## Research Article
Respons Ketahanan Tembakau terhadap Tobamovirus dengan Agens Hayati sebagai Induser
Resistance Response of Tobacco to Tobamovirus with Biological Agents as Inducer
Riska Awalia Putri 1) , Sri Sulandari 1) * , Christanti Sumardiyono 1) , & Triwidodo Arwiyanto 1)
1) Departemen Hama dan Penyakit Tumbuhan, Fakultas Pertanian, Universitas Gadjah Mada Jln. Flora No. 1, Bulaksumur, Sleman, Yogyakarta 55281
*Penulis untuk korespondensi. E-mail: sulandari77@ugm.ac.id

## ABSTRACT
Tobamovirus is one of the important pathogen that decrease the quantity and quality of cigar tobacco cultivation. One  of  the  alternative  control  of  this  disease  is  by  using  rhizosphere  biological  agents  such  as Bacillus spp., Streptomyces spp., and mycorrhiza. This study aims to determine the effectiveness and mechanism of the biological agents singly and in combination to induce cigar tobacco plant resistance of the F1 (TV38xG) variety in the greenhouse. The biological agents were applied on the root of tobacco during nursery and transplanting. The virus inoculation was performed 10 days after transplanting. The results showed that the treatment with Bacillus spp., Streptomyces spp., and mycorrhizal were capable to decrease disease incidence by delaying mosaic symptoms for 6-day in a single treatment and 3 days in combination treatment. The treatment of Bacillus spp., Streptomyces spp., and mycorrhiza both in single and in combination were capable to decrease the disease intensity for 26%, 23%, 15%, and 10%, respectively. Induced resistance was performed by increased peroxidase activity in the treatment of mycorrhiza as much as 29.27%, Bacillus spp. 20.65%, and Streptomyces spp. 11.10%. Protein analysis with SDS-PAGE of tobacco plants  showed the difference in profile and size of protein bands. Protein bands measuring 17 kDa and 30 kDa were found in tobacco infected Tobamovirus but was not found in healthy tobacco. The single application of Bacillus spp., Streptomyces spp., and mycorrhiza on tobacco infected Tobamovirus increase plant growth including plant height as much as 53.71%, number of leaves 57%, stem diameter 29.40%, root length 60.77%, fresh weight of leaves 196.90%, and dry weight of leaf of 265.31%.
Keywords: biological agent, induced resistance, SDS-PAGE, tobacco, Tobamovirus

## INTISARI
Tobamovirus merupakan salah satu patogen penting yang menyebabkan penurunan kuantitas dan kualitas pada budidaya tembakau cerutu. Salah satu alternatif pengendalian penyakit ini menggunakan agens hayati pengkoloni akar yaitu Bacillus spp., Streptomyces spp., dan Mikoriza. Penelitian bertujuan untuk mengetahui efektivitas dan mekanisme agens  hayati  secara  tunggal  dan  kombinasi  dalam  menginduksi  ketahanan  tanaman  tembakau  cerutu  varietas  F1 (TV38xG) di rumah kaca. Agens hayati diaplikasikan pada perakaran tembakau pada saat pembibitan dan pindah tanam. Inokulasi virus dilakukan 10 hari setelah pindah tanam. Hasil penelitian menunjukkan bahwa perlakuan Bacillus spp., Streptomyces spp., dan Mikoriza dapat menurunkan insidensi penyakit dengan menunda munculnya gejala mosaik 6 hari pada perlakuan tunggal dan 3 hari pada perlakuan kombinasi. Perlakuan Bacillus spp., Streptomyces spp., dan Mikoriza secara tunggal, dan kombinasi dapat menurunkan intensitas penyakit mosaik berturut-turut 26%, 23%, 15%, dan 10%. Induksi ketahanan terbentuk melalui peningkatan aktivitas peroksidase pada perlakuan Mikoriza 29,27%, Bacillus spp. 20,65%, Streptomyces spp. 11,10%. Analisis protein dengan SDS-PAGE diperoleh adanya perbedaan profi dan ukuran pita protein. Ditemukan pita protein berukuran 17 kDa dan 30 kDa pada tembakau yang terinfeksi Tobamovirus tetapi tidak ditemukan pada tembakau sehat. Aplikasi Bacillus spp., Streptomyces spp., dan Mikoriza secara tunggal pada tanaman tembakau yang terinfeksi Tobamovirus berpengaruh baik terhadap pertumbuhan tanaman. Tinggi tanaman meningkat 53,71%, jumlah daun 57%, diameter batang 29,40%, panjang akar 60,77%, berat segar daun 196,90%, dan berat kering daun 265,31%.
