## EKSPRESI β4 INTEGRIN DAN COX-2 PADA OSTEOSARKOMA STADIUM ENNEKING IIB DAN IIIB
Sri Rejeki Widyanti*  , Sjahjenny Mustokoweni*, Heriyawati*

## Abstrak
Osteosarkoma adalah keganasan primer pada tulang yang paling sering ditemukan, memiliki distribusi usia bersifat bimodal dengan kecenderungan metastasis yang tinggi dan di RSUD Dr.Soetomo paling banyak ditemukan  pada  stadium  Enneking  IIB  dan  IIIB.  Hal  ini  menunjukkan  pentingnya  faktor  prognosis  dalam meningkatkan  angka  ketahanan  hidup  penderita. β 4  integrin  dan  COX-2  terkait  dalam  menilai  prognosis suatu  osteosarkoma.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  m embuktikan  ekspresi  β4  integrin  dan  COX -2  sebagai marker  prognostik  pada    osteosarkoma  stadium  Enneking  IIB  dan  IIIB.  Desain  penelitian  adalah  analitik observasional dengan pendekatan cross sectional . Sampel penelitian dengan total sampling didapatkan 39 blok parafin penderita osteosarkoma stadium Enneking IIB dan IIIB di RSUD Dr. Soetomo Surabaya periode 1  Januari  2013  hingga  31  Desember  2017. Ekspresi  β4  integrin dan  COX-2  dideteksi  dengan  pewarnaan imununohistokimia  meng gunakan  antibodi  monoklonal  β4  i ntegrin  dan  COX-2,  evaluasi  ekspresi berdasarkan  nilai scoring semikuantitatif .  Perbedaan  ekspresi  β4  i ntegrin  dan  COX-2  dianalisis  secara statistik  dengan  Mann  Whitney  dan  hubungannya  dianalisis  menggunakan  uji  Spearman.  Hasil  penelitian menunjukkan tidak didapatkan perbedaan eks presi β4 i ntegrin dan COX-2 terhadap osteosarkoma stadium Enneking  IIB  dan  IIIB  (p  >  0,05).  Tidak  didapatkan  hubungan  eks presi  β4  i ntegrin  dan  COX-2  terhadap osteosarkoma stadium Enneking IIB dan IIIB (p > 0,05). Didapatkan hubungan bermakna antara ekspresi β4 integrin dan COX-2 (p = 0,008 dan r = 0,41). Kesimpulan penelitian ini adalah tidak didapatkan perbedaan dan hubungan antara ekspresi β4 i ntegrin serta COX-2 terhadap stadium Enneking IIB dan IIIB,  sehingga kedua protein tersebut tidak  dapat digunakan sebagai marker prognostik.
Kata kunci: β4 i ntegrin, COX-2, osteosarkoma, stadium Enneking.
THE EXPRESSION OF β4 INTEGRIN AND COX-2 ON ENNEKING STAGE IIB AND IIIB OF OSTEOSARCOMA

## Abstrak
Osteosarcoma is the most common malignancy of the bone, with bimodal distribution in age and  high metastatic tendency. It is most commonly found in Enneking IIB and IIIB stages in Dr. Soetomo hospital. This suggests  an  important  role  of  prognostic  factors  to  improve  survival  rates.  Expression  of β4  i ntegrins  and COX-2  are  related  to  the  prognosis  assessment  of  an  osteosarcoma.  Aim  of  this  study  was  to  prove  the expression of β4 integrin and COX -2 as prognostic marker on Enneking stage IIB and IIIB of osteosarcoma. Method of this study is analytical observational  with cross sectional. Total sampling was conducted on 39 paraffin  blocks  of  patients  with  IIB  and  IIIB    Enneking  stage  at    Dr.  Soetomo  hospital  Surabaya  during  1 January  2013  to  31  December  2017.  Expression  of β4 integrin  and  COX-2  were  tested  by immununohistochemical  staining  with β4  integrin  and  COX -2  monoclonal  antibodies,  their  expression  was evaluated by semi-quantitative  scoring. D ifferences in expression of β4 i ntegrin and COX-2 were analyzed with Mann Whitney statistical test, while correlation  was analyzed with Spearman test. The results showed no differences in the expr ession of β4 i ntegrin and COX-2 on IIB and IIIB Enneking stage of osteosarcoma  (p > 0.05). There were no correl ation between expression of β4 i ntegrin and COX-2 on IIB and IIIB Enneking stage of osteosarcoma (p > 0.05). A significant correlation was found between expression of β4 integrin and COX-2  (p = 0.008, r = 0.41). To conclude, there were no difference and correlation between β4 i ntegrin and COX-2 exspression with IIB and IIIB Enneking stage of osteosarcoma, so that the two proteins could not be used as prognostic markers.
Keywords : β4 Integrin, COX -2, Enneking s tage , osteosarcoma .
*Departmen Patologi Anatomy, Fakultas Kedokteran, Universitas Airlangga
 E-mail: wiwied_79@yahoo.co.id dan smustokoweni@gmail.com

## Latar Belakang
Osteosarkoma  adalah  tumor  ganas tulang  primer  yang  berasal  dari  sel mesenkimal primitif yang memproduksi tulang dan matriks  osteoid serta    kelainan nonhemopoetik tulang  primer yang  paling sering ditemukan. Insiden osteosarkoma pada semua populasi menurut WHO sekitar 4-5 per 1.000.000 penduduk. 1 Osteosarkoma mempunyai distribusi usia bimodal yaitu pada usia  muda,  terbanyak  usia  10-14  tahun  dan puncak  kedua  pada  usia  dewasa  tua  (30% terjadi  pada  usia  lebih  dari  40  tahun).  Lebih sering  terjadi  pada  laki-laki  daripada  wanita dengan perbandingan  2:1. 2 Stadium  dalam  osteosarkoma  yang dikenal saat ini adalah sistem Enneking yang pertama  kali  digunakan  oleh American Musculoskeletal Tumor Society dan International  Symposium  on  Limb-Salvage . Sistem lain adalah American Joint Committee on  Cancer  (AJCC) .  Di  Rumah  Sakit  Dr. Soetomo  lebih  lazim  menggunakan  sistem Enneking.    Secara  garis  besar    pada  sistem ini  kategori  morfologi  sel  terbagi  menjadi derajat  tinggi/ high  grade dan  derajat rendah /low grade bergantung pada selularitas,    pleomorfisme,  anaplasia,  jumlah mitosis  dan  adanya  metastasis  serta perluasan  atau  invasi  tumor  keluar kompartemen. 3 Stadium  yang  semakin meningkat menunjukkan aktifitas dan perilaku sel  tumor  yang  agresif  dan  progresif  serta cenderung untuk metastasis.
