Ekstraksi Xilan dari Limbah Ampas Singkong dan

## Pemanfaatannya sebagai Substrat Endo-B-1,4-D-Xilanase
(Extraction Xylan of Cassava Bagasse and Utility as Substrat Endo-B-1,4-D-Xylanase)
Fita Kurnia Firdausa, Agung Budi Santoso,  Wuryanti Handayani Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Jember (UNEJ)
Jln. Kalimantan 37, Jember 68121
E-mail : agungbsantoso@yahoo.com

## Abstrak
Ampas singkong merupakan limbah hasil pembuatan tepung tapioka. Hemiselulosa merupakan komponen kimia pada ampas singkong, komponen utama hemiselulosa adalah xilan. Penelitian ini bertujuan mendapatkan xilan dari ampas singkong serta pemanfaatan xilan sebagai substrat endo-B-1,4-D-xilanase. Ampas singkong yang akan diekstraksi diukur terlebih dahulu kadar  HCN,  lignin,  dan  air.  Ekstraksi  xilan  dari   ampas  singketode  DNS. Hasil   penelitian  menunjukkan  bahwa   ampas singkong yang digunakan pada penelitian ini memiliki kandungan HCN sebesar 16,10 ppm, kadar lignin sebesar 4,34% dan kadar air sebesar 7,45%. Ekstraksi xilan dengan NaOH 12% menghasilkan rendemen tertinggi yaitu 32,14% (delignifikasi) dan 52,36% (tanpa delignifikasi).
Kata Kunci: Ampas singkong, xilan, delignifikasi.

## Abstract
GCassava bagasse is waste the result of the manufacture of starch. Content of cassava bagasse is hemicellulose, the main component of hemicellulose is xylan. The aim of this study to obtain xylan from cassava bagasse and utilization of xylan as a substrate endo-B-1,4-D-xilanase . Bagasse of cassava to be extracted beforehand measured content HCN, lignin, and water. Extraction of xylan from cassava bagasse do two variations of treatment that the delignification and non-delignification. In addition, the extraction of xylan to be optimized solvent concentration of NaOH is 4, 8, 12 and 16%. Xylan obtained from the extraction was analyzed qualitative by TLC method and analyzed quantitative by DNS method. The result of study showed that the cassava bagasse used in this study contains HCN, lignin, and water which accounted for 16,10 ppm; 4,34%; and 7,45%. Extraction of xylan with NaOH 12% to produce the highest yield is 32,14% (delignification) and 52,36% (non- delignification).
Keywords: cassava bagasse, xylan, delignification.

## PENDAHULUAN
Singkong ( Manihot Ultissima ) merupakan bahan pangan yang   banyak   diprodukdi   di   Indonesia.   Singkong   sangat potensial untuk diolah menjadi tepung. Pengolahan   1 ton singkong, menghasilkan ampas singkong sebanyak 0,1 ton [1]. Ditinjau dari segi komposisi kimianya, ampas singkong mengandung 1,57 g protein, 1,06 g lemak, 21,10 g serat dan 1,10 g abu [2].  serat    pada ampas yang berlignoselulosa mengandung selulosa (36,6%),  hemiselulosa (21,3%), dan lignin (17,3%) [3].
Hemiselulosa pada ampas singkong adalah  komponen terbesar   kedua   setelah   selulosa.   Hemiselulosa   merupakan heteropolisakarida   yang   tersusun   atas   satuan-satuan   gula pentosa dan heksosa. Komponen utama dari hemiselulosa adalah xilan. Selain terdapat  pada ampas singkong, xilan juga   ditemukan   pada   limbah-limbah   pertanian   seperti dedakong   dilakukan   dua   variasi   perlakuan   yaitu   dengan delignifikasi   dan   tanpa   delignifikasi.   Selain   itu,   pada ekstraksi   xilan   dilakukan   optimasi   konsentrasi   pelarut NaOH yaitu 4, 8, 12, dan 16 (%). Xilan yang diperoleh dari hasil   ekstraksi   dianalisa   secara   kualitatif   dengan   metode KLT   dan   dianalisa   secara   kuantitatif   dengan     dengan   m gandum, bagas tebu, dan sekam padi [4]. Xilan merupakan
polimer   pentosa   atau   xilosa   dengan   ikatan   B-1,4   yang jumlah monomernya berkisar antara 150-200 unit [5]. Xilan mempunyai banyak manfaat  sebagai bahan baku industri, diantaranya sebagai thicking agen (pengental), dan bahan baku pembuatan film. Selain itu, xilan juga dimanfaatkan sebagai   substrat   endo-B-1,4-D-xilanase.     Endo-B-1,4-D- xilanase menghidrolisis xilan menjadi xilooligosakarida dan xilosa   [6].   Xilooligosakarida   sangat   bermafaat   bagi kesehatan yaitu merangsang pertumbuhan bifidobakteri di usus manusia sehingga xilooligosakarida dipertimbangkan sebagai prebiotik [7].
