Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jtip https://doi.org/10.6066/jtip.2022.33.2.157
Copyright © 2022 by Authors, published by Journal of Food Technology and Industry This is an open-access article distributed under the CC BY-SA 4.0 License https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/

## Produksi Hidrolisat Protein Kacang Koro Benguk dengan Aktivitas Penghambat Kerja Enzim Pengkonversi Angiotensin melalui Kombinasi Fermentasi dan Hidrolisis Enzimatik
[Production of Protein Hydrolysate of Mucuna Bean as Angiotensin-Converting Enzyme (ACE) Inhibitor through a Combination of Fermentation and In-vitro Proteolysis]
Tesy Pratami 1) , Azis Boing Sitanggang 1,2) , dan Christofora Hanny Wijaya 1) *
1) Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pangan, IPB University, Bogor, Indonesia
2) South-East Asia Food & Agricultural Science and Technology (SEAFAST) Center, IPB University, Bogor, Indonesia
Diterima 12 Juni 2022 / Disetujui 2 November 2022

## ABSTRACT
Mucuna bean (Mucuna pruriens L.) is a legume having high protein content which has the potential as a  source of bioactive peptides. One of the bioactive peptides is  an angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitor,  thus,  mucuna  beans  might  be  used  as  a  potential  source  of  antihypertensive  compounds.  This study  aimed  to  increase  the  functionality  of  proteins  from  mucuna  beans  as  ACE  inhibitors  using  a combination of fermentation and enzymatic hydrolysis followed by membrane filtration. The mucuna beans were fermented for 0, 24, 48, 96, and 144 h. The highest ACE inhibitory activity of 54.37%, was obtained by fermentation of the beans at 48 h, with a protein content of 20.82 mg/mL. The 48 h fermented mucuna beans were further hydrolyzed using alcalase  or neutrase and subsequently filtered with UF membranes  having 20,10  and  5  kDa  cut-off.  The  enzymatic  hydrolysis  followed  by  membrane  filtration  increased  the  ACE inhibitory  activity  of  mucuna  beans.  The  neutrase  hydrolysates  resulting  from  5  kDa  membrane filtration showed the best ACE inhibitory activity (62.96% with a protein content of 10.39 mg/mL). A combination of fermentation and enzymatic hydrolysis followed by filtration using UF-membrane was able to produce ACE inhibitory peptides from mucuna beans. The potential of mucuna beans peptides as ACE inhibitors was due to the presence of negatively charged amino acid residues such as Asp and Glu, positively charged amino acids such as Arg and Lys, and hydrophobic amino acids such as Val, Leu, Ala, and Ile.
Keyword: ACE inhibitor, bioactive peptide, membrane filtration, Mucuna pruriens, protein hydrolysate

## ABSTRAK
1
Kacang  koro  benguk ( Mucuna  pruriens L.)  merupakan  salah  satu  kacang-kacangan  dengan kandungan  protein  tinggi  yang  berpotensi  sebagai  sumber  peptida  bioaktif.  Salah  satu  peptida  bioaktif adalah penghambat ACE ( angiotensin-converting enzyme ) sehingga kacang koro benguk dapat digunakan sebagai bahan pangan fungsional antihipertensi yang potensial. Penelitian ini bertujuan untuk meningkatkan fungsionalitas  protein  dari  kacang  koro  benguk  sebagai  penghambat  ACE  dengan  menggunakan pendekatan  kombinasi  fermentasi  dan  hidrolisis  enzimatik, dilanjutkan dengan  pemisahan menggunakan membran filtrasi. Kacang koro benguk difermentasi pada 0, 24, 48, 96, dan 144 jam. Aktivitas penghambatan ACE tertinggi sebesar 54,37% diperoleh dari kacang koro benguk yang difermentasi pada 48 jam dengan kandungan protein sebesar 20,82 mg/mL. Tempe koro benguk fermentasi 48 jam selanjutnya dihidrolisis menggunakan enzim alkalase atau neutrase, dan kemudian dipisahkan menggunakan membran ultrafiltrasi (UF)  dengan  MWCO  ( molecular  weight  cut-off )  20,  10  dan  5  kDa.  Hidrolisis  enzimatik  dan  pemisahan membran meningkatkan aktivitas penghambatan ACE dari kacang koro benguk. Hidrolisat neutrase hasil pemisahan membran 5 kDa menunjukkan aktivitas penghambatan ACE terbaik (62,96% dengan kandungan protein 10,39 mg/mL). Kombinasi fermentasi dan hidrolisis enzimatik yang dilanjutkan dengan pemisahan menggunakan membran UF mampu menghasilkan peptida penghambat ACE. Potensi peptida kacang koro benguk  sebagai  penghambat  ACE  disebabkan  oleh  adanya  residu asam  amino  yang  bermuatan  negatif seperti Asp dan Glu, positif seperti Arg dan Lys, dan hidrofobik seperti Val, Leu, Ala dan Ile.
Kata kunci: hidrolisat protein, kacang koro benguk, membran ultrafiltrasi, penghambat ACE, peptida bioaktif

## PENDAHULUAN
Hipertensi atau tekanan darah tinggi merupakan penyakit  gangguan  sistem  peredaran  darah  akibat adanya  kenaikan  tekanan  darah  di  atas  140/90 mmHg.  Hipertensi  dapat  meningkatkan  risiko  ber- kembangnya penyakit kardiovaskular seperti penya- kit jantung, dan stroke (Daliri et al., 2018). Prevalensi hipertensi  di  Indonesia  adalah  sebesar  34,1%  pada orang dewasa beumur ≥18 tahun (Kemenkes, 2019). Menurut World  Health  organization (WHO)  (2019), sebanyak  1,13  Milyar  orang  di  dunia  menderita hipertensi,  dan  angka  ini  diperkirakan  naik  menjadi 1,5 Miliyar orang pada tahun 2025.
Angiotensin converting enzyme (ACE) berperan dalam  pengendalian  tekanan  darah  melalui  sistem renin  angiotensin.  ACE  mengkatalis  perubahan angiotensin I menjadi angiotensin II (vasokonstriktor), dan  menginaktifkan bradykinin (vasodilator)  yang menyebabkan  peningkatan  tekanan  darah  (Aluko, 2015).  Penggunaan  jangka  panjang  obat  antihiper- tensi sintetik memberikan efek samping seperti batuk, ruam  kulit,  dan  gangguan  rasa  (Ko et  al., 2012). Tingginya  prevalensi  hipertensi  dan  efek  samping obat  antihipertensi  sintetik mendorong  dilakukannya penelitian  untuk  mendapatkan  senyawa  antihiper- tensi  alami  dari  bahan  pangan.  Protein  dan  peptida bioaktif  dapat  menjadi  alternatif  senyawa  inhibitor ACE alami yang aman, tidak menimbulkan efek sam- ping, dan memberikan manfaat gizi tambahan seba- gai sumber asam amino esensial (Zarei et al., 2019). Kacang  koro  benguk  ( Mucuna  pruriens L.)  ter- masuk  kacang-kacangan  famili Fabaceae (polong- polongan)  yang  pemanfaatannya  masih  sebatas untuk  konsumsi  sebagai  sayuran  dan  pembuatan tempe  (Mulyani et  al., 2016).  Kacang  koro  benguk mengandung  protein  yang  cukup  tinggi  (26,75%) dibandingkan dengan kacang koro kratok ( Phaseolus lunatus L.)  (20,76%),  dan  koro  komak  ( Dolichus lablab L.) (21,37%) (Purwanti et al., 2019; Rahayu et al., 2019). Berdasarkan kandungan tersebut, kacang koro  benguk  memiliki  potensi  sebagai  sumber  pep- tida  bioaktif  (Sitanggang et  al., 2021a).  Beberapa penelitian  melaporkan  bahwa  hidrolisis  enzimatik langsung  dari  kacang  koro  benguk  menghasilkan peptida bioaktif yang berfungsi sebagai antihipertensi melalui penghambatan ACE (Segura-Campos et al. , 2013;  Herrera-Chalé et  al., 2014;  Chel-Guerrero et al., 2017;  Tuz  dan  Campos  2017).  Meskipun  demi- kian,  hingga  saat  ini  penelitian  terkait  produksi  dan karakterisasi peptida bioaktif penghambat ACE, serta karakteristik  asam  amino  dari  hidrolisat  tempe  koro benguk belum banyak dilaporkan.
Peptida bioaktif dari parent protein dapat dipro- duksi melalui fermentasi mikroba, dan hidrolisis enzi- matik (Singh et al., 2014), maupun kombinasi kedua- nya (Sitanggang et al., 2020a). Produksi peptida bio- aktif melalui kombinasi antara fermentasi dan hidro-
lisis enzimatik, serta diikuti pemisahan menggunakan membran  UF  yang  dilakukan  oleh  Sitanggang et  al. (2020a),  menghasilkan  bioaktivitas  hidrolisat  tempe kedelai lebih baik dibandingkan dengan hanya difer- mentasi. Kombinasi fermentasi dan hidrolisis enzima- tik  diharapkan  dapat  meningkatkan  fungsionalitas peptida  kacang  koro  benguk  sebagai  penghambat ACE (Sitanggang et al., 2021b).
Kacang koro benguk dapat diolah menjadi tem- pe  melalui  fermentasi.  Selama  proses  fermentasi, mikroba  memproduksi  enzim  proteolitik  yang  akan mendegradasi protein menjadi peptida dengan berat molekul  rendah  yang  berpotensi  memiliki  sifat  bio- aktif,  termasuk  kemampuan  sebagai  penghambat ACE  (Puspitojati et  al., 2019a).  Lama  fermentasi memengaruhi  pelepasan  peptida  bioaktif,  sehingga kondisi  proses  harus  dioptimalkan  untuk mendapat- kan  peptida  dengan  aktivitas  spesifik  (Jakubczyk et al., 2017).
Hidrolisis  enzimatik  memotong  protein  secara spesifik  yang  dapat  menghasilkan  peptida  dengan sifat fungsional yang diharapkan (Chalamaiah et al., 2015). Jenis enzim yang berbeda akan menghasilkan bioaktivitas peptida yang berbeda pula. Pada peneli- tian  ini,  proses  hidrolisis  dilakukan  menggunakan enzim  alkalase  dan  neutrase  untuk  melihat  potensi enzim  komersil  dalam  menghasilkan  peptida  peng- hambat ACE dari kacang koro benguk. Alkalase dan neutrase  merupakan  golongan  endopeptidase  yaitu enzim  yang  memotong  protein  dari  bagian  dalam molekul dan dari ujung rantai polipeptida (Mótyán et al., 2013), sehingga diharapkan dapat meningkatkan peluang untuk memperoleh peptida bioaktif.
Tahap  lanjutan  dalam  produksi  peptida  bioaktif adalah pemisahan. Pemisahan menggunakan mem- bran ultrafiltrasi dapat memisahkan peptida berdasar- kan  berat  molekulnya  (Wan  Mohtar et  al., 2014). Membran  ultrafiltrasi  efektif  digunakan  untuk  meng- hasilkan  peptida  dengan  berat  molekul  rendah  dan aktivitas  yang  tinggi  (Hong et  al., 2019).  Dengan demikian, penelitian ini bertujuan meningkatkan fung- sionalitas peptida kacang koro benguk sebagai peng- hambat  ACE  melalui  kombinasi  proses  fermentasi kacang  koro  benguk  menjadi  tempe  dan  hidrolisis enzimatik,  diikuti  separasi  menggunakan  membran ultrafiltrasi (UF).

