## Indonesian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research
Journal homepage: https://idjpcr.usu.ac.id

## Uji Toksisitas Akut Ekstrak Etanol Daun Sirsak (Annona muricata L.) Terhadap Ginjal Mencit
Emil Salim 1* , Puteri Nigie Kemala Dewi 2 , Herawaty Ginting 3
1 Departemen Farmakologi dan Klinik/Komunitas Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan, 20222, Indonesia
2 Program Studi Sarjana Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan, 20222, Indonesia
3 Departemen Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan, 20222, Indonesia *Corresponding Author: emilsalim@usu.ac.id
ARTICLE   INFO

## ABSTRACT
Article history: Received 21 September 2023 Revised 13 October 2023 Accepted 25 December 2023 Available online 27 December 2023 E-ISSN: 2620-3731 P-ISSN: 2615-6199
Soursop leaf ethanol extract was reported to have immunomodulatory, antidiabetic, anti-inflammatory, lowering uric acid and cholesterol levels properties. Based on these reports, soursop leaf ethanol extract has the potential to be developed into a standardized herbal medicine. To ensure safety, this extract must undergo toxicity studies before marketing. This study examined soursop leaf ethanol extract acute toxicity. LD 50 was estimated using the Reed and Muench method, and the effect of the extract on the kidneys was observed. This study used 50 mice—25 males and 25  females—divided  into  5  groups.  The  control  group  received  sodium carboxymethyl cellulose (CMC-Na) 0.5% w/v, and the treatment groups received ethanol extract of soursop leaves at doses of 500, 1000, 1500, and 2000 mg/kg bw orally on the first day, then body weight and number of deaths were calculated and the toxic symptoms were observed over 14 days. After 14 days, the surviving mice were  sacrificed  to  examine  the  relative  organ  weights,  macropathology  and histopathology of the mice kidneys. Male and female mice in the 1500 and 2000 mg/kg  bw  dose  groups  showed  toxic  symptoms.  There  was  no  significant difference in relative organ weight at 14 days between groups. The results of organ macropathology  showed  no  colour  differences  in  all  groups.  Based  on histopathological examination, mild damage to the kidney organs can be seen at doses  of  1500  and  2000  mg/kg  bw  and  the  LD 50 result  was  1819  mg/kg  bw.  In conclusion, soursop leaf ethanol extract has a mild toxic effect on mice. Keyword: Acute toxicity, soursop leaves, kidney histopathology, LD 50
How to cite: Salim E, Dewi PNK and Ginting H.  Uji  Toksisitas  Akut  Ekstrak Etanol  Daun  Sirsak  ( Annona muricata L.)  Terhadap  Ginjal Mencit.  Indonesian  Journal  of Pharmaceutical and Clinical Research. 2023 Dec 27 ;6(2):34- 46.

## ABSTRAK
Ekstrak  etanol  daun  sirsak  dilaporkan  memiliki  efek  imunomodulator, antidiabetes,  antinflamasi,  menurunkan  kadar  asam  urat  dan  kolesterol. Berdasarkan  laporan  ini,  ekstrak  etanol  daun  sirsak  memiliki  potensi  untuk dikembangkan  menjadi  obat  herbal  terstandar.  Sebelum  dipasarkan,  perlu dilakukan  uji  toksisitas  untuk  mengetahui  keamanan  ekstrak  ini.  Penelitian  ini bertujuan untuk mengetahui potensi toksisitas ekstrak etanol daun sirsak terhadap ginjal  mencit.  Metode  yang  digunakan  adalah  metode  Reed  dan  Muench,  nilai LD 50 dihitung  dan  diamati  pengaruh  ekstrak  terhadap  ginjal.  Penelitian  ini menggunakan 50 ekor mencit yang terdiri dari 25 ekor jantan dan 25 ekor betina, yang  dibagi  dalam  5  kelompok.  Kelompok  kontrol  diberi  natrium  karboksimetil selulosa (CMC-Na) 0,5% b/v dan kelompok perlakuan diberi ekstrak etanol daun sirsak (EEDS) dengan dosis 500, 1000, 1500, 2000 mg/kg bb yang diberikan dalam dosis  tunggal  secara  oral  pada  hari  pertama,  selanjutnya  dilakukan  pengamatan gejala  toksik,  berat  badan  dan  jumlah  kematian  selama  14  hari.  Setelah  14  hari, mencit yang masih hidup dikorbankan untuk dilakukan pemeriksaan berat organ relatif,  makropatologi  dan  histopatologi  ginjal  mencit.  Mencit  jantan  dan  betina pada kelompok dosis 1500 dan 2000 mg/kg bb menunjukkan gejala toksik. Berat organ  relatif  selama  14  hari  tidak  terdapat  perbedaan  yang  signifikan  antara kelompok.  Hasil  makropatologi  organ,  tidak  dijumpai  perbedaan  warna  pada semua kelompok. Pada pemeriksaan histopatologi dapat dilihat kerusakan ringan
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International. http://doi.org/10.32734/idjpcr.v6i2.13724
pada organ ginjal pada dosis 1500 dan 2000 mg/kg bb dan hasil LD 50 adalah 1819 mg/kg  bb  yang  menunjukkan  kategori  toksik  ringan.  Ekstrak  etanol  daun  Sirsak memiliki efek toksik ringan pada mencit.
Kata Kunci: Toksisitas akut, daun sirsak, histopatologi ginjal, LD 50

