## PENURUNAN KADAR AFLATOKSIN B

## 1 PADA SARI KEDELAI OLEH SEL HIDUP DAN SEL MATI Lactobacillus acidophilus SNP-2
[Reduction of Aflatoxin B 1 in Soymilk by Viable and Heat-killed Lactobacillus acidophilus SNP-2]
Tyas Utami 1) *, FX. Hartanta Adi Nugroho 1) , Sri Usmiati 3) , Sri Marwati 2) , dan Endang S. Rahayu 1)
1) Jurusan Teknologi Pangan dan Hasil Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta
2) Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pascapanen Pertanian, Bogor
Diterima 14 Desember 2010 / Disetujui 11 April 2012

## ABSTRACT
Aflatoxins  are  carcinogenic  mycotoxins  that  commonly  contaminate  foods  and  feed.  There  are  many  different  forms  of  aflatoxin  and  its metabolites. Of these, aflatoxin B 1 (AFB 1 ) is the most prevalent and toxic. Lactobacillus acidophilus SNP-2 has previously been shown to remove AFB 1 from liquid solution of phosphate saline buffer. However, the ability of lactic acid bacteria to reduce AFB 1 content in soymilk has not been studied yet. The objective of this study was to investigate the ability of viable and heat-killed cells of L. acidophilus SNP-2 to reduce AFB 1 in soymilk and fermented soymilk. Soymilk contaminated with Aspergillus flavus was inoculated with culture of L. acidophilus SNP-2, and incubated at 37  C for 12 hours. Fermented soymilk, then, was heat sterilized and stored at cool room (4°C). Heat-killed cells were introduced to soy milk and then kept  at  cool  room  for  3  days.  During  soymilk  fermentation,  there  was  reduction  of  AFB 1 content  in  soymilk  related  to  the  growth  of  lactic  acid bacteria and the reduction of pH. The initial concentration of AFB 1 in the soymilk was 4.9 ppb. Lactobacillus acidophilus SNP-2 reduced 67.58% of AFB 1 in  the  soymilk  after  12  hoursof  fermentation.  In  cool  environment,  the  binding  of  AFB 1 to  heat-killed  cell  after  soymilk  fermentation  was relatively more stable than that of soymilk without fermentation.
Key words: aflatoxin B 1 , heat-killed cell, lactic acid bacteria, reduction, soymilk

## PENDAHULUAN
1
Aflatoksin  merupakan  kelompok  metabolit  sekunder  yang dapat  memberikan  efek  yang  berbahaya  bagi  kesehatan manusia  dan  hewan  karena  bersifat  karsinogenik,  mutagenik, teratogenik  dan  immunosupresif.  Metabolik  sekunder  ini dihasilkan oleh kapang A. pergillus flavus dan A. parasiticus dan A.  nomius yang  tumbuh  pada  berbagai  biji-bijian  dan  kacang- kacangan pada suhu antara 24 sampai 35  C. Hasil penelitian di beberapa negara sedang berkembang di daerah tropis dan sub- tropis  menunjukkan  adanya  cemaran  aflatoksin  pada  berbagai komoditas  dan  hasil  olahannya  seperti  kacang  tanah,  jagung, kedelai,  hazelnut,  dan  sorghum  (Williams et  al .,  2004).  Hasil survey  juga  menunjukkan  sampel  jagung,  kacang  tanah  dan hasil  olahannya  di  berbagai  tempat  di  Indonesia  juga terkontaminasi aflatoksin (Rahayu et al ., 2003; Dharmaputra et al ., 2005; Lilieanny et al ., 2005).
Aflatoksin B 1 (AFB 1 ) merupakan jenis aflatoksin yang paling sering dijumpai dan mempunyai toksisitas yang paling tinggi di- bandingkan  jenis  aflatoksin  lainnya.  Banyak  penelitian  me- nunjukkan  keterlibatan  strain-strain Lactobacillus dalam  me- nurunkan  kadar  aflatoksin.  Pengikatan  aflatoksin  oleh  sel bakteri  merupakan  salah  satu  mekanisme  yang  diduga  men- jelaskan aktivitas antimutagenik Lactobacillus (El-Nezami et al ., 1998,  Peltonen et  al .,  2001;  Haskard et  al .,  2001;  Zinedine et al .,  2005). Lactobacillus  rhamnosus strain  GG  dan L. rhamnosus LC-705  menunjukkan  kemampuan  menghilangkan
* Korespondensi Penulis : Email : tys_utami@yahoo.com.sg
AFB 1 secara efektif pada media cair yang dipengaruhi oleh suhu dan konsentrasi bakteri (El-Nezami et al ., 1988). Haskard et al. (2000)  menduga  bahwa  AFB 1 berikatan  dengan  komponen karbohidrat  dan  protein  sel  hidup  dari L.  rhamnosus  GG . Penelitian yang dilakukan oleh Lahtinen et al . (2004) menunjuk- kan  bahwa  peptidoglikan  merupakan  komponen  karbohidrat yang  paling  mungkin  terlibat  dalam  proses  pengikatan  AFB 1 . Perlakuan  panas  dan  asam  secara  nyata  meningkatkan kemampuan pengikatan terhadap AFB 1 dan stabilitas kompleks bakteri  AFB 1 (Haskard et  al. ,  2001).  Perlakuan  panas  dapat menyebabkan  denaturasi  protein,  gangguan  terhadap  struktur dinding  sel  dan  fungsinya.  Perlakuan  dengan  asam  dapat merusak  ikatan  glikosidik  pada  polisakarida  dan  mengubah struktur peptidoglikan.
