J. Teknol. dan Industri Pangan Vol. 27(2): 148-156 Th. 2016 ISSN: 1979-7788 Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012
Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jtip DOI: 10.6066/jtip.2016.27.2.148 Hasil Penelitian

## SINTASAN Cronobacter sakazakii pGFPuv SELAMA PENYIMPANAN JAGUNG PIPILAN BERKADAR AIR AWAL BERBEDA DI BERBAGAI RH
[Survival of Cronobacter sakazakii pGFPuv on Corn Kernels with Different Initial Moisture Content during Storage at Various RH]
Karina Nola Sinamo 1) , Suliantari 2,3) , dan Ratih Dewanti-Hariyadi 2,3) *
1) Program Studi Ilmu Pangan, Sekolah Pasca Sarjana, Institut Pertanian Bogor, Bogor
2) Southeast Asian Food and Agricultural Science and Tecnology Center, Institut Pertanian Bogor, Bogor .
3) Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor
Diterima 11 Agustus 2016 / Disetujui 30 November 2016

## ABSTRACT
Cronobacter  sakazakii  is  an  opportunistic  foodborne  pathogen  reported  to  cause  necrotizing enterocolitis,  bacteremia,  and  meningitis  in  certain  groups  of  infant.  C.  sakazakii  has  been  reported  to survive  at  low  a w or  dryness.  Presence  of  wild-type  C.  sakazakii  in  dry  product  is  difficult  to  be distinguished from naturally occuring C. sakazakii. A pGFPuv mutant of C. sakazakii has been reported to have similar growth pattern, thus has the potential to be used in further investigation. The study aimed to evaluate the effect of initial moisture content and relative humidity (RH) on the survival rate of C. sakazakii pGFPuv in corn kernels during storage at room temperature. The study consists of drying corn kernels to achieve moisture contents of 12 and 16% (w.b), inoculation of C. sakazakii pGFPuv, and storage at RH 50, 70  and  90%  for  12  weeks.  Every  two  week,  corn  kernels  were  sampled  and  the  moisture  content  was measured using oven method, water activity was measured with a w meter, and total C. sakazakii pGFPuv was enumerated by spread plate method. Meanwhile, total bacteria, mold and yeast were enumerated by pour plate method. Corn kernels achieved equilibrium moisture content and a w after two weeks of storage. The  number  of  C.  sakazakii  decreased  rapidly  during  storage  at  RH  70  and  90%,  however  they  could survived at RH 50% for 12 weeks, especially when the initial moisture content was 16%. The total bacteria decreased by 3.5-3.9 Log CFU/g during storage at three RHs, but mold and yeast increased rapidly at RH 90%.
Keywords: corn, Cronobacter sakazakii, pGFPuv, moisture content, RH, storage

## ABSTRAK
1
Cronobacter  sakazakii adalah  bakteri  patogen  bawaan  pangan  oportunistik  yang  dapat  menyebab- kan necrotizing  enterocolitis , bacteremia ,  dan meningitis pada  kelompok bayi  tertentu. C.  sakazakii telah dilaporkan  dapat  bertahan  pada  lingkungan  dengan  a w rendah  atau  kodisi  kering.  Penggunaan  inokulan C. sakazakii wild-type pada produk kering sulit dibedakan dengan C. sakazakii yang secara alami sudah ada pada produk tersebut. Mutan C. sakazakii pGFPuv telah dilaporkan memiliki pola pertumbuhan serupa dengan isolat wild-type nya, sehingga dapat digunakan untuk tujuan penelitian ini. Penelitian ini bertujuan untuk  mengetahui  pengaruh  kadar  air  awal  dan  kelembaban  relatif  (RH)  terhadap  sintasan C.  sakazakii pGFPuv  dalam  jagung  pipilan  selama  penyimpanan  pada  suhu  ruang.  Penelitian  ini  terdiri  dari pengeringan  jagung  pipilan  untuk  mencapai  kadar  air  awal  12  dan  16%  (bb),  inokulasi C.  sakazakii pGFPuv,  dan  penyimpanan  pada  RH  50,  70  dan  90%  selama  12  minggu.  Setiap  dua  minggu,  jagung pipilan  diukur  kadar  airnya  dengan  metode  oven,  aktivitas  airnya  dengan  a w meter,  dan  dihitung  jumlah C. sakazakii pGFPuv dengan metode sebar, total bakteri dan jumlah kapang dan khamir dengan metode tuang. Jagung pipilan mencapai kadar air dan a w kesetimbangan setelah 2 minggu penyimpanan. Jumlah C.  sakazakii pGFPuv  menurun  dengan  cepat  selama  penyimpanan  pada  RH  70  dan  90%,  tetapi C.  sakazakii pGFPuv  dapat  bertahan  hidup  pada  RH  50%  selama  12  minggu  penyimpanan,  terutama pada  kadar  air  awal  16%.  Total  bakteri  menurun  sebesar  3,5-3,9  Log  CFU/g  pada  ketiga  RH penyimpanan, sedangkan jumlah kapang dan khamir meningkat pada RH 90%.
Kata kunci: Cronobacter sakazakii pGPuv, jagung pipilan, kadar air, penyimpanan, RH
Naskah  telah  dipresentasikan  dalam  International  Conference  2016,  Food  Innovations:  AEC  Challenges,  21-22  September  2016, Jakarta. *Penulis Korespondensi: E-mail: rdewantih@yahoo.com

## PENDAHULUAN
Cronobacter  sakazakii adalah  bakteri  patogen bawaan pangan oportunistik yang dapat menyebab- kan  gejala  infeksi  seperti  radang  usus  ( necrotizing enterocolitis ),  keracunan  darah  ( bacteremia ),  dan radang  selaput  otak  (meningitis)  pada  kelompok bayi  tertentu  dengan  tingkat  kematian  50-80% (Healy et  al., 2010).  Menurut  FAO-WHO  (2008) sejak  tahun  1958  sampai  juli  2008  di  dunia  telah terjadi 120 kasus infeksi C. sakazakii pada bayi dan anak-anak  sampai  usia  3  tahun.  Pada  tahun  2010 dilaporkan  adanya  dugaan  transmisi C.  sakazakii dari  susu  formula  ke  bayi  yang  menyebabkan  dua bayi  sakit  di  Mexico  (Jackson et  al., 2015).  Sumber kontaminasi C.  sakazakii dapat  berasal  dari  lingku- ngan  dan  makanan  (Iversen  dan  Forsythe,  2003). C.  sakazakii telah  diisolasi  dari  beberapa  makanan seperti  susu  formula  bayi,  makanan  bayi  kering, produk  keju  dan  ingredien  makanan  kering  seperti bumbu  dan  rempah-rempah  (Estuningsih et  al., 2006;  Friedamann,  2007).  Akan  tetapi,  hanya  susu formula yang dihubungkan dengan infeksi C. sakazakii (Bowen dan Braden, 2006). C.  sakazakii dilaporkan  lebih  resisten  terhadap kekeringan dibandingkan bakteri E. coli , Salmonella , dan Enterobacteriaceae lainya  dan  dapat  bertahan dalam kondisi kering lebih dari 2 tahun (Breeuwer et al., 2003;  Osaili  dan  Forsythe,  2009). C.  sakazakii sudah  dilaporkan  bertahan  dalam  susu  skim  bubuk selama  penyimpanan  3  bulan  pada  RH  50,  70  dan 90% (Dewanti-Hariyadi et al., 2012). Bakteri patogen ini  bertahan  lebih  baik  pada  akivitas  air  (a w )  rendah (0,25-0,30)  daripada  a w tinggi  (0,69-0,82)  selama penyimpanan  12  bulan  (Beuchat et  al., 2009).  Pe- nurunan  jumlah C.  sakazakii pada  susu  formula lebih besar pada a w 0,43-0,50 daripada a w 0,25-0,30 selama  penyimpanan  12  bulan  (Gurtler  dan Beuchat, 2007).