## 1. Pendahuluan
Penggunaan bahan-bahan alami asal tumbuhan (herbal) untuk mengobati berbagai penyakit sebenarnya bukan merupakan hal yang baru bagi masyarakat di Indonesia. Meskipun sempat tergeser oleh adanya modernisasi di bidang kesehatan, tetapi pada kenyataannya obat-obatan herbal tak kalah ampuh untuk mengobati penyakit. Obat-obatan herbal cenderung lebih aman karena tidak memberikan efek samping negatif yang terlalu besar bagi tubuh. Obat-obatan herbal juga cenderung lebih murah. Tidak mengherankan bila tren obat-obatan herbal kembali marak di kalangan masyarakat Indonesia [1].
Sirsak merupakan tanaman tahunan yang dapat tumbuh dan berbuah sepanjang tahun jika kondisi air tanah  terpenuhi  selama  pertumbuhannya.  Tanaman  ini  berasal  dari  daerah  tropis  di  Benua  Amerika,  yaitu Hutan  Amazon  (Amerika  Selatan),  Karibia,  dan  Amerika  Tengah.  Tanaman  sirsak  memiliki  nama  spesies Annona  muricata L.,  merupakan  salah  satu  tanaman  dari  kelas Dicotyledonae ,  keluarga Annonaceae ,  dan genus Annona . Nama sirsak sendiri berasal dari bahasa Belanda yaitu Zuurzak yang berarti "kantong asam" [2].  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  ekstrak  etanol  daun  sirsak  memiliki  efek  nefroprotektif  [3-4], imunomodulator [5], antidiabetes [6], antinflamasi [7], menurunkan kadar asam  urat [8] dan kolesterol [9]. Kandungan  senyawa  kimia  yang  terkandung  dalam  daun  sirsak  diantaranya  adalah  alkaloid,  flavonoid, saponin, steroid, terpenoid, tanin dan polifenol [10].
Telah  banyak  dilakukan  penelitian  efek  farmakologis  dari  daun  sirsak  [5-9],  perlu  dilakukan  uji toksisitas untuk mengetahu keamanan dari daun sirsak. Uji toksisitas akut adalah salah satu uji praklinik yang penting  untuk  menentukan  efek  toksik  suatu  senyawa  yang  akan  terjadi  pada  waktu  yang  singkat  setelah pemberiannya dalam takaran tertentu [11]. Prinsip uji toksisitas akut oral yaitu, sediaan uji dalam beberapa tingkat  dosis  diberikan  pada  beberapa  kelompok  hewan  uji  dengan  satu  dosis  per  kelompok,  kemudian dilakukan pengamatan terhadap adanya efek toksik dan kematian [12]. Tujuan uji toksisitas akut adalah untuk mendeteksi  toksisitas  intrinsik  suatu  zat,  menentukan  organ  sasaran  dan  kepekaan  spesies  dan  untuk memperoleh nilai LD 50 suatu bahan/sediaan dan penentuan penggolongannya dalam pelabelan [12]. Tujuan lain dilakukannya uji toksisitas akut yaitu untuk mengetahui hubungan antara dosis dengan timbulnya efek seperti perubahan perilaku, koma, dan kematian, mengetahui gejala-gejala toksisitas akut sehingga bermanfaat untuk membantu diagnosis adanya kasus keracunan dan untuk memenuhi persyaratan regulasi jika zat uji akan dikembangkan menjadi obat [13].
Ginjal  merupakan  salah  satu  organ  vital  yang  berfungsi  sebagai  pembentukan  urin,  mengatur keseimbangan asam basa, mengatur produksi eritrosit, sintesis glukosa, mengatur keseimbangan air dan urin dan keseimbangan elektrolit. Fungsi ginjal dapat menurun disebabkan karena salah satu faktor yaitu adanya penyakit pada organ ini. Pada berbagai keadaan yang menghalangi fungsi ginjal maka akan menimbulkan gagal ginjal akut maupun kronik [14].
Berdasarkan uraian diatas, ekstrak etanol memiliki berbagai efek farmakologis. Sebelum dipasarkan, perlu  dilakukan  uji  toksisitas  untuk  mengetahui  keamanan  ekstrak  ini.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui potensi toksisitas ekstrak etanol daun sirsak.

## 2. Metode
Penelitian  ini  menggunakan  metode  eksperimental  dengan  tahapan  penelitian  yaitu  pengumpulan tumbuhan,  identifikasi  tumbuhan,  pembuatan  simplisia,  pembuatan  ekstrak,  pengujian  efek  toksisitas  akut secara  oral  terhadap  mencit  jantan  dan  betina,  pengamatan  gejala  toksik,  berat  badan,  berat  organ  relatif, kematian mencit, penentuan LD 50 menggunakan metode Reed dan Muench, pemeriksaan makropatologi dan histopatologi organ ginjal mencit.

## 2.1. Bahan
Bahan tumbuhan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun sirsak ( Annona muricata L.). Bahan kimia yang digunakan yaitu akuades (air suling), CMC-Na (Sodium Carbocymethyl Cellulose), formaldehid 37 %, NaH 2 PO 4 , dan Na 2 HPO 4 . Bahan yang digunakan untuk pembuatan preparat histopatologi adalah larutan hemotaksilin, larutan eosin, etanol 70%, etanol absolut, silol, parafin cair dan cairan perekat (DPX).

## 2.2 Hewan Penelitian
Hewan yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit ( Mus musculus ) betina dan jantan sebanyak 50 ekor yaitu 25 ekor jantan dan 25 ekor betina dengan berat badan 20–30 g. Mencit diaklimatisasi terlebih dahulu selama 14 hari di dalam kandang, diberi makan pelet dan minum air suling.

## 2.3 Penyiapan Bahan Tumbuhan

## 2.3.1 Pengumpulan Bahan Tumbuhan
Pengumpulan bahan dilakukan secara purposif yaitu bahan tumbuhan diambil dari satu tempat saja tanpa  membandingkan  dengan  tumbuhan  yang  sama dari  daerah lain.  Sampel  yang  digunakan  adalah  daun sirsak  ( Annona  muricata L.)  yang  diperoleh  dari  Dusun  4,  Desa  Durin  Tonggal,  Kecamatan  Pancur  Batu, Kabupaten Deli Serdang, Provinsi Sumatera Utara.

## 2.3.2  Identifikasi Tumbuhan
Identifikasi tumbuhan daun sirsak dilakukan di Herbarium Medanese (MEDA), Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara.

## 2.3.3 Pembuatan Simplisia
Helai  daun  sirsak  ke  4  dan  5  disortir  dan  dipisahkan  antara  tangkai  dan  daunnya,  dibersihkan  dari pengotor, dicuci bersih dengan air mengalir, ditiriskan lalu ditimbang beratnya sebagai berat basah, dirajang, kemudian  dikeringkan di dalam lemari pengering  hingga kering dan rapuh (mudah dipatahkan), ditimbang berat keringnya, selanjutnya simplisia kering diserbuk dengan blender dan disimpan dalam kantong plastik kering, diberi etiket kemudian disimpan di tempat yang terlindung dari cahaya matahari langsung.

## 2.4. Pemeriksaan Karakterisasi Simplisia

## 2.4.1. Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan  makroskopik  dilakukan  dengan  mengamati  bentuk,  ukuran,  warna,  bau  dan  rasa  dari daun sirsak segar dari simplisia.

