## OPTIMASI METODE PCR UNTUK DETEKSI

## Pectobacterium carotovorum , PENYEBAB PENYAKIT BUSUK LUNAK ANGGREK
OPTIMIZATION OF PCR METHOD FOR THE DETECTION OF Pectobacterium carotovorum , A CAUSAL AGENT OF SOFT-ROT DISEASE ON ORCHID
Tri Joko * , Nanda Kusumandari, dan Sedyo Hartono Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada, Jln. Flora 1 Bulaksumur Yogyakarta 55281
* Penulis untuk korespondensi. E-mail: tjoko@ugm.ac.id

## ABSTRACT
Soft rot is one of the most important diseases of orchids caused by Pectobacterium carotovorum . The conventional methods for the detection of pathogen is tedious and time consuming. In recent years, numerous molecular diagnostic approaches for the detection of P. carotovorum have been developed, including various PCR-based assays. Optimiza- tion of PCR technique to DNA amplification is essential for time and material efficiency, which will make detection to be rapid and more appropriate. The purposes of this study were to decide concentration of DNA and primer, and also the concentration of bacterial pure cultures and primer to amplify 16S rRNA gene fragment. Optimization of PCR was done by using various concentration of DNA, pure cultures of bacteria, and primer to amplify the 16S rRNA gene se- quence. The results showed that the most optimum concentration to amplify 16S rRNA gene sequence at DNA and primer concentration were 63,4 ng/µl and 10 pmol, while pure cultures and primer concentrations were at 8×10 9 CFU/ml and 10 pmol respectively.
Key words: detection, PCR optimization, Pectobacterium carotovorum, soft rot disease

## INTISARI
Penyakit busuk lunak yang disebabkan oleh Pectobacterium carotovorum merupakan salah satu penyakit penting pada tanaman anggrek. Deteksi patogen secara cepat dan akurat dapat dilakukan secara molekular menggunakan teknik Polymerase chain reaction (PCR). Optimasi metode PCR perlu dilakukan untuk mengefisienkan waktu dan penggu- naan bahan sehingga proses deteksi dapat dilakukan dengan cepat dan tepat. Penelitian ini bertujuan untuk menen- tukan konsentrasi DNA dengan primer maupun konsentrasi kultur murni bakteri dengan primer yang paling tepat untuk mendapatkan fragmen gen 16S rRNA. Optimasi PCR dilakukan menggunakan beberapa variasi pengenceran pada DNA, kultur murni bakteri, dan primer untuk mengamplifikasi gen 16S rRNA. Hasil penelitian menunjukkan bahwa konsentrasi yang paling optimal untuk mengamplifikasi gen 16S rRNA yaitu DNA dan primer masing-masing sebe- sar 63,4 ng/ µ l dan 10 pmol, sedangkan konsentrasi kultur murni dan primer sebesar 8×10 9 CFU/ml dan 10 pmol. Kata kunci: deteksi, optimasi PCR, Pectobacterium carotovorum , penyakit busuk lunak

## PENGANTAR
Penyakit  busuk  lunak  merupakan  salah  satu penyakit penting dalam budidaya tanaman anggrek yang disebabkan oleh bakteri patogen, salah satunya Pectobacterium carotovorum (Agrios, 2005). Bak- teri tersebut dapat menyerang seluruh bagian tanam- an dan meluas dengan cepat bahkan menyebabkan kematian pada tanaman anggrek. Penyakit ini juga dapat menyebabkan kerusakan terutama pada saat di  pembibitan  hingga  80–100%. P.  carotovorum bersifat anaerob fakultatif dan mempunyai aktivitas pektolitik yang kuat sehingga menyebabkan busuk lunak pada tanaman. Bakteri ini menyerang jaringan tanaman pada umumnya melalui pelukaan dan juga dapat melalui lubang alami (Joko et al ., 2011). Banyak cara yang digunakan untuk mendeteksi bakteri patogen tumbuhan baik secara konvensional seperti penumbuhan bakteri di media agar hingga
