ISSN 2085-2916 e-ISSN 2337-3652 Tersedia daring http://jai.ipb.ac.id J. Agron. Indonesia, Desember 2020, 48(3):331-338 DOI: https://dx.doi.org/10.24831/jai.v48i3.32014 Respon Plantlet In Vitro dan Induksi Ketahanan Bibit Phalaenopsis amabilis terhadap Dickeya dadantii Menggunakan Asam Salisilat
Response of In Vitro Plantlets and Induced Resistance of Phalaenopsis amabilis Seedling to Dickeya dadantii Using Salicylic Acid
Uchti Nuzul Qhinanti Lubis 1 , Dewi Sukma 2* , dan Sudarsono 2
1 Program Studi Pemuliaan dan Bioteknologi Tanaman, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor 2 Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor (IPB University), Jl. Meranti, Kampus IPB Darmaga, Bogor 16680, Indonesia
Diterima 22 Agustus 2020/Disetujui 27 November 2020

## ABSTRACT
Phalaenopsis is one of the most popular orchid genera because of its beautiful flower with high color variation and long flowering period. One of the problems in orchid cultivation is a bacterial soft-rot disease (SRD) caused by Dickeya dadantii. Based on the previous report, P. amabilis is one of the susceptible species to D. dadantii. Induced resistance by using Salicylic Acid (SA) could be an alternative method to control SRD in Phalaenopsis. The research was conducted from November 2018 to March 2019, at Tissue Culture Laboratory, Department of Agronomy and Horticulture, IPB University. The research consisted of two experiments. The first experiment aimed to evaluate the variability responses of in vitro plantlets (seedling) from self-pollination of P. amabilis against D. dadanti by detached leaf inoculation methods and to determine their resistance levels to D. dadantii. Seven out of 158 evaluated seedlings have a moderate resistance response to D. dadantii, while the rest were either susceptible or very susceptible. The second experiment aimed to assess the responses of P. amabilis seedlings to D. dadantii at one day after SA treatment (0, 15, 30, 45, 60, 75, and 90 ppm) using the intact leaf inoculation method. It used a randomized block complete design (RBCD). The SA concentration at 75 ppm was the best treatment to induce seedling resistance to soft rot pathogen D. dadantii. Plants treated with SA 75 ppm showed the lower colony forming unit (CFU and area under the disease progress curve (AUPDC) and higher peroxidase activity than other treatments.
Keywords: disease severity, inoculation method, intact leaf, detached-leaf, soft-rot disease

## ABSTRAK
Phalaenopsis merupakan salah satu anggrek yang terkenal karena keindahan bunganya dengan variasi warna yang tinggi dan periode pembungaan yang lama. Salah satu masalah dalam budidaya anggrek adalah Penyakit Busuk Lunak (PBL) yang disebabkan oleh bakteri Dickeya dadantii. Induksi resistensi dengan Asam Salisilat (AS) merupakan metode alternatif dalam  mengendalikan  PBL  pada  Phalaenopsis.  Penelitian  ini  dilaksanakan  pada  bulan  November  2018  sampai  Maret 2019, di Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman, Departemen Agronomi dan Hortikultura IPB. Penelitian terdiri dari dua percobaan. Percobaan 1 bertujuan untuk mengevaluasi keragaman respon planlet in vitro asal biji hasil penyerbukan sendiri P. amabilis terhadap D. dadanti dengan inokulasi pada daun terpisah dan menentukan tingkat ketahanannya. Sebanyak 7 dari 158 planlet yang diuji, memiliki respon agak tahan terhadap D. dadantii, sedangkan sisanya rentan atau sangat rentan. Percobaan 2 bertujuan untuk membandingkan respon bibit P. amabilis terhadap D. dadantii pada 1 hari setelah perlakuan asam salisilat (AS) pada konsentrasi 0, 15, 30, 45, 60, 75, dan 90 ppm menggunakan metode inokulasi daun pada bibit yang masih menempel di tanaman. Percobaan 2 menggunakan rancangan acak kelompok lengkap teracak (RKLT). Hasil penelitian menunjukkan perlakuan AS  75 ppm paling baik dalam menginduksi ketahanan bibit P. amabilis terhadap patogen penyebab busuk lunak D. dadantii. Tanaman pada perlakuan tersebut menghasilkan nilai CFU dan AUPDC lebih rendah dan aktivitas peroksidase lebih tinggi dibanding perlakuan lainnya.
