## Aktivitas Anti Oksidan Fikosianin Dari
Spirulina Sp. Menggunakan Metode Transfer Elektron Dengan DPPH ( 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil )
Ali Ridlo * , Sri Sedjati, dan Endang Supriyantini
Jurusan Ilmu Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro Jl. Prof. Soedarto, SH. Kampus UNDIP Tembalang, Semarang 50275 E-mail :aliridlo26@gmail.com

## Abstrak
Mikroalga Spirulina sp. Memiliki kandungan fikosianin yang tinggi. Fikosianin berpotensi sebagai  pewarna  biru  alami  dan  antioksidan.Tujuan  dari  penelitian  ini  adalah  untuk menentukan aktivitas antioksidan fikosianin dari ekstrak Spirulina sp.dengan metode transfer elektron  dengan  DPPH  (1,1- diphenyl  picrilhydrazil ). Spirulina sp.  Diekstraksi  dengan  akuades dan  buffer  fosfat  pH  7.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  kandungan  fikosianin Spirulina sp.  Yang  diekstraksi  dengan  pelarut  aquadest  adalah  45,16±1,13  mg/g  dw  dan 60,51±0,11mg/g dw yang diekstraksi dengan pelarut buffer fosfat pH 7. Aktivitas antioksi dan fikosianin yang diekstraksi dengan aquades lebih tinggi (IC 50 = 110,80 ppm) dibandingkan fikosianin yang diekstraksi dengan buffer fosfat pH 7 (IC 50 =186,76 ppm). Keduanya termasuk dalam kategori antioksidan yang lemah.
Kata kunci : Spirulina sp., Fikosianin, Aktivitas Antioksidan, IC 50

## Abstract
Microalga Spirulina sp. has a high content of phycocyanin. Phycocyanin has potential as  a  natural  blue  colorant  and  antioxidants.  The  aim  ofthis  study  wasdetermine  the antioxidant  activity  of  phycocianin  extracted  from  Spirulina  sp  by  electron  transfer  method with DPPH (1,1-diphenyl picrilhydrazil). Spirulina sp was extracted by aquadest and phosphat buffer  pH  7.  The  results  showed  that  content  of phycocyanin  of  Spirulina  sp.  extracted  with aquadest was 45.16±1.13 mg/g dw and 60.51±0.11 mg/g dw that extracted with phosphate buffer  pH  7.  Antioxidant  activityof  phycocianin  extracted  with  aquadest  was  higher (IC 50 =110,80 ppm)   than phycocianin extracted with phosphate buffer pH7(IC 50 =186.76ppm). Both are included in the weak antioxidants category.
Keywords : Spirulina sp., Phycocyanin, Antioxidant Activity, IC 50

## PENDAHULUAN
Spirulina sp. merupakan mikro- organisme autrotrof berwarna hijau- kebiruan dengan sel berkolom membentuk filamen  terpilin  menyerupai  spiral  (helix), sehingga disebut alga biru-hijau berfilamen (cyanobacterium)  (Richmond  1988 dalam Pamungkas,  2005).Bentuk Spirulina sp menyerupai benang, merupakan rangkaian  sel  yang  berbentuk  silindris dengan  dinding  sel  berdiameter  1-12 μm.Filamen Spirulina sp hidup berdiri sendiri
dan  dapat  bergerak  bebas  (Richmond, 1988 dalam Pamungkas, 2005).
Spirulina ,  sp.  mengandung  pigmen biru  fikosianinsekitar  20%  berat  keringnya. Kandungan  fikosianin  dalam Spirulina ,  sp. tergantung  pada  suplai  nitrogen  (Boussiba dan  Richmond  1979;  Arlyza,  2005). Fikosianin  menghasilkan  warna  biru  cerah (Sarada et al ., 1999; Jespersen et al ., 2005; Yan et  al .,  2011).  Fikosianin  merupakan
pigmen  yang  berasosiasi  dengan  protein dan  bersifat  polar  serta  larut  air,    dapat diekstrak dengan menggunakan pelarut air atau  buffer  (Masojidek et  al .,  2004). Fikosianin telah digunakan sebagai pewarna  alami  makanan,  kosmetika,  dan obat-obatan.Fikosianinmerupakan  protein kompleks  yang  mampu    meningkatkan kekebalan  tubuh,  bersifat  antikanker
(Kozlenko
dan Henson, 1998),dan antioksidan.
