## OPTMALISASI ENZIM SELULASE KAPANG HASIL ISOLASI DARI LAHAN PERTANIAN DAERAH WUKIRSARI PASCA ERUPSI MERAPI

## THE OPTIMATION OF CELLULASE ENZYME OF MOLD ISOLATED FROM AGRICULTURE LAND IN WUKIRSARI AFTER MERAPI ERUPTION

## Siti Umniyatie*, Anna Rakhmawati dan Evy Yulianti
Jurusan Pendidikan Matematika, FMIPA, Universitas Negeri Yogyakarta
*email: s_umniyati@uny.ac.id
diterima 2 Desember 2014, disetujui 4 Maret 2015

## Abstrak
Penelitian ini bertujuan mengembangkan potensi kapang yang telah diisolasi pasca Erupsi Merapi 2010 dari lahan pertanian  Wukirsari,  Cangkringan,  Sleman,  Yogyakarta  Optimasi  suhu  dan  pH  terhadap  aktivitas  enzim  selulase  dan kadar  protein  yang  dihasilkan  oleh  kapang  isolat  A  2.10,  A  2.15  dan  B  3.18  dalam  jenis  substrat  avicel  dan CMC.Penelitian  ini  merupakan  penelitian  eksperimen,  yang  bertujuan  untuk  mengetahui  substrat  apa  dan  suhu  dan  pH berapa  yang  optimal  untuk  menghasilkan  aktivitas  dan  kadar  protein  dari  isolat  kapang  A  2.10,  A  2.15  dan  B  3.18. variable bebas dalam penelitian ini adalah pengaruh variasi substrat, suhu dan pH.Variabel tergayut adalah aktivitas enzim dan kadar protein yang dihasilkan oleh isolat A 2.10, A 2.15 dan B 3.18.Populasi penelitian adalah seluruh enzim kasar yang dihasilkan oleh isolat kapang A 2.10, A 2.15 dan B 3.18, sedangkan sampel penelitian ini menggunakan 1 ml enzim kasar yang diberikan perlakuan kombinasi jenis substrrat, suhu dan pH.Hasil menunjukkan bahwa substrat yang optimal untuk menghasilkan aktivitas enzim adalah substrat avicel dengan suhu 25 C pada pH 7 A 2.10 suhu 25 ⁰ C pH 7, isolat A 2.15 suhu 25 ⁰ C pH 9, dan isolat B 3.18 suhu 30 ⁰ C pH 7.Kadar protein tertinggi adalah yang dihasilkan oleh kapang  A 2.10 denagn suhu 25C pH 7, menyusul isolat B 3.18 dan A 2.15
Kata kunci: optimasi, enzim selulase, kapang selulolitik

## Abstract
The aim of this study was to develop potency of mold isolated from agriculture land after Merapi eruption in 2010 at  Wukirsari,  Cangkringan,  Sleman,  Yogyakaerta.  The  treatment  were  temperature  and  pH  optimation  to  the  cellulase enzyme activity and the protein level  yield by  mold isolate A 2.10, A 2.15 and B 3.18 in different substrate, avicel and carboxymethyl cellulose (CMC). This study was experimental study to find out the substrate, pH and temperature which yield the best activity and protein level from mold isolate A 2.10, A 2.15 dan B 3.18. the population of this study all of the crude enzymes from  mold isolate, and the sample was 1 ml of crude enzyme which treated with different substrate, pH and temperature. The result of this study showed that the best susbtrate was avicel and the optimum temeperature and pH for isolate A.2.10 was 25 ⁰ C
Keywords : optimation, cellulase enzyme, cellulolytic

## Pendahuluan
Penelitian  Siti  Umniyatie  &  Victoria Henuhili  [1]  berhasil  mengisolasi  25  isolat kapang  dari  lahan  pertanian  yang  terkena siraman  lahar  panas,  yaitu  di  daerah  Wukirsari, Cangkringan,  Sleman,  Yogyakarta.  Diantara  25 isolat tersebut berhasil diketahui 7 isolat kapang yang  bersifat  selulolitik  dan  8  isolat  kapang bersifat amilolitik.
