## UNPAD

## POTENTIAL OF RED BETEL LEAVES ( Piper crocatum ) AS TYROSINASE INHIBITOR IN SILICO AND IN VITRO
Syahrul Mustopa 1 , Mega Safithri 1* , Laksmi Ambarsari 1
1Department of Biochemistry, Faculty of Sciences and Mathematics, IPB University, West Java, Indonesia Submitted 26 August 2022; Revised 11 November 2022; Accepted 12 November 2022; Published 01 February 2024 *Corresponding author: safithri@apps.ipb.ac.id

## Abstract
Melasma is a pigmentation disorder caused by excess melanin synthesis in the form of brown patches around the face or neck. Melasma can affect all racial groups, especially areas with high ultraviolet radiation. Substances that are often used to prevent hyperpigmentation are kojic acid, azelic acid and mercury, but these substances are carcinogenic if used continuously. Red betel ( Piper crocatum ) has active compounds that act as antioxidants such as flavonoids and phenols. This study aims to determine the potential of the active compound of red betel leaves against tyrosinase inhibition. This research was conducted using in silico and in vitro methods. The receptors used were tyrosinase with PDB code 5M8O, tropolone as native ligand, and kojic acid as comparison ligand. A total of 34 active compounds of red betel leaf from LC-MS and GC-MS analysis were used as test ligands. Molecular docking was performed using AutoDock Vina and AutoDock Tools, and visualized using Ligplot + and PyMOL. In vitro tyrosinase inhibition used the tyrosinase activity assay kit ab252899 and kojic acid as a positive control. The catechin compound has the smallest binding free energy (ΔG), which is −6.7 kcal/mol, and the kinetics of inhibition is 12.12 M. In vitro test results, the water fraction has the largest tyrosinase inhibitory activity of 84.84% and kojic acid has an activity of 82.47%.
Keywords: Hiperpigmentation, Melasm, Molecular docking, Piper crocatum , Tyrosinase
Potensi Daun Sirih Merah ( Piper crocatum ) Sebagai Inhibitor Tirosinase Secara In silico dan In vitro

## Abstrak
Melasma adalah kelainan pigmentasi yang diakibatkan sintesis melanin berlebih berupa bercak cokelat disekitar wajah atau leher. Melasma dapat mengenai semua kelompok ras, terutama daerah dengan radiasi ultraviolet tinggi. Zat yang sering digunakan untuk mencegah hiperpigmentasi adalah asam kojat,  asam  azelat,  dan  merkuri,  akan  tetapi  zat  tersebut  bersifat  karsinogen  jika  digunakan  terus menerus. Sirih merah ( Piper crocatum ) memiliki senyawa aktif yang berperan sebagai antioksidan seperti flavonoid  dan  fenol.  Penelitian ini bertujuan untuk  mengetahui potensi  senyawa  aktif daun sirih merah terhadap penghambatan tirosinase. Penelitian ini dilakukan dengan metode in silico dan in vitro . Reseptor yang digunakan adalah tirosinase dengan kode PDB 5M8O, tropolon sebagai native ligand , dan asam kojat sebagai ligan pembanding. Sebanyak 34 senyawa aktif daun sirih merah hasil analisis LC-MS dan GC-MS digunakan sebagai ligan uji. Penambatan molekuler dilakukan dengan menggunakan AutoDock Vina dan AutoDock Tools, serta  divisualisasikan  menggunakan  Ligplot + dan  PyMOL.  Penghambatan  tirosinase  secara in vitro menggunakan  kit tyrosinase activity assay ab252899 dan asam kojat sebagai kontrol positif. Senyawa katekin memiliki energi bebas pengikatan (ΔG) terkecil, yaitu −6,7 kkal/mol, dan kinetika inhibisi sebesar 12,12 µM. Hasil pengujian in vitro , fraksi air memiliki aktivitas inhibisi tirosinase terbesar yaitu 84,84% dan asam kojat memiliki aktivitas sebesar 82,47%.
