## PENAMBAHAN TEPUNG UMBI DAHLIA, KEDELAI DAN BAWANG PUTIH SEBAGAI SUMBER PREBIOTIK UNTUK ENKAPSULASI PROBIOTIK
[Addition of Flours from Dahlia Tuber, Soybean and Garlic as Prebiotic Sources for Probiotic Encapsulation]

## Ngatirah* dan Maria Ulfah
Jurusan Teknologi Hasil Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Stiper, Yogyakarta
Diterima 15 Maret 2010 / Disetujui 04 Maret 2013

## ABSTRACT
The research was conducted to study  the effect of addition of flours made from  dahlia tuber, soybean and garlic as the sources of natural prebiotic on the encapsulation of probiotic (Lactobacillus acidophilus Dad 13) with carragenan and chitosan. Carragenan and chitosan are potential encapsulating agents that can protect bacterial cells from unfavorable conditions. It is hypothesized that addition of natural prebiotics from dahlia tuber, soybean and garlic can stimulate the growth of probiotic (L. acidophilus Dad 13) in MRS broth medium. Parameters evaluated were size and weight of capsule, number of cells in the capsule, acid and bile salt resistance of the biocapsule produced from carragenan and chitosan added with  flours  of  dahlia  tuber,  soybean  and  garlic  as  the  sources  of  natural  prebiotic.  The  randomized  complete  block  design  was  used  as  the experimental  design  with  two  factors.  The  first  factor  was  the  encapsulating  agents  (A1  carragenan,  A2  chitosan)  and  second  factor  was  the sources of natural prebiotic (P1 dahlia tuber, P2 garlic, P3 soybean). The results showed that the type of encapsulating agent had an effect on weight, diameter and number of cells in the capsule but did not affect the acid and bile salt resistance. Addition of prebiotic flour to biocapsules had an effect on weight and diameter of capsules but no effect on acid and bile salt resistance and the number of cells. Addition of flour as prebiotic source from dahlia, garlic and soybean increased the cell number by 1 log cycle. Capsules made from chitosan with the addition of prebiotic source flour  were  lighter,  had  shorter  diameter  and  lower  cell  reduction  by  acid  (4.63-5.24  log  cycle)  than  those  made  with  carragenan  (6.93-7.19  log cycle). Based on the acid resistance, the best biocapsules was made with chitosan and dahlia prebiotic flour.
Keywords : carragenan, chitosan, Lactobacillus acidophilus Dad 13, natural prebiotic fluor, probiotic encapsulation

## ABSTRAK
Penelitian  ini  mempelajari  pengaruh  penambahan  tepung  sumber  prebiotik  dari  umbi  dahlia,  kedelai  dan  bawang  putih  dalam  proses enkapsulasi probiotik ( Lactobacillus acidophilus Dad 13) menggunakan karagenan dan kitosan. Karagenan dan kitosan sudah diketahui sebagai bahan pengkapsul potensial yang dapat melindungi sel bakteri dari kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan. Sebagai hipotesis, penambahan prebiotik alami dari umbi dahlia, kedelai, dan bawang putih dapat menstimulasi pertumbuhan bakteri probiotik ( Lactobacillus acidophilus Dad 13 ) dalam media MRS broth . Evaluasi dilakukan terhadap ukuran dan berat biokapsul, jumlah sel dalam kapsul, ketahanan sel dalam kapsul terhadap asam dan garam empedu. Penelitian ini menggunakan rancangan blok  lengkap (RBL) teracak dengan dua  faktor. Faktor pertama adalah jenis bahan pengkapsul (A1 karagenan, A2 kitosan) dan faktor kedua adalah penambahan tepung sumber prebiotik alami (P1 umbi dahlia, P2 bawang putih, P3 kedelai). Hasil penelitian menunjukkan bahwa jenis bahan pengkapsul berpengaruh terhadap berat dan diameter biokapsul serta jumlah sel dalam kapsul, namun tidak berpengaruh pada ketahanan sel terhadap asam dan garam empedu. Penambahan tepung sumber prebiotik pada biokapsul berpengaruh terhadap berat dan diameter biokapsul namun tidak berpengaruh pada ketahanan sel terhadap asam dan garam empedu serta jumlah sel dalam kapsul. Penambahan tepung sumber prebiotik dari umbi dahlia, bawang putih, dan kedelai dapat meningkatkan jumlah sel sampai 1 siklus log. Karakteristik biokapsul kitosan dengan  penambahan tepung sumber prebiotik mempunyai berat dan ukuran diameter yang lebih kecil dibanding karagenan, dan memiliki jumlah penurunan sel terhadap asam yang lebih rendah (4.63-5.24 siklus log) dibanding karagenan (6.93-7.19  siklus  log).  Berdasarkan  ketahanan  sel  terhadap  asam  maka  biokapsul  terbaik  diperoleh  pada  biokapsul  yang  dibuat  dari  kitosan dengan penambahan tepung prebiotik dari umbi dahlia.
Kata kunci: enkapsulasi probiotik, karagenan, kitosan, Lactobacillus acidophilus Dad 13, tepung sumber prebiotik alami

