ejournal2.undip.ac.id/index.php/baf/index
Bobot Badan Mencit ( Mus musculus L.) setelah Pemberian Ekstrak Ethanol Daun Nimba ( Azadirachta indica ) Secara Oral Selama 21 Hari
Mice ( Mus musculus L.) Body Weight After Treated Orally with Ethanolic Neem ( Azadirachta Indica ) Leaf Extract During 21 Days

## Agung Janika Sitasiwi
Departemen Biologi, Fakultas Sains dan Matematika, Universitas Diponegoro Jl. Prof. Soedarto, SH, Tembalang, Semarang
Email: agssiwi@yahoo.co.id
Diterima 28 Desember 2017 / Disetujui 23 Januari 2018

## ABSTRAK
Penggunaan Nimba sebagai tanaman obat perlu dikaji dengan lebih teliti karena memiliki beberapa senyawa yang  bersifat  toksik.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  menguji  pengaruh  penggunaan  ekstrak  ethanol  daun A. indica sebagai  bahan  obat  herbal  terhadap  perubahan  bobot  badan    mencit  jantan.  Ekstraksi  daun  Nimba dilakukan  dengan teknik maserasi menggunakan ethanol 70%. Dua puluh empat mencit Swiss Webster jantan dewasa  dengan  usia  2.5  bulan  digunakan  sebagai  hewan  uji.  Penelitian  dilakukan  menggunakan  Rancangan Acak Lengkap, dengan empat perlakuan dan 6 ulangan. Perlakuan yang diberikan yaitu P0 (akuades), P1, P2, dan P3 berupa ekstrak ethanol daun Mimba dengan dosis 8, 11.2 dan 14 mg/kgBB/hari. Perlakuan diberikan secara oral selama 21 hari. Pengamatan bobot badan dilakukan pada awal perlakuan, dilanjutkan setiap tujuh hari.  Konsumsi  pakan  diukur  setiap  tiga  hari.  Konsumsi  minum  diukur  setiap  hari.    Data  dianalisa  dengan ANOVA dilanjutkan dengan uji DMRT. Hasil penelitian menunjukkan bahwa rerata bobot badan hewan uji pada akhir perlakuan adalah 36.62±3.52 untuk P0, 33.02±1.69 untuk P1, 32.40±2.89 untuk P2 dan 32.93±1.79 untuk  P3.  Bobot  badan  hewan  uji  kelompok  kontrol  menunjukkan  perbedaan  bermakna  (p<0.05)  dengan kelompok perlakuan P1, P2 dan P3. Konsumsi minum hewan uji kelompok kontrol menunjukkan perbedaan bermakna  (p<0.05)  dengan  kelompok  perlakuan  P2  dan  P3  tetapi  konsumsi  pakan  menunjukkan  perbedaan tidak  bermakna  (p>0.05).  Dapat  disimpulkan  bahwa  paparan  ekstrak  ethanol  daun  Nimba  menyebabkan penurunan bobot badan hewan uji.

## Kata kunci: nimba, bobot badan, mencit

## ABSTRACT
The use of Neem as a medicinal plant needs to be studied more thoroughly because it has several compounds that are toxic. The aim of this research was to examine the effect of ethanol extract of A. indica as an herbal medicine on male mice body weight changes has been done.  Neem leaf extraction was done by a maceration technique using ethanol 70%. Twenty-four of Swiss Webster male mice with 2.5 months in age were used as testing animals. The study was conducted using Completely Randomized Design, with four treatments  group and  6  replications in  each.  The  treatments  groups  were  P0 that  were  treated  with  tap  water;  P1,  P2,  and  P3 groups which treated with 8, 11.2 and 14 mg/kgBW/day respectively. Treatment was given orally for 21 days. Body  weight  observation  was  done  at  the  beginning  of  treatment,  continued  every  seven  days.  Feed consumption was measured every three days. Consumption of drinking water was measured daily. Data were analyzed with ANOVA followed by DMRT test. The results showed that the mean of animal body weight was 36.62±3.52; 33.02±1.69; 32.40±2.89; 32.93±1.79 for P0, P1, P2 and P3 groups respectively. The body weight of  control  group  showed  significantly  different  (p<0.05)  compared  with  all  of  treated  groups.  The  water consumption  of  control  group  showed  significantly  differences  (p<0.05)  compared  to  P2  and  P3  of  treated groups,  but  there  is  no  significant  difference  (p>0.05)  in  feed  consumption.  It  could  be  concluded  that ethanolic Neem leaves extract exposure causes body weight decreases of mice.
Keywords: neem, body weight, mice

