JBE 6 (3) (2021)173-184

## BIO-EDU: Jurnal Pendidikan Biologi
https://jurnal.unimor.ac.id/JBE/index
Isolasi dan Identifikasi Molekular Bakteri Asam Laktat Penghasil Antimikrobia dari Saluran Pencernaan Belut (Monopterus albus)
Ridwan 1 , La Ode Kaharudin 2 1,2 Pendidikan Biologi, Universitas Muslim Buton Jln. Betoambari No.146 Kota Baubau, Sulawesi Tenggara
Email: ridwan071093@gmail.com
DOI: https://doi.org/10.32938/jbe.v6i3.1277

## Abstrak
Isolasi  bakteri  asam  laktat  menggunakan  sampel  saluran  pencernaan  belut  ( Monopterus  albus ).  Hasil isolasi diperoleh sebanyak tigabelas isolat, bakteri hasil isolasi selanjutnya dikarakterisasi secara fenotipik untuk memilih bakteri asam laktat. Hasil karakterisasi fenotipik diperoleh tujuh isolat yang sesuai dengan karakter  bakteri  asam  laktat  (ciri  bakteri  asam  laktat  bersifat  gram  positif  dan  katalase  negatif).  Tujuh isolat  tersebut  kemudian  diuji  kemampuannya  dalam  menghambat  pertumbuhan  bakteri  patogen ( Aeromonas hydrophila, Staphylococcus aureus, dan Vibrio harveyi ). Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa  tujuh  isolat  bakteri  asam  laktat  memiliki  aktivitas  antimikroba  yang  mampu  menghambat pertumbuhan bakteri patogen dengan diameter zona hambat diantaranya isolat BA1 sebesar 23,33 ± 1,15 mm pada bakteri Vibrio harveyi, 11,67 ± 0,58 mm pada Aeromonas hydrophila dan 16,67 ± 0,58 mm pada Staphylococcus aureus . Isolat B1B memiliki diameter zona hambat sebesar 21,00 ± 1,00 mm pada Vibrio harveyi, 11,33 ± 1,15 mm pada Aeromonas hydrophila dan sebesar 14,67 ± 1,15 mm pada Staphylococcus aureus. Isolat B1C memiliki diameter zona hambat sebesar 21,00 ± 3,46 mm pada Vibrio harveyi, 12,33 ± 2,3  mm  pada Aeromonas  hydrophila dan  9,00  ±  1,73  mm    pada Staphylococcus  aureus. Isolat  B1D memiliki  diameter  zona  hambat  sebesar  25,33  ±  2,89  mm  pada Vibrio  harveyi, 12,33  ±  2,52  mm  pada Aeromonas hydrophila dan 13,00 ± 2,65 mm pada Staphylococcus aureus. Isolat B1E memiliki diameter zona  hambat  sebesar  22,33  ±  3,21  mm  pada Vibrio  harveyi, 12,00  ±  3,00  mm  pada Aeromonas hydrophila dan 11,33 ± 1,15 mm pada Staphylococcus aureus. Isolat B1F memiliki diameter zona hambat sebesar 21,00 ± 1,73 mm pada Vibrio harveyi, 11,33 ± 1,15 mm pada Aeromonas hydrophila dan 11,67 ± 2,08  mm  pada Staphylococcus  aureus .  Serta    isolat  B1G memiliki  diameter  zona  hambat  18,67  ±  0,58 mm  pada Vibrio  harveyi, 11,67  ±  0,58  mm  pada Aeromonas  hydrophila dan  13,67  ±  4,04  mm  pada Staphylococcus  aureus. Penghambatan  terhadap  bakteri  uji  mengindikasikan  bahwa  bakteri  tersebut mampu  menghasilkan antimikrobia. Tiga terbaik dari tujuh  isolat bakteri diidentifikasi secara molekular menggunakan gen 16Sr RNA dengan primer 27F (5'-AGAGTTTAGTCCTGGCTCAG-3') dan 1492R (5'- GGTTACCTTGTTACGACTT-3').  Hasil  yang  diperoleh  menunjukkan  bahwa  tiga  isolat  bakteri merupakan spesies Lactococcus lactis.
Kata Kunci: bakteri asam laktat, belut ( Monopterus albus ), antimikroba, gen 16s rRNA

