EFEK  PEMBERIAN ARTEMISIN DAN MINYAK BUAH MERAH ( Pandanus conoideus ) TERHADAP PRODUKSI REACTIVE OXYGEN INTERMEDIATE SEL MAKROFAG PERITONEUM MENCIT DIINFEKSI MALARIA
Rahmad*  , Agustina Tri Endharti**,  Loeki Enggar Fitri**

## Abstrak
Kerusakan  jaringan  hospes  yang  terinfeksi  malaria  dapat  disebabkan  oleh  radikal  bebas  yang dihasilkan akibat  respons imun yang berlebihan dan mekanisme kerja artemisin. Kandungan beta-karoten dan  tokoferol  yang  tinggi  dalam  minyak  buah  merah  berfungsi  sebagai  antioksidan  dan  imunostimulator. Penelitian ini bertujuan mengetahui pengaruh terapi kombinasi artemisin dan minyak buah merah terhadap pembentukan reactive  oxygen  intermediate (ROI)  oleh  makrofag.  Sebagai  model  malaria  digunakan Plasmodium berghei yang diinfeksikan ke mencit Balb/C secara intraperitoneal. Sampel  terdiri dari kelompok mencit normal, mencit yang diinfeksi P. berghei (kontrol positif), mencit yang diinfeksi P. berghei dan diterapi artemisin 0,0364 mg/gBB peroral, mencit yang diinfeksi P. berghei dan mendapat artemisin 0,0364 mg/gBB serta minyak buah merah (dosis 16,5μL/mencit,  49μL/mencit, dan 97,5μL/mencit).  Didapatkan penurunan parasitemia  pada  kelompok  mencit  yang  diterapi  dengan  artemisin  serta  kombinasi  artemisin  dan  minyak buah merah pada hari ke-3. Keadaan ini diikuti dengan rendahnya jumlah sel makrofag yang memproduksi ROI yaitu pada kelompok yang mendapat artemisin saja maupun kombinasinya dengan minyak buah merah dosis 16,5 μL/mencit, dan dosis 49 μL/mencit dibanding kelompok kontrol positif (berturut-turut p = 0,003; p = 0,007; p = 0,003), kecuali pada mencit dosis 97,5 μL yang menunjukkan setara dengan kontrol positif (p = 0,822). Pada hari ke-5, jumlah sel makrofag yang memproduksi ROI lebih rendah pada kelompok kombinasi artemisin  dan  minyak  buah  merah  dosis  49  μL/mencit,  dan  dosis  97,5  μL/mencit    dibandingkan  dengan kelompok artemisin saja dan kontrol positif (p = 0,000). Disimpulkan bahwa pada infeksi malaria yang diberi terapi  artemisin,  buah  merah  dosis  tinggi  diperlukan  sebagai  imunostimulator  pada  fase  akut  dan  sebagai antioksidan pada fase kronis.
Kata kunci: artemisinin, makrofag, malaria, reactive oxygen intermediate , buah merah ( Pandanus conoideus )
THE EFFECT OF ARTEMISIN AND RED FRUIT OIL ( Pandanus conoideus ) TO THE PRODUCTION OF REACTIVE OXYGEN INTERMEDIATE BY PERITONEAL MACROPHAGE IN MALARIA INFECTED MICE

## Abstract
Abundance immune response to malaria that involves free radical can cause damage in the host tissue as well as mechanism of artemisin. Red fruit oil consisted of high amount of beta-carotene and tocopherol that  has  multiple  roles  as  antioxidant  and  immunostimulator.  The  aimed  of  this  study  was  to  analyze  the influence of combination therapy of artemisin and red fruit oil to the forming of reactive oxygen intermediate (ROI) by the macrophage. Plasmodium berghei was used for malaria model, which infected to Balb/c strain mice  through  intraperitoneal.  The  samples  were  normal  mice  (negative  control  group),  mice  that  were infected by P. berghei (positive control group), mice were infected by P. berghei and treated with artemisin 0,0364 mg/gBW, mice were infected by P. berghei and treated with combination of artemisin 0,0364 mg/gBW and red fruit oil dose 16, 5μL/mice, dose 49μL/mice and dose 97,5μL/mice respectively. The treated groups had a lower number of parasitemia than positive control group on day-3. The decline of parasite density was followed by the low numbers of macrophage cell that produce ROI in red fruit oil dose 16,5 μL/mice, dose 49 μL/mice  compared to positive control (p = 0.003; p = 0.007; p = 0.003, respectively) except on the group that had  artemisin  and  dose  97,5  μL/mice  of  red  fruit  oil,  which  had  increased  number  of  macrophage  that produce ROI  similar to positive  group (p = 0.822). The number  of macrophage cells that produce ROI on group that treated with combination therapy artemisin and red fruit oil dose 49μL/mice and 97,5μL/mice were lower compare to artemisin only group and control positive group (p = 0.000) on day-5. In conclusion, that in malaria infection a high dosage of red fruit oil was needed to be a imunostimulators on the acute phase and to be antioxidant on the chronic phase.
 E-mail: rahmadanwar19833@gmail.com
Keywords: artemisin, macrophage, malaria, reactive oxygen intermediate, red fruit oil ( Pandanus conoideus ).
