## EFEK PENAMBAHAN KITOSAN MOLEKUL TINGGI NANOPARTIKEL PADA SEMEN IONOMER KACA NANOPARTIKEL TERHADAP KEMAMPUAN BERTAHAN HIDUP SEL PULPA
(EFFECT OF HIGH MOLECULAR CHITOSAN NANOPARTICLE ADDITION IN GIC NANOPARTICLE TO VIABILITY OF PULP CELLS)
Henny Sutrisman*, Trimurni Abidin*, Harry Agusnar**
*Departemen Ilmu Konservasi Gigi Fakultas Kedokteran Gigi, Universitas Sumatera Utara Jl. Alumni No. 2 Kampus USU, Medan **Departemen Ilmu Kimia Fakultas Teknik Kimia, Universitas Sumatera Utara Jl. Bioteknologi 1 Kampus USU, Medan

## Abstract
Some studies suggested to use of RMGIC in atraumatic restorative technique (ART), aiming at a higher success rate of restorations. Nowadays, due to development of nano technology, it is available in nano particle form. Chitosan is one of the natural materials used to increase the bioactivity of the glass ionomer to stimulate cell proliferation. The aim of this study  was to  investigate horseshoe crab’s chitosan nanoparticle roles in GIC nanoparticle to increase viability of pulp cells. Cultured  mouse  dental  pulp  cell  lines  were  exposed  to  each  of  the  restorative  materials  added  with  chitosan nanoparticle through a 4x3mm specimen for 72 hours  to simulate the in vitro situation. Calcium hydroxide was used as a control and the cell viability was measured by the MTT assay. Data was analysed by one-way Anova followed by LSD test,  and  a  statistical  significance  was  determined  at  p<  0.05. The  result  showed  that assessment  of  cellular  viability indicated that the addition of chitosan can increase cells viability both in RMGIC and RMGIC nanoparticle (p< 0.05). In conclusion,  the  addition  of  0,015  wt  %  of  horseshoe  crab’s  high  molecular  chitosan  nanoparticle  in  glass  ionomer nanoparticle can increase viability of pulp cells in vitro .
Key words: chitosan high molecule, glass ionomer cements, proliferation of cells

## Abstrak
Beberapa  penelitian  menyarankan  penggunaan  SIKMR  untuk  teknik  ART  dengan  tujuan  untuk  mencapai  tingkat kesuksesan  restorasi  yang  lebih  tinggi.  Pada  saat  ini  dengan  perkembangan  teknologi  nano,  material  ini  juga  tersedia dalam  bentuk  partikel  nano  yang  disebut  semen  ionomer  kaca  modifikasi  resin  nanopartikel  (SIKMRn).  Penggunaan produk alam di dalam dunia kedokteran gigi juga meningkat, kitosan merupakan salah satu produk alam yang digunakan untuk  meningkatkan  bioaktivitas  dari  SIK.  Penelitian  menunjukkan  kitosan  dapat  menstimulasi  proses  proliferasi  sel. Penelitian  ini  bertujuan untuk  melihat efek  penambahankitosan  molekul tinggi  nanopartikel pada  semen  ionomer  kaca nanopartikel  untuk  meningkatkan  viabilitas  sel  pulpa.  Bahan  restorasi  yang  ditambahkan  kitosan  nanopartikel  melalui spesimen berukuran 4x3 mm dipaparkan pada kultur mouse dental pulp cell lines selama 72 jam dengan keadaan in vitro . Kalsium  hidroksida  digunakan  sebagai  kontrol.  Viabilitas  sel  dihitung  dengan  menggunakan MTT  (3-[4,5- dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl-tetrazoliumbromide) assay. Data diuji dengan uji  Anova dan diikuti uji  LSD dengan nilai  yang  signifikan  p<  0,05.  Hasil  penelitian  menunjukkan  penambahan  kitosan  dapat  meningkatkan  kemampuan bertahan hidup sel baik pada SIKMR dan SIKMRn (p< 0,05). Sebagai kesimpulan, adanya  penambahan kitosan molekul tinggi  nanopartikel  dengan  0,015%  berat pada  semen  ionomer kaca  modifikasi resin  nanopartikel dapat  meningkatkan viabilitas sel pulpa secara in vitro .
