ISSN: 1410-8917
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi 17 (2) (2014) : 51 – 57
Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi Journal of Scientific and Applied Chemistry
Journal homepage: http://ejournal.undip.ac.id/index.php/ksa
Isolasi dan Karakterisasi Kitinase Isolat Jamur Akuatik Kitinolitik KC3 dari Kecoa ( Orthoptera )
Karso a , Wuryanti a* , Sriatun a
a Chemistry Department, Faculty of Sciences and Mathematics, Diponegoro University, Jalan Prof. Soedarto, Tembalang, Semarang Corresponding author: wuryanti@live.undip.ac.id
A r t i c l e   I n f o

## A b s t r a c t
Keywords: chitinases, N- acetylglucosamina, KC3 aquatic fungi, cockroach
The isolation and characterization of chitinase from the chitinolytic aquatic fungal isolate KC3  from  isolation  of  cockroach  carcasses  have  been  performed.  The  objective  of  this study  was  to  obtain  chitinase  from  KC3  aquatic  fungal  isolates  and  to  obtain  isolated chitinase  characterization  information  that  included  optimum  pH  and  optimum temperature. Chitinase is a complex enzyme composed of endocytinase, kitobiosidase and N-acetylglucosaminidase.  The  production  medium  contained  choloidal  chitin  as  an inducer. Fractionation was done with ammonium sulfate to a saturation level of 90% (F5). Chitinase activity was measured by Ueda-Arai method based on substrate reduction. The highest specific activity was obtained at fraction one (F1) that was equal to 73.258 U/mg. The chitinase characterization result was obtained by optimum chitinase pH profile at pH 3.8  whereas  the  temperature  profile  obtained  two  peaks  at  28,5°C  and  29,5°C.  The temperature profile of the two peaks/dots indicated if there were two possible types of chitinase in the enzyme under test.

## A b s t r a k
Kata Kunci: kitinase, N- asetilglukosamin, jamur akuatik KC3, kecoa
Isolasi  dan  karakterisasi  kitinase  dari  isolat  jamur  akuatik  kitinolitik  KC3  hasil  isolasi bangkai kecoa telah dilakukan. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan kitinase dari isolat jamur akuatik KC3 dan mendapatkan informasi karakter kitinase hasil isolasi yang meliputi  pH  optimum  dan suhu  optimum. Kitinase adalah enzim  kompleks  terdiri  dari endokitinase, kitobiosidase dan N-asetilglukosaminidase. Media produksi mengandung kitin  koloidal  sebagai  inducer.  Fraksinasi  dilakukan  dengan  amonium  sulfat  sampai tingkat  kejenuhan  90%  (F5).  Aktivitas  kitinase  diukur  dengan  metode  Ueda-Arai berdasarkan pengurangan substrat. Aktivitas spesifik paling tinggi diperoleh pada fraksi satu  (F1)  yaitu  sebesar  73,258  U/mg.  Hasil  karakterisasi  kitinase  diperoleh  profil  pH optimum kitinase pada pH 3,8 sedangkan profil suhunya diperoleh dua puncak yaitu pada 28,5°C dan 29,5°C. Profil suhu dua puncak/titik menunjukkan jika kemungkinan terdapat dua jenis kitinase pada enzim yang diuji.