Banyak  produk  industri  yang  dihasilkan oleh  mikroba  yang  aplikasinya  sangat  luas. Ditinjau  dari  produk  industri  yang  dihasilkan mikroba,  ada  beberapa  kelompok    yaitu  produk biokonversi (enzim), produk sel mikroba sebagai (pengendali  hayati,    untuk  inokulum  maupun sebagi sumber makanan), dan produk metabolit. Diantara  enzim  yang  dihasilkan  oleh  mikroba adalah    enzim  ekstraseluler  selulase,  yang
bersifat  merubah  sejenis  bahan  menjadi  bahan baru yang lain. Karena kemampuan inilah enzim ekstraseluler  banyak  digunakan  misalnya  dalam pengolahan  limbah  yang  mengandung  protein (protease),  industri  makanan  dan  minuman (amilase),  industri  kertas,  tekstil,  makanan  dan minuman.
Enzim ekstraseluler umumnya banyak dihasilkan oleh kapang. Enzim selulase merupakan  komplek  enzim  yaitu β -D-1,4 glukanase  sebagi  pengurai  selulosa  amorf, aviselase  sebagai  pengurai  selulosa  mikrokristal dan β -D-1,4  glukosidase  sebagai  pemotong oligosakharida  terutama  selobiosa  menjadi glukosa;  adanya  kemampuan  selulase  ini  maka selulase  dimanfatkkan  dalam  pembuatan  pakan kaya serat, pengolahan limbah sawit [2].
Isolat  penghasil  enzim  selulase  yang ditemukan  dilahan  pertanian  daerah  Wukirsari, Cangkringan,  Sleman  Yogyakarta,  sebanyak  7 isolat dan 3  isolat  diantaranya    memiliki kemampuan  selulolitik  yang  tinggi  yaitu  isolat A2.10  yang  diidentifikasi  sebagai  Genus Humicola.sp,  A2.15  yang  belum  teridentifikasi dan  B2.18  yaitu  genus  Acremonium.sp.  Utuk langkah  produksi  perlu  dilakukan  optimasi terlebih  dahulu  untuk  mencari  kondisi  optimal yang mendukung aktivitas maupun kadar protein yang  tinggi. Diantarakondisi  lingkungan  yang berpengaruh  terhadap  enzim  anatara  lain jenisdan konsentrasi substrat, oksigen, suhu, pH, dan  lama  inkubasi. Berdasarkan  permasalahan tersebut  penelitian  ini  bertujuan  untuk  1) mengetahui  substrat  apa  ,  suhu  dan  pH  berapa yang  optimal  untuk  menghasilkan  aktivitas enzim  tertinggi  pada  isolat  kapang  A  2.10,  A 2.15  dan  B  2.18  dan    2)  untuk  emngetahui substrat apa , suhu dan pH berapa yang optimal untuk menghasilkan protein tertinggi pada isolat kapang A 2.10, A 2.15 dan B 2.18.

## Metode Penelitian
Desain penelitian. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan objek penelitian adalah  enzim  selulase  ekstraseluler  yang dihasilkan oleh  kapang isolat A2.10, A2.15 dan B.318  pada  medium  yang  mengandung  CMC. Populasi  penelitian  adalah  enzim  selulase  yang diisolasi  dari  isolat  kapang  mesofilik  A  2.10,  A 2.15  dan  B  3.hasil  isolasi  dari  lahan  pertanian
Daerah Wukirsari, Cangkringan Sleman Yogyakarta. Sampel dalam penelitian ini adalah 1  ml  enzim  selulase  yang  berupa  ekstrak  kasar
protein  yang  diberi  perlakuan  kombinasi  suhu dan pH untuk memecah subtrat avicel dan CMC.
Alat dan  bahan.  Alat  yang  digunakan  pada penelitian  ini  antara  lain  adalah  tabung  reaksi, LAF,  petridish,  erlenmeyer,  ose,  mikropipet, autoklaf, lemari es, inkubator, spektrofotometer, water  bath,  shaker,  vortex,  hot  plate,  kompor. Bahan  yang  digunakan  antara  lain  adalah  isolat kapang  A  2.10,  A  2.5  dan  B  3.18, Mandels,0,05% ekstrak khamir, 0,075% pepton, 5  ml  NaCl-fisiologis,  Potato  Dextrose  Agar (PDA),  Potato  Dextrose  Broth  (PDB),    0,2% Na-asida,  CMC,  avisel  Sigmacell  20,  larutan baku  glukosa  konsentrasi  10,  20,  30,  40,  50 mg/L., pereaksi Nelson A dan Nelson B, es, 0,5 ml  pereaksi  arsenomolibdat,  akuades,    bovine serum  albumin  (BSA),  0.01  g  coomasie  brilian blue (CBB) G ‐ 250, 5 ml etanol 95% (v/v), 10 ml asam fosfor 85% (v/v), H 2 O steril.
