Efek Serbuk Bunga Rosella Merah ( Hibiscus sabdariffa L.) terhadap Ekspresi IL-10 pada Sukarelawan Sehat
Nur Azizah Syahrana 1 *, Akrom 1,2 , Endang Darmawan 1
1 Pascasarjana Fakultas Farmasi, Universitas Ahmad Dahlan,Yogyakarta
2 Pusat informasi dan kajian obat, Universitas Ahmad Dahlan,Yogyakarta
*Corresponding author: nurazizah.syahrana19@gmail.com

## Abstract
Background :  Rosella  calyx  (Hibiscus  sabdariffa  L.)  contain  phenol  and  anthocyanin  flavonoids  that  have activity  as  antioxidants  and  can  stimulate  the  immune  system. Objective :  The  purpose  of  this  study  was  to investigate the effect of rosella powder capsule on expression IL-10 using pre and post test method on 21 healthy volunteers who fulfilled inclusion criteria and willing to fill informed consent. Methods : Volunteers were given rosella  powder  in  capsules  form  with  500  mg  dose  for  30  days  and  IL-10  was  examined  using  flowsitometric method on days 0.30 and 45. The results were analyzed using SPSS with wilcoxon test. Results : The value of IL- 10 expression  in  the 0.30 and 45 day volunteers  were 0.42 ± 0.24; 0.83 ± 0.47 and 1.06 ± 0.67. These results showed  that  IL-10  expression  had  an  effect  on  day  0  to  30  (p  <  0.05)  and  IL-10  expression  did  not  affect  the 30 day of the 45 (p > 0.05). Conclusion : administration of rosella powder capsules (Hibiscus sabdariffa L.) dose 500 mg/day for 30 days increased the expression of IL-10, but within normal limits on healthy volunteers.
Keywords : roselle, IL-10 expression, healthy volunteers

## Abstrak
Pendahuluan :  Bunga rosella  merah  ( Hibiscus sabdariffa L.) mengandung  fenol dan  flavonoid antosianin  yang memiliki  aktivitas  sebagai  antioksidan  dan  dapat  meningkatkan  sistem  imun. Tujuan :  Tujuan  penelitian  ini untuk mengetahui pengaruh kapsul serbuk bunga rosella terhadap ekspresi IL-10 menggunakan metode pre and post  test pada  21  sukarelawan  sehat  yang  memenuhi  kriteria  inklusi  dan  bersedia  mengisi informed  consent . Metode :  Relawan  diberikan  serbuk  rosella  dalam  bentuk  kapsul  dengan  dosis  500  mg  selama  30  hari  dan dilakukan  pemeriksaan  IL-10  menggunakan  metode  flowsitometri  pada  hari  ke-0,  30  dan  45.  Hasil  dianalisis menggunakan SPSS dengan uji wilcoxon. Hasil : Nilai ekspresi IL-10 pada sukarelawan hari ke 0, ke-30 dan ke- 45 adalah 0,42 ± 0,24; 0,83 ± 0,47 dan 1,06 ± 0,67. Hasil ini menunjukkan ekspresi IL-10 bepengaruh pada hari ke-0 ke-30 (p < 0,05) dan ekspresi IL-10 tidak berpengaruh hari ke-30 ke-45 (p > 0,05). Kesimpulan : pemberian kapsul  serbuk  rosella  ( Hibiscus  sabdariffa L.)  dosis  500  mg/hari  selama  30  hari  meningkatkan  ekspresi  IL-10, tetapi dalam batas nilai normal pada sukarelawan sehat.
