## ISOLASI MIKROORGANISME HETEROFERMENTATIF PADA BIJI

## KAKAO ( Theobroma cacao L.) SELAMA FERMENTASI SPONTAN

## Elazmanawati Lembong, In-In Hanidah, Dwi Indah Puspita Sari
Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Industri Pertanian, Universitas Padjadjaran, Jalan Raya Bandung-Sumedang KM. 21, Jatinangor, Sumedang, 40600, Indonesia
Email : dwi14017@mail.unpad.ac.id

## ABSTRAK
Kakao merupakan komoditas perkebunan terbesar ketiga setelah kelapa sawit dan karet, produksi nasional dari biji kakao meningkat dari tahun ke tahun. Tetapi tingginya produktivitas kakao Indonesia selama ini kurang didukung dengan upaya peningkatan mutu dari kakao, salah satunya dikarenakan biji kakao tidak difermentasi. Padahal proses fermentasi merupakan proses vital dalam peningkatan mutu dan cita rasa. Dalam proses fermentasi, mikroorganisme memegang peran sangat penting, sehingga perlu dilakukan isolasi mikroorganisme yang terlibat didalamnya. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memperoleh perubahan pertumbuhan dari bakteri asam laktat (BAL), bakteri asam asetat (AAB), khamir dan  kapang  selama  proses  fermentasi  spontan.  Metode  penelitian  yang  digunakan  yaitu  metode  eksperimental  yang dianalisis secara deskriptif dengan enam perlakuan dan setiap perlakuan diuji secara duplo. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pertumbuhan optimum BAL pada biji kakao adalah pada lama fermentasi 24 jam, sedangkan AAB dan khamir optimum tumbuh pada lama fermentasi 48 jam. Perubahan pertumbuhan mikroorganisme didominasi oleh bakteri asam laktat dengan total koloni tertinggi yaitu 6,1 log CFU/g dan jumlah terendah 1,3 log CFU/g. Berdasarkan perubahan pertumbuhan  mikroorganisme  yang  terjadi  selama  fermentasi,  waktu  optimum  untuk  proses  fermentasi  kakao  adalah selama kurang dari 5 hari.

## ABSTRACT
Cocoa is the third largest plantation commodity after oil palm and rubber, national production of cocoa beans is increasing from year to year. However, the high productivity of Indonesian cocoa has not been supported by efforts to improve the quality of cocoa, one of which is because the cocoa beans are not fermented. Whereas the fermentation process is a vital process in improving the quality and taste. In the fermentation process, microorganisms play a very important role, so it is necessary to isolate the microorganisms involved in it. The purpose of this study was to obtain changes in the growth of lactic acid bacteria (LAB), acetic acid bacteria (AAB), yeast and molds during the spontaneous fermentation process. The research method used is the experimental method which was analyzed descriptively with six treatments and each treatment was tested in duplicate. The results showed that the optimum growth of LAB in cocoa beans was at 24 hours of fermentation, while the optimum growth of AAB and yeast was at 48 hours of fermentation. Changes in the growth of microorganisms were dominated by lactic acid bacteria with the highest total colony of 6.1 log CFU/g and the lowest number 1.3 log CFU/g. Based on changes in the growth of microorganisms that occur during fermentation, the optimum time for the cocoa fermentation process is less than 5 days.
Keywords : Cocoa, Fermentation, Isolation, Microorganisms