Beta  empat  integrin  (β4  i ntegrin) merupakan laminin reseptor lazim terekspresi pada  l apisan  basal  sel    jaringan.  β4  i ntegrin mempunyai  keunikan  pada  ekor  sitoplasma yang  panjang  berinteraksi  dengan  jaringan filamen  intermediat  sehingga  berfungsi mempertahankan  integritas  jaringan  normal terhadap  stres.  Secara  struktural  β4  Integrin berpasangan  dengan  subtipe  α6  integrin. Integrin  sendiri  adalah  keluarga  dari  protein transmembran  yang  terekspresi  hampir  di
setiap  tipe  sel  berperan  sebagai  media perlekatan  dengan extracellular    matrix (ECM),  mengatur  fungsi  fisiologi  termasuk migrasi    dan  proliferasi  sel. 4 Peningkatan ekspresi β4 integrin terjadi pada
osteosarkoma  derajat  tinggi dan  terekspresi pada sel tumor yang bermetastasis, sehingga semakin  tinggi  stadium  Enneking  pada Osteosarkoma  maka  ekspresi  β4  Integrin semakin meningkat. 5
Cyclooxygenase  2  (COX-2)  adalah enzim    katalisis  yang  merangsang  sintesis prostanoid termasuk prostaglandin E2 (PGE2).  COX-2  terekspresi  pada  sel-sel kanker dan berhubungan dengan progresifitas pertumbuhan  tumor.    Peningkatan  ekspresi COX-2  menunjukkan  peningkatan  proliferasi sel,  migrasi, angiogenesis ,  metastasis, hambatan apoptosis dan    imunosupresi sehingga  semakin  tinggi  stadium  Enneking Osteosarkoma  maka  ekspresi  COX-2 semakin meningkat. 6 Teknologi imunohistokimia untuk menentukan  marker  prognostik  dilakukan berdasarkan  stadium  Enneking  melalui analisis  ekspresi  β4  integrin  dan  COX -2. Penelitian  yang  ada  tentang  perbedaan ekspresi  antara  β4  integrin  dan  COX -2 terhadap  stadium  Enneking  osteosarkoma masih belum banyak digali secara mendalam.
Padahal pada beberapa penelitian menyebutkan ekspresi  β4 integrin dan COX - 2  yang  meningkat  dilaporkan  pada osteosarkoma  derajat  tinggi,  sehingga diperlukan    suatu  parameter  prognostik dengan pemeriksaan imunohistokimia sehingga  tata  laksana  terapi  dilakukan  lebih komprehensif  dan  pada  akhirnya  dapat meningkatkan ketahanan hidup penderita. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui  ekspresi  β4  i ntegrin  dan  COX-2 sebagai marker prognostik pada osteosarkoma  stadium Enneking IIB dan IIIB sebagai  stadium  terbanyak  pasien  yang datang ke RSUD Dr. Soetomo.

## Bahan dan Metode
Rancangan dan Sampel Penelitian
Rancangan  penelitian  yang  digunakan adalah  analitik  observasional  dengan pendekatan cross sectional karena observasi dilakukan  pada  variabel  dengan  kejadian sudah  terjadi  dari  pengamatan  sesaat  dan tanpa intervensi pada objek penelitian. Sampel  penelitian  dengan  teknik pengambilan sampel total sampling berdasarkan  kriteria  inklusi  yaitu:  A).  Hasil pemeriksaan histopatologik periode 1 Januari 2013 – 31  Desember  2017  ditegakkan  oleh dokter  spesialis  patologi  anatomi  RSUD  Dr. Soetomo  Surabaya  dengan  hasil  sesuai osteosarkoma,  B).  Didapatkan  hasil  radiologi dari  foto polos lokasi tumor dan thorax atau pemeriksaan  CT  scan  atau  MRI,  C). Dicantumkan  stadium  Enneking  pada diagnosis  osteosarkoma,  blok  D).  Parafin masih  memiliki  sel  tumor  yang  cukup representatif  untuk  dilakukan  pemeriksaan imunohistokimia. Berdasarkan kriteria tersebut didapatkan 39 blok parafin penderita osteosarkoma  stadium  Enneking  IIB  dan  IIIB di  RSUD  Dr.  Soetomo  Surabaya,  masing- masing terdiri dari 18 sampel dan 21 sampel.

