Hasil Penelitian                                                                        J. Teknol. dan Industri Pangan, Vol. XIX No. 2 Th. 2008
AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK BIJI TERATAI  ( Nymphaea pubescens Willd) TERHADAP BAKTERI PATOGEN PENYEBAB DIARE
[Antibacterial Activity of Water lily Seed Extract Toward Diarrhea-causing Pathogenic Bacteria]
Yuspihana Fitrial 1) , Made Astawan 2) , Soewarno S.Soekarto 2) , Komang G.Wiryawan 3) Tutik Wresdiyati 4) dan Rita Khairina 1)
1) Staf Pengajar Fakultas Perikanan UNLAM
2) Staf Pengajar Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fateta IPB
3) Staf Pengajar Departemen Ilmu Nutrisi dan Teknologi Pakan, Fakultas Peternakan, IPB
4) Staf Pengajar Departemen Anatomi,Fisiologi & Farmakologi, FKH IPB
Diterima 20 Agustus 2008/ Disetujui 28 Desember 2008

## ABSTRACT
The objectives of this study was to observe antibacterial activities of water lily seed, against diarrhea-causing pathogenic bacteria as well as lactic acid bacteria; phytochemistry components in water lily seed and to evaluate each component’s activities against pathogen bacteria.
Extraction of antibacterial components in the seed was done by fractional extraction methods using solvent based on its polar level, i.e. hexane, ethyl acetate and ethanol . The activities of each extract was tested by using diarrhea-causing bacteria, Enteropathogenic Escherichia coli K.1.1  (EPEC  K1.1)  and  S.  typhimurium  with  agar  well  diffusion  method.  The  minimum  inhibitory  concentration  (MIC)  and  minimum  bactericidal concentration (MBC) values were calculated with plate counting.  Qualitative phytochemical tests were performed on all extracts.  Fractionation was performed  on  extract  with  the  largest  antimicrobial  activity  by  using  thin-layer  chromatography.  The  activities  of  each  fraction  were  tested qualitatively by bio-autography method on thin layer chromatographic plates.
The water lily seed had an antibacterial activity against EPEC K.1.1 and Salmonella typhimurium, especially in ethyl acetate extract. Ethanol extract had the same, yet lower activity.  Ethyl acetate and ethanol extract of the seed did not show inhibition against the growth of lactic acid bacteria (Lactobacillus sp) and Bifidobacterium bifidum.
The MIC and MBC values of the  ethyl acetate extract on EPEC K1.1 were 0.89 (mg/mL) and 1.33 (mg/mL), respectively, while similar values of that on S. Typhimurium were 1.11 (mg/mL) and 1.33 (mg/mL), respectively.  Phytochemistry components within ethyl acetate extract were alkaloids, flavonoids, tannins, glycosides, saponins, and triterpenoids.  All fractions in the ethyl acetate extract had antimicrobial activities against EPEC K.1.1 and S. Typhimurium.  These fractions were thought to inhibit the growth of the test-microbes by synergic action of each component.
Key words : water lily seed, antibacterial, ethyl acetate extract

## PENDAHULUAN
Teratai merupakan  tanaman  air  yang  banyak tumbuh secara alami di perairan rawa atau sungai yang tidak begitu dalam dan berair tenang. Kalimantan Selatan memiliki rawa  seluas  800.000  Ha  (BPS  Kalimantan  Selatan,  2000) yang  banyak  ditumbuhi  tanaman  air,  salah  satunya  adalah teratai.  Bagian tanaman teratai ini yang dapat dimanfaatkan sebagai  bahan  pangan  adalah  bunga,  biji,  batang  dan umbinya.  Akan tetapi yang paling banyak dimanfaatkan oleh penduduk,  terutama  di  daerah  Hulu  Sungai  Utara  adalah bijinya.  Biji  buah  teratai  oleh  penduduk  setempat  sering dijadikan  sebagai  sumber  karbohidrat  pengganti  beras  di saat paceklik ataupun dijadikan tepung untuk membuat kue. Penelitian Kairina dan Fitrial (2001) memberikan hasil bahwa dari  setiap  rumpun  teratai  rata-rata  terdapat  5  buah  teratai tua  yang  menghasilkan  63.10  gram  biji  teratai  kering.    Biji teratai  kering  inilah  yang  kemudian  dikupas  kulitnya  dan dijual di pasar.
Biji  teratai  putih  yang  biasa  dijadikan  bahan pangan  berasal  dari  spesies Nymphaea pubescens Willd.
Di  Filipina  dan  India,  biji  teratai  dijadikan  tepung  untuk pembuatan  roti  (Sastrapradja  dan  Bimantoro,  1981).  Di daerah  Tuban,  Jawa  Timur,  biji  teratai  dicampur  dengan beras  ketan,  dijadikan  dodol  atau  jenang  yang  (Marianto, 2001).
