Pengaruh Purifikasi Terhadap Kandungan Zat Aktif  Dan Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol 50% Daun Kelor ( Moringa oleifera L.)
The Effect Of Purification On The Content Of Active Substances And Antioxidant Activity From 50% Ethanol Extract Of Moringa (Moringa oleifera L.) Leaves
Diyan Sakti Purwanto 1 , Hari Susanti 2 , Nining Sugihartini 3 1 Mahasiswa Pasca Sarjan Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Ahmad Dahlan
2 Laboratorium Kimia Analisis Fakultas Farmasi Universitas Ahmad Dahlan 3 Laboratorium Teknologi Farmasi Fakultas Farmasi Universitasmad Dahlan e-mail: diyansaktipurwanto@gmail.com
(tanggal diterima: 02-09-2021 , tanggal disetujui: 04-10-2021)

## INTISARI
Purifikasi  ekstrak  etanol  50%  daun  kelor  (Moringa  oleifera  L.)  dilakukan  untuk meningkatkan kandungan zat aktif flavanoid, β-karoten, saponin dan tanin yang memiliki aktivitas sebagai antioksidan dan dapat meningkatkan kandungan zat aktif serta  memperoleh warna ekstrak yang lebih menarik. Tujuan penelitian ini adalah mengetahui jenis pelarut yang paling optimal antara etil asetat dan n-heksana dalam fraksinasi ekstrak etanol 50% daun kelor.
Purifikasi menggunakan metode fraksinasi dengan  etil asetat dan n-heksana. Ekstrak dan fraksi  dievaluasi  parameter  meliputi  susut  pengeringan  ekstrak  dengan  Halogen  Moustureser, organoleptis,  kadar  β-karoten  dengan  HPLC  (High  Performance  Liquid  Chromatography)  dan aktivitas  antioksidan  dengan  DPPH  (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl).  Dari  data  yang  diperoleh dianalisis statistik one way ANOVA dengan taraf kepercayaam 95%.
Hasil  Penelitian  menunjukkan  bahwa  susut  pengeringan  ekstrak  etanol  50%  daun  kelor adalah 4,16 dengan CV (coefficient of variation) 4,62%. Hasil purifikasi pada kadar β-karoten paling optimal  pada  fraksi  n-heksana  (E3)  kemudian  etil  asetat  (E2)  dan  etanol  50%  (E1)  yaitu  1.48  ± 0.01%, 1.19 ± 005% dan 0.73 ± 0.01%. Sedangkan aktivitas antioksidan (IC50) paling optimal pada fraksi n-heksana (E3) kemudian etanol 50% (E1)  dan etil asetat (E2) yaitu 40.83 ± 0.04 ug/ml, 47.75 ± 0.09 ug/ml dan 58.79 ± 0.10ug/ml. Sehingga hasil purifikasi menunjukkan nilai aktivitas antioksian pada  fraksi  n-heksana  dan  ekstrak  etanol  50%  termasuk  dalam  kategori  sangat  kuat  sedangkan fraksi etil asetat termasuk dalam kategori kuat sehingga berpotensi sebagai antioksidan.
Kata kunci : daun kelor (Moringa oleifera L.); purifikasi; β-karoten; antioksidan

## ABSTRACT
Purification extract ethanol 50% of Moringa dry leaves was carried out to increase the active substance content of flavonoids, β-carotene, saponins and tannins which have antioxidant activity. So that purification extract ethanol 50% of Moringa dry leaves was carried out to increase the active substance content and to obtain a more attractive extract of color. The purpose of this study was to determine  the  optimal  solvent  between  ethyl  acetate  and  n-hexane  in  the  ethanol  extract fractionation of 50% Moringa leaves.
Fractionation was used ethyl acetate and n-hexane. The extract and fraction were evaluated for  the  parameters  including  the  drying  shrinkage  of  the  extract  with  Halogen  Moustureser, organoleptis, levels the β-carotene by HPLC (High Performance Liquid Chromatography)  and the antioxidant  activity  with  DPPH  DPPH  (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl).  Data  were  analyzed statistically one way ANOVA with a confidence level of 95%.
The results of drying shrinkage the ethanol extract of 50% Moringa leaves is 4.16 with a CV (coefficient of variation) of 4.62%. The purification on β-carotene level on fractured with n-hexane
(E3) then ethyl acetate fraction (E2) and ethanol extract 50 % (E1) that is 1.48 ± 0.01%, 1.19 ± 005% and  0.73  ±  0.01%.  While  antioxidant  activity  (IC50)  were  the  most  optimal  in  the  n-hexane fraction(E3) then ethanol extract 50 % (E1) and ethyl acetate fraction (E2) that is 40.83 ± 0.04 ug/ml, 47.75 ± 0.09 ug/ml and 58.79 ± 0.10ug/ml. The purification results ethanol extract of 50% Moringa leaves  and  n-hexane  fraction  were  included  in  the  very  strong  category  while  the  ethyl  acetate fraction was included in the strong category so that it has the potential to be an antioxidant.
Key words: Moringa oleifera L. leaf; purification; β-karoten; antioxidants

