Hasil Penelitian

## OPTIMASI PRODUKSI ENZIMATIS DIASILGLISEROL MELALUI GLISEROLISIS KONTINU
[Optimization of Enzymatic Diacylglycerol Production through Continuous Glycerolysis]
Tri-Panji 1) *, Septiany C. Palilingan 2) dan I Made Artika 2)
1) Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Jl. Taman Kencana No. 1 Bogor
2) Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor, Bogor
Diterima 24 Juni 2013 / Disetujui 10 Februari 2014

## ABSTRACT
Diacylglycerol  (DAG)  produced  from  crude  palm  oil  (CPO)  is  one  of  the  healthy  oils  that  can  be  consumed  for  daily  human  diet.  DAG production in Indonesia is constrained by the high cost of the mostly imported lipase. To overcome this problem, research of DAG production has been  carried  out  using  crude  extracts  of  lipase  produced  by  local  species  of  fungi  Rhizopus  oryzae.  This  study  aims  to  develop  a  continuous process of enzymatic glycerolysis of CPO for DAG production; to establish optimum conditions of DAG production which includes flow rate of CPO and glycerolysis time; and to test the performance of lipase from the local mold R. oryzae in catalyzing continuous process of glycerolysis for the production  of  DAG.  Lipase  isolation  was  carried  out  by  acetone  precipitation  and  lipase  was  used  as  a  catalyst  in  the  continuous  glycerolysis process. The glycerolysis was conducted by reacting CPO with glycerol continuously at various time periods. The optimum condition of automatic continuous glycerolysis process was achieved at a CPO flow rate of 3 mL/min with a glycerolysis time at the 18 cycles (9 hours). The conversion of DAG was 29%. The performance of lipase was proven to remain stable up to 3 times changes of CPO substrate for 9 hours of glycerolysis process with the best condition at the 3 cycles and can improved conversion of DAG until 37%.
Keywords : continuous glycerolysis, crude palm oil, diacylglycerol, lipase, Rhizopus oryzae

## ABSTRAK
Diasilgliserol (DAG) merupakan salah satu jenis minyak sehat ( healthy oil ) yang dapat dijadikan menu diet sehari-hari oleh masyarakat. DAG dapat diproduksi dari crude palm oil (CPO) yang ketersediaannya melimpah di Indonesia. Akan tetapi produksi DAG di Indonesia terkendala oleh mahalnya  harga  lipase  yang  masih  diimpor  dari  luar  negeri.  Untuk  mengatasi  masalah  tersebut,  telah  dilakukan  penelitian  produksi  DAG menggunakan ekstrak kasar lipase yang dihasilkan dari jenis kapang lokal Rhizopus oryzae. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan otomatisasi proses gliserolisis dalam produksi enzimatis DAG yang dilakukan secara kontinu; menetapkan kondisi optimum produksi DAG  yang meliputi laju alir  CPO  dan  waktu  gliserolisis  serta  menguji  kinerja  lipase  dari  kapang  lokal R.  oryzae dalam  mengkatalisis  proses  gliserolisis  kontinu  untuk produksi  DAG.  Isolasi  lipase  dilakukan  melalui  pengendapan  dengan  aseton  dan  lipase  tersebut  digunakan  sebagai  katalis  dalam  proses gliserolisis kontinu. Gliserolisis kontinu dilakukan dengan mereaksikan CPO yang dialirkan secara kontinu dengan gliserol pada berbagai variasi waktu. Hasil penelitian menunjukkan bahwa sistem yang dirancang dalam penelitian ini  dapat bekerja secara otomatis untuk proses gliserolisis kontinu. Kondisi optimum dicapai pada laju alir CPO 3 mL/menit dengan waktu gliserolisis pada siklus ke-18 (jam ke-9), dengan konversi produk DAG yang dihasilkan sebesar 29%. Adanya perlakuan 3 kali penggantian substrat CPO menunjukkan kinerja lipase terbukti tetap stabil selama 9 jam proses gliserolisis dengan kondisi terbaik pada siklus ke-3 dan meningkatkan konversi produk DAG hingga mencapai 37%.
Kata kunci : diasilgliserol, enzim lipase, gliserolisis kontinu, minyak sawit mentah, Rhizopus oryzae

