## PRODUKSI TOTAL REACTIVE OXYGEN SPECIES PADA KULTUR JARINGAN MOLA HYDATIDOSA KOMPLIT DENGAN PEMAPARAN 17-BETA ESTRADIOL
Subandi Reksohusodo*  , Tatit Nurseta*

## Abstrak
Frekuensi  kejadian  mola  hydatidosa  yang  berpotensi  menjadi  penyakit  trofoblast  ganas  terus meningkat.  Mekanisme  patologis  yang  mendasari  penyakit  tersebut  belum  dapat  dieksplorasi  secara mendalam,  terdapat  pemikiran  bahwa  mekanismenya  terkait  dengan  kerusakan  oksidatif  yang berhubungan  dengan  produksi reactive  oxygen  species (ROS).  Diketahui  bahwa  hormon  estrogen  dan metabolitnya dapat memproduksi ROS, untuk itu perlu dianalisis seberapa jauh keterlibatan estrogen (17 β - estradiol)  dalam  patomekanisme  penyakit  ini  melalui  pengukuran  total  ROS.  Penelitian  ini  dilaksanakan secara  eksperimental  dengan  menggunakan randomized  group  control  design .  Rancangan  percobaan yang  digunakan  adalah  rancangan  acak  lengkap  dengan  1  kelompok  perlakuan,  yaitu  kelompok  kultur jaringan mola hydatidosa yang mendapat suplementasi estrogen (17 β -estradiol) dalam 4 dosis (5  g/ml, 10  g/ml,  20  g/ml,  40  g/ml)  dan  tanpa  suplementasi.  Dari  hasil  penelitian  didapatkan  perbedaan  sangat bermakna kadar ROS antara kelompok kontrol dengan kelompok 17 β -estradiol 5  g/ml dan 17 β -estradiol 40  g/ml (p = 0,000 < 0,05), antara kelompok perlakuan 17 β -estradiol 10  g/ml dan 17 β -estradiol 40  g/ml (p = 0,000 < 0,05) dan antara kelompok perlakuan 17 β -estradiol 20  g/ml dan kelompok perlakuan 17 β - estradiol 40  g/ml (p = 0,000 < 0,05). Disimpulkan bahwa pemberian 17 β -estradiol 20  g/ml dan 40  g/ml mempengaruhi produksi total ROS pada kultur jaringan mola hydatidosa.
Kata kunci: 17 β -estradiol, mola hydatidosa, reactive oxygen species (ROS).

## TOTAL PRODUCTION OF REACTIVE OXYGEN SPECIES IN COMPLETE HYDATIDIFORM
MOLE’S TISSUE CULTURE WITH EXPOSURE OF 17 -BETA ESTRADIOL

## Abstract
The  frequency  of hydatidiform mole  (molar pregnancy)  that  developed  into  malignant  trophoblast disease continues to increase. The pathological mechanisms are still unknown, but there is a thought that this mechanism is related to oxidative damage associated with the production of reactive oxygen species (ROS).  Hormone  estrogen  and  its  metabolites  can  produce  ROS.  It  is  necessary  to  analyze  how  far estrogen involvement (17 β -estradiol) in the patho-mechanism of the disease through the measurement of the total ROS. The study was carried out experimentally by using a randomized control group design. The experimental  design  used  was  a  completely  randomized  design  (CRD)  with  a  treatment  group,  that  was hydatidiform mole culture which supplemented with estrogen (17 β -estradiol) in 4 doses (5  g /ml, 10  g /ml, 20  g  /ml,  40  g  /ml)  and  those  without  supplementation.  In  this  study,  there  were  highly  significant differences  in  ROS  levels  between  control  and  treatment  groups  with  17 β -estradiol  5  g/ml,  and  17 β - estradiol 40  g/ml (p = 0.000 < 0.05), between treatment groups of 17 β -estradiol 10  g/ml and 17 β -estradiol 40  g/ml (p = 0.000 < 0.05) and between treatment groups of 17 β -estradiol 20  g/ml and 17 β -estradiol 40  g/ml (p = 0.000 < 0.05). It can be concluded that supplementation of 17 β -estradiol 20  g/ml and 40  g/ml affects the production of total ROS in hydatidiform mole culture.
Keywords: 17 β -Estradiol, hydatidiform mole, reactive oxygen species (ROS) .
* Divisi Onkologi, Bagian Obstetri dan Ginekologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Brawijaya- RS Universitas Brawijaya
 E-mail: desobg@gmail.com

