Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.8 No.1 Juni 2021 Hal 7 - 13 P-ISSN: 2302-8270 E-ISSN: 2808-1048 DOI: http://dx.doi.org/10.20473/bikfar.v8i1.31204
Cite this as: Muhammad Mu’amar Fathoni, Isnaeni*, Asri Darmawati (2021),  Aktivitas  anti bakteri Ekstrak Bunga Rosela (Hibiscus sabdariffa L.) terhadap Extended-Spectrum Beta-Lactamase (ESBL) Eschericia coli, 8 (1), 7- 13
Aktivitas  anti bakteri Ekstrak Bunga Rosela (Hibiscus sabdariffa L.) terhadap Extended-Spectrum Beta-Lactamase (ESBL) Eschericia coli
Anti-bacterial activity of Rosela Flower Extract ( Hibiscus sabdariffa L.) against Extended-Spectrum Beta-Lactamase (ESBL) Eschericia coli
Muhammad Mu’amar Fathoni 1 , Isnaeni*, Asri Darmawati 1
1 Departemen Ilmu Kefarmasian Fakultas Farmasi Universitas Airlangga, Jl. Dr. Ir. H. Soekarno
*Corresponding author E - mail: isnaeni@ff.unair.ac.id
Article History
Received: 6 January 2021; Received in Revision: 30 January 2021; Accepted: 16 February 2021

## ABSTRACT
Roselle (Hibiscus sabdariffa L.) contains cyanidin-3-rutinoside, delphinidin, delphinidin-3-monoglucoside, cyanidin-3-monoglucoside, cyanidin-3-sambubioside, cyanidin-3,5-diglucoside may inhibit the growth of Extended-Spectrum-Beta-Lactamase  (ESBL)  Escherichia  coli,  but  there  is  no  research  reported  the determination of MIC of Roselle (Hibiscus sabdariffa L.) extract powder against ESBL E.coli ATCC 6110 and ATCC 5949 and their potency ratio  compared to meropenem. This study aimed to determine the MIC of Roselle flower extract powder on the growth of ESBL E. coli ATCC 6110 and ATCC 5949 and determine the potency ratio compared to meropenem. This study used two methods in determining MIC, namely the agar diffusion method and the dilution method with Nutrient Agar media which was incubated at 37 ±1°C for 24 hours, while the determination of the potency ratio was carried out by diffusion method with the same media which was incubated at 37 ±1°C for 24 hours. The results obtained were diameter of inhibition zone (mm) which were then observed and analyzed to calculate the potency ratio. The results showed that the  MIC of  Roselle  flower  extract  powder  was obtained  at  a  concentration of  12,500 ppm by diffusion method and at a concentration of 3,125 ppm by dilution method with 24 hours incubation at 37 ± 1º C and the potency ratio of Roselle flower extract powder compared to meropenem was 89.7% and 97.97% against ESBL E.coli ATCC 6110 and ESBL E.coli ATCC 5949 respectively.
Keywords: Roselle, Hibiscus sabdariffa L., ESBL E.coli, MIC, Ratio Potency

## ABSTRAK
Rosela  (Hibiscus  sabdariffa  L.)  mengandung  sianidin-3-rutinosida,  delphinidin,  delphinidin-3- monoglukosida,  sianidin-3-monoglukosida,  sianidin-3-sambubiosida,  sianidin-3,5-diglucosida  dapat menghambat  pertumbuhan  Extended-Spectrum-Beta-Lactamase  (ESBL)  Escherichia  coli,  namun  belum ada  penelitian  tentang  penentuan  KHM  serbuk  ekstrak  Rosela  (Hibiscus  sabdariffa  L.)  terhadap  ESBL E.coli  ATCC  6110  dan  ATCC  5949  serta  rasio  potensinya  dibandingkan  meropenem.  Penelitian  ini bertujuan  untuk  menetapkan  KHM  serbuk  ekstrak  bunga  Rosela    terhadap  pertumbuhan  ESBL  E.coli ATCC 6110 dan ATCC 5949  serta menetapkan rasio potensinya dibandingkan meropenem. Penelitian ini menggunakan  dua  metode  dalam  penetapan  KHM  yakni  metode  difusi  agar  dan  metode  dilusi  dengan media Nutrient Agar yang diinkubasi pada suhu 37 ±1°C selama 24 jam, sedangkan penetapan rasio potensi dilakukan dengan metode difusi menggunakan media yang sama, diinkubasi pada suhu 37 ±1°C selama 24 jam. Hasil yang didapat berupa zona hambat (mm) yang kemudian diamati dan dianalisis untuk menghitung rasio  potensi.  Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa  KHM  serbuk  ekstrak  Bunga  Rosela  diperoleh  pada konsentrasi 12.500 ppm dan 3,125 ppm masing-masing dengan metode difusi dilusi setelah inkubasi 24 jam pada suhu 37 ± 1 ºC. Rasio potensi serbuk ekstrak bunga Rosela dibandingkan meropenem sebesar 89,7% dan 97,97% masing-masing terhadap ESBL E.coli ATCC 6110 dan ESBL E.coli ATCC 5949.
Kata kunci: Rosela, Hibiscus sabdariffa L., ESBL E.coli, KHM, Rasio potensi

