Research Article

## UNPAD

## Non-aromatic compounds of
Centella asiatica methanolic extract and analysis of their pharmacology network on burn wounds
Rizki Awaluddin 1* , Rafli M. Mustaqim1 , Dayar Arbain 1 , Farida Hayati 2 , Siti Khaerunnisa 3 1Program Studi Sarjana Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta, Jakarta Utara, Indonesia. 2Program Studi Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Islam Indonesia, Yogyakarta, Indonesia.
3 Departemen Ilmu Faal dan Biokimia Kedokteran, Fakultas Kedokteran, Universitas Airlangga, Surabaya, Indonesia
Submitted 20 October 2023; Revised 22 December 2023; Accepted 26 December 2023; Published 07 June 2024 *Corresponding author: awaluddinrizki@gmail.com

## Abstract
Physical changes after burns reduce the skin function, quality of life, and aesthetics of the skin. The Centella asiatica reported contain triterpenoids to enhance burn wound healing. However, the polarity of its triterpenoids is similar to the presence of chlorophyll and other compounds in the extract and difficult to be separated. The aim of this study is to explore a new method for extracting non-aromatic triterpenoids  using  activated  carbon,  and  then  network  pharmacology  studies  were  carried  out in silico to study protein-protein and compound-protein interactions related to burn wounds. Centella asiatica was macerated with methanol, filtered, then treated with activated carbon until the green color disappeared then evaporated to yield a white powder. This powder was chromatographed on silica gel plate with anisaldehyde-sulfuric acid reagent together with standards compounds. The results showed that the presence of asiaticoside, madecasic acid and asiatic acid as major components  in the purified extract. The results showed that presence of asiaticoside, asiatic acid and madecassic acid as major constituents in the purified extract. Non-aromatic compounds play a role in accelerating the healing of burn wounds by influencing the proteins of enzyme, cytokine, and hormones.
Keywords: Activated-carbon, Burn wound, Centella asiatica, Purified extract, Triterpenoid
Senyawa Non-aromatik dari ekstrak metanol Herba Centella asiatica dan Analisis Farmakologi Jejaring pada Luka Bakar
Abstrak Perubahan fisik pasca luka bakar dapat menurunkan fungsi, kualitas hidup, dan estetika kulit. Herba pegagan ( Centella asiatica ) dilaporkan mengandung berbagai senyawa triterpenoid yang mempercepat luka bakar. Namun, polaritas senyawa triterpenoid yang polar identik dengan keberadaan klorofil dan senyawa lainnya yang sulit dipisahkan. Penelitian ini bertujuan untuk mengeksplorasi metode baru pada ekstraksi herba pegagan menggunakan karbon aktif serja kajian farmakologi jejaring dilakukan secara in silico untuk mengkaji interaksi protein-protein dan senyawa-protein yang berkaitan dengan luka bakar. Herba pegagan dimaserasi dengan metanol, difiltrasi kemudian diberikan karbon aktif hingga warna hijau memudah, kemudian dievaporasi hingga didapatkan ekstrak berwarna kekuningan. Ekstrak dikarakterisasi  menggunakan  KLT  dengan  reagen  anisaldehid-asam  sulfat  bersama  dengan  standar senyawa  triterpenoid.  Hasil  skrining  fitokimia  menunjukkan  keberadaan  asaticoside, asiatic acid, dan madecassic acid pada ekstrak terpurifikasi. Senyawa non aromatik berperan dalam mempercepat kesembuhan luka bakar dengan mempengaruhi protein enzim, sitokin dan hormon. Kata Kunci: Karbon aktif, Luka bakar, Centella asiatica, Ekstrak terpurifikasi, Triterpen

## 1. Pendahuluan
Di
Indonesia pada penelitian sebelumnya  dilaporkan  bahwa  pada  tahun 2013-2015  di  RSCM  Jakarta  terdapat peningkatan  kematian  dari  14.43%  menjadi 27.77%  kematian  akibat  luka  bakar. 1 Luka bakar  dikaitkan  dengan  trauma  psikologis dan  permasalahan  fisik  seperti contractures, hypertrophic scars, muscle wasting, keloid, pain, itching, depression, and anxiety. Penelitian  sebelumnya  juga  melaporkan bahwa  1-15%  penderita  pasca  luka  bakar kesulitan  bekerja. 2 Selain  itu,  perubahan fisik  pasca  luka  akibat  lama  penyembuhan/ regenerasi luka dan terbentuknya scar menjadi penyebab rendahnya kualitas hidup pasien. 3,4
Centella asiatica atau  pegagan  telah banyak  yang  melaporkan  terkait  aktivitas regenerasi  sel  dan  perbaikan  pasca  luka. Penelitian  sebelumnya  melaporkan  bahwa pasien dengan ulkus kronis dapat mempercepat penyembuhan  luka  pada  2  pekan  setelah pemberian 1% krim ekstrak Centella asiatica . 5
Pada penelitian yang lain, dilaporkan bahwa tikus jantan sparague-dawley yang diinduksi luka  bakar  dan  diberikan  ekstrak  metanol Centella asiatica 10%  secara  signifikan meningkatkan  penyembuhan  luka  sebesar 60.31%. 6 Penelitian  menggunakan  mencit ICR  jantan  yang  diinduksi  luka  bakar full-thickness burn (luka  bakar  derajat-3) menguji  empat  senyawa  triterpenoid; terlihat madecassic acid yang  menunjukkan penyembuhan  luka  yang  signifikan  secara in vitro dan in vivo . 7 Pemberian asiaticoside dosis rendah (10 pg/ml) dapat menstimulasi VEGF dan meningkatkan jumlah keratinosit. 8 Pemberian asiatic acid dapat ditoleransi oleh sel fibroblast dan dapat mempengaruhi TGF-β yang berkaitan erat dengan keloid pada luka bakar. 9,10 Penelitian  lain  melaporkan  bahwa kandungan asiaticoside dapat  mempercepat penyembuhan  luka  dalam  waktu  21  hari. 7
Disamping  triterpenoid  tersebut,  pada  herba pegagan ini juga ditemukan senyawa bioaktif lain  yang  berperan  dalam  peyembuhan  luka seperti  β–sitosterol. 11,12 Selain  itu,  senyawa asam ursolik dilaporkan dapat meningkatkan kerja enzim-enzim hyaluronidase, collagenase , dan elastase untuk penyembuhan
luka. 13 Bahkan,  Herba  Pegagan  telah  dibuat dalam bentuk sediaan salep madecassol yang mengandung ekstrak Centella asiatica 1%. 14 Hasil ekstraksi konvensional dilaporkan mengandung klorofil 57 mg/g berat simplisia kering, yang minim aktivitas farmakologi dan sulit  untuk  dipisahkan  meskipun  dilakukan fraksinasi  terutama  menggunakan  fraksi semipolar  dan  fraksi  polar. 15 Penelitian sebelumnya juga telah melakukan fraksinasi ekstrak  etanol,  dengan  kloroform  tapi  tetap menghasilkan  fraksi  yang  mengandung klorofil.  Adanya  kandungan  klorofil  dalam fraksi memungkinkan mempengaruhi efikasi dan  kelarutan  fraksi. 16 Banyak  penelitian yang telah melaporkan triterpenoid Centella asiatica tapi  masih  sangat  terbatas  upaya untuk menghasilkan bahan baku triterpenoid secara efisien.
