Uji  Antiangiogenesis  Secara  In  Vivo  Ekstrak  Etanol  Biji  Kopi  Robusta ( Coffea Robusta ) dengan Metode Chorio Allantoic Membrane (CAM)
( Antiangiogenesis  Test  In  Vivo  Extract  of  Robusta  Coffee  Beans  (Coffea  robusta)  Using Chorio Allantoic Membrane (CAM) Method )
Muhammad Yusuf 1* , Rugayyah Alyidrus 1
1* Fakultas Farmasi, Universitas Megarezky, Makassar, Indonesia. E-mail: yusuf.sukarta@gmail.com
Article Info:
Received: 8 Januari 2020
in revised form: 11 Februari 2020 Accepted: 20 Februari 2020
Available Online: 02 Maret 2020

## ABSTRACT
Angiogenesis  is  a  process  of  forming  new  capillaries  found  in  the  blood  vessel system. Angiogenesis plays an important role in tumor growth and metastasis which includes  several  biological  processes.  Cancer  cells  require  a  supply  of  nutrients through the blood vessels to grow and develop so that the cancer cells secrete growth substances to stimulate the  formation of new blood vessels to  meet their nutritional supply. Robusta coffee beans (C. robusta) contain compounds that function as strong antioxidants namely Chlorogenic acid which is a polyphenol group compound that is thought  to  have  antiangiogenesis  effects.  This  study  aims  to  look  at  the antiangiogenesis potential of robusta coffee bean ethanol extract (C. robusta) with the Chorio  Allantoic  Membrane (CAM)  method  and  determine  the  concentration  of robusta  coffee  bean  extract  (C.  robusta)  which  has  the  potential  as  an antiangiogenesis.  Antiangiogenesis  test  using  the  Chorio  Allantoic  Membrane (CAM) method using 9-day-old chicken eggs. In this study eggs were divided into 4 groups,  group  I  was  the  untreated  group,  groups  II,  III,  IV  were  groups  that  were given  ethanol  extract  of  robusta  coffee  beans  (C.  robusta)  with  concentrations  of 6000 μg/ml, 5500 µg/ml respectively. and 5000 µg/ml. The eggs are re-incubated for 72  hours.  In  this  study,  a  macroscopic  semi-quantitative  score  was  observed.  The score data obtained were analyzed statistically by the One Way Anova test. Based on the  Saphiro  Wilk  normality  test  results,  the  results  of  observations  of antiangiogenesis  in  ethanol  extracts  of  Robusta  (Coffea  robusta)  concentrations  of 6000  μg/ml,  5500  μg/ml,  and  5000  μg/ml  obtained  a  significance  value  of  0.248 (p>0.05). Continuing the One Way Anova test in the antiangiogenesis test obtained a significance  value  of  0.007  (p<0.05).  Then  proceed  with  the  Post  Hoc  Test.  In  the test group the concentration of 6000 µg/ml, 5500 µg/ml, and 5000 µg/ml had a value of p>0.05 which means that there  were no differences between groups in inhibiting angiogenesis. Based on the results of the study it can be concluded that the ethanol extract of robusta coffee beans (C. robusta) 6000 μg/ml, 5500 μg/ml, and 5000 μg/ml has  antiangiogenesis  effect  on Chorio  Allantoic  Membrane (CAM)  of  chicken embryo.
Keywords : Antiangiogenesis Chorio Allantoic Membrane (CAM) Robusta Coffee Beans (C.Robusta)

## Corresponding Author:
Muhammad Yusuf
Fakultas Farmasi
Universitas Megarezky Makassar
98220
Indonesia email: yusuf.sukarta@gmail.com
Copyright © 2019 JFG-UNTAD
This open access article is distributed under a Creative Commons Attribution (CC-BY-NC-SA) 4.0 International license.