Tujuan   dari   penelitian   ini   adalah   untuk   mendapatkan xilan   optimum   pada   ekstraksi,   serta   untuk   mengetahui aplikasi xilan dari ampas singkong sebagai substrat untuk endo-B-1,4-D-xilanase.

## METODE PENELITIAN
Penelitian   ini   dilakukan   di   laboratorium   Biokimia Jurusan Kimia FMIPA, Laboratorium CDAST ( Center of Development for Advances Science and Technology ), serta Laboratorium Terpadu Fakultas Teknologi Pertanian.
Bahan-bahan   yang   digunakan   dalam   penelitian   ini adalah ampas singkong, NaOH, HCl, etanol, xilosa, asam asetat, butanol, asam sulfat.
Peralatan  yang digunakan  dalam  penelitian ini  adalah spektrofotometer, autoclave, oven, pH meter, eppendorf dan peralatan gelas.
a. Preparasi Sampel
Singkong dikupas kulitnya dan dicuci dengan air bersih, kemudian singkong diparut. Hasil parutan dicuci berulang dengan   air  mengalir   dan  diperas   sampai  patinya  terpisah dari   ampas.   Kemudian   ampas   dikeringkan   menggunakan oven   dengan   suhu   65 0 C.   Setelah   kering,   ampas   digiling menggunakan   mesin   penggiling   sehingga   ampas   yang diperoleh   berbentuk   tepung.   Ampas   yang   sudah   digiling kemudian   dikukus   selama   30   menit.   Setelah   dikukus kemudian dikeringkan dihu ruang.
b. Analisa Kandungan Air, HCN dan Lignin - Penentuan Kadar Air Sebanyak 2 gram sampel ditempatkan pada cawan petri dan dipanaskan ke dalam oven pada suhu 105 0 C selama 4 jam. Kemudian   cawan   petri   yang   berisi   sampel   didinginkan dalam   desikator   dan   ditimbang.   Cawan   petri   dan  sampel dipanaskan kembali pada suhu 105 0 Cselama 1 jam. Cawan petri   dan   sampel   didinginkan   dalam   desikator   dan ditimbang kembali. Perlakuan tersebut dilakukan berulang- ulang hingga berat sampel konstan [8]. Presentase kadar air dihitung dengan menggunakan rumus 3.1.
∞ kadar air = a − b b x 100
- Penentuan  Kadar Asam Sianida (HCN) Pengukuran kadar HCN dilakukan dengan cara kertas pikrat direndam ke dalam sampel yang telah ditambahkan 5 mL akuades   selama   30   menit.   Kemudian   diukur   dengan spektofotometri UV-Vis pada panjang gelombang 510 nm. Larutan blanko yang digunakan yakni asam pikrat diredam ke akuades tanpa sampel. Kadar HCN total dihitung sebagai berikut:
HCN total = 396 x absorbansi
- Penentuan Kadar  Lignin pada Ampas Singkong Sebanyak  1 gram  sampel  ditempatkan  pada beaker  gelas 100 mL dan ditambahkan 15 mL asam sulfat 72% (v/v). Campuran   larutan   didiamkan   selama   2   jam   pada   suhu kamar.   Larutan   dituang   kedalam   tabung   Erlenmeyer   1L dan ditambah dengan 560 mL akuades. Larutan di autoclave selama   2   jam   dan   endapan   yang   terbentuk   disaring. Selanjutnya, endapan dikeringkan pada suhu 40 °C sampai berat   konstan   dan   ditimbang.   Presentase   kadar   lignin dihitung dengan menggunakan persamaan sebagai berikut:
∞ lignin = berat endapan yang terbentuk berat sampel awal
x 100
c. Delignifikasi dan Ekstraksi Xilan - Delignifikasi 5 gr sampel  direndam  dengan  larutan NaOCl  0,5% pada suhu 28 0 C selama 5 jam. Kemudian dibilas dengan akuades dan   disaring.  Padatan   yang   diperoleh   digunakan   untuk ekstraksi xilan - Ekstraksi Xilan Padatan   yang   dihasilkan   direndam   dalam   larutan   NaOH dengan   variasi   konsentrasi   4,   8,   12,   16,   dan   18%   (b/v) selama   24   jam   pada   suhu   28 0 C,   kemudian   disaring.