Simanjuntak  (2005)  mempelajari  kemampuan  beberapa strain bakteri asam laktat lokal dalam menurunkan kadar AFB 1 dan  salah  satu  yang  berpotensi  adalah  bakteri  asam  laktat probiotik Lactobacillus  acidophilus SNP-2.  Bakteri  ini  mampu mengikat  lebih  dari  50%  AFB 1 dalam  media phosphate  saline buffer (PBS).  Selanjutnya  Amanah  (2007)  mempelajari  faktor- faktor yang mempengaruhi pengikatan AFB 1 oleh L. acidophilus SNP-2.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  semakin  rendah pH  semakin  banyak  aflatoksin  yang  dapat  dihilangkan  dari media.  Semakin  tinggi  konsentrasi  AFB 1 dalam  media  bufer, kecepatan  pengikatan  AFB1  semakin  tinggi.  Hasil  penelitian Utami (2007) menunjukkan bahwa sel mati L. acidophilus SNP- 2  karena  perlakuan  pemanasan  dan  asam  mempunyai kemampuan pengikatan AFB 1 dua kali lebih besar dibandingkan dengan  sel  hidup.  Selain  itu  perlakuan  pemanasan  dan  asam meningkatkan  secara  nyata  stabilitas  komplek  yang  terbentuk
antara bakteri dengan AFB 1 . Namun demikian belum diketahui kemampuan L.  acidophilus SNP-2  dalam  mengikat  AFB 1 pada sistem pangan. Oleh karenanya tujuan dari penelitian ini adalah mempelajari kemampuan L. Acidophilus SNP-2 dalam mengikat AFB 1 dalam  media  sari  kedelai,  baik  dalam  bentuk  sel  hidup ataupun sel mati oleh panas ( heat-killed ).

## METODOLOGI

## Bahan dan alat
Lactobacillus acidophilus SNP-2 dan A. flavus FNCC 6109 merupakan  koleksi  dari  Food  and  Nutrition  Culture  Collection (FNCC),  Pusat  Studi  Pangan  dan  Gizi,  Universitas  Gadjah Mada.  Kedelai  lokal  diperoleh  dari  Pasar  Beringharjo, Yogyakarta.  Media  PDA  digunakan  untuk  pembentukan  spora A. flavus . Media MRS (Oxoid) digunakan untuk penyiapan stok kultur  bakteri  asam  laktat,  sedang  untuk  enumerasinya  meng- gunakan  MRS  agar  yang  ditambah  dengan  CaCO 3 .  Untuk produksi  biomasa  bakteri  asam  laktat  digunakan  media  air kelapa yang ditambah dengan 5% ekstrak khamir (Oxoid).
Bahan-bahan  untuk  uji  AFB 1 dengan  metoda  ELISA ( Enzyme-Linked  Immunosorbent  Assay )  adalah stip  antibody- coated  wells,  plate  frame,  microwell  plate, aflatoksin-enzim konjugat  ( horseradish peroksidase),  larutan  substrat, khromogen,  asam  sulfat  1,25  M  ( stopping  solution ),  dan metanol  60%  untuk  ekstraksi  sampel.  ELISA  kit  untuk  analisa AFB 1 ini  dikembangkan  dan  diperoleh  dari  Balai  Penelitian Veteriner (Balivet), Bogor.

## Penyiapan biji kedelai yang terkontaminasi aflatoksin
Aspergillus flavus FNCC 6109 ditumbuhkan dalam medium PDA  miring  selama  4-6  hari  untuk  mendapatkan  spora. Selanjutnya spora diinokulasikan pada biji kedelai dan disimpan dalam kotak plastik selama 1,5-2 bulan pada suhu ruangan (  29  C).  Kedelai  yang  telah  terkontaminasi  aflatoksin  digunakan untuk membuat sari kedelai.

## Penyiapan sari kedelai
Kedelai  sebanyak  100  g  direndam  selama  12  jam  pada suhu  ruang,  selanjutnya  diikuti  dengan  penghilangan  kulit  ari, pencucian,  penghancuran  menggunakan  blender  dengan  rasio kedelai dan air 1:10, dan penyaringan menggunakan kain saring untuk  memisahkanampas  dari  sari  kedelai.Sari  kedelai  yang diperoleh  dipanaskan  dan  ditambah  sukrosa  10%  (v/v). Selanjutnya  sari  kedelai  dipasteurisasi  pada  suhu  100  C selama  5  menit.  Selama  proses  pembuatan  sari  kedelai dilakukan  uji  kadar  AFB 1 menggunakan  ELISA  pada  kedelai, bekas air rendaman, kulit ari, sari kedelai dan ampasnya.
