## Pemodelan Molekuler Peptida Bioaktif Laut sebagai Antikoagulan Alami terhadap Enzim Sitokrom P450 (CYP) 2C9
(Molecular  Modelling  of  Marine  Bioactive  Peptides  as  Natural  Anticoagulants  against Cytochrome P450 (CYP) 2C9 Enzymes)
Taufik Muhammad Fakih * , Mentari Luthfika Dewi
Program Studi Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Islam Bandung, Bandung, Indonesia.
* E-mail: taufikmuhammadf@gmail.com
Article Info: Received: 18 Maret 2020 in revised form: 10 Mei 2020 Accepted: 04 Oktober 2020
Available Online: 04 Oktober 2020

## ABSTRACT
Anticoagulants  are  very  important  for  the  treatment  and  prevention  of thrombotic disorders. The use of conventional anticoagulants like heparin and warfarin can cause bleeding complications. To find safer anticoagulant therapy  agents,  the  development  of  isolation  of  new  anticoagulant compounds has shifted towards natural sources. Bioactive peptides can be considered a better alternative because of their therapeutic potential in the treatment of various diseases. Several peptide molecules have been shown to  inhibit  the  cytochrome  P450  (CYP)  2C9  enzyme  as  a  natural anticoagulant,  such  as  bioactive  peptides  produced  by  yellowfin  sole ( Limanda aspera ) and bioactive peptides in blue mussel  ( Mytilus edulis ). This study aims to identify and evaluate the interactions that occur between peptide  molecules  with  the  cytochrome  P450  (CYP)  2C9  enzyme  using protein-peptide  docking  methods.  Bioactive  peptide  sequencing  was modeled using the PEP-FOLD software. The best conformation was chosen for  an  interaction  study  against  the  macromolecule  of  cytochrome  P450 (CYP) 2C9 enzyme using PatchDock software. Further observations were made  for  the  interactions  by  using  BIOVIA  Discovery  Studio  2020 software.  Based  on  the  results  of  protein-peptide  docking,  the  yellowfin sole  peptide  molecule  has  a  good  affinity  against  the  macromolecule  of cytochrome P450 (CYP) 2C9 enzyme, with an ACE score of −2527.01 kJ / mol. Therefore, the bioactive peptide is predicted to be used as a candidate for the cytochrome P450 (CYP) 2C9 enzyme inhibitor.
Keywords : Anticoagulant Cytochrome P450 (CYP) 2C9 Marine Bioactive Peptides Protein-Peptide Docking In silico Study
Corresponding Author: Taufik Muhammad Fakih
Program Studi Farmasi Fakultas MIPA
Universitas Islam Bandung
Bandung 40116 Indonesia email:
taufikmuhammadf@gmail.com
Copyright © 2019 JFG-UNTAD
This open access article is distributed under a Creative Commons Attribution (CC-BY-NC-SA) 4.0 International license.

## How to cite:
Fakih, T. M., & Dewi, M. L. (2020). Pemodelan Molekuler Peptida Bioaktif Laut sebagai Antikoagulan Alami terhadap Enzim Sitokrom P450 (CYP) 2C9. Jurnal Farmasi Galenika :Galenika Journal of Pharmacy (e-Journal), 6 (2), 347-355. doi:10.22487/j24428744.2020.v6.i2.15041
Jurnal Farmasi Galenika (Galenika Journal of Pharmacy) (e-Journal) 2020; 6 (2): 347 – 355 ISSN : 2442-8744 (electronic); 2442-7284 (printed) Journal Homepage: https://bestjournal.untad.ac.id/index.php/Galenika DOI: 10.22487/j24428744.2020.v6.i2.15041

