Penulis Tita Juwitaningsih 1* , Sri Adelia Sari 1 ,Iis Siti Jahro 1 , Neneng Windayani 2
Afiliasi
1 Department  of  Chemistry,  Faculty  of  Mathematics  and  Natural  Science,  Universitas  Negeri Medan, Medan, North Sumatera, Indonesia 20221
2 Department of Science Education, Faculty of Tarbiyah and Education, Sunan Gunung Djati State Islamic University, Bandung 40614, Indonesia.
Kata Kunci
 Secang,
 Caesalpinia sappan L
 Fitokimia
 antibakteri
Keywords  Secang,
 Caesalpinia sappan L
 phytochemical
 antibacterial
Diterima 11 Desember 2020
Direvisi 28 April 2021
Disetujui 7 Juni 2021
*Penulis Koresponding

## Tita Juwitaningsih
email: juwitaningsih@gmail.com

## ABSTRAK
Di  Sumatera  Utara  batang  tumbuhan  secang  ( Caesalpinia  Sappan L)  telah digunakan  dalam  pengobatan  tradisional.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  analisis fitokimia  ekstrak aseton batang C. sappan L dan mengetahui potensinya sebagai antibakteri. Uji fitokimia menggunakan metode spektroskopi 1 H-NMR. Uji aktivitas anti bakteri dilakukan terhadap terhadap enam bakteri patogen, meliputi uji difusi cakram  kertas,  penentuan minimum  inhibitory  concentration (MIC)  dengan metode mikrodilusi dan minimum bactericidal concentration (MBC). Berdasarkan data  spektroskopi 1 H-NMR,  ekstrak  batang  aseton  C.  Sappan  L  mengandung golongan    senyawa  flavanoid  dan  terpenoid  serta  memiliki  aktivitas  terhadap semua  bakteri  uji  dengan  zona  hambat  pada  kisaran  6,20  ±  0,53 – 10,93  ±  2,55 mm,  MIC  312 – 5000  µg  /  mL  dan  MBC  625->  5000  µg  /  mL.  Aktivitas  terbaik ditunjukkan oleh ekstrak aseton C. sappan terhadap S. aureus ATCC 25923 dengan MIC 312 µg / mL. C. sappan L merupakan sumber potensial senyawa antibakteri baru.

## ABSTRACT
In North Sumatra, the stem of the secang (Caesalpinia Sappan L) has been used in traditional medicine. This study aimed to conduct phytochemical analysis of the acetone  extract  of  C.  sappan  and  determine  its  antibacterial  potency. Phytochemical test using 1H-NMR spectroscopy method  andantibacterial activity were  carried  out  on  six  pathogenic  bacteria,  including  paper  disc  diffusion  tests, determination  of  the  minimum  inhibitory  concentration  (MIC)  using  the microdilution method,  and  minimum  bactericidal  concentration (MBC).  Based  on 1H-NMR  spectroscopic  data,  the  acetone  stem  extract  of  C.  Sappan  L  contains flavonoids  and  terpenoids  and  has  activity  against  all  tested  bacteria  with  an inhibition zone in the range of 6.20 ± 0.53 - 10.93 ± 2.55 mm, MIC 312 - 5000 µg / mL and MBC 625->  5000 µg / mL. The  acetone extract of C. sappan showed the best activity against S. aureus ATCC 25923 with a MIC of 312 µg / mL. C. sappan L is a potential source of new antibacterial compounds.