## Pulasan dan Analisis Hasil Imunohistokimia
Sampel  dipulas  dengan  pengecatan imununohistokimia (IHK) menggunakan antibodi  monoklonal  β4 integrin  (sc-514426,
Santa  Cruz Biotechnology,  Inc. ,  Oregon, USA)  dengan pengenceran 1/150 dan COX-2 (RMA-B006, Diagnostic biosystem, CA, USA) dengan  pengenceran  1/75,  ekspresi  dinilai berdasarkan  nilai scoring semikuantitaif. Kontrol β4 integrin digunakan blok parafin dari
m ixed invasive  carsinoma  mammae  of  no special  type  grade  II dan invasive  lobular carsinoma yang  terpulas  positif  pada sitoplasma  sel  tumor.  Kontrol  COX-2  adalah blok parafin dari adenokarsinoma colon yang terpulas  positif  pada  sitoplasma  sel  tumor. Blok parafin dipotong dengan ketebalan 3 μm
dengan  mikrotom,  ditempatkan  pada slide mikroskopis  dilapisi  dengan  poli-L-lisin  dan dipulas dengan antibodi β4 integrin dan COX - 2, counterstain dengan  hematoxylin  mayer selama  5  menit, slide dicelupkan  ke  dalam alkohol  bertingkat  70%,  96%,  dan  100%, masing selama 5 menit kemudian xylol 1 dan xylol  2  masing-masing  selama  10  menit. Jaringan  diperiksa  menggunakan  mikroskop cahaya  intensitas  lemah-kuat  dengan penentuan  skor  sebagai  berikut:  Skor  0  = negatif/tidak terpulas. Skor +1 = terpulas pada sitopla sma  sel  tumor  ≤10%. Skor  +2  = terpulas  pada  sitoplasma  sel  tumor  >10% hingga ≤50%. Skor  +3  =  terpulas  pada sitoplasma sel tumor > 50%. Penentuan skor ekspresi COX-2 adalah: Skor 0 = negatif/tidak terpulas.  Skor  +1  =  intensitas  sangat  lemah, terpulas  pada sitoplasma  sel  tumor  ≤  10%. Skor +2 =  intensitas lemah-sedang, terpulas pada  sitoplasma  sel  tumor  >10%  hingga <30%.  Skor  +3  =  intensitas  sedang,  terpulas pada  sitoplasma  sel  tumor    30%  hingga <50%.  Skor  +4  =  intensitas  kuat,  terpulas pada sitoplasma sel tumor > 50%. 18

## Analisis Statistik
Perbedaan  ekspresi  β4 integrin  dan COX-2  dianalisis  dengan  uji  statistik  Mann Whitney  sedangkan  hubungan  antar  variabel dianalisis menggunakan tes korelasi
Spearman.

## Hasil
Ekspresi β4 Integrin Pada  Gambar  1  ditunjukkan  e kspresi  β4 integrin  pada  osteosarkoma.  Berdasarkan Tabel 1 pada osteosarkoma stadium Enneking IIB  didapatkan  hasil  terbanyak  pada  skor  3 yaitu 8 sampel (20,51%), serupa pada stadium Enneking  IIIB  pada  skor    3  yaitu  9  sampel (23,07%).
Hasil uji Mann Whitney menunjukkan  p  =  0,195  artinya  tidak  ada perbedaan  ekspresi  β4 integrin  antara
osteosarkoma stadium Enneking IIB dan IIIB (p > 0,05) (Tabel 2).
Tabel 1. Ekspresi β4 i ntegrin pada osteosarkoma stadium Enneking  IIB dan IIIB.
Skor Stadium Enneking IIB Stadium Enneking IIIB Total 1 6   (15,3%) 1 (2,56%) 7 (17,94%) 2 7 (17,94%) 8 (20,51%) 15 (38,46%) 3 8 (20,51%) 9 (23,07%) 17 (43,58%) Total 21 (53,8%) 18 (46,1%) 39  (100%)
Gambar 1. Ekspresi β4 integrin pada osteosarkoma dengan pengecatan IHK (tanda panah hitam).
Keterangan: A. kontrol, B. Skor 1, C. Skor 2, D.Skor 3. (400 x).
Tabel 2.  Uji stat istik Mann Whitney  β4 integrin . Minimum 25% Median  75%  Maximum  Nilai p StadiumEnneking IIB 1 1 2,0 3 3 0,195 Stadium Enneking.IIIB 1 2 2,5 3 3 A B C D
Tabel  3. Uji Spearman eks presi β4 integrin .
Pada  penelitian  ini  hasil  uji  Spearman menunjukkan  adanya  koefisien    korelasi  0,268 dengan p = 0,282 (p > 0,05) yang artinya tidak ada  hubungan  ekspresi  β4 integrin  antara stadium Enneking IIB dan IIIB.

## Ekspresi COX-2
Berdasarkan Tabel 4 pada osteosarkoma stadium  Enneking  IIB  didapatkan  hasil terbanyak  pada  skor  4  yaitu  10  sampel (25,64%),  sedangkan  pada  stadium  Enneking IIIB juga pada skor 4 yaitu 8 sampel (20,51%). Hasil analisis berdasarkan Tabel 5 menunjukkan  p  =  0,868  artinya  tidak  ada perbedaan ekspresi COX-2 antara osteosarkoma stadium Enneking IIB dan IIIB (p >  0,05).  Pada  penelitian  ini  menunjukkan
adanya  koefisien    korelasi  0,054  dengan  p  = 0,831  (p  >  0,05)    artinya  tidak  ada  hubungan ekspresi  β4  i ntegrin  antara  stadium  Enneking IIB dan IIIB.
Hubungan Ekspresi β4 Integrin dengan COX -2 pada Osteosarkoma Stadium Enneking IIB dan IIIB Hubungan  antara  ekspresi    β4  Integrin dengan  COX-2  pada  osteosarkoma  stadium Enneking  IIB  dan  IIIB  dilakukan  uji    statistik dengan uji korelasi Spearman.  Didapatkan p = 0,008  (α <  0,05),  menunjukkan  ada  korelasi yang signifikan  antara  ekspresi  β4  i ntegrin dengan  COX-2  pada  osteosarkoma  stadium Enneking IIB dan IIIB dengan koefisien korelasi 0,41.
Tabel 4.  Ekspresi COX-2  pada osteosarkoma stadium Enneking  IIB   dan IIIB.
Skor Stadium Enneking IIB  Stadium Enneking IIIB Total 1 2 (5,12%) 1 (2,56%) 3 (7,69%) 2 2 (5,12%) 3 (7,69%) 5 (12,82%) 3 7 (17,94%) 6 (15,38%) 13 (33,33%) 4 10 (25,64%) 8 (20,51%) 18 (46,15%) Total 21 (53,84%) 18 (46,15%) 39  (100%) Std.Enneking IIB Std.Enneking IIIB Spearman's rho  Std.Enneking IIB Correlation Coefficient 1.000 .268 Sig. (2-tailed) .282 N 18 18 Std.Enneking IIIB Correlation Coefficient .268 1.000 Sig. (2-tailed) .282 N 18 18
Gambar 1. Ekspresi COX-2 pada osteosarkoma dengan pengecatan IHK (tanda panah hitam) . Keterangan: A.Kontrol, B. Skor 1, C. Skor 2, D.Skor 3, E. Skor 4 (400 x). Tabel 5.  Uji statistik Mann Whitney COX-2. Minimum  25%  Median  75%  Maximum Nilai p Std.Enn IIB 1 3 3 4 4 0,868 Std.Enn.IIIB 1 3 3
4 4 A B C D E
Tabel  6.  Uji Spearman ekspresi COX-2.
