Efek  Kombinasi  Ekstrak  Etanol Acalypha  indica dan Centella  asiatica pada Jantung Tikus Pascahipoksia: Gen Hif-1a, Troponin I dan Stres Oksidatif
Marsetyo Edhiatmi 1 , Wawaimuli Arozal 2 , Erni H Purwaningsih 3
1 Departemen Pendidikan Kedokteran, Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia, Indonesia.
2 Departemen Farmakologi & Teraupetik, Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia, Indonesia.
3 Departemen Ilmu Farmasi Kedokteran, Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia, Indonesia.

## Abstrak
Hipoksia  meningkatkan  pembentukan  dan  pelepasan  spesies  oksigen  reaktif  (ROS).  Sel mempunyai  mekanisme  melindungi  diri  terhadap  kerusakan  akibat  pembentukan  ROS yang terjadi secara alami. Jika pembentukan radikal bebas terjadi berlebihan maka dapat menyebabkan  stres  oksidatif  yang  memicu  kerusakan  sel  terutama  pada  jantung. Sehingga  tubuh  memerlukan  asupan  antioksidan. Acalypha  indica dan Centella  asiatica terbukti  memiliki  efek  antioksidan  dan  melindungi  banyak  organ  dari  kondisi  hipoksia, sehingga  penelitian  ini  dilakukan  dengan  tujuan  untuk  mengetahui  efek  antioksidan kombinasi ekstrak etanol Acalypha indica dan Centella asiatica pada organ jantung tikus Spraque-Dawley pascahipoksia.  Tiga  puluh  lima  ekor  tikus Sprague-Dawley jantan diinduksi hipoksia selama 7 hari dalam ruang khusus, kemudian diberi perlakuan. Ekstrak Acalypha indica , ekstrak Centella asiatica dan kombinasinya diberikan kepada kelompok tikus  yang  telah  dibagi  menjadi  grup  A  (hipoksia  dan  diberi  air),  B  (hipoksia  dan  diberi kombinasi Acalypha indica 200 mg/kgBB dan Centella asiatica 150 mg/kgBB), C (hipoksia dan diberi kombinasi Acalypha indica 250 mg/kgBB dan Centella asiatica 100 mg/kgBB), D  (hipoksia  dan  diberi Acalypha  indica 250  mg/kgBB),  E  (hipoksia  dan  diberi Centella asiatica 150  mg/kgBB),  F  (hipoksia  dan  diberi  vitamin  C  100mg/kgBB)  dan  kelompok normal. Perlakuan diberikan secara oral selama 7 hari setelah hipoksia. Parameter yang diamati  adalah  ekspresi  mRNA  HIF- 1α,  kadar  MDA,  aktivitas  enzim  SOD  dan  ekspresi mRNA cTnI. Tidak terdapat perbedaan bermakna pada ekspresi HIF- 1α antara grup A dan kelompok tikus normal (p>0,05). Kadar MDA meningkat signifikan pada grup A (p<0,05) dibanding  tikus  normal.  Kadar  MDA  grup  D  mengalami  penurunan  secara  signifikan (p<0,05)  dibanding  grup  A.  Aktivitas  SOD  menurun  signifikan  pada  grup  A  (p<0,05) dibanding  tikus  normal.  Aktivitas  SOD  grup  B  dan  E  (p<0,05)  mengalami  peningkatan secara signifikan dibanding grup A. Grup B meningkat signifikan (p<0,05) dibanding grup E.  Tidak  terdapat  perbedaan  bermakna  antar  kelompok  perlakuan  pada  Ekspresi  cTnI. Tidak terdapat korelasi antara kadar MDA dan aktivitas SOD serta ekspresi mRNA HIF-1a dan mRNA cTnI. Pemberian kombinasi ekstrak Acalypha indica dan Centella asiatica tidak dapat membantu memproteksi kerusakan jantung pascahipoksia.
Penulis
Afiliasi

## Kata Kunci
 Acalypha indica
 Centella asiatica
 hipoksia
 HIF-1a
 MDA
 SOD
Diterima 7 September 2015
Direvisi 25 Desember 2015
Disetujui 20 April 2016

