## Jurnal Ilmu Farmasi dan Farmasi Klinik (JIFFK)
Vol. 16, No. 1, JUNI 2019, Hal. 15 – 20 ISSN: 1693 -7899
METODE ISOLASI YANG MUDAH DALAM ISOLASI SENYAWA β-KAROTEN DARI LABU KUNING ( Cucurbita moschata Duch ex Poiret)
Rollando Rollando * , Muhammad Hilmi Afthoni
Program Studi Farmasi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Ma Chung Jl. Villa Puncak Tidar Blok N-01, Malang-Jawa Timur Indonesia-65151 Telp: (0341) 550171
* Email: ro.llando@machung.ac.id

## INTISARI
Labu  kuning  ( Cucurbita  moschata Duch  ex  Poiret),  buah  yang  mengandung  beberapa senyawa,  memiliki  aktivitas  untuk  melindungi  tubuh  manusia  dari  radikal  bebas.  Beta  karoten (provitamin  A)  diakui  sebagai  senyawa  antioksidan.  Antioksidan  bisa  melindungi  tubuh  dari kerusakan  kardiovaskular  yang  disebabkan  oleh  radikal  bebas.  Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah untuk mengisolasi senyawa beta karoten dan menguji kemurnian isolat beta karoten yang diperoleh menggunakan  DR-UV  dan  spektrofotometri  inframerah.  Labu  kuning  diekstraksi  menggunakan aseton  :  petroleumeter  dengan  rasio  (1:  1).  Identifikasi  beta  karoten  dari  ekstrak  dilakukan menggunakan  KLT  dengan  fase  gerak  etanol:  aseton:  n-hexane  dengan  rasio  (2:1:1)  dan scan spectrum menggunakan spektofotometer UV-Vis. Beta karoten di identifikasi hasil elusi KLT pada UV  254  dan  366  nm  yang  menunjukkan  adanya  2  spot.  Deteksi  spektra  beta  karoten  dilakukan pada rentang 350 hingga 550 nm dan diperoleh puncak beta karoten pada panjang gelombang 234 nm.  Proses  pemurnian  ekstrak  dilakukan  menggunakan  KLT  Preparatif  dengan  fase  gerak  etanol: aseton:  n-hexane  dengan  rasio  (2:1:1)  dan  diperoleh  isolat  yang  dibersihkan  terlebih  dahulu menggunakan  kloroform:  metanol  perbandingan  1:1.  Isolat  dikeringkan  dan  diuji  menggunakan DR-UV  dan  spektrofotometri  inframerah.  Isolat  dari  ekstrak  labu  mengandung  beta  karoten  yaitu zeaxanthin.
Kata kunci : labu kuning; beta karoten; isolasi

## ABSTRACT
Pumpkin (Cucurbita moschata Duch ex Poiret), a fruit that contains several compounds, has activities  to  protect  the  human  body  from  free  radicals.  Provitamin  A  is  recognized  as  an antioxidant  compound. Antioxidants  can  protect  the  body’s  damage  caused  by  free  radicals.  The purpose of this study was to isolate beta carotene compounds and test the purity of beta carotene isolates  obtained  using  DR-UV  and  infrared  spectrophotometry.  Pumpkin  is  extracted  using acetone:  petroleum  ether  with  a  ratio  (1:  1).  Identification  of  beta  carotene  from  extracts  was carried out using TLC with the mobile phase of ethanol: acetone: n-hexane  with a ratio (2: 1: 1) and scan spectrum using a UV-Vis spectrophotometer. Beta carotene was identified as the result of TLC elution on UV 254 and 366 nm which showed 2 spots. Detection of beta carotene spectra was carried out in the range of 350 to 550 nm and obtained beta carotene peaks at wavelength x nm. The extract purification process  was  carried out using Preparative TLC with the mobile phase of ethanol:  acetone:  n-hexane  with  a  ratio  (2:  1:  1)  and  obtained  isolates  cleaned  first  using chloroform: methanol ratio of 1: 1. The isolates were dried and tested using DR-UV and infrared spectrophotometry.  Isolates  from  Cucurbita  moschataDuch  ex  Poiret  extract)  contain  beta carotene, zeaxanthin.
Keywords : pumpkin; beta carotene; isolation
*Corresponding author: Rollando Program Studi Farmasi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Ma Chung Jl. Villa Puncak Tidar Blok N-01, Malang-Jawa Timur Indonesia-65151 Email: ro.llando@machung.ac.id

