JPHPI 2012, Volume 15 Nomor 2
Enzim katepsin dari ikan bandeng, Nurhayati, T. et al.

## PURIFIKASI PARSIAL DAN KARAKTERISASI ENZIM KATEPSIN DARI IKAN BANDENG ( Chanos Chanos Forskall)
Partial Purification and Characterization of Cathepsin From Milkfish (Chanos chanos Forskall)

## Tati Nurhayati*,  Ella Salamah, Nico Dynnar
Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan,

## Institut Pertanian Bogor
Diterima 30 Mei 2012/Disetujui 11 Oktober 2012

## Abstract
Decomposition of protein in the enzymatic process will lead to changes in odor, texture, and appearance of fish. The enzymes that play a role in the enzymatic process is primarily proteolytic enzymes. Cathepsin enzyme is one of the proteolytic enzymes found in animal tissue that hydrolyzes peptide bonds of proteins. Information on optimal conditions of cathepsin enzyme activity is useful in the process of good handling, to avoid environmental conditions that can increase cathepsin enzymes activity, especially in milkfish. The purposes of this study were to partial purify the catepsin  enzyme of milkfish and characterize the enzymes. Crude extract of enzyme had specific activity 0.8598 U/mg and after presipitation with ammonium sulphate 70% obtained specific activity of 4.4643 U/mg and after 6 hours of dialysis obtained specific activity 14.4404 U/mg. The enzyme cathepsin worked optimally at 40 °C and pH 4, and 3% substrate. Divalent metal ions inhibited the activity of the enzyme, higher compared to monovalent or trivalent metals. Cathepsin enzyme identified had molecular weight of 86.67 kDa.
Key words: cathepsin, characterization, milkfish, purification

## Abstrak
Penguraian protein dalam proses enzimatis akan menyebabkan perubahan bau, tekstur, dan penampakan ikan.  Enzim  yang  berperan  dalam  proses  enzimatis  terutama  adalah  enzim  proteolitik.    Enzim  katepsin merupakan salah satu enzim proteolitik yang ditemukan pada jaringan hewan yang dapat menghidrolisis ikatan peptida pada protein.  Informasi mengenai kondisi optimal enzim katepsin bekerja berguna dalam proses penanganan yang tepat sehingga pada proses penanganan  dapat dihindari kondisi-kondisi lingkungan yang dapat meningkatkan kerja enzim katepsin secara optimal khususnya pada ikan bandeng. Tujuan penelitian ini ialah memurnikan secara parsial enzim katepsin dari ikan bandeng serta mengkarakterisasi enzim katepsin yang dihasilkan. Ekstraksi kasar diperoleh aktivitas spesifik 0,8598 U/mg dan setelah dipresipitasi dengan konsentrasi 70% amonium sulfat diperoleh aktivitas spesifik 4,4643 U/mg dan setelah 6 jam dialisis diperoleh aktivitas spesifik sebesar 14,4404 U/mg. Karakteristik enzim katepsin yang dihasilkan memiliki suhu dan pH optimum 40 °C dan 4, konsentrasi substrat 3%, sedangkan kehadiran ion logam menghambat aktivitas enzim. Ion  logam  divalen  menghambat  kerja  enzim  tertinggi,  bila  dibandingkan  dengan  logam  monovalen  atau trivalen. Enzim katepsin teridentifikasi memiliki bobot molekul 86,67 kDa.
Kata kunci: Ikan bandeng, karakterisasi, katepsin, pemurnian
*Korespondensi: Jln. Lingkar Akademik, Kampus IPB Dramaga Bogor 16680. Telp. +622518622915 e-mail: nurhayati7870@yahoo.com

## PENDAHULUAN
Proses  penurunan  mutu  ikan  segar terutama diawali dengan proses perombakan oleh  aktivitas  enzim  yang  secara  alami terdapat  di  dalam  ikan.    Salah  satu  jenis
enzim  yang  berperan  penting  dalam  proses kemunduran mutu ikan adalah enzim-enzim pengurai  protein  (enzim  proteolitik)  yang menguraikan protein menjadi pepton, peptida dan asam-asam amino. Hidrolisis protein oleh suatu  protease,  yaitu  katepsin,  calpain  dan kolagenase  dapat  menyebabkan  timbulnya akumulasi metabolit, perubahan citarasa, dan
pelunakan  tekstur,  terbentuknya  komponen volatil serta peningkatan jumlah bakteri yang akhirnya menimbulkan kebusukan Aktivitas proteolitik menyebabkan perubahan  fungsional  dan  sifat  organoleptik dari  daging  ikan.    Katepsin  ditemukan  di lisosom  serat  daging  dan  di  sel  fagosit. Lisosom  merupakan  intraseluler  organel yang  banyak  mengandung  enzim  hidrolitik dan  berperan  dalam  pencernaan  dalam  sel. Katepsin  merupakan  kelompok  dari  sistein protease diantaranya katepsin B (EC 3.4.22.2) dan L (EC 3.4.22.15) yang dapat menyebabkan terjadinya pelunakan daging ( softening ) pada ikan (Ladrat et al. 2006).  Katepsin L ditemukan pada  sebagian  besar  proteinase  termasuk penyebab  degradasi  protein  miofibril  pada surimi ikan Merluccius productus (Morrissey et al . 1995). Aktivitas  katepsin  berbeda-beda  tiap fraksi  daging  dan  spesies  ikan.  Aktivitas optimum dilaporkan pada suhu 40-50 °C dan aktivitasnya menurun dengan penurunan suhu. Enzim katepsin secara umum bekerja pada pH 3-4  dan  beberapa  katepsin  juga  mempunyai aktivitas tinggi pada pH 6-6,5 (Aoki et al . 2000; Kolodziejska dan Sikorski 1996). Informasi  mengenai  kondisi  optimal enzim katepsin bekerja berguna dalam proses penanganan yang tepat sehingga pada proses penanganan  dapat  dihindari  kondisi-kondisi lingkungan  yang  dapat  meningkatkan  kerja enzim  katepsin  secara  optimal  khususnya pada  ikan  bandeng.  Tujuan  penelitian  ini adalah  mengekstrak  dan  mengkarakterisasi enzim katepsin pada ikan bandeng.