Kata kunci: Kitosan molekul tinggi, semen ionomer kaca, proliferasi sel Edisi Cetak Dentika Dental Journal, Juli 2013 (ISSN: 1693-671X)

## PENDAHULUAN
Ilmu  kedokteran  gigi  restoratif  memiliki  tujuan utama  untuk  mengembalikan  dan  mempertahankan kesehatan  jaringan  pulpa  pada  gigi  berlubang  me- lalui  perawatan  restoratif  yang  adekuat.  Respons pulpa  terhadap  material  restorasi  dengan  formulasi spesifik  dapat  memicu  respons  biologis  yang  me- nguntungkan. 1,2 Di  antara  material  kedokteran  gigi yang  dikembangkan    akhir-akhir  ini  adalah  semen ionomer  kaca  (SIK)  yang  diperkenalkan  oleh Wilson  dan  Kent  pada  tahun  1972  serta  digunakan sebagai  bahan  dalam  perawatan Atraumatic  Res- toration  Technique (ART).  Semen  ionomer  kaca modifikasi resin (SIKMR) dan semen ionomer kaca nanopartikel (SIKMRn)digunakan sebagai alternatif untuk  memperbaiki  sifat-sifat  fisis  SIK  seperti  es- tetis, translusensi, dan kekuatan yang lebih baik. 2-4
SIK  yang  diaktivasi  sinar  menunjukkan  biokom- patibilitas  buruk  dan  sitotoksisitas    lebih  tinggi  di- bandingkan  SIK  konvensional.  Hal  ini  disebabkan adanya  unsur  HEMA (2-hydroxethyl  methacrylate) yang terlepas dan mampu berdifusi melalui  tubulus dentin ke pulpa. 5 Oleh karena itu, bahan ini menjadi pertimbangan untuk diaplikasikan pada kavitas yang dalam.
Penggunaan  produk  alam  di  bidang  kedokteran gigi saat ini semakin berkembang pesat. Banyaknya limbah kulit udang dan blangkas di Sumatera Utara memungkinkan  untuk  dikembangkan  bahan  baru yaitu  kitosan  dan  derivatnya  di  bidang  kedokteran gigi.
Tujuan  penelitian  ini  adalah  untuk  melihat  efek penambahan  kitosan  molekul  tinggi  nanopartikel pada  varian  semen  ionomer  kacauntuk  meningkat- kan  sifat  biologis  material  tersebut  sehingga  dapat digunakan  dalam  perawatan  ART  pada  kavitas- kavitas yang luas dan dalam.

## BAHAN DAN METODE
Penelitian  ini  merupakan  penelitian  eksperimen- tal  laboratorium  jumlah  sampel  30  sampel  dan  di- bagi  menjadi  enam  kelompok.  Pembuatan  spesi- men  penelitian  dilakukan  di  Laboratorium  FMIPA Universitas  Sumatera  Utara  sedangkan  kultur  sel dan    perlakuan    terhadap    kultur    sel    dilakukan  di Laboratorium  Biologi  Oral  Universitas  Indonesia. Hasil  pengamatan  viabilitas  sel  diukur  mengguna- kan  metode 3-  (4,5-dimethythiazol-2-yl)  -2,5-dip- henyl  tetrazoliun  bromide  (MTT)  assay .  Variabel bebas  penelitian  ini  adalah  SIKMR,  SIKMRn, Modifikasi  SIKMR  dan  SIKMRn  yang  ditambah- kan  kitosan  nano   dari  blangkas   dengan   0,015%
berat.  Variabel  tergantungnya  adalah  viabilitas  sel pulpa.
Kalsium  hidroksida  digunakan  sebagai  kelompok kontrol.  Bahan  ini  biasa  digunakan  pada  kaping pulpa langsung dan tidak langsung serta merupakan bahan  acuan  yang  digunakan  dalam  uji  biokompa- tibilitas  karena  kemampuannya  dalam  perbaikan pulpa yang terpapar.