Penggunaan  karbon  aktif  ( activated charcoal ) banyak digunakan  sebagai adsorben dalam cemaran air atau limbah untuk menyerap senyawa  aromatik.  Metode  ini  telah  dicoba dimanfaatkan  untuk  memisahkan  senyawa non-aromatik  pada  ekstraksi  herba Centella asiatica seperti asiatic acid, madecassic acid, asiaticoside, madecassoside, ursolic acid, maslinic acid, dan corosolic acid . 17 Pada  sisi  lain,  mekanisme  penyembuhan luka bakar melibatkan banyak ekskpresi gen yang masih menimbulkan kontroversi terkait mekanisme  aksi  dan  target  protein  yang potensial. Banyak penelitian yang melaporkan aktivitas  triterpenoid  menghambat  TGF-β, IL-1,  IL-6  dan  TNF-α  padahal  hormon  dan sitokin  tersebut  merupakan  kunci  proses penyembuhan  luka. 18,19 Namun,  paradigma penemuan obat tidak hanya ‘ one target, one drug ’  karena  kondisi  patologis  melibatkan banyak  protein. 20 Bahkan,  penelitian sebelumnya  melaporkan  bahwa  sebagian senyawa bahan alam memiliki efek sinergistik dan  sisanya  antagonis  yang  keduanya  tidak dapat  disimpulkan  hanya  melalui  satu pendekatan. 21 Oleh  karena  itu  dibutuhkan kajian  pendahuluan  yang  komprehensif menggunakan pendekatan multitarget melalui identifikasi  interaksi  antara  senyawa  dan protein guna menyimpulkan mekanisme aksi senyawa bahan alam. Penelitian ini berfokus
pada kajian fitokimia senyawa non-aromatik beserta analisa farmakologi jejaring pada luka bakar.
2.  Metode 2.1.  Alat Neraca  analitik  (Ohaus), Magnetic stirrer & heater (Ika  C-Mag  HS7), rotary evaporator (BUCHI), alat gelas (Pyrex). Studi farmakologi jejaring menggunakan perangkat keras berupa laptop dengan spesifikasi model sistem:  ASUS  dengan Processor Intel(R) Core(TM) i3-3217U CPU1.80Ghz (4 CPUs) ~1.8Ghz; Random Acces Memory (RAM)
2 Gigabyte; Windows 8.0.  Perangkat  lunak yang  digunakan  untuk  analisa  farmakologi jejaring  yakni MarvinSketch versi  16.8.1
( ChemAxon ), Cytoscape versi  3.10.1. Adapun  database  berbasis  website  yang digunakan yakni PubChem ( https://pubchem. ncbi.nlm.nih.gov/ ); STRING ( https:// string-db.org/ )  yang  didukung  oleh Swiss Institute of Bioinformatics , Novo Nordisk Foundation Center Protein Research, dan European Molecular Biology Laboratory ; DisGeNET ( https://www.disgenet.org/ ); Open Target ( https://platform.opentargets. org/ ); SwissTargetPrediction ( http://www. swisstargetprediction.ch/ )  yang  didukung oleh Swiss Institute of Bioinformatics .
2.2.  Bahan
Simplisia  Serbuk Centella asiatica (PT.  Merapi  Farma,  Yogyakarta),  plat  KLT (Merck),  Karbon  Aktif  (Sigma-Aldrich C9157-500G), Asiaticoside (Sigma-Aldrich 43191-5MG-F), Asiatic Acid (ACE  Biolabs CAS.464-92-6)  dan Madecassic acid (isolat yang didapatkan dari Prof. apt. Dayar Arbain, Ph.D). Pelarut analytical grade yakni Metanol 96%  (Merck),  Kloroform  (Merck),  Asam Asetat Anhidrat (Merck), Asam Asetat glasial (Merck), p-anisaldehid (Merck), Asam Sulfat (Merck) dan akuades.
2.3.  Prosedur
2.3.1. Preparasi Ekstrak Terpurifikasi Herba Centella asiatica
Sebanyak  1  Kg  simplisia  serbuk Centella asiatica dimaserasi dengan metanol
96% sebanyak 3 liter selama 48 jam dengan empat  kali  remaserasi.  Setelah  itu,  maserat ditambahkan  dengan  karbon  aktif  kedalam maserat  kemudian  diaduk  menggunakan magnetic stirrer dengan  skala  2  selama  25 menit pada suhu 28±2℃ hingga warna hijau memudar  atau  menjadi  jernih.  Campuran tersebut  didiamkan  selama  10  menit  dan dilakukan filtrasi menggunakan kertas saring. Supernatan dievaporasi menggunakan rotary evaporator hingga didapatkan ekstrak kental. 2.3.2. Identifikasi Fitokimia Senyawa
Golongan Triterpenoid Disiapkan  sampel  berupa  maserat ekstrak  metanol  herba Centella asiatica, ekstrak terpurifikasi herba Centella asiatica, standar asiaticoside, asiatic acid dan madecassic acid 0.1%. Sampel di totolkan pada plat KLT 3x10 cm dengan batas bawah 2 cm dan batas atas 1 cm dan di elusi menggunakan fase  gerak  kloroform:  asam  asetat  glasial: metanol:  akuades  (60:32:12:8  v/v).  Adapun identifikasi  adanya  senyawa asiatic acid dan madecassic acid dilakukan  dengan menotolkan  maserat,  ekstrak  terpurifikasi, asiatic acid dan madecassic acid pada  plat KLT 4x10 cm dengan batas bawah 2 cm dan batas atas 1 cm. Elusi dilakukan menggunakan fase  gerak  kloroform:  asam  asetat  glasial: metanol (95:7.5:2.5 v/v). Plat KLT hasil elusi dikeringkan  dengan  cara  diangin-anginkan pada udara terbuka, kemudian salah satu plat disemprot  menggunakan  pereaksi  semprot anisaldehid-asam sulfat.dan dipanaskan pada suhu  100℃  menggunakan hot plate selama 10 menit atau hingga terjadi perubahan warna pada area elusi sampel. Bercak yang muncul diidentifikasi  perubahan  warnanya  dan dihitung  niai  Rf  ketiga  sampel  diatas  pada sinar tampak atau cahaya visibel. 22
2.3.3. Preparasi  senyawa  non-aromatik  dan protein target yang terkait Senyawa  non-aromatik  yang  dipilih yaitu  senyawa  yang  telah  dilaporkan  pada penelitian sebelumnya dan tidak mengandung gugus aromatik, yaitu asiatic acid , madecassic acid, asiaticoside, madecassoside, ursolic acid, maslinic acid dan corosolic acid . 23,24,25
Struktur  2D  senyawa  direkonstruksi menggunakan  Marvin  Sketch  versi  16.8.1 (Gambar 1.). 26 Protein  target  yang  terkait  senyawa diperoleh  dari Comparative Toxicogenomics Database ( https://ctdbase.org/ ) yang didukung  oleh National Institute of
Environmental Health Sciences (NIEHS), dan SwissTargetPrediction ( http://www. swisstargetprediction.ch/ )  yang  didukung oleh Swiss Institute of Bioinformatics .  Data gene  interactions  disimpan  dalam  format excel (.xls). Data protein dari masing-masing senyawa dikumpulkan, digabung, dan dihapus apabila terdapat duplikasi. 27
2.3.4. Pengumpulan Protein Target terkait Luka Bakar
Protein target yang terkait dengan luka bakar  diperoleh  dengan  memasukkan  kata kunci “ burn ” dan “ burn scar ” pada basis data DisGeNET  ( https://www.disgenet.org/ )  dan Open Target ( https://platform.opentargets. org/ ).  Protein  target  yang  dikumpulkan  dari kedua  basis  data  ( database )  digabungkan dan  dihapus  apabila  terdapat  duplikasi. 28 Daftar  protein  tersebut  dibuat  jejaring  pada laman  STRING  ( https://string-db.org/ )  dan disimpan dalam format Tab-Separated Values (.tsv) untuk tahap selanjutnya.
