## ISSN: 0215-7950
*Alamat penulis korespondensi: Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Jalan Kamper, Kampus IPB Dramaga, Bogor 16680. Tel: 0251-8629364, Surel: widodo@apps.ipb.ac.id

## Volume 20, Nomor 3, Mei 2024
Halaman 140–153 DOI: 10.14692/jfi.20.3.140–153
Keragaman  Spesies Colletotrichum yang Berasosiasi dengan Buah Jeruk Impor dan Potensinya Menginfeksi Tanaman Cabai, Karet, dan Kakao di Indonesia
Diversity of Colletotrichum Species Assosiated with Imported Citrus Fruits, and their Potential to Infect Chili, Rubber, and Cacao Trees in Indonesia
Joni Hidayat, Sri Hendrastuti Hidayat, Suryo Wiyono, Widodo * Program Studi Fitopatologi, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor Jalan Kamper, Kampus IPB Dramaga, Bogor 16680
(diterima April 2024, disetujui Mei 2024)

## ABSTRAK
Spesies Colletotrichum telah banyak dilaporkan sebagai agens penyebab penyakit antraknosa pada tanaman jeruk.  Importasi buah jeruk dari beberapa negara produsen ke Indonesia berpotensi membawa masuk spesies Colletotrichum yang belum dilaporkan terdapat di Indonesia. Penelitian dilakukan untuk  mengidentifikasi  spesies Colletotrichum yang terbawa melalui impor jeruk dan mengevaluasi potensinya menginfeksi tanaman hortikultura dan perkebunan penting di Indonesia. Sebanyak 7 isolat Colletotrichum diisolasi dari buah jeruk impor asal Cina, Pakistan dan jeruk lokal asal Indonesia.  Isolat- isolat Colletotrichum tersebut diamati karakter morfologi dan molekulernya serta patogenisitasnya pada  tanaman  jeruk,  cabai,  karet,  dan  kakao. Analisis  filogenetik  dilakukan  dengan  metode  analisis multilokus gen ( multilocus sequence analysis ) dengan mengombinasikan lokus gen ITS, ACT, TUB2, dan GAPDH. Identifikasi isolat Colletotrichum menghasilkan satu spesies grup C. boninense kompleks spesies ( C. karstii ) , 3 spesies grup C. gloeosporioides kompleks spesies ( C. fructicola , C. gloeosporioides sensu stricto , dan C. siamense ). Isolat Colletotrichum asal jeruk Indonesia diidentifikasi sebagai C. gloeosporioides s.s . Strain C. fructicola mampu menginfeksi cabai, sedangkan strain C. karstii menginfeksi cabai, dan kakao. Strain C. gloeosporioides s.s. dan C. siamense memiliki kisaran inang yang lebih luas yaitu cabai, karet, dan kakao. Beberapa spesies Colletotrichum yang terbawa oleh buah jeruk impor berpeluang menjadi patogen pada beberapa tanaman penting di Indonesia, yaitu cabai, karet, dan kakao.
Kata kunci: analisis multilokus gen, kisaran inang, patogenisitas, spesies komplek

## ABSTRACT
Colletotrichum species have been widely reported as causative agents of anthracnose in citrus trees. The importation of citrus fruits brings the risks of introducing introducing species of Colletotrichum new to Indonesian territory. This research was conducted to identify species of Colletotrichum from imported citrus fruits and to evaluate their potential to infect important horticultural and plantation crops in Indonesia. A total of 7 Colletotrichum isolates were isolated from imported citrus fruit from
Jurnal Fitopatologi Indonesia
Hidayat et al.
China, Pakistan, and Indonesian local citrus fruit.  The Colletotrichum isolates were observed for their morphological and molecular characteristics as well as their pathogenicity on citrus fruit, chili, rubber and cocoa trees.  Phylogenetic analysis was carried out using the MLSA (multilocus sequence analysis) method which combines the ITS, ACT, TUB2 and GAPDH gene loci.  Identification of Colletotrichum isolates resulted in one species of the C. boninense complex species ( C. karstii ) and 3 species of the C. gloeosporioides complex species ( C. fructicola , C. gloeosporioides sensu stricto , and C. siamense ). The Colletotrichum isolate from Indonesian citrus was identified as C. gloeosporioides sensu stricto . The C. fructicola strain could infect chilies, while the C. karstii strain could infect chili and cocoa. Strain of C. gloeosporioides s.s. and C. siamense have a wider host range, namely chili, rubber, and cocoa.  Several species of Colletotrichum carried by imported citrus fruits could become pathogens in several important crops in Indonesia, including chili, rubber, and cocoa.
Keywords: host range, multilocus gene analysis, pathogenicity, species complex

## PENDAHULUAN
Tanaman jeruk adalah salah satu komoditas perdagangan yang penting di dunia.  Pertanaman jeruk di Indonesia ditemukan di beberapa daerah, dengan sentra produksi berada di Jawa Timur, Sumatera Utara, Kalimantan Barat, dan Kalimantan Selatan (Kementerian Pertanian 2020). Guna memenuhi kebutuhan konsumsi, Indonesia mengimpor buah jeruk dari beberapa negara seperti Cina, Pakistan, Australia, dan Argentina. Importasi buah jeruk dari beberapa negara produsen ke Indonesia berpotensi membawa masuk spesies Colletotrichum yang belum dilaporkan terdapat di Indonesia.  Spesies Colletotrichum penyebab antraknosa pada jeruk seperti C. gloeosporioides, C. truncatum,
dan C. siamense dilaporkan menginfeksi buah jeruk di Cina, dan masih terdeteksi keberadaannya di Jerman pada pemeriksaan buah jeruk impor (Douanla-Meli dan Unger 2017).  Buah jeruk impor asal Pakistan dilaporkan terinfeksi C. gloeosporioides sensu stricto setelah  dilakukan  identifikasi secara multilokus gen di Indonesia (Nurholis et al . 2023).  Sejauh ini telah dilaporkan 2 spesies Colletotrichum yang menginfeksi pertanaman jeruk di Pakistan yaitu C.
gloeosporioides s.s. dan C. siamense (Fayyaz et al . 2020).  Identitas spesies Colletotrichum yang terbawa buah melalui impor buah jeruk masih terbatas. Informasi ini penting karena spesies Colletotrichum diketahui dapat beradaptasi dengan lingkungan baru sehingga menyebabkan infeksi pada tanaman lain yang
dapat berdampak serius pada penurunan produksi (Sanders dan Korsten 2003; Photita et al . 2004; Phoulivong et al . 2012).
