p-ISSN 2527-6751
Jumlah Sel Leydig dan Mikroanatomi Testis Tikus Putih ( Rattus norvegicus ) Setelah Pemberian Teh Kombucha Konsentrasi 50% Waktu Fermentasi 6, 9 dan 12 Hari
The Number of Leydig Cells and Testicular Microanatomy Structure of Rattus Norvegicus After Consumption  Fermented  Kombucha Tea 6, 9 And 12 Days on 50% Level
Sri Isdadiyanto*, Silvana Tana
Departemen Biologi Fakultas Sains dan Matematika Universitas Diponegoro *Email : isdadiyanto@yahoo.com
Diterima 13 Mei 2019 / Disetujui 20 Februari 2020

## ABSTRAK
Tujuan penelitian ini untuk mengkaji potensi teh Kombucha kadar 50% dengan variasi waktu fermentasi dalam mempengaruhi jumlah sel leydig dan struktur mikroanatomi testis tikus putih ( Rattus norvegicus ). Penelitian ini menggunakan Tikus putih jantan sebanyak 16 ekor umur 2 bulan, dengan perlakuan Teh kombucha yang difermentasi selama 6, 9 dan 12 hari pada suhu 25 o C per oral. Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap  dengan  4  perlakuan  (selama  28  hari)  dan  4  ulangan,  yaitu  :  P0  =  kontrol,  tanpa  tambahan  teh kombucha, P1 = air minum + 1,8 ml teh kombucha pagi dan sore fermentasi 6 hari, P2 = air minum + 1,8 ml teh kombucha pagi dan sore fermentasi 9 hari, P3 = air minum + 1,8 ml teh kombucha pagi dan sore fermentasi 12 hari. Variabel yang diukur adalah diameter tubulus seminiferus dan jumlah sel Leydig. Data yang diperoleh dianalisis menggunakan ANOVA yang dilanjutkan dengan Uji Duncan dengan taraf kepercayaan 95% dengan menggunakan  perangkat  lunak  SPSS  16.0.  Penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  pemberian  teh  kombucha fermentasi 6, 9, dan 12 hari menurunkan diameter tubulus seminiferus sehingga berpotensi mengganggu proses spermatogenesis, tetapi tidak mempengaruhi jumlah sel Leydig tikus putih ( Rattus norvegicus ).
Kata kunci: Rattus norvegicus , teh kombucha , tubulus seminiferus, sel leydig

## ABSTRACT
The objective of this study was to analyze the number of leydig cells and testicular microanatomy structure of Rattus norvegicus after treatment by 50% kombucha tea with variation of fermentation time. Sixteen male of rats, 2 months of age were used as experimental animals treated with kombucha tea that had been fermented for 6, 9 and 12 days at the temperature of 25oC per oral. This research was using completely randomized design with 4 treatment (for 4 weeks) and 4 replications, namely: P0 = control, without of kombucha tea, P1 = water + 1,8 ml kombucha tea that had been fermented for 6 days in the morning and afternoon, P2 = water + 1,8 ml kombucha tea that had been fermented for 9 days in morning and afternoon, P3 = water + 1,8 ml kombucha tea that had been fermented for 12 days in morning and afternoon. The variables measured were seminiferous tubule diameter and Leydig cell counts. Data were analyzed with ANOVA followed by Duncan test at 95% significance level were performed using SPSS version 16,0. The results showed that kombucha tea decreased the diameter of the seminiferous tubule, showing the potention  of  spermatogenesis disturbance,  but did not affect Leydig cell counts of Rattus norvegicus .

## Keywords: Rattus norvegicus, kombucha tea, seminiferous tubule, leydig cell

## PENDAHULUAN
Minuman  teh  kombucha  menyegarkan dengan rasa sedikit manis dan sedikit asam yang dikonsumsi  secara  mendunia.  Teh  kombucha
diperoleh  dari  hasil  fermentasi  simbiosis  bakteri dan ragi membentuk “jamur teh” (Chen and Liu, 2000). Lapisan selulotik tipis terapung dan cairan seduhan  asam  merupakan  2  bagian  dari  teh kombucha  (Dufrense  and  Farnworth,  2000).  Teh
kombucha  dipersiapkan  dengan  menaruh  kultur kombucha (jamur teh) kedalam seduhan teh manis untuk fermentasi. Jika kultur kombucha dibudidayakan  sesuai  dengan  resep  standar menggunakan  teh  hitam,  dipermanis  dengan sukrosa, maka substansi ini akan berubah menjadi minuman teh jamur menyegarkan dengan nilai gizi tinggi dan kandungan berkhasiat medis (Loncar et al., 2000).