Antioksidan  merupakan  senyawa pemberi  elektron  ( electron  donor )  yang mampu  menginaktivasi  berkembangnya reaksi  oksidasi,  dengan  cara  mencegah terbentuknya radikal bebas. Saat ini,antioksidan  yang  banyak  digunakan dalam
bahan pangan umumnya merupakan  antioksidan  sintetik  seperti Propil Galat (PG), Tertiary Butylhydroquinone (TBHQ), Butylated Hydroxy  Toluene (BHT),  dan Butylated Hydroxy Anisole (BHA).
Penggunaan antioksidan sintetik sebagai bahan pangan tidak  direkomendasikan  oleh  Departemen Kesehatan karena diduga dapat menyebabkan kanker (karsinogenik) (Barus, 2009).  Hal  ini  mendasari  untuk  mencari senyawa  antioksidan  dari  bahan  alami. Antioksidan  alami  merupakan  antioksidan yang  diperoleh  dari  ekstrak  bahan  alami. Saat  ini  antioksidan  alami  umumnya berbahan  dasar  tumbuhan  tingkat  tinggi seperti daun pandan, daun suji, dan kunyit.
Aktivitas  antioksidan  dapat  dideteksi menggunakan  beberapa  metode,  salah satunya  adalah  metode  transfer  elektron menggunakan  radikal  DPPH( 1,1-difenil-2- pikrilhidrazil ). Uji DPPH adalah suatu metode yang efektif dan cepat untuk memperkirakan  aktivitas  antioksidan.Prinsip metode  ini  adalah  mengukur  daya peredaman ekstrak suatu bahan terhadap radikal bebas DPPH (Damayanti, 2004).
Sumber  antioksidan  alami  yang banyak  dikenal  masyarakat  umumnya berasal  dari  tumbuhan  darat  dan  masih jarang  yang  mengetahui  potensi  biota  air sebagai sumber senyawa antioksidan.Berdasarkan hal tersebut, perlu dilakukan  penelitian  tentang  potensi aktivitas antioksidan fikosianin yang
diekstrak dengan pelarut air dan buffer dari Spirulina sp.  dengan  metode  transfer elektron DPPH.
Tujuan  dilakukannya  penelitian  ini adalah  mengetahui  potensi  antioksidan fikosianin yang diekstraksi  dari spirulina sp.

## MATERI DAN METODE
Materi  yang  digunakan  adalah mikroalga Spirulina spdalam  bentuk kering (bubuk)  yang  diperoleh  dari  Balai  Besar Pengembangan  Budidaya  Air  Payau Jepara  (BBPBAP).  Pelarut  yang  digunakan adalah  akuades  dan  larutan  buffer  fosfat yang  dibuat  dengan  mencampurkan KH 2 PO 4 dengan NaOH.
Bahan  kimia  untuk  uji  aktivitas antioksidan  dengan  metode  DPPH  adalah 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
(DPPH),aquades,  metanol  (p.a.),    NaOH (p.a.),  KH 2 PO 4 (p.a.)  dan  kertas  saring Whatman no. 42. Alat-alat yang digunakan meliputi  neraca  analitik,  mortar  dan penggerus,  vortex,  refrigerator,  sentrifuse dan spektrofotometer UV-Vis.
Prosedur  kerja  untuk  penelitian  terdiri dari  beberapa  tahapan,  yaitu  persiapan pelarut  buffer  KH 2 PO 4 –  NaOH  pada  pH  7, ekstraksi  pigmen  fikosianin,  analisis  kadar pigmen  fikosianin,  pengukuran  aktivitas penangkapan  radikal  bebas  (antioksidan), dan pembuatan  spektra UV-Visible.
