## Indonesian Journal of Pharmaceutical Science and Technology
Journal Homepage : http://jurnal.unpad.ac.id/ijpst/
UNPAD
Inhibition of Heme Polymerization In Vitro Assay of Extract of Sirih Leaf (Piper Betle Linn.) and Sunflower Leaves (Helianthus Annuus L.)

## Ami Tjitraresmi*, Yasmiwar Susilawati, Moelyono Moektiwardoyo
Fakultas Farmasi, Universitas Padjadjaran, Jatinangor, Indonesia
Submitted 23 December 2019; Revised 7 January 2020; Accepted 22 January 2020; Published 3 February 2020 *Corresponding author: ami.tjitraresmi@unpad.ac.id

## Abstract
Malaria is a disease that occurs in tropical countries like Indonesia. The incidence of malaria in the world is still quite high and the occurrence of cases of Plasmodium resistance to antimalarial drugs and the widespread of resistance have prompted researchers to look for new antimalarial drugs, especially from natural materials. The people of Indonesia have long used betel leaf ( Piper betle Linn.) and sunflower leaf ( Helianthus annuus L.) as an antimalarial drug. The purpose of this study was to determine antimalarial activity through inhibition of heme polymerization and determine secondary metabolite compounds by phytochemical screening from betel leaves and sunflower leaves. The heme polymerization inhibition activity assay was carried out by the in vitro method using a microplate reader at 415 nm and 630 nm wavelengths. IC 50 values  of  betel  leaf  extract  and  sunflower  leaf were 178.67 μg/ml and 160.10 μg/ml, respectively. Phytochemical screening results from betel leaf showed the presence of flavonoids, polyphenols, tannins, quinones, saponins, and monoterpenoids- sesquiterpenoids,  while  sunflower  leaves  contain  alkaloids,  polyphenols,  flavonoids,  steroids  and monoterpenoids-sesquiterpenoids.
Keywords: antimalarial, Helianthus annuus L., heme polymerization, Piper betle Linn.
Aktivitas Penghambatan Polimerisasi Heme Secara In Vitro Ekstrak Daun Sirih (Piper Betle Linn.) dan Daun Bunga Matahari (Helianthus Annuus L.)

## Abstrak
Malaria adalah penyakit yang ada di negara tropis seperti Indonesia. Angka kejadian malaria di dunia yang masih cukup tinggi dan  terjadinya kasus resistensi Plasmodium terhadap obat antimalaria serta penyebaran resistensi yang meluas telah mendorong para peneliti untuk mencari obat antimalaria baru yang lebih efektif terutama dari bahan alam. Daun sirih ( Piper betle Linn.) dan daun bunga matahari ( Helianthus annuus L.) telah lama digunakan oleh masyarakat Indonesia sebagai obat antimalaria. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui aktivitas antimalaria melalui penghambatan polimerisasi heme dan mengetahui senyawa metabolit sekunder dengan penapisan fitokimia dari daun sirih dan daun bunga matahari. Uji aktivitas penghambatan polimerisasi heme dilakukan dengan metode in vitro dengan menggunakan microplate reader pada panjang gelombang 415 nm dan 630 nm. Nilai IC 50 dari ekstrak daun sirih dan daun bunga matahari berturut-turut sebesar 178,67 μg/ml  dan 160,10 μg/ml. Hasil penapisan fitokimia dari daun sirih menunjukkan adanya senyawa flavonoid, polifenol, tannin, kuinon, saponin, dan monoterpenoid-seskuiterpenoid, sedangkan daun bunga matahari mengandung senyawa alkaloid, polifenol, flavonoid, steroid dan monoterpenoid-sesquiterpenoid.