Langkah-langkah penelitian yang dilakukan meliputi :
a. Peremajaan  isolat  kapang  A2.10,A2.15  dan B3.18.
Peremajaan isolat kapang A2.10,A2.15  dan B 3.18 dengan diinkubasi selama  48  jam  pada  suhu  32 ⁰ C  pada  media PDA.
b. Pembuatan  media    PDB  untuk  produksi enzim.  Pembuatan  media  PDB  1500  ml dengan  ditambah  chloramfenicol  10%,  dan komposisinya  adalah  dalam  1  liter  PDB adalah    CMC  0,5%,  KH2PO4  0,05%, K2SO4  :  005%/,  (NH4)2.SO4  :  0,05%, MgSO4+h2O : 001%, CaCl2 :0,1%/, NaCl : 0,6%  dan  Yeast  Ekstrak  :  0,01%.Media dibagi  kedalam  labu    erlemeyer  masing- masing  50 ml .
c. Pembuatan  larutan  spora  isolat  kapang A2.10,  A2.15  dan  B3.18.  Melarutkan  spora dalam  larutan  NaCl  fisologis  5  ml,  sampai diperoleh jumlah spora 10 ⁶
d. Produksi enzim selulase. Menyiapkan Media kultur  Mandels  CMC  0,5%  masing-masing sebanyak  300  ml  yang  ditambah  0,05% ekstrak  khamir  dan  0,075%  pepton  sebagai sumber karbon dan induser. Media kultur ini dibagi  ke  labu  erlenmeyer  masing-masing berisi  50  ml  dan  selanjutnya  diinokulasi dengan  larutan  spora  sebanyk  2  ml  untuk masing-masing erlenmeyer. Inkubasi dengan tekhnik kutur terendam menggunakan inkubator  goyang  pada  kecepatan  150  rpm pada  suhu  30 ⁰ C  selama  36 jam  untuk  isolat A  2.10,  60  jam  untuk  islat  A  2.15  dan  84 jam untuk isolat B 3.18
e. Pemisahan  enzim.  Kultur  yang  sudah diinkubasikan sesuai
waktunya, disentrifugasi  dengan  kecepatan  500  rpm selama  30  menit,  untuk  memperoleh superntan bebas sel, sentrifugasi dilakukan 2 kali.Ekstrak  enzim  kasar  disimpan  dalam freezer (-10 ⁰ C) sebelum digunakan.
Pembuatan media/substrat Avicel dan CMC
f. Penentuan aktivitas enzim. Penentuan aktivitas enzim kapang menggunakan buffer asetat pH 5, 7 dan 9 dan dengan suhu 30 ºC, 50  °C,  60  ºC.  Substrat  yang  digunakan  ada dua macam, yaitu CMC dan avisel. Aktivitas CMC-ase  dan  aviselase  ditentukan  menurut metode  HAGGETT  et  al.  (1979)  dengan modifikasi.  Satu  unit  aktivitas  enzim didefinisikan sebagai banyaknya enzim yang menghasilkan  1 μ mol  glukosa  per  menit, CMCase terhadap substrat CMC, sedangkan aviselase terhadap substrat Sigmacell 20.
g. Pembuatan  kurva  baku  larutan  glukosa. Sepuluh  tabung  reaksi  masing-masing  diisi dengan  larutan  baku  glukosa  0,5  mL  untuk konsentrasi 10, 20, 30, 40, 50 mg/L. Semua tabung  ditambah  dengan  0,5  mL  campuran pereaksi  Nelson  A  dan  Nelson  B  lalu dikocok dan dipanaskan dalam penangas air pada suhu 100 ºC selama 20 menit. Tabung didinginkan  dengan  es  selama  5  menit  lalu ke dalam masing-masing tabung ditambahkan 0,5 mL pereaksi
arsenomolibdat  dan  dikocok.  Setelah  itu diencerkan  hingga  5  mL  dengan  akuades dalam labu ukur. Selanjutnya diukur serapan masing-masing  konsentrasi  larutan  baku pada  panjang  gelombang  540  nm  Blanko yang digunakan diperlakukan seperti sampel tetapi  penambahan  0,5  mL  larutan  baku glukosa diganti dengan 0,5 mL akuades.
