## Indonesian Journal of Pharmaceutical Science and Technology
Journal Homepage : http://jurnal.unpad.ac.id/ijpst/
UNPAD

## Molecular Docking Study of Anthocyanidin Compounds Against Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) as Anti-Lung Cancer
Riska Prasetiawati 1,2 , Meilia Suherman 1* , Benny Permana 3 , Rahmawati 1
1 Departemen Kimia Farmasi Analisis, Jurusan Farmasi, Fakultas MIPA, Universitas Garut, Garut - Indonesia.
2 Departemen Analisis Farmasi dan Kimia Medisinal, Fakultas Farmasi, Universitas Padjadjaran, Sumedang - Indonesia
3 Departemen Fisikokimia, Fakultas Farmasi, Institut Teknologi Bandung, Bandung - Indonesia Submitted 17 July 2020; Revised 23 August 2020; Accepted 20 October 2020; Published 05 February 2021 *Corresponding author: meilia.suherman@uniga.ac.id

## Abstract
It is presumed that antiproliferative activity of anthocyanidin has interaction with Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) which has effect on lung cancer cell growth. This study aimed to observe the interaction between anthocyanidin and EGFR and to find out prediction, absorption, distribution activities as well as anthocyanidin toxicity compared to Gefitinib, an EGFR inhibitor. All test compounds were optimized with Autodock Tools®, then molecular docking simulations and predictions of absorption, distribution and toxicity were carried out. Malvidin was stated to meet the Lipinski's Rule of Five, indicating good bioavailability. Result of molecular docking simulation showed that malvidin had better affinity against EGFR than Gefitinib. Molecular docking visualization result showed that malvidin had interaction with amino acid residue such as Met793, Gln791, Leu718, Thr854, Asp855 and Lys745. Absorption and distribution predictions included percentage scores of Human Intestinal Absorption (HIA), human colon adenocarcinoma (Caco-2), and Plasma Protein Binding. Toxicity test revealed that malvidin was mutagenic compound but not carcinogenic one. The findings indicated that malvidin was potential to be an anti lung cancer candidate through EGFR inhibition.
Keywords: Antiproliferative, Anthocyanidin, Epidermal Growth Factor Receptor, Molecular Docking

## Studi Molecular Docking Senyawa Antosianidin Terhadap Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) Sebagai Anti Kanker Paru

## Abstrak
Aktivitas antiproliferatif antosianidin diduga memiliki interaksi dengan Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) yang berperaruh terhadap pertumbuhan sel kanker paru (1,2). Tujuan penelitian ini adalah untuk melihat interaksi antosianidin terhadap EGFR dan mendapatkan prediksi aktivitas, absorpsi, distribusi serta toksisitas senyawa antosianidin dibanding Gefitinib, suatu inhibitor EGFR. Semua senyawa uji dioptimasi dengan Autodock Tools® kemudian dilakukan simulasi molecular docking serta prediksi absorpsi, distribusi dan toksisitasnya. Dari 19 senyawa antosianidin yang di dockingkan, maldivin menunjukan potensi sebagai senyawa pemandu untuk antikanker. Malvidin dinyatakan memenuhi aturan Lipinski’s Rule of Five yang berarti memiliki bioavailabilitas yang baik. Hasil simulasi molecular docking menunjukkan bahwa senyawa malvidin memiliki afinitas yang lebih baik terhadap EGFR dibandingkan dengan senyawa Gefitinib. Hasil visualisasi menunjukkan bahwa senyawa malvidin memiliki interaksi dengan residu asam amino Met793, Gln791, Leu718, Thr854, Asp855 dan Lys745. Prediksi absorpsi dan distribusi meliputi nilai persentase Human Intestinal Absorption (HIA), human colon adenocarcinoma (Caco-2), dan Protein Plasma Binding. Pengujian toksisitas menunjukkan bahwa senyawa malvidin bersifat mutagenik namun tidak karsinogenik. Hasil yang didapat menunjukkan bahwa senyawa malvidin memiliki potensi untuk dijadikan kandidat anti kanker paru melalui inhibisi EGFR.