Kata kunci: agens hayati, induksi ketahanan, SDS-PAGE, tembakau, Tobamovirus
Diterima 14 Desember 2017; diterima untuk diterbitkan 21 Mei 2018

## PENDAHULUAN
Tembakau merupakan salah satu komoditas yang banyak dibudidayakan petani di Indonesia. Khususnya untuk tembakau cerutu, elastisitas, warna, dan ukuran daun sangat penting untuk memenuhi standar ekspor. Berbagai  kendala  teknis  banyak  dihadapi  petani tembakau di Indonesia, salah satunya disebabkan oleh peningkatan gangguan organisme pengganggu tanaman  dari  kelompok Tobamovirus yang  dapat menyebabkan penyakit mosaik. Penyakit ini dapat dengan mudah ditularkan secara mekanik dan juga memiliki  kisaran  inang  yang  luas  sehingga  sulit untuk dikendalikan. Semangun (2006) menjelaskan penyakit mosaik tembakau disebabkan oleh beberapa galur ( strain ) virus yang menyebabkan timbulnya gejala  agak  berbeda.  Seperti  di  daerah  tembakau Vorstenlanden  disebut  penyakit  mosaik  “biasa” menyebabkan terjadinya klorosis di antara tulang daun, mosaik “bentol” menyebabkan bagian yang berwarna hijau tua menjadi melengkung, sehingga permukaan  daun  tidak  rata,  dan  mosaik  “keras” menyebabkan daun menjadi sangat keriting.
Salah  satu  alternatif  pengendalian  dalam mengurangi infeksi Tobamovirus adalah  dengan menginduksi ketahanan sistemik tanaman. Ketahanan sistemik  terinduksi  yang  salah  satunya  dicirikan oleh Pathogenesis  Related  Protein (PR-Protein) sebagai molekul gen ketahanan, misalnya peroksidase (Agrios, 2005). Peroksidase merupakan enzim oksido- reduktif yang berpartisipasi dalam proses lignifikasi dinding sel tanaman inang selama reaksi pertahanan terhadap patogen (Chittoor et al., 1997).
Induksi  ketahanan  sistemik  tanaman  dapat dilakukan  dengan  menggunakan  agens  hayati. Agens hayati yang umumnya digunakan termasuk ke  dalam  kelompok Plant  Growth  Promoting Rhizobacteria (PGPR) dan Plant Growth Promoting Fungi (PGPF), hidup bebas dan berasosiasi dengan akar di dalam rizosfer pada banyak spesies tanaman yang dapat meningkatkan pertumbuhan dan menurun- kan penyakit tanaman (Ryu et. al., 2007; Walters et al., 2013). Dalam penelitian ini digunakan tiga jenis agens hayati yaitu Streptomyces spp., Bacillus spp. dan Mikoriza. Agens hayati telah banyak menunjukkan keberhasilannya  dalam  mengendalikan  patogen. Berbagai  penelitian  telah  melaporkan  efektivitas PGPR dilaporkan efektif menekan Cucumber mosaic virus (CMV), Tobacco mosaic virus (TMV), Tobacco necrosis  virus (TNV),  dan Tomato  mottle  virus
(ToMoV)  (Maurhofer et  al., 1994;  Raupach  & Kloepper, 1998; Zehnder et al., 2000; Murphy et al,. 2000).  Mikoriza  mampu  mengakumulasi  asam salisilat di dalam tanaman cabai merah yang berperan sebagai  sinyal  penginduksi  yang  akan  meng- ekspresikan  gen  pertahanan  pertanaman  berupa pathogenesis  related protein  (PR-Protein)  antara lain peroksidase. Peroksidase berpengaruh dalam lignifikasi dinding sel tanaman Marlina et al. (2010). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui  efektivitas dan mekanisme agens hayati tersebut secara tunggal dan  kombinasi  ketiganya  dalam  menginduksi ketahanan  tanaman  tembakau  cerutu  varietas  F1 (TV38xG) di rumah kaca.

## BAHAN DAN METODE
Koleksi  dan  Perbanyakan  Isolat  Virus  dan Agens Hayati
Sumber inokulum Tobamovirus merupakan koleksi Sub Laboratorium Virologi Tumbuhan Departemen Hama dan Penyakit Tumbuhan, UGM (Gambar 1). Sumber  inokulum  tersebut  termasuk  ke  dalam spesies Rehmannia mosaic virus (ReMV) (Endarsih et al. , 2017). Isolat Bacillus spp., Streptomyces spp. dan Mikoriza dalam bentuk produk siap pakai berasal dari Laboratorium Mikrobiologi Pertanian Dasar, Departemen  Mikrobiologi  Pertanian,  Universitas Gadjah Mada.
Gambar 1. Daun tembakau cerutu terinfeksi Tobamovirus yang dijadikan sebagai sumber inokulum

## Perlakuan Agens Hayati dan Penyemaian Benih
Benih tembakau ditanam pada nampan plastik yang sebelumnya telah diisi dengan media tanam (tanah + kompos + arang sekam) dengan perbandingan 3:2:1. Aplikasi PGPR mengikuti metode Taufik et al. (2005) yang dimodifikasi. Sebelum benih ditutupi dengan selapis media semai, benih ditetesi dengan
(BSM2). Lima karakter  pertumbuhan tanaman yang dievaluasi meliputi tinggi tanaman, jumlah daun, diameter  batang,  dan  panjang  akar.  Pengamatan dilakukan 1−9 minggu setelah pindah tanam (MSPT). Penghitungan  berat  segar  dan  berat  kering  daun dilakukan  pada  akhir  pengamatan  (10  MSPT). Analisis sidik ragam dilakukan dengan uji F dan jika di  antara  perlakuan  terdapat  perbedaan  dilanjutkan dengan DMRT ( Duncan Multiple Range Test ) pada α = 0,05 dengan bantuan SAS 6.12 (SAS Institute, 1990).