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  yaitu kacang koro benguk putih yang diperoleh dari Pasar Beringharjo, Kota Yogyakarta, laru tempe (Raprima, KOPTI,  Indonesia),  enzim  alkalase  (6000  U/mL, Novozyme,  Denmark),  dan  neutrase  (11000  U/mL, Novozyme,  Denmark),  enzim  angiotensin  (0,33 U/mL) (Xi’An Saina Biological Technology Co., Ltd., China).

## Pembuatan tempe koro benguk
Pembuatan tempe koro benguk mengacu pada metode  Rahayu et  al. (2019)  dengan  modifikasi. Kacang  koro  benguk  yang  telah  disortir  direndam dengan  air  (perbandingan  kacang  dan  air  1:3  (b/v)) selama 24 jam, kemudian kacang koro benguk dire- bus  ( steam  jacket, Gardners,  New  Delhi,  India) dengan  perbandingan  kacang  dan  air  1:7  b/v  pada suhu  90-95°C,  tekanan  2-3  bar,  selama  90  menit. Setelah  itu,  kacang  koro  benguk  rebus  direndam kembali (perbandingan kacang-air 1:5 b/v) selama 48 jam.  Kacang  koro  benguk  yang  telah  direndam, dipecah  menggunakan  mesin  pemecah  biji  (KOPTI, Bogor, Indonesia) menjadi dua bagian, dikupas kulit- nya,  kemudian  dicuci  dan  ditiriskan.  Setelah  ditiris- kan, kacang koro benguk dikukus ( steamer ) selama 15 menit, kemudian didinginkan. Selanjutnya kacang koro benguk diberi ragi (2 g/kg kacang koro benguk) secara  merata,  dan  dikemas  menggunakan  plastik (450  g  kacang  koro  benguk/plastik)  yang  diberi lubang berjarak 2x2 cm. Proses fermentasi dilakukan pada suhu 25°C, dengan perlakuan waktu fermentasi selama 0, 24, 48, 96, dan 144 jam.
Tempe  koro  benguk  dipotong  dengan  ukuran 3x0,5x0,5 cm dan dikeringkan menggunakan cabinet dryer (Terara Seisakusho C. Ltd. No 4-60SP, Jepang) pada  suhu  70°C  selama  5  jam. Tempe  yang  sudah kering  kemudian  dihaluskan  menggunakan pin  disc mill (FFC  23  Agrowindo-Maksindo,  Indonesia)  dan diayak menggunakan ayakan 80 mesh. Selanjutnya, tepung  tempe  koro  benguk  dengan  berbagai  waktu fermentasi  dianalisis  aktivitas  penghambatan  ACE, kadar  protein  kasar,  kadar  protein  terlarut,  derajat hidrolisis,  total  fenolik,  kapasitas  antioksidan,  dan warna. Tempe koro benguk dengan waktu fermentasi terbaik  berdasarkan  aktivitas  inhibitor  ACE  tertinggi akan digunakan dalam produksi peptida bioaktif.

## Produksi hidrolisat tepung tempe koro benguk
Tepung  tempe  koro  benguk  dengan  waktu  fer- mentasi  terbaik  dihidrolisis  dengan  enzim  neutrase dan alkalase (Sitanggang et al., 2020 dengan modifi- kasi),  masing-masing  dilakukan  pada  suhu  50°C selama  4  jam  dengan  kecepatan  pengadukan  200 rpm.  Perbandingan  enzim  dan  substrat  adalah  1:10 b/v, dan perbandingan substrat dan bufer fosfat 0,01 M pH 7,4 adalah 5% b/v. Hidrolisis dihentikan dengan pemanasan pada suhu 90°C selama 20 menit. Hidro- lisat kemudian disaring dengan kertas Whatman No 43,  dan  separasi  dilanjutkan  dengan  membran  UF MWCO  5,  10,  dan  20  kDa  (Microdyn-Nadir  GmbH, Jerman), pada kondisi vakum dengan sistem operasi dead-and .  Empat  fraksi  hidrolisat  yang  diperoleh yaitu hidrolisat yang berukuran >20 kDa (penyaringan kertas Whatman  No.  43  diameter  90 mm), lolos  20, 10, dan 5 kDa, dianalisis kadar protein terlarut, total fenolik, kapasitas antioksidan dan aktivitas pengham- batan  ACE.  Hidrolisat  dengan  nilai  aktivitas  peng-
hambatan  ACE  tertinggi  dari  masing-masing  enzim dan  ukuran  MWCO  membran  dianalisis  nilai  IC 50 penghambatan  ACE  serta  diidentifikasi  komposisi asam aminonya.

## Pengukuran kadar protein
Analisis  kadar  protein  kasar  menggunakan metode Kjeldahl (AOAC 2012). Kadar protein terlarut diuji menggunakan metode Lowry (Lowry et al., 1951) dengan standar protein standar BSA ( Bovine Serum Albumin ) (Sigma-Aldrich, Inc., Singapore).

