## Penggunaan Albumen  untuk Separasi Spermatozoa Epididymis Domba Garut
(The Use of Albumen for Epididymal Sperm Separation of Garut Ram)
Nurcholidah Solihati, T.D. Lestari, R. Setiawan, J. Arifin dan T. Hariyanti Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran

## Abstrak
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  efektivitas berbagai konsentrasi  albumen  untuk separasi spermatozoa epididymis Domba  Garut. Penelitian  ini  menggunakan  semen  yang berasal  dari cauda epididymis  Domba  Garut  yang  baru  dipotong  dan  segera  diolah  di laboratorium.    Perlakuan  yang  digunakan  yaitu  media  separasi  menggunakan  berbagai kombinasi  konsentrasi  albumen  pada  lapisan  atas  dan  bawah  terdiri  dari  10%-30%,  10%- 50%,  10%-70%  dan  kontrol  (tanpa  media  separasi).  Penelitian  ini  dirancang  dengan menggunakan  Rangcangan  Acak  Lengkap  (RAL)  dengan  empat  perlakuan  dan  lima  kali ulangan.    Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  pada  lapisan  atas  kombinasi  konsentrasi albumen berpengaruh nyata (p<0.05) dapat meningkatkan jumlah spermatozoa X dari rasio alamiahnya,  dan  pada  lapisan  bawah  kombinasi  konsentrasi  albumen  berpengaruh  nyata (p<0.05)  dapat  meningkatkan  spermatozoa  Y  dari  rasio  alamiahnya.    Disimpulkan  bahwa kombinasi konsentrasi albumen yang digunakan cukup efektif digunakan untuk pemisahan spermatozoa X dan Y pada Domba Garut.
Kata kunci:  albumen, separasi spermatozoa, Domba Garut

## Abstract
The  objectives  of  this  research  were  to  study  the  effectivity  of  combination  of  albumen concentration  for epididymides sperm  separation  in  Garut  Ram.    This  research  use  semen from  new  slaughtered  Garut  Ram  cauda  epididymis  and  soon  was  processed  at laboratorium.  Treatments that  were separation  media  with  many combination of albumen concentration  at  upper  layer  and  bottom  layer  i.e  10%-30%,  10%-50%,  10%-70%  and control  (without  separation  media).    This  research  was  designed  by  Completely Randomized  Design  with  four  treatments  and  five  replications.    Result  of  this  research showed  that  at  upper  layer  combination  of  albumen  concentration  significantly  (p  <  0.05) increase  the  number  of  X  sperm  from  natural  ratio,  and  at  bottom  layer  combination  of albumen  concentration  significantly  (p  <  0.05)  increase  the number  of  Y  sperm  on  Garut Ram.
Key words:  albumen, sperm separation, Garut Ram

## Pendahuluan
Domba  Garut merupakan  plasma  nutfah Indonesia  yang  memiliki  keunggulan  seperti pertumbuhan yang baik dan sifat prolific.   Domba Garut  jantan  mempunyai  nilai  ekonomis  yang tinggi  dan  berperan  dalam  industri  pariwisata karena  biasa  digunakan  sebagai  domba  laga. Domba  Garut betina adalah  jenis  domba  tropis bersifat prolific yaitu  dapat  beranak  lebih  dari  2 (dua) ekor dalam 1 siklus kelahiran.
Mengingat  peran  Domba  Garut  sebagai domba laga yang memiliki resiko mengalami cacat fisik  atau  bahkan  kematian,  maka harus diupayakan suatu  teknologi  pemanfaatan  materi genetik  yang  dimilikinya.    Salah  satu  upaya  yang dapat  ditempuh  adalah  dengan  memanfaatkan
spermatozoa epididymis. Pemanfaatan spermatozoa  epididimis  dilakukan  apabila  ternak mengalami masalah dalam hal melakukan ejakulasi secara  alamiah,  cacat,  tidak  memberikan  respons terhadap penampungan semen, bahkan pada ternak yang mati secara mendadak.