## 2.4.2. Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan  mikroskopik  dilakukan  terhadap  serbuk  simplisia  daun  sirsak.  Serbuk  simplisia ditaburkan di atas kaca objek yang telah ditetesi dengan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup, kemudian diamati di bawah mikroskop.

## 2.4.3. Penetapan kadar air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi (destilasi toluen) [15].

## 2.4.4. Penetapan kadar sari larut dalam air
Sebanyak 5 g serbuk simplisia dikeringkan dimaserasi selama 24 jam dalam 100 mL campuran air dan kloroform  (2,5  mL  kloroform  dalam  air  sampai  1000  mL)  dalam  labu  bersumbat  sambil  sesekali  dikocok selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Disaring, sejumlah 20 mL filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan dangkal berdasar rata dan telah ditara, sisanya dipanaskan pada suhu 105 ℃ sampai bobot tetap. Kadar sari larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara [16].

## 2.4.5. Penetapan kadar sari larut dalam etanol
Sebanyak 5 g serbuk simplisia yang telah dikeringkan dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96% dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Disaring, 20 mL filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan berdasar rata yang telah ditara dan sisa filtrat dipanaskan sampai kering pada suhu 105 ℃ sampai bobot tetap. Kadar sari larut dalam etanol dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan [16].

## 2.4.6. Penetapan kadar abu total
Sebanyak  2  g  serbuk  simplisia  yang  telah  digerus  dan  ditimbang  seksama  dimasukkan  dalam  kurs porselin  yang  telah  dipijar  dan  ditara,  kemudian  diratakan  kurs  dipijar  perlahan,  kemudiaan  naikkan  suhu bertahap hingga 600 ℃ sampai arang habis, jika arang masih tidak dapat dihilangkan, ditambahkan air panas, saring melalui kertas saring bebas abu. Pijarkan sisa dan kertas saring dalam kurs yang sama. Masukkan filtrat ke dalam kurs, uapkan, pijarkan hingga bobot tetap, timbang. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan [16].

## 2.4.7. Penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam
Abu yang diperoleh dalam penetapan kadar abu total dididihkan dalam 25 ml asam klorida 2 N selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam dikumpulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu dan dicuci dengan air panas, dipijarkan kemudian didinginkan dan ditimbang sampai bobot tetap. Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan [16].

## 2.5. Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia dari serbuk simplisia meliputi pemeriksaan golongan senyawa alkaloida, glikosida, antrakuinon glikosida, flavanoida, saponin, dan steroida/triterpenoida [16].

## 2.6. Penyiapan ekstrak etanol daun sirsak
Sebanyak 900 g serbuk simplisia daun sirsak dimasukkan ke wadah kaca berwarna gelap, kemudian dituangi dengan etanol 96% sebanyak 6750 mL. Ditutup dan dibiarkan selama 5 hari dari terlindung cahaya sambil sering diaduk, diserkai dan diperas. Ampas dicuci dengan etanol 96% dipindahkan ke dalam bejana tertutup, dibiarkan di tempat sejuk, terlindung dari cahaya selama 2 hari, selanjutnya disaring. Maserat etanol yang diperoleh diuapkan dengan menggunakan rotary evaporator pada temperatur  40  C sampai diperoleh ekstrak kental kemudian dipekatkan dengan pemanasan di penangas air pada temperatur  40  C.

## 2.7. Pengujian Efek Toksik
Pengujian efek toksisitas meliputi pembuatan EEDS, pengujian toksisitas akut meliputi gejala-gejala klinis,  kematian  hewan,  LD 50 ,  penimbangan  berat  badan,  makropatologi  dan  histopatologi.  Rekomendasi persetujuan  etik  penelitian  diperoleh  dari  Komite  Etik  Penelitian  Hewan  FMIPA  USU  dengan  nomor 00233/KEPH-FMIPA/2022.

## 2.8. Uji toksisitas akut
Penelitian ini dilakukan berdasarkan metode Reed and Muench [15]. Hewan uji yaitu  mencit  ( Mus musculus )  jantan  dan  betina sebanyak 50 ekor dengan bobot 20-30 g. Mencit dibagi dalam 5 kelompok, tiap kelompok terdiri dari 10 ekor mencit yaitu mencit jantan dan 5 ekor mencit betina dan 5 ekor mencit jantan. Kelompok 1 sebagai kontrol, 2-5 sebagai kelompok perlakuan. Pembagian kelompok sebagai berikut: Kelompok 1: Kontrol, diberi larutan suspensi CMC-Na 0,5% b/v Kelompok 2: Perlakuan, diberi ekstrak etanol daun sirsak dosis 500 mg/kg bb Kelompok 3: Perlakuan, diberi ekstrak etanol daun sirsak dosis 1000 mg/kg bb Kelompok 4: Perlakuan, diberi ekstrak etanol daun sirsak dosis 1500 mg/kg bb Kelompok 5: Perlakuan, diberi ekstrak etanol daun sirsak dosis 2000 mg/kg bb

## 2.9. Pengamatan
Penimbangan mencit dilakukan pada hari ke-0, kemudian pada hari ke-1 diberi sediaan uji secara oral dan dilakukan pengamatan selama 14 hari [18].

## 2.9.1. Gejala Toksik
Pengamatan dilakukan setiap hari, setelah pemberian diamati adanya kejang, salivasi, diare, lemas, tidur dan koma [19].

## 2.9.2. Pengamatan Berat Badan
Mencit  ditimbang  setiap  hari  selama  14  hari  untuk  melihat  adanya  pengaruh  EEDS  terhadap  berat badan mencit. Perubahan berat badan mencit dianalisis seminggu sekali. Pada akhir penelitian, hewan yang masih bertahan hidup ditimbang dan kemudian dikorbankan dengan cara dislokasi leher.

## 2.9.3. Pengamatan Kematian Hewan
Mencit  diamati  kematiannya  dari  hari  pertama  sampai  hari  terakhir.  Mencit  yang  mati  setelah pemberian suspensi sediaan segera mungkin di bedah pada bagian perut secara melintang dan diambil organ ginjal. Hewan uji yang masih hidup sampai akhir terakhir, dikorbankan secara fisik dengan dislokasi leher, selanjutnya dibedah, ditimbang dan diambil organnya.

