Optimasi Enzim Isolat Bakteri Endofitik EUA-136 Dari Sonneratia Sp. Penghasil Protease
Anthoni Agustien 1) , Rima Dwitaviani 2) , Yetti Marlida 3)
1,2 Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Andalas
3) Jurusan Peternakan, Fakultas Peternakan, Universitas Andalas
anthoniagustien@sci.unand.ac.id (1) rimadwitaviani@gmail.com (2) yettimarlida@ansci.unand.ac.id (3)

## ABSTRAK
Enzim protease memiliki kemampuan untuk memecah protein menjadi oligopeptida dan asam amino. Enzim yang  dihasilkan  oleh  bakteri  endofitik  dapat  diproduksi  dalam  skala  besar  tanpa  perlu  merusak  atau menebang  tanaman  inangnya.  Penelitian  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  suhu,  pH,  dan  waktu  inkubasi optimum terhadap isolat bakteri endofitik EUA-136 dalam meningkatkan aktivitas enzim protease. Penelitian ini  merupakan  penelitian  eksperimen  dengan  menggunakan Response  Surface  Methodology (RSM)  tipe rancangan Central  Composite  Design (CCD)  pada  software  Design  Expert  13.  Hasil  dari  penelitian  ini didapatkan aktivitas protease  dari  isolat bakteri  endofitik EUA-136 optimum pada suhu  30 ºC, pH 8 dalam waktu inkubasi 15 menit.
Kata Kunci : optimasi, protease, bakteri endofitik, response surface methodology

## ABSTRACT
Protease  enzymes  have  the  ability  to  break  down  proteins  into  oligopeptides  and  amino  acids.  Enzymes produced by endophytic bacteria can be produced on a large scale without the need to damage or cut down the  host  plant.  This  study  aims  to  determine  the  optimum  temperature,  pH,  and  incubation  time  for endophytic  bacterial  isolate  EUA-136  in  increasing  protease  enzyme  activity.  This  research  is  an experimental study using Response Surface Methodology (RSM) type of Central Composite Design (CCD) design  on  Design  Expert  13  software.  The  results  of  this  study  obtained  optimum  protease  activity  of endophytic bacterial isolate EUA-136 at a temperature of 30 ºC, pH 8 in an incubation time of 15 minutes.
Keywords : optimization, protease, endophytic bacteria, response surface methodology