Kata Kunci: Hiperpigmentasi, Melasma, Penambatan molekuler, Piper crocatum , Tirosinase

## 1.  Pendahuluan
Kulit  merupakan  bagian  tubuh  terluar yang  berfungsi  sebagai  pelindung  utama dari paparan sinar ultraviolet. Melasma atau kloasma dikenal  juga  dengan  istilah  topeng kehamilan karena angka kasusnya meningkat pada wanita hamil. Prevalensi melasma pada populasi  Hispatik  di Amerika  mencapai  9% dan  di  Asia  tenggara  mencapai  40%  dari populasi. 1 Melasma disebabkan karena melanin diproduksi secara berlebihan berlebihan atau dikenal sebagai hiperpigmentasi. Enzim yang berperan  dalam  biosintesis  melanin  adalah tirosinase, sehingga enzim tersebut memiliki peranan  sangat  penting  dalam  proses pigmentasi. 2 Tirosinase  berperan  penting dalam  2  rekasi,  yaitu  hidroksilasi  L-Tirosin menjadi  L-DOPA  dan  oksidasi  L-DOPA menjadi  dopakuinon,  Senyawa  dopakuinon berpolimerasi  membentuk  dopakrom  yang kemudian membentuk pigmen melanin. 3
Senyawa  aktif  yang  berasal  dari alam  serta  memiliki  aktivitas  inhibitor tirosinase  adalah  dari  golongan  flavanoid, seperti  kuersetin,  mirisetin,  kaempferol, dari  golongan  isoflavon,  flavonol,  dan stilbenoid. 4 Alternatif  inhibitor  tirosinase berbahan  alam  sangat  dibutuhkan,  terlebih tanaman  di  Indonesia  sangat  berlimpah keanekaragamannya.  Tanaman  di  Indonesia yang  berlimpah  dan  banyak  dikenal masyarakat  Indonesia  diantaranya  adalah sirih  merah  ( Piper crocatum ).  Senyawa columbin dan schisandrin yang terdapat pada fraksi  etil  asetat  daun  sirih  merah  memiliki aktivitas  inhibitor  terhadap  α-glukosidase secara in silico . 5 Ekstrak  dan  fraksi  daun sirih  merah  juga  memiliki  aktivitas  sebagai inhibitor HMG-KoA reduktase secara in silico dan  dapat  menghambat  reaksi  pembentukan MDA  (malondialdehida)  secara in vitro , 6 dan  memiliki  aktivitas  penghambatan asetilkolinesterase secara in silico . 7 Inhibitor  tirosinase  sangat  dibutuhkan untuk  kepentingan  industri  kecantikan dan  juga  dunia  medis  dalam  mencegah terbentuknya Reaction Oxygen Species (ROS) sebagai  radikal  bebas. 8 Senyawa  aktif  yang sudah dimanfaatkan indutri kosmetik sebagai inhibitor  tirosinase  diantaranya  adalah
hidrokuinon,  tropolon,  asam  azelat,  merkuri dan  asam  kojat,  akan  tetapi  penggunaan senyawa  tersebut  memiliki  efek  yang berbahaya bagi tubuh dan asam kojat dalam konsentrasi tinggi bersifat hepatokarsinogen, menyebabkan  eritemia  dan  dermatitis 9 dan hidrokuinon  dapat  menyebabkan  inflamasi disekitar  kelenjar  sebaceous  dan  folikel rambut. 10 Penelitian  ini  bertujuan  untuk mengetahui potensi senyawa aktif daun sirih merah  sebagai  inhibitor  tirosinase  secara in silico dan in vitro . Parameter yang dianalisis pada in silico adalah  nilai  energi  bebas pengikatan  (ΔG),  nilai  konstanta  inhibisi (Ki), jenis ikatan dan jarak ikatan yang terjadi antara reseptor dengan ligan.

## 2.  Metode
2.1.  Alat Alat  yang  digunakan  pada  penelitian in silico adalah personal computer dengan spesifikasi processor AMD  E1,  memori
RAM  4GB,  piranti  lunak MarvinView 6.0.0,  BIOVIA  Discovery  Studio  Visualizer v16.1.0.15350, AutoDockTools -1.5.68,
Ligplot + dan  PyMOL (TM) 1.7.4.5  Edu.  Alat yang  digunakan  pada  penelitian in vitro adalah  vorteks,  desikator,  tabung  Effendorf, microplate 96 well , SPECTROstar nano BMG Labtech , mikropipet multichannel dan syringe injector 5 mL.
2.2.  Bahan Bahan  yang  digunakan  pada in silico adalah reseptor tirosinase dengan kode PDB 5M8O,  tropolon  sebagai native ligand ,  dan asam  kojat  sebagai  pembanding.  Ligan  uji yang digunakan adalah 34 struktur 3D senyawa aktif  daun  sirih  merah  ( Piper crocatum ) hasil  analisis Liquid Chromatography- Mass Spectroscopy (LC-MS) 11,12,13 dan  Gas Chromatography-Mass Spectroscopy (GC- MS) 14,15 pada  penelitian  sebelumnya.  Bahan yang  digunakan  pada  penelitian  secara in vitro adalah  ekstrak  dan  fraksi  (n-heksana, etil asetat dan air) daun sirih merah, DMSO, asam  kojat  dan tyrosinase activity assay kit Ab252899.
