## Aktivitas Ekstrak Kasar Enzim Fibrinolitik Bakteri
Bacillus cereus yang Diisolasi dari Air Hutan Mangrove Maroon Edupark Semarang secara In Vitro
Crude Extract Activity of Fibrinolytic Enzyme Bacillus cereus Isolated from Mangrove Forest Water Maroon Edupark Semarang  In Vitro
Rizky Bimantara HA , , Desi Purwaningsih, Ana Indrayati * Fakultas Farmasi Universitas Setia Budi Surakarta Jl. Letjen Sutoyo, Mojosongo, Kec. Jebres, Kota Surakarta, Jawa Tengah 57127 *Email: anaindrayati2020@gmail.com
(tanggal diterima: 06-08-2021 , tanggal disetujui: 07-04-2022)

## INTISARI
Enzim fibrinolitik merupakan enzim yang bekerja dengan cara mendegradasi fibrin dalam bekuan darah.  Enzim fibrinolitik dihasilkan oleh  banyak organisme, salah  satunya  adalah  bakteri Bacillus  cereus yang  berasal  dari  air  hutan  mangrove  Maroon  Edupark  Semarang.  Isolasi  enzim fibrinolitik  dari  bakteri  sangat  penting  dilakukan  karena  bakteri  mudah  ditumbuhkan,  memiliki waktu  generasi  yang  cepat,  tidak  memerlukan  lahan  yang  luas  untuk  kultivasi,  serta  mudah dimodifikasi secara genetik sehingga akan lebih menguntungkan secara ekonomi. Selain itu enzim fibrinolitik dari bahan alam memiliki efek samping yang lebih kecil dibandingkan obat fibrinolitik sintetik.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  aktivitas  ekstrak  kasar  enzim  fibrinolitik B. cereus dari air hutan mangrove Maroon Edupark Semarang dalam melisisikan bekuan darah secara in vitro . Penelitian  diawali  dengan  konfirmasi  keberadaan    gen    penyandi  enzim  fibrinolitik  dari bakteri B. cereus menggunakan popular resources ‘nucleotide’ NCBI, identifikasi morfologi bakteri pada media agar darah, pewarnaan Gram, pewarnaan endospora, pengujian katalase dan koagulase. Isolasi ekstrak kasar enzim fibrinolitik B. cereus dilakukan dengan ekstraksi enzim. Kadar protein ekstrak kasar enzim ditetapkan menggunakan metode Bradford dan uji aktivitas fibrinolitik secara in  vitro menggunakan  media  plat  fibrin  dengan  kontrol  positif  nattokinase.  Zona  bening  yang dihasilkan menunjukkan kemampuan ekstrak enzim dalam mendegradasi fibrin.
Hasil identifikasi gen bakteri B. cereus menggunakan data base NCBI terdaftar sebagai gen AprE . Hasil identifikasi pewarnaan Gram dan endospora, B. cereus merupakan bakteri Gram positif dan  mempunyai  endospora.  Identifikasi  bakteri  pada  media  agar  darah  menunjukkan  bahwa B. cereus merupakan  kelompok  β-hemolisis.  Hasil  uji  katalase  dan  koagulase  menunjukkan  bahwa bakteri tersebut  menghasilkan  enzim katalase dan koagulase.  Kadar protein  ekstrak kasar enzim fibrinolitik B. cereus yang didapat sebesar 19,63 mg/mL. Aktivitas fibrinolitik pada konsentrasi 20, 40, 80% berturut-turut sebesar 2,54; 6,11; dan 7,94 mm. Berdasarkan hasil diatas dapat disimpulkan bahwa  ekstrak  kasar  enzim  fibrinolitik B.  cereus berpotensi  untuk  dikembangkan  sebagai  agen fibrinolitik alami.
Kata kunci: Bacillus cereus ; nattokinase; fibrinolitik; plat fibrin; Bradford

## ABSTRACT
Fibrinolytic enzymes are enzymes that work by degrading fibrin in blood clots. Fibrinolytic enzymes are produced by many organisms, one of which is the bacterium Bacillus cereus from the water  of  the  Maroon  Edupark  mangrove  forest,  Semarang.  Isolation  of  fibrinolytic  enzymes  from bacteria is very important because bacteria are easy to grow, have a fast generation time, do not
require  a  large  area  for  cultivation,  and  are  easily  genetically  modified  so  that  it  will  be  more economically profitable. In addition, fibrinolytic enzymes from natural ingredients have fewer side effects than synthetic fibrinolytic drugs. This study aims to determine the activity of the crude extract of the fibrinolytic enzyme B. cereus in lysis blood clots in vitro.
The study began with confirmation of the presence of genes encoding fibrinolytic enzymes from  bacteria  B.  cereus  uses  NCBI's  popular  resources  'nucleotide',  identification  of  bacterial morphology in blood agar media, Gram staining, endospore staining, catalase and coagulase testing. Isolation of crude extract of fibrinolytic enzyme B. cereus is carried out by enzyme extraction. Protein concentration were determined using Bradford method and fibrinolytic activity test in vitro using fibrin plate media with nattokinase as positive control. The resulting clear zone shows the ability of the enzyme extract in degrading fibrin The  results  of  the  identification  of  the B.  cereus bacterial  gene  uses  the  NCBI  data  base registered  as  the  AprE  gene.  The  results  of  the  identification  of  gram  and  endospore  staining,  B. cereus is a Gram-positive bacterium and has endospores. Identification of bacteria on blood agar media indicates that B. cereus represents the group of the β-hemolysis. Catalase and coagulase test results show that the bacteria produce catalase and coagulase enzymes. Total protein concentration from crude extract of B. cereus obtained at 19.63 mg/mL. Fibrinolytic activity at concentrations of 20, 40, 80% was 2.54; 6.11; and 7.94 mm respectively. Based on the above results it can be concluded that the crude extract of fibrinolytic enzyme B. cereus has the potential to be developed as a natural fibrinolytic agent.
Keywords: Bacillus cereus ; nattokinase; fibrinolytic; fibrin plate; Bradford

