ISSN 2085-2916  e-ISSN 2337-3652 Tersedia daring http://jai.ipb.ac.id J. Agron. Indonesia, April 2022, 50(1):107-114 DOI: https://dx.doi.org/10.24831/jai.v50i1.39012

## PENDAHULUAN
Salah  satu  anggrek  endemik  Sulawesi  adalah Phalaenopsis  venosa Shim  &  Fowlie yang  merupakan anggrek  epifit  dan  memiliki  banyak  variasi  warna  bunga (Handoyo  dan  Prasetya,  2012).  Keragaman  warna  bunga
dapat digunakan dalam program pemuliaan tanaman untuk memperoleh  karakter  unggul. Warna  bunga  pada  anggrek Phalaenopsis umumnya dibentuk oleh dua pigmen utama, yaitu  antosianin  dan  karotenoid  (Handini et  al .,  2016). Bunga dan buah masak P. venosa dapat dilihat pada Gambar 1A dan 1B.
Status P. venosa terancam punah karena pengoleksian secara langsung di alam oleh para pemburu anggrek untuk diperjualbelikan.  Anggrek P.  venosa termasuk  ke  dalam
Mikromorfologi dan Perkecambahan In Vitro Biji Anggrek Endemik Sulawesi: Phalaenopsis venosa Shi m & Fowlie
Micromorphology and In Vitro Seed Germination of Endemic Orchid of Sulawesi: Phalaenopsis venosa Shim & Fowlie
Eka Martha Della Rahayu*, Winda Utami Putri, Fitri Fatma Wardani, dan Lydia Natalia Endewip
Pusat Riset Konservasi Tumbuhan dan Kebun Raya-Badan Riset dan Inovasi Nasional Jl. Ir. H. Juanda No. 13 Bogor, Jawa Barat 16003, Indonesia
Diterima 17 Desember 2021/Disetujui 6 April 2022

## ABSTRACT
Phalaenopsis  venosa  Shim  &  Fowlie, one  of Sulawesi’s endemic orchid species, is threatened to extinction, hence require conservation efforts. Capsules of P. venosa were harvested six months after pollination. Seeds were stored in the freezer at -4 °C for nine months. Micromorphology was observed using a light microscope OPTIKA M-699. The seeds of P. venosa were 91.99±17.73 µm long and 20.64 ±4.34 µm wide, containing embryos 52.27±12.13 µm long and 16.72±3.42 µm wide, and the air space was 13.25%±11.65%. The experiment used a completely randomized design with one factor, namely six media and six replications. Media for germination including modified Hyponex (HS), modified Vacin & Went (mVW), modified Knudson’s C (mKC), Knudson’s C (KCA), Murashige & Skoog half concentration (1/2MS), and Murashige & Skoog (MS). The highest germination rate at 12 weeks after planting (12 WAP) was found in HS (70.52%). The average number of seeds germinating in HS at 12 WAP was 14.35 seeds, but the development of protocorms was slower compared to 1/2MS, which showed the development of rhizoid and leaf primordia. This is due to the higher nutritional content of 1/2MS compared to HS.
Keywords : germination media, Orchidaceae, seed micromorphology

## ABSTRAK
Phalaenopsis venosa Shim & Fowlie adalah anggrek endemik Sulawesi terancam punah sehingga perlu dilakukan upaya konservasi. Tujuan penelitian untuk mengetahui mikromorfologi dan media perkecambahan in vitro untuk mendukung upaya konservasi P. venosa. Biji P. venosa dipanen pada enam bulan setelah penyerbukan dan disimpan di freezer pada suhu -4 °C selama sembilan bulan. Pengamatan mikromorfologi menggunakan mikroskop cahaya OPTIKA M-699. Biji P. venosa memiliki panjang 91.99±17.73 µm, lebar 20.64 ±4.34 µm�� serta embrio dengan panjang 52.27±12.13 µm, lebar 91.99±17.73 µm, lebar 20.64 ±4.34 µm�� serta embrio dengan panjang 52.27±12.13 µm, lebar �� serta embrio dengan panjang  52.27±12.13 µm, lebar 52.27±12.13 µm, lebar 16.72±3.42 µm, dan rongga udara 13.25% ± 11.65%. Pengujian perkecambahan menggunakan rancangan acak lengkap , dan rongga udara 13.25% ± 11.65%. Pengujian perkecambahan menggunakan rancangan acak lengkap dengan  satu  faktor,  yaitu  enam  macam  media,  dan  enam  ulangan.  Media  perkecambahan  yang  diujikan  yaitu  Hyponex modifikasi (HS), Vacin & Went modifikasi (mVW), Knudson’s C modifikasi (mKC), Knudson’s C (KCA), Murashige & Skoog setengah konsentrasi (1/2MS), dan Murashige & Skoog (MS). Tingkat perkecambahan tertinggi pada 12 minggu setelah tanam (12 MST) terdapat pada media HS (70.52%) dengan rata-rata 14.35 biji berkecambah. Perkembangan protokorm di media HS lebih lambat dibandingkan perkembangan protokorm di media 1/2MS yang menunjukkan pembentukan rhizoid dan pucuk daun. Hal itu karena media 1/2MS lebih kaya nutrisi dibandingkan dengan media HS.