## MATERIAL DAN METODE Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini  terdiri  atas  bahan  utama  yakni  ikan bandeng  dalam  keadaan  post-rigor,  bahan- bahan  untuk  ektraksi  kasar  (buffer  Tris  HCl 0,1 M pH 7,4, akuades), presipitasi (amonium sulfat  teknis),  dialisis  (kantong  dialisis, bufer Tris HCl pH 7,4), uji aktivitas katepsin (hemoglobin (Sigma), buffer Tris 0,1 pH 7,4,
tirosin  (Applichem),  akuades,  TCA  (Merck) 5%,  folin  (Merck),  HCl  1  N),  dan  uji  kadar protein  (pereaksi  Bradford,  bovine  serum albumin (Applichem)).
Alat yang digunakan pada penelitian ini antara lain inkubator (Thermoline), sentrifuse suhu  dingin  (Himac),  spektrofotometer (Yamato),  pH  meter,  tabung  dialisis,  kertas saring Whatman  No.1 dan labu Erlenmeyer.

## Metode Penelitian
Penelitian  ini  dilakukan  melalui  dua bagian,  yaitu  (1)  pemurnian  parsial  enzim katepsin  yang  terdiri  atas  ekstraksi  enzim katepsin  kasar,  presipitasi  dan  dialisis,  (2) karakterisasi enzim katepsin hasil dialisis yang memiliki aktivitas spesifik tertinggi  meliputi pH,  suhu,  konsentrasi  substrat,  pengaruh ion  logam,  serta  penentuan  bobot  molekul. Pengujian  aktivitas  enzim  katepsin  mengacu pada  metode  Dinu et  al .  (2002),  uji  kadar protein  mengacu  pada  Bradford  (1976),  dan SDS-PAGE  serta  zimogram  mengacu  pada Laemmli  (1970).  Diagram  alir  penelitian disajikan pada Gambar 1.

## Pemurnian parsial enzim katepsin
Ekstraksi enzim katepsin ( Dinu et al. 2002) Ekstraksi  dilakukan  dengan  preparasi sampel untuk memperoleh ekstrak kasar protease katepsin.  Proses  ekstraksi  menggunakan  ikan bandeng  yang  sudah  postrigor.  Daging  ikan diambil  dan  disuspensikan  dalam  akuades dengan  perbandingan  daging  ikan  dan akuades sebesar 1:1, lalu dihomogenisasi pada suhu 0-4 °C.
Ekstrak  daging  hasil  homogenisasi disentrifugasi pada 600 x g selama 10 menit dan  supernatan  yang  diperoleh  kemudian disentrifugasi  lagi  pada  10.000xg  selama 10  menit.  Pelet  yang  dihasilkan  dari  hasil sentrifugasi  kemudian  dilarutkan  dalam 0,1 M bufer Tris HCl pH 7,4 dengan jumlah yang  sama  seperti  jumlah  akuades  tadi  dan disentrifugasi pada 4.000xg selama 10 menit. Hasil  supernatan  (ekstrak  kasar  protease katepsin) yang diperoleh merupakan protein
Enzim katepsin dari ikan bandeng, Nurhayati, T. et al.
utama  dari  mitokondria  dan  lisosom  yang siap  untuk  diteliti  aktivitasnya  lebih  lanjut. Analisis  yang  dilakukan  meliputi  aktivitas enzim katepsin (Dinu et al . 2002), konsentrasi protein (Bradford 1976), dan aktivitas spesifik enzim.  Aktivitas  spesifik  enzim  (U/mg) dihitung dengan membagi aktivitas enzim (U/ mL) dengan konsentrasi protein (mg/mL).

## Presipitasi dan dialisis
Katepsin  semi  murni  diperoleh  dengan mengendapkan  ekstrak  kasar  katepsin
menggunakan  ammonium  sulfat  dengan tingkat  kejenuhan  30%,  40%,  50%,  60%, 70% dan 80% (b/v). Pengendapan dilakukan dengan menambahkan garam amonium sulfat ke dalam supernatan sedikit demi sedikit dan disentrifugasi pada 12000xg selama 30 menit. Pelet  dilarutkan  dalam  bufer  Tris  HCl 0,1  M  pH  7,4.  Langkah  selanjutnya  yakni dialisis.  Dialisis  dilakukan  dalam  bufer  Tris HCl  pH  7,4  menggunakan  kantong  selofan berukuran 12 kDa, dengan waktu dialisis 2, 4, 6, dan 8 jam. Tahap presipitasi dan dialisis ini
Ikan bandeng postrigor Preparasi Daging Ekstraksi kasar Enzim katepsin kasar Presipitasi (30, 40, 50, 60,70, dan 80%) Katepsin semi murni 1 Dialisis Katepsin semi murni 2 Penentuan Bobot Molekul dengan SDS PAGE dan Zimogram Pengukuran aktivitas enzim dan kadar protein Pengukuran aktivitas enzim dan kadar protein Pengukuran aktivitas enzim dan kadar protein Gambar 1 Diagram alir penelitian.
dilakukan pada suhu ≤ 4 °C. Pengujian yang dilakukan  pada  tahap  ini  meliputi  aktivitas enzim katepsin (Dinu et al. 2002), pengukuran konsentrasi  protein  (Bradford  1976),  dan aktivitas  spesifik  enzim.    Aktivitas  spesifik enzim  (U/mg)  dihitung  dengan  membagi aktivitas  enzim  (U/mL)  dengan  konsentrasi protein (mg/mL).