Kata kunci: daun terpisah, daun pada tanaman, keparahan penyakit, metode inokulasi, penyakit busuk lunak

## PENDAHULUAN
Phalaenopsis  amabilis (L.)  Blume  merupakan  salah satu  spesies  anggrek  yang  paling  terkenal  dari  genus Phalaenopsis dan banyak diminati oleh masyarakat karena keindahan bunganya. P. amabilis memiliki ciri khas bunga berukuran besar berwarna putih bersih, dan memiliki masa vase  life bunga  yang  panjang  (Alrich  dan  Higgins  2014; Aziz  dan  Sukma,  2015).  Di  Indonesia, P.  amabilis atau disebut  anggrek  bulan  telah  ditetapkan  sebagai  Bunga Nasional  Indonesia  yang  disebut  dengan  ‘Puspa  Pesona’ berdasarkan Keputusan Presiden Indonesia nomor 4 Tahun 1993. Anggrek  ini  merupakan  salah  satu  spesies  anggrek asli Indonesia yang sering digunakan sebagai tetua dalam persilangan anggrek untuk merakit varietas anggrek bulan hibrida unggul (Semiarti et al., 2013). Salah satu masalah penting dalam budidaya anggrek adalah  serangan  penyakit  busuk  lunak  (PBL)  yang disebabkan  oleh  bakteri Dickeya  dadantii (Elina,  2016; Sukma et al ., 2017; Sudarsono et al., 2018). Busuk lunak merupakan penyakit yang paling luas yang dapat merusak berbagai  tanaman  di  seluruh  dunia  termasuk  anggrek (Joko et  al .,  2013).  Penyakit  ini  menyebar  sangat  cepat sehingga dalam 2-3 hari tanaman menjadi busuk dan dapat menyebabkan  kerusakan  hingga  80-100%  terutama  pada saat  pembibitan.  Gejala  khas  penyakit  busuk  lunak  yang dimulai dari adanya luka kecil yang berair, menjadi bercak kehijauan yang basah, mengeluarkan aroma berbau busuk yang khas, dan menyebar dengan cepat ke seluruh bagian daun. Pada tanaman anggrek, penyakit ini dapat berkembang dan menyebar dengan cepat terutama pada tanaman muda atau bibit anggrek (Joko et al., 2011; Meera et al., 2016). Pengendalian  penyakit  busuk  lunak  biasanya dilakukan  dengan  penyemprotan  bakterisida,  namun  hal ini dapat mencemari lingkungan dan menurunkan kualitas tanaman karena sisa residu yang menempel pada permukaan tanaman (Firgiyanto et al ., 2016). Penelitian ini dilakukan untuk mencari alternatif lain yang lebih ramah lingkungan dan  efektif  dalam  mengendalikan  penyakit  busuk  lunak antara lain dengan menginduksi ketahanan tanaman. Induksi ketahanan merupakan strategi untuk merangsang ketahanan sistemik tanaman terhadap serangan patogen melalui metode yang  ramah  lingkungan  seperti  penambahan  senyawa penginduksi secara eksogen (Deenamo et al., 2018; Dewen et  al., 2017).  Salah  satu  senyawa  yang  berperan  dalam menginduksi ketahanan tanaman yaitu asam salisilat (AS).
Asam  salisilat  ( Salicylic  acid )  merupakan  hormon yang  diproduksi  oleh  berbagai  spesies  tanaman  (Li et al., 2019).  Asam  salisilat  (AS)  berperan  dalam  proses fisiologis  seperti  perkecambahan,  termogenesis,  respirasi, pertumbuhan vegetatif, senesen dan menginduksi resistensi tanaman  (Rivas et  al., 2011). Asam  salisilat  pertama  kali dilaporkan sebagai senyawa yang dapat mencegah penyakit tobacco mosaic virus (TMV) pada tembakau dengan cara menginduksi Systemic Acquired Resistance (SAR) (Klessig et al., 2018).  SAR  adalah  mekanisme  ketahanan  tanaman yang  terbentuk  di  seluruh  bagian  tanaman  setelah  terjadi
serangan patogen atau aplikasi senyawa kimia seperti asam salisilat (Prasannath, 2017). Ketika tanaman terinfeksi oleh patogen,  kandungan AS  meningkat  dan  sinyal  transduksi mengaktifkan ekspresi gen terkait patogenesis ( pathogenesis related /PR) (Li et al., 2019). Czajkowski et al. (2015) menggunakan asam salisilat untuk  mengendalikan Dickeya  solani pada  kultur in  vitro kentang. Leiwakabessy et al. (2017) menyatakan perlakuan asam salisilat terbukti mampu untuk menginduksi ketahanan padi varietas Conde dan Ciherang untuk menekan penyebab penyakit hawar daun bakteri Xanthomonas oryzae pv. oryzae. Jendoubi et al. (2015) melaporkan bahwa pemberian asam salisilat  200  μM  terbukti  aman  dan  dapat  meningkatkan ketahanan  tanaman  tomat  terhadap Fusarium  oxysporum f.sp radicis lycopercisi. Sementara Noviantia et al. (2017) melaporkan bahwa konsentrasi asam salisilat 85 ppm secara in vitro efektif menekan perkembangan penyebab penyakit layu  yang  disebabkan  oleh Fusarium  oxysporum pada anggrek P. amabilis. Namun belum diketahui apakah planlet in vitro P. amabilis dapat diinduksi ketahanannya terhadap D. dadantii dengan asam salisilat. Pengujian  ketahanan  tanaman  terhadap  patogen termasuk  patogen  penyebab  busuk  lunak  dapat  dilakukan dengan metode inokulasi pada daun terpisah ( detached leaf inoculation method ) di laboratorium atau inokulasi langsung pada  daun  yang  masih  menempel  di  tanaman  ( intact  leaf inoculation method ). Metode inokulasi pada daun terpisah dapat  membedakan  tingkat  ketahanan  berbagai  genotipe anggrek Phalaenopsis (Elina,  2016;  Sukma et  al. ,  2017; Sudarsono et  al .,  2018).  Metode  pengujian  daun  terpisah tersebut  sangat  membantu  dalam  proses  seleksi  tanaman yang  tahan.  Penelitian  tentang  konsistensi  hasil  antara pengujian  ketahanan  anggrek Phalaenopsis terhadap D. dadantii pada  daun  terpisah  dan  pada  daun  yang  masih menempel di tanaman belum banyak dilaporkan. Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi respon planlet P. amabilis in vitro terhadap patogen busuk lunak D. dadantii melalui metode inokulasi daun terpisah ( detached leaf inoculation method )  dan  respon  bibit P.  amabilis pasca  perlakuan induksi ketahanan dengan AS  terhadap inokulasi D. dadantii dengan metode inokulasi langsung pada daun yang masih menempel di tanaman ( intact leaf inoculation method ).