## 1. Pendahuluan
Kitinase  adalah  enzim  golongan  glikosil  hidrolase yang mengkonversi kitin menjadi monomernya yakni N- asetil glukosamin yang dapat digunakan sebagai substrat dalam  berbagai  aplikasi  industri  [1,  2].  N-asetil glukosamin merupakan komponen dari glikoprotein dan glikosaminoglikan yang berperan sebagai substrat untuk perbaikan  jaringan  dan  reaksi  anti-inflamasi  [3].  N-
asetil glukosamin memiliki aktivitas anti-inflamasi pada kondrosit manusia untuk mengatasi gejala osteoartritis [4].  Selain  itu,  N-asetil  glukosamin  juga  diaplikasikan pada  kosmetik  untuk  mencegah  hiperpigmentasi, penuaan dan menjaga elastisitas kulit [5]. Semua enzim yang dapat mendegradasi kitin disebut sebagai kitinase total  atau  kitinase  non  spesifik.  Berdasarkan mode  of action ,  kitinase  dapat  diklasifikasikan  ke  dalam  dua kategori utama, endokitinase (EC.3.2.1.14) dan
eksokitinase  yang  terdiri  dari  kitobiohidrolase  dan  N- asetilglukosaminidase  (EC.3.2.1.30)  [6].  Endokitinase menghidrolisis  kitin  secara  acak  dari  bagian  dalam menghasilkan  kitooligomer.  Eksokitinase  terdiri  dari kitobiohidrolase  yang  menghidrolisis  kitin  secara berurutan dari ujung nonreduksi menghasilkan kitobiosa sebagai  produk  akhir  dan β -N-asetilheksosaminidase yang  menghidrolisis  kitin  secara  berurutan  dari  ujung nonreduksi  menghasilkan  N-asetilglukosamin  [7].  Saat ini,  kitinase  banyak  diaplikasikan  dalam  bidang pertanian  dan  bioteknologi.  Kitinase  dapat  digunakan sebagai  agen  biokontrol  untuk  jamur  patogen, menghambat kerusakan makanan kemasan dan sebagai insektisida  [8].  Selain  itu,  kitinase  diantaranya  juga digunakan  sebagai  biokontrol  larva  nyamuk,  preparasi protoplats,  produksi  protein  sel  tunggal  dari  limbah perikanan,  produksi  senyawa  kitooligosakarida  dan  N- asetilglukosamin [7, 9].
Sumber  kitinase  dari  golongan  mikroorganisme misalnya  adalah  bakteri Bacillus  sp. DAU101  [10], Enterobacter  sp .  NRG4  [9].  Organisme  lain  yang  dapat menghasilkan kitinase adalah  aktinomiset [11]. Kitinase juga dapat ditemukan pada jamur Trichoderma viride [12].
Salah  satu  jamur  yang  memiliki  potensi  sebagai sumber  kitinase  adalah  jamur  akuatik.  Jamur  akuatik adalah  jamur  yang  hidup  dalam  habitat  berair.  Jamur akuatik  kitinolitik  merupakan  jamur  akuatik  yang memiliki  kemampuan  untuk  menghasilkan  kitinase sehingga  mampu  mendegradasi  kitin.  Al-Rekabi,  dkk (2005)  melaporkan  kemampuan  kitinolitik  dari  dua jamur  akuatik  yaitu Saprolegnia  turfosa dan Achlya  sp . Isolat  jamur  akuatik  KC3  koleksi  Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi FSM Undip juga berpotensi menjadi sumber kitinase. Jamur akuatik ini telah berhasil diisolasi oleh tim penelitian tematik DBD FSM Undip dari bangkai  kecoa  yang  ditempatkan  dalam  air.  Kecoa merupakan spesies serangga dari ordo orthoptera. Tubuh kecoa  mengandung  kitin  sebesar  35%  [13].  Karena  itu, jamur akuatik KC3  mampu tumbuh pada bangkai kecoa dengan  mendegradasi  kitin  pada  tubuh  kecoa  sebagai sumber karbon dan nitrogen untuk pertumbuhannya
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mendapatkan kitinase yang diisolasi dari jamur akuatik kitinolitik KC3 dan mendapatkan informasi karakteristik kitinase hasil isolasi yang meliputi pH dan suhu optimum.

## 2. Metode Penelitian

## Alat dan Bahan
Peralatan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah  peralatan  gelas  laboratorium  kimia,  autoklaf ( Napco  Model  8000-DSE ),  mikropipet  ( Nichiryo  Model 5000F ),  sentrifus  ( Centrific-228 ),  Spektrofotometer UV- Vis ( T60u  Spectrometer ), Shaker  incubator (ES-20 Giant ), neraca  analitik  ( Kern ),  oven  ( LG ),  kompor  listrik ( Maspion ).  Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini adalah  biakan  murni  jamur  akuatik  KC3  koleksi Laboratorium  Mikrobiologi Jurusan Biologi FSM  Undip, koloidal  kitin,  KH 2 PO 4 ,  NaNO 3 ,    BaCl 2 ,  MgSO 4 .7H 2 O, CuSO 4 , Kalium natrium tartrat , KCl, FeSO 4 , pepton, yeast
extract ,  BSA, Follin-Ciocalteau ,  bufer  asetat  0,2  M, (NH 4 ) 2 SO 4 .

## Peremajaan dan Aktivasi Jamur Akuatik KC3
Jarum  ose  yang  telah  disterilkan  dengan  autoklaf dan  pemijaran  digoreskan  pada  spora  biakan  murni  sel jamur  akuatik  dari  stok  awal  media  agar  miring. Kemudian  secara  aseptik  spora  tersebut  diinokulasikan pada  media  padat  kitin  yang  terdiri  dari  KH 2 PO 4 0,1  %, MgSO 4 .7H 2 O  0,05  %,  KCl  0,05  %,  agar  3  %  dan  kitin koloidal  0,5  %.  Media  yang  telah  diinokulasi  dengan spora  jamur  kemudian  diinkubasi  pada  suhu  ruang  di inkubator. Tahap selanjutnya sebanyak satu mata jarum ose  dari  hasil  peremajaan  yang  sudah  tumbuh  pada media  padat  kitin  diinokulasikan  pada  media  cair  yang mengandung  komposisi  seperti  tabel  I,  kemudian dilakukan  inkubasi  pada inkubator  shaker selama  3  hari dengan kecepatan 50 rpm.
Tabel 1: Komposisi 100 mL media fermentasi cair Bahan gram Koloidal kitin 1,5 NaNO 3 0,2 KH 2 PO 4 0,1 MgSO 4 .7H 2 O 0,05 FeSO 4 .7H 2 O 0,05 KCl 0,05 Yeast extract 0,25 Pepton 0,25