Ekstraksi  dilakukan  dengan  metoda coldmaceration dan
freezing-
thawing .Sampel
kering Spirulina spdigerusdengan  mortar  sampai  halus, kemudian  dimaserasi  dalam  aquades dengan  perbandingan  1:100  (w/v)  dan dihomogenasi  dengan  vortex  selama1 menit.  Sampel  dibekukan  dalam freezer selama  12  jam,  dilanjutkan  proses thawing (pencairan  sampel  beku)  selama  12  jam pada  suhu  kamar.  Proses freezing- thawing dilakukan 2 siklus. Filtrat disentrifugasi  pada  kecepatan  3000  rpm selama  30  menit,  kemudian  disaring sehingga di peroleh ekstrak kasar fikosianin Spirulina sp . Filtrat fikosianin diukur absorbansinya  dengn  Spektrofotometer
UV-VIS pada panjang gelombang 400 – 800 nm.  Kadar  fikosianin  dihitung  menurut Bennet  dan  Bogorad  (1973)  sebagai berikut:
Dimana : PC   :  Kadar Phycocyanin A 620 :  Nilai absorbansi  pada panjang gelombang
620 nm
A 650 :  Nilai absorbansi pada panjang gelombang
650 nm

## Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Fikosianin
Satu  ml  larutan  sampel  dengan pelarut aquades dengan konsentrasi  (0,00; 11,25; 22,50; 45,00; 90,00) ppm  dan pelarut buffer  fosfat  dengan  konsentrasi  (0,00; 25,70;  51,40;  102,81;  205,61)  ppm  masing- masing dimasukkan ke dalam vial ditambah  dengan  3  ml  reagen  DPPH  0,1 mM,  Larutan  diinkubasi  pada  suhu  37 0 C selama  30  menit.  Pengukuran  absorbansi dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 517 nm. Blanko dibuat dari 1 ml DPPH  tanpa  ekstrak  pada  tiap  seri konsentrasi  ditambah  dengan  3  ml metanol. Persentase inhibisi dihitung dengan rumus :
Dimana : A 0 :  absorbansi blanko A 1 :  absorbansi sampel

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Fikosianin  merupakan  pigmen  alami dari  Spirulina  sp  yang  bersifat  polar, sehingga  dalam  ekstraksinya  digunakan pelarut yang bersifat polar.Ekstraksi Spirulina sp  dengan  pelarut  buffer  fosfat  pH7 menghasilkan fikosianin lebih tinggi (60,51±0,11  dw)  dibandingkan  dengan pelarut aquades  (45,16±1,13 dw)  (Tabel 1). Hal  ini  diduga  karena  pelarut  buffer  fosfat dapat  menarik  pigmen  lebih  kuat  dari dalam sel karena mampu
mempertahankan  kondisi  asam  maupun basa.  Fungsi  larutan  penyangga  adalah menstabilkan  pH,  sehingga  setelah  proses ekstraksi,  larutan  fikosianin  dalam  kondisi stabil  dan  mampu  memperkecil  proses degradasi  pigmen.    Degradasi  fikosianin akan  terjadi  jika  derajat  keasaman  turun atau alkalinitas meningkat (stabil pH 4-9)
Kemurnian  fikosianindapat  diketahui berdasarkan rasio absorbansi pada   = 620 nm dan  absorbansi pada   = 280 nm.  Hasil penelitian  menunjukkan  bahwa  fikosianin yang  diekstraksi  dengan  pelarut  buffer fosfat1,74  ±  0,03  lebih  tinggi  kemurniannya daripada fikosianin yang diekstraksi dengan  akuades  1,61  ±  0,05.  Kemurnian fikosianin  pada  penelitian  ini  sudah memenuhi  syarat  bahan  pangan  berkisar antara 1,61-1,74 (Hemlata et al. , 2011).