## Analisis derajat hidrolisis
Analisis  derajat  hidrolisis  dilakukan  dengan metode  titrasi  formol  (Morais et  al., 2013).  Derajat hidrolisis  protein  dihitung  menggunakan  persamaan berikut ini:
Derajat Hidrolisis ( % ) =
Am N (asam amino-nitrogen) TN (total nitrogen)
x100% ……...…….. (1)
Total  nitrogen  dihitung  berdasarkan  metode Kjeldahl. Asam amino-nitrogen diperoleh mengguna- kan  metode  titrasi  formol.  Pereaksi  formaldehida dibuat  dengan  cara  25 mL formaldehida  diencerkan menggunakan etanol 50% hingga mencapai volume 250  mL.  Sampel  dilarutkan  dalam  akuades  dengan perbandingan 1:10 (b/v). Larutan sampel dinetralkan dengan NaOH 3 M hingga pH 8,0 dan diaduk meng- gunakan waterbath shaker pada suhu 50 ° C selama 2 jam. Selanjutnya, sebanyak 5 mL sampel ditambah- kan 2-3 tetes indikator fenolftalein dan 5 mL pereaksi formaldehida.  Hasil  pencampuran  sampel  dititrasi menggunakan  NaOH  0,01  M  hingga  muncul  warna merah jambu. Bahan kimia NaOH dan formaldehida diperoleh  dari  grade pro-analysis (Merck,  Jerman). Kandungan  asam  amino-nitrogen  (Am  N)  dihitung menggunakan  persamaan  sebagai  berikut,  dengan V NaOH = Volume NaOH, M NaOH = Molaritas NaOH yang digunakan  (0,01  M),  BM  N=  Berat  molekul  nitrogen (14):
Am N ( mg/g Sampel ) =
V NaOH x M NaOH x BM N x faktor pengenceran Berat sampel (g) ….. (2)

## Analisis warna
Pengukuran  warna  tepung  tempe  koro  benguk dilakukan  terhadap  tingkat  kecerahan  atau  nilai Lightness (L*)  menggunakan chromameter (Konica Minoltas CR 310, Amerika Serikat) (İçöz et al., 2007 dengan  modifikasi).  Pengukuran  dilakukan  dengan cara  meletakan  sampel  pada  wadah  sampel  uji, kemudian permukaan sampel diratakan dengan sen- dok,  selanjutnya  sampel  dianalisis  dengan  meletak-
kan measuring  head untuk  mengidentifikasi  nilai  L*, a*, dan b* Hunter.

## Analisis berat molekul protein metode SDS-PAGE
Penentuan berat molekul protein tepung tempe koro  benguk  dilakukan  dengan  metode  SDS-PAGE (Laemmli, 1970). Prosedur persiapan sampel berda- sarkan  mengacu  pada  metode  Mujoo et  al. (2003). Sebanyak  50  mg tepung  tempe  koro  benguk  bebas lemak dilarukan dalam 500 µ L Tris-HCl (pH 8,4), dan diinkubasi pada suhu 80°C selama 1 jam. Setelah itu, sampel disentrifus pada 12.000 rpm selama 25 menit. Supernatan  dikumpulkan,  sedangkan  residu  proses kembali  dilarutkan  dalam  Tris-HCl  hingga  3  kali. Seluruh supernatan digabung dan ditambahkan bufer sampel  dengan  perbandingan  1:1  (v/v),  kemudian dipanaskan pada suhu 95°C selama 10 menit.
Sebanyak  10 μ L  larutan  sampel  dan  10 μ L protein  marker  diinjeksikan  ke  dalam  sumur  yang mengandung 15% gel pemisah dan 3% gel penahan. Elektroforesis ( PerfectBlue™ dual gel system Twin S, VWR Peqlab, Jerman) dijalankan pada tegangan 35- 50  mA,  dan  70  Volt  selama  15  menit  dan  170  Volt selama 60 menit. Setelah proses selesai, gel diwarnai dengan larutan pewarna dan digoyangkan selama 60 menit menggunakan shaker ,  lalu  direndam  dengan larutan peluntur selama 60 menit. Selanjutnya, diren- dam  dengan  asam  asetat  5%  selama  15-30  menit. Marker protein yang digunakan berbobot 10-250 kDa. Berat molekul protein pada sampel diperoleh dengan aplikasi PhotoCapt  Mw (Vilber  Lourmat,  Marne-La- Vallee, Perancis).

## Analisis total fenolik
Analisis  total  fenolik  mengacu  pada  kavitha (2018)  dengan  modifikasi.  Sebanyak  1  mL  sampel dicampur  dengan  0,25  mL  reagen  Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, Inc., Singapura) dan 0,5 mL Na 2 CO 3 15%  (Merck  Milipore,  Jerman)  serta  ditambahkan akuades  sebanyak  8,25  mL.  Campuran  kemudian diinkubasi  pada  suhu  ruang  selama  30  menit. Absorbansi  diukur  pada  765  nm  menggunakan spektrofotometer  ( Genesys™  140/150  Vis/UV-Vis, Amerika  Serikat).  Total fenolik  dihitung  berdasarkan kurva standar menggunakan asam galat, dan dinya- takan  sebagai  mg gallic  acid  equivalent (GAE)/mL sampel.
Analisis  kapasitas  antioksidan  metode ferric reducing antioxidant power (FRAP) Pengujian kapasitas antioksidan diawali dengan menyiapkan  pereaksi  FRAP  (Iamsaard et  al., 2020) yaitu mencampurkan 300 mM bufer asetat (pH 3,6), 10 mM tris piridil triazin (TPTZ) (Sigma Aldrich, Saint Louis,  USA)  dalam  40  mM  HCl,  dan  20  mM FeCl 3 .6H 2 O  (Sigma  Aldrich,  Saint  Louis,  USA) dengan perbandingan 10:1:1 (v/v/v). Sebanyak 0,15 mL sampel ditambahkan 4,5 mL pereaksi FRAP, dan
didiamkan selama 30 menit pada suhu ruang. Absor- bansi  sampel  diukur  pada  panjang  gelombang  598 nm menggunakan spektrofotometer (G enesys™ 140/ 150 Vis/UV-Vis, Amerika Serikat). Hasil pengukuran dihitung  dengan  persamaan  kurva  standar  asam askorbat  dan  dinyatakan  dalam  mg ascorbic  acid equivalent antioxidant capacity (AEAC)/mL sampel.

## Uji aktivitas penghambatan ACE
Uji aktivitas penghambatan ACE mengacu pada Guo et al. (2009). Uji aktivitas ACE dilakukan dengan cara mencampurkan sebanyak 200 μL larutan bufer substrat  (6,7  mM hippuryl-L-histidyl-L-leucine atau HHL  dalam  50  mM  HEPES  buffer  dengan  300  mM NaCl pH 8,3) dengan 100 μL hidrolisat protein dan di pre-inkubasi  pada  suhu  37 ° C  selama  5  menit. Selanjutnya  ditambahkan  sebanyak  30  μL  enzim angiotensin  (0,33  U/mL)  untuk  memulai  reaksi. Setelah diinkubasi selama 20 menit pada suhu 37°C, reaksi  enzimatis  tersebut  kemudian  dihentikan  de- ngan penambahan 3 mL HCl 1 N. Asam hipurat yang terlepas akibat aksi dari enzim angiotensin dihidrolisis dengan  menggunakan  2,4  mL  etil  asetat  kemudian divorteks selama 2 menit. Lapisan bagian atas yang merupakan asam hipurat diambil sebanyak 1 mL dan dievaporasi  pada  suhu  120°C  selama  30  menit. Sedimen yang tersisa kemudian dilarutkan dalam 2,5 mL akuades dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang  228  nm  (Spektrofotometer Genesys™ 140/150 Vis/UV-Vis, Amerika Serikat). Aktivitas peng- hambatan  ACE  dihitung  menggunakan  persamaan beri-kut: (dengan a= absorbansi larutan mengandung ACE  tanpa  sampel,  b=  absorbansi  larutan  mengan- dung ACE yang telah diinaktivasi dengan HCl tanpa sampel;  c=  absorbansi  campuran  ACE  dan  sampel, dan,  d=  absorbansi  larutan  mengandung  ACE  dan sampel yang telah diinaktivasi dengan HCl).
Aktivitas Penghambatan ACE ( % ) =
( a-b ) -(c-d) (a-b) x 100% …………………..……………. (3)
Nilai inhibition concentration 50 (IC 50 ) diperoleh dari kurva hubungan antara aktivitas penghambatan ACE (%) dengan konsentrasi protein (mg/mL) meng- gunakan  aplikasi GraphPad  Prism 9.2.0  (GraphPad Software, Inc., California) yang didasarkan pada best fit value .

## Analisis komposisi asam amino
Analisis  komposisi  asam  amino  total  (diukur setelah  hidrolisis  dengan  HCl  6  M)  mengikuti Sitanggang et  al. (2020b)  untuk  hidrolisat  tepung tempe  koro  benguk  hasil  metode  preparatif  terbaik dilakukan oleh PT. Saraswanti Indo Genetech, Bogor, Indonesia,  menggunakan  metode  yang  dikembang- kan secara internal (18-5-17/MU SMM-SIG, UPLC).