## Pembuatan Kurva Pertumbuhan
Sebanyak  10  buah  botol  gelas  masing-masing  diisi dengan 20 mL media cair dengan komposisi seperti pada tabel  I  dalam  bufer  asetat  pH  5,  kemudian  disterilisasi dengan  autoklaf  selama  20  menit.  Pada  10  buah  botol gelas  masing-masing  ditambahkan  0,8  mL  inokulum jamur akuatik (sebagai sampel) secara aseptik. Kemudian ke-10 botol tersebut dimasukkan dalam inkubator shaker dengan kecepatan 50 rpm pada suhu ruang, selanjutnya sampel diambil tiap 6 jam untuk diukur berat keringnya. Penentuan kurva pertumbuhan jamur akuatik dilakukan dengan menggunakan metode pengukuran berat kering sel. Data yang didapatkan adalah jumlah berat kering sel jamur. Data yang diperoleh kemudian diplotkan terhadap waktu  sehingga diperoleh grafik  waktu  vs  jumlah  berat kering sel jamur.

## Produksi Kitinase
Produksi  kitinase  diawali  dengan  membuat  media starter sebanyak  50  mL  dengan  langkah  sama  seperti tahap  aktivasi  pada  media  cair.  Sebanyak  10  mL starter jamur  akuatik KC3 dipindahkan  secara aseptik  kedalam media  produksi  250  mL  (4% starter ).  Komposisi  media produksi  sama  dengan  komposisi  media starter dengan komposisi seperti tabel I. Media produksi diinkubasi pada shaker incubator . Setelah mencapai waktu sesuai fase log, media  produksi  disaring  menggunakan  kertas  saring untuk  memisahkan  sel  jamur  akuatik  dengan  media produksi.  Media  produksi  selanjutnya  disentrifugasi dengan  kecepatan  5000  rpm  pada  suhu  5°C  selama  30
menit untuk memisahkan filtrat (ekstrak kasar kitinase) dan endapan.

## Fraksinasi Kitinase dengan Amonium Sulfat
Amonium  sulfat  ditambahkan  kedalam  ekstrak kasar  enzim  sambil  diaduk  dengan magnetic  stirrer dengan  kecepatan  lambat  sampai  padatan  amonium sulfat  larut  sempurna.  Tingkat  kejenuhan  amonium sulfat  0-20%  dikelompokkan  menjadi  F1,  20-40%  F2, 40-60%  F3,  60-80%  F4  dan  80-90%  F%.  Campuran tersebut  didiamkan  selama  satu  malam  dalam  keadaan dingin.  Selanjutnya  campuran  disentrifugasi  dengan kecepatan  5000  rpm  selama  20  menit  pada  suhu  5°C. Hasil sentrifugasi akan diperoleh endapan yang terpisah dari  filtratnya.  Endapan  diambil  dan  disuspensikan dengan  bufer  asetat  0,2  M  pH  5.  Filtrat  yang  diperoleh kemudian  dilanjutkan  dengan  perlakuan  yang  sama untuk fraksi berikutnya.

## Dialisis Kitinase
Membran selofan yang berisi enzim direndam dalam 800 mL bufer asetat 0,0002 M pH 5,0 lalu diaduk dengan magnetic stirer dalam kondisi dingin. Tiap dua jam bufer diganti serta diuji kandungan amonium sulfatnya dengan BaCl 2 sampai tidak terbentuk endapan putih. Pada tahap ini  diperoleh  kitinase  F1  bebas  amonium  sulfat. Perlakuan yang sama diterapkan pada F2, F3, F4 dan F5 , untuk  mendapatkan  enzim  kitinase  F2,  F3,  F4  dan  F5 yang bebas amonium sulfat.

## Penentuan Aktivitas Kitinase
Aktivitas  kitinase  diuji  menurut  metode  Veda  dan Arai [14] dengan substrat koloidal kitin. Sebanyak 1,0 mL koloidal kitin 0,3 %, 2,0 mL bufer asetat 0,2 M pH 5 dan 1,0 mL filtrat enzim dimasukkan kedalam tabung reaksi dan diinkubasi pada suhu ruang selama waktu tertentu. Kemudian  campuran  tersebut  dipanaskan  dalam  air mendidih  selama  20  menit  untuk  menghentikan  reaksi enzimatis  dalam  campuran  tersebut  lalu  didinginkan. Aktivitas  enzim  dalam  campuran  tersebut  ditentukan secara spektrofotometri pada λ = 660 nm.
Unit aktivitas = x
Keterangan:   x = serapan kontrol

## y = serapan sampel

## Penentuan Kadar Protein
Kadar  protein  total  enzim  ditentukan  dengan metode  Lowry,  menggunakan  BSA  sebagai  larutan standar.

