Efek Kondisi Lingkungan Kultur terhadap Produksi Amilase Termostabil oleh Bacillus sphaericus AK-1 Tanah Api Kayangan Bojonegoro Jawa Timur
Achmad Toto Poernomo * , Isnaeni
Departemen Kimia Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Airlangga, Surabaya
*Corresponding author: achmad.toto.p@gmail.com

## Abstract
Background :  Amylase  production  has  been  investigated  using  bacteria  isolated  from  soil  Api  Kayangan Bojonegoro,  East  Java.  Objectives: Objective :  This  study  aimed  to  isolate  and  identify  the  bacteria  and investigate the effects of culture conditions on amylase activity. Methods : The bacteria were cultured in media containing  soluble  starch  as  carbon  source.  The  addition  of  calcium  (15  mM)  or  yeast  extract  (0.5%)  and peptone  (2%)  to  the  media  and  the  starch  dissolved  minerals  will  reduce  the  time  lag  phase  and  extend  the growth and production of amylase. Glucose added to the culture reducing the production of amylase, so that the effect of glucose on these organisms. Results : Initial pH media and optimum temperature on amylase production by organisms respectively 7.0 and 50°C. The optimal temperature and pH for the activity of each 50°C and 6.0. Enzyme solution  retained 100% activity  when incubated at  90°C for one hour and 40% at  60°C for 24 hours. Conlclusion : Glucose in the culture will decrease the production of amylase.
Keywords : amylase, thermophilic bacterium, thermostable enzyme, Bacillus sphaericus ak-1

## Abstrak
Pendahuluan :  Produksi  amilase  telah  diteliti  menggunakan  bakteri  yang  diisolasi  dari  tanah  Api  Kayangan Bojonegoro Jawa Timur. Tujuan : Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan identifikasi bakteri dan menggetahui efek  kondisi  kultur  pada  aktivitas  amilase. Metode :  Bakteri  dikulturkan  pada  media  yang  mengandung  pati terlarut  sebagai  sumber  karbon  tunggal.  Penambahan  kalsium  (15  mM)  atau  ekstrak  yeast  (0,5%)  dan  pepton (2%) ke media pati terlarut dan mineral akan mengurangi waktu fase lag dan memperpanjang pertumbuhan dan produksi amilase. Pemberian glukosa pada kultur  mengurangi produksi amilase,  sehingga  menunjukkan  bahwa efek glukosa berpengaruh pada organisme ini. Hasil : pH media awal dan suhu optimum pada produksi amilase oleh organisme masing-masing 7,0 dan 50°C. Suhu dan pH optimal untuk aktivitas masing-masing 50°C dan 6,0. Larutan  enzim dipertahankan aktivitasnya 100% saat diinkubasi pada suhu 90°C selama satu jam dan 40% pada suhu 60°C selama 24 jam. Kesimpulan : Pemberian glukosa pada kultur akan menurunkan produksi amilase.
Kata kunci :  amilase, bakteri termofilik, enzim termostabil, Bacillus sphaericus Ak-1

## PENDAHULUAN
Penemuan enzim pendegradasi pati telah menjadikan  peningkatan  aplikasi  amilase  dalam berbagai  proses  industri  (Zaferanloo  dkk.,  2013). Amilase  (1,4-α-D-glukan  glukanohi  drolase,  EC 3.2.1.1)    menghidrolisis  ikatan  α-1,4  glukosidik  pada pati  sebagai  substrat  amilase  (Tymoczko  dkk.,  2013; Voet  dkk.,  2013).  Amilase  secara  komersial  memiliki aplikasi  yang  luas  pada  pembuatan  minuman,  industri tekstil,  dan  kertas  serta  deterjen  (Zaferanloo  dkk.,
2013).  Termostabilitas    memegang  peranan  penting pada  industri  dan  mikroorganisme  termofilik  sebagai sumber  enzim  termostabil  baru.    Penelitian  terbaru bahwa  amilase  termostabil  dapat  dihasilkan  dari mikroorganisme  yang  mempunyai  sifat  termofilik  dan ekstratermofilik  dan  sedikit  yang  diketahui  tentang sifat-sifat  enzim  yang  dihasilkan  oleh  organisme  ini. Penelitian  ini  berhubungan  dengan  isolasi  dan identifikasi  bakteri  serta  menggambarkan  efek  dari kondisi kultur pada aktivitas amilase.