Std.Enneking IIB Std.Enneking IIIB Spearman's rho  Std.Enn.IIB Correlation Coefficient 1.000 .054 Sig. (2-tailed) . .831 N 21 18 Std.Enn.IIIB Correlation Coefficient .054 1.000 Sig. (2-tailed) .831 . N 18 18

## Pembahasan
Ekspresi  β4  Integrin  pada  Osteosarkoma
Stadium Enneking IIB dan IIIB β4 integrin  dapat  terekspresi  pada sitoplasma  sel  tumor. 7 Pada  penelitian  ini tidak  di dapatkan  perbedaan  ekspresi  β4 integrin  pada  stadium  Enneking  IIB  dan  IIIB. Hasil  penelitian  ini  menu njukkan  ekspresi  β4 integrin  tidak  dapat  digunakan  sebagai marker prognosis pada  stadium Enneking IIB dan  IIIB.  Stadium  IIB  dan  IIIB  secara morfologi  berada  pada  kategori  derajat diferensiasi tinggi, mitosis mudah didapatkan, rasio  jumlah  sel  lebih  tinggi  dibandingkan matriks.  Stadium  III  ditandai  adanya metastasis  (kelenjar  getah  bening  atau metastasis jauh) dengan sel-sel tumor derajat diferensiasi tinggi. 8 Ekspresi β4  i ntegrin  tidak  menunjukkan perbedaan  pada  stadium  Enneking  IIB  dan IIIB.  Hal  ini  karena  pada  sel  tumor  dengan derajat diferensiasi yang tinggi dapat memicu pelepasan β4  i ntegrin  dari hemidesmosom sehingga terjadi perubahan sinyal-sinyal yang memicu  pertumbuhan  sel,  invasi  sel,  dan metastasis.  Ikatan  β4  i ntegrin  pada  laminin secara langsung mengaktifkan jalur PI3K dan RhoA small GTPases.  Selain  itu, β4  i ntegrin juga  bekerja  sama  dengan  banyak  faktor pertumbuhan  seperti  reseptor  famili  EGF (ErbB-1,2,3),  c-Met,  LPA1,  LPA2  dan  Ron untuk  menguatkan  sinyal  melalui  jalur  PI3K, AKT, MAPK, dan RhoA small GTPases. 5
Satu  mekanisme  untuk  aktivasi  integrin β4 yang  dimediasi  PI3K  melibatkan  substrat reseptor  insulin-1  dan  -2  (IRS-1  dan  IRS-2) yang  bertindak  sebagai  sinyal  intermediet untuk aktivasi PI3K α6β4. Ligasi integrin α6β4 meningkatkan  fosforilasi  IRS-1  dan  IRS-2, yang  mengarah  ke  aktivasi  berikutnya  dari PI3K.  α6β4  bekerja  sama  dengan  ErbB -2 untuk  mempromosikan  PI3K.    Integrin  α6β4 mengaktifkan  PI3K  dengan  memfasilitasi interaksi  tirosin  kinase.  Keterlibatan  integrin α6β4  dalam  polarisasi  sel  dan  p embentukan struktur motilitas F-actin  seperti filopodia dan lamellae  mengarah    ke  Rho small GTPases yang  mengontrol  reorganisasi  sitoskeleton aktin untuk motilitas sel. Penelitian awal oleh Shaw  dkk.  pada  aktivasi  dan  fungsi  PI3K dalam  invasi  menemukan  bahwa  GTPase Rac1    diperlukan  untuk  invasi  hilir  PI3K. 9 Studi  lebih  lanjut  yang  meneliti  dampak integrin  α6β4  pada  migrasi  dan  invasi menemukan  bahwa    integrin  α6β4  dapat meningkatkan  aktivitas  phosphodiesterase spesifik  cAMP  sehingga  menurunkan konsentrasi  cAMP    dan  aktivasi  RhoA. Aktivasi  RhoA  oleh  integrin α6β4  mengarah ke  pembentukan ruffling membran RhoA- dependent dan  pembentukan  lamellae, migrasi sel. Stewart dkk. menemukan bahwa metastasis  terkait  protein  S100    yang  diatur oleh  integrin  α6β4  berinteraksi  dengan Rho effector  Rhotekin mempromosikan  membran sel ruffling integrin  α6β4  dapat  merubah fungsi  RhoA  untuk  memfasilitasi  invasi
tumor. 5 Integrin  α6β4  menguatkan  sinyal melalui  beberapa  reseptor  tirosin  kinase  dan reseptor  berpasangan  G  protein  untuk mengaktifasi  proliferasi  sel  tumor  dan  invasi. EGFR dan  integrin  α6β4  juga  telah  terbukti menyebabkan colocalize pada  sel karsinoma yang mengalami stimulasi EGF. 5
Pada  penelitian  sebelumnya  yang dilakukan  oleh  Xiaolin  dkk  terhadap osteosarkoma  derajat  tinggi  dan  rendah di dapatkan  perbedaan  ekspresi  β4  i ntegrin yang terpulas positif kuat pada semua sampel osteosarkoma  derajat  dan  stadium  tinggi, sedangkan pada derajat dan stadium rendah terpulas  positif  lemah,  tidak  didapatkan pulasan  yang  negatif.  Pada  penelitian tersebut  juga  dilaporkan  bahwa  pada osteosarkoma  derajat  tinggi  berhubungan dengan ekspresi β4 i ntegrin yang berlebihan,
hasil sebaliknya terjadi pada derajat rendah. 7 Pemeriksaan dengan metode imunohistokimia  oleh  Li  dkk. pada  82 penderita hepatocellular  carcinoma (HCC) baik  yang  metastasis  maupun  belum metastasis,  serta  pada  jaringan  hepar  tanpa kelainan  tertentu  mend apatkan  ekspresi  β4 integrin  berlebihan  pada  HCC  dengan metastasis  dan  ekspresi  kuat  didapatkan pada  tumor  di  tempat  metastasis.  Penelitian tersebut  juga  mendapatkan    hubungan  yang signifikan  (p  <  0,01) antara  ekspresi  β4 integrin berlebihan dengan derajat histopatologik dan stadium dari HCC. 10 Penelitian  oleh  Nagata  dkk.  terhadap 270  penderita squamous  cell  carcinoma (SCC) pada organ mulut dengan antibodi β4 integrin,  α3  i ntegrin,  CD9  dan  plakoglobin
(JUP)  dengan Real  Time Polymerase  Chain Reaction (RT-PCR)  mendapatkan  bahwa rasio  β4  i ntegrin  terhadap  JUP  yang  tinggi terjadi pada kasus dengan metastasis jauh (p = 0,003). Penelitian ini lebih banyak mengkaji pendekatan  kuantitatif  untuk  mendapatkan biomarker  prognostik  dari  SCC  pada  rongga mulut.