## 1. PENDAHULUAN
Penyakit  atherotrombosis  seperti  infark  miokard  dan  infark  serebral merupakan penyakit yang terjadi akibat sumbatan bekuan darah (trombus) pada pembuluh darah (arteri). Pada tahun 2004, penyakit tersebut merupakan penyebab kematian utama di dunia. Terhitung sebanyak 7.200.000 (12,2%) kematian terjadi akibat penyakit ini di seluruh dunia[1]. Salah satu penyebab dari infark miokard dan infark  serebral  adalah  trombosis  yang  diakibatkan  oleh  ruptur  dari  plak aterosklerosis pada dinding pembuluh darah sehingga menghasilkan bekuan darah.
Trombus  yang  menyumbat  pembuluh  darah  tersebut  dapat  dihancurkan dengan  mekanisme  trombolisis  (fibrinolisis).  Fibrinolisis  bekerja  dengan mengaktifkan  plasminogen  menjadi  enzim  proteolitik  plasmin.  Plasmin  akan mengubah  bentuk  trombus  dan  membatasi  perkembangan  trombosis  dengan memecah proteolitik fibrin. Agen fibrinolitik dapat diperoleh dari tanaman, hewan, atau mikroba. Penggunaan mikroba khususnya bakteri telah banyak diteliti sebagai penghasil agen fibrinolitik [19] .
Bakteri  adalah  salah  satu  mikroba  dari  sumber  alam  yang  perlu dimanfaatkan dan dikembangkan. Saat ini, salah satu potensi di bidang kesehatan adalah  agen  fibrinolitik  yang  bekerja  dengan  cara  mendegradasi  fibrin  dalam bekuan darah. Agen fibrinolitik telah digunakan sebagai agen terapeutik. Tes in vitro menunjukkan bahwa enzim fibrinolitik dapat mengaktifkan plasminogen dan secara signifikan  mendegradasi  jaringan  fibrin  dari  bekuan  darah,  yang  menunjukkan potensinya sebagai agen trombolitik yang efektif.
Luasnya  daerah  perairan  di  Indonesia  (sekitar  6%  sumber  air  dunia  atau 21% dari total sumber air di area Asia Pasifik) dan biodiversitas bakteri yang tinggi
itu merupakan potensi sumber daya alam yang sangat vital untuk dimanfaatkan bagi kesejahteraan manusia. Mangrove berada di daerah muara sungai yang merupakan tujuan akhir dari partikel-partikel organik dan endapan lumpur yang terbawa dari hulu oleh erosi.  Dengan demikian, daerah mangrove merupakan daerah subur, baik daratan maupun perairannya, oleh karena selalu terjadi transportasi nutrien akibat pasang surut. Sehingga mangrove tumbuh baik sepanjang pantai tropis terlindung seperti delta pada sungai besar[2]. Mikroba yang berasal dari lingkungan mangrove memiliki keunikan karena telah beradaptasi dengan kondisi ekstrim seperti kadar garam tinggi, kadar oksigen rendah, serta nutrisi terbatas[3]. Salah satu bakteri yang berhasil diisolasi dari air hutan mangrove adalah Bacillus cereus . Bakteri ini tersebar luas di alam dan pada berbagai sumber makanan baik hewani, nabati, telur, susu, dan  air,  dan  ditemukan  di  tanah  sebagai  organisme  saprofit[4]. B.    cereus menghasilkan enzim fibrinolitik yang lebih tinggi dari hasil yang dilaporkan pada produksi enzim fibrinolitik oleh Bacillus sp dan B. Vallismortis Ace02[5].

## 2. METODE PENELITIAN 2.1. ALAT DAN BAHAN
Alat  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  adalah  autoklaf,  gelas  beker (Pyrex),  cawan  petri  (Pyrex),  erlenmeyer  (Pyrex),  gelas  ukur  (Pyrex),  inkubator, kertas  perkamen,  kuvet, Laminar  Air  Flow ,  lampu  spirtus,  lemari  pendingin, mikropipet, mikroskop binokuler, gelas obyek, jarum Ose, jangka sorong, pipet tetes, pipet  volume  (Pyrex),  pH  meter,  tabung  reaksi  (Pyrex),  sentrifugator,  sonikator, timbangan analitik, vortex.
Bahan yang digunakan adalah isolat bakteri B. cereus yang diperoleh dari air hutan  mangrove  Maroon  Edupark  Semarang,  Jawa  Tengah,  pewarna  Gram  A ( chrystal violet ), Gram B ( lugol iodine ), Gram C (alkohol), Gram D (safranin), larutan buffer fosfat, akuades, hidrogen peroksida (H 2 O 2 ), amonium sulfat, etanol, plasma kelinci, larutan Tween 20, sodium dodecyl sulphate (SDS) 10%, malachite green , metilen  blue , blood  agar  plate (Oxoid), nutrient  agar (Oxoid),    dan brain  heart infusion (Oxoid), Water For Injection (WFI), Phospat Buffered Saline Solution (PBS). Bovine Serum Albumin (BSA)
2.2. CARA KERJA
1. Identifikasi Gen
Identifikasi gen dilakukan pada bakteri Bacillus cereus dengan menggunakan data  base  nukleotida  dari National  Center  for  Biotechnology  Information (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) dengan cara memasukkan kata kunci “ AprE ” pada kolom search nukleotida.