Secara  tradisional,  tanaman  teratai  digunakan sebagai  bahan  obat-obatan.  Bagian  umbi  dimanfaatkan sebagai jamu-jamuan yang direbus untuk mengobati disentri atau  diare yang disebabkan oleh sindrom iritasi pada usus besar,  gonorrhoe,  bisul  dan  tumor  ( Anonim ,  2004;  Grieve, 2004;  Depkes,  1997).  Biji  teratai  juga  memiliki  khasiat meningkatkan  fungsi  hati  dan  limfa,  memperbaiki  stamina dan membuat awet muda. Bagian biji mengandung alkaloid, nupharine (Hughes, 2004). Oleh karena itu perlu kajian lebih lanjut  mengenai  potensi  biji  teratai  sebagai  pangan fungsional  antidiare  dengan  menganalisis  aktivitas antimikroba  ekstrak  biji  teratai  terhadap  bakteri  patogen penyebab  diare,  menganalisis  komponen  fitokimia  ekstrak serta  mengevaluasi  aktivitas  masing-masing  fraksi  ekstrak terhadap pertumbuhan bakteri patogen penyebab diare .
Hasil Penelitian                                                                        J. Teknol. dan Industri Pangan, Vol. XIX No. 2 Th. 2008

## METODOLOGI
Bahan Biji  teratai  jenis Nymphaea  pubescens Willd. diperoleh  dari  daerah  Hulu  Sungai  Utara,  Kalimantan Selatan.  Biji yang terdapat dalam buah dipanen dengan cara memetik  buahnya  yang  sudah  tua.    Buah  yang  sudah  tua dibusukkan  sehingga buah akan pecah.  Biji dipisahkan dari daging buah dan dicuci. Biji yang sudah bersih mengendap di dasar wadah pencucian.  Biji dijemur sehingga kering. Biji yang kering berwarna hijau tua atau kecoklatan dan kulitnya keras. Sebelum dibuat tepung, kulit biji dibuang dengan cara menumbuknya atau menggunakan  alat pembuang kulit padi. Biji  teratai  yang  sudah  dibuang  kulit  arinya  digiling  halus dengan blender sehingga berbentuk tepung.

## Ekstraksi  senyawa  antimikroba  biji  teratai (Houghton and Raman, 1998)
Ekstraksi  komponen  antimikroba  secara  maserasi menggunakan  metode    ekstraksi  bertingkat  berdasarkan tingkat  kepolaran  pelarut  yaitu  heksana  (tidak  polar),  etil asetat  (semi  polar)  dan  etanol  (polar).  Pertama-tama  biji teratai  dalam  bentuk  tepung  dimaserasi  pada  suhu  ruang selama  24  jam  dengan  heksana,  dengan  perbandingan tepung  biji  teratai  dengan  pelarut  1  :  4  (b/v).  Ekstraksi dengan  pelarut  yang  sama  diulang  lagi  dengan perbandingan  bahan  dan    pelarut  sama  dengan  yang pertama.  Filtrat  diambil  sebagai  ekstrak  heksana  dan endapan dimaserasi dengan etil asetat selama 24 jam. Filtrat diambil  sebagai  ekstrak  etil  asetat,  sedangkan  endapan dimaserasi  lagi  dengan  etanol  selama  24  jam  dan  filtratnya diambil  sebagai  ekstrak  etanol.  Pelarut  diuapkan  dengan rotavapor  suhu  40  C,  sisa  pelarut  diuapkan  dengan  gas nitrogen.  Ekstrak yang diperoleh digunakan sebagai sampel untuk analisis dan pengujian antibakteri.
Rendemen ekstrak dihitung sebagai persen ekstrak kering (tanpa pelarut)  (g ekstrak/100 g tepung biji teratai).

## Analisis senyawa antimikroba dengan difusi agar
Mikroba
uji adalah
Escherichia
coli Enteropatogenik  K1.1  (EPEC  K1.1)  koleksi  dari Dr. dr. Sri Budiarti dari Laboratorium Bioteknologi  Hewan  & Biomedis, Pusat Penelitian Bioteknologi IPB, S.Typhimurium (FNCC-050)  dan L.  acidophilus (FNCC-051)  koleksi  dari Laboratorium Mikrobiologi PAU Universitas Gajah Mada dan Bifidobacterium  bifidum (INCC)  koleksi  dari  Balitbang Mikrobiologi Puslitbang Biologi LIPI Bogor.
