## PENGARUH PERBEDAAN KONSENTRASI GLISEROL DALAM SUSU SKIM KUNING TELUR UNTUK PROSES PENYIMPANAN SPERMA BEKU TERHADAP  MOTILITAS DAN
VIABILITAS  SPERMATOZOA IKAN PATIN ( Pangasius pangasius )
EFFECT OF DIFFERENT GLYCEROL CONCENTRATION IN SKIM MILK AND EGG YOLK DILUTER FOR STORAGE PROCESS OF FROZEN SEMEN ON SPERM MOTILITY AND VIABILITY OF CATFISH ( Pangasius pangasius )
Bagus Rizki Novianto, Sudarno dan Endang Dewi Masithah
Fakultas Perikanan dan Kelautan Universitas Airlangga Kampus C Mulyorejo - Surabaya, 60115 Telp. 031-5911451

## Abstract
Needs  of  catfish  seed  always  increase  every  years,  especially  for  farming  activities.  Fulfillment demand  of  seed  in  large  quntities  and  continuing  are  the  main  obstacle  in  the  production  process  of catfish.  This  can  be  overcome  by  the  process  of  cryopreservation.  This  process  requires  diluents  and cryoprotectants to maintain the fertility of spermatozoa. Skim milk and egg yolks diluents has been used on fish because it was applied to carp and showing a good result of sperm motility and fertilization rate. Glycerol  as  cryoprotectant  was  reported  effective  to  be  used  for  European  Catfish  than  the  other  kind cryoprotectant.
This study aimed to determine the effect of different concentrations of glycerol in the diluent skim milk  and  egg  yolk  on  the  motility  and  viability  of  catfish  ( Pangasius  pangasius )  spermatozoa  after freezing.  This  research  method  is  the  experiment  with  completely  randomized  design  (CRD)  as  the experimental  design.  The  treatment  used  is  different  glycerol  concentrations,  P1  (11%),  P2  (13%),  P3 (15%),  and  P4  (17%)  and  each  of  the  treatment  was  repeated  5  times.  The  main  parameters  measured were  motility  (%)  and  viability  (%)  of  spermatozoa.  Supporting  parameters  include  odor,  color,  pH, viscosity, sperm concentration and catfish ( Pangasius pangasius ). Analysis of the data using Analysis Of Variance  (ANOVA)  and  to  determine  the  best  treatment  performed  Duncan's  Multiple  Range  Test  with 95% confidance interval.
The results showed that the effect of the concentration of glycerol in the diluent skim milk and egg  yolk  was  not  significantly  (P>  0.05)  on  the  motility  and  viability  of  catfish  ( Pangasius  pangasius ) spermatozoa after freezing. Further testing needs to be done on the level of  fertility of  frozen sperm, as well as the growth rate of seeds produced from sperm frozen catfish ( Pangasius pangasius ) products.
Keywords : Frozen Semen, Catfish, Cryoprotectant, Glycerol

## Pendahuluan
Pemenuhan  permintaan  benih  dalam jumlah  besar  dan  berkelanjutan  masih  menjadi kendala utama dalam proses produksi ikan patin (Kementerian  Kelautan  dan  Perikanan,  2010). Peningkatan  produksi  benih  patin  baik  jumlah dan kualitasnya perlu dijaga mengingat pemijahan  ikan  patin  yang    sering  digunakan hanya  dengan  mengandalkan  bantuan  hipofisa (Saparinto, 2010). Salah satu alternatif lain yang bisa  dilakukan  untuk  menyediakan  benih  ikan patin sepanjang tahun yaitu melalui penyimpanan  spermatozoa  (Sulmartiwi  dkk., 2011). Penyimpanan spermatozoa dapat dilakukan  dengan  proses  kriopreservasi.  Proses kriopreservasi  membutuhkan  bahan  pengencer dan krioprotektan untuk mempertahankan fertilitas spermatozoa (Hardijanto dkk., 2010).