## Pendahuluan
Penyakit  trofoblastik  gestasional ( gestational  trophoblastic  disease /GTD) merupakan  kelompok  penyakit  yang  muncul dari  jaringan  trofoblastik  plasenta  setelah fertilisasi  normal  maupun  abnormal. 1 WHO mengklasifikasikan  GTD  menjadi  mola  hyda- tidosa (komplit dan parsial), mola invasif,  ko- riokarsinoma,  tumor  trofoblastik  pada plasental  site,  miscellaneous dan  lesi  trofo- blastik  yang  tidak  terklasifikasi. 2 Complete hydatidiform  mole (CHM)  merupakan  varian yang  jarang  ditemui  dan  merupakan  lesi plasenta  yang  ditandai  dengan  villi  khorionik yang  melebar,  edematous,  dan  vesikuler, disertai  proliferasi  trofoblastik  pada  berbagai derajat. 3
Terdapat  variasi  distribusi  GTD  yang luas di seluruh dunia, dengan frekuensi lebih tinggi  didapatkan  di  beberapa  bagian  Asia, Timur  Tengah,  dan  Afrika.  Tingkat  kejadian GTD  adalah  130±10  kasus  per  100.000 kehamilan, yang diklasifikasikan sebagai lalat hydatidiform  (HM),  lalat  invasif,  atau  neo- plasma  ganas  plasenta  dengan  tingkat kejadian  masing-masing  110±10,  20±0,  atau 10±0  kasus  per  100.000  kehamilan.  Insiden GTD  terendah  di  antara  wanita  berusia  akhir 20-an  dan  awal  30-an.  Kejadian  HM menyumbang 80,3% semua kasus GTD. 4
Sebagian  besar  penderita  mola  hida- tidosa  akan  menjadi  baik  kembali  setelah ditangani  secara  tuntas.  Tetapi  lebih  kurang 15-20%  akan  mengalami  transformasi  ke- ganasan  menjadi  tumor  trofoblas  gestasional (TTG). 5
Reactive  oxygen  species diproduksi selama  proses  metabolik  dan  fisiologis normal.  Namun,  pada  kondisi  tertentu, peningkatan  oksidan  dan  penurunan  anti- oksidan  tidak  dapat  dicegah,  sehingga  ke- seimbangan  oksidan/antioksidan  bergeser pada  kondisi  oksidatif.  Sebagai  konsekuensi, terbentuklah stres oksidatif yang terlibat pada banyak  kondisi  patologis. 6 Terganggunya
keseimbangan  oksidan/antioksidan diperkirakan  merupakan  faktor  penyebab yang mendasari kerusakan oksidatif terhadap molekul seluler seperti DNA. 7
Sel-sel di dalam tubuh kita berada dalam keseimbangan.  Keseimbangan  antara proliferasi, diferensiasi dan apoptosis dari sel merupakan  salah  satu  pengatur  utama perilaku tumorigenik atau kemampuan invasif tumorigenik  pada  trofoblas.  Mekanisme patologis yang mendasari penyakit trofoblastik gestasional  belum  dieksplorasi  secara  luas, namun terdapat pemikiran bahwa mekanisme ini  terkait  dengan  kerusakan  oksidatif  yang berhubungan dengan produksi ROS. Produksi ROS bisa dideteksi berdasarkan sumber asal ROS  dihasilkan.  Pada  ROS  yang  dihasilkan oleh reaksi peroksidasi lemak, dapat dideteksi dengan  melihat  kadar  senyawa  malon- dialdehida    menggunakan  tes thiobarbituric acid reactive substances (TBARS). Selain itu, deteksi  produksi  ROS  dapat  menggunakan probe hidroetidin (HE) yang merupakan probe fluorogenik  yang  paling  banyak  digunakan untuk  deteksi  anion  radikal  superoksida intraseluler. 8
Penyakit  keganasan  trofoblas  ( Tumor Trophoblas  Gestasional )  dapat  menimbulkan gejala  klinik  ringan  sampai  berat  yang  dapat mengakibatkan  kematian. 9 Gejala  klinik  yang ditimbulkan tergantung dari daya invasif tumor dan  kemampuan  metastasisnya.  Sehingga deteksi  dini  dan  penanganan  yang  tepat diperlukan  untuk  pengobatan  penyakit  ini. 10 Upaya  pencegahan  penyakit  trofoblas  mola menjadi  ganas  sangat  diperlukan  mengingat bahaya  yang  ditimbulkanya,  tetapi  sampai saat  ini  patofisiologi  masih  belum  jelas  dan sangat  sedikit  penelitian  yang  telah dilakukan. 11
Untuk melakukan penelitian sel trofoblas mola tidak mungkin dilakukan pada manusia. Oleh  karena  itu  dibutuhkan  media  kultur  sel trofoblas  secara in  vitro yang  menyerupai kondisi sebenarnya sehingga dapat diberikan berbagai perlakuan yang diinginkan.
Oleh  karena  itu,  perlu  dilakukan  penelitian eksperimental  mengenai  efek  estrogen  (17 β - estradiol)  terhadap  produksi  total  ROS  pada kultur jaringan mola hydatidosa.

