Insersi gen lisozim pada ikan patin siam Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878) untuk membentuk galur tahan penyakit
[Lysozyme gene insertion in striped catfish Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878) to generate desease resistence breeds line]
Wartono Hadie  1 , Sularto 2 , Lies Emmawati Hadie 1 , Angela Mariana Lusiastuti 3 ,
Alimuddin 4 , Evi Tahapari 2 , Huria Marnis 2
1 Pusat Penelitian dan Pengembangan Perikanan Budidaya Balitbang KP Jl. Ragunan 20, Pasar Minggu, Jakarta Selatan 12540
2 Balai Penelitian Pemuliaan Ikan Jl. Raya 2, Sukamandi Pantura, Subang
3 Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Tawar Jl. Sempur No.1 Bogor
4 Departemen Budi daya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, IPB Jl. Agatis Kampus IPB Dramaga, Bogor 16680
Diterima: 11 Mei 2014; Disetujui: 26 Mei 2015

## Abstrak
Serangan penyakit bakterial pada ikan patin telah banyak merugikan para pembudi daya ikan patin terutama pada seg- men perbenihan hingga ukuran siap tebar. Oleh karena itu diperlukan teknologi yang mampu menghasilkan ikan patin yang  tahan  penyakit.  Berkaitan  dengan  hal  itu,  salah  satu  enzim  antimikroba  yaitu  lisozim  yang  memainkan  peranan penting dalam imunitas bawaan dapat diintroduksikan ke dalam genom ikan. Penelitian ini bertujuan untuk mengevalu- asi keberhasilan insersi gen lisozim ke dalam genom ikan patin siam sebagai galur ikan patin tahan penyakit. Transfer gen  dilakukan  dengan  menggunakan  teknik  elektroporasi  pada  spermatozoa  ikan  patin  siam.  Elektroporasi  dilakukan dengan konstruksi gen lisozim berupa plasmid DNA dosis 100 µg.ml -1 dengan voltase 125 V. cm -1 , panjang kejutan 30 milidetik dengan interval kejutan 0.1 milidetik dan jumlah kejutan lima kali. Spermatozoa hasil elektroporasi digunakan untuk membuahi telur. Pengujian keberhasilan insersi gen lisozim dilakukan pada tahap embrio larva, dan pada benih. Hasil pengujian, baik pada tingkat DNA  maupun pada tingkat RNA dari sampel spermatozoa dan  larva ( whole cell ), memperlihatkan hasil yang positif.  Individu ikan patin yang membawa gen lisozim dan telah terintegrasi ke dalam ge- nomnya akan digunakan sebagai kandidat dalam pembentukan galur ikan patin tahan penyakit.
Kata penting: elektroporasi, gen lisozim, ekspresi gen, RNA, DNA, daya tahan penyakit

## Abstract
Bacterial disease in catfish has many detrimental to farmers, especially in the larvae stadium in the hatchery up to ready size of stocking seed. Therefore we need technology that can produce disease resistant of catfish. In that regard, one of the antimicrobial enzyme namely lysozyme which plays an important role in the maternal immunity can be introduced into  the  catfish  genome.  This  study  aimed  to  evaluate  the  success  of  the  lysozyme  gene  insertion  into the  genome  of striped  catfish  to  generate  maternal  disease  resistance.  Gene  transfer  method  was  done  by  using  electroporation  on striped catfish spermatozoa. Lysozyme plasmid electroporation performed with a dose 100µg ml -1 and 125V.cm -1 , pulse length  30  milliseconds  with  a  pulse  interval  0.1  milliseconds  and  pulse  number  5  times.  Electroporated  spermatozoa were  used  to  fertilize  the  egg.  Lysozyme  gene  insertion  success  was  indicated  by  tests  performed  on  embryogenesis, larval, and seed stage. The test results at both DNA and RNA level showed a positive result. Individual that brings the lysozyme  gene  will  be  used  as  a  candidate  for  breed  line  maternal  immune  as  other  ways  to  formation  of  resistant disease varieties.
Keywords: electroporation, lisozyme gene, gene expression, RNA, DNA, disease resistance

