Karakteristik Molekuler Variasi Somaklonal Ubi Kayu Varietas Carvita 25 Menggunakan Marka SSR
Molecular Characteristics of Cassava Carvita 25 Somaclonal Variant

## Using SSR Marker
Nur Ayu Ramadanti 1 , Hartati 2*) , Dwi Hilda Putri 1 , N. Sri Hartati 2 1 Universitas Negeri Padang, Padang 2 Puslit Bioteknologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia Cibinong * E-mail: tatiktikta@yahoo.com

## ABSTRACT
Cassava  is  one  of  the  most  important  food  commodities  besides rice  and  corn.  Carvita 25  is  a somaclonal variation that was induced from Adira IV cassava variety. Our study aimed to analyze the genetic differences of Carvita 25 compared to Adira IV by using SSR markers. Two cassava varieties, Carvita 25 and Adira IV, were used as plant materials and eleven SSRY primers were used  to  amplifythe  fragments  of  cassava  DNA.  The  results  showed  that    SSRY  151  primer produced the highest polymorphic band (85.71%) where 6 out of 7 alels  were polymoprphics with the length size from 120 to600 bp. Of the total 56 of polymorphic bands, 26 alels were previously present in Adira IV but then it can not be found in Carvita 25, while 30 other bands were new fragments that were previously not present in Adira IV but then were present in Carvita 25. These genetic differencesof both Adira IV and Carvita 25 were also strengthened by the Jacard similarity value.  The  Jaccard  similarity    between  Carvita  25  and  Adira  IV  were  0.40-0.50,  while  the similarity  between  plants  of  Carvita  25  were  0.79-0.87,  and  in  plants  of  Adira  IV  were  0.98- 1.These values showed thewide genetic difference between Adira IV and a somaclonal variation of Carvita 25.
Keywords: cassava, Carvita 25, polymorphic, somaclonal variation, SSR Marker .
PENDAHULUAN Kebutuhan  ubi  kayu  ( Manihot  esculanta ) dalam negeri akan semakin meningkat di masa yang  akan  datang  sejalan  dengan  semakin meningkatnya  dan  berkembangnya  industri berbahan  baku  ubi  kayu,  termasuk  industri mocaf  kaya  beta  karoten  (KBK).  Kebutuhan ubi kayu pada tahun 2025 diperkirakan sekitar 30  juta  ton  ubi  kayu  segar,  dan  untuk memenuhi  kebutuhan  tersebut  diperlukan peningkatan  produksi  ubi  kayu  sekitar  27% (Suryana 2006). Khusus untuk produksi mocaf KBK  diperlukan  jenis  ubi  kayu  tertentu  yang berumbi  kuning  (Hartati et  al .,  2017).  Untuk memenuhi  kebutuhan  industri  mocaf  KBK maka perlu dilakukan penanaman jenis ataupun perakitan  galur  unggul  ubi  kayu  dengan kandungan beta karoten tinggi. Upaya peningkatan produksi ubi kayu demi kecukupan  kebutuhan  permintaan  ubi  kayu dapat dilakukan melaluiperakitan varietas atau galur  superior  ubi  kayu  dengan  pemuliaan tanaman,  baik  melalui  aplikasi  bioteknologi ataupun  secara  konvensional.  Zhang et  al ., (2014)  melaporkan  beberapa  target  perakitan galur superior ubi kayu oleh pemulia tanaman, diantaranya adalah perbaikan ecotipe ubi kayu
untuk  meningkatkan  produktivitas  ubi  kayu, seperti peningkatan berat umbi hingga 9 kg per tanaman, harvest indeks lebih dari 0,6,  jumlah umbi  9-13  buah  per  pohon,  retensi  daun  100 hari  serta  diameter  batang  hingga  3,5  cm. Selain itu, beberapa target pemuliaan yang juga penting adalah perakitan ubi kayu kaya vitamin dan protein, berumur genjah (8-10 bulan), dan memiliki  kemampuan  adaptasi  seperti  dalam efisiensi  penggunaan  air  dan  NPK,  bebas penyakit,  dan  tahan  daya  simpan.  Untuk perbaikan  kandungan  nutrisi,  salah  satu  target pemulia  ubi  kayu  adalah  melakukan  perakitan ubi kayu dengan kandungan beta karoten yang lebih tinggi.
Perakitan  galur  superior  ubi  kayu  dapat dilakukansalah satunya melalui induksi  variasi somaklonal. Variasi somaklonal adalah variasi genetik/epigenetik, ataupun perubahan fenotipik,  karyotip,  fisiologi,  biokimia  atau variasi  pada  level  molekuler,  yang  terjadi dalam  populasi  tanaman  yang  diinduksi melalui kultur jaringan ataupun kultur sel, baik sel somatik seperti sel daun, akar, dan batang, maupun sel gamet (Lestari et al ., 2010, Anil et al .,  2018).  Variasi  ini  dapat  berasal  dari perubahan  yang sudah ada dalam eksplan dari
mana kultur  diinisiasi atau  diinduksi  secara in vitro oleh media kultur dan lingkungan. Variasi somaklonal  dipicu  oleh  mutasi  karena  proses kultur yang menginduksi munculnya keragaman  genetik  yang  sangat  penting  untuk pengayaan genetic  pool atau  pengembangan basis  genetik  pada  program  pemuliaan  dan program konservasi tanaman (Sato et al ., 2011, Krishna et  al .,  2016).  Sebagai  contoh, polimorfisme  ditemukan  lebih  tinggi  pada tanaman    variasi  somaklonal  dibanding  pada tanaman induk/budidaya, dan tingkat kesamaan atau similarity berbasis  nilai  Jaccard  indeks lebih  rendah  pada  variasi  somaklonal dibanding  tanaman  induk/budidaya.  Hal  ini mengindikasikan  adanya  perluasan  basis genetik pada variasi somaklonal (Adriana et al . 2010). Perubahan genetik pada variasi somaklonal bukan  disebabkan  oleh  segregasi  atau rekombinasi  gen,  seperti  yang  biasa  terjadi akibat  proses  persilangan,  tapi  karena  mutasi genetik  pada  eksplan  yang  diinduksi  pada kondisi in  vitr o.  