Bahan  pengencer  susu  skim  dan  kuning telur  dapat  digunakan  di  ikan  karena  telah diteliti pada ikan mas (Setyono, 2009). Gliserol telah  dilaporkan  efektif  untuk  digunakan sebagai  krioprotektan  pada European  Catfish dibandingkan  dengan  krioprotektan  lain  (Ogier, 1999 dalam Muchlisin  et  al.,  2004).  Susu  skim mengandung  zat  nutrisi,  lipoprotein  dan  lesitin untuk  melindungi  spermatozoa  dari  pengaruh kejut  dingin  ( cold  shock )  (Widjaya,  2011). Kuning  telur  mengandung  lipoprotein  untuk mencegah  terjadinya cold  shock pada  saat proses  pembekuan  (Vishwanath  and  Shannon, 2000). Gliserol sebagai krioprotektan intraseluler  dapat  mempertahankan  motilitas spermatozoa  ikan  pada  saat post  thawing (Diwan  et  al.,  2010)  serta  dapat  mencegah pembentukan kristal es pada proses kriopreservasi  sehingga  dapat  mengurangi
kematian dari spermatozoa pada saat dibekukan (Susilowati dkk., 2010). Motilitas dan viabilitas sperma  merupakan  parameter  yang  penting untuk  keberhasilan  proses  fertilisasi.  Motilitas sperma
menggambarkan
kemampuan
spermatozoa untuk membuahi sel telur, semakin tinggi  nilai  motilitas  maka  semakin  tinggi  pula persentase hidup (viabilitas) spermatozoa tersebut  (Junior  dkk.,  2005).  Penggunaan gliserol dalam pengencer susu skim dan kuning telur  ini  diharapkan mampu melindungi spermatozoa  ikan  patin  dari  kematian  selama proses  pembekuan  sehingga  spermatozoa  dapat digunakan dalam proses fertilisasi buatan.
Berdasarkan  latar  belakang  yang  ada, maka  timbul  permasalahan  yaitu  bagaimana pengaruh  perbedaan  konsentrasi  gliserol  dalam campuran  susu  skim  dengan  kuning  telur sebagai bahan pengencer terhadap motilitas dan viabilitas spermatozoa ikan patin  pada saat pre- freezing dan post-thawing . Tujuan  dilakukannya  penelitian  ini adalah  untuk  mengetahui  konsentrasi  gliserol yang  tepat  dalam  bahan  pengencer  susu  skim kuning  telur  yang  digunakan  untuk  pembekuan sperma ikan patin.
Manfaat penelitian ini
ialah memberikan informasi bagi mahasiswa maupun masyarakat lain tentang penggunaan konsentrasi gliserol  yang  optimal  dengan  bahan  pengencer susu  skim  dan  kuning  telur  untuk  digunakan dalam pembekuan sperma ikan patin. Penelitian ini sebagai salah satu upaya dalam meningkatkan produksi benih ikan patin melalui teknik  kriopreservasi  yang  dapat  diterapkan pada  para  pembudidaya  serta  memberikan informasi  bagi  balai  pembenihan  ikan  maupun balai inseminasi buatan yang ingin mengembangkan  produksi  benih  ikan  patin melalui teknik kriopreservasi sel spermatozoa.

## Materi dan Metode
Penelitian ini dilaksanakan di
Laboratorium  Taman  Pendidikan  ( Teaching Farm )  Fakultas  Kedokteran  Hewan  Universitas Airlangga.  Penelitian  ini  dilaksanakan  pada bulan April 2013.
Alat-alat  yang  digunakan  yaitu  bak plastik,  aerator,    kain  lap  halus,  gelas  ukur, tabung reaksi, spuit , alumunium foil , mikroskop, beaker  glass , water  bath (pemanas air),  spatula,  termometer,  timbangan  digital, kertas  saring, ministraw ,  dan  pendingin/kulkas. Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitan  ini adalah  2  ekor  induk  jantan  ikan  patin  yang berukuran  ±  2  kg,  berumur  ±  2  tahun  serta matang  gonad,  nitrogen  cair,  bahan  pengencer (aquades  50  ml,  susu  bubuk  skim  5  g,  kuning
telur  sebanyak  5%  dari  total  pengencer, penicillin    0,17  g,  fruktosa  0,5  g,  streptomycin 0,08 g, glisero 4,03 ml).