Kata Kunci: antimalaria, Helianthus annuus L., Piper betle Linn., polimerisasi heme
1. Pendahuluan Malaria adalah penyakit yang disebabkan oleh parasit Plasmodium . Parasit menyebar ke manusia melalui gigitan nyamuk Anopheles sp. betina yang terinfeksi, yang disebut sebagai "vektor malaria". 1,2 Penularan malaria banyak ditemukan di daerah tropis dan subtropis, karena di daerah ini nyamuk Anopheles dapat bertahan dan berkembang biak. Namun di negara endemis malaria penularan malaria tidak terjadi di seluruh wilayah negara baik daerah tropis maupun subtropis, dikarenakan transmisi tidak akan terjadi pada daerah dengan ketinggian yang sangat tinggi, selama musim dingin, dan di beberapa negara di mana transmisi telah terganggu melalui program pengendalian malaria. 3
Pengendalian penyakit malaria membutuhkan pendekatan terpadu, termasuk pencegahan (terutama pengendalian vektor) dan pengobatan dengan senyawa antimalaria yang efektif. Sejak edisi pertama pedoman untuk pengobatan malaria oleh WHO pada tahun 2006,  negara yang merupakan daerah endemik P. falciparum telah memperbarui kebijakan pengobatan mereka dari penggunaan monoterapi dengan obat-obatan  seperti  klorokuin,  amodiaquine dan  sulfadoxine-pirimetamin  (SP)  ke  terapi kombinasi berbasis artemisinin (ACT) yang saat ini direkomendasikan. ACT umumnya sangat efektif dan ditoleransi dengan baik. Ini telah memberikan kontribusi besar pada pengurangan morbiditas dan mortalitas global akibat malaria. 4 Saat ini resistensi Plasmodium falciparum terhadap obat-obatan antimalaria menjadi masalah terutama di daerah endemik. 5
Hal ini dapat meningkatkan morbiditas dan mortalitas akibat malaria. Resistensi terjadi terutama karena adanya mutasi pada gen dari Plasmodium . 6 Banyaknya kasus resistensi Plasmodium terhadap obat malaria digunakan saat ini, serta penyebaran resistensi yang meluas telah mendorong para peneliti untuk mencari obat antimalaria baru yang lebih efektif. 4 Plasmodium sp. mendegradasi hemoglobin dalam eritrosit inang untuk
menggunakan produk katabolik yang dihasilkan sebagai sumber asam amino selama masa perkembangan dan proliferasi. Proses degradasi hemoglobin juga disertai dengan pelepasan heme bebas. Heme bebas bersifat aktif secara oksidatif serta bersifat toksik bagi sel inang dan parasit malaria, dan menyebabkan kematian parasit. Karena tidak adanya enzim heme oksigenase, parasit tidak dapat memotong heme menjadi tetrapyrrole rantai terbuka, yang diperlukan untuk ekskresi seluler. Untuk melindungi dirinya, parasit mendetoksifikasi heme bebas melalui netralisasi dengan protein yang kaya histidin, degradasi dengan reduksi glutation, atau kristalisasi menjadi hemozoin, yang merupakan pigmen malaria yang tidak larut dalam air yang diproduksi dalam vakuola makanan. Klorokuin dan obat antimalaria yang telah terbukti menghambat pembentukan kristal heme sintetik, β-hematin, yang secara memiliki struktur yang identik dengan hemozoin, dan menghambat pembentukan hemozoin dalam vakuola makanan parasit malaria. Saat ini uji aktivitas inhibisi pembentukan  β-hematin  berguna  dalam mengidentifikasi  beberapa  anti  malaria  baru atau untuk penapisan aktivitas antimalaria. 7,8 Penggunaan obat tradisional dan herbal merupakan pilihan alternatif untuk pengobatan di  negara-negara  endemik  malaria,  seperti Indonesia.  Hal ini dikarenakan Indonesia merupakan salah satu negara terbesar yang kaya akan keanekaragaman hayati serta biota laut. Selain itu, mayoritas masyarakat Indonesia masih menggunakan tanaman sebagai obat tradisional karena dipercaya memiliki khasiat sebagai obat. 9