## 1. Pendahuluan
Buah  kakao  (Theobroma  cacao  L.)  terdiri beberapa bagian yakni: kulit buah, plasenta, pulp, kulit biji dan biji, seluruh bagian buah kakao dapat dimanfaatkan sebagai bahan pangan, pakan, pupuk maupun  bahan  bakar  (Djaafar,  2014).  Namun,  biji kakao  merupakan  fokus  utama  dalam  produksi kakao  yang  berperan  sebagai  bahan  baku  paling penting  dari  pembuatan  cokelat  yang  selama  ini dikonsumsi dan diperjual belikan.
Kakao  merupakan  komoditas  perkebunan terbesar ketiga setelah kelapa sawit dan karet. Pada
tahun 2019 lahan dari perkebunan kakao menurun dibandingkan  tahun  tahun  sebelumnya,  tetapi berbeda dengan luas lahan yang semakin menurun, produksi  nasional  dari  biji  kakao  meningkat  dari tahun  sebelumnya  (BPS,  2019).  Tingginya produktivitas  kakao  Indonesia  selama  ini  masih kurang didukung dengan upaya peningkatan mutu dari kakao, pengolahan hasil biji kering kakao dan pemasaran (Managanta et al., 2019).
Mutu  kakao  Indonesia  rendah  dikarenakan antara  lain  tidak  difermentasi,  tidak  terfermentasi dengan baik, tidak cukup kering, ukuran biji tidak
seragam,  kadar  kulit  tinggi,  keasaman  tinggi, citarasa  sangat  beragam  dan  tidak  konsisten (Abriani  et  al.,  2018).  Sementara  menurut  Manalu (2018),  rendahnya  mutu  kakao  Indonesia disebabkan  oleh  2  beberapa  hal  misalnya kurangnya kemampuan petani untuk memanfaatkan  teknologi  maupun  kurangnya pengetahuan manajerial.
Apriyanto et al., (2018) mengungkapkan bahwa produksi  biji  kakao  kering  terutama  dari perkebunan rakyat, umumnya tidak melalui proses fermentasi  secara  alami  maupun  dengan penambahan  inokulum.  Pada  umumnya  petani kakao hanya merendam biji kakao segar dalam air untuk  membantu  menghilangkan  pulp  kemudian menjemur biji kakao tersebut.
Biji kakao kering yang berasal dari perkebunan rakyat biasanya tidak diketahui kadar airnya, dijual tanpa memperhatikan mutu baik dari aspek kadar air maupun kondisi biji kering disebut sebagai biji kakao asalan (Apriyanto et al., 2018).
Mutu  biji  kakao  yang  dihasilkan  perkebunan rakyat  Sumedang  serupa  dengan  biji  kakao Indonesia  lainnya,  hal  tersebut  dikarenakan  biji kakao tidak difermentasi terlebih dahulu. Menurut data statistik Dinas Perkebunan Provinsi Jawa Barat 2017  perkebunan  rakyat  kakao  di  Sumedang memiliki luas total sebesar 58 hektar yang dimiliki oleh 537 kepala keluarga, dengan lahan yang berisi tanaman  menghasilkan  (TM)  hanya  seluas  19 hektar dan menghasilkan 7 ton/tahun (ministry of plantation, 2018). Berdasarkan data tersebut dapat diketahui  bahwa  lahan  dan  hasil  panen  yang dimiliki dan didapatkan oleh masingmasing petani hanya  sedikit,  hal  ini  yang  menjadi  salah  satu alasan  petani  lebih  memilih  untuk  menjual  buah kakao secara langsung pada tengkulak atau berupa biji kering tanpa fermentasi.
Fermentasi  merupakan  tahap  yang  paling memengaruhi mutu dari biji kakao, karena selama proses  fermentasi  terjadi  penguraian  senyawa- senyawa  yang  akan  merubah  tekstur,  warna,  cita rasa, kandungan air, aroma, dan kenampakan biji (Thompson  et  al.,  2007)  yang  akan  meningkatkan mutu serta harga jualnya. Tetapi proses ferementasi ini  pun  harus  dilakukan  dengan  tepat,  menurut (Diansari et al., 2015), fermentasi yang tidak tepat atau  biji  yang  tidak  difermentasi  akan menghasilkan biji yang berwarna ungu dan keabu- abuan  dan  bertekstur  padat  keras  (pejal), sedangkan  fermentasi  biji  yang  terlalu  lama  akan menghasilkan  biji  berjamur  dan  rapuh  sehingga sangat  mudah  pecah  yang  dapat  menurunkan mutu biji.
Maka,  untuk  meningkatkan  mutu  dari  biji kakao, perlu diketahui lama fermentasi yang ideal dan  perubahan  karakteristik  fisik,  kimia  dan mikrobiologis  selama  fermentasi  sehingga  dapat ditentukan  lama  fermentasi  yang  menghasilkan mutu biji terbaik  Maka akan dilakukan penelitian mengenai perubahan pertumbuhan mikroorganisme heterofermentatif pada biji kakao selama fermentasi spontan.

## 2. Bahan dan Metode Penelitian

## Alat dan Bahan
Bahan  baku  utama  yang  akan  digunakan adalah buah kakao matang dengan usia ± 5 bulan yang berasal dari perkebunan warga di Sumedang, Jawa  Barat.  Bahan-bahan  lain  yang  digunakan adalah  aquades,  CaCO 3 1%,  daun  pisang,  larutan BPW 0,1%, NaCl 0,85%, media GYC, MEA, MRSA, dan PDA.
Alat-alat  yang  digunakan  adalah  alumunium foil,  autoklaf, beaker  glass, botol  schott, bulb pipet, cawan  aluminium,  cawan  petri, colony  counter , cutter, desikator,  gelas  ukur,  gunting, hot  plate , inkubator,  kapas,  kasa,  kotak  kayu  fermentasi berukuran p × l × t 25,5 × 25,5 × 30,5 cm, laminar flow , mikro  pipet,  neraca  analitik,  ose,  oven,  pengaduk (untuk aerasi), pH meter, pipet ukur, pisau, plastik wrap, rak  tabung,  spatula , tabung  reaksi, termometer dan vortex mixer .