Chen and Liu (2000) menyatakan kandungan  ethanol  pada  kombucha  meningkat seiring  waktu  dan  mencapai  nilai  tertinggi  pada sekitar  5,5  g/L,  diikuti  dengan  penurunan  yang lambat. Kusumah dan Ismail (2010) menunjukkan pemberian teh kombucha dengan dosis bertingkat dapat menyebabkan perubahan gambaran struktur histologis  hepar  mencit Balb/c berupa degenerasi parenkimatosa, degenerasi hidropik, dan nekrosis sesuai  dosisnya.  Hasil  penelitian  Yuanita  dan Ismail  (2010)  juga  menunjukkan  pemberian  teh kombucha dosis bertingkat menyebabkan perubahan strukur histologis ginjal mencit Balb/c berupa  penutupan  lumen  tubulus  proksimal. Isdadiyanto  dan  Tana  (2019)  menyatakan  bahwa pemberian teh kombucha kadar 75% menurunkan diameter  tubulus  seminiferus  hingga  berpotensi mengganggu  proses  spermatogenesis  dan  tidak mempengaruhi sel Leydig tikus putih.
Penelitian  menunjukkan  alkohol  merupakan zat  yang  bersifat  sitotoksik  pada  testis.  Luka  pada jaringan  testis  dapat  berakibat  pada  menurunnya produksi sperma atau mengurangi sekresi testosteron  dari  testis  dan  gangguan  transportasi sperma  melalui  sistem  saluran  atau  pengiriman  ke dalam saluran kelamin betina. Kualitas sperma yang tersedia  untuk  fertilisasi  juga  dapat  terganggu (Creasy,  2001)..  Menurut  El-Sokkary  (2001) pemberian alkohol secara kronik mampu menyebabkan penurunan diameter tubulus seminiferus,  jumlah  sel  spermatogenik,  dan kemunculan  sel-sel  germinal  yang  mati  serta mengalami  vakuolasi  berbagai  ukuran.  Alkohol juga  mampu  menyebabkan  penurunan  jumlah  dan volume  inti  sel  Leydig  secara  signifikan. Keragaman fungsional dari sistem reproduksi jantan dan kompleksitas regulasi hormonnya memberikan lokasi  potensial  untuk  gangguan  kimiawi.  Tujuan penelitian ini untuk mengkaji potensi teh kombucha
kadar 50% dengan variasi waktu fermentasi dalam mempengaruhi  jumlah  sel  Leydig  dan  struktur mikroanatomi testis tikus putih ( Rattus norvegicus ).

## METODE PENELITIAN
Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi    Struktur  dan  Fungsi  Hewan  Departemen Biologi Fakultas Sains dan Matematika Universitas Diponegoro Semarang. Hewan percobaan menggunakan  tikus  putih  ( Rattus  norvegicus ) jantan    sebanyak  16  ekor  umur  2  bulan,  sedang untuk  bahan  perlakuan  yaitu  teh  kombucha  kadar 50% yang difermentasi selama 6, 9 dan 12 hari pada suhu  25 o C per  oral dengan  spuit  injeksi  ujung berkanul. Adapun alat-alat yang digunakan yaitu 20 kandang individu yang dilengkapi dengan  tempat minum  dan  pakan,  gelas  ukur,  timbangan  digital, disetting set.