Kata kunci: media perkecambahan, mikromorfologi biji, Orchidaceae
Apendiks II (CITES, 2021). Jenis ini juga termasuk salah satu Spesies Prioritas untuk dikonservasi kategori A, yang artinya perlu segera dilakukan aksi konservasinya (Risna et al ., 2010). Ancaman lain bagi kelestarian P. venosa adalah deforestasi. Menurut  Global Forest Watch (2021), luasan hutan primer di Sulawesi berkurang 25.58 kha pada tahun 2020. Oleh karena itu, perlu dilakukan upaya konservasi bagi P. venosa, baik secara in situ maupun ex situ .  Konservasi in situ dapat dilakukan dengan cara melestarikan habitat alami P. venosa melalui pembentukan taman nasional dan hutan lindung. Sedangkan upaya konservasi ex situ dapat dilakukan dengan cara mengoleksi tanaman hidup, menyimpan biji di bank biji, dan memperbanyak P. venosa di Kebun Raya. Penyimpanan  biji  penting  untuk  konservasi  dan pemuliaan tanaman. Biji dari berbagai jenis anggrek telah disimpan  pada  berbagai  suhu, seperti  25, 5, 4, -4, -20, -80,  dan  -196  °C  (Pritchard  dan  Seaton,  1993;  Seaton et al ., 2018). Penyimpanan biji Phalaenopsis spp. diantaranya telah  dilakukan  pada Phalaenopsis Sogo  ‘Little Angel’  × ‘Golden Treasure’ pada suhu -196 °C dan 4 °C (Mweetwa et al ., 2007)  dan Phalaenopsis  amabilis Blume  pada suhu -20 °C  (Puspitaningtyas dan Handini, 2021).
Biji  berperan  penting  dalam  regenerasi,  distribusi, dan  konservasi  suatu  jenis  anggrek.  Verma et  al .  (2014) menyatakan bahwa mode penyebaran biji dan ukuran biji merupakan  faktor  penting  dalam  mengatur  pertumbuhan populasi baru. Biji anggrek sangat bervariasi dalam bentuk, warna, ukuran, volume embrio, dan struktur testa (Diantina (Diantina et al ., 2020). Morfologi biji terkait erat dengan proses biologis dan  ekologis  seperti  dormansi  biji  dan  perkecambahan (Prasongsom et al ., 2017) serta adaptasi untuk penyebaran ) serta adaptasi untuk penyebaran biji (Arditti dan Ghani, 2000; Gamarra et al ., 2018).
Perbanyakan  anggrek P.  venosa dapat  dilakukan dengan  kultur  biji.  Perkecambahan in  vitro biji  anggrek penting untuk upaya konservasi dan perbanyakan anggrek alam karena menghasilkan bibit dalam jumlah besar serta memiliki tingkat keanekaragaman yang tinggi (Teixeira da Silva et  al .,  2015).  Keanekaragaman  genetik  merupakan faktor penting bagi reintroduksi jenis tumbuhan ke alam liar (Ren et al ., 2014).
Media perkecambahan biji anggrek berbeda-berbeda dan  bersifat  spesifik  untuk  setiap  jenis  (Teixeira  da  Silva et  al. ,  2015).  Kultur  biji P.  venosa telah  dilakukan  oleh Herlina  (2012)  dan  Kartikaningrum et  al. (2017).  Kedua penelitian  tersebut  menggunakan  biji  masak  dan  segar, yang tidak mengalami penyimpanan di suhu rendah. Hasil penelitian  Herlina  (2012)  menunjukkan  bahwa  biji P. venosa berkecambah  dengan  baik  pada  dua  bulan  setelah semai  (2  BST)  di  media  Knudson’C  modifikasi  70%  dan media Murashige & Skoog setengah konsentrasi (1/2MS). Penelitian Kartikaningrum et al. (2017) menunjukkan bahwa persentase perkecambahan biji P. venosa di media Vacin & Went pada 23 hari setelah semai adalah 40%. Faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan kultur biji anggrek antara lain adalah media dasar yang digunakan, penambahan bahan
organik ke dalam media kultur (1, 2, atau 3 g L -1 pepton; 50 g L -1 homogenat pisang ambon lumut, 15% (v/v) air kelapa) serta  umur eksplan (Schwallier et al ., 2011; Balilashaki et al ., 2014; Balilashaki et al ., 2015a; Balilashaki et al ., 2015b; Kartikaningrum et al ., 2017; Abbaszadeh et al ., 2018; Utami dan Hariyanto, 2019).
Tujuan  penelitian  adalah  untuk  mengetahui mikromorfologi dan media perkecambahan in vitro terbaik bagi  biji  masak P. venosa yang telah disimpan pada suhu -4 °C, untuk mendukung upaya konservasinya.