Supernatan  yang  dihasilkan  diukur  pH-nya  menggunakan pH   meter.   Kemudian   supernatan   dinetralkan   dengan menambahkan tetes demi tetes HCl 6 N  sampai pH netral (pH   =   7)  dan   disentrifugasi   pada   kecepatan  8000   rpm selama 10 menit. Hasil sentrifugasi dipisahkan dengan cara dekantasi. Kemudian supernatan ditambahkan etanol 95% dengan   perbandingan   1:3   (supernatant   :   etanol)   dan disentrifugasi  kembali  dengan   kecepatan   10.000   rpm selama 10 menit. Endapan yang diperoleh dikeringkan pada suhu   40 0 C   sampai   beratnya   konstan.  Berat   xilan   dapat dihitung dengan rumus :
Rendemen xilan ∞= berat akhir berat awal x 100 ∞
d.   Hidrolisis   Xilan   dengan   Enzim   Endo-B-1,4-D- xilanase
Sebanyak 125µL  enzim endoxilanase  ditambahkan dengan 125  µL   substrat  (0,5%   b/v)   xilan  dari   ampas   singkong dalam buffer fosfat-sitrat pH 5. Kemudian diinkubasi dalam waterbath pada   40 0 C   selama   5   jam.  Produk   hidrolisis dianalisis dengan metode DNS dan KLT.
-  Analisis Total Gula Pereduksi Produk   hidrolisis   yang   dihasilkan   pada   tiap-tipa   waktu inkubasi,   selanjutnya   ditambahkan  masing-masing  600µL larutan   DNS   dan   dipanaskan   pada   suhu   100 0 C   dalam waterbath selam   15   menit.   Setelah   dipanaskan,   larutan didinginkan   dalam   air   es   selama   20   menit.   Warna   yang dihasilkan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 550 nm.
-  Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Sebanyak   8µl   (pada   masing-masing   waktu   inkubasi) ditotolkan pada plat silica yang sudah diberi tanda nomor pada tempat penotolannya. Eluen yang digunakan adalah 1- butanol:   asetat:   akuades   (2:1:1,   v/v/v).   Plat   silika dimasukkan   ke   dalam   chamber   yang   diisi   dengan   eluen. Elusi dilakukan hingga 1,5 cm di bawah tepi atas plat silika. Plat diambil dan dikeringkan selama 30 menit. Spot yang dihasilkan divisualisasikan dengan menyemprotkan larutan naftol dan H 2 SO 4 dalam etanol kemudian dioven pada suhu 100 0 C selama 5 menit [9].

## HASIL PENELITIAN

## a. Kandungan HCN, Air, dan Lignin
Xilan yang diekstrak pada penelitian berasal dari ampas singkong. Ampas singkong yang digunakan diperoleh dari limbah   pembuatan   tepung   tapioka   yang   diproses   sendiri oleh   peneliti   dengan   mengacu   pada   proses   pembuatan tapung tapioka seperti pada industri. Namun pada penelitian ini,   ampas   singkong   dicuci   berulang-ulang   dengan   air bersih sampai pati benar-benar berkurang. Hal ini dilakukan karena apabila pada ampas masih terdapat pati maka hal ini akan mengganggu proses ekstraksi. Pada proses pencucian berulang-ulang, tidak hanya pati yang akan berkurang pada ampas   tetapi   juga   kandungan   asam   sianida   juga   ikut berkurang. Hal ini karena berdasarkan sifat kelarutan asam sianida yaitu mudah larut dalam air.
