## PENAPISAN BAKTERIOSIN DARI BAKTERI ASAM LAKTAT ASAL BEKASAM

## SCREENING FOR BACTERIOCIN OF LACTIC ACID BACTERIA  FROM BEKASAM
Desniar 1* , Iman Rusmana 2 , Antonius Suwanto 2 , Nisa Rachmania Mubarik 2
1 Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor,
2 Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor
*Korespondensi: Jl. Agathis 1, Darmaga-Bogor, Indonesia 16680 E-mail : desniar2004@yahoo.com

## Abstract
Bacteriocin  is  proteinaceous  compound  that  has  bactericidal  action  against  other  microorganisms. Bacteriocin-producing lactic acid bacteria (LAB) is generally considered safe for human consumption and can be applied in food preservation. One source of indigenous LAB is from Indonesian fermented fish products, bekasam. This study aimed to obtain LAB isolates from bekasam that have high potential as  producer of bacteriocin. The steps were screening of bacteriocin compound and protein precipitation using ammonium sulfate with a concentration of 0-10% to 70-80%. Screening of bacteriocin compounds of 25 isolates LAB from bekasam showed that there were 11 isolates (44%) that have the potential as  producer of bacteriocin, in which the cell-free supernatant to pH 5 and or pH 6 produce inhibitory zones on the indicator bacteria Escherichia coli, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes. Then, the precipitation of proteins from the cell-free supernantant was done for the selected four isolates that have the potential as  producer of bacteriocin. The supernatant and the precipitate from yield of protein precipitation in the selected four isolates showed that inhibition zone against the indicator bacteria E. coli, S. typhimurium ATCC 14 028, and L. monocytogenes with inhibition zone around 3.0 to 10.0 mm. Inhibition zones in the supernatant and the precipitate were indication that  active compound is organic acid and bacteriocin, respectively. The highest inhibition zone of the supernatant and the precipitate of the BP(3) and SK(5) isolates against L. monocytogenes and S. typhimurium , respectively. The highest inhibition zone of the supernatant of the BP(20) and BI(3) isolates against S. typhimurium and S. typhimurium and E. coli , respectively. While the highest inhibition zone of precipitate of the BP(20) and BI(3) isolates were same, that is against E. coli . Each with ammonium sulfate concentrations were different.
Key words: Bacteriocin, lactic acid bacteria, bekasam

## Abstrak
Bakteriosin  merupakan  senyawa  protein  yang  memiliki  efek  bakterisida  terhadap  mikroorganisme  lain. Bakteriosin  dari  bakteri  asam  laktat  (BAL)  secara  umum  dianggap  aman  untuk  konsumsi  manusia  dan  dapat diaplikasikan dalam pengawetan makanan. Salah satu sumber BAL indigenous adalah dari produk fermentasi ikan Indonesia, bekasam. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan isolat BAL asal bekasam yang berpotensi tinggi sebagai penghasil bakteriosin. Tahapan yang dilakukan adalah penapisan senyawa bakteriosin dan pengendapan protein menggunakan amonium sulfat dengan konsentrasi 0-10% sampai 70-80%. Penapisan senyawa bakteriosin dari 25 isolat BAL asal bekasam menunjukkan bahwa  ada 11 isolat (44%) yang berpotensi sebagai penghasil bakteriosin, dimana supernatan bebas sel dengan pH 5 dan atau pH 6 menghasilkan zona hambat pada bakteri indikator Escherichia coli, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus dan Listeria monocytogenes . Kemudian dilakukan pengendapan protein terhadap supernantan bebas sel  dari empat isolat terpilih. Supernatan dan endapan dari hasil pengendapan protein pada keempat isolat terpilih menunjukkan zona hambat terhadap bakteri indikator E. coli, S. typhimurium ATCC 14028, dan L. monocytogenes dengan zona hambat sekitar 3,0-10,0 mm. Zona hambat pada supernatan dan endapan mengindikasikan bahwa senyawa aktifnya masing-masing ialah asam organik dan bakteriosin. Zona hambat tertinggi dari supernatan dan endapan pada isolat BP(3)  dan  SK(5)  masing-masing  terhadap L.  monocytogenes dan S.  typhimurium .  Zona  hambat  tertinggi  dari supernatan pada isolat BP(20) dan BI(3) masing-masing terhadap S. typhimurium dan S. typhimurium dan E. coli . Sedangkan zona hambat tertinggi dari endapan pada isolat BP(20) dan BI(3) sama, yaitu terhadap E. coli.  Masing- masing dengan konsentrasi amonium sulfat yang berbeda.
Kata kunci : bakteriosin, bakteri asam laktat, bekasam

## PENDAHULUAN
Bakteriosin  merupakan  senyawa  protein yang  memiliki  efek  bakterisida  terhadap mikroorganisme lain. Bakteriosin dari BAL atau BAL  yang    menghasilkan  bakteriosin  secara umum  dianggap  aman  untuk  konsumsi  manusia dan  dapat  diaplikasikan  dalam  pengawetan makanan. Penggunaan bakteriosin dalam industri makanan  dapat  membantu  untuk  mengurangi penambahan  pengawet  kimia  sama  seperti mengurangi intensitas perlakuan panas, dan pada akhirnya akan menghasilkan makanan yang lebih awet  secara  alami  dan  lebih  kaya  akan  sifat- sifat  organoleptik  dan  nutrisinya.  Keawetan  ini disebabkan BAL berkontribusi dalam menghambat pertumbuhan  bakteri  pembusuk  dan  patogen. Hambatan  ini  karena  BAL  dapat  memproduksi beberapa  metabolit  seperti  asam  organik  (asam laktat dan asetat), hidrogen peroksida, diasetil dan bakteriosin (Gálvez et al . 2007).
