Penulis Siti Sa’diah 1,2 *, Effionora Anwar 3 , Mahdi Jufri 3 , Umi Cahyaningsih 4
Afiliasi 1 Departemen  Anatomi  Fisiologi  &  Farmakologi,  Fakultas  Kedokteran  Hewan,  IPB  University,
Bogor, Jawa Barat, 16680, Indonesia.
2 Pusat Studi Biofarmaka Tropika, IPB University, Indonesia.
3 Fakultas Farmasi, Universitas Indonesia, Depok, Jawa Barat, 16424, Indonesia.
4 Departemen  Ilmu  Penyakit  Hewan  dan  Kesehatan  Masyarakat  Veteriner,  Fakultas  Kedokteran Hewan, IPB University, Bogor, Jawa Barat, 16680, Indonesia.
Kata Kunci  Anti-toksoplasma
 Gingerol
 Shogaol
 Toksoplasma gondii
 Zingiber officinale var rubrum
Keywords  Anti-toxoplasma
 Gingerol
 Shogaol
 Toksoplasma gondii
 Zingiber officinale var. rubrum
Diterima 2 Agustus 2019
Direvisi 28 Oktober 2019 Disetujui 4 November 2019

## *Penulis Koresponding
Siti Sa’diah email: sitisa@apps.ipb.ac.id

## ABSTRAK
Metode  ekstraksi  dan  jenis  pelarut  yang  digunakan  akan  berdampak  pada  proses penarikan  komponen  aktif  sehingga  akan  berpengaruh  juga  pada  aktivitasnya.  Jahe merah ( Zingiber officinale var. Rubrum) merupakan salah satu bahan rempah yang juga berpotensi sebagai tanaman obat. Salah satu khasiat ekstrak jahe merah adalah sebagai anti  toksoplasma.  Pada  penelitian  ini  telah  dilakukan  pembuatan  ekstrak  jahe  merah dengan  dua  jenis  metode  yaitu  maserasi  dan  sokhletasi  masing-masing  menggunakan tiga jenis pelarut (etanol 30%, etanol 70% dan etanol 96%) sehingga diperoleh enam jenis ekstrak. Kemudian masing-masing ekstrak ditentukan kadar senyawa pencirinya meliputi 6-gingerol, 8-gingerol, 10-gingerol dan 6-shogaol dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).  Selanjutnya  ekstrak  diuji  aktivitas  antitoksoplasma  secara in  vitro terhadap parasit Toksoplasma  gondii pada  fase  takhizoit  yang  ditumbuhkan  pada  sel  vero. Penentuan  aktivitas  antitoksoplasma  juga  dilakukan  pada  senyawa  murni  6,  8,  10- gingerol dan 6-shogaol serta kontrol positif antibiotik spiramisin. Hasilnya menunjukkan bahwa ekstrak etanol 96% dengan metode maserasi adalah yang paling baik aktivitasnya dan 6-gingerol adalah senyawa penciri yang paling berperan sebagai anti-toksoplasma.

## ABSTRACT
The  extraction  method  and  the  type  of  solvent  used  will  affect  the  process  of  the active  component  transfer  so  that  it  will  also  affect  its  activity.  Red  ginger  (Zingiber officinale var. Rubrum) is one of the ingredients of spices which also has the potential as a medicinal  plant.  One  of  the  benefits  of  red  ginger  extract  is  as  anti-toxoplasma.  In  this study, red ginger extract was made with two types of methods, namely maceration and soxhletation,  each  using  three  types  of  solvents  (30%  ethanol,  70%  ethanol  and  96% ethanol) to obtain six types of extracts. Then each extract was determined of the active compound including 6-gingerol, 8-gingerol, 10-gingerol and 6-shogaol by HPLC method. The  extract  was  then  tested  for  anti-toxoplasma  activity  in  vitro  against  Toxoplasma gondii  parasites  in  the  takhizoite  phase  grown  on  vero  cells.  Determination  of  anti- toxoplasma  activity  was  also  carried  out  on  pure  compounds  6,  8,  10-gingerol  and  6- shogaol as  well as  positive control of Spiramycin antibiotics. The results show that  96% ethanol  extract  by  maceration  method  is  the  best  activity  and  6-gingerol  is  a characteristic compound which has the most role as anti-toxoplasma.
Perbandingan Ekstrak Jahe Merah ( Zingiber Officinale Roscoe. Var. Rubrum), Gingerol dan Shogaol sebagai Anti-Toksoplasma terhadap Parasit Toxoplasma Gondii Secara In-Vitro
Comparation of Red Ginger Extracts, Gingerols and Shogaol as Anti-Toksoplasma Activity againts Toxoplasma Gondii In Vitro
Sa’diah et al .

## PENDAHULUAN
Rimpang  jahe  ( Zingiber  officinale Roscoe)  yang dikenal di Indonesia ada 3 jenis, yaitu jahe gajah/ white ginger ( Z.  officinale Roscoe)/  yang  umum  digunakan sebagai  bahan  rempah  untuk  memasak,  jahe  emprit/ small white ginger ( Z. officinale Roscoe varian Amarum ) dan jahe merah/ red ginger ( Z. officinale Roscoe varian Rubrum ) (Adnyana dan Suciyati 2017). Jahe emprit dan jahe merah umum digunakan sebagai bahan baku obat tradisional karena memiliki rasa yang lebih pedas. Rasa pedas  ini  berkaitan  dengan  kadar  gingerol  dan shogaolnya  yang  tinggi  (Heryani  dan  Winarti 2001). Gingerol  dan  shogaol  merupakan  komponen  non- minyak  atsiri  dari  rimpang  jahe  yang  banyak  berperan dalam  memberikan  efek  farmakologis  diantaranya antiinflamasi  dan  analgesik  (Kim et  al .  2005),  anti apoptosis  yang  kuat  (Kim et  al, 2007),  dan  antifungal (Ficker et al . 2003).
Penelitian  yang  dilakukan  Choi et  al (2013) membuktikan  bahwa  ekstrak  metanol Zingiber officinale dan  fraksinya  efektif  terhadap Toxoplasma gondii secara in  vitro .  Pelarut  metanol  merupakan pelarut  universal  yang  umumnya  digunakan  sebagai pelarut  pengekstraksi  senyawa  bahan  alam  karena memiliki titik didih rendah sehingga lebih mudah dalam proses  penguapan  pelarut.  Namun  demikian,  pelarut metanol  bersifat  toksik  dibandingkan  etanol  (Pohanka 2016),  sehingga  pengkajian  kembali  potensi  ekstrak jahe  sebagai  anti-toksoplasma  dengan  etanol  sebagai pelarut  pengekstraksi  akan  menjadi  sebuah  kebaruan. Untuk  mendapatkan  ekstrak  etanol  dengan  potensi yang  mendekati  ekstrak  metanol  perlu  dilakukan optimasi  dengan    metode  ekstraksi  dan  konsentrasi etanol yang berbeda.