## ABSTRAK
Antikoagulan  sangat  penting  untuk  pengobatan  dan  pencegahan  penyakit  trombotik.  Penggunaan  antikoagulan konvensional  seperti heparin  dan warfarin  dapat  menyebabkan komplikasi  perdarahan. Dalam upaya  pencarian agen terapi antikoagulan yang lebih aman, maka pengembangan isolasi senyawa antikoagulan baru telah bergeser dengan memanfaatkan sumber-sumber alami. Peptida bioaktif dapat dianggap sebagai alternatif yang lebih baik karena potensi terapeutiknya dalam pengobatan berbagai penyakit. Terdapat beberapa molekul peptida yang telah terbukti dapat menghambat enzim sitokrom P450 (CYP) 2C9 sebagai antikoagulan alami, seperti peptida bioaktif yang dihasilkan oleh ikan tuna sirip kuning ( Limanda aspera ) dan peptida bioaktif kerang biru ( Mytilus edulis ). Penelitian ini  bertujuan untuk  mengidentifikasi  dan  mengevaluasi  interaksi  yang terjadi antara  molekul  peptida dengan enzim sitokrom P450 (CYP) 2C9 menggunakan motode penambatan molekuler berbasis protein-peptida. Sekuensing peptida bioaktif terlebih dahulu dimodelkan dengan menggunakan software PEP-FOLD. Konformasi terbaik dipilih untuk dilakukan studi interaksi terhadap makromolekul enzim sitokrom P450 (CYP) 2C9 dengan menggunakan software PatchDock. Pengamatan lebih lanjut dilakukan terhadap interaksi yang terbentuk dengan menggunakan software BIOVIA Discovery Studio 2020.  Berdasarkan hasil dari penambatan molekuler berbasis protein-peptida, molekul peptida ikan tuna sirip kuning memiliki afinitas yang baik terhadap makromolekul enzim sitokrom P450 (CYP) 2C9, yaitu dengan ACE score −2527,01 kJ/mol. Oleh karena itu, peptida bioaktif tersebut diprediksi dapat digunakan sebagai kandidat inhibitor enzim sitokrom P450 (CYP) 2C9.
Kata  kunci:  Antikoagulan; Enzim  Sitokrom  P450  (CYP)  2C9 ;  Peptida  Bioaktif  Laut;  Penambatan Molekuler Berbasis Protein-Peptida; Studi In silico .

## PENDAHULUAN
Trombosis merupakan keadaan berkurangnya aliran darah di dalam pembuluh darah yang diakibatkan oleh  proses  pembekuan  darah  (Mackman,  2012).  Proses  tersebut  melibatkan  interaksi  kompleks endotelium vaskuler, trombosit, dan faktor pembekuan  lain sehingga akhirnya bermanifestasi sebagai tromboemboli vena (VTE), meliputi trombosis vena dalam (DVT) dan emboli paru (PE) atau sindrom koroner akut (Mega dan Simon, 2015). Kematian yang disebabkan oleh trombosis hingga saat ini masih menjadi  perhatian.  Menurut  Raskob et  al. ,  (2014),  trombosis  merupakan  faktor  risiko  utama  beban penyakit  global.  Oleh  karena  itu,  terapi  antikoagulasi  menjadi  alternatif  untuk  pencegahan  dan pengobatan trombosis (Alquwaizani et al. , 2013), tromboemboli vena (Franchini dan Mannucci, 2016), stroke iskemik akut (Patterson et al. , 2006), serta fibrilasi atrium (Katritsis et al. , 2015).
Terapi trombosis secara konvensional dapat menggunakan heparin dan warfarin yang telah digunakan sebagai antikoagulan dalam pengobatan klinis (Hawkins, 2004). Heparin diberikan kepada pasien yang membutuhkan  antikoagulasi  parenteral,  sedangkan  warfarin  untuk  pasien  yang  membutuhkan antikoagulasi  oral  (Harter et  al. ,  2015).  Warfarin  adalah  antagonis  vitamin-K  (VKA)  yang  bekerja dengan  cara  menghambat  sintesis  faktor  pembekuan  darah.  Sementara  heparin  merupakan  campuran heterogen dari polimer polisakarida yang biasanya dihasilkan dari mukosa usus babi. Heparin memiliki berat  molekul  rata-rata  15  kDa,  tetapi  setelah  mengalami  proses  pembelahan  fraksi  berat  molekul heparin  menjadi  lebih  rendah  (~5  kDa)  (Hawkins,  2004).  Meskipun  kedua  antikoagulan  tersebut berkhasiat pada dosis yang tepat, namun memiliki sejumlah faktor pembatas yang dapat menimbulkan efek  samping.  Pendarahan  merupakan  masalah  serius  dari  penggunaan  warfarin  (Snipelisky  dan Kusumoto, 2013). Keterbatasan lainnya adalah adanya interaksi dengan makanan kaya vitamin K dan dapat melemahkan atau bahkan menghilangkan efek warfarin (Hawkins, 2004). Selain itu, efek samping utama heparin adalah dapat menginduksi perkembangan trombositopenia (Ahmed et al. , 2007).