How to cite (APA 6 th Style):
Yusuf, M., & Alyidrus, R. (2020). Uji Antiangiogenesis Secara In Vivo Ekstrak Etanol Biji Kopi Robusta ( Coffea Robusta ) dengan Metode Chorio Allantoic Membrane (CAM). Jurnal Farmasi Galenika :Galenika Journal of Pharmacy (e-Journal), 6 (1), 63-69. doi:10.22487/j24428744.2020.v6.i1.14975
Jurnal Farmasi Galenika ( Galenika Journal of Pharmacy ) (e-Journal) 2020; 6 (1): 63 – 69 ISSN : 2442-8744 (electronic); 2442-7284 (printed) Journal Homepage: https://bestjournal.untad.ac.id/index.php/Galenika DOI: 10.22487/j24428744.2020.v6.i1.14975

## ABSTRAK
Angiogenesis  merupakan  proses  pembentukan  kapiler  baru  yang  terdapat  dalam  sistem  pembuluh  darah. Angiogenesis  berperan  penting  dalam  pertumbuhan  dan  metastasis  tumor  yang  meliputi  beberapa  proses biologis.  Sel-sel  kanker  memerlukan  pasokan  nutrisi  melalui  pembuluh  darah  untuk  tumbuh  dan  berkembang sehingga  sel-sel  kanker  mengeluarkan  zat  pertumbuhan  untuk  merangsang  pembentukan  pembuluh  darah  baru untuk  memenuhi suplai nutrisinya. Biji kopi robusta ( C.robusta ) mengandung  senyawa  yang berfungsi sebagai antioksidan kuat yaitu Chlorogenic acid yang merupakan senyawa golongan polifenol yang diduga mempunyai efek  antiangiogenesis.  Penelitian  ini  bertujuan  untu  melihat  potensi  antiangiogenesis  ekstrak  etanol  biji  kopi robusta ( C.robusta ) dengan metode Chorio Allantoic Membrane (CAM) dan menentukan konsentrasi ekstrak biji kopi robusta ( C.robusta ) yang berpotensi sebagai antiangiogenesis. Uji antiangiogenesis dengan metode Chorio Allantoic  Membrane (CAM)  menggunakan  telur  ayam  yang  berumur  9  hari.  Pada  penelitian  ini  telur  dibagi menjadi 4 kelompok, kelompok I adalah kelompok tanpa perlakuan, kelompok II, III, IV merupakan kelompok yang  diberi  ekstrak  etanol  biji  kopi  robusta  ( C.robusta )  dengan  masing-masing  konsentrasi  6000  µg/ml,  5500 µg/ml,  dan  5000  µg/ml.  Telur  diinkubasi  kembali  selama  72  jam.  Pada  penelitian  ini  dilakukan  pengamatan secara macroscopic  semiquantitative  score .  Data  skor  yang  diperoleh  dianalisis  statistik  dengan  uji One  Way Anova .  Berdasarkan  hasil  uji  normalitas Saphiro  Wilk data  hasil  pengamatan  antiangiogenesis  pada  ekstrak etanol  biji  kopi  robusta  ( Coffea  robusta )  konsentrasi  6000  µg/ml,  5500  µg/ml,  dan  5000  µg/ml  diperoleh  nilai signifikansi sebesar 0,248 (p>0,05). Dilanjutkan uji One Way Anova pada pengujian antiangiogenesis diperoleh nilai  signifikansi  sebesar  0,007  (p<0,05).  Kemudian  dilanjutkan  uji Post  Hoc  Test .  Pada  kelompok  uji konsentrasi  6000  µg/ml,  5500  µg/ml,  dan  5000  µg/ml  memiliki  nilai  p>0,05  yang  berarti  bahwa  tidak  ada perbedaan  antar  kelompok  dalam  menghambat  angiogenesis.  Berdasarkan  hasil  penelitian  dapat  disimpulkan bahwa  ekstrak  etanol  biji  kopi  robusta  ( C.  robusta )  6000  µg/ml,  5500  µg/ml,  dan  5000  µg/ml  memiliki  efek antiangiogenesis pada Chorio Allantoic Membrane (CAM)  embrio ayam.
