## DNA Barcoding Tanaman Mangga Kasturi
(Mangifera casturi ) Asal Kalimantan Selatan Berbasis DNA Kloroplas Gen rbcL dan matK
(DNA Barcoding of Mango Casturi ( Mangifera casturi ) Origin of South Borneo Based on DNA Chloroplas rbcL Gene and matK Gene)

## ZURAIDA SAGALA, SOGANDI*
Fakultas Farmasi, Universitas 17 Agustus 1945, Jl Sunter Permai Raya, Jakarta 14350, Indonesia
Diterima 11 Januari 2022, Disetujui 23 April 2022
Abstract: This study aims to see the genetic diversity of the musk mango ( Mangifera casturi ) plant in South Kalimantan based on DNA barcode techniques using sequences from the rbcL gene and the matK gene. The plant samples used in this study were the leaves of the musk mango ( Mangifera casturi ) taken from eight regencies and cities in South Kalimantan Province, namely from Amuntai, Astambul, Barito Kuala, Peat, Kandanga, Babirik, Tabalong, and Tanah Laut. Isolation and DNA analysis of the musk mango plant was carried out in the research laboratory of the Faculty of Biotechnology, Atma Jaya Catholic University of Indonesia, Jakarta. The analysis of the genetic diversity of the musk mango began with the stage of amplifying genomic DNA (gDNA) using rbcL and matK primers. The results of the DNA isolation samples showed a high concentration level of 17-91 ng/µL with a purity of 1.72 -1.92 ng/µL. When PCR was carried out using rbcL and matK primers, from 8 areas in South Kalimantan, 5 samples (Babirik, Tabalong, Kandangan, Amuntai, Batola, Peat, and Tanah Laut) were ampliﬁ ed with rbcL primers and 6 samples (Tanah Laut, Babirik, Tabalong , Amuntai, Peat, and Kandangan) ampliﬁ ed with matK primer. The relationship between the musk mango in South Kalimantan can be seen from the phylogenetic tree.
Keywords: DNA barcoding, casturi, genetic, Mangifera , phylogenetic.
Abstrak: Penelitian  ini  bertujuan  untuk  melihat  keragaman  genetik  tanaman  mangga  kasturi ( Mangifera casturi ) di Kalimantan Selatan menggunakan sekuens dari gen rbcL dan gen matK . Sampel tumbuhan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun mangga kasturi ( Mangifera casturi ) yang diambil  dari  delapan  kabupaten  dan  kota  di  Provinsi  Kalimantan  Selatan  yaitu  dari  Kota Amuntai, Astambul, Barito Kuala, Gambut, Kandanga, Babirik, Tabalong, dan Tanah Laut. Isolasi dan analisis DNA tanaman mangga kasturi dilakukan di laboratorium penelitian Fakultas Bioteknologi Universitas Katolik  Indonesia Atma  Jaya,  Jakarta. Analisis  keragaman  genetik  mangga  kasturi  dimulai  dengan tahap ampliﬁ kasi DNA genom (gDNA) menggunakan primer rbcL dan matK . Hasil isolasi DNA sampel menunjukkan konsentrasi yang tinggi yaitu 17-91 ng/µL dengan kemurnian berkisar antara 1,72-1,92 ng/µL. Pada saat PCR dilakukan dengan primer rbcL dan matK , dari 8 wilayah di Kalimantan Selatan, terdapat 5 sampel (Babirik, Tabalong, Kandangan, Amuntai, Batola, Gambut, dan Tanah Laut) dapat terampliﬁ kasi  menggunakan  primer rbcL dan  6  sampel  (Tanah  Laut,  Babirik,  Tabalong,  Amuntai, Gambut, dan Kandangan) terampliﬁ kasi menggunakan primer matK . Hubungan antara mangga kasturi di Kalimantan Selatan dapat dilihat dari pohon ﬁ logenetiknya.
Kata kunci: DNA barcoding , ﬁ logenetik, genetik, kasturi, Mangifera .
Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia
Gen rbcL dan matK berukuran panjang sekitar 500 - 1400 bp, sehingga menyediakan banyak karakter untuk  kajian  ﬁ logenetik (6) .  Peranan  gen rbcL yang mengkode  protein  RuBisCO  diduga  menyebabkan sekuen gen ini memiliki tingkat mutasi yang rendah dibandingkan dengan gen barcode lain dalam cpDNA sehingga  tingkat  kesamaan  antar  spesies  cukup tinggi (7,8) . Tingkat mutasi yang rendah ini memberikan keuntungan untuk  kajian mendalam tentang  variasi genetik dan ﬁ logenetik intraspesies.
Penelitian  tentang  studi  filogenetik  jenis Mangifera Indonesia  berdasarkan  penanda rbcL sudah pernah dilakukan oleh Suparman (6) . Akan tetapi untuk jenis mangga kasturi ( Mangifera casturi ) asal Kalimantan Selatan belum pernah dilaporkan. Tujuan dari penelitian ini adalah merekonstruksi hubungan kekerabatan spesies Mangifera casturi yang berasal dari delapan Kabupaten Kota di Kalimantan Selatan dan  kerabatnya  berdasarkan  sekuen  gen rbcL dan juga matK .

## BAHAN DAN METODE
BAHAN. Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian adalah  daun  mangga  kasturi  yang  diambil  dari  8 Kabupaten Kota di Kalimantan Selatan (Gambar 1), tips ukuran 1000 µL, 200 µL, 10 µL, agaros gel, PCR kit, etanol, dan kit ekstraksi.
Alat . Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain pipet mikro, mortal, pastel, tube rack, mesin  PCR,  mesin  elektroforesis,  hot  plate,  gel doc, sentrifuse, UV transluminator, gelas ukur, dan timbangan.

## PENDAHULUAN
INFORMASI  keragaman  genetik,  berupa  tingkat dan distribusi keragaman yang ada pada suatu jenis tanaman  sangat  penting  untuk  diketahui  berkaitan dengan  penyusunan  strategi  pemuliaan  ( breeding ) dan  juga  konservasinya.  Informasi  yang  lengkap dapat mendukung  upaya pemuliaan  dan  konservasi tanaman mangga kasturi termasuk informasi terkait keanekaragaman genetik yang masih belum banyak dilakukan.  Keanekaragaman  genetik  timbul  karena setiap individu mempunyai pola keterulangan susunan basa  nitrogen yang  khas.  Keanekaragaman  genetik terjadi melalui mekanisme mutasi dan rekombinasi (1) . Salah  satu  pendekatan  yang  digunakan  untuk mengkaji  keanekaragaman  genetik  adalah  dengan DNA barcode . DNA barcode yang sering digunakan pada  tanaman  umumnya  adalah  DNA  kloroplas (cpDNA) (2) .  Istilah  DNA barcode mengisyaratkan bahwa setiap spesies makhluk hidup dicirikan oleh suatu sekuen atau urutan DNA tertentu sehingga dapat menunjukkan variasi genetik di dalam suatu spesies dan antar spesies. DNA barcode merupakan salah satu sarana molekuler dan bioinformatik untuk identiﬁ kasi spesies  biologi.  Gagasan  mendasar  pemanfaatan DNA barcode adalah bahwa analisis variabilitas pada satu  atau  beberapa  penanda  molekuler  terstandar yang  memungkinkan  untuk  membedakan  tingkat taksonomi spesies. Penggunaan DNA barcode untuk analisis  variasi  genetik  didasarkan  pada  asumsi bahwa variasi genetik antar spesies melebihi variasi intraspesies (3) .  DNA barcode digunakan  untuk  dua tujuan, yaitu identiﬁ kasi molekuler spesies yang sudah terdeskripsikan  maupun  untuk  spesies  yang  belum terdeskripsikan.  DNA barcode dapat  memberikan kontribusi  kuat  untuk  penelitian  keanekaragaman hayati dan taksonomi.