Kata Kunci: Antiproliperasi, Antosianidin, Epidermal Growth Factor Receptor, Penambatan Molekul

## 1.  Pendahuluan
Kanker paru adalah penyebab utama kematian terkait kanker di AS dan di seluruh dunia, baik pada pria dan wanita, dengan perkiraan 1,3 juta total kematian setiap tahun. 1,2 Secara nasional prevalensi penyakit kanker pada penduduk semua umur di Indonesia tahun 2013 sebesar 1,4% atau diperkirakan sekitar 347.792 orang. Data Pusat Kanker Nasional Dharmais di Indonesia juga menunjukkan bahwa kanker paru adalah salah satu dari tiga kanker teratas di tahun 2010-2013. 3 Berbagai macam jenis terapi serta obat-obatan untuk penyakit kanker sudah banyak diaplikasikan untuk meningkatkan kualitas hidup pasien. Terapi penyakit kanker dapat berupa kemoterapi, radioterapi, terapi hormon, maupun terapi target. Pasien kanker wajib untuk secara rutin dan teratur mengkonsumsi obat-obatan yang telah diresepkan oleh dokter untuk tercapainya tujuan terapi kanker tersebut, namun obat- obatan dengan bahan kimia memiliki banyak efek samping yang merugikan. Saat ini penggunaan obat-obatan dari alam menjadi alternatif bahan pengobatan penyakit kanker untuk menekan efek samping yang timbul dari penggunaan obat-obatan berbahan dasar kimia yang sudah ada sebelumnya. 4–6 Antosianin merupakan bagian metabolit sekunder yang tersebar luas di  alam  yang  dikenal  sebagai  flavonoid. Antosianidin ialah aglikon antosianin yang terbentuk dari hidrolisis asam. Antosianin adalah golongan flavonoid yang larut dalam air dengan berbagai efek farmakologis, seperti pencegahan penyakit kardiovaskular, pengendalian obesitas dan aktivitas antitumor, antioksidan dan antiproliferatif. 7,8 Antosianin adalah  flavonoid  yang  paling  teroksidasi dengan cincin C sepenuhnya tidak jenuh dan hidroksil pada posisi 3. Mereka juga dapat ditemukan sebagai bentuk turunan glikosilasi dari polihidroksi dan turunan polimetoksi dari 2-fenilbenzopirilium, diasilasi atau tidak dengan asam alifatik. 9 Pengujian secara in vitro , menunjukkan bahwa senyawa antosianidin berpotensi sebagai antikanker. Adanya potensi antiproliferatif dari fraksi antosianin yang berasal dari ekstrak blueberry
dan blackcurrant ditemukan terkait dengan adanya potensi antioksidannya. Hal ini juga diperkuat dengan telah dianalisisnya aktivitas antiproliferatif yang signifikan oleh ekstrak Syzigium cumini dengan kandungan 5 diglukosida senyawa antosianidin terhadap sel kanker paru manusia A549. 7,9
EGFR adalah protein reseptor tirosin kinase reseptor transmembran yang terdapat pada epitel normal, mesenchymal, dan jaringan neurogenik. Ekspresi EGFR yang berlebihan telah dilaporkan dan terlibat dalam patogenesis kanker NSCLC ( Non Small Cell Lung Cancer ). 1,10 Gefitinib adalah tyrosine kinase inhibitor dari EGFR. Gefitinib merupakan lini pertama untuk pasien dengan kanker paru non-sel kecil lanjut yang dipilih berdasarkan mutasi EGFR. 11 Keberhasilan pengobatan NSCLC bermutasi EGFR dengan erlotinib atau gefitinib diikuti dalam sebagian besar kasus dengan memperoleh resistensi terhadap masing-masing tyrosine kinase inhibitor (TKI), yang bahkan menyebabkan mutasi sekunder T790M. 12–15
Studi penambatan molekul ( molecular docking ) adalah suatu proses komputasi mencari ligan yang cocok secara geometris dan energi ke situs pengikatan protein ini. Metode ini merupakan salah satu metode yang digunakan untuk meniru peristiwa interaksi suatu molekul ligan dengan protein yang menjadi targetnya pada uji in vitro melalui simulasi model menggunakan komputer. Penambatan molekul sering digunakan untuk memprediksi orientasi ikatan kandidat obat bermolekul kecil terhadap target proteinnya untuk  memprediksi  afinitas  dan  aktivitas molekul kecil. Maka penambatan molekul memainkan peran penting dalam penemuan obat dan desain obat secara rasional. Tujuan utama dari simulasi penambatan molekul adalah untuk mengidentifikasi kandidat lead compound . 16
Tujuan penelitian ini adalah untuk mencari kandidat obat kanker dari antosianidin yang memiliki aktivitas sebagai antikanker dengan berinteraksi dengan Reseptor Epidermal Growth Factor (EGFR). Pada penelitian ini dilakukan simulasi penambatan molekul senyawa antosianidin
terhadap EGFR, serta prediksi awal absorpsi, distribusi dan toksisitasnya, sebagai rangkaian pencarian kandidat obat anti kanker paru dengan  obat  golongan  Gefitinib  sebagai kontrol positif.

## 2.  Metode
2.1.  Alat Perangkat Keras yang digunakan yaitu laptop HP dengan spesifikasi Processor Intel® Core i3™ 6006U @2.0GHz, RAM (Random Acces Memory) 4 gigabyte. Graphic Card Intel®, Sistem Operasi Microsoft® Windows 10® (Amerika).
Perangkat Lunak yang digunakan yaitu Sistem Operasi Windows® 10 64-bit, x64 based processor, dilengkapi dengan program MGL-Tools® terdiri dari aplikasi Autodock Tools® (The Scripps Research Institute, Amerika) dan Python Moleculer Viewer® (PMV), Discovery Studio Visualizer®, Open Babel®, Marvin Sketch® (ChemAxon), Command Prompt, Notepad++® serta situs Protein Data Bank, PubChem dan Pre- ADMET.
2.2.  Bahan Struktur tiga dimensi protein yang dipilih adalah EGFR bermutasi (L858R, T790M, V948R) pada manusia yang didapat dari  metode  kristalografi  X-ray  dengan resolusi 1,46Å. Identitas makromolekul tersebut adalah 5UG8 berformat (.pdb). Struktur tiga dimensi ligan yang digunakan  adalah  Gefitinib  dan  19  senyawa antosianidin, baik yang diunduh pada situs PubChem dengan format (.sdf) dan dibuat pada program Marvin Sketch®.
2.3.  Prosedur Rinci
2.3.1. Persiapan Reseptor Kompleks protein 5UG8 dipisahkan antara  makromolekul  dan  ligan  Gefitinib dengan menggunakan program Discovery Studio Visualizer®, kemudian dilakukan optimasi dengan penambahan atom hidrogen dan minimisasi energi. Hasil pemisahan tersebut disimpan dalam format .pdb.