Penelitian  ini  menggunakan  Rancangan Acak  Lengkap  dengan  4  perlakuan  dan  4  ulangan yaitu :  P0 = kontrol, tanpa tambahan teh kombucha, P1 = air minum + 1,8 ml teh kombucha kadar 50% pagi dan sore fermentasi 6 hari, P2 = air minum + 1,8  ml  teh  kombucha  kadar  50%    pagi  dan  sore fermentasi  9  hari,  P3  =  air  minum  +  1,8  ml  teh kombucha kadar 50%  pagi dan sore fermentasi 12 hari. Pakan dan minum diberikan  secara ad libitum .Preparat histopatologi testis dibuat dengan metode parafin dan fiksatif yang digunakan adalah larutan 10% neutral  buffered  formalin .  Tahapan  yang dilakukan setelah proses fiksasi adalah melakukan pemotongan  tipis  jaringan  setebal  kurang  lebih  4 mm  dengan  orientasi  sesuai  dengan  organ  yang akan  dipotong  ( trimming ).  Pisau  yang  digunakan untuk trimming adalah  pisau  skalpel  No.  22-24. Jumlah potongan jaringan yang dapat dimuat dalam embedding  cassette berkisar  antara  1-5  buah disesuaikan  dengan  ukuran  organ.  Dehidrasi jaringan dilakukan setelah trimming menggunakan tissue processor (Leica, Germany), ini dimaksudkan  untuk  mengeluarkan  air  yang terkandung  dalam  jaringan  dengan  menggunakan cairan  dehidran  seperti  etanol  atau  iso  propyl alkohol. Cairan dehidran kemudian dibersihkan dari dalam  jaringan  dengan  menggunakan  reagen pembersih (clearing  agent) yaitu xylol.  Reagen pembersih ini akan diganti dengan parafin dengan
Jumlah Sel Leydig dan Mikroanatomi Testis Tikus Putih (Rattus norvegicus) Setelah Pemberian Teh Kombucha Konsentrasi 50% Waktu Fermentasi 6, 9 dan 12 Hari
cara  dimasukkan  dalam  larutan  parafin  cair sehingga  parafin  terpenetrasi  ke  dalam  jaringan; proses  ini  disebut  impregnasi.  Parafin  yang digunakan mempunyai titik cair 56-58˚C. Pengaturan  waktu  dehidrasi  pada tissue  processor diberikan pada pada Tabel 1. Setelah melalui proses dehidrasi,  jaringan  yang  berada  di  dalam embedding  cassette dipindahkan  ke  dalam base mold, kemudian  diisi  dengan  parafin  cair  dan dilekatkan  pada embedding  cassette yang  disebut blok.  Jaringan  dalam  blok  yang  telah  dingin, selanjutnya  dipotong  pada  ketebalan  irisan  4  µ dengan rotary microtome . Irisan tersebut ditempel
pada gelas objek yang sebelumnya diolesi Mayer’s egg  albumin dan  ditetesi  aquades  kemudian dibiarkan  kering  pada  suhu  kamar.  Selanjutnya setelah  preparat  mikroanotomi  kering  dilakukan pewarnaan dengan metode pewarnaan Hematoxylin Ehrlich-Eosin,  kemudian  dilakukan mounting dengan meneteskan entelan secukupnya dan ditutup dengan coverglass .  Pengamatan  preparat  pada setiap  perlakuan  dilakukan  dengan  mikroskop cahaya  untuk  menentukan  jumlah  sel  leydig  dan diameter  tubulus  seminiferus  antar  kelompok perlakuan.
Tabel 1.  Pengaturan waktu dehidrasi pada tissue processor Proses Cairan Waktu Dehidrasi Alkohol 80% 2 jam Alkohol 95% 2 jam Alkohol 95% 1 jam Alkohol absolut 1 jam Alkohol absolut 1 jam Alkohol absolut 1 jam Clearing Xylol 1 jam Xylol 1 jam Xylol 1 jam Impregnasi Parafin 2 jam Parafin 2 jam Parafin 2 jam
Variabel  yang  diukur  adalah  jumlah  sel Leydig  dan  diameter  tubulus  seminiferous.  Data yang  diperoleh  dianalisis  dengan  ANOVA, berdasarkan Rancangan Acak Lengkap (RAL) pada taraf  kepercayaan  95%  (α  =  0,05)  (Mattjik  dan Sumertajaya, 2006). Analisis keseluruhan menggunakan perangkat lunak software SPSS 10,0.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil penelitian tentang pengaruh pemberian teh kombucha dengan waktu fermentasi  berbeda  terhadap  jumlah  sel  Leydig dan diameter tubulus seminiferus tikus pada taraf kepercayaan  95%  dapat  dilihat  di  Tabel  2.  Rata- rata  jumlah  sel  Leydig  (Gambar  1)  tidak menunjukkan  beda nyata  pada  perlakuan  P0,  P1, P2,  dan  P3,  demikian  juga  dengan  kenampakan mikroanatominya.  Hasil  ini  menunjukkan  teh
kombucha  dengan  fermentasi  6,  9,  dan  12  hari konsentrasi  50%  tidak  menyebabkan  perubahan pada  struktur  sel  Leydig.  Fungsi  sel  Leydig menurut  Dong  and  Hardy  (2004)  adalah  sumber utama  dari  hormon  androgenik  testosteron,  yang penting untuk diferensiasi seksual jantan, produksi gamet  dan  pematangan,  dan  pengembangan karakteristik  seksual  sekunder.  Menurut  Creasy (2001) fungsi utama sel Leydig adalah steroidogenesis,  sehingga  zat  apa  pun  yang mengganggu jalur metabolismenya akan menghasilkan gangguan fungsional dalam keseimbangan hormon. El-Sokarry (2011) menyatakan  bahwa  sel  leydig  rentan  terhadap beberapa  toksikan  melalui  efek  langsung  atau gangguan sumbu hipotalamus-hipofisis.
