## Research Articles
Pengaruh  waktu  penyimpanan  inokulum Escherichia  coli dan Staphilococcus aureus pada  suhu  dingin  terhadap  jumlah  sel  bakteri  di  Laboratorium Mikrobiologi
Rosmania 1* , Yuniar 2
1 Jurusan Biologi, Fakultas MIPA, Universitas Sriwijaya, Sumatera Selatan, Indonesia
2 Jurusan Kimia, Fakultas MIPA, Universitas Sriwijaya, Sumatera Selatan, Indonesia
Received 18 Februari 2021; Accepted 22 Juli 2021; Published 8 September 2021
Keywords: Bacteria ;
Media ; Inoculum; Plate count ABSTRACT: Bacteria that have been grown in the media are often stored in cold non- freezing temperatures after treatment or before treatment. This is due to limited time in  completing  research  and  efficiency  in  terms  of  both  media  and  time  in  making inoculums  for  further  experiments  so  that  research  on  this  needs  to  be  done.  This research  was  conducted  from  April  2020  until  October  2020,  at  the  Microbiology Laboratory,  Department  of  Biology,  Faculty  of  Mathematics  and  Natural  Sciences, Sriwijaya University, Indralaya. The research method used consists of several stages, namely  preparation  of  purification  media,  reisolation  suspension  and  Bacteria  test, sterilization, purification of Bacteria test, reisolation of test Bacteria, preparation of suspension of tested bacteria, measurement of the number of bacteria using the plate count method. Storage time of Escherichia coli and Staphylococcus aureus inoculum before storage (H0) and after being stored in the refrigerator (5 oC - 10 oC) with storage variations  for  1,  2,  3,  4,  5,  6  and  7  days  had  a  significant  effect  to  the  value  of  the number of cells (Standard Plate Count) and the absorbance value. @2021 Published by UP2M, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Sriwijaya University
Kata Kunci: Bakteri; Media; Inokulum; Hitungan Cawan ABSTRAK: Bakteri yang sudah ditumbuhkan dalam media seringkali disimpan dalam suhu  dingin  non  beku  (refrigerator)  setelah  perlakuan  atau  sebelum  perlakuan.  Ini dikarenakan  keterbatasan  waktu  dalam  menyelesaikan  penelitian  dan  efisiensi  baik dari  segi  media  dan  waktu  dalam  pembuatan  inokulum  untuk  percobaan  lanjutan sehingga penelitian tentang ini perlu dilakukan. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan April 2020 sampai dengan bulan Oktober 2020, di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi,  Fakultas  Matematika  dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam,  Universitas  sriwijaya, Indralaya.  Metode  penelitian  yang  digunakan  terdiri  dari  beberapa  tahapan,  yaitu Pembuatan Media Pemurnian, Peremajaan¸Suspensi dan Pengujian Bakteri, Sterilisasi, Pemurnian  Bakteri  Uji,  Peremajaan  Bakteri  Uji,  Pembuatan  suspensi  bakteri  uji, Pengukuran  jumlah  bakteri  secara  metode  hitungan  cawan.  waktu  penyimpanan inoculum Escherichia  coli dan Staphylococcus  aureus sebelum  disimpan  (H0)  dan setelah  disimpan  dalam  lemari  pendingin/  refrigerator  (5 o C  -  10 o C)  dengan  variasi penyimpanan  selama  1,  2,  3,  4,  5.  6  dan  7  hari  memberikan  pengaruh  yang  nyata terhadap nilai jumlah sel ( Standard Plate Count ) dan nilai absorban. @2021 Published by UP2M, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Sriwijaya University

## Jurnal Penelitian Sains
Journal Home Page: http://ejurnal.mipa.unsri.ac.id/index.php/jps/index
∗ Corresponding author. E-mail address: rosmaniania83@gmail.com
2597-7059 Online, 1410-7058 print/ @2021 Published by UP2M, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Sriwijaya University

