## PENGGUNAAN BERBAGAI JENIS BAHAN PELINDUNG UNTUK MEMPERTAHANKAN VIABILITAS BAKTERI ASAM LAKTAT YANG DI ISOLASI DARI AIR SUSU IBU PADA PROSES PENGERINGAN BEKU
[ Utilization of various cryogenic agents during freeze drying to Maintain the viability of Lactic Acid Bacteria Isolated from breast milk ]
Ni Nyoman Puspawati 1) *, Lilis Nuraida 2) , dan Dede Robiatul Adawiyah 2)
1) Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Udayana
2) SEAFAST Center dan Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Institut Pertanian Bogor
Diterima  21 Januari 2009 / Disetujui  18 Mei  2010

## ABSTRACT
Lactic acid bacteria are the  most important bacteria having potential as probiotic. The objectives of the present study were to examine the growth of Lactic Acid Bacteria,  identify the Lactic Acid Bacteria capable of surviving and  evaluate the best cryogenic agents that  protect the viability of  Lactic Acid Bacteria during freeze drying. Four cryogenic agents, i.e. sucrose, lactose, skim milk and maltodextrin, were used in freeze drying  of  three  species  of  Lactic  Acid  Bacteria,  i.e.  Pediococcus  pentosaceus  A16,  Lactobacillus  brevis  A17  and  Lactobacillus  rhamnosus  R21 isolated from breast milk.  Evaluation included viability before and after freeze drying, survival of freeze dried culture in 0.5 % bile salt and low pH for 5 hours. The result showed that three of cryogenics, i.e. sucrose, lactose and skim milk improved the viability of freeze dried of all lactobacilli, except maltodextrin that did not give protection to L. rhamnosus R21. Evaluation on the survival  of LAB in 0.5 % bile salt showed that cryogenic agents improved the survival rate of all Lactic Acid Bacteria during freeze drying. The cryogenic  also improved the survival rate of LAB at low pH, with the best protection given by skim milk on L. rhamnosus R21.
Key words : isolate from breast milk, freeze drying, cryogenic, probiotic

## PENDAHULUAN
Bakteri  asam  laktat  sebagai  mikroorganisme  probiotik memegang peranan penting dalam meningkatkan dan menjaga kesehatan,  sehingga  mendorong  penggunaan  bakteri  asam laktat  untuk  pengembangan  pangan  fungsional  dan farmasetikal.  Probiotik  didefinisikan  sebagai  mikroorganisme hidup yang mampu mencapai saluran pencernaan dalam jumlah tertentu dan memberi manfaat terhadap kesehatan. Persyaratan sebagai probiotik yang harus terpenuhi antara lain; berasal dari manusia,  tidak  bersifat  patogen,  toleran  terhadap  asam lambung  dan  garam  empedu,  mempunyai  kemampuan  untuk bertahan dalam proses pengawetan dan selama penyimpanan, serta telah terbukti mempunyai efek terhadap kesehatan (Shortt 1999).  Manfaat  bakteri  asam  laktat  sebagai  probiotik  dalam meningkatkan  kesehatan  dapat  terjadi  bila  kultur  dikonsumsi dalam  keadaan  hidup  dan  mampu  bertahan  dalam  saluran pencernaan.  Nuraida et  al., (2007)  telah  mengisolasi  bakteri asam  laktat  dari  ASI  yang  berpotensi  sebagai  probiotik  antara lain: Pediococcus  pentosaceus A16, Lactobacillus  brevis A17 dan Lactobacillus  rhamnosus R21. P.  pentosaceus A16, L. brevis A17 dan L. rhamnosus R21 secara in vitro memiliki sifat tahan  terhadap  garam  empedu,  tahan  terhadap  pH  rendah, dapat  menghambat  pertumbuhan  bakteri  patogen  seperti: Escherichia  coli,  Salmonella,  Bacillus  cereus,  Staphylococcus aureus .  Isolat-isolat  ini  secara  in  vivo  juga  mempunyai  sifat dapat  meningkatkan jumlah  bakteri  asam  laktat  dan  dapat
menghambat  pertumbuhan  bakteri  patogen  seperti E.  coli di sekum.  Isolat  ini  diketahui  memiliki  potensi  sebagai immunomodulator,  dimana  secara in  vitro memiliki  indeks stimulasi  terhadap  respon  imun  antara  1,50  -  1,69  sedangkan secara in  vivo indeks  stimulasi  terhadap  respon  imun  antara 1,45  -  1,65  (Susanti et  al .,  2008).    Bakteri  asam  laktat  untuk dapat berfungsi sebagai probiotik, juga harus mampu bertahan selama  proses  pengolahan  dan  penyimpanan.  Proses penyimpanan  dan  pengolahan  dapat  menurunkan  jumlah bakteri  asam  laktat  sehingga  perannya  sebagai  probiotik  juga akan menurun. Penyimpanan kultur dalam keadaan segar tidak dapat  dilakukan  untuk  jangka  waktu  yang  lama.  Dengan demikian  perlu  suatu  metode  pengawetan  (preservasi)  yang dapat  mempertahankan  viabilitasnya.  Metode  pengawetan kultur  yang  biasa  digunakan  adalah  pengeringan  semprot ( spray drying ),  pembekuan  ( freezing )  dan  pengeringan  beku ( freeze drying ) (Fu dan Etzel, 1995). Freeze drying merupakan teknik  yang  umumnya  digunakan  untuk  mengawetkan  kultur dan  untuk  produksi  konsentrat  kultur  starter.  Kerusakan  sel bakteri  asam  laktat  akibat  proses freeze  drying dapat diminimumkan  dengan  penambahan  bahan  pelindung (kriogenik)  tertentu  sebelum  proses  pembekuan  dan pengeringan dilakukan (Tamime 1981). Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari pola  pertumbuhan isolat bakteri asam laktat
asal  ASI,  mengidentifikasi  isolat  yang  paling  tahan  terhadap proses freeze  drying ,  mengidentifikasi  jenis  bahan  pelindung yang terbaik.