## *Penulis korespondensi
Marsetyo Edhiatmi Pendidikan Kedoketran, FK Universitas Indoneisa emi.akbar@gmail.com

## Pendahuluan
Kondisi  hipoksia  pada  organ  jantung  dapat membahayakan  fungsi  miokardium.  Hipoksia  adalah keadaan  patologis  di  dalam  tubuh  atau  bagian  dari tubuh  (jaringan  atau  sel)  yang  disebabkan  kurang adekuatnya  asupan  oksigen.  Hipoksia  meningkatkan pembentukan  dan  pelepasan reactive  oxygen  species (ROS) dari dalam mitokondria. Spesies radikal bebas ini menyebabkan  peroksidasi  lipid  dan  efek  delesi  lain pada  struktur  sel.  Salah  satu  senyawa  produk  dari reaksi peroksidasi lipid yang digunakan sebagai marker (petanda) terjadinya stres oksidatif adalah malondialdehid.  Jika  hipoksia  tidak  dihilangkan, kerusakan  fungsi  mitokondria  dan  peningkatan permeabilitas membran dapat menyebabkan kerusakan morfologi sel (Enikarmila et al. 2009; Richard et al. 2010; Septelia et al. 2009).
Salah satu respons sel terhadap kondisi hipoksia adalah  peningkatan  kadar  protein Hypoxia-inducible factor -1  (HIF-1).  HIF- 1  terdiri  atas  subunit  β  yang diekspresikan secara terus- menerus dan subunit α yang diregulasi  oleh  oksigen.  Ekspresi  HIF- 1α  meningkat secara  nyata  pada  kondisi  hipoksia.  HIF- 1α  yang dihidroksilasi  oleh  PHD  mengikat  protein  von  Hippel Lindau  (pVHL),  selanjutnya  diubiquitinasi  (Ub)  dan akhirnya  terdegradasi  oleh  26S-proteasome.  Pada kondisi hipoksia atau kelebihan nitrat oksida (NO) atau superoksida  dapat  menghambat  PHD  sehingga  HIF- 1α menjadi  stabil.  Telah  dibuktikan  bahwa  peningkatan ekspresi  HIF- 1α pada  organ  jantung  mencapai maksimum  pada  hari  ke  tujuh  dan  tetap  intensif dipertahankan sampai hari ke 21 (Bemhard et al. 2007; Enikarmila et al. 2009; Septelia et al. 2009).
Antioksidan  merupakan  perlindungan  terhadap kelebihan  radikal  bebas  yang  mudah  dioksidasi  dan dapat  menetralkan  sebagian  besar  radikal  bebas tersebut. Antioksidan yang penting diantaranya adalah enzim  alamiah  termasuk glutathion  peroxidase , Superoxyde Dismutase dan katalase, serta vitamin A, C, dan  E  (Scott  &  Meg  2008).  Pengobatan  untuk mengatasi kerusakan organ seringkali kurang bermanfaat  dan  menimbulkan  efek  samping  obat, sehingga  diperlukan  alternatif  berupa  pemanfaatan tanaman berkhasiat antioksidan terhadap perbaikan sel miosit jantung.
Sifat  antioksidan  juga  dapat  ditemukan  pada tanaman yang telah banyak diteliti di antaranya adalah akar Acalypha indica dan Centella asiatica (Pooja et al. 2014;  Vasantharuba et  al. 2012;  Sanseera et  al. 2012;
Anirban et  al. 2013).  Penelitian  pendahuluan  oleh Farida,dkk  (Farida et  al. 2010).  bahwa  kombinasi ekstrak  air  akar Acalypha  indica 200  mg/kgBB  dengan Centella  asiatica 150  mg/kgBB  menunjukkan  efek terapi pada hipoksia otak berupa perbaikan jumlah sel normal, kondensasi khromatin nukleus dan piknotik sel lapis  luar  girus  dentatus  hipokampus.  Pada  dosis Acalypha indica 250 mg/kgBB dan Centella asiatica 150 mg/kgBB  juga  menunjukkan  perbaikan  namun  tidak sebaik  kombinasi  ekstrak  air Acalypha  indica 200 mg/kgBB  dengan Centella  asiatica 150  mg/kgBB  yang kemungkinan  disebabkan  karena  peningkatan  efek vasodilator  oleh Centella  asiatica ,  sehingga  dosis Centella  asiatica perlu  diturunkan.  Sampai  saat  ini belum  ada  bukti  ilmiah  yang  menunjukkan  bahwa kombinasi ekstrak  etanol Acalypha indica dan Centella asiatica pada  dosis  tertentu  dapat  memperbaiki kerusakan  jaringan  jantung  pascahipoksia.  Secara in vitro ,  kombinasi  ke  dua  ekstrak  tersebut  juga  belum terbukti menunjukkan efek antioksidan yang lebih baik dibandingkan  dengan  efek  antioksidan  ekstrak Acalypha  indica atau Centella  asiatica yang  diberikan secara  tunggal  maupun  dengan  antioksidan  kuat  yaitu vitamin C.
Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  melihat  efek kombinasi  ekstrak  etanol Acalypha  indica (AI)  dan Centella  asiatica (CA)  pada  organ  jantung  tikus Sprague-Dawley pascahipoksia,  fokus  pada  efek antioksidan  dan  kerusakan  otot  jantung  melalui pemeriksaan  malondialdehid  (MDA), Superoxyde dismutase (SOD),  ekspresi  mRNA  HIF- 1α  dan  mRNA cardiac Troponin I (cTnI).

## Metode Penelitian
Penelitian  dilakukan  pada  tiga  puluh  lima  (35) ekor  tikus  jantan  galur Spraque  Dawley usia  10-12 minggu,  dengan  berat  badan  150-250  gram  yang diperoleh  dari  Pusat  Penelitian  dan  Pengembangan Kesehatan  Kemenkes  RI.  Selama  eksperimen  seluruh hewan  coba  diadaptasi  di  kandang  hewan  Dep. Biokimia,  dengan  suhu  dan  kelembaban  ruangan  yang konstan,  penerangan  yang  cukup  serta  diberi  makan dan  minum  bebas  selama  satu  minggu  sebelum perlakuan. Hewan coba dibagi menjadi tujuh kelompok. Induksi  hipoksia  dilakukan  dengan  memasukkan  tikus ke dalam kandang khusus hipoksia (makan dan minum bebas) yang dialiri gas N 2 90 % dan 10% gas O 2 selama seminggu.  Kondisi  tikus  dikontrol  setiap  hari. Konfirmasi tikus hipoksia dilakukan dengan
pengambilan  darah  arteri  untuk  diperiksa  analisis  gas darah. Pemeriksaan dilakukan di laboratorium Patologi Klinik RSCM. Setelah induksi hipoksia selama seminggu dilakukan  reoksigenasi  selama  2  jam.  Selama  satu minggu  berikutnya  setiap  kelompok  diberi  perlakuan setiap  hari  selama  7  hari.  Tikus  dibagi  secara  acak  ke dalam 7 kelompok: 1)  Tikus normal; 2)  Kontrol negatif hanya  diberi  air;  3)  Kombinasi  ekstrak  AI  200 mg/kgBB+CA150  mg/kgBB;  4)  Kombinasi  AI  250 mg/kgBB+CA 100mg/kgBB; 5) Ekstrak AI 250 mg/kgBB; 6) Ekstrak CA 150 mg/kgBB;

