## PERBANDINGAN FRAGMENTASI DNA FOLIKEL PRIMER JARINGAN KORTEKS OVARIUM FRESH
NON TRANSPLAN,

## FRESH TRANSPLAN, VITRIFIKASI NON TRANSPLAN DAN VITRIFIKASI TRANSPLAN PADA MODEL BINATANG

## COMPARISON OF PRIMARY FOLLICLE DNA FRAGMENTATION OF OVARIAL CORTEX TISSUE FRESH NON TRANSPLAN, FRESH TRANSPLAN, VITRIFICATION NON TRANSPLAN AND VITRIFICATION TRANSPLAN IN ANIMAL MODELS
Edy Priyanto 1 ,Shofwal Widad 2 ,Agung Dewanto 2
1 Departemen Obstetri dan Ginekologi Fakultas Kedokteran Universitas Jenderal Soedirman
2 Departemen Obstetri dan Ginekologi Fakultas Kedokteran, Kesehatan Masyarakat dan Keperawatan Universitas Gadjah Mada/RSUP dr.Sardjito Yogyakarta

## ABSTRAK
Latar Belakang : Kriopreservasi jaringan ovarium merupakan salah satu pendekatan cara mempertahankan  fertilitas  pada  wanita  yang  diprediksi  mengalami  kegagalan  ovarium prematur  sebagai  konsekuensi  dari  kemoterapi,  radioterapi  atau  kelainan  genetik. Kriopreservasi  dengan  vitrifikasi  menjadi  fokus  investigasi  meskipun  masih  terdapat kontroversi  terhadap   hasil akhirnya,  karena  belum  ada  protokol  optimal  untuk  vitrifikasi serta data vitrifikasi jaringan ovarium manusia masih terbatas dan berlainan hasil. Tujuan dari  penelitian  ini  untuk  mengevaluasi  metode  vitrifikasi  modifikasi  Suzuki  pada  folikel primer jaringan korteks ovarium
Metode : P enelitian ini menggunakan uji eksperimental jenis one shot case study dengan menggunakan 28 jaringan korteks ovarium kambing ( Capra aegagrus hircus ) yang terbagi dalam  4  perlakuan  yaitu  jaringan  korteks  ovarium fresh non  transplan,  jaringan fresh ditransplantasikan  ke  CAM  ( chorioallantoic membrane )  ayam,  jaringan  di  vitrifikasi  non transplan  dan  jaringan  di  vitrifikasi  yang  ditransplantasikan  ke  CAM.  Penilaian fragmentasi DNA folikel primer pada setiap grup dilakukan dengan metode TUNEL ( TdT- mediated dUTP-biotin nick end labeling ) yang dilakukan di laboratorium fisiologi Fakultas Kedokteran,  Kesehatan  Masyarakat  dan  Keperawatan  Universitas  Gadjah  Mada Yogyakarta. Analisis statistik data penelitian dilakukan dengan uji ANOVA.
Hasil  : Fragmentasi  DNA  pada  folikel  primer  grup fresh non  transplan  :  17,39  %, fresh transplan : 12,5 %, vitrifikasi non transplan : 17,39 % dan vitrifikasi transplan 7,4 %. Uji komparasi 4 grup didapatkan p = 0.782 (p<0.05).
perbandingan fragmentasi dna folikel primer jaringan korteks ovarium fresh non transplan, fresh transplan, vitrifikasi non transplan dan vitrifikasi transplan pada model binatang ( edy priyanto )
Simpulan : Tidak terdapat perbedaan signifikan fragmentasi DNA folikel primer jaringan korteks  ovarium  antara  fresh  non  transplan,  fresh  transplan,  vitrifikasi  non  transplan  dan vitrifikasi  transplan  yang  menunjukkan  metode  vitrifikasi  modifikasi  Suzuki  dapat mempertahankan folikel dari fragmentasi DNA.