Kandungan  fikosianin  pada Spirulina sp.  berkisar  1-10%  berat  kering  (Sedjati et al., 2012).  Sumber  lain  menyebutkan kandungan  fikosianin  dalam  10  gram Spirulina sp  kering  yaitu  1400  mg  atau sekitar  14%  (Henrikson,  2000)  dan  bisa mencapai  20%  dari  total  protein  selnya (Thomas, 2010). Kandungan pigmen fikosianin  yang  tinggi  tersebut,  menjadi daya  tarik  bagi  pengembangan  dan dianggap  memiliki  pasar  yang  potensial dalam  industry  pangan  dan  kesehatan (Chrismandha et al., 2006).
Uji DPPH dilakukan untuk mengetahui nilai  hambat  ekstrak  yang  berpotensi sebagai  antioksidan.IC 50 fikosianin  diamati dengan  melihat  nilai  persentase  inhibisi absorbansi  fikosianin  pada  tiap  seri konsentrasi  dibandingkan  dengan  larutan standar, kemudian dihitung dengan menggunakan analisis regresi linier sederhana.  Hasil  penelitian  menunjukkan fikosianin  yang  diekstraksi  dengan  pelarut aquades memiliki IC 50 sebesar 110,80 ppm, sedangkan  dengan  pelarut  buffer  fosfat adalah 186,76 ppm. (Tabel 2 dan 3).
Nilai IC 50 berbanding terbalik dengan aktivitas  antioksidan.  Semakin  rendah  nilai IC 50 maka semakin kuat aktivitas antioksidannya.  Fikosianin  dari  ekstrak Spirulina sp.  dengan  pelarut  aquades memiliki  nilai  IC 50 sebesar  110,80  ppm, artinya bahwa konsentrasi 110,80 ppm dari
Tabel 1. Kadar dan Kemurnian Fikosianin Spirulina sp
No. Pelarut Fikosianin (ppm) Fikosianin (mg/g sampel) Kemurnian (A620/A280) 1. Aquades 451,65±11,26 45,16±1,13 1,61±0,05 2. Buffer KH 2 PO 4 - NaOH 605,08±1,29 60,51±0,11 1,74±0,03
Tabel 2. Nilai IC 50 Ekstrak Kasar Fikosianin dengan Pelarut Aquades
Konsentrasi (ppm) % inhibisi IC 50 (ppm) 0,00 0,00 110,80 11,25 5,87 22,50 12,84 45,00 23,38 90,00 39,57
Tabel 3. Nilai IC 50 Ekstrak Kasar Fikosianin dengan Pelarut Buffer Fosfat pH 7
Konsentrasi (ppm) % inhibisi IC 50 (ppm)
0,00 0,00
186,76 25,70 6,48 51,40 14,04 102,81 32,13 205,61 53,29
ekstrak  akuades  dapat  menghambat  50% aktivitas  radikal  bebas  DPPH,  sedangkan nilai IC 50 ekstrak buffer adalah 186,76 ppm, berarti  bahwa  konsentrasi  186,76  ppm ekstrak  buffer  fosfat  dapat  menghambat 50% aktivitas radikal bebas DPPH.
Suatu  senyawa  dikatakan  memiliki aktivitas  antioksidan  apabila  senyawa tersebut  mampu  mendonorkan  atom hidrogennya  pada  radikal  bebas  DPPH yang ditandai dengan terjadinya perubahan  warna  ungu  menjadi  kuning pucat  (Molyneux,  2004).  DPPH  memiliki serapan  yang  kuat  pada  panjang gelombang  517  nm  dalam  bentuk teroksidasi  (Masuda,  1999).  Beberapa komponen Spirulina sp.  yang  diduga memiliki  aktivitas  antioksidan adalah senyawa  fenolat,  karotenoid,  pigmen fikobiliprotein,  klorofil,  dan  turunan  klorofil (Estrada et al., 2001). Fikosianin (fikobiliprotein)  adalah  antioksidan  alami
atau primer dari kelompok phytochemical , (Hamid et al., 2010).