## PENDAHULUAN
Nimba  ( Azadirachta  indica )    merupakan tanaman yang telah dikenal sebagai tanaman obat. Sharma  (2013)  menyatakan  bahwa  ekstrak tanaman  nimba  memiliki  efek  antiinflamasi, antidiabetes  serta  memiliki  kemampuan  sebagai antikanker.  Ekstrak  Nimba  juga  dapat  digunakan sebagai  antimalaria,  spermisida,  antituberkulosis, antipiretik,  antivirus,  antijamur,  serta  antiseboroik (Auta  dan  Hasan,  2016).  Tanaman  Nimba  juga memiliki  kemampuan  sebagai  antifertilitas  (Auta and Hasan, 2016) tetapi mekanisme kerja senyawa tersebut  belum  diketahui  dengan  pasti  (Sharma, 2013).  Umadevi  (2013)  menyatakan  bahwa  efek antifertilitas esktrak Nimba bersifat temporer, serta menunjukkan  hasil  yang  sama  pada  hewan  jantan maupun  betina  (Suryawanshi,  2011).  Hasil penelitian  Sitasiwi et  al .  (2017a)  membuktikan bahwa  aksi  antifertilitas  esktrak  daun  Nimba menyebabkan level hormon estradiol 17-β mengalami penurunan yang signifikan pada mencit betina.
Tanaman  Nimba  tidak  hanya  mengandung senyawa  golongan  steroid  seperti  campesterol, beta-sitosterol, stigmasterol tetapi juga mengandung  beberapa  senyawa  yang  bersifat toksik.    Beberapa  senyawa  yang  bersifat  toksik adalah  azadirachtin,  nimbin,  nimbidin,  dan salannin (Suryawanshi, 2011). Pankaj et al . (2011) menyatakan  bahwa  nimbidin  merupakan  senyawa utama  yang  terdapat  dalam  esktrak  tanaman nimba. Senyawa tersebut menunjukkan sifat toksik sampai  konsentrasi  tertentu.  Senyawa  lain  yang diduga  memiliki  aktivitas  toksik  yang  tinggi adalah  azadirachtin  (Pankaj et  al .,  2011;  Hashmat et al ., 2012; Koriem, 2013).
Penggunaan tanaman sebagai obat
tradisional  umumnya  dilakukan  dengan  alasan khasiat senyawa kimia yang terkandung didalamnya,  walaupun  dapat  menyebabkan  efek toksik  (Omotayo et  al .,  2012).  Efek  toksik  suatu obat  herbal  tradisional  yang  memiliki  aktivitas farmakologi  harus  diuji  sebelum  obat  herbal tersebut  digunakan  dalam  pelayanan  kesehatan. Hal  tersebut  sesusai  dengan  Joshi et  al .  (2013) yang  menyatakan  bahwa  metode  baku  pengujian suatu senyawa anti-fertilitas terhadap hewan harus
dilakukan dengan tepat karena senyawa yang sama juga  berpotensi  mengganggu  atau  mempengaruhi fungsi  beberapa  organ  dalam  tubuh  yang  lain. Pengujian  toksisitas  tanaman  obat  tradisional  juga dapat  memberi  keyakinan  yang  besar  sehingga dapat  diterima  oleh  masyarakat  luas  (Umadevi, 2013).
Sitasiwi dan Isdadiyanto (2017)
membuktikan  bahwa  penggunaan  ekstrak  ethanol daun  Nimba  sebagai  senyawa  antifertilitas  sampai dosis 14 mg/kgBB/hari selama 21 hari menyebabkan  penurunan  kadar  Hb  dan  eritroist mencit  jantan  yang  berbeda  bermakna.  Hal tersebut membuktikan terdapat efek yang merugikan.  Kupradinun et  al .  (2012)  menyatakan bahwa  efek  samping  nimba  diduga  dapat menyebabkan  kerusakan  struktur  hati  dan  ginjal. Sitasiwi et  al .  (2017b)  telah  membuktikan  bahwa ekstrak  ethanol  daun  Mimba  menyebabkan peningkatan  bobot  hepar  dan  nilai Hepatosomatic Index mencit.
Hepatosomatic  Index merupakan  nilai  yang menggambarkan  jumlah  senyawa  toksik  yang masuk  serta  menggambarkan  ketersediaan  energi dalam  tubuh  (Nunes et  al .,  2011).  Colville  dan Bassert (2008) menyatakan bahwa hepar merupakan  organ  yang  berfungsi  sebagai  tempat glukoneogenesis  sehingga  gangguan  hepar  akan menyebabkan  penurunan  ketersediaan  energi. Omotayo et  al .  (2012)  menyatakan    gangguan ketersediaan energi diduga terjadi karena kenaikan enzim  ALT,  AST,  ALP  dan  GGT  yang menandakan  kerusakan  hepar  serta  terjadinya hemolisis  dan  obstruksi  pada  duktus  biliaris. Kedua hal tersebut diduga  merupakan faktor yang menyebabkan  penurunan  bobot  badan.    Berlatar belakang  hal  tersebut,  penelitian  ini  dilakukan untuk  membuktikan  efek  pajanan  ekstrak  ethanol daun  nimba  terhadap  perubahan  bobot  badan mencit jantan.  Hasil  penelitian  ini diharapkan jadi bahan rujukan tentang tingkat keamanan penggunaan  esktrak  ethanol  daun  nimba  sebagai senyawa  anti-fertilitas  terhadap  perubahan  bobot badan.

