Penulis Eti Rohaeti 1 *, Dea Nurafifah 1 , Irmanida Batubara 1,2
Afiliasi 1 Departemen  Kimia,  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam,  Institut  Pertanian  Bogor, Kampus IPB Dramaga, Jl. Kamper, Babakan, Kec. Dramaga, Kabupaten Bogor, Jawa Barat 16680 2 Pusat  Studi  Biofarmaka  Tropika,  Lembaga  Penelitan  dan  Pengabdia  kepada  Masyarakat.,  Institut Pertanian  Bogor,  Kampus  IPB  Taman  Kencana,  Jl.  Taman  Kencana  No.3,  RT.03/RW.03,  Babakan, Kecamatan Bogor Tengah, Kota Bogor, Jawa Barat 16128
Kata Kunci  fraksionasi
 ikan zebra
 inhibitor α -glukosidase
 KLT bioautografi
Keywords  fractionation
 zebra fish
 α -glucosidase inhibitor
 bioautographic TLC
Diterima 20 Juli 2020 Direvisi 29 November 2022 Disetujui 30 November 2022
*Penulis Koresponding
Eti Rohaeti email: etirohaeti@apps.ipb.ac.id

## ABSTRAK
Penelitian  bertujuan  menentukan  fraksi  aktif  dan  profil  senyawa  aktif  pada  ekstrak kulit  buah  salak  Manonjaya  yang  berperan  sebagai  antidiabetes  serta  menentukan aktivitas antidiabetes menggunakan hewan uji berupa ikan zebra. Kulit buah diekstraksi dengan  cara  maserasi  menggunakan  pelarut  etanol  70%  kemudian  difraksionasi menggunakan  n-heksana,  etil  asetat  dan  metanol.  Fraksi  etil  asetat  menunjukkan rendemen dan kadar fenolik total tertinggi juga penghambatan α -glukosidase paling kuat dengan  persen  inhibisi  sebesar  64.43%.    Fraksi  etil  asetat  memberikan  spot  teraktif sebagai  inhibitor  α -glukosidase.  Profil  senyawa  aktif  yang  berperan  sebagai  senyawa antidiabetes ialah flavonoid dari golongan glikosilflavon dan flavon. Aktivitas antidiabetes menggunakan ikan zebra, menunjukkan ekstrak kasar etanol dan fraksi etil asetat dapat menurunkan  kadar  gula  darah  ikan  zebra  yang  diinduksi  dengan  aloksan.  Kelompok ekstrak  kasar  memiliki  kadar  gula  54.51%  lebih  rendah  dibandingkan  kelompok  induksi dan  41.70%  lebih  rendah  dibandingkan  kontrol  negatif.  Sementara  kelompok  fraksi  etil asetat  memiliki  kadar  gula  65.10%  lebih  rendah  dibandingkan  kelompok  induksi  dan 55.27% lebih rendah dibandingkan kontrol negatif.

## ABSTRACT
This  research  aimed  to  determine  the  active  fraction  and  profile  of  active compounds in Manonjaya snakefruit skin extract that can be used as antidiabetic and the antidiabetic activity using zebra fish. Manonjaya snakefruit skin was extracted by maceration  using  70%  ethanol  and  then  fractionated  using  n-hexane,  ethyl  acetate and methanol. The ethyl acetate fraction showed the highest yield and total phenolic content  as  well  as  the  strongest  α -glucosidase  inhibition  with  an  inhibition percentage of 64.43%. The ethyl acetate fraction provided the most active spot as an α -glucosidase  inhibitor.  The  profile  of  active  compounds  that  act  as  antidiabetic compound is flavonoid from glycosylflavone and flavone groups. Antidiabetic activity using  zebra  fish  was  indicates  that  Manonjaya  snakefruit  skin  extract  from  ethanol extract and ethyl acetate fraction can decrease blood sugar level of zebra fish after induced with alloxan. The crude extract group had 54.51% lower sugar content than the  induction  group  and  41.70%  lower  than  the  negative  control.  Meanwhile,  the ethyl  acetate  fraction  group  had  65.10%  lower  sugar  content  than  the  induction group and 55.27% lower than the negative control.
Aktivitas Antidiabetes Ekstrak Kulit Buah Salak Manonjaya dengan Ikan Zebra ( Danio rerio ) Sebagai Hewan Model
Antidiabetic Activity of Manonjaya Snakefruit Skin Extract with Zebra Fish (Danio rerio) as Animal Model

