To  Cite  this  Paper: Walter  Balansa,  W.,  Lukas,  L,  C.,  Rieuwpassa,  F,  J.,  Tomasoa,  A,  M.  2023.  Aktivitas  Antibakteri  Sponge Agelas Nakamurai Terhadap Bakteri Gram Negative: Study In Vitro dan In Silico . Samakia: Jurnal Ilmu Perikanan, 14 (1) : 76-85. Journal Homepage : https://journal.ibrahimy.ac.id/index.php/JSAPI
http://dx.doi.org/10.35316/jsapi.v14i1.3012

## Aktivitas Antibakteri Sponge
Agelas Nakamurai Terhadap Bakteri Gram Negative : Study In Vitro dan In Silico
Antibacterial Activity of Sponge Agelas Nakamurai Against Gram Negative Bacteria: In Vitro and In Silico Study
Walter Balansa 1* , Lis C. Lukas 1 , Frets J. Rieuwpassa 2 , Aprelia M. Tomasoa 1
1 Program Studi Teknologi Budidaya Ikan, Politeknik Negeri Nusa Utara
2 Program Studi Pengolahan dan Penyimpanan Hasil Perikanan, Politeknik Negeri Nusa Utara.
Korespondensi : email : walterbalansa@polnustar.ac.id
(Diterima November 2022 /Disetujui April 2023)

## ABSTRACT
Gram  negative  bacteria  remain  a  serious  threat  to  aquaculture,  the  economy  and  human  health. Ironically, while effective antibiotics have not yet been discovered, the resistance of these bacteria to various antibiotics is increasing at alarming pace. This indicates the urgency of discovering new antibiotics, especially antibiotics that can inhibit the replication of enzymes such as topoisomerase IV.  The  purpose  of  this  research  was  to  investigate  antibacterial  potential  of  Agelas  nakamurai against  A.  hydrophila,  A.  salmonicida  and  E.  tarda  using  the  sponge’s  extracts  (1,  10,  and  100 mg/mL) and tetracycline (1 mg/mL) and to predict antibacterial potential of agelasine A-F (1-6) and agelasidine  A  (7)  from  Sangihe’s  Agelas  sponge  against  topoisomerase  IV  protein  through molecular  docking.  The  in  vitro  test  was  carried  out  using  the  Kirby  Bauer  method  with  slight modifications and in silico study using CB-dock 2 and Protein Ligand Interaction Profiler. Although the extract showed weaker antibacterial activity against A. hydrophila, A. salmonicida and E. tarda than  tetracycline,  molecular  docking  with  CB-dock  2  showed  that  agelasine  A-F  ( 1 - 6 )  and agelasidine  A  ( 7 )  had  stronger  binding  affinity  (-7.1  to  -8.6  kJ/mol)  than  tetracyclines  ( 10 ), ciprofloxacin ( 11 ) or levofloxacin ( 12 ) (-6.6 to -8.3 kJ/mol). Molecular docking on agelasidine C ( 9 ) and D ( 10 ) also showed strong binding affinities (-8.3 and -8.8 kJ/mol) to the  1S16  target protein mainly due to hydrogen bonding and hydrophobic interactions. Collectively, the result showed the potential  for  agelasidine  A,  C  and  D  as  modulators  of  the  emerging  antibacterial  target,  the topoisomerase IV enzyme.
Keywords: antibacterial, Gram negative bacteria, Agelas nakamurai, docking moleculer.

## ABSTRAK
Bakteri  gram  negatif  tetap  menjadi  ancaman  serius  bagi  akuakultur,  ekonomi,  dan  kesehatan manusia.  Ironisnya,  sementara  antibiotik  yang  efektif  belum  ditemukan,  resistensi  bakteri  ini terhadap  berbagai  antibiotik  meningkat  dengan  kecepatan  yang  mengkhawatirkan.  Hal  ini menunjukkan  urgensi  penemuan  antibiotik  baru,  terutama  antibiotik  yang  dapat  menghambat replikasi  enzim  seperti  DNA  gyrase  atau  topoisomerase  IV,  yang  saat  ini  menjadi  target  baru penemuan antibiotik. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui potensi antibakteri Agelas nakamurai terhadap  A .  hydrophila,  A.  salmonicida dan E.  tarda menggunakan  ekstrak  spons  (1, 10,  dan  100)  mg/mL  dan  tetrasiklin  (1  mg/mL)  sebagai  kontrol  positif  dan  memprediksi  potensi antibakteri  dari  agelasine  A-F  (1-6)  dan  agelasidine  A  ( 7 )  dari A.  nakamurai dari  Kepulauan Sangihe  terhadap  protein  topoisomerase  IV  melalui  docking  molekuler.  Uji in  vitro dilakukan dengan  menggunakan  metode  Kirby  Bauer  dengan  sedikit  modifikasi  dan  studi  in  silico menggunakan  CB-dock  2 dan  Protein  Ligand  Interaction  Profiler. Meskipun  ekstrak menunjukkan aktivitas  antibakteri  yang  lebih  lemah  terhadap A.  hydrophila,  A.  salmonicida dan E.  tarda dibandingkan  tetrasiklin,  molekul  docking  dengan  CB-dock  2  menunjukkan  bahwa  agelasine  A-F
Samakia: Jurnal Ilmu Perikanan Volume 14, No. 1, April 2023 ISSN:2086-3861 E-ISSN: 2503-2283
To  Cite  this  Paper: Walter  Balansa,  W.,  Lukas,  L,  C.,  Rieuwpassa,  F,  J.,  Tomasoa,  A,  M.  2023.  Aktivitas  Antibakteri  Sponge Agelas Nakamurai Terhadap Bakteri Gram Negative: Study In Vitro dan In Silico . Samakia: Jurnal Ilmu Perikanan, 14 (1) : 76-85. Journal Homepage : https://journal.ibrahimy.ac.id/index.php/JSAPI
http://dx.doi.org/10.35316/jsapi.v14i1.3012
( 1-6 ) dan  agelasidin  A  (7) memiliki afinitas pengikatan  yang  lebih  kuat (-7.1). hingga  -8,6 kJ/mol) daripada  tetrasiklin  ( 10 ),  ciprofloksasin  ( 11 )  atau  levofloksasin  ( 12 )  (-6,6  hingga  -8,3  kJ/mol). Docking  molekuler  pada  agelasidin  C  ( 9 )  dan  D  ( 10 )  juga  menunjukkan  afinitas  pengikatan  yang kuat  (-8,3  dan  -8,8  kJ/mol)  ke  protein  target  1S16  terutama  akibat  ikatan  hidrogen  dan  interaksi hidrofobik. Secara kolektif, hasil ini menunjukkan potensi agelasidin A, C dan D sebagai modulator dari target antibiotik baru, enzim topoisomerase IV.