## Abstract
Isolation of lactic acid bacteria using eel digestive tract samples (Monopterus albus). The isolation results obtained as many as thirteen isolates, the isolate bacteria were then phenotypically characterized to select lactic  acid  bacteria.  The  results  of  phenotypic  characterization  obtained  seven  isolates  that  are  in accordance  with  the  character  of  lactic  acid  bacteria  (the  characteristic  of  lactic  acid  bacteria  is  gram positive and negative catalase). The seven isolates were then tested for their ability to inhibit the growth of pathogenic bacteria ( Aeromonas hydrophila, Staphylococcus aureus, and Vibrio harveyi ). The results
obtained  showed  that  seven  isolates  of  lactic  acid  bacteria  had  antimicrobial  activity  that  was  able  to inhibit  the  growth  of  pathogenic  bacteria  with  a  zone  of  inhibition  diameter  including  BA1  isolates  of 23.33 ± 1.15 mm in Vibrio harveyi bacteria, 11.67 ± 0.58 mm in Aeromonas. hydrophila and 16.67 ± 0.58 mm in Staphylococcus aureus . Isolate B1B had inhibition zone diameters of 21.00 ± 1.00 mm in Vibrio harveyi , 11.33 ± 1.15 mm in Aeromonas hydrophila and 14.67 ± 1.15 mm in Staphylococcus aureus . B1C isolates  had  inhibition  zone  diameters  of  21.00  ±  3.46  mm  in Vibrio  harveyi ,  12.33  ±  2.3  mm  in Aeromonas  hydrophila and  9.00  ±  1.73  mm  in Staphylococcus  aureus .  B1D  isolate  had  inhibition  zone diameter of 25.33 ± 2.89 mm in Vibrio harveyi , 12.33 ± 2.52 mm in Aeromonas hydrophila and 13.00 ± 2.65  mm  in Staphylococcus  aureus .  B1E  isolate  had  inhibition  zone  diameters  of  22.33  ±  3.21  mm  in Vibrio  harveyi ,  12.00  ±  3.00  mm  in Aeromonas  hydrophila and  11.33  ±  1.15  mm  in Staphylococcus aureus . B1F isolates had inhibition  zone diameters of 21.00 ± 1.73 mm in Vibrio harveyi , 11.33 ± 1.15 mm  in Aeromonas  hydrophila and  11.67  ± 2.08  mm  in Staphylococcus  aureus .  And  isolate  B1G  had  an inhibition  zone  diameter  of  18.67  ±  0.58  mm  in Vibrio  harveyi ,  11.67  ±  0.58  mm  in Aeromonas hydrophila and  13.67  ± 4.04 mm  in Staphylococcus  aureus .  The  inhibition  of  the  test  bacteria  indicated that the bacteria were capable of producing antimicrobials. The best three of the seven bacterial isolates were identified molecularly using the 16Sr RNA gene with primers 27F (5'- AGAGTTTAGTCCTGGCTCAG-3')  and  1492R  (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3').  The  results obtained showed that the three bacterial isolates were Lactococcus lactis species.
Keywords: lactic acid bacteria, eel ( Monopterus albus ), antimicrobial, 16s rRNA gene

## PENDAHULUAN
Bakteri  asam  laktat  merupakan  kelompok  bakteri  gram  positif  yang dikelompokkan  berdasarkan  karakteristik  morfologi,  metabolik,  dan  fisiologi  tertentu (Wright  and  Axelsson,  2012).  Bakteri  asam  laktat  termasuk  flora  normal  saluran pencernaan  hewan  sehat,  seperti  mamalia  dan  hewan  akuakultur  termasuk  ikan (Nikoskelainen  dkk.  2001).  Strain  bakteri  asam  laktat  bermanfaat  bagi  kesehatan  ikan yang  dapat  merangsang  sistem  kekebalan  (Gatesoupe,  2007).  Bakteri  asam  laktat memiliki  aktivitas  antimikroba  karena  produksi  asam  laktat,  asam  asetat,  molekul bioaktif  seperti etanol, asam format, asam lemak, hidrogen peroksida, diasetil, reuterin, dan  reutericyclin.  Banyak  strain  juga  menghasilkan  bakteriosin  dan  molekul  mirip bakteriosin yang menunjukkan aktivitas bakteriosin (Aween dkk., 2012).
Baketeri  asam  laktat  merupakan  kelompok  bekteri  heterogeny  yang  berperan penting  dalam  berbagai  proses  fermentasi.  Bakteri  asam  laktat  memfermentasi karbohidrat  makanan  dan  menghasilkan  asam  laktat  sebagai  produk  utama  fermentasi. Bakteri asam  laktat  dapat diaplikasikan sebagai  kultur starter, dengan berbagai  macam produk  susu  fermentasi  (yaitu  keju,  yoghurt,  susu  fermentasi),  daging,  ikan,  buah, sayuran  dan  sereal  (Bintsis  2018).  Bakteri  Asam  Laktat  dapat  dikembangkan  sebagai probiotik  yang  menguntungkan  bagi  kesehatan  inang,  termasuk  perlindungan  terhadap patogen  dan  pengembangan  sistem  kekebalan  tubuh.  Probiotik  didefinisikan  sebagai tambahan  mikroganisme  hidup  yang  memiliki  efek  menguntungkan  bagi  kesehatan inang dengan memodifikasi komunitas mikroganisme inang (Verschuere dkk. 2000).
Peranan penting bakteri asam laktat bagi kesehatan inang mendorong para peneliti untuk  mengisolasi  dan  menguji  kemampuan  bakteri  tersebut  dari  berbagai  sumber, misalnya  usus  ikan.  Penelitian  ini  dilakukan  untuk  mengisolasi  dan  mengidentifikasi bakteri asam laktat penghasil antimikorobia dari saluran pencernaan belut ( Monopterus albus ).

## METODE

## Alat dan Bahan
Alat  yang digunakan pada penelitian meliputi:  tabung reaksi,  erlenmeyer, cawan petri, kaca  objek,  pipet  ukur  dan  gelas  ukur,  timbangan  analitik,  mikropipet,  inkubator, autoklaf,  rak  tabung,  vortex,  sentrifuga,  lemari  pendingin, mortar,  jarum  ose, tube, spatula, bunsen dan kamera. Selanjutnya bahan yang digunakan diantaranya: usus belut, media MRSA ( De Mann Rogosa Shape Agar ), MRSB ( De Mann Rogosa Shape broth ), media Natrium Agar, akuades steril, kapas, kristal violet, iodin, etanol, safranin, spritus, alkohol, aluminium foil, tisu, serbuk agaros, TAE, loading dye , EtBr, deionized water , primer, buffer , enzim lysozyme , proteinase K, kloroform, CaCO 3 , NaoH 0,1 N dan HCL 1 N.

