## KARAKTERISASI DAN UJI TOKSISITAS IKAN BUNTAL DARI PERAIRAN PAMEUNGPEUK, JAWA BARAT

## CHARACTERIZATION AND TOXICITY TEST OF PUFFER FISH FROM PAMEUNGPEUK WATERS, WEST JAVA
Eka Deskawati 1* , Sri Purwaningsih 1 , dan Purwantiningsih 2
1 Departemen Teknologi Hasil Perairan, Institut Pertanian Bogor, Bogor
* e-mail: ekadeskawati@yahoo.co.id
2 Departemen Kimia, Institut Pertanian Bogor, Bogor

## ABSTRACT
A  puffer  fish  contains  a  secondary  metabolite  toxic  called  tetrodotoxin  (TTX),  which  can  be used as an anesthetic and medication to relieve chronic pain for cancer patients. The purposes of  this  study  were  to  determine  the  LC50  value  and  chemical  composition  of  extracts  from various tissues of puffer fishes as a first step to determine the further isolation of tetrodotoxin. In this study various tissues from meat, liver, skin, heart, and ovary of Arothron hispidus and Diodon hystrix species  were extracted, characterized, and tested levels of toxicity using Brine Shrimp  Lethality  Test  (BSLT)  methods.  Between  the  two  puffer  fishes  studied,  the  highest toxicity  was  found  in  Arothron  hispidus  ovary  with  LC 50 value  of  29.65  ppm.  Chemical constituents  of  the  ovary  were  alkaloids,  carbohydrates,  and  amino  acids.  Toxic  compounds found  in  the  extracts  of  puffer  fish  ovaries  were  tetrodotoxin  which  is  a  compound  of  the alkaloid class of secondary metabolites.
Keywords: Puffer fish, Arothron hispidus, Diodon hystrix, toxicity, Brine Shrimp Lethality Test

## ABSTRAK
Ikan buntal memiliki metabolit sekunder berupa racun yang bernama tetrodotoxin (TTX) yang  dapat  dimanfaatkan  sebagai  obat  anastesi  dan  obat  untuk  mengurangi  rasa  sakit  kronis yang  dialami  pasien  kanker.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  menentukan  nilai  LC 50 dan komposisi  kimia  ekstrak  dari  berbagai  macam  bagian  tubuh ikan  buntal  sebagai  langkah  awal untuk  menentukan  proses  isolasi  tetrodotoxin  selanjutnya  Pada  penelitian  ini  berbagai  organ ikan buntal  seperti daging, hati, kulit, jantung dan ovarium dari spesies Arothron hispidus dan Diodon hystrix diekstraksi,  dikarakterisasi dan diuji tingkat toksisitasnya menggunakan metode Brine Shrimp Lethalty Test (BSLT).  Hasil penelitian menunjukan diantara dua ikan buntal yang diteliti, nilai toksisitas tertinggi yaitu organ ovarium Arothron hispidus dengan nilai LC 50 yaitu 29,65  ppm.  Kandungan  kimia  dari  ovarium  ini  yaitu  alkaloid,  karbohidrat  dan  asam  amino. Senyawa racun yang terdapat di dalam ekstrak ovarium ikan buntal ini diperkirakan tetrodotoxin yang merupakan senyawa metabolit sekunder golongan alkaloid.
Kata kunci: Ikan buntal, Arothron hispidus , Diodon hystrix , racun, Brine Shrimp Lethality Test