h. Penentuan  Kadar  Gula  Pereduksi  dengan Nelson-Somogyi.  Enzim  selulase  sebanyak 1 mL dan 1 mL larutan CMC 0,1 %, 0,2 %, 0,3 % (w/v) dan avisel 0,1 %, 0,2 %, 0,3 % (w/v)  dengan    pH  5,  7  dan  9  dimasukkan tabung,  diinkubasi  pada  suhu  40ºC,  50°C, 60ºC  dan  waktu  inkubasi  20  menit. Dipanaskan  pada  suhu  100ºC  dalam penangas  air  selama  10  menit,  untuk menghentikan  aktivitas  enzim,  didinginkan. Kemudian  ditambahkan  0,5  mL  campuran pereaksi  Nelson  A  dan  Nelson  B  dan dikocok  dengan  vortex.  Dipanaskan  selama 10  menit  pada  suhu  100ºC,  didinginkan selama  5  menit  dalam  es,  ditambahkan  0,5
mL  pereaksi  arsenomolibdat,  ditambah dengan  akuades  hingga  5  mL.  Kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm dengan spektrofotometer UV-Vis.  Blanko  yang  digunakan  untuk  uji gula  pereduksi  diperlakukan  sama  dengan sampel  tetapi  filtrat  enzim  dimatikan aktivitasnya dengan dipanaskan pada penangas air pada temperatur 100 ºC selama 15 menit sebelum dicampur dengan substrat.
i. Analisis  kadar  protein.  Penentuan  kadar protein  pada  enzim  selulase  bakteri  dan kapang  ditentukan  berdasarkan  metode BRADFORD  (1976).  Sebanyak  0,2  mL filtrat  enzim  ditambahkan  5  mL  pereaksi Bradford  dan  divorteks.  Absorbansinya diukur  pada  panjang  gelombang, λ =  595 nm.  Kadar  protein  ditentukan  dari  kurva standar  larutan  bovine  serum  albumin (BSA). Reagen Bradford dibuat dengan cara menimbang  0.01  g  coomasie  brilian  blue (CBB)  G ‐ 250  yang  kemudian  dilarutkan dalam  5  ml  etanol  95%  (v/v),  lalu ditambahkan  10  ml  asam  fosfor  85%  (v/v). Campuran  dihomogenkan  (dikocok  kuat) lalu  disaring  dengan  kertas  saring  dan disimpan  dalam  botol  gelap  dan  suhu rendah.  Stok  pereaksi  Bradford  harus diencerkan 5 kali sebelum digunakan.
j. Pembuatan  larutan  standar  protein.  Dibuat dengan  menimbang  0,01  g  BSA  (bovine serum  albumin)  yang  kemudian  dilarutkan dengan 10 ml H 2 O steril sehingga diperoleh larutan  stok  BSA  dengan  konsentrasi  1000 ppm.  Larutan  stok  dengan  konsentrasi  1000 ppm  diencerkan  dengan  melarutkan  0,5  ml larutan  stok  ditambahkan  4,5  ml  H 2 O  steril sehingga  diperoleh  larutan  stok  BSA  100 ppm.  Dari  larutan  stok  tersebut  dilakukan pengukuran terhadap standar protein terlarut dengan konsentrasi 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70,  80,  90  dan  100  ppm.  Kemudian dilakukan  pengukuran  terhadap  standar protein  dengan  menambahkan  0.1  ml  seri larutan  standar  dengan  5  ml  reagen Bradford. Kemudian larutan divortex dan di inkubasi  pada  suhu  ruang  selama  10 ‐ 60 menit.  Larutan  ini  memberikan  warna  biru dan  dibaca  pada  panjang  gelombang  595 nm.  Dengan  menggunakan  regresi  linear, akan  didapatkan  persamaan  matematik untuk larutan standar protein yang diperoleh dari  nilai  absorbansi  standar,  yang  akan
digunakan  pada  pengukuran  kadar  protein terlarut.
k. Pengukuran  protein  terlarut.  Pengukuran sampel dilakukan dengan cara menambahkan  0,1  ml  ekstrak  enzim  kasar dengan  5  ml  reagen  Bradford  divortex  dan diinkubasi  pada  suhu  ruang  selama  10 ‐ 60 menit.  Absorbansi  Larutan  sampel  protein dibaca  pada  panjang  gelombang  595  nm. Dengan  persamaan  matematik  dari  kurva standar  protein,  akan  didapatkan  kadar protein  terlarut  yang  terkandung  dalam larutan ekstrak enzim kasar.