2.3.5. Pembuatan  farmakologi  jejaring  dan analisa interaksi protein-protein Dokumen  daftar  protein  (.tsv)  dibuka dan dianalisa menggunakan Cytoscape versi 3.10.1 kemudian dilakukan filter  berdasarkan
Gambar 1. Struktur senyawa non-aromatik yang terdapat pada Centella asiatica. 23,29
“ degree centrality (DC)”  (10  –  82)  dan “ betweeness centrality (BC)” (0.01 - 0.216). Klasterisasi dilakukan dengan menggunakan ClusterONE dengan minimum size 10  dan minimum density 0.5.  Visualisasi  proses biologis  ( gene ontology )  dilakukan  dengan GOlorize  berdasarkan  proses  biologis  yang relevan. 28
2.3.6. Analisa jejaring interaksi senyawa pada protein Protein  hasil  klasterisasi  dan  protein terkait  senyawa  dielaborasi  dan  dianalisa protein yang menjadi bagian dari irisan dari kedua  data  tersebut,  kemudian  ditampikan melalui  diagram venn .  Jejaring  mode  aksi dibuat  dengan #node1 adalah  senyawa  non- aromatik  dan node2 adalah  protein  yang menjadi  irisan  pada  diagram venn serta combined score ditetapkan  dengan  nilai 0,7.  Dokumen  tersebut  disimpan  dengan format  excel  (.xls)  dan  dianalisa  jejaring menggunakan Cytoscape versi 3.10.1. Mode aksi  suatu  senyawa  ditentukan  berdasarkan pada  data gene interaction yang  terdapat di Comparative Toxicogenomics Database
( https://ctdbase.org/ ) dan dielaborasi berdasarkan referensi yang relevan. 27

## 3. Hasil Berdasarkan  hasil  purifikasi  metanol
herba Centella asiatica ekstrak,  didapatkan bahwa  maserat  yang  semula  berwarna  hijau atau  hijau  gelap  (Gambar  2A)  berubah menjadi  tak  berwarna  hingga  kuning  jernih (Gambar  2B).  Karbon  aktif  berwarna  hitam sehingga  menghasilkan  maserat  kehitaman disertai  dengan  endapan  hitam  pada  dasar tabung  sebelum  difiltrasi  (Gambar  2C). Adapun setelah evaporasi didapatkan ekstrak dengan konsistensi kental berwarna kuning.
3.1.  Identifikasi Fitokimia Senyawa Golongan Triterpenoid Skrining  fitokimia  bertujuan  untuk mengidentifikasi keberadaan senyawa asiaticoside, asiatic acid, dan madecassoside pada ekstrak terpurifikasi. Berdasarkan hasil elusi menggunakan KLT ditunjukkan bahwa ekstrak terpurifikasi mengandung asiaticoside pada Rf 0.73 (Tabel 1.) dengan warna violet atau ungu tua (Gambar 3A.). Selain itu, pada ekstrak  terpurifikasi  juga  terdapat  bercak- bercak  lain  dengan  warna  kuning  dan  hijau muda  dengan  nilai  Rf  yang  identik  pada sampel  maserat  setelah  disemprot  dengan reagen anisaldehid-asam sulfat (Tabel 1). Hasil elusi asiatic acid, dan madecassic acid , ekstrak terpurifikasi, dan maserat  pada menggunakan KLT pada Gambar 3B, terlihat bahwa  ekstrak  terpurifikasi  mengandung asiatic acid pada Rf 0.49 dengan bercak yang
Gambar 2. Hasil purifikasi ekstrak metanol Herba Pegagan ( Centella asiatica ) . Maserat(A); maserat terpurifikasi setelah difiltrasi (B); maserat setelah pemberian karbon aktif (C).
berwarna biru keunguan. Ekstrak terpurifikasi juga mengandung madecassic acid pada nilai Rf  0.21  dengan  bercak  berwarna  ungu  atau violet  (Tabel  1).  Ekstrak  terpurifikasi  dan maserat masih terdapat bercak lain berwarna hijau gelap setelah disemprot dengan reagen anisaldehid-asam sulfat (Gambar 3B).
3.2.  Jejaring interaksi protein-protein Identifikasi interaksi protein-protein ini bertujuan  untuk  menentukan  klaster  protein yang paling berpengaruh dan proses biologis yang  terjadi  pada  luka  bakar.  Hasil  analisa menunjukkan  bahwa  dari  382 node protein
didapatkan  51 node protein  dengan degree (10  -  82)  dan betweeness centrality (0.01 –  0.216).  Hasil  klasterisasi  menggunakan metode ClusterONE didapatkan  32  node protein  yakni  IL1β,  MMP1,  IL-2,  IRF4, KITLG, ICAM1, MAPK8, IL-1α, COL1A1, TGF-β1,  TNF,  XDH,  TP53,  CSF3R,  IL-6, NR3C1,  PTGS2,  VCAM1,  CD4,  TJP1,  IL- 10,  FGF-2,  IL-4,  MMP8,  PLG,  MMP-14, MMP13,  NFκB1,  SOD2,  NOX-4,  PPAR-α, dan  IFNGγ  (Gambar  4).  Selain  itu,  hasil analisa interaksi protein-protein pada Gambar 5A, menunjukkan bahwa protein TP53, IL1B dan  SOD2  memiliki degree centrality yang
Gambar 3. Profil fitokimia KLT asiatic acid (AA), dan madecassic acid (MA), ekstrak terpurifikasi (ET), maserat (M) dan asiaticoside (AS) setelah diberikan pereaksi semprot anisaldehid- asam sulfat.