## I.  PENDAHULUAN
Indonesia  merupakan  salah  satu pusat  keanekaragaman  hayati  dunia. Berbagai  jenis  organisme  baik  tanaman, hewan  maupun  mikroorganisme  tersebar luas  dengan  jumlah  yang  melimpah.
Dalam  organisme  tersebut  terkandung senyawa  kimiawi  hasil  metabolisme  yang digunakan  sebagai  upaya  untuk  memper- tahankan  hidupnya.  Senyawa  tersebut dikenal sebagai metabolit sekunder. Potensi  senyawa metabolit  sekunder  yang ada merupakan pustaka kimiawi
( chemical library ) yang dapat dieksplorasi dan  dijadikan  rujukan  untuk  kajian  upaya pemanfaatannya  (Wibowo et  al .,  2003). Salah satu sumber daya hayati yang belum optimal untuk dieksplorasi dan dimanfaatkan adalah ikan buntal. Ikan  buntal  berasal  dari  famili
Diodontidae dan  berasal  dari  ordo Tetraodontiformes .  Nama tetraodontifor- mes berasal  dari  morfologi  gigi  ikan  ini, yaitu memiliki dua gigi besar pada rahang atas  dan  bawahnya  yang  cukup  tajam (BPOM, 2006). Ikan ini banyak ragamnya di  perairan  tropis,  tidak  umum  ada  di perairan  subtropis  maupun  di  perairan dingin.  Di  Asia  ikan  buntal  menyebar  di Jepang, India, Birma, Thailand, Singapura dan  Philipina.  Di  Indonesia  sendiri,  ikan buntal  tersebar  di  seluruh  perairan  seperti Pulau  Weh,  Sumatera  (Bagan  Siapi-api, Sibolga,  Deli),  Pulau  Bintang,  Pulau Bangka,  Pulau  Jawa  (Jakarta,  Karawang, Subang,  Cilacap,  Semarang,  Surabaya), Madura,
Kalimantan (Pemangkat,
Singkawang,  Pontianak,  Sungai  Kapuas, Banjarmasin,  Sungai  Mahakam)  (Weber dan de Beaufort, 1962).
Selain  memiliki  kandungan  meta- bolit primer yang cukup lengkap terutama asam aminonya, ikan buntal juga memiliki kandungan  metabolit  sekunder  seperti racun  tetrodotoksin  (TTX).  Racun  ini biasanya  digunakan  sebagai  alat  pertaha- nan  diri  dari  serangan  predator.  Beberapa kasus keracunan  yang terjadi di  Indonesia diantaranya  pada  tahun  2010  dan  2008  di Cirebon  (Seo,  2010).  Kasus  keracunan ikan buntal juga terjadi di beberapa daerah seperti  Tapanuli  tengah,  Bengkulu  dan Maluku.  Meskipun  berbahaya,  tetrodoto- xin  ternyata  dapat  dimanfaatkan  terutama pada    bidang    farmasi.  Tetrodotoksin dapat    digunakan    sebagai    obat  anastesi lokal  (dapat  memblok  syaraf).  Tetrodo- toksin yang dicampur dengan bupivacaine dan  dexamethasone  dapat  meningkatkan waktu anastesi (Kohane et al. , 2003). Obat berbahan  dasar  dari  tetrodotoksin  yang
pertama  kali  dipasarkan  adalah  Tectin, obat  ini  dikembangkan  oleh  WEX Pharmaceutical  Inc.  Dalam  dosis  kecil, obat  ini  sangat  mampu  mengurangi  rasa sakit  kronis  yang  dialami  oleh  pasien kanker (Hagen et al ., 2007).
Di  Indonesia,  penelitian  mengenai racun ikan buntal masih jarang dilakukan. Melihat  manfaat  racun  TTX  terutama pada  bidang  farmasi  maka  penelitian mengenai  karakteristik  kimia  ikan  buntal dan  pengujian  toksisitas  menggunakan model  hewan  uji Artemia  salina penting dilakukan.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk menentukan  nilai  LC 50 dan  komposisi kimia ekstrak dari berbagai macam bagian tubuh  ikan  buntal  sebagai  langkah  awal untuk menentukan proses isolasi tetrodotoxin selanjutnya.

## II.  METODE PENELITIAN

## 2.1. Bahan dan Alat
Bahan utama  yang digunakan  yaitu ikan buntal bintik putih ( Arothron hispidus ) dan  buntal  duren  ( Diodon  hystrix )  yang diperoleh dari Perairan Pameungpeuk pada bulan  September  2012.  Bahan-bahan  lain yang  digunakan  yaitu  air  laut  dan Artemia salina.
Peralatan  utama  yang  digunakan antara  lain  timbangan, homogenizer, corong  pisah,  labu  erlenmeyer, magnetic stirer , desikator, freezer , vaccum evaporator , freeze drying, centrifuge.

