## PENETAPAN KADAR KOFEIN DALAM MINUMAN BERNERGI YANG BEREDAR DI PASARAN DENGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
Afdhil Arel 1) , B.A. Martinus 1) , Romi Nofiandri 1)
1) Sekolah Tinggi Farmasi Indonesia Yayasan Perintis Padang

## INTISARI
Telah dilakukan penelitian tentang penetapan kadar kofein dalam minuman berenergi yang beredar  dipasaran  secara  Kromatografi  Cair  Kinerja  Tinggi.  Minuman  energi  ini  difraksinasi dengan  kloroform.  Hasil  fraksi  kloroform  diuapkan  dengan rotary  evaporator .  Kadar  kofein diukur dengan kromatografi cair kinerja tinggi menggunakan kolom LC- 20AD dengan panjang 25 cm  dan  detektor  SPD-20MAD  dengan  panjang  gelombang  272nm.  Fase  gerak  yang  digunakan Metanol  :  Air  (50:50)dengan  laju  alir 1  mL/menit.  Dari  hasil  penelitian  didapatkan  kadar  kofein dalam 1 botol sampel Kr =27,73 mg,  M =34,14 mg, , Pm=28,41 mg dan sampel Lv =69,78 mg. Hasil tersebut sampel Lv  yang melebihi batas yang telah ditentukan oleh  SNI No. 01-6684-2002 yaitu kurang dari 50 mg persaji.
Kata Kunci : KCKT (Kromatografi cair kinerja tinggi, Koffein

## ABSTRACT
This research is telling about estimating amount of coffeine cosumption in energy drink which  available  in  the  market  with  HPLC  method.  Energy  drink  filtrat  fractionated  with chloroform  and  chloroforom  fractionation  evaporated  by  rotary  evaporator.  Coffein  amount measured by HPLC using column LC- 20 AD ( Length 20 cm ) and detector SPD – 20 MAD (λ 272 nm) with mobile phase methanol : water (50:50).  Amount  estimating  of  coffein  from  this research  in  1  bottle  Sample Kr =27,7264 mg, M =34,140 mg, Pm=28,41 mg and sample Lv= 69,78 mg. The results sample Lv that exceed the limit set by SNI Num. 01-6684-2002 is less than 50 mg.
Keywords: HPLC(high performance liquid chromatography), Coffeine