Sampel Plat A (Gambar 2A) Plat B (Gambar 2B) Kloroform:asam asetat:metanol:air (80:32:12:8) Kloroform: asam asetat: metanol (95:7.5:2.5) Asiatic acid (AA) - 0.50 Madecassic acid (MA) - 0.21 Asiaticoside (AS) 0.74 - Ekstrak terpurifikasi (ET) 0.73;  0.57; 0.43; 0.53; 0.30; 0.21; 0.16; 0.09 0.49; 0.21; 0.01 Maserat (M) 0.74; 0.60; 0.44; 0.31; 0.17; 0.09 0.87; 0.51; 0.21; 0.01 Tabel 1. Nilai Rf bercak sampel pada KLT setelah disemprot anisaldehid-asam sulfat
dominan  ( continuous mapping mendekati 0.22)  dibandingkan  dengan  protein  lainnya. Protein  yang  terlibat  pada  proses  inflamasi yakni  IL-1β,  IL-1α,  TGF-1β,  TNF,  IL- 6,  VCAM,  IL10,  NF-kB1  dan  NOX. Adapun  protein  yang  terlibat  pada  proses penyembuhan luka ( wound healing ) yakni IL- 1β, IL-1α, TGF-1β, IL-6, PLG, dan PPAR-α.
3.3.  Jejaring interaksi senyawa pada protein Analisa  parameter  ini  bertujuan  untuk mengkaji  target  protein  yang  terkait  dengan senyawa  dan  mode  aksi  senyawa  pada protein.  Pada  data gene interaction pada Comparative Toxicogenomics Database , senyawa asiaticoside terkait  dengan  14 protein, asiatic acid 29 protein, corosolic acid 53 protein, madecassoside 2 protein, maslinic acid 13 protein, ursolic acid 73 protein, dan madecassic acid 100 protein. Berdasarkan data protein tersebut, hasil elaborasi data protein dari  7  senyawa  didapatkan  230  protein  dari 284 protein  setelah menghilangkan duplikasi data protein. Berdasarkan 230 protein tersebut dan  32  protein  hasil  klasterisasi  didapatkan
14 protein yang merupakan irisan dari kedua data (Gambar 5A) dan hanya 10 protein yang relevan dengan mekanisme senyawa pada luka bakar  yakni  IL-1β,  IL-6,  MAPK8,  PTGS2, NOX4,  IFN-γ,  NF-κB1,  TGF-β1,  MMP- 13,  dan  TNF  (Gambar  5B).  Pada  Gambar 4,  berdasarkan  10  protein  tersebut  diatas menunjukkan  bahwa  protein  IL1β  memiliki degree centrality dan betweenes centrality yang  paling  besar,  kemudian  diikuti  protein TNF dengan degree centrality dan betweenes centrality lebih rendah dibandingkan IL-1β.
Mode  aksi  suatu  senyawa  dikaji berdasarkan  data gene interaction pada Comparative Toxicogenomics Database dengan  kategori  stimulus  protein  ( increased expression ), menghambat protein ( decreased expression , downregulate expression, dan inhibit protein ).  Berdasarkan  hasil  kajian mode  aksi  (Gambar  5B),  didapatkan  bahwa senyawa asiatic acid menghambat protein IL- 1β, IL-6, dan MAPK8; senyawa ursolic acid menghambat  protein  IL-6,  TNF,  NF-κB1, MAPK8,  IFN-γ,  PTGS2  dan  menstimulasi TGFβ1; Madecassic acid menghambat
Gambar 4. Gen dan protein beserta proses biologis (biological process) yang terlibat pada luka bakar.
MMP13; senyawa corosolic acid mengham- bat PTGS2 dan NOX4; serta senyawa maslin- ic acid menghambat protein PTGS2.
4. Pembahasan Kandungan  bioaktif  pada Centella asiatica terkenal  dengan  4  senyawa  yakni asiatic acid, madecassic acid, asiaticoside, madecassoside yang  memiliki  aktivitas penyembuhan  luka. 17,22,29 Namun,  tidak tertutup kemungkinan adanya senyawa non- aromatik  lain  seperti ursolic acid, corosolic acid, dan maslinic acid juga telah dilaporkan memiliki aktivitas penyembuh luka. Penelitian
sebelumnya  melaporkan  bahwa ursolic acid dapat mempercepat penyembuhan luka dalam waktu kurang dari 3 hari yang ditandai dengan re-epitelisasi  lengkap. 30 Senyawa maslinic acid menurunkan  fase  inflmasi  melalui penghambatan jalur pensinyalan NF-κB dan STAT-1. 31 Adapun corosolic acid menekan inflamasi  melalui  penghambatan interleukin receptor- associated kinase (IRAK)-1 melalui jalur NF-κB. 32
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa maserat yang pada awalnya berwarna hijau tua berubah menjadi jernih tak berwarna setelah pemberian karbon aktif. Teknik tersebut telah

## A

## B
Gambar 5. (A) Gen dan protein beserta proses biologis (biological process) yang terlibat pada luka bakar, (B) Diagram irisan protein yang terkait luka bakar dan yang menjadi target aksi senyawa
dilakukan pada penelitian sebelumnya untuk menghilangkan  klorofil  pada  produk  herbal ekstrak  rosemary  dan  thyme. 33 Karbon  aktif dapat  menghilangkan  klorofil  pada  maserat dengan cara mengikat senyawa dengan gugus aromatik pada lapisan struktur karbon. 34 Kar- bon  aktif  kerap  digunakan  untuk  memurni- kan  air  atau  meminimalkan  cemaran  dalam air. 35,36 Karbon  aktif  serbuk  ( powdered acti- vated carbon ) memiliki struktur mikrokristal dengan  banyak  pori-pori  partikel.  Struktur karbon  aktif  terdiri  dari  atom  karbon  yang berikatan secara kovalen, membentuk struk- tur  heksagon  dan  tersusun  berlapis-lapis. 37
Karakteristik tersebut memungkinkan karbon aktif menyerap lebih optimal interaksi antara senyawa  organik  aromatik  melalui  interaksi phi (π- π interaction ), interaksi van der waals dan elektrostatik. 38 Oleh karena itu, senyawa golongan  klorofil,  flavonoid,  kumarin,  dan tanin  terjerap  pada  karbon  aktif  dan  meny- isakan  senyawa  non-aromatik  pada  ekstrak terpurifikasi.