## 2.2. Ekstrasi Sampel
Sampel  berupa  ovarium,  hati, jantung,  kulit  dan  daging  ikan  buntal dipisahkan,  disimpan  dalam  plastik  dan dibekukan  untuk  dibawa  ke  laboratorium. Ekstraksi sampel dilakukan dengan mengacu pada metode Hasan et al . (2008). Masing-masing sampel sebanyak 100 gram dicampur  dengan  300  ml  aquades  dingin, kemudian  distirer  selama  2  jam  pada  suhu ruangan.  Setelah  itu  dilakukan  sentrifugasi dengan  kecepatan  8.000  rpm  selama  8
menit pada suhu 10 o C. Ekstrak supernatant (aq)  dicuci  menggunakan  berbagai  pelarut organik seperti hexane, chloroform dan etil asetat  untuk  menghilangkan  senyawa  yang larut  dalam  pelarut  organik.  Ekstrak  hasil pencucian kemudian di freeze dried.
2.3.  Uji Toksisitas Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)
Uji  toksisitas  ekstrak  sampel dilakukan dengan menentukan nilai Lethal Concentration (LC 50 )  menggunakan  larva udang Artemia  salina L.  yang  mengacu pada  metode Meyer et  al .  (1982).  Telur udang  ditetaskan  dalam  gelas  piala  yang berisi  air  laut,  disinari  dengan  lampu  TL 40  watt  dan  diaerasi  agar  kadar  oksigen tercukupi  sehingga  telur  udang  menetas menjadi larva. Penetasan dilakukan selama 48 jam.
Sebanyak  1  mL  air  laut  yang mengandung  larva  udang  sebanyak  10 ekor  dipipet,  kemudian  dimasukkan  ke dalam  wadah  uji.  Ditambahkan  larutan ekstrak  sampel  yang  akan  diuji  masing- masing sebanyak 1 mL,  sehingga konsen- trasi  akhir  dalam  wadah  uji  adalah  10, 100,  500  dan  1000  ppm.  Untuk  setiap konsentrasi dilakukan 3 kali pengulangan. Untuk kontrol dilakukan tanpa penambahan  sampel.  Larutan  dibiarkan selama 24 jam, kemudian dihitung jumlah larva  yang  mati  dan  ditentukan  % mortalitasnya.  Data  %  mortalitas  dianali- sis  dengan  menggunakan  analisis  probit untuk menentukan harga LC 50 . Nilai LC 50 ditentukan dengan membuat kurva hubungan  antara  mortalitas  probit  (sumbu y) dan log konsentrasi  ekstrak (sumbu x). Nilai LC50 merupakan konsentrasi dimana  zat  menyebabkan  kematian  50% yang  diperoleh  dengan  memakai  persa- maan  regresi  linier  y  =  a  +  bx.  Suatu  zat dikatakan aktif atau toksik bila nilai LC50 <  1000  ppm  untuk  ekstrak  dan  <  30  ppm untuk suatu senyawa.

## 2.4. Analisis Fitokimia
Organ  dari  spesies  dengan  nilai LC 50 paling  rendah  dianalisis  fitoki- mianya.  Uji  fitokimia  dilakukan  untuk menentukan  komponen  bioaktif  yang terdapat  pada  serbuk  ekstrak  kasar  organ ikan  buntal  paling  toksik.  Analisis  fitoki- miawi yang dilakukan terdiri dari alkaloid, steroid/triterpenoid,  saponin,  flavonoid, fenol  hidrokuinon,  molisch,  benedict, biuret,  ninhidrin  yang  mengacu  pada metode Harbone (1987).

## a)  Alkaloid
Sejumlah  contoh  dilarutkan  dalam beberapa  tetes  asam  sulfat  2  N  kemudian diuji  dengan  tiga  pereaksi  alkaloid,  yaitu pereaksi  dragendorf,  meyer  dan  wagner. Hasil  uji  dinyatakan  positif  bila  dengan pereaksi  meyer  terbentuk  endapan  putih kekuningan,  dengan  pereaksi  wagner membentuk  endapan  coklat  dan  dengan pereaksi  dragendorf  membentuk  endapan merah sampai jingga.
Pereaksi  meyer  dibuat  dengan  cara menambahkan  1,36  HgCl 2 dengan  0,5  g kalium iodida lalu dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 100 ml dalam  labu  takar.  Pereaksi  ini  tidak berwarna.    Pereaksi  wagner  dibuat  dengan cara  10  ml  akuades  dipipet  kemudian ditambahkan  2,5  g  iodin  dan  2  g  kalium iodida, kemudian dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 200 ml dalam labu takar.  Pereaksi  ini  berwarna  coklat. Pereaksi dragendorf dibuat dengan cara 0,8 g  bismut  subnitrat  ditambahkan  dengan  10 ml  asam  asetat  dan  40  ml  air.    Larutan  ini dicampur dengan larutan yang dibuat dari 8 g kalium iodida dalam 20 ml air.  Sebelum digunakan, 1 volume campuran ini diencer- kan  dengan  2,3  volume  campuran  20  ml asam asetat glasial dan 100 ml air.  Pereaksi berwarna jingga.

