Accredited by Ministry of Research, Technology                          DOI: https://doi.org/10.35799/jis.20.1.2020.27702 and Higher Education No: 28/E/KPT/2019                    Available online at https://ejournal.unsrat.ac.id/index.php/jis
Evaluasi Deteksi Berbasis PCR untuk Bakteri Bifidobacterium longum dalam Sampel Feses Bayi dari Kota Manado
Beivy Jonathan Kolondam 1 * )
1) Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sam Ratulangi, Manado 95115
*Corresponding author: beivy.kolondam@unsrat.ac.id
(Article History:  Received 24-01-2020; Accepted 06-04-2020; Published 06-04-2020)

## ABSTRAK
Bifidobakteria  merupakan  mikroflora  yang  umum  hidup  dalam  usus  manusia  sejak  bayi.  Peran Bifidobacterium  longum yang  positif  sebagai  salah  satu  bakteri  yang  menunjang  kesehatan inangnya  membuat  bakteri  ini  menjadi  objek  studi  yang  menarik.  Salah  satu  instrumen  dalam penelitian adalah adalah metode deteksi bakteri B. longum yang berbasis PCR (Polymerase Chain Reaction) gen 16S rRNA. Dengan mempertimbangkan bahwa perancangan primer  untuk  deteksi ini  sudah  lebih  dari  20  tahun,  penelitian  ini  bertujuan  mengevaluasi  hasil  deteksi  melalui  PCR terhadap B. longum dalam feses bayi. Akurasi hasil dilihat melalui sekuensing terhadap hasil PCR sampel yang terdeteksi positif. Dua sampel feses bayi di Manado yang diperiksa menunjukkan hasil positif dan produk PCR tersebut dilakukan sekuensing. Panjang DNA yang nyata dari hasil deteksi ini yaitu 829 bp dan bukan 831 bp. Sekuens DNA kedua sampel ini identik satu sama lain. Hasil BLAST ( Basic Local Alignment Search Tool ) mengonfirmasi kesamaan 100% (identik) dari kedua specimen dari Kota Manado dengan sekuens gen 16S rRNA specimen bakteri B. longum yang telah ada dalam GenBank.
Kata-kata kunci: Bifidobacterium longum , Polymerase Chain Reaction, deteksi, feses, bayi.
Evaluation of PCR-Based Detection for Bifidobacterium longum in Infant Fecal Samples from Manado City

## ABSTRACT
Bifidobacteria  are  common  members  of  the  gut  microflora  of  humans  since  infant.  The Bifidobacterium longum has positive roles and one of supportive bacteria to the host, which made interesting  as  a  study  object.  One  instrument  in  studying  this  bacterial  species  is  the  detection method based on PCR of 16S rRNA gene. In consideration of the design of primers for this detection method is already more than 20 years, this research aimed to evaluate the PCR-based detection of B.  longum in  infant  feces.  The  accuracy  of  the  method  was  evaluated  from  sequencing  of  DNA fragment from positive results. Two fecal samples in Manado City shown positive result were sent for sequencing. The actual length of DNA amplified by PCR was 829 bp, not 831 bp. The DNA sequence of both samples were identical to each other. The BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) result confirmed the similarity of both samples from Manado with 16S rRNA gene sequence of B. longum specimens in GenBank.
Keywords: Bifidobacterium longum , Polymerase Chain Reaction, detection, feces, infant.