## METODE Bahan
Rimpang  jahe  merah  segar  asal  Kabupaten  Bogor, metanol  (PT.  Bratachem,  Indonesia),  etanol  96%  (PT. Bratachem,  Indonesia),  standar  6-gingerol  (Sigma,
Jerman),  standar  8-gingerol  (Sigma-Jerman),  10- gingerol  (Sigma-Jerman),  6-shogaol  (Sigma-Jerman), akuades, akuabides, asetonitril (Sigma-Jerman), ekstrak jahe merah komersial (PT. Javaplant, Indonesia), kertas saring  Whatman  0,45  µm , fase  diam  C18 , asetonitril (Sigma-Jerman), Buffered  Peptone  Water /BPW  (Gibco, USA), Nutrient  Agar (Gibco,  USA), Potatoes  Dectrose Agar /PDA (Gibco, USA), agar Eosin Methylen Blue /EMB (Gibco,  USA),  isolat  takhizoit  (BBBALITVET,  Indonesia), Dulbecco’s phosphate buffered saline /PBS (Gibco, USA), Dulbecco’s  Modifield  Eagle  Medium /DMEM  (Gibco, USA), Fetal  Bovine  Serum /FBS  (Gibco,  USA),  Penisillin (Sigma,  Jerman),  Steptomycin  (Sigma,  Jerman), Spiramycin  (Kimia  Farma,  Indonesia),  trypan  blue, glutamin, (3-(4,5-dimethylthiazol-2-il)-5(3-carboxy methoxy  phenyl)-2-(4-sulfofenil)-2  tetrazolium  (Sigma- Jerman).

## Preparasi Ekstrak Jahe Merah
Rimpang  jahe  merah  (asal  Kabupaten  Bogor) dikupas  dan  dicuci  bersih  dengan  air  mengalir selanjutnya diiris melintang dengan ketebalan 0,3 – 0,5 cm lalu dikeringkan dengan oven pengering suhu 50°C hingga  kering.  Jahe  kering  kemudian  digiling  hingga menjadi  serbuk  halus.  Serbuk  jahe  merah  masing- masing  diekstraksi  dengan  pelarut  metanol  (3)  dan pelarut  etanol dengan metode maserasi dan sokletasi. Preparasi  ekstraksi  jahe  seperti  yang  tampak  pada Tabel 1.

## Standardisasi dan Karakterisasi Simplisia dan Ekstrak
Standardisasi  dilakukan  terhadap  serbuk  simplisia rimpang  jahe  merah  meliputi  kadar  air,  kadar  abu, kadar  abu  tak  larut  asam,  cemaran  logam  berat, cemaran  mikroorganisme  dan  uji  organoleptik. Sedangkan pada ekstrak dilakukan penentuan kadar air dan  kadar  senyawa  aktif  6-gingerol,  8-gingerol,  10- gingerol  dan  6-shogaol.  Parameter  yang  diamati mengacu pada Farmakope Herbal Indonesia (Kemenkes RI 2008).

## Tabel 1. Preparasi Ekstraks Jahe Merah
Kode Ekstrak Pelarut Perbandingan Jahe:Pelarut Metoda Ekstraksi JM Metanol 1:5 Maserasi 24 jam JE30 Etanol 30% 1:5 Maserasi 48 jam, Sokletasi 8 jam JE70 Etanol 70% 1:5 Maserasi 48 jam, Sokletasi 8 jam JE96 Etanol 96% 1:5 Maserasi 48 jam, Sokletasi 8 jam
Keterangan :
JM= Ekstrak jahe merah dengan pelarut metanol, JE30=ekstrak jahe merah dengan pelarut etanol 30%, JE70= Ekstrak jahe merah dengan pelarut etanol 70%, JE96= Ekstrak Jahe merah dengan pelarut etanol 96%
Perbandingan Ekstrak Jahe Merah ( Zingiber Officinale Roscoe . Var. Rubrum), Gingerol dan Shogaol sebagai Anti-Toksoplasma terhadap Parasit Toxoplasma Gondii Secara In-Vitro
Penentuan  Kadar  6-.8-,10-gingerol  dan  6-shogaol Ekstrak Jahe Merah ( Lee et al . 2007; Schwertner dan Deborah 2007)
Penentuan  Larutan  Standar  6-.8-,10-gingerol  dan  6- shogaol
Larutan  standar  6-gingerol  1000  ppm,  8-gingerol 500  ppm,  6-shogaol  1000  ppm,  dan  10–gingerol  1000 ppm  disiapkan  masing-masing  sebanyak  10  mL  dalam metanol. Larutan kemudian dipipet sebanyak 5 mL; dan diencerkan  pada  labu  100,  ditera  dengan  metanol. Campuran  kemudian  disonikasi  selama  30  menit, kemudian  didiamkan  selama  15  menit,  dan  disonikasi kembali  selama  30  menit  kemudian  disaring menggunakan kertas Whatman 0,45um, lalu diinjeksikan pada alat KCKT (UFLC-Shimadzu, Japan).