## PENDAHULUAN
1
Kelapa  sawit  merupakan  komoditas  perkebunan  yang berpotensi  besar  untuk  terus  dikembangkan  dalam  bidang agroindustri.  CPO  merupakan  produk  turunan  pertama  dari buah  kelapa  sawit.  Beberapa  produk  turunan  bermanfaat  dari bahan  baku  CPO,  seperti  minyak  sehat  ( healthy  oil ) ,  specialty fat dan confectionery  fat ,  memiliki  harga  yang  lebih  tinggi  dari minyak makan ( cooking oil ) yang dikonsumsi oleh masyarakat. Salah satu jenis minyak sehat yang dapat diproduksi dari CPO adalah  minyak  Diasilgliserol  (DAG).  Terjadinya  peningkatan kasus  obesitas  akibat  tingginya  konsumsi  minyak  makan  di berbagai  negara  dan  memicu  berbagai  penyakit  degeneratif,
*Penulis Korespondensi:
Email: tri_panji@yahoo.com; Telp. 0251-8324048, Fax. 0251-8328516
telah mendorong masyarakat untuk mengonsumsi minyak sehat seperti DAG (Suharyanto et al . 2011).
DAG dapat berperan sebagai healthy oil karena DAG dapat dimetabolisme secara efisien sebagai sumber energi, sehingga dapat mencegah akumulasi lemak dalam tubuh (Matsuo, 2004; Takase,  2007;  Morita  dan  Soni,  2009;  Yuan et  al .  2010). Manfaat  lain  DAG  adalah  sebagai  emulsifier  dan  surfaktan makanan  (Anggirasti et  al .  2008)  serta  bahan  anti  mikroba (Nuraida et al . 2008).
Secara komersial DAG diproduksi melalui proses gliserolisis secara batch pada  suhu  tinggi  dengan  mereaksikan triasilgliserol  (TAG)  dengan  gliserol  atau  esterifikasi  antara asam  lemak  dan  gliserol  dibantu  katalis  anorganik  (basa). Kelemahan  dalam  penggunaan  suhu  tinggi,  antara  lain  mem- butuhkan energi besar, terbentuk produk samping toksik, serta
Hasil Penelitian
Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012
Produk gliserolisis yang terkumpul dibagian atas reaktor Larutan enzim lipase Produk gliserolisis yang terkumpul dibagian atas reaktor
Larutan enzim lipase
menimbulkan  warna  dan  rasa  yang  tidak  diinginkan  pada produk. Proses gliserolisis secara enzimatis (enzim lipase) telah banyak  dilakukan  sebagai  metode  alternatif  dalam  produksi DAG,  karena  memiliki  keuntungan  antara  lain  spesifitas  tinggi, penggunaan  energi  rendah,  ramah  lingkungan,  produk  yang dihasilkan  lebih  aman  serta  warna  produk  lebih  terang (Suharyanto et al . 2011; Noureddini et al . 2004).
Enzim lipase yang  dihasilkan dari sejumlah kapang seperti Penicillium sp, Rhizopus sp dan Aspergillus niger diketahui aktif menghasilkan  lipase  dalam  substrat  CPO.  Akan  tetapi  harga lipase komersial yang relatif mahal sehingga harus diimpor dari luar negeri (Suharyanto et al . 2011).
Masalah  tingginya  harga  lipase,  mendorong  para  peneliti untuk  memproduksi  dengan  harga  yang  lebih  murah.  Salah satunya  dengan  memfermentasikan  jenis  kapang  lokal  seperti Neurospora  sitophila dan Rhizopus oryzae yang  diketahui mampu  menghasilkan  lipase  (Tri-Panji et  al .  2008).  Melihat berbagai  manfaat  DAG  bagi  kesehatan  serta  potensi  lipase yang  dihasilkan  dari  kapang  lokal  sebagai  biokatalis  produksi DAG,  maka  perlu  dilakukan  penelitian  lebih  lanjut  tentang metode  produksi  DAG.  Suharyanto et  al .  2011  sebelumnya telah  melakukan  optimasi  produksi  DAG  melalui  gliserolisis enzimatis  dengan  sistem batch ,  dan  kondisi  optimumnya dicapai pada suhu kamar, pH netral, konsentrasi substrat 3 g (± 4%  dari  total  medium  gliserolisis)  selama  18  jam.  Penerapan teknik  gliserolisis  enzimatis  untuk  produksi  DAG  dalam penelitian  ini,  dilakukan  dengan  sistem  kontinu  dengan menambahkan  informasi  yang  telah  diperoleh  dari  penelitian Suharyanto et al . 2011. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk melakukan  otomatisasi  proses  gliserolisis  dalam  produksi enzimatis  DAG  yang  dilakukan  dengan  sistem  kontinu; menetapkan  kondisi  optimum  produksi  DAG  yang  belum dilakukan  pada  penelitian  sebelumnya  yang  dibatasi  pada variasi laju alir substrat (CPO), waktu gliserolisis serta menguji kinerja lipase dari kapang lokal R. oryzae dalam mengkatalisis proses  gliserolisis  kontinu  untuk  produksi  DAG  dengan  per- lakuan penggantian substrat baru sebanyak 3 kali.

## BAHAN DAN METODE

## Bahan
CPO  yang  digunakan  untuk  produksi  DAG  berasal  dari Pabrik  Kelapa  Sawit  (PKS)  Kebun  Bekri,  PTPN  VII,  Lampung. Rhizopus  oryzae untuk  produksi  lipase  adalah  isolat  lokal koleksi  Balai  Penelitian  Bioteknologi  Perkebunan  Indonesia (BPBPI)  yang  dipelihara  pada  media Potato  Dextrose  Agar (PDA) (Difco) dan diremajakan setiap dua minggu.
Kondisi kultur dan penyiapan lipase dari R. oryzae Kultur  kapang R.  oryzae dalam  media  PDA  (Difco)  pada cawan petri yang berumur 3-4 hari, sporanya diambil sebanyak 1  ose  dan  diinokulasikan  dalam  media  fermentasi  yang  terdiri dari campuran 0.25 gram MgSO 4 (E-Merck), 0.25 gram KH 2 PO 4 (E-Merck), 12.5 gram pepton (Difco) yang dilarutkan dalam 250 mL akuades yang mengandung CPO 3%. Kemudian diinkubasi pada suhu ruang (25-30°C) selama lima hari  sambil di shaker (IKA Labortechnik HS  250 Basic )  dengan  kecepatan  75  rpm. Setelah  lima  hari  spora  yang  tumbuh  dipisahkan  dengan
penyaringan vakum menggunakan kertas saring (Whatman No. 40) dan filtrat yang diperoleh diekstraksi dengan menggunakan aseton (E-Merck) dingin dengan perbandingan filtrat dan aseton 1 : 2 (v : v), dan di sentrifugasi (Beckman Allegra 64 R) dengan kecepatan  10.000  rpm  selama  15  menit  pada  suhu  4°C. Endapan  yang  diperoleh  dilarutkan  dalam  larutan  buffer  Tris- HCl  (E-Merck)  0.05  M  pH  7.  Ekstrak  lipase  yang  diperoleh kemudian disimpan dalam freezer sampai siap digunakan untuk bahan percobaan selanjutnya.