## METODE PENELITIAN

## Hewan Uji
Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit jantan dewasa sebanyak 24 ekor. Usia  hewan  uji  berumur  2.5  bulan,  dengan  bobot badan  berkisar  25-30  g.  Aklimasi  hewan  uji dilakukan  selama  dua  minggu  dalam  kondisi laboratorium,  masing-masing  dengan  kepadatan  3 ekor  per  kandang.  Hewan  uji  diberi  pakan  berupa pellet 594 dan air minum berupa air kran secara ad libitum .
Cara  Pembuatan  ekstrak  ethanol  daun A. Indica
Pemilihan dan persiapan daun Nimba untuk esktraksi dilakukan dengan metoda yang dilakukan oleh  Sitasiwi et al . (2017a). Ektraksi ethanol 70% dengan metode maserasi dilakukan di Laboratorium Kimia Universitas Negeri Semarang. Serbuk  hasil  akhir  ekstraksi  ethanol  selanjutnya dibuat  sediaan  bahan  perlakuan  dengan  dosis  8.4, 11.2 dan 14 mg/kgBB/hari.

## Cara Perlakuan
Penelitian ini meggunakan Rancangan Acak Lengkap dengan 4 perlakuan (P0, P1, P2 dan P3), masing-masing  dengan  6  ulangan.  Kelompok  P0 adalah  hewan  uji  yang  diberi  perlakuan  akuades, sedangkan  P1,  P2  dan  P3  merupakan  hewan  uji yang  masing-masing  diberi  esktrak  ethanol  daun Nimba  dengan  dosis  8.4;  11.2;  14  mg/ekor/hari. Perlakuan  diberikan  setiap  pagi  hari  selama  21 hari.
Bahan  uji  berupa  serbuk  ekstrak  ethanol daun  Nimba  pada  setiap  dosis  dilarutkan menggunakan  air  hangat.  Bahan  perlakuan diberikan  menggunakan  jarum  gavage,  dengan volume  0.3  mL/mencit/hari.  Pemberian  bahan  uji dilakukan setiap pagi hari, pada pukul 09.00-10.00 pagi.

## Pengambilan Data
Data  penelitian  berupa  bobot  badan  hewan uji  diukur  pada  awal  perlakuan,  selama  perlakuan
dengan  interval  satu  minggu,  serta  pada  akhir perlakuan. Data pendukung berupa rataan konsumsi  pakan  dan  air  minum  hewan  uji  selama perlakuan diukur setiap hari.