Kitosan  pasta  dibuat  dengan  melarutkan  1  gram kitosan  dalam  50  ml  larutan  asam  lemah  (asam asetat  1%)  dan  diaduk  pada  kecepatan  200  rpm. Larutan kitosan ditetesi dengan larutan amoniak dan diaduk  kembali.  Larutan  yang  telah  membentuk pasta tersebut dimasukkan ke dalam Ultrasonicbath untuk  memecahkan  partikel  kitosan  menjadi  nano- partikel.  Selanjutnya  disaring  dan  residunya  dicuci dengan  akuades  untuk  menghilangkan  bau  amo- niak.
Spesimen dibuat dengan mengaduk pasta SIKMR, pasta  SIKMRn,  pasta  SIKMRditambahkan  kitosan nano  sebanyak  0,015%  berat,  pasta  SIKMRn  di- tambahkan  kitosan  nano  sebanyak  0,015%  berat, serta  pasta  Ca(OH) 2 .  Pasta  yang  sudah  diaduk  di- masukkan ke dalam cetakan yang terbuat dari vinyl polisiloksan dan disinar.
Mouse dental pulp cell line (MDPC) diambil dari stok  nitrogen  cair  di  Laboratorium  Biologi  Oral FKG UI. Pipet transfer dan flask disterilkan dengan cara  di  sinar  dengan  sinar  ultraviolet  selama  15 menit.  Kemudian  medium  DMEM  ( Dulbecco’s Modified  Eagle  Medium) komplit  dimasukkan  ke dalam flask 5 ml dan ditambahkan MDPC . Setelah itu dimasukkan ke dalam inkubator pada suhu 37 0 C dan 5% CO2.
Perlakuan masing-masing kelompok diaplikasikan pada  sel  yang  telah  terkonfluen dan diobservasi se- lama  72  jam.  Uji  viabilitas  sel  dilakukan  dengan MTT assay. Medium kultur sel pada setiap piringan ditambahkan  15  µl  larutan  MTT  (5mg/ml)  dan diinkubasi  pada  suhu  37 0 C  dan  5%  CO2  selama 3 jam. Setiap piringan ditambahkan 150µl acidified isopropanol lalu diletakkan di atas pengaduk orbital (50  rpm)  selama  1  jam.  Kemudian  dibaca  pada pembaca microplate panjang  gelombang  650  nm. Nilai  absorbansi  kelompok  perlakuan  dipersentasi- kan  terhadap  kelompok  kontrol  untuk  menentukan viabilitas sel.
Data yang diperoleh dilakukan uji statistik analisis varian  satu  arah  (Anova)  dengan  tingkat  kemakna- an α= 0,05. Uji LSD ( Least Significancy Different ) dilakukan untuk mengetahui perbedaan viabilitas sel Di  antara  kelompok perlakuan. Hipotesis penelitian ini adalah SIKMR dan SIKMRn yang ditambahkan kitosan  molekul  tinggi   dapat   menstimulasi  proli-
ferasi sel pada jaringan pulpa.

## HASIL
Viabilitas  sel  terlihat  meningkat  secara  signifikan pada  seluruh  kelompok  yang  ditambahkan  kitosan molekul  tinggi  nanopartikel.  Di  antara  kelompok tersebut,  SIKMRn  yang  ditambahkan  kitosan  mo- lekul tinggi nanopartikel menghasilkan viabilitas sel yang lebih tinggi (Gambar 1).

## Gambar 1. Rerata  nilai  viabiltas  sel  dalam  persen  yang dipaparkan  empat  kelompok  spesimen  ter- hadap kalsium hidroksida (kelompok kontrol)
selama 72 jam
Perbedaan pada masing-masing kelompok terlihat pada  uji  LSD.  Perbedaan  viabilitas  sel  yang  sig- nifikan  terlihat  pada  seluruh  kelompok  yang  di- tambahkan dengan kitosan molekul tinggi, yaitu K3 (2,214 ± 0,199) dan K4 (2,236 ± 0,314) dengan nilai p< 0,05. Pada seluruh kelompok yang ditambahkan kitosan  molekul  tinggi  nanopartikel  menunjukkan tidak ada perbedaan bermakna antara nilai viabilitas sel  baik  kelompok  SIKMR  maupun  SIKMRn dengan nilai p> 0,05 (Tabel 1).
