## Aktivitas Proteolitik Lactobacillus acidophilus dalam Fermentasi Susu Sapi
(Proteolitic  Activity  of Lactobacillus  acidophilus  in

## Fermentation of Dairy Cow Milk)

## Wendry Setiyadi Putranto
Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran Bandung

## Abstrak
Lactobacillus  acidophilus memiliki kemampuan  mengekskresikan  ekstraseluler protease. Tujuan p enel itia n d ari  p en elitia n i ni ad ala h untuk  mengetahui  aktivitas  proteolitik dari L. acidophilus. Enzim protease telah dimurnikan dengan sentrifugasi, pengendapan 45% ammonium sulfat, dan kromatographi. Hasil penelitian menunjukkan Protease Lactobacillus acidophilus memiliki  aktivitas  spesifik  0,752 U/mg  (ekstrak  kasar),  1,24  U/mg (pengendapan dengan 45% ammonium sulfate) and 1,15  U/mg (Gel Filtration). Protein enzim yang diperoleh sebesar 12,6% ekstrak kasar protease. Kata kunci: aktivitas proteolitik, pemurnian, L. acidophilus

## Abstract
Lactobacillus  acidophilus is  able  to  produce extracelluler  protease, the  aim  of this research was to find  out its proteolytic  activity.  The enzyme was  purified  using centrifugation,  45%  ammonium  sulfate  precipitation, chromatography column using Sephadex G-l00. The  result shows    that Lactobacillus  acidophilus protease has  specific activity was 0,752 U/mg (crude extract), 1,24 U/mg (purified using 45% ammonium sulfate precipitation)  and  1,15  U/mg (Gel  Filtration).  The purification  yield 12,6% extracelluler protease from crude extract.
Keywords: proteolytic activity, purification, L. acidophilus

## Pendahuluan
Protease  merupakan  enzim  yang  mampu menghidrolisis ikatan peptida pada protein. Berdasarkan Nomenclature Comitte of The International  Union  of Biochemistry, protease digolongkan dalam  enzim hidrolase (EC.3.4). Berdasarkan  letak  pemecahan  peptida  protease dapat dibedakan atas dua bagian, yaitu eksopeptidase  dan  endopeptidase.  Eksopeptidase memotong ikatan peptida pada terminal amino atau karboksil  dari  substrat,  sedangkan  endopeptidase memotong bagian tengah dari ikatan peptida.
Beberapa  penghasil  protease  komersial antara  lain  genus Bacillus  (B. cereus,  B.  pumilus, B. subtilis, B. licheniformis, B. stearothermophilus, dan B. polymixa). Kelompok bakteri lain adalah Aeromonas, Lactobacillus, Pseudomonas, Serratia, Streptomyces, dan Staphylococcus. Fungi  juga  menghasilkan  protease yaitu dari genus Acremonium, Aspergillus, Candida, Sacharomyces,  Fusarium,  Mucor,  Jan Rhizopus ( Rao dkk,1998)
Bak - teri asam  laktat  memiliki  kemampuan menghasilkan  enzim  proteolitik  di sekitar  dinding sel, membran sitoplasma, atau di dalam sel (Thomas dkk,  1987). Lactobacillus  acidophilus selama proses  fermentasi  selain  memanfaatkan  peptida
atau  asam  amino  bebas  untuk  pertumbuhannya, bakteri tersebut  juga  mampu menghidrolisis  kasein dengan  menggunakan protease  yang  diekskresikan di sekitar  permukaan  dinding  selnya  (Thomas dkk,1987).
Enzim  proteolitik  yang  dihasilkan  dari Lactobacillus  bulgaricus telah diisolasi  dan dimurnikan  menggunakan  kromatografi  DEAE- cellulose dan Sephadex  G-150,  diperoleh  enzim murni  dan  setelah  diseparasikan  dengan  SDS-- PAGE  menunjukan  satu pita  protein  dengan  berat molekul  98.000  Dalton. Enzim tersebut  memiliki aktivitas  optimum  pada  pH  6  dan  suhu  40°C, spesifisitas terhadap  substrat  L-lysyl-4-nitroanilide, aktivitasnya  dihambat oleh  EDTA  dan 1,10- phenanthroline,  dan  diaktifkan  oleh  kofaktor logam  Ca 2+ . Aminopeptidase (proteolitik)  yang diisolasi dan Streptococcus thermophillus menggunakan kromatografi  DEAE-cellulose  dan Sephadex  G-150,  menghasilkan  enzim murni dengan  berat  molekul  89.000  Dalton,  memiliki aktivitas  optimum  pada  pH  6,5 dan  suhu  35°C, diaktifkan  oleh  kofaktor  logam  Mg 2+ ,  dihambat oleh  EDTA  dan  1,10-phenanthroline  (Tsakalidou dkk, 1993).
Satu unit aktivitas protease dapat didefinisikan  sebagai  jumlah  enzim  yang  mampu
menghasilkan  satu  mikromol  tirosin  per  menit. Analisis  protease  dapat mengikuti metode  yang dikemukakan  Walter (1984), sedangkan untuk mengetahui berat  molekul protein enzim  tersebut dapat  menggunakan elektroforesis SDS-PAGE metode Laemmli (1970) selanjutnya untuk memastikan bahwa pita protein tersebut merupakan  suatu  enzim  dapat  digunakan analisis Zymogram.