Tanaman  variasi  somaklonal mengalami mutasi atau penyimpangan sitologi sehingga  muncul  keragaman  yang  disebabkan oleh  perubahan  struktur  kromosom,  kerusakan kromosom  (seperti  delesi,  duplikasi,  inversi dan  translokasi),  perubahan  pada  metilasi kromatin  dan  perubahan  jumlah  kromosom (Delgarado-Paredes et  al., 2017).  Variasi somaklonal  yang  disebabkan  oleh  perubahan genetik  akan  diwariskan  secara  seksual  ke generasi  selanjutnya  atau  turunannya  dan biasanya  bersifat  stabil,  tetapi  variasi somaklonal  yang  bersifat  epigenetik  biasanya akan  hilang  bila  diturunkan  secara  seksual. Variasi  somaklonal  dalam  kultur  jaringan diinduksi  oleh  penggunaan  zat  pengatur tumbuh,  seperti  dari  kelompok  auksin  2,4-D dan 2,4,5-T, konsentrasi pemakaian ZPT, lama fase  pertumbuhan  kalus,  dan  tipe  kultur  yang digunakan  (sel,  protoplasma,  kalus  jaringan), kondisi  pencahayaan,  kelembaban  dan transpirasi.  Perakitan  tanaman  melalui  variasi somaklonal  telah  diaplikasikan  untuk memperoleh  tanaman  toleran  terhadap kekeringan,  salinitas  tinggi,  pH  rendah  atau tinggi  serta  ketahanan  terhadap  penyakit (Yunita et al ., 2009, Sato et al ., 2011). Pusat  penelitian  Bioteknologi  LIPI  telah melakukan  pengembangan  varietas  baru  ubi kayu  yang  tinggi  beta  karoten  melalui pembentukan  variasi  somaklonal.  Varian  ini, yang  sebelumnya  bernama  FEC  25,  telah
terdaftar  menjadi varietas Carvita 25 (Fitriani et  al .,  2018).  Carvita  25  memiliki  kandungan beta  karoten  hingga  21  ng/g,  dan  telah dimanfaatkan sebagai material untuk pembuatan  tepung  mocaf  kaya  beta  karoten (Hartati et  al .,  2012).Varietas  Carvita  25 berasal  dari  induk  ubi  kayu  unggul  Adira  IV. Ubi  kayu  Adira  IV  merupakan  jenis  varietas ubi  kayu  dengan  ciri  ketahanan  yang  cukup tinggi,  buah  besar,  agak  pahit  dan  berumbi putih.  Pendaftaran  varietas  Carvita  25 didasarkan pada perubahan unik pada karakter morfologi  produk  tanaman  hasil  variasi somaklonal  tersebut  dibandingkan  induknya. Data  morfologi  pada  variatas  Carvita  25 adalah:  tipe  tanaman  bercabang  memiliki diameter  batang  kecil,  memiliki  warna  daun yang  membuka  sempurna  yaitu  hijau keunguan,  memiliki  bentuk  umbi  silindris, warna  kulit  umbi  bagian  luar  yaitu  coklat gelap, kulit bagian dalam pink. memiliki warna daging  kuning,  memiliki  kadar  pati berdasarkan  ekstraksi  28,13,  jumlah  umbi  per pohon 6,5 ± 0.508 dan memiliki umur panen 10 bulan (Hartati et al ., 2012). Untuk memperkaya dan  melengkapi  karakterisasi morfologi,  maka dilakukan  karakterisasi  molekuler  Carvita  25, terutama  untuk  melihat  seberapa  jauh perbedaan dan perubahan genetik pada Carvita 25  yang  merupakan  tanaman  ubi  kayu  hasil variasi  somaklonal  dibandingkan  tanaman asalnya yaitu Adira IV. Identifikasi varietas tanaman sangat penting bila  dihubungkan  dengan  pemuliaan  tanaman (Mulsanti et  al .,  2013).  Teknik  penanda molekuler telah terbukti menjadi alat yang kuat untuk  mengidentifikasi  spesies  tanaman, varietas,  klon,  individu  dan  populasi (Karihaloo, 2015). Metode penanda molekular telah  banyak  diterapkan  untuk  pengujian varietas,  perbanyakan  benih  dan  pemuliaan tanaman, selain itu pemanfaatan teknik ini juga digunakan untuk alat bantu seleksi (Mulsanti et al .,  2013).    Berdasarkan  aplikasi  teknik  PCR, metode  teknologi  penanda  molekuler  dibagi menjadi  beberapa  jenis,  termasuk  diantaranya restriction  fragment  length  polymorphism (RFLP), polymerase  chain  reaction (PCR) randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) dan amplified  fragment  length  polymorphism (AFLP), single  nucleotide  polymorphisms (SNP)  dan sequence  tagged  sites (STS), s equence  characterized  amplifiedregions (SCAR),  dan simple  sequence  repeats (SSR)
(Azrai,  2006).
Simple  sequence  repeat
merupakan  pengulangan  nukleotida  tandem pendek  dengan  tingkat  polimorfisme  yang tinggi (Sharp & Hayden, 2001). Penanda SSR mudah dideteksi, sangat informatif, stabil, dan relatif murah digunakan dalam penelitian. Hasil laporan beberapa peneliti terdahulu menggunakan SSR ( Simple Sequence Repreat ) menyebutkan  bahwa  jumlah  marka  SSR  pada ubikayu ada 186 (Mba et al ., 2001), 124 (Raji et al ., 2009), atau 2190 (Sraphet et al ., 2011). Ferguson et  al. (2012)  menggunakan  data jumlah  marka  SSR  tersebut  untuk  melihat redundancy/pengulangan  dan  menemukan bahwa jumlah SSR yang berhasil diidentifikasi tanpa pengulangan adalah sebesar 2146 marka. Artinya, ada peluang menggunakan 2146 jenis marka  SSR  untuk  menganalisis  keragaman genetik plasma nutfah ubi kayu. Penelitian ini bertujuan untuk mengkonfirmasi  kestabilan  morfologi  Carvita 25,  mendeteksi  tingkat  polimorfisme  dan variasi  molekuler  ubi  kayu  Carvita  25    yang berasal  dari  variasi  somaklonal  Adira  IV berdasarkan marka SSR dengan menggunakan 11  primer  untuk  melengkapi  data  karakter morfologi    dan  molekuler  yang  telah dilaporkan sebelumnya.