Bakteriosin secara komersial telah digunakan sebagai  biopreserfatif  dibeberapa  Negara  dan telah  diaplikasikan  pada  beberapa  makanan. Beberapa  galur  BAL  menghasilkan  bakteriosin yang  mempunyai  aktivitas  bakterisidal  terhadap bakteri Gram positif dan Gram negatif (Tahara et al .  1996).  Keuntungan  penggunaan  bakteriosin sebagai  biopreservatif    adalah:  (1)  tidak  toksik dan  mudah  didegradasi  oleh  enzim  proteolitik, karena  bakteriosin  adalah  senyawa  protein;  (2) tidak berbahaya terhadap mikroflora usus karena bakteriosin mudah dicerna oleh enzim pencernaan; (3)  mengurangi  penggunaan  preserfatif  kimia yang  tidak  aman;  (4)  penggunaannya  mudah disesuaikan;  dan  (5)  stabil  dengan  range  pH dan  suhu  yang  luas,  karena  bakteriosin  toleran terhadap  proses  pengolahan  yang  menggunakan asam dan basa sama seperti juga toleran terhadap panas dan dingin (Cleveland et al . 2001).
Bekasam  merupakan  produk  fermentasi  ikan Indonesia  yang  rasanya  asam,  banyak  dikenal di  daerah  Jawa  Tengah,  Sumatera  Selatan  dan Kalimantan  Selatan.  Proses  pembuatan  bekasam umumnya masih menggunakan proses fermentasi secara spontan dengan bahan baku ikan air tawar, garam  dan  sumber  karbohidrat  seperti  nasi  atau
tape  dengan  lama  fermentasi  sekitar  4-10  hari. Bekasam banyak mengandung BAL.
Menurut  Ostergaard et  al .  (1998)  BAL merupakan  mikroorganisme  dominan  yang ditemukan  dalam  produk  fermentasi  ikan, termasuk plaa-som (produk sejenis bekasam dari Thailand). Seperti yang dilaporkan oleh Paludan- Muller et  al .    (2002)  bahwa  telah  diisolasi BAL  dari  produk  fermentasi  ikan    plaa-som, yaitu Pediococcus  pentosaceus,  Lactabacillus alimentarius/farciminis,  Weisella  confusa,  L. plantarum dan Lactococcus garviae . Tanasupawat et al . (1998) juga melaporkan bahwa ada 47 galur BAL  homofermentatif  berbentuk  batang  dan  5 heterofermentatif bentuk bola yang diisolasi dari 4  jenis  fermentasi  ikan  (pla-ra,  pla-chom,  kung- chom  dan  hoi-dong).  Kopermsub et  al .  (2006) juga mengisolasi bakteri asam laktat dari produk plaa-som,  yaitu Lactobacillus spp., Pediococcus spp., Aerococcus spp., Cornobacterium spp. dan Enterococcus spp.
Beberapa  bakteri  yang  diisolasi  dari  produk fermentasi  ikan  ini  menghasilkan  bakteriosin bahkan  di  antaranya  termasuk  jenis  baru. Misalnya, Weissella  cibaria 110,  yang  diisolasi dari  produk  fermentasi  ikan  Thai  plaa-som ditemukan  menghasilkan  bakteriosin  yang  aktif terhadap bakteri Gram positif. Karena bakteriosin ini  tidak  ada  kesamaan  dengan  bakteriosin lain  yang  sudah  diketahui,  maka  bakteriosin ini  didefinisikan  sebagai  bakteriosin  baru, yaitu  weissellicin  110  (Sriounnual et  al .  2007). Staphylococcus homini KQU-131, yang diisolasi dari  produk  fermentasi  ikan  laut  Thai  (pla-ra), menghasilkan  suatu  bakteriosin  yang  stabil terhadap panas. Bakteriosin ini merupakan varian nukasin ISK-1, tipe II(A) lantibiotik, dan dikenal sebagai nukasin KQU-131 (Wilaipun et al . 2008). Satu  galur Lactobacillus  plantarum PMU33 yang  diisolasi  dari  produk  fermentasi  ikan  som- fak  menghasilkan  bakteriosin  yang  menghambat bakteri Gram positif, L. monocytogenes, B. cereus dan S.  aureus .  Bakteriosinnya  stabil  terhadap panas  pada  suhu  autoklaf  (121  °C  selama  15 menit)  dan  aktif  pada  kisaran  pH  luas  (2-10). Bakteriosin  ini  mempunyai  dua  peptida  yang mirip dengan plantaricin W (Plw, yaitu Plwα dan
Plwβ)  (Noonpakdee et al . 2009). Berdasarkan hal ini  maka  ada  kemungkinan  untuk  mendapatkan BAL penghasil bakteriosin asal bekasam.
Menurut  Usmiati  dan  Marwati  (2009) bakteriosin sebagai biopreserfatif sangat potensial untuk    mengontrol  bakteri  pada  makanan  dan produk  makanan,  akan  tetapi  secara  komersial kurang dan mahal. Indonesia mempunyai banyak koleksi BAL yang dapat digunakan sebagai bahan untuk produksi bakteriosin. Akan tetapi, penelitian produksi  bakteriosin  masih  kurang,  karena  itu penelitian ini butuh untuk dilakukan.