Perlakuan yang diberikan berupa kelompok  konsentrasi  gliserol  yang  berbeda dalam bahan pengencer susu skim kuning telur. Perlakuan  A  (konsentrasi  gliserol  11%  dalam bahan  pengencer  susu  skim  kuning  telur), Perlakuan  B  (konsentrasi  gliserol  13%  dalam bahan  pengencer  susu  skim  kuning  telur), Perlakuan  C  (konsentrasi  gliserol  15%  dalam bahan  pengencer  susu  skim  kuning  telur), Perlakuan  D  (konsentrasi  gliserol  17%  dalam bahan pengencer susu skim kuning telur).
Persiapan Penelitian Sterilisasi  alat-alat  yang  digunakan selama penelitian dengan cara dicuci dengan air bersih  kemudian  dikeringkan  dan  dimasukkan ke  lemari  pemanas  dengan  suhu  ±40 o C  selama 60  menit  serta  mempersiapkan  bahan-bahan sesuai dengan kebutuhan.
Pengambilan Sperma Ikan
Pengambilan sperma ikan patin dilakukan  dengan  cara  stripping.  Proses stripping  dilakukan  dengan  cara  mengurut secara  perlahan  pada  daerah  perut  persis  di depan  papila  alat  kelamin  sampai  keluar  cairan semen  ikan  yang  berwarna  putih  dan  kemudian ditampung  dalam  wadah  (Slembrouck et  al., 2005).
Pemeriksaan Makroskopis dan Mikroskopis Pemeriksaan makroskopis meliputi volume  sperma,  konsentrasi  sperma,  bau sperma,  warna  sperma  dan  derajat  keasaman (pH) sperma. Pemeriksaan mikroskopis meliputi gerakan  massa,  gerakan  individu,  dan  viabilitas menggunakan  mikroskop  dengan  pembesaran 100x (Susilowati dkk., 2010).
Pembuatan Bahan Pengencer Pengencer  yang  digunakan  dalam penelitian ini adalah susu skim dan kuning telur yang ditambahkan dengan 4 macam konsentrasi gliserol yang berbeda. Konsentrasi gliserol yang digunakan dalam penelitian ini yaitu 11%, 13%, 15%,  dan  17%.  Komposisi  bahan  pengencer yang  digunakan  yaitu  aquades  50  ml,  susu bubuk skim 5 g, kuning telur sebanyak 5%  dari total  pengencer,  penicillin    0,17  g,  fruktosa  0,5 g, streptomycin 0,08 g.
Pembuatan Sperma Beku Sperma  dicampur  dengan  larutan  A hingga  50%  dari  volume  akhir,  kemudian larutan  B  50%  dari  volume  akhir  dan
dimasukkan ke  dalam lemari es secara bersama dengan  suhu  3-5 o C  selama  1-1,5  jam.  Setelah mencapai  suhu  3-5 o C,  larutan  A  dan  larutan  B dicampur  secara  bertahap  dan  perlahan  melalui dinding  tabung  (gliserolisasi)  selama  1  jam. Spermatozoa  dibiarkan  dalam  suhu  5 o C  selama 2-6  jam  agar  bisa  menyeimbangkan  cairan intraseluler  dengan  diluter  yang  mengandung gliserol  sebelum  proses  pembekuan  dimulai (equilibrasi).  Motilitas  dan  persentase  hidup spermatozoa setelah equilibrasi diperiksa menggunakan  mikroskop  dengan  perbesaran 400x,  bila  motilitas  masih  60-70%  maka dilakukan filling  sealing straw .  Setelah  itu dilakukan  proses pre-freezing dengan  cara meletakkan  1-2  cm  di  atas  permukaan  N 2 cair selama  9  menit,  diteruskan  dengan  proses freezing dengan  menenggelamkan ministraw ke dalam  N 2 cair.  Pemeriksaan  motilitas  setelah thawing dilakukan  setelah  proses freezing dengan  menggunakan  mikroskop  perbesaran 400x. (Susilowati dkk., 2010)
Pemeriksaan Motilitas Sperma Pemeriksaan motilitas massa  dan individu dilakukan dengan perbesaran 100x dan
400x. Penentuan nilai motilitas massa
berdasarkan  besarnya  gelombang  pergerakan sperma  sedangkan  motilitas  individu  dengan cara  perhitungan  sperma  yang  bergerak  cepat dan progresif (Susilowati  dkk.,  2010).  Rumus perhitungan  motilitas  individu  adalah  sebagai berikut :
Pemeriksaan Viabilitas Sperma Viabilitas  sperma  diamati  dengan teknik  sediaan  ulas  menggunakan  zat  warna eosin dan negrosin. Satu tetes kecil sperma dan satu  tetes  besar  larutan  eosin  negrosin diletakkan  pada object  glass ,  kemudian  zat warna  dan  sperma  dicampur  hingga  homogen. Membuat preparat ulas tipis  dan dikeringkan di atas  nyala  api,  proses  tersebut  harus  selesai dalam  15  detik.  Pengamatan  di  bawah mikroskop  dengan  perbesaran  400x  (Susilowati dkk., 2010).