## METODOLOGI
Strain bakteri Strain  bakteri  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  adalah tiga isolat yang berasal dari Air Susu Ibu yaitu P. pentosaceus A16, L.  brevis A17  dan L.  rhamnosus R21  yang  merupakan koleksi  Seafast  Center,  IPB.  Perbanyakan  massa  sel  bakteri asam  laktat  dilakukan  dalam  media  de  Man  Rogosa  Sharpe Broth (MRSB).

## Media dan alat
Media  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  MRSB,  MRSA, KH 2 PO 4 ,  PCA,  chloramphenicol.  Bahan-bahan  pelindung  yang digunakan  adalah  sukrosa,  susu  skim,  laktosa  dan maltodekstrin  diperoleh  dari  Toko  Bratachem  di  Bogor.  Alat yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  alat-alat  standar untuk  analisa  mikrobiologi, freeze  drier,  deep  freezer dan sentrifuse .

## Tahapan penelitian
Dalam  penelitian  ini  dipelajari  kurva  pertumbuhan  masing- masing  kultur  bakteri  asam  laktat  untuk  mengetahui  waktu panen  pada  saat  produksi  biomassa  yang  paling  optimal  yaitu lama  inkubasi  pada  saat  kultur  mencapai  pertumbuhan maksimum  (fase  logaritmik  akhir).  Selanjutnya  dilakukan pembuatan  kultur  kering  dengan  proses freeze  drying . Pembuatan  kultur  kering  mengacu  pada  Harmayani et  al ., (2001).  Parameter  yang  diamati  dari  kultur  kering  probiotik meliputi:  total  bakteri  asam  laktat  sebelum  dan  setelah  proses freeze  drying (Harrigan et  al., 1998),  ketahanan  terhadap  pH rendah  yang  mengacu  pada  Chou  dan  Weimer  (1999)  yang telah dimodifikasi dan ketahanan terhadap garam empedu 0,5% (Moser dan Savage 2001; Ngatirah et al., 2000).
Rancangan  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  adalah Rancangan  Acak  Lengkap  (RAL)  yang  terdiri  dari  2  faktor. Faktor pertama adalah jenis isolat bakteri asam laktat (3 taraf) dan faktor kedua adalah jenis bahan pelindung (5 taraf) dengan 2  kali  ulangan.  Data  hasil  pengamatan  diolah  dengan  analisis ragam  (ANOVA),  bila  hasilnya  menunjukkan  pengaruh  nyata maka dilakukan uji lanjut Duncan (Steel and Torie, 1995).

## Kurva pertumbuhan
Sebelum  dilakukan  pembuatan  biomassa  sel,  maka  harus diketahui terlebih dahulu bagaimana kurva pertumbuhan kultur bakteri  asam  laktat  yang  akan  digunakan.  Kurva  pertumbuhan dibuat  dengan  cara  menginokulasikan  masing  -  masing  kultur yang  berumur  24  jam  pada  media  MRSB  dan  diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37 C. Pada awal inkubasi (jam ke-0) dan setiap 1 jam dilakukan pengukuran jumlah bakteri dengan menggunakan spektrofotometer pada λ 600 nm.
Pembuatan  Kultur  Kering  dengan  Pengeringan  Beku (Nuraida et al ., 1995; Harmayani et al ., 2001; Champagne et al., 2001 yang dimodifikasi)
Sebelum  proses  pengeringan  beku  dilakukan  produksi biomassa sel bakteri asam laktat (Harmayani et al ., 2001 yang dimodifikasi).  Biomassa  bakteri  asam  laktat  dibuat  dengan menggunakan  media  MRSB.  Pada  medium  yang  telah  steril diinokulasi  kultur  bakteri  asam  laktat  yang  telah  disegarkan sebanyak  10  %  kemudian  diinkubasikan  pada  suhu  37 o C selama  16  -  20  jam.  Kultur  kerja  selanjutnya  dipanen  dan disentrifugasi  pada  kecepatan  10000  rpm  selama  10  menit. Supernatan dipisahkan dengan bagian filtrat sehingga diperoleh biomassa basah.
Proses  pengeringan  beku  dilakukan  penambahan  bahan pelindung berupa laktosa, sukrosa, susu skim dan maltodekstrin dengan  konsentrasi  10%  (b/v)  pada  biomassa  basah  bakteri asam  laktat.  Perbandingan  antara  biomassa  basah  dengan bahan pelindung adalah 1 : 10. Untuk memungkinkan difusi dari bahan  pelindung  maka  larutan  disimpan  selama  1  jam  pada suhu  23 C.  Kultur  selanjutnya  dibekukan  pada  suhu  -80 C selama  12  jam  dan  kemudian  dikeringkan  (drying)  dengan pengering beku merk Labconco pada kondisi -50 C; 0,01 MPa selama 2 hari. Kultur bakteri asam laktat kering yang diperoleh selanjutnya  diuji  viabilitasnya  selama  pengeringan  beku, ketahanan  terhadap  pH  rendah,  ketahanan  terhadap  garam empedu.

## Viabilitas sel
Pengujian  viabilitas  sel  bakteri  asam  laktat  sebelum  dan sesudah  pengeringan  beku  dilakukan  pada  media  MRS  agar dengan  metode  tuang  ( plate  count )  dengan  beberapa  seri pengenceran.  Sebanyak  1  ml  kultur  sebelum  dikeringbekukan dan  0,1  gram  kultur  kering,  kemudian  diencerkan  sampai pengenceran 10 -8 , sebanyak 1 ml hasil pengenceran ditanam ke dalam  cawan  petri  steril  dan  dituang  media  MRS  agar diatasnya, digoyang-goyangkan sampai merata dan selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 C selama 48 jam. Total bakteri asam laktat  sebelum  dan  setelah  proses  pengeringan  beku dibandingkan.