Kata Kunci : rosella, ekspresi IL-10 , sukarelawan sehat

## PENDAHULUAN
Rosella  ( Hibiscus  sabdariffa L.)  secara  empiris berkhasiat  sebagai  antiseptik,  diuretik,  meningkatkan daya  tahan  tubuh,  antihipertensi,  antikolesterol, antibakteri dan bersifat antioksidan (Hodgson & Kevin, 2006;  Kusumastuti,  2014;  Rizki  dkk.,  2017).  Rosella memiliki  kandungan  kimia  berupa  karbohidrat,  asam amino,  glikosida,  steroid,  flavonoid,  tanin,  fenol, triterpenoid,  kuersetin,  sianidin,  β-karoten,  fitosterol, delpinidin,  gosiperidin, hibiscetin , hibiscin ,  dan hibiscitrin (Mahadevan  dkk ., 2009;  Kumar,  2012). Adanya  kandungan  asam  askorbat  dan  flavonoid
(flavonol dan pigmen  antosianin)  menjadikan tanaman ini  memiliki  aktivitas  antioksidan  alami  yang  dapat menangkal  berbagai  radikal  bebas  dan  memiliki efeksistem  imun  (imunostimulator)  (Mardiyah,  2009). Sistem  imun  adalah  sistem  yang  digunakan  tubuh sebagai  perlindungan  diri  terhadap  bahaya  yang ditimbulkan  oleh  lingkungan  (Baratawidjaja,  2006). Sistem  imun  terdiri  dari  sistem  imun  spesifik ( imunadaptif )  dan  sistem  imun  non  spesifik (innate atau natural  immunity) .  Sistem  imun  spesifik diperankan oleh limfosit B dan limfosit T. Sel T terdiri dari  Th  (helper)  subset  Th1,  dan  Th2.  Sel-sel  Th1
memproduksi  IL-2,  interferon  gamma  (IFN-γ)  dan
tumor necrosis factor-beta (TNF-β). Sel Th2 mensintesis  interleukin  (IL)  yakni  IL-4,  IL-5,  IL-6, IL-10  dan  IL-13  yang  mengoptimalkan  produksi antibodi  (Ranieri  dkk . ,  2014).  Interleukin  adalah bagian dari sistem kekebalan yang disebut sitokin yang mengaktifkan sistem kekebalan tubuh. IL-10 merupakan
sitokin anti-inflamasi, berfungsi menghambat  produksi  beberapa  jenis  sitokin  lain (TNF-α,  IL-1,  IFN-γ, chemokine ,  dan  IL-12)  dan menghambat  fungsi  makrofag  dalam  membantu aktivasi sel T (Couper dkk., 2008; Niikura dkk., 2011).
Penelitian tentang keamanan rosella dilakukan oleh Sari  &  Moch.  (2016)  menyatakan  nilai lethal  dose 50 (LD 50 ) ekstrak etanol rosella sebesar 850,90 mg/KgBB tehadap  tikus  SD  (tergolong  dalam toksik  ringan, LD 50 >  500  -  5000  mg)  (BPOM  RI,  2014a).  Hasil  uji praklinik di atas diperlukan untuk melanjutkan ke fase uji  klinik  (BPOM  RI,  2014b)  dengan  tujuan  melihat keamanan  dan  pengaruh  kapsul  bunga  rosella  dosis 500  mg/hari  selama  30  hari  terhadap  ekspresi  IL-10 pada sukarelawan sehat.

## BAHAN DAN METODE Bahan
Penelitian  ini  memperoleh  izin  dengan  terbitnya surat  keterangan  layak  etik  ( Ethical  Clearance) bernomor  255/EP-FKIK-UMY/IV/2017.  Penelitian  ini menggunakan  serbuk  rosella  merah  dari  PT.  Natura (nomor batch: RH162703, kode produk: 5055C).
Alat
Alat untuk pemeriksaan IL-10 flowcytometri merek Calibur.

## Metode
Penelitian  ini  menggunakan  desain  eksperimental dengan pre  and  post  test .  Subjek  berjumlah  21  orang terdiri 11 orang laki-laki dan 10 orang perempuan yang sesuai  dengan  kriteria  inklusi  dan  eksklusi.  Serbuk rosella  diberikan  pada  sukarelawan  dalam  bentuk kapsul  dengan  dosis  500  mg  1  kali  sehari  sesudah makan pada malam hari sebelum tidur. Penentuan dosis kapsul  rosella  berdasarkan  penelitian  yang  dilakukan Nurkhasanah (2015) menyatakan ekstrak etanol rosella dengan dosis 50 dan 100 mg/KgBB berpotensi sebagai agen  imunomodulator.  Dosis              500  mg  yang diperoleh  dari  konversi  dosis  tikus  ke  dosis  manusia. Pemberian  rosella  dilakukan  selama      30  hari. Flowchart penelitian disajikan pada Gambar 1.