Penyiapan biomasa sel mati Lactobacillus acidophilus

## SNP-2
Sebanyak  10  ml  kultur L.  acidophilus SNP-2  dalam  media MRS  yang  berumur  24  jam  diinokulasikan  ke  dalam  100  ml media  air  kelapa  yang  ditambah  dengan  5%  (b/v)  ekstrak khamir  dan  diinkubasi  pada  suhu  37  C  selama  24  jam. Selanjutnya  kultur  diinokulasikan  pada  1000  ml  media  yang sama dan diinkubasi pada suhu dan waktu yang sama. Setelah
inkubasi,  dilakukan  sentrifugasi  pada  1800  g  selama  20  menit pada  suhu  10  C.  Pelet  yang  diperoleh  dicuci  dua  kali menggunakan peptone  water 0,1%,  dan  dilakukan  enumerasi jumlah  sel  menggunakan  metoda dilution dan plating ( pour plate )  pada  media  MRS  agar  yang  ditambah  CaCO 3 .  Pelet diresuspensi  dengan  aquades  sterill  hingga  mencapai  jumlah sel 10 10 -10 11 cfu/ml. Setelah dilakukan penghitungan jumlah sel, suspensi  sel  disterilisasi  menggunakan  autoklaf  pada  suhu 121  C  selama  20  menit.  Sel  mati  oleh  panas  tersebut (selanjutnya  ditulis  sel  mati)  disimpan  pada  ruang  pendingn (4  C) sampai digunakan.
Reduksi  AFB 1 pada  sari  kedelai  selama  fermentasi oleh Lactobacillus acidophilus SNP-2 Sari  kedelai  yang  terkontaminasi  AFB 1 diinokulasi  dengan sel hidup L. acidophilus SNP-2 (10% v/v) dan diinkubasi  pada suhu 37  C selama 12 jam. Kultur starter disiapkan dengan cara menginokulasikan kultur L. acidophilus SNP-2 ke dalam media cair  MRS  dan  diinkubasi  pada  suhu  37  C  selama  24  jam. Selama  fermentasi  dilakukan  penghitungan  jumlah  sel  dengan metoda dilution  and  plating ,  serta  pengukuran  pH  dan  kadar AFB 1 pada sari kedelai.
Stabilitas pengikatan AFB1 oleh sel mati Lactobacillus acidophilus SNP-2  pada  sari  kedelai  terfermentasi selama penyimpanan
Sari  kedelai  difermentasi  oleh L.  acidophilus SNP-2  pada suhu  37  C  selama  12  jam.  Selanjutnya  sari  kedelai  ter- fermentasi  tersebut  disterilisasi  menggunakan  autoklaf  pada suhu  121  C  selama  10  menit  untuk  mematikan  sel  bakteri L. acidophilus SNP-2,  dan  disimpan  pada  ruang  dingin  (4  C) selama 3 hari. Selama penyimpanan dingin dilakukan uji kadar AFB 1 dan pH setiap 24 jam.
Reduksi  AFB 1 pada  sari  kedelai  oleh  sel  mati Lac- tobacillus acidophilus SNP-2 Sari  kedelai  yang  telah  terkontaminasi  dengan  AFB 1 ditambah  dengan  biomasa  sel  mati L.  acidophilus SNP-2 dengan  konsentrasi  sel  10 9 dan  10 10 cfu/ml.  Penghitungan jumlah  sel  dilakukan  pada  suspensi  pelet  sebelum  sel dipanaskan.  Volume  suspensi  sel    mati L.  acidophilus SNP-2 yang  ditambahkan  ke  dalam  sari  kedelai  yang  terkontaminasi berdasarkan  jumlah  sel  hidup  pada  suspensi  pelet  sehingga konsentrasinya  menjadi  10 9 dan  10 10 cfu/ml.  Selanjutnya disimpan pada suhu 4  C selama 3 hari. Setiap 24 jam dilakukan pengujian kadar AFB 1 pada sari kedelai.