## BAHAN DAN METODE
Kultur media
Cawan  petri  agar  A  terdiri  dari  2,0% Bacto- tryptone , 2,0% ekstrak Bacto-yeast , 2,0% NaCl dan 2% agar  pada  pH  7,0.  Ini  digunakan  untuk  seleksi  bakteri termofilik.
Cawan  petri  agar  B  yang  terdiri  2%  pati  terlarut, 0,2%  ekstrak  yeast,  0,5%  pepton,  0,1%  MgSO 4 ,
0,1%  NaCl,  0,025%  CaCl 2 dan  agar  3%  pada  pH  7,0. Ini  digunakan  untuk  skrining  bakteri  yang  mampu menghasilkan amilase.
Media  cair  untuk  produksi  enzim  (g/L):  10,0  pati terlarut, 1,56 NaH 2 PO 4 .2H 2 O, 5,35 NH 4 Cl, 0,745 KCl,
0,64 Na 2 SO 4 .10H 2 O, 0,42 asam sitrat, 0,25  MgCl 2 .6H 2 O,  2.0x10 -3 CaCl 2 ,  2.0x10 -3 ZnO, 2.5x10 -2 FeCl 3 .6H 2 O,  1,5  x  10 -2 MnCl 2 .4H 2 O, 8.0x10 -4 CuCl 2 .2H 2 O,  2.5x10 -3 CoCl 2 .6H2O,  2.0x10 -4 NiCl 2 .6H 2 H 2 O,  2.0x10 -4 H 3 BO 4 ,  1.5  x  10 -3 Na 2 Mo 4 dan  1.0x10 -3 Biotin.  pH  diatur  7,2  dan  media disterilkan dengan autoklaf pada 121 o C,  15 psi selama 30 menit.
Isolasi  dan  determinasi  bakteri  termofilik  yang memproduksi amilase
Suspensi tanah Api Kayangan dalam akuades steril suhu  60 o C,  dituangkan  dan  disebarkan  ke  cawan  petri agar  A.  Cawan  ini  diinkubasi  pada  suhu  55°C  selama 48 jam. Koloni yang ditemukan dipindahkan ke cawan petri  agar  B.  Cawan  petri  ini  diinkubasi  pada  55°C selama  48  jam.  Beberapa  koloni  bakteri  yang memproduksi  amilase  dipilih  setelah  cawan  petri dituangkan  dengan  larutan  yodium.  Strain  yang menghasilkan  amilase  paling  tinggi  dipilih  untuk  uji lebih  lanjut.  Dilakukan  karakterisasi  fisiologi  secara biokimia  dan  hasilnya  akan  di  determinasi  dengan acuan  buku Bergey’s  Manual  of  Determinative Bacteriology ,  dan  diketahui  genus  dan  spesies  dari bakteri tersebut.

## Kondisi lingkungan kultur
Bakteri  akan  tumbuh  pada  cawan  petri  agar  B, seperti  yang  dijelaskan  oleh Mukesh  dkk.  (2012),  dan cawan petri diinkubasi pada suhu 55°C selama 18 jam. Media cair (sekitar 5 mL) dipipet ke dalam cawan petri agar B dan sel-sel diambil menggunakan pipet Pasteur steril.  Media  cair  (sebanyak  50  mL  dalam  labu Erlenmeyer ca 250    mL)  diinokulasi  dengan  suspensi ini  untuk  memberikan  transmitan  25%  pada  470  nm dan  inokulum  diinkubasi  pada  50°  C  dengan  aerasi yang  kuat  dalam shaker  incubator kecepatan  250  rpm selama 96 jam. Sebelum uji, sel-sel dipisahkan dengan sentrifugasi  10000  rpm.  Supernatan  yang  jernih
digunakan  untuki  preparasi  enzim  kasar.  Perlakuan untuk  mengetahui  pengaruh  suhu  dan  pH  pada pertumbuhan  bakteri  dan  produksi  amilase  dilakukan pada suhu yang bervariasi dari 30° C hingga 60° C, dan pada berbagai nilai pH yang bervariasi 4,0 - 9,0 selama 40 jam.

