## SKRINING AKTIVITAS SITOTOKSIK EKSTRAK DAN FRAKSI BEBERAPA JENIS SPON LAUT ASAL PULAU MANDEH SUMATERA BARAT
1 Noveri Rahmawati, 2 Dian Handayani, 1 Nofri Mulyanti
1 Sekolah Tinggi Ilmu Farmasi Riau Pekanbaru
2 Fakultas Farmasi Universitas Andalas Padang

## ABSTRAK
Telah  dilakukan  skrining  aktivitas  sitotoksik  dari  beberapa  jenis  spon  laut  yang diperoleh  dari  Pulau  Mandeh  Sumatera  Barat.  Ekstrak  methanol  spon  yang  telah dikeringkan difraksinasi ke dalam fraksi non polar, semi polar dan polar, masing-masing dengan  menggunakan  heksan,  etil  asetat,  dan  butanol.  Uji  aktifitas  sitotoksik  dilakukan dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Hasil Uji sitotoksik terhadap ekstrak methanol  menunjukkan  bahwa  sampel  spon  AN  07  mempunyai  nilai  LC 50 yang  paling tinggi  yaitu  26,1036  µg/ml.  Hasil  uji  sitotoksik  terhadap  fraksi  heksan  dan  etil  asetat menunjukkan  bahwa  sampel  spon  AN  01  mempunyai  nilai  LC 50 1,4585  µg/ml  dan 29,4289 µg/ml sedangkan fraksi butanol menunjukkan bahwa sampel AN 04 mempunyai LC 50 yang paling tinggi yaitu 0,0002 µg/ml.
Kata kunci : Sitotoksik, Spon Laut , Brine Shrimp Lethaliy Test

## PENDAHULUAN
Spon  (porifera)  merupakan  organisme  multiselular  yang  paling  primitif  yang dapat  memproduksi  racun  dan  senyawa  kimia  lain  yang  dapat  digunakan  untuk mempertahankan  dirinya  dari  serangan  predator  (Ferretti et  al ,  2007).  Spon  kaya  akan senyawa  sitotoksik  yang  melebihi  biota  laut  lainnya  maupun  biota  darat.  Dalam  suatu proses  skrining  masal  senyawa  sitotoksik  dari  bahan  alam  oleh  NCI  ( National  Cancer Institute ) Amerika, ternyata >10% dari semua jenis spon yang diobservasi bersifat aktif. Hal  ini  disebabkan  karena  spon  termasuk  pada  hewan  pemakan  dengan  cara  menyaring ( filter feeder ). Dalam penyaringan tersebut, ribuan sampai jutaan mikroba terperangkap. Apabila konsentrasi mikroba sangat besar maka spon akan terkena infeksi dan sakit oleh karena itu spon memproduksi senyawa kimia yang mampu melumpuhkan mikroba yang terperangkap. Mikroba yang resisten terhadap senyawa kimia tersebut akan bertahan dan hidup  bersimbiosis  di  dalam  tubuh  spon.  Senyawa  kimia  yang    merupakan  metabolit sekunder  tersebut  dirancang  untuk  melawan  pertumbuhan  sel  yang  sangat  cepat,  mirip ciri-ciri  pertumbuhan  sel  kanker  (Cetkovic and Lada,  2003).  Selain  itu,  spon  mudah dikoleksi  dan  memiliki  kandungan  metabolit  sekunder  dengan  bioaktivitas  menarik lainnya  seperti  antioksidan  yang  telah  berhasil  diisolasi  dari Callyspongia sp,  antifungi dari Stylissa  flabelliformi s,antibakteri  dari Axinella dan  insektisida  dari Axinella  carteri (Yalcin, 2007).
Penelitian  ini  bertujuan  menguji  aktivitas  sitotoksik  terhadap  ekstrak  dan  fraksi beberapa  jenis  spon  laut  dari  Sumatera  Barat  yang  diharapkan  dapat  bermanfaat  untuk mengobati  penyakit  kanker.  Setiap  ekstrak  dan  fraksi  diuji  aktivitas  sitotoksisitasnya dengan  metoda Brine  Shrimp  Lethality  Test (BSLT)  dengan  menggunakan  larva  udang Artemia salina Leach sebagai hewan percobaan (Fajarningsih et al , 2008).