Kata kunci: antibakteri, bakteri Gram negatif, Agelas nakamurai , docking moleculer

## PENDAHULUAN
Bakteri-bakteri  Gram  negatif  seperti Aeromonas  hydrophila , Aeromonas  salmonicida dan Edwardsiella  tarda adalah  tiga  patogenik  ikan  utama  (Pridgeon  &  Klesius,  2012).  Gejala-gejala infeksi oleh ketiga jenis bakteri ini termasuk pembengkakan pada bagian perut, luka di bagian sirip dan  ekor  pada  ikan  lele  dan  mas  dan  penyakit  edwardsiellosis  pada  ikan  lele  yang  terinfeksi E. tarda (Meidiza et al., 2017), penyakit MAS (Motil Aeromonas Septicemia ) pada ikan nila terinfeksi A.  hydrophila (Triyaningsih  et  al.,  2014)  dan  frunculosis  pada  ikan  mas  terinfeksi A.  salmonicida (Wintoko et al., 2013). Menurut perkiraan, infeksi tiga bakteri ini dan 11 genus bakteri patogen ikan lainnya  adalah  penyebab  kerugian  ratusan  juta  dolar Amerika  di bidang  budidaya  ikan  di seluruh dunia setiap tahunnya (Pridgeon & Klesius, 2012).
Ironisnya,  ancaman  menakutkan  dari  infeksi  bakteri-bakteri  patogen  belum  disertai  dengan penemuan  antibiotik  baru  (Rogers  et  al.,  2012).  Dalam  5  dekade  terakhir,  para  ilmuwan  hanya berhasil mengembangkan 3 jenis antibiotik baru (Abad et al., 2011). Alasannya, para peneliti lebih memilih  mengembangkan  obat  melalui  sintesa  molekul  di  laboratorium  daripada  isolasi  molekul dari bahan alam. Hasilnya ialah hanya 1 obat yang berhasil dikembangkan dalam 25 tahun, sangat mencolok  jika  dibandingkan  dengan  bahan  alam  yang  menyumbang  80%  obat  antikanker  dan antibiotik (Newman & Cragg, 2004).
Akibatnya,  belakangan  ini  peneliti-peneliti  kembali  mengkaji  bahan  alam  sebagai  sumber  obat secara  intensif  dengan  invertebrata  laut  sebagai  salah  satu  target  utama.  Hingga  tahun  2010, sebanyak  ~15.000  molekul  telah  ditemukan  dari  sponge  (Mehbub  et  al.,  2014)  saja  dan  >300 molekul dari teripang laut (Mondol et al., 2017). Banyak dari molekul itu termasuk dari sponge A. nakamurai menunjukan aktivitas antimikroba terhadap bakteri-bakteri Gram positif, jamur dan virus (Indraningrat  et  al.,  2016).  Tetapi  informasi  ilmiah  serupa  masih  sangat  terbatas  untuk  bakteri- bakteri patogenik ikan Gram negatif, penyebab kerugian ekonomi sangat besar di bidang budidaya ikan seperti A. hydrophila , A. salmonicida dan E. tarda. Terlebih penting lagi, pengujian antibakteri yang  kami  lakukan  sebelumnya  membuktikan  bahwa A.  nakamurai dari  perairan  Kabupaten Sangihe  mengandung  7  molekul  terpene  alkaloid  disebut  agelasine  A-F  ( 1-6 )  dan  agelasidine  A ( 7 ). Beberapa jenis molekul agelasine telah dilaporkan sebagai antibakteri terhadap bakteri Gram positif maupun Gram negatif (Balansa  et  al., 2020; Riyanti et  al., 2020).  Meskipun begitu, hingga sekarang  belum  ada  penelitian  tentang  aktivitas  agelasines  terhadap  topoisomerase  IV,  target antimikroba  yang  sedang  banyak  menarik  perhatian  peneliti.  Padahal,  akses  untuk  target  protein maupun studi in silico sangat memungkinan untuk penelitian sedemikian.
Jadi,  penelitian  ini  bertujuan  untuk  menguji  aktivitas  ekstrak  kasar  dari  spongne A.  nakamurai terhadap  tiga  bakteri  ikan  Gram  negatif A.  hydrophila , A.  salmonicida dan E.  tarda .  Selain  itu, penelitian ini juga berfokus pada pengujian secara in silico kandungan molekul A. nakamurai dari perairan  Kabupaten  Sangihe  yaitu  Agelasine  A-F  ( 1-6 )  dan  agelasidine  C  ( 7 )  terhadap  target protein E.  coli topoisomerase  IV  (1S16).  Melalui  kombinasi  pendekatan  ini  diharapkan  dapat menyingkap pengetahuan tentang aktivitas ekstrak kasar A. nakamurai terhadap tiga jenis bakteri ikan  Gram  negatif  maupun  potensi  metabolit  dari  sponge  ini  atau  derivatnya  sebagai  modulator topoisomerase IV, salah satu target menjanjikan untuk penemuan antibiotik baru.

