Research Article

## UNPAD
Molecular Docking of Red Betel Leaf Bioactive Compounds ( Piper crocatum ) as Lipoxygenase Inhibitor
Fernanda Chairunisa 1 *, Mega Safithri 1 , Dimas Andrianto 1
1Department of Biochemistry, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Bogor Agricultural University, Bogor 16680, West Java Indonesia.
Submitted 03 June 2022; Revised 10 June 2022; Accepted 27 July 2022; Published  30 June 2023 *Corresponding author: fernandachairunisa@apps.ipb.ac.id

## Abstract
Degenerative diseases occurred due to several risk factors that are directly related to inflammation which  affected  several  diseases  such  as  coronary  heart  disease  (CHD)  and  diabetes.    One  of  the inflammatory causative agents is leukotrienes produced by the lipoxygenase enzyme (LOX) so that it takes anti-inflammatory drugs made from herbal plants. Red betel leaf ( Piper crocatum ) potentially inhibited  the  lipoxygenase  enzyme  because  it  contains  potential  phytochemical  compounds  such as  alkaloids,  flavonoids,  eugenol,  saponins,  and  tannins. This  research  aimed  to  test  the  inhibition of active compounds from extract and fractions of red betel leaves that have the best inhibition for lipoxygenase enzymes causing malondialdehyde formed through molecular docking simulations. This research used lipoxygenase enzyme as receptor (PRB code: 4NRE), C8E as natural ligand and active compound from extract and fractions of red betel leaves as a ligand. The highest inhibition regarded to Nandrolone phenylpropionate and Sofalcone ligand with -10.4 kcal/mol and -9.1 kcal/mol of affinity energy. Amino acid residues that played a role in ligand and receptor interaction were HIS373 and HIS378. The receptor structure with the best ligands was declared stable based on molecular dynamics simulations.
Keywords: Inflammation, Lipoxygenase, Molekular docking, Red betel leaf
Penambatan Molekuler Senyawa Bioaktif Daun Sirih Merah ( Piper crocatum ) sebagai Inhibitor Lipoksigenase

## Abstrak
Penyakit  degeneratif  terjadi  karena  beberapa  faktor  risiko  yang  berhubungan  langsung  dengan peradangan yang mempengaruhi beberapa penyakit seperti penyakit jantung koroner (PJK) dan diabetes. Salah  satu  agen  penyebab  inflamasi  adalah  leukotrien  yang  diproduksi  oleh  enzim  lipoksigenase (LOX) sehingga dibutuhkan obat antiinflamasi yang terbuat dari tanaman herbal. Daun sirih merah ( Piper crocatum ) berpotensi menghambat enzim lipoksigenase karena mengandung senyawa fitokimia potensial  seperti  alkaloid,  flavonoid,  eugenol,  saponin,  dan  tanin.  Penelitian  ini  bertujuan  menguji penghambatan senyawa aktif dari ekstrak dan fraksi daun sirih merah yang memiliki penghambatan terbaik untuk enzim lipoksigenase yang menyebabkan terbentuknya malondialdehid melalui simulasi penambatan molekuler. Penelitian ini menggunakan enzim lipoxygenase sebagai reseptor (kode PRB: 4NRE), ligan alami C8E, dan senyawa aktif dari ekstrak dan fraksi daun sirih merah sebagai ligan. Penghambatan  tertinggi  dimiliki  oleh Nandrolone phenylpropionate dan Sofalcone dengan  energi bebas pengikatan sebesar -10,4 kkal/mol dan -9.1 kkal/mol. Residu asam amino yang berperan dalam interaksi  ligan  dan  reseptor  adalah  HIS373  dan  HIS378.    Struktur  reseptor  dengan  ligan  terbaik dinyatakan stabil berdasarkan simulasi dinamika molekul.
Kata Kunci: Daun sirih merah, Inflamasi, Lipoksigenase, Penambatan molekuler

## 1.  Pendahuluan
Penyakit degeneratif atau penyakit tidak menular  menjadi  permasalahan  kesehatan terdepan yang belum terkendali saat ini yang menyebabkan  kematian  tertinggi  di  dunia sebesar  71%1.  Penyakit  degeneratif  terjadi akibat beberapa faktor resiko yang berkaitan langsung dengan inflamasi salah satunya pola hidup  yang  tidak  baik.  Inflamasi  ini  terjadi akibat  dari  reaksi  oksidasi  berlebih  yang menghasilkan  senyawa  radikal  bebas  dan apabila  keadaanya  berlebihan  dalam  tubuh akan  menyebabkan stress oksidatif  yang berkorelasi  kuat  dengan  kemunculannya inflamasi2. Penyakit degeneratif yang berkaitan dengan  inflamasi  seperti  penyakit  jantung koroner (PJK) dan diabetes 1 . Kematian akibat PJK  di  dunia  pada  tahun  2019  dilaporkan terjadi  pada  17.9  juta  jiwa  dengan  kriteria yakni usia kurang dari sama dengan 70 tahun dan 1.5 juta jiwa kematian disebabkan akibat penyakit  diabetes.  Indonesia  memiliki  total prevalensi  PJK  dan  stroke  sebesar  13.6% dan menjadi Negara dengan jumlah penderita diabetes terbanyak di dunia yakni pada posisi ke-4 yaitu sebesar 8,4 juta jiwa 3,4 . Pengobatan  untuk  penyakit  yang berkaitan  dengan  inflamasi  umumnya merupakan  obat-obatan  kimiawi,  salah satunya  obat  anti  inflamasi  komersil  yakni obat  anti  inflamasi  non  steroid  (NSAID). Disamping  pemakaiannya  yang  sering digunakan, NSAID menjadi obat yang harus dihindari  oleh  penderita  diabetes  dan  PJK. Penderita  diabetes  yang  mengkonsumsi NSAID  dapat  mengalami  gagal  ginjal  akut akibat  perubahan  hemodinamik  ginjal  dan memiliki  resiko  peningkatan  tekanan  darah yang  menjadikan  diabetes  sebagai  faktor resiko primer untuk PJK. Selain itu, konsumsi NSAID dalam jangka panjang pada penderita PJK beresiko terjadinya stroke5. Oleh karena itu, obat-obatan berbahan dasar alami menjadi harapan  baru  sebagai  obat  antiinflamasi dengan efek samping yang sedikit. Salah satu agen penyebab inflamasi yaitu leukotrien yang dihasilkan oleh enzim lipoksigenase (LOX). Hal tersebut menjadikan LOX sebagai target obat  untuk  terapi  berbagai  penyakit  yang berkaitan  dengan  inflamasi  menggunakan
bahan  dasar  alami  seperti  senyawa  turunan kumarin dan tanaman Cuminum cyminum 6,7 . Tanaman  herbal  telah  banyak  diteliti terkait  kandungan  antioksidan  yang  dapat berpotensi sebagai agen antiinflamasi. Salah satu  tanaman  herbal  yang  berpotensi  untuk menjadi  obat  antiinflamasi  yaitu  daun  sirih merah  ( Piper crocatum )  yang  mengandung senyawa fitokimia yang baik untuk manusia seperti alkaloid, flavonoid, kavakol, eugenol, saponin,  dan  tannin8.  Penelitian  mengenai potensi daun sirih merah sebagai antiinflamasi telah  dilakukan  dengan  ekstrak  etanol  90% daun  sirih  merah  sebagai  peningkat  kadar SOD dan penurun kadar MDA pada jaringan paru-paru  mencit  akibat stress oksidatif dengan  pemberian  ekstrak  dosis  optimal  di 230.4  mg/g9.  Penelitian  secara  komputasi juga  telah  berhasil  dilakukan  menggunakan komponen  daun  bahan  dasar  alam  yang mengandung  flavonoid,  alkaloid,  dan fenol  untuk  menghambat  sebagai  inhibitor enzim  lipoksigenase 10,11 namun  penggunaan daun  sirih  merah  sebagai  inhibitor  enzim lipoksigenase belum pernah dilakukan. Oleh karena  itu,  pengembangan  antiinflamasi berbasis daun sirih merah diperlukan.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk menentukan senyawa aktif ekstrak dan fraksi daun  sirih  merah  yang  berpotensi  untuk menghambat  enzim  lipoksigenase  penyebab terbentuknya malondialdehid melalui simulasi  penambatan  molekuler.  Penelitian ini bermanfaat sebagai acuan peneliti lainnya yang ingin melakukan penelitian terkait serta sebagai  pembaruan  untuk  penemuan  obat penghambatan pembentukan malondialdehid.