## Analisis data
Data  karakteristik  tepung  dan  hidrolisat  tepung tempe  koro  benguk  dianalisis  dengan One-Way ANOVA dengan uji lanjut Duncan ( p <0,05). Data IC 50 dianalisis dengan Independent-samples-t-test . Anali- sis data menggunakan aplikasi SPSS IBM 25. Hasil dinyatakan sebagai rata-rata  SD.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Waktu fermentasi terbaik
Waktu  fermentasi  terbaik  kacang  koro  benguk diperoleh  pada  48  jam  dengan  nilai  aktivitas  peng- hambatan  ACE  sebesar  54,37%  (Tabel  1).  Hasil  ini sesuai  dengan  penelitian  Rizkaprilisa et  al. (2020), fermentasi kacang koro benguk selama 48 jam meng- hasilkan  aktivitas  penghambatan  ACE  sekitar  50%. Aktivitas  penghambatan  ACE  ditemukan  selama tahap  awal  fermentasi  dan  terus  meningkat  saat fermentasi  berlangsung.  Namun,  fermentasi  yang lebih lama menyebabkan  penurunan  aktivitas  peng- hambatan ACE. Hal ini dapat disebabkan oleh hidro- lisis peptida penghambat ACE menjadi asam amino bebas. Bentuk asam amino bebas memiliki aktivitas penghambatan  kerja  ACE  yang  lebih  rendah  diban- dingkan dengan bentuk peptidanya (Puspitojati et al., 2019b).
Kadar protein, derajat hidrolisis, total fenolik, dan kapasitas antioksidan meningkat selama fermentasi, namun  menurunkan  kecerahan  tepung  tempe  koro benguk  (Tabel  1).  Hal  ini  dapat  disebabkan  oleh aktivitas enzim ekstraseluler (protease, lipase, karbo- hidratase)  yang  dihasilkan  selama  fermentasi,  yang dapat  mendegradasi  senyawa-senyawa  kompleks berbasis makromolekul menjadi senyawa yang lebih sederhana (Sharma et al., 2020). Hasil analisis berat molekul protein tepung tempe koro benguk (Gambar
1)  mengonfirmasi bahwa  terjadi  degradasi  protein berbobot  molekul  besar  selama  fermentasi  tempe koro benguk. Pita protein untuk berat molekul besar semakin  tipis  seiring  dengan  meningkatnya  lama fermentasi.  Hasil  ini  sejalan  dengan  penelitian Sitanggang et  al. (2020a)  bahwa  pita  protein  tempe kedelai  dengan  berat  molekul  >35  kDa  semakin menipis dengan bertambahnya lama fermentasi. Pola perubahan  berat  molekul  protein  yang  sama  juga dilaporkan  oleh  Rahayu et  al. (2019),  fermentasi kacang koro benguk menghasilkan protein berbobot molekul  rendah  (<25  kDa)  yang  berpotensi memiliki sifat bioakif.

## Kadar protein terlarut
Tepung  tempe  koro  benguk  dengan  lama fermentasi  48  jam  dihidrolisis  menggunakan  enzim alkalase  (HA)  dan  neutrase  (HN).  Hidrolisat  yang dihasilkan  memiliki  beberapa  karakteristik  dianta- ranya  kadar  protein  terlarut,  total  fenolik,  kapasitas antioksidan,  aktivitas  penghambatan  ACE,  dan  kan- dungan  asam  amino.  Kandungan  protein  terlarut dalam  hidrolisat  alkalase  dan  neutrase  masing- masing  berkisar  antara  9,1-19,8  dan  10,4-16,4 mg/mL. Hidrolisat HA lebih banyak mengandung pro- tein terlarut dengan berat molekul >20 kDa, dan HN lebih  banyak mengandung  protein  terlarut <20  kDa. Perbedaan  kadar  protein  terlarut  ini  dapat  disebab- kan  oleh  perbedaan  aktivitas  hidrolitik  enzim.  Alka- lase  termasuk  golongan  serin  endopeptidase  yang memiliki serin pada sisi aktifnya, dan neutrase meru- pakan  metalloprotease  yang  membutuhkan  ion logam  sebagai  kofaktor  dalam  aktivitas  katalitiknya (Ramakrishnan et al., 2013). Hasil ini sesuai dengan penelitian  Xu et  al. (2021),  hidrolisat  protein  dari kacang  gude  yang  dihidrolisis  dengan  enzim  yang berbeda (alkalase dan bromelin) menghasilkan kadar protein yang berbeda pula.
Tabel 1. Karakteristik tepung tempe koro benguk Table 1. Characteristics of koro benguk tempe flour
Keterangan: Data dalam satu baris dengan huruf yang berbeda menunjukkan perbedaan yang signifikan ( p ˂0,05) Note: Data in one row with different letters indicates a significant difference (p˂0.05)
Parameter Lama Fermentasi (jam) ( Fermentation Length (h) ) 0 24 48 96 144 Penghambatan ACE (%) ( ACE inhibition (%) ) 31.84±0.18 a 42.72±0.46 b 54.37±0.92 c 32.36±1.83 a 42.23±0.23 b Kadar protein kasar (% bk)
( Crude protein content (% dw) ) 30.82±0.02 a 30.73±0.29 a 33.77±0.56 b 38.46±0.23 c 40.63±0.42 d Kadar protein terlarut (mg/mL) ( Soluble protein content (mg/mL) ) 1.07±0.58 a 9.51±0.29 b 20.82±1.16 c 27.82±1.16 d 37.08±0.87 e Derajat hidrolisis (%) ( Degree of hydrolysis (%) ) 7.35±0.16 a 13.53±0.24 b 45.28±0.96 c 56.00±0.20 d 69.43±0.32 e Total fenolik (mg GAE/g bk)
( Total phenolics (mg GAE/g dw) ) 13.12±0.07 a 14.65±0.89 a 19.88±0.17 b 25.28±0.34 c 30.51±0.99 d
Kapasitas antioksidan (mg AEAC/g bk) ( Antioxidant capacity (mg AEAC/g dw) )
15.94±0.84 a 18.99±0.70 b 15.66±0.30 a 18.03±0.75 b 18.36±0.52 b Warna (Nilai L*) ( Color (L* value) ) 70.31±2.62 a 70.39±0.82 a 67.83±2.30 ab 64.27±1.84 bc 61.37±1.57 c
BM MW (kDa) 250 150 75 50 37 25 20 15 10 M (kDa) 73 62 46 33 22 19 15 13 12 9 Lama Fermentasi (Jam) ( Fermentation Length (h) )
0       24     48      96      144
Keterangan: M= Marker protein, BM= Berat molekul Note: M= Protein marker, MW= Molecular weight

## Gambar 1.  Profil berat molekul protein tepung tempe koro benguk
Figure 1.   Molecular  weight  profile  of  proteins  from koro benguk tempeh flour
Kadar  protein  terlarut  hidrolisat  tepung  tempe koro benguk menurun setelah dipisahkan mengguna- kan membran UF. Hal ini menunjukkan bahwa masih terdapat  protein  dengan  berat  molekul  tinggi  (≥20 kDa)  sehingga  ketika  dipisahkan,  protein  dengan berat molekul yang lebih besar dari MWCO membran akan  tertahan  pada  permukaan  membran  (Wan Mohtar et  al., 2014).  Pemisahan  hidrolisat  dengan membran UF yang dilaporkan oleh Herrera-Chalé et al. (2014), menunjukkan bahwa penggunaan MWCO membran UF yang lebih kecil dapat menolak protein dengan  ukuran  yang  lebih  besar,  sehingga  kan- dungan protein pada permeat lebih rendah.
Kadar protein tertinggi tidak selalu menghasilkan aktivitas  penghambatan  ACE  tertinggi  pula. Ber- dasarkan Gambar 2A dan 2D, kadar protein tertinggi kedua  hidrolisat  tepung  tempe  koro  benguk  dimiliki oleh hidrolisat fraksi >20 kDa. Namun, aktivitas peng- hambatan ACE justru paling rendah. Hal ini menun- jukkan bahwa senyawa penghambat ACE dari hidro- lisat  tepung tempe koro benguk merupakan protein dengan  berat  molekul  rendah.  Temuan  ini  serupa dengan penelitian Tuz dan Campos (2017), hidrolisat kacang koro benguk dengan kadar protein yang tinggi tidak  menghasilkan  aktivitas  penghambatan  ACE yang tertinggi.