## Pengamatan Perkembangan Penyakit
Pengamatan  terhadap  perkembangan  penyakit dilakukan dengan menghitung insidensi dan intensitas penyakit. Pengamatan perkembangan penyakit dilaku- kan 3−30 hari setelah inokulasi. Perhitungan insidensi penyakit mengikuti rumus:
Pengamatan intensitas penyakit dilakukan dengan mengukur skor keparahan penyakit. Kategori skor keparahan penyakit yang digunakan ialah : 0, tidak ada gejala; 1, vein clearing dan klorotik; 2, mosaik ringan; 3, mosaik sedang dan malformasi ringan; 4, mosaik  berat  dan  malformasi  sedang;  5,  mosaik sangat  berat,  malformasi  daun  parah,  dan  kerdil. Intensitas penyakit dihitung dengan rumus:
dengan, n, jumlah tanaman terserang dengan kategori tertentu; v, nilai skala setiap kategori serangan; Z, nilai skala tertinggi; N, jumlah tanaman yang diamati.

## Aktivitas Enzim Peroksidase
Aktivitas enzim peroksidase mengikuti metode Zen et al. (2002) cit. Faizah et al. (2012). Ekstraksi enzim  peroksidase  satu  hari  sebelum  inoklasi Tobamovirus  dan  10  hari  setelah  inokulasi,  pada daun tembakau termuda. Daun tembakau sebanyak 10 ulangan kemudian dikompositkan. Sebanyak 5 g daun digerus dalam mortar dalam 50 ml akuades pada suhu 4°C sampai homogen, kemudian gerusan disaring. Filtrat disentrifugasi selama 15 menit pada 4500 rpm. Supernatan digunakan sebagai ekstrak enzim. Aktivitas enzim peroksidase dilakukan dengan menggunakan dua tabung. Tabung pertama sebagai blanko  berisi  campuran  yang  terdiri  atas  2,5  ml ekstrak enzim dan 2,5 ml larutan pyrogallol 0,05 M. Tabung kedua berisi campuran yang terdiri atas 2,5
suspensi PGPR (10 8 CFU/ml) sebanyak 50 µl/lubang tanam  saat  penyemaian,  1  ml/lubang  tanam  saat pembibitan, dan 7,5 ml/lubang tanam saat pindah tanam. Untuk PGPF diaplikasi dengan cara dicampur dengan  media  tanam  sebanyak  2  g/lubang  tanam saat penyemaian, 5 g/lubang tanam pada saat pem- bibitan dan 10 g/lubang tanam saat pindah tanam. Penyemaian  tanaman  dilakukan  di  rumah  kaca hingga berumur 14 hari, kemudian bibit dipindahkan ke  dalam  gelas  plastik  ukuran  200  ml.  Setelah berumur 45 hari, bibit dipindah tanam pada polybag berukuran 30×30 cm.

## Inokulasi Virus secara Mekanik
Daun tembakau sumber inokulum Tobamovirus ditimbang sebanyak 1 g. Kemudian daun digerus dalam  mortar  steril  dengan  menambahkan  10  ml larutan penyangga fosfat 0,01 M (pH 7) (w : v = 1 : 10). Sebelum diinokulasi, serbuk karborundum ditabur- kan pada bagian permukaan atas daun ketiga atau keempat tembakau, kemudian sap segera dioleskan dengan kapas steril pada permukaan daun. Setelah sap mengering, pembilasan dilakukan terhadap sisa- sisa sap yang masih melekat pada permukaan daun tanaman  uji  dengan  menyemprotkan  air  steril. Pengamatan dilakukan setiap 3 hari sekali selama 30 hari.

## Rancangan Percobaan
Percobaan dilakukan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan sepuluh perlakuan, setiap  perlakuan  15  ulangan.  Perlakuan  tersebut adalah tanaman tembakau tanpa PGPR/PGPF, tanpa diinokulasi dengan Tobamovirus (K1); tanaman tembakau tanpa PGPR/PGPF, diinokulasi dengan Tobamovirus (K2); tanaman tembakau diberi perlakuan Bacillus spp., tanpa diinokulasi dengan Tobamovirus (B1);  tanaman  tembakau  diberi  perlakuan Bacillus spp., diinokulasi dengan Tobamovirus (B2); tanaman tembakau diberi perlakuan Streptomyces spp., tanpa diinokulasi  dengan Tobamovirus (S1);  tanaman tembakau  diberi  perlakuan Streptomyce s  spp., diinokulasi  dengan Tobamovirus (S2);  tanaman tembakau diberi  perlakuan  Mikoriza,  diinokulasi dengan Tobamovirus (M1); tanaman tembakau diberi perlakuan Mikoriza, diinokulasi dengan Tobamovirus (M2); tanaman tembakau, diberi perlakuan Bacillus spp., Streptomyces spp., Mikoriza, tanpa diinokulasi dengan Tobamovirus (BSM1); tanaman tembakau yang diberi perlakuan Bacillus spp., Streptomyces spp., Mikoriza, tanpa diinokulasi dengan Tobamovirus
Putri et al. : Respons Ketahanan Tembakau terhadap Tobamovirus dengan Agens Hayati sebagai Induser 203
ml ekstrak enzim, 2,5 ml larutan pyrogallol 0,05 M dan 2,5 ml H 2 O 2 dengan konsentrasi 1%. Aktivitas enzim  peroksidase  ditentukan  berdasarkan  pada absorbansi  dari  larutan  yang  diuji  menggunakan spektrofotometer  Uv- vis .  Absorbansi  diukur pada panjang gelombang 420 nm. Aktivitas enzim perok- sidase dihitung dengan mengikuti rumus:
dengan V, aktivitas enzim dinyatakan sebagai unit aktivitas  enzim  gram  sampel  daun;  A,  selisih absorbansi  sesudah  dan  sebelum  penambahan H 2 O 2 ; t, waktu yang diperlukan untuk perubahan absorbansi; c, konsentrasi enzim (menit -1 mg -1 ).