Kultur  bakteri  murni  dalam  bentuk  liofil  dibuka secara aseptis lalu dipindahkan ke dalam tabung yang berisi medium  NB  steril,  diinkubasi  48  jam  pada  37  C.    Sebagai stok bakteri, dibuat kultur bakteri dalam agar miring dengan medium  NA,  disimpan  di  dalam  lemari  pendingin  setelah terlebih dahulu diinkubasikan selama 24-48 jam.  Setiap stok bakteri  yang  akan  digunakan  dalam  pengujian  aktivitas antibakteri, selalu disegarkan kembali di dalam medium NB
steril selama 24 jam pada 37  C, dihomogenkan dengan alat vorteks,  lalu  diinokulasikan  sebanyak  20  L  ke  dalam  labu erlemeyer yang berisi 20 ml medium agar cair (NA,44-45  C) steril,  dikocok  merata,  kemudian  dituang  ke  dalam  cawan petri  steril  dan  dibiarkan  sampai  membeku.    Selanjutnya dibuat  3-4  lubang  (sumur)  secara  aseptis  dengan  diameter sumur  6.0  mm  (seragam).  Ke  dalam  tiap  lubang, diinokulasikan 60  L ekstrak biji teratai dengan konsentrasi 10  %,  20  %  dan  30  %  (b/v)  dalam  pelarut  heksana  (untuk ekstrak  heksana),  etil  asetat  (untuk  ekstrak  etil  asetat  dan etanol  (untuk  ekstrak  etanol).  Sebagai  kontrol  (0  %), diinokulasikan    60  L  pelarut  (Gariga et  al .  1983).  Pada antibiotik (ampisilin, amoksilin dan kloramfenikol) digunakan konsentrasi 2 % (b/v) antibiotik dalam pelarut DMSO.
Zona hambatan yang diukur adalah radius (r, mm) penghambatan  berupa  areal  bening  di  sekeliling  sumur  uji, setelah  diinkubasikan  selama  24  jam  pada  37  C. Pengukuran  jari-jari  zona  hambatan  di  sekeliling  sumur  uji dilakukan dengan cara mengukur jarak dari tepi sumur uji ke batas lingkaran zona hambatan menggunakan jangka sorong (ketelitian 0.01 mm) pada beberapa sisi sumur uji, lalu dirata- ratakan.    Selanjutnya  nilai  diameter  (d,  mm)  zona  hambat hasil  pengamatan  langsung,  diperoleh  dengan  perhitungan d = 2 x r.

## Penentuan MIC dan MBC
Penentuan  konsentrasi  minimum  penghambatan (MIC = minimum inhibitory concentration ) dilakukan dengan metode  Kubo  (1992)  pada  konsentrasi  0-1.55  mg/mL. Ekstrak  dicampur  dengan  kultur  bakteri  uji  dalam  inkubator goyang  dengan  kecepatan  150  rpm  selama  24  jam.    Total mikroba dihitung dengan metode hitungan cawan. Nilai MIC yaitu konsentrasi minimum ekstrak yang dapat menghambat pertumbuhan  bakteri  uji  sebanyak  90  %  selama  24  jam, sedangkan konsentrasi minimum pembunuhan (MBC  = minimum  bactericidal  concentration )  merupakan konsentrasi minimum ekstrak yang dapat membunuh bakteri uji.

## Fraksinasi ekstrak biji teratai
Fraksinasi menggunakan TLC  kaca (Kieselgel 60 F254 0.2 mm, Merck).  Sebagai fase gerak adalah heksana dan  etil  asetat  dengan  perbandingan  7:3.  Komponen- komponen yang terpisah dilihat dengan menggunakan sinar ultra violet (254 dan 360 nm).

## Bioautografi
Ekstrak biji difraksinasikan dengan TLC berukuran 5x20 cm (Kieselgel 60 F254 0.2 mm, Merck)  dengan pelarut heksana:etil  asetat  =  7:3.  Setelah  komponen  ekstrak terpisah,  TLC  disiram  dengan  agar  yang  mengandung mikroba  uji  (EPEC  K1.1  dan Salmonella  Typhimurium ) dengan  konsentrasi  10 5 dalam  media  agar.  TLC diinkubasikan dalam cawan steril selama 18 jam suhu 37  C. Setelah diinkubasikan, plate TLC disemprot dengan 2 mg/mL larutan p -iodonitrotetrazolium violet (Sigma) menurut metode Springfield et  al .  (2003)  yang  dimodifikasi.    Daerah  bening
dari kromatogram menunjukkan penghambatan pertumbuhan mikroba.

