Pengaruh pemberian mikrokapsul probiotik Bacillus cereus P22 dan Staphylococcus lentus L1k pada pakan terhadap kinerja pertumbuhan, respons imun, dan resistensi ikan lele, Clarias gariepinus Burchell 1822 yang diinfeksi Aeromonas hydrophila
[Effects of dietary probiotic microcapsules Bacillus cereus P22 and Staphylococcus lentus L1k on growth performance, immune response, and resistance of African catfish, Clarias gariepinus Burchell 1822 infected with Aeromonas hydrophila ]
Lilik Setiyaningsih 1 , Widanarni 2 , Angela Mariana Lusiastuti 3 , Munti Yuhana 2
1 Mahasiswa Magister, Program Studi Ilmu Akuakultur, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor
2 Departemen Budidaya Perairan, FPIK-IPB
3 Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Tawar Bogor Jl. Agatis, Kampus IPB, Dramaga, Bogor 16680 Jl. Sempur No 1 Bogor 16154
Diterima: 02 Juni 2016; Disetujui: 04 April 2017

## Abstrak
Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji dosis dan frekuensi pemberian mikrokapsul probiotik melalui pakan terhadap kinerja pertumbuhan, respons imun, dan resistensi ikan lele yang diinfeksi Aeromonas hydrophila . Penelitian ini meng- gunakan Bacillus cereus P22 dan Staphylococcus lentus L1k yang telah dienkapsulasi  melalui metode spray draying . Penelitian ini dilaksankan selama 56 hari dengan delapan perlakuan dan empat ulangan, terdiri atas perlakuan K- (kon- trol negatif), K+ (kontrol positif), A (pakan+mikrokapsul probiotik dosis 0,5% frekuensi setiap hari), B (pakan+mikro- kapsul probiotik dosis 0,5% frekuensi tiga hari sekali), C (pakan+mikrokapsul probiotik dosis 1% frekuensi setiap hari), D (pakan+mikrokapsul  probiotik dosis 1% frekuensi tiga hari sekali), E (pakan+mikrokapsul  probiotik  dosis 2% fre- kuensi setiap hari) dan F (pakan+mikrokapsul probiotik dosis 2% frekuensi tiga hari sekali). Ikan diuji tantang dengan A. hydrophila pada hari ke 42 dengan kepadatan 10 8 CFU ml -1 secara intramuscular (kecuali K- diinjeksi dengan phos- phate  buffer  saline ). Setelah  40  hari pascainjeksi, laju  sintasan tidak  menunjukkan  perbedaan  yang  signifikan antarperlakuan (p>0,05).Perlakuan E menunjukkan laju pertumbuhan (4,54±0,02%) dan total probiotik B. cereus (P22) dan S. lentus (L1k) (4,06±0,09 log CFU g -1 ; 4,02±0,08 log CFU g -1 ) tertinggi; sementara perlakuan D memberikan hasil nisbah konversi pakan terbaik (1,191±0,013), perlakuan F menunjukkan total bacterial count tertinggi (7,11±0,53 log CFU g -1 ). Hasil penelitian menunjukkan bahwa dosis 2% yang diberikan setiap hari memberikan hasil yang lebih baik dalam meningkatkan laju pertumbuhan, respons imun, dan resistensi ikan lele terhadap A. hydrophila.
Kata penting: A. hydrophila, Bacillus cereus, mikrokapsul probiotik , Staphylococcus lentus

## Abstract
The aimed of this research  was to evaluate the effects of dietary  probiotic microcapsules B.cereus P22 and S. lentus (L1k)  at  different  dose  and  frequency  on  growth  performance,  immune  response  and  resistance  of  African  catfish infected with A. Hydrophila . Probiotics used in this study were B. cereus P22 and S. lentus L1k encapsulated by spray draying method. The research was carried out for 56 days with eight treatments and four replications. The treatments were  K- (negative  control),  K+  (positive  control),  A  (feed supplemented  with  0,5%  of  microencapsulated  probiotic, fedevery day), B (feed supplemented with 0,5% of  microencapsulated probiotic, fed once every three days), C (feed supplemented with 1% of microencapsulated probiotic, fed every day), D (feed supplemented with 1% of microencap- sulated probiotic with an administration once every three days), E (feed with 2% of microencapsulated probiotic with an administration every day) and F  (feed with 2% of  microencapsulated probiotic with an administration once every three days). On day 42, all of the fish except K- were challenged by intramuscular injection of A. hydrophila (10 8 CFU ml -1 ). In 40 days after infection, there were no significant difference on survival rate (SR) between treatments (p> 0.05). Treatment E displayed the higher growth rate (4,54±0,02%), total probiotic B. cereus (P22) and S . lentus (L1k) (4.06± 0.09 log CFU g -1 ; 4.02±0.08 log CFU g -1 ) than other treatments; whereas treatment D showed the best feed conversion rasio(1.191±0.013), and treatment F offered the highest total bacterial count (7.11±0.53 log CFU g -1 ). An administration of 2% microencapsulated probiotic in every day frequency demonstrated the better growth performance, immune res- ponse and resistance of African catfish to A. hydrophila compare with other treatments.
Keywords: A. hydrophila, Bacillus cereus, catfish, microcapsulated probiotic , Staphylococcus lentus ____________________________ Penulis korespondensi Alamat surel: lilik.setiyaningsih92@gmail.com