## Metode Penelitian
Penelitian  ini  didesain  dengan  metode eksperimental kemudian dianalisis secara deskriptif,  pengujian  dilakukan  dengan  enam perlakuan, dua kali 30 pengulangan (duplo) pada setiap  ulangannya.  Adapun  perlakuan  dalam penelitian  ini  adalah  sebagai  berikut:  (Apriyanto 2018)
A : Tanpa Fermentasi (standar) B : Lama Fermentasi jam ke-24 C : Lama Fermentasi jam ke-48 D : Lama Fermentasi jam ke-72 E : Lama Fermentasi jam ke-96 F : Lama Fermentasi jam ke-120 Setelah didapatkan data pengamatan, kemudian  dihitung  nilai  standar  deviasi,  yaitu ukuran  sebaran  yang  paling  banyak  digunakan. Berikut merupakan rumus standar deviasi.
S x = " ∑ $ x i − x &' 2 n i = 1 n − 1
Keterangan: S= standar deviasi/simpangan baku x i = nilai x data ke-i
x & = rata – rata sampel n = jumlah data

## Parameter Pengamatan
Total Koloni BAL, AAB, Khamir dan Kapang Sampel  diambil  setiap  interval  waktu  24  jam sekali  secara  aseptik.  Penimbangan  sampel sebanyak  1g.    Dilakukan  pengenceran  hingga  10 -6 menggunakan larutan NaCl fis 0,85% untuk BAL, pengenceran  hingga  10 -5 menggunakan  larutan BPW  untuk  AAB  dan  pengenceran  hingga  10 -4 menggunakan larutan BPW untuk khamir, dengan perbandingan sampel:pelarut adalah 1:9. Pengambilan 1 mL suspensi dari tiga pengenceran terakhir  menggunakan  mikropipet.  Suspensi dituang  ke  dalam  cawan  petri  steril  (cawan  petri dilalukan  pada  Bunsen  terlebih  dahulu).  Media MRSA  (untuk  pertumbuhan  BAL),  GYC  (untuk pertumbuhan  AAB),    MEA  (untuk  pertumbuhan khamir),  dan  PDA  (untuk  pertumbuhan  kapang) dituang ke dalam cawan petri yang berisi suspensi (mulut  botol  schott  yang  berisi  media  dan  cawan petri  dilalukan  pada  Bunsen  terlebih  dahulu). Cawan  petri  berisi  media  dan  suspensi digoyangkan  searah  angka  8.  Media  ditunggu hingga  memadat,  kemudian  dibungkus  dengan plastik wrap dan diinkubasi selama 48 jam dalam suhu 37 ℃ .

## Keasaman (pH) Luar Biji Kakao Basah
Pengukuran  pH  luar  biji  kakao  basah  dilakukan setiap 12 jam sekali dengan meggunakan pH meter jenis  digital.  Pengukuran  dilakukan  dengan  cara pH  meter  dimasukkan  kedalam  kotak  fermentasi yang berisikan kakao yang sedang difermentasi.

## Pengukuran Kadar Air
Analisis  kadar  air  ini  menggunakan  prinsip penguapan  molekul  air  bebas  yang  terkandung dalam  sampel  (BSN,  1992).  Cawan  yang  akan digunakan dioven terlebih dahulu selama 60 menit pada  suhu  100-105ºC.  Setelah  itu  didinginkan dalam desikator untuk menghilangkan uap air dan ditimbang  (A).  Sampel  ditimbang  sebanyak  1-2g dalam  cawan  yang  sudah  dikeringkan  (B) kemudian  dioven  pada  suhu  105ºC  selama  3  jam. Sampel  didinginkan  dalam  desikator  selama  15 menit dan ditimbang (C). Tahap ini diulangi hingga dicapai  bobot  yang  konstan.  Penentuan  kadar  air dihitung dengan rumus sebagai berikut.
Kadar Air (𝑤𝑏) = B − (C − A) B x 100% Keterangan:
A: berat cawan kosong (g)
B: berat sampel awal (g)

## C: berat cawan + sampel kering (g)

## 3. Hasil dan Pembahasan
Aktivitas  mikroorganisme,  perubahan  suhu, pH  dan  kadar  air  saling  berkaitan  selama  proses fermentasi  berlangsung.  Seperti  yang  disajikan dalam diagram berikut ini.
Gambar 1. Grafik Rata-rata Total BAL, AAB, Khamir dan Kapang, Perubahan Suhu, Kadar Air