## PENDAHULUAN
Kesehatan merupakan keadaan sejahtera  dari  badan,  jiwa  dan  sosial  yang memungkinkan setiap orang hidup produktif secara  sosial  dan  ekonomis.  Dan  upaya kesehatan adalah kegiatan untuk memelihara dan meningkatkan kesehatan yang dilakukan oleh  pemerintah  atau  masyarakat.  Setiap orang  memiliki  hak  yang  sama  dalam memperoleh derajat kesehatan yang optimal. Dalam rangka peningkatan  derajat  kesehatan  masyarakat maka pemerintah  telah mengusahakan berbagai  cara  dan  upaya  sebagaimana dijelaskan dalam Undang  –  Undang No. 23 tahun 1992, yaitu penyelenggaraan kesehatan sebagaimana dimaksudkan dalam  pasal  10  yang  dilakukan  melalui beberapa  kegiatan,  dimana  salah  satu  dari kegiatan  itu  adalah  pengamanan  makanan
dan  minuman  (Departemen  Kesehatan, 1992).
Di  kota  Padang  banyak  dijual minuman  berenergi  yang  sebagian  besar pembeli  atau  pengguna  minuman  berenergi adalah para pengemudi kendaraan, khususnya  para  supir  bus  antar  kota. Minuman  berenergi  memungkinkan  para supir  untuk  selalu  waspada  saat  berkendara, karena  minuman  berenergi  dapat  memberi efek tidak mudah lelah dan ngantuk, karena di  dalam  minuman  berenergi  terdapat komposisi  kofein  yang  berperan  sebagai  zat aktif  yang  dapat   menimbulkan    efek    tidak mudah  ngantuk  dan  dapat  menjaga  stamina tubuh.  Kofein  sebagai  zat  stimulan  tingkat sedang  memang  seringkali  dituding  sebagai penyebab  kecanduan.  Hal  tersebut  tidak sepenuhnya  benar,  kafein  hanya  dapat menimbulkan  kecanduan  jika  dikonsumsi
dalam jumlah yang sangat banyak dan rutin. Namun  kecanduan  kofein  berbeda  dengan kecanduan obat psikotropika, karena gejalanya  akan  hilang  dalam  satu  dua  hari setelah konsumsi (Moore, 2001).
Pemerintah telah menetapkan standar  kofein  pada  minuman  berenergi yaitu  SNI  No  01-6684-2002  tentang minuman  berenergi.  Tujuan  dari  SNI tersebut adalah untuk melindungi konsumen dari  efek  negatif  kafein  yang  berlebih. Namun  disisi  lain,  konsentrasi  kofein  yang telah  ditentukan  tersebut  tidak  memberikan efek  stamina  yang  instan  bagi  konsumen, sehingga  dimungkinkan  ada  produsen  yang meningkatkan kadar kafeinnya untuk menghasilkan efek yang cepat bagi pengkonsumsinya.  Kadar  maksimum  pada minuman  berenergi  berdasarkan  peraturan menurut SNI No 01-6684- 2002 yaitu 50 mg persaji (SNI, 2002).
Dari uraian tersebut penulis tertarik untuk melakukan penelitian apakah kandungan kofein dalam minuman berenergi kemasan  botol  yang  beredar  di  daerah  kota Padang memenuhi syarat atau tidak. Metode yang  digunakan  dalam  penetapan  kadar kofein  pada  minuman  berenergi  kemasan botol  yang  beredar  di  daerah  kota  Padang, yaitu  menggunakan  metoda  kromatografi cair  kinerja  tinggi  (KCKT).  Pemilihan Metode  ini  dikarenakan  waktu  analisis cepat,  daya  pisah  baik  memiliki  kepekaan yang  tinggi      bisa    untuk      molekul      besar dan kecil mudah untuk memperoleh kembali cuplikan (Johnson & Stevenson, 1991).

## METODE PENELITIAN
Bahan
Minuman berenergi, etanol,
reagen  Parry,  NH4OH  pekat,  asam klorida,  kalium  klorat,  natrium  sulfat, kloroform  p.a,  aquabidest,  metanol  p.a, kofein pembanding kimia.

## Alat
Alat-alat  yang  digunakan  dalam penelitian meliputi : HPLC SHIMADZU, UV-    VIS detector ,  kolom  vp  ods  C18 dengan    panjang  kolom    50    x    4,6, Volume    injector    (20  µL),  timbangan analitik, labu ukur, pipet ukur, erlenmeyer,  gelas  piala,  corong,  pipet tetes,  cawan  penguap,  batang  pengaduk,
corong pisah, penyaring membrane milipore 0,22 mm, alat untuk menghilangkan  gas  yang  terdapat  dalam larutan (Branson 1800), rotary
evaporator , kertas saring

## PROSEDUR PENELITIAN Pengambilan Sampel
Sampel  yang  diambil  adalah  Minuman berenergi  dari  merek  Kr,  Pm,  Lv  dan  M yang  beredar  di  pasaran  kota  Padang.  Dari masing-  masing  produk  diambil  empat sampel  dengan  nomor  batch,  tanggal kadaluwarsa  dan  waktu  produksi  yang sama, sehingga sampel dianggap homogen.