Menurut Dong and Hardy (2004), toksisitas dapat  merusak  sel  Leydig  dengan  tiga  cara: stimulasi berlebih atau penghambatan
steroidogenesis, induksi pembentukan tumor, dan promosi kematian sel. Teh kombucha mengandung alkohol (Chen and Liu, 2000; Pratiwi dan Aryawati , 2012) dan alkohol dapat menurunkan  jumlah  sel  Leydig  (El-  Sokarry, 2011) serta menurunkan tingkat testosteron (Dong and Hardy, 2004). Peluang toksisitas alkohol pada teh kombucha berdasarkan hasil pengamatan tidak terlihat secara kuantitatif pada jumlah sel Leydig. Sel  Leydig  berkaitan  dengan  spermatogenesis karena menurut Holstein et  al. (2003)  sel  Leydig mensekresikan testosteron dan zat neuroendokrin tambahan  dan growth  factor yang  terlibat  dalam
pemeliharaan  sel  Sertoli  dan  sel  jaringan peritubular; mempengaruhi kontraktilitas myofibroblasts dan mengatur pergerakan peristaltik tubulus seminiferus dan pengangkutan spermatozoa.  Hasil  pengukuran  diameter  tubulus seminiferus  (Tabel  1)  menunjukkan  adanya perubahan  berupa  penurunan  diameter  tubulus seminiferus pada tikus yang diberi teh kombucha. Penurunan diameter menunjukkan adanya penurunan  jumlah  sel  germinal  (Lanning et  al ., 2002)  yang  bisa  diasumsikan  adanya  gangguan pada  siklus  spermatogenik  yang  diregulasi oleh hormon androgenik dari sel Leydig.
Tabel 2 . Hasil analisis rata-rata jumlah sel Leydig dan diameter tubulus seminiferus tikus.
P0 P1 P2 P3 Jumlah Sel Leydig (Sel) 14,70a±2,65 12,35a±0,96 13,25a±2,36 13,75a±2,36 Diameter tubulus seminiferus (µm) 291,856b±4,37 253,078a±15,61 252,212a±10,38 240,372a±6,54
Keterangan:   Angka yang ditunjukkan dengan superskrip yang sama pada baris yang sama menunjukkan perbedaan tidak nyata (P>0,05). P0: Perlakuan Kontrol, P1: Pemberian teh kombucha fermentasi 6 hari, P2: Pemberian the kombucha  fermentasi  9  hari,  P3:  Pemberian  teh  kombucha  fermentasi  12  hari.  Data  yang  ditampilkan berupa rerata ± SD
Nugroho  (2009)  menyatakan  gangguan sintesis  dan  sekresi  GnRH  hipotalamus  yang disebabkan  oleh  alkohol  akan  menyebabkan kegagalan hipofisis untuk melakukan sintesis  dan sekresi  FSH  maupun  LH.  Gangguan  hormon selanjutnya  akan  diikuti  oleh  kegagalan  sel Leydig  untuk  mensintesis  testosteron  dan  sel Sertoli tidak mampu melakukan fungsinya sebagai nurse cell. Alkohol menimbulkan gangguan pada hipotalamus  dan  hipofisis,  selain  itu  juga bertindak  sebagai  inhibitor  bagi  enzim  5  α- reduktase. Enzim ini digunakan untuk mengubah prohormon (testosteron) menjadi bentuk  aktifnya yaitu  5  α-dihidrotestosteron.  Testosteron  dalam bentuk  aktif  yang  tidak  dihasilkan  akhirnya menyebabkan proses spermatogenesis tidak terjadi dan menyebabkan  penurunan  jumlah  lapisan  sel spermatogenik.  Menurut  Lanning et  al .  (2002) penurunan diameter tubulus seminiferus merupakan indikasi penurunan jumlah lapisan sel spermatogenik atau sel germinal.
