## SIFAT OSTEOINDUKTIF SILIKA AMORPHOUS SEKAM PADI

## (OSTEOINDUCTIVITY OF AMORPHOUS SILICA FROM RICE HUSK )
Didin Erma Indahyani*, Zahreni Hamzah**, Izzata Barid*
* Laboratorium Biologi Mulut
** Laboratorium Fisiologi
Fakultas Kedokteran Gigi, Universitas Jember Jl. Kalimantan 37 Jember E-mail: didinermae@yahoo.com

## Abstract
Currently, bone graft is recommended to improve and support the biological repair of bone defects properly. Bone graft was found to cause death in the donor area, long pain, infection, cosmetic deformity, hematoma, the amount of blood loss, injury or damage to the nervous in the donor area. Synthetic bone graft material was developed as a scaffold that serves to template the formation of bone. The ideal scaffold should be biodegradable, osteoconductive and osteoinductive. During there  graft  materials  have  not  optimally  provide  the  morphological,  mechanical  properties,  biocompatibility  and biodegradation, and  osteoinductive-osteoinductive. Silica is  proven to  support  and promote primary  osteoblast growth, synthesis  of  matrix  proteins, collagen  type I,  so  that  it  can  cause  bone formation.  Rice husk contains of  silica is high enough. Because of abundant material and its potential in bone formation, needs to be done research on silica from rice husk in the manufacture of synthetic bone graft. The purpose of this study was to analyze the amorphous silica from waste rice husks as synthetic bone graft material (scaffold), especially against osteoblasts proliferation.  Type of study was an experimental  laboratory.  This  research  was  conducted  by  isolating  the  amorphous  silica  from  rice  husk.  Primary osteoblast  cultures  derived  from  calvaria  rats  aged  2  days,  growing  in  Alpha  Modified  Eagle  Medium  (α-MEM)  (as negative control), α-MEM that in condition with 58S silica (as positive control group) and α-MEM condition with silica from rice husk (as treatment group). Osteoblast proliferation was observed with Quick Cell Proliferation Assay Kit for 7 and 14 days. The result showed that the  rice husk silica was significantly (p <0.05) osteoinductive, osteoblast cultures demonstrated that its proliferation was higher in the groups that were implanted in the culture medium condition with 58S silica. In conclusion, rice husk amorphous silica is potentially osteoinductive scaffold for synthetic bone graft material.
Key words: bone remodeling, bone graft, scaffold, silica

## PENDAHULUAN
Pada saat ini, bahan sintetis bone graft sedang di- kembangkan  untuk  menghindarkan  keterbatasan perawatan  secara  konvensional  pada  transplantasi dan biomaterial implan. 1 Secara khusus bahan graft ditujukan  untuk  memberikan scaffold yang  porus untuk template regenerasi  tulang  dan  pembentukan tulang baru. 2,3 Biomaterial scaffold mengganti fungsi biologis dan mekanis matriks ekstraseluler  jaringan di  dalam  tubuh  dengan  bertindak  sebagai  matriks ekstra  seluler  artifisial. 4 Data  dkk.  menyatakan bahwa  secara in  vivo ,  matriks  ekstraseluler  mem- punyai peranan penting dalam mempertahankan dan memediai  fungsi  tulang,  karena  mengandung  be- berapa  faktor  osteoinduktif  dan  osteokonduktif. 5 Oleh karena  itu, scaffold sintetis harus mempunyai sifat  osteoinduktif,  osteokonduktif,  integritas  me- kanisnya   tinggi,  biodegradabilitas,  biocompatibili-
