## UJI TOKSISITAS EKSTRAK PIGMEN DARI MAKROALGA COKLAT Sargassum sp
Rini Prastyawati Program Studi Teknik Analis Kesehatan Fakultas Ilmu-Ilmu Kesehatan, Universitas Sains dan Teknologi Jayapura Jl. Raya Sentani, Padang Bulan. Jayapura 99351
riniprastyawati@ymail.com

## Abstrak
Salah satu alternatif sumber antitumor adalah makroalga, khususnya Sargassum  sp karena mengandung  senyawa  pigmen.  Tujuan  penelitian  ini  adalah  menentukan  toksisitas  ekstrak pigmen dari makroalga coklat Sargassum sp. Penelitian diawali dengan mengisolasi ekstrak pigmen Sargassum sp dengan cara maserasi bertingkat menggunakan pelarut n-heksan, etil asetat  dan metanol.  Uji  toksisitas  dilakukan  dengan  menentukan  nilai  LC 50 dengan  metode Brine  Shrimp  Lethality  Test  (BSLT).  Hasil  penelitian  menunjukkan  ekstrak  pigmen  fraksi  n- heksan, fraksi etil asetat dan fraksi metanol memiliki nilai LC 50 berturut-turut adalah 131.07; 729.12; dan 555.27 ppm. Ekstrak pigmen fraksi n-heksana dari makroalga coklat Sargassum sp  memiliki  toksisitas  yang  paling  tinggi  dibandingkan  fraksi  lainya  dan  berpotensi  sebagai antitumor.
Kata kunci : Ekstrak pigmen, Sargassum sp, Toksisitas, LC 50

## 1.  PENDAHULUAN
Penelitian  yang  mengarah  pada  penemuan senyawa  antioksidan  yang  dapat  menghambat tumor  menjadi  target  untuk  dikembangkan. Sampai  saat  ini  telah  dilakukan  skrining  terhadap sekitar  15.000  produk  bahan  hayati  laut  untuk aktivitas  biologis  dan  45  diantaranya  telah dilakukan  potensinya  sebagai  bahan  obat  bahkan telah  dilakukan  uji  preklinis  dan  klinis  (Milledge, 2011).
Dalam  kurun  waktu  tiga  dekade  terakhir, penelitian  untuk  mengungkap  potensi  bioaktivitas makroalga meningkat tajam, dan makroalga tropis ternyata  kaya  akan  senyawa  bioaktif  untuk keperluan  biomedis.  Sekarang  ini,  mulai  banyak penelitian  mengenai  senyawa  pigmen  yang berasal  dari  laut  yang  akan  menjadi  sumber pigmen  alami  terbarukan  dan  berkelanjutan  yang memiliki  potensi  sebagai  antitumor.  Biota  laut seperti  alga,  terumbu  karang,  dan  bakteri  serta organisme  laut  lainnya  mampu  menghasilkan senyawa bioaktif pigmen (Arlita et al., 2013). Salah satu  jenis  pigmen  alami  selain  klorofil  adalah karotenoid  yang  memiliki  potensi  yang  besar  baik pada  masa  sekarang  maupun  masa  depan sebagai antioksidan dan antitumor. Lebih dari 700 struktur  berbeda  dari  karotenoid  dan  terdapat  40 jenis  karotenoid  telah  ditemukan  (Stafsnes et  al., 2010).
Alga  merupakan  jenis  organisme  laut  yang mampu menghasilkan  pigmen  alami  sendiri  (Stahl dan  Sies,  2003).  Salah  satu  jenis  alga  yang  kaya akan  senyawa  pigmen  adalah  alga  coklat.  Alga coklat  kaya  akan  fukoxantin,  pigmen  fotosintesis
(klorofil  a  dan  c)  (Zapata et  al., 2006),  β-karoten dan  violaxantin  (Burtin,  2003).  Hasil  penelitian Merdekawati  (2009),  menunjukkan  komposisi karotenoid  pada  alga  coklat Sargassum  sp yaitu fukosantin, xantofil dan β-karoten.