## PENDAHULUAN
Bifidobakteria  merupakan  penghuni alami  dari  saluran  pencernaan  manusia  yang telah ada dalam usus sejak bayi (Ventura et al ., 2012).  Golongan  bakteri  ini  memiliki  peran positif  untuk  menunjang  kesehatan  inangnya (Tojo  et  al.,  2014).    Meskipun  demikian, mekanisme  ini  belum  diketahui  secara  jelas. Untuk  itulah  maka  berbagai  studi  tentang genom bakteri ini selalu dilakukan (Motherway et  al .,  2011).  Meski  terdapat perbedaan  prevalensi  dari  masing-masing spesies Bifidobakteria, Bifidobacterium longum subsp. longum tersebar  secara  luas dalam  usus  orang  dewasa,  manula  dan  juga pada bayi yang baru lahir (Turroni et al , 2009;
Gavini et al ., 2001).
Dengan  dirancangnya  primer-primer PCR  yang  spesifik  untuk  berbagai  jenis Bifidobakteria  oleh  Matsuki et  al .  (1999), termasuk untuk B. longum , proses deteksi dan identifikasi  bakteri  ini  sangat  mendukung penelitian-penelitian  ekologi  mikroba,  nutrisi dan klinis (Hernández-Rodríguez et al ., 2018; Oki et al ., 2018). Perancangan primer tersebut berbasis  pada  gen  16S  rRNA  sebagai  target. Deteksi dan identifikasi Bifidobakteria menggunakan primer-primer ini sangat bermanfaat karena B. longum adalah salah satu dari enam spesies yang secara umum sebagai mikroflora usus (Temmerman et al ., 2004).
Mempertimbangkan
bahwa perancangan  primer  ini  sudah  lebih  dari  20 tahun  sejak  dipublikasikan,  maka  penelitian ini  bertujuan  untuk  melakukan  evaluasi sederhana  dari  deteksi  atau  diagnostik  PCR terhadap Bifidobacterium longum dalam feses bayi. Dalam studi ini diuji keakuratan metode yang dirancang primernya oleh Matsuki et al .
(1999)  yang  sudah  banyak  digunakan  dalam penelitian. Spesimen feses diambil dari bayi di Kota  Manado,  Provinsi  Sulawesi  Utara. Akurasi metode diagnostik ini dilihat dengan melakukan  sekuensing  terhadap  hasil  PCR yang dianggap positif.

## METODE PENELITIAN

## Koleksi Sampel dan Isolasi DNA Total
Dua  sampel  feses  diambil  dari  dua bayi  (berusia  30  hari)  di  Kota  Manado menggunakan  spatula  steril  dan  dimasukkan ke  dalam  tabung  Falcon  15  ml.  Sampel  ini segera  dipreservasi  dengan  didinginkan
selama 6 jam dalam lemari  es (4°C) sebelum proses  isolasi  DNA.  Isolasi  DNA  total  dari sampel feses dilakukan menggunakan UltraClean Fecal DNA Isolation Kit (Mo Bio Laboratories, Inc.) sesuai petunjuk manual.

## Polymerase Chain Reaction (PCR) dan Elektroforesis
Proses  PCR  dilakukan  menggunakan MyTaq™  HS  Red  Mix  (Bioline).  Pasangan primer  yang  digunakan  dalam  primer  ini berdasarkan  Matsuki et  al .  (1999)  yaitu BiLON-1 (5’-ttc cag ttg atc gca tgg tc-3’) and BiLON-2  (5’-ggg  aag  ccg  tat  ctc  tac  ga-3’). Reaksi  PCR  sebanyak  50  ul  terdiri  atas komponen  25  ul  2x  MyTaq™  HS  Red  Mix, 1,5  ul  masing-masing  primer  (10  uM),  20  ul Milli-Q  water  steril,  dan  2  ul  DNA  total sampel.
Pengaturan panas mesin PCR menggunakan  suhu  penempelan  primer  yang sama  dengan  Matsuki et  al .  (1999),  dengan perubahan  sesuai  rekomendasi  manual  kit PCR  yang  digunakan.  Pemanasan  dimulai dengan  denaturasi  awal  95°C  (3  menit)  dan dilanjutkan dengan 35 siklus denaturasi 95°C (15 detik), perlekatan primer 55°C (20 detik) dan  pemanjangan  DNA  72°C  (20  detik). Untuk  pemanjangan  akhir  digunakan  suhu 72°C (1 menit).
Hasil  PCR  diseparasi  menggunakan electroforesis gel agarosa 1%. Sebanyak 10 ul produk  PCR  sampel  dan  juga  DNA  ladder  1 kb dengan  jumlah  yang  sama  dimasukkan ke dalam  sumur-umur  gel  dan  kemudian  dialiri arus  listrik  100  volt  selama  30  menit.  Gel direndam  dalam  cairan  yang  mengandung etidium bromide selama 10 menit dan diamati keberadaan pita DNA tunggal dengan panjang 831 bp, sesuai Matsuki et al . (1999), dalam gel agarosa.  Pita  DNA  ini  berada  di  antara  pita DNA standar berukuran 750 bp dan 1000 bp.

