## HIDROLISIS Eucheuma cottonii DENGAN ENZIM K-KARAGENASE DALAM MENGHASILKAN GULA REDUKSI UNTUK PRODUKSI BIOETANOL

## HIDROLISYS OF Eucheuma cottonii BY K-CARRAGENASSE IN PRODUCE REDUCING SUGAR TO PRODUCTION OF BIOETHANOL
Mustika Zelvi 1)* , Ani Suryani 2) , dan Dwi Setyaningsih 2)
Departemen Teknologi Industri Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Kampus IPB Darmaga, Jl. Raya Dramaga, Bogor, Indonesia
E-mail:m4zelv1@gmail.com
Makalah: Diterima 27 Juli 2016; Diperbaiki 12 Juni 2017; Disetujui 20 Juni 2017

## ABSTRACT
Bioethanol is one of the renewable resources derived from sugar fermentation process of carbohydrate substance  with  microorganismaid.  Hydrolysis  is  the  stage  to  get  the  simple  sugar  and  is  done  with  using  k- carragenasethat is obtained from the isolation result of marine microbe in E.cottonii’s habitat. The objectives of this  research  were  to  gain  time  hydrolysis  to  produce  the  enzyme  activity  and  reducing  sugar  highs  by  k- karagenase and to determine the best of the substrate concentration and k-carragenasein producing a reduction sugar and the highest ethanol. The research steps was started from isolate rejuvenation of IH22 microbe, enzyme production  of  crudeextraction  k-carragenase  and  80%  acetone  precipitation,  determination  of  the  hydrolysis timeand activity of k-carragenase. The next step was the substrate hydrolysis with amounts of 6%, 9%, and 12% (b/v) solids, by enzyme from acetone concentrations of 0%, 2.5%, and 5% (v/v) and then they were fermented for six days with the S.cereviseaeadapted yeast extract. Thek-carragenasse highest enzyme activity was obtained in incubation for 30-60 minutes while the highest reduction sugar was obtained inhydrolysis time for 120 minutes. During  the  hydrolysis,12%  substrate  concentration  generated  the  highest  reduction  sugar  and  whole  sugar  of 3.21% and 9.89%, respectively, while 9% substrate with 5% enzyme treatment contained1.49% reduction sugar and  2.75%  whole  sugar,  which  was  the  best  substrate  in  producing  ethanol  during  fermentation  process  of 1.23% (v/v) and 0.82% (b/v) with 55.78% substrate efficiency and 70.44% fermentation efficieny.
Keywords : bioethanol, Eucheuma cottonii, k-carragenasse, S.cerevisiae

## ABSTRAK
Bioetanol merupakan salah satu sumber bahan bakar terbarukan  yang diperoleh dari proses fermentasi gula  dari  bahan  berkarbohidrat  dengan  bantuan  mikroorganisme.  Hidrolisis  adalah  tahapan  untuk  mendapatkan gula  sederhana  dari  rumput  laut  dengan  menggunakan  enzim k -karagenase  yang  diperoleh  dari  hasil  isolasi mikroba laut pada habitat Eucheuma cottonii. Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan  waktu hidrolisis dalam  menghasilkan  aktivitas  enzim  dan  gula  reduksi  tertinggi  oleh k -karagenase  dan  menentukan  konsentrasi substrat  dan  enzim  terbaik  dalam  menghasilkan  gula  reduksi  dan  etanol  tertinggi.  Tahapan  penelitian  dimulai dari peremajaan isolatIH22, produksi enzim k -karagenase ekstrak kasar dan pengendapan aseton 80%, penentuan waktu  hidrolisis  dan  aktivitas  enzim  karagenase.  Selanjutnya  proses  hidrolisis  substrat E.cottonii dengan  total padatan  6%,  9%,  dan  12%  (b/v)  dengan  enzim  padakonsentrasi  0%,  2,5%,  dan  5%  (v/v),  yangkemudian difermentasi  selama  6  hari  dengan  bantuan  khamirteradaptasi S.cereviseae .  Aktivitas  enzim k -karagenase tertinggi diperoleh pada waktu inkubasi 30-60 menitdan gula reduksi tertinggi diperoleh setelah inkubasi selama 120 menit. Selama proses hidrolisis, konsentrasi substrat 12% menghasilkan gula reduksi dan total gula tertinggi sebesar  3,21%  dan  9,89%,sedangkan  substrat  9%  dengan  perlakuan  enzim  5%  yang  mengandung  gula  reduksi 1,49%  dan  total  gula  2,75%,  merupakan  substrat  terbaik  dalam  menghasilkan  etanol  selama  proses  fermentasi, yaitu 1,23% (v/v) dan 0,82% (b/v) dengan efisiensi substrat55,78% dan efisiensi fermentasi 70,44%.
Kata kunci: bioetanol , Eucheuma cottonii, k- karagenase ,S.cerevisiae