## 2.  Metode
2.1.  Alat Peralatan  yang  digunakan  berupa perangkat  keras  dan  perangkat  lunak. Perangkat  keras  tersebut  berupa  laptop dengan  spesifikasi  Acer  Swift  3, Processor AMD Ryzen 5 4500U with Radeon Graphics, sistem  operasi windows 10  dan  perangkat lunak  ( software ) MarvinView, Discovery Studio Visualizer, Autodock Tools Vina (The Scripps Research Institute ,  USA),  CMD, Ligplot+, PyMOL dan YASARA- Structure .

## 2.2.  Bahan
Bahan yang digunakan adalah file ligan 3D  dari  tanaman  daun  sirih  merah  dalam format  *.sdf,  yang  diambil  dari  PDB  serta reseptor yang digunakan yaitu struktur kristal ALOX 15 (4NRE) dengan format fasta, PDB, PDBQT,  struktur  kimia  enzim  ALOX  15, struktur kimia senyawa aktif fraksi n-heksan dan  etil  asetat  berdasarkan  hasil  LCMS sebanyak 61 ligan uji 12,13,14,15,16,17,18,19,20 .
2.3.  Prosedur 2.3.1. Preparasi Struktur Reseptor Reseptor  yang  digunakan  pada penelitian kali ini adalah LOX-15 kode 4NRE yang  diperoleh  dari  laman  https://www. rcsb.org/  dengan  format  *.pdb.  Preparasi reseptor menggunakan Discovery Studio dan Autodock vina.  Preparasi  dilakukan  dengan menghilangkan  molekul  air  dan  ligan  yang sudah  ada  pada  reseptor,  ditambahkan  atom hidrogen dan disimpan dalam format *.pdbqt.
Ekstrak etanol Ekstrak n-heksana Fraksi n-heksan Fraksi etil asetat Fraksi air Beta -amyrin Butil etanoat L-(+)-Arginin hidroklorida MLS000557666 (3R,4R,5R)-3,4-Bis(benzyloxy)- 5-((benzyloxy)-methyl) dihydrofuran-2(3H)-one Spathulenol Alfa pinen 1-(1,4-Ditian-2-ylmetil)-3-(3- metoksi propil) tiourea 6-Amino-4-[3- benzyloxy) phenyl] -3-tert-butyl-1,4- dihydropyrano[2,3-c] pyrazole-5- carbonitrile [(1S,4S,7R,9S,10S,12R,15S)- 4,12-Diacetyloxy-9,15-dihydroxy- 10,14,17,17-tetramethyl-11-oxo-6- oxatetracyclo [11.3.1.03,10.04,7] heptadec-13-en-1-yl] benzoate Humulene Limonen Metil eugenol 6XO32ZSP1D CHEMBL2398181 Beta- Caryophyllene Cineol-1,8 4-Metoksi indole Columbin CHEMBL518595 Kaempferitrin Terpinen-4-ol Leusilleusin amida hidroklorida (1:1) Isocaviunin 7- O-gentiobioside 5-[Bis(4,4-dimethyl-2,6- dioxocyclohexyl) methyl]-2- methoxybenzyl acetate Rutin Ni-(5-methylisoxazole-3- yl) ethanediamide Ethyl L-serinate hydrochloride Methyl 2-[14-acetyloxy-6-(furan- 3-yl)-1,5,15,15-tetramethyl-8,17- dioxo-7-oxatetracyclo Germacrene D Asam protokatekuat CHEMBL216163 Guanidine Tartrate Nandrolone Phenylpropionat CHEMBL3217136 Flemiphilippin A Methyl 3-(4-hydroxy-2-oxo-2H- chromen-3-yl)-3-(4-(octyloxy) phenyl) propanoate Neophytadiene 1H-pyrazole-1- carboximidamidmidhydrochloride Schisandrin B Isobenzofuran-4,7-dione Beta-Bisabolene 2-(3,4-Dimethoxyphenyl)-6- ethoxy-7-methoxy-1-naphthol Asam asetat Lankacidin C Asam Propionat SCHEMBL569003 CHEMBL2398181 Ingenol-3-Benzoate Sulfamethoxazole Beta-ocimene Anthocyanin Thiamine nitrat Beta-mycrene Elemicin Phytol Euphorbiasteroid N-(Decanoyl) piperidine Phthalic anhydride Methyl 6-hidroxyangolensate Sofalcone Urapidil

## Tabel 1. Bahan Ligan ekstrak dan fraksi daun sirih merah
2.3.2. Preparasi Struktur Ligan
Ligan yang digunakan pada penelitian terdiri dari dua jenis ligan, yaitu ligan alami dan  ligan  uji  dari  daun  sirih  merah.  Ligan diunduh di situs PubChem (https://pubchem. ncbi.nlm.nih.gov/)  dengan  bentuk  3D  yang disimpan  dengan  format  *.sdf.  Ligan  yang telah  diunduh  kemudian  diubah  menjadi*. pdb menggunakan Marvin View 6.0.0. Ligan yang digunakan merupakan komponen yang didapatkan  dari  hasil  penelitian  terdahulu yang  merupakan  hasil  analisis  LC-MS ( Liquid Chromatography Mass Spectrometry ) dengan  sensitivitas  dan  spesifisitas  yang dapat  digunakan  untuk  penelitian  berbasis komputasi 12,13,14,15,16,17,18,19,20 .
2.3.3. Prediksi  Toksisitas  dan  Analisis Stabilitas  Ligan  Senyawa  Bioaktif Daun Sirih Prediksi  toksisitas  dilakukan  pada ligan  uji  daun  sirih  merah  yang  diunduh pada  laman  https://pubchem.ncbi.nlm.nih. gov/ dalam bentuk format SMILES. Prediksi dilakukan  dengan  mengunggah  ligan  yang telah  dipilih  pada  laman  http://lmmd.ecust. edu.cn/admetsar1/predict/  yang  merupakan perangkat lunak admetsar 1.0. Hasil analisis berupa  inhibisi  herG,  karsinogenisitas,  dan toksisitas  oral  akut. Analisis  stabilitas  ligan dilakukan pada laman http://www.swissadme. ch  untuk  prediksi  stabilitasnya  http://scfbio- iitd.res.in/.