Ekstrak pigmen karoteniod lutein dari mikroalga Chlorella pyrenoidosa dilaporkan mempunyai  aktivitas  antioksidan  (Kusmiati et  al., 2010). Secara umum alga coklat juga mengandung
violaxantin, flavosantin dan neosantin a dan b sedangkan kelompok karotenoid  yang  umum  adalah  β-karoten  yaitu karotenoid  yang  tidak  mengandung  atom  oksigen dalam  strukturnya.  Golongan  senyawa  ini  sudah dikenal  memiliki  aktivitas  antitumor  yang  baik. Menurut  penelitian  Yudiati et  al (2011),  ekstrak pigmen  kasar  dari Spirulina  sp yang  diperoleh mengandung  pigmen  β-karoten  dan  klorofil  α menunjukkan toksisitas yang tinggi.
Penelitian  ini  bertujuan  untuk  menentukan toksisitas  ekstrak  pigmen  dari  makroalga  coklat Sargassum  sp .  Informasi  tentang  toksisitas  dari Sargassum  sp tersebut  belum  pernah  dilakukan. Atas  dasar  pemikiran  tersebut,  maka  dilakukan penelitian  tentang  uji  toksisitas  dari  ekstrak pigmen  yang  diisolasi  dari  makroalga  coklat Sargassum sp.

## 2.  METODOLOGI
Penelitian  ini  dilaksanakan  di  Laboratorium Biokimia  Jurusan  Kimia  FMIPA  Universitas Hasanuddin selama 8 bulan.
Preparasi  sampel  dan  ekstraksi  senyawa  pigmen yang dilakukan adalah Makroalga coklat
Sargassum  sp segar  ditimbang  sebanyak  100  g dicuci  dengan  air  mengalir  hingga  bersih  dari kotoran,  dipotong-potong  dan  dikeringanginkan untuk keperluan isolasi.
Sampel kering sebanyak 40 g kemudian dimaserasi  bertingkat  (sampai  seluruh  jaringan terendam)  dengan  pelarut  n-heksana,  etil  asetat, dan  metanol  kualitas  p.a.  Maserat  yang  diperoleh disaring  dengan  menggunakan  kertas  saring, kemudian  pelarut  diuapkan  kembali  dengan menggunakan rotary evaporator sehingga diperoleh  ekstrak  pigmen  fraksi  n-heksana,  etil asetat dan metanol.
Penentuan  toksisitas  dilakukan  dengan  metode Brine  Shrimp  Lethality  Test (BSLT)  (Meyer et  al., 1982).  Mula-mula  dibuat  larutan  stok,  masing- masing dari ekstrak pigmen fraksi n-heksan, fraksi etil  asetat  dan  fraksi  metanol  dalam  larutan metanol dengan konsentrasi 5000 ppm. Selanjutnya,  dibuat  seri  konsentrasi  ekstrak pigmen  sebesar  10,  100  dan  1000  ppm  dari larutan stok tersebut dengan pengenceran menggunakan air laut. Sebagai kontrol, digunakan pelarut  metanol  dalam  air  laut  tanpa  ekstrak pigmen.  Kemudian,  sepuluh  ekor  nauplii Artemia salina Leach  dimasukkan  pada  masing-masing sampel  uji  dan  kontrol  disetiap  seri  konsentrasi. Masing-masing  perlakuan  sampel  uji  dan  kontrol dilakukan tiga kali ulangan. Selanjutnya diinkubasi pada  suhu  ruang  di  bawah  lampu  TL  15  watt selama  24  jam.  Persentase  kematian  larva didapatkan  dengan  cara  menghitung  mortalitas nauplii Artemia  salina Leach  yang  terjadi  setelah dilakukan  pemaparan  selama  24  jam  pada  ketiga ekstrak  pigmen  tersebut.  Efek  toksisitas  dianalisis dari  pengamatan  dengan  menentukan  persentase kematian larva dengan rumus sebagai berikut:
% Kematian larva Jumlah larva mati Jumlah larva uji 100 %
Kurva  LC 50 dibuat  dengan  nilai  %  kematian larva  sebagai  sumbu  Y  dan  seri  konsentrasi sebagai  sumbu  X.  Nilai  LC 50 (50% Lethal Concentration )  ditentukan  dengan  analisis  probit (Meyer et al., 1982).