Senyawa  triterpenoid  tidak  dapat diamati pada UV 254 dan 366. Oleh karena itu, visualisasi bercak pada plat KLT derivatisasi pereaksi semprot seperti asam asetat anhidrat pada reagen Liebermann-burchard dan reagen anisaldehid-asam sulfat. Metode derivatisasi senyawa  menggunakan  anisaldehid-asam sulfat  akan  terjadi  penambahan  gugus anisaldehid pada atom C-3 struktur triterpen sehingga yang semula tidak memiliki gugus kromofor  yang  dapat  terdeteksi  oleh  sinar UV,  dengan  masuknya  gugus  anisaldehid yang terikat pada rantai oksigen C-3 triterpen membentuk  struktur  aromatik.  Keberadaan asam sulfat disertai pemanasan maka struktur non-aromatik  berubah  menjadi  aromatik akibat  oksidasi  dan  resonansi  elektron  yang menghasilkan variasi warna. 39 Pada  penelitian  ini asiaticoside, madecassoside, dan asiatic acid sulit dielusi pada fase gerak yang sama. Hal ini dikarenakan gugus  gula  (glikon)  meningkatkan  polaritas senyawa sehingga terelusi lebih lambat. Pada penelitian  sebelumnya  dilaporkan  bahwa asiaticoside dan madecassoside memiliki nilai  Rf  lebih  rendah  dibandingkan  asiatic acid  dan  madecassic  acid. 22 Oleh  karena
itu,  identifikasi asiatic acid dan madecassic acid dilakukan  pada  fase  gerak  dengan polaritas rendah yakni menghilangkan air dan menurunkan  rasio  metanol  pada  fase  gerak. Penelitian  sebelumnya  melaporkan  bahwa kandungan  empat  senyawa  triterpenoid pada Centella asiatica cukup  rendah  yakni asiaticoside 0.25%, madecassoside 1.02%, asiatic acid 0.12%,  dan madecassic acid 0.54%. 40 Tanaman Centella asiatica dipercaya baik  secara  etnofarmakologi  maupun secara eksperimental mempercepat proses  penyembuhan  luka.  Kandungan bioaktif  triterpen  dilaporkan  memiliki efek  mempercepat  penyembuhan  luka. Berdasarkan hasil kajian jejaring farmakologi didapatkan  10  protein  yang  relevan  dengan mekanisme  senyawa  pada  luka  bakar beberapa  IL-1β,  IL-6,  MAPK8,  PTGS2, NOX4,  IFN-γ,  NF-κB1,  TGF-β1,  MMP13, dan  TNF.  Protein  IL-1β  dan  TNF  memiliki degree centrality dan betweenes centrality yang  besar  dibandingkan  protein  lainnya. Protein  IL-1β  merupakan  sitokin  pro- inflamasi yang berperan pada respon imunitas terhadap  infeksi  dan  kerusakan  jaringan. Adanya  kerusakan  sel  akibat  luka  bakar mengaktivasi  sel  makrofag  melalui damage associated molecular pattern (DAMP) untuk mensekresikan IL-1β (41,42). Adapun tumor necrosis factor (TNF)  merupakan sitokin  sebagai  kunci  regulasi  inflamasi dan  proses  penyembuhan  luka.  TNF  secara cepat disekresikan oleh sel endotel vaskuler, keratinosit, dan sel fibroblast pada area luka, kemudian menginisiasi fase inflamasi dengan mengundang sel leukosit ke area luka. Selain itu,  TNF  meregulasi  aktivitas  fibroblast, endotel  vaskular  dan  keratinosit  untuk mensintesis  matriks  ekstraseluler. 43 Pada penelitian ini, asiatic acid mengurangi sekresi sitokin  IL-1β  sehingga  memperpendek  fase inflamasi  dan  bergeser  ke  fase  proliferasi dan  remodeling.  Pada  fase  tersebut asiatic acid menstimulasi  fibronektin  dan sintesis  kolagen. 44 Secara  umum,  inflamasi berkaitan  dengan  dua  jalur  pensinyalan yakni  jalur  MAPK  dan  NF-κB,  kedua  jalur tersebut  merupakan second messenger
setelah aktivasi reseptor interleukin-1 (IL-1) oleh IL-1 pada saat terjadi luka bakar. 45
Proses  penyembuhan  luka  terdiri  dari 3  (tiga)  tahap  yakni  fase  inflamasi,  fase proliferasi  dan  fase  remodeling.  Pada  fase inflamasi, adanya induksi panas menyebabkan kerusakan  sel  dan  membentuk damage- associated molecular pattern molecules (DAMPs)  yang  memicu  aktivasi  makrofag menjadi  M1  makrofag  yang  mensekresikan mediator  proinflamasi.  Makrofag  membantu perubahan sel T Naïve untuk berdiferensiasi menjadi  Sel  Th1  dan  Sel  Th2.  Sel  Th1 bertanggungjawab  pada  sekresi  sitokin IL-2  dan  IFN,  sedangkan  Sel  Th2  yang mensekresikan  IL-4  dan  IL-10. 46 Sel  M1 makrofag  mensekresikan  mediator  inflamasi IL-23  yang  mempengaruhi  sel  Th-17  untuk mensekresikan  IL-17  dan  TNF-α  guna mengundang  leukosit  ke  tempat  luka  untuk meminimalkan adanya infeksi. 44,47 Pada  penelitian  ini  kami  menemukan bahwa protein IL-1β, IL-6, MAPK8, PTGS2, IFN-γ,  NF-κB1,  dan  TNF  merupakan protein yang terlibat dalam proses inflamasi. Senyawa  asiatic  acid  menekan  IL-1β  dan IL-6 dengan mekanisme penghambatan pada NF-κB1  sebagai  faktor  inflamasi.  Senyawa triterpenoid  mengurangi  inflamasi  dengan menurunkan  pelepasan  TNF-α,  IL-1β,  dan IL-6 serta menghambat ekspresi iNOS, COX- 2 dan NF-kB. 44,48
Fase  proliferasi  berkaitan  dengan perbanyakan  sel  keratin  ( keratinocyte )  dan sel  fibroblas.  Fase  proliferasi  umumnya terjadi  secara  tumpang  tindih  ( overlapping ) dengan fase remodeling yang ditandai dengan perbanyakan  sel  keratin  ( keratinocyte )  dan sel  fibroblas  melalui  sitokin  dan  faktor pertumbuhan. Asiaticoside dilaporkan meningkatkan migrasi sel keratin ke area luka melalui  peningkatan  ekspresi  gen  Rac1  dan ThoA  serta  menginduksi  fosforilasi  protein ERK dan p38 MAPK. 49,50
Fase remodeling diperankan  oleh aktivasi  TGF-β  yang  diproduksi  oleh  sel M2  makrofag.  Penelitian  ini  didapatkan bahwa NOX4, TGF-β1, dan MMP13 terlibat pada  proses  remodeling.  Senyawa ursolic acid memacu  TGF-β1  yang  berperan  pada