## Ketahanan terhadap pH rendah (pH 2,0)
Uji  ketahanan  terhadap  asam  dilakukan  dengan  metode plate  count dengan  modifikasi  media.  Ketahanan  terhadap asam dilakukan dalam medium MRS broth yang diatur pada pH 2,0 menggunakan HCl 37%. Kultur yang telah disegarkan dalam MRS broth selama 24 jam, diinokulasikan ke dalam MRS broth kontrol  dan  MRS  broth  yang  telah  diatur  pada  pH  2,0, selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 C selama 0 dan 5 jam. Hal ini sesuai dengan lamanya makanan berada di lambung yaitu 2 –  6  jam  (Gropper  &  Groff  2001).  Setelah  inkubasi  dilakukan hitungan  cawan  pada  MRSA  dengan  metode  tuang  dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 48 jam. Ketahanan terhadap asam  dihitung  berdasarkan  selisih  unit  log  jumlah  koloni  yang tumbuh pada waktu inkubasi 0 jam dengan 5 jam.
Ketahanan terhadap garam empedu 0,5%
Uji  ketahanan  terhadap  garam  empedu  dilakukan  menurut Ngatirah et  al .,  (2000)  tetapi  konsentrasi  garam  empedu  yang digunakan  sebesar  0,5%  (Moser  dan  Savage  2001). Konsentrasi  ini  dipilih  karena  ekuivalen  dengan  konsentrasi fisiologis garam empedu di dalam duodenum.
Sebanyak 1 ml kultur bakteri asam laktat dalam MRS broth berumur  24  jam  dimasukkan  ke  dalam  9  ml  MRS  broth  yang mengandung  0,5  %  garam  empedu  kemudian  diinkubasi  pada suhu  37 C  selama  0  dan  5  jam.  Jumlah  bakteri  asam  laktat dihitung  dengan  metode  tuang  pada  media  MRSA  dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 48 jam. Ketahanan terhadap garam  empedu  dihitung  berdasarkan  selisih  unit  log  jumlah koloni  yang  tumbuh  setelah  inkubasi  selama  0  jam  dengan kultur yang tumbuh setelah diinkubasi selama 5 jam.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Kurva pertumbuhan kultur bakteri asam laktat Isolat  bakteri  asam  laktat  yang  berasal  dari  ASI  yaitu P. pentosaceus A16 ,  L.  brevis A17 dan L.  rhamnosus R21  yang berpotensi  sebagai  probiotik  mempunyai  pola  pertumbuhan yang  hampir  sama.  Pertumbuhan  diartikan  sebagai penambahan  dan  dapat  dihubungkan  dengan  penambahan ukuran,  jumlah  bobot,  massa  dan  banyak  parameter  lainnya dari  suatu  bentuk  hidup.  Pengukuran  peningkatan  jumlah  sel selama  masa  inkubasi  diukur  dengan  menggunakan spektrofotometer pada λ 600 nm. Padatan pada medium yang merupakan sel dari bakteri asam laktat dapat menyerap cahaya pada panjang gelombang ini. Semakin banyak jumlah sel yang tumbuh  maka  penyerapan  cahaya  semakin  tinggi  yang diketahui  dari  peningkatan  absorbansi.  Kurva  pertumbuhan bakteri asam laktat dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1.  Kurva pertumbuhan isolat Bakteri Asam Laktat dari ASI
Sel  mengalami  tahap  adaptasi  (fase  lag)  pada  jam  ke-0 sampai  jam  ke-2  (awal  inkubasi).  Fase  lag  merupakan  masa penyesuaian  mikroba  sejak  inokulasi  sel  mikroba  ke  dalam medium  pertumbuhan  (Mangunwidjaja et  al. 1994).  Pada  fase lag tidak ada pertambahan populasi, sel mengalami perubahan dalam  komposisi  kimiawi  dan  bertambahnya  ukuran,  terjadi sintesis  enzim  oleh  sel  yang  diperlukan  untuk  metabolisme metabolit serta mengalami pertambahan substansi intraseluler. Setelah  fase  lag  selesai  sel  memasuki  fase  logaritma
(eksponensial)  reproduksi  selular  mulai  berlangsung. Konsentrasi selular atau biomassa meningkat sehingga massa sel  menjadi  dua  kali  lipat  dengan  laju  sama  dimana  sel  akan mengalami  pembelahan  dengan  laju  konstan  (Pelczar et  al., 2005). Fase logaritmik berlangsung mulai jam ke-2 sampai jam ke-21,  dimana  masing-masing  isolat  memiliki  waktu  generasi dan kecepatan pertumbuhan yang spesifik.
Semua  isolat  yang  digunakan  memasuki  fase  akhir logaritmik  pada  jam  ke-15  sampai  jam  ke-21  inkubasi.  Pada saat  memasuki  fase  stationer,  konsentrasi  biomassa  menjadi maksimal,  jumlah  sel  cenderung  stabil,  pertumbuhan  berhenti dan menyebabkan terjadinya modifikasi struktur biokimiawi sel. Berdasarkan pola pertumbuhan dapat diketahui bahwa isolat L. rhamnosus R21  memiliki  kecepatan  pertumbuhan  yang  paling tinggi  dibandingkan  dengan  isolat  lain  yang  kemudian  diikuti oleh isolat L. brevis A17 dan P.  pentosaceus A16. Dari kurva pertumbuhan  tersebut  dapat  ditentukan  waktu  panen  untuk produksi biomassa sel yaitu sekitar jam ke-15 sampai jam ke-21 inkubasi (pada saat akhir fase logaritmik).
Bakteri  asam  laktat  dapat  mengalami  fase  kematian  yang disebabkan  oleh  beberapa  faktor  seperti:  ketersediaan  nutrisi pada  media  berkurang,  energi  cadangan  dalam  sel  habis, adanya  penumpukan  asam  dan  metabolit  lainnya.  Perubahan pH  medium  dan  metabolit  dapat  menurunkan  jumlah  sel-sel yang  tumbuh  pada  fase  berikutnya,  kecepatan  pembelahan menjadi menurun. Pertumbuhan bakteri asam laktat dapat terus berlangsung bila karbohidrat, asam amino, dan nutrien lainnya tersedia,  komponen  penghambat  atau  racun  dihilangkan, didegradasi  atau  diencerkan  serta  konsentrasi  ion  hidrogen diatur  dibawah  level  toleransi  spesies  tersebut  (Hutkins  & Nannen 1993).