l. Uji  aktivitas  enzim  selulase.  Uji  Aktivitas Selulase  Selulase  merupakan  enzim  yang bekerja  menghidrolisis  ikatan  glikosidik pada  selulosa  untuk  glukosa.  Aktivitas selulase  ditentukan  dalam  satuan  Unit  (U) yang  menyatakan  jumlah  produk  yang dihasilkan  (mol)  oleh  setiap  mL  enzim  per menit. Pengukuran aktivitas enzim dilakukan  dengan  mengkonversikan  nilai absorbansi  menjadi  konsentrasi  glukosa standar,  kemudian  dihitung  dengan  rumus berikut
Keterangan : v = volume total sampel percobaan pada setiap tabung (mL) p = jumlah enzim (mL) q = waktu inkubasi (menit) fp = faktor pengenceran

## Hasil dan Pembahasan
Aktivitas enzim untuk masing-masing isolat dimungkinkan  berbeda  satu  sama  lain.Dalam pemanfaatan  enzim  untuk  menghidrolisis  suatu substrat  memerlukan  langkah  optimasi  terhadap faktor-faktor  lingkungan  yang  berpengaruh, antara  lain  optimasi  penggunaan  substrat,  suhu, dan  pH  Dalam  penelitian  ini  digunakan  3  isolat yaitu  A  2.10,  A  2.15  dan  B  3.18    yang  akan dicari  aktivitas  optimalnya  pada  variasi  substrat yaitu avicel dan CMC  dengan  variasi suhu dan pH. Aktivitas enzim dari  isolat  yaitu A 2.10, A 2.15 dan B 3.18 ditunjukkan Gambar 1.
Aktivitas  enzim  yang  dihasilkan  oleh kapang  isolat  A  2.10,  di  substrat  avicel  lebih tinggi    dibanding  dengan  pada  substrat  CMC. Paling  tinggi  aktivitasnya  pada  substrat  avicel dengan perlakuan suhu dan pH 25 ⁰ C pH 7.
Gambar 1. Aktivitas enzim selulase kapang isolat A 2.10 pada media avicel dan CMC dalam variasi suhu dan pH
Gambar 2. Kadar gula reduksi hasil aktivitas selulase kapang isolat A 2.10,  pada media avicel dan CMC dalam variasi suhu dan pH
Gambar 3. Aktivitas enzim selulase kapang isolat A 2.15 pada media avicel dan CMC dalam variasi suhu dan pH
Jika  dicermati  pada  Gambar  2,  dapat dinyatakan  bahwa  kadar  gula  reduksi  yang merupakan indikator dari aktivitas enzim, pada isolat  A  2.10  paling  tinggi  pada substrat  avicel dengan    suhu  25 ⁰ C  pH  7,  sesuai  dengan tingginya  aktivitas  enzim  yang  juga  pada  suhu dan  pH  yang  sama.  Aktivitas  enzim  selulase isolat  kapang  A  2.15  dapat  digambarkan  pada grafik dibawah ini.
Agak  sedikit  berbeda  ativiatas  enzim selulase      isolat    kapang  A  2.15,  paling  tinggi pada  suhu  25 ⁰ C  pH  9  dalam  substart avicel.Sedangkan kadar gula reduksi dari isolat A  2.15  digambarkan  sebagai  berikut.  Kadar gula reduksi yang dihasilkan oleh isolat kapang A  2.15  tertinggi  pada  substrat  avicel juga  pada suhu  25 ⁰ C  dan  pH  9  seperti  ditunjukkan  pada Gambar  4.  Fakta  ini  sesuai  dengan  aktivitas
enzim  tertinggi  dari  isolat  A  2.15  juga  dicapai pada suhu 25 ⁰ C pH 9.
Aktivitas  enzim  selulase  yang  dihasilkan oleh  isolat  kapang  B  3.18,  digambarkan  pada Gambar  5.  Aktivitas  enzim  selulase  yang dihasilkan  oleh  isolat  kapang  B  3.18,  tertinggi pada  substart  avicel  suhu  30 ⁰ C  pH  7.  Pada rentang  suhu  25 ⁰ C-  35  C  pH  7    aktivitas selulase pada substrat avicel rata-rata juga lebih
tinggi  dibanding  pada  substrat  CMC.  Aktivitas paling  rendah  secara  rata-rata  pada  rentang suhu 25 ⁰ C-35 ⁰ C pH 5 baik pada substrat avicel maupun  CMC.  Aktivitas  enzim  selulase  isolat kapang  B  3.18  pada  media  avicel  dibuktikan juga  dengan  tingginya  gula  reduksi  pada  suhu 30 ⁰ C pH 7, seperti pada Gambar 6.