Sebelum   dilakukan   ekstraksi,   ampas   singkong ditentukan kadar air, HCN, dan lignin. Kadar HCN, air, dan lignin pada ampas singkong dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Kandungan kimia ampas singkong
Asam sianida merupakan senyawa kimia yang bersifat toksik.   Batas   aman   konsumsi   HCN   yang   diperbolehkan oleh FAO adalah kurang dari 50 ppm. Hal ini yang menjadi landasan   dilakukan   pengukuran   HCN   pada   ampas singkong. Apabila pada pengukuran awal kandungan HCN masih tinggi maka perlu dilakukan pengurangan kandungan HCN.   Namun   pada   penelitian   ini   diperoleh   kandungan HCN sebesar 16,10 ppm. Kandungan tersebut sudah berada dibawah   batas   aman   sehingga   tidak   perlu   dilakukan pengurangan HCN.
Kadar air adalah perbedaan antara berat bahan sebelum dan   susudah   dilakukan   pemanasan.   Pada   penelitian   ini, penentuan kadar air menggunakan metode gravimetri yaitu dengan menguapkan air yang ada dalam ampas singkong dengan   jalan   pemanasan   menggunakan   oven   pada   suhu 105°C kemudian menimbang ampas singkong sampai berat konstan. Pada tabel 1 diperoleh kadar air sebesar 7,45%.
Kadar lignin pada ampas singkong ditentukan dengan metode   Klason   (lignin   tidak   larut   asam).   Metode   ini didasarkan   pada   hidrolisis   selulosa   dan   hemiselulosa menggunakan   asam   sulfat   72%,   kemudian   dilanjutkan hidrolisis   dengan   asam   sulfat   3%   pada   pemanasan menggunakan autoclave pada suhu 121°C dan tekanan 1,5 kg/cm 3 selama 30 menit. Lignin yang diperoleh merupakan komponen   yang   tidak   larut   dan   ditentukan   secara gravimetri. Kadar kignin yang diperoleh sebesar 4,34%. Hal yang   mendasari   dilakukannya   pengukuran   kadar   lignin adalah untuk mengetahui berapa konsentrasi NaOCl yang akan ditambahkan pada proses delignifikasi.

## b. Rendemen Xilan
Sampel   yang   digunakan   untuk   ekstraksi   xilan   yaitu sampel   yang   sudah  dikukus . Tujuan   utama  pengukusan adalah untuk membuka dan memecah struktur lignoselulosa agar xilan mudah diekstraksi (gambar 2).
Gambar 1. Pemecahan struktur lignoselulosa
Delignifikasi   merupakan   penghilangan   lignin   dari limbah   lignoselulosa   untuk   mempermudah   enzim
menghidrolisis   xilan   yang   diperoleh   dari   ekstraksi. Penelitian yang dilakukan, terdapat  dua variasi perlakuan pada   sampel   yaitu   delignifikasi   dan   tanpa   delignifikasi. Pelarut   yang   digunakan   pada   proses   delignifikasi   adalah NaOCl 0,5%. NaOCl berfungsi melarutkan senyawa lignin dengan  cara  mendegradasi  rantai  panjang menjadi  rantai- rantai   yang   kecil.   Ion   hipoklorit   (ClO - )   yang   memiliki muatan negatif bertindak sebagai nukleofil menyerang atom karbon yang lebih elektropositif. Reaksi antara lignin dan ion hipoklorit  menyebabkan  lignin terfragmentasi  dengan berat molekul rendah sehingga larut dalam pelarut NaOCl [10]
Ampas  singkong yang  sudah  direndam  dalam  NaOCl kemudian   disaring   dengan   kertas   saring.   Padatan   yang diperoleh   akan   digunakan   pada   tahap   selanjutnya   yaitu ekstraksi xilan dengan NaOH. Padatan yang diperoleh dari proses   didelignifikasi  kemudian   diekstraksi  menggunakan pelarut NaOH pada berbagai variasi konsentrasi (4%, 8%, 12%, dan 16% (b/v)) selama 24 jam. Hemiselulosa pada ampas singkong akan larut dalam larutan NaOH sedangkan selulosa strukturnya akan rusak sehingga akan mengalami penggembungan (swelling) sehingga tidak akan larut dalam larutan   NaOH.   Namun,   ada   sebagian   selulosa   yang mungkin terlarut dalam larutan NaOH.