Enzim  sitokrom  P450  (CYP) 2C9 merupakan komponen utama  dari  subfamili  CYP2C  yang  terdapat dalam  hati  manusia  dan  terlibat  dalam  oksidasi  beberapa  senyawa  endogen  dan  xenobiotik,  serta memainkan peranan penting dalam metabolisme warfarin. Metabolisme warfarin yang diperantarai oleh CYP2C9  dapat  menghasilkan  produk  yang  aman  atau  beracun,  hal  tersebut  terkait  dengan  mode pengikatan  antara  warfarin  dengan  CYP2C9  (Suguna et  al. ,  2014).  Dengan  demikian,  diperlukan kandidat antikoagulan alami yang memiliki aktivitas lebih baik dari warfarin dan heparin serta toksisitas
rendah.  Beberapa  penelitian  yang  telah  dilakukan  sebelumnya  membuktikan  bahwa  terdapat  peptida bioaktif  laut  yang  memiliki  aktivitas  terhadap  CYP2C9  sebagai  antikoagulan,  antara  lain  peptida bioaktif TDGSEDYGILEIDSR yang berasal dari ikan tuna sirip kuning ( Limanda aspera ) (Rajapakse et al. , 2005) dan peptida EADIDGDGQVNYEEFVAMMTSK yang berasal dari kerang biru ( Mytilus edulis ) (Jung dan Kim, 2009).
Oleh  karena  itu,  penelitian  ini  bertujuan  untuk  mempelajari,  mengidentifikasi,  dan  mengevaluasi interaksi  yang  terjadi  antara  petida  bioaktif  dengan  enzim  sitokrom  CYP2C9  menggunakan  studi penambatan  molekuler  berbasis  protein-peptida.  Penelitian  ini  menekankan  energi  interaksi  yang terbentuk dan residu asam amino yang bertanggung jawab dalam pengikatan protein-peptida. Kemudian, berdasarkan hasil penelitian diharapkan informasi terkait peptida yang mampu berinterakasi dengan baik terhadap CYP2C9 sehingga dapat dijadikan struktur peptida acuan dalam pengembangan antikoagulan alami.

## METODE PENELITIAN

## Alat dan Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah struktur kristal makromolekul enzim sitokrom P450 (CYP) 2C9 yang telah membentuk kompleks dengan warfarin. Makromolekul target tersebut diperoleh dari web Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb) dengan kode PDB 1OG5 dan memiliki resolusi 2,55 Å (Gambar 1) (Akif et al. , 2011). Molekul peptida bioaktif yang digunakan dalam penelitian ini merupakan  peptida  bioaktif  yang  memiliki  aktivitas  terhadap  CYP2C9  dan  telah  dibuktikan  pada penelitian  sebelumnya.  Sekuensing  dari  peptida  bioaktif  tersebut  antara  lain  TDGSEDYGILEIDSR yang berasal  dari  ikan  tuna  sirip  kuning  ( Limanda aspera )  dan  EADIDGDGQVNYEEFVAMMTSK yang  berasal  dari  kerang  biru  ( Mytilus  edulis )  (Wang et  al. ,  2017).  Perangkat  lunak  yang  digunakan diantaranya  terdapat  Sistem  Operasi  Windows  10  dan  Linux  Ubuntu  18.10 , MGLTools  1.5.6  yang dilengkapi  dengan  AutoDock  4.2,  PEP-FOLD  (http://bioserv.rpbs.univ-paris-diderot.fr/PEP-FOLD/), PachDock,  serta  BIOVIA  Discovery  Studio  2020.  Perangkat  keras  yang  digunakan  adalah  komputer dengan  spesifikasi processor Intel  (R)  Core  i3-6100  CPU  @  2.30GHz  (4  CPUs), memory 4096  MB RAM, Harddisk 320GB, dan VGA Intel HD Graphics 520.

## Metode

## Preparasi Makromolekul Enzim
Struktur  kristal  makromolekul  enzim  yang  telah  diunduh  dari  web  Protein  Data  Bank  selanjutnya dilakukan preparasi terlebih dahulu menggunakan software  MGLTools 1.5.6 yang dilengkapi dengan AutoDock 4.2.  Preparasi  makromolekul  enzim  ini  dilakukan dengan  menghilangkan  molekul  air  dan ligan alami, kemudian dilanjutkan dengan menambahkan atom hidrogen polar dan menghitung muatan parsial Kollman (Kurniawan et al. , 2018).