3. HASIL  DAN PEMBAHASAN
3.1.  solasi  ekstrak  pigmen  dari  makroalga Sargassum sp
Isolasi  senyawa  pigmen  dilakukan  secara maserasi bertingkat dengan menggunakan beberapa  pelarut  dengan  tingkat  kepolaran berbeda, pertama dengan n-heksan p.a, dilanjutkan  dengan  etil  asetat  p.a  dan  terakhir dengan metanol p.a. Masing-masing filtrat fraksi n- heksan,  fraksi  etil  asetat,  dan  fraksi  metanol ditampung. Warna filtrat dari masing-masing fraksi tersebut  berturut-turut  adalah  kuning,  kuning
kehijauan,  dan  hijau  kekuningan.  Semua  filtrat yang  diperoleh  dari  hasil  maserasi  diuapkan pelarutnya menggunakan rotary evaporator sehingga  diperoleh  ekstrak  pigmen  fraksi  n- heksan, etil asetat dan metanol.
Gambar  1  Filtat  pigmen  dari  makroalga  coklat Sargassum  sp fraksi;  n-heksan  (F1), etil asetat (F2), dan metanol (F3)

## 3.2. Toksisitas ekstrak pigmen
Pada  penelitian  ini,  diperoleh  data  jumlah kematian  ( mortalitas )  nauplii Artemia  salina Leach yang  dihitung  sebagai  persentase  kematian  larva dan  dari  data  tersebut  ditentukan  nilai  LC 50 dengan  analisis  probit.    Berdasarkan  data  pada Tabel  3.1,  ketiga  ekstrak  pigmen  memiliki  nilai LC 50 yang bervariasi tetapi semua fraksi menunjukkan  bersifat  toksik,  dimana  nilai  LC 50 ekstrak  pigmen  fraksi  n-heksan,  fraksi  etil  asetat dan  fraksi  metanol  berturut-turut  yaitu  131.07; 729.12; dan 555,27 ppm.
Tabel  3.1  Hasil  uji  toksisitas  ekstrak  pigmen dari makroalga coklat Sargassum sp Ekstrak pigmen Nilai LC 50 (ppm) Toksisitas Fraksi n-Heksan 131.07 Toksik Fraksi Etil Asetat 729.12 Toksik Fraksi Metanol 555.27 Toksik Penelitian ini
menunjukkan adanya perbedaan  warna  filtrat  dari  hasil  maserasi masing-masing  pelarut  yang  disebabkan  oleh kelarutan senyawa-senyawa pigmen  yang mampu terekstrak  pada  pelarut  n-heksan  (non  polar),  etil asetat (semi polar) dan metanol (polar). Penggunaan  pelarut  paling  berpengaruh  dalam mempengaruhi kepekatan dari hasil ekstraksi atau penentuan  pigmen  yang  terdeteksi.  Pemisahan senyawa-senyawa pigmen berdasarkan perbedaan  kepolaran  (Harborne,  1987).  Aturan umum  dari  polaritas  adalah  polar  menyukai  yang polar  dan  yang  tidak  polar  menyukai  tidak  polar
( like  disolves  like ).  Pelarut  yang  digunakan  dalam ekstraksi pigmen mampu memecah ikatan kompleks  protein-klorofil,  ikatan  non  kovalen  dan mengekstraksi  pigmen  secara  kuantitatif  (Gross, 1991).