## 2. Pembuatan media uji
Media  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  meliputi,  media nutrient  agar (NA)  yang  dibuat  dengan  cara  sebanyak  4  g  serbuk  NA  ditimbang  dan  dicampur dengan  200  mL  akuades  didalam  tabung  erlenmeyer  [6].  Media blood  agar  plate (BAP) dibuat dengan cara serbuk BAP ditimbang sebanyak 8 g, dimasukan dalam erlenmeyer  dan  dilarutkan  dalam  200  ml  akuades[7],    dan  media brain  heart
infusion (BHI) yang dibuat dengan cara  melarutkan 18,7 gram bubuk BHI kedalam 500 mL akudes steril[8]. Media NA, BAP dan BHI selanjutnya disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 o C, tekanan 1 atmosfer selama 20 menit.

## 3. Peremajaan bakteri
Peremajaan bakteri B. cereus dilakukan dengan cara satu ose biakan bakteri B. cereus murni diinokulasikan pada media NA miring yang selanjutnya diinkubasi didalam inkubator selama 24 jam pada suhu 37 o C[9].

## 4. Pembuatan suspensi bakteri
Pembuatan  suspense  bakteri  bertujuan  untuk  memperkirakan  jumlah bakteri yang digunakan sebagai starter untuk ekstraksi enzim. Sebanyak 1 ose B. cereus ditumbuhkan dalam tabung reaksi steril yang berisi media BHI 10 mL yang kemudian  diinkubasi  pada  suhu  37 o C  selama  24  jam[10]. Starter berisi  suspensi bakteri B. cereus pada media BHI yang telah diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37 o C.
5. Identifikasi bakteri Bacillus cereus 5.1. Identifikasi B. cereus pada media BAP. Bakteri diidentifikasi secara makroskopis menggunakan media BAP dengan cara 1 ose bakteri diinokulasi pada cawan petri yang berisi media BAP dengan metode gores . Bakteri diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C[11]. 5.2. Identifikasi B. cereus dengan pewarnaan Gram. Identifikasi B. cereus dilakukan dengan pewarnaan Gram dan pewarnaan endospora. Pewarnaan Gram dilakukan  dengan  cara  mengambil  1  ose  biakan  bakteri  dan  1  ose  akuades diletakkan  diatas  kaca  objek,  diratakan  dan  dilakukan  fiksasi.  Sampel  bakteri selanjutnya secara berturut-turut diwarnai dengan Gram A ( kristal violet ), Gram B ( lugol  iodine ),  Gram  C  (alkohol),  dan  Gram  D  (safranin).  Pada  masing-masing tahapan  pewarnaan  diinkubasi  selama  satu  menit  pada  suhu  ruang  dan  dicuci dengan  akuades.  Hasil  pewarnaan  diamati  menggunakan  mikroskop  pada perbesaran lensa okuler 10x dan obyektif 100x[12].
5.3.  Identifikasi B.  cereus dengan  pewarnaan  endospora. Pewarnaan endospora  dilakukan  dengan  cara    1  ose  biakan  bakteri  dan  1  ose  akuades diletakkan  pada  kaca  objek,  diratakan  dan  kemudian  dilakukan  fiksasi.  Preparat kemudian  dibungkus  dengan  kertas  saring  kemudian  ditetesi  dengan malachite green, setelah itu kertas saring dilepas dan  dibilas dengan air mengalir. Preparat kemudian  dikeringkan  diatas  api  bunsen  dan  ditetesi  safranin.  Hasil  pewarnaan diamati menggunakan mikroskop pada perbesaran lensa okuler 10x dan obyektif 100x [13].
5.4. Identifikasi B. cereus dengan uji katalase dan koagulase. Identifikasi yang digunakan yaitu uji katalase dan uji koagulase. Uji katalase dilakukan dengan cara mengambil 1 – 2 ose biakan bakteri kemudian diletakkan diatas kaca objek dan ditetesi dengan 1 – 2 tetes H 2 O 2 3%[14].
Uji  koagulase  dilakukan  dengan  cara  menginokulasikan  1  ose  biakan  bakteri kedalam 5 mL plasma darah kelinci kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam[15].
6. Isolasi ekstrak kasar enzim fibrinolitik B. cereus Sebanyak 2% starter dimasukkan  ke dalam 500 mL media BHI, diinkubasi pada inkubator goyang ( shaker incubator ) dengan kecepatan 5000 rpm selama 24 jam  pada  suhu  37 o C.  Pemanenan  sel  bakteri  dilakukan  dengan  sentrifugasi  5000 rpm pada  suhu 4 o C selama 15 menit. Pelet dicuci dengan Water For Injection (WFI) kemudian disentrifugasi selama 15 menit pada suhu 4 o C pada kecepatan 5000 rpm sebanyak 3 kali. Pelet yang diperoleh ditimbang dan diresuspensi dengan Phospat Buffered Saline Solution (PBS) dengan perbandingan 1 : 2,5 mL PBS. Pelet yang telah ditimbang dan diresuspensi kemudian dipecah menggunakan cara  mekanik yaitu sonikasi. Pelet yang diperoleh disonikasi dengan sonikator pada amplitudo 50, cycle 0,5 selama 5 menit dengan jeda interval setiap 1 menit pada suhu 4 o C. Pemisahan protein  dilakukan  dengan  sentrifugasi  pada  suhu  4 o C  selama  15  menit  dengan kecepatan 5000 rpm dan diambil supernatannya (ekstrak kasar enzim)[16]