## METODE
Bahan Penelitian  ini  menggunakan  dua  varietas  ubi  kayu, yaitu  varietas  Adira  IV  dan  Carvita  25,  dengan  10 kali ulangan untuk karakter morfologi dan tiga kali pengulangan untuk analisis DNA, yaitu : Adira IV 1, Adira IV 2, Adira IV 3, Carvita 25 1, Carvita 25 2, dan  Carvita  25  3.  Semua  bahan  yang  digunakan merupakan varietas ubi kayu  koleksi Kebun Plasma Nutfah (KPN) Puslit Bioteknologi LIPI.
Konfirmasi Kestabilan Morfologi Carvita 25 Kestabilan karakter morfologi Carvita 25 dilakukan dengan  mengamati  karakter  morfologi  tanaman Carvita  25  di  dua  lokasi  KPN  dengan  jumlah masing-masing  10  tanaman,  dan  dibandingkan dengan hasil pengamatan morfologi Carvita 25 dari hasil  penelitian  Hartati et  al .,  (2012),  lalu dibandingkan  dengan    Adira  IV.  Parameter pengamatan  morfologi  dalam  studi  ini  mengacu pada Hartati et  al ., (2012) ditambah dua  parameter yang  lain  yaitu  morfologi  petiole  dan  batang  ubi kayu.
Ekstraksi DNA Ubikayu Protokol  yang  digunakan  untuk  ekstraksi  DNA adalah prosedur ekstraksi berbasis CTAB mengikuti metode  Cold  Spring  Harbor  (2017)  yang  telah dimodifikasi. Pucuk ubi kayu yang segar diambil 5 lobus  daun,  lalu  ditransfer  ke  dalam  tabung Eppendorf 1,5ml, ditutup tidak rapat, lalu langsung
direndam  dalam  nitrogen  cair.  Sampel  kemudian digerus  menggunakan  pestle  plastik,  setelah  halus ditambah  1  ml  larutan  buffer  CTAB  yang  telah ditambah  2%  mercapto  etanol  .  Larutan  sampel diinkubasi 1 jam pada suhu 60 o C, lalu disentrifugasi pada  10000  rpm  selama  5  menit  untuk menghilangkan  debris  sel.  700  µl  supernatan dimasukkan dalam tube baru, lalu ditambahkan 750 µl  larutan  chloroform:oktonol,  24:1,  tube  dikocok pelan  sambil  dibolak  balik.  Proses  dilanjutkan dengan  disentrifugasi  pada  kecepatan  11000  rpm selama  10  menit.  Proses  ekstraksi  dengan chloroform:oktanol  diulangi  hingga  total  ekstraksi tiga kali, dengan volume supernatan dan chloroform :oktanol berturut-turut 700 µl  /750 µl, 600 µl  /650 µl, dan 500 µl /550 µl. Supernatan sebanyak 500 ul supernatan  ditambah  isopropanol  500ul,  tube dikocok pelan sambil dibolak balik, lalu disentrifuse pada  kecepatan  11000 rpm  selama  10  menit.  Pelet yang  telah  dikeringkan  dilarutkan  dengan  ddH 2 O. DNA  hasil  isolasi  selanjutnya  diuji  kualitas  dan kuantitasnya  menggunakan  elektroforesis  pada  gel agarose  1  %  dan  Nanodrop  2000  spektrofotometer untuk  melihat  konsentrasi  dan  kemurniannya.
Pengukuran konsentrasi DNA dengan spektrofotometer dilakukan pada panjang gelombang 260 nm, sedangkan protein diukur pada panjang gelombang 280 nm. Batas kemurnian yang diterima  dalam  analisis  molekuler  pada  rasio A260/A280 adalah 1.8 – 2.0.

## Amplifikasi DNA Dengan Primer SSR
Dua  belas  pasang  primer  (SSR  digunakan  untuk amplifikasi  DNA  ubi  kayu  varietas  Adira  IV  dan Carvita 25 yang memiliki motif pengulangan sekuen tertentu  seperti  yang  dilaporkan  oleh  Mba et  al ., (2001), yaitu SSRY 8, SSRY 9, SSRY 20, SSRY 28, SSRY  51,  SSRY 59,  SSRY  63,  SSRY 100,  SSRY 103, SSRY 151, SSRY 171 dan SSRY 181 dengan sekuen primer dan TM yang tertera pada Tabel 1. Reaksi amplifikasi dilakukan mengikuti protokol yang  diusulkan  oleh  Mba et  al .  (2001)  dengan volume  akhir  berisi  10  μl  yang  terdiri  atas  1,0  μl DNA  (10ng  /  μl);  1.0  μl  10x  buffer  PCR  yang mengandung  20  mM  MgCL2  (Promega),  0,8  μl dNTPs (2,5 mM masing-masing), 0,25 μl polimerase TaqDNA  (Promega;  5  u  /  μl),  1,25  μl  dari  primer forward dan reverse (1 μM masing-masing) dan 5,0 μl air suling. Kondisi  PCR  yang  digunakan  mengikuti prosedur  Mba et  al .,  (2001)  dengan  sedikit modifikasi,  yakni  :  pra  denaturasi  94  °C  selama  2 menit,  dilanjutkan  35  siklus  meliputi  denaturasi 94°C  selama  30  detik, annealing 55°C  (Tabel  1) selama 1 menit, extention 72°C selama 1 menit, dan terakhir post extention 72°C selama 5 menit. Produk PCR  di visualisasikan pada gel poliakrilamid 12%. kemudian dilakukan elektoforesis selama 3 jam dan dilanjutkan dengan skoring data.