## PENDAHULUAN
1
Probiotik  merupakan  suplemen  mikroba  hidup  yang  dapat memberikan  efek  menguntungkan  bagi  inang/tubuh  dengan cara  memperbaiki  keseimbangan  mikroflora  usus  (Patel  dan Goyal,  2012). Lactobacillus  acidophilus Dad  13  merupakan
*Korespondensi Penulis: E-mail: ngatirah@yahoo.com; Telp.: 081215722323
salah  satu  bakteri  asam  laktat  yang  diisolasi  dari  dadih  dan berpotensi sebagai bakteri probiotik penurun kolesterol. Bakteri tersebut  mempunyai  kemampuan  dalam  mengasimilasi kolesterol (3.77%) dan mendekonjugasi garam empedu/ bile salt (3.98%) secara in vitro serta tahan terhadap garam empedu dan pH rendah (Ngatirah et al. 2000). Bakteri tersebut juga pernah digunakan  dalam  suplementasi  produk  yoghurt  (Lestari et  al. 2003).
Persyaratan mikrobia untuk dikatagorikan sebagai probiotik adalah  mampu  mencapai  usus  dalam  keadaan  hidup.  Faktor- faktor  lingkungan  yang  dapat  menurunkan  viabilitas  sel  antara lain: adanya pengaruh suhu ekstrim selama proses pengolahan dan penyimpanan, adanya pengaruh pH lambung yang sangat ekstrim  yaitu  sekitar  pH  1.5  serta  adanya  pengaruh  garam empedu  ( bile  salt ).  Oleh  karena  itu,  diperlukan  suatu  upaya untuk  melindungi  sel  probiotik  dari  pengaruh  faktor  lingkungan yang  sangat  ekstrim.  Salah  satu  cara  yang  dapat  ditempuh adalah  melindungi  sel  dengan  semacam  kapsul  atau  meng- gunakan teknik enkapsulasi (Petrovic et al. 2007; Akhiar, 2010; Islam et al. 2010; Burgain et al. 2011; Gbassi dan Vandamme, 2012).  Dari  berbagai  penelitian,  bahan-bahan  yang  dapat  di- gunakan sebagai bahan enkapsulasi adalah karagenan (Tsen et al. 2004), resistant starch (Shafiei et al. 2012), alginat (Grosso dan  Favaro-Trindade,  2004),  kitosan  (Le-Tien et  al. 2004; Chavarri et al. 2010; Ivanovska et al. 2012), tepung terigu dan pollard (Widodo et al. 2003) serta sesame oil (Hou et al. 2003). Bahan-bahan tersebut mempunyai sifat-sifat yang berbeda satu sama lain, sehingga akan memberikan kekuatan gel yang ber- beda-beda yang akan berpengaruh pada fleksibilitas biokapsul. Untuk  meningkatkan  fleksibilitas  biokapsul,  maka  beberapa jenis  bahan  pengkapsul  sering  digunakan  secara  bersama- sama seperti yang telah diteliti oleh Ouyang et al. (2004) meng- gunakan  kombinasi  bahan  pengkapsul  dari  alginat  dan  pektin, maupun Chavarri et al. (2010) menggunakan kombinasi kitosan dan alginat.
Hasil  penelitian  Ngatirah  dan  Ulfah  (2006),  menunjukkan bahwa  sel  bakteri  yoghurt  ( L.  bulgaricus dan S.  thermophilus ) yang dienkapsulasi dengan alginat maupun kitosan  mempunyai viabilitas  maupun  ketahanan  terhadap  pH  lambung  (pH  1.5) yang  masih  rendah.  Oleh  karena  itu  perlu  dilakukan  usaha untuk memperbaiki atau meningkatkan ketahanan dan viabilitas terhadap  pH  dan  pengaruh  ekstrim  yang  lain,  antara  lain dengan  melakukan  ko-enkapsulasi  probiotik  dengan  me- nambahkan  senyawa  prebiotik.  Menurut  Roberfroid  (2007), Prebiotik  didefinisikan  sebagai  bahan  pangan  yang  dapat difermentasi  secara  selektif  untuk  memberikan  perubahan spesifik  baik  komposisi  dan  atau  aktivitas  mikroflora  pada saluran  pencernaan  yang  dapat  memberikan  manfaat  bagi kesehatan  inang.  Beberapa  senyawa  yang  termasuk  prebiotik antara  lain  inulin,  fruktooligosakarida  (FOS),  galakto- oligosakarida  (GOS),  xilo-oligosakarida  (XOS),  isomalto- oligosakarida  (IMO),  lactulosa  dan resistant  starch (Cho  dan Finocchiaro,  2010;  Patel  dan  Goyal,  2012).  Penambahan prebiotik  dapat  menstimulasi  pertumbuhan  bakteri  probiotik ketika sudah dikonsumsi (Anal dan Singh, 2007; Mortazavian et al. 2007). Prebiotik juga dapat memperbaiki viabilitas organisme probiotik  pada  yoghurt,  penambahan  prebiotik  FOS  (raftilose® P95) sebanyak 1.5% pada yoghurt dapat memperbaiki viabilitas probiotik sebanyak 1.42 log selama empat minggu penyimpan- an  pada  suhu  4°C  (Capela et  al. 2006).  Jumlah  sel Lactobacillus  spp. akan  meningkat  secara  nyata  dengan penambahan  prebiotik  Hi-maize TM 1%  (And  dan  Kailasapathy, 2005).  Menurut  Vidhyalakshmi et  al. (2009),  penambahan prebiotik inulin pada yoghurt dapat meningkatkan pertumbuhan bakteri asam laktat dan ketika digunakan dalam proses mikro- enkapsulasi  mampu  meningkatkan  ketahanan  mikroba.
Ivanovska et  al .  (2012),  mendapatkan  bahwa  metode  mikro- enkapsulasi  sinbiotik  dengan  kombinasi  alginat,  FOS  dan kitosan lebih efektif dalam melindungi sel L. casei dari pengaruh lingkungan yang ekstrim dan mampu menghasilkan viabilitas sel pada simulasi pH kolon sebesar 8.31±0.14 log CFU/g.
Menurut  Chen et  al. (2005),  penambahan  prebiotik  pada proses mikroenkapsulasi probiotik dapat meningkatkan viabilitas probiotik. Dalam proses enkapsulasi penambahan prebiotik ber- tujuan untuk memperbaiki porositas matriks biokapsul sehingga dapat meningkatkan kekukuhan gel. Inkorporasi prebiotik dalam kapsul alginat mampu memberikan sinergi dalam melindungi sel probiotik selama proses pengolahan pangan dan dalam saluran pencernaan.  Penggunaan  1%  sodium  alginat  yang  dicampur dengan  1%  peptida  dan  3%  FOS  mampu  menghasilkan ketahanan  sel  probiotik  yang  paling  tinggi  (Chen et  al. 2005). And  dan  Kailasapathy  (2005),  juga  menemukan  bahwa  pe- nambahan  pati  Hi-Maize TM dengan  konsentrasi  1%  (b/v)  pada proses enkapsulasi L. acidophilus CSCC 2400 atau CSCC 2409 menggunakan  alginat,  kitosan  dan poly-L-lysine ,  mampu  me- lindungi sel terhadap pengaruh pH 2.0 dan mampu meningkat- kan  jumlah  sel  secara  nyata.  Hal  itu  disebabkan  oleh  pati  Hi- Maize TM yang  mampu  masuk  ke  dalam  matriks  kapsul  dan menutupi pori-pori kapsul sehingga mencegah terjadinya difusi asam ke dalam kapsul. Menurut Mortazavian et al. (2007), pati HACS  ( high-amylose  corn  starch )  dapat  melapisi  atau  mem- perbaiki pembentukan dinding kapsul alginat.
Sebenarnya prebiotik secara alami terdapat pada beberapa jenis  tanaman  misalnya  inulin  pada  umbi  dahlia  (Bernal et  al. 2005;  Glibowski  dan  Bukowska,  2011),  FOS  pada  bawang merah,  bawang  putih  dan  asparagus  (Gibson  dan  Rastall , 2006), rafinosa dan stakiosa pada kedelai  oligosakarida pada ubi  jalar  (Moongngram et  al. 2011)  dan  laktulosa  pada  susu. Jumlah  dan  jenisnya  tergantung  pada  varietas  tanaman.  Hasil penelitian  Moongngram et  al. (2011)  menunjukkan  bahwa bawang  putih  mengandung  inulin  paling  tinggi  (41.72%)  diikuti oleh  bawang  merah  (33.22%)  dan  hanya  sedikit  inulin  yang terdapat  pada  ubi  jalar,  lobak  putih,  singkong  dan yam  bean (berkisar  antara  0.42-2.14%),  sementara  pada  beras  tidak ditemukan adanya inulin dan FOS.
Tujuan  penelitian  ini  adalah  mengetahui  pengaruh penambahan tepung sumber prebiotik dari umbi dahlia, kedelai, dan  bawang  putih  pada  proses  enkapsulasi Lactobacillus acidophilus Dad  13  menggunakan  karagenan  dan  kitosan, mengetahui  karakteristik  biokapsul  yang  dihasilkan  dan  me- ngetahui viabilitas biokapsul yang dihasilkan terhadap pengaruh pH rendah dan garam empedu.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi tepung sumber prebiotik yang diperoleh dari  umbi dahlia, kedelai, dan bawang putih, etanol, media MRS broth (Merck) dan MRS agar (Merck),  kitosan,  karagenan,  kalsium  klorida,  garam  fisiologis, asam  asetat, sodium  tri  poliphosphat (STPP),  KCl  serta  isolat Lactobacillus  acidophilus Dad  13  yang  merupakan  koleksi FNCC PAU Pangan dan Gizi UGM.
Versi Online: http://journal.ipb.ac.id/index.php/jtip DOI: 10.6066/jtip.2013.24.1.14

## Hasil Penelitian

## Rancangan percobaan
Penelitian  ini  menggunakan  rancangan  blok  lengkap dengan  dua  faktor,  faktor  pertama  adalah  jenis  bahan  peng- kapsul  (A1  kitosan,  A2  karagenan),  faktor  kedua  adalah penambahan tepung sumber prebiotik dari berbagai sumber (P1 umbi  dahlia,  P2  bawang  putih,  P3  kedelai)  dengan  2  kali ulangan.  Data  hasil  pengamatan  diolah  dengan  analisis  ke- ragaman  (ANAKA),  dan  bila  hasilnya  menunjukkan  pengaruh nyata maka dilakukan uji jarak berganda Duncan.