Jumlah Spermatozoa yang Hidup X 100% Jumlah Spermatozoa yang Diamati
Analisis Data Rancangan  penelitian  ini  menggunakan RAL  (Rancangan  Acak  Lengkap)  dan  analisis data dihitung dengan menggunakan uji ANOVA,  dengan  menggunakan  4  perlakuan dan  5  kali  ulangan,  kemudian  dilanjutkan dengan  Uji  Jarak  Berganda  Duncan  dengan selang kepercayaan 95%.

## Hasil dan Pembahasan
Hasil  pemeriksaan  semen  segar  secara makroskopis  dan  mikroskopis  pada  penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 1.
Hasil  pemeriksaan  motilitas  dan viabilitas  spermatozoa  ikan  patin  dapat  dilihat pada Tabel 2.
Motilitas spermatozoa ditentukan dari banyaknya  jumlah  spermatozoa  yang  bergerak dari  suatu  lapang  pandang  (Susilowati  dkk., 2010).  Pemeriksaan  motilitas  spermatozoa  ikan patin  dilakukan  sebanyak  tiga  kali,  yaitu  saat sebelum  diberi  perlakuan  (semen  segar), sebelum  dibekukan  ( pre  freezing ),  dan  setelah dibekukan ( post thawing ) .
Jumlah Spermatozoa yang Motil Progresif X 100% Jumlah Spermatozoa yang Diamati
Tabel 1. Data semen segar ikan patin
Makroskopis Parameter Hasil Penelitian Referensi Volume 1,4 ml 1, 23 ml (Japet, 2011) Warna Putih Susu Krem-Putih Susu (Japet, 2011) Bau Amis Bau Khas Sperma / Amis (Mar’ati, 2007) pH 7,5 7,14-7,85 (Fujaya, 2002) Konsistensi Kental / Pekat Sedang-Pekat (Japet, 2011) Mikroskopis Konsentrasi (sel / ml) 9,58 x 10 9 5,53 x 10 9 (Japet , 2011) Motilitas :
Progresifitas Kecepatan Gerakan Massa 76% 3 +++ 70%-99% (Chew et al., 2010) 3 (Japet, 2011) +++ (Japet, 2011) Viabilitas 84% >70% (Fujaya, 2002)
Keterangan : +++ = membentuk gelombang besar dan banyak; 3 = cepat
Pemeriksaan  motilitas  pada  sperma segar menunjukkan bahwa 76% sel spermatozoa masih bergerak, sehingga dapat digunakan pada proses penyimpanan. Hasil pemeriksaan motilitas  spermatozoa  pada  saat pre  freezing menunjukkan  bahwa  penggunaan  konsentrasi gliserol  13%  memiliki  nilai  motilitas  tertinggi yaitu sebesar 65% dibandingkan ketiga perlakuan lain yang menunjukkan nilai motilitas sebesar  60%.  Hasil  pemeriksaan  motilitas spermatozoa  saat post  thawing menunjukkan bahwa  penggunaan  konsentrasi  gliserol  13% memiliki  nilai  rata-rata  motilitas  tertinggi  yaitu sebesar  51±10,25,  sedangkan  penggunaan konsentrasi  gliserol  17%  menunjukkan  nilai rata-rata  motilitas  terendah  yaitu  sebesar 46±4,18.