Sebagian besar spesies Colletotrichum dilaporkan  tidak  spesifik  inang  (Phoulivong et al . 2012) dan memiliki potensi menginfeksi tanaman inang yang lain, khususnya spesies yang tergabung dalam C. acutatum dan C. gloeosporioides kompleks spesies (Sanders dan Korsten 2003; Peres et al . 2008; Kim et al . 2009).  Spesies Colletotrichum di dalam kelompok C. gloeosporioides kompleks spesies seperti C. fructicola menginfeksi tanaman perkebunan (karet dan kopi) dan tanaman hortikultura (jeruk, cabai, dan mangga).  Hal sama tampak pada C. siamense , patogen ini dapat menginfeksi karet, kopi, kakao, jeruk, cabai, dan pepaya (Prihastuti et al . 2009; Phoulivong et al . 2010; Phoulivong et al . 2012; James et al . 2014; Liu et al . 2018; Anggrahini et al . 2020).  Penelitian dilakukan untuk mengidentifikasi spesies Colletotrichum yang berasosiasi dengan buah jeruk impor dan buah jeruk asal Indonesia, serta memahami kisaran inangnya pada beberapa tanaman hortikultura dan tanaman perkebunan penting di Indonesia.

## BAHAN DAN METODE
Isolasi Colletotrichum dari Jeruk Lokal dan Impor Isolasi,  identifikasi,  dan  pengamatan patogenisitas isolat Colletotrichum dilakukan di Laboratorium Mikologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman IPB, dan
Balai Uji Terap Teknik dan Metode Karantina Hewan Ikan dan Tumbuhan, Bekasi.  Sampel isolat Colletotrichum diperoleh dari jeruk impor asal Cina dan Pakistan, serta buah jeruk asal Sumatera Utara, Indonesia. Beberapa buah jeruk impor asal Cina masih terdapat 1–2 helai daun bergejala antraknosa. Oleh karena itu isolasi Colletotrichum dari buah jeruk asal Cina juga dilakukan dari daun bergejala. Bagian buah dan daun jeruk yang bergejala antraknosa dipotong dengan ukuran 1 cm 2 , direndam dalam natrium hipoklorit 1% selama 3 menit, kemudian dibilas 3 kali dengan air steril. Potongan buah dan daun dikeringanginkan di atas kertas saring steril lalu diletakkan pada cawan Petri berisi 5 lembar kertas saring lembap dan diinkubasi selama 7 hari dengan pengaturan 12 jam siklus cahaya. Aservulus yang tumbuh diamati dan dipindahkan ke medium agar-agar dekstrosa kentang (ADK). Pengamatan dilakukan pada 3 hari pertama untuk memastikan biakan tidak terjadi kontaminasi. Pada hari ke-8 biakan disub kultur dengan mengambil 1 ujung jarum miselia muda pada bagian tepi biakan dan dipindahkan pada cawan ADK yang baru untuk mendapatkan biakan murni.
Karakterisasi Molekuler dan Morfologi Isolat Ekstraksi DNA. Miselium dari biakan murni berumur 8 hari dipanen dan dimasukkan dalam tabung mikro dan ditambahkan 100 µL
buffer  GP1.  Miselium  digerus  menggunakan mikropistil steril, ditambahkan kembali 300 µ L buffer GP1 dan diinkubasi pada suhu 60  ℃  selama  10  menit.  Prosedur  ekstraksi DNA selanjutnya dilakukan dengan mengikuti protokol Geneaid Genomic DNA Mini Kit ( Plant , Taiwan). Amplifikasi  DNA. Amplifikasi  DNA isolat-isolat Colletotrichum menggunakan PCR didasarkan pada empat wilayah gen, yaitu ITS rDNA, sebagian Actin (ACT), sebagian glyceraldehyde -3- phosphate dehydrogenase (GAPDH), dan sebagian β -tubulin (TUB2). Primer yang digunakan untuk masing-masing target gen disajikan pada Tabel 1. Reaksi amplifikasi menggunakan master mix MyTaq HS Red PCR Mix ( Bioline , Amerika Serikat).
Analisis filogenetik berbasis multilokus gen . Perunutan sikuen nukleotida dilakukan dengan mengirim sampel ke 1 st Base Malaysia. Pengolahan data sikuensing dilakukan menggunakan software Bioedit versi 7.2.5, sedangkan pensejajaran sikuen DNA menggunakan aplikasi Blastn (http://ncbi. nlm.nih.gov) untuk melihat kesesuaian DNA sampel dengan data sikuen Colletotrichum yang tersedia di NCBI GenBank. Analisis filogenetik  menggunakan  aplikasi  MrBayes dengan  replikasi  1000  kali.    Pohon  filogeni dibentuk dengan metode MLSA ( multilocus sequence analysis ), menggabungkan sikuen ITS, ACT, GAPDH, dan TUB2 setiap isolat dan disejajarkan dengan sikuen ex-tipe isolat
Tabel 1 Primer yang digunakan dalam uji analisis multilokus gen terhadap isolat Colletotrichum Table 1  Primers used in multilocus gene analysis of Colletotrichum isolates
Lokus gen Locus gene Nama primer Primer name Runutan (5’-3’) Sequence (5'-3') Suhu annealing Annealing temperature (℃) Referensi Reference ITS ITS-1 5’- CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’ 55 White et al. (1990) ITS-4 5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ GAPDH GDF1 5’- GCCGTCAACGACCCCTTCATTGA-3’ 60 Guerber et al. (2003) GDR1 5’- GGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGT-3’ TUB2 T1 (F) 5’-AACATGCGTGAGATTGTAAGT-3’ 55 Glass and Donaldson (1995) Bt2b (R) 5’-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3’ ACT ACT-512F 5’-ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC-3’ 57 Carbone and Kohn (1999) ACT-783R 5’-TACGAGTCCTTCTGGCCCAT-3’
Jurnal Fitopatologi Indonesia
Hidayat et al.