## PENDAHULUAN
Laboratorium  adalah  merupakan  salah  satu sarana  pendukung  penting  yang  bersifat  sangat strategis  dalam  kegiatan  pelaksanaan  sistem pendidikan,  khusus  nya  pada  sistem  pendidikan  di perguruan tinggi yang digunakan untuk melaksanakan kegiatan  pendidikan,  penelitian,  dan  pengabdian kepada masyarakat. Dengan menggunakan peralatan, bahan  dan  metode  keilmuan  tertentu  (Kertiasih, 2016).
Salah  satu  jenis  laboratorium  yang  ada  di perguruan  tinggi  adalah  laboratorium  mikrobiologi. Laboratorium mikrobiologi yaitu laboratorium yang di desain secara khusus untuk keperluan praktikum atau eksperimen yang berhubungan dengan mikrobiologi. Mikrobiologi  adalah  ilmu  pengetahuan  tentang kehidupan  makhluk-makhluk  kecil  yang  hanya kelihatan  dengan  mikroskop.  Semua  makhluk  hidup yang berukuran beberapa mikron atau lebih kecil lagi disebut  mikroorganisme  atau  mikroba  yaitu  bakteri, jamur, ragi/khamir, alga dan protozoa (Syauqi, 2017).
Di laboratorium Mikrobiologi, untuk menumbuhkan  bakteri  diperlukan  suatu  substansi yang  sudah  diatur  komposisi  nutrisinya,yaitu  media. Media  adalah  suatu  substansi  yang  komposisinya terdiri  dari  nutrisi  tertentu  yang  diperlukan  untuk menumbuhkan  dan  mempelajari  sifat-sifat  bakteri (Sutarma,  2000).  Selain  untuk  menumbuhkan mikrobia, medium dapat digunakan pula untuk isolasi, memperbanyak,  pengujian  sifat-sifat  fisiologi  dan perhitungan jumlah mikrobia (Jutono, 1973).
Dalam  pelaksanaan  penelitian  dan  praktikum, bakteri  yang  sudah  ditumbuhkan  dalam  media seringkali  disimpan  dalam  suhu  dingin  non  beku (refrigerator)  setelah  perlakuan  atau  sebelum perlakuan. Ini dikarenakan keterbatasan waktu dalam menyelesaikan  penelitian  dan  efisiensi  baik  dari segi media dan waktu dalam pembuatan  inokulum untuk percobaan lanjutan.
Pembuatan inokulum bakteri butuh persiapan yang  panjang  seperti  pembuatan  media,  sterilisasi, peremajaan bakteri, pembuatan inokulum bakteri dan menghitung  jumlah  sel  bakteri.  Oleh  karena  ini  lah, banyak  mahasiswa  penelitian  dan  juga  untuk praktikum menyimpan kultur inokulum bakteri dalam suhu dingin non beku (refrigerator) pada suhu 6 - 10 0 C. Setelah pembuatan inokulum/suspensi bakteri,  jumlah  sel  bakteri  nya  dihitumg  terlebih dahulu  sebelum  digunakan  untuk  perlakuan
penelitian. Metode yang sering dipakai yaitu metode hitungan  cawan  karena  merupakan  cara  yang  paling sensitif untuk menghitung jumlah mikroba yaitu hanya sel yang masih hidup yang dihitung. Metode ini juga memiliki  kelemahan  yaitu  membutuhkan  persiapan dan waktu inkubasi beberapa hari untuk menghitung pertumbuhan koloni bakteri (Fardiaz, 1993). Sehingga, inokulum bakteri tersebut harus disimpan dulu dalam lemari  pendingin  supaya  jumlah  sel  nya  tidak bertambah.  Tetapi  tidak  dihitung  lagi  jumlah  sel bakteri nya setelah disimpan dalam lemari pendingin. Asumsi  nya  jumlah  sel  bakteri  nya  tidak  berubah karena laju pertumbuhan bakteri terhenti.
Oleh  karena  itu,  maka  perlu  dilakukan penelitian  tentang  Pengaruh  Waktu  Penyimpanan Inokulum Escherichia  coli dan Staphilococcus  aureus Pada  Suhu  Dingin  Terhadap  Jumlah  Sel  Bakteri. Bakteri  uji  yang  akan  digunakanakan  adalah Escherichia coli dan Staphilococcus aureus. Bakteri ini sering digunakan untuk praktikum dan penelitian.

## BAHAN DAN METODE

## Waktu dan Tempat
Penelitian  ini  dilaksanakan  pada  bulan  April 2020  sampai  dengan  bulan  Oktober  2020,  di Laboratorium  Mikrobiologi,  Jurusan  Biologi,  Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas sriwijaya, Indralaya.

