Karakterisasi Molekuler Isolat-Isolat Penyebab Bulai ( Peronosclerospora spp) Pada Tanaman Jagung Berbasis Simple Sequence Repeat (SSR )
Hikmahwati 1 , Tutik Kuswinanti 2 , Melina 3
1 Program Studi Agroteknologi Universitas Al Asyariah Mandar
2 Program Studi Agroteknologi Universitas Hasanuddin)
3 Program Studi Agroteknologi Universitas Hasanuddin) hikma_wt00@yahoo.co.id

## Abstrak
Karakterisasi Molekuler Isolat-Isolat Penyebab Bulai (Peronosclerospora spp.) pada Tanaman Jagung Berbasis Simple Sequence Repeat (SSR).Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui (1) spesies Peronosclerospora spp yang diperoleh dari beberapa lokasi di  Indonesia  dan  (2)  keragaman  genetik  dan  pengelompokkan  antara  isolat Peronosclerospora spp . yang  diperoleh  dari beberapa lokasi di Indonesi.  Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Balai Penelitian Sereal (Balitsereal) Kabupaten Maros, Sulawesi Selatan dan di Pusat Kegiatan Penelitan Universitas Hasanuddin.  Isolat yang digunakan berasal dari Medan, Kediri dan Maros.   Metode karakterisasi  dilakukan  secara  molekuler  dengan  metode  SSR.  Hasil  pengamatan  dengan  metode  SSR  efektif digunakan dalam studi keragaman genetik Peronosclerospora spp., Analisis kluster dengan UPGMA menghasilkan 3 kelompok, kelompok I terdiri dari 3 isolat asal Kediri, kelompok II terdiri dari 3 isolat asal Medan dan kelompok III terdiri dari 3 isolat asal Maros.  Berdasarkan  karakterisasi dan analisis kluster isolat dari 3  lokasi yang berbeda memiliki kemungkinan adalah spesies yang berbeda
Keywords : Jagung, Peronosclerospora spp, Ciri morfologi,  Karakterisasi molekuler, SSR