## 1. PENDAHULUAN
Purifikasi  ekstrak  etanol  50%  daun  kelor  perlu  dilakukan  untuk meningkatkan  kadar  zat  aktif  dan  nilai  estetika  ekstrak  sehingga  ketika diformulasikan dalam sediaan akan memberikan manfaat dan warna yang menarik. Hal ini berdasarkan penelitian [1] dan [2] yang menunjukkan bahwa konsentrasi ekstrak mempengaruhi sifat fisik sediaan dan diperoleh fakta bahwa warna sediaan masih terlalu pekat sehingga kurang menarik.
Penelitian  sebelumnya  juga  telah  menunjukkan  bahwa  purifikasi  ekstrak mampu  meningkatkan  kadar  dan  aktifitas  zat  aktif.  Penelitian  [3]    menunjukkan bahwa  fraksinasi  ekstrak  petroleum  eter  daun  kelor  dengan  n-heksana  mampu meningkatkan kadar vitamin E. Demikian juga penelitian [4] menunjukkan bahwa fraksinasi  ekstrak  etanol  50%  daun  kelor  dengan  etil  asetat  memberikan  warna ekstrak yang lebih menarik serta memiliki kadar total fenol dan flavonoid yang lebih tinggi dari pada fraksi n-heksana. Tujuan purifikasi tersebut adalah meningkatkan kandungan zat aktif dalam ekstrak yang tersari sehingga aktivitas akan meningkat serta warna ekstrak akan lebih cerah [5].
Beberapa  penelitian  menunjukkan  bahwa  daun  kelor  memiliki  aktivitas antioksidan,  antiaging,  tabir  surya  dan  agen  anti  tirosinase  namun  setiap  hasil menunjukkan  nilai  hambat  yang  berbeda  tergantung  pada  jenis  dan  konsentrasi pelarut  yang  digunakan  .  Salah  satu  faktor  yang  mempengaruhi  jumlah  zat  aktif adalah  tahapan  dan  jenis  pelarut  dalam  penyarian.  Dalam  penelitian  ini  akan dilakukan  metode  penyarian  dengan  menggunakan  etanol  50%  daun  kelor  yang dilanjutkan  purifikasi  dengan  etil  asetat  dan  n-heksana.  Jenis  pelarut  yang digunakan  pada  saat  ekstraksi  mempengaruhi  jumlah  senyawa  aktif  yang terkandung  di  dalam  ekstrak  sesuai  dengan  konsep like  dissolve  like dimana senyawa polar dalam tanaman akan larut dalam pelarut polar, senyawa semipolar akan larut dalam pelarut semipolar dan senyawa non polar akan larut dalam pelarut non  polar.  Etil  asetat  merupakan  pelarut  semipolar  sehingga  dapat  melarutkan senyawa semi polar, sedangakan n-heksana merupakan pelarut non polar sehingga β-karoten dapat lebih banyak tersari pada fraksi n-heksana yang bersifat non polar yang akan berpengaruh pada aktivitas antioksidan [6].
Dari  hasil  penelitian  sebelumnya  diketahui  bahwa  pelarut  etanol konsentrasi  50%  memiliki  aktivitas  paling  baik  sebagai  tabir  surya.  Sehingga berdasarkan  uraian  di  atas,  perlu  dilakukan  penelitian  tentang purifikasi  ekstrak etanol  50%  daun  kelor  dengan  etil  asetat  serta  n-heksana  yang  ditujukan  untuk mengetahui kandungan zat aktif, β-karoten dan aktivitas antioksidan. Hasil uji akan
memberikan informasi pelarut yang optimal dalam fraksinasi ekstrak etanol daun kelor utamanya dalam menyari β-karoten yang mampu mengikat spesies oksigen reaktif (ROS) sebagai antioksidan [7].

## 2. METODE 2.1. ALAT DAN BAHAN
Tanaman yang digunakan adalah daun kelor ( Moringa oleifera L.)  kering yang  diperoleh  dari  daerah  Sleman  sebanyak  1  kg  dipanen  pada  bulan  Februari 2019 serta telah dilakukan determinasi di Laboratorium Biologi Farmasi Unversitas Gadjah Mada Yogyakarta. Sedangkan bahan kimia yang digunakan dalam penelitian adalah  DPPH  ( Aldrich )  p.a,  β-karoten  ( Sigma )  p.a,  KH2PO4  ( Merck )  PA,  NaOH ( Merck ) p.a, Asetonitril, methanol, diklorometana aquades, etanol teknis, etil asetat teknis, n-heksana teknis, aqua pro HPLC.

## 2.2.CARA KERJA Determinasi Tumbuhan Kelor
Determinasi tumbuhan adalah proses dalam menentukan nama atau jenis tumbuhan  secara  spesifik  agar  dapat  tepat  sasaran  dalam  pemanfatannya  [8]. Determinasi kelor dilakukan di Laboratorium Biologi Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.

## Penyiapan Ekstrak Daun Kelor
Penyarian serbuk daun kelor dengan metode maserasi pada perbandingan 1:40.  Serbuk  sampel  yang  telah  ditimbang  direndam  dalam  pelarut  etanol  50% selama  72  jam  pada  suhu  kamar  dengan  pengadukan  setiap  24  jam.  Setelah  itu difiltrasi  dengan  kertas  saring  dan  pompa  vakum.  Ekstrak  yang  diperoleh dipekatkan  menggunakan  evaporator  kemudian  dikentalkan  menggunakan waterbath  pada  suhu 50 0 C  selama  48  jam.  Ekstrak  kering kemudian  diambil  dan ditempatkan dalam kemasan botol dan disimpan dalam freezer sebelum digunakan sebagai bahan analisis [9].
Purifikasi ekstrak
Ekstrak  etanol  50%  daun  kelor  yang  diperoleh  kemudian  difraksinasi dengan  menggunakan  etil  asetat  dan  n-heksana.  Ekstrak  etanol  50%  kering dilarutkan dalam aquades pada suhu 70 o C kemudian dimasukkan ke dalam corong pisah dan ditambah dengan etil asetat atau n-heksana [10].  Berdasarkan aktivitas tersebut maka akan diperoleh 3 jenis ekstrak yaitu ekstrak etanol 50% (E1), ekstrak etanol  50%  (E1)  terpurifikasi  etil  asetat  (E2)  dan  ekstrak  etanol  50%  (E1) terpurifikasi  n-heksana(E3).  Masing-masing  ekstrak  akan  ditetapkan  kadar  air, kadar β-karoten dan aktivitas antioksidan.