## Analisis Data
Data  berupa  bobot  badan,  konsumsi  pakan dan  minum  dianalisis  dengan  ANOVA.  Hasil ANOVA menunjukkan perbedaan bermakna maka dilanjutkan  dengan  uji  DMRT  pada  taraf signifikansi 5%.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Analysis Of Varians (ANOVA) dan uji lanjut  Duncan  pada  penelitian  mengenai  efek ekstrak ethanol Daun Nimba terhadap pertambahan  berat  badan  menit  ditunjukkan  pada Tabel  1.  Rerata  bobot  badan  hewan  uji menunjukkan  perbedaan  tidak  bermakna  (p>0.05) pada  awal  perlakuan  sampai  perlakuan  hari  ke-7 (Minggu  I).  Hal  tersebut  menunjukkan  bahwa  di awal perlakuan bobot hewan uji relatif seragam/homogen. Proses fisiologi hewan uji juga tidak  terpengaruh  oleh  paparan  bahan  uji  sampai perlakuan  hari  ke-7.  Hal  tersebut  ditunjukkan dengan bobot badan yang tidak berbeda bermakna pada perlakuan hari ke-7 (Minggu II).
Rerata  bobot  badan  hewan  uji  kelompok kontrol (P0) sampai perlakuan hari ke-14 (Minggu II)  menunjukkan  perbedaan  tidak  bermakna (p>0.05)  kelompok  perlakuan  1  (P1),  tetapi menunjukkan perbedaan bermakna dengan kelompok  perlakuan  P2  dan  P3.  Hal  tersebut membuktikan  bahwa  perlakuan  ekstrak  ethanol daun  Nimba  sampai  dengan  konsentrasi  11.2 mg/ekor/hari diduga sudah menyebabkan gangguan  fungsi  organ  yang  menyebabkan  bobot badan kelompok perlakuan berbeda bermakna.
Tabel  1  juga  menunjukkan  rerata  bobot badan  hewan  uji  kelompok  kontrol  (P0)  berbeda bermakna  (p<0.05)  dengan  semua  hewan  uji kelompok  perlakuan  ekstrak  ethanol  daun  Nimba (P1,  P2  dan  P3)  pada  hari  perlakuan  ke-21 (Minggu  III).  Bobot  badan  hewan  uji  kelompok kontrol  menunjukkan  bobot  badan  yang  lebih tinggi  jika  dibandingkan  dengan  bobot  hewan  uji
kelompok  perlakuan.  Hal  tersebut  dapat  diartikan bahwa  paparan  ekstrak  ethanol  daun  Nimba dengan  dosis  8.4  mg/ekor/hari  memberikan
pengaruh  yang  signifikan  terhadap  bobot  badan, jika paparan diberikan lebih dari 14 hari.
Tabel 1.  Rerata bobot badan (gram) mencit selama perlakuan esktrak ethanol daun Nimba secara oral selama 21 hari
Kelompok Awal X ± SD Minggu I X ± SD Minggu II X ± SD Minggu III X ± SD P0 ( 0.3 mL akuades/ekor/hari) 26.86 a ± 2.12 29.67 a ± 2.97 33.96 a ± 3.35 36.62 a ± 3.52 P1 (8.4 mg/kgBB/hari) 27.23 a ± 1.56 29.73 a ± 3.56 33.65 a ± 3.46 33.02 b ± 1.69 P2 (11.2 mg/kgBB/hari) 25.95 a ± 2.55 28.78 a ± 2.34 30.07 b ± 0.74 32.40 b ± 2.89 P3 (14 mg/kgBB/hari) 26.93 a ± 1.47 29.57 a ± 3,21 30.18 b ± 0.31 32.93 b ± 1.79