## Bahan dan Metode

## Desain Penelitian
Penelitian  ini  dilaksanakan  secara eksperimental  menggunakan randomized group  control  design .  Rancangan  percobaan yang  digunakan  adalah  Rancangan  Acak Lengkap  (RAL)  dengan  1  kelompok perlakuan,  yaitu  kelompok  kultur  jaringan mola  hydatidosa  yang  mendapat  suplemen- tasi  estrogen  (17 β -estradiol)  berbagai  dosis dan tanpa suplementasi.

## Subjek Penelitian
Penelitian  ini  menggunakan  sampel jaringan  mola  hydatidosa  dari  hasil suction curretage  mola  hydatidosa .  Penelitian  ini telah  mendapatkan  persetujuan  etik  dari Komite  Etik  Penelitian  Kesehatan,  Fakultas Kedokteran,  Universitas  Brawijaya  dengan nomor 132/KEPK-FKUB/05/2012.

## Isolasi dan Kultur Jaringan Mola Hydatidosa
Prosedur  kultur  jaringan  mola hydatidosa  dilakukan  di  Laboratorium  Faal, Fakultas  Kedokteran,  Universitas  Brawijaya. Jaringan  mola  hydatidosa  hasil suction curretage dicuci  dengan  normal  salin, gelembung  mola  lalu  dimasukkan  ke  dalam larutan    cord  solution  (Hank’s  balance  salt solution  (Sigma  H  1641),    gentamycine (Gentamerck),  sodium  hydrogen  bicarbonate (Sigma),  phenol  red  (Sigma  P5530),  HEPES solution  (Sigma),  and  deionized  water  (WFI Otsuka)  dan  disimpan  ke  refrigerator. Pengerjaan  kultur  jaringan  mola  hydatidossa tidak  melebihi  12  jam  setelah  waktu pengambilan  sampel,  dilakukan  pemilihan gelembung  mola  dari  jaringan  mola hydatidosa,  dan  selanjutnya  dikultur. Gelembung  mola  diinkubasi  dalam  larutan
Collagenase  (type  1)  7  mg/10  cc  selama  2 jam, dan disentrifus pada 2,000 rpm selama 7 menit.  Supernatan  dibuang  dan  pelet diresuspensi  ke  dalam  serum  free  media. Kemudian  disentrifus  kembali  dan  pelet diresuspensi  ke  dalam  4  mL  medium  kultur yang mengandung newborn calf serum (NCS, [Sigma N4637]) and 10% FBS, lalu diinkubasi di  inkubator  37  °C,  5%  CO 2 .  Kultur  diamati menggunakan mikroskop.
Kultur Jaringan mola dibagi  ke dalam 5 kelompok;  Kelompok  I:      tanpa  ditambahkan estrogen  (17 β -estradiol),  kelompok  II: ditambahkan estrogen  dosis fisiologis (10  g/ ml 17 β -estradiol), kelompok III:  ditambahkan estrogen  dosis  rendah  (5  g/ml  17 β - estradiol),  kelompok  IV:    ditambahkan estrogen    dosis  sedang  (20  g/ml  17 β - estradiol),  kelompok  V:    ditambahkan estrogen  dosis    tinggi  (40  g/ml  17 β - estradiol).
Reactive Oxygen Species (ROS) Assay Pengukuran  kadar  ROS  dari  medium kultur  menggunakan  Colorimetric  Hidrogen Peroxide Kit (Assay Design). Larutan standart dibuat  dengan  melarutkan  34  µl  stok Hydrogen  Peroxide  Standart  dengan  966  µl diluent dan disebut sebagai larutan standart I. Larutan standart II dibuat dengan melarutkan 500  µl  larutan  standart  I  dengan  500  µl diluent.  Dibuat  hingga  larutan  standart  6 dengan  cara  yang  sama.  Kemudian dimasukkan 50 µl diluent pada well 1 sebagai larutan  blanko,  50  µl  larutan  standart  1 hingga IV ke dalam well selanjutnya. Masing- masing  larutan  sampel  dia  mbil  50  µl dimasukkan  ke  dalam  well  selanjutnya. Selanjutnya  semua  well  ditambahkan  100  µl Color Reagent dan dipipeting selama 1 detik. Inkubasi  dilakukan  pada  suhu  ruang  selama 30  menit.  Selanjutnya  dibaca  pada  panjang gelombang  550  nm    dengan  Elisa  Reader. Angka  hasil  bacaan  Colorimeter  yang berbanding  terbalik  dengan  intensitas  warna senyawa hasil reaksi H 2 O 2
dalam  supernatan  kultur  sel  dengan  reagen yang mengandung besi dan pewarna xylenol yang  menghasilkan  warna  ungu,  dimana intensitas  warna  ungu  ini  sebanding  dengan kadar H 2 O 2 dalam supernatan kultur tersebut.