Kata kunci: Antiangiogenesis, Chorio Allantoic Membrane (CAM), Biji kopi robusta ( C. robusta ).

## PENDAHULUAN
Kanker merupakan suatu kondisi pertumbuhan atau pembengkakan massa dari sel yang abnormal dan bersifat ganas. Sel kanker berkembang dengan mengambil nutrisi dan oksigen dari inang (host) dengan cara  membentuk  pembuluh  darah  baru  (angiogenesis)  dari  pembuluh  darah  yang  sudah  ada. Penghambatan  proses  angiogenesis  dari  kanker  akan  menyebabkan  sel  kanker  mengalami penghambatan  pertumbuhan  dan  akhirnya  mati.  Angiogenesis  diketahui  merupakan  kunci  bagi perkembangan. Angiogenesis merupakan peristiwa pertumbuhan pembuluh darah baru /neovaskularisasi  yang  memungkinkan  sel  mendapatkan  suplai  nutrien  dan  oksigen,  sehingga  dapat bertahan hidup (Hanahan & Weinberg, 2000).
Antiangiogenesis merupakan terapi yang bertujuan untuk menghentikan pembentukan pembuluh darah baru,  karena  tanpa  suplai  darah,  sel  kanker  akan  mati.  Pada  uji  antiangiogenesis  secara  in  vivo  ini menggunakan  metode Chorio  Allantoic  Membrane (CAM)  karena  vaskularisasi  yang  luas,  mudah dilihat,  mudah  dijangkau,  masa  eksperimen  lebih  cepat,  dan  diferensiasi  pembuluh  darah  yang  baik (Mustafida et al ., 2014).
Hal  ini  mendorong  peneliti  untuk  melakukan  uji  pendahuluan  untuk  melakukan  pencarian  senyawa yang  dapat  menghambat  pertumbuhan  sel  kanker,  dari  bahan  pangan  yang  mungkin  nantinya  dapat berkhasiat  sebagai  antikanker  yang  terdapat  pada  biji  kopi  robusta  ( C.robusta ).  Biji  kopi  robusta ( C.robusta ) mengandung senyawa yang berfungsi sebagai antioksidan. Senyawa di dalam kopi robusta ( C.robusta )  yang  bertindak  sebagai  antioksidan  kuat  adalah Chlorogenic  acid yang  merupakan senyawa golongan polifenol (Gaascht et al ., 2015).
Berdasarkan beberapa penelitian menujukkan bahwa kopi juga memiliki aktivitas sebagai antikanker. Pada  penelitian  tersebut  disebutkan  bahwa Cafestol dan Kahweol yang  merupakan  zat  yang terkandung di dalam kopi ini secara spesifik memiliki aktivitas antikarsinogenik (Cavin et al., 2002).
Penelitian  lain  juga  menunjukkan  bahwa  potensi  kopi  sebagai  antikanker  ditunjukan  dengan  cara meningkatkan  aktivitas  enzim  fase  II,  akan  tetapi  belum  diketahui  dengan  pasti  seberapa  banyak minuman  kopi  yang  diperlukan  agar  berefek  sebagai  pelindung  tubuh  dari  serangan  kanker.  Dr. Thomas  Hofmann,  prof  dr  Institute for  Food  Chemistry  at  the  University  of  Manchester di  Jerman menyebutkan bahwa kopi espresso mengandung 2-3 kali lebih banyak komponen antikanker (Winarsi, 2007).
Berdasarkan uraian tersebut, untuk mengoptimalkan pemanfaatan biji kopi robusta ( C.robusta ) sebagai sumber bahan obat maka peneliti berencana melakukan uji antiangiogenesis secara in vivo ekstrak biji kopi  robusta  ( C.robusta )  dengan  metode Chorio  Allantoic  Membrane (CAM)  dengan  menggunakan telur.