Teknologi separasi spermatozoa akan sangat menguntungkan  apabila  dapat  diterapkan  untuk tujuan  mendapatkan  Domba  Garut  dengan  jenis kelamin  sesuai  keinginan. Dalam  hal  ini, pemanfaatan  spermatozoa  yang  membawa  sifat jantan  atau  yang  mengandung  kromosom  Y  akan sangat bermanfaat untuk pelestarian materi genetik unggul  dari  seekor  pejantan  Domba  Garut yang memiliki permasalahan seperti tersebut di atas.
Salah  satu  teknik  yang  dapat  digunakan untuk  separasi spermatozoa  adalah  dengan menggunakan albumen dengan kombinasi konsentrasi  albumen  pada  lapisan  atas  dan bawah sebesar  10%-30%  dan  10%-50% (Saili,  1999). Pada sapi perah, penggunaan kombinasi konsentrasi  albumen  tersebut  cukup  efektif  untuk merubah  rasio  spermatozoa  X  dan  Y  dari  rasio alamiah. Sejauh  ini  informasi  mengenai penggunaan kombinasi konsentrasi albumen terhadap  Domba  Garut belum  tersedia, sehingga serangkaian  penelitian harus  dilakukan  untuk mendapatkan informasi yang lengkap dalam kaitan aplikasi terhadap Domba Garut.

## Metode
Penelitian  ini  dilakukan  di  Laboratorium
Reproduksi
Ternak
Fakultas
Peternakan Universitas  Padjadjaran. Semen  yang  digunakan adalah semen asal cauda epididymis Domba Garut yang  baru  dipotong.    Albumen  yang  digunakan dilarutkan  dalam  larutan BO  (Brackett-Oliphant) dengan konsentrasi sesuai kebutuhan.
a. Persiapan Semen
Spermatozoa cauda epididymis  dikoleksi dengan cara membuat sayatan-sayatan pada cauda epididimydis  menggunakan  gunting  stainless  steel steril,  kemudian  dibilas-tekan  pada  petridis. Larutan  spermatozoa  yang  diperoleh  kemudian dicuci  dengan  cara  disentrifugasi  pada  kecepatan 2500  rpm  selama  10  menit,  untuk  memperoleh endapan spermatozoa.
b. Separasi Spermatozoa
Endapan  spermatozoa  yang  diperoleh kemudian ditambahkan larutan BO hingga konsentrasinya  mencapai 200 juta  sel/ml. Sampel semen sebanyak satu milliliter dimasukan kedalam kolum yang berisi medium pemisahan spermatozoa dan dibiarkan  mengendap  selama  satu  jam  pada suhu  28 o C.    Selanjutnya  setiap  fraksi  semen disedot dengan pipet dan ditampung dalam tabung sentrifus.  Sentrifugasi dilakukan dengan kecepatan 2500  rpm  selama  10  menit untuk  mendapatkan endapan  spermatozoa  yang  telah  bersih  dari medium  pemisahan. Kemudian ditambahkan kembali dengan  larutan  BO  untuk  selanjutnya dibuat preparat ulas.
c. Perlakuan
Perlakuan yang  dicobakan  pada  penelitian ini terdiri dari :
1. Kontrol :  semen  dilarutkan  dalam larutan  BO tanpa albumen.
2. Kombinasi konsentrasi albumen 10% (v/v) pada lapisan  atas  (A10/30)  dan  30%  (v/v)  pada lapisan bawah (B30).
3. Kombinasi konsentrasi albumen 10% (v/v) pada lapisan  atas (A10/50)  dan  50%  (v/v)  pada lapisan bawah (B50).
4. Kombinasi konsentrasi albumen 10% (v/v) pada lapisan  atas  (A10/70)  dan  70%  (v/v)  pada lapisan bawah (B50).
d. Peubah yang Diukur
Peubah yang diukur adalah rasio spermatozoa X dan Y pada lapisan atas dan lapisan bawah. Evaluasi dilakukan secara morfometri.