## BAHAN DAN METODE
Penelitian  ini  terdiri  dari  dua  percobaan  yang dilaksanakan  pada  bulan  November  2018  sampai  dengan November 2019. Planlet P. amabilis diperoleh dari Kebun Raya  Bogor.  Subkultur  planlet P.  amabilis dilakukan di  Laboratorium  Kultur  Jaringan  1,  aklimatisasi  dan pemeliharan  bibit  di  Rumah  Anggrek,  Kebun  Percobaan Leuwikopo, dan pengujian infeksi bakteri dilaksanakan di Laboratorium Pemuliaan dan Biologi Molekuler Tanaman (PMB  1),  di  Departemen  Agronomi  dan  Hortikultura, Fakultas  Pertanian,  IPB.  Analisis  enzimatik  dilakukan  di Laboratorium  Biorin,  Departemen  Ilmu  dan  Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, IPB.
Percobaan  1.  Uji  Respon  Planlet  In  Vitro  P.  amabilis terhadap Patogen PBL D. dadantii
Percobaan  ini  bertujuan  untuk  mengevaluasi  variasi respon 158 individu planlet P. amabilis asal benih terhadap patogen busuk lunak dan mengelompokkan planlet menurut kelas  ketahanannya.  Benih P.  amabilis dari  benih  hasil penyerbukan  sendiri  ( selfing ),  dikecambahkan  dalam setengah  konsentrasi  media  Murashige  &  Skoog.  Planlet diperoleh sekitar 10 bulan setelah penyemaian benih in vitro setelah melalui 3 kali subkultur dalam media pembesaran berupa Hyponex 2 g L -1 , arang aktif 2 g L -1 , ekstrak kentang 50 g L -1 ekstrak pisang 50 g L -1 , vitamin MS (Murashige dan Skoog), dan gula 20 g L -1 . Planlet yang diuji memiliki 3-4 daun. Bakteri D. dadantii yang digunakan dalam percobaan ini diisolasi dari daun tanaman anggrek yang terinfeksi PBL dari penelitian Putri (2019). Untuk inokulasi, koloni tunggal hasil subkultur dari media NA ( Nutrient Agar ) di kultivasi dalam 15 mL media LB ( Lactose Broth ) cair dan dikocok dengan kecepatan 100 rpm ( rotate per minute ) selama 24 jam. Suspensi bakteri kemudian dipipet sebanyak 2 mL dan dimasukkan ke dalam microtube untuk disentrifugasi selama 6 menit dengan kecepatan 8,000 rpm. Pelet yang diperoleh dilarutkan  di  media  LB  cair,  dipipet  sebanyak  2  mL  dan dimasukkan  ke  dalam microtube untuk  disentrifugasi  lagi dengan  kecepatan  sama  selama  15  menit.  Pelet  yang dihasilkan  dilarutkan  dalam  15  mL  media  LB.  Suspensi bakteri tersebut kemudian diencerkan secara berseri dengan menambahkan 1 mL stok suspensi ke dalam 9 mL akuades, sehingga  diperoleh  pengenceran  10 -1 ,  diteruskan  hingga diperoleh pengenceran 10 -3 . Metode  uji  ketahanan  planlet  terhadap D.  dadantii menggunakan  metode  inokulasi  daun  terpisah  ( detached leaf inoculation method mengikuti metode yang dilaporkan Sukma et al. (2017) dan Sudarsono et al. (2018). Pengamatan respon  daun  planlet P.  amabilis terhadap  infeksi  bakteri penyebab penyakit busuk lunak dilakukan dengan mengukur diameter gejala busuk lunak setiap 6 jam sekali selama masa inkubasi dimulai dari 12 sampai 48 jam setelah inokulasi (JSI).  Perhitungan  keparahan  penyakit  (KP)  dan  kelas ketahanan (KK) planlet dihitung menggunakan rumus pada penelitian Sanjaya et al. (2020).
Keterangan : ni = jumlah daun terserang pada skor ke-1, v = skor penyakit pada skala i, Z  = nilai skor tertinggi, N = jumlah tanaman yang diamati. Skor gejala ( v ) ditetapkan berdasarkan kriteria sebagai berikut: 1 = diameter gejala ≤ 1 mm, 3 = diameter gejala 2 < i ≤ 4 mm, 5 = diameter gejala 4 < i ≤   6 mm, 7 = diameter gejala 6 < i ≤ 8 mm, 9 = diameter gejala > 8 mm.
Kelas  ketahanan  (KK)  planlet  terhadap D.  dadantii ditentukan  berdasarkan  kriteria  Keparahan  Penyakit  (KP) sebagai  berikut:  tahan  (T)  untuk  KP  antara  0-20%,  agak tahan  (AT)  untuk  KP  antara  21-40%,  agak  rentan  (AR) untuk KP antara 41-60%, rentan (R) untuk KP antara 61- 80%, sangat rentan (SR) untuk KP lebih dari 80%.
Percobaan  2.  Uji  Konsentrasi  Asam  Salisilat  (AS)  untuk Induksi Ketahanan Bibit P. amabilis di Greenhouse terhadap Infeksi Patogen PBL D. dadantii.
