## Pengecatan Imunohistokimia HER2 Menggunakan Susu Skim dan Normal Serum
ABSTRAK
ABSTRACT

## BIOMEDIKA
ISSN : 1979 - 035X (printed edition)
ISSN : 2302 - 1306 (electronic/Portal e-Journal)
Immunohistochemistry Staining of HER2 Using Nonfat Dry Milk and Normal Serum
Arya Iswara*, Sri Sinto Dewi, Yulfa Ariza Masruro
Laboratorium Biologi Molekuler Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas Muhammadiyah Semarang * Corresponding author : aryaiswara@unimus.ac.id
Volume 10, No. 1, Maret 2017
HER2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) merupakan suatu reseptor pada permukaan sel yang ber- pengaruh pada proliferasi jaringan, mutasinya dapat menjadi onkogen. Over ekspresi dari HER2 pada kasus kanker dapat dilihat dengan teknik imunohistokimia (IHC). Protein blocking merupakan salah satu langkah dalam pengecatan IHC yang berfungsi menghalangi ikatan non spesifik pada jaringan dengan menggunakan normal serum dan protein solution (susu skim). Tujuan penelitian mengetahui gambaran hasil pengecatan IHC menggunakan normal serum dan susu skim. Penelitian secara eksperimental dengan pendekatan cross sectional. Sampel penelitian jaringan kanker pa- yudara HER2 positif dengan stadium +2 dari satu organ dan pasien yang sama. Pengecatan IHC menggunakan teknik Strep (Avidin) Biotin Complex. Pengecatan menggunakan normal serum didapatkan  hasil +2, menggunakan susu skim 1% didapatkan hasil +3, sedangkan menggunakan susu skim 2% dan 3% didapatkan hasil +2. Terdapat perbedaan yang signifikan antara normal serum dengan susu skim 1%. Tidak terdapat perbedaan yang signifikan antara normal serum dengan susu skim 2%  dan susu skim 3%. Simpulan adalah normal serum dapat diganti dengan susu skim 2%.
Kata kunci: HER2, normal serum, susu skim
HER2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) is a receptor on the cell surface that affect on the tissue pro- liferation, HER2's mutations can become the oncogenes. Over expression of HER2 in cancer cases can be seen in immu- nohistochemistry (IHC) technique. Protein blocking is the one of IHC-staining's step that blocks the non-specific binding on tissue using normal serum and protein solution (nonfat dry milk). Purpose of the research was to described the results of IHC staining using normal serum and nonfat dry milk. This research was experimental with cross-sectional approach. Sample of the research was HER2 positive on breast cancer tissue with stadium +2 of a same organ and patient. IHC- staining used Strep(Avidin) Biotin Complex technique. IHC-staining used normal serum obtained the result +2, used 1% nonfat dry milk obtained +3, while the 2% nonfat dry milk and 3% nonfat dry milk obtained the results of +2. There was significant difference between normal serum with 1% nonfat dry milk. There wasn't significant difference between normal serum with 2% nonfat dry milk and 3% nonfat dry milk. The conclusion is normal serum can be replaced with 2% nonfat dry milk.
Keywords: HER2, normal serum, nonfat dry milk
Kanker merupakan sel dengan proliferasi yang tidak  terkendali  dan  dapat  bermetastasis  menuju jaringan  tubuh  lain  melalui  cairan  limfe  dan  da- rah  (Stratton et  al .,  2009).  Mutasi  DNA  dapat berasal  dari  faktor  lingkungan  seperti  radiasi, paparan  bahan  kimia  dan  virus  (Kumar et  al. , 2010).  Kanker  ditemukan  karena  adanya  mutasi dan  ekspresi  hasil  metabolisme  patologik  yang berlebihan  (over  ekspresi).  Over  ekspresi  dari
reseptor faktor pertumbuhan yang dapat ditemu- kan pada kasus kanker adalah HER2 (Kumar et al., 2005).  HER2 (Human  Epidermal  Growth Factor  Receptor  2) merupakan  suatu  reseptor pada permukaan sel yang berpengaruh pada pro- ses proliferasi sel pada jaringan (Coussen, 2005). Ekspresi HER2 pada kasus kanker dapat dilihat dengan  suatu  penanda  biologi  atau  biomarker. American  Society  of  Clinical  Oncology/Collage of  American  Pathologis (ASCO/CAP) telah  me-
netapkan bahwa teknik yang dapat digunakan un- tuk  pemeriksaan  biomarker  secara  valid  adalah immunohistochemistry (IHC)  dan fluorescence in  situ  hybridization (FISH)  (Park et  al., 2014). IHC merupakan suatu teknik yang digunakan un- tuk  menetapkan  dan  mengidentifikasi  jenis  pro- tein  tersebut  dalam  sel-sel  jaringan  dengan  me- manfaatkan  prinsip  pengikatan  antigen-antibodi (Hastuti dan Lubis, 2011).
Kesalahan-kesalahan yang terjadi selama pro- ses  pengecatan  IHC  dapat  menimbulkan trouble shooting yang dapat memengaruhi hasil pemerik- saan,  salah  satunya  adalah  buruknya  intensitas background staining yang dapat disebabkan oleh tidak  cukupnya blocking  agent yang  digunakan. Blocking  agent yang  dapat  diantaranya  adalah normal  serum, protein  solution, dan commercial mixes . Normal serum hingga saat ini masih sering digunakan untuk protein blocking karena normal serum tidak dapat terlibat dalam reaksi imunologi (Dabbs,  2014),  tetapi  dalam  penggunaannya  se- hari-hari  normal  serum  memiliki  kekurangan, yaitu  harganya  relatif  mahal  dan  susah  didapat sehingga  diperlukan blocking  agent yang  lebih mudah  didapat  dan  harganya  relatif  lebih  murah yaitu protein  solution ,  seperti nonfat  dry  milk (susu skim).
Penelitian  ini  merupakan  penelitian  eksperi- mental menggunakan susu skim Indomilk® 1%, 2%, dan 3% pada pengecatan IHC HER2 metode (Strep) Avidin biotin complex dalam proses pro- tein blocking .