## Prosedur Penelitian
Pembuatan Media Pemurnian, Peremajaan¸Suspensi dan Pengujian Bakteri
a. Media Eosin  Methylen  Blue  Agar (EMBA) ditimbang  36  gram  dilarutkan  dengan  aquadest sebanyak  1  liter  dalam  Erlenmeyer  1000  ml kemudian  dimasak  sampai  larut  diatas  hot  plate magnetic stirrer yang ditandai dengan muncul nya gelembung air didasar erlenmeyer, alat dimatikan. Erlenmeyer  diangkat  dan  mulut  nya  ditutup dengan kapas yang dibaluti dengan kain kasa dan ditutupi dengan aluminium foil.
b. Media Media  Brain  Heart  Infusion  (BHI)  Agar , ditimbang  sebanyak  52-gram  dilarutkan  dengan aquadest sebanyak 1 liter dalam Erlenmeyer 1000 ml kemudian dimasak sampai larut diatas hot plate magnetic  stirrer .  Setelah  larut  yang  ditandai dengan larutan jadi jernih  ada  gelembung didasar  erlenmeyer,  alat  dimatikan.  Erlenmeyer diangkat dan mulut nya ditutup dengan kapas yang
dibaluti dengan kain kasa dan ditutupi dengan
aluminium foil.
c. Media Nutrient Agar (NA), ditimbang sebanyak 20 gram dilarutkan dengan aquadest sebanyak 1 liter dalam  Erlenmeyer  1000  ml  kemudian  dimasak sampai  larut  diatas  hot  plate  magnetic  stirrer. Setelah  larut  yang  ditandai  dengan  larutan  jadi jernih  ada  gelembung  didasar  erlenmeyer,  alat dimatikan. Erlenmeyer   diangkat  dan  mulut  nya ditutup  dengan  kapas  yang  dibaluti  dengan  kain kasa dan ditutupi dengan aluminium foil.
d. Media Nutrient Broth (NB), ditimbang sebanyak 8 gram dilarutkan dengan aquadest sebanyak 1 liter dalam  Erlenmeyer  1000  ml  kemudian  dimasak sampai larut diatas hot   plate  magnetic  stirrer. Setelah  larut  yang  ditandai  dengan  larutan  jadi jernih  ada  gelembung  didasar  erlenmeyer,  alat dimatikan.  Erlenmeyer  diangkat  dan  mulut  nya ditutup  dengan  kapas  yang  dibaluti  dengan  kain kasa dan ditutupi dengan aluminium foil.

## Sterilisasi
Media yang sudah dibuat di sterilisasi bersama dengan alat-alat lain yang akan dipakai seperti cawan petri, tabung reaksi, tip mikropipet. Di sterilisasi pakai alat Autoklaf pada suhu 121 0 C tekanan 15 lbs selama 15 menit.

## Pemurnian Bakteri Uji
Media  yang  sudah  disterilisasi,  biarkan  suhu nya turun sampai ±40 0 C pada suhu ruang. Setelah itu, dimasukan kedalam cawan petri steril. Biarkan media padat dalam cawan petri ±20 menit. Bakteri uji yang digunakan adalan Escherichia coli dan Staphilococcus aureus .  Masing  -masing  bakteri  diinokulasikan kedalam  cawan  petri  secara  kuadrant  4.  setelah dinokulasikan bakteri, cawan petri dibungkus dengan kertas, dimasukan ke dalam incubator secara tebalik pada suhu 37 0 C selama 1x24 jam.

## Peremajaan Bakteri Uji
Koloni tunggal yang tumbuh pada media cawan diambil  dengan  jarum  ose,  diinokulasikan  ke  dalam media  miring  dalam  tabung  reaksi  secara  zig  zag. Pekerjaan ini dilakukan dengan aseptik dekat dengan api bunsen.  Tabung reaksi dibungkus dengan kertas, diinkubasi dalam inkubator selama 1x24 jam.
Pembuatan suspense bakteri uji Kultur Escherichia  coli dan Staphilococcus aureus yang digunakan diambil masing-masing 1 ose,
dimasukan  dalam  25  ml  media Nutrient  Broth (NB) yang  sudah  disterilkan.  Kemudian  di  inkubasi  pada shaker  incubator  suhu  37 o C,  120  rpm  selama semalam.