2.3.4. Validasi Metode Penambatan Molekuler Validasi  dilakukan  dengan  menambat ulang  protein  4NRE  dengan  ligan  alaminya sebagai  acuan  penentuan  grid  box  berupa sisi  aktif  enzim  untuk  berikatan  dengan ligan  uji  coba.  Validasi  metode  dilakukan dengan  penentuan  daerah  penambatan  ( grid box )  menggunakan AutoDockTools 1.5.6. Dimensi grid box dilakukan  pada  daerah pusat pusat x=11.646, y=-57.414, z=-23.690 dan dimensi x=28, y=20, dan z=30.  Validasi penambatan  molekuler  dilakukan  sebanyak 20 kali hingga mendapatkan nilai Root Mean Standard Deviation (RMSD) kurang dari 2.5 Å sebanyak minimal 20 kali.
2.3.5. Penambatan Molekuler. Penambatan  molekuler  dilakukan menggunakan AutoDock Tools 1.5.6  dan AutoDock Vina ( Scripps Research Institute, USA).  File  reseptor  dan  ligan  yang  telah dipreparasi  di  simpan  dengan  format PDBQT. File yang sudah disimpan kemudian diletakkan  dalam  folder  yang  sama  yakni folder  vina  yang  diletakkan  dalam  folder C.  Penambatan  molekuler  diawali  dengan menggunakan  program  “ command prompt ” atau cmd dan dilakukan proses pemerintahan program  yang  berada  dalam  folder  vina. Perintah yang dituliskan yaitu “--config conf. txt --log log.txt”. Hasil penambatan molekuler dengan  perintah  dari  program  cmd  dibuka dengan  aplikasi Discovery Studio Visualizer untuk  melihat  nilai  perubahan  energi  bebas Gibbs  (ΔG).  Dokumen  kemudian  di  simpan dengan aplikasi LigPlot+.
2.3.6. Analisis Hasil Penambatan Molekuler Analisis  hasil  penambatan  berupa energi  bebas  pengikatan  daribeberapa  mode dalam  format  log.txt  dan  nilai  konstanta inhibisi (KI). Visualisasi tiga dimensi ikatan kimia  dan  residu  asam  amino  dilakukan menggunakan  LigPlot+.  Hasil  diujikan dengan rumus ΔG=RT ln KI untuk didapatkan nilai energi bebas pengikatan.
2.3.7. Simulasi Dinamika Molekul (MD) Preparasi gabungan reseptor 4NRE dan ligan uji terbaik Nandrolone phenylpropionate dan  Sofalcone  dilakukan  dengan  pymol kemudian  dilakukan  analisis  dengan YASARA- Structure .  Simulasi  menggunakan makro  “md_run.mcr”  dengan  pemilihan waktu 10 ns, penambahan “ AddSpring ”, serta tiap  10  ps  lintasan  simulasi  disimpan.  Fisik sel diatur pada suhu 310K, pH 7,4, dan NaCl 0,9%.
2.3.8. Analisis Hasil Simulasi MD Analisis  hasil  simulasi  menggunakan “md_analyze.mcr” pada YASARA-Structure. Analisis  yang  dipilih  yakni  perhitungan Root Mean Square Deviation (RMSD), jari- jari  girasi, Root Mean Square Fluctuation (RMSF),  dan Solvent-Accessible Surface
Area (SASA).  Hasil  analisis  kemudian disimpan  dalam  bentuk file  notepad dan diolah menggunakan Microsoft Excel .
3.  Hasil
3.1.  Prediksi  bioavailabilitas  dan  toksisitas ligan
Ligan uji terpilih dari daun sirih merah dilakukan analisis stabilitas berdasarkan aturan Lipinski dan toksisitas dengan admetsar 1.0 sebelum diujikan pada protein target. Prediksi bioavailabilitas ligan menggunakan ligan uji sebanyak 61 ligan. Ligan kemudian dilakukan analisis stabilitas ligan dengan hasil sebanyak 3 ligan uji yakni Rutin, Isocaviunin 7-O, dan CHEMBL2398181  melanggar  lebih  dari  2 aturan  Lipinski.  Rutin  senyawa  dari  ekstrak etanol  melanggar  4  aturan,  Isocaviunin  7-O senyawa  dari  fraksi  etil  asetat  melanggar 4  aturan,  dan  CHEMBL2398181  senyawa dari  fraksi  air  melanggar  3  aturan.  Ligan uji  tersisa  yakni  sebanyak  58  ligan  lainnya yang  telah  memenuhi  syarat  lima  aturan Lipinski  sehingga  dapat  menjadi  kandidat sebagai ligan penghambat protein target yang tergolong stabil.
Prediksi  toksisitas  menjadi  salah  satu kunci  dalam  penemuan  berbagi  obat-obatan yang  berguna  untuk  menilai  tingkat  bahaya suatu senyawa pada lingkungan dan manusia. Uji  toksisitas  juga  diujikan  menggunakan perangkat  lunak  admetsar  1.0  dengan  tiga parameter  kontrol  yaitu human ether a go- go related gene (herG),  karsinogenik,  dan toksisitas  oral  akut  pada  tikus.  Semua  ligan masuk  kedalam  kategori  inhibitor  lemah untuk  inhibisi human ether a go-go related gene (herG).  Beberapa  ligan  didapatkan masuk  kedalam  kategori  karsinogenik yakni  asam  propionat,  neophytadiene,  beta- ocimene,  beta-myrcene,  butil  etanoat,  asam asetat, leusilleusin amida hidroklorida (1:1), dan  SCHEMBL569003.  Kategori  toksisitas oral akut pada tikus juga telah dilanggar oleh beberapa ligan yaitu columbin, Isobenzofuran- 4,7-dione,  Methyl  6-  hidroxyangolensate dan  methyl  2-[14-acetyloxy-6-(furan-3- yl)-1,5,15,15-tetramethyl-8,17-dioxo-7- oxatetracyclo [11.3.1.02,11.05,10] heptadeca- 10,13-dien-16-yl] acetate.
3.2.  Validasi metode penambatan molekuler Validasi  grid  box  merupakan  langkah awal  untuk  menentukan  titik  koordinat yang  tepat  dengan  sisi  aktif  reseptor  4NRE oleh  ligan  alami.  Selain  itu,  hasil  validasi akan  memberikan  nilai Root Mean Square Deviation (RMSD)  serta  energi  bebas pengikatan. Validasi menggunakan perangkat lunak Autodock Tools 1.5.6  dan Autodock vina menggunakan  ligan  alami  C8E  dari 4NRE dengan reseptor lipoksigenase 4NRE. validasi dilakukan sebanyak 20 kali ulangan dengan  menghasilkan  daerah  pusat  pusat x=11.646, y=-57.414, z=-23.690 dan dimensi x=28, y=20, dan z=30. Validasi mendapatkan nilai RMSD rata-rata sebesar 1.9161 dengan nilai  energi  bebas  pengikatan  sebesar  -5.4 kkal/mol.
3.3.  Penambatan  Molekuler  dan  Energi Bebas Pengikatan Penambatan  molekuler  dilakukan dengan  Visualisasi  2D  ligplot+  dan  3D discovery studio untuk  menunjukkan  ikatan hidrofobik  dan  ikatan  hidrogen  berdasarkan interaksi  residu  asam  aminonya.  Reseptor 4NRE  memiliki  residu  asam  amino  yang merupakan  sisi  katalitik  yang  diperlukan untuk  penghambatan  kinerja  enzim  sebagai inhibitor  kompetitif  yakni  residu  His373, His378,  dan  His553  yang  berikatan  secara hidrofobik. Ligan alami (gambar 1), ligan uji terbaik Nandrolone Phenylpropionate ,  dan Sofalcone berikatan secara hidrofobik dengan 2 residu asam amino penting yang terikat pada sisi aktif enzim yakni His373 dan His378.