## Pendahuluan
Serangan penyakit bakterial pada ikan pa- tin merugikan para pembudidaya ikan terutama
pada segmen pembenihan hingga ukuran siap te- bar (panjang 5-8 cm dan bobot 3-5 gram). Keru- gian  yang  diderita  oleh  para  pengusaha  benih ikan  patin  mencapai  milyaran  rupiah  (Hadie et al .  2010a).  Salah  satu  upaya  untuk  mengatasi
________________________________  Penulis korespondensi Alamat surel: tono_hadi@yahoo.com
masalah  tersebut  adalah  melalui  teknologi  trans- fer gen  untuk  menghasilkan ikan  yang tahan pe- nyakit.
Lisozim sebagai enzim antimikroba, diya- kini  memainkan  peran  penting  dalam  imunitas bawaan (Magnadttir et al . 2005). Enzim ini efek- tif  untuk  melawan  bakteri  terutama  jenis  gram positif  (Hikima et  al .  2003).  Dengan  demikian insersi gen lisozim pada ikan secara umum mam- pu  meningkatkan  kinerja  sistem  kekebalan  ikan terhadap  bakteri.  Enzim  ini  juga  berperan  dalam fagositosis  bakteri  (Saurabh  &  Sahoo  2008).  Li- sozim  terdapat  pada  mucus,  darah  dan  jaringan lain, terutama ginjal (Balfry & Iwama 2004, Fer- nandes et  al .  2004).  Lisozim  juga  ditemukan  di dalam telur  yang telah dibuahi dan diyakini ber- peran dalam mencegah penularan bakteri patogen dari induk kepada keturunannya.
Melihat pentingnya lisozim sebagai sistem kekebalan bawaan yang potensinya  berspektrum luas,  maka  dapat  dijadikan  kandidat  gen  untuk transfer  gen  dalam  rangka  meningkatkan  keke- balan pertahanan ikan. Sistem budi daya perikan- an bergantung kepada tiga komponen utama, yai- tu  biota  (penggunaan  benih  unggul),  pakan  (ha- rus tepat jumlah dan mutu), dan lingkungan (ter- masuk  kesehatan  lingkungan).  Hambatan  yang sering  terjadi  pada  kegiatan  budi  daya  ikan  ada- lah kesehatan lingkungan yang kurang memadai, di  antaranya  hadirnya  patogen  pada  lingkungan budi daya.
Bakteri jenis Aeromonas merupakan suatu kelompok  bakteri  yang  tersebar  luas  di  alam. Aeromonas mesofilik  dikenali  sebagai  bakteri yang  bertanggung  jawab  untuk  beberapa  penya- kit. A. hydrophila merupakan spesies yang paling mematikan  ( phenospecies )  di  antara  kelompok mesofilik. A.  hydrophila menyebabkan  penda- rahan pada amfibi dan ikan seperti extraintestinal dan  infeksi  atau  peradangan  luka  dalam, gastro-
enteritis,  cellulitis ,  radang  selaput  otak,  radang sumsum  tulang  belakang,  infeksi  atau  peradang- an  jaringan,  radang  selaput  perut,  infeksi/pera- dangan bronchopulmonary ,  dan  infeksi/pera- dangan pada  manusia.
Ikan  patin  pasupati  yang  telah  memiliki laju pertumbuhan yang cepat masih dapat diting- katkan  lagi  ketahanannya  terhadap  penyakit  me- lalui  introduksi  gen  antibakteri  lisozim.  Lisozim adalah  enzim  yang  bertindak  sebagai  hidrolase yang  merusak  ikatan  beta  1-4  pada  lapisan  pep- tidoglukan dinding bakteri. Organisme multiselu- ler  mampu  mempertahankan  diri  dengan  sistem kekebalan  bawaan  atau  kekebalan  nonspesifik ( innate  immune  system), baik  secara  fagositik maupun sekresi larutan antimikrobial (Tort et al.
2003).
Introduksi  gen  lisozim  ke  dalam  genom ikan patin untuk  menghasilkan ikan  yang  memi- liki  komponen  gen  antibakteri  dapat  melindungi diri dari patogen lingkungan yang tidak dapat di- kendalikan  dengan  baik.  Kemampuan  inkorpo- rasi  gen  tersebut  diharapkan  dapat  memberi  ke- kebalan  yang  memadai,  sehingga  menjadikan ikan sebagai komponen budi daya yang unggul.
Fletcher et  al .  (2011)  menjelaskan  bahwa pada ikan salmon ( Salmo salar L) yang ditransfer dengan  gen  lisozim,  ditemukan  gen  tersebut  da- lam  jumlah  yang  banyak  pada  semua  organ  tu- buhnya,  walaupun  belum  diketahui  ketahanan terhadap  penyakitnya.  Namun  demikian  Grinde (1989)  mengemukakan  bahwa  ikan  yang  memi- liki banyak lisozim mampu melawan bakteri baik gram positif maupun gram negatif, walaupun pa- da  bakteri  gram  negatif  diperlukan  komplemen Dengan demikian kehadiran lisozim dalam tubuh ikan  berdampak  kepada  meningkatnya  kemam- puan ikan untuk melawan penyakit bakterial.
Transfer  gene  pertumbuhan  (GH)  pada ikan  patin,  juga  telah  dilakukan  Dewi et  al ,
(2012)  dengan  menggunakan  metode  elektropo- rasi pada spermatozoa. Metode tersebut juga da- pat  diterapkan  untuk  transfer  gen  lainnya  pada ikan  patin  yang  disesuai  dengan  karakter  gen yang diinsersikan.
Metode  transfer  gen  pada  ikan  patin  telah dilakukan oleh Dewi et al . (2013), yang selanjut- nya  dapat  digunakan  sebagai  model  transfer  gen pada  ikan  patin.  Transfer  gen  dilakukan  melalui cara  elektroporasi  spermatozoa  menggunakan alat Gene Pulser II (Biorad, USA). Penelitian ini bertujuan  untuk  mengevaluasi  keberhasilan  in- sersi  gen  lisozim  ke  dalam  genom  ikan  patin  si- am  ( Pangasianodon  hypophthalmus )  sebagai kandidat galur ikan patin tahan penyakit.