Analisis Fitokimia dan Aktivitas Antibakteri Ekstrak Aseton Secang ( Caesalpinia sappan L )
Phytochemical analysis and Antibacterial Activity of Acetone Extract of Secang (Caesalpinia sappan L)

## PENDAHULUAN
Kemajuan  dalam  bidang  pengobatan  modern  yang semakin  pesat  ternyata  tidak  menggeser  atau mengesampingkan  pengobatan  tradisional,  hal  ini terbukti dari banyaknya sistem pengobatan tradisional yang  berkembang  di  berbagai  negara  termasuk Indonesia  yang  sebagian  penduduknya  bergantung pada  sistem  pengobatan  tradisional.  Sehingga  di Indonesia  berkembang  obat  herbal  dalam  bentuk “jamu”.  Salah  satu  alasan penggunaan  obat obat yang berasal  dari  bahan  alam  seperti  jamu  karena  ada kehatiran atau menghindari efek samping [1] . Di  Indonesia Caesalpinia  sappan L  dikenal  dengan
nama secang yang termasuk dalam famili Caesalpiniaceae .    Di  Asia,  secang  sering  digunakan untuk  pengobatan  tradisional,  khususnya  untuk mengobati  tumor  dan  kanker.  Di  Indonesia,  kayu secang  digunakan  sebagai  minuman  kesehatan  untuk mengurangi  penyakit  antara  lain:  batuk  darah  (TBC), diare,  disentri,  penawar  racun,,  pengobatan  setelah melahirkan, katarak, maag, radang sendi, masuk  angin dan  kelelahan [2] Di  Thailand  kayu  secang  dapat digunakan  sebagai  pewarna  makanan,  pakaian,  dan kosmetik [3] .
Beberapa  peneliti  telah  melaporkan  berbagai aktivitas  biologis  dari  berbagai  bagian  tanaman  C. Sappan  L  yaitu  sebagai  antioksidan [4,5] ,  antikanker [6,7]
anti-implantasi [8] ,  hipoglikemik [9] ,  hepatoprotektif [10] . Antibakteri [11,12,  13,14] .  Penelitian  sebelumnya  tentang aktivitas antibakteri yang telah dilakukakan antara lain ekstrak etanol C. sappan memiliki aktivitas antimikroba pada  beberapa  jenis  mikroba  dengan  zona  hambat antara  14-34  mm  yaitu  terhadap Pseudomanas aeruginosa (34  mm), Staphylococcus  aureus (31  mm), Salmoenlla  typhi (24  mm), Enterobacter  aerogens (21 mm), Candida  albicans (20  mm), Escherichia  coli (15 mm)  dan Aspergillus  niger (14  mm) [11] .  Begitu  juga ekstrak metanol dan air C.sappan mempunyai aktivitas terhadap  bakteri  gram-  positif  diantaranya  S.  aureus. NCIM 5021, B. subtilis NCIM 2010, strain gram negative diantaranya  K.  pneumonia  NCIM  2707,  E.  coli  NCIM 2118dan P.vulgaris NCIM 2027dengan MIC mulai 0,14- 0,82 mg / ml dan 0,22-0,86 mg / ml [12] .
Ekstrak  Fraksi  etil  asetat  dan  metanol C.sappan dengan  konsentrasi  100  mg/mL,  200  mg/mL  mg/mL dan  300  mg/mL  mempunyai  aktivitas  antibakteri terhadap S. Aureus , Streptococcus pyogenes , E. coli , P. aeruginosa mempunyai aktivitas pada kisaran 11.2±0.11 mm -17.6±0.12mm [14]
Aktivitas  biologis  suatu  tumbuhan  dikarenakan kandungan metabolitnya. Kandungan metabolit
sekunder  dipengaruhi  oleh  factor  internal  dan eksternal.  Faktor  eksternal  terdiri  dari  factor  biotik (stress  akibat  bakteri,  fungi,  virus  dan  parasite)  dan 69bioti 69biotic (perbedaan geografi,ketinggian tempat tumbuh,  perubahan  iklim,  jenis  dan  kondisi  tanah, ketersediaan  air,  kandungan  mineral  dan  stress  akibat temperature, radiasi dan senyawa kimia [15] . Artikel ini melaporkan  analisis  kandungan  golongan  metabolit sekunder  ekstrak  aseton C.sappan yang  berasal  dari Sumatera  Utara  dengan  menggunakan  metode spektroskopi 1 H-NMR  serta  potensinya  sebagai antibakteri terhadap bakteri ATTC

## METODE Bahan
Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  terdiri dari: Sampel kering batang C. sappan L yang diperoleh dari  toko  obat  herbal  CV.Sempurna  Medan,  aseton teknis,  Mueller-Hinton  Agar  (MHA)  (Oxoid,  England). Mueller-Hinton Broth (MHB) (Himedia, Mumbai India), dimethylsulfoxide  (DMSO)  pa  (Sigma  Aldrich,St  Louis, Amerika Serikat), NaCl 0,9%, kultur bakteri
Propionibacterium  acne ATCC  27853, Staphylococcus saprophyticus ATCC  49907, S.  aureus ATCC  25923, Bacillus  cereus ATCC  1178, Salmonella  enterica ATCC 14028, Escherichia coli ATCC 25922.