## Pengukuran MDA
Pengukuran  kadar  MDA,  digunakan  homogenat jantung (50-100 mg jaringan jantung dalam PBS 0,1 M pH 7,2) dan plasma. Homogenat yang sudah diencerkan ditambah asam
trikarboksilat
10% untuk
mengendapkan protein, kemudian dilakukan sentrifugasi  5000  rpm  selama  10  menit.  Supernatan diambil  dan  dipindahkan,  kemudian  ditambahkan  TBA 0,67% dan diinkubasi pada suhu 96ºC selama 10 menit. Dinginkan  pada  suhu  ruang.  Serapan  diukur  pada panjang  gelombang  530  nm  dibandingkan  dengan serapan  standar  MDA  dengan  konsentrasi  0;  0,3125; 0,625; 1,25; 2,5  dan  3,75 nmol/mL.  Pemeriksaan MDA dilakukan  secara  duplo.  Kadar  MDA  dinyatakan  dalam satuan nmol/mg jaringan jantung (Jusman 2010).
Ekspresi HIF-1 α dan cTnI Ekspresi  HIF-1 α jantung  dilakukan  melalui analisis  relatif  mRNA  HIF-1 α dengan  cara  isolasi  RNA, Pengukuran konsentrasi dilakukan dengan meggunakan Spektrofotometer  pada λ 260  nm  dan  280  nm  untuk menilai  kemurnian  RNA.  Amplifikasi  cDNA  dengan menggunakan  alat  Real  Time  PCR.  Dengan  Real  Time PCR  dapat  ditentukan  jumlah  salinan  cDNA  hasil amplifikasi  yang  menggambarkan  ekspresi  gen  HIF-1  secara  kuantitatif.  Gen  β  Actin  digunakan  sebagai standar  eksternal.  Amplifikasi  gen  β  Actin  dilakukan
dengan kondisi yang sama dengan gen HIF- 1α. Dengan Real  Time  PCR  diperoleh  nilai  efisiensi  dan Cycle Threshold /C(t).  Analisis  ekspresi  gen  dinilai  secara “ relative quantification ” sehingga diperoleh nilai kadar relatif  mRNA,  dengan  menggunakan  metode  Livax (Livak 2001).
Pemeriksaan  aktivitas  enzim Superoxide  Dismutase (SOD)
Aktivitas  SOD  ditentukan  secara  biokimia  sesuai metode  Misra  dan  Fridovich  (Misra  &  Fridovich  1972) dengan  cara  mengukur  hambatan  auto  oksidasi epinefrin menjadi adenokrom dalam pH basa (pH 10,2) dan  diukur  serapannya  pada  panjang  gelombang  480 nm. SOD dinyatakan dalam unit/mg protein.

## Analisis Data
Data  ekspresi  mRNA  HIF- 1α,  kadar  MDA, aktivitas  enzim  SOD,  dan  ekspresi  cardiac  troponin  I (cTnI)  yang  diperoleh  dianalisis  dengan  uji one  way ANOVA  diikuti  dengan  analisis post-hoc dimana perbedaan  dianggap  bermakna  secara  statistik  bila p<0,05.  Jika  distribusi  dan  varians  data  tidak  normal maka  dilakukan  transformasi  data  dahulu  namun  bila tetap  tidak  normal  analisis  data  menggunakan  uji Kruskal  Wallis  dilanjutkan  dengan  analisis  post-hoc Mann  whitney.  Melakukan  uji  korelasi  Pearson  antara data MDA dan SOD serta antara data mRNA HIF- 1α dan mRNA cTnI.

## Hasil Penelitian
Seluruh  tikus  tidak  mengalami  perubahan  berat badan  yang  bermakna  selama  induksi  hipoksia  dan perlakuan.

## Perubahan ekspresi mRNA HIF-1a
Hasil  analisis  statistik  ekspresi  mRNA  HIF- 1α diperoleh  peningkatan  bermakna  antar  kelompok perlakuan  (p<0,05).  Kelompok  B,  C,  D,  E  dan  F
Tabel 1. Susunan Basa Primer
HIF- 1α Forward 5’ -AATCCATTTTCAGCTCAGGAC- 3’ Reverse 5’ -GGCAGTGACAGTGATGGTAGG- 3’ cTnI Forward 5’ -TTGAAGAGCTTCAGGACCTA- 3’ Reverse 5’ -CAGTGATGTTCTTGGTGACT- 3’ Β -aktin Forward 5’ -TGTTGTCCCTGTATGCCTCT- 3’ Reverse 5’ -TAATGTCACGCACGATTTCC- 3’
didapatkan  perbedaan  tidak  bermakna  dibanding kelompok A (p>0,05). Terdapat peningkatan bermakna pada  kelompok  D,  E  dan  F  dibanding  kelompok  B (p<0,05)  serta  antara kelompok  E  dibanding  kelompok C.

## Aktivitas Enzim SOD dan Kadar MDA Jantung
Rasio  aktivitas  enzim  SOD  dan  kadar  MDA jantung  dihitung  dengan  membagi  seluruh  kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol sehingga didapatkan grafik sesuai gambar 3 dan 4. Hasil analisis statistik  rasio  aktivitas  enzim  SOD  didapatkan peningkatan  bermakna  antara  kelompok  B  (p=0,000)
dan  E  (p=0,010)  dibanding  kelompok  A.  Kelompok  C (p=0,000),  D  (p=0,000),  E  (p=0,000)  dan  F  terjadi penurunan  yang  bermakna  dibanding  kelompok  B. Kelompok  B  (p=0,000)  dan  E  (p=0,004)  meningkat secara bermakna dibanding kelompok F. Dari data rasio kadar  MDA  jantung  dibanding  kontrol  dilakukan  uji kemaknaan  Kruskal  Wallis.  Hasil  analisis  statistik  rasio kadar  MDA  jantung  didapatkan  tidak  terdapat perbedaan  bermakna  antar  kelompok  perlakuan (p=0,133).