## Pengukuran jumlah bakteri secara metode hitungan cawan
Sebelum  pengukuran  jumlah  bakteri,  sudah disiapkan  alat  dan  bahan  steril  untuk  melakukan proses  perhitungan  bakteri.  Suspensi  bakteri  uji diencerkan dari 10 -1 sampai 10 -7 dengan cara diambil 1  ml  suspensi  bakteri  dengan  mikropipet  lalu dimasukan pada tabung  pertama (10 -1 ) yang berisi 9 ml  larutan  NaCl  fisiologi  lalu  di  vortex  sampai homogen. Selanjutnya diambil 1 ml lalu dimasukan ke dalam tabung kedua (10 -2 ) di vortex sampai homogen. Ini  dilakukan  terus  sampai  tabung  ketujuh  (10 -7 ). Setelah  selesai  pengenceran  bertingkat,  lalu  diambil seri  pengenceran  2  terakhir  masing-masing  diambil 100 µl dengan mikropipet dimasukan kedalam cawan petri  steril  kemudian  tuangkan  media  Nutrient  agar (NA) steril yang suhu nya ±40 o C. homogenkan dengan cara  memutar  cawan  diatas  meja  secara  perlahan dengan gerakan seperti angka delapan. Biarkan  ± 15 menit, kemudian cawan dibungkus dengan kertas dan di inkubasi dalam incubator secara terbalik suhu 37 o C selama 1x24 jam ( Fardiaz, 1993).
Menurut  pendapat  Wasteson  and  Hornes (2009)  dalam  Yunita et  al. (2015)  bahwa  tujuan  dari pengenceran  bertingkat  yaitu  memperkecil  atau mengurangi  jumlah  mikroba  yang  tersuspensi  dalam cairan.  Penentuan  besarnya  atau  banyaknya  tingkat pengenceran  tergantung  kepada  perkiraan  jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan 1 : 9 untuk  sampel  dan  pengenceran  pertama  dan selanjutnya,  sehingga  pengenceran  berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisma dari pengenceran sebelumnya.
Penghitungan  populasi  jumlah  sel  bakteri dilakukan dengan metode standard plate count (SPC) dengan  ketentuan  mengandung  30  -  300  koloni  per cawan dengan rumus sebagai berikut :

## 𝐽𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑘𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖 𝑝𝑒𝑟 𝑚𝑙
= 𝐽𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑘𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖 𝑥 1
𝐹𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛 𝑝𝑒𝑟 𝑐𝑎𝑤𝑎𝑛

## Variabel pengamatan
Variabel  pengamatan  yang  diamati  pada penelitian  ini  adalah  jumlah  sel  bakteri  uji  sebelum
disimpan  dalam  suhu  dingin  dan  setelah  dismpan dengan   waktu  penyimpanan yaitu 1,2,3,4,5,6 dan 7 hari dalam suhu dingin (refrigerator).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengaruh  waktu  penyimpanan  inokulum Escherichia  coli dan Staphylococcus  aureus sebelum disimpan  (H0)  dan  setelah  disimpan  dalam  lemari pendingin/  refrigerator  (5 o C  -  10 o C)  dengan  variasi
penyimpanan  selama  1,  2,  3,  4,  5.  6  dan  7  hari, dilakukan pengamatan nilai jumlah sel ( Standard Plate Count )  dan  nilai  absorban/kekeruhan  (Yunita  et  al., 2015) ditampilkan pada Tabel 1, Tabel 2, Tabel 3, Dan Tabel  4.  Hasil  analisis  yang  telah  dilakukan menunjukkan  bahwa  lama  waktu  penyimpanan inoculum Escherichia  coli dan Staphylococcus  aureus memberikan  perbedaan  nyata  terhadap  jumlah  sel dan nilai absorban.
Tabel 1. Jumlah sel Escherichia coli No Waktu Pengamatan (Hari) Ulangan (CF/ml) Rata-rata jumlah sel bakteri (CFU/ml) Log Jumlah Sel (CFU/ml) I II III 1. H0 2,5 x 10 7 2,6 x 10 7 2,1 x 10 7 2,4 x 10 7 7,4 2. H1 2,3 x 10 7 2,4 x 10 7 2,4 x 10 7 2,4 x 10 7 7,4 3. H2 2 x 10 7 2,2 x 10 7 2,3 x 10 7 2,2 x 10 7 7,3 4. H3 2,2 x 10 7 2,1 x 10 7 2,1 x 10 7 2,1 x 10 7 7,3 5. H4 2,1 x 10 7 1,9 x 10 7 1,9 x 10 7 2 x 10 7 7,3 6. H5 1,9 x 10 7 1,8 x 10 7 1,9 x 10 7 1,9 x 10 7 7,3 7. H6 5,3 x 10 6 8 x 10 6 6,8 x 10 6 6,8 x 10 6 6,8 8. H7 3 x 10 6 4,1 x 10 6 3,8 x 10 6 6,6 x 10 6 6,6