Larutan sampel hasil ekstraksi dengan NaOH kemudian dinetralkan   dengan   larutan   HCl   6M   sampai   pH   larutan netral. Saat penambahan HCl 6M terbentuk endapan yang diduga selulosa. Selulosa yang mengendap dipisahkan dari larutan   dengan   sentrifugasi.   Supernatan   yang   dihasilkan ditambah etanol 95% dengan tujuan mengendapkan xilan. Endapan   xilan   yang   terbentuk   dipisahkan   dari   larutan dengan  sentrifugasi. Endapan yang diperoleh dikeringkan menggunakan   oven   dengan   suhu   40 0 C   sampai   berat konstan.
Profil   xilan   pada   ampas   singkong   dengan   perlakuan delignifikasi maupun non-delignifikasi memiliki tren yang sama   pada   setiap   konsentrasi   NaOH   (Gambar   3). Konsentrasi   NaOH   yang   digunakan   semakin   besar   maka semakin besar pula rendemen xilan yang dihasilkan pada proses   ekstraksi.   Rendemen   xilan   naik   pada   konsentrasi NaOH   4%   sampai   12%   dan   mengalami   penurunan   pada konsentrasi NaOH 16%. Hal ini disebabkan karena pelarut mendegradasi   xilan   yang   menyebabkan   menurunnya rendemen xilan yang dihasilkan.
Gambar 2. Rendemen xilan dari ampas singkong Rendemen   xilan   tertinggi   pada   sampel   delignifikasi yaitu 32,14% dan pada non-delignifikasi 52,36% . Sampel non-delignifikasi   menghasilkan   rendemen   lebih   tinggi daripada sampel delignifikasi. Hal ini diduga karena adanya
lignin maupun zat-zat lain (pengotor) yang ikut larut dalam larutan NaOH.
c. Produk Hidrolisis Xilan dari Ampas Singkong dengan Endo-ß-1,4-D-Xilanase
Endo-ß-1,4-D-xilanase merupakan enzim yang bekerja secara   spesifik  terhadap  substrat   xilan.   Endo-ß-1,4-D- xilanase menghidrolisis ikatan glikosida pada bagian dalam struktur menjadi xilooligosakarida dan xilosa sebagai hasil samping.   Adanya   xilooligosakarida   (XO)   sebagai   produk hidrolisis   menunjukkan   bahwa   xilan   berhasil   diekstraksi dari   ampas   singkong.   Proses   hidrolisis   dilakukan   dengan menginkubasi substrat xilan dari  ampas singkong dengan endo-ß-1,4-D-xilanase.   Adapun   konsentrasi   substrat  yang digunakan adalah  0,5%  (b/v)  pada suhu 40°C dan pH 5. Waktu inkubasi 5 jam.
Gambar 3. Kromatogram KLT produk hidrolisis
Hasil   hidrolisis   dianalisis   secara   kualitatif  dan kuantitatif.  Analisa secara  kualitatif  dengan  metode KLT yang   bertujuan   untuk   melihat   kemampuan   enzim   dalam menghidrolisis xilan dalam campuran  sampel dan produk hidrolisis yang dihasilkan. Analisis didasarkan pada  warna noda   yang   terbentuk   pada   titik   penotolan   dan   juga munculnya spot baru pada kromatogram (gambar 3). Eluen yang   digunakan   adalah   campuran   dari   larutan   1- butanol/H 2 O/asam   asetat   dengan   perbandingan   2:1:1 (v/v/v).   Jumlah   produk   hidrolisis   pada   tiap-tiap   waktu inkubasi yang ditotolkan pada plat KLT adalah sama yaitu 8 mL.
Analisis secara kuantitatif dengan menghitung total gula pereduksi menggunakan metode DNS. Total gula pereduksi merupakan   jumlah   keseluruhan   gula   pereduksi   yang dihasilkan   selama   proses   hidrolisis.   Total   gula   pereduksi yang   dihasilkan   pada   produk   hidrolisis   sebesar   1,931 mg/mL.