differensiasi  sel  fibroblas    untuk  sintesis matrik  ekstraseluler,  sedangkan madecassic acid menghambat  MMP13.  Adanya  TGF-β akan  mengaktivasi  reseptor  TGF-β1  dan TGF-β2  yang  bertanggungjawab  pada proliferasi  sel  fibroblas,  differensiasi sel  fibroblast  menjadi  myofibroblas  dan sekresi  kolagen,  serta  menekan  enzim matrixs  metalloproteinase/MMP. 44 Setelah tercapainya  jumlah  myofibroblas  maka sel  Th1  berperan  dalam  menekan  aktivitas myofibroblas dengan melepaskan IFN-γ dan IL12. 51 Senyawa asiatic acid dan ursolic acid menekan  ekspresi  TGF-β  melalui penghambatan  fosforilasi  Smad  2/3  dan peningkatan kadar Smad7 (52,53). Penelitian sebelumnya  juga  melaporkan  bahwa ursolic acid menghambat  menurunkan  ekspresi  gen TGF-β  melalui  aktivasi  jalur  Nrf2/HO-1. 54 Namun, hal tersebut berbeda dengan penelitian sebelumnya  yang    melaporkan  bahwa ursolic acid mempercepat  penyembuhan luka  setelah  pemberian ursolic acid 0.2%. 55 Adapun NOX4 dihambat oleh corosolic acid padahal  NOX4  berperan  dalam  diferensiasi fibroblas.  Pada  penelitian  sebelumnya dilaporkan  bahwa  hambatan  NOX4  tidak berpengaruh  signifikan  pada  diferensiasi fibroblas  karena  TGF-β  merupakan  faktor kunci  diferensiasi  fibroblast. 56 Oleh  karena itu,  pada  penelitian  ini  mengungkap  bahwa senyawa  non-aromatik  pada  herba Centella asiatica dimungkinkan  dapat  mempercepat penyembuhan  luka  bakar  dengan  cara menekan  mediator  proinflamasi  dan  jalur pensinyalannya serta menekan enzim MMP. Penelitian selanjutnya masih memungkinakn untuk  dilakukan  guna  mengkaji  senyawa non-aromatik pada penyembuhan luka bakar secara in vitro dan in vivo untuk  mengukur parameter  makroskopis,  mikroskopis  dan molekuler.
5. Conclusion
Penambahan karbon aktif pada ekstrak metanol  herba Centella asiatica dapat menhilangkan  pigmen  daun  dan  senyawa aromatik.  Ekstrak  terpurifikasi  mengandung senyawa asiaticoside, asiatic acid dan madecassic acid pada hasil KLT. Hasil kajian
farmakologi  jejaring  menunjukkan  bahwa senyawa  non-aromatik  pada  herba Centella asiatica menghambat  pelepasan  mediator proinflamasi  dan  jalur  pensinyalannya serta  menekan  enzim  MMP  pada  proses penyembuhan luka.

## Ucapan Terimakasih
Peneliti  mengucapkan  terimakasih  kepada Kementerian Pendidikan, Kebudayaan, Riset, dan Teknologi (Kemdikbudristek) atas penda- naan hibah penelitian tahun anggaran 2023.

## Referensi
1.  Wardhana A, Basuki A, Prameswara ADH,
Rizkita DN, Andarie AA, Canintika AF. The epidemiology of burns in Indonesia’s national referral burn center from 2013 to 2015. Burns Open. 2017;1(2):67–73.
2.  Utami  AM,  Elfiah  U,  Wisudanti  DD. Assessments  of  quality  of  life  in  burn patients  after  hospital  treatment  in Jember. Jurnal Kedokteran dan Kesehatan Indonesia. 2020;11(2):157–64.
3.  Spronk  I,  Legemate  CM,  Dokter  J,  van Loey  NEE,  van  Baar  ME,  Polinder  S. Predictors of health-related quality of life after burn injuries: A systematic review. Critical Care. 2018;22(1):1–13.
4.  Spronk I, Legemate C, Oen I, van Loey N,  Polinder  S,  van  Baar  M.  Health related quality of life in adults after burn injuries: A systematic review. PLoS ONE. 2018;13(5):1–21.
5.  Kosalwatna S, Shaipanich C, Bhanganada K. The effect of one percent centella asiatica cream on chronic ulcers. 1988 [cited 2023 Dec  8];  Available  from:  http://imsear. searo.who.int/handle/123456789/138303
6.  Somboonwong J, Kankaisre M, Tantisira B,  Tantisira  MH.  Wound  healing activities of different extracts of Centella asiatica  in  incision  and  burn  wound models :  an  experimental  animal  study. BMC  Complementary  and  Alternative Medicine. 2012;12(1):1.
7.  Wu  F,  Bian  D,  Xia  Y,  Gong  Z,  Tan  Q, Chen  J,  et  al.  Identification  of  Major Active Ingredients Responsible for Burn Wound  Healing  of  Centella  asiatica
Herbs. 2012;2012.
8.  Kimura  Y,  Sumiyoshi  M,  Samukawa  K ichi, Satake N, Sakanaka M. Facilitating action  of  asiaticoside  at  low  doses  on burn  wound  repair  and  its  mechanism. European Journal of Pharmacology. 2008 Apr;584(2–3):415–23.
9.  Awaluddin  R,  Nugrahaningsih  DAA, Solikhah  EN.  The  concentration- dependent pro-fibrotic effect of metformin on  LPS  and  high  glucose  induced fibroblast NIH 3T3 and macrophage raw 264.7 cell co-culture. Medical Journal of Malaysia. 2020;75(May):10–3.
10. Awaluddin  R,  Nugrahaningsih  DAA, Solikhah  EN,  Chabib  L.  The  Effect of  Asiatic  Acid  and  Metformin  on the  Viability  Percentage  of  Mouse Macrophage  Cell  Lines  RAW264.7  and Mouse  Fibroblast  Cell  Lines  NIH3T3. IOP  Conference  Series:  Earth  and Environmental Science. 2020;448(1).
11. Abbas    manal  mohammad,  Ar-rawi N,  Abbas  M  ahmad,  Al-khateeb  I. Naringenin  potentiated  β-sitosterol healing  effect  on  stracth  wound  assay. Research  in  Pharmaceutical  Sciences. 2019;14(6):566–73.
12. Jewo  PI,  Fadeyibi  IO,  Babalola  OS, Saalu  LC,  Benebo  AS,  Izegbu  MC,  et al. A  Comparative  Study  of  the  Wound Healing  Properties  of  Moist  Exposed Burn  Ointment  (MEBO)  and  Silver Sulphadiazine. Annals  of  burns  and  fire disasters. 2009;22(2):79–82.