Tujuan penelitian ini ialah untuk mendapatkan isolate BAL asal bekasam yang berpotensi tinggi sebagai penghasil bakteriosin.

## MATERIAL DAN METODE

## Bahan dan Alat
Isolat  BAL  yang  digunakan  adalah  isolat BAL yang diisolasi dari 8 sampel bekasam yang berasal dari 4 lokasi pengambilan sampel. Bakteri indikator yang digunakan untuk pengujian aktivitas antimikrob meliputi E. coli, S. typhimurium ATCC 14028, B. cereus, S. aureus dan L. monocytogenes. Media yang digunakan untuk analisis mikrobiologi dan  pertumbuhan  BAL  serta  untuk  uji  aktivitas adalah    Nutrient  Agar  (NA),  de  Man  Rogosa Sharpe  Agar  (MRSA),  de  Man  Rogosa  Sharpe Broth  (MRSB),  Mueller  hinton  agar  (MHA). Bahan kimia yang digunakan untuk pengendapan protein  adalah  amonium  sulfat,  Na 2 HPO 4 dan NaH 2 PO 4 .
Alat-alat  penelitian  meliputi  inkubator,  clean bench,  vortex  mixer,  magnetik  stirrer,  sentrifus, jarum  inokulasi,  pipet  tetes,  bunsen,  pH  meter, autoklaf,  pengaduk, bulb, alumunium foil, cawan petri, tabung reaks, dan erlenmeyer.

## Lingkup Penelitian

## Penapisan senyawa bakteriosin
Isolat disegarkan dari gliserol ke MRSA miring, kemudian  diinkubasi  selama  48  jam.  Kultur  di media MRSA miring diinokulasikan 1 ose kedalam MRSB  10  mL,  kemudian  diinkubasi  selama  18 jam dengan kondisi mikroaerofilik, pada suhu 37 °C. Kemudian 1% (v/v) inokulum diinokulasikan
ke media MRSB 15 ml. Kultur diinkubasi selama 24  jam  pada  suhu  37  °C.  Supernatan  bebas  sel diperoleh dengan cara mensentrifugasi kultur cair (10.000 rpm, 15 menit, 4 °C).
Supernatan  bebas  sel  kemudian  diberi  tiga perlakuan,  yaitu  tanpa  perubahan  pH,  diset pada  pH  5,  dan  pH  6  dengan  menambahkan NaOH  1N.  Kemudian  supernatan  tersebut  diuji aktivitas  penghambatan  pada  bakteri  indikator dengan  menggunakan  metode  difusi  sumur agar.  Bakteri  indikator  yang  digunakan  ialah E. coli , S. typhimurium ATCC  14028, B. cereus , S. aureus , dan L. monocytogenes .  Sebanyak 20 μL bakteri indikator dengan kepadatan sel 108 CFU/ mL  disuspensikan  dalam  20  mL  media  MHA, kemudian  dituang  kedalam  cawan  petri  steril, dibiarkan dingin dan membeku. Setelah membeku dibuat  sumur  dengan  diameter  5  mm.  Sebanyak 70  μL  supernatan  bebas  sel  yang  sudah  diberi perlakuan  diatas  dimasukkan  kedalam  sumur, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu  37 o C. Zona bening yang terbentuk kemudian diukur diameternya.  Zona  hambat  bakeriosin  adalah diameter zona bening dikurangi dengan diameter sumur.

## Pengendapan protein dengan amonium sulfat.
Isolat  disegarkan  dari  gliserol  ke  MRSA miring,  kemudian  diinkubasi  selama  48  jam. Kultur  di  media  MRSA  miring  diinokulasikan  1 ose kedalam MRSB 10 mL, kemudian diinkubasi selama  18  jam  dengan  kondisi  mikroaerofilik, pada  suhu  37 o C.  Inokulum  1%  dimasukkan dalam media produksi MRSB 100 mL, kemudian diinkubasi  dalam  shaker  inkubator  pada  suhu 37 °C, 150 rpm selama 24 jam. Kultur berumur 24  jam  disentrifuse  10000  rpm,  10  menit,  4  °C. Supernatan  yang  diperoleh  dipisahkan  dengan metode  salting  out  dengan  menambahkan amonium  sulfat.  Sebanyak  100  mL  filtrat  kultur diendapkan secara bertahap dengan menambahkan amonium  sulfat  mulai  dari  konsentrasi  (0-10%) sampai  konsentrasi  akhir  (70-80%)  pada  suhu  4 °C.  Penambahan  dilakukan  sedikit  demi  sedikit sambil  diaduk  dengan  menggunakan  pengaduk magnet  dengan  kecepatan  lambat.  Endapan protein  dipisahkan  dari  cairannya  menggunakan
sentrifugasi 10000 rpm, 15 menit, 4 °C. Endapan yang diperoleh dilarutkan dalam 0,1 M buffer fosfat pH 5,3 dengan volume ± 2 mL, kemudian masing- masing diuji aktivitas penghambatan pada bakteri indikator E. coli, S. typhimurium ATCC 14028, dan L.  monocytogenes menggunakan  metode  difusi sumur agar. Supernatan pengendapan juga diukur aktivitasnya.  Supernatan  dan  hasil  pengendapan diukur  kadar  proteinnya  menggunakan  metode Bradford.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Penapisan senyawa bakteriosin
Hasil  penapisan  senyawa  bakteriosin  dari  25 isolat BAL asal bekasam dengan kontrol negatif media  MRSB  dengan  pH  4,  5  dan  6  disajikan pada Tabel 1. Semua perlakuan dari 25 isolat yang dicobakan supernatan bebas sel tanpa dinetralkan menghasilkan  zona  hambat  kecuali  pada  isolat SK(19),  BI(1)  dan  PS(14)  tidak  menghasilkan zona hambat pada kelima bakteri uji.  Isolat SS(8) dan  SI(3)  hanya  menghambat  empat  bakteri  uji, sedangkan yang menghambat tiga bakteri uji ada 5 isolat (BI(2); BI(6), BI(15); BP(6) dan BP(7)) dan  dua  isolat,  yaitu  SS(10)  dan  BP(19)  hanya menghambat dua bakteri uji.