## Pendahuluan
Aeromonas  hydrophila termasuk  ke  dalam patogen  oportunistik  yang  dapat  menyebabkan kematian  yang  tinggi  (80-100%)  pada  ikan  budi daya (Janda & Abbott 2010). Ikan yang terinfeksi A. hydrophila dapat mengalami pendarahan pada organ yang terinfeksi sehingga menyebabkan lu- ka. Secara umum gejala klinis yang ditimbulkan pada ikan yang terinfeksi bakteri tersebut adalah penurunan respons terhadap pakan, berenang ab- normal,  luka  kemerahan,  sisik  lepas,  sirip  terki- kis, kerusakan sel berupa hipertropi dan hiperpla- sia, kerusakan organ hati dan ginjal (Hardi et al . 2014).
Salah  satu  solusi  yang  diharapkan  sebagai upaya  penanggulangan  infeksi  bakteri A.  hydro- phila adalah  pemberian  probiotik.  Probiotik mampu  memberikan  efek  antimikrobial  berupa produksi  antibiotik,  bakteriosin,  enzim  (lisozym dan  protease)  atau  hidrogen  peroksida  (Cruz et al .  2012).  Bakteri  probiotik  bersifat  kompetitor terhadap  patogen  dan  mampu  meningkatkan sistem imun (El- Bouhy et al . 2013).
Probiotik dalam  bentuk  kultur  sel  memiliki keterbatasan  dalam  masa  penyimpanan  dan  mu- dah rusak oleh pengaruh lingkungan (Weinbreck et al. 2010). Salah satu upaya yang dapat dilaku- kan  untuk  mempertahankan  viabilitas  probiotik adalah  melalui  penggunaan  teknologi  mikroen- kapsulasi  yang  merupakan  teknik  pengemasan bahan  dalam  bentuk  partikel  mikro  dan  nano. Mikroenkapsulasi  dapat  melindungi  bahan  sen- sitif  dari  kelembaban,  panas,  cahaya  atau  oksi- dasi  (Jafari et  al. 2008).  Menurut  Jyothi et  al.
(2010)  proses  kering  ( spray  drying )  merupakan metode  mikroenkapsulasi  yang  tergolong  murah dibandingkan dengan metode lainya dan  mampu menghasilkan  serbuk  kualitas  tinggi  untuk  pro- duksi skala besar.
Penggunaan  dosis  dan  frekuensi  pemberian probiotik  yang  tepat  berhubungan  dengan  nilai ekonomis dan diharapkan mampu menekan biaya produksi  yang dikeluarkan  selama  masa  pemeli- haraan.  Dosis  pemberian  mikrokapsul  probiotik S.  lentus pada  pakan  sebesar  0,5%,  1%  dan  2% sebelumnya  pernah  dilaporkan  oleh  Rahmawati (2015). Pemberian mikrokapsul probiotik S. len- tus dengan dosis berbeda menunjukkan pengaruh yang nyata terhadap laju pertumbuhan dan efisi- ensi  pakan  pada  ikan  nila  ( Oreochromis  niloti-- cus )  yang  terinfeksi S.  agalactiae .  Beberapa  pe- nelitian  lain  mengenai  dosis  probiotik  juga  per- nah dilaporkan (Bagheri et al . 2008, Utami et al.
2015). Munaeni et al. (2014) menyatakan bahwa pemberian  mikrokapsul  sinbiotik Bacillus sp. NP5  RfR  dan  oligosakarida  dengan  frekuensi yang  berbeda  memberikan  pengaruh  yang  nyata terhadap laju pertumbuhan dan respons imun pa- da udang vaname yang terinfeksi Vibrio harveyi . Namun penelitian mengenai gabungan dosis dan frekuensi  mikrokapsul  probiotik  multispesies untuk pengendalian A. hydrophila pada ikan lele belum pernah dilakukan.
Penggunaan probiotik multispesies diketahui memiliki  efektivitas  yang  lebih  tinggi  dalam menghambat penyebaran beberapa jenis penyakit bakterial  (Welker & Lim 2011). Pada penelitian ini probiotik multispesies B. cereus dan S. lentus digunakan  untuk  mengendalikan  infeksi A. hy- drophila pada ikan lele.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengkaji  do- sis  dan  frekuensi  pemberian  mikrokapsul  pro- biotik  melalui  pakan  terhadap  kinerja  pertum- buhan, respons imun dan resistensi ikan lele yang diinfeksi A. hydrophila .

## Bahan dan metode
Penelitian  ini  dilaksanakan  pada  bulan  Sep- tember 2015-Januari  2016 di Instalasi Penelitian
dan  Pengembangan  Pengendalian  Penyakit  Ikan (IP4I)  (Balai  Penelitian  dan  Pengembangan  Bu- didaya Air Tawar Bogor) dan Laboratorium Ter- padu SEAFAST, Institut Pertanian Bogor. Bakte- ri  probiotik  yang  digunakan  adalah B.  cereus (P22)  (10 8 CFU  ml -1 )  dan S.  lentus (L1k)  (10 8
CFU  ml -1 )  dengan  penanda  molekuler  resisten antibiotik  (Rifampisin  untuk  P22  dan  Chloram- penicol  untuk  L1k)  dan  dimikroenkapsulasi  ses- uai dengan metode Zubaidah et al. (2015). Bak- teri A.  hydrophila yang  digunakan  merupakan koleksi  Instalasi  Penelitian  dan  Pengembangan Pengendalian Penyakit Ikan (IP4I) Bogor.
Penelitian  ini  terdiri  atas  delapan  perlakuan dengan empat ulangan, yaitu K- (kontrol negatif), K+ (kontrol positif), A (pakan+mikrokapsul pro- biotik dosis 0,5% frekuensi setiap hari), B (pakan +mikrokapsul probiotik dosis 0,5% frekuensi tiga hari sekali), C (pakan+mikrokapsul probiotik do- sis  1%  frekuensi setiap  hari),  D  (pakan+  mikro- kapsul probiotik dosis 1% frekuensi tiga hari se- kali),  E (pakan+mikrokapsul  probiotik  dosis  2% frekuensi  setiap  hari  sekali)  dan  F  (pakan  +mi- krokapsul probiotik dosis 2% frekuensi tiga hari sekali).  Rancangan  penelitian  yang  digunakan adalah  rancangan  acak  lengkap.  Pakan  yang  di- gunakan  merupakan  pakan  komersial  dengan kadar protein sebesar 30%. Mikrokapsul probio- tik  ditambahkan  ke  dalam  pakan  sesuai  dengan dosis yang telah ditentukan dan dilakukan proses pelapisan ( coating ) menggunakan 2% putih telur.
Pakan dikering udarakan dan disimpan di dalam lemari pendingin bersuhu 4 0 C.
Ikan lele yang digunakan adalah galur muti- ara dengan bobot rata-rata 3,72±0,505 g. Ikan di- pelihara pada bak berukuran 60×70×40 cm 3 ber- isi  60  liter  air  dan  kepadatan  15  ekor  tiap  bak. Pemberian  pakan  dilakukan  sebanyak  tiga  kali sehari, frekuensi pemberian pakan yang mengan- dung mikrokapsul probiotik sesuai dengan perla-
kuan dan diberikan secara ad satiation selama 40 hari  masa  pemeliharaan.  Ikan  diuji  tantang  de- ngan A. hydrophila pada hari ke 42 dengan kepa- datan 10 8 CFU ml -1 sebanyak 0,2 ml ekor -1 meng- gunakan syringe steril secara intramuscular (ke- cuali K- diinjeksi dengan phosphate buffer saline PBS), ikan diberi pakan perlakuan selama 14 hari pascauji  tantang.  Pengamatan  sintasan  pascauji tantang  dilakukan  dengan  mengamati  kematian setiap  hari  selama  14  hari.  Kualitas  air  selama masa  pemeliharaan  diukur  menggunakan water quality checker.
Parameter yang diamati  selama masa peme- eliharaan  meliputi  kinerja  pertumbuhan,  respons imun,  jumlah  total  bakteri  di  usus  ikan  uji  dan jumlah  total  bakteri A.  hydrophila di  organ  tar- get.  Pascauji  tantang A.  hydrophila ,  parameter yang diamati  meliputi  respons imun, laju sintas- an, dan jumlah total bakteri A. hydrophila di or- gan target.