cara  modern  seperti polymerase  chain  reaction (PCR)  (Schaad et  al .,  2001).  PCR  merupakan metode molekular untuk menggandakan potongan DNA hingga berjuta kali lipat dalam waktu yang re- latif singkat. Penggandaan tersebut tidak terlepas dari penggunaan enzim dan sepasang primer bersi- fat spesifik terhadap DNA target yang akan dilipat- gandakan.  Sehingga  nantinya  dapat  digunakan untuk keperluan lain yang berkaitan dengan DNA. Komponen-komponen yang harus ada dalam proses PCR antara lain DNA cetakan yaitu potongan DNA yang akan dilipatgandakan, primer yaitu suatu po- tongan atau sequence dari oligonukleotida pendek yang digunakan untuk mengawali sintesis DNA, deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), terdiri atas dATP,  dCTP,  dGTP,  dTTP,  dan  enzim  DNA polimerase yaitu enzim yang melakukan katalisis reaksi  sintesis  rantai  DNA,  dan  senyawa  bufer (Erlich, 1989). Secara singkat menurut Sambrook
Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia, Vol. 17, No. 2, 2011: 54–59
et al. (1989) metode PCR menginkubasi sampel dalam tiga suhu berbeda yakni untuk memisahkan potongan DNA pada suhu 90–95 o C, suhu 40–60 o C terjadi penempelan primer pada DNA cetakan, di- lanjutkan dengan sintesis DNA pada suhu 70–75 o C. Proses pemecahan untai DNA ganda menjadi untai tunggal disebut denaturasi DNA template, bia- sanya terjadi pada suhu 95 o C selama 1–2 menit se- hingga  DNA  yang  berupa  untai  ganda  ( double stranded ) akan terpisah menjadi untai tunggal. Ke- mudian  dilanjutkan  dengan  proses  penempelan ( annealing ) primer pada DNA cetakan pada suhu 56 o C selama 1 menit. Primer akan membentuk ikat- an hidrogen dengan cetakan pada daerah sekuen yang komplementer. Tahap selanjutnya yakni sinte- sis DNA dimana akan terbentuk DNA baru ber- dasarkan informasi yang ada pada DNA cetakan dengan bantuan enzim DNA polimerase. Tahap sin- tesis ini biasanya terjadi pada suhu 72 o C selama 1– 2 menit. Tahapan-tahapan tersebut diulangi 25–35 siklus. Di akhir proses PCR maka hasilnya disim- pan pada suhu 4 o C (Yuwono, 2006). Salah satu fak- tor penting yang mempengaruhi kualitas deteksi molekular berbasis PCR yakni pemilihan primer yang  tepat  (Rychlik et  al. ,  1990;  Greisen et  al ., 1993).  Primer  PCR  merupakan  oligonukleotida yang berperan untuk mengawali proses amplifikasi molekul DNA. Keberadaan primer PCR tersebut menyebabkan gen target akan teramplifikasi sepan- jang  reaksi  PCR  berlangsung  (Marchesi et  al ., 1998).
Pemanfaatan gen 16S rRNA telah digunakan se- bagai parameter sistematik molekular yang univer- sal, representatif, dan praktis untuk mengkonstruksi kekerabatan  filogenetik  pada  tingkat  jenis  atau spesies. Hal ini disebabkan karena keberadaan gen tersebut tidak tergantung pada kondisi pertumbuhan dan  media  yang  digunakan  (Case et  al .,  2007; Clarridge,  2004).  Penelitian  ini  bertujuan  untuk menentukan  konsentrasi  DNA  dengan  primer maupun konsentrasi kultur murni bakteri dengan primer yang paling tepat untuk mendapatkan frag- men gen 16S rRNA pada P. carotovorum .