Pengaruh  pengeringan  beku  ( freeze  drying )  terhadap kultur kering Lactobacillus
Perubahan  total  bakteri  asam  laktat  selama  pengeringan beku
Uji  ketahanan  bakteri  asam  laktat  dilakukan  dengan membandingkan  jumlah  total  bakteri  asam  laktat  sebelum  dan setelah  pengeringan  beku.  Perubahan  jumlah  bakteri  asam laktat selama pengeringan beku disajikan pada Gambar 2.
Gambar 2.  Penurunan  jumlah  bakteri  asam  laktat  setelah  proses pengeringan  beku  ( freeze  drying ),  (a) P.  pentosaceus A16, (b) L. brevis A17, (c) L. rhamnosus R21
0 1 2 3 4 5 (a) A16 (b) A17 (c) R21 Jenis BAL Pe nurun an Jm l B A L (log cf u/ g) Kontrol Sukrosa Susu Skim Laktosa Maltodekstrin 0,01 0,10 1,00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Jam ke- A bsor bans i ( ? 60 0 nm ) A = log (1 /T) L. brevis A17 P. pentosaceus A16 L.rhamnosus R21
Ketahanan  bakteri  asam  laktat  dihitung  berdasarkan  berat kering.  Gambar  2  menunjukkan  bahwa  diantara  ketiga  kultur bakteri  asam  laktat  yang  digunakan,  kultur  yang  paling  tinggi mengalami  penurunan  adalah L.  rhamnosus R21  dan  yang paling  rendah  mengalami  penurunan  adalah P.  pentosaceus A16.  Semakin  rendah  penurunan  jumlah  total  bakteri  maka kultur  tersebut  semakin  tahan  terhadap  proses freeze  drying . Penurunan  total  bakteri  asam  laktat  pada  kultur  kering P. pentosaceus A16 tanpa perlakuan (kontrol) yaitu sebesar 1,44 log  cfu/g  lebih  rendah  dibandingkan L.  brevis A17  (2,21  log cfu/g)  dan L.  rhamnosus R21  sebesar  2,33  log  cfu/g.  Hal  ini menunjukkan  bahwa  kultur P.  pentosaceus A16  lebih  resisten terhadap  perlakuan freeze  drying dibandingkan  dengan L. brevis A17 dan L. rhamnosus R21. Pada  kultur P.  pentosaceus A16,  penambahan  bahan pelindung  laktosa  dengan  penurunan  jumlah  bakteri  sebesar 0,85  log  cfu/g,  susu  skim  (1,05  log  cfu/g)  dan  maltodekstrin (1,08 log cfu/g) mampu melindungi viabilitas sel setelah freeze drying dengan  penurunan  total  BAL  lebih  rendah  dari  kontrol (1,44  log  cfu/g)  sedangkan  penambahan  sukrosa  (1,79  log cfu/g)  kurang  mampu  memberikan  perlindungan  dengan penurunan  total  bakteri  yang  lebih  besar  dari  kontrol  (Gambar 2).  Seluruh  bahan  pelindung  seperti  sukrosa  (1,17  log  cfu/g), susu  skim  (1,61  log  cfu/g),  laktosa  (0,63  log  cfu/g)  dan maltodekstrin (1,48 log cfu/g) yang ditambahkan pada kultur L. brevis A17  mampu  mempertahankan  viabilitas  sel  dengan penurunan total bakteri lebih rendah dari kontrol (2,21 log cfu/g). Penambahan  sukrosa  (0,99  log  cfu/g),  susu  skim  (1,53  log cfu/g)  dan  laktosa  (1,25  log  cfu/g)  pada  kultur L.  rhamnosus R21,  mampu  melindungi  viabilitas  sel  setelah freeze  drying dengan  penurunan  total  bakteri  asam  laktat  lebih  rendah  dari kontrol (2,33 log cfu/g), sedangkan penambahan maltodekstrin (4,56  log  cfu/g)  kurang  mampu  memberikan  perlindungan dengan  penurunan  total  bakteri  lebih  tinggi  dibandingkan kontrol.
Hasil  analisis  statistik  secara  keseluruhan  terhadap ketahanan P.  pentosaceus A16  dengan  penurunan  jumlah bakteri 1,24 log cfu/g dan L. brevis A17 (1,42 log cfu/g) secara nyata  (p<0,05)  lebih  baik  dibandingkan  dengan L.  rhamnosus R21 (2,134 log cfu/g). Penambahan bahan pelindung susu skim (1,39 log cfu/g), laktosa (0,91 log cfu/g) dan sukrosa (1,32 log cfu/g) secara nyata (p<0,05) mampu mempertahankan viabilitas sel lebih baik dibandingkan dengan kontrol (1,99 log cfu/g) dan maltodekstrin (2,37 log cfu/g).
Penurunan  ketahanan  sel  selama freeze  drying kemungkinan  disebabkan  oleh  proses  pembekuan  dan pengeringan. Proses pembekuan menyebabkan sel kehilangan kestabilannya,  sehingga  menjadi  mudah  rusak  selama pengeringan.  Faktor  utama  penyebab  kerusakan  akibat pengeringan  sel  bakteri  kemungkinan  karena shock  osmotik dengan  kerusakan  membran  dan  perpindahan  ikatan  hidrogen yang  berpengaruh  terhadap  sifat-sifat  makromolekul  hidrofilik dalam  sel  (Ray  1993).  Hasil  penelitian  yang  dilakukan  oleh Leslie et  al., (1995)  menunjukkan  bahwa  gula  dapat meningkatkan  ketahanan  mikroba  terhadap freeze  drying karena  kemampuannya  menurunkan  suhu  pada  fase  transisi membran  dan  melindungi  struktur  protein  dalam  keadaan kering.

## Ketahanan terhadap pH rendah (pH 2,0)
Ketahanan  kultur  kering  terhadap  pH  rendah  ditunjukkan dengan  penurunan  total  bakteri  asam  laktat  setelah  inkubasi dalam media yang mengandung asam selama 5 jam (Gambar 3).