Viabilitas  spermatozoa  dihitung  dari jumlah spermatozoa hidup dan mati dalam suatu lapang pandang dengan jumlah total spermatozoa  yang  dihitung  sebanyak  100  sel spermatozoa  (Susilowati  dkk.,  2010).  Proses pemeriksaan  viabilitas  dilakukan  dua  kali  pada saat segar dan pada saat setelah dibekukan ( post thawing ).  Pemeriksaan  viabilitas  pada  sperma segar menunjukkan bahwa 84% sel spermatozoa masih  hidup,  sehingga  dapat  digunakan  pada proses  penyimpanan.  Spermatozoa  hidup  dapat dilihat  melalui  bentuk  dan  warna  spermatozoa yang  berbeda.  Hasil  pemeriksaan  viabilitas spermatozoa  saat post  thawing menunjukkan bahwa  penggunaan  konsentrasi  gliserol  13% memiliki  nilai rata-rata  viabilitas tertinggi  yaitu sebesar  59,2±14,27,  sedangkan  penggunaan konsentrasi  gliserol  17%  menunjukkan  nilai rata-rata  viabilitas  terendah  yaitu  sebesar 53,6±7,44.
Berdasarkan hasil
penelitian, persentase  motilitas  sebelum  pembekuan  ( pre freezing ) pada keempat perlakuan tersebut dapat dikatakan  stabil  karena  menunjukkan  selisih yang  hampir  sama  yaitu  antara  11%-14%. Penurunan  motilitas  tersebut  diakibatkan  efek dari cold shock . Salah satu efek negatif dari cold shock adalah  menurunkan  proses  metabolisme
spermatozoa  (Gazali  dan  Tambing,  2002). Berdasarkan analisis statistik, rata-rata motilitas sperma  ikan  patin  pada  saat post  thawing tidak memiliki  perbedaan  yang  nyata  (P>0,05). Beberapa  faktor  yang  diduga  menyebabkan terjadinya perbedaan yang tidak nyata pada nilai motilitas  sperma  ikan  patin  pada  saat post thawing adalah  spermatozoa  yang  belum matang  dan  rasio  pengenceran  yang  kurang tepat.
Pelaksanaan  penelitian  ini  pada  bulan April  sehingga  kematangan  gonad  diduga menurun  dan  spermatozoa  yang  dihasilkan cenderung masih belum matang. Menurut Zairin (2000) dalam Sutrisna  (2002),  perkembangan dan  aktivitas  gonad  ikan  patin  menurun  pada bulan  Maret  sampai  Juni  dan  optimal  selama bulan November sampai Januari. Fujaya (2002) menambahkan  bahwa  stimulasi  dan  lama pergerakan spermatozoa dipengaruhi oleh kematangan  spermatozoa.  Suhu thawing yang digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  sebesar 26 o C  dengan  periode thawing selama  15  detik. Yavas and Bozkurt (2011), menyatakan  bahwa suhu dan periode terbaik yang berpengaruh pada motilitas pada saat thawing adalah dengan suhu 35 o C selama 30 detik. Steyn et al . (1985) dalam Francis et  al .  (2013)  menambahkan  bahwa proses thawing harus  dilakukan  dengan  waktu yang  singkat  untuk  menghindari  kerusakan  sel yang disebabkan oleh rekristalisasi.