## BAHAN DAN METODE
Isolat Bakteri Isolat P.  carotovorum secara  rutin  dibiakkan pada  media  agar  YPA  (0,5%  ekstrak  yeast;  1% polipepton; 1,5% agar) pada pH 6,8.  Bakteri di- tumbuhkan pada suhu ruang dan secara periodik koloni tunggalnya ditumbuhkan pada medium YPA yang baru untuk menjaga viabilitas dan kemurnian isolat. Isolat bakteri selanjutnya di-simpan di dalam
ddH 2 O steril pada 4°C untuk penyimpanan jangka pendek  (±  1  bulan).  Untuk  tujuan  penyimpanan jangka panjang, isolat bakteri disimpan di dalam freezer (-20°C) pada medium yang mengandung 30% glycerol dan 70% YPB (Joko et al ., 2007a).
Isolasi DNA Total  genom  bakteri  diisolasi  dengan  teknik minipreparation  DNA  isolation (Ausubel et  al ., 1990) dengan sedikit modifikasi. Sebanyak 1,5 ml kultur sel disentrifus dengan kecepatan 5.000 g se- lama 2 menit. Pelet yang diperoleh kemudian dire- suspensi dalam 540 µl TE buffer (0,1 M Tris-HCl, 0,1 M EDTA pH 8), lalu ditambahkan 30 µl 10% SDS dan diinkubasikan pada suhu 37°C selama 60 menit, ditambahkan 100 µl 5 M NaCl, dan 80 µl CTAB/NaCl,  kemudian  dihomogenkan  dan  di- inkubasikan pada suhu 65°C selama 10 menit. Se- lanjutnya ditambahkan 750 µl chloroform isoamyl alcohol (24:1) dan disentrifus pada 12.000 g selama 5 menit. Lapisan atas yang terbentuk dipindahkan ke tabung 1,5 ml eppendorf yang baru kemudian di- tambahkan 600 µl phenol/chloroform/isoamylalco- hol (25:24:1)  dan  disentrifus  12.000 g selama  5 menit. Lapisan atas dipindahkan ke tabung 1,5 ml eppendorf yang  baru.  Selanjutnya  ditambahkan 0,6× volume isopropanol dan disentrifus kembali pada 12.000 g selama 5 menit. Pelet yang terbentuk dicuci dengan etanol 70% dan dikeringanginkan, kemudian diresuspensi dalam 20 µl bufer TE. Perhitungan  Konsentrasi  DNA,  Kultur  Murni Bakteri, dan Primer Pada penelitian ini dilakukan dua macam opti- masi PCR yakni berdasarkan konsentrasi DNA de- ngan primer dan kultur murni bakteri umur ± 48 jam dengan primer. Konsentrasi DNA P. carotovorum hasil ekstraksi dihitung terlebih dahulu menggu- nakan spektrofotometer ( GeneQuant DNA calcula- tor , Amersham Biosciences). Variasi pengenceran DNA  ada  lima  yakni  DNA  tanpa  pengenceran, pengenceran 5×, 10×, 50×, dan 100× serta variasi pengenceran primer yakni 10×, 50×, dan 100×. Konsentrasi kultur murni bakteri diketahui de- ngan  menghitung  jumlah  koloni  per  unit  (CFU/ Colony Forming Unit ). Hasil biakan P. carotovorum berumur ± 48 jam dipanen di dalam 5 ml ddH 2 O steril dan dihitung OD ( Optical Density ) dengan spektrofotometer. Nilai OD= 2 atau yang mendekati dibuat pengenceran hingga 10 -10 . Selanjutnya di- lakukan cover  plate  method masing-masing  se- banyak  100  µl pada  media  solid YPA  dan  akan diketahui jumlah koloni tunggal berdasarkan peng- amatan langsung. Variasi pengenceran kultur murni antara lain OD = 2, 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , 10 -4 , 10 -5 , 10 -6 ,
Joko et al. : Optimasi Metode PCR untuk Deteksi Pectobacterium carotovorum
10 -7 , 10 -8 , 10 -9 dan 10 -10 . Sedangkan variasi peng- enceran primer yaitu 10×, 50×, dan 100×.