## Susut Pengeringan Ekstrak
Penentuan  susut  pengeringan  ekstrak  etanol  50%  alat  Halogen Moustureser  [11].  Satu  gram  ekstrak  kental  etanol  50%  daun  kelor    ditimbang dalam  wadah  alumuniumfoil  yang  telah  ditara  kemudian  dikeringkan  pada  suhu 105ºC  dalam  waktu  15  menit  hingga  konstan  dan  ditimbang  serta  dilihat  susut pengeringan  ekstraknya.  Dilakukan  pencatatan  nilai  susut  pengeringan  ekstrak
yang  ditunjukkan  oleh  Halogen  Moustureser.  Pengukuran  susut  pengeringan ekstrak dilakukan tiga kali replikasi.

## Uji Organoleptis
Uji  organoleptik  merupakan  pengenalan  awal  yang  sederhana  seobjektif mungkin.  Uji  organoleptik  dilakukan  dengan  pengamatan  terhadap  bentuk,  rasa, warna dan bau.

## Penetapan β-karoten
Penetapan  kadar  β-karoten dilakukan  dengan High  Performance Liquid  Chromatography (HPLC).  Sebelum  penetapan  kadar β-karoten  dilakukan validasi  metode  analisis  dengan  parameter  yang  digunakan  meliputi  linieritas, presisi, akurasi, LOD & LOQ. Linieritas dengan cara membuat seri larutan baku β- karoten pada konsentrasi 1, 2, 3, 4, 5 dan 6 µg/ml sehingga dihasilkan luas area yang dicatat  dan  dibuat  persamaan  linier  hubungan  antara  kadar  dan  luas  area  yang dihasilkan.  Presisi  dengan  cara  membuat  larutan  standar  β-karoten  dengan    3 variasi  konsentrasi  yaitu  2,  4  dan  6  µg/ml  dengan  masing-masing  3  replikasi kemudian  data  waktu  retensi  dan  luas  area  dicatat  dan  dihitung  rata-rata, simpangan baku (SD) dan simpangan baku relatif (RSD). Akurasi dilakukan dengan adisi  antara  standar  β-karoten  dan  sampel  kemudian  campuran  dianalisis  dan hasilnya dibandingkan terhadap kadar analit yang ditambahkan (kadar sebenarnya) dengan  konsentrasi  yang  digunakan  adalah  80%,  100%  dan  120%  dari  kadar ekstrak yang didapat. LOD & LOQ diperoleh dengan cara menyuntikkan standar β- karoten pada konsentrasi 0,2 – 1 ppm hingga diperoleh persamaan kurva baku  LOD & LOQ.
Penetapan kadar β-karoten menggunakan fase gerak Asetonitril : metanol : diklorometana (37 : 10 : 53 v/v/v) untuk pemisahan karotenoid. Sampel E1, E2, dan E3 sebanyak 40 µl disuntikkan kedalam sistem HPLC dengan kecepatan 1 ml/menit dan  dibaca  pada  panjang  gelombang  450  nm.  Identitas  puncak  dan  nilai  λ  max senyawa  ini  dibandingkan  dengan  waktu  retensi  dan  karakteristik  spektra kromatogram standard [12].

## Aktivitas Antioksidan
Aktivitas antioksidan ditentukan dengan aktivitas penangkal radikal bebas DPPH [13]. Kemampuan ekstrak dalam menangkap radikal bebas DPPH dilihat dari berkurangnya  intensitas  warna  ungu  dari  larutan  DPPH  setelah  ditambahkan sampel.  Pengujian  dilakukan  dengan  metode  DPPH  dengan  beberapa  seri konsentrasi yaitu 10, 25, 50,75 dan 100 ppm. E1, E2, dan E3 diberi sebanyak 1 ml sampel ditambahkan dalam 1 ml DPPH 0,15 mM kemudian divorteks lalu disimpan dalam ruang tertutup (diinkubasi) pada suhu 37°C selama rentang waktu 20 – 60 menit  dan  divorteks  kembali,  selanjutnya  diukur  absorbansinya  pada  panjang gelombang maksimum. Hasil pengukuran yang baik, larutan memberikan serapan sebesar  0,2  –  0,8  di  daerah  ultraviolet  atau  cahaya  tampak.  Aktivitasnya dibandingkan dengan β-karoten sebagai standar. Persentase penghambatan radikal bebas dapat dihitung menggunakan rumus:
% 𝒑𝒆𝒏𝒈𝒉𝒂𝒎𝒃𝒂𝒕𝒂𝒏 = 𝑨𝒃𝒔 𝒌𝒐𝒏𝒕𝒓𝒐𝒍 𝒏𝒆𝒈𝒂𝒕𝒊𝒇−𝑨𝒃𝒔 𝑺𝒂𝒎𝒑𝒆𝒍 𝑨𝒃𝒔 𝒌𝒐𝒏𝒕𝒓𝒐𝒍 𝒏𝒆𝒈𝒂𝒕𝒊𝒇 𝒙 100%
Nilai  IC 50 dihitung  menggunakan  persamaan  regresi  linier,  konsentrasi sampel sebagai sumbu x dan persen penghambatan (% inhibisi) sebagai sumbu y. Dari persamaan y=a+bx dapat dihitung nilai IC 50 . IC 50 β-karoten dan sampel ekstrak daun kelor masing - masing dihitung nilai standar deviasi (SD) dan koefisien variasi (CV).
Analisis Data
Pada penelitian ini data nilai β-karoten dan nilai IC 50 dibandingkan dengan analisis statistik menggunakan One Way ANOVA untuk melihat ada atau tidaknya perbedaan bermakna secara signifikan dengan taraf kepercayaan 95%.