## Bahan dan metode

## Waktu dan tempat
Penelitian  ini  dilaksanakan  pada  tahun 2012-2013.  Pematangan  dan  pemijahan  induk ikan  patin  dilakukan  di  kolam  percobaan    Balai Penelitian  Pemuliaan  Ikan  (BPPI)  Sukamandi. Perlakuan  transgenik,  pembuahan,  penetasan, dan  pemeliharaan  larva  dilakukan  di  Laborato- rium  Biotek  BPPI  Sukamandi.  Konstruksi  gen dan  perbanyakan  plasmid  dilakukan  di  Labora- torium  Reproduksi  dan  Genetika  Ikan  Departe- men Budidaya Perairan FPIK, IPB Bogor. Peme- liharaan ikan produk transgenik dilakukan di ko- lam percobaan BPPI Sukamandi.

## Ikan uji
Ikan  uji  yang  digunakan  pada  penelitian ini adalah ikan patin jambal ( Pangasius djambal ) jantan  dan  betina,  sedangkan  ikan  patin  siam ( Pangasianodon  hypophthalmus )  hanya  diguna- kan  induk  betina.  Ikan  patin  jambal  digunakan sebagai sumber gamet jantan  (sperma) pembawa gen lisozim. Spermatozoa yang telah membawa
gen  lisozim  digunakan  untuk  membuahi  telur ikan  patin  jambal  guna  memperoleh  ikan  patin jambal  jantan  pembawa  gen  lisozim.  Selain  itu spermatozoa  pembawa  gen  lisozim  juga  diguna- kan  untuk  membuahi  telur  ikan  patin  siam  guna memperoleh induk betina pembawa gen lisozim.

## Transfer gen lisozim
Gen  lisozim  yang  digunakan  dalam  pene- litian ini diperoleh dari Laboratorium Reproduksi dan Genetika Ikan, Departemen  Budi daya Pera- iran, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, IPB Bogor. Transfer gen lisozim dilakukan pada kon- sentrasi DNA plasmid 100 µg ml -1 . Transfer gen dilakukan  dengan  menggunakan  metode  elektro- porasi  dengan  perantara  sperma.  Elektroporasi sperma  dilakukan  dengan  menggunakan  mesin Gene  Pulser II  (Biorad,  USA).  Sperma  diencer- kan  dengan  menggunakan  larutan  fisiologis  (1  :
1) sebelum dicampur dengan plasmid. Elektropo- rasi  dilakukan  dengan  tipe  kejutan square  wave dengan panjang kejutan ( pulse length ) 30 milide- tik dan interval kejutan ( pulse interval ) 0,1 detik, kuat  medan  listrik  ( electric  field  strength )  125 V.cm -1 ,  dan  jumlah  kejutan  ( pulse  number )  lima kali.

## Pembuahan hingga pemeliharaan larva
Pembuahan  telur  dengan  sperma  yang  te- lah membawa gen lisozim dilakukan pada wadah plastik dengan volume 200 ml yang berisi + 200 butir  telur  dan  dibiarkan  dalam  wadah  tersebut hingga  menetas.  Setiap  enam  jam,  air  media  pe- netasan  diganti  dengan  air  mineral  (Aqua®)  un- tuk  menjaga  kualitas  air  tetap  baik.  Setelah  me- netas, larva dipindahkan ke dalam akuarium dan dipelihara hingga ukuran 3 inci, kemudian dipin- dahkan ke dalam jaring di kolam untuk dipeliha- ra hingga dewasa.

## Efektivitas transfer gen lisozim
Keberhasilan transfer gen lisozim diidenti- fikasi  pada  sperma.  Sebelum  dianalisis  sperma dicuci dahulu menggunakan DNAse. Identifikasi keberhasilan transfer gen pada embrio dilakukan dengan  cara  menganalisis  25  embrio  yang  beru- mur 25 jam setelah pembuahan digabung menja- di  satu  sampel.  Selanjutnya  dilakukan  proses PCR  untuk  mendeteksi  keberadaan  gen  lisozim. Primer  yang  digunakan  adalah  GFP-R  (5’-TAT GAA GGT TAT GCT CTG CCC-3’) dan GFP-R (5’-CAT ACC CAG GAA AGA TGG CTG-3’). Ukuran  fragmen  transgen  (lisozim)  adalah  600 bp. Proses  PCR  dilakukan  pada  kondisi:  denatu- rasi  (94ºC,  30  detik),  annealing  (55ºC,  30  detik) dan  ekstensi  (72ºC,  1  menit)  sebayak  35  siklus. Pengecekan hasil amplifikasi PCR dilakukan de- ngan  elektroforesis  menggunakan  gel  agarose 1,5%.