## Preparasi Larutan Sampel
Ekstrak  jahe  merah  sebanyak  ±100  mg  dimasukkan ke  dalam  labu  Erlenmeyer  100  mL,  ditambahkan metanol  untuk  KCKT  sebanyak  80  mL,  kemudian campuran  disonikasi  sampai  larut.  Larutan  tersebut disaring  dengan  kertas  saring  Whatman  no.  41  ke dalam labu takar 100 mL, kemudian diimpitkan sampai tanda tera dengan metanol untuk KCKT. Larutan dalam labu takar 100 mL disaring  menggunakan kertas saring Whatman 0,45 µm. Larutan sampel dan standar 6-, 8-, 10-gingerol,  serta  6-  shogaol  dianalisis  dengan  KCKT Shimadzu  LC  20A  (UFLC-Shimadzu,  Japan).  Fase  diam digunakan  C18,  dan  fase  gerak  yang  digunakan  ialah gradien  asetonitril  dengan  akuabides  (Tabel  2).  Laju alirnya  1  mL/menit.  Panjang  gelombang  yang digunakan untuk deteksi ialah 280 nm.
Uji In vitro Ekstrak Jahe Merah (Kavitha et al. 2012) Pengujian in  vitro dilakukan  pada  13  sampel  yang terdiri  dari  ekstrak  metanol  jahe  merah  (JM),  6  jenis ekstrak  jahe  merah  hasil  maserasi  dan  sokletasi,  4 senyawa murni yaitu 6-gingerol, 8-gingerol, 10-gingerol dan  6-shogaol,  ekstrak  komersial  (PT.  Javaplant),  dan antibiotik  spiramisin.  Semua  perlakukan  dilakukan dengan 3 kali ulangan. Tahap prosedurnya meliputi: Kultur  Takhizoit :  Takhizoit  dari  galur  RH  virulen T. gondii (dalam PBS/ phosphate buffered saline ), pH 7,2, diberikan  secara  intraperitoneal  pada  mencit  putih. Kemudian dalam interval 3-4 hari asites cairan diambil dari  peritoneal  mencit.  Asites  cairan  yang  diperoleh dari mencit yang terinfeksi disentrifugasi pada 200 rpm selama  10  menit  pada  suhu  kamar  untuk  mengangkat sel inang dan puing-puing. Supernatan, yang berisi situs parasit, dikumpulkan dan disentrifugasi pada 1000 rpm selama 10 menit. Pelet  dicuci dengan PBS, pH 7,2 dan kemudian  di  media  DMEM  tanpa  serum  janin  sapi (FBS/ Fetal  Bovine  Serum ).  Kelangsungan  hidup  parasit dievaluasi  menggunakan trypan  blue dalam  waktu tidak lebih dari 30-40 menit sejak cairan asites diambil dari  peritoneum.  Selanjutnya  pengujian in  vitro dilakukan  menggunakan  sel  Vero.  Sel  Vero  dikultur dalam  medium  DMEM  ditambah  dengan  10%  FBS, glutamin  (2  RAM),  penisilin  (100  unit/ml)  dan streptomisin  (100  mg/ml).  Sel-sel  dikultur  pada inkubator dengan kelembaban CO 2 5% dan temperatur 37°C.
Uji Aktivitas Anti-Toksoplasma In Vitro (Kavitha et al. 2012)
Tabel 2. Komposisi Fase Gerak untuk Penentuan 6-, 8-, 10-gingerol, dan 6-shogaol
Waktu(menit) Akuabides(%) Asetonitril(%) 0 60 40 10,0 60 40 40,0 10 90 40,5 0 100 45,0 0 100 45,5 60 40 50,0 60 40
Sel Vero dipanen selama pertumbuhan eksponensial (hari  2)  dalam  pelat  sumur  96  (ca.  6  ×  10 4 sel/ml). Kemudian, 3 × 10 5 parasit/ml ditambahkan ke masing- masing  pelat  sumur  (parasit  :  rasio  sel  =  5:  1,  akhir volume  200  µl).  Enam  jam  setelah  inokulasi,  sel-sel yang  terinfeksi  dicuci  dua  kali  dengan  medium  DMEM tanpa  FBS  untuk  menghilangkan  parasit  tidak  baik. Setelah  12  jam  inkubasi,  medium  DMEM  dengan  FBS 2%  ditambahkan  ke  masing-masing  sumur  plat,  dan ekstrak/spiramisin kemudian ditambahkan pada konsentrasi  yang  sama  (50  µg/ml).  Setelah  48  jam pengobatan, viabilitas T. gondii ditentukan menggunakan  MTT  (3-(4,5-dimethylthiazol-2-il)-5(3- carboxy methoxy phenyl)-2-(4-sulfofenil)-2 tetrazolium) assay.  Sebanyak  10  µl  MTT  konsentrasi  5  ppm ditambahkan pada masing-masing sumur lalu campuran  diinkubasi  selama  4  jam.    Medium  DMEM kemudian  dibuang  dan  diganti  masing-masing  dengan 100  µl  etanol  untuk  melisiskan  sel.  Selanjutnya  plat sumur  96  dibaca    menggunakan Elisa  reader (Bio-Rad, California, USA) pada panjang gelombang 490 nm.
Sel  vero  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini merupakan  sel  line  yang  berasal  dari  ginjal  monyet hijau  afrika  ( African  green  monkey )  ATCC ® 1587 TM koleksi  Pusat  Studi  Satwa  Primata  (PSSP)  LPPM  IPB. Prosedur  pemeliharaan  sel  vero  mengacu  pada  teknik yang dilakukan di PSSP. Adapun isolat takhizoit sebagai agen  toksoplasma  merupakan  koleksi  yang  dimiliki
laboratorium  parasitologi  Balai  Besar  Penelitian Veteriner (BBalitvet).
Morfologi  sel  vero  tunggal  berbentuk  bulat  dan dalam  perkembangannya  sel  vero  yang  dinkubasi dalam inkubator dengan kadar CO 2 5% akan membelah diri  dan  menempel  di  dasar flash hingga  membentuk jaringan yang rapat (konfluen 100%) seperti tampak di Gambar  3.  Ketika  memulai  pemeliharaan  sel  vero  dari kondisi  yang  dibekukan  dengan  nitrogen  cair,  untuk mencapai  konfluen  diperlukan  waktu  sekitar  5  hari. Tapi  pada  proses  selanjutnya  waktu  yang  dibutuhkan untuk  pertumbuhan  sel  vero  semakin  cepat  sehingga setiap  2  hari  sekali  perlu  dilakukan  subkultur (memisahkan  sel  yang  sudah  konfluen  menjadi  sel tunggal  kemudian  sebagian  besar  sel  dibuang,  dan sebagian kecil ditanam ulang dalam media yang baru). Waktu  yang  diperlukan  untuk  mencapai  kondisi  yang rapat  (konfluen  100%)  sangat  dipengaruhi  konsentrasi jumlah  sel  dan  volume  media  tanam.  Semakin  sedikit jumlah  sel  yang  ditanam  dengan  volume  media  yang besar maka akan semakin lama waktu yang diperlukan untuk  mencapai  konfluen  tersebut.  Dalam    sumur plat96, dengan 5000 sel per 200μl media, waktu untuk mencapai 100% konfluen adalah lebih dari 48 jam.