tas  (mudah  diterima  secara  imun)  dan  porositas yang  akan  menyebabkan  pertumbuhan  jaringan dalam  tulang.  Selain  itu, scaffold harus  didegradasi ketika jaringan yang rusak telah diregenerasi. 6 Peristiwa  seluler  yang  terjadi  pada  pembentukan tulang  merupakan  peristiwa  pergerakan  prekursor osteoblas  ke  daerah  resorpsi  dengan  proses  ke- motaksis, dan  juga  adanya proliferasi prekursor  os- teoblas yang diikuti oleh diferensiasi untuk menjadi sel  yang  matur.  Osteoblas  matur  mampu  mensin- tesis protein tulang yaitu kolagen tipe I, osteokalsin, osteopontin,   alkalin    fosfatase,   proteoglikan   dan komponen-komponen  faktor  regulasi  pertumbuhan, misalnya fibroblast  growth  factors  (FGFs), trans- forming growth factors (TGF), insuline-like growth factors  (IGFs) yang disimpan dalam matriks tulang termasuk bone sialoprotein juga osteonektin. 7
Selama  ini beberapa bahan graft telah banyak di- gunakan misalnya  metal, keramik, polimer, hidrok-
siapatit dll, tetapi bahan-bahan tersebut belum mem- berikan morfologis, sifat mekanis, biokompatibilitas dan biodegradasi yang optimal dan mempunyai har- ga yang mahal. 6 Silika bahan semi konduktor mem- punyai potensi untuk mencapai sifat-sifat tersebut di atas.  Silika  terbukti  mempengaruhi  pembentukan tulang.  Makanan  yang  mengandung  silikon  dapat menstimulasi  sel  osteoblas  dan osteo-blast-like untuk  mensekresi  kolagen  tipe  I  dan  marker  bio- kimia lain pada maturasi sel tulang dan pembentuk- an tulang. 8
Bioactive glass berbasis silika yang digunakan se- bagai coating implant menunjukan percepatan pem- bentukan  tulang baru dengan  adanya  ekspresi bone morphogenic  protein s-2  (BMP-2)  dan  komponen- komponen matriks tulang (kolagen tipe I, II dan III, osteokalsin,  serta  marker-marker  resorpsi  tulang yaitu  katepsin  K  dan matrix  metalloproteinase -9 (MMP-9)). 9 Silikon atau silika ini mudah dilakukan resorpsi setelah pembentukan tulang, sehingga scaf- fold silika  akan  diganti  dengan  tulang. 6 Menurut Koh dan Atala 4 biomaterial yang ideal harus kompa- tibel  yaitu biodegradable dan bioresorbable untuk mendukung  penggantian  jaringan  normal  tanpa  in- flamasi.  Silika  banyak  berasal  dari  bebatuan  mau- pun  pasir.  Sekam  padi  ternyata  banyak  juga  me- ngandung  silika.  Kandungan  silika  dari  abu  sekam adalah 94 - 96 % dan atau mendekati di bawah 90%. Silika  yang  terdapat  dalam  sekam  dalam  bentuk amorf terhidrat. 10 Tujuan penelitian ini adalah meng- analisis  sifat  osteoinduktif  silika  amorf  dari  sekam padi  sebagai  bahan  sintetis bone  graft  (scaffold), khususnya terhadap proliferasi osteoblas pada media kultur yang di kondisikan dengan  silika  amorf  lim- bah sekam padi.

## BAHAN DAN METODE
Ekstraksi silika diperoleh dengan cara mengering- kan sekam padi di bawah sinar matahari, kemudian dilakukan  proses  pengabuan.  Abu  sekam  padi  di- murnikan  dengan  cara  pengasaman,  kemudian  di- uapkan  dan  diberi  akuades  dan  HCL  untuk  di- panaskan  kembali.  Hasilnya  disaring  dan  dicuci  4 sampai  5  kali  dengan  akuades  panas.  Hasil  pe- nyaringan berupa residu padat beserta kertas saring- nya  dipanaskan hingga kertas saring menjadi arang. Kemudian  dilanjutkan  dengan   memanaskan  pada suhu  600 o C  hingga  yang  tersisa  hanya  endapan silika  (SiO 2 )  berwarna  putih. 10 Identifikasi  dilaku- kan dengan menggunakan Gravimetri.