## Kinerja pertumbuhan
Parameter  kinerja  pertumbuhan  yang  dia- mati  meliputi  laju  sintasan  ( survival  rate ),  laju pertumbuhan spesifik ( spesific growth rate ), dan nisbah konversi pakan ( feeding conversion rate ).
Laju  sintasan  dihitung  menggunakan  persa- maan menurut Effendie (1997):
SR= N t /N o × 100 Keterangan:  S  =  laju  sintasan  (%),  N t =  jumlah  ikan yang hidup pada akhir pengamatan (ekor), N o = jumlah ikan yang hidup pada awal uji tantang (ekor)
Penghitungan laju pertumbuhan  spesifik pa- da masa pemeliharaan sebelum uji tantang meng- gunakan persamaan Giri et al. (2013):
Keterangan:  SGR=  laju  pertumbuhan  spesifik  (%), We=  rata-rata  bobot  ikan  pada  akhir  penelitian  (g), Ws= rata-rata bobot ikan pada awal penelitian (g), t= lama pemeliharaan (hari)
Nisbah konversi pakan pada masa pemeliha- raan  sebelum  uji  tantang  dihitung  menggunakan rumus Zonneveld et al. (1991):
FCR = F/ (B t + B m - B o ) Keterangan: FCR= nisbah konversi pakan, F = jumlah pakan yang diberikan (g), B t =  biomassa  ikan  pada akhir pemeliharaan (g), Bm= biomassa ikan yang mati selama  pemeliharaan  (g),  Bo=  biomassa  ikan  pada awal memeliharaan (g)

## Respons imun
Parameter  respons  imun  yang  diamati  yaitu kadar  hematokrit  (Hc),  kadar  hemoglobin  (Hb), aktivitas fagositosis (AF), dan ledakan respiratori ( respiratory burst RB).
Kadar  Hc  diukur  menggunakan  tabung  mi- krohematokrit.  Darah  dimasukkan  ke  dalam tabung  mikro  hematokrit  secara  kapiler  hingga mencapai  ¾  bagian  tabung.  Ujung  tabung  yang telah berisi darah ditutup menggunakan crytoceal dan  disentrifugasi  dengan  kecepatan  5000  rpm selama lima menit. Panjang darah yang mengen- dap dan panjang total volume darah pada tabung diukur untuk menunjukkan nilai kadar Hc. Kadar Hc dihitung dengan rumus (Anderson & Siwicki 1995):
Hc = (a/b) × 100% Keterangan:  a = panjang darah yang mengendap, b = panjang total volume darah pada tabung
Penghitungan kadar AF dilakukan untuk me- nentukan persentase aktivitas sel-sel fagosit. Da-
eppendorf
- kan  ke  dalam  eppendorf  dan  diinkubasi  selama 20  menit  dalam  suhu  ruang.  Suspensi  darah  se-
- buat  preparat  ulas.  Preparat  ulas  dikering  udara- kan,  lalu  difiksasi  dengan  metanol  selama  5-10 menit dan dikering udarakan. Kemudian dilanjut- kan  perendaman  dengan  giemsa  selama  10-15 menit.  Preparat  tersebut  dibilas  dengan  akuades dan  dikering  udarakan,  kemudian  dilakukan
pengamatan  secara  mikroskopis.  Penghitungan dilalukan  dengan  pengamatan  terhadap  sel-sel yang memfagosit bakteri hingga 100 sel (Ander- son & Siwicki 1995).
Kadar Hb diukur menggunakan metode Sah- li.  Darah  yang  telah  ditampung  dihisap  dengan menggunakan  pipet  sahli  sampai  skala  20  mm 3 atau  pada  skala  0,2  ml.  Ujung  pipet  kemudian dibersihkan  dengan  tisu.  Darah  yang  telah  dihi- sap ke dalam pipet dipindahkan ke dalam tabung Hb-meter yang telah diisi HCl 0,1 N sampai ska- la 10 (merah), larutan tersebut diaduk dan dibiar- kan  selama  3-5  menit.  Akuades  ditambahkan sampai  warna  darah  dan  HCl  tersebut  nampak seperti  warna  larutan  standar  yang  ada  di  dalam Hb-meter  tersebut.  Skala  yang  terbentuk  dibaca dengan  mencocokkan  permukaan  cairan  dengan skala  tabung  Sahli  pada  skala  jalur  gr  %  (ku- ning).  Skala  tersebut  menunjukkan  banyaknya hemoglobin  dalam  gram  100  ml -1 darah  (Wede- meyer & Yasutake 1997).
Pengukuran  RB  atau  uji nitroblue  tetrazo- lium (NBT)  dilakukan  untuk  melihat  produksi radikal  oksigen  dari  fagosit  sel  yang  berperan melawan  patogen.  Darah  ikan  sampel  diambil sebanyak 50 µl, dimasukkan ke dalam microplate dan diinkubasi di dalam inkubator bersuhu 37 o C selama  satu  jam.  Darah  kemudian  dibuang  dan dibilas  menggunakan  100  µl PBS  sebanyak tiga kali  hingga  darah  dalam  lubang mikroplate hi- lang. Larutan NBT dimasukkan ke dalam lubang microplate sebanyak  50 µl  lalu  diinkubasi  kem- bali  selama  satu  jam  pada  suhu  37 o C.  Satu  jam setelah inkubasi larutan NBT dibuang dan dibilas dengan  metanol  100%  sebanyak  50  µl  selama dua-tiga  menit,  kemudian  ditambahkan  kembali metanol 30% sebanyak 50 µl dan dilakukan seba- nyak  tiga  kali, microplate kemudian  dikering- anginkan selama ± 15 menit. Larutan KOH 60 µl dan  DMSO  70  µl  dimasukkan  ke  dalam  lubang
microplate dan  dibaca  di microplate  reader un- tuk mendapatkan hasil.

## Jumlah total bakteri di usus ikan uji
Total  bakteri  serta  total  probiotik  P22  dan L1k  di  dalam  usus  diamati  pada  awal  dan  akhir pemeliharaan.  Usus  ikan  diambil  kemudian  di- homogenkan dalam larutan PBS. Parameter yang diamati  adalah Total  Viable  Bacterial  Count
(TBC)  dan  total  probiotik.  Media  yang  diguna- kan berupa media TSA ( Tryptic Soy Agar ) untuk TBC dan media TSA+antibiotik (Rifampisin un- tuk P22 dan Chlorampenicol untuk L1K). Penga- matan dilakukan setelah  inkubasi 48 jam.  Popu- lasi masing-masing probiotik dihitung dengan ca- ra Total Plate Count (TPC).