Kontrol  media  MRSB  dengan  pH  4 menghasilkaan zona hambat pada kelima bakteri uji sedangkan pada pH 5 dan 6 tidak menghasilkan zona  hambat,  hal  ini  menunjukkan  bahwa  asam laktat pada pH 5 dan 6 tidak bersifat antibakteri, sehingga apabila supernatan bebas sel yang diset pada pH 5 dan 6 menghasilkan zona hambat berarti hambatan tersebut dapat diduga bukan berasal dari asam  yang  dihasilkan,  akan  tetapi  oleh  senyawa antibakteri  lain  diantaranya  adalah  bakteriosin. Bakteriosin  biasanya  dihasilkan  dalam  substrat cair.  Alakomi et  al .  (2000)  menyatakan  bahwa sifat  antimikrob  asam  laktat  karena  rendahnya pH, 5mM (pH 4) asam laktat selalu menyebabkan permeabilisasi utama pada membran luar bakteri Escherichia  coli O157:H7, Pseudomonas aeruginosa ,  dan Salmonella  enterica serovar Typhimurium .
Hasil  penelitian  menunjukkan  ada  11  isolat (44%)  dari  25  isolat  yang  menunjukkan  zona hambat  pada  supernatan  bebas  sel  dengan  pH
5  dan  atau  6.  Sebelas  isolat  ini  diduga  sebagai penghasil bakteriosin. Setiap isolat menunjukkan penghambatan  spesifik  pada  bakteri  indikator tertentu. Papagiani et al . (2006) menyatakan bahwa batas sensitivitas dan respon yang linier terhadap bermacam-macam  tingkat  bakteriosin  sangat berbeda nyata diantara mikroorganisme indikator yang  berbeda.  Hasil  penelitian  menunjukkan dari  sembilan  mikroorganisme  indikator  yang digunakan,  hanya  dua  isolat  darinya,  yaitu  L. curvatus ATCC  51436  dan  P.  acidilactici ATCC 25740  yang  sensitif  terhadap  konsentrasi  nisin yang sangat rendah dan menghasilkan tipe respon yang  linier  baik  pada  metode  difusi  cawan  agar atau uji tubidimetri.
Pengendapan protein dengan amonium sulfat.
Pengendapan protein dilakukan dari supernantan  bebas  sel    yang  berasal  dari  empat isolat (BI(3), BP(3), BP(20), dan SK(5)) terpilih yang diduga berpotensi menghasilkan bakteriosin. Pengendapan  protein  menggunakan  amonium sulfat  dengan  pemekatan  secara  bertingkat  dari 0-10%  sampai  70-80%  terhadap  supernatan bebas  sel.  Pingitore et  al .  (2007)  menyatakan bahwa  karena  proteinnya  itu  alami,  bakteriosin dapat  dikonsentratkan  melalui  aplikasi  metoda salting-out,  dan  yang  paling  sering  digunakan adalah  amonium  sulfat.  Bakteriosin  biasanya dihasilkan dalam substrat cair. Hasil pengendapan bakteriosin  dari  keempat  isolat  dan  aktivitasnya terhadap bakteri indikator L. monocytogenes , S. typhimurium dan E. coli serta konsentrasi protein pada  supernatan  dan  endapan  disajikan  pada Gambar 1 dan Gambar 2.