2.3.2. Penyiapan Senyawa Uji
Ligan atau Senyawa yang diuji dalam penelitian ini merupakan senyawa antosianidin. Ke 19 senyawa antosianidin merupakan senyawa turunan antosianin (Tabel 1). Ligan digambar ulang dengan menggunakan program ChemDraw® Ultra 12.0 dan diminimasi energi menggunakan program Chem3D® Pro 12.0 kemudian disimpan dengan format .pdb. Setelah dilakukan penyiapan, dilakukan penentuan sifat  fisikokimia  senyawa  berdasarkan Lipinski’s Rule of Five .
2.3.3. Validasi Metode
Validasi metode dilakukan untuk mengetahui apakah program yang digunakan untuk penambatan molekul sesuai persyaratan atau tidak aplikasi dapat digunakan. Validasi metode molecular docking dilakukan dengan cara redocking antara ligan bawaan yaitu N-[(3R,4R)-4-fluoro-1-{6-[(1-methyl-1H- pyrazol-4-yl)amino]-9-(propan-2-yl)-9H- purin-2-yl}pyrrolidin-3-yl]propanamide dari reseptor target yang diunduh (5UG8) dari situs bank data protein menggunakan perangkat lunak Autodock Tools® dengan makromolekul EGFR. Analisis yang digunakan untuk mengevaluasi hasil validasi yaitu nilai RMSD, situs pengikatan yang ditemukan dan parameter yang digunakan dianggap valid jika nilai RMSD ≤ 2Å.

## 2.3.4. Mengatur Grid Box
Pengaturan Grid Box dilakukan dengan membuka menu Grid pada Autodock Tools®.
2.3.5. Running Docking Setelah semua pengaturan docking selesai kemudian dilakukan running terhadap 19  senyawa antosianidin dengan menggunakan Autogrid4 dan Autodock4. Proses docking dilakukan dengan menggunakan pengaturan terhadap beberapa parameter seperti grid box (x = 40 y = 40 z = 40), Spacing (0,375 Å), grid box center (x = -13,156 y = 15,093 z = -25,719), number of runs (100), Number of Evals : Medium, dan Metode Algoritma : Lamarckian Genetic Algorithm yang dapat dilakukan secara langsung melalui program Autodock Tools®. Setelah running selesai
akan dihasilkan output dengan format .dlg yang dapat dibuka dengan bantuan program Notepad++®, kemudian dilihat parameter yang  dihasilkan  berupa  (∆G  dan  Cluster) dan membandingkan hasil yang didapat satu dengan yang lainnya.
2.3.6. Pengujian Pre-ADMET Pengujian yang dilakukan bertujuan untuk menganalisa parameter awal farmakokinetika yang meliputi absorpsi dan distribusi serta uji toksisitas yang meliputi sifat mutagenik dan karsinogenik senyawa. Pengujian dilakukan dengan menggunakan program khusus yang dilakukan dengan menggunakan program khusus yang dilakukan secara online pada situs http:// preadme.bmdrc.kr/. Struktur senyawa uji digambar dan kemudian diklik submit untuk dianalisa. Hasil yang didapat berupa data disimpan dalam format .pdb.
3.  Hasil Pengujian  parameter  fisikokimia  yang ditentukan sesuai dengan Lipinski’s Rules of Five menunjukkan bahwa semua senyawa
antosianidin memenuhi persyaratan Lipinski’s Rules of Five untuk bobot molekul dan log P, namun terdapat terdapat tiga senyawa yang memiliki jumlah donor dan ikatan hidrogen yang lebih dari 5, yaitu senyawa uji 6-hydroxycyanidin, delphinidin, dan 6-hydroxydelphinidin (Tabel 2). Berdasarkan optimasi ligan alami 5UG8 dengan EGFR (proses redocking) didapatkan grid box dengan koordinat x = -13,156, y = 15,093, dan z = -25,719 dengan RMSD 1,150 Å, sehingga sistem operasi dapat digunakan untuk menambatkan senyawa uji. Dari hasil docking ke 19 senyawa antosianidin (Tabel 3), diperoleh 1 senyawa yang memiliki energi ikatan yang lebih baik dari ligan uji (Gefitinib dengan ΔG  -7,08kkal/ mol dan Ki 584,15nM), yaitu malvidin dengan ΔG  −9,83kkal/mol  dan  Ki  62,25nM,  Selain itu pula senyawa uji malvidin memiliki lebih banyak ikatan hidrogen, yaitu pada Met793, Gln791, Leu718, Thr854, Asp855 dan Lys745. Selain itu pula untuk pengujian pre- ADME, nilai ketiga parameter dari senyawa malvidin memberikan gambaran prediksi parameter absorpsi dan distribusi yang baik

## Tabel 1. Senyawa antosianidin 22
No Antosianidin Struktur Molekul Pola Substituen 3 5 6 7 3’ 5’ 1 Pelargonidin OH OH H OH H H 2 Sianidin OH OH H OH OH H 3 Peonidin OH OH H OH OMe H 4 Delfinidin OH OH H OH OH OH 5 Petunidin OH OH H OH OMe OH 6 Malvidin OH OH H OH OMe OMe 7 Aurantinidin OH OH OH OH H H 8 6-Hidroksisianidin OH OH OH OH OH H 9 6-Hidroksidelfinidin OH OH OH OH OH OH 10 Apigeninidin H OH H OH H H 11 Luteolinidin H OH H OH OH H 12 Tricetinidin H OH H OH OH OH 13 5-Metilsianidin OH OMe H OH OH H 14 Rosinidin OH OH H OMe OMe H 15 Pulchellidin OH OMe H OH OH OH 16 Europinidin OH OMe H OH OMe OH 17 Capensinidin OH OMe H OH OMe OMe 18 Hirsutidin OH OH H OMe OMe OMe 19 Riccionidin A OH H OH OH H H