## METODE
Blok  parafin  dari  jaringan  kanker  payudara HER2  positif  dipotong  menggunakan  mikrotom menjadi  12  sediaan  untuk  4  perlakuan  berbeda, masing-masing 3 sediaan untuk setiap perlakuan. Penelitian tentang pengecatan IHC menggunakan normal  serum atau background  sniper dan  susu skim dengan  konsentrasi 1%, 2%, dan 3% dila- kukan  terhadap  3  sediaan  untuk  masing-masing

## HASIL DAN PEMBAHASAN
perlakuan, yang berasal dari organ payudara dari satu  pasien  kanker  dengan  HER2  positif.  Hasil pengamatan dari pengecatan IHC dengan normal serum dan susu skim 1%, 2%, dan 3% dapat di- lihat pada Gambar 1.
Gambar 1. Pengecatan IHC menggunakan normal serum (A) , susu skim 1% (B) , susu skim 2% (C) , susu skim 3% (D) pada perbesaran 400x.
Keterangan tanda panah: ekspresi HER2 pada membran sel
Ekspresi HER2 tampak pada bagian membran sel,  yang  akan  dinilai  berdasarkan  intensitasnya, yaitu  kuat-lemahnya  penyerapan  cat.  Distribusi ekspresi  HER2  berdasarkan  intensitasnya  terha- dap tiga sediaan dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Hasil pengamatan pengecatan IHC berdasarkan ekspresi HER2
Blocking Agent Penilaian ekspresi HER2 1 2 3 Normal serum 2+ 2+ 2+ Susu skim 1% 3+ 3+ 3+ Susu skim 2% 2+ 2+ 2+ Susu skim 3% 2+
2+ 2+
Berdasarkan hasil yang telah ditunjukkan mem-
Protein blocking pada pengecatan IHC HER2 dapat  menggunakan blocking  agent berupa  susu skim  Indomilk®  2%.  Penelitian  lanjutan  dapat dilakukan  dengan  menggunakan blocking  agent berupa  larutan  protein  yang  lain  sehingga  lebih bervariasi.  Selain  itu  penelitian  juga  dapat  di- kembangkan  dengan  melakukan  modifikasi  lain pada  prosedur  pengecatan  IHC  seperti  penggan- tian  metode  fiksasi  dan antigen  retrieval yang digunakan.
perlihatkan  bahwa normal  serum dapat  diganti dengan susu skim dengan konsentrasi 2% dan 3% karena  mampu  menghalangi  ikatan  nonspesifik yang terdapat dalam jaringan. Susu skim mengan- dung  dua  jenis  protein,  yaitu  protein  kasein  (76 – 80%) dan non kasein (14 – 24%), protein yang berperan pada pengikatan nonspesifik adalah pro- tein jenis kasein (Kumar et al ., 2009 ; Thompson et al. , 1965). pengecatan IHC yang menggunakan susu  skim  konsentrasi  1%  menunjukkan  adanya peningkatan  intensitas  HER2  dibandingkan  de- ngan  kontrol  yang  menggunakan normal  serum . Intensitas  yang  tinggi  ini  disebabkan  oleh  anti- bodi  sekunder  yang  berikatan  dengan  protein nonspesifik  yang  terdapat  dalam  jaringan.  Anti- bodi  primer  bersifat  spesifik  sehingga  hanya akan  berikatan  dengan  antigen  spesifik  pula,  na- mun  antibodi  sekunder  bersifat  universal  yang dapat  membentuk  ikatan  spesifik  dengan  antibo- di  primer  maupun  nonspesifik  dengan  protein nonspesifik  pada  jaringan.  Rendahnya  konsen- trasi protein yang terdapat dalam susu skim kon- sentrasi  1%  akan  menurunkan  kemampuannya berikatan  dengan  protein  nonspesifik  sehingga kemungkinan  antibodi  sekunder  untuk  berikatan dengan  antigen  nonspesifik  menjadi  tinggi  (Ira- wan, 2013).
Intensitas background staining tidak dipenga- ruhi  oleh  jenis blocking  agent yang  digunakan, namunbesaran  konsentrasi protein dalam block- ing  agent yang  digunakan  untuk  menghalangi ikatan  non  spesifik  yang  terbentuk.  Susu  skim dengan konsentrasi sebesar 1% memiliki konsen- trasi protein yang lebih rendah daripada 2% dan 3% sehingga hal ini dapat memungkinkan untuk protein nonspesifik lain yang tidak dihalangi oleh protein  susu  skim  1%  untuk  berikatan  dengan antibodi sekunder. Beberapa blocking agent yang berfungsi  untuk  menghalangi  ikatan  nonspesifik perlu  dikembangkan  (Duhamel  dan  Johnson, 1985 ; Vogt et al ., 1987).