Supernatan  hasil  pengendapan  pada  semua konsentrasi  amonium  sulfat  pada  keempat  isolat menunjukkan  penghambatan  terhadap  ketiga bakteri  indicator,  akan  tetapi  endapan  dari hasil  pengendapan  protein  dari  keempat  isolat menunjukkan adanya zona hambat yang berbeda terhadap ketiga bakteri indikator pada konsentrasi amonium yang berbeda.  Zona hambat supernatan tertinggi  pada isolat BI(3) sebesar 8 mm terhadap S. typhimurium dan E. coli yaitu masing-masing pada pemekatan 50-60% dan 20-30%, sedangkan zona  hambat  endapan  tertinggi  sebesar  10
Tabel 1
Aktivitas hambat senyawa antibakteri (mm) dari supernatan bebas sel yang tidak dinetralkan dan yang diset pada pH 5 dan 6 dari 25 isolat No. Isolat pH  kultur  18 jam Aktivitas hambat senyawa antibakteri (mm) L. monocytogenes S. typhimurium E. coli S. aur eus B. cer eus SBS SBS  pH 5 SBS  pH 6 SBS SBS  pH 5 SBS  pH 6 SBS SBS  pH 5 SBS  pH 6 SBS SBS  pH 5 SBS  pH 6 SBS
SBS  pH 5 SBS  pH 6 1 SS (8) 4,5 5 - - - - - 5 - - 5 - - 3 - - 2 BP(1) 4,5 3 - - 5 - - 4 - - 5 - - 3 - - 3 BP (8) 4,0 5 - - 5 - - 6 - - 5 - - 3 - - 4 SS  (10) 4,5 5 - - - - - 5 - - _ - - - - - 5 SK (5) 4,0 6 - - 7 5 - 6 - - 7 - - 4 - - 6 SK  (19) 4,5 - - - - - - _ - - _ - - - - - 7 NS (5) 4,0 6 - - 6 - - 6 - - 7 - - 5 - - 8 PS  (16) 4,0 5 - - 5 - - 4 - - 5 - - 4 - - 9 BI (2) 4,5 5 - - 5 - - 5 - - - - - - - - 10 BI (1) 4,5 - - - - - - _ - - - - - - - - 11 BP (10) 4,0 6 - - 5 - - 4 - - 5 - - 5 - - 12 BP(19) 4,5 - - - 4 3 3 4 - - - - - - - - 13 BP(20) 4,0 3 - - 3 5 5 4 - - 4 - - 3 - - 14 BI(6) 4,5 - - - 6 4 4 4 - - - - - 3 - - 15 BI(15) 4,5 3 - - 5 - - 4 - - - - - - - - 16 SS(8) 4,0 3 - - 4 - - 5 - - 5 - - 4 - - 17 BP(3) 4,0 2 - - 3 2 2 3 2 2 5 3 2 2 - - 18 BP(7) 4,0 5 - - 4 - - 4 2 - - 2 - - - - 19 SK(15) 4,0 6 - - 5 - - 7 2 3 7 2 3 7 2 - 20 SS(3) 4,0 5 - - 6 - - 6 2 2 6 2 2 6 - - 21 SS(5) 4,0 6 - - 6 - - 5 - - 5 3 2 6 - - 22 BP(6) 4,0 4 - - 2 3 - - - - 5 - - - - - 23 SI(3) 4,0 - - - 3 2 - 5 2 - 5 - - 4 - - 24 BI(3) 4,0 3 2 - 3 2 - 4 - - 6 - - 3 - - 25 PS(14) 4,5 - - - - - - - - - - - - - - - 26 K(4) 4 3 6 5 7 6 27 K(5) 5 - - - - - 28 K(6) 6 - - - - -
Keterangan: SBS = supernatan bebas sel, K(4), K(5) dan K(6) = kontrol negatif, media MRSB dengan pH 4, pH 5 dan pH 6
mm  terhadap E.coli pada  pemekatan  40-50% sampai 70-80%, zona hambat juga terdapat pada pemekatan  20-30%  dan  30-40%.  Zona  hambat terhadap L.  monocytogenes dan S.  typhimurium hanya  pada  pemekatan  30-40%  sebesar  5  mm (Gambar 1A).
Zona hambat supernatan tertinggi  pada isolat BP(3) sebesar 7 mm terhadap L. monocytogenes yaitu  masing-masing  pada  pemekatan  50-60% sampai 70-80%, sedangkan zona hambat endapan tertinggi sebesar 8 mm terhadap L. monocytogenes pada  pemekatan  0-10%,  zona  hambat  juga terdapat pada pemekatan 10-20% sampai 40-50% yang cenderung menurun. Zona hambat terhadap S.  typhimurium hanya  pada  pemekatan  0-10% sebesar 5 mm dan terhadap E.coli pada pemekatan 0-10% dan 10-20% yang masing-masing sebesar 5 mm dan 3 mm (Gambar 1B).
Zona hambat supernatan tertinggi  pada isolat BP(20)  sebesar  8  mm  terhadap S.  typhimurium yaitu  pada  pemekatan  60-70%,  sedangkan  zona hambat endapan tertinggi  sebesar 10 mm terhadap
E.coli pada  pemekatan  40-50%  sampai  70-80%, zona  hambat  juga  terdapat  pada  pemekatan  10- 20%  sampai  30-40%.  Zona    hambat  terhadap L.  monocytogenes hanya  pada  pemekatan  60- 70% dan 70-80%,  dan terhadap S. typhimurium meningkat  dari  pemekatan  20-30%  sampai 70-80%  dengan  zona  hambat  berkisar  5-9  mm (Gambar 1C).
Supernatan  hasil  pengendapan  pada  semua konsentrasi  amonium  sulfat  menunjukkan penghambatan  terhadap  ketiga  bakteri  indikator, hal  yang  sama  juga  terjadi  pada  isolat  SK(5), zona hambat tertinggi sebesar 9 mm terhadap S. typhimurium pada pemekatan 70-80%, sedangkan zona  hambat  endapan  tertinggi  sebesar  10  mm terhadap S.  typhimurium pada  pemekatan  30- 40% dan 60-70%, zona hambat juga terdapat pada pemekatan  50-60%  sebesar  8  mm,  sedangkan terhadap L.  monocytogenes dan E.  coli tidak menunjukkan  adanya  zona  hambat  pada  semua konsentrasi ammonium sulfat (Gambar 1D).
Supernatan  hasil  pengendapan  protein  secara
(1A) (1B)
(1C)
(1D)
Gambar 1   Aktivitas antibakteri dari  supernatan  dan endapan pada isolat BI(3) (1A), BP(3) (1B),
BP(20)  (1C)  dan  SK  (5)  (1D).  Keterangan:  LM  ( L.  monocytogenes ),  ST  ( S. typhimurium ), EC ( E.coli ), (S=supernatan hasil pengendapan, E=endapan).