## Metode
Strain yang digunakan Lactobacilus acidopillus, media  propagasi menggunakan  MRS  broth, sedangkan  media  produksi  menggunakan MRS broth  dan susu sapi perah. Lactobacilus  acidopillus dari  media  padat  diinokulasikan pada  media propagasi  MRS  broth  (10  ml)  inkubasi  37°C, dilakukan  pengamatan  pertumbuhannya  pada  600 nm.  Selanjutnya  sebanyak  2%  (v/v)  diinokulasikan pada media produksi MRS broth dan susu sapi perah (UHT).  Pengambilan sampel  dilakukan  tiap  jam terhadap  kedua  media  produksi  tersebut, dilakukan pengamatan pernunbuhan mikrobanya, dan pengukuran  aktivitas  protease (Walter,  1984)  serta kadar protein (Bradford, 1978).
Pengukuran densitas bakteri pada media produksi susu UHT
Sebanyak  1  ml  sampel  ditambahkan 9  ml  EDTA (2g/l,pH 12) selanjutnya dilihat absorbansinya pada 600 nm ( Metoda Kanasaki ) Isolasi ekstraselzcler protease Lactobacilus acidopillus
Sampel  disentrifugasi  12000  g,  pada suhu  4°C, selama 15 merit. Supernatan diambil dan dianalisis kadar protein dan aktivitas proteolitiknya.

## Pengukuran konsentrasi protein (Bradford, 1976)
Konsentrasi  protein  diukur  dengan  menggunakan standar  protein  Bovine  Serum Albumin  (BSA) dengan konsentrasi 0,1 hingga 1 mg/ml. Sebanyak 100  µl sampel ditambah  5  ml  pereaksi  Bradford, selanjutnya  dihomogenkan  dan  diinkubasi selama 5  menit  pada  suhu  37°C  dan  kemudian  diukur absorbansinya  dengan  spektrofotometer  pada  595 nm
Aktivitas protease dihitung dengan formula:
UA =     T p A A A A bl st bl sp 1    
Keterangan:
UA = Unit aktivitas enzim (U/menit) A sp = Nilai absorbansi sampel A st = Nilai absorbansi standart A bl = Nilai absorbansi blanko P = Faktor pengenceran
T = Waktu inkubasi (menit)

## Pengendapan dengan Amonium sulfat
Untuk  menggumpalkan protein,  supernatan hasil sentrifugasi ditambahkan ammonium  sulfat  sedikit demi sedikit sambil diaduk dengan magnetic stirrer dengan  konsentrasi  (30%,  40%,  45%,  60%)  dan dibiarkan  selama  satu malam pada  suhu  4 ° C. Selanjutnya  disentrifugasi  10.000  rpm,  suhu  4 ° C, selama 15 menit. Pelet yang diperoleh diresuspensikan dengan buffer Tris-HCI 10 mM pH 8, kemudian dilakukan pengujian aktivitas proteasenya  dengan  metode  Walter  (1984)  dan penentuan  kadar  proteinnya  dengan  metode Bradford (1976)
.
Tabel 1. Pengukuran Aktivitas Protease (Walter, 1984) Pereaksi Jumlah (ml) Blanko (ml) Standar (ml) Sampel (ml Bufer Tris HCl 0,2 M pH 8 Kasein 2% Aquades Tirosin standar (5 mmol/l) Enzim sampel 1 1 0,2 - - 1 1 - 0,2 - 1 1 - - 0.2 Inkubasi pada suhu 50 C selama 10 menit TCA 2 2 2 Aquades - - 0 2 Enzim protease 0,2 0 2 - Inkubasi pada suhu 37 C selama 10 menit dan sentrifugasi 4000 rim, 10 merit_ Filtrat Natrium Karbonat Folin (1:2) 1,5 5 1 1,5 5 1 1 5 5 1
Inkubasi pada suhu 37 ° C selama 20 merit, Absorbansi diukur pada panjang gelombang 578 nm