## PENDAHULUAN
Salah  satu  sumber  bahan  bakar  terbarukan dan  ramah  lingkungan  yang  sangat  prospektif  saat ini  adalah  bioetanol.  Penggunaan  bioetanol  sangat dibutuhkan  untuk  10  tahun  kedepan,  dimana berdasarkan  peraturan  Kementrian  Energi  dan Sumber Daya Mineral No.32 tahun 2008, pada tahun 2008  hingga  2010  etanol  harus  mensubstitusi
premium sebanyak 3% untuk transportasi, meningkat  menjadi  10%  pada  tahun  2010  dan  akan meningkat  15%  di  tahun  2025  (Sutarto,  2009). Bioetanol  diperoleh  dari  proses  fermentasi  gula bahan-bahan  berkarbohidrat  menggunakan  bantuan mikroorganisme.
Bioetanol  dapat  dibuat  dari  bahan  baku tanaman  yang  kaya  akan  pati,  serat  dan  gula.  Salah satu  bahan  yang  potensial  yaitu  rumput  laut.Jenis
ISSN 0216-3160    EISSN 2252-3901 Terakreditasi DIKTI No 56/DIKTI/Kep/2012
rumput  laut  yang  paling  banyak  digunakan  adalah Eucheuma  cottonii karena  jenis  rumput  laut  ini banyak  tumbuh  di  perairan  Indonesia  dengan kepadatan  populasi  yang  tinggi.  Pada  rumput  laut terdapat karbohidrat karagenan yang dapat digunakan  sebagai  bahan  baku  etanol  (Banati et  al,. 2009). Kappaphycus  sp atau  lebih  dikenal  dengan Eucheuma  cottonii adalah  salah  satu  rumput  laut yang  menghasilkan  ekstrak  karagenan  yang  tinggi, dimana  menurut  Istini et  al .  (1986),  kandungan karagenan pada rumput laut E.cottonii adalah sebesar 65,75%.
Proses  pembuatan  etanol  dengan  bahan berselulosa  memerlukan  beberapa  tahapan  sebelum menghasilkan  etanol,  salah  satu  tahapnya  adalah hidrolisis. Proses hidrolisis dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan gula sederhana dan mempermudah  kerja  dalam  proses  fermentasi. Proses  hidrolisis  karagenan  yang  merupkan  polimer galaktosa  terdapat  dalam Eucheuma  cottonii dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu secara kimiawi dan enzimatik.  Menurut  Riyanti  (2008)  efisiensi  proses hidrolisis  dengan  menggunakan  asam  masih  rendah serta  penanganan  limbah  asam  yang  tidak  mudah. Kelemahan  lainnya  adalah  menghasilkan  senyawa toksik  yang  dapat  menghambat  pertumbuhan mikroorganisme  pada  proses  fermentasi  nantinya. Sehingga  banyak  yang  beralih  menggunakan hidrolisis  enzimatik  dimana  selain  produk  yang dihasilkan aman, senyawa penghambat pertumbuhan mikroba tidak terbentuk.
Enzim k -karagenase  merupakan  enzim  yang memiliki  aktivitas  tinggi  dalam  menghidrolisis k - karagenan.  Enzim  yang  digunakan  adalah  enzim yang diproduksi dari hasil isolasi  mikroba laut pada habitat Eucheuma  cottonii dan  menghasilkan  isolat dengan  potensi  aktivitas  karagenase  yang  tinggi. Salah  satunya  yaitu  isolat  IH22.  Isolat  IH22  adalah isolat  mikroba  laut  yang  berhasil  diisolasi  oleh laboratorium  Surfactan  Bioenergy  Reserach  Center (SBRC),  LPPM  IPB,  dan  merupakan  isolat  terbaik dengan nilai aktivitas tertinggi sebesar 0,061 IU/mL, kadar  gula  reduksi  yang  dihasilkan  sebesar  0,117 mg/mL  dengan  kadar  etanol  yang  tertinggiyaitu 0,89%  (v/v)  dengan  waktu  inkubasi  10  jam  pada suhu  40°C.  Enzim  yang  dihasilkan  telah  dievaluasi aktivitasnya  dengan  cara  pemekatan  enzim  melalui pengendapan dengan aseton 80% (Meliawati, 2015). Khamir  yang  digunakan  untuk  fermentasi  etanol pada  penelitian  ini  adalah  khamir S.cerevisiae yang telah diadaptasi dalam media galaktosa yaitu IPBCC AL  IX,  dimana  kebanyakan S.cerevisiae yang digunakan memiliki kemampuan untuk memetabolisme  jenis  gula  tertentu  salah  satunya glukosa,  sehingga  perlu  dilakukan  adaptasi  khamir pada media yang sesuai.
Penggunaan dan pemanfaatan enzim karagenase  hasil  isolasi  dari  lingkungan  hidup rumput  laut  pada  hidrolisis  enzim k -karagenase
merupakan penelitian yang perlu dikembangkan lagi. Hal inilah yang melatarbelakangi penelitian hidrolisis  rumput  laut E.cottonii dengan  enzim k - karagenase  untuk  memproduksi  bioetanol  oleh S.cerevisiae .  Penelitian  ini  secara  umum  bertujuan untuk  menganalisis  konsentrasi  substrat E.cottonii dan  enzim k -karagenase  yang  terbaik  dalam menghasilkan  gula  reduksi  selama  proses  hidrolisis dengan kadar etanol tertinggi pada proses fermentasi. Sebelumnya dilakukan hidrolisis terhadap  enzim k -karagenase  untuk  menentukan waktu optimum enzim dalam menghasilkan aktivitas enzim dan gula reduksi yang tertinggi.

## BAHAN DAN METODE Bahan
Bahan-bahan  yang digunakan penelitian ini meliputi bakteri isolat IH22 dan khamir S.cerevisiae (IPBCC  AL  IX),  rumput  laut  ( Eucheuma  cottonii ), media  karagenan, kappa -karagenan,  CaCl 2 ,  KCl, MgSO 4 , K 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 , NaCl, pepton, galaktosa,ekstrak  khamir,  asam  dinitrolisilat  (DNS), asetat  pH-5,  fosfat  pH-6,  dan  aseton.  Alat-alat  yang digunakan dalam penelitian ini meliputi laminar / transfer  box ,  cawan  petri  steril,  labu erlenmeyer ,  tabung  reaksi,  inkubator,  sentrifus, vorteks,  autoklaf,  pipet  mikro,  timbangan  analitik, viskometer, refraktrometer dan alat densitometer.

## Metode Penelitian
Diagram  alir  penelitian  pada  kajian  ini disajikan pada Gambar 1.

## Peremajaan Isolat IH22
Peremajaan  bakteri  dilakukan  dengan menumbuhkan  isolat  IH22  pada  media  padat kappa - karagenan(media agar cawan). Isolat IH22 merupakan  mikroba  laut  yang  dikoleksi  oleh Laboratorium  Pusat  Studi  Surfaktan  dan  Bioenergi, LPPM  IPB  yang  diperoleh  dari  Perairan  Desa Lontar, Serang, Banten. Selanjutnya bakteri diinkubasi selama 2 hari pada suhu 35 o C.
Produksi  Enzim  k-Karagenase  (Enzim  Ekstrak Kasar)
Produksi  enzim k -karagenase  dilakukan dengan  cara  menginokulasi  isolat  IH22  yang  sudah diremajakan  sebanyak  satu  ose  ke  dalam  media startercair (galaktosa), selanjutnya diinkubasi selama 10  jam  dengan  suhu  35 o C  dengan  kecepatan  agitasi 100  rpm.  Sebanyak  50  mL  kultur  starter  kemudian dimasukkan  ke  dalam  450  mL  media  produksi k - karagenan.  Media  produksi  enzim  diinkubasi  pada waterbath dengan  suhu  40°C  dengan    kecepatan agitasi  100  rpm  selama  12  jam  (merupakan  waktu optimum  berdasarkan  hasil  gula  reduksi  tertinggi terhadap  aktivitas  enzim  tertinggi  pada  isolat  IH22) (Meliawati, 2015).
Gambar 1. Diagram alir penelitian
Langkah  selanjutnya,  media  produksi  yang mengandung  enzim  disentrifugasi  pada  kecepatan 2.500  rpm  dengan  suhu  4 o C  selama  15  menit  untuk memisahkan  larutan  enzim  dengan  endapan. Supernatan  hasil  sentrifugasi  kemudian  disimpan pada  suhu  10 o C  sebagai  enzim  ekstrak  kasar (Modifikasi dari Khambaty et al ., 2007). Supernatan yang  dihasilkan  dari  proses  sentrifugasi  enzim ekstrak kasardilakukan analisa kadar protein (metode Bradford)  untuk  memperoleh  aktivitas  spesifik enzim  dengan  cara  pembagian  nilai  aktivitas  enzim (IU/mL) dengan kadar proteinnya (mg/mL).
Kemudian  dilakukan  analisa  aktivitas enzim dengan cara mengambil sampel sebanyak 0,33 mL supernatan ditambah 0,67 mL substrat karagenan dalam  buffer  asetat  pH  5  dan  selanjutnya  diaduk menggunakan  vorteks  dan  diinkubasi  selama  30 menit pada suhu 50 o C. Sebanyak 1 mL sampel yang telah  diinkubasi  ditambah  dengan  3  mL  DNS (Miller, 1959), diaduk kembali dan dipanaskan pada air  yang  telah  mendidih  selama  15  menit. Selanjutnya  sampel  diukur  absorbansinya  pada panjang gelombang 540 nm dan dihitung kadar gula reduksinya.  Aktivitas  enzim  merupakan  jumlah enzim  yang  dibutuhkan  untuk  menghasilkan  1 mikromol  gula  reduksi  (D-galaktosa equivalent )
permenit.    Pengukuran  aktivitas  enzim  dimasukkan ke dalam rumus dibawah ini:
Aktivitas enzim (IU/mL) =
gula reduksi ( mg mL )×(volume enzim  +  volume substrat)