Kemampuan C.  sakazakii bertahan  pada  pro- duk pangan kering selama penyimpanan  berpotensi menjadikan  produk  pangan  kering  tersebut  sebagai sumber bakteri patogen C. sakazakii . Untuk meneliti sintasan C.  sakazakii pada  produk  pangan  kering, penggunaaan  galur wild-type memiliki  keterbatasan karena tidak dapat dibedakan dari C. sakazakii yang mungkin terdapat secara alami pada produk pangan tersebut.  Untuk  itu,  penelitian  ini  memanfaatkan mutan C.  sakazakii hasil  transformasi  dengan plasmid  yang  mengandung  gen  penyandi green fluoresencent protein (pGFP)  yang dapat  berpendar hijau  (Nurjanah et  al., 2014).  Jagung  dipilih  karena secara  luas  digunakan  sebagai  bahan  baku  untuk produk  pangan  kering,  baik  dalam  bentuk  pati maupun  tepung  jagung.  Selain  itu,  beberapa penelitian  menunjukkan C.  sakazakii telah  diisolasi dari jagung atau produk turunan jagung (Restaino et
al., 2006;  Gitapratiwi et  al., 2012).  Kadar  air  awal jagung  dan  kelembaban  udara  ruang  penyimpanan (RH) diduga dapat mempengaruhi sintasan C. sakazakii selama proses penyimpanan. Untuk itu, pada  penelitian  ini  penyimpanan  jagung  dilakukan dengan kadar air awal jagung (12 dan 16% bb) dan tingkat kelembaban udara ruang penyimpanan yang berbeda (RH 50, 70, dan 90%).
Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  untuk  meng- evaluasi sintasan C. sakazakii selama penyimpanan jagung pipilan dengan kadar air awal bahan dan RH ( relative humidity ) yang berbeda dengan mengguna- kan mutan C. sakazakii pGFPuv. Hasil penelitian ini diharapkan  dapat  dimanfaatkan  sebagai  dasar  per- timbangan  dalam  menyimpan  jagung  pipilan  pada kondisi  kadar  air  awal  bahan  dan  RH  ruang  pe- nyimpanan  yang  tepat  sehingga  keamanan  pangan terjaga.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Bahan-bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian ini  antara  lain  jagung  varietas  Pioneer  P27  Gajah (Kebun  Percobaan  IPB  Cikabayan,  Indonesia)  dan isolat Cronobacter  sakazakii pGFPuv  E2  yang sudah  ditransformasi  dengan  plasmid  pGFPuv (SEAFAST Center, Indonesia).

## Pembuatan jagung pipilan
Jagung  varietas  Pioneer  P27  Gajah  dengan umur  panen  98  hari  dipipil  secara  manual  dan dikeringkan  dengan cabinet  dryer (H.ORTH  GmbH, West  Germany)  pada  suhu  50ºC  hingga  diperoleh jagung  pipilan  dengan  kadar  air  yang  diinginkan yaitu 12 dan 16% bb.
Konfirmasi isolat Cronobacter sakazakii pGFPuv Konfirmasi  isolat C.  sakazakii pGFPuv  me- ngacu  pada  penelitian  Nurjanah et  al .  (2013).  Stok beku  isolat  mutan C.  sakazakii pGFPuv  diinkubasi dalam  media Brain  Heart  Infusion (BHI)  (Oxoid  Ltd, UK)  yang  disuplementasi  100  µg/mL  ampisilin  (PT. Erita Farma, Indonesia)  pada  suhu  37ºC  selama  24 jam. C.  sakazakii pGFPuv  dikonfirmasi  dengan  me- numbuhkannya  pada  media  TSAA  yaitu  media Tryptic  Soy  Agar (TSA)  (Oxoid  Ltd,  UK)  yang disuplementasi 100  μg/mL  ampisilin  dengan  cara menggoreskan  satu loop ke  permukaan  media tersebut. Setelah itu, kultur diinkubasi menggunakan inkubator  (Heraeus,  Germany)  pada  suhu  37ºC selama 24 jam dan diamati di bawah sinar lampu UV (Desaga,  Heidelberg,  Germany)  dengan  panjang gelombang  366  nm.  Koloni C.  sakazakii pGFPuv akan tampak berfluorosen (berpendar hijau).
Persiapan Cronobacter  sakazakii pGFPuv  se- bagai Inokulum
Pembuatan  inokulum C.  sakazakii pGFPuv mengacu  pada  penelitian  Nurjanah et  al .  (2013). Koloni berfluoresen yang tumbuh pada media TSAA disuspensikan  dengan  larutan  pengencer Buffered Peptone  Water (BPW)  (Oxoid  Ltd,  UK)  dan  disen- trifugasi  menggunakan  sentrifus  (HERMLE  Z383K, Germany)  dengan  kecepatan  3500  rpm  (2.600  x  g) selama  10  menit  pada  suhu  4ºC.  Setelah  super- natan dibuang, pelet dicuci dengan 10 mL BPW dan disentrifugasi  kembali.  Pelet sel  diresuspensi  dalam BPW,  distandarisasi  jumlah  selnya  dengan  mengu- kur  Optical  Density (OD)  pada λ=590  nm  meng- gunakan  spektrofotometer  UV-VIS  (Shimadzu  UV- 2450,  Japan).  Pengenceran  dilakukan  sampai  men- capai nilai OD 0,4 yang setara dengan jumlah koloni 10 8 CFU/mL,  dan  selanjutnya  suspensi  mutan  ini digunakan sebagai inokulum.