## Total fenolik
Penurunan  kandungan  total fenol  (Gambar  2B) hidrolisat tepung tempe koro benguk setelah proses pemisahan menggunakan membran ultrafiltrasi didu- ga disebabkan oleh adsorpsi komponen fenolik pada
permukaan  membran  sehingga  terjadi  penolakan senyawa fenolik oleh membran UF (Mnif et al., 2017). Sitanggang et  al. (2021b)  juga  melaporkan  bahwa terjadi  penolakan  senyawa  fenolik  dari  hidrolisat tempe  kedelai  oleh  membran  10  kDa  yang  menye- babkan  kandungan  total  fenolik  pada  permeat  lebih kecil daripada substrat.
Senyawa fenolik dapat berikatan dengan protein membentuk  kompleks  protein-fenolik  melalui  ikatan kovalen  maupun  ikatan  non-kovalen  (Aydemir  dan Yemenicioglu,  2013).  Proses  hidrolisis  enzimatik mampu  memecah  kompleks  protein-fenolik  yang menghasilkan  peptida  dan  senyawa  fenolik  bebas (Chen et  al., 2021).  Hidrolisis  tepung  tempe  koro benguk dengan enzim alkalase dan neutrase meng- hasilkan  kandungan  total  fenolik  yang  berbeda.  Hal ini diduga disebabkan oleh perbedaan aktivitas hidro- litik enzim yang berperan dalam pelepasan senyawa fenolik. Temuan ini sesuai dengan hasil penelitian Ee et al. (2019), hidrolisat dari biji bunga telang ( Clitoria ternatea L.)  yang  dihidrolisis  dengan  protease  yang berbeda menghasilkan kandungan total fenolik yang berbeda. Menurut Yun dan Park (2018), kandungan total  fenolik  pada  hidrolisat  dipengaruhi  oleh  jenis protease, konsentrasi, dan waktu hidrolisis.
Selain  berperan  sebagai  antioksidan  (Koley et al., 2018),  senyawa  fenolik  juga  dapat  berfungsi sebagai  penghambat  ACE  (Al  Shukor et  al., 2013). Kandungan  total  fenolik  dan  kapasitas  antioksidan hidrolisat tertinggi terdapat pada hidrolisat fraksi >20 kDa,  sedangkan  aktivitas  penghambatan  ACE  ter- tinggi terdapat pada hidrolisat <20 kDa yaitu fraksi 10 dan  5  kDa.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  senyawa fenolik  mungkin  berpengaruh  terhadap  kapasitas antioksidan  hidrolisat  tepung  tempe  koro  benguk, tetapi  tidak  berpengaruh  pada  aktivitas  pengham- batan ACE.

## Kapasitas antioksidan
Kapasitas antioksidan tertinggi dari kedua hidro- lisat  tepung  tempe  koro  benguk  terdapat  pada hidrolisat fraksi >20 kDa. Berdasarkan hasil tersebut diduga  komponen  yang  aktif  sebagai  antioksidan banyak  terkandung  pada  hidrolisat  dengan  berat molekul  tinggi  (>20  kDa) . Hasil  ini  sesuai  penelitian Mosquera et al. (2015) bahwa berat molekul hidrolisat protein mempengaruhi aktivitas antioksidan. Peptida rantai  panjang  dengan  berat  molekul  lebih  tinggi, lebih banyak mengandung gugus pereduksi daripada peptida  rantai  pendek  sehingga  berpengaruh  ter- hadap nilai kapasitas antioksidan (Girgih et al., 2011). Aguilar et al. (2018) melaporkan bahwa aktivitas anti- oksidan tertinggi hidrolisat kacang buncis ( Phaseolus vulgaris L.)  terdapat  pada  hidrolisat  dengan  berat molekul  tinggi  (30  kDa),  dan  menyatakan  bahwa campuran  peptida  dengan  berat  molekul  yang  ber- beda memberikan kontribusi lebih pada aktivitas anti- oksidan daripada masing-masing fraksi.
a b bc c a b b c 0 5 10 15 20 25 >20 kDa (Whatman No. 43) 20 kDa 10 kDa 5 kDa K a d a r P ro te in T e rl a ru t (m g /m L ) Membran UF A S o lu b le P ro te in C o n te n t (m g /m L ) UF Membranes a b b b a b b c 0 10 20 30 40 50 60 70 >20 kDa (Whatman No. 43)
20 kDa 10 kDa 5 kDa
A kt ivi ta s P e n g h a m b a ta n A C E ( % ) Membran UF D A C E I n h ib it io n A ct iv it y (% ) UF Membranes a b b c a b b b 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 >20 kDa (Whatman No. 43) 20 kDa 10 kDa 5 kDa T o ta l F e n o lik (m g G A E /m L ) Membran UF B T o ta l P h e n o lics (G A E /m L ) UF Membranes 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0
Keterangan: Grafik batang dengan pola yang sama dengan huruf yang berbeda pada setiap grafik batang menunjukkan perbedaan signifikan ( p <0,05);      Alkalase,      Neutrase Note: Different letters on bar graphs with the same pattern show significant differences (p<0.05);     Alcalase,     Neutrase
Gambar 2. Karakteristik hidrolisat tepung tempe koro benguk Figure 2. Characteristics of the hydrolysates of koro benguk tempeh flour
Berdasarkan kandungan total fenolik dan protein terlarut  antara  hidrolisat  HA  dan  HN  tidak  menun- jukkan perbedaan, namun terdapat perbedaan pada nilai kapasitas antioksidan (Gambar 2A-2C). Hasil ini menunjukkan bahwa kapasitas antioksidan hidrolisat tepung  tempe  koro  benguk  tidak  sepenuhnya  dipe- ngaruhi oleh kandungan total fenolik maupun protein terlarut,  tetapi  dapat  dipengaruhi  oleh  keberadaan peptida  dan  komposisi  asam  amino  penyusun  pep- tida yang dihasilkan selama hidrolisis (Sbroggio et al., 2016). Zou et al. (2016) melaporkan bahwa aktivitas antioksidan  dipengaruhi  oleh  berat molekul,  kompo-
sisi asam amino, sekuens, struktur, dan hidrofobisitas peptida.

## Aktivitas penghambatan ACE
Aktivitas  penghambatan  ACE  tertinggi  ditemu- kan  pada  hidrolisat  HA fraksi  10  kDa,  dan  hidrolisat HN  fraksi  5  kDa  (Gambar  2D)  dengan  nilai  IC 50 masing-masing sebesar 0,34 dan 0,15 mg protein/mL ( p <0,05).  Hasil  ini  sesuai  dengan  penelitian Sitanggang et  al. (2020a)  yang  menyatakan  bahwa peptida dengan berat molekul kecil lebih bersifat lebih aktif.  Menurut  García-Moreno et  al. (2015)  peptida
a b b b a ab b b 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 >20 kDa (Whatman No. 43) 20 kDa 10 kDa 5 kDa
K a p a si ta s A n ti o ksi d a n ( m g A E A C /m L ) Membran UF C A n ti o x id a n t C a p a ci ty (A E A C /m L ) 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 UF Membranes
penghambat kerja ACE biasanya tersusun atas 2-12 asam  amino.  Peptida  dengan  berat  molekul  besar sulit  masuk  kedalam  sisi  aktif  ACE,  sedangkan peptida  dengan  berat  molekul  kecil  lebih  mudah berikatan  dengan  sisi  aktif  enzim  ACE,  dan  dapat mengganggu aktivitas katalitik ACE sehingga meng- hambat konversi angiotensin I menjadi angiotensin II (Lee dan Hur, 2019; He et al., 2021).
Kombinasi  antara  proses  fermentasi  dan  hidro- lisis enzimatik serta pemisahan menggunakan mem- bran UF menghasilkan aktivitas penghambatan ACE hidrolisat tepung tempe koro benguk yang lebih kecil dibandingkan  dengan  hasil  penelitian  yang  dilapor- kan  oleh  Segura-Campos et  al. (2013)  dan  Chel- Guerrero et  al. (2017)  (Tabel  2).  Nilai  IC 50 hidrolisat tepung tempe koro benguk juga lebih kecil dibanding- kan  hidrolisat  kedelai  (Rayaprolu et  al., 2015),  dan tempe  koro  kratok  (Pertiwi et  al., 2019),  yang  dapat disebabkan oleh perbedaan jenis enzim yang diguna- kan, jenis parent protein dan kondisi operasi hidrolisis (Ciau-Solís et  al., 2018).  Semakin  kecil  nilai  IC 50 maka semakin besar aktivitas penghambatan ACE.
Aktivitas penghambatan ACE dapat berasal dari senyawa  fenolik  dan  antioksidan  (Al  Shukor et  al., 2013;  Sorriento et  al., 2018) . Pada  penelitian  ini, kandungan  total  fenolik  dan  kapasitas  hidrolisat tepung  tempe  koro  benguk  tertinggi  berasal  dari hidrolisat fraksi >20  kDa,  sedangkan  aktivitas  peng- hambatan  ACE  tertinggi  merupakan  fraksi  <20  kDa yaitu fraksi 10 dan 5 kDa. Hal ini menunjukkan bahwa aktivitas  penghambatan  ACE  dari  hidrolisat  tepung tempe  koro  benguk  dominan  tidak  berasal  dari senyawa  fenolik  maupun  antioksidan,  akan  tetapi didominasi  oleh  peptida  yang  dihasilkan  selama hidrolisis.
Aktivitas penghambatan ACE yang tinggi meng- indikasikan  bahwa  hidrolisat  kacang  koro  benguk yang dihasilkan melalui kombinasi proses fermentasi dan  hidrolisis  enzimatik  berpotensi  sebagai  sumber senyawa antihipertensi, namun perlu dilakukan uji in vivo untuk  membuktikan  peranan  dari  peptida  yang dihasilkan.  Bila  dibandingkan  dengan  beberapa penelitian sebelumnya (Segura-Campos et al., 2013; Herrera-Chalé et al., 2014; Tuz dan Campos, 2017) , yang sebagian besar menggunakan enzim pencern- aan  (pepsin  dan  pankreatin)  dalam  menghasilkan hidrolisat  kacang  koro  benguk,  enzim  protease komersil  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  juga mampu menghasilkan peptida bioaktif dari hidrolisat tepung  tempe  koro  benguk  dengan  aktivitas  peng- hambatan ACE yang potensial. Adanya peningkatan aktivitas  penghambatan  ACE  kacang  koro  benguk setelah  difermentasi  selama  48  jam  dan  hidrolisis dengan  enzim  neutrase,  serta  diiukuti  pemisahan menggunakan  membran  ultrafiltrasi  MWCO  5  kDa menunjukkan  bahwa  metode  preparatif  tersebut mampu  meningkatkan  fungsionalitas  kacang  koro benguk.