## Pengolahan Data
Analisis  statistik  dilakukan  untuk  mengetahui  ada tidaknya  perbedaan  perlakuan  terhadap  viabilitas  sel

## Tabel 3. Karakteristik Simplisia Jahe Merah
No  Parameter Hasil Rujukan (FHI) Satuan  Metode 1 Rendemen 12,5 % Gravimetri 2 Kadar air 4,40 <10 % Gravimetri 3 Kadar abu 4,37 <5 % Gravimetri 4 Kadar abu tak larut asam 1,65 < 2 % Gravimetri 5 Cemaran Logam berat As Tidak terdeteksi Negatif AAS Pb Tidak terdeteksi < 0,001 ppm Cd 0,007 <  0,03 ppm 6 Cemaran Mikroba Angka Lempeng total 3,7 x 10 2 < 10 7 kol/g Kultur Patogen/ E.coli Negatif Negatif Kapang 3,4 x 10 2 < 10 4 kol/g 7 Uji Organoleptik Bau Khas khas Aromatik Pancaindera Rasa Agak pedas Agak pedas Warna Coklat kehijauan Coklat muda-hingga coklat tua Penampakan Serbuk -
Perbandingan Ekstrak Jahe Merah ( Zingiber Officinale Roscoe . Var. Rubrum), Gingerol dan Shogaol sebagai Anti-Toksoplasma terhadap Parasit Toxoplasma Gondii Secara In-Vitro
dilakukan  dengan one  way  Anova dan  dilanjutkan dengan uji Duncan.