Eksklusi (n = 8)
- Tidak memenuhi kriteria inklusi
(n = 4)
- Mundur dari partisipan (n = 4)
Intervensi (n = 22)
Kapsul Rosella 500 mg/hari selama 30 hari
Follow-up (n = 22) Analisis Data Pemeriksaan hari ke-31 (n = 21) - IL-10 Droup out relawan karena tidak patuh (n = 1) Kriteria Inklusi Pemeriksaan hari ke-0 Sukarelawan sehat yang memenuhi kriteria inklusi (n = 22) - IL-10
Pemeriksaan hari ke-45 (n = 21) (14 hari setelah treatmed ) - IL-10
Calon sukarelawan sehat (n = 30)

## Kriteria inklusi dan eksklusi
Kriteria inklusi sehat dibuktikan dengan pemeriksaan  tanda  vital  didukung  oleh  pemeriksaan laboratorim klinis meliputi hematologi lengkap, fungsi hati dan fungsi ginjal dan dinyatakan sehat berdasarkan surat  keterangan  sehat  dari  dokter,  laki-laki  dan perempuan  usia  18  -  45,  IMT  18  -  30  Kg/m 2 ,  tidak merokok  dan  bersedia  mengisi informed  concent . Kriteria  eksklusi:  wanita  hamil,  tidak  minum  obat sesuai  interval  dan  petunjuk  penggunaan  obat, menggunakan herbal lain selama penelitian berlangsung.
Pemeriksaan IL-10 Darah tepi  diambil dari vena  cubiti sebanyak 3 cc. Darah yang sudah terkumpul, ditampung dalam tabung vacutainer yang  berisi  antikoagulan  (EDTA).  Hasil pengambilan darah relawan pada tabung EDTA dipipet sebanyak  50  µL  dimasukkan  ke  dalam  tabung  falcon kemudian  ditambahkan  masing-masing  5  µL    reagen antibodi  IL-10  PE  ( clones:  JES3-19F1  antibody ). Campuran  tersebut  di vortex homogeny  selama 1  menit,  kemudian  di  inkubasi  15  menit  dengan  suhu 20  -  25°C  (di  tempat  gelap).  Larutan  pelisis  50  µL diencerkan  10  x fluoresce-activated  cell  sorting (FACS)  dengan  aquades  sebanyak  450  µL  kemudian
dicampur  homogen.  Setelah  masa  inkubasi  selesai, sampel ditambahakan  450 µL  reagen  FACS (1x)  yang sudah diencerkan, campur homogen kemudian diinkubasi 15 menit dengan suhu 20 - 25°C (di tempat gelap).  Setelah  masa  inkubasi  selesai,  dilakukan analisis menggunakan alat FACS flowcytometer .