## BM galaktosa × waktu inkubasi × volume enzim
Keterangan: BM galaktosa = 0,18 mg/µmol Waktu inkubasi dalam menit Vol enzim dan vol substrat dalam mL
Pemekatan  Enzim  k-Karagenase  Ekstrak  Kasar dengan Metode Pengendapan Aseton 80%
Enzim  ekstrak  kasar  yang  diproduksi sebanyak  500  mL  dipekatkan  dengan  aseton  pada konsentrasi  80%  dimana  sebanyak  2  mL  enzim ekstrak  kasar  ditambahkan  dengan  pelarut  aseton  8 mL  dalam  tabung  reaksi.  Setelah  itu  campuran diaduk  dengan  vorteks  sampai  homogen  dan disimpan  semalaman  di  dalam  lemari  pendingin. Kemudian  dilakukan  pemisahan  dengan  sentrifus selama  15  menit  pada  suhu  4°C.  Enzim  yang mengendap  dipisahkan  dan  dilarutkan  kembali  ke dalam  0,05  M  bufer  fosfat  pH  6  sebanyak  200  µL. Sehingga  dari  500  mL  enzim  ekstrak  kasar  yang telah dipekatkan akan diperoleh konsnetrat enzim k -
karagenase  sebanyak  50  mL  untuk  satu  kali pembuatan  media  produksi k- karagenan.  Kemudian enzim  yang telah dimurnikan dilakukan uji aktivitas enzim  dengan  perhitungan  yang  sama  dengan pengujian  sebelumnya  dan  kadar  proteinnya  untuk mengetahui  aktivitas  spesifikasi  enzim  (Meliawati, 2015).

## Penentuan  Waktu  Hidrolisis  terhadap  Aktivitas Enzim dan Gula Reduksi Menggunakan Enzim k- Karagenase
Pengujian dilakukan pada enzim yang telah diendapkan  dengan  aseton.  Sebelumnya  dilakukan persiapan substrat k -karagenan sebanyak 0,25% (w/v) yang dilarutkan dalam bufer fosfat pH 6. Kemudian substrat k -karagenan  diambil  sebanyak  0,67  mL kemudian  ditambahkan  dengan  konsentrat  enzim k - karagenase  sebanyak  0,33  mL  dan  dihidrolisis  pada suhu  40°C,  dengan  waktu  pengamatan  dilakukan setiap 30 menit yang dimulai dari 0, 30, 60, 90, 120 dan  180  menit.  Selanjutnya  dilakukan  analisa terhadap  aktivitas  enzim  dan  gula  reduksi  pada  tiap interval 30 menit untuk memperoleh waktu inkubasi dan hidrolisis yang terbaik.

## Hidrolisis E.cottonii dengan Enzim k-Karagenase
Pada  tahap  ini,  substrat  yang  telah dihidrolisis  selama  30  menit,  dinetralkan  dengan kapur  tohor  hingga  pH  mencapai  5,5  kemudian dilanjutkan proses  hidrolisis  menggunakan enzim k - karagenase.  Hidrolisat  asamdengan  konsentrasi  6%, 9%  dan  12%  yang  telah  dingin  ditambahkan  enzim k- karagenase dengan konsentrasi 0%, 2,5% dan 5%. Hidrolisis enzimatik dilakukan dengan cara menginkubasi substrat E.cottonii selama 2 jam(waktu  hidrolisis  yang  terbaik  untuk  gula reduksi)  pada  suhu  40°C,  dimana  banyak  enzim yang ditambahkan dalam 100 mL bufer adalah 5 mL untuk  konsentrasi  2,5%  dan  10  mL  untuk konsentrasi  enzim  5%  dan  kemudian  sisanya ditambahkan dengan bufer fosfat pH 6 sehingga total volume  hidrolisat E.cottonii yang  digunakan  adalah 200 mL.  Kemudian hidrolisat dipanaskan pada suhu 90°C  selama  15  menit  yang  bertujuan  untuk menghentikan  reaksi  pada  hidrolisat  dan  masing- masing  substrat  diambil  sampelnya  untuk  dianalisa gula  reduksi  dan  total  gulanya  setelah  hidrolisis menggunakan enzim.

## Fermentasi
Substrat
yang telah dihidrolisis menggunakan enzim k -karagenase selanjutnya difermentasi,  yang  sebelumnya  dilakukan  persiapan inokulum S.cerevisiae IPBCC  AL  IX  yang  diambil sebanyak  2  ose  untuk  ditanam  dalam  10  mL  media YMGP  ( yeast  malt  galactose  pepton ),  dimana banyaknya  media  YMGP  yang  ditambahkan  pada hidrolisat  adalah  sebesar  10%  dari  total  volume hidrolisat  yaitu sebanyak 20 mL. Selanjutnya  media diinkubasi  pada  suhu  30 o C  selama  24  jam
(Yanagisawa et  al., 2011).  Proses  fermentasi dilakukan  pada  kondisi  anaerobik  pada  suhu  ruang 30ºC.  Substrat  yang  telah  dihidrolisis  ditambahkan dengan pupuk urea 0,5% dan NPK 0,06% dari °Brix gula  substrat  sebagai  sumber  nutrien  (Setyaningsih et  al .,  2012).  Proses  fermentasi  dilakukan  selama  6 hari.  Hidrolisat  yang  telah  difermentasi  diambil sampelnya untuk dilakukan analisa gula reduksi dan total  gula  setelah  fermentasi.  Selanjutnya  hidrolisat hasil  fermentasi  didistilasi,  kemudian  rendemen etanol  yang  diperoleh  diukur  dengan  bantuan  alat densitometer (%v/v).