Penambatan molekuler memiliki parameter dalam analisisnya untuk menentukan  kualitas  ligan  uji  dengan menggunakan energi bebas pengikatan (ΔG) dan nilai Konstanta Inhibisi (Ki). Banyaknya energi  bebas  pengikatandidapatkan  dari 20  moda  dari  konformasi  terbaik.  Hasil penambatan  molekuler  menggunakan  ligan uji  ekstrak  etanol,  ekstrak  n-heksan,  fraksi n-heksan, fraksi etil dan fraksi air yang baik menghasilkan  nilai ΔG<0.  Ligan  uji  dengan energi  bebas  pengikatan  terbaik  yakni Nandrolone Phenylpropionate ligan  ekstrak etanol dengan energi bebas pengikatansebesar
-10.4  kkal/mol  memiliki  nilai  Ki  sebesar 0.0023  μM  dan Sofalcone ligan  fraksi  air dengan energi bebas pengikatan.sebesar -9.1 kkal/mol memiliki nilai Ki sebesar 0.021 μM (Tabel 2).
3.4.  Dinamika Molekular
Analisis dinamika molekul menganalisis kestabilan  struktur  atas  4  dasar  yakni Root Mean Square Deviation (RMSD),  jari-jari girasi (RG), Solvent-Accessible Surface Area (SASA), dan Root Mean Square Fluctuation (RMSF) terhadap ligan uji terbaik Nandrolone Phenylpropionate dan Sofalcone .  Hasil nilai Root Mean Square Deviation (RMSD) (Gambar  2)  menginterpretasikan  kecocokan struktur protein tiap perubahan waktu. Jarak yang  terlalu  jauh  dari  struktur  sebelumnya menunjukkan  stabilitas  protein  yang kurang  baik.  Nilai  RMSD  yang  dihasilkan Nandrolone phenylpropionate berada  pada rentang  0.988-1.459  Å  dengan  rata-rata sebesar 1.267 Å. Nilai RMSD yang dihasilkan Sofalcone berada pada rentang 1.004 - 1.552 Å  dengan  rata-rata  sebesar  1,319  Å.  Hasil RG  (gambar 3)  didapatkan dari Nandrolone Phenylpropionate memiliki  rata-rata  28.268
Å pada rentang 28.098-28.417 Å. Hasil RG Sofalcone memiliki rata-rata sebesar 28.341 Å dengan rentang 28.178-28.418 Å. Kedua ligan memiliki rentang RG tidak terlalu jauh selama simulasi  dan  cukup  untuk  dikatakan  stabil untuk  volume  protein  dan  cukup  kompak. Analisis  stabilitas  selanjutnya  dilakukan dengan  analisis  SASA  untuk  melihat  luas permukaan  dan  pola  pengikatanannya  pada ligan.  Ligan Nandrolone phenylpropionate dan Sofalcone memberikan grafik yang cukup stabil  yang  ditunjukka  dengan  tidak  adanya perubahan  grafik  secara  signifikan.  Hasil tersebut  menujukkan  kedua  ligan  tergolong stabil dan interaksi antara ligan dan reseptor kompak dan baik. Analisis interaksi reseptor dengan ligan ditentukan oleh  analisis RMSF yang  menunjukkan  pergeseran  keadaan struktur residu protein mengenai kekakuannya selama  simulasi.  Kedua  ligan  menghasilkan simpangan  terkecil  pada  residu  asam  amino HIS373  dan  HIS378  yang  merupaka  sisi katalatiki enzim 4NRE dengan nilai dibawah 1.4  Å  sehingga  ikatan  reseptor  dan  ligan tergolong baik.
Gambar 1. (1) Visualisasi Docking Molekuler ligan  alami  C8E,  (2)  Visualisasi Nandrolone phenylpropionate ,  dan  (3)  Visualisasi Sofalcone A)  diagram  2D  ikatan  hidrogen  dan interaksi hidrofobik antara ligan-reseptor; B) Kantong pengikat 4NRE 3D
1
2 3

## 4.  Pembahasan
4.1.  Validasi Metode Penambatan Molekuler Pemilihan reseptor dengan kode 4NRE didasarkan  atas  struktur  kristal  4NRE  yang bersifat  original  protein  template.  Struktur 15-LOX  dengan  kode  pdb  4NRE  memiliki struktur yang analog dengan asam arakidonat karena  memiliki  rongga  serta  tempat pengikatan  asam  amino  yang  homolog 21 . Selain itu, reseptor juga memiliki kompleks dengan  inhibitor  yang  bekerja  sebagai substrat  analog  sehingga  dapat  dijadikan acuan  untuk  melakukan  desain  obat  yang bersifat kompetitif inhibitor.  Reseptor dengan
resolusi  medium  berada  pada  kisaran  2.00 Å  sampai  2.70  Å  sehingga  reseptor  4NRE dengan resolusi sebesar 2.63 Å dari manusia tergolong  medium  dan  layak  untuk  menjadi reseptor untuk desain obat 22 . Struktur  4NRE  kemudian  dilakukan validasi  sebelum  dilanjutkan  ke  tahap penambatan  molekuler.  Metode  penambatan molekuler  merupakan  langkah  awal  untuk menentukan titik koordinat yang tepat sehingga ligan dapat terarahkan ke sisi aktif reseptor. Validasi  menggunakan Autodock tools 1.5.6 dan Autodock vina dengan  memisahkan inhibitor  alami  protein  kemudian  dilakukan
1

## 2
Gambar 2. (1) RMSD (Root Mean Square Deviation) dan (2) RMSF (Root Mean Square Fluctuation) Nandrolone Phenylpropionate (kiri) dan Sofalcone (kanan)
Gambar 3. (1)  Jari-jari  girasi  (RG)  dan  (2)  SASA  (Solvent-Accessible  Surface Area)  Nandrolone Phenylpropionate (kiri) dan Sofalcone (kanan)
1
Tabel 2. Energi bebas pengikatan dan ikatan antar residu asam amino
Ligan Jarak Ikatan Hidrogen Ikatan Hidrogen Atom pada ligan ikatan hidrofobik Energi Bebas Ikatan Ki (μM) Ligan alami 4NRE (C8E) 2.96 3.22 2.85 Leu419 Val426 Gln425 O21 O21 O21 Phe365, Val427, Phe438, Ile412, Leu420, His373, His378, Ala416, Glu369, Leu374, Leu607, Leu415 -5.4 10.898 beta-amirin (73145) Val426, Leu420, Ala416, Ile412, Leu419, Leu415 -9.6 0.0090 Spathulenol (92231) Val426, Leu420, Leu419, Leu415 -7.0 0.7299 Beta-Caryophyllene (5281515) Leu415, Ile412, Ala416, Leu420 -7.4 0.3713 Humulene (5281520) Leu420, Ile412, Leu415, Leu419, Ala416 -7.5 0.3135 Kaempferitrin (5486199) Gln425 -7.4 0.3713 Germacrene D (5317570  ) Leu420, Ala416, Ile412, Leu419, Leu415 -7.2 0.5206 Elemicin (10248) Leu415, Leu419, Ile412, Ala416, Leu420 -5.6 7.7734 Phytol (5280435) Phe365, Val426, Val427, Leu420, Phe438, His373, His378, Ala416, Glu369, Leu374, Ile412, Leu607, Leu415, Leu419 -7.1 0.6164 beta-Bisabolene (10104370) Phe365, Val426, Leu420, Ile412, Phe438, His373, His378, Ala416, Glu369, Leu374 -7.3 0.4396 Sulfamethoxazole (5329 ) Leu420, Phe438, His373, His378, Ala416, Glu369, Leu374, Ile412, Leu607 -7.5 0.3135 Nandrolone Phenylpropionate (229455 ) Leu420, His373, His378, Ala416, Leu374, Ile412, Leu419, Leu415 -10.4 0.0023 Thiamine nitrate (10762 ) Val 426, Ala416 Leu420, Ile412, Leu419, Leu415 -6.1 3.3396 Anthocyanin (145858) Phe365, Val 426, Leu420, Phe438, His373, His378, Glu369, Leu374, Leu607 -7.9 0.1595 Alfa pinen (82227) Phe365, Val 426, Val427, Leu420, Phe438, Glu369, Leu607 -5,8 5.5443 Limonen (22311) Phe365, Val 426, Leu420, Phe438, His373, Leu374, Glu369 -6.4 2.0116 Cineol-1,8 (2758) Leu420, Leu415, Leu419 -5.3 12.905 Terpinen-4-ol (11230) 2.94 Glu369 O Phe365, Val 426, Leu420, Phe438, His373, Lue607 -6.5 1.6989 L-(+)-Arginin hidroklorida (66250) Leu415, Leu374, Ala416, His378, His373, Phe438, Leu420 -5.0 21.424 1-(1,4-Ditian-2-ylmetil)-3- (3-metoksi propil) tiourea (116510220) 2.97 2.81 Glu369 Ile412 N3 O1 Phe365, Val426, Leu420, Phe438, His373, His378, Ala416, Leu374, Leu607 -4.8 30.037 4-Metoksi indole (138363) Val427, Leu607, Leu420, Phe438, His373, His378, Glu369, Leu374 -5.1 18.093 Metil eugenol (7127) 3.20 3.07 Ile412 Glu369 O4 O2 Leu420, Phe438, His373, His378, Ala416, Leu374 -5.6 7.7734 Asam protokatekuat (72) Leu420, His373, His378, Ala416, Leu374 -5.8 5.5443 CHEMBL3217136 (90665169) -5.8 5.5443 1H-pyrazole-1- carboximidamidmid hydrochloride (2734672) -4.7 35.5674
2-(3,4-Dimethoxyphenyl)-6- ethoxy-7-methoxy-1-naphthol (1511955) -6.9 0.8642 Ni-(5-methylisoxazole-3- yl) ethanediamide (2805645) Leu420, Phe438, His373, His378, Glu369, Leu374, Leu607 -5.8 5.5443 MLS000557666 (1077234 ) Val426, Leu420, Ala416, Ile412, Leu415, Leu419 -9.0 0.0248 Ethyl L-serinate hydrochloride (2724185 ) 3.10 2.35 2.90 2.21 His373 His373 His378 His378 O3 FE O3 FE Leu420, Leu374 -4.2 82.7868 6XO32ZSP1D (75019) Leu420, His378, Ala416, Ile412, Leu415, Leu419 -6.0 3.9544 Schisandrin B (108130) Val426, Leu420, Gln425, Leu419 -6.9 0.8642 6-Amino-4-[3-(benzyloxy) phenyl]-3-tert-butyl-1,4- dihydropyrano[2,3-c] pyrazole- 5-carbonitrile (2865476) Leu420, Gln425, Leu415, Leu419 -8.4 0.0685 CHEMBL216163 (44418672) 2.80 3.13 Gln425 Val426 N3 N3 Leu420, Ala416, Ile412, Leu415 -7.5 0.3135 Flemiphilippin A (10074228) Gln425, Leu420, Leu419 -8.6 0.0488 (3R,4R,5R)-3,4- Bis(benzyloxy)-5- ((benzyloxy)-methyl) dihydrofuran-2(3H)-one (562066) Val426, Leu420, Leu415, Leu419 -7.8 0.1888 [(1S,4S,7R,9S,10S,12R,15S)- 4,12-Diacetyloxy-9,15- dihydroxy-10,14,17,17-
tetramethyl-11-oxo-
6-oxatetracyclo
[11.3.1.03,10.04,7] heptadec-13-en-1-yl] benzoate (9985480)
2.70 Leu419 O10 Val426, Leu420, Gln425, Ala416, Ile412, Leu415 -8.8 0.0348 CHEMBL518595 (44578655  ) Val426, Leu420, Ala416, Leu415, Leu419 -9.7 0.0076 5-[Bis(4,4-dimethyl-2,6- dioxocyclohexyl) methyl]- 2-methoxybenzyl acetate (3754322) Val426, Gln425, Leu420, Ala416, Leu415, Ile412, Leu419 -8.5 0.0578 Euphorbiasteroid (15940183) Val426, Gln425, Leu420, Ala416, Leu415, Ile412, Leu419 -8.4 0.0685 Guanidine tartrate (18533741) -4.7 35.5674 Ingenol-3-Benzoate (44292399) Gln425, Leu420, Ala416, Leu415, Leu419 -8.9 0.0294 Lankacidin C (6440871) Val426, Gln425, Leu420, Ala416, Leu415, Ile412, Leu419 -8.5 0.0578 Methyl 3-(4-hydroxy-2-oxo- 2H-chromen-3-yl)-3-(4- (octyloxy) phenyl) propanoate (91636868) Leu420, Phe438, His373, His378, Ala416, Glu369, Leu415, Leu374, Leu419 -8.1 0.1137
penempelan  kembali  untuk  memastikan titik pengikatan menyerupai celah situs aktif dengan  sedikit  penyimpangan 23 .  Validasi akan menghasilkan koordinat grid box yang menunjukkan posisi kantong situs aktif yang tepat. Hasil  validasi  memberikan  nilai Root Mean Square Deviation (RMSD)  yang bertujuan  untuk  melihat  perbedaan  orientasi pengikatan kristalografi pada sisi aktif protein dari beberapa pose dengan menggunakan ligan yang sama. Nilai RMSD memiliki tiga nilai yakni RMSD ≤ 2.0 Å, RMSD antara 2.0 dan 3.0 Å, dan RMSD > 3.0 Å. Nilai RMSD ≤ 2.0 Å  menunjukkan  bahwa  posisi  tepat,  RMSD antara 2.0 dan 3.0 Å menunjukkan posisi yang masih  dapat  diterima  dengan  kemungkinan sedikit  penyimpangan,  dan  RMSD  >  3.0  Å menunjukkan  posisi  yang  salah 24 .  Merujuk dari kriteria validasi yang baik, hasil validasi metode penambatan molekuler struktur 4NRE dengan  ligan  alaminya  menghasilkan  hasil yang  baik  dengan  titik  koordinat grid box yang  valid  sehingga  dapat  dijadikan  acuan sebagai  posisi  yang  tepat  untuk  melakukan penambatan molekuler.
4.2.  Prediksi  bioavailabilitas  dan  toksisitas ligan Prediksi bioavailabilitas ligan diperlukan  untuk  penemuan  suatu  obat khususnya untuk obat oral dan daya serapnya. Analisis  stabilitas  dilakukan  menggunakan lima aturan Lipinski yaitu berat molekul tidak lebih  dari  500  kDa,  donor  ikatan  hidrogen tidak  lebih  dari  5,  akseptor  ikatan  hidrogen tidak lebih dari 10, nilai Log P tidak lebih besar dari 5, dan refraktivitas molar berada diantara 40-130 25 .Ligan  uji  sebanyak  61  ligan  telah dilakukan analisis stabilitas ligan dengan hasil sebanyak 3 ligan uji yakni Rutin, Isocaviunin 7-O, dan CHEMBL2398181 melanggar lebih dari  2  aturan Lipinski sehingga  tersisa  58
ligan  lainnya  yang  telah  memenuhi  syarat lima aturan Lipinski sehingga dapat menjadi kandidat  sebagai  ligan  penghambat  protein target yang tergolong stabil.