## Pembuatan biokapsul
Pembuatan biokapsul menggunakan karagenan dan kitosan dengan  penambahan  tepung  sumber  prebiotik  mengacu  pada metode Le-Tien et al. (2004) yang dimodifikasi. Seratus (100) µl kultur cair bakteri L. acidophilus Dad 13 berumur 24 jam dalam media  MRS broth ,  ditumbuhkan  ke  dalam  10  ml  Media  MRS broth  steril  kemudian  diinkubasi  pada  suhu  30°C  selama  48 jam. Kultur cair kemudian disentrifugasi pada 3500 x g selama 15  menit  untuk  memperoleh pellet .  Kemudian  10  g pellet dilarutkan ke dalam 100 ml akuades steril dan  digojog sampai homogen  (konsentrasi  10%).  Selanjutnya  disiapkan  100  ml larutan  pengkapsul  (A1  kitosan  dan  A2  karagenan)  dengan konsentrasi  3.5%  (untuk  karagenan  sebanyak  3.5  g  dilarutkan dalam  100  ml  akuades  dan  untuk  kitosan  sebanyak  3.5  g dilarutkan  dalam  100  ml  asam  asetat  2%)  dan  kemudian ditambahkan  tepung  sumber  prebiotik  (P1  umbi  dahlia,  P2 bawang  putih,  P3  kedelai)  dengan  konsentrasi  1.5%  b/v. Larutan  kemudian  dikocok  hingga  homogen  dan  disterilkan menggunakan  otoklaf  pada  suhu  121°C  selama  10  menit. Selanjutnya dicampurkan suspensi kultur dengan larutan peng- kapsul  dengan  perbandingan  1:4  (sebanyak  10  ml  suspensi kultur  ditambahkan  40  ml  larutan  pengkapsul)  dan  di- homogenisasi  kemudian  dimasukkan  ke  dalam syringe ber- volume  50  ml.  Campuran  tersebut  selanjutnya  diteteskan  ke dalam larutan pengeras dengan konsentrasi tertentu yang steril (jika  bahannya  kitosan  digunakan  larutan  STPP  4%  dan  jika bahannya karagenan digunakan larutan KCl 4%) sambil digojog dan  dibiarkan  kurang  lebih  15  menit  hingga  terbentuk  kapsul. Setelah kapsul terbentuk kemudian disimpan di dalam kulkas.

## Analisis berat biokapsul
Sepuluh  butir  biokapsul  diambil  secara  acak  kemudian ditimbang satu persatu menggunakan timbangan/neraca (merk Sartorius TE214S), selanjutnya dihitung rata-ratanya (Le-Tien et al. 2004).

## Analisis diameter biokapsul
Analisis  diameter  biokapsul  dilakukan  dengan  mengacu pada metode Le-Tien et al. (2004). Biokapsul diambil sebanyak 10  buah  secara  acak  kemudian  diukur  diameternya  meng- gunakan  jangka  sorong.  Diameter  yang  diperoleh  dari  ke sepuluh biokapsul selanjutnya dihitung rata-ratanya.

## Analisis jumlah sel dalam biokapsul
Untuk  perhitungan  jumlah  sel  dalam  biokapsul  terlebih dahulu  dilakukan  pelarutan  biokapsul  dengan  mengacu  pada metode Le-Tien et al. (2004). Sebanyak 1 g biokapsul (sekitar 15 butir) dimasukkan dalam larutan buffer phosphate 0.1 M pH
7  steril  (untuk  biokapsul  karagenan)  atau  larutan  garam fisiologis steril (untuk biokapsul kitosan) dan selanjutnya digojog dengan vortek selama 30 menit sampai larut. Selanjutnya dibuat seri pengenceran untuk perhitungan jumlah sel dengan metode agar tuang menggunakan media MRS agar .

## Analisis ketahanan sel terhadap pH rendah (pH 1.5)
Analisis  ketahanan  sel  dalam  kapsul  terhadap  pH  rendah dilakukan  dengan  mengacu  metode  Le-Tien et  al. (2004). Pertama-tama disiapkan larutan HCl steril dengan pH 1.5 dalam erlenmeyer  untuk  masing-masing  sampel,  kemudian  dimasuk- kan  1  g  biokapsul  (sekitar  15  butir)  dan  dibiarkan/diinkubasi selama  ±3  jam.  Kemudian  diambil  biokapsulnya  dan  dicuci dalam  aquades  steril  kemudian  dilarutkan  dalam  9  ml  larutan pelarut  biokapsul  (larutan buffer phosphate 0.1  M  pH  7  steril untuk  biokapsul  karagenan  atau  larutan  garam  fisiologis  steril untuk biokapsul kitosan) dan selanjutnya dibuat seri pengencer- an sampai 10 2 kemudian dihitung jumlah selnya menggunakan metode agar tuang menggunakan media MRS agar .
Analisis  ketahanan  sel  dalam  kapsul  terhadap  garam empedu
Analisis  ketahanan  sel  dalam  kapsul  terhadap  garam empedu  mengacu  pada  metode  Le-Tien et  al .  (2004)  yaitu  di- masukkan  biokapsul  sebanyak  1  g  (sekitar  15  butir)  ke  dalam larutan bile salt steril sebanyak 25 ml dengan konsentrasi 1.2%, kemudian  dibiarkan/diinkubasi  selama  ±3  jam.  Setelah  itu biokapsul  diambil  dan  dicuci  dengan  akuades  steril,  lalu dilarutkan  ke  dalam  9  ml  larutan  pelarut  biokapsul  (larutan buffer phosphate 0.1 M pH 7 steril untuk biokapsul karagenan atau larutan garam fisiologis steril untuk biokapsul kitosan) dan selanjutnya  dibuat  seri  pengenceran  hingga  pengenceran  10 6 dan  dihitung  jumlah  selnya  menggunakan  metode  agar  tuang menggunakan media MRS agar .