* Departemen Ilmu Kedokteran Fisik dan Rehabilitasi, Fakultas Kedokteran UB-RSSA Malang ** Departemen Parasitologi, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang

## Pendahuluan
Patologi dan berbagai manifestasi klinis dari  penyakit  malaria  dapat  dijelaskan melalui  berbagai  teori  imunologis,  teori mekanik  atau  keduanya.  Penelitian  terakhir menunjukkan  adanya  keterlibatan  radikal bebas  dalam  patologi  malaria.  Penelitian sebelumnya  menunjukkan  bahwa  pada mencit  yang  diinfeksi Plasmodium  berghei terdapat  peningkatan  aktifitas  radikal  bebas melalui peroksidasi lemak dan berhubungan dengan  kelainan  patologi.  Hal  ini  dapat dilihat dari peningkatan kadar malonyldialdehide (MDA)  dan  secara  tidak langsung melalui penurunan kadar superoxyde dismutase (SOD) yang berfungsi sebagai scavenger . 1 Respons  imun  hospes  dalam  rangka melawan keberadaan Plasmodium merupakan  proses  yang  kompleks  dan spesifik  tergantung  spesiesnya.  Respons imun  hospes  melibatkan  aktivasi  makrofag, limfosit  T,  limfosit  B,  disertai  pelepasan sitokin,  dan  melibatkan  berbagai  sel  imun yang  lain.  Adanya  parasit  dalam  eritrosit akan  menstimulasi  sel-sel  fagosit  untuk melepaskan  radikal  bebas  atau reactive oxygen  species (ROS)  yang  menyebabkan stres  oksidatif  yang  sebenarnya  bertujuan mengeliminasi parasit atau eritrosit berparasit (pRBC). Namun karenan sifatnya yang  tidak  spesifik  dapat  menyebabkan penghancuran  terhadap  eritrosit  normal (RBC) atau hemolisis. Selain itu, ROS dapat menyerang endotel yang dapat menyebabkan  kerusakan  pada  berbagai jaringan.  Dapat  dikatakan  perusakan oksidatif  oleh  radikal  bebas  diduga mengarah pada terjadinya berbagai kelainan patologis  pada  penderita  malaria  seperti
thrombositopeni  dan  kerusakan  endotel hingga malaria serebral. 2 Artemisin  bekerja  sebagai  antimalaria karena  memiliki  jembatan endoperixides . Obat  ini  bekerja  melalui  pembentukan radikal  bebas  dengan  memutus  jembatan peroksida  tersebut  dengan  bantuan  haem. Radikal  bebas  yang  terbentuk  akan mengalkilasi  berbagai  protein  parasit, bereaksi  dengan translationally  controlled tumor protein (TCTP), menginhibisi sarcoplasmic/endoplasmic-reticulum  Ca 2 +- ATPase (SERCA) dan Plasmodium falciparum  cysteine  proteases. Juga  ikatan haem dan artemisin (haemarts) menghambat biosintesis haemozoin. 3 Dalam penelitian lain menunjukkan bahwa pemberian  artemisin  juga  berperan  dalam meningkatkan  stres  oksidatif,  ditandai dengan peningkatan kadar lipid peroksidase serta menurunnya kadar glutathone pada ibu hamil yang terinfeksi malaria. 4
Normalnya,  efek  yang  merugikan  dari radikal  bebas  ini  dapat  dihambat  oleh adanya  sistem  pertahanan  enzimatik  di dalam  sel  sendiri.  Di  dalam  tubuh,  terdapat berbagai  macam  sistem  proteksi  terhadap radikal  bebas,  yaitu  terdiri  dari  sistem enzimatik  dan  nonenzimatik.  Contoh  sistem enzimatik  adalah superoxyde  dismutase (SOD), katalase, dan gluthation peroxydase . Contoh  dari  sistem  nonenzimatik  adalah vitamin  larut  lemak  (betakaroten,  vitamin  A, vitamin E) serta  vitamin larut air (vitamin C, gugus thiol). Superoxyde dismutase sebagai antioksidan  dapat  bereaksi  atau  mencegah pembentukan  radikal  bebas  dari  molekul lain. Dalam batas-batas tertentu, kemampuan  sel  untuk  membentuk  SOD meningkat  dengan  adanya  rangsangan radikal  bebas. 5 Sebagai  usaha  untuk menjaga integritas jaringan, maka harus ada
keseimbangan antara produksi radikal bebas dengan  sistem  antioksidan.    Pada    saat potensi  oksidan  dalam  jumlah  tinggi  maka akan terjadi efek oksidan yang luas sehingga dapat terjadi kerusakan irreversible. .Konsep ini  mendasari  suatu  upaya  pencegahan penyakit  atau  pengobatan  kerusakan jaringan  atau  organ  akibat  radikal  bebas. Dengan demikian, perlu dipikirkan penggunaan suplemen antioksidan  eksogen pada infeksi malaria sebagai scavenger atau sebagai  pertahanan  sel  untuk  meredam dampak  negatif  dari  radikal  bebas  tersebut. Salah  contoh  jenis  antioksidan  yang  sering diteliti dalam fungsinya sebagai pencegahan penyakit  kronis  adalah  beta  karoten  atau karotenoid.  Beta  karoten  memiliki  fungsi antioksidan  baik  secara in  vitro maupun dalam model hewan coba. 6
Buah  merah, Pandanus  conoideus , mengandung  senyawa  antioksidan  dalam jumlah yang tinggi. Buah merah mengandung  zat-zat    aktif  seperti betakaroten,  tokoferol,  dan  sejumlah  asam lemak  esensial.  Buah  endemik  dari  Irian  ini telah  digunakan  secara  tradisional  oleh masyarakat  setempat  sejak  nenek  moyang antara  lain  untuk  bahan  pangan,  obat cacing,  penyakit  kulit,  dan  penghambat kebutaan. 7 Buah  merah  sudah  dicoba  pada berbagai  penyakit  seperti  kanker,  HIV  dan lain-lain. 8 Namun  penggunaan  buah  merah pada  infeksi  malaria  belum  pernah  diteliti. Penelitian  ini  berguna  untuk  mengetahui efek pemberian minyak buah merah sebagai terapi  ajuvan  artemisinin  pada  penderita malaria.  Penulis  ingin  meneliti  efek penambahan buah merah tersebut terhadap produksi radikal bebas oleh makrofag.