## Analisis fitokimia
Analisis  fitokimia  dari  masing-masing  ekstrak meliputi  alkaloid,  tanin,  saponin,  glikosida,  flavonoid, triterpenoid dan steroid (Harborne, 1987).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Zat antibakteri biji teratai
Sifat fisik dan rendemen ekstrak heksana, ekstrak etil  asetat  dan  ekstrak  etanol  dapat  dilihat  pada  Tabel  1. Ekstrak  polar  yang  merupakan  ekstraksi  dengan  pelarut etanol  memberikan  rendemen  yang  paling  tinggi  (7.34  %) dibandingkan  ekstrak  nonpolar  (heksana,  0.84  %)  dan ekstrak semipolar (etil asetat, 0.95 %). Tingginya rendemen pada ekstral etanol selain karena adanya komponen fitokimia yang  bersifat  polar  yang  larut  pada  etanol,  juga  karena  biji teratai mengandung karbohidrat yang tinggi (88.36 % bk) dan protein  (10.39 % bk) (Khairina dan Fitrial, 2002).   Beberapa dari  komponen  karbohidrat  dan  protein  tersebut  dapat  larut pada etanol yang sifatnya polar.
Tabel 1  Sifat fisik dan rendemen ekstrak biji teratai Jenis ekstrak Fisik ekstrak Rendemen (%) Ekstrak heksana Jingga, cair (oily) 0.84 Ekstrak etilasetat Jingga kecoklatan, kental 0.95 Ekstrak etanol Coklat kemerahan, kental 7.34
Keterangan : Kadar air tepung biji = 13%
Aktivitas  antimikroba  ekstrak  heksana,  ekstrak  etil asetat  dan  ekstrak  etanol  biji  teratai  terhadap  EPEC  K.1.1 dan S.typhimurium dengan  metode  difusi  sumur  pada nutrient  agar  ditunjukkan  pada  Tabel  2.  Secara  umum ekstrak  etil  asetat  mempunyai  penghambatan  relatif  lebih tinggi daripada ekstrak heksana dan ekstrak etanol terhadap kedua  bakteri  uji.    Ekstrak  heksana  terlihat  tidak      memiliki aktivitas penghambatan terhadap pertumbuhan   EPEC K1.1 dan S.typhimurium. Kedua mikroba uji terlihat lebih sensitif terhadap  ekstrak  etil  asetat  dibandingkan  dengan  ekstrak etanol.
Gambar 1. Bioautogram penghambatan ekstrak  etil asetat biji teratai  terhadap EPEC K1.1 dan S. typhimurium
UV 366 nm
Salmonella Typhimurium EPEC K.1.1 1 2 7 6 5 4 3 11 10 9 8 Daerah penghambatan Daerah penghambatan Daerah penghambatan Daerah penghambatan Daerah yang ditumbuhi mikroba
Ekstraksi  dengan  heksana  bertujuan  untuk menghilangkan  senyawa-senyawa  nonpolar  alami,  terutama senyawa-senyawa  lilin  tanaman,  minyak  nabati  dan/atau sebagian  minyak  atsiri  (Houghton  dan  Raman,  1998). Menurut  Kanasawa et  al .(1995)  senyawa  minyak  dan  lipida lainnya  mempunyai  ukuran  molekul  besar  sehingga  tidak dapat masuk ke dalam dinding sel dan menjadi penghalang masuknya  minyak  atsiri  dan  komponen  fitokimia  lainnya  ke dalam sel bakteri uji, akibatnya sel tetap akan tumbuh.
Hal yang sama juga terjadi pada ekstrak heksana Helianthemum g lomeratum yang menunjukkan tidak adanya aktivitas penghambatan terhadap bakteri patogen penyebab diare  seperti Shigella sp, Salmonella sp., Vibrio  cholera , E.coli EIEC dan ETEC (Meckes et al . 1997).  Demikian pula pada ekstrak heksana andaliman ( Zanthoxylum acanthopodium DC)  terhadap B.  cereus , S.  typhimurium , S.  aureus (Parhusip,  2006)  dan  ekstrak  heksana  bunga kecombrang  terhadap B.  cereus , S.  typhimurium , L. monocytogenes, E. coli, A. hydrophila dan P. aeruginosa (Naufalin, 2005).
Pada  Tabel  2  terlihat  ekstrak  etil  asetat  memiliki aktivitas  antimikroba  yang  lebih  tinggi  daripada  ekstrak etanol  dan  ekstrak  heksana.    Hal  ini  menunjukkan  bahwa senyawa  aktif  yang  berperan  sebagai  antimikroba  adalah senyawa  semi  polar.  Ekstrak  etil  asetat  memberikan penghambatan  yang  tinggi.    Kemampuan  senyawa  semi polar  untuk  menghambat  pertumbuhan  bakteri  berkaitan dengan  komponen  dinding  sel  bakteri  yang  tidak  bersifat
absolut hidrofobik maupun absolut hidrofilik.  Kanazawa et al . (1995) menyatakan bahwa suatu senyawa yang mempunyai polaritas  optimum  akan  mempunyai  aktivitas  antimikroba yang  maksimum,  karena  untuk  interaksi  suatu  senyawa antimikroba  dengan  bakteri  diperlukan  keseimbangan hidrofilik-hidrofobik.  Diduga senyawa semi polar mempunyai afinitas  lebih  tinggi  untuk  berinteraksi  dengan  dinding  sel, sehingga  ekstrak  semi  polar  lebih  efektif  menghambat pertumbuhan  EPEC  K.1.1  dan S.typhimurium daripada ekstrak etanol (polar) dan ekstrak heksana (non polar). Sifat hidrofilik  diperlukan  untuk  menjamin  senyawa  dapat  larut dalam fase air yang merupakan tempat hidup mikroba, tetapi senyawa  yang  bekerja  pada  membran  sel  yang  hidrofobik memerlukan pula sifat lipofilik, sehingga senyawa antibakteri memerlukan keseimbangan hidrofilik-lipofilik untuk mencapai aktivitas yang optimum.
