Available online at BIOMA: Jurnal Ilmiah Biologi Website: http://journal.upgris.ac.id/index.php/bioma/index BIOMA: Jurnal Ilmiah Biologi, 10(1), April 2021, 14-29 DOI: https://doi.org/10.26877/bioma.v10i1.7140

## AKTIVITAS ANTIBAKTERI ISOLAT BAKTERI ENDOFIT DAUN

## PEGAGAN ( Centella asiatica) TERHADAP Staphylococcus aureus
Sembodho Edi Kurniawan 1 , Mahyarudin 2* , Ambar Rialita 3
1 Program Studi Kedokteran, Fakultas Kedokteran, Universitas Tanjungpura Jl. Prof. Dr. Hadari Nawawi, Pontianak Tenggara, Kota Pontianak, Kalimantan Barat
2 Departemen Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Tanjungpura Jl. Prof. Dr. Hadari Nawawi, Pontianak Tenggara, Kota Pontianak, Kalimantan Barat
3 Departemen Dermatologi, Fakultas Kedokteran Universitas Tanjungpura Jl. Prof. Dr. Hadari Nawawi, Pontianak Tenggara, Kota Pontianak, Kalimantan Barat *Corresponding author: mahyarudin@medical.untan.ac.id
Naskah diterima: 8 November 2020; Direvisi: 23 Januari 2021; Disetujui: 9 Februari 2021

## ABSTRAK
Ancaman global pada kasus Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) membutuhkan  alternatif  penanganan  dengan  tanaman  obat  tradisional.  Bakteri endofit  pada  tanaman  pegagan  ( Centella  asiatica )  memiliki  kemampuan menghasilkan senyawa metabolit sekunder bersifat antibakteri yang serupa dengan tanaman  inangnya.  Tujuan  penelitian  ini  untuk  mengetahui  aktivitas  antibakteri isolat bakteri endofit daun pegagan ( C. asiatica ) terhadap S. aureus . Penelitian ini bersifat deskriptif yaitu isolat bakteri endofit daun pegagan ( C. asiatica ) diujikan dengan  metode  difusi  cakram  terhadap S.  aureus. Isolat  yang  paling  berpotensi memiliki aktivitas antibakteri dilakukan uji metabolit untuk mengetahui senyawa antibakteri  yang  dihasilkan.  Identifikasi  bakteri  endofit  berdasarkan  morfologi koloni,  morfologi  sel,  dan  uji  biokimia.  Hasil  penelitian  menunjukkan  2  dari  37 isolat memiliki aktivitas terhadap S. aureus dengan zona hambat sebesar 9,02 mm dan 15,9 mm. Isolat yang paling berpotensi memiliki aktivitas tertinggi yaitu isolat I2  dengan  zona  hambat  sebesar  15,9  mm.  Isolat  I2  memiliki  kemiripan  dengan genus Bacillus dan kemampuan mengasilkan senyawa antibakteri seperti alkaloid, saponin dan terpenoid.
Kata kunci : antibakteri; bakteri endofit; Centella asiatica ; Staphylococcus aureus

## ABSTRACT
Antibacterial  activity  of  endophytic  bacteria  isolate  from  pegagan  leaves (Centella asiatica) against Staphylococcus aureus
The  global  threat  in  the  case  of  Methicillin  Resistant  Staphylococcus  aureus (MRSA)  requires  alternative  treatment  using  traditional  medicinal  plants. Endophytic  bacteria  found  in  Pegagan  plants  (Centella  asiatica)  have  ability  to produce secondary metabolites with antibacterial capabilities similar to their host plants.  The  purpose  of  this  study  is  to  determine  the  antibacterial  activity  of endophytic bacterial isolates of Pegagan (C. asiatica) against S. aureus. This study is a descriptive research where endophytic bacterial isolates of Pegagan leaves (C. asiatica)  were  tested  with  disk  diffusion  method  against  S.  aureus.  The  most
Kurniawan et al. , Aktivitas antibakteri isolat bakteri endofit...
potential  isolates  with  antibacterial  activity  were  performed  metabolites  test  to determine  the  antibacterial  compounds  produced.  Endophytic  bacteria identification based on colony morphology, cell morphology and biochemical tests. The  results  showed  that  2  out  of  37  isolates  had  activity  against  S.  aureus  with inhibition zone of 9,02 mm and 15.9 mm. The most potential isolate that has highest activity was I2 isolate with inhibition zone of 15.9 mm. Isolate I2 has similarities with the genus Bacillus and the ability to produce antibacterial compounds such as alkaloids, saponins and terpenoids.
Key words : antibacterial; Centella asiatica; endophytic bacteria; Staphylococcus aureus
__________________________________________________________________