## 7. Penetapan kadar ekstrak kasar enzim fibrinolitik
Larutan  standar  protein  BSA  dibuat  sebagai  kurva  dalam  penentuan konsentrasi  protein  dengan  cara  membuat  campuran  PBS  dan  BSA  dengan  seri larutan 1, 2, 4, 8, 16, dan 32 µg/µL kemudian dicampur dengan 200 µL biorad assay , diinkubasi  selama  10  menit  lalu  dipindahkan  ke  kuvet.  Absorbansi  dibaca  pada panjang gelombang 595 nm[17].
Pengukuran  konsentrasi  sampel  ekstrak  kasar  enzim  dibuat  dengan  cara menyiapkan 1 mL reagen Bradford kemudian ditambahkan dengan 50  µL sampel ekstrak  kasar  enzim,  kemudian  diinkubasi  selama  15  menit  dan  dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 595 nm[18].

## 8. Pembuatan sampel uji
Ekstrak kasar enzim bakteri B. cereus dibuat menjadi tiga variasi konsentrasi yaitu  20,  40,  dan  80%.  Pengujian  dilakukan  replikasi  sebanyak  3  kali,  sehingga setiap sampel uji yang digunakan harus dikalikan 3 untuk setiap perhitungannya. Kontrol positif yang digunakan pada penelitian ini adalah nattokinase. Pembuatan suspensi  nattokinase  dilakukan  dengan  cara  menimbang  100  mg  serbuk nattokinase dan dihomogenkan dengan aquadest didalam labu ukur 10 mL hingga tanda  batas  (10  mL).  Kontrol  negatif  yang  digunakan  pada  penelitian  ini  adalah aquades[19].
9. Uji aktivitas fibrinolitik ekstrak kasar enzim secara in vitro Media uji yang digunakan pada penelitian ini adalah campuran plasma darah kelinci dengan NA yang dibiarkan hingga memadat. Media yang telah padat dibuat 5 lubang sumuran dengan menggunakan boor prop. Masing-masing lubang sumuran diisi 3 sampel ekstrak kasar enzim sebanyak 50 µL dengan konsentrasi 20, 40, dan 80%;  kontrol  positif  berupa  larutan  nattokinase;  dan  akuades  sebagai  kontrol negatif. Sampel selanjutnya diinkubasi selama 22 jam pada suhu 37 o C. Zona bening
yang  terbentuk    diukur  diameternya  menggunakan  jangka  sorong.  Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali dengan tujuan untuk mendapatkan konsentrasi ekstrak kasar enzim yang memberikan aktivitas fibrinolitik paling baik[20].

## 3. HASIL DAN PEMBAHASAN

## 1. Identifikasi gen
Berdasarkan  hasil  penelitian  yang  telah  dilakukan,  bakteri Bacillus  cereus memiliki gen pengkode enzim fibrinolitik yaitu gen AprE. Hal ini dibuktikan dengan pencarian  pada  data  base  nukleotida  dari  NCBI  dan  didapatkan  nomor  akses “WP_000754168” yang menjelaskan bahwa B cereus memiliki gen AprE yaitu gen yang menyandi serin protease . Identifikasi gen AprE merupakan studi in silico untuk memastikan bahwa B. cereus menghasilkan enzim fibrinolitik.
2. Identifikasi bakteri Bacillus cereus
2.1. Identifikasi B.  cereus pada  BAP. Bakteri B.  cereus diidentifikasi secara  makroskopis  dengan  pengujian  hemolisis  berdasarkan  kemampuannya dalam  melisiskan  sel-sel  darah  merah,  yang  ditandai  oleh  adanya  zona  bening disekitar koloni  pada  media  BAP.  Berdasarkan  hasil  identifikasi  bakteri B.  cereus pada  media  BAP didapatkan  hasil  bahwa B.  cereus menunjukkan  hasil  uji  positif dengan  bentuk  tak  beraturan  dan  menyebar,  elevasi  datar,  warna  putih  bening disekitar isolat, dan tepi berlekuk pada media BAP (Gambar 1). Berdasarkan ciri-ciri yang  didapat  bakteri Bacillus  cereus masuk  dalam  kategori  bakteri  yang  mampu melisiskan sel darah merah tipe beta hemolisis (β) yaitu tipe hemolisis yang dapat memecah  sel  darah  merah  secara  sempurna.  Kemampuan  bakteri  dalam menghemolisis sel darah merah, karena bakteri menghasilkan enzim hemolisin.
2.2. Identifikasi B.  cereus dengan  pewarnaan  Gram. Berdasarkan hasil  pengujian  dengan  pewarnaan  Gram  menunjukkan  bahwa  bakteri B.  cereus termasuk dalam kelompok bakteri Gram positif, hal ini ditunjukkan dengan sel yang berwarna violet atau ungu, berbentuk batang (basil), dengan susunan sel tunggal pada pengamatan dengan menggunakan mikroskop (Gambar 2). Perbedaan respon yang  ditimbulkan  terhadap  mekanisme  pewarnaan  Gram  didasarkan  pada komposisi  dinding  sel  bakteri.  Bakteri  Gram  positif  mengandung  protein  dengan prevalensi lebih rendah dan memiliki dinding sel yang tebal, dimana dinding terluar bakteri  Gram  positif  terdiri  dari  peptidoglikan  tebal  tanpa  dilindungi  lapisan lipoprotein atau lipopolisakarida seperti pada bakteri Gram negatif yang memiliki peptidoglikan  tipis,  sehingga  pada  saat  diberikan  larutan  kristal  violet  dan diperkuat  dengan  lugol  iodin  sel  berwarna  ungu.  Pemberian  etanol  96%  akan melarutkan lapisan lipid dan membentuk pori-pori kecil pada bakteri Gram positif menyebabkan  pewarna  safranin  tidak  dapat  masuk  sehingga  sel  tetap  berwarna ungu[21].
2.3. Identifikasi B. cereus dengan pewarnaan endospora. Pewarnaan endospora bertujuan untuk mendapatkan genus yang lebih spesifik dari isolat yang sebelumnya  telah  dilakukan  pewarnaan  Gram  dan  telah  diketahui  bahwa  isolat tersebut  merupakan  bakteri  Gram  positif[22].  Hasil  dari  pewarnaan  endospora menunjukkan  bahwa  bakteri  menghasilkan  endospora  (Gambar  3). B.  cereus
mempunyai endospora yang berbentuk oval atau kadang-kadang berbentuk bulat atau silinder.  Hal ini disebabkan karena bakteri mengikat kuat senyawa pewarna yaitu malachite green dan ketika dilakukan pewarnaan selanjutnya menggunakan safranin, spora tidak dapat berikatan dengan pewarna lain karena sudah berikatan dengan malachite green [23] .
2.4 Identifikasi B. cereus dengan uji katalase dan koagulase. Hasil uji katalase dari bakteri B. cereus menunjukkan bahwa B. cereus menghasilkan enzim katalase yang ditandai  dengan terbentuknya gelembung oksigen (Gambar 4). Enzim katalase  memecah  H 2 O 2 menjadi  H 2 O  dan  O 2 [24].  Hasil  uji koagulase  positif ditunjukkan  dengan  terbentuknya clot atau jelly . B . cereus memberikan  hasil koagulase positif (Gambar 5). Gumpalan atau clot yang terbentuk pada uji koagulase ini  terjadi  akibat  adanya  aktivitas  enzim  koagulase  yang  mengubah  fibrinogen dalam plasma sitrat menjadi fibrin [12] .

