Penjaringan A zotobacter Sp Dan Azospirillum Sp Dari Ekosistem Lahan Sawah Sebagai Sumber Isolat Pupuk Hayati Penambat Nitrogen
Nana Danapriatna 1*)
1) Fakultas Pertanian, Universitas Islam "45", Bekasi 17113 *Penulis untuk korespondensi: nadaprina@yahoo.co.id
Diterima 21 April 2016/Disetujui 23 Juni 2016

## ABSTRACT
Utilization of Azotobacter and Azospirillum as microbial N 2 fixation may be a solution in reducing the use of inorganic N fertilizer. Inoculation of microbial N 2 fixation requires superior isolates in N 2 fixation and high viability. A screening experiment to get the Azotobacter and Azospirillum isolates superior in N 2 fixation and high viability  in paddy  field  has  been  performed  at  the  Laboratory  of  Biology  and  Biotechnology  soil,  Faculty  of  Agriculture, Universitas  Padjadjaran.  Isolates  taken  from  the  rhizosphere  and  roots  of  paddy  at  Sukatani  and  Karangbahagia– Bekasi, Rengsdengklok  - Karawang, Jatinangor  - Sumedang and Ciparay  - Bandung. The results obtained bacterial isolates are superior in N 2 fixation and viability were Azotobacter chroococcum from rhizosphere of paddy Ciherang varieties at Rengasdengklok-Karawang and Azospirillum irakense from roots of paddy Ciherang varieties at Ciparay- Bandung.
Keywords: Azospirillum sp, Azotobacter sp, Biofertilizer, N fixation,  Paddy field

## ABSTRAK
Pemanfaatan  Azotobacter  dan  Azospirillum  sebagai  mikroba  fiksasi  N 2 dapat  menjadi  solusi  dalam mengurangi  penggunaan  pupuk  N  anorganik.  Inokulasi  mikroba  fiksasi  N 2 tersebut  memerlukan  isolat  yang  unggul dalam fiksasi  N 2 dan viabilitasnya tinggi.  Sebuah percobaan  penjaringan Azotobacter sp dan Azospirillum  sp untuk mendapatkan isolat yang unggul dalam menambat N 2 dan  tinggi viabilitasnya pada lahan sawah telah dilakukan di Laboratorium  Biologi  dan  Bioteknologi  tanah,  Fakultas  Pertanian,  Universitas  Padjadjaran.  Isolat  diambil  dari rizosfir dan padi akar di Sukatani dan Karangbahagia - Bekasi, Rengsdengklok - Karawang, Jatinangor - Sumedang dan Ciparay - Bandung. Hasil penelitian didapat isolat bakteri yang unggul dalam fiksasi N 2 dan viabilitasnya yaitu Azotobacter chroococcum dari rizosfir padi sawah varietas ciherang di Rengasdengklok-Karawang dan Azospirillum irakense dari akar padi sawah varietas ciherang di Ciparay-Bandung.
Kata kunci : Azospirillum sp, Azotobacter sp, pupuk hayati, penambat N, sawah

## PENDAHULUAN
Program  intensifikasi  lahan  sawah  dalam rangka meningkatkan produksi beras nasional menyebabkan  terjadinya  peningkatan  penggunaan pupuk  anorganik  terutama  urea  sebagai  sumber nitrogen.  Peningkatan pemupukan anorganik terutama urea  pada  lahan  sawah  dan  praktek  membakar  jerami padi  oleh  petani  berdampak  pada  menurunnya kesuburan dan kesehatan tanah.  Oleh karena itu perlu upaya  perbaikan  kesuburan  dan  pemulihan  kesehatan tanah.    Salah  satu  tindakan  dalam  rangka  pemulihan kesehatan  dan  kesuburan  lahan  sawah  tersebut  dapat dilakukan  dengan  memanfaatkan  pupuk  hayati ( biofertilizers )  yang  adaptif  pada  ekosistem  lahan sawah.    Sebagaimana  hasil  penelitian  Gharib et  al . (2008)  bahwa  inokulasi  dengan  bakteri  penambat nitrogen  dapat  meningkatkan  populasi  rizobakteria penambat  N 2 yang  merupakan  indikator  sensitif  dari kesehatan tanah.
Aplikasi  pupuk  hayati  penambat  nitrogen seperti Azotobacter  sp. dan Azospirillum sp . Pada
beberapa  penelitian  mampu  menurunkan  penggunaan urea, meningkatkan kesehatan tanah dan hasil tanaman padi  (Simarmata,  1994;  Danapriatna,  2010)  sehingga dapat  dipertimbangkan  untuk  diaplikasikan  pada  padi sawah.