## BAHAN DAN METODE
Penelitian  dilakukan di  Laboratorium  Treub, Laboratorium Kultur Jaringan Bank Biji dan Laboratorium Kultur  Jaringan  Pusat  Riset  Konservasi  Tumbuhan  dan Kebun Raya-Badan Riset dan Inovasi Nasional (PRKTKR- BRIN), sejak 1 Februari sampai dengan 7 September 2021. Bahan  penelitian  adalah  biji Phalaenopsis  venosa koleksi Kebun Raya Massenrempulu Enrekang, Sulawesi Selatan, yang dipanen pada umur enam bulan setelah penyerbukan (Gambar 1B). Biji diekstrak lalu disimpan di dalam botol kaca tertutup yang berisi silica gel selama tujuh hari. Setelah itu, biji disimpan di dalam amplop kertas lalu dimasukkan ke dalam plastik klip yang berisi silica gel . Biji kemudian disimpan  di  dalam freezer dengan  suhu  –4  °C  selama sembilan bulan.

## Mikromorfologi Biji dan Embrio P. venosa
Pengamatan  mikromorfologi  meliputi  karakter kualitatif dan kuantitatif. Pengamatan mikromorfologi biji meliputi  bentuk  biji  (BB),  warna  biji  (WB),  panjang  biji (PB), lebar biji (LB), rasio panjang biji/lebar biji (PB/LB), dan volume biji (VB). Pengamatan mikromorfologi embrio meliputi bentuk embrio (BE), warna embrio (WE), panjang embrio  (PE),  lebar  embrio  (LE),  perbandingan  panjang embrio/lebar  embrio  (PE/LE),  volume  embrio  (VE), perbandingan  volume  biji/volume  embrio  (VB/VE),  dan ruang udara (RU).  Volume biji (µm 3 ) dihitung dengan rumus = 2 [(P/2) (L/2) 2 (π/3)], dan volume embrio (µm 3 ) dihitung dengan rumus 4/3 π (P/2) (L/2) 2 , dimana P = panjang, L = lebar,  π  =  22/7.  Persentase  ruang  udara  (RU  %)  dihitung dengan  metode: (volume biji – volume embrio)/volume biji x 100 % (Arditti dan Ghani, 2000).
Pengamatan mikromorfologi biji P. venosa dilakukan dengan  menggunakan  mikroskop  cahaya  OPTIKA  M-699 pada perbesaran 100x. Pengamatan dilakukan pada 30 biji P.  venosa secara  acak  (Hariyanto,  2019).  Biji P.  venosa disebar di kaca objek lalu ditetesi akuades kemudian ditutup dengan kaca penutup. Panjang dan lebar biji serta embrio diukur  dari  bagian  terpanjang  dan  terlebar  dari  biji  dan embrio. Pengukuran dilakukan menggunakan piranti lunak Optika Vision Lite 2.1. Data hasil pengukuran dihitung nilai rata-ratanya.

## Perkecambahan In Vitro Biji P. venosa
Sterilisasi  biji  di  luar  Laminar  Air  Flow  Cabinet (LAFC) dengan cara biji dimasukkan ke dalam botol berisi akuades steril yang ditambah 3 tetes Tween 20, lalu divakum selama satu jam.  Setelah divakum, biji anggrek mengendap di dasar botol. Larutan Tween 20 lalu dikeluarkan dengan cara  dihisap  menggunakan  pipet  sehingga  biji  tetap  ada di dasar botol. Proses sterilisasi lalu dilanjutkan di dalam LAFC. Biji direndam dalam larutan NaOCl 0.525% yang ditambah 3 tetes Tween 20 selama 10 menit. NaOCl 0.525% lalu  dikeluarkan  dari  botol  menggunakan  pipet.    Setelah itu  biji  direndam  dengan  larutan  NaOCl  0.2625%  yang ditambah 3 tetes Tween 20 selama lima menit. Selanjutnya biji P.  venosa dibilas  dengan  akuades  steril  sebanyak tiga  kali.  Bilasan  akuades  terakhir  disisakan  secukupnya untuk  membantu  penyebaran  biji P.  venosa di  media perkecambahan.  Sebanyak 1 mL suspensi akuades dan biji P. venosa disebar di media perkecambahan. Lalu akuades dihisap dengan pipet sehingga hanya biji yang tetap ada di media perkecambahan.
Media perkecambahan in vitro yang diujikan adalah media  standar  untuk  uji  perkecambahan  biji  anggrek  di Pusat  Penelitian  Konservasi  Tumbuhan  dan  Kebun  Raya. Biji P. venosa disemai di enam macam media, yaitu media Hyponex modifikasi (HS), Vacin & Went modifikasi (mVW), Knudson’s  C  modifikasi  (mKC),  Knudson’s  C  (KCA), Murashige  &  Skoog  setengah  konsentrasi  (1/2MS),  serta Murashige  &  Skoog  (MS)  (Murashige  dan  Skoog,  1962; Puspitaningtyas dan Handini, 2014; Utami dan Hariyanto, 2019; Rahayu dan Mulyani, 2020).