Silika amorf  sekam padi (60%) ditambahkan CaO (36%)  dan  P 2 O  (54%),  sedangkan  58S bioactive glass (60% SiO 2 , CaO (36%) dan P 2 O (54%), dalam mol  persen)  disiapkan  sebagai  kontrol.  Bahan  ter-
sebut  masing-masing  digiling  (dihaluskan)  dalam wadah dan  diayak  untuk  mendapatkan  ukuran  par- tikel  antara  90-710µm.  Medium  yang  belum  di- suplemen akan dikondisikan dalam silika amorf dari sekam  padi  dan 58S  bioactive  glass ,  disiapkan dengan perendaman partikel silika  amorf   dan  juga 58S bioactive  glass (antara  0,1  dan  0,5  g/100mL) selama  24  jam  pada  suhu  37 0 C.  Ekstraks  tersebut kemudian  disterilisasi  dengan  v acum  filtration menggunakan  membran  nilon  dengan  ukuran  pori- pori 0,2- µm. Medium yang telah dikondisikan ter- sebut,  kemudian  disuplemen  dengan  10-15%  FBS, penisilin-streptomisin  (100  U/mL),  2mM L -glu- tamin, askorbat -2 fosfat (50 µg/mL) dan 10mM β- glycerophosphate . 11
Setelah kalvaria diambil dari tikus umur 2 hari, di- cuci  dengan phosphate  buffer  saline (PBS)  dan  di- potong-potong  kecil  dengan  gunting,  kemudian  di- hancurkan  5  kali  dengan  kolagenase  selama  10 menit  pada  suhu  37 0 C.  Masing-masing  hasil  pe- motongan  diambil  supernatannya  dan  dipindahkan dalam Fetal bovine serum (FBS). Kumpulan dari ke 3,4 dan 5 supernatan tersebut, dikumpulkan dan di- sentrifuse pada 1500 rpm selama 5 menit, kemudian diresuspensi  dalam basic  medium  culture ( α-modi- fied  Eagle’s  medium (α-MEM)  dengan  15%  FBS, penisilin  G  (50U/mL) dan  streptomisin  (50µg/mL). Sel  dipertahankan  dalam basic  medium dan pas- saged 3  kali  sebelum  digunakan  untuk  eksperimen dalam medium yang diberi suplemen.
Sel-sel ditumbuhkan dalam plate 96 well selama 7 dan  14  hari,  dalam  medium  yang  dikondisikan dengan  silika,  glas  dan  pada  medium  yang  tidak dikondisikan.  Sel-sel  disuplai  dengan  mitomycin  C (100  µg/mL)  atau human  recombinant  basic  fibro- blast  growth  factosr (bFGF,  10ng/mL).  Sel  primer osteoblas yang diperoleh melalui kultur sel, di treat- ment dengan  mengkondisikan  medium  kultur dengan bahan silika dan juga silika yang berasal dari sekam  padi.  Sebagai  kontrol  digunakan  α-MEM sebagai mediumnya. 11 Proliferasi osteoblas di amati dengan Quick  Cell  Proliferation  Assay  Kit sesuai instruksi  pabrik.  Hasil  yang  diperoleh  berdasarkan nilai absorbansi yang dilakukan dengan  pengukuran 405  nm.  Nilai  absorbansi  diinterpolasikan  dengan kurva standar. Data  yang  telah  diperoleh dilakukan analisa statistik dengan uji Anava Satu satu arah.

## HASIL
Penelitian  ini  menunjukkan  nilai  absorbansi  pada kelompok silika sekam mempunyai nilai absorbansi yang lebih tinggi di bandingkan yang lain pada hari ke 14 , tetapi pada hari ke 7 kelompok kontrol mem- punyai  nilai  absorbansi  yang  paling  tinggi,  sedang-
kan  silika  58S Bioactive  Glass ,  mempunyai  absor- bansi  yang  paling  rendah.  Hal  ini  menunjukkan bahwa  silika  yang  berasal  dari  sekam  padi  mem- punyai  kemampuan  untuk  menstimulasi  proliferasi osteoblast.  Pada  hari  ke  14,  nilai  absorbansi  cen- derung menurun, tetapi mempunyai pola yang sama dengan hari ke 7, yaitu pada kelompok silika sekam, mempunyai  nilai  absorbansi  yang  paling  tinggi  di antara yang lain, sedangkan absorbansi dari kelom- pok  silika  58S Bioactive  Glass mempunyai  nilai yang  lebih  rendah  di  bandingkan  dua  kelompok yang lain.  Dalam Tabel 1 dapat dilihat dengan jelas.
Tabel 1. Rerata proliferasi kultur primer osteoblast
Kelompok Lama Perlakuan N Rerata ±SD SILIKA58 7 hari 24 33.31±0.81 14 hari 24 13.67±1.02 SEKAM 7 hari 24 35.13±0.77 14 hari 24 15.69±0.68 KONTROL 7 hari 24 35.33±0.67 14 hari 24 13.88±0.80
Analisis  statistik  dengan  uji  Anova  menunjukkan terdapat  perbedaan  rerata  nilai  absorbansi  kultur osteoblast secara bermakna (p<0,05) pada kelompok penelitian.  Hal  ini  menunjukan  bahwa  medium mempunyai  pengaruh  kuat  pada  tingkat  proliferasi sel  osteoblast.  Medium  yang  dikondisikan  dengan glas  silika  sekam  padi  secara  bermakna  (p<0,05) mempunyai  rerata  yang  lebih  tinggi  dibandingkan medium  tanpa  glas  silika  maupun  medium  yang dikondisikan dengan  58S Bioactive glass . Pada hari ke 14 perlakuan rerata proliferasi osteoblas menurun dalam semua kelompok (Gambar 1).