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Diameter biokapsul
Berdasarkan Tabel 1 dapat diketahui bahwa ada perbedaan yang  nyata  antara  diameter  biokapsul  yang  berbahan karagenan dengan biokapsul kitosan, sedangkan penambahan tepung  sumber  prebiotik  tidak  menghasilkan  perbedaan  yang nyata  terhadap  diameter  pada  masing-masing  biokapsul. Diameter  biokapsul  kitosan  lebih  kecil  dibandingkan  biokapsul karagenan,  diduga  disebabkan  oleh  adanya  perbedaan  sifat antara kitosan dan karagenan dalam membentuk gel/kapsul.
Menurut Honary et al . (2009), berat molekul mempengaruhi ukuran  mikropartikel  kitosan.  Semakin  tinggi  berat  molekul kitosan akan menghasilkan ukuran mikropartikel yang semakin kecil.  Berat  molekul  akan  berpengaruh  terhadap  sifat  mekanik dari  gel  yang  terbentuk,  makin  besar  berat  molekulnya  akan menghasilkan ikatan yang lebih kuat sehingga ukuran partikel- nya  menjadi  lebih  kecil.  Selain  itu,  kekuatan  ionik  dari  polimer juga  berpengaruh  dalam  pembentukan  gel/kapsul.  Menurut Islam et  al .  (2010),  kekuatan  ikatan  dalam  kapsul  tergantung dari  kation  dan  sifat  polimer.  Kitosan  merupakan  polikationik sehingga  ketika  bertemu  dengan  larutan  yang  mengandung
polianionik seperti STPP maka akan berikatan secara ionik dan membentuk  gel  yang  kuat,  akibatnya  diameter  kapsul  yang terbentuk lebih kecil. Hal itu didukung oleh pendapat Aranaz et al .  (2009),  bahwa  sifat-sifat  kitosan  berhubungan  dengan adanya  gugus-gugus  amin,  asetil  dan  hidroksil.  Adanya  gugus tersebut  menyebabkan  kitosan  mempunyai  reaktivitas  kimia yang  tinggi  dan  penyumbang  sifat  polielektrolit  kation.  Di  lain pihak karagenan lebih bersifat hidrofilik, dengan adanya gugus hidroksil dan gugus sulfat di sepanjang rantai polimer sehingga molekul air akan mudah terjerap/terimobilisasi masuk ke dalam struktur  gel,  yang  mengakibatkan  diameter  kapsul  yang  lebih besar. Chan et al. (2011), menyatakan bahwa semakin banyak air  yang  terperangkap  di  dalam  gel  akan  menyebabkan  pe- nurunan kekuatan mekanik sehingga gel yang dihasilkan men- jadi lebih lunak. Menurut William dan Harper (2010), karagenan lebih  bersifat  hidrofilik  karena  adanya  gugus  2-sulfat.  Adanya gugus sulfat di sepanjang rantai polimer karagenan menyebab- kan  rantai  molekul  menegang  dan  karena  sifat  hidrofiliknya, polimer  tersebut  dikelilingi  oleh  molekul  air  yang  terimobilisasi dan  larutan  menjadi  kental.  Adanya  penambahan  tepung sumber  prebiotik  juga  menyebabkan  pembentukan  gel  pada karagenan menjadi lebih besar dan lunak. Diduga hal itu karena adanya  penurunan  kekuatan  ionik  dalam  membentuk  matriks gel.  Menurut  Janaswamy  dan  Chandrasekaran  (2002)  serta Kara et  al. (2006),  kombinasi  karagenan  dengan  bahan  lain misalnya locust  bean  gum dapat  menyebabkan  gel  karagenan menjadi rapuh dan lunak.
Tabel 1.  Diameter  (mm)  biokapsul Lactobacillus  acidophilus Dad  13 dengan  berbagai  jenis  bahan  pengkapsul  dan  penambahan tepung sumber prebiotik
Tepung Sumber Prebiotik (P) dengan Konsentrasi 1.5% b/v Diameter Biokapsul (mm) dengan Jenis Bahan Pengkapsul (A) dengan Konsentrasi 3.5% b/v A1 (Kitosan) A2 (Karagenan) P1 (umbi dahlia) 2.98 ± 0.29 b 3.74 ± 0.33 a P2 (bawang putih) 2.64 ± 0.28 c 3.79 ± 0.38 a P3 (kedelai) 2.87 ± 0.27 b 3.76 ± 0.29 a
Keterangan: Rata-rata perlakuan yang diikuti dengan huruf yang berbeda pada kolom  maupun  baris  menunjukkan  adanya  beda  nyata  pada  uji  jarak berganda Duncan pada tingkat kepercayaan 5%

## Berat biokapsul
Berat  biokapsul  berbahan  kitosan  berbeda  nyata  dengan biokapsul berbahan karagenan (Table 2). Biokapsul dari kitosan mem-punyai berat yang lebih rendah dibandingkan karagenan. Hal  itu  disebabkan  oleh  diameter  biokapsul  kitosan  yang  lebih kecil  dibandingkan  biokapsul  karagenan,  sehingga  jika  di- asumsikan bobot jenisnya sama maka diameter yang lebih kecil akan  menghasilkan  berat  biokapsul  yang  lebih  kecil.  Hal  itu didukung  dengan  data  rata-rata  diameter  (Tabel  1),  yang menunjukan  bahwa  pada  biokapsul  yang  berbahan  kitosan diameternya  lebih  kecil  (rata-rata  2.73  mm)  dibandingkan biokapsul yang berbahan karagenan (rata-rata 3.76 mm). Pada Tabel  2  juga  terlihat  bahwa  penambahan  tepung  sumber prebiotik tidak menghasilkan perbedaan berat biokapsul. Hal itu diduga karena tepung prebiotik yang ada dalam tanaman umbi dahlia,  bawang  putih  maupun  kedelai  sangat  kecil  sehingga tidak berpengaruh nyata terhadap penambahan berat biokapsul. Biokapsul  dengan  penambahan  tepung  sumber  prebiotik  dari
bawang  putih  mempunyai  berat  yang  sedikit  lebih  rendah namun  tidak  berbeda  nyata  dengan  data  yang  lain.  Hal  itu disebabkan  oleh  diameter  biokapsul  dengan  penambahan tepung sumber prebiotik bawang putih lebih kecil, sehingga hal itu tidak berpengaruh pada berat biokapsul.
Tabel 2.  Berat (mg/biokapsul) biokapsul Lactobacillus acidophilus Dad 13  dengan  berbagai  jenis  bahan  pengkapsul  dan  penam- bahan tepung sumber prebiotik
Tepung Sumber Prebiotik (P) dengan Konsentrasi 1.5% b/v Berat (mg/biokapsul) Biokapsul dengan Jenis Bahan Pengkapsul (A) dengan Konsentrasi 3.5% b/v A1 (Kitosan) A2 (Karagenan) P1 (umbi dahlia) 2.9 ± 0.57 b 5.6 ± 1.17 a P2 (bawang putih) 2.6 ± 0.39 b 5.2 ± 0.65 a P3 (kedelai) 2.7 ± 0.48 b 5.6 ± 0.69 a
Keterangan: Rata-rata perlakuan yang diikuti dengan huruf yang berbeda pada kolom  maupun  baris  menunjukkan  adanya  beda  nyata  pada  uji  jarak berganda Duncan pada tingkat kepercayaan 5%