## PENDAHULUAN
Pada tubuh  manusia dapat  ditemukan banyak flora normal  yang berpotensi menjadi  patogen diantaranya  yaitu bakteri Staphylococcus  aureus (Brooks et  al.,
2004) . Pertumbuhan S. aureus yang berlebihan dapat menimbulkan infeksi yang serius pada manusia maupun hewan (Staf Pengajar FK UI, 2010). Bakteri ini dapat menyebabkan infeksi pada tubuh manusia seperti bakteremia, impetigo, meningitis, pneumonia dan endokarditis (Tong et al ., 2015).
Staphylococcus aureus menghasilkan banyak toksin seperti Panton-Valentine leukocidin, alfa-hemolysis, phenol-soluble modulins, dan arginine catabolic mobile element yang  berperan  dalam  patogenitas  bakteri  yang  dapat  merusak  jaringan (Tortora et  al. ,  2010;  Tong et  al., 2015). Sebagian  besar  kasus  infeksi  yang disebabkan bakteri S. aureus secara efektif dapat diobati dengan antibiotik. Namun, penggunaan antibiotik dengan intensitas yang tinggi dapat menimbulkan berbagai permasalahan dan merupakan  ancaman  global bagi  kesehatan terutama resistensi bakteri  terhadap  antibiotik  seperti Methicillin  Resistant Staphylococcus  aureus (MRSA) (Permenkes, 2011).
Tanaman  pegagan  ( C.  asiatica) mengandung  senyawa  antibakteri  sehingga banyak  digunakan  sebagai  tanaman  obat.  Tanaman  pegagan  ( C.  asiatica) mengandung  metabolit  sekunder  seperti  saponin,  triterpenoid,  flavonoid,  dan alkaloid  (Bermawie et  al., 2008).  Flavonoid  memiliki  bioaktivitas  sebagai antibiotik,  antiperadangan,  antialergi,  antivirus  dan  anti  kanker  (Sundaryono, 2011). Tanaman ini juga dapat digunakan sebagai obat analgesik, antidepresan , obat penenang,  dan  antimikrob  (Brinkhaus et  al. ,  2000).  Beberapa  penelitian
Kurniawan et al. , Aktivitas antibakteri isolat bakteri endofit...
sebelumnya  menunjukkan  bahwa  tanaman  pegagan  ( C.  asiatica) mempunyai aktivitas  antibakteri  terhadap  bakteri S.  aureus , Mycobacterium  leprae,
Pseudomonas aeruginosa dan Escherichia coli (Delbò & Calapai , 2010) .
Bakteri  endofit  adalah  bakteri  yang  hidup  di  jaringan  tanaman  inang  tanpa menimbulkan  gejala-gejala  penyakit  pada  tanaman  tersebut  (Bhore  &  Sathisha , 2010). Simbiosis mutualisme antara bakteri dan tumbuhan memungkinkan bakteri menghasilkan senyawa bioaktif serupa dengan yang terkandung dalam tumbuhan inangnya  (Schulz  &  Boyle , 2006).  Bakteri  endofit  ditemukan  pada  biji,  buah, batang,  akar,  umbi  akar  dan  daun  tanaman  (Abdulla,  2009;  Vega et  al., 2005). Bakteri  endofit  daun  kemangi  dengan  genus Acetobacter diketahui  memiliki kemampuan untuk melawan S. aureus. Acetobacter menghasilkan asam asetat kuat yang dapat mengubah pH lingkungan dan menekan bakteri tersebut (Utami, 2018). Penggunaan  bakteri  endofit  diharapkan  mampu  menghasilkan  senyawa  bioaktif yang sama dengan tanaman inangnya tanpa harus ekstraksi (Prihatiningtias et al.,
2011). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri dari bakteri endofit pada tanaman pegagan ( C. asiatica) terhadap bakteri patogen S. aureus .

## MATERIAL DAN METODE

## Subjek Penelitian
Penelitian menggunakan subjek berupa  bakteri  endofit  yang diisolasi  dari daun  pegagan  ( C.  asiatica )  dan  biakan  murni  bakteri S.  aureus .  Penelitian dilaksanakan  di  Laboratorium  Mikroskopis,  Fakultas  Kedokteran,  Universitas Tanjungpura.

## Alat dan Bahan
Alat  yang  digunakan  adalah  cawan  petri,  jarum  ose, cotton  swab steril, inkubator,  mikropipet,  sentrifus,  mikroskop  cahaya,  jangka  sorong, paper  disk , tabung reaksi, kaca obyek, tabung reaksi, gelas ukur, dan handscoon steril. Bahan yang digunakan meliputi biakan murni bakteri S. aureus , isolat bakteri endofit daun pegagan ( C. asiatica ), media pertumbuhan nutrient agar (NA) , media pertumbuhan nutrient broth (NB) , media Mannitol salt agar (MSA) , media Mueller hinton agar (MHA) , larutan standar Mc Farland 0,5, larutan NaCl steril, zat warna kristal violet, alkohol 96%, safranin, dan lugol.
Kurniawan et al. , Aktivitas antibakteri isolat bakteri endofit...

## Prosedur Penelitian
Peremajaan bakteri endofit daun pegagan ( C. asiatica)
Bakteri  endofit  daun  pegagan  ( C.  asiatica) diremajakan  dalam  media lempeng  NA.  Satu  koloni  bakteri  endofit  diambil  dengan  jarum  ose  steril,  lalu diinokulasi pada media lempeng NA dengan metode cawan gores dan diinkubasi pada 37 o C selama 24-48 jam (Anjum & Chandra , 2015).