## I. PENDAHULUAN

## 1. Latar Belakang
Indonesia  memiliki  ekosistem  mangrove  yang  luas,  memainkan  peran  penting  dalam memberikan  manfaat  ekologis  dan  ekonomi  bagi  kehidupan  manusia.  Secara  ekologis, hutan bakau bertindak sebagai  penghalang alami terhadap  abrasi  pantai,  angin  topan, dan tsunami,  sementara  juga  berfungsi  sebagai  habitat  satwa  liar  yang  vital  (Zainal et  al., 2023).  Ekosistem  mangrove  terletak  pada  zona  daerah  pertemuan  antara  laut  dan  daratan antara  pasang  naik  dan  surut.  Daerah  ini  kaya  akan  material  organik  dan  anorganik  yang berperan  dalam  arus  energi  seperti  bakteri.  Bakteri  memainkan  peran  penting  dalam ekosistem  bakau,  berkontribusi  pada  siklus  nutrisi  dan  menjaga  keseimbangan  dinamis habitat pesisir ini. Bakteri endofit telah dicirikan pada akar dan daun bakau, dengan spesies Bacillus  lazim  dan  menunjukkan  potensi  untuk  mendegradasi  minyak  mentah  (Nnrior, 2022).  Bakteri  dalam  zona  mangrove  sangat  beragam,  termasuk  bakteri  Gram  positif maupun  bakteri  Gram  negatif    (Ayu et  al .,  2017).  Bakteri  yang  hidup  pada  peraiaran mangrove bersifat halofilik dan dapat hidup pada suhu hingga 27 o C. Bakteri ini tumbuh di tempat  dengan  toleransi  kadar  garam  tinggi.  Untuk  tetap  hidup  dan  melakukan metabolisme, bakteri di tempat ekstrim membutuhkan jumlah protein yang tinggi.  Bakteri mangrove  menghasilkan  enzim  lipolitik,  proteolitik,  amilolitik,  dan  selulolitik  (Wilis  dan Subagiyo,  2012).  Enzim  adalah  sekelompok  protein  yang  katalisator  dan  mengatur perubahan  kimiawi  kimiawi  dan  mengatur  perubahan-perubahan  dalam  sistem  biologi. Enzim  dapat  diproduksi  oleh  hewan,  tumbuhan  dan  mikroorganisme.  Dalam  mengkatalis suatu reaksi, enzim berfungsi dalam banyak reaksi hidrolisis, oksidasi, reduksi, isomerisasi ,  adisi  dan  terkadang  pemutusan  rantai  karbon  (Chia-Hung,  2022).    Saat  ini,  peningkatan industri  pengguna  enzim  dengan  cepat,  terutama  kelompok  enzim  penghidrolisis  seperti protease,  amilase,  lipase,  kitinase,  dan  xilanase.  Beberapa  penelitian  tentang  enzim  telah banyak  dilakukan,  karena  enzim  sebagai  salah  satu  agen  alternatif  untuk  menggantikan proses-proses  kimiawi  baik  dalam  industri  maupun  bidang  bioteknologi  (Neha .,  et  al ., 2020).  Enzim protease memainkan peran penting dalam berbagai industri seperti deterjen, penyamakan  kulit, tekstil, pangan, proses pengolahan susu, farmasi, bir, dan pengelolaan limbah (Ashwini et al ., 2023). Enzim ini dipelajari secara ekstensif karena kemampuannya untuk mengkatalisis hidrolisis ikatan peptida dalam protein, menjadikannya penting untuk berbagai aplikasi di bidang industri dan pengobatan (Sonia et al., 2018). Enzim, termasuk protease,  adalah  biokatalis  yang  sangat  spesifik  yang  bersumber  dari  asal  mikroba  untuk produksi komersial,  memastikan hasil  tinggi  dan efektivitas biaya (Fernanda et  al., 2023; Archana et al., 2023).  Ada kebutuhan untuk mengembangkan enzim protease baru untuk aplikasi lebih lanjut yang diperlukan dari enzim-enzim ini. Enzim terutama seperti protease perlu dilakukan optimalisasi parameter pertumbuhan sangat penting untuk memaksimalkan produksi  protease,  meningkatkan  kinerja  katalitik,  stabilitas,  pH,  dan  toleransi  termal. Spektrum luas aplikasi enzim protease menggarisbawahi nilai ekonomi dan signifikansinya di  berbagai  industri,  menjadikannya  alat  bioteknologi  yang  sangat  diperlukan  untuk berbagai  keperluan.  Penelitian  ini  dilakukan  untuk  mengetahui  keadaan  optimum  dari isolat bakteri endofitik EUA-136 dalam meningkatkan aktivitas protease.

## 2. Perumusan Masalah
Rumusan masalah dari penelitian ini, yaitu:
1. Menganalisis  suhu,  pH,  serta  waktu  inkubasi  optimum  terhadap  isolat  bakteri endofitik  EUA-136  dalam  meningkatkan  aktivitas  protease  menggunakan  metode Response Surface Methodology (RSM)?
2. Bagaiman kondisi aktivitas protease sebelum dan sesudah optimasi?
3. Tujuan Penelitian
Adapun tujuan dari peneltian ini yaitu :
1. mengetahui suhu, pH, serta waktu inkubasi optimum terhadap isolat bakteri endofitik EUA-136  dalam  meningkatkan  aktivitas  protease  menggunakan  metode Response Surface Methodology (RSM)
2. Kondisi aktivitas protease sebelum dan sesudah optimasi?

## 4. Manfaat Penelitian
Penelitian  ini  bermanfaat  untuk  meningkatkan  wawasan  dan  menyajikan  data  ilmiah mengenai  optimasi  suhu,  pH,  serta  waktu  inkubasi  optimum  terhadap  isolat  bakteri endofitik EUA-136 dalam meningkatkan aktivitas protease

## I. METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian  ini  dilakukan  dari  bulan  Februari  s/d  Mei  2024  di  Laboratorium  Bioteknologi, UPT Sumber Daya Hayati, Universitas Andalas.

## Rancangan Penelitian atau Model
Penelitian  ini  merupakan  penelitian  eksperimen  dengan  metode  respon  permukaan ( response  surface  metodhology /RSM)  tipe  rancangan Central  Composite  Design (CCD) pada software Design Expert 13.