## PENDAHULUAN
Diabetes  melitus  merupakan  penyakit  metabolik yang  berlangsung  kronik  dimana  penderita  diabetes tidak  bisa  memproduksi  insulin  dalam  jumlah  yang cukup  atau  tidak  mampu  menggunakan  insulin  secara efektif sehingga terjadi kelebihan gula dalam darah dan baru  dirasakan  setelah  terjadi  komplikasi  lanjut  pada organ tubuh (Misnadiarly, 2006). Diabetes melitus yang paling banyak diderita oleh masyarakat adalah diabetes melitus  tipe  2,  dimana  tidak  disebabkan  oleh  rasio insulin  di  dalam  sirkulasi  darah  melainkan  akibat kelainan  dari  metabolisme,  yaitu  meningkatnya  kadar glukosa dalam darah akibat terlalu banyak mengonsumsi makanan yang mengandung karbohidrat dan  gula.  Mengontrol  kadar  gula  dalam  darah merupakan  salah  satu  cara  untuk  mengobati  diabetes melitus  tipe  2  sehingga  dapat  menunda  absorpsi glukosa, salah satu caranya yaitu dengan menghambat enzim  α - glukosidase  (Yuhao  2005).  Enzim  α - glukosidase  merupakan  enzim  yang  mampu  memecah molekul karbohidrat menjadi glukosa pada dinding usus halus.  Inhibisi  kerja  enzim  α -glukosidase  dapat mengurangi  pencernaan  karbohidrat  kompleks  dan absorpsinya  sehingga  dapat  mengurangi  peningkatan kadar  glukosa  dalam  darah.  Indonesia  memiliki tanaman dan buah yang mampu menghambat enzim α - glukosidase,  namun  sebagian  besar  belum  dapat dibuktikan secara ilmiah.
Buah  salak ( Salacca  edulis Reinw)  merupakan  salah satu buah yang sangat melimpah di Indonesia. Buah ini merupakan  buah  khas  dari  Indonesia  yang  dapat ditemukan  hampir  di  setiap  daerah.  Selain  itu,  buah salak  digemari  oleh  masyarakat  karena  memiliki  rasa yang  bervariasi  bergantung  tempat  tumbuhnya.  Di Indonesia  semua  bagian  salak  dapat  dimanfaatkan, seperti  buahnya  dapat  dimanfaatkan  sebagai  bahan pangan, bijinya dapat dibuat menjadi kopi (Nazaruddin & Kristiawati 1992). Kulit salak merupakan limbah yang biasanya tidak digunakan lagi, tetapi ada sebagian kecil masyarakat  yang  menggunakan  kulit  salak  dan mempercayai  bahwa  jika  meminum  air  seduhan  kulit salak dapat mengurangi penyakit diabetes.
Hasil  uji  fitokimia  pada  kulit  dan  daging  buah  salak membuktikan terdapatnya  golongan senyawa alkaloid, flavonoid,  hidrokuinon,  steroid,  dan  tanin  serta beberapa  jenis  salak  tertentu  mengandung  saponin (Rohaeti et al , 2017). Penelitian tersebut menggunakan buah  salak  dari  Cililin,  Tasikmalaya,  dan  Taman  Buah Mekarsari serta ekstraknya diuji aktivitas antidiabetesnya  dengan  cara  uji  inhibisi  α -glukosidase. Nilai IC50 menunjukkan bahwa ekstrak yang berpotensi
sebagai  antidiabetes  adalah  ekstrak  kulit  buah  salak Manonjaya sebesar 17.9 µl/mL. Aktivitas penghambatan  enzim  α -glukosidase  ini  berhubungan dengan tingginya kadar fenol dan flavonoid totalnya.
Berdasarkan  jenis  senyawa  aktif  yang  berperan sebagai  antidiabetes  pada  ekstrak  kulit  buah  salak Manonjaya  dan  profil  senyawa  aktif  menggunakan kromatografi lapis tipis telah yang dilaporkan tersebut, maka  perlu  dilakukan  analisis  lebih  lanjut  mengenai aktivitas  antidiabetes  ekstrak  kulit  buah  salak Manonjaya  secara  in  vivo  menggunakan  ikan  zebra sebagai hewan model. Ikan zebra dipilih sebagai hewan model  sebab  telah  dilaporkan  kecocokan  hewan  ini untuk pengamatan penyakit akibat gangguan metabolic termasuk  diabetes  melitus.  Ikan  zebra  dapat  dibuat berkondisi  hiperglikemik  melalui  pemberian  agen diabetogenik seperti streptozotocin dan alloxan (Utami 2018).  Ikan  zebra  adalah  hewan  model  unik  untuk penelitian biomedis, termasuk studi proses biologis dan penyakit  manusia.  Ikan  zebra  memiliki  semua  organ utama  yang  terlibat  dalam  proses  metabolisme  dan dapat  digunakan  untuk  mempelajari  beberapa gangguan  metabolisme  manusia  seperti  diabetes melitus  tipe  2,  dislipidemia,  dan  penyakit  hati  (Teame et  al 2019).    Ikan  zebra  memiliki  keunggulan  sebagai hewan uji sebab berukuran tubuh kecil, berkemampuan reproduksi tinggi, dan memiliki embrio yang transparan, mampu menyerap bahan-bahan larut air (Amsterdam & Hopkins 2006; Rubistein et al. 2006, Khan  dan  Alhewairini  2018).  Sebagai  hewan  bertulang belakang,  ikan  zebra  memiliki  kesamaan  genetik  dan psikologi  dengan  mamalia    (Shin et  al. 2012)  dan memiliki  fisiologi  berbasis  sistem  insulin  mamalia. Penelitian  ini  bertujuan  menentukan  fraksi  aktif  dan profil  senyawa  aktif  pada  ekstrak  kulit  buah  salak Manonjaya  yang  berperan  sebagai  antidiabetes  serta menentukan  aktivitas  antidiabetes  menggunakan hewan uji berupa ikan zebra.

## METODE Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas (Pyrex), penguap putar, Gluco Strip Test, Accu  Check,  tanur,  oven  pengering,  eksikator, mikropelat  96-sumur,  akuarium,  pompa,  bejana kromatografi, dan pelat KLT GF254. Bahan-bahan yang digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  buah  salak Manonjaya  dari  daerah  Tasikmalaya,  n-butanol,  asam asetat glasial, akuades, etil asetat, n-heksana, metanol, etanol pa, etanol 70% (v/v), akuades, glukosa, enzim α - glukosidase, bufe r fosfat pH 7.0, substrat pnitrofenil α -
D-glukopiranosa,  tablet  metformin,  HCl  2  N,  Na 2 CO 3 , NaCl  0.9%  (v/v)  ,  Folin-Ciocalteu  10%  (v/v),  AlCl 3 10% (b/v), CH 3 COOK 1 M, asam galat, kuersetin, DMSO, ikan zebra, aloksan, dan pakan kering tetramin.