## HASIL & PEMBAHASAN

## Karakteristik Simplisia dan Ekstrak Jahe Merah
Karakteristik  simplisia  jahe  merah  yang  dihasilkan seperti  terangkum  pada  Tabel  3  secara  umum  telah memenuhi  persyaratan  Farmakope  Herbal  Indonesia (Kemenkes  RI  2008)  dan  SNI  rimpang  Jahe. Karakterisasi  simplsia  perlu  dilakukan  sebagai  bagian dari  proses  standardisasi  dan  keajegan  khasiat  dari bahan alam.
Karakteristik  ekstrak  jahe  merah  yang  dihasilkan dari  perbedaan  konsentrasi  pelarut  dan  metoda ekstraksi  secara  organoleptik  karakteristiknya  tidak jauh  berbeda  seperti  yang  ditunjukkan  pada  Tabel  4. Degradasi  warna  ekstrak  dari  coklat  muda  hingga menjadi  coklat  tua  tampak  dengan  semakin meningkatnya  konsentrasi  pelarut  etanol.  Variasi  nilai rendemen  selain  adanya  perbedaan  komponen metabolit  yang  dapat  tertarik  oleh  pelarut  juga dipengaruhi oleh proses penyaringan hasil ektraksi dan juga penguapan pelarut pengektraksi. Bila diamati hasil kadar  air  yang  relatif  tidak  berbeda  artinya  proses penguapan pelarut telah sempurna. Jika mengacu pada Farmakope  Herbal  Indonesia  (Kemenkes  RI  2008), bahwa rendemen ekstrak jahe merah  tidak kurang dari 6,6%,  kadar  air  tidak  lebih  dari  11%,  dan  kadar  abu tidak  lebih dari 1,0%,  maka  hasil yang diperoleh pada penelitian  ini  dengan  perbedaan  jenis  pelarut  dan metode  ekstraksi  masih  menghasilkan  ekstrak  jahe merah  yang  memenuhi  kriteria  Farmakope  Herbal Indonesia.    Rendemen  yang  tinggi  umumnya  akan berkorelasi  dengan tingginya  komponen  senyawa  aktif yang  dapat  ditarik  oleh  pelarut  tersebut.  Kadar
senyawa  aktif  akan  sangat  dipengaruhi  oleh  umur tanaman  ketika  dipanen  dan  lokasi  tempat  tumbuh tanaman  tersebut.  Dalam  hal  ini  jahe  merah  yang diperoleh  dari  petani  di  Kabupaten  Bogor  memiliki kadar  senyawa  aktif  yang  cukup  tinggi.    Jahe  merah termasuk  jenis  tanaman  yang  sudah  budidayakan sehingga peluang untuk mendapatkan jahe merah yang memenuhi  kriteria  yang  diharapkan  cukup  mudah diperoleh.  Waktu  panen  Jahe  merah  rata-rata  pada usia tanam 7 bulan (Litbang Pertanian 2000). Kadar air akan berpengaruh pada umur simpan ekstrak. Semakin rendah  kadar  airnya,  akan  semakin  kecil  kerusakan ekstrak  oleh  cemaran  mikroorganisme.  Adapun  kadar abu  menunjukkan  kandungan  mineral  pada  ekstrak. Jika kadar abu sangat tinggi, kemungkinan ada cemaran logam  dari  unsur  tanah  yang  mungkin  terbawa  pada saat  pengolahan  simplisia.  Unsur  mineral  yang terkandung  pada  tanaman  jahe  yang  utama  adalah Kalium, Natrium, Mangan, dan Ferrum (Fe) (Ravindran 2005).
Kadar  6-gingerol,  8-gingerol,  6-gingerol  dan  10- gingerol Ekstrak Jahe Merah
Penentuan  kadar  metabolit  sekunder  ekstrak  jahe dilakukan  terhadap  4  jenis  metabolit  yang  diduga berperan  dalam  sejumlah  aktivitas  farmakologi. Senyawa  6-gingerol,  8-gingerol,  10-gingerol,  dan  6- shogaol  dianalisis  menggunakan  Kromatografi  Cair Kinerja  Tinggi  (KCKT)  karena  merupakan  senyawa- senyawa  yang  tidak  mudah  menguap.  Pemisahan terjadi disebabkan oleh perbedaan interaksi komponen dengan fase gerak dan fase diam, yang ditentukan oleh tingkat  kepolaran  senyawa  (Harvey  2000).    Pada penentuan  kadar  gingerol  ini  digunakan  kolom  C18 sebagai  fase  diam  dan  untuk  fase  geraknya
Tabel 4. Karakteristik Ekstrak Jahe Merah dengan Variasi Pelarut dan Metoda Ekstraksi
Ekstrak Rendemen (%) Kadar Air (%) Kadar Abu (%) JM 8,99 3,01 0,67 JE30M 11,47 3,90 0,52 JE70M 9,42 3,39 0,62 JE96M 8,89 3,36 0,69 JE30S 9,26 2,81 0,45 JE70S 10,21 2,88 0,65 JE96S 7,01 3,37 0,63
Keterangan:
JM=pelarut  metanol  (maserasi  24  jam);  JE30M=pelarut  etanol  30%  (maserasi  48  jam);  JE70M=pelarut  etanol  70%  (maserasi 48jam);  JE96M=pelarut  etanol  96%  (maserasi  48jam);  JE30S=pelarut  etanol  30%  (Sokletasi  8  jam);  JE70S=pelarut  etanol  70% (Sokletasi 8jam); JE96S=pelarut etanol 96% (Sokletasi 8jam).
Sa’diah et al .
menggunakan kombinasi asetonitril:air. Analisis kualitatif  dilakukan  berdasarkan  waktu  retensi, sedangkan  analisis  kuantitatif  dilakukan  berdasarkan luas  puncak  yang  dibandingkan  dengan  standar. Perbedaan  panjang  gelombang  pengukuran  tidak mengubah urutan waktu retensi senyawa gingerol dan shogaol  namun  berpengaruh  pada  besarnya  puncak yang  dihasilkan  (He et  al. 1998; Lee et  al .  2007). Pada panjang  gelombang  280  nm  puncak  yang  dihasilkan dapat  lebih  tinggi  dibandingkan  pada  panjang gelombang  230nm  (He et  al. 1998).  Urutan  senyawa gingerol  berdasarkan  waktu  retensi  jika  digunakan kolom  C-18  dan  eluen  asetonitril:  akubides  (60:40) berurut-turut  adalah  6-gingerol,  8-gingerol,  6-shogaol dan  10-gingerol  (6;12).  Namun  urutan  waktu  retensi berbeda dihasilkan jika digunakan eluen eluen metanol: akudes  (65:35)  menjadi  berturut-turut  6-gingerol,  6- shogaol,  8-gingerol  dan  10-gingerol  (Schwertner  dan Deborah 2007). Dengan  demikian  perbedaan  jenis kolom  dan  jenis  eluen  serta  gradien  eluen  dapat menyebabkan  terjadinya  perbedaan  waktu  rentensi senyawa  aktif  sedangkan  panjang  gelombang  yang optimal berdampak pada puncak yang lebih tinggi dan luas  area  puncak  yang  lebih  lebar.  Pada  penelitian  ini, prosedur yang digunakan mengacu pada metode Lee et al. (2007) dengan bentuk kromatogram yang dihasilkan seperti  tampak  pada  Gambar  1a,  namun  dilakukan pada  panjang  gelombang  280  nm  seperti  yang dilakukan oleh He et al. (1998) dan Schwertner & Rios (2007). Kromatogram standar keempat metabolit yang dihasilkan  menunjukkan  waktu  retensi  6-,  8-  dan  10- gingerol  berturut-turut  adalah  pada  menit  ke  12,8; 24,2, dan 31,3;sedangkan 6-shogaol pada waktu retensi 25,9 menit (Gambar 1b), Luas puncak standar 6-, 8- dan 10-gingerol berturut-turut adalah 473702, 253835 dan
438796  sedangkan  6-shogaol  luas  areanya  sebesar 542585.  Luas  puncak  standar  ini  menjadi  salah  satu faktor  yang  dibutuhkan  dalam  perhitungan  kadar metabolit sampel ekstrak jahe merah.
Kadar  senyawa  aktif    ekstrak  jahe  merah  dengan pelarut  pengekstraksi  yang  berbeda  menunjukkan bahwa  kadar  6-gingerol  merupakan  senyawa  yang paling  dominan  dibanding  3  komponen  aktif  lainnya baik  dengan  metode  maserasi  maupun  sokletasi (Gambar  2).    Jika  dibandingkan  pengaruh  konsentrasi pelarut  etanol  terhadap  kadar  senyawa  aktifnya  maka pada  metode  maserasi  48  jam,  pelarut  etanol  96% mampu  menarik  keempat  komponen  senyawa  aktif lebih  tinggi  dibandingkan  pelarut  etanol  70%  dan etanol 30%. Semakin rendah konsentrasi pelarut, kadar keempat senyawa aktifnya juga semakin kecil. Berbeda dengan  metoda  sokletasi  (pemanasan  8  jam)  pelarut etanol 98% dan etanol 70% mampu menarik 6-gingerol dengan  kadar  yang  hampir  sama  tingginya  yaitu sebesar  11,44  ppm  dan  11,40  ppm,  demikian  juga dengan  kadar  8-gingerol  dan  6-shogaol  juga  hampir sama,  namun  untuk  kadar  10-gingerol  sama  halnya dengan  metoda  maserasi,  pelarut  etanol  96%  dapat menarik  jauh  lebih  tinggi  dibandingkan  dua  pelarut lainnya.
Apabila  membandingkan  metoda  ekstraksi  dengan jenis pelarut yang sama, maka metoda sokletasi 8 jam mampu  menarik  komponen  aktif  lebih  tinggi dibandingkan  metode  maserasi  48  jam  pada  pelarut etanol 30% dan etanol 70%. Namunpelarut etanol 96% dengan  metode  maserasi  48  jam  masih  lebih  tinggi kandungan  aktifnya  dibandingkan  dengan  metoda sokletasi  8  jam.  Hal  ini  menunjukkan  bahwa  tingkat kepolaraan  etanol  30%  dan  etanol  70%  lebih  rendah dibandingkan  polaritas  senyawa  gingerol  sehingga
(a)
(b)
Gambar 1.
Kromatogram  standar  campuran  6-,8-,10-gingerol  dan  6-shogaol;  (a)  Rujukan  urutan  waktu retensi  penelitian  Lee et  al .  (2007),  (b)  hasil  pengukuran  dengan  kolom  C-18  dan  eluen asetonitril:akuabidest (60:40) pada λ 280 nm.
Perbandingan Ekstrak Jahe Merah ( Zingiber Officinale Roscoe . Var. Rubrum), Gingerol dan Shogaol sebagai Anti-Toksoplasma terhadap Parasit Toxoplasma Gondii Secara In-Vitro
perlu  bantuan  pemanasan  untuk  dapat  meningkatkan ekstraksinya.  Penggunaan  pelarut  etanol  96%  faktor pemanasan  tidak  terlalu  berpengaruh  pada  proses ekstraksi  bahkan  dengan  maserasi  48  jam  senyawa aktif  dapat  tertarik  lebih  tinggi  dibanding  sokletasi  8 jam.  Struktur  kimia  gingerol  dan  shogaol  (Gambar  3) memiliki  1  buah  cincin  benzena  dengan  lebih  dari  6 buah  rantai  karbon  sehingga  tidak  terlalu  polar (Bhattarai dan Duke 2001).
Gingerol    dapat  terkonversi  menjadi  shogaol  atau zingeron  selama  proses  pemanasan  (Wohlmuth et  al. 2005).  Kecepatan  degradasi  dari  6-gingerol  menjadi 6- shogaol tergantung pada pH, stabilitas terbaik pada pH 4,  sedangkan  pada  suhu  100°C  dan  pH  1  justru perubahan degradasi relatif cukup cepat (Bhattarai dan Duke  2001).  Jika  mengacu  pada  pendapat  ini  kadar shogaol pada proses sokhletasi seharusnya lebih tinggi dibandingkan  pada  proses  maserasi.  Hasil  ini  tampak pada  pelarut  etanol  30%  dan  etanol  70%,  namun tingginya  kadar  shogaol  ini  tidak  berkorelasi  dengan lebih  rendahnya  kadar  6-gingerol  pada  proses