## Produksi metabolit antibakteri dari bakteri endofit
Isolat  bakteri  endofit  pada  media  NA  ditumbuhkan  pada  media  NB  untuk memproduksi metabolit antimikroba, kemudian diinkubasi pada 37 o C selama 48- 72 jam. Isolat disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 15 menit dengan suhu 4 o C hingga didapatkan supernatan. Supernatan dipindahkan dan disentrifugasi kembali agar  metabolit  antibakteri  terpisah  dengan  bakteri  endofit.  Isolat  diuji  dengan metode difusi cakram terhadap bakteri uji (Adityawarman, 2019; Utami, 2018).
Peremajaan bakteri uji S. aureus
Staphylococcus  aureus diperoleh  dari  Laboratorium  Parasitologi  Fakultas Kedokteran  Universitas  Indonesia.  Peremajaan  dilakukan  untuk  mendapatkan bakteri  segar  yang  berusia  24  jam.  Koloni  yang  tumbuh  dari  hasil  peremajaan tersebut digunakan sebagai sampel penelitian (Waluyo, 2008).

## Pembuatan suspensi bakteri uji
Koloni  bakteri  uji  pada  media  peremajaan  berumur  24  jam  diambil  dan disuspensi  dalam  5  ml   NaCl  steril  0,9%.  Kekeruhan  yang  diperoleh  disetarakan dengan standar Mc Farland 0,5 (Ayyagari & Sushma , 2009).

## Kontrol positif dan negatif
Kontrol  positif  yang  digunakan  adalah  siprofloksasin  yang  merupakan antibiotik  dan  kontrol  negatif nutrient  broth .  Siprofloksasin  diketahui  memiliki daya hambat terhadap mikroba ( Tabel 1 ).
Tabel 1 . Zona hambat antibiotik (Vendepitte et al., 2010)
Jenis Antibiotik Konsentrasi Cakram Antibiotik Diameter Zona Hambat (mm) Sensitif Intermediet Resisten Siprofloksasin 5 μg ≥20 mm 15-19 mm ≤14 mm
Kurniawan et al. , Aktivitas antibakteri isolat bakteri endofit...

## Skrining bakteri endofit dengan metode difusi cakram
Kultur  isolat  bakteri  endofit  diuji  potensi  antibakteri  dengan  metode  kertas cakram ( disc diffusion Kirby Bauer ). Suspensi bakteri uji disebar pada permukaan media  MHA  dengan  metode swab .  Supernatan  hasil  sentrifugasi  bakteri  endofit diserapkan  pada  kertas  cakram  dengan  diameter  6  mm.  Cakram  diletakkan  pada permukaan MHA yang telah diinokulasi bakteri uji dan diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 24-48 jam (Muharni et al., 2014).

## Pengukuran zona hambat
Pengamatan  dilakukan  selama  24  jam  masa  inkubasi.  Zona  hambat  yang terbentuk  diukur  diameternya  dari  satu  tepi  ke  tepi  lain  dengan  melewati  bagian tengah kertas cakram menggunakan jangka sorong dengan satuan mm (Hudzicki, 2009) untuk mengetahui respon hambatan pertumbuhan bakteri ( Tabel 2 ).
Tabel 2 . Klasifikasi respon hambatan pertumbuhan bakteri (Tchaou, 1996)

## Identifikasi bakteri endofit
Bakteri  murni  yang  memiliki  efek  aktivitas  antibakteri  tertinggi dikarakterisasi  dan  diidentifikasi  dengan  uji  biokimia  mengacu  pada Bergey’s Manual  of  Determinative  Bacteriology .  Karakterisasi  yang  dilakukan  meliputi pengamatan morfologi koloni, morfologi sel, dan biokimia bakteri.
Pengamatan morfologi koloni dilihat dari bentuk, permukaan, tepi, dan warna koloni.  (Holt et  al., 2000).  Karakterisasi  mikroskopis  dilakukan  dengan  metode pewarnaan Gram. Bakteri  gram  positif akan ditunjukkan dengan sel  warna ungu, sedangkan bakteri gram negatif akan ditandai dengan sel yang bewarna merah atau merah muda (Cappuccino & Sherman , 2014). Selain itu, juga dilakukan pewarnaan endospora  dan  uji  biokimia,  meliputi  uji  kebutuhan  oksigen,  uji  oksidasi,  uji
Diameter Zona Hambat (mm) Interpretasi 0 mm Tidak memiliki efek antibakteri 1,4-6,2 mm Lemah 6,3-10,3 mm Sedang 10,4-26,8 mm Kuat ≥26,8 mm Sangat kuat
Kurniawan et al. , Aktivitas antibakteri isolat bakteri endofit...
motilitas, uji katalase, uji fermentasi karbohidrat, uji dekarboksilasi, uji urease, uji indol, uji oksidase-fermentasi, uji penggunaan sitrat dan uji TSIA.

## Uji metabolit sekunder bakteri yang potensial
Bakteri  endofit  yang  potensial  dilakukan  fermentasi  cair  agar  supernatan terpisah  dengan  bakteri  endofit.  Supernatan  yang  diperoleh  digunakan  untuk  uji metabolit  sekunder  bakteri  endofit  yang  potensial  (Adityawarman,  2019;  Utami, 2018), berupa uji terpenoid/steroid, uji alkaloid, uji flavonoid, dan uji saponin.