## Optimasi produksi DAG dengan sistem kontinu
Proses  optimasi  produksi  DAG  dilakukan  melalui  proses gliserolisis  kontinu  dalam  suatu  reaktor  dengan  cara  mengalir- kan substrat CPO secara kontinu menggunakan selang dengan bantuan  pompa  peristaltik  ( peristaltic  pump 131900)  (Gambar 1).
µ = 1 mL/menit
µ = 3 mL/menit
Keterangan :  (1) Sampel CPO ( Sampling point ); (2) Bioreaktor gliserolisis;  (3) Pompa peristaltik; (4) Pengaduk ( Magnetic stirrer)
Gambar 1. Skema proses gliserolisis kontinu
Substrat  CPO  dialirkan  dari  bagian  bawah  reaktor  tabung kaca  berkapasitas  ±2.500  mL  hingga  naik  ke  atas  ( upward flow ).  Ketika  substrat  kontak  dengan  enzim  dan  terbentuk produk yang tertampung di bagian atas reaktor, produk tersebut dialirkan kembali ke dalam sampling point . Waktu yang diperlu- kan ketika substrat dialirkan ke dalam reaktor hingga terbentuk produk dibagian atas reaktor dan dialirkan kembali ke sampling point disebut  sebagai  “satu  siklus”  yang  setara  dengan  ±30 menit. Proses “siklus” tersebut dilakukan secara terus-menerus hingga  mencapai  48  siklus  yang  setara  dengan  24  jam gliserolisis.  Komponen yang dimasukkan dalam reaktor adalah 1 mL ekstrak lipase, 24 gram gliserol (E-Merck), 1.500 mL buffer Tris-HCl (E-Merck) 0.05 M pH 7, 600 mL n-heksana (E-Merck) serta 90 g CPO. Komposisi komponen tersebut merupakan per- besaran  perbandingan  sebesar  30  kali  (skala  lab)  dari komposisi  komponen  medium  gliserolisis  yang  telah  dilakukan oleh  Suharyanto et  al .  (2011)  melalui  sistem batch .  Untuk menjaga  agar  campuran  komponen  dalam  reaktor  tetap homogen, maka dilakukan pengadukan menggunakan magnetic stirrer .  Pengambilan  sampel  minyak  (produk)  hasil  gliserolisis kontinu  sebanyak  (3  µL)  dilakukan  berdasarkan  variasi  waktu per  “siklus”,  yaitu  siklus  ke-0,  9,  18,  27,  36  dan  45.  Analisis
Hasil Penelitian
Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 4 18 21 24 Fr ak si M as sa D AG (% ) Waktu Gliserolisis (Jam)
Laju Alir 1 mL/menit Laju Alir 3 mL/menit
komponen  produk  hasil  gliserolisis  kontinu  dilakukan  meng- gunakan  Kromatografi  Lapis  Tipis  (KLT).  Proses  gliserolisis kontinu  tersebut  terlebih  dahulu  telah  dilakukan  berdasarkan variasi laju alir CPO (µ) yaitu 1 dan 3 mL/menit dengan waktu gliserolisis selama 4 jam (siklus ke-8), 18 jam (siklus ke-36), 21 jam (siklus ke-42) dan 24 jam (siklus ke-48).

## Penentuan  kinerja  lipase  dalam  mengkatalisis  proses gliserolisis kontinu
Untuk  mengetahui  kinerja  lipase  dalam  mengkatalisis proses  gliserolisis  kontinu,  dilakukan  perlakuan  penggantian substrat  CPO  sebanyak  3  kali  setiap  dilakukan  proses gliserolisis kontinu selama 3 jam, sehingga proses keseluruhan dilakukan  selama  3x3  jam  yaitu  9  jam  untuk  total  proses gliserolisis  kontinu,  dimana  komponen  lain  dalam  bioreaktor gliserolisis tetap dipertahankan. Selanjutnya setiap 30 menit (1 siklus)  selama  3  kali  penggantian  substrat  CPO  dilakukan pengambilan sampel (3 µL) untuk dianalisis komponen produk- nya  menggunakan  KLT.  Metode  gliserolisis  kontinu  untuk penentuan  kinerja  lipase  mengacu  pada  prosedur  yang  telah dilakukan pada tahap optimasi produksi DAG.