Komposisi  media  HS  terdiri  atas  0.5  g  L -1 pupuk Hyponex, 40 g L -1 homogenat kentang, 2 g L -1 pepton, dan 1 g L -1 arang aktif.  Media mVW terdiri atas makronutrien dan mikronutrien Vacin & Went dengan penambahan 100 g L -1 ekstrak tauge, 100 g L -1 homogenat tomat, 15% (v/v) air kelapa, 10 mg L -1 NAA, dan 1 g L -1 arang aktif.  Media mKC terdiri atas makronutrien dan mikronutrien Knudson’s C  dengan  penambahan  15%  (v/v) air  kelapa,  150  g  L -1 ekstrak    tauge,  dan  1  g  L -1 arang  aktif.  Sedangkan  media KC  hanya  mengandung  makronutrien  dan  mikronutrien Knudson’s  C.  Media  1/2MS  terdiri  atas  makronutrien, mikronutrien,  vitamin  dan  asam  amino  MS  setengah konsentrasi.  Sedangkan media MS terdiri atas makronutrien, mikronutrien, vitamin, dan asam amino MS (Murashige dan Skoog,  1962).  Keenam  media  tersebut  mengandung  30  g L -1 gula    dan  8  g  L -1 agar.  pH  media  diatur  pada  5.6-5.8. Media diautoklaf pada suhu 121 °C, tekanan 1 atm, selama 15 menit. Sebanyak  20  mL media dituang ke cawan petri 90 mm x 15 mm.
Setelah  biji  disemai  di  media  kultur,  petri  langsung ditutup  dengan plastic  wrap .  Kultur  biji  diinkubasi  pada suhu 25±2 ºC dan kelembapan relatif 80% di bawah lampu fluoresens  dengan  fotoperiodisitas  12/12  jam  (terang/ gelap). Pengujian perkecambahan menggunakan rancangan acak lengkap dengan satu faktor, yaitu enam macam media perkecambahan. Setiap perlakuan terdiri atas enam ulangan. Perkecambahan biji dan tahapan perkembangan protokorm
P. venosa diamati di bawah mikroskop cahaya OPTIKA M- 699  yang  terkoneksi  dengan  komputer  pada  pembesaran 100x.  Tahapan  perkecambahan  dan  perkembangan protokorm  mengacu  Utami  dan  Hariyanto  (2019)  serta Rahayu dan Mulyani (2020). Jumlah biji yang berkecambah, protokorm dengan rhizoid, serta protokorm dengan rhizoid dan pucuk daun pada satu, empat, delapan, dan 12 minggu setelah tanam (1, 4, 8, dan 12 MST) dihitung berdasarkan 100-200 biji yang disemai pada 10 bidang pandang. Data lalu dianalisa dengan ANOVA dan Duncan Post Hoc Test. Pengamatan perkecambahan biji dan tahapan perkembangan protokorm dilakukan selama 12 minggu setelah tanam (12 MST) (Utami dan Hariyanto, 2019; Rahayu dan Mulyani, 2020).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Mikromorfologi Biji dan Embrio P. venosa
Biji P. venosa berbentuk fusiformis, berwarna coklat dan  transparan,  serta  sel  dinding  testa  berbentuk  silindris (Gambar 1C, Tabel 1).  Embrio P. venosa berbentuk bulat telur  dan  berwarna  kuning  muda  (Gambar  1C  dan  Tabel 1). Biji P. venosa memiliki panjang 91.99±17.73 µm dan 91.99±17.73 µm  dan lebar  20.64±4.34  µm  (Tabel  2).  Perbandingan  panjang biji (PB) dan lebar biji (LB) dapat memberikan informasi tentang  derajat  pemendekan  biji  ( seed  truncation )  yang merupakan salah satu karakter taksonomi yang baik (Verma et al ., 2014). Menurut Verma et al . (2014), biji dikatakan memendek  ( truncated )  jika  memiliki  PB/LB  <  6.0  dan memanjang ( elongated ) jika memiliki PB/LB > 6.0.  Biji Biji P. venosa pada penelitian ini menunjukkan nilai PB/LB adalah 2.31±1.76  (Tabel  2)  sehingga  termasuk  biji  memendek ( truncated seed ). Volume biji P. venosa pada penelitian ini adalah 10,921.90±6,660.59 µm 3 (Tabel 2). Embrio P. venosa terletak di tengah biji (Gambar 1C). Embrio P. venosa memiliki panjang 52.27±12.13 µm, lebar 16.72±3.42  µm,  dan  volume  sebesar  4,650.71±3,999.76 µm 3 (Tabel 2). Menurut Verma et al. (2014), volume embrio merupakan  salah  satu  karakter  penting  yang  berpengaruh langsung  terhadap  persentase  rongga  udara  di  dalam suatu  biji.  Hasil  pengamatan  menunjukkan  bahwa  nilai perbandingan  volume  biji  (VB)  dan  volume  embrio  (VE) P.  venosa adalah  0.69±0.55.  Hal  tersebut  sejalan  dengan hasil penelitian Hariyanto (2019) yang menunjukkan bahwa nilai  perbandinganVB/VE  dari P.  venosa tidak  melebihi dua.    Rongga  udara P.  venosa pada  penelitian  ini  adalah 13.25±11.65 % (Tabel 2). Rongga udara tersebut berguna bagi P.  venosa dalam  proses  penyebaran  biji  karena penyebaran biji dari suku Orchidaceae dibantu oleh angin (Arditti dan Ghani, 2000; Diantina et al ., 2020).