Penelitian  ini  belum  dapat  dipastikan apakah  teh  kombucha  yang  tidak  memberikan perubahan  signifikan  pada  jumlah  sel  Leydig menunjukkan adanya penurunan hormon androgenik  juga  berpengaruh  pada  fertilitas. Untuk  mengetahui  pengaruh  teh  kombucha  pada kesuburan  secara  langsung  diperlukan  penelitian lanjutan  seperti  jumlah  spermatozoa  dan  kondisi hormonal  hewan  uji.Hasil  analisis  pengaruh pemberian teh kombucha berbeda hari fermentasi pada  diameter  tubulus  seminiferus  tikus  dengan Analysis  of  Variance (ANOVA)  menunjukkan hasil  berbeda  nyata  (P<0,05)  antara  P0  (kontrol) dan  P1  (fermentasi  6  hari)  berupa  penurunan diameter tubulus seminiferus testis, demikian juga dengan P0 dan P2 (fermentasi 9 hari), serta P0 dan P3  (fermentasi  12  hari).  Hasil  ini  menunjukkan bahwa  pemberian  teh  kombucha  berpengaruh pada diameter tubulus seminiferus tikus.
Menurut  Lanning et  al .  (2002), penurunan ukuran  diameter  tubulus  seminiferus  merupakan
Jumlah Sel Leydig dan Mikroanatomi Testis Tikus Putih (Rattus norvegicus) Setelah Pemberian Teh Kombucha Konsentrasi 50% Waktu Fermentasi 6, 9 dan 12 Hari
salah  satu  indikasi  adanya  kerusakan  jaringan akibat  dari  penurunan  jumlah  sel  germinal  dan penurunan  sekresi  cairan  tubular.  Cairan  tubulus seminiferus  disekresikan  oleh  sel  Sertoli  dan berfungsi mempertahankan ukuran lumenal, yang bervariasi dengan tahap spermatogenesis.
Sekresinya  adalah  bagian  dari  fungsi androgen yang  bergantung  pada  sel  Sertoli  dan  akan terpengaruh oleh sekresi testosteron yang berubah. Perubahan  ini  juga  terlihat  pada  pengamatan mikroskopis.  Hasil  fotomikrograf  (Gambar  1) menunjukkan  adanya  perbedaan  berupa  struktur tubulus  seminiferus  P0  memiliki  susunan  sel
spermatogenik yang rapat dan kompak, sedangkan tikus  dengan  perlakuan  P1,  P2,  dan  P3 menunjukkan  struktur  sel  spermatogenik  yang semakin  renggang  seiring  pertambahan  waktu fermentasi dengan lumen yang tidak terisi penuh oleh  spermatozoa.  Menurut  Waty et  al. (2017), struktur  mikroanatomi  tubulus  seminiferus  yang normal akan menunjukkan asosiasi sel spermatogenik  tersusun  sesuai  dengan  tingkat perkembangannya  dari  membran  basalis  menuju ke  arah  lumen  tubulus,  yakni  spermatogonia, spermatosit, dan spermatid.
Gambar 1. Hasil Fotomikrograf Sel Leydig. Sel Leydig (ditunjukkan oleh panah) di antara tubulus seminiferus (ditunjukkan oleh tanda silang) pada perlakuan kontrol (A), pemberian teh kombucha fermentasi 6 hari (B), pemberian teh kombucha fermentasi 9 hari (C), dan pemberian teh kombucha fermentasi 12 hari (D) Perbesaran 400x dengan pewarnaan
Hasil pengukuran diameter tubulus seminiferus dan pengamatan mikroskopis menunjukan teh kombucha mempengaruhi struktur  mikroanatomi  testis  tikus.  Perubahan struktur  mikroanatomi  menunjukkan  adanya  zat berpotensi  toksik  yang  terkandung  dalam  teh kombucha,  dan  salah  satu  yang  sudah  diketahui
adalah alkohol atau ethanol. Chen and Liu (2000) menyatakan kandungan etanol pada teh kombucha mencapai nilai tertinggi pada sekitar 0,55% pada hari ke-20 diikuti dengan penurunan yang lambat, sedangkan menurut Pratiwi dan Aryawati (2012) mencapai 0,4683% pada hari ke 12.