## MATERI DAN METODE
Penyiapan ekstrak kasar sponge. Ekstrak kasar sponge disiapkan dengan memotong kecil-kecil sponge, lalu dikeringkan selama 24 jam dengan suhu 45 0 C. Setelah kering, sponge ditimbang dan sebanyak 30-gram dan  dilarutkan  dalam metanol 300 mL  dan  didiamkan  selama 24  jam.  Tahap berikutnya ialah menyiapkan ekstrak dengan konsentrasi 1, 10 dan 100 (mg/mL).
To  Cite  this  Paper: Walter  Balansa,  W.,  Lukas,  L,  C.,  Rieuwpassa,  F,  J.,  Tomasoa,  A,  M.  2023.  Aktivitas  Antibakteri  Sponge Agelas Nakamurai Terhadap Bakteri Gram Negative: Study In Vitro dan In Silico . Samakia: Jurnal Ilmu Perikanan, 14 (1) : 76-85. Journal Homepage : https://journal.ibrahimy.ac.id/index.php/JSAPI
http://dx.doi.org/10.35316/jsapi.v14i1.3012

## Isolasi Dan Kultur Bakteri
Bakteri yang pakai dalam pengujian diperoleh dari Badan Karantina Ikan Pengendalian Mutu Hasil Perikanan Tahun kemudian di kultur lagi pada media Tryptic Soy Agar (TSA) untuk memperbanyak kultur bakteri E.  tarda,  A.  hydropilla,  A. salmonicida dilakukan  inokulasi  dengan menggoreskan  3 kultur bakteri tersebut pada 3 cawan petri yang sudah berisi media TSA lalu  di ingkubasi selama 24 jam.

## Tahapan Uji Antibakteri
Ekstrak  kasar  sponge  diencerkan  dengan  menggunakan  pelarut  metanol  dengan  konsentrasi  1, 10, dan 100 (mg/mL) dilakukan dengan meggunakan kawat ose steril dengan mengambil inokulum bakteri E.  tarda , A.  hydropilla , A.  salmonicida dan  menggores  miring  pada  media  TSA.  Kertas saring  berbentuk  berbentuk  cakram  (6  mm)  yang  sudah  steril  diletakan  dengan  posisi  segi  tiga. Setelah  itu,  sebanyak  20  µL  ekstrak  dengan  konsentrasi  berbeda  maupun  antibiotik  diteteskan pada masing-masing kertas cakram dengan menggunakan pipet.

## Penyiapan Larutan Antibiotik
Menyiapkan  0.1  larutan  tetrasilkin,  sebanyak  1.0  mg  serbuk  antibiotik  perbandingan  ini ditambahkan  pada  tabung  reaksi  berisi  10  mL  aquades.  Selanjutnya  kedua  bahan  tersebut dicampur  hingga  homogen  menggunakan  vortex  sebelum  digunakan  dalam  pengujian  aktivitas antibakteri.

## Studi Docking Molekuler
Persiapan protein target. Docking semua ligan (agelasines, tetracycline, ciprofloxacin dll) di dalam protein  target  (1)  dilakukan  dengan  menggunakan  CB-dock  2  (Liu  et  al.,  2022).  File  pdf  untuk struktur kristal target protein diambil dari situs web bank data protein (//www.rcsb.org/pdb) PDB ID: resolusi  1S16  2.10  Å.  Sebelum  docking,  semua  molekul  air  dan  heteroatom  akan  dihapus  dari protein yang akan diunggah yang blind dockingya dijalankan secara default pada CB-dock 2.
Penyiapan ligan . Struktur dari semua ligan digambar menggunakan ChemiDraw Ultra 12.0 untuk mendapatkan  struktur  2D.    cdx  dari  semua  ligan.  Selanjutnya,  struktur  2D  dari  tiap  molekul diminimalisasi energinya menggunakan Chem3D Pro dan disimpan sebagai format tipe Mol2.
Docking  molekul .  Kantung  yang  dipilih  untuk  semua  docking  adalah  tempat  pengikatan  untuk enzim topoisomerase (1S16). Docking dijalankan dengan nilai RMDS <2.0 (Liu et al., 2019) untuk topoisomerase IV.
Protein Ligand Interaction Profiler . PLIP focuses on one-click processing of protein structures for the  detection  of  interaction  patterns.  There  are  other  tools,  web  pages  and  databases.  Protein ligand  complex  obtained  from  the  docking  through  CB-2  dock  (Liu  et  al.,  2022)  was  uploaded  to PLIP  web  server  and  analyzed  using  the  tool  on  PLIP. https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip- web/plip/index .

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil  pengujian  antibakteri  ekstrak  kasar  sponge Agelas  nakamurai terhadap Aeromonas hydrophila , Aeromonas  salmonicida dan Edwardsiella  tarda membuktikan  bahwa  ekstrak  kedua invertebrata laut itu  aktif atau mampu menghambat pertumbuhan  terhadap hampir semua bakteri uji. Sementara ekstrak A. nakamurai terbukti aktif terhadap ketiga bakteri Gram negatif itu. Aktivitas antibakteri  juga  bervariasi  berdasarkan  jenis  ekstrak  kasar  (sponge A.  nakamurai ),  konsentrasi ekstrak  kasar  (1,  10  dan  100)  mg/mL  dan  jenis  bakteri  uji  ( A.  hydrophila , A.  salmonicida dan E. tarda ) (Tabel 1, Gambar 1 dan 2).
To  Cite  this  Paper: Walter  Balansa,  W.,  Lukas,  L,  C.,  Rieuwpassa,  F,  J.,  Tomasoa,  A,  M.  2023.  Aktivitas  Antibakteri  Sponge Agelas Nakamurai Terhadap Bakteri Gram Negative: Study In Vitro dan In Silico . Samakia: Jurnal Ilmu Perikanan, 14 (1) : 76-85. Journal Homepage : https://journal.ibrahimy.ac.id/index.php/JSAPI
http://dx.doi.org/10.35316/jsapi.v14i1.3012
Tabel 1. Hasil pengujian aktivitas antibakteri dari ekstrak sponge Agelas nakamurai terhadap tiga bakteri patogen A. hydrohila, A. salmonicida dan E. tarda .