## Jumlah total bakteri A. hydrophila organ target
Total  bakteri A.  hydrophila di  organ  target
(ginjal dan hati) diamati pada awal pemeliharaan serta  tujuh  hari  dan  14  hari  pascauji  tantang. Penghitungan  jumlah  bakteri  dilakukan  dengan mengambil  sampel  ginjal  dan  hati  ikan  masing- masing  sebanyak  0,1  g.  Sampel  dihaluskan menggunakan mortar dan  dihomogenkan  dalam
0,9 ml larutan PBS. Media yang digunakan beru- pa  media  selektif A.  hydrophila RS  ( Rimler- Shotts ), kemudian dilakukan pengenceran berseri serta  penghitungan  bakteri  dengan  metode  ca- wan.  Pengamatan  dilakukan  setelah  inkubasi  24 jam. Jumlah total bakteri A. hydrophila dihitung dengan cara Total Plate Count (TPC).

## Analisis data
Data  total  bakteri  di  usus,  total  probiotik  di usus, dan total A. hydrophila di organ target dia- nalisis  secara  deskriptif,  sedangkan  data  lainnya dianalisis  menggunakan  sidik  ragam  (ANOVA) pada selang kepercayaan 95%, data yang berbeda nyata diuji menggunakan uji lanjut Duncan.

## Hasil

## Kinerja pertumbuhan
Laju sintasan ikan lele pada perlakuan A, B, C, D, E, F dan kontrol selama masa pemeliharaan memiliki  kisaran  nilai  93,31-97,78%  dan  tidak menunjukkan  adanya  perbedaan  yang  signifikan antarperlakuan (p>0,05; Tabel 1). Nilai laju per- tumbuhan  spesifik  tertinggi  terdapat  pada  perla- kuan  E  (4,537±0,018%),  tidak  berbeda  nyata dengan  perlakuan  D  (p>0,05;  Tabel  1)  namun berbeda  nyata  dengan  perlakuan  lain  (p<0,05; Tabel  1).  Perlakuan  D  menunjukkan  nilai  FCR terendah  (1,191±0,013),  tidak  berbeda  nyata (p>0,05;  Tabel  1)  dengan  perlakuan  C  (1,242± 0,062) dan F (1,25±0,034) namun berbeda nyata dengan perlakuan lainnya (p<0,05; Tabel 1).
Total  bakteri  pada  saluran  pencernaan  sela- ma masa pemeliharaan 40 hari pada perlakuan F (7,11±0,53  log  CFU  g -1 )  diketahui  memberikan hasil tertinggi (Tabel 2). Total probiotik B. Cere- us (P22) dan S. lentus (L1k) tertinggi dihasilkan oleh perlakuan E (4,06±0,09 log CFU g -1 ; 4,02±
0,08 log CFU g -1 ) (Tabel 2). Total bakteri di usus pada  seluruh  perlakuan  probiotik  diketahui  me- miliki  jumlah  yang  lebih  tinggi  dibandingkan perlakuan kontrol (Tabel 2).