## Bahan dan Metode

## Desain Penelitian
Desain penelitian adalah post test-only control  group menggunakan  mencit  Balb/C yang diinfeksi Plasmodium bergehei sebagai
model  malaria.  Sampel  terdiri  dari  6 kelompok  yaitu  kelompok  1  (kelompok mencit  normal  atau  kontrol  negatif), kelompok 2 (kelompok mencit yang diinfeksi Plasmodium  berghei atau  kontrol  positif), kelompok 3 (kelompok mencit yang diinfeksi dan  mendapat  terapi  artemisin  0,0364 mg/gBB), dan kelompok 4 (kelompok mencit yang diinfeksi dan mendapat terapi artemisin 0,0364  mg/gBB  serta  minyak  buah  merah dosis  16,5  μL/hari),  kelompok  5  (kelompok mencit  yang  diinfeksi  dan  mendapat  terapi artemisin  0,364  mg/gBB  serta  minyak  buah merah  dosis  49  μL/hari),  kelompok  6 (kelompok  mencit  yang  diinfeksi  dan mendapat  terapi  artemisin  0,0364  mg/gBB serta  minyak  buah  merah  dosis  dosis  97,5 μL/hari).  Pada  masing-masing  kelompok dilakukan  pengulangan  sebanyak  3  (tiga) kali.  Pemeriksaan  sekresi reactive  oxygen intermediate (ROI)  oleh  sel  makrofag dilakukan menggunakan Nitroblue Tetrazolium (NBT) reduction assay.
Pemeriksaan  parasitemia  dan  ROI  oleh  sel makrofag dilakukan pada hari ke-3 dan ke-5 setelah pemberian terapi.

## Model Hewan Coba
Hewan  coba  yang  digunakan  adalah mencit jantan Balb/c dengan berat 30 - 40 g, sehat, aktif,  dan memiliki bulu putih. Hewan coba  didapatkan  dari  LPPT  Universitas Gadjah  Mada.  Mencit  diletakkan  di  dalam kandang  ukuran  30  x  30  cm  berisikan  4 mencit  tiap  kandang.  Mencit  diberi  makan dan  minum  standar  tiap  harinya.  Perlakuan pada  hewan  coba  sudah  disetujui  oleh Komite Etik Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya.  Sebelum  diberikan  perlakuan percobaan, hewan coba dikandangkan tanpa perlakuan unuk aklimatisasi selama 7 hari.

## Persiapan  dan  Inokulasi  Plasmodium Berghei
Plasmodium  berghei strain  ANKA didapatkan  dari  Laboratorium  Biomedik
Universitas  Brawijaya.  Pelet  eritrosit terinfeksi P. berghei yang disimpan di tangki nitrogen cair dengan suhu -135 ºC, dicairkan di dalam refrigerator dan disentrifugasi pada 2000  rpm  selama  5  menit.  Pelet  kemudian dicuci  dua  kali  dalam  medium  RPMI  dan diencerkan  untuk  kebutuhan  inokulasi secara intraperitoneal (ip) dengan jumlah 10 7 parasit  pada  0,2  ml  darah  per  mencit. 9 Parasitemia kemudian diperiksa menggunakan  hapusan  darah  tipis  yang diwarnai dengan giemsa. Derajat parasitemia diukur dengan cara menghitung eritrosit yang terinfeksi per 100 eritrosit.

## Pemberian Terapi pada Hewan Coba
Ekstrak  minyak  buah  merah  dengan dosis 16,5 μL/mencit, 49 μL/mencit, dan 97,5 μL/mencit  diberikan  pada  hewan  coba secara per oral  menggunakan sonde. Dosis artemisin  yang  digunakan  adalah  0,0364 mg/grBB  setelah  sebelumnya  dilarutkan dalam 10% DMSO (Dimethyl Sulfoxide) dan 90%  salin  dan  diberikan  secara  per  oral. Pemberian  terapi  pada  hewan  coba  dimulai 48  jam  setelah  inokulasi P.  berghei serta diberikan satu kali sehari selama 5 hari.