Gambar 1. Zona hambat esktrak sponge Agelas nakamurai terhadap bakteri (a) A. hydrophila , (6) A. salmonicida , (C) E. tarda pada konsentrasi 1, 10 dan 100 mg/mol.
Meskipun  daya  hambat  ekstrak  bervariasi  terhadap  tiga  jenis  bakteri  uji,  ukuran  zona  bening  itu konsisten berdasarkan konsentrasi  yakni makin besar dengan meningkatnya konsentrasi  ekstrak. Pada konsentrasi 1 mg/mL, ekstrak kasar A. nakamurai menghambat pertumbuhan A. hydrophila dengan zona hambat rata-rata sebesar ±15.3 mm. Zona hambat meningkat menjadi 18.7 mm pada konsentrasi 10 mg/mL dan mencapai nilai tertinggi (23.0 mm) pada konsentrasi 100 mg/mL.
Hasil serupa juga terlihat pada pengujian terhadap A. salmonicida meskipun dengan zona hambat lebih  kecil  (12.33  mm)  pada  konsentrasi  1  mg/mL  tetapi  lebih  tinggi  pada  konsentrasi  10  mg/mL (20.33 mm) dan 100 mg/mL (29.0 mm) dibandingkan hasil pengujian pada A. hydrophila . Berbeda dengan dua hasil pengujian sebelumnya, hasil uji terhadap E. tarda tidak memperlihatkan aktivitas antibakteri pada konsentrasi 1 mg/mL, tetapi menunjukan zona hambat terbesar pada konsentrasi 10 mg/mL (22.7 mm), lebih besar dari zona hambat A. hydrophila meskipun dengan zona hambat lebih kecil lebih kecil (27.67 mm) daripada A. salmonicida (29 mm) pada konsentrasi 100 mg/mL (Gambar 1 dan Tabel 1).
Hasil  pengujian  ini  mengindikasikan  bahwa A.  nakamurai mampu  menghambat  ketiga  bakteri  uji dengan besar daya hambat bergantung pada konsentrasi ekstrak A. nakamurai . Sementara daya hambat  terbesar  pada  konsentrasi  1  mg/mL  teramati  pada A.  hydrophila ,  pada  konsentrasi  10 mg/ml terhadap E. tarda sedangkan pada konsentrasi 100 mg/ml terhadap A. salmonicida (Tabel 1).
Jika  dibandingkan  dengan  kontrol  positif,  kemampuan  daya  hambat  ekstrak A.  nakamurai masih lebih rendah bahkan hingga pengujian pada konsentrasi ekstrak 100 mg/mL (Gambar 2) walaupun pada konsentrasi 100 mg/mL, zona hambat ekstrak A. nakamurai terhadap bakteri A. salmonicida
Jenis Bakteri ikan Konsentrasi Sponge (mm) Rata-rata (mm) Aeromonas hydrophila 1 mg/mL 15 16 15 15.33 10 mg/mL 18 19 19 18.67 100 mg/mL 23 23 23 23.00 Tetrasiklin 25 25 25 25.00 Aeromonas salmonicida 1 mg/mL 12 13 12 12.33 10 mg/mL 19 22 20 20.33 100 mg/mL 30 27 30 29.00 Tetrasiklin 30 30 30 30.00 Edwarsiella tarda 1 mg/mL 0 0 0 00.0 10 mg/mL 22 23 23 22.67 100 mg/mL 27 3 26 27.67 Tetrasiklin 27 25 28 26.67
1 10 100 1 10 100 1 10 100 A A A
To  Cite  this  Paper: Walter  Balansa,  W.,  Lukas,  L,  C.,  Rieuwpassa,  F,  J.,  Tomasoa,  A,  M.  2023.  Aktivitas  Antibakteri  Sponge Agelas Nakamurai Terhadap Bakteri Gram Negative: Study In Vitro dan In Silico . Samakia: Jurnal Ilmu Perikanan, 14 (1) : 76-85. Journal Homepage : https://journal.ibrahimy.ac.id/index.php/JSAPI
http://dx.doi.org/10.35316/jsapi.v14i1.3012
(29.0 mm) dan terhadap A. salmonicida (20.00 mm) hampir menyamai daya hambat tetrasiklin 30 dan  21.7  (mm)  berturut-turut  (Tabel  1)  dan  aktivitas A.  nakamurai terhadap E.  tarda (27.7  mm) pada konsentrasi 100 mg/mL sedikit lebih tinggi dari tetrasiklin (26.7).

## Studi Docking Molekuler
Docking  molekuler  dilakukan  pada  agelasine  A-F  ( 1-6 )  and  agelasidine  A (7 )  yang  diisolasi  dari sponge A. nakamurai dari perairan Kabupaten Sangihe (Balansa et al., 2020; Riyanti et al., 2020), agalasidine  C  ( 8 ),  D  ( 9 )  tetrasiklin  ( 10 )  dan  antibiotik  ciprofloxacin  and  levofloxacin  ( 10 - 11 ) (Gambar 2).