Massa  atom  relatif  berkaitan  dengan kemampuan  suatu  senyawa  untuk  berdifusi menembus  membran  biologis  sehingga dibutuhkan ukuran senyawa yang kecil agar mudah  menembus  membran  biologis 26 . Aturan  donor  dan  akseptor  ikatan  hidrogen menunjukkan  kemampuan  suatu  senyawa dalam  mengikat  protein,  semakin  besar nilainya  maka  semakin  sulit  pemutusan ikatannya  sehingga  dibutuhkan  energi  yang lebih besar agar proses penyerapan senyawa terjadi 27 .  Nilai  Log  P  berkorelasi  dengan gugus polar senyawa sehingga semakin kecil nilai Log P maka semakin kuat sifat hidrofilik suatu  senyawa 28 .  Nilai  refraktivitas  molar dibawah  130  menyatakan  permeasi  yang baik 29 . Prediksi  toksisitas  menjadi  langkah selanjutnya  setelah  prediksi  bioavailabilitas yang  merupakan  kunci  untuk  menemukan berbagai  obat-obatan  yang  berguna  untuk menilai  tingkat  bahaya  suatu  senyawa  pada lingkungan  dan  manusia.  Prediksi  toksisitas suatu  senyawa  dilakukan  menggunakan admetSAR dengan 3 parameter yang kontrol pada penelitian ini yaitu human ether a go- go related gene (herG),  karsinogenik,  dan toksisitas  oral  akut  pada  tikus  yang  dipilih sebagai keterkaitannya untuk penemuan obat terkait  inflamasi.  Suatu  senyawa  dikatakan lolos uji toksisitas apabila parameter human ether a go-go related gene (herG)  bersifat inhibitor  lemah,  tidak  karsinogenik,  dan toksisitas oral akut berada pada golongan III atau IV 11 . Ligan uji sebanyak 58 ligan hasil saringan  uji Lipinski telah  di  uji  toksisitas dengan  admetsar  dengan  menghasilkan sebanyak 12 ligan uji melanggar satu dari tiga syarat  toksisitas  sehingga  ligan  yang  layak
N-(Decanoyl) piperidine
(4130169) Val426, Val427, Phe438, Leu420, His373, His378, Ala416, Glu369, Leu374, Ile412, Leu607 -7.3 0.4396 Phthalic anhydride (6811) -5.7 6.5649 Sofalcone (5282219) Phe438, Leu420, His373, His378, Ala416, Glu369, Leu374, Ile412, Leu415, Le419 -9.1 0.021 Urapidil (5639) Val426, Leu420, Ala416, Leu419, Leu415 -7.2 0.5206
dilanjutkan  untuk  dilakukan  penambatan molekuler sebanyak 46 ligan.
4.3.  Simulasi penambatan molekuler Penambatan molekuler memiliki parameter dalam analisisnya untuk menentukan  kualitas  ligan  uji  dengan menggunakan  nilai  energi  bebas  pengikatan (ΔG)  dan  nilai  konstanta  inhibisi  (Ki). Banyaknya  energi  bebas  pengikatan didapatkan  dari  20  mode  dari  konformasi terbaik.  Hasil  penambatan  molekuler menggunakan ligan uji ekstrak etanol, ekstrak n-heksan,  fraksi  n-heksan,  fraksi  etil  dan fraksi  air  menghasilkan  nilai  ΔG<0.  Ligan uji  dengan  energi  bebas  pengikatan  terbaik yakni Nandrolone Phenylpropionate dengan energi  bebas  pengikatan  sebesar  -10.4  kkal/ mol. Hal tersebut disebabkan karena semakin negatif  nilai  energi  bebas  pengikatan  maka semakin  baik  pengikatan  ligan  terhadap protein target 30 .Parameter nilai Ki berbanding lurus dengan energi bebas pengikatan. Nilai Ki  menunjukkan  pengikatan  suatu  ligan sebagai  inhibitor  kompetitif  dengan  rentan nilai micromolar yang rendah 31 . Berdasarkan pernyataan  tersebut  dapat  dikatakan  semua ligan  uji  yang  diujikan  pada  penelitian  ini memenuhi  syarat  sebagai  inhibitor  yang berikatan kuat dengan nilai Ki terbaik yaitu Nandrolone Phenylpropionate sebesar 0.00233 μM.
Visualisasi reseptor dengan ligan alami maupun  ligan  uji  menggunakan  Visualisasi ligplot+ dengan menunjukkan beberapa ikatan yakni ikatan hidrofobik dan ikatan hidrogen berdasarkan interaksi residu asam aminonya 32 . Protein  target  4NRE  memiliki  residu  asam amino  yang  merupakan  sisi  katalitik  yang diperlukan untuk penghambatan kinerja enzim sebagai  inhibitor  kompetitif  yakni  residu His373,  His378  dan  His553  yang  berikatan secara  hidrofobik  pada  konformasi  bentuk U  enzim 33 .  Ligan  uji  yang  di  visualisasinya menghasilkan ligan terbaik yakni Nandrolone Phenylpropionate dan Sofalcone berikatan secara  hidrofobik  dengan  dua  residu  asam amino  yang  terikat  pada  sisi  aktif  enzim lipoksigenase yaitu His373 dan His378. Selain itu, Nandrolone Phenylpropionate berikatan
secara  hidrofobik  dengan  residu  Leu420, Ala416,  Leu374,  Ile412,  Leu419,  Leu415 dan Sofalcone berikatan  secara  hidrofobik dengan  residu  Phe438,  Leu420,  Ala416, Glu369,  Leu374,  Ile412,  Leu415,  Le419. Beberapa senyawa metabolit sekunder dapat menjadi analog asam arakidonat dan fenolat yang  berperan  untuk  menghambat  kinerja enzim lipoksigenase yang berikatan pada sisi aktifnya 7 .  Oleh  karena  itu,  kedua  senyawa aktif  ini  berpotensi  sebagai  inhibitor  enzim lipoksigenase.
4.4.  Dinamika Molekul Simulasi  MD  dilakukan  untuk memperkirakan  stabilitas  interaksi  antara reseptor  dengan  ligan  uji  dengan  kondisi lingkungan  yang  menyerupai  lingkungan fisiologis tubuh manusia 34 . Nilai RMSD dua ligan terbaik dari nandorolone propionate dan sofalcone memiliki rata-rata sebesar 1.267 Å dan  1,319  Å.  Nilai  tersebut  kurang  dari  2Å yang  menandakan  bahwa  mode  pengikatan reseptor dengan kedua ligan tersebut stabil 35 . Simulasi  dilakukan  selama  10ns  untuk melihat nilai RMSD backbone yang berfungsi sebagai  indikator  keseimbangan  pengikatan dengan tidak adanya perubahan konformasi. Hasil  ini  juga  menandakan  bahwa  ligan  uji Nandrolone Phenylpropionate dan Sofalcone bertindak  sebagain  ligan  kompetitif  yang berpotensi menstrabilkan secara keseluruhan stuktur protein.