## Koleksi dan Preparasi
Sampel ( Gambar  1 )  dikoleksi  dari kebun  salak  yang berada  di  Desa  Kalimanggis  Kecamatan  Manonjaya, Tasikmalaya.  Selanjutnya  dilakukan  pemisahan  kulit dengan  buah  salak,  perajangan,  dan  pengeringan. Setelah  sampel  sudah  kering,  sampel  digiling  sehingga didapatkan simplisia yang berukuran 80 mesh.

## Gambar 1. Buah Salak Manonjaya yang Digunakan dalam Penelitian

## Ekstraksi Kulit Buah Salak
Simplisia  kering  kulit  buah  salak  diekstraksi  dengan etanol  70%  (v/v).  Perbandingan  sampel  dan  pelarut etanol  sebesar  1:3  menggunakan  metode  maserasi selama  24  jam,  dilakukan  triplo.  Ekstrak  yang  telah didapat  kemudian  diuapkan  dengan  penguap  putar pada suhu 30-40°C sehingga diperoleh ekstrak kasar.

## Penentuan Kadar Fenolik Total
Kadar  fenolik  total  ditentukan  berdasarkan metode Amarowicz et al. (2004), Swain dan Hillis (1959), Naczk dan  Shahidi  (1989)  dan  modifikasi  prosedur  dari pengukuran  menggunakan  mikropelat  96-sumur. Sebanyak 10 µl larutan ekstrak diambil dan dimasukkan ke dalam mikropelat 96-sumur, kemudian ditambahkan akuades  sebanyak  160  µl.  Setelah  tercampur, ditambahkan  sebanyak  10  µl  reagen  Folin-Ciocalteu 10%  (v/v)  dan  20  µl  larutan  Na 2 CO 3 7%  (b/v).  Lalu campuran diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang, pengukuran  dilakukan  triplo.  Absorbans  diukur  pada panjang gelombang 750 nm dengan microplate reader. Kadar  fenolik  total  sampel  ditentukan  sebagai  nilai ekivalen  asam  galat  (EAG)  yang  dihitung  berdasarkan kurva  kalibrasi  yang  dibuat  dari  absorbans  larutan
standar asam galat pada konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25 dan 3,125 ppm.

## Penentuan Kadar Flavonoid Total
Kadar  flavonoid  total  ditentukan  berdasarkan metode  Chang et  al. (2002)  dengan  modifikasi. Sebanyak  10  µl  larutan  ekstrak  dimasukkan  ke  dalam mikropelat  96-sumur,  kemudian  ditambahkan  60  µl etanol, 10 µl AlCl3 10% (b/v), 10  µl CH 3 COOK 1 M dan 120  µl  akuades.  Lalu  campuran  diinkubasi  selama  30 menit  pada  suhu  ruang,  pengukuran  dilakukan  triplo. Absorbans  diukur  pada  panjang  gelombang  415  nm dengan microplate  reader .  Kadar  flavonoid  total ditentukan  berdasarkan  ekivalen  kuersetin  (EK)  dari kurva  kalibrasi  larutan  standar  kuersetin  pada konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25 dan 3,125 ppm.

## Fraksinasi
Ekstrak kasar yang diperoleh difraksionasi menggunakan pelarut non polar, semi polar, dan polar. Ekstrak etanol kulit salak dimasukkan ke dalam corong pisah  dan  ditambahkan  pelarut  non  polar  yaitu  n- heksana  dengan  perbandingan  ekstrak:pelarut  (1:1). Campuran  dikocok  selama  5  menit  sekali  sebanyak  3 kali  lalu  didiamkan  hingga  membentuk  dua  lapisan. Lapisan atas (lapisan n-heksana) diambil, lapisan bawah kemudian  difraksionasi  kembali  menggunakan  pelarut semi  polar  yaitu  etil  asetat  dengan  prosedur  yang sama, dan terakhir difraksionasi 4 kembali menggunakan  larutan  polar  yaitu  metanol.  Ekstrak yang  dihasilkan  dari  ketiga  fraksi  diuapkan  dengan penguap putar. Proses pemisahan dilakukan triplo.
Penentuan Aktivitas I nhibisi α -glukosidase Sebanyak  10  µL  larutan  sampel  ditambahkan dengan  50  µL  bufer  fosfat  pH  7.00  dan  25  µL  larutan substrat  p- nitrofenil  α -D-glukopiranosa,  diinkubasi pada  suhu  37  °C  selama  5  menit.  Campuran ditambahkan  25  µL  larutan  enzim  α -glukoasidase  dan diinkubasi  kembali  selama  15  menit  pada  suhu  37  °C. Setelah selesai diinkubasi, campuran ditambahkan 100 µL  Na 2 CO 3 200  mM.  Bahan  tersebut  dimasukkan  ke dalam  mikropelat  96-sumur.  Absorbans  sampel  dan standar yaitu akarbosa dibaca pada 410 nm.
Bioautografi Inhibitor α -glukosidase
Profil  senyawa  diuji  untuk  menentukan  fraksi senyawa  aktif  yang  berperan  sebagai  antidiabetes. Ekstrak ditotolkan pada pelat KLT GF254 menggunakan Linomat,  pelat  dimasukkan  ke  dalam  bejana kromatografi yang berisi eluen terbaik n-butanol: asam
asetat  glasial:  air  dengan  perbandingan  6:2:2, kemudian  pelat  KLT  diangkat  dan  dikeringkan.  Setelah pelat kering kemudian disemprot dengan larutan enzim α -glukosidase  dan  pelat  didokumentasi  dan  dievaluasi dengan  lampu  UV  254  dan  366  nm.  Kemudian diinkubasi  selama  60  menit  pada  suhu  ruang  dan disemprot dengan substrat p- nitrofenil α -D- glukopiranosa. Spot pita berwarna kuning akan muncul setelah  didiamkan  pada  suhu  ruang.  Spot  tersebut menunjukkan  bahwa  sampel  yang  diuji  aktif  sebagai inhibitor  α -glukosidase.  Pelat  didokumentasi  dan dievaluasi pada sinar tampak (Pires et al. 2009).