## 3. Isolasi ekstrak kasar enzim fibrinolitik bakteri B. cereus
Isolasi  ekstrak  kasar  enzim  fibrinolitik  dari  bakteri B.  cereus dimulai dengan  bakteri  ditumbuhkan  pada  media  cair,  diinkubasi  dan  disentrifugasi. Sentrifugasi  dilakukan  dengan  dua  tahapan,  hasil  sentrifugasi  tahap  pertama diperoleh pelet sel sebanyak 4,84 gram dan supernatan sebanyak 485 mL. Pelet sel dipecah dengan metode sonikasi untuk mengeluarkan enzim dari dalam sel bakteri. Prinsip dasar dari sonikasi adalah adanya getaran yang disebabkan oleh frekuensi gelombang  ultrasonik  pada  resonansi  15–25  kHz.  Gelombang  ultrasonik  akan menyebabkan  terjadi  kavitasi  yang  dapat  merusak  dinding  sel  bakteri[16].  Hasil yang  didapat  dari  proses  sonikasi  dilanjutkan  dengan  sentrifugasi  tahap  kedua untuk memisahkan protein dari dari komponen-komponen yang tidak diinginkan, hasilnya  didapatkan  supernatan  yang  berisi  ekstrak  kasar  enzim  intraseluler sebanyak  10  mL  yang  kemudian  hasil  dari  proses  sentrifugasi  disimpan  didalam tabung mikro pada suhu 4 o C.

## 4. Penetapan kadar protein total ekstrak kasar B. cereus
Penetapan kandungan protein yang terdapat dalam ekstrak kasar enzim bakteri B. cereus ditentukan dengan menggunakan metode Bradford . Prinsip dari metode Bradford ini adalah pengikatan zat pewarna Commasive Briliant Blue G-250 (CCB)  yang  terdapat  dalam  pereaksi  Bradford dengan  protein  yang  mengandung residu  asam  amino  dengan  rantai  samping  aromatik  (tirosin,  triptofan,  dan fenilalanin) atau bersifat basa (arginin, histidin, dan leusin) membentuk kompleks berwarna biru [9] . Metode Bradford digunakan karena tingkat kemurniannya tinggi dan harganya relatif murah dibandingkan dengan metode Lowry[17]. Pengukuran konsentrasi protein dalam larutan dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis dengan  panjang  gelombang  595  nm.  Tabel  1  menunjukkan  nilai  serapan spektrofotometri UV-Vis panjang gelombang 595 nm seri pengenceran larutan BSA (sebagai standar).
Tabel 1.  Larutan standar BSA ( Bovine Serum Albumin )
Larutan BSA (µg/µL) Absorbansi (λ= 595 nm) 1 0,063 2 0,148 4 0,231 8 0,440 16 0,642 32 0,934