Tabel 1.  Perbedaan  masing-masing  kelompok  dalam jumlah  viabilitas  sel  yang  dipaparkan  pada kultur sel selama 72 jam dengan uji LSD
Kelompok Rerata jumlah viabilitas sel (x ± SD) p K1 vs K5 1,222 ± 0,026 1,593 ± 0,525 0,061 K2 vs K5 1,664 ± 0,186 1,593 ± 0,525 0,712 K3 vs K5 2,214 ± 0,199 1,593 ± 0,525 0,003 K4 vs K5 2,236 ± 0,314 1,593 ± 0,525 0,002 K1 vs K2 1,222 ± 0,026 1,664 ± 0,186 0,027 K1 vs K3 1,222 ± 0,026 2,214 ± 0,199 0,000 K2 vs K4 1,664 ± 0,186 2,236 ± 0,314 0,005 K3 vs K4 2,214 ± 0,199 2,236 ± 0,314 0,907
Keterangan:  K1=  kelompok  SIKMR,  K2=  kelompok SIKMRn,  K3=  kelompok    SIKMR  +  Kitosan  molekul tinggi,  K4=  kelompok  SIKMRn  +  Kitosan  molekul tinggi,  K5=  kelompok  kalsium  hidroksida;  K1-K2= Kelompok kontrol (-); K5= kelompok kontrol (+)

## PEMBAHASAN
SIK  dapat  diaplikasikan  pada  karies  awal  yang sedang  berkembang.  SIK  melekat  pada  gigi  dan menghentikan  atau  memperlambat  perkembangan lesi terutama karena SIK mengeluarkan fluor secara perlahan.Pada perkembangannya, selain sebagai ba- han  restorasi  SIK  juga  digunakan  sebagai  bahan dalam  penggunaan  ART.  Teknik  perawatan  ART dikembangkan  di  daerah  terpencil  untuk  perawatan gigi berlubang seperti yang disarankan WHO. ART merupakan  teknik  pembuangan  jaringan  karies menggunakan  instrumen  tangan  dan  merestorasi dengan bahan restorasi adhesif. 6-8
Keberhasilan  restorasi  gigi  dengan  menggunakan ART  bergantung  pada  beberapa  faktor  klinis.  Ke- gagalan  ART  umumnya  karena  beberapa  faktor, seperti kehilangan sebagian ataupun seluruh struktur gigi,  karies  yang  terjadi  pada  daerah  tepi  restorasi, tingkat  keausan  bahan  >  0.5  mm  dan  kavitas  yang dalam. 6,8 Ferracane  dkk.  menyatakan  bahwa  ketika SIK  digunakan  dalam  teknik  perawatan  ART  yang menggunakan  prinsip  preparasi  minimal,  terlihat jumlah  bakteri  yang  lebih  sedikit  dan  kandungan kalsium  yang  lebih  tinggi.  Hal  tersebut  menimbul- kan  keyakinan  bahwa  dentin  telah  mengalami  re- mineralisasi. 1
Aplikasi  SIK  pada  jaringan  pulpa  yang  terpapar dalam  prosedur  iatrogenik  dan  mengalami pulpitis reversible diharapkan  dapat  membangkitkan  daya reparatif  pulpa  sehingga  material  ini  dapat  di- kembangkan  dalam  ART.  Hal  ini  mungkin  di- sebabkan  karena  SIK  merupakan  bahan  bioaktif dengan didasari adanya komponen SiO2 yang lebih kecil  dari  60%.  yang  berperan  dalam apatite  hete- rogenous dalam  lingkungan  biologis  serta  mampu berikatan  dengan  jaringan  gigi  secara  kimia  karena pertukaran  ion. 4 SIKMR  dan  SIKMRn  dikembang- kan  untuk  menghasilkan properties  mechanical yang lebih baik dibandingkan SIK. 7,8
SIKMR  dapat  melepaskan  monomer  HEMA  (2- hydroxethyl  methacrylate).  HEMA  dapat  berdifusi melewati  dentin  menuju  pulpa  dan  ketika  HEMA mencapai  pulpa,  pulpa  dapat  mengalami  beberapa efek biologis yang merugikan seperti inflamasi per- sisten. 5 Beberapa  penelitian  menunjukkan  resin adhesif  seperti  resin  komposit,  kompomer,  SIKMR dapat menyebabkan sitotoksisitas pada sel pulpa dan terhambatnya regenerasi dentin. Hal  ini disebabkan