No Nama Senyawa Struktur Kimia Rumus Struktur Berat Molekul (g/mol) Log P Jumlah Donor Ikatan Hidrogen Jumlah Akseptor Ikatan Hidrogen 1 Sianidin C 15 H 11 O 6 +
287,247 2,61 5 5 2 Delfinidin C 15 H 11 O 7 + 303,246 2,33 6 6 3 Malvidin C 17 H 15 O 7 + 331,3 2,39 4 6 4 Pelargonidin C 15 H 11 O 5 + 271,248 2,90 4 4 5 Peonidin C 16 H 13 O 6 + 301,274 2,64 4 5 6 Petunidin C 16 H 13 O 7 + 317,273 3,11 5 6 7 Aurantinidin C 15 H 11 O 6 + 287,247 2,61 5 5 8 6-hidroksisianidin C 15 H 11 O 7 + 303,246 2,33 6 6 9 6-hidroksidelfinidin C 15 H 11 O 8 + 319,246 2,04 7 7 10 Apigeninidin C 15 H 11 O 4 + 255,249 3,16 3 3

## Tabel 2. Sifat fisikokimia senyawa antosianidin
dengan nilai HIA sebesar 83,1034%; Caco- 2 sebesar 1,7590nm.sec -1 ; dan PPB sebesar 94,9441% (Tabel 4). Dan dari hasil pengujian toksisitas (Tabel 5), maldivin memiliki sifat mutagen namun tidak karsinogen.

## 4.  Pembahasan
4.1.  Preparasi Struktur Tiga Dimensi Makromolekul EGFR dan Ligan
Struktur tiga dimensi EGFR diunduh dari Protein Data Bank pada situs http://
No Nama Senyawa Struktur Kimia Rumus Struktur Berat Molekul (g/mol) Log P Jumlah Donor Ikatan Hidrogen Jumlah Akseptor Ikatan Hidrogen 11 Luteolinidin C 15 H 11 O 4 + 255,249 3,16 3 3 12 Tricetinidin C 15 H 11 O 5 + 271,248 2,90 4 4 13 5-metilsianidin C 15 H 11 O 6+ 287,247 2,61 5 5 14 Rosinidin C 16 H 13 O 6 + 301,224 2,64 4 6 15 Pulchellidin C 17 H 15 O 6 + 315,301 2,67 3 5 16 Europinidin C 16 H 13 O 7 + 317,273 2,36 5 6 17 Capensinidin C 17 H 15 O 7 + 331,3 2,39 4 6 18 Hirsutidin C 18 H 17 O 7 + 345,327 2,42 3 6 19 Ricciniodin A C 15 H 9 O 6 + 285,231 2,67 4 5
No Ligan ΔG (kkal/mol) Konstanta Inhibisi (nM) Jumlah Ikatan Hidrogen Residu Asam Amino 1 Gefitinib -7,08 584,15 2 Met793, Ser 720 2 Sianidin -9,35 140,16 6 Met793, Gln791, Thr854, Asp855, Lys745 3 Delfinidin -9,59 94,10 8 Met793   (2), Leu718 (2), Gln791, Thr854 4 Malvidin -9,83 62,25 6 Met793, Gln791, Leu718 Thr854, Asp855, Lys745 5 Pelargonidin -9,27 108,23 6 Met793, Gln791, Leu718 Thr854, Asp855, Lys745 6 Peonidin -9,48 112,81 6 Met793, Gln791, Leu718 Thr854, Asp855, Lys745 7 Petunidin -9,71 76,53 6 Met793, Gln791, Leu718 Thr854, Asp855, Lys745 8 Aurantinidin -8,64 461,93 5 Met793, Gln791, Leu718, Thr854 (2) 9 6-hidroksisianidin -8,63 469,45 5 Met793, Gln791, Leu718, Thr854 (2) 10 6-hidroksidelfinidin -7,42 3.640 6 Met793, Leu718, Gln791, Cys797, Asp800 (2) 11 Apigeninidin -8,86 319,02 5 Gln791, Leu718, Thr854, Asp855, Lys745 12 Luteolinidin -9,02 242,45 5 Met793, Thr854, Asp855, Lys745, Gln791 13 Tricetinidin -9,05 230,54 7 Met793, Gln791,Thr854, Asp855, Lys745, Leu718(2) 14 5-metilsianidin -8,56 535,66 5 Gln791, Lys745, Leu718, Thr854 (2) 15 Rosinidin -7,92 1.560 5 Met793 (2), Gln791, Cys797, Asp800 16 Pulchellidin -7,62 2.600 6 Met793, Cys797, Leu718, Gln791, Asp800 (2) 17 Europinidin -9,12 207,09 6 Met793, Thr854, Asp855, Lys745, Leu718 (2) 18 Capensinidin -9,03 241,09 5 Met793, Leu718, Thr854, Asp855, Lys745 19 Hirsutidin -7,90 1.630 5 Met793(2), Gln791, Cys797, Asp800 20 Ricciniodin A -7,73 2.140 3 Met793, Thr854, Lys745
www.rcsb.org. Makromolekul protein yang dipilih adalah EGFR bermutasi (L858R, T790M, V948R) pada manusia yang didapat dari  metode  kristalografi  X-ray  dengan resolusi 1,46 Å. Makromolekul ini dipilih untuk melihat kemampuan penghambatan senyawa uji terhadap EFGR bermutasi yang menjadi penyebab kanker paru. Identitas makromolekul tersebut adalah 5UG8 berformat (.pdb). Makromolekul dengan kode 5UG8 ini dipilih karena memiliki nilai resolusi yang paling baik dan memiliki nilai validasi ( re-docking ) yang baik pula (<2Å). Struktur tiga dimensi ligan yang digunakan adalah Gefitinib dan 19 senyawa antosianidin, baik yang diunduh pada situs PubChem dengan format (.sdf) dan dibuat pada Marvin
Sketch® (ChemAxon). Ke-19 senyawa antosianidin yang dipilih merupakan senyawa turunan antosianin (Tabel 1).