11 Gleason  dkk.  dalam  penelitian  yang dilakukan terhadap adenokarsinoma
pankreas  juga  melaporkan  bahwa  ekspresi berlebihan terjadi pada 44 kasus adenokarsinoma di  antara  48  kasus  (92%)
dibandingkan  dengan  kasus pankreatitis kronik dan pankreas normal. 12
Pada  beberapa  penelitian  dengan sampel  yang  didapat  dari  penderita osteosarkoma  yang  menjalani  kemoterapi neoadjuvant secara inheren terbatas  dalam ukuran  sehingga  rentan  terhadap  kesalahan sampling dan kurang mencerminkan keseluruhan  tumor  secara  akurat.  Selain  itu, perilaku  agresif  tumor  yang  dicerminkan dalam  tingkat  mitosis,  LVI (lymp-vascular invasi ),  pleomorfisme  inti  ditemukan  secara signifikan  berkorelasi  dengan  kelangsungan hidup di praperlakuan. Penelitian oleh Bacchi dkk.  menyatakan  meluasnya  penggunaan kemoterapi neoadjuvant dalam  pengobatan osteosarkoma,  nekrosis  tumor  spontan ditemukan menjadi faktor prognostik independen,  bahkan  setelah  disesuaikan dengan  ukuran  tumor  ada  hubungan  yang lebih  kuat  yang  mungkin  disebabkan  oleh perkiraan  nekrosis  yang  lebih  akurat  pada pemeriksaan  reseksi  bedah  daripada  biopsi. Ukuran  tumor,  lokasi  anatomi  dan  status metastasis  pada  presentasi  adalah  penentu kuat  dari  hasil  bertahan  hidup. 13 Lazimnya, respons  terhadap  kemoterapi  dijelaskan dalam  istilah  nekrosis  tumor,  mirip  dengan peneliti  lain,  namun  pada  penelitian  ini cenderung menggunakan istilah berdasarkan persen  sel  tumor  yang  layak.  Perbedaan seperti  itu  meliputi  tumor  nekrosis,  adanya fibrosis  dan matriks aseluler  sebagai  unsur- unsur  tumor  yang  tidak  dapat  bertahan,  dan secara kumulatif mewakili efek pengobatan. 14 Pada penelitian Bottini dkk. menunjukkan  bahwa  pengaruh  kemoterapi menyebabkan  perubahan ukuran  dan jumlah sel  menjadi  lebih  kecil  serta  mempengaruhi jumlah sel yang berada pada siklus sel, akan tetapi pengaruh kemoterapi primer menyebabkan  perubahan  minimal  pada agresifitas dan biologi tumor. 15
Ekspresi COX-2 pada Osteosarkoma Stadium Enneking IIB dan IIIB Ekspresi COX-2 dinilai secara semikuantitatif  dengan  menilai  pulasan  pada sitoplasma  sel  tumor  dalam  bentuk persentase dan diklasifikasikan dalam bentuk scoring ,  kemudian  dilakukan  uji  normalitas pada  seluruh  variabel  dan  uji  beda  dengan Mann  Whitney.  Hasil  uji  normalitas  pada penelitian  ini  mendapatkan  hasil  ekspresi COX-2  pada  stadium  Enneking  IIB  dan  IIIB tidak  berdistribusi  normal.  Selanjutnya  tidak didapatkan  perbedaan  bermakna  ekspresi COX-2    pada  stadium  Enneking  IIB  dan  IIIB dengan p = 0,87 (p > 0,05).