## 2.9.4. Penentuan LD 50
Penentuan LD 50 dilakukan dengan metode Reed dan Muench [17]. Persamaan untuk mendapatkan LD 50 yaitu :
h= 50−𝑎 𝑏−𝑎 i= log 𝑘 𝑠 , g= h×i, y= g + log s, LD 50 = anti log y Dimana: h: Ukuran jarak a: Presentase kematian yang lebih kecil dan paling dekat dari 50% b: Presentase kematian yang lebih besar dan paling dekat dari 50% i: Kenaikan dosis k: Dosis yang menyebabkan kematian yang lebih besar dan paling dekat dari 50% s: Dosis yang menyebabkan kematian yang lebih kecil dan paling besar dari 50% g: Hasil perkalian antara kematian dosis dengan ukuran jarak
y: Hasil penambahan antara g dan log s

## 2.9.5. Pengamatan Berat Organ Relatif
Organ ginjal dicuci dengan natrium klorida, dikeringkan terlebih dahulu dengan kertas penyerap dan ditimbang. Hasil yang dianalisis adalah berat organ relatif, yaitu berat organ dibagi berat badan.

## 2.9.6. Makropatologi Organ
Organ  ginjal  yang  diamati  secara  visual  yaitu  mengamati  warna,  permukaan,  bentuk,  konsistensi organ.  Perubahan  warna  menjadi  salah  satu  parameter  terjadinya  efek  toksik  yang  bertujuan  mendapatkan informasi mengenai toksisitas zat uji yang berkaitan dengan organ sasaran dan efek terhadap organ tersebut [20].

## 2.9.7. Histopatologi Organ
Organ  ginjal  dicuci  dengan  natrium klorida, ditimbang dan dimasukkan kedalam pot berisi formalin 10%. Organ-organ tersebut dikirim untuk diobservasi di bagian histopatologi kedokteran Universitas Sumatera Utara,  untuk  pembuatan  preparat  histopatologi  dilakukan  di  Laboratorium  Patologi  Anatomi  Rumah  Sakit Vina Estetica, Medan, Sumatera Utara. Dilakukan pengamatan preparat histopatologi dengan menggunakan mikroskop untuk melihat adanya perubahan atau kerusakan struktur histopatologi ginjal.

## 2.9.8. Analisis Data
Pengamatan berat badan dan organ relatif dianalisis dengan menggunakan uji normalitas, jika normal dilanjutkan  dengan Two  Way  Analysis  of  Variance (ANOVA)  dan  dilanjutkan  dengan  uji Post  Hoc  Tukey menggunakan program Statistic Product and Service Solutions (SPSS).

## 3. Hasil dan Pembahasan

## 3.1. Hasil Identifikasi Tumbuhan
Identifikasi  tumbuhan  yang  dilakukan  oleh  Herbarium  Medanense  (MEDA),  Universitas  Sumatera Utara Medan menunjukkan bahwa tumbuhan yang diteliti adalah tumbuhan daun sirsak ( Annona muricata L.) suku Annonaceae.
3.2. Hasil Pemeriksaan Karakteristik Simplisia
3.2.1. Hasil pemeriksaan makroskopik simplisia
Hasil pemeriksaan makroskopik simplisia daun sirsak  menunjukkan  si m p l i sia berwarna hijau tua, bertekstur keras, sedikit berbau, tidak berasa dan bentuk daun bulat memanjang.

## 3.2.2. Hasil pemeriksaan mikroskopik serbuk simplisia
Hasil pemeriksaan mikroskopik serbuk simplisia daun sirsak yaitu adanya epidermis atas, rambut penutup, stomata  tipe  anomositik,  pembuluh  kayu  dengan  penebalan  tangga.  Hasil  pemeriksaan  mikroskopik  serbuk simplisia daun sirsak dapat dilihat pada Gambar 1.
a
b c
d
Gambar  1. Mikroskopik  serbuk    simplisia  daun  sirsak  ( Annona  muricata L.).  (a)  Epidermis  atas, (b) Stomata tipe anomositik, (c) Rambut penutup, (d) Pembuluh kayu dengan penebalan tangga.

## 3.2.3. Hasil pemeriksaan karakteristik serbuk simplisia
Standarisasi suatu simplisia dan ekstrak adalah pemenuhan terhadap persyaratan sebagai bahan obat dan menjadi penetapan nilai untuk berbagai parameter  produk  [21]. Hasil  pemeriksaan  karakteristik  serbuk simplisia daun sirsak dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Hasil pemeriksaan karakteristik simplisia daun sirsak No. Karakteristik simplisia Hasil 1 Kadar air 7,95% 2 Kadar sari larut dalam air 24,24% 3 Kadar sari larut dalam etanol 24,03% 4 Kadar abu total 6,43% 5 Kadar abu tidak larut dalam asam 0,89%
Kadar air simplisia daun sirsak yang diperoleh dalam penelitian ini adalah 7,95%, hal ini sesuai dengan standar kadar  air  simplisia  secara  umum  dengan  syarat  yaitu  tidak  lebih  dari  10%  [16].  Pemeriksaan  kadar  air
dilakukan  untuk  mengetahui  kandungan  air  dalam  simplisia,  khususnya  yang  mudah  mengabsorpsi  air  dan membusuk akibat kadar air yang tinggi. Kadar air yang tinggi akan meningkatkan pertumbuhan bakteri dan jamur [15].
Kadar sari larut air simplisia diperoleh 24,24% dan kadar sari larut etanol s eb es ar 24,03%. Hal ini menunjukkan  bahwa  jumlah  senyawa  polar  yang  terdapat  dalam  air  lebih  besar  daripada  jumlah  senyawa kurang polar (semi polar maupun non polar) yang dapat terlarut dalam etanol.
Kadar abu total simplisia daun sirsak yang diperoleh dalam penelitian ini adalah 6,43% dan kadar abu tidak  larut  dalam  asam  sebesar  0,89%.  Penetapan  kadar  abu  total  dilakukan  dengan  tujuan  memberikan gambaran  kandungan  mineral  internal  dan  eksternal  yang  berasal  dari  proses  awal  sampai  terbentuknya simplisia. Kadar abu total berkaitan dengan mineral baik senyawa organik maupun anorganik, sedangkan abu tidak larut dalam asam bertujuan untuk mengetahui jumlah abu yang diperoleh dari faktor eksternal, bersumber dari  pengotor  yang  berasal  dari  pasir  atau  tanah  silikat  [22].  Monografi  dari  simplisia  daun  sirsak  tidak ditemukan di buku Materia Medika Indonesia (MMI), sehingga tidak ada acuan untuk menentukan parameter karakteristik simplisia tersebut.