## Identifikasi Sisi Aktif Makromolekul Enzim
Makromolekul enzim yang telah dilakukan preparasi kemudian diidentifikasi dan dievaluasi bagian sisi aktif pengikatan yang berperan terhadap aktivitas antikoagulan dengan menggunakan software BIOVIA Discovery  Studio  2020  (Kemmish et  al. ,  2017).  Molekul  warfarin  yang  merupakan  ligan  alami  dari makromolekul  target  enzim  sitokrom  P450  (CYP)  2C9  digunakan  untuk  mengidentifikasi  dan mengevaluasi area sisi aktif dari makromolekul enzim tersebut.

## Pemodelan Molekul Peptida Bioaktif
Pemodelan  molekul  bioaktif  peptida  dilakukan  dengan  menggunakan  server  PEP-FOLD (http://bioserv.rpbs.univ-paris-diderot.fr/PEP-FOLD/) (Gambar 3). Server PEP-FOLD merupakan suatu software yang digunakan untuk memodelkan sekuensing peptida menjadi konformasi 3D secara de novo dengan jumlah asam amino antara 9 sampai 25 (Chavan dan Deobagkar, 2015).

## Studi Penambatan Molekuler Berbasis Protein-Peptida
Studi  penambatan  molekuler  berbasis  protein-peptida  dilakukan  dengan  menggunakan  software PatchDock untuk mengamati dan mengidentifikasi  interaksi yang terjadi antara makromolekul enzim sitokrom  P450  (CYP)  2C9  dengan  molekul  peptida  bioaktif.  Jarak  antara  bagian  permukaan makromolekul enzim dan molekul peptida bioaktif dibatasi dengan batas radius maksimum 4.0 Å. Studi penambatan molekuler ini menggunakan parameter dengan berdasar pada representasi bentuk molekul, bagian  sisi  aktif  pengikatan  makromolekul  target,  serta  pemilihan  dan  penilaian.  Studi  penambatan molekuler  ini  juga  dilakukan  secara  efisien  tanpa  adanya  ikatan  antar  molekul  yang  bersifat  rigid (Aruleba et al. , 2018).

## Analisis Hasil Studi Penambatan Molekuler Berbasis Protein-Peptida
Hasil  penambatan  molekuler  berbasis  protein-peptida  kemudian  dilakukan  identifikasi  dan  evaluasi terhadap interaksi yang terjadi antara makromolekul enzim sitokrom P450 (CYP) 2C9 dengan peptida bioaktif berdasarkan Atomic Contact Energy (ACE) score (Prabhu dan Rajeswari, 2016). Residu asam amino yang berperan dalam interaksi molekuler yang terbentuk diamati dengan menggunakan software BIOVIA Discovery Studio 2020.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Agen terapi yang memiliki aktivitas lebih baik dengan efek samping minimum saat ini menjadi suatu kebutuhan  penting  untuk  mengobati  gangguan  trombotik.  Kelemahan  utama  dari  antikoagulan konvensional adalah masih tingginya faktor risiko pendarahan. Peptida bioaktif dapat dianggap sebagai pilihan ideal untuk terapi antikoagulasi yang lebih aman karena sifatnya yang lebih spesifik terhadap target. Sejauh ini, terdapat peningkatan jumlah penelitian yang melaporkan peptida antikoagulan dari berbagai  sumber,  akan  tetapi  data  mengenai  spesifisitas  inhibisinya  masih  sedikit  dan  perlu  untuk dipelajari lebih lanjut.
Penelitian sebelumnya telah membuktikan bahwa terdapat beberapa peptida bioaktif dari organisme laut yang telah berhasil dikarakterisasi, dipreparasi, dan dipurifikasi. Proses pembuatan peptida bioaktif ini memanfaatkan  proses  sintesis  organik,  Microwave  Assisted  Extraction  (MAE),  hidrolisis  kimia,  dan hidrolisis  enzim.  Kemudian  tahapan  selanjutnya  dilakukan  proses  pemurnian  peptida  bioaktif menggunakan kromatografi eksklusi gel, kromatografi penukar ion, dan kromatografi cair kinerja tinggi. Sekuensing  peptida  bioaktif  yang  memiliki  aktivitas  terhadap  enzim  sitokrom  P450  (CYP)  2C9, diantaranya  TDGSEDYGILEIDSR  yang  berasal  dari  ikan  tuna  sirip  kuning  ( Limanda  aspera )  dan EADIDGDGQVNYEEFVAMMTSK yang berasal dari kerang biru ( Mytilus edulis ) ( Wang et al. , 2017 ) .