Bahan tanaman yang digunakan berupa bibit anggrek P.  amabilis yang  berumur  4  bulan  setelah  aklimatisasi  di greenhouse dan memiliki 3 sampai 5 daun. Bibit merupakan sampel acak dari populasi bibit hasil silang sendiri ( selfing ) P.  amabilis yang  belum  diketahui  tingkat  ketahanannya terhadap D.  dadantii. Bibit  tanaman  tersebut  dibawa  ke Laboratorium,  disemprot  dengan  AS  sesuai  konsentrasi perlakuan,  hingga  seluruh  daun  tanaman  basah  merata. Percobaan  menggunakan  satu  faktor  perlakuan  yaitu konsentrasi AS dalam rancangan kelompok lengkap teracak (RKLT)  dengan  ulangan  sebagai  kelompok.  Konsentrasi perlakuan AS terdiri dari 7 taraf (0, 15, 30, 45, 60, 75, dan 90 ppm) dan diulang sebanyak 3 kali dengan 1 tanaman sebagai 1 ulangan.  Inokulasi bakteri D. dadantii dilakukan satu hari setelah perlakuan AS.  Persiapan bakteri dilakukan seperti percobaan  1  dan  menggunakan  pengenceran  10 -2 untuk inokulasi.  Metode  inokulasi  dilakukan  dengan  inokulasi langsung  pada  daun  yang  masih  menempel  di  tanaman ( intact  leaf  inoculation  method ).  Daun  yang  diinokulasi adalah  daun  nomor  2  (dihitung  dari  pangkal  tanaman) P. amabilis. Permukaan atas daun pada bagian tengah lamina (bukan tulang daun) ditusuk dengan jarum steril sebanyak satu kali, kemudian inokulum bakteri dengan pengenceran 10 -2 sebanyak 10 μL diteteskan di atas permukaan daun yang luka  menggunakan  mikropipet.  Bibit  anggrek  kemudian diinkubasi di dalam container box dengan suhu 25-30 o C. Pengamatan  respon  daun  bibit P.  amabilis yang diinokulasi bakteri D. dadantii dilakukan dengan mengukur diameter  gejala  busuk  lunak  pada  daun,  selanjutnya perhitungan keparahan penyakit (KP) dan kelas ketahanan (KK) dilakukan seperti pada percobaan 1. Disamping itu, juga dihitung area di bawah kurva progres penyakit ( area under the disease progress curve (AUDPC)) yang dihitung berdasarkan KP pada 18, 24, dan 30 JSI mengikuti metode Campbell & Madden (1990) dalam Yap (2017).
Keterangan: x  =  Persentase  keparahan  penyakit,  t  =  selang  waktu pengamatan.
Analisis  aktivitas  peroksidase  dilakukan  mengikuti metode Sukma et al. (2008) dan Firgiyanto et al. (2016). Sampel  yang  digunakan  yaitu  bagian  ujung  daun  bibit anggrek  yang  tidak  terkena  gejala  busuk,  dipotong  dari masing-masing  tanaman  dan  digabung  sebagai  sampel komposit  untuk  setiap  konsentrasi  perlakuan AS.  Sampel komposit  yang  digunakan  untuk  analisis  peroksidase sebanyak  1  g.  Protein  total  dari  jaringan  daun  diekstrak dengan  buffer  fosfat.  Sebanyak  100  µL  ekstrak  protein jaringan  ditambahkan  ke  dalam  larutan  2.5  mL  pirogalol 0.2 M, lalu ke dalam campuran tersebut ditambahkan H 2 O 2 (1%)  sebanyak  250  µL.  Nilai  absorbansi  larutan  sesudah
𝐾𝐾𝐾𝐾 = Σ (𝑛𝑛𝑛𝑛  × 𝑣𝑣)
𝑍𝑍  × 𝑁𝑁 × 100% AUDPC = ∑ ( 𝑥𝑥𝑥𝑥 + ( 𝑥𝑥𝑥𝑥 + 1) 2 )(( 𝑡𝑡𝑥𝑥 + 1) − 𝑡𝑡𝑥𝑥 )
𝑛𝑛−1 𝑖𝑖
reaksi diukur dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang λ 420 nm setiap 30 detik dalam periode 0-150 detik, dengan menggunakan blanko campuran larutan yang sama tetapi tanpa ekstrak protein. Sebagai ganti ekstrak protein,  ke  dalam  larutan  blanko  ditambahkan  larutan penyangga  fosfat.  Aktivitas  peroksidase  dihitung  sebagai peningkatan  nilai  absorbansi  per  satuan  waktu  per  bobot protein (∆A420/menit/mg protein) pada kondisi analisis.
Pada  percobaan  2  diamati Colony  Forming  Unit (CFU),  untuk  mengetahui  jumlah  koloni  bakteri  yang terdapat  daun  yang  bergejala  busuk  lunak.  CFU  dihitung dengan mengambil 50 mg bagian daun antara yang terkena gejala dan yang tidak bergejala pada 30 JSI. Bagian daun tersebut  digerus  hingga  halus  dan  larutkan  dengan  1  mL akuades  steril  selanjutnya  diencerkan  sampai  tiga  kali. Masing-masing  pengenceran  diambil  sebanyak  3  µL  dan diteteskan  di  atas  permukaan  media  Nutriet  Agar  (NA) dengan tiga ulangan. Koloni yang muncul dihitung setelah media diinkubasi selama 24 jam dalam suhu kamar.
Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan aplikasi Microsoft Excel 2016 dan STAR ( Statistical Tool for Agricultural Research ). Pengaruh nyata perlakuan diuji dengan analisis sidik ragam dan jika perlakuan berpengaruh nyata diuji lanjut dengan BNJ pada α = 0.05.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Percobaan 1. Respon Planlet In Vitro P. amabilis terhadap Patogen PBL D. dadantii
Hasil uji respon planlet P. amabilis setelah diinokulasi patogen D.  dadantii dapat  dilihat  pada  Tabel  1.  Hasil pengujian menunjukkan bahwa dari 158 planlet yang diuji, 56.7% (90 planlet) anggrek menunjukkan kelas ketahanan sangat rentan (SR) diikuti oleh kelas ketahanan rentan (R) sebanyak  22.2%  (35  planlet,  agak  rentan  (AR)  sebanyak 16.5% (26 planlet) dan agak tahan (AT) sebanyak 4.4% (7 planlet).  Planlet  dengan  kelas  ketahanan  tahan  (T)  tidak
ditemukan  sama  sekali.  Hasil  ini  menunjukkan  bahwa secara umum P. amabilis tidak tahan terhadap D. dadantii , sesuai  dengan  hasil  penelitian-penelitian  yang  dilakukan sebelumnya  yang  menyatakan  anggrek P.  amabilis merupakan  spesies  yang  rentan  terhadap  penyakit  busuk lunak  (Sukma et al., 2017;  Sanjaya et al., 2020).  Respon ketahanan yang berbeda dari individu planlet menunjukkan kemungkinan adanya variasi genetik pada planlet walaupun benih dihasilkan dari penyerbukan sendiri, namun dugaan tersebut  perlu  dibuktikan  lebih  lanjut  melalui  analisis molekuler  pada  planlet.  Suryowinoto  (1990)  menyatakan dalam satu buah anggrek dapat menghasilkan biji 2-3 juta, ketidakpastian sebagai galur murni mengakibatkan tanaman yang dihasilkan mempunyai variasi genetik yang besar.
Percobaan 2. Konsentrasi Asam Salisilat (AS) untuk Induksi Ketahanan Bibit P. amabilis di Greenhouse terhadap Infeksi Patogen PBL D. dadantii
Diameter  gejala,  keparahan  penyakit  dan  kelas ketahanan  bibit  setelah  uji  konsentrasi  AS  dan  inokulasi bakteri penyebab penyakit busuk lunak langsung pada daun yang masih menempel di batang bibit anggrek P. amabilis dapat dilihat pada Tabel 2. Perlakuan AS berpengaruh nyata terhadap diameter gejala busuk lunak pada pengamatan 24 JSI. Diameter gejala busuk lunak yang paling besar ditemukan pada  kontrol  (AS  0  ppm)  namun  tidak  berbeda  nyata dengan  perlakuan AS 15, 30, dan 45 ppm. Diameter gejala busuk lunak pada perlakuan AS 60, 75, dan 90 ppm tidak berbeda nyata satu sama lainnya namun nyata lebih rendah dibanding  kontrol  dan  perlakuan  konsentrasi AS  30  ppm. Terdapat koefisien keragaman respon diameter gejala yang cukup besar (sekitar 20%) dalam setiap waktu pengamatan. Secara  umum  terlihat  kecenderungan  menurunnya  gejala busuk  lunak  dengan  peningkatan  konsentrasi AS.  Respon luas  gejala  busuk  lunak  pada  setiap  konsentrasi AS  pada pengamatan  24  jam  setelah  inokulasi  dapat  dilihat  pada Gambar  1.  Bibit  pada  perlakuan AS  60,  75,  dan  90  ppm
Nomor aksesi Diameter gejala busuk lunak (mm) KP (%) KK 1,10, 17, 23, 119, 167, 192 3.7±1.5 33 AT 6, 9, 11, 19, 20, 21, 120, 129, 130, 139, 152, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 168, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 179, 191 4.8±0.8 56 AR 3, 4, 5, 7, 8, 13, 14, 24, 25, 30, 31, 32, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 132, 135, 150, 151, 159, 160, 170, 177, 178, 182, 183, 187, 189, 190, 193 6.5±0.5 78 R 2, 12, 15, 16, 18, 22, 26, 27, 28, 29, 33, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 67, 69, 70, 71, 72, 73, 75, 77, 78, 80, 81, 82, 84, 89, 92, 98, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 131, 134, 136, 137, 138, 140, 141, 142, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 169, 180, 181, 184, 185, 186, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207 9.3±1.0 100 SR Tabel 1. Diameter gejala, keparahan penyakit dan kelas ketahanan planlet in vitro P. amabilis terhadap patogen busuk lunak D. dadanti pada 24 JSI
Keterangan: Data  merupakan  rata-rata ± standar deviasi;  JSI = jam setelah inokulasi; KP = keparahan penyakit; KK = kelas ketahanan; AT = agak tahan; AR = agak rentan; R = rentan; SR = sangat rentan
menunjukkan tingkat keparahan lebih rendah, 11% (60 dan 75  ppm)  dan  19%  (90  ppm)  dibanding  perlakuan  lainnya (>40%).  Bibit  pada  ketiga  perlakuan  tersebut  termasuk ke dalam kelas ketahanan tahan (T) terhadap D. dadantii , namun konsentrasi terbaik adalah pada AS 75 ppm karena menghasilkan intensitas penyakit dan CFU paling rendah.