Kata Kunci : Kriopreservasi, vitrifikasi, fragmentasi DNA, TUNEL

## ABSTRACT
Background : Ovarian tissue cryopreservation is one approach to maintaining fertility in women  who  are  predicted  to  experience  premature  ovarian  failure  as  a  consequence  of chemotherapy, radiotherapy or genetic disorders. Vitrified cryopreservation is the focus of investigations although there is still controversy over the final results, because there is no optimal protocol for vitrification and human ovarian tissue vitrification data is still limited and  different.  The  purpose  of  this  research  is  for  evaluating  the  Suzuki  modification vitrification method on primary follicles of ovarian cortex tissue
Method : This research is an experimental test type of one shot case study using 28 goat ovarian  cortex  tissues  (Capra  aegagrus  hircus)  which  are  divided  into  4  treatments, namely fresh non-transplanted ovarian cortex tissue, fresh tissue transplanted into chicken CAM  (chorioallantoic  membrane),  tissue  in  non-transplanted  vitrification  and  vitrified tissue transplanted into CAM. Assessment of primary follicular DNA fragmentation in each group  was  carried  out  using  the  TUNEL  (TdT-mediated  dUTP-biotin  nick  end  labeling) method conducted at the physiology laboratory of the Faculty of Medicine, Public Health and Nursing, University of Gadjah Mada Yogyakarta. Statistical analysis of research data was carried out with the ANOVA test.
Conclusion  : There  were  no  significant  differences  in  DNA  fragmentation  of  primary follicles of ovarian cortex tissue between fresh non-transplanted, fresh transplanted, non- transplanted vitrification and transplant vitrification which showed that Suzuki's modified vitrification method can defend follicles from DNA fragmentation.
Keywords : Cryopreservation, vitrification, DNA fragmentation, TUNEL

## PENDAHULUAN
Beberapa  tahun  terakhir,  permintaan  preservasi  fertilitas  karena  alasan  onkologi dan  non-onkologi  serta  alasan  pribadi  meningkat  secara  dramatis,  dan  untuk  memenuhi permintaan  ini  akan  menjadi  tantangan  besar  di  tahun-tahun  mendatang.  Saat  ini, kriopreservasi  embrio  dan  kriopreservasi  oosit  setelah  stimulasi  ovarium  adalah  satu- satunya  metode  preservasi  kesuburan  yang  didukung  oleh American  Society  for Reproductive  Medicine .  Namun,  banyak  ahli  percaya  bahwa  sekarang  ada  cukup  bukti untuk  mendukung  penggunaan  kriopreservasi  jaringan  ovarium  sebagai  terapi  yang  valid dan  teknik  yang  efektif  bukan  hanya  sebagai  eksperimen  saja  (Donnez  dan  Dolmans, 2017).
Kriopreservasi  jaringan  ovarium  manusia  merupakan  salah  satu  pendekatan  cara mempertahankan  fertilitas  pada  wanita  yang  diprediksi  mengalami  kegagalan  ovarium prematur  sebagai  konsekuensi  dari  kemoterapi,  radioterapi  atau  kelainan  genetik.
Kriopreservasi  merupakan  pilihan  yang  paling  baik  untuk  usia  prapubertas  dan  bagi banyak  wanita  muda  untuk  menyimpan  oosit.  Sampai  saat  ini,  autotransplantasi  jaringan korteks  ovarium  yang  dibekukan  dan  kemudian  di- thawing telah  menghasilkan  kelahiran 24 anak-anak yang sehat di seluruh dunia (Sheiki, 2013). Kriopreservasi oosit manusia dan embrio  atau  blastokis  merupakan  pilihan  penting  dalam  teknik  reproduksi  berbantu.  Ini memberi kesempatan bagi pasien untuk memiliki lebih dari satu kesempatan dengan hanya sekali  stimulasi  ovarium,  sehingga  mengurangi  paparan  pasien  terhadap  gonadotrofin eksogen (Tavukcuoglu et al , 2012).