## Jumlah sel
Hasil  analisis  jumlah  sel  pada  biokapsul Lactobacillus acidophilus Dad  13  (CFU/g)  dengan  berbagai  jenis  bahan pengkapsul  dan  penambahan  tepung  sumber  prebiotik  dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3.  Jumlah  sel  (CFU/g)  dalam  biokapsul Lactobacillus acidophilus Dad 13 dengan berbagai jenis bahan pengkapsul dan penambahan tepung sumber prebiotik
Tepung Sumber Prebiotik (P) dengan Konsentrasi 1.5% b/v Jenis Bahan Pengkapsul (A) dengan Konsentrasi 3.5% b/v A1 (Kitosan) A2 (Karagenan) P1 (umbi dahlia) 9.2 x 10 6b 1.4 x 10 9a P2 (bawang putih) 6.0 x 10 6b 1.6 x 10 9a P3 (kedelai) 1.7 x 10 7b 1.7 x 10 9a
Keterangan: Rata-rata  perlakuan yang diikuti dengan huruf yang berbeda pada kolom  maupun  baris  menunjukkan  adanya  beda  nyata  pada  uji  jarak berganda Duncan pada tingkat kepercayaan 5%
Penambahan  tepung  sumber  prebiotik  tidak  berpengaruh nyata  terhadap  jumlah  sel  dalam  biokapsul.  Diduga  senyawa prebiotik  yang  ada  pada  tepung  sumber  prebiotik  (inulin  pada umbi  dahlia,  FOS  pada  bawang  putih,  dan  rafinosa  atau stakiosa  pada  kedelai)  tidak  begitu  banyak  berperan  dalam peningkatan  jumlah  sel  karena  diperkirakan  jumlahnya  dalam matriks kapsul hanya sedikit. Dari Tabel 3 juga diketahui bahwa jumlah  sel  dalam  kelompok  bahan  pengkapsul  karagenan secara nyata lebih tinggi dibanding biokapsul kitosan. Biokapsul dengan  bahan  karagenan  mempunyai  jumlah  sel  yang  lebih tinggi 2 siklus log dibanding biokapsul kitosan (jumlah sel pada biokapsul  kitosan  rata-rata  1.1  x  10 7 CFU/g  sedangkan  pada biokapsul karagenan rata-rata 1.6 x 10 9 CFU/g). Diduga hal itu disebabkan struktur gel/kapsul karagenan yang terbentuk lebih lunak,  sehingga  larutan  air  yang  di  dalamnya  mengandung biomassa  sel  lebih  mudah  terjerap  masuk  ke  dalam  gel  dan mudah dilarutkan kembali. Sedangkan kitosan hanya dapat larut dengan  baik  pada  larutan  asam  asetat  encer,  dan  akibat adanya  penambahan  larutan  kultur  dalam  air  steril  menyebab- kan  homogenitasnya  berkurang  sehingga  berpengaruh  pada jumlah sel yang dapat terjerap dalam kapsul. Menurut Aranaz et al .  (2009),  banyaknya  muatan  positif  pada  kitosan  menyebab-
kan sel terikat lebih kuat pada matriks kapsul, sehingga ketika dilakukan  pelarutan  kembali  jumlah  sel  yang  terdeteksi  lebih sedikit.  Menurut  Aranaz et  al .  (2009),  kitosan  tidak  dapat  larut dalam larutan netral dan basa tetapi hanya larut dalam larutan asam. Larutan asam yang dapat melarutkan kitosan yaitu asam formiat, asam asetat, asam laktat dan asam glutamat.  Apabila dilarutkan  dalam  campuran  asam  dan  air,  kitosan  akan  me- ngalami  protonasi  dan  akan  terjadi  muatan  positif.  Jika  dalam larutan  ditambahkan  partikel  yang  membawa  muatan  negatif maka  akan  terjadi  koagulasi/gel.  Selain  itu  ada  kemungkinan, tekstur biokapsul dengan bahan kitosan yang lebih keras, me- nyebabkan  saat  dilarutkan  kembali  dengan  garam  fisiologis steril  tidak  larut  secara  sempurna,  sehingga  jumlah  sel  yang terhitung lebih rendah.
Biokapsul yang berbahan baku karagenan mempunyai berat dan diameter yang lebih besar  sehingga menyebabkan jumlah sel  yang  terjerap  dalam  kapsul  lebih  banyak  dibandingkan biokapsul  yang  berbahan  baku  kitosan,  seperti  terlihat  pada Tabel  3.  Jumlah  sel  pada  biokapsul  kitosan  1.1  x  10 7 CFU/g sedangkan pada biokapsul karagenan 1.6 x 10 9 CFU/g. Menurut Mortazavian et al. (2007), biokapsul yang mempunyai berat dan diameter  lebih  besar  akan  mampu  menjerap  sel  mikroba  lebih banyak,  namun  juga  dapat  menyebabkan  struktur  biokapsul menjadi lembek. Selain itu, diameter biokapsul yang lebih besar kurang  baik  apabila  diaplikasikan  ke  produk  tertentu  seperti yoghurt  karena  ketika  di  mulut  akan  terasa  seperti  berpasir ( sandy ).

## Viabilitas/ketahanan sel pada pH rendah (pH 1.5)
Viabilitas sel pada biokapsul Lactobacillus acidophilus Dad 13  (CFU/g)  dengan  berbagai  jenis  bahan  pengkapsul  dan penambahan prebiotik dari berbagai sumber  setelah perlakuan pH  rendah  dapat  dilihat  pada  Tabel  4.  Berdasarkan  Tabel  4 diketahui bahwa penurunan jumlah sel karena pH rendah pada biokapsul karagenan lebih tinggi dibanding kitosan.
Sel  dalam  biokapsul  kitosan  dengan  penambahan  tepung sumber prebiotik mengalami penurunan viabilitas sekitar 4-5 log CFU/g.  Sedangkan sel dalam biokapsul karagenan mengalami penurunan  viabilitas  yang  lebih  tinggi  yaitu  sekitar  6-7  log CFU/g. Jumlah penurunan ketahanan terhadap pH rendah yang terjadi  pada  sel  dalam  biokapsul  karagenan,  hampir  sama
dengan penurunan ketahanan pada sel bebas yaitu sekitar 7 log CFU/g  (jumlah  sel  bebas  yang  tidak  dilindung)  sebelum perlakuan  pH  rendah  adalah  5.4  x  10 8 CFU/g  dan  setelah perlakuan  pH  rendah  menurun  menjadi  5.8  x  10 1 CFU/g). Diduga  hal  tersebut  disebabkan  oleh  struktur  kapsul  yang terbentuk  pada  karagenan  lebih  lunak  dibanding  kitosan, sehingga  asam  akan  lebih  mudah  masuk  ke  dalam  struktur kapsul dan menyebabkan kematian sel. Menurut Muthukumarasamy et al. (2006), viabilitas sel karena pH rendah dipengaruhi oleh jenis polimer dan tipe struktur jaringan kapsul yang  terbentuk  sedangkan  ukuran  kapsul  tidak  begitu  ber- pengaruh dalam melindungi sel terhadap asam.
Dari  Tabel  4  juga  diketahui  bahwa  penambahan  tepung sumber  prebiotik  dari  umbi  dahlia  pada  biokapsul  kitosan maupun karagenan menghasilkan penurunan jumlah sel paling kecil  (4.63  log  CFU/g  pada  kitosan  dan  6.93  log  CFU/g  pada karagenan).  Diduga  hal  itu  terjadi  karena  pada  umbi  dahlia terdapat  senyawa  prebiotik  inulin  yang  lebih  tinggi  (13%) dibanding  sumber  prebiotik  yang  lain  dan  dapat  masuk  ke dalam matriks kapsul serta menutupi pori-pori kapsul sehingga dapat menahan laju difusi asam.