## Inokulasi dan penyimpanan jagung
Sejumlah C.  sakazakii pGFPuv  diinokulasikan ke  jagung  pipilan  dalam  kantong  plastik  steril kemudian  diaduk  rata  sehingga  jumlah  awal C.  sakazakii pGFPuv  pada  jagung  pipilan  adalah 10 6 CFU/g.  Kemudian,  sampel  disimpan  di  dalam botol  kaca  yang  berisi  larutan  garam  teknis  K 2 CO 3 (RH  ±50%),  NaNO 3 (RH  ±70%)  dan  BaCl 2 (RH ±90%)  (Shen  Zhen  Yang  Feng  Industrial  Co.,  Ltd., China) jenuh pada suhu ruang (27-30ºC) selama 12 minggu  (Greenspan,  1977).  Percobaan  diulang  2 kali untuk setiap perlakuan RH penyimpanan.
Analisis  kadar  air  dan  aktivitas  air  (a w )  selama penyimpanan jagung pipilan
Analisis  kadar  air  dan  a w dilakukan  pada kelompok  kontrol  setiap  dua  minggu  selama  12 minggu  penyimpanan.  Kadar  air  jagung  pipilan diukur  menggunakan  oven  kadar  air  (Memmert, Western  Germany)  pada  suhu  105ºC  selama minimal  6  jam  (Nielsen,  2010).  Pengukuran  a w dilakukan  menggunakan  alat  a w meter  (Rotronic, USA) yang telah dikalibrasi (Passot et al., 2012).
Analisis  jumlah C.  sakazakii pGFPuv  selama penyimpanan jagung pipilan
Sebanyak  10  g  sampel  dilarutkan  ke  dalam  90 mL  BPW,  dihomogenkan  dengan  pengocokan manual,  dan  dilakukan  seri  pengenceran  untuk dipupukan  dengan  metode  sebar  ke  dalam  media TSAA  ((TSA)  + 100  μg/mL  ampisilin).  Setelah  itu, diinkubasi menggunakan inkubator  pada suhu 37ºC selama ±24 jam, kemudian koloni dihitung di bawah sinar  lampu  UV  dengan  panjang  gelombang  366 nm,  sesuai Standard  Plate  Count (BAM,  2001). Kurva  jumlah C.  sakazakii selama  penyimpanan dibuat  dengan  memplot  jumlah  koloni C.  sakazakii (Log  CFU/g)  pada  sumbu  Y  dan  interval  waktu (minggu) penyimpanan pada sumbu X.
Kurva  sintasan C.  sakazakii selama  penyimpa- nan jagung
Kurva  ketahanan  hidup  isolat C.  sakazakii pGFPuv  dibuat  dengan  memplotkan  logaritma jumlah  koloni  yang  bertahan  hidup  pada  waktu tertentu  (Nt)  dibagi  dengan  jumlah  koloni  awal  (No) pada sumbu Y dan interval  waktu (minggu) penyim- panan  pada  sumbu  X.  Laju  penurunan  jumlah (Log/minggu) selama penyimpanan ditunjukkan oleh besarnya  slope  dari  persamaan  linier  (Nurjanah et al., 2013).

## Analisis statistik
Perlakuan dilakukan sebanyak dua kali ulangan.  Data  jumlah C.  sakazakii pGFPuv  yang bertahan selama  penyimpanan  diuji  normalitasnya dengan  metode  Saphiro  Wilk.  Pengaruh  kadar  air awal  terhadap  jumlah C.  sakazakii pGFPuv  selama penyimpanan  dianalisis  menggunakan  uji  t  ber- pasangan  jika  data  tersebar  normal  atau  meng- gunakan  uji Mann-Whitney jika  data  tidak  tersebar secara  normal.  Pengaruh  RH  ruang  penyimpanan terhadap  jumlah C.  sakazakii pGFPuv  selama penyimpanan  dianalisis  menggunakan One  Way Anova dengan  uji  lanjut  Duncan  jika  data  tersebar normal atau uji Friedman dengan uji lanjut Wilcoxon jika data tidak tersebar secara normal.

## Analisis  total  bakteri  dan  jumlah  kapang  dan khamir selama penyimpanan jagung pipilan
Analisis  total  bakteri  dan  jumlah  kapang  dan khamir  pada  jagung  pipilan  dilakukan  setiap  dua minggu selama 12 minggu penyimpanan. Sebanyak 10  g  sampel  dilarutkan  ke  dalam  90  mL  BPW, dihomogenkan  dengan  pengocokan  manual,  dan dilakukan  seri  pengenceran.  Total  bakteri  dianalisis menggunakan  metode  tuang  dalam  media Plate Count  Agar (PCA)  (Oxoid  Ltd.,  UK)  dan  diinkubasi menggunakan  inkubator    pada  suhu  35ºC  selama ±48  jam  (BAM,  2001).  Jumlah  kapang  dan  khamir dianalisis menggunakan metode tuang dalam media media Potato Dextrose  Agar (PDA)  (Oxoid  Ltd,  UK) ditambah asam  tartarat  10%  (Merck,  USA)  dan diinkubasi  menggunakan  inkubator  (Fisher  Scien- tific,  USA)  pada  suhu  25ºC  selama  3-5  hari,  me- ngacu pada penelitian Aguayo et al . (2006).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Perubahan kadar air dan aktivitas air (a w ) jagung pipilan selama penyimpanan
Kadar  air  dan  a w jagung  pipilan  mencapai kesetimbangan  setelah  penyimpanan  2  minggu pada RH penyimpanan 50, 70, dan 90% (Gambar 1 dan 2).