## Penentuan Aktivitas Spesifik  Kitinase
Aktivitas  spesifik  kitinase  ditentukan  dengan menghitung unit aktivitas kitinase dibagi dengan kadar protein total.

## Karakterisasi Kitinase
Penentuan  pH  optimum  dilakukan  dengan mereaksikan  1  mL  kitinase  ditambah  1  mL  substrat koloidal  kitin  0,3%  yang  telah  dilarutkan  dalam  bufer
asetat  0,2  M  dengan  variasi  pH  3,6;  3,8;  4,0;  4,2;  4,4 ditambah  buffer  asetat  0,2  M  sesuai  dengan  variasi  pH tersebut sebanyak 2 mL, kemudian diinkubasi pada suhu ruang  selama  90  menit.  Hasil  inkubasi  kemudian dipanaskan  dalam  air  mendidih  selama  20  menit. Aktivitas  enzim  dalam  campuran  tersebut  ditentukan secara spektrofotometri pada λ = 660 nm.
Setelah diperoleh pH optimum, dilakukan penentuan suhu optimum. Sebanyak 1 mL kitinase hasil fraksinasi  ditambah  1  mL  substrat  koloidal  kitin  0,3% yang telah dilarutkan dalam bufer asetat 0,2 M pada pH optimum  yang  telah  diperoleh  sebelumnya,  kemudian diinkubasi selama 90 menit dengan variasi suhu inkubasi 28°C,  28,5°C,  29°C,  29,5°C,  dan  30,0°C.  Hasil  inkubasi kemudian  dipanaskan  dalam  air  mendidih  selama  20 menit.  Aktivitas  enzim  dalam  campuran  tersebut ditentukan secara spektrofotometri pada λ = 660 nm.

## 3. Hasil dan Pembahasan

## Peremajaan dan Aktivasi Jamur Akuatik Kitinolitik KC3
Peremajaan dilakukan pada media padat mengandung  kitin.  Peremajaan  dilakukan  2  kali  agar diperoleh sel jamur yang semakin murni dan bebas dari kontaminasi  mikroba  lainnya.  Peremajaan  akan menghasilkan  sel  yang  lebih  muda.  Media  yang digunakan  untuk  peremajaan  adalah  media  padat, sedangkan  media  untuk  produksi  adalah  media  cair, karena  itu  sel  jamur  akuatik  dari  media  peremajaan diaktivasikan  pada  media  cair  terlebih  dulu.  Media  cair yang digunakan mengandung kitin koloidal. Kandungan kitin pada media cair akan menjadi inducer sehingga sel jamur mensekresikan kitinase untuk memecah kitin pada media.

## Pembuatan Kurva Pertumbuhan Jamur Akuatik KC3
Kurva  pertumbuhan  menunjukkan  fase-fase pertumbuhan mikroorganisme. Jika fase hidup sel jamur akuatik  diketahui  akan  memudahkan  proses  isolasi kitinase.  Enzim  biasanya  diisolasi  pada  fase  log  karena pada fase ini sel jamur sedang mengalami pertumbuhan yang  cukup  pesat  dengan  jumlah  sel  yang  banyak.  Jika jumlah  sel  yang  tumbuh  banyak  maka  enzim  yang dihasilkan  juga  banyak  karena  masing-masing  sel mensekresikan  enzim.  Kurva  pertumbuhan  yang diperoleh dapat dilihat pada gambar I.
Gambar 1. Kurva Pertumbuhan Jamur Akuatik Kitinolitik KC3
Pada  gambar  1  dapat  dilihat  terjadi  peningkatan massa  sel  secara  signifikan  pada  jam  ke-24,  kemudian
menurun drastis pada jam ke-30. Kurva yang diperoleh tidak  memiliki  fase  stasioner,  mungkin  karena  rentang waktu  pengukuran  masih  terlalu  lebar  sehingga  fase stasioner  tidak  diperoleh.  Lonjakan  massa  sel  yang signifikan  mungkin  juga  disebabkan  karena  adanya pengaruh dari sisa-sisa media (terutama kitin koloidal) yang tidak larut dalam bufer. Sisa media yang tidak larut ataupun tidak digunakan oleh jamur dapat mempengaruhi  pengukuran  berat  sel  karena  metode yang  digunakan  dalam  pembuatan  kurva  pertumbuhan ini  menggunakan  pengukuran  berat  kering  sel  jamur. Kurva  pertumbuhan  isolat  jamur  tersebut  perlu  diteliti lebih  lanjut  dengan  mempersempit  rentang  waktu pengukuran dan memperbesar volume media pertumbuhan  yang  digunakan  untuk  menghindari terbawanya  sisa  media  saat  penyaringan.  Waktu  panen yang  tepat  berdasarkan  kurva  pertumbuhan  di  atas adalah jam ke-24 karena pada jam ini massa sel paling besar  dengan  demikian  diharapkan  jumlah  enzim  yang disekresikan juga besar