## Peremajaan Bakteri
Pengaruh  waktu  penyimpanan  pada  suhu dingin  memberikan  pengaruh  yang  nyata  terhadap jumlah sel inoculum Escherichia coli. Rata-rata jumlah sel  ( Standard  Plate  Count )  inoculum Escherichia  coli terhadap  pengaruh  waktu  penyimpanan  pada  suhu refrigerator terdapat  pada  Tabel  1.  Nilai  rata-rata jumlah sel ( Standard Plate Count ) yang diperoleh dari
hasil penelitian yaitu 2,4 x 10 7 CFU / mL (H0); 2,4 x 10 7 CFU / mL (H1); 2,2 x 10 7 CFU / mL (H2); 2,1 x 10 7 CFU / mL (H3); 2 x 10 7 CFU / mL (H4); 1,9 x 10 7 CFU / mL (H5); 6,8 x 10 6 CFU / mL (H6); dan 6,6 x 10 6 CFU / mL (H7). Nilai  rata-rata  jumlah  sel  ( Standard  Plate  Count ) terendah diperoleh pada pengamatan H7, sedangkan nilai  rata-rata  jumlah  sel  ( Standard  Plate  Count ) tertinggi didapat pada sebelum penyimpanan (H0).
Tabel 2. Jumlah sel Staphilococcus aureus
No Waktu Pengamatan (Hari) Ulangan (CFU/ml) Rata-rata jumlah sel bakteri (CFU/ml) Log Jumlah Sel (CFU/ml) I II III 1. H0 1,2 x 10 7 1,2 x 10 7 1,6 x 10 7 1,3 x 10 7 7,1 2. H1 1,2 x 10 7 1,1 x 10 7 1,2 x 10 7 1,2 x 10 7 7,1 3. H2 1,1 x 10 7 1,3 x 10 7 1 x 10 7 1,1 x 10 7 7 4. H3 1 x 10 6 1,2 x 10 6 1,1 x 10 6 1,1 x 10 6 7 5. H4 4 x 10 6 4,3 x 10 6 5,6 x 10 6 4,5 x 10 6 6,7 6. H5 3,9 x 10 6 4 x 10 6 4,9 x 10 6 4,3 x 10 6 6,6 7. H6 3,5 x 10 6 3,4 x 10 6 3,8 x 10 6 3,6 x 10 6 6,6 8. H7 3,3 x 10 6 3,2 x 10 6 3 x 10 6 3,2 x 10 6 6,5
Pengaruh  waktu  penyimpanan  pada  suhu dingin  memberikan  pengaruh  yang  nyata  terhadap jumlah sel inoculum Staphylococcus aureus. Rata-rata jumlah  sel  ( Standard  Plate  Count )  inoculum
Staphylococcus aureus terhadap waktu penyimpanan pada  suhu refrigerator terdapat  pada  Tabel  2.  Nilai rata-rata  jumlah  sel  ( Standard  Plate  Count )  yang diperoleh dari hasil penelitian yaitu 1,3 x 10 7 CFU / mL
(H0); 1,2 x 10 7 CFU / mL (H1); 1,1 x 10 7 CFU / mL (H2); 1,1 x 10 6 CFU / mL (H3); 4,5 x 10 6 CFU / mL (H4); 4,3 x 10 6 CFU / mL (H5); 3,6 x 10 6 CFU / mL (H6); dan 3,2 x 10 6 CFU / mL (H7). Nilai rata-rata jumlah sel ( Standard Plate  Count ) Staphylococcus  aureus terendah diperoleh pada pengamatan H7, sedangkan nilai rata- rata  jumlah  sel  ( Standard  Plate  Count )  tertinggi didapat pada sebelum penyimpanan (H0).
Staphylococcus  aureus merupakan  bakteri yang  termasuk  kedalam  kelompok  psikrofilik  yang mampu tumbuh pada suhu rendah (< 5 – 7 °C) dengan suhu optimum (30 - 37 °C) (Gnanamani, 2016; Harris, 2002;  Karimela,  2017;  Yilmaz,  2010).  Bakteri  ini tergolong anaerob fakultatif, tumbuh lebih cepat dan lebih  banyak  dalam  keadaan  aerobik  (Pelczar  dan chan,  2005).  Selain  itu,  bakteri  ini  juga  mempunyai
sifat yang tahan garam dan tumbuh baik pada medium yang  mengandung  7.5  %  NaCl  serta  dapat memfermentasi mannitol (Fardiaz, 1993).