Pengukuran  sperma  dari  masing-masing lapisan  semen  dilakukan  dengan  cara  membuat preparat ulas terlebih dahulu.  Pengukuran panjang dan  lebar  kepala  spermatozoa  dilakukan  di bawah mikroskop  cahaya  pada  pembesaran  10  x  100 dengan menggunakan micrometer. Jumlah spermatozoa  yang dihitung  dari  masing-masing lapisan minimal 100 sel spermatozoa. Luas kepala spermatozoa dihitung dengan menggunakan metoda  integral Riemann (Purcell  dan  Vanberg, 1987)  dan  analisis  regresi  untuk  mengetahui hubungan antara ukuran panjang dan lebar dengan luas kepala spermatozoa.
LKS = (0.8988 x P x L) – 1.63
Keterangan: LKS :  luas kepala spermatozoa 0.8988 : faktor  koreksi  yang  dibangkitkan  dari data yang ada dengan menerapkan  metoda  integral  untuk menentukan luas kepala spermatozoa  dari  setiap  satuan  ukuran dan metoda regresi untuk menentukan  hubungan  ukuran  panjang dan lebar dengan luas kepala spermatozoa 1.63 : nilai konstanta regresi P : panjang kepala spermatozoa L : lebar kepala spermatozoa
e. Rancangan Percobaan dan Analisis Statistika Penelitian ini  akan  dilaksanakan secara eksperimental  laboratoris.  Penelitian  dirancang menggunakan Rancangan  Acak  Lengkap  (RAL) dengan empat perlakuan dan lima kali  ulangan. Analisis  data  dilakukan  pada  setiap  lapisan albumen terhadap masing-masing perolehan spermatozoa  X  dan  Y. Data  yang  diperoleh dianalisis menggunakan  Analisis  Varians,  dan perbedaan  antar  perlakuan  diuji  menggunakan  uji jarak berganda Duncan (Gaspersz, 1991).

## Hasil dan Pembahasan Karakteristik Semen Segar
Evaluasi  terhadap semen  segar  asal cauda epididimidis pada  penelitian  ini dilakukan  secara makroskopis  maupun  mikroskopis.    Evaluasi secara  makrokopis  meliputi    warna,  bau,  volume yang  terkoleksi  dan  pH,  sedangkan  secara mikroskopis  meliputi  konsentrasi  spermatozoa, motilitas  spermatozoa,  presentase  spermatozoa hidup,  persentase  membran  plasma  utuh  dan abnormalitas. Hasil  evaluasi  secara  makroskopis dan mikroskopis tercantum pada Tabel 1.
Tabel 1.  Karakteristik Semen Segar
Parameter Nilai Warna Volume Bau pH Konsentrasi Total Motilitas Presentase sperma hidup Presentase membrane plasma utuh (MPU) Abnormalitas Krem 0,52 ml Khas sperma 6,9 – 7,1 12.900 sel/ml 70,56% 80,03% 76,64% 9,85%
Warna  semen cauda epididymidis Domba Garut pada penelitian ini lebih cenderung krem, hal ini  disebabkan  konsentrasi spermatozoa  yang sangat  tinggi. Menurut  Senger  (1999),  konsentrasi pada cauda epididymidis  yang  normal  adalah 10.000 – 50.000  juta/ml, pada caput dan corpus 8.000 – 25.000 juta/ml, sedangkan menurut Rizal et al.  (2003)  bahwa  konsentrasi  spermatozoa cauda epididymidis pada Domba Garut rata-rata 13.993,33 juta/ml.