## Berat sel kering
Berat  sel  kering  ditentukan  dengan  menggunakan metode  Sreekanth  dkk . (Sreekanth  dkk.,  2013).    Lima mL  Sampel  (replikasi  3  kali)  disentrifugasi  pada 5000  rpm  selama  10  menit  dan  dicuci  sekali  dalam akuades  steril.  Sel-sel  disuspensikan  kembali  dalam akuades steril (2 mL) dan dituangkan ke dalam tabung sebelum ditimbang. Tambahan akuades steril (2x2    mL)  untuk  memastikan  bahwa  semua  sel  yang tersisa  dicuci  sudah  keluar  dari  tabung.  Dikeringkan sampai  berat  konstan  dalam  oven  pada  suhu  105°  C. Tabung  didinginkan  dalam  desikator  dan  ditimbang pada neraca analitik.

## Prosedur analisis enzim
Uji amilase didasarkan pada pengurangan intensitas  warna  biru  yang  dihasilkan  dari  hidrolisis amilase  pada  substrat  pati  (Shaw  dkk.,  1995).  Reaksi yang  terkandung  enzim  1    mL  (sel  bebas  supernatan) dan  10    mL  larutan  kanji  1%  diinkubasi  pada  50°C selama 10 menit. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 10  mL 0,1 N HCl. Satu mililiter larutan ini ditambahkan ke 10  mL 0,1 N HCl. Dari 1  mL ini ditambahkan  ke  10    mL  larutan  yodium  (0,05% yodium dalam 0,5% KI). Kerapatan optik (OD) larutan berwarna  biru  ditentukan  pada  panjang  gelombang 660  nm.  Prosedur  yang  sama  diulangi  menggunakan akuades  1    mL  sebagai  blanko.  Satu  unit  aktivitas amilase    didefinisikan  sebagai  jumlah  enzim  yang menyebabkan  pengurangan  1%  dari  intensitas  warna biru  larutan  pati-yodium  pada  suhu  50°  C  dalam 1 menit.
Pengaruh suhu pada aktivitas amilase Profil aktivitas amilase diperoleh dengan mengukur  aktivitas  amilase  dalam  0,1  M  dapar  asam sitrat-natrium  fosfat,  antara  suhu  30°  C  dan  90  °  C. Dan pH 6,0,

## Pengaruh pH pada aktivitas amilase
Pengaruh  pH  pada  aktivitas  amilase  diukur  pada suhu 50° C dalam larutan dapar yang berbeda.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi  dan  determinasi  bakteri  termofilik  yang memproduksi amilase
Strain  basil  Gram-positif,  negatif  pada  tes  Voges- Proskauer (pada pH 7,2), dan anaerob fakultatif. Motil aktif,  panjang  2,5  -  3,0  um  dan  lebar  sekitar  0,6  um, dengan  spora  terpusat  dan  didominasi  sporangia silinder  yang  kecil.  strain  memiliki  kemampuan  untuk menghidrolisis  baik  pati  dan  gelatin.  Katalase  positif. Indole tidak dibentuk, dan pembentukan asetoin positif. Nitrat  berubah  menjadi  nitrit.  pH  akhir  setelah pertumbuhan  pada  larutan  glukosa  sekitar  5,5  dan pertumbuhan  diperoleh  dalam  larutan  nutrisi  yang mengandung 7% NaCl. Sel akan tumbuh dalam nutrien broth pada 30° C hingga 60° C dan optimum pada suhu 50°  C  selama  24  jam.  Dari  hasil  ini,  strain
diidentifikasi  sebagai Bacillus  sphaericus dengan kriteria  yang  dicantumkan Bergey’s  Manual  of Determinative Bacteriology .