## Respons imun
Pemberian probiotik dengan dosis dan freku- ensi berbeda diketahui memberikan pengaruh ter- hadap  parameter  gambaran  darah.  Setelah  masa pemeliharaan  selama  40  hari,  kadar  hematokrit (Hc),  hemoglobin  (Hb),  aktivitas  fagositosis (AF), dan ledakan respiratori (RB) pada perlaku- an pemberian probiotik  menunjukkan  hasil  yang lebih tinggi dibanding kontrol (p<0,05) (Gambar 1a, 1b, 1c, dan 1d). Fluktuasi nilai pada parame- ter  gambaran  darah  terjadi  pascauji  tantang (Gambar 1a, 1b, 1c dan 1d), hal tersebut diduga berkaitan dengan status kesehatan ikan.
Tabel 1 Laju sintasan (SR), laju pertumbuhan spesifik (SGR),  dan nisbah konversi pakan (FCR) ikan lele yang diberi probiotik dengan dosis dan frekuensi berbeda Perlakuan SR (%) SGR (%) FCR K 93,31±6,67 a 3,681±0,000 a 1,750±0,070 d A 93,33±6,67 a 4,143±0,016 b 1,340±0,004 b B 97,78±3,85 a 4,361±0,077 c 1,441±0,036 c C 97,78±3,85 a 4,367±0,101 c 1,242±0,062 ab D 93,33±6,67 a 4,433±0,003 cd 1,191±0,013 a E 97,78±3,85 a 4,537±0,018 d 1,462±0,004 c F 95,55±3,85 a 4,195±0,055 b 1,244±0,034 ab
Keterangan:  huruf  yang  berbeda  pada  kolom  yang  sama  menunjukkan  pengaruh  perlakuan  yang  berbeda  nyata  (Uji Duncan;  p<0,05).  Nilai  yang  tertera  merupakan  nilai  rata-rata  dan  simpangan  baku.  K  (kontrol  tanpa pemberian  probiotik),  A  (pakan  +  mikrokapsul  probiotik  dosis 0,5%  frekuensi  setiap  hari),  B  (pakan  + mikrokapsul probiotik dosis 0,5% frekuensi tiga hari sekali), C (pakan + mikrokapsul probiotik dosis 1% frekuensi setiap hari), D (pakan + mikrokapsul probiotik dosis 1% frekuensi tiga hari sekali), E (pakan + mikrokapsul  probiotik  dosis  2%  frekuensi  setiap  hari)  dan  F  (pakan  +  mikrokapsul  probiotik  dosis 2% frekuensi tiga hari sekali).
Tabel 2 Total bacterial count (TBC) dan total probiotic count (TPC) P22 & L1k pada saluran pencernaan ikan lele yang diberi probiotik dengan dosis dan frekuensi berbeda
Perlakuan TBC (log CFU g -1 ) TPC (log CFU g -1 ) P22 L1k K 6,37±0,16 0,00±0,00 0,00±0,00 A 6,81±0,51 3,12±0,16 3,04±0,06 B 6,42±0,16 3,06±0,08 3,54±0,08 C 6,84±0,08 3,85±0,07 3,49±0,16 D 6,57±0,23 3,10±0,15 3,47±0,01 E 6,99±0,83 4,06±0,09 4,02±0,08 F 7,11±0,53 3,65±0,08 3,88±0,05
Keterangan:  K+  (kontrol  positif),  A  (pakan  +  mikrokapsul  probiotik  dosis  0,5%  frekuensi  setiap  hari),  B  (pakan  + mikrokapsul probiotik dosis 0,5% frekuensi tiga hari sekali), C (pakan + mikrokapsul probiotik dosis 1% frekuensi setiap hari), D (pakan + mikrokapsul probiotik dosis 1% frekuensi tiga hari sekali), E (pakan + mikrokapsul  probiotik  dosis  2%  frekuensi  setiap  hari)  dan  F  (pakan  +  mikrokapsul  probiotik  dosis 2% frekuensi tiga hari sekali).
Kadar Hc dan Hb  menurun  pada hari ke 44 dan  meningkat  kembali  pada hari  ke  49  dan  56. Kadar Hb tertinggi pada akhir pemeliharaan dan pascauji  tantang  ditunjukkan  oleh  perlakuan  E (Gambar  1a)  berbeda  nyata  dengan  seluruh  per- lakuan (p<0,05). Nilai Hc tertinggi pada hari ke 44  dan  49  dihasilkan  oleh  perlakuan  E  (27,70± 0,61;  31,83±1,25)  tidak  berbeda  nyata  dengan perlakuan  A,  dan  C  (p>0,05)  namun  berbeda nyata  dengan  perlakuan  lainnya  (p<0,05).  Nilai Hc  tertinggi  pada  hari  ke  56  ditunjukkan  oleh perlakuan  C  (34,52±1,69)  tidak  berbeda  nyata
dengan perlakuan  A dan E (p<0,05) namun ber- beda nyata dengan perlakuan lainnya (p>0,05).
Pascauji tantang, nilai AF dan RB meningkat pada hari ke 44 kemudian menurun kembali pada hari ke 49 dan 56. Nilai AF tertinggi pada hari ke 44  ditunjukkan  oleh  perlakuan  E  (58,75±1,77) tidak  berbeda  nyata  dengan  perlakuan  C  dan  F (p>0,05) namun berbeda nyata dengan perlakuan lainnya (p<0,05). Nilai RB tertinggi pada hari ke 44  dihasilkan  oleh  perlakuan  E  (0,076±0,004) berbeda  nyata  dengan  seluruh  perlakuan  lainnya (p<0,05).
a g e c a a a a a d c c a e c b cd b cd c c c b b d
f e d b e d c 0 5 10 15 40 44 49 56 K ad ar H em og lo bi n (g % ) Hari ke- K- K+ A B C D E F a f c cd a
a a a c de c cd b b b c a e c d a cd b b b e c d bc c b c 0 20 40 40 44 49 56 K ad ar H em at ok ri t (% ) Hari ke- K- K+ A B C D E F
a a a a
a b b b b d cd d b c c c c de ef e b c de c bc e f e bc de ef d 0 20 40 60 80 40 44 49 56 A kt iv it as F ag os it os is (% ) Hari ke- K- K+ A B C D E F
a a a a a ab a ab b ab b ab ab abc
a ab b d b ab ab bcd ab ab b f c b
ab cd b ab
0.0000 0.0200 0.0400 0.0600 0.0800 0.1000 40 44 49 56 A kt iv it as R es pi ra to ry B ur st
(O .D 6 30 ) Hari ke- K- K+ A B C D E F (a) (b) (c) (d)
Gambar 1 Kadar hemoglobin (a), kadar hematokrit (b), aktivitas fagositosis (c), aktivitas ledakan respiratori (d) ikan lele yang diberi probiotik dengan dosis dan frekuensi yang berbeda pada akhir pemeliha- raan (hari ke-40) dan pascauji tantang (hari ke- 44, 49 dan 56). Huruf yang berbeda di setiap ba- tang hari yang sama menunjukkan pengaruh perlakuan yang berbeda nyata (Uji Duncan; p<0,05). K+  (kontrol  positif),  A  (pakan  +  mikrokapsul  probiotik  dosis  0,5%  frekuensi  setiap  hari),  B (pakan + mikrokapsul probiotik dosis 0,5% frekuensi tiga hari sekali), C (pakan + mikrokapsul probiotik dosis 1% frekuensi setiap hari), D (pakan + mikrokapsul probiotik dosis 1% frekuensi tiga hari sekali), E (pakan + mikrokapsul probiotik dosis 2% frekuensi setiap hari) dan F (pakan + mikrokapsul probiotik dosis 2% frekuensi tiga hari sekali).
Total A.  hydrophila di  organ  target  pada awal  pemeliharaan  untuk  seluruh  perlakuan  me- nunjukkan  hasil  <2,00±0,00  log  CFU  g -1 .  Ke- mampuan  bakteri  probiotik  dalam  menghambat pertumbuhan A. hydrophila dapat diketahui dari total A.  hydrophila pada  organ  target.  Total A. hydrophila di organ ginjal dan hati terendah pada hari  ke-49  dihasilkan  oleh  perlakuan  E  (3,65± 0,49  log  CFU  g -1 ;  3,75±0,21  log  CFU  g -1 ),  se-
dangkan  total A.  hydrophila di  organ  hati    dan ginjal  terendah  pada  hari  ke-56  dihasilkan  oleh seluruh  perlakuan  probiotik  dengan  frekuensi pemberian  setiap  hari  yaitu  perlakuan  A,  C,  E (<2,00±0,00  log  CFU  g -1 )  (Tabel  3).  Total A. hydrophila di organ ginjal dan hati pada K- (hari ke-49  dan  56)  memiliki  nilai  <2,00±0,00  log CFU g -1 .
Tabel 3 Total A. hydrophila pada organ target ikan lele pasca uji tantang yang diberi probiotik dengan dosis dan frekuensi berbeda Perlakuan H49 (log CFU g -1 ) H56 (log CFU g -1 ) Ginjal Hati Ginjal Hati K- <2,00±0,00 <2,00±0,00 <2,00±0,00 <2,00±0,00 K+ 6,31±1,17 6,87±0,17 4,81±0,29 5,34±0,62 A 4,95±0,06 4,05±0,21 <2,00±0,00 <2,00±0,00 B 5,45±0,02 4,57±0,13 3,84±0,34 3,89±0,16 C 4,21±0,19 3,88±0,39 <2,00±0,00 <2,00±0,00 D 5,29±0,02 3,93±0,21 3,80±0,28 3,89±0,16 E 3,65±0,49 3,75±0,21 <2,00±0,00 <2,00±0,00 F 5,05±0,57 4,41±0,21 3,54±0,34 3,65±0,49
Keterangan:  K+  (kontrol  positif),  A  (pakan  +  mikrokapsul  probiotik  dosis  0,5%  frekuensi  setiap  hari),  B  (pakan  + mikrokapsul probiotik dosis 0,5% frekuensi tiga hari sekali), C (pakan + mikrokapsul probiotik dosis 1% frekuensi setiap hari), D (pakan + mikrokapsul probiotik dosis 1% frekuensi tiga hari sekali), E (pakan + mikrokapsul  probiotik dosis  2% frekuensi setiap hari),  dan F (pakan +  mikrokapsul probiotik dosis 2% frekuensi tiga hari sekali).
Gambar 2 Laju sintasan ikan lele pascauji tantang A. hydrophila . Huruf yang berbeda di setiap bar menun- jukkan  pengaruh  perlakuan  yang  berbeda  nyata  (Uji  Duncan;  p<0,05).  K+  (kontrol  positif),  A (pakan + mikrokapsul probiotik dosis 0,5% frekuensi setiap hari), B (pakan + mikrokapsul pro- biotik dosis 0,5% frekuensi tiga hari sekali), C (pakan + mikro-kapsul probiotik dosis 1% fre- kuensi  setiap  hari), D  (pakan  +  mikrokapsul pro-biotik dosis 1% frekuensi  tiga  hari  sekali), E (pakan  +  mikrokapsul  probiotik  dosis  2%  frekuensi  setiap  hari),  dan  F  (pakan  +  mikrokapsul probiotik dosis 2% frekuensi tiga hari sekali).
f a cd c d b e de 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 Pasca Uji Tantang S in ta sa n (S R ) K- K+ A B C D E F