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 2 4 6 8 10 12 Ka d a r A ir (% b b ) Lama Penyimpanan (Minggu) RH 50% RH 70% RH 90% 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 2 4 6 8 10 12 Ka d a r A ir (% A w ) Lama Penyimpanan (Minggu)
RH 50% RH 70% RH 90% 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 0 2 4 6 8 10 12 Ak ti v ita s Ai r (A w ) Lama Penyimpanan (Minggu)
RH 50% RH 70% RH 90% 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 0 2 4 6 8
10 12 Ak ti v ita s Ai r (A w ) Lama Penyimpanan (Minggu)
RH 50% RH 70%
RH 90%
Gambar 1.  Perubahan  kadar  air  jagung  pipilan dengan  kadar  air  awal  12%  (A)  dan 16% (B)
Gambar 2.  Perubahan  aktivitas  air  jagung  pipilan dengan  kadar  air  awal  12%  (A)  dan 16% (B)
Akan  tetapi,  jagung  pipilan  berkadar  air  awal 12%  yang  disimpan  di  RH  70%  dan  jagung  pipilan berkadar  air  awal  16%  yang  disimpan  di  RH  90% sudah  mengalami  kadar  air  kesetimbangan  dari awal  penyimpanan.  Demikian  juga,  jagung  pipilan berkadar  air  12%  yang  disimpan  di  RH  70%  sudah mengalami  a w kesetimbangan  dari  awal  penyimpa- nan.  Kadar  air  kesetimbangan  jagung  pipilan  yang disimpan  pada  RH  50,  70,  dan  90%  berturut-turut sebesar  9,9±0,09;  12,3±0,5;  16±0,08%  pada  kadar air awal 12%, dan 9,9±0,15; 13,2±0,11; 16,1±0,01% pada  kadar  air  awal  16%.  Sementara  itu,  a w kese- timbangan  jagung  pipilan  yang  disimpan  pada  RH 50,  70,  dan  90%  berturut-turut  sebesar  0,45±  0,01; 0,67±0,03;  0,82±0,03  pada  kadar  air  awal  12%  dan 0,45±0,01;  0,68±0,01;  0.85±0.00  pada  kadar  air awal  16%.  Kadar  air  dan  a w kesetimbangan  jagung pipilan  tersebut  dipengaruhi  oleh  RH  penyimpanan. Kingsly  dan  Ileleji  (2009)  menyatakan  kelembaban udara  (RH)  yang  tinggi  memberikan  nilai  kadar  air kesetimbangan jagung pipilan yang tinggi juga.
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  dengan kadar  air  awal  yang  berbeda  jagung  pipilan  men- capai  kadar  air  kesetimbangan  yang  serupa  pada RH  penyimpanan  yang  sama.  Hal  ini  terjadi  karena bila  jagung  pipilan  berkadar  air  awal  12%  disimpan di lingkungan dengan kelembaban relatif lebih tinggi maka jagung pipilan tersebut akan menyerap uap air dari lingkungannya hingga tercapai kondisi kadar air kesetimbangan.  Sementara  itu,  apabila  jagung pipilan  berkadar  air  awal  16%  disimpan  di  lingku- ngan  dengan  kelembaban  relatif  lebih  rendah  maka sebagian  air  dari  produk  pangan  tersebut  akan berpindah  ke  lingkungannya  hingga  kadar  air  kese- timbangan tercapai (Strelec et al., 2010).
Hal serupa terjadi pada aktivitas airnya  dimana dengan  kadar  air  awal  yang  berbeda  jagung  pipilan mencapai  a w kesetimbangan  yang  serupa  pada  RH penyimpanan  yang  sama.  Jagung  pipilan  berkadar air  awal  12%  memiliki  a w awal  sebesar  0,67  dan ketika  disimpan  di  lingkungan  dengan  kelembaban relatif  tinggi  akan  menyerap  uap  air  dari  lingkungan hingga  dicapai  a w kesetimbangannya.  Sementara itu, jagung pipilan berkadar air awal 16% memiliki a w awal  sebesar  0,77  dan  ketika  disimpan  di  ling- kungan  dengan  kelembaban  relatif  rendah  akan melepas  sebagian  airnya  ke  lingkungan  hingga dicapai a w kesetimbangannya.
Perubahan  jumlah C.  sakazakii pada  jagung pipilan selama penyimpanan
C.  sakazakii pGFPuv  pada  jagung  pipilan  ber- kadar  air  awal  12  dan  16%  mengalami  penurunan selama  penyimpanan  pada  tiga  RH  yang  berbeda. Penurunan  jumlah C.  sakazakii pGFPuv  pada  RH 50%  lebih  lambat  daripada  RH  70  dan  90% (Gambar  3).  Pada  12  minggu  penyimpanan, C.  sakazakii pGFPuv  yang  bertahan  pada  jagung
A
B A
B
0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 2 4 6
8 10 12
J u m la h C. s a k a z a k ii p G FPu v
( L o g CFU/g ) Lama Penyimpanan (Minggu)
RH 50% (a) RH 70% (a) RH 90% (a) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 2 4 6
8 10 12 J u m la h
C. s a k a z a k i i p G FPu v ( L o g CFU/g ) Lama Penyimpanan (Minggu)
RH 50% (b) RH 70% (b)
RH 90% (b)
ya = -0,789x
R² = 0,955 ya = -2,001x R² = 0,988 ya = -2,024x R² = 0,968
yb = -0,557x R² = 0,824 yb = -1,487x R² = 0,973 yb = -2,058x R² = 0,985 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 0 2 4 6
8 10 12
L o g Nt /No Lama Penyimpanan (Minggu)
RH 50% (a) RH 70% (a) RH 90% (a)
RH 50% (b) RH 70% (b) RH 90% (b)
pipilan  berkadar  air  awal  12  dan  16%  di  RH  50% berturut-turut  sebesar  0,7±0,92  dan  2,5±0,11  Log CFU/g sedangkan pada RH 70 dan 90% sudah tidak ada bakteri C. sakazakii pGFPuv yang bertahan. Pe- nurunan C.  sakazakii pGFPuv  pada  jagung  pipilan berkadar  air  awal  12  dan  16%  yang  disimpan  pada RH  50%  selama  12  minggu  berturut-turut  sebesar 5,4  dan  3,8  Log  CFU/g.  Jumlah C.  sakazakii pGFPuv  pada  jagung  pipilan  setelah  penyimpanan tersebut dipengaruhi oleh RH penyimpanan ( P <0,05).  Laporan  serupa  oleh  Dewanti-Hariyadi et al . (2012) juga menunjukkan penurunan C. sakazaki pada  susu  skim  selama  12  minggu  penyimpanan dipengaruhi oleh RH  penyimpanan, dimana  penuru- nan terbesar terjadi pada RH 90% dibandingkan RH 50 dan 70%.