## PENDAHULUAN
Karotenoid  dikenal  sebagai  senyawa  yang  luas  distribusinya,  keragaman  struktural  dan berbagai  fungsi.  Lebih  600  karotenoid  tidak  termasuk  isomer cis -  dan trans -,  terlah  diisolasi  dan dikarakterisasi  dari  sumber  alam  (Delia,  2004).  Karotenoid  tersebut  adalah  pewarna  alami  yang larut  dalam  lemak,  metabolit  sekunder  dari  jenis  terpenoid  berupa  suatu  poliisoprenoid  panjang (terdinframerahi  atas 40 atom karbon/tetraterpen) yang me-ngandung  ikatan rangkap dan tersusun dari  rantai  poliisoprena  simetris  terhadap  pusat  ikatan.  Kedua  molekulnya  mengandung  cincin sikloheksena  yang  tersubstitusi.  Karotenoid  juga  merupakan  sumber  vitamin  A  yang  dibutuhkan tubuh  manusia  untuk  penglihatan,  pertumbuhan  dan  perkembangan  embrionik  (Apel  dan  Bock, 2009).  Kekurangan  vitamin  A  dapat  menyebabkan  gangguan  penglihatan  dan  kematian  bayi. Defisiensi  vitamin  A  diterapi  dengan  pemberian  suplemen  vitamin  A  atau  dengan  mengonsumsi buah  atau  sayur  yang  kaya  akan  kandungan  karotenoid.  Karotenoid  dalam  makanan  umumnya adalah  tetraterpenoid  C40  terbentuk  dari  delapan  unit  isopren  C5  bergabung  kepala  dengan  ekor, kecuali di pusat di mana hubungan ekor-ke-ekor membalik  urutan,  menghasilkan  molekul  simetris (Basu dkk., 2001).
Senyawa-senyawa  ini  berasal  dari  phytoene,  yang  disintesis  oleh  reduktif  dimerisasi geranylgeranyl  pyrophosphate  (GGPP),  setelah  langkah  dehidrogenasinya,  siklisasi,  hidroksilasi, oksidasi  dan  epoksidasi  (Tee  dan  Siong,  1991).  Karotenoid  secara  struktural  dibagi  menjadi  dua kelas  utama.  Pertama,  karoten  (misalnya,  karoten,  β-karoten,  lycopene),  yang  secara  eksklusif adalah  hidrokarbon  (tanpa  molekul  oksigen)  (Aizawa  dan  Inakuma,  2007),  dan  kedua,  xanthofil (misalnya,  lutein,  zeaxanthin,  fucoxanthin  dan  astaxanthin)  (Noviendri  dkk.,  2011),  yang teroksigenasi mengandung hidroksil, metoksi, karboksil, keto, atau kelompok epoksi (Apel, 2009).
Penyerapan karotenoid lebih baik pada sayuran dan buah berwarna kuning atau oranye. Beta karoten  dapat  larut  dalam  lemak,  tidak  larut  dalam  ainframerah,  mudah  rusak  karena  teroksidasi pada  suhu  tinggi.  Salah  satu  buah  yang  memiliki  sumber  karotenoid  yaitu  labu  ( Cucurbita moschata Duch ex Poiret). Buah labu kuning berbentuk bulat pipih, lonjong, atau panjang. Ukuran pertumbuhannya  cepat  sekali,  mencapai  350  gram  per  hari.  Labu  kuning  mengandung  karotenoid (betakaroten),  Vitamin  A  dan  C,  mineral,  lemak  serta  karbohidrat  (Fedha,  2008).  Aktivitas terapeutik  beta  karoten,  antara  lain  dapat  meningkatkan  sistem  imunitas  serta  mencegah  penyakit jantung  dan  kanker. Cucurbita  moschata dikatakan  sebagai  rajanya  beta  karoten  bukan  karena bentuknya yang besar, tetapi sebab kandungan karotennya sangat tinggi, seperti lutein, zeaxanthin, dan  karoten,  yang  memberi  warna  kuning  pada  labu  kuning  yang  membantu  melindungi  tubuh dengan menetralkan radikal bebas (Durante dkk., 2014).
Isolasi senyawa beta karoten dari Cucurbita moschata dapat diawali dengan proses ekstraksi. Pemilihan  metode  ekstraksi  menjadi  sangat  penting  karena  hasil  ekstraksi  dapat  menentukan keberhasilan metode tersebut. Ekstraksi  konvensional memakan waktu  lebih  lama dan melibatkan proses  termal  yang  dapat  merusak  karotenoid.  Oleh  karena  itu,  dilakukan  modifikasi  ekstraksi konvensional dalam mengekstraksi senyawa beta karoten dari Cucurbita moschata (Carvalho, 2012 ). Tujuan penelitian ini  adalah mengisolasi beta karoten dalam Cucurbita moschata dan dilakukan pemeriksaan  purifikasi  isolat  menggunakan  spektrofotometer  UV-DAD  dan  spektrofotometri inframerah.