## dan pH

## Total Koloni BAL, AAB, Khamir dan Kapang
Pertumbuhan  mikroorganisme  terjadi  secara bertahap,  khamir  tumbuh  dominan  pada  awal fermentasi,  digantikan  oleh  bakteri  asam  laktat selama 48 jam berikutnya, dan akhirnya digantikan oleh  bakteri  asam  asetat  (Haliza  et  al.,  2020). Berdasarkan  Gambar  1,  dapat  terlihat  bahwa khamir dan bakteri asam laktat sudah tumbuh sejak fermentasi belum berlangsung. Khamir merupakan perintis didalam fermentasi kakao dengan spesies antara lain Saccharomyces cerevisiae , Candida rugosa dan Kluyveromyces marxianus (Schwan, 1998). Khamir mengalami fase adaptasi pada waktu inkubasi  jam  ke-0,  kemudian  khamir  memasuki fase logatirmik dari jam ke-0 hingga jam ke-48, pada jam  ke-48  pertumbuhan  khamir  mencapai  titik optimum karena  pada  jam  ke-48  suhu  fermentasi mencapai suhu 30 ℃ yang termasuk dalam rentang suhu  optimum  untuk  pertumbuhan  khamir. Kisaran  suhu  optimal  pertumbuhan  khamir dituturkan dalam penetilian Hardianto, Muhibuddin,  dan  Sektiono  (2018)  bahwa  suhu optimum  pada  perkembangan  khamir  umumnya yaitu  28-30 ℃ .  Setelah  pertumbuhan  optimumnya khamir  mengalami  penurunan  karena  memasuki fase  kematian,  hal  ini  disebabkan  karena  adanya faktor  pembatas  bagi  pertumbuhan  khamir  yaitu alkohol  yang  dihasilkan  khamir  yang  semakin meningkat, kemudian menjadi bersifat desinfektan bagi khamir itu sendiri (Muzaifa et al., 2017).
Jam  ke-0  merupakan  fase  adaptasi  dari bakteri asam laktat (BAL), fase logaritmik dari BAL adalah  pada  rentang  waktu  inkubasi  ke-0  hingga
0 2 4 6 8 0 10 20 30 40 50 60 70 0 24 48 72 96120144 Suhu da n K ada r A ir Jam suhu kadar air BAL AAB kapang khamir pH pH da n Log CF U/ g
ke-24  dan  BAL  tumbuh  optimum  pada  waktu inkubasi jam ke-24, kemudian BAL memasuki fase kematian  hingga  waktu  inkubasi  ke-96  jam,  dan diakhiri dengan fase long term stationary yaitu fase dimana  populasi  bakteri  telah  mati  90%  dari keseluruhan  bakteri  dan  bakteri  yang  tersisa memanfaatkan sisa metabolisme dari bakteri yang sudah mati dan dari sisa nutrisi pada media yang tersisa (Setiawati, et al. 2014).
Fase  adaptasi  AAB  berada  pada  waktu inkubasi jam ke-0, jam ke-0 hingga jam ke-24 bakteri asam  asetat  berada  pada  fase  logaritmik,  dengan kenaikan total koloni dari 0 log CFU/g menjadi 5 log  CFU/g.  Kemudian  tumbuh  optimum  pada waktu  inkubasi  jam  ke-72.  Bakteri  asam  asetat memasuki  fase  stasioner  pada  rentang  waktu fermentasi  jam  ke-24  hingga  jam  ke-72. Meningkatnya  jumlah  bakteri  asam  asetat dikarenakan oleh adanya proses aerasi pada proses fermentasi,  saat  proses  fermentasi  sudah  mulai teraerasi,  kondisi  ini  cocok  untuk  perkembangan bakteri asam asetat (Schwan dan Wheals, 2004).
Pertumbuhan  optimum  bakteri  asam  asetat berada  pada  rentang  suhu  30-38,5 ℃ ,  kemudian setelah  melalui  fase  optimum  bakteri  asam  asetat mulai  memasuki  fase  kematian  sehingga  terus mengalami  penurunan  hingga  akhir  fermentasi berlangsung.  Penurunan  jumlah  bakteri  asam asetat  setelah  jam  ke-72  diakibatkan  karena penghambatan pertumbuhan oleh suhu yang terus meningkat  (Schwan  dan  Wheals,  2004).  Kenaikan pH  diakhir  fermentasi  disebabkan  oleh  adanya degradasi  asam  sitrat  di  dalam  pulp  yang  terjadi selama  sisa  waktu  fermentasi  akibat  aktivitas mikroorganisme (Vuyst et al., 2010).
Pertumbuhan  kapang  saat  proses  fermentasi berlangsung  cukup  rendah  dibandingkan  dengan bakteri  dan  khamir  yang  berperan  dalam  proses fermentasi dan tidak ada keberadaannya pada awal dan  akhir  proses  fermentasi.  Fase  logaritmik  dari kapang ada pada jam ke-24 hingga jam ke-48, fase stasioner  tidak  tergambarkan  karena  waktu pengambilan  sampel  yang  cukup  jauh,  lalu  fase kematian dimulai dari jam ke-72 hingga 96 hingga kapang tidak ada lagi keberadaaannya pada proses fermentasi.  Kapang  tidak  dianggap  sebagai mikroorganisme  penting  pada  biji  kakao,  bahkan keberadaannya tidak dikehendaki karena menyebabkan beberapa efek negatif pada biji kakao yang dihasilkan, salah satunya akan menyebabkan rasa biji
Suhu Berdasarkan Gambar 1, pertumbuhan mikroorganisme pada proses fermentasi biji kakao
tumbuh  optimum  pada  kisaran  suhu  23  –  30 ℃ , yang menandakan sebagian besar mikroorganisme yang tumbuh bersifat mesofilik. Peningkatan suhu yang  terjadi  secara  terusus-menerus  setelah fermentasi berlangsung selama 72 jam mengakibatkan  pertumbuhan  dari  bakteri  asam asetat mengalami penurunan (Schwan dan Wheals, 2004). Selama  fermentasi  berlangsung,  perubahan suhu  sangat  memengaruhi  pertumbuhan  dari mikroorganisme  selama  fermentasi,  selain  itu mikroorganisme  yang  tumbuh  pun  memengaruhi perubahan  suhu  yang  terjadi  di  dalam  proses fermentasi.
Perubahan  suhu  terjadi  kenaikan  signifikan dimulai  dari  waktu  fermentasi  jam  ke-24  hingga jam ke-96. Kenaikan suhu ini mulanya disebabkan oleh  khamir  yang  berperan  merombak  gula menjadi  alkohol  secara  eksotermis  sehingga mengakibatkan  suhu  meningkat  (Shindy  et  al., 2014).  Kemudian  kenaikan  suhu  diakibatkan  oleh isolat  bakteri  yang  diduga  tumbuh  didalamnya yaitu Leuconostoc mesenteroides yang  mampu memproduksi CO 2 dalam jumlah yang banyak dan mengakibatkan  peningkatan  suhu  (Shindy  et  al., 2014).
Kenaikan  suhu  juga  disebabkan  oleh  bakteri asam asetat bertanggung jawab atas oksidasi etanol menjadi  asam  asetat  dan  oksidasi  selanjutnya menjadi  CO 2 dan  air,  yang  mengakibatkan meningkatnya suhu dan kadar air (Papalexandratou  et  al.,  2011). Suhu  mulai mengalami  penurunan  sebesar  11,6%  dari  waktu fermentasi  jam  ke-96  hingga  jam  ke-120,  hal  ini disebabkan  karena  aktivitas  mikrobiologis  yaitu BAL,  AAB,  dan  khamir  yang  sudah  menurun (Aryani et al., 2018).