Gambar 3.  Perubahan  jumlah C.  sakazakii pGFP- uv  pada  jagung  pipilan  dengan  kadar air awal 12% (A) dan 16% (B)
Penurunan  jumlah C.  sakazakii pGFPuv  yang lambat  pada  RH  50%  juga  berkaitan  dengan penurunan  a w -nya  selama  penyimpanan.  Menurut Gurtler  dan  Beuchat  (2007)  kelangsungan  hidup C.  sakazakii meningkat  ketika  a w sangat  rendah. Aktivitas  air  jagung  pipilan  yang  disimpan  pada  RH 50%  lebih  rendah  daripada  RH  70%  dan  RH  90%. a w jagung  pipilan  berkadar  air  awal  12  dan  16%  di RH  50%  berturut-turut  sebesar  0,45±0,01  dan  0,45 ±0,01 sedangkan di RH 70% sebesar 0,67±0,03 dan 0,68±0,01,  dan  di  RH  90%  sebesar  0,82±0,03  dan
0,85±0,00.  Penelitian  Beuchat et  al .  (2009)  menun- jukkan C.  sakazakii bertahan  lebih  baik  pada  for- mula dan sereal  bayi dengan a w 0,25-0,30 daripada a w 0,69-0,82 selama penyimpanan 12 bulan. Lin dan Beuchat  (2007)  menyatakan  dengan  meningkatnya a w dapat  mempercepat  laju  kematian C.  sakazakii . Selain itu, meningkatnya jumlah kapang dan khamir pada  jagung  pipilan  yang  disimpan  di  RH  90%  juga dapat menyebabkan penurunan jumlah C. sakazakii pGFPuv  yang  sangat  cepat  dibandingkan  pada jagung pipilan yang disimpan di RH 50%.
Sintasan C.  sakazakii pGFPuv  pada  jagung pipilan dapat diketahui dengan membandingkan laju penurunan  jumlah  koloni  yang  bertahan  hidup  pada waktu tertentu (Nt) dengan jumlah koloni awal (No). Laju  penurunan  jumlah C.  sakazakii pGFPuv  per minggu  ditunjukkan  oleh  besarnya  slope  yang  di- peroleh  dari  persamaan  linier  kurva  sintasan.  Laju penurunan  jumlah  isolat C.  sakazakii pGFPuv  pada jagung  pipilan  berkadar  air  awal  12  dan  16%  yang disimpan  di  RH  50%  lebih  lama  dibandingkan  pada RH  70  dan  90%  (Gambar  4).  Hal  ini  ditunjukkan dengan  nilai  slope  dari  persamaan  linier  RH  50% lebih  kecil  dibandingkan  RH  70  dan  90%.  Pada jagung  pipilan  berkadar  air  awal  12  dan  16%,  laju penurunan C. sakazakii pGFPuv pada RH 50% ber- turut-turut  sebesar  0,789  dan  0,557  siklus  Log/ minggu,  sedangkan  pada  RH  70%  berturut-turut sebesar  2,001  dan  1,487  siklus  Log/minggu,  dan pada  RH  90%  berturut-turut  sebesar  2,024  dan 2,058 siklus Log/minggu.
Gambar 4.  Sintasan C.  sakazakii pGFPuv  mutan pada  jagung  pipilan  berkadar  air  awal 12% (a) dan 16% (b) selama penyimpa- nan pada RH 50, 70, dan 90%
A
B
0 1 2 3 4 5 6 7 0 2 4 6 8 10 12 T o ta l B a k te ri ( L o g CFU/g ) Lama Penyimpanan (Minggu)
RH 50% RH 70% RH 90% 0 1 2 3 4 5 6 7 0 2 4 6 8 10 12 T o ta l B a k te ri ( L o g CFU/g )
Lama Penyimpanan (Minggu) RH 50% RH 70% RH 90%
Pada  RH  50%,  laju  penurunan  jumlah C.  sakazakii pGFPuv  di  jagung  pipilan  berkadar  air awal 16% lebih lambat dibandingkan dengan jagung pipilan  berkadar  air  awal  12%.  Hal  ini  ditunjukkan dengan  nilai  slope  dari  persamaan  garis  linier jagung  pipilan  berkadar  air  awal  16%  yang  lebih kecil  dibandingkan  dengan  jagung  pipilan  berkadar air awal 12%. Pada RH 50%, laju penurunan jumlah C.  sakazakii pGFPuv  di  jagung  pipilan  berkadar  air awal  12  dan  16%  berturut-turut  sebesar  0,789  dan 0,557  siklus  Log/minggu.  Akan  tetapi,  berdasarkan uji  non  parametrik  independent  samples,  kadar  air awal  jagung  pipilan  berpengaruh  tidak  nyata ( P >0,05) terhadap jumlah C. sakazakii pGFpuv yang bertahan  hidup  di  RH  50%  setelah  penyimpanan. Hal ini disebabkan karena kedua taraf kadar air awal jagung  pipilan  tersebut  pada  RH  50%  mengalami kadar air kesetimbangan setelah minggu kedua dan memiliki  kadar  air  yang  serupa  selama  penyim- panan. Kadar air jagung pipilan berkadar air awal 12 dan  16%  berturut-turut  memilki  kadar  air  selama penyimpanan 9,4-9,9% dan 9,8-10,1%.
Penelitian  Breeuwer et al .  (2003)  menunjukkan sintasan C.  sakazakii pada  kondisi  kering  disebab- kan oleh kemampuannya  mengakumulasi trehalosa, yang  berperan  dalam  menstabilkan  membran  fos- folipid  dan  proteinnya.  Trehalosa  akan  berikatan (ikatan  hidrogen)  secara  langsung  dengan  gugus polar  dari  fosfolipid  sehingga  dapat  menstabilkan ikatan  yang  sebelumnya  ditempati  air  (Patist  dan Zoerb,  2005).  Trehalosa  dapat  meningkatkan tegangan  permukaan  dengan  cairan  intraseluler sehingga  dapat  mencegah  terjadinya  autolisis. Semakin  banyak  cairan  intraseluler  terikat  dengan trehalosa  maka  interaksi  hidrofobik  intramolekuler akan  semakin  meningkat,  sehingga  kerusakan membran  dan  protein  dapat  dicegah  (Leslie et  al., 1995).  Selain  trehalosa,  adanya  zat  terlarut  betaine juga  dapat  membuat C.  sakazakii resisten  terhadap kondisi  kering  (Feeney et  al., 2014).  Menurut penelitian  Riedel  dan  Lehner  (2007) C.  sakazakii dapat  bertahan  dalam  keadaan  kering  karena adanya  akumulasi  protein  yang  berperan  struktural dan  protektif.  Protein  tersebut  adalah  protein heat shock (Hsp),  protein cold  shock (Cspc),  protein perlindungan  dan  perbaikan  (Dps),  protein  pengika- tan  DNA  (Hns)  seperti  histon,  dan  protein  protektif yang  melawan  oksigen  radikal,  superoksida  dis- mutase, dan alkil hidroperoksida reduktase.