## Gambar 1. Sembilan Jenis Spon Laut

## METODOLOGI

## Bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan untuk ekstraksi adalah 9 jenis spon laut diambil di Pulau  Mandeh,  aquadest,  metanol,  heksan,  etil  asetat  dan  butanol.  Bahan-bahan  yang digunakan untuk uji aktivitas sitotoksik adalah ekstrak dan fraksi spon laut, air laut, larva Artemia salina Leach, metanol dan dimetilsulfoksida (DMSO).

## Alat Penelitian
Destilasi vakum, rotary evaporator , desikator, penangas air, plat tetes, pipet tetes, tabung  reaksi  dan  rak,  spatel,  timbangan  analitik,  corong,  corong  pisah,  kapas  dan alumunium foil. Alat-alat yang digunakan untuk pengerjaan uji aktivitas sitotoksik adalah wadah pembiakan larva, airasi (pembentuk gelembung udara), lampu, timbangan analitik, pipet mikro, pipet tetes dan vial yang telah dikalibrasi.

## Jalannya Penelitian
1. Ekstraksi spon laut
Sampel  ditimbang  ±  300  gram  kemudian  direndam  dalam  pelarut  metanol  3-5 hari.  Lakukan  hingga  3x  maserasi, hasil  maserasi  kemudian  dipekatkan  menjadi  ekstrak kental  dan  ditimbang.  Ekstrak  kental  yang  diperoleh  masih  mengandung  campuran beberapa senyawa sehingga perlu dilakukan pemisahan dengan cara fraksinasi.

## 2. Pemeriksaan kandungan metabolit sekunder
Pemeriksaan  kandungan  metabolit  sekunder  dilakukan  terhadap  ekstrak  kental metanol dengan cara menambahkan air suling dan kloroform sama banyak (± 5 ml) lalu dikocok  kuat  dan  dibiarkan  sampai  terbentuk  dua  lapisan  yaitu  lapisan  air  dan  lapisan kloroform  kemudian  pisahkan.  Lapisan  air  digunakan  untuk  uji  senyawa  fenolik  dan saponin.  Sedangkan  lapisan  kloroform  digunakan  untuk  uji  senyawa  alkaloid,  terpenoid dan steroid.

## 3. Pemeriksaan Saponin
Lapisan air dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian dikocok kuat. Apabila terbentuk busa yang bertahan selama 15 menit berarti positif adanya saponin.

## 4. Pemeriksaan Fenolik
Beberapa  tetes  lapisan air diletakkan  pada  plat  tetes kemudian  ditambahkan  1-2 tetes  larutan  besi  (III)  klorida  1%.  Apabila  terbentuk  warna  biru  berarti  positif  adanya fenolik.

## 5. Pemeriksaan Alkaloid
Beberapa  tetes  lapisan  kloroform  ditambahkan  kloroforn  amoniak  0,05  N dikocok, ambil lapisan kloroform. Tambahkan asam sulfat 2 N, dikocok perlahan. Ambil lapisan  asam  kemudian  tambahkan  pereaksi  Mayer  atau  Dragendorff.  Apabila terbentuk endapan  putih  dengan  pereaksi  Mayer  atau  warna  jingga  dengan  peraksi  Dragendorff berarti positif alkaloid.

## 6. Pemeriksaan Terpenoid dan Steroid
Lapisan  kloroform  disaring  melalui  pipet  yang  berisi  norit  dan  kapas.  Hasil saringan  dipipet  dan  dibiarkan  mengering  pada  plat  tetes.  Setelah  kering  ditambahkan pereaksi Liebermann-Burchard ( 2 tetes asam asetat anhidrat ditambah 1 tetes asam sulfat pekat). Apabila terbentuk warna merah berarti positif adanya terpenoid dan warna hijau- biru berarti positif adanya steroid.
7. Pengujian aktivitas sitotoksik terhadap ekstrak dari spon laut dengan  metoda