## Research Article
Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.8 No.1 Juni 2021 Hal 7 - 13 P-ISSN: 2302-8270 E-ISSN: 2808-1048

## Pendahuluan
Kejadian  resistensi  E.  coli  terhadap  antibiotik sefalosporin generasi ke-3 di Eropa pada tahun 2012- 2016 meningkat dari 6,9% menjadi 10,5% (Struyf and Mertens, 2017). Hasil penelitian yang dilakukan oleh Refdanita (2004) menunjukkan bahwa E. coli sudah 86,4%  mengalami  resistensi  terhadap  antibiotik amoksisilin, sehingga amoksisilin tidak lagi menjadi antibiotik  lini  pertama  (first  line)  yang  diberikan untuk  mengatasi  infeksi    E.coli.  Sementara  itu, Juliette  et  al.,  (2005)  melaporkan  bahwa  E.coli resisten terhadap gentamisin 74,0%, amikasin 12,3%, ciprofloxacin  76,7%,  trimetrophim/  sulfametoksazol 61,6%, dan tetrasiklin 84,9%.
Extended  Spectrum  Beta-Lactamase  (ESBL)  adalah enzim yang mempunyai  kemampuan menghidrolisis antibiotika golongan penisillin, sefalosporin generasi satu,  dua,  dan  tiga  serta  golongan  monobaktam. Extended Spectrum Beta-Lactamase tidak menghidrolisis cephamycin, yang mempunyai kekerabatan dekat dengan sefalosporin serta menyebabkan resistensi terhadap antibiotik golongan penisilin,  sefalosporin,  aztreonam,  aminoglikosida, trimetoprim-sulfametoksazol, dan kuinolon (Paterson, 2000). Extended Spectrum Beta- Lactamase  diinhibisi  oleh  beta-lactamase  inhibitor seperti  klavulanat,  sulbaktam  dan  tazobactam.  Pada umumnya  ESBL  dapat  dihambat  pertumbuhannya oleh  golongan  karbapenem  (imipenem,  meropenem, erta penem) (Lalitha, 2017).
Rosela (Hibiscus sabdariffa L) merupakan tumbuhan keluarga Malvaceae yang relatif mudah tumbuh dan banyak  digunakan  sebagai  bahan  makanan  dan  juga pengobatan alternatif (Da-Costa-Rocha et al., 2014). Kelopak  bunga  rosela  mengandung  sianidin-3- rutinosida, delphinidin, delphinidin-3- monoglukosida, siani din-3-monoglukosida, sianidin- 3-sambubiosida, dan sianidin-3,5-diglucosida. Senyawa  flavonol  seperti  glikosida  hibiscetin-3- monoglucosida,  gossypetin-3-glucosida,  gossypetin- 7-glucosida,  gossypetin-8-glucosida  dan  sabdaritrin. Senyawa-senyawa  tersebut  dapat  melawan  bakteri Gram positif dan Gram negatif (Sasmita et al., 2007).
Isnaeni  et  al.  (2020)  telah  melaporkan  bahwa  gel ekstrak  Rosela  dengan  basis  HPMC  6000  memiliki Konsentrasi  Hambat  Minimum  (KHM)  terhadap  S. aureus  ATCC  25923  sebesar  3%.  Ekstrak  etanol H. sabdariffa  memiliki  kemampuan  hambatan  terhadap E.coli  (Al-Hasyimi,  2012).  Jung  et  al.  (2013) melaporkan  bahwa    E.  coli  ATCC  8739  dapat dihambat oleh ekstrak air Rosela pada konsentrasi 25 mg/mL.  Priscilla  (2014)  juga  melaporkan  bahwa ekstrak  air  H.  sabdariffa  memilik  daya  hambat terhadap  ESBL  E.coli    C13EU  dan  CI6E5  dengan KHM  masing-masing  sebesar  50  mg/ml.  Penelitian
ini  dilakukan  untuk  menguji  aktivitas  hambatan serbuk  ekstrak  bunga  Rosela  terhadap  pertumbuhan ESBL  E.  coli  dengan  menetapkan  KHM  serta  rasio potensi ekstrak dibandingkan meropenem.

## Bahan dan Cara Kerja
Serbuk ekstrak bunga Rosela (Hibiscus sabdariffa L.) diperoleh  dari  PT.  Konimex,  biakan  ESBL  E.  coli ATCC 6110 dan ATCC 2959 diperoleh dari Institute Tropical  Diseases,  Universitas  Airlangga  Surabaya, Meropenem (sediaan injeksi, PT. Meprofarm), serbuk NaCl (Merck), Nutrient Agar (NA, Oxoid), Nutrient Broth (NB, Oxoid), dan air suling.