## Pengolahan Data
Pengolahan data dilakukan untuk mengetahui pengaruh konsentrasi substrat dan enzim terhadap  proses  hidrolisis  dan  fermentasi  dilakukan uji  F  dengan  RAL  dua  faktor.  Faktor  pertama  yang mempengaruhi adalah konsentrasi substrat E.cottonii sebanyak  3  taraf    yaitu  6%  (S1),  9%  (S2)  dan  12% (S3). Faktor kedua konsentrasi enzim dengan 3 taraf yaitu  0%  (E1),  2,5%  (E2)  dan  5%(E3).  Percobaan dilakukan  sebanyak  2  kali  dengan  masing-masing pengukuran  diulang  sebanyak  2  kali.  Apabila  ada salah  satu  perlakuan  atau  interaksinya  berpengaruh nyata  maka  analisis  dilanjutkan  dengan  uji  Duncan (Gomez  dan  Gomez,  1995).  Parameter  yang  diuji diantaranya  gula  reduksi  dan  total  gula  selama proses  hidrolisis  dan  fermentasi,  kadar  etanol, efisiensi penggunaan substrat dan efisiensi fermentasi.Persamaan  model  rancangannya  sebagai berikut :
Y ikj = μ+ S i + E j + (SE) ij + ε( ij ) k

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Stabilitas Aktivitas Enzim k-Karagenase pada Berbagai Waktu Inkubasi
Pengukuran  aktivitas  enzim k -karagenase dilakukan  untuk  melihat  berapa  lama  enzim  dapat bekerja  secara  maksimal  pada  suhu  tertentu.  Satu unit  aktivitas  enzim  didefinisikan  sebagai  1 mikromol  galaktosa  (gula  reduksi)  yang  dihasilkan per  satuan  waktu  pada  kondisi  pengukuran  enzim, yang  dinyatakan  dalam  satuan  unit/mL  yang merupakan  mikromol  yang  dilepas  per  menit/mL enzim.
Pada  Gambar  2  terlihat  bahwa  aktivitas enzim  mengalami  peningkatan  di  menit  30  hingga menit  ke-60  yaitu  sebesar  0,007-0,01  IU/mL. Kemudian  aktivitas  enzim  menurun  di  menit  120 hingga  menit  ke-180,  dimana  pada  waktu  ini  enzim sudah  kurang  aktif  sehingga  tidak  menghasilkan kenaikan gula reduksi yang tinggi. Dapat disimpulkan  bahwa  aktivitas  enzim  yang  tinggi diperoleh  pada  awal  masa  inkubasi  yaitu  pada kisaran 30 hingga 60 menit.
Gambar  2.    Aktivitas  enzim k -karagenase  selama waktu inkubasi
Kadar  Gula  Reduksi  selama  Hidrolisis  oleh Enzim k-Karagenase
Enzim k -karagenase  diperoleh  dengan  cara mencampurkan  media  produksi  karagenase  dengan media  starter  isolat  IH22  dan  diinkubasi  selama  12 jam. Enzim ekstrak kasar yang dihasilkan disentrifugasi  untuk  memisahkan  supernatan  dan endapannya  ( crude )  yang  kemudian  dipekatkan dengan metode pengendapan aseton 80% (Meliawati,  2015).  Perlakuan  waktu  hidrolisis  yang diberikan  dimulai  dari  0  hingga  180  menit  dengan rentang  waktu  setengah  jam.  Tahapan  ini  bertujuan untuk  mendapatkan  waktu  hidrolisis  karagenan dalam menghasilkan gula reduksi yang tertinggi oleh enzim k -karagenase  seperti  yang  disajikan  pada Gambar 3.
Gambar 3. Gula reduksi k -karagenase selama proses hidrolisis
Gambar  3  menjelaskan  bahwa  gula  reduksi yang dihasilkan dari menit pertama hingga menit ke- 120  mengalami  peningkatan,  kemudian  pada  menit ke-150  menurun  hingga  menit  ke-180.  Enzim karagenase  menghasilkan  gula  reduksi  yang  tinggi pada  saat  mencapai  waktu  hidrolisis  2  jam  (120 menit).  Dimana  selain  suhu,  waktu  inkubasi merupakan salah satu faktor yang dapat mempengaruhi besarnya gula reduksi yang dihasilkan.  Semakin  lama  waktu  hidrolisis  maka akan  semakin  tinggi  kadar  gula  reduksi  yang dihasilkan.  Namun jika waktu hidrolisis yang terlalu lama  maka  akan  mengakibatkan  gula  reduksi (galaktosa)  terdegradasi,  sehingga  menyebabkan konsentrasi  gula  reduksi  menurun  dalam  proses
hidrolisis  (Idral et  al .,  2012).  Waktu  2  jam  ini selanjutnya digunakan untuk menghidrolisis substrat E.cottonii pada  proses  hidrolisis  oleh  enzim k - karagenase.

## Hidrolisis E.cottoniidengan Enzim k-Karagenase
Konsentrasi  Gula  Reduksi  dan  Total  Sebelum Penambahan Enzim
Total  gula  merupakan  campuran  gula reduksi  dan  non  reduksi  yang  merupakan  hasil hidrolisis  pati.  Gula  pereduksi  merupakan  golongan gula  (karbohidrat)  yang  dapat  mereduksi  senyawa- senyawa  penerima  elektron,  contohnya  adalah glukosa  dan  fruktosa.  Ujung  dari  suatu  gula pereduksi  adalah  ujung  yang  mengandung  gugus aldehid  atau  keton  bebas.  Semua  monosakarida (glukosa,  fruktosa,  galaktosa)  dan  disakarida (laktosa,  maltosa)  kecuali  sukrosa  dan  pati (polisakarida),  termasuk  sebagai  gula  pereduksi. (Poedjiadi, 2006).
Karagenan  merupakan  polisakarida  yang linier  atau  lurus,  dan  merupakan  molekul  galaktan dengan  unit-unit  utamanya  adalah  galaktosa  dari hasil  ekstraksi  rumput  laut.  Sebagian  besar karagenan  mengandung  natrium,  magnesium,  dan kalsium  yang  dapat  terikat  pada  gugus  ester  sulfat dari galaktosa dan kopolimer 3,6-anhydro-galaktosa. Tingginya  kandungan  karagenan  pada  rumput  laut akan  memberikan  pengaruh  terhadap  konsentrasi gula  reduksi  yang  dihasilkan.  Semakin  banyak karagenan/oligosakarida  yang  terhidrolisis  semakin banyak  gula  reduksi  yang  terbentuk  (Winarno, 2004). Gambar 4 menunjukkan histogram persentase gula  reduksi  dan  total  gula  yang  dihasilkan  setelah hidrolisis  menggunakan  asam  pada  konsentrasi substrat E.cottonii.
Gambar 4.   Pengaruh penambahahan asam terhadap konsentrasi  gula  reduksi  dan  total  gula yang dihasilkan
Pada  Gambar  4  terlihat  bahwa  semakin tinggi konsentrasi substrat maka semakin besarkadar gula reduksi dan total gula yang dihasilkan. Substrat 12%  merupakan  substrat  yang  paling  tinggi  dalam menghasilkan  gula  reduksi  dan  total  gula  selama proses  hidrolisis  menggunakan  asam.  Hal  ini dikarenakan  semakin  tinggi  konsentrasi  substrat
0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010 0.012 30 60 90 120 150 180 A k ti v it as En zi m (l U/m L ) Waktu Inkubasi (menit) 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 0 30 60 90 120 150 180 G u la R ed u k si ( mg /mL ) Waktu Hidrolisis (menit) 0 1 2 3 4 5 6% 9% 12% K o n se n tr asi G u la ( % ) Konsentrasi Substrat E. cottonii Gula Reduksi Total Gula
E.cottonii maka  semakin  banyak  pati  (polisakarida) yang tersedia untuk hidrolisis oleh asam.
Salah  satu  yang  mejadi  faktor  utama  yang berpengaruh  terhadap  hasil  yang  diperoleh  dan kecepatan  selama  proses  hidrolisis  adalah  susbtrat. Semakin  tinggi  konsentrasi  substrat  akan  menjadi penghambat  selama  proses  hidrolisis  karena  dapat memperlambat proses. Hal inilah yang menyebabkan kecilnya kandungan gula reduksi dan total gula pada substrat  12%.  Berdasarkan  rasio  antara  konsentrasi gula  reduksi  atau  total  gula  terhadap  konsentrasi substrat E.cottonii ,  konsentrasi  gula  reduksi  yang terkandung setelah dihidrolisis sebelum ditambahkan enzim  sebesar  9-10%  dan  total  gulanya  sekitar  40- 45%.