2.3.  Metode

## 2.3.1. Preparasi Ligan dan Analisi Stabilitas
Reseptor Struktur  3D  ligan  uji  diunduh  dari https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ dan disimpan  dalam  format  sdf,  kemudian dikonversi menjadi format pdb menggunakan MarvinView 6.0.0.  Struktur  3D  Reseptor enzim  tirosinase  diunduh  dari  laman PDB https://www.rcsb.org/ dengan  kode PDB  5M8O  dalam  format  PDB.  Reseptor memiliki  4  rantai  yang  sama.  Preparasi ligan dilakukan dengan menambahkan atom hidrogen  polar  menggunakan Discovery Studio Visualizaer v16.1.0.15350  dan  rotasi ikatan menggunakan piranti AutoDock Tools v.1.5.6.  Preparasi  reseptor  menggunakan piranti BIOVIA DSV v16.1.0.15350 dengan menghilangkan molekul air, hetero atom dan ligan alami. File pdbqt reseptor ditambahkan atom  hidrogen  polar,  dan Gesteiger partial charges menggunakan  piranti AutoDock Tools v.1.5.616. Analisis plot Ramachandran dilakukan dengan cara mengunggah struktur 3D  reseptor  dalam  format  PDB  pada  laman http://servicesn.mbi.ucla.edu/ kemudian dipilih “ run procheck ” dan plot Ramachandran hasil analisis disimpan dalam format PDF. 17
2.3.2. Validasi Gridbox dan Penapisan Virtual Validasi gridbox dilakukan dengan cara menentukan  area  penambatan  menggunakan AutoDock Tools v.1.5.6.  Zona gridbox diperoleh  size  x,  y  dan  z  secara  berurutan 14×14×14 dengan center_x -13.194, center_y 2.661  dan  center_z  -24.972  serta  jarak antaratom 1 Å. Validasi penambatan dilakukan 20 kali ulangan hingga mendapatkan RMSD ≤ 2Å16. Sebanyak 34 ligan uji , tropolon dan asam kojat ditambatkan pada reseptor secara bersamaan  menggunakan  PyRx  0.8.  Ligan ditambatkan pada area gridbox hasil validasi. Nilai energi bebas pengikatan (ΔG) yang lebih rendah dari tropolon akan ditambatkan secara molekuler menggunakan AutodockTools. 18

## 2.3.3. Penambatan  Ligan  Uji  dan  Analisis
Hasil Ligan yang lolos penapisan virtual dan reseptor  yang  sudah  dipreparasi  disimpan dalam  format  *.pdbqt,  kemudian  disalin
ke  folder  Vina.  Program AutoDock Vina dijalankan melalui Command Prompt (CMD). Perintah pemograman yang dijalankan yaitu “vina    --config  conf.txt  --log  log.txt”.  Hasil penambatan  molekuler  berupa  file  output dalam  format  *.pdbqt  dan  file  log  yang berisi  informasi  enegi  afinitas  dan  RMSD dalam format txt. 19 Analisis hasil penambatan berupa  nilai  ΔG  dan  menghitung  konstanta inhibisi  (Ki)  yang  diperoleh  dari  persamaan ΔG = − R×T×In Ki, dengan keterangan ΔG = energi bebas Gibbs (kkal/mol), R = konstanta gas universal (1.986 kal/molK) dan T = suhu (Kelvin). Ligan yang tertambat pada reseptor divisualisasikan  2D  menggunakan  Ligplot + dan 3D menggunakan PyMOL. 20
2.3.4. Prediksi Toksisitas Ligan Prediksi  toksisitas  dilakukan  dengan cara  diunggah  struktur  SMILES  ligan pada http://biosig.unimel.edu.au/pkcsm/ prediction ,  kemudian  klik  ‘ADMET’. Parameter yang prediksi adalah permeabilitas dan  sensitifitas  pada  kulit, 21 sedangkan prediksi  inhibisi  herG,  toksisitas  oral  akut dan karsinogenitas dengan cara diunggah di http://lmmd.ecust.educn/admestar1 . 22
2.3.5. Uji Inhibisi Tirosinase Uji  inhibisi  tirosinase  dilakukan menggunakan  kit  uji  aktivitas  tirosinase Ab252899  (kolorimetri).  Sampel  terdiri atas  ekstrak  etanol,  fraksi  etil  asetat,  fraksi n-heksana,  dan  fraksi  air  daun  sirih  merah. Sampel  dibuatkan  10.000  ppm  dalam  2 mL,  sedangkan  asam  kojat  (kontrol  positif) dibuatkan  pada  1000  ppm.  Pemilihan konsentrasi asam kojat dikarenakan memiliki aktivitas  sangat  kuat  sebagai  inhibitor tirosinase, 23 sedangkan pemilihan konsentrasi 10000  ppm  pada  ekstrak/fraksi  bertujuan untuk  mendeteksi  potensi  awal  sampel sirih  merah  yang  memiliki  aktivitas  inhibisi tirosinase.  Sebanyak  5  µL enhancer dan  50 µL ddH2O dimasukkan ke dalam mikroplate 1,  kemudian  sebanyak  43  µL  buffer  dan  2 µL  enzim  dimasukkan  kedalam  mikroplate 2,  kedua  campuran  tersebut  digabungkan. Larutan tersebut sebagai sample background control (SBC).  Sebanyak  5  µL enhancer ,
10 µL substrat tirosinase dan 50 µL sampel dimasukkan  kedalam  mikroplate  1  dan sebanyak  33  µL buffer dan  2  µL  enzim dimasukkan  kedalam  mikroplate  2,  kedua campuran  tersebut  digabungkan  secara bersamaan dengan menggunakan mikropipet multichannel .  Sampel  diinkubasi  pada  suhu kamar  selama  10  menit  di  ruangan  gelap dan  diukur  absorbansinya  pada  λ  509  nm menggunakan SPECTROstar nano BMG Labtech .  Sampel  dilakukan  pengujian sebanyak tiga kali ulangan. 24
3. Hasil 3.1.  Preparasi Ligan dan Reseptor Sebanyak 34 struktur 3D ligan uji hasil analisis  LC-MS  dan  GC-MS  dipreparasi dengan  cara  menambahkan  ion  hidrogen. Reseptor  yang  digunakan  pada  penelitian ini  adalah  enzim  tirosinase  dengan  kode PDB  5M8O.  Reseptor  diperoleh  dari  basis data  RCSB  PDB.  Residu  asam  amino  pada reseptor  5M8O  berjumlah  446  dan  ikut tertambat  senyawa  tropolon  ( native ligand ). Stabilitas  reseptor  ditentukan  berdasarkan
plot Ramachandran dan resolusi kristalografi. Hasil  plot  Ramachandran  menunjukkan bahwa 85.5% residu asam amino berada pada kuadran I, 14% berada pada kuadran II, 0.3% berada  pada  kuadran  III  dan  0.3%  berada pada kuadran IV (Gambar 1).