karena pada dentin bonding agent terdapat kandung- an triethylene  glycol  dimethacrylate (TEGDMA) atau 2-hydroxy-ethyl  methacrylate (HEMA).  Bah- kan  setelah  polimerisasi,  sejumlah  monomer  sisa yang  dilepaskan  dari  bahan  berbasis  resin  cukup untuk menimbulkan kerusakan pada populasi sel di sekitarnya. 9,10
Berkembangnya  aplikasi  teknologi  nano  dalam dunia kedokteran gigi terlihat juga pada penambah- an  partikel  nano  ke  dalam  komposisi  SIK  yang disebut  SIKMRn.  Pada  prinsip  rekayasa  jaringan, ukuran  partikel  material  dapat  mempengaruhi  efek biologi,  yaitu  makin  kecil  ukuran  partikel,  makin luas permukaannya, sehingga makin meningkat pula interaksi material dan jaringan sekitarnya.Silika dan natrium merupakan elemen yang berperan pada bio- aktivitas  material  dimana  kandungan  silika  dan  na- trium tertinggi terdapat pada SIKMRn. 4
Biomaterial yang digunakan sebagai bahan kaping pulpa  dapat  berfungsi  sebagai  pembawa  molekul pemberi  sinyal.  Potensi  penyembuhan  melalui  sti- mulasi regenerasi jaringan pulpa terjadi karena ada- nya  pelepasan  biomolekul. 11 Mekanisme  yang  ter- jadi  pada  pulpa  di  bawah  material  kaping  diawali dengan  adanya  proliferasi  dan  migrasi  sel  yang  di- lanjutkan dengan penguraian kolagen yang baru dan kokoh  pada  daerah  yang  kontak  dengan  bagian pulpa  nekrotik.  Selanjutnya  garam  mineral  dipresi- pitasi  pada  zona  nekrotik  dan  membentuk  matriks kolagen  baru.  Akhirnya  dentin  reparatif  mulai  di- bentuk oleh selapis odotoblast like cell . 4,12
Kitosan  merupakan  salah  satu  biomaterial  yang terus dikembangkan karena memiliki berbagai man- faat medik dan biokompatibilitas yang baik. Kitosan dalam bentuk terprotonisasi menunjukkan kerapatan muatan  yang  tinggi  dan  bersifat  sebagai  polielek- trolit kationik dan sangat efektif berinteraksi dengan biomolekul  bermuatan  negatif  dan  biomolekul  per- mukaan. 13
Berdasarkan beberapa sifat  istimewa dari  kitosan, maka  kitosan  dan  modifikasi  dengan  bahan  lain dapat  digunakan  untuk  aplikasi  klinis  sebagai  bio- material. 14-16 Penggunaan kitosan blangkas dan kito- san  komersil  pada  perawatan  kaping  pulpa  direk menunjukkan  adanya  pembentukan  dentin  reparatif dan  dengan  jumlah  sel-sel  inflamasi  yang  lebih  se- dikit  dibandingkan  dengan  kalsium  hidroksida  se- bagai  kontrol. 15 Kitosan  juga  dibuat  dalam  bentuk nanopartikel. Ukuran partikel kitosan berskala nano- meter  akan  meningkatkan  luas  permukaan  sampai ratusan kali dibandingkan dengan partikel yang ber- ukuran  mikrometer,  sehingga  dapat  meningkatkan efektifitas kitosan dalam mengikat gugus kimia lain- nya. 17
Penambahan kitosan ke dalam SIK komersil dapat
meningkatkan  performa  mekanis  dan  mampu  se- bagai katalisator dalam pelepasan ion fluor. Efek ini dijelaskan  berdasarkan  penemuan  jaringan  poli- merik  yang  berikatan  kuat  di  sekitar  pengisi  an- organik. 18