## Analisis ekspresi gen lisozim pada ikan patim
Ekstraksi  RNA  dilakukan  menggunakan kit Tri Reagent ( Molecular Research Center, Inc. Cincinnati,  OH,  USA ).  Tingkat  kemurnian  dan kuantitas  RNA  diukur  menggunakan  qubit®  2.0 flourometri ( Invitrogen ). RNA hasil ekstraksi di- sintesis menjadi cDNA menggunakan kit Ready- To-Go™ RT-PCR Beads ( GE Healthcare ).
Ekspresi gen lisozim pada larva Reverse  transcriptase-polymerase  chain reaction (RT-PCR) menggunakan  alat thermal cycler mycycler (Biorad) yang diprogram dengan 25 siklus. Sebanyak 2 µl cDNA digunakan seba- gai  templet  untuk  PCR  dan  1  µl  primer  GFP-R
(5’-TAT  GAA  GGT  TAT  GCT  CTG  CCC-3’) dan  GFP-R  (5’-CAT  ACC  CAG  GAA  AGA TGG  CTG-3’).  Proses  PCR  transgen  (lisozim) dilakukan  dengan  denaturasi  pada  suhu  94 o C selama  30  detik,  penempelan  primer  pada  suhu 55 o C selama 30 detik dan pemanjangan pada su- hu 72 o C selama 1 menit, dengan ukuran transgen adalah  600  bp.  Sebagai  internal  kontrol  diguna- kan β-aktin dengan primer bact-F (5’-TAT GAA GGT  TAT  GCT  CTG  CCC-3’)  dan  bact-R  (5’- CAT  ACC  CAG  GAA  AGA  TGG  CTG-3’) (Dewi et al . 2012). Panjang fragmen β-aktin ikan patin yang diapit oleh kedua primer tersebut seki- tar 300 bp. Proses PCR β-aktin dilakukan dengan denaturasi  pada  suhu  94 o C  selama  30  detik,  pe- nempelan primer pada suhu 48 o C selama 30 detik dan  pemanjangan  pada  suhu  72 o C  selama  1  me- nit,  sebanyak  25  siklus.  Amplikon  dipisahkan menggunakan gel agarose 2,0%.

## Hasil
Sperma  yang  dielektroporasi  mampu membawa  gen lisozim dan dapat terdeteksi pada sperma  (Gambar  1).  Pada  penelitian  ini,  kebera- daan  gen  lisozym  pada  embrio  25  jam  setelah pembuahan  dan  larva  25  jam  setelah  penetasan ikan  patin  terdeteksi  pada  ukuran  600  bp  (Gam- bar  2).  Penggunaan  konsentrasi  DNA  plasmid 100  µg  ml -1 mampu  menunjukkan  keberhasilan insersi gen lisozym pada ikan patin yang dianali- sis  (Gambar  3).  Hasil  analisis  ekspresi  gen  pada RNA  ikan  transgen  lisozym    juga  terlihat  pada larva  ikan  patin,    hal  ini  menunjukkan  ekspresi gen tersebut mulai nampak (Gambar 4).
Gambar 1. Deteksi transgen (lisozym) pada sperma ikan patin siam ( Pangasianodon hypophthalmus ) meng- gunakan  metode  PCR.  Tanda  (-)  =  kontrol  negatif  PCR,  tanda  (+)  =  kontrol  positif  plasmid (pMSH1-Lys).  Nomor  1-5  =  Sampel  sperma  ikan  patin  siam.    M  =  marker  DNA  100-3000 bp (Vivantis). Ukuran fragmen transgen 600 bp.
Gambar 2. Deteksi transgen pada embrio dan larva ikan patin siam ( Pangasianodon hypophthalmus ) meng- gunakan  metode  PCR.  Tanda  (-)  =  kontrol  negatif  PCR,  tanda  (+)  =  kontrol  positif  plasmid (pMSH1-Lys). E1, E2 dan E3 = sampel embrio setelah 1 jam fertilisasi. Nomor 1 dan 2 = kon- trol  tanpa  plasmid  pMSH1-Lys  dan  tanpa  perlakukan  elektroporasi.  Nomor  3  dan  4  =  kontrol tanpa  plasmid  pMSH1-Lys  dan  perlakukan  elektroporasi.  Nomor  5  dan  6  =  kontrol  ditambah plasmid pMSH1-Lys dan tanpa perlakukan elektroporasi. L1, L2 dan L3 = sampel larva setelah 25 jam memetas. M =  marker DNA 100-3000 bp (Vivantis). Ukuran fragmen transgen 600 bp.
Gambar 3. Deteksi transgen pada beberapa individu  yang akan dijadikan  P 0 ( founder ) ikan patin siam de- ngan menggunakan metode PCR. Nomer 1-5= individu ikan patin transgenik Founder . Tanda (-)
=  kontrol  negatif  PCR,  tanda  (+)  =  kontrol  positif  plasmid  (pMSH1-Lys).  M  =    marker  DNA 100-3000 bp (Vivantis). Ukuran fragmen transgen 600 bp.