## Analisis dan Interpretasi Data
Data  dianalisis  dengan  mengumpulkan  semua  hasil  pengamatan  isolat  dari pengujian  antibakteri,  diameter  zona  hambat  yang  terbentuk,  identifikasi karakteristik  bakteri  endofit,  serta  uji  metabolit  sekunder  bakteri  endofit  yang potensial sebagai antibakteri terhadap S. aureus .

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Peremajaan bakteri endofit
Sebanyak 37 dari 42 isolat bakteri endofit berhasil dilakukan peremajaan pada media NA, terdiri dari 20 isolat bakteri Gram negatif dan 17 isolat bakteri Gram positif. Lima isolat bakteri endofit lainnya yang terdiri dari 3 bakteri Gram negatif dan 2 bakteri Gram positif tidak berhasil dilakukan peremajaan karena kontaminasi ( Tabel 3 ).
(a) (b)
Gambar 1 . Morfologi koloni S. aureus (a) usia 24 jam pada media MSA dan (b) perbesaran 1000x
Kurniawan et al. , Aktivitas antibakteri isolat bakteri endofit...
Tabel 3. Hasil peremajaan bakteri endofit
No Nama Isolat Morfologi Koloni Morfologi Sel Bentuk Permukaan Tepi Warna 1. I1 Iregular  Datar Bergelombang Kuning Basil, Positif 2. I2 Iregular  Cembung Bergelombang Putih Basil, Positif 3. I3 Iregular  Cembung Bergelombang Putih Kekuningan Basil, Positif 4. I4 Bulat Datar Bergerigi Putih Basil, Positif 5. I5 Iregular  Datar Bergelombang Kuning Basil, Positif 6. I6 Iregular  Cembung Bergerigi Putih Kekuningan Basil, Positif 7. I7 Bulat Datar Bergerigi Putih Basil, Positif 8. I8 Titik Datar Utuh Putih Basil, Positf 9. I10 Iregular  Cembung Bergelombang Putih Kekuningan Basil, Positif 10. I11 Iregular  Cembung Bergerigi Putih Basil, Negatif 11. I12 Bulat Datar Bergerigi Putih Kekuningan Basil, Positif 12. I13 Iregular  Cembung Bergelombang Putih Kekuningan Basil, Negatif 13. I14 Iregular  Cembung Bergerigi Putih Basil, Positif 14. I15 Iregular  Cembung Bergelombang Putih Kekuningan Basil, Negatif 15. I17 Iregular  Cembung Bergelombang Putih Kekuningan Basil, Negatif 16. I18 Bulat Datar Bergelombang Putih Basil, Positif 17. I19 Iregular  Datar Bergelombang Putih Kekuningan Basil, Positif 18. I20 Iregular  Cembung Bergelombang Putih Basil, Negatif 19. I21 Iregular  Datar Bergerigi Putih Kekuningan Basil, Negatif 20. I22 Titik Cembung Utuh Putih Basil, Negatif 21. I23 Iregular  Cembung Bergelombang Putih Basil, Positif 22. I24 Iregular  Datar Bergerigi Putih Kekuningan Basil, Positif 23. I25 Iregular  Datar Bergerigi Putih Kekuningan Basil, Positif 24. I26 Iregular  Datar Bergelombang Kuning Basil, Positif 25. I27 Iregular  Cembung Bergelombang Putih Kekuningan Basil, Negatif 26. N1 Iregular  Cembung Bergerigi Putih Kekuningan Basil, Negatif 27. N2 Iregular  Datar Bergelombang Putih Kekuningan Basil, Negatif 28. N4 Bulat Datar Bergerigi Putih Basil, Negatif 29. N5 Iregular  Cembung Utuh Putih Basil, Negatif 30. N6 Iregular  Cembung Utuh Putih Kekuningan Basil, Negatif 31. N7 Iregular  Cembung Bergelombang Putih Kekuningan Basil, Negatif 32. N8 Ireguler  Cembung Utuh Putih kekuningan Basil, Negatif 33. N9 Iregular  Datar Bergelombang Putih kekuningan Basil, Negatif 34. N10 Bulat Cembung Utuh Putih Basil, Negatif 35. N11 Iregular  Cembung Bergelombang Kuning Basil, Negatif
Kurniawan et al. , Aktivitas antibakteri isolat bakteri endofit...
36. N14 Titik Cembung Utuh Putih Kokus, Negatif 37. N15 Ireguler  Cembung Bergerigi Putih Kekuningan Kokus, Negatif