Fase  adaptasi Staphylococcus  aureus adalah saat  dimana  fase  penyesuaian  bakteri  terhadap substrat  dan  kondisi  lingkungan  di  sekitarnya  dan belum  terjadinya  pembelahan  sel  karena  beberapa enzim  belum  disintesis.  Jumlah  sel  pada  fase  ini mengalami tetap, namun kadang kala menurun. Pada penelitian ini berdasarkan jumlah sel ( Standard Plate Count ) Staphylococcus  aureus yang  diperoleh,  fase adaptasi  dimulai  pada  hari  ke-0  hingga  hari  ke-7. Menurut  Hasan  dan  Wikandari  (2018),  menyatakan bahwa  setelah  beradaptasi  dengan  lingkungannya, bakteri akan mengalami peningkatan jumlah sel yang berlangsung cepat dalam fase log (eksponensial).
Gambar 1. Pengaruh lama penyimpanan  terhadap jumlah sel suspensi Escherichia coli dan Staphilococcus aureus
Jumlah  sel  inokulum Escherichia  coli dan Staphylococcus  aureus dipengaruhi  oleh  waktu penyimpanan  dan  suhu  penyimpanan.  Menurut Gnanamani  (2016);  Pratiwi  (2008),  menyatakan bahwa  pertumbuhan  bakteri  dipengaruhi  oleh  suhu dan  lama  waktu  simpan.  Pada  penelitian  ini  peneliti melakukan  uji  waktu  penyimpanan  dari  hari  ke-0 hingga hari ke-7, Fitrianto (2020) pada hari 0 hingga dua  minggu  adalah  masa  pertumbuhan  bakteri sehingga  nilai  rata-rata  jumlah  sel  yang  diperoleh belum optimal.
Pada  Tabel  3  dan  Tabel  4  menunjukkan  nilai absorban inoculum Escherichia coli dan
Staphylococcus  aureus yang  memberikan  pengaruh nyata  terhadap  terhadap  waktu  penyimpanan  pada suhu  dingin . Rata-rata  nilai  absorban  (OD)  inoculum Escherichia  coli terhadap  waktu  penyimpanan  pada suhu refrigerator terdapat  pada  tabel  4.3.  Rata-rata nilai  absorban  (OD) Escherichia  coli yang  diperoleh dari hasil penelitian yaitu 0,109 (H0); 0,109 (H1); 0,112 (H2);  0,117  (H3);  0,121  (H4);  0,124  (H5);  0,132  (H6); dan  0,137  (H7).  Nilai  rata-rata  absorban  terendah diperoleh  dari  H0  dan  H1,  sedangkan  nilai  rata-rata absorban tertinggi didapat pada sebelum penyimpanan (H7).
Tabel 3. Nilai Absorban Escherichia coli No Waktu Pengamatan (Hari) Ulangan (OD) Rata - rata nilai Absorban (OD) I II III 1. H0 0,111 0,101 0,116 0,109 2. H1 0,110 0,104 0,113 0,109 3. H2 0,115 0,115 0,105 0,112 4. H3 0,124 0,110 0,119 0,117 5. H4 0,120 0,122 0,122 0,121 6. H5 0,127 0,125 0,121 0,124 7. H6 0,135 0,128 0,133 0,132 8. H7 0,144 0,132 0,136 0,137
Pengaruh  waktu  penyimpanan  pada  suhu dingin  memberikan  pengaruh  yang  nyata  terhadap nilai absorban (OD) inoculum Staphylococcus aureus. Rata-rata nilai absorban (OD) inoculum Staphylococcus  aureus terhadap  pengaruh  waktu penyimpanan  pada  suhu refrigerator terdapat  pada Tabel 4. Nilai rata-rata absorban (OD) Staphylococcus
aureus yang diperoleh dari hasil penelitian yaitu 0,073 (H0);  0,075  (H1);  0,083  (H2);  0,093  (H3);  0,129  (H4); 0,138 (H5); 0,145 (H6); dan 0,148 (H7). Nilai rata-rata absorban (OD) terendah diperoleh pada pengamatan H0, sedangkan nilai rata-rata absorban (OD) tertinggi didapat  pada  saat  sebelum  dilakukan  penyimpanan (H7).