## Analisis produk hasil gliserolisis kontinu dengan KLT
Fraksi  massa  komponen  TAG,  DAG,  monoasilgliserol (MAG)  dan  asam  lemak  bebas  (ALB)  dari  reaksi  gliserolisis kontinu dianalisis dengan metode KLT. Lempeng yang diguna- kan  adalah  lempeng  silika  gel  G-60.  Sebanyak  3  µL  sampel minyak  ditotolkan  sedikit  demi  sedikit  ke  dalam  lempeng tersebut  dan  dielusikan  dengan  campuran  petroleum  benzena (E-Merck):  dietileter  (E-Merck):  asam  asetat  glasial  (E-Merck) dengan perbandingan 90 : 10 : 1 (v : v : v). Lempeng KLT yang sudah  dielusikan  dibiarkan  mengering  terlebih  dahulu, kemudian visualisasi nodanya dilakukan dengan menggunakan uap iodine. Kristal iodine (E-Merck) dituangkan ke dalam cawan petri hingga rata. Lempeng KLT yang sudah kering diletakkan di atas  cawan  petri  selama  dua  menit  (hingga  terlihat  noda cokelat).  Noda  yang  terlihat  langsung  diberi  tanda  meng- gunakan pensil. Noda yang terlihat dijiplak menggunakan kertas HVS  80  g  lalu  ditimbang  bobotnya.  Fraksi  massa  komponen dihitung berdasarkan persentase perbandingan berat komponen terhadap berat total.

## Penentuan nilai dan laju konversi produk hasil gliserolisis kontinu
Setelah  komponen  TAG,  DAG,  MAG  dan  ALB  dianalisis dengan metode  KLT, dapat ditentukan  nilai konversi  serta laju konversi  masing-masing  komponen  tersebut  berdasarkan persentase peningkatan fraksi massa komponen terhadap fraksi massa awal serta persen peningkatan fraksi massa komponen terhadap fraksi massa awal per satuan waktu gliserolisis.

## HASIL DAN PEMBAHASAN

## Proses gliserolisis kontinu secara otomatis
Proses  gliserolisis  kontinu  yang  dilakukan  secara  otomatis untuk  memproduksi  DAG  telah  berhasil  dilakukan  dalam  skala laboratorium.  Rancangan  sistem  pemroses  berjalan  dengan
baik,  dan  sistemnya  dapat  berjalan  secara  otomatis.  Proses otomatisasi  tersebut  menunjukkan  bahwa  proses  gliserolisis secara kontinu untuk produksi DAG dapat berlangsung dengan lebih  cepat,  mudah  dan  efisien,  dibandingkan  dengan  proses gliserolisis  secara batch .  Hal  tersebut  terbukti  dari  komposisi produk DAG yang terbentuk mencapai kondisi optimum dengan waktu  yang  lebih  cepat.  Selain  itu  sistem  otomatisasi  lebih mudah,  karena  melalui  sistem  ini  hanya  menggunakan  satu bioreaktor  sehingga  tidak  diperlukan  lagi  banyak  wadah ataupun penggantian wadah untuk menampung produk seperti pada proses batch . Hal ini tentu saja memperkecil keterlibatan tenaga  manusia,  dan  menjadi  suatu  metode  alternatif  yang dapat  dikembangkan  dalam  skala  industri  (Suharyanto et  al . 2006).

## Laju  alir  CPO  optimum  produksi  DAG  melalui  gliserolisis kontinu
Optimasi  produksi  DAG  melalui  proses  gliserolisis  kontinu dilakukan  dengan  variasi  laju  alir  substrat  (CPO)  dan  waktu gliserolisis.  Data  pada  Gambar  2  menunjukkan  perbandingan fraksi  massa  produk  DAG  yang  terbentuk  selama  gliserolisis kontinu dengan perbedaan laju alir CPO.
Gambar 2.  Perbandingan  fraksi  massa  DAG  selama  gliserolisis kontinu dengan laju alir CPO berbeda
Dari  Gambar  2  dapat  dilihat  bahwa  fraksi  massa  produk DAG  pada  laju  alir  3  mL/menit  cenderung  lebih  tinggi  di- bandingkan  dengan  laju  alir  1  mL/menit.  Hal  ini  mengindikasi- kan  adanya  hubungan  antara  kecepatan  alir  substrat  CPO dengan  fraksi  massa  produk  DAG.  Adanya  laju  alir  substrat yang  lebih  cepat  menyebabkan  proses  kerja  lipase  dalam mengkatalisis pembentukan produk DAG baik melalui hidrolisis TAG  maupun  esterifikasi  ALB  dengan  gliserol  menjadi  lebih cepat.  Substrat  yang  dibutuhkan  lipase  untuk  membentuk produk  disuplai/diumpan  dengan  laju  alir  yang  lebih  cepat  ke dalam  bioreaktor  gliserolisis  dan  memungkinkan  terjadinya kontak enzim dengan substrat yang lebih banyak, sehingga laju alir substrat yang lebih cepat menghasilkan produk DAG yang lebih tinggi. Kittikun et al . 2008 telah melakukan produksi MAG dan  DAG  secara  kontinu  dalam packed-bed  reactor (PBR) selama 96 jam dengan melakukan perbesaran laju alir substrat dari 0.02 mL/menit menjadi 0.2 mL/menit, dan didapatkan hasil bahwa laju alir yang lebih besar yaitu 0.2 mL/menit menunjuk- kan  peningkatan  produktivitas  dibandingkan  laju  alir  0.02 mL/menit.  Hal  tersebut  menunjukkan  bahwa  laju  alir  dapat
Hasil Penelitian
0 5 10 15 20 25 0 9 18 27 36 45 Fr ak si M as sa D AG (% ) Waktu Gliserolisis (Siklus Ke-) -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 9 18 27 36 45 Fr ak si M as sa K om po ne n (% ) Waktu Gliserolisis (Siklus ke-) TAG DAG MAG ALB 0 5 10 15 20 25 30 9 18 27 36 45 Ko nv er si D AG (% )
Waktu Gliserolisis (Siklus Ke-)
mempengaruhi  terbentuknya  produk  DAG  dalam  proses gliserolisis kontinu.