Jari-jari girasi (RG) menentukkan pusat massa zat terlarut untuk menunjukkan besar volume  dan  kekompakkan  suatu  protein sehingga  menjadi  salah  satuan  penentu kestabilan  protein.  Semakin  tinggi  nilai  RG maka  konformasi  protein  semakin  fleksibel dengan  volume  protein  yang  longgar 36 . Kedua  ligan  memiliki  rentang  RG  yang tidak  jauh  antara  nilai  RG  terkecil  hingga terbedasar dengan rata-rata yakni Nandrolone Phenylpropionate dan Sofalcone sebesar 28.268 dan 28.341 Å. Hasil ini menunjukkan bahwa  protein  dalam  kondisi  stabil  dengan kompak  dengan  volume  sedikit  longgar. Nilai  Rg  yang  lebih  tinggi  menunjukkan pengepakan  yang  longgar  dari  struktur protein, yang berarti konformasi protein lebih
fleksibel 36 . Analisis SASA dilakukan untuk melihat stabilitas protein berdasarkan luas permukaan dan pola pengikatan atom yang terdapat pada permukaan untuk melakukan kontak dengan pelarut 37 .  Hasil  analisis  SASA  pada  kedua ligan memiliki hasil yang cukup stabil. Ligan Sofalcone memiliki  beberapa  perubahan nilai  pada  beberapa  ns  namun  masih  cukup stabil.  Ligan Nandrolone Phenylpropionate memiliki  grafik  yang  stabil  pada  tiap  ns. Hal  ini  menunjukkan  bahwa  kedua  ligan membentuk  kompleks  yang  lebih  kompak dengan tidak mengubah luas permukaannya. Selain  itu,  nilai  yang  SASA  yang  stabil menunjukkan  bahwa  volume  situs  aktif  dan hidrofobisitas  total  stabil  sehingga  dapat mempertahankan  interaksi  dengan  residu poket secara maksimal 34 . Interaksi  reseptor  dengan  ligan dipengaruhi  oleh  peran  residu  asam  amino yang  akan  mempengaruhi  kekakuan  dari seluruh  protein.  Analisis  peran  residu dilakukan  dengan  penilaian  RMSD  untuk menghitung  simpangan  rata-rata  dari  tiap residu  selama  simulasi 38 .  Analisis  RMSF menghasilkan  tren  terhadap  residu  asam amino  dengan  interpretasi  yakni  puncak menandakan  ligan  tidak  berikatan  dengan residu  sehingga  menjadi  tidak  kaku  dan lembah menunjukkan adanya interaksi ligan dengan  residu  sehingga  struktur  menjadi kaku 34 .Semakin  kecil  nilai  RMSF  maka semakin  baik  ikatan  antara  ligan  dengan residu  dengan  syarat  nilai  RMSF  dibawah 1.4  Å 38 .  Kedua  ligan  memiliki  nilai  RMSF terendah  pada  residu  HIS373  dan  HIS378 yang  merupakan  sisi  katalitik  dari  reseptor 4NRE sehingga kedua ligan ini menjadi ligan memiliki  kekuatan  penghambatan  terbaik secara kompetitif.
5.  Kesimpulan
Senyawa daun sirih merah yang mampu menghambat enzim lipoksigenase yakni ligan uji Nandrolone Phenylpropionate dari ekstrak etanol  dan Sofalcone dari  fraksi  air  yang telah  lolos  analisis  stabilitas  dan  prediksi toksisitas.  Ligan  uji  memiliki  energi  bebas pengikatan  sebesar  -10.4  kkal/mol  dan  -9.1
kkal/mol dengan nilai KI sebesar 0.0023 µM dan 0.021 µM. Kedua ligan berikatan dengan sisi aktif enzim 4NRE yakni pada residu asam amino His373 dan His378 secara hidrofobik. Struktur  protein  dengan  kedua  ligan  terbaik memberikan  hasil  yang  stabil  berdasarkan analisis dinamika molekul.

## Ucapan Terimakasih
Ucapan terima kasih diberikan kepada Indonesia  Collaborative  Research–WCU (World  Class  University)  Fiscal  Year  2020 Number: 1755/IT3.L1/PN/2020/IT3.L1/ PN/2020 atas nama Dr. Mega Safithri, S.Si, M.Si  yang  telah  mendanai  penelitian  ini, Rini  Kurniasih  S.Si,  M.Si  dan  Riyan Alifbi Putera Irsal, S.Si yang telah berperan dalam penulisan jurnal.

## Referensi
1.  [WHO]  World  Health  Organization. Noncommunicable  disease.  [diacu  2022 Maret  21].  Tersedia  dari:  https://www. who.int/news-room/fact-sheets/detail/ noncommunicable-diseases
2.  Yuslianti  ER.  Pengantar  radikal  bebas dan antioksidan. Yogyakarta: Deepublish.
2018 3.  Kementerian Kesehatan Republik Indonesia.  2013.  Situasi  kesehatan jantung  [internet].  [diunduh  2022  Maret 22].  Tersedia  dari  https://pusdatin. kemkes.go.id.
4.  Kementerian Kesehatan Republik
Indonesia. 2013. Tetap produktif, cegah, dan  atasi  diabetes  melitus  [internet]. [diunduh  2022  Maret  22].  Tersedia  dari https://pusdatin.kemkes.go.id.
5.  Fanelli  A,  Ghisi  D,  Aprile  PL,  Lapi  F. Cardiovascular  and  cerebrovascular  risk with  nonsteroidal  anti-inflammatory drugs  and  cyclooxygenase  2  inhibitors: latest evidence and clinical implications. Ther. Adv. Drug. Saf. 2017;8(6): 173-182.
6.  Lončarić  M,  Strelec  I,  Pavić  V,  Šubarić D,  Rastija  V,  Molnar  M.  Lipoxygenase inhibition activity of coumarin derivatives qsar  and  molecular  docking  study. Pharmaceuticals. 2020; 13(154): 1-19.
7.  Tomy  MJ,  Dileep  KV,  Prasanth  S,
Preethidan  DS,  Sabu  A,  Sadasivan C,  Haridas  M.  Cuminaldehyde  as  a lipoxygenase  inhibitor:in  vitro  and in  silico  validation.  Appl  Biochem Biotechnol. 2014; 174:388–397.
8.  Safithri  M,  Kurniawati  A,  Syaefudin. Formula of Piper crocatum, Cinnamomum burmanii, and Zingiber officinale extracts as  a  functional  beverage  for  diabetics. IFRJ. 2016; 23(3):1123-1130.
9.  Prayitno  SA,  Kusnadi  J,  Murtin  ES. Karakteristik (total flavonoid, total fenol, aktivitas antioksidan) ekstrak serbuk daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.). Foodscitech. 2018; 1(2): 26-34.
10. Afagnigni  AD,  Nyegue  MA,  Djova SV,  Etoa  FX.  LC-MS  analysis, 15-lipoxygenase  inhibition,  cytotoxicity, and  genotoxicity  of  dissotis  multiflora (Sm)  triana  (Melastomataceae)  and Paullinia  pinnata  linn  (Sapindaceae). Journal  of  Tropical  Medicine.2020; 2020:1-8.
11. Alaba  CSM,  Chichioco-Hernandez, CL.  15–Lipoxygenase  inhibition  of Commelina  benghalensis,  Tradescantia fluminensis, Tradescantia  zebrina. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. 2014; 4(3): 184–188.