Kriopreservasi  dan  transplantasi  jaringan  ovarium  masih  merupakan  prosedur eksperimental  untuk  preservasi  fertilitas  pada  wanita  yang  mengalami  kegagalan  fungsi reproduksi.  Teknik  ini  memungkinkan  sebagai  alternatif  terapi  medis  untuk  mengobati gangguan  medis  utama  akibat  obat  gonadotoxic.  Jaringan  ovarium  dapat  diambil  dengan laparoskopi atau laparotomi dengan melakukan beberapa biopsi ovarium, atau ooforektomi parsial,  uni  atau  bilateral  dan  kemudian  dilakukan  vitrifikasi.  Jaringan  ovarium  yang divitrifikasi selanjutnya dilakukan autotransplantasi setelah selesainya terapi medis dengan obat  gonadotoxic.  Selain  itu  dapat  berfungsi  juga  sebagai  sumber  folikel  untuk  IVM/  in vitro maturation (Amorim et al, 2012).  Autotransplantasi akan bermanfaat  terutama pada pasien  yang  berurusan  dengan  perawatan  imunosupresan.  Pilihan  yang  paling menguntungkan  adalah  autotransplantasi  ortotopik  karena  menyerupai  pada  konsepsi alami,  sementara  transplantasi  heterotopic  adalah  alternatif  autotransplantasi  lain.  Baik allotransplantation (spesies yang sama) maupun xenografting pada hewan dari spesies yang berbeda juga menyediakan opsi dan perawatan lebih lanjut.
Vitrifikasi  adalah  teknik  yang  cepat  dan  sederhana  yang  menunjukkan  prospek nyata  untuk  kriopreservasi  jaringan  biologis  heterogen  seperti  korteks  ovarium.  Untuk meminimalkan toksisitas krioprotektan tanpa mempengaruhi sifat vitrifikasi, konsentrasinya yang relatif rendah dari krioprotektan yang berbeda dapat dikombinasikan.
Protokol  vitrifikasi  tidak  meningkatkan  persentase  folikel  dan  sel  stroma  pada fragmentasi  DNA  setelah warming .  Dengan  demikian  vitrifikasi  korteks  ovarium  tidak didapatkan  kerusakan  DNA  ireversibel  yang  mungkin  timbul  akibat  apoptosis  dan  /  atau aktivasi  stres  oksidatif  (Sanfilippo et  al ,  2015).  Namun  dalam  sebuah  penelitian sebelumnya,  Xiao et  al ,    melaporkan  peningkatan  yang  signifikan  dalam  fragmen  DNA TUNEL yang dinilai pada folikel manusia dan sel stroma setelah vitrifikasi dengan kontak langsung korteks ovarium dengan nitrogen cair.
Penelitian  ini  mengamati  protokol  vitrifikasi  modifikasi  dari  Suzuki  pada  folikel primer.

## SUBYEK DAN METODE PENELITIAN
Penelitian  ini  menggunakan  ovarium  dari  kambing  yang  didapatkan fresh dari tempat  pemotongan  hewan  (RPH)  ditempatkan  dalam  botol  transport  dengan menggunakan  medium  M199,  FBS.  Untuk  menjaga  kualitas  ovarium  agar  tetap  baik setelah  proses  pemotongan  hewan  menuju  laboratorium  dilakukan  dengan  cara menempatkan  ovarium  pada  kondisi  lingkungan  yang  tepat  (Silva et  al ,.  2014).  Waktu, suhu dan medium yang digunakan merupakan beberapa faktor yang berpengaruh terhadap kondisi  ovarium  selama  penyimpanan.  (Santos et  al ,  2002;  Tulake et  al ,  2014; Febretrisiana et al , 2015). Titik kritis yang perlu perhatian khusus adalah periode dari saat pemotongan  ternak  dengan  saat  ovarium  diproses  untuk  koleksi  oosit.  Rentang  waktu  ini
perbandingan fragmentasi dna folikel primer jaringan korteks ovarium fresh non transplan, fresh transplan, vitrifikasi non transplan dan vitrifikasi transplan pada model binatang ( edy priyanto )
merupakan  penentu  kualitas  ovarium  dan  oosit  yang  akan  diperoleh.  Medium  untuk penyimpanan  ovarium  selama  transportasi  diupayakan  pada  suhu  yang  optimal  untuk ovarium  baik  dalam  keadaan  dingin  (4 0 C)  (Febresitrisiana  dan  Pamungkas,  2017). Kemudian  jaringan  ovarium  bagian  korteks  dipotong  dengan  ukuran  1  x  1  x  0,1  cm 3 dengan menggunakan tissue slicer .
Jaringan  kemudian  di  bagi  menjadi  4  kelompok  dengan  perlakuan  berbeda  antara lain  vitrifikasi  non  transplan,  vitrifikasi  transplan,  fresh  non  transplan,  fresh  transplan. Pada perlakuan unfrozen/ fresh non transplan potongan jaringan ovarium langsung difiksasi dalam  4%  paraformaldehid  (PFA  4%)  dan  dilakukan  pemeriksakan  histologi.  Pada perlakuan  vitrifikasi  potongan  jaringan  ovarium  dilakukan  protocol  vitrifikasi menggunakan resep vitrifikasi modifikasi Suzuki et al (2015).