## Pendahuluan
Salah  satu  hambatan  utama  dalam  pengembangan jagung  adalah  adanya  gangguan  hama  dan  penyakit. Penyakit  bulai  ( downey  mildew ),    merupakan  penyakit utama  pada  tanaman  jagung,  karena  tanaman  yang tertular tidak menghasilkan biji sama sekali. Di lapangan terdapat  beberapa  laporan  yang  menyatakan  bahwa kehilangan akibat penyakit bulai dapat mencapai 100 % (Sujono, 1988, Wakman et al. , 2002, Yasin et al., 2008). Bulai  di  Indonesia  yang  telah  diidentifikasi disebabkan  oleh  tiga  spesies  yaitu P.  maydis , P. philippinensis dan P. sorghi. P. maydis ditemukan menyerang  tanaman  jagung  di  pulau  Jawa  dan Kalimantan, P. sorghi ditemukan di pulau Sumatera dan P. phillippinensis awalnya  meyerang  di  Minahsa, Sulawesi Utara (van Hoof 1953) dan saat ini dolaporkan menyerang  tanaman  jagung  di  pulau  Sulawesi,  dan penyebaran  spesiesnya  sudah  teridenfikasi  di  18 kabupaten/propinsi di Indonesia (Wakman et al. 2006).,). Identifikasi Peronosclerospora sp p. dilakukan berdasarkan  ciri  morfologi  seperti  bentuk  atau  ukuran spora yang dimiliki.
Adanya  perbedaan  respon  penyakit  terhadap beberapa  kultivar  inang  termasuk pada  varietas  tahan bulai  yang  berekembang  saat  ini  diduga  menimbulkan perubahan pada tingkat spesies atau pada tingkat patotipe dan  adanya  perbedaan  beberapa  hasil  penelitan  pada identifikasi  secara  morfologi  yang  pernah  dilakukan sehingga  perlu  dilakukan  karakterisasi  secara  morfologi untuk  melihat  bentuk  morfologi Peronosclerospora spp
di  di  beberapa  wilayah  Indonesia  saat  ini,  seperti  di Medan  (Sumtera  Utara),  di  Kediri  (Jawa  Timur)  dan  di Maros  (Sulawesi  Selatan)  yang  diduga  memiliki  3 spesies yang berbeda. Menurut Wakman et al., (2006) di Indonesia  terdapat  3  spesies  penyebab  penyakit  bulai pada  tanaman  jagung  yaitu P.  maydis yang  tersebar  di pulau  Jawa  dan  Kalimantan, P.    philippinensis yang tersebar di pulau Sulawesi dan P. sorghi yang tersebar di pulau Sumatera.
Keragaman  struktur  populasi P.  sorghi telah diidentifikasi  berdasarkan  karakter  morfologi  dan patotipenya.  Perbedaan  patotip  ditandai  dengan  adanya perbedaan respon penyakit pada beberapa kultivar inang yang  berbeda  (Bock et  al. ,  2000;  Bock et  al. ,  1998). Metode  konvensional  untuk  mendeteksi  perbedaan patotipe  bulai  yang  menyerang  tanaman  sereal  tidak cukup akurat untuk digunakan didalam mengkarakterisasi organisme parasit obligat seperti pada patogen  tanaman    karat  dan  bulai,  yang  tidak  dapat dikulturkan,  karena  pada  iklim  tropis  gejala  dari Peronosclerospora spp . sulit dibedakan.
Adanya  perbedaan  patotipe,  gejala  yang  sulit dibedakan  dan  perbedaan  beberapa  hasil  penelitan  pada identifikasi  secara  konvensial  ini  menunjukkan  adanya kelemahan  pada  metode  identifikasi  konvensional. Metode  konvensional  yang  berdasarkan  ciri  morfologi dan  patotipe  kurang  akurat  akibat  adanya  pengaruh perubahan-perubahan  lingkungan.  Menurut  Smith  et  al. (1997),  karakter-karakter  morfologi  sering  tidak menggambarkan  hubungan  genetik  akibat  adanya interaksi  lingkungan  dan  sejumlah  kontrol  genetik  yang
Agrovital | Jurnal Ilmu Pertanian Universitas Al Asyariah Mandar                                                                                   2
tidak  diketahui,  sehingga  perlu  dilakukan  karakterisasi molekuler  untuk  lebih  mendapatkan  hasil  yang  akurat didalam  mengkarakterisasi  terhadap  perbedaan  spesies dan  struktur  populasi Peronosclerospora spp  di Indonesia.