Gambar 4 .Kadar gula reduksi  hasil aktivitas isolat kapan A 2.15, pada substrat  avicel dan CMC dalam variasi suhu dan pH
Gambar 5. Aktivitas enzim selulase kapang isolat B 3.18 pada subtrat avicel dan CMC dalam variasi suhu dan pH
Gambar 6. Kadar gula reduksi hasil aktivitas  kapang isolat B 3.18 pada subtrat avicel dan CMC dalam variasi suhu dan pH
Dari  data-data  di  atas  tentang  aktivitas enzim  selulase  dan  kadar protein  masing-masing isolat,  menunjukkan  bahwa  aktivitas  enzim selulase  yang  dihasilkan  oleh  kapang  isolat  A 2.10  ,  A  2.15  dan  B  3.18  paling  tinggi  pada substrat  avicel  dibanding  pada  substrat  CMC, walaupun  suhu  dan  pH  yang  mempengaruhinya nampak bervariasi yaitu untuk isolat A 2.10 suhu 25 ⁰ C pH 7, isolat A 2.15 suhu 25 ⁰ C pH 9, dan isolat  B  3.18  suhu  30 ⁰ C  pH  7.  Untuk  isolat  A 2.10  dan  B  3.18  cenderung  membutuhkan lingkungan asam dan isolat A 2.15 membutuhkan lingkungan basa.
Untuk mengetahui kwalitas  produksi enzim ekstraseluler  dari  suatu  mikroorganisme,  bisa diketahui  dari  jumlah  protein  yang  terdapat dalam  media  tumbuhnya.  Kadar  protein  kasar
yang dihasilkan oleh kapang isolat A 2.10 paling tinggi  pada  suhu  25 ⁰ C  pH  7  dengan  kadar  0,18 mg/ml  dalam  substrat  avicel,  yang  lebih  tinggi jika  dibandingkan  dengan  protein  pada  media CMC.  Secara  keseluruhan  pada  rentang  suhu 25 ⁰ C  -35 ⁰ C  pH  7  rata-rata  kadar  protein  kasar yang dihasilkan  oleh kapang isolat A 2.10, lebih tinggi  pada  substrat  avicel  dibanding  CMC. Namun  pada  substrat  CMC  sedikit  lebih  tinggi pkadar proteinnya yaitu pada rentang suhu 25 ⁰ C - 35 ⁰ C  pada  pH  5,  jika  dibandingkan  dengan substrat avicel, . Gambaran tentang kadar protein yang  dihasilkan  oleh  isolat  A  2.10  ditunjukkan pada Gambar 7.
Gambar 7. Kadar protein yang dihasilkan oleh kapang isoat A 2.10 pada berbagai variasi suhu dan pH.
Gambar 8. Kadar protein yang dihasilkan oleh kapang isoat A 2.15 pada berbagai variasi suhu dan pH
Pada  pH  9  rentang  suhu  25 ⁰ C  -35 ⁰ C  juga tidak  menunjukkan  kadar  protein  yang  lebih tinggi  dibanding  pada  pH  7.Sedangkan  kadar protein  dari  isolat  kapang  A  2.18  memiliki gambaran  yang  agak  berbeda jika  dibandingkan dengan  isolat  yang  lain,  seperti  dituangkan
dalam  Gambar  8  yang  menunjukkan  bahwa kadar protein yang paling tinggi yang dihasilkan oleh kapang isolat A 2.15 pada suh 25 ⁰ C pH 9 atau  cenderung  pada  pH    basa.Nampak  pada substrat CMC rentang suhu 25 ⁰ C-35 ⁰ dengan pH 9  sangat  tidak  cocok  bagi  isoat  A  2.15.  Pada
semua  perlakuan  suhu  maupun  pH  dibawahnya nampak  menurun  kadar  proteinnya  baik  pada substrat avicel maupun CMC.
Kapang  isolat  B  3.18  menunjukkan  hasil kadar protein sebagaimna tertuang pada Gambar 9.    Kadar  protein  yang  dihasilkan  oleh  kapang isolat  B  3.18  nampak  mencolok  perbedaannya pada  pengaruh  substrat,  suhu  dan  pH.Kadar protein  paling  tinggi  yang  dihasilkanadalah dalam    substrat  avicel,  dengan  suhu  30 ⁰ C  pH  7 sebesar 0,13475 mg/ml, dan pada suhu dibawah atau  diatasnya  pada  pH  7  rata-rata  masih dihasilkan kadar protein yang tinggi. Lingkungan  yang  paling  tidak  cocok  adalah rentang suhu 25 ⁰ C-35 ⁰ C pH 5.