Sumber  karakter  data  untuk  mengidentiﬁ kasi keanekaragaman  genetik  secara  molekuler  dapat diperoleh  dari  DNA  inti  (nDNA),  kloroplas (cpDNA)  dan  mitokondria  (mtDNA).  Sumber  data keanekaragaman genetik yang banyak dipilih untuk objek  penelitian  tanaman  adalah  cpDNA.  cpDNA mengontrol  produksi  RNA  transfer  (tRNA),  RNA ribosomal (rRNA), dan sebagian besar protein yang terdapat  di  dalam  organel  kloroplas (4) .  Setidaknya terdapat  19  DNA  kloroplas  yang  telah  diketahui urutannya,  terdapat  ratusan  gen  yang  terdapat  di dalam  cpDNA  genom.  Tumbuhan  berpembuluh, umumnya memiliki kemiripan kandungan dan fungsi gen dalam cpDNA (5) . Sekuen DNA yang berpeluang untuk  dijadikan  sebagai  DNA barcode adalah  gen rbcL dan matK .
Gambar 1. Peta wilayah Kalimantan Selatan.
METODE. Pengambilan Sampel. Sampel daun mangga  kasturi  dalam  penelitian  ini  diambil  dari 8  daerah  Kabupaten  Kota  yang  ada  di  Kalimantan Selatan.  Sampel  diambil  dari  daerah Amuntai, Astambul,  Barito  Kuala,  Gambut,  Kandangan, Babirik, Tabalong, dan Tanah Laut.
Isolasi  DNA. Metode  yang  digunakan  untuk ekstraksi DNA adalah metode CTAB ( Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide ) yang telah dimodiﬁ kasi. Daun dipotong  kecil-kecil,  kemudian  digerus  dengan menambahkan nitrogen cair dan diekstraksi dengan buﬀ er ekstraksi sebanyak 750 µL. Genomik DNA hasil ekstraksi ditambahkan dengan larutan TE sebanyak 30  µL,  divortex  dan  kemudian  disimpan  didalam freezer (9) . PCR  ( Polymerase  Chain  Reaction ). Proses PCR  diawali  dengan  membuat  campuran  antara genomik DNA 1,5 µL dicampurkan dengan ( HotStar Mix 7,5  µL, Nuclease-free  water 2,5  µL  dan primer  1,5  µL). Sequence  primer  forward  rbcL (5-TGTCACCACCAACAGAGACTAAAGC-3), p r i m e r r e v e r s e r b c L ( 5 - G T A A A A T C A A G T C C A C C R C G -   3 ) ( 1 0 ) , s e q u e n c e   p r i m e r   f o r w a r d m a t K (5-ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC-3), d a n p r i m e r   r e v e r s e   m a t K ( 5 - CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG-  3) (11) . Proses PCR dilakukan dengan tahapan pre-denaturasi 95 °C selama 1 menit untuk 1 siklus dan dilanjutkan dengan tahapan denaturasi 95 °C 15 detik, annealing 52 °C 30 detik, ekstensi 72 °C 45 detik sebanyak 35 siklus dan ekstensi akhir 72 °C selama 3 menit 1 siklus. Pengujian  polimorﬁ sme  dilakukan  dengan  melihat pita hasil PCR yang divisualisasi berdasarkan hasil elektroforesis. Target PCR gene rbcL adalah 700 bp ( base pair ) dan 1500 bp untuk gen matK (12) . DNA  Sequencing dan Analisis  Filogenetik . Produk PCR disequencing untuk melihat urutan basa
DNA  yang  terdapat  disetiap  sampel  daun  mangga kasturi berdasarkan hasil ampliﬁ kasi dengan primer rbcL dan matK .  Proses sequencing dilakukan  oleh Macrogen .  Kemudian  untuk  proses  pencarian kesamaan  urutan  basa  nitrogen  DNA  dilakukan dengan  analisis  BLAST  secara online (http://blast. ncbi.nlm.gov/Blast.cgi).  Untuk analisis ﬁ logenetik, sekuens disejajarkan dengan menggunakan CLUSTAL X (13) .  Pohon  ﬁ logenetik  dibangun  dengan  metode neighbor joining dan strain Streptococcus pyogenes digunakan sebagai out grup (14) .