## Sterilisasi
Cawan petri, tabung reaksi, mikropipet (eppendorf), larutan  NaCl  0,9%,  air  suling,  media  NA  dan  NB disterilkan  dengan  otoklaf  pada  suhu  121°C  selama 15  menit.  Kawat  Öse,  pinset,  pencetak  agar digunakan secara aseptis

## Peremajaan Bakteri
Pembuatan  kultur  bakteri  dilakukan  dengan  cara  1 Öse  biakan  ESBL  E.coli  dari  stock  culture digesekkan  pada  agar  miring  NA  steril.  Biakan disimpan dalam inkubator suhu 37°C selama 24 jam.

## Pembuatan Media Agar
Serbuk  padat  NA  sebanyak  28  gram,  dilarutkan dalam  1  L  air  suling  mendidih    dan  diaduk  hingga homogen.  Media  yang  masih  cair  tersebut  segera diambil dengan spuit dan dimasukan ke dalam tabung reaksi, masing masing sebanyak 12,5 mL dan 8 mL. Tabung  ditutup  dengan  kapas,  kemudian  disterilkan 121°C selama 15 menit (Mitayani, DA., 2018)
Pembuatan Media Agar Cair
Serbuk padat Nutrient Broth ditimbang sebanyak 0.4 gram  pada  timbangan  analitik,  kemudian  dilarutkan dalam 50 mL air suling dan diaduk hingga homogen. Larutan  dituang  ke  dalam  beberapa  tabung  reaksi masing-masing  5  ml.  Masing-masing  tabung  reaksi ditutup  dengan  kapas  dan  disterilkan  121°C  selama 15 menit (Mitayani, DA., 2018).
Penyiapan Larutan Uji Ekstrak Rosela
Sebanyak 5 g serbuk ekstrak bunga Rosela dilarutkan ditambah NaCl 0,9% sampai 50 mL, kemudian dibuat 3 seri enceran  sehingga diperoleh konsentrasi 12.500 ppm,  25.000  ppm,  50.000  ppm.  Setiap  seri konsentrasi  dibuat  dalam  tabung  eppendorf  dengan menambahkan NaCl 0.9% sampai volume 1 mL.
Penyiapan Larutan Meropenem
Meropenem 1 g dilarutkan dalam air suling sampai 10 mL  kemudian  diencerkan  hingga  diperoleh tiga  seri
Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.8 No.1 Juni 2021 Hal 7 - 13 P-ISSN: 2302-8270 E-ISSN: 2808-1048
konsentrasi  yakni  4 ppm  (M1), 2 ppm  (M2), 1 ppm (M1).
Persiapan Inokulum ESBL E.coli
Biakan  ESBL  E.coli  ATCC  6110  dan  ATCC  5949 pada agar miring yang telah diremajakan ditambah 10 mL  larutan  NaCl  0,9%,  dikocok  hingga  seluruh koloni  di  permukaan  lepas  dan  tersuspensi  dalam larutan NaCl  0,9%. Suspensi  bakteri tersebut  diukur dengan  spektrofotometer  pada  λ  580  nm  dan  diatur sampai diperoleh transmitan 25%.
Uji Antibakteri Metode Difusi
Media NA cair didinginkan sampai 45-50oC, tabung yang berisi media NA sebanyak 12,5 mL dimasukkan ke  dalam  cawan  petri  steril,  diratakan  dan  ditunggu hingga memadat sebagai base layer. Inokulum ESBL E.coli  transmitan  25%  diambil  sebanyak  5μL  dan dimasukkan  ke  dalam  8  mL  media  NA,  kemudian dikocok dengan vortex hingga homogen. Media yang telah  mengandung  ESBL  E.coli  tersebut  kemudian dituang  di  atas  permukaan  base  layer.  Setelah  agar memadat,  dibuat  sumuran  dengan  cara  melubangi media  dengan  ring  dan  pencongkel.  Desain  yang digunakan adalah 3x3 yang  berarti terdapat  masing- masing  3  tingkat  konsentrasi  larutan  sampel  uji  dan standar,  sehingga  dalam  satu  cawan  petri  terdapat  6 lubang.  Ekstrak  bunga  Rosela  pada  berbagai konsentrasi  dimasukkan  sebanyak  50  μL  pada sumuran yang telah dibuat. Media yang sudah berisi larutan uji diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Selanjutnya diamati dan diukur diameter zona hambat yang  terbentuk  di  sekitar  sumuran  dan  dianalisis untuk  penentuan  KHM  dan  rasio  potensi  ekstrak Rosela ditentukan terhadap larutan standar.
Uji Antibakteri Metode Dilusi
Sebanyak 6 tabung reaksi diberi label I, II, III, IV, V, VI.  Masing-masing  tabung  diisi  dengan  media  NB sebanyak  1  ml.  Dari  ekstrak  Rosela  50.000  ppm, diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung No.1 yang  sudah  diisi  Media  NB,  kemudian  divortex hingga  homogen  (didapatkan  konsentrasi  25.000 ppm).  Dari  tabung  No.  I,  diambil  1  ml  dan dimasukkan  ke  dalam  tabung  No.2  (didapatkan konsentrasi 12.500 ppm). Dari tabung No. II, diambil 1  ml  dan  dimasukkan  ke  dalam  tabung  No.III (didapatkan konsentrasi 6.250 ppm). Dari tabung No. III,  diambil  1  ml  dan  dimasukkan  ke  dalam  tabung No.IV  (didapatkan  konsentrasi  3.125  ppm).  Dari tabung  No.  IV,  diambil  1  ml  dan  dimasukkan  ke dalam  tabung  No.V  (didapatkan  konsentrasi  1.563 ppm).  Dari  tabung  No.  V  diambil  1  ml  kemudian dibuang sehingga didapatkan masing-masing tabung volume  sama  1  ml.  Kemudian  dari  tabung  No.  I-V ditambahkan  inokulum  bakteri  sebanyak  50  µL. Adapun  tabung  No.  VI  merupakan  kontrol  positif
yang  berisi  1  ml  media  NB  dan  inokulum  bakteri sebanyak 50 µL. Tabung diinkubasi pada suhu 37°C selama  24  jam.  Dari  metode  dilusi,  KHM  dapat diamati  secara  visual  dengan  melihat  pada  tabung yang jernih tepat sebelum keruh. Apabila tidak dapat diamati  secara  visual,  dapat  dilakukan  pengukuran OD (Optical density) dengan spektrofotometer.