## Ekstraksi Kofein dalam Sampel
Siapkan minuman  berkofein  seperti minuman berenergi, ambil sebanyak
50mL.  Masukan  ke  corong  pisah  dan difraksinasi dengan 4 x   25 mL kloroform selama 15 menit. Kloroform akan memisahkan  kafein  dari  minuman,  akan terbentuk  2  lapisan  air  dan  kloroform. Kemudian  lapisan  kloroform  dipisahkan, gabungkan  hasil  fraksinasi  dari  masing- masing  kloroform.  Tambahkan  Na2SO4 anhidrat  yang  berfungsi  sebagai  pengikat air  pada  kloroform,  kemudian  disaring. Kloroform hasil saringan diuapkan menggunakan rotary  evaporator maka akan terbentuk ekstrak kental

## Pembuatan larutan Standar
Timbang  50   mg   kofein standar, dilarutkan dengan    air    dalam    labu  ukur  100  mL, kemudian  tambahkan  aquabidest  sampai tanda  batas  hingga  didapatkan  konsentrasi kafein standar 500 µg/mL.
Penentuan dan Pemilihan Kondisi Analisa a. Panjang gelombang serapan maksimum
Dibuat  larutan  standar  kofein    15 µg/mL dengan melakukan pengenceran dari      larutan    standar  500  µg/mL. Kemudian  diukur  serapannya  dengan spektrofotometerdidapatkan panjang gelombang  272 nm.
b. Fase gerak Fase  gerak  yang  digunakan  adalah methanol  :  air    dengan  perbandingan (50:50).
c. Kecepatan alir
Kecepatan  alir  yang  digunakan adalah  0,8  mL/menit  dan  1,0 mL/menit. Untuk  pemilihan kondisi analisa, dibuat larutan standar kofein 30 µg/mL dengan melakukan pengenceran  dari    larutan    standar kofein    500  µg/ml.  Kemudian diinjeksikan larutan tersebut sebanyak 20 µL ke alat KCKT pada panjang gelombang maksimum, dengan kecepatan 0,8 mL/menit dan 1,0  mL/menit,  dengan  fase  gerak metanol : air (50:50).

## Pembuatan kurva kalibrasi
Dari larutan standar kofein dengan konsentrasi  500  µg/mL,  dipipet   0,2; 0,4;  0,6;  0,8;  dan  1  mL  berturut-turut dan  dimasukkan  kedalam  labu  ukur  10 mL, dicukupkan volumenya dengan fase gerak  sampai  tanda  batas  hingga diperoleh konsentrasi 10, 20, 30, 40 dan 50  µg/mL.  Kemudian  masing-  masing konsentrasi  diinjeksikan  sebanyak  20 µL  ke  alat  KCKT  dengan  kondisi analisa terpilih, lalu dianalisis hubungan antara  konsentrasi  dengan  luas  puncak kromatogram  dan  dicari  persamaan regresi linearnya.
Validasi Metoda Analisis

## a.
Linieritas
Larutan  standar  dengan  konsentrasi 10,  20,  30,  40  dan  50  µg/mL diinjeksikan  sebanyak  20  µl  ke dalam sistem KCKT. Kurva kalibrasi  dibuat  dengan  memplot konsentrasi  dan  luas  puncak  pada masing-masing  konsentrasi.  Harga koefisen  korelasi  (r)  ditentukan dengan persamaan regresi linier : y = a + bx.
b. Sensitifitas Sensitifitas ditentukan dari perhitungan nilai batas  deteksi (BD) dan  nilai  batas  kuantitasi  (BK). Penentuan BD dan BK dihitung dari persamaan  regresi  kurva  kalibrasi
yang  diperoleh  dan  dari  data simpangan baku.
c. Presisi Larutan standar kofein dengan konsentrasi 40 µg/mL, dipipet 0,1 mL. Kemudian dimasukkan ke labu ukur 10 mL dan dicukupkan volumenya dengan fase gerak. Lalu saring  dengan penyaring  membrane  milipore  0,22
mm dan  diinjeksikan 20 µl ke sistem KCKT, dielusi dengan fase  gerak  yang.  Percobaan  dilakukan sebanyak 5 kali. Lalu dihitung simpangan baku dan koefisien variasinya (KV).