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi  DNA. Metode  yang  digunakan  untuk ekstraksi DNA adalah metode CTAB ( Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide ) yang telah dimodiﬁ kasi. Daun dipotong  kecil-kecil,  kemudian  digerus  dengan menambahkan nitrogen cair dan diekstraksi dengan buﬀ er ekstraksi sebanyak 750 µL. Genomik DNA hasil ekstraksi ditambahkan dengan larutan TE sebanyak 30  µL,  divortex  dan  kemudian  disimpan  didalam freezer (15) .
Berdasarkan  Gambar  2  dapat  diketahui  bahwa genomik DNA dari sampel mangga kasturi berhasil diisolasi dengan baik yang ditunjukkan oleh pita yang terbentuk  tidak  mengalami smear saat  dilakukan elektroforesis gel. Sampel DNA yang konsentrasinya rendah  adalah  sampel  Kandangan  (HSS)  dengan konsentrasi hanya 17,1 ng/µL, sedangkan yang paling tinggi terdapat pada sampel Amuntai (HSU) dengan nilai konsentrasi 191,4 ng/µL (Tabel 1).
H a s i l   k e m u r n i a n   D N A  b e r d a s a r k a n spektrofotometer menghasilkan sampel yang murni yaitu sampel kasturi yang berasal dari daerah Tabalong dengan nilai 260/280 sebesar 1,91 dan 260/230 sebesar 1,78. Nilai konsentrasi genomik DNA yang didapatkan dalam  penelitian  ini  sudah  cukup  tinggi  dan  murni
Gambar 2. Hasil elektroforesis genomik DNA. Keterangan sumur: (1) Sampel Kasturi berasal dari Amuntai, (2) Astambul, (3) Batola, (4) Gambut, (5) Kandangan, (6) Babirik, (7) Tabalong, dan (8) Tanah Laut.
waktu  relatif  singkat  dan  memudahkan  teknik  lain yang menggunakan DNA seperti elektroforesis dan sekuensing.  Hasil  amplifikasi  gen matK dengan PCR  mangga  kasturi  yang  dilakukan  dalam  proses elektroforesis  dapat  dilihat  pada  (Gambar  3). Berdasarkan  ukuran  DNA ladder ,  menunjukkan bahwa pita DNA mangga kasturi dengan primer rbcL berada pada ukuran ±600 bp.
Barcode DNA berupa hasil penjajaran sekuens DNA dari primer forward dan primer reverse mangga kasturi (Gambar 4) menunjukkan kemiripan genetik yang lestari. Dengan demikian bahwa kedua primer
dilihat dari hasil pembacaan spektrofotometer 260/230 yang lebih dari 1,0 (16) . PCR  ( Polymerase  Chain  Reaction ). Hasil isolasi DNA tanaman mangga kasturi yang diperoleh dilanjutkan ke proses ampliﬁ kasi PCR menggunakan pemanasan. Dalam pemanasan ini DNA akan melewati 5  tahapan  yaitu  pradenaturasi  DNA,  denaturasi DNA,  penempelan  primer,  polimerisasi  DNA  dan polimerisasi  DNA  akhir (17) .  Tahapan  ini  disebut dengan  proses  replikasi  DNA  secara  enzimatik tanpa  menggunakan  organisme.  Dengan  teknik  ini, DNA  dapat  dihasilkan  dalam  jumlah  besar  serta
Tabel 1. Hasil pengukuran konsentrasi dan kemurnian genomik DNA.