Stadium    Enneking  IIB  dan  IIIB dikategorikan pada derajat diferensiasi tinggi, perbedaan  terletak  pada  adanya  metastasis. Ekspresi  COX-2  yang  berlebihan  didapatkan pada  sel-sel  tumor  dengan  derajat diferensiasi  tinggi  dan  pada  tumor  di  tempat metastasis.  Hal  yang  mendasari  adalah ekspresi  konstitutif  COX-2  dan  biogenesis berkelanjutan  PGE2  berperan  utama  dalam inisiasi  dan  promosi  perkembangan  kanker. PGE2 yang menjadi perantara efek ini melalui banyak  jalur  sinyal  termasuk  aktivasi  faktor pertumbuhan  endotel  vaskular  (VEGF)  yang menyebabkan  peningkatan  proliferasi  sel, metastasis  dan  invasif  potensial,  dan angiogenesis Ekspresi  yang  meningkat  dari proto-onkogen,  BCL-2,  dan  EGFR,  melalui aktivasi mitogenaktivatedprotein kinase (MAPK)  dan  fosfoinositida3-kinase  (PI3K) atau  jalur  AKT,  masing-masing    jalur  dapat meningkatkan  aktifitas  transkripsi  dari mediator  anti apoptosis  nuclear  factor  κB (NFκB),  peningkatan  metastasis  dan  invasi dengan  aktivasi  matriks  metaloprotease (MMP-2  dan  MMP-9)  dan  penekanan produksi  IL-12  menyebabkan  imunosupresi . Selain itu, PGE2 yang diaktivasi oleh COX-2 akan  mengaktifkan  jalur-jalur  yang  terkait dengan survival sel-sel dan proliferasi. COX-2 juga bekerjasama  dengan marker  CSC  yang lain  seperti  CD44,  CD133,  Oct3/4,  LGR5,
SOX-2, ALDH. Marker CSC tersebut memiliki kemampuan  untuk  menumbuhkan  koloni- koloni spheroid yang  mendorong  proliferasi sel-sel undifferentiated. Stadium  IIB  dan  IIIB memiliki  derajat  diferensiasi  tinggi  pada  sel tumor  sehingga  tidak  didapatkan  perbedaan ekspresi COX-2 maupun keterkaitan. 6 Hasil  penelitian  ini  berbeda  dengan penelitian  yang  dilakukan  oleh  Fang  dkk. tentang ekspresi COX-2 dan micro-RNA pada osteosarkoma. Sebanyak 26 sampel osteosarkoma  dari  RS  Jingling  diambil  dari periode  desember  2011  hingga  desember 2013  dan  didapatkan  9  sampel  dengan stadium I, 8 sampel stadium II dan 3 sampel stadium  III.  Didapatkan  ekspresi  yang berlebihan pada stadium II dibanding stadium I. 16
Penelitian yang dilakukan oleh Urakawa dkk.  terhadap  51  pasien  osteosarkoma  tipe konvensional  pada  ekstremitas  yang  belum menjalani  kemoterapi  mendapatkan  hasil yang  berbeda  dengan  penelitian  ini.  Pada penelitian  tersebut  didapatkan  perbedaan ekspresi  pada  osteosarkoma  derajat  tinggi dengan  p  =  0,029. 17 Sejalan  dengan penelitian  yang  dilakukan  oleh  Dickens  dkk. yang mendapatkan ekspresi berlebihan pada sarkoma yang metastasis dibandingkan pada nonmetastasis  yaitu  pada  osteosarkoma, rhabdomyosarkoma dan Ewing sarkoma. 18,19 Pada  penelitian  ini  tidak  didapatkan hubungan  antara  ekspresi  COX-2  dengan stadium Enneking IIB dan IIIB osteosarkoma. Hasil  tersebut  sejalan  dengan  penelitian Urakawa  dkk. terhadap  51  penderita osteosarkoma  yang  sudah  mendapatkan neoadjuvant kemoterapi  menyebutkan  tidak didapatkan hubungan antara ekspresi COX-2 pada  osteosarkoma  derajat  tinggi  stadium AJCC  IIA,  IIB  dan  IIIB. 17 Penelitian  oleh Rodriguez  dkk.  melaporkan  pada  36 penderita  osteosarkoma  yang  disertai metastasis  maupun  tanpa  metastasis  tidak didapatkan hubungan  ekspresi COX-2. Pada penelitian  tersebut  didapat  p  =  0,325  (p  >
0,05).  Faktor  metastasis  tumor,  perluasan area nekrosis, lokasi primer dari tumor, jenis histopatologik juga diteliti walaupun mendapatkan hasil yang tidak berhubungan. 19 Uraian sebelumnya telah jelas menjabarkan  bahwa  pada  stadium  Enneking IIB  dan  IIIB  yang  berada  pada  kategori derajat  diferensiasi  tinggi  tidak  didapatkan hubungan  dengan  ekspresi  COX-2  karena memiliki  pola  aktifitas  dan  pengaruh  yang sama  serta  melibatkan  berbagai  jalur  sinyal yang saling mempengaruhi satu sama lain.
Hubungan    Ekspresi  β4  Integrin  dan  COX -2 pada  Osteosarkoma  Stadium  Enneking  IIB dan IIIB
Hubungan  antara  ekspres i  β4  integrin dengan  COX-2  pada  osteosarkoma  stadium Enneking IIB dan IIIB  diuji statistik dengan uji korelasi  Spearman.  Didapatkan  hasil  p  = 0,008  (p  <  0,05)  dengan  koefisien  korelasi 0,41. Hal ini membuktikan adanya hubungan antara  ekspresi  β4  integrin dan  COX-2 pada osteosarkoma stadium Enneking IIB dan IIIB, yang  berarti  semakin  tinggi  ekspresi  β4 integrin semakin tinggi pula ekspresi COX-2.