Derajat keasaman atau pH sangat mempengaruhi  hidup  dan  mati  spermatozoa. Variasi  pH  diduga  disebabkan  oleh  konsentrasi asam  laktat  yang  merupakan  produk  akhir metabolisme.  Tingkat  keasaman  semen  yang diperoleh  pada  penelitian  ini  adalah  6,9-7,1.  Hasil ini  relatif  berada  pada  kisaran  pH  semen  yang normal,  seperti  yang  dilaporkan  oleh  Rizal et  al. (2003),  menyatakan  bahwa  pH  semen  domba berkisar  6,8-7,2.    Menurut  Toelihere  (1993),  pada umumnya  spermatozoa  sangat  aktif  dan  tahan hidup lama  pada  pH  7,0,  namun  motilitas  parsial dapat dipertahankan pada pH antara 5,0-10.
Nilai  MPU  hasil  penelitian  ini  sebesar 76,56%. Keutuhan  membran  plasma  sangat dibutuhkan  untuk  menjamin  kelangsungan  hidup dan  keberhasilan  dalam  membuahi  sel  telur. Dengan  demikian,  nilai  yang  ditunjukan  oleh
presentase membran plasma utuh mempunyai nilai kolerasi  kuat  terhadap  nilai  persentase  hidup spermatozoa.  Apabila  membran  plasma  rusak, maka  proses  metabolisme  akan  terganggu  yang akan  menimbulkan  akibat  yang  fatal bagi spermatozoa  (Saili, 1999).
Motilitas  spermatozoa cauda epididymis hasil  penelitian  ini  sebesar  70,56%. Motilitas merupakan  kemampuan  gerak  maju  individu spermatozoa  didalam  lingkungan  zat  cair. Telah diketahui  bahwa  fungsi  pergerakan  spermatozoa adalah  membantu  spermatozoa  menembus  sel-sel pelindung  yang  mengelilingi  sel  telur  dan  juga untuk dapat melewati mukosa pada cerviks masuk kedalam  uterus,  terutama  pada  domba  dan kambing  yang  spermatozoanya  ditempatkan  di mulut  cerviks  pada  saat  inseminasi buatan. Toelihere  (1993),  menyatakan  bahwa  motilitas merupakan  ciri  utama  yang  dijadikan  patokan untuk  program  IB,  sedangkan  semen  yang  layak digunakan  dalam  program  IB  harus  memiliki motilitas  paling  sedikit  40%. Adapun  rataan motilitas  pada  Domba  Garut adalah  76,7%  (Rizal et al., 2003).
Abnormalitas  spermatozoa  dibedakan  atas abnormalitas  primer  dan  abnormalitas  sekunder. Abnormalitas primer terjadi pada saat spermatogenesis seperti kepala besar, kepala kecil, kepala  pipih  dan  lain-lain.  Abnormalitas sekunder terjadi ketika spermatozoa berada di dalam saluran epididimis,  seperti  terdapatnya  butiran  sitoplasma pada  semen  ejakulat,  spermatozoa  tanpa  kepala, ekor  melingkar,  ekor  melengkung  dan  lain-lain (Briz et al., 1996). Nilai abnormalitas spermatozoa yang digunakan dalam penelitian ini sebesar 9,85% lebih  rendah  daripada  yang  dilaporkan Rizal  dan Herdis (2005) yaitu bahwa presentase spermatozoa abnormal  dan  butiran  sitoplasma  spermatozoa segar cauda epididimidis  Domba  Garut  masing- masing rata-rata 10,83% dan 8,5%.
Berdasarkan evaluasi baik secara makroskopis maupun mikroskopis dapat dikatakan bahwa  kualitas  spermatozoa cauda epididymis Domba Garut hasil penelitian ini memenuhi syarat kualitas  untuk  inseminasi  buatan. Selanjutnya, semen  yang  memenuhi  syarat  kualitas  diproses untuk mendapatkan perlakuan separasi

## Konsentrasi Spermatozoa Setelah Separasi
Konsentrasi  spermatozoa  yang  terdapat dalam fraksi semen bagian atas dan bawah setelah pemisahan spermatozoa dapat dilihat pada Tabel 3. Hasil  pemisahan menunjukkan  bahwa  konsentrasi terendah  pada  lapisan  bawah  70%  yaitu  sebesar 18,8  juta  sel/ml.  Hal  ini  mungkin  disebabkan
tingkat  kepekatan  albumen  yang  padat  sehingga sperma  sulit  untuk  menembusnya,  sedangkan konsentrasi  terbesar  berada  pada  lapisan  atas A10%-70%  yaitu  sebesar  43,4  juta  sel/ml.  Hal  ini dapat disebabkan  karena  bertumpuknya  sperma pada bagian atas yang tidak bisa menembus bagian bawah  70%  yang  konsentrasinya  lebih  besar. Menurut  Ericsson et  al., (1973)  hal  tersebut disebabkab  karena penambahan  BSA  kedalam pengencer  meningkatkan  viskositas  dan  densitas pengencer  sehingga  membatasi  jumlah  sperma yang masuk, yaitu sperma yang benar-benar motil.