## Analisis data
Data  hasil  penelitian  dianalisis  secara  statistik untuk  melihat  adanya  perbedaan pre  and  post treatment pada  sukarelawan  dengan  perbandingan antara  sebelum  dan  sesudah  pemberian  kapsul  ekstrak rosella  menggunakan  SPSS  versi  21.  Analisis  data diawali dengan uji normalitas menggunakan shapiro-wilk dan dilanjutkan menggunakan uji wilcoxon pada taraf kepercayaan 95%

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Peneliti  melibatkan  tenaga  dokter  dalam  pemilihan sukarelawan  yang  terlibat  dalam  penelitian  dan diperoleh  sebanyak  21  orang  sukarelawan  yang  ikut serta  dalam  penelitian.  Karakteristik  sukarelawan disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1. Karakteristik sukarelawan sehat yang diberi kapsul ekstrak etanol rosella dosis 500 mg/hari selama 30 hari
No. Karakteristik sukarelawan Σ Sukarelawan (n = 21) Persentasi (%) 1 Jenis kelamin Laki-laki 11 52,4 Perempuan 10 47,6 2 Usia(tahun) a. ≤ 25 tahun 15 71,4 b. > 25 tahun 6 28,6 3 Rerata Indeks Massa Tubuh (Kg/m 2 ) 21,25 100 4 Pendidikan SMA 10 47,6 Perguruan Tinggi 11 52,4 5 Pekerjaan Tidak Bekerja 15 71,4 Bekerja 6 28,6 6 Status Pernikahan Tidakmenikah 17 81,0 Menikah 4 19,0 Keterangan uji statistik: distribusi frekuensi
Pengukuran IL-10 dilakukan dengan  menggunakan metode  flowsitometri.  Pengukuran  dilakukan  sebelum mengkonsumsi  kapsul  rosella  dosis  500  mg/hari (hari  ke-0),  setelah  mengkonsumsi  kapsul  rosella (hari  ke-30)  dan  15  hari  setelah  tidak  mengkonsumsi
kapsul  rosella  (hari  ke-45).  Pemeriksaan  hari  ke-0 bertujuan  sebagai  baseline  ( pre  treatment) .  Pemilihan 30 hari untuk mengkonsumsi kapsul rosella berdasarkan  Resnik  (2011)  yang  menyatakan  interval standar  penelitian  fase  1  adalah  30  hari  untuk  ukuran
standar  keamanan.  Pemilihan  pemeriksaan  hari  ke-45 berdasarkan ICH (2010) menyatakan setelah pemberian  perlakuan  suatu  obat  dilakukan  evaluasi lebih  lanjut  selama  2  minggu  untuk  menilai  toksisitas dan  atau  pemulihan  yang  tertunda.  Data  hasil
pengukuran  ekspresi  IL-10  sukarelawan  yang  diberi kapsul  rosella  dosis  500  mg/hari  selama  30  hari  dan 15  hari  setelah  tidak  mengkonsumsi  kapsul  rosella disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2. Hasil analisis rata-rata ekspresi IL-10 hari ke-0 - hari ke-30 dan hari ke-30 - hari ke-45 sukarelawan sehat
(n = 21) Parameter n Hari ke - (Mean ± SD) p-value (0-30) p-value (30-45) 0 30 45 IL-10 21 0,42 ± 0,24 0,83 ± 0,47 1,06 ± 0,67 0,01 0,14
Keterangan:  uji wilcoxon (p < 0,05)
Hari ke-0   : Sebelum pemberian kapsul ekstrak etanol rosella ( baseline ) Hari ke-30 : Setelah pemberian kapsul ekstrak etanol rosella Hari ke-45 : 15 hari setelah pemberian kapsul ekstrak etanol rosella
Hasil  analisis  yang  terlihat  pada  Tabel  2 menunjukkan rerata kadar IL-10 pada pemeriksaan hari ke-0  sampai  hari  ke-30  terdapat  perbedaan  yang bermakna  (p  <  0,05),  sedangkan  rerata  kadar  IL-10 pada  pemeriksaan  hari  ke-30  sampai  hari  ke-45  tidak terdapat  perbedaan  yang  bermakna  (p  >  0,05).  Kadar IL-10 hari ke-0 (sebelum diberikan kapsul rosella)adalah  0,42  ±  0,24  data  ini  bisa  dianggap sebagai kadar normal IL-10 ( baseline ) pada sukarelawan  sehat.  Pemeriksaan  hari  ke-30  setelah mengkonsumsi  kapsul  rosella  kadar  IL-10  meningkat dari  hari  ke-0  sebesar  0,83  ±  0,47,  dan  hari  ke-45 (15  hari  setelah  tidak  mengkonsumsi  kapsul  rosella) sebasar  1,06  ±  0,67  pada  sukarelawan  sehat  yang diberikan  kapsul  rosella  dosis  500  mg/hari.  Hasil penelitian  ini  menunjukkan  adanya  peningkatan  kadar ekspresi IL-10 pada sukarelawan yang diberikan kapsul rosella  dosis  500  mg/hari  selama  30  hari,  namun perubahan  ini  tidak  signifikan  secara  klinis  karena masih  dalam  batas  normal.  Nilai  ekspresi  IL-10  pada sukarelawan  sehat  yaitu  0,08  -  3,80  %  (Muris  dkk., 2012).