## Karakterisasi enzim katepsin
Karakterisasi dilakukan
terhadap hasil  dialisis  dengan  aktivitas  spesifik  yang tertinggi.    Karakterisasi  meliputi  penentuan suhu optimum (20, 30, 40, 50, 60 dan 70  °C), pH optimum (2, 3, 4, 5, 6, dan 7) dengan bufer Tris HCl, pengaruh ion logam (NaCl, BaCl 2 , CaCl 2 ,  AlCl 3 dan  FeCl 3 )  dengan  konsentrasi logam masing-masing 5 mM dan penentuan konsentrasi  substrat  optimum  (0,5-4,5% dengan selang 0,5% b/v).

## HASIL DAN PEMBAHASAN
Pemurnian Parsial Enzim Katepsin

## Ekstrak kasar
Pemurnian  enzim  katepsin  diawali dengan  ekstraksi  kasar  dari  daging  ikan bandeng  yang  sudah  memasuki  tahap postrigor.  Ekstrak  kasar  yang  dihasilkan memiliki aktivitas spesifik sebesar 0,86 U/mg. Penelitian Toyohara et al . (2006) menyebutkan bahwa ekstrak kasar katepsin A yang berasal dari  daging  ikan  mas  memiliki  aktivitas spesifik sebesar 0,279 U/mg. Ini berarti bahwa aktivitas  ekstrak  kasar  enzim  katepsin  yang dihasilkan  dari  ikan  bandeng  lebih  tinggi dibandingkan  dengan  yang  diekstrak  dari daging ikan mas.

## Presipitasi
Ekstrak kasar yang diperoleh dipresipitasi menggunakan  amonium  sulfat.  Aktivitas spesifik  pelet  pada  beberapa  tingkat konsentrasi  amonium  sulfat  mengalami peningkatan dan mencapai aktivitas optimum pada  perlakuan  konsentrasi  amonium  sulfat 70% (Gambar 2), sementara aktivitas spesifik pada  supernatan  menunjukkan  penurunan
aktivitas spesifik.
Aktivitas  spesifik  pelet  pada  beberapa tingkat konsentrasi amonium sulfat mengalami peningkatan dan mencapai aktivitas optimum pada  perlakuan  konsentrasi  amonium  sulfat 70% (Gambar 2), sedangkan aktivitas spesifik pada  supernatan  menunjukkan  penurunan. Penurunan  kadar  protein  dalam  supernatan terjadi selama proses presipitasi, namun terjadi peningkatan konsentrasi dalam pelet. Kondisi ekstraksi  yang  optimum  ditunjukkan  oleh aktivitas yang paling tinggi dalam endapan.
Enzim  yang  dihasilkan  dari  presipitasi 70%  memiliki  aktivitas  spesifik  sebesar  4,46 U/mg.  Penelitian  Toyoharay et  al .  (2006) menyebutkan bahwa katepsin A yang berasal dari daging ikan mas pada hasil pengendapan amonium sulfat didapatkan aktivitas spesifik sebesar  3,43  U/mg,    sementara  penelitian Baehaki et  al .  (2004)  terhadap  aktivitas spesifik  protease  lain  yang  didapatkan  dari bakteri Aeromonas  hydrophila menunjukkan aktivitas spesifik tertinggi pada pengendapan amonium sulfat 70% sebesar 2,07 U/mg.  Ini berarti  bahwa  aktivitas  enzim  katepsin  dari ikan  bandeng  hasil  pengendapan  amonium sulfat lebih tinggi dibandingkan yang berasal dari daging ikan mas dan bakteri A. hyrophila. Kelarutan  protein  (pada  pH  dan temperatur tertentu) akan meningkat sejalan dengan  peningkatan  konsentrasi  garam ( salting  in ).  Peningkatan  kelarutan  protein akan  meningkatkan  kekuatan  ion  larutan. Penambahan  garam  dengan  konsentrasi