Analisis data Setiap  band  diberi  skor  sebagai  ada/hadir  (1)  atau absen  (0)  dan  data  yang  dihasilkan  dirangkai
menjadi  matriks.  Matriks  data  kemudian  dianalisis menggunakan  program  pengolahan  data  molekular PAST  (Paleontological  Statistics) software 3.2 (Hammer et al. , 2001).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Konfirmasi  kestabilan morfologi Carvita 25 Hasil identifikasi varietas Adira IV yang dirilis oleh  Kementrian  Pertanian  menunjukkan varietas  Adira  IV  memiliki  karakter  bentuk daun  lonjong,  warna  petiole  merah  kehijauan pada  bagian  atas,  dan  hijau  kemerahan  pada bagian  bawah,  warna  umbi  putih,  agak  pahit, kadar  pati  25-30%,  protein  0,8%,  HCN  68 mg/100mg,  daya  hasil  25-40  t/ha,  dan ketahanan  yang  cukup  tinggi  pada  penyakit karena tungau  merah,  bakteri  hawar  daun  dan penyakit  layu  bakteri  (Balitkabi  2004,  2005, Wargiono et  al .,  2006).  Hasil  karakterisasi pada  variasi  somaklonal  Carvita  25
menunjukkan  adanya  perubahan  ciri-ciri morfologi. Perubahan karakter morfologi yang paling  menonjol  pada  variasi  somaklonal Carvita 25 dibanding tanaman induknya Adira IV adalah perubahan pada warna umbi dimana umbi  berubah  menjadi  kuning,  dan  rasa  umbi yang  lebih  enak/tidak  pahit    (Tabel  2),  dan karakter  ini  stabil  pada  tiap  individu  yang diamati karakter morfologinya. Selain karakter tersebut, (Hartati et al ., (2012) melaporkan ciri lainnya,  yaitu  tipe  tanaman  bercabang, diameter  batang  kecil,  memiliki  warna  daun yang  membuka  sempurna  yaitu  hijau keunguan,  memiliki  bentuk  umbi  silindris, warna  kulit  umbi  bagian  luar  yaitu  coklat gelap, kulit bagian dalam pink, memiliki kadar pati  berdasarkan  ekstraksi  28.13  %,  jumlah umbi per pohon 6,5 ± 0,508 dan memiliki umur panen 10 bulan.
Tabel 1. Primer SSR Ubi Kayu (Mba et al ., 2001) No Nama Primer Tipe pengulangan Sekuen Temperatur Anneling ( o C) Ukuran (bp) 1 SSRY 8 (CA)14CT(CA)2 F : AGTGGTTTGAGAAGACTGGTGA R : TTTCCAAAATGGAACTTCAAA 55 143 2 SSRY 9 (GT)15 F : ACAATTCATCATGAGTCATCAACT R : CCGTTATTGTTCCTGGTCCT 3 SSRY 20  (GT)14 F : CATTGGACTTCCTACAAATATGAAT R : TGATGGAAAGTGGTTATGTCCTT 55 143 4 SSRY 28  (CT)26(AT)3AC(AT)2 F : TTGACATGAGTGATATTTTCTTGAG R : GCTGCGTGCAAAACTAAAAT 55 180 5 SSRY 51 (CT)11CG(CT)11(CA)18  F : AGGTTGGATGCTTGAAGGAA R : GGATGCAGGAGTGCTCAACT 55 298 6 SSRY 59  (CA)20 F : GCAATGCAGTGAACCATCTTT R : CGTTTGTCCTTTCTGATGTTC 55 158 7 SSRY 63  (GA)16 F : TCAGAATCATCTACCTTGGCA R : AAGACAATCATTTTGTGCTCCA 55 290 8 SSRY 100  (CT)17TT(CT)7 F : ATCCTTGCCTGACATTTTGC R : TTCGCAGAGTCCAATTGTTG 55 210 9 SSRY 103  (GA)22 F : TGAGAAGGAAACTGCTTGCAC R : CAGCAAGACCATCACCAGTTT 272 10 SSRY 151  (CT)11TT(CT)21(CA)19  F : AAGGAACACCTCTCCTAGAATCA R : CCAGCTGTATGTTGAGTGAGC 55 220 11 SSRY 181  (GA)22(G)3C(GA)3GGA A(GA)4 F : GGTAGATCTGGATCGAGGAGG R : CAATCGAAACCGACGATACA 55 199 Tabel 2. Karakter  morfologi Carvita 25 dan Adira IV No  Karakter Morfologi Adira-4 Carvita 25 1 Warna pucuk Hijau keunguan Hijau keunguan 2 Warna daging umbi Putih Kuning 3 Bentuk umbi Conical silindris Silindris 4 Warna korteks Pink Pink 5 Warna kulit luar Coklat tua Coklat tua 6 Warna petiol Merah kehijauan Merah kehijauan 7 Distribusi antosianin di petiol Bagian atas Bagian atas 8 Warna kortek batang Hijau tua Hijau muda 9 Rasa Agak Pahit Enak
Perubahan fenotip tanaman  yang  diinduksi oleh  pembentukan  variasi  somaklonal  telah dilaporkan  oleh  beberapa  peneliti  terdahulu. Cao  (2016)  melaporkan  perubahan  fenotip daun tanaman hias Red Flash  Caladium hasil variasi somaklonal, yaitu hilangnya bintik putih pada  tanaman  induk/ wild  type ,  dan  berubah menjadi  bintik  merah,  selain  itu  juga  terjadi perubahan  warna  tulang  daun  dari  merah menjadi  hijau, ungu atau merah muda, bentuk daun  yang  lebih  bulat  dan  perubahan  warna pada pinggir daun. Podwyszynska et al., (2006) melihat  terjadi  perubahan  fenotip  tanaman bunga tulip dari ungu menjadi ungu kemerahan karena  penanaman  dalam  jangka  lama  pada media  kultur  thidiazuron.  Manchanda et  al ., (2018)  melaporkan  perubahan  morfologi tanaman  tebu  hasil  variasi  somaklonal,  yaitu terjadinya  pertambahan  jumlah  rumpun  yang lebih  banyak  pada  tebu  hasil  variasi somaklonal  yang  ditanaman  di  lapang, disamping  terjadinya  peningkatan  lingkar atau diameter tebu dan variasi panjang ruas tebu. Perubahan morfologi  atau  fenotip  tanaman hasil  kultur  karena  pembentukan  variasi somaklonal  sudah  banyak  dilaporkan,  namun perlu  dievaluasi  lebih  lanjut  untuk mendapatkan  keuntungan  atau  dampak  yang lebih  besar  untuk  pemuliaan  tanaman  ataupun untuk pengembangan varietas dengan karakter agronomi  yang  penting.  Pengembangan  ubi kayu  variasi  somaklonal  Carvita  25 memberikan  karakter  agronomi  yang  penting, yaitu kandungan nutrisi beta karoten yang lebih tinggi  dibanding  ubi  kayu  biasa,  dan  karakter ini diperlukan untuk mendukung industri yang salah satunya adalah industri mocaf  kaya beta karoten dan industri produk olahan pangan tape berbeta karoten. Polimorfisme  Marka  Berbasis  Data Mikrosatelit Untuk memperkaya dan melengkapi karakterisasi  morfologi,  maka  dilakukan karakterisasi  molekuler  Carvita  25,  terutama untuk  melihat  seberapa  jauh  perubahan molekuler  antara Adira IV dengan Carvita 25 yang merupakan tanaman ubi kayu hasil variasi somaklonal.  Hasil  amplifikasi  PCR  dengan SSRDNA  genom  Carvita  25  dan  Adira  IV menggunakan 11 primer SSR menghasilkan 87 total  fragmen  teramplifikasi,  dimana  31 fragmen diantaranya adalah fragmen monomorfik dan 56 fragmen yang polimorfik.