## 3. HASIL DAN PEMBAHASAN Determinasi Tumbuhan kelor
Determinasi  tumbuhan  kelor  ( Moringa  oleifera L.)  adalah  proses  dalam menentukan  nama  atau  jenis  tumbuhan  secara  spesifik  agar  dapat  tepat  sasaran dalam  pemanfatannya.    Determinasi  kelor  dilakukan  di  Laboratorium  Biologi Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta yang terdapat dalam surat keterangan hasil  determinasi  nomor  17.14.09/UN1/FFA/BF/PT/2020  tertanggal  14 September 2020. Hasil determinasi tumbuhan menunjukkan bahwa tumbuhan yang digunakan  dalam  penelitian  adalah  spesies  kelor Moringa  oleifera L.  suku Moringaceace .

## Susut Pengeringan Ekstrak
Pengukuran  susut  pengeringan  ekstrak  etanol  50%  daun  kelor  dengan menggunakan alat Halogen Moustureser. Penetapan susut pengeringan merupakan salah  satu persyaratan  yang  harus  dipenuhi  dalam standardisasi  tumbuhan  yang berkhasiat  obat  dengan  tujuan  dapat  memberikan  batas  maksimal  (rentang) tentang besarnya senyawa yang hilang pada proses pengeringan [14]. Pada uji susut pengeringan  ini  dilakukan  pengukuran  sisa  zat  setelah  pengeringan  pada  suhu 105°C  dimana  air  akan  menguap  dan  senyawa  yang  mempunyai  titik  didih  yang lebih  rendah  dari  air  akan  ikut  menguap  (Depkes  RI  2000).  Rerata  susut pengeringan ekstrak etanol 50% daun kelor adalah 4,16% dengan CV 4,62%. Untuk parameter  susut  pengeringan  tidak  ada  syarat  atau  rentang  nilai  yang diperbolehkan tetapi pengukuran susut pengeringan ekstrak etanol 50% daun kelor perlu diketahui karena sebagai bahan utama sebelum dilakukan purifikasi dengan etil  asetat  dan  n-heksana  agar  dapat  memberikan  kualitas  dan  stabilitas  suatu ekstrak.

## Uji organoleptik
Uji  organoleptik  merupakan  pengenalan  awal  yang  sederhana  seobjektif mungkin  dengan  pancaindra.  Hasil  organoleptik  pada  ekstrak  etanol  50%  (E1), Fraksi etil asetat (E2) dan fraksi n- heksana (E3) yang disajikan pada tabel 1dapat diketahui  bahwa  dengan  melakukan  fraksinasi  akan  mempengaruhi  sifat organoleptis dari ekstrak daun kelor.  Pada fraksi etil asetat dan fraksi n-heksana terlihat warna yang hijau kuning cerah sehingga akan lebih di sukai di dunia indstri. Dengan  organoleptis  dapat  di  gunakan  sebagai  evaluasi  penggunaan  bahan, formulasi dan penggunaan peralatan baru.
Tabel 1. Organoleptis Ekstrak Etanol 50% Daun Kelor yang Terpurifikasi Uji Ekstrak Etanol 50% (E1) Fraksi Etil Asetat (E2) Fraksi N-Heksana (E3) Bentuk Ekstrak kental Ekstrak kental Ekstrak Kental Warna Kuning kecoklatan Hijau Kekuningan cerah Kuning  ke  arah  putih jernih Bau Khas Khas Khas Rasa Pahit Pahit Pahit Gambar
Penetapan β-karoten
Penetapan  kadar  β-karoten  pada  ekstrak  etanol  50%  daun  kelor menggunakan  HPLC  [15]pada  kondisi  seperti  yang  disajikan  pada  Tabel  2.  HPLC lebih  efektif  apabila  dibandingkan  dengan  spektrofotometer  karena  memiliki sensitivitas  dan  akurasi  yang  tinggi  serta  analisis  dapat  langsung  dimonitor komputer  dan  rekorder.  HPLC  didasarkan  waktu  retensinya  dalam  suatu  pelarut [16].