Perubahan  total  bakteri  pada  jagung  pipilan selama penyimpanan
Total  bakteri  pada  jagung  pipilan  mengalami penurunan  selama  12  minggu  penyimpanan  pada ketiga  RH  (Gambar  5).  Pada  jagung  pipilan  dengan kadar  air  awal  12%,  total  bakteri  setelah  penyim- panan  pada  RH  50,  70,  90%  berturut-turut  sebesar 2,3±0,15;  2,3±0,25  dan  2,2±0,14  Log  CFU/g  dari
jumlah  awal  6,1±0,1  Log  CFU/g.  Sementara  itu, pada  jagung  pipilan  dengan  kadar  air  awal  16%, total  bakteri  setelah  penyimpanan  pada  RH  50,  70, 90%  berturut-turut  sebesar  2,8±0,06;  2,7±0,02;  dan 2,6±0,08  Log  CFU/g  dari  jumlah  awal  6,3±0,05  Log CFU/g.  Total  bakteri  pada  jagung  pipilan  setelah penyimpanan  tersebut  tidak  berbeda  signifikan meskipun kadar air awal dan RH yang berbeda.
Gambar 5.  Perubahan  total  bakteri  pada  jagung pipilan  dengan  kadar  air  awal  12%  (A) dan 16% (B)
Total bakteri di jagung pipilan berkadar air awal 12%  turun  lebih  banyak  daripada  jagung  pipilan berkadar air awal 16% selama 12 minggu penyimpa- nan.  Penurunan  total  bakteri  di  jagung  pipilan berkadar  air  awal  12%  sebesar  3,8;  3,8;  3,9  Log CFU/g  berturut-turut  pada  RH  50,  70,  dan  90%, sedangkan  pada  jagung  pipilan  berkadar  air  awal 16%  sebesar  3,5;  3,6;  3,7  Log  CFU/g  berturut-turut pada  RH  50,  70,  dan  90%.  Penurunan  total  bakteri pada  RH  50  dan  70%  dapat  disebabkan  oleh penurunan nilai a w jagung pipilan selama penyimpa- nan  dimana  a w tersebut  tidak  sesuai  untuk  per- tumbuhan  bakteri.  Nilai  a w jagung  pipilan  berkadar air 12 dan 16% selama penyimpanan  sebesar 0,43- 0,46  pada  RH  50%  dan  0,66-0,69  pada  RH  70%. Penelitian  Leong et  al .  (2012)  menemukan  bakteri asam  laktat  ( Lactobacillus  plantarum , Leuconostoc
A
B
0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 2 4 6 8 10 12 J u m la h K a p a n g d a n K h a m ir (L og C FU /g ) Lama Penyimpanan (Minggu)
RH 50% RH 70% RH 90% 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 2 4 6 8 10 12 J u m la h K a p a n g d a n K h a m ir (L o g CFU/g )
Lama Penyimpanan (Minggu) RH 50% RH 70% RH 90%
citreum )  muncul  di  awal  penyimpanan  dan  bakteri Enterobacteriaceae dominan  selama  penyimpanan jagung.  Akan  tetapi,  pertumbuhan  bakteri  asam laktat dan Enterobacteriaceae dipengaruhi oleh nilai a w -nya,  dimana  bakteri  asam  laktat  dan Entero- bacteriaceae tidak dapat tumbuh berturut-turut pada a w di  bawah  0,90  dan  0,95.  Ketika  bakteri  terpapar pada  lingkungan  ber-a w rendah,  jumlah  air  bebas pada  jagung  pipilan  tersebut  tidak  cukup  untuk mempertahankan  viabilitas  selnya  sehingga  sel mengalami  dehidrasi  dan  tidak  mampu  untuk tumbuh  atau  bahkan  mengalami  kematian  (Sperber dan  Doyle,  2009).  Sementara  itu,  penurunan  total bakteri  pada  RH  90%  dapat  disebabkan  oleh meningkatnya  jumlah  kapang  dan  khamir  akibat meningkatnya  a w jagung  pipilan  pada  RH  90%. Peningkatan  jumlah  kapang  dan  khamir  tersebut menyebabkan  interaksi  antagonis  dengan  bakteri dalam  bersaing  mendapatkan  nutrisi  dari  substrat jagung pipilan (Mille-Lindblom et al., 2006).
Perubahan  jumlah  kapang  dan  khamir  pada jagung pipilan selama penyimpanan
Jumlah kapang dan khamir pada jagung pipilan berkadar  air  12%  setelah  penyimpanan  12  minggu pada  RH  50,  70,  dan  90%  berturut-turut  adalah 3±0,01; 3±0,03 dan 7,2±0,01 Log CFU/g dari jumlah awal  4,1±0,07  Log  CFU/g.  Sementara  itu,  jumlah kapang dan khamir pada jagung pipilan berkadar air awal  16%  setelah  penyimpanan  12  minggu  di  RH 50,  70,  dan  90%  berturut-turut  sebesar  3,5±0,14; 4,2±0,11  dan  7,4±0,01  Log  CFU/g  dari  jumlah  awal 4,1±0,04  Log  CFU/g.  Selama  penyimpanan  12 minggu,  jumlah  kapang  dan  khamir  pada  jagung pipilan  berkadar  air  awal  12%  yang  disimpan  pada RH 50 dan RH 70% mengalami penurunan sebesar 1,1  Log  CFU/g,  sedangkan  pada  RH  90%  me- ngalami  peningkatan  sebesar  3,1  Log  CFU/g,  dan jumlah  kapang  dan  khamir  pada  jagung  pipilan berkadar air awal 16% yang disimpan pada RH 50% mengalami  penurunan  sebesar  0,6  Log  CFU/g, sedangkan  pada  RH  70  dan  RH  90%  mengalami peningkatan  berturut-turut  sebesar  0,1  dan  3,3  Log CFU/g (Gambar 6). Jumlah kapang dan khamir pada jagung  pipilan  setelah  penyimpanan  tersebut  dipe- ngaruhi  oleh  RH  penyimpanan.  Menurut  Kusuma- ningrum et al . (2010), kelembaban relatif merupakan faktor  yang  mempengaruhi  pertumbuhan  kapang A.  flavus pada  jagung  pipilan  di  daerah  Bojonegoro selama penyimpanan.
Jumlah  kapang  dan  khamir  setelah  penyimpa- nan  pada  jagung  pipilan  baik  berkadar  air  awal  12 maupun 16% yang disimpan di RH 90% lebih besar daripada  RH  50  dan  70%.  Selain  disebabkan  oleh RH  penyimpanan  yang  lebih  tinggi,  pertumbuhan kapang dan khamir pada RH 90% tersebut berkaitan dengan  peningkatan  a w -nya,  yaitu  0,83-0,87,  yang merupakan  a w yang  sesuai  untuk  pertumbuhan
kapang  dan  khamir.  a w minimal  untuk  pertumbuhan kapang  dan  khamir  pembusuk  berturut-turut  adalah 0,84  dan  0,90  (Sperber  dan  Doyle,  2009).  Menurut Marin et  al .  (1998),  kapang Aspergillus spp.  pada media  ekstrak  jagung  dapat  bergerminasi  pada  a w 0,85-0,88,  dimana Aspergillus  niger mampu  ber- germinasi pada a w 0,8, sedangkan Aspergillus flavus pada  0,85. A.  awamori yang  diisolasi  dari  jagung pipilan  memiliki  a w minimal  pertumbuhan  0,85  pada suhu 30ºC (Astoreca et al., 2007).