13. Küpeli  Akkol  E,  Renda  G,  İlhan  M, Bektaş  NY.  Wound  healing  acceleration and  anti-inflammatory  potential  of Prunella  vulgaris  L.:  From  conventional use  to  preclinical  scientific  verification. Journal of Ethnopharmacology. 2022 Sep 15;295:115411.
14. Farida D, Hidayathillah AP, Firdaus SD. Perbandingan  Efektivitas  Daun  Sesu (Chromolaena  odorata)  dengan  Salep Madecassol terhadap Luka Bakar Derajat IIA pada Mencit (Mus musculus).
15. Seong  E,  Heo  H,  Sang  Jeong  H,  Lee H,  Lee  J.  Enhancement  of  bioactive compounds  and  biological  activities  of
Centella  asiatica  through  ultrasound treatment.  Ultrasonics  Sonochemistry. 2023;94(March):106353.
16. Harwoko,  Pramono,  Nugroho  A  Endro. Triterpenoid-rich    fraction    of    Centella asiatica  leaves  and  in  vivo antihypertensive activity. 2014;21(1):149–54.
17. Chong  NJ,  Aziz  Z.  A  systematic review  on  the  chemical  constituents  of Centella  asiatica.  Research  Journal  of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. 2011;2(3):445–59.
18. Moon GH, Lee Y, Kim EK, Chung KH, Lee KJ, An JH. Immunomodulatory and Anti-inflammatory Effects of Asiatic Acid in  a  DNCB-Induced  Atopic  Dermatitis Animal  Model.  Nutrients.  2021  Jul 17;13(7):2448.
19. Lv  H,  Qi  Z,  Wang  S,  Feng  H,  Deng X,  Ci  X.  Asiatic  Acid  Exhibits  Anti- inflammatory  and Antioxidant Activities against
Lipopolysaccharide and d-Galactosamine-Induced Fulminant Hepatic Failure. Frontiers in Immunology [Internet].  2017  [cited  2023  Dec  22];8. Available  from:  https://www.frontiersin. org/articles/10.3389/fimmu.2017.00785 20. Noor  F,  Tahir  ul  Qamar  M,  Ashfaq UA,  Albutti  A,  Alwashmi  ASS,  Aljasir MA.  Network  Pharmacology  Approach for  Medicinal  Plants:  Review  and Assessment.  Pharmaceuticals.  2022
May;15(5):572. 21. Uduwana S, Abeynayake
N, Wickramasinghe I. Synergistic, antagonistic,  and  additive  effects  on  the resultant antioxidant activity in infusions of  green  tea  with  bee  honey  and  Citrus limonum extract as additives. Journal of Agriculture and Food Research. 2023 Jun 1;12:100571.
22. James  J,  Dubery  I.  Identification  and quantification  of  triterpenoid  centelloids in  Centella  asiatica  (L.)  Urban  by densitometric  TLC.  Journal  of  Planar Chromatography  -  Modern  TLC. 2011;24(1):82–7.
23. Arribas-López  E,  Zand  N,  Ojo  O, Snowden  MJ,  Kochhar  T. A  Systematic Review of the Effect of Centella asiatica
on  Wound  Healing.  IJERPH.  2022  Mar 10;19(6):3266.
24. Sun  B,  Wu  L,  Wu  Y,  Zhang  C,  Qin  L, Hayashi  M,  et  al.  Therapeutic  Potential of  Centella  asiatica  and  Its  Triterpenes: A  Review.  Front  Pharmacol.  2020  Sep 4;11:568032.
25. Bylka W, Znajdek-Awiżeń P, Studzińska- Sroka  E,  Dańczak-Pazdrowska  A,
Brzezińska  M.  Centella  asiatica  in Dermatology:  An  Overview:  THE EXPERIMENTS ABOUT USE OF  CENTELLA  ASIATICA  IN DERMATOLOGY.  Phytother  Res.  2014 Aug;28(8):1117–24.
26. Nursamsiar  N,  M.  Mangande  M, Awaluddin A, Nur S, Asnawi A. In Silico Study  of  Aglycon  Curculigoside  A  and Its  Derivatives  as  α-Amilase  Inhibitors. Indonesian  Journal  of  Pharmaceutical Science and Technology. 2020;7(1):29.
27. Rubianto Tjandrawinata R, Winda Amalia A,  Tuna  H,  Novalinda  Saidi  V,  Tan  S, Tradisional Tiongkok P, et al. Mekanisme
Molekuler Imunomodulasi oleh Huangqi (Astragali  Radix)  Menggunakan  Sistem Farmakologi Jejaring (Molecular Mechanisms of Network Pharmacology- Based  Immunomodulation  of  Huangqi (Astragali Radix)). Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia. 2022;20(2):184– 95.
28. Fan  J,  Zhou  J,  Qu  Z,  Peng  H,  Meng  S, Peng  Y,  et  al.  Network  Pharmacology and  Molecular  Docking  Elucidate  the Pharmacological  Mechanism  of  the OSTEOWONDER  Capsule  for  Treating Osteoporosis.  Frontiers  in  Genetics. 2022;13(February):1–13.
29. Sun  B,  Wu  L,  Wu  Y,  Zhang  C,  Qin  L, Hayashi  M,  et  al.  Therapeutic  Potential of  Centella  asiatica  and  Its  Triterpenes: A  Review.  Frontiers  in  Pharmacology. 2020;11(September):1–24.
30. Saeidinia  A,  Keihanian  F,  Lashkari  AP, Lahiji HG, Mobayyen M, Heidarzade A, et al. Partial-thickness burn wounds healing by  topical  treatment:  A  randomized controlled  comparison  between  silver sulfadiazine  and  centiderm.  Medicine
(United States). 2017;96(9).
31. Lee W, Kim J, Park EK, Bae JS. Maslinic Acid  Ameliorates  Inflammation  via  the Downregulation  of  NF-κB  and  STAT- 1.  Antioxidants  (Basel).  2020  Jan 25;9(2):106.
32. Kim  SJ,  Cha  JY,  Kang  HS,  Lee  JH, Lee  JY,  Park  JH,  et  al.  Corosolic  acid ameliorates  acute  inflammation  through inhibition  of  IRAK-1  phosphorylation in  macrophages.  BMB  Rep.  2016  May 31;49(5):276–81.
33. Tzima  K,  Brunton  NP,  Rai  DK. Evaluation  of  the  impact  of  chlorophyll removal  techniques  on  polyphenols  in rosemary and thyme by‐products. J Food Biochem [Internet]. 2020 Mar [cited 2023 Dec  10];44(3).  Available  from:  https:// onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/ jfbc.13148
34. Villacañas  F,  Pereira  MFR,  Órfão  JJM, Figueiredo  JL.  Adsorption  of  simple aromatic  compounds  on  activated carbons. Journal of Colloid and Interface Science. 2006 Jan 1;293(1):128–36.