Colletotrichum spesies komplek mengikuti prosedur Damm et al . (2012). Pengamatan Morfologi Isolat. Karakter morfologi yang diamati ialah warna dan diameter biakan, bentuk dan ukuran konidium, serta karakter apresoria. Konidium diukur secara acak sebanyak 30 konidium setiap isolat.
Patogenesitas Isolat dan Uji Infeksi pada Cabai, Karet, dan Kakao Patogenesitas isolat. Patogenesitas isolat dilakukan pada buah jeruk. Sebanyak 100 µL suspensi konidium Colletotrichum (10 6 konidium mL -1 ) diinokulasi pada permukaan daun, tangkai buah, dan buah jeruk sesuai tempat awal isolat diisolasi. Daun, tangkai dan buah jeruk kemudian diinkubasi pada ruangan suhu 20–25 ℃ selama 14 hari. Uji infeksi pada cabai, karet, dan kakao . Inokulasi tanaman cabai dan karet dilakukan dengan menyemprotkan suspensi konidium (kepadatan 10 6 konidium mL -1 ). Isolat yang digunakan adalah isolat yang mewakili berdasarkan hasil MLSA.  Metode inokulasi dilakukan dengan 2 cara, yaitu tanpa dan dengan pelukaan menggunakan jarum steril. Tanaman cabai yang digunakan berumur 3 bulan, dengan buah yang telah matang (berwarna merah). Inokulum dimasukkan ke dalam botol sprayer kemudian disemprotkan pada permukaan buah cabai sebanyak tiga kali.  Inokulasi pada karet dilakukan pada bibit karet berumur 1–2 bulan pada daun paling muda (berwarna ungu). Permukaan bawah daun karet disemprot dengan suspensi
inokulum sebanyak tiga kali. Metode inokulasi pada bibit kakao (berumur 2–3 bulan) tidak menggunakan penyemprotan. Daun kakao memiliki rambut halus yang rapat pada permukaannya, hal ini kemungkinan menyebabkan penyemprotan suspensi tidak efektif karena suspensi tidak dapat menempel pada daun. Inokulasi dilakukan pada permukaan bawah daun kakao paling muda dengan menempelkan biakan isolat (diameter 1 cm) yang mengandung konidium, dengan dan tanpa pelukaan.  Tanaman selanjutnya disungkup plastik selama 7 hari. Jumlah tanaman yang diuji adalah 4 ulangan, kontrol diinokulasi dengan akuades steril.
Evaluasi penyakit dan analisis data . Evaluasi gejala antraknosa seperti penampilan lesio, ukuran lesio, keberadaan aservulus, dan keparahan penyakit dilakukan 7 hingga 14 hari setelah inokulasi.  Tingkat infeksi dinilai berdasarkan deskripsi gejala pada skala 0 sampai 9 berdasarkan persentase area yang terinfeksi (Tabel 2). Skala infeksi kemudian dikonversi dengan rumus Montri et al. (2009) menjadi keparahan penyakit dan dikategorisasikan menjadi ringan, sedang, berat, dan sangat berat (Tabel 3).

## HASIL
Hubungan Filogenetik Berbasis Multilokus Gen Sebanyak 7 isolat asal jeruk lokal dan impor dianalisis secara MLSA. Data sikuen DNA tersebut disejajarkan dengan 11 sikuen DNA
Tabel 2 Deskripsi gejala penyakit pada tanaman uji berdasarkan skor dengan skala 0 sampai 9 (Montri et al. 2009) (Table 2  Description of disease symptoms in test plants based on score with a scale of 0 to 9 (Montri et al. 2009).)
Skala Scale Deskripsi gejala Symptom description 0 Tidak ada infeksi. (No infection) 1 1 sampai 2% daun menunjukkan nekrotik. (1 to 2% of leaves show necrotic spots) 3 Lebih dari 2–5% daun menunjukkan nekrotik, aservuli mungkin ada. (More than 2–5% of leaves show necrotic spots, ascervuli may be present.) 5 Lebih dari 5–15% daun menunjukkan nekrotik, terdapat aservuli. ( More than 5–15% of leaves show necrotic spots, ascervuli are present.)
7 Lebih dari 15–25% daun menunjukkan nekrotik dengan aservuli. (More than 15–25% of leaves show necrotic spots with ascervuli.) 9 Lebih dari 25% area daun menunjukkan nekrotik, aservuli melimpah. (More than 25% of leaf area shows necrotic spots, ascervuli are abundant.)
ex-type C. boninense kompleks spesies dan 19 ex-type C. gloeosporioides kompleks spesies yang diperoleh dari Genbank. Hasil analisis menunjukkan bahwa isolat Colletotrichum dibagi menjadi 2 grup, yaitu isolat grup 1 (J2) merupakan C. boninense kompleks spesies, dan grup 2 (J1, J3, J4, J6, S1, S42) adalah C. gloeosporioides kompleks spesies.  Analisis multilokus gen (gabungan sekuen ITS, ACT, GAPDH dan TUB2) dilakukan pada masing-masing grup. Pada pohon filogeni C. gloeosporioides kompleks spesies isolat asal jeruk impor teridentifikasi sebagai C. fructicola (J1), C. gloeosporioides s.s. (J3 dan J4), C. siamense (J6), dan isolat asal jeruk Indonesia sebagai C. gloeosporioides s.s. (S1 dan S42) (Gambar 1A).   Pohon filogeni C. boninense kompleks spesies menunjukkan bahwa isolat J2 asal Cina teridentifikasi sebagai C. karstii dengan peluang sebesar 100% (Gambar 1B).  Sikuen DNA isolat Colletotrichum telah didaftarkan di GenBank, nomor aksesi isolat dan ex-type tersaji pada Tabel 4.
Karakter Morfologi Isolat Colletotrichum Pengamatan makroskopis dan mikroskopis terhadap 7 isolat Colletotrichum spp. menghasilkan data karakter morfologi yaitu biakan seperti kapas, berwarna putih hingga sedikit kemerahan dan tidak terdapat perbedaan diameter biakan pada semua isolat. Konidium semua isolat berbentuk silindris dengan kedua ujung membulat, dan bentuk apresoria bervariasi mulai dari bulat hingga tidak beraturan (Tabel 5).