## Waktu gliserolisis optimum produksi DAG secara kontinu
Optimasi  produksi  DAG  melalui  gliserolisis  kontinu  yang kedua  dilakukan  dengan  variasi  waktu  gliserolisis  berdasarkan siklus perputaran substrat/produk. Satu siklus merupakan waktu yang  dibutuhkan  untuk  mengalirkan  total  substrat  CPO  yang digunakan  sampai  terbentuk  produk.  Hal  ini  merupakan  waktu total  yang  dibutuhkan  ketika  substrat  CPO  dialirkan  ke  dalam bioreaktor melalui selang yang kemudian mengalir naik ke atas ( upward  flow )  sampai  terbentuk  produk  pada  bagian  atas bioreaktor  hingga  dialirkan  kembali  ke sampling  point .  Data pada  Gambar  3  menunjukkan  fraksi  massa  produk  DAG  yang terbentuk dengan variasi waktu gliserolisis.
Gambar 3. Fraksi massa DAG dengan variasi waktu gliserolisis
Data  pada  Gambar  3  menunjukkan  bahwa  fraksi  massa produk  DAG  meningkat  hingga  siklus  ke-18,  kemudian  terus menurun pada siklus ke-27, 36 sampai 45. Dari hasil ini dapat dilihat bahwa fraksi massa produk DAG mencapai nilai tertinggi pada  waktu  gliserolisis  siklus  ke-18,  setiap  siklus  gliserolisis membutuhkan waktu 30 menit  maka untuk  siklus ke-18 setara dengan  jam  ke-9.  Oleh  karena  itu,  waktu  gliserolisis  optimum yang terpilih adalah pada siklus ke-18 (jam ke-9) dengan fraksi DAG  sebesar  18.5%.  Hasil  ini  menunjukkan  bahwa  waktu gliserolisis  untuk  memproduksi  DAG  dua  kali  lipat  lebih  cepat dibandingkan dengan yang dilaporkan Suharyanto et al . (2011) menggunakan  lipase  dari R.  oryzae yang  sama  yaitu  18  jam dan  oleh  Tri-Panji et  al .  (2008)  menggunakan  lipase  asal Neurospora  sitophila yaitu  10  hari,  dimana  keduanya  meng- gunakan  proses  gliserolisis  dengan  sistem batch .  Gliserolisis sistem batch yang  lain  juga  telah  dilakukan  oleh  Valerio et  al . 2010  untuk  produksi  MAG  dan  DAG  dengan  sistem  bebas pelarut  menggunakan  lipase  komersial  Novozym  435  dengan penambahan  surfaktan  Tween  65  pada  substrat olive  oil dan didapatkan  fraksi  DAG  sebesar  17%.  Untuk  gliserolisis  sistem kontinu telah dilakukan antara lain oleh Kaewthong et al . 2005 dan Kittikun et al . 2008 dengan menggunakan continous stirred- tank  reactor (CSTR)  dan packed-bed  reactor (PBR),  lipase komersial IM-PS ( Pseudomonas sp), substrat palm olein selama 96  jam  dan  didapatkan  rata-rata  fraksi  MAG  dan  DAG  yang terbentuk sebesar 14 dan 2%.
Pada  Gambar  3  adanya  peningkatan  fraksi  massa  DAG hingga  mencapai  nilai  optimum  disebabkan  oleh  kerja  lipase
yang  menghidrolisis  TAG  menjadi  DAG,  dapat  juga  diperoleh dari proses esterifikasi MAG dengan ALB ataupun ALB dengan gliserol,  sedangkan  penurunan  fraksi  massa  DAG  disebabkan karena  DAG  mengalami  hidrolisis  kembali  oleh  lipase  menjadi MAG  dan  ALB.  Hal  ini  karena  kerja  dari  lipase  yang  dapat mengkatalisis  proses  dua  arah,  yaitu  hidrolisis  dan  esterifikasi (Turner et  al .  2004;  Lumor  dan  Akoh,  2008).  Aktivitas  katalitik lipase akan lebih mengarah ke reaksi hidrolisis  ketika aktivitas air  dalam  sistem  reaksi  lebih  tinggi,  sedangkan  reaksi  akan lebih  mengarah  ke  proses  esterifikasi  ketika  aktivitas  air  lebih rendah  sehingga  akan  menghasilkan  konversi  pembentukan ikatan ester yang lebih tinggi dan dalam suasana pelarut yang lebih  hidrofobik  (Sasi et  al .  2006).  Perubahan  fraksi  massa produk  lain  selain  DAG  yang  terbentuk  selama  gliserolisis kontinu  ketika  dibandingkan  dengan  fraksi  massa  awalnya dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4.  Perubahan fraksi massa produk TAG, DAG, MAG dan ALB dibandingkan fraksi massa awal