Gambar 1.  Sel-sel  yang  mengalami  pertumbuhan  dan proliferas  A.  medium  α-MEM,  B.  Medium silika  dari  sekam  padi,  C.  Medium  58S bioactive  glass ,  (tanda  panah  menunjukkan osteoblas)

## PEMBAHASAN
Scaffold pada bone tissue engineering secara ideal harus  bersifat  osteokonduktif  dan  osteoinduktif. Osteokonduktif  berhubungan  dengan  kemampuan- nya untuk mendukung perlekatan dan pembentukan serta  deposisi  matriks  tulang.  Osteoinduktif  di- maksudkan untuk template sel prekursor osteogenik untuk  berdiferensiasi  menjadi  sel  yang  mampu
membentuk  tulang.  Dengan  demikian  model scaf- fold harus mampu merekruit sel progenitor ataupun stem  untuk  penyembuhan  daerah  tulang  di  mana mereka  akhirnya  akan  berdiferensiasi  menjadi  ma- triks  ektraseluler  yang  disekresi  oleh  osteoblas. Scaffold harus  mempunyai  integritas  mekanis,  bio- degradabilitas, biocompatibilitas dan porositas yang akan menyebabkan pertumbuhan jaringan dalam tu- lang. 6
Silika  atau silicon telah  lama  diketahui  mem- pengaruhi  pembentukan  tulang.    Peranan  silika  da- lam  metabolism  tulang  secara  jelas  belum  begitu diketahui. Namun, beberapa penelitian menunjukan bahwa  konsentrasi  plasma  yang  tinggi  oleh  silika setelah  mengkonsumsi  makanan  yang  banyak  me- ngandung  silika,  menstimulasi  ostoblas  dan  sel-sel osteoblast-like untuk mensekresi kolagen tipe I dan marker biokimia lain pada sel tulang yang matur dan pembentukan tulang. Silika yang terlarut dapat men- stabilkan  spesies  radikal  hidroksil  cairan  dan  be- berapa menyatakan bahwa silika terlibat dalam jalur radical  dependent prolyl-hydroxylase selama  pem- bentukan kolagen tipe I. 12
Di  klinik,  penggunaan  silika  secara  umum  dalam bentuk bioactive glass . Di pasaran berbagai macam bioactive glass dapat ditemukan, misalnya 45S  dan 58S dan keduanya berbeda pada komposisinya. Da- lam  penelitian  ini  digunakan  58S  yang  terdiri  atas 60%  SiO 2 ,  36%  CaO  dan  4%  P 2 O 5 ,  dalam  mol persen,  sedangkan  58S  digunakan  sebagai  kontrol. Silika  amorf  sekam  padi,  digunakan  untuk  meng- gantikan  unsur  SiO 2 yang  terdapat  di  dalam  kom- posisi 58S.
Hasil  penelitian  ini  menunjukan  bahwa  kultur primer  osteoblas  yang  berasal  dari  kalvaria  tikus yang  dikondisikan  dalam  medium bioactive  glass (58S) dan silika yang berasal dari sekam padi meng- alami proliferasi. Dasar mekanisme terjadinya proli- ferasi  osteoblas  tersebut  adalah  adanya  reaksi  per- mukaan yang melepaskan spesies ionik yang terlarut dengan  cepat  dari  glas  dalam  larutan  interfasial (medium).  Menurut  Hench  dan  Polak,    silika  ter- hidrat  yang  tinggi  di  daerah  permukaan,  dan poly- crystalline hydroxyl carbonate apatit (HCA) bilayer terbentuk beberapa jam. 13 Lapisan tersebut memper- tinggi  adsorpsi  dan  daya  desorpsi  faktor  per- tumbuhan.  Perlekatan sel, proliferasi dan diferensia- si  secara  cepat  terjadi  pada  permukaan  bahan  bio- aktif.  Pada  saat  itu  juga  dimulai  memproduksi faktor-faktor pertumbuhan yang menstimulasi divisi sel, mitosis dan produksi protein matriks  ekstra  se- lular.  Peranan  aktif  ion-ion  yang  terlepas  pada  sel osteoblas  adalah  mengaktifkan  gen-gen  yang  ber- hubungan  dengan  perlekatan,  proliferasi  dll.    Gen- gen tersebut mengontrol siklus sel osteoblas, mitosis
C B C A