## Alat dan Bahan
Alat-alat  yang  digunakan  adalah  cawan  Petri,  tabung  reaksi,  gelas  ukur,  Erlenmeyer, termometer,  pH  meter,  pipet  tetes,  gelas  beker,  jarum  ose,  autoclave,  lampu  spritus, timbangan  analitik,  inkubator,  gelas  ukur,  mikroskop,  alumunium  foil,  kapas,  kain  kasa, tissue,  centrifuge,  mikropipet,  mikrotips,  eppendorf,  platform  shaker,  shaker  incubator, autoclaf,  magnetic  stirer,  hotplate  stirrer,  keranjang,  spatula,  spatula,  laminar  air  flow, spektrofotometer.
Bahan  yang  digunakan  dalam  penelitian  ini  yaitu  isolat  EUA-136  koleksi  Laboratorium Bioteknologi  yang  berasal  dari  daun  mangrove  Sonneratia  sp.,  medium  Nutrient  Agar (NA), KH 2 PO 4 , K 2 HPO 4 , MgSO 4 , NaCl,  Tris-HCl,  TCA, Na 2 CO 3 ,  KNO 3 , NaOH,  kasein, folin ciocalteu, agar, tirosin, akuades, alkohol, spritus,
Tahapan Penelitian

## Peremajaan bakteri endofitik
Peremajaan  isolat  bakteri  endofitik  EUA-136  dilakukan  dengan  menggoreskan  isolat bakteri pada tabung reaksi yang berisi medium NA.

## Optimasi Enzim
Kondisi  optimasi  enzim  dilakukan  pengamatan  dan  pengujian  aktivitas  enzim  metode Takami  et  al.  (1989)  dengan  penentuan  optimasi  pada  suhu,  pH  dan  waktu  inkubasi menggunakan Response  Surface  Methodology (RSM)  dengan  rancangan  percobaan  tipe Central Composite Design (CCD) pada software statistic Design Expert 13. Variasi faktor perlakuan  pada  suhu  (A)  mulai  dari  suhu  20  ºC  hingga  40ºC;  pH  (B)  larutan  bufer  yang digunakan mulai dari 6 sampai 10; waktu inkubasi (C) mulai dari 5 sampai 25 menit.

## Pengujian aktivitas protease
Pengujian  aktivitas  protease  menggunakan  metode  takami  yang  sudah  dimodifikasi, substrat  kasein  dipipetkan  sebanyak  0,5  mL,  selanjutnya  ditambahkan  larutan  enzim
sebanyak 0,5 mL, ditambahkan 0,25 Tris-HCL buffer 50 pH optimum dan diinkubasi pada suhu  optimum  selama  waktu  optimum.  Setelah  itu  ditambahkan  0,5  mL  TCA  dan diinkubasi  pada  suhu  ruang  selama  20  menit.  Disentrifugasi  pada  6000  rpm  selama  20 menit, supernatan diambil sebanyak 0,375 mL dan ditambahkan 1,25 mL Na 2 CO 3 dan 0,25 mL 1N Folin Ciocelteu. Pembacaan Optical Density dilakukan pada λ 578 nm. Penentuan nilai  blanko dilakukan dengan cara  yang sama, dimana 0,5  mL  enzim diganti  dengan 0,5 mL akuades. Penentuan nilai standar juga dilakukan dengan cara 0,5 mL sampel protease diganti dengan 0,5 mL tirosin Rumus perhitungan aktivitas enzim protease:
UA =
Keterangan: UA : Unit Aktivitas Protease (unit/mL) Asp : Absorbansi sampel Abl : Absorbansi blanko Ast : Absorbansi standar T : Waktu inkubasi (menit)