Sesuai  klasifikasi  nilai  IC 50 ,    ekstrak aquades fikosianin memiliki potensi antioksidan  dengan  kategori  sedang karena mempunyai nilai IC 50 antara 101-150 ppm , sedangkan ekstrak fikosianin dengan buffer  fosfat  termasuk  kategori  lemah (antara  150  –  200  ppm)(Mardawati et al. ,2008).Perbedaan  potensi  antioksidan  ini diduga karena adanya senyawa kelompok lain  di  luar  fikosianin  yang  ikut  terekstrak dan  juga  memiliki  kemampuan  mereduksi radikal bebas DPPH.
Aktivitas  antioksidan  dari  ekstrak Spirulina  sp tergolong  lemah,  diduga karena  merupakan  ekstrak  kasar,dimana dalam  ekstrak  ini  belum  murni  senyawa antioksidan.  Hal  ini  sesuai  dengan  Wikanta et  al. (2005),  yang  menyatakan  bahwa rendahnya  aktivitas  antioksidan  dapat
dikarenakan  adanya  zat  pengotor  yang terdapat  dalam  ekstrak.  Selain  itu  Spirulina yang  diekstraksi  berupa  serbuk  kering. Proses  pengeringan  sangat  berpengaruh atau merusak senyawa antioksidan. Sampel  segar  akan  mempunyai  aktivitas antioksidan  yang  lebih  baik  daripada sampel kering (Damar et al ., 2014).

## KESIMPULAN
Ekstrak fikosianin Spirulina sp berpotensi  sebagai  antioksidan  alami. Penggunaan pelarut yang berbeda memberikan  hasil  aktivitas  antioksidan yang  berbeda  pula.  Pelarut  buffer  fosfat menghasilkan  ekstrak  fikosianin  yang  lebih banyak  dan  lebih  murni  dibanding akuades, tetapi aktivitas  antioksidan ekstrak  akuades  lebih  kuat  daripada pelarutbuffer.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih kepada  reviewer  dan  semua  pihak  yang telah  membantu  dalam  menyelesaikan penulisan karya ilmiah ini.

## DAFTAR PUSTAKA
Arylza, I.S. 2005.Phycocyanin dari Mikroalga Bernilai Ekonomis Tinggi sebagai Produk Industri.Oseana.XXX(3): 27-36.
Barus, P.
2009.Pemanfaatan Bahan Pengawet  dan  Antioksidan  Alami pada Industri Bahan
Makanan.
Universitas Sumatra Utara, Medan. Bennett,  A.  and  L.  Bogorad.    1973.
Complementary
Chromatic Adaptation  in  a  Filamentous  Blue- Green Alga. J. Cell. Biol . 58: 419-435.
Boussiba, S. and Richmond, A. 1979.Isolation  and  Purification  of Fikosianin  from  The  Blue  Green  Alga Spirulina platensis. Arch. Microbiol ., 120: 155-159.
Chrismandha,  T.,  Panggabean  L.M.,  dan Mardiati,  Y.  2006.Pengaruh  Konsentrasi Nitrogen dan Fosfor terhadap Pertumbuhan,  Kandungan  Protein, Karbohidrat, dan Fikosianin pada Kultur
Spirulina  fusiformis .  Berita  Biologi  8(3)  : 163-169.
Damar,  A.R.,  M.R.J.  Runtuwene  dan  D. Silvia.2014.  Kandungan  Flavonoid  dan Aktivitas  Antioksidan  Total  Ekstrak Etanol Daun Kayu Kapur  ( Melanolepsis multiglandulosa Reinch). Jurnal  Ilmiah Farmasi  FMIPA  UNSRAT,  Manado . Vol.3(4): 11-21. Damayanti,  E.  2004.Mempelajari  Aktivitas Antioksidan dan Antibakteri dari Ekstrak Campuran  Rempah  Minuman Cinna- ale .(Skripsi). Fakultas Teknologi Pertanian,  Institut  Pertanian  Bogor, Bogor. 52 p.
Estrada,  J,E.P.,  P.B.  Bescos  and  A.M.  V. Fresno.  2001.    Anti  Oxidant  Activity  of Different
Fractions of
Spirulina platensis Protean Extract. Il Farmaco 56: 497-500.
Hamid,  A.A.,  O.O  Aiyelaagbe,  L.A.  Usman, O.M.  Ameen,  dan  A.  Lawal.  2010.