Peningkatan  produksi  padi  sawah  melalui aplikasi  pupuk  hayati  memerlukan  isolat  indigenus yang  telah  beradaptasi  dengan  lingkungan  tanah  dan tanaman  dimaksud.  Sebagaimana  yang  dikemukakan oleh Akbari et al. (2007) bahwa strain indigenus lebih baik  dari  pada  strain  introduksi  dalam  meningkatkan pertumbuhan tanaman karena telah beradaptasi dengan lingkungannya. Umumnya Azotobacter yang digunakan  sebagai  pupuk  hayati  berasal  dari  rizosfer tanaman lahan kering. Isolasi Azotobacter dari rizosfer padi di lahan sawah belum banyak dilakukan.
Kebanyakan penelitian Azotobacter dan
Azospirillum
di lahan sawah
belum mempertimbangkan  daya  hidup  maupun  aktivitas fiksasi  N 2 di  bawah  tekanan  oksigen  rendah  akibat penggenangan.  padahal  menurut    Tschapek  dan Giambiagi  (1955) Azotobacter menggunakan  sumber
energi  lebih  baik  pada  tekanan  O 2 rendah  seperti  di tanah  basah.  Pendapat  tersebut  diperkuat  oleh  Omari et al . (2004) yang membuktikan bahwa penggenangan meningkatkan  populasi Azotobacter tetapi  populasi Azospirillum menurun.
Berdasarkan  uraian  di  atas,  perlu  dilakukan penelitian untuk mendapatkan isolat bakteri fiksasi N 2 (Azotobacter sp dan Azospirillum sp) yang unggul dari ekosistem  lahan  sawah  dan  menguji  daya  hidup  serta aktivitas  fiksasi  N 2 kedua  bakteri  tersebut  pada  tanah sawah.

## BAHAN DAN METODE
Sumber  isolat  adalah  rizosfir  padi  di  areal persawahan Kecamatan Sukatani dan Karang Bahagia Kabupaten
Bekasi; Kecamatan Rengsdengklok Kabupaten Karawang; Kecamatan Jatinangor
Kabupaten  Sumedang  dan  Kecamatan  Ciparay Kabupaten  Bandung.  Isolasi  dan  seleksi  bakteri Azotobacter sp  dan Azospirillum sp  dilakukan  di Laboratorium  Biologi  dan  Bioteknologi  Tanah, Fakultas  Pertanian  UNPAD.    Percobaan  dilaksanakan selama  lima bulan.
Bahan percobaan yang digunakan adalah tanah sawah  di  rizosfir  tanaman  padi  dan  akar  padi  varietas Ciherang,  IR  64  dan  Mekongga  pada  fase  vegetatif aktif,  media  Asbhy  untuk  kultur Azotobacter sp . dan Nfb dan Okon untuk Azospirillum sp.
Isolasi Azotobacter sp dan Azospirillum sp
Pengambilan  sampel  tanah  untuk  isolasi Azotobacter sp  dilakukan  secara  komposit  dari  lima titik  rizosfir  tanaman  padi  sawah  untuk  setiap  lokasi sampel.  Pengambilan  akar  padi  untuk  isolasi Azospirillum sp  dilakukan  dengan  cara  mencabut sebagian  rumpun  tanaman  pada  lima  titik  yang  sama dengan pengambilan tanah.
Isolasi Azotobacter sp  dilakukan  dengan metode pengkayaan pada medium cair Ashby bebas N pada  suhu  30 O C  dan  pemisahan  koloni  dilakukan dengan  metode  gores  pada  lempeng  agar  media  yang sama  pada  suhu  30 O C  (Subba  Rao,  1982).    Isolasi Azopirillum sp  dari  akar  padi  dilakukan  dengan metode  pengkayaan  pada  agar  tegak  semi  solid  Nfb pada  suhu  30 O C  (Dobereiner,  1995).    Pemisahan koloni  dari  pelikel  yang  terbentuk  di  bawah permukaan  agar  semi  solid  dilakukan  pada  lempeng agar Okon pada suhu inkubasi 30 O C.  Pemurnian isolat dilakukan  dengan  menggoreskan  koloni  tunggal  yang terbentuk  di  atas  lempeng  agar  medium  Asbhy  untuk Azotobacter sp dan Okon untuk Azospirillum sp. Isolat bakteri hasil penjaringan diseleksi kembali berdasarkan kapasitas fiksasi N 2 menggunakan metode acetylene  reduction  assay  (ARA)  (Olivares et  al ., 1996)  dan  kepadatan  bakteri  dalam  kultur  cair (Schinner et al .,  1995).