## Produksi Kitinase
Tahap  awal  proses  produksi  adalah  pembuatan starter. Starter adalah biakan yang siap difermentasikan. Starter memenuhi syarat untuk difermentasikan karena telah  dikondisikan  sesuai  dengan  kondisi  fermentasi produksi. Media untuk starter dibuat dengan komposisi yang  sama  dengan  media  untuk  produksi.  Selain komposisi media, suhu inkubasi dan kecepatan incubator shaker juga sama. Penggunaan starter akan mempercepat waktu  produksi  karena  fase  adaptasi  menjadi  lebih singkat.
Saat  proses  produksi  berlangsung,  kitinase disekresikan  keluar  sel  oleh  jamur  akuatik  untuk memecah  kitin  menjadi  unit  yang  lebih  kecil.  Hasil hidrolisis  kitin  digunakan  oleh  jamur  akuatik  sebagai sumber  karbon  dan  nitrogen  untuk  menunjang pertumbuhannya.  Kitinase  yang  telah  disekresikan  ke luar sel akan bercampur dengan media produksi, karena itu  untuk  memperoleh  kitinase  dilakukan  penyaringan media produksi. Sel jamur dan sisa media akan terpisah dengan filtrat yang mengandung kitinase.

## Fraksinasi dengan Amonium Sulfat
Penambahan  amonium  sulfat  dapat  menurunkan kelarutan protein melalui dua mekanisme yaitu salting in dan salting  out.  Salting  in terjadi  pada  saat  konsentrasi garam  rendah,  ion  garam  yang  dihasilkan  akan melindungi  molekul-molekul  protein  dan  mencegah bersatunya  molekul-molekul  protein  sehingga  protein tetap  melarut. Salting  out terjadi  pada  saat  konsentrasi garam  tinggi,  ion  yang  dihasilkan  akan  meningkatkan muatan  listrik  di  sekitar  protein  yang  mengakibatkan tertariknya  mantel  air  dari  koloid  protein  sehingga interaksi  hidrofobik  di  antara  sesama  molekul  protein menurunkan kelarutan protein.
Protein yang mengendap pada fraksi satu sebagian besar  adalah  protein  yang  mengandung  asam-asam amino  hidrofobik  yang  cukup  banyak,  karena  itu  pada penambahan  garam  dengan  konsentrasi  kecil  (0-20%) sudah  dapat  mengendap.  Semakin  besar  konsentrasi
garam  yang  diperlukan  untuk  mengendapkan  protein berarti kandungan asam aminonya semakin banyak yang hidrofilik.

## Dialisis Kitinase
Fraksi  kitinase  yang  diperoleh  dari  fraksinasi bertingkat  masih  mengandung  amonium  sulfat,  untuk memisahkan  amonium  sulfat  dari  protein  dapat dilakukan  dengan  dialisis  menggunakan  membran selofan  [15].  Dialisis  adalah  suatu  cara  yang  digunakan untuk  desalinasi  enzim  secara  difusi  melalui  membran semipermeabel  berpori  dengan  ketebalan  10- 100  μm, dimana pemisahannya berdasarkan gradien konsentrasi. Konsentrasi  bufer  asetat  yang  terdapat  dalam  kantung membran selofan adalah 0,2 M, sedangkan bufer asetat di  luar  membran  0,002  M.  Perbedaan  konsentrasi  akan menyebabkan  difusi,  molekul-molekul  yang  berukuran kecil seperti sisa-sisa garam amonium sulfat akan keluar dari membran, sedangkan molekul besar seperti protein akan  tetap  berada  di  dalam  membran.  Proses  dialisis terus  dilakukan  sampai  protein  enzim  dalam  membran terbebas  dari  amonium  sulfat,  untuk  mengetahui  hal tersebut, bufer di luar membran diambil sekitar 1-2 mL kemudian  direaksikan  dengan  BaCl 2 .  Jika  masih terbentuk  endapan  putih  berarti  protein  enzim  dalam membran belum terbebas dari amonium sulfat. Endapan putih tersebut terbentuk dari reaksi antara Ba 2+ dan SO 4 2- membentuk endapan putih BaSO 4 .