Tumbuhan yang secara empiris digunakan sebagai obat malaria di Indonesia diantaranya adalah daun sirih ( Piper betle Linn.) dan daun bunga matahari ( Helianthus annuus L.). 10 Tumbuhan sirih ( Piper betle Linn.) dalah tumbuhan yang termasuk ke dalam suku Piperaceae. Tumbuhan ini paling banyak dibudidayakan di wilayah Asia Selatan dan Asia Tenggara. 11 Uji aktivitas antimalaria secara in vivo ekstrak metanol daun sirih pada mencit yang diinfeksi oleh Plasmodium berghei menunjukkan hasil bahwa pada dosis
ekstrak methanol daun sirih 50, 100, 200 dan 400  mg/kg  secara  berurutan  menghasilkan penurunan kadar parasitemia sebesar 37,50%, 45,83%, 66,46% dan 70,63%. 12 Tumbuhan bunga matahari  ( Helianthus annuus L.) adalah tumbuhan yanga termasuk ke dalam suku Asteraceae. Uji aktivitas antimalaria secara in vitro terhadap Plasmodium falciparum 3D7 menunjukkan bahwa  IC50 ekstrak metanol daun bunga matahari adalah 22,18  mg/mL  sedangkan  IC 50 fraksi etil asetatnya  adalah  sebesar  16,68  mg/mL. 13
Walaupun pengujian aktivitas antimalaria dari kedua tumbuhan ini sudah dilakukan akan tetapi aktivitas antimalaria dengan mekanisme penghambatan polimerisasi heme belum diketahui.

## 2. Metode
2.1.  Alat Maserator, rotavapor (Buchi), plate 96 sumuran (NEST), mikropipet (Thermo), microplate reader (EPOCH), alat gelas yang biasa digunakan di laboratorium fitokimia.
2.2.  Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun sirih ( Piper betle Linn.)  dan daun bunga matahari ( Helianthus annuus L.) yang diperoleh dari daerah Bandung, Jawa Barat, etanol, hemein klorida (SIGMA), dimetil sulfoksida (DMSO) (MERCK), Tween 20 (MERCK), buffer asetat 1 M (pH 4,8).
2.3.  Prosedur Penelitian
2.3.1. Ekstraksi
Ekstraksi dilakukan terhadap daun sirih ( Piper betle Linn.)  dan daun bunga matahari ( Helianthus annuus L.) yang telah dikeringkan. Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan metode maserasi menggunakan pelarut etanol 70% selama 3x24 jam dengan penggantian pelarut setiap 24 jam. Ekstrak etanol ditampung dan dikisatkan dengan menggunakan rotary evaporator dan disimpan di atas penangas air dengan suhu 60 o C hingga mencapai berat konstan.
2.3.2. Penapisan fitokimia
Penapisan fitokimia dilakukan terhadap simplisia tumbuhan dengan menggunakan metode Farnsworth, 14 yang dimodifikasi. A.  Alkaloid Bahan yang akan diuji dibasakan dengan amonia 1% kemudian ditambahkan kloroform. Lapisan kloroform diambil dan ditempatkan pada tabung reaksi. Ke dalam filtrat ditambahkan HCl 1N kemudian dikocok kuat dan didiamkan hingga terjadi pemisahan. Lapisan asam dipipet dan dibagi menjadi tiga bagian pada tabung reaksi berbeda. Tabung reaksi 1 ditambahkan larutan pereaksi Dragendorf, tabung reaksi 2 ditambahkan pereaksi Mayer dan tabung reaksi 3 digunakan sebagai blanko. Hasil positif dapat dilihat dari terbentuknya endapan merah kecoklatan pada tabung 1 dan endapan putih pada tabung 2. B.  Polifenol Bahan dimasukan ke dalam tabung reaksi yang berisi aquades kemudian dipanaskan di atas penangas air selama beberapa menit lalu disaring. Filtrat diambil kemudian ditambahkan pelarut besi (III) klorida. Hasil positif dapat dilihat dari terbentuknya warna biru kehitaman pada larutan.