## A. Pembuatan Ekstrak
Dua  ratus  gram  sampel  kering  batang C.  sappan L dimaserasi dengan aseton selama 3 x 24 jam, kemudian diuapkan  menggunakan  rotary  evaporator  hingga diperoleh ekstrak pekat.

## B. AnalisisFitokimia
Ekstrak  aseton  dinalisis  fitokimianya  dengan menggunakan  metode  spektroskopi  proton  NMR. Pengukuran 1 H-NMR  dilakukan  dengan  spectrometer Agilent DD2 yang dioperasikan pada 500 MHz.

## C. Uji aktivitas antibakteri
(i) Persiapan Larutan uji
Larutan uji disiapkan pada konsentrasi 1% . Larutan uji  dibuat  dengan  cara    menimbang  100  mg  ekstrak kemudian  dilarutkan  dalam  100%  DMSO  selanjutnya diencerkan  10x  sehingga  diperoleh  larutan  1%  dalam 10%  DMSO.  Bila  sampel  tidak  larut  dalam  10%  DMSO maka  pengenceran  dilakukan  dengan  100%  DMSO. Larutan standar antibiotik kloramfenikol dibuat dengan konsentrasi 500 μg / mL dalam 100% DMSO.
(ii) Uji Aktivitas Antibakteri
Uji  aktivitas  antibakteri  dilakukan  secara  in  vitro dengan tahapan sebagai berikut:
a. Persiapan inokulum
Metode pertumbuhan digunakan untuk mempersiapkan  inokulum,  dengan  cara  mengambil beberapa koloni bakteri kemudian dilarutkan ke dalam 4-5  mL  NaCl  0,9%.    Kekeruhan  inoculum  distandarkan terhadap kekeruhan 0,5 Mc. Farland.
b. Penentuan Zona Hambat
Metode  difusi  cakram  kertas  (CLSI-M02-A11) [16] digunakan sebagai uji pendahuluan aktivitas antibakteri.    Pada  permukaan  media  agar-agar dituangkan  100  µL  inokulum  bakteri,  kemudian disapukan  sampai  rata.  Cakram  kertas  ditempatkan pada  permukaan  agar,  kemudian  diteteskan  20  µL larutan uji dan sebagai antibiotik standar menggunakan cakram kertas kloramfenikol. Plat agar diinkubasi pada suhu  37 o C  selama  16-18  jam.  Adanya  zona  bening  di sekitar  cakram  kertas  menandakan  terhambatnya pertumbuhan bakteri.
c. Penentuan Minimum  inhibitory  Concentration ( MIC )
Penentuan MIC dilakukan dengan Metode
Microdilution  (CLSI-M07-A9) [17] ,  dengan  memasukkan 100  µL  media  cair  MHB,  bakteri  dan  sampel  ke  dalam microplate 96- well . Kolom pertama merupakan Kontrol
negatif  hanya  diisi  MHB  saja  dan  kontrol  positif ditempatkan  pada  kolom  no  2  yaitu  berisi  MHB  dan bakteri. Sampel dengan berbagai konsentrasi dan MHB yang tersuspensi bakeri ditempatkan pada Kolom no 3 sampai 12. Jumlah larutan di setiap lubang adalah 100 µL.  Microplate  diinkubasi  pada  suhu  37 o C  selama  24 jam. Sebagai antibiotik standar digunakan kloramfenikol.
d. Penentuan Minimum Bactericidal Concentration ( MBC )
Penentuan  MBC  mengikuti  prosedur  seperti  pada penelitian sebelumnya [18] , dengan cara mengambil  10 µL dari setiap lubang microplate, kemudian ditumbuhkan  di  atas  media  agar  dan  diinkubasi  pada suhu  37 o C  selama  24  jam  atau  sampai  terlihat pertumbuhan pada kontrol positif.

## HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Analisis Fitokimia
Khasiat suatu tanaman bergantung pada kandungan metabolit  sekundernya.  Analisis  fitokimia  dapat dilakukan  dengan  metode  spektroskopi  NMR  dengan menganalisis sinyal pergeseran kimia. Berdasarkan data hasil  pengukuran 1 H-NMR  ( Gambar 1)  dengan  pelarut CD 3 OD  menunjukkan  adanya  sinyal  pergeseran  kimia pada rentang δ H 0,87 – 7,72 ppm .
Gambar 1. Data 1H- NMR ekstrak aseton C. sappan L pada δH 0,87 – 7,72 ppm
Sinyal δ H -  6,3  -  7,7  ppm  yang  merupakan  sinyal senyawa  aromatik  turunan  benzena,  Sinyal  tersebut merupakan  sinyal  gugus  CH  dari  cincin  benzen.  Sinyal pada  pergeseran  kimiawi  δ H 4.  -  4.46  ppm  (gambar  3) adalah  sinyal  dari  gugus  oksimetin  (CH 2 -O).  Dengan demikian  senyawa  aromatik    tersebut  mengarah  pada senyawa  flavonoid.  Flavanoid  yang  telah  diisolasi  dari C.sappan L  dari  India  adalah  Brazilin,  Brazilein,  3,8,9- Trihidroksi-6-benzokroman-6-on,  Sappanon  B,  3- Deoksisappanon B, Protosappanin A, Protosappanin B , Protosappanin  C,  (e)  -3-  (3,4-Dihidroksibenziliden)  -7- hidroksikroman-4-on,  Safancalkon,  Butein [1] . C.  sappan dari  Cina  mengandung  plavanoid,  3'-deoksi-4-O- metilsappanol, 3'-O-metilbrazilin, Isoprotosappanin [19] .
Sinyal  pada  δ H 0,87 – 2,33  ppm  ( Gambar 2) merupakan sinyal dari gugus CH 3 dan CH 2 . Sedangkan δ H 2,52 – 3.03  ppm  sinyal  dari  gugus  metal  olifenik, yakni  metal  yang  terikat  pada  karbon  ikatan  rangkap
(C=C).  Sinyal  sinyal  tersebut  merujuk  ke  senyawa terpenoid  karena  Senyawa  terpenoid  memiliki  banyak gugus  CH 3 dan  CH 2 .  Senyawa  terpenoid  yang  telah dilaporkan  adalah  panginoksi  A  dan  panginin  A.  yang merupakan senyawa diterpenoid. [20]

## Hasil Uji Aktivitas Antibakteri
Uji aktivitas antibakteri dilakukan secara in vitro. Uji pendahuluan  antibakteri  menggunakan  metoda  difusi cakram  kertas,  keberadaan  potensi  antibakteri ditunjukkan  dengan  adanya  zona  bening  di  sekitar cakram  kertas,  seperti  terlihat  pada  gambar  di  bawah ini ( Gambar 3).
Hasil pengujian menunjukkan bahwa ekstrak aseton C.sappan L  memiliki  aktivitas  antibakteri  terhadap tujuh  bakteri  uji.  Data  diameter  zona  hambat dirangkum pada Tabel 1 .
Gambar 2. Data 1 H-NMR ekstrak aseton C. sappan L pada δ H 0,87 - 3,03 ppm
Tabel 1.