4.2.  Lipinski’s Rule of Five Parameter fisikokimia yang ditentukan sesuai dengan Lipinski’s Rules of Five terkait kemampuan permeabilitas untuk difusi pasif, antara lain lipofilisitas (C Log P) kurang dari 5, jumlah donor ikatan hidrogen kurang dari 5, jumlah akseptor ikatan hidrogen kurang dari 10, dan bobot molekul (BM) yang kurang dari 500 g/mol. 17 Semua senyawa antosianidin memenuhi persyaratan Lipinski’s Rules of Five untuk bobot molekul dan log P, namun terdapat terdapat tiga senyawa yang memiliki jumlah donor dan ikatan
Tabel 3. Hasil penambatan molekul senyawa gefitinib dan antosianidin
hidrogen yang lebih dari 5, yaitu senyawa uji 6-hydroxycyanidin, delphinidin, dan 6-hydroxydelphinidin. Jumlah donor ikatan hidrogen mendeskripsikan semakin tinggi kapasitas ikatan hidrogen, maka semakin tinggi energi yang dibutuhkan agar proses absorpsi dapat terjadi. 17 Sehingga ke-3 senyawa antosianidin tersebut menunjukan sifat absopsi yang kurang baik.
4.3.  Molecular Docking dengan AutoDock Proses penambatan molekul dilakukan dengan menggunakan aplikasi AutoDock Tools. Parameter hasil penambatan molekul dapat dilihat dari nilai energi bebas Gibbs atau  energi  ikatan  (ΔG)  dan  konstanta
inhibisi (KI). Semakin rendah nilai energi ikatannya,  maka ikatan kompleks senyawa dengan reseptor akan semakin kuat karena terjadi kestabilan dan kekuatan interaksi non-kovalen pada senyawa dengan reseptor. Tahapan pertama yang dilakukan adalah proses validasi dengan melakukan re -docking antara ligan standar dan makromolekul. Hasil re- docking makromolekul EGFR dan  ligan  alaminya  N-[(3R,4R)-4fluoro-1- {6-[(1-methyl-1H-pyrazol-4-yl)amino]-9- (propan-2-yl)-9H-purin-2-yl}pyrrolidin- 3-yl]propanamida yang sebelumnya telah dioptimasi dengan aplikasi Autodock Tools® (The Scripps Research Institute, Amerika) kemudian di dockingkan kembali.
No Ligan Caco-2 (nm.sec -1 ) HIA (%) Protein Plasma Binding (%) 1 Ligan alami 5UG8 22,1465 93,3514 20,0030 2 Gefitinib 48,1068 96,6375 79,9981 3 Sianidin 0,6532 72,5057 100 4 Delfinidin 0,3754 54,2244 100 5 Malvidin 1,7590 83,1034 94,9441 6 Pelargonidin 1,2937 83,5832 100 7 Peonidin 1,6510 83,4343 100 8 Petunidin 0,9684 71,3174 100 9 Aurantinidin 0,6527 72,4918 100 10 6-hidroksisianidin 0,3754 54,2071 100 11 6-hidroxidelfinidin 0,2692 32,0734 100 12 Apigeninidin 1,0145 89,7256 100 13 Luteolinidin 0,6829 83,5778 100 14 Tricetinidin 0,4325 72,4977 100 15 5-metilsianidin 1,6511 83,4334 98,4563 16 Rosinidin 2,1245 90,1303 87,7842 17 Pulchellidin 0,9685 71,3159 100 18 Europinidin 1,7591 83,1024 89,7021 19 Capensinidin 2,9877 90,2363 75,2381 20 Hirsutidin 2,3472 90,2336 80,6339 21 Ricciniodin A 2,3417 87,1771 94,0949

## Tabel 4. Hasil uji pre-ADME senyawa ligan alami 5UG8, gefitinib dan antosianidin
Klasifikasi: In Vitro Caco-2 cell permeability (nm sec-1) :   > 70 higher permeability (a),
4-70 medium permeability (b), <4 low permeability (c) % human intestinal absorption (% HIA) : 70-100% well absorbed (a),
20-70% moderately absorbed (b),
0-20% poorly absorbed (c);
% plasma protein binding: > 90% strongly bound (a), <90% weakly bound (b).