## Viabilitas/ketahanan sel terhadap garam empedu
Hasil  analisis  viabilitas  sel  dalam  biokapsul Lactobacillus acidophilus Dad  13  dengan  berbagai  jenis  bahan  pengkapsul dan  penambahan  tepung  sumber  prebiotik  dari  berbagai tanaman  terhadap  garam  empedu  dapat  dilihat  pada  Tabel  5. Berdasarkan Tabel 5 dapat dilihat bahwa penambahan tepung sumber prebiotik dari kedelai pada biokapsul karagenan meng- hasilkan  penurunan  jumlah  sel  yang  paling  kecil  (0.23  log CFU/g).  Diduga  hal  itu  disebabkan  karena  tepung  sumber prebiotik dari kedelai lebih banyak mengandung pati dibanding dengan  tepung  sumber  prebiotik  yang  lain.  Menurut  And  dan Kailasapathy  (2005),  molekul  pati  mampu  masuk  ke  dalam matriks  kapsul  dan  menutupi  pori-pori  kapsul  sehingga  meng- hambat  terjadinya  difusi  asam  maupun  garam  empedu  ke dalam kapsul. Hal itu juga didukung oleh Muthukumarasamy et al .  (2006)  yang  mendapatkan  bahwa  penambahan  pati  pada alginat  dalam  proses  enkapsulasi  dapat  melindungi  sel Lactobacillus  reuteri lebih  baik  dibanding xanthan-gellan maupun karagenan- locust bean gum .
Tabel 4.  Viabilitas  sel  (CFU/g)  dalam  biokapsul Lactobacillus  acidophilus Dad  13  dengan  berbagai  jenis  bahan  pengkapsul  dan  penambahan tepung sumber prebiotik setelah perlakuan pada pH rendah
Tepung Sumber Prebiotik (P) dengan Konsentrasi 1.5% b/v Viabilitas Sel (CFU/g) dalam Biokapsul dengan Jenis Bahan Pengkapsul (A) dengan Konsentrasi 3.5% b/v A1 (Kitosan) A2 (Karagenan) Jumlah Sel Awal (CFU/g) Viabilitas pada pH Rendah (CFU/g) Penurunan Jumlah Sel karena pH Rendah ( log CFU/g) Jumlah Sel Awal (CFU/g) Viabilitas pada pH Rendah (CFU/g) Penurunan Jumlah Sel karena pH Rendah ( log CFU/g) P1 (umbi dahlia) 9.2 x 10 6 2.2 x 10 2a 4.63 a 1.4 x 10 9 1.7 x 10 2a 6.93 d P2 (bawang putih) 6.0 x 10 6 1.3 x 10 2a 4.67 a 1.6 x 10 9 7.8 x 10 1a 7.31 e P3 (kedelai) 1.7 x 10 7 6.8 x 10 1a 5.24 b 1.7 x 10 9 1.1 x 10 2a 7.19 e Tanpa penambahan tepung sumber prebiotik 4.0 x 10 7 8.2 x 10 1a 5.69 c 2.1 x 10 7 4.8 x 10 2a 4.65 a
Keterangan:  Rata-rata perlakuan yang diikuti dengan huruf yang berbeda pada kolom maupun baris menunjukkan adanya beda nyata pada uji jarak berganda Duncan pada tingkat kepercayaan 5%. Jumlah sel yang tidak dilindungi (sel bebas) sebelum perlakuan pH rendah adalah 5.4 x 10 8 CFU/g sedangkan setelah perlakuan pH  rendah jumlah selnya menjadi 5.8 x 10 1 CFU/g
Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012

## Biokapsul terbaik
Dilihat dari penurunan jumlah sel karena pH rendah (Tabel 4),  dapat  diketahui  bahwa  biokapsul  kitosan  dengan  pe- nambahan  tepung  sumber  prebiotik  dari  umbi  dahlia  me- ngalami  penurunan  jumlah  sel  yang  paling  sedikit  (4.63  log CFU/g)  dan  tidak  berbeda  nyata  dengan  penambahan  tepung sumber  prebiotik  dari  bawang  putih  (4.67  log  CFU/g).  Pe- nambahan  tepung  sumber  prebiotik  pada  karagenan  me- nyebabkan  menurunnya  ketahanan  sel  terhadap  pH  rendah (penurunan  jumlah  sel  sekitar  6-7  log  CFU/g)  dibanding  tanpa penambahan  tepung  sumber  prebiotik  (penurunan  jumlah  sel 4.65 log CFU/g). Diduga hal ini disebabkan karena penambah- an  tepung  sumber  prebiotik  pada  biokapsul  karagenan  dapat merubah  struktur  matriks  biokapsul  menjadi  lebih  lunak sehingga tidak dapat menahan difusi asam. Berdasarkan Tabel 5  juga  terlihat  bahwa  penurunan  jumlah  sel  terhadap  garam empedu  pada  biokapsul  kitosan  maupun  karagenan  dengan penambahan  tepung  sumber  prebiotik  lebih  rendah  (rata-rata kurang dari 1 siklus log).
Dilihat dari viabilitas sel terhadap garam empedu, biokapsul karagenan  yang  dibuat  dengan  penambahan  tepung  sumber prebiotik dari kedelai mempunyai ketahanan sel terhadap garam empedu  yang  paling  tinggi  (penurunan  jumlah  sel  terhadap garam empedu paling kecil yaitu 0.23 log CFU/g). Diduga, hal tersebut  disebabkan  karena  adanya  peranan  dari  tepung sumber  prebiotik  kedelai  yang  di  dalamnya  mengandung  pati yang  lebih  tinggi.  Menurut  And  dan  Kailasapathy  (2005), molekul  pati  mampu  masuk  ke  dalam  matriks  kapsul  dan menutupi  pori-pori  kapsul  sehingga  menghambat  terjadinya difusi asam maupun garam empedu ke dalam kapsul. Menurut Mortazavian et  al. (2007),  pati  juga  dapat  melapisi  atau memperbaiki pembentukan dinding kapsul.
Diduga  senyawa  prebiotik  yang  ada  pada  tepung  sumber prebiotik (inulin pada umbi dahlia, FOS pada bawang putih dan rafinosa  atau  stakhiosa  pada  kedelai)  tidak  begitu  banyak berperan  dalam  penelitian  ini  diperkirakan  karena  jumlahnya dalam matriks kapsul hanya sedikit. Menurut Gibson dan Rastall (2006), bawang putih mengandung FOS sekitar 16% (16 g/100 g  bahan),  umbi  dahlia  mengandung  inulin  13%  (13  g/100  g bahan) dan kedelai mengandung rafinosa dan stakhiosa sekitar 5%  (5  g/100  g  bahan).  Berdasarkan  hal  tersebut,  diperkirakan
bahwa  dalam  1.5%  (1.5  g/100  ml  larutan  pengkapsul)  tepung sumber  prebiotik  yang  ditambahkan,  untuk  100  ml  larutan pengkapsul  hanya  terdapat  0.24  g  FOS  dari  tepung  sumber prebiotik  bawang  putih,  0.195  g  inulin  dari  tepung  sumber prebiotik  umbi  dahlia,  dan  0.075  g  rafinosa/stakhiosa  dari tepung  sumber  prebiotik  kedelai.  Apabila  jumlah  senyawa prebiotik  yang  ditambahkan  mencukupi  (1-3%  b/v),  pe- nambahan prebiotik dalam proses enkapsulasi dapat berperan memperbaiki porositas matriks biokapsul sehingga dapat mem- perkuat  kekukuhan  gel  (Anal  dan  Singh,  2007;  Mortazavian et al. 2007).
Penambahan  tepung  sumber  prebiotik  dari  bahan  bawang putih  menyebabkan  timbulnya  bau  yang  sangat  tajam  pada biokapsul  yang  dihasilkan  sehingga  apabila  diaplikasikan  ke produk minuman akan menimbulkan flavor yang kurang sedap.