Struktur makromolekul  enzim sitokrom P450 (CYP) 2C9 dipilih sebagai target untuk  kedua molekul peptida  bioaktif.  Makromolekul  tersebut  terlebih  dahulu  dilakukan  preparasi  dengan  menghilangkan molekul air dan ligan alami yaitu warfarin, kemudian tahapan selanjutnya menambahkan atom hidrogen polar, dan menghitung muatan parsial Kollman dengan menggunakan software MGLTools 1.5.6 yang dilengkapi  dengan  AutoDock  4.2  (Kurniawan et  al. ,  2018).  Tahapan  preparasi  makromolekul  ini bertujuan  untuk  memastikan  agar  molekul  peptida  bioaktif  dapat  membentuk  interaksi  yang  stabil dengan  makromolekul  enzim.  Selain  itu,  warfarin  yang  telah  membentuk  kompleks  dengan  enzim sitokrom  P450  (CYP)  2C9  digunakan  sebagai  molekul  pembanding  untuk  mengamati  interaksi  dan afinitas yang paling baik.
Gambar 1. Struktur kristal makromolekul enzim sitokrom P450 (CYP) 2C9 yang telah membentuk kompleks dengan warfarin.
Makromolekul enzim sitokrom P450 (CYP) 2C9 yang telah dipreparasi kemudian dilakukan dentifikasi dan  evaluasi  bagian  sisi  aktifnya  dengan  menggunakan  software  BIOVIA  Discovery  Studio  2020 sehingga  sifat  dan  karakteristik  dari  area  pengikatan  pada  enzim  sitokrom  P450  (CYP)  2C9  dapat diketahui secara detail. Seperti yang ditunjukkan pada  Gambar 2, interaksi yang terjadi antara  enzim sitokrom P450 (CYP) 2C9 dengan warfarin meliputi 2 ikatan hidrogen (dengan Ile99 dan Phe100) dan 11  interaksi  hidrofobik  (dengan  Phe100,  Ala103,  Phe114,  Leu366,  dan  Pro367).  Berdasarkan  hasil pengamatan  tersebut  maka  dapat  diprediksi  bahwa  residu  asam  amino  tersebut  berperan  sebagai komponen penyusun dari sisi aktif pengikatan makromolekul enzim sitokrom P450 (CYP) 2C9.
Gambar 2. Bagian sisi aktif pengikatan makromolekul enzim sitokrom P450 (CYP) 2C9.
Pemodelan sekuensing peptida bioaktif menjadi struktur tiga dimensi dilakukan dengan menggunakan server PEP-FOLD. Konformasi hasil pemodelan molekul peptida bioaktif  terbaik dipilih berdasarkan energi sOPEP (Optimized Potential for Efficient Structure Prediction)  (Thevenet et al. , 2012;Shen et al. ,  2014).  Energi  sOPEP  ini  sudah  terintegrasi  dalam  server  PEP-FOLD  digunakan  untuk menggambarkan  konformasi  struktur  peptida  bioaktif  yang  dimodelkan  sehingga  mendekati  keadaan aslinya dan diharapkan mampu menghasilkan suatu interaksi yang stabil dengan makromolekul enzim target.  Berdasarkan  hasil  pemodelan  molekul  peptida  bioaktif  yang  terdapat  pada  Gambar  3  dapat diprediksi bahwa peptida tersebut akan mampu berinteraksi dengan baik pada area sisi aktif pengikatan enzim sitokrom P450 (CYP) 2C9.
TDGSEDYGILEIDSR EADIDGDGQVNYEEFVAMMTSK Ikan tuna sirip kuning (Limanda aspera) Kerang biru (Mytilus edulis) Energi sOPEP = −18,34 Energi sOPEP = −30,91
Gambar 3. Hasil pemodelan tiga dimensi sekuensing molekul peptida bioaktif yang berasal dari organisme laut.