Seleksi  Isolat  Berdasarkan  Fiksasi  N 2 dan Kepadatan Bakteri
Seleksi  isolat  dilakukan  berdasarkan  uji kapasitas  fiksasi  N 2 pada  media  cair  Ashby  untuk Azotobacter sp  dan  Okon  untuk Azospirillum sp. Sebanyak  50  mL  media  ditempatkan  di  dalam  gelas Erlenmeyer    100  mL  yang  diinokulasi  oleh  10  % kultur  murni  isolat Azotobacter sp  atau Azospirillum sp.      Kultur  diinkubasi  di  atas  gyratory  shaker  pada suhu  kamar  selama  72  jam  dengan  kecepatan  putaran 110  rpm.  Akhir  inkubasi  diukur  kapasitas  fiksasi  N 2 menggunakan metode ARA (Olivares et al ., 1996) dan kepadatan sel bakteri ( Azotobacter sp dan Azospirillum sp) menggunakan metode plat pengenceran  (Schinner et  al .,    1995).    Kemudian dilakukan  analisis  klaster  berdasarkan  kemamapuan memfiksasi N 2 dan kepadatan bakteri untuk mengetahui isolat unggulan yang terpilih menggunakan  perangkat  lunak  Minitab  15.0.  Isolat terpilih  dari  analisis  klaster  diukur  kemampuan produksi  hormon  giberelin,  sitokinin  dan  auksin  yang diukur dengan HPLC menurut  Chen (1987).
Uji  Hayati  Isolat  Terseleksi  pada  Tanah  Sawah Steril
Percobaan  dilakukan  dua  seri  yaitu  percobaan isolat Azotobacter sp  dan  isolat Azospirillum sp. Media tanah sawah steril yang digunakan adalah tanah sawah  dari  SPLPP  unit  Ciparay  dengan  kandungan  C organik rendah (1,25 %) dan N total rendah (0,12 %). Percobaan dilaksanaan di rumah kaca dan Laboratorium  Biologi  dan  Bioteknologi  Tanah, Fakultas
Pertanian Universitas Padjadjaran.
Percobaan  menggunakan  rancangan  acak  lengkap dengan perlakuan masing-masing setiap seri percobaan  adalah  5  isolat  terpilih  berdasarkan  uji klaster dengan kepadatan 10 7 cfu mL -1 dan ulangan 3 kali.
A. Uji  hayati  isolat Azotobacter sp  dengan  perlakuan sebagai  berikut  :    tanpa  isolat  (a o );  Isolat Azotobacter sp AZT 4.3 (a 1 );  Isolat Azotobacter sp AZT  5.1  (a 2 );  Isolat Azotobacter sp  AZT  5.2  (a 3 ); Isolat Azotobacter sp  AZT  5.3  (a 4 )  dan  Isolat Azotobacter sp AZT 9.3 (a 5 ).
B. Uji hayati isolat Azospirillum sp dengan perlakuan sebagai  berikut  :  tanpa  isolat  (b o );  Isolat Azospirillum sp AZSP 7.2 (b 1 ); Isolat Azospirillum sp AZSP 8.1 (b 2 ); Isolat Azospirillum sp AZSP 9.2 (b 3 );  Isolat Azospirillum sp  AZSP  13  (b 4 );  Isolat Azospirillum sp AZSP 14 (b 5 ).
Bibit  padi  berumur  satu  minggu  ditanam  pada botol berukuran 100 mL yang berisi 75 g tanah sawah steril  dengan  kondisi  air  macak-macak.  Inokulasi bakteri dilakukan segera setelah penanaman bibit padi. Kultur ini ditempatkan selama 21 hari di dalam rumah kaca  dan  dilakukan  penyiraman  secara  rutin  empat hari  sekali  sebanyak  4  mL  untuk  mempertahankan kondisi  tanah  macak-macak  (kadar  sekitar  125  %).
Seteah  tanaman  berumur  21  hari  diukur  kapasitas fiksasi  N 2 menggunakan  metode  ARA,  panjang  akar, tinggi  pupus,  nisbah  pupus  akar  (NPA)  berdasarkan bobot pupus dan akar setelah pemanasan 70 o C.
Data  dianalisis  dengan  analisis  ragam  pada taraf  5  %  dan  dilanjutkan  dengan  uji  jarak  berganda Duncan  pada  taraf  5  %.  Isolat Azotobacter sp  dan Azospirillum sp yang unggul diidentifikasi berdasarkan  karakteristik  biokimia  mengacu  pada klasifikasi menurut Holt et al. (1994).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi dan Seleksi Azotobacter sp. dan Azospirillum sp.
Isolasi Azotobacter sp  dari  sampel  tanah rizosfir  padi  sawah  dilakukan  dengan  mengunakan media  selektif  Asbhy  cair  (Subba-Rao,  1982).  Pelikel yang  terbentuk  di  atas  permukaan  Asbhy  cair kemudian ditumbuhkan pada cawan Petri berisi media Asbhy  padat  dengan  cara  digores  untuk  mendapatkan isolat  murni Azotobacter . Koloni  yang terbentuk pada cawan  Petri  berisi  media  Asbhy  padat  kemudian dipilih  yang  berbentuk  cembung,  berlendir  dan terpisah  untuk  ditumbuhkan  lagi  dalam  cawan  Petri baru  berisi  Asbhy  padat  sebagai  upaya  pemurnian isolat.