Gambar  3.  Penurunan  jumlah  bakteri  asam  laktat  setelah  inkubasi dalam  media  yang  mengandung  asam  selama  5  jam  (a) P.  pentosaceus A16,  (b) L.  brevis A17  dan  (c) L. rhamnosus R21
Gambar  3  menunjukkan  bahwa  penurunan  jumlah  kultur segar P.  pentosaceus A16  (5,39  log  cfu/g)  lebih  rendah dibandingkan  dengan  kultur  kering  setelah freeze  drying (kontrol) yaitu             7,30 log cfu/g. Jumlah kultur segar L. brevis A17 sebesar 0,46 log cfu/g sementara penurunan kultur kering  setelah freeze  drying (kontrol)  sebesar  7,20  log  cfu/g. Penurunan kultur segar L. rhamnosus R21 (6,80 log cfu/g) lebih rendah dibandingkan dengan kultur kering setelah freeze drying (kontrol) yaitu 9,35 log cfu/g. Hal ini menunjukkan bahwa proses freeze drying dapat menurunkan ketahanan semua kultur kering terhadap pH rendah.
Penambahan bahan pelindung susu skim dan laktosa pada kultur  kering P.  pentosaceus A16  mampu  meningkatkan ketahanannya  terhadap  pH  rendah  dibandingkan  dengan kontrol (7,30 log cfu/g) dengan penurunan jumlah sel berturut- turut  5,84  dan  5,85  log  cfu/g,  sedangkan  sukrosa  dan maltodekstrin  kurang  mampu  mempertahankan  ketahanannya terhadap pH rendah dengan penurunan jumlah sel berturut-turut 7,70  dan  7,76  log  cfu/g  dibandingkan  dengan  kontrol  (7,30 siklus  log).  Penambahan  bahan  pelindung  susu  skim,  laktosa dan  maltodekstrin  mampu  meningkatkan  ketahanan  kultur L. brevis A17  terhadap  pH  rendah  (masing-masing  terjadi penurunan sebesar 5,37 log cfu/g, 4,78 log cfu/g, 5,13 log cfu/g) dibandingkan  dengan  kontrol  (7,20  log  cfu/g),  sedangkan sukrosa  kurang  mampu  mempertahankan  ketahanannya terhadap  pH  rendah  dengan  penurunan  jumlah  sel  8,62  log cfu/g  lebih  tinggi  dari  kontrol  (7,20  log  cfu/g).  Penambahan semua  jenis  bahan  pelindung  pada  kultur L.  rhamnosus R21 mampu  meningkatkan  ketahanannya  terhadap  pH  rendah dibandingkan  dengan  kontrol  (9,35  log  cfu/g),  dengan penurunan jumlah bakteri sebesar 3,95 log cfu/g pada sukrosa, 3,21 log cfu/g pada susu skim, 5,09 log cfu/g pada laktosa dan 1,38 log cfu/g pada maltodekstrin.
Hasil  analisis  statistik  ketahanan  kultur L.  rhamnosus R21 secara keseluruhan terhadap pH rendah lebih baik secara nyata (p<0,05)  dengan  rata-rata  penurunan  4,96  log  cfu/g dibandingkan L. brevis A17 (5,23 log cfu/g) dan P. pentosaceus
0 2 4 6 8 10 (a) A16 (b) A17 (c) R21 Jenis BAL P e n u ru n a n J m l BA L ( lo g c fu /g ) Kultur Segar Kontrol Sukrosa Susu Skim Laktosa Maltodekstrin
A16  (6,64  log  cfu/g).  Penambahan  semua  jenis  bahan pelindung  secara  nyata  (p<0,05)  mampu  meningkatkan ketahanan  sel  terhadap  pH  rendah  dibandingkan  dengan kontrol.
Nilai pH rendah (pH 2,0) memiliki sifat merusak yang sangat kuat  terhadap  semua  kultur  yang  diuji.  Hal  ini  ditunjukkan  dari penurunan jumlah sel setelah diinkubasi pada pH 2,0 selama 5 jam.  Penghambatan  asam  terhadap  pertumbuhan  sel  bakteri terjadi  melalui  efek  denaturasi  enzim-enzim  yang  ada dipermukaan sel, kerusakan lipopolisakarida dan membran luar serta  penurunan  pH  sitoplasma  melalui  peningkatan permeabilitas membran. Selain itu sel bakteri telah mengalami stres  yang  cukup  kuat  karena  pengaruh  pengeringan  dan pembekuan.
Asam lambung (HCl) termasuk asam kuat yang terdisosiasi dalam  medium  dan  mampu  menurunkan  pH  eksternal  tetapi tidak  dapat  menembus  membran  sel.  Adaptasi  struktur membran  luar  merupakan  mekanisme  resistensi  bakteri terhadap  asam  yang  tergolong  asam  kuat.  Adaptasi  dapat berupa  perubahan  komposisi  asam  lemak  dan  fosfolipid membran. Hal yang serupa juga ditunjukkan dari hasil penelitian yang dilakukan oleh Jacobsen (1999), terhadap 47 galur bakteri asam laktat dari berbagai sumber pada pH 2,5. Hasil pengujian tersebut  menunjukkan  bahwa  hanya  29  galur  bakteri  asam laktat  yang  mampu  bertahan  pada  pH  2,5  dan  tidak  ada satupun yang mampu tumbuh setelah inkubasi selama 4 jam.