El-Sokarry  (2011)  menyatakan  bahwa
ukuran  tubulus  seminiferus  bisa  berkurang  pada tikus yang mengkonsumsi alkohol. Rachadoul dan Sarkar (2013) menyatakan bahwa tingkat hormon testosteron  menurun  pada  tikus  dengan  paparan alkohol  yang  diasosiasikan  dengan  penurunan FSH  (Follicle  Stimulating  Hormone)  dan  LH (Luteinzing  Hormone).  Rachadoul  dan  Sarkar (2013)  juga  menyatakan  bahwa  asetaldehid, metabolit dari alkohol, bisa menghambat produksi testosteron dengan inhibisi protein Kinase C yang merupakan enzim kunci pada sintesis testosteron. Produksi sel germinal dan proses spermatogenesis pada  testis  sangat  berkaitan  dengan  aktivitas
hormonal.  Holstein et  al. (2003)  menyatakan regulasi spermatogenesis membutuhkan rangsangan  ekstratestikular  dari  hipotalamus  dan hipofisis. Sekresi Gonadotropin-releasing Hormone  (GnRH)  dari  hipotalamus  menginisiasi pelepasan Luteinzing Hormone (LH) dari hipofisis dan  sebagai  hasilnya  menstimulasi  sel  Leydig untuk memproduksi testosteron. Testosteron tidak hanya  mempengaruhi  spermatogenesis  pada tubulus seminiferus testis tetapi juga didistribusikan ke seluruh tubuh dan memberikan umpan  balik  terhadap  hipofisis  yang  terkait dengan aktivitas sekretori sel Leydig.
Gambar 2. Hasil fotomikrograf tubulus seminiferus Rattus norvegicus. Perlakuan kontrol (A), pemberian teh kombucha fermentasi 6 hari (B), pemberian teh kombucha fermentasi 9 hari (C), dan pemberian teh kombucha fermentasi 12 hari (D). Garis menunjukkan pengukuran diameter tubulus seminiferus. Pewarnaan H&E perbesaran 100×.
Perubahan  struktur  tubulus  seminiferus menghasilkan  dugaan  awal  bahwa  bahwa pemberian  teh  kombucha  yang  mengandung ethanol  bisa  memberikan  pengaruh  buruk  pada tingkat  fertilitas  kelamin  jantan,  akan  tetapi menurut  Creasy  (2001)  apabila  ada  zat  bersifat toksik  yang  merusak  sel  germinal,  kematian  sel
yang  benar-benar  mempengaruhi  kesuburan bergantung  pada  populasi  sel  germinal  yang terkena  dampak  toksiknya.  Semisal,  apabila spermatogonia  pada  tikus  mati,  kesuburan  tidak akan  terpengaruh  hingga  8-10  minggu  semenjak paparan  zat  toksin.  Maka  dari  itu,  masih  ada kemungkinan  bahwa  sel  germinal  pada  tubulus
Jumlah Sel Leydig dan Mikroanatomi Testis Tikus Putih (Rattus norvegicus) Setelah Pemberian Teh Kombucha Konsentrasi 50% Waktu Fermentasi 6, 9 dan 12 Hari
seminiferus tikus yang diberi teh kombucha untuk kembali  pulih.  Kemungkinan  pemulihan  sel germinal ini menunjukkan perlu adanya penelitian kualitas  dan  kuantitas  sperma  dari  tikus  yang diberi teh kombucha.

## KESIMPULAN
Penelitian ini menunjukkan bahwa
pemberian teh kombucha fermentasi 6, 9, dan 12 hari  menurunkan  diameter  tubulus  seminiferus sehingga berpotensi mengganggu proses spermatogenesis,  tetapi  tidak  mempengaruhi jumlah sel Leydig tikus putih ( Rattus norvegicus ).

## DAFTAR PUSTAKA
Chen  and  Liu.  (2000).  Changes  in  major components  of  tea  fungus  metabolites during  prolonged  fermentation. Journal
Applied Microbiology 89(5):834-839. Creasy,  D.M.  (2001).  Pathogenesis  of  Male Reproductive Toxicity. ToxicologicPathology , 29(1), 64 –76
Cunningham,  J.G.  and  Klein,  B.G.  (2007) Textbook of Veternary Physiology . London:
Saunders/Elsevier Dong,  Q.  and  Hardy,  M.P.  (2004).  Leydig  Cell Function  in  Man.  In  Winters,  S  & Huthaniemi, I.T (Ed.). Male Hypogonadism: Basic, Clinical, and TherapeuticPrinciple . New Jersey: Humana Press Inc.