## Peremajaan Staphylococcus aureus
Hasil  peremajaan  bakteri  ini  pada  media  MSA  menunjukkan  pertumbuhan koloni  berbentuk  bundar,  halus,  dan  berwarna  putih  kekuningan.  Morfologi  sel bakteri uji menunjukkan bakteri Gram positif yang berbentuk kokus, bergerombol membentuk seperti buah anggur ( Gambar 1 ). Peremajaan dilakukan pada media selektif diferensial MSA ( mannitol salt agar ) yang spesifik untuk pertumbuhan S. aureus yang  memiliki  kemampuan  memfermentasi mannitol sehingga  merubah indikator fenol merah pada MSA menjadi berwarna kuning (Dewi, 2013; Brooks et al., 2004; Pumipuntu et al., 2017) .
Skrining bakteri endofit yang berpotensi sebagai antibakteri terhadap S. aureus Hasil  pengujian  bakteri  endofit  sebagai  antibakteri  dengan  metode  difusi cakram menunjukkan hanya dua isolat yang memiliki aktivitas antibakteri terhadap S.  aureus ( Tabel  4 ).  Beberapa  isolat  bakteri  tumbuh,  namun  tidak  memiliki aktivitas antibakteri terhadap S. aureus.
(a) (b) (c)
Gambar 2 . (a) Morfologi koloni isolat I2, (b) morfologi sel isolat I2, dan (c) zona hambat yang dibentuk oleh isolat I2
Kurniawan et al. , Aktivitas antibakteri isolat bakteri endofit...
Tabel 4 . Hasil uji aktivitas antibakteri bakteri endofit
No Nama Isolat Zona Hambat (mm) 1 Isolat I1 9,02 2 Isolat I2 15,9 3 Isolat I3 Tidak ada zona hambat 4 Isolat I4 Tidak ada zona hambat 5 Isolat I5 Tidak ada zona hambat 6 Isolat I6 Tidak ada zona hambat 7 Isolat I7 Tidak ada zona hambat 8 Isolat I8 Tidak ada zona hambat 9 Isolat I10 Tidak ada zona hambat 10 Isolat I11 Tidak ada zona hambat 11 Isolat I12 Tidak ada zona hambat 12 Isolat I13 Tidak ada zona hambat 13 Isolat I14 Tidak ada zona hambat 14 Isolat I15 Tidak ada zona hambat 15 Isolat I17 Tidak ada zona hambat 16 Isolat I18 Tidak ada zona hambat 17 Isolat I19 Tidak ada zona hambat 18 Isolat I20 Tidak ada zona hambat 19 Isolat I21 Tidak ada zona hambat 20 Isolat I22 Tidak ada zona hambat 21 Isolat I23 Tidak ada zona hambat 22 Isolat I24 Tidak ada zona hambat 23 Isolat I25 Tidak ada zona hambat 24 Isolat I26 Tidak ada zona hambat 25 Isolat I27 Tidak ada zona hambat 26 Isolat N1 Tidak ada zona hambat 27 Isolat N2 Tidak ada zona hambat 28 Isolat N4 Tidak ada zona hambat 29 Isolat N5 Tidak ada zona hambat 30 Isolat N6 Tidak ada zona hambat 31 Isolat N7 Tidak ada zona hambat 32 Isolat N8 Tidak ada zona hambat 33 Isolat N9 Tidak ada zona hambat 34 Isolat N10 Tidak ada zona hambat 35 Isolat N11 Tidak ada zona hambat 36 Isolat N14 Tidak ada zona hambat
Kurniawan et al. , Aktivitas antibakteri isolat bakteri endofit...
37 Isolat N15 Tidak ada zona hambat

