## AKTIVITAS ANTIBAKTERI KOMPLEKS KITOSAN - MONOSAKARIDA TERHADAP PATOGEN DALAM SURIMI IKAN GABUS SEBAGAI MODEL MATRIKS PANGAN
Shanti Dwita Lestari * , Ace Baehaki, Reny Meliza Universitas Sriwijaya, Jalan Raya Palembang Prabumulih Km. 32 Ogan Ilir, Sumatera Selatan, Indonesia *Korespondensi: shantidwita_thi@unsri.ac.id Diterima: 21 Januari 2019 /Disetujui: 1 April 2019
Cara sitasi : Lestari SD, Baehaki A, Meliza R. 2019. Aktivitas antibakteri kompleks kitosan-monosakarida terhadap patogen dalam surimi ikan gabus sebagai model matriks pangan. Jurnal Pengolahan Hasil Perikanan Indonesia . 22(1): 80-88.
Abstrak
Senyawa kompleks yang terbentuk antara kitosan dengan gugus gula akibat proses pemanasan yang dikenal sebagai produk reaksi Maillard (PRM) diketahui memiliki sifat antibakteri dan antioksidan. Penelitian ini bertujuan untuk membandingkan aktivitas antibakteri yang berasal dari senyawa kompleks kitosan monosakarida terhadap Bacillus subtilis, Listeria monocytogenes dan Vibrio cholera dalam matriks pangan berupa surimi ikan gabus. Analisis dilakukan terhadap intensitas warna PRM yang terbentuk melalui reaksi kitosan dengan glukosa, galaktosa dan fruktosa serta aktivitas antibakteri masing-masing PRM secara in vitro maupun dalam matriks pangan yang masing-masing dilakukan menggunakan metode difusi cakram dan hitungan cawan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kompleks kitosan glukosa memiliki intensitas warna tertinggi dengan nilai absorbansi pada panjang gelombang 420 nm yaitu 0,248. Hasil uji in vitro menunjukkan bahwa kompleks kitosan glukosa memiliki daya hambat terbesar terhadap ketiga bakteri uji. Kompleks kitosan galaktosa memiliki daya hambat terbaik terhadap bakteri B. subtilis dan L. monocytogenes dengan penurunan jumlah bakteri masing-masing 0,63 dan 2,13 log CFU/mL dibandingkan kontrol, sedangkan aktivitas penghambatan terhadap V. cholera lebih rendah dibandingkan kontrol. Penambahan kitosan serta kompleks kitosan monosakarida pada matriks pangan secara umum menurunkan jumlah mikroba total (TPC) yaitu 1,53 log CFU/mL. Hal tersebut menunjukkan bahwa aktivitas antibakteri menunjukkan hasil yang konsisten baik secara in vitro maupun dalam matriks pangan.
Kata kunci: antimikroba, in vitro, kitosan-monosakarida, produk reaksi Maillard

## Antibacterial Effects of Chitosan Monosaccharides Complex on Pathogens in Snakehead Fish Surimi as Food Matrix Model
Abstract
The complex formed between chitosan and sugar as a result of heating process which induces the Maillard reaction is known to have antibacterial and antioxidant properties. This study aims to compare the antibacterial activity of chitosan monosaccharide complexes against Bacillus subtilis, Listeria monocytogenes and Vibrio cholera in snakehead fish surimi as the food matrix model. The analysis was conducted on the color intensity of the Maillard Reaction Products (MRPs) which was formed through the reaction of chitosan with glucose, galactose and fructose. The antibacterial activity of each MRPs was studied both in vitro and in the food matrix using disc difussion and standard plate count method respectively. The results showed that the chitosan galactose complex had the highest color intensity with absorbance values   at 420 nm of 0.248. In vitro tests result showed that the chitosan glucose complex had the greatest inhibition on all three test bacteria. Whereas, when MRPs was applied in the food matrix of snakehead fish surimi, the galactose chitosan complex showed the best inhibitory effect against B. subtilis and L. monocytogenes with a decrease in the number of bacteria of 0.63 and 2.13 log CFU/mL respectively compared to the control. On the other hand, the inhibitory activity of V. cholera in the food matrix was effectively performed by the glucose chitosan complex with the total bacterial count of 2.25 log CFU/mL l lower than the control. The addition of chitosan and chitosan monosaccharide complex to the food matrix generally reduced the total microbial count (TPC) by 1.53 log CFU/mL. This result confirms that the antibacterial activity of MRPs is consistent .both in vitro and in the food matrix.
Keywords: antimicrobial, in vitro, Maillard reaction products
Aktivitas antibakteri kompleks kitosan-monosakarida, Lestari et al.