Plot Ramachandran merupakan diagram  dua  dimensi  yang  berisi  plot  asam amino berdasarkan torsi putaran phi (ɸ) dan psi (ѱ). Rantai utama ikatan N-Cα dan Cα-C pada polipeptida relatif berputar secara bebas, dan  rotasi  tersebut  disebut  dengan  torsi  phi dan psi. 25
3.2.  Validasi  area gridbox dan  penapisan virtual Validasi area gridbox adalah penambatan  kembali  ( redocking )  tropolon pada  reseptor  untuk  mengetahui  ukuran gridbox, nilai RMSD dan sisi aktif reseptor. Validasi  area  penambatan  didapatkan  zona gridbox size x, y, dan z adalah 14×14×14 dan center_x  =  -13.194,  center_y  =  2.661  dan center_z = -24.972 dengan jarak 1 Å dengan nilai RMSD rata-rata 0.9962 Å dan ΔG rata-
Gambar  1. Plot  Ramachandran  tirosinase (kode  PDB:  5M8O)  (sumber: https://saves.mbi.ucla.edu/ results?job=1062217&p=procheck ) Gambar 2. Visualisasi (a) reseptor tirosinase; (b)  tropolon;  (c)  tropolon redocking  (biru)  dengan  tropolon native ligand (kuning)
A
B C
rata sebesar -5.4 kkal/mol. Sebanyak 34 ligan uji ditambatkan pada reseptor dan didapatkan hasil ΔG yang bervariasi. Terdapat 9 ligan uji yang lolos penapisan virtual dengan kriteria memiliki  ΔG  lebih  rendah  dari  tropolon, yaitu sebesar -5.4 kkal/mol. Kesebelas ligan tersebut  adalah  katekin,  3-(3,4  dimetilfenil) asam  propionat,  asam  protokatekuat,  L-(+) arginin  hidroklorida,  1-amino-1,3,5  triazin- 2-yl)  glisinat  dihidroklorida,  metoksiindol, N1-(5-metilisoxazol-3-yl)  etana  diamida, limonen,  terpinen-4-ol,  metil  eugenol,  dan sineol.
3.3.  Penambatan  Ligan  Uji  dan  Analisis hasil Penambatan  molekul  dilakukan  untuk mengidentifikasi  potensi  penghambatan senyawa  aktif  pada  daun  sirih  merah.  Hasil penambatan  molekuler  diperoleh  nilai  ΔG, konstanta  inhibisi  (Ki)  dan  divisualisasikan secara 2D dan 3D. Nilai ΔG dan Ki merupakan parameter  daya  inhibisi  ligan  terhadap reseptor. Visualisasi 2D menunjukkan residu asam  amino  yang  berinteraksi  dengan  ligan membentuk  ikatan  hidrogen  dan  interaksi hidrofobik.  Nilai  ΔG  terendah  didapatkan pada katekin, sebesar -6,7 kkal/mol dan nilai Ki sebesar 12,12 µM. Nilai ΔG dan Ki terkecil diperoleh  dari  ligan  sineol  secara  berurutan sebesar -5.4 kkal/mol dan 108,99 µM. Nilai ΔG  dan  Ki  berbanding  lurus,  semakin  kecil energi  afinitas  (ΔG)  maka  ligan  semakin mudah untuk menghambat kinerja enzim.
3.4.  Toksisitas Ligan Uji Analisis  bioavaibilitas  ligan  uji berdasarkan aturan Lipinski untuk mengetahui kriteria  senyawa  kandidat  obat  yang  ideal. Ligan  uji  yang  lolos  penapisan  virtual dianalisis  bioavaibilitas-nya.  Semua  ligan uji memenuhi kriteria sesuai aturan Lipinski. Ligan yang memiliki bioavaibilitas yang baik tidak lebih dari dua kriteria yang dilanggar. 22 Prediksi toksisitas ligan berdasarkan ADMET ( absorption, distribution, metabolism, excretion and toxicity ),  permeabilitas  dan sensitivitas  terhadap  kulit.  Semua  ligan  uji, tropolon  dan  asam  kojat  bersifat  inhibitor lemah, non karsinogen dan non toksik. Ligan yang  menyebabkan  sensitif  terhadap  kulit adalah  terpinen-4-ol,  sineol  dan  tropolon (ligan alami).