No Ligan Mutagenik Karsinogenik 1 Ligan alami 5UG8 Non-mutagen Negatif 2 Gefitinib Mutagen Positif 3 Sianidin Mutagen Negatif 4 Delfinidin Mutagen Negatif 5 Malvidin Mutagen Negatif 6 Pelargonidin Mutagen Negatif 7 Peonidin Mutagen Negatif 8 Petunidin Mutagen Negatif 9 Aurantinidin Mutagen Negatif 10 6-hidroksisianidin Mutagen Negatif 11 6-hidroxidelfinidin Mutagen Negatif 12 Apigeninidin Mutagen Negatif 13 Luteolinidin Mutagen Negatif 14 Tricetinidin Mutagen Negatif 15 5-metilsianidin Mutagen Negatif 16 Rosinidin Mutagen Negatif 17 Pulchellidin Mutagen Negatif 18 Europinidin Mutagen Negatif 19 Capensinidin Mutagen Negatif 20 Hirsutidin Mutagen Negatif 21 Ricciniodin A
Mutagen
Negatif
Tabel 5. Hasil uji pre-ADME senyawa ligan alami 5UG8, gefitinib dan antosianidin
Berdasarkan hasil validasi didapatkan posisi x = -13,156  y = 15,093 z = -25,719 dengan RMSD  1,150  Å,  dan  nilai  ΔG  −8,60  kkal/ mol konstanta inhibisi 495,16 nM. Visualisasi hasil re- docking dapat dilihat pada Gambar 1. Dari hasil re- docking didapatkan nilai RMSD sebesar 1,150 Å yang artinya reseptor tersebut memenuhi syarat karena nilai hasil RMSD < 2Å dan dapat digunakan untuk menambatkan senyawa uji. Kemudian dilanjutkan simulasi penambatan molekul dilakukan dengan aplikasi yang sama, menggunakan 19 senyawa antosianidin  dan  Gefitinib  sebagai  ligan terhadap EGFR secara oriented docking .  Dari 19 senyawa antosianidin yang ditambatkan diperoleh bahwa senyawa terbaik adalah malvidin  dengan ΔG  −9,83kkal/mol  dan  Ki 62,25nM, bahkan lebih baik dibandingkan Gefitinib    yang  merupakan  kontrol  positif (ΔG    -7,08kkal/mol;  Ki  584,15nM).  Hal  ini menunjukkan bahwa EGFR akan memiliki ikatan yang lebih stabil dengan senyawa malvidin dibandingkan Gefitinib (Tabel 3).
Adapun visualisasi hasil re- docking
ligan alami 5UG8 dengan EGFR diamati dengan bantuan Discovery Studio Visualizer®. Telah dilakukan analisis ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik yang terbentuk antara ligan alami dengan EGFR. Berdasarkan hasil optimasi, jumlah ikatan hidrogen yang terjadi antara ligan alami dengan EGFR adalah 2 ikatan hidrogen yang melibatkan 1 asam amino yaitu Met793. Selain ikatan hidrogen terdapat juga interaksi hidrofobik yang melibatkan Ser720, Phe723, Phe856, Arg841, Cys797, Asn842, Gly796, Pro794, Leu792, dan Thr854. Berdasarkan hasil analisis ikatan hidrogen senyawa uji dengan EGFR, menunjukkan bahwa beberapa senyawa uji memiliki ikatan pada residu asam amino yang sama dengan ligan alami dan Gefitinib pada reseptor. Senyawa uji yang berikatan pada residu asam amino yang sama dengan ligan alami memiliki kemungkinan adanya aktivitas biologi yang sama dengan ligan alami. Ikatan hidrogen yang terbentuk pada interaksi EGFR dan ligan alaminya

## melibatkan residu asam amino Met793.
Senyawa pembanding Gefitinib juga terlibat dengan residu asam amino Met793, namun juga pada Ser720. Met793 merupakan suatu residu asam amino yang terlibat dalam interaksi inhibitor EGFR pada EGFR. 11,12,15,18
Senyawa uji malvidin memiliki lebih banyak ikatan hidrogen, yaitu pada Met793, Gln791, Leu718, Thr854, Asp855 dan Lys745 (Gambar 1b, 1c). Senyawa uji malvidin memiliki ikatan hidrogen pada residu yang sama seperti ligan alami 5UG8 dan Gefitinib, yaitu Met793 (Gambar 1d). Hal ini kemudian menunjukkan afinitas yang lebih baik, karena ikatan hidrogen yang lebih banyak dan prediksi  aktifitas  biologi  yang  sama  seperti ligan  alami  5UG8  dan  Gefitinib  sebagai inhibitor EGFR. Literatur juga menyebutkan bahwa adanya ikatan yang terjadi dan mengisi  daerah  lipofilik  antara  Met790  dan Lys745 memberikan selektifitas dan stabilitas ikatan. 12 Salah satu inhibitor EGFR juga memiliki interaksi ikatan hidrogen terhadap Met793 dan Gln791, pada EGFR dengan double mutan G719S/T790M menunjukkan adanya ikatan hidrogen terhadap Asp855 dan Lys745. 14
Selain ikatan hidrogen terdapat pula interaksi hidrofobik. Interaksi hidrofobik merupakan interaksi residu dari asam amino yang bersifat non-polar. Binding site ATP dari EGFR sebagian besar dikelilingi oleh residu  lipofilik,  dan  semakin  meningkat lipofilisitasnya  pada  EGFR  dengan  mutasi T790M. 12 Malvidin memiliki interaksi hidrofobik dengan residu asam amino Leu792, Gly719, Gly796 dan Phe856. Senyawa  Gefitinib  dan  malvidin  hanya memiliki interaksi hidrofobik pada dua residu asam amino yang sama yaitu Leu792 dan Gly796. Sementara ligan alami 5UG8 memiliki interaksi hidrofobik yang sama dengan senyawa malvidin yaitu pada Leu792, Gly796 dan Phe856. Analisis interaksi hidrofobik ini semakin menguatkan bahwa senyawa malvidin menempati active binding site seperti Gefitinib dan ligan alami 5UG8.