## Konsentrasi  Gula  Reduksi  dan  Total  Gula  Setelah Hidrolisis Enzimatik
Proses  hidrolisis  enzim  merupakan  proses penguraian  suatu  polimer  yang  kompleks  menjadi monomer penyusunnya dengan menggunakan enzim.  Enzim k -karagenase  dalam  proses  hidrolisis berperan  untuk  memecah  molekul  karagenan sehingga  menghasilkan  neokarrabiosa  dan  diubah menjadi galaktosa. Kadar gula reduksi dan total gula setelah  hidrolisis  menggunakan  enzim k -karagenase pada  berbagai  konsentrasi  substrat E.cottonii disajikan pada Gambar 5.
Pada  Gambar  5  terlihat  bahwa  semakin tinggi  konsentrasi  substrat  dan  enzim,  gula  reduksi dan  total  gula  yang  dihasilkan  semakin  meningkat pula.  Dimana  selain  konsentrasi  substrat,  enzim k - karagenase memberikan pengaruh terhadap konsentrasi gula yang dihasilkan. Hal ini dikarenakan semakin tinggi konsentrasi enzim maka substrat  yang  berikatan  dengan  lokasi  aktif  enzim akan  semakin  banyak  sehingga  jumlah  produk  yang dihasilkan  akan  semakin  banyak  (Mauliana,  2015). Substrat  12%  merupakan  susbtrat  yang  memiliki kadar gula reduksi dan total gula yang tertinggi yaitu sebesar 1,94-3,21% dan 4,26-9,89%.
Sama  halnya  pada  hidrolisat  setelah  diberi perlakuan  awal  asam,  besarnya  konsentrasi  substrat juga  dapat  mempengaruhi  kecepatan  hidrolisis enzimatis.  Terjadinya  penghambatan  selama  proses hidrolisis  selain  karena  konsentrasi  substrat  yang tinggi juga dipengaruhi oleh  banyaknya enzim  yang diberikan.  Banyaknya  konsentrasi  enzim  sangat berpengaruh  terhadap  kecepatan  selama  proses hidrolisis.  Hal ini dapat dilihat dari hasil rasio antara kadar  gula  reduksi  atau  total  gula  terhadap  substrat dengan  atau  tanpa  perlakuan  enzim.  Dimana semakin  tinggi  konsentrasi  substrat  semakin  kecil kandungan  gula  reduksi  dan  total  gula  yang dihasilkan  akan  tetapi  semakin  tinggi  konsentrasi enzim  yang  ditambahkan  pada  masing-masing substrat  semakin tinggi  kandungan  gula reduksi dan total  gula  setelah  hidrolisis  enzimatis.  Adapun kandungan  gula  reduksi  yang  dihasilkan  berkisar antara 16-38% dengan total gula sebesar 36-90%.

## Fermentasi
Konsentrasi  Gula  Reduksi  dan  Total  Gula  setelah Fermentasi
Pada  tahap  fermentasi,  substrat E.cottonii mengubah  menjadi  gula  sederhana  salah  satunya adalah  galaktosa.  Produksi  etanol  dari  substrat  gula oleh khamir S.cerevisiae merupakan proses fermentasi  dengan  kinetika  sangat  sederhana. Disebut  sederhana  karena  hanya  melibatkan  satu fasa  pertumbuhan  dan  produksi,  pada  fase  tersebut galaktosa diubah  secara simultan  menjadi biomassa, etanol dan CO 2 . Terdapat dua parameter  yang dapat mengendalikan  pertumbuhan  dan  metabolisme khamir  dalam  keadaan  anaerobik,  yaitu  konsentrasi gula dan etanol. Pada Gambar 6 dapat dilihat bahwa konsentrasi  gula  reduksi  dan  total  gula  yang dihasilkan  setelah  fermentasi  mengalami  penurunan saat  setelah  dihidrolisis  menggunakan  enzim k - karagenase, hal ini dikarenakan S.cerevisiae mengkonsumsi gula reduksi selama proses fermentasi untuk proses metabolismenya.
(a) (b)
Gambar 5. Konsentrasi (a) gula reduksi dan (b) total gula setelah hidrolisis enzimatik
0 2 4 6 8 10 6% 9% 12% G u la Red u k si ( % ) Konsentrasi substrat E. cottonii 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 6% 9% 12% T o ta l G u la ( %) Konsentrasi Substrat E. cottonii Enzim 0% Enzim 2,5% Enzim 5%
Pada Gambar 6 dapat dilihat bahwa substrat 12%  masih  menghasilkan  kadar  gula  reduksi  dan total  gula  yang  tinggi.  Besarnya  kadar  gula  reduksi dan  total  gula  yang  dihasilkan  setelah  fermentasi, menunjukkan bahwa sedikitnya gula yang dikonsumsi oleh S.cerevisiae selama proses fermentasi.  Menurut  Osho  (2005),  khamir  memiliki batas toleransi terhadap jumlah gula dalam hidrolisat (substrat).  Adapun  gula  optimum  bagi S.cerevisiae adalah sekitar 15-18%.