## Gambar 6. Grafik kurva standar BSA
Gambar  grafik  kurva  diatas  menunjukkan slope positif  dengan  gradien garis  yang  mendekati  1  (r=0,9740)  dengan  regresi  linear  yang  diperoleh  dengan nilai a = 0,123 dan b = 0,0273. Persamaan dalam garis linear dirumuskan y = bx + a, sehingga diperoleh persamaan regresi kurva standar yaitu y = 0,0273x +  0,1230. Hasil  pengujian  kurva  standar  menunjukkan  bahwa  nilai  absorbansi  semakin meningkat seiring dengan penambahan volume BSA pada tiap tabung. Penyebabnya adalah semakin banyaknya volume pelarut protein dalam hal ini adalah aquades, maka semakin sedikit jumlah larutan BSA, jumlah protein yang larut akan semakin banyak karena pengompleksan protein dan zat warna CBB dalam reagen Bradford berkurang, sehingga nilai absorbansi semakin kecil[25].
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1 2 4 8 16 32
Berdasarkan hasil pengujian menunjukkan bahwa kandungan protein dalam ekstrak  kasar  enzim  bakteri B.  cereus sebesar  19,63  mg/mL.  Hasil  penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa ekstrak kasar enzim fibrinolitik bakteri B. cereus RSA1  memiliki  kadar  protein  sebesar  15,4  mg/ml[26].  Perbedaan  kadar  protein yang didapat kemungkinan disebabkan karena perlakuan yang diberikan terhadap sampel seperti media biakan, volume starter, waktu inkubasi, maupun pelarut yang digunakan pada proses resuspensi yang digunakan.
5. Uji aktivitas fibrinolitik ekstrak kasar enzim B. cereus in vitro Pengujian aktivitas ekstrak kasar enzim fibrinolitik menggunakan metode plat fibrin pada sampel uji. Pengukuran aktivitas fibrinolitik ekstrak kasar enzim bakteri B. cereus dibuat dalam beberapa variasi konsentrasi yakni 20, 40, dan 80% dan  hasil  pengukuran  diameter  yang  diperoleh  digunakan  digunakan  untuk menentukan Indeks Aktivitas Enzim (IAE). Hasil pengukuran diameter zona bening berturut-turut  dari  konsentrasi  20,  40,  80%  adalah  2,54;  6,11;  dan  7,94  mm (Gambar  7).  Hasil  pengujian  menunjukkan  konsentrasi  80%  merupakan konsentrasi yang mempunyai aktivitas paling tinggi dalam mendegradasi fibrin, hal ini ditunjukkan dengan semakin besarnya zona bening yang terbentuk (Gambar 7c)
a b
c d
Gambar  7.  Uji  aktivitas  fibrinolitik  ekstrak  kasar  enzim B.  cereus plat  fibrin in  vitro (a) Konsentrasi 20 %, (b) Konsentrasi 40%, (c) Konsentrasi 80%, (d) Kontrol (-) dan (+).
Indeks  fibrinolitik  yaitu  rasio  antara  hasil  diameter  zona  bening  yang terbentuk  dari  sampel  uji  dengan  diameter  lubang  (sumuran)  uji.  Rasio  indeks fibrinolitik sampel uji terhadap kontrol positif Nattokinase sebesar 7,64 kali lebih kecil  dibandingkan  dengan  kontrol  positifnya  (Nattokinase)  yang  mempunyai indeks  fibrinolitik  8,64  dan  besar  diameter  zona  bening  yang  dihasilkan  adalah 60,46 mm. Perbedaan yang dihasilkan pada zona beningnya dapat disebabkan oleh
+ + + - - -
faktor  perbedaan  tingkat  kemurnian  enzim  yang  diuji,  dimana  Nattokinase  yang digunakan  sebagai  kontrol  positif  mempunyai  kemurnian  yang  lebih  tinggi dibandingkan  dengan  ekstrak  kasar  enzim  fibrinolitik  bakteri B.  cereus dan  juga perbedaan konsentrasi dalam pengujian tidak sebanding antara sampel uji dengan Nattokinase  FU[27].  Hasil  yang  diperoleh  dari  pengujian  yang  digunakan  baik sampel uji maupun kontrol positif Nattokinase sudah dapat dikatakan sama-sama mempunyai  aktivitas  fibrinolitik  yang  terbukti  dari  zona  bening  yang  terbentuk disekitar lubang media uji plat fibrin.
Tabel 2. Hasil pengukuran aktivitas fibrinolitik ekstrak kasar enzim fibrinolitik B. cereus yang dinyatakan sebagai diameter zona bening Keterangan : K+ = Kontrol positif Nattokinase K- = Kontrol negatif aquadest x Diameter = Rata-rata diameter zona bening yang terbentuk R = Replikasi pengujian
Hasil  pengujian  menunjukkan  ekstrak  kasar  enzim  fibrinolitik  dari mempunyai  aktivitas  fibrinolitik.  Aktivitas  tertinggi  didapat  pada  sampel konsentrasi 80%. Berdasarkan Tabel 2 diketahui bahwa semakin besar konsentrasi maka  semakin  tinggi  aktivitas  fibrinolitik  yang  dihasilkan.  Aktivitas  enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor diantaranya adalah kemurnian enzim. Aktivitas yang  masih  rendah  dari  sampel  disebabkan  karena  pada  penelitian  ini  belum dilakukan  pemurnian  enzim  untuk  memisahkan  zat-zat  pengotor  yang  terdapat dalam sampel. Beberapa peneliti telah melakukan pemurnian enzim pada bakteri yang  sama  seperti  pemurnian  protein  pada  bakteri B.  cereus B80  mendapatkan kadar  protein  sebanyak  87,2  mg/ml[28]  dan  pemurnian  protein  pada  bakteri B. cereus IND5  mendapatkan  kadar  protein  36,5  mg/ml[29].  Hal  ini  menunjukkan bahwa pemurnian enzim berperan penting dalam peningkatan kadar protein serta aktivitasnya.
Nattokinase  (NK)  digunakan  sebagai  pembanding  pada  pengujian.  NK adalah serin protease dengan aktivitas fibrinolitik, antihipertensi, antiaterosklerosis,  menurunkan  lipid,  anti-platelet  dan  memiliki  efek neuroprotektif. NK merupakan suplemen makanan yang mudah diserap oleh usus sebagai hasil fermentasi pada kondisi spesifik dari biji-bijian seperti natto, kedelai, dan douche menggunakan bakteri Bacillus subtilis natto.
Konsentrasi sampel (%) R 1 (mm) R 2 (mm) R 3 (mm) x Diameter ± SD Diameter lubang (mm) Indeks fibrinolitik 20 2,38 2,56 2,68 2,54 ± 0,15 7,00 0,36 40 5,67 5,92 6,73 6,11 ± 0,55 7,00 0,87 80 7,28 7,73 8,82 7,94 ± 0,79 7,00 1,13 K+ 60,95 59,90 60,54  60,46 ±0,53 7,00 8,64 K- - - - - 7,00 -
Gambar 8. Histogram aktivitas fibrinolitik ekstrak kasar enzim fibrinolitik B. cereus terhadap diameter zona bening
Fibrinogen adalah protein solubel yang akan diubah menjadi fibrin suatu protein non-solubel oleh enzim serin protease thrombin. Hal ini terjadi pada proses pembekuan darah. NK sebagai agen fibrinolitik bekerja dengan cara memecah fibrin menjadi  molekul-molekul  yang  lebih  kecil[30]  Ekstrak  kasar  enzim  yang  berasal bakteri B.  cereus diduga  memiliki  mekanisme  yang  sama  dengan  NK.  Mekanisme kerja agen trombolitik dibagi menjadi dua yaitu fibrin dependent (tergantung fibrin) dan non-fibrin  dependent . Tissue  plasminogen  activator (tPA)  merupakan  contoh agen  trombolitik  dengan  mekanisme  fibrin  dependent,  sedangkan  streptokinase merupakan contoh non-fibrin dependent .