## Hasil Dan Pembahasan

## Hasil Penelitian

## Gambar 1. Hasil pengamatan KHM metode difusi

## Penentuan KHM Metode Difusi
Serbuk  ekstrak  Rosela  menunjukkan  hambatan pertumbuhan ESBL E. coli ATCC 6110 dan ATCC 5949  pada  konsentrasi  50.000  ppm,  25.000  ppm, 12.500 ppm, dan tidak terdapat hambatan pertumbuhan  pada  konsentrasi  6.250  ppm,  sehingga didapatkan  KHM  serbuk  ekstrak  bunga  Rosela terhadap ESBL E.coli ATCC 6110 dan 5949 adalah 12.500 ppm (Gambar 1).

## Penentuan KHM Metode Dilusi
Gambar 2. Hasil pengukuran absorbansi enceran inokulum pada 580 nm 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 6.250 3.125 1.562 K+ ab so rb an konsentrasi (ppm)
Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.8 No.1 Juni 2021 Hal 7 - 13 P-ISSN: 2302-8270 E-ISSN: 2808-1048
Pada penentuan KHM dengana metode dilusi secara visual, tidak  dapat  diamati  dengan  jelas  KHM,  yang  ditandai dengan  kejernihan  sebelum  terjadi  kekekeruhan  (Gambar 2).  Pengamatan  OD  (optical  density)  menggunakan spektrofotometer  UV/Vis    menunjukkan  bahwa  terjadi hambatan  pertumbuhan  ESBL  E.coli  ATCC  6110  dan ATCC 5949 pada konsentrasi pada konsentrasi 6.250 ppm, 3.125  ppm  sedangkan  pada  konsentrasi  1.562  ppm  tidak terdapat hambatan pertumbuhan. Hal ini disebabkan karena nilai  absorban  pada  konsentrasi  1.562  ppm  (A=  0.979) berada  di  atas  nilai  absorban  kontrol  positif  (A=  0.673), sehingga  diperoleh  KHM  ekstrak  Rosela  3.125  ppm (Gambar 3).
Gambar 3. Hasil pengamatan KHM metode dilusi secara visual
Peningkatan konsentrasi serbuk ekstrak Rosela linier dengan  zona  hambatan  pertumbuhan  ESBL  E.coli. Semakin  besar  konsentrasi  serbuk  ekstrak  bunga Rosela,  maka  semakin  besar  aktivitas  hambatan pertumbuhan terhadap ESBL E.coli ATCC 6110  dan ATCC 5949 (Tabel I, Gambar 4).
Tabel I. Data hasil pengamatan zona hambat
Gambar 4. Grafik potensi hambatan serbuk ekstrak Rosela terhadap pertumbuhan ESBL E.coli
ATCC 6110 dan ESBL E.coli ATCC 5969
Tabel II. Data uji rasio potensi terhadap ESBL E.coli
Dari  Tabel  II  menunjukkan  bahwa  serbuk  ekstrak Rosela  memiliki  rasio  potensi  antibakteri  terhadap ESBL  E.coli  ATCC  5949  lebih  besar  dibandingkan ESBL E.coli ATCC 6110, masing-masing dibandingkan larutan standar meropenem.
Gambar  5.  Hasil  pengamatan  zona  hambat pertumbuhan  ESBL  E.coli  ATCC  6110  dan  ESBL E.coli ATCC 5949 dari ekstrak serbuk bunga Rosela
0 5 10 15 20 0 20000 40000 60000 D Ia m e te r Zo n a H am b at (M m ) Konsentrasi ekstrak (ppm)
ATCC 6110 ATCC 5969
Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.8 No.1 Juni 2021 Hal 7 - 13 P-ISSN: 2302-8270 E-ISSN: 2808-1048
(50.000 ppm, 25.000 ppm, 12,500 ppm) dibandingkan meropenem (M1, M2, M4)