## Konsumsi  Gula  Reduksi  dan  Total  Gula  Selama Fermentasi
Besarnya konsentrasi gula reduksi dan total gula  sebelum  dan  setelah  fermentasi  dapat digunakan untuk menentukan konsumsi gula reduksi dan  total  gula  selama  proses  fermentasi.  Adanya perbedaan jumlah gula yang dikonsumsi berhubungan  dengan  pembentukan  etanol,  karena gula  reduksi  yang  terukur  sebagai  galaktosa  dapat dimanfaatkan  oleh S.cerevisiae dalam  proses metabolisme  dalam  menghasilkan  etanol.  Gambar  7 adalah  histogram  konsumsi  gula  reduksi  dan  total gula yang dihasilkan selama proses fermentasi.
Berdasarkan  gambar  diatas  menjelaskan bahwa  substrat  9%  menghasilkankonsumsi    gula reduksi  dan  total  gula  yang  paling  tinggi dibandingkan  substrat  6%  dan  12%.  Karena  selama fermentasi,  pada  konsentrasi  substrat  9%  khamir dapat bekerja secara maksimal dalam mengkonsumsi
gula  reduksi  dengan  sangat  baik  selama  fermentasi yaitu  sebesar  1,03%-1,49%,  dan  kadar  total  gula yang dihasilkan sebesar 1,56%-2,75%. Pada substrat 12%  konsentrasi  gula  reduksi  yang  dikonsumsi masih  sangat  kecil,  dimana  secara  kinetik  glukosa memiliki  peran  ganda  dimana  substrat  dengan konsentrasi gula yang rendah yaitu kurang dari 1 g/L merupakan substrat pembatas, sedangkan konsentrasi  gula  yang  tinggi  dimana  lebih  dari  300 g/L  akan  menjadi  penghambat  (Mangunwidjaja, 1994).  Hal  inilah  yang  menyebabkan  rendahnya konsumsi  gula  reduksi  dan  total  gula  pada  substrat 12%.
Berdasarkan  nilai  kadar  gula  reduksi  yang diperoleh,  efisiensi  penggunaan  substrat  dapat dihitung  dengan  membandingkan  persentase  total gula  reduksi  yang  dikonsumsi  selama  fermentasi dengan  jumlah  gula  reduksi  awal  (sebelum fermentasi).  Gambar  8  merupakan  histogram  nilai efisiensi penggunaan subsrat.
Nilai efisiensi penggunaan substrat berbanding  lurus  terhadap  konsumsi  gula  reduksi selama  fermentasi.  Pada  Gambar  7,  terlihat  bahwa substrat  9%  memiliki  nilai  efisiensi  substrat  yang paling  tinggi  dengan  atau  tanpa  perlakuan  enzim yaitu  sebesar  69,87-55,78%.  Menurut  Nababan (2013), semakin tinggi efisiensi penggunaan substrat yang  dihasilkan,  maka  degradasi  substrat  yang terjadi selama proses hidrolisis akan semakin baik.
(a) (b)
Gambar 6.  Konsentrasi (a) gula reduksi dan (b) total gula setelah fementasi
(a) (b)
Gambar7. Konsumsi (a) gula reduksi dan (b) total gula selama fermentasi
0 1 2 3 4 5 6 7 8 6% 9% 12% G u la R ed u k si ( % ) Konsentrasi Substrat E. cottonii 0 1 2 3 6% 9% 12% K o n su msi G u la R ed u k si ( %) Konsentrasi Substrat E. cottonii 0 1 2 3 4 5 6 7 8 6% 9% 12% T o ta l G u la ( %) Konsentrasi Substrat E. cottonii Enzim 0% Enzim 2,5% Enzim 5% 0 1 2 3 6% 9% 12% K o n su m si T o tal G u la (% ) Konsentrasi Substrat E. cottonii Enzim 0% Enzim 2,5 % Enzim 5%
Gambar 8. Efisiensi penggunaan substrat
Efisiensi penggunaan substrat menunjukkan seberapa  banyak  gula  yang  dimanfaatkan  oleh khamir  ( S.cereviseae )  untuk  diubah  menjadi  etanol (produk utama), asam organik (produk samping) dan energi yang digunakan untuk pertumbuhan khamir.