## 3.3. Hasil Skrining Fitokimia Simplisia
Skrining fitokimia yang dilakukan terhadap serbuk simplisia daun sirsak bertujuan untuk mendapatkan informasi golongan senyawa metabolit sekunder yang terdapat di dalamnya. Hasil skrining fitokimia serbuk simplisia dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Hasil skrining fitokimia serbuk simplisia daun sirsak
No. Golongan senyawa Hasil Serbuk simplisia 1 Alkaloida + 2 Glikosida + 3 Saponin + 4 Tanin + 5 Flavonoida + 6 Steroid/triterpenoid +
Keterangan: ( + ) positif: mengandung golongan senyawa
( ˗ ) negatif: tidak mengandung golongan senyawa
Tabel 2 menunjukkan bahwa serbuk simplisia daun sirsak memiliki kandungan senyawa kimia alkaloida, glikosida, flavanoid, saponin, tanin dan steroid/triterpenoid. Hasil uji fitokimia ekstrak etanol daun sirsak dengan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) menunjukkan adanya kandungan senyawa-senyawa metabolit sekunder berupa saponin, terpenoid, steroid, flavonoid, tanin dan alkaloid [23].

## 3.4. Ekstraksi Daun Sirsak
Ekstraksi  daun  sirsak  dilakukan dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanol 96%. Dari 900 g serbuk simplisia yang diekstrak diperoleh ekstrak etanol 150 g (randemen 16%).

## 3.5. Pengujian Toksisitas Akut
3.5.1. Hasil Pengamatan Gejala Toksik
Hasil pengamatan  gejala  toksik  dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Hasil pengamatan gejala toksik
No. Dosis Jenis kelamin Lemas Tremor Salivasi Urinasi Diare 1 K Jantan - - - + - Betina - - - + - 2 P1 Jantan - - - + - Betina - - - + - 3 P2 Jantan - - - + - Betina - - - + - 4 P3 Jantan + + - + + Betina + + - + + 5 P4 Jantan + + - + + Betina + + - + +
Keterangan: K= kontrol CMC-Na 0,5%; P1= dosis 500 mg/kg bb; P2= dosis 1000 mg/kg bb; P3= dosis 1500 mg/kg bb; P4= dosis 2000 mg/kg bb; (-) = tidak menunjukkan gejala toksik; (+) = menunjukkan gejala toksik
Tabel 3 menunjukkan bahwa setelah pemberian EEDS pada mencit tidak ditemukan gejala toksik pada kelompok kontrol CMC-Na 0,5%, EEDS dosis 500 dan 1000 mg/kg bb. Pada dosis 1500 dan 2000 mg/kg bb ditemukan gejala klinis yaitu lemas, tremor, urinasi dan diare baik pada mencit jantan dan betina. Hal tersebut menunjukkan adanya hubungan antara dosis efek toksik, dimana makin besar dosis yang diberikan maka makin besar pula efek toksik yang timbul [20].

## 3.5.2. Hasil Pengamatan Kematian Hewan
Hasil pengamatan kematian hewan selama 14 hari dapat dilihat pada Tabel 4.
Tabel 4. Hasil pengamatan kematian mencit selama 14 hari Kelompok Jumlah awal mencit  (ekor) Jumlah mencit yang mati (ekor) Jumlah mencit yang hidup (ekor) Jantan Betina Jantan Betina Jantan Betina K 5 5 0 0 5 5 P1 5 5 0 0 5 5 P2 5 5 0 0 5 5 P3 5 5 1 2 4 3 P4 5 5 2 3 3 2
Keterangan: K= kontrol CMC-Na 0,5%; P1= dosis 500 mg/kg bb; P2= dosis 1000 mg/kg bb; P3= dosis 1500 mg/kg bb; P4= dosis 2000 mg/kg bb
Tabel  4    menunjukkan  bahwa  setelah  pemberian  EEDS  pada  kelompok  kontrol,  dosis  500  dan  1000 mg/kg bb tidak terdapat mencit yang mati, sedangkan pada dosis 1500 mg/kg bb terdapat 3 ekor mencit yang mati dan pada dosis 2000 mg/kg bb terdapat 5 ekor mencit yang mati. Kematian pada mencit betina lebih banyak daripada  mencit  jantan.  Perbedaan  ketoksikan  dapat  terjadi  karena    hewan    betina    dengan    hewan    jantan mempunyai  sistem  hormonal  yang berbeda. Hormon yang diproduksi oleh kelenjar endokrin mempengaruhi secara langsung perbedaan dari ketoksikan [24].

## 3.5.3. Nilai LD 50
Daya toksisitas suatu bahan biasanya dihitung dari nilai LD 50 . Dosis tersebut adalah konsentrasi suatu bahan yang dapat menyebabkan kematian sampai 50% dari jumlah hewan yang diuji. Nilai LD 50 digunakan untuk mengelompokkan dosis toksik dari suatu bahan biasanya bervariasi untuk setiap spesies, sehingga LD 50 tersebut merupakan  perkiraan  [25].  Asumsi  yang  dipakai  bahwa  kematian  seekor  hewan  akibat  dosis  tertentu  akan mengalami kematian juga oleh dosis yang lebih besar dan hewan bertahan hidup pada dosis tertentu juga akan tetap bertahan hidup pada dosis yang lebih rendah [20].
Hasil perhitungan berdasarkan metode Reed and Muench. Hasil perhitungan nilai LD 50 pada mencit yang didapat adalah sebesar 1819 mg/kg bb. Menurut BPOM RI (2014) termasuk didalam kategori toksisitas ringan sebab nilai LD 50 diantara 500-5000 mg/kg bb [26].