maserasi.  Demikian  juga  pada  pelarut  etanol  96%, sekalipuan  6-gingerol  pada  metode  sokhletasi  lebih rendah  daripada  metode  maserasi,  namun  kadar shogaol  pada  metode  sokhletasi  tidak  lebih  tinggi dibandingkan dengan metode maserasi. Dugaan hal ini terjadi  karena  faktor  pH  tidak  diperhatikan  selama proses pembuatan ekstrak tersebut.
Proses ekstraksi sangat memengaruhi efisiensi hasil ekstrak  yang  diperoleh.  Penggunaan  perbandingan pelarut dalam penelitian ini tidak ada perbedaan antara maserasi dan sokletasi.  Metode maserasi yang sangat sederhana dan tidak memerlukan energi sudah mampu menarik  komponen  aktif  lebih  tinggi  dibandingkan sokletasi yang memerlukan suhu lebih tinggi walaupun waktu  ekstraksi  lebih  singkat  sehingga  secara  efisiensi energi  metode  maserasi  lebih  menguntungkan dibandingkan metode sokhletasi.
Menurut  Lee et  al. (2007),  metanol  dapat menghasilkan  kadar  6-,  8-,10-gingerol  dan  6-shogaol paling  tinggi  dibandingkan  pelarut  air,  air:metanol (50:50),  etanol  dan  heksana  menggunakan  metode
Gambar 2. Grafik  perbandingan  komposisi  kadar  6-gingerol  (biru),  8-gingerol  (merah),  6-shogaol  (hijau),10- gingerol (ungu) ekstrak jahe merah dengan variasi pelarut dan metoda ekstraksi
Keterangan:
JM=pelarut  metanol  (maserasi  24  jam);  JE30M=pelarut  etanol  30%  (maserasi  48  jam);  JE70M=pelarut  etanol  70%  (maserasi 48jam);  JE96M=pelarut  etanol  96%  (maserasi  48jam);  JE30S=pelarut  etanol  30%  (Sokletasi  8  jam);  JE70S=pelarut  etanol  70% (Sokletasi 8jam); JE96S=pelarut etanol 96% (Sokletasi 8jam).
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 ka d ar m g/g b o b o t sim p lis ia metabolit ekstrak jahe merah 6-gingerol 8-gingerol 6-shogaol 10-gingerol
Sa’diah et al . maserasi  selama  24  jam.  Kadar  6-gingerol  yang diperoleh  Lee et  al tersebut,  lebih  rendah  (9,7  mg/g pada  ekstrak  metanol  dan    8,9  mg/g  pada  ekstrak etanol)  dibandingkan  yang  diperoleh  pada  penelitian ini.  Hal  ini  mungkin  dapat  terjadi    karena  yang digunakan  pada  penelitian  ini  adalah  jahe  merah sedangkan pada penelitian Lee et al .(2007) adalah jahe putih.  Kandungan  aktif  jahe  merah  lebih  tinggi dibandingkan jahe gajah/ white ginger /jahe putih besar (Heryani dan Winarti 2001).
Hasil  yang  diperoleh  Lee et  al. (2007)  juga mendukung  hasil  yang  diperoleh  pada  penelitian  ini yaitu  bahwa  kadar  6-gingerol  jauh  lebih  tinggi dibandingkan  3  komponen  aktif  lainnya.    Pada penelitian  ini  tampak  bahwa  pelarut  etanol  96% dengan metode maserasi 48 jam mampu menghasilkan kadar  keempat  metabolit  sekunder  yang  lebih  tinggi dibandingkan pelarut metanol dengan maserasi 24 jam. Tetapi apabila dibandingkan terhadap 2 pelarut lainnya yaitu etanol 30% dan etanol 70% baik dengan metode
maserasi  maupun  sokletasi,  pelarut  metanol  masih lebih  tinggi.  Oleh  karenanya  jika  mengacu  hanya  pada kadar  keempat  metabolit  sekunder  yang  paling  tinggi, maka  yang  terbaik  adalah  pelarut  etanol  96%  dengan maserasi  2  kali  lebih  lama  (48  jam)  dibandingkan dengan  pelarut  metanol.  Penggunaan  etanol  96%  ini lebih  aman  digunakan  sebagai  bahan  aktif  obat  jika digunakan secara per-oral.
Berdasarkan  rumus  molekulnya,  6-,  8-  dan  10- gingerol  berbeda  jumlah  gugus  metilnya,  yaitu berturut-turut 4, 6 dan 8 gugus metil, artinya semakin banyak  gugus  metil  kepolarannya  semakin  menurun. Pada  penelitian  ini  tampak  bahwa  polaritas  gingerol lebih  mendekati  etanol  96%  dibandingkan  etanol  30% dan 70%. Di antara ketiga senyawa gingerol tersebut 6- gingerol adalah yang paling polar sehingga yang paling banyak  tertarik  dibandingkan  2  senyawa  gingerol lainnya.
Gambar 4. Sel vero yang diinfeksi takhizoit pada jam ke 0,3,6,12,24 dan 36. (VC) sel vero, (  )  takhizoit  (Kavitha et al . 2012)
Gambar 5. Viabilitas  sel  vero  yang  terinfeksi  takhizoit  setelah  diberikan  perlakuan  dengan  konsentrasi  50  ppm dalam 200ul DMEM dan diinkubasi selama 48 jam
Keterangan: JM=pelarut metanol  (maserasi 24 jam); JE30M=pelarut etanol 30% (maserasi 48 jam); JE70M=pelarut etanol 70% (maserasi 48jam); JE96M=pelarut etanol 96% (maserasi 48jam); JE30S=pelarut etanol 30% (Sokletasi 8 jam); JE70S=pelarut etanol 70% (Sokletasi 8jam); JE96S=pelarut etanol 96% (Sokletasi 8jam).
0 20 40 60 80 100 120 Ko n tr o l JM JE 96 M
JE 70M JE 30M JE 96S JE 70S JE 30S 6 -G in ge ro l 8 -g in ge ro l 10 gi n ge ro l 6 -S h o gao l Sp yramyc in JK
Pe rse n tase v iab ili tas (% ) Konsentrasi sampel 500 ppm dalam 200 ul DMEM
Perbandingan Ekstrak Jahe Merah ( Zingiber Officinale Roscoe . Var. Rubrum), Gingerol dan Shogaol sebagai Anti-Toksoplasma terhadap Parasit Toxoplasma Gondii Secara In-Vitro 101
Aktivitas Anti-toksoplasma (in vitro)
Pada penelitian ini Sel vero yang merupakan sel line yang  berasal  dari  ginjal  monyet  hijau  afrika  ( African green monkey ) ATCC ® 1587 TM koleksi Pusat Studi Satwa Primata  (PSSP)  LPPM  IPB    digunakan  sebagai  tempat tumbuhnya  sel  takhizoit  karena  takhizoit  merupakan parasit  yang  bersifat  intraseluler  (hidup  di  dalam  sel). Hampir  semua  sel  jaringan  dapat  ditumbuhi  takhizoit seperti jaringan otak, paru-paru, hati (Al-Zanbagi 2009).
Isolat  takhizoit T.  gondii merupakan  agen  penyakit yang  bersifat  zoonosis  yang  dapat  menginfeksi  hewan dan juga manusia, maka untuk keamanan bagi peneliti dan  juga  lingkungan,  penelitian  uji in  vitro dengan  sel takhizoit  ini  harus  dilakukan  di  laboratorium mikrobiologi  dengan  tingkat  keamanan  minimal standar ke 2 ( Biosafety Level 2).
Bentuk  sel  takhizoit  berbeda  dengan  sel  vero. Takhizoit  memiliki  bentuk  seperti  bulan  sabit  dengan ukuran  jauh  lebih  kecil  dibanding  sel  vero  dan  bentuk tersebut dapat diamati pada pembesaran minimal 40X. Mengingat takhizoit dapat mengkontaminasi sel hidup, maka  perlakuan  harus  dilakukan  dalam  laboratorium mikrobiologi  khusus  untuk  infeksius  dan  terpisah dengan  laboratorium  kultur  sel  normal.    Takhizoit  jika diinfeksikan  pada  sel  normal,  maka  parasit  ini  akan masuk ke dalam sel dan memakan sel normal tersebut hingga  selnya  habis.  Pada  perbandingan  jumlah  sel parasit  terhadap  sel  vero  5:1,  sel  vero  akan  habis termakan  parasit  takhizoit  dalam  waktu  48  jam. Berbeda  dengan  kontaminasi  oleh  bakteri  yang menimbulkan  kekeruhan  pada  media  hanya  dalam waktu  24  jam,  infeksi  takhizoit  pada  sel  vero  tidak menimbulkan  kekeruhan  pada  jam  ke  24,  karena semua  sel  parasit  masih  berada  di  dalam  sel  vero. Kekeruhan akan muncul ketika sebagian besar sel vero telah  habis  sehingga  kelebihan  sel  takhizoit  akan terapung dalam media. Bentuk morfologi sel vero yang terinfeksi T. gondii seperti tampak pada Gambar 4.
Hasil  perlakuan  uji  i n  vitro terhadap  sel  vero  yang telah  diinfeksi  takhizoit  menunjukkan  bahwa  ekstrak dengan  pelarut  etanol  30%  baik  secara  maserasi maupun  sokhletasi  menghasilkan  persentasi  kematian sel vero tertinggi hingga lebih dari 80%, artinya ekstrak tersebut  tidak  memiliki  efektivitas  untuk  menghambat pertumbuhan  takhizoit  akibatnya  takhizoit  terus mematikan sel vero hingga viabitas sel atau jumlah sel yang  hidup  menjadi  rendah.  Aktivitas  ekstrak  dengan pelarut  30%  ini  jika  dikaitkan  dengan  komponen aktifnya (Gambar 2) cukup berkorelasi karena kadarnya juga paling rendah dibandingkan 2 pelarut pengektraksi
lainnya.  Aktivitas  ekstrak  dengan  pelarut  metanol, etanol  96%  dan  juga  etanol  70%  berdampak  positif sebagai  anti-toksoplasma,  yang  ditandai  dengan  nilai viabilitas  lebih  dari  100%,  yang  berarti  terjadi pertumbuhan sel vero lebih tinggi dibandingkan kondisi normalnya..  Jumlah  sel  vero  yang  lebih  tinggi dibandingkan  kontrol  normal  tanpa  infeksi  takhizoit dimungkinkan  terjadi  karena  pada  kontrol  normal setelah  inkubasi  48  jam  kondisinya  menjadi  terlalu konfluen  sehingga  medium  kurang  mencukupi kebutuhan nutrisi sel yang menyebabkan kematian sel. Sel  vero  yang  diberi  takhizoit  dapat  menyebabkan kematian  sel,  namun  ketika  diberikan    ekstrak  yang dapat  mematikan  takhizoit,  maka  sel  vero  yang  hidup dapat  menjadi  lebih  banyak.  Persentase  viabilitas  sel vero setelah perlakuan dapat diamati pada Gambar 5.
Hasil  analisis  secara  statistik  menunjukkan  bahwa ekstrak  etanol  96%  maserasi  (JE96M) secara signifikan lebih  efektif  dibandingkan  ekstrak-ekstrak  lainnya bahkan  juga  lebih  baik  dibandingkan  senyawa  tunggal 6-gingerol karena viabilitas sel vero lebih tinggi. Dengan demikian JE96M berpeluang untuk dikembangkan lebih lanjut sebagai anti-toksoplasma.