## Laju sintasan pascauji tantang
Hasil penelitian menunjukkan bahwa seluruh perlakuan probiotik memberikan tingkat sintasan yang  lebih  baik  dibandingkan  kontrol  positif (p<0,05)  (Gambar  2).  Perlakuan  E  (93,10± 0,33%)  memberikan  hasil  laju  sintasan  yang  le- bih  tinggi,  tidak  berbeda  nyata  (p>0,05)  dengan perlakuan F (89,77±4,38%) namun berbeda nyata dengan perlakuan lainnya (p<0,05).

## Kualitas air
Hasil pengukuran  menunjukkan bahwa  kua- litas  air  selama  masa  pemeliharaan  adalah  suhu 26-30 0 C, oksigen terlarut 4-5,93 mg L -1 , amoniak
0,016-0,673 mg L -1 , dan pH 5,5-7,0.

## Pembahasan

## Kinerja pertumbuhan
Laju  pertumbuhan  spesifik  meningkat  sei- ring dengan peningkatan dosis pemberian probio- tik, kecuali pada perlakuan F (4,195±0,055) yang mengalami penurunan.  Penurunan  nilai  laju per- tumbuhan spesifik pada perlakuan F tersebut di- duga  terjadi  karena  adanya  penurunan  frekuensi pemberian  mikrokapsul  probiotik  pada  dosis tinggi (2%). Pada dosis tinggi (2%) bakteri probi- otik  bekerja  lebih  efektif  dalam  meningkatkan nilai laju pertumbuhan spesifik apabila diberikan dengan frekuensi tinggi (setiap hari). Hal tersebut sesuai dengan pernyataan Zubaidah et al . (2015) bahwa semakin tinggi dosis sinbiotik Bacillus sp. yang  diberikan  maka  laju  pertumbuhan  semakin meningkat.  Peningkatan  frekuensi  pemberian probiotik pada dosis yang rendah (0,5%) menga- kibatkan penurunan laju pertumbuhan, pada dosis sedang (1%) tidak menunjukkan perbedaan yang nyata, sedangkan pada dosis tinggi (2%) menun- jukkan  adanya  peningkatan  laju  pertumbuhan. Probiotik yang diberikan pada dosis sedang (1%) dengan  frekuensi  pemberian  probiotik  tiga  hari
sekali  menunjukkan  nilai  nisbah  konversi  pakan terbaik.
Pemberian  mikrokapsul  probiotik B.cereus P22  dan S.  lentus L1k  diketahui  dapat  mening- katkan  laju  pertumbuhan  spesifik  dan  menurun- kan  nisbah  konversi  pakan  dibandingkan  perla- kuan kontrol. Peningkatan laju pertumbuhan spe- sifik dan penurunan  nisbah konversi pakan pada perlakuan  mikrokapsul  probiotik  diduga  akibat pengaruh  dari  meningkatnya  probiotik B.cereus P22  dan S.  lentus L1k  pada  saluran  pencernaan.
et  al. (2015)  menyatakan  bahwa  pem- berian  probiotik Bacillus sp  dan Staphylococcus sp.  pada  media  budi  daya  diketahui  mampu memberikan hasil konversi pakan yang lebih baik dibandingkan  dengan  kontrol.  Menurut  Bagheri et al. (2008), peningkatan laju pertumbuhan spe- sifik  dan  penurunan  nilai  nisbah  konversi  pakan pada perlakuan pemberian probiotik Bacillus sp. melalui  pakan  diduga  disebabkan  oleh  peran Bacillus sp.  dalam  membantu  memecah  protein dan karbohidrat. Balcazar et al. (2007) menyata- kan  bahwa  probiotik  melalui  pakan  mampu  me- modifikasi komposisi mikrobiota sehingga mem- berikan pengaruh yang baik terhadap sistem pen- cernaan.
Peningkatan  dosis  pemberian  probiotik mengakibatkan  peningkatan  total bakteri  dan to- tal  probiotik  pada  saluran  pencernaan  ikan  uji. Peningkatan  frekuensi  pemberian  probiotik  juga mengakibatkan  peningkatan  jumlah  total  bakteri (kecuali  pada  perlakuan  dosis  2%).  Pada  dosis yang sama, ikan uji yang diberikan dengan freku- ensi  pemberian  tiga  hari  sekali  menunjukkan jumlah probiotik yang lebih sedikit dibandingkan dengan perlakuan frekuensi pemberian setiap ha- ri.  Tingginya  jumlah  probiotik  P22  dan  L1k  di saluran pencernaan  pada perlakuan E diduga di- sebabkan  oleh  tingginya  jumlah  sel  probiotik yang  diberikan  pada  pakan  dengan  frekuensi
pemberian  yang lebih tinggi.  Organisme probio- tik diketahui  mampu bertahan pada saluran pen- cernaan  apabila  diberikan  dalam  jangka  waktu yang  lama,  sehingga  semakin  lama  waktu  pem- berian  probiotik  maka  jumlah  mikroorganisme dalam  saluran  pencernaan  semakin  meningkat (Cruz et  al. 2012).  Peningkatan  jumlah  total bakteri  di  saluran  pencernaan  akibat  pemberian probiotik Bacillus sp. melalui pakan  pada Oreo- chromis niloticus (Utami et al. 2015) juga pernah dilaporkan sebelumnya.