Amplifikasi Gen 16S rRNA DNA hasil ekstraksi diamplifikasi dengan teknik PCR  mengikuti  prosedur  Heuer et  al .  (1999) menggunakan  primer  984f;  5’-AACGCGAA- GAACCTTAC-3’  dan  1378r;  5’-CGGTGTGTA- CAAGGCCCGGGAACG-3’.  Reaksi  PCR  (total volume  25  μl)  menggunakan  Kit Go  Taq  Green (DNA template 2,5 µl, primer forward dan reverse masing-masing sebanyak 1,5 µl, master mix Go Taq green sebanyak 12,5 µl dan nuclease free water se- banyak 7 µl). Tabung-tabung tersebut ditempatkan pada mesin PCR ( thermal cycler ) pada suhu 94°C selama 2 menit untuk denatu-rasi awal. Amplifikasi dengan PCR dilakukan sebanyak 35 siklus dengan tahapan  sebagai  berikut:  Proses  denaturasi  pada suhu 94°C selama 15 detik, proses penempelan pada suhu 55°C selama 30 detik, dan proses pemanjang- an pada suhu 68°C selama 30 detik. Kemudian di- lanjutkan dengan final extention pada 72°C selama 5 menit.
Visualisasi DNA DNA bakteri hasil amplifikasi dianalisis dengan elektroforesis menggunakan gel agarose 1% (dalam TBE  0,5×)  yang  mengandung ethidium  bromide (Joko et al ., 2007b). Untuk peng-ukuran DNA di- gunakan marker 100 bp DNA ladder . Elektroforesis dilakukan pada tegangan 75 V DC selama 90 menit. Hasil eletroforesis kemudian dilihat dengan trans- illuminator ultra violet dan hasilnya difoto dengan kamera digital.

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Optimasi Konsentrasi DNA dengan Primer Hasil optimasi PCR 16S rRNA pada keempat variasi pengenceran DNA  (5×, 10×, 50×, dan 100×) dengan  ketiga  variasi  pengenceran  primer  (10×, 50×, dan 100×) dapat teramplifikasi dengan baik se- hingga  pita  DNA  terlihat  jelas,  sedangkan  DNA murni (tanpa pengenceran) tidak dapat terampli- fikasi atau tidak terbentuk pita DNA (Gambar 1). Target pita DNA akan berada pada ukuran yang sama tetapi yang membedakan satu sama lain yakni ketebalan dan kejelasan pita tersebut. Konsentrasi DNA dan primer berpengaruh terhadap produk pita DNA yang dihasilkan. Konsentrasi DNA yang ter- lalu tinggi kemungkinan masih mengandung konta- minan seperti fenol dan metabolit sekunder lainnya sehingga  dapat  mengganggu  proses  penempelan primer pada DNA dan proses amplifikasi selanjut- nya. Proses annealing atau penempelan primer pada
DNA yang komplementer menjadi tidak sempurna sehingga tidak terbentuk penggandaan pita DNA. Menurut Padmalatha dan Prasad (2006) dan Harini et al. (2008) konsentrasi primer yang terlalu rendah atau yang terlalu tinggi dapat menyebabkan tidak terjadinya amplifikasi. Rasio rendah antara primer dan  DNA  menyebabkan  produk  yang  dihasilkan tidak konsisten (Ali et al ., 2006). Hal tersebut meru- pakan salah satu faktor yang menyebabkan hasil ek- straksi DNA yang tidak diencerkan pada penelitian ini tidak dapat teramplifikasi.