Gambar 6.  Perubahan  jumlah  kapang  dan  khamir pada  jagung  pipilan  dengan  kadar  air awal 12% (A) dan 16% (B)
Selain  karena  a w jagung  pipilan,  pertumbuhan kapang  dan  khamir  pada  RH  90%  juga  disebabkan oleh peningkatan kadar airnya. Kadar air jagung pipil berkadar air awal 12 dan 16% yang disimpan di RH 90% setelah penyimpanan sebesar 16-16,9 sedang- kan  di  RH  70%  sebesar  12,3-13,4,  dan  di  RH  50% sebesar  9,4-10,1.  Menurut  penelitian  Reed et  al . (2007)  jagung  yang  berkadar  air  lebih  tinggi  me- ngalami  pertumbuhan  kapang  yang  lebih  banyak daripada  jagung  yang  berkadar  air  lebih  rendah. Jumlah kapang pada jagung yang berkadar air 18% lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  jagung  berkadar air  14,8%  setelah  penyimpanan  selama  2  minggu pada suhu 25ºC .
A
B

## KESIMPULAN
Sintasan C.  sakazakii pGFPuv  pada  jagung pipilan  lebih  dipengaruhi  oleh  RH  ruang  penyimpa- nan  dibandingkan  dengan  kadar  air  awal  jagung pipilan. C.  sakazakii pGFPuv  lebih  bertahan  hidup pada RH 50% dibandingkan RH 70 dan 90% selama 12 minggu penyimpanan. Ketahanan hidup C.  sakazakii pGFPuv  ini  berkaitan  dengan  kemam- puannya untuk bertahan hidup pada kondisi a w yang lebih  rendah  selama  penyimpanan  di  RH  50%  yaitu a w 0,43-0,46. C.  sakazakii pGFPuv  dapat  bertahan hidup  pada  RH  50%,  terutama  pada  jagung  pipilan berkadar air awal 16%. Dengan demikian, sebaiknya penyimpanan jagung pipilan dilakukan dengan kadar air  awal  12%  (bb)  pada  RH  50%,  karena  selain menurunkan jumlah kapang dan khamirnya sebesar 1,1  Log  CFU/g  dan  total  bakteri  sebesar  3,8  Log CFU/g, juga  dapat menurunkan  jumlah C.  sakazakii sebesar 5,4 Log CFU/g.

## DAFTAR PUSTAKA
Aguayo  E,  Escalona  VH,  Artes  F.  2006.  Effect  of cyclic  exposure  to  ozone  gas  on  physico- chemical,  sensorial  and  microbial  quality  of whole  and  sliced  tomatoes.  Postharvest  Biol Tech  39:  169-177.  DOI:  10.1016/j.postharvbio. 2005.11.005.
Astoreca  A,  Magnoli  C,  Ramirez  ML,  Combina  M, Dalcero A. 2007. Water activity and temperature  effects  on  growth  of Aspergillus niger , A.  awamori and A.  carbonarius isolated from  different  substrates  in  Argentina.  Int  J Food  Microbiol  119:  314-318.  DOI:  10.1016/j.ij foodmicro. 2007.08.027.
[BAM]  Bacteriological  Analytical  Manual.  2001. Chapter  3:  Aerobic  plate  count.  http://www. fda.gov/Food/FoodScienceResearch/Laborator yMethods/ucm063346.htm [04 November 2014].
Beuchat  LR,  Kim  H,  Gurtler  JB,  Lin  LC,  Ryu  JH, Richards  GM.  2009. Cronobacter  sakazakii in foods  and  factors  affecting  its  survival,  growth, and  inactivation.  Int  J  Food  Micobiol  136:  204- 213. DOI: 10.1016/j.ijfoodmicro.2009.02.029.
Bowen AB, Braden CR. 2006. Invasive Enterobacter sakazakii disease  in  infants.  Emerg  Infect  Dis 12: 1185-1189. DOI: 10.3201/eid1208.051509.
Breeuwer  P,  Lardeau  A,  Peterz  M,  Joosten  HM. 2003. Desiccation and heat tolerance of Entero- bacter  sakazakii .  J  Appl  Microbiol  95:  967-973. DOI: 10.1046/j.1365-2672.2003.02067.x.
Dewanti-Hariyadi  R,  Larasati  F,  Nuraida  L.  2012. Survival  of Cronobacter  sakazakii in  skim  milk during  spra  drying,  storage,  and  reconstitution.
J  Teknol  Industri  Pangan  23:  186-192.  DOI: 10.6066/jtip.2012.23.2.186.
Estuningsih  S,  Kress  C,  Hassan  AA,  Akineden  Ö, Schneider  E,  Usleber  E.  2006. Entero- bacteriaceae in  dehydrated  powdered  infant formula manufactured in Indonesia and Malaysia. J Food Protect 69: 3013-3017.
[FAO-WHO]  Food  and  Agriculture  Organization- World  Health  Organization.  2008. Enterobacter sakazakii ( Cronobacter spp.)  in  powdered follow-up  formula:  meeting  report.  Micro- biological  Risk  Assessment  Series,  No.  15, Roma,  Itali.  hlm  1-86.  http://www.who.int/food safety/publications/micro/MRA_followup.pdf. [04 November 2014].
Feeney  A,  Johnston  CD,  Govender  R, O’Mahony J, Coffe A, Sleator RD. 2014. Analysis of the role of the Cronobacter sakazakii ProP homologues in  osmotolerance.  Gut  Pathogens  6:  15.  DOI: 10.1186/1757-4749-6-15.
Friedamann M. 2007. Review. Enterobacter sakazakii in  food  and  beverages  (other  than infant  formula  and  milk  powder).  Int  J  Food Microbiol 116: 1 –10. DOI: 10.1016/j.ijfoodmicro. 2006.12.018.
Gitapratiwi  D,  Dewanti-Hariyadi  R,  Hidayat  SH.
2012.  Genetic  relatedness  of Cronobacter spp. ( Enterobacter  sakazakii )  isolated  from  dried food  products  in  Indonesia.  Int  Food  Res  J  19: 1745-1749.
Greenspan  L.  1977.  Humidity  fixed  points  of  binary saturated aqueous solutions. J Res Nat Bureau Stand-a Physics Chem 81A: 89 –96.