## Pemeriksaan kadar MDA plasma
Terdapat  perbedaan  bermakna  antara  seluruh
Gambar 3. Rasio kadar SOD jantung. Data disajikan sebagai rasio terhadap kontrol.
Gambar 4. Rasio kadar MDA jantung. Data disajikan sebagai rasio terhadap kontrol.
kelompok  perlakuan  dibanding  kelompok  normal (p<0,05). Kelompok  B, C dan D didapatkan kadar MDA dalam plasma lebih rendah secara bermakna dibanding kelompok  A(p<0,05).  Kelompok  E  dan  F  menunjukkan kadar  MDA  yang  lebih  tinggi  secara  bermakna dibanding  kelompok  A  (p<0,05).  Antar  kelompok  B,  C dan  D  tidak  didapatkan  perbedaan  yang  bermakna (p>0,05).
Pemeriksaan ekspresi gen cardiac Troponin I (cTnI) Cardiac  Troponin  I telah  digunakan  secara  luas sebagai penanda kerusakan miokardium. Untuk melihat perubahan  ekspresi  mRNA  cTnI  pada  jantung  tikus
akibat  hipoksia  sistemik  selama  tujuh  hari  dan pengaruh  pemberian  kombinasi  ekstrak  etanol Acalypha  indica dan Centella  asiatica dilakukan pemeriksaan  ekspresi  mRNA  cTnI  dengan Real  Time PCR.  Hasil  analisis  statistik  diperoleh  pada  pemberian perlakuan  ekstrak  tanaman Acalypha  indica dan Centella  asiatica kombinasi  maupun  tunggal  serta pemberian  vitamin  C  tidak  memberikan  perbedaan yang bermakna dibanding tikus hipoksia yang diberi air (p>0,05). Terdapat peningkatan bermakna kelompok D, E  dan  F  dibanding  kelompok  B.  Ekspresi  cTnI  pada kelompok  E  berbeda  secara  signifikan  dibanding kelompok C.
Gambar 5. Kadar  MDA  plasma  tikus  pascahipoksia.  Data  disajikan  dalam  nilai  rerata.  *)  berbeda bermakna  dibanding  kelompok  K;  #)  berbeda  bermakna  dibanding  kelompok  A.
Gambar 6. Perubahan Ekspresi gen cTnI. Data disajikan sebagai nilai median dan grafik boxplot . Box (garis bawah : nilai min, garis tengah : median, garis atas : nilai max).