## PENDAHULUAN
Kitin merupakan komponen utama dari cangkang krustasea dapat dideasetilasi menghasilkan suatu polimer hidrofilik bermuatan positif yang dikenal sebagai kitosan (López-León et al. 2005).  Aktivitas antimikroba senyawa kitosan umumnya terkait dengan interaksi ioniknya terhadap komponen bermuatan negatif yang terdapat pada dinding sel bakteri. Aktivitas tersebut dipengaruhi oleh karakteristik intrinsik kitosan seperti berat molekul dan derajat deasetilasi serta karakteristik ekstrinsik seperti pH, suhu dan keberadaan senyawa lain (Hu dan Gazle 2018). Modifikasi kitosan acapkali diperlukan untuk mengubah karakteristik intrinsik kitosan guna meningkatkan efektivitas antibakteri dalam sistem pangan tertentu. Huang dan Chen (1997) dalam penelitiannya menyimpulkan bahwa pengawetan hasil panen jamur dengan komplek kitosan glukosa sebagai coating terbukti efektif melindungi produk dari degradasi oleh bakteri, dibandingkan pelapisan dengan kitosan atau glukosa saja. Hal ini dipengaruhi oleh pembentukan produk reaksi Maillard yang berkontribusi pada peningkatan efektivitas sifat antibakteri. Reaksi Maillard disebut juga reaksi pencoklatan non enzimatik adalah reaksi antara gugus amino (kitosan) dan gugus karbonil gula pereduksi (monosakarida).  Produk reaksi Maillard yang dihasilkan dari pemanasan kitosan dengan glukosa menunjukkan aktivitas antibakteri lebih tinggi daripada kitosan atau glukosa saja
(Kanatt et al . 2008).
Aktivitas antibakteri kitosan serta modifikasinya telah banyak dibuktikan dengan metode in vitro , namun hasil tersebut belum dibuktikan secara in situ pada sistem pangan yang komplek. Rhoades dan Roller (2000) menyatakan bahwa kitosan memiliki potensi sebagai pengawet makanan, namun matriks pangan memainkan peran penting terhadap efek antibakteri. Matriks pangan didefinisikan sebagai kumpulan komponen organik yang dikenal sebagai gizi yang terkandung di dalam suatu bahan pangan. Komponen organik tersebut dapat mengakibatkan perubahan efektifitas antibakteri pada kitosan dan modifikasinya, baik peningkatan maupun penurunan pada aktivitasnya. Berdasarkan latar belakang di atas, penting dilakukan uji aktivitas antibakteri pada komplek kitosan-monosakarida pada matriks pangan surimi ikan gabus untuk membandingkan keefektifan senyawa intermediet hasil reaksi Maillard tersebut dalam melindungi pangan dari kerusakan secara in vitro dan in situ (dalam matriks pangan). Penelitian ini juga bertujuan menentukan komplek kitosan-monosakarida yang paling efektif dalam menghambat mikroba uji yang meliputi Bacillus subtilis, Listeria monocytogenes dan Vibrio cholerae . Penggunaan ketiga jenis bakteri tersebut bertujuan untuk membandingkan penghambatan komplek kitosan terhadap bakteri Gram positif maupun Gram negatif.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan meliputi ikan gabus segar yang diperoleh dari pasar Indralaya, Ogan Ilir, Chitosan dari cangkang udang DD ≥ 75% (Sigma Aldrich), asam asetat (Merck), NaOH (Merck), glukosa (Merck), galaktosa (Merck), fruktosa (Merck) dan akuades. Bakteri Bacillus subtilis berasal dari Laboratorium Biologi Laut Jurusan Kelautan Universitas Sriwijaya, Listeria monocytogenes
dan Vibrio cholerae dari BPOM Palembang. Bahan analisis yaitu butterfield’s phosphate buffered , Nutrient Agar (OXOID), Nutrient Broth (OXOID), Plate Count Agar (OXOID), Tryptone Soy Agar OXOID) , Listeria agar Oxford formulation (OXOID) dan Thiosulfat Citrate Bile Salt Sucrose Agar (OXOID), asam borat (Merck), indikator bromcresol hijau (Merck), metil merah (Merck), alcohol (Merck), HCl (Merck), kloroform (Merck) dan natrium benzoate (Merck). Alat yang digunakan meliputi autoklaf (Hirayama HL36AE, Japan), hot plate stirrer (B-one AHS 12A, China), pH meter (Hanna HI98107, USA) dan meat grinder (Panasonic MKMG1300) .  Alat untuk analisis adalah tabung reaksi, mikro pipet, cawan petri, inkubator (Memmert IN55, Germany), colony counter (Today’s Galaxy 230 , Taiwan), spektrofotometer (Shimadzu UV1800, Japan), stomacher (Interscience Bag Mixer 400W, USA) .