Pada  ekstrak  etanol  yang  bersifat  polar  terlihat aktivitas antimikroba yang lebih rendah dibandingkan ekstrak etil  asetat  terhadap  EPEC  K1.1  dan S . typhimurium. Beberapa  peneliti  melaporkan  bahwa  keberadaan  minyak dalam  ekstrak  non-polar  dan  protein  dalam  ekstrak  polar merupakan faktor yang mempengaruhi aktivitas antimikroba dari  senyawa  fenolik  (Nychas,  1995).    Ekstrak  etanol  biji teratai  merupakan  ekstrak  polar  yang  mengandung  tanin (Tabel 3), tanin dapat berikatan dengan protein biji sehingga aktivitas tanin sebagai antimikroba menjadi terganggu.
Tabel 2  Diameter penghambatan (mm) ekstrak heksana, ekstrak etil asetat dan ekstrak  etanol biji teratai dibandingkan dengan antibiotik
Jenis ekstrak/ antibiotik Konsentrasi  (% b/v) Diameter penghambatan (mm) E.coli K.1.1 S. typhimurium B. bifidum Lactobacillus acidophilus Ekstrak Heksana 0 0 0 - - 10 0 0 - - 20 0 0 - - 30 0 0 - - Ekstrak Etil asetat 0 0 0 0 0 10 19.33±0.91 17.90±1.08 0 0 20 25.50±1.27 23.18±0.23 0 0 30 29.57±1.00 26.40±0.48 0 0 Ekstrak Etanol 0 0 0 0 0 10 12.36±0.28 12.47±2.38 0 0 20 14.08±1.02 13.43±1.10 0 0 30 15.79±0.53 15.49±0.21 0 0 Amosilin 2 0 23.94±0.78 - - Ampisilin 2 0 23.65±1.48 - - Kloramfenikol 2 1.72±0.39 25.14±2.49 - - Keterangan : 0% = tanpa ekstrak hanya pelarut yang digunakan 0    = tidak ada penghambatan
- = tidak diamati
Ekstrak yang diuji masing-masing 60 uL pada media bakteri dengan jumlah 10 5 CFU/mL
Hasil Penelitian                                                                        J. Teknol. dan Industri Pangan, Vol. XIX No. 2 Th. 2008
Tabel 3  Komponen fitokimia biji teratai dan ekstrak Komponen fitokimia Biji Ekstrak heksana Ekstrak etil asetat Ekstrak etanol Alkaloid + + + + Saponin + + + + Tanin + - + + Glikosida + + + - Flavonoid + - + + Steroid + + - - Triterpenoid + - + +
Keterangan : + menunjukkan ada pada contoh - menunjukkan tidak terdapat pada contoh
Alkaloid merupakan senyawa nitrogen heterosiklik. Menurut Cowan (1999) alkaloid yang diisolasi dari tanaman famili Ranunculaceae diketahui  memiliki  aktivitas antimikroba.  Sementara  alkaloid  yang  terdapat  pada berberine dapat  mengkelat  DNA  dari trypanosoma dan plasmodia.
Ada  tiga  mekanisme  aktivitas    tanin  sebagai antimikroba  (Scalbert,  1991)  yaitu  pertama,  tanin  bersifat astringen  (zat  yang  menciutkan);  tanin  dapat  membentuk kompleks  dengan  enzim  mikroba  ataupun  substrat.  Kedua, tanin  masuk  melalui  membran  mikroba,  untuk  mencapai membran tanin harus melewati dinding sel mikroba.  Dinding sel terbuat dari polisakarida dan protein yang berbeda yang memungkinkan  bagian  dari  tanin  masuk.  Ketiga,  tanin membentuk kompleks dengan ion metal.  Kebanyakan tanin memiliki lebih dari dua grup o -difenol pada molekulnya, yang dapat  mengkelat  ion-ion  metal  seperti  Cu  dan  Fe.  Tanin mereduksi  ketersediaan  ion  metal  esensial  untuk mikroorganisme.