## KESIMPULAN
Simpulan dari penelitian ini adalah gambaran
pengecatan  IHC  HER2  menggunakan normal serum didapatkan hasil +2, susu skim Indomilk® 1%    didapatkan  hasil +3, susu  skim Indomilk® 2%  didapatkan  hasil  +2,  dan  susu  skim  Indo- milk®  3%  didapatkan  hasil  +2.  Pembacaan  in- tensitas HER2 pada pengecatan IHC mengguna- kan  susu  skim  Indomilk®  1%  memiliki  perbe- daan  jika  dibandingkan  dengan normal  serum , susu skim Indomilk® 2%, dan susu skim Indo- milk®  3%.  Hasil  pembacaan  intensitas  penge- catan  IHC  HER2  antara normal  serum dengan susu  skim  2%  dan  3%  tidak  menunjukkan  ada- nya perbedaan. Normal serum dapat diganti de- ngan susu skim Indomilk® 2%

## SARAN

## DAFTAR PUSTAKA
Caussen L, Yang-Feng TL, Liao YC, Chen E, Gray A, McGrath J, et.al. 2005. Tyrosine kinase receptor with extensive homolo- gy to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science Journal 230 (4730): 1132-9. Dabbs DJ. 2013. Diagnostic Immunohistochemistry: Theranostic and Genomic Applications: Techniques of Immunohistoche- mistry: Principles. Pitfalls, and Standarization 4th Edition . United States of America: Elsevier Saunders p.1-19.
Duhamel RC dan Johnson DA. 1985. Use of nonfat dry milk to block nonspecific nuclear and membrane staining by avidin conjugates. J Histochem Cytochem 33: 711-4.
Hastuti NW dan Lubis HML. 2011. Manfaat pemeriksaan imuno- histo(sito)kimia. CDK 38 (5). Irawan, Vidya. IHC part 3: Normal Serum dan Imunofluoresence .
Kumar GL, Wendelboe HG, Bisgaard K, Boenisch T, Farmilo AD, Stead RH, et al. 2009. Education Guide: Immunohistochemi- cal Staining Methods Fifth Edition . California: DAKO Cor- poration. p.120.
Kumar V, Abbas A, Fausto N, Aster J. 2010. Robbins and Cotran Pathologic Basic of Disease 8th Edition . Philadelphia: Saun- ders Elsevier.
http://vetsciencereview.blogspot.co.id/2015/11/ihc-part-3- normal-serum-dan.html. 13 November 2013 (diakses pada 16 Juli 2016)
Kumar V, Cotran RS, dan Collins T. 2005. Neoplasia in Robbins Pathologic Basic of Disease 7th Edition . Philadelphia: WB Saunders. p.269-71.
Park MHM, Ebel JJ, Zhao W, Zynger DC. 2014. ER and PR im- munohistochemistry and HER2 FISH versus oncotype DX: implication for breast cancer treatment . The Breast Journal 20 (1): 37-45.
Prichard JW. 2014. Overview of automated immunohistochemis- try. Arch Pathol Lab Med 138.
Stratton MR, Campbell PJ, dan Futreal PA. 2009. The cancer ge- nome. Nature 458.
Thompson MP, Tarrassuk NP, James R, Lillevik HA, Aswurth UI, Pose D. 1965 Nomenclature of proteins of cow milk and revision. J. Diary Sci : 157.
Vogt  RF  Jr,  Philips DL,  Henderson LO, Whitfield W,  Spierto FW. 1987. Quantitative difference among various proteins as blocking agents for ELISA microtiter plates . J Immunol Methods 101: 45