## Penetapan Kadar Kofein
Ekstrak Sampel dicukupkan dengan methanol sampai 10 mL, di  pipet 3  mL  masukan  dalam  labu  10  mL cukupkan  dengan  methanol,  sehingga terbentuk  larutan  ekstrak  kemudian  di pipet  2  mL  encerkan  dengan  methanol dalam labu 50 mL , Hasil yang  diperoleh diinjeksikan  20  µL  ke  alat  KCKT.
Kromatogram yang diperoleh dibandingkan dengan  kromatogram baku pembanding dan kadarnya dihitung dengan menggunakan kurva kalibrasi.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Hasil
Setelah dilakukan penelitian tentang penetapan kadar kofein dalam minuman berenergi secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), maka diperoleh hasil sebagai berikut :
1. Identifikasi  kofein  dalam  sampel dengan menggunakan reagen   Parry memberikan  hasil  negatif,      reaksi murexid  memberikan  hasil  yang positif,  reaksi  murexid  memberikan warna merah keunguan yang menandakan  adanya  kofein  dalam sampel.
2. Penentuan  dan  pemilihan  kondisi analisa  dilakukan  pada  fase  gerak metanol : air dengan tiga perbandingan dan laju alir 0,8 dan 1 mL/menit.  Pada  laju  alir  0,8 ml/menit dengan fase gerak  metanol : air (20:80) diperoleh waktu retensi
kofein  pada  7,454  menit  dengan jumlah  plat  teoritis  17094.158  dan nilai  HETP  8,775.  Pada  fase  gerak metanol  :  air  (70:30)  diperoleh waktu  retensi  kofein  4,694  menit dengan jumlah plat teoritis 2075.508 dan nilai HETP 72,271 . Sedangkan untuk laju alir  1  ml/menit pada  fase gerak metanol : air (50:50) diperoleh waktu  retensi  kofein  lebih  cepat 3,554  menit  dengan  jumlah  plat teoritis  5416.594  dan  nilai  HETP 27,639 .
3. Pada  pembuatan  kurva  kalibrasi dengan pelarut  metanol menggunakan sederetan larutan standar  (10,  20,  30,  40,  dan     50 µg/mL) diperoleh persamaan regresi linear y = a + bx. 4. Untuk pengujian linearitas, berdasarkan perhitungan statistik regresi linier diperoleh nilai koefisien korelasi  untuk  baku  kofein  adalah 0,9995.
5. Untuk  batas  deteksi  dan  batas kuantitasi,  dari  hasil  pengujian diperoleh  batas  deteksi  kofein  pada konsentrasi 1,806913532 µg/mL dan batas  kuantitasi  pada  konsentrasi 6,023045  µg/mL.
6. Dari  hasil  uji  presisi  dengan  baku kofein konsentrasi 40 µg/ml
diperoleh  nilai  simpangan  baku 6,46510      dan  KV    1,598%.
Perhitungan  kadar  kofein  dalam  1 botol  (150  mL),  Sampel  Kr  =27,73 mg,  sampel  M  =34,14  mg,  sampel Lv  =69,78  mg,  sampel  Pm=28,41 mg