## Uji Aktivitas Kitinase
Aktivitas kitinase yang diukur merupakan aktivitas kitinase total atau non-spesifik, yakni meliputi aktivitas endokitinase  maupun  eksokitinase  [16].  Produk  yang dihasilkan adalah kitooligosakarida dan N- asetilglukosamin. Aktivitas kitinase diuji dengan metode Veda  dan  Arai  [14]  berdasarkan  pengurangan  substrat koloidal  kitin.  Turbiditas  yang  disebabkan  karena berkurangnya  jumlah  kitin  di  dalam  campuran  reaksi diukur absorbansinya pada panjang gelombang 660 nm. Satu unit aktivitas enzim diukur sebagai sejumlah enzim yang mengakibatkan pengurangan absorbansi campuran reaksi sebesar 0,001 pada 660 nm tiap menit.
Kadar  total  protein  enzim  diukur  dengan  metode Lowry dkk. [17]  dengan  menggunakan  panjang gelombang  maksimum  larutan  standar  BSA  yang sebelumnya  telah  diperoleh  dari  pengukuran  yaitu  732 nm.  Standar  yang  digunakan  BSA  karena  BSA  tersusun atas semua asam amino yang lengkap.
Metode Lowry dkk. [17]  dipilih  karena  lebih mudah dan sensitif terhadap residu protein sistein, tirosin dan triptofan.  Prinsip  metode  Lowry  adalah  reaksi pembentukan  kompleks  antara  nitrogen  pada  ikatan peptida dengan ion Cu 2+ pada suasana basa dan reduksi fosfomolibdat  serta  fosfotungstat  pada  reagen  Follin- ciocalteu  oleh  rantai  samping  asam  amino  tirosin  dan triptofan  [18].  Jika  unit  aktivitas  suatu  fraksi  semakin tinggi dan kadar protein totalnya semakin rendah, akan semakin tinggi nilai aktivitas spesifiknya. Unit aktivitas kitinase dapat dilihat pada gambar 2, sedangkan aktivitas spesifik kitinase disajikan pada gambar 3.
Gambar 2. Grafik Unit  Aktivitas Kitinase
Gambar 3. Grafik aktivitas  spesifik kitinase
Fraksi  yang  memiliki  aktivitas  spesifik  tertinggi adalah  F1.  Hal  ini  berarti  sebagian  besar  protein  yang terendapkan  pada  F1  adalah  protein  kitinase.  Fraksi dengan aktivitas spesifik tertinggi selanjutnya dikarakterisasi pH dan suhu optimumnya.

## pH Optimum
Sebagian  besar  kitinase  dari  mikroba  memiliki kondisi  optimum  pada  rentang  pH  3,5-9  [6].  Beberapa hasil  penelitian  menyebutkan  jika  kitinase  dari Penicillium  sp. LYG  0704  memiliki  pH  optimum  5  [19], sedangkan pada Isaria fumosorosea memiliki pH optimum 5,7  [20].  Hasil  penelitian  Sharaf dkk. [12]  menyebutkan jika  kondisi  optimum  kitinase  dari Trichoderma  viride diperoleh pada pH 4. Hasil karakterisasi pH diperoleh pH optimum  kitinase  adalah  pH  3,8  dengan  unit  aktivitas sebesar 7,333 U/mL. Kondisi pH optimum kitinase dapat dilihat pada gambar berikut ini.
Gambar 4. Grafik pH optimum
Perubahan
muatan pada enzim dapat mempengaruhi  aktivitasnya,  baik  dengan  perubahan struktur  maupun  perubahan  muatan  pada  residu  asam amino  yang  memiliki  kemampuan  katalitik.  Perubahan
ion  H + yang  ada  dalam  larutan  enzim  memberikan pengaruh  pada  konformasi  bagian  katalitik  enzim.  Jika pH terlalu rendah atau terlalu tinggi akan menyebabkan perubahan  konformasi  enzim  sehingga  aktivitas  enzim menurun. Perubahan pH yang ekstrim akan menyebabkan  enzim  mengalami  denaturasi  karena terganggunya  interaksi-interaksi  nonkovalen  yang menjaga kestabilan struktur tiga dimensi enzim [21].

## Suhu Optimum
Di  lingkungan  alami,  aktivitas  enzim  yang diproduksi mikroorganisme mesofil (termasuk kitinase) umumnya tidak melampaui temperatur 30 0 C [22]. Hasil penelitian  Sharaf dkk. [12]  menyebutkan  kitinase  yang diperoleh  dari Tricoderma  Viridae memiliki  suhu optimum yang tidak berbeda jauh yaitu 28 0 C.
Kitinase  merupakan  enzim  kompleks  yang  terdiri dari endokitinase, kitobiosidase dan N-
asetilglukosaminidase.  Satu  spesies  organisme  mampu menghasilkan lebih dari satu kitinase. Organisme dengan kemampuan menghasilkan lebih dari satu kitinase bukan sesuatu yang baru. Bakteri Pseudomonas aeuroginosa K- 187 dilaporkan menghasilkan dua kitinase yang masing- masing  memiliki  suhu  optimum  50 0 C  dan  40 0 C, sedangkan pH optimumnya pada pH 8 dan 7 [23]. Bacillus sp MH-1  menghasilkan  tiga  kitinase,  dua  diantaranya memiliki suhu optimum yang sama yaitu 75 0 C sedangkan pH  optimumnya  5,5  dan  6,5  [24].  Isolat  jamur  akuatik kitinolitik KC3 kemungkinan juga mampu menghasilkan lebih  dari  satu  kitinase.  Hal  ini  dapat  dilihat  dari  hasil karakterisasi  suhu  optimum  kitinase  yang  ditunjukkan pada gambar V terdapat dua puncak menunjukkan bahwa kemungkinan  terdapat  lebih  dari  satu  kitinase  pada enzim yang diuji.
Gambar 5. Grafik suhu optimum
Temperatur  ketika  aktivitas  enzim  cukup  besar disebut  temperatur  optimum.  Pada  suhu  optimum substrat akan lebih sering bertumbukan dengan sisi aktif enzim sehingga pembentukan kompleks enzim-substrat optimal.  Berdasarkan  profil  suhu  yang  diperoleh  suhu optimum  kitinase  jamur  akuatik  kitinolitik  KC3  adalah 28,5 0 C dan 29,5 0 C.
Enzim  merupakan  suatu  protein,  jika  suhu  terlalu tinggi dapat menyebabkan terjadinya proses denaturasi. Jika  suatu  protein  terdenaturasi,  maka  susunan  tiga dimensi  khas  dari  rantai  polipeptida  terganggu  dan molekul ini terbuka menjadi struktur acak, tanpa adanya kerusakan pada struktur kerangka kovalen. Protein yang terdenaturasi  dapat  membentuk  berbagai  bentuk  acak
yang  biasanya  tidak  aktif  [25].  Perubahan  bentuk  ini menyebabkan aktivitas enzim menurun, karena sisi aktif kehilangan  kemampuan  katalitiknya  sehingga  produk yang dihasilkan juga sedikit.