## Pemeliharaan dan Persiapan Ikan Zebra
Pemeliharaan  dan  persiapan  ikan  zebra  sebagai hewan uji adalah sistem sirkulasi akuarium menggunakan  filter  canister.  Sistem  aerasinya menggunakan  pompa  dan  selang  yang  tersambung  ke dalam  setiap  akuarium.  Setelah  kondisi  ruangan  dan akuarium  siap,  ikan  zebra  sebanyak  200  ekor ditempatkan dalam akuarium dengan ukuran 10 x 15 x 100  cm  dan  dilakukan  masa  adaptasi  selama  1  bulan. Ikan  zebra  diberi  makan  1  kali  sehari  dengan  pakan kering  tetramin  sebanyak  4%/ekor/hari  (Advesh et  al. 2012).

## Induksi Glukosa pada Ikan Zebra
Sebanyak  90  ekor  ikan  zebra  ditempatkan  dalam akuarium berisi air keran yang telah didiamkan selama 24  jam.  Ikan  zebra  diinduksi  dengan  cara  perendaman menggunakan  larutan  aloksan  0.05%  (b/v)  selama  30 menit,  kemudian  larutan  glukosa  5%  (b/v)  selama  60 menit,  selanjutnya  dipindahkan  ke  dalam  akuarium berisi  akuades.  Induksi  dilakukan  selama  7  hari  pada suhu  kamar,  larutan  aloksan,  glukosa  dan  akuades diganti setiap hari. Jika perwakilan beberapa ekor telah mencapai  tingkat  hiperglikemia  maka  ikan  zebra  telah siap medapatkan ekstrak. Pengecekan kadar gula darah dilakukan  pada  hari  pertama,  ketiga  dan  ketujuh menggunakan  Glucose  Strip  Test  ACCU-CHECK®  Active (Shin et al. 2012).

## Pembuatan Pakan Ekstrak
Pakan  kering  dimasukkan  ke  dalam  tabung  plastik, kemudian ekstrak ditambahkan ke dalam pakan sedikit demi  sedikit  sambil  terus  diaduk.  Proses  ini  dilakukan sampai  ekstrak  tercampur  sempurna  dengan  pakan. Variasi nisbah pakan: ekstrak yang dibuat adalah 1:0.6. Untuk  kontrol  positif  menggunakan  nisbah  pakan: tablet metformin 1:0.6.

## Pengujian  Ekstrak  Kasar  dan  Ekstrak  Fraksi  Terpilih dengan Ikan Zebra
Ikan zebra yang telah mengalami diabetes kemudian diberi pakan yang mengandung ekstrak berupa ekstrak kasar  dan  dari  fraksi  teraktif  yaitu  etil  asetat  selama  3 hari.  Kemampuan  ekstrak  sebagai  antidiabetes  diukur setelah  pemberian  pakan  ekstrak  setiap  hari  selama  3 hari. Ikan zebra dipindahkan ke dalam wadah berisi air dingin,  dengan  tujuan  membuat  ikan  zebra  pingsan. Setelah pingsan, ikan zebra  diangkat  dan kelebihan air pada  sisik  dihilangkan  menggunakan  tisu.  Bobot  ikan zebra  ditimbang,  lalu  diletakkan  di  atas  alas  keramik dalam  posisi  melintang,  darah  diperoleh  dengan memotong  bagian  ekor.  Contoh  darah  ditempelkan pada Glucose Strip Test ACCUCHECK® Active yang akan secara otomatis menyerap darah (Capiotti et al. 2014).

## Analisis Data
Analisis  data-data  yang  diperoleh  dari  uji  aktivitas antidiabetes ekstrak secara in vivo diolah menggunakan software  statistical  package  for  social  science  (SPSS) versi 18. Metode yang digunakan yaitu analisis oneway ANOVA.  Analisis  ini  digunakan  untuk  menguji  adanya perbedaan nilai rerata antar ulangan. Adanya data yang berbeda nyata dilanjutkan dengan uji Duncan.