## Analisis Pita Protein Tanaman dengan SDS-PAGE
Analisis  pita  protein  tanaman  dengan  SDS- PAGE ( Sodium Dodecyl Sulfat- Polyacrilamide Gel Electrophoresis ) mengikuti metode Leammli (Gall et al., 1980) yang dimodifikasi. Sampel daun tembakau ditimbang 0,1 g kemudian digerus dengan meng- gunakan  bufer  fosfat.  Sap  tersebut  kemudian dimasukkan ke dalam 1,5 ml tabung mikro sentrifus, kemudian  ditambah  300  µl  buffer  ekstraksi  (Tris HCl 0,5 M pH 6,8; gliserol; SDS 10%; Dionized water )  dan  mercaptoetanol  2%,  dicampur  meng- gunakan vorteks hingga homogen. Selanjutnya ekstrak diinkubasi selama 5 menit pada 95 o C dan disentrifus pada 8000 rpm selama 5 menit. Supernatan dipindah- kan ke tabung mikro yang baru dan ditambahkan bromophenol blue 0,5% dengan perbandingan 1:5 dari volume sampel. Elektroforesis protein dibuat larutan  SDS-PAGE  dengan  konsentrasi  12,5%. Elektroforesis dijalankan pada tegangan konstan 20 mA, dan 5 watt selama 2,5 jam. Setelah elektroforesis selesai, gel dipindahkan dan berkas protein dilihat dengan  merendam gel dalam  asam  asetat  glasial 12,5% selama 5 menit kemudian direndam dalam larutan commasie  blue 0,25%  sambil  dishaker selama  kurang  lebih  12  jam. Gel dicuci  dengan destaining solution. Hal ini dilakukan untuk mem- pertahankan berkas protein yang terlihat pada gel untuk  kemudian  pita-pita  protein  yang  terlihat dibandingkan dengan penanda berat molekul pada gel tersebut.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Perkembangan Penyakit Mosaik Tembakau
Secara umum aplikasi Bacillus spp., Streptomyces spp., dan Mikoriza pada tanaman tembakau mampu
menekan insidensi dan intensitas penyakit mosaik secara nyata dibandingkan dengan kontrol. Dari hasil pengamatan  insidensi  penyakit  mosaik,  aplikasi agens hayati pada tanaman tembakau dapat menunda gejala  penyakit  mosaik  lebih  lambat  6  hari  pada tanaman tembakau yang diaplikasi secara tunggal, dan  3  hari  pada  perlakuan  kombinasi  ketiganya dibandingkan dengan kontrol (Gambar 2a). Hasil pengamatan intensitas penyakit pada 30 hari setelah inokulasi virus diperoleh persentase tertinggi hingga terendah ialah perlakuan K2, BSM2, M2, S2, dan B2. (Gambar 2b). Persentase penghambatan antar- perlakuan  dibandingkan  dengan  kontrol  pada perlakuan  B2  sebesar  26%,  S2  sebesar  23%,  M2 sebesar  15%  dan  BSM2  sebesar  10%.  Hasil pengamatan  intensitas  penyakit  ini  dapat  dilihat pada Gambar 3 dimana terlihat variasi gejala yang dihasilkan tanaman tembakau yang diamati pada 12 HSI.
Penurunan  insidensi  dan  intensitas  penyakit mosaik  tembakau  yang  diaplikasi  dengan  agens hayati tunggal maupun kombinasi disebabkan oleh kemampuan Bacillus spp., Streptomyces spp., dan Mikoriza  memicu  peningkatan  aktivitas  enzim peroksidase yang berperan dalam sistem pertahanan tanaman. Menurut Ross (1961), agens hayati telah banyak  digunakan  sebagai  bahan  penginduksi ketahanan  tanaman  salah  satunya  dari  kelompok Bacillus yang pertama kali diteliti pada tahun 1961 dengan  pra-inokulasi  tanaman  tembakau  dengan TNV ( Tobacco necrosis virus ). Putri et al. (2015) melaporkan bahwa aplikasi Streptomyces spp. pada tanaman  cabai  dapat  meningkatkan  pertumbuhan tanaman  dan  secara  nyata  dan  menekan  per- kembangan penyakit daun kerinting kuning cabai yang  disebabkan  oleh Begomovirus .  Imron et  al. (2015)  dalam  penelitiannya  melaporkan  bahwa inokulasi jamur mikoriza arbuskular (JMA) pada tanaman  cabai  dapat  menunda  munculnya  gejala penyakit daun keriting kuning cabai.