## pH Luar Biji Kakao
Pertumbuhan  dari  mikroorganisme  dan perubahan  pH  yang  terjadi  selama  proses fermentasi  saling  terkait  dan  memengaruhi  satu sama  lainnya.  Mikroorganisme  memiliki  rentang pH  minimum,  optimum  dan  maksimum  untuk keberlangsungan  hidupnya,  kemudian  perubahan pertumbuhan  dari  mikroorganisme  selama  proses fermentasi  mengakibatkan  perubahan  pH  pada proses  fermentasi  karena  adanya  proses  yang menghasilkan asam dan mengoksidasi asam.
Awal  waktu  fermentasi  pH  tidak  mengalami penurunan yang signifikan   karena pertumbuhan BAL dan AAB belum mencapai tingkat optimum, tetapi  penurunan  pH  ini  disebabkan  oleh pertumbuhan  dari Leuconostoc  mesenteroides yang menghasilkan  asam  laktat  juga  asam  asetat (Zubaidah et al., 2020). Lama fermentasi jam ke-24,
pertumbuhan  BAL  menunjukkan  fase  stasioner, pada fase ini pH mulai menurun 21% hingga jam ke-48 dikarenakan BAL sudah tumbuh optimal dan menghasilkan asam laktat yang melimpah.
Bakteri asam asetat pada waktu fermentasi jam ke-24 sudah mulai tumbuh karena memasuki fase logaritmik sehingga jumlahnya semakin meningkat dan  asam  asetat  yang  dihasilkan  pun  semakin melimpah,  hal  ini  mengakibatkan  suasana  pulp menjadi  asam  (Aryani  et  al.,  2018).  Selain disebabkan  oleh  bakteri  penghasil  asam,  khamir juga  memiliki  peran  dalam  penurunan  pH  ini karena  selain  memetabolisme  gula  untuk menghasilkan  etanol,  khamir  juga  mengasilkan metabolit  sekunder  berupa  asam  sitrat  dan  asam asetat  menyebabkan  pH  menurun  (Thompson, Miller, and Lopez 2007; Yuliasni and Zakaria 2013).
Kenaikan  pH  pada  waktu  fermentasi  jam ke-48  hingga  jam  ke-96  diakibatkan  karena  total BAL  terus  menurun  sebesar  30%,  yang menunjukkan  bahwa  BAL  telah  memasuki  fase kematian,  yang  mangakibatkan  asam  laktat  yang diproduksi  menurun  pula. pH  mengalami peningkatan  yang  tidak  signifikan  pada  akhir fermentasi, kenaikan pH diakhir fermentasi terjadi disebabkan  oleh  adanya  degradasi  asam  sitrat  di dalam  pulp,  asam  tersebut  akan  mengalir (berdifusi) kedalam biji kakao yang terjadi selama sisa waktu fermentasi akibat aktivitas mikroorganisme (Vuyst et al. 2010; Sigalingging, et al.  2020).    Nilai  pH  biji  kakao  yang  baik  adalah mendekati  netral  (pH>6)  agar  senyawa-senyawa khas  cokelat  dapat  terbentuk  secara  intensif  dan standar pH kakao berkisar antara 6 - 7 (Aryani, et al . 2018).