## METODE PENELITIAN Alat dan bahan
Alat yang digunakan pada penelitian antara lain Timbangan analitik (Ohaus), pisau, blender, timbangan  (Krischef),  gelas  ukur  100  mL  (Schott-Duran),  corong  100  mm  (Herma),  erlenmeyer 250 mL (Iwaki), labu alas bulat, rotary evaporator (IKA type RV10 basic P diagonal), pipet ukur 5
mL  (Schott),  pipet  ukur  10  mL  (Schott),  chamber,  bejana  maserasi,  plat  KLT  250mm  (Merck TLC), membran filter 0.2 mm (Sartorius CA), spuit injeksi 5 mL  (Terumo), botol vial, alumunium foil,  kolom  kromatografi  (Iwaki),  statif  dan  clemp,  cawan  porselein  250  mL,  waterbath,  spatula, lampu  UV  254  dan  366nm,  spektrofometer  (UV-Vis  LabTech),  spektrofotometri  inframerah (FT/INFRAMERAH-  6800typeA).  Untuk  bahan  kimia,  yang  digunakan  labu  kuning  sebanyak 1.364  kg,  aseton,  petroleum  eter,  alkohol,  n-heksana.  Pelarut  yang  digunakan  merupakan  pelarut teknis.

## Prosedur kerja
Preparasi  sampel.  Sampel  diperoleh  dari  salah  satu  pusat  swalayan  di  kota  Malang,  Jawa Timur  seberat  1,364  kg.  Sampel  dibersihkan  kulit  dan  dibuang  bijinya.  Sampel  dipotong  dan dihaluskan menggunakan blender.
Ekstraksi.  Sampel  yang  sudah  diblender  ditimbang  seberat  500  gram  menggunakan timbangan  KrisChef.  Sampel  dimasukkan  dalam  bejana  maserasi.  Disiapkan  pelarut  yang digunakan  yakni  aseton  dan  petroleum  eter  dengan  perbandingan  pelarut  1:1  sebanyak  1000  mL. Perbandingan  antara  maserat  dengan  pelarut  yaitu  1:2.  Dituang  pelarut  dalam  bejana  yang  sudah berisi  maserat.  Sesekali  dilakukan  pengadukan.  Kemudian  bejana  disimpan  di  tempat  yang terhindar dari cahaya selama ± 24 jam. Selanjutnya dilakukan proses remaserasi sebanyak  2 kali. Filtrat  hasil  maserasi  dipisahkan  dan  kemudian  dievaporasi  dengan rotary  evaporator dengan kecepatan  80  rpm  dan  suhu  50oC.  Filtrat  yang  terpisah  dari  pelarut  dimasukkan  ke  dalam  cawan porselein dan diuapkan di atas waterbath pada suhu 50 o C. Ekstrak kental yang diperoleh kemudian ditimbang dan dihitung rendemennya.
Kromatografi  Lapis  Tipis  dilakukan  untuk  mengetahui  ada  atau  tidaknya  senyawa  beta karoten  di  dalam  ekstrak,  dilakukan  pengujian  kromatografi  lapis  tipis.  Proses  pemeriksaan senyawa beta karoten dilakukan dengan eluen n-heksan: aseton: etanol dengan perbandingan 1:1:2. Scan Spectrum dengan Spektrofotometer UV-Vis, dengan preparasi melarutkan ekstrak sebanyak 1 ml campuran pelarut petroleum eter : aseton (1:9). Metode ini dilakukan untuk mengetahui ada atau tidaknya  senyawa  beta  karoten  di  dalam  ekstrak  Dilakukan  pemeriksaan  scan  spectrum menggunakan instrumen spektrofotometer UV-Vis dengan rentang 350-550 nm.