## KESIMPULAN
Jenis  bahan  pengkapsul  berpengaruh  terhadap  berat, diameter, jumlah sel, dan ketahanan terhadap garam empedu, namun tidak berpengaruh pada ketahanan terhadap pH rendah. Penambahan  tepung  sumber  prebiotik  pada  biokapsul  ber- pengaruh terhadap berat dan diameter biokapsul, namun tidak berpengaruh  pada  jumlah  sel  dalam  kapsul  serta  ketahanan terhadap pH rendah dan garam empedu. Penambahan tepung sumber  prebiotik  dari  umbi  dahlia,  kedelai,  dan  bawang  putih pada  biokapsul  kitosan  maupun  karagenan  mampu  mening- katkan jumlah sel dalam kapsul sebanyak satu log. Karakteristik biokapsul  kitosan  yang  dibuat  dengan  penambahan  tepung sumber  prebiotik  mempunyai  berat  dan  diameter  yang  lebih kecil  serta  penurunan  jumlah  sel  terhadap  pH  rendah  lebih sedikit  (antara  4.63-5.24  log  CFU/g)  dibanding  karagenan (antara  6.93-7.19  log  CFU/g).  Penurunan  jumlah  sel  biokapsul kitosan  dan  karagenan  terhadap  garam  empedu  keduanya kurang dari 1.5 log CFU/g. Berdasarkan penurunan jumlah sel terhadap  pH  rendah,  biokapsul  dengan  penurunan  jumlah  sel paling  sedikit  dihasilkan  oleh  pada  biokapsul  kitosan  dengan penambahan tepung sumber prebiotik dari umbi dahlia.
Tabel 5.  Viabilitas sel (CFU/g) dalam biokapsul Lactobacillus Dad 13 dengan berbagai jenis bahan pengkapsul dan penambahan tepung sumber prebiotik dari berbagai tanaman setelah perlakuan pada garam empedu
Tepung Sumber Prebiotik (P) dengan Konsentrasi 1.5% b/v Jenis Bahan Pengkapsul (A) dengan Konsentrasi 3.5% b/v A1 (Kitosan) A2 (Karagenan) Jumlah Sel Awal (CFU/g) Viabilitas pada Garam Empedu (CFU/g) Penurunan Jumlah Sel karena Garam Empedu (log CFU/g) Jumlah Sel Awal (CFU/g) Viabilitas pada Garam Empedu (CFU/g) Penurunan Jumlah Sel karena Garam Empedu (log CFU/g) P1 (umbi dahlia) 9.2 x 10 6 7.4 x 10 5b 1.09 a 1.4 x 10 9 9.4 x 10 7a 1.18 b P2 (bawang putih) 6.0 x 10 6 1.7 x 10 6b 0.54 a 1.6 x 10 9 8.5 x 10 7a 1.27 b P3 (kedelai) 1.7 x 10 7 1.8 x 10 6b 0.81 a 1.7 x 10 9 9.9 x 10 8a 0.23 a Tanpa penambahan tepung sumber prebiotik 4.0 x 10 7 3.8 x 10 5b 2.02 b 2.1 x 10 7 1.5 x 10 6a 1.15 b
Keterangan:  Rata-rata  perlakuan  yang  diikuti  dengan  huruf  yang  berbeda  pada  kolom  maupun  baris  menunjukkan  adanya  beda  nyata  pada uji  jarak  berganda Duncan  pada  tingkat  kepercayaan  5%.  Jumlah  sel  yang  tidak  dilindungi  (sel  bebas)  sebelum  perlakuan  garam  empedu  adalah  5.4  x  10 8 CFU/g sedangkan setelah perlakuan garam empedu jumlah selnya menjadi 1.7 x 10 7 CFU/g

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis  mengucapkan  terima  kasih  kepada:  Direktorat Jenderal  Dikti  yang  telah  membiayai  penelitian  ini  melalui proyek  Hibah  Bersaing  dengan  nomor  kontrak:  166/SP2H/PP/ DP2M/III/2008 tanggal 6 Maret 2008, Prof.Dr. Endang Sutriswati Rahayu  dan  Prof.Dr.  Eni  Harmayani  yang  telah  mengijinkan penulis  untuk  menggunakan  isolat Lactobacillus  acidophilus Dad 13 yang merupakan kultur koleksi dari FNCC PAU Pangan dan  Gizi  Universitas  Gadjah  Mada,  dan  Sdr.  Predikus  Dino  T. yang telah membantu dalam pelaksanaan penelitian.