Kemajuan  di  bidang  bioteknologi  utamanya dibidang  biologi  molekuler  menyebabkan  variabilitas genetik  suatu  populasi  dapat  diamati  pada  tingkat protein,  isoenzim,  dan  tingkat  DNA.    Analisis  DNA memiliki  efisiensi  dan  keakuratan  yang  tinggi  sehingga dapat  membantu  dalam  identifikasi  dan  determinasi keragaman  genetik  cendawan Peronssclerospora spp . Menurut  Albert et  al. (2002),  untuk  identifikasi  dan determinasi  cendawan  yang  lebih  detail  dapat menggunakan penciri DNA.
Beberapa penanda molekuler yang telah digunakan untuk  mendeteksi  perbedaan  antara  spesies  penyebab bulai  adalah  dengan  teknik  RFLP  ( Restriction  fragment length  polymorphism )  yang  berguna  untuk  mendeteksi variasi  pada  tingkat  DNA,  pemetaan  dan  pencirian  gen. Namun demikian metode ini  memiliki kelemahan karena menghasilkan  sedikit  perbedaan  pola  yang  dapat dideteksi  pada  isolat P.  sorghi, sama  halnya  dengan
ITS-2 ( Internal Transcribed Spacer ) hanya menghasilkan  sebuah transcribed  spacer di  dalam  gen ribosom yang memiliki ukuran yang berbeda (Yao et al. , 1992).  ITS-2 merupakan penanda molekuler yang dapat digunakan  untuk  mengidentifikasi  spesies,  yang  dapat membedakan  ukuran  gen  pada  ribosom.    Penggunaan RAPD-PCR  juga  dapat  digunakan  untuk  mengetahui adanya  polomorfisme  pada  SDM  ( Sorghum  Downey Mildew )  pada  tingkat  patotipe  dengan  menggunakan banyak  primer  pendek  (10  mer).    Masalah  besarnya adalah  adanya  amplifikasi  pita  yang  tidak  konsisten dengan hasil yang bervariasi meskipun pada eksperimen yang sama (Perumal et al. , 2006).  Untuk itu diperlukan sebuah metode  yang sifatnya  stabil dan  konsisten  untuk proses  karakterisasi  yang  lebih  akurat,  sehingga dikembangkan penanda mikrosatelit.
Mikrosatelit  atau  SSR  ( Simple  Sequence  Repeat ) (untaian berulang sederhana), memiliki variasi yang luas dan  menyebar luas dalam  bentuk  susunan  yang  panjang dari  unit  tandem  yang  pendek  dan  berulang  di  dalam genom  (Jeffreys et  al .,  1985;  Tautz  dan  Renz,  1984). SSRs  ini  menyediakan  penanda Kodominan  Mendelian yang  sangat  kuat  dibandingkan  marker Dominan sehingga  dapat  digunakan  untuk  membedakan  struktur populasi  genetik,  kekerabatan,  model  reproduksi  dan isolasi  genetik  (Queller,  1993,  Taylor et  al. ,  1999) Ketika  dibandingkan  dengan  tipe  penanda  lainnya penanda  SSR  sangat  akurat  untuk  karakterisasi  genetik, seperti pada Aspergillus fumigates dan Saccharomycetes cerevisae (Bart et  al. ,  2001,  Perez et  al. ,  2001) , Phytophthora  infestans (Lees,  2006), Magnoporthe grisea (Brondani  ,  2000,  Kaye et  al. ,  2003)  dan oomycetes lainnya.
Perumal  (2008) telah mendesain primer  yang  tepat dan  dapat  digunakan  untuk  penggandaan  loci mikrosatelit  yang  telah  diuji    kemampuannya  untuk membedakan patogenitas pada beberapa isolat P. sorghi dan  untuk  spesies  patogen  bulai  lainnya  seperti P. philipinensis,  P. Maydis  ,  P.  sachari,  Sclerospora graminicola dan P. sparsa. Dengan demikian primer ini
dapat  digunakan  didalam  analisis  kluster  atau pengelompokan  untuk  menentukan  keragaman  genetik dan kekerabatan diantara beberapa spesies patogen bulai yang berbeda di beberapa lokasi di Indonesia.
Berdasarkan  uraian  di  atas  maka  perlu  dilakukan karakterisasi  DNA  pada Peronosclerospora spp . dari beberapa  lokasi  di  Indonesia  yaitu  Medan,  Kediri  dan Maros dengan karakterisasi secara genetik berbasis SSR untuk  menentukan  keragaman  genetik  dan  kekerabatan diantara  beberapa  spesies  patogen  bulai  yang  berbeda dan  selanjutnya  dapat  menentukan  spesies  dan  struktur populasinya  untuk  menjadi  panduan  didalam  proses perakitan  varietas  jagung    tahan  bulai  dan pemanfaatannya  secara  luas  sebagai  komponen pengendalian penyakit.