## Perkecambahan In Vitro Biji P. venosa
Hasil pengamatan pada 12 MST menunjukkan bahwa persentase perkecambahan biji masak P. venosa yang telah disimpan pada suhu -4 °C selama sembilan bulan, berkisar 0.2-70.52% (Tabel 3). Persentase perkecambahan tertinggi
(70.52%)  dan  rata-rata  jumlah  biji  berkecambah  tertinggi (14.35  biji)  terdapat  pada  media  Hyponex  modifikasi (HS).  Berdasarkan  uji ANOVA,  jumlah  biji  berkecambah berbeda  signifikan  dibandingkan  dengan  media  lainnya. Hasil  penelitian  Puspitaningtyas  dan  Handini  (2021)  juga menunjukkan bahwa perkecambahan tertinggi  biji masak P. amabilis yang disimpan pada suhu rendah (-20 °C) selama 1-8 tahun terdapat di media HS.  Media HS mengandung 2 g L -1 pepton. Pepton meningkatkan persentase perkecambahan pada kultur biji Phalaenopsis cv. ‘Dublin’ (Balilashaki et al ., 2015b) dan Dendrobium phalaenopsis Fitzg. (Setiari et al ., 2016). Hal tersebut karena pepton berperan penting dalam aktivasi gen-gen yang berhubungan dengan fungsi klorofil dalam  proses  fotosintesis  (Setiari et  al .,  2016).  Pepton juga  berfungsi  sebagai  sumber  Nitrogen  dan  asam  amino sehingga dapat meningkatkan perkecambahan biji anggrek. Asam  amino  penting  dalam  proses  biosintesis  molekul klorofil  yang  akan  mempengaruhi  kandungan  karbohidrat dalam sel tumbuhan (Soad et al ., 2010).
Penyimpanan biji pada suhu rendah dan praperlakuan eksplan  dengan  kloroks  (NaOCl)  dapat  mendukung perkecambahan  biji  anggrek  dengan  cara  mematahkan dormansi (Mweetwa et al ., 2007; Chen et al. , 2015; Seaton et al ., 2018). Biji P. venosa pada penelitian ini mengalami
penyimpanan pada suhu -4 °C dan sterilisasi dengan kloroks. Waktu berkecambah P. venosa pada penelitian ini adalah 2 MST,  lebih  cepat  daripada  biji P.  venosa segar  dan  tidak disterilisasi dengan kloroks pada penelitian Herlina (2012) dan  Kartikaningrum et  al. (2017).  Waktu  berkecambah biji P. venosa pada kedua penelitian tersebut berturut-turut adalah dua bulan dan 23 hari setelah tanam.
Menurut  Schwallier et  al .  (2011)  dan  Balilashaki et al. (2015a), tingkat kemasakan buah berpengaruh terhadap waktu berkecambah serta persentase perkecambahan.  Buah yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  termasuk  kategori masak karena dipanen pada enam bulan setelah penyerbukan dan  buah  sudah  berwarna  hijau  kekuningan.  Persentase perkecambahan P. venosa pada penelitian ini lebih rendah (0.2-70.52%)  daripada  perkecambahan  biji P.  amabilis hibrida (>95%) dari buah yang dipanen pada lima  bulan setelah penyerbukan (belum masak sempurna). Biji anggrek yang  sudah  masak  memiliki  kulit  biji  bagian  dalam  yang kaku (karapas). Semakin masak biji maka dinding karapas semakin mengalami lignifikasi. Akhirnya, biji anggrek yang masak menjadi dorman karena impermeabilitas (Balilashaki et al ., 2015a). Hal tersebut diduga terjadi pada biji P. venosa yang digunakan pada penelitian ini.
Tahap  perkembangan  biji  dan  protokorm P.  venosa (Gambar 1C, D , E, dan F) sejalan dengan hasil penelitian Utami dan Hariyanto (2019) pada Phalaenopsis amboinensis J.J.  Smith serta  Rahayu  dan  Mulyani  (2020)  pada Dendrobium spectabile Blume (Miq.). Tahap perkembangan dimulai dengan biji yang baru disemai belum menunjukkan perubahan.  Tahap  kedua,  biji  mulai  membengkak  karena proses  imbibisi  dan  masih  terbungkus  testa.  Tahap ketiga,  embrio  membesar  dan  testa  pecah  (berkecambah). Selanjutnya pada tahap 4, protokorm menunjukkan adanya perkembangan  rhizoid  dan  pada  tahap  5,  protokorm menunjukkan adanya perkembangan pucuk daun.
Biji P.  venosa mulai  berkecambah  pada  2  MST  di media  HS  dan  pada  14  MST  memiliki  perkecambahan tertinggi dibandingkan dengan media lainnya (Gambar 2A).