C.  Flavonoid Bahan dimasukan ke dalam tabung reaksi yang berisi aquades kemudian dipanaskan di atas penangas air selama beberapa menit lalu disaring. Filtrat diambil dan ditambahkan serbuk Mg dan HCl 2N. Ke dalam larutan kemudian ditambahkan amil alkohol lalu campuran dikocok kuat. Campuran didiamkan selama beberapa menit hingga terpisah. Hasil positif ditandai dengan terbentuknya warna kuning hingga merah yang dapat ditarik oleh amil alkohol.
D.  Monoterpenoid dan seskuiterpenoid Bahan digerus dengan menggunakan eter. Filtrat diambil kemudian diuapkan hingga kering. Ke dalam residu diteteskan vanilin 10% dalam H 2 SO 4 pekat. Terbentuknya warna-warna  menunjukkan  adanya  senyawa monoterpen dan seskuiterpen. E.  Steroid dan triterpenoid Bahan digerus dengan menggunakan eter. Filtrat diambil kemudian diuapkan hingga kering. Ke dalam residu diteteskan pereaksi Lieberman-Burchard.  Adanya
senyawa golongan triterpenoid ditunjukkan dengan terbentuknya warna ungu sedangkan senyawa golongan steroid ditandai dengan terbentuknya warna biru kehijauan.
F. Kuinon Bahan dimasukan ke dalam tabung reaksi yang berisi aquades kemudian dipanaskan di atas penangas air selama beberapa menit lalu disaring. Filtrat diambil kemudian ditambahkan larutan KOH 5%. Hasil positif dapat dilihat dari terbentuknya warna kuning hingga merah pada larutan. G.  Tanin Bahan dimasukan ke dalam tabung reaksi yang berisi aquades kemudian dipanaskan di atas penangas air selama beberapa menit lalu disaring. Filtrat diambil dan ditetesi larutan gelatin 1%. Hasil positif dapat dilihat dari terbentuknya endapan putih pada larutan.
H.  Saponin Bahan dimasukan ke dalam tabung reaksi yang berisi aquades kemudian dipanaskan di atas penangas air selama beberapa menit lalu disaring. Filtrat diambil kemudian dikocok kuat secara vertikal selama sepuluh hingga dua puluh detik. Keberadaan senyawa saponin ditunjukkan dengan terbentuknya busa persisten setelah pendiaman selama kurang lebih sepuluh menit atau setelah penambahan asam klorida.
2.3.3. Uji aktivitas penghambatan polimerisasi heme secara in vitro Penapisan aktivitas antimalaria dilakukan terhadap 10 ekstrak tumbuhan uji secara in vitro dengan metode inhibisi polimerisasi heme atau metode Huy et al , 15 yang  dimodifikasi.  Pengujian  antimalaria dilakukan dengan tahapan penelitian: A.  Sebanyak 16,3 mg hemin klorida dilarutkan dalam 1 mL dimetil sulfoksida (DMSO) lalu disaring dengan membran  filter  berdiameter  0,2  μm.
B. Sebanyak 22,2 μL larutan hemin klorida dalam DMSO dilarutkan dengan buffer asetat 1 M (pH 4,8) sampai 5 mL. Larutan ini dipakai sebagai larutan hemin uji.
C. Sebanyak    masing-masing  20  μL larutan uji berupa ekstrak daun sirih,
ekstrak daun bunga matahari dan ekstrak kulit batang kina sebagai pembanding,  dengan  masing-masing konsentrasi akhir sebesar 31,25; 62,5; 125;  250  dan  500  μg/mL  dimasukkan ke dalam plate 96 sumuran.
D.  Kemudian ditambahkan sebanyak masing-masing 90 μL larutan hemin uji dan reaksi polimerisasi heme dimulai dengan menambahkan larutan Tween-20 (konsentrasi  akhir  0,02  mg/mL).