## Kerangka Teori
Penyakit  bulai  telah  dikenal  di  Indonesia  pertama kali di Jawa tahun 1897 , Jawa tengah (Raciborski, 1897), Jawa  timur  dan  Yogyakarta  (Raciborski,  1900).    Selain di  Jawa  dan  Madura  penyakit  ini  juga  dilaporkan menyerang  di  Aceh,  Sumatera  Utara,  Palembang, Kalimantan  Barat,  Bali,  Lombok,  Sulawesi  Selatan, Minahasa,  Tidore,  Ternate,  Ambon,  Flores  dan  Timor (Wakman, 1987/1988; Roelofsen, 1956;  Rutgers, 1916; van  Der  Goot;  1935,  1936;  van  Hall  1918,  1919). Penyakit bulai juga ditemukan di Lampung pada musim tanam 1973 (Tantera, 1975).
Wakman  dan  Djatmiko  (2002)  melaporkan  bahwa terdapat  10  spesies  cendawan  penyebab  penyakit  bulai, dan  hanya  3  spesies  yang  telah  diidentifikasi  ada  di Indonesia  yaitu Peronosclerospora maydis (Java  downy mildew), P . philippinensis (Philippine  downy  mildew) dan P . sorghi
(Sorghum downy mildew). Peronosclerospora maydis merupakan  salah  satu penyebab  bulai  yang  hanya  menyebar  di  Indonesia (Shaw,  1978). P.philippinensis khusus  terdapat  di daerah  Minahasa,  Sulawesi  Utara  (Semangun,  2006). P . sorghi ditemukan  dapat  menginfeksi  sorghum  dan jagung  (Williams,  1984).  Wakman  dan  Hasanuddin (2003)  menemukan  konidia  patogen  bulai  yang berbentuk  oval  dan  menyerupai  konidia P.sorghi di Karo, Sumatera Utara

## 1.1. Gejala
Penyakit  bulai  dapat  menimbulkan  gejala  sistemik yang  meluas  keseluruh  bagian  tanaman  dan  dapat  juga menimbulkan  gejala  lokal  atau  setempat.    Hal  ini tergantung  dari  meluasnya  jamur  penyebab  penyakit dalam  tubuh  tanaman  yang  terinfeksi.    Gejala  sistemik hanya  terjadi  bila  jamur  dapat  mencapai  titk  tumbuh (Semangun, 2006).
Agrovital | Jurnal Ilmu Pertanian Universitas Al Asyariah Mandar                                                                                   3
Gambar  1.      Gejala  Penyakit  Java  downy  mildew  Pada Tanaman Jagung
Tabel  1.    Perkembangan  gejala  penyakit  bulai  ( downy mildew ) Hari setelah inokulasi Gejala 2 5 6 7 9 14-25 Muncul  bintik-bintik  hijau  pucat  (1-2 mm). Muncul  garis-garis  berwarna  hijau kekuningan.
Garis-garis  tadi  semakin  jelas.
Beberapa  daun  berubah  warna menjadi kuning.
Seluruh  daun  berwarna  kuning  dan beberapa diantaranya mulai layu. Daun pertama sampai daun ke tiga mati. Garis-garis  kuning  yang  jelas  muncul pada daun ke empat. Gejala  serangan  sistemik  mulai  terlihat pada daun-daun yang baru terbentuk. Sumber : Kajiwara (1974)

## 1.2. Pengendalian
Menurut  Wakman  (2008)  untuk  pengendalian penyakit  bulai  secara  terpadu,  hanya  bisa  dengan  4 (empat)  komponen  pengendalian  lainnya  yaitu:  periode bebas  tanaman  jagung,  penanaman  jagung  secara serempak  pada  satu  hamparan,  eradikasi  tanaman terinfeksi bulai, menanam varietas jagung tahan penyakit bulai