## Persiapan sampel
Belut  diperoleh  dari  pasar  Yogyakarta,  dibawa  ke  Laboratorium  Mikrobiologi. Setelah  itu,  belut  dibedah  pada  bagian  perut  secara  aseptis  dan  diambil  saluran pencernaan  yang  terdiri  dari  usus.  Saluran  pencernaan  tersebut  kemudian  dihaluskan sampai halus menggunakan mortar.

## Isolasi Bakteri Asam Laktat
Isolasi bakteri asam laktat menggunakan meetode pour plate. Tahapan dilakukan dengan  menimbang  sampel  usus  belut  yang  telah  dihaluskan  sebanyak  1  g  dan dimasukkan  ke  dalam  9  mL  akuades  steril  lalu  di  homogenkan  menggunakan  vortex. Selanjutnya  akuades  yang  telah  dimasukkan  1  g  sampel  diambil  sebanyak  1  mL  dan dimasukkan ke dalam tabung yang berisi akuades 9 mL, sehingga diperoleh pengencer 10 -2 . Prosedur yang sama dilakukan sampai pada pengencer 10 -6 . Pengencer   10 -2 -10 -6 masing-masing diambil sebanyak 0,4 mL dan dimasukkan kedalam cawan petri. Cawan petri  yang  telah  berisi  sampel  ditambahkan  media  MRSA  ( De  Man  Rogosa  Sharpe Agar ). Setelah itu diinkubasi pada suhu ruang selama 24-48 jam (Bajpai dkk.. 2016). Koloni yang tumbuh setelah inkubasi 24-48 jam dipilih untuk dimurnikan. Koloni yang dipilih hanya kelompok bakteri asam laktat. Bakteri Asam Laktat ditandai dengan adanya zona bening di sekitar koloni (Mithun, et al. 2015). Pemurnian bakteri dilakukan dengan menggunakan metode spread plate. Isolat  bakteri  diambil menggunakan jarum ose steril kemudian digores  pada permukaan media MRSA dalam cawan petri, setelah itu  diinkubasi  pada  suhu  ruang  selama  24-48  jam.  Koloni  yang  tumbuh  selanjutnya diinokulasi pada media miring dalam tabung reaksi, setelah itu diinkubasi selama 24-48 jam  pada  suhu  ruang.  Isolat  dalam  media  miring  diperbanyak  dan  disimpan  dalam lemari pendingin sebagai stok kultur.

## Karakterisasi Fenotipik Bakteri Asam Laktat Pengecatan Gram
Pengecatan  gram  bertujuan  untuk  memilih  bakteri  yang  kemungkinan  termasuk golongan  bakteri  asam  laktat.  Bakteri  asam  laktat  termasuk  kelompok  bakteri  gram positif.  Pengecatan  gram  dilakukan  dengan  cara  sediaan  bakteri  difiksasi  di  atas  kaca objek  dan  diwarnai  dengan  Kristal  violet  (A)  lalu  didiamkan  selama  1  menit.  Kristal violet  tersebut  kemudian  dibilas  dengan  akuades,  setelah  itu  diwarnai  dengan  larutan iodin (B) dan didiamkan selama 1 menit. Kemudian dibilas dengan etanol (C) selama 30 detik, lalu dicuci dengan air dan diwarnai dengan safranin (D) selama 20 detik. Sediaan dicuci, dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop (Radji, 2010).

## Uji Katalase
Uji  katalase  bertujuan  untuk  memilih  bakteri  yang  kemungkinan  termasuk golongan  bakteri  asam  laktat.  Umumnya  bakteri  asam  laktat  memilki  sifat  katalase negatif. Uji katalase dilakukan dengan membuat preparat bakteri diatas permukaan kaca preparat.  Setelah  itu  preparat  ditetesi  dengan    1-2  tetes  hidrogen  peroksida  30%,  jika terbentuk  gelembung  udara  pada  preparat  mengindikasikan  bahwa  bakteri  termasuk katalase positif (Sari dkk., 2012).