E.  Plate kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 250 menit untuk selanjutnya dibaca serapannya pada panjang gelombang 415 dan 630 nm menggunakan microplate reader (EPOCH). Fraksi heme yang  diubah  menjadi  β-hematin dihitung berdasarkan persamaan: 15
f = (A kontrol - A sampel )/(A kontrol - A min ) Keterangan: A kontrol = nilai serapan heme tanpa  Tween-20  atau  ekstrak  uji
A sampel = serapan heme dengan penambahan Tween-20 dan ekstrak uji A min = serapan heme dengan penambahan Tween-20 tanpa ekstrak uji f = fraksi heme yang diubah menjadi β-hematin  Persentase  penghambatan pembentukan β-hematin oleh ekstrak uji ataupun pembanding ekstrak kulit batang kina dihitung berdasarkan persamaan: 15

## Penghambatan=(1-f)×100%
Keterangan: f = fraksi heme yang diubah menjadi
β-hematin
F. Data diolah menggunakan analisa probit antara log konsentrasi larutan uji (x) dengan persentase inhibisi (y) sehingga diperoleh nilai IC 50 .

## 3. Hasil
3.1.  Ekstraksi Rendemen ekstrak kental yang diperoleh dari hasil ekstraksi dengan metode
maserasi menggunakan pelarut etanol 70% adalah 17,3% untuk ekstrak daun sirih dan 14% untuk ekstrak daun bunga matahari.
3.2. Penapisan fitokimia Hasil penapisan fitokimia dari simplisia daun sirih ( Piper betle Linn.)  dan daun bunga matahari ( Helianthus annuus L.) dapat dilihat pada Tabel 1.
3.3.  Uji aktivitas penghambatan polimerisasi heme secara in vitro
Hasil uji aktivitas penghambatan polimerisasi heme secara in vitro terhadap ekstrak etanol daun sirih dan ekstrak etanol daun bunga matahari dapat dilihat pada Tabel 2.

## 4. Pembahasan
4.1.  Ekstraksi
Ekstrak kental sirih yang diperoleh berwarna hijau dan memiliki yang khas, sedangkan ekstrak daun bunga matahari berwarna hijau dan tidak berbau khas.
4.2. Penapisan fitokimia Kuinin adalah senyawa alkaloid yang merupakan obat malaria pertama yang diisolasi dari Cinchona sp . 16,17 dan artemisinin adalah senyawa seskuiterpen yang saat ini direkomendasikan oleh WHO sebagai obat malaria. 18 Berdasarkan hasil penapisan fitokimia terhadap kedua bahan tumbuhan uji maka terlihat adanya senyawa monoterpenoid dan seskuiterpenoid dari daun sirih dan daun bunga matahari sedangkan senyawa alkaloid terdapat pada daun bunga matahari. Pan et al, 19 melaporkan bahwa pada kurun waktu 2001-
2017 ada sekitar 175 senyawa antimalaria yang diperoleh dari tumbuhan dan ada sekitar 25 senyawa antimalaria yang diperoleh dari alga. Aktivitas antimalaria dari berbagai ekstrak tumbuhan biasanya dihasilkan dari berbagai macam golongan metabolit sekunder, seperti alkaloid, terpenoid, iridoid, cardenolides,  flavonoid,  kumarin,  senyawa fenolat, poliasetilen, xanton, kuinon, steroid, lignin, tanin dan saponin.