Analisis kadar AFB 1 Pengujian  kadar  AFB 1 menggunakan  metoda  ELISA  yang merupakan  format  ELISA  kompetitif  langsung  yang  di- kembangkan  oleh  Balai  Penelitian  Veteriner,  Bogor.  Sampel diekstraksi  dengan  metanol  60%.  Masing-masing  larutan standar  AFB 1 dan  ekstrak  sampel  dicampur  dengan  enzim konjugat (AFB 1 Horseradish peroksidase). Campuran dimasuk- kan  ke  dalam  plat  mikro  yang  sudah  dilapisi  antibodi. Selanjutnya  terjadi  kompetisi  antara  AFB 1 standar  atau  AFB 1 dalam sampel dengan enzim konjugat untuk berikatan dengan
antibodi dalam plat mikro. Enzim konjugat yang tidak berikatan dengan  antibodi  dicuci  dengan  air.  Enzim  yang  berikatan dengan  antibodi  dengan  penambahan  substrat  akan  mem- berikan  warna.  Semakin  tinggi  kadar  AFB 1 pada  standar  atau sampel, warna yang terbentuk makin pudar. Reaksi dihentikan dengan penambahan larutan penghenti reaksi. Intensitas warna yang  terbentuk  pada  masing-masing  sumur  (blanko,  standar dan  sampel)  diukur  dengan  ELISA reader pada  panjang gelombang  450  nm  dan  dihitung  persen  inhibisi  standar  dan sampel. Kadar AFB 1 pada sampel dihitung menggunakan kurva standar AFB 1 vs persen inhibisi. Kurva standar hubungan antara kadar AFB 1 dengan persen inhibisi menghasilkan persamaan y =  a  lnx  +  b,  dimana  y  dan  x  adalah  persen  inhibisi  dan  kadar AFB 1 ,  sedang  a  dan  b  masing-masing  merupakan  slope  dan intercept dari persamaan tersebut. Kadar AFB 1 (ppb) = 2,718 x [(%  inhibisi  sampel  –  b)/a]x  faktor  pengenceran.  Kemampuan mereduksi  AFB 1 merupakan  selisih  dari  kadar  AFB 1 pada  sari kedelai sebelum dengan setelah perlakuan dikalikan 100%.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Kadar AFB 1 selama proses pembuatan sari kedelai
Selama  proses  pengolahan  sari  kedelai,  terjadi  berbagai perlakuan yang kemungkinan dapat mempengaruhi kadar AFB 1 dalam  bahan.  Pengolahan  sari  kedelai  melalui  tahapan  pe- rendaman,  pengupasan  kulit,  ekstraksi  dan  penyaringan,  serta pemanasan. Hasil penelitian menunjukkan bahan baku kedelai yang  telah  terkontaminasi  spora A.  flavus mengandung  107,1 ppb  AFB 1 atau  10,71  µg  per  100  g  kedelai,  dan  setelah mengalami proses pengolahan menjadi sari kedelai kadar AFB 1 turun  menjadi  4,9  ppb,  masih  di  bawah  ambang  batas  yang diijinkan  yaitu  20  ppb  (Tabel  1).  Air  bekas  rendaman mengandung 20,3 ppb AFB 1 ataudalam air rendaman terdapat 3,76  µg  AFB 1 .  Pada  proses  perendaman  kedelai  dalam  air selama  12  jam  terjadi  reduksi  AFB 1 pada  kedelai  sebanyak 28,62%.
Hasil  penelitian  yang  dilakukan  oleh  Rubak  (2007)  me- nunjukkan bahwa perendaman kacang tanah  selama 30 menit dapat  menurunkan  kadar  AFB 1 sebanyak  5,14%.  Kelarutan AFB 1 dalam air diperkirakan berkisar antara 11-33 µg/ml (Grant dan  Philips,  1998).  Penelitian  yang  dilakukan  oleh  Nugroho (2005)  menunjukkan  bahwa  sebagian  besar  AFB 1 terbawa dalam  air  pada  tahap  perendaman  jagung.  Selama  proses pengolahan sari kedelai, sebagian AFB 1 berada pada kulit dan ampas, sehingga setelah pemanasan pada suhu 80  C selama 15  menit,  kadar  AFB 1 pada  sari  kedelai  tinggal  4,9  ppb. Penurunan kadar AFB 1 dalam sari kedelai setelah pemanasan ini,  selain  disebabkan  oleh  terikutnya  AFB 1 dalam  kulit  dan ampas  kemungkinan  juga  karena  adanya  pemanasan.  Hasil penelitian  Marwati  (2007)  menunjukkan  bahwa  perebusan kacang  tanah  dengan  air  selama  20  menit  dapat  menurunkan cemaran  AFB 1 pada  kacang  tanah  sebesar  36,1%.  Diduga keberadaan  air  akan  membantu  dalam  pembukaan  cincin lactone  pada  AFB 1 .  Aflatoksin  bersifat  stabil  pada  suhu  tinggi, tetapi masih dapat dirusak oleh air mendidih (Christensen et al ., 1977).  Berdasarkan  hasil  penelitian  ini,  terlihat  bahwa  proses pengolahan kedelai menjadi sari kedelai memberikan kontribusi
yang  cukup  besar  terhadap  penurunan  kadar  AFB 1 pada  sari kedelai yaitu dari 107,1 ppb pada kedelai menjadi 4,9 ppb pada sari kedelai.
Tabel  1.    Kadar  AFB 1 pada  kedelai  selama  proses  pembuatan  sari kedelai
Bahan AFB 1 ppb µg (dari 100 g kedelai) Kedelai 107,1 10,71 Air Rendaman 20,3 3,76 Kulit 9,2 0,23 Ampas 8,7 0,71 Sari Kedelai 4,9 5,25
Reduksi  AFB 1 pada  sari  kedelai  selama  fermentasi oleh Lactobacillus acidophilus SNP-2 Kemampuan L. acidohilus SNP-2 dalam menurunkan kadar AFB 1 pada  sari  kedelai  selama  fermentasi  dilakukan  dengan menginokulasikannya ke dalam sari kedelai dan diinkubasi pada suhu  37  C  selama  12  jam.  Setelah  penambahan  inokulum L. acidophilus SNP-2 (10% v/v) terjadi penurunan pH menjadi 4,68 karena selama penyiapan inokulum telah terjadi produksi asam dan pHnya menjadi turun. Selama fermentasi terjadi peningkat- an jumlah sel dan penurunan pH karena aktivitas metabolisme menghasilkan asam laktat (Tabel 2).