## Aktivitas Enzim Peroksidase
Aktivitas  enzim  peroksidase  pada  tanaman tembakau  sebelum  dan  setelah  inokulasi  dengan Tobamovirus pada berbagai perlakuan berpengaruh sangat  nyata  terhadap  tanaman  tembakau  yang diberi perlakuan Bacillus spp., Streptomyces spp, dan Mikoriza secara tunggal dibandingkan dengan perlakuan kombinasi ketiganya dan juga kontrol. Persentase peningkatan enzim peroksidase tertinggi terjadi pada tanaman tembakau yang diberi perlakuan
204 V= A (t×c)

## Analisis Pita Protein Tanaman dengan SDS-PAGE
Hasil elektroforesis dengan pewarnaan comasie blue pada deteksi ini berhasil memvisualisasikan adanya  berbagai  ukuran  dan  jumlah  pita  protein ( band )  pada  tanaman  tembakau  pada  berbagai perlakuan (Gambar 4). Dari hasil tersebut terlihat adanya perbedaan yang jelas jumlah dan ukuran pita protein  antara  tembakau  sehat  dan  tembakau terinfeksi Tobamovirus pada  berbagai  perlakuan. Hal  ini  diduga  sebagai  tanggapan  tanaman tembakau pada saat terjadi infeksi patogen berupa protein-protein asing yang berperan dalam respons ketahanan tanaman.
Dari  berbagai  ukuran  pita  protein  tersebut, ditemukan adanya pita sekitar 17 kDa dan 30 kDa yang  ditemukan  pada  sampel-sampel  tanaman tembakau sakit (K2, M2, B2, S2, BSM2) dan tidak ditemukan pada sampel tembakau sehat (K1) dengan
Mikoriza sebesar 39,27 %, Bacillus spp. 20,65 %, Streptomyces spp. 11,10 %. Sedangkan pada tanaman tembakau  yang  diberi  perlakuan  kombinasi  dan kontrol, terjadi penurunan aktivitas enzim peroksidase (Tabel 1).
Sejalan dengan penelitian yang dilakukan oleh Taufik et al. (2005) dilaporkan tanaman cabai yang diberi  perlakuan  PGPR  dan  diinokulasi  virus menyebabkan peningkatan konsentrasi asam salisilat dan peroksidase bila dibandingkan dengan tanaman cabai  tanpa  PGPR  dan  tanpa  inokulasi  virus. Demikian  pula  tanaman  cabai  yang  diinokulasi dengan CMV atau ChiVMV setelah diberi perlakuan PGPR  mengalami  peningkatan  konsentrasi  asam salisilat dan peroksidase bila dibandingkan dengan tanaman  cabai  yang  diberi  perlakuan  PGPR  dan tetapi tidak diinokulasi virus.
Gambar 2. Perkembangan penyakit mosaik tembakau (a. Insidensi penyakit; b. Intensitas penyakit) pada berbagai perlakuan [keterangan: tanaman tembakau tanpa PGPR/PGPF, diinokulasi Tobamovirus (K2); tanaman tembakau  diberi  perlakuan Bacillus spp.,  diinokulasi Tobamovirus (B2);  tanaman  tembakau  diberi perlakuan Streptomyce s spp., diinokulasi Tobamovirus (S2); tanaman tembakau diberi perlakuan  Mikoriza, diinokulasi Tobamovirus (M2); tanaman tembakau diberi perlakuan Bacillus spp., Streptomyces spp., Mikoriza, tanpa diinokulasi Tobamovirus (BSM2)]
a b
Gambar 3. Variasi gejala mosaik daun tembakau pada 12 hari setelah inokulasi (HSI) pada berbagai perlakuan; (a) perlakuan Bacillus spp.; (b) perlakuan Streptomyces spp.; (c) perlakuan Mikoriza; (d) perlakuan kombinasi ketiganya; (e). kontrol
a b c d e
Putri et al. : Respons Ketahanan Tembakau terhadap Tobamovirus dengan Agens Hayati sebagai Induser 205
ketebalan yang berbeda-beda. Hal ini sejalan dengan penelitian yang dilakukan oleh Spitsin et al. ( 1999) dimana  TMV  yang  termasuk  kedalam  kelompok Tobamovirus memiliki ukuran mantel protein ( coat protein )  sekitar  17,5  kDa,  protein  ini  merupakan satu-satunya protein struktural TMV yang diperlukan untuk membungkus genom virus pada inang yang terinfeksi.  Protein  30  kDa  merupakan  salah  satu protein nonstruktural yang digunakan sebagai protein gerak  ( movement  protein ) yang  diperlukan  untuk mentrasfer RNA virus dari sel ke sel (Meshi et al., 1987). Dari hasil tersebut dapat dilihat perbedaan ketebalan pita protein yang diperoleh. Perbedaan ketebalan  pita  protein  yang  diperoleh,  diduga disebabkan oleh perbedaan konsentrasi virus yang ada pada tanaman terinfeksi Tobamovirus . Terdapat- nya  perbedaan  pola  pita  pada  tanaman  sakit  dan tanaman sehat dapat digunakan sebagai salah satu cara untuk mendeteksi keberadaan Tobamovirus pada tanaman.