## Uji Aktivitas Antimikrobia Bakteri
Uji  aktivitas  antimikrobia bakteri  asam  laktat  menggunakan tiga jenis bakteri  uji diantarnya Aeromonas  hydrophila , Vibrio  harveyi dan Staphylococcus  aureus .  Bakteri uji merupakan bakteri patogen yang dipilih untuk menguji aktivitas antimikroba bakteri asam laktat.  Uji kemampuan bakteri asam laktat dilakukan dengan metode difusi agar, satu  ose  kultur  bakteri  uji  ( Aeromonas  hydrophila , Vibrio  harveyi,  Staphylococcus aureus )  masing-masing  diinokulasikan  ke  dalam  media  Nutrien  Broth  20  mL,  lalu diinkubasi  pada  suhu  30 o C  selama  24  jam.  Selanjutnya  masing-masing  bakteri  uji sebanyak  25  µL  diinokulasikan  ke  dalam  cawan  petri  lalu  ditambahkan  media  media NA  ( Nutrient  Agar ).  Setelah  memadat,  dibuat  sumuran  pada  media  NA  dalam  cawan petri  sebesar  6mm.    Sumuran  pada  media  NA  diinokulasikan  sebanyak  20  µL  media MRSB  yang  telah  berisi  kultur  Bakteri  Asam  Laktat.  Media  NA  tersebut  kemudian diinkubasi  pada  suhu  30 o C  selama  24-48  jam.  Zona  bening  yang  terbentuk  di  sekitar sumuran diukur sebagai aktivitas antimikroba Bakteri Asam laktat (Vasiee dkk., 2014). Bakteri  yang  memiliki  aktivitas  penghambatan  paling  baik  di  identifikasi  secara molekular.

## Identifikasi Molekular Bakteri Asam Laktat Ekstraksi DNA Bakteri
Ekstraksi  DNA  genom  dilakukan  sesuai  dengan  protokol  ekstraksi  DNA  yang terdapat  dalam  Geneaid  Presto TM Mini  gDNA  Bacteria  Kit.  Tahapan  yang  dilakukan yaitu  menyiapkan  kultur  bakteri  pada  media  MRSB  yang  berusia  48  jam.  Kultur bakteri sebanyak 1,5 ml dipindahkan ke tube mikrosentrifugasi, kemudian di sentrifuge selama  1  menit  dengan  kecepatan  14-16,000  x  g  lalu  supernatant  dibuang.  Sebanyak 200  µl  gram  (+)  buffer  dimasukkan  ke tube  sentrifuge dan  ditambahkan lysozyme (4 mg/ml) kemudian di vortex sampai lysozyme benar-benar larut. Larutan gram (+) buffer yang  telah  ditambahkan lysozyme dimasukkan  ke  dalam  sampel  kemudian pellet disuspensi  ulang menggunakan vortex atau pipet. Sampel selanjutnya diinkubasi  pada suhu  37 o C  selama  20  menit,  selama  inkubasi  dilakukan  pembalikkan  beberapa  kali. Selanjutnya 20 µ l proteinase K ditambahkan dan di vortex sampai homogen.  Inkubasi pada  suhu  60 o C  selama  10  menit,  selama  inkubasi  setiap  3  menit  dilakukan pembalikkan (Geneaid 2017).
Tahapan selanjutnya sampel ditambahkan 200 µ l  GB buffer kemudian di voretex, setelah  itu  diinkubasi  selama  10  menit  pada  suhu  70 o C.  Sampel  selanjutnya ditambahkan  200 µ l ethanol  absolute kemudian  di vortex selama  10  detik.  Setelah dimasukkan  kedalam  GD collum dan  di sentrifuge dengan  kecepatan  14-16.000  g selama  2  menit. Collect  tube yang  sebelumnya  digunakan  diganti  dengan  yang  baru. Setelah  itu  ditambahkan  400  µl  W1 buffer dan  di sentrifuge dengan  kecepatan  14- 16.000 g selama 30 detik. Kemudian 600 µl W1 buffer ditambahkan dan di sentrifuge dengan kecepatan 14-16000 g selama 30 detik, selanjutnya GD colomm dipindahkan ke dalam  tabung eppendorf steril  dan  ditambahkan  100  µl pre-heated  elution. Sampel
kemudian di sentrifuge dengan kecepatan 14-16000 g selama 3 menit. Supernatan yang masih berada dalam tebung eppendorf adalah ekstrak DNA.

## Pengukuran Konsentrasi dan Kemurnian DNA
Pengukuran  konsentrasi  dan  kemurnian  DNA  dilakukan  dengan  meneteskan sebanyak  1  µL  suspensi  DNA  ke  atas UV-Vis nanodrop-spektrofotometer  ( termo Scientific ), di ulang sebanyak 3 kali. Kemurnian DNA diukur pada panjang gelombang A260/A280.  Sampel  DNA  dianggap  baik  berada  pada  kisaran  nilai  1.8-2.0.  Jika  nilai kemurnian kurang dari kisaran tersebut maka konsentrasi protein bawaan cukup tinggi sedangkan  jika  nilai  lebih  besar  maka  konsentrasi  DNA  cukup  tinggi  (Syahputra, 2016).

## Amplifikasi Gen 16S rRNA Bakteri Asam Laktat
Reaksi amplifikasi dilakukan dalam tabung PCR , ampifikasi menggunakan TaKara Eq Taq sebanyak 0,25 µl, 10 x Ex Taq Buffer (mengandung Mg 2+ 2,5 mM) sebanyak 5 µl, dNTP mixture (2,5 mM) sebanyak 4µl, primer 27f (5'-
AGAGTTTAGTCCTGGCTCAG-3')  dan  1492r  (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') masing-masing  sebanyak  0,5  µl,  ekstrak  genom  sebanyak  1  µg  dan  air  destilasi ditambahkan sebanyak 10 µl. Amplifikasi dilakukan sampai mendapatkan pita tunggal, proses  amplifikasi  diberi  perlakuan:  pra-denaturasi  pada  suhu  96ºC  selama  4  menit, diikuti  30  siklus  pada  suhu  94ºC  selama  1  menit, annealing pada  suhu  51,5ºC  selama 1,30  menit.  Setelah  itu  ekstensi  pada  suhu  68ºC  selama  8  menit,  PCR  diselesaikan dengan elongasi selama 10 menit pada suhu 68°C. Produk PCRkemudian diambil dan disimpan    pada  suhu  4°C  dan  diperiksa  menggunakan  agarosa  1%  (Lawalata  dkk., 2015).