Hasil  analisis  kadar  protein  tertinggi  dari kapang  isolat  A  2.10,  A  2.15  dan  isolat  B  3.18 masing-masing  adalah  bahwa  untuk  isolat  A 2.10  25 ⁰ C pH 7 sebesar 0,18025 mg/ml , isolat A 2.15 suhu 25 ⁰ C pH 9 sebesar 0,11975 mg/ml dan  isolat  B  3.18  pada  suhu  30 ⁰ C  pH  7 diperoleh  kadar  protein  0,13475  mg/ml,    yang kesemuanya  dalam  substrat  avicel.  Jika  dilihat lingkungannya  yaitu  semua  isolat  menghasilkan protein  tertinggi  pada  suhu  yang  sama  yaitu  25 ⁰ C  namun  pH  berbeda.  Dengan  demikian, produksi  enzim  selulase  menggunakan    kapang isolat  A  2.10,  A  2.15  dan  isoat  B  3.18  lebih produktif  pada  asubstrat  avicel  dengan  suhu  25 ⁰ C  dibanding  dengan  CMC,  namun  perlu
memperhatikan  kebutuhan  pH  lingkungannya yang  nampak  spesifik  pada  masing-masing isolat.  Dari  fakta  ini    nampak  bahwa  pH merupakan  faktor  yang  berpengaruh  terhadap kadar  protein    enzim  disamping  faktor  substrat. Isolat A 2.15 dan B 3.18 nampak ada kesamaan didalam  kebutuhan  suhu    lingkungannya  untuk menghasilkan protein yang tinggi yaitu pada pH basa,  namun  kebutuhan  suhunya  seluruh  isolat pada rentang mesofilik.
Analisis  data  di  atas  menunjukkan  bahwa rata-rata  kebutuhan  substrat    isolat  kapang  A 2.10,  A  2.15  dan  B  3.18  baik  untuk menghasilkan aktivitas enzim , gula reduksi dan kadar protein yang tinggi lebih sesuai menggunakan substrat avicel, walaupun masing- masing isolat memerlukan kondisi  suhu dan pH yang bervariasi. Isolat A 2.10 suhu 25 ⁰ C pH 7, isolat A 2.15 suhu 25 ⁰ C pH 9, dan isolat B 3.18 suhu  30 ⁰ C  pH  7.  Karena  ke  3  kapang  ini diisolasi  dari  lingkungan  yang  bersuhu  mesofil maka enzim yang dihasilkan umumnya aktivitas optimalnya    pada  suhu  mesofil.Untuk  isolat  A 2.10  dan  B  3.18  cenderung  membutuhkan lingkungan asam dan isolat A 2.15
membutuhkan lingkungan basa.
Gambar 9. Kadar protein yang dihasilkan oleh kapang isoat A 2.15 pada berbagai variasi suhu dan pH
Menurut [4],  degradasi  selulosa  pada  keadaan asam terutama oleh fungi sedangkan netral sampai alkali  banyak  mikroba  aktif  terutama  bakteri  dan aktinomisetes.  pH  optimum  selulase  4,2-5,2  [5]. Enzim selulase yang diproduksi oleh kapang stabil pada pH 5,0-6,0 [2]
Substrat  avicel  memberikan  hasil  aktivitas yang  tinggi  dibuktikan  dengan  hasil  kadar  gula reduksinya  yang  tinggi  pula,  sebagai  hasil hidrolisinya.  Pada  substrat  CMC  aktivitasnya cenderung    rendah  terutama  pada  suhu  dan  pH yang  optimum  untuk  substrat  avicel    Hal  ini mungkin  disebabkan  oleh  adanya  kemampuan enzim exoglukanase yang bekerja pada rantai akhir reduksi  atau  non  reduksi  menjadi  glukosa  atau selobiosa  dan  dapat  beraksi  juga  pada  selulosa mikrokristal, dan aktivitas enzim
β - glucosidaseyang menghidrolisis allodekstrin terlarut  dan  selobiosa  menjadi  glukosa,  dan  pada sustrat CMC lebih rendah aktivitasnya karenaadanya  aktivitas  enzim  endoglukanase  yang bekerja  pada  selulosa  amorf  seperti  CMC    Hal  ini didukung  oleh  pendapat  Sadhu,  S  &  T.K.  Maiti (2013:  238)  yang  mengemukakan  bahwa  enzim selulase  merupakan  suatu  sistem  enzim  yang diklasifikasikan berdasarkan aksi katalitiknya yaitu endoglukanase (Endo-1,4 β -D-Glucan Glucanohydrolase)  aktif  mendegradasi  selulosa amorf seperti CMC dan selooligosakarida;
eksoglukanase (1,4 – β -D-Glucan selobiohydrolase)  aktif  mendegradasi  selulosa kristalin  seperti  avicel  tetapi  inaktif  terhadap selulosa amorf; β -glucosidase; selobiose; cellodextrin fosforylase; cellobiose epimerase.