Gambar 2. Struktur agelasines A-F ( 1-6 ), agelasidine A, C-D  ( 7-9 ), tetrasiklin ( 10 ), ciprofloxasin
( 11 ), levofloxacin ( 12 )
Docking  molekuler  menggunakan  CB-dock  2  (Liu  et  al.,  2022)  memperlihatkan  bahwa  dari  7 molekul yang diisolasi dari sponge A. nakamurai dari Kabupaten Sangihe, agelasidine A memiliki afinitas  ikatan  tertinggi  (-8.6  kJ/mol).  Hasil  ini  mengindikasikan  bahwa  agelasidine  A  sebagai molekul  dengan  afinitas  pengikatan  atau  sebagai  modulator  paling  potensial  untuk  enzim topoisomerase  IV  (Gambar  3).  Afinitas  ikatan  ini  lebih  tinggi  daripada  afinitas  ikatan  atibiotik tetrasiklin  (-8.1  kJ/mol),  ciproflaxin  (-6.6  kJ/mol)  maupun  levofloxacin  (-7.7kJ/mol).Afinitas  ikatan dari  agelasines  tergolong  lebih  lemah  (-7.1-7.3  kJ/mol)  daripada  tetrasiklin,  hampir  menyamai aktivitas  antibiotik  quinolone  agesiline  E  (-7.7  kJ/mol)  dan  masih  lebih  kuat  daripada  aktivitas antibiotik  ciproflaxin.  Hasil  ini  mengindikasikan  dari  senyawa  agelasine  khususnya  potensi  dari agelasidine  A  sebagai  senyawa  sebagai  senyawa  antibiotik.  Perbedaan  struktur  tampakanya berperan penting pada perbedaan ikatan afinitas dari struktur dari agelasine (gabungan diterpene halimene,  claderone  atau  labdane  dan  gugus  fungsi  methyladenine)  dan  agelasidine  (diterpene bercabang dan gugus fungsi hypotaurocyamine). Dugaan ini didukung dengan hasil docking pada dua  molekul  agelasidine  lainnya  yang  memperlihatkan  afinitas  ikatan  agelasidine  C  (-8.3  kJ/mol) dan agelasidine D (-8.8 kJ/mol).
To  Cite  this  Paper: Walter  Balansa,  W.,  Lukas,  L,  C.,  Rieuwpassa,  F,  J.,  Tomasoa,  A,  M.  2023.  Aktivitas  Antibakteri  Sponge Agelas Nakamurai Terhadap Bakteri Gram Negative: Study In Vitro dan In Silico . Samakia: Jurnal Ilmu Perikanan, 14 (1) : 76-85. Journal Homepage : https://journal.ibrahimy.ac.id/index.php/JSAPI http://dx.doi.org/10.35316/jsapi.v14i1.3012
Gambar 3: Gambar 3D pengikatan agelasidine C (A, B) dan tetraksiklin pada kantung 1S16 (C, D)
Table 2. Hasil docking menggunakan CB-dock 2 pada protein target topoisomerase IV (1S16)
Ligands Binding affinity (kJ/mol) Asam Amino Agelasine A ( 1 ) -7.7 Chain  A:  Phe1100  Asp1326  Gln1328  Ser1338  Ser1339  Arg1340 Gln1341  Chain  B:  Arg2020  Arg2021  Arg2022  Pro2023  Thr2172 Phe2173 Phe2174 Asp2175\ Agelasine B ( 2 ) -7.4 Chain  B:  Leu2048  Ala2049  Gln2106  Phe2107  Val2193  Leu2194 Pro2196  Gln2216  Asp2217  Leu2219  Ala2243  Gly2244  Ala2248 Val2249 Asp2250 Leu2270 Ser2321 Val2322 Lys2323 Agelasine C ( 3 ) -7.3 Chain  B:  Leu2048  Ala2049  Gln2106  Phe2107  Val2193  Leu2194 Cys2195  Pro2196  Asp2217  Leu2219  Ala243  Gly2244  Ala2248 Asp2250 Leu2270 Ser2321 Lys2323 Agelasine D ( 4 ) -7.1 Chain  A:  Glu1038  Val1039  Ile1040  Asn1042  Ser1043  Glu1046 Val1067  Asp1069  Gly1073  Mer1074  Ile1090  Ala1096  Gly1097 Gly1098  Lys1099  Tyr1105  Gly1110  Leu1111  His1112  Gly1113 Val1114  Gly1115  Ile1116  Ser1117  Thr1163  Ser1164  Val1165 Lys1334. Chain B: Tyr2005 Ile2010 Agelasine F ( 6) -7.8 Asn85,  Ser122,  Trp84,  Gly123,  Glu199,  Gly119,  Gly118,  Ser200, GLy441, Tyr70, Aps72, Tyr121, Ser81 Agelasidine A ( 7 ) -8.6 Chain A: Tyr1005 Iel1010 Chain  B:  Glu2038  Val2039  Asn2042  Ser2043  Asp2045  Glu2046 Val2067  Asp2069  Gly2073  Met2074  Pro2075  Ile2090  Ala2096 Gly2097  Gly2098  Lys2099  Tyr2105  Gly2109  Gly2110  Leu2111 His112 Gly2113 Val2114 Gly2115 Ile2116 Thr2163 Val2165 Gln2332 Lys23340 Agelasidine _C ( 8 ) -8.3 Chain  A:  Gln1037  Glu1038  Val1039  Asp1041  Asl1042  SER1043 ASP1045  Glu1046  Asp1069  Met1074  Pro1075  Ile1090  Arg1093 Ala1096  Gly1097  Gly1098  Lys1099  Tyr1105  Gly1109  Gly1110
Leu1111  His1112  Gly1113  Val1114  Gly1115  Ile1116  Ser1117 Thr1163 Val1165 Ile1271 Gln1332 Lye1334
To  Cite  this  Paper: Walter  Balansa,  W.,  Lukas,  L,  C.,  Rieuwpassa,  F,  J.,  Tomasoa,  A,  M.  2023.  Aktivitas  Antibakteri  Sponge Agelas Nakamurai Terhadap Bakteri Gram Negative: Study In Vitro dan In Silico . Samakia: Jurnal Ilmu Perikanan, 14 (1) : 76-85. Journal Homepage : https://journal.ibrahimy.ac.id/index.php/JSAPI
http://dx.doi.org/10.35316/jsapi.v14i1.3012
A B C D
Chain B: Tyr2005 Ile2010