Hasil  analisis  aktivitas  enzim  peroksidase  dapat dilihat  pada  Gambar  2.  Bibit  pada  perlakuan AS  75  ppm menunjukkan aktivitas peroksidase paling tinggi dibanding perlakuan lainnya yaitu 0.000476 U per menit per mg protein, sedangkan perlakuan konsentrasi AS 30 ppm memiliki nilai peroksidase paling rendah yaitu 0.000091 U per menit per mg  protein.  Hasil  tersebut  menunjukkan  ketidakstabilan respon aktivitas  peroksidase terhadap konsentrasi AS yang perlu  dievaluasi  lebih  lanjut.  Aktivitas  peroksidase  yang tinggi diduga kuat menekan pertumbuhan bakteri pada daun dari perlakuan AS 75 ppm. Peroksidase merupakan enzim antioksidan  yang  aktivitasnya  berkorelasi  kuat  dengan penekanan penyakit (Yasmin et al ., 2016). Hasil CFU pada daun bibit P. amabilis yang diinokulasi bakteri D. dadantii dengan metode intact leaf inoculation
method pada  pengamatan  30  JSI  dapat  dilihat  pada Tabel 3.  Rata-rata  hasil  CFU  pada  pengenceran  gerusan  daun terinfeksi 10 -1 menghasilkan konsentrasi bakteri yang sangat tinggi  sehingga  tidak  dapat  dihitung  jumlah  koloninya. Sebaliknya  pada  konsentrasi  AS  75  ppm,  hanya  terdapat 2  koloni  bakteri  pada  pengenceran  10 -1 ,  menunjukkan tertekannya  pertumbuhan  sel  bakteri  pada  daun  tanaman. Seluruh daun pada semua perlakuan konsentrasi AS, CFU dapat  dihitung  pada  pengenceran  10 -2 .  CFU  paling  tinggi ditemukan  pada  perlakuan  konsentrasi  AS  45  ppm  yaitu sebanyak 50 koloni tunggal. Nilai AUPDC pada perlakuan AS 60, 75, dan 90 ppm terlihat pada Gambar 1B. Diameter gejala  yang  lebih  kecil  akan  menghasilkan  nilai AUPDC yang lebih rendah. Aktivitas peroksidase yang tinggi pada perlakuan AS 75 ppm (Gambar 2) diduga merupakan salah satu  yang  menekan  pertumbuhan  bakteri  pada  daun  yang diinokulasi sehingga CFU dari daun pada perlakuan tersebut menjadi lebih rendah dibanding perlakuan lainnya.
Hasil  Percobaan  1  dan  2  mengkonfirmasi  hasil penelitian sebelumnya seperti dilaporkan Sukma et al., 2017 dan Sanjaya et al. (2020), dimana P. amabilis merupakan Konsentrasi AS (ppm) Diameter gejala busuk lunak (mm) KP (%) KK 18 JSI 24 JSI 30 JSI 0 7.20±3.25a 9.55±0.64a 10.0±0.00a 100 R 15 4.43±1.40ab 6.93±0.91ab 9.07±0.90ab 78 R 30 7.20±1.49a 9.17±1.19a 9.80±0.35a 93 SR 45 2.57±1.00ab 4.10±2.15abc 9.63±0.64a 48 AR 60 0.73±1.27b 1.07±1.85c 2.57±4.45bc 11 T 75 0.93±1.62b 1.20±2.08c 1.57±2.71c 11 T 90 1.23±2.14b 1.90±3.29bc 2.17±3.75bc 19 T Koefisien keragaman 21.62% 19.94% 21.64%
Tabel 2. Pengaruh konsentrasi asam salisilat (AS) terhadap diameter gejala, keparahan penyakit busuk lunak yang disebabkan D. dadantii dan kelas ketahanan bibit P. amabilis terhadap D. dadantii dengan intact leaf inoculation method
Keterangan: Angka yang diikuti huruf yang sama pada kolom yang sama tidak berbeda nyata pada uji beda nyata jujur (BNJ) dengan α = 5%. JSI = Jam Setelah Inokulasi. KP = keparahan penyakit; KK = kelas ketahanan; R = rentan; SR = sangat rentan; AR = agak rentan; T = tahan
Gambar 1. (A) Gejala busuk pada daun bibit P. amabilis pada 24 jam setelah inokulasi D. dadantii pada berbagai perlakuan konsentrasi asam salisilat (AS), (B) Grafik area under disease progress curve (AUPDC) pada perlakuan konsentrasi asam salisilat (AS)
0% 20% 40% 60% 80% 100% 1 8 2 4 3 0 K ep ar ah an p en ya ki t Jam setelah inokulasi 0 ppm 15 ppm 30 ppm 45 ppm 60 ppm 75 ppm 90 ppm B
Kontrol 15 ppm
30  ppm 45 ppm 60 ppm 75 ppm 90 ppm A 2 cm 0% 20% 40% 60% 80% 100% 1 8 2 4 3 0 K ep ar ah an p en yak it Jam setelah inokulasi 0 ppm 15 ppm
30 ppm 45 ppm 60 ppm 75 ppm 90 ppm B
salah  satu  spesies  anggrek  yang  rentan  terhadap  busuk lunak. Putri (2019) menyatakan kematian bibit anggrek P. amabilis yang disebabkan oleh penyakit busuk lunak sangat tinggi di greenhouse mencapai 78% setelah dua bulan fase aklimatisasi. Terdapatnya beberapa planlet yang agak tahan terhadap D.  dadantii menunjukkan  kemungkinan  adanya variasi genetik antar planlet yang berkaitan dengan respon terhadap D. dadantii. Raynalta et al. (2018) dan Humaira et al. (2020) melaporkan adanya variasi antar klon planlet asal seedling in vitro P. amabilis dalam respon terhadap D. dadantii dan analisis keragaman dengan marka Pto-SNAP. Hasil  percobaan  1  menunjukkan  adanya  variasi ketahanan  planlet P.  amabilis terhadap D.  dadantii yang diduga berasal dari faktor genetik tanaman. Sementara pada hasil  Percobaan  2,  terlihat  bahwa  konsentrasi  60  dan  75
ppm AS  dapat  menginduksi  ketahanan  tanaman  terhadap D.  dadantii. Adanya  keragaman  respon  planlet  pada Percobaan 1 menimbulkan keraguan apakah ketahanan pada perlakuan AS  60  dan  75  ppm  benar-benar  meningkatkan ketahanan  tanaman  atau  karena  faktor  genetik  tanaman, karena itu penelitian ini perlu dilanjutkan dengan mengujj AS pada bibit asal perbanyakan klonal dari genotipe rentan P.  amabilis. Sanjaya et  al. (2020)  melaporkan  bahwa AS 60  ppm  tidak  meningkatkan  ketahanan  berbagai  spesies Phalaenopsis terhadap D. dadantii , namun ketahanan sedikit meningkat dengan perlakuan AS 720 ppm pada P. amabilis. Konsistensi  AS  dalam  menginduksi  ketahanan  tanaman anggrek Phalaenopsis terhadap penyakit busuk lunak yang disebabkan D. dadantii masih perlu diteliti lebih lanjut.