## Elektoforesis  Agarosa
Agarosa  sebanyak  1,5%  dipanaskan  sampai  mendidih  dengan  pelarut buffer TAE  ( tris  asetat ).  Setelah  itu  didinginkan,  lalu  dituang  pada tray elektroforesis  dan ditunggu  sampai  memadat,  kemudian  sisiran  diangkat.  Selanjutnya,  pada  alat elektroforesis dituangkan buffer TAE 1x, tray yang berisi agarosa yang sudah memadat kemudian ditempatkan di alat elektroforesis sampai terendam oleh buffer. Loading dye disiapkan  di  atas  parafilm  kemudian  dicampur  produk  PCR  sebanyak  4  µl  dan dimasukkan  ke  dalam  sumur  agarosa  menggunakan  mikropipet,  selain  itu  disiapkan marker  3  µl.  Alat  elektroforesis  dijalankan  pada  voltase  100  volt  selama  30  menit. Agarosa  hasil  elektroforesis  direndam  pada  larutan  pewarna  etidium  bromida  selama 10  menit.  Selanjutnya  divisualisasikan  pada transilluminator .  Adanya  pita  DNA dengan ukuran ± 1500 bp menunjukkan bahwa gen 16S rRNA telah teramplifikasi,hasil yang diperoleh di dokumentasikan menggunakan kamera.

## Sekuensing Gen 16S rRNA
Sekuensinggen 16S  rRNA hasil  elektroforesis  dilakukan  dilakukan  oleh  PT  Genetika Indonesia.

## Analisis data
Analisis data meliputi analisis hasil pengujian aktivitas antimikroba dan analisis hasil  sekuensing  gen 16S  rRNA .  Hasil  pengujian  aktivitas  antimikroba  dianalisis menggunakan  SPSS  17.0  dengan  metode  analisis  varian  satu  arah  ( one  way  anova ).
Analisis  statistik  menggunakan  taraf  kepercayaan  95%  (α  =  0,05)  dan  dilanjutkan dengan  uji Duncan .  Data  hasil  sekuensing  gen 16S  rRNA dianalisis  pada  situs www.ncbi.nlm.nih.gov.  Program  BLAST  digunakan  untuk  menentukan  similaritas sequen nukleotida sehingga dapat dilakukan identifikasi berdasarkan kesamaan sequen
nukleotida.  Selanjutnya  dilakukan  Kontruksi Phylogeny  Tree untuk  menentukan tingkat kedekatan antar spesies menggunakan aplikasi MEGAX (Kumar dkk., 2018).

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Isolasi Bakteri Asam Laktat
Isolasi  bakteri  asam  laktat  diperoleh  sebanyak  13  isolat  bakteri.  Hasil  isolasi seperti  yang tercantum pada Gambar 1 kemudian dikarakterisasi  secara fenotipik  yang meliputi:  bentuk  sel,  pengecatan  gram  dan  uji  katalase.  Hasil  karakterisasi  fenotipik tercantum pada Tabel 1.

## Tabel 1. Hasil Karakterisasi Fenotipik
Kode Isolat Karakter Sifat katalase Bentuk sel Sifat gram Bentuk koloni Elevasi  Margin  Tekstur  Warna B1A (-) Coccus (+) Sirkular Conveks Entire Halus Cream B1B (-) Coccus (+) Sirkular Flat Entire Halus Cream B1C (-) Coccus (+) Sirkular Conveks Entire Halus Putih susu B1D (-) Coccus (+) Sirkular Conveks Entire Halus Putih susu B1E (-) Coccus (+) Sirkular Conveks Entire Halus Cream B1F (-) Coccus (+) Sirkular Conveks Entire Halus Putih susu B1G (-) Coccus (+) Sirkular Conveks Entire Halus Putih susu B1H (+) Coccus (-) Sirkular Konveks Entire Halus Putih susu B1I (+) Coccus (-) Sirkular Conveks Entire Halus Putih susu B1J (+) Coccus (+) Sirkular Conveks Entire Halus Putih susu B1K (+) Coccus (-) Sirkular Conveks Entire Halus Putih susu B1L (+) Coccus (-) Sirkular Conveks Entire Halus Putih susu B1M (+) Coccus (-) Sirkular Conveks Entire Halus Putih susu
Keterangan: B1A s.d B1M : Isolat 1 s.d Isolat 13
Berdasarkan  data  pada  Tabel  1  menunjukkan  bahwa  13  isolat  bakteri  hasil isolasi memiliki perbedaan pada sifat gram dan sifat katalase. Sifat katalase yang sesuai dengan karakter bakteri asam laktat dimiliki oleh 7 isolat bakteri. Ketujuh isolat tersebut diantaranya  B1A,  B1B,  B1C,  B1D,  B1F,  B1G.  Sedangkan  6  isolat  lainnya  memiliki sifat  katalase  positif.  Tujuh  isolat  bakteri  yang  identik  dengan  karakter  bakteri  asam laktat  berdasarkan  karakteristik  fenotipik  selanjutnya  dialakukan  uji  aktivitas antimikroba  yang  dihasilkan.  Karakter  yang  membedakan  Bakteri  asam  laktat  dengan bakteri  lain  diantaranya  sifat  katalase  negatif,  bersifat  gram  positif  dan  menghasilkan zona hambat pada sekitar koloni (Nursyirwani dkk., 2017).