10
Isolasi  dan  Kultur  Sel  Makrofag  Peritoneum Mencit
Setelah  mencit  dieuthanasia,  dinding abdomen  disterilkan  dengan  alkohol  70%. Dinding  abdomen  dibuka  sehingga  tinggal peritoneum  yang  menutupi  isi  abdomen. Untuk mendapatkan sel makrofag peritoneum,  medium  M+  diinjeksikan sebanyak  10  mL  dengan  spuit.  Medium dalam  abdomen  digoyang  selama  5  menit, kemudian  medium  diambil  kembali  dengan spuit.  Medium  M+  yang  mengandung  sel makrofag  dipindahkan  ke  dalam  tabung falcon  15  ml.  Tabung  diletakkan  dalam termos berisi es +4 0 C selama 30 menit agar makrofag  tidak  aktif,  kemudian  disentrifus 3000  rpm  10  menit.  Supernatan  yang didapat  dibuang,  pellet  yang  tersisa  dalam
tabung dicampur dengan eritrosit lisis buffer sebanyak  1  ml  untuk  melisiskan  eritrosit. Eritrosit dilisiskan untuk mendapat makrofag yang  lebih  murni.  Isolat  makrofag  divortex dan  didiamkan  selama  10  menit.  Isolat makrofag  disentrifus  3000  rpm  selama  5 menit,  kemudian  supernatan  dibuang. Ditambahkan  medium  komplit  ke  dalam pellet  dan  di pipeting .  Lalu,  isolat  makrofag dituang  ke  dalam well  plate 24  kemudian diinkubasi  pada  suhu  37 o C  selama  2  jam agar  makrofag  melekat  sehingga  makrofag dan  sel-sel  lain  terpisah.  Setelah  2  jam, medium  di pipetting dan  dibuang  sehingga sel-sel  selain  makrofag  terbuang  bersama medium  tersebut,    sedangkan  makrofag tidak  ikut  terbuang  karena  telah  melekat pada cover  slip. Ditambahkan  kembali medium  komplit  sebanyak  0,5  ml  ke  dalam well  plate .  Kemudian  makrofag  diinkubasi lagi pada 37 o C selama 24 jam. 11

## Reactive Oxygen Intermediate Assay
Pengukuran  ROI  yang  dihasilkan  oleh sel  makrofag  menggunakan  metode Nitroblue  Tetrazolium  (NBT)  Reduction Assay . Pada uji ini Phorbol 12-Myristate 13- Acetate (PMA) akan menstimulasi makrofag untuk  mensekresi  ROI,  dan  adanya  ROI (anion superoksida, O2-) akan menyebabkan  NBT  tereduksi  sehingga membentuk  presipitat  formazan  yang  tidak terlarut. 12 Dipersiapkan  biakan  sel  makrofag di  atas cover  slip dalam  sumuran plate 24 yang sudah mendapat perlakuan. Dilakukan pencucian  dengan  menggunakan  PBS sebanyak  2  kali.  Pada well  plate ditambahkan  PMA  125  ng/mL  sebanyak  50 μL, Nitroblue  tetrazolium 1  mg/mL sebanyak  400  μL,  dan  HBSS  (Hank’s Balance  Salt  Solution)  sebanyak  50  μL. Diinkubasikan kedalam inkubator 37 o C, 5% CO 2 ,  selama  satu  jam.  Supernatan  dibuang dan  sel  makrofag  dicuci  dengan  PBS ( phospate-buffered  saline )  sebanyak  tiga kali.  Difiksasi  dengan  metanol  (30  detik,
suhu ruang). Metanol diambil dari well plate , kemudian  ditambahkan neutral  red  solution 2% selama 30 menit. Terakhir dicuci dengan air  mengalir  dan  kemudian  dikeringkan. Setelah  kering, cover  slip yang  berisi  sel makrofag  ditempelkan  di  atas  gelas  objek dengan  menggunakan  perekat  preparat, setelah  menempel    bagian  atasnya  ditutup lagi  dengan  menggunakan  gelas  tutup.
Aktivitas  makrofag  untuk  mensekresi  ROI diukur  dengan  menghitung  persentase makrofag  yang  mensekresi  ROI  yaitu  yang menunjukkan pembentukan formazan (warna  gelap),  dihitung  100  makrofag  yang terlihat di bawah mikroskop cahaya.
13

## Hasil
Jumlah  Sel  Makrofag  yang  Memproduksi Reactive Oxygen Intermediate
Untuk mengetahui pengaruh pemberian artemisin dan minyak  buah merah  terhadap produksi  radikal  bebas  pada  infeksi  malaria dilakukan  pemeriksaan  produksi  ROI  oleh sel makrofag peritoneum pada hari ke-3 dan ke-5. Pada Gambar 1 ditunjukkan jumlah sel
makrofag  yang  memproduksi  ROI,  dan Gambar 2 memperlihatkan foto sel makrofag hasil pengecatan khusus ROI.