## Respons imun
Suplementasi  probiotik  memberikan  hasil imun  yang  lebih  baik  dibanding  perlakuan  kon- trol.  Kadar  hemoglobin,  hematokrit,  aktivitas fagositosis dan aktivitas ledakan respiratori pada akhir pemeliharaan serta pascauji tantang menun- jukkan bahwa perlakuan probiotik dengan freku- ensi  pemberian  setiap  hari  menghasilkan  nilai yang lebih tinggi dibandingkan frekuensi pembe- rian tiga hari sekali. Peningkatan dosis probiotik mengakibatkan  peningkatan  kadar  hemoglobin, aktivitas  fagositosis  dan  aktivitas ledakan  respi- ratori,  namun  tidak  memberikan  pengaruh  yang nyata  terhadap  peningkatan  kadar  hematokrit. Pemberian  probiotik  selama  masa  pemeliharaan diduga  berpengaruh  terhadap  peningkatan  bebe- rapa parameter tersebut. Meningkatnya kadar he- matokrit  mengindikasikan bahwa probiotik  yang digunakan efektif dalam meningkatkan status ke- sehatan ikan (Aly et al. 2008). Bakteri probiotik dapat  memberikan  efek  imunostimulan  melalui interaksi dengan Gut associated Lymphoid Tissue (GALT)  sehingga  mampu  menstimulasi  sistem imun  (El-Bouhy et  al .  2013).  Pascauji  tantang terjadi  fluktuasi  nilai  hematokrit,  hemoglobin, aktivitas fagositosis, dan aktivitas ledakan respi- ratori. Penurunan kadar hematokrit dan hemoglo- bin pascauji tantang diduga berhubungan dengan
masa  inkubasi A.  hydrophila dan  terkait  adanya infeksi  oleh  bakteri  tersebut.  Penurunan  dua  pa- rameter ini pascauji tantang menandakan adanya penurunan  produksi  sel  darah  merah  oleh  ginjal (Utami et al. 2015) dan lisis pada sel darah me- rah  akibat  eksotosin  maupun  endotoksin  yang dihasilkan oleh A. hydrophila (Hardi et al . 2014).
Meningkatnya  aktivitas  fagositosis  dan  le- dakan respiratori pascauji tantang  mengindikasi- kan adanya peningkatan respons imun pada ikan uji.  Menurut  Aly et  al. (2008),  meningkatnya aktivitas  ledakan respiratori menandakan adanya peningkatan respons imun non spesifik. Balcazar et al. (2007) menyatakan bahwa aktivitas fagosi- tosis  merupakan  perlawanan  awal  sebagai  res- pons  inflamasi  sebelum  produksi  antibodi,  hal tersebut diperantarai oleh sel fagosit seperti neu- trofil, monosit, dan makrofag. Fagosit merupakan mekanisme  pertahanan  yang  paling  penting  ter- kait  dengan  produksi reactive  oxygen  species (ROS). Proses tersebut akan mereduksi  O 2 men- jadi  O 2 - yang  akan  menghasilkan  enzim  katalis dari  berbagai  produk  reaktif  oksigen  termasuk H 2 O 2 ,  OH, hypocholous  acid ,  dan peroxynitrite yang  berperan  sebagai  efek  antimikroba.  Hasil penelitian  Biller-Takahasi et  al. (2013)  menun- jukkan  bahwa  aktivitas  ledakan  respiratori  me- ningkat  setelah  injeksi A.  hydrophila pada Pia- ractus mesopotamicus .
Peningkatan  dosis  dan  frekuensi  pemberian probiotik  pada pakan  memberikan  pengaruh  ter- hadap penurunan total A. hydrophila pada organ target.  Semakin  tinggi  frekuensi  pemberian  pro- biotik  maka  semakin  cepat  penurunan  total A. hydrophila pada organ target. Hari ke-56 menun- jukkan  bahwa  seluruh  perlakuan  probiotik  de- ngan  frekuensi  pemberian  setiap  hari  dapat  me- nurunkan total A. hydrophila hingga <2,00±0,00 log CFU g -1 . Penurunan total A. hydrophila di or- gan  target  mengindikasikan adanya  upaya perla-
wanan  sistem  imun  pada  ikan  terhadap  pertum- buhan A.  hydrophila oleh B.  cereus P22  dan S. lentus L1k. B.  cereus diketahui  mampu  mengu- rangi patogenitas dan pertumbuhan A. hydrophila
(Lalloo et al . 2010). Probiotik diketahui memiliki efek antimikroba dengan  memodifikasi  mikrobi- ota  usus,  mensekresi  zat  antibakteri  (bakteriosin dan asam organik) (Cruz et al . 2012), berinterak- si dengan sel fagosit dan NK sel dalam mening- katkan respons imun (El-Bouhy et al. 2013).

## Laju sintasan pascauji tantang
Pemberian pakan  yang mengandung probio- tik  mampu  meningkatkan  jumlah  total  bakteri serta total P22 dan L1k pada saluran pencernaan sehingga  dapat  menekan  infeksi A.  hydrophila dan mampu meningkatkan sintasan ikan lele. Hal tersebut sesuai dengan pernyataan Nayak (2010) bahwa  probiotik  mampu  menempel  di  jaringan limfoid  usus  sehingga  mempercepat  rangsangan pada makrofag untuk mengetahui keberadaan an-
et  al. (2015) menyatakan  bahwa
pemberian  probiotik Bacillus sp.  dan Staphylo-
coccus sp. pada media budi daya diketahui mam- pu  meningkatkan  sintasan ikan lele ( Clarias  ga- riepinus ) yang diinfeksi A. hydrophila . Hasil pe- nelitian  Khalwan et  al. (2012)  menunjukkan bahwa suplementasi probiotik Bacillus sp. dapat menurunkan  persentase  jumlah  kematian  pada ikan  gurami  ( Osphronemus  goramy )  yang  diin- feksi A. hydrophila . Utami et  al . (2015) menya- takan bahwa suplementasi probiotik mikrokapsul diketahui  efektif  mengendalikan  streptococcosis pada  ikan  nila  ( Oreochromis  niloticus )  dengan laju sintasan yang lebih tinggi setelah uji tantang.

## Kualitas air
Hasil pengukuran suhu, oksigen terlarut, pH, dan amoniak selama masa pemeliharaan menun- jukkan bahwa kualitas air pada media pemeliha-
raan masih berada pada kisaran normal. Menurut Boyd (1990), nilai kualitas air yang layak  untuk ikan air tawar meliputi suhu 24-30 0 C, pH 6,5-9,5 dan amoniak <0,52 mg L -1 .

## Simpulan
Suplementasi  mikrokapsul  probiotik B. cereus P22 dan S. lentus L1k  pada pakan dengan dosis  2%  yang  diberikan  setiap  hari  menunjuk- kan  hasil  yang  lebih  baik  dalam  meningkatkan laju  pertumbuhan,  respons  imun,  dan  resistensi ikan lele terhadap A. hydrophila.

## Persantunan
Penulis  mengucapkan  terimakasih  kepada Balai  Penelitian  dan  Pengembangan  Budidaya Air Tawar Bogor (BPPBAT) atas sarana prasara- na  yang  mendukung  selama  pelaksanaan  peneli- tian. Ucapan terimakasih juga disampaikan kepa- da semua tim yang telah membantu selama penu- lis melakukan penelitian.