Pada  tumbuhan,  flavonoid  disintesis  sebagai respon  terhadap  infeksi  mikrobia.    Sebagai  antimikroba, flavonoid  dapat  membentuk  kompleks  dengan  protein ekstraseluler  dan  dinding  sel  bakteri.  Selain  itu  flavonoid yang  bersifat  lipofilik  dapat  merusak  membran  mikroba (Cowan,  1999).    Menurut  Otshudi et  al .  (2000)  flavonoid diketahui  memiliki  aktivitas  antivirus,  anti-inflamasi,  dan sitotoksik.  Flavonoid memiliki aktivitas antioksidan dan juga memperkuat  sistem  pertahanan  mukosa  melalui  stimulasi sekresi mukus gastrik (Aniagu et al . 2005). Flavonoid dapat berperan sebagai penangkap spesies oksigen reaktif (seperti anion superoksida) dan radikal bebas (Aniagu et al . 2005).
Terpena  atau  terpenoid  memiliki  aktivitas antibakteri.    Mekanisme  antibakteri  dari  terpena  tidak sepenuhnya  diketahui,  akan  tetapi  diduga  senyawa  ini bekerja  pada  pengrusakan  membran  oleh  senyawa  lipofilik. Adanya  penambahan  senyawa  metil  pada  diterpenoid menjadikan  diterpenoid  lebih  hidrofililk  yang  dapat mengurangi aktivitas antimikrobanya (Cowan 1999).
Menurut  Aguwa  dan  Lawal  (1988)  saponin menunjukkan  anti-ulcer  melalui  pembentukan  perlindungan pada  mukus  permukaan  mukosa  usus.  Saponin  memiliki aktivitas ekspektoran dan antitusif.
Pengujian  aktivitas  antimikroba  dari  ekstrak  etil asetat biji dilakukan menggunakan metode kontak langsung antara bakteri uji dengan ekstrak. Metode ini dilakukan untuk mendapatkan  nilai  MIC  dan  MBC  dari  suatu  ekstrak
antimikroba.  Nilai MIC dan MBC ekstrak etil asetat biji teratai terhadap  pertumbuhan  bakteri  EPEC  K1.1  dan S. typhimurium dapat dilihat pada Tabel 4.
Tabel 4. Nilai MIC dan MBC ekstrak etil asetat biji teratai terhadap pertumbuhan EPEC K.1.1 dan Salmonella typhimurium
Mikroba uji MIC (mg/mL) MBC   (mg/mL) EPEC K 1.1 0.89 1.33 S. typhimurium 1.11 1.33
Berdasarkan  Tabel  4  terlihat  bahwa  nilai  MIC ekstrak  etil  asetat  biji  terhadap  EPEC  K1.1  dan S. typhimurium adalah  0.89  mg/ml,  sedangkan  nilai  MBC ekstrak terhadap EPEC K1.1 adalah 1.33 mg/ml.  Nilai MIC dan  MBC  terhadap S.  typhimurium adalah  1.11  mg/ml  dan 1.33  mg/ml.    Hal  ini  menunjukkan  bahwa  EPEC  K1.1  lebih sensitif terhadap ekstrak etil asetat biji dibandingkan dengan S.typhimurium .
Jika  dibandingkan  dengan  nilai  MIC  ekstrak tanaman  lain,  seperti  ekstrak  etil  asetat  bunga  kecombrang nilai MIC ekstrak terhadap E. coli dan S.typhimurium adalah 4  mg/ml  (Naufalin  2005);  ekstrak  jahe  terhadap E.  coli dan S.Typhi adalah  10  mg/ml  (Radiati  2002),  dan  ekstrak  daun sirih  terhadap E.  coli dan S.typhimurium adalah  2  mg/ml (Sugiastuti 2002).
Fraksinasi ekstrak etil asetat  dan uji aktivitas fraksi Ekstrak  etil  asetat    memiliki  aktivitas  antimikroba yang  lebih  tinggi  daripada  ekstrak  etanol.    Oleh  karena  itu hanya ekstrak tersebut yang dipilih untuk analisis fraksi-fraksi yang  berperan  sebagai  antimikroba.    Fraksinasi  ekstrak  etil asetat dilakukan menggunakan  TLC silika G60 F 245 dengan fase gerak heksana dan etil asetat (7:3).  Fraksinasi ekstrak etil  asetat  dengan  menggunakan  fase  gerak  tersebut, menghasilkan 11 fraksi dengan nilai R f disajikan pada Tabel 5 dan Gambar 1.