## (2) Presipitasi
Ekstrak kasar yang diperoleh dipresipitasi menggunakan amonium sulfat. Aktivitas  spesifik  pelet  pada  beberapa  tingkat  konsentrasi  amonium  sulfat mengalami  peningkatan  dan  mencapai  aktivitas  optimum  pada  perlakuan konsentrasi  amonium  sulfat  70%  (Gambar  2),  sementara  aktivitas  spesifik  pada supernatan menunjukkan penurunan aktivitas spesifik.
Gambar    2  Aktivitas  spesifik  katepsin  setelah  pengendapan  dengan  amonium sulfat        aktivitas spesifik pelet,         aktivitas spesifik supernatan
Aktivitas  spesifik  pelet  pada  beberapa  tingkat  konsentrasi  ammonium sulfat  mengalami  peningkatan  dan  mencapai  aktivitas  optimum  pada  perlakuan konsentrasi ammonium sulfat 70% (Gambar 2), sedangkan aktivitas spesifik pada supernatan menunjukkan penurunan. Selama proses presipitasi terjadi penurunan kadar  protein  dalam  supernatan,  namun  terjadi  peningkatan  konsentrasi  dalam pelet.  Kondisi  ekstraksi  yang  optimum  ditunjukkan  oleh  aktivitas  yang  paling tinggi dalam endapan.
Enzim  yang  dihasilkan  dari  presipitasi  70%  memiliki  aktivitas  spesifik sebesar 4,46 U/mg. Penelitian Cheret et al. (2006) menyebutkan bahwa katepsin A  yang  berasal  dari carp  muscle pada  hasil  pengendapan  sulfat  didapatkan
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 0 20 40 60 80 100 Ak tivitas spes ifi k ( U /mg) Konsentrasi amonium sulfat (%)
Gambar  2  Aktivitas  spesifik  katepsin  setelah pengendapan  dengan  amonium sulfat ♦ aktivitas  spesifik  pelet, ■ aktivitas spesifik supernatan
Enzim katepsin dari ikan bandeng, Nurhayati, T. et al.
tertentu akan menyebabkan kelarutan protein menurun  ( salting  out) .  Molekul  air  yang berikatan  dengan  ion-ion  garam  semakin banyak  yang  menyebabkan  penarikan selubung  air  yang  mengelilingi  permukaan protein  sehingga  mengakibatkan  protein saling berinteraksi, beragregasi, dan kemudian mengendap (Grogan 2009).

## Dialisis
Aktivitas spesifik pada pelet yang didialisis mengalami  peningkatan  sampai  titik  optimum yaitu 6 jam (Gambar 3). Enzim yang dihasilkan dari  tahap  dialisis  memiliki  aktivitas  spesifik sebesar  14,44  U/mg.  Prinsip  dari  dialisis  ialah aplikasi preparasi enzim ke dalam kantong dialisis yang terbuat dari membran semi-permeabel yang memungkinkan molekul berukuran kecil untuk bermigrasi (Grogan 2009).
Pemurnian  parsial  hingga  tahap  dialisis mampu  meningkatkan  kelipatan  pemurnian sebesar  16,8  kali.  Rendemen  yang  dihasilkan pada tahap ini sebesar 24%. Kelipatan pemurnian pada setiap tahap disajikan pada Tabel 1.

## Karakterisasi Katepsin
Karakterisasi  dilakukan  untuk  melihat seberapa besar pengaruh kondisi lingkungan
terhadap  aktivitas  enzim  dan  mengetahui kondisi  optimum  lingkungan  untuk mendapatkan  enzim  dengan  aktivitas  yang tinggi.  Karakterisasi  yang  dilakukan  pada enzim  katepsin  berupa  konsentrasi  substrat, tingkat keasaman (pH), suhu, dan pengaruh logam.

## Tingkat keasaman (pH)
Enzim katepsin memiliki aktivitas spesifik optimum  pada  pH  4  sebesar  11,5523  U/mg (Gambar  4),  hal  ini  sesuai  dengan  pendapat Aoki et al . (2000) bahwa enzim katepsin aktif pada  pH  asam,  sementara  penelitian  yang dilakukan Toyohara et al . (2006) pada daging ikan mas, katepsin A memiliki pH optimum 5. Penelitian yang dilakukan oleh Balti et al.
(2010) terhadap katepsin D yang berasal dari hepatopankreas  sotong  memiliki  aktivitas spesifik  optimum  pada  pH  3.  Penelitian yang  dilakukan  oleh  Krause et  al. (2010) terhadap enzim   katepsin D yang berasal dari daging  burung  unta  ( Musculus  iliofibularis ) menyebutkan  katepsin  D  memiliki  aktivitas optimal  pada  pH  4.  Penelitian  lain  yang dilakukan oleh  Jiang et al. (2002) terhadap katepsin  D  ikan  tongkol  dan  ikan  bandeng, menyatakan  katepsin  D  memiliki  aktivitas
24%.  Secara lengkap data kelipatan pemurnian pada setiap tahap disajikan pada Tabel 1.
Gambar 3  Aktivitas spesifik enzim setelah didialisis Tabel 1  Peningkatan aktivitas katepsin pada berbagai tahap pemurnian Tahapan Total protein (mg) Total aktivitas (U) Aktivitas spesifik (U/mg) Yield (%) Kel ipatan pemurnian Ektrak kasar 58,15 50 0,86 100 1,00 Presipitasi 2,02 9 4,46 18 5,20 Dialisis 0,83 12 14,44 24 16,80

## Karakterisasi Katepsin
Karakterisasi  dilakukan  untuk  melihat  seberapa  besar  pengaruh  kondisi lingkungan terhadap aktivitas enzim dan mengetahui kondisi optimum lingkungan untuk  mendapatkan  enzim  dengan  aktivitas  yang  tinggi.  Karakterisasi  yang dilakukan  pada  enzim  katepsin  berupa  konsentrasi  substrat,  tingkat  keasaman (pH), suhu, dan pengaruh logam.