Jumlah  fragmen  yang  teramplifikasi  pada masing-masing primer sangat bervariasi seperti
terlihat  pada  Tabel  3.  Polimorfisme  yang paling  tinggi  terdapat  pada  primer  SSRY  151 yaitu  85.71%    atau  sebanyak  6  pita  fragmen dari  total  7  fragmen  dengan  panjang  basa bervariasi  dari  120-600  bp.  Primer  dengan polimorfisme paling rendah adalah SSRY 171 yaitu    0%  atau    tidak  terdapat  polimorfisme, dan  panjang  basa  yang  teamplifikasi  adalah 270-760  bp.  Primer  lainnya  mengamplifikasi dengan  tingkat  polimorfisme  berkisar  antara 50-80%.  Polimorfisme  rata-rata  sebesar 62,03%, dan  tingkat  polimorfisme  ini,  kecuali SSRY171, tergolong cukup tinggi karena lebih dari 50%.  Menurut Poerba & Martanti (2008), bahwa  primer dengan tingkat polimorfismenya yang  tinggi  adalah  yang  memiliki    >50%  pita polimorfik.

## Perubahan genetik Carvita 25
Analisis marka yang mengalami insersi, delesi, dan  monomorfik  dilakukan  untuk  melihat perubahan  genetik  atau  perubahan  di  tingkat molekuler pada  variasi  somaklonal  Carvita 25 dibanding  varietas  asalnya  Adira  IV.  Data insersi dan delesi marka genetik  disajikan pada Tabel  4,  yang  diperoleh  berdasarkan  analisis kemunculan alel pada hasil skoring Carvita 25 dan Adira IV dengan menggunakan 11 primer SSRY.  Insersi  adalah  apabila  terdapat penambahan  alel  baru  pada  Carvita  25 dibandingkan dengan alel pada Adira IV yang merupakan varietas asal dari Carvita 25. Delesi didapatkan  dari  alel  yang  hilang/tidak ditemukan  pada  Carvita  25,  sedangkan  pada gen awal, terdapat pita atau alel pada Adira IV di  lokus  yang  sama.  Sebuah    pita  dikatakan monomorfik  apabila  terdapat  kesamaan  atau konsistensi  munculnya  pita  pada  lokus  yang sama antara varietas yaitu Carvita 25 dan Adira IV (Gambar 1).
Marka  yang  mengalami  insersi  terbanyak terdeteksi pada penggunaan primer SSRY 151 dan SSRY59  yaitu sebanyak 5 alel, sementara marka  yang  mengalami  delesi  paling  banyak terdeteksi  pada  hasil PCR  yang  menggunakan primer  SSRY  181  yaitu  8  alel,  sementara marka monomorfik paling banyak adalah pada primer  SSR171  dengan  5  pita  monomorfik. Total  keseluruhan  insersi  adalah  30  alel,  total keseluruhan  delesi  26  alel  dan  total  pita monomorfik  31  alel.  Hal  ini  menunjukkan perubahan  di  tingkat  molekuler  yang  cukup besar  dari  gen  gen  variasi somaklonal Carvita 25 dibanding induknya Adira IV, yang berarti adanya  perubahan  besar  dari  genetik  masing- masing varietas.
Tabel 3. Total fragmen DNA hasil amplifikasi dengan menggunakan 11 primer SSR dan presentase fragmen polimorfik pada 6 sampel Adira IV dan Carvita 25. No  Nama Primer Total fragmen Teramplifikasi Fragmen Monomorfik Fragmen Polimorfik Persentase Polimorfik Kisaran panjang pita (bp) 1 SSRY 181 14 3 11 78,57% 60 – 1000 2 SSRY 151 7 1 6 85.71% 120-600 3 SSRY 103 5 1 4 80% 350-1000 4 SSRY 171 5 5 0 0 % 270-760 5 SSRY 63 6 2 4 66.67% 120 -950 6 SSRY 59 10 4 6 60% 120 – 900 7 SSRY 51 8 3 5 62.5% 50 -1000 8 SSRY 28 9 2 7 77.8% 170 – 890 9 SSRY 20 7 2 5 71,14% 120-350 10  SSRY 9 8 4 4 50% 250-500 11  SSRY 8 8 4 4 50% 275-1000 Total 87 31 56
Gambar 1. Perubahan genetik/ditingkat molekuler variasi somaklonal Carvita 25 dibanding Adira IV  menggunakan  beberapa  primer  mikrosatelit  SSRY  20  :  120-350  bp  yang diindikasikan  dengan  hilangnya  (delesi)  atau  pertambahan  (insersi)  beberapa  marka pada tiap individu dari genotip ubi kayu.