## Metode Penelitian
Penelitian ini menggunakan rancangan acak kelompok (RAK), setiap perlakuan diulang sebanyak dua kali dengan analisis secara duplo.  Penelitian dilakukan dalam kondisi heterogen berdasarkan waktu inkubasi yang terdiri dari lima waktu yang berbeda, di antaranya adalah 0 jam (tanpa inkubasi); 6; 12; 24 dan 48 jam.  Perlakuan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut:
C0  = tanpa komplek kitosan-monosakarida C1  = 1 % larutan kitosan (K) C2  = 1 % komplek kitosan glukosa (KKG) C3  = 1 % komplek kitosan galaktosa (KKGa) C4 = 1 % komplek kitosan fruktosa(KKF)
Persiapan surimi ikan gabus Ikan gabus segar disiangi, dicuci dan dipisahkan antara daging dengan tulangnya hingga menghasilkan fillet kemudian digiling dengan fish mincer . Daging ikan lumat yang diperoleh dicuci menggunakan air dingin dengan suhu 5 ºC dengan perbandingan air dan daging 3:1. Proses pencucian dilakukan sebanyak tiga kali dan dalam proses tersebut dilakukan pengadukan selama masing-masing 5 menit. Garam (NaCl) dengan konsentrasi 0,3% ditambahkan pada pencucian ketiga. Proses pemerasan dan pengepresan selanjutnya dilakukan untuk mengeluarkan sebagian besar air sehingga diperoleh surimi, metode pembutan surim mengacu pada (Park dan Lin 2005).  Analisis kimia yang meliputi uji kadar protein, lemak, air, abu dan karbohidrat dilakukan terhadap surimi yang dihasilkan sesuai dengan prosedur dalam SNI 01-2891-1992 mengenai cara uji makanan dan minuman.

## Persiapan larutan stok komplek kitosan-monosakarida
Pembuatan larutan komplek kitosan- monosakarida 1% mengacu pada metode (Kanatt et al . 2007), dilakukan dengan melarutkan 1 g kitosan dan 1 g monosakarida (glukosa, galaktosa dan fruktosa) dalam asam asetat 1% hingga mencapai 100 mL. Larutan dihomogenkan dengan magnetic stirrer selama
30 menit lalu ditambahkan 1 N NaOH hingga nilai pH menjadi 5,8. Larutan selanjutnya diautoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit
lalu didinginkan. Intensitas warna produk reaksi Maillard pada setiap larutan komplek kitosan-monosakarida diukur melalui nilai absorbansi pada panjang gelombang 420 nm.
Analisis antibakteri komplek kitosan -monosakarida secara in vitro Pengujian antibakteri dilakukan berdasarkan metode Kirby-Bauer dengan modifikasi berupa penggantian media Mueller-Hinton agar menjadi media selektif sesuai dengan jenis pathogen yang diujikan. Medium agar selektif untuk masing-masing jenis bakteri dituangkan ke dalam cawan petri dengan ketebalan 4-5 mm, dibiarkan mengeras, kemudian diinokulasikan dengan bakteri uji sebanyak 0,1 mL dengan kepadatan sel 10 8 CFU/mL (standar Mc Farland 0,5) menggunakan teknik spread plate . Kertas cakram berdiameter 6 mm yang telah dicelupkan ke dalam sampel uji (larutan kitosan, KKG, KKGa, KKF dengan konsentrasi masing-masing 1%) selama minimal 15 menit, diletakkan dengan cara ditekan hingga seluruh bagian permukaan kertas cakram menyentuh permukaan medium. Inkubasi dilakukan selama 24 jam pada suhu 37 o C. Diameter daerah hambatan yang terbentuk di sekeliling kertas cakram diukur dengan menggunakan penggaris. Analisis antibakteri komplek kitosan-monosakarida secara in vitro mengacu pada metode (Hudzicki 2009).