## Hasil uji biokimia bakteri endofit yang potensial sebagai antibakteri
Pengujian  biokimia  yang  dilakukan  terhadap  isolat  I2  yaitu  uji  kebutuhan oksigen, uji motilitas, uji glukosa, uji laktosa, uji manitol, uji maltosa, uji sakarosa, uji indol, uji simon sitrat, uji oksidase dan uji katalase ( Tabel 5 ). Isolat I2 memiliki karakteristik  mirip  dengan Bacillus yang  berbentuk  batang,  dapat  berupa  gram positif ataupun negatif, ada yang bersifat motil atau nonmotil (Logan et al., 2015).
Genus  ini  mampu  menghasilkan  endospora  ketika  kondisi  ekstrim  seperti kekeringan, sinar UV, suhu, larutan asam dan basa kuat, zat oksidatif, dan tekanan hidrostatik yang ekstrim (Wolska et al., 2007).
Tabel 5 . Hasil uji biokimia bakteri endofit isolat I2 No Uji Biokimia Isolat I2 1. Kebutuhan Oksigen Aerob 2. Motilitas - 3. Glukosa + 4. Laktosa - 5. Manitol + 6. Maltosa - 7. Sakarosa + 8. Indol - 9. Urea + 10. Simon Sitrat + 11. KIA (TSIA) K/A 12. Oksidase + 13. Katalase + 14. Glukosa OF N/F
Uji  pewarnaan  endospora  diperlukan  untuk  memastikan  bahwa  isolat  I2 merupakan Bacillus .  Penggunaan carbol  fuchsin yang  mengandung  fenol membantu melarutkan dinding sel bakteri. Pemanasan dilakukan untuk melelehkan lilin  yang  melapisi  endospora  dan  agar  zat  pewarna  dapat  masuk.  Ketika  suhu menurun  lilin  akan  kembali  membeku  dan  zat  warna  akan  terperangkap  dalam
Kurniawan et al. , Aktivitas antibakteri isolat bakteri endofit...
lapisan  tersebut  sedangkan  sel  vegetatifnya  akan  terwarnai  zat  kedua  yaitu methylene blue ( Gambar 3 ).
Gambar 3 . Pewarnaan spora isolat I2 perbesaran 1000x
Bacillus selain  mampu  menghasilkan  endospora,  juga  menghasilkan  enzim katalase. Genus ini bersifat oksidase positif maupun negatif. Biasanya ditemukan di tanah, lingkungan  yang terkontainasi oleh tanah baik secara langsung maupun tidak, serta juga dapat ditemukan pada air dan makanan (Logan et al., 2015). Hal ini  sesusai  dengan  penelitian  yang  dilakukan  oleh  Rafat et  al. (2012)  bahwa ditemukan  bakteri Bacillus  gibsoni yang  diisolasi  dari  tanaman  pegagan  ( C. asiatica ).
Hasil uji metabolit sekunder bakteri endofit yang potensial sebagai antibakteri Uji  metabolit  sekunder  dilakukan  terhadap  supernatan  isolat  I2  untuk mengetahui  adanya  senyawa  metabolit  sekunder  yang  dihasilkan.  Isolat  I2 menghasilkan  senyawa  metabolit  alkaloid,  saponin,  dan  terpenoid  yang  bersifat sebagai  antibakteri  ( Tabel  6 ).  Senyawa  metabolit  inilah  yang  berperan  dalam membentuk zona hambat pada skrining isolat bakteri I2 terhadap S. aureus. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri endofit I2 mampu menghasilkan senyawa yang serupa dengan yang dihasilkan tanaman pegagan ( C. asiatica ) yaitu saponin, triterpenoid, flavonoid, dan alkaloid (Schulz & Boyle , 2006; Bermawie et al., 2008).
Bakteri endofit dapat menghasilkan senyawa metabolit sekunder yang serupa dengan  tanaman  inangnya  (Schulz  &  Boyle,  2006).  Senyawa  alkaloid  memiliki mekanisme  penghambatan  dengan  cara  mengganggu  komponen  penyusun peptidoglikan pada sel bakteri, sehingga lapisan dinding sel tidak terbentuk secara utuh dan menyebabkan kematian sel tersebut (Julianti, 2008). Mekanisme terpenoid
Kurniawan et al. , Aktivitas antibakteri isolat bakteri endofit...
sebagai  antibakteri  yaitu  dengan  cara  merusak  membran  sel  bakteri.  Kerusakan membran sel terjadi ketika senyawa aktif antibakteri bereaksi dengan sisi aktif dari membran  atau  dengan  melarutkan  konstituen  lipid  dan  meningkatkan permeabilitasnya.
Tabel 6. Hasil uji senyawa metabolit sekunder bakteri endofit isolat I2 No. Golongan Senyawa Metabolit Sekunder I2 Kontrol (-) 1. Alkaloid Positif (+) Negatif (-) 2. Flavonoid Positif (-) Negatif (-) 3. Fenol Negatif (-) Negatif (-) 4. Saponin Positif (+) Negatif (-) 5. Terpenoid Positif (+) Negatif (-) 6. Steroid Negatif (-) Negatif (-)
Senyawa saponin sebagai antibakteri dapat menyebabkan kebocoran protein dan  enzim  dari  dalam  sel  (Madduluri et  al., 2013).  Flavonoid  berfungsi  sebagai antibakteri  dengan  cara  membentuk  senyawa  kompleks  terhadap  protein extraseluler yang mengganggu keutuhan membran sel bakteri. Mekanisme kerjanya dengan  cara  mendenaturasi  protein  sel  bakteri  dan  merusak  membran  sel  tanpa dapat diperbaiki lagi (Julianti, 2008).
Bacillus  cereus,  B.  thuringiensi, dan B.  licheniformis yang  diisolasi  dari tanaman Pinellia  ternata memiliki kemampuan  menghasilkan alkaloid (guanosin dan  inosin)  yang  serupa  dengan  tanaman  inangnya  pada  media broth fermentasi (Singh et  al., 2017).  Sedangkan  pada  penelitian  yang  lainnya  juga  disebutkan bahwa B.  subtilis memiliki  peluang  dan  prospek  yang  bagus  untuk  biosintesis terpenoid  dikarenakan  bakteri  ini  banyak  memproduksi  isoprena  secara  alami. Isoprena  yang  dihasilkan B.  subtilis melalui  proses  metabolik  diubah  menjadi senyawa metabolit terpenoid (Guan et al., 2015).
Bakteri endofit yang diisolasi dari daun pegagan ( C. asiatica ) pada penelitian ini  memiliki  potensi  aktivitas  untuk  menghambat S.  aureus berdasarkan  adanya senyawa metabolit sekunder seperti alkaloid, saponin, dan terpenoid. Kemampuan penghambatan tersebut ditunjukkan dengan adanya zona hambat di sekitar cakram.
Kurniawan et al. , Aktivitas antibakteri isolat bakteri endofit...

## KESIMPULAN
Isolat  bakteri  endofit  dari  daun  pegagan  ( C.  asiatica) memiliki  aktivitas antibakteri  terhadap S.  aureus ditunjukkan  dengan  terbentuknya  zona  hambat sebesar 9,02 pada I1 mm dan 15,9 mm pada I2. Isolat I2 yang memiliki kemiripan dengan Bacillus memiliki  aktivitas  antibakteri  yang  paling  potensial  untuk menghambat S. aureus berdasarkan karakter morfologi koloni, morfologi sel, dan aktivitas biokimia yang menghasilkan metabolik sekunder berupa alkaloid, saponin dan terpenoid.