Tabel  2.  Konsentrasi Spermatozoa pada Setiap Fraksi Perlakuan Konsentrasi awal Konsentrasi setelah separasi (juta/ml) (juta/ml) A10%-30% 200 24,4 B30% 200 24,2 A10%-50% 200 38,5 B50% 200 25,2 A10%-70% 200 43,4 B70% 200 18,8

## Hasil Evaluasi terhadap Rasio Spermatozoa X dan Y secara Morfometrik
Evaluasi  spermatozoa  secara  morfometrik dilakukan dengan  cara  mengukur  panjang  dan lebar  dari  kepala  spermatozoa  dibawah  mikroskop cahaya  pembesaran  10  x  40  dengan  bantuan  alat micrometer.  Penetapan  rumus  untuk  menentukan luas kepala spermatozoa domba digunakan metode integral Reimann untuk menentukan luasan kepala spermatozoa  dari  setiap  pengukuran  luas  kepala spermatozoa. Hasil  evaluasi  terhadap  larutan semen sebelum dan setelah separasi menggunakan media albumen ditampilkan pada Tabel 3.
Tabel  3.    Rataan  Jumlah  Spermatozoa  Pembawa
Kromosom X dan Y Sebelum Separasi  (S0) dan  Setelah  Separasi Menggunakan Albumen Perlakuan Jumlah Spermatozoa Pembawa Kromosom (%) X Y S0 49,20 50,80 A10-30 60,60 39,40 B30 43,80 56,20 A10-50 59,80 44,28 B50 44,00 56,00 A10-70 61,60 38,40 B70 37,60 62,40
Berdasarkan Tabel  3 tampak  bahwa  rasio antara  spermatozoa  pembawa  kromosom  X  dan  Y pada  perlakuan  S0  hampir  seimbang  (49,201%  : 50,80%).    Di  lapisan  atas  (A)  pada  seluruh perlakuan, rasio spermatozoa pembawa kromosom X (spermatozoa X) lebih besar dibanding pembawa kromosom  Y  (spermatozoa  Y).    Sebailknya  di lapisan bawah (B), rasio spermatozoa Y lebih besar dibanding spermatozoa X.    Hal  ini dapat disebabkan karena  konsentrasi  albumen  yang tinggi  pada  lapisan  bawah  menyebabkan  sulit ditembus  oleh  spermatozoa,  hanya  spermatozoa yang  memiliki  motilitas  tinggi yang  mampu menembus  lapisan  bawah. Hasil ini  sesuai  dengan pendapat  Goodall  dan  Robert  (1976)  yang menyatakan bahwa spermatozoa pembawa kromosom  Y  memiliki  motilitas  yang  lebih  tinggi dibanding dengan spermatozoa pembawa kromosom  X.    Demikian  pula  Ericsson  dan  Glass (1982) melaporkan bahwa spermatozoa Y mempunyai  gerakan  yang  lebih  cepat  dan  ukuran yang  lebih  kecil  karena  mengandung  lebih  sedikit DNA dibandingkan spermatozoa X.