## Pembahasan
Uji  aktivitas  antibakteri  memiliki  tujuan  mengukur aktivitas  daya  antibakteri  dari  suatu  senyawa  kimia yang diduga memiliki kemampuan dalam menghambat  pertumbuhan  atau  bahkan  mematikan bakteri dan mengukur kepekaan suatu antibiotik atau senyawa  dari  ekstrak  terhadap  beberapa  konsentrasi (Jawetz  et  al.,  2005).  Berdasarkan  prinsipnya,  uji aktivitas  antibakteri  dapat  dilakukan  dengan  dua metode yaitu metode difusi  dan metode dilusi. Pada metode difusi agar, pertumbuhan organisme uji dapat dihambat penyebarannya sepanjang difusi antibakteri (terbentuk zona jernih di sekitar pencadang) sehingga dapat  dikatakan  bahwa  bakteri  tersebut  merupakan bakteri  yang  sensitif  terhadap  senyawa  antibakteri. Zona  hambat  tersebuttermasuk  salah  satu  parameter untuk menentukan KHM, seprti yang telah dilaporkan dalam penelitian ini. Pada metode dilusi, KHM dapat dilihat baik secara visual atau alat semiotomatis dan otomatis  (Koneman,  2006).  Metode  dilusi  dapat diaplikasikan pada penentuan kualitatif dan kuantitatif secara bersama-sama (Soleha, 2015). Bakteri uji yang digunakan pada penelitian ini adalah ESBL  E.coli  ATCC  6110  dan  ATCC  5949.  Kedua bakteri  uji  yang  digunakan  harus  memenuhi  syarat sensitifitas,  sehingga  respon  yang  dihasilkan  dapat diukur.  Potensi  aktivitas  hambatan  ekstrak  Rosela terhadap  bakteri  uji  dapat  dibandingkan  dengan standar, dalam penelitian ini digunakan meropenem. Bakteri  uji  yang  dipilih  merupakan  bakteri  yang sering  menyebabkan  infeksi  pada  manusia  serta memiliki  sifat  resisten  terhadap  beberapa  antibiotik, terutama golongan penisilin.
Media  NA  dipilih  sebagai  media  pertumbuhan, karena  media  ini  merupakan  media  umum  untuk pertumbuhan  sebagian  besar  bakteri.  Media  umum (tidak selektif) biasanya mudah ditumbuhi kontaminan, sehingga selama pengerjaan persyaratan aseptis  harus  diperhatikan.  Nilai  pH  media  diatur sekitar  7,4  ±  0,2,  karena  pada  pH  ini  E.coli  pada umumnya  tumbuh  optimal.  Demikian  pula  Suhu inkubasi juga diatur 37ºC karena pada suhu ini E.coli tumbuh optimal.
Sebelum  dilakukan  uji,  bakteri  perlu  diremajakan terlebih dahulu dari stock culture. Bakteri yang sudah diremajakan dipanen pada fase pertumbuhan, karena yang  diamati  adalah  hambatan  pertumbuhannya. Selanjutnya  dibuat  suspensi  bakteri  dengan  cara media  agar  miring  diberi  beberapa  ml  larutan  NaCl 0,9% dan dilakukan pengukuran transmitan menggunakan  spektrofotometer  panjang  gelombang 580  nm  sampai  diperoleh  transmitan  25%.  Bila transmitansnya  kurang  dari  25%  maka  suspensi bakteri  diencerkan  sedangkan  bila  transmitans  lebih dari  25%  suspensi  bakteri  ditambahkan  dengan
inokulum  bakteri.  Transmitan  25  %  menghasilkan biomasa sel yang optimum (109) yang berarti jumlah biomasa  sel  yang  hidup  lebih  banyak  dari  pada jumlah sel yang mati (Isnaeni, 2020).