Studi  penambatan  molekuler  berbasis  protein-peptida  dilakukan  dengan  menggunakan  software PatchDock  untuk  mengamati  afinitas  paling  baik  diantara  kedua  molekul  peptida  bioaktif,  serta mengidentifikasi dan mengevaluasi interaksi yang terlibat terhadap makromolekul enzim sitokrom P450 (CYP) 2C9. Model pengikatan protein-peptida dengan konformasi terbaik hasil penambatan molekuler dipilih  berdasarkan  PatchDock score ,  selanjutnya  molekul  peptida  bioaktif  tersebut  dibandingkan berdasarkan Atomic Contact Energy (ACE) score (Prabhu dan Rajeswari, 2016) . Berdasarkan data hasil penambatan  molekuler  yang  terdapat  pada  Tabel  1  menunjukkan  bahwa  molekul  peptida  bioaktif TDGSEDYGILEIDSR  yang  berasal  dari  ikan  tuna  sirip  kuning  ( Limanda  aspera )  memiliki  afinitas yang lebih baik apabila dibandingkan dengan  EADIDGDGQVNYEEFVAMMTSK yang berasal dari kerang  biru  ( Mytilus  edulis )  dan  warfarin,  yaitu  dengan  ACE score masing-masing  adalah  −2527,01 kJ/mol,  464,63  kJ/mol,  dan  −1070,31  kJ/mol.  Hal  tersebut  dapat  diprediksi  bahwa  lokasi  tempat pengikatan  peptida  ikan  tuna  sirip  kuning  tidak  jauh  berbeda  dengan  warfarin  (Veeraragavan et  al. , 2017).
Tabel 1. Energi bebas pengikatan hasil studi penambatan molekuler berbasis protein-peptida.
Molekul Pembanding Organisme Laut Sekuensing Molekul Peptida Bioaktif PatchDock score ACE score (kJ/mol) Warfarin 5014 −1070,31 Ikan tuna sirip kuning ( Limanda aspera ) TDGSEDYGILEIDSR 7946 −2527,01 Kerang biru ( Mytilus edulis ) EADIDGDGQVNYEEFVAMMTSK 8806 464,63
Selanjutnya, dilakukan identifikasi dan evalusi lebih lanjut terhadap visualisasi dari kompleks molekul peptida bioaktif dan makromolekul enzim sitokrom P450 (CYP) 2C9.  Sebagaimana yang ditunjukkan pada Gambar 4, dapat diamati bahwa peptida TDGSEDYGILEIDSR yang berasal dari ikan tuna sirip kuning  ( Limanda aspera )  memiliki  kemiripan  posisi  pengikatan  dengan warfarin,  sedangkan  peptida EADIDGDGQVNYEEFVAMMTSK yang berasal dari kerang biru ( Mytilus edulis ) berada jauh di luar area  sisi  aktif  pengikatan  makromolekul  enzim.  Kemudian  apabila  dieksplorasi  berdasarkan  interaksi yang terbentuk, peptida ikan tuna sirip kuning memiliki ikatan yang lebih banyak dibandingkan peptida kerang biru. Interaksi yang terbentuk dari kompleks peptida ikan tuna sirip kuning dan enzim sitokrom P450  (CYP)  2C9  terdiri  dari  22  interaksi  yang  meliputi  9  ikatan  hidrogen  (dengan  Leu208, Asn217, Glu300,  Thr305,  Cys435,  Phe428,  dan  Glu438),  10  interaksi  hidrofobik  (dengan  Phe100,  Val113, Leu233, Ala297, Leu366, Pro367, Arg433, Cys435, dan Phe476), dan 3 interaksi elektrostatik (dengan Arg97  dan  Phe114).  Sementara,  interaksi  yang  terbentuk  antara  peptida  kerang  biru  dengan  enzim sitokrom P450 (CYP) 2C9 hanya 13 interaksi antara lain terdapat 5 ikatan hidrogen (dengan Asn107, Arg108,  Gly109,  Lys  118,  dan  Thr371),  4  interaksi  hidrofobik  (dengan  Ile99,  Phe110,  Lys118,  dan Lys119), dan 4 interaksi elektrostatik (dengan Lys72, Arg108, Phe110, dan Lys383). Dengan demikian, fenomena ini membuktikan bahwa ACE score positif dari kompleks peptida bioaktif  kerang biru dan makromolekul enzim sitokrom P450 (CYP) 2C9 dapat disebabkan karena molekul peptida tersebut tidak berikatan pada area sisi aktif target (Norel et al. , 2001).