## Produksi enzim
Pengukuran aktivitas amilase dan pertumbuhan sel Bacillus  sphaericus di  sejumlah  interval  waktu ditunjukkan  pada  Gambar  1.  Awalnya,  organisme ditumbuhkan  dalam  media  cair  (Gambar  1a)  lalu,  di media cair ditambah dengan garam kalsium ( 15  mM) (Gambar.  1b).  Penambahan  garam  kalsium  ke  media cair  dapat  meningkatkan  pertumbuhan  dan  produksi amilase. Karena enzim ini dikenal sebagai metalloenzim  kalsium,  ada  kemungkinan  hasil  yang ditemukan  adalah  karena  semakin  tersedianya  ion kalsium.  Hasil  ini  mirip  dengan  temuan  (Saha  dkk., 2014), dengan kultur Bacillus amyloliquefaciens .
Gambar 1 . Waktu pertumbuhan dan produksi amilase oleh Bacillus sphaericus AK-1 dalam media cair (a) dan dalam media cair ditambah dengan kalsium (b).
Produksi  amilase  oleh  beberapa  mikroorganisme telah  berkaitan  dengan  ada  tidaknya  berbagai  asam amino  dan  sumber  nitrogen  kompleks  dalam  media kultur  (Saha  dkk.,  2014;  Mukesh  dkk ., 2012).  Pada
penambahan  ekstrak  yeast  (0,5%)  dan  pepton  (2%) pada  media  cair  akan    memperpendek  fase  lag  dan dapat meningkatkan baik berat kering sel dan produksi enzim (Gambar. 2).
Gambar 2. Waktu pertumbuhan dan produksi amilase oleh Bacillus sphaericus AK-1 dalam media cair yang ditambah ekstrak yeast dan pepton
Oleh  karena  itu,  hasilnya  menunjukkan  bahwa ekstrak yeast dan  pepton  disukai  untuk  pertumbuhan dan produksi amilase oleh bakteri ini. Telah dilaporkan bahwa  produksi  enzim  pendegradasi  karbohidrat  di sebagian  besar  spesies  genus  Bacillus  mengikuti
represi  katabolik  oleh  substrat  seperti  glukosa  (Santos dkk.,  2003).  Hasil  ini  sesuai  dengan    hasil  penelitian tersebut.  Penambahan  glukosa  (0,5%)  pada  kultur dapat menurunkan produksi amilase (Gambar. 3).
Gambar 3 . Penekanan glukosa pada produksi amilas, sel tumbuh pada media cair dengan 0,5% (a) dan 1,0% (b) pati terlarut
Hasil  ini  mirip  dengan  temuan  Sivakumar  dkk. (Sivakumar  dkk.,  2012;  Bini  dkk.,  2002),  yang mengamati  bahwa  glukosa  menekan  produksi  amilase pada Bacillus  cereus dan archaeon hipermofilik Sulfolobus  solfataricus .  Dikatakan  bahwa  glukosa
mencegah  ekspresi  gen  amilase  dan  bukan  hanya sekresi  enzim  yang  terbentuk  sebelumnya.  Organisme tidak  tumbuh  pada  media  kultur  yang  telah  diatur dengan pH 4.0, 5.0, 6.0 dan 10.0 (Gambar.4).
Gambar 4 . Pengaruh pH awal medium kultur pada pertumbuhan dan produksi amilase oleh Bacillus AK-1 (a) dan pengaruh pH terhadap aktivitas amilase pada suhu 50 ° C (b)