Gambar  4  menunjukkan  bahwa  selama  gliserolisis  kontinu berlangsung,  lipase  dapat  sekaligus  mengkatalisis  dua  proses berbeda  secara  bersamaan  yaitu  hidrolisis  dan  esterifikasi. Adanya nilai positif menunjukkan bahwa komponen mengalami peningkatan fraksi massa sedangkan nilai negatif menunjukkan bahwa komponen mengalami pengurangan fraksi massa ketika dibandingkan  dengan  fraksi  massa  awal  (sebelum  gliserolisis). Peningkatan  fraksi  massa  produk  disebabkan  karena  reaktan mengalami hidrolisis atau esterifikasi, sedangkan pengurangan fraksi  massa  disebabkan  karena  reaktan  terhidrolisis  sehingga produk  yang  terbentuk  berkurang  fraksi  massanya.  Gambar  5 menunjukkan  nilai  konversi  fraksi  massa  produk  DAG  di- bandingkan fraksi massa DAG awal.
Gambar  5.  Nilai  konversi  fraksi  massa  DAG  dibandingkan  dengan fraksi massa DAG awal
Hasil Penelitian
Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012
0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 9 18 27 36 45 La ju K on ve rs i D AG (% /J am ) Waktu Gliserolisis (Siklus Ke-) 0 5 10 15 20 25 1 2 3 4 5 6 Fr ak si M as sa D AG (% ) Waktu Gliserolisis (Siklus ke-) Substrat 1
Substrat 2 Substrat 3
Gambar  5  menunjukkan  adanya  pola  yang  hampir  sama dengan  Gambar  3,  yaitu  nilai  konversi  DAG  tertinggi  terdapat pada siklus ke-18 (jam ke-9). Artinya bahwa ada korelasi antara fraksi massa (Gambar 3) dan nilai konversi DAG. Nilai konversi DAG  merupakan  besarnya  peningkatan  persentase  fraksi massa  produk  DAG  ketika  dibandingkan  dengan  fraksi  massa DAG  awal  (sebelum  gliserolisis).  Nilai  konversi  DAG  tertinggi terdapat pada siklus ke-18 (jam ke-9) sebesar 29%.
Hal  ini  masih  lebih  rendah  jika  dibandingkan  dengan gliserolisis kontinu yang dilakukan oleh Noureddini et al . (2004) dengan  substrat  minyak  kedelai  dengan  nilai  konversi  DAG sebesar  36%.  Akan  tetapi  proses  tersebut  masih  dilakukan secara kimiawi menggunakan katalis basa (natrium hidroksida) pada suhu tinggi (230°C) dan berdampak pada kualitas produk, sehingga  metode  gliserolisis  kontinu  secara  enzimatis  dalam penelitian  ini  memiliki  keunggulan  yaitu  dilakukan  pada  suhu rendah, tidak memerlukan energi yang besar serta dapat meng- hasilkan produk dengan nilai konversi yang tidak jauh berbeda (selisih  7%).  Akan  tetapi  nilai  konversi  DAG  perlu  ditingkatkan dengan  menggunakan  lipase  dengan  aktivitas  dan  stabilitas yang  lebih  baik,  salah  satunya  dapat  dilakukan  dengan  per- lakuan  pemurnian  lipase,  karena  dalam  penelitian  ini  lipase yang  digunakan  masih  dalam  bentuk  ekstrak  kasar  dengan aktivitas  sebesar  1.091  U.  Selanjutnya,  ketika  didapatkan  nilai konversi DAG, dapat pula ditentukan laju konversi produk DAG dibandingkan  dengan  kondisi  awalnya  per  satuan  waktu gliserolisis (Gambar 6).
Gambar 6.  Laju  konversi  produk  DAG  dibandingkan  dengan  kondisi awalnya per satuan waktu gliserolisis
Gambar  6  menunjukkan  nilai  laju  konversi  produk  DAG selama  proses  gliserolisis  kontinu  ketika  dibandingkan  dengan kondisi awalnya. Laju konversi  merupakan kecepatan konversi fraksi massa produk DAG yang terbentuk dibandingkan dengan fraksi  massa  DAG  awal  per  satuan  waktu  gliserolisis.  Pada Gambar  6  dapat  dilihat  bahwa  laju  konversi  DAG  tertinggi  ter- dapat pada siklus ke-18 (jam ke-9), sebesar 0.47%/jam. Artinya bahwa pada siklus ke-18 terdapat  sebesar 0.47% peningkatan fraksi  massa  DAG  per  jam  reaksi  gliserolisis  ketika  dibanding- kan dengan kondisi awalnya. Hal ini sejalan dengan data pada Gambar  3  dan  Gambar  5  yang  menunjukkan  bahwa  persen fraksi  massa  dan  konversi  DAG  tertinggi  juga  terdapat  pada siklus  ke-18  (jam  ke-9).  Dengan  demikian  terlihat  adanya korelasi  yang  berbanding  lurus  antara  persen  fraksi  massa (Gambar 3), nilai konversi (Gambar 5) serta laju konversi DAG (Gambar 6). Pada siklus ke-45 terlihat bahwa laju konversi DAG
adalah nol. Artinya bahwa pada siklus ke-45 secara perhitungan tidak  terdapat  peningkatan  persentase  fraksi  massa  DAG  per satuan  waktu  gliserolisis  dibandingkan  kondisi  awalnya, sehingga pada siklus ke-45 fraksi massa produk DAG konstan dan  yang  mengalami  perubahan  diduga  adalah  komponen produk yang lain yaitu TAG, MAG dan ALB.