Pada  hari  ke-3  jumlah  sel  makrofag yang  memproduksi  ROI  lebih  rendah  dan berbeda bermakna pada kelompok 3, 4, dan 5  dibanding  dengan  kelompok  2  atau kelompok  kontrol  positif    (p  =  0,003;  p  = 0,007; p = 0,003, one way Anova ). Jumlah sel  makrofag  yang  memproduksi  ROI  lebih tinggi  dan  berbeda  bermakna  pada kelompok 6 dibanding kelompok 3, 4, dan 5 (p  =  0,000;  p  =  0,000;  p  =  0,000, one  way Anova ),  tetapi  tidak  berbeda  bermakna dibanding dengan kempok kontrol positif (p =
0,822, one  way  Anova ).  Jumlah  sel makrofag  yang  memproduksi  ROI  tidak berbeda bermakna di antara kelompok 3, 4, dan 5 (p > 0,05, one way Anova ). Pada hari ke-5, jumlah sel makrofag yang memproduksi  ROI  pada  kelompok  5  dan  6 lebih  rendah  dan  berbeda  bermakna dibanding  kelompok  3  atau  kelompok dengan terapi artemisin saja (p = 0,000; p = 0,000, one way Anova ).
0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 4 5 6 KELOMPOK  MENCIT JUMLAH SEL MAKROFAG H-3 H-5
Gambar 1. Diagram rata-rata jumlah ROI/100 sel makrofag pada hari ke-3 dan ke-5.
Keterangan: 1: Kelompok kontrol negatif; 2: Kelompok  kontrol positif; 3: Kelompok dengan terapi artemisin; 4: Kelompok dengan terapi artemisin dan  minyak buah  merah dosis  16,5 μL; 5: Kelompok  dengan terapi artemisin  dan  minyak  buah  merah  dosis  49  μL;  6:  Kelompok  dengan  terapi  artemisin  dan  minyak  buah merah dosis 97,5 μL.  Notasi asterix (*) menunjukkan perbedaan yang signifikan dengan kelompok kontrol positif (p < 0,05).
* *
* *
(A)
(B) (C) (D)
Gambar 2. Produksi ROI pada kelompok kontrol positif dan kelompok perlakuan.
Tanda panah menunjukkan ROI yang dihasilkan oleh sel makrofag peritoneum. (A) Kelompok kontrol positif; (B) Kelompok yang diterapi artemisin, (C) Kelompok yang diterapi artemisin dan minyak buah merah dosis 16,5 μL, (D) Kelompok yang diterapi artemisin dan minyak buah merah dosis 49 μL.
0 5 10 15 20 25 1 2 3 4 5 6 KELOMPOK P E R S E N TA S E P A R A S ITE M IA ( % ) H-3 H-5
Gambar 3. Diagram persentase parasitemia pada hari ke-3 dan ke-5 .
Keterangan: 1: Kelompok kontrol negatif; 2: Kelompok  kontrol positif; 3: Kelompok dengan terapi artemisin; 4: Kelompok dengan terapi artemisin dan  minyak buah  merah dosis  16,5 μL; 5: Kelompok  dengan terapi artemisin  dan  minyak  buah  merah  dosis  49  μL;  6:  Kelompok  dengan  terapi  artemisin  dan  minyak  buah merah dosis 97,5 μL. Notasi asterix (*) menunjukkan perbedaan yang bermakna dengan kelompok kontrol positif  (p < 0,05).

## Persentase Parasitemia
Produksi  ROI  oleh  sel  makrofag merupakan  salah  satu  respons  imun terhadap infeksi malaria. Untuk mensinkronkan  pengaruh  pemberian  terapi artemisin  dan  minyak  buah  merah  dengan beratnya  infeksi  terhadap  produksi  ROI dilakukan penghitungan persentase
* * * * *
parasitemia. Hasil penghitungan ditunjukkan pada Gambar 3.
Dapat  dilihat  bahwa  kelompok  yang diberi  terapi,  baik  dengan  artemisinin (kelompok  3)  maupun  artemisinin  dengan adjuvant minyak  buah  merah  menunjukkan persentase  parasitemia  lebih  rendah dibanding kontrol positif ( p = 0,000, one way Anova) .  Turunnya  persentase  parasitemia dengan  penambahan  dosis  ajuvan  minyak buah  merah  yang  diberikan  pada  hari  ke-5 menunjukkan  korelasi  yang  tidak  bermakna (p = 0,073; r = - 0,623, Pearson correlation test) ,  tetapi  pada  hari  ke-3  menunjukkan korelasi  yang  bermakna (p  =  0,007;  r  =
- 0,821, Pearson correlation) .