4.3.  Uji aktivitas penghambatan polimerisasi heme secara in vitro Hasil uji aktivitas menunjukkan bahwa ekstrak etanol dari bunga matahari memiliki nilai IC 50 lebih rendah, yaitu sebesar 160,10 μg/ml  dibandingkan  dengan  ekstrak  daun sirih yang memiliki nilai sebesar 178,67 μg/ml,  akan  tetapi  aktivitas  penghambatan polimerisasi heme dari kulit batang kina yang mengandung alkaloid kuinin, yang  sampai saat ini masih digunakan sebagai antimalaria, memiliki nilai IC 50 yang lebih rendah yaitu sebesar  59,24  μg/ml    dibandingkan  dengan kedua ekstrak uji. Dilaporkan  klorokuin dan sejumlah antimalaria quinolin lainnya seperti  amodiakuin,  kuinidin,  dan kuinin  mempunyai  kemampuan dalam penghambatan  β-hematin. 20
Peningkatan konsentrasi heme di dalam vakuola parasit dapat menimbulkan lisis membran parasit, sehingga plasmodium mempunyai mekanisme detoksifikasi heme, yaitu dengan mengubahnya menjadi senyawa hemozoin (pigmen malaria) yang inert bagi parasit. 21,22 Polimerisasi heme untuk  detoksifikasi  heme  oleh  parasit malaria adalah proses yang penting bagi
Tabel 1. Hasil penapisan fitokimia simplisia daun sirih dan daun bunga matahari
Golongan senyawa metabolit sekunder Daun sirih Daun bunga matahari Alkaloid - + Flavonoid + + Polifenolat + + Tanin + - Kuinon + - Saponin + - Steroid/ triterpenoid + + Monoterpenoid/ seskuiterpenoid + +

## kehidupan parasit dan bersifat unik untuk
Plasmodium intraeritrositik, dengan demikian pengujian aktivitas malaria dengan metode penghambatan polimerisasi heme menjadi salah satu pilihan untuk mencari senyawa antimalaria baru. 23

## 5. Simpulan
Ekstrak daun sirih dan daun bunga matahari mempunyai aktivitas penghambatan polimerisasi heme dan dapat dikembangkan sebagai obat herbal untuk malaria. Ekstrak daun bunga matahari memiliki aktivitas penghambatan polimerisasi heme yang lebih baik dari ekstrak daun sirih.
Pustaka 1.  Murray, C.J.L., Rosenfeld, L.C., Lim, S.S., Andrews, K.G., Foreman, K.J., Haring, D., Fullman, N., Naghavi, M., Lozano, R. & Lopez, A.D. Global Malaria  Mortality  Between  1980-2010: a Systematic Analysis. The Lancet. 2012; 379 (9814): 413–431.
2.  World Health Organization Malaria. Geneva, Switzerland. 2018; Available at http://www.who.int/mediacentre/ factsheets/fs094/en/    {diakses  tanggal  :
25 Maret 2018].
3.  Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Where Malaria Occurs . 2017; Available at https://www.cdc.gov/ malaria/about/distribution.html  [Diakses pada tanggal 9 Januari 2019].
4.  World Health Organization, Guidelines for the treatment of malaria – 3rd edition,  2015;  Available  at  https:// www.who.int/malaria/publications/ atoz/9789241549127/en/ [diakses tanggal 15 Desember 2018].
5.  De Villiers, K.,  Egan, T.J., Recent Advances  in  the  Discovery  of  Haem- Targeting Drugs for Malaria and Schistosomiasis,  Molecules, 2009; 14:2868-2887.
6. Kurosawa, Y., Dorn, A., Kitsuji-Shirane, M., Shimada, H., Satoh, T., Matile, H., Hofheinz, W., Masciadri, R., Kansy, M. & Ridley, R.G., Hemeatin Polymerization Assay  as  a  High-Throughput  Screen for  Identification  of  New  Antimalarial Pharmacophores. Antimicrobial Agents and Chemeotherapy. 2000; 44 (10):2638– 2644.