## Gambar 1. A) Koloni Bakteri Asam Laktat Hasil Isolasi yang Membentuk Zona
Bening, B) Koloni Bakteri Hasil Streak
Uji  aktivitas  antimikrobia  bakteri  dilakukan  untuk  mengetahui  kemampuan bakteri  asam  laktat  dalam  menghambat  pertumbuhan  bakteri  patogen.  Bakteri  patogen yang dipilih sebagai bakteri uji diantaranya, Aeromonas hydrophila, Vibrio harveyi dan Staphylococcus aureus.
Gambar  2.  Zona  hambat  bakteri  asam  laktat  hasil  screening  terhadap  :  A) Aeromonas hydrophila; B) Vibrio harveyi; danC) Staphylococcus aureus
Tabel 2. Uji Aktivitas Antimikrobia Bakteri Asam Laktat
No Kode isolate Ø Sumuran (mm) Ø Rata-rata zona hambat (mm) Vibrio harveyi Aeromonas hydrophila Staphylococcus aureus 1 B1A 5 23,33 ± 1,15 ab 11,67 ± 0,58 a 16,67 ± 0,58 a 2 B1B 5 21,00 ± 1,00 cd 11,33 ± 1,15 a 14,67 ± 1,15 ab 3 B1C 5 21,00 ± 3,46 cd 12,33 ± 2,31 a 9,00 ± 1,73 c 4 B1D 5 25,33 ± 2,89 a 12,33 ± 2,52 a 13,00 ± 2,65 b 5 B1E 5 22,33 ± 3,21 bc 12,00 ± 3,00 a 11,33 ± 1,15 bc 6 B1F 5 21,00 ± 1,73 cb 11,33 ± 1,15 a 11,67 ± 2,08 bc 7 B1G 5 18,67 ± 0,58 d 11,67 ± 0,58 a 13,67 ± 4,04 ab 8 K- 5 - - - Keterangan : Ø = Diameter Huruf  yang  berbeda  pada  kolom  yang  sama  menunjukkan  tingkat  perbedaan nyata – uji Duncan α < 0,05 (rata-rata±std)
Berdasarkan  data  pada  Tabel  2  diketahui  bahwa  7  isolat  bakteri  asam  laktat  yang diisolasi dari saluran pencernaan belut ( Monopterus albus ) memiliki kemampuan dalam menghambat  pertumbuhan  bakteri  patogen  seperti Vibrio  harveyi,  Aeromonas hydrophila dan Staphylococcus  aureus. Ringo  (2005)  menyatakan  bahwa  bakteri  asam
A B A B C
laktat  yang  diisolasi  dari  hewan  akuatik  memiliki  kemampuan  dalam  menghambat pertumbuhan bakteri patogen seperti Aeromonas hydrophila dan Vibrio harveyi. (Buntin et.al 2008) melaporkan bahwa bakteri asam laktat yang diisolasi dari saluran pencernaan ikan mampu menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus.
Hasil  uji  antimikroba  yang  diperoleh  selanjutnya  dibuat  dalam  bentuk  diagram batang  untuk  mempermudah  melihat  perbandingan  perbedaan  aktivitas  diantara  isolat. Diagram  batang  hasil  uji  tujuh  isolat  bakteri  asam  laktat  terhadap  bakteri  uji ( Aeromonas  hydrophila,  Staphilococcus  aureus dan Vibrio  harveyi )  tercantum  pada Gambar 3.
Gambar 3. Diagram Penghambatan Tujuh Isolat Bakteri Asam Laktat yang Diisolasi dari Saluran Pencernaan Belut (Monopterus albus )
Identifikasi molekular bakteri pada penelitian ini terdiri dari 3 isolat (B1A, B1D dan B1E). Bakteri tersebut merupakan bakteri yang memiliki kemampuan paling unggul dalam  menghambat  pertumbun  bakteri  patogen.  Bakteri  tersebut  bersifat  gram  positif dan sel berbentuk coccus . Bentuk sel bakteri tercantum pada Gambar 4.

## Gambar 4. Bentuk Sel Bakteri di Bawah Mikroskop A) B1A; B) B1D dan C) B1E (Perbesaran: 100X)
Identifikasi  molekular  bakteri  menggunakan  gen  16  SrRNA.  Amplifikasi  gen 16S  rRNA  menggunakan  primer  27F  (5'-AGAGTTTAGTCCTGGCTCAG-3')  dan 1492R  (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3').  Hasil  amplifikasi  tercantum  pada Gambar 5.
D I A
M E T E R Z O N A A B C