## Pembahasan
Artemisin  dapat  menurunkan  derajat parasitemia  dengan  cepat.  Persentase parasitemia  pada  mencit  yang  diterapi dengan  artemisin  (dengan  atau  tanpa kombinasi minyak buah merah) lebih rendah dan berbeda bermakna dibanding kelompok kontrol  positif  yang  tidak  mendapat  terapi pada hari ketiga dan hari kelima (p = 0,000, p = 0,000, one way Anova ). Walaupun dapat menurunkan  derajat  parasitemia  secara signifikan,  masih  didapatkan  bentuk  parasit malaria  pada  semua  kelompok  mencit  yang mendapat  terapi  pada  hari  kelima.  Hal  ini dimungkinkan  karena  artemisin  diberikan secara  tunggal  (monoterapi).  Terapi antimalaria  yang  direkomendasikan  oleh World  Health  Organization untuk  malaria tanpa  komplikasi  adalah artemisinin-based combination  treatments (ACT);  yaitu kombinasi  antara  derivat  artemisinin  dan antimalaria  lainnya  yang  secara  struktural lebih  lambat  eliminasinya  dalam  sirkulasi. Tingkat  kesembuhan  paling  tidak  harus mencapai  90%  dan  >95%  jika  dimonitor pada  ≥28  hari  setelah  pengobatan.    ACT menjamin kesembuhan yang tepat dan cepat dan  menggantikan  pemberian  artemisinin
monoterapi yang memang sering mengalami kegagalan dalam menurunkan parasitemia. 14
Dalam  sebuah  uji  klinis,  didapatkan  juga artemisin dapat menghancurkan 95% parasit malaria dalam waktu dua puluh jam. Demam yang menyertai infeksi malaria hilang dalam delapan  jam  setelah  pemberian  artemisin. 15 Masih  didapatkannya  parasit  pada  hari kelima  kemungkinan  juga  karena  pengaruh kombinasi  artemisin  dan  minyak  buah merah.  Pemberian  artesunate  bersama minyak  buah  merah  mungkin  menurunkan absorbsi  artesunate  karena  obat  ini  bersifat water soluble . Dari penelitian didapatkan hasil bahwa jumlah sel makrofag yang memproduksi ROI pada kelompok kontrol positif lebih tinggi dan berbeda  bermakna  dibanding  kelompok mencit  sehat  pada  hari  ketiga  dan  hari kelima  (p  =  0,000;  p  =  0,000, one  way Anova ). Hal ini menunjukan adanya respons imun terhadap infeksi malaria. Radikal bebas dihasilkan  oleh  makrofag  sebagai  respons terhadap  parasit.  Makrofag  menghasilkan oksigen  reaktif dan  nitrogen  reaktif  yang bersifat  mikrobisidal  yang  dapat  membunuh parasit melalui proses oksidasi. 16
Jumlah  radikal  H 2 O 2 dan  O 2  yang dihasilkan  oleh  eritrosit  yang  terinfeksi Plasmodium  falciparum dua  kali  lebih banyak  dibanding  dengan  yang  dihasilkan oleh  eritrosit  normal.  Didapatkan  total  lipid peroksidase  serum  yang  tinggi  pada penderita  malaria  dibanding  orang  sehat. Dilaporkan  juga  lipid  peroksidase  dalam serum  penderita  malaria Plasmodium falciparum lebih  tinggi  dibanding  penderita malaria Plasmodium  vivax .  Penurunan antioksidan ( superoxide dismutase, serum α- tocopherol ,  dan serum  iron )  juga  teramati ketika  terjadi  peningkatan  stres  oksidatif pada  penderita  malaria  yang  tidak  diobati. Penurunan maksimum aktivitas SOD eritrosit ditemukan pada infeksi P. vivax dibandingkan infeksi P. falciparum . 17
Penelitian  lain  mengungkapkan  bahwa ekspresi  gen  yang  mensintesis  NO mengalami up-regulation pada  limpa  mencit yang diinfeksi malaria. Makrofag peritoneum dan limpa memproduksi NO pada level yang tinggi (24 μM per 10 5 makrofag peritoneum dan 15 μM per 10 5 makrofag limpa sebagai respons terhadap lipopolisakarida. 18 Masuknya  parasit  malaria  ke  dalam makrofag  disertai  dengan  peningkatan metabolisme  berupa  peningkatan  respirasi ( respiratory burst ). Dalam peristiwa lonjakan respirasi  akan  terjadi  kenaikan  konsumsi oksigen,  serta  pembentukan  radikal  bebas. Dalam  membran  makrofag  terdapat  rantai transfer elektron yang mengandung NADPH oksidase.  NADPH  ini  aktif  apabila  terjadi kontak  antara  membran  makrofag  dengan partikel, maka akan terjadi transfer elektron. Transfer  elektron  dari  oksigen  akan mengakibatkan reduksi sebuah elektron dari oksigen tersebut membentuk anion superoksida. 19