Karakter Keterangan Biji Bentuk Fusiformis Warna Coklat dan transparan Bentuk sel dinding testa Silindris Embrio Bentuk embrio Bulat telur Warna embrio Kuning muda Tabel  1.  Karakter  mikromorfologi  biji  dan  embrio P. venosa Karakter Nilai rata-rata Biji Panjang biji 91.99±17.73 µm Lebar biji 20.64±4.34 µm Panjang biji/lebar biji 2.31±1.76 Volume biji (µm 3 ) 10,921.90±6,660.59 µm 3 Embrio Panjang embrio 52.27±12.13 µm Lebar embrio 16.72±3.42 µm Panjang embrio/lebar embrio 1.70±1.27 Volume embrio 4,650.71±3,999.76 µm 3 Volume biji/volume embrio 0.69±0.55 Rongga udara (%) 13.25±11.65%
Tabel 2. Data mikromorfometri dari karakter biji dan embrio P. venosa
Akan tetapi, pertumbuhan rhizoid tercepat ditemukan pada media 1/2MS yang mulai menunjukkan pertumbuhan pada 4 MST dan jumlah terbanyak pada 12 MST (Gambar 2B). Pertumbuhan  terbanyak  pucuk  daun  juga  ditemukan  pada media  1/2MS  (Tabel  3,  Gambar  2C).  Dengan  demikian, perkembangan  protokorm  di  media  HS  lebih  lambat daripada perkembangan protokorm di media 1/2MS.  Hal tersebut  diduga  karena  media  HS  memiliki  konsentrasi Nitrogen,  Fosfor,  Kalium  serta  vitamin,  asam  amino  dari bahan  organik  yang  ditambahkan,  lebih  rendah  daripada konsentrasi  bahan-bahan  tersebut  di  dalam  media  1/2MS. Hasil  penelitian  Puspitaningtyas  dan  Handini  (2021)  juga menunjukkan bahwa walaupun persentase perkecambahan
P.  amabilis di  media  HS  tertinggi,  namun  perkembangan protokorm kurang baik, yaitu jumlah rhizoid lebih sedikit dan  protokorm  berwarna  coklat  kekuningan.  Hasil penelitian  Shekarriz et  al .  (2014)  dan  Abbaszadeh et  al. (2018) juga menunjukkan bahwa media 1/2MS mendukung perkembangan protokorm. Hal tersebut karena media 1/2MS kaya akan Nitrogen, baik dalam bentuk makronutrien maupun mikronutrien.  Keberadaan  ammonium  nitrat  dalam  media MS  berpengaruh  dalam  perkembangan  protokorm  (Paul et al ., 2012).  Selain itu, media 1/2MS juga mengandung vitamin dan asam amino. Media MS mengandung ion Ca 2+ yang dibutuhkan untuk sintesis dinding sel dan membran sel (Erfani et al ., 2017). Media Persentase perkecambahan (%) Jumlah rata-rata Biji berkecambah Protokorm dengan rhizoid Protokorm dengan pucuk daun HS 70.52 14.35a 0.03b 0.00b VW modifikasi 0.20 0.02c 0.00b 0.00b KC modifikasi 2.92 0.17c 0.00b 0.00b KCA 14.03 1.60bc 0.18b 0.00b 1/2MS 25.63 4.42b 0.58a 0.45a MS 11.82 1.82bc 0.18b 0.00b
Tabel 3. Pengaruh media semai pada perkecambahan biji P. venosa pada 12 minggu setelah tanam (12 MST)
Keterangan: Angka yang diikuti huruf yang sama pada kolom yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan DMRT pada taraf a = 5%
1 A B C D t e r E F 50µm 50µm 3 cm 50µm 50µm 3 cm
Gambar 1.  Bunga, buah masak (A-B), serta tahap perkembangan biji dan protokorm P. venosa (C-F). A. bunga. B. buah masak, C. Tahap 1: Biji P. venosa , tampak testa (t) dan embrio (e). D. Tahap 2: Biji di sebelah kiri terimbibisi, membengkak, dan masih terbungkus testa. E. Tahap 3: Embrio membesar dan testa pecah (berkecambah). F. Tahap 4 (Protokorm dengan rhizoid (r)) dan Tahap 5 (Protokorm dengan rhizoid (r) dan pucuk daun (p)). Perbesaran  100x

## KESIMPULAN
Biji anggrek P. venosa memiliki panjang 91.99±17.73 91.99±17.73 µm,  lebar    20.64±4.34  µm, serta embrio dengan panjang ,  serta  embrio  dengan  panjang 52.27±12.13  µm  dan  lebar  16.72±3.42  µm, dan rongga ,  dan  rongga udara sebesar 13.25%±11.65%. Persentase perkecambahan biji P.  venosa tertinggi  pada  media  Hyponex  modifikasi (HS) yang mengandung pepton. Akan tetapi, perkembangan protokorm  di  media  1/2MS  lebih  baik  daripada perkembangan  protokorm  di  media  HS.  Oleh  karena  itu, setelah berkecambah, protokorm sebaiknya disubkultur ke media 1/2MS.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian  ini  didanai  oleh  Pusat  Riset  Konservasi Tumbuhan  dan  Kebun  Raya-BRIN  melalui  program penelitian  In  House  2021.  Penulis  mengucapkan  terima kasih  kepada  Kebun  Raya  Massenrempulu  Enrekang  atas sumbangan  buah P.  venosa .  Penulis  juga  mengucapkan terima kasih atas bantuan teknis dan fasilitas dari Unit Bank Biji, Laboratorium Treub, dan Laboratorium Kultur Jaringan Pusat Konservasi Tumbuhan dan Kebun Raya-BRIN.