## Kadar Air
Kadar  air  biji  kakao  setelah  dipanen mengandung  kadar  air  yang  tinggi  yaitu  sekitar 51%-60% (Ardhana and Fleet, 2003) . Kadar air biji kakao  basah  selama  fermentasi  mengalami kenaikan  seiring  dengan  lamanya  fermentasi berlangsung, kadar air semakin meningkat karena menurut  Mulato et  al. (2005)  dan  Paper  (2012) waktu  fermentasi  merupakan  salah  satu  faktor penting  penyebab  meningkatnya  kadar  air sehingga  apabila  waktu  fermentasi  meningkat maka  kadar  air  dalam  biji  kakao  akan  meningkat pula. Selain itu, peningkatan kadar air pada proses fermentasi disebabkan oleh aktivitas mikroorganisme.
Sejak 24 jam pertama fermentasi berlangsung, kadar  air  sudah  mengalami  perubahan,  kadar  air menurun  sebesar  24,2%  karena  cairan  pulp  yang terurai mulai keluar melalui celah kotak fermentasi
dan  belum  terjadi  aerasi  karena  fermentasi  masih bersifat  anaerob  fakultatif  sehingga  belum  ada perubahan  asam  laktat  menjadi  H 2 O  (Afrida  & Gram,  2016).  Kadar  air  mengalami  peningkatan setelah  24  jam  fermentasi  berlangsung  karena setelah  24  jam  fermentasi,  dilakukan  pembalikan dan  pengadukan  biji  kakao  yang  berfungsi  untuk meningkatkan  aerasi  dan  menjadikan  proses fermentasi menjadi aerob, sehingga pada tahap ini asam  laktat  dan  asam  asetat  akan  diuraikan  lagi hingga  menghasilkan  H 2 O  dan  CO 2 (Afrida  and Gram 2016; Papalexandratou et al. 2011). Peningkatan  kadar  air  terjadi  pada  waktu fermentasi ke-24 jam hingga ke-96 jam. Setelah 96 jam  fermentasi  berlangsung,  kadar  air  kembali mengalami penurunan dikarenakan biji kakao yang telah  mencapai  akhir  fermentasi  mengalami pengeringan  disebabkan  pulp  telah  hampir  habis diuraikan  oleh  mikroorganisme  dan  aktivitas mikroorganisme  pun  menurun  pada  akhir  waktu fermentasi  karena  ketersediaan  substrat  yang sudah menurun (Aryani et al. 2018)

## 4. Kesimpulan
Pertumbuhan  bakteri  asam  laktat  optimum pada waktu fermentasi 24 jam dengan total koloni 6,1  log  CFU/g.Pertumbuhan  bakteri  asam  asetat dan  khamir  optimum  pada  waktu  fermentasi  72 jam,  dan  kapang  adalah  mikroorganisme  dengan pertumbuhan  yang  paling  rendah  dengan  total koloni  1,3  log  CFU/g  dan  optimum  pada  waktu fermentasi  48  jam.  Fermentasi  spontan  pada  biji kakao dapat berjalan optimal pada fase logaritmik dengan waktu fermentasi kurang dari 5 hari.