## Sekuensing DNA
Pita  DNA  hasil  PCR  dilakukan sekuensing  dua  arah.  Sekuensing  dilakukan menggunakan  masing-masing  primer  PCR  di First  Base  C.O.  (Malaysia).  Kromatogram hasil  sekuensing  disunting  menggunakan piranti lunak Geneious 5.6 (Drummond et al ., 2012)  yang  diawali  dengan  menggabungkan hasil sekuensing dari kedua primer menggunakan  algoritma  MUSCLE  (Edgar, 2004).  Penyuntingan  dilanjutkan  dengan
menentukan  area  penempelan  primer  di daerah  5’  dan  3’  sekuens.  Sekuens  DNA  di antara area penempelan primer ini digunakan untuk identifikasi (Kolondam, 2015). Sekuens DNA  yang  sudah  bersih  ini  dibandingkan kesamaanya dengan semua sekuens yang ada dalam Genbank melalui Basic Local Alignment Search Tool (Altschul et al ., 1990) atau  BLAST  yang  tersedia  secara  daring (www.ncbi.nlm.nih.gov).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Elektroforesis Gel Agarosa dari Hasil PCR
Deteksi keberadaan bakteri B. longum dari  sampel  feses  menunjukkan  keduanya memberikan  hasil  deteksi  positif.  Ini  terlihat dari  munculnya  pita  yang  berukuran  antara 750  bp  dan  1000  bp  (Gambar  1)  dari perbandingannya  dengan  DNA  standar  1  kb yang digunakan.
Gambar 1 . Elektroforesis gel agarosa 1% hasil PCR untuk deteksi Bifidobacterium longum Hal  ini  sesuai  dengan  panjang  yang diharapkan dalam Matsuki et al . (1999) yang merancang bahwa hasil PCR yaitu berupa pita DNA  tunggal  berukuran  831  bp  untuk dikategorikan sebagai hasil diagnostik positif. Pita yang dihasilkan berupa pita tunggal yang jelas  dari  dokumentasi  elektroforesis  gel agarosa.

## Evaluasi Panjang Pita DNA Hasil PCR
Konfirmasi  keakuratan  diagnostik PCR  dalam  penelitian  ini  salah  satunya
dilakukan  dengan  melihat  sekuens  pita  DNA yang berhasil diamplifikasi (amplikon) melalui  PCR.  Kedua  sampel  DNA  telah disunting  sekuens  DNAnya  berdasarkan kualitas  kromatogram.  Daerah  penempelan primer  (diberi  label  “ forward  primer  region ” dan “ reverse primer region ”) telah ditentukan lebih  dahulu  untuk  kemudian  ditentukan daerah  di  antara  kedua  primer  tersebut  yang akan  digunakan  untuk  identifikasi  sekuens secara molekuler melalui GenBank.
Berdasarkan sekuens DNA hasil PCR, panjang keseluruhan amplikon kedua spesimen (F1 dan F2) adalah 829 bp (Gambar 2  dan  Gambar  3,  ditunjukkan  oleh  gambar panah  berwarna  merah).  Panjangnya  bukan tepat 831 bp seperti yang dirancang Matsuki et al .  (1999)  yang  menjadi  acuan  untuk  metode deteksi ini. Pada Gambar 2 dinotasikan untuk amplikon  sampel  F1  bahwa  terdapat  20 nukleotida  di  awal  sebagai  primer  maju (forward)  yaitu  BiLON-1  dan  juga  20 nukleotida  di  akhir  sebagai  primer  mundur (reverse)  yaitu  BiLON-2.  Hal  yang  sama ditunjukkan  oleh  amplikon  sampel  F2  pada Gambar 3 Perbedaan  panjang  pita  hasil  PCR diagnostik  dinilai  sebagai  sebuah  kewajaran dengan pertimbangan bahwa referensi perancangan  primer  BiLON-1  dan  BiLON-2 dari  Matsuki et  al .  (1999)  ini  menggunakan sekuens  16S  rRNA  dari Escherichia  coli (Neefs et  al .,  1991).  Secara  otomatis  juga penomoran  semua  primer  dalam  artikel  ini mengikuti  satu  acuan  ( E.  coli )  untuk memperkirakan panjang.
Dalam  penelitian  Moreno et  al .
(2002), Ward et al . (1998) dan Yatsunenko et al . (2012) menggambarkan bahwa perbandingan gen 16S rRNA, baik intraspesies maupun interspesies, akan terdapat variasi nukleotida dan variasi panjang dari  specimen-spesimen  yang  ada.  Variasi panjang  nukleotida  ini  tidak  berpengaruh untuk  hasil  diagnostik  karena  perbedaan  dua nukleotida  akan  sulit  dibedakan  dalam elektroforesis gel agarosa.
Gambar 2 . Bagian ujung DNA 5’ dan 3’ dari penjajaran kromatogram Sampel F1
Gambar 3 . Bagian ujung DNA 5’ dan 3’ dari penjajaran kromatogram Sampel F2