Isolasi Azospirillum sp dari akar padi dilakukan dengan menggunakan media  Nfb  semi solid (Dobereiner,  1995).    Pelikel  yang  terbentuk  di  bawah permukaan  (±  2  mm)  pada  media  Nfb  semi  solid
diambil  menggunakan  ose  untuk  ditumbuhkan  di cawan  Petri  berisi  media  Okon  padat  dengan  cara digores  sebagai  upaya  untuk  memurnikan  isolat Azospirillum sp.  Koloni  bakteri  yang  terbentuk  pada cawan  Petri  dari  kedua  jenis  media  yaitu  Asbhy  dan Okon  kemudian  diuji  pewarnaan  gram.  Bakteri  yang menunjukkan  gram  negatif  ditumbuhkan  lagi  pada agar  miring  masing-masing  berisi  Asbhy  padat  untuk Azotobacter sp dan Okon untuk Azospirillum sp.
Proses  penapisan  menghasilkan  24  isolat Azotobacter dan 19 isolat Azospirillum . Didapatkannya  isolat  kedua  bakteri  pemfiksasi  N 2 sejalan dengan penelitian Hindersah dan Gofar (2008) yang berhasil mengisolasi Azotobacter dari tanah rawa tengah  di  Palembang  serta  Dewi et  al .  (2008)  dari lahan  sawah  di  Bandung.  Penelitian  Rusmana  dan Hadijaya  (1994)  berhasil  mengisolasi Azospirillum dari perakaran padi sawah.
Seleksi Azotobacter sp
Kapasitas  fiksasi  N 2 dan  kepadatan  bakteri hasil  penapisan  bervariasi.  Kapasitas  fiksasi  N 2 isolat Azotobacter berkisar dari 24,64 sampai dengan 134,29 nmol  C 2 H 4 g -1 jam -1 dan  kepadatan  berkisar  dari  1,1 sampai  dengan  2,4  x  10 9 cfu  mL -1 (Tabel  1). Berdasarkan kapasitas penambatan N 2 dari bakteri dan tingginya  kepadatan  sel  bakteri  menunjukkan  bahwa Azotobacter sp  yang  berhasil  diisolasi  dari  ekosistem lahan sawah mempunyai kemampuan dalam memfiksasi N 2 udara dan viabilitasnya tinggi.
Tabel 1. Kapasitas fiksasi N 2 dan kepadatan isolat Azotobacter sp
Kode Isolat Sumber Isolat ARA (nmol C 2 H 4 g -1 jam -1 ) Kepadatan (x 10 9 cfu mL -1 ) AZT1.1 Rizosfir padi Var. Mekongga 24,64 1,1 AZT1.2 Rizosfir padi Var. Mekongga 59,29 2,0 AZT1.3 Rizosfir padi Var. Mekongga 60,36 1,2 AZT1.4 Rizosfir padi Var. Mekongga 34,29 1,1 AZT1.5 Rizosfir padi Var. Mekongga 71,79 1,2 AZT2.1 Rizosfir padi Var. Ciherang 76,79 2,4 AZT2.2 Rizosfir padi Var. Ciherang 77,50 1,6 AZT2.3 Rizosfir padi Var. Ciherang 93,57 2,1 AZT3.1 Rizosfir padi Var. IR 64 36,43 1,8 AZT3.2 Rizosfir padi Var. IR 64 75,36 1,5 AZT3.3 Rizosfir padi Var. IR 64 82,86 1,2 AZT4.1 Rizosfir padi Var. Ciherang 88,21 2,0 AZT4.2 Rizosfir padi Var. Ciherang 78,93 1,4 AZT4.3 Rizosfir padi Var. Ciherang 108,21 1,8 AZT5.1 Rizosfir padi Var. Cigeulis 115,36 1,7 AZT5.2 Rizosfir padi Var. Cigeulis 130,71 1,9 AZT5.3 Rizosfir padi Var. Cigeulis 134,29 2,0 AZT6.1 Rizosfir padi Var. Ciherang 37,14 1,4 AZT6.3 Rizosfir padi Var. Ciherang 34,64 1,5 AZT7.1 Rizosfir padi Var. Ciherang 97,86 1,3 AZT8.1 Rizosfir padi Var. Ciherang 75,36 1,1 AZT8.3 Rizosfir padi Var. Ciherang 71,43 1,2 AZT9.1 Rizosfir padi Var. Ciherang 75,00 1,2 AZT9.3 Rizosfir padi Var. Ciherang 114,64 2,0
Analisis  klaster  terhadap  24  isolat Azotobacter berdasarkan  kapasitas  fiksasi  N 2 dan  kepadatannya diperoleh  tiga  kelompok  (Gambar  1).    Kelompok pertama terdiri dari lima isolat, kelompok kedua terdiri dari  14  isolat  dan  kelompok  ketiga  terdiri  dari  lima isolat.  Lima  isolat  anggota  kelompok  pertama  (AZT 4.3,  AZT  5.1,  AZT  5.2,  AZT  5.3  dan  AZT  9.3)
merupakan  isolat-isolat  dengan  kapasitas  fiksasi  N 2 dan  kepadatan  yang  lebih  tinggi  dari  pada  kelompok lainnya.    Kapasitas  fiksasi  N 2 dari  lima  isolat  terpilih ini  berkisar  dari  108,21  sampai  dengan  134,29  nmol C 2 H 4 g -1 jam -1 .    Lima  isolat  ini  digunakan  pada percobaan  uji  hayati  untuk  memilih  satu  isolat Azotobacter sp unggulan.