## SIMPULAN
Ekstrak  jahe  merah  yang  diproses  menggunakan pelarut etanol 96% baik dengan cara maserasi maupun sokhletasi  menunjukkan  aktivitas  anti-toksoplasma yang  paling  baik  dibandingkan  ekstrak  dengan  pelarut etanol  30%  dan  70%.  Ekstrak  etanol  96%  dengan  cara maserasi  mampu  menghasilkan  kadar  6-gingerol  yang lebih  tinggi  dibandingkan  dengan  cara  sokletasi. Senyawa  aktif  yang  paling  berperan  sebagai  anti- toksoplasma  adalah  6-gingerol  dibandingkan  8,  10 gingerol dan juga shogaol. Oleh karena itu Ekstrak jahe merah  dengan  pelarut  etanol  96%  yang  diproses dengan cara maserasi lebih potensial untuk dikembangkan  lebih  lanjut  sebagai  anti-toksoplasma. Metoda  ekstraksi  jahe  merah  yang  efektif  sebagai antitoksoplasma  ini  telah  didaftarkan  paten  dengan nomor registrasi  P00201810635.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Terimakasih  kami  ucapkan  kepada  Pusat  Studi Biofarmaka Tropika yang telah mendanai penelitian ini melalui skim penelitian internal sebagai Pusat Unggulan IPTEK (PUI-  PT) dengan sumber dana dari Kemenristek Dikti.
Sa’diah et al .