## Analisis Data
Data  disajikan  dengan  delta  rata-rata produksi total ROS pada kultur jaringan mola hydatidosa, perbedaan antar kelompok diana- lisis menggunakan one-way ANOVA dan post hoc dengan SPSS 15.

## Hasil
Pada  Gambar  1  dapat  dilihat  produksi total  ROS  pada  kelompok  kontrol  dan kelompok  perlakuan.  Peningkatan  produksi total  ROS  diketahui  sesuai  dengan
peningkatan  dosis  17 β -estradiol  yang diberikan  dan  didapatkan  tertinggi  pada kelompok V (40 mg/ml 17 β -estradiol).
Hasil  analisis  uji  ANOVA  menunjukkan bahwa  produksi  ROS  pada  kultur  jaringan mola  hydatidosa  menunjukkan  adanya perbedaan  yang  signifikan  antara  kelompok kontrol dengan kelompok 17 β -estradiol 5  g/ ml  dan  17 β -estradiol  40  g/ml  (p  =  0,000  < 0,05),  antara  kelompok  perlakuan  17 β - estradiol 10  g/ml dan 17 β -estradiol 40  g/ml (p  =  0,000  <  0,05)  dan  antara  kelompok perlakuan  17 β -estradiol  20  g/ml  dan kelompok perlakuan 17 β -estradiol 40  g/ml (p = 0,000 < 0,05). Selain itu, didapatkan selisih rata-rata  antara  setiap  kolompok  perlakuan yang diuji dalam penelitian ini berbeda cukup banyak,  sehingga  secara  statistik  perbedaan yang ada bersifat signifikan.
Gambar 1. Produksi total ROS pada kultur jaringan mola hydatidosa. Keterangan: K: Kontrol, P1: 17 β estradiol 5 µg/ml, P2: 17 β estradiol 10 µg/ml, P3: 17 β estradiol 20 µg/ml, P4:  17 β estradiol  40  µg/ml.  Notasi  a:    p  <  0,05  dibandingkan  K,  notasi  b:  p  <  0,05  P2 dibandingkan  P4, notasi c; p < 0,05 P3 dibandingkan P4.