## METODE PENELITIAN

## Alat dan Bahan
Alat  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  adalah  alat-alat  gelas  (pyrex),  gunting, Laminar  Air  Flow (LAF), Minidrill ,  Timbangan  analitik, Rotavapor ,  seperangkat  alat  maserasi,  seperangkat  alat penetasan, inkubator,  spoit, Termometer, Timbangan O’haus dan Vial. Bahan yang digunakan pada penelitian  ini  yaitu  Aquadest,  Ekstrak  etanol  biji  kopi  robusta  ( C.robusta ),  Etanol  70  %, Na-CMC , Parafin, Paper disc , telur ayam kampung.

## Metode
Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekperimental laboratorium dengan metode Chorio Allantoic Membrane (CAM).

## Pengambilan dan Pengolahan Sampel
Sampel biji kopi robusta diperoleh dari kab. Toraja, lalu dibuat menjadi ekstrak biji kopi. Pembuatan ekstrak biji kopi ini dilakukan dengan cara maserasi dengan proses sebagai berikut; Biji kopi dijadikan serbuk  dengan  mesin  penyerbuk.  Serbuk  biji  kopi  yang  didapatkan  dilarutkan  dengan  etanol  70% sebanyak  7  liter,  diaduk  selama  30  menit,  didiamkan  selama  24  jam,  kemudian  disaring.  Proses  ini diulang 3 kali. Kemudian di peroleh hasil berupa ampas dan filtrat. Ampas dibuang, sedangkan filtrat diuapkan  dengan  vacum  rotary  evaporator.  Ekstrak  kental  yang  didapatkan  dituang  dalam  cawan porselin, lalu dipanaskan dalam water bath sambil terus diaduk sampai diperoleh ekstrak biji kopi.

## Pemilihan sampel uji
Sampel uji yang digunakan adalah telur ayam kampung yang berumur 1 hari.

## Pengujian Antiangiogenesis
Telur  ayam  diinkubasikan  terlebih  dahulu  selama  9  hari  dan  kemudian  diberikan  perlakuan.  Tahap awal  perlakuan  dengan  proses candling untuk  melihat  udara  yang  ada  didalam  telur  kemudian memberi tanda pada kerabang telur di daerah yang akan dibuat segi empat (jendela) berukuran 1x1 cm di atas embrio. Kerabang telur disucihamakan dengan alkohol. Selanjutnya pada kedua daerah tersebut dibuat  lubang  kecil  menggunakan  sebuah  mini  drill.  Kerabang  telur  di  atas  embrio  dipotong  dengan gergaji (mini drill) didalam Laminar Air Flow (LAF)  untuk membuat lubang segi empat dengan luas 1x1  cm.  Melalui  lubang  ini  sampel  uji  diimplantasi  ke  dalam  membran  korio  alantois  yang  telah terbentuk.  Subyek  uji  berupa  telur  dibagi  dalam  empat  kelompok    (masing-  masing  kelompok  terdir dari 5 butir telur). Kelompok I kelompok tanpa perlakuan, kelompok II kelompok kontrol paper disc bermuati  ekstrak  etanol  biji  kopi  robusta  ( C.robusta ) dengan konsentrasi 6000  μg/ml, kelompok III kelompok kontrol paper disc bermuati ekstrak etanol biji kopi robusta ( C.robusta ) dengan konsentrasi 5500 μg/ml, dan kelompok IV kelompok kontrol paper disc bermuati ekstrak etanol biji kopi robusta ( C.robusta ) dengan konsentrasi 5000 μg/ml. Setelah diberi perlakuan, tutup pintu pada telur dengan
segera  dan  hati-hati.  Kemudian  segel  pintu  tersebut  dengan parafin  solidium, telur  diinkubasi  pada suhu  37 o C    selama  3  hari  atau  72  jam,  kemudian  telur  dibuka  pada  umur  12  hari  secara  vertikal kemudian  dilakukan  pengamatan  secara  makroskopis  dan  pendokumentasian  membran chorio allantoic yang berada di atas paper disc (Mustafida et al , 2014).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil pengujian ekstrak etanol biji kopi robusta ( Coffea robusta ) berdasarkan pemberian skor pada uji antiangiogenesis menggunakan metode Chorio Allantoic Membrane (CAM) dapat dilihat pada  tabel berikut.