Metode  BSLT merupakan  suatu  pengujian tahapan  awal  ( pre-screening )  dalam  penapisan senyawa  bioaktif  antitumor  (Meyer et  al., 1982). Metode ini banyak digunakan karena cepat, murah dan  mudah  dikerjakan.  Pada  pengujian  ini digunakan  hewan  uji  berupa  larva  udang Artemia salina Leach  yang  telah  berumur  1-2  hari  yang disebut  Nauplii.  Hal  ini  dikarenakan  Nauplii Artemia  salina Leach  yang  baru  menetas  identik dengan  sel  kanker/tumor.  Metode  BSLT  dipilih karena  metode  ini  cukup  akurat  dan  mampu memprediksi  aktivitas cytotoxicity dan pesticidal (Ghisalberti, 1993). Uji toksisitas BSLT ditunjukkan dengan  nilai  LC 50 .  Tingkat  toksisitas  dari  suatu ekstrak  dapat  ditentukan  dengan  melihat  harga LC 50 (Meyer et  al., 1982).  Hasil  penelitian menunjukkan  pada  ketiga  ekstrak  pigmen  yang diperoleh  bersifat  toksik  dengan  nilai  LC 50 <1000 ppm.  Hal  ini  mengindikasikan  bahwa  semua ekstrak  pigmen  dari Sargassum  sp dari  berbagai fraksi  yang  diuji  mengandung  senyawa  yang bersifat  antitumor.  Menurut  Meyer et  al (1982), suatu ekstrak dianggap sangat toksik bila memiliki nilai  LC 50 ≤  30  ppm  dan  dianggap  toksik  bila memiliki  nilai  LC 50 <1000  ppm.  Nilai  LC 50 ekstrak pigmen  fraksi  n-heksan  memiliki  sifat  toksik  lebih tinggi  diikuti  dengan  fraksi  metanol  dan  fraksi  etil asetat mempunyai nilai terendah. Hal ini menunjukkan  bahwa  ekstrak  pigmen  fraksi  n- heksan  lebih  toksik  dibandingkan  yang  lainnya. Semakin  kecil  harga  LC 50 semakin  toksik  suatu senyawa  dan  berpotensi  sebagai  antitumor. Tingkat  toksisitas  tersebut  akan  memberi  makna terhadap potensi aktivitasnya sebagai antitumor.
Senyawa  pigmen  yang  diduga  memiliki aktivitas  antioksidan  adalah  pigmen  golongan karotenoid  dan  klorofil.  Antioksidan  berfungsi sebagai pemadam ( quencher ) oksigen singlet dan penangkal  radikal  bebas.  Oksigen  singlet  adalah tingkat  tenaga  molekul  O 2 yang  sangat  reaktif, dapat  menginisiasi  peroksida  lipid  hingga  terjadi reaksi  berantai  radikal  bebas yang  dapat mengoksidasi  komponen  sel  lain,  seperti  protein dan  DNA.  Sejumlah  penelitian  menunjukkan bahwa oksigen singlet yang berbahaya ini dapat di non-aktifkan  oleh  pigmen  karotenoid.  Selain  itu, karotenoid  juga  mampu  bereaksi  dengan  radikal bebas  (R.)  dengan  proses  transfer  muatan (elektron).  Pada  reaksi  ini  akan  diperoleh  radikal bebas  dari  karotenoid  yang  relatif  lebih  stabil  dan tidak  memiliki  energi  yang  cukup  untuk  dapat bereaksi  dengan  molekul  lain  membentuk  radikal baru  (Britton,  1982).  Sedangkan  pigmen  klorofil berpotensi  sebagai  antioksidan  karena  mampu mengangkap  oksigen  singlet  dan  melakukan
resonansi maupun vibrasi untuk membuang energi yang  berlebihan  ke  lingkungan  (Yanishlieva, 2003).  Mekanisme  ini  didukung  oleh  struktur utama  klorofil,  yaitu  tetrapirol  yang  merupakan struktur poliena terkonjugasi. Struktur ini menyebabkan  energi  menjadi  stabil,  terutama melalui  resonansi  dalam  struktur  orbital  pi  yang overlap (Lee et al., 2002). Klorofil juga dimungkinkan  mampu  menangkap  radikal  bebas karena  klorofil  termasuk  senyawa  yang  lipofilik (Burrati et al., 2001).

## 4.  KESIMPULAN
Ekstrak  pigmen  fraksi  n-heksan,  etil  asetat dan methanol dari makroalga coklat Sargassum sp bersifat  toksik  dan  yang  memiliki  toksisitas  paling besar  dibandingkan  fraksi  lainnya  adalah  fraksi  n- heksana.  Sebaiknya  pada  penelitian  selanjutnya dilakukan pemurnian ekstrak pigmen dari fraksi n- heksana  untuk  mendapatkan  kandungan  pigmen yang  lebih  murni  dan  dibandingkan  aktivitasnya dengan ekstrak pigmen tersebut.