Hasil  penelitian ini  menunjukkan  bahwa lapisan  atas  dapat  digunakan  untuk  separasi spermatozoa  dengan  tujuan  untuk  memperoleh spermatozoa  X,  sedangkan  lapisan  bawah  untuk memperoleh  spermatozoa  Y.    Hasil  ini  juga mendukung laporan Saili (1999) bahwa spermatozoa  hasil  pemisahan  pada  fraksi  bawah dipandang  cukup  layak  untuk  menghasilkan spermatozoa  pembawa  kromosom  Y,  dan  fraksi atas cukup layak untuk menghasilkan spermatozoa pembawa kromosom X.
Hasil analisis  statistik terhadap  persentase sperma X pada lapisan atas ditampilkan pada Tabel 4.
Tabel  4. Perolehan Spermatozoa  X  pada  Fraksi Atas Perlakuan Spermatozoa X Signifikansi (0,05) A10%-70% A10%-30% A10%-50% S0/control ……….%.......... 61,60 60,60 59,80 49,20 a a a b
Keterangan  :  huruf    yang  sama  ke  arah  kolom menyatakan  perlakuan  tidak  berbeda nyata (p<0,05)
Berdasarkan Tabel 4. dapat  diketahui bahwa
perlakuan A10%-70% (61,6%) menghasilkan  rasio  sperma  X  paling  tinggi dibandingkan dengan perlakuan A10%-30%
(60,6%),  A10%-50%  (59,8%)  dan S0/kontrol (49,2%).  Hal  ini dapat  disebabkan semakin  tinggi konsentrasi  albumen  pada  lapisan  bawah  maka semakin sulit untuk sperma melakukan penembusan  terhadap  lapisan  albumen  tersebut. Dengan  demikian semakin  tinggi  konsentrasi albumen pada lapisan bawah maka semakin sedikit sperma  yang  terdapat  di  lapisan  bawah tersebut yang mengakibatkan sperma akan terkonsentrasi di lapisan atas.  Selain itu, bentuk dan berat sperma X lebih  besar  dengan  pergerakan  yang  lambat menyebabkan hanya  sebagian  kecil  saja sperma  X yang  menembus  lapisan  bawah. Hal tersebut sesuai  dengan  hasil  penelitian  Ke-hui  cui  dan Matthews  (1993)  yang  menunjukkan  bahwa ukuran  spermatozoa  X  lebih  besar  dibanding spermatozoa Y.
Hasil  analisis ragam  menunjukkan  bahwa perlakuan  berpengaruh  nyata  (p<0,05)  terhadap persentase spermatozoa X pada lapisan atas. Hasil uji Duncan menunjukkan bahwa persentase sperma X  dari  perlakuan  A10%-70%,  A10%-50%  dan A10%-30%  tidak  berbeda  nyata  (p<0,05),  namun ketiganya nyata  lebih  tinggi  dibandingkan  dengan S0/kontrol. Hasil  ini  menunjukkan  bahwa konsentrasi  albumen  yang  digunakan  pada  lapisan atas  cukup  efektif  untuk  meningkatkan  perolehan spermatozoa X dari rasio alamiahnya.
Hasil analisis  statistik terhadap  sperma  Y pada lapisan bawah ditampilkan pada Tabel 5.
Tabel  5. Perolehan Spermatozoa  Y  pada  Fraksi
Bawah Perlakuan Spermatozoa Y Signifikansi (0,05) B70% B50% B30% S0/control ……….%.......... 62,4 56,0 56,2 50,8 a b b b
Keterangan  :  huruf  yang  sama  ke  arah  kolom menyatakan  perlakuan  tidak  berbeda nyata (p<0,05)
Berdasarkan  Tabel  5. dapat  diketahui bahwa  lapisan  B70%  (62,4%)  menghasilkan persentase  sperma  Y paling tinggi  dibandingkan dengan  perlakuan  B50%  (56,2%),  B30%  (56,0%), dan S0/kontrol  (50,8%).  Hasil  analisis  ragam menunjukkan  bahwa  perlakuan  berpengaruh  nyata (P<0,05)  terhadap  persentase  sperma  Y.  Hasil  uji Duncan  menunjukkan  bahwa  perlakuan  B70% menghasilkan  persentase  sperma  Y  nyata  lebih tinggi  dibandingkan  perlakuan  lainnya,  namun antara  B50%,  B30%  dan  S0  tidak  berbeda  nyata.