Analisis antibakteri komplek kitosan -monosakarida dalam matriks pangan surimi
Larutan stok komplek kitosan- monosakarida dengan konsentrasi 2,5% sebanyak 20 mL dihomogenkan dengan 30 g surimi sehingga terbentuk konsentrasi 1% komplek kitosan-monosakarida di dalam surimi. Konsentrasi 1% ini mengacu pada konsentrasi komplek kitosan yang digunakan dalam uji in vitro . Inokulum bakteri dengan kepadatan sel ±10 6 CFU/mL sebanyak 0,05 mL ditambahkan ke dalam surimi dan dihomogenkan kembali. Sampel yang telah diinokulasi ditimbang masing-masing 5 g dan ditempatkan dalam plastik clip lock lalu diinkubasi selama 48 jam. Analisis antibakteri komplek kitosan-monosakarida
Aktivitas antibakteri kompleks kitosan-monosakarida, Lestari et al.
dalam matriks pangan surimi menggunakan metode modifikasi (Kanatt et al. 2007). Pengamatan dilakukan dengan interval 6 jam dan pada setiap pengamatan dilakukan analisis pertumbuhan bakteri total (TPC) serta bakteri spesifik ( Bacillus subtilis, Listeria monocytogenes dan Vibrio cholerae ).
Analisis Data Data yang diperoleh dilakukan analisis keragaman menggunakan statistik parametrik dengan Rancangan Acak Kelompok (RAK) dilanjutkan dengan uji Beda Nyata Terkecil (BNT) menggunakan selang kepercayaan 95%.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengukuran Intensitas Warna Produk Reaksi Maillard Produk reaksi Maillard yang terbentuk dalam komplek kitosan-monosakarida berasal dari interaksi antara senyawa asam amino bebas yang terdapat dalam kitosan dengan senyawa karbonil yang terkandung di dalam gula pereduksi yaitu glukosa, galaktosa dan fruktosa dengan bantuan pemanasan.  Hasil pengukuran intensitas warna produk Mailard dapat dilihat pada Figure 1 . Nilai absorbansi terendah dihasilkan oleh perlakuan C1 yaitu 0,052 dan nilai absorbansi tertinggi adalah C3 yaitu 0,248.  Terbentuknya warna cokelat pada komplek kitosan
menjadi indikasi terbentuknya produk reaksi Maillard.  Intensitas warna komplek kitosan galaktosa  yang  tinggi  juga  dilaporkan  oleh Benjakul et al . (2005). Produk reaksi Maillard yang dihasilkan melalui reaksi protein dan galaktosa menunjukkan peningkatan intensitas warna coklat lebih besar dibandingkan komplek protein dengan glukosa dan fruktosa.
Analisis Antibakteri secara In Vitro Pengujian antibakteri secara in vitro dilakukan dengan menggunakan media selektif untuk meminimalkan pertumbuhan bakteri lain. Diameter daerah hambatan (DDH) bakteri uji yang dihasilkan oleh setiap perlakuan dapat dilihat pada Table 1 .
Table 1 menunjukkan bahwa perbedaan monosakarida tidak memberikan pengaruh yang signifikan (α=0,05) terhadap DDH
B.subtilis , L. monocytogenes maupun V. cholerae . Efek antibakteri yang ditunjukkan oleh kitosan dan komplek kitosan-monosakarida dapat berasal dari asam asetat yang digunakan sebagai pelarut, sifat polikationik kitosan maupun produk reaksi Maillard yang dihasilkan. Efek tersebut dipengaruhi oleh interaksi kitosan dan karakteristik permukaan sel mikroba. Menurut Chung et al. (2003), mekanisme aktivitas antibakteri kitosan adalah interaksi ionik antara sisi kationik kitosan dengan sisi anionik protein dalam
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 C1 C2 C3 C4 A bso rba nc e ( Λ 420 n m )
Chitosan / chitosan-monosaccharide complex
Figure 1 UV absorbance of Maillard Reaction Products at ʎ 420 nm.
fosfolipid sel mikroba yang menyebabkan perubahan sifat permeabilitas membran sel.
Huang dan Chen (1997) menyimpulkan bahwa produk reaksi Maillard yang terbentuk dalam komplek kitosan glukosa berkontribusi terhadap peningkatan efektivitas antibakteri pada produk jamur. Proses depolarisasi membran seluler sebagai akibat bertambahnya muatan positif yang berasal dari gugus asam amino dalam pH rendah mengakibatkan terhambatnya pertumbuhan mikroba. Kong et al . (2010) menyatakan bahwa perubahan integritas dinding sel pada akhirnya dapat menyebabkan kematian bagi mikroba tersebut.