Resep vitrifikasi menurut Suzuki et al (2015) telah  dimodifikasi dari medium dan serumnya. Dimana TCM199 diganti dengan M199 dan SSS diganti dengan FBS. Menjadi sebagai berikut:
1. Medium (M199)+ 20% serum (FBS) + ethylon glikol 10%  5 menit 2. Medium (M199)+ 20% serum (FBS)+ ethylon glikol 20%  5menit
3. Medium (M199)+ 20%serum (FBS) +35% ethylon glikol +5% PVP+0,5 mol/L sukrosa  15 menit
Resep thawing Suzuki et al (2015) dengan modifikasi :
1. medium+20% serum+0,8M sukrosa  1 menit
2. medium+205serum+ 0,4 M sukrosa (3 menit)
3. medium +20% serum (5 menit)
4. medium +20% serum (5 menit)
Setelah satu hari dalam kondisi beku potongan jaringan dilakukan protocol thawing sesuai resep Suzuki et al (2015). Setelah melalui prosedur vitrifikasi dan thawing,  jaringan diperkecil ukurannya menjadi 0,5x0,5x0,1 cm3. Jaringan korteks ovarium pasca vitrifikasi- thawing ditanam  pada chorioallantoic  membrane (CAM)  telur  ayam  berusia  5-10  hari selama  5  hari  pada  suhu  37-38 O C  dan  kelembaban  44% . Jaringan  kemudian  dipanen difiksasi  dalam  4%  paraformaldehid  dan  dibuat  sediaan  histologis  serta  dilakukan pemeriksakan  histologi.  Adapun  pemeriksaan  histologi  yang  dilakukan  pada  keempat perlakuan  adalah  DNA  fragmentasi  menggunakan  TUNEL  dengan  kontrol  positif  uji optimasi DNase.
Pemeriksaan  DNA  fragmentasi  menggunakan  pemeriksaan TUNEL  pada  keempat kelompok  perlakuan.  Folikel  dikategorikan  atretic  jika  ditemui  49%  dari  GC  dan  oosit positif  TUNEL.  Data  berupa  persentase  folikel  primer  atretic  dari  tiap  potongan  ovarium unfrozen dan vitrifikasi kemudian dianalisis secara statistik.
Metode  penelitian  ini  menggunakan  uji  eksperimental  jenis one  shot  case  study dengan menggunakan 28 jaringan korteks ovarium kambing ( Capra aegagrus hircus ) yang terbagi  dalam  4  perlakuan  yaitu  jaringan  korteks  ovarium fresh non  transplan,  jaringan fresh ditransplantasikan ke CAM ( chorioallantoic membrane ) ayam, jaringan di vitrifikasi non  transplan  dan  jaringan  di  vitrifikasi  yang  ditransplantasikan  ke  CAM.  Penilaian fragmentasi DNA folikel primer pada setiap grup dilakukan dengan metode TUNEL ( TdT- mediated dUTP-biotin nick end labeling ) yang dilakukan di laboratorium fisiologi Fakultas Kedokteran,  Kesehatan  Masyarakat  dan  Keperawatan  Universitas  Gadjah  Mada Yogyakarta. Analisis statistik data penelitian dilakukan dengan uji ANOVA.

## HASIL PENELITIAN
Dari  semua  sampel  terdapat  folikel  yang  tampak  setelah  pengecatan  HE (hematoksilin-eosin), seperti terlihat dalam gambar berikut ini :
Gambar 1. Gambaran folikel  dengan pewarnaan HE
Tampak gambaran folikel primer (anak panah) adalah folikel ovarium yang belum matang, yang dikelilingi oleh satu atau beberapa lapisan sel granulosa kuboid.