## (1) Tingkat keasaman (pH)
Enzim  katepsin  memiliki  aktivitas  spesifik  optimum  pada  pH  4  sebesar 11,5523  U/mg  (Gambar  4),  hal  ini  sesuai  dengan  pendapat  Aoki et  al .  (2000) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 2 4 6 8 Ak tivitas spesi fik (U /mg) Lama dialisis (jam)
Gambar 3  Aktivitas spesifik enzim setelah didialisis
Tabel 1  Peningkatan aktivitas katepsin pada berbagai tahap pemurnian
Tahapan Total protein (mg) Total aktivitas (U) Aktivitas spesifik (U/mg) Yield (%) Kelipatan pemurnian Ektrak kasar 58,15 50 0,86 100 1,00 Presipitasi 2,02 9 4,46 18 5,20 Dialisis 0,83 12 14,44 24 16,80
bahwa enzim katepsin aktif pada pH asam, sementara penelitian yang dilakukan Cheret et  al .  (2006)  pada carp  muscle ,  katepsin  A  memiliki  pH  optimum  5. Penelitian  yang  dilakukan  oleh  Balti et  al. (2010)  terhadap  katepsin  D  yang berasal  dari  hepatopankreas  sotong  memiliki  aktivitas  spesifik  optimum  pada pH  3.  Penelitian  yang  dilakukan  oleh  Krause et  al. (2010)  terhadap  enzim katepsin  D  yang  berasal  dari  daging  ikan ostrich menyebutkan  katepsin  D memiliki aktivitas optimal pada pH 4. Penelitian lain yang dilakukan oleh  Jiang et  al. (2002)  terhadap  katepsin  D  ikan  tongkol  dan  ikan  bandeng,  menyatakan katepsin D memiliki aktivitas tertinggi pada pH 5,04 (ikan tongkol) dan pH 4,91 (ikan bandeng).
Pengikatan  antara  enzim  dengan  substrat  dan  reaksi  katalisisnya bergantung pada interaksi antara substrat dengan rantai samping asam amino yang menyusun sisi aktif enzim. Peristiwa ini harus berada pada keadaan ionisasi yang tepat untuk mengikat, dan hal ini tergantung pada pH medium (Jiang et al .  2002).
Gugus  ionik  berperan  dalam  menjaga  konformasi  sisi  aktif  dalam  mengikat substrat dan dalam mengubah substrat menjadi produk (Baehaki et al. 2005).
Gambar 4  Pengaruh pH terhadap aktivitas spesifik katepsin menggunakan bufer TrisCl 0 2 4 6 8 10 12 14 2 3 4 5 6 7 Ak tivitas spes ifi k ( U/ mg) pH
Gambar 4  Pengaruh pH terhadap aktivitas spesifik katepsin menggunakan bufer Tris HCl.
tertinggi pada pH 5,04 (ikan tongkol) dan pH 4,91 (ikan bandeng).
Pengikatan  antara  enzim  dengan substrat  dan  reaksi  katalisisnya  bergantung pada  interaksi  antara  substrat  dengan  rantai samping  asam  amino  yang  menyusun  sisi aktif enzim. Peristiwa ini harus berada pada keadaan ionisasi yang tepat untuk mengikat, dan  hal  ini  tergantung  pada  pH  medium (Jiang et  al. 2002).  Gugus  ionik  berperan dalam  menjaga  konformasi  sisi  aktif  dalam mengikat  substrat  dan  dalam  mengubah substrat menjadi produk (Baehaki et al. 2005).

## Suhu
Kenaikan  suhu  meningkatkan  aktivitas spesifik  enzim  katepsin  sampai  pada  titik tertentu,  sementara  peningkatan  suhu  lebih lanjut  membuat  aktivitas  spesifik  enzim menurun.  Enzim  katepsin  pada  penelitian ini memiliki aktivitas spesifik optimum pada suhu  40  °C  dengan  nilai  aktivitas  sebesar 6,4982 U/mg (Gambar 5).
Penelitian  yang  dilakukan  oleh  Balti et al. (2010)  terhadap  katepsin  D  yang  berasal dari  hepatopankreas  sotong  memiliki  aktivitas spesifik  optimum  pada  suhu  50  ºC.  Penelitian yang  dilakukan  oleh  Krause et  al .  (2010) terhadap  enzim  katepsin  D  yang  berasal  dari daging  burung  unta  menyebutkan  katepsin  D memiliki  aktivitas  optimum  pada  suhu  45  ºC. Penelitian lain yang dilakukan oleh Jiang et al. (2002)  terhadap  katepsin  D  ikan  tongkol  dan ikan bandeng, menyatakan enzim katepsin pada ikan  tongkol  memiliki  aktivitas  tertinggi  pada suhu 45 °C dan ikan bandeng pada suhu 50 °C.
Tingkat  enzim  mengkatalisis  reaksi akan meningkat sejalan dengan peningkatan suhu  (Polgar  1990).  Suhu  yang  lebih  tinggi akan membuat molekul-molekul lebih sering bertabrakan.  Konsep  ini  berlaku  juga  untuk tumbukan  antar  molekul  substrat  dengan enzim,  hal  ini  disebabkan  suhu  yang  tinggi akan  mengkatalisis  reaksi  enzimatis,  namun ketika  kenaikan  suhu  melebihi  titik  tertentu akan  menyebabkan  gangguan  terhadap struktur  tersier  enzim  (Aledo  dan  Riveres 2008).  Perubahan  struktur  tersier  pada  sisi aktif  akan  menghambat  aktivitas  katalitik enzim (Liu et al . 2008).