## Tabel 2. Kondisi operasi analisis β-karoten dengan HPLC
Kriteria Kondisi HPLC yang digunakan shimadzu prominence LC-2030 Fase gerak Asetonitril : Metanol : Diklorometana (37 : 10 : 53 v/v/v) Fase diam kolom Shimadzu C-18 dengan panjang 25 cm Detector UV-Visible λmaks 450nm Flow rate 1 ml/menit pada suhu normal
Validasi  metode  analisis  bertujuan  untuk  membuktikan  bahwa  metode penetapan  kadar  yang  digunakan  dapat  memberikan  hasil  yang  tepat  dan  teliti. Parameter yang digunakan meliputi uji kesesuaian sistem, presisi, akurasi, LOD & LOQ  dan  linieritas    [17].  Metode  analisis  tersebut  telah  memenuhi  persyaratan sehingga  dapat  digunakan  untuk  penetapan  kadar  β-karoten.  Validasi  metode analisis disajikan pada Tabel 3 dengan hasil sebagai berikut.
Tabel 3. Hasil validasi metode analisa β-karoten
Parameter Hasil Uji Presisi Kadar β-karoten (ppm) 2,136; 4,272 dan 6,408 adalah 1,92; 4,36 dan 6,26 dengan CV (%)0,83; 0,38 dan 0,12 Akurasi 97,59%, 99,27% dan101,95% pada kadar 12,4 ug, 15,5 ug dan 18,6 ug Batas Deteksi (LoD) 0,16 ppm Batas Kuantifikasi (LoQ) 0,54 ppm Linearitas (R2 ) 0,9933
Presisi adalah kemampuan metode analisis yang menghasilkan pengukuran tetap pada setiap waktu dari sampel yang sama. Dari tabel 3 diketahui bahwa nilai CV  <  2%  sehingga  memenuhi  pesyaratan  presisi  dimana  nilai  CV  yang diperbolehkan  berdasarkan  100%  analit  adalah    ≤  2%.  Akurasi  diekspresikan dengan nilai perolehan kembali yang umum untuk senyawa obat mayor dalam suatu campuran  adalah  kurang  lebih  98-102%  dan  telah  sesuai  syarat  persentase perolehan kembali (recovery) yang sesuai dengan level konsentrasi. Batas deteksi (LOD) adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan  respon  signifikan  dibandingkan  dengan  blangko.  Batas  kuantitasi (LOQ) merupakan parameter pada analisis reknik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil  analit  dalam  sampel  yang  masih  dapat  memenuhi  kriteria  akurasi  dan presisi, dari tabel II diketahui bahwa dalam penentuan kadar β-karoten harus diatas LOD  yaitu  0,16  dan  di  atas  LOQ  yaitu  0,54.  Linieritas  menunjukkan  hubungan matematik antara konsentrasi analit dalam sampel pada rentang tertentu dengan luas  area  puncak  dan  dari  hasil  uji  menunjukkan  persamaan  kurva  baku  linier karena memiliki nilai r 0,9933 dimana nilai r lebih besar dari r tabel yaitu 0,959 sehingga dapat digunakan dalam meghitung kadar β-karoten dengan HPLC.
Kadar  β-karoten  diperoleh  dengan  cara  menyuntikkan  sampel  ekstrak etanol  50%,  fraksi  etil  asetat  dan  fraksi  n-heksana  dengan  melarutkan  pada  fese gerak. Luas area yang diperoleh dibuat persmaan regresi  kurva baku standar  β- karoten sehingga diperoleh kadar β-karoten yang disajikan pada tabel 4.
Tabel 4. Hasil kadar β-karoten ekstrak Etanol 50% daun kelor
Sampel Kadar β-karoten (µg/ml) ± SD CV (%) Ekstrak Etanol 50% 0,73 ± 0,01* 1,30 Fraksi Etil Asetat 1,19 ± 0,05* 4,24 Fraksi N-Heksana 1,48 ± 0,01* 0,64
Diketahui  bahwa  fraksi  n-heksana  (E3)  memiliki  kadar  β-karoten  paling tinggi 1,48 ± 0,01, kemudian  fraksi etil asetat (E2)  sebesar 1,19 ± 0,05 dan ekstrak etanol 50% (E1) sebesar 0,73 ± 0,01. Hal ini disebabkan oleh senyawa β-karoten yang bersifat non polar akan sangat larut baik dalam pelarut non polar[18] yaitu fraksi n-heksana sehingga kadar β-karotennya lebih banyak tertarik pada pelarut fraksi n-heksana. Hal ini berkaitan dengan teori like dissolve like, yaitu pelarut polar akan melarutkan solut yang polar dan pelarut non polar akan melarutkan solut non polar  [19].  Pada  penelitian  yang  lain  disampaikan  bahwa  kadar  β-karoten  pada setiap ekstrak etanol 50%, 70%, 96% memiliki β-karoten 0,24 ± 0,01; 0,40 ± 0,00; 5,33 ± 0,15; µg/ml[20]. Ada perbedaan kadar dimungkinkan karena adanya proses dalam  pengukuran  kadar.  β-karoten    adalah  salah  satu  senyawa  yang  berfungsi sebagai  antioksidan  karena  β-karoten  memiliki  kemampuan  dalam  meredam radikal bebas terutama radikal singlet oksigen[21]. β-karoten memiliki sifat larut dalam  minyak,  kloroform,  benzena,  karbon  disulfida,  aseton  dan  petroleum  eter tetapi  tidak  larut  dalam  air,  etanol  dan  metanol  [22].  Rumus  struktur  kimia  β- karoten disajikan pada gambar 1.
Gambar 1. Struktur kimia β-karoten [23]
Hasil  analisis  statistik  pada  post  hoc  test  menunjukkan  bahwa  fraksi  n- heksana memiliki perbedaan yang signifikan dengan fraksi etil asetat dan ekstrak etanol 50%. Dengan demikian proses purifikasi efektif dalam proses pemurnian dan penetapan kadar β-karoten.