## Konfirmasi Sekuens Amplikon
Kedua sampel yang digunakan dalam penelitian  ini  memiliki  sekuens  dengan tingkat  kesamaan  100%  atau  keduanya identik (Gambar 4). Sekuens gen 16S rRNA sepanjang 789 bp dari masing-masing sampel penelitan yang dibandingkan satu sama lain, juga  dibandingkan  dengan  seluruh  sekuens yang  ada  dalam  database  GenBank  NCBI (National Center for Biotechnology
Information).  Ini  digambarkan  dalam  Tabel 1,  semua  spesimen  (hampir  100  spesimen) yang terdaftar dalam GenBank juga memiliki kemiripan  100%  dengan  sampel  penelitian. Cakupan  panjang  DNA  dari  sekuens pembanding ( query coverage ) juga mencapai 100%.  Ini  menandakan  bahwa  tingkat kesamaan  ( maximum  identity )  diperoleh lewat cakupan yang sebanding antara sampel dalam  penelitian  ini  dengan  spesimen pembanding di GenBank.
Gambar 4 . Penjajaran hasil sekuensing spesimen F1 dan F2
Tabel 1 . Identifikasi Sekuens Gen 16S rRNA Sampel Penelitian Hasil Diagnostik menggunakan Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) tanggal 16 Januari 2020
Nama Spesimen Query Coverage Maximum Identity Nomor Aksesi GenBank Sumber Spesimen Referensi Bifidobacterium longum subsp. infantis 100% 100% AP010890.1 Manusia dewasa (Japan) Fukuda et al . (2011) Bifidobacterium longum subsp. longum 100% 100% HM009032.1 Manusia dewasa (France) Messaoudi et al . (2011) Bifidobacterium longum 100% 100% CP043002.1 Manusia dewasa (China) Xiao et al . (2019) Bifidobacterium longum 100% 100% JN004063.1 Carassius gibelio (Czech Republic) Vlková et al . (2012) Bifidobacterium longum 100% 100% KU321257.1 Manusia dewasa (Finland) Priha et al . (2016) Bifidobacterium longum subsp. longum 100% 100% AB733110.1 Bayi (Thailand) Uraipan dan Hongpattarakere (2015) Bifidobacterium longum 100% 100% KY448279.1 Bayi (India) Achi dan Halami (2019) Bifidobacterium longum 100% 100% MN372103.1 Manusia (China) Wei (2019)
Lewat  perbandingan  dengan  BLAST,  dapat dikonfirmasi  bahwa  pita  DNA  (dari  dua sampel)  hasil  deteksi  PCR  adalah  benar hanya  mengamplifikasi  gen  targetnya  yaitu gen  16S  rRNA  dari B.  longum saja.  Di samping banyaknya bakteri yang terkandung dalam DNA total sampel feses, target deteksi yang dilakukan dengan kondisi PCR standar ini dinilai akurat.

## KESIMPULAN
Deteksi  bakteri B . longum melalui metode berbasis PCR berdasarkan Matsuki et al . (2019) mampu mendeteksi adanya bakteri ini  dalam  dua  spesimen  feses  bayi  di  Kota Manado. Panjang DNA nyata hasil diagnostik ini adalah 829 bp, bukan 831 bp seperti yang diperoleh  dari  pengukuran  dengan  acuan DNA E.  coli dalam  publikasi.  Keakuratan metode deteksi ini telah berhasil dikonfirmasi oleh  hasil  BLAST  sebagai  sekuens  gen  16S rRNA  dari B . longum dengan  hasil  identik dengan semua pembandingnya.