Untuk  mengetahui  konsentrasi  hambat  minimal serbuk  ekstrak  Rosela  terhadap  ESBL  E.coli,  maka dilakukan  pengamatan  zona  hambat  dengan  seri pengenceran dibuat 1:2 pada konsentrasi 50.000 ppm, 25.000 ppm, 12.500 ppm, 6.250 ppm dengan metode difusi  dan  konsentrasi  25.000  ppm,  12.500  ppm, 6,250  ppm,  3.125  ppm,  1.562  ppm  pada  metode difusi.  Penentuan  dengan  beberapa  seri  konsentrasi ini  mengacu  kepada  penelitian  terdahulu  yang menunjukkan ekstrak air H. sabdariffa memiliki daya hambat terhadap isolat ESBL E.coli galur C13EU dan CI6E5  dengan  KHM  masing-masing  sebesar  50 mg/ml  (50.000  ppm),  sehingga  dibuat  beberapa konsentrasi di bawah 50.000 ppm untuk mengevaluasi terbentuknya zona hambat.
Pelarut serbuk ekstrak digunakan NaCl, karena NaCl dapat menghambat pertumbuhan bakteri dengan cara menyerap air yang menyebabkan sel-sel bakteri mati karena dehidrasi, selain itu penggunaan pelarut NaCl juga  bermanfaat  untuk  penyimpanan  yang  lama (Nakayama, et al.2012)
Pada  penentuan  KHM  dengan  metode  difusi  dan dilusi  terjadi  perbedaan  KHM  (KHM  difusi  12.500 ppm dan KHM dilusi 3.125 ppm). Adanya perbedaan hasil yang besar pada penentuan KHM metode difusi dan  dilusi  dapat  disebabkan  perbedaan  konsentrasi awal  karena  adanya  pengaruh  warna  ekstrak, sehingga kedua metode perlu divalidasi, dibandingkan  dengan  metode  standar.  Pada  metode dilusi  dengan  konsentrasi  serbuk  ekstrak  bunga Rosela  di  atas  6.250  ppm,  kepekatan  konsentrasi serbuk  ekstrak  bunga  Rosela  dapat  memengaruhi penyerapan cahaya oleh sel-sel-bakteri  yang mati  di dalam larutan (Watson, 2005). Salah satu kekurangan metode  dilusi  dengan  pengukuran  OD  (optical density) menggunakan spektrofotometer yaitu cahaya yang diserap tidak dapat membedakan antara sel-sel bakteri mati dan hidup.
Setelah diketahui KHM serbuk ekstrak Rosela secara difusi, maka dilakukan uji potensi dan dihitung rasio potensinya terhadap antibakteri meropenem. Meropenem  yang  sudah  diketahui  efek  antibakteri digunakan  sebagai  kontrol  positif  untuk  mengetahui apakah  serbuk  ekstrak  bunga  Rosela  mampu menghambat  bakteri  uji.  Meropenem  digunakan sebagai  kontrol  positif  karena  memiliki  sentitifitas yang  tinggi  terhadap  ESBL  E.coli  (95%.).  Hal  ini dikarenakana Meropenem terdapat substituent pyrrolidinyl  yang  berguna  untuk  meningkatkan aktivitas  terhadap  Gram  negatif,  sehingga  terjadi gangguan dalam sintesis dinding sel bakteri, (Zhanel et al., 2007).
Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.8 No.1 Juni 2021 Hal 7 - 13 P-ISSN: 2302-8270 E-ISSN: 2808-1048
Dari penentuan potensi serbuk ekstrak Rosela secara difusi  diketahui  bahwa  peningkatan  logaritmik konsentrasi serbuk ekstrak Rosela linier dengan zona hambatan pertumbuhan ESBL E.coli. Semakin besar konsentrasi  serbuk  ekstrak  bunga  Rosela  maka semakin  besar  aktivitas  hambatan  pertumbuhan terhadap ESBL E.coli ATCC 6110  dan ATCC 5949. Pada  penentuan  rasio  potensi  antibakteri  diketahui bahwa serbuk ekstrak Rosela memiliki rasio  potensi antibakteri  lebih besar pada bakteri  uji ESBL E.coli ATCC 5949 (97,97%) daripada rasio potensi ekstrak Rosela terhadap bakteri uji ESBL E.coli ATCC 6110 (89,37%) yang masing-masing dibandingkan dengan meropenem.  Perbedaan  ini  dapat  disebabkan  oleh penyimpanan  yang  terlalu  lama  pada  meropenem, inokulum, dan larutan uji sehingga dapat menyebabkan  zona  hambatan  yang  terbentuk  kecil. Selain  itu  terdapat  masalah  teknis  seperti  media terlalu tebal, dan inokulum tidak homogen.