Pengaruh Agens Hayati terhadap Pertumbuhan Tanaman Tembakau
Aplikasi Bacillus spp., Streptomyces spp., dan Mikoriza secara tunggal berpengaruh nyata dalam meningkatkan  pertumbuhan  tanaman  tembakau dibandingkan  dengan  kontrol  pada  berbagai parameter agronomi, meliputi tinggi tanaman 53,71%, jumlah daun 57%, diameter batang 29,40%, panjang akar 60,77% (Tabel 2), berat segar daun mencapai 196,90% dan berat kering daun mencapai 265,31% (Gambar  5).  Adanya  pengaruh  pemberian  agens hayati secara tunggal terhadap seluruh parameter agronomi tanaman tembakau disebabkan oleh ke- mampuannya secara langsung sebagai biostimulant dan biofertilizer .  Sebagai biostimulant dengan memproduksi fitohormon. Menurut Dewi (2008), fitohormon  di  dalam  tanaman  berupa Indole– 3 - acetic  acid (IAA),  sitokinin,  dan  giberelin  akan meningkatkan jumlah dan ukuran sel yang secara secara  bersama-sama  dengan  hasil  fotosintesis
Tabel 1. Konsentrasi enzim peroksidase pada berbagai perlakuan tanaman tembakau yang  diukur 25 jam sebelum dan 120 jam setelah inokulasi Tobamovirus
Perlakuan Rata-rata konsentrasi enzim peroksidase (menit -1 mg -1 ) Peningkatan enzimperoksidase (%) Sebelum diinokulasi Tobamovirus Setelah diinokulasi Tobamovirus Bacillus spp. (B) 1,066 b 1,286 b 20,65 Streptomyces spp. (S) 1,139 a 1,266 c 11,10 Mikoriza (M) 0,992 c 1,382 a 39,27 Kombinasi (BSM) 0,881 e 0,654 e -25,79 Kontrol (K) 0,902 d 0,862 d -4,44
Keterangan: Data yang diikuti huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata berdasarkan uji DMRT dengan taraf  kepercayaan 95 %.
Gambar 4.  Hasil visualisasi pita protein daun tembakau pada berbagai perlakuan dengan menggunakan SDS-PAGE; tanaman tembakau tanpa PGPR/PGPF, tanpa diinokulasi Tobamovirus (K1); tanaman tembakau tanpa PGPR/PGPF, diinokulasi Tobamovirus (K2); tanaman tembakau diberi perlakuan Bacillus spp., diinokulasi Tobamovirus (B2); tanaman tembakau diberi perlakuan Streptomyce s spp., diinokulasi Tobamovirus (S2); tanaman tembakau diberi perlakuan  Mikoriza, diinokulasi Tobamovirus (M2); tanaman tembakau diberi perlakuan Bacillus spp., Streptomyces spp., Mikoriza, tanpa diinokulasi Tobamovirus (BSM2)]
meningkatkan  dan  mempercepat  proses  pertum- buhan tanaman. Sebagai biofertilizer , meningkatkan ketersediaan  nutrisi  bagi  tanaman,  salah  satunya dengan melarutkan fosfat. Menurut Thakuria et al. (2004),  kemampuan  PGPR  dan  PGPF  dalam melarutkan  fosfat  yang  ada  di  sekitar  perakaran dapat membantu meningkatkan persediaan fosfat yang akan digunakan untuk pertumbuhan tanaman.
Aplikasi Bacillus spp., Streptomyces spp., dan Mikoriza  secara kombinasi  kurang  memberikan hasil yang baik terhadap intensitas penyakit mosaik tembakau maupun terhadap pertumbuhan tanaman. Hal ini mengindikasikan bahwa ketiga agens hayati tersebut tidak kompatibel untuk digunakan secara bersamaan. Hal ini tidak sesuai dengan penelitian Kavatagi dan Lakshman (2014), yang melaporkan
Gambar 5. Pengaruh aplikasi Bacillus spp., Streptomyces spp., dan Mikoriza secara tunggal maupun kombinasi terhadap berat segar dan berat kering daun tembakau; tanaman tembakau tanpa PGPR/PGPF, tanpa diinokulasi Tobamovirus (K1);  tanaman  tembakau  tanpa  PGPR/PGPF,  diinokulasi Tobamovirus (K2);  tanaman tembakau diberi perlakuan Bacillus spp., tanpa diinokulasi Tobamovirus (B1); tanaman tembakau diberi perlakuan Bacillus spp., diinokulasi Tobamovirus (B2); tanaman tembakau diberi perlakuan Streptomyces spp., tanpa diinokulasi Tobamovirus (S1); tanaman tembakau diberi perlakuan Streptomyce s spp., diinokulasi Tobamovirus (S2); tanaman tembakau diberi perlakuan Mikoriza, diinokulasi Tobamovirus (M1); tanaman tembakau diberi perlakuan  Mikoriza, diinokulasi Tobamovirus (M2); tanaman tembakau, diberi perlakuan Bacillus spp., Streptomyces spp., Mikoriza, tanpa diinokulasi Tobamovirus (BSM1); tanaman tembakau yang diberi perlakuan Bacillus spp., Streptomyces spp., Mikoriza, tanpa diinokulasi Tobamovirus (BSM2)]
Tabel 2. Pengaruh aplikasi agens hayati terhadap pertumbuhan tanaman tembakau pada berbagai perlakuan pada 9 minggu setelah tanam.