Hasil  penelitian  ini  sejalan  dengan  penelitian Fakeye  dkk . (2008)  mengemukakan  kelopak  bunga rosella  kering  larut  air  dosis  100  mg/KgBB  dapat meningkatkan produksi IL-10. Penelitian Nurkhasanah (2015) menyatakan ekstrak etanol rosella dengan dosis 50  dan  100  mg/KgBB  sekali  sehari  selama  21  hari berpotensi  sebagai  agen  imunomodulator  dengan  efek peningkatan  sekresi  IL-10  pada  tikus  SD.  Efek imunostimulator  bunga  rosella  karena  kandungan senyawa  fenolik  dan  flavanoid  (Chiang  dkk.,  2003; Mahadevan dkk ., 2009).
Peningkatan  IL-10  diketahui  sebagai  mediator penting  dalam  respon  pertahanan.  Aktivitas  IL-10
terjadi  karena  menghambat  produksi  TNF-α  dan berpengaruh  terhadap  sel  B  untuk  memproduksi antibodi (Fakeye dkk . , 2008). Mekanisme penghambatan ekstrak rosella terhadap ekspresi protein TNF-α  melalui  penghambatan  aktifasi  NF-κβ  dengan penghambatan enzim kinase  iκβ  sehingga tidak terjadi fosforilasi akibatnya dimer NF-κβ (p50 dan p65) tidak terlepas  dan  selanjutnya  tidak  terjadi  translokasi  p50 dan  p65  ke  dalam  inti  sel  (Sarbini  dkk.,  2011;  Maiti dkk., 2015).

## KESIMPULAN
Pemberian  kapsul  serbuk  bunga  rosella  merah ( Hibiscus  sabdariffa L.)  dosis  500  mg/hari  selama 30  hari  berpengaruh  dengan  terjadinya  peningkatan terhadap  ekspresi  IL-10,  tetapi  dalam  batas  nilai normal pada sukarelawan sehat.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Hibah  penelitian  unggulan  program  studi  dari  LPP Universitas  Ahmad  Dahlan  Tahun  2017  dan  Relawan yang berpartisipasi.

## DAFTAR PUSTAKA
Badan  Pengawas  Obat  dan  Makanan  Republik Indonesia (BPOM RI). (2014)a. Peraturan Kepala Badan  Pengawas  Obat  Dan  Makanan  Republik Indonesia  Nomor  7  Tahun  2014  Tentang Pedoman  Uji  Toksisitas  Non  klinik  Secara  In Vivo. Jakarta: BPOM.
Badan  Pengawas  Obat  dan  Makanan  Republik Indonesia (BPOM RI). (2014)b. Peraturan Kepala
Badan  Pengawas  Obat  dan  Makanan,  Pedoman Pelaksanaan  Uji  Klinik  Obat  Herbal  Nomor  13. Jakarta: BPOM.
Baratawidjaja, K. G. (2006). Imunologi Dasar. Jakarta:
Balai  Penerbit  Fakultas  Kedokteran  Universitas Indonesia
Chiang, L. C., Ng, L. T., Chiang, W., Chang, M. Y. & Lin,  C. C. (2003).  Immunomodulatory  Activities of  Flavonoids,  Monoterpenoids,  Triterpenoids,
Iridoid  Glycosides  and  Phenolic  Compounds  of Plantago Species. Planta Medica; 69; 600-604.
Couper,   K.  N., Blount,  D.  G.  & Riley,  E.  M.  (2008).
IL-10:  The  Master  Regulator  of  Immunity  to Infection,  Ournal  of  Immunology. American Association Of Immunologist; 180; 5771-5777. Fakeye,  T.  O.,  Pal,  A.,  Bawankule,  D.  U.  &  Khanuja,
S.  P.  (2008).  Immunomodulatory  Effect  of Extracts  of Hibiscus  sabdariffa L.  (Family
Malvaceae)  in  a  Mouse  Model. Phytotherapy Research; 22; 664-668.