Tabel 1. Data deskripsi histologi Grup Folikel Primordial Folikel Primer Folikel Sekunder Total Fresh non transplan (FN) 110 46 2 158 Fresh transplan (FT) 105 16 0 121 Vitrifikasi non transplan (VN) 63 23 0 86 Vitrifikasi transplan (VT) 68 27 2 75
Dari tabel di atas didapatkan jumlah folikel primordial dominan pada setiap grup, sedang fokus penelitian ini adalah folikel primer dimana peran FSH sudah terjadi pada tahap ini. Grup FN sebanyak 29,1 % dari total folikel pada grup FN, grup FT 13,2 %, grup VN 26,7 % dan grup VT 36 %.

## Gambar 2. Gambar folikel primer terfragmentasi (anak panah)

## Tabel 2. Data folikel primer terfragmentasi
Grup Folikel Primer Jumlah Positif (%) Fresh non transplan (FN) 46 17,39 Fresh transplan (FT) 16 12,5 Vitrifikasi non transplan (VN) 23 17,39 Vitrifikasi transplan (VT) 27 7,4
Pada  folikel  primer  terfragmentasi  didapatkan  angka  terendah  pada  kelompok vitrifikasi  transplan  (7,4  %)  dan  pada  kelompok  non  transplan  mendapatkan  hasil  yang sama (17,39 %).
Grafik 1. Rerata Jumlah Folikel Primer Terfragmentasi
Uji  normalitas  dan  varians  data  menunjukkan  semua  grup  mempunyai  data  yang normal dan sama, p=0,260 (p>0,05). Dari uji ANOVA komparasi 4 grup folikel primordial terfragmentasi  didapatkan  p  =  0.782  (p<0.05)  yang  berarti  tidak  terdapat  perbedaan fragmentasi DNA folikel primordial antara fresh non transplan, fresh transplan, vitrifikasi non transplan dan vitrifikasi transplan pada model binatang.

## PEMBAHASAN
Kriopreservasi oosit dari folikel pra-antral telah dipelajari selama dekade terakhir. Prosedur  dapat  dibagi  antara  kriopreservasi  jaringan  ovarium  atau  folikel  yang  terisolasi. Sebagian  besar  penelitian  menggambarkan  protokol  pembekuan  lambat/pencairan  cepat untuk  fragmen  ovarium  cryopreserve.  Gambaran  histologi  menunjukkan  bahwa  folikel mempertahankan  integritas  morfologisnya,  dan  transplantasi  jaringan  ovarium menunjukkan  bahwa  folikel  dapat  memulai  kembali  pertumbuhannya  dan  akhirnya berovulasi.  Beberapa  kelompok  penelitian  telah  memperoleh  keturunan  menggunakan prosedur  ini  pada  tikus  dan  domba.  Berkenaan  dengan  kriopreservasi  folikel  terisolasi, beberapa penelitian yang dilaporkan di daerah ini menggunakan protokol pembekuan yang sama,  dan  beberapa  dari  mereka  menggambarkan  pertumbuhan  folikel  menggunakan kultur  in-vitro.  Hasil  terbaik  diperoleh  pada  tikus,  dengan  kelahiran  hewan  setelah kriopreservasi  dan  kultur  folikel.  Namun,  studi  tambahan  diperlukan  untuk  pemahaman yang  lebih  baik  tentang  peristiwa  selama  kriopreservasi  folikel  dan  untuk  menetapkan protokol standar untuk transplantasi ovarium atau kultur folikel (Amorim et al, 2003). Kriopreservasi jaringan kortikal ovarium yang mengandung folikel primordial dan primer  dalam  jumlah  tinggi  akan  bermanfaat  bagi  wanita  muda  yang  akan  menjalani kemoterapi  atau  radioterapi,  atau  mengantisipasi  kegagalan  ovarium  prematur.  Jaringan ovarium  manusia  telah  berhasil  cryopreserved  menggunakan  dimetil  sulfat,  propanediol dan  etilen  glikol  sebagai  cryoprotectants.  Pematangan  oosit  dalam  kultur  in  vitro  dari folikel  awal  akan  lebih  baik  daripada  penanaman  kembali  untuk anak  perempuan  dengan keganasan yang dapat ditanam kembali dengan jaringan. Untuk saat ini kami telah berhasil mengkultur folikel primordial dan primer manusia kriopreservasi ke sekunder, dan kadang-
perbandingan fragmentasi dna folikel primer jaringan korteks ovarium fresh non transplan, fresh transplan, vitrifikasi non transplan dan vitrifikasi transplan pada model binatang ( edy priyanto )
kadang  ke  tahap  antral  awal  dalam  kultur  organ  dalam  irisan  jaringan  kortikal  dalam matriks ekstraseluler. Pematangan oosit dalam kultur in vitro dari folikel awal akan lebih baik  daripada  penanaman  kembali  untuk  anak  perempuan  dengan  keganasan  yang  dapat ditanam  kembali  dengan  jaringan.  Untuk  saat  ini  kami  telah  berhasil  mengkultur  folikel primordial  dan  primer  manusia  kriopreservasi  ke  sekunder,  dan  kadang-kadang  ke  tahap antral awal dalam kultur organ dalam irisan jaringan kortikal dalam matriks ekstraseluler. Viabilitas  setelah  pencairan  telah  ditunjukkan  secara  morfologis,  menggunakan  tes viabilitas,  dengan  mentransplantasikan  jaringan  ke  tikus  immunodeficient,  dan  dengan mengkulturnya secara in vitro. (Hovatta, 2000).