## HASIL & PEMBAHASAN
Kadar Fenolik Total, Flavonoid Total, dan Penghambatan α -Glukosidase
Ekstrak  kulit  buah  salak  Manonjaya  yang  didapat sebesar  8.65%.  Ekstrak  etanol  70%  ini  mengandung total fenolik sebesar 114.24mg EAG/g ekstrak dan total flavonoid  sebesar  16.12  mg  EK/g  ekstrak  ( Tabel  1 ). Kadar fenolik total hasil penelitian ini lebih rendah dari penelitian  sebelumnya  yaitu  136.63  ±  2.43  mg  EAG/g ekstrak,  sementara  total  flavonoidnya  lebih  tinggi dibandingkan  hasil  penelitian  sebelumnya  yaitu  6.45 ± 0.44 mg EK/g ekstrak (Rohaeti et  al. 2017). Perbedaan kandungan  dapat  terjadi  karena  jenis  salak  berbeda kondisi  fisik  dengan  penelitian  sebelumnya.  Senyawa golongan  fenolik  dan  flavonoid  dapat  penghambatan kerja enzim α -glukosidase karena mampu menetralkan radikal  bebas  sehingga  dapat  mencegah  kerusakan  sel beta  pankreas  yang  memproduksi  insulin  (Zahid et  al. 2022).
Ekstrak  kulit  buah  salak  Manonjaya  memiliki  nilai IC 50 yang baik terhadap enzim α -glukosidase, walaupun tidak  sebaik  akarbosa  yang  berperan  sebagai  kontrol positif  ( Tabel  1 ).  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  ekstrak kulit  buah  salak  Manonjaya  memiliki  potensi  sebagai antidiabetes dengan menghambat enzim α -
glukosidas e.  Jika  enzim  α -glukosidase  dapat  dihambat maka  katabolisme  polisakarida  dapat  dihambat  juga, sehingga  dapat  mengurangi  tingkat  kadar  gula  darah pada penderita diabetes (Prasetiyo et al . 2019).
Fraksionasi  Ekstrak  Kulit  Salak  Manonjaya  dan Bioautografi I nhibitor α -Glukosidase
Untuk  mengetahui  senyawa  aktif  pada  ekstrak etanol 70% kulit salak Manonjaya, dilakukan fraksinasi. Fraksi  yang  didapat  sebanyak  tiga  fraksi  yaitu  fraksi n - heksana  dengan  rendemen  0.63%,  fraksi  etil  asetat 0.94%  dan  fraksi  metanol  0.52%.  Berdasarkan  hasil rendemen  tersebut,  ekstrak  dari  fraksi  etil  asetat memiliki  jumlah  rendemen  yang  lebih  besar dibandingkan  fraksi  metanol  dan n -heksana,  hal  ini menunjukkan bahwa metabolit sekunder yang terdapat pada  ekstrak  kasar  lebih  banyak  terekstraksi  ke  dalam pelarut yang bersifat semi polar yaitu etil asetat.
Kandungan  total  flavonoid,  total  fenolik  dan aktivitas  penghambatan  enzim  alfa  glucosidase  ketiga fraksi  terangkum  pada Tabel  2 .  Kadar  flavonoid  total tertinggi  terdapat  pada  fraksi n -heksana,  sedangkan kadar flavonoid terendah pada fraksi metanol ( Tabel 2 ). Kadar  fenolik  total  tertinggi  terdapat  pada  fraksi  etil asetat, sedangkan kadar fenolik terendah pada fraksi n - heksana. Nilai IC 50 penghambatan kerja enzim alfa gluk osidase  terbaik  ditemukan  pada  fraksi  metanol walaupun  tidak  berbeda  nyata  dengan  kedua  fraksi lainnya. Nilai IC 50 ini lebih besar dibandingkan nilai IC 50 ekstrak etanol 70%. Hal ini menunjukkan bahwa setelah difraksinasi,  aktivitas  penghambatan  kerja  enzim  alfa glukosidase  menurun.  Aktivitas  inhibisi  pada  fraksi  n- heksana  33.52%,  fraksi  etil  asetat  64.43%,  dan  fraksi metanol 16.87%. dengan kontrol positif yaitu akarbosa
memiliki  aktivitas  inhibisi  88.73%  pada  konsentrasi 2000  ppm.  Berdasarkan  persen  inhibisi  dari  ketiga fraksi yang memiliki aktivitas inhibisi terbaik yaitu fraksi etil  asetat.  Pada  riset  tahap  selanjutnya  digunakan fraksi etil asetat sebagai fraksi untuk diuji secara in vivo menggunakan ikan zebra.
Penentuan  komponen  senyawa  aktif  antidiabetes ditentukan  menggunakan  KLT  Bioautografi.  KLT Bioautografi  adalah  metode  kromatografi  yang  dapat memisahkan  dan  mengetahui  aktivitas  dari  suatu metabolit  sekunder.  Ekstrak  dari  kulit  buah  salak Manonjaya  ditentukan  profil  senyawanya  dilihat  dari warna  noda  pada  sinar  UV  254  dan  366  nm  dan menentukan senyawa tersebut aktif sebagai antidiabetes  dilihat  dari  warna  noda  pada  sinar tampak.  Pada  deteksi  UV  254  nm  noda  warna  hitam yang  terbentuk  dapat  menunjukkan  adanya  senyawa flavonoid,  lignin,  alkaloid  dan  triterpena.  Markham (1988)  menyatakan  bahwa  noda  berwarna  biru  pada deteksi  UV  366  nm  menunjukkan  adanya  golongan flavonoid.  Pada  deteksi  UV  366  nm  semua  noda berwarna  biru,  hal  ini  menandakan  semua  noda menunjukkan adanya golongan flavonoid.
Noda  pada  bioautogram  antidiabetes  ekstrak  kulit buah salak Manonjaya yang menunjukkan aktif sebagai antidiabetes  ialah  noda  yang  warna  kuningnya memudar  pada  pelat  KLT  berwarna  putih  pada  sinar tampak  setelah  disemprot  oleh  en zim  α -glukosidase ( Gambar  2 ).  Spot  aktif  sebagai  antidiabetes  terdapat pada spot fraksi etil asetat dan ekstrak kasar ( Tabel 3 ). Setelah  diidentifikasi  nilai  Rf  dan  warna  noda  yang dihasilkan pada UV 254 nm, 366 nm dan sinar tampak ( Tabel 4 ), diduga pada spot fraksi etil asetat noda yang aktif  ialah  pada  Rf  0.55  (kuning  seulas)  merupakan
Tabel 1. Kadar Fenolik Total, Flavonoid Total, dan Nilai IC 50 Ekstrak Kasar
Sampel Total Fenolik Total Flavonoid IC 50 (mg EAG/g ekstrak) (mg EK/g ekstrak) (µg/mL) Kulit Salak Manonjaya 114.24 ± 17.29 16.12 ± 0.18 1.37 Akarbosa - - 0.012
Tabel 2 Kadar Fenolik Total, Flavonoid Total, dan Nilai IC 50 Alfa Glucosidase Fraksi Fraksi Total Flavonoid Total Fenolik IC 50 alfa glukosidase (mg EK/g ekstrak) (mg EAG/g ekstrak) (µg/mL) n -heksana 398.98 40.82 2.88 etil asetat 149.59 1086.73 3.08 Methanol 81.63 168.37 2.86
golongan glikosilflavon senyawa isoviteksin dan pada Rf 0.78 (kuning seulas) diduga merupakan golongan flavon senyawa luteolin. Pada spot ekstrak kasar noda dengan Rf  0.56  (kuning  seulas)  diduga  merupakan  golongan glikosilflavon  senyawa  isoviteksin  (Harborne  1987). Berdasarkan  pada  rendemen,  kadar  flavonoid  dan fenolik,  dan  aktivitas  inhibisi  yang  paling  tinggi,  serta memiliki spot  paling aktif pada KLT  bioautografi, maka fraksi  etil  asetat  merupakan  fraksi  paling  aktif  yang selanjutnya  ditentukan  aktivitas  antidiabetes  secara  in vivo dengan ikan zebra ( Danio rerio ).
Aktivitas  Antidiabetes  Ekstrak  Kulit  Salak  Manonjaya Secara in vivo
Pada  penelitian  ini,  ikan  zebra  dibagi  ke  dalam  6 kelompok  yaitu  kelompok  induksi  (kelompok  yang
diinduksi aloksan selama percobaan), kelompok kontrol negativef  (kelompok  yang  diinduksi  aloksan  selama tujuh  hari  kemudian  diberi  pakan  standar  tanpa induksi),  kelompok  kontrol  positif  (kelompok  yang diinduksi  aloksan  selama  percobaan  dan  diberi metformin),  kelompok  ekstrak  kasar  (kelompok  yang diinduksi aloksan selama percobaan dan diberi ekstrak kasar kulit buah salak Manonjaya), kelompok fraksi etil asetat  (kelompok  yang  diinduksi  aloksan  selama percobaan  dan  diberi  fraksi  etil  asetat),  dan  kelompok normal  (kelompok  yang  tidak  diinduksi  aloksan  sama sekali).
Perubahan  gula  darah  ikan  zebra  pada  tiap kelompok  selama  3  hari  perlakuan  terangkum  pada Tabel  4 .  Kelompok  yang  hanya  diinduksi  aloksan selama  percobaan  memiliki  kadar  gula  darah  yang
Gambar 2. Kromatogram  Ekstrak  Kulit  Salak  (a)  254nm,  (b)  366nm,  (c)  Sinar  Tampak  dan  Bioautogram  (d)  Sinar Tampak
Keterangan: (1) fraksi n -heksana, (2) fraksi etil asetat (3) fraksi metanol, (4) ekstrak kasar. Bulatan putih menunjukkan noda aktif dan merah menunjukkan noda tidak aktif dalam menghambat enzim
Tabel 3. Identifikasi Golongan Senyawa Aktif berdasarkan Nilai Rf dan Warna Pita pada KLT Bioautografi
tinggi  dan  meningkat  dari  hari  ke  harinya.  Induksi menggunakan aloksan telah dapat meningkatkan kadar gula  darah  pada  ikan  zebra.  Menurut  Jorgens et  al. (2012)  pada  ikan  zebra  dewasa  kadar  gula  darah normalnya sekitar 50-75 mg/dL, karena telah melewati batas  kadar  gula  darah  normal  pada  ikan  zebra  dan telah mengalami persentase kenaikan kadar gula darah normal  yang  tinggi,  maka  ikan  zebra  dapat  dikatakan telah  mencapai  kondisi  hiperglikemia  atau  telah mengalami diabetes.  Kelompok kontrol negatif, masih memiliki  kadar  gula  darah  pada  rentang  normal  yaitu paling tinggi 66.33 mg/dL pada hari ketiga setelah tidak diinduksi  aloksan.  Hal  ini  menunjukkan  adanya self recovery pada  ikan  zebra  setelah  air  tempat  hidupnya tidak  mengandung  aloksan  (Wang et  al. 2022). Kelompok  kontrol  positif  memiliki  kadar  gula  darah yang lebih rendah 25.75% dibandingkan kontrol negatif dan  42.00%  lebih  rendah  dibandingkan  kelompok induksi,  namun  belum  mampu  mencapai  kadar  gula darah  kelompok  normal.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa metformin dapat menurunkan gula darah dengan cara meregenerasi  sel  beta  di  pankreas  dalam  merangsang pembentukan hormon insulin. Kelompok  ekstrak  kasar dan  kelompok  fraksi  etil  asetat  mampu  menurunkan kadar  gula  darah  lebih  baik  dibandingkan  dengan kelompok  kontrol  positif.  Kelompok  ekstrak  kasar memiliki kadar gula 54.51% lebih rendah dibandingkan kelompok induksi dan 41.70% lebih rendah dibandingkan  kontrol  negative.  Sementara  kelompok fraksi  etil  asetat  memiliki  kadar  gula  65.10%  lebih rendah  dibandingkan  kelompok  induksi  dan  55.27% lebih rendah dibandingkan kontrol negative.
Hasil uji oneway ANOVA terhadap kadar gula darah setelah  induksi  dan  setelah  diberi  perlakuan
menunjukkan bahwa pada hari 1 (P>0.05), maka secara statistika  tidak  berbeda  nyata  artinya  tidak  ada perubahan  yang  signifikan  antara  gula  darah  setelah induksi  dan  setelah  diberi  perlakuan.  Pada  hari  2 (P<0.05)  secara  statistika  berbeda  nyata  artinya  ada perubahan  yang  signifikan  pada  penurunan kadar  gula darah ikan zebra yang telah mengalami diabetes, maka dilanjutkan  uji  Duncan  untuk  mengetahui  perbedaan pada  setiap  perlakuan  dan  perlakuan  mana  yang memberikan pengaruh signifikan. Hasil uji Duncan, gula darah  setelah  induksi  tidak  berbeda  nyata  dengan kelompok  ekstrak  kasar  dan  fraksi  aktif,  hal  ini menunjukkan  bahwa  ekstrak  kulit  buah  salak  belum mampu menurunkan kadar gula darah pada ikan secara signifikan.  Pada  hari  3  (P<0.05)  secara  statistika berbeda  nyata  artinya  ada  perubahan  yang  signifikan. Hasil uji Duncan, gula darah ikan zebra setelah induksi tidak  berbeda  nyata  dengan  kontrol  negatif,  tetapi berbeda  nyata  dengan  kelompok  kontrol  positif, ekstrak kasar, fraksi aktif dan kelompok normal. Hal ini menunjukkan  bahwa  secara  statistika  obat  metformin sebagai  kontrol  positif  dan  ekstrak  kulit  buah  salak telah mampu menurunkan kadar gula darah ikan zebra yang mengalami diabetes. Kelompok yang memberikan pengaruh  signifikan  pada  penurunan  kadar  gula  darah ikan  zebra  adalah  kelompok  ekstrak  kasar  dan  fraksi aktif.
Aktivitas hipoglikemia pada ekstrak kulit buah salak diduga  muncul  karena  kulit  buah  salak  memiliki senyawa inhibitor α -glukosidase. Senyawa ini berperan dalam  proses  menghambat  pencernaan  karbohidrat kompleks  menjadi  glukosa,  sehingga  asupan  glukosa dari  usus  kedalam  darah  dapat  dikurangi.  Selain  itu, flavonoid memiliki kemampuan merangsang