## DAFTAR PUSTAKA
Abdulla,  D.  (2009).  Plasmids  profiles,  antibiotic  and  heavy  metal  resistance incidence of endophytic bacteria isolated from grapevine ( Vitis inifera L.). African Journal of Biotechnology , 8 (21), 5873–82. https://doi.org/10.5897/AJB09.1391
Adityawarman. (2019). Isolasi, identifikasi dan aktivitas antibakteri bakteri endofit daun  pegagan  ( Centella  asiatica L.)  terhadap Escherichia  coli ,  Jurnal Cerebellum, 5 (4B), 1569-1582. https://jurnal.untan.ac.id/index.php/ JC/article/view/44821/75676588266
Anjum,  N.  &  Chandra,  R.  (2015).  Endophytic  bacteria:  Optimizaton  of  isolation procedure  from  various  medicinal  plants  and  their  preliminary characterization. Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research , 8 (4), 233-238. https://doi.org/6586-24211-1-PB
Ayyagari,  A.  &  Sushma,  G.  (2009).  Detection  of  antimicrobial  resistance  in common gram negative and gram positive bacteria encountered in infectious diseases – an update. Indian Council of Medical Research Bulletin , 39 (1– 3), 1–20. https://doi.org/ISSN 0377-4910
Bermawie, N., Purwiyanti, S. & Mardiana. (2008). Keragaan sifat morfologi, hasil dan  mutu  plasma  nutfah  pegagan  ( Centella  asiatica (L.)  Urban.). Buletin Penelitian
Tanaman Rempah dan Obat, 19 (1), 1-17.
http://dx.doi.org/10.21082/bullittro.v19n1.2008.%25p
Bhore, S. J., & Sathisha, G. (2010). Screening of endophytic colonizing bacteria for cytokinin-like compounds : crude cell-free broth of endophytic colonizing bacteria  is  unsuitable  in  cucumber  cotyledon  bioassay. World  Journal  of Agricultural  Sciences , 6 (4),  345–52.  https://www.idosi.org/wjas/wjas6(4). htm
Brooks, G. F., Butel, J. S., & Morse, S. A. (2004). Mikrobiologi kedokteran; Jawetz, Melnick & Adleberg’s , Edisi 23. Jakarta: EGC.
Cappuccino, J. G. & Sherman, N. (2014). Microbiology: A laboratory manual . 10th
Kurniawan et al. , Aktivitas antibakteri isolat bakteri endofit...
edition . New York: Pearson Education Inc. https://doi.org/10.1007/s13398- 014-0173-7.2
Delbò, M. & Calapai, G. (2010). Assessment report on Centella asiatica (L.) urban herba. European  Medicines  Agency  Science  Medicine  Health , 44 ,  1-44. https://doi.org/10.1109/MWSYM.2007.380531
Guan, Z., Xue, D., Abdallah, I. I., Dijkshoorn L., Setroikromo, R., Lv, G., & Quax, W.  J.  (2015).  Metabolic  engineering  of Bacillus  subtilis for  terpenoid production. Applied Microbiology and Biotechnology , 19 (22), 9395–9406. https://doi.org/10.1007/s00253-015-6950-1
Holt, J. G., Krieg, N. R., Sneath, P. H. A., Staley, J. T., & Williams, S. T. (2000). Bergey’s  manual  of  determinative  microbiology,  9th  Edn .  Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins.
Hudzicki,  J.  (2009).  Kirby-Bauer  disk  diffusion  susceptibility  test  protocol.
American Society for Microbiology , 1–23. https://www.asmscience.org/docserver/fulltext/education/protocol/protocol .3189.pdf?expires=1614643573&id=id&accname=guest&checksum=670B 88756452CA10BCBAD3B66714DBA8
Julianti,  F.  R.  (2008).  Manfaat  sirih  merah  ( Piper  crocatum )  sebagai  agen  anti bakterial terhadap bakteri gram positif dan gram negatif. Jurnal Kedokteran Dan Kesehatan Indonesia . https://journal.uii.ac.id/JKKI/article/view/543
Logan, N. A. & De Vos, P. (2015). Bergeys`s manual of systematics of archaea and bacteria :  Genus  Bacillus .  New  Jersey:  John  Wiley  &  Sons,  Inc . https://doi.org/10.1002/9781118960608.gbm00530.
Madduluri, S., Rao, K. B., & Sitaram, B. (2013). In vitro evaluation of antibacterial activity of five indegenous plants extract against five bacterial pathogens of human. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences , 5 (4), 679–84. https://innovareacademics.in/journal/ijpps/Vol5Suppl4.htm Muharni, F., Oktaruliza, M., & Elfita. (2014). Antibacterial and antioxidant activity testing of pyranon derivated compound from endophytic fungi Penicillium sp.  of  kunyit  putih  ( Curcuma  zedoaria (Berg)  Roscoe). Traditional Medicine Journal , 19 (3), 107–12. https://doi.org/10.7717/peerj.5425.