## Pembahasan
Model  eksperimental  yang  dilakukan  adalah dengan  menginduksi  hipoksia  secara  sistemik  pada tikus  selama  7  hari.  Kondisi  hipoksia  telah  dilakukan konfirmasi  dengan  pemeriksaan  analisis  gas  darah. Tikus  yang  diinduksi  hipoksia  selama  tujuh  hari  dan hanya diberi air didapatkan ekspresi HIF- 1α rendah. Hal ini  disebabkan  karena  tikus  dipindahkan  ke  kandang biasa  untuk  mendapatkan  perlakuan.  Dalam  kandang normoksia,  HIF- 1α  akan  terdegradasi  oleh  proteasom. Prolyl  hydroxylase (PHD-2)  dan  von  Hippel-Lindau tumor  supresor  (pVHL)  adalah  kompleks  protein  yang berperan dalam degradasi HIF- 1α (Septelia et al. 2009). Kelompok  tikus  yang  diberikan  perlakuan kombinasi ekstrak Acalypha indica dan Centella asiatica mengalami  penurunan  ekspresi  HIF- 1α  dibanding kelompok  tikus  hipoksia  yang  hanya  diberi  air.  Pada kelompok  kombinasi Acalypha  indica 200  mg/kg  dan Centella  asiatica 150  mg/kg  menunjukkan  penurunan secara  bermakna  sedangkan  kelompok  kombinasi Acalypha  indica 250  mg/kg  dan Centella  asiatica 100 mg/kg  menunjukkan  penurunan  yang  tidak  bermakna. Hal ini dapat disebabkan aktivitas antioksidan senyawa dalam  tanaman  tersebut.  Jika  ROS  yang  terbentuk dapat  dinetralisasi  sehingga  enzim  PHD  akan  bekerja secara optimal dan akan mengakibatkan degradasi HIF- 1α.  Gambaran  ini  juga  dapat  di akibatkan  kandungan flavonoid  dalam  tanaman  tersebut  karena  telah dibuktikan  oleh  peneliti  lain  bahwa  flavonoid  dapat menghambat  aktivitas  HIF- 1α  dengan  merusak fosforilasi HIF- 1α tergantung MAPK sehingga menurunkan akumulasi HIF- 1α pada nucleus (Kohen et al. 2002).  Pada  pemberian  ekstrak  tunggal Acalypha indica atau Centella asiatica serta vitamin C didapatkan peningkatan  ekspresi  HIF- 1α  secara  tidak  bermakna dibanding tikus hipoksia yang diberi air. Flavonoid telah terbukti  dapat  mengikat  zat  besi  yang  merupakan kofaktor  enzim  PHD  pada  kondisi  normoksia  sehingga menyebabkan akumulasi HIF- 1α (Alle 2012;
Triantafyllou et al. 2008).
Peneliti lain yang memeriksa ekspresi mRNA HIF- 1α  pada  organ  ginjal  didapatkan  kelompok  hipoksia diberi  air  lebih  tinggi  dibanding  kelompok  normal. Kelompok  tikus  yang  diberi  kombinasi  ektrak didapatkan  menurun  secara  signifikan  dibanding kelompok hipoksia diberi air. Tidak terdapat perbedaan bermakna  pada  kelompok  yang  diberi  ekstrak  tunggal dan vitamin C dibanding kelompok hipoksia diberi air.
Kadar  MDA  plasma  pada  kelompok  yang diinduksi  hipoksia  lebih  tinggi  secara  signifikan dibanding  kelompok  tikus  normal.  Peningkatan  kadar MDA  ini  diakibatkan  oleh  peningkatan  jumlah  ROS. Hipoksia  meningkatkan  pembentukan  dan  pelepasan ROS  dari  dalam  mitokondria  kemudian  ROS  bereaksi dengan membran sel yang terdiri atas poly unsaturated fatty  acid disebut  proses  peroksidasi  lipid.  MDA merupakan  hasil  akhir  peroksidasi  lipid  (Jusman  2010; Livak 2001; Richard et al. 2010). Peningkatan ROS dapat diatasi  dengan  sistem  antioksidan  endogen  termasuk superoxide  dismutase (SOD).  SOD  merupakan  enzim yang  berinteraksi  langsung  dengan  ROS  dan  dapat melindungi sistem biologi. Enzim ini mampu melakukan dismutasi  radikal  superoksida  menjadi  H 2 O 2 secara spontan.  Produk  reaksi  dismutasi  H 2 O 2 dapat  dibuang oleh  aktivitas  enzim  katalase  dan  enzim  peroksidase lain termasuk glutation peroksidase (Juswan 2010).
O 2 • - + O 2 • - H 2 O 2 + O 2 Aktivitas  kompensasi  ini  dapat  melindungi PUFA  sehingga  molekul  ini  tidak  mengalami  oksidasi oleh  radikal  oksigen  pada  tahap  hipoksia  lebih  lanjut (Enikarmila et  al 2009  ).  Pada  penelitian  ini  rasio aktivitas enzim SOD pada kelompok tikus hipoksia yang diberi ekstrak kombinasi Acalypha indica 200 mg/kgBB dan Centella  asiatica 150  mg/kgBB  didapatkan  lebih tinggi  secara  bermakna  dibanding  kelompok  hipoksia yang  hanya  diberi  air.  Namun  kondisi  ini  tidak  dapat mengatasi peningkatan zat-zat oksidan dengan ditandai rasio  kadar  MDA  jantung  yang  lebih  tinggi  yang  tidak bermakna  dibanding  kelompok  hipoksia  yang  hanya diberi  air.  Kadar  MDA  plasma  tikus  hipoksia  dengan pemberian  ekstrak  kombinasi  ini  didapatkan  lebih rendah secara bermakna dibanding kelompok hipoksia dan  diberi  air.  Pemberian  kombinasi  ekstrak Acalypha indica 200 mg/kgBB dan Centella asiatica 150 mg/kgBB tidak  dapat  mengatasi  peningkatan  ROS  pada  miosit jantung.  Hal  ini  dapat  terjadi  karena  aktivitas antioksidan  senyawa-senyawa  dalam  ektrak  tanaman yaitu polifenol, flavonoid, β -karoten dan tannin, namun senyawa  yang  memiliki  aktivitas  antioksidan  dapat membentuk  prooksidan.  Sesuai  dengan  penelitian Fukumoto  dan  Mazza  (2000)  yang  meneliti  aktivitas prooksidan pada ekstrak berry termasuk senyawa fenol yang  memiliki  aktivitas  prooksidan  pada  konsentrasi rendah. Kondisi ini juga dapat terjadi karena campuran beberapa senyawa flavonoid selain dapat memberikan efek  sinergistik  juga  dapat  memberikan  efek  yang
SOD
berlawanan.  Seperti  pada  campuran  flavonoid  dari ekstrak Ginko biloba (EGb761) dengan pycnogenol (pyc) yang memiliki efek antioksidan tetapi tidak memberikan  efek  protektif  pada  aktivitas  Ca 2+ -ATPase (Lubica 2011).
Pada  pemberian  kombinasi  ekstrak Acalypha indica 250 mg/kgBB dan Centella asiatica 100 mg/kgBB dapat menurunkan kadar MDA plasma secara signifikan dibanding kelompok tikus hipoksia dan diberi air. Rasio MDA  jantung  lebih  rendah  yang  tidak  bermakna  dan rasio  aktivitas  enzim  SOD  lebih  tinggi  yang  tidak bermakna  dibanding  kelompok  tikus  hipoksia  dan diberi  air.  Pemberian  ekstrak  tunggal Acalypha  indica 250  mg/kgBB  didapatkan  rasio  kadar  MDA  jantung lebih rendah yang tidak bermakna dibanding kelompok tikus  hipoksia  sesuai  dengan  penurunan  kadar  MDA plasma  namun  peningkatan  rasio  aktivitas  enzim  SOD tidak  terjadi  secara  signifikan.  Hal  ini  sesuai  dengan penelitian  Matthew et  al. (2011),  yang  mengukur peroksidasi  lipid  dan  enzim  SOD  pada  tikus  yang diinduksi  paracetamol  dan  diberi  perlakuan  ekstrak etanol Acalypha indica 100 mg/kgBB per oral selama 5 hari.  Hasilnya  didapatkan  kadar  MDA  lebih  rendah secara  signifikan  dibanding  tikus  yang  tidak  mendapat ekstrak Acalypha indica . Kondisi ini dapat terjadi karena aktivitas  antioksidan  senyawa-senyawa  yang  terdapat dalam tanaman tersebut. Telah banyak diteliti aktivitas Acalypha  indica dan Centella  asiatica sebagai antioksidan  karena  mengandung  flavonoid  dan  fenol yang  merupakan  senyawa  yang  berperan  sebagai antioksidan  (Mijanur et  al. 2013;  Duangsuree et  al. 2012; Durga et al. 2009; Rajeswara et al. 2011; Hashim 2011; Viswanatha et al. 2011).