Selama ini belum pernah ada penelitian yang menganalisis hubungan  antara ekspresi β4  integrin    dan  COX -2  pada  osteosarkoma berdasarkan  stadium  Enneking.  Penelitan yang  dilakukan  oleh  Song  dkk.  tentang mekanisme lncRNA pada sel kanker lambung dengan  terapi  celecoxib  (COX-2 inhibitor ) yang  melibatkan  berbagai  jaringan  protein, melaporkan  adanya upregulation dan downregulation dari  jalur-jalur  sinyal  yang terlibat di dalamnya salah satunya adalah β4
integrin  yang  menyebabkan  terhambatnya sel-sel  kanker  lambung.  Penelitian  tersebut menggunakan sejumlah 490 DEGs ( Differentially Expressed Gene) . 20
Ekspresi β4 integrin dan COX-2 memiliki keterkaitan  yang  signifikan.  Integrin  sebagai protein  transmembran  yang  berada  di perbatasan  plasma  membran  mempengaruhi jalur-jalur  yang  ada  di  bawahnya  antara  lain
FAK,  ILK,  IRK,  PI3K,  NFκB. 21 Berbeda dengan  subunit  β  lainnya,  β4  integrin mengandung  domain  β4  sitoplasmik  unik (1017 asam amino). Domain ini tidak berbagi homologi dengan subunit β lain, dan memiliki fungsi  cytoskeletal  dan signaling yang berbeda. 22 Residu  tirosin  spesifik  dalam domain  sitoplasma  integrin  β4,  Y1494  telah diidentifikasi  dan  diperlukan  untuk  aktivasi PI3K. 9 Ekspresi  integrin  β4  dipertahankan, atau  sering  diregulasi,  dalam  berbagai  jenis tumor invasif dan metastatik. Tingginya kadar integrin  ini  telah  dikaitkan  dengan  prognosis buruk pada jenis tumor ini. 23 β4 int egrin juga bekerja  sama  dengan  beberapa  reseptor onkogenik tirosin kinase (RTKs), seperti EGF- R,  ErbB2  /  Neu  dan  Met,  dan  meningkatkan kelangsungan  hidup  sel,  proliferasi,  invasi dan migrasi. 24,25,26
Sejumlah  penelitian  telah  menunjukkan bahwa ekspresi dan fungsi β4 integrin terlibat dalam perkembangan kanker. 23,24,25,27 Data ini memberikan bukti bahwa ekspresi berlebihan β4  integrin  meningkatkan  metastasis  tumor dan menunjukkan bahwa blokade β4 integrin secara rasional dapat menghambat metastasis  tumor  pada  pasien  dengan osteosarkoma. 28
Dalam  penelitian  yang  dilakukan  oleh Qu  dkk.  melaporkan  bahwa Celecoxib , penghambat  siklooksigenase-2,  menginduksi apoptosis pada  manusia  melalui  garis  sel osteosarcoma  MG-63  dengan  mengatur downregulation dari  PI3K/Akt. 28 PI3K/Akt memainkan  peran  penting  dalam  sel/ Extra Cellular  Matrix (ECM)  dan  adhesi  sel-sel. 28 Peran  tersebut  juga  dimiliki  oleh β4  integri n. Kurangnya  adhesi  yang  benar  akan mendorong  terjadinya  apoptosis  terkait adhesi  (anoikis).  Aktivasi  sinyal  PI3K/Akt telah terbukti memediasi sinyal kelangsungan hidup  yang  dipicu  oleh  keterlibatan  E- cadherin  dan  cadherin  klasik  lainnya. Penghubung  yang  memungkinkan  antara integrin  dan  β -catenin  adalah  integrin  aktif, antiapoptotic  kinase PKB/Akt.  PKB  dikenal
untuk menghambat aktivitas glikogen sintase kinase  3- β  yaitu  serin kinase  yang  berfungsi langsung untuk mengurangi protein β catenin dan  memberi  sinyal.  Adanya  faktor neurotropik yang diturunkan dari otak (BDNF) yang  berikatan  dengan  reseptor  TrkB menghasilkan  reseptor  yang  sangat  spesifik autofosforilasi dan pada gilirannya mengaktifkan  PI3K  dan  jalur  Akt.  Target  lain dari jalur PI3K/Akt bisa jadi survivin. Survivin adalah  anggota  dari  penghambat  protein apoptosis (IAP). 28 Kesimpulan pada penelitian ini  didapatkan  hubungan  bermakna  dengan koefisien  korelasi  >0,40  antara  β4  integrin dan  COX- 2,  sehingga  ekspresi  β4  integrin yang meningkat juga menyebabkan peningkatan ekspresi COX-2.

## Kesimpulan
Tidak  didapatkan  hubungan  antara  β4 integrin  dan  COX-2  pada  osteosarcoma stadium  Enneking  IIB  dan  IIIB  yang menunjukkan  bahwa  kedua  antibodi  itu  tidak dapat  digunakan  sebagai  marker  prognostik pada stadium tersebut.

## Saran
Penelitian  lebih  lanjut  perlu  dilakukan dengan  sampel  dari  bahan  operasi  maupun biopsi  pada  penderita  yang  belum mendapatkan  maupun  telah  mendapat kemoterapi    pada  semua  stadium  Enneking. Perlu  penelitian  lanjutan  dengan  biomarker lain  yang ikut  mempengaruhi  ekspresi  β4 integrin  dan  COX-2  sehingga  dapat digunakan sebagai marker prognostik, seperti osterix  dan  RUNX2  yang  berperan  pada osteogenesis,  e zrin,  MMP,  CD44,  subtipe  α dan β integrin yang lain.

## Daftar Pustaka
1. Komite  Penanggulangan    Kanker Nasional.  Pedoman  Nasional  Pelayanan
Kedokteran,  Osteosarkoma.  Kementerian kesehatan. 2010. 2.  Fletcher  C,  Bridge  J. WHO  Classification of  tumors  of  Soft  Tissue  and  Bone .    4 th Edition.  Sanders  Elsevier.  2013.  P.  281- 295.
3.  Samardziski  M,  Zanevska  V,  Gamokanin S,.  Osteosarcoma:  Diagnosis  and Treatment. Journal  of  Pediatric  Science . 2010; 2(e27).
4.  Ata  R  and  Antonescu  CN.  Integrins  and Cell Metabolism : An Intimate Relationship Impacting  Cancer. Int  J  Mol  Sci. 2017; 18(1):E189. doi: 10.3390/ijms18010189
5.  Stewart RL, Connor KLO. Pathobiology in Focus: Clinical Significance of the Integrin α6β4 in Human Malignancies. Lab Invest.
2015; 95:976 – 86.
6.  Pang  LY,  Hurst  EA,  Argyle  DJ. Cyclooxygenase-2 :  A  Role  in  Cancer
Stem  Cell  Survival  and  Repopulation  of Cancer  Cells  during  Therapy. Stem  Cell Int . 2016;2016:2048731.
7.   Wan  X,  Kim  SY,  Guenther  LM,  Mendoza
A,  Briggs  J,  Yeung  C,  et  al.  HHS  Public Access. 2010;28(38):3401 – 11. 8.  Kundu ZS. Classification, Imaging, Biopsy and  Staging  of  Osteosarcoma. Indian  J Orthop . 2014; 48(3):238 – 246. doi: 10.4103/0019-5413.132491.