## II. HASIL DAN PEMBAHASAN
Optimasi enzim dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui kondisi yang diperlukan dalam menghasilkan aktivitas enzim yang tinggi seperti suhu, pH dan waktu inkubasi  yang akan digunakan  bakteri  untuk  proses  metabolismenya. Optimasi  enzim  (suhu,  pH  dan  waktu inkubasi) dilakukan berdasarkan pengacakan kombinasi yang diatur oleh Response Surface Methodology (RSM) dengan  rancangan percobaan tipe Central Composite Design (CCD) pada Software statistic Design Expert 13. Kombinasi suhu (A), pH (B) dan waktu inkubasi (C).
Gambar 1 . Response surface bentuk tiga dimensi (3D) aktivitas spesifik protease (U/mg) terhadap optimasi (A: suhu, B: pH dan C: waktu inkubasi).
Gambar  1  menampilkan  bentuk  tiga  dimensi  dari response  surface suhu,  pH,  dan  waktu inkubasi dan terdapat perbedaan warna dari bentuk 3D surfacenya. Sumbu x dan sumbu y memperlihatkan  faktor  yang  di  optimasi.  Garis-garis  yang  muncul  di  sudut  plot menunjukkan respons; area yang lebih hijau menunjukkan nilai respons yang lebih rendah, dan  area  yang  lebih  merah  menunjukkan  nilai  respons  yang  lebih  tinggi.  Karena  model kuadratik  yang  digunakan,  bentuk  grafik  tiga  dimensi  berbentuk  parabola.  (Pitshou  dan wasley, 2018). Gambar 1 menunjukkan response surface untuk faktor suhu, pH, dan waktu inkubasi.  Diketahui  bahwa  titik  respons  ideal  dalam  penelitian  ini  berada  di  tengah spektrum., yaitu pada suhu 30 0 C, pH 8, dan waktu inkubasi 15 menit. Perlakuan pada suhu 30ºC  aktivitas  spesifik  lebih  optimum  dibandingkan  suhu  20ºC  dan  40ºC.  Ini  disebabkan oleh  fakta  bahwa  meskipun  reaksi  enzimatis  berlangsung  lambat  pada  suhu  rendah  dan tinggi, peningkatan suhu akan mempercepat reaksi karena energi rata-rata molekul reaktan meningkat, yang pada gilirannya mengurangi energi aktivasi reaksi. Dengan demikian, laju reaksi  akan  meningkat  sampai  suhu  ideal  tercapai,  di  mana  reaksi  enzimatis  mencapai puncaknya.  (Van der Ent,  2023) .  Gambar 1  menunjukkan pH optimal untuk  enzim  yaitu pH  8,  hal  ini  diduga  pada  pH  8  dapat  meningkatkan  efisiensi  reaksi,  mengurangi  waktu yang  diperlukan  untuk  reaksi,  dan  menghindari  kerusakan  pada  enzim  (Nurkhotimah  et al.,2017)  Waktu  inkubasi  enzim  yang  optimal  selama  15  menit  dapat  dipengaruhi  oleh berbagai  faktor  yang  meliputi  kinetika  enzim,  kondisi  reaksi,  stabilitas  enzim  dan konsentrasi substrat (Bohari & Ibrahim 2016). Semakin lama inkubasi reaksi enzim dapat meningkatkan  laju  reaksi  enzim,  yang  berarti  aktivitas  enzim  lebih  banyak  dihasilkan.
Namun, pada titik tertentu, aktivitas enzim tidak lagi meningkat karena diakrenakan enzim telah  jenuh.  (Buaben  &  Pelis,  2023)  .  Hartati  (2012)  menyatakan  bahwa  lama  waktu inkubasi berpengaruh nyata dalam meningkatkan aktivitas protease isolat B2, dengan nilai tertinggi sebesar 0,148 U/ml selama 60 menit inkubasi. Waktu inkubasi yang terlalu lama menyebabkan aktivitas enzim menurun, yang berarti enzim mengalami perubahan struktur molekul atau terdenaturasi, sehingga tidak ada produk yang dihasilkan oleh aktivasi enzim. (Zusfahair, 2011).
Aktivitas Protease (U/mL) Peningkatan aktivitas protease (kali) Sebelum Sesudah 0,756 1,04 1,3
Peningkatan aktivitas itu menunjukkan bahwa berbagai faktor seperti suhu, pH, dan waktu inkubasi memengaruhi produksi enzim yang dihasilkan oleh bakteri. Penelitian Aznia et al. (2014), diperoleh peningkatan aktivitas protease setelah dilakukan optimasi ekstrinsik pada isolat  bakteri  M5-24  yaitu  mencapai  1,3  kali.  Penelitian  Liu  pada  tahun  2014  diperoleh peningkatan protease sekitar 3,6 kali setelah pengoptimalan pada Bacillus subtilis 100075. Sedangkan  penelitian  dari  Chen et  al., (2023)  bakteri  Bacillus  subtilis  GC021  setalah dioptimasi aktivitas protease meningkat sebesar 3,5 kali.

## III. KESIMPULAN
Dari  optimasi  yang  telah  dilakukan  pada  isolat  bakteri  endofitik  EUA-136  dalam meningkatkan aktivitas protease diperoleh aktivitas optimum pada suhu 30 ºC, pH 8 dalam waktu inkubasi 15 menit serta terjadi peningkatan aktivitas sebesar 1,3 kali.