## 3.5.4. Hasil Pengamatan Berat Badan
Pengamatan berat badan dilakukan untuk mengetahui perubahan berat badan mencit yang merupakan salah satu parameter efek toksik selain jumlah kematian dan berat organ. Penimbangan berat badan dilakukan setiap  hari  selama  14  hari,  kemudian  data  berat  badan  dirata-ratakan  setiap  minggu  untuk  analisis    secara statistik  [19].  Hasil    pengamatan  berat  badan  dapat  dilihat  pada  Tabel  5  yang  menunjukkan  bahwa  tidak terdapat perbedaan yang signifikan pada rata-rata berat badan minggu I dan II baik mencit jantan dan betina antara  kelompok kontrol dengan perlakuan yang ditunjukkan nilai p>0,05. Dengan demikian dapat dilihat bahwa pemberian ekstrak etanol daun sirsak tidak berpengaruh terhadap berat badan pada mencit jantan maupun betina.
Parameter yang merupakan indikator sensitif untuk mengetahui toksisitas yaitu gejala klinis dan berat badan. Hewan uji diamati setiap hari untuk gejala klinis dan berat badan diukur secara berkala [27]. Dilakukan pengamatan terhadap berat badan untuk mengetahui perubahan berat badan mencit yang merupakan salah satu parameter dan efek toksik [19].
Tabel 5. Berat badan mencit Mingg u ke- Jenis kelamin Rata-rata berat badan mencit (g) ± SD K P1 p P2 p P3 p P4 P I Jantan 26,82± 0,44 26,88 ± 0,43 0,591 26,58 ± 0,37 0,130 26,95 ± 0,12 0,995 26,76 ± 0,40 0,665 Betina 27,04 ± 0,40 26,50 ± 0,37 0,152 26,48 ± 0,37 0,020 27,06 ± 0,11 0,701 26,50 ± 0,37 0,188 II Jantan 27,12 ± 0,34 27,10 ± 0,33 0,595 26,96 ± 0,51 0,427 27,32 ± 0,33 0,742 27,16 ± 0,20 0,994 Betina 27,18 ± 0,35 26,78 ± 0,33 0,154 26,84 ± 0,18 0,092 27,36 ± 0,05 0,233 26,95 ± 0.21 0,694
Keterangan: K= kontrol CMC-Na 0,5%; P1= dosis 500 mg/kg bb; P2= dosis 1000 mg/kg bb; P3= dosis 1500 mg/kg bb; P4= dosis 2000 mg/kg bb; SD= standar deviasi; p= angka kebermaknaan

## 3.5.5. Pengamatan Berat Organ Relatif
Pengamatan gejala toksik dilakukan selama 14 hari. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa tedapat 8 ekor mencit yang mati. Jika selama 14 hari tidak ada mencit yang mati maka semua mencit yang masih hidup dibedah  lalu  diambil  organ  ginjalnya  untuk  dilakukan  pemeriksaan  berat  organ  relatif,  makropatologi  dan histopatologi. Hasil pemeriksaan  berat  organ relatif  ginjal  mencit  yang  didata  pada  akhir  perlakuan dapat dilihat pada Tabel 6.
Tabel 6. Berat organ relatif mencit Organ J.K Rata-rata berat organ relatif ± SD K P1 P P2 p P3 p P4 p Ginjal kiri J 0,70 ± 0,047 0,72 ± 0,034 0,59 2 0,66 ± 0,099 0,117 0,72 ± 0,065 1,000 0,72 ± 0,025 1,000 B 0,75       ± 0,049 0,66 ± 0,030 0,15 3 0,67 ± 0,060 0,118 0,74 ± 0,013 0,919 0,72 ± 0,017 0,846
Ginjal kanan J 0,73       ± 0,035 0,71 ± 0,029 0,50 0 0,68 ± 0,076 0,285 0,73 ± 0,047 0,996 0,75 ± 0,063 0,965 B 0,73       ± 0,053 0,66 ± 0,066 0,11 6 0,67 ± 0,062 0,053 0,75 ± 0,055 0,721 0,75 ± 0,016 0,520
Keterangan: K= kontrol CMC-Na 0,5%; P1= dosis 500 mg/kg bb; P2= dosis 1000 mg/kg bb; P3= dosis 1500 mg/kg bb; P4= dosis 2000 mg/kg bb; SD= standar deviasi; p= angka kebermaknaan; JK= Jenis Kelamin; J= Jantan; B= Betina
Hasil uji statistik pada Tabel 6 menunjukkan bahwa tidak terdapat perbedaan yang signifikan pada berat organ relatif baik mencit jantan dan betina antara kelompok kontrol dengan perlakuan yang ditunjukkan nilai p>0,05. Dengan demikian dapat dilihat bahwa pemberian ekstrak etanol daun sirsak tidak berpengaruh terhadap berat organ pada mencit jantan maupun betina. Berat organ relatif ginjal normal berkisaran antara 0,47g - 1,13g [28].

## 3.5.6. Pemeriksaan Makropatologi Organ
Pemeriksaan makropatologi organ dilakukan dengan mengamati warna, bentuk  permukaan dan konsistensi organ ginjal mencit jantan dan betina. Hasil pemeriksaan makropatologi organ dapat dilihat pada Tabel  7.
Tabel 7 Hasil pemeriksaan makropatologi organ ginjal mencit Kelompok Jenis kelamin Pengamatan Warna Permukaan Konsistensi Kontrol Na-CMC 0,5% b/v Jantan Merah kecoklatan Licin Kenyal Betina Merah kecoklatan Licin Kenyal EEDS Dosis 500 mg/kg bb Jantan Merah kecoklatan Licin Kenyal Betina Merah kecoklatan Licin Kenyal EEDS Dosis 1000 mg/kg bb Jantan Merah kecoklatan Licin Kenyal Betina Merah kecoklatan Licin Kenyal EEDS Dosis 1500 mg/kg bb Jantan Merah kecoklatan Licin Kenyal Betina Merah kecoklatan Licin Kenyal EEDS Dosis  2000 mg/kg bb Jantan Merah kecoklatan Licin Kenyal Betina Merah kecoklatan Licin Kenyal
Tabel  7  menunjukkan  bahwa  makropatologi  organ  ginjal  mencit  jantan  maupun  betina  dari  semua kelompok,  baik  kelompok  kontrol  maupun  perlakuan  masih  dalam  keadaan  normal  yaitu  berwarna  merah kecoklatan,  permukaannya  licin  dan  konsistensinya  kenyal.  Kriteria  normal  pada  organ  yaitu  bila  tidak ditemukan perubahan warna, perubahan tekstur permukaan dan perubahan konsistensi [29]. Adanya perubahan warna  organ  menjadi  salah  satu  parameter  suatu  efek  toksik  pada  organ.  Umumnya  toksikan  hanya mempengaruhi  satu  atau  beberapa  organ.  Hal  ini  dapat  disebabkan  lebih  pekanya  suatu  organ,  atau  lebih tingginya kadar kimia dan metabolitnya di organ [20].