## 1.3. Isolasi DNA dan teknik PCR
Isolasi DNA  genom dilakukan dengan merusak sel atau dinding  sel terlebih dahulu, hal ini dapat dilakukan dengan  beberapa  teknik,  baik  dengan  menggunakan agensia  hayati  ,  bahan  kimia,  menggunakan  enzim tertentu  maupun  secara  fisik.  Pemecahan  sel  dengan menggunakan enzim dapat dilakukan dengan menggunakan  enzim  lisozim  yang  dapat  memecah dinding  sel,  senyawa  lain  yang biasa  digunakan    adalah CTAB ( Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide ) (Yuwono, 2008).
Isolasi  DNA  dari  organisme  eukariot  biasanya dilakukan  melalui  penghancuran  sel  (lisis),  pemusnahan protein  dan  RNA,  dan  pemurnian  DNA  dengan memanfaatkan  senyawa  kimia  seperti  EDTA  (Etilen Diamin Tetra Acetat) yang berfungsi merusak sel dengan cara  mengikat  ion  magnesium,  dan  SDS  (Sodium Dodesil  Sulfat)  yang  merupakan  sejenis  deterjen  untuk merusak membran sel sehingga dapat menyebabkan lisis pada sel. Protein dapat dibersihkan menggunakan larutan fenol  (mengikat  protein  dan  sebagian  kecil  RNA)  dan kloroform  (membersihkan  protein  dan  polisakarida  dari
larutan). Protein juga  dapat dihilangkan  dengan bantuan enzim  proteinase,  dan  RNA  dapat  dihilangkan  dengan RNAse.  Adapun  ethanol  serta  NaCl  berfungsi memekatkan,  memisahkan  DNA  dari  larutan  dan mengendapkan DNA (Muladno, 2002).
Proses  pemurnian  dapat  pula  menggunakan Proteinase  K  dan  RNAse  untuk  membersihkan  protein dan  RNA.  Tahap  ini  juga  memanfaatkan  NH 4 Ac (Amonium  Asetat)  yang  berfungsi  untuk  mengurangi terjadinya  presipitasi  sejumlah  kontaminan.  Tahap selanjutnya  yaitu  membersihkan  kembali  protein  dan sejumlah RNA yang masih tersisa dengan menggunakan larutan  fenol,  kloroform  dan  isoamilalkohol  (25:24:1) (Chisholm, 1992; Steen, 1999).
Gambar  2.  Proses  PCR  untuk  amplifikasi/perbanyakan DNA  target  dapat  meningkatkan  jumlah urutan  DNA  ribuan  bahkan  jutaan  kali  dari jumlah semula .

## 1.4. Teknik Dasar dan Amplifikasi PCR
PCR  dilakukan  dengan  mencampurkan  keempat komponen  PCR  dengan  melalui  proses  (i)  denaturasi dimana  molekul  DNA  cetakan  untainnya  terpisah  agar oligonukleotida  primer  dapat  menempel  (95  –  100 0 C) (Yuwono,  2008),  (ii)  annealing  (penempelan)  adalah proses penempelan primer ( primer annealing ) pada DNA cetakan(50 – 60 0 C),(iii) extension (pemanjangan) dimana DNA  mengalami  pemanjangan  dan  kembali  menjadi untaian ganda (72 0 C).
1.5. Mikrosatelit atau SSR(Simple Sequance Repeat) Simple Sequence Repeats (SSRs) (Untaian berulang sederhana) atau mikrosatelit merupakan salah satu marka yang  berdasarkan  pada  PCR  dengan  menggunakan primer  yang  menggabungkan  sekuen  komplementer spesifik dalam DNA sasaran (Rakoczy et al .,2004).
SSR  ini  menyediakan  penanda Kodominan Mandelian yang  sangat  kuat  dibandingkan  marker Dominan dan  dapat  digunakan  untuk  membedakan struktur populasi genetik, kekerabatan, model reproduksi dan isolasi genetik (Taylor, et al. , 1999) sehingga dapat digunakan  untuk  mendeteksi  spesies  yang  berkerabat dekat  secara  lebih  baik  dibandingkan  dengan  markah molekuler yang lain (Santoso, 2008).

## 1.6. Kemiripan  Genetik Kaitannya dengan Populasi Spesies
Kemiripan  genetik  dari  dua  genotipe  dapat diperkirakan secara tidak langsung dari data pedigree dan
Agrovital | Jurnal Ilmu Pertanian Universitas Al Asyariah Mandar                                                                                   4
melalui  markah  molekuler (isozim,  protein  dan  marka DNA). (Pabendon et al. tanpa tahun)  Estimasi kedekatan genetik antara indifidu bermanfaat di dalam studi evolusi populasi  atau  spesies  (Cox et  al .,  1985).  Pabendon (2002) menyatakan bahwa jarak genetik dapat digunakan di  dalam  penentuan  kelompok  atau  kluster    yang didasarkan  juga  pada  metode  pautan  rataan  ( average linkage)  dengan  memilih  selisih  jarak  terbesar  serta didukung  oleh  populasi  asal  genotip,  selain  itu  juga didukung  oleh  hasil  analisis bootstrapping kemudian ditarik  garis  memotong  dendogram  pada  skala  tingkat kemiripan genetic ( genetic similarity).