## Gambar 5. Hasil Amplifikasi Gen 16S rRNA
Hasil amplifikasi gen 16 SrRNA disekuensing menggunakan primer yang sama dengan proses amplifikasi yaitu primer 27F dan 1492R. Hasil yang diperoleh dianalisis menggunakan  Basic  Local  Alignment Search Tool  (BALAST).  BALAST  adalah salah satu  alat  analisis  sequen  gen  yang  tersedia  di  domain  publik  pada  link http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/  (Mcginnis  and  Madden  2004).Sekuen  gen  yang diperoleh  pada  penelitian  dicocokkan  dengan  database  gen  16S  rRNA ribosomal pada situs  www.ncbi.nlm.nih.gov . Hasil analisis menunjukkan bahwa ketiga isolat memiliki tingkat  kemiripan  99%  dengan    spesies Lactococcus  lactis. Selanjutnya  dilakukan kontruksi pohon filogenetik untuk menentukan hubungan evolusi antara spesies bakteri hasil isolasi dan hasil BLAST. Pohon filogenetik direkontruksi menggunakan software MEGAX. Hasil rekontruksi pohon filogenetik tercantum pada Gambar 6 .
Gambar 6. Pohon Filogeni Isolat Bakteri Asam Laktat dari Belut (Monopterus albus) (Boostrap = 1000)
Berdasarkan  pohon  filogeni  yang  tercantum  pada  Gambar  3.  Menunjukkan bahwa  isolat  B1A,  B1D  dan  B1E  yang  diisolasi  dari  saluran  pencernaan  belut  berada pada  satu cluster dengan Lactococcus  lactis. Hasil  yang  diperoleh  tersebut  dapat disimpulkan  bahwa  isolat  bakteri  asam  laktat  yang  diisolasi  dari  saluran  pencernaan belut  ( Monopterus  albus )  merupakan  spesies Lactococcus  lactis berdasarkan  analisis sekuen  gen  16S  rRNA .  Lactococcus  lactis merupakan  salah  satu  bakteri  asam  laktat yang  terdapat  di  dalam  saluran  penecernaan  ikan.  Menurut  penelitian  (Merrifield  &
10.000 2.000 1.500
1.000 750 500 250
Ringo  2014) bakteri  asam  laktat  termasuk bakteri  indigenous saluran pencernaan ikan. Bakteri  asam  laktat  yang  menempati  saluran  pencernaan  ikan  termasuk  diantaranya lactococcus  lactis,  Streptococcus spp., Weissella  cibaria ,  dan Lactobacillus spp. Penelitian  Kato  et  al.  (2016)  melaporkan  bahwa Lactococcus spp.  merupakan  spesies bakteri  asam  laktat  yang  paling  dominan  menempati  saluran  pencernaan  ikan  pebbly ( Alestes baremoze ). Hasil penelitian tersebut juga melaporkan bahwa Lactococcus spp. dari saluran pencernaan ikan pebbly ( Alestes baremoze ) memiliki aktivitas antimikroba dan  mampu  menghambat  pertumbuhan  bakteri Staphylococcus  aureus (zona  hambat 6±0,17) , Echericia coli (zona hambat 7±0,10) dan Proteus spp. (3,5±0,10).

## KESIMPULAN DAN SARAN

## Kesimpulan
Hasil  isolasi  bakteri  dari  saluran  pencernaan  belut  mampu  menghasilkan antimikroba, ditunjukkan dengan adanya zona hambat setelah uji penghambat terhadap bakteri  patogen.Bakteri  asam  laktat  dari  saluran  pencernaan  belut  termasuk  dalam spesies Lactococcus lactis .

## Saran
Bakateri  asam  laktat  yang  diisolasi  dari  saluran  pencernaan  belut  menghasilkan antimikroba,  sehingga  perlu  dilakukan  penelitian  lanjutan  terkait  kemampuan  daya hambat antimikroba yang dihasilkan.