## Analisis Antibakteri dalam Matriks Surimi Ikan Gabus
Keberadaan bahan organik asing dapat menurunkan efektifitas zat antimikrobial dengan cara menginaktifkan senyawa antimikroba melalui pembentukan komplek maupun endapan dan juga memberikan barrier yang mengganggu kontak antara bahan antimikrobial dan sel mikroorganime (Afrianti 2010). Aktivitas antimikroba kitosan dan senyawa turunannya yang merupakan senyawa polikationik sangat dipengaruhi oleh komponen matriks makanan. Hasil analisis menunjukkan bahwa surimi ikan gabus yang digunakan dalam penelitian ini memiliki komposisi kimia yaitu: protein 16,01%, air 82%, abu 0,35%, lemak 0,47%, karbohidrat ( by difference ) 0,43%. Pengaruh matriks makanan yang mengandung protein terhadap aktivitas antibakteri kitosan tergantung pada pH serta titik isoelektriknya, jika pH media lebih rendah dari titik isoelektrik protein maka kitosan masih memiliki aktivitas antibakteri yang baik, sebaliknya, jika nilai pH media meningkat hingga di atas titik isoelektrik protein, aktivitas antibakteri kitosan menjadi
terhambat.  Protein bermuatan negatif akan menetralisir muatan positif pada kitosan sehingga tidak bisa lagi berinteraksi dengan permukaan sel bakteri yang bermuatan negatif (Devlieghere et al . 2004). Keberadaan lemak dalam matriks pangan dapat memengaruhi aktivitas antimikroba. Kitosan diketahui tetap menunjukkan aktivitas antibakteri meskipun terjadi pembentukan komplek dengan lemak dalam matriks pangan. Fenomena ini dapat dijelaskan oleh fakta bahwa kitosan diposisikan di luar emulsi ketika terjadi interaksi antara gugus positif kitosan dan asam lemak bebas bermuatan negatif (Jumaa dan Muller 1999).
Pengaruh Perlakuan terhadap Pertumbuhan Bacillus subtilis dalam Matriks Surimi
B. subtilis merupakan bakteri Gram positif  pembentuk  spora.  Respon  osmotik B. subtilis terhadap peningkatan ion positif di dalam membrane sitoplasma dapat dilakukan dengan mensintesis prolin dan mengakumulasikan senyawa zwitterion organik seperti glisin, betaine, karnitin, kolin, prolin maupun ektoin yang merupakan senyawa osmoprotektan dengan kelarutan tinggi. Senyawa osmoprotektan tersebut dapat disintesis maupun ditransportasikan dari luar sel dan menjadi pelindung B. subtilis dalam kondisi lingkungan yang buruk (Lopez et al .
2006). Kurva pertumbuhan B. subtilis pada surimi ikan gabus dengan adanya penambahan kitosan dan komplek kitosan-monosakarida disajikan dalam Figure 2 . Surimi dengan perlakuan penambahan larutan kitosan (C1) dan komplek kitosan- monosakarida (C2, C3 dan C4) memiliki jumlah total bakteri (TPC) yang lebih rendah dibandingkan surimi dengan perlakuan C0.
Hal tersebut menunjukkan adanya aktivitas penghambatan bakteri oleh larutan kitosan dan senyawa komplek kitosan-monosakarida.
Table 1 Inhibition zone of chitosan / chitosan-monosaccharide complex against test bacteria Species of bacteria Inhibition zone (mm) C1 C2 C3 C4 B. subtilis 11±1.41 a 11.75±1.26 a 10±1.29 a 10±0.58 a L. monocytogenes 11.5±1 a 11.25±1.26 a 10±0.82 a 10.25±0.5 a V. cholerae 9.75±0.5 a 12±1 a 10±1 a 9.25±0.96 a
Aktivitas antibakteri kompleks kitosan-monosakarida, Lestari et al.
Hasil analisis sidik ragam menunjukkan bahwa nilai TPC perlakuan C0 berbeda nyata (α<0,05) dengan perlakuan lainnya.
Perlakuan C3, yaitu penambahan komplek kitosan galaktosa, memberikan nilai rata-rata TPC yang paling rendah dan nilai tersebut berbeda nyata dengan perlakuan lainnya.
Jumlah B. subtilis terendah dalam sampel surimi juga ditemukan pada perlakuan C3, namun nilai tersebut berbeda tidak nyata dengan perlakuan lainnya. Secara keseluruhan, surimi yang ditambahkan dengan larutan kitosan dan komplek kitosan-monosakarida dengan konsentrasi yang sama yaitu 1% memiliki nilai TPC 0 hingga 1,62 log CFU/mL lebih rendah dibandingkan dengan control, sedangkan untuk B. subtilis , setiap jenis perlakuan memberikan penghambatan pertumbuhan dengan jumlah rata-rata bakteri 0,57 hingga 0,63 log CFU/mL lebih rendah dibandingkan kontrol. Menurut Mahae et al . (2011) efek penghambatan komplek kitosan-gula terhadap bakteri uji tergantung pada konsentrasi yang digunakan. Konsentrasi komplek kitosan- gula 5% mampu menurunkan jumlah Bacillus cereus sebanyak 2-3 log CFU/mL. Peningkatan konsentrasi komplek kitosan  hingga 15% memberikan efek bakterisidal terhadap bakteri tersebut.