Gambar 1  Aktivitas antibakteri dari supernatan dan endapan pada isolat BI(3) (1A), BP(3) (1B), BP(20) (1C) dan SK (5) (1D). Keterangan: LM ( L. monocytogenes ), ST ( S. typhimurium ), EC ( E.coli ), (S=supernatan hasil pengendapan, E=endapan).
bertingkat  dengan  amonium  sulfat  (konsentrasi 0-10%  sampai  70-80%)  pada  keempat  isolat yang  dicobakan  secara  umum  menunjukkan adanya  aktivitas  antibakteri  terhadap  ketiga bakteri  indikator  dengan  zona  hambat  4,0-9,0 mm, hal ini menunjukkan bahwa pada supernatan menghasilkan  senyawa  antibakteri  yang  bersifat asam atau berupa diasetil. Adanya asam organik menyebabkan  pH  menjadi  asam,  kemudian kombinasi pH rendah dan asam organik ini dapat membunuh bakteri pembusuk dan patogen. Asam organik  yang  biasanya  diasosiasikan  dengan bakteri  asam  laktat  adalah  asam  laktat,  asam propionat, dan asam asetat yang diproduksi dalam jumlah  yang  kecil. Asam  laktat  berperan  dalam proses  penghambatan  bakteri  lain.  Alakomi et al .  (2000)  menyatakan  bahwa  sifat  antimikrob asam  laktat  karena  rendahnya  pH,  5mM  (pH  4) asam  laktat  selalu  menyebabkan  permeabilisasi utama  pada  membran  luar  bakteri Escherichia coli O157:H7, Pseudomonas  aeruginosa ,  dan Salmonella enterica serovar Typhimurium .
Hasil  penelitian  secara  umum  menunjukkan bahwa S.  typhimurium dan E.  coli lebih  sensitif terhadap    senyawa  antibakteri  dari  supernatan yang  dihasilkan  oleh  isolat  BI(3),  BP(20)  dan SK(5), sedangkan L. monocytogenes lebih sensitif terhadap  isolat  BP(3).  Theron  dan  Lues  (2011) menyatakan  bahwa  setiap  bakteri  indikator memiliki ketahanan masing-masing terhadap jenis asam  organik  yang  berbeda. L.  monocytogenes memiliki  kerentanan  yang  lebih  besar  terhadap asam laktat dibandingkan dengan asam asetat. E. coli dan S. typhimurium emiliki kerentanan yang tinggi terhadap asam laktat dan asam asetat.  Cheng et al . (2003) juga melaporkan bahwa asam laktat lebih  lethal  daripada  asam  asetat  untuk E.  coli O157:H7, sedangkan menurut Alvarez-Ordonez et al . (2009), S. typhimurium memiliki kemampuan bertahan hidup pada pH ekstrem, yaitu 3, namun kemampuan hidup pada pH ekstrem tersebut tidak menjadikan bakteri ini dapat hidup dengan normal ketika bereaksi dengan asam organik.
Theron  dan  Lues  (2011)  menyatakan  bahwa asam terdisosiasi menjadi ion hidrogen dan anion toksik yang mampu mengganggu fungsi fisiologis sel  dan  mendestabilasi  protein  sel.  Pelaez  dan
Orue  (2010)  menyatakan  bahwa  asam  laktat mampu melemahkan permeabilitas bakteri Gram negatif  dengan  merusak  membran  luar  bakteri Gram  negatif.  Asam  laktat  merupakan  molekul yang larut dalam air sehingga mampu menembus ke dalam periplasma bakteri Gram negatif melalui protein  porin  pada  membran  luarnya.  Pelindung dari  permeabilitas  membran  luar  berupa  lapisan lipopolisakarida  yang  terletak  pada  permukaan membran  dirusak  oleh  asam  laktat  sehingga substrat  antibakteri  yang  lain  yaitu  diasetil, bakteriosin, hidrogen peroksida dan lactoperidase system  dapat  berpenetrasi  ke  dalam  membran sitoplasma.
Endapan  hasil  pengendapan  protein  secara bertingkat  dengan  amonium  sulfat  (konsentrasi 0-10% sampai 70-80%) pada keempat isolat yang dicobakan  secara  umum  menunjukkan  adanya aktivitas antibakteri yang berbeda terhadap ketiga bakteri  indikator  dengan  zona  hambat  berkisar antara 3,0-10,0 mm, hal ini menunjukkan bahwa pada endapan menghasilkan senyawa antibakteri dari senyawa protein dan diduga adalah bakteriosin. Adanya perbedaan penghambatan terhadap ketiga bakteri indikator pada setiap konsentrasi amonium sulfat  menunjukkan  senyawa  protein  aktif  yang juga berbeda.
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa S. typhimurium lebih  sensitif  terhadap  senyawa antibakteri dari endapan yang dihasilkan oleh isolat SK(5); E. coli lebih sensitif terhadap isolat BI(3) dan  BP(20),  sedangkan L.  monocytogenes lebih sensitif  terhadap  isolat  BP(3).  Masing-masing dengan konsentrasi amonium yang berbeda.