## 4. KESIMPULAN
Kesimpulan  dari  penelitian  ini  adalah  bakteri B.  cereus dari  air  hutan Mangrove  Maroon  Edupark  Semarang menghasilkan  ekstrak  kasar  enzim fibrinolitik  dengan  kadar  sebesar  19,63  mg/mL.  Ekstrak  kasar  enzim  memiliki aktivitas fibrinolitik yang ditunjukkan dengan  zona bening pada media plat fibrin. Aktivitas  fibrinolitik  pada  konsentrasi  20,  40,  80%  berturut-turut  sebesar  2,54; 6,11; dan 7,94 mm.

## 5. DAFTAR PUSTAKA
[1] World Health Organization. (2011). The world health report (2008): primary health  care  now  more  than  ever.  Geneva:  WHO  Library  Cataloguing-in Publication.
[2] Macintosh D J, Ashton E C, dan Havanon S. (2002). Mangrove rehabilitation and intertidal  biodiversity:  a  study  in  the  Ranong  mangrove  ecosystem, Thailand. Estuarine, Coastal and Shelf Science , 55(3): 331-345.
[3] Siti  S,  Sutrisno  A,  dan  Niniek  W.  (2017).  Kelimpahan  bakteri  heterotroph sedimen  berbagai  tipe  kerapatan  dikawasan  konservasi  mangrove  Desa
2,54 ± 0,15 6,11 ± 0,55 7,94 ± 0,79 60,46 ± 0,53 0 0 10 20 30 40 50 60 70 A 20% A 40% A 80% K+ K-