No. Nama sampel Konsentrasi (ng/µL) A 260/280 A 260/230 Volume (µL) 1 Amuntai (HSU) 191,4 1,79 0,66 50 2 Astambul 157,9 1,89 0,89 50 3 Batola 66,6 1,77 0,73 50 4 Gambut 170,9 1,72 0,68 50 5 Kandangan (HSS) 17,1 1,75 0,33 50 6 Rawa-Rawa Babirik 23,0 1,79 1,78 50 7 Tabalong 22,1 1,91 1,78 50 8 Tanah Laut 81,5 1,75 2,27 50
Gambar 3. Hasil PCR sampel mangga kasturi dengan primer matK . Keterangan : Sumuran (1) Sampel kasturi berasal dari Amuntai, (2) Astambul, (3) Batola, (4) Gambut, (5) Kandangan, (6) Babirik, (7) Tabalong, dan (8) Tanah Laut.
Gambar 4. Pensejajaran 8 sequence sampel DNA mangga kasturi.
tersebut  teramplifikasi  gen matK dalam  teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) dengan baik (18) . Konstruksi  Pohon  Filogenetik. Urutan  DNA hasil ampliﬁ kasi ditentukan dan disejajarkan dengan urutan  dasar  yang  diambil  dari  database  NCBI. Sequence  alignment ditemukan  ±  600  bp  untuk primer rbcL dan 1500 bp untuk primer matK . Hasil pencarian dengan metode BLAST di NCBI-GenBank menunjukkan bahwa semua mangga kasturi memiliki kemiripan dengan spesies Mangifera indica sebesar 99,88%  (nomor  akses:  MN711724.1)  untuk matK primer, dan primer rbcL memiliki kemiripan 100% dengan Mangifera  indica (Acc  no  MN711724.1). Hasil ini belum pernah dilaporkan sebelumnya.
Selanjutnya  hasil  penelitian  ini  dilanjutkan dengan membuat pohon ﬁ logenetik untuk mengetahui hubungan  kekerabatan  antar  spesies.  Pensejajaran urutan mangga kasturi  yang diamati dengan urutan mangga  lain  yang  diperoleh  dari  database  NCBI- GenBank  dilakukan  menggunakan  Clustal  X. Selanjutnya  hasil  alignment  tersebut  dimasukkan ke dalam NJPlot untuk membuat pohon ﬁ logenetik. Pohon ﬁ logenetik yang dibangun berdasarkan urutan rbcL dan matK tersebut menunjukkan bahwa mangga kasturi dari Kalimantan Selatan termasuk dalam famili Mangifera indica clade (17) (Gambar 5).

## SIMPULAN
Penelitian  ini  menunjukkan  bahwa  dengan
menggunakan  primer  spesiﬁ k rbcL dan matK ,  dari 8 wilayah di Kalimantan Selatan, terdapat 5 sampel kasturi  (Babirik,  Tabalong,  Kandangan, Amuntai, Batola, Gambut, dan Tanah Laut) dapat diampliﬁ kasi menggunakan primer rbcL dan 6 sampel (Tanah Laut, Babirik, Tabalong, Amuntai, Gambut, dan Kandangan) dapat diampliﬁ kasi menggunakan primer matK .

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Fakultas Farmasi  Universitas  17 Agustus  1945,  Jakarta, Indonesia  yang  telah  menyediakan  fasilitas  yang dibutuhkan untuk melaksanakan pekerjaan ini.

## DAFTAR PUSTAKA
1.  Indrawan  M,  Primack  RB,  Supriatna  J.  Biologi Konservasi:  Edisi  Revisi. Yayasan  Pustaka  Obor Indonesia; 2012 Mar 20.
2.  Geﬀ en E, Luikart G, Waples RS. Impacts of modern molecular genetic techniques on conservation biology. Key topics in conservation biology. 2007:46.
3.  Mayer  F,  Dietz  C,  Kiefer A.  Molecular  species identiﬁ cation boosts bat diversity. Frontiers in zoology. 2007 Dec;4(1):1-5.