Keterangan sampel: M = DNA ladder 50 bp, (1). Adira IV-1, (2). Adira IV-2, (3). Adira IV-3,  (4). Carvita 25-1, (5). Carvita 25-2, (6). Carvita 25-3 Tabel 4. Variasi delesi dan insersi marka yang terdeteksi menggunakan 11 primer mikrosatelit No. Primer Jumlah Alel  Insersi Delesi Tetap (Monomorfik) 1 SSRY181 14 3 8 3 2 SSRY171 5 0 0 5 3 SSRY151 7 5 1 1 4 SSRY103 5 2 2 1 5 SSRY63 6 2 2 2 6 SSRY59 10 5 1 4 7 SSRY51 8 2 3 3 8 SSRY28 9 4 3 2 9 SSRY20 7 3 2 2 10 SSRY9 8 2 2 4 11 SSRY8 8 2 2 4 Total 87 30 26 31
Banyaknya  jumlah  alel  yang  mengalami delesi  dan  adanya  insersi  alel  baru  telah menyebabkan perubahan genetik dan fenotipik pada Carvita 25, diantaranya adalah perubahan warna  umbi  yang  berassosiasi  dengan kandungan  beta  karoten  pada  umbi,  dan perubahan rasa  yang semula  pahit  pada  Adira IV  menjadi  lebih  manis  pada  Carvita  25. Induksi variasi somaklonal diduga menyebabkan  terjadinya  mutasi  gen  pada Carvita  25.  Mutasi  dapat  dikelompokkan menjadi  tiga  kategori  yaitu  mutasi  genom, mutasi  kromosom  (termasuk  mutasi  gen)  dan mutasi  di  luar  inti.  Mutasi  genom  terjadi apabila  satu  atau  lebih  jumlah  set  kromosom mengalami  perubahan.  Mutasi  kromosom terbagi  menjadi  mutasi  jumlah  kromosom  dan struktur  kromosom.  Mutasi  jumlah  kromosom terjadi  apabila  jumlah  kromosom  bertambah atau  berkurang  setelah  mengalami  mutasi, sedangkan  mutasi  struktur  kromosom  terjadi apabila  segmen  kromosom  mengalami pengurangan  (delesi),  translokasi,  duplikasi atau inversi (Widiastuti et al ., 2013)  Mutasi di luar inti terjadi apabila organel-organel di luar inti seperti DNA plastid, DNA mitokondria dan lainnya mengalami perubahan akibat perlakuan mutagenesis.  Cao  (2016)  melaporkan hilangnya  alel  pada  tanaman  hias  Red  Flash Caladium  disertai  atau  ditandai  dengan hilangnya  satu  hingga  2  kromosom,  dan  ini menyebabkan  perubahan  fenotip  tanaman  hias tersebut. Mutasi yang menyebabkan pembentukan variasi somaklonal pada tanaman hasil  kultur  jaringan  dapat  diaplikasikan  atau dimanfaatkan  untuk  pembentukan  klon tanaman  unggul  baru  yang  bermanfaat  untuk pengembangan bibit tahan cekaman dan untuk peningkatan produksi (Yunita, 2009). Analisis Kesamaan Analisis  klaster  dilakukan  untuk  melihat kesamaan genetik pada sampel ubi kayu Adira IV dan Carvita 25. Hasil analisis menunjukkan pemisahan  yang  jelas  antara  kedua  varietas, dimana keduanya terpisah ke dalam dua klaster utama,  yaitu klaster I terdiri dari Adira  IV-1, Adira IV-2, dan Adira IV-3 dan Klaster II yaitu terdiri  atas  Carvita  25.2,  Carvita  25.2,  dan Carvita  25.3.  Kemudian  pada  masing-masing klaster  terdiri  dari  bagian  Sub-klaster,  yaitu Sub-klaster IA,IB,  IIA dan IIB. Sub-klaster IA terdiri  atas  Adira  IV-1  dan  Adira  IV-2 sedangkan  Adira  IV-3  terpisah  menjadi  sub- klaster  IB.  kemudian  pada  subklaster  IIA terdiri  dari  Carvita  25-1  dan  Carvita  25-3,
sedangkan  Carvita  25-2  terpisah  menjadi sub- klaster  IIB.  Hal  ini  menunjukkan  perbedaan genetik  yang  jelas  dan  cukup  jauh  antara variasi  somaklonal  Carvita  25  dan  induknya Adira IV, dimana kesamaan atau similarity nya berada  pada  nilai  0,45.  Selain  itu,  masing- masing  varietas  juga  mengelompok  di  kluster yang sama (Gambar 2). Individu pada varietas Adira  1  memiliki  kesamaan  genetik  yang sangat tinggi, yaitu dari 0,957-1,0 (95,7-100%). Sementara  antar  individu  pada  Carvita  25 sedikit berbeda, walau nilai kesamaannya juga cukup tinggi, yaitu diatas 0,75 dari 1. Perbedaan  genetik  ini  juga  didukung  oleh nilai Jaccard’s  similarity yang  cukup  jauh antara  Carvita 25 dan Adira IV (Tabel 5), yaitu dari  0,4-0,5.  Nilai Jaccard’s  similarity dari  6 pasangan  sampel  ditampilkan  pada  Tabel  5. Pasangan yang memiliki nilai tingkat kesamaan tertinggi  adalah  Adira  IV-1  dan  Adira  IV-2 dengan nilai Jaccard’s similarity 1. Sedangkan pasangan  dengan  nilai Jaccard’s  similarity terendah,  yaitu  0,40,  adalah  pasangan  Carvita 25-  3  atau  Carvita  25-2  atau  Carvita  25-3 dengan Adira IV-1,  Adira IV-2 atau Adira IV- 1.  Rentangan nilai yang muncul adalah 0,40-1. Hal  ini  menunjukkan  bahwa  pasangan  sampel yang memiliki nilai tertinggi (1) memiliki latar belakang  genetik  yang  sama  atau  identik,  dan mungkin berasal dari satu populasi yang besar. Semakin Jaccard’s similarity mendekati nilai 1,  maka  sampel  semakin  mirip  atau  identik. Adanya  jarak  kekerabatan  yang  jauh (mendekati 0)  menandakan adanya keragaman genetik  yang  tinggi/jauh,  dan  sangat  potensial untuk  digunakan  sebagai  tetua  dalam pemuliaaan  tanaman  ubi  kayu  untuk menghasilkan  varietas  baru  jika  memiliki karakter  agronomi  yang  penting.  Berdasarkan analisis  klaster  dan  Jaccard’s  similarity,  baik Carvita-25  ataupun  Adira  IV  dapat  dijadikan tetua  untuk  pemuliaan  karena  nilai  kesamaan keduanya  adalah  0,40-0,50.  Untuk  pemuliaan dengan  persilangan,  maka  tetua  yang  pas adalah yang memiliki nilai Jaccard’s similarity 0,4,  yaitu  Carvita  25-  3  atau  Carvita  25-2 dengan  Adira  IV-1,    Adira  IV-2,    atau  Adira IV-3 dengan Carvita-25-2. Pemuliaan tanaman dengan menggunakan tetua dengan keragaman genetik  yang  sama  dapat  menyebabkan timbulnya sifat-sifat agronomi yang tidak baik, seperti sifat rentan terhadap hama dan penyakit serta  mengakibatkan  produktifitas  menjadi rendah (Basuki, 2018).