Dalam  studi  ini  didapatkan  tidak  adanya  perbedaan  jumlah  folikel  dan  morfologi dari sebelum dan sesudah perlakuan. Hal ini sesuai dengan penelitian Wiweko et al (2014) yang  menyatakan tidak  adanya  perbedaan  bermakna morfologi  dari  sel  granulosa,  stroma dan  kolagen  jaringan  ovarium  sebelum  dan  sesudah  vitrifikasi  termasuk  jumlah  folikel primordial,  primer  dan  fokilel  atresia.  Penurunan  jumlah  folikel  berkaitan  dengan  usia lanjut  dan  distribusi  folikel  di  korteks  ovarium  (Wiweko et  al, 2014  ;  Fabbri,  2006)  . Jumlah folikel juga tergantung pada teknik pengambilan sampel dan pemilihan permukaan kortikal  ovarium  (Wang et  al ,  2009).  Pada  korteks  ovarium  yang  dibekukan,  jumlah  dan kualitas  folikel  dapat  diprediksi  kemungkinan  pengembalian  fungsi  reproduksi  (Shi et  al, 2017).  Pada  penelitian  ini  didapatkan  nilai  fragmentasi  DNA  pada  kelompok  transplan lebih  rendah  daripada  non  transplan  pada  folikel  primordial  dan  primer.  Hal  ini menandakan kerusakan jaringan lebih sedikit pada grup transplan baik pada jaringan fresh maupun  jaringan  vitrifikasi  yang  mendukung  sebuah  hipotesis  adanya  fase  ischemic- reperfusion  yang  ditandai  adanya  penurunan  densitas  vaskular  secara  signifikan  pada jaringan  simpan  beku  pasca  transplan.  Adanya  regenerasi  stroma  jaringan  paska tranplantasi  yang  dipicu  oleh  adanya  kerusakan  jaringan  dan  indicator  kembalinya vaskularisasi melelui proses neovaskularisasi (Hamurajib et al , 2018).
Walaupun  tidak  berbeda  bermakna,  penelitian  ini  menunjukkan  jaringan  yang divitrifikasi  dan  di  transplantasikan  lebih  superior  dalam  ketahanan  terhadap  kerusakan DNA  menjadikan  wacana  baru  yang  dapat  dikembangkan  untuk  penelitian  yang  akan datang  sehingga  kriopreservasi  dan  transplantasi  jaringan  ovarium  dapat  merupakan pilihan  utama  dalam  preservasi  fertilitas  pasien  kanker.  Kriopreservasi  dapat  dilakukan dengan  teknik  slow  freezing  dan  vitrifikasi,  namun  vitrifikasi  lebih  diunggulkan  karena membutuhkan  waktu  lebih  singkat  dengan  tingkat  kerusakan  folikel  dan  doxyribonucleic acid (DNA) yang lebih sedikit (Shi et al, 2017). Sedangkan transplantasi jaringan ovarium dapat dilakukan baik dengan autotransplantasi atau xenografting pada hewan (Varghese et al ,  2008).  Hasil  dari  penelitian  ini  merupakan  langkah  awal  yang  diharapkan  mampu mendukung  pengembangan  protocol  transplantasi  simpan  beku  korteks  ovarium  yang mampu mencegah dari kehilangan sel folikel yang signifikan pada manusia. ada penelitian ini  didapatkan  nilai  p  =  0,782  pada  komparasi  keempat  grup  menandakan  tidak  adanya perbedaan  dalam  fragmentasi  DNA  yang  terjadi,  hal  ini  dapat  menguatkan  kriopreservasi dan  transplantasi  jaringan  korteks  ovarium  merupakan  metode  yang  dapat  digunakan terutama  untuk  kasus  preservasi  ovarium  jangka  panjang  sesuai  dengan  penelitian Ayuandari et  al (2016)  yang  menyatakan  berkembangnya  secara  signifikan  folikel primordial, primer dan sekunder setelah kriopreservasi dan xenotransplantasi pada ovarium setelah 4 dan 12 minggu.