Adanya  efek  antibakteri  dari  serbuk  ekstrak  Rosela dalam penghambatan pertumbuhan beberapa bakteri ini  telah  dikemukakan  oleh  beberapa  peneliti terdahulu.  Beberapa  penelitian  mengungkapkan bahwa  ekstrak  bunga  Rosela  memiliki  aktivitas antibakteri  terhadap  hambatan  pertumbuhan  bakteri Gram  positif  dan  Gram  negatif,  atau  disebut  broad spectrum.  Ekstrak  etanol  dan  air  dari  daun  dan kelopak bunga Rosela memiliki aktivitas antibakteri dan efektif terhadap beberapa isolat bakteri (Priscilla, 2014). Frimpong (2008) juga mengungkapkan bahwa ekstrak tanaman Rosela efektif terhadap S. aureus, E. coli dan Pseudomonas aeruginosa. Khalaphallah and Wagdi (2014) menjunjukkan ekstrak tanaman Rosela memiliki aktivitas terhadap Pseudomonas aeruginosa,  E.  coli  dan  Bacillus  subtilis.  Priscilla (2014)  melaporkan  bahwa  ekstrak  Rosela  memiliki aktivitas  antibakteri  terhadap  Escherichia  coli, Salmonella  typhi,  Klebsiella  sp.,  Proteus  mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus dan dua galur resisten ESBL dan MRSA.
Adanya aktivitas antibakteri pada Rosela dikarenakan terdapat  metabolit  sekunder  seperti  alkaloid, flavonoid,  fenolik,  dan  biterpen  dalam  ekstrak (Olaleye,  2007).  Gugus  hidroksil  diduga  berkaitan dengan aktivitas toksisitasnya terhadap mikroorganisme, yang mana peningkatkan hidroksilasi mengakibatkan peningkatakan toksisitas. Mekanisme  ekstrak  dalam  hambatan  ESBL  E.coli mungkin  berkaitan  dengan  hambatan  pada  transpor elektron,  translokasi  protein,  fosforilasi  dan  reaksi lain  yang  melibatkan  enzim,  yang  menyebabkan terjadinya  peningkatan  permeabilitas  membran plasma  dan  akhirnya  terjadi  ketidakseimbangan  ion pada dinding sel. Selain itu, mekanismenya mungkin juga  berkaitan  dengan  permeabilitas  permukaan dinding  sel  bakteri  dengan  ekstrak  (Walsh  et  al., 2003).  Kandungan  lain  dari  ekstrak  Rosela  yakni
Proantosianidin. Proantosianidin menyebabkan perubahan struktur P-fimbriae dan hambatan adesi P- fimbriae E.coli ke uroepitelium, juga hambatan pada pembentukan  biofilm  secara  in  vitro  (Gupta  et  al., 2012).  Alshami  and  Alharbi  (2014)  menungkapkan bahwa  ekstrak  kelopak  bunga  Rosela  diduga menghambat  kapasitas  pembentukan  biofilm  pada isolat  uropatogenik.  Bakteri  pembentuk  biofilm diketahui  berkaitan  dengan  resisten  dan  persisten jangka  panjang  pada  antibiotik.  Efektifitas  ekstrak Rosela terhadap beberapa bakteri tersebut memberikan  gambaran  tentang  potensinya  melawan bakteri yang resisten seperti ESBL.
Aktivitas  hambatan  disebabkan  adanya  multiple compund  dalam  serbuk  ekstrak  Rosela  yang berkontribusi  terhadap    efek  antibakteri  dan  tidak terhadap ESBL E.coli, sehingga diperlukan konsentrasi  yang  cukup  besar.  Adapun  meropenem digunakan  dalam  konsentrasi  yang  sangat  kecil (KHM    0,03  ppm),  dikarenakan  meropenem merupakan  senyawa  tunggal  yang    aktif  terhadap ESBL E.coli.