Mitokondria  yang  rusak  akan  menyebabkan putusnya rantai oksidasi. Akibatnya, pergerakan spermatozoa  terhenti  karena  tidak  ada  lagi pasokan  energi  dari  organel  mitokondria  yang berfungsi merangsang fungsi mikrotubula (Gazali  dan  Tambing,  2002).  Rasio  antara semen  dengan  bahan  pegencer  yang  digunakan dalam penelitian ini adalah 1:50. Berbagai rasio pengenceran  yang  telah  digunakan  pada  ikan antara  lain  1:6  (Uddowla et  al .,  2011)  hingga
1:60 (Adipu, 2011). Penentuan rasio pengenceran berdasarkan konsentrasi dari spermatozoa,  konsentrasi  sperma  yang  tinggi memerlukan  rasio  pengenceran  yang    tinggi
Tabel 2. Hasil pengamatan motilitas dan viabilitas spermatozoa ikan patin
Perlakuan Parameter Gliserol 11% Gliserol 13% Gliserol 15% Gliserol 17% Motilitas Pre Freezing (%) 60 65 60 60 Selisih Motilitas Pre Freezing dan Post Thawing (%) 11 14 12 14 Motilitas Post Thawing (%) 49±5,48 a 51±10,25 a 48±9,75 a 46±4,18 a Viabilitas Post Thawing (%) 58,2±10,35 a 59,2±14,27 a 57,8±10,89 a 53,6±7,44 a
Keterangan : Huruf superskrip yang sama pada tiap baris menunjukkan tidak adanya perbedaan yang nyata (P>0,05).
begitu  pula  sebaliknya  (Uddowla et  al .,  2011). Menurut  Adipu  (2011),  motilitas  sperma  yang tinggi  disebabkan  karena  bahan  pengencer sudah  memberikan  ruang  gerak  yang  baik  bagi spermatozoa.  Selain  itu,  semen  yang  encer mengandung kadar potassium sehingga pergerakan spermatozoa menjadi lebih aktif.
Penurunan  motilitas  yang  terjadi  pada konsentrasi  gliserol  11%,  15%,  dan  17%  yang disebabkan  oleh  berkurangnya  metabolisme  sel spermatozoa  ini  terjadi  akibat  efek cold  shock . Kejutan dingin ( cold shock ) dapat menyebabkan penurunan  motilitas  dan  memicu  terjadinya kerusakan  langsung  yang  berpengaruh  pada struktur  dan  fungsi  seluler,  salah  satunya  yaitu penurunan  proses  metabolisme  spermatozoa (Gazali  dan  Tambing,  2002).  Berdasarkan analisis statistik, rata-rata viabilitas spermatozoa ikan  patin  pada  saat post  thawing tidak menunjukkan  adanya  perbedaan  yang  nyata antara keempat perlakuan (P>0,05). Hal tersebut diduga akibat dari penggunaan waktu equilibrasi  yang  kurang  tepat  serta  pengaruh suhu dan periode thawing yang kurang optimal.
Waktu  equilibrasi  yang  digunakan dalam  penelitian  ini  adalah  selama  90  menit. Menurut Francis et al. (2013), salah  satu  faktor penentu  dalam  mempertahankan  viabilitas spermatozoa adalah penggunaan waktu equilibrasi  yang  tepat.  Equilibrasi  yang  terlalu lama  akan  menyebabkan  gliserol  akan  menarik air secara berlebihan dan menyebabkan dehidrasi  sel  sehingga  terjadi  kerusakan  sel spermatozoa (Best, 2006 dalam Arifiantini dkk., 2005).  Apabila  waktu  equilibrasi  kurang  maka krioprotektan  tidak  mempunyai  waktu  untuk melakukan  penetrasi  ke  dalam  sel  sperma sehingga  tidak  dapat  melindungi  sel  sperma dengan  baik  (Francis et  al ,  2013).  Proses thawing pada  penelitian  ini  dilakukan  dengan menggunakan  suhu  26 o C  selama  15  detik. Menurut  Yavas and Bozkurt  (2011),  proses thawing yang terbaik adalah dengan menggunakan  suhu  35 o C  selama  30  detik  pada spermatozoa grass  carp .  Proses thawing yang tepat  dapat  mencegah  terjadinya  pembentukan kembali  kristal  es  (Lahnsteiner,  2000 dalam Yavas and Bozkurt, 2011). Pembentukan kristal es selama proses kriopreservasi sel spermatozoa menyebabkan  terjadinya  penumpukan  elektrolit di dalam sel. Hal tersebut mengakibatkan terjadi kerusakan  sel  secara  mekanik.  Pembentukan kristal es dapat menyebabkan kerusakan organel seperti lisosom dan mitokondria sehingga dapat menyebabkan  kematian  pada  spermatozoa (Gazali  dan  Tambing,  2002).  Penurunan  yang terjadi  pada  konsentrasi  gliserol  sebesar  11%, 15%,  dan  17%  dikarenakan  oleh  efek  gliserol
yang kurang baik dalam menggantikan air bebas dan  mendesak  keluar  elektrolit-elektrolit  pada saat proses pembekuan, sehingga elektrolit akan menumpuk  dan  merusak  dinding  sel  sehingga pada  waktu  pencairan  kembali  ( post  thawing ) permeabilitas  membran  plasma  akan  menurun dan sel akan mati (Gazali dan Tambing 2002).