Tabel 5. Nilai Jaccard’s similarity dari 6 pasangan sampel Carvita 25-1 Carvita 25-2 Carvita 25-3 Adira IV- 1 Adira IV- 2 Adira IV-3 Carvita 25-1 1.00 Carvita 25-2 0.81 1.00 Carvita 25-3 0.87 0.79 1.00 Adira IV-1 0.47 0.40 0.40 1.00 Adira IV-2 0.47 0.40 0.40 1.00 1.00 Adira IV-3 0.46 0.40 0.50 0.98 0.98 1.00
Gambar 2. Dendogram sampel Carvita 25 dan Adira IV menggunakan program PAST 3.2 dengan nilai bootstrap 1000  dan Jaccard index similarity KESIMPULAN Pengamatan morfologi Carvita 25 menunjukkan bahwa secara morfologi, karakter Carvita  25  berbeda  dari  karakter  induknya yaitu  Adira  IV.  Perbedaan  terutama  terletak pada warna daging umbi yaitu Adira IV putih, dan Carvita 25 kuning, serta rasa dimana Adira IV pahit dan Carvita 25 enak/tidak pahit), dan karakter  ini  stabil  pada  tiap  individu  yang diamati.  Analisis  tingkat  polimorfisme  antara Carvita  25  dan  Adira  IV  cukup  tingi  dengan rata-rata  polimorfisme  >50%  yaitu  62,53  %, kecuali SSRY171 dengan tingkat polimorfisme 0. Berdasarkan hasil amplifikasi menggunakan sebelas  primer,  maka  diperoleh  tingkat polimorfisme  paling  tinggi  pada  amplifikasi dengan  primer  SSRY  151,  yaitu  sebesar 85.71% atau sebanyak  6 fragmen  dari total 7. Variasi  molekuler  diamati  berdasarkan  variasi pola  fragmen  hasil  amplifikasi  DNA  dari genom Carvita 25 dan Adira IV. Hasil analisis terhadap 87 alel dari Carvita-25 dan Adira IV menunjukkan  bahwa  insersi  alel  pada  Carvita 25 adalah sebesar30 alel , sementara delesi alel
terjadi pada 26 alel. Dan total pita monomorfik berjumlah31  alel.  Hal  ini  menunjukkan perbedaan  yang  cukup  besar  dari  gen  gen Carvita  25  dengan  Adira  IV  yang  berarti adanya  perubahan  besar  dari  genetik  masing- masing varietas.

## UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian  ini  merupakan  bagian  dari  PN Pangan  DIPA  Pusat  Penelitian  Bioteknologi LIPI  tahun  anggaran  2018.  Terimakasih disampaikan kepada Hani Fitriani S.Si sebagai salah  satu  pemulia  ubi  kayu  Carvita  25  dan kepada  Pak  Nanang  Taryana,  Nawawi  dan Muhammad  Usen  untuk  penyediaan  material tanaman.

## DAFTAR PUSTAKA
Adriana RG, Mangolin CA &da Silva MMFP. 2010.  Somaclonal  Variation  in Cereus peruvianus Mill.  (Cactaceae):  Its  Potential to Generate New Varieties and Broaden the Species's  Genetic  Basis. J.  Basic
Appl.Genet . 21 (1): 1-10.
Anil  VA,  Bennur  S  &  Lobo  S.  2018. Somaclonal Variations for Crop Improvement:  Selection  for  Disease Resistant  Variants  in  Vitro. Plant  Science Today . 5 (2): 44-54. Azrai  M.  2006.  Sinergi  Teknologi  Marka Molekuler  dalam  Pemuliaan  Tanaman Jagung. Jurnal  Litbang  Pertanian . 25 (3)  : 81-89. Balitkabi.  2004.  Balai  Penelitian  Tanaman
Kacang-kacangan  dan  Umbi-umbian. Malang.
Balitkabi.  2005. Teknologi  produksi  kacang- kacangan  dan  umbi-umbian .  Balai Penelitian  Tanaman  Kacang-kacangan  dan Umbi-umbian Malang, Kementerian Pertanian. Basuki  TMD.  2018. Aanlisis  Keragama Genetik  Sepuluh  Aksesi  Cabai  Merah ( Capsicum  annuum L.)  Indonesia Menggunakan  Marka  Random  Amplified Polymorphic  DNA .  [Skripsi].  Jurusan Pertanian.  Fakultas  Pertanian.  Universitas Jendral Soedirman, Purwokerto Cao Z, Sui S, Cai X, Yang Q & Deng Z. 2016. Somaclonal  Variation  in  Red  Flash Caladium  morphological,  Cytological  and Molecular  Characterization. Plant  Cell, Tissue  and  Organ  Culture . 126 (2):  269-
279.
Delgarado-Paredes  GE,  Rojas-Idrogo  C, Chaneme-Cespedes  J,  Floh  EIS  &  Handro W.  2017.  Development  and  Agronomic Evaluation  of  in  Vitro  Somaclonal Variation  in  Sweet  Potato  Regenerated Plants from Direct Organogenesis of Roots. Asian  Journal  of  Plant  Science  and
Research. 7 (1): 39-48.