Interaksi ikatan yang terjadi salah satunya dipengaruhi oleh jarak ikatan yang terjadi. Interaksi yang lemah hanya mungkin terjadi jika permukaan molekul berada pada jarak yang dekat dan saling komplementer, oleh karena itu kekuatan ikatan sangat tergantung pada jarak. Dapat diamati bahwa
Gambar 1. 1a. Tumpang tindih ligan alami sebelum dan sesudah optimasi. 1b. Side active pocket EGFR yang ditempati Malvidin. 1c. Interaksi Malvidin dengan EGFR. 1d. Interaksi Gefitinib dan EGFR. 1e. Jarak ikatan Malvidin terhadap EGFR
a. b. c. d. e.
jarak ikatan yang terbentuk dari interaksi ikatan hidrogen dari senyawa malvidin terhadap EGFR memiliki nilai kurang dari 3Å (Gambar 1e). Hal ini menunjukkan bahwa ikatan yang terbentuk antara senyawa malvidin dan EGFR adalah ikatan yang kuat.
4.4.  Absorpsi, Distribusi, dan Toksisitas Parameter absorbsi, distribusi dan toksisitas diukur dengan bantuan program yang diakses secara online melalui situs https://preadmet.bmdrc.kr/adme/. Struktur kimia dari senyawa digambar dan di-submit pada situs tersebut, kemudian program akan secara otomatis menghitung nilai prediksi. Parameter yang dipilih, yaitu: permeabilitas sel human colon adenocarcinoma (Caco- 2), Human Intestinal Absorption (HIA) dan Plasma Protein Binding (PPB). Prediksi absorpsi obat dikaji berdasarkan kemampuan obat terabsorpsi pada usus ( Human Intestinal Absorption ) dan kemampuan permeabilitas pada sel Caco-2. HIA merupakan penjumlahan dari bioavailabilitas dan absorbsi yang dievaluasi dari rasio eksresi melalui urin, empedu, dan feses. Sebagian besar senyawa antosianidin memiliki persentase HIA yang berada pada rentang diabsorbsi dengan baik yaitu pada rentang 70-100%, kecuali senyawa Cyanidin, Delphinidin, dan 5-methyldelphinidin.
Sel Caco-2 merupakan model in vitro untuk mengetahui transport obat melalui epitel intestinal yang berasal dari adenocarcinoma kolon manusia yang memiliki jalur transportasi ganda. 19 Nilai Caco-2 tertinggi dimiliki oleh senyawa malvidin dan europinidin, yaitu pada 1,7590 dan 1,7591nm. sec -1 . Data menunjukkan bahwa permeabilitas antosianidin untuk dapat melewati epitel testinal masih cukup kecil dan hal ini dapat mempengaruhi bioavaibilitas nya dalam darah,  sehingga  diperlukan  modifikasi  baik secara farmasetik ataupun modifikasi struktur untuk meningkatkan sifat permeabilitas dari senyawa-senyawa antosianin tersebut. Parameter distribusi yang diprediksi berdasarkan keterikatan pada protein plasma. Protein Plasma Binding (PPB) merupakan fraksi obat yang tersedia dalam bentuk bebas
untuk didistribusikan ke berbagai jaringan. Ikatan terhadap protein plasma digambarkan melalui persentase pada rentang dari 0-100% yang menunjukkan kekuatan ikatan. Ikatan obat yang bersifat irreversible dapat terjadi akibat ikatan kimia yang kuat seperti ikatan kovalen yang dapat menyebabkan munculnya toksisitas obat tertentu baik yang muncul dalam jangka waktu panjang ataupun pendek. Secara umum obat-obat berikatan secara reversible yang terjadi akibat ikatan kimia yang lemah seperti ikatan hidrogen dan Van der Waals. 20 Sebagian besar nilai PPB antosianidin berkisar pada rentang 90- 100% yang menunjukkan ikatan yang kuat. Senyawa malvidin memiliki nilai PPB sebesar 94,9441%.
Prediksi toksisitas melalui situs yang sama, dengan metode Tes Ames, metode sederhana untuk menguji sifat senyawa berupa sifat mutagenik dan karsinogen sebagai Frameshift Mutagen. Hasil prediksi berupa data menunjukkan bahwa semua senyawa antosianidin bersifat mutagenik namun bukan karsinogenik. Respon  mutagenik pada senyawa mutagen tergantung dari struktur kimia  senyawa  mutagen. 21 Untuk itulah diperlukan penelitian lanjutan untuk menghilangkan sifat mutagenik tersebut dengan  memodifikasi  struktur  kimia  yang bersifat mutagen pada senyawa-senyawa antosianidin.