Gambar 4. Pose pengikatan pada makromolekul enzim sitokrom P450 (CYP) 2C9 dan interaksi yang terbentuk oleh peptida bioaktif ikan tuna sirip kuning ( Limanda aspera ).

## KESIMPULAN
Molekul  peptida  bioaktif  yang  berasal  dari  ikan  tuna  sirip  kuning  ( Limanda  aspera )  telah  terbukti mampu  menghambat  enzim  sitokrom  P450  (CYP)  2C9  melalui  identifikasi  dan  evaluasi  terhadap interaksi molekuler yang terjadi dengan menggunakan metode penambatan molekuler berbasis protein- peptida  secara in  silico .  Berdasarkan  hasil  penambatan  molekuler  diperoleh  bahwa  molekul  peptida tersebut memiliki afinitas yang baik terhadap sisi aktif pengikatan makromolekul enzim sitokrom P450 (CYP)  2C9  yaitu  dengan  ACE score −2527,01  kJ/mol.  Dengan  demikian,  peptida  bioaktif  tersebut memiliki  potensi  sebagai  kandidat  inhibitor  enzim  sitokrom  P450  (CYP)  2C9  untuk  pengembangan antikoagulan alami berbasis peptida.

## DAFTAR PUSTAKA
Ahmed,  I.,  Majeed,  A.,  &  Powell,  R.  (2007).  Heparin  induced  thrombocytopenia:  diagnosis  and management update. Postgrad Med J , 83, 575-582. https://doi.org/10.1136/pgmj.2007.059188
Akif,  M.,  Masuyer,  G.,  Schwager,  S.L.U.,  Bhuyan,  B.J.,  Mugesh,  G.,  Isaac,  R.E.,  Sturrock,  E.D.,  & Acharya, K.R. (2011). Structural characterization of angiotensin I-converting enzyme in complex with a selenium analogue of captopril. FEBS J , 2011, 278, 3644-3650. http://doi.org/10.1111/j.1742-4658.2011.08276.x
Alquwaizani,  M.,  Buckley,  L.,  Adams,  C.,  &  Fanikos,  J.  (2013).  Anticoagulants:  a  review  of  the pharmacology,  dosing,  and  complications. Curr  Emerg  Hosp  Med  Rep ,  1,  83-97. https://doi.org/10.1007/s40138-013-0014-6
Aruleba,  R.T.,  Adekiya, T.A., Oyinloye, B.E.,  &  Kappo,  A.P.  (2018).  Structural  studies  of  predicted ligand  binding  sites  and  molecular  docking  analysis  of Slc2a4 as  a  therapeutic  target  for  the treatment of cancer. Int J Mol Sci , 19. https://doi.org/10.3390/ijms19020386
Chavan, S.G., & Deobagkar, D.D. (2015). An in silico insight into novel therapeutic interaction of LTNF Peptide-LT10 and design of structure based peptidomimetics for putative anti-diabetic activity. PLoS One , 10, e0121860. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0121860
Franchini, M., & Mannucci, P.M. (2016). Direct oral anticoagulants and venous thromboembolism. Eur Respir Rev , 25, 295-302. https://doi.org/10.1183/16000617.0025-2016
Harter,  K.,  Levine,  M.,  &  Henderson,  S.O.  (2015).  Anticoagulation  drug  therapy:  a  review. West  J Emerg Med , 16, 11-17. https://doi.org/10.5811/westjem.2014.12.22933
Hawkins,  D.  (2004).  Limitations  of  traditional  anticoagulants. Pharmacother ,  24,  62-65. https://doi.org/10.1592/phco.24.10.62s.36120
Jung, W.K., & Kim S.K. (2009). Isolation and characterisation of an anticoagulant oligopeptide from blue mussel, Mytilus edulis . Food Chem , 117, 687-692.