Agelasidine _D ( 9 ) -8.8 Chain  A:  Gln1037  Glu1038  Val1039  Asp1041  Asn1042  Ser1043 Asp1045  Glu1046  Asp1069  Met1074  Pro1075  Leu1089  Ile1090 Leu1091  Arg1093  Ala1096  Gly1097  Gly1098  Lys1099  Tyr1105 Gly1109  Gly1110  Leu1111  His1112  Gly1113  Val1114  Gly1115 Ile1116 Ser1117 Thr1163 Val1165 Ile1271 Gln1332 Lys1334 Chain B: Tyr2005 Ile2010 Tetracycline ( 10 ) -8.3 Chain  A:  Thr1246  Glu1247  Met1324  ASP1326  Pro1327  Gln1328 Ser1339 Arg1340 Gln1341 Cys1342 Chain B: Arg2021 Arg2022 Pro2023 Thr2172 Phe2173 Ciproflaxin ( 11 ) -6.6 Chain  B:  Peh2107  Ala2192  Val2193  Leu2194  Pro2196  Tyr2215 Gln2216  Asp217  Gly2218  Leu2219  Ala2243  Ala2248  Asp2250 Ser2321 Lys2323 Levofloxacin ( 12 ) -7.7 Chain  B:  Phe2107  Ala2192  Val2193  Leu2194  Cys2195  Pro2196 Tyr2215  Gln2216  Asp2217  Gly2218  Leu2219  Asn2241  Ala2243 Ala2248 Asp2250 Ser2321 Lys2323 Table 2. Hasil analisa protein ligan interaksi menggunakan PLIP dari agelasidine A, C-D (1-3) atau tetrasiklin dan stuktur kristal dari topoisomerase IV (PDB ID: 1S16) Ligands Ikatan Hidrogen (Kcal/mol) Ikatan Hidrofobik Salt bridge Tetracylcine Gln132, Gln132, Ser1339, Arg1340, Gln1341, Gln1341, Cys1342, Thr217 Asp1326 Agelasidine A Gly117, Tyr130 Tyr70, Asp72, Ile287, Phe330, Phe331, Tyr334, Tyr334, Glu103, Asp104 Agelasidine C Glu1038, Gly1038, Asn104, Ile1116, Tyr334 Asn104, Glu104, Met107, Ile116, Thr116 Agelasidine D Lys1334, Lys1334 Ile2090, Lys2099, Val2114, Ile2116, Ser2117, Ser2117 Tyr1005, Gly2046, Met2074, Ile2090, Lys2099m Tgr2163
Gambar 4. Interaksi Protein Ligand antara agelasidien A ( 1 ) agelasidine C ( 2 ), Agelasidine D ( 3 ) tetrasiklin ( 4 ) dan topoisomerase enzim (PDB ID: 1S16); garis biru menunjukan ikatan hidrogen, garis coklat putus-putus mewakili ikatan hidrofobik.
To  Cite  this  Paper: Walter  Balansa,  W.,  Lukas,  L,  C.,  Rieuwpassa,  F,  J.,  Tomasoa,  A,  M.  2023.  Aktivitas  Antibakteri  Sponge Agelas Nakamurai Terhadap Bakteri Gram Negative: Study In Vitro dan In Silico . Samakia: Jurnal Ilmu Perikanan, 14 (1) : 76-85. Journal Homepage : https://journal.ibrahimy.ac.id/index.php/JSAPI
http://dx.doi.org/10.35316/jsapi.v14i1.3012
Hasil  profiling  menggunakan  protein  ligand  interaction  profiler  (PLIP)  menunjukan  sementara interaksi  tetrasikin  dengan  protein  target  melibatkan  ikatan  hidrogen  saja  (Gambar  4D,  Tabel  2), pada  ketiga  molekul  agelasine  A,  C  dan  D,  interaksi  itu  melibatkan  bukan  saja  ikatan  hidrogen tetapi  juga  ikatan  hidrofobik  (Gambar  4A-C).  Interaksi  ikatan  yang  lebih  banyak  antara  senyawa- senyawa  agelasidine  A,  C  dan  D  dan  protein  target  1S16  dibandingkan  dengan  interaksi  antara tetrasiklin  dan  1S16  kemungkinan  bisa  menjadi  penyebab  afinitas  ikatan  lebih  kuat  pada agelasidine  A,  C  dan  B  dibandingkan  dengan  tetrasiklin.  Muley  et  al.  (2010)  juga  melaporkan peningkatan afinitas ikatan akibat gabungan antara interaksi hidrofobik dan ikatan hidrogen.
Secara in  vitro aktivitas  antibakteri  ekstrak  sponge A.  nakamurai memperlihatkan  daya  hambat lebih  kecil daripada  tetrasiklin  atau  kontrol positif dalam penelitian  ini.  Hal  ini kemungkinan  besar berhubungan  karakteristik  bahan  alami  dari  sponge A.  nakamurai dalam  studi  ini  yang  masih berupa  ekstrak  kasar.  Salah  satu  penjelasan  ialah  ekstrak  kasar  masih  merupakan  campuran kompleks  berbagai  molekul  yang  aktivitas  antibakteri  teramati  saat  ini  bisa  saja  akibat  aktivitas sinergetik  (aktivitas  antibakteri  gabungan  dua  atau  lebih  molekul  lebih  kuat  daripada  aktivitas molekul-molekul  itu  secara  individu)  atau  antagonistik  (aktivitas  molekul-molekul  secara  individu lebih kuat dari aktivitas gabungan dari dua atau lebih senyawa). Alternatifnya, ketidakmurnian pada ekstrak kasar kemungkinan besar mempengaruhi kandungan bahan aktif atau fitokimia dari ekstrak A.  nakamurai dan  berdampak  pada  rendahnya  aktivitas  antimikroba A.  nakamurai dibandingkan dengan kontrol positif atau tetrasiklin dalam penelitian ini. Angeloni et al. (2021) juga membuktikan adanya korelasi positif antara kandungan total fenolik dan penurunan aktivitas radical scavenging pada  ekstrak  kasar Leonorus  cardiaca .  Menurut  kelompok  peneliti  ini,  perbandingan  kandungan fitokimia  pada  senyawa  murni  jauh  lebih  tinggi  daripada  esktrak  kasar,  salah  satu  penyebab senyawa murni memiliki bioaktifitas yang cenderung lebih kuat daripada ekstrak kasar.