## Pembahasan
Pada penelitian ini digunakan empat sampel  minuman  energi  yang  beredar  di pasaran  kota  padang  pemilihan  sampel  ini dikarenakan banyak dikonsumsi oleh masyarakat,  dan  dikatakan  juga  memiliki kadar kofein yang tinggi .
Berdasarkan  SNI  tentang  minuman energi  ,  kadar  kofein  yang  terdapat  pada Minuman  energi  kurang  dari  50  mg  .  Oleh karena  itu  perlu  kiranya  di  lakukan penelitian untuk mengetahui dan menetukan kadar  konsumsi  kofein  dalam  Minuman energi.  Untuk  data  pendukung    dilakukan analisis  kualitatif  dan  kuantitatif  dari  kofein
pada sampel minuman energi .
Untuk menarik kofein dalam minuman energi dilakukan fraksinasi dengan kloroform  karena  kofein  larut  dalam  6 bagian  kloroform.  Metoda  fraksinasi  ini dilakukan  dalam  corong  pisah.  Setelah fraksinasi  selesai,  seluruh  fraksi  kloroform digabungkan dan diuapkan dengan menggunakan rotary  evaporator .  Proses penguapan  berjalan  dalam  keadaan  vakum sehingga  kloroform  dapat  menguap  dengan mudah,  bahkan  sebelum  mencapai  titik didihnya. Dengan demikian proses
penguapan  dapat  berjalan  lebih  cepat  dan juga dapat mengatasi kemungkinan rusaknya sampel karena pemanasan yang terlalu lama.
Analisis  kofein  secara  kualitatif dilakukan  dengan  menggunakan  reaksi murexid  dan  reagen  Parry.  Reagen    Parry menggunakan  kobal  nitrat  dalam  metanol tidak  memberikan  warna  hijau  .  Reaksi murexid        akan        memberikan  warna merah violet bila di uap amoniak dan hilang dengan  penambahan  alkali  kuat.  Timbul nya  warna  ini  karena  adanya  pemecahan oksidatif struktur purin.
Penetapan  kadar  konsumsi  kofein pada penelitian ini dilakukan menggunakan metoda  kromatografi    Cair  Kinerja  Tinggi. Metoda  ini  dipilih  karena  tidak  memakan waktu  yang  cukup  lama  dan  memiliki ketepatan dan ketelitian yang relatif   tinggi (Rohman,  2009).  Metoda  kromatografi yang  digunakan  adalah  fase  terbalik, dimana  fase  diam  yang  digunakan  adalam colom  LC-  20  AD  yang  bersifat  non  polar dan  fase  geraknya  metanol  :  air  yang bersifat polar.
Pengukuran panjang gelombang maksimum kofein dilakukan dengan menggunakan  spektrofotometer  ultraviolet pada  panjang  gelombang  200-400nm  dan diperoleh  penjang  gelombang  serapan maksimum kofein dalam metanol pada 272 nm  dengan  nilai  absorban  0,622.  Panjang gelombang  ini  yang  akan  digunakan  pada detektor pada KCKT.
Dalam  kondisi  pemilihan  optimum ada beberapa faktor yang perlu di perhatikan,  yaitu  nilai  efisiensi  kolom  (N), HETP, waktu retensi dan puncak kromatogram  yang  dihasilkan.  Efisiensi kolom  (N)  adalah  jumlah  plat  teori sedangkan  HETP  adalah  tinggi  setara lempeng  teoritis.  Kolom  yang  baik  akan
mempunyai    nilai  N  yang  tinggi  dan  HETP yang  rendah.  Waktu  retensi  adalah  waktu yang  dibutuhkan  oleh  analit  mulai  saat injeksi sampai keluar dari kolom. Kromatogram  yang  baik  memiliki  waktu retensi  yang  pendek  dengan  puncak  yang tajam dan tidak lebar  serta pemisahan yang jelas. Berdasarkan data- data yang diperoleh untuk  pemelihan  kondisi  optimum,    fase gerak  metanol:  air  (  50  :      50) dengan laju alir 1 mL/menit memberikan hasil yang paling  baik  karena  memiliki  nilai  N  yang tinggi    dan  HETP  yang  rendah.  Selain  itu juga  puncak  yang  dihasilkan  tajam    dan tidak  lebar  serta  waktu  retensi  yang  tidak terlalu  lama  yaitu,  3,554  menit,  Waktu retensi  ini  tidak  mutlak  bahkan  dapat bergeser,  ini  dapat  terjadi  karena  beberapa hal yaitu perbedaan waktu retensi , lamanya menginjeksi, pemutaran valve dan pengupan selektif dari fase gerak.
Validasi  metoda  analisis  dilakukan untuk memastikan bahwa beberapa parameter  metoda  analisis  yang  digunakan memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan, terutama untuk menjamin bahwa metoda  analisis  tersebut  memberikan  hasil yang  cermat  dan  handal  sehingga  dapat dipercaya.  Parameter  tersebut  meliputi linearitas, batas deteksi, dan batas kuantitas.
Linearitas  merupakan  ukuran  seberapa baik  kurva  kalibrasi  yang  menghubungkan antara  respon  (y)  dengan  konsentrasi  (x  ) (Rohman,    2009).  Berdasarkan  perhitungan statistik  regresi  linear  kurva  kalibrasi diperoleh  persaman  regresi  linear  y  = 55904,9 + 57286,99x.     Dengan koefisiensi korelasi  (r)  =  0,9995.  Nilai  (r)  tersebut mendekati  1,  menunjukkan  bahwa  kurva kalibrasi  yang  dibuat  telah  membentuk  satu garis lurus linear.
Batas  deteksi  merupakan  konsentrasi analit  terendah  dalam  sampel  yang  masih dapat  dideteksi  dan  memberikan  respon yang  signifikan,  sedangkan  batas  kuantitas merupakan jumlah terkecil analit yang msih dapat  memenuhi  kriteria  cermat    dan seksama.  Dari  hasil    pengujian  diperoleh batas  deteksi  pada  konsentrasi  1,806913532 µg/mL  dan  batas  kuantitas  pada  konsentrasi
6,023045 µg/mL. Hasil pengukuran konsentrasi  larutan  sampel  menunjukkan bahwa  konsentrasi  tidak  melewati  batas deteksi  dan  batas  kuantitas.  Sehingga  dapat disimpulkan bahwa data yang diperoleh dari
hasil  pengukuran  tidak  memenuhi  kriteria cermat dan seksama.
Hasil  pemeriksaan  kadar  kofein masing–masing  sampel  menggunakan persamaan regresi linier didapatkan kadar kofein  dalam  sampel  minuman  energi. Sampel Kr =27,73 mg, sampel M =34,14 mg,  sampel  Lv  =69,78  mg,  sampel Pm=28,41 mg
Dari  penetapan  kadar  keempat  jenis sampel tersebut, pada sampel Lv terdapat kadar  kofein  yang  lebih  tinggi  melebihi batas  yg  telah  ditentukan  oleh  SNI  No. 01-6684-2002.

## KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Dari hasil penelitian dapat disimpulkan  bahwa  kadar  kofein  dalam  1 botol  (150mL)  sampel  Kr  =27,73  mg,  M =34,14 mg, , Pm=28,41 mg dan sampel Lv =69,78  mg.  Pada  hasil  tersebut  sampel  Lv yang  melebihi  batas  yang  telah  ditentukan oleh  SNI  No.  01-  6684-2002  yaitu  kurang dari 50 mg persaji.

## Saran
Pada  peneliti  selanjutnya  disarankan untuk  melakukan  analisa  kuantitatif  kofein pada jenis bahan minuman lain dan kepada masyarakat terutama anak –anak dan orang dewasa  sebagai  konsumen  agar  tidak berlebihan  dalam  mengkosumsi  minuman berenergi

## DAFTAR PUSTAKA
Departemen  Kesehatan,  1992. Undang- Undang Tentang Kesehatan Nomor 23 . Jakart Johnson,  E.  and  L.,    Stevenson,    R.,  1991, Dasar  Kromatografi  Cair ,  Penerbit ITB, Bandung, 1-54. Moore,  2001, Essensial  Obstetri  dan Ginekologi . Edisi Dua. Jakarta. Rohman,  A.,  2009, Kromatografi  Untuk Analisis  Obat, Graha  Ilmu, Yogyakarta.
Standar  Nasional  Indonesia, Minuman Energi, No. 01- 6684- 2002.