9.  Shaw LM. Identification of Insulin Receptor Substrate (IRS-1) and IRS-2 as Signalling Intermediates  in  the  6  4  Integrin- Dependent Activation of Phosphoinositide 3-OH  Kinase  and  Promotion  of  Invasion. Mol Cell Biol. 2001; 21(15):5082-93.
10. Li X, Liu L, Li D, He Y, Guo L, Sun L, et al. Integrin  β 4  Promotes  Cell  Invasion  and Epithelial-Mesenchymal Transition Through  The  Modulation  of  Slug Expression  in  Hepatocellular  Carcinoma. Sci Rep. 2017; 7:40464. doi: 10.1038/srep40464. 11. Nagata M, Noman AA, Suzuki K, Kurita H, Ohnishi  M,  Ohyama  T,  et  al.  ITGA3  and ITGB4  Expression  Biomarkers  Estimate
the Risks of Locoregional and Hematogenous  Dissemination  of  Oral Squamous Cell Carcinoma. BMC Cancer .
2013; 13:410. doi: 10.1186/1471-2407-13-
410.
12.  Gleason  B,  Adley  B,  Rao  MS,  Diaz  LK. Immunohistochemical Detection of the ␤ 4 Integrin Subunit in Pancreatic Adenocarcinoma. Semin Oncol . 2005;53(6):799 – 801. 13. Bacci G, Longhi A, Versari M, Mercuri  M, Briccoli A, Picci P. Prognostic Factors for Osteosarcoma  of  the  Extremity    Treated with  Neoadjuvant    Chemotherapy:  15- Year  Experience  in  789  Patients  Treated at  a  Single  Institution  Cancer.  American Cancer Society Wiley InterScience. 2006; 106(5):1154 – 1161. doi: 10.1002/cncr.21724. 14.  Chui  MH,  Kandel  RA,  Wong  M,  Griffin AM,  Bell  RS,  Blackstein  ME,  et  al. Histopathologic  Features  of  Prognostic Significance in High-Grade Osteosarcoma. Arch  Pathol  Lab  Med. 2016; 140. 15. Bottini A, Berruti A, Bersiga A, Brizzi MP, Bruzzi  P,  Aguggini  S,  et  al.  Relationship between Tumour Shrinkage and Reduction  in  Ki67  Expression  after Primary  Chemotherapy  in  Human  Breast Cancer. Br  J  Cancer .  2001;  85(8):1106 – 1112.
16.  Fang  Y,  Zhang  Z,  Wang  Q,  Zhao  J. Expression  and  Clinical  Significance  of Cyclooxygenase-2  and  MicroRNA-143  in Osteosarcoma. Exp  Ther  Med .  2015;
9(6):2374 – 2378. 17.  Urakawa  H,  Nishida  Y,  Naruse  T, Nakashima H, Ishiguro N. Cyclooxygenase-2 Overexpression Predicts  Poor  Survival  in  Patients  with High-grade Extremity Osteosarcoma. Clin Orthop  Relat  Res .  2009;  467(11):2932-8.
doi: 10.1007/s11999-009-0814-x. 18.  Dickens  DS,  Kozielski  R,  Khan  PJ. Cyclooxygenase-2 Expression in Pediatric
Sarcomas. Pediatr  Dev  Pathol .  2002; 5:356 – 364.
19.  Rodriguez  NI,  Hoots  WK,  Koshkina  NV,
Morales-Arias JA, Arndt CA. Inwards CY, Hawkins  DS,    Munsell  MF,    Kleinerman ES.  COX-2  Expression  Correlates  with
Survival  in  Patients  with  Osteosarcoma
Lung  Metastases. J  Pediatr  Hematol Oncol . 2008; 30(7): 507 – 512. 20. Song BIN, Du J, Feng YE, Gao YJ, Zhao JIS. Co-expressed Differentially Expressed  Genes  and  Long  Non-Coding RNAs Involved in the Celecoxib Treatment of  Gastric  Cancer :  An  RNA  Sequencing Analysis. Experimental  and  Therapeutic Medicine. 2016; 12(4):2455-2468. 21. Ganguly KK, Pal S, Moulik S, Chatterjee A.  Integrins  and  Metastasis. Cell  Adhes
Migr 2013 ; 7(3 ):251 – 61 : 251 – 61.
22.  Giancotti  FG,  Ruoslahti  E.  Integrin Signaling. Science .  1999;  285:1028-32; PMID:10446041; http://dx.doi. org/10.1126/science.285.5430.1028. 23. Mercurio  AM,  Rabinovitz  I,  Shaw
LM. The α6β4 Integrin and Epithelial Cell
Migration. Curr  Opin  Cell  Biol .  2001;
13(5):541-5.
24. Mariotti  A,  Kedeshian  PA,  Dans  M, Curatola  AM,  Gagnoux-Palacios  L, Giancotti  FG.  EGF-R  Signalling  Through Fyn  Kinase  Disrupts  the  Function  of Integrin a 6  4 at Hemidesmosome. J Cell Biol . 2001; 155(3):447-58.
25. Guo W, Pylayeva Y, Pepe A, Yoshioka T, William  JM,  Inghirami  G,  Filippo  GG.  ß4 Integrin  Amplifies  ErbB2  Signalling  to Promote  Mammary  Tumorigenesis. Cell.
2006; 126(3):489-502.
26. Trusolino  L,  Bertotti  A,  Comoglio  PM.  A Signalling  Adapter  Function  for  a  6  ß4 Integrin in the Control of HGF-Dependent Invasive Growth. Cell .  2001; 107(5):643- 654.
27. Nikulopoulos  SN,  Blaikie  P,  Yoshioka  T, Guo  W,  Giancotti  FG.  Integrin  4 Signalling Promotes Tumor Angiogenesis.
Cancer Cell . 2004;  6(5):471-83.
29. 28.  Qu  L,  Liu  B.  Cyclooxygeanse-2
Promotes  Metastasis  in  Osteosarcoma. Cancer Cell . 2015;2 – 5.
http://dx.doi.org/10.1186/s12935-015- 0220-2.