## Metode Pelaksanaan
1.7. Sampel Patogen Isolat merupakan
koleksi laboratorium Biomolekular  Balai  Sereal  Maros,    Total  18  isolat Peronosclerospora spp yang digunakan yang berasal dari Kediri,  Medan  dan  Maros.  Isolat  di  ambil  dari  tanaman sakit yang berumur 3 minggu.

## 1.8. Primer yang Digunakan
Primer  yang  digunakan  sebanyak  47  primer  terdiri dari 14 primer (DM 1, DM  6, DM 20, DM  21, DM 23, DM 24, DM 32, DM 34, DM 36, DM  37, DM 38, DM 41,  DM  43,  DM 51)  yang  khusus  untuk Peronosclerospora maydis dan 6 primer (DM 3, DM 10, DM 18, DM 22, DM 39, dan DM 50) khusus untuk P. philippinensis sedangkan terdapat 27 primer (DM 5, DM 7, DM 8, DM 9, DM 11, DM 12, DM 13, DM  14, DM 16,  DM  19,  DM  26,  DM  27,  DM  28,  DM  30,  DM  31, DM 33, DM 35, DM 40, DM 44, DM  45, DM 46, DM 47, DM 49, DM 52, DM 53, DM 54, dan DM 55) yang dapat digunakan untuk ketiga spesies
Tabel 2 Nama-nama isolat dan lokasi sampel pathogen

## 1.9. Isolasi Patogen
Konidia  dikumpulkan  dari  daun  yang  terinfeksi dengan  langkah  sebagai  berikut  :  tanaman  sakit  yang berumur  3  minggu  dicuci  dengan  air  dingin  kemudian dikering anginkan dan ditempatkan di dalam ember yang berisi  air  setinggi  1-2  cm  sampai  jam  8  malam. Kemudian  disungkup    dengan  kantong  plastik  hitam, kemudian  daun  ditempatkan    di  dalam  gelap  sepanjang malam dengan suhu 23 0 C.  Kemudian pada pukul 04.00 spora    dikumpulkan  pada  air  steril  dan  konidia  dicuci sekali  dengan  etanol  70%  untuk  digunakan  pada ekstraksi DNA.

## 1.10. Ekstraksi dan Isolasi DNA
Proses  isolasi  DNA  ini  mengikuti  prosedur  Geoge (2004) dan Khan.  Elektroforesis dan Visulisasi hasi PCR menggunakan  Polyacrilamid  Gel  (PAGE),  Deteksi Fragmen DNA Menggunakan Silver Staining

## 1.11. Analisis Data
Analisis  data  dilakukan  berdasarkan  nilai  Analisis Tingkat Polimorfisme ( Polimorphic Information Content – PIC
Genotip yang muncul dikelompokkan berdasarkan  matriks  kemiripan  genetik  melalui Unweighted  Pair  Group  Method  Using  Arithmatic Average (UPGMA).    Dendrogram  dikonstruksi berdasarkan  UPGMA  dengan  menggunakan  koefisien Jaccard.  Jarak matriks dan dendrogram dibentuk dengan menggunakan program NTSYS-pc ( Numerical Taxonomic System ) Versi 2.1 (Rohlf, 2000).

## Hasil

## 1.11.1. Profil  Primer  SSRs  pada  9  Sampel  Patogen Bulai yang Diidentifikasi
Dari total 9 sampel DNA dari daun bergejala dan 9 sampel DNA dari konidia yang dianalisis diperoleh total 70 pita dengan jumlah rata-rata 4,7 pita untuk DNA dari daun bergejala dan 36 pita dengan jumlah rata-rata 5 pita untuk  DNA  dari  konidia.    Tingkat  polimorfisme ( Polymorphism  Information  Content  =  PIC) berkisar antara  0,54-0,81%  dengan  rata-rata  0,7%  untuk  kedua sumber DNA. Gambar profil pita DNA dapat dilhat pada gambar 3.
13 MD-1 Daun Medan Pulut harapan 90 14 MD-2 Daun Medan Pulut harapan 90 15 MD-3 Daun Medan Pulut harapan 90 16 MR-1 Daun Maros Anoman 100 17 MR-2 Daun Maros Anoman 100 18 MR-3 Daun Maros Anoman 100
No. Kode sampel Isolat Lokasi Varietas Intesitas Serangan (%) 1 KD-1 Konidia Kediri Pioner 21 85 2 KD-2 Konidia Kediri Pioner 21 85 3 KD-3 Konidia Kediri Pioner 21 85 4 MD-1 Konidia Medan Pulut harapan 90 5 MD-2 Konidia Medan Pulut harapan 90 6 MD-3 Konidia Medan Pulut harapan 90 7 MR-1 Konidia Maros Anoman 100 8 MR-2 Konidia Maros Anoman 100 9 MR-3 Konidia Maros Anoman 100 10 KD-1 Daun Kediri Pioner 21 85 11 KD-2 Daun Kediri Pioner 21 85 12 KD-3 Daun Kediri Pioner 21 85