Pengendapan dengan penambahan garam netral adalah  metode  yang    paling  umum  digunakan untuk  fraksionasi  protein  dengan  pengendapan. Protein  yang  diendapkan  tidak  didenaturasi  dan aktivitasnya diambil kembali dengan melarutkan kembali  pelet  hasil  sentrifugasi.  Penambahan garam  ini  dapat  menstabilkan  protein  terhadap denaturasi,  proteolisis  atau  kontaminasi  bakteri. Salting  out  tergantung  pada  hidrofobik  alami permukaan  protein.  Kelompok  hidrofobik    lebih banyak  pada  interior  protein  tetapi  beberapa berlokasi  pada  permukaan,  seringnya  di  bagian
patches.  Patches  hidrofobik  pada  satu  molekul protein  dapat  berinteraksi  dengan  yang  lain. Protein  dengan  patches  hidrofobik  yang lebih  besar  akan  berkumpul  dan  mengendap sebelum  patches  yang  lebih  kecil,  menghasilkan fraksinasi.  Agregat  (kumpulan)  yang  terbentuk adalah  campuran  dari  beberapa  protein  dan  ini akan  mempengaruhi  konsentrasi  garam  yang dibutuhkan  untuk  mengendapkan  protein  yang diinginkan  (Harris  2001).  Bagian  hidrofobik  di dalam  molekul  bakteriosin  merupakan  hal  yang diperlukan untuk aktivitasnya dalam menghambat bakteri sensitif karena inaktivasi mikroorganisme oleh  bakteriosin  tergantung  pada  interaksi hidrofobik antara sel-sel bakteri dengan molekul- molekul bakteriosin (Parada et al . 2007).
Konsentrasi  protein  pada  endapan  dari  isolat BI(3)  jauh  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan supernatan,  dengan  konsentrasi  protein  pada endapan  sebesar  0,014-0,735  g/L  dan  pada supernatan sebesar 0,051-0,191 g/L (Gambar 2A), hal  yang  sama  juga  terjadi  pada  isolat  BP(20) dengan konsentrasi protein endapan sebesar 0,023- 0,870  g/L  sedangkan  pada  supernatan  sebesar
0,107-0,159  g/L  (Gambar  2C).  Konsentrasi protein  dari  endapan  isolat  BP(3)  dan  SK(5) lebih  kecil  dibandingkan  dengan  isolat  BI(3) dan BP(20), yaitu masing-masing sebesar 0,045- 0,363 g/L (Gambar 2B) dan sebesar 0,021-0,376 g/L  (Gambar  2D)  sedangkan  pada  supernatan masing-masing sebesar  0,055-0,104 g/L (Gambar 2B) dan sebesar  0,048-0,117 g/L (Gambar 2D), hal ini menunjukkan  bahwa aktivitas antibakteri pada endapan berupa protein atau dengan kata lain adalah  bakteriosin.  Supernatan  yang  konsentrasi proteinnya lebih rendah juga menghasilkan zona hambat yang relatif tinggi pada semua konsentrasi, hal  ini  dapat  diduga  bahwa  aktivitas  antibakteri pada supernatan disebabkan oleh adanya senyawa asam organik yang menyebabkan pH supernantan cenderung  asam  yaitu  sekitar  pH  4.  Gálvez et al . (2007) menyatakan BAL dapat memproduksi beberapa senyawa antimikrob seperti asam organik (asam  laktat  dan  asetat),  hidrogen  peroksida, diasetil dan bakteriosin.  Bakteriosin merupakan antimikrob  peptida  yang  disintesis  oleh  ribosom dan  dapat  membunuh  bakteri  yang  berhubungan erat dengan penghasil  bakteriosin.
(2A)
(2B)
(2C) (2D)
Gambar 2  Konsentrasi protein dari supernatan (    ) dan endapan (    ) pada isolat  BI(3) (2A), BP(3) (2B), BP(20) (2C), dan SK (5) (2D). Gambar 2  Konsentrasi protein dari supernatan ( ) dan endapan ( ) pada isolat  BI(3) (2A), BP(3) (2B), BP(20) (2C), dan SK (5) (2D).

## KESIMPULAN
Penapisan  senyawa  bakteriosin  dari  25  isolat BAL  asal  bekasam  menunjukkan  bahwa    ada 11  isolat  (44%)  yang  diduga  berpotensi  sebagai penghasil  bakteriosin,  dapat  menghambat pertumbuhan  bakteri  indikator Escherichia  coli , Salmonella  typhimurium ATCC  14028, Bacillus cereus,  Staphylococcus  aureus dan Listeria monocytogenes .  Setiap  isolat  menunjukkan penghambatan  spesifik  pada  bakteri  indikator tertentu.  Supernatan  dan  endapan  dari  hasil pengendapan  protein  secara  bertingkat  dengan amonium  sulfat  (konsentrasi  0-10%  sampai  70- 80%) pada keempat isolat (BI(3), BP(3), BP(20) dan SK(5)) terpilih menunjukkan adanya aktivitas antibakteri  terhadap  bakteri  indikator E.  coli,  S. typhimurium ATCC 14028, dan L. monocytogenes dengan zona hambat sekitar 3,0 - 10,0 mm. Adanya zona  hambat  pada  supernatan  diduga  senyawa aktifnya  adalah  asam  organic,  sedangkan  pada endapan  senyawa  aktifnya  adalah  protein  yang diduga  sebagai  bakteriosin.  Senyawa  antibakteri yang  dihasilkan  oleh  isolat  BP(3)  lebih  sensitif terhadap L.  monocytogenes ,  sedangkan  senyawa antibakteri  yang  dihasilkan  oleh  isolat  BI(3), BP(20)  dan  SK(5)  secara  umum  lebih  sensitif terhadap S. typhimurium dan atau E. coli.