Protokol  vitrifikasi  yang  peneliti  gunakan  merupakan  protokol  vitrifikasi modifikasi  dari  Suzuki,  tidak  didapatkan  perbedaan  bermakna  DNA  fragmentasi  pada
folikel primer antara grup fresh dan  vitrifikasi. Berbeda  dengan penelitan oleh Xiao et al (2010) yang menyatakan adanya peningkatan signifikan dalam fragmentasi DNA TUNEL dinilai  dalam  folikel  manusia  dan  sel  stroma  setelah  vitrifikasi  oleh  kontak  langsung  dari korteks  ovarium  dengan  nitrogen  cair.  Hal  ini  dimungkinkan  karena  protokol  yang berbeda,  Xiao et  al menamai  protokolnya  dengan needle  immersed  vitrification (NIV) dimana ditambahkan jaringan tembaga yang dapat menurunkan kadar konsentrasi CPA.
Disisi  lain  yang  dapat  diambil  dari  penelitian  ini,  dimanfaatkan  sebagai  metode memperoleh  bibit  unggul  pada  hewan  ternak  khususnya  kambing.  Pemanfaatan  ovarium yang berasal dari RPH sebagai bagian dari penyelamatan materi genetik dan peningkatan nilai  guna  ternak  dapat  diupayakan  melalui  perkembangan  teknologi  yang  saat  ini berkembang pesat. Teknologi reproduksi berbantuan seperti fertilisasi in vitro merupakan salah satu yang dapat diaplikasikan (Rani dan Paliwal, 2014).

## DAFTAR PUSTAKA
Amorim CA, Goncalves PBD, Figueiredo JR, Cryopreservation of oocytes from pre-antral follicles, Hum Reprod Update. 2003 Mar-Apr;9(2):119-29. doi: 10.1093/humupd/dmg014.
Amorim  CA,  Dolmans  MM,  David  A,  Jaeger  J,  Vanacker  J,  Camboni  A,  Donnes  J, Langendonckt  AV., 2012, Vitrification  and xenografting of human ovarian tissue . Fertil Steril . 2012;98(5):1291-1298
Ayuandari  S.,  Wagner  C.,  Wildt  L.,  Crepaz  KW.,  Zavadil  C,  Manzl  C.,  Tollinger  SH., Paulitsch  M.,  Ziehr  SC,  2016, Follicular  growth  after  xenotransplantation  of cryopreserved  /thawed  human  ovarian  tissue  in  SCID  mice:  dynamics  and molecular aspects , J Assist Reprod Genet , DOI 10.1007/s10815-016-0769-2
Donnez J., Dolmans M.M, 2017, Fertility Preservation in Women , NEJM 377;17
Fabbri R., 2006, Cryopreservation of human oocytes and ovarian tissue. Cell Tissue Bank 2006;7:113-22
Febretrisiana  A.,  Setiadi  M.A.,  Karja  N.W.K.,  2015, Nuclear  maturation  rate  of  sheep oocyte  in  vitro: Effect  of  storage  duration  and  ovary  temperature.  J  Indonesian Trop Anim Agric. 40:93-99
Hamurajib  KC,  Alma  NA,  Huda  RF,  Pradatama  I,  Husna  N,  Ayuandari  S.,  Widad  S., Dewanto  A.,  2018,  Vaskularisasi  Jaringan  Korteks  Ovarium  Kambing  Setelah Vitrifikasi  dan  Transplantasi  pada  Chorioallantoic  Membrane  Ayam,  INAJOG , volum 6 suplement 1. July 2018
Hovatta  O,  Cryopreservation  and  culture  of  human  primordial  and  primary  ovarian follicles,  Molecular  and  Celullar  Endocrinology,  Volume  169,  Issues  1–2,  27 November 2000, Pages 95-97
Rani K, Paliwal S. 2014. A brief review on in vitro fertilization (IVF) : An advanced and miraculous gateway for infertility treatments. World J Pharm Sci . 3:647-658 Sanfilippo  S.,  Canis  M.,  Smitz  J.,  Sion  B.,  Darcha  C.,  Janny  L.,  Brugnon  F.,  2015, Vitrification of human ovarian tissue: a practical and relevant alternative to slow freezing, Reproductive Biology and Endocrinology (2015) 13:67