Pada  kelompok  tikus  yang  diberikan  ekstrak tunggal Centella  asiatica 150  mg/kgBB  didapatkan penurunan  rasio  kadar  MDA  homogenat  jantung  yang tidak  bermakna  dan  peningkatan  MDA  plasma  yang signifikan.  Rasio  aktivitas  SOD  lebih  tinggi  secara bermakna  dibandingkan  tikus  hipoksia  yang  hanya diberi air.
Viswanatha et  al. (2011),  telah  meneliti  efek kardioprotektif  asam  askorbat  pada  tikus  yang diinduksi  doksoribisin  dan  didapatkan  bahwa  asam askorbat yang diberikan 20 mg/kgBB secara oral dapat melindungi  miokardium  dengan  meningkatkan  kadar antioksidan SOD, GSH, dan CAT dan menurunkan kadar MDA  secara  signifikan.  Namun  pada  penelitian  ini kelompok  tikus  hipoksia  yang  diberi  vitamin  C didapatkan rasio kadar MDA jantung lebih rendah yang
tidak  signifikan  dan  kadar  MDA  plasma  lebih  tinggi signifikan  dibanding  kelompok  tikus  hipoksia  yang hanya diberi air, sedangkan aktivitas SOD lebih rendah yang  tidak  bermakna.  Vitamin  C  secara  umum berfungsi  sebagai  antioksidan,  tetapi  vitamin  C  juga dapat  membentuk  prooksidan  dengan  mengubah radikal  bebas  menjadi  hidrogen  peroksida.  Hidrogen peroksida  dapat  merusak  membran  sel  dan  DNA  jika tidak  dinetralisasi  oleh  enzim  katalase. 30 Vitamin  C merupakan  agen  pereduksi  kuat  yang  membentuk radikal  askorbat  sebagai  pada  proses  oksidasi  (AscH - + X • - →  Asc •– +  XH).  Asc • - memiliki  elektron  yang  tidak berpasangan  dan  dapat  membentuk  superoksida  pada level  rendah.  Asc • - dapat  direduksi  kembali  menjadi askorbat  oleh  sistem  enzim.  Terdapat  variasi konsentrasi  sehingga  terjadi  perubahan  prooksidan menjadi antioksidan. Hal ini dapat dipengaruhi adanya logam  katalis  yang  menginisiasi  oksidasi  rantai  radikal (Garry  &  Beth  1996).  Kondisi  hipoksia  kemungkinan menyebabkan  penurunan  kemampuan  enzim  katalase dalam  mengatasi  prooksidan  yang  terbentuk  oleh vitamin C.
Peneliti  lain  yang  menguji  organ  ginjal  dari penelitian  utama  didapatkan  hasil  bahwa  kombinasi ekstrak Acalypha  indica 250  mg/kgBB  dan Centella asiatica 100  mg/kgBB  serta  ekstrak  tunggal Acalypha indica 250 mg/kgBB dan Centella asiatica 150 mg/kgBB didapatkan  kadar  MDA  homogenat  ginjal  menurun secara  signifikan  dibanding  kelompok  hipoksia  yang hanya diberi air, sedangkan ekstrak kombinasi tanaman Acalypha indica 200 mg/kgBB dan Centella asiatica 150 mg/kgBB  didapatkan  kadar  MDA  menurun  tidak signifikan.  Pemberian  vitamin  C  juga  menyebabkan peningkatan  MDA  homogenat  ginjal  (Nurfitri  2015). Berbeda  dengan  kadar  MDA  homogenat  hati,  kadar MDA  setelah  pemberian  ekstrak  kombinasi Acalypha indica 200 mg/kgBB dan Centella asiatica 150 mg/kgBB didapatkan  lebih  rendah  secara  signifikan  dibanding kelompok  tikus  hipoksia  diberi  air,  sedangkan kelompok  tikus  yang  diberikan  ekstrak  kombinasi Acalypha indica 250 mg/kgBB dan Centella asiatica 100 mg/kgBB didapatkan MDA homogenat hati lebih tinggi dibanding kelompok hipoksia. Ekstrak tunggal Acalypha indica 200 mg/kgBB dan Centella asiatica 150 mg/kgBB serta  vitamin  C  dapat  menurunkan  kadar  MDA  hati tetapi  tidak  berbeda  bermakna  dibanding  kelompok hipoksia  yang  diberi  air  (Agnes  2015).  Variasi  hasil pengukuran  kadar  MDA  antar  organ  ini  dapat
disebabkan  aliran  darah  dan  kemampuan  regenerasi masing-masing organ berbeda.
Cardiac  troponin I  merupakan  protein  yang dilepaskan  ketika  kardiomiosit  mengalami  kerusakan. Protein ini telah digunakan sebagai penanda kerusakan sel  miokardium  dengan  sensitivitas  tinggi  (Xun et  al. 2011).  Jean et  al. (1999),  menginduksi  tikus  dengan hipoksia  60  menit  kemudian  direoksigenasi.  Setelah induksi  hipoksia  selama  60  menit  didapatkan konsentrasi cardiac troponin I dalam plasma meningkat signifikan  dibanding  pada  kondisi  normoksia.Jika terdapat  kerusakan  pada  kardiomiosit  troponin  I  akan meningkat  dan  bertahan  selama  7-14  hari  pada sirkulasi darah (Stillman et al. 2011). Pada penelitian ini tidak  diukur cardiac  troponin I  pada  plasma  karena plasma  telah  digunakan  untuk  mengukur  parameter oleh  peneliti  lain.  Kelompok  tikus  yang  diinduksi hipoksia  selama  7  hari  didapatkan  ekspresi  gen  cTnI rendah.  Hal  ini  dapat  terjadi  jika  miosit  jantung mengalami kerusakan troponin I dilepaskan ke sirkulasi darah atau mengalami degradasi. Stres oksidatif dapat menyebabkan  perubahan  homeostasis  kalsium.  Pada peningkatan  konsentrasi  kalsium,  protease  I  yang diaktivasi  kalsium  (kalpain  I)  menjadi  teraktivasi. Aktivasi  kalpain  I  dapat  merusak  target  protein termasuk troponin I. Troponin yang bertanggung jawab pada interaksi antara aktin dan miosin akan mengalami proteolisis  oleh  kalpain  I  sehingga  menyebabkan kerusakan  kontraksi  dan  relaksasi. 37 Pemberian kombinasi  ekstrak  tanaman Acalypha  indica 200 mg/kgBB  dan Centella  asiatica 150  mg/kgBB  serta pemberian  ekstrak  tunggal Centella  asiatica 150 mg/kgBB    dan  vitamin  C  didapatkan  ekspresi  mRNA cTnI  lebih  rendah  tetapi  tidak  bermakna  dibanding kelompok hipoksia diberi air (p>0,05). Kondisi ini dapat terjadi  karena  efek  antioksidan  tersebut  tidak  mampu menetralisir  ROS  sehingga  menyebabkan  terjadinya kerusakan miosit jantung.
Pemberian kombinasi ekstrak tanaman Acalypha indica 250 mg/kgBB dan Centella asiatica 100 mg/kgBB serta  ekstrak  tunggal Acalypha  indica 250  mg/kgBB didapatkan  ekspresi  mRNA  cTnI  lebih  tinggi  dibanding tikus  hipoksia  diberi  air.  Pada  penelitian  ini  tikus mendapat  induksi  hipoksia  selama  7  hari  kemudian dipindahkan  ke  kandang  normoksia  untuk  mendapat perlakuan,  sehingga  aktivitas  antioksidan  yang menetralisir  ROS  dan  melindungi  kardiomiosit  dari kerusakan.  Kondisi  ini  juga  dapat  terjadi  karena hipoksia  dapat  mempengaruhi  ekspresi  cTnI.  Karena
HIF- 1α  yang  stabil  pada  kondisi  hipoksia  merupakan faktor  transkripsi  yang  mengaktivasi  ekspresi  gen sebagai respon adaptif terhadap hipoksia.