## 1.11.2. Analisis  Kemiripan Genetik
Analisis  kemiripan  genetik  digunakan  untuk menentukan  hubungan  kekerabatan  secara  genetik diantara 9 sampel patogen bulai yang diidentifikasi yang ditampilkan dalam bentuk dendrogram seperti gambar 3, melalui  analisis  NTSYS  pc-2.1    Dendrogram  tersebut dikonstruksi melalui UPGMA pada 15 primer SSR.
Gambar  3  :Profil  DNA  patogen Peronosclerospora spp dengan   menggunakan primer SSRs DM14. Jalur  1,2,3  adalah  DNA  patogen  bulai  asal Kediri, jalur 4,5,6adalah DNA patogen bulai asal  Medan  dan  jalur  7,8,9  adalah  DNA patogen bulai asal Maros Berdasarkan  dendrogram  isolat  dari  satu  lokasi berada  pada  tingkat  kemiripan  yang  sama  dan  masing- masing  lokasi  berada  pada  tingkat  kemiripan  yang berbeda  dengan  nilai  tingkat  kemiripan  genetik  berkisar antara  0,51-1,00  pada  isolat  yang  berasal  dari  daun  dan 0,54-1,00  pada  isolat  yang  berasal  dari  konidia  dengan skala  tingkat  kemiripan  genetik  0,55  pada  isolat  asal daun  dan  0,60  pada  isolat  asal  konidia,  sehingga terbentuk  3  kelompok  atau  kluster  (Gambar  3  dan  4). Kelompok  I,  II  dan  III  masing  masing  dengain  nilai kemiripan  genetik  1,00,  antara  kelompok  I  dan  II memiliki nilai kemiripan genetik sebesar 0,55 pada isolat asal  daun  dan  0,60  untuk  isolat  asal  konida,  sedangkan antara  kelompok  I,II  dengan  kelompok  III  sebesar  0,51 pada isolat asal daun, dan 0,54 untuk isolat asal konida. tingkat  konfidensi  atau  kepercayaan  pengelompokkan dari  hasil  analisis bootstrapping mendukung  nilai kemiripan  berdasarkan  UPGMA  atau  dendrogram. Setiap  kelompok  memiliki  tingkat  kepercayaan  yang tinggi  yaitu  sbesar  100%  dan  pengelompokkan  antara kelompok  I,  II  dengan  kelompok  III  memiliki  tingkat kepercayaan  51,9%  pada  sampel  bulai  dari  daun  dan 68,1% untuk sampel bulai dari konidia.
Gambar  4:  Dendrogram  keragaman  genetik  isolat Peronosclerospora spp.  yang  diperoleh dari  sampel  daun  dan  berasal  dari  Kediri (KD),    Medan  (MD)  dan  Maros  (MR)
berdasarkan 15 primer SSR dan dikonstruksi berdasarkan koefisien kemiripan  Jaccard. Nilai  di  atas  garis menunjukkan tingkat kepercayaan pengelompokan  yang  diperoleh  melalui analisis bootstrapping
Gambar  5:  Dendrogram  keragaman  genetik  isolat Peronosclerospora spp.  yang  diperoleh dari  sampel  Konidia  dan  berasal  dari Kediri  (KD),    Medan  (MD)  dan  Maros (MR)  berdasarkan  7  primer  SSRs  dan dikonstruksi berdasarkan koefisien kemiripan  Jaccard. Nilai  di  atas  garis menunjukkan tingkat
kepercayaan pengelompokan  yang  diperoleh  melalui analisis bootstrapping

## Pembahasan
Nilai  kemiripan  gentik  pada  kelompok  I dan  II sebesar  0,55  dan  kelompok  III  sebesar  0,51.    Hal  ini menunjukkan bahwa kekerabatan antara kelompok I dan II  lebih  dekat  dibandingkan  dengan  kelompok  III memiliki  kekerabatan  yang  lebih  jauh.  Nilai  similaritas yang semakin mengecil dari kelompok I ke kelompok III menunjukkan hubungan kekerabatan yang semakin jauh, sehingga  memiliki  kemungkinan  adalah  isolat  pada kelompok  I  adalah  spesies  P. maydis dan  kelompok  II adalah  spesies    P. sorghi dan  kelompok  III  adalah  isolat P. philippinensis. Hal ini sejalan dengan hasil penelitan Perumal  et  al.,  2008  menunjukkan  bahwa  Kelompok  I yang terdiri dari P. sorghi memiliki nilai similaritas 0,90, kelompok  II  yang  terdiri  dari  isolat  P. maydis dan  P. scchari dengan  nilai  similaritas  0,85  dan  P.
Agrovital | Jurnal Ilmu Pertanian Universitas Al Asyariah Mandar                                                                                   6
philippinensis yang  berdir  sendiri  memiliki  nilai similaritas 0,77 yang juga memiliki nilai similaritas yang semakin jauh antara kelompok.
Adanya  perbedaan  profil  sidik  jari  DNA  dan morfologi  dari masing-masing isolat dengan lokasi yang berbeda  dapat  digunakan  sebagai  alat  diagnosa  didalam strategi  pemuliaan  untuk  mendapatkan  tanaman  yang resisten  terhadap  penyakit  bulai  dan  dapat  juga  untuk dijaadikan  alat  memonitoring  munculnya  ras  virulensi bari  dari  patogen.  Hal  ini  juga  menunjukkan  metode pengendalian yang diterapkan disuatu lokasi belum tentu dapat  dikembangkan  di  lokasi  yang  lain,  sehingga metode  pengendalian  yang  digunakan  harus  bersifat spesifik  lokasi.    Hal  ini  disebabkan  dengan  adanya perbedaan  karakteristik  patogen  pada  lokasi  yang berbeda  mengarah  pada  perbedaan  spesies  dan  tingkat virulensi  patogen  di  dalam  menyebabkan  penyakit  bagi tanaman.