## Antioksidan
Pengujian aktivitas penangkapan radikal bebas DPPH bertujuan mengukur kemampuan suatu senyawa sampel dalam menangkap radikal bebas DPPH. Prinsip metode DPPH berdasarkan penangkapan hidrogen dari senyawa antioksidan oleh DPPH menjadi DPP hidrazin (non radikal) dengan berubahnya warna ungu menjadi warna  kuning.  Perubahan  warna  tersebut  yang  kemudian  diukur  absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV-Vis yang disajikan pada gambar 2.
Gambar 2. Reaksi Antioksidan dengan DPPH [24]. Persen  penangkapan  radikal  bebas  digunakan  untuk  membandingkan aktivitas  penangkapan  radikal  bebas  DPPH  β-karoten  dengan  sampel  sedangkan IC 50 merupakan  konsentrasi  efektif  senyawa  uji  yang  menghasilkan  aktivitas penangkapan  radikal  bebas  DPPH  sebesar  50%.  Berdasarkan  hasil  pengukuran didapatkan bahwa panjang gelombang maksimum DPPH pada panjang gelombang 517 nm. Data serapan maksimum DPPH digunakan sebagai serapan kontrol negatif. Nilai IC 50 Antioksidan disajikan pada tabel 5.
Tabel 5. Nilai IC 50 Antioksidan Ekstrak Etanol 50%  Daun Kelor
Sampel Nilai IC 50 (µg/ml) ± SD CV (%) Penggolongan Standar β-karoten 84,90 ± 0,358* 0,421 Kuat Ekstrak Etanol 50% 47,75 ± 0,09* 0,18 Sangat kuat Fraksi Etil Asetat 58,79 ± 0,10* 0,18 kuat Fraksi N Heksana 40,83 ± 0,04* 0,11 Sangat kuat
Suatu senyawa dinilai sebagai antioksidan sangat kuat jika nilai IC 50 kurang dari 50, kuat (50-100), sedang (100- 150) dan lemah (151-200). Semakin kecil nilai
IC 50 semakin  tinggi  aktivitas  antioksidan.  Dari  tabel  5  diketahui  bahwa  nilai  IC 50 fraksi  n-heksana  (E3)  dan  ekstrak  etanol  50%  (E1)  secara  berturut-turut  adalah 40,83  ± 0,04µg/ml; 47,75 ± 0,09µg/ml  dan termasuk  dalam kategori sangat kuat sedangkan fraksi etil asetat (E2) adalah 58,79 ± 0,10 µg/ml  dan termasuk dalam kategori  kuat  sehingga  berpotensi  sebagai  antioksidan.  Salah  satu  senyawa  yang berpotensi  sebagai  antioksidan  adalah  β-karoten.  Kemampuan  larutan  ekstrak dalam menangkap radikal bebas DPPH dilihat dari berkurangnya intensitas warna ungu  dari  larutan  DPPH  setelah  ditambahkan  sampel.  Pengurangan  intensitas warna tersebut disebabkan oleh bereaksinya molekul radikal DPPH (1,1 difenil-2- pikrilhidrazil) dengan satu atom hidrogen yang dilepaskan oleh sampel, sehingga terbentuk senyawa DPPH tereduksi yaitu 1,1 difenil-2-pikrilhidrazil yang berwarna kuning stabil [25]. Perbedaan aktivitas antioksidan secara teoritis dipengaruhi oleh kadar β-karoten yang memiliki kontribusi terhadap aktivitas antioksidan sehingga semakin tinggi kadarnya semakin baik pula aktivitas antioksidannya [26]. Aktivitas antioksidan juga dapat dipengaruhi oleh adanya senyawa fitokimia yang lain seperti asam  askorbat,  tokoferol  dan  pigmen  seperti  β-karoten  yang  memberikan  efek sinergis[27].
Nilai  IC 50 dihasilkan  dari  persamaan  regresi  linear  hubungan  antara konsentrasi  ekstrak  uji  dengan  persen  penangkapan  radikal  bebas[28].  Terdapat hubungan korelasi antara aktivitas antioksidan dengan kadar β-karoten. Korelasi antara kadar β-karoten dengan antioksidan pada masing-masing ekstrak diketahui bahwa nilai IC 50 fraksi n-heksana (E3)  yaitu 40,83 ± 0,04µg/ml dipengaruhi oleh kadar  β-karoten  fraksi  n-heksana  (E3)  yaitu  1,48±0,01  %.  Hal  ini  dikarenaka  β- karoten memberikan efek sinergis terhadap nilai IC 50 .  Dimana semakin tinggi nilai β-karoten pada fraksi n-heksana dapat lebih menurunkan nilai IC 50. Hasil  analisis  statistik  pada post  hoc  test menunjukkan  bahwa  fraksi  n- heksana memiliki perbedaan yang signifikan dengan ekstrak etanol 50% dan etil asetat.  Dengan  demikian  polaritas  dari  pelarut  n-heksana  berpengaruh  terhadap penetapan aktivitas antioksidan.

## 4. KESIMPULAN
Berdasarkan hasil uji yang telah dilakukan pada ekstrak etanol 50% daun kelor (E1), purifikasi dengan etil asetat (E2) dan purifikasi dengan n-heksana (E3) maka dapat diambil kesimpulan bahwa Purifikasi ekstrak etanol 50% daun kelor dengan n-heksana (E3) lebih dapat melarutkan β-karoten daripada etil asetat (E2) dan  ekstrak  etanol  50%  (E1)  secara  signifikan  serta  menurunkan  nilai  IC 50 antioksidan.

## 5. UCAPAN TERIMAKASIH
Ucapan terima kasih kepada Fakultas Farmasi Ahmad Dahlan Yogyakarta atas dukungan dan bantuan dalam pelaksanaan penelitian serta publikasi.