## 3.5.7. Pemeriksaan Histopatologi Organ
Pengamatan histopatologi dilakukan pada akhir masa uji, yaitu pada hari ke-15. Mencit yang masih hidup dibedah untuk diambil organ vitalnya yaitu ginjal. Melalui pengamatan histopatologi ini dapat dilihat kerusakan organ pada tingkat seluler yang tidak terlihat secara makroskopik Gambar 2.
Gambar 2. Hasil pemeriksaan histopatologi organ ginjal EEDS mencit jantan dan betina. (a) CMC-Na 0,5% jantan, (b) CMC-Na 0,5% betina, (c) EEDS Dosis 500 mg/kg bb jantan, (d) EEDS Dosis 500 mg/kg bb betina, (e) EEDS Dosis 1000 mg/kg bb jantan, (f) EEDS Dosis 1000 mg/kg bb betina, (g) EEDS Dosis 1500 mg/kg
bb jantan, (h) EEDS Dosis 1500 mg/kg bb betina, (i) EEDS Dosis 2000 mg/kg bb jantan, (j) EEDS Dosis 2000 mg/kg bb betina. 1 = glomerulus normal, 2 = pembesaran glomerulus, 3 = degenerasi hidrofik.
Berdasarkan hasil pemeriksaan histopatologi organ ginjal mencit pada Gambar 2 dapat dilihat bahwa organ ginjal mencit kelompok kontrol, dosis 500 mg/kg bb, dan dosis 1000 mg/kg bb baik jantan maupun betina masih mempunyai gambaran histopatologi yang normal yang ditunjukkan dengan adanya glomerulus yang masih utuh dengan sitoplasma yang berwarna ungu dan sel yang masih utuh.
Kelompok dosis 1500 mg/kg bb dan 2000 mg/kg bb baik jantan maupun betina mengalami kerusakan yang ditunjukkan dengan adanya glomerulus yang  membesar dengan sitoplasma yang berwarna ungu yang sudah mulai pudar karena terjadi degenerasi hidropik. Hasil dari pengamatan pada semua kelompok menunju
kkan  bahwa  persen  degenerasi  hidrofik  dan  pembesaran  glomerulus  meningkat  seiring  dengan meningkatnya  dosis  pemberian  ekstrak.  Degenerasi  hidrofik  merupakan  peristiwa  meningkatnya  kadar  air  di intraseluler yang menyebabkan sitoplasma dan organel-organel membengkak dan membentuk vakuola-vakuola. Rusaknya  permeabilitas  membran  sel  menyebabkan  terhambatnya  aliran  Na + keluar  dari  sel  sehingga menyebabkan ion-ion dan air masuk secara berlebihan ke dalam sel. Degenerasi hidropik merupakan respon awal sel terhadap bahan-bahan yang bersifat toksik, serta merupakan proses awal dari kematian sel [30]. Kadar Na + intrasel diatur oleh pompa Na + yang memerlukan ATP, jika ATP berkurang maka akan mengakibatkan masuknya Na + ke intrasel melebihi jumlah normalnya [13]. Kerusakan sel secara terus-menerus akan mencapai suatu titik sehingga terjadi kematian sel [12]. Paparan zat toksik pada sel apabila cukup lama, maka sel tidak dapat lagi mengompensasi dan tidak dapat melanjutkan metabolisme [31].

## 4. Kesimpulan
Berdasarkan  hasil  penelitian  ini,  ekstrak  etanol  daun  sirsak  dosis  500  dan  1000  mg/kg  bb  tidak menimbulkan efek toksik. Dosis yang lebih tinggi yaitu 1500 dan dosis 2000 mg/kg bb menimbulkan gejala toksik berupa lemas, tremor, salivasi, urinasi dan diare pada mencit jantan dan betina dan termasuk kategori toksik ringan dengan nilai LD 50 pada mencit 1819 mg/kg bb. Ekstrak etanol daun sirsak tidak berpengaruh terhadap berat badan mencit jantan dan betina. Selanjutnya, ekstrak etanol daun sirsak dosis 1500 dan 2000 mg/kg bb menyebabkan degenerasi hidrofik dan pembesaran glomerulus.

## Ucapan Terima Kasih
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof. Dr. Syafruddin Ilyas, M.Biomed. atas persetujuan etik penelitian,  Dr.  Erti  Sartina  Siregar,  S.Si.,  M.Si.  atas  identifikasi  tanaman,  Pimpinan  dan  staf  laboratorium Biologi  Farmasi,  Farmakologi  Farmasi,  Fakultas  Farmasi,  Universitas  Sumatera  Utara.  Pimpinan  dan  staf Bagian  Histopatologi  Kedokteran,  Fakultas  Kedokteran,  Universitas  Sumatera  Utara,  Pimpinan  dan  staf Laboratorium  Patologi  Anatomi  Rumah  Sakit  Vina  Estetica,  Medan,  Sumatera  Utara  atas  fasilitas  dan bimbingan terkait penelitian ini.