Pada  media  dimana  pertumbuhan  bakteri  terjadi, pH  meningkat  setelah  18  jam  fermentasi,  dan  tidak pernah  mencapai  nilai  lebih  besar  dari  9,0.  Aktivitas amilase meningkat selama 72 jam inkubasi pada semua nilai  pH.  Hasil  ini  menunjukkan  bahwa  ada  stimulasi sintesis enzim pada pH 7.0 dan bahwa produksi enzim yang lebih tinggi pada pH ini adalah hasil pertumbuhan sel  yang  meningkat.  pH  optimum  untuk  aktivitas amilase  adalah  antara  6,0  dan  6,5.  Ada  hampir  73% penurunan aktivitas maksimum pada pH 8,5 atau 9,0.
Genus Bacillus dapat menghasilkan enzim dengan aktivitas  optimal  pada  nilai  pH  serendah  3,5  atau setinggi  10,6    (Dutta  dkk.,  2006).  Pertumbuhan  dan
produksi  enzim  keduanya  meningkat  dengan  suhu  di kisaran  30°C  hingga  50°C  dengan  optimal  pada  suhu 50°C (Gambar. 5a). Dengan demikian, hasil penelitian menunjukkan  bahwa  suhu  optimum  untuk  produksi amilase dan pertumbuhan bakteri adalah sama. Peneliti lain  juga  melaporkan  bahwa  produksi  amilase maksimum  terjadi  pada  suhu  pertumbuhan  optimum (Saha  dkk.,  2014).  Suhu  optimum    aktivitas  amilase adalah  antara  45°C  dan  55°C.  Penurunan  aktivitas amilase diamati pada nilai di atas 60°C (Gambar. 5b).
Gambar 5 . Pengaruh suhu pada pertumbuhan dan produksi amilase Bacillus sphaericus AK-1 (a) dan pengaruh suhu terhadap aktivitas amilase (b)
Menurut  hasil  penelitian,    kondisi  yang  optimal untuk pertumbuhan sel cukup memadai untuk produksi amilase.  Hasil  ini  berbeda  dengan  peneltian  Alberto dkk. (2002) untuk Bacillus licheniformis. Mikroorganisme  ini  tidak  menghasilkan  amilase  pada 30°  C  meskipun  tumbuh  dengan  baik  pada  suhu  ini. Selain  itu,  (Saha  dkk.,  (2014),  mempelajari B. amyloliquefaciens yang  menghasilkan  amilase  pada suhu  sekitar  50°  C  dan  tidak  pernah  menghasilkan enzim pada suhu lebih rendah dari 45°C  (Alberto dkk. 2002). Ekstrak kasar enzim aktivitasnya dipertahankan
100% saat diinkubasi selama satu jam pada suhu 90°C (Gambar. 6a).
Setelah  waktu  ini  aktivitasnya  menurun  drastis. Setelah  24  jam  pada  suhu  50°C  dan  60°C,  enzim dipertahankan  65%  dan  62%  dari  aktivitas  awalnya (Gambar. 6b) dan tidak aktif pada inkubasi suhu 95°C selama 10 menit. Stabilitas suhu  amilase dari Bacillus licheniformis 584  telah  dilaporkan  oleh  Saito  (1973). Enzim ini cepat kehilangan aktivitas pada suhu di atas 76°  C. Menurut hasil  yang disajikan dalam  artikel  ini, amilase dari Bacillus sphaericus AK-1, bersifat thermo stabil.
Gambar 6 Pengaruh suhu  pada stabilitas amilase diuji dengan rentang waktu sampai dengan 170 menit (a) rentang waktu sampai dengan 24 jam (b).