## b)  Steroid/Triterpenoid
Sejumlah contoh dilarutkan dalam 2 ml kloroform dalam tabung reaksi. Anhidri-
da asetat sebanyak 10 tetes dan asam sulfat pekat  sebanyak  3  tetes  ditambahkan  ke dalam campuran tersebut.  Hasil uji positif contoh  mengandung  steroid  dan  triterpe- noid  yaitu  terbentuknya  larutan  berwarna merah  untuk  pertama  kali  kemudian berubah menjadi biru dan hijau.

## c)  Saponin
Saponin  dapat  dideteksi  dengan  uji busa  dalam  air  panas.    Busa  yang  stabil selama  30  menit  dan  tidak  hilang  pada penambahan 1 tetes HCl 2 N menunjukkan contoh mengandung saponin.

## d)  Flavonoid
Sejumlah  contoh  ditambah  serbuk magnesium 0,1 mg dan 0,4 ml amil alkohol (campuran  asam  klorida  37%  dan  etanol 95%  dengan  volume  sama)  dan  4  ml alkohol,  kemudian  campuran  dikocok. Hasil  uji  positif  contoh  mengandung flavonoid, yaitu terbentuknya warna merah, kuning  atau  jingga  pada  lapisan  amil alkohol.

## e)  Fenol Hidrokuinon
Sebanyak  1  g  contoh  diekstrak dengan  20  ml  etanol  70%.    Larutan  yang dihasilkan diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan  2  tetes  larutan  FeCl3  5%. Hasil  uji  positif  contoh  mengandung senyawa  fenol,  yaitu  terbentukya  larutan berwarna hijau atau hijau biru.

## f)  Molisch
Sebanyak  1  ml  larutan  contoh ditambahkan 2 tetes pereaksi molisch dan 1 ml  asam  sulfat  pekat  melalui  dinding tabung.
Hasil uji positif contoh mengandung  karbohidrat  ditandai  oleh terbentuknya  kompleks  berwarna  ungu diantara 2 lapisan cairan.

## g)  Benedict
Larutan  contoh  sebanyak  8  tetes dimasukkan  ke  dalam  5  ml  pereaksi benedict.    Campuran  dikocok  dan  dididih-
kan  selama  5  menit.    Hasil  uji  positif contoh  mengandung  gula  pereduksi  yaitu terbentuknya larutan berwarna hijau, kuning atau endapan merah bata.

## h)  Biuret
Larutan  contoh  sebanyak  1  ml ditambahkan pereaksi biuret sebanyak 4 ml. Campuran dikocok dengan seksama.  Hasil uji  positif  contoh  mengandung  senyawa peptida yaitu terbentuknya larutan berwarna ungu.
i)  Ninhidrin Larutan  contoh    sebanyak  2  ml ditambahkan beberapa tetes larutan ninhidrin  0,1%.  Campuran  dipanaskan dalam penangas air selama 10 menit. Hasil uji positif contoh mengandung asam amino, yaitu terbentuknya larutan berwarna biru.

## III.  HASIL DAN PEMBAHASAN

## 3.1. Ekstraksi Ikan Buntal
Tetrodotoxin  merupakan  neuro- toxin yang memiliki berat molekul rendah (319,27)  dan  memiliki  struktur  yang sangat  unik  yang  dapat  dilihat  pada Gambar  1.  Racun  ini  sangat  polar sehingga  dapat  larut  dalam  air  dan  tidak larut  dalam  senyawa  organik.  Berbagai penelitian mengenai isolasi racun tetrodotoxin  telah  dilakukan,  Hasan et  al. (2008)  menggunakan  aquades  dingin untuk  mengekstrak  liver  ikan  buntal,  dan menggunakan  berbagai  macam  pelarut organik untuk mencucinya. Nilai
randemen ekstrak dapat dilihat di Tabel 1.