Penggunaan  kitosan  blangkas  dan  komersil  se- bagai  bahan  pembanding  dengan  kalsium  hidrok- sida pada perawatan kaping pulpa direk menunjuk- kan  keduanya  lebih  mampu  menstimulasi  pem- bentukan dentin reparatif dengan kemampuan mem- bentuk  koagulum  yang  padat  sebagai  sub base membran yang memudahkan perlekatan sel-sel pul- pa  seperti  dentinoblast  untuk  memudahkan  migrasi dan proliferasi sel pulpa dentinoblas. 15
Oleh  karena  itu,  dengan  adanya  perkembangan biomaterial,  maka  diharapkan  kitosan  nanopartikel yang  ditambahkan  pada  varian  SIKmampu  me- rangsang dentinogenesis dan memperbaiki kerusak- an  pulpodentino  kompleks  sehingga  dapat  diguna- kan sebagai bahan restorasi pada teknik ART.
Peningkatan  signifikan  viabilitas  sel  diperoleh pada  SIKMR  dan  SIKMRn  yang  ditambahkan  ki- tosan  nanoblangkas.  Hal  ini  disebabkan  karena  ki- tosan yang merupakan biopolimer  alami dan mem- punyai  glukosamina  mempunyai  sifat  yang  sangat istimewa  yaitu  biokompatibiliti  baik,  biodegrade- biliti  baik,  tidak  bersifat  toksik  dan  bioaktif.  Sifat- sifat  kitosan ini dihubungkan dengan adanya  gugus amino  dan  hidroksil  yang  terikat.  Adanya  gugus- gugus  tersebut  menyebabkan  kitosan  mempunyai reaktivitas kimia yang tinggi dan menyumbang sifat elektrolit  kation  sehingga  dapat  berperan  sebagai amino pengganti. 14,15
Pada  penelitian  ini  digunakan  kalsium  hidroksida sebagai kelompok kontrol karena beberapa peneliti- an  sebelumnya  menunjukkan  bahwa  kalsium  hid- roksida dapat menginduksi mineralisasi dan inhibisi pertumbuhan bakteri. Banyak penelitian menunjuk- kan  perbaikan  pulpa  dan  pembentukan  perisai jaringan  keras  ketika  dilakukan  kaping  pulpa langsung pada pulpa  yang  terpapar.  Adanya perisai jaringan  keras  setelah  perawatan  kaping  pulpa  di- anggap  suatu  keuntungan  karena  dapat  mencipta- kan  perlindungan  alami  terhadap  infiltrasi  bakteri dan  produk  khemis.  Namum,  kalsium  hidroksida tidak  bertindak  sebagai  biostimulator  maupun  bio- kompatibel  terhadap  jaringan  pulpa.  Sel  yang  ber- kontak  langsung  dengan  kalsium  hidroksida  akan mati  akibat  pH  yang  basa  sehingga  membentuk suatu lapisan nekrose. Hal ini dapat mengakibatkan terjadinya kebocoran dan penetrasi bakteri ke dalam pulpa. 1, 19
Dapat  disimpulkan  bahwa  penambahan  kitosan molekul  tinggi  nanopartikel  pada  SIKMR  dan SIKMRn  dapat  meningkatkanviabilitas  sel  bila  di-
bandingkan  dengan  kalsium  hidroksida  sehingga bahan  ini  dapat  dijadikan  suatu  biomaterial  baru yang  mampu  merangsang  dentinogenesis  dan  me- miliki  sifat fisis baik  serta dapat digunakan  sebagai bahan restorasipada perawatan ART.

## Daftar Pustaka
1. Ferracane  JL,  Cooper  PR,    Smith  AJ.  Can  inter- action  of  materials  with  the  dentin–pulp  complex contribute to dentin regeneration? Odontology 2010; 98: 2-14.