## Brine Shrimp Lethality Test
Larva  udang Artemia  salina Leach  ditetaskan  dalam  wadah  pembiakan  yang berisi  air  laut dan  digunakan  setelah  48 jam  setelah pembentukan  larva.  Masing-masing ekstrak  ditimbang  sebanyak  30  mg  kemudian  dilarutkan  dalam  3  ml  metanol  maka didapat  larutan  induk  masing-masing  ekstrak  dengan  konsentrasi  10.000  µg/ml. Pengujian aktivitas dilakukan dengan 3 variasi konsentrasi yaitu 1000, 100 dan 10 µg/ml dengan pengulangan masing-masing tiga kali.
Larutan uji dibuat dengan memipet masing-masing 500, 50 dan 5 µl dari larutan induk. Setelah itu larutan uji dimasukkan ke dalam desikator sampai pelarutnya menguap. Ekstrak  yang  telah  kering  dari  masing-masing  vial  dilarutkan  dengan  50  µl  DMSO kemudian  ditambahkan  air  laut  ±  2  ml.  Masukkan  larva Artemia  salina Leach  pada masing-masing  vial  sebanyak  10  ekor  kemudian  tambahkan  air  laut  hingga  batas kalibrasi.  Kematian  larva  udang  diamati  setelah  24  jam  dan  nilai  LC 50 dapat  dihitung dengan metoda probit.
Untuk kontrol 50 µl DMSO dimasukkan ke dalam vial uji kemudian tambahkan air laut ± 2 ml. Masukkan larva Artemia salina Leach 10 ekor kemudian tambahkan lagi air laut hingga batas kalibrasi. Masing-masing konsentrasi dibuat 3 kali pengulangan.

## 8. Fraksinasi spon laut
Ekstrak  kental  metanol  ditambahkan  aquadest  dan  dihomogenkan  kemudian difraksinasi  dalam  corong  pisah.  Fraksinasi  dilakukan  terhadap  tiga  pelarut  berdasarkan tingkat kepolaran yang berbeda. Pertama difraksinasi dengan pelarut heksan yang bersifat non polar kemudian dikocok dan dibiarkan hingga terbentuk dua lapisan yang terdiri dari fraksi  heksan  dan  fraksi  air.  Fraksinasi  dilakukan  berulang  sampai  ekstrak  terfraksi sempurna.  Hasil  fraksi  diambil  dan  dipekatkan  dengan rotary  evaporator sehingga didapatkan fraksi kental heksan.
Fraksi  air  selanjutnya  difraksinasi  dengan  pelarut  etil  asetat  yang  bersifat  semi polar  kemudian  dikocok  dan  dibiarkan  hingga  terbentuk  dua  lapisan  yang  terdiri  dari fraksi  etil  asetat  dan  fraksi  air.  Hasil  fraksi  diambil  dan  dipekatkan  dengan rotary evaporator sehingga didapat fraksi kental etil asetat.
Fraksi  air  selanjutnya  difraksinasi  dengan  pelarut  butanol  yang  bersifat  polar kemudian  dikocok  dan  dibiarkan  hingga  terbentuk  dua  lapisan  yang  terdiri  dari  lapisan butanol  dan  lapisan  air.  Hasil  fraksi  diambil  dan  dipekatkan  dengan rotary  evaporator sehingga didapat fraksi kental butanol.
9. Pemeriksaan  aktivitas  sitotoksik      terhadap  hasil  fraksinasi  dengan    metoda Brine Shrime Lethality Test
Uji  aktivitas  sitotoksik  hasil  fraksinasi  dilakukan  terhadap  larva Artemia  Salina Leach dengan metoda BSLT. Larutan fraksi dibuat dengan konsentrasi 1000, 100 dan 10 µg/mL.

## HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
Sampel  spon  laut  diambil  di  Pulau  Mandeh  Kecamatan  Koto  XI  Tarusan Kanagarian Ampang Pulau Kabupaten Pesisir Selatan Sumatera Barat pada kedalaman ± 15  m.  Sampel  dibersihkan  dari  kotoran  dan  disiram  dengan  metanol  agar  sampel  tidak busuk  sampai  di  Laboratorium  Biota  Sumatera  (LBS).  Sampel  terlebih  dahulu  dirajang halus.  Penghalusan  sampel  bertujuan  untuk  memperluas  permukaan  sampel  agar  kontak antara pelarut dengan sampel semakin luas sehingga mempermudah penetrasi pelarut ke dalam  membran  sel  dan  proses  penarikan  senyawa-senyawa  yang  terkandung  di  dalam sampel juga semakin optimal.
Kemudian  sampel  diekstraksi  dengan  metode  maserasi  yaitu  penyarian  dengan cara  merendam  sampel  dalam  pelarut  yang  sesuai  selama  waktu  tertentu.  Metoda  ini dipilih karena metode ini merupakan metode yang paling sederhana, pengerjaannya lebih mudah  dibandingkan  dengan  metode  penyarian  lainnya,  tidak  memerlukan  perlakuan khusus dan menghindari terjadinya penguraian zat aktif oleh pemanasan. Proses maserasi dilakukan dengan menggunakan pelarut metanol. Pelarut metanol ini dipilih karena sifat kimianya  yang  menguntungkan,  selain  itu  metanol  bersifat  universal  dimana  dapat melarutkan  senyawa-senyawa  nonpolar  sampai  polar.  Proses  ekstraksi  dilakukan  hingga ekstrak  yang  keluar  tidak  menampakkan  noda  bila  ditotolkan  pada  plat  KLT.  Ekstrak yang  didapat  diuapkan  dengan  alat rotary  evaporator sehingga  didapat  ekstrak  kental metanol (Bogoriani et al , 2007).
Hasil  ekstraksi  dengan  metoda  maserasi  dari  sampel  spon  laut  didapat  berat ekstrak  metanol  AN  01  sebanyak  17,9441  gram  (5,981%),  AN  02  sebanyak  11,4110 (3,804%),  AN  03  sebanyak  9,6750  gram  (3,225%),  AN  04  sebanyak  13,5941  gram (4,651%),  AN  06  sebanyak  8,9312  gram  (2,977%),  AN  07  sebanyak  6,2279  gram (5,662%),  AN  08  sebanyak  14,0255  gram  (4,675%),  AN  09  sebanyak  13,5659  gram (4,522%), AN 10 sebanyak 9,7144 gram (4,626%).
Setelah  didapatkan  ekstrak  kental  metanol  dilakukan  uji  pendahuluan  terhadap kandungan  kimia  dan  uji  aktivitas  sitotoksik.  Dari  hasil  uji  pendahuluan  terhadap kandungan  kimia  diketahui  bahwa  spon  laut  mengandung  alkaloid,  fenolik,  terpenoid, saponin dan steroid yang dapat dilihat pada Tabel I sebagai berikut:
Tabel I. Kandungan Kimia Spon Laut
No Sampel Kandungan Kimia A F T Sp St 1 AN 1 + + + - - 2 AN 2 - - - - + 3 AN 3 - - + - - 4 AN 4 - - + + + 5 AN 6 - - + - - 6 AN 7 + + + - + 7 AN 8 - - + - - 8 AN 9 - + + - - 9 AN 10 - - - - +
Keterangan :  A  = Alkaloid, F  = Flavonoid, T  = Terpenoid, Sp= Saponin, St = Steroid
Uji  aktivitas  sitotoksik  dilakukan  terhadap  larva Artemia  salina Leach  dengan menggunakan metoda Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Masing-masing ekstrak yang akan diuji dibuat dalam  konsentrasi 1000, 100 dan 10 µg/ml. Larutan uji dibuat dengan mengunakan  pelarut  metanol  karena  pelarut  ini  melarutkan  hampir  semua  senyawa  dan mudah  menguap.  Dimana  pelarut  ini  akan  dibiarkan  menguap  sempurna  agar  tidak mengganggu pada pengujian sitotoksik. Sebelum ditambahkan air laut, larutan uji terlebih dahulu  ditambahkan  DMSO  (dimethylsulfoksida)  sebanyak  50  µl.  Penambahan  DMSO ini  bertujuan  untuk  membantu  kelarutan  ekstrak  didalam  air.  Penambahan  DMSO  tidak boleh  lebih  dari  50  µl,  karena  jika  lebih  akan  dapat  menyebabkan  kematian  pada  larva udang.  Pemilihan  DMSO  untuk  membantu  kelarutan  senyawa  dalam  air  laut  ini  karena sifatnya  yang  tidak  terlalu  toksik.  Proses  fraksinasi  dilakukan  dengan  menggunakan pelarut  heksan,  etil  asetat  dan  butanol.  Senyawa-senyawa  nonpolar  akan  larut  dalam pelarut  nonpolar  dan  senyawa-senyawa  polar  akan  larut  dalam  dalam  pelarut  polar. Fraksinasi dilakukan sampai terfraksi sempurna sehingga didapat fraksi heksan, etil asetat dan  butanol.  Tiap-tiap  fraksi  dilakukan  uji  aktivitas  sitotoksik  terhadap  larva Artemia salina Leach dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT).
Hasil  uji  aktivitas  sitotoksik  dari  ekstrak  metanol,  fraksi  heksan,  etil  asetat  dan butanol spon laut AN 01, AN 02, AN 03, AN 04, AN 06, AN 07, AN 08, AN 09 dan AN 10  pada  Tabel  II.  Ekstrak  dikatakan  aktif  sitotoksik  jika  nilai  LC 50 nya  kecil  dari  1000 µg/ml.
Tabel  II.  Nilai LC 50 (µg/ml) dari ekstrak metanol, fraksi heksan, etil asetat dan butanol beberapa jenis spon laut No Sampel Ekstrak metanol Fraksi Heksan Fraksi Etil Asetat Fraksi Butanol 1 AN 01 46,9462 1,4585 29,4239 14,8765 2 AN 02 1281,1500 287,4749 159,1109 160,0663 3 AN 03 453,0019 300,1926 509,2136 647,7389 4 AN 04 58,7219 8,6996 669,2679 0,0002 5 AN 06 98627,9486 133,1680 149,5891 6,4938 6 AN 07 26,1036 42,4913 56,0789 1109,6857 7 AN 08 255,2114 64,4021 1021,8802 104,3278 8 AN 09 1198,9470 295,7331 307,2557 53,3703 9 AN 10 96,9393 219,7354 195,1192 149,9685