Permenkes,  Republik  Indonesia.  (2011). Pedoman  umum  penggunaan  antibiotik. Kementerian Kesehatan RI . Indonesia.
Prihatiningtias,  Widyati,  &  Wahyuningsih,  M.  S.  H.  (2011).  Prospek  mikroba endofit  sebagai  sumber  senyawa  bioaktif  (Skripsi,  Universitas  Gadjah Mada). Retrieved from  https://docplayer.info/33637397-Prospek-mikroba- endofit-sebagai-sumber-senyawa-bioaktif-prospect-of-endophyte-as-a- bioactive-compound-source.html
Pumipuntu,  N.,  Kulpeanprasit,  S.,  Santajit,  S.,  Tunyong,  W.,  &  Kong-ngoen,  T.
(2017).  Screening  method  for Staphylococcus  aureus identification  in
Kurniawan et al. , Aktivitas antibakteri isolat bakteri endofit...
subclinical bovine mastitis from dairy farms. Veterinary World , 10 , 721–26. https://doi.org/10.14202/vetworld.2017.721-726
Rafat,  A.,  Philip,  K.,  &  Muniandy,  S.  (2012).  A  novel  source  of  bioactive compounds: endophytic bacteria isolated from Centella asiatica . Journal of Pure and Applied Microbiology , 6 (1): 11–20. https://microbiologyjournal.org/archive_mg/jmabsread.php?snoid=741&m onth=&year=
Schulz, B. J. E., & Boyle, C. J. C. (2006). What are endophytes. In microbial root endophytes ,  edited  by  Schulz,  B. J.  E.,  Boyle,  C.  J.  C.,  and  Sieber,  T.  N. Berlin: Springer-Verlag.
Singh, M., Kumar, A., Singh, R., & Pandey, K. D. (2017). Endophytic bacteria: a new source of bioactive compounds. Biotech, 7 (5), 315. https://doi.org/10.1007/s13205-017-0942-z
Staf  Pengajar  FK  UI.  (2010). Buku  ajar  mikrobiologi  kedokteran,  Edisi  Revisi . Tangerang: Binapura Aksara Publisher.
Sulistiyani,  Ardyati,  T.  &  Winarsih,  S.  (2016).  Antimicrobial  and  antioxidant activity of endophyte bacteria associated with Curcuma longa rhizome. The
Journal of Experimental Life Science, 6 (1), 45–51.
https://doi.org/10.21776/ub.jels.2016.006.01.11
Sundaryono, A. (2011). Penggunaan batang tanaman betadin ( Jatropha multifida L.)  untuk  meningkatkan  jumlah  trombosit  pada Mus  musculus . Media Medika  Indonesia , 45 (2),  1–5.  https://ejournal.undip.ac.id/index.php/ mmi/article/view/3017
Tchaou, W. S. (1996). Inhibiting of pure culture of oral bacteria by root canal filling materials. Pediatric Dentistry , 18 (7), 444–49. https://www.researchgate.net/publication/14238061_Inhibition_of_pure_c ultures_of_oral_bacteria_by_root_canal_filling_materials
Tong,  S.  Y.  C.,  Davis,  J.  S.,  Eichenberger,  E.,  Holland,  T.  L.,  &  Fowler,  V.  G. (2015). Staphylococcus aureus infections: epidemiology, pathophysiology, clinical  manifestations,  and  management. Clinical  Microbiology  Reviews , 28 (3), 603–61. https://doi.org/10.1128/CMR.00134-14
Tortora, G. J., Funke, B. R., & Case, C. L. (2010). Microbiology: An introduction. 10th edition . San Francisco: Bejamin Cummings.
Utami,  D.  P.  (2018).  Isolasi,  identifikasi  dan  aktivitas  antibakteri  bakteri  endofit daun  kemangi  ( Ocinum  basilicum L.)  terhadap Staphylococcus  aureus . Jurnal  Mahasiswa  PSPD  FK  Universitas  Tanjungpura,  4 (1),  4-31. https://jurnal.untan.ac.id/index.php/jfk/article/view/25672/75676576756
Vega, F. E., Pava-Ripoll, M., Posada, F., & Buyer, J. S. (2005). Endophytic bacteria in Coffea  arabica L. Journal  of  Basic  Microbiology , 45 (5),  371–80. https://doi.org/10.1002/jobm.200410551
Kurniawan et al. , Aktivitas antibakteri isolat bakteri endofit...
Vendepitte,  J.  J.,  Engbaek,  K.,  Rohmer,  P.,  Piot,  P.,  &  Heuck,  C.  C.  (2010).
Prosedur  laboratorium  dasar  untuk  bakteriologis  klinis.  2nd  edition . Jakarta: EGC.
Waluyo,  L.  2008. Teknik  dan  metode  dasar  dalam  mikrobiologi .  Malang: Universitas Muhammadiyah Malang Press.
Wolska, K. I., Grudniak, A. M., & Kraczkiewicz-dowjat, A. (2007). Genetic and physiological  regulation  of  bacterial  endospore  development. Polish Journal  of  Microbiology , 56 (1),  11-17.  http://www.pjmonline.org/pjm- 2007-vol-56/