## Pengaruh logam
Keberadaan  logam  sangat  berpengaruh terhadap aktivitas spesifik enzim. Keberadaan logam  pada  enzim  akan  menghambat  kerja enzim,  sehingga  aktivitas  spesifik  enzim akan  lebih  kecil  jika  dibandingkan  dengan enzim tanpa adanya logam. Ion logam divalen (BaCl 2 dan  CaCl 2 )  menghambat  kerja  enzim lebih  tinggi,    dibandingkan  dengan  logam monovalen (KCl) maupun trivalen (AlCl 3 dan FeCl 3 ) (Gambar 6). Penelitian  yang  dilakukan  oleh  Balti et al. (2010)  terhadap  katepsin  D  yang  berasal dari  hepatopankreas  sotong,  menyebutkan aktivitas  enzim  katepsin  D  akan  meningkat oleh  keberadaan  ion  logam  Mg 2+ ,  Ni 2+ , Zn 2+ ,  Cu 2+ ,  Cd 2+ ,  Sr 2+ ,  and  Co 2+ ,  sementara keberadaan  ion  logam  Na + ,  K + ,  dan  Ca 2+ tidak  berpengaruh  terhadap  aktivitas  enzim katepsin  D.  Penelitian  lain  yang  dilakukan oleh  Jiang et  al. (2002)  terhadap  katepsin  D

## (2) Suhu
Peningkatan  suhu  menyebabkan  peningkatan  aktivitas  spesifik  enzim katepsin  sampai  pada  titik  tertentu,  sementara  peningkatan  suhu  lebih  lanjut membuat  aktivitas  spesifik  enzim  menurun.  Penelitian  ini  enzim  katepsin memiliki  aktivitas  spesifik  optimum  pada  suhu  40  °C  dengan  nilai  aktivitas sebesar 6,4982 U/mg (Gambar 5).
Gambar 5  Pengaruh suhu terhadap aktivitas spesifik katepsin Penelitian  yang  dilakukan  oleh  Balti et  al. (2010)  terhadap  katepsin  D yang  berasal  dari  hepatopankreas  sotong  memiliki  aktivitas  spesifik  optimum pada  suhu  50  ºC.  Penelitian  yang  dilakukan  oleh  Krause et  al. (2010) terhadap enzim katepsin D yang berasal dari daging ikan ostrich menyebutkan katepsin D memiliki aktivitas optimum pada suhu 45 ºC. Penelitian lain yang dilakukan oleh Jiang et  al. (2002)  terhadap  katepsin  D  ikan  tongkol  dan  ikan  bandeng, menyatakan  enzim  katepsin  pada  ikan  tongkol  memiliki  aktivitas  tertinggi  pada suhu 45 °C dan ikan bandeng pada suhu 50 °C.
Tingkat  enzim  mengkatalisis  reaksi  akan  meningkat  sejalan  dengan peningkatan suhu (Polgar 1990). Suhu yang lebih tinggi akan membuat molekul-
0 1 2 3 4 5 6 7 20 30 40 50 60 70 Ak tivitas spes ifi k ( U/ mg ) Suhu (°C) Gambar  5  Pengaruh  suhu  terhadap  aktivitas spesifik katepsin.
molekul lebih sering bertabrakan. Konsep ini berlaku juga untuk tumbukan antar molekul  substrat  dengan  enzim,  hal  ini  disebabkan  suhu  yang  tinggi  akan mengkatalisis reaksi enzimatis, namun ketika kenaikan suhu melebihi titik tertentu akan menyebabkan gangguan terhadap struktur tersier enzim (Aledo dan Riveres 2008).  Perubahan  struktur  tersier  pada  sisi  aktif  akan  menghambat  aktivitas katalitik enzim   (Liu et al. 2008).

## (3) Pengaruh logam
Keberadaan  logam sangat berpengaruh terhadap aktivitas spesifik enzim. Keberadaan logam pada enzim akan menghambat kerja enzim, sehingga aktivitas spesifik  enzim  akan  lebih  kecil  jika  dibandingkan  dengan  enzim  tanpa  adanya logam.  Ion  logam  divalen  (BaCl 2 dan  CaCl 2 )  menghambat  kerja  enzim  lebih tinggi,  dibandingkan dengan logam monovalen (KCl) maupun trivalen (AlCl 3 dan FeCl 3 ) (Gambar 6).
Gambar  6    Pengaruh  logam  terhadap  aktivitas  spesifik  pada  konsentrasi logam 5 mM
Penelitian  yang  dilakukan  oleh  Balti et  al. (2010)  terhadap  katepsin  D yang berasal dari hepatopankreas sotong, menyebukan aktivitas enzim katepsin D
0 2 4 6 8 10 12 14 16 Kontrol NaCl BaCl2 CaCl2 AlCl3 FeCl3 Ak tivitas spes ifi k ( U/ mg) Logam Gambar 6 Pengaruh logam terhadap aktivitas spesifik pada konsentrasi logam 5 mM.
Enzim katepsin dari ikan bandeng, Nurhayati, T. et al.
ikan tongkol dan ikan bandeng, menyatakan keberadaan  ion  logam  Na + dan  K + akan meningkatkan aktivitas katepsin D, sementara ion  logam  Mg 2+ ,  Sr 2+ ,  Fe 2+ ,  dan  Hg 2+ akan menghambat aktivitas katepsin D.
Kerja  enzim  dapat  dihambat  oleh  zat penghambat  atau  inhibitor.  Inhibitor  non kompetitif  tidak  bersaing  dengan  substrat untuk  berikatan  dengan  enzim.  Inhibitor jenis  ini  akan  berikatan  dengan  enzim  pada sisi yang berbeda (bukan sisi aktif). Sisi aktif enzim akan berubah jika telah terjadi ikatan enzim-inhibitor, sehingga substrat tidak dapat berikatan  dengan  enzim.  Banyak  ion  logam bekerja  sebagai  inhibitor  non-kompetitif (Grogan 2009).