## DAFTAR PUSTAKA
Adnyana  IK, &  Suciyati  SW.  2017. Red  ginger  ( Zingiber officinale
Roscoe var Rubrum): a  review. Pharmacology On Line . 2 :60–65.
Al-Zanbagi  NA.  2009.    In  vivo  effect  of  some  home spices  extracts. Journal  Family  Community  Med . 16(2);59–65.
Bhattarai S, Tran VH,  dan Duke CC. 2001. The stability of gingerol and shogaol in aqueous solution. Journal of Pharmaceutical Sciences . 90:1658-1664.
Choi  WH,  Jiang  MH,  &  Chu  JP.  2013.  Antiparasitic effects of Zingiber officinale (ginger) extract against Toxoplasma  gondii . Journal  of  Applied  Biomedicine . 11(1); 15–26.
Harvey D. 2000. Modern Analytical Chemistry . Ed ke-1. Amerika (US): The McGraw-Hill Companies, Inc. He  XG,  Bernart  MW,  Lian  LZ,  Lin  LZ.  1998.  High- Performance  Liqid  Chromatography-Electrospray Mass Spectrometric Analysis Of Pugent Constituents Of  Ginger. Journal  Of  Chromatography. 796:327- 334.
Heryani,  Winarti  C.  2001.  Kandungan  bahan  aktif  jahe dan  pemanfaatannya  dalam  bidang  kesehatan, status teknologi hasil penelitian jahe, www.balitro.litbang.pertanian.go.id.
Kavitha N, Noordin R, Chan KL, & Sasidharan S. 2012. In vitro  anti- Toxoplasma gondii activity  of  root extract/fractions  of Eurycoma  longifolia Jack. BMC
Complementary and Alternative Medicine .
12(1);91.Doi:10.1186/1472-6882-12-91.
Kementerian Kesehatan RI. 2008 Karakteristik simplisia jahe  merah,  Farmakope  Herbal  Indonesia,  edisi  I,: Jakarta.
Lee  S,  Khoo  C,  Halstead  CW,  Huynh  T,  Bensoussan  A.
2007. Liquid Cromatographic Determination of 6-, 8-
,  10-gingerol  and  6-shogaol  in  ginger  ( Zingiber officinale )  as  the  raw  herb  and  dried  aqueous extract. Journal  of  AOAC  International .  90(5):1219- 1226.
Litbang  Pertanian.  2000.  Budi  daya  Jahe,  sumber: Sistem  Informasi  Manajemen  Pembangunan  di Pedesaan,  BAPPENAS,  editor  Kemal  Prihatman. http://nad.litbang.pertanian.go.id/ind/images/doku men/modul/18-BUDIDAYA%20JAHE.pdf
Pohanka M. 2016. Toxicology and the biological role of methanol  and  ethanol:  Current  view. Biomedical Papers . 160(1):54–63.
Ravindran  PN,  and  Babu  KN.  2005. Ginger  the  Genus Zingiber , RC Press, New York. 87-90.
Schwertner  HA,  Deborah  C,  Rios.  2007.  High- performance liquid chromatographic dietary supplements,  spices,  teas,  and  beverages. Journal of Chromatography B . 856(1-2): 41-47.
Wohlmuth  H,  Leach  DN,  Smith  MK,  dan  Myers  SP. 2005.  Gingerol  content  of  diploid  and  tetraploid clones of ginger ( Zingiber officinale Roscoe). Journal of Agricultural Food Chemistry . 53:5772-5778.