## Kadar Etanol pada Hidrolisat E.cottonii
Produksi  bioetanol  merupakan  parameter yang  dapat  menunjukkan  keberhasilan  dari  proses fermentasi  alkohol.  Selain  mikroba,  nutrien  (urea dan  NPK)  yang  terlibat  dalam  proses  fermentasi, besarnya  konsumsi  gula  reduksi  selama  proses fermentasi  dapat  memberikan  pengaruh  terhadap kadar  etanol  yang  dihasilkan.  Semakin  banyak  gula yang  dikonsumsi  maka  semakin  tinggi  kadar etanolnya.  Hal  ini  terlihat  pada  Gambar  8  bahwa substrat  9%  menghasilkan  kadar  etanol  tertinggi sebesar  0,53%  untuk  enzim  2,5%  dan  1,24%  pada konsentrasi enzim 5%. Kadar etanol yang dihasilkan oleh  hidrolisis  enzim k -karagenase  masih  tergolong rendah,  hal  ini  dikarenakan  mikororganisme  yang digunakan  tidak  sesuai  dan  juga  selama  proses fermentasi  khamir  lebih  membutuhkan  glukosa sebagai  sumber energi dibandingkan  galaktosa  yang banyak dihasilkan oleh hidrolisat E.cottonii . Berdasarkan  penelitian  Radesiyani  (2013) menyatakan  bahwa  semua  galur  khamir  mampu mengubah  glukosa  menjadi  bioetanol,  namun  hanya dua  galur  khamir  yakni P.tannophilus IPBCC  y 11.1149  dan S.cerevisiae IPBCC  y  03.545  yang dapat menggunakan galaktosa dan hidrolisat rumput laut E.cottonii sebagai  media  untuk  fermentasi. Namun, ketika kedua galur tersebut diuji kemampuan  produksi  bioetanolnya  dari  hidrolisat rumput  laut E.cottonii ,  khamir P.tannophilus menunjukkan  kemampuan  produksi  yang  lebih  baik dengan  kadar  etanol  yang  dihasilkan  sebesar  0,50- 1,18%  sedangkan S.cerevisiae sebesar  0,05-0,58%. Hal  ini  menunjukkan P.tannophilus memiliki kemampuan  untuk  menggunakan  galaktosa  lebih baik  daripada S.cerevisiae. Khamir P.tannophilus diduga  lebih  toleran  terhadap  inhibitor  dalam hidrolisat E.cottonii dibandingkan dengan S.cerevisiae. Khamir  yang  toleran  terhadap  HMF dan  furfural  akan  mengkonversi    HMF  dan  furfural menjadi alkohol (Maharani, 2011).
Gambar 9. Kadar etanol pada hidrolisat
Pada Gambar 9 dapat dilihat bahwa adanya perlakuan enzim pada masing-masing substrat dapat meningkatkan  kadar  etanol.  Semakin  banyak  enzim yang  digunakan  maka  akan  semakin  tinggi  kadar etanol  yang  dihasilkan.  Menurut  Nababan  (2013), konsentrasi  enzim  dapat  mempengaruhi  hasil  etanol yang  optimal,  dimana  jumlah  etanol  optimal  yang dihasilkan  bergantung  pada  konsentrasi  gula (substrat)  yang  akan  diubah  oleh  enzim.  Sehingga semakin  banyak  enzim  yang  ditambahkan  maka semakin  cepat  reaksi  kimia  pada  substrat  dalam menghasilkan  gula.  Akan  tetapi  konsentrasi  gula yang  diperlukan  untuk  fermentasi  adalah  10  sampai 18%.  Apabila  konsentrasi  gula  terlalu  tinggi  maka proses fermentasi akan berjalan lambat.
Sedangkan  substrat  tanpa  penambahan enzim,  tidak  menghasilkan  etanol  sama  sekali.  Hal ini  dikarenakan  gula  yang  dihasilkan  oleh  substrat E.cottonii lebih  banyak  mengandung  galaktosa dibandingkan  glukosa  dan  khamir  yang  digunakan memiliki kemampuan yang lemah dalam memfermentasi  galaktosa.  Rendahnya  etanol  yang dihasilkan  pada  hidrolisat E.cottonii mungkin diakibatkan  oleh  adanya  senyawa-senyawa  inhibitor yang  terbentuk  pada  hidrolisat.  Salah  satu  senyawa inhibitor  yang  terdapat  pada  hidrolisat  rumput  laut. Menurut  Maharani  (2011),  konsentrasi  tinggi  dari HMF  dan  asam  levulinat  dapat  menghambat produktivitas  fermentasi  mikroorganisme  sehingga menurunkan  produksi  etanol. S.cerevisiae juga diduga  dapat  menggunakan  gula  sebagai  sumber energi  untuk  menghilangkan  inhbitor  HMF  dan  AL daripada  memproduksi  bioetanol.  Akan  tetapi dengan  adanya  senyawa-senyawa  inhibitor  tersebut mengakibatkan  khamir  lebih  mengutamakan  untuk mengurangi  senyawa-senyawa  inhibitor  terlebih dahulu  daripada  mengkonversi  substrat  menjadi etanol.
Berdasarkan besarnya konsumsi gula reduksi  yang  dihasilkan  selama  fermentasi,  dapat disimpulkan  bahwa  konsentrasi  substrat  9%  dengan penambahan  enzim  5%  merupakan  kombinasi perlakuan  yang  terbaik  dalam  menghasilkan  etanol yang  tertinggi.  Pada  penelitian  ini  selain  untuk mengetahui  kadar  etanol  pada  masing-masing substrat E.cottonii .  Perbandingan  nilai  efisiensi fermentasi dan jumlah Y p/s dapat dilihat pada Tabel 1.
0 20 40 60 80 6% 9% 12% E fi si en si P en g g un aa n S u bs tr at (% ) Konsentrasi Substrat E. cottonii Enzim 0% Enzim 2,5% Enzim 5% 0.0 0.5 1.0 1.5 6% 9% 12% K ad ar Et an o l (%) Konsentrasi Substrat E. cottoni Enzim 2,5% Enzim 5%
Tabel 1. Perbandingan nilai efisiensi fermentasi dan Y p/s pada hidrolisat E.cottonii
Perlakuan Efisiensi fermentasi(%) Y p/s (g etanol/ g bhn kering) Y p/s (etanol/Δ g.reduksi) Substrat 6% Enzim 0% - - - Enzim 2.5% 44,39 0,07 0,57 Enzim 5% 81,70 0,16 1,14 Substrat 9% Enzim 0% - - - Enzim 2.5% 31,44 0,05 0,41 Enzim 5% 70,44 0,11 0,83 Substrat 12% Enzim 0% - - - Enzim 2.5% 22,35 0,03 0,56 Enzim 5% 50,41 0,07 1,05
Berdasarkan  Tabel  1,  nilai  efisiensi fermentasi  pada  substrat  6%  memiliki  nilai  yang paling  tinggi  dibandingkan  dengan  substrat  9  dan 12%  yaitu  sebesar  44,39  dan  81,70%.  Tingginya nilai efisiensi yang dihasilkan menunjukkan bahwa kinerja  dari  khamir  pada  konversi  gula  menjadi etanol  sangat  baik  demikian  halnya  pada  efisiensi penggunaan substrat (Nababan, 2013).
Efisiensi  fermentasi  merupakan  ukuran banyaknya  jumlah  gram  etanol  yang  terbentuk  per 100  g  gula  dalam  substrat  dibandingkan  dengan gram etanol yang terbentuk secara teoritis. Efisiensi fermentasi  etanol  menunjukkan  banyaknya  mol gula  yang  diubah  menjadi  etanol.  Besar  kecilnya nilai  efisiensi  sangat  bergantung  pada  konsentrasi substrat  dan  kadar  gula  reduksi  yang  dihasilkan. Semakin banyak konsentrasi substrat yang digunakan  akan  menghasilkan  gula  reduksi  yang tinggi sehingga berpengaruh terhadap nilai efisiensi fermentasi  yang  dihasilkan.  Selain  itu,  adanya faktor  enzim  juga  dapat  meningkatkan  kadar  gula reduksi  pada  substrat E.cottonii .  Berdasarkan  hasil sidik  ragam  yang  dihitung  adanya  faktor  substrat dan  enzim  memberikan  pengaruh  yang  berbeda nyata terhadap efisiensi fermentasi yang dihasilkan.
Nilai  efisiensi  fermentasi  yang  dihitung pada Tabel 1merupakan basis perhitungan terhadap glukosa,  sedangkan  kandungan  gula  reduksi  yang terdapat  pada E.cottonii ( k -karagenan)  sebagian besar  adalah  galaktosa.  Sehingga  perlu  dilakukan perhitungan  terhadap total  yield (Y p/s )  etanol  per konsentrasi  substrat  (bahan  kering)  dan  konsumsi gula  reduksi  yang  dihasilkan  selama  fermentasi. Pada Tabel 2 dapat dilihat bahwa nilai Y p/s dengan produk  (etanol)  dan  substrat  (bahan  kering  dan  Δ gula  reduksi),  memiliki  nilai  yang  berbeda  pada tiap  perlakuan.  Substrat  6%  merupakan  substrat dengan  nilai  Y p/s yang  tertinggi,  yaitu  sebesar  0,07 dan  0,16  pada  Y p/s (gram  etanol/gram  bahan kering).  Sedangkan  nilai    Y p/s (etanol/Δ  gula reduksi)  sebesar  0,57  dan  1,14.  Berdasarkan perbandingan  tersebut  dapat  disimpulkan  bahwa semakin  tinggi  konsentrasi  substrat  serta  besarnya
konsumsi  gula  reduksi  maka  nilai  Yp/s  yang dihasilkansemakin kecil.

## KESIMPULAN DAN SARAN

## Kesimpulan
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa aktivitas enzim berjalan  dengan  baik  pada  waktu  inkubasi  30  -  60 menit,  sedangkan  akumulasi  gula  reduksi  tertinggi diperoleh  pada  waktu  hidrolisis  selama  120  menit. Selama proses hidrolisis dengan perlakuan konsentrasi  substrat  dan  enzim,  substrat  12% menghasilkan  gula  reduksi  dan  total  gula  tertinggi yaitu  sebesar  3,21%  dan  9,89%.  Selama  proses fermentasi,  substrat  9%  pada  perlakuan  enzim 5%,yang memiliki kadar gula reduksi dan total gula sebesar  1,49%  dan  2,75%  merupakan  kombinasi terbaik  dalam  menghasilkan  etanol  yang  tertinggi yaitu sebesar 1,23%.

## Saran
Pada peneliti selanjutnya disarankan untuk menggunakan  khamir  teradaptasi  yang  dapat menggunakan  galaktosa  dan  hidrolisat  rumput  laut E.cottonii sebagai  media  fermentasi  salah  satunya adalah P.  Tannophilus .  Kemudian  perlu  dilakukan penelitian  lanjut  terhadap  waktu  inkubasi  selama proses fermentasi  sehingga didapat  waktu inkubasi yang  tepat  menggunakan  enzim k -karagenase dalam menghasilkan etanol yang optimal.