## Dialisis
Dialisis  dilakukan  untuk  menghilangkan  kadar garam  yang  tersisa dari  proses pengendapan dengan  ammonium  sulfat  menggunakan  kantong dialisis. Kantong diikat  dengan  benang  jahit,  lalu dimasukkan  10  ml  larutan  enzim,  dan  kemudian ujung  lain  diikat  dengan  benang.  Kantung dimasukkan dalam larutan Tris HC120 mM dengan volume  100  kali  volume  filtrat  dan  diagitasi  secara perlahan  pada suhu  4 ° C  selama  1  jam.  Setelah  30 menit bufer diganti dengan bufer segar. Enzim hasil dialisis dipekatkan menjadi setengah volume dengan freeze  dryer dan disimpan  pada  suhu  4 ° C  untuk segera dilakukan kromatografi filtrasi gel.

## Kromatografi Filtrasi Gel
Kolom  kromatografi  filtrasi gel Sephadex  G-100 diekuilibrasi dengan mengalirkan bufer Tris HCL 10  M  sebanyak  200  ml  dan  didiamkan selama semalam pada suhu 4 ° C. Larutan protease sebanyak 2  ml  dimasukkan  dengan  pipet  secara  perlahan kedalam kolom tepat di atas permukaan gel. Enzim dibiarkan  mengalir  perlahan  sampai  selunih  enzim berada  dibawah  permukaan gel.  Kolom  diisi dengan  pengelusi  yaitu  bufer  Tris  HCI  10 mM pH 8. Fraksinasi sebanyak 20 fraksi sebanyak 70  tetes  pada  masing-masing  fraksi  menggunakan fraction  collector. Setiap  fraksi  diukur  aktivitas protease dan kadar proteinnya.

## Hasil dan Pembahasan
Lactobacillus  acidophilus mengekskresikan protease ektraseluler dengan aktivitas  tertinggi adalah (0,752  U/mg)  masa  pertumbuhan bakteri tersebut (fase logaritma pertumbuhan).

## Pengendapan Ammonium sulfat dan Dialisis
Sebelum  dilakukan  pemurnian  dengan filtrasi  gel,  protease  terlebih  dahulu dipekatkan menggunakan  garam  amoruum  sulfat. Pengendapan menggunakan garam  didasarkan  pada  kelarutan protein yang berinteraksi polar dengan molekul air, interaksi ionik protein dengan garam, dan daya tolak menolak  protein  yang  beimuatan  sama.  Kelarutan protein (pada pH dan suhu tertentu) meningkat pada kenaikan  konsentrasi  garam (salting  in). Kenaikan kelarutan  protein  akan meningkatkan  kekuatan ion larutan. Penambahan garam tertentu akan menyebabkan  kelarutan  protein  menurun (salting out). Molekul  air  yang berikatan  dengan  ion-ion garam semakin banyak yang akhirnya menyebabkan penarikan selubung air yang mengeiilingi permukaan  protein,  sehingga  menyebabkan  protein saling  berinteraksi  ,  beragregasi,  dan  kemudian mengendap. Amonium  sulfat  merupakan  garam
yang paling sering digunakan untuk mengendapkan protein  karena  memiliki  daya  larut  tinggi  didalam air, relatif tidak mahal (Scopes 1987).
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 30 40 45 60 Kelarutan amonium sulfat (%) A k ti v ita s s p e s ifi k p ro te a s e ( U /m g ) Aktivitas spesifik protease (U/mg)
Gambar l .  Pengendapan  protease Lactobacillus acidophilus dengan amonium sulfat.
Protease Lactobacillus  acidophilus hasil pengendapan 45%  amonium  sulfat  menunjukan aktivitas  spesifik  protease  yang  tertinggi  yaitu  1,24 U/mg,  sehingga  digunakan  untuk  pemurnian  tahap selanjutnya. Pengaruh garam mineral dan kelebihan amonium  sulfat  dalam  enzim  dihilangkan  dengan menggunakan metoda  dialisa. Proses  penghilangan garam (desalting) menggunakan  metoda dialisa dilakukan  dalam  waktu  yang  tidak  terlalu  lama (kurang  lebih 60  menit) untuk  menghindari terjadinya  penurunan  aktivitas  proteasenya. Hasil yang diperoleh  menunjukkan  aktivitas  spesifik protease yaitu 1,15 U/mg.