Ferguson  M,  Rabbi  I,  Jin  Kim  D,  Gedil  M, Lopez-Lavalle LAB & Okogbenin E. 2012. Molecular  Markers  and  Their  Application to  Cassava  Breeding:  Past,  Present  and Future. Tropical Plant Biol . 5 :95–109. Fitriani H, Supatmi & Sudarmonowati E. 2018.
Induksi  embriogenesis  somatik  untuk perbanyakan  bibit  dan  perbaikan  mutu genetik  ubi  kayu .  Dalam:  Sudarmonowati E,  Hartati  NS,  Hartati.  Biodiversitas, Perakitan  Klon  Unggul  dan  Pemanfaatan bioresources  ubi  kayu  untuk  mendukung ketahanan pangan. LIPI Press, Jakarta. Hammer  O,  Tarper  DAT  &  Ryan  PD.  2001. Paleontological Statistics Software Package for  Education  and  Data  Analysis. Palaentologia Electronica . 4 (1):9-18.
Hartati  NS,  Fitriani  H,  Supatmi  & Sudarnonowati E. 2012. Karakter umbi dan nutrisi  tujuh  genotip  ubi  kayu( Manihot esculenta ). Jurnal Agricola . 2 (2): 101-110. Hartati, Fathoni A, Kurniawati S, Hartati NS &
Sudarmonowati  E.  2017.  Technological Innovation  in  The  Protection  of  Beta Carotene  on  Mocaf  Production  which  is Rich  in  Beta  Carotene.
Nusantara
Bioscience . 9 (1): 6-11. Karihaloo  LJ.  2015.
DNA  Fingerprinting Techniques  for  Plant  Identification .  In:
Plant Biology and Biotechnology. Springer.
India
Krishna H, Alizadeh M, Singh D, Singh U, Chauhan N, Eftekhari M & Sadh RK. 2016. Somaclonal Variations and Their Applications  in  Horticultural  Crops Improvement. 3 Biotech . 6 (1):54.
Lestari EG, Dewi IS, Yunita R & Sukmadjaja D.  2010.  Induksi  Mutasi  dan  Keragaman Somaklonal untuk Meningkatkan Ketahanan  Penyakit  Blas  Daun  pada  Padi Fatmawati.
Buletin  Plasma  Nutfah . 16 (2):
96-102 Manchanda  P,  Kaur  A  &  Gosal  SS.  2018. Somaclonal  Variation  for  Sugarcane Improvement . Dalam Gosal SS & Wani SH (eds.). Biotechnologies of Crop Improvement,  1:  299-326.  Springer International Publishing AG. Mba  REC,  Stephensen  P,  Edwards  K,  Melzer
S,  Nkumbira  J,  Gullberg  U,  Apel  K,  Gale M,  Tohme  J  &  Fregene  M.2001.  Simple Sequence Repeat (SSR) Markers Survey of the  Cassava  ( Manihot  esculenta Crantz) Genome:  Towards  and  SSR-based Molecular Genetik Map of Cassava. Theor Appl Genet . 102 :21–31. Mulsanti  IW,  Surahman  M,  Wahyuni  S  & Utami DW. 2013. Identifikasi Galur Tetua Padi  Hibrida  dengan  Marka  SSR  Spesifik dan Pemanfaatannya dalam Uji Kemurnian Benih. Penelitian  Pertanian  Tanaman Pangan . 32 (1) : 1-8. Podwyszynska  M,  Niedoba  K,  Korbin  M&
Marasek A. 2006. Somaclonal Variation In Micropropagated  Tulips  Determined  By Phenotype And DNA Markers. Acta Hortic .
714: 211-220.
Poerba  YS  &  Martanti  D.  2008.  Keragaman genetik  berdasarkan  marka  random amplified  polymorphic  DNA  pada Amorphophallus  muell eri  Blume  di  Jawa. Biodiversitas . 9(4): 245-249.
Raji A, Anderson J, Kolade O, Ugwu C, Dixon
A & Ingelbrecht I.2009. Gene-based  SSRs for  cassava  ( Manihot  esculenta Crantz): prevalence, polymorphisms, and cross-taxa utility. BMC Plant Biol . 9:118
Sato  M,  Hosokawa  M&  Doi  M.  2011.
Somaclonal  variation  is  induced  de  novo via  the  tissue  culture  process:  a  study quantifying  mutated  cells  in  Saintpaulia.
PLoS ONE . 6:e23541. Sharp  MJ  &  Hayden  P.    2001.  Targeted development  of  informative  SSR  (SSR) markers. Nucleic Acids Research .29 (8): 44. Suryana  A.  2006. Kebijakan  penelitian  dan pengembangan  ubikayu  untuk  agroindustri dan ketahanan pangan . Lokarya Pengembangan  Ubikayu  di  Balitkabi, Malang, 7-8 September 2006. Sraphet  S,  Boonchanawiwat  A,  Thanyasiriwat T,  Boonseng  O,  Tabata  S,  Sasamoto  S, Shirasawa  K,  Isobe  S,  Lightfoot  D,
Tangphatsornruang  S  &  Triwitayakorn  K.
2011.  SSR  and  EST-SSR-based  genetik linkage map of cassava ( Manihot esculenta
Crantz). Theor Appl Genet .122:1161–1170. Wargiono  J,  Hasanuddin  A  &  Suyamto.2006. Teknologi  produksi  ubi  kayu  mendukung industri bioetanol . Puslitbangtan. Bogor. Widiastuti A, Sobir M & Suhartanto  R. 2013. Analisis  Keragaman  Genetik  Manggis ( Garcinia  Mangostana )  Diiradiasi  Dengan Sinar  Gamma  Berdasarkan  Penanda SSR. Bioteknologi . 10 (1): 15-22. Yunita  R.  2009.  Pemanfaatan  Variasi Somaklonal  dan  Seleksi  in  Vitro  dalam Perakitan  Tanaman  Toleran  Cekaman Abiotik. Jurnal  Litbang  Pertanian . 28 (4): 142-148.
Zhang S, Ma P, Wang H, Lu C, Chen X, Xia Z, Zou  M,  Zhou  X  &  Wang  W.  2014.
Genomics Approaches to Unlock the Heigh Yield  Potential  of  Cassava,  a  Tropical Model  Plant. Front.  Agr.  Scie.  Eng. 1 (4):259-266