## Komposisi asam amino
Hasil  analisis  komposisi  asam  amino  hidrolisat tepung  tempe  koro  benguk  disajikan  pada  Tabel  3. Hidrolisat  HA  fraksi  10  kDa  dan  HN  fraksi  5  kDa mengandung asam amino hidrofobik seperti Val, Leu, Ala  dan  Ile,  asam  amino  bermuatan  negatif  seperti Asp  dan  Glu,  asam  amino  bermuatan  positif  seperti Arg dan Lys, dan asam amino aromatik seperti Phe dan Tyr.
Tabel 2.  Perbandingan nilai IC 50 antara hidrolisat tepung tempe koro benguk dengan bahan pangan lain Table 2.  Comparison  of  IC 50 values  between  hydrolysates  of  koro  benguk  tempe  flour  and  other  food ingredients
Bahan Pangan ( Food ) Enzim ( Enzyme ) IC 50 Penghambatan ACE
(mg/mL)
( IC 50 of ACE inhibition (mg/mL)) Referensi ( Reference )
Kacang koro benguk ( Mucuna pruriens ) ( Koro benguk nut ) Pepsin ( Pepsin ) Pankreatin ( Pancreatin ) 2.63 4.30 Segura-Campos et al. (2013) Kacang koro benguk ( Mucuna pruriens. L) ( Koro benguk nut ) Alkalase- Flavourzyme ( Alcalase- Flavourzyme ) 0.59-0.99 Chel-Guerrero et al. (2017) Kedelai ( Soybeans ) Alkalase ( Alcalase ) 0.56 Rayaprolu et al. (2015) Tempe koro kratok ( Phaseolus lunatus L.)
( Koro kratok tempe )
Pepsin-Pankreatin ( Pepsin-Pancreatin ) 0.59 Pertiwi et al. (2019) Tempe koro benguk ( Koro benguk tempe ) Alkalase ( Alcalase ) Neutrase ( Neutrase ) 0.34±0.11 a 0.15±0.04 b
Hasil penelitian ( Research )
Keterangan: Data hasil penelitian dalam satu kolom dengan huruf yang berbeda menunjukkan perbedaan yang signifikan ( p <0,05) Note: Research data in one column with different letters shows a significant difference (p<0.05)
J. Teknol. dan Industri Pangan Vol. 33(2): 157-168 Th. 2022

## Tabel 3. Komposisi asam amino hidrolisat tepung tempe koro benguk
Table 3. Amino acid composition of hydrolysates from koro benguk tempeh flour
Asam Amino ( Amino Acids )
Hidrolisat Alkalase Fraksi 10 kDa ( Alcalase Hydrolysate Fraction 10 kDa ) Hidrolisat Neutrase Fraksi 5 kDa ( Neutrase Hydrolysate Fraction 5 kDa ) (mg/100 g Hidrolisat) ( mg/100 g Hydrolysate ) Alanin (Ala) a 55.20 62.64 Glisin (Gly) a 55.72 47.74 Valin (Val) a 65.07 67.60 Leusin (Leu) a 89.15 92.30 Isoleusin (Ile) a 58.79 63.42 Prolin (Pro) a 53.33 49.19 Fenilalanin (Phe) c 66.58 53.91 Metionin (Met) a tt ( nd ) 0.93 Sistein (Cys) e tt ( nd ) tt ( nd ) Triptofan (Trp) c 13.66 12.92 Asam aspartat (Asp) b 149.04 128.36 Asam glutamat (Glu) b 139.48 128.01 Arginin (Arg) d 67.38 49.79 Lisin (Lys) d 71.71 83.84 Histidin (His) d 28.89 22.59 Serin (Ser) e 68.80 58.49 Threonin (Thr) e 65.94 58.10 Tirosin (Tyr) c 73.98 60.58 Total 1122.72 1040.39 Keterangan: a Asam amino hidrofobik, b Asam amino muatan negatif, c Asam amino aromatik, d Asam amino muatan positif, e asam amino hidrofilik, tidak terdeteksi (tt) Note: a Hydrophobic  amino  acids, b Negatively  charged  amino  acids, c Aromatic  amino  acids, d Positively  charged  amino acids, e Hydrophilic amino acids, not detected (nd)
Aktivitas penghambatan ACE dari peptida dipe- ngaruhi  oleh  komposisi  asam  amino  penyusunnya (Paiva et al., 2017). Menurut Hernández-Ledesma et al. (2011),  peptida  yang  mengandung  residu  asam amino  Tyr,  Phe,  Trp,  dan  Pro  pada  terminal-C menunjukkan aktivitas penghambatan ACE. Adanya residu asam amino bermuatan positif seperti Lys dan Arg pada terminal-C, dan asam amino alifatik seperti Ile dan Val juga dapat berpotensi sebagai pengham- bat ACE. Selain itu, tiga asam amino hidrofobik pada terminal-C juga menentukan aktivitas penghambatan ACE  (Segura-Campos et  al., 2013).  Aluko et  al. (2015)  mengungkapkan  bahwa  peptida  yang  me- ngandung  residu  asam  amino  bermuatan  negatif diketahui  dapat  mengkelat  atom  seng  (Zn)  yang merupakan  kofaktor  ACE.  Pengikatan  atom Zn  oleh peptida  dapat  mengurangi  bioavailabilitas  Zn  yang menyebabkan penurunan aktivitas katalikik ACE. Bila ditinjau  dari  profil  asam  amino  (asam  amino  total) pada  penelitian  ini  (Tabel  3),  menunjukkan  bahwa keberadaan asam amino muatan negatif, positif dan hidrofobik dalam hidrolisat tepung tempe koro benguk dapat  berperan  sebagai  kontributor  untuk  aktivitas penghambatan ACE yang dihasilkan.

## KESIMPULAN
Kombinasi  fermentasi  dan  hidrolisis  enzimatik yang  dilanjutkan  dengan  pemisahan  menggunakan membran  UF  mampu  menghasilkan  peptida  peng-
hambat  ACE.  Kombinasi  fermentasi  kacang  koro benguk  selama  48 jam  dan  hidrolisis  dengan  enzim neutrase,  diikuti  dengan  pemisahan  menggunakan membran  ultrafiltrasi  MWCO  5  kDa  mampu  meng- hasilkan  peptida  bioaktif  sebagai  penghambat  ACE yang  lebih  aktif  yaitu  sebesar  62,96%.  Potensi  pep- tida  dari  tempe  koro  benguk  sebagai  penghambat ACE  disebabkan  oleh  adanya  residu  asam  amino bermuatan negatif seperti Asp dan Glu, positif seperti Arg dan Lys, dan hidrofobik seperti Val, Leu, Ala dan Ile yang terlihat dari profil asam amino total.