## DAFTAR PUSTAKA
Abbaszadeh, S.M., S.M. Miri, R. Naderi. 2018. An effective nutrient  medium  for  asymbiotic  seed  germination and in  vitro seedling  development  of Phalaenopsis ‘Bahia Blanca’. J. Ornamental Plants 8:183-192.
Arditti, J., A.K.A. Ghani. 2000. Tansley Review No. 110: Numerical  and  physical  properties  of  orchid  seeds and  their  biological  implications.  New  Phytol. 145:367-421.
Balilashaki, K., R. Naderi, S. Kalantari, M. Vahedi. 2014. Efficient in  vitro culture  protocols  for  propagating Phalaenopsis ‘Cool  Breeze’.  Plant  Tissue  Cult. Biotech. 24:191‐203.
Balilashaki, K., S. Gantait,  R. Naderi, M. Vahedi. 2015a. Capsule formation and asymbiotic seed germination in  some  hybrids  of Phalaenopsis ,  influenced  by pollination  season  and  capsule  maturity.  Physiol. Mol. Biol. Plants 21:341-347.
0 5 10 15 20 25 30 35 1 MST 4 MST 8 MST 12 MST Ju m la h bi ji be rk ec am ba h Waktu pengamatan HS mVW mKC
KC 1/2MS MS 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 1 MST 4 MST 8 MST 12 MST Ju m la h pr ot ok or m d en ga n rh iz oi d Waktu pengamatan HS mVW mKC KC 1/2MS MS 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 1 MST 4 MST 8 MST 12 MST Ju m la h pr ot ok or m d en ga n rh iz oi d da n
pu cu k da un Waktu pengamatan HS mVW mKC KC 1/2MS MS
Gambar 2. Pengaruh media semai terhadap perkecambahan dan perkembangan protokorm P. venosa pada 1, 4, 8, dan 12 minggu setelah tanam (MST): A. biji berkecambah, B. protokorm dengan rhizoid, C. Protokorm dengan rhizoid dan pucuk daun. HS = Hyponex modifikasi, mVW = Vacin & Went modifikasi, mKC = Knudson’s C modifikasi, KCA = Knudson’s C, 1/2MS = Murashige & Skoog setengah konsentrasi, MS = Murashige & Skoog

## A B
C
Balilashaki, K., R. Naderi, S. Gantait, M. Vahedi. 2015b. Asymbiotic germination of Phalaenopsis cv. ‘Dublin’ seeds in relation to pollination months and nutrient media. Not. Sci. Biol. 7:330-333.
Chen,  Y.,  U.  M.  Goodale,  X.L.  Fan,  J.Y.  Gao.  2015. Asymbiotic  seed  germination  and in  vitro seedling development  of Paphiopedilum  spicerianum :  An orchid with an extremely small population in China. Glob. Ecol. Conserv. 3:367-378.
CITES.  2021. Phalaenopsis  venosa .  https://cites.org  [22 Juni 2021].
Diantina,  S.,  C.  McGill,  J.  Millner,  J.  Nadarajan,  H.W.
Pritchard, A.C. McCormick. 2020. Comparative seed morphology of tropical and temperate orchid species with  different  growth  habits.  Plants  9:1-11.  Doi: 10.3390/plants9020161.
Erfani,  M.,  S.M.  Miri,  A.  Imani.  2017. In  vitro shoot proliferation  and  rooting  of  Garnem  rootstock  as influenced  by  basal  media,  plant  growth  regulators and carbon sources. Plant Cell Biotechnol. Mol. Biol. 18:101-109.
Gamarra,  R.,  E.  Ortúñez,  P.G.  Cela,  A.  Merencio.  2018. Seed micromorphology of Orchidaceae in the Gulf of Guinea (West Tropical Africa). Plant Syst. Evol. 304:665-677.
Global  Forest Watch.  2021.  Indonesia  Country  Summary,
Dashboard.  https://www.globalforestwatch.org  [30 Maret 2021].
Handini,  A.S.,  D.  Sukma,  Sudarsono.  2016.  Analisis keragaman  morfologi  dan  biokimia  pada  anggrek Phalaenopsis (Orchidaceae). J. Agron. Indonesia 44:62- 67.
Handoyo,  F.,  R.  Prasetya.  2012. Orchids  of  Sulawesi . Indonesian Orchid Society, Jakarta.
Hariyanto. 2019. Variations in seed micromorphology and Variations in seed micromorphology and morphometry  of  native  Indonesian Phalaenopsis and Paphiopedilum orchids. Biodiversitas 20:3559-3567. . Biodiversitas 20:3559-3567.