Fraksinasi dengan Kromatografi Kolom. Ekstrak sebanyak 1 gram ditimbang dan dilarutkan menggunakan  etanol  8  mL.  Ditimbang  silika  gel254  sebanyak  5  gram.  Silika  dilarutkan  dengan eluen  yaitu  aseton  10%  dan  petroleum  eter  90%.  Suspensi  silika  dituang  ke  dalam  kolom kromatografi  yang  sudah  dibersihkan  sebelumnya.  Pelarut  dibiarkan  tersisa.  Ekstrak  dimasukkan dan dielusi menggunakan eluen. Fraksi yang diperoleh dihitung volumenya. Fraksi yang diperoleh dielusi dengan petroleum eter dan dilakukan pemeriksaan senyawa dengan kromatografi lapis tipis dengan eluen n- heksan:aseton: etanol dengan perbandingan 1:1:2.
KLT  Preparatif  dilakukan  dengan  melarutkan  sejumlah  ekstrak  dalam  etanol  kemudian ditotolkan  pada  plat  silika  yang  dipreparasi  sebelumnya.  Plat  KLT  Preparatif  dibuat  dengan menimbang  30  gram  silika  GF60  (Merck)  dan  dilarutkan  dengan  akuades.  Plat  dibuat  dan dikeringkan dengan oven dengan suhu 115 o C selama ± 2 jam. Plat yang sudah ditotolkan dengan larutan  ekstrak  kemudian  dielusi  dengan  eluen  etanol:  aseton:  n-hexane  dengan  rasio  (2:1:1).  Plat yang  selesai  dielusi  kemudian  dikeringkan  dan  dilihat  di  bawah  lampu    UV  254    dan    266    nm. Pemisahan  yang  terjadi ditandai dan dikerok menggunakan spatula. Serbuk isolat yang diperoleh dikumpulkan  dan  dibilas  menggunakan  kloroform  :  metanol  perbandingan  1:1.  Serbuk  dibilas hingga tidak berwarna. Filtrat yang diperoleh dikeringkan pada suhu ruang.
Pemeriksaan  kemurnian  senyawa  dengan  spektrofotometri  inframerah  dan  UV-DAD.  Isolat yang  diperoleh  dikumpulkan.  Isolat  dihaluskan  terlebih  dahulu  menggunakan  mortinframerah  dan stamper  sebelum  dilakukan  uji  menggunakan  spektrofotometer  inframerah  FT/INFRAMERAH- 6800typeA  pada  bilangan  gelombang  4000  –  400  cm-1.  Pengujian  menggunakan  UV-DAD dilakukan  dengan  memasukkan  serbuk  isolat  dan  ditutup  rapat  pada  wadah  sampel.  Sebelum dilakukan analisis sampel, digunakan blanko plat KBr.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Kromatografi Lapis Tipis
Identifikasi  komposisi  pigmen  menggunakan  KLT  (Kromatografi  Lapis  Tipis)  dengan  plat silika  gel  sebagai  fase  diam/normal  dan  fase  geraknya  adalah  n  heksan  :  aseton  :  etanol  (1:1:2). Proses  kerja  kromatografi  lapis  tipis  ini  adalah,  silika  dapat  membentuk  ikatan  hidrogen  pada permukaanya,  karena  pada  permukaan  silika  terdapat  gugus  hidroksil  dan  gugus  silanol.  Silika bersifat  sangat  polar.  Jika  fase  gerak  yang  digunakan  bersifat  non-polar,  maka  senyawa  yang bersifat polar akan semakin lama bertahan pada fase diam, sedangkan senyawa yang bersifat non- polar akan cepat terelusi (prinsip like dissolve like ).
Hasil  kromatografi  lapis  tipis  menggunakan  cairan  pengelusi  ini  terdampak  noda  sinar UV254nm  ekstrak  labu menampakkan 2 spot berwarna  kuning  pucat.  Pada  penampak  noda  sinar UV  366  nm spot terlihat  namun  hanya  bercak  kedua  yang  lebih  terlihat  jelas  .  Gambar  pada  UV 254 dapat dilihat seperti pada Gambar 1.