Gambar 2. Aktivitas peroksidase pada daun bibit anggrek P. amabilis yang diinokulasi D. dadantii dengan intact leaf inoculation method pada 30 jam setelah inokulasi pada perlakuan induksi ketahanan dengan asam salisilat (AS)
Konsentrasi AS (ppm) Jumlah koloni bakteri Coloni forming unit (CFU) 10 -1 10 -2 10 -3 0 ~ 13 0 8.8 x 10 6 15 ~ 39 0 2.6 x 10 7 30 ~ 1 0 6.6 x 10 5 45 ~ 50 1 6.6 x 10 6 60 ~ 14 0 9.3 x 10 6 75 2 0 0 1.3 x 10 5 90 ~ 22 0 1.5 x10 7 Tabel 3. Colony forming unit (CFU) D. dadantii asal daun bibit anggrek P. amabilis pada perlakuan induksi ketahanan dengan AS dari daun yang bergejala busuk lunak pada 30 jam setelah inokulasi
Keterangan : ~ = jumlah koloni tidak dapat untuk dihitung

## KESIMPULAN
Sebanyak 158 planlet in vitro P. amabilis yang diuji ketahanannya  terhadap  patogen  busuk  lunak D.  dadantii terdistribusi  ke  dalam  4  kelas  ketahanan  yaitu  sangat rentan  (90  planlet),  rentan  (35  planlet),  agak  rentan  (26 planlet),  agak  tahan  (7  planlet)  dan  tidak  didapatkan sama  sekali  planlet  tahan.  Perbedaan  ketahanan  terhadap penyakit busuk lunak yang disebabkan bakteri D. dadantii
pada  planlet  mengindikasikan  adanya  keragaman  genetik planlet  walaupun  berasal  dari  hasil  penyerbukan  sendiri ( selfing ).  Perlakuan  bibit  dengan  asam  salisilat  (AS)  75 ppm  paling  baik  dalam  menginduksi  ketahanan  bibit P. amabilis terhadap penyakit busuk lunak yang disebabkan D. dadantii. Perlakuan tersebut juga menghasilkan nilai CFU dan AUPDC  yang lebih rendah dan aktivitas peroksidase lebih tinggi dibanding perlakuan lainnya.
0.000103 0.000123 0.000091 0.000219 0.000136 0.000476 0.000176 0.000000 0.000100 0.000200 0.000300 0.000400 0.000500 0 15 30 45 60 75 90 U per menit per mg protein K on se nt ra si A S (p pm)

## UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan  terima  kasih  kepada  Kemenristek  Dikti yang telah mendanai penelitian ini dalam skema Program Tesis  Magister  (PTM)  dengan  kontrak  Nomor:  1/E1/ KP.PTNBH/2020 dibawah koordinasi Dr. Dewi Sukma, SP. MSi.

## DAFTAR PUSTAKA
Alrich,  P.,  W.  Higgins.  2014. Phalaenopsis  amabilis (Linnaeus)  Blume.  Bijdragen  tot  de  Flora  van Nederlandsch Indie 24:18-21.
Aziz, S.A., D. Sukma. 2015. Morphological characterization of Phalaenopsis spp.  and  Hybrids  from  Indonesia. Acta Hortic. 1078:149-154.
Czajkowski, R., J.M.V.D. Wolf, A. Krolicka, Z. Ozymko, M. Narajczyk, N. Kaczynska, E. Lojkowska. 2015. Salicylic acid can reduce infection symptoms caused by Dickeya  solani in  tissue  culture  grown  potato
( Solanum tuberosum L.) plants. Eur J. Plant Pathol. 141:545-558.
Deenamo, N., A. Kuyogsuy, K. Khompatara, T. Chanwun, K. Ekchaweng, N. Churngchow. 2018. Salicylic acid
induces resistance in rubber tree against Phytophthora palmivora . Intl. J. Mol. Sci. 19:1883. Doi:10.3390/ ijms19071883.
Dewen, Q., D. Yijie, Z. Yi, L. Shupeng, S. Fachao 2017.
Plant immunity inducer development and application. Molecular Plant-Microbe Interactions 30:355-360.
Elina,  J.  2016.  Respon  Ketahanan Anggrek Phalaenopsis terhadap  Penyakit  Busuk  Lunak  Akibat  Infeksi Dickeya  dadantii .  Tesis.  Sekolah  Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Firgiyanto,  R.,  S.A. Aziz,  D.  Sukma,  Giyanto.  2016.  Uji ketahanan  anggrek  hibrida Phalaenopsis terhadap penyakit busuk lunak yang disebabkan oleh Dickeya dadantii . J. Agron. Indonesia 44:204-210.