Hasil morfologi menunjukkan bahwa bentuk konidium semua isolat ialah silindris dengan kedua ujung membulat, tetapi isolat J2 yang berasal dari daun jeruk asal Cina berukuran lebih panjang dibandingkan dengan isolat lainnya, dan terdapat hilum pada bagian pangkalnya. Terdapat pola menyerupai gelembung ( guttule ) pada kedua ujung permukaan spora, dan ciri ini tidak dimiliki oleh 6 isolat lainnya.  Berdasarkan karakter morfologi, isolat ini  mengarah ke dalam grup C. boninense kompleks spesies (Damm et al. 2012) . Enam isolat lainnya yang berasal dari buah jeruk impor asal Cina (J1, J3, dan J4), Pakistan (J6) dan asal Indonesia (S1 dan S42) memiliki ukuran yang lebih pendek dibandingkan grup boninense , tidak terdapat guttule. Karakter morfologi isolat-isolat ini mengarah ke dalam C. gloeosporioides kompleks spesies (Gambar 2).
Patogenisitas Isolat dan Uji Infeksi pada Tanaman Cabai, Karet dan Kakao Patogenisitas pada jeruk. Uji patogenesitas dilakukan untuk memastikan bahwa isolat yang akan digunakan bersifat patogenik pada inang asalnya. Seluruh isolat Colletotrichum menginfeksi inang aslinya yaitu daun, tangkai buah, dan buah sesuai tempat isolat diisolasi (Gambar 3).  Gejala pada daun berupa bercak nekrotik melingkar, berwarna cokelat pucat hingga abu-abu dan membentuk aservulus.  Gejala pada tangkai buah adalah layu, mengering, kemudian menghitam.  Gejala yang muncul pada buah yaitu bercak nekrotik cekung tidak beraturan, dengan ukuran bervariasi, berwarna cokelat hingga hitam disertai aservulus.
Infeksi pada cabai. Inokulasi suspensi konidium 5 isolat Colletotrichum pada buah cabai menghasilkan gejala yang berbeda-beda. Bercak nekrotik yang meluas membentuk area cekung, pembusukan bagian buah, hifa yang menyelimuti permukaan buah, dan massa konidium berwarna oranye ditemukan pada buah cabai 7 sampai 10 hari setelah inokulasi (Gambar 4). Pada tanaman cabai dan karet cenderung tidak ada perbedaan keparahan penyakit antara metode pelukaan dan tanpa
Tabel 3 Kategorisasi tingkat infeksi antraknosa pada tanaman uji hasil konversi skor 0–9 (Montri et al. 2009)
(Table 3  Categorization of anthracnose infection levels in test plants resulting from the conversion of scores 0–9 (Montri et al. 2009).)
Keparahan penyakit Disease severity Kategori tingkat infeksi Infection level category Tidak bergejala (Asymptomatic) Tidak terinfeksi (No infection) 1%–10% Ringan (Mild) 11%–25% Sedang (Moderate) 26%–75% Berat (Severe) 75%–100% Sangat berat (Very severe)
Jurnal Fitopatologi Indonesia
pelukaan. Perbedaan hanya pada persentase keparahan penyakit, tetapi kategori keparahan cenderung tetap sama. Perbedaan hanya terlihat pada isolat C. siamense Pakistan yang menyebabkan keparahan sedang pada cabai
dengan metode tanpa pelukaan, dan berat dengan metode pelukaan.
Inokulasi C. fructicola Cina (J1) dan C. gloeosporioides s.s. Indonesia (S1) menginduksi gejala kebusukan buah
Gambar 1  Filogenetika isolat Colletotrichum asal jeruk impor yang dibentuk dengan analisis Bayesian menggunakan kombinasi sekuen ITS, ACT, GAPDH, dan TUB2.  a,  Filogeni C. gloeosporioides komplek spesies dengan isolat J1 ( C. fructicola ), J6 ( C. siamense ), J3, J4, S1 dan S42 ( C. gloeosporioides ), serta C. boninense sebagai outgroup . b,  Filogeni C. boninense spesies komplek dengan isolat J2 ( C. karstii ) dan C. gloeosporioides sebagai outgroup . (Figure 1  Phylogenetics of Colletotrichum isolates from imported citrus constructed using Bayesian analysis using combined ITS, ACT, GAPDH, AND TUB2 sequences. a, Phylogeny of the C. gloeosporioides species complex with isolates J1 (C. fructicola), J6 (C. siamense), J3, J4, S1, and S42 (C. gloeosporioides), and C. boninense as outgroup. b, Phylogeny of the C. boninense species complex with isolate J2 (C. karstii) and C. gloeosporioides as outgroup.)