Tabel 1. Hasil skor uji Antiangiogenesis ekstrak etanol biji kopi robusta ( Coffea robusta ) Kelompok T1 T2 T3 T4 T5 K1 5 5 4 5 4 K2 2 0 2 3 2 K3 3 4 3 3 4 K4 4 3 4 4 3
Keterangan : K1 : Kelompok tanpa perlakuan K2 : Kelompok ekstrak etanol biji kopi robusta (6000 µg/ml) K3 : Kelompok ekstrak etanol biji kopi robusta (5500 µg/ml) K4 : Kelompok ekstrak etanol biji kopi robusta (5000 µg/ml) T1  : Telur 1 T2  : Telur 2 T3  : Telur 3 T4  : Telur 4 T5  : Telur 5
Tabel 2. Hasil Rerata uji Antiangiogenesis ekstrak etanol biji kopi robusta ( Coffea robusta ) Kelompok N Hasil uji antiangiogenesis ( mean ± SD ) K1 5 4,6±0,577 K2 5 1,8±0,577 K3 5 3,4±0,577 K4 5 3,6±0,577 Keterangan :
K1 : Kelompok tanpa perlakuan K2 : Kelompok ekstrak etanol biji kopi robusta (6000 µg/ml) K3 : Kelompok ekstrak etanol biji kopi robusta (5500 µg/ml) K4 : Kelompok ekstrak etanol biji kopi robusta (5000 µg/ml)
Untuk hasil pengujian ekstrak etanol biji kopi robusta ( Coffea robusta ) menggunakan metode Chorio Allantoic Membrane (CAM) dapat dilihat pada gambar berikut ini :
Gambar 1. Kontrol tanpa perlakuan pada telur ayam
Gambar 2. Kontrol perlakuan dengan ekstrak etanol biji kopi robusta konsentrasi 6000 µg/ml pada telur ayam
Gambar 3. Kontrol perlakuan dengan ekstrak etanol biji kopi robusta konsentrasi 5500 µg/ml pada telur ayam
Gambar 4. Kontrol perlakuan dengan ekstrak etanol biji kopi robusta konsentrasi 5000 µg/ml pada telur ayam
Berdasarkan  hasil  pengamatan  secara macroscopic  semiquantitative  score ,  pada  uji  antiangiogenesis dapat  dilihat  pada  tabel  1dan  hasil  rerata  uji  antiangiogenesis  dapat  dilihat  pada  tabel  2.  Pada kelompok  1  yaitu  kelompok  telur  tanpa  diberi  perlakuan  diperoleh  nilai  rerata  skor  4,6  karena  pada kelompok  ini  tidak  terjadi penghambatan  pertumbuhan  pembuluh  darah.pada  kelompok  2  yaitu  telur
yang  diberi  ekstrak  dengan  kosentrasi  6000  µg/ml  diperoleh  rerata  skor  1,8  karena  dapat  terlihat dengan  jelas  bahwa  pembuluh  darah  yang  tumbuh  atau  berkembang  terhambat  oleh  adanya  ekstrak etanol  biji  kopi  robusta  ( Coffea  robusta ),  pembuluh  darah  terpotong  atau  terpisah  menjadi  beberapa bagian, pada kelompok 3 yaitu telur yang diberi ekstrak dengan konsentrasi 5500 µg/ml diperoleh nilai rerata  skor  3,4  karena  jumlah  pembuluh  darah  sudah  mulai  berkurang.  Pada  kelompok  4  yaitu  telur yang  diberi  ekstrak  konsentrasi  5000  µg/ml  diperoleh  nilai  rerata  skor  3,6  karena  jumlah  pembuluh darahnya  masih  banyak.  Berdasarkan  hasil  penelitian  tersebut  menunjukkan  bahwa  semakin  besar jumlah konsentrasi ekstrak etanol biji kopi robusta ( Coffea robusta ) yang dimasukkan, maka semakin berkurang jumlah pembuluh darah yang tumbuh dan nilai skor semakin rendah.