## 4. Kesimpulan
Kitinase  dapat  diisolasi  dari  isolat  jamur  akuatik kitinolitik  KC3  dengan  menggunakan  kitin  koloidal sebagai inducer .  Kondisi  optimum  reaksi  enzimatis kitinase hasil isolasi adalah pada suhu 28,5 0 C dan 29,5 0 C serta  pH  3,8.  Setiap mikroorganisme  memiliki  karakter yang  berbeda  sehingga  kemampuan  menghasilkan kitinase  dan  karakter  kitinase  yang  dihasilkan  juga berbeda.  Oleh  karena  itu,  penting  untuk  dilakukan identifikasi  isolat  yang  digunakan  karena  dapat membuka  ruang  eksplorasi  kitinase  lebih  luas. Mikroorganisme  yang  memiliki  hubungan  kekerabatan dekat  biasanya  juga  mampu  menghasilkan  enzim  yang sama.

## 5. Daftar Pustaka
[1]  Magdalena  A  Gutowska,  Jeffrey  C  Drazen,  Bruce  H Robison,  Digestive  chitinolytic  activity  in  marine fishes  of  Monterey  Bay,  California, Comparative Biochemistry  and  Physiology  Part  A:  Molecular  & Integrative  Physiology ,  139,  3,  (2004)  351-358 http://dx.doi.org/10.1016/j.cbpb.2004.09.020
[2]  Gemma Reguera, Susan B Leschine, Biochemical and genetic characterization of ChiA, the major enzyme component  for  the  solubilization  of  chitin  by Cellulomonas  uda, Archives  of  microbiology ,  180,  6,
(2003)  434-443 http://dx.doi.org/10.1007/s00203- 003-0611-y
[3]  Jeen-Kuan  Chen,  Chia-Rui  Shen,  Chao-Lin Liu,  N- acetylglucosamine:  production  and  applications, Marine drugs , 8, 9, (2010) 2493-2516 http://dx.doi.org/10.3390/md8092493
[4]  Alexander  R  Shikhman,  Klaus  Kuhn,  Nada Alaaeddine,  Martin  Lotz,  N-acetylglucosamine prevents  IL-1 β -mediated  activation  of  human chondrocytes, The  Journal  of  Immunology ,  166,  8,
(2001) 5155-5160 http://dx.doi.org/10.4049/jimmunol.166.8.5155
[5]  Donald  L  Bissett,  Larry  R  Robinson,  Patricia  S Raleigh, Kukizo Miyamoto, Tomohiro Hakozaki, Jim Li,  Gary  R  Kelm,  Reduction  in  the  appearance  of facial  hyperpigmentation  by  topical  N ‐ acetyl glucosamine, Journal  of  cosmetic  dermatology ,  6,  1,
(2007) 20-26 http://dx.doi.org/10.1111/j.1473- 2165.2007.00295.x
[6]  Winda  Haliza,  Maggy  Thenawidjaya  Suhartono, Karakteristik  kitinase  dari  mikrobia, Buletin Teknologi Pasca Panen , 8, 1, (2016) 1-14
[7]  Reetarani  S.  Patil,  Vandana  Ghormade,  Mukund  V. Deshpande,  Chitinolytic  enzymes:  an  exploration, Enzyme and Microbial Technology , 26, 7, (2000) 473- 483 http://dx.doi.org/10.1016/S0141- 0229(00)00134-4
[8]  Luis Morales de la Vega, J Eleazar Barboza-Corona, Maria  G  Aguilar-Uscanga,  Mario  Ramírez-Lepe, Purification and characterization of an exochitinase from  Bacillus  thuringiensis  subsp.  aizawai  and  its action  against  phytopathogenic  fungi, Canadian
Journal  of  Microbiology ,  52,  7,  (2006)  651-657 http://dx.doi.org/10.1139/w06-019
[9]  Neetu  Dahiya,  Rupinder  Tewari,  Gurinder  Singh Hoondal,  Biotechnological  aspects  of  chitinolytic enzymes:  a  review, Applied  Microbiology  and Biotechnology , 71, 6, (2006) 773-782
http://dx.doi.org/10.1007/s00253-005-0183-7