## Kesimpulan
Hasil  penelitian  dapat  disimpulkan bahwa  penggunaan  konsentrasi  gliserol  11%- 17% pada pengencer susu skim dan kuning telur tidak  memberikan  perbedaan  yang  nyata terhadap  persentase  motilitas  dan  viabilitas spermatozoa  ikan  patin  pada  saat post  thawing dalam teknik kriopreservasi sperma.
Perlu  dilakukan  pengujian  lebih lanjut  tentang  pengaruh  dari  kematangan spermatozoa,  suhu  dan  periode  saat thawing , rasio  pengenceran,  dan  waktu  equilibrasi  pada proses peyimpanan sperma beku ikan.

## Daftar Pustaka
Adipu, Y., H. Sinjal, dan J. Watung. 2011. Ratio Pengenceran Sperma Terhadap Motilitas  Spermatozoa,  Fertilitas  dan Daya  Tetas  Ikan  Lele  ( Clarias sp.). Jurnal  Perikanan  dan  Kelautan  Tropis,
8 (1) : 48-55.
Arifiantini,  R.  I.,  I.  Supriatna,  dan  Samsurizal.
2007.  Penentuan  Waktu  Equilibrasi pada Pembekuan Semen Kuda Menggunakan  Bahan  Pengencer  Susu Skim.  Animal  Reproduction,  9  (3)  : 145-152.
Chew,  P.C.,  Z.A.  Rashid  and  R.  Hassan.  2010.
Application of Innovative Biotechnologies Regarding  Aquaculture  and  Fisheries Sector  in  Malaysia:  Cryopreservation Programme. Freshwater Fisheries Research Center. Malaysia. www.fao.org . 3 Juni 2013. 17 hal. Diwan,  A.D.,  S.  Ayyapan,  K.K.  Lal,  and  W.S. Lakra.  2010.  Cryopreservation  of  Fish Gametes  and  Embryos.  Indian  Journal of Animal Sciences, 80 (4) : 109-124.
Francis,  T.  C.A  Devi,  and  M.  Selvamagheswaran. 2013.  Cryopreservaation  of    Carp Spermatozoa. Indian Journal of Science and Technology, 6 (5) : 4524-4530
Fujaya,  Y.  2002.  Fisiologi  ikan  :  Dasar Pengembangan  Teknologi  Perikanan.
PT Rineka Cipta. Jakarta
Gazali,  M  dan  S.  N.  Tambing.  2002.
Kriopreservasi Sel Spermatozoa. Hayati, 9 (1) : 27-32.
Hardijanto,  S.  Susilowati,  T.  Hernawati,  T. Sardjito,  dan  T.  W.  Suprayogi.  2010,
Buku Ajar Inseminasi Buatan. Universitas  Airlangga.  Surabaya.  Hal 40. Japet,  N.  2011.  Karakteristik  Semen  Ikan Ekonomis  Budidaya  :  Mas  ( Cyprinus carpio ), dan Patin ( Pangasius hypothalamus ). Skripsi. Institut
Pertanian Bogor. Bogor. Hal : 20. Junior,  M.Z.,  S.  Handayani  dan  I.  Supriatna. 2005. Kualitas Sperma Ikan Batak ( Tor soro )  Hasil  Kriopreservasi  Semen
Menggunakan Dimetilsulfoksida
(DMSO)  dan  Gliserol  5,  10  dan  15%. Jurnal  Akuakultur  Indonesia,  4  (2)  :
145-151.
Kementerian  Kelautan  dan  Perikanan.  2010. Laporan  Akhir  Kegiatan  Penelitian  :
Teknologi  Pembenihan  Ikan  Patin ( Pangasius sp.) yang Dipelihara Secara Outdoor di  Kolam  yang  Dipupuk.