Perlakuan Tinggi tanaman (cm) Jumlah daun Diameter batang (cm) Panjang akar (cm) B1 109,2 ab 27,5 a 9,41 ab 31,47 a B2 109,9 ab 27,5 a 9,02 abc 30,729 a S1 92,5 cd 27,5 a 8,8 bcd 27,943 ab S2 97,2 bc 27,7 a 9,24 abc 27,871 ab M1 114,1 a 26,3 a 9,58 ab 24,571 abc M2 107,1 ab 27,6 a 9,99 a 26,914 ab BSM1 86,0 cde 22,9 b 8,11 cde 21,0 bcd BSM2 81,0 def 22,9 b 7,65 e 14,829 d K1 73,1 ef 22,9 b 7,57 e 19,057 cd K2 71,5 f 22,6 b 7,72 de 19,114 cd
Keterangan: 1. Data yang diikuti huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata berdasarkan uji DMRT dengan taraf  kepercayaan 95%.
2. Tanaman tembakau tanpa PGPR/PGPF, tanpa diinokulasi Tobamovirus (K1); tanaman tembakau tanpa PGPR/PGPF, diinokulasi Tobamovirus (K2); tanaman tembakau diberi perlakuan Bacillus spp., tanpa diinokulasi Tobamovirus (B1); tanaman tembakau diberi perlakuan Bacillus spp., diinokulasi Tobamovirus (B2); tanaman tembakau diberi perlakuan Streptomyces spp., tanpa diinokulasi Tobamovirus (S1); tanaman tembakau diberi perlakuan Streptomyce s spp., diinokulasi Tobamovirus (S2); tanaman tembakau diberi perlakuan Mikoriza, diinokulasi Tobamovirus (M1); tanaman tembakau diberi perlakuan Mikoriza, diinokulasi Tobamovirus (M2); tanaman tembakau, diberi perlakuan Bacillus spp., Streptomyces spp., Mikoriza, tanpa diinokulasi Tobamovirus (BSM1); tanaman tembakau yang diberi perlakuan Bacillus spp., Streptomyces spp., Mikoriza, tanpa diinokulasi Tobamovirus (BSM2).
Putri et al. : Respons Ketahanan Tembakau terhadap Tobamovirus dengan Agens Hayati sebagai Induser 207
bahwa aplikasi kombinasi JMA dengan PGPR akan berinteraksi sinergis untuk merangsang pertumbuhan tanaman dan secara signifikan dapat meningkatkan panjang akar, berat akar segar, berat kering akar, bobot segar tunas, berat kering tunas, jumlah daun, dan biomassa tunas dan akar tomat.

## KESIMPULAN
Aplikasi Bacillus spp., Streptomyces spp., dan Mikoriza pada tanaman tembakau yang diinokulasi Tobamovirus dapat menekan insidensi dan intensitas penyakit  mosaik.  Induksi  ketahanan  tanaman tembakau  terhadap Tobamovirus karena  adanya peningkatan aktivitas enzim peroksidase. Analisis protein  dengan  SDS-PAGE,  diperoleh  perbedaan jumlah  dan  ukuran  pita  protein  pada  tanaman tembakau  yang  diinokulasi Tobamovirus dengan tanaman yang tidak diinokulasi Tobamovirus pada berbagai perlakuan. Aplikasi Bacillus spp., Streptomyces spp., dan Mikoriza   secara tunggal berpengaruh nyata terhadap  pertumbuhan  tanaman  tembakau  yang terinfeksi Tobamovirus pada parameter tinggi tanaman, jumlah daun, diameter batang, panjang akar, berat segar dan berat kering daun tembakau.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Naskah ini disusun berdasarkan sebagian data dari  tesis  penulis  pertama.  Ucapan  terima  kasih penulis sampaikan kepada Ibu Erna Anastasia selaku Kepala Penelitian Tembakau PTPN X serta seluruh staf Pusat Penelitian Tembakau Klaten yang telah memberikan fasilitas dan benih.

## DAFTAR PUSTAKA
Agrios, G.N. 2005. Plant Pathology , 5 th ed, Elsevier. Academic Press, New York. 272 p.
Chittoor,  J.M.,  J.E.  Leach,  &  White,  F.F.  1997. Differential  Induction  of  a  Peroxidase  Gene Family during Infection of Rice by Xanthomonas oryzae pv. oryzae . Molecular Plant-Microbe Interactions 10: 861−871.
Dewi, I.R. 2008. Peranan dan Fungsi Fitohormon bagi Pertumbuhan Tanaman. http://repository. unpad.ac.id/2326/1/makalah_fitohormon.pdf. diakses 20/11/2017. 43 hlm.
Endarsih,  W.,  S.  Hartono,  &  S.  Sulandari.  2017. Perbaikan Metode Ekstraksi dsRNA Virus secara Sederhana untuk RT-PCR Tiga Virus Tumbuhan. Jurnal  Perlindungan  Tanaman  Indonesia 21: 106−113.
Faizah, R., Sriani S, M. Syukur, & S.H. Hidayat. 2012.  Ketahanan  Biokimia  Tanaman  Cabai terhadap Begomovirus Penyebab Penyakit Daun Keriting Kuning. Jurnal Fitopatologi Indonesia 8: 138−144.
Gall, O., G.A. Medgyesi, & L. Vereskey. 1980. Electrophoresis in the Separation of Biological Macromolecules . John Willey & Sons. New York. 422 p.