Konsentrasi pengenceran DNA 5×, 10×, 50×, dan 100× berturut-turut yakni 317,1 ng/µl, 63,42 ng/µl,  31,72  ng/µl,  6,34  ng/µl,  dan  3,17  ng/µl. Sedangkan konsentrasi pengenceran primer 10×, 50×, dan 100× masing-masing 10 pmol, 2 pmol, dan 1  pmol.  Amplifikasi  PCR  16S  rRNA  biasanya menggunakan konsentrasi DNA dan primer univer- sal  masing-masing  sekitar  65,3  ng/µl  dan  5–20 pmol. Pita DNA yang paling baik dari optimasi PCR 16S rRNA ini pada konsentrasi DNA dan primer universal masing-masing 63,42 ng/µl dan 10 pmol. Hasil  optimasi  PCR  16S  rRNA  tersebut  dapat dikatakan optimal karena konsentrasi DNA ataupun primernya rendah tetapi masih dapat menghasilkan pita DNA yang terlihat tebal dan jelas (Gambar 1). Konsentrasi keduanya lebih rendah dibandingkan dengan konsentrasi yang biasa digunakan untuk am- plifikasi  tetapi  hasilnya  sama  baik.  Penggunaan konsentrasi yang rendah bertujuan untuk menge- fisienkan  penggunaan  bahan  (DNA  dan  primer) maupun waktu.
Konsentrasi DNA 3,17 ng/ µ l dan konsentrasi primer 1 pmol masih dapat teramplifikasi dengan baik sehingga pita DNA masih terlihat jelas. Pada proses identifikasi bakteri menggunakan PCR 16S rRNA  hingga  analisis  filogenetik  tidak  memer- hatikan ketebalan dan kejelasan pita DNA. Hasil amplifikasi yang kurang jelas masih dapat digu- nakan untuk proses sekuensing, akan tetapi optimasi ini sangat berguna dalam meminimalkan penggu- naan DNA dan primer. Jika hasil amplifikasi DNA terlihat baik dan jelas maka akan berpengaruh baik juga pada proses sekuensingnya.
Optimasi  Konsentrasi  Kultur  Murni  Bakteri dengan Primer Selain penggunaan DNA hasil ekstraksi juga di- gunakan kultur murni bakteri secara langsung untuk amplifikasi gen 16S rRNA. Proses isolasi DNA bak- teri membutuhkan banyak waktu dan penggunaan bahan-bahan ekstraksi yang cukup banyak sehingga pada penelitian ini dilakukan optimasi konsentrasi kultur  murni  dan  primer  untuk  mengefisienkan
penggunaan bahan tersebut serta menghemat waktu. Isolat murni bakteri diamplifikasi dengan bebe- rapa macam pengenceran primer (10×, 50×, dan 100×). Seluruh kultur murni bakteri dengan peng- enceran bertingkat dapat teramplifikasi dengan baik oleh  gen  16S  rRNA  (Gambar  2A,  2B,  dan  2C). Meskipun konsentrasi kultur murni bakteri beragam akan tetapi hasilnya tidak terlalu berbeda. Konsen- trasi atau jumlah koloni bakteri pada OD = 2 sebe-
sar 8×10 10 CFU/ml artinya pada pengenceran kul- tur murni bakteri 10 -10 mengandung jumlah koloni 8 CFU/ml. Hasil PCR pada kultur murni bakteri ini berbeda  dengan  PCR  pada  DNA  hasil  ekstraksi yang mana DNA tanpa pengenceran tidak dapat ter- amplifikasi (Gambar 1). Hal tersebut kemungkinan disebabkan karena pada kultur murni bakteri tidak dilakukan ekstraksi DNA sehingga proses PCR di- lakukan langsung terhadap biakan murni bakteri se-
Gambar 1. Hasil amplifikasi gen 16S rRNA P. carotovorum menggunakan primer universal pada reaksi PCR yang dielektroforesis pada 1,5% gel agarosa ( Lane 1–5: DNA murni tanpa pengenceran, peng- enceran DNA 5×, 10×, 50×, dan 100× dengan pengenceran primer 10×; Lane 6–10: DNA murni tanpa pengenceran, pengenceran DNA 5×, 10×, 50×, dan 100× dengan pengenceran primer 50×; Lane 11–15: DNA murni tanpa pengenceran, pengenceran DNA 5×, 10×, 50×, dan 100× dengan pengenceran primer 100×; M: DNA ladder 100 bp)
Gambar 2. Hasil amplifikasi gen 16S rRNA P. carotovorum menggunakan primer universal pada reaksi PCR yang dielektroforesis pada 1,5% gel agarosa ( Lane 1: Kultur murni bakteri dengan konsentrasi 8 × 10 10 CFU/ml; Lane 2–11: pengenceran kultur murni bakteri 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , 10 -4 , 10 -5 , 10 -6 , 10 - 7 , 10 -8 , 10 -9 dan 10 -10 dengan pengenceran primer 10× (A), 50× (B), dan 100× (C); M: DNA ladder 100 bp)
Joko et al. : Optimasi Metode PCR untuk Deteksi Pectobacterium carotovorum
hingga total jumlah DNA pada konsentrasi bakteri yang  ada  (8  ×  10 10 CFU/ml)  kemungkinan  jauh lebih sedikit dari pada DNA hasil ekstraksi. Selain itu DNA hasil ekstraksi memiliki tingkat kemurni- an yang lebih tinggi dari pada kultur murni bakteri.