## KESIMPULAN
1. Hasil  uji  aktivitas  sitotoksik  terhadap  larva Artemia  salina Leach  dengan mengunakan  metoda Brine  Shrimp  Lethality  Test (BSLT)  terhadap  ekstrak  metanol beberapa  jenis  spon  laut  didapatkan  hasil  bahwa  sampel  spon  AN  07  mempunyai aktivitas sitotoksik yang tinggi dibandingkan dengan yang lainnya.
2. Sampel  spon  dengan  nomor  koleksi  AN  01  mempunyai  aktivitas  sitotoksik  paling tinggi  pada  fraksi  heksan  yaitu  1,4585  µg/ml  dan  fraksi  etil  asetat  yaitu  29,4289 µg/ml.
3. Fraksi  butanol  dari  sampel  AN  04  mempunyai  aktivitas  yang  paling  tinggi  yaitu 0,0002 µg/ml.

## DAFTAR PUSTAKA
Bogoriani, N. W., Santi, S. R., dan Asih, I. A. R. A., 2007, Isolasi Senyawa Sitotoksik dari Daun Andong ( Cordyline terminalis Kunth), Jurnal Kimia 1 (1) : 1-6 Cetkovic,  H. And Lada,  L.  B.,  2003,  HMGB2  Protein  from  The  Marine  Sponge  Suberites Docuncula, Jurnal of Food Technol . Biotechnol. 41 (4) : 361-365
Fajarningsih, N. D., Januar, H. D., Wikanta, T. and Cytotoxicity Assay in Marine Natural Products Screening, Internasional Seminar and Workshop Marine Biodiversity and Their Potential for Developing Bio-Pharmaceutical Industry in Indonesia, 136-141
Ferriti, C., Morengo, B., Ciucis, D. C., Nitti, M., Pronzato, A. M., Marinari, M. U., Pronzato, R., Manconi,  R.  and  Dominicotti,  C.,  2007,  Effects  of  Angelas  Oroides  and Petrosia ficiformis Crude  Extracts  on  Human  Neuroblastoma  Cell  Survival, Internasional  Jurnal of Oncology 30 : 161-169
Yalcin, F. N., 2007, ‘’Biological Activities of the Marine Sponge Axinella’’, Hacettepe University Jurnal of the Faculty of Pharmacy, Volume 27/Number1 2007/pp.47-60