Menariknya,  docking  molekuler  justru  memperlihatkan  afinitas  pengikatan  lebih  kecil  atau bioaktivitas lebih kuat pada senyawa-senyawa agelasines (-7.1 sampai -8.6 kJ/mol) dibandingkan dengan  beberapa  antibiotik  seperti  tetrasiklin  dan  antibiotik  quinolone  seperti  ciprofloxacin  dan levofloxacin  dengan  afinitas  ikatan  dengan  nilai  lebih  besar  atau  bioaktivitas  lebih  lemah  yaitu antara  -6.6  dan  -8.3  kJ/mol  (Tabel  2).  Hasil  docking  ini  juga  mendukung  asumsi  sebelumnya bahwa aktivitas ekstrak kasar cenderung lebih lemah dibandingkan dengan senyawa murni. Selain itu,  hasil  ini  juga  memperlihatkan  bahwa  agelasidine  C  memiliki  afinitas  ikatan  terkuat  terhadap protein target, topoisomerasi E. coli (1S16) dibandingkan dengan agelasine A-F karena perbedaan mendasar  pada  struktur  kimia  agelasine  (gabungan  gugus  fungsi  diterpene  halimene,  claderone atau  labdane  dan  methyladenine)  dan  agelasidine  (diterpen  bercabang  dan  hypotaurocyamine). Seperti telah disentil sebelumnya, asumsi ini juga telah didukung dengan hasil docking molekuler pada dua analag dari agelasidine A yaitu agelasidine C dan D yang juga memperlihatkan afinitas pengikatan yang kuat. Bahkan agelasidine D memiliki afinitas ikatan (-8.8 kJ/mol) sedikit lebih kuat dari  agelasidine  C  (-8.5  kJ/mol).  Secara  kolektif,  hasil  ini  menunjukan  potensi  dari  senyawa terkandung  pada  sponge  genus Agelas secara  khusus  agelasidine  sebagai  senyawa  dengan potensi menjadi modulator enzim topoisomerase IV salah satu target antibakteri menjanjikan.
Selanjutnya,  sulitnya  penemuan  antibiotik  khususnya  untuk  bakteri  Gram  negatif  (1000  kali  lebih rendah  daripada  penemuan  antibotik  untuk  bakteri  Gram  positif)  (Silver,  2011)  menjadikan pengujian  lebih  lanjut  untuk  agelasidine  A,  C  maupun  D  sebagai  modulator  topoisomerase  IV relevan. Selain itu, peningkatan resistensi bakteri yang sangat mengkuatirkan memperingatkan kita tentang  pentingnya  studi  kombinasi  antibiotik  dan  ekstrak  kasar  untuk  mengetahui  dampak sinergetik dari kombinasi itu untuk peningkatan aktivitas antibiotik misalnya dengan menggunakan ekstrak A.  nakamurai .  Berbagai  hasil  penelitian  antibiotik  seperti  itu  makin  banyak  dipublikasikan (Nascimento et al., 2000; Hübsch et al., 2014) dan  membuka peluang  untuk penemuan antibiotik atau kombinasi antibiotik untuk pengobatan infeksi bakteri patogen pada ikan maupun manusia.

## KESIMPULAN
Ekstrak  kasar  sponge A.  nakamurai dari  Kabupaten  Kepulauan  Sangihe  mampu  menghambat pertumbuhan  tiga  jenis  bakteri  ikan A.  hydrophila , A.  salmonicida dan E.  tarda .  Aktivitas penghambatan  ekstrak A.  nakamurai masih  jauh  lebih  lemah  daripada  antibiotik  tetrasiklin  tetapi hasil  docking  molekuler  pada  agelasine  A-F  dan  agelasidine  memperlihatkan  bahwa  molekul- molekul  ini  memiliki  aktivitas  antimikroba  lebih  kuat  terhadap  protein  topoisomerase  IV  daripada
To  Cite  this  Paper: Walter  Balansa,  W.,  Lukas,  L,  C.,  Rieuwpassa,  F,  J.,  Tomasoa,  A,  M.  2023.  Aktivitas  Antibakteri  Sponge Agelas Nakamurai Terhadap Bakteri Gram Negative: Study In Vitro dan In Silico . Samakia: Jurnal Ilmu Perikanan, 14 (1) : 76-85. Journal Homepage : https://journal.ibrahimy.ac.id/index.php/JSAPI
http://dx.doi.org/10.35316/jsapi.v14i1.3012
tetrasiklin,  ciprofloxacin  maupun  levofloxacin.  Pengujian  lanjut  agelasidine  A,  C  dan  D  maupun pengujian kombinasi ekstrak dan antibiotik komersial bisa menjadi pendekatan-pendekatan relevan dalam  mengatasi  resistensi  bakteri  sekaligus  sebagai  upaya  penemuan  antibiotik  baru  untuk bakteri penginfeksi ikan maupun manusia .