Kadar AFB 1 pada sari kedelai sebelum fermentasi 4,9 ppb, dan  setelah  fermentasi  6  jam  pada  suhu  37  C  terjadi  reduksi AFB 1 dalam sari kedelai sebesar 59,82% (Tabel 3). Pada akhir fermentasi  kadar  AFB 1 pada  sari  kedelai  terfermentasi  tinggal 1,60  ppb  atau  terjadi  reduksi  kadar  AFB 1 sebesar  67,58%. Reduksi  AFB 1 selama  fermentasi  12  jam  meningkat,  seiring dengan kenaikan jumlah sel dan penurunan pH. Hasil penelitian Amanah  (2007)  menunjukkan  bahwa  kenaikan  konsentrasi  sel meningkatkan  kemampuan  pengikatan  terhadap  AFB 1 sampai konsentrasi  10 9 cfu/ml  pada  media  bufer  fosfat.  Selain konsentrasi  sel,  pengikatan  AFB 1 dipengaruhi  juga  oleh  pH media.  Hasil  penelitian  Amanah  (2007)  menunjukkan  bahwa pengikatan  AFB 1 oleh L.  acidophilus SNP-2  meningkat  secara nyata pada pH  5,0 dibandingkan pada pH 6,0 dan 7,0. Diduga pada  pH  rendah  dapat  terjadi  perubahan  AFB 1 menjadi  AFB 2a yang  memiliki  kemampuan  toksisitas  yang  lebih  rendah. Penelitian  yang  dilakukan  oleh  El-Nezami et  al .,  1998  me- nunjukkan bahwa penambahan HCl pada standar AFB 1 meng- hasilkan  konversi  AFB 1 menjadi  AFB 2a .  Penelitian  yang  lain menyebutkan  bahwa  keberadaan  asam  organik  dapat  pula mengubah  AFB 1 menjadi  aflatoksikol  yang  toksisitasnya  juga lebih  rendah  dari  AFB 1 (Omaye,  2004).  Haskard et  al .  (2001) menyebutkan bahwa perlakuan dengan asam kuat (HCl) dapat mempengaruhi  komponen  dinding  sel  seperti  polisakarida  dan peptidoglikan.  Perlakuan  dengan  asam  kuat  tersebut  dapat merusak dinding sel bakteri, sehingga menyebabkan pengikat- an  AFB 1 oleh  komponen  membran  sitoplasma  menjadi  lebih mudah. Namun pada penelitian ini tidak melibatkan asam kuat yang dapat merusak dinding sel bakteri, sehingga kemungkinan reduksi  AFB 1 selama  fermentasi  disebabkan  oleh  pengikatan dengan  sel  bakteri  dan  pengaruh  pH.  Hasil  penelitian  ini menunjukkan bahwa terjadi penurunan kadar AFB 1 yang sangat
nyata dari bahan baku kedelai (107,1 ppb) menjadi sari kedelai (4,9 ppb) dan setelah fermentasi oleh L. acidophilus SNP2 (1,6 ppb). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa fermentasi oleh L. acidophilus SNP-2  berpotensi  sebagai  salah  satu  cara  untuk detoksifikasi aflatoksin pada bahan pangan, dan oleh karenanya masih memerlukan kajian lebih lanjut.
Tabel  2.    Pertumbuhan  sel L.  acidophilus SNP-2  dan  penurunan  pH sari kedelai selama fermentasi 12 jam pada suhu 37°C
Fermentasi (jam) Jumlah Sel (cfu/ml) pH 0 1,0 x 10 8 4,68 4 5,3 x 10 8 4,06 6 - 3,94 8 1,1 x 10 9 3,73 10 - 3,67 12 7,0 x 10 8 3,53
Tabel  3.  Kadar  AFB 1 pada  sari  kedelai  selama  fermentasi  oleh L. acidophilus SNP-2 pada suhu 37  C Sampel Kadar AFB 1 (ppb) % Reduksi AFB 1 Sari kedelai 4,90 0 Fermentasi 0 jam 4,50 7,98 Fermentasi 6 jam 1,93 59,82 Fermentasi 8 jam 1,87 61,97 Fermentasi 10 jam 2,20 54,74 Fermentasi 12 jam 1,60 67,58 Reduksi AFB 1 pada sari kedelai terfermentasi oleh L. acidophilus SNP-2 setelah pemanasan
Pada tahap selanjutnya, diamati stabilitas pengikatan AFB 1 oleh  sel  mati L.  acidophilus SNP-2  setelah  fermentasi  sari kedelai.  Setelah  fermentasi  sari  kedelai  selama  12  jam, dilakukan  sterilisasi  sehingga  semua  sel  mati  dan  sari  kedelai terfermentasi  disimpan  pada  suhu  4  C  selama  72  jam.  Pada penelitian ini tidak dilakukan pengukuran kadar AFB 1 pada sari kedelai  terfermentasi  setelah  pemanasan,  tetapi  pengukuran AFB 1 dilakukan  setelah  sari  kedelai  terfermentasi  tersebut disimpan selama 24 jam pada suhu 4  C. Kadar AFB 1 pada sari kedelai setelah fermentasi 12 jam adalah 1,60 ppb atau terjadi reduksi  AFB 1 sebesar  67,58%  dibandingkan  kadar  AFB 1 pada sari  kedelai  (Tabel  3).  Setelah  dilakukan  pemanasan  sari kedelai terfermentasi untuk mematikan sel L. acidophilus SNP-2 dan  penyimpanan  pada  suhu  4  C  selama  24  jam  kadar  AFB 1 menjadi  2,20  ppb,  sehingga  reduksi  AFB 1 menurun  menjadi 54,4%  (Gambar  1).  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  kemungkinan terjadi pelepasan AFB 1 dari kompleks sel-AFB 1 .  Haskard et  al. (2000) mempelajari faktor-faktor yang mempengaruhi pengikat- an  AFB 1 oleh Lactobacillus  rhamnosus GG  dan  menduga bahwa  AFB 1 berikatan  dengan  komponen  karbohidrat  dan protein  dari  sel  hidup.  Setelah  dilakukan  pencucian  lima  kali dengan air terjadi penurunan jumlah AFB 1 yang terikat pada sel hidup dari 78,9% menjadi 49,5%, sedang pengikatan AFB 1 oleh sel mati turun dari 84,1% menjadi 66,4% (Haskard et al ., 2001). Pelepasan kembali AFB 1 ke dalam larutan ini mengindikasikan bahwa  pengikatan  AFB 1 oleh  sel  bakteri  melibatkan  interaksi non kovalen.