Keterangan:  Data disajikan berupa rataan (X) ± simpangan baku (SD) Rerata yang diikuti superskrip yang  sama pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan tidak bermakna dengan uji ANOVA pada taraf kepercayaan 95
Salah satu faktor yang mempengaruhi bobot badan  adalah  nutrisi  yang  dikonsumsi  hewan  uji. Tabel  2  menunjukkan  bahwa  rerata  konsumsi pakan  pada  kelompok  kontrol  (P0)  yang  berbeda tidak  bermakna  dengan  kelompok  perlakuan  (P1,
P2,  dan  P3).  Konsumsi  air  minum  hewan  uji kelompok  kontrol  menunjukkan  perbedaaan  tidak bermakna  dengan  hewan  uji  kelompok  P1,  tetapi menunjukkan  perbedaan  bermakna  dengan  hewan uji kelompok P2 dan P3.
Tabel 2.  Rerata konsumsi pakan dan air minum harian mencit jantan selama perlakuan esktrak ethanol daun Nimba secara oral selama 21 hari
Kelompok Konsumsi pakan (gram/ekor/hari) X ± SD Konsumsi air minum (mL/ekor/hari) X ± SD P0 ( 0.3 mL akuades/ekor/hari) 5.03 a ± 0.62 4.42 a ± 0.92 P1 (8.4 mg/kgBB/hari) 4.58 a ± 0.13 5.78 a ± 0.52 P2 (11.2 mg/kgBB/hari) 4.32 a ± 0.36 6.75 b ± 0.37 P3 (14 mg/kgBB/hari) 4.16 a ± 0.62 7.23 b ± 0.13
Keterangan:   Data disajikan berupa rataan (X) ± simpangan baku (SD)  Rerata  yang diikuti  superksrip  yang sama  pada kolom  yang  sama  menunjukkan  perbedaan  tidak  bermakna  dengan  uji  ANOVA  pada  taraf  kepercayaan 95%
Hasil penelitian yang menunjukkan
penurunan  bobot  badan  sesuai  dengan  penelitian Ghimeray et al . (2008). Penelitian ini menggunakan  ethanol  sebagai  bahan  ekstraksi daun  Nimba.  Ethanol  merupakan  pelarut  yang dapat  melarutkan  zat  yang  memiliki  polaritas rendah  sampai  tinggi  (Samsudin,  2011).  Ekstraksi ethanol bagian tanaman Nimba dapat menyebabkan  beberapa  senyawa  aktif  dapat terisolasi. Senyawa tersebut diantaranya azadirachtin, nimbin, nimbidin. Nimbin
merupakan  senyawa  yang  berperan  sebagai spermisidal (Pankaj et al ., 2011).
Azadirachtin  merupakan  senyawa  yang bersifat  sitotoksik  (Kupradinun et  al .,  2012;  Auta and  Hassan,  2016)  sehingga  diduga  menyebabkan gangguan  fungsi  dan  struktur  organ,  termasuk hepar  dan  ginjal  (Kupradinun et  al .,  2012).  Efek sitotoksik  tersebut  menyebabkan  hepar  hewan  uji pada  kelompok  perlakuan  mengalami  penurunan kemampuan  dalam  mengkonversi  nutrisi  menjadi sumber  energi  dalam  tubuh  (Auta  and  Hassan, 2016).  Hal  tersebut  menyebabkan  perbedaan