Gurtler  JB,  Beuchat  LR.  2007.  Survival  of Enterobacter  sakazakii in  powdered  infant formula  as  affected  by  composition,  water activity,  and  temperature.  J  Food  Protect  70: 1579 –1586.
Healy B, Cooney S, O’Brien S, Iversen C, Whyte P, Nally  J,  Callanan  JJ,  Fanning  S.  2010. Cronobacter ( Enterobacter sakazakii ): An oppurtunistic  foodborne  pathogen –  a  review. Foodborne  Pathog  Dis  7:  339-350.  DOI:  10.10 89/fpd.2009.0379.
Iversen  C,  Forsythe  S.  2003.  Risk  profile  of Enterobacter  sakazakii ,  an  emergent  pathogen associated  with  infant  milk  formula.  Trends Food  Sci  Techn  14:  443-454.  DOI:  10.1016/S 0924-2244(03)00155-9.
Jackson  EE,  Flores  JP,  Fernandez-Escartin  E, Forsythe  SJ.  2015.  Reevaluation  of  a  Sus- pected Cronobacter  sakazakii Outbreak  in Mexico.  J  Food  Protect  78:  1191-1196.  DOI: 10.4315/0362-028X.JFP-14-563.
Kingsly  ARP,  Ileleji  KE.  2009.  Sorption  isotherm  of corn distillers dried grains with solubles (DDGS) and  its  prediction  using  chemical  composition. Food  Chem  116:  939-946.  DOI:  10.1016/j.food chem.2009.03.050.
Kusumaningrum HD, Suliantari, Toha AD, Putra SH, Utami  AS.  2010.  Cemaran Aspergillus  flavus dan  aflatoksin  pada  rantai  distribusi  produk pangan  berbasis  jagung  dan  faktor  yang  mem- pengaruhinya.  J  Teknol  Industri  Pangan  21: 171-176.
Leong  S-LL,  Niba  AT,  Ny  S,  Olstorpe  M.  2012. Microbial  populations  during  maize  storage  in Cameroon.  Afr  J  Biotechnol  11:  8692-8697. DOI: 10.5897/AJB12.108.
Leslie  SB,  Israeli  E,  Lighthart  B,  Crowe  JH,  Crowe LM.  1995.  Trehalose  and  sucrose  protect  both membranes  and  proteins  in  intact  bacteria during drying. Appl Environ Microbiol 61: 3592- 3597.
Lin  LC,  Beuchat  LR.  2007.  Survival  of Enterobacter sakazakii in  infant  cereals  as  affeceted  by composition,  water  activity,  and  temperature. Food  Microbiol  24: 767-777.  DOI:  10.1016/j. fm.2007.02.001.
Marin  S,  Sanchis  V,  Saenz  R,  Ramos  AJ,  Vinas  I, Magan  N.  1998.  Ecological  determinants  for germination  and  growth  of  some Aspergillus and Penicillium spp.  from  maize  grain.  J  Appl Microbiol  84:  25 –36.  DOI:  10.1046/j.1365- 2672.1997.00297.x.
Mille-Lindblom  C,  Fischer  H,  Tranvik  LJ.  2006. Antagonism  between  bacteria  and  fungi: substrate  competition  and  a  possible  tradeoff between  fungal  growth  and  tolerance  towards bacteria.  Oikos  113:  233-242.  DOI:  10.1111/j. 2006.0030-1299.14337.x.
Nielsen  SS.  2010.  Food  Analysis  Laboratory Manual. Second  Edition.  17-20.  Springer, West Lafayette IN, USA.
Nurjanah  S,  Dewanti-Hariyadi  R,  Estuningsih  S,
Suhartono  MT.  2014.  Stability  and  Growth Characteristic GFPuv-Labeled Cronobacter sakazakii Isolated  from  Foods.  Food  Sci Biotechnol  23:  1491-1496.  DOI:  10.1007/s1 0068-014-0204-3.
Nurjanah  S,  Suhartono  MT,  Dewanti-Hariyadi  R, Estuningsih  S.  2013.  Aplikasi  mutan  ber- fluoresens  untuk  mempelajari  ketahanan  hidup kolonisasi  dan  penetrasi  isolat Cronobacter sakazakii selama pengeringan jagung. J Teknol Industri  Pangan  24:  184-193.  DOI:  10.6066/ jtip.2013.24.2.184.
Osaili  T,  Forsythe  S.  2009.  Desiccation  resistance and  persistence  of Cronobacter species  in infant formula. Int J Food Microbiol International 136:  214-220.  DOI:  10.1016/j.ijfoodmicro.2009. 08.006.
Passot  S,  Cenard  S,  DouaniaI,  TréléaI  C,  Fonseca F.  2012.  Critical  water  activity  and  amorphous state  for  optimal  preservation  of  lyophilised lactic  acid  bacteria.  Food  Chem  132:  1699- 1705. DOI: 10.1016/j.foodchem.2011.06.012.
Patist  A,  Zoerb  H.  2005.  Preservation  mechanisms of  trehalose  in  food  and  biosystems.  Coll Surface  B:  Biointerface  40:  107-113.  DOI: 10.1016/j.colsurfb.2004.05.003.
Reed  C,  Doyungan  S,  Ioerger  B,  Getchell  A.  2007.
Response  of  storage  molds  to  different  initial moisture  contents  of  maize  (corn)  stored  at 25ºC, and effect on respiration rate and nutrient composition.  J  Stored  Prod  Res  43:  443 –458. DOI: 10.1016/j.jspr.2006.12.006.
Restaino L, Frampton EW, Lionberg WC, Becker RJ. 2006.  A  chromogenic  plating  medium  for  the isolation  and  identification  of Enterobacter sakazakii from  foods,  food  ingredients,  and environmental  sources.  J  Food  Protect  69: 315 –322.
Riedel  K,  Lehner  A. 2007 . Identification  of  proteins involved  in  osmotic  stress  response  in Entero- bacter  sakazakii by  proteomics.  Proteomics  7:
1217-1231. DOI: 10.1002/pmic. 200600536.
Sperber  WH,  Doyle  MP.  2009.  Food  Microbiology and Food Safety. Compendium of the Microbio- logical  Spoilage  of  Foods  and  Beverages.  8- 9,267. Springer Science Inc, New York.
Strelec  I,  Popovic  R,  Ivanisic  I,  Jurkovic  V,  Jurkovic Z, Ugarcic-Hardi Z, Sabo  M. 2010.  Influence of temperature  and  relative  humidity  on  grain moisture, germination and vigour of three wheat cultivars during  one  year storage. Poljoprivreds 16: 20-24.