## M      1        2       3      4     5     ( -)
600 bp 100 bp Transgen 600 bp M (-)  (+)  E1  E2  E3   1   2    3    4    5     6     L1  L2 L3 600 bp
100 bp
600 bp 100 bp M     (-)     1       2       3       4      5       (+)
Gambar  4.  Analisis  ekspresi  transgen  pada  larva  ikan  patin  siam  dengan  menggunakan  metode  RT-PCR. (A). Ekspresi transgen (lisozym) pada larva. (B). Ekspresi gen  β-aktin pada larva. Nomer 1-8 = sampel larva ikan patin transgenik. Tanda (-) = kontrol negatif PCR, tanda (+) = kontrol positif plasmid (pMSH1-Lys). M  =  marker DNA 100-3000 bp (Vivantis). Ukuran fragmen transgen 600 bp. Gen β-aktin digunakan sebagai internal kontrol dengan ukuran fragmen 300 bp.

## Pembahasan
Sperma yang dielektroforasi mampu mem- bawa  gen  lisozim,  hal  ini  membuktikan  bahwa teknik  yang digunakan sesuai (Gambar 1). Inter- aksi  antara  DNA  eksogen  dan  sel  sperma  bukan merupakan  peristiwa  yang  acak,  tetapi  merupa- kan  proses  yang  teratur  yang  diperantarai  oleh faktor-faktor  spesifik.  Kemampuan  spermatozoa dari hampir semua spesies untuk mengikat DNA asing telah terdokumentasi dengan baik. Individu yang  ditransformasi  secara  genetik  dari  berbagai spesies  telah  diperoleh  dengan  menggunakan  sel sperma  sebagai  vektor  dari  DNA  asing.  Hasil- hasil  observasi  ini  menunjukkan  bahwa  transfer gen dengan mediasi sperma (SMGT) jika dikem- bangkan lebih jauh, dapat diterapkan dengan baik
untuk  tujuan  bioteknologi  dan  dapat  digunakan sebagai  alat  untuk  transformasi  transgenik  pada hewan-hewan  yang  sulit  dilakukan  mikroinjeksi. Pada  perkembangan  dalam  bidang  perikanan teknik  tersebut  juga  telah  dilakukan  pada  ikan mas  komet  (Hadie et  al .  2010b)  dan  pada  ikan patin (Dewi et al . 2012). Hal tersebut menunjuk- kan  bahwa  transfer  gen  menggunakan  mediasi sperma  bisa  dilakukan  pada  berbagai  jenis  ikan dan berbagai tujuan, termasuk gen tahan penyakit pada ikan patin.
Pada saat sel sperma atau sel  telur dielek- troporasi,  aplikasi  kejutan  listrik  pada  suspensi sel  menginduksi  polarisasi  komponen  membran sel  dan  mengembangkan  potensi  tegangan  di  se- luruh  membran. Penelitian  mula-mula  yang dila-