[10] Yong-Seok Lee, In-Hye Park, Ju-Soon Yoo, Soo-Yeol Chung,  Young-Choon  Lee,  Young-Su  Cho,  Soon- Cheol  Ahn,  Cheol-Min  Kim,  Yong-Lark  Choi, Cloning,  purification,  and  characterization  of chitinase  from  Bacillus  sp.  DAU101, Bioresource
Technology , 98, 14, (2007) 2734-2741
http://dx.doi.org/10.1016/j.biortech.2006.09.048
[11]  MS Hosny, NA El-Shayeb, Amira Abood, AM Abdel- Fattah,  A  potent  chitinolytic  activity  of  marine Actinomycete  sp.  and  enzymatic  production  of chitooligosaccharides, Australian Journal of Basic and Applied Sciences , 4, 4, (2010) 615-623
[12] Eman Fathi Sharaf, Abd El-Aziz Qablan El-Sarrany, Mai  El-Deeb,  Biorecycling  of  shrimp  shell  by Trichoderma  viride  for  production  of  antifungal chitinase, African Journal of Microbiology Research , 6, 21, (2012) 4538-4545 http://dx.doi.org/10.5897/AJMR12.148
[13] Riccardo AA Muzzarelli, Chitin, Elsevier, 2013.
[14] Mitsuhiro  Veda,  Motoo  Arai, Purification  and  some properties of chitinases from Aeromonas sp. No. 10S- 24, Bioscience, biotechnology, and biochemistry , 56, 3,
(1992) 460-464
http://dx.doi.org/10.1271/bbb.56.460
[15] Felix Franks, Characterization of Proteins, Humana Press, 1988.
[16] H Bielka, HBF Dixon, P Karlson, C Liebecq, N Sharon, EJ Van Lenten, SF Velick, JFG Vliegenthart, EC Webb, A  Cornish-Brown,  Enzyme  nomenclature,  in, Academic Press, New York, 1984.
[17] Oliver  H  Lowry,  Nira  J  Rosebrough,  A  Lewis  Farr, Rose J Randall, Protein measurement with the Folin phenol  reagent, The  Journal  of  biological  chemistry , 193, 1, (1951) 265-275
[18] Keith  Wilson,  John  Walker,  Principles  and techniques  of  practical  biochemistry,  Cambridge University Press, 2000.
[19] Yoon  Gyo  Lee,  Ki-Chul  Chung,  Seung  Gon  Wi,  Jae Chang  Lee,  Hyeun-Jong  Bae,  Purification  and properties  of  a  chitinase  from  Penicillium  sp.  LYG 0704, Protein  Expression  and  Purification ,  65,  2,
(2009) 244-250
http://dx.doi.org/10.1016/j.pep.2008.12.004
[20] Shaukat  Ali,  Jianhui  Wu,  Zhen  Huang,  Shun  Xiang Ren,  Production  and  regulation  of  extracellular chitinase from the entomopathogenic fungus Isaria fumosorosea, Biocontrol science and technology , 20, 7,
(2010) 723-738
http://dx.doi.org/10.1080/09583151003714091
[21] BD  Hames,  NM  Hooper,  Biochemistry:  The  Instant Notes.  2nd  editioin, Hongkong:  Spinger-Verlag ,
(2000)
[22] Maria  Swiontek  Brzezinska,  Elżbieta  LALKE– PORCZYK,  Wojciech  Donderski,  Maciej  Walczak, Degradation of chitin in natural environment: role of actinomycetes, Pol. J. Ecol , 57, 2, (2009) 229-238
[23] San-Lang  Wang,  Wen-Tsu  Chang,  Purification  and characterization of two
bifunctional chitinases/lysozymes  extracellularly  produced  by Pseudomonas aeruginosa K-187 in a shrimp and crab shell  powder  medium, Applied  and  environmental microbiology , 63, 2, (1997) 380-386
[24] Kenji  Sakai,  Akira  Yokota,  Hajime  Kurokawa, Mamoru
Wakayama, Mitsuaki
Moriguchi, Purification and characterization of three thermostable  endochitinases  of  a  noble  Bacillus strain,  MH-1,  isolated  from  chitin-containing compost, Applied  and  Environmental  Microbiology , 64, 9, (1998) 3397-3402
[25] Albert  L  Lehninger,  Dasar-Dasar  Biokimia,  M. Thenawidjaja, Erlangga, Jakarta, 1990.