## Ketahanan terhadap garam empedu 0,5 %
Ketahanan  terhadap  garam  empedu  ditunjukkan  dengan penurunan  total  bakteri  asam  laktat  setelah  inkubasi  dalam media yang mengandung garam empedu 0,5  % selama 5 jam (Gambar 4). Gambar 5 menunjukkan bahwa penurunan jumlah kultur  segar P.  Pentosaceus A16  (0,15  log  cfu/g)  lebih  tinggi dibandingkan  dengan  kultur  kering  setelah freeze  drying (kontrol) yaitu 0,12 log cfu/g. Jumlah kultur segar L. brevis A17 mengalami  penurunan  sebesar  4,56  log  cfu/g  sementara penurunan  kultur  kering  setelah freeze  drying (kontrol)  yaitu 1,43 log cfu/g. Penurunan kultur segar L. rhamnosus R21 (0,36 log cfu/g) lebih tinggi dibandingkan dengan kultur kering setelah freeze  drying (kontrol)  yaitu  0,03  log  cfu/g.  Hal  tersebut menunjukkan  bahwa  proses freeze  drying tidak  menurunkan ketahanan kultur kering terhadap garam empedu 0,5%.
Gambar 4.  Penurunan  jumlah  bakteri  asam  laktat  setelah  diinkubasi dengan  MRSB  yang  mengandung  garam  empedu  0,5% selama  5  jam  (a) P.  pentosaceus A16,  (b) L.  brevis A17 dan (c) L. rhamnosus R21
Penambahan bahan pelindung susu skim pada kultur kering P.  pentosaceus A16  mampu  meningkatkan  ketahanannya terhadap garam empedu 0,5% dengan penurunan sebesar 0,11 log cfu/g dan tidak berbeda jauh dengan kontrol (0,12 log cfu/g) sedangkan  penambahan  sukrosa,  laktosa  dan  maltodekstrin mengalami  penurunan  jumlah  sel  lebih  tinggi  dibandingkan dengan  kontrol  yaitu  pada  sukrosa  sebesar  0,24  log  cfu/g, laktosa dan maltodekstrin sebesar 0,22 log cfu/g. Penambahan bahan  pelindung  susu  skim,  laktosa  dan  maltodekstrin  pada kultur L.  brevis A17  mampu  meningkatkan  ketahanannya terhadap  garam  empedu  0,5%  dengan  penurunan  jumlah  sel pada susu skim sebesar 0,24 log cfu/g, laktosa (0,92 log cfu/g) dan maltodekstrin (0,30 log cfu/g) dibandingkan dengan kontrol (1,43  log  cfu/g)  sedangkan  sukrosa  (1,60  log  cfu/g)  kurang mampu  mempertahankan  ketahanannya  terhadap  garam empedu  0,5  %  dengan  penurunan  jumlah  sel  lebih  besar  dari kontrol.  Penambahan  bahan  pelindung  sukrosa,  susu  skim, laktosa  dan  maltodekstrin    pada  kultur L.  rhamnosus R21 kurang  mampu  mempertahankan  ketahanannya  terhadap garam empedu 0,5% dengan penurunan pada sukrosa (0,66 log cfu/g),  susu  skim  (0,31  log  cfu/g),  laktosa  (0,40  log  cfu/g)  dan maltodekstrin  (2,56  log  cfu/g)  dibandingkan  dengan  kontrol (0,03  log  cfu/g).  Hal  ini  menunjukkan  penurunan  yang  terjadi relatif  kecil  pada  semua  bahan  pelindung  yang  digunakan kecuali pada maltodekstrin.
Hasil  analisis  statistik  ketahanan  terhadap  garam  empedu 0,5%  menunjukkan  perbedaan  yang  sangat  nyata  (p<0,05) dimana kultur P. pentosaceus A16 dengan penurunan 0,18 log cfu/g  lebih  tahan  dibandingkan L.  rhamnosus R21  dengan penurunan  sebesar  0,76  log  cfu/g  dan L.  brevis A17  sebesar 1,51  log  cfu/g.  Perlakuan  penambahan  bahan  pelindung berpengaruh  sangat  nyata  (p<0,05)  terhadap  ketahanan  kultur kering  terhadap  garam  empedu  0,5%,  dimana  penambahan susu  skim  dengan  penurunan    sebesar  (0,22  log  cfu/g) memberikan  hasil  terbaik  dalam  meningkatkan  ketahanan  sel terhadap  garam  empedu  0,5%  dibandingkan  dengan  laktosa (0,51 log cfu/g), sukrosa (0,83 log cfu/g), maltodekstrin (1,11 log cfu/g)  dan  kontrol  (0,53  log  cfu/g).  Data  di  atas  menunjukkan bahwa kultur kering yang diberi bahan pelindung maupun yang tidak  diberi  bahan  pelindung  memiliki  ketahanan  yang  tinggi terhadap garam empedu 0,5% setelah diinkubasi selama 5 jam kecuali  pada  kultur  segar L.  brevis A17  penggunaan  bahan pelindung maltodekstrin pada L. rhamnosus R21. Penurunan  jumlah  bakteri  karena  adanya  garam  empedu 0,5% diduga disebabkan karena terjadinya kebocoran pada sel yang  diinduksi  oleh  garam  empedu,  namun  tidak  sampai menyebabkan  sel  mengalami  lisis.  Toleransi  terhadap  garam empedu diduga disebabkan oleh peranan polisakarida sebagai salah satu komponen penyusun dinding sel bakteri gram positif namun  mekanisme  yang  terlibat  didalamnya  belum  diketahui dengan jelas (Surono et al., 2000). Komponen lipid yang lebih dominan  ditemukan  pada  membran  bakteri  gram  positif, merupakan  bagian  penting  untuk  menjaga  struktur  membran ( Kimoto et  al., 2001).  Asam  lemak  dapat  menurunkan kebocoran sel yang disebabkan oleh garam empedu.