Keterangan:    Kelompok 1 : AZT4.3, 5.1, 5.2, 9.3, dan 5.3 Kelompok 2 : AZT 1.2,1.3, 1.5, 8.3, 2.1, 2.2, 4.2, 3.2, 8.1, 9.1,2.3,7.1, 3.3, dan 4.1 Kelompok 3 : AZT 1.1, 1.4, 6.3, 3.1, dan 6.1
Gambar 1. Dendogram kluster 24 Isolat Azotobacter sp berdasarkan kapasitas fiksasi N 2 dan kepadatan bakteri
Selain mampu memfiksasi N 2 , isolat Azotobacter sp  terpilih  juga  memproduksi  hormon tumbuh.  Hasil  pengukuran  sitokinin  lima  isolat Azotobacter sp berkisar dari 11,8 sampai dengan 21,1 ppm  dan  giberelin  berkisar  dari  19,6  sampai  dengan 39,1 ppm (Gambar 2). Diperolehnya isolat
Azotobacter yang  mampu  memproduksi  hormon
tumbuh  sejalan  dengan  beberapa  penelitian  yang mengungkap  bahwa Azotobacter sp  dapat  menambat N (Wedhastri, 2002) dan menghasilkan sitokonin(Taller  dan  Wong,  1989)  dan  giberelin (Mrkovacki  dan  Milic,  2001;  Hindersah  dan Simarmata, 2004).
Gambar 2. Produksi hormon tumbuh dari lima isolat Azotobacter sp terseleksi dalam media Asbhy cair
Seleksi Azospirillum sp
Kapasitas  fiksasi  N 2 Azospirillum sp  berkisar dari 26,79 sampai dengan 132,86 nmol C 2 H 4 g -1 jam -1 dan  kepadatan  berkisar  dari  1,1  sampai  dengan  2,3  x 10 9 cfu  mL -1 (Tabel  2.).    Berdasarkan  tabel  tersebut terlihat  bahwa Azospirillum sp  yang  berhasil  diisolasi
dari  akar  padi  sawah  mempunyai  kemampuan  dalam menambat  N 2 .      Kemampuan  penambatan  N 2 oleh Azospirillum sp  tersebut  sejalan  dengan  hasil penelitian Rusmana dan Hadijaya (1994) yang berhasil mengisolasi Azospirillu m  dari  akar  padi  dengan  rata- rata nilai ARA yaitu 25,84 nmol C 2 H 4 g -1 jam -1 .
12,4
19,6
11,9 20,1 11,8 20,4
12,2
21,1
21,1 39,1 0 10 20 30 40 50 Sitokinin Giberelin AZT 4.3 AZT 5.1 AZT 5.2 AZT 5.3 AZT 9.3 Ko n sen tr asi
Ho rm o n
(p p m )
Tabel 2. Kapasitas fiksasi N 2 dan kepadatan isolat Azospirillum sp
Kode Isolat Sumber Isolat ARA (nmol C 2 H 4 g -1 jam -1 ) Kepadatan (x 10 9 cfu mL -1 ) AZSP1.1 Akar padi Var. Mekongga 26,79 1,8 AZSP1.2 Akar padi Var. Mekongga 55,00 1,1 AZSP2.2 Akar padi Var. Ciherang 43,21 1,3 AZSP3.2 Akar padi Var. IR 64 48,57 1,7 AZSP4.1 Akar padi Var. Ciherang 37,86 1,7 AZSP4.2 Akar padi Var. Ciherang 39,64 1,9 AZSP5.1 Akar padi Var. Cigeulis 72,86 1,6 AZSP5.2 Akar padi Var. Cigeulis 75,36 1,8 AZSP6.1 Akar padi Var. Ciherang 73,57 1,7 AZSP6.2 Akar padi Var. Ciherang 75,36 1,1 AZSP6.3 Akar padi Var. Ciherang 83,93 1,4 AZSP7.1 Akar padi Var. Ciherang 87,86 1,3 AZSP7.2 Akar padi Var. Ciherang 105,36 2,3 AZSP8.1 Akar padi Var. Ciherang 101,43 2,0 AZSP9.1 Akar padi Var. Ciherang 73,57 1,6 AZSP9.2 Akar padi Var. Ciherang 105,36 2,2 AZSP11 Akar padi Var. Ciherang 75,36 1,9 AZSP13 Akar padi Var. Ciherang 120,71 1,4 AZSP14 Akar padi Var. Ciherang 132,86 1,8 Berdasarkan  analisis  klaster  terhadap  19  isolat Azospirillum dari kapasitas fiksasi N 2 dan kepadatannya  diperoleh  tiga  kelompok  (Gambar  3). Kelompok  pertama  terdiri  dari  lima  isolat,  kelompok kedua  terdiri  dari  delapan  isolat  dan  kelompok  ketiga terdiri dari enam isolat. Lima isolat anggota kelompok pertama  (AZSP  7.2,  AZSP  8.1,  AZSP  9.2,  AZSP  13
dan AZSP 14) merupakan isolat-isolat yang mempunyai  kemampuan  fiksasi  N 2 dan  kepadatan yang  lebih  tinggi  daripada  kelompok  lainnya. Kapasitas  fiksasi  N 2 lima  isolat  terpilih  berkisar  dari 101,43  sampai  dengan  132,86  nmol  C 2 H 4 g -1 jam -1 . Lima  isolat  ini  digunakan  pada  percobaan  uji  hayati untuk memilih satu isolat Azospirillum sp. unggulan.