## Kesimpulan
Berdasarkan  hasil  penelitian  yang  telah  dilakukan secara  karakterisasi  molekuler  maka  dapat  dibuat kesimpulan  bahwa  keragaman  genetik  yang  diperoleh membentuk  3  kelompok,  kelompok  I  adalah  isolat  asal Kediri  yang  merupakan P. maydis ,  kelompok  II adalah isolat  asal  Medan  yeng  merupakan P.  sorghi dan kelompok  III  adalah  isolat  asal  Maros  adalah P. philippinensis .

## Daftar Pustaka
Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter,  P.,    2002. Molecular  Biology  of  the Cell . Edisi ke-4. Garland Science: New York.
Bart-Delabesse  E,  J.  Sarfati,  J.P.    Debeaupuis,  W
Leeuwen van, A, Belkum van, S. Bretagne, J.P. Latge,  2001. Comparison  of  Restriction Fragments Length Polymorphism, Microsatellite  Length  Polymorphism,  and Random Amplification of Polymorphic DNA Analyses Fingerprinting Aspergillus fumigatus Isolates. J  Clin  Microbiology,
39:2683-2686.
Bock  C,  Jeger  M,  Mughogo  L,  Mtisi  E,  Cardwell  KF, 1998. : Production of conidia by Peronosclerospora sorghi in  Zimbabwe. Plant Pathology 1998, 47:243-251.
Bock, C.H., Jeger, J.J., Mughogho, L.K., Cardwell, K.F., Mtisi,  E.,  Kaula,  G.,  and  Mukansabimana,  D. 2000. Variability of Peronosclerospora sorghi isolates  from  different  geographic  locations and hosts in Africa. Mycological Research 104 61-68.
Brondani C, Brondani RPV, Garridon LR, Ferreira ME,
2000. Development of microsatellite  markers for  genetic  analysis  of Magnaporthe  grisea . Genetica Moleculer Bioogyl, 23:753-762. CIMMYT,  2010. Downy  mildew  (extended information)
http://maizedoctor.cimmyt.org/index.php?id=23 3&option=com_content&task=view. Diakses Desember 2010.
Jeffreys AJ, Wilson V, Thein SL, 1985. Hypervariable 'Minisatellite'  Regions  in  Human  DNA. Nature, 314(6006):67-73. Kajiwara  T.    1974. Some  Experiments  on  Downy Mildew  of  Maize.    Proc.  Symposium  on Downy Mildew of Maize, Tokyo .  Trop. Agric. Res., Series No. 8:121-123.
Kaye C, Milazzo J, Rozenfeld S, Lebrun MH, Tharreau D,  2003. The  development  of  simple sequence  repeat  markers  for Magnaporthe grisea and  their  integration  into  an established  genetic  linkage  map. Fungal Genet Biol, 40(3):207-214
.Lees  AK,  Wattier  R,  Shaw  DS,  Sullivan  L,  Williams NA, Cooke DEL, 2006. Novel Microsatellite Markers  for  the  Analysis  of Phytophthora infestans Populations .  Plant  Pathology, 55:311-319.
Muladno,  2000., Tekhnologi  Rekayasa  genetika . Pustaka Wira Usaha Muda dan ESESE, Bogor. Pabendon,M.B.,  2002. Identifikasi Genotip Jagung  ke dalam  Kelompok  Heterotik  Melalui  Marka SSRs(Simple  Sequence  Repeats)  Kaitannya dengan  Penentuan  Tetua  Hibrida. TESIS, Universitas Padjadjaran Bandung Perez  MA,  Gallego  FJ,  Martinez  I,  Hidalgo  P,  2001.
Detection,  Distribution  and  Selection  of Microsatellites  (SSRs)  in  the  Genome  of  the Yeast Saccharomyces cerevisiae as Molecular Markers. Lett Appl Microbiol, 33:461-466. Perumal R, Isakeit T, Menz M, Katile S, No EG, Magill CW,  2006. Characterization  and  Genetic
Distance Analysis
of Isolates of
Peronosclerospora  sorghi Using  AFLP Fingerprinting . Mycological Research, 110(4):471-478.
Perumal  R.,  Padmavathi  N.,  Saradha  R.E,Eun-Gyu  No, Umesh K. R., Louis K. P., Gary N. O.,Douglas G.L.  and Clint W M., 2008. Simple Sequence Repeat Markers Useful for Sorghum Downy Mildew  ( Peronosclerospora  sorghi )  and Related Species.
BMC Genetics.
http://www.biomedcentral.com/1471-2156/9/77. diakses tgl 16 Desember 2010. Queller, 1993. Rakoczy,  M.  T.,  and  Hanna  Bolibok,  2004.
Characteristics  and  a  Comparison  of  Three Classes  of  Microsatellite-based  Markers  and their  Application  In  Plants. Cellular  & molecular biology letters Volume 9, (2004): 221 – 238 http://www.cmbl.org.pl .
Santoso,  T.J.,  W.U.  Dwinita,  ,  dan  M.S.  Endang  2008.
Analisis  Sidik  Jari  DNA  Plasma  Nutfah Kedelai  Menggunakan  Markah SSR. Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik
Pertanian. Bogor.
Semangun,  H.,  2006. Pengantar  Ilmu  Penyakit Tumbuhan. Gadjah Mada University Press. Shaw,  C.G,  1978. Peronosclerospora Species  and other  Downy  Mildews  of  the  Gramineae. Mycologia, 70:594-604.
Smith, J.S.C., E.C.L. Liu, H. Shu, O.S. Smith, S.J. Wall, M.L.  Senior,  S.E.  Mitchell,  S.  Kresovich  dan
Agrovital | Jurnal Ilmu Pertanian Universitas Al Asyariah Mandar                                                                                   7
J.Ziegle, 1997. An Evaluation of the Utility of SSR Loci as Moleculer Marker in Maize ( Zea mays L.):  Comparison  with  Data  from RFLPs  and  Pedigree. Theor.    Appl.  Genet. 95:163-173. Steen,  S.W.,  1999. Handbook  for  DNA  Isolation RAPD-PCR  and  PCR-RFLP. Botanical Garden and Museum.  University of Oslo
Sudjono,  M.S.,  dan  Y.  Sopandi.  1988. Pendugaan penurunan  hasil  jagung  oleh  penyakit  bulai (P.  maydis  Rac.  Shaw.) .  Seminar  Balittan Bogor tahun. 7 hal.
Tautz  D,  Renz  M,  1984. Simple  sequences  are ubiquitous repetitive components of eukaryotic  genomes. Nucleic  Acids  Res 12(10):4127-4138.
Taylor  JW,  Jacobson  DJ,  Fisher  MC,  1999. The Evolution  of  Asexual  Fungi:  Reproduction,
Speciation and Classification. Annu RevPhytopathol,  37:197-246. van  Der  Goot;
1935, 1936;
Wakman, W. dan H.A. Djatmiko. 2002. Sepuluh Spesies Cendawan  Penyebab  Penyakit  Bulai  pada Tanaman  Jagung. Makalah  disajikan  pada Seminar  PFI  di  Purwokerto  7  September  2002. 10.
Wakman,  W.,  S.  Asikin,  A.  Bustan,  dan  M.Thamrin, 2006. Identifikasi spesies cendawan penyebab penyakit  bulai  pada  tanaman  jagung  di Kabupaten Tanah Laut Propinsi Kalimantan
Selatan . Seminar Mingguan, Balitsereal. Jumat, 30 Juni 2006. Wakman,  W.,  2008. Pengendalian  Penyakit  Bulai pada jagung di bengkayang kalbar. Prosiding Seminar  Ilmiah  dan  Pertemuan  Tahunan  PEI PFI XIX Komisariat Daerah Sulawesi Selatan, 5 Nopember  2008  on  line  http://www.peipfi- komdasulsel.org/wp-content/uploads/2011/06/8- WASMO-Pengendalian-Penyakit-Bulai-Pada- 79-85.pdf.  diakses 15 juli 2011 Wiliams,  R.J.,  1984. Downy  Mildews  of  Tropical Cereals .  Pages  1-103 in Advances  in  Plant Pathology.  Volume  2  (Ingrams,  D.S.,  and Wiliams,  P.H.,  eds.).  London,  UK:  Academic Press.
Yao  C,  Frederiksen  RA,  Magill  CW,  1992. Length heterogeneity  in  ITS  2  and  the  methylation status  of  CCGG  and  GCGC  sites  in  the rRNA  genes  of  the  genus. Perosclerospora . Current Genetics 22:415-420 Yasin,  M.S., Soertiningsih,  Tenriware.A., Adnan.  A.M., Wakman.W.,  Tolanca.A.H.  dan  Syafruddin, 2008. Petunjuk  Lapanga  Hama,  Penyakit dan  Hara  pada  Jagung. Pusat  Penelitian  dan Pengembangan  Tanaman  Pangan.  Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian. Yuwono  Tribowo,    2008. Bioteknologi  Pertanian. Gadjah Mada University Press, Yogyakarta.