dan diferensiasi yang menyebabkan peningkatan re- generasi  tulang  dengan  cepat.  Selain  itu  diperlukan untuk  sel  progenitor  mengalami  mitosis  dan  me- nerima  stimuli  kimia  yang  benar  dari  lingkungan lokalnya  yang  menginstruksikannya  untuk  me- masuki  segmen aktif pada  siklus  sel yang berperan untuk mitosis sel. 14 Medium silika yang berasal dari sekam padi mem- punyai  tingkat proliferasi yang  lebih  tinggi. Hal ini disebabkan  bahwa  sekam  padi  berasal  dari  bahan alami yang lebih sesuai dengan kultur sel osteoblas. Proses  pengolahan  yang  sederhana  menyebabkan bahan silika dari sekam padi tidak berubah menjadi bentuk  kristalin.  Silika  dalam  bentuk  kristal  akan dapat  menyebabkan  terjadinya  kematian  sel. Bio- active glass mempunyai 5 mekanisme utama dalam pertumbuhan  tulang  yaitu surface  chemistry ,  topo- grafi,  rata-rata dan tipe kelarutan  ion-  ion yang  ter- lepas dan sifat mekanis dari interface tulang itu sen- diri. 14 Bioactive glass , secara kimia dapat berikatan dengan  jaringan  lunak  dan  keras,  sehingga  dapat menimbulkan pembentukan lapisan apatit yang aktif secara biologi pada permukaan implan dan jaringan secara  interface  tanpa  menimbulkan  toksik,  in- flamasi,  juga  respon  imun  yang  berlebihan  yang dapat  menimbulkan  gangguan.  Secara in  vitro ,  pe- nilaian bioactive glass dilakukan dengan membasahi glass dengan medium dan memonitor pertumbuhan osteoblas  sampai  pembentukan  lapisan  apatitnya. 15
Dalam  penelitian  ini  dilakukan  dengan  membasahi bubuk glass 58S  dan  58S  yang  unsur  silikanya diganti dengan silika yang berasal dari sekam padi. Menurut Henc dan Polak, 13 siklus sel baru dimulai setelah  sel  selesai  mitosis  sempurna.  Beberapa  pe- nelitian  menunjukkan  bahwa  kontrol  siklus  sel osteoblas  dicapai  dengan  mengontrol  pelepasan produk  ionik yang terlarut dari  bahan bioaktif.  Sel tersebut  berkoloni  di  permukaan bioactive  glass . Konsentrasi Si yang terlarut dan ion Ca pada i nter- face larutan sel penting untuk mengontrol siklus sel. Hal ini  juga nampak  terlihat pada hari ke 14, yang terjadi penurunan jumlah proliferasi osteoblas dalam semua  kelompok.  Pada  hari  ke  14  konsentrasi  Si menurun  dan  berkurang,  sehingga siklus sel meng- alami penurunan.
Scaffold yang  dilakukan  pada bone  tissue  engi- neering adalah  untuk  mengkondisikan  sel-sel  yang akan  ditanam  dapat  tumbuh  dengan  baik. Marrow stromal  cells (MSCs)  merupakan  sel  multipoten yang  ditemukan  kebanyakan  di dalam sumsum tu- lang,  yang   tidak  berdiferensiasi  tetapi  pada   ling- kungan  yang  tepat  dapat  berpotensi  berdiferensiasi menjadi beberapa tipe sel termasuk tulang, kartilago, dan  adipose. Secara in-vivo , osteodiferentiation ter- jadi  dengan  beberapa  rangkaian  tahapan  prolix-
ferasi seluler, maturasi matriks ekstra seluler tulang dan  mineralisasi  matriks.  Oleh  karena  itu,  diperlu- kan scaffold yang mempunyai sifat osteoinduksi dan osteokonduktif.  Hal  ini  sesuai  dengan  pernyataan Data  dkk 5 bahwa  secara in-vivo ,  matriks  ekstra- seluler  mempunyai  peranan  penting  dalam  mem- pertahankan  dan  memediai  fungsi  tulang.  Matriks ekstra  seluler  mengandung  beberapa  faktor  osteo- induktif, yang terletak diseluruh matriks tulang yaitu glikoprotein, misalnya thrombospondin, fibronektin, vitronektin,  and  fibrilin  yang  membantu  mem- promosikan  perlekatan  seluler.  Ada  juga  protein adesi  yaitu  osteopontin, bone  sialoprotein ,  dan matrix  glycoproteins yang  lain  juga  terlibat  dalam proses  mineralisasi  matriks.  Dapat  disimpulkan bahwa  silika  amorf  yang  berasal  dari  sekam  padi mempunyai  sifat  osteoinduktif,  yang  mampu  me- nyebabkan terjadinya proliferasi sel kultur osteoblas. Selain  itu,  sifat  osteoinduktif  silika  amorf  akan mengalami  penurunan  dengan  panjangnya  waktu kultur, oleh karena adanya pengurangan konsentrasi Si terlarut dalam medium kultur.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan  terima  kasih  tak  terhingga  kepada  Men- ristek  yang  telah  membiayai  penelitian  ini  pada anggaran  tahun  2010.  Terimakasih  juga  disampai- kan  kepada  pihak-pihak  yang  telah  membantu penyelesaian penelitian ini.