Data Zona hambat ekstrak aseton C.sappan L No Diameter of inhibition zones (mm) Gram-positive bacteria chloramphenicol C.sappan L 1 B.cereus ATCC 1178 26.33±0.91 10.37 ± 0.83 2 S. aureus ATCC 25923 33.80 ± 0.40 8.10 ± 0.20 3 P. acne ATCC (27853) 21.53 ± 1.12 8.63 ± 1.53 4 S. saprophyticus ATCC 49907 20.60±1.8 9.47 ± 0.31 Gram-negative bacteria 5 S. enteric ATCC 14028 30.00 ± 2.25 10.93 ± 2.55 6 E coli ATCC 25922 22,4  ±  0,34 6.2± 0.53
Ekstrak  aseton C.sappan L  memiliki  aktivitas terhadap  semua  bakteri  uji  dengan  diameter  zona hambat  antara  6.20  ±  0.53 – 10,93  mm.  Berdasarkan kriteria  diameter  zona  hambat,    aktivitas  antibakteri sangat  kuat  jika  zona  hambat  ≥ 20  mm,  kuat  jika diameter zona hambat 10-20 mm dan sedang jika zona hambat  5-10  mm [21] .  Bila  menggunakan  kriteria tersebut,  ekstrak  aseton C.  sappan L  menunjukkan aktivitas antibakteri dengan kategori sedang. Hasil yang diperoleh sedikit berbeda dengan penelitian sebelumnya  yang  dilakukan  oleh  Srinivasan  R [22] , dimana  hasil  penelitian  tersebut  menunjukkan  ekstrak etanol C.  sappan memiliki  aktivitas  antibakteri terhadap  Staphylococcus  aureus  (31  mm),  Escherichia
coli  (15  mm).  Perbedaan  hasil  ini  disebabkan perbedaan  pelarut  pengekstraksi  yang  digunakan, sehingga komposisi metabolit sekunder yang terekstraksi  berbeda,  begitu  juga  lingkungan  tempat tumbuh  akan  mempengaruhi  kandungan  metabolit sekunder tumbuhan tersebut. [23]
Senyawa  antibakteri  bekerja  dengan  dua  cara  yaitu dengan menghambat pertumbuhan bakteri (bakteriostatik)  yang  diukur  dengan MIC dan  dengan membunuh  bakteri  (bakterisidal)  yang  diukur  dengan MBC .  Hasil pengukuran MIC dan MBC dirangkum pada table 2.
Bila nilai  MIC  kurang  dari  100  μg  /  mL, ekstrak dikategorikan  aktif,  dan  bila  nilai  MIC  berkisar  antara
Gambar 3. Zona bening ekstrak aseton C.sappan L (kode Cs : ekstrak yang berwarna merah)
Tabel 2.
Nilai MIC and MBC ekstrak aseton C.sappan L Gram-positive bacteria C.sappan L chloramphenicol MIC (  g/mL) MBC (  g/mL) MIC (  g/mL)  MBC (  g/mL) B.cereus ATCC 1178 625 1250 0,48 1,95 S. aureus ATCC 25923 312,5 >5000 0,48 7,8 P. acne ATCC (27853) 625 >5000 31,5 0,49 S. saprophyticus ATCC 49907 625 625 0,48 56,3 Gram-negative bacteria S. enterica ATCC 14028 625 1250 0,48 7,8 C.freundi ATCC 8090 625 625 1,9 62,5 E coli ATCC 25922 5000 5000 0,97 31,3
100 <MIC <625 μg / mL aktivitas penghambatan ekstrak sedang dan  tidak  aktif  bila  nilai  MIC>  625 μg / mL. [24] Aktivitas penghambatan yang kuat ditunjukkan dengan ekstrak  aseton C.sappan L  terhadap S.  aureus ATCC 25923  dengan  MIC  312.5  (  g/mL),  dengan  kata  lain ekstrak  aseton C.sappan L    bersifat  bakteriostatik terhadap S.  aureus ATCC  25923.  Kemampuan membunuh  terbaik  ekstrak  acetone C.sappan L ditunjukkan  terhadap  bakteri S.saprophyticus ATCC 49907 dan C. freundi ATCC 8090 dengan MBC 625. (  g / mL)
Sifat  bakteriostatik  dan  bakterisidal  berkaitan dengan  cara  kerja  atau  interaksi  metabolit  sekunder dan  bakteri.  Senyawa  flavonoid  menyebabkan kerusakan permeabilitas dinding sel bakteri [25]. Adapun mekanisme  kerja  antibakteri  dari  senyawa  terpenoid menyebabkan kerusakan membrane, Hal ini disebabkan karena senyawa terpenoid dapat berinterkasi dengan porin pada membrane luar dinding sel  bakteri  dengan  membentuk  ikatan  polimer  yang kuat  sehingga  merusak  porin  dan  mengurangi permeabilitas  dinding  sel  bakteri. [26] Akibatnya  sel bakteri  kekurangan  nutrisi  dan  pertumbuhannya  akan terhambat atau mati.