Badan  Penelitian  dan  Pengembangan Kelautan dan Perikanan. Sukamandi.
Mar’ati,  K.  2007.  Pengaruh  Dosis  dan  Lama Penyimpanan  Pengencer  Susu  Skim Kuning Telur Terhadap Kualitas
Semen Ikan Mas ( Cyprinus carpio L.) . Skripsi. Jurusan Biologi Fakultas Sains dan  Teknologi.  Universitas  Islam Negeri Malang.
Muchlisin, Z.A., R. Hashim, and A.S.C. Chong.
2004.  Preliminary  Study  on  The
Cryopreservation  of  Tropical  Bagrid Catfish (Mystus nemurus) Spermatozoa;  The  Effect  of  Extender and  Cryoprotectant  on  The  Motility After Short-Term Storage. Theriogenology, 62 (2004) : 25-34.
Saparinto,  C.  2010.  Usaha  Ikan  Konsumsi  di Lahan  100  m 2 .  Penebar  Swadaya.
Jakarta. Setyono, B. 2009. Pengaruh Perbedaan Konsentrasi  Bahan  pada  Pengencer Sperma  Ikan  “Skim  Kuning  Telur” terhadap Laju Fertilisasi, Laju Penetasan  dan  Sintasan  Ikan  Mas ( Cyprinus carpio L). GAMMA, V (1) : 01-12. Slembrouck, J., O. Komarudin, Maskur. dan M. Legendre.  2005.  Petunjuk  Teknis Pembenihan  Ikan  Patin  Indonesia, Pangasius djambal . Terjemahan : Subandi,  A  dan  Khan,  Z.  IRD  dan Pusat Riset Perikanan Budidaya, Badan Riset Kelautan dan Perikanan. Jakarta.
Sulmartiwi,  L.,  E.  Ainurrohmah,  dan  A.  S. Mubarak.  2011.  Pengaruh  Konsentrasi Air  Kelapa  Muda  dan  Madu  dalam NaCl Fisiologis Terhadap Motilitas dan Lama  Hidup  Spermatozoa  Ikan  Patin ( Pangasius  pangasius ).  Jurnal  Ilmiah Perikanan dan Kelautan, 3 (1) : 67-71.
Susilowati,  S.  Hardijanto,  T.  W.  Suprayogi,  T. Sardjito,  dan  T.  Hernawati.  2010. Penuntun Praktikum Inseminasi Buatan.  Airlangga  University  Press. Surabaya.
Sutrisna.  2002.  Keragaman  Kualitas  Sperma Ikan  Patin  ( Pangasius  hypopthalmus Sauvage)  pada  Bulan  Oktober  2000- Februari 2001. Skripsi. Jurusan Budidaya  Perairan.  Fakultas  Perikanan dan  Ilmu  Kelautan.  Institut  Pertanian Bogor.
Uddowla, M.H., U. Salma, M.M. Rahman, M.S. Hossain  and  M.F.A.  Mollah.  2011. Effect of Diluents, Dilution  Ratios and Cryoprotectants for The Cryopresevation  of  Thai  Sharpunti ( Barbodes  gonionotus )  spermatozoa. International Journal of Natural Sciences, 1 (2) : 44-51.
Vishwanath,  R.  and  P.  Shannon.  2000.  Storage of  Bovine  Semen  in  Liquid  Frozen State.  Animal  Reproduction  Science, 62 : 23-53.
Widjaya,  N.  2011.  Pengaruh  Pemberian  Susu Skim  dengan  Pengencer  Tris  Kuning
Telur  terhadap  Daya  Tahan  Hidup Spermatozoa Sapi pada Suhu Penyimpanan  5ºC.  Sains  Peternakan,  9 (2) : 72-76. Yavas,  I.,  and  Y.  Bozkurt.  2011.  Effect  of Different  Thawing  Rates  on  Motility and Fertilizing Capacity of Cryopreserved Grass Carp ( Ctenopharyngodon idella ) Sperm.
Biotechnol  &  Biotechnol.  25  (1)  : 2254-2257.