## DAFTAR PUSTAKA
Achi,  S.C.  &  P.M.  Halami.  2019.  In  Vitro
Comparative Analysis of Probiotic and Functional  Attributes  of  Indigenous Isolates of Bifidobacteria. Curr.
Microbiol., 76: 304–311.
Altschul,  S.F.,  W.  Gish,  W.  Miller,  E.W. Myers,  &  D.J.  Lipman.  1990.  Basic Local Alignment Search Tool. Journal of  Molecular  Biology, 215(3):  403- 410.
Drummond  A.J.,  B.  Ashton,  S.  Buxton,  M. Cheung,  A.  Cooper  A,  C.  Duran,  M. Field,  J.  Heled,  M.  Kearse,  S. Markowitz, R. Moir, S. Stones-Havas, S.  Sturrock,  T.  Thierer  &  A.  Wilson. 2012. Geneious v5.6. New Zealand.
Edgar,  R.C.  2004.  MUSCLE:  Multiple
Sequence Alignment with High
Accuracy  and  High  Throughput. Nucleic Acids Research, 32(5): 1792– 1797.
Fukuda, S., H. Toh, K. Hase, K. Oshima, Y. Nakanishi,  K.  Yoshimura,  T.  Tobe, J.M. Clarke, D.L. Topping, T. Suzuki, T.D.  Taylor,  K.  Itoh,  J.  Kikuchi,  H. Morita,  M.  Hattori  &  H.  Ohno.  2011. Bifidobacteria can Protect from Enteropathogenic  Infection  through Production  of  Acetate. Nature, 469: 543–547.
Gavini, F., C. Cayuela, J. Antoine, C. Lecoq, B.  Lefebvre,  J.  Membré  &  C.  Neut. 2001.    Differences  in  the  Distribution of  Bifidobacterial  and  Enterobacterial Species in Human Faecal Microflora of Three  Different  (Children,  Adults, Elderly)  Age  Groups. Microbial Ecology in Health and Disease, 13(1): 40-45.
Hernández-Rodríguez,  D.,  A.A.  Vásquez- Aguilar,  J.C.  Serio-Silva,  E.  Rebollar, A.  Azaola-Espinosa.  2018.  Molecular Detection  of  Bifidobacterium  spp.  in Faeces  of  Black  Howler  Monkeys ( Alouatta  pigra ). J.  Med.  Primatol .
48(2): 99-105.
Kolondam, B.J. 2015.  Applying  matK  Gene for  Identification  of  Liliopsida  Plant Species  from  North  Sulawesi  through Bold Systems. International Journal of Applied  Biology  and  Pharmaceutical Technology, 6(2): 242-245.
Matsuki,  T.,  K.  Watanabe,  R.  Tanaka,  M.
Fukuda & H. Oyaizu. 1999. Distribution of Bifidobacterial Species in Human Intestinal Microflora Examined  with  16S  rRNA  Gene- targeted Species-specific primers.
Appl.  Environ.  Microbiol .  65:  4506– 4512.
Messaoudi,  M.,  R.  Lalonde,  N.  Violle,  H. Javelot,  D.  Desor,  A.  Nejdi,  J.F. Bisson,  C.  Rougeot,  M.  Pichelin  &  J. Cazaubiel.  2011.  Assessment  of Psychotropic-like  Properties  of  a Probiotic  Formulation  ( Lactobacillus helveticus R0052 and Bifidobacterium longum R0175)  in  Rats  and  Human
Subjects. British Journal of Nutrition, 105(5): 755-764.
Moreno, C., J. Romero & R.T. Espejo. 2002. Polymorphism in Repeated 16S rRNA Genes is a Common Property of Type Strains  and  Environmental  Isolates  of the  Genus  Vibrio. Microbiology, 148:
1233–1239.
Motherway, M.O.C. A. Zomer, S.C. Leahy, J.
Reunanen, F. Bottacini, M. J.
Claesson,  F.  O'Brien,  K.  Flynn,  P.  G. Casey,  J.A.M.  Munoz,  B.  Kearney, A.M.  Houston,  C.  O'Mahony,  D.G. Higgins, F. Shanahan, A. Palva, W.M. de  Vos,  G.F.  Fitzgerald,  M.  Ventura, P.W.  O'Toole  &  D.  van  Sinderen. 2011. Functional Genome Analysis of
Bifidobacterium breve UCC2003 Reveals  Type  IVb  Tight  Adherence (Tad)  Pili  as  an  Essential  and Conserved  Host-colonization  Factor.
Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA, 108: 11217–11222.
Neefs,  J.-M.,  Y.V.  de  Peer,  P.D.  Rijk,  A. Goris & R.D. Wachter. 1991.
Compilation  of  Small  Ribosomal Subunit RNA Sequence. Nucleic Acids Res ., 19: 1987–2015.
Oki, K., T. Akiyama, K. Matsuda, A. Gawad, H.  Makino,  E.  Ishikawa,  K.  Oishi,  A. Kushiro & Junji Fujimoto. 2018. Long- term  Colonization  Exceeding  Six Years from early Infancy of
Bifidobacterium longum subsp. longum in Human Gut. BMC Biology , 18(1): 209.
Priha,  O.,  M.  Raulio,  J.  Maukonen,  A. Vehviläinen  &  E.  Storgårds.  2016.
Bacterial  Populations  on  Brewery Filling  Hall  Surfaces  as  Revealed  by Next Generation Sequencing. Biofouling, 32(5): 571-581.
Tojo, R., A. Suárez, M.G. Clemente, C.G. de los  Reyes-Gavilán,  A.  Margolles,  M. Gueimonde & P. Ruas-Madiedo. 2014. Intestinal  Microbiota  in  Health  and Disease: Role of Bifidobacteria in Gut Homeostasis. World  J.  Gastroenterol , 20: 15163–15176.
Turroni,  F.,  E.  Foroni,  P.  Pizzetti,  V. Giubellini,  A.  Ribbera,  P.  Merusi,  P.
Cagnasso, B. Bizzarri, G. L. de'Angelis,  F.  Shanahan,  D.  van Sinderen,  &  M.  Ventura.    2009. Exploring  the  Diversity  of  the Bifidobacterial  Population  in  the Human  Intestinal  Tract. Applied  and Environmental  Microbiology, 75(6): 1534-1545.
Temmerman, R., G. Huys & J. Swings. 2004.
Identification of Lactic Acid Bacteria:
Culture-dependent and Culture- independent Methods. Trends in Food Science  &  Technology, 15(7):  348– 359.
Uraipan,  S.  &  T.  Hongpattarakere.  2015.
Antagonistic  Characteristics  Against Food-borne  Pathogenic  Bacteria  of Lactic Acid Bacteria and Bifidobacteria  Isolated  from  Feces  of
Healthy  Thai  Infants. Jundishapur  J. Microbiol . 8(6): e18264.
Ventura, M., F. Turroni, M.O.C. Motherway,
J. MacSharry & D. van Sinderen. 2012. Host-microbe Interactions that Facilitate Gut Colonization by Commensal  Bifidobacteria. Trends Microbiol. 20: 467–476.
Vlková,  E.,  L.  Kalous,  V.  Bunešová,  K. Rylková,  R.  Světlíková  &  V.  Rada. 2012.  Occurrence  of  Bifidobacteria and  Lactobacilli  in  Digestive  Tract  of Some Freshwater Fishes. Biologia, 67: 411-416.
Ward, D.M., M.J. Ferris, S.C. Nold & M.M. Bateson.  1998.  A  Natural  View  of Microbial  Biodiversity  within  Hot Spring Cyanobacterial Mat Communities. Microbiology and
Molecular Biology Reviews, 62: 1353– 1370.
Wei, L. 2019. Bifidobacterium longum strain ZJ1 16S ribosomal RNA gene, partial sequence. https://www.ncbi.nlm.nih . gov/nucleotide/MN372103.1  [diakses 21 Jan 2020].
Xiao,  W.,  F.  Lin,  &  Y.  Hou.  2019.  The
Complete Genome Sequence of Bifidobacterium  longum BAMA-B05. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleoti de/CP043002.1 [diakses 21 Jan 2020].
Yatsunenko,  T.,  F.  Rey,  M.  Manary,  I. Trehan,  M.G.  Dominguez-Bello,  M. Contreras,  M.  Magris,  G.  Hidalgo, R.N.  Baldassano,  A.P.  Anokhin,  A.C. Heath,  B.  Warner,  J.  Reeder,  J. Kuczynski,  J.G.  Caporaso,  C.A. Lozupone,  C.  Lauber,  J.C.  Clemente, D.  Knights,  R.  Knight  &  J.I.  Gordon .
2012 . Human Gut Microbiome Viewed
Across  Age  and  Geography. Nature ,
486: 222–227.