a
b
146 Tabel 4 Isolat Colletotrichum dan ex-type yang digunakan dalam analisis filogenetik (Table 4 Colletotrichum isolates and ex-type used in the phylogenetic analysis) Spesies (Species) Isolat (Isolate) Inang (Host) Negara (Country) Nomor aksesi GenBank (GenBank accession number) ITS ACT TUB2 GAPDH Gloeosporioides kompleks (Gloeosporioides complex) C. aenigma ICMP:18608 Persea americana Israel JX010244 JX009443 JX010044 JX010389 C. aesTchynomenes ICMP:17673 Aeschynomene virginica USA JX010176 JX009483 JX009930 JX010392 C. alatae ICMP:17919 Discorea alata India JX010190 JX009471 JX009990 JX010383 C. alienum ICMP:12071 Malus domestica New Zealand JX010251 JX009572 JX010028 JX010411 C. asianum ICMP:18580 Coffea arabica Thailand FJ972612 JX009584 JX010053 JX010406 C. asianum ICMP:18696 Mangifera indica Australia JX010192 JX009576 JX009915 JX010384 C. fructicola CBS:125395 Theobroma cacao Panama JX010172 JX009543 JX009992 JX010408 C. fructicola ICMP:18120 Discorea alata Nigeria JX010182 JX009436 JX010041 JX010401 C. fructicola J1* Citrus leaves China PP494225 PP681327 PP681334 PP681341 C. gloeosporioides CBS:112999 Citrus sinensis Italy JQ005152 JQ005500 JQ005239 JQ005587 C. gloeosporioides ICMP:17821 Citrus sinensis Italy JX010152 JX009531 JX010056 JX010445 C. gloeosporioides J3* Citrus fruit China PP494227 PP681329 PP681336 PP681343 C. gloeosporioides J4* Citrus fruit China PP494228 PP681330 PP681337 PP681344 C. gloeosporioides S1* Citrus fruit Indonesia PP494223 PP681325 PP681332 PP681339 C. gloeosporioides S42* Citrus fruit Indonesia PP494224 PP681326 PP681333 PP681340 C. kahawae subsp. kahawae ICMP:17816 Coffea arabica Kenya JX010231 JX009452 JX010012 JX010444 C. musae ICMP:17817 Musa sp. Kenya JX010142 JX009432 JX010015 JX010395 C. nupharicola CBS:470.96 Nuphar polysepala USA JX010187 JX009437 JX009972 JX010398 C. proteae CBS 132882 Protea sp. South Africa KC297079 KC296940 KC297009 KC297101 C. queenslandicum ICMP:1778 Carica papaya Australia JX010276 JX009447 JX009934 JX010414 C. salsolae ICMP:19051 Salsola tragus Hungary JX010242 JX009562 JX009916 JX010403 C. siamense ICMP:12567 Persea americana Australia JX010250 JX009541 JX009940 JX010387 C. siamense ICMP:18578 Coffea arabica Thailand JX010171 FJ907423 JX009924 JX010404 C. siamense J6* Citrus fruit Pakistan PP494229 PP681331 PP681338 PP681345 C. tropicale CBS:124949 Theobroma cacao Panama JX010264 JX009489 JX010007 JX010407
....... lanjutan (continued)
Tabel 4 Isolat Colletotrichum dan ex-type yang digunakan dalam analisis filogenetik (Table 4 Colletotrichum isolates and ex-type used in the phylogenetic analysis)
Spesies (Species) Isolat (Isolate) Inang (Host) Negara (Country) Nomor aksesi GenBank (GenBank accession number) ITS ACT TUB2 GAPDH Boninense kompleks ( Boninense complex) C. annellatum CBS:129826 Hevea brasiliensis Columbia JQ005222 JQ005570 JQ005309 JQ005656 C. boninense CBS:112115 Leucospermum sp. Australia JQ005160 JQ005508 JQ005247 JQ005594 C. boninense CBS:123755 Crinum asiaticum var. sinicum Japan JQ005153 JQ005501 JQ005240 JQ005588 C. citricola SXC151 Proteaceae Unknown KC293576 KC293616 KC293736 KC293656 C. doitungense MFLUCC_14_0128 Dendrobium sp. Thailand MF448524 MH376385 MH049480 MH351277 C. karstii CBS:126532 Citrus sp. South Africa JQ005209 JQ005557 JQ005296 JQ005643 C. karstii CBS:128551 Citrus sp. New Zealand JQ005208 JQ005556 JQ005295 JQ005642 C. karstii J2* Citrus leaves China PP494226 PP681328 PP681335 PP681342 C. limonicola CPC 31141 Citrus limon Malta KY856472 KY856045 KY856296 KY856554 C. novae-zelandiae CBS:128505 Capsicum annuum New Zealand JQ005228 JQ005576 JQ005315 JQ005662 C. phyllanthi CBS:175.67 Phyllantus acidus India JQ005221 JQ005569 JQ005308 JQ005655 C. torulosum CBS:128544 Solanum melongena New Zealand JQ005164 JQ005512 JQ005251 JQ005598
Tabel 5   Karakter morfologi biakan, konidium, dan apresoria isolat Colletotrichum asal jeruk impor dan asal Indonesia (Table 5 Morphological characters of cultures, conidia, and appressoria of Colletotrichum isolates from imported and Indonesian citurs) Grup (Group) Isolat (Isolate) Asal isolat (Isolate origin) Diameter biakan (Culture diameter) (cm) Konidium ( Conidium ) (µm) Bentuk apresoria (Appressoria shape) Bentuk (Shape) Panjang (Length) Lebar (Width) 1 J2 Cina 7.03 a Cylindrical, terdapat hilum (hilum present) 14.78 a 4.39 ab Ovoid, irregular 2 J1 Cina 7.60 a cylindrical 13.26 b 4.68 a Ovoid, irregular J3 Cina 7.28 a cylindrical 11.76 c 4.01 c Ovoid, irregular J4 Cina 7.07 a cylindrical 12.03 c 4.14 bc Ovoid, irregular J6 Pakistan 7.05 a cylindrical 13,59 b 3,94 cd Ovoid, irregular S1 Indonesia 6.68 a cylindrical 13.94 ab 3.88 cd Ovoid, irregular S42 Indonesia 7.97 a cylindrical 13.46 b 3.67 d Ovoid, irregular
Ket: angka pada kolom yang sama yang diikuti huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata berdasarkan uji Tukey dengan tingkat kepercayaan 95%.
(Note: Numbers in the same column fo llowed by the same letter indicate no significant difference based on Tukey’s test with a confidence level of 95%.)
yang disertai miselia yang menutupi permukaan buah.  Isolat C. karstii Cina (J2), C. gloeosporioides s.s. Cina (J3), dan C. siamense Pakistan (J6) menyebabkan bercak coklat kehitaman berbentuk cekung yang luas, buah menjadi layu dan mengering.  Keparahan penyakit akibat infeksi C. fructicola Cina dan C. gloeosporioides s.s. Indonesia lebih besar dibandingkan spesies Colletotrichum lainnya, dengan kategori infeksi sangat berat (Tabel 6). Keparahan penyakit disebabkan C. karstii dan C. siamense dikategorikan sedang, namun paling rendah dibandingkan dengan isolat lainnya. Keparahan penyakit akibat infeksi C. gloeosporioides s.s. asal Indonesia berbeda
dengan spesies yang sama asal Cina, dimana strain asal Indonesia dikategorikan sangat berat, sedangkan strain asal Cina kategori berat.
Infeksi pada karet dan kakao. Terdapat 2 isolat Colletotrichum yang menghasilkan gejala antraknosa pada tanaman karet, yaitu C. siamense Pakistan dan C . gloeosporioides s.s. Indonesia, ditandai dengan adanya bercak nekrotik terpusat disertai cincin berwarna kuning. Keparahan penyakit yang disebabkan kedua isolat sama besarnya, dengan kategori tingkat infeksi sedang.  Hasil yang berbeda diperoleh pada tanaman kakao, yaitu semua isolat tidak menimbulkan gejala pada metode tanpa pelukaan.  Semua isolat menghasilkan
Gambar 2  Karakter biakan, konidium, dan apresorium isolat Colletotrichum asal jeruk.  J1-J4, Isolat asal jeruk impor dari Cina; J6, Isolat asal jeruk impor dari Pakistan; dan S1 serta S42 Isolat asal jeruk Indonesia.