0 1 2 3 4 5 (a) A16 (b) A17 (c) R21 Jenis BAL Pe n u ru n a n J m l B A L ( lo g c fu /g ) Kultur segar Kontrol Sukrosa Susu skim Laktosa Maltodekstrin
Tabel 1.  Perkiraan jumlah bakteri asam laktat yang mampu mencapai kolon Perlakuan Σ awal kultur kering BAL (log cfu/g) Penurunan setelah terpapar pH 2,0 di lambung (log cfu/g) Penurunan setelah terpapar garam empedu 0,5% di usus halus (log cfu/g) Perkiraan Jumlah BAL di kolon (log cfu/g) A16-K 10,75 7,30 0,12 3,33 A16-S 9,64 7,70 0,24 1,70 A16-SK 10,32 5,84 0,11 4,37 A16-L 10,53 5,85 0,22 4,47 A16-M 10,37 7,77 0,22 2,38 A17-K 10,20 7,20 1,43 1,58 A17-S 10,89 8,62 1,60 0,68 A17-SK 10,38 5,37 0,24 4,76 A17-L 10,84 4,78 0,92 5,14 A17-M 10,17 5,13 0,30 4,74 R21-K 10,14 9,35 0,03 0,76 R21-S 10,716 3,95 0,66 6,11 R21-SK 10,32 3,21 0,31 6,80 R21-L 10,54 5,09 0,40 5,05 R21-M 7,08 1,38 2,80 2,89 Keterangan : A16 : P. pentosaceus A16 A17 : L. brevis A17 R21 : L. rhamnosus R21 K
: Kontrol tanpa bahan pelindung
S     : Bahan pelindung sukrosa SK  : Bahan pelindung susu skim L     : Bahan pelindung laktosa M    : Bahan pelindung maltodekstrin
Perkiraan jumlah bakteri asam laktat yang mencapai kolon Bakteri  asam  laktat  akan  memiliki  fungsi  sebagai  probiotik jika mampu mencapai kolon dalam keadaan hidup. Untuk dapat mencapai  kolon,  bakteri  asam  laktat  akan  melalui  berbagai rintangan seperti kondisi asam tinggi pada lambung dan garam empedu di usus halus. Jumlah bakteri asam laktat yang mampu mencapai kolon dihitung berdasarkan selisih antara jumlah awal bakteri  asam  laktat  dengan  penurunan  jumlah  bakteri  asam laktat  setelah  dipapar  dengan  asam  (pH  2,0)  dan  garam empedu  0,5%  selama  5  jam.  Jika  dikonsumsi  sebesar  1  gram kultur  kering  maka  perkiraan  jumlah  bakteri  asam  laktat  yang mampu mencapai kolon dapat dilihat pada Tabel 1.
Pada Tabel 1 menunjukkan bahwa bakteri asam laktat yang mampu mencapai kolon dalam jumlah yang paling tinggi adalah L.  rhamnosus R21  dengan  bahan  pelindung  susu  skim  yaitu mencapai 6,4 x 10 6 cfu/g yang tidak berbeda jauh dengan kultur L.  rhamnosus R21  dengan  bahan  pelindung  sukrosa  yaitu sebesar 1,3 x 10 6 cfu/g. Sedangkan jumlah bakteri asam laktat yang  paling  rendah  mencapai  kolon  adalah L.  brevis A17 dengan bahan pelindung sukrosa yaitu sebesar 4,8 x 10 1 cfu/g (48 cfu/g) yang tidak berbeda jauh dengan kontrol pada kultur L. rhamnosus R21 yaitu sebesar 5,8 x 10 1 cfu/g (58 cfu/g). Jumlah sel  mikroba  hidup  yang  harus  terdapat  pada  produk  probiotik masih  menjadi  perdebatan  tetapi  umumnya  sebesar  10 6 –  10 8 cfu/ml  (Tannock  1999).  Berdasarkan  hal  tersebut,  kultur Lactobacillus  rhamnosus R21  dengan  bahan  pelindung  susu skim dapat dikatakan memiliki potensi sebagai probiotik.
Setiap  jenis  bahan  pelindung  memiliki  kemampuan  yang berbeda dalam kapasitasnya sebagai pelindung. Susu skim dan laktosa menunjukkan kemampuan melindungi yang paling baik diantara bahan yang lain. Namun antara laktosa dan susu skim memiliki kemampuan yang berbeda dari setiap stres/hambatan yang  dialami  oleh  bakteri  asam  laktat.  Laktosa  mampu memberikan  perlindungan  yang  lebih  baik  terhadap  pengaruh pengeringan  beku  sedangkan  susu  skim  mampu  memberikan perlindungan  terbaik  kultur  kering  terhadap  paparan  asam lambung (pH 2,0) dan garam empedu 0,5%. Hal ini disebabkan karena  komponen  penyusun  laktosa  yaitu  berupa  glukosa  dan galaktosa  lebih  sederhana  dibandingkan  susu  skim,  dimana susu skim tersusun dari berbagai bahan yang kompleks seperti laktosa,  protein  kasein,  sitrat,  phospat  yang  mampu  berperan sebagai buffer sehingga mampu melindungi sel dari paparan pH rendah dan garam empedu. Berat molekul laktosa lebih rendah dari  susu  skim  sehingga  laktosa  dapat  masuk  ke  dalam  sel bakteri asam laktat dan memberikan perlindungan dari dua sisi membran  sel  selama  proses  pengeringan  beku.  Kasein  susu yang berbentuk misel ( micelles ) mempunyai ukuran yang besar sehingga  tidak  dapat  berdifusi  ke  dalam  sel  bakteri  hanya komponen whey dari susu yang mampu berdifusi (Passos et al . 1993  diacu  dalam  Champagne et  al .,  2001).  Hal  ini  juga didukung  hasil  penelitian  sebelumnya  yang  menunjukkan bahwa  penggunaan  medium  sukrosa-whey  memberikan  hasil lebih efektif sebagai bahan pelindung pada proses pengeringan beku  dibandingkan  medium  berbasis  susu  (Champagne et  al ., 1996 diacu dalam Champagne et al ., 2001).