Hasil  analisis  kadar  protein  tertinggi  dari kapang  isolat  A  2.10,  A  2.15  dan  isolat  B  3.18 masing-masing  adalah  untuk  isolat  A  2.10    25 ⁰ C pH  7  sebesar  0,18025  mg/ml  ,  isolat  A  2.15  suhu 25 ⁰ C  pH  9  sebesar  0,11975  mg/ml  dan  isolat  B 3.18 pada suhu 20 ⁰ C pH 7 diperoleh kadar protein 0,13475  mg/ml,    yang  kesemuanya  dalam  substrat avicel  dengan  suhu  rata-rata  25 ⁰ C,  dan  pH bervariasi.Isolat kapang yang menghasilkan protein tertinggi  diantara  islata  kapang  yang  lain,  adalah isoat A 2.10 dengan didukung suhu 25 ⁰ C pH7.
Jumlah  protein  yang  tinggi  nampaknya berhubungan  dengan  aktivitasnya  yang  tinggi. Fakta ini ditunjukkan pada isolat A 2.10 yang hasil protein  tertnggi  pada  suhu  25 ⁰ C  pH  7,    aktivitas tertingginya  juga  pada  25 ⁰ C  pH  7.Isolat  A  2.15 dan Isolat B 3.18 juga menunjukkan kecenderungan yang sama. Sehingga aktivitas yang tinggi  dapat  disebabkan  oleh  kadar  protein  yang
tinggi,  dan    filtrat  protein  kasar  dimungkinakan terdiri  dari enzim selulase,

## Simpulan
Aktivitas enzim selulase masing-masing isolat berbeda satu sama lain yaitu untuk isolat kapang A 2.10 suhu 25 ⁰ C pH 7, isolat A 2.15 suhu 25 ⁰ C pH 9, dan isolat B 3.18 suhu 30 ⁰ C pH 7, yang kesemua isolat  optimal    pada  substrat  avicel  dengan  suhu 25 ⁰ C  namun  kebutuhan  pH  untuk  mendukung aktivitas  enzim  lebih    bervariasi  tergantung  pada isolatnya.
Isolat  yang  menghasilkan  kadar    protein tertinggi adalah isolat A 2.10 denagn suhu 25C pH 7, menyusul isolat B 3.18 dan A 2.15. A 2.10, dan untuk  masing-masing  isolat  adalah  A  2.10    25 ⁰ C pH  7  sebesar  0,18025  mg/ml  ,  isolat  A  2.15  suhu 25 ⁰ C  pH  9  sebesar  0,11975  mg/ml  dan  isolat  B 3.18 pada suhu 30 ⁰ C pH 7 diperoleh kadar protein 0,13475 mg/ml.

## Ucapan Terima Kasih
Terimaksih  diucapkan  kepada  FMIPA  yang memberikan  dana    dan  kesempatan  untuk mendukung  terlaksananya  penelitian  ini.  Ucapan terimakasih juga diucapkan untuk Jurusan Pendidikan Biologi FMIPA yang telah memberikan fasilitas ruang dan alat-alat laboratorium

## Pustaka
[1]  Umniyatie,  S  dan  V.  Henuhili.  (2013) Diversitas  fungi  saprofit  pada  tanah  pertanian di Wukirsari Cangkringan Sleman Yogyakarta. Laporan penelitian
[2]  Kansoh,  A.M.,  S.A  Essam,  and    A.N.  Zaenat. (1999)  Biodegradation  and  utilization  of baggase  with  Trichoderma  reesei.  Polymer Degradation and Stability. 63 (2): 273-278
[3]  Sadhu,  S  and  T.K.  Maiti.  (2013)  Cellulase Production  by  Bacteria:  A  Review.  British Microbiology Research Journal 3 (3): 235-258
[4]  Kabirun. (1990) Biodegradasi limbah berselulosa:  kursus  singkat  ekologi  mikrobia. PAU Bioteknologi UGM. Yogyakarta
[5]  WBC (Worthington Biochemical Corporation). (2009). Cellulase. http://www.worthington diakses tgl 1 Juni 2009, pkl 10.21 WIB