## 5. Daftar Pustaka
1. Abriani,  C.  R.,  Noor,  A.,  &  Dali,  S.  (2018). Identifikasi  Mikroba  pada  Fermentasi  Biji  Kakao (Theobroma cacao L.) Klon Sulwesi 1. Bioma , 9 (2),
1–8.
2. Afrida,  I.  R.,  &  Gram,  P.  (2016). Deteksi Keberadaan Bakteri Asam pada Proses Pengolahan  Kakao  Detection  of  Acid  Bacteria  in the  Process  of  Cocoa  Production  Tempat  dan Waktu  Penelitian  Pengamatan  Pola  Pertumbuhan Bakteri  Asam  pada  Medium  Ekstrak  Pulp . 13 (1), 822–826.
3. Apriyanto,  M.,  Sutardi,  S.,  Supriyanto,  S.,  & Harmayani,  E.  (2018).  Fermentasi  Biji  Kakao Kering  Menggunakan  Saccharomyces  cerevisiae, Lactobacillus  lactis,  dan  Acetobacter  aceti.
Agritech , 37 (3), 302. https://doi.org/10.22146/agritech.17113
4. Ardhana,  M.  M.,  &  Fleet,  G.  H.  (2003).  The microbial  ecology  of  cocoa  bean  fermentations  in Indonesia. International  Journal  of  Food
Microbiology , 86 (1–2), 87–99. https://doi.org/10.1016/S0168-1605(03)00081-3
5. Aryani, N. L. P. N. A., Yulianti, N. L., & Arda, G. (2018). Karakteristik Biji Kakao Hasil Fermentasi Kapasitas  Kecil  dengan  Jenis  Wadah  dan  Lama Fermentasi yang Berbeda Characteristics of Cocoa
Beans  on  Small  Capacity  Fermentation  Results Based  on  Different  Types  of  Containers  and Different  Fermentation  Lengths  A. Jurnal  Beta (Biosistem Dan Teknik Pertanian) , 6 (1), 17–24.
6. BPS.2019,  I.  C.  S.  (2005). STATISTIK  KAKAO INDONESIA  2019  Indonesian  Cocoa  Statistics 2019 (D.  S.  T.  Perkebunan  (ed.)).  Badan  Pusat Statistik.
7. BSN. (1992). Cara Uji Makanan dan Minuman SNI 01-2891-1992. In Sni (p. Jakarta (ID): BSN).
8. Diansari,  A.  Z.,  Suwasono,  S.,  &  Yuwanti,  S. (20015). Karakteristik fisik, kimia, dan mikrobiologis  biji  kakao  kering  produksi  ptpn  xii kebun  kalikempit,  banyuwangi. Berkala  Ilmiah Pertanian , 1 (1), xx–xx.
9. Haliza,  W.,  Purwani,  E.  Y.,  Fardiaz,  D.,  & Suhartono, M. T. (2020). KAKAO FERMENTASI : PELEPASAN PEPTIDA BIOAKTIF DAN MANFAATNYA BAGI KESEHATAN  Fermented  Cocoa:  The  Release  of Bioactive  Peptides  and  Their  Health  Benefits. Perspektif , 18 (2), 104. https://doi.org/10.21082/psp.v18n2.2019.104-119
10. Hardianto,  Muhibuddin,  A.,  &  Sektiono,  A.  W. (2018).  Optimalisasi  Fosfat  untuk  Meningkatkan Pertumbuhan Kerapatan Populasi dan Kemampuan Antagonis  Saccharomyces  cerevisiae  terhadap Fusarium sp. Saintekbu , 10 (2), 27–41.
https://doi.org/10.32764/saintekbu.v10i2.206
11. Managanta,  A.  A.,  Sumardjo,  Sadono,  D.,  & Tjitropranoto,  P.  (2019).  Faktor-Faktor  yang Berpengaruh terhadap Kompetensi Petani Kakao di Provinsi  Sulawesi  Tengah. Jurnal  Peyuluhan ,
15 (1), 120–133.
12. Manalu.  (2018).  Pengolahan  biji  kakao  produksi perkebunan  rakyat  untuk  meningkatkan  pendapat petani. J  Ekonomi  &  Kebijakan  Publik , 9 (2),  99– 111.
13. ministry  of  plantation.  (2018).  Indonesian Plantation  statistics. Directorate  General  of Indonesian Plantation , 1 (December 2014), 96.
14. Mulato,  S.,  Widyotomo,  S.,  &  Misnawi,  E.  S. (2005).  Pengolahan  produk  primer  dan  sekunder kakao. Pusat Penelitian Kopi Dan Kakao Indonesia