## 4. Pembahasan
4.1.  Ligan dan Stabilitas Reseptor Ligan uji merupakan senyawa bioaktif yang  terdapat  pada  daun  sirih  merah. Senyawa  tropolon  berperan  sebagai  ligan alami  yang  sudah  tertambat  pada  reseptor, dan  asam  kojat  sebagai  ligan  pembanding. Preparasi  ligan  uji,  ligan  alami  dan  ligan pembanding  dilakukan  dengan  tujuan  untuk menghitung  energi  interaksi  antara  ligan dan  reseptor  sehingga  dapat  menghasilkan fleksibilitas ligan dengan menambah jumlah ikatan  yang  dapat  diputar  oleh  ligan. 26 Reseptor enzim tirosinase merupakan enzim
Tabel 1. Energi bebas pengikatan ligan dengan reseptor Ligan Energi Bebas Pengikatan (kkal/mol) Ki (µM) Tropolon -5,4 108,99 Asam Kojat -5,7 65,65 Katekin -6,7 12.,12 3-(3,4 dimetilfenil) asam propionat -5,9 46,82 Asam protokatekuat -6,2 28,20 L-(+) Arginin hidroklorida -5,8 55,44 1-amino-3-(aminooxy)-2-propanyl  N-(4,6-diamino-1,3,5  triazin-2- yl) glisinat dihidroklorida -6,3 23,82 Metoksi indol -5,6 77,73 N1-(5-methylisoxazol-3-yl)ethanediamide -6,6 14,34 Terpinen-4-ol -5,6 77,73 Sineol -5,4 108,99
yang memiliki empat subunit yang sama (A, B,  C  dan  D),  sehingga  pada  penelitian  ini hanya menggunakan subunit A saja (gambar 1a  dan  1b).  Reseptor  tidak  terdapat  mutasi, dikristalisasi berasal dari manusia, memiliki 446 residu asam amino dan nilai resolusinya 2.5 Å. Reseptor memiliki kualitas yang baik dan  dapat  digunakan  untuk  docking  adalah reseptor yang memiliki nilai resolusi kurang atau  sama  dengan  2,5. 27 Analisis  stabilitas reseptor  berdasarkan  plot  Ramachandran menunjukkan  bahwa  reseptor  5M8O  residu asam  amino  sebagian  besar  berada  pada kuadran  I  dan  II,  yang  merupakan  daerah disukai, sedangkan pada kuadran IV banyak tersebar  glisin  dan  terdapat  asam  amino Leu376.  Suatu  protein  dinyatakan  baik apabila jumlah residu asam amino non glisin pada kuadran IV kurang dari 20%. 28

## 4.2.  Ukuran Gridbox dan Penapisan virtual
Validasi  area  penambatan  molekuler
( gridbox ) dilakukan dengan cara meredocking ligan alami dengan reseptor. Validasi gridbox
berfungsi mendapatkan ukuran gridbox yang tepat meliputi sisi aktif tirosinase. Nilai energi bebas  pengikatan  rata-rata  yang  dihasilkan sebesar  -5,5  kkal/mo1  dengan  nilai  RMSD 0,9962  (Gambar  1c  dan  1d),  maka  dapat dinyatakan bahwa nilai RMSD hasil validasi dapat diterima karena lebih kecil dari 3,0 Å. 18 Sebanyak  9  ligan  uji  yang  lolos penapisan virtual dari 34 ligan atau senyawa aktif  daun  sirih  merah.  Pemilihan  ligan uji  yang  lolos  adalah  ligan  yang  memiliki nilai  ΔG  lebih  rendah  dari  ΔG  tropolon, yaitu  sebesar  -5,4  kkal/mol.  Sembilan  ligan uji  tersebut,  dianalisis  biovaibilitas  dan toksisitasnya.  Kelebihan  penapisan  virtual dapat  menambatkan  banyak  ligan  secara bersamaan,  namun  kekurangannya  adalah spesifitas lebih rendah dibandingkan dengan penambatan molekuler. 29
4.3.  Penambatan  Molekuler  dan  Analisis Hasil Penambatan molekuler terhadap reseptor  bertujuan  untuk  mengetahui

## Tabel 2. Bioavaibilitas Ligan Berdasarkan Aturan Lipinski
No Ligan Inhibisi herG Karsinogenitas Toksisitas oral akut Sensitisasi kulit Permebalitas kulit Sensitisasi kulit Kategori Skor Kategori Skor 1 Tropolon Inhibitor Lemah 0,9 Non karsinogen 0,8 III -3,078 Ya 2 Asam Kojat Inhibitor Lemah 0,9 Non karsinogen 0,9 III -3,157 Tidak 3 Katekin Inhibitor Lemah 0,9 Non karsinogen 0,9 IV -2,735 Tidak 4 Terpinen-4-ol Inhibitor Lemah 0,8 Non karsinogen 0,8 III -2,182 Ya 5 3-(3, 4 dimetilfenil) asam propionat Inhibitor Lemah 0,9 Non karsinogen 0,9 III -2,712 Tidak 6 N1-(5-methylisoxazol- 3-yl)ethanediamide Inhibitor Lemah 0,9 Non karsinogen 0,7 III -3,313 Tidak 7 Asam protokatekuat Inhibitor Lemah 0,9 Non karsinogen 0,9 III -2,727 Tidak 8 L-(+)-Arginin Hidroklorida Inhibitor Lemah 0,9 Non karsinogen 0,8 IV -2,735 Tidak 9 Metoksi indol Inhibitor lemah 0,9 Non karsinogen 0,9 III -2,397 Tidak 10 Sineol Inhibitor Lemah 0,86 Non arsinogen 0,9 III -2,437 Ya
kemampuan ligan dalam menginhibisi enzim dengan parameter nilai ΔG dan nilai Ki.  Pada penelitian  ini,  didapatkan  senyawa  katekin yang memiliki nilai energi bebas pengikatan terendah, yaitu sebesar -6,7 kkal/mol dengan nilai konstanta inhibisinya (Ki) sebesar 12,12 µM. Nilai ΔG dan Ki terendah dihasilkan oleh sineol dengan nilai ΔG sebesar -5,4 kkal/mol dan  konstanta  inhibisi  sebesar  108,99  µM, nilai tersebut sama dengan tropolon sebagai ligan alami.