4.  Hidayat T, Pancoro A, Kusumawaty D, Eiadthong W. Development matK gene as DNA barcode to assess evolutionary relationship of important tropical forest tree genus Mangifera ( Anacardiaceae ) in Indonesia and Thailand. Jurnal Teknologi. 2012 Sep 15;59(1): 17-20.
Gambar 5. Kladogram metode neighbor-joining untuk gen rbcL dan matK.
43 SAGALA ET AL.
5.  Pierce BA. Genetiks: A Conceptual Approach. New York: W. H. Freeman and Company. 2002.
6.  Suparman.  Desain  Primer  PCR  In  Silico  untuk Ampliﬁ kasi Gen rbcL pada Genus Mangifera . Jurnal Bioedukasi. 2013; 2(1):163-170.
7.  Teletchea  F.  Molecular  identification  methods  of ﬁ sh species: reassessment and possible applications. Reviews  in  Fish  Biology  and  Fisheries.  2009 Sep;19(3):265-93.
8.  Chen X, Liao B, Song J, Pang X, Han J, Chen S. A fast SNP  identiﬁ cation and analysis of intraspeciﬁ c variation  in  the  medicinal  Panax  species  based  on DNA barcoding. Gene. 2013 Nov 1;530(1):39-43.
9.  Sogandi  S,  Riyanto  J.  Investigating  the  anti-acne potential  of  endophytic  bacterial  extracts  isolated from Mangifera casturi in indigenous South Borneo,
Indonesia. Journal of Agriculture and Applied Biology. 2020 Dec 24;1(2):54-63.
10.  Erwina  J,  Fitmawati,  Nery  S. Analisis  Filogenetik Mangifera odorata Sumatera Tengah dan Kerabatnya Menggunakan  Gen  rbcL.  Jurnal  Riau  Biologia. 2016;1(2): 155 -159
11.  Fattah  YR,  Kamu  VS,  Runtuwene  MR,  Momuat LI.  Identifikasi  barcode  tumbuhan  gedi  merah ( Abelmoschus  manihot L.  medik)  dan  gedi  hijau ( Abelmoschus  moschatus )  berdasarkan  gen matK . Jurnal MIPA. 2014;3(2):120-4.
12.  Sogandi  S, Triandriani  W,  Saputri  D,  Suhendar  U. Antioxidant Activity of Endophytic Bacterial Extract Isolated from Clove Leaf ( Syzygium aromaticum L.).
Journal of Agriculture and Applied Biology. 2020 Jun 5;1(1):9-17.
13.  Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M,  Kumar  S.  MEGA5:  molecular  evolutionary genetics  analysis  using  maximum  likelihood, evolutionary  distance,  and  maximum  parsimony methods. Molecular biology and evolution. 2011 Oct 1;28(10):2731-9.
14.  Cheng  T,  Xu  C,  Lei  L,  Li  C,  Zhang  Y,  Zhou  S. Barcoding  the  kingdom  Plantae:  new  PCR  primers for ITS regions of plants with improved universality and  speciﬁ city.  Molecular  ecology  resources.  2016 Jan;16(1):138-49.
15.  Ali MA, Gyulai G, Hidvegi N, Kerti B, Al Hemaid FM,  Pandey AK,  Lee  J.  The  changing  epitome  of species identiﬁ cation–DNA barcoding. Saudi journal of biological sciences. 2014 Jul 1;21(3):204-31.
16.  Fitmawati F, Swita A, Sofyanti N, Herman H. Analisis Kekerabatan  Morfologi Mangifera Dari  Sumatera Tengah. Floribunda. 2013;4(7).
17.  Priyono, Putranto RA. Molecular markers and their application  for  DNA  fingerprinting  and  genetic diversity studies in Coﬀ ea species. Menara Perkebunan. 2014; 82: 39-50.
18.  Arif IA, Khan HA, Bahkali AH, Al Homaidan AA, Al Farhan AH, Al Sadoon M, Shobrak M. DNA marker technology for wildlife conservation. Saudi journal of biological sciences. 2011 Jul 1;18(3):219-25.