## KESIMPULAN DAN SARAN
Terdapat   2   sampel   xilan   yang   dihasilkan   dari   proses ekstraksi   yaitu   xilan   dari   ampas   singkong   yang   telah didelignifikasi   dan   xilan   dari   ampas   singkong   tanpa delignifikasi.   Konsentrasi   NaOH   12%   menghasilkan rendemen xilan paling tinggi pada sampel delignifikasi dan non-delignifikasi   yaitu   sebesar   32,14%   dan   52,36%. Rendemen xilan pada sampel non-delignifikasi lebih tinggi
dari pada sampel delignifikasi karena lignin pada sampel ikut terekstrak.
Xilan   dari   ampas   singkong   dapat   digunakan   sebagai substrat   enzim   endo-ß-1,4-D-xilanase   yang   ditunjukkan dengan dihasilkannya produk hidrolisis.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih disampaikan kepada Dr. A.A Istri Ratnadewi   S.Si.,   M.si   dan   I   Nyoman   Adi   Winata   S.Si., M.Si Atas masukan dan saran  dalam penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
[1] Naufalina, R. & Condro W. 2004. “Pemanfaatan Hasil Samping   Pengolahan   Tepung   Tapioka   Untuk Pembuatan   Nata De   Cassava”.   Teknologi   Dan Industri Pangan. Vol XV:153
[2] Pandey, A., Carlos R.S., Poonam, N., Vanete, T. S., Luciana,   P.S.,   Vandenberghe.,   &   Radjiskumar, M.2000. “Biotechnological potential of agro-industrial residues.   II:   cassava   bagasse”. Bioresource Technology . 74: 82-84
[3]  Amenaghawon, N. A., Samuel, E.O., & Charity, O.O. 2014. “Application of Statistical Experimental Design for   the   Optimisation   of   Dilute   Sulphuric   Acid Hydrolysis of  Cassava  Bagasse”. Acta  Polytechnica Hungarica . 11: 242-243
[4] Richana, N., Pia, L., & Tun T. 2004. “Karakterisasi Lignoselulosa   Dari   Limbah   Tanaman   Pangan   Dan Pemanfaatannya   Untuk   Pertumbuhan   Bakteri   RXA III-5Penghasil   Xilanase”. Penelitian   Pertanian Tanaman Pangan Vol. 23 No.3 2004 .
[5] Richana,   N.,   Tun   T.I.,   M.   Anwar   Nur.,   Illah   S., Khaswar S & Yandra A. 2007. “Ekstraksi Xilan Dari Tongkol Jagung”. Pascapanen. 4: 38-37.
[6] Jiang, Z. Q., Deng, W., Zhu, Y. P., Sheng, Y.J., & Hayashi, K. 2004. “The Recombinant Xylanase B of Thermotoga maritima is Highly Xylan Specific 46 and Produces   exclusively   Xylobiose   from   Xylans,   a Unique Character for Industrial Applications”. J. Mol Catal B Enzym , 27: 13-207.
[7] Ratnadewi, A. A. I., Handayani, W., & Puspaningsih, N. N. T. 2007. “Produksi dan Karakterisasi, Enzim β- Endoxilanase   dari   Bakteri  Sistem  Intestinal   Rayap”. Jurnal Ilmu Dasar , 8(2): 110-117 .
[8] Wrolstad, R. E., Acree, T. E., Decker, E. A., Penner, M. H., Reid, D. S., Schwartz, S. J., Shoemaker, C. F., Smith,   D.,   &   Sporns,   P.   2005. Handbook   of   Food Analytical   Chemistry:   Water,   Proteins,   Enzymes, Lipids, and Carbohydrate . New Jersey: John Wiley & Sons Inc.
[9] Ratnadewi, A. A. I., Handayani, W., & Puspaningsih, N. N. T. 2007. “Produksi dan Karakterisasi, Enzim β- Endoxilanase   dari   Bakteri  Sistem  Intestinal   Rayap”. Jurnal Ilmu Dasar , 8(2): 110-117 .
[10] Sjostrom,   E.   1981. Wood   Chemsitry   Fundamentals and Applications . New York: Academic Press.