## DAFTAR PUSTAKA
Alvarez-Ordonez A, Fernandez A, Bernardo A, Lopez M. 2009. Comparison of acids on the induction of an acid tolerance response in Salmonella typhimurium , consequences for food safety. Journal Meat Science 81(1): 65-70.
Alakomi  HL,  Skytta  E,  Saarela  M,  Mattila-Sandhol T,  Latva-Kala  K,  Helander  IM.  2000.  Lactic  acid permeabilizes gram negative bacteria by disrupting the  outer  membrane. Applied  and  Environmental Microbiology 66(5):2001-2005. Cheng,  HY,  Ye  RC,  Chou  CC.  2003.  Increased  acid tolerance  of Escherichia  coli O157:H7  by  acid adaptation  time  and  conditions  of  acid  challenge. Food Research International 36:49-56. Cleveland  J,  Montville  TJ,  Nes  IF,  Chikindas  ML. 2001. Bacteriocins: safe, natural antimicrobials for food preservation [Review]. International Journal of Food Microbiology 71:1-20 Gálvez  A,  Abriouel  H,  López  RL,  Omar  NB. 2007.  Bacteriocin-based  strategies  for  food biopreservation. International  Journal  of  Food
Microbiology 120:51-70.
Harris  ELV.  2001.  Concentration  of  the  extract.  Di dalam: Roe S. (Ed). Protein Purification Techniques . Second  Edition.  New  York:  Oxford    Universiy Press. Hlm 135-139.
Kopermsub  P,  Vichitphan  S,  Yunchalard    S.    2006. Lactic  acid  bacteria  isolated  from  Plaa-som,  a Thai  fermented  fish  product. Thailand  Journal Biotechnology 7(1):32-39. Noonpakdee W, Jumriangrit P, Wittayakom K, Zendo J. 2009. Two-peptide bacteriocin from Lactobacillus plantarum PMU 33 strain isolated from som-fak, a Thai low salt fermented fish product. Asia Pasific Journal of  Molecular Biology and  Biotechnology 17(1):19-25.
Ostergaard  A,  Ben  E,  Mbarek  PK,  Yamprayoon  J, Wedel-Neergaard  C,  Huss  HH,  Gram  L.    1998. Fermentation and spoilage of som-fak a Thai low- salt fish product. Tropical  Science 38:105-112. Parada JL, Caron CR, Medeiros ABP, Soccol CR. 2007. Bacteriocin from lactic acid bacteria: purification, properties  and  use  as  biopreservatives. Brazilian Archives  of    Biology  and  Technology 50(3):521-
542.
Pelaez SM, Orue SM. 2010. Feeding strategies for the control  of Salmonella in  pigs. Food  Science  and Technology Bulletin 5(1):39-47. Pingitore  EV,  Salvucci  E,  Sesma  F,  Nader-Macias ME.  2007. Different strategies for purification of antimicrobial  peptides  from  lactic  acid  bacteria (LAB).    Dalam:  Vilas  AM  (Ed.) Communicating Current  Research  and  Educational  Topics  and Trend in Apllied Microbiology . Hlm 557-568. Papagianni  M, Avramidis  N,  Filioussis  G,  Dasiou  D, Ambrosiadis I. 2006. Determination of bacteriocin activity  with  bioassays  carried  out  on  solid  and liquid  substrates:  assessing  the  factor  “indicator microorganism”. Microbial Cell Factories 5:1-14. Paludan-Muller C, Madsen M , Sophanodora P, Gram L, Møller PL. 2002. Fermentation and microf lora of plaa-som, a Thai fermented fish product prepared with  different  salt  concentrations. International Journal of Food Microbiology 73:61-70. Srionnual  S,  Yanagida  F,  Lin  LH,  Hsiao  KN,  Chen Y.  2007.  Weissellicin  110,  a  newly  discovered bacteriocin  from Weissella  cibaria 110,  isolated from  Plaa-Som,  a  fermented  fish  product  from Thailand. Applied and Environmental Microbiology 73(7):2247-2250. Theron MM, Lues JFR. 2011. Organic Acids and Food Preservation. United states: CRC Press. Hlm: 273. Tanasupawat  S,  Okada  S,  Komagata  K.  1998.  Lactic acid bacteria found in fermented fish in Thailand. Journal  of  General  and  Applied  Microbiology 44:193-200.
Tahara  T,  Oshimura  M,  Umezawa  C,  Kanatani K.  1996.  Isolation,  parsial  characterization, and  mode  of  action  of  acidocin  J1132  a  two-
compound  bacteriocin  produce  by Lactobacillus acidophilus JCM 1132. Applied and Environmental
Microbiology 62:892-897. Usmiati  S,  Marwati  T.    2009.  Selection  and optimization process of bacteriocin production from
Lactobacillus sp. Indonesian Journal of Agriculture
2(2): 82-92.
Wilaipun P, Zendo T, Okuda K, Nakayama J, Sonomoto K.  2008.  Identification  of  the  nukacin  KQU-
131  a  new  type-A(III)  lantibiotic  produced  by Staphylococcus  homini KQU-131  isolated  from Thai  fermented  fish  product  (Pla-ra). Bioscience Biothecnology and Biochemistry 72(8):2232-2235