## AKTIVITAS FIBRINOLITIK EKSTRAK KASAR ENZIM BAKTERI B. cereus
A: Ekstrak kasar enzim; K+: Nattokinase; K-: Aquades
Bendono,  Kecamatan  Sayung,  Demak. JOURNAL  OF  MAQUARES ,  volume  6, nomor 3: 311-317
[4] Villain  S, Luo Y, Hildreth M, dan Brozel V. (2006). Analysis of the Life cycle of the  soil  saprophyte Bacillus  cereus in  liquid  soil  extract  and  in  soil. Applied Environmental Microbiology , 72(7): 4970-4977.
[5] Choi N S, Kim B Y, Lee J Y, Yoon K S, Han K Y dan Kim S H. (2002). Relationship between  acrylamide  concentration  and  enzymatic  activity  in  an  improved single  fibrin  zymogram  gel  system. Journal  of  biochemistry  and  molecular biology , 35(2), 236-238. Oxoid. Manual Oxoid . Edisi 9.
[6] Nugraha  U  S,  Haryani  T  S,  Larashati.  (2018).  Skrining  isolat  bakteri  limbah industri  berpotensi menurunkan konsentrasi kadmium (Cd) secara in vitro . JOM, 2: 2-3
[7] Krihariyani D, Evy D W, Entuy K. (2016). Pola pertumbuhan Staphylococcus aureus pada    media  agar  darah  manusia  golongan  O,  AB,  dan  darah  domba sebagai kontrol. Jurnal Ilmu dan Teknologi Kesehatan , 3: 193-198
[8] Arifin  A,  Hayati  Z,  Jamil  K  F.  (2016).  Isolasi  dan  identifikasi  bakteri  di lingkungan laboratorium  mikrobiologi klinik  RSUDZA Banda Aceh. Original Article , 1: 3-4.
[9] Wijayati  N,  Astutiningsih  C,  dan  Mulyati    S.  (2014).  Transformasi-pinena dengan bakteri Pseudomonas aeruginosa ATCC 25923. Biosaintifika: Journal of Biology & Biology Education , 6(1): 24-28.
[10] Dinoto  A,  Julistiono  H,  Handayani  R,  Roswiem  A  P,  Sari  P  N  dan  Saputra  S. (2020). Seleksi bakteri asam laktat dari nira aren [( Arenga pinnata (Wurmb)] asal Papua sebagai kandidat probiotik. Jurnal Biologi Indonesia , 16(1).
[11] Dayanara,  I.,  Kawuri,  R.,  &  Yulihastuti,  D.  A.  (2019).  The  presences  of pathogenic bacteria in snack for school children on Sapeken Island, Sumenep, East Java. Jurnal Biologi Udayana , 23(2), 68-79.
[12] Marler Linda M,  Siders Jean A,  Allen,  Stephen D. (2017). Atlas Pewarnaan Gram . Jakarta: EGC.
[13] Oktari A, Supriatin Y, Kamal M and Syafrullah H. (2017).  The bacterial endospore stain on Schaeffer Fulton using variation of methylene blue solution. J. Phys.: Conf. Ser, 812 012066.
[14] Lay B W. (1994). Analisis Mikroba di Laboratorium. PT. Raja Persada , Jakarta.
[15] Siagian  R.  (2016).  Identifikasi  jamur  pada  apusan  AC  di  ruang  kelas  S-1 Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara.
[16] Anggraini N E D,  dan Awan N C E. (2018). Uji daya hambat antibakteri ekstrak kasar enzim bromelin dari bonggol nanas (Ananas comosus (L) Merr) terhadap Lactobacillus  acidhopilus (Doctoral  dissertation,  Akademi  Farmasi  Putera Indonesia Malang).
[17] Utami  P,  Lestari  S,    dan  Lestari  S  D.  (2016).  Pengaruh  metode  pemasakan terhadap  komposisi  kimia  dan  asam  amino  ikan  seluang  (Rasbora argyrotaenia). Jurnal FishtecH , 5(1), 73-84.
[18] Poernomo A T. (2015). Aktivitas in vitro enzim fibrinolitik ekstrak tempe hasil fermentasi Rhizopus  Oligosporus ATCC  6010  pada  substrat  kedelai  hitam. Berkala Ilmiah Kimia Farmasi , 4(2), 18-24.
[19] Zaman  R, Parvez M, Jakaria M, Sayeed M A, dan Islam M. (2015). In vitro clot lysis activity of different extracts of Mangifera sylvatica roxb. leaves. Research Journal of Medicinal Plant , 9(3): 135-140
[20] Poernomo A T, dan Sudjarwo R A P. (2014). Purifikasi parsial enzim fibrinolitik tempe kacang koro . Berkala Ilmiah Farmasi : Universitas Airlangga.
[21] Hakim R F, Fakhrurrazi F, dan  Ferisa W. (2016). Pengaruh air rebusan daun salam  ( Eugenia  polyantha wight)  terhadap  pertumbuhan Enterococcus faecalis . Journal of Syiah Kuala Dentistry Society , 1(1):21-28
[22] Pratita M Y E, Putra S R. (2012). Isolasi dan identifikasi bakteri termofilik dari sumber mata air panas di Songgoriti setelah dua hari inkubasi. Teknik Pomits . Institut Teknologi Sepuluh Nopember
[23] Beattie S H, Holt C, Hirst D, and Williams A G. (1998). Discrimination among Bacillus cereus , B. mycoides and B. thuringiensis and some other species of the genus Bacillus by Fourier transform infrared spectroscopy. FEMS microbiology letters , 164(1): 201-206.
[24] Mercedes A, Xevi B, Pietro V, Carme R. (2009]. The Molecular Mechanism of the  Catalase  Reaction. Journal  of  the  American  Chemical  Society ,  131(33): 1751-61
[25] Khopkar S M. (2007). Konsep dasar kimia analitik, UI Press, Jakarta
[26] Sharma  C,  Salem  G  E  M,  Sharma  N,  Gautam  P,  dan  Singh  R.  (2020). Thrombolytic  potential  of  novel  thiol-dependent  fibrinolytic  protease  from Bacillus cereus RSA1. Biomolecules , 10(1): 3.
[27] Dabbagh F, Negahdaripour M, Berenjian A, Behfar A, Mohammadi F, Zamani M, dan  Ghasemi  Y.  (2014).  Nattokinase:  production  and  application. Applied microbiology and biotechnology , 98(22): 9199-9206
[28] Saxena  R,  Singh  R.  (2015).  MALDI-TOF  MS  and  CD  spectral  analysis  for identification and structure prediction of a purified,  novel,  organic solvent stable, fibrinolytic metalloprotease from Bacillus cereus B80. BioMed Research International , 13.
[29] Biji  GD,  Arun  A,  Muthulakshmi  E,  Vijayaraghavan  P,    Arasu  MV.  (2016). Bioprospecting  of    cuttle  fish  waste  and  cow  dung  for  the  production  of fibrinolytic  enzyme  from Bacillus  cereus IND5  in  solid  state  fermentation.
Biotech 6: 231
[30] Hongjie C, Eileen M, Nina R, Sara L, Najah N, Fatima S, Xianqin Q, and Yiguang L. (2018). Nattokinase: a promising alternative in prevention and treatment of cardiovascular diseases. Biomark Insights ,13: 1177271918785130.