Ketahanan B. subtilis terhadap kitosan atau komplek kitosan-monosakarida relatif rendah, penurunan nilai log diduga disebabkan oleh keberadaan senyawa fosfolipid anionik dan juga senyawa lipid lain yang muncul pada
kondisi stress yang dapat mempengaruhi struktur membran serta aktivitas enzim yang terlibat dalam proses osmosensing dan modifikasi fungsi protein (Lopez et al . 2006).
Pengaruh Perlakuan terhadap Pertumbuhan L. monocytogenes dalam Matriks Surimi
Listeria monocytogenes merupakan bakteri Gram positif, tidak membentuk spora dengan bentuk basil yang sering mengkontaminasi produk perikanan (Jami et al . 2014). Salah  satu penanda taksonomi ( taxonomic marker ) bagi L. monocytogenes adalah proporsi struktur hidrofilik dan hidrofobik pada asam lipoteikoat yang merupakan polimer ampifilik pada membrane sitoplasma. Asam ini mengandung rantai poligliserofosfat hidrofilik yang berikatan kovalen dengan gliko atau fosfatidilglikolipid yang secara struktural bersifat analog dengan asam lipoteikoat dari Bacillus, Streptococcus, Staphylococcus dan Lactobacillus (Rocourt dan Buchrieser 2007).  Nilai  TPC  dan  respon  pertumbuhan
L. monocytogenes pada surimi ikan gabus dengan adanya penambahan kitosan dan komplek kitosan-monosakarida disajikan dalam Figure 3.
Penambahan kitosan maupun komplek kitosan-monosakarida dapat menurunkan jumlah bakteri total pada surimi. Perlakuan C3 memberikan nilai rata-rata TPC yang paling rendah dan nilai tersebut berbeda nyata (α<0,05) dengan perlakuan C1, C2 dan kontrol.
0 2 4 6 8 10 0 6 12 24 48 To ta lpl at e c ou nt (l og C FU /mL ) Time (H) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 6 12 24 48 Ba cillus sub tili s (lo g C FU /mL )
Time (H)
Figure  2  Effect  of  chitosan  and  chitosan  monosaccharide  complex  on  total  plate  count  and B. subtilis growth in snakehead fish surimi surimi,               C0 (no chitosan);              C1 (chitosan 1%);                 C2 (chitosan glucose complex 1%);                 C3 (chitosan galactose complex 1%);             C4 (chitosan fructose complex 1%).
Rata-rata jumlah Listeria monocytogenes terendah juga dihasilkan oleh perlakuan C3 dengan nilai 4,83 log CFU/mL. Hasil uji lanjut BNJ menunjukkan nilai tersebut berbeda nyata dengan perlakuan lainnya. Hasil rata- rata TPC pada sampel surimi yang diberikan perlakuan kitosan maupun kompek kitosan- monosakarida memiliki nilai 1,69–1,88 log CFU/mL lebih rendah dibandingkan kontrol, sedangkan untuk total L. monocytogenes, sampel yang diberi perlakuan memiliki jumlah bakteri 1,74–2,13 log CFU/mL lebih rendah dibandingkan kontrol. Hasil tersebut sejalan dengan hasil penelitian Takahashi et al . (2011) bahwa kandungan 14% kitosan dalam senyawa preservatif alami yaitu San Keeper K-3 10.000 ppm mampu menurunkan total L. monocytogenes pada hari ke-3 dalam produk daging tuna giling dan telur salmon masing-masing yaitu 3,1 dan 1,97 log CFU/ mL.
Pengaruh Perlakuan terhadap Pertumbuhan V. cholerae dalam Matriks Surimi V. cholerae merupakan salah satu spesies dalam genus Vibrio . Sensitifitas setiap spesies dalam genus Vibrio terhadap mikropartikel kitosan bervariasi dan dipengaruhi oleh komposisi polisakarida kapsul, LPS serta protein outer membrane yang berkontribusi terhadap perubahan muatan permukaan, hidrofobisitas, sifat pengikatan dan lain sebagainya (Fang et al. 2015). Efek penambahan kitosan dan komplek kitosan-
monosakarida terhadap total bakteri serta respon pertumbuhan V. cholerae pada surimi ikan gabus sebagai model matriks pangan disajikan dalam Figure 4 . Perlakuan C2 memberikan nilai rata- rata TPC terendah yaitu 5,11 log CFU/mL.