Keterangan:   Kelompok 1 : AZSP 7.2, 9.2, 8.1, 13, dan 14 Kelompok 2 : AZSP 5.1, 6.1, 9.1, 5.2, 11, 6.2, 6.3, dan 7.1 Kelompok 3 : AZSP 1.1, 1.2, 3.2, 2.2, 4.1, dan 4.2
Gambar 3. Dendogram kluster 19 isolat Azospirillum sp berdasarkan kapasitas fiksasi N 2 dan kepadatan bakteri
Selain  mampu  memfiksasi  N  udara,  isolat Azospirillum sp.  terpilih  juga  memproduksi  hormon tumbuh  IAA.  Hasil  pengukuran  IAA  dari  lima  isolat Azospirillum sp. berkisar dari 24,0 sampai dengan 54,9 ppm  (Gambar  4.).  Hal  ini  sejalan  dengan  penelitian yang  dilakukan  oleh  Rusmana  dan  Hadijaya  (1994) yang berhasil  mengisolasi Azospirillum dari akar padi
sawah  dan  mampu  memfiksasi  N  serta  penelitian Lestari et  al. (2007)  yang  menunjukkan  bahwa Azospirillum mampu  menghasilkan  auksin  (IAA) pada  kultur  cair  yang  barangkali  berpengaruh  lebih besar terhadap pertumbuhan tanaman daripada N yang ditambat oleh bakteri tersebut.
Gambar 4. Produksi hormon tumbuh lima isolat Azospirillum sp terseleksi dalam media Okon cair
Uji Hayati Isolat Azotobacter sp
Inokulasi  isolat Azotobacter sp  yang  berbeda berpengaruh  nyata  meningkatkan  nilai  ARA  tanah, tetapi  tidak  berpengaruh  nyata  terhadap  tinggi  pupus, panjang akar dan nisbah pupus akar (NPA) (Tabel 3.).
Inokulasi Azotobacter sp  dapat  meningkatkan nilai  ARA  mulai  dari  140,6%  (AZT  5.3)  sampai dengan  357,8%  (AZT  9.3)  lebih  tinggi  daripada kontrol.  Fakta ini menunjukkan bahwa Azotobacte r sp yang  diinokulasi  tinggi  viabilitas  dan  kapasitasnya
dalam menambat N 2 pada lahan sawah dengan kondisi air  macak-macak  (kadar  air  125%).    Hanya  saja inokulasi Azotobacter sp  tidak  nyata  meningkatkan panjang akar, tinggi pupus dan NPA.    Hal ini diduga masih  rendahnya  sumbangan  N  dari  tambatan Azotobacter sp    akibat  rendahnya  C-organik  tanah (1,25%)  sebagai  sumber  energi  bagi  bakteri  tersebut. Berdasarkan  hasil  uji  hayati  maka  isolat  AZT  9.3 merupakan  isolat  unggul  dan  hasil  identifikasi  isolat tersebut adalah Azotobacter chroococcum .
Tabel 3. Pengaruh isolat Azotobacter sp. terhadap panjang akar, tinggu pupus, NPA dan kapasitas memfiksasi N 2 Perlakuan Panjang Akar (cm) Tinggi Pupus (cm) NPA ARA (nmol C 2 H 4 g -1 jam - 1 ) Tanpa Isolat 9.67 a 30.17 a 2.17 a 9.05 a AZT 4.3 10.67 a 31.17 a 1.61 a 25.59 ab AZT 5.1 8.33 a 31.50 a 2.33 a 27.38 c AZT 5.2 11.50 a 33.50 a 2.00 a 25.59 bc AZT 5.3 8.67 a 31.33 a 1.78 a 21.78 b AZT 9.3 10.00 a 32.10 a 1.67 a 41.43 d Keterangan: angka  yang  diikuti  dengan  huruf  kecil  yang  sama  dalam  kolom  menunjukkan  tidak  berbeda  nyata berdasarkan uji DMRT pada taraf nyata 5%.