## Tabel 4 Rerata Gula Darah Ikan Zebra
Kelompok Perlakuan 7 hari pertama Perlakuan 3 hari selanjutnya Rerata gula darah ( mg/dL ) pada perlakuan 3 hari Hari 1 Hari 2 Hari 3 Induksi Induksi aloksan induksi aloksan, pakan standar 70.33 ± 21.50b 78 ± 12.77c 85 ± 5.29d Kontrol negatif Induksi aloksan pakan standar 57 ± 21.50b 41.33 ± 11.06ab 66.33 ± 0.58cd Kontrol positif Induksi aloksan Induksi aloksan, pakan standar, metformin 34.67 ± 9.07ab 34.67 ± 18.58ab 49.33 ± 29.48bc Ekstrak kasar Induksi aloksan Induksi aloksan, pakan standar, ekstrak kasar 44 ± 28.16ab 63 ± 18.19bc 38.67 ± 15.04ab Fraksi etil asetat  Induksi aloksan Induksi aloksan, pakan stadnar, fraksi etil asetat 37.33 ± 3.21ab 53 ± 17.35bc 29.67 ± 9.07ab Normal Tanpa induksi Pakan standar 16 ± 3.46a 20.33 ± 8.08a 12.67 ± 2.08a
Keterangan:  Angka yang diikuti huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak  berbeda nyata pada  uji lanjut Duncan  dengan tingkat kepercayaan 95% (P>0.05).
pengeluaran insulin dengan cara meregenerasi sel beta pankreas.  Flavonoid  juga  mampu  berperan  sebagai antioksidan  untuk  menangkap  radikal  bebas  yang dihasilkan  setelah  diinduksi  menggunakan  aloksan (Nurishmaya  2014).  Flavonoid  yang  diduga  memiliki aktivitas  hipoglikemia  pada  hewan  uji  yang  diinduksi aloksan  adalah  dari  golongan  glikos  iflavon  dan  flavon yang terdapat pada ekstrak kulit buah salak.