## 600 bp
100 bp M      (+)     1       2       3       4       5       6      7       8      (-) Transgen 600 bp 100 bp 300 bp A β-aktin 300 bp B M      (+)    (-)      1         2       3       4       5       6       7      8
kukan oleh Knight & Scrutton (1986), dilaporkan bahwa  pada  saat  perbedaan  potensial  antara  ba- gian  dalam  dan  luar  membran  sel  melewati  titik kritis, komponen membran di-reorganisasi ke da- lam  pori  dalam  area  terlokalisasi,  dan  kemudian sel  menjadi  permeabel  terhadap  masuknya  ma- kromolekul.  Kondisi  demikian  merupakan  ke- sempatan  gen  lisozim  untuk  masuk  ke  dalam membran  spermatozoa.  Dengan  demikian  sper- matozoa  mampu  membawa  material  gen  pada saat  terjadinya  fusi  gamet  membentuk  zigot  dan akan  terus  berkembang  membentuk  individu  de- wasa.
Keberhasilan  pengantaran  gen  yang  dila- kukan  oleh  spermatozoa  dibuktikan  dengan  ma- suknya  materi  gen  kedalam  zigot  (Gambar  2). Fusi spermatozoa pembawa gen lisozim kedalam sel  telur  membuat  semua  materi  yang  dibawa oleh  spermatozoa  dan  sel  telur  melebur  menjadi satu.  Fusi  ini  ikut  membentuk  rantai  DNA  baru pada  genom  zigot.  Gen  lisozim  yang  terpindai dalam  embrio  membuktikan  bahwa  gen  telah berhasil  dibawa  masuk  ke  zigot  namun  untuk mengetahui  inkorporasinya  kedalam  DNA  ge- nom  perlu  diikuti  pada  individu  larva  hingga dewasa.
Terpindainya  gen  lisozim  pada  larva (Gambar  3),  membuktikan  bahwa  gen  lisozim telah mampu menyatu dengan genom ikan patin. Hal  ini  ditunjukkan  dengan  adanya  aktivitas RNA  yang  terpindai  pada  stadia  larva  (Gambar
4).  Fletcher et  al .  (2011)  melaporkan  bahwa konsentrasi  DNA  yang  tinggi  meningkatkan  efi- siensi  pengikatan  DNA  oleh  sperma,  dan  me- ningkatkan  efisiensi  transfer  pada  telur.  Namun demikian  hasil  penelitian  Hadie et  al .  (2010b) memperlihatkan  bahwa  dosis  100µg.ml -1 cukup efektif untuk ikan komet ( Carasius auratus ). De- ngan demikian dosis tersebut telah dapat diguna-
kan  sebagai  dosis  rujukan  untuk  berbagai  jenis ikan dalam transfer gen melalui elektropoasi.
Gen lisozim yang ditemukan pada bebera- pa organ ikan  mengindikasikan bahwa gen yang ditransfer  telah  terangkai  ke  dalam  DNA  genom ikan. Namun demikian ekspresi gen tersebut per- lu  dibuktikan  lebih  lanjut  apakah  gen  turut  aktif dalam sintesis protein atau tidak. Aktivitas sinte- sis  protein  dari  DNA  dengan  lisozim  baru  dapat diukur dengan indikator  RNA (Gambar  4). Ter- pindainya  RNA  pada  individu  ikan  transgen membuktikan dengan jelas bahwa penyisipan gen lisozim  kedalam  genom  ikan  patin  telah  bekerja dengan baik.
Dengan terekspresinya hingga taraf  RNA, maka aktivitas lisozim pada saat dibutuhkan juga dapat  berfungsi  dengan  baik.  Namun  demikian pada generasi selanjutnya efektivitas gen lisozim transgen  ini  perlu  dibuktikan  melalui  uji  tantang terhadap bakteri penyebab penyakit ikan patin.
Level  ekspresi  gen  dari  individu  transgen bervariasi  di  antara  individu  transgenik.  Hal  ini dikarenakan antara lain oleh bervariasinya kuali- tas  transgen  yang  terintegrasi  dan  situs  integrasi pada  individu  yang  berbeda.  Mekanisme  kerja lisozim  pada  saat  terjadi  infeksi  maka  jaringan akan  mengekspresikan  gen  untuk  menghasilkan lisozim yang akan dikirimkan ke daerah terinfek- si sebagai bagian dari respons imun. Pada udang ( Litopenaeus  vannamei ,  Boone  1931)  ekspresi transkripsi  lisozim  akan  terjadi  pada  empat  jam setelah infeksi yang meningkat secara nyata pada jaringan sekitar infeksi dan pada hemosit (Burge et  al .  2007).  Dengan  demikian  gen  lisozim  yang diinsersikan  kedalam  genom  akan  diekspresikan dengan mudah jika terjadi infeksi bakteri.
Individu ikan patin siam hasil transfer gen, akan  dipelihara  hingga  mencapai  dewasa  dan matang gonad. Individu-individu tersebut selan-