35. Gaydukova  AM,  Nenasheva  AS, Kolesnikov  VA,  Vetlugin  NA.  The Extraction  of  Activated  Carbon  from Aqueous  Solutions  in  the  Presence  of Organic and Inorganic Compounds by the Electroflotation Method. Journal of Water Chemistry  and  Technology  2021  43:2. 2021 Jun 8;43(2):116–22.
36. Oesterle P, Lindberg RH, Fick J, Jansson S.  Extraction  of  active  pharmaceutical ingredients  from  simulated  spent activated  carbonaceous  adsorbents. Environmental  Science  and  Pollution Research. 2020;27(20):25572–81.
37. Sujiono  EH,  Zabrian  D,  Zurnansyah, Mulyati,  Zharvan  V,  Samnur,  et  al. Fabrication  and  characterization  of coconut  shell  activated  carbon  using variation  chemical  activation  for wastewater treatment application. Results  in  Chemistry.  2022;4(November 2021):100291.
38. Jawad  AH,  Abdulhameed  AS,  Mastuli MS.  Mesoporous  Crosslinked  Chitosan- Activated  Charcoal  Composite  for
the  Removal  of  Thionine  Cationic Dye:  Comprehensive  Adsorption  and Mechanism  Study.  Journal  of  Polymers and  the  Environment.  2020  Mar 1;28(3):1095–105.
39. Agatonovic-Kustrin  S,  Kustrin  E, Gegechkori  V,  Morton  DW.  High- performance  thin-layer  chromatography hyphenated  with  microchemical  and biochemical derivatizations in bioactivity profiling  of  marine  species.  Marine Drugs. 2019;17(3):1–14.
40. Sawatdee  S,  Choochuay  K,  Chanthorn W, Srichana T. Evaluation of the topical spray containing Centella asiatica extract and  its  efficacy  on  excision  wounds  in rats. Acta Pharm. 2016 Jun 1;66(2):233–
44. 41. Lopez-Castejon G, Brough D. Understanding  the  mechanism  of  IL-1β secretion.  Cytokine  Growth  Factor  Rev. 2011 Aug;22(4):189–95. 42. Wilson SE. Interleukin-1 and Transforming  Growth  Factor  Beta: Commonly  Opposing,  but  Sometimes Supporting,  Master  Regulators  of  the Corneal  Wound  Healing  Response  to Injury.  Investigative  Ophthalmology  & Visual Science. 2021 Apr 15;62(4):8.
43. Ritsu M, Kawakami K, Kanno E, Tanno H,  Ishii  K,  Imai  Y,  et  al.  Critical  role of  tumor  necrosis  factor-α  in  the  early process of wound healing in skin. Journal of Dermatology & Dermatologic Surgery. 2017 Jan 1;21(1):14–9.
44. Diniz  LRL,  Calado  LL,  Duarte  ABS, de  Sousa  DP.  Centella  asiatica  and  Its Metabolite Asiatic Acid: Wound Healing Effects  and  Therapeutic  Potential. Metabolites. 2023;13(2).
45. Xiao K, Liu C, Tu Z, Xu Q, Chen S, Zhang Y,  et  al.  Activation  of  the  NF-κB  and MAPK  Signaling  Pathways  Contributes to the Inflammatory Responses, but Not Cell Injury, in IPEC-1 Cells Challenged with  Hydrogen  Peroxide.  Oxidative Medicine  and  Cellular  Longevity.  2020 Jan 21;2020:e5803639.
46. Penatzer JA, Srinivas S, Thakkar RK. The role of macrophages in thermal injury.
International  Journal  of  Burns  and Trauma. 2022;12(1):1. 47. Lateef  Z,  Stuart  G,  Jones  N,  Mercer
A,  Fleming  S,  Wise  L.  The  cutaneous inflammatory  response  to  thermal  burn injury  in  a  Murine  model.  International Journal of Molecular Sciences.
2019;20(3).
48. Xu  X,  Si  L,  Xu  J,  Yi  C,  Wang  F,  Gu W,  et  al.  Asiatic  acid  inhibits  cardiac hypertrophy  by  blocking  interleukin-1β- activated  nuclear  factor-κB  signaling  in vitro  and  in  vivo.  Journal  of  Thoracic Disease. 2015;7(10):1787–97.
49. Lee  JH,  Kim  HL,  Lee  MH,  You  KE, Kwon  BJ,  Seo  HJ,  et  al.  Asiaticoside enhances  normal  human  skin  cell migration, attachment and growth in vitro wound  healing  model.  Phytomedicine : international  journal  of  phytotherapy and  phytopharmacology.  2012  Oct 15;19(13):1223–7.
50. Singkhorn  S,  Tantisira  MH,  Tanasawet S,  Hutamekalin  P,  Wongtawatchai  T, Sukketsiri  W.  Induction  of  keratinocyte migration  by  ECa  233  is  mediated through FAK/Akt, ERK, and p38 MAPK signaling.  Phytotherapy  Research.  2018 Jul 1;32(7):1397–403.
51. Korkmaz  HI,  Flokstra  G,  Waasdorp  M, Pijpe A, Papendorp SG, de Jong E, et al. The Complexity of the Post-Burn Immune Response: An Overview of the Associated Local and Systemic Complications. Cells. 2023;12(3).
52. Bian  D,  Zhang  J,  Wu  X,  Dou  Y,  Yang Y,  Tan  Q,  et  al.  Asiatic  Acid  Isolated From  Centella  Asiatica  Inhibits  TGF- β  1-induced  Collagen  Expression  in Human  Keloid  Fibroblasts  via  PPAR- γ  Activation.  International  Journal  of Biological Sciences. 2013;9:1032–42.
53. Ruan JS, Zhou H, Yang L, Wang L, Jiang
ZS, Sun H, et al. Ursolic acid attenuates TGF-b1-induced epithelial-mesenchymal transition in NSCLC by targeting integrin Avb5/MMPs
signaling.
Oncology Research. 2019;27(5):593–600. 54. Pei J, Wu M, Cai S, Peng J, Zhan X, Wang D, et al. The Protective Effect of Ursolic Acid
on Unilateral Ureteral Obstruction in Rats by Activating the Nrf2/HO-1 Antioxidant Signaling  Pathway.  Computational Intelligence and Neuroscience. 2022 Aug 25;2022:e3690524.
55. Lv H, Zhao M, Li Y, Li K, Chen S, Zhao W, et al. Electrospun Chitosan–Polyvinyl Alcohol  Nanofiber  Dressings  Loaded with  Bioactive  Ursolic  Acid  Promoting Diabetic Wound Healing. Nanomaterials. 2022 Jan;12(17):2933.
56. Lévigne  D,  Modarressi  A,  Krause  KH, Pittet-Cuénod  B.  NADPH  oxidase  4 deficiency leads to impaired wound repair and  reduced  dityrosine-crosslinking,  but does not affect myofibroblast formation. Free  Radic  Biol  Med.  2016  Jul;96:374– 84.