Masing-masing  fraksi  yang  telah  dipisahkan dengan  TLC  diuji  aktivitas  antimikrobanya  secara  kualitatif menggunakan  metode  bioautografi.  Pada  bioautogram (Gambar  1)  terlihat  zona  bening  (terang)  pada  dan  atau  di sekitar  fraksi  (pita)  yang  menunjukkan  adanya penghambatan  oleh  masing-masing  fraksi,  sedangkan dengan pewarnaan, mikroba uji terlihat berwarna ungu. Pada fraksi  10  terlihat  berwarna  merah  dan  fraksi  6  terlihat berwarna  jingga  yang  merupakan  warna  asal  dari    fraksi-
fraksi  tersebut.      Meskipun  demikian,  pada  fraksi  tersebut tidak ditumbuhi oleh mikroba uji  yang menunjukkan adanya penghambatan  oleh  fraksi  tersebut.  Adanya  penghambatan oleh  masing-masing  fraksi  terhadap  EPEC  K.1.1  dan S.typhimurium menunjukkan  bahwa  fraksi-fraksi  tersebut memiliki aktivitas antimikroba.  Fraksi-fraksi tersebut bekerja menghambat pertumbuhan mikroba uji secara sinergis.
Tabel 5  Nilai R f fraksi ekstrak etil asetat biji teratai
No. Fraksi R f 11 0.930 10 0.892 9 0.820 8 0.720 7 0.540 6 0.510 5 0.466 4 0.431 3 0.376 2 0.320 1 0.076

## KESIMPULAN
Ekstrak  biji  teratai  ( Nymphaea  pubescens Willd) memiliki  aktivitas  antibakteri    terhadap  EPEC  K.1.1  dan Salmonella  typhimurium terutama  pada  ekstrak  etil  asetat. Ekstrak etanol memiliki aktivitas yang lebih rendah daripada ekstrak etil asetat.
Nilai MIC dan MBC ekstrak etil asetat biji teratai terhadap  EPEC  K1.1  adalah  0.89  mg/mL  dan  1.33  mg/mL. Nilai  MIC  dan  MBC  ekstrak  etil  asetat  biji  teratai  terhadap S.  typhimurium adalah  1.11  mg/mL  dan  1.33  mg/mL. Komponen  fitokimia  yang  terdapat  pada  biji  teratai  adalah alkaloid,  flavonoid,  steroid,  glikosida,  tanin,  saponin,  dan triterpenoid  sedangkan  ekstrak  etil  asetat  biji  teratai  adalah alkaloid, tanin, glikosida, saponin, flavonoid dan triterpenoid Fraksinasi menggunakan TLC menunjukkan bahwa semua fraksi yang terdapat pada ekstrak etil asetat biji teratai memiliki  aktivitas  antibakteri  terhadap  EPEC  K.1.1  dan S.typhimurium .  Fraksi-fraksi  tersebut  bekerja  menghambat pertumbuhan bakteri uji secara sinergis.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada Direktorat  Pembinaan  Penelitian  dan  Pengabdian  kepada Masyarakat,  Ditjen  Pendidikan  Tinggi,  Departemen Pendidikan Nasional RI atas dana penelitian yang diberikan melalui Program Hibah Bersaing XIV (2006).
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada Dr. dr. Sri Budiarti dari Laboratorium Bioteknologi Hewan dan Biomedis,  Pusat  Sumberdaya  Hayati  dan    Bioteknologi LPPM IPB, yang telah memberikan koleksi isolat EPEC K.1.1 sebagai bakteri uji pada penelitian ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Aguw CN and Lawal AM.  1988.  Pharmacologic studies on the  active  principles  of Calliandra  portoricensis leaf extracts. J. Ethnopharmacology , 22:  63-71
Aniagu SO, Binda LG, Nwinyi FC, and  Orisadipe A.  2005.
Anti-diarrhoeal  and  ulcer-protective  effects  of  the aqueous  root  extract  of Guiera  senegalensis in rodents. J. Ethnopharmacology , 97: 549-554 [Anonim]. 2004. Water Lily- Nymphaea alba .
www.botany.hawaii.edu . Maret 2004
AOAC.  1984.  Official Methods of Analysis.  Assosiation of Official Agricultural Chemists, Washington DC, USA.
Asp  NG,  Johnson  CG,  Halmer  H  and  Siljestrom  M.  1983.
Rapid  enzymatic  assay  of  insoluble  dietary  fiber. J. Agr. Food Chem ., 31:476-482
BPS  Kalimantan  Selatan.    2000.    Biro  Pusat  Statistik Kalimantan Selatan.  Banjarmasin.
Cappaso R, Evidente A, Schivo L, Orru G, Marcialis MA and Cristinzio  G.    1995.  Antibacterial  polyphenols  from olive oil mill waste waters. J.Appl . Bacteriol . 79: 393- 398.
Cowan MM. 1999.  Plants products as antimicrobial agents.