(Figure 2 Characters of cultures, conidia, and appressoria of Colletotrichum isolates from citrus. J1-J4, Isolates from imported citrus from China; J6, Isolates from imported citrus from Pakistan; and S1 and S42 Isolates from Indonesian citrus.)
Biakan
Konidia Apresorium
Gambar 3   Gejala antraknosa pada jeruk (14 hari setelah inokulasi). a, C. fructicola (J1) pada daun dan tangkai buah; b, C. karstii (J2) pada daun; c, aservulus C. gloeosporioides (J3 dan J4) pada buah;
d, C. siamense (J6) pada buah; dan e, C. gloeosporioides (S1 dan S42) pada buah jeruk.
(Figure 3  Anthracnose symptoms on citrus (14 days after inoculation). a, C. fructicola (J1) on leaves and fruit stems; b, C. karstii (J2) on leaves; c, C. gloeosporioides aservuli (J3 and J4) on fruit; d, C. siamense (J6) on fruit; and e, C. gloeosporioides (S1 and S42) on citrus fruit.)
a b e d c
Jurnal Fitopatologi Indonesia
gejala antraknosa pada metode pelukaan kecuali C. fructicola. Keparahan penyakit akibat infeksi C. karstii , C. siamense , dan C. gloeosporioides dikategorikan ringan, ditunjukkan dengan adanya bercak nekrotik yang sempit pada area inokulasi.
Strain C. gloeosporioides s.s. asal jeruk Cina menginfeksi cabai dan kakao, sedangkan C. gloeosporioides s.s. yang diisolasi dari jeruk Indonesia menginfeksi seluruh tanaman yang diuji yaitu cabai, karet, dan kakao.  Strain C. siamense asal jeruk Pakistan juga menginfeksi tanaman cabai, karet, dan kakao.  Dua strain Colletotrichum yang diisolasi dari daun jeruk menginfeksi lebih sedikit inang, yaitu C. fructicola hanya menginfeksi cabai, sedangkan C. karstii menginfeksi cabai dan kakao.

## PEMBAHASAN
Identitas spesies Colletotrichum yang berasosiasi dengan buah jeruk impor maupun jeruk asal Indonesia telah diketahui menggunakan  analisis  filogenetik  multilokus gen, karakter morfologi isolat, dan uji patogenisitas. Kombinasi lokus gen ITS, ACT, GAPDH, dan TUB2 terbukti akurat mengidentifikasi  spesies  didalam  grup C. boninense kompleks dan C. gloeosporioides kompleks. Spesies Colletotrichum yang menginfeksi buah jeruk di Indonesia dilaporkan sebagai C. endophytichum ; C. queenslandicum ; C. gloeosporioides s.s. , menggunakan 3 lokus gen yaitu ACT, GAPDH, dan TUB2 (Shidiq et al . 2024),
Gambar 4  Patogenisitas isolat Colletotrichum asal jeruk pada tanaman cabai (1), karet (2), dan kakao (3). a, Kontrol; b, isolat C. fructicola Cina; c, isolat C. karstii Cina; d, C. gloeosporioides Cina; e, C. siamense Pakistan; dan f, C. gloeosporioides Indonesia.
(Figure 4 Pathogenicity of Colletotrichum isolates from citrus on chili (1), rubber (2), and cocoa plants (3). a, Control; b, isolate C. fructicola from China; c, isolate C. karstii from China; d, C. gloeosporioides from China; e, C. siamense from Pakistan; and f, C. gloeosporioides from Indonesia.)
sedangkan dalam penelitian ini telah digunakan 4 lokus gen.  Hasil penelitian mempertegas laporan sebelumnya bahwa C. gloeosporioides s.s. menginfeksi tanaman jeruk di Indonesia. Spesies Colletotrichum menginfeksi berbagai jenis tanaman inang, namun strain Colletotrichum memiliki perilaku yang berbeda. Strain C. fructicola menginfeksi tanaman jeruk, cabai, karet, dan kakao (Huang
et al . 2013; Phoulivong et al . 2012; James et al . 2014; Liu et al . 2018) namun dalam penelitian ini strain C. fructicola asal jeruk Cina menginfeksi jeruk dan cabai, namun tidak menginfeksi tanaman karet dan kakao. Strain C. siamense dilaporkan menginfeksi tanaman jeruk, cabai, karet, kakao dan pisang (James et al . 2014; Liu et al . 2018; Anggrahini et al . 2020; Fayyaz et al . 2020; Zhafarina et al.
Tabel 6  Keparahan penyakit dan kategori infeksi isolat Colletotrichum asal jeruk pada tanaman cabai, karet, dan kakao
Table 6  Disease severity and infection category of Colletotrichum isolates from citrus on chili, rubber, and cocoa plants
Tanaman uji (Test plants ) Spesies (Species) Asal isolat (Isolate origin) Keparahan penyakit (Disease severity) (%) Kategorisasi infeksi (Infection category) Tanpa pelukaan (Without wounds) Dengan pelukaan (With wounds) Buah cabai (Chili fruit) C. fructicola Cina 88.89 88.89 Sangat berat (Very severe) C. karstii Cina 11.11 16.67 Sedang (Moderate) C. gloeosporioides s.s Cina 33.89 44.44 Berat (Severe) C. siamense Pakistan 16.67 27.78 Sedang-berat C. gloeosporioides s.s Indonesia 77.78 77.78 Sangat berat (Very severe) Daun karet (Rubber leaves) C. fructicola Cina 0 0 Tidak terinfeksi (No infection) C. karstii Cina 0 0 Tidak terinfeksi (No infection) C. gloeosporioides s.s Cina 0 0 Tidak terinfeksi (No infection) C. siamense Pakistan 11.11 11.11 Sedang (Moderate) C. gloeosporioides s.s Indonesia 16.67 22.22 Sedang (Moderate) Daun kakao (Cocoa leaves) C. fructicola Cina 0 0 Tidak terinfeksi (No infection) C. karstii Cina 0 8.33 Ringan (Mild) C. gloeosporioides s.s Cina 0 5.56 Ringan (Mild) C. siamense Pakistan 0 5.56 Ringan (Mild) C. gloeosporioides s.s Indonesia 0 8.33 Ringan (Mild)
Jurnal Fitopatologi Indonesia
Hidayat et al.