## DAFTAR RUJUKAN
Aween,  Mohamed  Mustafa,  Zaiton  Hassan,  Belal  J  Muhialdin,  Hanina  Mohd  Noor, Yossra  A  Eljamel,  Negeri  Sembilan,  and  U  P  M  Serdang.  2012.  “Evaluation  on Antibacterial  Activity  of  Lactobacillus  Acidophilus  Strains  Isolated  from  Honey Department  of  Microbiology  ,  Faculty  of  Science  and  Technology  ,  Universiti Sains Islam Malaysia ( USIM ) Bandar Baru Nilai , Faculty of Science , University Put.” American Journal of Applied Sciences 9 (6): 807–17.
Bajpai,  Vivek  K.,  Jeong  Ho  Han,  Gyeong  Jun  Nam,  Rajib  Majumder,  Chanseo  Park, Jeongheui  Lim,  Woon  Kee  Paek,  Irfan  A.  Rather,  and  Yong  Ha  Park.  2016. “Characterization  and  Pharmacological  Potential  of  Lactobacillus  Sakei  1I1 Isolated  from  Fresh  Water  Fish  Zacco  Koreanus.” DARU,  Journal  of Pharmaceutical Sciences 24 (1): 1–12. https://doi.org/10.1186/s40199-016-0147-8.
Bintsis,  T.  2018.  “Lactic  Acid  Bacteria:  Their  Applications  in  Foods.” Journal  of Bacteriology & Mycology: Open Access 6 (2): 89–94.
https://doi.org/10.15406/jbmoa.2018.06.00182.
Buntin,  Nirunya,  Suphitchaya  Chanthachum,  and  Tipparat  Hongpattarakere.  2008. “Screening of Lactic Acid Bacteria from Gastrointestinal Tracts of Marine Fish for Their  Potential  Use  as  Probiotics.”  Prince  of  Songkla  University,  Hat  Yai, Songkhla.
Gatesoupe,  François  Joël.  2007.  “Updating  the  Importance  of  Lactic  Acid  Bacteria  in
Fish  Farming:  Natural  Occurrence  and  Probiotic  Treatments.” Journal  of Molecular Microbiology and Biotechnology 14 (1–3): 107–14. https://doi.org/10.1159/000106089.
Geneaid. 2017. “Presto TM Mini GDNA Bacteria Kit.” Geneaid 004: 1–8.
Kato, Charles, Mark Mugaanyi, Samuel Majalija, Andrew Tamale, Nathan Musisi, and Asuman  Sengooba.  2016.  “Isolation  and  Identification  of  Potential  Probiotics Bacteria  from  the  Gut  of  Oreochromis  Niloticus  and  Clarias  Gariepinus  in Uganda.” British Microbiology Research Journal 17 (5): 1–8.
https://doi.org/10.9734/bmrj/2016/29721.
Kumar,  Sudhir,  Glen  Stecher,  Michael  Li,  Christina  Knyaz,  and  Koichiro  Tamura. 2018.  “MEGA  X:  Molecular  Evolutionary  Genetics  Analysis  across  Computing
Platforms.” Molecular Biology and Evolution 35 (6): 1547–49. https://doi.org/10.1093/molbev/msy096.
Lawalata,  Helen  Joan,  Langkah  Sembiring,  and  Endang  Sutriswati  Rahayu.  2015. “Molecular Identifcation of Lactic Acid Bacteria Producing Antimicrobial Agents from  Bakasang,  An  Indonesian  Traditional  Fermented  Fish  Product.” Indonesian Journal of Biotechnology 16 (2): 93. https://doi.org/10.22146/ijbiotech.16368.
Mcginnis,  Scott,  and  Thomas  L  Madden.  2004.  “BLAST :  At  the  Core  of  a  Powerful and Diverse Set of Sequence Analysis Tools” 32: 20–25.
https://doi.org/10.1093/nar/gkh435.
Merrifield,  Daniel  L.,  and  Einar  Ringø.  2014.  “Aquaculture  Nutrition:  Gut  Health, Probiotics  and  Prebiotics.” Aquaculture  Nutrition:  Gut  Health,  Probiotics  and Prebiotics , 1–465. https://doi.org/10.1002/9781118897263.
Mithun,  Sarangdhar,  Vora  Dipak,  and  Sarang  Sheela.  2015.  “Screening  and Characterization of Novel Bacteriocin Producing Lactobacilli Obtained From Raw Milk  Samples.” World  Journal  of  Pharmaceutical  Research  World  Journal  of Pharmaceutical  Research  SJIF  Impact  Factor  Research  Article  ISSN 4045  (4): 2277–7105.
Nikoskelainen, Sami, Seppo Salminen, Göran Bylund, and Arthur C. Ouwehand. 2001. “Characterization  of  the  Properties  of  Human-  and  Dairy-Derived  Probiotics  for Prevention  of  Infectious  Diseases  in  Fish.” Applied  and  Environmental Microbiology 67 (6): 2430–35. https://doi.org/10.1128/AEM.67.6.2430-2435.2001.
Nursyirwani,  Nursyirwani,  Widya  Asmara,  Agnesia  Endang  Tri  Hastuti  Wahyuni,
Triyanto  Triyanto,  Muhammad  Fauzi,  and  Zainal  Abidin  Muchlisin.  2017. “Phenotype and Genotype of Lactic Acid Bacteria (LAB) Isolated from the Tiger Grouper  Epinephelus  Fuscoguttatus  Alimentary  Tract.” F1000Research 6  (0):  1– 14. https://doi.org/10.12688/f1000research.12734.1.
Sari,  Rohmah  Anita,  Risa  Nofiani,  Puji  Ardiningsih.  2012.  “KARAKTERISASI BAKTERI ASAM  LAKTAT GENUS Leuconostoc DARI PEKASAM  ALE-ALE
HASIL  FORMULASI  SKALA  LABORATORIUM.” Jurnal  Kimia 1  (1  ISSN 2302-1077): 14–20.
Syahputra,  A.  2016.  “Evaluasi  Metode  Isolasi  Asam  Nukleat  Dalam  Deteksi  PCR Untuk Patogen Antraknosa, Bulai, Huanglongbing Dan Mosaik,” 1–59.
Vasiee,  A.  R.,  F.  Tabatabaei  Yazdi,  A.  Mortazavi,  and  M.  R.  Edalatian.  2014. “Isolation,  Identification and Characterization of Probiotic Lactobacilli Spp. from Tarkhineh.” International Food Research Journal
21 (6): 2487–92. https://doi.org/10.4172/2327-5073.C1.019.
Verschuere,  Laurent,  Geert  Rombaut,  Patrick  Sorgeloos,  and  Willy  Verstraete.  2000. “Probiotic  Bacteria  as  Biological  Control  Agents  in  Aquaculture.” Microbiology and Molecular Biology Reviews 64 (4): 655–71. https://doi.org/10.1128/mmbr.64.4.655-671.2000.