## 6. DAFTAR PUSTAKA
[1] A. G. Latif, Auliah Rahmi, Nining Sugihartini. 2020. Physical Properties Of A/M Type Cream With Concentration Variation Of Moringa Leaves Ethanol Extract ( Moringa  oliefera )  Using  Tween  80  And  Span  80  Emulgators.  Jurnal Media Farmasi. vol. XVI, no. 1, pp. 9–17. doi: DOI:
https://doi.org/10.32382/mf.v16i1.1408.
[2] R. Rikadyanti, N. Sugihartini, and S. Yuliani. 2020. Sifat Fisik Krim Tipe M/A Ekstrak Etanol Daun Kelor [ Moringa oleifera L.] dengan Variasi Konsentrasi Menggunakan  Emulgator  Asam  Stearat  dan  Trietanolamin.  Jurnal Media Farasi. vol. 16, no. 1, p. 88.  doi: 10.32382/mf.v16i1.1423.
[3] T. Wuryandari, N. Sugihartini, and K. Kintoko. 2019. Emulgel Formulation of Purified Extract of Moringa ( Moringa oleifera L.) Leaf. Folia Medica Indonesia. vol. 55, no. 1, p. 17. doi: 10.20473/fmi.v55i1.12545.
[4] B. Herdi, Sugihartini N., Susanti H. 2020. Pengaruh purifikasi terhadap Profil Organoleptis, Rendemen, Total Fenol dan Total Flavonoid dari Ekstrak Etanol 96 % daun kelor ( Moringa oleifera L.). Purification effect on Organoleptic Profile, Yield, Total Phenol and Total Flavonoids from 96 % E. Jurnal Farmasi Indonesia . vol. 17, no. 2, pp. 1–10. https://doi.org/10.31001/jfi.v17i2.983.
[5] W. S. Putri, N. K. , Warditiani, and L. P. F. , Larasanty. 2012. Skrining Fitokimia Ekstrak  Etil  Asetat  Kulit  Buah  Manggis  ( Garcinia  mangostana L  .). Thesis. Jurusan  Farmasi  Fakultas  Matematika  Dan  Ilmu  Pengetahuan  Alam. Universitas Udayana .
[6] W. B. Leksono, R. Pramesti, G. W. Santosa, and W. A. Setyati. 2018. Jenis Pelarut Metanol  Dan  N-Heksana  Terhadap  Aktivitas  Antioksidan  Ekstrak  Rumput Laut Gelidium sp.  Dari  Pantai  Drini  Gunungkidul  –  Yogyakarta. J.  Kelautan Tropis. , vol. 21, no. 1, p. 9. doi: 10.14710/jkt.v21i1.2236.
[7] A. Aprilia and E. Kurniawati. 2016. Pengaruh Beta Karoten pada Kulit Pisang Kepok  dalam  Mencegah  Infark  Miokard  Akut  The  Influence  Effect  of  Beta Carotene  on  The  Banana  Peel  in  Preventing  Acute  Myocardial  Infarction. MAJORITY , vol. 5, no. 4, pp. 2–6, 2016.
[8] Fika Rofiuddin Izza. 2018. Pengembangan Kunci Determinasi Tumbuhan Hasil Eksplorasi Hutan Wisata Guci Kabupaten Tegal Untuk Sekolah Menengah Atas , vol. 7, no. 2.
[9] P. Husni, A. N. Pratiwi, and A. Baitariza. 2019. Formulasi Krim Ekstrak Etanol Daun Kelor ( Moringa oleifera Lamk). Jurnal Ilmu Farmasi. Farmasyifa . vol. 2, no. 2, pp. 101–110. doi: 10.29313/jiff.v2i2.4796.
[10]  S. Anwar, E. Yulianti, A. Hakim, A. G. Fasya, B. Fauziyah, and R. Muti’ah. 2014. Uji  Toksisitas  Ekstrak  Akuades  (Suhu  Kamar)  Dan  Akuades  Panas  (70 0 C) Daun Kelor ( Moringa oleifera Lamk.) Terhadap Larva Udang Artemia salina Leach. Jurnal Alchemy . vol. 3, pp. 84–92.  doi: 10.18860/al.v0i0.2900.
[11]  N. Safitri. 2013. Penentuan Kadar Air Pada Jamu Serbuk Di Surakarta Secara Metode Gravimetri. Skripsi. Fakultas Ilmu Kesehatan. Universitas Setia Budi.
[12]  A. Siswanto, A. Fudholi, A. K. Nugroho, and S. Martono. 2016. Validasi Metode HPLC  Untuk  Penetapan  Aspirin  Dan  Asam  Salisilat  Dalam  Plasma  Kelinci  (
Lepus curpaeums ) secara Simultan Validation of A High Performance Liquid Chromatography Method for The Simultaneous Determination of Aspirin and Salisylic Acid In Rabb. Jurnal Kefarmasian Indonesia. vol. 6, pp. 68–78. doi: p- ISSN: 2085-675X.
[13]  N. Rahman, P. Bahriul, and A. Diah. 2014. Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun  Salam  ( Syzygium  Polyanthum )  Dengan  Menggunanakan  1,1-Difenil-2- Pikrilhidrazil. J.  Akad.  Kim. ,  vol.  3,  no.  3,  pp.  143–149. https://dx.doi.org/10.22487/j24775185.2017.v6.i2.9238
[14]  Y.  P.  Utami,  A.  H.  Umar,  R.  Syahruni,  and  I.  Kadullah.  2017.  Standardisasi Simplisia dan Ekstrak Etanol Daun Leilem ( Clerodendrum minahassae Teisjm. & Binn.). J. Pharm. Med. Sci. , vol. 2, no. 1, pp. 32–39.