## KESIMPULAN
Proses  pengeringan  beku  ( freeze  drying )  menurunkan jumlah  bakteri  asam  laktat  namun  masih  dapat  menghasilkan kultur kering probiotik yang memiliki viabilitas yang tinggi. Isolat P. pentosaceus A16 memiliki ketahanan paling tinggi terhadap proses freeze drying dengan penurunan rata-rata sebesar 1,24 log  cfu/g,  selanjutnya L  brevis A17  (1,42  log  cfu/g)  dan L. rhamnosus R21  (2,13  log  cfu/g).  Proses freeze  drying dapat menurunkan  ketahanan  kultur  kering  terhadap  pH  rendah. Ketahanan terhadap pH rendah paling tinggi dimiliki oleh kultur kering L..  rhamnosus R21  dengan  penurunan  jumlah  bakteri 4,96 log cfu/g, kedua L. brevis A17 (5,26 log cfu/g) dan terakhir P. pentosaceus A16 (6,64 log cfu/g). Proses freeze drying tidak terlalu berpengaruh terhadap ketahanan kultur kering terhadap garam empedu 0,5%. Ketahanan terhadap garam empedu 0,5% paling  tinggi  pada P.  pentosaceus A16  dengan  penurunan jumlah bakteri 0,18 log cfu/g, kedua L. rhamnosus R21 (0,76 log cfu/g)  dan  terakhir L.  brevis A17  (1,51  log  cfu/g).  Bahan pelindung  yang  paling  baik  digunakan  untuk  melindungi  kultur kering adalah susu skim walaupun tidak berbeda nyata dengan laktosa.  Dari  hasil  penelitian  ini  menyarankan  bahwa  perlu dilakukan  pengujian  lebih  lanjut  terhadap  sifat-sifat  probiotik yang  lainnya  pada  kultur  kering  yang  telah  di freeze  drying seperti kemampuan menurunkan jumlah bakteri patogen.

## DAFTAR PUSTAKA
Champagne  CP,  Gardner  NJ.  2001.  The  Effect  Protective Ingredients  On  The  Survival  of  Immobilized  Cells  of Streptococcus  thermophillus to  Air  and  Freeze  Drying.
Journal of Biotechnology. Vol. 4 No. 3: 1-7.
Chou LS, Weimer B. 1999. Isolation and characterization of acid and  bile  tolerant  isolates  from  strains  of Lactobacillus acidophilus . J Dairy Sci 82:23-31.
Fu W, Etzel MR. 1995. Spray Drying of Lactococcus lactis sp . lactis C2 and Cellular injury. J. Food Sci. 60:195-200.
Groff  JL,  Gropper  SS.  2001.  Advanced  Nutrition  and  Human Metabolism. Wadsworth, Canada.
Harmayani E, Ngatirah, Rahayu ES, Utami T. 2001. Ketahanan dan Viabilitas Probiotik Bakteri Asam Laktat selama Proses Pembuatan Kultur Kering dengan Metode Freeze dan Spray Drying. J. Teknologi dan Industri Pangan. XII: 126-132.
Harrigan  WF.  1998.  Laboratory  Methods  in  Food  Microbiology 3 rd edition. Academic Press, Inc., New York.
Hutkins RW, Nannen NL. 1993. pH Homeostatis in Lactic Acid Bacteria . J. Dairy Sci. 76: 2354-2365.
Jacobsen  CN.  1999.  Screening  of  probiotics  activities  of  forty- seven strains of Lactobacillus spp by in vitro techniques and
evaluation  the  colonization  of  five  selected  strains  in humans. J. Appl and Environ Microbial 65(11): 4949-4959.
Kimoto H, Ohmomo S, Okamoto T. 2002. Enhancement of bile tolerance  in Lactococci by  Tween  80.  J.  of  Applied Microbiology. 92: 41- 46.
Leslie  SB,  Israeli  E,  Lighthart  B,  Crowe  JH,  Crowe  LM.  1995.
Trehalose  and  Sucrose  Protect  Both  Membranes  and Proteins  in  Intact  Bacteria  during  Drying.  J.  Appl.  Environ. Microbiol. 61: 3592-3597.
Mangunwidjaja  D,  Suryani  A.  1994.  Teknologi  Bioproses. Penebar Swadaya. Jakarta.
Moser  SA,  Savage  DC.  2001.  Bile  salt  hydrolase  activity  and resistance  to  toxicity  of  conjugated  bile  salt  are  unrelated properties  in Lactobacilli .  J  Appl  and  Environ  Microbial p:3476-3480.
Ngatirah,  Harmayani  E,  Rahayu  ES,  Utami  T.  2000.  Seleksi Bakteri  Asam  Laktat  sebagai  Agensia  Probiotik  yang Berpotensi  Menurunkan  Kolesterol.  Seminar  Nasional Industri  Pangan.  Patpi.  2000.  Surabaya  10  –  11  Oktober 2000.
Nuraida L, Susanti, Hartanti AW. 2007. Lactic Acid Bacteria and Bifidobacteria Profile of Breast Milk and Their Potency as Probiotics 10 th Asean Food Conference. Food for Mankind-
Contribution of Science and Technology. Kuala Lumpur, Malaysia.
Pelczar  MJ,  Chan  ECS.  2005.  Dasar-dasar  Mikrobiologi. Penerjemah Ratna Siri Hadioetomo, Teja Imas,  S.  Sutarmi Tjitrosomo,  Sri  Lestari  Angka.  Penerbit  Universitas Indonesia.
Ray  B.  1993.  Sublethal  injury,  bacteriocins  and  food microbiology. ASM News 59, 258-291.
Shortt  C.  1999.  The  Probiotic  century:  Historical  and  Current Perspectives.  Review  Trends  Food  Science  and  Tech. 10:411-417.
Steel  RGD,  Torrie  JH.  1995.  Prinsip  dan  Prosedur  Statistika. Suatu  Pendekatan  Biometrik.  Edisi  kedua.  Penerbit  PT Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.
Surono, Nurani D. 2000.  Exploration of indigenous Lactic  Acid Bacteria from  Dadih  of  West  Sumatra  for  Good  Starter Cultures and Probiotic bacteria. Laporan Akhir DCRG.
Susanti,  Nuraida  L,  Palupi  NS.  2008.  Immunomodulatory properties of four Lactobacillus strains isolated from breast milk  in  vitro  and  in  vivo.  International  Symposium  on Probiotic from Asian Traditional Fermented for Healthy Gut Function. 2008. Jakarta 19 – 20 Agustus 2008.
Tamime AY. 1981. Microbiology of Culture Structure. Di dalam:
Robinson,  R.K.(ed).  Dairy  Micobiology  Vol  II.  Appl.  Sci. Publ., London.