## 3.2. Toksisitas Ikan Buntal
Hasil penelitian menunjukkan bahwa sampel ikan buntal memiliki kadar racun  yang  tinggi  (Tabel  1).  Menurut
Meyer et  al. (1982)  suatu  zat  dianggap sangat  toksik  jika  nilai  LC 50 <30  ppm, toksik  jika  nilai  LC 50 30-1000  ppm,  dan kurang toksik jika nilai LC 50 >1000 ppm.
Gambar 1. Struktur kimia tetrodotoxin (Noguchi dan Arakawa, 2008).
Tabel 1. Nilai randemen dan toksisitas ekstrak ikan buntal.
No.  Nama organ Nama spesies Nilai randemen (%) Nilai LC 50 (ppm) 1. Jantung Diodon hystrix 4,47 155,67 2. Kulit Diodon hystrix 3,38 79,91 3. Daging Diodon hystrix 3,34 38,52 4. Hati Diodon hystrix 4,93 190,27 5. Kulit Arothron hispidus 2,41 181,91 6. Hati Arothron hispidus 5,51 35,16 7. Ovarium Arothron hispidus 3,57 29,65 8. Daging Arothron hispidus 4,36 57,09 Organ hispidus ovarium dari
Arothron memiliki  nilai  LC 50 paling rendah yaitu 29,65 ppm. Tingkat toksisitas ikan  buntal  bervariasi  tergantung  pada jenis  organ  tubuh,  geografi,  musim,  dan jenis  kelamin.  Racun  TTX  pada  ikan betina  lebih  tinggi  daripada  jantan  karena di  ovarium  terdeteksi  TTX  lebih  banyak bila  dibandingkan  dengan  testis  ikan (Hashimoto  dan  Kamiya,  1970).  Menurut Noguchi  dan  Arakawa  (2008)  racun  TTX pada ikan buntal terdistribusi di organ hati dan  ovarium  (paling  tinggi),  diikuti  oleh usus  dan  kulit.  Daging  dan  testis merupakan  organ  yang  tidak  toksik  atau toksisitasnya  lemah,  kecuali  pada  spesies Lagochephalus  lunaris dan Chelonodon patoca. Tingkat toksisitas pada organ hati umumnya  sangat  tinggi  sepanjang  tahun, kecuali  pada  musim  pemijahan  dimana racun  dari  hati  akan  ditransfer  ke  organ ovarium.  Racun  TTX  pada  telur  yang dipijahkan  dari  ovarium  berfungsi  untuk melindungi  telur  dari  predator.  Selain  itu,
ketika  ada  predator  ikan  buntal  akan menggelembungkan  dirinya  2-3  kali ukuran  normal  dan  racun  TTX  akan diekskresikan  dari  kulit  untuk  mengusir musuh.

## 3.3. Komposisi Kimiawi Ekstrak Ikan Buntal
Penapisan fitokimiawi secara kualitatif dilakukan sebagai uji awal untuk mengetahui  keberadaan  senyawa  kimiawi spesifik, yaitu senyawa metabolit sekunder  yang  diharapkan  merupakan racun  tetrodotoxin.  Penapisan  fitokimiawi ini  berdasarkan  pada  metode  Harborne (1987).  Hasil  pengujian  analisis  fitokimia dapat dilihat pada Tabel 2.
Hasil penelitian mendapatkan ovarium Arothron  hispidus positif  (+) mengandung  alkaloid,  karbohidrat  dan asam  amino  serta  negatif  (-)  mengandung steroid/triterpenoid, saponin, flavonoid, dan fenol  hidroquinon.  Hal  ini  sesuai  dengan struktur dari tetrodotoksin yang merupakan
Tabel 2. Hasil uji fitokimia ekstrak ovarium Arothron hispidus.
Keterangan: (+): Terdeteksi, (-): tidak terdeteksi
alkaloid  yang  memiliki  gugus  fungsi guanidium (Cordell et  al. ,  1993). Gugus guanidium  ini  dapat  terikat  pada  reseptor neurotoxin site 1  di subunit-α serambi luar VGSC  ( Voltage-Gate  Sodium  Channels ) dan  memblokir  masuknya  ion  natrium dengan menyumbat pori saluran (French et al., 2010).  Ikatan  ini  akan  menghambat penjalaran aksi potensial, sehingga melumpuhkan  fungsi  syaraf  dan  otot  (Lee et  al., 2008).  Pakar  lain  membuktikan bahwa TTX adalah senyawa amin dan gula (Noguchi dan Arakawa, 2008).

## IV.  KESIMPULAN
Penelitian  yang  telah  dilakukan dapat  diketahui  bahwa  diantara  dua  ikan buntal  yang  diteliti,  nilai  toksisitas tertinggi  yaitu  organ  ovarium Arothron hispidus dengan  nilai  LC 50 yaitu  29,65 ppm.  Kandungan  kimia  dari  ovarium  ini yaitu  alkaloid,  karbohidrat  dan  asam amino.  Senyawa  racun  yang  terdapat  di dalam  ekstrak  ovarium  ikan  buntal  ini diperkirakan  tetrodotoxin  yang  merupakan senyawa  metabolit  sekunder  golongan alkaloid.