jutnya  akan  digunakan  sebagai  induk  utama  (P 0 ) dalam  program  seleksi.  Pembentukan  populasi induk  tahan  penyakit  hasil  transfer  gen  dapat dilakukan  dengan  membentuk  induk  ikan  patin (P 0 )  dilanjutkan  dengan  pembentukan  generasi baru  (G 1 )  homozigot  lisozim  yaitu  dengan mengawinkan  induk  positif  dengan  induk  yang tidak  diperlakukan  dengan  lisozim.  Individu- individu  homozigot  lisozim  (F 1 )  kemudian  dila- kukan seleksi untuk melihat pola pewarisan sifat tahan  penyakit  dalam  program  pemuliabiakan ( selective breeding ).
Menurut  Fletcher et  al .  (2011),  gen  liso- zim  eksogen  dapat  diwariskan  kepada  generasi berikutnya  mengikuti  pola  Mendel.  Pada  ikan salmon  ( Salmo  salar L)    hasil  transfer  gen,  gen eksogen  dapat  diturunkan  secara  komplet  pada dua  generasi  berikutnya  (F 1 dan  F 2 ).  Walaupun terdapat  sedikit  perbedaan  pada  lokasi  kodon empat  asam  amino  dibanding  dengan  referensi Gene  Bank.  Namun  demikian  lisozim  dapat  ter- ekspresi  pada  hampir  seluruh  organ  dalam  dan sirip  (ekstrimitasnya).  Bahkan  pada  F 2 ikan  sal- mon,  aktivitas  lisis  dari  lisozim  pada  ikan  trans- genik  dapat  meningkat  40%  dibanding  dengan non  transgenik.  Dengan  demikian  individu  ikan patin  yang  telah  membawa  gen  lisozim  eksoge- nus  tersebut  diharapkan  memiliki  heritabilitas yang  tinggi  atau  kemampuannya  menanggulangi penyakit dapat diwariskan kepada generasi selan- jutnya.
Dari sisi program seleksi, hasil ini membe- ri  gambaran  bahwa  sistem  pewarisan  gen  yang diinsersikan  ke  dalam  genom  mengikuti  pola Mendel  dapat  berjalan  dengan  baik.  Ini  berarti bahwa  pola  perkawinan  yang  diatur  dalam  se- leksi  dapat  dirancang  dan  hasilnya  dapat  dipre- diksi  dengan  baik.  Induk  ikan  patin  yang  telah membawa gen lisozim sangat bermanfaat sebagai komponen  dalam  penggabungan  gen  (Hadie et
al .  2010c).  Seleksi  pada  individu  pembawa  gen lisozim  dapat  diarahkan  melalui  pembentukan individu  homozigot  pada  F1,  dan  selanjutnya dapat  diperoleh  induk  yang  tahan  penyakit  pada generasi selanjutnya.
Berhasilnya transfer gen kedalam ikan sal- mon  (Hew  &  Fletcher  2001)  menunjukkan  bah- wa  peningkatan  kekebalan  dapat  dicapai  dengan menciptakan  salmon  transgenik  menggunakan satu atau lebih dari gen yang bertanggung jawab untuk  kekebalan  pada  ikan.  Hal  serupa  diharap- kan  terjadi  juga  pada  ikan  patin  yang  memiliki gen lisozim yang dapat terekspresi dengan baik.
Penemuan  gen  yang  bertanggung  jawab untuk  kekebalan  bawaan  telah  membuat  kema- juan yang cukup selama beberapa tahun terakhir. Penelitian  selanjutnya  menunjukkan  bahwa  sela- in  lisozim,  terdapat  sejumlah  antimikroba/anti- bakteri  protein  lain  dan  peptida  yang  berfungsi untuk  mempertahankan  terhadap  patogen  yang bersifat  infektif  (Patrzykat  &  Douglas  2005). Peningkatan  pertahanan  bawaan  ini  cukup  sig- nifikan  dan  dapat  diharapkan  untuk  meningkat- kan kapasitas individu untuk menetralisir potensi invasif mikroba, meningkatkan pertumbuhan dan kelangsungan hidup (Fletcher et al . 2011).
Di  Indonesia  budi  daya  ikan  patin  secara umum telah mengalami kerugian yang besar baik pada  tahap  pembenihan,  pendederan,  maupun pembesaran  akibat  adanya  serangan  penyakit bakterial.  Kerugian  yang  ditimbulkan  oleh  jenis bakteri Aeromonas di  unit  pembenihan  rakyat (UPR) berupa menurunnya produksi benih, kare- na tingginya tingkat kematian benih pada tingkat larva  sampai  umur  14  hari.  Kematian  larva  di UPR  umumnya  terjadi  pada  minggu  pertama (umur  empat  hari)  dan  secara  umum  terjadi  ke- matian  terbesar  hingga  umur  14  hari.  Kematian benih  umumnya  disebabkan  oleh  penyakit,  yang ditimbulkan akibat tidak menerapkan prinsip bio-
sekuritas. Pada sistem pemeliharaan di UPR yang sangat  sederhana,  kematian  akibat  penyakit  bisa mencapai 95-100% (Hadie et al . 2010a). Masalah tersebut  dapat  diatasi  jika  pencegahan  penyakit dapat  dilakukan baik melalui terapi maupun de- ngan cara penyediaan induk unggul tahan penya- kit, termasuk transgenik lisozim.