## Gambar 1. Hasil Pemisahan Ekstrak Labu Kuning dengan metode KLT pada UV 254
Untuk dapat mengidentifikasi  senyawa  target  yang  dimiliki  dalam  sampel  dianalisis menggunakan  faktor  reterdasi  atau retardation  factor (Rf).  Untuk  menghitung  nilai  Rf  pada  hasil KLT  diperoleh  dari  perbandingan  jarak  yang  ditempuh  oleh  pigmen  dengan  jarak  yang  ditempuh oleh pelarut. Hasil peneitian ini menunjukkan kisaran nilai Rf yang berbeda-beda, hasil penelitian ini menunjukkan kisaran Rf karotenoid berada pada bercak bagian atas dan Rf santofil berada pada bercak  yang  bagian  bawah  atau  mendekati  titik  awal.  Menandakan  sampel  labu  kuning  ini mengandung beta karoten.

## Spektrofotometri (UV-Vis LabTech)
Ekstrak  labu kuning digunakan  untuk  mengidentifikasi  β-  karoten  Dilakukan  dengan melarutkan  ekstrak  sebanyak  1  ml  campuran  pelarut  petroleum  eter:aseton  (1:9)  agar  mengetahui absorbansi pada panajng gelombang tertentu yang menunjukkan adanya beta karoten. Berdasarkan hasil scan spectrum 300-600 nm pada spektrofotmetri (UV-Vis LabTech) pada panajng gelombang 441 nm dengan absorbansi 0,37775 menunjukkan adanya beta karoten. Hasil ini mendekati dengan referensi  panjang  gelombang  β-karoten  maksimal  antara  425,  450,  478  nm.  Serapan-serapan  ini muncul  karena  adanya  transisi  antara  π  dan  π*  dan  yang  menunjukkan  adanya  ikatan  rangkap terkonjugasi pada senyawa beta karoten.

## Kromatografi Kolom
Setiap fraksi-fraksi yang didapatkan dari metode fraksinasi kromatografi kolom, dilanjutkan dengan proses elusi pada plat KLT. Setelah diamati, didapatkan adanya kesamaan titik bercak pada fraksi ke 5, 6, 7, dan 8. Sehingga keempat fraksi ini digabungkan menjadi menjadi satu, kemudian kembali elusi namun menggunakan KLT preparatif, karena kemungkinan keempat fraksi gabungan tersebut dicurigai merupakan beta karoten.

## KLT Preparatif
Hasil  fraksinasi  kromatografi  kolom  pada  metode  sebelumnya  terrnyata  tidak  menunjukkan adanya  bercak  karena  fraksi  yang  digunakan  terlalu  sedikit.  Sehingga  dilakukan  kembali  proses KLT  preparatif  isolat  secara  langsung  dari  ekstrak  labu  kuning  yang  dilarutkan  dengan  pelarut petroleum  eter  agar  mendapatkan  isolat  yang  lebih  banyak  dan  tidak  mengganggu  hasil  akhir inframerahnya. Isolat KLT preparatif ini dilakukan  untuk melakukan pengujian % T pada analisis Spektroskopi Inframerah.