## SIMPULAN
Ekstrak  aseton C.  sappan mengandung  senyawa terpenoid dan senyawa flavonoid dan memiliki aktivitas anti bakteri dengan spektrum luas. C. sappan potensial sebagai sumber senyawa antibakteri
DAFTAR PUSTAKA [1]  Nirmal,  N.P.,  Rajput,  M.S.,  Prasad,  R.G.S.V.,  &
Ahmad, M, (2015), Brazilin from Caesalpiniasappan heartwood and its pharmacological  activities:  A  review. Asian  Pacific
Journal  of  Tropical  Medicine ,  8(6):421 – 430.  DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.apjtm.2015.05.014.
[2]  Badami, S., MoorkothdanB.Suresh., (2004), Caesalpiniasappan a medicinal anf  dye yelding plant, Natural Product Radiace , 3(2):75-84.
[3]  Wetwitayaklung  P,  Phaechamud  T,  Keokitichai  S., (2005),  The  antioxidant  activity  of Caesa lpiniasappan L.  heartwood  in  various  ages, Naresuan Uni J , 13(2):43-52.
[4]  Batubara,  I.,  Mitsunaga,  T.  &  Ohashi,  H.,  (2009), Screening  antiacne  potency  of  Indonesian medicinal  plants:  antibacterial,  lipase  inhibition, and  antioxidant  activities. Journal  of  Wood Science , 55(3):230 – 235. DOI:
http://dx.doi.org/10.1007/s10086-008-1021-1
[5]  Sasaki,  Y.,  T.  Hosokawa,  &  Nagai,  M.,  (2007),  In Vitro  Study for  Inhibition of  NO Production  about Constituents  of  Sappan  Lignum, Biological  & Pharmaceutical  Bulletin ,  30(1):1993 – 196.  DOI: http://dx.doi.org/10.1248/bpb.30.193
[6]  Bukke,  A.N.,  Fathima,  N.H.,  Babu  S.K.,  Shankar, P.C., (2018), In Vitro Studies Data on Anticancer of Caesalpiniasappan L, Heartwood and Leaf Extracts on MCF7 And A549 Cell Lines , 19: 868-877.
[7]  Suyatmi,  F.,  Azzumar,  R.  N.  Pesik,  &  D.  Indarto,
(2019), Potential Anticancer Activity of
CaesalpiniaSappan  Linn.,  In  Silico  and  In  Vitro Studies. KnE Life Sciences , 4(12):96.
[8]  You, E.-J., Khil, L.-Y., Kwak, W.-J., Won, H.-S., Chae, S.-H.,  Lee,  B.-H.,  &  Moon,  C-K.,  (2005),  Effects  of brazilin  on  the  production  of  fructose-2,6- bisphosphate  in  rat  hepatocytes. Journal  of Ethnopharmacology ,  102(1):53 – 57.  DOI:  DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.jep.2005.05.020
[9]  Hu, C.M., Kang, J.J., Lee, C.C., Li, C.H., Liao, J.W., &
Cheng,  Y.W.,  (2002),  Induction  of  vasorelaxation through  activation  of  nitric  oxide  synthase  in endothelial  cells  by  brazilin. Eur  J  Pharmacol, 468(1):37-45.
[10] Srilakshmi, V.S, Vijayan, P., Raj, P.V, Dhanaraj, S.A., & Chandrashekhar, H.R., (2010), Hepatoptotective properties  of  Caesalpiniasappan  Linn.  Heartwood on  carbon  tetrachloride  induced  toxicity. Ind  J ExperBiol, 48(9):905-910.
[11]  Nilesh,  P.N.,  Mithun,  S.  R.,  Rangabhatla,  G.S.V.P., Mehraj,  A.,  (2015),  Brazilin  from  Caesalpinia sappan  Heartwood  and  Its  Pharmacological Activities:  A  review, Asian  Pacific  Journal  of Tropical Medicine , 8(6):421- 430.
[12] Mohan, G., S.P. Anand., & A. Doss., (2011), Efficacy of  Aqueous  and  Methanol  extracts  of  Caesalpinia sappan L. and Mimosa pudica L. for their potential Antimicrobial activity, South As.J.Biol. Sci , 1(2): 48-57.