## Tabel 4. Nilai Absorban Staphilococcus aureus
No Waktu Pengamatan (Hari) Ulangan (OD) Rata - rata nilai Absorban (OD) I II III 1. H0 0,074 0,075 0,071 0,073 2. H1 0,071 0,076 0,079 0,075 3. H2 0,081 0,083 0,086 0,083 4. H3 0,090 0,091 0,097 0,093 5. H4 0,125 0,130 0,131 0,129 6. H5 0,130 0,139 0,146 0,138 7. H6 0,141 0,149 0,144 0,145 8. H7 0,148 0,141 0,155 0,148
Gambar 2. Nilai kekeruhan (OD) terhadap lama penyimpanan  suspensi Escherichia coli dan Staphilococcus aureus
Suhu  penyimpanan  dan  waktu  penyimpanan memiliki pengaruh yang signifikan terhadap kelangsungan  hidup  organisme  uji.  Berdasarkan penelitian  yang  telah  dilakukan  oleh  Adhikari  et  al. (2018),  bahwa  terdapat  pengaruh  suhu  dan  waktu penyimpanan  terhadap  viabilitas  beberapa  bakteri pathogen ( Escherichia coli dan Staphilococcus aureus ) bawaan makanan yang diinokulasi ke dalam keju susu sapi  pasteurisasi  kalengan,  yaitu  pada  saat penyimpanan suhu 4.4 °C pada waktu penyimpanan 0 – 30  hari  mengalami  penurunan  drastis  yang  dapat dilihat berdasarkan nilai viabilitas jumlah sel bakteri.
Pada saat suhu penyimpanan inoculum bakteri Escherichia  coli dan Staphilococcus  aureus menurun atau dingin, maka bakteri berusaha untuk mengatasi stress  lingkungan  tersebut.  Menurut  Russel  (1990), bakteri mengembangkan mekanisme untuk mengatasi stress  lingkungan  dengan  memodifikasi  membrane untuk  menjaga  fluiditas  membrane.  Ketika  suhu ertumbuhan  menurun,  komposisi  lipid  membrane berubah  menjadi  asam  lemak  tak  jenuh  yang  lebih pendek dan / atau tak jenuh.
Menurut  Gao  et  al.  (2007),  bakteri E.  coli sensitif terhadap pembekuan. Pada saat penyimpanan di  suhu  dingin  atau  beku/  freezing,  terjadi pengurangan  log  jumlah  sel  yang  signifikan  sebagai akibat  dari  kerusakan  atau  cedera  sel  yang  fatal. Tingkat  inaktivasi  meningkat  secara  signifikan  ketika waktu penyimpanan beku ditingkatkan menjadi 2 hari.
Waktu  penyimpanan  inoculum  berpengaruh terhadap pertumbuhan bakteri. Semakin lama waktu penyimpanan  pada  nutrisi  didalam  media  akan berkurang. Menurut Chung et al. (2006), bahwa ketika mikroorganisme  mengalami  kekurangan  nutrisi  atau kondisi  kelaparan,  mereka  meresponsnya  dengan menghentikan  semua  aktivitas  metabolisme  dan pertumbuhan.