## Kinerja  lipase  dalam  mengkatalisis  proses  gliserolisis kontinu
Penentuan  kinerja  lipase  sebagai  biokatalis  dalam  proses gliserolisis  kontinu,  dilakukan  setelah  proses  optimasi  laju  alir CPO dan waktu gliserolisis. Data pada Gambar 7 menunjukkan perbandingan  fraksi  massa  produk  DAG  ketika  dilakukan  per- lakuan penggantian substrat CPO.
Gambar 7.  Perbandingan  fraksi  massa  produk  DAG  selama  9  jam gliserolisis  dengan  perlakuan  penggantian  substrat  CPO sebanyak 3 kali per 3 jam gliserolisis
Data  pada  Gambar  7  menunjukkan  bahwa  lipase  mampu untuk mempertahankan kinerjanya dalam mengkatalisis proses gliserolisis kontinu. Hal ini terlihat dari fraksi massa produk DAG yang terbentuk pada tiap siklus dan tiap perlakuan penggantian substrat  CPO  yang  relatif  sama.  Hal  ini  membuktikan  bahwa aktivitas  lipase  tetap  stabil  dan  tidak  menurun  drastis  seiring dengan  bertambahnya  perlakuan  penggantian  substrat  dan waktu  gliserolisis.  Ketika  dihubungkan  dengan  fraksi  massa DAG  pada  kondisi  awal,  maka  dapat  ditentukan  nilai  konversi produk  DAG  dibandingkan  dengan  komposisi  DAG  awal (sebelum gliserolisis) (Gambar 8).
Data  pada  Gambar  8  menunjukkan  bahwa  nilai  persen konversi  DAG  tertinggi  yang  mampu  dihasilkan  sebesar  37% pada  siklus  ke-3  dan  penggantian  substrat  ke-2,  dengan  total waktu gliserolisis adalah 4.5 jam. Waktu gliserolisis tersebut dua kali  lebih  cepat  dibandingkan  waktu  gliserolisis  optimum  yang diperoleh saat proses optimasi produksi DAG (Gambar 3) yaitu 9 jam, dengan nilai konversi DAG sebesar 29% (Gambar 5). Hal ini diduga karena saat dilakukan optimasi waktu gliserolisis tidak dilakukan  proses  penggantian  substrat,  artinya  substrat  yang digunakan  tetap  sama  hingga  akhir  proses,  sedangkan  untuk prosedur penentuan kinerja lipase dilakukan perlakuan sampai 3  kali  penggantian  substrat.  Hal  ini  yang  menjadi  penyebab konversi  DAG  pada  prosedur  penentuan  kinerja  lipase  lebih besar daripada proses optimasi waktu gliserolisis.
Hasil Penelitian
Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 1 2 3 4 5 6 Ko nv er si D AG (% ) Waktu Gliserolisis (Siklus ke-)
Substrat 1 Substrat 2 Substrat 3
Gambar 8.  Konversi  produk  DAG  hasil  gliserolisis  dengan  3  kali  per- gantian substrat CPO dibandingkan komposisi awalnya
Pada proses optimasi waktu gliserolisis (Gambar 3), adanya penurunan  fraksi  massa  DAG  setelah  jam  ke-9,  disebabkan karena  kondisi  tersebut  sudah  mencapai  kondisi  optimumnya, sehingga  tidak  dapat  lagi  meningkatkan  fraksi  massa  produk yang  berdampak  pada  nilai  konversinya  hanya  mencapai  29% (Gambar  5).  Akan  tetapi  setelah  diberi  perlakuan  penggantian substrat  yang  baru,  diduga  hal  inilah  yang  menjadi  suplai (donor)  asil  baru  yang  kembali  tersedia  untuk  membentuk tambahan  fraksi  massa  DAG  baru,  sehingga  nilai  konversinya menjadi lebih tinggi, yaitu mencapai 37%.
Kelemahan proses gliserolisis kontinu yang dilakukan dalam penelitian ini, yaitu enzim lipase yang digunakan dalam proses gliserolisis  masih  dalam  bentuk  ekstrak  kasar,  sehingga konversi  produk  DAG  yang  dihasilkan  belum  maksimal.  Untuk meningkatkan  konversi  DAG  dalam  proses  gliserolisis  kontinu, perlu  dilakukan  perlakuan  terhadap  lipase  itu  sendiri  agar stabilitas  dan  aktivitas  katalitiknya  menjadi  semakin  besar  dan berkorelasi dengan terbentuknya fraksi massa produk dan nilai konversi  produk  DAG  yang  lebih  tinggi,  salah  satunya  dapat dilakukan  dengan  tahapan  pemurnian  lipase,  atau  melakukan rekayasa  genetik  terhadap  mikroba  penghasil  lipase  untuk menghasilkan enzim dengan aktivitas  dan stabilitas yang lebih baik.