Pada  Gambar  1  terlihat  bahwa  setelah  penyimpanan  24 jam,  selanjutnya  stabilitas  kompleks  antara  sel  mati  dengan
AFB 1 pada  sari  kedelai  terfermentasi  relatif  stabil  sampai dengan penyimpanan 72 jam. Selama penyimpanan pada suhu 4  C selama 24 jam, 48 jam dan 72 jam. Kadar AFB 1 pada sari kedelai  terfermentasi  yang  telah  dipanaskan  adalah  berturut- turut  2,20  ppb,  2,40  ppb,  dan  2,40  ppb.  Selama  penyimpanan dingin  ini  kemungkinan  tidak  terjadi  pengikatan  AFB 1 oleh  sel mati,  tetapi  AFB 1 yang  sudah  terikat  pada  sel  relatif  stabil sehingga  tidak  terjadi  pelepasan  AFB 1 sampai  72  jam  pe- nyimpanan pada suhu 4  C. Bila  dibandingkan  dengan  pengikatan  AFB 1 oleh  sel  mati pada  sari  kedelai  tanpa  fermentasi  (Gambar  2),  maka  reduksi AFB 1 pada sari kedelai oleh sel mati setelah fermentasi ini relatif lebih tinggi dan lebih stabil dari pada reduksi AFB 1 oleh sel mati pada sari kedelai tanpa fermentasi.
Gambar 1.   Reduksi AFB 1 pada sari kedelai terfermentasi oleh sel mati L. acidophilus SNP-2 selama penyimpanan dingin (4  C)
Hal  ini  kemungkinan  terkait  dengan  pH  media.  Pada perlakuan  tanpa  fermentasi,  pH  sari  kedelai  yang  telah ditambah sel mati L. acidophilus SNP-2 adalah 6,54, dan tidak terjadi perubahan pH selama penyimpanan. Sebaliknya selama fermentasi  terjadi  penurunan  pH  sari  kedelai  sampai  3,42. Penelitian  yang  dilakukan  oleh  Utami  (2007)  menunjukkan bahwa  sel  mati L.  acidophilus SNP-2  baik  dengan  perlakuan panas  maupun  asam  meningkatkan  secara  nyata  kemampuan pengikatan AFB 1 dalam media bufer, dibandingkan dengan sel hidup. Disamping itu stabilitas kompleks antara sel mati dengan AFB 1 ,  baik  karena  pemanasan  maupun  asam  jauh  lebih  tinggi dari  pada  stabilitasnya  dengan  sel  hidup.  Kemungkinan kombinasi  perlakuan  pemanasan  dalam  kondisi  asam  lebih meningkatkan stabilitas komplek  antara  sel mati L. acidophilus SNP-2 dengan AFB 1 .