## Konflik Kepentingan
Penulis menyatakan bahwa tidak ada konflik kepentingan.

## Daftar Pustaka
[1] Mardiana L, Ratnasari J. Ramuan dan khasiat sirsak. Penebar Swadaya Grup; 2011.
[2]   Zuhud E.A.M . Bukti kedahsyatan: sirsak menumpas kanker. AgroMedia; 2011.
[3]   Adedapo, A. A., Oni, O. A., Falayi, O. O., Ogunmiluyi, I. O., Ogunpolu, B. S., Omobowale, T. O., ... & Yakubu, M. A. (2022). Annona muricata mitigates glycerol-induced nephrotoxicities in male albino rats through signaling pathways of angiotensin conversion enzyme, kidney injury molecule-1, and antioxidant properties. Scientific African, 16, e01225.
[4]   Zeweil, M. M., Khafaga, A. F., Mahmoud, S. F., Wasef, L., Saleh, H., Elrehim, A. M. A., ... & Ghoneim, H. A. (2024). Annona Muricata L. extract restores renal function, oxidative stress, immunohistochemical structure, and gene expression of TNF-α, IL-β1, and CYP2E1 in the kidney of DMBA-intoxicated rats. Frontiers in Pharmacology, 15, 1348145.
[5]   Dewi LK, Widyarti S. Pengaruh pemberian ekstrak Etanol daun Sirsak ( Annona muricata Linn.) terhadap peningkatan jumlah sel T CD4+ dan CD8+ pada Timus Mencit ( Mus musculus ). Biotropika: Journal of Tropical Biology. 2013 May 1;1(1):24-6.
[6]   Pandaleke SS, de Queljoe E, Abdullah SS. Uji Efektivitas Ekstrak Etanol Daun Sirsak ( Annona muricata L.)  Untuk  Menurunkan  Kadar  Gula  Darah  Tikus  Putih  Jantan  ( Rattus  norvegicus )  Yang  Diinduksi Aloksan. Pharmacon. 2022 Feb 24;11(1):1321-7.
[7]   Rahmawati  R,  Rahman  S,  Mustari  M.  Uji  Efek  Antiinflamasi  Ekstrak  Etanol  Daun  Sirsak  ( Annona muricata Linn.) Terhadap Mencit  ( Mus musculus ) Jantan Yang Diinduksi Dengan Karagen. As-Syifaa Jurnal Farmasi. 2012 Jul 1;4(1):7-15.
[8]   Tayeb R, Ubyaan M, Usmar U. Uji Efek Pemberian Ekstrak Etanol Daun Sirsak ( Anonna muricata L.) terhadap  Kadar  Asam  Urat  pada  Tikus  Putih  ( Rattus  norvegicus ).  In  Proceeding  of  Mulawarman Pharmaceuticals Conferences 2016 Apr 26 (Vol. 3, pp. 367-373).
[9]   Florencia E, Ginting B. Uji Efek Ekstrak Etanol Daun Sirsak ( Annona Muricata L,) Terhadap Penurunan Kadar Kolesterol Pada Kelinci Dengan Atorvastatin Sebagai Pembanding. Politeknik Kesehatan Medan. 2022.
[10] Sari, Sudarmi, Patilaya P. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Sirsak Muda dan Tua ( Annona muricata L . ) Terhadap Staphylococcus aureus (Skripsi). Medan: Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara. 2018.
[11] Casarett  LJ.  Casarett and  Doull's  toxicology:  The  basic science  of  poisons.  New  York:  McGraw-Hill; 2008.
[12] Lu FC, Toksikologi Dasar: Asas, Organ Sasaran, dan Penilaian Risiko. Diterjemahkan oleh Nugroho E, Bustami ZS, dan Darmansjah I. Edisi Kedua. Jakarta: UI Press. 1994.
[13] Priyanto SH. Toksikologi mekanisme, terapi antidotum dan penilaian risiko. Yogyakarta: Leskonfi. 2009.
[14] Robbins dan Cotran. Pathology Basic of Disease. Edisi Ketujuh. New York: Elsevier, Inc. 2009. Halaman 977-981.
[15] World Health Organization (WHO). Quality control methods for medicinal plant materials. World Health Organization; 1998.
[16] DepKes  RI.  Materia  Medika  Indonesia  Jilid  VI,  Cetakan  Keenam.  Jakarta:  Direktorat  Jenderal Pengawasan Obat Dan Makanan. 1995:92-4 .
[17] Reed  LJ,  Muench  H.  A  simple  method  of  estimating  fifty  percent  endpoints.  American  journal  of epidemiology. 1938 May 1;27(3):493-7.
[18] Angelina M, Hartati S, Dewijanti ID, Banjarnahor SD, Meilawati L. Penentuan LD 50 Daun Cinco ( Cyclea barbata Miers.) pada Mencit. Makara Journal of Science. 2010 Oct 14.
[19] Organization  for  economic  cooperation  and  development  (OECD).  Guidelines  for  the  Testing  of Chemicals, OECD 407. Acute Oral Toxicity-Acute Toxic Class Method.
[20] Lu FC, Toksikologi dasar: asas, organ sasaran, dan penilaian resiko. Edisi II. Jakarta. UIP. 1995. Hal. 85- 86, 206-220.
[21] Ditjen POM, Depkes RI. Parameter standar umum ekstrak tumbuhan obat. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 2000:10-5.
[22] Depkes RI. Pedoman pelaksanaan uji klinik obat tradisional. Jakarta: DepKes RI, DitJen POM, Direktorat Pengawasan Obat Tradisional. 2000.
[23] Rahman, Friska Ani, Tetiana Haniastuti, and Trianna Wahyu Utami. "Skrining fitokimia dan aktivitas antibakteri  ekstrak  etanol  daun  sirsak  (Annona  muricata  L.)  pada Streptococcus  mutans ATCC 35668." Majalah Kedokteran Gigi Indonesia 3.1 (2017): 1-7.
[24] Lazarovici P, Laberbourn-Galski H. Chimeric tocin. Mechanisms of actions and theraupeutic applications. New York: CRC Press. 2002.
[25] Syamsuni dan Darmono. Buku ajar farmakologi experimental. Jakarta: UI Press. 2011. Hal. 46.
[26] Ditjen POM, Depkes RI. Pedoman Uji Toksisitas Nonklinik Secara In Vivo. 2014.
[27] Bhardwaj  S,  Gupta  D.  Study  of  acute,  sub-acute  and  chronic  toxicity  test.  International  Journal  of Advanced Research in Pharmaceutical & Bio Sciences. 2012 Apr 1;1(3):103-30.
[28] Ar  Razi  F,  Uji Toksisitas Akut  Ekstrak  Etanol  Bunga  Pepaya Jantan  ( Carica  papaya L.) pada  Mencit Jantan (Skripsi). Medan: Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara. 2014.
[29] Anggraini  DR,  Gambaran  makroskopik  hati  dan  ginjal  mencit  akibat  pemberian plum  asetat  (Tesis). Medan: Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara. 2008.
[30] Setiati N. Pemberian Ekstrak Benalu Mangga terhadap Perubahan Histologis Hepar Tikus yang Diinduksi Kodein. Biosaintifika: Journal of Biology & Biology Education. 2014;6(2):80-6.
[31] Juhryyah,  S.  Gambaran  Histopatologi  Organ  Hati  dan  Ginjal  Tikus  Intoksikasi  Akut  Insektisida (Metofluthrin,  D-Phenothrin,  D-Allethrin)  dengan  Dosis  Bertingkat  (Skripsi).  Bogor:  Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor; 2008.