## KESIMPULAN
pH  media  awal  dan  suhu  optimum  pada  produksi amilase oleh organisme masing-masing 7,0 dan 50° C. Suhu  dan  pH  optimal  untuk  aktivitas  masing-masing 50°C dan 6,0. Larutan enzim dipertahankan aktivitasnya  100%  saat  diinkubasi  pada  suhu  90°C selama  satu  jam  dan  40%  pada  suhu  60°C  selama 24  jam.  Pemberian  glukosa  pada  kultur  akan menurunkan produksi amilase.

## DAFTAR PUSTAKA
Alberto,  C.,  Cordeiro,  M.,  Lelis,  M.,  Martins,  L.  &
Luciano,  A.  B.  (2002).  Production  and  Properties Of  α-Amylase  from  Thermophilic  Bacillus  Sp.
Brazilian Journal of Microbiolog y ; 33; 57–61.
Bini, E., Dikshit, V., Dirksen, K., Drozda, M. & Blum,
P. (2002). Stability of mRNA in the Hyperthermophilic Archaeon Sulfolobus
Solfataricus. RNA (New York, N.Y.) ; 8; 1129–1136. Dutta, T. K., Jana, M., Pahari, P. R. & Bhattacharya, T. (2006). The Effect of Temperature, pH, and Salt on Amylase  in Heliodiaptomus  viduus (Gurney) (Crustacea: Copepoda: Calanoida). Turkish Journal of Zoology ; 30 ; 187–195.
Mukesh,  K.,  Andal,  P.,  Suresh,  K.,  Saranya,  G., Rajendran,  K.  &  Kalaichelvan,  P.  (2012). Production, Purification and Characterization of  α- Amylase  and  Alkaline  Protease  by  Bacillus  sp  . HPE  10  in  a  Concomitant  Production  Medium. Pelagia Research Library ; 2 ; 376–382.
Saha,  K.,  Maity,  S.,  Roy,  S.,  Pahan,  K.,  Pathak,  R., Majumdar, S. & Gupta, S. (2014). Optimization  of Amylase  Production  from  B.  amyloliquefaciens (MTCC  1270)  using  Solid  State  Fermentation. International Journal of Microbiology ; 2014; 1-7. Saito,  N.  (1973).  Thermophilic  Extracellular  Alfa-
Amylase from Bacillus licheniformis . Arch Biochem Biophys ; 155; 290–298.
Santos, E. D. O., Lelis, M. & Martins, L. (2003). Effect of  the  Medium  Composition  on  Formation  of Amylase  by  Bacillus  sp. Brazilian  Archives  Of Biology Technology; 46; 129-134.
Shaw,  J.,  Lin,  F.,  Chen,  S.  &  Chen,  H.  (1995).
Purification  and  Properties  of  an  Extracellular  α-
Amylase  from  Thermus  sp. Botanical  Bulletin  of Academia Sinica; 36; 195-200.
Sivakumar,  T.,  Shankar,  T.,  Vijayabaskar,  P.,
Muthukumar,  J.  &  Nagendrakanna,  E.  (2012). Amylase Production using Bacillus cereus Isolated from a Vermicompost Site. International Journal of Microbiological Research ; 10; 55–64.
Sreekanth, M. S., Vijayendra, S. V. N., Joshi, G. J.  &
Shamala,  T.  R.  (2013).  Effect  of  Carbon  and Nitrogen  Sources  on  Simultaneous  Production  of
Alpha-Amylase  and  Green  Food  Packaging Polymer  by Bacillus  sp .  CFR  67. Journal  of  Food Science and Technology ; 50; 404–408.
Tymoczko,  J.  L.,  Berg,  J.  M.  &  Stryer,  L.  (2013). Biochemistry  A  Short  Course (Third  Ed.).  New York:  Kate  Ahr  Parker  W.  H.  Freeman  and Company 41 Madison.
Voet,  D.,  Voet,  J.  G.,  &  Pratt,  C.  W.  (2013). Fundamentals  of  Biochemistry  Life  at  the Molecular (fourth). John Wiley & Sons, Inc.
Zaferanloo, B., Virkar, A., Mahon, P. J. & Palombo, E. A.  (2013).  Endophytes  from  an  Australian  Native Plant are a Promising Source of Industrially Useful Enzymes. World  Journal  of  Microbiology  and Biotechnology ; 29 ; 335–345.