## DAFTAR PUSTAKA
Abad,  M.,  Bedoya,  L.,  &  Bermejo,  P.  (2011).  Marine  compounds  and  their  antiviral  activities. Antiviral Research , 86 (3), 231–240. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2010.03.009
Angeloni, S., Spinozzi, E., Maggi, F., Sagratini, G., Caprioli, G., Borsetta, G., Ak, G., Sinan, K. I., Zengin,  G.,  Arpini,  S.,  Mombelli,  G.,  &  Ricciutelli,  M.  (2021).  Phytochemical  profile  and biological  activities  of  crude  and  purified  leonurus  cardiaca  extracts. Plants , 10 (2),  1–15. https://doi.org/10.3390/plants10020195
Balansa,  W.,  Wodi,  S.  I.  M.,  Rieuwpassa,  F.  J.,  &  Ijong,  F.  G.  (2020).  Agelasines  B,  D  and antimicrobial  extract  of  a  marine  sponge  Agelas  sp.  From  Tahuna  Bay,  Sangihe  Islands, Indonesia. Biodiversitas , 21 (2), 699–706. https://doi.org/10.13057/biodiv/d210236
Hübsch,  Z.,  Van  Zyl,  R. L.,  Cock,  I.  E.,  & Van  Vuuren, S. F. (2014).  Interactive  antimicrobial  and toxicity  profiles  of  conventional  antimicrobials  with  Southern  african  medicinal  plants. South African Journal of Botany , 93 , 185–197. https://doi.org/10.1016/j.sajb.2014.04.005
Indraningrat,  A.  A.  G.,  Smidt,  H.,  &  Sipkema,  D.  (2016).  Bioprospecting  sponge-associated microbes for antimicrobial compounds. Marine Drugs , 14 (5), 1–66. https://doi.org/10.3390/md14050087
Liu,  Y.,  Grimm,  M.,  Dai,  W.  tao,  Hou,  M.  chun,  Xiao,  Z.  X.,  &  Cao,  Y.  (2019).  CB-Dock:  a  web server for cavity detection-guided  protein–ligand blind docking. Acta Pharmacologica  Sinica , 41 (1), 138–144. https://doi.org/10.1038/s41401-019-0228-6
Liu,  Y.,  Yang, X., Gan,  J.,  Chen,  S., Xiao,  Z.  X.,  &  Cao,  Y.  (2022).  CB-Dock2:  improved protein- ligand blind docking by integrating cavity detection, docking and homologous template fitting. Nucleic Acids Research , 50 (W1), W159–W164. https://doi.org/10.1093/nar/gkac394
Mehbub,  M.  F.,  Lei,  J.,  Franco, C.,  &  Zhang, W.  (2014).  Marine  sponge  derived  natural  products between 2001 and 2010: Trends and opportunities for discovery of bioactives. Marine Drugs , 12 (8), 4539–4577. https://doi.org/10.3390/md12084539
Meidiza,  R.,  Arimbi,  A.,  &  Hastutiek2,  P.  (2017).  Gambaran  Patologi  Hepar  Ikan  Lele  Dumbo (Clarias  gariepinus)  yang  Diinfeksi  Bakteri  Edwardsiella  tarda. Jurnal  Ilmiah  Perikanan  Dan Kelautan , 9 (1), 47. https://doi.org/10.20473/jipk.v9i1.7632
Mondol,  M.  R.,  Hossen,  M.  A.,  &  Nahar,  D.  A.  (2017).  Length–weight  relationships  of  three  fish species from the Bay of Bengal, Bangladesh. Journal of Applied Ichthyology , 33 (3), 604–606. https://doi.org/10.1111/jai.13268
Muley, L., Baum, B., Smolinski, M., Freindorf, M., Heine, A., Klebe, G., & Hangauer, D. G. (2010). Enhancement  of  hydrophobic  interactions  and  hydrogen  bond  strength  by  cooperativity: Synthesis, modeling, and molecular dynamics simulations of a congeneric series of thrombin inhibitors.
Journal of Medicinal Chemistry , 53 (5), 2126–2135. https://doi.org/10.1021/jm9016416
Nascimento, G. G. F., Locatelli, J., Freitas, P. C., & Silva, G. L. (2000). Antibacterial activity of plant extracts and phytochemicals on antibiotic-resistant bacteria. Brazilian Journal of Microbiology , 31 (4), 247–256. https://doi.org/10.1590/S1517-83822000000400003
To  Cite  this  Paper: Walter  Balansa,  W.,  Lukas,  L,  C.,  Rieuwpassa,  F,  J.,  Tomasoa,  A,  M.  2023.  Aktivitas  Antibakteri  Sponge Agelas Nakamurai Terhadap Bakteri Gram Negative: Study In Vitro dan In Silico . Samakia: Jurnal Ilmu Perikanan, 14 (1) : 76-85. Journal Homepage : https://journal.ibrahimy.ac.id/index.php/JSAPI
http://dx.doi.org/10.35316/jsapi.v14i1.3012
Newman, D. J., & Cragg, G. M. (2004). Marine natural products and related compounds in clinical and  advanced  preclinical  trials. Journal  of  Natural  Products , 67 (8),  1216–1238. https://doi.org/10.1021/np040031y
Pridgeon, J. W., & Klesius, P. H. (2012). Major bacterial diseases in aquaculture and their vaccine development. CAB  Reviews:  Perspectives  in  Agriculture,  Veterinary  Science,  Nutrition  and Natural Resources , 7 (048), 1–16. https://doi.org/10.1079/PAVSNNR20127048
Riyanti,  Marner,  M.,  Hartwig,  C.,  Patras,  M.  A.,  Wodi,  S.  I.  M.,  Rieuwpassa,  F.  J.,  Ijong,  F.  G., Balansa, W., & Schäberle, T. F. (2020). Sustainable Low-Volume Analysis of Environmental Samples  by  Semi-Automated  Prioritization  of  Extracts  for  Natural  Product  Research  ( SeaPEPR ). Marine Drugs , 18 (649), 1–15.
Rogers, G. B., Carroll, M. P., & Bruce, K. D. (2012). Enhancing the utility of existing antibiotics by targeting  bacterial  behaviour? British  Journal  of  Pharmacology , 165 (4),  845–857. https://doi.org/10.1111/j.1476-5381.2011.01643.x
Silver, L. L. (2011). Challenges of antibacterial discovery. Clinical Microbiology Reviews , 24 (1), 71– 109. https://doi.org/10.1128/CMR.00030-10
Triyaningsih,  Sarjito,  & Prayitno, S. B. (2014). Patogenisitas Aeromonas hydrophila  yang diisolasi dari  lele  dumbo  (Clarias  gariepinus)  yang  berasal  dari  boyolali. Journal  of  Aquaculture Management and Technology , 3 (2), 11–17. http://ejournal-s1.undip.ac.id/index.php/jfpik
Wintoko, F., Setyawan, A., Hudaidah, S., & Ali, M. (2013). Imunogenisitas heat killed vaksin inaktif Aeromonas salmonicida pada ikan mas (Cyprinus carpio). E-Jurnal Rekayasa Dan Teknologi Budidaya Perairan , II (1), 205–210. http://jurnal.fp.unila.ac.id/index.php/bdpi/article/view/228