Reduksi  AFB 1 pada  sari  kedelai  oleh  sel  mati L. acidophilus SNP-2 Sari  kedelai  ditambah  dengan  biomasa  sel  mati L. acidophilus SNP-2,  yang  konsentrasinya  sebelum  mati  adalah 10 9 dan 10 10 cfu/ml. Selanjutnya dilakukan penyimpanan dalam cool  room (4  C)  selama  3  hari.  Hasil  penelitian  menunjukkan bahwa  10 9 cfu/ml  sel L.  acidophilus SNP-2  yang  telah  mati karena  pemanasan  dapat  mereduksi  kadar  AFB 1 pada  sari kedelai sebanyak 19,4%, dan peningkatan konsentrasi sel mati (10 10 cfu/ml)  tidak  secara  nyata  meningkatkan  kemampuan mereduksi  AFB 1 (Gambar2).  Penelitian  yang  dilakukan  oleh Amanah  (2007)  menunjukkan  bahwa  sel  hidup L.  acidophilus SNP-2  kurang  efektif  mereduksi  AFB 1 pada  media  cair  pada
a a a 0 10 20 30 40 50 60 24 48 72 R ed uk si AF B 1 (% )
Waktu penyimpanan pada suhu 4°C (jam)
konsentrasi  10 8 cfu/ml,  namun  pada  konsentrasi  10 9 dan  10 10 cfu/ml  kemampuan  mereduksi  AFB 1 tidak  jauh  berbeda. Penelitian  yang  dilakukan  oleh  El-Nezami et  al .  (1998),  me- nunjukkan bahwa minimal diperlukan 2x10 9 cfu/ml untuk dapat mengikat lebih dari 50% AFB 1 pada media cair. Haskard et al . (2001) menyatakan bahwa AFB 1 terikat pada komponen dinding sel yaitu peptidoglikan. Hasil penelitian Utami (2007) menunjuk- kan bahwa kemampuan pengikatan AFB 1 oleh sel bakteri hidup setara  dengan  peptidoglikan  murni. Lactobacillus  acidophilus SNP-2 yang mati karena pemanasan masih berupa sel utuh. Pada  penelitian  ini  kadar  AFB 1 pada  sari  kedelai  adalah 9,60  ppb.  Setelah  ditambahkan  10 9 sel L.  acidophilus SNP-2 yang telah dimatikan dan disimpan pada suhu dingin selama 24 jam,  48  jam  dan  72  jam  maka  kadar  AFB 1 menjadi  7,70  ppb, 5,80  ppb,  dan  7,80  ppb.  Sedang  sari  kedelai  yang  ditambah dengan 10 10 sel L. acidophilus SNP-2 yang telah dimatikan dan disimpan pada suhu dingin selama 24 jam, 48 jam, dan 72 jam, kadar AFB 1 menjdai 7,20 ppb, 5,60 ppb, dan 9,1 ppb. Sehingga dibandingkan dengan kadar AFB 1 pada sari kedelai awal, maka terjadi  reduksi  AFB 1 oleh  sel  mati  pada  sari  kedelai  selama penyimpanan  dingin  yang  meningkat  sampai  dengan  pe- nyimpanan 48 jam, dan selanjutnya terjadi penurunan (Gambar 2). Hal ini menunjukkan bahwa masih terjadi proses pengikatan AFB 1 oleh  sel  mati  selama  penyimpanan  dingin,  dan  ikatan antara  AFB 1 dengan  dinding  sel L.  acidophilus SNP-2  relatif tidak stabil, sehingga terjadi pelepasan kembali AFB 1 ke dalam sari  kedelai.  Penelitian  yang  dilakukan  oleh  Peltonen et  al . (2001)  menunjukkan  bahwa  pengikatan  antara  AFB 1 oleh beberapa  galur  bakteri  asam  laktat  berbeda-beda,  ada  yang masih terjadi pengikatan AFB 1 setelah 72 jam, namun ada pula yang  sudah  terlepas  lagi  setelah  24  jam.  Komponen  petidogli- kan  dinding  sel  bakteri  asam  laktat  berpengaruh  dalam pengikatan  aflatoksin.  Ikatan  yang  terjadi  antara  bakteri  asam laktat dan aflatoksin adalah secara fisik dan bersifat reversibel atau  ikatan  non  kovalen  yang  lemah.  Stabilitasnya  kompleks yang  terbentuk  tergantung  dari  strain,  perlakuan  dan  kondisi lingkungan  (Haskard et  al .,  2001).  Pencucian  berulang-ulang dapat  membebaskan  kembali  aflatoksin  yang  telah  terikat (Peltonen et al ., 2001; Utami, 2007 ).
Gambar  2.    Kemampuan  sel L.  acidophilus SNP-2 heat  killed dalam mengikat  AFB 1 pada  sari  kedelai  selama  penyimpanan dingin
KESIMPULAN
Selama  proses  pengolahan  kedelai  menjadi  sari  kedelai, terjadi penurunan kandungan AFB 1 dari 107,1 ppb pada kedelai menjadi  4,9  ppb  pada  sari  kedelai,  yang  memenuhi  batas maksimal  (20  ppb)  yang  ditetapkan  oleh  BPOM.  Selama fermentasi  sari  kedelai  oleh L.acidophilus SNP-2  pada  suhu 37  C  selama  12  jam  terjadi  pengikatan  AFB 1 sejalan  dengan peningkatan jumlah sel dan penurunan pH sari kedelai.
Pada  akhir  fermentasi  sari  kedelai  terjadi  reduksi  AFB 1 sebesar  67,58%.  Pengikatan  AFB 1 dalam  sari  kedelai  ter- fermentasi oleh Lactobacillus acidophilus SNP-2 setelah proses pemanasan  relatif  lebih  stabil  selama  penyimpanan  dingin dibandingkan dengan pengikatan AFB 1 oleh sel mati pada sari kedelai.  Sel  mati Lactobacillus  acidophilus SNP-2  dapat  me- reduksi  AFB 1 pada  sari  kedelai  sampai  40%,  namun ikatannya  tidak  stabil  dan  terjadi  pelepasan  kembali  AFB 1 ke dalam sari kedelai setelah 2 hari penyimpanan dingin.