Residu asam amino reseptor berinteraksi dengan  ligan  membentuk  ikatan  hidrogen atau interaksi hidrofobik. Residu asam amino yang  konsisten  berinteraksi  dengan  ligan tropolon, asam kojat adalah His192, His215, His381,  Thr391  dan  Ser394.  Sisi  aktif tirosinase  terletak  pada  residu  asam  amino His192  His215,  His224,  Arg374,  His377, His381,  Thr391  dan  Ser394. 30 Katekin memiliki  interaksi  hidrofobik  lebih  banyak
A B Gambar 3. Visualisasi interaksi reseptor dengan ligan (a) tropolon (2D dan 3D); (b) katekin (2D dan 3D)
Gambar 4. Daya inhibisi terhadap tirosinase (ket: E = ekstrak; F = fraksi)
dibandingkan dengan troplon dan asam kojat, sehingga memiliki nilai ΔG lebih rendah. Li- gan uji sineol, metoksiindol dan terpinen-4-ol tidak terbentuk ikatan hidrogen sehingga me- miliki nilai ΔG dan Ki yang besar. Nilai kon- stanta inhibisi yang kecil menunjukkan ligan semakin  mudah  menginhibisi  enzim.  Ikatan hidrogen mampu menstabilkan ikatan dan in- teraksi hidrofobik menurunkan nilai ΔG. 31
4.4.  Toksisitas Ligan
Prediksi  toksisitas  yang  dilakukan berdasarkan
ADMET ( Adsorption, distribution, metabolism, excretion dan toxicity ) dengan parameter herG, karsinogen, toksisitas  oral  akut,  skin  permeability  dan sensitisasion.  Semua  ligan  uji,  tropolon  dan asam kojat bersifat inhibitor lemah terhadap herG  dan  bersifat  nonkarsinogen.  herG merupakan gen pengkode kanal protein kalium yang  berkontribusi  untuk  aktivitas  detak jantung. 32 Ligan uji katekin dan L-(+) arginin hidroklorida yang kategori  IV dan ligan uji yang lainnya termasuk kategori III. Kategori toksisitas  III  dan  IV  merupakan  nontoksik. Terdapat 5 ligan yang menyebabkan sensitif terhadap  kulit,  yaitu  tropolon,  terpinen- 4-ol,  metil  eugenol  dan  sineol.  Zat  yang menyebabkan sensitif terhadap kulit membuat tidak nyaman bagi sebagian orang. 22
4.5.  Inhibisi Tirosinase Secara In vitro Inhibisi  tirosinase  oleh  ekstrak  etanol, fraksi n-heksana, fraksi etil asetat dan fraksi air daun sirih merah secara in vitro . Analisis inhibisi  tirosinase  ekstrak  etanol  dan  fraksi daun sirih merah dilakukan hanya pada satu konsentrasi  yaitu  10000  ppm,  karena  hanya untuk melihat potensi awal ektrak etanol dan fraksi nya sebagai inhibitor tirosinase. Hasil menunjukkan bahwa semua sampel memiliki aktivitas  sebagai  inhibitor  tirosinase.  Asam kojat  (kontrol  positif)  memiliki  aktivitas inhibisi  tirosinase  sebesar  82,47%  pada konsentrasi 1000 ppm. Asam kojat merupakan inhibitor  tirosinase  yang  kuat. 24 Pada  fraksi air terdapat senyawa katekin yang termasuk golongan flavonoid, dan golongan flavonoid dapat menghambat tirosinase karena memiliki kemiripan struktur dengan substrat sehingga
dopakrom tidak terbentuk. 33
Ekstrak  etanol  memiliki  aktivitas penghambatan terendah dibandingkan dengan fraksi-fraksinya. Ekstrak etanol mengandung senyawa elimisin, neoptadien, germakron dan asam  propionat.  Senyawa  elimisin  diduga memiliki aktivitas inhibitor tirosinase karena senyawa  tersebut  memiliki  aktivitas  sebagai antioksidan dan antivirus. Elimisin memiliki cincin benzena dan rantai karbon (pada C3− C6),  sehingga  terdapat  kemiripan  struktur dengan substrat tirosinase. 34
Fraksi  etil  asetat  mengandung metabolit sekunder diantaranya adalah 3-(3,4 dimetilfenil)  asam  propionat,  schisandrin, dan  columbin.  Senyawa  yang  diduga memiliki aktivitas inhibitor tirosinase adalah (3,4  dimetilfenil)  asam  propionat.  Senyawa (3,4  dimetilfenil)  asam  propionat  memiliki aktivitas  antioksidan,  akseptor  gugus hidroksil,  dan  mampu  mengkelat  ion  logam Zn yang terdapat pada tirosinase. 35
Fraksi n-heksana melarutkan senyawa- senyawa  non  polar  dari  daun  sirih  merah. Senyawa-senyawa  yang  diduga  sebagai inhibitor  tirosinase  adalah  4-metoksiindol, asam  protokatekuat,  N1-(5-metillisoxazol-3- yl) etana diamida, L-(+)-arginin hidroklorida dan
1-amino-3-(aminooxy)-2-propanyl
N-(4, 6 diamino-1, 3, 5 triazin-2-yl) glisinat dihidroklorida. Hal ini dikarenakan senyawa- senyawa tersebut termasuk kelompok fenolik dan memiliki cincin benzena yang menyerupai substrat tirosinase. 36
Ekstrak  dan  fraksi  daun  sirih  merah memiliki  aktivitas  penghambatan  terhadap tirosinase.  Pada  pengujian in vitro fraksi n-heksana  dan  fraksi  air  pada  konsentrasi 10000  ppm  memiliki  akivitas  yang  tinggi dalam  menghambat  tirosinase,  hal  tersebut diperkuat  dengan  hasil  pengujian  secara in silico .  Terdapat  7  senyawa  pada  fraksi n-heksana dan katekin pada ekstrak air yang memiliki nilai ΔG lebih rendah dibandingkan dengan ligan alami, sehingga pada pengujian in vitro terbukti bahwa fraksi n-heksana dan fraksi air memiliki aktivitas sebagai inhibitor tirosinase  yang  tinggi  dibandingkan  dengan ekstrak dan fraksi lainnya.