## SIMPULAN
Fraksi aktif dari ekstrak kasar etanol kulit buah salak Manonjaya  adalah  fraksi  etil  asetat  dengan  nilai rendemen tertinggi 0.94%, kadar fenolik total tertinggi 1087  mg  ekuivalen  asam  galat/g  ekstrak,  kadar flavonoid  total  tertinggi  150  mg  ekivalen  kuersetin/g ekstrak,  penghambatan  α -glukosidase  paling  kuat berdasarkan  persen  inhibisi  64.43%  dan  yang memberikan  spot  teraktif  sebagai  inhibitor  α - glukosidase. Profil senyawa aktif yang berperan sebagai senyawa  antidiabetes  ialah  flavonoid  dari  golongan glikosilflavon  dan  flavon.  Aktivitas  antidiabetes menggunakan ikan zebra, menunjukkan bahwa ekstrak kulit  buah  salak  Manonjaya  dari  ekstrak  kasar  etanol dan  fraksi  etil  asetat  dapat  menurunkan  kadar  gula darah ikan zebra yang diinduksi dengan aloksan.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  menyampaikan  terima  kasih  kepada Keluarga  Ibu  Siti  Rahma  di  Tasikmalaya  yang  telah menyediakan  sampel.  Riset  ini  juga  didanai  oleh kegiatan  Bantuan  Penguatan  Kelembagaan  Pusat Unggulan  Ilmu  Pengetahuan  dan  Teknologi  Perguruan Tinggi  tahun  2019  kepada  Pusat  Studi  Biofarmaka Tropika LPPM IPB dengan nomor kontrak 212/301196/III/2019.