Dufrense and Farnworth. (2000). Tea, kombucha, and  health:  a  review. Food  Research
International , 33(6), 409–21
El-Sokarry,  G.H.  (2001).  Quantitative  Study  on
The Effects of chronic Ethanol
Administration on Testis of Adult Male Rat.
Neuroendocrinology Letters , 22(2),93- 99
Hughes,  I.A.  and  C.L.  Acerini.  2008.  Factors controlling testis descent. European
Journal of Endocrinology , 159, 575–582.
Isdadiyanto,  S.  dan  Tana,  S.  (2019).  Struktur mikroanatomi  testis  tikus  putih  ( rattus norvegicus ) setelah pemberian teh kombucha konsentrasi 75% waktu
fermentasi  6,  9  dan  12  hari. J.  Bioma: Berkala ilmiah Biologi 21(1).
Jayabalan, R. Malbasa, R.  Loncar, E. Vitas, J. and
Sathiskumar,  M.  (2014).  A  Review  on Kombucha Tea−Microbiology, Composition, Fermentation, Beneficial
Effects,  Toxicity,  and  Tea  Fungus. Comprehensive  Reviews  in  Food  Science and Food Safety , 13(4), 538-55
Kusumah,  L.P.  dan  Ismail  A.  (2010). Pengaruh Pemberian  Teh  Kombucha  Per  Oral
Dengan Dosis Bertingkat Terhadap Gambaran Histologis Hepar Mencit Balb/C . 02  Desember  2010.  Universitas Diponegoro Semarang, Fakultas Kedokteran http://eprints.undip.ac.id/24315/
Mattjik,  A.A.  dan  Sumertajaya,  I.M.  2006.
Perancangan  Percobaan  dengan  Aplikasi SAS  dan  Minitab .  Ed.  Ke-3.  IPB-Press. Bogor.
Lanning, L.L.  Creasy, D.M.  Chappin, R.M. Mann,
P.C. Barlow, N.J. Regan, K.S. and Goodman, D.G. (2002). Recommended Approaches for the Evaluation of Testicular and Epididymal Toxicity. Toxicologic Pathology , 30(4), 507- 520
Loncar,  E.S.  Petrovic,  S.E.  Malbasa,  R.V.  and Verac,  R.M.  (2000).  Biosynthesis  of glucuronic  acid  by  means  of  tea  fungus.
Nahrung , 44(2),138–9.
Nugroho,  C.A.  (2009).  Pengaruh  Minuman Beralkohol  Terhadap  Jumlah  Lapisan  Sel Spermatogenik dan Berat Vesikula
Seminalis Mencit. Widya Warta , 33(1), 41-
52
Pratiwi, A.E. dan  Aryawati, R. (2012). Pengaruh Waktu  Fermentasi  terhadap  sifat  fisik  dan kimia pada pembuatan minuman kombucha dari  Rumput  Laut Sargassum  sp . Maspari Journal , 4(1), 131-136.
Rachadoul, N. and Sarkar, D.K. (2013). Effects of
Alcohol on the
Endocrine System. Endocrinology  Metabolism  Clinics of North America , 42(3), 593–615
Waty,  M.  Tana,  S.,  &  Saraswati,  T.  (2017).
Histologis  Testis  pada  Keturunan  F1  dari Induk  Puyuh  (Coturnix  coturnix  japonica L.)  yang  diberi  Suplemen  Serbuk    Kunyit (Curcuma longa L.) dalam Pakan. Bioma : Berkala  Ilmiah  Biologi, 19(1),  13-17. doi:http://dx.doi.org/10.14710/bioma,  19, 1, 13-17
Yuanita,  D.A  dan  Ismail,  A.  (2010). Pengaruh Pemberian Teh Kombucha Dosis Bertingkat  Per  Oral  Terhadap  Gambaran Histologi  Ginjal  Mencit  Balb/C .  02 Desember  2010,  Fakultas  Kedokteran, Universitas Diponegoro Semarang.
http://eprints.undip.ac.id/24332/