5.  Simpulan Dari hasil pengujian terhadap 19 senyawa antosianidin, malvidin menunjukkan afinitas terbaik dari semua antosianidin yang diujikan, dengan interaksi berupa jumlah ikatan yang lebih banyak, serta pada residu Met793 yang berperan dalam aktivasi EGFR. Afinitas  dan  interaksi  malvidin  bahkan lebih  baik  dibandingkan  Gefitinib.  Prediksi absorpsi, distribusi dan toksisitas melalui Caco-2, HIA, PPB menunjukkan potensi malvidin sebagai kandidat lead compound untuk antikanker paru, hanya saja untuk tes toksisitas menunjukan sifat mutagenik namun tidak karsinogen, sehingga diperlukan modifikasi lebih lanjut untuk menghilangkan sifat mutagen dari malvidin.

## Daftar Pustaka
1. Liu TC, Jin X, Wang Y, Wang K.. Role of epidermal growth factor receptor in lung cancer and targeted therapies. Am J Cancer Res 2017;7(2):187-202
2.  Aqil F, Jeyabalan J, Kausar H, Munagala R, Singh IP, Gupta R. Lung cancer inhibitory activity of dietary berries and berry polyphenolics. J Berry Res. 2016;6(2):105–14.
3.  RI PD dan IKK. Situasi Penyakit Kanker [Internet]. Jakarta; 2015. Available from: https://pusdatin.kemkes.go.id/article/ view/15090700004/situasi-penyakit- kanker.html
4.  Pucci C, Martinelli C, and Ciofani G. Innovative approaches for cancer treatment: current perspectives and new challenges. Ecancermedicalscience. 2019; 13: 961.
5.  Falzone L, Salomone S, Libra M. Evolution of cancer pharmacological treatments at the turn of the third millennium. Front Pharmacol. 2018;9(11):1300.
6.  Aqil F, Gupta A, Munagala R, Jeyabalan J, Kausar H, Sharma RJ, et al. Antioxidant and antiproliferative activities of anthocyanin/ellagitannin- enriched extracts from Syzygium cumini L. (Jamun, the Indian Blackberry). Nutr Cancer. 2012;64(3):428–38.
7.  Schirrmacher V. From chemotherapy to biological therapy: A review of novel concepts  to  reduce  the  side  effects  of systemic cancer treatment (Review). Int J Oncol. 2019;54(2):407–19.
8. Lin  BW,  Gong  CC,  Song  HF,  Cui  YY. Effects of anthocyanins on the prevention and treatment of cancer. Br J Pharmacol. 2017;174(11):1226–43.
9. Diaconeasa  Z,  Leopold  L,  Rugină  D, Ayvaz H, Socaciu C. Antiproliferative and antioxidant properties of anthocyanin rich extracts from blueberry and blackcurrant juice. Int J Mol Sci. 2015;16(2):2352–65.
10. Zhu SJ, Zhao P, Yang J, Ma R, Yan XE, Yang  SY,  et  al.  Structural  insights  into drug development strategy targeting EGFR T790M/C797S. Oncotarget. 2018;9(17):13652–65.
11. Nurwidya F, Takahashi F, Takahashi K.
Gefitinib in the treatment of nonsmall cell lung cancer with activating epidermal growth factor receptor mutation. J Nat Sci Biol Med. 2016;7(2):119-123.
12. Heald R, Bowman KK, Bryan MC, Burdick D, Chan B, Chan E, et al. Correction to Noncovalent Mutant Selective Epidermal Growth Factor Receptor Inhibitors: A Lead Optimization Case Study. J Med Chem. 2016;59(6):2848–2848.
13. Kong LL, Ma R, Yao MY, Yan XE, Zhu SJ, Zhao P, et al. Structural pharmacological studies on EGFR T790M/C797S. Biochem Biophys Res Commun. 2017;488(2):266–72.
14. Yoshikawa S, Kukimoto-Niino M, Parker L, Handa N, Terada T, Fujimoto T, et al. Structural basis for the altered drug sensitivities of non-small cell lung cancer- associated mutants of human epidermal growth factor receptor. Oncogene. 2013;32(1):27–38.
15. Metro G and Crinò L. Advances on EGFR mutation for lung cancer. Transl Lung Cancer Res. 2012 Mar; 1(1): 5–13.
16. Agarwal S, Mehrotra R. An overview of Molecular Docking. JSM Chem. 2016;4(2):1024.
17. Schneider G. Prediction of Drug-Like Properties. In: Madame Curie Bioscience Database [Internet]. Austin (TX): Landes Bioscience; 2000-2013. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/ NBK6404/
18. Gajiwala KS, Feng J, Ferre R, Ryan K, Brodsky O, Weinrich S, et al. Insights into the aberrant activity of mutant EGFR kinase domain and drug recognition. Structure. 2013;21(2):209–19.
19. Nursamsiar, Toding AT, Awaluddin A. Studi In Silico Senyawa Turunan Analog Kalkon dan Pirimidin sebagai
Antiinflamasi:
Prediksi Absorpsi,
Distribusi, dan Toksisitas. Pharmacy. 2016;13(1):92–100.
20. Shargel  L,  Yu  ABC.  Applied Biopharmaceutics and Pharmacokinetics 7th  Edition.  New  York  :  McGraw  Hill, 2016;. 273 p.
21. Hsu  KH,  Su  BH,  Tu  YS,  Lin  OA,  and Tseng  YJ.  Mutagenicity  in  a  Molecule: Identification of Core Structural Features of  Mutagenicity  Using  a  Scaffold Analysis. PLoS One. 2016; 11(2). 22. Andersen OM, Jordheim M. Anthocyanins. Encyclopedia of live science (ELS). 2010;(10). https://doi. org/10.1002/9780470015902.a0001909.
pub2