Santos  R.R.,  Silva  J.R.V.,  Costa  S.H.,  Rodrigues  A.P.R.,  Lobo  R.N.B.,  Figueiredo  J.R., 2002. Effect  of  0.9%  saline  solution  and  phosphate  buffer  saline  at  different
perbandingan fragmentasi dna folikel primer jaringan korteks ovarium fresh non transplan, fresh transplan, vitrifikasi non transplan dan vitrifikasi transplan pada model binatang ( edy priyanto )
temperatures  and  incubation  times  on  the  morphology  of  goat  preantral  follicles. Braz J vet Res anim Sci . 39:254-259
Sheikhi  M.,  2013, Clinical  Grade  Vitrification  of  Human  Ovarian  Tissue  for  Fertility Preservation , Karolinska Institutet, Stockholm 2013
Shi Q., Xie Y., Wang Y., Li S., 2017, Vitrification versus slow freezing for human ovarian tissue cryopreservation: a systematic review and meta-anlaysis, Scientific Reports 7, Article number: 8538 (2017)
Silva  A,  Lima  G,  Peixoto  GCX,  Caetano  de  Souza  AC,  2015,  Cryopreservation  in mammalian  conservation  biology:  current  applications  and  potential  utility, Research and Reports in Biodiversity Studies, DOI : 10.2147/RRBS.S54294
Suzuki  N.,  Yoshioka  N,  Takae  S.,  Sugishita  Y.,  Tamura  M,  Hashimoto  S.,  Morimoto  Y,
Kawamura  K.,  2015, Successful  fertility  preservation  following  ovarian  tissue vitriﬁcation in patients with primary ovarian insufﬁciency, Hum. Reprod., Vol.30, No.3 pp. 608–615, 2015
Tavukcuoglu  S.,  Al-Azawi  T.,  Khaki  A.A.,  Al-Hasani  S.,  2012, Is  vitriﬁcation  standard method of cryopreservation, Middle East Fertility  Society Journal (2012) 17, 152– 156
Tulake K., Yanagawa Y., Takahashi Y., Katagiri S.,  Higaki S., Koyama K.,  Wang X.,  Li H., 2014. Effects of ovarian storage condition on in vitro maturation of Hokkaido Sika deer (Cervus nippon yesoensis) oocytes . Jpn J Vet Res . 62:187-192. Varghese  A.C.,  du  Plessis  S.S.,  Falcone  T.,  Agarwal  A.,  2008, Cryopreservation/ transplantation  of  ovarian  tissue  and  in  vitro  maturation  of  follicles  and  oocytes: challanges  for  fertility  preservation.  Reproductive  biology  and  endokrinology , 6:47, 1-10.
Wang LH, Mullen SF, Li Y, Zhong JQ, Crister JK, Chen ZJ. Morphological and apoptotic comparison  of  primordial  and  primary  follicles  in  cryopreserved  human  ovarian tissue. Reprod Domest Anim 2009;44:879-83
Wiweko B., Maidarti M., Mansyur E., Yuningsih T., Ahmad A., Boediono A.,  Soebijanto S.,  Affandi  B.,  2014, Ovarian  tissue  vitrification  as  a  method  for  fertility preservation: A study of follicle number and morphology after vitrification, Journal of Minimal Stimulation IVF , Volume 1 Issue : 3 p.148-152 Xiao Z., Wang Y.,  Li  L., Luo S.,  Li S.W., 2010, Needle immersed vitrification can lower the  concentration  of  cryoprotectant  in  human  ovarian  tissue  cryopreservation. Fertil Steril. 2010;94(6):2323-8