12. Afifah  S,  Lukiati  B,  Maslikah  SI.  The potentials  of  red  betel  (Piper  crocatum Ruiz  &  Pav)  terpenoid  compounds  as Microsomal  Prostaglandin  E  Synthase-1 (mPGES-1)  enzyme  inhibitor  of rheumatoid  arthritis  through  virtual screening.  Proceedings  of  The  3rd International  Seminar  on  Metallurgy and  Materials  (ISMM2019):  Exploring New  Innovation  in  Metallurgy  and Materials; 22 April 2020; AIP Conference Proceedings 2231; 2020
13. Amalia A, Maslikah SI, Lestari SR. Virtual screening flavonoid compounds from red betel  (Piper  crocatum  Ruiz  &  Pav.)  as inhibitor  of  cyclooxygenase-2  (COX- 2). Proceedings of The 3rd International Seminar  on  Metallurgy  and  Materials (ISMM2019): Exploring New Innovation in  Metallurgy  and  Materials;  22  April 2020; AIP Conference Proceedings 2231;
2020 14. Anugrahwati  M,  Purwaningsih  T, Rustina,  Manggalarini  JA,  Alnavis  NB, Wulandari DN, Pranowo HD. Extraction of  ethanolic  extract  of  red  betel  leaves and  its  cytotoxicity  test  on  HeLa  cells. Procedia  Engineering.  2016;  148(2016): 1402-1407.
15. Wahjuni  S,  Sukadana  IM,  Arisanti LP.  Red  Piper  crocatum  leaves  extract ethanol lowering malondialdehyde (mda) and blood glucose level in hyperglycemic wistar  rat.  Jurnal  of  Global  Pharma Technology. 2017; 5(9):59-64.
16. Irawan  C,  Foliatini,  Hanafi.  GC-MS composition  of  leaf  extract  of  Piper  cf. arcuatum  blume  and  their  antioxidant activity  and  toxicity  studies.  Journal  of Pharmacognosy  and  Phytochemistry. 2015; 6(4): 461-468.
17. Ramadani  F.  Aktivitas  antioksidan, total  tanin  ekstrak  dan  fraksi  daun  sirih merah  (Piper  crocatum)  dan  identifikasi dengan LC-MS (skripsi). Bogor: Institut Pertanian Bogor; 2018
18. Wedasari IAI. Aktivitas ekstrak etanol dan fraksi daun sirih merah (Piper crocatum) dengan metode rancimat dan identifikasi dengan LC-MS (skripsi). Bogor: Institut Pertanian Bogor; 2018
19. Septiani R. Ekstrak dan fraksi daun sirih merah  (Piper  crocatum  Ruiz  &  Pav) sebagai  antioksidan  dengan  metode 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (skripsi).
Bogor: Institut Pertanian Bogor; 2017 20. Safithri  M,  Kurniawati  A,  Syaefudin. Formula of Piper crocatum, Cinnamomum burmanii, and Zingiber officinale extracts as  a  functional  beverage  for  diabetics. IFRJ. 2016;23(3): 1123-1130.
21. Venugopala  KN,  Govender  R,  Khedr MA,  Venugopala  R,  Aldhubiab  BE, Harsha  S,  Odhav  B.  2015.  Design, synthesis,  and  computational  studies  on dihydropyrimidine  scaffolds  as  potential lipoxygenase  inhibitors  and  cancer chemopreventive  agents.  Drug  Design, Development and Therapy. 9: 911–921 22. Wlodawer A, Minor W, Dauter Z, Jaskolski M.  2007.  Protein  crystallography  for
non-crystallographers,  or  how  to  get the  best  (but  not  more)  from  published macromolecular structures.
FEBS Journal. 275(1): 1–21. 23. Shivanuka C, Deepak
KS,
Venkataraghavan  R,  Pawan  T,  Sumitha
A,  Brindha  DP.  Molecular  docking, validation,  dynamics  simulations,  and pharmacokinetic  prediction  of  natural compounds  against  the  SARS-CoV-2 main-protease.  Journal  of  Biomolecular Structure and Dynamics.2020; 1:1–27.
24. Ramírez D, Caballero J. Is It Reliable to Take the Molecular Docking Top Scoring Position  as  the  Best  Solution  without Considering  Available  Structural  Data? Molecules. 2018; 23(5):1-17.
25. Benet  LZ,  Hosey  CM,  Ursu  O,  Oprea TIBDDCS. the Rule of 5 and Drug ability. Adv. Drug Deliv. Rev. 2016; 2016:1-10.
26. Ruswanto.  Molecular  docking  empat turunan  isonicotinnohydrazide  pada Mycobacterium  tuberculosis  enoyl-acyl carrier  protein  reductase  (InhA).  Jurnal Kesehatan  Bakti  Tunas  Husada.  2015; 13(1): 135-141.
27. Syahputra  G,  Ambarsari  L,  Sumaryada T.  Simulasi  docking  kurkumin  enol, bisdemetoksikurkumin  dan  analognya sebagai inhibitor enzim 12- lipoksigenase. J. Biofisika. 2014; 10(1): 55-67.
28. Halligudi N, Mullaicharam AR, Al-bahri HS. Molecular modification of ibuprofen using  in  silico  modeling  system.  Int. J.  Nutr.  Pharmacol.  Neurol.  Dis.  2022; 2(2):156-162.
29. Daddam  JR,  Sreenivasulu  B,  Peddanna K,  Umamahesh  K.  Designing,  docking and  molecular  dynamics  simulation studies of novel cloperastine analogues as anti-allergic agents: homology modeling and active site prediction for the human histamine  H1  receptor.  RSC  Advances. 2020; 10(8):4745–4754.
30. Dallakyan  S,  Olson AJ.  Small-molecule library screening by docking with PyRx. Methods  in  Molecular  Biology  (Clifton, N.J). 2015; 1263:243-250.
31. Ramsay  RR,  Tipton  KF.  Assessment of  enzyme  inhibition:  a  review  with
examples  from  the  development  of monoamine  oxidase  and  cholinesterase inhibitory drugs. Molecules. 2017; 22(7):
1-46.
32. Sun R, XU G, Dongyang G, Ding Q, Shi Y.  2021.  To  predict  anti-inflammatory and immunomodulatory targets of guizhi decoction  in  treating  asthma  based on  network  pharmacology,  molecular docking,  and  experimental  validation. Hindawi. 2021; 2021:1-17.
33. Kobe MJ, Neau DB, Mitchell CE, Bartlett SG,  Newcomer  ME.  The  structure  of human 15-lipoxygenase-2 with a substrate mimic. Journal of Biological Chemistry. 2014; 289(12): 8562–8569
34. Dutta M, Tareq AM, Rakib A, Mahmud S,  Sami  SA,  Mallick  J,  Islam  MN, Majumder M, Uddin MZ, Alsubaie A, et al. Phytochemicals from Leucas zeylanica targeting main protease of SARS-CoV-2: chemical  profiles,  molecular  docking, and  molecular  dynamics  simulations. Biology. 2021; 10(789): 1-19.
35. Liu  K,  Watanabe1  E,  Kokubo  H. Exploring the stability of ligand binding modes to proteins by molecular dynamics simulations.  J  Comput  Aided  Mol  Des. 2017; 31: 201-211.
36. Dash  R, Ali  MC,  Dash  N, Azad  MAK, Hosen  SMZ,  Hannan  MA,  Moon  IS. Structural and dynamic characterizations highlight the deleterious role of SULT1A1 R213H  polymorphism  in  substrate binding. Int. J. Mol. Sci. 2019; 20(6256):
1-22
37. Ali SA, Hassan MD, Islam A, Ahmad F. A review of methods available to estimate solvent-accessible surface areas of soluble proteins in the folded and unfolded states. Current  Protein  and  Peptide  Science. 2014; 15(3): 1-21.
38. Biswas S, Mahmud S, Mita MA, Afrose S,  Hasan  MR,  Shimu  MSS,  Saleh  MA, Mostafa-Hedeab G, Alqarni A, Obaidullah AJ et al. Molecular docking and dynamics studies  to  explore  effective  inhibitory peptides  against  the  spike  receptor binding  domain  of  SARS-CoV-2.  Front. Mol. Biosci. 2012; 8(791642): 1-10.