## Bobot Badan Mencit (Mus musculus L.) setelah Pemberian Ekstrak Ethanol Daun Nimba (Azadirachta indica) Secara Oral Selama 21 Hari
bermakna  bobot  badan  hewan  uji  kelompok kontrol  jika  dibandingkan  dengan  kelompok perlakuan,  walaupun  konsumsi  pakan  tidak menunjukkan  perberbedaan  bermakna.  Biswas et al .  (2002)  menyatakan  bahwa  azadirachtin memiliki  efek anti-feedant yang  dapat  diartikan menekan  keinginan  makan.  Hal  tersebut  yang diduga  menyebabkan  penurunan  konsumsi  pakan pada  hewan  uji  kelompok  perlakuan,  walaupun tidak berbeda bermakna dengan kelompok kontrol.
Nimbidin,  bahan  aktif  yang  dapat  terisolasi dengan  ekstraksi  ethanol,  berfungsi  sebagai hypoglycaemic  agent (Pankaj et  al .,  2011;  Asif, 2013)  sehingga  diduga  menyebabkan  penurunan ketersediaan  energi  untuk  metabolisme  hewan  uji. Colville  and  Bassert  (2008)  menyatakan  bahwa penurunan  ketersediaan  energi  dalam  tubuh  akan menyebabkan  penurunan  bobot  badan  karena hewan tidak dapat mensintesis komponen penyusun  tubuh  dengan  sempurna.  Nimbidin  juga memiliki  efek  diuretik  (Biswas et  al .,  2002).  Hal tersebut  diduga  menjadi  penyebab  hewan  uji kelompok  perlakuan  mengkonsumsi  lebih  banyak air minum, jika dibandingkan hewan uji kelompok kontrol (Tabel 2.)
Penelitian  menggunakan  bahan  uji  dalam penelitian ini berkisar dari 8.4 mg/ekor/hari sampai 14  mg/ekor/hari.  Kupradinun et  al .  (2012)  yang menyatakan  bahwa  toksisitas  nimba  pada  tikus diperkirakan  0,25  g/kgBB.  Dosis  yang  diberikan dalam  penelitian  ini  masih  di  bawah  dosis  toksik Nimba  untuk  tikus,  tetapi  sudah  menyebabkan penurunan bobot badan. Koriem (2013) menyatakan  bahwa  efek  paparan  senyawa  toksik dipengaruhi oleh beberapa hal, diantaranya adalah strain hewan uji. Penelitian ini menggunakan Mus musculus L.  strain  Swiss  Webster  yang  diduga bersifat  lebih  sensitif  terhadap  bahan  uji  yang diberikan sehingga menyebabkan penurunan bobot badan hewan uji di kelompok perlakuan. Bansal et al .  (2010)  menyatakan  bahwa  faktor  lain  yang dapat  mempengaruhi  adalah  lama  pajanan  bahan uji.  Hasil  penelitian  ini  menunjukkan  bahwa paparan  bahan  uji  selama  2  minggu  belum mempengaruhi  bobot  badan,  tetapi  paparan  bahan uji melebihi hari tersebut sudah mampu mempengaruhi  bobot  badan.  Hal  tersebut  diduga karena  selama  dua  minggu  hewan  uji  masih
memiliki  ketersediaan  energi  yang  cukup  dalam tubuh  sehingga  tidak  mempengaruhi  bobot  badan. Pajanan  bahan  uji  setelah  dua  minggu  diduga menyebabkan  ketidakseimbangan  antara  laju biosintesa  dengan  degradasi  makromolekul  dalam tubuh  sehingga  menyebabkan  penurunan  bobot hewan uji yang signifikan.
Paparan  ekstrak  ethanol  daun  nimba  juga diduga mengganggu biosintesa HDL dan trigliserida  pada  hewan  uji.  Hal  tersebut  sesuai dengan  pernyataan    Kupradinun et  al .  (2012)  dan Koriem et  al .  (2013)  yang  menyatakan  bahwa esktrak  Nimba  menyebabkan  HDL  serum  dan triasilgliserol menurun secara signifikan. Triasilgliserol  adalah  komponen  utama  deposit lemak  pada  sel  yang  juga  disintesa  dalam  hepar (Colville and Bassert, 2008). Penurunan biosintesa HDL  dan  triasilglierol  menyebabkan  penurunan ketersediaan energi hewan uji kelompok perlakuan.  Hal  tersebut  menyebabkan  komponen energi  yang  berasal  dari  pakan  dikonsumsi  hanya digunakan  untuk  mencukupi  kebutuhan  energi pada  hewan  uji  kelompok  perlakuan,  tidak digunakan  untuk  biosintesa  makromolekul  yang mempengaruhi bobot badan. Gangguan biosintesis HDL  dan  triasilgliserol  akibat  paparan  esktrak ethanol  daun  nimba  pada  hewan  uji  kelompok perlakuan  pada  akhirnya  menyebabkan  perbedaan bobot  badan  yang  signifikan  antara  hewan  uji kelompok  kontrol dan kelompok perlakuan.