Pada  hari  ketiga,  jumlah  sel  makrofag yang  memproduksi  ROI  pada  kelompok yang mendapat terapi artemisin dengan atau tanpa  kombinasi  minyak  buah  merah (kecuali  kelompok  F)  lebih  rendah  dan berbeda  bermakna  dibanding  kelompok kontrol  positif  (p  =  0,003;  p  =  0,007;  p  = 0,003, one  way  Anova ).  Artemisin  dengan cepat menurunkan kepadatan parasit dalam darah.  Keadaan  ini  selanjutnya  akan menurunkan  rangsangan  pada  sistem  imun karena  sedikitnya  antigen  yang  beredar. Sehingga  respons  imun  terhadap  infeksi malaria  berkurang  atau  berhenti.  Demikian juga pembentukan ROI oleh makrofag akan berkurang  atau  berhenti  apabila  tidak  ada rangsangan.  Tetapi  tidak  ada  perbedaan jumlah  makrofag  yang  menproduksi  ROI diantara  kelompok  mencit  yang  mendapat artemisin  saja  dengan  kelompok  yang mendapat  artemisin  dan  buah  merah  dosis 16,5  μL/hari,  dan  kelompok  mencit  yang mendapat  artemisin  dan  buah  merah  dosis
49  μL/hari.  Kemungkinan  hal  ini  karena masih  adanya  parasit  walaupun  dengan derajat  parasitemia  yang  lebih  rendah dibanding kontrol positif sehingga rangsangan  terhadap  sistem  imun  masih terjadi.  Kulkarni et  al., (2003)  melaporkan bahwa tiga hari setelah pengobatan dengan klorokuin  terjadi  penurunan  total  lipid peroksidase  serum  dibandingkan  dengan penderita  yang  tidak mendapat  terapi. 17 Hal ini  diduga  terkait  dengan  pengurangan produksi reactive  oxygen  species oleh parasit  malaria  karena  pembersihan  parasit dari darah. Pada penelitian ini dilakukan penambahan  buah  merah  sebagai  ajuvan artemisinin karena buah merah mengandung antioksidan  yang  tinggi  seperti  karotenoid, tokoferol,  betakaroten,  dan  alfatokoferol. 20 Karoten  dapat  meredam  aktifitas  radikal bebas  yang  dihasilkan  parasit  dan  sistem imun,  menghambat  peroksidasi  membran lipid,  sehingga  membantu  mencegah kerusakan  membran  sel  serta  mengurangi kerusakan  jaringan  sekitar. 21 Tokoferol dalam  buah  merah  juga  berperan  sebagai pemutus reaksi radikal bebas pada jaringan dan plasma terutama pada jaringan dengan tekanan  parsial  oksigen  yang  tinggi  seperti membran  traktrus  respiratorius  dan  retina. Tokoferol  dapat  mencegah  peroksidasi  lipid dan  pengrusakan  membran  sel  serta menjaga  stabilisas  membran,  sehingga dapat mengurangi kerusakan jaringan akibat radikal bebas. 22 Antioksidan eksogen seperti vitamin  A,  vitamin  C,  vitamin  E,  NAC  dan riboflavin dapat digunakan sebagai adjunctive/supporting terapi  pada  infeksi malaria  yang  akut  dan  kronis.  Antioksidan tersebut  dapat  mempercepat  kesembuhan, penurunan  aktivitas  radikal  bebas  dan peningkatan imunitas. 23
Pada  hari  ketiga,  jumlah  sel  makrofag yang  memproduksi  ROI  mencit  kelompok yang  diterapi  dengan  artemisin  dan  minyak buah  merah  dosis  97,5  μl/hari  lebih  tinggi
dan berbeda bermakna dibanding kelompok yang mendapat terapi artemisin dan minyak buah  merah  dosis16,5  μL  dan  49  μL. Produksi ROI pada mencit kelompok ini tidak berbeda dibanding dengan kelompok kontrol positif.  Hal  ini  menunjukan  dosis  tertentu yang  tinggi  diperlukan  agar  buah  merah memiliki efek imunostimulator terutama pada fase akut untuk mengeliminasi parasit.
Pada hari kelima, jumlah sel makrofag yang  memproduksi  ROI  pada  kelompok yang  mendapat  terapi  kombinasi  artemisin dan  buah  merah    dosis  49  μL  dan  97,5  μL lebih rendah dibandingkan dengan kelompok yang  diterapi  artemisin  saja.  Diperlukan dosis  yang  tinggi  pada  fase  kronis  untuk mendapat  efek  buah  merah  sebagai antioksidan.
Keterbatasan  pada  penelitian  ini  tidak dilakukan  pemeriksaan  produksi  ROI  hari ketujuh.  Mungkin  dosis  buah  merah  yang tinggi  diperlukan  pada  fase  awal  sebagai imunostimulator  dan  dosis  ini  harus dipertahankan  unutk  mendapatkan  efek antioksidannya  pada  fase  akhir.  Penelitian yang  dilakukan  oleh  Kulkarni et  al., (2003) didapatkan  bahwa  indikator  oksidan  dan antioksidan pada penderita malaria Plasmodium  falciparum yang  telah  diterapi
klorokuin mulai membaik pada hari ke-3 dan menjadi normal pada hari ke-20. 17

## Kesimpulan
Berdasarkan  hasil  penelitian  ini dapat disimpulkan  bahwa  terdapat  peningkatan jumlah sel makrofag yang memproduksi ROI pada  mencit  yang  mendapat  terapi kombinasi  artemisin  dan  buah  merah  dosis 97,5  µL/mencit  dibandingkan  dengan  yang diberi artemisin saja pada hari ke-3. Jumlah sel  makrofag  yang  memproduksi  ROI  pada kelompok  yang  diterapi  kombinasi  artemisin dan  buah  merah  dosis  49  µL/mencit  dan dosis 97,5 µL/mencit  lebih rendah dibanding yang diberi artemisin saja pada hari ke-5.

## Daftar Pustaka
1. Percário S, Moreira DR, Gomes BAQ, et al. Oxidative  Stress  in  Malaria. International  Journal  of  Molecular Sciences .  2012;  13(12):16346-16372. doi:10.3390/ijms131216346.