Uji Hayati Isolat Azospirillum sp.
Inokulasi  isolat Azospirillum sp  berpengaruh nyata  terhadap  peningkatan  nilai  ARA,  tetapi  tidak berpengaruh nyata terhadap panjang akar, tinggi pupus dan  NPA  (Tabel  4.).  Inokulasi Azospirillum sp  isolat AZSP  14  dapat  meningkatkan  nilai  ARA  tanah  mulai dari  316,1%  (AZSP  7.2)  sampai  dengan    535,5% (AZSP  14)  lebih  tinggi  daripada  kontrol.    Adanya
peningkatan  nilai  ARA  yang  nyata  pada  tanah  yang diinokulasi Azospirillum sp  ini  menunjukkan  bahwa bakteri  tersebut  mampu  beradaptasi  dan  tinggi kapasitasnya  dalam    menambat  N 2 pada  lahan  sawah dengan kondisi macak-macak.
Meskipun  demikian,    panjang  akar,  tinggi tanaman  dan  NPA  tidak  terjadi  peningkatan  yang nyata akibat inokulasi Azosirillum sp.  Hal  ini terjadi diduga  sebagai  akibat  rendahnya  N  hasil  tambatan
46,2 54,9 42,9 28,5 24 0 10 20 30 40 50 60 IAA AZSP 7.2 AZSP 8.1 AZSP 9.2 AZSP 13 AZSP 14 Ko n sen tr asi Ho rm o n (p p m )
bakteri  tersebut.    Rendahnya  sumber  energi  bagi bakteri  tersebut  yang  berasal  dari  C-organik  tanah (1,25%)  merupakan  penyebab  tidak  optimalnya  N hasil  tambatan.    Selain  itu,  tidak  nyatanya  pengaruh inokulasi Azospirillum sp  terhadap  panjang  akar  dan tinggi pupus diduga rendahnya sumber C yang berasal
dari eksudat akar karena masih terbatasnya pertumbuhan  tanaman  pada  umur  21  hari  setelah semai.  Berdasarkan  uji  hayati, Azospirillum sp  isolat AZSP  14  merupakan  isolat  unggulan  dan  hasil identifikasi  isolat  tersebut  adalah Azospirillum irakense .
Tabel 4. Pengaruh isolat Azospirillum sp. terhadap panjang akar, tinggi pupus, NPA dan kapasitas memfiksasi N 2 Perlakuan Panjang Akar (cm) Tinggi Pupus (cm) NPA ARA (nmol C 2 H 4 g -1 jam - 1 ) Tanpa Isolat 9.70 a 33.00 a 2.2 a 7.38 a AZSP 13 8.90 a 28.73 a 2.0 a 46.07 d AZSP 14 11.63 a 32.73 a 2.2 a 46.90 d AZSP 7.2 10.17 a 32.83 a 2.0 a 30.71 b AZSP 8.1 9.07 a 31.93 a 2.2 a 36.07 bc AZSP 9.2 9.47 a 34.20 a 1.9 a 39.17 cd
Keterangan:   angka  yang  diikuti  dengan  huruf  kecil  yang  sama  dalam  kolom  menunjukkan  tidak  berbeda  nyata berdasarkan uji DMRT pada taraf nyata 5%.

## KESIMPULAN
Hasil penapisan Azotobacter sp dan Azospirillum sp dari ekosistem lahan sawah berdasarkan  kapasitas  fiksasi  N 2 dan  uji  hayati diperoleh masing-masing isolat unggul yaitu Azotobacter AZT  9.3  yang  teridentifikasi  yaitu Azotobacter  chroococcum asal  rizosfir  padi  sawah varietas  Ciherang  dari  Kecamatan  Rengasdengklok, Karawang dan Azospirillum AZSP 14 yang teridentifiasi  sebagai Azospirillum  irakense asal  akar padi sawah varietas Ciherang dari Kecamatan Ciparay, Bandung.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terima kasih disampaikan kepada staf laboratorium  Biologi  dan  Bioteknologi  Faperta UNPAD atas bantuan analisis.

## DAFTAR PUSTAKA
Akbari,  G.A.,  S.M.  Arab,  H.A  Alikhani,  I.  Allahdadi and  M.H.  Arzanesh.  2007.  Isolation  and selection  of  indegenous Azospirillum spp.  and the  IAA  of  superior  strains  effects  on  wheat roots. World J.Agric.Sci. 3(4) : 523 – 529.
Chen. C-M. 1987. Characterization of  Cytokinins and Related Compounds by HPLC dalam Linskens. HF.  And  J.F  Jackson  (ed.)  High  Performance Liqiud  Chromatography  in  Plant  Science. Springer-Verlag. Berlin.