## Konsentrasi substrat
Konsentrasi  substrat  merupakan  salah satu faktor yang berpengaruh terhadap jumlah produk yang dihasilkan.  Substrat dibutuhkan
oleh enzim untuk berikatan dengan sisi aktif enzim sehingga akan terbentuk produk.
Hasil  penelitian  menunjukkan  bahwa konsentrasi  substrat  memberikan  pengaruh terhadap  aktivitas  spesifik  enzim  yang dihasilkan. Semakin meningkatnya konsentrasi substrat,  maka  aktivitas  spesifik  cenderung meningkat sampai titik tertentu.
Konsentrasi  substrat  sebesar  3% merupakan  konsentrasi  substrat  optimum untuk  enzim  katepsin  dengan  nilai  aktivitas spesifik  sebesar  9,3863  U/mg  (Gambar  7). Semakin  banyak  molekul  substrat  yang tersedia,  semakin  sering  molekul-molekul tersebut memasuki sisi aktif molekul enzim. Konsentrasi  substrat  itu  akan  menjadi cukup tinggi pada suatu titik tertentu sehingga semua  sisi  aktif  pada  semua  molekul  enzim sudah  ditempati  oleh  substrat,  segera  setelah produk  meninggalkan  sisi  aktif,  molekul substrat yang lain akan masuk. Pada konsentrasi substrat seperti ini, enzim dikatakan mengalami kejenuhan,  dan  laju  reaksi  ditentukan  oleh kecepatan sisi aktif mengubah substrat menjadi produk. Satu-satunya cara untuk meningkatkan produktivitas  ketika  suatu  enzim  telah  jenuh ialah  menambahkan  lebih  banyak  lagi  enzim (Champbell et al. 2002).

## Bobot molekul
Penentuan  bobot  molekul  dilakukan menggunakan  SDS-PAGE  dan  zimogram.
(Gambar  7).  Semakin  banyak  molekul  substrat  yang  tersedia,  semakin  sering molekul-molekul tersebut memasuki sisi aktif molekul enzim.
Gambar 7  Pengaruh konsentrasi substrat terhadap aktivitas spesifik katepsin
Konsentrasi substrat itu akan menjadi cukup tinggi pada suatu titik tertentu sehingga  semua  sisi  aktif  pada  semua  molekul  enzim  sudah  ditempati  oleh substrat, segera setelah produk meninggalkan sisi aktif, molekul substrat yang lain akan  masuk.  Pada  konsentrasi  substrat  seperti  ini,  enzim  dikatakan  mengalami kejenuhan, dan laju reaksi ditentukan oleh kecepatan sisi aktif mengubah substrat menjadi produk. Satu-satunya cara untuk meningkatkan produktivitas ketika suatu enzim telah jenuh ialah menambahkan lebih banyak lagi enzim (Champbell 2002).

## (5) Bobot molekul
Penentuan  bobot  molekul  dilakukan  menggunakan  SDS-PAGE  dan zimogram. Hasil analisis menggunakan SDS-PAGE dan zimogram disajikan pada Gambar 8.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 A ktiv itas sp esifi k (U/m g) Konsentrasi substrat (%) Gambar 7 Pengaruh konsentrasi substrat terhadap aktivitas spesifik katepsin.
(B) (C)
Gambar 8 Penentuan bobot molekul enzim katepsin dengan SDS PAGE (A) dan zimogram  (B),  ilustrasi dari hasil zimogram (C)
Bobot  molekul  ditentukan  berdasarkan  kurva  standar,  pada  SDS diketahui persamaannya Y= -1,037x + 2,112, sementara pada zimogram diketahui persamaannya Y= - 1,384x + 2,145.
Enzim  katepsin  baru  terlihat  aktivitas  katalitiknya  pada  tahap  presipitasi dan dialisis, pada tahap ini enzim katepsin teridentifikasi memiliki bobot molekul 88,67  kDa.  Hasil  penelitian  yang  dilakukan  oleh  (Balti et  al. 2010)  terhadap katepsin D yang berasal dari hepatopankreas sotong ( Sepia officinalis ) terestimasi memiliki  bobot  molekul  37,5  kDa.  Katepsin  D  yang  berasal  dari  daging  ikan ostrich memiliki  bobot  molekul  29,1  kDa  (Krause et  al. 2010).  Penelitian  lain yang dilakukan oleh Jiang et al. (2002) terhadap katepsin D ikan tongkol dan ikan bandeng, menyatakan katepsin D pada ikan tongkol terestimasi sebesar   51 kDa dan pada ikan bandeng sebesar 54 kDa.