[15]  S. Mangunsong, R. Assiddiqy, E. P. Sari, P. N. Marpaung, and R. A. Sari. 2019. Penentuan  Beta  Karoten  Dalam  Buah  Wortel  ( Daucus  carota )  Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ( U-HPLC)(Determine of β-Caroten in carrot ( Daucus  carota )  using  Ultra  High  Performance  Liquid  Chromatograph  (U-
HPLC)). Jurnal AcTion: Aceh Nutrition Journal,
( 4)1: 36-4. http://dx.doi.org/10.30867/action.v4i1.151.
[16]  C. M. Erawati. 2006. Kendali Stabilitas Beta Karoten Selama Proses Produksi Tepung Ubi Jalar ( Ipomoea batatas L.). Tesis . Sekolah Pasca Sarjana Institut Pertanian Bogor.
[17]  B. Nugraheni and B. Anggoro. 2017. Validasi Metode Analisis dan Penurunan Kadar Infus Ciprofloksasin yang Dipengaruhi Reaksi Oksidasi Menggunakan HPLC,” J. Ilm.
Manuntung , vol. 2, no. 2, pp. 218–223. http://jurnal.akfarsam.ac.id/index.php/jim_akfarsam/article/view/69/67.
[18]  A. Purwanti, M. Egenia, and N. Alviyati. 2019. Optimasi Ekstraksi β-Karoten Ubi  Jalar  Kuning  ( Ipomoea  Batatas .L)  sebagai  Sumber  Potensial  Pigmen Alami,” Pros. Nas. Rekayasa Teknol. Ind. dan Inf. XIV , pp. 414–419
[19]  Yulianti,  A.  Laga,  and  M.  Meta.  2012.  Ekstraksi  Beta  Karoten  Dari  Wortel Dengan Pelarut Heksana Dan Petroleum Eter (Extraction of Beta Carotenes from Carrots with Hexane and Petroleum Ether Solvent),” J. Ilmu. Bertani , vol. 66, pp. 37–39. https://doi.org/10.18343/jipi.26.2
[20]  N. Sugihartini, D. E. Mugita Sari, M. S. Bachri, and S. Yuliani. 2019. The Amount of βCarotene, Total Phenolic and Total Flavonoid of Ethanol Extract of Leaf Moringa oleifera with Variation Concentration of Solvent,” Adv. Heal. Sci. Res. , vol.  18,  no.  ADICS-PHS  2019,  pp.  110–114,  doi:  10.2991/adics-phs- 19.2019.22.
[21]  I.  Oka  Adi  Parwata,  K. Ratnayani,  and  A.  Listya.  2010.  Aktivitas  Antiradikal Bebas  Serta  Kadar  Beta  Karoten  Pada  Madu Randu  (Ceiba  Pentandra)  Dan Madu Kelengkeng ( Nephelium longata L.),” J. Chem. , vol. 4, no. 1, pp. 54–62.
[22]  Nurhasanah Idris. 2011. Penentuan Aktivitas Antioksidan Dari Buah Melon ( Cucumis Melo Linn .) Secara Spektrofotometri Uv-Vis. Skripsi. Jurusan Farmasi Fakultas Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri Alauddin Makassar.
[23]  T.  Octaviani,  A.  Guntarti,  and  H.  Susanti.  2014.  Penetapan  Kadar ß-Karoten Pada  Beberapa  Jenis  Cabe  ( Genus  Capsicum )  Dengan  Metode
Spektrofotometri Tampak. Jurnal Pharmaciana , vol. 4, no. 2, pp. 101–109, doi: 10.12928/pharmaciana.v4i2.1566.
[24]  D. P. D. Jackie Kang Sing Lung. 2018. Uji Aktivitas Antioksidan Vitamin A, C, E dengan Metode DPPH. Jurnal Farmaka , vol. 15, no. 1, pp. 53–62.
[25]  A.  K.  Hari  Susanti,  T.  Wuryandari,  N.  Sugihartini,  and  K.  Kintoko.  2019. Emulgel Formulation of Purified Extract of Moringa ( Moringa oleifera L.) Leaf. Folia Medica Indonesia. vol. 55, no. 1, p. 17. doi: 10.20473/fmi.v55i1.12545.
[26]  Klaokwan Srisook. 2012. Antioxidant and anti-inflammatory activities of hot water extract from Pluchea indica Less. herbal tea,” J. Med. Plants Res. , vol. 6, no. 23, pp. 4077–4081. doi: 10.5897/jmpr12.773.
[27]   Reslely Harjanti and Anita Nilawati. 2020. Aktivitas Antioksidan dan Potensi Tabir  Surya  Serum  Ekstrak  Terpurifikasi  Daun  Wangon  ( Olax  psittacorum (Willd.)  Vahl.). Jurnal  Farmasi  Indonesia .,  Vol.  17  No.  1.  DOI  : https://doi.org/10.31001/jfi.v17i1.779.
[28]   Vivin Nopiyanti and Reslely Harjanti. 2016. Analisis Stabilitas Senyawa Aktif Antioksidan  Kelopak  Bunga  Rosella  ( Hibiscus  sabdariffa  L .)  Pada Penggunaannya  Sebagai  Bahan  Tambahan  Pangan  Alami. Jurnal  Farmasi Indonesia . Vol. 13 No. 2. DOI: https://doi.org/10.31001/jfi.v13i2.197.