## DAFTAR PUSTAKA
Aguilar JGS, Cason VG, de Castro RJS. 2018. Impro- ving antioxidant activity of black bean protein by hydrolysis  with  protease  combinations.  Int  J Food  Sci  Technol  54:  34-41. https://doi.org/10. 1111/ijfs.13898
Al  Shukor  N,  Van  Camp  J,  Gonzales  GB,  Staljans- sens D, Struijs K, Zotti MJ, Raes K, Smagghe G. 2013. Angiotensin-converting enzyme inhibitory effects by plant phenolic compounds: A study of structure  activity  relationships.  J  Agric  Food Chem 61: 11832-11839. https://doi.org/10.1021/ jf404641v
Aluko RE. 2015. Antihypertensive peptides from food proteins.  Annu  Rev  Food  Sci  Technol  6:  235- 262. https://doi.org/10.1146/annurev-food-0228 14-015520
Aluko  RE,  Girgih  AT,  He  R,  Malomo  S,  Li  H,  Offen- genden M, Wu J. 2015. Structural and functional characterization of yellow field pea seed ( Pisum sativum L.)  protein-derived  antihypertensive peptides. Food Res Int 77: 10-16. https://doi.org/ 10.1016/j.foodres.2015.03.029
[AOAC]  Association  of  Official  Analytical  Chemists. 2012.  Official  methods  of  analysis  of  AOAC international. 19th Edition. Washington DC (US): AOAC International.
Aydemir  LY,  Yemenicioglu  A.  2013.  Are  protein- bound phenolic antioxidants in phenolic unseen part of iceberg?. J Plant Biochem Physiol 1: 1-4. https://doi.org/10.4172/2329-9029.1000118
Chalamaiah M, Jyothirmayi T, Diwan PV, Dinesh KB. 2015. Antioxidant activity and functional proper- ties  of  enzymatic  protein  hydrolysates  from common  carp  ( Cyprinus  carpio )  roe  (egg).  J Food Sci Technol 52: 5817-5825. https://doi.org/
10.1007/s13197-015-1714-6
Chel-Guerrero  L,  Galicia-Martínez  S,  Acevedo- Fernández  JJ,  Santaolalla-Tapia  J,  Betancur- Ancona D. 2017. Evaluation of hypotensive and antihypertensive effects of velvet bean (Mucuna pruriens  L.)  Hydrolysates.  J  Med  Food  20:  37- 45. https://doi.org/10.1089/jmf.2016.0080
Chen  H-J,  Dai F-J,  Chen  C-Y,  Fan S-L,  Zheng  J-H, Huang Y-C, Chau C-F, Lin Y-S, Chen C-S. 2021. Evaluating the antioxidants, whitening and anti- aging  properties  of  rice  protein  hydrolysates. Molecules 26: 1-16. https://doi.org/10.3390/mole cules26123605
Ciau-Solís  NA,  Acevedo-Fernández  JJ,  Betancur- Acona D. 2018. In vitro renin-angiotensin system inhibition and in vivo antihypertensive activity of peptide  fractions  from  Lima  bean  ( Phaseolus lunatus L.). J Sci Food Agric 98: 781-786. https:// doi.org/10.1002/jsfa.8543
Daliri EB-M, Lee BH, Kim J-H, Oh D-H. 2018. Novel angiotensin I-converting enzyme inhibitory pep- tides from soybean protein isolates fermented by Pediococcus pentosaceus SDL1409. LWT-Food Sci Technol 93: 88-93. https://doi.org/10.1016/j. lwt.2018.03.026
Ee K-Y, Khoo L-Y, Ng W-J, Wong F-C. 2019. Effects of  Bromelain  and  trypsin  hydrolysis  on  the phytochemical content,  antioxidant  activity,  and antibacterial  activity  of  roasted  butterfly  pea seeds. Processes 7: 1-13. https://doi.org/10.339 0/pr7080534
García-Moreno  PJ,  Espejo-Carpio  FJ,  Guadix  A, Guadix EM. 2015. Production and identification of angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibi- tory peptides from mediterranean fish discards. J Funct Foods 18: 95-105. https://doi.org/10.101 6/j.jff.2015.06.062
Girgih  AT,  Udenigwe  CC,  Aluko  RE.  2011.  In  vitro antioxidant  properties  of  hemp  seed  (Cannabis sativa L.) protein hydrolysate fractions. J Am Oil Chem Soc 88: 381-389. https://doi.org/10.1007/ s11746-010-1686-7
Guo  Y,  Pan  D,  Tanokura  M.  2009.  Optimisation  of hydrolysis  conditions  for  the  production  of  the angiotensin-I  converting  enzyme  (ACE)  inhibi- tory peptides from whey protein using response surface methodology. Food Chem 114: 328-333. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2008.09.041
He  Z,  Liu  G,  Qiao  Z,  Cao  Y,  Song  M.  2021.  Novel angiotensin-I converting enzyme inhibitory pep- tides  isolated  from  rice  wine  lees:  Purification, characterization,  and  structure-activity  relation- ship. Front Nutr 8: 1-12. https://doi.org/10.3389/ fnut.2021.746113
Hernández-Ledesma B, del Mar Contreras M, Recio I.  2011.  Antihypertensive  peptides:  Production, bioavailability and incorporation into foods.  Adv Colloid Interface  Sci  165:  23-35. https://doi.org/ 10.1016/j.cis.2010.11.001
Herrera-Chalé  FG,  Ruiz-Ruiz  JC,  Acevedo  Fernán- dez  JJ,  Betancur  Ancona  DA,  Segura-Campos MR. 2014. ACE inhibitory, hypotensive and anti- oxidant peptide fractions from Mucuna pruriens proteins.  Process  Biochem  49:  1691-1698. https://doi.org/10.1016/j.procbio.2014.06.021
Hong G-P, Min S-G, Jo Y-J. 2019. Anti-oxidative and anti-aging activities of porcine by-product colla- gen  hydrolysates  produced  by  commercial  pro- teases:  Effect  of  hydrolysis  and  ultrafiltration. Molecules  24:  1104. https://doi.org/10.3390/ molecules24061104
Iamsaard  S,  Arun  S,  Burawat  J,  Yannasithinon  S, Tongpan  S,  Bunsueb  S,  Lapyuneyong  N, Choowong-in P, Tangsrisakda N, Chaimontri C, Sukhorum  W.  2020.  Evaluation  of  antioxidant capacity  and  reproductive  toxicity  of  aqueous extract of Thai Mucuna pruriens seeds. J Integr Med  18:  265-273. https://doi.org/10.1016/j.joim. 2020.03.003
İçöz D, Sumnu G, Sahin S. 2007. Color and texture development  during  microwave  and  conventio- nal baking of breads. Int J Food Prop 7: 201-213. https://doi.org/10.1081/JFP-120025396
Jakubczyk  A,  Karaś  M,  Złotek  U,  Szymanowska  U. 2017.  Identification  of  potential  inhibitory  pep- tides of enzymes involved in the metabolic syn-
https://doi.org/10.6066/jtip.2022.33.2.157
drome  obtained  by  simulated  gastrointestinal digestion of fermented bean ( Phaseolus vulgaris L.) seeds. Food Res Int 100: 489-496. https://doi. org/10.1016/j.foodres.2017.07.046
Kavitha  K.  2018.  Evaluation  of  total  phenols,  total flavonoids, antioxidant, and anticancer activity of mucuna  pruriens  seed  extract.  Asian  J  Pharm Clin  Res  11:  242-246. https://doi.org/10.22159/ ajpcr.2018.v11i3.22999
[Kemenkes] Kementrian Kesehatan Republik Indonesia. 2019. Laporan Nasional RISKESDAS 2018.  Badan  Penelitian  dan  Pengembangan Kesehatan. Kementrian Kesehatan RI. Jakarta.
Ko S-C, Lee J-K, Byun H-G, Lee S-C, Jeon Y-J. 2012.
Purification  and  characterization  of  angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide from en- zymatic hydrolysates of Styela clava flesh tissue. Process  Biochem  47:  34-40. https://doi.org/10. 1016/j.procbio.2011.10.005
Koley TK, Maurya A, Tripathi A, Singh BK, Singh M, Bhutia TL, Tripathi  PC,  Singh  B.  2018. Antioxi- dant  potential  of  commonly  consumed  under- utilized leguminous vegetables. Int J Veg Sci 25: 362-372. https://doi.org/10.1080/19315260.201 8.1519866
Laemmli  U.  1970.  Cleavage  of  structural  proteins during  the  assembly  of  the  head  of  bacterio- phage  T4.  Nat  227:  680-685. https://doi.org/10. 1038/227680a0
Lee  SY,  Hur  SJ.  2019.  Purification  of  novel  angio- tensin  converting  enzyme  inhibitory  peptides from  beef  myofibrillar  proteins  and  analysis  of their  effect  in  spontaneously  hypertensive  rat model.  Biomed  Pharmacother  116:  1-7. https:// doi.org/10.1016/j.biopha.2019.109046
Lowry  OH,  Rosebrough  NJ,  Farr  AL,  Randall  RJ. 1951. Protein measurement with the folin phenol reagent.  J  Biol  Chem  193:  265-275. https://doi. org/10.1016/S0021-9258(19)52451-6
Mnif A, Mouelhi M, Hamrouni B. 2017. Understanding of phenolic compound retention mechanisms on PES-UF  membrane.  Turkish  J  Chem  41:  813- 825. https://doi.org/10.3906/kim-1611-64