## KESIMPULAN
Berdasar  hasil  yang  diperoleh  dalam penelitian  ini  dapat  disimpulkan  bahwa  ekstrak ethanol  daun  Nimba  dengan  dosis  sampai  14 mg/kgBB/hari  menyebabkan  penurunan  bobot badan mencit ( Mus musculus L.).

## DAFTAR PUSTAKA
Asif, M., 2013. A review on Spermicidal activities of Azadirachta indica. Journal of Pharmacognosy  and  Phytochemistry .  1(5): 61-80.
Auta,  T.  dan  A.T.  Hasan,  2016.  Reproductive toxicity  of  aqueous  wood-ash  extract  of Azadirachta  indica (neem)  on  male  albino
mice. Asian Pacific Journal of Reproduction x(x):1- 5.
Bansal, P., R. Bansal, V. Gupta, 2010. Antifertility effects  of Azadirachta  indica (Neem)  -  A Review. Annals  of  Biological  Research .
1(2): 108-113.
Biswas,  K.,  I.  Chattopadhyay,  R.K.  Banerjee,  and
U. Bandyopadhyay, 2002. Biological
activities  and  medicinal  properties  of  neem ( Azadirachta  indica ). Current  Science .  Vol.
82 (11): 1336-1435.
Colville,  T.  and  J.M.  Bassert,  2008.  Clinical Anatomy  and  Physiology  for  Veterinary Technicians.  2 nd Edition.  Mosby  Elsevier.
United Kingdom.
Ghimeray,  A.K.,  C.Jin,  B.K.  Ghimire,  D.H.  Cho, 2009.  Antioxidant  activity  and  quantitative estimation  of  azadirachtin  and  nimbin  in Azadirachta  Indica A.  Juss  grown  in foothills of Nepal. Afri J Biol . 8: 3084-3091.
Hashmat, I., H. Azad and A. Ahmed, 2012. Neem ( Azadirachta  indica A.  Juss)  -  A  Nature's
Drugstore:  An  overview.  International Research  Journal  of  Biological  Sciences. Vol. 1(6): 76-79.
Joshi,  M.,  K.  Gaonkar,  S.  Mangoankar,  S. Satarkar, 2011. Pharmacological investigation  of  Areca  catechu  extracts  for evaluation of learning, memory and behavior  in  rats. International  Current Pharmaceutical Journal . 1(6): 128-132. Koriem, K.M.M., 2013. Review on pharmacological  and  toxicologyical  effects of  oleum  azadirachti  oil.  Asian  Pac  J  Trop
Biomed. 3(10): 834-840.
Kupradinun,  P.,  A.  Tepsuwan,  N.  Tanthasri,  N.
Meesiripan,  S.  Tunsakul,  W.  Tompat,  Y. Jarratwisautpom,  W.R.  Kusamran,  2012. Toxicity  Testing  of  Flowers  of  Neem  Tree ( Azadirachta  indica A.  Juss). Thai  J.  Vet.
Med . 40(1): 47-55.
Nunes, C., A. Silva, and E. Soares, 2011. The Use of  Hepatic  and  Somatic  Indices  and
Histological Information to Characterize the
Reproductive  Dynamics  of  Atlantic  Sardine
Sardina  pilchardus  from  the  Portuguese.
Coast    Marine  and  Coastal  Fisheries: Dynamics,  Management,  and  Ecosystem Science. 3:127–144.
Omotayo,  A.,  T.  Ashafa,  L.  O.  Orekayo,  M.  T. Yakubu,  2012. Toxicity  profile  of  ethanolic extract  of  Azadirachta  indica  stem  bark  in male Wistar rats. Asian Pac J Trop Biomed.
2(10): 811-817.
Pankaj,  S.,  T.  Lokeswar,  B.  Mukesh,  and  B.
Vishnu, 2011. Review on Neem (Azadirachta  indica):  A  thousand  problem one solution. International Research Journal of Pharmacy. 2(12): 97-102.
Samsudin,  2011, Biosintesa  Dan  Cara  Kerja Azadirachtin Sebagai Bahan Aktif Insektisida Nabati , Balai Penelitian
Tanaman  Rempah  dan  Aneka  Tanaman Industri, Sukabumi.
Sharma,  R.K.,  A.K.  Goyal,  R.A.  Bhat,  2013. Antifertility  of  Plants  Extracts  on  Female Reproduction:  A  Review. IJBS .  3(3):  493- 514.
Sitasiwi,  A.J.,  S.  Isdadiyanto,  S.M.  Mardiati, 2017a.  The  Estradiol  17-β  Concentration  in Mice  after  Treated  with  Ethanolic  Leaf Extract  of Azadirachta  indica (Neem). Proceeding  of  International  Conference  on Global Resource and Conservation.
Sitasiwi,  A.J.,  and  S.  Isdadiyanto,  2017b.  Kadar Hemoglobin  dan  Jumlah  Eritrosit  Mencit ( Mus  musculus )  Jantan  setelah  perlakuan dengan ekstrak etanol daun Nimba ( Azadirachta  indica ). Buletin  Anatomi  dan Fisiologi. Vol. 2(2): 161-167
Sitasiwi, A.J., S. Isdadiyanto, S.M. Mardiati, 2017. Effect  of  ethanolic  Neem  leaf  extract  as  an herb contraceptive on Hepato-somatic Index of  the  male  mice  ( Mus  musculus ). Abstract of  International Seminar on New Paradigm and  Inovation  on  Natural  Science  and  Its Application.  Science  and  Mathematics Faculty. Diponegoro University.
Suryawanshi,  J.  A.  S.,  2011.  Neem-natural contraceptive  for  male  and  female–an overview. IJBB . 1(2): 1-6.
Umadevi, K., P.K. Sampath Khumar, D. Bhownik,
S.  Duraivel,  2013.  Medicinal  Plants  with
Potential  Antifertility  Activities. Journal  of Medicinal Plants Studies . 1(1): 26-33.