## DAFTAR PUSTAKA
Antonopoulos A, Patrick F, William H dan Michel L.  2004.  Isolation  of k -carrageenan oligosaccharides  using  ion-pair  liquid chromatography characterisation by electrospray  ionisation  mass  spectrometry in positive-ion mode. Carbohydrate Research . 339: 1301–1309.
Banati  F.  2008.  Pengaruh  penambahan  enzim  α- Amilase  pada  fermentasi  karbohidrat
ekstrak Ulvafasciata dari  Bale  Kamban,
Malang  menggunakan  ragi  roti  fermipan [Skripsi].  Surabaya:  Institut  Teknologi Surabaya.
Bawa  BAGI,  Putra  BAA,  dan  Laila  RI.  2007. Penentuan  pH  optimum  isolasi  karagenan dari rumput laut jenis Eucheuma Cottonii . Kimia 1: 15-20.
Campo  VL,  Daniel  FK,  Dílson  Braz  da  Silva  Jr, Ivone  Carvalho.  2009.  Carrageenans:
Biological
properties, chemical modifications  and  structural  analys is  – A review . Carbohydr Polym. 167–180.
Doty  MS.  1987. The  Production  and  Uses  of Eucheuma .  Didalam:  Doty  MS,  Caddy  Jf, Santelices  B  (editors). Studies  of  Seven Commercial  Seaweeds  Resources .  FAO Fish.  Tech.  Paper  No.  281  Rome.  P  123- 161.
Gomez  KA  dan  Gomez  AA.  1995. Prosedur Statistik untuk Penelitian Pertanian [Edisi kedua].  Terjemahan  Endang  Sjamsuddin dan Justika S. Baharsjah. Jakarta: Universitas Indonesia (UI-Press), hlm: 13- 16.
Idral  DD,  Salim  M,  dan  Mardiah  E.  2012.
Pembuatan  bioetanol  dari  ampas  sagu dengan
proses hidrolisis
asam
menggunakan S. cerevisiae. J Kimia. 1(1): 34–39.
Istini  S,  Zatnika  A,  dan  Suhaimi.  1986 .  Manfaat dan  Pengolahan  Rumput  laut .  Jakarta: Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi. hlm: 128-135.
Khambhaty  Y,  Mody  K,  dan  Jha  B.  2007. Purification  and  characterization  of k - carrageenase from a Novel ɤ- protobacterium, Pseudomonas  elongata (MTCC 5261) syn. Microbulbifer elongatus com.  Nov. Biotechno  Bioproc Eng. 12: 668-675.
Knutsen  SH  dan  Hans  G.  1992.  Analysis  of carrageenans  by  enzymic  degradation,  gel filtration  and 1 H  NMR  spectroscopy. Carbohydrate Polym . 19: 199-210. Maharani  DM.  2011.  Adaptasi Saccharomyces cerevisiae terhadap  hidrolisat  asam  ubi kayu untuk produksi etanol [Tesis]. Bogor: Institut Pertanian Bogor.
Mangunwidjaja D dan Suryani  A. 1994. Teknologi Bioproses. Jakarta: Penebar Swadaya.
Mauliana  RS,  Sutikno,  dan  Marniza.  2015.  Effect of Seaweed ( Eucheuma cottonii ) Extraction  and  Hydrolysis  On  Reducing Sugar  For  Bioethanol  Production. Naskah Seminar  Nasional  Sains  &  Teknologi  VI  - Lembaga  Penelitian  dan  Pengabdian Universitas  Lampung .  Lampung.  hlm: 447-458.
Meinita  MDN,  Ji-Young  K,  Gwi-Taek  J,  Hyun MK,  Sung  MP,  Yong-Ki  H.  2012. Bioethanol  production  from  the  acid hydrolysate of the carrageenophyte Kappaphycus  alvarezii ( E.  cottonii ). J Appl Phycol . 24: 857–862.
Meliawati T. 2015. Karakterisasi enzim karagenase dari  isolat  mikroba  laut  untuk  hidrolisis Eucheuma  cottonii .  [Skripsi].  Bogor: Institut Pertanian Bogor.
Michel G, Laurent C, Emile D, Tristan B, Bernard
H,  Bernard  K  dan  Otto  D.  2001.  The k- carrageenase of P. carrageenovora features  a  tunnel-shaped  active  site: a novel  insight  in  the  evolution  of  clan-B Glycoside  Hydrolases.  Structure .  9:  513– 525.
Miller  GL.  1959.  Use  of  dinitrosaiicyiic  acid reagent  for  determination  of    reducing sugar. J. Analytical Chemistry . 31(3): 426- 428, ISSN 0003-2700.
Nababan  D.  2013.  Hidrolisis  enzimatik  untuk meningkatkan  produksi  bioetanol  dari makroalga  ( E.  cottonii )  [Skripsi].  Bogor:
Institut Pertanian Bogor.
Osho A. 2005. Ethanol and sugar tolerance of wine yeasts  isolated  from  fermenting  cashew apple juice. Afri J Biotechnol. 4: 660-662. Poedjiadi  A.  2006. Dasar  -  Dasar  Biokimia.  Edisi Revisi .  Jakarta:  Universitas  Indonesia Press.
Rahmadini  I.  2012.  Pemurnian  dan  karakterisasi enzim  selulose  dari  bakteri  yang  diisolasi dari  limbah  rumput  laut.  [Tesis].  Bogor: Institut Pertanian Bogor.
Radesiyani  I.  2013.  Potensi  khamir  dalam fermentasi
hidrolisat
rumput laut( Kappaphycus alvarezii ) menjadi bioetanol. [Skripsi]. Bogor: Institut Pertanian Bogor.
Riyanti  EI.  2008. Biomassa  Sebagai  Bahan  Baku Bioetanol .  Bogor.  Balai  Besar  Penelitian dan  Pengembangan  Bioteknologi  dan Sumberdaya Genetika Pertanian – IPB.
Setyaningsih D, Windarwati S, Khayati I, Muna N,
Hernowo  P.  2012.  Acid  hydrolysis technique and  yeast adaptation to increase red  macroalgae  bioethanol  production .  Int
J Environ Bioen . 3(2): 98-110.
Sutarto  I.  2009.  Challenges  of  Biofuel  Industry  in Indonesian. Naskah  Seminar  Nasional pada  Dies  Natalis  Fakultas  Teknologi Pertanian - IPB. Bogor. 16 Oktober 2009.
Taherzadeh  MJ  dan  Karimi  K.  2007.  Acid-based hydrolysis  processes  for  etanol  from lignocellulosic  material .  J  Biores .  2:  472-
499.
Trust  N.  2008. Ethanol  Fermentation  Batch Reactor  Design  Basic .  New  Jersey:  Team
Analysts, GB Analysts Reports.
Hackensack.
Van  de  Velde  F,  Knutsen  SH,  Usov  AI,  Romella
HS,  Cerezo  AS.  2002.  1H  and  13  C  high resolution NMR spectoscopy of carrageenans:  aplication  in  research  and industry .  J  Trends  in  Food  Sci  Technol . 13: 73-92.
Winarno  FG.  2004. Kimia  Pangan  dan  Gizi . Gramedia: Jakarta.
Yanagisawa M, Kanami N, Osamu A, Kiyohiko N. 2011. Production of high concentrations of bioethanol  from  seaweeds  that  contain easily  hydrolysable  polysaccharides. Proc Biochem . 46: 2111-2116.