2021) dan hasil yang serupa diperoleh dalam percobaan ini dimana strain C. siamense asal jeruk Cina juga menginfeksi inang yang sama.  Pada penelitian lainnya diketahui bahwa C. karstii tidak bersifat spesifik inang karena dapat menginfeksi jeruk, cabai, karet, dan kakao (Damm et al . 2012; Lijuan et al .
2012; Cai et al . 2016; De Silva et al .  2019), sedangkan dalam penelitian ini strain C. karstii asal jeruk Cina menimbulkan gejala antraknosa pada jeruk, cabai, kakao, tetapi tidak bergejala pada tanaman karet.  Strain C. gloeosporioides asal buah jeruk Cina hanya menginfeksi cabai dan kakao, sedangkan spesies yang sama asal Indonesia menginfeksi semua tanaman yang diuji.
Perbedaan hasil percobaan dengan data penelitian-penelitian sebelumnya kemungkinan disebabkan oleh kurangnya faktor-faktor patogenesitas yang dapat dikenali oleh sel buah atau daun tanaman untuk terjadinya infeksi dan kolonisasi (Than et al . 2008; Sanders dan Korsten 2003).  Informasi ini penting karena menunjukkan bahwa spesies yang sama yang diisolasi dari inang yang berbeda memiliki kemampuan infeksi yang berbeda.  Penelitian ini membuktikan bahwa strain Colletotrichum dapat menginfeksi lebih dari satu inang dan satu inang dapat terinfeksi oleh beberapa spesies Colletotrichum . Penelitian yang dilakukan mengkonfirmasi bahwa sebagian besar spesies Colletotrichum , terutama grup C. gloeosporioides dan C. boninense spesies kompleks mempunyai kisaran inang yang luas (tidak spesifik inang) (Phoulivong et al . 2010; Damm et al . 2012;
Weir et al . 2012).  Infeksi pada buah dan daun tanaman kemungkinan bergantung pada berbagai faktor seperti varietas dan kondisi buah, kelembapan dan suhu, serta konsentrasi inokulum, dan bukan bergantung pada spesies Colletotrichum yang mengkolonisasi (Freeman et al . 1998).
Uji patogenesitas dilakukan dengan metode pelukaan maupun tanpa pelukaan, sehingga hasil penelitian ini cukup akurat mencerminkan potensi virulensi strain Colletotrichum .  Strain Colletotrichum asal buah jeruk impor bersifat patogenik terhadap
tanaman lain yaitu cabai, dan karet, karena menginfeksi tanaman tanpa melalui pelukaan; sedangkan pada tanaman kakao, strain Colletotrichum asal buah impor berpotensi sebagai patogen karena menyebabkan infeksi ringan hanya melalui metode pelukaan daun.  Dalam perspektif karantina, penting untuk menetapkan kisaran inang dari spesies Colletotrichum , karena penyebaran strain yang  spesifik  inang  (contoh C. kahawae ) harus dibatasi.  Hingga kini C. fructicola, dan C. karstii belum dilaporkan menginfeksi tanaman jeruk dan karet di Indonesia.  Begitu juga C. siamense, belum dilaporkan dapat menginfeksi karet di Indonesia.  Strain C. siamense ditemukan pada tanaman kakao di Pinrang, Sulawesi Selatan namun berperan sebagai cendawan endofit ( Rehner et al . 2023). Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa spesies Colletotrichum yang berasosiasi dengan buah jeruk impor asal Cina dan Pakistan diidentifikasi sebagai C. fructicola, C. karstii , C. gloeosporioides s.s. dan C. siamense .  Isolat Colletotrichum asal jeruk Indonesia diidentifikasi sebagai C . gloeosporioides s.s .  Strain Colletotrichum asal jeruk impor bersifat patogenik terhadap tanaman cabai, dan karet, namun hanya berpotensi sebagai patogen pada tanaman kakao karena menginfeksi hanya melalui pelukaan daun.

## DAFTAR PUSTAKA
Anggrahini DS, Wibowo A, Subandiyah S.  2020.  Morphological and molecular identification  of Colletotrichum spp. associated with chili anthracnose disease in Yogyakarta region.  Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia. 24(2):161–174. DOI: https://doi.org/10.22146/jpti.58955.
Cai ZY, Liu YX, Shi YP, Mu HJ, Li GH.  2016. First report of leaf anthracnose caused by Colletotrichum karstii of rubber tree in China. Plant disease. 100(12):2528. DOI: https://doi.org/10.1094/PDIS-04-16-0577- PDN.
Carbone I, Kohn LM.  1999.  A method for designing primer sets for speciation studies
in  filamentous  ascomycetes.  Mycologia. 91:553–556. DOI: https://doi.org/10.1080 /00275514.1999.12061051. Damm U, Cannon PF, Woudenberg JHC, et al . 2012. The Colletotrichum boninense species complex. Studies in Mycology. 73: 1–36.
Damm U, Woudenberg JHC, Cannon PF, et al . 2009. Colletotrichum species with curved conidia from herbaceous hosts. Fungal Diversity 39:45–87.
De Silva DD, Groenewald JZ, Crous PW, Ades PK, Nasruddin A, Mongkolporn O, Taylor PW.  2019.  Identification, prevalence, and pathogenicity of Colletotrichum species causing anthracnose of Capsicum annuum in Asia.  IMA Fungus. 10:1–32. DOI: https:// doi.org/10.1186/s43008-019-0001-y. Douanla-Meli C, Unger JG. 2017. Phylogenetic study of the Colletotrichum species on imported citrus fruits uncovers a low diversity and a new species in the C. gigasporum complex. Fungal Biology. 121(10):858–868. DOI: https://doi. org/10.1016/j.funbio.2017.06.003. Fayyaz A, Sahi ST, Nawaz-ul-Rehman MS,
Amrao L.  2020. Molecular characterization of fungal pathogens associated with citrus withertip/dieback from major citrus growing areas of Punjab, Pakistan. International Journal of Agriculture and Biology. 23(6):1165‒1170. Freeman S, Katan T, Shabi E. 1998. Characterization of Colletotrichum species responsible for anthracnose diseases of various fruits.  Plant Disease. 82:596–605.DOI: https://doi.org/10.1094/ PDIS.1998.82.6.596.