Hodgson,  J.  &  Kevin,  D.  C.  (2006).  Dietary
Flavonoids:  Effects  on  Endothelial  Function  and Blood Pressure. Journal Of The Science Of Food And Agriculture; 86; 2492–2498.
ICH.  (2010).  M3(R2)  Nonclinical  Safety  Studies  for the  Conduct  of  Human  Clinical  Trials  and Marketing  Authorization  for  Pharmaceuticals.
Guidance  for  Industry; U.S.  Department  of Health  and  Human  Services  Food  and  Drug Administration.
Kumar,  R.  (2012).  Phytochemical  Properties  And
Antioxidant Activity of Hibiscus Sabdariffa Linn. International  Journal  Of  Pharmaceutical  and Chemical Science ; 1.
Kusumastuti,  E.,  Juni,  H.  &  Heni,  S.  (2014). Ekspresi COX-2 dan Jumlah Neutrofil Fase Inflamasi pada Proses  Penyembuhan  Luka  Setelah  Pemberian Sistemik  Ekstrak  Etanolik  Rosela  ( Hibiscus sabdariffa L)  Studi  in  Vivo  Pada  Tikus  Wistar.
Majalah Kedokteran Gigi; 21 ; 13-19.
Mahadevan, N., Shivali & Kamboj, P. (2009). Hibiscus sabdariffa  Linn:  An  overview. Natural  Product
Radiance; 8; 77-83.
Maiti,  S.,  Dai,  W.,  Alaniz,  R.  C.  &  Jayaraman,  A.
(2015). Mathematical Modeling of Pro- and Anti-
Inflammatory Signaling in Macrophages. Processes; 3; 1-18.
Mardiyah. (2009). Budi Daya dan Pengolahan Rosella, Cet. I. Jakarta: Agromedia Pustaka.
Muris, A. H., Jan, D., Joost, S., Jan, W. C., Raymond,
H.  &  Marielle,  T.  (2012).  Intracellular  IL-10 Detection  in T Cells by Flowcytometry: The Use of Protein Transport Inhibitors Revisited. Journal of Immunological Methods; 381; 59–65.
Niikura, M, Inone, S. I., & Kobayashi, F. (2011). Role of  Interleukin-10  in  Malaria:  Focusing  on Coinfection  With  Lethal  and  Nonlethal  Murine Malaria  Parasites. Journal  of  Biomedicine  and Biotechnology; 2011; 1-8.
Nurkhasanah.  (2015).  The  Effect  of  Rosella  ( Hibiscus sabdariffa L)  Treatment  on  IL-10  and  IL-14 Secretion  on  Dimethylbenz  (A)  Anthracene (DMBA)  Induced  Rat. International  Journal  Of Pharmacy and Pharmaceutical  Sciences;  7; 402- 404.
Ranieri,  E.,  Popescu  &  Gigante,  M.  (2014).  CTL
Elispot Assay. CytotoxicT-Cells; 1186; 75-86. Resnik, D. B. & Greg,  K. (2011). A National Registry for Healthy Volunteers in Phase 1 Clinical Trials. JAMA; 305; 1236–1237.
Rizki,  M.  I.,  Nurkhasanah,  Tedjo,  Y.,  Laela,  H.  N.  &
Krisana,  K.  (2017).  Antioxidant  Activity  of Nanoparticle  from  Rosella  ( Hibiscus  sabdariffa L.)  Calyx  Extract  Originated  Indonesia  and Thailand. Research  Journal  Of  Pharmaceutical,
Biological and Chemical Sciences; 8; 149-157. Sarbini, D. D. J., Sargowo, S. & Rohman. (2011). Efek Penghambatan  Ekstrak  Teh  Rosela  Merah terhadap NF-ĸβ, TNF-α, dan ICAM-1. Journal of Experimental Life Science; 1; 56-110.
Sari,  F.,  Nurkhasanah  &  Moch.  S.  B.  (2016).  Uji Toksisitas  Akut  Ekstrak  Etanol  Kelopak  Rosella ( Hibiscus  sabdariffa L.)  pada  Tikus  Sprague Dawley. Traditional  Medicine  Journal;  21 ;  12- 18.