2. Porto BN, Alves LS, Fernández PL, Dutra TP,  Figueiredo  RT,  Graça-Souza  AV,
Bozza  MT.  Heme  Induces  Neutrophil Migration  and  Reactive  Oxygen  Species Generation  Through  Signaling  Pathways Characteristic of Chemotactic Receptors. J Biol Chem. 2007; 282:24430–24436. 3. Kannan R, Kumar K, Sahal D, Kukreti S, Chauhan  VS. R eaction  of  Artemisinin with  Haemoglobin:  Implications  For Antimalarial  Activity . Biochem.  J. 2005;
385:409–418.
4. Akanbi  OM,  Odaibo  AB,  Ademowo  OG. Effect  of  Antimalarial  Drugs  and  Malaria
Infection on Oxidative Stress in Pregnant
Women. African Journal of Reproductive Health . 2010; 14(3):212.
5. Gutteridge  JM,  and  Halliwell  B. Antioxidants  in  Nutrition,  Health,  and Disease. Oxford:  Oxford  University Press. 1994. P 1-72.
6. Krinsky  NI,  Jhonson  Ej.  Carotenoids Action  and  their  Relation  to  Health  and
Disease .  Mol  Aspect  med. 2005;
26(6):459-516.
7. Redaksi  Trubus.  Seri  Praktis:  Buah Merah  dan  Bukti  Empiris.  Jakarta: Penebar Swadaya. 2005.
8. Tahergorabi  Z,  Abedini  MR,  Mitra  M, Fard  MH,  Beydokhti  H.  “ Pandanus conoideus ”:  A  Red  Fruit  with  Promising Anticancer Activities. Pharmacognosy Reviews . 2015; 9 (18):99–106. doi.10.4103/0973-7847.162108.
9. Blazquez  K,  Moll  K,  Ljungstrom  I, Petmann,  Scherf  A,  Wahlgren,  M.
Thawing  of  Glicerolyte  Frozen  Parasites
with NaCl. Methods in Malaria Research
5 th . Paris: BioMalPar. 2008. pp15.
10. Clemmer  L,  Martins  Y,  Zanini  M. Arthemeter  and  Artesunate  Show  The Highest Efficacies in Rescuing Mice with Late-Stage Cerebral Malaria and Rapidly Decrease  Leukocyte  Accumulation  in
Brain. American Society for Microbiology .
2011. p1383-1390. 11. Wu  X,  Gowda  NM,  Gowda  DC. Phagosomal Acidification Prevents Macrophage  Inflammatory  Cytokine Production to Malaria, and Dendritic Cells are the Major Source at the Early Stages of  Infection:  Implication  for  Malaria Protective  Immunity  Development. The Journal  of  Biological  Chemistry . 2015; 290(38):23135–23147. doi.10.1074/jbc.M115.671065.
12. Leijh  PCJ,  Furh  RV,  Zwet  TLV..  In  Vitro Determination  of  Phagocyte  and Intracellular Killing by Polymorphonuclear and  Mononuclear  Phagocyte.  In:  Weir
DM  (Editor). Cellular  Immunology . London:  Blackwell  Scientific  Publication. 2001. 46.1 - 46.21.
13. Supargiyono.  Production,  Proliferation, and Functional Activities of Mononuclear Phagocytes  during Plasmodium  vinkei pitteri Infection in Mice. Thesis. 1993. 14. Nosten  F,  and  White  NJ.  Artemisinin- Based  Combination  Treatment  of Falciparum  Malaria. Am  J  Trop  Med Hyg. 2007. 77(Suppl 6):181–192. 15. NDCF.  Artemisin  New  Hope  for  Malaria Victim. (Online). 2 005. www.ndcf.org/reports/Artemisinin. 16. Good  MF,  Xu  H,  Wykes  M,  and Engwerda,  CR.  Development  and Regulation  of  Cell-Mediated  Immune
Responses  to  the  Blood  Stages  of Malaria:  Implications  for  Vaccine Research. Annual  Review  Immunol. 2004; 23:69–99.
17. Kulkarni AG, Suryakar AN, Sardeshmukh AS,  and    Rathi  DB.  Studies  on Biochemical  Changes  with  Special
Reference to Oxidant and Antioxidants in
Malaria  Patients. Indian  Journal  of Clinical Biochemistry. 2003;18:136-149.
18. Ahvazi  BC,  Jacobs  P,  Stevenson  MM. Role of Macrophage-Derived Nitric Oxide in Suppression of Lymphocyte Proliferation During Blood-Stage Malaria. (Online).1995.www.jleukbio.org/cgi/conte nt/abstract/58/1/23; 19. Subowo. Imunobiologi ..Jakarta:  Penerbit Angkasa. 1993. P. 35.
20. Budi  IM,  dan  Paimin  FR.  Buah  Merah. Bogor: Penebar Swadaya. 2005.
21. Hunt  N,  Kopp  M,  and  Stocker.  Free Radicals  and  Antioxidant  in  Malaria.  In:
ASH  Ong,  and  L  Pocker  (Editor). Lipid Soluble  Antioxidants,  Biochemistry,  and Clinical Application. Switzerland: Birkhasen Verlong. 1992. P. 337-354. 22. Murray. Biokimia  Harper. Edisi  ke-24.
Jakarta: EGC. 1996.
23. Simamora  D.  dan  Fitri  L.E.  Antioksidan pada  Infeksi  Malaria. Jurnal  Molluca
Medica . 2007; II(I):47-56.