## Simpulan
Kesimpulan yang dapat diambil dari penelitian ini adalah  pemberian  kombinasi  ekstrak  etanol Acalypha indica 200 mg dan Centella asiatica 150 mg pada tikus Spraque-Dawley pascahipoksia  dapat  meningkatkan enzim Superoxide  Dismutase (SOD)  secara  bermakna akibat  kerusakan  jaringan  jantung  dibandingkan pemberian  kombinasi Acalypha  indica 250  mg  dan Centella  asiatica 100  mg  maupun  ekstrak  tunggal Acalypha  indica 250  mg/kgBB  atau Centella  asiatica 150  mg/kgBB.  Pemberian  kombinasi  ekstrak  etanol Acalypha  indica dan Centella  asiatica pada  tikus Spraque-Dawley pascahipoksia tidak dapat menurunkan produksi malondialdehid akibat kerusakan jaringan  jantung  pascahipoksia  selama  7  hari. Pemberian  kombinasi  ekstrak  etanol Acalypha  indica dan Centella  asiatica pada  tikus Spraque-Dawley pascahipoksia tidak dapat menurunkan ekspresi mRNA HIF-1 α akibat  kerusakan  jaringan  jantung . Pemberian kombinasi ekstrak  etanol Acalypha indica dan Centella asiatica pada tikus Spraque-Dawley pascahipoksia tidak dapat  meningkatkan  ekspresi  mRNA Troponin-I (cTnI) akibat kerusakan jaringan jantung .