Perbedaan kenampakan pita DNA pada setiap pengenceran kultur murni hanya sedikit akan tetapi terlihat bahwa semakin sedikit jumlah koloni bak- teri maka hasil pita DNAnya semakin tipis. Tingkat pengenceran  kultur  murni  dengan  pengenceran primer  10×  tidak  terlalu  menunjukkan  adanya perbedaan yang signifikan. Hasil amplifikasi kultur murni bakteri pada pengenceran 50× dan 100× ter- lihat  lebih  tipis  dibandingan  pada  pengenceran primer  10×.  Dari  hasil  amplifikasi  dapat  dilihat bahwa konsentrasi primer sangat berpengaruh ter- hadap kenampakan pita DNA. Jumlah koloni yang digunakan untuk proses identifikasi bakteri patogen tumbuhan menggunakan gen 16S rRNA yakni seki- tar 10 6 –10 8 CFU/ml. Hasil amplifikasi kultur murni bakteri  paling  optimal  pada  konsentrasi  kultur murni dan primer masing-masing 8 × 10 9 CFU/ml dan  10  pmol.  Meskipun  jumlah  koloni  cukup banyak akan tetapi konsentrasi primernya cukup kecil dan masih bagus dalam mengamplifikasi DNA bakteri tersebut. Konsentrasi DNA dan primer pa- ling rendah yakni berturut-turut sebesar 8 CFU/ml dan 1 pmol ternyata masih dapat mengamplifikasi gen 16S rRNA.

## KESIMPULAN
1.  Konsentrasi DNA dengan primer yang paling op- timal  untuk  mengamplifikasi  gen  16S  rRNA berturut-turut  yakni  63,4  ng/µl  dan  10  pmol, sedangkan  konsentrasi  kultur  murni  isolat P. carotovorum dan primer universal masing-mas- ing sebesar 8 × 10 9 CFU/ml dan 10 pmol.
2. Konsentrasi DNA dengan primer yang paling minimal untuk mengamplifikasi gen 16S rRNA berturut-turut  yakni  6,34  ng/µl  dan  1  pmol, sedangkan  konsentrasi  kultur  murni  isolat P. carotovorum dan  primer  universal  masing- masing sebesar 8 CFU/ml dan 1 pmol.

## DAFTAR PUSTAKA
Agrios, G.N. 2005. Plant Pathology, 5 th Edition. Academic Press. New York. 922 p.
Ali, B.A., T.H. Huang, H.H. Salem, & Q.D. Xie. 2006. Influence of Thermal Cycler Day-to-day Re- producibility of Random Amplified Polymorphic DNA Fingerprints. Biotechnology 5: 324–329.
Ausubel F.M, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith, & K. Struhl (eds.). 1990.
Current Protocols in Molecular Biology . New York: Greene  Publishing  Associates  and  Wiley-Inter- Science.