Danapriatna,  N.,  R.  Hindersah  dan  Y.  Sastro.  2010. Pengembangan pupuk hayati Azotobacter DAN Azospirillum untuk meningkatkan produktivitas dan efisiensi penggunaan pupuk N di atas 15 %
pada  tanaman  padi.  (Laporan  penelitian KKP3T Deptan TA 2010, Nomor : 1148/LB.602/I.1/4/2010).  Universitas  Islam “45”  Bekasi  Kerjasama  dengan  Badan  litbang Departemen pertanian. Bekasi.
Dewi,  T.,  A.  Purnomo  dan  R.  Hindersah.  2008. Kandungan logam berat dan populasi Azotobacter di  lahan  sawah  terkontaminasi limbah industri di Bandung. Prosiding Seminar Nasional  Himpunan  Ilmu  Tanah  Indonesia. Palembang  17-18  Desember  2008.  Hal  195- 201.
Dobereiner.  J.  1995.  Isolation  and  identification  of aerobic  nitrogen-fixing  bacteria  from  soil  and plants. In Alef.  K  and  P.  Nanniperi  (Eds.). Methods  in  Applied  Soil  Microbiology  and Biochemistry. Academic Press. London.
Gharib,  F.A.,  L.A.  Moussa  and  O.N.  Massoud,  2008. Effect of compost and bio-fertilizers on growth, yield  and  essential  oil  of  sweet  marjoram ( Majorana  hortensis )  plant.  Int.  J.  Agri.  Biol., 10: 381–387.
Hindersah,  R.  dan  T.  Simarmata.  2004.  Kontribusi rizobakteri Azotobacter dalam  meningkatkan kesehatan  tanah  melalui  fiksasi  N 2 dan produksi fitohormon di rizosfer. J. Natur Indon 6 : 127–133.
Hindersah,  R.  dan  N.  Gofar.  2008.  Isolasi  bakteri azotobacter  dari  rawa  lebak  kabupaten  Ogan Ilir Propinsi Sumatera Selatan. 2008. Prosiding Seminar  Nasional  Himpunan  Ilmu  Tanah Indonesia.  Palembang  17-18  Desember  2008. hal 92-97.
Holt. J.G..  N.R. Krieg. J.T. Shaley dan  S.T. William.
1994.  Bergey’s  Manual  of  Determinative
Bacteriology. William dan  Wilkins. Baltimore.
Lestari,  P.,  D.N.  Susilowati  dan  E.I.  Riyanti.  2007.
Pengaruh  hormon  asam  indol  asetat  yang dihasilkan
Azospirillum
sp. terhadap perkembangan akar padi. J. AgroBiogen 3 (2) : 66 – 72.
Mrkovacki, N. and V. Milic. 2001. Use of Azotobacter chroococcum as potentially useful in agricultural  application.  Ann.  Microbiol.    51  : 145-158.
Omari,  K.,  T.  Mubyana,  M.I.  Matsheka,  M.C. Bonyongo  and  E.  Veenendaal.  2004.  Flooding and its influence on diazotroph populations and soil  nitrogen  levels  in  the  Okavango  Delta. South African Journal of Botany 2004. 70 (5) : 734–740.
Olivares,  F.L.,  V.L.D.  Baldani,  V.M.  Reis,  J.L. Baldani.  and  J.  Dobereiner.  1996.  Occurences of  the  endophytic  diazotrophs Herbaspirillum spp. In root. stems and leaves predominantly of Graminae. Biol. Fertil. Soils. 21:197-209.
Rusmana,  I.  dan  D.D.  Hadijaya.  1994.  Aktivitas nitrogenase Azospirillum sp. Dan efektivitasnya dengan jagung. Hayati 1:51-54.
Schinner,  F.,  R.  Ohlinger,  E.  Kandeler  and  R. Margesin.  1995.  Methods  in  Soil  Biology. Springer-Verlag. Berlin.
Simarmata, T. 1994. Prospek Pemanfaatan
Bioteknologi  Tanah  ( Azotobacter sp.  dengan Pupuk Kandang) dalam Meningkatkan Produktivitas  Lahan  Marginal  Ultisol  dengan Indikator Tanaman Tomat ( Lycopersicon esculentum ).  Jurnal Agrikultura 5 (1) : 60 – 74.
Subba-Rao,  N.S.    1982.    Biofertilizers  in  Agriculture.
Oxford  and  IBH  Publishing  Co.  New  Delhi, Bombay, Calcutta.
Taller,  B.J.  dan    T.Y.  Wong.  1989.  Cytokinins  in Azotobacter  vinelandii Culture  Medium.  Appl. Environ. Microbiol. 55 : 266-267.
Tschapek,  M.  and  N. Giambiagi.  1955.  Nitrogen fixation  of Azotobacter in  soil  —Its  inhibition by oxygen.  Archives of Microbiology 21: 376- 390.
Wedhastri,  W.  2002.  Isolasi  dan  seleksi Azotobacter spp.  penghasil  faktor  tumbuh  dan  penambat nitrogen  dari  tanah  masam.  Jurnal  Ilmu  Tanah dan Lingkungan. 3 (1) : 45-51.