## Pembahasan
Pada penelitian ini, produksi ROS pada kultur jaringan mola hidatidosa yang diberikan 17 β -estradiol  5  g/ml  dan  10  g/ml  tidak menunjukkan  perbedaan  yang  bermakna (tidak  signifikan)  dibandingkan  dengan kelompok kontrol. Hal ini disebabkan dosis 5  g/ml dan 10  g/ml  merupakan dosis rendah dan  secara  fisiologis  tidak  mempengaruhi produksi ROS. Kemudian produksi ROS pada kultur  jaringan  mola  hydatidosa  kembali meningkat  ketika  diberikan  17 β -  estradiol yang lebih tinggi yaitu dosis 20  g/ml dan 40  g/ml.  Bahkan  pada  dosis  40  g/ml  dapat menunjukkan  produksi  ROS  pada  kultur jaringan mola hydatidosa yang paling tinggi.
Sel  trofoblas  normal  maupun  yang patologis  secara  histologi  sama  yaitu menunjukkan ekspresi reseptor estrogen. 12 Pada sel trofoblas mola  terdapat ekspresi reseptor estrogen alfa (ER-  ) yang berada di  villous  sitotrofoblas  (CT).  Selain  itu, dengan  analisis  Western  blot  diketahui terdapat reseptor estrogen beta (ER-  ) pada chorionic  vili  (CV)  terbatas  hanya  pada sinsitiotrofoblas. 13 Senyawa  17 β -estradiol yang berperan sebagai hormon estrogen bisa masuk  melalui  membran  plasma  dan berinteraksi  dengan ER α dan ER β intraseluler untuk memberikan efek langsung melalui  ikatannya  dengan  sekuen  DNA. Namun,  estrogen  juga  bisa  mengaktifkan kaskade  signal  intraseluler  via  GPER1  dan/ atau ER α dan ER β. Terkait dengan hal ini, peristiwa signaling yang  diperantarai  oleh estrogen  dibagi  menjadi  genomik  dan nongenomik.  Efek  genomik  yaitu  melibatkan kompleks estrogen-reseptor ke dalam inti sel dan  interaksinya  secara  langsung  dengan kromatin  pada  sekuen estrogen  response elements (EREs).  Sementara  itu,  efek nongenomik melibatkan regulasi ekspresi gen melalui  berbagai  peristiwa signaling intraseluler. 13
Estrogen alami seperti 17 β -estradiol dan estrone  dapat  membentuk  cathecol  estrogen melalui  aktivitas  gen  CYP1A1,  CYP1A2  dan CYP1B1.  Cathecol  estrogen  berfungsi sebagai  molekul signaling ,  namun  demikian juga  menghasilkan  senyawa  genotoksik pemicu  karsinogenesis  yang     menyebabkan ikatan  yang  tidak  stabil  dengan  adenin  dan guanin  pada  DNA  dan  menyebabkan depurinasi dan mutasi in vitro maupun in vivo . Proses  reduksi  estrogen  quinon  menjadi hydroquinon  dan  catechol  menyebabkan produksi reactive  oxygen  species yang menyebabkan  kerusakan  oksidatif  pada  lipid dan DNA akibat paparan estrogen. 14,15
Oleh  karena  itu,  berdasarkan  nilai  rata- rata produksi ROS pada kultur jaringan mola hydatidosa, bahwa 17 β -estradiol memberikan pengaruh yang berbeda dalam meningkatkan produksi  ROS  pada  kultur  jaringan  mola hydatidosa  jika  dibandingkan  dengan kelompok kontrol.

## Kesimpulan
Produksi total ROS pada kultur jaringan mola  hydatidosa  yang  dipapar  dengan  17 β estradiol  dosis  20  g/ml  dan  40  g/ml menunjukkan  adanya  perbedaan  yang signifikan  (p  <  0.05)  dibandingkan  dengan 17 β estradiol  dosis  5  g/ml  dan  10  g/ml, dan kelompok kontrol.