Berdasarkan  hasil  uji  normalitas Saphiro  Wilk data  hasil  pengamatan  antiangiogenesis  pada  ekstrak etanol  biji  kopi  robusta  ( Coffea  robusta )  konsentrasi  6000  µg/ml,  5500  µg/ml,  dan  5000  µg/ml diperoleh nilai signifikansi sebesar 0,248 yang berarti data terdistribusi normal (p>0,05). Dilanjutkan uji statistik One Way Anova pada pengujian antiangiogenesis diperoleh nilai signifikansi sebesar 0,007 (p<0,05) yang berarti bahwa terdapat perbedaan nilai rerata antar kelompok. Kemudian dilanjutkan uji Post Hoc Test untuk melihat perbedaan rerata dari tiap kelompok. Pada kelompok uji konsentrasi 6000 µg/ml,  5500  µg/ml,  dan  5000  µg/ml  memiliki  nilai  p>0,05  yang  berarti  bahwa  tidak  ada  perbedaan antar  kelompok  dalam  menghambat  angiogenesis  yang  menandakan  bahwa  ekstrak  etanol  biji  kopi robusta  ( Coffea  robusta )  dapat  menghambat  proses  angiogenesis  pada Chorio  Allantoic  Membrane (CAM). Penghambatan angiogenesis oleh ekstrak ini diasumsikan disebabkan oleh kandungan kimia yang  berada  pada  biji  kopi  robusta  ( Coffea  robusta )  yaitu  senyawa Chlorogenic  acid dan  juga Caffeine . Senyawa Caffeine pada biji kopi memiliki aktivitas antiangiogenesis secara in vivo dan juga dapat menghambat proliferasi sel dan juga dapat  mengiduksi apoptosis dengan memodulasi caspase-3 dan Bcl-2 (Li et al ., 2013; Yeh et al ., 2012).
Chlorogenic  acid yang  terdapat  pada  biji  kopi  dilaporkan  juga  dapat  menghambat laser-induced neovascularization (CNV)  pada  model  tikus,  dan  juga  senyawa p-coumaric  acid yang  merupakan suatu  senyawa  konstituen  fenolik  dari Chlorogenic  acid yang  dilepaskan  selama  katabolisme  dapat menghambat  pertumbuhan  dan  migrasi  sel-sel  endotel,  dan  juga  mengurangi  sekresi growth  factor (FGF, VEGF) pada tingkat mRNA yang bekerja pada jalur Akt dan Erk (Kong et al ., 2013).
Mekanisme  penghambatan  angiogenesis  oleh  ekstrak  etanol  biji  kopi  robusta  ( Coffea  robusta )  pada Chorio Allantoic Membrane (CAM) belum dapat dipastikan, karena diduga dengan cara menghambat Vascular  endhotelial  growth  factor (VEGF).  Walaupun  demikian  penelitian  ini  belum  bisa menjelaskan  senyawa  bioaktif  mana  pada  biji  kopi  robusta  ( Coffea  robusta )  yang  bersifat antiangiogenik (Gaascht et al ., 2015).
Dalam  hal  ini  dapat  dilihat  bahwa  pada  penelitian  tersebut  ekstrak  etanol  biji  kopi  robusta  ( Coffea robusta )  dapat  memberikan  efek  antiangiogenesis  serta  bersifat  toksik  pada  konsentrasi  6000 µg/ml, 5500  µg/ml,  dan  5000  µg/ml.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  ekstrak  etanol  biji  kopi  robusta  ( Coffea robusta ) dapat berpotensi sebagai antikanker.