## 5.  DAFTAR PUSTAKA
Arlita  N.R.,  Ocky  K.R.  &  Adi  S.(2013).Identifikasi pigmen karotenoid pada bakteri simbion rumput  laut Caulerpa  cupressoides
(Vahl)  C.  Agardh. Journal  of  Marine Research, 2 (3):68-77.
Britton  G.  &  Goodwin  T.W.  (1982). Carotenoid chemistry  and  biochemistry,  Proc.6 th IUPAC  Int.  Symp.  on  Carotenoids .
Oxford: Pergamon Press.
Burrati  S.,  N.  Pellegrini.,  O.V.  Brenna.  &  S. Mannino.(2001).Rapid electrochemical method  for  the  evaluation  of  the antioxidant power of some lipolhilic food extract. J. Agriculture and Food Chemistry, 49 :5136-5141.
Burtin  P.(2003).Nutritional  value  of  seaweeds.  J. Environ.  Agric.  Food.  Chem. 2 (4):498- 503.
Ghisalberti  E.L.(1993).Detection  and  isolation  of bioactive  natural  products,  bioactive natural  products;  detection,  isolation, and  structural  determination.  London: Ed.  Steven  M.  Collegate  and  Russell  J. Molyneux CRC Press Inc, hal 605. Gross J. (1991). Pigment in vegetables . New York:
Van Nastrand Reinhold, hal 351.
Harbone  J.B.(1987). Metode  fitokimia  penuntun cara  modern  menganalisa  tumbuhan .
Bandung: Institut Teknologi Bandung.
Kusmiati  N.,  W.S.  Agustini.,  S.R.  Tamat.  &  I. Mellia.(2010).Ekstraksi  dan  purifikasi senyawa luthein dari mikroalga Chlorella pyreniodosa galur  Lokal  Ink.  J.  Kimia Indonesia, 5 (1):30-34.
Lee  M.,  L.  Lee.,  S.  Lee.,  K.  Park.  &  E.
Choe.(2002). Spinach ( Spinacea olecea )  powder  as  a  natural  food-grade antioxidant in deep fat dried products. J.
Agriculture and Food Chemistry, 50 :5664-5669.
Merdekawati  W.(2009).Kandungan  dan  aktivitas antioksidan  Klorofil  a  dan  β-karoten Sargassum sp .Jurnal Kelautan Nasional, 2 :144-145.
Meyer  B.N.,  N.R.  Ferrigni.,  J.E.  Putman.,  L.B. Jacbsen., D.E. Nicols. & J.L. McLaughlin. (1982).Brine shrimp: A Convenient general  Bioassay  for  Active  Plant Constituents. Planta Medica, 45 :31-34. Milledge  J.J.(2011).Commercial  application  of microalgae  other  than  as  biofuels.  A
Brief Review, Re. Environ, Sci.
Biotechnol , 10 :31- 41. Stafsnes M.H., K. D. Josefsen., G.K. Andersen., S. Valla.,  T.E.  Ellingsen.  &  P.  Bruheim. (2010).Isolation  and  characterization  of marine
pigmented bacteria from Norwegia  coastal  waters  and  screening for  carotenoids  with  UVA-blue  light absorbing  properties.  Journal  Microbiol,
48 (1):16-23.
Stahl  W.  &  H.  Sies.(2003).Antioxidant  activity  of carotenoids  molecular.Journal  Aspects.
Med, 24 :345-351.
Yanishlieva  N.V.(2003). Inhibiting  antioxidant . dalam: Pokorny,  J.,  N.  Yanishlieva.,  & M.  Gordon  (Eds.)  Antioxidant  in  Food. Notrh  America:  Woodhead  Publishing
Limited hal 22-27.
Yudiati  E.,  Sedjati  S.,  Sunarsih. &  Agustian
R.(2011).Aktivitas antioksidan dan toksisitas  ektrak  metanol  dan  pigmen kasar Spirulina sp . Jurnal Ilmu Kelautan, 16 (4):187- 192. ISSN 0853-7291.
Zapata M., Garrido
J.L. & Jeffrey S.W.(2006). Chlorophyll c pigments : Current  Status.  Dalam  Griman,  B., Porra, J.P., Rudiger, W., and Seheer, H. Chlorophylls  and  Bacteriochlorophylls: Biochemistry,  Biophysic,  Functions,  and Applications. Springer 25 :39-53.
.