## UCAPAN TERIMAKASIH
Penelitian  ini  didanai  oleh  Badan  Litbang  Pertanian  Tahun Anggaran  2007-2008  melalui  Kerjasama  Kemitraan  Penelitian Pertanian  Dengan  Perguruan  Tinggi  (KKP3T).  Untuk  itu diucapkan terimakasih.

## DAFTAR PUSTAKA
Amanah  HZ.  2007.  Studi  faktor  yang  berpengaruh  pada pengikatan  aflatoksin  B 1 oleh  bakteri  asam  laktat  strain Lactobacillus  acidophilus SNP-2.  [Tesis].  PS  Ilmu  dan Teknologi Pangan. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta. Christensen  CM,  Mirocha  CI,  Meronuck  RA.  1977.  Mold, mycotoxin  and  mycotoxicosis.  In:  agricultural  experiment station report. University of Minosita.
Dharmaputra  OS,  Retnowati  I,  Ambarwati  S,  Maysra  E.  2005.
Aspergillus  flavus infection  and  aflatoxin  contamination  in peanuts  at  various  stages  of  delivery  chains  in  Cianjur regency, West Java, Indonesia. Biotropia 24: 1-19.
El-Nezami  H,  Kankaanpaa  P,  Salminen  S,  Ahokas  J.  1998.
Ability  of  dairy  strains  of  lactic  acid  bacteria  to  bind  a common food carcinogen, aflatoxin B 1 . Food and Chemical Toxico 36: 321-326.
Grant PG,  Philips TD. 1998. Isothermal adsorption of aflatoxin B 1 on HSCAS clay. J Agric Food Chem 46: 599-605.
Haskard  C,  Binnion  C,  Ahokas  J.  2000.  Factors  affecting  the sequestration of aflatoxin by Lactobacillus rhamnosus strain GG. Chem Biol Interact 128: 39-49.
Haskard  CA,  El-Nezami  HS,  Kankaanpaa  PE,  Salminen  S, Ahokas  JT.  2001.  Surface  binding  of  aflatoxin  B 1 by  lactic acid  bacteria.  Appl  and  Environmental  Microbiol  67:  3-86- 3091.
Marwati. 2007. Reduksi aflatoksin B1 dengan perebusan dalam larutan  kapur  pada  pembuatan  enting-enting.  [Tesis].  PS Ilmu dan Teknologi Pangan. Universitas Gadjah Mada.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 24 48 72 R ed uk si AF B 1 (% ) Waktu Penyimpanan Dingin (jam) Sel 9 log Sel 10 log
Lahtinen SJ, Haskard CA, Ouwehand AC, Salminen SJ, Ahokas JT. 2004. Binding of aflatoxin B1 to cell wall components of Lactobacillus  rhamnosus strain  GG.  Food  Additives  and Contaminants 21: 158-164.
Lilieanny O, Dharmaputra S, Putri ASR. 2005. Populasi kapang pascapanen dan kandungan aflatoksin pada produk olahan kacang tanah. J Mikrobiologi Indonesia 17-20.
Nugroho  DA.  2005.  Penurunan  cemaran  aflatoksin  B1  pada pengolahan emping jagung. [Tesis]. PS Ilmu dan Teknologi Pangan. Universitas Gadjah Mada.
Omaye ST. 2004. Food and Nutritional Toxicology. CRC Press LLC, Boca Raton.
Peltonen  K,  El-Nezami  H,  Haskard  C,  Ahokas  J,  Salminen  S. 2001. Aflatoxin B 1 binding by dairy strain lactic acid bacteria and bifidobacteria. J of Dairy Sci 84: 2152-2156.
Rahayu  ES,  Raharjo  S,  Rahmianna  AA.  2003.  Cemaran aflatoksin  pada  produksi  jagung  di  daerah  Jawa  Timur. Agritech 23: 174.
Rubak  YT.  2007.  Reduksi  aflatoksin  B 1 dengan  proses fermentasi menggunakan Rhizopus oligosporus MK-1 pada pembuatan  bumbu  pecel.  [Tesis].  PS.  Ilmu  dan  Teknologi Pangan. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.
Simanjuntak  R.  2005.  Dekontaminasi  aflatoksin  B 1 melalui pengikatan  oleh  bakteri  asam  laktat.  [Tesis].  PS.  Ilmu  dan Teknologi Pangan. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta. Utami  R.  2007.  Pengikatan  aflatoksin  B 1 oleh  bakteri  Gram positif  dan  bakteri  Gram  negative.  [Tesis].  PS  ilmu  dan Teknologi Pangan. Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
Williams JH, Phillips TD, Jolly PE, Stiles JK, Jolly CM, Aggarwal D.  2004.  Human  aflatoxicosis  in  developing  countries:  a review  of  toxicology  exposure,  potential  health  con- sequences,  and  interventions.  Am  J  Clin  Nutr  80:  1106- 1022.
Zinedine  A,  Faid  M,  Benlemlih  M.  2005.  In  vitro  reduction  of aflatoxin  B 1 by  strain  of  lactic  acid  bacteria  isolated  from Morocca sourdough bread. International J of Agric and Biol 7: 67-70.