## Daftar Pustaka
1. Rosenberg T. Anterior cervical dicectomy & fusion : advanced  level.  <http://www.  mayfieldclinic.com> (4 Oktober 2011).
2. Meijer  GJ,  de  Bruijn  JD,  Koole  R,  van  Blitterswijk CA.  Cell-based  bone  tissue  engineering,  PLoS Medicine  <www.plosmedicine.org>  (24  Agustus 2010).
3. Sachlos  E,  Czernuszka  JT.  Making  tissue  engi- neering  scaffolds  work review on the application of solid freeform fabrication technology to the produc- tion  of  tissue engineering  scaffolds. E.u Sroapchea- lons Caenldls Mzeartneruisazlksa 2003; 5: 29-40.
4. Koh CJ, Atala A. Tissue engineering, stem cells, and cloning:  opportunities  for  regenerative  medicine.  J Am Soc Nephrol 2004; 15: 1113–25.
5. Datta N, Pham QP, Sharma U, Sikavitsas VI, Jansen JA,  Mikos   AG.   In   vitro   generated   extracellular matrix  and  fluid  shear  stress  synergistically  enhan- ce 3D  osteoblastic  differentiation.  PNAS  2005; 21: 2488–93.
6. Sun  W.  Porous  silicon  based  biomaterials  for  bone tissue  engineering.  Partial  Fulfillment  of  the  Requi- rements  for  the  Degree  Doctor  of  Philosophy. Department of Biomedical Engineering The College
School  of  Engineering  and  Applied  Science,    New York: University of Rochester, 2007: 8-20.
7. Stannard,  Schmidt  AH,  Kregor  PJ.  Surgical  treat- ment  of  orthopaedic  trauma.  New  York:  Thieme Medical Publishers Inc., 2007: 95.
8. Reffitt DM, Ogston N, Jugdaohsingh R Orthosilicic acid  stimulates  collagen  type  1  synthesis  and osteoblastic  differentiation  in  human  osteoblast-like cells in vitro. Bone 2003; 32:127-35.
9. Valimaki, Ville-Valtteri  BM.,  Yrjans  JJ, Vuorio EI, Aro HT. Molecular biological evaluation of bioactive glass microspheres and adjunct bone morphogenetic protein  2  gene  transfer  in  the  enhancement of new bone formation. Bone  2005; 11:1.
10. Harsono   H.  Pembuatan  silika  amorf   dari   limbah sekam padi , J Ilmu Dasar 2002; 3: 98-103.
11. Bielby   RC,  Christodoulo  IS,   Pryce   RS,  Radford
WJP, Hench LL, Polak JM, Time-and concentration- dependent effects of dissolution products of 58s sol- gel bioactive glass on proliferation and differentiation of  murine  and  human  osteoblasts.  Tissue  Engi- neering 2004; 10: 200.
12. Waked    W,  Grauer J. Silicates  and  bone  fusion. Orthopedics 2008; 31:591.
13. Hench LL, Polak JM. A genetic basis for  design of biomaterials  for  in  situ  tissue  regeneration.  Key Enginer Mater 2008; 377: 151-66.
14. Lutz-Christian  G,  Boccaccini  AD.  Bioactive  glass and  glass-ceramic  scaffolds  for  bone  tissue engineering. Materials 2010; 3: 3867-910.
15. Shi Q, Wang J, Zhang J, Fan J,  Stucky GD. Rapid- setting,  mesoporous,  bioactive  glass  cements  that induce  accelerated  in  vitro  apatite  formation.  Adv Mater 2006; 18: 1038-42.