## Saran
Penelitian  ini  masih  ada  kekurangan  dan memerlukan informasi yang lebih lengkap. Saran untuk penelitian  selanjutnya  adalah  pemeriksaan  HIF-1a  dan cTnI  segera  setelah  induksi  hipoksia  selama  7  hari untuk membandingkan sebelum dan sesudah perlakuan,  perlu  pemeriksaan  untuk  membandingkan ekspresi  mRNA  cTnI  pada  homogenat  jantung  dengan kadar  troponin  I  dalam  plasma,  membandingkan ekspresi mRNA HIF-1a dengan protein HIF-1a dan perlu penelitian  lebih  lanjut  terhadap  kerusakan  jantung secara histopatologi.

## Daftar Pustaka
Agnes  F.  2015.  Kajian  efek  antioksidan  kombinasi ekstrak  etanol  Acalypha  Indica  dan  Centella Asiatica  pada  fungsi  hati  tikus  Spraque-Dawley pascahipoksia sistemik [tesis]. Universitas Indonesia: Jakarta. Publ.in progress.
Aline  B,  Julia  BS,  Dieter  S,  Daniela  F,  Thomas  K.  2010. The  antioxidant  quercetin  inhibits  cellular
proliferation  via  HIF-1-dependent  induction  of p21WAF. Antioxidants  &  Redox  Signaling . 13(4):437-48.
Alle B. 2012. 1,25-dihydroxyvitamin D regulation of von Hippel-Lindau (VHL), prolyl hydroxylase 2 (PHD2) in  MCF10A  breast  epithelial  cells  containing  the Harvey-Ras-Oncogen  [thesis]  The  College  of Health  and  Human  Sciences.  Indiana  (:  Purdue University.
Anirban M, Sunanda M, Rituparna B, Anindita B. 2013.
In  vitro  assay  of  antioxidant  and  antibacterial activity  of  leaf  extract  and  leaf  derived  callus extract of Acalypha indica L. International Journal of Pharma Bio Sciences . 3(1):504-10.
Bernhard  B,  Jie  Z.  2007.  Nitric  oxide  and  superoxide:
Interference with hypoxic signaling.
Cardiovascular Research . 75:275-82.
Casciari  JJ,  Riordan  NH,  Schmidt  TL,  Meng  XL,  Jackson JA,  Riordan  HD.  2001.  Cytotoxicity  of  ascorbate, lipoic acid, and other antioxidants in hollow fibre in  vitro  tumours. British  Journal  of  Cancer . 84(11):1544-50.
Duangsuree  S,  Wirat  N,  Boonsom  L,  et  al.  2012. Antioxidant and Anticancer Activities from Aerial Parts of Acalypha indica Linn. Journal of Natural Science . 11(2):157-68.
Durga KR, Karthikumar S, Jegatheesan K. 2009. Isolation of  potential  antibacterial  and  antioxidant compounds  from  Acalypha  indica  and  Ocimum basilicum. Journal  of  Medicinal  Plants  Research . 3(10):703-6.
Enikarmila  A,  Indriati  P,  Ani  RP,  Septelia  IW,  Sri  WAJ,
Mohamad  S.  2009.  Malondialdehyde,  reduced glutathione,  and  catalase  activity  of  rat  kidney tissue  in  chronic  hypoxia.  Majalah  Kedokteran Indonesia. 59(12):596-600.
Farida  S,  Krisnamurti  DGB,  Sianipar  I,  Mudjihartini  N. 2010.  Efek  neuroterapi  kombinasi  ekstrak  akar kucing (Acalypha Indica L) dan pegagan (Centella asiatica L) pada sel neuron tikus Sprague Dawley pascahipoksia. Forthcoming 2010.
Garry  RB,  Beth  AJ.  1996.  Catalytic,  ascorbate  and  free radicals:  Combinations  to  avoid. Radiation Research . 145:532-41.
Hashim P. 2011. Centella asiatica in food and beverage applications  and  its  potential  antioxidant  and neuroprotective  effect. International  Food Research Journal . 18(4): 1215-22.
Jean  PB,  Anne  P,  Emmanuelle  R,  Nadia  S,  Pascale  FP, Sophie  P,  et  al.  1999.  Time  course  of  cardiac troponin  I  release  from  isolated  perfused  rat hearts during hypoxia/reoxygenation and ischemia/reperfusion. Clinica  Chimica  Acta . 283:43-56.
Jusman  SW.  2010.  Respons  jaringan  hati  terhadap hipoksia  sistemik  kronik  :  regulasi  ekspresi  gen sitoglobin  oleh  hypoxia-inducible  factor-1a [disertasi]. Jakarta: Universitas Indonesia
Kohen R, Nyska A. 2002. Oxidation of biological system:
Oxidative  stress  phenomena,  antioxidant,  redox reaction,  and  methods  for  their  quantification.
Toxicologic pathology . 30(6):620-650.
Livak  KJ.  2001.  Analysis  of  Relative  Gene  Expression Data  Using  Real-Time  Quantitative  PCR  and  the 2- ΔΔCT Method. Methods . 25:402 – 408 LR Fukumoto, G Mazza. 2000. Assesing antioxidant and prooxidant  activities  of  phenolic  Compounds. Journal Agriculture Food Chemistry . 48:3597-604. Lubica  H.  2011.  Flavonoids  in  prevention  of  diseases with respect to modulation of Ca-pump function .
Interdisciplinary Toxicology . 4(3):114-24.
Mathew  M,  Nair  C,  Sheoy  T,  Varghese  J.  2011.
Preventive  and  curative  affects  of  Acalypha indica on
acetaminophen-induced hepatotoxicity. International  Journal  of  Green Pharmacy . 5:49-54.
Michael PM. 2009. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochemical Journal . 417:1-13. Mijanur  R,  Hossain  S,  Rahaman  A,  Fatima  N,  Nahar  T,
Uddin  B,  et  al.  2013.  Antioxidant  activity  of Centella  asiatica  (Linn.)  urban,  impact  of extraction solvent polarity. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry . 1(6):27-32. Misra  HP,  Fridovich  I.  1972.  Substances  of  low molecular  weight:  The  role  of  superoxide  anion in  the  autoxidation  of  epinephrine  and  a  simple assay  for  superoxide  dismutase. The  Journal  of Biological Chemistry . 247:3170 – 5.
Nurfitri.  2015.  Efek  kombinasi  ekstrak  akar  Acalypha Indica  L.  dan  herba  Centella  Asiatica  L.  pada beberapa  parameter  biokimia  dan  histopatologi ginjal tikus Sprague-Dawley pascahipoksia [tesis]. Universitas Indonesia: Jakarta. Publ.in progress.
Pooja  A,  Malathi  N,  Chamudeeswari  D,  Dinesh  MG. 2014.  In  vitro  antioxidant  activity  of  ethanolic extracts  of  Centella  asiatica  L,  Oregano  vulgare sub.sp  hirtum  and  Ocimum  basilicum  L.  Via  five
model  systems. Indian  Journal  of  Research  in Pharmacy and Biotechnology . 2(3):1230-6.
Rajeswara  RP,  Venkatesh  V,  Sambasiva  RE,  Praneth VSP.  2011.  Phytochemical  investigation  and  in vitro  anti  oxidant,  antimicrobial  activity  of different fractions of Acalypha Indica. International Journal of Pharmacy and
Pharmaceutical Sciences . 3(4):314-7.
Richard M, Vinay K, Abul KA, Nelson F. 2010. Buku Saku Dasar  Patologi  Penyakit.  7th  edition.  Jakarta: EGC.  Available  in  books.google.co.id/.  Diunduh tanggal 7 Februari 2015.
Sanseera  D,  Niwatananun  W,  Liawruangrath  B, Liawruangrath  S,  Baramee  A,  Trisuwan  K,  et  al. 2012.  Antioxidant  and  anticancer  activities  from aerial  parts  of  Acalypha  indica  Linn. Journal  of Natural Sciences . 11(2):157-68.
Scott  MW,  Meg  S.  2008.  Cardiac  troponin .  Journal  of
Veterinary  Emergency and Critical Care . 18(3):235-45.
Septelia IW, Syarifah D, Reni P. 2009.  Ekspresi relative mRNA HIF-1a pada jantung, otak dan darah tikus selama  induksi  hipoksia  sistemik. Makara .
13(2);185-8.
Shanmugapriya  R,  Ramathan  T,  Thirunavu  P.  2011. Evaluation of antioxidant potential and antibacterial  activity  of  Acalypha  indica  Linn. using in vitro model. Asian Journal of Biomedical and Pharmaceutical Sciences .
Stillman AE, Oudkerk M, Bremerich J, Esteves FP, Garcia EV,  Gutberlet  M,  et  al.  2011.  Assessment  of acute  myocardial  infarction:  current  status  and recommendations  from  the  North  American Society  for  cardiovascular  imaging  and  the European  Society  of  Cardiac  Radiology. The International  Journal  of  Cardiovascular  Imaging . 27:7-24.
Triantafyllou A, Mylonis I, Bonanou S, Tsakalof A. 2008. Flavonoid  induce  HIF-1alpha  but  impair  its nuclear  accumulation  and  activity. Free  Radical Biology & Medicine Journal . 44(4):657-70. Van DL. 2002. Hypothesis: troponin degradation is one of the factors responsible for deterioration of left ventricular function in heart failure. Cardiovascular Research . 56:8-14.
Vasantharuba  S,  Banumathi  P,  Premalatha  MR, Sundaram  SP,  Arumugam  T.  2012.  Functional properties  of  Centella  asiatica  (L.):  A  review.
International Journal of Pharmacy &
Pharmaceutical Sciences. 4(5):8-14.
Viswanatha  S,  Wangikar  U,  Manjula  DV.  2011. Cardioprotective  effect  of  ascoric  acid  on doxorubicin  induced  myocardial  toxicity  in  rats. Indian Journal of Pharmacology . 43(5):507-11. Xun L, James T, Else ML, Suleiman MS. 2011. Marianne. Immediate hypothermia reduces cardiac troponin I following hypoxic-ischemic encephalopathy  in  newborn  pigs. Pediatric
Research . 70(4).