5. Kesimpulan Senyawa bioaktif atau ligan uji dari daun sirih merah yang digunakan terbukti memiliki aktivitas  penghambatan  terhadap  tirosinase. Senyawa katekin merupakan ligan uji terbaik dalam menghambat aktivitas tirosinase secara in silico . Secara in vitro , fraksi air dan fraksi n-heksana  memiliki  nilai  tidak  berbeda nyata dan memiliki daya hambat yang tinggi terhadap tirosinase.

## Referensi
1.  Rinandari U, Putti FD, Arie K, Irawanto ME, Mochtar M. Terapi L-ascorbic acid dan  glutation  2%  dibandingkan  dengan hidrokuinon 4% pada pasien melasma. J Health Sains. 2021; 2(8): 1091-1108.
2.  Mawadah  M,  Yasmiwar.  Potensi tumbuhan  sebagai  whitening  agent. Farmaka. 2018; 16(2): 598-604.
3.  3.  Aprilliani  A,  Asep  GS,  Rika  H. Inhibition test of tyrosinase activity from Zingiberaceae.  Jurnal  Ilmiah  Farmasi. 2018; 14(1):46-58.
4.  Sohretuglu D, Suat S, Burak B, Arzu O. Tyrosinase inhibition by some flavonoids: inhibitory activity, mechanism, by in vitro and in silico. Bioorganic Chem. 2018; 18: 168-174.
5.  Weni M, Mega S, Djarot SHS. Molecular docking  of  active  compound  Piper crocatum  on  the  alpha-glucosidase enzyme  as  antidiabetic.  IJPST.  2018; 7(2): 64-72.
6.  Bella  Fatima  ZD,  Mega  S,  Dimas A.  Molecular  docking  of  red  betel (Piper  crocatum  Ruiz  &  Pav)  bioactive compounds  as  HMG-CoA  reductase inhibitor. JKSA. 2021; 24(3): 101-107.
7.  Khalida S. Analisis potensi senyawa aktif daun sirih merah (Piper crocatum) sebagai inhibitor enzim asetilkolinesterase secara  in  silico  (skripsi).  Bogor:  Institut Pertanian Bogor; 2021.
8.  Meiliana  C,  Joshita  D,  Berna  E. Antioxidant  activity  assay,  inhibition of  tyrosinase  and  efficacy  test  of  gel containing Taya cortex (Nauclea subdita) extract  on  human  skin.  J  Kefarm  Ind. 2016; 6(1): 98-107.
9.  Yaowares C, Rawiwan W, Anna K. Non- genotoxic  mode  of  action  and  possible threshold  for  hepatocarcinogenicity  of kojic acid in F344 rats. Food and Chem Tox. 2011; 49(2): 471-476.
10. Joshua  O,  Oluseyi  SF,  Lola  Adeloa  A, Miriammilicent  CE.  Effects  of  skin lightening  cream  agents  –  hydroquinon and kojic acid, on the skin of adult  female experimental  rats.  Clin  Cosmet  Investig Dermatol. 2020; 13(2): 283-289.
11. Safithri  M,  Kurniawati,  Syaifudin. Formula of Piper crocatum, Cinnamomum burmanii, and Zingiber officinale extracts as functional beverage for diabetics. IFRJ. 2016; 23(3):1123-1130.
12. Ramadani  F.  Aktivitas  antioksidan, total  tanin  ekstrak  dan  fraksi  daun  sirih merah  (Piper  crocatum)  dan  identifikasi dengan LC-MS (skripsi). Bogor: Institut Pertanian Bogor; 2018.
13. Wedaswari  IAI.  Aktivitas  antioksidan etanol dan fraksi daun sirih merah (Piper crocatum) dengan metode Rancimat dan identifikasi  dengan  LC-MS  (skripsi). Bogor: Institut Pertanian Bogor; 2018.
14. Sundari  H,  Prabowo  MH,  Rachmawaty FJ,  Tahmid  HA.  Standardization  of  leaf extract  of  red  betel  (Piper  crocatum) leaves  using  ethanol.  Ind  J  Med  Heal. 2015;7(1):3-9.
15. Anugrahwati  M,  Purwaningsih  T, Rustiana,  Manggalarini  JA,  Alnavs NB,  Wulandari  DN  et  al.  Extraction  of ethanolic extract of red betel leaves and cytotoxicity test HeLa cells. Proc Engine. 2016;148:1402-1407.