## DAFTAR PUSTAKA
[BPOM]  Badan  Pengawas  Obat  dan Makanan.    2006.    Ikan  buntal ( Puffer  Fish )  ikan  nikmat  yang beracun. InfoPOM , 7(6):5-10. Cordell,  G.A.,  A.D.  Kinghorn,  and  J.M. Pezzuto.    1993.    Separation, structure elucidation and bioassay of  cytotoxic  natural  products. In: Colegate,  S.M.  and  R.J.  Moly- neux  (eds.).  Bioactive  natural products:  detection,  isolation  and structure  elucidation. CRC Press. Boca Raton. 196-198pp. French, R.J., D. Yoshikami, M.F. Sheets, and  B.M.  Olivera.  2010.  The tetrodotoxin  receptor  of  voltage- gated  sodium  channels:  perspec- tives  from  interactions  with  μ- conotoxins. Mar.  Drugs ,  8:2153- 2161.
Hagen,  Fisher,  Lapointe,  Souich,  Chary, Moulin, Sellers, and Ngoc.  2007. A  multicenter  open  label  safety and efficiency study of tetrodotoxin for cancer pain. J. of Pain  and  Symptom  Management , 34(2):171-182. Harborne,  J.B.    1987.    Metode  fitokimia penuntun  cara  modern  mengana- lisis  tumbuhan,  (2 nd ed.).    Padma- Uji Hasil Alkaloid Wagner + Meyer + Dragendorf + Steroid/Triterpenoid - Saponin - Flavonoid - Fenol hidroquinon - Molisch + Benedict - Biuret - Ninhidrin +
winata,  K.  dan  I.  Soedira  (penter- jemah).  ITB  Press.  Bandung.  354 hlm.
Hasan,  S.,    F.  Nikkon,  F.  Pervin,  M.M.
Rahman,  S.  Khatun,  T.  Hossain,
A. Khan, S.K. Sarker, A. Mosaddik,  and  N.  Absar . 2008.
Biochemical  and  histopathological effects  of  tetrodotoxin  isolated from Puffer fish Tetraodon patoca available  in  Bangladesh. Research J.  of  Medicine  and  Medical Sciences , 3(2):177-181.
Hashimoto,  Y.  and  H.  Kamiya.  1970. Food  chain  hypothesis  on  the origin  of  marine  toxins. Bull.  Jpn.
Soc. Sci. Fish ., 36:425–434. Kohane, D.S., S.E. Smith, D.N. Louis, G. Colombo,  P.  Ghoroqhchian,  N.G. Hunfeld,  C.B.  Berde,  and  R. Langer.  2003.  Prolonged duration local anesthesia from tetrodotoxin- enhanched local anesthetic micros- pores. Pain, 104:415-421.
Lee,  C.H.  and  P.C.  Ruben.  2008. Interaction  between  voltage-gated sodium  channels  and  the  neuro- toxin, tetrodotoxin. Channels , 2:407–412.
Meyer,  B.N.,  N.R.  Ferrighi,  J.E.  Putnam, L.B.  Jacobsen,  D.E.  Nichols,  and J.L.  McLaughlin.    1982.    Brine shrimp:  a  convenient  general bioassay  for  active  plant  consti- tuents. Planta Medica, 45:31-34. Noguchi,  T.  and  O.  Arakawa.    2008.
Tetrodotoxin-distribution and accumulation  in  aquatic  organism, and  cases  of  human  intoxiction. Marine Drugs , 6:220-242.
Seo,  Y.    2010.    Empat  warga  tewas
setelah makan ikan buntal. Tempo, 13 Maret 2010. Wibowo, A.E., A. Supriyono, Subintoro, dan  Y.  Rusman.  2003.    Studi eksplorasi senyawa metabolit sekunder dari biota laut. Prosiding Seminar Teknologi untuk  Negeri.  Buku2.  Hlm.:112- 118.
Weber,  M.  and  L.F.  De  Beaufort,  1962. The fishes of the Indo-Australian Archipelago.  XI.  Scleroparei, Hypostomides,  Pediculati,  Plec- tognathi,  Opisthomi,  Discoce- phali, Xenopterygii . A.J. Reprints
Agency, New Delhi, India. 481p. Diterima : 11 Mei 2014 Direview : 28 Mei 2014 Disetujui : 9 Juni 2014