## DAFTAR PUSTAKA
Ashwini,  Nilesh,  Puntambekar.,  Manjusha,  Dake.  (2023).  Microbial  Proteases:  Potential Tools  for  Industrial  Applications .  Research  Journal  of  Biotechnology ,    doi: 10.25303/1802rjbt1590171
Ayu    K.D.,    Lisna    M.,    Rolan    R.    2017.    Isolasi    Bakteri    Dari    Tanah    Mangrove Rhizopora Sp.  Di  Kota  Bontang.  Proceeding  Of  The  5th  Mulawarman Pharmaceuticals     Conferences.     Fakultas     Farmasi     Universitas Mulawarman. Samarinda.
Aznia, A., A. Agustien & N. Nasir. 2014. Optimasi Parsial Isolat Termofilik M5-24 dalam Produksi Protease. Jurnal Biologi Universitas Andalas (J. Bio. UA.) 3(3): 238-243. Buaben,  Aaron  O.,  and  Ryan  M.  Pelis.  2023.  Incubation  Time  Influences  Organic  Anion Transporter  1  Kinetics  and  Renal  Clearance  Predictions. Journal  of  Xenobiotics 13(2): 205–17
Chen,  Jingying.,  Gu,  Yan.  2023.  Optimization  of  fermentation  conditions  for  protease production from Bacillus subtilis . BIO web of conferences , doi: 10.1051/bioconf/20235901006
Chia-Hung, Kuo., Chun-Yung, Huang., Chwen-Jen, Shieh., C, D, Dong. (2022). Enzymes and Biocatalysis . Catalysts ,  doi: 10.3390/catal12090993
Fernanda,  Cosme.,  António,  Inês.,  Alice,  Vilela.  (2023).  Microbial  and  Commercial Enzymes  Applied  in  the  Beverage  Production  Process.  Fermentation,    doi: 10.3390/fermentation9040385
Hartanti,  Lilis.  Yusiati  Mira  Lisa  (2012). Karakterisasi  Protease  dan  Isolat  Bakteri Pendegradasi  Tepung  Bulu. Fakultas  Pertanian  Universitas  Lambung  Mangkurat Kalimantan Selatan
Neha,  V.,  Agrawal.,  Nayana,  A.,  Patil.  (2020).  Enzyme  Technology  Prospects  and  Their Biomedical Applications. doi: 10.1007/978-981-15-2063-1_9
Nrior,,  Renner,  Renner.,  Douglas,  Salome,  Ibietela.,  Somiari,,  Adaobi,  Assumpta,  Abiye.
(2022).  Culture  on  Nutritive  Media  and  Characterization  of  Some  Endophytic Bacteria  Isolated  from  the  Roots  and  Leaves  of  Mangrove  Plants:  Avicennia germinans,  Acrostichum  aureum  and  Rhizophora  mangle .  Journal  of  advances  in microbiology ,  doi: 10.9734/jamb/2022/v22i11675
Pitshou,  Bokoro.,  Wesley,  Doorsamy.  (2018).  Contour  Plots-Based  Approach  for Reliability  Analysis  of  Small  Data  Sets  of  Varistor  Arrester's  Failure  Times.  doi: 10.1109/EEEIC.2018.8494614
Sonia,  Barberis.,  Sonia,  Barberis.,  Mauricio,  Omar,  Adaro.,  Mauricio,  Omar,  Adaro., Anabella,  Lucía,  Origone.,  Anabella,  Lucía,  Origone.,  Grisel,  Bersi.,  Grisel,  Bersi., Fanny,  Guzmán.,  Andrés,  Illanes.  (2018).  Peptide  Synthesis  Using  Proteases  as Catalyst.   doi: 10.1007/978-3-319-97132-2_4
Subagiyo.,    Muhammad    S.    R.    D.,Wilis    A.S.    (2017).    Potensi    Ekosistem  Mangrove Sebagai   Sumber   Bakteri   Untuk   Produksi   Protease, Amilase   Dan   Selulase. Jurnal   Kelautan   Tropis .   Vol.   20(2):106–111.(ISSN 0853-7291). Takami,  H.,  Akiba,  T.  and  Horikoshi,  K.  (1989).  Production  of  extremely  thermostable alkaline  protease  from  Bacillus  sp.  no.  AH-101. Appl.  Microbiol.  Biotechnol .  30, 120-124.
Van  der  Ent,  Florian.  (2023).  Computational  Design  of  the  Temperature  Optimum  of  an Enzyme Reaction. Science Advances 9(26): 1–9
Zainal,  Abidin.,  Dhira,  Kurniawan,  Saputra.,  Mochammad,  Fattah.,  Nuddin,  Harahab., Andriani,  Kusumawati.  (2023).  Mangrove  potential  assessment  for  determining ecotourism  attraction  and  strengthening  destination  branding  and  marketing: ”gunung  pithing  mangrove  conservation”,  indonesia. Geojournal  of  Tourism  and Geosites, doi: 10.30892/gtg.47204-1036
Zusfahair.  (2011).  Amobilisasi  Protease  daari Bacillus sp.  BT  1  Menggunakan Poliakrilamida. Jurnal molekul, Vol 6 No 2.
Accepted Date Revised Date Decided Date Accepted to Publish 15 Mei 2024 20  Mei 2024 18 Juni 2024 Ya