16. Anitha  K,  Gopi  G,  Girish,  Senthil  KP. Molecular  docking  study  on  dieptidyl peptidase-4  inhibitors.  Int  J  Res  Dev Pharm L Sci. 2013;2(5):602-610.
17. Zaelani Bella FD. Kajian in silico dan in vitro Piper crocatum Ruiz & Pav sebagai inhibitor  HMG-KoA  reduktase  serta aktivitas  penghambatan  terbentuknya malondialdehida  (tesis).  Bogor:  Institut Pertanian Bogor; 2021.
18. Dallakyan  S,  Arthur  JO.  Small-molecul library screening by docking with PyRx. Chem Biol. 2015;1263:243-250.
19. Trot  O,  Arthur  JO.  AutoDock  Vina: improving  the  speed  and  accuracy  of docking  with  a  new  scoring  function, efficient optimization, and multithreading. J Comp Chem. 2010; 31(2): 455-461.
20. Seeliger  D,  Groot  BL.  Ligand  docking and  binding  site  analysis  with  PyMOL and AutoDock Vina. J Comp Mol Design. 2010;24(5): 417-422.
21. Ochieng  PJ,  Sumaryada  T,  Okun  D. Molecular docking and pharmacokinetic of  herbal  derivates  as  maltase- glucoamylase  inhibitor.  Asian  J  Pharm Clin Res. 2017;10(9): 392-398.
22. Cahyani  FN, Ardiana  R,  Khasanah  DU. Pengembangan  dan  optimasi  kapsul mikrosfer esktrak Licorice sebagai bentuk sediaan  oral  extended  release  kanker payudara. Pharm J Indon. 2021;7(1): 63- 70.
23. Kurniasari  A,  Effionora  A,  Joshita  D. The potency of Cocoa Bean (Theobroma cacao Lim) extract as tyrosinase inhibitory for skin lightening product. J Kim Farm. 2018;8(1):34-43.
24. Batubara  I,  Darusman  L,  Mitsunaga  T, Rahminiwati,  Djauhari  E.  Potency  of Indonesia  medical  plants  as  tyrosinase inhibitor  and  antioxydant  agent.  J  Biol Sci. 2010;10(2): 138-144.
25. Vinsentricia A, Seno DSH, Bintang M. In silico analysis of Curcuma longa against PCAF  histon  asetiltransferase.  Curr Biochem. 2015;2(2): 43-55.
26. Putri RG. Penambatan molekuler senyawa aktif  sirih  merah  (Piper  crocatum)  pada butirilkolinterase sebagai kandidat antialzheimer  (skripsi).  Bogor:  Institut Pertanian Bogor; 2021.
27. Susanti  NMP,  Laksmiani  NPI,  Dewi PPP,  Dewi  PYC.  Molecular  docking terpinen-4-ol  pada  protein  IKK  sebagai antiinflamasi  pada  aterosklerosis  secara in silico. J Farm Udayana. 2019;8(1): 44-
46.
28. Aziz  A,  Dimas  A,  Mega  S.  Molecular docking  of  bioactive  wungu  leaves (Graptophyllum  pictum  (L)  Griff)  as tyrosinase inhbitors. IJPST.2022; 9(2):94- 105.
29. Shafillah  M.  Penambatan  molekuler xantin  oksidase  oleh  senyawa  aktif sirih  merah  (Piper  crocatum)  sebagai pengobatan alternatif asam urat (skripsi). Bogor; Institut Pertanian Bogor.
30. Xuelei Lai, Wichers Harry J, Soler-Lopez M, Dijkstra Bauke W. Enzyme structure and  function  very  important  paper structure  of  human  tyrosinase  related protein 1 reveals a binuclear zinc active site important for melanogenesis. Angew Chem Int. 2017; 56: 648-660.
31. Pratama  R.  Penambatan  Molekuler Senyawa  Aktif  Temulawak  (Curcuma xanthoriza) dengan Enzim Cox-2 Sebagai Kandidat  Obat  Antikanker  Payudara (tesis).  Bogor:  Institut  Pertanian  Bogor; 2015.
32. Xiao  Li,  Lei  Chen,  Feixiong  Cheng, Zengrui Wu, Hanping Bian, Congying Xu, et al. In silico prediction of chemical acute oral  toxicity  using  multi-classification methods.  J  Chemical  Inform  and  Mod. 2014;54(4):1061-1069.
33. Mustika  R,  Hindun  S,  Nurul A.  Potensi tanaman sebagai pencerah wajah alami. J Sai Kes. 2020;2(4): 558-162.
34. Yang X, Wang Y, Zhu X, Dai M, Zhang T, Qu Y, Yang XW, Qin HB, Frank J, Li F. Metabolic activation of elimicin leads to the inhibition of stearoyl-coA desaturase 1. Res Tox. 2019;32: 1965-1967.
35. Sugiyama  Y,  Shunro  K,  Toshihiko  O. Involvement  of  the  β-diketon  moiety in  the  antioxidative  mechanism  of tetrahydrocurcumin.  Biochem  Pharm. 2006; 52:519-525.
36. Batubara  I,  Adfa  M.  Potency  of  kayu bawang  leaves  (Protium  javanicum) as  tyrosinase  inhibitor.  Sains  dan Matematika. 2013;1(2):52-56.