Herlina, D. 2012. Konservasi anggrek Phalaenopsis dengan perbanyakan biji secara in vitro. Iptek Hortikultura 8:29-
35.
Kartikaningrum, S., D. Pramanik, M. Dewanti, R. Soehendi, M.P.  Yufdy.  2017.  Konservasi  anggrek  spesies  alam menggunakan  eksplan  biji  pada  media Vacin  & Went. Bul. Plasma Nutfah 23:109-118.
Murashige, T., F. Skoog. 1962. A revised medium for rapid growth  and  bioassays  with  tobacco  tissue  cultures. Physiol. Plant 15:473-497.
Mweetwa,  A.M.,  G.E.  Welbaum,  D.  Tay.  2007.  Orchid seed storage for germplasm preservation. Acta Hortic. 760:629-635.
Paul, S., S. Kumaria, P. Tandon. 2012. An effective nutrient medium  for  asymbiotic  seed  germination  and  large- scale in vitro regeneration of Dendrobium hookerianum , a  threatened  orchid  of  northeast  India. AoB  PLANTS 2012: plr032; Doi:10.1093/aobpla/plr032.
Prasongsom,  S.,  K.  Thammasiri,  H.W.  Pritchard.  2017. Seed  micromorphology  and ex  vitro germination  of Dendrobium orchids. Acta Hortic. 1167:339-344.
Pritchard,  H.W.,  P.T.  Seaton.  1993.  Orchid  seed  storage: Historical  perspective,  current  status,  and  future prospects for long-term conservation. Selbiyana 14:89- 104.
Puspitaningtyas,  D.M.,  E.  Handini.  2014.    Penyimpanan biji  anggrek Coelogyne spp.  untuk  konservasi ex  situ . Buletin Kebun Raya 17:101-112.
Puspitaningtyas, D.M., E. Handini. 2021. Seed germination evaluation of Phalaenopsis amabilis in various media for long-term conservation.  Biodiversitas 22:5231-5238.
Rahayu,  E.M.D.,  M.  Mulyani.  2020.  Asymbiotic  seed germination  and  plantlet  development  of Dendrobium spectabile (Blume) Miq. Buletin Kebun Raya 23:25-35.
Ren, H., S.G. Jian, H.X. Liu, Q.M. Zhang, H.F. Lu. 2014. Advances in the reintroduction of rare and endangered wild plant species. Sci. China Life Sci. 57:603-609.
Risna, R.A., Y.W.C. Kusuma, D. Widyatmoko, R. Hendrian, D.O. Pribadi. 2010. Spesies Prioritas untuk Konservasi Tumbuhan  Indonesia  seri  I:  Arecaceae,  Cyatheaceae, Nepenthaceae, Orchidaceae. LIPI Press, Jakarta.
Schwallier,  R.,  V.  Bhoopalan,  S.  Blackman.  2011.  The influence  of  seed  maturation  on  desiccation  tolerance in Phalaenopsis amabilis hybrids. Sci. Hortic. 128:136- 140.
Seaton, P.T., S.T. Hosomi, C.C. Custódio, T.R. Marks, N.B. Machado-Neto,  H.W.  Pritchard.  2018.  Orchid  seed and  pollen:  A  toolkit  for  long-term  storage,  viability assessment and conservation. p. 71-98. In Lee, Y.I., E.C.T. Yeung ( Eds .). Orchid propagation: From laboratories to greenhouses-Methods and protocols. Springer Protocols Handbooks. Humana Press, New York.
Setiari, N., A. Purwantoro, S. Moeljopawiro, E. Semiarti. 2016.  Peptone  and  tomato  extract  induced  early  stage of  embryo  development  of Dendrobium  phalaenopsis orchid.  J.  Tropical  Biodiversity  Biotechnology    1:77- 84.
Shekarriz, P., M. Kafi, S. Dianati, M. Mirmasoumi. 2014. Coconut water and peptone improve seed germination and protocorm like body formation of hybrid Phalaenopsis . Agric. Sci. Dev. 3:317-322.
Soad, M.M. Ibrahim, Lobna, S. Taha, M.M. Farahat. 2010. Influence  of  foliar  application  of  peptone  on  growth, flowering  and  chemical  composition  of Helichrysum bracteatum plants  under  different  irrigation  intervals.
Ozean J. Appl. Sci. 3:143-155.
Teixeira  da  Silva,  J.A.,  E.A.  Tsavkelova,  T.B.  Ng,  S. Parthibhan, J. Dobránszki, J.C. Cardoso, M.V. Rao, S. Zeng. 2015. Asymbiotic in vitro seed propagation of Dendrobium . Plant Cell Rep. 34:1685-1706.
Utami, E.S.W., S. Hariyanto. 2019. In vitro seed germination and  seedling  development  of  a  rare  Indonesian  native orchid Phalaenopsis  amboinensis J.J.Sm.  Hindawi Scientiﬁca 2019:1-6.
Verma, J., K. Sharma, K. Thakur, J.K. Sembi, S.P. Vij. 2014. Study on seed morphometry of some threatened Western Himalayan orchids. Turk. J. Bot. 38:234-251.