## DAFTAR PUSTAKA
Amarowicz R, R.B. Pegg, P. Rahimi-Moghaddam, B. Barl, J.  A.  Weil.  2004.  Free-  radical  scavenging  capacity and  antioxidant  activity  of  selected  plant  species from  the  Canadian  prairies. Food  Chemistry .  84: 551-562.
Advesh et al. 2012. Regular care and maintenance of a ikan zebra (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments . 69(4196):1- 8. Amsterdam  A  and  Hopkins  N.  (2006).  Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in  development  and  disease. Trends  Genet .
22(9):473-478.
Capiotti  KM,  Junior  RA,  Kist  LW,  Bogo  RM,  Bonan  CD, Silva  RSD.  2014.  Persistent  impaired  glucose
metabolism  in  a  zebrafish  hyperglycemia  model. Comparative  Biochemistry  and  Physiology .  171:  58- 65.
Chang  CC,  Yang  MH,  Wen  HM,  Chern  JC.  2002. Estimation of total flavonoid content  in propolis by two  complementary  colorimetric  methods. Journal Food Drug Analytical. 10: 178-182.
Harborne  JB.  1987.  Metode  Fitokimia  Penuntun  Cara Modern Menganalisa Tumbuhan. Bandung (ID): ITB. Jorgens  K,  Hillebrands  JL,  Hammes  HP,  Kroll  J.  2012.
Zebrafish:  a  model  for  understanding  diabetic complication. Experimental Clinic Endocrinol Diabetes . 120: 186-187. Khan, F.R. dan Alhewairini, S.S.  2018.  Zebrafish (Danio rerio) as a model
organism. https://www.intechopen.com/chapters/64178. Markham  KR.  1988.  Cara  Mengidentifikasi  Flavonoid. Bandung (ID): ITB.
Misnadiarly.  2006.  Diabetes  Mellitus:  Gangren,  Ulcer, Infeksi,  Mengenal  Gejala,  Menanggulangi  dan Mencegah  Komplikasi.  Jakarata.  Pustaka  Populer Obor.
Naczk  N,  F.  Shahidi.  1989.  The  effect  of methanolammonia-water treatment on the content of phenolic acids of canola. Food Chemistry . 31: 159- 164.
Nazaruddin,  Kristiawati.  1992.  18  Varietas  Salak. Jakarta (ID): Penebar Swadaya.
Nurishmaya  MR.  2014.  Pendekatan  bioinformatika formulasi jamu baru berkhasiat antidiabetes dengan ikan  zebra  (Danio  rerio)  sebagai  hewan  model [Skripsi].FMIPA Institut Pertanian Bogor, Bogor. Pires S, Hmicha B, Marston A, Hostettmann K. 2009. A TLC  bioautographic  method  for  the  detection  of  α - and  β -glucosidase  inhibitors  in  plant  extracts. Phytochemical Analysis. 20:511-515.
Prasetiyo, A. ., Mumpuni, E. ., & R. Tjandrawinata, R. . (2019).  Docking  Molekular  dari  Trigonella  foenum- graceum sebagai Antidiabetes menggunakan Molegro  Virtual  Docking.  Jurnal  Jamu  Indonesia, 4(2), 74 – 80. https://doi.org/10.29244/jji.v4i2.132 Rahmawati  A.  2009.  Kandungan  fenol  total  ekstrak buah  mengkudu  (Morinda  citrifolia).  [Skripsi]. Jakarta (ID): Universitas Indonesia.
Rohaeti E, Fauzi M R, Batubara I. 2017. Inhibition of α - glucosidase,  total  phenolic  content  and  flavonoid content  on  skin  fruit  and  flesh  extracts  of  some varieties  of  snakes  fruits. Earth  and  Environmental Science . doi:10.1088/1755-1315/58/1/012066. Rubistein  AL.  2006.  Zebrafish  assay  for  drug  toxicity screening. Toxicol . 2(2):231-240.
Sahputra  FM.  2008.  Potensi  ekstrak  kulit  dan  daging buah  salak  sebagai  antidiabetes  [Skripsi].  FMIPA Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Shin  E,  Hong  B  N,  and  Kang  T  H.  2012.  An  optimal establishment  of  acute  hyperglycemia  fish  zebra model. African Journal of Pharmacy and Pharmacology . 6(42): 2922-2928.
Sudjadi A, Rohman. 2004. Analisis Obat dan Makanan. Yogyakarta (ID): Yayasan Farmasi Indonesia.
Swain T, W. E. Hillis. 1959. The phenolic constituents of Prunus  domestica.  I.  The  quantitative  analysis  of phenolic  constituents. Journal  Science  Food Agriculture . 10: 63-68.
Teame, T., Zhang, Z., Ran, C. Zhang, H., Yang, Y., Ding, Q.,  Xie,  M.,  Gao,  C.,  Ye,  Y.,  Dua,  M.  The  use  of zebrafish  ( Danio  rerio )  as  biomedical  models. Animal Prontiers . 9(3):68-77. Utami, N. 2018. Zebrafish ( Danio rerio ) sebagai hewan model diabetes mellitus. BioTrens 9(1):15-19.
Wang, L., Ma, J., Wu, W., Fang, Y., Liu, F., Yang, Q., Hu, X.,  Gu,  X.,  He,  Z.,  Sun,  D.  Jin,  L.,  Zhang,  X.,  2022. Effect of aerobic exercise as a treatment on type 2 diabetes  mellitus  with  depression-like  behavior zebrafish,
Life Sciences, 300, 120578, https://doi.org/10.1016/j.lfs.2022.120578. Yuhao  L.  2005.  Punica  granatum  flower  extract,  a potent -glucosidase
inhibitor, improves postprandial  hyperglycemia  in  Zucker  diabetic  fatty rats. Journal of Ethnopharmacology . 99: 239-244. Zahid, H.F., Ali, A., Ranadheera, C.S., Fang, Z., Dunshea, F.R.,  Ajlouni,  S.  2022.  In  vitro  bioaccessibility  of phenolic compounds and alpha-glucosidase inhibition  activity  in  yoghurts  enriched  with  mango peel  powder, Food  Bioscience 50,  Part  A,  102011, https://doi.org/10.1016/j.fbio.2022.102011.