7.  Hermanto, F, Yenny F, Lilis S A, Tri R S, Uji aktivitas antimalaria ekstrak etanol daun cocor bebek (Kalanchoe blossfeldiana Poelln.) pada Plasmodium
Tabel 2. Hasil uji aktivitas penghambatan polimerisasi heme secara in vitro ekstrak daun sirih dan sirih merah dibandingkan dengan ekstrak kulit batang kina
Sampel Konsentrasi ( μg/ml) f (fraksi β-hematin) % inhibisi
IC 50 ( μg/ml) Daun sirih 31,25 0,9710 2,90 178,67 62,5 0,8968 10,32 125 0,8645 13,55 250 0,2742 72,58 500 0,0806 91,94 Daun bunga matahari 31,25 0,838 16,17 160,10 62,5 0,785 21,45 125 0,746 25,41 250 0,604 39,60 500 0,050 95,05 Kulit batang kina 31,25 0,9944 0,55 59,24 62,5 0,922 7,74 125 0,069 93,09 250 0,046 95,30 500 0,005 99,45
falciparum 3D7. Kartika jurnal ilmiah farmasi,  2014; 2(2):54-58.
8.  Ihwan K, S. H. A. Antimalarial Herbal Plants in Kupang, Indonesia. Biosaintifika: Journal of Biology & Biology Education, 2017; 9(1):95-104.
9. Al-Adhroey,  A.H.  Antimalarial  Activity of Methanolic Leaf Extract of Piper betle L. Molecules, MDPI, 2011;16(1):107-18.
10. Al-Adhroey,  A.H.;  Nor,  Z.M.;  Al-
Mekhlafi, H.M.; Mahmud, R. Ethnobotanical study on some Malaysian anti-malarial  plants:  A  community based survey. J. Ethnopharmacol. 2010;132:362–364.
11. Mutiah, R.,  Activity of Antimalarial Compounds from Ethyl Acetate Fraction of Sunflower Leaves (Helianthus annuus L.) against Plasmodium falciparum Parasites 3D7, Asian J. Pharm. Tech. 2017; 7(2):61-5.
12. Farnsworth, N.R. Biological and phytochemical screening of plants. Journal of Pharmaceutical Sciences, 1966; 55:259-260.
13. Huy, N. T., Uyen, D. T., Maeda, A., Trang, D. T., Oida, T., Harada, S., & Kamei, K. Simple colorimetric inhibition assay of heme crystallization for high-throughput screening of antimalarial compounds. Antimicrobial agents and chemotherapy, 2006; 51(1):350-353.
14. Tu, Y. The discovery of artemisinin (qinghaosu) and gifts from Chinese medicine. Nat. Med. 2011; 17:1217– 1220.
15. Klayman, D. Qinghaosu (artemisinin): An antimalarial drug from China. Science 1985; 228:1049.
16. Faurant C., From bark to weed: the history of artemisinin. Parasite. 2011;18(3): 215- 8.
17. Pan, Wen-Hui  Xu, Xin-Ya  Shi, Ni  Tsang, Siu Wai    Zhang,  Hong-Jie. Antimalarial Activity of Plant Metabolites. International Journal of Molecular Sciences. 2018; 19:1382.
18. Egan, Timothy  J.,  Kanyile  K. Ncokazi. Quinoline Antimalarials Decrease the Rate  of    β-Hematin  Formation.  Journal of Inorganic Biochemistry, 2005; 99(7): 1532– 1539.
19. Pisciotta JM, Scholl PF, Shuman JL, Shualev V, Sullivan DJ. Quantitative characterization of hemozoin in Plasmodium berghei and vivax. Int J Parasitol Drugs Drug Resist.
2017;7(1):110-119.
20. Fong, K. Y., Wright, D. W. Hemozoin and antimalarial drug discovery. Future Medicinal Chemistry. 2013; 5(12):1437– 1450.
21. Kurosawa, Y., Dorn, A., Kitsuji-Shirane, M., Shimada, H., Satoh, T., Matile, H., Hofheinz, W., Masciadri, R., Kansy, M. & Ridley, R.G.. Hemeatin Polymerization Assay  as  a  High-Throughput  Screen for  Identification  of  New  Antimalarial Pharmacophores. Antimicrobial Agents and Chemeotherapy. 2000;. 44 (10):2638– 2644.