Morais  HA,  Silvestre  MPC,  Silveira  JN,  Silva  ACS, Silva  VDM,  Silva  MR.  2013.  Action  of  a  pan- creatin  and  an Aspergillus  oryzae protease  on whey  proteins:  Correlation  among  the methods of  analysis  of  the  enzymatic  hydrolysates. Brazilian  Arch  Biol  Technol  56:  985-995. https: //doi.org/10.1590/S1516-89132013000600014
Mosquera M, Giménez B, Ramos S, López-Caballero ME,  del  Carmen Gómez-Guillén M,  Montero  P. 2015.  Antioxidant,  ACE-inhibitory,  and  anti- microbial activities of peptide fractions obtained
from dried giant squid tunics. J Aquat Food Prod Technol  25:  444-455. https://doi.org/10.1080/ 10498850.2013.819543
Mótyán  JA ,  Tóth  F,  Tőzsér  J.  2013.  Research applications of proteolytic enzymes in molecular biology.  Biomolecules  3:  923-942. https://doi. org/10.3390/biom3040923
Mujoo R, Trinh DT, Ng PKW. 2003. Characterization of storage proteins in different soybean varieties and  their  relationship  to  tofu  yield  and  texture. Food  Chem  82:  265-273. https://doi.org/10. 1016/S0308-8146(02)00547-2
Mulyani  L,  Kartadarma  E,  Fitrianingsih  SP.  2016. Manfaat  dan  kandungan  kacang  kara  benguk ( Mucuna pruriens L.) sebagai obat herbal. Prosi- ding Farmasi. Volume ke-2. 351 –357.
Paiva L, Lima E, Neto AI, Baptista J. 2017. Angioten- sin I-converting enzyme (ACE) inhibitory activity, antioxidant  properties,  phenolic  content  and amino  acid  profiles  of Fucus  spiralis L.  Protein hydrolysate fractions. Mar Drugs 15: 311. https:// doi.org/10.3390/md15100311
Pertiwi  MGP,  Marsono  Y,  Indrati  R.  2019. In  vitro gastrointestinal  simulation  of  tempe  prepared from  koro  kratok  ( Phaseolus  lunatus L.)  as  an angiotensin-converting enzyme inhibitor. J Food Sci  Technol  57:  1847-1855. https://doi.org/10.1 007/s13197-019-04219-1
Purwanti E, Prihanta W, Permana TI. 2019. Karakteri- sasi  kandungan  protein  berbagai  aksesi  koro lokal sebagai upaya penggalian sumber pangan fungsional. Proceeding Biol Educ Conf 16: 172- 175.
Puspitojati  E,  Cahyanto  MN,  Marsono  Y,  Indrati  R. 2019a.  Production  of  angiotensin-I-converting enzyme  (ACE)  inhibitory  peptides  during  the fermentation of jack bean ( Canavalia ensiformis ) tempe. Pakistan J Nutr 18: 464-470. https://doi. org/10.3923/pjn.2019.464.470
Puspitojati  E,  Indrati  R,  Cahyanto  MN,  Marsono  Y.
2019b. Formation of ACE-inhibitory peptides du- ring fermentation of jack bean tempe inoculated by usar  Hibiscus  tiliaceus leaves  starter.  IOP Conference  Series:  Earth  and  Environmental Science.  International  Conference  on  Food Science  and  Technology.  2019  Nov  28 –29. Semarang,  Indonesia. https://doi.org/10.1088/
1755-1315/292/1/012022
Rahayu NA, Cahyanto MN, Indrati R, Mada UG, No JF.  2019.  Pola  perubahan  protein  koro  benguk ( Mucuna  pruriens )  selama  fermentasi  tempe menggunakan  inokulum  raprima.  Agritech  39: 128-135. https://doi.org/10.22146/agritech.41736
https://doi.org/10.6066/jtip.2022.33.2.157
Ramakrishnan V, Ghaly AE, Brooks MS, Budge SM. 2013. Enzymatic extraction of amino acids from fish  waste  for  possible  use  as  a  substrate  for production of jadomycin. Enzym Eng 2: 1-9.
Rayaprolu  S,  Hettiarachchy  N,  Horax  R,  Satchitha- nandam  E,  Chen  P,  Mauromoustakos  A.  2015. Amino  acid  profiles  of  44  soybean  lines  and ACE ‑ I  inhibitory  activities  of  peptide  fractions from  selected  lines.  J  Am  Oil  Chem  Soc  92: 1023-1033. https://doi.org/10.1007/s11746-015-
2655-y
Rizkaprilisa W, Marsono Y, Indrati R. 2020. Bioactive peptide  tempe made from Mucuna  pruriens (L) DC  as  an  inhibitor  of  angiotensin-I-converting enzyme  (ACE)  in  a  digestion  simulation.  Prev Nutr Food Sci 25: 93-97. https://doi.org/10.3746/ pnf.2020.25.1.93
Sbroggio MF, Montilha MS, Ribeiro V, Figueiredo G De, Georgetti SR, Kurozawa LE. 2016. Influence of the degree of hydrolysis and type of enzyme on  antioxidant  activity  of  okara  protein  hydro- lysates. Food  Sci Technol  36:  375-381. https:// doi.org/10.1590/1678-457X.000216
Segura-Campos  MR,  Tovar-Benítez  T,  Chel- Guerrero L, Betancur-Ancona D. 2013. Functio- nal  and  bioactive  properties  of  Velvet  bean ( Mucuna  pruriens )  protein  hydrolysates  pro- duced  by  enzymatic  treatments.  J  Food  Meas Charact  8:  61-69. https://doi.org/10.1007/s1169 4-013-9165-0
Sharma R, Garg P, Kumar P, Bhatia SK, Kulshrestha S.  2020.  Microbial  fermentation  and  its  role  in quality  improvement  of  fermented  foods. Fermentation  6:  1-20. https://doi.org/10.3390/ fermentation6040106
Singh BP, Vij S, Hati S. 2014. Functional significance of  bioactive  peptides  derived  from  soybean. Peptides  54:  171-179. https://doi.org/10.1016/j. peptides.2014.01.022
Sitanggang  AB,  Lesmana  M,  Budijanto  S.  2020a. Membrane-based  preparative  methods  and bioactivities  mapping  of  tempe-based  peptides. Food Chem 329: 1-10. https://doi.org/10.1016/j. foodchem.2020.127193
Sitanggang  AB,  Putri  JE,  Palupi  NS,  Hatzakis  E, Syamsir E, Budijanto S. 2021a. Enzymatic pre- paration  of  bioactive  peptides  exhibiting  ace inhibitory activity from soybean and velvet bean: A systematic review. Molecules 26: 1-14. https:// doi.org/10.3390/molecules26133822
Sitanggang  AB,  Sinaga  WSL,  Wie  F,  Fernando  F, Krusong  W.  2020b.  Enhanced  antioxidant  acti- vity of okara through solid state fermentation of GRAS  fungi.  Food  Sci  Technol  40:  178-186. https://doi.org/10.1590/fst.37218
Sitanggang  AB,  Sumitra  J,  Budijanto  S.  2021b. Continuous production of tempe-based bioactive peptides  using  an  automated  enzymatic  mem- brane  reactor.  Innov  Food  Sci  Emerg  Technol 68: 1-10. https://doi.org/10.1016/j.ifset.2021.102 639
Sorriento  D,  De  Luca  N,  Trimarco  B,  Iaccarino  G. 2018.  The  antioxidant  therapy:  New  insights  in the treatment of hypertension. Front Physiol 9: 1- 11. https://doi.org/10.3389/fphys.2018.00258
Tuz  MAO,  Campos  MRS.  2017.  Purification  of Mucuna  pruriens (L)  peptide  fractions  and evaluation of their ACE inhibitory effect. Biocatal Agric Biotechnol 10: 390-395. https://doi.org/10. 1016/j.bcab.2017.05.001
Wan  Mohtar  WAAQI,  Hamid  AA,  Abd-Aziz  S, Muhamad  SKS,  Saari  N.  2014.  Preparation  of bioactive  peptides  with  high  angiotensin  con- verting  enzyme  inhibitory  activity  from  winged bean  [ Psophocarpus  tetragonolobus (L.)  DC] seed. J Food Sci Technol 51: 3658-3668. https:// doi.org/10.1007/s13197-012-0919-1
[WHO] World  Health  Organization.  2019.  Hyperten- sion.  https://www.who.int/news-room/fact-sheet s/detail/hypertension [03 September 2020].
Xu  X,  Qiao  Y,  Shi  B,  Dia  VP.  2021.  Alcalase  and bromelain  hydrolysis  affected  physicochemical and functional properties and biological activities of legume proteins. Food Struct 27: 1-10. https:// doi.org/10.1016/j.foostr.2021.100178
Yun  YR,  Park  SH.  2018.  Antioxidant  activities  of brown  teff  hydrolysates  produced  by  protease treatment.  J  Nutr  Heal  51:  599-606. https://doi. org/10.4163/jnh.2018.51.6.599
Zarei  M,  Abidin  NBZ,  Auwal  SM,  Chay  SY,  Haiyee ZA,  Sikin  AM,  Saari  N.  2019.  Angiotensin  con- verting enzyme (ACE) peptide interactions: Inhi- bition  kinetics,  in  silico  molecular  docking  and stability study of three novel peptides generated from palm kernel cake proteins. Biomolecules 9: 1-12. https://doi.org/10.3390/biom9100569
Zou T-B, He T-P, Li H-B, Tang H-W, Xia E-Q. 2016. The structure-activity relationship of  the antioxi- dant  peptides  from  natural  proteins.  Molecules 21: 1-14. https://doi.org/10.3390/molecules2101 0072