Imron, M., Suryanti, & S. Sulandari. 2015. Peranan Mikoriza  Arbuskular  terhadap  Perkembangan Penyakit Daun Keriting Kuning Cabai. Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia 19: 94−98.
Kavatagi, P.K., & H.C Lakshman. 2014. Interaction between AMF  and  Plant  Growth-Promoting Rhizobacteria  on  Two  Varieties  of Solanum lycopersicum L.. World Applied Sciences Journal 32: 2054−2062.
Marlina, Susanna, & C.M.F. Kausa. 2010. Kemampuan Fungi Mikoriza Arbuskula (FMA) dalam Menekan Perkembangan Colletotrichum capsici Penyebab Antraknosa pada Cabai Merah ( Capsicum annum L.). Jurnal Penelitian Universitas Jambi Seri Sains 12: 37−42.
Maurhofer, M., C. Hase, P. Meuwly, J.P. Metraux, & G. Defago. 1994. Induction of Systemic Resistance of  Tobacco  to Tobacco  necrosis  virus by  the Root-colonizing Pseudomonas fluorescens S train CHA0: Influence of the gacA Gene and Pyoverdine Production. Phytopathology 84: 139−146.
Meshi, T., Y. Watanabe, T. Saito, A. Sugimoto, T.
Maede, & Y. Okada. 1987. Function of the 30 kd Protein of Tobacco mosaic virus : Involvement in Cell-to-cell  Movement  and  Dispensability  for Replication. EMBO Journal 6: 2557–2563.
Murphy,  J.F.,  G.W.  Zehnder,  D.J.  Schuster,  E.J. Sikora, J.E.Polston, & J.W. Kloepper. 2000. Plant Growth-Promoting  Rhizobacteria  Mediated Protection  in  Tomato  against Tomato  mottle virus . Plant Disease 84: 779−784.
Putri,  R.A.,  S.  Sulandari,  & T. Arwiyanto.  2015. Pengaruh Aplikasi Streptomyces spp. terhadap Penyakit Kuning, Pertumbuhan, dan Produksi Tanaman Cabai Besar. Skripsi. Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. 55 hlm.
Raupach, G.S. & J.W. Kloepper, 1998. Mixture of Plant Growth-Promoting Rhizobacteria Enhance Biological Control of Multiple Cucumber Pathogens. Phytopathology 88: 1158−1164.
Ross, A.F. 1961. Localized Acquired Resistance to Plant Virus Infection in Hypersensitive Hosts. Virology 14: 340–358.
Ryu,  C.M.,  J.F.  Murphy,  M.S.  Reddy,  &  J.W. Kloepper.  2007.  A  Two  Strain  Mixture  of Rhizobacteria  Elicits  Induction  of  Systemic Resistance  against Pseudomonas  syringae and Cucumber mosaic virus Coupled to Promotion of Plant Growth on Arabidopsis thaliana . Journal of Microbiology and Biotechnology 17: 280−286.
SAS Institute. 1990. SAS User’s Guide, version 6.0. NC: SAS Institute, Cary.
Semangun,  H.  2006. Pengantar  Ilmu  Penyakit Tumbuhan. Gadjah  Mada  University  Press,
Yogyakarta. 754 hlm.
Spitsin, S., K. Steplewski., N. Fleysh, H. Belanger, T.  Mikheeva, S.  Shivprasad,  W.  Dawson,  H. Koprowski, & V. Yusibov. 1999. Expression of Alfalfa  mosaic  virus  C oat  Protein  in Tobacco mosaic virus (TMV) Deficient in the Production of  its  Native  Coat  Protein  Supports  Long- Distance  Movement  of  a  Chimeric  TMV. Proceedings  of  the  National  Academy  of Sciences  of  the  United  States  of  America 96: 2549−2553.
Taufik, M., S.H. Hidayat, G. Suastika, S.M. Sumaraw,
&  S.  Sujiprihati.  2005.  Kajian Plant  Growth Promoting Rhizobacteria sebagai Agens Proteksi Cucumber mosaic virus dan Chilli veinal mottle virus pada Cabai. Hayati 12: 139−144.
Thakuria, D., N.C. Talukdar, C. Goswani, S. Hazarika, R.C. Boro, & M.R. Khan. 2004. Characterization and Screening of Bacteria from Rhizosphere of Rice  Grown in Acidic Soils of Assam. Current Science 86: 978−985.
Walters, D.R, J. Ratsep, & N.D. Havis. 2013. Controlling Crop Disease Using Induced Resistance: Challenges for the Future. Journal of Experimental Botany 64: 1263−1280.
Zehnder, G.W., C. Yao, J.F. Murphy, E.R. Sikora, & J.W. Kloepper. 2000. Induction of Resistance in Tomato against Cucumber mosaic cucumovirus by Plant Growth-Promoting Rhizobacteria. Bio Control 45: 127−137.
Zen, K., R. Setiamiharja, Murdaningsih, & T. Suganda.
2002. Aktivitas Enzim Peroksidase pada Lima Genotip  Cabai  yang  Mempunyai  Ketahanan Berbeda terhadap Penyakit Antraknosa. Zuriat 13: 97−105.
Putri et al. : Respons Ketahanan Tembakau terhadap Tobamovirus dengan Agens Hayati sebagai Induser 209