## KESIMPULAN
Berdasarkan  penelitian  yang  telah  dilakukan dapat  disimpulkan  bahwa  waktu  penyimpanan inoculum Escherichia  coli dan Staphylococcus  aureus sebelum  disimpan  (H0)  dan  setelah  disimpan  dalam lemari  pendingin/  refrigerator  (5 o C  -  10 o C)  dengan variasi penyimpanan selama 1, 2, 3, 4, 5. 6 dan 7 hari memberikan  pengaruh  yang  nyata  terhadap  nilai jumlah sel ( Standard Plate Count ) dan nilai absorban.

## SARAN
Perlu  diketahui  lebih  lanjut  mengenai  waktu maksimal  penyimpanan  yang  lebih  lama  untuk mengetahui fase puncak terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus aureus .

## REFERENSI
[1] Adhikaria,  A.,  K.  Yemmireddya,  V.,  J.  Costellob, M.,  M.  Grayb,  P.,  Salvadalenab,  R.,  Rascob,  B., Killingerb,  K.  2018.  Effect  of  storage  time  and temperature on the viability of E. coli O157:H7, Salmonella spp., Listeria innocua, Staphylococcus aureus ,  and Clostridium  sporogenes vegetative cells  and  spores  in  vacuum-packed  canned pasteurized milk cheese. International Journal of Food Microbiology . Vol 286 (2018): 148-154.
[2] Chung,  H.J.,  Bang,  W.,  Drake,  M.A.  Stress Response  of Escherichia  coli.  Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety Journal. Vol. 5 (2006): 52-64.
[3] Fardias,  S.  1993. Analisis  Mikrobiologi  Pangan . Jakarta: Raja Grafindo Persada.
[4] Gao,  W.,  Smith,  D.W.,  Li,  Y.  2007.  Effects  of Freezing  on  the  Survival  of Escherichia  coli and Bacillus and Response to UV and Chlorine After Freezing. Journal  of  Water  Environment Research . Volume 79 (5): 507-513
[5] Hwang, J.M.D., Toni, E., Piccinini., J. Lammel, C., Keith, H.W., F. Brooks, G. 1986. Effect of Storage Temperature  and  pH  on  the  Stability  of Antimicrobial  Agents  in  MIC  Trays. Journal  of Clinical Microbioiogy . Vol 23 (5): 959-961.
[6] Jones,  T.,  Gill,  C.O.,  McMullen,  L.M.  2004.  The behaviour  of  log  phase Escherichia  coli at temperatures that fluctuate about the minimum for  growth. Journal  of  Letters  in  Applied Microbiology . Vol. 39(2004): 296 – 300
[7] Jutono,  Soedarsono,  J.,  Hartadi,  S.,  Kabirun,  S., Suhadi, dan Soesanto. 1972. Pedoman Praktikum Mikrobiologi  Umum .  Yogyakarta:  Offset  Gadjah Mada University Press.
[8] Kertiasih,  N.  L.  P.  2016.  Peranan  Laboratorium Pendidikan untuk Menunjang Proses Perkuliahan Jurusan  Keperawatan  Gigi  Poltekkes  Denpasar. Jurnal Kesehatan Gig i. Vol. 4(2): 59-66.
[9] Muwarni,  S.  2015. Dasar-Dasar  Mikrobiologi Veteriner . Malang: UB Press.
[10] Nedwell, D.B. 1999. E¡ect of low temperature on microbial growth: lowered a¤nity for substrates limits  growth  at  low  temperature. Journal  of FEMS Microbiology Ecology . Vol. 30 (1999): 101- 111.
[11] Pelczar, M. J. J. dan Chan, E. C. S. 2013. Dasar- Dasar Mikrobiologi . Jakarta: UI Press.
[12] Pratiwi, S. T. 2008. Mikrobiologi Farmasi . Jakarta: Erlangga.
[13] Russell N. 1990. Cold adaptation of microorganisms.  Phil  Trans  R  Soc  (Lond) 436:595 – 611.
[14] Sutarma,  2000. Kultur  Media  Bakteri.  Bogor : Balai Penelitian Veteriner.
[15] Syauqi,  A.  2017. Mikrobiologi  Lingkungan Peranan  Mikroorganisme  dalam  Kehidupan . Yogyakarta: ANDI Offset.
[16] Yunita,  M.,  Hendrawan,  Y.,  dan  Yulianingsih,  R. 2015.  Analisis  Kuantitatif  Mikrobiologi  Pada Makanan  Penerbangan  ( Aerofood  ACS )  Garuda Indonesia  Berdasarkan  TPC  ( Total  Plate  Count) Dengan  Metode Pour  Plate . Jurnal  Keteknikan Pertanian  Tropis  dan  Biosistem .  Vol.  3(3):  237- 248.