## Daftar pustaka
Aly  SM,  Ahmed YA, Abdel-Aziz  A. 2008. Stu- dies  on Bacillus  subtilis and Lactobacillus acidophilus ,  as  potential  probiotics,  on  the immune  response  and  resistance  of  tilapia nilotica ( Oreochromis niloticus ) to challenge infections. Fish  and  Shellfish  Immunology , 25(1-2): 128-136.
Anderson DP, Siwicki AK. 1995. Basic hemato- logy  and  serology  for  fish  health  programs. Proceeding  of  the  second  symposium  on disease  in  Asian  Aquaculture,  October  25- 29. 1993, Phuket, Thailand. pp. 185-202.
Bagheri  T,  Hedayati  SA,  Yavari  V,  Alizade  M, Farzanfar A. 2008. Growth, survival and gut microbial load of rainbow trout ( Onchorhyn- chus  mykiss )  fry  given  diet  supplemented with probiotic during the two months of first feeding. Turkish  Journal  of  Fisheries  and Aquatic Sciences , 8(1): 43-48.
Balcazar  JL,  Blas  ID,  Ruiz-Zarzuela  I,  Vandrell D,  Girones O, Muzquiz JL. 2007. Enhance- ment of the immuneresponse and protection induced  by  probiotic  lactic  acid  bacteria
against  furunculosis  in  rainbowtrout  ( Onco- rhynchus  mykiss ). FEMS  Immunology  and Medical Microbiology , 51(1): 185-193.
Biller-Takahasi  JD,  Takahashi  LS,  Saita  MV, Gimbo  RY,  Urbinati  EC.  2013.  Leukocytes respiratory  burst  activity  as  indicator  of  in- nate immunity of pacu Piaractus mesopota- micus . Brazilian  Journal  of  Biology ,  73(2):
425-429.
Boyd,  CE.  1990. Water  Quality  in  Ponds  for Aquaculture.  2nd  Ed .  Alabama  Agricultural Experiment  Station,  Auburn  University, Auburn, AL, USA. 482 p.
Cruz PM, Ibanez L, Hermosillo OAM, Saad HC. 2012.  Use  of  probiotics  in  aquaculture. International  Scholarly  Research  Network , (1): 1-14.
Effendie  MI. 1997. Biologi Perikanan . Yayasan Pustaka Nusatama, Yogyakarta. 163 hlm.
El-Bouhy  ZM,  El-Nobi  GA,  Hassanin  ME,  El- Hady MA. 2013. Effects  of dietary applica- tion of two antagonistic gut-isolated Bacillus species  on  the  immune  response  of Oreo- chromis  niloticus to Aeromonas  hydrophila infection. Zagazig  Veterinary  Journal,
41(2): 31-39.
Giri  SS,  Sukumaran  V,  Oviya  M.  2013.  Po- tential    probiotic Lactobacillus  plantarum
VSG3  improves  the  growth,  immunity,  and disease  resistance  of  tropical    freshwater fish, Labeo    rohita . Fish  and  Shellfish  Im- munology . 34(2): 660-666.
Hardi EH, Pebrianto CA, Hidayanti T, Handaya- ni, R. T. 2014. Infeksi Aeromonas hydrophi- la melalui jalur yang berbeda pada ikan nila
( Oreochromis  niloticus )  di  Loa  Kulu  Kutai Kartanegara  Kalimantan  Timur. Jurnal  Ke- dokteran Hewan , 8(2): 130-133.
Jafari  SM,  Assadpoor  E,  He  Y,  Bhandari  B. 2008.  Encapsulation  efficiency  of  food  fla- vours  and  oils  during  spray  drying. Drying Technology , 26(7): 816-835.
Janda J M, Abbott SL. 2010. Genus Aeromonas: taxonomy,  pathogenicity  and  infection. Cli- nical Microbiology Reviews , 23(1):35-73.
Jyothi  NVN,  Prasanna  PM,  Suhas  NS,  Prabha KS, Ramaiah PS, Srawan GY. 2010. Micro- encapsulation  technique,  factors  influensing encapsulation  effisiency.  review .  Journal  of Microencapsulation , 27(3): 187-197.
Khalwan,  Irianto  A,  Rachmawati  FN.  2012. Pe- ngaruh  suplementasi Bacillus sp.  melalui
perifiton  terhadap  jumlah  total  mikroba intestinal  dan  gambaran  darah  ikan  gurami ( Osphronemus gouramy ). Bioteknologi , 9(2):
35-40.
Lalloo R, Moonsamy G, Ramchuran S, Gorgens J,  Gardinel  N.  2010.  Competitive  exclusion as  a  mode  of  action  of  a  novel Bacillus  ce- reus aquaculture  biological  agent. Journal compilation, 50(2010): 563 570.
Munaeni W, Yuhana M, Widanarni. 2014. Effect of  micro-encapsulated  synbiotic  at  different frequencies for luminous vibriosis control in white  shrimp  ( Litopenaeus  vannamei ). Jur- nal Mikrobiologi Indonesia, 8(2): 73-80.
Nayak  SK.  2010.  Probiotics  and  immunity:  A fish  perspective. Fish  and  Sellfish  Immu- nology , 29(1): 2-14.
Rahmawati FF. 2015. Suplementasi mikrokapsul probiotik  melalui  pakan  sebagai  pencegah infeksi streptococcosis pada ikan nila ( Oreo- chromis  niloticus ). Tesis .  Institut  Pertanian Bogor. 43 p.
A.  2015.  Frekuensi  penambahan  probiotik Bacillus sp.  Dan Staphylococcus sp.  Pada media pemeliharaan ikan lele dumbo ( Clari- as  gariepinus )  untuk  ketahanan  terhadap A eromonas  hydrophila. Jurnal  Perikanan Kelautan, 6(2): 130-140.
Utami  DAS,  Widanarni,  Suprayudi  MA.  2015. Administration of microencapsulated probio- tic at different doses to control streptococco- sis in tilapia ( Oreochromis niloticus ). Micro- biologi Indonesia , 9(1):17-24.
Weinbreck  F,  Bodnar  I,  Marco  ML.  2010.  Can encapsulation lengthen the  shelf-life of pro- biotic bacteria in dry products?. International Journal of Food Microbiology , 136(3): 364- 367.
Welker  TL,  Lim  C.  2011.  Use  of  probiotics  in diets  of  tilapia. Journal  of  Aquaculture  Re- search and Development , 31(14): 2-8.
Zubaidah  A,  Yuhana  M,  Widanarni.  2014.  En- capsulated synbiotic dietary supplementation at  different  dosages  to  prevent  vibriosis  in white shrimp, Litopenaeus vannamei . Hayati Journal of Biosciences, 22(4): 163-168.
Zonneveld N, Huisman EA, Boon JH. 1991. Prinsip-Prinsip Budidaya Ikan. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta. 318 hlm.