Case, R.J., Y. Boucher, I. Dahllöf, C. Holmström, W.F. Doolittle, & S. Kjelleberg. 2007. Use of 16S rRNA and rpoB Genes as Molecular Markers for Microbial Ecology Studies . Applied and Environ- mental Microbiology 73: 278–288.
Clarridge, J.E. 2004. Impact of 16S rRNA Gene Se- quence Analysis for Identification of Bacterial on Clinical  Microbiology  and  Infectious  Diseases . Clinical Microbiology Review 17: 840–862. Erlich,  H.A.  1989.  Polymerase  Chain  Reaction . Journal of Clinical Immunology 9: 437−447. Greisen, K., A. Loeffelholz, Purohit, & D. Leong. 1993. PCR Primers and Probes for the 16s rRNA Gene of Most Species of Pathogenic Bacteria, In- cluding  Bacteria  Found  in  Cerebrospinal  Fluid. Journal of Clinical Microbiology 32: 335–51. Harini, S.S., M. Leelombik, M.N.S. Kameshwari, & N. Sathyanarayana. 2008. Optimization of DNA Isolation and PCR-RAPD Methods for Molecular Analysis of Urginea indica Kunth. International Journal of Integrative Biology 2: 138–144. Heuer, H., K. Hartung, G. Wieland, I. Kramer, & K. Samalla. 1999. Polynucleotide Probes That Target a  Hypervariable  Region  of  16S  rRNA  Genes  to Identify Bacterial Isolate Corresponding to Bands of Community Fingerprint. Applied and Environ- mental Microbiology 65: 1045–1049. Joko, T., D. Kiswanti, S. Subandiyah, & Hanudin. 2011.  Occurence  of  Bacterial  Soft  Rot  of Phalaenopsis Orchids in Yogyakarta and West Java, Indonesia,  p.  255–265. In Y.  Koentjoro (ed.), Proceeding of Internasional Seminar on “Natural Resources, Climate Change, and Food Security in Developing  Countries” .  27−28  June  2011. Surabaya, Indonesia.
Joko, T., H. Hirata, & S. Tsuyumu. 2007a. Sugar Transporter  (MfsX)  of  Major  Facilitator  Super- family is Required for Flagella-mediated Pathogen- esis in Dickeya dadantii 3937. 2007. Journal of General Plant Pathology 73: 266−273. Joko,  T.,  H.  Hirata,  &  S.  Tsuyumu.  2007b.  The Sugar Transporter (MfsX) is Required Also for Fit- ness  to  Plant  Environments  in Dickeya  dadantii 3937. Journal  of  General  Plant  Pathology 73: 274−280.
Marchesi,  J.R.,  T.  Sato,  A.J.  Weightman,  T.A. Martin, J.C. Fry, S.J. Hiom, & W.G. Wade. 1998. Design and Evaluation of Useful Bacterium Spe- cific PCR Primer that Amplify Genes Coding for Bacterial 16S-rRNA . Applied and Environmental Microbiology 64: 795–799.
Padmalatha, K. & M.N.V. Prasad. 2006. Optimiza- tion of DNA Isolation and PCR Protocol for RAPD Analysis of Selected Medicinal and Aromatic Plants of Conservation Concern from Peninsular India. African Journal Biotechnology 5: 230–234.
Rychlik, W., W.J. Spencer, & R.E. Rhoads. 1990. Optimization  of  the  Annealing  Temperature  for DNA  Amplification In  vitro . Nucleic  Acids Research 18: 6409–6412.
Sambrook, J., E.F. Fritsch, & T. Maniatis. 1989. Mo- lecular Cloning: A Laboratory Manual. 2 nd edition . Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. Schaad N.W., J.B. Jones, & W. Chun. 2001. Labo- ratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria . APS Press USA. 373 p.
Yuwono, T. 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Andi Offset. Yogyakarta. 237 p.
Joko et al. : Optimasi Metode PCR untuk Deteksi Pectobacterium carotovorum