## KESIMPULAN
Proses  gliserolisis  enzimatis  untuk  produksi  DAG  yang dilakukan secara kontinu untuk tujuan otomatisasi telah berhasil dilakukan.  Berdasarkan  kondisi  yang  diteliti,  hasil  terbaik  pada proses  optimasi  produksi  DAG  melalui  gliserolisis  kontinu dicapai  pada  laju  alir  substrat  (CPO)  3  mL/menit;  waktu gliserolisis  siklus  ke-18  (9  jam),  waktu  optimum  gliserolisis kontinu  tersebut  mencapai  dua  kali  lipat  lebih  cepat  dari penelitian  sebelumnya  yang  dilakukan  dengan  sistem batch serta;  penentuan  kinerja  lipase  menunjukkan  bahwa  lipase mampu  mengkatalisis  proses  gliserolisis  kontinu  dengan  baik ditandai dengan pembentukan fraksi massa produk  DAG yang
relatif stabil hingga 3 kali perlakuan penggantian substrat CPO selama 9 jam gliserolisis dan kondisi terbaik dicapai pada peng- gantian substrat ke-2 dan waktu gliserolisis siklus ke-3 dengan nilai konversi sebesar 37%.

## DAFTAR PUSTAKA
Anggirasti,  Hariyadi  P,  Andarwulan  N,  Haryati  T.  2008. Gliserolisis  RBDPO (Refined  Bleached  Deodorized  Palm Oil) dengan  Lipase  untuk  Sintesis  MDAG  (Mono- diasilgliserol). Dalam Prosiding Seminar PATPI, Palembang. 1062-1070.
Kaewthong W, Sirisansaneeyakul S , Prasertsan P, Kittikun AH. 2005.  Continuous  production  of  monoacylglycerols  by glycerolysis  of  palm  olein  with  immobilized  lipase.  Process Biochem  40:  1525–1530.  DOI:  10.1016/j.procbio.2003.12. 002.
Kittikun  AH,  Kaewthong  W,  Cheirsilp  B.  2008.  Continuous production of monoacylglycerols from palm olein in packed- bed  reactor  with  immobilized  lipase  PS.  Biochem  Eng  40: 116–120. DOI: 10.1016/j.bej.2007.11.023.
Lumor  SE,  Akoh  CC.  2008.  Esterification  and  hydrolytic activities  of Candida  rugosa lipase  isoform  1  (LIP1) immobilized on celite 545, duolite A7, and sephadex G-25. J Agr Food Chem 56: 10396-10398. DOI: 10.1021/jf802136d.
Matsuo  N.  2004.  Nutritional  characteristics  and  health  benefits of  diacylglycerol  in  foods.  Food  Sci  Technol  Res  10:  103- 110. DOI: 10.3136/fstr.10.103.
Morita O, Soni MG. 2009.  Safety assessment of diacylglycerol oil as an edible oil: a review of the published literature. Food Chem Toxicol 47: 9-21. DOI: 10.1016/j.fct.2008.09.044.
Noureddini  H,  Harkey  DW,  Gutsman  MR.  2004.  A  continuous process for the glycerolysis of soybean oil. J Am Oil Chem Soc 81: 203-207. DOI: 10.1007/s11746-004-0882-y.
Nuraida  L,  Anggraini  D,  Mintarti  IS,  Haryati  T.  2008.  Kajian
Aktivitas  Antimikroba  Monoasilgliserol  dan  Mono- diasilgliserol  dari  Minyak  Kelapa  dan  Minyak  Inti  Sawit. Dalam  Prosiding  Seminar  Tahunan  MAKSI  2008.  Bogor, Masyarakat  Perkelapa-Sawitan  Indonesia  (MAKSI)  & SEAFAST Center, IPB. p 204-214.
Sasi P, Mehrotra RR, Debnath M. 2006. Esterification reactions catalyzed  by  surfactant-coated Rhizopus  arrhizus lipase. Indian J Biotechnol 5: 364-367.
Suharyanto,  Tri-Panji,  Abdullah  MI,  Syamsu  K.  2006.  Bio- konversi  CPO  dengan  desaturase  amobil  sistem  kontinu pada  skala  semipilot  untuk  produksi  minyak  mengandung GLA. Menara Perkebunan 74: 96-105.
Suharyanto,  Tri-Panji,  Perwitasari  U.  2011.  Optimasi  produksi diasilgliserol  dari  crude  palm  oil  menggunakan  lipase spesifik  1.3-gliserida  dari Rhizopus  oryzae TP-2.  Menara Perkebunan 79: 23-29.
Hasil Penelitian
Terakreditasi Dikti: 80/DIKTI/Kep/2012
Takase H. 2007. Metabolism of diacylglycerol in humans.  Asia Pac J Clin Nutr 16: 398-403.
Tri-Panji,  Suharyanto,  Arini  N.  2008.  Lipase  spesifik  1,3- gliserida  dari  fungi  lokal  untuk  biokonversi  CPO  menjadi diasilgliserol. Menara Perkebunan 76: 11-22.
Turner C, King JW, Mckeon T. 2004. Selected uses of enzymes with  critical  fluids  in  analytical  chemistry . J  AOAC  Int  87: 797-810.
Valerio  A,  Rovani  S,  Treichel  H,  de  Oliveira  D,  Oliveira  JV. 2010.  Optimization  of  mono  and  diacylglycerols  production from  enzymatic  glycerolysis  in  solvent-free  systems. Bioprocess  Biosys  Eng  33:  805-12.  DOI:  10.1007/s00449- 009-0402-1.
Yuan Q, Ramprasath VR, Harding SV, Rideout TC, Chan YM, Jones JH. 2010. Diacylglycerol oil reduces body fat but does not  alter  energy  or  lipid  metabolism  in  overwight, hypertriglyceridemic  women.  J  Nutr  140:  1122-1126.  DOI: 10.3945/jn.110.121665.