## Simpulan
Metoda  insersi  gen  lisozim  ke  dalam  ge- nom  ikan  patin  siam  dapat  dilakukan  dengan menggunakan  teknik  elektroforasi  pada  sperma- tozoa. Keberhasilan penggabungan gen ke dalam genom  ikan  patin  dapat  terdeteksi  pada  sperma- tozoa,  zigot  dan  embrio,  fase  larva,  dan  fase  be- nih. Ekspresi gen lisozym pada tingkat RNA juga memperlihatkan  keberhasilan  penggabungan  gen lisozym  sebagai  kandidat  gen  tahan  penyakit pada  calon  induk  ikan  patin  sebagai  parental ( founder )  untuk  membentuk  benih  unggul  tahan panyakit.

## Daftar pustaka
Balfry SK, Iwama GK. 2004. Observation on the inherent  variability  of  measuring  lyso- zyme activity in Coho salmon Onchorhyn- chus  kissutch . Journal  Comparative    Bio- chemistry and Physiology . 138B: 207-211.
Burge EJ, Madigan DJ, Burnett LE, Burnett KG.
2007. Lysozyme gene expression as a mo- lecular marker of hemocyte location in Pa- cific white shrimp, Litopenaeus vannamei , after injection with Vibrio. Fish and Shell- fish Immunology , 22(4): 327-339.
Dewi  RRSPS,  Alimuddin,  Sudrajat  AO,  Suman- tadinata  K.  2012.  Efektivitas  transfer  gen PhGH  pada  ikan  patin  siam  ( Pangasiano- don  hypophthalmus ). Jurnal  Riset  Akua- kultur , 7(2): 171-180.
Dewi  RRSPS,  Alimuddin,  Sudrajat  AO,  Suman- tadinata  K,  Hayuningtyas  EP.  2013.  Pola ekspresi  gen  enhaced  green  fluorescent protein  pada  embrio  dan  larva  ikan  patin siam  ( Pangasianodon  hypophthalmus ). Jurnal Riset Akuakultur , 8(3): 339-346.
Fernandes  JMO,  Kemp  CD,  Smith  VJ.  2004. Two  novel  muramidases  from  skin  muco-
sa  of  rainbow  trout  ( Onchorhynchus  my- kiss ). Comparative Biochemistry and Phy- siology, 138B: 53-64.
Fletcher  GL,  Hobb  RS,  Evans  RP,  Shears  MA, Hahn  AL,  Hew  CL.  2011.  Lysozyme transgenic  Atlantic  salmon  ( Salmo  salar L). Aquaculture Research , 42(3): 427-440.
Grinde  B.  1989.  A  lysozyme  isolated  from  rain- bow  trout  acts  on  mastitis  pathogens. Mi- crobiology Letters , 60(2): 179–182
Hadie  W,  Lusiastuti  AM,  Sularto,  Tahapari  E. 2010a.  Imunitas  maternal  terhadap Aero- monas  hydrophila :  pengaruhnya  terhadap fekunditas  dan  daya  tetas  ikan  patin  siam ( Pangasianodon  hypophthalmus ). Jurnal Riset Akuakultur , 5 (2): 229-235
Hadie  W,  Kusrini  E,  Priyadi  A,  Alimuddin. 2010b.  Penyisipan  gen  warna  pada  ikan Carasius  auratus menggunakan  metode elektroforasi  dalam  upaya  meningkatkan kualitas  ikan  hias. Jurnal  Riset  Akuakul- tur , 5(3): 335-343.
Hadie W, Tahapari E, Hadie LE, Sularto. 2010c. Efektivitas persilangan dalam peningkatan produktivitas ikan patin melalui hibridisasi antar  spesies. Jurnal  Iktiologi  Indonesia , 10(2): 179-184.
Hikima J, Hirono I, Aoki T. 2003. The lysozyme gene in fish . Aquatic Genome. Tokyo Uni- versity of Fisheries. Tokyo. 301-309.
Hew CL, Fletcher GL. 2001. The rule of aquatic biotechnology  in  aquaculture. Aquacul- ture , 197(1-4): 191-204.
Knight  DE,  Scrutton  MC.  1986.  Gaining  access to  the  cytosol:  the  technique  and  some application  of  electropermeabilization. Biochemical Journal. 234(3): 497-506.
Magnadttir B, Lange S, Gudmundsduttir S, Bog- wald  J,  Dalmo  RA.  2005.  Ontogeny  of humoral  immune  parameters  in  fish. Fish and Shelfish Immunology , 19(5): 429-439.
Patrzykat  A,  Douglas  SE.  2005.  Antimicrobial peptides:  cooperative  approaches  to  pro- tection. Protein  and  Peptide  Letters , 12(1): 19-25.
Saurabh  S,  Sahoo  PK.  2008.  Lysozyme:  an  im- portant  defence  molecule  for  fish  innate immune  system. Aquaculture  Research , 39(3): 223-239.
Tort L, Balasch JC, Mackenzie S. 2003. Fish im- mune  system.  A  crossroads  between innate  and  adaptive  responses. Immunolo- gia , 22(3): 277-286.