https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2009.04.077
Katritsis, D.G., Gersh, B.J., & Camm, A.J. (2015). Anticoagulation in atrial fibrillation current concepts. Arrhythm Electrophysiol Rev , 4, 100–107. https://doi.org/10.15420/aer.2015.04.02.100
Kemmish,  H.,  Fasnacht,  M.,  &  Yan,  L.  (2017).  Fully  automated  antibody  structure  prediction  using
BIOVIA tools: Validation study. PLoS One , 12, e0177923.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177923
Kurniawan, F., Miura, Y., Kartasasmita, R.E., Yoshioka, N., Mutalib, A., & Tjahjono, D.H. (2018). In silico study, synthesis, and cytotoxic activities of porphyrin derivatives. Pharmaceuticals , 11, 8. https://doi.org/10.3390/ph11010008
Mackman,  N.  (2012). New  insights  into  the mechanisms  of  venous  thrombosis. J  Clin  Investig ,  122, 2331-2336. https://doi.org/10.1172/JCI60229.paralysis
Mega, J.L., & Simon, T. (2015). Novel antithrombotic agents 1 pharmacology of antithrombotic drugs: an  assessment  of  oral  antiplatelet  and  anticoagulant  treatments. Lancet ,  386,  281-291. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(15)60243-4
Norel, R., Sheinerman, F., Petrey, D., & Honig, B. (2001). Electrostatic contributions to protein–protein interactions: Fast energetic filters for docking and their physical basis. Protein Sci , 10, 2147-2161. https://doi.org/10.22159/10.1110/ps.12901
Patterson, S.L., LaMonte, M.P., Mikdashi, J.A., Haines, S.T., & Hursting, M.J. (2006). Anticoagulation strategies for treatment of ischemic stroke and antiphospholipid syndrome: case report and review of the literature. Pharmacotherapy , 26, 1518-1525. https://doi.org/10.1592/phco.26.10.1518
Prabhu,  D.S.,  &  Rajeswari,  V.D.  (2016). In  silico docking  analysis  of  bioactive  compounds  from Chinese medicine Jinqi Jiangtang Tablet (JQJTT) using Patch Dock. J Chem Pharm Res , 8, 15- 21.
Rajapakse, N., Jung, W.K., Mendis, E., Moon, S.H., & Kim, S.K. (2005). A novel anticoagulant purified from  fish  protein  hydrolysate  inhibits  factor  XIIa  and  platelet  aggregation. Life  Sci , 76, 2607-2619. https://doi.org/10.1016/j.lfs.2004.12.010
Raskob, G.E., Angchaisuksiri, P., Bianco, A.N., Buller, H., Gallus, A., Hunt, B.J., Hylek, E.M., Kakkar, A.,  Konstantinides,  S.V.,  McCumber,  M.,  Ozaki,  Y.,  Wendelboe,  A.,  &  Weitz,  J.I.  (2014). Thrombosis: a major contributor to the global disease burden. J Thromb Haemost , 12, 1580-1590. https://doi.org/10.1111/jth.12698
Shen,  Y.,  Maupetit,  J.,  Derreumaux,  P.,  &  Tuffery,  P.  (2014).  Improved  PEP-FOLD  approach  for peptide  and  miniprotein  structure  prediction. J  Chem  Theory  Comput ,  10,  4745-4758. https://doi.org/10.1021/ct500592m
Snipelisky, D., & Kusumoto, F. (2013). Current strategies to minimize the bleeding risk of warfarin. J Blood Med , 4, 89-99. https://doi.org/10.2147/JBM.S41404
Suguna, S., Kunkulol, R., Kumar, V., Ambadasu, B., & Nandal, D.H. (2014). Affinity of warfarin with cyp2c9 by molecular docking study. Int J Pharm Pharm Sci. 6, 181-182 .
Thevenet, P., Shen, Y., Maupetit, J., Guyon, F., Derreumaux, P., & Tuffery, P. (2012). PEP-FOLD: an updated de novo structure prediction server for both linear and disulfide bonded cyclic peptides. Nucleic Acids Res , 2012, 40, 288-293. https://doi.org/10.1093/nar/gks419
Veeraragavan,  V.,  Narayanaswamy,  R.,  &  Chidambaram,  R.  (2017).  Predicting  the  biodegradability nature  of  imidazole  and  its  derivatives  by  modulating  two  histidine  degradation  enzymes (urocanase  and  formiminoglutamase)  activities. Asian  J  Pharm  Clin  Res ,  10,  383-386. https://doi.org/10.22159/ajpcr.2017.v10i11.20999
Wang, X., Yu, H., Xing, R., & Li, P. (2017). Characterization, preparation, and purification of marine bioactive peptides. Biomed Res Int , 9746720. https://doi.org/10.1155/2017/9746720