[13] Srinivasan, R., Selvam G.G., Karthik, S.,
Mathivanan,  K.M.,  Baskaran,  R.,  Karthikeyan,  M., Gopi,  M.,  &  Govindasamy,  C.K.,  (2012),  In  Vitro Antimicrobial  Activity  of  Caesalpiniasappan  L. Asian Pac J Trop Biomed , 1(1): S136-S139.
[14]  Kaur,  H.,  Mohammad,  H.  A.,  Pranav,  K.  P., Amritpal,  S.,  Ashish,  S.,  (2016),  Phytochemical Screening and Antimicrobial Activity of Caesalpinia sappan L .  Leaves, International  Journal  of Pharmacognosy and Phytochemical Research, 8(6): 1064-1069.
[15] Verma,  N.,  &  Shukla  S.,  (2015),  Impact  of  various factors  responsible  for  fluctuation  in  plant secondary  metabolites. Journal  of  Applied
Research  on  Medicinal  and  Aromatic  Plants
Elsevier BV. Dec. 2(4):105 – 13. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.jarmap.2015.
[16]  Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)., (2012), Performance  Standards  for  Antimicrobial Disk  Susceptibility  Tests;  Approved  Standard — Eleventh  Edition  CLSI  document  M02-A11, Clinical and Laboratory Standards Institute, USA.
[17]  Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)., (2012), Methods  for  Dilution  Antimicrobial Susceptibility  Tests  for  Bacteria  That  Grow Aerobically;  Approved  Standard — Ninth  Edition CLSI  document  M07-A9 ,  Clinical  and  Laboratory Standards Institute, USA.
[18] Juwitaningsih, T., Jahro, I.S., Sari, S.A., & Rukayadi, Y. 2020. Antibacterial Activity of Various Medicinal Plants in North Sumatera Against Common Human Pathogens .  Research  Journal  of  Chemistry  and Environment , 24(1):99-105.
[19] Fu, L. C., Xin, A. H., Zhen, Y. L., Ying, J.H., Hong, J.L., Xiong,  L.  C.,  (2008),  A  New  3-Benzylchroman
Derivates from Sappan Lignum (Caesalpiniasappan ), Molecules , 13: 1923-1930.
[20] Xu,  Y.J.,  Jianbing,  Z.,  Chun,  P.T.,  dan  Yang,  Y., (2013),  A  New  Diterpenoids  from  the  Seeds  of
Caesalpiniasappan Linn .  Rec.  Nat.  Prod 7(2):  124- 128.
[21] Davis,  W.W.,  dan  Stout,  T.R.,  (1971),  Disc  Plate Method  of  Microbiological  Antibiotic  Assay, Applied Microbiology 22 (4): 659-665.
[22]  Srinivasan, R., Selvam G.G., Karthik, S.,
Mathivanan,  K.M.,  Baskaran,  R.,  Karthikeyan,  M., Gopi,  M.,  &  Govindasamy,  C.K.,  (2012),  In  Vitro Antimicrobial  Activity  of  Caesalpiniasappan  L. Asian Pac J Trop Biomed , 1(1): S136-S139.
[23]  Manish, P., Vijay, L., Dharam, C., & M.C. Nautiyal., (2016),  Antimicrobial  Potential  of  Acetone  and Methanol  extracts  of  Rhusparviflora  Roxb. Indian Journal of Forestry , 39(3):1-4.
[24]  Dzoyem,  J.P.,  N.  Kuete.,  A.H.L,  Kuete,  V.,  Tala, M.F., Wabo, H.K., Guru, S.K., Rajput, V.S., Sharma, A., Tane, P., Khan, I.A., Saxena, A.K., Laatsch, H., & Tan,  N.H.,  (2012),  Cytotoxity  and  Antimicrobial Activity  of  the  Methanol  Extract  and  Compounds from  Polygonum  limbatum. Planta  Med, 78:787 – 792.
[25] Cushnie,  T.P.Tim.  Lamb,  Andrew  J.  Amtimicrobial Activity  of  Flavonoids.  International  Journal  of Antimicrobial AgentsI. 2005;26: 343-356.
[26] Cowan, M.M., (1999), Plant Product as Antimicrobial  Agents. J.  Microbiology  Reviews. 12(4): 564582.