## Daftar Pustaka
1.  Ning  F,  Hou  H,  Morse  AN,  Lash  GE. Understanding  and  Management  of Gestational  Trophoblastic  Disease [version  1;  peer  review:  2  approved]. [Internet].  F1000Research  2019;  8(F1000 Faculty  Rev):428.  [cited  2020  Sep  29]. A va ila ble   fr om:   /p mc /a rti cles / PMC6464061/?report=abstract.
2.  Ngan  HYS,  Seckl  MJ,  Berkowitz  RS,
Xiang  Y,  Golfier  F,  Sekharan  PK,  et  al. Update  on  the  Diagnosis  and Management of Gestational Trophoblastic Disease. Int  J  Gynecol  Obstet. 2018;
1 4 3 : 7 9 – 8 5 .   D O I :   h t t p : / /
doi.wiley.com/10.1002/ijgo.12615.
3.  Carey L, Nash BM, Wright DC. Molecular Genetic Studies of Complete Hydatidiform Moles. Transl Pediatr . 2015; 4(2):181.
4. Yuk  JS,  Baek  JC,  Park  JE,  Jo  HC,  Park JK,  Cho  IA.  Incidence  of  Gestational Trophoblastic  Disease  in  South  Korea:  A longitudinal,  Population-Based  Study. Peer  J. 2019;  2019(2).  e6490.  doi: 10.7717/peerj.6490. eCollection 2019. 5.  Huang  F,  Zheng  W,  Liang  Q,  Yin  T.
Diagnosis and Treatment of Placental Site Trophoblastic  Tumor. Int  J  Clin  Exp Pathol .  2013;  6(7):1448 – 51.  Available from: www.ijcep.com/.
6.  Pambuk  CIA  and  Muhammad  FM.  Free Radicals:  The  Types  Generated  in Biological  System. MOJ  Cell  Sci  Rep .
2018;  5(3):72-73.  DOI:  10.15406/ mojcsr.2018.05.00118.
7. Lee  T-H,  Kang  T-H.  DNA  Oxidation  and Excision Repair Pathways. Int. J. Mol. Sci.
2 0 1 9 ; 2 0 ( 2 3 ) : 6 0 9 2 .   h t t p s : / /
doi.org/10.3390/ijms20236092 .
8.  Çakmak  B,  Toprak  M,  Nacar  MC,
Köseo ǧ lu  RD,  Güneri  N.  Incidence  of Gestational  Trophoblastic  Disease  In Tokat  Province,  Turkey. J  Turkish  Ger Gynecol Assoc. 2014; 15(1):22 – 4.
9.  De  Nola  R,  Schönauer  LM,  Fiore  MG, Loverro  M,  Carriero  C,  Di  Naro  E. Management  of  Placental  Site
Trophoblastic  Tumor.  Medicine.  2018;  97 (48):e13439.
10. Braga A, Mora P, Melo AC de, Nogueira- Rodrigues  A,  Amim-Junior  J,  Rezende- Filho J, et al. Challenges in the Diagnosis and  Treatment  of  Gestational Trophoblastic Neoplasia Worldwide. World J Clin Oncol. 2019; 10(2):28 – 37.
11. Lurain  JR.  Gestational  Trophoblastic
Disease  I:  Epidemiology,  Pathology, Clinical  Presentation  and  Diagnosis  of Gestational  Trophoblastic  Disease,  and Management  of  Hydatidiform  Mole. American  Journal  of  Obstetrics  and Gynecology. 2010;  203(6):531 – 9.
D O I : h t t p s : / / d o i . o r g / 1 0 . 1 0 1 6 / j.ajog.2010.06.073. 12. Snijders  M,  Theunissen  P,  Debets-Te B a e r t s K o u d s t a a l M J . Immunhistochemischer  Nachweis  von Ostrogen-  und  Progesteronrezeptoren  In
Paraffinschnitten. Pathologe . 1990; 11:236 – 9.
13. O’Lone  R,  Frith  MC,  Karlsson  EK,  & Hansen  U.  Genomic  Targets  of  Nuclear Estrogen  Receptors. Mol  Endocrinol . 2004; 18(8):1859 – 1875.
14. Strausslll  JF,  FitzGerald  GA.  Streroid Hormone  and  Other  Lipid  Molecules Involved  in  Human  Reproduction.  In Yen and  Jaffe’s  Reproductive  Endrocrinology . Physiology,  Pathophysiology,  and  Clinical Management.  8 th Edition.  2019.  P.  75- 114.e7.
15. Boon  WC,  Chow  JDY,  Simpson  ER.  The Multiple  Roles  of  Estrogens  and  the Enzyme  Aromatase. Prog  Brain  Res . 2010; 181(C):209 – 32.