR,  Grandjean  P.  Plasma Malondialdehyde as Biomarker Foroxidative  Stress:  Reference  Interval and Effects of Life-Style Factors. Clinical Chemistry. 1997; 43(7):1209–1214.
15. Cardinault  N,  Abalain  JH,  Sairafi  B, Coudray  C,  Grolier  P,  Rambeau  M,
Carré  JL,  Mazur  A,  Rock  E. Lycopene but  not  Lutein  Nor  Zeaxanthin Decreases in Serum and Lipoproteins in Age-Related  Macular  Degeneration Patients. Clin  Chim  Acta. 2005; 357(1):34-42.
16. Chichili GR, Nohr D, Frank J, Flaccus A,
Fraser  PD,  Enfissi  EM,  and  Biesalski
HK. Protective Effects of Tomato Extract with  Elevated  -Carotene  Levels  on Oxidative  Stress  in  ARPE-19  Cells. British  Journal  of  Nutrition .  2006; (96):643–649.