Clinical Microbiology Reviews .: 564-582
Departemen  Kesehatan.    1995.    Materia  Medika  Indonesia. Jilid VI.  Departemen Kesehatan RI.  Jakarta.
Departemen  Kesehatan.    1997.    Inventaris  Tanaman  Obat Indonesia  (IV).    Dep.Kes.    Badan  Penelitian  dan Pengembangan Kesehatan.  Jakarta.
Gariga  M,  Hugas  M,  Aymerich  T  and  Monfort  JM.  1983. Bacteriogenic  activity  of  lactobacilli  from  fermented sausage. App. Bacteriol .,  75:142-148
Grieve  M.  2004.  Monograph-A  Modern  Herbal. www.herbdatan2.com . Januari 2004
Harborne  JB.    1987.    Metode  Fitokimia:  Penuntun  cara modern  menganalisis  tumbuhan.  Ed  ke-2. Padmawinata  K  &  Soediro  I,  penerjemah. Terjemahan dari: Phytochemical Methods.   Penerbit ITB Bandung, Bandung.
Herbert  RB.  1988.    Biosynthesis  of  Secondary  Metabolites. Chapman & Hall.  London.
Houghton PJ and Raman A.  1998.  Laboratory Handbook for The  Fractionation  of  Natural  Extracts.    Chapman  & Hall.  London.
Hughes.    2004.    Lily,  White  Pond. www.botanical.com . Maret 2004
Kanazawa A, Ikeda T and Endo T. 1995.  A Novel approach to  mode  of  action  of  cationic  biocides  morfological effect on bacterial activity. J. Appl. Bacteriol . 78:55- 60.
Khairina R.  dan   Fitrial Y.  2002.  Produksi dan Kandungan Gizi  Biji  Teratai  ( Nymphae  pubescens Willd) Tanaman  Air  yang  terdapat  di  Hulu  Sungai  Utara. Jurnal Ilmiah Fakultas Pertanian , UNLAM.  77-88
Kubo  I.    1992.    Antimicrobial  activity  of  green  tea  flavour components  (effectiveness  against Streptococcus mutans ).  Di  dalam    :  Teranishi  R,  Buttery  RG, Sugisama H. (Ed.).  Bioactive Volatile Compounds for plants.  American Chemical Society.  Washington.
Lavlinesia.    2004.    Kajian  Pola  dan  Mekanisme  Inaktivasi Bakteri oleh Ekstrak Etil Asetat Biji Atung ( Parinarium globerimum Hassk)  [Ringkasan  Disertasi].    Program Pascasarjana IPB, Bogor.
Marianto LA  2001.  Tanaman Air.  Penerbit PT. Agro Media Pustaka.  Bintaro, Jakarta.
Meckes  M,  Torres  J,  Calzada  F,  Rivera  J,  Camorlinga  M, Lemus H, Rodriguez G. 1997. Antibacterial properties of Helianthemum  glomeratum ,  a  plant  used  in  Maya traditional medicine to treat diarrhoea. Phytotherapy Research 11:128-131
Moat AG, JW Foster,  MP Spector, editor.  2002.  Microbial Physiology. 4 th Ed.  A Wiley Interscience Publication, John Wiley and Sons, New York.
Naufalin R.  2005.   Kajian  Sifat  Antimikroba  Ekstrak  Bunga Kecombrang  ( Nicolaia  speciosa Horan)  terhadap berbagai  Mikroba  Patogen  dan  Perusak  Pangan [Disertasi].  Sekolah Pascasarjan IPB, Bogor.
Nychas GJE.  1995.  Natural Antimicrobials from plants.  Di dalam  :  Gould,  G.W.  (Ed).    New  Methods  of  Food Preservation.    Blackie  Academic  and  Profesional. London.
Otshudi  LA,  Vercruysse  A,  and  Foriers  A.    2000. Contribution to the ethnobotanical, phytochemical and pharmacological  studies  of  traditionally  used medicinal  plants  in  the  treatment  of  dysentery  and diarrhoea  in  Lomela  area,  Democratic  Republic  of Congo (DRC ).  J Ethnopharmacology , 71: 411-423
Parhusip AJN.  2006. Kajian Mekanisme  Antibakteri Ekstrak Andaliman  ( Zanthoxylum  acanthopodium DC) terhadap Bakteri Patogen Pangan. [Disertasi].  Bogor: Sekolah Pascasarjan IPB.
Sastrapradja dan Bimantoro. 1981. Tumbuhan Air.  Lembaga Biologi Nasional-LIPI.  Bogor.
Scalbert A.  1991.  Antimicrobial properties of tanins.  Review Article  Number  63. Phytochemistry, 30(12):  3875- 3883
Springfield  EP  2003.  An  assessment  of  two Carpobrotus species  extracts  as  potential  antimicrobila  agents. Phytomedicine 10: 434-439.