Humaira,  M.,  A.  Purwito,  Sudarsono,  D.  Sukma.  2020. Multiplikasi tunas in vitro anggrek Phalaenopsis dan analisis keragaman genetik dengan Marka SNAP. J. Agron. Indonesia 47:59-67.
Jendoubi, W., K. Harbaoul, W. Hamada. 2015. Salicylic acid- induced  resistance  against Fusarium  oxysporumf. s.pradicis  lycopercisi in  hydroponic  grown  tomato plants. J. New Sciences Agric. Biotech. 21:985-995.
Joko, T., N. Kusumandari, H. Sedyo, 2011. Optimization of PCR  methode  for  the  detection  of Pectobacterium carotovorum a  causal  agent  of  soft  rot  disease  on orchid.  J.  Perlindungan  Tanaman  Indonesia  17:54- 59.
Joko,  T.,  A.  Subandi,  N.  Kusumandari,  A.  Wibowo,  A. Priyatmojo.  2013.  Activities  of  plant  cell  wall degrading  enzymes  by  bacterial  soft  rot  of  orchid. Phytopathol. Plant Protect. 47:1239-1250.
Klessig, D.F., H.W. Choi, D.A. Dempsey. 2018. Systemic acquired resistance and salicylic acid: past, present, and  future.  Mol.  Plant-Microbe  Interact.  31:871- 888.
Leiwakabessy,  C.,  M.S.  Sinaga,  K.H.  Mutaqin, Trikoesoemaningtyas, Giyanto. 2017. Asam salisilat sebagai  penginduksi  ketahanan  tanaman  padi terhadap penyakit hawar daun bakteri. J. Fitopatologi Indonesia 13:207-215.
Li,  T.,  Y.  Huang,  Z.S.  Xu,  F.  Wang,  A.S.  Xiong.  2019. Salicylic  acid-induced  differential  resistance  to the  tomato  yellow  leaf  curl  virus  among  resistant and  susceptible  tomato  cultivars.  BMC  Plant  Biol. 19:173.
Meera,  T.M.,  Louis,  V.,  Beena,  S.  2016.  Diseases  of Phalaenopsis symptoms: etiology and management. Intl. J. Agric. Innov. Res. 5:296-300.
Noviantia,  R.A.,  E.  Nurcahyani,  M.L.  Lande.  2017.  Uji ketahanan  planlet  anggrek  bulan  ( Phalaenopsis amabilis (L.) Bl.) hasil seleksi dengan asam salisilat terhadap Fusarium  oxysporum secara in  vitro .  J Penelitian Pertanian Terapan 17:132-137 .
Prasannath, K. 2017. Plant defense-related enzymes against pathogens:  a  review.  AGRIEAST:  J.  Agric.  Sci. 11:38-48.
Putri, H.A. 2019. Keragaman dan Respon Ketahanan Planlet Phalaenopsis  amabilis (L.)  Blume  Hasil  Iradiasi Protocorm tehadap Dickeya dadantii . Tesis. Sekolah Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Raynalta, E., J. Elina,  Sudarsono, D. Sukma. 2018. Clonal fidelity of micro-propagated Phalaenopsis plantlets based  on  assessment  using  eighteen Ph-Pto SNAP marker loci. AGRIVITA J. Agric. Sci. 40:390-402.
Rivas,  M.,  S.  Vicente,  J.  Plasencia.  2011.  Salicylic  acid beyond  defence:  its  role  in  plant  growth  and development. J. Exp. Bot. 62:3321-3338.
Sanjaya, I.P.W.,  D. Sukma, S.Sudarsono,M.T. Chan. 2020. Effect  of  genotype,  concentration  and  timing  of salicylic  acid  application  to Phalaenopsis against Dickeya dadantii infection.  Biodiversitas  21:4317-
4328.
Semiarti, E., I.S. Mercuriana, A. Slamet, B. Sulistyaningsih, I.A.P. Bestari, S. Jang, Y. Machida, C. Machida. 2013. Induction  of in  vitro flowering  of  Indonesian  wild orchid Phalaenopsis  amabilis (L.)  Blume.  Knowl. Publ. Sci. 2:398-404.
Sudarsono, S., J. Elina, Giyanto, D. Sukma. 2018. Pathogen causing Phalaenopsis soft rot disease-16S rDNA and virulence characterisation. Plant Protect Sci . 54:1-8.
Sukma,  D.,  R.  Poerwanto,  Sudarsono,  N.  Khumaida,  S. Wiyono,  I.M.  Artika.  2008.  Aktivitas  kitinase  dan peroksidase dari ekstrak protein daun, akar, kalus dan tunas in vitro Trichosanthes tricuspidata Lour. Bul. Agron. 36:56-63.
Sukma,  D.,  J.  Elina,  Giyanto,  Sudarsono.  2017.  Disease resistance breeding of Phalaenopsis spp. for tropical environment and molecular marker development for plant selection. Acta Hortic. 1167:237-243.
Suryowinoto, M. 1990. Pemuliaan Tanaman secara In Vitro. Fakultas Biologi. UGM. Yogyakarta, ID.
Yap,  H.S.  2017.  Penyakit  Cacar  Daun  Teh  ( Exobasidium vexans )  Tingkat  Infeksinya  di  Perkebunan  Gunung Mas  (PTPN  VIII)  dan  Bah  Butong  (PTPN  IV). Skripsi. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Yasmin,  S.,  A.  Zaka,  A.  Imran,  M.A.  Zahid,  S.  Yousaf, G. Rasul, M. Arif, M.S. Mirza. 2016. Plant growth promotion and suppression of bacterial leaf blight in rice by inoculated bacteria. PloS One 11: e0160688.