## Spektroskopi Inframerah
Analisis spektroskopi inframerah terhadap isolat (Gambar 2) memperkuat hipotesis dari hasil analisis  spektroskopi  UV  bahwa  isolat  merupakan  golongan  senyawa  karotenoid,  dengan  spektra bilangan gelombang 3310 cm-1 menunjukkan ikatan O-H, pada serapan bilangan gelombang 2923 cm-1  menunjukan  vibrasi  ulur  C-H  alifatik  yaitu  ikatan  C-H  dari  CH 3 ,  pada  serapan  bilangan gelombang 1621,84 cm-1 menunjukkan ikatan rangkap C=C, yang diperkuat oleh serapan C-H dari ikatan  rangkap  terkonjugasi  pada  bilangan  gelombang  pada  serapan  bilangan  gelombang  781,993 cm-1 dan 453,19 cm-1.

## Gambar 2. Data Spektroskopi Inframerah
Untuk  dapat  mengetahui  senyawa  apa  yang  disolasi  dalam  penelitian  ini,  harus  didukung dengan menggunakan instrumen dan metode lainnya, kalau hanya berdasarkan panjang gelombang pada spektrofotometri inframerah, tidak dapat mendukung  sepenuhnya. Namun, berdasarkan  hasil pmebacaan  panjang  gelombang  inframerah,  didukung  kuat  oleh  keluarnya  ikatan  O-H  pada  3310 cm-1 untuk golongan xanthin, maka dapat dikatakan hasil penelitian ini adalah zeaxanthin dengan rumus  molekul  C 4 0H 56 O 2 .  Lepasnya  molekul  -OH  dalam  struktur  zeaxanthin  sangat  mungkin terjadi, karena senyawa karotenoid sangat rentan mengalami degradasi oleh cahaya selama proses analisis.

## KESIMPULAN
Isolasi  pigmen beta karoten  dari  ekstrak  labu  kuning  ( Cucurbita  moschata Duch  ex  Poiret) diperoleh  isolat  berdasarkan  hasil  pengujian menggunakan KLT,spektrofotometri  UV-Vis,  KLT preparatif, DR-UV, dan spektroskopi inframerah, maka kemungkinan didapatkan komponen utama karotenoid  dengan  struktur  yang  hampir  merah  menyerupai  senyawa  zeaxanthin  dengan  rumus molekul C 4 0H 56 O 2 .

## DAFTAR PUSTAKA
Aizawa K,  Inakuma T. Quantitation of Carotenoids in CommonlyConsumed Vegetables  in Japan.
Food Sci. Technol. Res., 2007, 13(3):247-252.
Apel  W,  Bock  R.  Enhancement  of  Carotenoid  Biosynthesis  in  Transplastomic  Tomatoes  by Induced Lycopene-to-Provitamin A Conversion1[OA]. Plant Physiol., 2009. 151: 59-66.
Basu  HN,  Vecchio  AJD,  Flider  F,  Orthoefer  FT.  Nutritional  andPotential  Disease  Prevention Properties of Carotenoids. J.A.O.C.S.,2001. 78(7): 665-675. Delia B.HarvestPlus Handbook for Carotenoid Analysis. HarvestPlus, 2004. Carvalho  LMJ,  Gomes  PB,  Godoy  RL de  O,  Pacheco  S,  do  Monte  PHF,  de  Carvalho  JLV,  et  al.
Total  carotenoid  content,  α-carotene  and  β-carotene,  of  landrace  pumpkins  (Cucurbita moschata  Duch):  A  preliminary  study.  Food  Res  Int  [Internet].  2012;47(2):337–40. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.foodres.2011.07.040
Durante  M,  Lenucci  MS,  Mita  G.  Supercritical  carbon  dioxide  extraction  of  carotenoids  from pumpkin (Cucurbita spp.): A review. Int J Mol Sci. 2014;15(4):6725–40.
Fedha,  M.  Physicochemical  Characterization  and  Food  Application  Potential  of  Pumpkin (Cucurbita Sp.) Fruit and Seed Kernel Flours. Food Science and Postharvest Technology in the Jomo Kenyatta University of Agriculture and Technology. 2008.
Tee,  SiongE.  Carotenoid composition and content of  malaysian vegetables and fruits by the aoac and hplc methods.  Food Chemistry. 1991; 41:309-339.