## DAFTAR PUSTAKA
Akhiar  NSAM.  2010.  Enhancement  of  probiotics  survival  by microencapsulation  with  alginate  and  prebiotics.  Basic Biotechnol 6: 13-18.
Anal  AK,  Singh  H.  2007.  Recent  advances  in  micro- encapsulation  of  probiotics  for  industrial  applications  and targeted  delivery.  Trends  in  Food  Sci  Tech  18:  240-251. DOI: 10.1016/j.tifs.2007.01.004.
And  CI,  Kailasapathy  K.  2005.  Effect  of  co-encapsulation  of probiotics  with  prebiotics  on  increasing  the  viability  of encapsulated  bacteria  under in  vitro acidic  and  bile  salt conditions  and  in  yoghurt.  J  Food  Sci  70:  M18-M23. DOI: 10.1111/j.1365-2621.2005.tb09041.x.
Aranaz I, Mengibar M, Harris R, Panos I, Miralles B, Acosta N, Galed  G,  Heras  A.  2009.  Functional  characterization  of chitin  and  chitosan.  Current  Chem  Biol  3:  203–230. DOI: 10.2174/187231309788166415.
Bernal BH, Calle J, Duarte ED, Pinzon R, Velasques M. 2005. Inulin  from  tuber  of Dahlia  imperialis roetz.  Rev  Col  Cipuc Quim Farm 34: 122-125.
Burgain J, Gaiani C, Linder M, Scher J. 2011. Encapsulation of probiotic  living  cells:  from  laboratory  scale  to  industrial applications.  J  Food  Eng  104:  467-483. DOI:  10.1016/j. jfoodeng.2010.12.031.
Capela P, Hay TKC, Shah NP. 2006. Effect of cryoprotectans, prebiotics  and  microencapsulation  on  survival  of  probiotic organism in yoghurt and freeze-dried yoghurt. Food Res Int 39: 203-211. DOI: 10.1016/j.foodres.2005.07.007.
Chan  SW,  Mirhosseini  SH,  Farah  ST,  Tan  CP.  2011. Comparative study on physical properties of Κ-carrageenan extracted  from Eucheuma  cottonii in  Tawau,  Sabah  and commercial κ-carrageenan. LSP 18: 310-317.
Chavarri M, Maranon I, Ares R, Ibanez FC, Marzo F, Villaran M del C. 2010. Microencapsulation of a probiotic and prebiotic in alginat-chitosan capsules improves survival in stimulated gastro-intestinal  conditions.  Int  J  Food  Microbiol  142:  185- 189. DOI: 10.1016/j.ijfoodmicro.2010.06.022.
Chen  KN,  Chen  MJ,  Liu  JR,  Lin  CW,  Chiu  HY.  2005. Optimization of incorporated prebiotics as coating materials for  probiotic  microencapsulation.  J  Food  Sci  70:  M260- M266. DOI: 10.1111/j.1365-2621.2005.tb09981.x.
Cho  SS,  Finocchiaro  ET.  2010.  Handbook  of  Prebiotics  and Probiotics Ingredients. Health Benefit and Food Application. 13-139. CRC Press, New York.
Gbassi  GK,  Vandamme  T.  2012.  Probiotic  encapsulation technology: from microencapsulation to release into the gut. Pharmaceutics  4:  149-163. DOI:  10.3390/Pharmaceutics 4010149.
Gibson  GR,  Rastall  RA.  2006.  Prebiotic:  Development  and Applications. 1-28. John-Wiley & Son, New York.
Glibowski P, Bukowska A. 2011. The effect of pH, temperature, and  heating  time  on  inulin  chemical  stability.  Acta  Sci  Pol Technol Aliment 10: 189-196
Grosso  CRF,  Favaro-Trindade  CS.  2004.  Stability  of  free  and immobilized Lactobacillus  acidophilus and Bifidobacterium lactis in acidified milk and of immobilized B. lactis in yoghurt. Braz  J  Microbiol  35:  1-11. DOI:  10.1590/S1517- 83822004000100025.
Honary  S,  Maleki  M,  Karami  M.  2009.  The  effect  of  chitosan molecular  weight  on  the  properties  of  alginate/chitosan microparticles containing prednisolone. Trop J Pham Res 8: 53-61.
Hou RC, Lin MY, Wang MM, Tzen JT. 2003. Increase of viability of entrapped cells of Lactobacillus delbruekii ssp. Bulgaricus in artificial sesame oil emulsion. J Dairy Sci 86: 424-428.
Islam MA, Yun CH, Choi YJ, Cho CS. 2010. Microencapsulation of live probiotic bacteria. J Microbiol Biotech 20: 1367-1377. DOI: 10.4014/jmb.1003.03020.
Ivanovska TP, Petrusevska-Toji L, Kostoska MKD, Geskovski N, Grozdanov  A,  Stain  C,  Stafilov  T,  Mladenovska  K.  2012. Microencapsulation  of Lactobacillus  casei in  chitosan-Ca- alginat  microparticles  using  spray  drying  method.  Maced  J Chem Chem Eng 31: 115–123.
Janaswamy S, Chandrasekaran R. 2002. Effect of calcium ions on  the  organization  of  iota-carrageenan  helices:  an  X-ray investigation.  Carbohyd  Res  337:  523–535. DOI:  10.1016/ S0008-6215(02)00017-4.
Kara S, Arda E, Kavzak B, Pekcan Ö. 2006. Phase transitions of  K-carrageenan  gels  in  various  types  of  salts.  J  Appl Polym Sci 102: 3008–3016. DOI: 10.1002/app.24662.
Lestari LA, Harmayani E, Marsono Y. 2003. Supplementation of indigenous probiotic bacteria into yoghurt. Indonesian Food and Nutrition Progress 10: 34-39.
Le-Tien C, Millette M, Mateescu MA, Lacroix M. 2004. Modified alginate and chitosan for lactic acid bacteria immobilization. Biotechnol Appl Biochem 39: 347-354.
Moongngram  A,  Trachoo  N,  Sirigungwan  N.  2011.  Low molecular  weight  carbohydrates,  prebiotic  content  and prebiotic activity of selected food plants in Thailand. Adv J Food Sci Technol 3: 269-274.
Mortazavian  A,  Razavi  SH,  Ehsani  MR,  Sohrabvandi  S.  2007. Principle  and  methods  of  microencapsulation  of  probiotic microorganisms. Iranian J of Biotechnol 5: 1-18.
Muthukumarasamy P, Allan-Wojtas P, Holley RA. 2006. Stability of Lactobacillus reuteri in different type of microcapsules. J Food  Sci  71:  M20-M24.  DOI: 10.1111/j.1365-2621.2006. tb12395.x.
Ngatirah,  Harmayani  E,  Rahayu  ES,  Utami  T.  2000.  Bakteri Asam  Laktat  sebagai  Agensia  Probiotik  yang  Berpotensi menurunkan Kolesterol. Proseding Seminar Nasional PATPI di Surabaya 10-11 Oktober 2000.
Ngatirah,  Ulfah  M.  2006.  Enkapsulasi  Probiotik  Menggunakan Alginat  dan  Khitosan  untuk  Meningkatkan  Viabilitasnya [Laporan  Dosen  Muda].  Yogyakarta:  Fakultas  Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Stiper Yogyakarta.
Ouyang  W,  Chen  H,  Jones  ML,  Metz  T,  Haque  T,  Martoni  C, Prakash S. 2004. Artificial cell microcapsule for oral delivery a live bacterial cells for therapy: design, preparation and in vitro characterization. J Pharm Pharmaceut Sci 7: 315–324. Patel  S,  Goyal  A.  2012.  The  current  trends  and  future perspectives  of  prebiotics  research:  a  review.  Biotech  2: 115-125. DOI: 10.1007/s13205-012-0044-x.
Petrovic  T,  Nedovic  V,  Brankovic  SD,  Bugarski  B,  Lacroix  C. 2007.  Protection  of  probiotic  microorganism  by  micro- encapsulation. CI & CEQ 13: 169-174.
Roberfroid  M.  2007.  Prebiotics:  the  concept  revisited.  J  Nutr 137: 830S-837S.
Shah  NP.  2004.  Probiotics  and  Prebiotics.    Agrofood  Industry Hi-tech. January/February
Shafiei Y, Razavilar V, Javadi A, Mirzaei H. 2012. Survivability of free and microencapsulated Lactobacillus plantarum with alginat  and  resistant  starch  in  simulated  gastrointestinal conditions. J Food Agric Environ 10: 207-212.
Tsen  JH,  Lin  YP,  King  VAE.  2004.  Fermentation  of  banana media  by  using  K-carragenan  immobilized Lactobacillus acidophilus .  Int  J  Food  Microbiol  91:  215–220. DOI: 10.1016/S0168-1605(03)00376-3.
Vidhyalakshmi  R,  Bhakyaraj  R,  Subhasree  RS.  2009. Encapsulation: the future of probiotics-a review. Advan Biol Res 3: 96-103.
Widodo, Soeparno, Wahyuni E. 2003. Bioenkapsulasi probiotik ( Lactobacillus casei ) dengan pollard dan tepung terigu serta pengaruhnya  terhadap  viabilitas  dan  laju  pengasaman.  J Teknol dan Industri Pangan 14: 98-106.
William RB, Harper AR. 2010. Carragenan. In Imerson A. (ed). Food Stabilizer, Thickener and Gelling Agent. 73-88. Wiley- Blackwell Publishing Ltd, Oxford England.