Glass NL, Donaldson G. 1995. Development of primer sets designed for use with PCR to amplify conserved genes from filamentous ascomycetes. Applied Enviromental Microbiology. 61:1323–1330. DOI: https://doi.org/10.1128/aem.61.4.1323- 1330.1995.
Guerber JC, Liu B, Correll JC, Johnston PR. 2003. Characterisation of  the diversity of Colletotrichum acutatum sensu lato by sequence analysis of two gene introns,
mtDNA and intron RFLP’s and mating compatibility.  Mycologia . 95:872–895. DOI: https://doi.org/10.1080/15572536.2 004.11833047.
Huang F, Chen GQ, Hou X, et al. 2013.
Colletotrichum species associated with cultivated citrus in China. Fungal Diversity. 61:61–74. DOI: https://doi.org/10.1007/ s13225-013-0232-y.
James RS, Ray J, Tan YP, Shivas RG. 2014. Colletotrichum siamense , C. theobromicola and C. queenslandicum from several plant  species  and  the  identification  of C. asianum in the northern territory, Australia. Australasian Plant Disease Notes. 9:1–6. DOI: https://doi.org/10.1007/s13314-014- 0138-x.
Kementerian Pertanian. 2020.  Analisis Kinerja Perdagangan Jeruk.  Pusat Data dan Informasi Kemeterian Pertanian, Jakarta. Hlm 1-51 Kim H, Lim TH, Kim J, Kim YH, Kim HT. 2009.  Potential of cross-infection of Colletotrichum species causing anthracnose in persimmon and pepper. The Plant Pathology Journal. 25(1):13– 20. DOI: https://doi.org/10.5423/ PPJ.2009.25.1.013.
Liu X, Li B, Cai J, Zheng X, Feng Y, Huang G.  2018. Colletotrichum species causing anthracnose of rubber trees in China. Scientific Reports. 8(1):1–14. DOI: https:// doi.org/10.1038/s41598-018-28166-7.
Montri P, Taylor PWJ, Mongkolporn O. 2009.
Pathotypes of Colletotrichum capsici , the causal agent of chili anthracnose, in Thailand. Plant Disease.  93:17–20. DOI: https://doi.org/10.1094/PDIS-93-1-0017.
Nurholis, Hidayat SH, Mutaqin KH, Widodo S, Widodo. 2023. Morphological, molecular, and pathogenic characterization of Colletotrichum gloeosporioides sensu stricto associated with imported citrus fruits. Agronomy Research. 21:1499–1518. Lijuan P, Youlian Y, Bahkali AH, Zuoyi L. 2012. Colletotrichum species on Citrus leaves in Guizhou and Yunnan provinces, China.  Cryptogamie. Mycologie. 33(3):
267–283.
Jurnal Fitopatologi Indonesia
Hidayat et al.
Peres NA, MacKenzie SJ, Peever TL, Timmer LW. 2008.  Postbloom fruit drop of citrus and key lime anthracnose arecaused by distinct phylogenetic lineages of Colletotrichum acutatum . Phytopathology. 98(3):345–352. DOI: https://doi. org/10.1094/PHYTO-98-3-0345.
Photita W, Lumyong S, Lumyong P, McKenzie EHC, Hyde KD. 2004. Are some endophytes of Musa acuminata latent pathogens? Fungal Diversity. 16:131–140. Phoulivong S, Cai L, Chen H, McKenzie EHC, Abdelsalam K, Chukeatirote E, Hyde KD. 2010. Colletotrichum gloeosporioides is not a common pathogen on tropical fruits. Fungal Diversity. 44:33–43. DOI: https:// doi.org/10.1007/s13225-010-0046-0. Phoulivong S, McKenzie EHC, Hyde KD 2012. Cross infection of Colletotrichum species; a case study with tropical fruits. Current Research in Environmental & Applied Mycology. 2(2):99–111. DOI: https://doi.org/10.5943/cream/2/2/2.
Prihastuti H, Cai L, Chen H, McKenzie EHC,
Hyde KD. 2009. Characterization of
Colletotrichum species associated with coffee berries in northern Thailand . Fungal Diversity . 39:89-109 . Rehner SA, Gazis R, Doyle VP, Vieira WAS, Campos PM, Shao J. 2023.  Genome resources for the Colletotrichum gloeosporioides species complex: 13 tree endophytes from the neotropics and paleotropics. Microbiology Resource Announcements.
12(4):e01040-22. doi: 10.1128/mra.01040-22.
Sanders GM, Korsten L. 2003. A comparative morphology of South African avocado
and mango isolates of Colletotrichum gloeosporioides . Canadian Journal of Botany. 81:877– 885. DOI: https://doi. org/10.1139/b03-073.
Shidiq MAA, Widyaningsih S, Wibowo A, Widiastuti A. 2024.  First report of Colletotrichum quuenslandicm and Colletotrichum endophyticum causing citrus anthracnose in Indonesia. Journal of the Saudi Society of Agricultural Sciences. (Article In Press: 30 March 2024) . Than PP, Jeewon R, Hyde KD, Pongsupasamit S, Mongkolporn O, Taylor PWJ. 2008. Characterization and pathogenicity of Colletotrichum species associated with anthracnose disease on chili ( Capsicum spp.) in Thailand. Plant Pathology. 57:562– 572. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1365- 3059.2007.01782.x.
Weir BS, Johnston PR, Damm U. 2012. The Colletotrichum gloeosporioides species complex. Studies in Mycology. 73:115– 180.
White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J. 1990.
Amplification  and  direct  sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. Dalam: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JH, White TJ. PCR Protocols. San Diego (US): Academic Press. hlm.
315–322.
Zhafarina S, Wibowo A, Widiastuti A. 2021. Multi-genetic analysis of Colletotrichum spp. associated with post harvest disease of fruit anthracnose in Special Region of Yogyakarta, Indonesia. Pakistan Journal of Biological Sciences. 24(1):53–65. DOI: https://doi.org/10.3923/pjbs.2021.53.65.