Berdasarkan hasil uji lanjut BNJ pada taraf 5% perlakuan C2 berbeda nyata terhadap perlakuan C1, C3 dan C0 namun berbeda tidak nyata dengan perlakuan C4. Perlakuan yang sama juga memberikan rata-rata total Vibrio cholera terendah yaitu dengan nilai 4,39 log CFU/mL. Nilai tersebut berbeda nyata dengan keempat perlakuan lainnya. Hasil rata- rata total V. cholerae pada sampel surimi yang diberikan perlakuan kitosan maupun kompek kitosan-monosakarida secara umum memiliki nilai 1,8 hingga 2,25 log CFU/mL lebih rendah dibandingkan control. Sedangkan untuk nilai rata-rata TPC, penurunan jumlah bakteri yang terjadi akibat perlakuan adalah 1,80-1,94 log CFU/mL. Menurut Darmadji dan Izumimoto (1994), kitosan 1% dapat mengurangi 1-2 log CFU/mL dari Pseudomonas , Staphylococcus dan jumlah total bakteri pada produk daging cincang. Jika ditinjau kembali, efek antibakteri yang diberikan oleh komplek kitosan glukosa terhadap V. cholerae lebih baik dibandingkan dengan inhibisi yang ditunjukkan oleh komplek kitosan galaktosa terhadap B. subtilis dan L. monocytogenes . Hal tersebut dapat dipengaruhi oleh perbedaan struktur dinding sel antara kedua jenis bakteri, dimana V.  cholera merupakan bakteri Gram negatif
Figure  3  Effect  of  chitosan  and  chitosan  monosaccharide  complex  on  total  plate  count  and L. monocytogenes growth in snakehead fish surimi,               C0 (no chitosan);              C1 (chitosan 1%);               C2 (chitosan glucose complex 1%);              C3 (chitosan galactose complex 1%);               C4 (chitosan fructose complex 1%).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 6 12 24 48 To ta l p la te co un t ( lo g C FU /m L) Time (h) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 6 12 24 48 Li ste ria m on oc ytog en es (lo g C FU /m L) Time (h)
Aktivitas antibakteri kompleks kitosan-monosakarida, Lestari et al.
sedangkan B. subtilis dan L. monocytogenes tergolong ke dalam Gram positif. Aktivitas antibakteri kitosan terhadap bakteri Gram negatif terkait dengan kemampuannya untuk mengikat dan melemahkan fungsi barrier pada outer  membrane (Helander et al . 2001). Menurut Nikaido
(1996), struktur polikationik kitosan dapat berinteraksi dengan senyawa-senyawa anionik seperti protein dan polisakarida pada permukaan membran sel bakteri Gram negatif. Penghambatan pertumbuhan bakteri oleh komplek kitosan-monosakarida diduga karena adanya senyawa produk reaksi Maillard (PRM) yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri.  Glukosa, galaktosa dan fruktosa merupakan gula pereduksi yang dapat bereaksi dengan gugus amina pada reaksi Maillard. Senyawa PRM tersebut adalah struktur HMF
(5-hidroksi metil furfural) furfural dan maltol.
Pengaruh penghambatan PRM tergantung pada jenis PRM dan bakteri yang digunakan. PRM tertentu dapat mempengaruhi kelarutan besi yang merupakan kofaktor enzim penting dalam metabolisme bakteri sehingga dapat mengakibatkan penurunan aktivitas metabolisme dan pengikatan nutrisi (Ambarsari dan Mochtar 2002).

## KESIMPULAN
Aktivitas antibakteri yang ditunjukkan oleh kitosan maupun komplek kitosan- monosakarida tidak terhambat oleh komponen nutrisi di dalam matriks pangan surimi dan
menunjukkan hasil yang sama baik dalam kondisi in vitro maupun in situ (dalam matriks pangan). Komplek kitosan-monosakarida lebih efektif dalam menghambat V. cholera dibandingkan B. subtilis dan L. monocytogenes .
Perbedaan efektivitas setiap komplek kitosan- monosakarida dalam menghambat bakteri uji terkait dengan jenis, jumlah dan karakterisitik senyawa produk reaksi Maillard yang masih perlu dikaji lebih lanjut.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Universitas Sriwijaya yang telah mendanai riset ini melalui skema penelitian Hibah Bersaing dengan nomor kontrak 121/ UN.9.3.1/LT/2014.

## DAFTAR PUSTAKA
Afrianti LH. 2010. Pengawet Makanan Alami dan Sintetis . Bandung (ID): Alfabeta.