Antioxidant : its Medidal and Pharmacological  Applications.  African Journal of Pure and Applied Chemistry vol.4(8):142-151
Hemlata,  G.  Pandey,  F.  Bano.  &  T.  Fatma. 2011. Studies of Anabaena sp. NCCU-9 with special reference to phycocyanin.
J. Algae Biomass Utln . 2(1): 30-51. Henrikson, R. 2000.Earth Food
Spirulina.Essential  Fatty  Acids  and Phytonutrients.Ronore  Enterprises,  Inc. California.
Jespersen,  L.,  L.D.  Stremdahl,  K.  Olsen,and L.H.Skibsted.    2005.    Heat  and  Light Stability  of  Three  Natural  Blue  Colorant for Use in Confectionery and Beverages. Europ.  Food  Res.  Technol. 220(3-4): 261-266.
Kozlenko,  R,  dan  Henson,  RH.  1998. Spirulina:    Effects  on  the  AIDS  Virus, Cancer  and  the  Immune  System.
Spirulina
Health
Library.www.
Spirulina.com. (1 Nopember 2000). Mardawati,  E.,  Fitry,  F.,  dan  Herlina,  M.
2008.Kajian Aktivitas Antioksidan Ekstrak Kulit Manggis ( Garcinia mangostana L) dalam  Rangka  Pemanfaatan  Limbah Kulit
Manggis
di Kecamatan Puspahiang  Kabupaten  Tasikmalaya. Fakultas  Teknologi  Industri.  Universitas Padjadjaran, Bandung.
Masojidek,  J.,  M.  Koblizek,  and  G.  Torzillo. 2004.    Photosynthesis  in  Microalgae in :
A.  Richmond  (Ed).    Handbook  of Microalgal Culture: Biotechnology and Applied  Phycology.    Blakwell  Science Ltd., Iowa. p.20-39.
Masuda,  T.  1999.  Evaluation  of  the Antioxidant    Activity  of  Environmental Plants:  Activity  of  the  Extract  from Sheashore  Plants.  J .  Agronomy  Food Chemistry. 47: 1749-1754.
Molyneux,  P.  2004.  The  Use  of  Stable  Free Radical  Diphenylpicrylhydrazyl  (DPPH) for Estimating Antioxidant. Songklanakarin J. Sci. Technol . 26(2):212.
Pamungkas,  A.  2005.  Sistem  Taksonomi hewan  dan  tumbuhan . ANDI  , Bandung.
Sarada, R., M.G. Pillai, dan G.A. Ravishankar.  1999.   Phycocyanin from Spirulina sp.: Influence of  Processing of Biomass on Phycocyanin Yield, Analysis of Efficiency of Extraction Methods and Stability  Studies  on  Phycocyanin. J. Proc. Biochem. 34:795-801.
Sedjati, S., E. Yudiati dan Suryono.2012. Profil Pigmen Polar dan Non Polar Mikroalga Laut Spirulina sp  dan  Potensinya sebaagai  Pewarna  Alami. Jurnal  Ilmu Kelautan ., Vol. 17 (3): 176 – 181.
Thomas, S.S. 2010.The Role of Parry Organic Spirulina in Health Management. India: Parry  Nutraceuticals,  Division  of  EID Parry (India) Ltd.
Wikanta,  T.,  Januar  H.D.  dan  Nursed,  M. 2005. Uji  Aktivitas  Antioksidan, Toksisitas dan  Sitotoksisitas  Ekstrak  Alga  Merah Rhodymenia palmate . Jurnal Penelitian Perikanan Indonesia Vol. 11(4): 12-25. Yan, S., Zhu LP,  Su HN,  Zhang XY, Chen XL,
Zhou  BC,  and  Zhang  YZ.    2011.  Single- step Chromatography for Simultaneous Purification  of  C-Phycocyanin  and Allophycocyanin  with  high  Purity  and Recovery  from Spirulina ( Arthrospira ) platensis . J. Appl. Phycol. 23: 1-6.