2. Lohbauer  U.  Dental  glass  ionomer  cements  as permanent  filling  materials?  properties,  limitations and future trends. Materials 2010; 3: 76-96.
3. Ghavamnasiri    M,  Mousavinasab  M,  Mohtahsam M.  A  histopathologic  study  on  pulp  response  to glass ionomer cements in human teeth. J Dent 2005; 2(4): 135-41.
4. Suprastiwi  E.  Bioaktivitas  semen  ionomer  kaca dalam menginduksi peningkatan kadar ALP, DMP- 1,  dan  pembentukan  dentin  reparatif  (penelitian  in vivo  pada  Macaca  nemestrina).  Disertasi.  Jakarta: FKG UI, 2011.
5. Nicholson  JW,  Czarnecka  B.  The  biocompatibility of   resin-modiﬁed   glass-ionomer    cements   for dentistry. Dental materials 2008; 24: 1702-8.
6. Mickenautsch  S,  Grossman  E.  Atraumatic  resto- rative    treatment  (art)  -  factors  affecting  success.  J Appl Oral Sci 2006; 14(sp.issue): 34-6.
7. Cefaly  DF,  Barata  T,  Tapety  CM,  Bresciani  E, Navarro  MF.  Clinical  evaluation  of  multi-surface ART restorations.  J Minim Interv Dent 2008; 1(1): 52-8.
8. Frencken  JE,  Leal  SC,  Navarro  MF.  Twenty-five- year  atraumatic  restorative  treatment  (ART)  app- roach: a comprehensive overview. Clin Oral Invest 2012; 16: 1337-46.
9. Quinlan  CA,  Zisterer  DM,  Tipton  KF,  O’Sullivan MI.  In  vitro  cytotoxicity  of  a  composite  resin  and com-pomer.  International  Endodontic  J  2002;  35: 47-55.
10. Mantellini  MG,  Botero  TM,  Yaman  P,  Dennison JB,  Hanks  CT,  Nor  JE.  Adhesive  resin  induces apoptosis and cell-cycle arrest of pulp cells. J Dent Res 2003; 82(8): 593-4.
11. Goldberg  M,  Smith  AJ.  Cells  and  extracellular matrices of dentin and pulp:  A  biological  basis  for repair  and  tissue  engineering.  CROBM  2004;  15: 13-27.
12. Bouillaguet  S.  Biological  risks  of  resin-based  ma- terials to the dentin-pulp Complex. CROBM 2004; 15(1): 47-60.
13. Sugita  P,  Wukisari  T,  Sjahriza  A,  Wahyono  A. Kitosan  sumber  biomaterial  masa  depan.    Bogor: IPB Press, 2009; 27: 125.
14. Irawan  B.  Chitosan  dan  aplikasi  klinisnya  sebagai biomaterial. IJD 2005; 12(3): 146-51.
15. Trimurni  A,  Harry  A,  Wandania  F.  Efek  dentino- genesis  kitosan  dan  derivatnya  terhadap  inflamasi jaringan  pulpa  gigi reversible .  Laporan  akhir penelitian riset pembinaan iptek kedokteran. Medan: FKG USU, 2006: 16-8, 27-30, 39-41.
16. Hafdani FN, Sadeghinia N. A review on application of  chitosan  as  a  natural  antimicrobial.  World  Aca- demy of Science 2011; 74: 257-61.
17. Ningsih  W.  Pengaruh  viskositas  larutan  kitosan nano-partikel sebagai penyalut asam askorbat untuk menyerap asam  lemak bebas (ALB) dalam minyak goreng curah. Medan, Tesis. USU 2010: 1-21.
18. Petri  DFS,  Donega  J,  Benassi  AM.  Preliminary study  on  chitosan  modified  glass  ionomer  resto- ratives. J Dent Materials 2007; 23: 1004-10.
19. Modena  KC,  Casas-Apayco  LC,  Atta  MT. Cytotoxicity  and  biocompatibility  of  direct  and indirect  pulp  capping  materials.  J  Appl  Oral  Sci 2009; 17(6): 544-54.