## KESIMPULAN
Aktivitas  spesifik  optimum  enzim  katepsin  diperoleh  pada  presipitasi menggunakan amonium sulfat 70% dan dialisis selama 6 jam. Kondisi optimum
14,4 kD
20,1 kD 30 kD 45 kD 66 kD 97 kD Gambar 8 Penentuan bobot molekul enzim katepsin dengan SDS PAGE (A) dan zimogram  (B). (A) (B)
Hasil  analisis  menggunakan  SDS-PAGE  dan zimogram  disajikan  pada  Gambar  8.  Bobot molekul  ditentukan  berdasarkan  kurva standar,  pada  SDS  diketahui  persamaannya Y= -1,037x + 2,112, sementara pada zimogram diketahui persamaannya Y= - 1,384x + 2,145.
Enzim  katepsin  baru  terlihat  aktivitas katalitiknya pada tahap presipitasi dan dialisis, pada tahap ini enzim katepsin teridentifikasi memiliki  bobot  molekul  88,67  kDa.  Hasil penelitian  yang  dilakukan  oleh  (Balti et  al. 2010) terhadap katepsin D yang berasal dari hepatopankreas  sotong  ( Sepia  officinalis ) terestimasi  memiliki  bobot  molekul  37,5 kDa.  Katepsin  D  yang  berasal  dari  daging burung  unta  memiliki  bobot  molekul  29,1 kDa (Krause et al. 2010). Penelitian lain yang dilakukan  oleh  Jiang et  al .  (2002)  terhadap katepsin  D  ikan  tongkol  dan  ikan  bandeng, menyatakan  katepsin  D  pada  ikan  tongkol terestimasi  sebesar  51  kDa  dan  pada  ikan bandeng sebesar 54 kDa.

## KESIMPULAN
Aktivitas spesifik optimum enzim katepsin diperoleh  pada  presipitasi  menggunakan amonium sulfat 70% dan dialisis selama 6 jam. Kondisi  optimum  lingkungan  untuk  aktivitas enzim katepsin yang tinggi ialah suhu 40 °C, pH 4, dan konsentrasi substrat 3%. Ion logam divalen menghambat kerja enzim lebih tinggi dibandingkan  dengan  logam  monovalen maupun trivalen. Enzim katepsin teridentifikasi memiliki bobot molekul sebesar 86,67 kDa.

## DAFTAR PUSTAKA
Aoki T, Yamashita T, Ryuji U. 2000. Distribution of  cathepsins  in  red  and  white  muscles among  fish  species. Fisheries  Science 66(4): 776-782.
Aledo  JC,  Riveres  SJ.  2008.  The  effect    of temperature  on  the  enzyme  catalyzed reaction: insights from thermodynamics.
Journal  Chemical  Education 87(3):  296- 298.
Baehaki A, Nurhayati T, Suhartono MT. 2004.
Karakterisasi protease bakteri Aeromonas hydrophila. Buletin  Teknologi  Hasil Perikanan 7(2): 60-71. Baehaki  A,  Nurhayati  T,  Suhartono  MT. 2005. Karakterisasi protease dari bakteri pathogen Staphylococcus  epidermidis . Buletin  Teknologi  Hasil  Perikanan 8(2): 25-34.
Balti  F,  Noomen  H,  Kemel    J,  Naima NA,  Guillochon  D,  Moncef  N.  2010.
Cathepsin D from hepatopancreas of the cuttlefish  ( Sepia  officinalis ):  purification and characterization. Journal Agricultural
Food Chemistry 19:10623-10630. Bradford  MM.  1976.  A  rapid  and  sensitive method for quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of  protein  dye  binding. Analitical
Biochemistry 72: 234-254. Champbell NA, Reece JB, Mitchell LG. 2002. Biologi Ed ke-5 . Manalu W, penerjemah. Terjemahan  dari  Biology.  Jakarta: Erlangga. Dinu  D,  Dumitru  IF,  Neichifor  MT.
2002.  Isolation  and  characterization of  two  chatepsin  from  muscle  of Carrassius  auratus gibelio. Roumanian Biotechnological Letters 7(3): 753-758. Grogan G. 2009. Practical Biotransformation. Postgraduates Chemistry Series. Chichester: John Willey & Sons Ltd. Jiang  ST,  Her  YH,  Lee  JJ,  Jeng  HW.  2002. Comparison  of  the  cathepsin  D  from mackerel  ( Scomber  australasicus )  and milkfish  ( Chanos  chanos )  muscle.
Bioscience,  Biotechnology,  Biochemistry
57(4): 571-577.
Kolodziejska I,  Sikorski ZE. 1996. Neutral and alkaline muscle proteases of marine fish and  invertebrates  -  A  review. Journal  of Food Biochemistry 20: 349-363.
Krause  J,  Shonisani  CT,  Tomohisa  O,
Yasuharu, Vaughan, Benesh S, Muramoto
K, Ryno JN. 2010. Purification and partial characterization of ostrich skeletal muscle cathepsin D and its activity during meat maturation. Journal  Meat  Science 87(3):
196-201.
JPHPI 2012, Volume 15 Nomor 2
Enzim katepsin dari ikan bandeng, Nurhayati, T. et al.
Ladrat  DC,  Cheret  R,  Taylor  R,  Bagnis  VV. 2006.  Trends  in  postmortem  aging  in fish:  understanding  of  proteolysis  and disorganization  of  the  myofibrillar structure. Critical Review in Food Science and Nutrition 46(5): 409-421
Laemmli  UK.  1970.  Cleavage  of  structural protein during the assembly of the heat of bacteriophag T4. Nature 227: 680-685. Liu  H,  Yin  L,  Li  S,  Zhang  N,  Ma  C.  2008. Effects of endogenous cathepsin  b and l on degradation of silver carp myofibrillar proteins. Journal  of  Muscle  Foods 19(2):
125-139.
Morrissey  MT,  Hartley  PS,  An  H.  1995.
Proteolysis in Pacific Whiting and Effect of Surimi Processing. Journal of Aquatic Food Product Technology 4(4): 5-18. Polgar L. 1990. Mechanism of Protease Action . Florida: CRC Press.
Toyohara  H,  Makinodan  Y,  Ikeda  S.  1981.
Purification and properties of carp muscle cathepsin A. Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries 48(8): 1145-1150.