## Kesimpulan
1.Serbuk  ekstrak  bunga  Rosela  (Hibiscus  sabdariffa L.)  mampu  menghambat  pertumbuhan  ESBL Escherichia coli ATCC 6110 dan ATCC 5949 dengan KHM  12.500  ppm  dan  3.125  ppm  masing-masing menggunakan metode difusi dan dilusi.
2.  Rasio  potensi  serbuk  ekstrak  bunga  Rosela  dan meropenem  terhadap  ESBL  ATCC  6110  dan  ESBL E.coli ATCC 5949 masing-masing sebesar 89,7% dan 97,97%.

## Daftar Pustaka
Al-Hashimi, A.G., 2012. Antioxidant and antibacterial  activities  of  Hibiscus  sabdariffa L. extracts. African Journal of Food Science, 6(21), pp.506-511.
Da-Costa-Rocha,  I.,  B.  Bonnlaender,  H.  Sievers,  I.
Pischel  and  M.  Heinrich.  2014.  Hibiscus sabdariffa L. –A  phytochemical  and pharmacological  review.  Food  Chemistry.
165. 424–443
Frimpong,  G.  2008.  Investigating  the  Suitability  of Hibiscus sabdariffa Calyx Extract
as Colouring Agent for Paediatric Syrups. Pp 107. Gupta,  A.,  Dwivedi,  M.,  Mahdi,  A.A.,  Nagana Gowda,  G.A.,  Khetrapal,  C.L.,&  Bhandari, M.2012. Inhibition of adherence of multi-drug resistant E. coli by
proanthocyanidin. Urol Res; 40(2): 143-150 Isnaeni,  Hendradi,  Esti,.  Zara,  Natalia.,  2020.
Inhibitory Effect of Roselle Aqueous Extract- HPMC  6000  Gel  on  the  Growth  of Staphylococcus aureus ATCC 25923. Turkish
Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.8 No.1 Juni 2021 Hal 7 - 13 P-ISSN: 2302-8270 E-ISSN: 2808-1048
journal  oh  pharmaceutical  sciences  Volume 17 No.2 p.190-195
Isnaeni  et  al.,  2020.  Validated  TLC-Contact Bioautography  Method  for  Identification  of Kanamycin  Sulfate  in  Injection  Preparation. Jurnal  Farmasi  Dan  Ilmu  Kefarmasian Indonesia. Vol. 7No.1 p. 35-41
Juliëtte A. Severin, et al. 2010. on behalf of the study group ‘Antimicrobial Resistance in Indonesia: Prevalence  and  Prevention’  (AMRIN), Molecular  characterization  of  extended- spectrum β-lactamases in clinical Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolates from Surabaya, Indonesia, Journal of Antimicrobial Chemotherapy,  Volume  65,  Issue  3,  Pages
465–469. Surabaya: indonesia https://doi.org/10.1093/jac/dkp471
Jung,  E.,  Kim,  Y.  and  Joo,  N.,  2013.  Physico chemical properties and antimicrobial activity of Roselle (Hibiscus sabdariffa L.). Journal of the Science of Food and Agriculture, 93(15), pp.3769-3776
Khalaphallah, R., & Wagdi S.S. 2014. Effect of henna and  roselle  extracts  on  pathogenic  bacteria. Asian Pac J Trop Dis; 4(4): 292-296
Koneman  EW.  2006.  Koneman's  color  atlas  and textbook of diagnostic microbiology. Edisi ke- 6.  Philadephia:  Lippincott  Williams  & Wilkins.
Lalitha,  M.,  2017.  Manual  on  Antimicrobial Susceptibility Testing. www.ijmm.org/ document/antimicrobial.com,  Accessed  31 Desember 2020.
Mitayani,  Dyah  Ayu.  2018,  Perbandingan  Metode Difusi  Agar  dan  Mikrodilusi  untuk  Uji  Daya Hambat  Rebusan  Bunga  Rosella  (Hibiscus sabdariffa  L.)  Kering  Terhadap  Pertumbihna Eschericia coli ATCC 8729. Skripsi.
Universitas Airlangga
Nakayama,  M.,  Shigemune,  N.,  Tsugukuni,  T.,  Jun,
H.,Matsushita,T.,Mekada,  Y.,  Kurahachi,  M. and  Miyamoto,  T.,  2012.  Mechanism  of  the combined  anti-bacterial  effect  of  green  tea extract  and  NaCl  against  Staphylococcus aureus  and  Escherichia  coli  O157:  H7. Foodcontrol, 25(1), pp.225-232
Olaleye,  M.T.  2007.  Cytotoxicity  and  antibacterial activity  of  Methanolic  extract  of  Hibiscus sabdariffa.  Journal  of  Medicinal  Plants Research:1(1): 009- 013.
Paterson,  DL.  2000.  Recommendation for  treatment of  severe  infections  caused  by  Enterobac- teriaceae  producing  Extended-Spectrum  β- Lactamases  (ESBLs).  Clinical  Microbiology and Infection Journal6:460–463
Priscilla Adelaide Naa Agowa Lovell-Antiaye. 2015.
Antimicrobial Activity Of Hibiscus Sabdariffa Against Clinical Isolates Of
Refdanita,  Maksum  R,  Nurgani  A,  Endang  P.Pola kepekaan  kuman  terhadap  antibiotikdi  ruang rawat  intensifRS  Fatmawati  Jakarta  tahun 2001-2002. Makara Kesehatan. 2004;8(2):41−8.
Sasmita IS, Pertiwi ASP, Halim M. 2007. Gambaran Efek  Pasta  Gigi  yang  Mengandung  Herbal Terhadap  Penurunan  Indeks  Plak.  J  PDGI. Hal.37
Soleha, TU. 2015. Uji Kepekaan terhadap Antibiotik. Juke Unila, Vol. 5 No. 9,  p. 120-122
Walsh, S.E., Maillard, J.Y., Russel, A.D., Catrenich,
C.E.,  Charbonneau,  A.L.,&  Bartolo,  R.G. 2003.  Activity  and  mechanism  of  action  of selected biocidalagents on Gram -positive and -negative bacteria. J Appl Microbiol 94: 240– 247.
Watson  DG.  2005.  Pharmaceutical  Analysis.  2nd edition. London: Elsevier. p88
Wibowo,  M.H.  2008.  Mengungkap  patogenisitas Eschericia  coli.  Poultry  indonesia.  Vol. VII.:68-69
Zhanel  GG,  Wiebe  R,  Dilay  L,  Thomson  K,
Rubinstein  E,  Hoban  DJ,  Noreddin  AM, Karlowsky  JA.  2007.  Comparative review  of carbapenem. Drugs. 67(7):10271052.