Ambarsari L, Mochtar HM. 2002. Mekanisme penghambatan produk-produk reaksi Maillard. Buletin Kimia. 2: 19-23.
Benjakul S, Lertittikul W, Bauer F. 2005.
Antioxidant activity of Mailllard reaction products from a porcine plasma protein- sugar model system. Food Chemistry.
93(2):189-196.
Chung YC, Wang HL, Chen YM, Li SL. 2003. Effect of abiotic factors on the antibacterial activity of chitosan against waterborne pathogens. Bioresource Technology . 88(3): 179-184. Darmadji P, Izumimoto M. 1994. Effect of
Figure  4  Effect  of  chitosan  and  chitosan  monosaccharide  complex  on  total  plate  count  and V. cholerae growth in snakehead fish surimi,                   C0(no chitosan);                 C1(chitosan 1%);               C2 (chitosan  glucose  complex 1%);               C3(chitosan  galactose  complex 1%);              C4 (chitosan fructose complex 1%).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 6 12 24 48 Tota l P la te C ou nt (log C FU /m L Time (h) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 6 12 24 48 V ib rio ch ole rae (lo g C FU /mL ) Time (h)
chitosan in meat preservation. Meat Scienc e. 38(2): 243-254. Devlieghere F, Vermeulen A, Debevere J. 2004. Chitosan: antimicrobial activity, interactions with food components and applicability as a coating on fruit and vegetables. Food Microbiology. 21:                   703-714. Helander I, Nurmiaho-Lassila EL, Ahvenainen R, Rhoades J, Roller S. 2001. Chitosan disrupts the barrier properties of the outer membrane of Gram-negative bacteria. International Journal of Food Microbiology. 71(2-3): 235–244. Hu Z, Ganzle MG. 2018. Challenges and opportunities related to the use of chitosan as a food preservative. Journal of Applied Microbiology. Huang JR, Chen RH. 1997. The bactericide effects on chitosan glucose Maillard reaction products obtained for different reaction times and the preservative effects of chitosan for kamaboko. Journal of Food
Science. 24: 458-468. Hudzicki J. 2009. Kirby-Bauer Disk Diffusion Susceptibility Test Protocol. www. asmscience.org/content/education/ protocol/protocol.3189 Jami M, Ghanbari M, Zunabovic M, Domig KJ, Kneifel. 2014. Listeria monocytogenes in aquatic food products—A Review. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 13(5): 798-813. Jumaa M, Muller BW. 1999. Physiochemical properties of chitosan-lipid emulsions and their stability during the autoclaving process . International Journal of Pharmaceutics. 183:175-184.
Kanatt SR, Chander R, Sharma A. 2008.
Chitosan glucose complex-A novel food preservative. Food Chemistry. 106: 521-528. Kong M, Chen XG, Xing K, Park HJ. 2010. Antimicrobial properties of chitosan and mode of action: a state of the art review. International Journal of Food Microbiology. 144: 51-63. Lo´pez CS, Alice AF, Heras H, Rivas EA, Sa´nchez-Rivas C. 2006. Role of anionic phospholipids in the adaptation of Bacillus subtilis to high salinity. Microbiology. 152: 605–616. López-León T, Carvalho ELS, Seijo B, Ortega- Vinuesa JL, Bastos-González D. 2005. Physicochemical characterization of chitosan nanoparticles: electrokinetic and stability behavior. Journal of Colloid and
Interface Science. 283: 344-351. Nikaido H. 1996. Outer membrane. Neidhardt FCZ (Editor) Escherichia coli and Salmonella : Cellular and Molecular Biology. Washington DC (USA): American Society for Microbiology. Park JW, Lin TMJ. 2005. Surimi: Manufacturing and Evaluation. Park JW (Editor) Surimi and Surimi Seafood Second Edition. Boca Raton (FL): CRC Press. Rhoades J, Roller S. 2000. Antimicrobial actions of degraded and native chitosan against spoilage organisms in laboratory media and foods. Applied and Environmental
Microbiology . 66: 80-86. Rocourt J, Buchrieser C. 2007. The genus Listeria and Listeria monocytogenes: phylogenetic position, taxonomy and identification. Elliot TR, Elmer HM (editor) Listeria, Listeriosis, and Food Safety. Boca Raton (FL): CRC Press. Takahashi H, Kuramoto S, Miya S, Koiso H, Kuda T, Kimura B. 2011. Use of commercially available antimicrobial compounds for prevention of Listeria monocytogenes growth in ready-to- eat minced tuna and salmon roe during shelf life. Journal of Food Protection. 74(6): 994–998.