## Kromatografi Filtrasi Gel
Pemilihan  metode  kromatografi  kolom didasarkan pada  sifat protein enzim yang dipisahkan. Sehingga  perlu  dilakukan  pencarian informasi  tentang  karakterisasi  enzim tersebut, antara  lain  perkiraan  berat  molekul,  derajat hidrofobisitas, dan adanya ikatan sulfidril.
Hasil  kolom  Sephadex G-100  menghasilkan satu  puncak  protein  yang melebar.  Fraksi  yang memiliki  aktivitas  protease  yang  tertinggi  adalah fraksi  ke-7 dengan  aktivitas  spesifik  sebesar  12,5 U/mg.  Pemurnian  hyaluronidase SGB dengan kolom  Sephadex  G-100  memberikan  tingkat kemurnian  sampai 16,6  kali  ekstrak  kasar  dengan perolehan 12,6%. Perolehan dibawah 50% diperkirakan karena  kadar  protein  yang  memiliki aktivitas hyaluronidase lebih rendah daripada protein lain  yang  diekskresikan  sel.  Kehilangan  protein selama  pemurnian  dapat  terjadi  karena  autolisis (Scopes 1987),  dan  hal ini terjadi  karena pengaruh
pengenceran enzim
0 2 4 6 8 10 12 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Fraksi A k ti v it a s p ro te a s e ( U /m l) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 K a d a r p ro te in ( m g /m l) Aktivitas protease (U/ml) Kadar protein (mg/ml)
Gambar 2. Profil  hasil pemurnian  dengan kromatografi  filtrasi gel Sephadex  G-
100.

## Kesimpulan
Metode pemurnian yang digunakan untuk memurnikan  protease ekstraseluler Lactobacillus acidophilus memiliki  effektivitas  yang  rendah karena  hanya menghasil  12,6%  protein  enzim  dari ekstrak kasar.

## Ucapan Terimakasih
Penulis  ucapkan  terimaksih  sebesarnya  kepada semua  pihak  yang  berperan  demi  terselesainya
penelitian  ini,  khususnya  bagi  Lembaga  Penelitian Universitas Padjadjaran yang memberikan pendanaan.

## Daftar Pustaka
Bradford,  MM.1976. A rapid  and  sensitive  method  for quantitation  of  protein u t i l i z a t i o n . The principle  of  protein-dye  binding. Anal.  Biochem. 72:248-254
Laemmli UK. 1970. Cleavage of structural protein during the  assembly  of  head of  bacteriophage T-4.
Nature: 227:680-685
Rao MB, Tanksale AM, Ghatge MS, and Deshpande VV. 1998. Molecular and biotechnological aspects of microbial proleases. J.Microbiol. Mol.Bio.Rev.62:597-635
Scopes  RK.  1987.  Protein  Purification  Principles  and Practice. Edisi ke-2. New York: SpringerVerlag. Thomas  TD and Pritchard GG. 1987.Proteolytic enzymes from dairy starter cultures. Fed. Eur.
Microbiol.Soc.Microbiol. Rev. 46:245
Tsakalidou  E,  Dalezios  I,  Georgalaki  M,  and
Kalantzopoulos G.  1993. A Comparative: Aminopeptidase  Activities from Lactobacillus delbrueckii  ssp.bulgaricus  and  Streptococcus thermophilus. J.Dairy Sci. 76:21452151
Walter HE. 1984. Method with haemoglobin, casein, and azocoll  as  substrate In. Bergmeyer.  HU (ed). Methods  of  enzymatic  analysis.  Verlag  Chemie. Deerfield Beach Florida Basel
. Tabel 2. Pemurnian protease Lactobacillus acidophilus Tahap Pemurnian Volume (ml) Total Protein (mg) Total Aktivitas (Unit) Aktivitas Spesifik (Unit/mg) Tingkat Kemurnian Perolehan (%) Ekstrak kasar 100 40 30,1 0,752 1 100 (NH 4 ) 2 SO 4 45% 15 15 18,6 1,24 1,64 62 Dialisa 10 9 10,34 1,15 1,52 34 Filtrasi Gel 10 4 50 12,5 16,6 12,6