## KESIMPULAN
Berdasarkan  hasil  penelitian  dapat  disimpulkan  bahwa  ekstrak  etanol  biji  kopi  robusta  ( Coffea robust a) memiliki efek antiangiogenesis pada Chorio Allantoic Membrane (CAM) pada embrio ayam, dan ekstrak etanol biji kopi robusta ( Coffea robust a) memiliki efek antiangiogenesis  pada konsentrasi 6000  µg/ml,  5500  µg/ml,  dan  5000  µg/ml.  Adapun  saran  dari  penelitian  ini  agar  pada  penelitian selanjutnya  menggunakan  konsentrasi  yang  lebih  variatif  dengan  jumlah  yang  lebih  besar  dan  perlu dilakukan  penelitian  lebih  lanjut  mengenai  uji  zat  aktif  ekstrak  etanol  biji  kopi  robusta  ( Coffea robusta ) yang berperan pada mekanisme penghambatan angiogenesis.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Kami mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada para dosen program studi S1 Farmasi Universitas  Megarezky  atas  masukan  dan  arahan  dalam  proses  penelitian  ini  sehingga  dapat terselesaikan.  Ucapan  terima  kasih  juga  kami  ucapkan  kepada  Kementerian  Riset,  Teknologi  dan Pendidikan Tinggi karena telah membiayai keseluruhan dalam penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Cavin, C., Holzhaeuser, D., Scharf, G., Constable, A., Huber, W. W., & Schilter, B. (2002). Cafestol and kahweol, two coffee specific diterpenes with anticarcinogenic activity. Food and Chemical Toxicology, 40 (8), 1155–1163.
Gaascht,  F.,  Dicato,  M.,  Diederich,  M.  (2015).  Coffee  provides  a  natural  multitarget  pharmacopeia against the hallmarks of cancer. Genes Nutr, 10 :51. Pp 1-17. doi: 10.1007/s12263-015-0501-3
Hanaahan,  D.,  &  Weinberg.  2000.  The  Hallmark  of  Cancer.  Cell,  Vol.  100,  50-70. DOI:https://doi.org/10.1016/S0092-8674(00)81683-9.
Kong,  C.  S.,  Jeong,  C.  H.,  Choi,  J.  S.,  Kim,  K. J., Jeong,  J.  W.  (2013)  Antiangiogenic  effects  of  p- coumaric acid in human endothelial. Cells Phytother Res, 27 :317–323. doi:10.1002/ptr.4718
Li, H., Jin, S. Y., Son, H. J., Seo, J. H., Jeong, G. B. (2013) Caffeine-induced endothelial cell death and the inhibition of angiogenesis. Anat Cell Biol 46 :57–67. doi:10.5115/acb.2013.46.1.57
Mustafida,  Y,  R.,  Munawir,  A.  L.,  Dewi,  R.  (2014),  Efek  Antiangiogenik  Ekstrak  Etanol  Mahkota Dewa  (Phaleria  Macropa  (Scheff).Boerl.)  pada  Membran  Kolorioalantois  (CAM)  Embrio Ayam, E-jurnal Pustaka Kesehatan , 2 :5.
Winarsi,  H.  (2007). Antioksidan  dan  Radikal  Bebas  Potensi  dan  Aplikasinya  dalam  Kesehatan . Yogyakarta: Kanisius.
Yeh,  C.  H.,  Liao,  Y.  F.,  Chang,  C.  Y.,  Tsai,  J.  N.,  Wang,  Y.  H.,  Cheng,  C.  C.,  ...  &  Chen,  Y.  H. (2012). Caffeine treatment disturbs the angiogenesis of zebrafish embryos. Drug and chemical toxicology, 35 (4), 361-365.