Walaupun  secara  statistik  konsentrasi  albumen 30%  dan  50%  pada  lapisan  bawah  tidak menunjukkan pengaruh yang nyata dalam peningkatan  perolehan  spermatozoa  Y,  metode separasi tersebut  masih dapat  meningkatkan perolehan  jumlah  sperma  Y  dari  rasio  alamiahnya yang  tentunya  dapat  meningkatkan  peluang  untuk memperoleh jenis kelamin jantan.

## Kesimpulan
Berdasarkan  hasil  dan  pembahasan  dapat disimpulkan bahwa kombinasi konsentrasi albumen  10%-30%,  10%-50%  dan  10%-70% cukup  efektif  untuk  digunakan  sebagai  media separasi spermatozoa epididymis Domba Garut.

## Daftar Pustaka
Briz, M.D., S. Bonet,  B. Pinart and R. Camps.  1996.
Sperm Malformation throughout the Boar Epididymal Factors that Protect Ejakulated Bovine Sperm during In Vitro Storage. J. Reprod. fertil. 117: 199-205.
Ericsson,  R.J.  and R.H.  Glass.    1982.  Functional differences  between  sperm  bearing  the  X- or  Y- chromosome. In Prospects for Sexing Mammalian  Sperm.    S.P.  Amann  and  G.E. Seidel,  Jr.  (Ed.).    1982.  Colorado  Ass.  Univ. Press, USA.
Ericsson,  R.J.,  C.N.  Langevin  and  M.  Nishino.    1973. Isolation  of  fractions  rich  in  human  Y  sperm. Nature (246) : 421-424.
Gaspersz,  V.  1991. Teknik  Analisis  dalam  Penelitian Percobaan. Tarsito, Bandung.
Goodall,  H.  And  A.M.  Roberts.    1976.    Differences  in motility of human X and Y bearing spermatozoa. J. Reprod. Fertil. (48) : 433-436.
Ke-hui Cuin and  C.D. Matthews.  1993.  X larger than Y.  Nature (366) : 117-118.
Purcell, E.J. and Van Berg. 1987. Kalkus and Geometry Analisis. Terjemahkan  oleh  Susila,  I.Y.,  B. Kartasasmita dan Rawuh. Erlangga. Jakarta.
Rizal,  M.  dan  Herdis.  2005. Daya  Hidup  Spermatozoa
Epididimis Domba Garut Yang
Dikriopreservasikan  Menggunakan  Modifikasi Pengencer Tris. Hayati 12: 61-66.
Rizal,  M.,  M.R.  Toelihere,  T.L.  Yusuf,  B.  Purwantara dan  P.  Situmorang.  2003.    Pengaruh  lama penyimpanan  epididimis  domba  pada  suhu  5 0 C terhadap kualitas spermatozoa epididimis. Seminar Nasional dan Gelar Produk “Pengelolaan dan Pemanfaatan Keanekaragaman Hayati dalam Kerangka Pembangunan Berkelanjutan”. Pusat Studi Ilmu Hayati, Lembaga Penelitian, IPB.  Bogor.
Saili,  T.    1999.    Efektivitas  Penggunaan  Albumen Sebagai Medium Separasi Dalam Upaya Mengubah Rasio Alamiah Spermatozoa
Pembawa Kromosom X dan Y pada Sapi.  Tesis. PPS IPB, Bogor.
Senger,  P.L.    1999.    The  organization  and  function  of the male reproduction system. In :  Pathways to Pregnancy  and  Parturition.    Current  Conception,
Inc., Pullman. Pp.. 32-57.
Toelihere,  M.R.    1993.
Inseminasi  Buatan  pada Ternak.  Angkasa-Bandung.