… .
15. Muzaifa,  M.,  Abubakar,  Y.,  &  Haris,  F.  (2017).
Profil Pertumbuhan Mikroorganisme pada Fermentasi Biji Kakao Aceh. Jurnal Teknologi Dan Industri  Pertanian  Indonesia , 9 (2),  50–54. https://doi.org/10.17969/jtipi.v9i1.5975
16. Papalexandratou, Z., Vrancken, G., de Bruyne, K., Vandamme, P., & de Vuyst, L. (2011). Spontaneous organic cocoa bean box fermentations in Brazil are characterized  by  a  restricted  species  diversity  of lactic  acid  bacteria  and  acetic  acid  bacteria. Food
Microbiology , 28 (7), 1326–1338. https://doi.org/10.1016/j.fm.2011.06.003
17. Paper,  T.  (2012).  Kajian  Fermentasi  dan  Suhu Pengeringan pada Mutu Kakao (Theobroma cacao L.). Journal Keteknikan Pertanian , 26 (2), 129–136. https://doi.org/10.19028/jtep.26.2.129-136
18. Schwan, Rosane F., & Wheals, A. E. (2004). The microbiology of cocoa fermentation and its role in chocolate quality. Critical Reviews in Food Science and Nutrition , 44 (4), 205–221. https://doi.org/10.1080/10408690490464104 19. Schwan, Rosane Freitas. (1998). Cocoa fermentations  conducted  with  a  defined  microbial cocktail  inoculum. Applied  and  Environmental Microbiology , 64 (4), 1477–1483. https://doi.org/10.1128/aem.64.4.1477-1483.1998
20. Setiawati,  Ernie  Maduratna;  Prahasanti,  Chiquita, W, P. A. (Ed.). (2014). Identifikasi Warna Koloni Bakteri  Anaerob  Pada  Saliva  Pasien  Dengan Penyakit  Periodontal.  In Ikatan  Periodonsia Indonesia . Airlangga University Press. https://doi.org/10.2307/j.ctv1s5nzzw
21. Shindy, B., Putri, P., Suwasono, S., & Choiron, M. (2014). IDENTIFIKASI BAKTERI ASAM LAKTAT SEBAGAI  ANTI  KAPANG  DARI  FERMENTASI KAKAO  DI  GUNUNG  KIDUL  YOGYAKARTA Identification of Lactic Acid Bacteria as Antifungal Agent  Isolated  from  Cocoa  Fermentation  at Gunung Kidul Yogyakarta . x (1), 1–5.
22. Sigalingging, H. A., Putri, S. H., & Iflah, T. (2020). Perubahan  Fisik  Dan  Kimia  Biji  Kakao  Selama Fermentasi. J. Industri Pertanian , 2 (2), 158–165.
23. Thompson,  S.  S.,  Miller,  K.  B.,  &  Lopez,  A.  S. (2007). Cocoa and Coffee 39 .
24. Titiek  F.  Djaafar,  R.  U.  H.  (2014). Pemanfaatan Buah  Kakao  Sabagai  Bahan  Baku  Bioindustri  Di
Indonesia . https://doi.org/http://dx.doi.org/10.21082/jp3.v33n
2.2014.p69-78
25. Vuyst, L. De, Lefeber, T., Papalexandratou, Z., & Camu, N. (2010). Chapter 17 Bean Fermentation . 301–325.
26. Yuliasni,  &  Zakaria.  (2013).  Kajian  Penambahan Khamir  Kluyveromyces  lactis,  Candida  curiosa, dan Brettanomyces custersii Asal Dadih Terhadap Konsentrasi Asam-Asam Amino, Lemak, Organik dan Karbohidrat Susu Kerbau Fermentasi (Dadih). Bionatura-Jurnal  Ilmu-Ilmu  Hayati  Dan  Fisik ,
15 (2), 54–59.
27. Zubaidah, E., Susanti, I., Yuwono, S. S., Rahayu, A. P., Srianta, I., & Blanc, P. J. (2020). Effect of lactobacillus plantarum and
leuconostoc
mesenteroides  starter  cultures  in  lower  salt concentration  fermentation  on  the  sauerkraut quality. Food  Research , 4 (4),  1038–1044. https://doi.org/10.26656/fr.2017.4(4).029